(57)【要約】      （修正有）【課題】個体における血管新生を減少させる方法の提供。【解決手段】血管新生を減少させるために有効な量で、メカミルアミン等、ニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類における血管新生を減少させる方法。特に病的な血管新生に関連するまたはそれに起因する状態を治療するために有用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を減少させるために有効な量でニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類における血管新生を減少させる方法。
【請求項２】
nAChR拮抗剤が、メカミルアミン、ヘキサメトニウム、ジヒドロ-β-エリトロイジン、d-ツボクラリン、ペンピジン、クロルイソンダミン、エリソジン、カンシル酸トリメタファン、ペントリニウム、ブンガロトキシン、スクシニルコリン、テトラエチルアンモニウム、トリメタファン、クロルイソンダミン、およびトリメチジニウムからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
投与が、静脈内、固形腫瘍内またはその周辺、全身、動脈内、および局所からなる群より選択される経路によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
病的な血管新生を減少させるために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を哺乳類に投与することを含む、病的な血管新生に関連した障害を治療する方法。
【請求項５】
nAChR拮抗剤が、メカミルアミン、ヘキサメトニウム、ジヒドロ-β-エリトロイジン、d-ツボクラリン、ペンピジン、クロルイソンダミン、エリソジン、カンシル酸トリメタファン、ペントリニウム、ブンガロトキシン、スクシニルコリン、テトラエチルアンモニウム、トリメタファン、クロルイソンダミン、およびトリメチジニウムからなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
投与が、静脈内、固形腫瘍内またはその周辺、全身、動脈内、および局所からなる群より選択される経路によって行われる、請求項4記載の方法。
【請求項７】
第二の血管新生阻害剤を投与することをさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項８】
投与が腫瘍周囲であって、血管新生の減少が腫瘍の増殖を阻害する、血管新生を減少させるために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を、腫瘍を有する哺乳類に投与することを含む、哺乳類における腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項９】
抗腫瘍化学療法剤を投与する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類における異常な線維血管増殖を減少させるために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を、異常な線維血管増殖を有する哺乳類に投与することを含む、哺乳類における異常な線維血管増殖を阻害する方法。
【請求項１１】
異常な線維血管増殖が、炎症性関節炎に関連する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類における増殖性網膜症を減少させるために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を、腫瘍を有する哺乳類に投与することを含む、哺乳類における増殖性網膜症を阻害する方法。
【請求項１３】
増殖性網膜症が哺乳類における糖尿病の結果として起こる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類における腫瘍に関連する病的な血管新生を減少させるために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を、腫瘍を有する哺乳類に投与することを含む、腫瘍に関連した病的な血管新生を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府助成研究に関する声明
本発明は、米国国立心肺血液研究所によって与えられた助成金番号第R01 HL-58638号およびカリフォルニア州タバコ関連研究疾患プログラムの下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を保有する可能性がある。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に血管新生および脈管形成の調節、特に病的な血管新生の減少の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管新生および脈管新生は、血管増殖に関係するプロセスである。血管新生は、それによって既存の毛細管から新しい血管が形成されるプロセスであるが、脈管形成は、内皮前駆細胞に由来する血管の増殖を伴う。血管新生は、前血管新生分子と抗血管新生分子とのバランスによって調節される複雑な複合プロセスである。血管新生刺激（例えば、低酸素または炎症性サイトカイン）によって、血管内皮増殖因子（VEGF）または線維芽細胞増殖因子（FGF）のような血管新生増殖因子の発現および放出が誘導される。これらの増殖因子は、既存の血管における内皮細胞（EC）を刺激して増殖させ、組織の中を遊走させて、新しい血管内皮で覆われたチャンネルを形成する。
【０００４】
血管新生および脈管新生、ならびにこれらのプロセスを調節する因子は、胚発生、炎症、および創傷治癒において重要であり、同様に、腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎、および慢性炎症疾患のような病態にも関与している（例えば、米国特許第5,318,957号(特許文献１)；Yancopoulosら（1998）、Cell 93：661〜4(非特許文献５)；Folkmanら（1996）、Cell 87：1153〜5(非特許文献６)；およびHanahanら（1996）、Cell 86：353〜64(非特許文献７)を参照されたい）。
【０００５】
血管新生と脈管新生はいずれも、内皮細胞の増殖に関与している。内皮細胞は血管壁に沿って並ぶ；毛細管は、ほぼ内皮細胞のみを含む。血管新生プロセスは、内皮細胞増殖の増加を含むのみならず、内皮細胞によるプロテアーゼ分泌、基底膜の分解、周辺のマトリクスへの遊走、増殖、整列、管様構造への分化、および新しい基底膜の合成を含むさらなる事象のカスケードを含む。脈管新生は、間葉細胞の動員および血管芽細胞への分化を含み、次に血管芽細胞が内皮細胞に分化して、新たな血管を形成する（例えば、Folkmanら（1996）、Cell 87：1153〜5(非特許文献６)を参照されたい）。
【０００６】
不適当なまたは病的な血管新生は、アテローム斑の増殖、糖尿病性網膜症、変性性黄斑症、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸窮迫症候群、および喘息に関与している。さらに、腫瘍の進行は、血管新生に関連しており、これはそれによって増殖しつつある腫瘍組織に栄養が輸送されるメカニズムを提供する。
【０００７】
病的な血管新生を減少する方法が当技術分野において必要である。本発明は、この必要性に取り組む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,318,957号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Schullerら (1989) Carcinogenesis 10:1753-1755
【非特許文献２】Maneckjeeら(1994) Cell Growth Differ. 5:1033-1040
【非特許文献３】Hongら(1995) Pharm. Sci. 84:65-70
【非特許文献４】Schullerら(1989) Biochem. Pharmacol. 38:3439-3442
【非特許文献５】Yancopoulosら(1998) Cell 93:661-4
【非特許文献６】Folkmanら(1996) Cell 87;1153-5
【非特許文献７】Hanahanら(1996) Cell 86:353-64
【非特許文献８】Carmelietら(2000) Nature 407:249-257
【非特許文献９】Folkman (1995) Nat Med 1:27-31
【非特許文献１０】Heeschenら(2001) Nat Med 7:833-837
【非特許文献１１】Grandoら(1995) J Invest Dermatol 105:774-781
【非特許文献１２】Macklinら(1998) Pharmacol Exp Ther 287:435-439
【非特許文献１３】Wesslerら(1999) Clin Exp Pharmacol Physiol 26: 198-205
【非特許文献１４】Kawashimaら(1989) Neurosci Lett 104:336-339
【非特許文献１５】Kawashimaら(1990) Neurosci Lett 119:156-158
【非特許文献１６】Kureishiら(2000) Nat Med 6:1004-1010
【非特許文献１７】Jangら(2000) Circulation 102:1414-1419
【非特許文献１８】Couffinhalら(1998) Am J Pathol 152:1667-1679
【非特許文献１９】LagasseおよびWeissman (1996) J Immunol Methods 197:139-150
【非特許文献２０】Villablanca (1998) J Appl Physiol 84:2089-2098
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、個体における血管新生を減少する方法を提供する。方法は、一般的にニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤の有効量を個体に投与することを含む。方法は、血管新生、特に病的な血管新生に関連するまたはそれに起因する状態を治療するために有用である。本発明はさらに、血管新生に関連するまたはそれに起因する状態を治療する方法を提供する。
【００１１】
発明の特徴
本発明は、哺乳類における血管新生を減少させる方法を特徴とする。方法は一般的に、血管新生を減少するために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor: nAChR）拮抗剤を哺乳類に投与することを含む。
【００１２】
本発明はまた、病的な血管新生に関連した障害を治療する方法も特徴とする。いくつかの態様において、方法は、哺乳類における異常な線維血管増殖を阻害する方法を特徴とする。これらの態様のいくつかにおいて、異常な線維血管増殖は炎症性関節炎に関連している。いくつかの態様において、本発明は、哺乳類における増殖性網膜症を阻害する方法を特徴とする。これらの態様のいくつかにおいて、増殖性網膜症は、哺乳類における糖尿病の結果として起こる。方法は一般的に、病的な血管新生を減少させるために有効な量のnAChR拮抗剤を哺乳類に投与することを含む。いくつかの態様において、方法はさらに、第二の血管新生阻害剤を投与することを含む。
【００１３】
本発明はさらに、哺乳類における腫瘍増殖を阻害する方法を特徴とする。いくつかの態様において、本発明は腫瘍に関連した病的な血管新生を阻害する方法を特徴とする。方法は一般的に、腫瘍に関連した血管新生を減少させるために有効な量のnAChR拮抗剤を哺乳類に投与することを含む。いくつかの態様において、本発明はさらに、nAChR拮抗剤以外の抗腫瘍化学療法剤を投与することを含む。
【００１４】
本発明の方法において用いるために適したnAChR拮抗剤には、メカミルアミン(mecamylamine)、ヘキサメトニウム(hexamethonium)、ジヒドロ-β-エリトロイジン、d-ツボクラリン、ペンピジン(pempidine)、クロルイソンダミン(chlorisondamine)、エリソジン(erysodine)、カンシル酸トリメタファン、ペントリニウム(pentolinium)、ブンガロトキシン、スクシニルコリン(succinylcholine)、テトラエチルアンモニウム、トリメタファン、クロルイソンダミン、およびトリメチジニウムが含まれるがこれらに限定されない。nAChR拮抗剤は、静脈内、固形腫瘍内または周囲、全身、動脈内、および局所を含むがこれらに限定されない如何なる投与経路によっても投与することができる。
【００１５】
定義
「ニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤」、「ニコチン拮抗剤」、および「ニコチン受容体拮抗剤」という用語は、本明細書においてニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）に実質的に特異的に結合して、薬理作用、例えば血管新生の減少を提供する化合物を指すために互換的に用いられる。「ニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤」は、天然に存在する化合物（低分子、ポリペプチド、ペプチド等、特に天然に存在する植物アルカロイド等を含むがこれらに限定されない）、内因性のリガンド（例えば、天然起源から精製された、組み換えまたは合成によって産生された、ならびにそのような内因性のリガンドの誘導体および変種を含むリガンドをさらに含む）、および合成によって産生された化合物（例えば、低分子、ペプチド等）、ならびに前述の薬学的に許容される塩を含む。
【００１６】
「治療」、「治療する」等の用語は、本明細書において、一般的に、所望の薬理作用および／または生理作用、例えば血管新生および／または脈管新生の減少を得ることを意味するように用いられる。この作用は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であってもよく、ならびに／または疾患および／もしくはnAChRの内因性の活性化による疾患に帰因する副作用を部分的もしくは完全に治癒することに関して治療的であってもよい。本明細書において用いられる「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の如何なる治療も含み、それらには、（a）疾患の素因がある可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない被験者において疾患または状態の発生を予防すること、（b）疾患を阻害すること、例えばその発達を停止させること、または（c）疾患を軽減すること、が含まれる。本発明の状況において、血管新生および／または脈管新生の減少は、血管新生を減少することによる治療に対して感受性がある疾患または状態を有する被験者のために用いられる。
【００１７】
「アセチルコリン受容体拮抗剤の治療的有効量」とは、所望の治療効果、例えば、血管新生および／または脈管新生の減少を促進するために有効なcAChR拮抗剤の量を意味する。正確な所望の治療効果は、治療すべき状態に応じて変化するであろう。
【００１８】
「単離された」とは、天然においてそれに伴う成分の全てまたは一部から分離されている化合物を意味する。
【００１９】
「実質的に純粋なニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤」とは、nAChR拮抗剤が天然においてそれに伴う成分から分離されていることを意味する。典型的に、nAChR拮抗剤は、天然において会合する天然に存在する有機分子を重量で少なくとも60％含まない場合に実質的に純粋である。好ましくは、調製物はnAChR拮抗剤の重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％である。実質的に純粋なnAChR拮抗剤は、例えば、天然資源からの抽出によって、化合物を化学合成することによって、または精製と化学改変の組み合わせによって得ることができる。純度は、任意の適当な方法、例えば、クロマトグラフィー、質量分析、HPLC分析等によって測定することができる。
【００２０】
nAChR拮抗剤は、それがその天然の状態で伴う混入物から分離されている場合に天然に会合する成分を実質的に含まない。このように、例えば、化学合成された、またはそれが本来由来する細胞とは異なる細胞系において産生されたnAChR拮抗剤は、その天然に会合する成分を実質的に含まないであろう。例えばnAChR拮抗剤が化学合成される多くの態様において、nAChR拮抗剤は一般的に、実質的に純粋、例えば少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、または少なくとも約99％純粋である。
【００２１】
本発明をさらに詳しく記述する前に、本発明は、記述の特定の態様は当然のことながら変化する可能性があるために、これらにに限定されないと理解すべきである。同様に、本明細書において用いた用語は、特定の態様を説明する目的に限られ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に限って制限されるため、制限的に解釈してはならないと理解される。
【００２２】
値の範囲が提供される場合、本文が特に明記していない限り、その範囲の上限と下限のあいだの下限の単位の10分の1までのそれぞれの介在する値、およびその記述の範囲内における他の任意の記述の値または介在値が本発明に含まれると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、同様に、記述の範囲における任意の特に除外された限界を条件として、本発明に含まれる。記述の範囲に、限界の一つまたは双方が含まれる場合、含まれる限界のいずれか双方を除外する範囲も同様に本発明に含まれる。
【００２３】
特に明記していない限り、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記述の方法および材料と類似または同等の如何なる方法および材料も、本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を記述する。本明細書において言及した全ての出版物は、それに関連して出版物が引用される方法および／または材料を開示および記述するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００２４】
本明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「一つの（a）」、「および（and）」および「その（the）」には、本文が特に明記していない限り複数形が含まれることに注意しなければならない。このように、例えば、「1つの（a）ニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤」という場合には、そのような複数の拮抗剤が含まれ、「その（the）方法」という場合には、当業者に既知の一つまたはそれ以上の方法およびその同等物に対する言及等が含まれる。
【００２５】
本明細書において考察した出版物は、本出願の提出日以前に単にその開示がなされたために提供される。本明細書の如何なる開示も、先行発明に基づいて、本開示がなされた日付を早める権利が本発明者にはないと自認したと解釈されるべきではない。さらに、提供された出版日は、実際の出版日とは異なっている可能性があり、それらは個々に確認する必要がある可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】メカミルアミンがインビボで血管新生を阻害することを示すディスク血管新生系による結果を示す。
【図２】α7 nAChR欠損マウスにおいて、血管新生反応が有意に減少していることを示す結果を示す。
【図３】対照と比較してメカミルアミンが毛細管密度を用量依存的に減少したことを示す、マウス後肢虚血モデルの結果を示す。
【図４】虚血発生後6時間以内のα7-サブユニットのアップレギュレーションおよび7日目での最大効果を示すウェスタンブロット分析を示す。
【図５】ルイス肺腫瘍モデルによる結果を示す：メカミルアミンは、進行した腫瘍の増殖を阻害し、メカミルアミン処置動物は有意に小さい腫瘍増殖を示したことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、個体における血管新生を減少させる方法を提供する。方法は一般的に、ニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤の有効量を個体に投与することを含む。方法は、血管新生、特に病的な血管新生に関連した、またはそれに起因する状態および障害を治療するために有用である。
【００２８】
本発明は、内皮細胞上のコリン作動性受容体に依存する内因性血管新生経路が存在するという知見に基づいている。ニコチンの非存在下において、この経路は、実質的に血管新生に関与する。以下の知見が得られた：1）nAChRの阻害は、インビトロで毛細管の網目構造形成を有意にそして可逆的に減少させた；2）nAChRの阻害は、炎症（ディスク血管新生モデル）、虚血（大腿動脈結紮モデル）、および新生物（ルイス（Lewis）肺癌モデル）に対する血管新生反応を減少させた；3）虚血によってnAChR発現の増加が起こった。これらのデータは、nAChRが本来の血管新生反応に関係していることを始めて明らかにする。nAChR拮抗剤は、腫瘍における血管新生を遮断して、腫瘍の増殖を約50％減少させることが判明した。
【００２９】
本明細書に示した結果は、nAChR拮抗剤が、例えば、癌、アテローム性動脈硬化症、増殖性網膜症、慢性関節炎において認められる過剰な線維血管増殖、乾癬、および血管腫のような血管の異形成を含む、病的な血管新生に関連するおよび／またはそれに起因する状態および障害を治療するために有用であることを示している。
【００３０】
血管新生を減少させる方法
本発明は、個体における血管新生を減少させる方法を提供する。方法は一般的に、ニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤の有効量を個体に投与することを含む。このように、方法は、nAChR受容体に依存するまたはそれによって媒介される内因性の血管新生経路を阻害することによって、血管新生を減少させることを含む。内因性経路は、ニコチンの非存在下で活性化される。
【００３１】
ニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤
多様なnAChR拮抗剤の如何なるものも、本発明の方法において用いることができる。例には、メカミルアミン；ヘキサメトニウム（Wotringら、1995、Neuroscience 67：293〜300）；ジヒドロ-β-エリトロイジン（Stolermanら、1997、Psychopharmacology 129：390〜397）；d-ツボクラリン（Wotringら、1995）；ペンピジン（Rapierら、1990、J. Neurochem. 54：937〜945）；クロルイソンダミン（Caggiulaら、1995、Psychopharmacology 122：301〜306）；エリソジン（Deckerら、1995、Eur. J. Pharmacol. 280：79〜80）；カンシル酸トリメタファン（Hisayamaら、1998、Br. J. Pharmacol. 95：465〜472）；ペントリニウム；ブンガロトキシン；スクシニルコリン；テトラエチルアンモニウム；トリメタファン；クロルイソンダミン；およびトリメチジニウムが含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
適したnAChR拮抗剤にはまた、細胞上のnAChRのレベルを減少させる物質；およびnAChRの活性を減少させる物質が含まれるがこれらに限定されないnAChRの調節物質が含まれる。置換ピリジン2-エチルピリジンおよび3-エチルピリジンのようなニコチンの類似体も同様に、抗血管新生作用を有する可能性がある。
【００３３】
ニコチン拮抗剤は、遊離の塩基として、または薬学的に許容されるその塩の形のいずれかで投与してもよい。酸基またはアミノ基の薬学的に許容される塩には、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イソチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸のような有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびp-トリルスルホン酸のような有機スルホン酸、ならびに塩酸、硫酸、燐酸、およびスルファミン酸のような無機酸の塩が含まれるがこれらに限定されない。
【００３４】
ニコチン作動性アセチルコリン受容体拮抗剤は、実施例に記述された方法を含む、容易に利用できる方法を用いて同定することができる。候補物質が血管新生を減少させることができることは、インビトロMatrigelアッセイ、ディスク血管新生系、マウス後肢虚血モデル、マウス肺癌モデル等を含むがこれらに限定されない任意の既知の方法を用いてインビトロまたはインビボで評価することができる。
【００３５】
薬学的組成物
本明細書を読むことによって、当業者は、本明細書に記述のnAChR拮抗剤を含む薬学的組成物が広く多様な製剤で提供されうることを認識すると思われる。より詳しく述べると、nAChR拮抗剤は、適当な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって薬学的組成物に調製することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルのような、固体、半固体（例えば、ゲル）、液体、またはガス様剤形に調製してもよい。nAChR拮抗剤が天然に存在する化合物である場合、薬学的組成物は、生薬調製物としても提供することができる。
【００３６】
用いられるnAChR拮抗剤製剤は、治療すべき状態または疾患、投与経路、投与されるnAChR拮抗剤の量、および当業者によって容易に認識される他の変数に従って変化するであろう。一般的に、そして下記により詳細に考察するように、nAChR拮抗剤の投与は、全身または局所のいずれかとなりえて、経口、非経口、静脈内、動脈内、心膜内、筋肉内、腹腔内、関節内、眼内、局所、経皮、皮下、皮内、肺内等が含まれるが必ずしもこれらに限定されない様々な経路によって行うことができる。
【００３７】
薬学的投与剤形において、nAChR拮抗剤は、その薬学的に許容される塩の形で投与してもよく、またはそれらは単独もしくは他の薬学的活性化合物と適当に会合させてもしくは組み合わせて用いてもよい。以下の方法および賦形剤は、単なる例示に過ぎず、決して制限的なものではない。
【００３８】
nAChR拮抗剤は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高等脂肪酸またはポリエチレングリコールのエステルのような、水性または非水性溶媒において、望ましければ、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、および保存剤のような通常の添加剤と共にそれらを溶解、懸濁、または乳化させることによって、注射用製剤に調製することができる。
【００３９】
局所、経皮、および経皮投与に適した製剤は、適当な懸濁剤、溶解剤、濃化剤、安定化剤、および保存剤を用いることによって同様に調製してもよい。局所製剤はまた、例えば、徐放性ペレットまたは放出調節パッチに組み入れることによって、メカミルアミンまたは他のnAChR拮抗剤の連続的な投与を提供する手段と共に利用してもよい。
【００４０】
nAChR拮抗剤はまた、生体適合性のゲルに調製することができ、このゲルを局所に適用するまたは埋め込むことができる（例えば、内部治療部位でのnAChR拮抗剤の持続的な放出を提供するため）。ゲルを用いて送達するための所望の化合物を調製するために適したゲルおよび方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第5,801,033号；第5,827,937号；第5,700,848号；およびMATRIGEL（商標）を参照されたい）。
【００４１】
経口調製物の場合、nAChR拮抗剤は、単独、または適当な添加物、例えば乳糖、マンニトール、コーンスターチもしくはジャガイモデンプンのような通常の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチもしくはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；および望ましければ希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、および着香料と組み合わせて、錠剤、粉剤、顆粒剤、またはカプセル剤を作製することができる。
【００４２】
nAChR拮抗剤は、吸入によって投与されるエアロゾル製剤において利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような許容される加圧噴射剤に調製することができる。
【００４３】
さらに、nAChR拮抗剤は、乳化基剤、または水溶性基剤のような多様な基剤と混合することによって坐剤に調製することができる。本発明の化合物は、坐剤によって直腸内投与することができる。坐剤には、体温で融解するが、室温では固化するカカオバター、カルボワックス、およびポリエチレングリコールのような溶媒が含まれうる。
【００４４】
それぞれの用量単位、例えば小さじ1杯、大さじ1杯、錠剤、または坐剤が、一つまたはそれ以上の阻害剤を含む組成物の規定量を含む、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤のような、経口または直腸投与のための単位投与剤形が提供される。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与剤形は、滅菌水溶液、通常生理食塩液、または他の薬学的に許容される担体における溶液として組成物中に1つまたは複数の阻害剤を含んでもよい。
【００４５】
本明細書において用いられる単位投与剤形という用語は、それぞれの単位が、血管新生の所望の減少を得るために十分な量で計算されたnAChR拮抗剤の規定量を、薬学的に許容される希釈剤、担体または溶媒と共に含む、ヒトおよび／または動物被験者のための単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。本発明の単位投与剤形の仕様は、用いる特定の化合物および得られる効果、ならびに宿主におけるそれぞれの化合物に関連した薬物動態に依存する。
【００４６】
溶媒、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。その上、pH調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤等のような薬学的に許容される補助剤は、一般に容易に入手可能である。
【００４７】
いくつかの態様において、nAChR拮抗剤は、一つまたはそれ以上のさらなる治療物質との併用治療において投与される。例としての治療物質には、癌、アテローム性動脈硬化症、増殖性網膜症、慢性関節炎、乾癬、血管腫等を治療するために用いられる治療物質が含まれる。
【００４８】
用量
本発明の状況において被験者、特にヒトに投与されるnAChR拮抗剤の用量は、妥当な時間の枠内で被験者における血管新生の治療的減少を行うために十分でなければならない。用量は、他の検討の中でも、用いられる特定のnAChR拮抗剤の効力および被験者の状態と共に、治療される被験者の体重によって左右されるであろう。例えば、ニコチン作動性アセチルコリン受容体のnAChR拮抗剤のレベルもしくは親和性またはその両者は、化合物の抗血管新生活性を調節するために役割を果たす可能性がある。用量の大きさはまた、特定の化合物の投与を伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって左右されるであると考えられる。
【００４９】
血管新生を減少させるためのnAChR拮抗剤の有効量を決定する場合、最小の副作用で所望の抗血管新生作用を得るために、投与経路、放出系（例えば、丸剤、ゲル、または他のマトリクス）の動態、およびニコチンアゴニストの効力を考慮する。nAChR拮抗剤は典型的に、治療される被験者の臨床状態に一致する1日から数週間の期間、治療すべき被験者に投与されるであろう。
【００５０】
当業者に容易に認識されるように、用量は、標準的な、例えばメカミルアミンと比較してその効力および／または有効性に従ってnAChR拮抗剤に関して調節される。用量は、約0.01 mg〜10 mgの範囲を1〜20回毎日投与してもよく、1日の総量約0.1 mg〜100 mgまでとなりうる。全身効果の目的で局所適用される場合、パッチまたはクリームは、約0.01 mg〜10 mgの範囲の用量の全身送達を提供するようにデザインされるであろう。局所製剤（例えば、クリーム）の目的が局所抗血管新生作用を提供することである場合、用量は約0.001 mg〜1 mgの範囲となるであろう。全身作用の目的のために注射する場合、nAChR拮抗剤が投与されるマトリクスは、約0.001 mg〜1 mgの範囲の用量の全身送達を提供するようにデザインされる。局所作用の目的のために注射する場合、マトリクスは、約0.03 mg〜1 mgの範囲のnAChR拮抗剤の量を局所的に放出するようにデザインされる。
【００５１】
以下は、用量の非制限的な実施例である。塩酸メカミルアミンに関して、経口用量は、通常、1日量が25 mgであるが、1日量2.5 mgもの低さとなりうる。カンシル酸トリメタファンは、0.1〜4.0 mg/分の用量で静脈内投与され、注入速度は医療従事者が必要と思われるように増加させることができる。酒石酸ペントリニウムは、20 mg、40 mg、もしくは100 mgの用量で経口もしくは注射（皮下もしくは筋肉内）によって、または10 mg/mlを含む10 mlバイアルにおける注射剤として投与される。
【００５２】
投与経路にかかわりなく、nAChR拮抗剤の用量は、任意の適当な期間、例えば1〜24時間、1日〜数日等のあいだ投与することができる。さらに、選択された治療期間に複数回投与することができる。適した用量は、特に予防的レジメにおいて、1日あたり適した分割用量を投与することができる。正確な治療レベルは、治療される被験者の反応に依存すると考えられる。
【００５３】
併用治療
いくつかの態様において、nAChR拮抗剤は、血管新生阻害剤および癌化学療法剤を含む一つまたはそれ以上の他の治療物質と併用して投与される。
【００５４】
適した化学療法剤には、アルキル化剤、例えばシスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン；ブレオマイシンのようなDNA鎖切断剤；アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、およびメソトレキセートのようなインターカレート剤を含むDNAトポイソメラーゼII阻害剤；エトポシドおよびテニポシドのような非インターカレートトポイソメラーゼII阻害剤；DNAの小さい溝に結合する物質であるプリカマイシン；クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤；チオテパのようなアジリジン；ブスルファンのようなメタンスルホネートエステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンのようなニトロソウレア；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ複合体；マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびアルトレタミンのような生体還元アルキル化剤；メソトレキセートおよびトリメトレキセートのような葉酸拮抗剤を含む抗代謝剤；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジン、シタラビンのようなピリミジン拮抗剤；メルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンを含むフロクスリジンプリン拮抗剤；シクトラビン、フルダラビンを含む糖改変類似体；ヒドロキシウレアを含むリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセルを含むチューブリン相互作用剤；プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプロドニソロンのような副腎皮質ホルモン；エストロゲン、抱合エストロゲン、およびエチニルエストラジオールおよびジエチルスチルベステロール、クロロトリアニセンおよびイデネストロールを含むホルモン遮断剤；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロールのようなプロゲスチン；テストステロン、プロピオン酸テストステロンのようなアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロンエストロゲン、抱合エストロゲン、およびエチニルエストラジオールおよびジエチルスチルベステロール、クロロトリアニセンおよびイデネストロール；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロールのようなプロゲスチン；テストステロン、プロピオン酸テストステロンのようなアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロン等が含まれるがこれらに限定されない。
【００５５】
nAChR拮抗剤は、他の抗血管新生剤と共に投与してもよい。抗血管新生剤には、ヘパリン誘導体およびグルココルチコステロイドのような血管新生ステロイド；トロンボスポンジン；IL-12のようなサイトカイン；フマギリンおよびAGM 12470のようなその合成誘導体；インターフェロン-α；エンドスタチン；可溶性増殖因子受容体；増殖因子に対する中和モノクローナル抗体等が含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
インビボでの血管新生の減少
本発明は、哺乳類における血管新生を減少させる方法を提供する。方法は一般的に、血管新生を減少させるために有効な量でnAChR拮抗剤を哺乳類に投与することを含む。nAChR拮抗剤の有効量は、無処置（例えば、プラセボ処置）対照と比較して血管新生を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、またはそれ以上減少させる。
【００５７】
血管新生が減少するか否かは、任意の既知の方法を用いて決定することができる。血管新生に及ぼす物質の影響を決定する方法は当技術分野で既知であり、これには、血管新生因子を含浸したインプラントへの血管新生の阻害；角膜または前眼房における血管増殖の阻害；内皮細胞の増殖、遊走、またはインビトロ管形成の阻害；ニワトリ漿尿膜アッセイ；ハムスターチークパウチアッセイ；ポリビニルアルコールスポンジディスクアッセイが含まれるがこれらに限定されない。そのようなアッセイは当技術分野で周知であり、例えば、Ausubelら（（1991）、Pharmac. Ther. 51：1〜11）およびそこに引用されている引用文献を含む多数の刊行物に記述されている。
【００５８】
本発明はさらに、病的な血管新生に関連するまたはこれに起因する状態または障害を治療する方法を提供する。癌治療の状況において、本発明の方法に従う血管新生の減少は、腫瘍の大きさの減少および腫瘍の転移の減少を引き起こす。腫瘍の大きさの減少が得られるか否かは、例えば、標準的な造影技術を用いて腫瘍の大きさを測定することによって決定することができる。転移が減少するか否かは、任意の既知の方法を用いて決定することができる。腫瘍の大きさに及ぼす物質の影響を評価する方法は周知であり、これには、コンピューター断層撮影および磁気共鳴画像のような造影技術が含まれる。
【００５９】
治療に対して感受性がある病態
病的な血管新生に関連もしくはそれに起因する、または血管新生によって促進される（例えば、血管新生に依存する腫瘍）如何なる状態または障害も、nAChR拮抗剤による治療に対して感受性がある。
【００６０】
治療に対して感受性がある状態および障害には、癌；アテローム性動脈硬化症；糖尿病性網膜症、加齢関連黄斑症のような増殖性網膜症；慢性関節炎に認められる過度の線維血管増殖；および血管腫のような血管の異形成等が含まれるがこれらに限定されない。
【００６１】
本発明の方法は、癌、肉腫、白血病、およびリンパ腫を含む、原発性および転移固形腫瘍の双方の治療において有用である。血管新生部位に発生する腫瘍の治療が特に重要である。このように、方法は、乳腺、結腸、直腸、肺、口咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱、および尿路上皮を含む）、女性生殖器（子宮頚部、子宮、および卵巣と共に絨毛癌および妊娠性栄養膜病を含む）、男性生殖器（前立腺、精嚢、精巣、および生殖細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、および下垂体を含む）、および皮膚の癌と共に、血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織に由来する腫瘍と共にカポジ肉腫を含む）、ならびに脳、神経、眼、および髄膜（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽種、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、シュワン細胞腫、および髄膜腫を含む）の腫瘍を含むがこれらに限定されない任意の新生物の治療において有用である。本発明の方法はまた、白血病（例えば、緑色腫、骨髄腫、および菌状息肉腫の斑および腫瘍、ならびに皮膚Tリンパ腫／白血病）のような造血悪性疾患に由来する固形腫瘍を治療するためのみならず、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の双方を含む）の治療のために有用である。さらに、本発明は、単独または放射線療法および／または他の化学療法剤と併用して用いた場合に、上記の腫瘍からの転移を減少させるために有用である。
【００６２】
本発明の方法を用いる治療に対して感受性がある他の状態および障害には、リウマチ性、免疫性、および変性性関節炎のような自己免疫疾患；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜の移植拒絶、後水晶体線維増殖、新生血管緑内障、ルベオーシス、黄斑変性による網膜血管新生、低酸素症、感染症または外科的介入に関連した眼の血管新生、および他の異常な眼の血管新生状態のような様々な眼の疾患；乾癬のような皮膚疾患；血管腫、およびアテローム斑内の毛細管増殖のような血管疾患；オスラー・ウェーバー症候群；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；および過度の創傷肉芽（ケロイド）が含まれる。
【００６３】
治療に適した被験者
本発明の方法を用いる治療に適した被験者には、上記の状態または障害、例えば血管新生を減少させることによる治療に対して感受性がある障害を有する被験者が含まれる。いくつかの態様において、個体は、被験者の体において血管新生を刺激するであろうニコチンレベルを有しない。いくつかの態様において、被験者は、そのような製品の利用によって、nAChR拮抗剤を同時投与すると血管新生を刺激するために十分な量で被験者の体内にニコチンが導入されることになる、ニコチン含有製品を用いていない。ニコチン含有産物には、紙巻きタバコ、パイプ用のタバコ、葉巻タバコ、かみタバコ、嗅ぎタバコ、およびタバコ含有ガムおよびトローチ剤、またはニコチン含有パッチもしくはガムが含まれるがこれらに限定されない。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例は、本発明の作製および使用法を完全に開示および説明するために、当業者に提供するために述べるのであって、本発明者らが本発明であると見なす範囲を制限すると解釈してはならず、また下記の実験は、行われた全てまたは唯一の実験であることを表すと解釈してはならない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関しては正確を期すよう努力したが、何らかの実験誤差および偏差は認められるべきである。特に明記していなければ、割合は重量での割合であり、分子量は平均分子量、温度はセ氏、および圧力はほぼ大気圧である。
【００６５】
実施例1：ニコチン受容体拮抗剤は血管新生を阻害する
方法
インビトロMatrigelアッセイ：ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト微小血管内皮細胞（HMVEC；継代5回まで；バイオウィッタッカー（BioWhittaker）、ウォーカースビル、メリーランド州）は、5％FBS、0.5 ml hEGF、0.2 mlヒドロコルチゾン、2.0 ml BBE、および0.5 ml GA-1000（バイオウィッタッカー）を添加したEGM-MVにおいて増殖させた。4ウェルチャンバーのスライドガラスに増殖因子を増強したMatrigel（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）をコーティングして、基本培地によって平衡にした。Kureishiら（2000）Nat. Med. 6：1004〜1010。細胞は、5％FBSを含む新鮮な基本培地において103細胞/ウェルの密度でゲルの上部に播種した。2時間後、メカミルアミンの漸増濃度（10-12〜10-4 M；シグマ（Sigma）、セントルイス、モンタナ州）または溶媒を培地に加えた。それぞれのウェルの中心における管形成の発達を24時間、48時間、および72時間目に調べた。
【００６６】
ディスク血管新生系：ニトロセルロース細胞非浸透性濾紙（ミリポア（Millipore）、バーリントン、マサチューセッツ州）で覆ったポリビニルアルコールスポンジのディスク（リッピー（Rippey）、エルドラドヒルズ、カリフォルニア州）は、ディスクの辺縁部に限って毛細管を増殖させる。2週間の試験期間の無作為処理は、浸透圧ミニポンプ（0.25 μl/時間；デュレクト（Durect）、キュパーチノ、カリフォルニア州）によって行った。ディスクを10週齢のC57BL/6Jマウスまたはいくつかの実験ではα7-nAChR欠損（B6.129S7-Chrna7tmlBay）マウス（1群6匹；ジャクソン（Jackson）、バーハーバー、メイン州）の背部皮下に埋め込んだ。2週間後、マウスを麻酔して、左心室から間隙充填蛍光ミクロスフェア（0.2 μm、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州）を注入した。還流した血管で覆われたディスクの面積と容器の密度の双方を定量した。Heeschenら（2001）Nat. Med. 7：833〜837；およびJangら（2000）Circulation 102：1414〜1419（3,10）。増殖しつつある血管におけるα7-nAChRは、免疫組織化学（サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）、サンタクルズ、カリフォルニア州）によって同定した。染色の特異性を確認するため、ホモ接合α7-nAChR-/-マウスから外植したディスクを陰性対照として用いた。
【００６７】
マウス後肢虚血モデル：10週齢のC57BL/6Jマウスにおいて、遠位末端外腸骨動脈ならびに深大腿動脈および浅大腿動脈を結紮した（1群動物8匹（n=8））。メカミルアミンを毎日の筋肉内注射によって3週間投与した。血清VEGFレベルはマウスVEGF ELISAキット（R＆Dシステム（R ＆D System）、ミネアポリス、ミネソタ州）によって決定した。毛細管密度は、内転筋および半膜様筋において決定した。10 μm凍結切片において、筋腹中央部を横断して、CD31に対するモノクローナル抗体（BDファーミンゲン（BD PharMingen）、サンジエゴ、カリフォルニア州）によって毛細管を同定して、筋細胞をエオジン（シグマ）によって対比染色した。それぞれの切片の毛細管密度は、無作為に選択した視野10個において決定し、筋細胞に対する毛細管の比率として表記する。
【００６８】
FACS：蛍光活性化細胞ソーティングを用いて、虚血と、虚血プラスメカミルアミンとによって動員された細胞集団をそれぞれ同定した。それぞれの時点で（ベースライン、3日、7日、14日）、血液を右心房から得た。骨髄をそれぞれの動物の両側の大腿骨および脛骨から単離して、HBSS（1％FCS）中で氷上にてインキュベートした。末梢血及び骨髄細胞を蛍光標識抗体と共にインキュベートして、FACS-Vantageフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン、フランクリンレークス、ニュージャージー州）によって分析した。マウスCD34に対するFITC結合抗体およびマウスFlk-1に対するPE結合抗体（BDファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州）を、内皮系列マーカーとして用いた。CD34+およびFlk-1+細胞の分析は、単球の大きさにゲートを調節してから行った。アビジン-テキサスレッド（BD ファーミンゲン）に結合させたMAC-1に対するビオチン結合抗体（BD ファーミンゲン）を、単球の大きさにゲートを調節した後の単球／マクロファージ系列マーカーとして用い、APCに結合したマウスに対するLy-6G-GR-1（BD ファーミンゲン）をマーカーとする顆粒球を除去した。Lagasseら（1996）J. Immunol. Methods 197：139〜150。染色は、非特異的結合を減少させるために、Fc受容体に対するラットモノクローナル非結合抗体（抗CD16/32、BD ファーミンゲン）の飽和濃度の存在下で行った。死細胞は、ヨウ化プロピジウム染色によって除外して、赤血球は光散乱ゲート調節によって除外した。それぞれの分析には、100,000事象が含まれた。データは、Flojoソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン）を用いて分析した。
【００６９】
ルイス肺腫瘍モデル：ルイス肺癌細胞（ATCC、マナッサス、バージニア州）全体で106個を、10％FBSを添加したRPMI 1640培地において培養した。癌細胞を10週齢のC57BL/6J野生型マウスのそれぞれの脇腹に皮下注射するか、または開胸を行わずに小さい皮膚切開部を通して肺実質に正所性移植を行った。動物には、浸透圧ミニポンプによってメカミルアミン（3 mg/kg）または溶媒を投与した。腫瘍細胞を皮下注射したマウスは、触診可能な腫瘍の有無に関して毎日チェックして、腫瘍の増殖をゲージによって測定した。腫瘍の大きさは、長さ×幅×0.5 mm3の積として計算した。如何なる群のマウスも1.5 cm3より大きい腫瘍を有する場合、実験を停止して、動物を全て屠殺して組織学評価を行った。腫瘍血管は、左心室から間隙充填蛍光ミクロスフェア（0.2 μm；モレキュラー・プローブス）を注入することによって同定した。
【００７０】
統計分析：連続変数に関する結果は全て、95％信頼区間（図面：75および95％CI）と共に中央値として表記する。群間の比較は、t検定（両側）または二つより多い亜群を有する実験の場合にはANOVAによって分析した。ポスト・ホック（post-hoc）範囲検定および対応のある多重比較は、ボンフェロニの補正を行ってt検定（両側）によって行った。カテゴリ変数の比較は、ペアソンχ2検定によって行った。分析は全てSPSS 10.0（SPSSインク）によって行った。P値＜0.05は、統計学的に有意であると見なされた。
【００７１】
結果
インビトロMatrigelアッセイ
本発明者らは、毛細管様構造のネットワークを形成するECによるインビトロ血管新生モデルを用いて、遊走および分化のような血管新生における重要な段階を調べた。細胞を増殖因子に富むmatrigelに播種した後、HMVECおよびHUVECはそれぞれ、対照培地に反応して48時間以内に管形成を示した。しかし、培地に、nAChRの特異的非競合的阻害剤であるメカミルアミン（10-4〜10-12 M）の増加濃度を添加すると、ネットワーク形成は阻害された。メカミルアミン処置（10-6 M）を36時間後に停止すると、ECはなおも72時間でネットワーク構造を整列させることができ、メカミルアミンの作用が可逆的であったことを示している。
【００７２】
ディスク血管新生系
nAChRがインビボで天然の血管新生反応に関係しているか否かを決定するために、本発明者らはディスク血管新生系を用いた。対照群において、ディスクを皮下移植後3週間目に取り出すと、ディスクの断面積の54.9％（95％CI 46.1〜63.6）が新しい血管で覆われた。図1．浸透圧ミニポンプによるメカミルアミンの全身処置によって、ディスクの血管新生は有意に減少した（14.3％（95％CI 9.0〜19.5）；p＜0.001）。図1．同様に、メカミルアミンとは対照的に血液-脳関門を通過しないnAChRの非競合的阻害剤であるヘキサメトニウムを加えても、ディスクの血管新生は同様に有意に減少した（11.5％（95％CI 6.5〜16.5）；P＜0.001）。α7-nAChRの免疫組織化学は、ディスクにおける増殖しつつある血管において陽性染色を示した。
【００７３】
ホモ接合α7-nAChR-/-マウスにおいて、天然の血管新生反応は、α7-nAChR+/+野生型に関して39.5（95％CI 28.7〜44.8）から28.7 mm2（95％CI 25.2〜32.2）（P＝0.009）に減少した（図2）。
【００７４】
マウス後肢虚血モデル
nAChRが虚血に反応する血管新生の状況において重要な役割を果たすか否かを決定するために、本発明者らは、マウス後肢虚血モデルを用いた。浅大腿動脈および深大腿動脈を両側で結紮した後、本発明者らは、メカミルアミンまたは溶媒を3週間のあいだ毎日筋肉内注射によって虚血後肢に投与した。動物（各群8匹(n=8)）に0 μg/kg、0.05 μg/kg、または0.5 μg/kgメカミルアミンを投与した。処理3週間後、0.5 μg/kgメカミルアミンは、血管新生反応を0.45毛細管／筋細胞（95％CI 0.39〜0.51）から0.26毛細管／筋細胞（95％ CI 0.21〜0.31）（P＜0.001）へと有意に減少させた（図3）。本発明者らは、浸透圧ミニポンプによってメカミルアミンを全身投与した場合でも、類似の結果を得た（5.0 μg/kg；0.24（95％CI 0.19〜0.28）；P＜0.001）。
【００７５】
毛細管密度が増加しても、側副血管が同時に増加しなければ、局所血流は必ずしも変化しない。したがって、本発明者らは、共焦点顕微鏡を用いてCD31（EC）およびα-アクチン（SMC）に対する二重染色によって側副血管を同定した。側副血管数は、血管の直径が少なくとも0.02 mmであって、アクチン陽性血管平滑筋壁によって覆われているCD31-陽性内皮が並ぶ血管内腔を同定することによって、横断面について定量した。非虚血後肢と比較すると、対照動物の虚血後肢における側副血管数は、2.6（95％CI 2.5〜4.3）から7.5（95％CI 5.2〜9.5）（P＜0.001）へと有意に増加して、側副血管の大きさの中央値は、0.05 mm（95％CI 0.02〜0.11）から0.12 mm（95％CI 0.08〜0.15）（P＜0.001）へと増加した。メカミルアミンによる処置は、側副血管数を有意に減少させなかった（高用量：6.2（95％CI 3.9〜8.6）；低用量：7.1（95％CI 4.7〜8.5）；P＝0.08）。しかし、血管の直径の中央値はそれぞれ、0.07 mm（95％CI 0.04〜0.10）および0.09 mm（95％CI 0.06〜0.11）へと減少した（P＝0.002）。
【００７６】
α7-nAChRに対する免疫組織化学から、この受容体サブユニットが非虚血後肢において検出可能なレベルで発現されていないことが証明された。対照的に、虚血の導入7日後、この受容体サブタイプは、フォン・ウィルブラント因子またはCD31によってそれぞれ同定したところ、内皮細胞のいくつかと明らかに同時局在した。虚血組織におけるα7-サブユニットの発現のアップレギュレーションは、ウェスタンブロット分析によって確認した（図4）。α7-サブユニットは、ベースラインでは検出不能であったが、後肢虚血導入のわずか6時間後にこの受容体サブタイプは有意にアップレギュレートされて、7日目では最大シグナルを示した。
【００７７】
深大腿動脈および浅大腿動脈を結紮した7日および14日後、虚血単独によって、骨髄CD34+/Flk-1+細胞がベースラインと比較して有意に増加した（表1）。表1は、マウス後肢虚血モデルにおいて大腿動脈の結紮前後の、骨髄（BM）および末梢血（PB）における内皮前駆細胞の割合として表記したデータを表す。
【００７８】
【表１】
2010143935.tif 000002
【００７９】
末梢血へのCD34+/Flk-1+細胞の動員は骨髄と比較して同時であり、7日および14日で有意に増加した。メカミルアミンの全身投与によって、骨髄におけるCD34+/Flk-1+細胞数は減少した。
【００８０】
マウス肺癌モデル
これまでの研究は、nAChRが、幅広い実験条件スペクトルにおいて血管新生において重要な役割を有することを示している。メカミルアミンが、腫瘍の血管新生に影響を及ぼしうるか否かを調べるため、本発明者らはインビボルイス肺癌モデルを用いた。癌細胞の移植および溶媒またはメカミルアミンによる処置後12日まで、マウスは全て、類似の腫瘍の大きさを示した（0.46 cm2（95％CI 0.32〜0.56）対0.49 cm2（95％CI 0.35〜0.62）；P＝0.54）（図5）。しかし、追跡期間21日目では、対照群の腫瘍の増殖は、メカミルアミン群において認められた増殖を有意に超えて、動物の屠殺を必要とした（1.21 cm3（95％CI 0.82〜1.36）対0.85 cm3（95％CI 0.66〜1.05）；P＜0.001）。メカミルアミン群においてこのように腫瘍増殖が遅れて減少することは、腫瘍組織の血管新生の減少と一致した。本発明者らは、メカミルアミン群（0.82 毛細管/mm2（95％CI 0.67〜1.22）対0.56毛細管/mm2（95％CI 0.38〜0.92）；P＜0.001）について有意に低い毛細管密度を認めた。もう一つの実験において、本発明者らは、肺実質にルイス肺癌細胞を正所的に移植した。対照群ではより大きい腫瘍のために、17日後に実験の中止を必要とした（腫瘍の容積0.62 cm3（95％CI 0.37〜0.85）対0.45 cm3（95％CI 0.28〜0.66）；P＜0.001）。この場合も、腫瘍の血管新生は、メカミルアミン群では有意に低かった（1.56毛細管/mm2（95％CI 0.82〜2.17）対0.98毛細管/mm2（95％CI 0.68〜1.31）；P＜0.001）。さらに、VEGFの全身レベルは、対照群ではメカミルアミン群と比較して有意に高かった（152.2 pg/ml（95％CI 98.5〜187.2）対78.7 pg/ml（95％CI 45.3〜99.4）；P＜0.001）。
【００８１】
その後の細胞培養実験において、本発明者らは、このように減少した腫瘍の増殖が同様に、癌細胞に及ぼすメカミルアミンの直接的な抗増殖作用に関連するか否かを調べた。メカミルアミンによる48時間までの処置後、本発明者らは、ルイス肺癌細胞数に有意差を認めなかった。本発明者らはまた、フローサイトメトリーを用いて、低酸素症の際にアポトーシスを受ける細胞の割合に及ぼすメカミルアミン濃度を増加させた影響を調べた。この場合もメカミルアミン群と対照群のあいだに差を認めなかった。低酸素症の際に10-6 Mメカミルアミンを処置した細胞は、12％（95％CI 8〜15）においてアネキシンV陽性であり、これに対し、対照細胞では13％（95％CI 10〜17）において陽性であった（P＝0.42）。
【００８２】
本発明者らの研究の顕著な知見は、1）nAChRの阻害は、インビトロでの毛細管ネットワーク形成を有意にそして可逆的に減少させた；2）nAChRの阻害は、炎症（ディスク血管新生モデル）、虚血（大腿動脈結紮モデル）、および新生物（ルイス肺癌モデル）に対する血管新生反応を減少させた；3）虚血によってnAChR発現が増加したという点である。これらのデータは、nAChRが、本来の血管新生反応に関与していることを始めて明らかにするものである。
【００８３】
本発明は、その特定の態様を参照して説明してきたが、様々な改変を行ってもよく、同等物を置換してもよく、それらも本発明の真の趣旨および範囲に含まれることは当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの1つまたは複数の段階を、本発明の目的、趣旨、および範囲に適合させるために多くの改変をおこなってもよい。そのような改変は全て、添付の特許請求の範囲内であると解釈される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月17日(2010.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において病的な血管新生に関連した障害を治療するための組成物であって、病的な血管新生を減少させるために有効な量のニコチン作動性アセチルコリン受容体（nAChR）拮抗剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記病的な血管新生に関連した障害が眼の障害である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記眼の障害が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜の移植拒絶、後水晶体線維増殖、新生血管緑内障、ルベオーシス、および黄斑変性からなる群より選択される、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記眼の障害が、増殖性網膜症、加齢に関連した黄斑症、加齢に関連した後水晶体線維増殖、および加齢に関連した糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
前記眼の障害が、黄斑変性による網膜血管新生である、請求項２記載の組成物。
【請求項６】
前記nAChR拮抗剤が、メカミルアミン、ヘキサメトニウム、ジヒドロ-β-エリトロイジン、d-ツボクラリン、ペンピジン、クロルイソンダミン、エリソジン、カンシル酸トリメタファン、ペントリニウム、ブンガロトキシン、スクシニルコリン、テトラエチルアンモニウム、トリメタファン、クロルイソンダミン、およびトリメチジニウムからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、静脈内、固形腫瘍内またはその周辺、全身、動脈内、および局所からなる群より選択される経路による投与のためである、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
第二の血管新生阻害剤と併用して投与するための、請求項１〜５のいずれか記載の組成物。
【請求項９】
前記第二の血管新生阻害剤が、増殖因子に対する中和モノクローナル抗体である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記nAChR拮抗剤が、遊離塩基の形態である、請求項１〜５のいずれか記載の組成物。
【請求項１１】
前記nAChR拮抗剤が、薬学的に許容される塩の形態である、請求項１〜５のいずれか記載の組成物。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜５のいずれか記載の組成物。