(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト様糖タンパク質を真菌または他の下等真核生物で発現するための方法を提供する。【解決手段】真菌または他の下等真核生物宿主細胞中においてエンドマンノシダーゼ活性を発現させることによって、組換えタンパク質のグリコシル化グリカンを高等哺乳動物（特に、ヒト）に由来するタンパク質のグリコシル化構造により密接に類似させる方法。また、新規酵素、およびそれらをコードする核酸、およびそれらの酵素を発現するように操作された宿主、宿主において改変糖タンパク質を産生するための方法およびそのように産生された改変糖タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１または３；
（ｂ）配列番号１または３の変性改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号１または３に対して少なくとも７８％同一な核酸配列；
（ｄ）配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列
；
（ｅ）配列番号２または４に対して少なくとも７７％同一なポリペプチドをコードする
核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１または３にハイブリダイズする核酸配列
；および
（ｇ）長さが少なくとも６０個連続したヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のうちのい
ずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはそれらからなる、ポリヌクレオチド
。
【請求項２】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１または３；
（ｂ）配列番号１または３の変性改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号１または３に対して少なくとも８７％同一な核酸配列；
（ｄ）配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列
；
（ｅ）配列番号２または４に対して少なくとも８３％同一なポリペプチドをコードする
核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１または３にハイブリダイズする核酸配列
；および
（ｇ）長さが少なくとも６０個連続したヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のうちのい
ずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはそれらからなる、ポリヌクレオチド
。
【請求項３】
前記核酸配列が、エンドマンノシダーゼ活性をコードする、請求項１または２に記載のポ
リヌクレオチド。
【請求項４】
前記核酸配列が、エンドマンノシダーゼの触媒活性フラグメントをコードする、請求項１
または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記コードされたエンドマンノシダーゼが、約５．２と約７．２との間のｐＨにおいて最
適活性を有する、請求項４に記載のコードされたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記コードされたエンドマンノシダーゼ活性が、約６．２のｐＨにおいて最適活性を有す
る、請求項４に記載のコードされたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、グリコシル化グリカン上に少なくとも１つのグルコース残基と１つ
のマンノース残基とを含む組成物を加水分解する、請求項１または２に記載のコードされ
たポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、オリゴ糖におけるＧｌｃα１，３Ｍａｎダイマー、Ｇｌｃ２α１，
３ＭａｎトリマーまたはＧｌｃ３α１，３Ｍａｎテトラマーを加水分解する、請求項１ま
たは２に記載のコードされたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ６Ｇｌ
ｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ
２、Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはグリコシル化高級マンナングリカン上の
少なくとも１つのグルコース残基と１つのマンノース残基とを加水分解する、請求項１ま
たは２に記載のコードされたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のコードされたポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１２】
前記コードされたポリペプチドが、目的のタンパク質上に改変された糖形態を産生する、
請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記コードされたポリペプチドが、Ｇｌｃα１，３Ｍａｎ、Ｇｌｃ２α１，３Ｍａｎまた
はＧｌｃ３α１，３Ｍａｎを加水分解する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、藻細胞また
は細菌細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、
Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈ
ｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈ
ｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈ
ｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉ
ｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐ
ｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌ
ａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ
、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏ
ｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒ
ｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より
選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
下等な真核生物におけるグリコシル化構造を改変するための方法であって、該方法は、エ
ンドマンノシダーゼ活性を発現する工程であって、ここで、該エンドマンノシダーゼ活性
が、オリゴ糖上に少なくとも１つのグルコース残基と１つのマンノース残基とを含む組成
物を除去する、工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記エンドマンノシダーゼ活性が、Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ９−５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ８
−４ＧｌｃＮＡｃ２に切断する活性をさらに含み、ここで、Ｇｌｃα１，３Ｍａｎ、Ｇｌ
ｃ２α１，３ＭａｎまたはＧｌｃ３α１，３Ｍａｎが除去される、請求項１７に記載の方
法。
【請求項１９】
前記エンドマンノシダーゼ活性が、グリコシル化グリカン上に少なくとも１つのグルコー
ス残基と１つのマンノース残基とを含む組成物の加水分解を含む、請求項１７に記載の方
法。
【請求項２０】
前記導入されたエンドマンノシダーゼが、小胞体、初期ゴルジ、内側ゴルジ、後期ゴルジ
、トランスゴルジ網または前記宿主生物内の任意の小胞区画に標的される、請求項１７に
記載の方法。
【請求項２１】
前記エンドマンノシダーゼが、宿主起源であるが、変異、プロモータ強度またはコピー数
によって改変されて、活性が高められている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記エンドマンノシダーゼが分泌される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、藻細胞また
は細菌細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記下等な真核生物が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎ
ｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ
、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ
、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ
、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓ
ｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  
ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏ
ｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌ
ｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａから
なる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
グルコシル化糖タンパク質を改変するための方法であって、該方法は、下等真核生物宿主
細胞にエンドマンノシダーゼ活性を導入する工程であって、ここで、該エンドマンノシダ
ーゼ活性の発現の際に、前記ＥＲをバイパスしたグルコシル化糖タンパク質を改変する、
工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許出願第１０／６９５，２４３号への優先権を主張する。米国特許出
願第１０／６９５，２４３号は、米国特許出願第１０／３７１，８７７号（２００３年２
月２０日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、高等哺乳動物（特にヒト）由来のタンパク質のグリコシル化に
より近く似せるための、真菌または他の下等真核生物において発現された組換えタンパク
質のグリコシル化構造を改変（ｍｏｄｉｆｙ）する方法に関する。本発明はまた、新規の
酵素および、その酵素をコードする核酸および、その酵素を発現するように操作された宿
主、修飾された糖タンパク質を宿主において産生するための方法、およびそのように産生
された、修飾された糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＤＮＡがタンパク質に転写および翻訳された後、さらなる翻訳後プロセシングは、糖残
基の結合を包含する（グリコシル化として公知のプロセス）。種々の生物体は、種々のグ
リコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を産生し、そし
て利用可能な種々の基質（ヌクレオチド糖）を有し、その結果、グリコシル化型および個
々のオリゴ糖の組成は、１つの同じタンパク質でさえも、特定のタンパク質が発現される
宿主系に依存して異なる。細菌は、代表的には、タンパク質をグリコシル化せず、もしそ
うである場合も、非常に非特異的様式でだけである（ＭｏｅｎｓおよびＶａｎｄｅｒｌｅ
ｙｄｅｎ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８（３）：１６９−１７５（１９９７）
）。下等真核生物（例えば、糸状菌および酵母）は、主としてマンノースおよびマンノシ
ルホスフェート糖を付加し、他方昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、さらに別の方法で
タンパク質をグリコシル化する。Ｒ．Ｋ．Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９  ３０：１９
３−２００（１９９９）；Ｗ．Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ  １９９８  ２０：１１７１−１１７７（１９９８）；Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔら
，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９  １７：１１１６−１１２１（
１９９９）；Ｍ．Ｍａｌｉｓｓａｒｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍ．２０００  ２６７：１６９−１７３（２０００）；Ｄ．Ｊａｒｖｉｓら，Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９８  ９：５２８−５３３（１９９８）；ならびにＴａ
ｋｅｕｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９７  ９：Ｓ２９−Ｓ３５（１９９７）を参照のこと。
【０００４】
Ｎ結合グリコシル化は、多くの細胞タンパク質および分泌タンパク質のプロセシングに
おいて主要な役割を果たす。真核生物において、事前構築された（ｐｒｅａｓｓｅｍｂｌ
ｅｄ）オリゴ糖Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は、小胞体中のオリゴサッカリルトラン
スフェラーゼによって、ドリコールから上記タンパク質のアクセプター部位上に輸送され
る（ＤｅｍｐｓｋｉおよびＩｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｌ．６：８４４−８５０（２００２））。引き続いて、末端ａ−１，２−グルコースが、
グルコシダーゼＩＩによる残存する２つのａ−１，３−グルコース残基の除去を促進する
グルコシダーゼＩによって除去される（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７３：９６−１０７（１９９９））。糖タンパク質のゴルジへ
の転位置の前に、残存する高次マンノースグリカンは、ＥＲマンノシダーゼによってＭａ
ｎ８ＧｌｃＮＡｃ２にプロセシングされ、ここで、このグリカン構造は、さらに修飾され
る。次には、ＥＲでのグリカン構造の不正確なプロセシングが、引き続く修飾を防ぎ得、
疾患状態をもたらす。グルコシダーゼＩの非存在は、極めて稀であり（ヒトの症例が１つ
だけ報告された）、かつ、早い死をもたらす、グリコシル化型（ＣＤＧ）ＩＩｂの先天性
障害をもたらす（ＭａｒｑｕａｒｄｔおよびＤｅｎｅｃｋｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔ
ｒ．１６２：３５９−３７９（２００３））。チャイニーズハムスター卵巣細胞株Ｌｅｃ
２３（グルコシダーゼＩが欠乏している）の単離は、存在する優性な糖形態がＧｌｃ３Ｍ
ａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２であると示した（Ｒａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２
２８１８−２２８２５（１９９１））。酵母および哺乳動物におけるグリコシル化の初期
段階は、小胞体から出現する同じグリカン構造と同一である。しかし、これらのグリカン
がゴルジによってプロセシングされる場合、生じる構造は大幅に異なり、従って、高等真
核生物（例えば、ヒトおよび他の哺乳動物）に見出されるグリコシル化型と実質的に異な
る酵母グリコシル化型をもたらす（Ｒ．Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１９３−２００（
１９９９））。さらに、大いに異なるグリコシル化型は、いくつかの場合、ヒトにおける
これらのタンパク質の免疫原性を上昇させ、そしてこれらの半減期を短縮すると示された
（Ｔａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）前出）。
【０００５】
ヒトグリコシル化の初期段階は、少なくとも２つの異なる段階に分けられ得る：（ｉ）
小胞体（ＥＲ）の膜における反応の連続セットにより構築される脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ
９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖；および（ｉｉ）このオリゴ糖の、脂質アンカードリキル（ｄ
ｏｌｉｃｈｙｌ）ピロリン酸から新規合成タンパク質への輸送。この特異的輸送部位は、
配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸
であり得る）中のアスパラギン残基によって定義される（Ｙ．Ｇａｖｅｌら，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３：４３３−４４２（１９９０））。
【０００６】
新生糖タンパク質が初期ゴルジ装置に輸送される前に、グルコシダーゼおよびマンノシ
ダーゼによるさらなるプロセシングが、ＥＲにおいて起こる。初期ゴルジ装置において、
さらなるマンノース残基が、ゴルジ特異性ａ−１，２−マンノシダーゼによって除去され
る。プロセシングは、上記タンパク質がゴルジの中を進むにつれて続く。内側のゴルジに
おいて、多くの修飾する酵素（Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（Ｇｎ
Ｔ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ）、
マンノシダーゼＩＩ、およびフコシルトランスフェラーゼを含む）が、特定の糖残基を付
加および除去する。最終的に、トランスゴルジにおいて、ガラクトシルトランスフェラー
ゼおよびシアリルトランスフェラーゼが、このゴルジより放出される構造を産生する。ビ
−、トリ−、およびテトラ−アンテナリー（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造と特徴付けられる
グリカン（ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ならびに高度の末端シ
アル酸を含む）は、糖タンパク質にヒトの特徴的を与える。
【０００７】
タンパク質がヒトまたは動物から単離される場合、有意数のこのタンパク質は、最も有
意な修飾のうちの１つであるグリコシル化によって翻訳後に修飾される。いくつかの研究
は、グリコシル化は、（１）免疫原性、（２）薬物動態学的特性、（３）輸送（ｔｒａｆ
ｆｉｃｋｉｎｇ）、および（４）治療用タンパク質の効力を決定することに重要な役割を
果たすと示した。治療用タンパク質全てのうち推定７０％はグリコシル化され、従って、
現在のところは、ヒトに類似の様式でグリコシル化し得る産生系（すなわち、宿主）に依
存する。現在まで、大部分の糖タンパク質が哺乳動物宿主系で作製されている。従って、
医薬産業によるかなりの努力が、可能な限り「ヒューマノイド」な糖タンパク質を得るた
めのプロセスを開発することに向けられたことは驚くべきことでない。これは、細胞によ
って発現されたタンパク質のシアリル化（すなわち、シアル酸の末端付加）の程度を高め
るための、このような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含み得、これは、このようなタンパク
質の薬学動態的特性を向上させることが公知である。代替的に、シアリル化の程度は、公
知のグリコシルトランスフェラーゼおよびこれらそれぞれのヌクレオチド糖基質（例えば
、２，３シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰシアル酸）を使用することによる、こ
のような糖のインビトロ付加によって向上され得る。
【０００８】
さらなる研究は、特定の糖形態の生物学的有意性および治療的有意性を明らかにし得、
これによって、このような特定の所望な糖形態を産生する能力を与える。現在までに、か
なり良好に特徴付けられたグリコシル化型を有するタンパク質を作製すること、および、
以下の高等真核生物タンパク質発現系のうちの１つにおいてこのようなタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡを発現することに、努力が集中した：
１．チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞およびマウス骨髄
腫細胞のような高等真核生物（Ｒ．Ｗｅｒｎｅｒら，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒ
ｓｃｈｕｎｇ−Ｄｒｕｇ  ｒＲｅｓｅａｒｃｈ  １９９８  ４８：８７０−８８０（１９
９８））；
２．ヤギ、ヒツジ、マウスなどのようなトランスジェニック動物（Ｄｅｎｔｅら，Ｇｅ
ｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：２５９−２６６（１９８８）；Ｃｏｌｅ
ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５：補遺１８Ｄ（１９９４）；Ｐ．ＭｃＧａｒ
ｖｅｙら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１４８４−１４８７（１９９５）；Ｂａ
ｒｄｏｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：３７６−３８０（
１９９９））
３．植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、タバコなど）（Ｓｔａｕｂら
，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３３３−３３８（２０００）；
ＭｃＧａｒｖｅｙら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：  １４８４−１４８７  （
１９９５）；  Ｂａｒｄｏｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４
：３７６−３８０（１９９９））；
４．組換えバキュロウイルス（例えば、鱗翅類細胞に感染するＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核体病ウイルス）と組み合わせた昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９，Ｓｆ２１，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど
）（Ａｌｔｍａｎｎら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６：１０９
−１２３（１９９９））。
【０００９】
大部分の高等真核生物が、ヒトに見出されるグリコシル化反応と類似のグリコシル化反
応を行うが、上記の宿主系で発現される組換えヒトタンパク質は、これらの「天然」ヒト
対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）と常に異なる（Ｒａｊｕら  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ  １０：４７７−４８６（２０００））。従って、広範な開発研究が、これらの発現系
で作製されるタンパク質の「ヒト特徴」を改善する方法を見出すことに向けられてきた。
これは、タンパク質発現宿主の発酵条件の最適化、およびヒト様糖形態の形成に関与する
酵素をコードする遺伝子を導入することによる遺伝子組換え（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
）を包含する（Ｗｅｒｎｅｒら，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ−Ｄｒ
ｕｇ  Ｒｅｓ．４８：８７０−８８０（１９９８）；Ｗｅｉｋｅｒｔら  Ｎａｔｕｒｅ  
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１１１６−１１２１（１９９９）；Ａｎｄｅｒｓｅ
ｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５４
６−５４９（１９９４）；Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６８：３７０−３８０（２０００））。
【００１０】
しかし、全ての哺乳動物発現系に関連する固有の問題が、まだ解決されていない。哺乳
動物細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞、マウス細胞、またはより最近では、ヒト細胞）に基
づく発酵プロセスは、非常に遅い傾向があり（一週間を越える発酵時間も珍しくない）、
多くの場合低産物力価をもたらし、高価な栄養分および補因子（例えば、ウシ胎仔血清）
を必要とし、プログラム細胞死（アポトーシス）によって制限され、そして多くの場合特
定の治療的に有用なタンパク質の発現を可能にしない。より重要なことには、哺乳動物細
胞は、ヒト病原体である可能性を有するウイルスに対して感受性であり、そして製品安全
性を保証するために厳密な品質管理が必要とされる。このことは、格別に関心がある。な
ぜなら、このようなプロセスと同じ数だけ、動物に由来する複雑かつ温度感受性な培地成
分（例えば、子ウシ血清）（これは、ヒトに対して病原性の因子（例えば、ウシの海綿状
脳症（ＢＳＥ）プリオンまたはウイルス）を保有し得る）の添加を必要とするからである
。
【００１１】
治療用化合物の製造は、好ましくは、しっかり管理された無菌環境下で行われる。動物
飼育場は、どんなに清潔に維持されていても、このような環境を構築しない。トランスジ
ェニック動物は、現在のところ、高体積の治療用タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、組織プラスミノゲン活性化因子、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、コラーゲン、
フィブリノゲンなど）を製造するために考えられている。トランスジェニックヤギおよび
他のトランスジェニック動物（マウス、ヒツジ、ウシなど）は、遺伝子操作され、乳中に
治療用タンパク質を高濃度に産生し得るが、回収が厄介である。なぜなら、全てのバッチ
が、厳密な品質管理を受けなければならないからである。トランスジェニックヤギは、一
年にわたって十分な量の治療用タンパク質を産生し得るが、乳の全てのバッチは、細菌、
真菌、ウイルスおよびプリオンによる夾雑について検査（ｉｎｓｐｅｃｔ）および検査（
ｃｈｅｃｋ）されなければならない。これは、製品安全性および法規則の順守を保証する
ために、厳密な品質管理および保証設備を必要とする。スクラピーおよびウシの海綿状脳
症の場合、感染を除外するために、検査を約１年間行い得る。その間、動物の信頼できる
供給源における信用は、不在の実際の証拠に代わってしまう。発酵槽中で増殖した細胞は
、１つの十分に特徴付けられたＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＭＣＢ）に由来する
が、トランスジェニック技術は、種々の動物に依存し、従って、固有に不均一性である。
さらに、外部因子（例えば、異なる食物の取り組み、疾患および群内の同質性の欠如）は
、最終生成物のグルコシル化型に影響を与え得る。ヒトにおいて、例えば、異なる食習慣
がグルコシル化型に影響することが公知であり、従って、動物において類似の効果を予測
することに慎重である。より少ないバッチ発酵において同じタンパク質を製造することは
、（１）より実用的であり、（２）より安全であり、そして（３）より安価であり、従っ
て、好ましい。
【００１２】
トランスジェニック植物は、治療的価値があるタンパク質を得るための潜在的な供給源
として浮上した。しかし、植物中でのタンパク質の高レベル発現は、遺伝子サイレンシン
グ（高度に発現されたタンパク質が、次世代においてダウンレギュレーションされる機構
）を受ける。さらに、植物は、キシロースおよびａ−１，３結合フコース（ヒト糖タンパ
ク質には通常見いだされないグリコシル化型）を付加し、そして高等哺乳動物において免
疫原性副作用をもたらすと示されたことが公知である。オープンフィールドにおいてトラ
ンスジェニック植物を成長させることは、しっかり管理された製造環境を構成しない。植
物からのタンパク質の回収は、簡単なことではなく、発酵槽中の分泌タンパク質の回収に
対する費用競争力をさらに実証しなければならない。
【００１３】
従って、現在製造される治療用糖タンパク質の多くは、哺乳動物細胞において発現され
、そして多くの努力が、これらの組換えタンパク質のグリコシル化型を改善すること（す
なわち、例えば、ヒト化すること）に向けられてきた。培地組成の変化およびヒトグリコ
シル化に関与する酵素をコードする遺伝子の共発現が、うまく使用されてきた（例えば、
Ｗｅｉｋｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１１１６−１１
２１（１９９９）を参照のこと）。
【００１４】
これらのヒト対応物に類似の組換えタンパク質は、哺乳動物発現系において作製され得
るが、下等真核生物（例えば、真菌および酵母）においては、ヒト型グルコシル化型を有
するタンパク質を作製することは現在のところ不可能である。小胞体中のタンパク質に輸
送されるコアオリゴ糖構造は、哺乳動物と下等真核生物とで基本的には同一であるが、実
質的な差異が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置の続いて起こるプロセシング反応に見出
された。実際、異なる下等真核生物の間でさえ、非常に種々のグリコシル化構造が存在す
る。これは、哺乳動物発現系より優れた他の注目すべき利点（例えば、（１）一般的によ
り高い産物力価、（２）より短い発酵時間、（３）哺乳動物細胞においてあまり発現され
ないタンパク質について代替を有すること、（４）化学的に定義されたタンパク質を含ま
ない培地において増殖（成長）する能力、および従って、複雑な動物由来培地成分を必要
としないこと、ならびに（５）このような宿主のレトロウイルス感染がないこと）にも拘
らず、組換えヒト糖タンパク質の製造のための宿主としての下等真核生物の使用を阻止し
てきた。
【００１５】
種々のメタノール資化性酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉ
ａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、
真核生物発現系として、特に重要な役割を果たしている。なぜなら、それらは、高い細胞
密度に細胞を増殖させて、大量の組み換えタンパク質を分泌することが可能だからである
。しかし、上記のように、酵母のような下等な真核生物は、高等動物のようにタンパク質
をグリコシル化しない。例えば、Ｍａｒａｓらに対する米国特許第５，８３４，２５１号
（１９９４）を参照のこと。ＭａｒａｓおよびＣｏｎｔｒｅｒａｓは最近、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓが、本質的に、有用な量（５％より多く）のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ
受容性炭水化物を産生し得ないことを示した（Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０：１１７１−１１７７（１９９８））。Ｃｈｉｂａら（
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−２６３０４（１９９８））は、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅが、１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）、１，３マンノ
シルトランスフェラーゼ（ＭＮＮ１）およびマンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮ
Ｎ４）を除去することによって、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来の
ａ−１，２−マンノシダーゼＩの触媒ドメインを、ＥＲ検索（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）／標
的化配列を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲ中へと標的化することによって、Ｍ
ａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の範囲に及ぶ構造を産生する
ように操作され得ることを示した（Ｃｈｉｂａ  １９９８，上述）。しかし、この試みは
、所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生をほとんど生じないか、または全く生じない。こ
のモデルタンパク質（カルボキシペプチダーゼＹ）は、トリミングされて、２７％のＭａ
ｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、２２％のＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、２２％のＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ
２、２９％のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からなる混合物を生じる。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
グリカンのみが、ヒト糖形態へのさらなる酵素変換に感受性であるので、このアプローチ
は、以下の理由から非常に非効率的である：単一Ｎ−グリコシル化部位を有するタンパク
質において、全Ｎ−グリカンの少なくとも７３％は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ
による改変のために利用できない。２個または３個のＮ−グリコシル化部位を有するタン
パク質において、それぞれ少なくとも９３％または９８％が、ＧｌｃＮＡｃトランスフェ
ラーゼＩによる改変のために利用できない。このような低効率の変換は、治療剤の産生の
ために十分でない；多数の改変工程を施される場合、各クローン化酵素は、可能な最も高
い効率で機能する必要がある。
【００１６】
上記に述べられたグリカン形態の産生における非効率性は、多数の理由により説明され
得る。これは、ＥＲにおける、グルコシダーゼＩ、ＩＩまたは常在性ＥＲマンノシダーゼ
のいずれかによる、グリカンの非効率なプロセシングに部分的に起因し得る。最近進化し
たクラスのマンノシダーゼタンパク質が、脊索動物門の真核生物（哺乳類、鳥類、爬虫類
、両生類および魚類を含む）において同定されており、このタンパク質もまた、グルコー
ス除去に関与する。これらのグリコシド酵素は、エンドマンノシダーゼとして定義されて
いる。エンドマンノシダーゼの活性は、Ｎ−連結オリゴ糖のプロセシング（すなわち、グ
ルコースα１，３マンノース二糖（ｄｉｓｓａｃｈａｒｉｄｅ）の除去）を特徴とする。
複雑な炭水化物の生成のために有用であることが知られているＮ−連結オリゴ糖プロセシ
ングの最初の工程における、オリゴ糖上のグルコースおよびマンノース残基の除去におけ
る有用性は、十分確立されている。エンドマンノシダーゼは、元々、ＧｌｃＭａｎ９Ｇｌ
ｃＮＡｃ２からＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングにおいて検出されたが、これはま
た、他のグリコシル化構造もプロセシングする（図１）。全体的に見て、ジグリコシル化
グリカンおよびトリグリコシル化グリカンもまたより低い程度でプロセシングされ得るが
、モノグリコシル化グリカンが最も効率的に改変される（Ｌｕｂａｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３（８）：３９９０−８（１９８８））。さらに、ＧｌｃＭａｎ９Ｇｌｃ
ＮＡｃ２が好ましい基質であるだけでなく、他のグリコシル化グリカン（例えば、Ｇｌｃ
Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）も、同様に効率的に（そ
れぞれＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に）トリミングされる。進
化の中でこのように遅いこのクラスのタンパク質の発生は、この発生が、高等真核生物で
観察されるようなＮ−連結グリカンの強力なトリミングを増強することへの独自の要求で
あることを示唆する。この示唆は、エンドマンノシダーゼが、ゴルジ体中に局在し、そし
て完全な脱グリコシル化が生じることが従来報告されているＥＲに局在しないという知見
によって、さらに強化される。
【００１７】
以前の研究は、グルコース除去が、グルコシダーゼＩおよびＩＩの連続的作用を通じて
、主にＥＲで起こることを示してきた（Ｍｏｒｅｍｅｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  
４：１１３−１２５（１９９４））。しかし、より最近の研究は、ゴルジ装置における品
質管理機構に関与する、見かけ上別のグルコシダーゼＩＩ非依存性脱グリコシル化経路を
示唆する（Ｚｕｂｅｒら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｃ；１１（１２）：４２２
７−４０（２０００））。グルコシダーゼＩＩ−欠乏性マウスリンパ腫細胞における研究
は、エンドマンノシダーゼによる脱グリコシル化機構の証拠を示す（Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１２）：８４４３−５１（１９９２））。さらに、マウス
リンパ腫細胞株、ＰＨＡＲ２．７が単離された。これは、グルコシダーゼＩＩ活性を有さ
ず、主に糖形態Ｇｌｃ２Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃ２Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２
の産生をもたらした（Ｒｅｉｔｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０３５７
−１０３６３（１９８２））。この後者の細胞株の分析は、グルコシダーゼＩＩが存在し
ないにもかかわらず、脱グリコシル化高次マンノース構造が存在したことを示し、したが
って、グリコシル化構造のための代替的プロセシング経路の存在を示した（Ｍｏｏｒｅお
よびＳｐｉｒｏ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８４４３−８４５１（１９９２））
。このグルコシダーゼ非依存経路を担う酵素は、エンドマンノシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２
．１．１３０）として同定されている。エンドマンノシダーゼは、モノグリコシル化、ジ
グリコシル化およびトリグリコシル化高次マンノース糖形態の加水分解を触媒し、存在す
るグルコース残基および近傍に位置するマンノースを除去する（Ｈｉｒａｉｚｕｍｉら，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９９２７−９９３５（１９９３）；Ｂａｕｓｅおよび
Ｂｕｒｂａｃｈ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６３９−６４６（１９９６））。
【００１８】
エンドマンノシダーゼは、種々のグリコシル化糖形態のマンノース構造間を区別せずに
、Ｇｌｃ１Ｍａｎ９〜５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ８〜４ＧｌｃＮＡｃ２に加水分解するよ
うに見える（ＬｕｂａｓおよびＳｐｉｒｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３９９０
−３９９８（１９８８））。これまでに、クローン化されるべきであった唯一のエンドマ
ンノシダーゼは、ラット肝臓に由来する。ラット肝臓エンドマンノシダーゼは、５２ｋＤ
ａの分子量を有する４５１アミノ酸の予測オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコ
ードする（Ｓｐｉｒｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９３５６−２９３６３（
１９９７））。この酵素は、中性の最適ｐＨを有し、そしてどのような特定の陽イオン要
求性をも有さないように見える（ＢａｕｓｅおよびＢｕｒｂａｃｈ  １９９６，前出）。
ＥＲに局在するグルコシダーゼ酵素と異なり、エンドマンノシダーゼは、主にゴルジ体に
局在し（Ｚｕｂｅｒら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：４２２７−４２４０（２０
００））、このことは、ＥＲから漏出したグリコシル化糖形態をプロセシングすることに
よって、品質管理の役割を果たし得ることを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ヒト様糖タンパク質の産生に対しての改変グリコシル化グリカンの有用性を考えると、
宿主細胞中においてエンドマンノシダーゼ活性を発現することによってグリコシル化グリ
カンを改変するための方法が、所望される。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
非哺乳動物真核生物株を遺伝的に操作することによってグリコシル化Ｎ−グリカンを改
変するために、方法が開発された。この非哺乳動物真核生物株は、組み換え糖タンパク質
を産生し得、この組み換え糖タンパク質は、それらのヒト対応物と実質的に等しい。これ
らの細胞株（懸濁培養液中で増殖された酵母、糸状菌、昆虫細胞、および植物細胞が挙げ
られる）は、ヒトにおける糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反応が起こ
る、遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する。本明細書において記載されるように
、株は、触媒作用的に活性なエンドマンノシダーゼ遺伝子を発現して、よりヒト様のグリ
カン構造を得ることを全般的な目標としたＮ−連結グリカン構造のプロセシングを増強す
るように開発された。さらに、新規のヒトおよびマウスのエンドマンノシダーゼのクロー
ニングおよび発現も、また開示される。本発明の方法は、治療用タンパク質の産生におい
て有用な所望のグリコシル化構造を有する細胞株を操作するように、適合され得る。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中、他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当
業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り
、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含む。本発明の方法および
技術は概して、当該分野で周知の従来法に従って行なわれる。概して、本明細書中に記載
される、生化学、酵素学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質化学
および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される術語、およびそれ
らの技術は、当該分野において周知であり、一般に使用されている。本発明の方法および
技術は、概して、当該分野で周知の従来法、および他に示されない限り本明細書を通して
引用され、考察される種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載される従
来法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈ
ａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２への補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎ
ｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐ
ｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｋｕｒｔ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙ
ｍｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．Ｆ
ｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ節  Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉ巻  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ節  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＩＩ巻  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ
ｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細
書中で記される生化学および分子生物学と関連して使用される術語、ならびにそれらの研
究室手順および技術は、当該分野において周知であり、一般に使用されている。
【００２２】
本明細書中に言及される全ての出版物、特許および他の参考文献は、本明細書中に参考
として援用される。
【００２３】
以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解される：
本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」とは、Ｎ結合したオリゴ糖（例え
ば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン
残基に結合しているオリゴ糖）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍ
ａｎ」とは、マンノースをいい；「Ｇｌｃ」とは、グルコースをいい；「ＮＡｃ」とは、
Ｎ−アセチルをいい；ＧｌｃＮＡｃとは、Ｎ−アセチルグルコサミンをいう）の一般的な
五糖のコアを有する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構
造に付加される末梢糖（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｕｇａｒ）（例えば、フコースおよび
シアル酸）を含む枝（アンテナ）の数の点で異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝した
構成要素（例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド）に従って分類される。「
高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−
グリカンは、代表的に１，３マンノースアームに結合した少なくとも一つのＧｌｃＮＡｃ
および「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも一つのＧ
ｌｃＮＡｃを有する。「トリマンノースコア」は、Ｍａｎ３構造を有する五糖コアである
。複合Ｎグリカンはまた、必要に応じてシアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで
、「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸をいい、「Ａｃ」とはアセチルをいう）で改変されたガラ
クトース（「Ｇａｌ」）残基を有し得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「二分」ＧｌｃＮＡ
ｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎグ
リカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１個のＧｌ
ｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースアーム上に０個以上のマンノー
スを有する。
【００２４】
本明細書中で使用される略語は、当該分野で共通の用法である（例えば、上記糖の略語
を参照のこと）。他の一般的な略語としては、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．
１８）をいう「ＰＮＧａｓｅ」；３個のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
酵素の内の１つをいう「ＧｌｃＮＡｃ  Ｔｒ（Ｉ〜ＩＩＩ）」；Ｎ−アセチルノイラミニ
ン酸をいう「ＮＡＮＡ」が挙げられる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「分泌経路」とは、脂質結合オリゴ糖前駆体および
Ｎ−グリカン基質が連続して曝露され、その後細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装
置の区画への初期ポリペプチド鎖の分子の流れが続く、種々のグリコシル化酵素のアセン
ブリラインをいう。酵素は、この経路に沿って局在化しているとされる。酵素Ｙの前に脂
質結合グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙの上流にあるといわれる
か、または酵素Ｙの上流で作用するといわれる；同様に、酵素Ｙは、酵素Ｘの「下流」に
あるか、または酵素Ｘの「下流」で作用する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全な抗体（二つの重鎖および二つ
の軽鎖からなる）またはそのフラグメントをいう。このようなフラグメントとしては、そ
のフラグメントが抗原に対する特異的結合能を残す限り、種々のプロテアーゼで消化され
ることにより産生されたフラグメント、化学的切断および／または化学的解離により産生
されたフラグメント、ならびに組換えにより産生されたフラグメントが挙げられるが、こ
れらに限定されない。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フ
ラグメントは、これらのフラグメントの内である。配列は改変されているが、抗原に対す
る特異的な結合能が残っている抗体もまた、用語「抗体」の範囲内である。改変された抗
体の例は、種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合体；およびヘテロマー抗体複合体
（例えば、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（二重特異性抗体）、単鎖ジアボディおよびイ
ントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ（編）Ｉｎｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．
（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４１５１３）を参照のこと、その開示は、その全体
が参考として本明細書中に援用される）である。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「変異」とは、（例えば、グリコシル化関連酵素の
）遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列におけるあらゆる変化をいう。
【００２８】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長のヌクレオ
チドのポリマー形態をいう。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）ならび
に非天然のヌクレオチドアナログ、非天然のヌクレオチド間結合またはその両方を含むＤ
ＮＡもしくはＲＮＡのアナログを包含する。核酸は、任意の幾何学的形態であり得る。例
えば、核酸は、一本鎖形態、二本鎖形態、三本鎖形態、四本鎖形態、部分的に二本鎖形態
、分枝形態、ヘアピン状形態、環状形態または南京錠様の（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）形態で
あり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
【００２９】
他に示されない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、少なくともその一部が（ｉ）配
列番号Ｘの配列または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的である配列のどちらかを有する核酸を
いう。この二つの間の選択は、文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使
用される場合、その二つの間の選択は、プローブが所望の標的に相補的であるという必要
性によって決定される。
【００３０】
「単離された」、または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）は、その天然の宿主細胞中にネイティブのポリ
ヌクレオチドとともに天然に存在する他の細胞構成要素（例えば、リボソーム、ポリメラ
ーゼおよびそれが天然に関連するゲノム配列）から実質的に分離された核酸またはポリヌ
クレオチドである。この用語は、（１）その天然に存在する環境から取り除かれている、
（２）その「単離されたポリヌクレオチド」が天然において見出されるポリヌクレオチド
の全てまたは一部と結合していないか、（３）天然では結合していないポリヌクレオチド
に作動可能に連結しているか、または（４）天然には存在しない、核酸またはポリヌクレ
オチドを包含する。用語「単離された」、または「実質的に純粋な」はまた、組換え体ま
たはクローニングされたＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログま
たは異種系により生物学的に合成されるポリヌクレオチドアナログに関して使用され得る
。
【００３１】
しかし、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチド自体が
、そのネイティブの環境から物理的に取り除かれることを必ずしも必要としない。例えば
、生物のゲノム中の内生の核酸配列は、異種配列（すなわち、この内生の核酸配列に天然
には隣接しない配列）が内生核酸配列に隣接し、従って、この内生核酸配列の発現が変化
する場合、本明細書中では「単離された」と判断される。例として、非ネイティブのプロ
モーター配列は、ヒト細胞のゲノムにおける遺伝子のネイティブなプロモーター配列に対
して（例えば、相同組換えによって）置換され得、従ってこの遺伝子は、発現パターンが
変化する。ここで、この遺伝子は、その遺伝子に天然に隣接する配列の少なくともいくつ
かから分離されるので、「単離された」になる。
【００３２】
核酸が、ゲノム中の対応する核酸に対して天然には生じない任意の改変を含む場合、そ
の核酸はまた、「単離された」とも考えられる。例えば、内生のコード配列は、人工的に
、例えば、ヒトの介入によって導入された挿入、欠失または点変異を含む場合、「単離さ
れた」と考えられる。「単離された核酸」はまた、宿主細胞染色体の非相同な部位に組み
込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物を包含する。さらに、「単離された
核酸」は、他の細胞物質、組換え技術により作製された場合は、培養培地、または化学的
に合成された場合は、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり
得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、語句、参照核酸配列の「縮重改変体」は、参照核酸配列
から翻訳されたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を提供するための、標準的な遺伝子コ
ードに従って翻訳され得る核酸配列を包含する。
【００３４】
核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」または「同一である」とは、最
大限対応させるために並べられた場合に同一である２個の配列中の残基をいう。配列同一
性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、よ
り通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、
より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６ヌク
レオチド以上の長さを上回り得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用され得
る当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配
列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
のプログラムであるＦＡＳＴＡ，ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較され得る。Ｆ
ＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最大重複の領域の配置および配列同一性パ
ーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０（本明細書中で参考として援用される）
）。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡとそのデフォルトのパラ
メーター（スコアマトリクスに対して単語サイズ６およびＮＯＰＡＭ因子）またはＧａｐ
とＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１に提供されるそのデフォルトのパラメーターを用いて
決定され得る（これらは、本明細書中に参考として援用される）。
【００３５】
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはそのフラグメントを
いう場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を別の核酸（またはその相補的な鎖）と最
適に並べる場合、任意の周知の配列同一性のアルゴリズム（例えば、上に議論したＦＡＳ
ＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ）により測定して、少なくとも約５０％、より好ましくは
６０％のヌクレオチド塩基に、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０
％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基に、ヌクレオチド配列同一性が存在す
ることを示す。
【００３６】
あるいは、実質的な相同性または類似性は、核酸またはそのフラグメントが、別の核酸
、別の核酸の鎖またはその相補的な鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイズする場合に存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈にお
ける「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗
浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーション
は、当業者によって容易に理解されるように、例えば、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダ
イズする種の塩基組成、相補的領域の長さおよびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチ
ド塩基ミスマッチの数のような条件に影響される。
ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するためにこれらのパラメー
ターをどのように変化させるかは、当業者には、既知である。
【００３７】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の条件セットの下で
特異的ＤＮＡハイブリッドについての融点（Ｔｍ）よりも約２５℃低い温度で実施される
。「ストリンジェントな洗浄」は、特定の条件セット下で、特定のＤＮＡハイブリッドに
ついてのＴｍよりも約５℃低い温度にて実施される。このＴｍは、標的配列のうちの５０
％が、完全に一致したプローブに対してハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら（上記）９．５１頁（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
本明細書中での目的のために、「高ストリンジェンシー条件」とは、溶液相ハイブリダイ
ゼーションについて、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍ
クエン酸ナトリウムを含む）、１％  ＳＤＳ中での６５℃にて８〜１２時間の水性ハイブ
リダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）と、その後の０．２×ＳＳＣ、
０．１％  ＳＤＳにおける６５℃にて２０分間の２回の洗浄として定義される。６５℃で
のハイブリダイゼーションは、多数の要因（ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性
パーセントを含む）に依存して、種々の速度で生じることが、当業者によって認識される
。
【００３８】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーを
包含し得る。これらは、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学
的に改変され得るし、または非天然ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基
を含み得る。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレ
オチドのうちの１つ以上をアナログで置換すること、ヌクレオチド改変（例えば、非荷電
結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバ
メートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど））
、ペンダント（ｐｅｎｄｅｎｔ）部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレート剤（
例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および改変型結合（
例えば、αアノマー核酸など）が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用
を介して指定した配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も包
含される。そのような分子は、当該分野で公知であり、そのような分子としては、例えば
、その分子の骨格中のリン酸結合をペプチド結合で置換している分子が挙げられる。
【００３９】
用語「変異（した）」とは、核酸配列に適用される場合には、核酸配列中のヌクレオチ
ドが、参照核酸配列と比較して挿入、欠失、または変化され得ることを意味する。単一の
変化が、座においてなされ得る（点変異）か、または複数のヌクレオチドが、単一の座に
おいて挿入、欠失、または変化され得る。さらに、１つ以上の変化が、核酸配列中の多数
の座においてなされ得る。核酸配列は、当該分野で公知の任意の方法によって変異され得
、そのような方法としては、変異誘発技術（例えば、「エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐ
ｒｏｎｅ）ＰＣＲ」（ＤＮＡポリメラーゼのコピー信頼度が低い条件下でＰＣＲを実施す
るためのプロセスであり、その結果、そのＰＣＲ産物の全長に沿って、高率の点変異が得
られる。例えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，ｐｐ．１１〜１５
（１９８９）ならびにＣａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．およびＪｏｙｃｅ  Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，２，ｐｐ．２８〜３３（１９９２）参照）；ならび
に「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発」（目的とする任意のクローン化ＤＮＡセグメン
ト中での部位特異的変異の生成を可能にするプロセス。例えば、Ｒｅｉｄｈａａｎ−Ｏｌ
ｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．およびＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，ｐｐ．５３
〜５７（１９８８）参照））を参照のこと。
【００４０】
用語「ベクター」とは、本明細書中で使用される場合、連結されている別の核酸を輸送
可能である核酸分子を指すことが意図される。ベクターの型の１つは、「プラスミド」で
ある。これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指
す。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色
体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、さらなるＤ
ＮＡセグメントが、そのウイルスゲノム中に連結され得る（以下により詳細に考察される
）。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞中で自己複製可能である（例えば、そ
の宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞中に導
入された際にその宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより、その宿主ゲノムとと
もに複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、それが作動可能に連結されている
遺伝子の発現を指令することが可能である。そのようなベクターは、本明細書中で「組換
え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれ得る。
【００４１】
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、その発現制御配列が、目的の遺伝子と連
続していてその目的の遺伝子を制御する連結、ならびにその目的の遺伝子を制御するよう
にトランスまたは一定距離にて作用する発現制御配列を指す。
【００４２】
用語「発現制御配列」とは、本明細書中で使用される場合、それが作動可能に連結され
ているコード配列の発現をもたらすために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御
配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列と
しては、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配
列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシングシグナルおよびポリア
デニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例え
ば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；および望ましい場合には
、タンパク質分泌を増強する配列；が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生
物に依存して異なる。原核生物においては、そのような制御配列としては、一般的には、
プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列
」は、最低限、発現のためにその存在が必須とされるすべての構成要素を包含することが
意図され、この用語はまた、その存在が有利であるさらなる構成要素（例えば、リーダー
配列、および融合パートナー配列）を含み得る。
【００４３】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、本明細書中で使用される場
合、組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。このような用語は、
特定の対象細胞を指すのみならず、そのような細胞の子孫をも指すと意図されることが理
解されるべきである。特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかに起因して続く世
代において生じ得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞とは同一ではないかもし
れないが、本明細書中で使用される用語「宿主細胞」の範囲内になお包含される。組換え
宿主細胞は、単離された細胞もしくは培養中で増殖した細胞株であり得るか、または生存
組織もしくは生物中に存在する細胞であり得る。
【００４４】
用語「ペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、短いポリペプチド（例えば、代
表的には、約５０アミノ酸長未満であり、より代表的には約３０アミノ酸長未満である）
を指す。この用語は、本明細書中で使用される場合、アナログ、ならびに構造的機能（従
って、生物学的機能）を模倣する模倣物を包含する。
【００４５】
用語「ポリペプチド」とは、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパ
ク質の両方、ならびにそれらのフラグメント、変異体、誘導体、およびアナログを包含す
る。ポリペプチドは、モノマーであっても、ポリマーであってもよい。さらに、ポリペプ
チドは、多数の異なるドメインを含み得、それらのドメインの各々は、１つ以上の別個の
活性を有する。
【００４６】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、その起源もし
くは誘導源によって、（１）その天然状態で付随する天然で関連している成分と関連して
いないか、（２）天然では見出されない純度で存在する場合であって、その純度は、他の
細胞物質の存在に関して調節され得る（例えば、同じ種由来の他のタンパク質を含まない
）か、（３）異なる種由来の細胞により発現されるか、または（４）天然で存在しない（
例えば、それが、天然で見出されるポリペプチドのフラグメントであるか、あるいはそれ
が、天然で見出されないアミノ酸アナログもしくは誘導体または標準的ペプチド結合以外
の結合を含む）、タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学合成されるかまた
は天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然で
関連する成分から「単離」される。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野で周
知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然で関連する成分を実質的に含まな
いようにされ得る。そのように定義される場合、「単離された」とは、そのような記載さ
れるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはオリゴペプチドが、その天然環境から
物理的に取り除かれていることを必ずしも必要とはしない。
【００４７】
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、本明細書中で使用される場合、全長ポリペプ
チドと比較してアミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有する、ポリペプチ
ドを指す。好ましい実施形態において、そのポリペプチドフラグメントは、そのフラグメ
ントのアミノ酸配列がその天然に存在する配列中の対応する位置と同一である、連続配列
である。フラグメントは、代表的には、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミ
ノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、または１０アミノ酸長であり、好ましくは、少な
くとも１２アミノ酸長、１４アミノ酸長、１６アミノ酸長、または１８アミノ酸長であり
、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２５
アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長、４０アミノ酸長、または４５アミノ酸長
であり、なおより好ましくは、少なくとも約５０アミノ酸長または６０アミノ酸長であり
、なおより好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。  
【００４８】
「改変型誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同なポリペプチドまたはその
フラグメントであって、例えば、インビボもしくはインビトロでの化学的改変および生化
学的改変を含むか、またはネイティブポリペプチドにおいて見出されないアミノ酸を組み
込んでいる、ポリペプチドまたはそのフラグメントを指す。そのような改変としては、当
業者によって容易に認識されるような、例えば、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリ
ル化、グリコシル化、ユビキチン化、（例えば、放射性核種による）標識、ならびに種々
の酵素的改変が挙げられる。ポリペプチドを標識するための種々の方法、およびそのよう
な目的のために有用な置換もしくは標識の種々の方法は、当該分野で周知であり、その方
法としては、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ、標識アン
チリガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光薬剤、酵素、およ
び標識リガンドにとって特異的な結合パートナー対のメンバーとして作用し得るアンチリ
ガンドが挙げられる。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合体化の容易さ、安
定性要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当
該分野で周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２（本明細書中で参考として援用される
）を参照のこと。
【００４９】
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列に結合しているポリペプチドまたはフ
ラグメントを含む、ポリペプチドを指す。融合タンパク質は、有用である。なぜなら、そ
れは、２つ以上の異なるタンパク質由来の２つ以上の望ましい機能的エレメントを含むよ
うに構築され得るからである。融合タンパク質は、目的のポリペプチドに由来する少なく
とも１０個連続するアミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸もしくは３
０アミノ酸を含み、なおより好ましくは少なくとも４０アミノ酸、５０アミノ酸、もしく
は６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５アミノ酸、１００アミノ酸、もしく
は１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、そのポリペプチドまたはそのフラグメント
をコードする核酸配列を、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とイン
フレームの状態で構築すること、その後、その融合タンパク質を発現させることによって
、組換え生成され得る。あるいは、融合タンパク質は、そのポリペプチドまたはそのフラ
グメントを、別のタンパク質に架橋させることによって、化学的に生成され得る。
【００５０】
用語「非ペプチドアナログ」とは、参照ポリペプチドの特性と同様の特性を有する化合
物を指す。非ペプチド化合物はまた、「ペプチド模倣物」または「ペプチドミメティック
」とも呼ばれ得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
；Ｊｕｎｇ（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎ
ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；
Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ」Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９９２；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０
：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２
９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９
８５）；ならびに上記の各々において引用される参考文献（これらは、参考として本明細
書中で援用される）を参照のこと。そのような化合物は、しばしば、コンピュータ化した
分子モデリングの補助を得て開発される。本発明の有用なペプチドと構造的に類似するペ
プチド模倣物は、等価な効果を生じるために使用され得、従って、本発明の一部であるよ
うに想定される。
【００５１】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、ネイティブタンパク質
もしくは野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複
、欠失、再配置、または置換を含む、ポリペプチドを指す。ムテインは、１つ以上のアミ
ノ酸の点置換（ある位置にある単一アミノ酸が別のアミノ酸へと変化されている）、１つ
以上の挿入および／もしくは欠失（天然に存在するタンパク質の配列において１つ以上の
アミノ酸がそれぞれ挿入または欠失している）、ならびに／あるいはアミノ末端もしくは
カルボキシ末端のいずれかもしくは両方にあるアミノ酸配列の短縮を有し得る。ムテイン
は、天然に存在するタンパク質と比較して、同じであるが、好ましくは異なる生物学的活
性を有し得る。
【００５２】
ムテインは、その野生型対応物に対して、少なくとも７０％の全体的配列相同性を有す
る。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％、または９０％の
全体的配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態において、ムテイ
ンは、９５％の配列同一性を示し、なおより好ましくは９７％の全体的配列同一性を示し
、なおより好ましくは、９８％の全体的配列同一性を示し、なおより好ましくは、９９％
、９９．５％、もしくは９９．９％の全体的配列同一性を示す。配列相同性は、任意の一
般的な配列分析アルゴリズム（例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ）によって測定され
得る。
【００５３】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少する置換、（２
）酸化に対する感受性を減少する置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親
和性を変化する置換、（４）結合親和性または酵素活性を変化する置換、および（５）そ
のようなアナログの他の物理化学的特性または機能的特性を付与もしくは改変する置換で
ある。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、２０個の慣用的なアミノ酸およびこれらの誘導体は、慣
用的用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．Ｇ
ｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎ
ｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（これは、本明細書中に参考として援用され
る）を参照のこと。２０個の慣用的なアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、
非天然のアミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、およ
び他の非慣用的なアミノ酸がまた、本発明のポリペプチドにとって適切な成分であり得る
。非慣用的なアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−
カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン
、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチ
ジン、５−ヒドロキシリジン，ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸
およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用されるポリペプ
チド表記法において、標準的用法および慣例に従い、左手方向はアミノ末端方向であり、
右手方向はカルボキシ末端方向である。
【００５５】
あるタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列に対
し類似の配列を有する場合、このタンパク質は、第二のタンパク質に対し、「相同性（ｈ
ｏｍｏｌｏｇｙ）」を有するか、または「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」である。ある
いは、２つのタンパク質が、「類似の」アミノ酸配列を有する場合、このタンパク質は、
第二のタンパク質に対して相同性を有する。（従って、用語「相同なタンパク質（ｈｏｍ
ｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、上記２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列
を有することを意味すると規定される）。好ましい実施形態において、相同なタンパク質
は、野生型タンパク質に対し６０％の配列相同性を示すタンパク質であり、より好ましく
は、７０％の配列相同性を示すタンパク質である。さらにより好ましくは、野生型タンパ
ク質に対し、８０％、８５％または９０％の配列相同性を示す相同なタンパク質である。
なおより好ましい実施形態において、相同なタンパク質は、９５％、９７％、９８％また
は９９％の配列同一性を示す。本明細書中で使用される場合、（特に、予測された構造類
似性に関して）２つの領域の間の相同性は、機能における類似性を意味すると解釈される
。
【００５６】
「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」がタンパク質またはペプチドに関して使用される場
合、同一ではない残基位置が、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認識さ
れる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電
荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置
換である。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化しな
い。２つ以上のアミノ酸配列が保存的な置換によって互いに異なる場合、配列同一性％ま
たは相同性の程度は、この置換の保存的な性質を補正するように上方修正され得る。この
修正を行うための手段は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら，１９９４（
これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００５７】
以下の６つの群は、各々、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ
）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラ
ギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシ
ン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５８】
ポリペプチドについての配列相同性（これはまた、配列同一性％と呼ばれる）は、代表
的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）の配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９
１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５
３７０５）を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、
種々の置換、欠損および他の改変に割り当てられる相同性の測定を使用して類似の配列を
一致させる。例えば、ＧＣＧは、密接に関連のあるポリペプチド（例えば、種々の生物種
由来の相同性ポリペプチド）の間、または野生型タンパク質とこれらのムテインとの間の
配列相同性もしくは配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータで使用され得る、
「ギャップ」および「ベストフィット」のようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバー
ジョン６．１を参照のこと。
【００５９】
阻害性分子の配列と種々の生物由来の多くの配列を含むデータベースとを比較する場合
、好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ
．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈおよび
Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅ
ｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３
３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎ
ｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）であり、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔ
ｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐ用の好ましいパラメータは、
以下である：期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；オープ
ンギャップへのコスト：１１（デフォルト）；延長ギャップへのコスト：１（デフォルト
）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字サイズ：１１（デフォルト）；記
載の数：１００（デフォルト）；ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。
【００６０】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、概して、少なくとも約１６アミ
ノ酸残基であり、一般的には少なくとも約２０残基であり、より一般的には少なくとも約
２４残基であり、代表的には少なくとも約２８残基であり、好ましくは、約３５残基より
長い。多数の種々の生物の由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列
を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、当該分野で公
知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列
は、ＦＡＳＴＡ（ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラム）を使用して比較され得る
。ＦＡＳＴＡは、クエリー（ｑｕｅｒｙ）と検索配列との間の最高のオーバーラップの領
域のアライメントおよび配列同一性％を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０（本明細書
中に参考として援用される））。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性％は、ＧＣＧバー
ジョン６．１（本明細書中で参考として援用される）に提供されるようなＦＡＳＴＡのデ
フォルトパラメータ（文字サイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用
いたＦＡＳＴＡを使用して決定され得る。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「ドメイン」とは、生体分子の公知機能または擬似
機能に寄与する生体分子の構造を言う。ドメインは、領域またはこれらの位置と同一の広
がりを持ち得る；ドメインはまた、生体分子の別の、非近接の領域を含み得る。タンパク
質ドメインの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞
質ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書中に使用される場合、用語「分子」とは、任意の化合物（小分子、ペプチド、
タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるが、これらに限定されない
）を意味し、このような化合物は、天然物または合成物であり得る。
【００６３】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本
発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。例示
的な方法および材料はまた、以下に記載されるが、本明細書中に記載されるものと類似ま
たは等価である方法および材料が、本発明の実施において使用され得、かつ当業者に明ら
かである。本明細書中に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参考
として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が制御する。材料、方法、お
よび実施例は、例示に過ぎず、限定されることは意図されない。
【００６４】
本明細書およびその実施形態にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエ
ーションは、記載される完全体または完全体の群を包含することをいうが、任意の他の完
全体または完全体の群を排除することをいわないことが理解される。
【００６５】
（ヒトエンドマンノシダーゼ遺伝子をコードする核酸配列）
ラットエンドマンノシダーゼがクローニングされている（Ｓｐｉｒｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７２（４６）：２９３５６−２９３６３（１９９７））。ラットエンドマ
ンノシダーゼは、現在までにこのファミリーのうちで唯一クローニングされたメンバーで
あり、このＯＲＦ（特に、ラットエンドマンノシダーゼ触媒ドメイン）に対して有意な相
同性を示す遺伝子およびＥＳＴが、データベースに存在する。ラットエンドマンノシダー
ゼタンパク質配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｇｉ：２６４２１８７）を使用してタンパク質ＢＬ
ＡＳＴ検索を行うことによって、本発明者らは、ラットエンドマンノシダーゼ配列と有意
な相同性の領域を有する、Ｇｅｎｂａｎｋの２つの仮想ヒトタンパク質を同定した（実施
例２；図３Ａ〜３Ｃ）。１つのＯＲＦに、これらの２つの仮想タンパク質の５’領域およ
び３’領域を組み合わせると、４６２個の推定アミノ酸配列（図４）および５４ｋＤａの
予測分子量を生じた。この推定のヒトエンドマンノシダーゼ配列と公知のラット配列との
アライメントにより、これらのタンパク質のＣ末端は高度に保存されているが、Ｎ末端は
より異なることが示された（図７）。保存領域（すなわち、モチーフ「ＤＦＱ（Ｋ／Ｒ）
ＳＤＲＩＮ」〜Ｃ末端）は、各エンドマンノシダーゼの触媒ドメイン、または少なくとも
活性に不可欠な領域に対応するようである。
【００６６】
上記の推定ヒトエンドマンノシダーゼ遺伝子配列に基づき、本発明者らは、プライマー
を構築し、ＰＣＲによってヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）を増幅した（実施例２）。そのＯＲＦをコードする核酸配列は、その長さ
にわたって、ラットエンドマンノシダーゼＯＲＦをコードする全長核酸配列と、７７．８
％同一である（加重した残基重量表を用いたＣｌｕｓｔａｌ法を使用して配列対の距離）
。アミノ酸配列レベルで、ヒトおよびラットのエンドマンノシダーゼタンパク質は、全体
で７６．７％同一であると予測される。上記のより保存された領域（すなわち、モチーフ
「ＤＦＱ（Ｋ／Ｒ）ＳＤＲＩＮ」〜Ｃ末端）において、タンパク質は、全体で８６．８％
同一である。ラットタンパク質と異なり、予測されたヒトタンパク質は、Ｎ末端に非常に
疎水性の領域（残基１０〜２６）を有し、これは、膜貫通領域であり得る（図４、囲み）
。ヒトエンドマンノシダーゼ（ラットタンパク質と異なる）は、大部分の他の高等真核生
物のマンノシダーゼであるようなＩＩ型膜タンパク質であると予測される。
【００６７】
本発明者らは、ヒトエンドマンノシダーゼＯＲＦを、酵母組込みプラスミドを含む種々
のベクターにサブクローニングして（実施例３）、下等真核宿主細胞（Ｐｉｃｈｉａ  ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）のＮ−グリコシル化経路におけるその発現の効果を研究した。以下に記
載されるように、宿主細胞のグリコシル化経路へヒトマンノシダーゼ酵素を操作すること
は、その宿主細胞およびその子孫で産生されるタンパク質のその後のグリコシル化プロフ
ィールに影響を及ぼす。好ましくは、宿主細胞は、１つ以上の他の操作されたグリコシル
化活性と組み合わせてヒトマンノシダーゼ酵素活性（例えば、触媒ドメインに由来する）
を発現するように操作されて、ヒト様糖タンパク質が作製される。
【００６８】
従って、本発明は、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子としては、ヒトエンド
マンノシダーゼをコードする全長核酸配列を含むか、またはその全長核酸配列からなる核
酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトエンドマンノシダーゼの核酸配列お
よびＯＲＦは、図４に配列番号１として示される。コードされるアミノ酸配列はまた、図
４に配列番号２として示される。
【００６９】
一実施形態において、本発明は、野生型ヒトエンドマンノシダーゼコード配列（配列番
号１）；これらのホモログ、改変体および誘導体；ならびに任意の上記のフラグメントを
含むか、またはこれらからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。一実施
形態において、本発明は、野生型のヒトエンドマンノシダーゼコード配列（配列番号１）
の縮重した改変体である配列を含むか、またはこの配列からなる核酸分子を提供する。好
ましい実施形態において、本発明は、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性を有する
、ヒトエンドマンノシダーゼコード配列（配列番号１）の改変体である配列を含むか、ま
たはこの配列からなる核酸分子を提供する。上記核酸配列は、好ましくは、ヒトエンドマ
ンノシダーゼコード配列（配列番号１）と、少なくとも７０％、７５％または８０％の同
一性を有し得る（しかし、具体的には、全体で約７８％同一なラットエンドマンノシダー
ゼ遺伝子を除く）。さらに、より好ましくは、上記核酸配列は、野生型ヒトエンドマンノ
シダーゼコード配列（配列番号１）と、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９
．９％、またそれ以上高い同一性を有し得る。
【００７０】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、ま
たはこのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。また、配列番号２と少なくと
も６５％同一であるポリペプチド配列をコードする核酸分子が提供される（しかし、具体
的には、全体で約７７％の同一性であるラットエンドマンノシダーゼポリペプチドを除く
）。代表的に、本発明の核酸分子は、配列番号２と、少なくとも７０％、７５％または８
０％同一のポリペプチド配列をコードする。好ましくは、コードされるポリペプチドは、
配列番号２と、少なくとも８５％、９０％または９５％同一であり、この同一性は、さら
により好ましくは、９８％、９９％、９９．９％またはそれより高くあり得る。
【００７１】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、上記の核酸分子とハイブリダイズする核
酸分子を提供する。上に規定され、当該分野で周知であるように、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーションは、特定の一連の条件下での特定のＤＮＡハイブリッドについての
熱融解点（Ｔｍ）以下の、約２５℃で行われ、このＴｍは、５０％の標的配列が、完全に
一致したプローブとハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな洗浄は、特定の
一連の条件下での特定のＤＮＡハイブリッドについてのＴｍよりも低い約５℃の温度で行
われる。
【００７２】
上記の核酸配列のいずれか一つのフラグメントを含む核酸分子もまた提供される。これ
らのフラグメントは好ましくは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む。より
好ましくは、核酸配列のフラグメントは、少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個、
４５個、または５０個の連続したヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、核酸配列
のフラグメントは、少なくとも６０個、７０個、８０個、９０個、１００個またはそれ以
上の連続したヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施形態において、核酸配列は、野
生型の遺伝子フラグメントと少なくとも６５％の同一性を有するフラグメントの改変体で
ある。核酸配列は好ましくは、野生型の遺伝子フラグメントと少なくとも７０％、７５％
または８０％の同一性を有し得る。さらにより好ましくは、核酸配列は、野生型の遺伝子
フラグメントと８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の
同一性を有し得る。
【００７３】
本発明の核酸配列フラグメントは、種々のシステムおよび方法における有用性を示す。
例えば、これらのフラグメントは、種々のハイブリダイゼーション技術においてプローブ
として用いられ得る。方法に応じて、標的核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで
あり得る。この標的核酸配列は、ハイブリダイゼーションの前に（例えば、ゲル電気泳動
によって）分画され得るか、またはハイブリダイゼーションが、インサイチュでサンプル
において実施され得る。当業者は、既知配列の核酸プローブが、染色体構造の（例えば、
サザン・ブロッティングによる）決定および遺伝子発現の（例えば、ノーザン・ブロッテ
ィングによる）測定において有用性を見出すことを理解する。このような実験において、
この配列フラグメントは好ましくは、検出可能に標識化され、その結果、標的配列に対す
るその特異的なハイブリダーゼーションが検出され、必要に応じて定量され得る。当業者
は、本発明の核酸フラグメントが、本明細書中に詳細に記載されていない、広範な種々の
ブロッティング技術に用いられ得ることを理解する。
【００７４】
本明細書中に開示される核酸配列フラグメントはまた、マイクロアレイに固定された場
合、プローブとして有用であることを見出すこともまた理解されるべきである。支持基板
上への核酸の沈着および固定によるマイクロアレイの作製方法は、当該分野において周知
である。ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ
（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｏｘ
ｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７
７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（補遺）：１−６０（１９９９）；Ｍ
ｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓ
ｃｈｅｎａ（編）、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９
９３７６）に概説され、この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。例
えば、核酸配列フラグメント（例えば、本明細書中に開示される核酸配列フラグメント）
を含むマイクロアレイを用いる遺伝子発現の分析は、細胞生物学および分子生物学の分野
において十分に確立された配列フラグメントについての有用性である。マイクロアレイに
固体された配列フラグメントの他の用途は、Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：１６８−１７３（１９９９）およびＺｗｅｉｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄ
ｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７：４２９−４３６（１９９９）；ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａ
ｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅ
ｎｅｔ．２１（１）（補遺）：１−６０（１９９９）；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃ
ｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｅａｔｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）に記載され、これら
の各開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。別の実施形態において、エ
ンドマンノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子が、提供
される。当該分野において周知であるように、酵素活性は、種々の方法によって測定され
得る。あるいは、この酵素活性は、クロマトグラフ技術（例えば、高性能液体クロマトグ
ラフィーによる）を用いて追跡され得る（ＣｈｕｎｇおよびＳｌｏａｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｒ
ｍａｔｏｇｒ  ３７１：７１−８１（１９８６））。他の方法および技術はまた、当業者
によって公知であるように、酵素活性の測定にも適切であり得る。
【００７５】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする。本発明の核酸配列は、野生型ラットエンドマンノシダーゼ遺伝子
（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ０２３６５７）と少なくとも７７％の同一性を有するポリペプチ
ドをコードする。別の実施形態において、核酸配列は、野生型ラットマンノシダーゼ触媒
ドメインと少なくとも８７％の同一性を有する。さらにより好ましい実施形態において、
核酸配列は、野生型ラットエンドマンノシダーゼ遺伝子と９０％、９５％、９８％、９９
％、９９．９％またはそれ以上の同一性を有し得る。
【００７６】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチド（特に、生物学的な（例えば、触媒な
ど）活性および／または免疫学的な活性を有するペプチド）もまた、本発明によって提供
される。
【００７７】
（マウスエンドマンノシダーゼ遺伝子をコードする核酸配列）
マウスエンドマンノシダーゼ遺伝子は、マウスエンドマンノシダーゼ遺伝子とヒトエン
ドシダーゼ遺伝子との間の推定される相同な領域と相補的なプライマーを設計し、ＰＣＲ
増幅することによってクローン化され、マウスエンドマンノシダーゼをコードする全長ｃ
ＤＮＡを取り出すために用いられ得るプローブを作製する（実施例２）。マウスエンドマ
ンノシダーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチドおよび予想され
るアミノ酸配列は、図６およびそれぞれ配列番号３および配列番号４として示される。
【００７８】
このマウスＯＲＦは、既知のラットエンドマンノシダーゼおよび本発明のヒト肝臓エン
ドマンノシダーゼと実質的に相同性を示す（図７）。詳細には、マウスエンドマンノシダ
ーゼＯＲＦをコードする核酸配列は、ラットエンドマンノシダーゼＯＲＦおよびヒトエン
ドマンノシダーゼＯＲＦをコードしている全長核酸配列に対して、その長さにわたって、
それぞれ８６．０％および８４．２％同一である（ウェイティッドレジデュウェイトテー
ブル（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｗｉｅｉｇｈｔ  ｔａｂｌｅ）を用いるＣｌ
ｕｓｔａｌ法を用いた配列対の相違）。アミノ酸配列レベルでは、マウスエンドマンノシ
ダーゼタンパク質およびラットエンドマンノシダーゼタンパク質は、８２．３％同一であ
ると予測され、マウスエンドマンノシダーゼタンパク質およびヒトエンドマンノシダーゼ
タンパク質は、全体として８４．９％同一であると予測される。上記のより保存された領
域（すなわち、モチーフ「ＤＦＱ（Ｋ／Ｒ）ＳＤＲＩＮ」からＣ末端まで）において、こ
のマウスおよびラットのタンパク質は、９２．３％同一であり、そしてこのマウスおよび
ヒトのタンパク質は、全体として８６．１％同一である。
【００７９】
従って、本発明はさらに、マウスエンドマンノシダーゼをコードする単離された核酸分
子およびその改変体を提供する。一つの実施形態において、本発明は、マウスエンドマン
ノシダーゼ（配列番号３）、相同体、改変体およびその誘導体をコードする遺伝子を含む
かまたはこれらの遺伝子からなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。
【００８０】
従って、本発明は、単離された核酸分子を提供する。この単離された核酸分子としては
、マウスエンドマンノシダーゼをコードする全長核酸配列を含むか、またはこの全長核酸
配列からなる核酸配列が挙げられるが、これらには限定されない。マウスエンドマンノシ
ダーゼの核酸配列およびＯＲＦは、図６および配列番号３として示される。このコードさ
れたアミノ酸配列もまた、図６および配列番号４に示される。
【００８１】
一つの実施形態において、本発明は、野生型マウスエンドマンノシダーゼのコード配列
（配列番号３）；相同体、改変体およびその誘導体；ならびに上記のいずれかのフラグメ
ントを含むか、またはこれらからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。
一つの実施形態において、本発明は、野生型マウスエンドマンノシダーゼのコード配列（
配列番号３）の縮重改変体である配列を含むか、またはこの配列からなる核酸分子を提供
する。好ましい実施形態において、本発明は、野生型遺伝子と少なくとも６５％の同一性
を有するマウスエンドマンノシダーゼコード配列（配列番号３）の改変体である配列を含
むか、またはこの配列からなる核酸分子を提供する。この核酸配列は好ましくは、野生型
ヒトエンドマンノシダーゼコード配列（配列番号３）と少なくとも７０％、７５％、８０
％または８５％の同一性を有し得る（しかし、詳細には、全体として約８６％同一である
ラットエンドマンノシダーゼ遺伝子を除く）。さらにより好ましくは、この核酸配列は、
野生型マウスエンドマンノシダーゼコード配列（配列番号３）と９０％、９５％、９８％
、９９％、９９．９％またはそれ以上の同一性を有し得る。
【００８２】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまた
はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。また、配列番号４と少なくとも
６５％同一であるポリペプチド配列をコードする核酸分子が提供される（しかし、詳細に
は全体として約８２％同一であるラットエンドマンノシダーゼポリペプチドを除く）。代
表的に、本発明の核酸分子は、配列番号４と少なくとも７０％、７５％、または８０％同
一であるポリペプチド配列をコードする。好ましくは、コードされたポリペプチドは、配
列番号４と少なくとも８５％、９０％または９５％同一であり、この同一性はさらにより
好ましくは、９８％、９９％、９９．９％またはさらにそれ以上であり得る。
【００８３】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で上記の核酸分子に対してハイブリダイズす
る核酸分子を提供する。上に規定されるように、そして当該分野で周知であるように、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーションは、特定の条件セットの下、特異的なＤＮＡハ
イブリッドについての熱融点（Ｔｍ）よりも約２５℃低い温度で実施される。このＴｍは
、標的配列の５０％が、プローブと完全に適合するようにハイブリダイズする温度である
。ストリンジェントな洗浄を、特定の条件セットの下、特異的なＤＮＡハイブリッドにつ
いてのＴｍよりも約５℃低い温度で実施される。
【００８４】
また、上記核酸配列のいずれか一つのフラグメントを含む核酸分子も提供される。これ
らのフラグメントは好ましくは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む。より
好ましく、」は核酸配列のフラグメントは、少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個
、４５個または５０個の連続したヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、核酸配列
のフラグメントは、少なくとも６０個、７０個、８０個、９０個、１００個またはそれ以
上の連続するヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施形態において、核酸配列は、野
生型遺伝子フラグメントと少なくとも６５％の同一性を有するフラグメントの改変体であ
る。核酸配列は好ましくは、野生型遺伝子フラグメントと少なくとも７０％、７５％、ま
たは８０％の同一性を有する。さらにより好ましくは、この核酸配列は、野生型遺伝子フ
ラグメントと８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の同
一性を有し得る。
【００８５】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまた
はこの配列からなるポリペプチドをコードする。また、配列番号４と少なくとも６５％同
一であるポリペプチド配列をコードする核酸分子が提供される（しかし、詳細には全体と
して約８２％同一であるラットエンドマンノシダーゼポリペプチドは除く）。代表的に本
発明の核酸分子は、配列番号４と少なくとも７０％、７５％または８０％同一であるポリ
ペプチド配列をコードする。好ましくは、コードされるポリペプチドは、配列番号４と少
なくとも８５％、９０％または９５％同一であり、この同一性はより好ましくは、９８％
、９９％、９９．９％またはそれ以上であり得る。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、野生型ラットエンドマンノシダーゼ
遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ０２３６５７）と少なくとも８３％の同一性を有するポリ
ペプチドをコードする。別の実施形態において、アミノ酸配列をコードする核酸配列は、
野生型ラットエンドマンノシダーゼ触媒ドメインと少なくとも９３％の同一性を有する。
さらにより好ましい実施形態において、この核酸配列は、野生型ラットエンドマンノシダ
ーゼ遺伝子と９４％、９５％、９８％、９９．９％またはそれ以上の同一性を有し得る。
【００８７】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチド（特に生物学的な（例えば、触媒など
）活性および／または免疫学的な活性を有するペプチド）もまた、本発明によって提供さ
れる。
【００８８】
（コードされるエンドマンノシダーゼ産物の特徴付け）
ヒト肝臓エンドマンノシダーゼおよび推定マウスエンドマンノシダーゼは、グリコシド
酵素の新たに生じた、現れたファミリーの第２および第３のメンバーである（第１のこの
ようなメンバーであるラットエンドマンノシダーゼ酵素と同じく）。ヒトＯＲＦ、マウス
ＯＲＦおよびラットＯＲＦの配列比較（図７）は、「ＤＦＱ（Ｋ／Ｒ）ＳＤＲＩ」モチー
フからこの配列のＣ末端までと高い相同性を示し、このことは、この領域が、このタンパ
ク質の必須フラグメント、そして潜在的には触媒ドメインをコードすることうを示唆する
。対照的に、このタンパク質のＮ末端における低い相同性は、進化的な分岐を示す。大多
数のグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの大部分のように、このマウス
およびヒトの酵素は、膜貫通ドメインを示す疎水性領域を有する。このようなドメインは
、分泌経路におけるこの酵素の配向および局在化を容易にする。対照的に、ラットエンド
マンノシダーゼは、位置２に膜貫通ドメインを有さないが、グリシン残基を有する（Ｓｐ
ｉｒｏ  １９９７、前出）。この最後から二番目のグリシン残基は、ミリストイル化され
る可能性を有し、次々に膜局在化のための機構を提供する（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｃｅｌｌ  Ｓ
ｉｇｎａｌ  ９：１５−３５（１９９７））。あるいは、ミリストイル化は、ゴルジ装置
にラットエンドマンノシダーゼを局在化させる手段でなくてもよく（Ｚｕｂｅｒ  ２００
０，前出）−タンパク質−タンパク質の相互作用が、決定機構であり得る。
【００８９】
ラットエンドマンノシダーゼのように、ヒトおよびマウスのアイソファームの両方は、
この種類のタンパク質の活性に基づいてゴルジ装置に局在することが予測される。代表的
に，Ｎ−グリカンからのグルコースの除去は、グルコシダーゼＩおよびグルコシダーゼＩ
ＩによってＥＲに生じると考えられた。しかし、エンドマンノシダーゼの特徴付けならび
にシス槽およびゴルジ装置の中間槽へのその局在化は、グルコースのトリミングが、グル
コースの局在化に続いて生じさせることを示す（Ｒｏｔｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８５
：２８７−２９４（２００３））。
【００９０】
エンドマンノシダーゼが果たす特異的な役割は、現在不明である。ラットエンドマンノ
シダーゼのアフィニティ精製はカルレチキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）との同時
精製を示し、これはＮ−グリコシル化の品質制御におけるその役割を示唆する（Ｓｐｉｒ
ｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５８８−１１５９４（１９９６））。ある
いは、エンドマンノシダーゼは、迂回されるグルコシダーゼトリミングを有するグリコシ
ル化構造を回収し、適切に成熟させる能力を有する細胞を提供し得る。従って、グリコシ
ル化された高マンノース構造からグルコース−α１，３−マンノース二量体を除去するこ
とは、常在性のゴルジグリコシドおよびグリコシルトランスフェラーゼ酵素に対する基質
を提示し、Ｎ−グリカンの成熟を可能にする。
【００９１】
本発明者らは、ヒトエンドマンノシダーゼおよび類似のラットアイソフォームの組織分
布を分析し（Ｓｐｉｒｏ（１９９７））、これは、試験された組織において広範囲に及ん
だ（図８）（実施例６）。肝臓および腎臓は、高い発現レベルを示したが、この組織の残
りにおけるパターンは、かなり異なっていた。興味深いことに、ヒトエンドマンノシダー
ゼとは対照的に、ラットのアイソフォームは、脳および肺の両方において、高い発現レベ
ルを示す（Ｓｐｉｒｏ（１９９７））。ラットおよびヒトにおけるこの酵素の両方のアイ
ソフォームの広範な発現は、エンドマンノシダーゼが、Ｎ−グリカンのプロセシングにお
いて、ハウスキーピングの役割を果たし得ることを示唆する。
【００９２】
本発明のヒトエンドマンノシダーゼのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現は、単離され
たＯＲＦが活性を有することを確認する。興味深いことに、ラットのアイソフォームは、
ヌクレオチドおよびタンパク質のレベルでは高度に相同であるが、ウェスタンブロットに
おいて見られるヒトタンパク質よりも少なくとも５倍高いレベルで発現する（図９）。ラ
ット酵素は、発現の間、または培養培地において、本質的により安定であることが可能で
ある。
【００９３】
両方の組換え発現させたエンドマンノシダーゼ酵素は、これらのＣ末端においてプロセ
シングされた。ヒト酵素の場合、Ｃ末端のプロセシングが、完全に現れた（おそらく低い
発現レベルに起因する、５９ｋＤａのバンドから５４ｋＤａの形態への見かけ上全体的な
変換に基づく）。対照的に、ラットアイソフォームの大部分は、５４ｋＤａの形態であっ
たが、いくつかの５９ｋＤａのバンドが残った（実施例７）。同様に、ラットエンドマン
ノシダーゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて発現させた場合、そのタンパク
質は、経時的に、Ｃ末端においてタンパク質分解性にプロセシングされた（Ｓｐｉｒｏ  
１９９７，前出）。さらに、ラット肝臓からのラットアイソフォームのアフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製は、２つの形態（５６ｋＤａおよび６０ｋＤａ）の存在を示
した（Ｈｉｒａｉｚｕｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４６９７−４７００（
１９９４））。一緒に、これらのデータは、ヒトおよびラットのエンドマンノシダーゼタ
ンパク質が、タンパク質分解性のプロセシングに感受性であることを示す。タンパク質分
解後の２つの酵素の同様のサイズに基づいて、切断部位は、同じであるようである。細菌
系、酵母系および哺乳動物系における切断部位が同じであるかどうかが、依然として決定
されるべきである。エンドマンノシダーゼのさらなる特徴は、約ｐＨ６．２にて最適な活
性を示し（実施例９）、そして、約３７℃の最適温度を示す（実施例９）。
【００９４】
ヒトエンドマンノシダーゼの単離および特徴づけ、ならびに、マウスホモログの同定は
、ラットアイソフォームから構成される孤立性メンバーに由来するグリコシダーゼのこの
ファミリーを拡大する。このことは、次いで、本発明者らが、タンパク質の子のファミリ
ーをさらに特徴付けることを可能にした。実際、このことは、本発明者らが、これらのタ
ンパク質のＣ末端配列が高度に保存されている一方で、Ｎ末端構造においてはバリエーシ
ョンが生じることを示すことを可能にした。エンドマンノシダーゼの以前に報告された系
統発生調査は、このタンパク質が、進化の間、最近にだけ出現し、そして、脊索動物門（
哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類および骨性魚類を含む）のメンバーに限定され、唯一の
例外は、これがまた、Ｍｏｌｌｕｓｃａにおいて同定されたことである（Ｄａｉｒａｋｕ
およびＳｐｉｒｏ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５７９−５８６（１９９７））。従
って、タンパク質のこのファミリーのより多様化したメンバーの単離が、エンドマンノシ
ダーゼの構造の、そして、潜在的にはエンドマンノシダーゼの活性のさらなるバリエーシ
ョンを示すことが期待される。
【００９５】
（エンドマンノシダーゼ発現の有用性）
ヒトおよびマウスのエンドマンノシダーゼ酵素または触媒ドメイン（およびこのような
活性をコードする本発明の核酸分子）は、各々、例えば、特定のグリコシル化構造を改変
するため、特に、グルコシル化されたグリカン構造上の少なくとも１つのグルコース残基
、および１つのマンノース残基を含む組成を加水分解するために、有用である（図１およ
び図２）。１つの実施形態において、コードされる酵素は、グリコシル化されたグリカン
前駆体の少なくとも１つのグルコース残基および１つのマンノース残基を含む、二糖、三
糖、または四糖の組成の切断を触媒する（図１）。別の実施形態において、コードされる
酵素はまた、多数のグリコシル化構造（Ｇｌｃ１−３Ｍａｎ９−５ＧｌｃＮＡｃ２を含む
）を改変する（図２）。本発明の１つ以上の核酸および／またはポリペプチドは、選択し
た宿主細胞内に導入され、その宿主細胞により産生される糖タンパク質を改変する。
【００９６】
（インビボにおけるエンドマンノシダーゼの細胞標的化）
グルコシダーゼは、ＥＲにおける高度のマンナングリカンに作用するが、いくつかのマ
ンナンは、適切に修飾されることなくＥＲを逃れ、従って、望ましくなくグリコシル化さ
れたマンナンが、分泌経路を通って移動する。以前の研究は、より高等な真核生物におい
て、グリコシル化マンノース構造の画分は、実際にＥＲの品質制御を迂回し、そして、エ
ンドマンノシダーゼが、その後のコンパートメントに存在し、この画分を回収することを
示唆する。従って、本発明の特徴において、エンドマンノシダーゼは、ＥＲを迂回した、
グリコシル化マンノース構造を修飾する。好ましい実施形態において、本発明の核酸によ
りコードされるエンドマンノシダーゼ酵素は、ゴルジ、トランスゴルジ網、輸送小胞また
はＥＲに局在化する。この酵素は、酵母において、グルコシル化された高度のマンナング
リカンのトリミングに関与する。例えば、ＥＲのグルコシダーゼＩ酵素およびグルコシダ
ーゼＩＩ酵素を迂回した、グリコシル化構造ＧｌｃＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は、エンドマ
ンノシダーゼにより修飾され、ここで、少なくとも１つのグルコース−マンノース残基が
加水分解されて、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を生じる。本発明のエンドマンノシダーゼ酵素
は、ゴルジにおいて品質制御工程として機能し、グリコシル化された高度のマンナングリ
カンを回収し、少なくとも１つのグルコース残基および１つのマンノース残基を含む組成
を除去する。
【００９７】
（エンドマンノシダーゼ触媒ドメインをコードするコンビナトリアル核酸ライブラリー
）
本発明の別の局面において、新規エンドマンノシダーゼタンパク質をコードする１つ以
上のキメラ核酸分子は、例えば、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグ
メントと、エンドマンノシダーゼ酵素をコードするＤＮＡフラグメントもしくはその触媒
活性フラグメントとのインフレームライゲーションによって、エンドマンノシダーゼ酵素
と細胞標的化シグナルペプチドとの間で融合タンパク質を形成することによって、構築さ
れる。好ましくは、１つ以上の融合タンパク質は、エンドマンノシダーゼのコンビナトリ
アルＤＮＡライブラリーの背景において作製される。一般的には、ＷＯ  ０２／００８７
９および米国出願番号１０／３７１，８７７の公報（２００３年２月２０日出願）（この
各々が、その全体において、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。エンド
マンノシダーゼＤＮＡライブラリーは、例えば、ｐＲＣＤ２５９のような組み込み型プラ
スミド（実施例５）を使用することによって、目的の宿主細胞において発現される、広範
種々の融合構築物を含む。
【００９８】
（ペプチド配列サブライブラリーの標的化）
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、トランスゴルジ網内の特定の位置への
タンパク質の局在化を生じる、標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。こ
れらの標的化ペプチドは、遺伝子操作される宿主生物から、そして、他の関連する生物、
または無関係の生物から選択され得る。一般に、このような配列は、以下の３つのカテゴ
リーに分類される：（１）サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）および
ステム領域（ｓｒ）の一部または全てをコードするＮ末端配列（一緒になってか、または
個々に、ゴルジの内側（管腔）膜へとタンパク質を係留する）；（２）ＨＤＥＬテトラペ
プチドまたはＫＤＥＬテトラペプチドのような、Ｃ末端において一般に見出される想起シ
グナル；ならびに（３）ゴルジに局在することが公知の、種々のタンパク質（例えば、ヌ
クレオチド糖トランスポーター）に由来する膜架橋領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎ
ｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）。
【００９９】
標的化ペプチドが種々のエレメント（サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔ
ｍｄ）およびステム領域（ｓｒ））から構成される、第１の場合において、ライブラリー
は、ｃｔ、ｔｍｄおよびステム領域の種々の部分が代表的なものとなるように設計される
。従って、標的化ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実施形態は、ＥＲまたはゴ
ルジの膜結合タンパク質に由来するｃｔ、ｔｍｄおよび／またはｓｒの配列を含む。いく
つかの場合、可変長のｓｒ配列を含むサブライブラリーを提供することが望ましくあり得
る。このことは、サイトゾル領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するプライマーを
使用し、ステム領域の種々の部分に結合する一連の対抗するプライマーを採用するＰＣＲ
によって達成され得る。
【０１００】
標的化ペプチド配列のなお他の有用な供給源としては、ＥＲまたはゴルジへと逆方向に
輸送される、タンパク質のＣ末端において代表的に見出される、ペプチドの想起シグナル
（例えば、テトラペプチドＨＤＥＬまたはＫＤＥＬ）が挙げられる。標的化ペプチド配列
のなお他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）最適ｐＨを有する酵素、
（ｃ）ゴルジに局在する膜架橋ヌクレオチド糖トランスポーター、および（ｄ）表１にお
いて参照される配列、が挙げられる。
【０１０１】
（表１）
【０１０２】
【表１−１】
2010187693.tif 000002
【０１０３】
【表１−２】
2010187693.tif 000003
（エンドマンノシダーゼ融合構築物）
プラスミドに挿入される本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するエン
ドマンノシダーゼ融合構築物の代表例は、プライマー（配列番号５および配列番号６）か
ら構築される短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１１（ｍ）標的化ペプチド（Ｓ
ｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ４６９８５からのＭＮＮ１１のヌクレオチド１〜３０３）を含み、
ラットのエンド−α１，２−マンノシダーゼの４８Ｎ末端アミノ酸欠失（Ｇｅｎｂａｎｋ
ＡＦ  ０２３６５７）にインフレームで連結された、ｐＳＨ２８０である。従って、本
明細書中で使用される命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域
を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１１（ｍ）／ラットエンドマンノシダーゼΔ４
８と呼ぶ。コードされる融合タンパク質は、そのエンドマンノシダーゼ触媒ドメイン活性
を保持しつつ、ＭＮＮ１１標的化ペプチド配列によってゴルジに局在し、より下等な真核
生物においてＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２のようなグリコシル化されていないＮ−グリカンを
生成し得る。ｐＳＨ２８０で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ２５の株（ｏ
ｃｈ１  ａｌｇ３）において発現されるレポーター糖タンパク質Ｋ３に由来するグリカン
プロフィールは、とりわけ、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１０９９ｍ／ｚ［
ｃ］、およびヘキソース６の質量に対応する１４２４ｍ／ｚ［ａ］にピークを示す（図１
０Ｂ；実施例１１および実施例１２を参照のこと）。ＹＳＨ９７と命名されたこの新しい
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、グリコシル化されたヘキソース６の構造がレポーター糖タン
パク質から除去される程度によって証明される、約９５％より高いエンドマンノシダーゼ
活性を示す。
【０１０４】
宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ２５）において発現されるヘキソー
ス６［ａ］の構造は、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２なら
びにその異性体を含む、グリカンの混合物を含む（図１０Ａ）。本発明のエンドマンノシ
ダーゼを宿主細胞において導入および発現させることによって、少なくとも１つのグルコ
ース残基およびマンノース残基を含む組成が、ヘキソース６構造から除去される（図１０
Ｂ）。グリコシル化された構造ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、容易にＭａｎ４Ｇｌｃ
ＮＡｃ２に変換され、次いで、その後、α１，２−マンノシダーゼのインビトロ消化によ
りＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換される。グリコシル化マンナンを含むヘキソース６種は
、α１，２−マンノシダーゼにより切断されない。α１，２−マンノシダーゼ消化後に示
される構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］に対応する優性ピークは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡ
ｃ２を生成する加水分解のために、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に末端Ｍａｎα１，２を露出
するＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からの、グルコース−マンノース二量体の見かけ上の
除去を確認する。
【０１０５】
ヘキソース６の他の種であるＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２は、本発明のエンドマンノシダー
ゼにより容易には影響を受けず、従って、グリコシル化されていない構造として意図され
る。ヘキソース６のこの種であるＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２が、Ｍａｎα１，２付加を含み
、このことは、その後のα１，２−マンノシダーゼのインビトロ消化が、Ｍａｎ３Ｇｌｃ
ＮＡｃ２を生成する（図１０Ｃ）ことによって証明されることを、当業者は理解する。
【０１０６】
プラスミドに挿入される、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するエ
ンドマンノシダーゼ融合構築物の別の例は、プライマー（配列番号７および配列番号８）
から構築される短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド（Ｓ
ｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ２３６４２からのＶＡＮ１のヌクレオチド１〜２７９）であり、ラ
ットのエンド−α１，２−マンノシダーゼの４８Ｎ末端アミノ酸欠失（Ｇｅｎｂａｎｋ  
ＡＦ  ０２３６５７）にインフレームで連結された、ｐＳＨ２７９である。従って、本明
細書中で使用される命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域を
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１（ｓ）／ラットエンドマンノシダーゼΔ４８と
呼ぶ。コードされる融合タンパク質は、そのエンドマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保
持しつつ、ＶＡＮ１標的化ペプチド配列によってゴルジに局在し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
（ＲＤＰ２５）においてＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ−グリカンを生成し得る。ｐ
ＳＨ２７９で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ２５の株（ｏｃｈ１  ａｌｇ
３）において発現されるレポーター糖タンパク質Ｋ３に由来するグリカンプロフィールは
、とりわけ、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１１１６ｍ／ｚ［ｃ］、およびヘ
キソース６の質量に対応する１４４１ｍ／ｚ［ａ］にピークを示す（図１１；実施例１１
および実施例１２を参照のこと）。図１１Ｂは、エンドマンノシダーゼの部分的な活性の
みを示す残存のヘキソース６［ａ］のピークを示す。ＹＳＨ９６と命名されたこの株は、
グリコシル化されたヘキソース６の構造がレポーター糖タンパク質から除去される程度に
よって証明される、約４０％より高いエンドマンノシダーゼ活性を示す。
【０１０７】
宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ２５）において発現されるヘキソー
ス６［ａ］の構造は、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２なら
びにその異性体を含むグリカンの混合物を含む（図１１Ａ）。宿主細胞における本発明の
エンドマンノシダーゼの導入および発現によって、少なくとも１つのグルコース残基およ
びマンノース残基を含む組成物は、ヘキソース６構造から除去される（図１１Ｂ）。イン
ビトロ消化において、このグルコシル化構造ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｍａｎ４
ＧｌｃＮＡｃ２に容易に変換され、これは次いで、α１，２−マンノシダーゼによりＭａ
ｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に続いて変換される。グルコシル化マンナンを含むヘキソース６種は
、α１，２−マンノシダーゼによって切断されない。α１，２−マンノシダーゼ消化後に
示される構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］（図１１Ｃ）に対応する顕著なピークは、Ｍ
ａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する加水分解について、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２上の末端Ｍ
ａｎα１，２を露出するＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からのグルコース−マンノースダ
イマーの明らかな除去を確認する。
【０１０８】
ヘキソース６の他の種：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２は、本発明のエンドマンノシダーゼに
よって容易に影響を受けず、従って、非グルコシル化構造と考察される。当業者は、この
ヘキソース６：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２の種は、Ｍａｎα１，２付加物を含むと理解する
。これは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生する、その後のα１，２−マンノシダーゼイン
ビトロ消化によって証明される（図１１Ｃ）。
【０１０９】
さらに、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来する明らかな触媒活性を
示さないプラスミドに挿入される、エンドマンノシダーゼ融合構築物の一例は、ｐＳＨ２
７８プライマー（配列番号９および配列番号１０）から構築された短縮型Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ  ＧＬＳｌ（ｓ）ターゲッティングペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ５３
００８由来のＧＬＳｌの１〜１０２ヌクレオチド））（ラットエンド−α１，２−マンノ
シダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ  ０２３６５７）の４８Ｎ−末端アミノ酸欠失にインフ
レームで連結される）である。従って、本明細書中で使用される名称は、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ  ＧＬＳｌ（ｓ）／ラットエンドマンノシダーゼΔ４８としてのグリコシル
化酵素のターゲッティングペプチド／触媒ドメイン領域をいう。ｐＳＨ２７８で形質転換
されたＰ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈｌ  ａｌｇ３）の株で発現されるレ
ポーター糖タンパク質Ｋ３由来のグリカンプロファイルは、ヘキソース６［ａ］の質量に
対応する、とりわけ、１４３９ｍ／ｚ（Ｋ＋付加物）［ｃ］にあるピーク、および１４２
２  ｍ／ｚ（Ｎａ＋付加物）にあるピークを示す（図１２；実施例１１および１２）。こ
の株（ＹＳＨ９５と命名される）は、グルコシル化ヘキソース６構造がレポーター糖タン
パク質から除去された程度によって明らかなように、約１０％未満のエンドマンノシダー
ゼ活性を示す。
【０１１０】
図１０および図１１に示される前の２つのグリカンプロファイルと異なり、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ２５で発現されるエンドマンノシダーゼ構築物ｐＳＨ２７８は、比較
的低いエンドマンノシダーゼ活性を示す（図１２）。しかし、α１，２マンノシダーゼで
の続いての消化は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  ［ｂ］の質量に対応するピークを示す。Ｍ
ａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２を含むヘキソース６種は、α１，２マンノシダーゼの導入によって
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されたが、他方、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含む他
のヘキソース６種は、なお存在し、これは、実質的に、さらにグリコシル化されると、当
業者は理解する。
【０１１１】
本発明に従うこれらのこのようなエンドマンノシダーゼ融合構築物および他のこのよう
なエンドマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製するこ
とによって、当業者は、最適細胞内エンドマンノシダーゼ切り出し活性を有するこれらの
構築物と比較的低い活性を有するかまたは活性を有さない構築物とを区別し得、そして比
較的低い活性を有するかまたは活性を有さない構築物から最適細胞内エンドマンノシダー
ゼ切り出し活性を有するこれらの構築物を選択し得る。本発明のコンビナトリアルＤＮＡ
ライブラリーを使用する方法は有用である。なぜなら、選り抜きのいくつかのエンドマン
ノシダーゼ融合構築物だけが、インビボで特に望ましいＮ−グリカンを産生し得るからで
ある。さらに、エンドマンノシダーゼ切り出し活性は、目的とする特定のタンパク質に特
異的であり得る。従って、ターゲッティングペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合
構築物の全てが、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を良好に引き起こすように
同等に機能し得るわけではないことがさらに理解されるべきである。従って、目的のタン
パク質は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーで形質転換された宿主細胞に導入され、
この目的のタンパク質に最適なマンノシダーゼ活性を発現する１つ以上の融合構築物を同
定し得る。当業者は、本明細書中で記載されるコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプ
ローチを使用して、最適な融合構築物を産生または選択し得る。
【０１１２】
さらに、局在化活性エンドマンノシダーゼ触媒ドメインを示す他のこのような融合構築
物は、ＷＯ  ０２／００８７９に例示された技術および本明細書中で記載される技術のよ
うな技術を使用して作製され得ることが明らかである。当業者にとって、本発明のコンビ
ナトリアルＤＮＡライブラリーを作製および使用して、特定の宿主細胞に導入された特定
の発現ベクター中の融合構築物のライブラリー由来の非グルコシル化Ｎ−グリカン（例え
ば、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２）産生を最適化することは、慣用実験法にすぎない。
【０１１３】
（エンドマンノシダーゼをコードする遺伝子の組換え発現）
本発明の別の特徴は、エンドマンノシダーゼをコードする核酸配列の組換え発現である
。この核酸配列は、適切な発現ベクター中の発現コントロール配列に作動可能に連結され
、そして適切な宿主細胞において形質転換される（実施例３）。当該分野で容易に利用可
能な広範な種々の適切なベクターは、種々の宿主細胞において本発明の融合構築物を発現
するために使用される。ベクターｐＳＨ２７８、ベクターｐＳＨ２７９およびベクターｐ
ＳＨ２８０（実施例４）は、下等真核生物Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるエン
ドマンノシダーゼ活性の発現に適切な、本明細書中で記載される選り抜きのいくつかの例
である。選択された宿主細胞におけるエンドマンノシダーゼ活性の発現に適切な広範な種
々のベクターは、本発明内に包含されることが理解されるべきである。
【０１１４】
本発明の１つの局面において、グルコシル化高マンノース構造を産生する下等真核生物
宿主細胞は、本発明のエンドマンノシダーゼの導入および発現によって改変される。例え
ば、ヘキソース６を産生する宿主細胞Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ２５（ｏｃｈｌ  ａ
ｌｇ３）は、本発明のエンドマンノシダーゼの導入および発現によって改変される。本発
明の宿主細胞は、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に変換する修
飾されたグリカンを産生する。従って、１つの実施形態において、本発明のエンドマンノ
シダーゼを発現する下等真核生物宿主細胞は、少なくとも１つのグルコース残基およびマ
ンノース残基を含む分子の除去を触媒する。
【０１１５】
本発明のエンドマンノシダーゼをコードする組換え核酸分子の活性が、本明細書中で記
載される。変動される発現レベルは、グルコシル化グリカンＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ
２の脱グルコシル化グリカンＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２への変換によって定量される。１つ
の実施形態において、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２への変換
は、部分的である（図１０、図１１）。
【０１１６】
別の実施形態において、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２への
変換は、全体的である。好ましい実施形態において、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の少
なくとも３０％が、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に変換される。より好ましい実施形態におい
て、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の少なくとも６０％が、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に変
換される。なおより好ましい実施形態において、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の少なく
とも９０％が、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に変換される。さらに、グルコースを含む他のグ
リカンが、本発明のエンドマンノシダーゼによって除去されることが予測される。例えば
、本発明のエンドマンノシダーゼは、グリカンＧｌｃｌ〜３Ｍａｎ９〜５ＧｌｃＮＡｃ２
をＭａｎ８〜４ＧｌｃＮＡｃ２に切断する活性をさらに含む。
【０１１７】
さらに、触媒的に活性なエンドマンノシダーゼをコードする遺伝子は、目的のタンパク
質上でのグリコシル化を改変する下等真核生物宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）において発現される。１つの実施形態において、本発明のエンドマンノシダ
ーゼは、目的のタンパク質上でグルコシル化Ｎ結合オリゴ糖を修飾する。その結果生じる
タンパク質は、よりヒト様の糖タンパク質を産生する。本発明のエンドマンノシダーゼに
よって改変される下等真核生物宿主細胞は、目的のタンパク質上でグルコシル化糖形態か
らＭａｎ８〜４ＧｌｃＮＡｃ２を産生する（図２）。例えば、本発明のエンドマンノシダ
ーゼによって改変されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株は、目的のタンパク質上でＭａｎ４Ｇ
ｌｃＮＡｃ２糖形態を産生し、そしてグルコシル化ヘキソース６糖形態の実体を減少させ
る（図１０Ｂ）。Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２糖形態の続いてのα１，２−マンノシダーゼ消
化は、トリマンノシルコアをもたらす（図１０Ｃ）。従って、本発明は、目的の治療用タ
ンパク質上でグルコシル化糖形態を所望の糖形態に変換する下等真核生物宿主細胞におけ
る触媒的に活性なエンドマンノシダーゼを提供する。
【０１１８】
治療用タンパク質は、代表的には、注射によって、経口的に、肺に、または他の手段に
よって投与される。本発明に従って産生され得る適切な標的糖タンパク質の例としては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：エリスロポイエチン、サイトカイン（例え
ば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロン
ω）、および顆粒球ＣＳＦ、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子）、および
ヒトタンパク質Ｃ、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ
、インターロイキン、ウロキナーゼ、カイメース（ｃｈｙｍａｓｅ）、ならびに尿素トリ
プシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ア
ネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子２、骨髄前駆体抑制因
子１、オステオプロテゲリン、α−１−抗トリプシンならびにα−フェトプロテイン、Ａ
ＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ｏｎｅｒｃｅｐｔ、ＴＮＦ結合タンパク質１としても公知）、Ｔ
ＡＣＩ−Ｉｇ  （膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびサイクロ
フィリンリガンドインテラクター）、ＦＳＨ（濾胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣ
ありまたはなしのＧＬＰ−１（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１レセプターアゴニス
ト、ｓＴＮＦｒ（ｅｎｂｒｅｌ、可溶性ＴＮＦレセプターＦｃ融合物としても公知）ＡＴ
ＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼならびにＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害
性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）。
【０１１９】
（プロモーター）
本発明の別の局面において、ラット肝臓エンドマンノシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｇｉ
：２６４２１８６）、ヒトエンドマンノシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｇｉ：２０５４７４
４２）またはマウスマンノシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＫ０３０１４１）は、構成プロ
モーターの制御下で酵母組込みプラスミドにクローン化され、細胞に対する副作用を制限
すると同時にエンドマンノシダーゼ活性の量を最適化する。これは、プロモーター強度を
改変（ａｌｔｅｒ）する工程を包含し、そして必要に応じて、これらのタンパク質の発現
をより良好に制御するために誘発性プロモーターを使用する工程を包含する。
【０１２０】
野生型エンドマンノシダーゼを発現する工程に加えて、エンドマンノシダーゼの改変さ
れた形態が、細胞の局在化および活性を高めるために発現される。エンドマンノシダーゼ
の触媒的ドメインの変動する長さは、ＷＯ  ０２／００８７９に記載されるような内因性
酵素ターゲッティング領域に融合される。エンドマンノシダーゼ遺伝子をコードする触媒
的に活性なフラグメントは、構成プロモーターの制御下で、酵母組込みプラスミドにクロ
ーン化される。これは、プロモーター強度を改変（ａｌｔｅｒ）する工程を包含し、そし
てこれらのタンパク質の発現をより良好に制御するために誘発性プロモーターを使用する
工程を包含し得る。さらに、酵素活性を高めるために、上記タンパク質は、新たな特性を
生じるように変異される。当業者は、本明細書中で開示される手順の慣用改変法は、目的
の非グルコシル化糖タンパク質の産生において向上された結果を提供し得ると理解する。
【０１２１】
（コドン最適化）
本発明の核酸は、一次アミノ酸配列の１つ以上の変化（例えば、保存的アミノ酸の置換
、付加、欠失またはこれらの組み合わせ）をもたらすのを最適化されたコドンであり得る
こともまた、検討される。
【０１２２】
（分泌エンドマンノシダーゼ）
本発明の別の特徴において、可溶性分泌エンドマンノシダーゼは、宿主細胞において発
現される。好ましい実施形態において、可溶性マウスエンドマンノシダーゼまたは可溶性
ヒトエンドマンノシダーゼは、組み換え的に発現される。可溶性エンドマンノシダーゼは
、ゴルジ装置に正常に局在化するかまたは細胞膜に結合する、細胞局在化シグナルを欠損
する。可溶性組換え酵素（これは、膜貫通ドメインを欠損する）を産生するエンドマンノ
シダーゼの触媒的ドメインの発現は、インフレームで、第２ドメインに融合し得るか、ま
たはその精製を促進するタグに融合し得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の本発明の分泌ラ
ットエンドマンノシダーゼおよびヒトエンドマンノシダーゼは、図９に示される（実施例
８）。
【０１２３】
発現されたエンドマンノシダーゼは、特に、グルコシル化グリカン構造のインビトロ改
変に有用である。より好ましい実施形態において、上記組換えエンドマンノシダーゼは、
大規模糖タンパク質産生において非グルコシル化グリカン中間体を産生するために使用さ
れる。図１３は、グリカン中間体ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２上のグルコース−α１，
３−マンノースダイマーを切断し、これをＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に変換した、ラットエ
ンドマンノシダーゼ（図１３Ｂ）およびヒトエンドマンノシダーゼ（図１３Ｃ）の活性を
示す（図１４を参照のこと）。従って、本発明のエンドマンノシダーゼは、グルコシル化
グリカンをインビトロで改変（ｍｏｄｉｆｙ）するために使用される。さらに、このよう
な可溶性エンドマンノシダーゼは、当該分野で周知の方法に従って精製される。
【０１２４】
分泌エンドマンノシダーゼは、オリゴ糖上の少なくとも１つのグルコース残基および１
つのマンノース残基を加水分解することによって、グルコシル化構造（例えば、ＧｌｃＭ
ａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）（図１４（ｉ））を脱グルコシル化構造（例えば、Ｍａｎ４Ｇｌ
ｃＮＡｃ２）（図１４（ｉｉ））に変換する。例えば、グルコース−α１，３−マンノー
スダイマーは、図１４に示されるように、エンドマンノシダーゼによってグルコシル化オ
リゴ糖から切断される。続いてのα１，２−マンノシダーゼ消化（図１４（ｉｉｉ））は
、トリマンノシルコア上にさらなるＭａｎα１，２を示す構造：Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
をもたらす。
【０１２５】
（宿主細胞）
多くの宿主細胞は、本発明のエンドマンノシダーゼを発現するために使用され得る。例
えば、上記エンドマンノシダーゼは、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵
母細胞、藻細胞または細菌細胞において発現され得る。目的のタンパク質上でのグルコシ
ル化の改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）については、好ましい宿主細胞は、Ｇｌｃｌ〜
３Ｍａｎ９〜５ＧｌｃＮＡｃ２構造を産生する下等真核生物である。さらに、グルコシル
化グリカンの混合物を産生する他の宿主細胞が、選択される。例えば、非グルコシル化構
造（例えば、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２およびその異性体）に加えてグルコシル化構造（例
えば、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を産生する宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ  ＲＤＰ２５）が、選択される。
【０１２６】
好ましくは、下等真核生物宿主細胞は、以下からなる群より選択される：Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｒａｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈ
ａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａ
ｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏ
ｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ
、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅ
ｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃ
ｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎ
ｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅ
ｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ。
【０１２７】
他の宿主としては、培養中の、周知の真核生物宿主および原核生物宿主（例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの株
）、ならびに動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ；例えば、αグル
コシダーゼＩ欠損株Ｌｅｃ−２３）、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞およびＬ−Ｍ細胞、アフ
リカミドリザル腎細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ−７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およ
びＢＭＴ１０））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、およびヒト細胞（例えば、ＨｅｐＧ２
））ならびに植物細胞が挙げられ得る。
【０１２８】
（グルコシル化Ｎ−グリカンを改変するための方法）
本発明の別の局面において、本発明のエンドマンノシダーゼを導入および発現すること
によってグルコシル化グリカンを改変するための方法が、本明細書中で提供される。図１
は、強調されるように、モノグルコシル化グリカン、ジグルコシル化グリカン、およびト
リグルコシル化グリカンのエンドマンノシダーゼ切断（第２のグルコース残基および第３
のグルコース残基によって表される）を示す。従って、本発明のエンドマンノシダーゼ酵
素は、脱グルコシル化の効率を高めるために宿主（例えば、酵母）のゴルジに導入され、
従って、さらなる糖の付加の前にマンナン構造の続いての切り出しを高め、よりヒト様の
Ｎ結合型グルコシル化構造を産生する（図２）。
【０１２９】
本発明のさらなる局面において、エンドマンノシダーゼのゴルジへの導入（例えば、酵
母）は、ゴルジの中に入り、従って、もはやＥＲグルコシダーゼＩ酵素およびＥＲグルコ
シダーゼＩＩ酵素が接近可能でないグルコシル化糖タンパク質を回収する方法を提供する
。本発明のエンドマンノシダーゼは、図２に示されるように４つのマンノース残基によっ
て強調されるこのようなグルコシル化構造を、プロセシングし得る（例えば、Ｇｌｃ１〜
３Ｍａｎ９〜５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ８〜４ＧｌｃＮＡｃ２に）。従って、本発明は、
回収されたグルコシル化オリゴ糖が脱グルコシル化される品質管理機構を提供する。
【０１３０】
さらに、エンドマンノシダーゼの使用は、グリカン切り出しの初期工程に必要とされる
グルコシダーゼＩ酵素およびグルコシダーゼＩＩ酵素についての必要性を取り除くことが
企図される。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、グルコシダーゼＩ活性およ
び／またはグルコシダーゼＩＩ活性が欠乏し得る。グルコシダーゼＩ活性またはグルコシ
ダーゼＩＩ活性の非存在下では、本発明の宿主細胞は、エンドマンノシダーゼによるグル
コース触媒活性をさらに示し得る。従って、エンドマンノシダーゼをコードする核酸を宿
主（例えば、酵母）に導入し、発現の際に、ゴルジ中に入ったグルコシル化糖タンパク質
（これは、もはやＥＲグルコシダーゼＩ酵素およびＥＲグルコシダーゼＩＩ酵素に接近可
能でない）を改変する方法が、本明細書中で提供される。好ましくは、本発明の酵素をコ
ードする核酸は、オリゴ糖に結合された少なくとも１つのグルコース残基および１つのマ
ンノース残基を含む組成物を切断する（図２）。より好ましくは、Ｇｌｃα１，３Ｍａｎ
ダイマー、Ｇｌｃ２α１，３ＭａｎトリマーまたはＧｌｃ３α１，３Ｍａｎテトラマーは
、本発明の方法に従って切断される。
【０１３１】
当業者にとって、本明細書中に開示される方法を使用して、特定の発現ベクターおよび
宿主細胞株において、選択された融合構築物を使用して脱グルコシル化グリカン（例えば
、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２）の産生を最適化することは、慣用実験事項にすぎない。従っ
て、慣用改変物が、本発明のエンドマンノシダーゼを発現する下等真核生物宿主細胞にお
いて作製され得、これは、グルコシル化グリカンを脱グルコシル化グリカン（例えば、Ｍ
ａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２）に変換し、続いて、治療用糖タンパク質の製造のための所望の中
間体に変換する。
【０１３２】
（宿主細胞中への他のグリコシル化酵素の導入）
さらに、一組の改変されたグリコシル化酵素が、細胞の局在化、および目的の糖タンパ
ク質を産生する活性を高めるために宿主細胞に導入される。これは、変動する長さの触媒
的ドメインの、酵母内因性ターゲッティング領域への融合を包含する（ＷＯ  ０２／００
８７９に記載されるような）。１つの実施形態において、宿主細胞Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＹＳＨ９７（ｏｃｈ１  ａｌｇ３エンドマンノシダーゼ）は、グリコシル化酵素または
その触媒的に活性なフラグメント（α１，２−マンノシダーゼＩおよびα１，２−マンノ
シダーゼＩＩ、ＧｎＴ  Ｉ（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ）、Ｇｎ
Ｔ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼならびにフコシルトランスフェラーゼか
らなる群より選択される）の導入および発現によって改変される。同様に、酵素のそれぞ
れの輸送体およびこれらの基質（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭ
Ｐ−ＮＡＮＡ）は、宿主細胞に導入され、そしてこの宿主細胞で発現される。ＷＯ  ０２
／００８７９を参照のこと。
【０１３３】
（エンドマンノシダーゼの最適ｐＨ）
本発明の別の局面において、コードされたエンドマンノシダーゼは、約５．０と約８．
５との間に、好ましくは約５．２と約７．２との間に、より好ましくは約６．２に、最適
ｐＨを有する。別の実施形態において、上記コードされた酵素は、小胞体、ゴルジ装置も
しくはＥＲ間の輸送小胞、ゴルジもしくは宿主生物体のトランスゴルジ網に標的化され、
ここで、このコードされた酵素は、オリゴ糖上に存在するグルコシル化構造を除去する。
図１５は、ヒトエンドマンノシダーゼ（配列番号２）の最適ｐＨプロファイルを示す（実
施例９）。
【０１３４】
以下は、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定
するように解釈されるべきでなく：この実施例は、例示のみの目的で包含される。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１：株、培養条件、および試薬）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＴＯＰ１０またはＤＨ５αを、組換えＤＮＡ研究
のために使用した。酵母株におけるタンパク質発現を、室温で、増殖培地として１％酵母
抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％酵
母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロールを含む、緩衝化グリセロ
ール複合培地（ＢＭＧＹ）を備える９６ウェルプレート形式で行った。誘発培地は、ＢＭ
ＧＹ中のグリセロールの代わりに１．５％メタノールを含む、緩衝化メタノール天然培地
（ＢＭＭＹ）であった。最小培地は、１．４％酵母窒素塩基、２％デキストロース、１．
５％寒天および４×１０−５％ビオチン、ならびに適切に補充されたアミノ酸である。制
限酵素および修飾酵素を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）から得た。オリゴヌクレオチドを、Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃｏｒ
ｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＨ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から得た。ＭＯＰＳ、カコジ
ル酸ナトリウム、塩化マンガンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯから得た。酵素Ｎ−グリコシダーゼＦ、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖を、Ｇｌｙ
ｋｏ（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）から得た。ＤＥＡＥ  ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂を、
ＴｏｓｏＨａａｓから得た。金属キレート「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂を、Ｎｏｖａｇｅｎ（
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。９６ウェル溶解物清浄化プレート（ｌｙｓａｔｅ−ｃ
ｌｅａｒｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。
タンパク質結合９６ウェルプレートを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）か
ら得た。塩および緩衝剤を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ＭＡＬＤ
Ｉマトリックスを、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得た。
【０１３６】
（実施例２：ヒトエンドマンノシダーゼおよびマウスエンドマンノシダーゼのクローニ
ング）
ポジティブコントロールとして、本発明者らは、特異的プライマー：
【０１３７】
【数１】
2010187693.tif 000004
を使用してラットマンノシダーゼ遺伝子の推定触媒ドメインに相同な領域を増幅し、そし
て、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、生じた領域を酵母組込みプラスミドにサブク
ローン化した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
．およびこの中で記載される参考文献（全てが参考として援用される）を参照のこと；実
施例３もまた参照のこと）。
【０１３８】
ヒトエンドマンノシダーゼのＯＲＦ配列を同定し、そしてヒトエンドマンノシダーゼの
ＯＲＦを単離するために、本発明者らは、ラットエンドマンノシダーゼタンパク質配列（
Ｇｅｎｂａｎｋ  ｇｉ：２６４２１８７）を使用してタンパク質ＢＬＡＳＴ検索を行い、
そして、ラットＯＲＦのアミノ酸１６２〜４５１に対して８８％の同一性および９４％の
類似性を示す、２９０アミノ酸長の仮想ヒトタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｇｉ：２０５
４７４４２）を同定した（図３Ａ）。このヒト配列のＤＮＡ５’末端を、翻訳ＢＬＡＳＴ
を使用して分析し、そして検索配列の最初の２２個のアミノ酸にわたって９５％の同一性
を保有したが、その後停止コドンで終結する別の仮想ヒトタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ  
ｇｉ：１８０３１８７８）を同定した（図３Ｂ）。この第２の配列のリーディングフレー
ム分析は、１７２個のアミノ酸が、相同領域の上流でインフレームであったと示した（図
３Ｃ）。これらの５’領域および３’領域の両方を組み合わせることにより、４６２個の
アミノ酸および５４ｋＤａの推定分子量のＯＲＦを有する推定配列（図４）を生じた。
【０１３９】
２つのヒト配列が１つの完全なＯＲＦであることを確認するために、本発明者らは、ｇ
ｉ：１８０３１８７７  ＯＲＦの５’末端に特異的なプライマーおよびｇｉ：２０５４７
４４１  ＯＲＦの３’末端に特異的なプライマー：
【０１４０】
【数２】
2010187693.tif 000005
を設計した。これらのプライマーを使用し、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を製造者に推奨されるように、サイク
ル条件：９５℃で１分、１サイクル：９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２．
５分間、３０サイクル；７２℃で５分間、１サイクル下で使用して、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）由来の１３８９ｂｐフラグメントを増幅
した。産生されたＤＮＡフラグメントを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと一緒に、１０分
間６８℃でインキュベートし、そしてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）にＴＯＰＯクローン化した。ＡＢＩ  ＤＮＡ配列決定により、ＢＬＡＳＴ
検索によって同定されたヒト配列の両方が、１つの完全なＯＲＦを産生したと確認され、
この確認された構築物を、ｐＳＨ１３１と命名した。
【０１４１】
マウス由来のエンドマンノシダーゼ遺伝子は、同様に増幅および単離され得る（また、
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，Ｉｎｎｉｓ
ら（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  
ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
，ＮＹおよびこれらの中に記載される参考文献（全てが参考として援用される）を参照の
こと）。プライマー：
【０１４２】
【数３】
2010187693.tif 000006
を使用し、マウス全長エンドマンノシダーゼオープンリーディングフレームを産生する。
【０１４３】
（実施例３：組換えエンドマンノシダーゼ構築物の作製および発現）
ヒトエンドマンノシダーゼの酵母分泌形態を産生するために、推定触媒ドメインをコー
ドする領域を、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で製造者により推奨されるように発現させた。手短に言うと、Ｐ
ＣＲを使用し、プライマーｈＥｎｄｏΔ５９順方向およびプライマーｈＥｎｄｏΔ停止逆
方向：
【０１４４】
【数４】
2010187693.tif 000007
を使用して、ｐＳＨ１３１から１７８〜１３８６塩基のＯＲＦフラグメントを増幅した。
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏを用いて使用した条件は、以下であった：９５℃で１分間、１サイク
ル；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間、２５サイクル；７２℃で３
分間、１サイクル。この産物を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと一緒にインキュベートし
、上記のようにＴＯＰＯクローン化およびＡＢＩ配列決定を行った。得られたクローンを
、ｐＳＨ１７８と命名した。この構築物から、ヒトエンドマンノシダーゼフラグメントを
、ＥｃｏＲＩでの消化によって切り出し、そして同じ酵素で消化されたｐＰｉｃＺαＡ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化し、ｐＡＷ１０５を
産生した。この構築物を、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に付属のＰｉｃｈｉａ  ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ酵母株ＧＳ１１５に形質転換し、株ＹＳＨ１６を産生した。続いて、キット
製造者により推奨されるように、この株をＢＭＧＹにおいてＯＤ６００＝２まで増殖させ
、そしてＢＭＭＹにおいて、４８時間３０℃で誘導した。
【０１４５】
単離されたＯＲＦがエンドマンノシダーゼであることを確認するために、以前に報告さ
れたラット肝臓エンドマンノシダーゼを、０平行してポジティブコントロールとして増幅
および発現させた。手短に言うと、ラットエンドマンノシダーゼのアミノ酸４９〜４５１
をコードするフラグメント（推定触媒ドメインに対応する）を、上のヒトエンドマンノシ
ダーゼについて記載された条件と同じ条件を使用して、ラット肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）から増幅した。使用したプライマーは、ｒＥｎｄｏ  Δ４８順方向およびｒＥｎ
ｄｏ  Δ停止逆方向
【０１４６】
【数５】
2010187693.tif 000008
であった。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定をし、そして得られ
た構築物をｐＳＨ１７９と命名した。続いて、このラットエンドマンノシダーゼを、上記
のように、ｐＰｉｃＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブク
ローン化し、そしてＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にお
いて発現させ、ｐＡＷ１０６およびＹＳＨ１３を産生した。
【０１４７】
Ｎ末端型タグ組換えヒトエンドマンノシダーゼおよびＮ末端型タグ組換えラットエンド
マンノシダーゼについて、以下の通り、ダブルＦＬＡＧタグをα接合因子のＫｅｘ２切断
部位に対して３’側に操作し、そしてｐＰｉｃＺαＡでのエンドマンノシダーゼクローニ
ングに使用したＥｃｏＲＩ制限に対して５’側に操作した。手短に言うと、リン酸化オリ
ゴヌクレオチドのＦＬＡＧタグ順方向およびＦＬＡＧタグ逆方向
【０１４８】
【数６】
2010187693.tif 000009
を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（前出）に記載されるようにアニーリングし、Ｅｃ
ｏＲＩで消化されたｐＰｉｃＺαＡに連結し、そして子ウシアルカリホスファターゼで脱
リン酸化した。２つのタンデムＦＬＡＧタグを正しい配向で含む構築物を、ｐＳＨ２４１
と命名した。続いて、ラットエンドマンノシダーゼおよびヒトエンドマンノシダーゼを、
ｐＳＨ１７９およびｐＳＨ１７８からＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＳＨ２４１に連結し
、同じ酵素で消化した。得られたラットエンドマンノシダーゼ構築物およびヒトエンドマ
ンノシダーゼ構築物を、ｐＳＨ２４５およびｐＳＨ２４６とそれぞれ命名した。これらの
構築物のＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への形質転換は
、株ＹＳＨ８９および株ＹＳＨ９０をそれぞれ産生した。これらの株におけるエンドマン
ノシダーゼ活性の発現を、上記のように研究した。
【０１４９】
（実施例４：ラットエンドマンノシダーゼのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現）
ラットエンドマンノシダーゼの触媒ドメインを、プライマーのラットエンドマンノシダ
ーゼΔ４８ＡｓｃＩおよびｒＥｎｄｏ  ＰａｃＩ：
【０１５０】
【数７】
2010187693.tif 000010
を使用してｐＳＨ１７９から増幅した。これらのプライマーを使用し、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂ
ｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者に推奨されるようにサイクル
条件：９５℃で１分、１サイクル：９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２．５
分間、３０サイクル；７２℃で５分間、１サイクル下で使用して、１２１２ｂｐフラグメ
ントをｐＳＨ１７９から増幅した。産生されたＤＮＡフラグメントを、Ｔａｑ  ＤＮＡポ
リメラーゼと共に、１０分間６８℃でインキュベートし、そしてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にＴＯＰＯクローン化した。ＡＢＩ  ＤＮＡ配
列決定により、ＢＬＡＳＴ検索によって同定されたヒト配列の両方が、１つの完全なＯＲ
Ｆを産生したことを確認した。この確認された構築物を、ｐＳＨ２２３と命名した。続い
て、ラットエンドマンノシダーゼフラグメントを、この構築物から消化し、そして酵母発
現ベクターｐＲＣＤ２５９に連結し、構築物ｐＳＨ２２９を与えた。この発現構築物は、
以下を含み、細菌の複製を促進する：ハイグロマイシン選択マーカー；ＧＡＰＤＨプロモ
ーターおよびＣＹＣ１ターミネーター（これらの２つの領域の間に位置したクローニング
部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを有する）；ＵＲＡ３ターゲッティング組込み領
域；ならびにｐＵＣ１９プラスミドのフラグメント。
【０１５１】
（実施例５：発現ベクターおよび組込み）
酵母においてラットエンドマンノシダーゼタンパク質を発現するために、触媒ドメイン
をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＳＨ２２９を産生する発現ベクターｐＲＣＤ２５９
にクローン化した（実施例４を参照のこと）。続いて、Ｇｌｓ１（ｓ）リーダー、Ｖａｎ
１（ｓ）リーダーおよびＭｎｎ１１（ｍ）リーダーをコードするｃＤＮＡを、プラスミド
ｐＳＨ２７８（ｒＥｎｄｏ  Δ４８  Ｇｌｓ１ｓリーダー）、ｐＳＨ２７９（ｒＥｎｄｏ
Δ４８  Ｖａｎ１ｓリーダー）およびｐＳＨ２８０（ｒＥｎｄｏ  Δ４８  Ｍｎｎ１１
ｍリーダー）を産生するラットエンドマンノシダーゼ触媒ドメインをコードするｃＤＮＡ
に対して５’側にクローン化した。組込みをコロニーＰＣＲによって確認し、結果として
得られたポジティブクローンを分析し、分泌レポータータンパク質のＮグリカン構造を決
定した。
【０１５２】
（実施例６：ノーザンブロット分析）
ヒトエンドマンノシダーゼ転写物の組織分布を、組織の各々に由来の２μｇの精製ポリ
Ａ＋ＲＮＡを表すヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の指示書に従って使用して決定した。使用した５４７ｂｐヒト
エンドマンノシダーゼＤＮＡプローブ（８４３〜１３８９）を、ＲａｄＰｒｉｍｅ  ＤＮ
Ａ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ
）および［３２Ｐ］ｄＣＴＰを使用して産生した。この結果を、図８に示す。
【０１５３】
（実施例７：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の培地を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  Ｉ
Ｉ装置を使用して、サンプルを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（
１９７０）Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒ
ｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｐｈａｇｅ  Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５）上で泳動することによって
、エンドマンノシダーゼ分泌について分析した。次いで、このタンパク質をニトロセルロ
ース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）上に転写した
。組換えエンドマンノシダーゼを、製造者の指示書に従ってヤギ抗マウスＨＲＰ結合体化
二次抗体と組み合わせて抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体を使用して検出し、そして
ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を
使用して可視化した。ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由
来の培地を、コントロールとして使用した。この結果を、図９に示す。
【０１５４】
（実施例８：組換えエンドマンノシダーゼのインビトロでの特徴付け）
ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（エンドマンノシダーゼアッセイのための基質）を、ｏ
ｃｈ１  ａｌｇ３変異株ＲＤＰ２５（ＷＯ  ０３／０５６９１４Ａ１）（Ｄａｖｉｄｓｏ
ｎら，２００３（近刊））から単離した。２−アミノベンズアミド標識化ＧｌｃＭａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２を、１０μｌの培地上清に添加し、そして３７℃で、８時間または一晩、
インキュベートした。次いで、Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２２−５０２７（２００３）のプロトコルに従って、１０
μｌの水を添加し、続いてグリカンを、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  ＮＨ２  ４．６×２５０ｍｍ
、５ミクロンビーズ、アミノ結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ
）を使用して、サイズおよび電荷によって分離した。
【０１５５】
（実施例９：操作されたエンドα−１，２−マンノシダーゼの最適ｐＨおよび最適温度
のアッセイ）
蛍光標識化ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を、種々のｐＨ（表２）に調
節した２０μＬの上清に添加し、そして８時間室温でインキュベートした。インキュベー
ト後、このサンプルを、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  ＮＨ２  ４．６×２５０  ｍｍ、５ミクロン
ビーズ、アミノ結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）を使用して
、ＨＰＬＣにより分析した。流速は、４０分間１．０ｍｌ／分であり、そしてこのカラム
を３０℃に維持した。定組成的に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）（６８％  Ａ：３２％
Ｂ）３分間溶出した後、直線的な溶媒勾配（６８％  Ａ：３２％  Ｂ〜４０％  Ａ：６
０％  Ｂ）を２７分にわたって使用し、グリカン（１８）を溶出した。溶媒Ａ（アセトニ
トリル）および溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム）は、５０ｍＭ、ｐＨ４．５であった。このカ
ラムを、流出の間の２０分間、溶媒（６８％  Ａ：３２％  Ｂ）で平衡化した。以下の表
は、種々のｐＨにおいてＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から生じたＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ
２の量（％）を示す（図１５、表２）。
【０１５６】
【表２】
2010187693.tif 000011
ヒトエンドマンノシダーゼについての最適温度を、同様に、種々の温度（室温、３０℃
および３７℃）で酵素基質を培養上清と共にインキュベートすることによって試験した。
３７℃が最適であった。
【０１５７】
（実施例１０：レポータータンパク質発現、Ｎ結合型グリカンの精製および解離）
（タンパク質精製）
Ｋｒｉｎｇｌｅ  ３（Ｋ３）ドメイン（アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモ
ーターの制御下）を、モデルタンパク質として使用した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ
２０００サンプル操作ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒａｎｃｈ  Ｃｕ
ｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）で９６ウェル形式を使用して、Ｋｒｉｎｇｌｅ  ３を精製した。
Ｋｒｉｎｇｌｅ  ３を、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（Ｃｈｏｉら  ２００３、前出）
を使用して発現培地から精製した。自動化精製は、ＮｏｖａｇｅｎによってそれらのＨｉ
ｓＢｉｎｄ樹脂について提供されたプロトコルの適応である。手短に言うと、１５０μＬ
（μＬ）固定体積の樹脂を、９６ウェル溶解物結合プレートのウェルに注ぎ、３倍容量の
水で洗浄し、そして５倍容量の５０ｍＭ  ＮｉＳＯ４で満たし、そして３倍容量の結合緩
衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣＩ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７
．９）で洗浄する。このタンパク質発現培地を、３：２、培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ  ＰＯ
４、１６ｍＭ  ＫＣ１、８２２ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４）に希釈し、そして上記カラ
ム上にロードする。排液後、このカラムを１０倍体積の結合緩衝液および６倍体積の洗浄
用緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣＩ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  
ｐＨ７．９）で洗浄し、そして上記タンパク質を、６倍体積の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾ
ール、０．５Ｍ  ＮａＣＩ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）で溶出する。溶
出した糖タンパク質を凍結乾燥によって乾燥するまでエバポレートする。
【０１５８】
（Ｎ結合型グリカンの解離）
以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８（５）：４４５
−５４（１９９８））の改変によって、グリカンを、糖タンパク質から解離および分離す
る。９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＩＰ（イモビロン−Ｐ膜）プレート（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ）のウェルを、１００μＬのメタノールで湿らせ、３×１５０μＬの水および
５０μＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐ
Ｈ８．６）で洗浄し、各々の添加後に緩やかな減圧によって排液した。上記乾燥タンパク
質サンプルを、３０μＬのＲＣＭ緩衝液に溶解し、そして１０μＬのＲＣＭ緩衝液を含む
ウェルに移した。このウェルを排液し、そしてＲＣＭ緩衝液で２回洗浄した。このタンパ
ク質を、ＲＣＭ緩衝液中６０μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴの添加によって、１時間３７℃で還
元した。このウェルを、３００μＬの水で３回洗浄し、そして６０μＬの０．１Ｍヨード
酢酸の添加によって、３０分間、暗所で、室温においてカルボキシメチル化した。このウ
ェルを、水で３回再度洗浄し、そして上記膜を、水中１％  ＰＶＰ３６０を１００μＬ添
加することによって、１時間、室温でブロッキングした。このウェルを排液し、そして３
００μＬの水で３回洗浄し、そして、１ミリ単位のＮ−グリカネーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含
む１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ８．３を３０μＬ添加することによって脱グルコシル
化した。１６時間、３７℃でのインキュベートの後、上記グリカンを含む溶液を、遠心分
離によって取り除き、そして乾燥するまで蒸発させた。
【０１５９】
その他：タンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ  １９７０）に従うＳＤＳ／
ＰＡＧＥによって分離した。
【０１６０】
（実施例１１：飛行時間型質量分析法のマトリックス補助レーザー脱離イオン化）
グリカンの分子量を、ディレイドエクストラクション（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃ
ｔｉｏｎ）を用いるＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＰＲＯ  ｌｉｎｅａｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析計を使用して決定した。各ウェル
からの乾燥グリカンを、１５μＬの水に溶解し、そしてステンレス鋼サンプルプレート上
に０．５μＬスポットし、そして０．５μＬのＳ−ＤＨＢマトリックス（１：１水／アセ
トニトリル０．１％  ＴＦＡ中、９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸、１ｍｇ／ｍＬの
５−メトキシサリチル酸（ｍｅｔｈｏｘｙｓａｌｉｃｉｌｉｃ  ａｃｉｄ））と混合し、
そして乾燥させた。
【０１６１】
イオンは、４ｎｓのパルス時間を有するパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）での放射に
よって発生された。この装置を、１２５ｎｓの遅延および２０ｋＶの加速電圧を使用する
ディレイドエクストラクションモードで操作した。グリッド電圧は９３．００％であり、
ガイドワイヤー電圧は０．１０％であり、内圧は５×１０〜７トル未満であり、そして低
質量ゲートは８７５Ｄａであった。スペクトルを、１００〜２００レーザーパルスの合計
から生成し、そして２  ＧＨｚデジタイザーを用いて得た。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリ
ゴ糖を、外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを、陽イオンモードで装置を
使用して生成した。このスペクトルの推定質量精度は、０．５％であった。
【０１６２】
（実施例１２）
（キメラエンドマンノシダーゼタンパク質を生成するためのコンビナトリアルライブラ
リー）
最適温度および最適ｐＨの範囲を有する触媒ドメインによって特徴付けられる、ヒトエ
ンドマンノシダーゼ、マウスエンドマンノシダーゼ、ラットエンドマンノシダーゼおよび
／または混合エンドマンノシダーゼの任意の組み合わせのライブラリーは、公表された手
順（例えば、ＷＯ  ０２／００８７９；Ｃｈｏｉら、２００３、前出、および米国出願番
号１０／３７１，８７７（２００３年２月２０日出願）の公報を参照のこと）に従って作
製される。このライブラリーは、酵母のような下等な真核宿主細胞で発現された場合に、
レポータータンパク質のグリコシル化パターンを改変して所望のグリカン構造を産生する
ことにおいて最適に機能するエンドマンノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする
１以上の配列を選択するのに有用である。特定の細胞区画に対するエンドマンノシダーゼ
の触媒ドメインを標的するのが有利であることが期待される。ＤＮＡコンビナトリアルラ
イブラリーアプローチ（標的ペプチドと酵素ドメインとの間のインフレーム融合）は、選
択のために使用される宿主細胞において、所望もしくは効率的な様式でエンドマンノシダ
ーゼ活性を発現するキメラ分子を同定することを可能にする。エンドマンノシダーゼ配列
は、多くの発現系（細菌細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞が挙げられる）において発現
され、コードされたタンパク質が特徴付けされる。
【０１６３】
宿主（例えば、微生物）においてヒト様糖形態を生成するために、宿主を操作して、モ
ノグリコシル化高マンノース糖形態、ジグリコシル化高マンノース糖形態およびトリグリ
コシル化高マンノース糖形態を加水分解し、存在するグルコース残基および近接位のマン
ノースを除去するエンドマンノシダーゼ酵素（例えば、本明細書中で記載されるヒトマン
ノシダーゼまたはマウスマンノシダーゼ）を発現させる（図１を参照のこと）。シスゴル
ジ局在化シグナルおよび内側ゴルジ局在化シグナル（ならびに必要に応じてＥＲ局在化シ
グナルを含む）をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーは、インフレームで１以上の
エンドマンノシダーゼ触媒ドメインをコードするライブラリーに融合される。宿主生物は
、菌株（例えば、酵母）であり、これは、高マンノシル化（例えば、ｏｃｈ１変異体）に
欠けており、好ましくは、ゴルジおよび／またはＥＲにおいてＧｌｃＭａｎＧｌｃＮＡｃ
２の構造を有するＮ−グリカンを提供する。（エンドマンノシダーゼは、Ｇｌｃ１−３Ｍ
ａｎ９−５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ８−４ＧｌｃＮＡｃ２に加水分解し得、従って、好ま
しいＧｌｃＭａｎＧｌｃＮＡｃ２構造は必須ではない）。形質転換後、所望のグリコシル
化表現型を有する生物を選択する。好ましくは、エンドマンノシダーゼ活性は、オリゴ糖
上に少なくとも１つのグルコース残基と１つのマンノース残基とを含む組成物を除去する
。インビトロアッセイが、１つの方法で使用される。所望の構造は、酵素α１，２−マン
ノシダーゼに対する基質である（図２を参照のこと）。従って、シグナルコロニーは、イ
ンビトロでこの酵素を使用してアッセイされ得る。
【０１６４】
上記のインビトロアッセイは、ハイスループットなスクリーニング機器を使用して、個
々のコロニーで簡便に実施される。あるいは、レクチン結合アッセイが使用される。この
場合には、末端マンノースに特異的なレクチンの減少した結合が、所望の表現型を有する
形質転換体の選択を可能にする。例えば、Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチンは
、末端α−１，３−マンノースに特異的に結合し、その濃度は、操作可能に発現されたエ
ンドマンノシダーゼ活性の存在下で減少される。１つの適切な方法では、固体アガロース
支持体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）に結合
したＧ．ｎｉｖａｌｉｓレクチンを使用して、高レベルの末端α−１，３−マンノースを
有する細胞の形質転換集団を枯渇させる。
【０１６５】
（配列表）
【０１６６】
【数８】
2010187693.tif 000012
【０１６７】
【数９】
2010187693.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、ＥＲにおけるＮ−グリカンのグルコースプロセシングと比較した、ゴルジ体におけるモノグリコシル化グリカン、ジグリコシル化グリカンおよびトリグリコシル化グリカンを改変するエンドマンノシダーゼの模式図である。強調表示は、加水分解され得るさらなるグルコース残基である。
【図２】図２は、ゴルジ体においてグリコシル化構造Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンへとプロセシングする、エンドマンノシダーゼの模式図である。強調表示されたマンノース残基は、種々の組合せで、エンドマンノシダーゼの基質となり得る種々の型の高分子マンナングリカンを生じる構成を表す。
【図３】図３は、相同体を同定するための、ラットエンドマンノシダーゼのＢＬＡＳＴ分析を示す。パネルＡは、ラットエンドマンノシダーゼのＣ−末端に対して８８％同一性を示すヒト配列の同定を示す。パネルＢは、パネルＡに由来する単離された配列のＮ−末端を示し、これは、パネルＣにおけるヒトエンドマンノシダーゼの５’領域を単離するために使用された。パネルＣは、可能性のあるヒトエンドマンノシダーゼの潜在的Ｎ−末端配列を示す。
【図４】図４は、ヒト肝臓エンドマンノシダーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ヒトエンドマンノシダーゼのヌクレオチド配列（上）および一文字アミノ酸配列（下）は、左に標識された残基番号とともに示される。太字のヌクレオチド領域は、推定全長ヒト肝臓エンドマンノシダーゼの構築に使用される、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ｇｉ：１８０３１８７８（下線）およびｇｉ：２０５４７４４２（標準文字）の重複セグメントを表す。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの分析（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２））（図５参照）によって同定された推定膜貫通ドメインは、四角によって強調表示される。
【図５】図５は、ウェブベースのソフトウェアＧＲＥＡＳＥおよび１１残基のウインドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（（１９８２）前出）の方法に従って作製された、ヒトエンドマンノシダーゼのアミノ酸配列の水治療プロットを示す。黒四角は、高疎水性のＮ−末端領域を表し、推定膜貫通ドメインの存在を示唆する。この領域はまた、図４において四角によって表わされる（アミノ酸残基１０〜２６）。
【図６】図６は、マウスエンドマンノシダーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＫ０３０１４１）を示す。マウスエンドマンノシダーゼのヌクレオチド配列（上）および一文字アミノ酸配列（下）は、左に標識された残基番号とともに示される。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの分析（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２））によって同定された推定膜貫通ドメインは、四角によって強調表示される。
【図７】図７は、３つのエンドマンノシダーゼオープンリーディングフレームの配置を示す。ヒト、マウスおよびラットのエンドマンノシダーゼのＯＲＦは、ＤＮＡＳＴＡＲ  ｓｕｉｔｅのプログラムのうちのＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを用いて並置された。この分析のために選択されたアルゴリズムは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖバージョン（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５，１５１−１５３（１９８９））であった。陰影によって表示された残基は、少なくとも２つのＯＲＦの間で同一のアミノ酸を表す。各ＯＲＦのアミノ酸位置は、並置された配列の左に提示される。
【図８】図８は、標識化ヒトエンドマンノシダーゼ核酸プローブにハイブリダイズされた、種々のヒト組織に由来するＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図９】図９は、分泌されたＮ−末端タグ化エンドマンノシダーゼの、Ｎｉ−樹脂上における前精製物（コントロール（ＧＳ１１５）（Ａ）株、ｒＥｎｄｏ（ＹＳＨ８９）（Ｂ）株およびｈＥｎｄｏ（ＹＳＨ９０）（Ｃ）株由来のサンプル）のウェスタンブロット分析を示す。これらのサンプルは、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて検出された。
【図１０】図１０Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈ１  ａｌｇ３）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。図１０Ｂは、ｐＳＨ２８０（ラットエンドマンノシダーゼΔ４８／Ｍｎｎ１１（ｍ））によって形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈ１  ａｌｇ３）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示し、この分析は、とりわけ、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１０９９ｍ／ｚにおけるピーク［ｃ］、およびヘキソース６の質量に対応する１４２４ｍ／ｚにおけるピーク［ａ］を示す。この株は、ＹＳＨ９７と命名された。図１０Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ９７において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、α１，２−マンノシダーゼによるインビトロ消化後における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示し、この分析は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する９３８ｍ／ｚにおけるピーク［ｂ］（Ｎａ＋付加）を示す。
【図１１】図１１Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈ１  ａｌｇ３）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。図１１Ｂは、ｐＳＨ２７９（ラットエンドマンノシダーゼΔ４８／Ｖａｎ１（ｓ））によって形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈ１  ａｌｇ３）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示し、この分析は、とりわけ、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１１１６ｍ／ｚにおけるピーク［ｃ］、およびヘキソース６の質量に対応する１４４１ｍ／ｚにおけるピーク［ａ］を示す。この株は、ＹＳＨ９６と命名された。図１１Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ９６において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、α１，２−マンノシダーゼによるインビトロ消化後における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示し、この分析は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する９３８ｍ／ｚにおけるピーク［ｂ］（Ｎａ＋付加）、およびヘキソース６の減少を示す１４２５ｍ／ｚにおける第二のピーク［ａ］を示す。
【図１２】図１２Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈ１  ａｌｇ３）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。図１２Ｂは、ｐＳＨ２７８（ラットエンドマンノシダーゼΔ４８／Ｇｌｓ１（ｓ））によって形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＤＰ−２５（ｏｃｈ１  ａｌｇ３）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示し、この分析は、とりわけ、１４３９ｍ／ｚ（Ｋ＋付加）におけるピーク［ｃ］、およびヘキソース６の質量に対応する１４２２ｍ／ｚ（Ｎａ＋付加）におけるピーク［ａ］を示す。この株は、ＹＳＨ９５と命名された。図１２Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ９５において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンの、α１，２−マンノシダーゼによるインビトロ消化後における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示し、この分析は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する９３６ｍ／ｚにおけるピーク［ｂ］（Ｎａ＋付加）、およびヘキソース６の減少を示す１４２３ｍ／ｚにおけるピーク［ａ］を示す。
【図１３】図１３は、ラットおよびヒトのエンドマンノシダーゼ活性についての高速液体クロマトグラムインビトロアッセイを示す。パネルＡは、ＢＭＭＹにおけるヘキソース６標準ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示す。パネルＢは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ１３由来の上清とインキュベートしたラットエンドマンノシダーゼから産生されたグリカン基質を示す。パネルＣは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ１６由来の上清とインキュベートしたヒトエンドマンノシダーゼから産生されたグリカン基質を示す。（ｉ）および（ｉｉ）に対応する構造については、図１４を参照のこと。
【図１４】図１４は、エンドマンノシダーゼによる基質グリカン改変、およびα１，２−マンノシダーゼ消化および分析による生成物の構造のその後の確認を示す。図示された構造は、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ｉ）、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２（ｉｉ）およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ｉｉｉ）である。Ｒは、グリカンの還元末端を示す。基質ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ｉ）は、それをＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２（ｉｉ）に変換する（Ｇｌｃα１，３  Ｍａｎを加水分解する）エンドマンノシダーゼにより改変されている。その後のα１，２−マンノシダーゼ消化により、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ｉｉｉ）を生じる。
【図１５】図１５は、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に変換したＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質の％として示した、ヒトエンドマンノシダーゼの活性のｐＨプロフィールを、ｐＨの関数として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月21日(2010.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物、植物、昆虫、真菌、酵母または藻の宿主細胞におけるグリコシル化構造を改変するための方法であって、該方法は、エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性をコードする核酸および糖タンパク質をコードする核酸を前記宿主細胞に導入する工程、および、該エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性および該糖タンパク質を該宿主細胞中で発現させる工程を含み、ここで、該エンドマンノシダーゼ活性が、オリゴ糖上に少なくとも１つのグルコース残基と１つのマンノース残基とを含む組成物を除去することができる、方法。
【請求項２】
前記エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性が、さらにＧｌｃ１−３Ｍａｎ９−５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ８−４ＧｌｃＮＡｃ２に切断することができ、ここで、Ｇｌｃα１，３Ｍａｎ、Ｇｌｃ２α１，３ＭａｎまたはＧｌｃ３α１，３Ｍａｎが除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンドマンノシダーゼ活性ＥＣ３．２．１．１３０活性が、グリコシル化グリカン上に少なくとも１つのグルコース残基と１つのマンノース残基とを含む組成物の加水分解が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性が、小胞体、初期ゴルジ、中期ゴルジ、後期ゴルジ、トランスゴルジ網または前記宿主生物内の小胞区画を標的とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性が、宿主起源であるが、活性を高めるために、変異、プロモータ強度またはコピー数によって改変されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０が分泌される、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
グルコシル化糖タンパク質を改変するための方法であって、該方法は、哺乳動物、植物、昆虫、真菌、酵母または藻の宿主細胞にエンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性を導入する工程を含み、ここで、該エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性の発現の際に、前記エンドマンノシダーゼＥＣ３．２．１．１３０活性が、前記宿主細胞中でＥＲをバイパスしたグルコシル化糖タンパク質を改変する、方法。