(57)【要約】【課題】光学活性β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法であって、新規なＤ−フェニルセリンデアミナーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を用い、ＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸のＤ体のみを分解することによりＬ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法の提供を課題とする。【解決手段】アルスロバクター属、アクロモバクター属、ボルデテラ属、ステノトロフォモナス属、シュードモナス属に存在するＤ−３−フェニルセリンデアミナーゼを精製し、その酵素科学的性質を明らかにした。精製酵素の内部アミノ酸配列の一部を利用し、該酵素をコードする遺伝子を大腸菌にクローニングし、発現させた。得られた形質転換株により、Ｄ−３−フェニルセリンデアミナーゼが生産された。本酵素をＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、光学分割することにより、Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸が生産できることを見いだした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）から（３）に示す理化学的性状を有するＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
（１）作用
Ｄ−スレオ−フェニルセリンに作用し、フェニルピルビン酸とアンモニアを生成する。
（２）基質特異性
（ａ）Ｄ−スレオ−フェニルセリンに対して、Ｄ−セリンに対する活性の１０％以上の活性を有する。
（３）分子量
ゲル濾過による分子量が約110,000、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約45,000。
【請求項２】
請求項１に加えて、次の（４）および（５）に示す理化学的性状を有する請求項1記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
（４）最適ｐＨ
ｐＨ７．５−８．５
（５）最適温度
５０−６０℃
【請求項３】
アルスロバクター属 (Arthrobacter)、アクロモバクター属 (Achromobacter)、ボルデテラ属(Bordetella)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophomonas) 、またはシュードモナス属 (Pseudomonas)に属する微生物により生産される、請求項１に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
【請求項４】
前記アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター・アウレッセンス (Arthrobacter aurescens)、アルスロバクター・ニトログアジャコリナス (Arthrobacter nitroguajacolinus)であり、前記アクロモバクター属に属する微生物がアクロモバクター・キシロースオキシダンス (Achromobacter xylosoxydans)であり、前記ボルデテラ属に属する微生物がボルデテラ・ペトリー(Bordetella petrii)であり、前記ステノトロフォモナス属に属する微生物がステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophylia)であり、前記シュードモナス属に属する微生物がシュードモナス・プチダ (Pseudomonas putida)であることを特徴とする、請求項３に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
【請求項５】
前記アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター・エスピー TKS1株であることを特徴とする、請求項３に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
【請求項６】
前記アルスロバクター・アウレッセンスに属する微生物がアルスロバクター・アウレッセンス NBRC 12136であり、前記アルスロバクター・ニトログアジャコリナスに属する微生物がアルスロバクター・ニトログアジャコリナス JCM 14115であり、前記アクロモバクター・キシロースオキシダンスに属する微生物がアクロモバクター・キシロースオキシダンスNBRC 15126であり、前記ボルデテラ・ペトリーに属する微生物がボルデテラ・ペトリー DSM 12804株、ボルデテラ・ペトリーTKS2株であり、前記ステノトロフォモナス・マルトフィリアに属する微生物がステノトロフォモナス・マルトフィリアNBRC 14161株であり、前記シュードモナス・プチダに属する微生物がシュードモナス・プチダP-9-3株であることを特徴とする、請求項４に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
【請求項７】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項８】
アルスロバクター属 (Arthrobacter)、アクロモバクター属 (Achromobacter)、ボルデテラ属(Bordetella)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophomonas)、および／またはシュードモナス属 (Pseudomonas)に属する微生物を培養する工程を含む請求項１記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼを発現する形質転換株を培養する工程を含む、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼを製造する方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼをＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、Ｄ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解することにより、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼが、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、請求項９に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項１２】
請求項１０に記載のＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸がＤＬ−スレオ−β−フェニルセリンであり、生成するＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸がＬ−スレオ−β−フェニルセリンであることを特徴とする、Ｌ−スレオ−β−フェニルセリンを製造する方法。
【請求項１３】
前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼが、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１２に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼをＤ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を含むβ−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解することにより、対応するα−ケト酸を製造する方法。
【請求項１５】
前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼが、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１４に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項１６】
請求項１３に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸がβ−ヒドロキシフェニルセリンであり、生成するα−ケト酸がフェニルピルビン酸であることを特徴とする、フェニルピルビン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＤ−フェニルセリンデアミナーゼに関する。さらに、該酵素を利用することにより、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関する。より具体的には、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼを用い、ＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸のＤ体のみを分解することによりＬ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−ヒドロキシアミノ酸は、各種医薬品、医薬中間体として重要な化合物であるが、2つの不斉点をもつ、4種類の異性体が存在するため、特定の異性体のみを合成するのは困難であった。
【０００３】
特に、Ｌ−スレオもしくはＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の選択的な合成は困難であり、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ（特許文献１）、Ｄ−フェニルセリン脱水素酵素（特許文献２）などの酵素をＤＬ−スレオもしくはＤＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、Ｄ−スレオもしくはＤ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解することによりＬ−スレオもしくはＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を得る方法、ＤＬ−スレオもしくはＤＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を原料に、光学分割剤を用いてラセミ体を分割する方法（特許文献２）などに限られていた。
【０００４】
Ｄ−スレオニンアルドラーゼを用いる方法は、生成物として対応するアルデヒドとグリシンを生成するため、アルデヒドが酵素反応を阻害すること、生成するグリシンと目的とするＬ−β−ヒドロキシアミノ酸と分離する必要があり、精製工程が煩雑となることなどの問題がある。
【０００５】
Ｄ−フェニルセリン脱水素酵素を用いる方法は、反応により生成するアミノケトンが不安定で反応液の着色や反応阻害をもたらす、反応が完結しにくい、などの問題がある。
【０００６】
光学分割剤を用いる方法は、例えば、Ｌ−スレオ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セリン（以下、MDOPSと略す）の場合、原料となるDL-threo-MDOPSをカルボベンゾキシクロリドによりＮ−カルボベンゾキシ化した後に、エフェドリン、キニジン、キニンなどの高価な分割試薬を使用して分割し、更に脱保護する必要があり、工程が長い、高価な分割剤を使用する、など問題がある。
【０００７】
β−ヒドロキシアミノ酸に作用し、対応するα−ケト酸とアンモニアを生成するβ−ヒドロキシアミノ酸デアミナーゼ（別名、デヒドラターゼ、アンモニアリアーゼ）は、反応が不可逆である、生成物が反応をほとんど阻害しない、生成物が一般に中性付近で水溶性の高いα−ケト酸なので精製が容易、などのメリットがある。
【０００８】
Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用するデアミナーゼとしては、Ｄ−セリンデアミナーゼ (EC 4.3.1.18)が知られており、Ｄ−セリンに作用し、まず、脱水反応を触媒することによりデヒドロセリンを生成し、生成物が不安定であるために非酵素的に脱アミノ化反応が起こり、ピルビン酸とアンモニアが生成すると考えられている。また、同酵素は、Ｄ−スレオニンに対しても弱い活性を有することが報告されているが、Ｄ−フェニルセリンに対する活性は報告がないか、実質的に存在しない。尚、実質的に存在しないとは、Ｄ−フェニルセリンに対する活性が、Ｄ−セリンに対する活性の１０％未満であることを指す。
【０００９】
一方、フェニルセリンに作用するデアミナーゼとして、シュードモナス・ピケッティー（現在名、ラルストニア・ピケッティー (Ralstonia pickettii))より、Ｌ−スレオ−フェニルセリンデアミナーゼが報告されているが、本酵素は、Ｌ−スレオ−フェニルセリンに特異的に作用し、Ｄ−フェニルセリンには作用しない（非特許文献２）。
【００１０】
従って、Ｄ−フェニルセリンに作用するデアミナーゼはこれまでに報告されていない。
【００１１】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平 06-125786
【特許文献２】特開昭 58-216146
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】J. Biochem., 114, 930-935 (1993)
【非特許文献２】J. Biochem., 119, 690-696 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、新規なＤ−フェニルセリンデアミナーゼ、及びこれを用いた、Ｌ−フェニルセリン誘導体などＬ−β−ヒドロキシアミノ酸の効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、効率的なＬ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法を開発するために、Ｄ−フェニルセリンに立体選択的に作用し、Ｌ−フェニルセリンに実質的に作用しない、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの探索を行い、鋭意検討を行った結果、土壌より分離した微生物がＤ−フェニルセリンデアミナーゼを生産することを見出した。
【００１６】
得られた５株を同定した結果、2株がアルスロバクター・エスピー、残りは、シュードモナス・プチダ、ボルデテラ・ペトリー、ステノトロフォモナス・マルトフィリアが各1株であった。
これらのうち、アルスロバクター・エスピーTKS1株については、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号 NITE P-590として寄託された。
【００１７】
得られた5株の内、アルスロバクター・エスピーTKS1株よりＤ−フェニルセリンデアミナーゼを精製し、その部分アミノ酸配列を決定した。部分アミノ酸配列を用いて、BLAST検索を行った結果、アルスロバクター・アウレッセンス TC1株のゲノム解析の結果得られた予想ＯＲＦの1つ(ID=A1RBW8_ARTAT)、機能未知タンパク質(Putative amino acid aldolase or racemase)のＮ末端アミノ酸配列と１５アミノ酸の内１３アミノ酸が一致した。
【００１８】
精製酵素より得られたＮ末端アミノ酸配列及び A1RBW8_ARTAT の予想C末端アミノ酸配列を元にプライマーをデザインし、ＰＣＲによりアルスロバクター・エスピーTKS1株よりＤ−フェニルセリンデアミナーゼをコードすると思われる遺伝子を取得した。
【００１９】
得られたＯＲＦを、pET21a(+) ベクターに導入し、大腸菌において発現させた結果、Ｄ−スレオ−フェニルセリンに対するデアミナーゼ活性が検出され、得られたＯＲＦが目的とするＤ−フェニルセリンデアミナーゼをコードする遺伝子であることが確認できた。
【００２０】
即ち、本発明は、光学活性Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関し、以下の〔１〕〜〔１６〕を提供するものである。
〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性状を有するＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
（１）作用
Ｄ−スレオ−フェニルセリンに作用し、フェニルピルビン酸とアンモニアを生成する。
（２）基質特異性
（ａ）Ｄ−スレオ−フェニルセリンに対して、Ｄ−セリンに対する活性の１０％以上の活性を有する。
（３）分子量
ゲル濾過による分子量が約110,000、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約45,000。
〔２〕〔１〕に加えて、次の（４）および（５）に示す理化学的性状を有する〔１〕記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ
（４）最適ｐＨ
ｐＨ７．５−８．５
（５）最適温度
５０−６０℃
〔３〕アルスロバクター属 (Arthrobacter)、アクロモバクター属 (Achromobacter)、ボルデテラ属(Bordetella)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophomonas) 、またはシュードモナス属 (Pseudomonas)に属する微生物により生産される、〔１〕に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
〔４〕前記アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター・アウレッセンス (Arthrobacter aurescens)、アルスロバクター・ニトログアジャコリナス (Arthrobacter nitroguajacolinus)であり、前記アクロモバクター属に属する微生物がアクロモバクター・キシロースオキシダンス (Achromobacter xylosoxydans)であり、前記ボルデテラ属に属する微生物がボルデテラ・ペトリー(Bordetella petrii)であり、前記ステノトロフォモナス属に属する微生物がステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophylia)であり、前記シュードモナス属に属する微生物がシュードモナス・プチダ (Pseudomonas putida)であることを特徴とする、〔３〕に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
〔５〕前記アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター・エスピー TKS1株であることを特徴とする、〔３〕に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
〔６〕前記アルスロバクター・アウレッセンスに属する微生物がアルスロバクター・アウレッセンス NBRC 12136であり、前記アルスロバクター・ニトログアジャコリナスに属する微生物がアルスロバクター・ニトログアジャコリナス JCM 14115であり、前記アクロモバクター・キシロースオキシダンスに属する微生物がアクロモバクター・キシロースオキシダンスNBRC 15126であり、前記ボルデテラ・ペトリーに属する微生物がボルデテラ・ペトリー DSM 12804株、ボルデテラ・ペトリーTKS2株であり、前記ステノトロフォモナス・マルトフィリアに属する微生物がステノトロフォモナス・マルトフィリアNBRC 14161株であり、前記シュードモナス・プチダに属する微生物がシュードモナス・プチダP-9-3株であることを特徴とする、〔４〕に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
〔７〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、〔１〕に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔８〕アルスロバクター属 (Arthrobacter)、アクロモバクター属 (Achromobacter)、ボルデテラ属(Bordetella)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophomonas)、および／またはシュードモナス属 (Pseudomonas)に属する微生物を培養する工程を含む〔１〕記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼの製造方法。
〔９〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼを発現する形質転換株を培養する工程を含む、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼを製造する方法。
〔１０〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼをＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、Ｄ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解することにより、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
〔１１〕前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼが、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、〔９〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔１２〕〔１０〕に記載のＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸がＤＬ−スレオ−β−フェニルセリンであり、生成するＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸がＬ−スレオ−β−フェニルセリンであることを特徴とする、Ｌ−スレオ−β−フェニルセリンを製造する方法。
〔１３〕前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼが、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、〔１２〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔１４〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼをＤ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を含むβ−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解することにより、対応するα−ケト酸を製造する方法。
〔１５〕前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼが、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、〔１４〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔１６〕〔１３〕に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸がβ−ヒドロキシフェニルセリンであり、生成するα−ケト酸がフェニルピルビン酸であることを特徴とする、フェニルピルビン酸を製造する方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、光学活性Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸及びα−ケト酸の効率的な合成に利用可能な酵素であるＤ−フェニルセリンデアミナーゼ、それをコードする遺伝子、並びにこれらを利用した光学活性Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸及びα−ケト酸の効率的な合成方法が提供された。
【００２２】
光学活性Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸は、各種医薬品原料として有用な化合物である。また、α−ケト酸も各種医薬品の原料として有用な化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】TKS1株の16S rDNAを用いた分子系統樹を示す図である。左下の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のTはその種の基準株であることを示す。
【図２】Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの反応最適ｐＨの検討結果を示す図である。本酵素の最大活性はトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で示され、ｐＨ７．５−８．５において最大活性の８０％以上の活性が示された。
【図３】Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの反応最適温度の検討結果を示す図である。本酵素は、ｐＨ７．５の条件において５５℃で最大活性を有し、５０−６０℃において最大活性の８０％以上の相対活性を示した。
【図４】Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの耐熱性の検討結果を示す図である。本酵素は、５５℃まで８０％以上の残存活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、Ｄ−β−フェニルセリンデアミナーゼを利用し、光学活性Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸を生産することを特徴とする。
【００２５】
本発明に利用するＤ−フェニルセリンデアミナーゼは、下記の（１）から（３）の性質により特徴づけられる。
（１）作用
Ｄ−スレオ−フェニルセリンに作用し、フェニルピルビン酸とアンモニアを生成する。
（２）基質特異性
（ａ）Ｄ−スレオ−フェニルセリンに対して、Ｄ−セリンに対する活性の２０％以上の活性を有する。
（３）分子量
ゲル濾過による分子量が約110,000、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約45,000。
（４）最適ｐＨ
ｐＨ７．５−８．５
（５）最適温度
５０−６０℃
【００２６】
なお、ゲル濾過やSDS-PAGEで測定される分子量が測定条件等によって変わりうることは、当該分野の技術常識である。よって、約110,000、約45,000における「約」とは、そのような変わりうる範囲を含むことを意味している。約110,000の範囲としては100,000〜120,000が例示でき、また約45,000の範囲としては40,000〜50,000が例示できるが、これらの範囲に限定されるものではなく、約110,000と約45,000の範囲は、当該分野の技術常識に基づき判断されるべきである。
最適ｐＨとは最大活性を示すｐＨにおける活性を１００％とし、その８０％以上の活性を示すｐＨ範囲を言う。また、最適温度とは、最大活性を示す温度における活性を１００％とし、その８０％以上の活性を示す温度範囲を言う。
【００２７】
本発明において、上述のフェニルセリンデアミナーゼ活性は、例えば、次のようにして確認することができる。
【００２８】
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼ活性測定法（ＤＮＰ法）
【００２９】
２０ｍＭ Ｄ−スレオ−３−フェニルセリン、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２０μＭ ピリドキサール−５'−リン酸（ＰＬＰ）及び酵素液から成る全量０．５ｍＬの反応液を調製し、３０℃で反応させる。反応液に１Ｎ塩酸を０．５ｍＬ加えて反応を停止し、０．１％ ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの２Ｎ塩酸溶液０．１５ｍＬを加え、３０℃で２０分間反応させた。その後、３Ｎ水酸化ナトリウムを０．８５ｍＬ加え、１０分間３０℃で反応させた後、分光光度計で４４０ｎｍの吸光度を測定する。
【００３０】
なお、反応開始前に1N塩酸を０．５ml加えた後に、酵素液を加えて反応させたものをコントロールとして使用できる。また、検量線は、例えば200 mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、20 μM PLPを含む溶液にフェニルピルビン酸を溶解したものを用いて作製することができる。
【００３１】
１Ｕは、上記の条件下、1分間に1μｍｏｌのフェニルピルビン酸の生成を触媒する酵素量とした。
【００３２】
上記のＤ−フェニルセリンデアミナーゼは、アルスロバクター属、アクロモバクター属、ボルデテラ属、ステノトロフォモナス属、シュードモナス属に属する微生物より精製することが出来る。アルスロバクター属に属する微生物としては、アルスロバクター・エスピー、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・ニトログアジャコリナスが挙げられ、アルスロバクター・エスピー TKS1株、アルスロバクター・アウレッセンスNBRC 12136株、アルスロバクター・ニトログアジャコリナス JCM 14115株が好適に挙げられる。アクロモバクター属に属する微生物としては、アクロモバクター・キシロースオキシダンスが挙げられ、アクロモバクター・キシロースオキシダンス NBRC 15126株が好適に挙げられる。ボルデテラ属に属する微生物としてはボルデテラ・ペトリーが挙げられ、ボルデテラ・ペトリー TKS2株、DSM 12804株が好適に挙げられる。ステノトロフォモナス属に属する微生物としては、ステノトロフォモナス・マルトフィリアが挙げられ、ステノトロフォモナス・マルトフィリアP-16-7株、NBRC 14161 株が好適に挙げられる。シュードモナス属に属する微生物としては、シュードモナス・プチダが挙げられ、シュードモナス・プチダ P-9-3株が好適に挙げられる。
【００３３】
本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼを産生する本発明者らが単離した微生物のうち、アルスロバクター・エスピー TKS1株、ボルデテラ・ペトリー TKS2株、およびシュードモナス・プチダ P-9-3株は、本発明者らによって、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
アルスロバクター・エスピー TKS1株
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：  〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：NITE P-590
（４）識別のための表示：アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）TKS1株
（５）寄託日：２００８年６月２４日
ボルデテラ・ペトリー TKS2株
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：  〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：NITE P-697
（４）識別のための表示：DC 3255ボルデテラ・ペトリー（Bordetella petrii）TKS2
（５）寄託日：２００８年１２月２６日
シュードモナス・プチダ P-9-3株
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：  〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：NITE P-696
（４）識別のための表示：DC 3254シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）P-9-3
（５）寄託日：２００８年１２月２６日
【００３４】
上記微生物は、Ｄ（もしくはＤＬ）−スレオ−フェニルセリン培地（０．５％ Ｄ（もしくはＤＬ−）−スレオ−３−フェニルセリン、０．２％リン酸２水素１カリウム、０．２％リン酸１水素２カリウム、０．０１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０１％酵母エキス（ｐＨ７．５））、ブイヨン培地（肉エキス７ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム３ｇ／Ｌ （ｐＨ７．０））、ＬＢ培地（バクト−トリプトン１０ｇ／Ｌ、バクト−酵素エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ（ｐＨ７．２））の細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。培養液にＤ（もしくはＤＬ）−スレオ−フェニルセリンを０．０１〜５％好ましくは０．１〜１％添加することにより酵素活性を増加させることが出来る。
【００３５】
十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンスルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。例えば、40-60％硫安沈殿、ＤＥＡＥ−トヨパール陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチル−トヨパール疎水クロマトグラフィー、スーパーロース１２ゲル濾過クロマトグラフィーにより高度に精製することが出来る。
【００３６】
したがって本発明は、上記微生物を培養する工程を含むＤ−フェニルセリンデアミナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法もまた提供する。
【００３７】
このようにして精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析すると分子量４５，０００付近にメジャーなバンドが得られ、該バンドが、本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼを示す。
【００３８】
さらに本発明は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる配列を有するＤ−フェニルセリンデアミナーゼを提供する。本発明により提供されるＤ−フェニルセリンデアミナーゼは配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
【００３９】
本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼのホモログとは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００４０】
本発明において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）から（３）に示す理化学的性状を有することを意味する。
【００４１】
当業者であれば、配列番号：２記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res.10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりＤ−フェニルセリンデアミナーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのＤ−フェニルセリンデアミナーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：１に記載のＤ−フェニルセリンデアミナーゼのホモログを得ることが可能である。尚、配列番号2に記載のDNA配列においては、開始コドンはATGであるが、これはＰＣＲクローニング時のプライマー由来の配列であり、ゲノムの配列を確認した結果、本酵素の本来の開始コドンは GTGであった。
【００４２】
さらに、本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼのホモログとは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは95％、96%、97％、98％、99％以上の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、例えばSWISS-PROT, PIR, DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLASTなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００４３】
本発明の配列番号：１に記載のアミノ酸配列を元にBlastを用いて相同性検索を行った結果、最も高い同一性を示したのは、アルスロバクター・アウレッセンス由来の機能未知タンパク質(Putative amino acid aldolase or racemase)であり、約82%であった。
【００４４】
本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ、あるいはそのホモログは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な活性を有する限り、断片であってもよい。
【００４５】
本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドは、以下のような方法によって単離することができる。例えば、配列番号：２に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより本発明のDNAを得ることができる。さらに、得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株の染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４６】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のDNAの外側に伸長させるためのPCRプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりDNAを鋳型として逆PCRを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００４７】
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００４８】
ハイブリダイゼーションにおいては、配列番号：２の相補配列またはその部分配列からなる核酸（DNAまたはRNA）をプローブとして、対象とする核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した20塩基以上、好ましくは25塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、さらに好ましくは80塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上（例えば配列番号：２全長）を用いる。プローブに配列番号：２またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００４９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００５０】
本発明は、このようにして単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。本発明によるＤ−フェニルセリンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼ発現ベクターが提供される。
【００５１】
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼを組換え体から得ることができる。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程、を含む本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法もまた提供する。
【００５２】
本発明においてＤ−フェニルセリンデアミナーゼを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
・エシェリヒア(Escherichia)属
・バチルス(Bacillus)属
・シュードモナス(Pseudomonas)属
・セラチア(Serratia)属
・ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
・コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
・ストレプトコッカス(Streptococcus)属
・ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
・ロドコッカス(Rhodococcus)属
・ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
・サッカロマイセス(Saccharomyces)属
・クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
・シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
・チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
・ヤロウイア(Yarrowia)属
・トリコスポロン(Trichosporon)属
・ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
・ピキア(Pichia)属
・キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
・ノイロスポラ(Neurospora)属
・アスペルギルス(Aspergillus)属
・セファロスポリウム(Cephalosporium)属
・トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００５３】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００５４】
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００５５】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PRなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｕ（WO 060132145に記載）が好適に利用できる。
【００５６】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００５７】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００５８】
ブレビバクテリウム属、特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５９】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984))などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００６０】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００６１】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００６２】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol.138,1003 (1992) )。
【００６３】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００６４】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００６５】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００６６】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００６７】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００６８】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００６９】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００７０】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００７１】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００７２】
また本発明は、前記Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼおよびそのホモログを利用したＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸の光学分割によるＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸（式１）、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸（式２）、それらに対応するα−ケト酸の製造方法に関する。本発明の製造方法に利用できるＤ−フェニルセリンデアミナーゼのホモログとは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは80%、85%、更に好ましくは少なくとも90％、より好ましくは95％、96%、97％、98％、99％以上の同一性を有し、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をいう。
【００７３】
【化１】
2010187658.tif 000002
【００７４】
【化２】
2010187658.tif 000003
【００７５】
式１または２におけるＲとしては、水素やハロゲン基、ニトロ基、アルコキシ基、水酸基などにより置換されても良いアルキル基、シクロアルキル基、ベンゼン環状に低級アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、アルコキシ基、水酸基などを有してもよいフェニル基、ピリジンなどヘテロアリル基などが挙げられる。例えば、原料となるＤＬ−β−ヒドロキシルアミノ酸として、ＤＬ−スレオニン、ＤＬ−スレオ−３−ヒドロキシノルバリン、ＤＬ−スレオ−３−フェニルセリン、ＤＬ−スレオ−３−チエニルセリン、ＤＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン、、ＤＬ−スレオ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）セリン、、ＤＬ−スレオ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セリン、ＤＬ−スレオ−２−アミノ−３−シクロヘキシルプロピオン酸、、ＤＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸、などが挙げられ、これらの原料より、Ｌ−スレオニン、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシノルバリン、Ｌ−スレオ−３−フェニルセリン、Ｌ−スレオ−３−チエニルセリン、Ｌ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン、Ｌ−スレオ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）セリン、ＤＬ−スレオ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セリン、Ｌ−スレオ−２−アミノ−３−シクロヘキシルプロピオン酸、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸、などを合成することが出来る。また、上記、光学分割反応に付随して、Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸が分解され対応するα−ケト酸である、α−ケト酪酸、α−ケト吉草酸、フェニルピルビン酸、チエニルピルビン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸、３，４−ジメトキシフェニルピルビン酸、３，４−メチレンジオキシフェニルピルビン酸、シクロヘキシルピルビン酸、オキサロ酢酸を合成することが出来る。
原料となるＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸は、アルデヒドとグリシンより化学的なアルドール縮合などにより容易に合成することが出来る。4種類の異性体の内2種類のラセミ体の作り分けも可能であり、溶解度の差、金属イオンの利用などにより、ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を選択的に合成することが可能であり（Synthesis (1979), (3), 216-17、特開昭 54-092915）、２，３−エポキシカルボン酸へベンジルアミンを開環的に付加させた後、脱ベンジルすることにより、容易にＤＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を合成することが出来る。
【００７６】
本発明におけるラセミＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸は、目的とする生成物を効率的に生成できるように、反応を阻害しない範囲で、適切な濃度で用いることができる。例えば、ＤＬ−スレオ−３−フェニルセリンの反応液中における濃度として、０．０１−５０％、好ましくは０．１−２０％、さらに好ましくは０．１−１０％を示すことができる。基質の添加方法は特に限定されないが、例えば、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することも可能である。また、反応時間は、通常１−５日、好ましくは１−３日であればよい。反応温度は、４−７０℃、好ましくは２５−５５℃であればよい。反応時のpHは、ｐＨ５．５−１１、好ましくはｐＨ６．５−９．５であればよい。
【００７７】
得られた光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、イオン交換クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留、結晶化等を適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００７８】
例えば、ＤＬ−スレオ−フェニルセリンを原料として本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼを作用させ、Ｄ−スレオ−フェニルセリンを分解してフェニルピルビン酸とアンモニアに変換後、Ｌ−スレオ−フェニルセリンを生成する場合であれば、反応終了液を遠心分離や膜濾過により除菌し、限外濾過などにより除蛋白したのちに、濾過液を濃縮し、硫酸等により濃縮液のｐＨを2以下に低下した後に、酢酸エチルなどの溶媒によりフェニルピルビン酸を抽出し、水相のｐＨを等電点付近（ｐＨ６程度）に調製したあと、晶析することにより精製することができる。
【００７９】
本発明の方法により生成されたＬ−β−ヒドロキシアミノ酸の光学純度（enantiomeric excess;ee）は、好ましくは80％ee以上、より好ましくは90％ee以上、さらにより好ましくは99％ee以上を有する。生成物の光学純度は、反応生成物の光学分割カラムなどによる解析によって確認できる。
【００８０】
また、本発明の酵素を機能的に発現する微生物等の形質転換体を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることによって、光学活性なＬ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造を行うこともできる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。また、上記方法に使用される微生物としては、配列番号：１に記載のタンパク質を機能的に発現する異種の形質転換体、例えば、pPSDAで形質転換された大腸菌などを挙げることができる。
【００８１】
本発明におけるＤ−フェニルセリンデアミナーゼを含む形質転換体の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したもの、精製酵素、形質転換体や酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物などが含まれる。
【００８２】
本発明の好ましい態様においては、本発明のＤ−フェニルセリンデアミナーゼもしくはＤ−フェニルセリンデアミナーゼを発現する形質転換体、もしくは該形質転換体の処理物、をＤＬ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用させ、Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造することを特徴とする、Ｌ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法を提供する。
【００８３】
本発明の酵素を用いた反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエステルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８５】
［実施例１］  D-スレオ-3-フェニルセリン（以下、フェニルセリンをPSと略す）を資化する微生物のスクリーニング
高知大学内などの土壌36カ所から土壌、泥などを集め、５ｍＬの滅菌水に懸濁し、その5μＬをD-threo-3-PS培地（0.5% D-threo-3-PS、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、0.2% NaOH、0.01% MgSO4・7H2O、0.01% 酵母エキス、ｐＨ７．５）1.5 mLに添加し、30℃で7-14日間振盪培養した。
白濁した培養液50μLを同組成の寒天培地に塗布し、30℃で1日培養し、単菌を分離した。
分離した菌をD-threo-PS培地で培養し、菌体を集菌、破砕後、D-PSデアミナーゼ活性をDNP法により測定した結果、5株 (TKS1, TKS2, P-9-3, P-10-9, P-16-7)に活性が確認できた。
【００８６】
［実施例２］  フェニルピルビン酸生成の確認
20 mM D-threo-PS、200 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 7.5）、20μM ピリドキサール-5’-リン酸（以下、PLPと略す）及び粗酵素液を含む1 mLの反応液を30℃、30分間反応させ、15分間煮沸して反応を停止し、遠心分離により沈殿物を除いた。
【００８７】
800 mM アンモニア緩衝液 (pH 8.5)、0.1 mM NADH、上記版の上終了液の上清0.5 mLにL-フェニルアラニン脱水素酵素を加え（計1 mL）て反応を行い、340 nmの吸光度の変化を追跡した。反応終了液にフェニルピルビン酸を含む場合にはＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の作用により吸光度の減少が見られ、上記5株がL-threo-3-PSの分解に付随してフェニルピルビン酸を生成していることが確認され、これらの株が目的とするD-PSデアミナーゼを生産していることが示唆された。
【００８８】
［実施例３］菌株の同定
菌株の同定は、16S-rDNA配列の解析により行った。
2種類のプライマー（16S-1541R 及び 16S-9F）、各コロニー、ExTaq（タカラバイオ製）を用いてＰＣＲを行った（前処理: ９４℃、５分; 変性: ９４℃、４５秒; アニール: ５５℃、1分; 伸長: ７２℃、２分を３５サイクル）。
【００８９】
増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドを単離し、その塩基配列を解析した。
配列番号3
16S-1541R: 5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’
配列番号4
16S-9F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
【００９０】
［実施例４］TKS1株の16S-rDNA配列
TKS1株の16S-rDNA配列を解析した結果、16S-9Fプライマーより配列番号5に示した配列が、16S-1541Rより配列番号6に示した配列が得られた。得られた配列を用いて分子系統解析を行った結果、TKS1株は アルスロバクター・エスピー (Arthrobacter sp.) と同定された。
【００９１】
BLASTをもちいたアポロンDB-BA 4.0（テクノスルガ製）に対する相同性検索の結果、TKS1株の16S rDNA 塩基配列はアルスロバクター（Arthrobacter） 由来の16S rDNA に対し高い同一性を示し、アルスロバクター・ニトログアジャコリカス（Arthrobacter nitroguajacolicus） G2-1株の16SrDNAに対し相同率99.7%の最も高い同一性を示し、次いでアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens） DSM20116株の16S rDNAに対し相同率99.5%の高い同一性を示した。
【００９２】
TKS1株の16S rDNAとアポロンDB-BA4.0に対する相同性検索上位15株の16S rDNAをもちいて行った簡易分子系統解析の結果、TKS1株はアルスロバクター・アウレッセンスの16S rDNAとクラスターを形成し近縁であることが示され、次いでアルスロバクター・ニトログアジャコリカスにも近縁であることが示された(図1)。これらの結果より、TKS1株をアルスロバクター・アウレッセンスおよびアルスロバクター・ニトログアジャコリカスに近縁なアルスロバクター・エスピーであると判断した。
【００９３】
細菌第一段階試験の結果、TKS1株は運動性を有さないグラム陽性梓菌で、培養時間の経過につれて形態が変化する梓菌−球菌生活環を示し、普通寒天培地上のコロニーは黄色を呈し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した。これらの性状は16S rDNA塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたアルスロバクター（Arthrobacter）の性状と矛盾しなかった。
【００９４】
APlキットを使った試験の結果、TKS1株は硝酸塩を還元せず、ピラジンアミダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-グルコシダーゼおよびN-アセチルーβ-グルコサミニダーゼ活性を示し、エスクリンおよびゼラチンを加水分解した。またTKS1株は嫌気条件および6% NaCl下で生育せず、でんぷんおよびカゼインを加水分解し、リパーゼ活性を示さず、抗酸染色陰性を示した。これらの性状は16S rDNA塩基配列解析の結果において近縁性が示唆されたアルスロバクター・ニトログアジャコリカスやアルスロバクター・アウレッセンスの性状と類似したものの、相違点も認められる。特に、運動性およびオキシダーゼ活性を示さず、6% NaClで生育しないことはアルスロバクター・ニトログアジャコリカスの性状と異なり、硝酸塩を還元せず、嫌気条件下で生育しない点などはアルスロバクター・アウレッセンスの性状と異なる。
【００９５】
以上の生理学的、生化学的同定の結果は、16S rDNA塩基配列解析の結果と矛盾せず、TKS1株をアルスロバクター・アウレッセンスおよびアルスロバクター・ニトログアジャコリカスに近縁なアルスロバクター・エスピーとすることが妥当と判断した。
【００９６】
［実施例５］TKS2株の16S-rDNA配列
TKS2株の16S-rDNA配列を解析した結果、配列番号7に示した配列が得られた。得られた配列を用いて分子系統解析を行った結果、TKS2株は、 ボルデテラ・ペトリー(Bordetella petrii)と同定された。
【００９７】
［実施例６］P-9-3株の16S-rDNA配列
P-9-3株の16S-rDNA配列を解析した結果、配列番号8に示した配列が得られた。得られた配列を用いて分子系統解析を行った結果、P-9-3株はシュードモナス・プチダ (Pseudomonas putida)と同定された。
【００９８】
［実施例７］P-16-7株の16S-rDNA配列
P-16-7株の16S-rDNA配列を解析した結果、16S-9Fプライマーより配列番号9に示した配列が、16S-1541Rより配列番号10に示した配列が得られた。得られた配列を用いて分子系統解析を行った結果、P-16-7株はステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophylia)と同定された。
【００９９】
[実施例８] タイプストレインにおける-PSデアミナーゼ活性
土壌より単離された菌株の同定結果を元に、各種のタイプストレインのD-PSデアミナーゼを測定した。
アルスロバクター・アウレッセンスNBRC 12136株、アルスロバクター・ニトログアジャコリナス JCM 14115、アクロモバクター・キシロースオキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）NBRC 15126株、ステノトロフォモナス・マルトフィリアNBRC 14161 株、ボルデテラ・ペトリー DSM 12804株をそれぞれ培養し、D-PSアミナーゼ活性を測定した。まず、これらの菌株を栄養培地（アルスロバクター・アウレッセンス、アクロモバクター・キシロースオキシダンスおよびステノトロフォモナス・マルトフィリア：1% ポリペプトン、0.2% 酵母エキス、0.1% MgSO4・7H2O、(1.5% 寒天)、pH 7.0）、または、LB培地（ボルデテラ・ペトリー：1.0% ポリペプトン、1.0% 酵母エキス、0.5% NaCl、(2.0% 寒天)、pH 7.2）、およびフェニルセリン培地（0.5% DL-フェニルセリン (PS)、0.2% K2HPO4、0.2% KH2PO4、0.2% NaCl、0.01% MgSO4・7H2O、0.01% 酵母エキス、(2.0% 寒天)、pH 7.5）で培養した。
培養菌体を集菌、超音波破砕 (100 mM Tris-HCl (pH 7.5)を使用)、遠心分離し、上清を調製後、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン法によりデアミナーゼ活性を測定した。
【０１００】
酵素活性を測定した結果を表１に示した。
その結果、4種全ての菌株がD-PSアミナーゼ活性を有する酵素を有することが判明した。得られた比活性を比較した結果、アルスロバクター・エスピー TKS1株が最も高い活性を有することが明らかになった。
【０１０１】
【表１】
2010187658.tif 000004
【０１０２】
［実施例９］TKS1株培養における誘導物質の効果
TKS1株を0.5% D-threo-3-PS培地、D-threo-3-PS培地のD-threo-3-PSの代わりに0.4% D-グルコース及び 0.5% 塩化アンモニウムを含む非誘導培地で30℃、4日間培養し、集菌、菌体破砕後、D-PSデアミナーゼ活性を測定した。その結果、表２に示したように、非誘導培地に比較してD-PS培地では、比活性、総活性とも高い結果となり、本酵素がD-threo-PSにより誘導されることが示された。
【０１０３】
【表２】
2010187658.tif 000005
【０１０４】
［実施例10］TKS1株からのD-PSデアミナーゼの精製
TKS1株の菌体25 g を100 mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 7.5)及び 1 mM フェニルメタンスルホニルフルオリド (PMSF) に懸濁し、超音波により菌を破砕した。遠心分離の上清から、40-60% 硫安沈殿、DEAE-トヨパールイオン交換カラム(3.0 × 29 cm)に供し、洗浄後、0-0.5 M 塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。活性画分を集め、濃縮後、35%硫安飽和にした後、35%飽和硫安で平衡化したブチル−トヨパールカラム(2.5 × 25 cm)に供した。硫安濃度を35-0%の勾配溶出を行い、活性画分を回収した。得られた酵素液を濃縮後、Superose 12カラム (1.0 × 30 cm) を用いたゲル濾過を行い、活性画分を集めた。
精製の要約を表３に示した。
【０１０５】
【表３】
2010187658.tif 000006
【０１０６】
［実施例11］TKS1株由来D-PSデアミナーゼの部分アミノ酸配列の解析
Superose 12における溶出画分をSDS-PAGEで解析した結果、最も高い活性を示したNo.48画分において45 kDa 付近のバンドが最も太くなったことから、このバンドをPVDF膜に転写し、プロテインシーケンサーでN末端アミノ酸配列を解析した。
その結果、得られた配列を配列番号11に示した。
配列番号11
MNTSEAISANAVAGL
【０１０７】
［実施例12］45 kDa バンドのアミノ酸配列を用いた相同性検索
配列番号11のアミノ酸配列を用い、DDBJを利用して相同性検索を行った結果、最も高い同一性を示したのは、アルスロバクター・アウレッセンス TC1株のゲノム解析に由来する予想ORF (ID=A1RBW8_ARTAT) と15アミノ酸のうち13アミノ酸が一致した。
【０１０８】
本ORFは、機能未知タンパク質であり、アノテーションの結果、putative amino acid aldolase or racemase と推定されていた。
【０１０９】
［実施例13］45 kDa バンドをコードするDNAのクローニング
実施例10により得られたN末端アミノ酸配列、及び、最も同一性の高かったORF (ID=A1RBW8_ARTAT)のDNA配列を元に、2種類のPCRプライマー ArDPSDA-N (配列番号12) 及びArDPSDA-C (配列番号13)を調製した。
配列番号12
5’-GGAATTCCATATGAACACTTCCGAAGCCATCTC-3’
配列番号13
5’-CCCAAGCTTCTAGAAGAAGGTATGGATGAGGTCG-3’
【０１１０】
これらのプライマーを用い、TKS1株より Ultra Clean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO社) を用いて精製したゲノムDNAを鋳型にPfuUltra を用いてPCRを行った（熱変性: 95℃, 30秒; アニーリング: 55℃, 30秒; 伸長: 72℃, 1分; 25 cycles）。PCR増幅産物を制限酵素 NdeI 及びHindIIIにより硝化し、同制限酵素で消化したベクター pET21a(+) とライゲーションした。ライゲーション液でE. coli DH5α株を形質転換した。得られた形質転換株を100mg/L アンピシリンを含むLB培地に植菌し、培養した。培養終了後、菌体よりプラスミドを HiYieldTM Plasmid Minikit (RBC)を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドをpPSDAとした。
【０１１１】
［実施例14］形質転換株のD-PSデアミナーゼ活性の確認
得られたプラスミドによりE. coli BL21(DE3)及び E. coli Rosetta2(DE3)を形質転換し、形質転換株を得た。形成したコロニーを100 mg/L アンピシリン及び30 mg/L クロラムフェニコールを含むLB培地に植菌し、37℃で16時間培養後、1 mM IPTG（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、更に3時間誘導培養した。
菌を集菌し、無細胞抽出液を調製し、各種基質に対するデアミナーゼ活性を測定した。
また、プラスミドを含まない宿主のみも同様に培養し、コントロールとして用いた。
【０１１２】
酵素活性を測定した結果を表４に示した。
その結果、形質転換株では D-threo-PSに対して宿主に比較して優位に高いデアミナーゼ活性を示し、クローニングした遺伝子が、D-PSデアミナーゼをコードすることが確認できた。
【０１１３】
【表４】
2010187658.tif 000007
BL21：宿主のみコントロール
BL21 (pPSDA)：形質転換株
【０１１４】
［実施例15］DNA配列の解析
pPSDAの挿入DNAの塩基配列を解析した結果、配列番号2に記載のDNA配列が得られた。この配列より予想されるアミノ酸配列を配列番号1に示した。
【０１１５】
［実施例16］得られたアミノ酸配列を元にした相同性検索
配列番号1に記載のアミノ酸配列を元にDDBJを利用して相同性検索を行った結果、最も高い同一性を示したのは、N末端アミノ酸配列を用いた相同性検索と同じアルスロバクター・アウレッセンス TC1株のゲノム解析に由来する予想ORF (ID=A1RBW8_ARTAT)の82%であった。
【０１１６】
［実施例17］TKS2株およびP-9-3株のPSDA活性
１）菌株の単離
研究室保存株のTKS2、P-9-3株をDL-フェニルセリン（PS）液体培地で4日間、30℃で振とう培養した。そして、それぞれの培養液を生理食塩水で104倍希釈、106倍希釈してDL- PS平板培地へ塗布し、コロニー形成を確認した。形成されたコロニーの中から、目視によって色や質感が異なるコロニーを選び、DL-PS液体培地で4日間、30℃で振とう培養した。増殖の見られた培養液を遠心分離し、得られた菌体の粗抽出液中のPSDA活性を測定した。なお、集菌前に培養液をDL-PS、LB平板培地へ植菌し、保存した。
DL-PS平板培地に植菌した単離菌株を再びDL-PS液体培地で培養し、同じ方法でPSDA活性を測定した（再現性の確認）。
【０１１７】
２）PSDA活性測定とタンパク質定量
2,4-dinitrophenylhydrazine法に従ってPSDA活性測定をした。20 mM D-スレオ-3-フェニルセリン、200 mM Tris-HCl (pH7.5)、20 μM PLP、200 μl 粗抽出液から成る全量0.5 mlの反応液を調製し、一定時間30℃で反応させた。その後、1N HClを0.5 ml加えて反応を停止し、0.1% 2,4-ジニトロフェニルヒドラジン-2N HClを0.15 ml加え、30℃で20分間反応させた。その後、3N NaOHを0.85 ml加え、10分間30℃で反応させた後、分光光度計（SHIMADZU UV-1200 SPECTROPHOMETER） でABS440nmを測定した。なお、反応開始前に1NのHClを0.5 ml加えて、同じように各菌体の粗抽出液を加えたものをコントロールとした。
タンパク質定量はCopper-Folin法で行った。
【０１１８】
研究室保存株から単離した菌株のPSDA活性
【表５】
2010187658.tif 000008
【０１１９】
PSDA活性の再現性
【表６】
2010187658.tif 000009
【０１２０】
最も比活性の高かった菌株は、TKS2からの単離株（２）の比活性0.0018 U/mg、P-9-3からの単離株（１）の比活性0.0019 U/mgであった。
【０１２１】
［実施例18］形質転換体からのＤ−フェニルセリンデアミナーゼの精製
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼを発現するためのプラスミド pPSDA を含む大腸菌 BL21 (DE3) 株をアンピシリンを含むLB培地で培養し、16時間後にIPTGを添加して更に3時間培養し、酵素を発現させた。
培地約1.75Lより得られた菌を破砕し、Butyl-トヨパールによる疎水クロマトグラフィー、DEAE-トヨパールによるイオン交換クロマトグラフィーを実施例10と同様に行い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) において単一バンドまで精製し、酵素科学的性質の検討に用いた。尚、精製の要約を以下の表７に示した。
【０１２２】
【表７】
2010187658.tif 000010
【０１２３】
［実施例19］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの基質特異性
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの酵素活性測定条件において、基質を替えて測定した結果を下表８に示した。本酵素はＤ−β−ヒドロキシアミノ酸に特異的に作用することが示された。
【０１２４】
【表８】
2010187658.tif 000011
【０１２５】
［実施例20］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの反応最適ｐＨ
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの酵素活性測定条件において、ｐＨを酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化カリウム−塩化カリウム緩衝液を用いてｐＨ５．０から１１．０まで変化させて活性を測定した結果を図２に示した。
その結果、最大活性はトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で示され、ｐＨ７．５−８．５において最大活性の８０％以上の活性が示された。
【０１２６】
［実施例21］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの反応最適温度
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの酵素活性測定条件において、反応温度を変えて活性を測定した結果を図３に示した。
本酵素は、ｐＨ７．５の条件において５５℃で最大活性を有し、５０−６０℃において最大活性の８０％以上の相対活性を示した。
【０１２７】
［実施例22］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの耐熱性
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼを各温度で30分間インキュベートしたのち、残存活性を測定した。その結果を未処理の活性を１００とした相対活性で図４に示した。
本酵素は、５５℃まで８０％以上の残存活性を示した。
【０１２８】
［実施例23］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼに対するピリドキサール−５'−リン酸の影響
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの反応液に水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジンを各２０ｍＭ添加して活性を測定した結果、表９の結果となり、本酵素がＰＬＰ依存性酵素である可能性が示唆された。
【０１２９】
【表９】
2010187658.tif 000012
【０１３０】
［実施例24］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼに対する金属イオン等の影響
Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼの活性測定において、各種金属イオン、エチレンジアミン４酢酸などを１ｍＭ添加し、活性への影響を検討し、表１０に示した。
本酵素は、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化バリウム、塩化コバルトにより活性化され、塩化カリウム、EDTAにより阻害されることが示された。
【０１３１】
【表１０】
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【０１３２】
［実施例25］Ｄ−フェニルセリンデアミナーゼによるＬ−ｔｈｒｅｏ−β−フェニルセリンの合成
pPSDA を含む大腸菌 BL21 (DE3) 株を培養し、菌体を調製した。培養菌体（培養液12 mL相当）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０２ｍＭ ＰＬＰ、１％ ＤＬ−スレオ−フェニルセリンを含む４ｍＬの反応液を３０℃、24時間反応し、反応液を除菌後、SUMICHIRAL OA-5000 を用いて光学純度を測定した結果、100%ee のＬ−スレオ−フェニルセリンが約20%の収率で得られた。
移動相：0.5 mM 酢酸銅(II), 100 mM 酢酸アンモニウム pH 5.5 / 2-プロパノール =  92.5 / 7.5
流速：1.0 mL/min
カラム温度：45℃
検出：UV280nm
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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