(57)【要約】      （修正有）【課題】基質特異性の低い脂肪族アミノ酸水酸化酵素を開発し、該酵素を用いて、基質分子を替えるだけでさまざまな脂肪族アミノ酸の水酸化物を製造することができる脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法を提供する。【解決手段】２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒するＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼと、Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法。Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法は、特定のアミノ酸配列からなるＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼを、脂肪族アミノ酸に対して作用させて、該脂肪族アミノ酸の水酸化物を得るステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒することを特徴とする、Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼ。
【請求項２】
前記Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは、
（１）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号１、３又は５のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号１、３又は５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼ。
【請求項３】
２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒するＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼと、脂肪族アミノ酸とを用意するステップと、
前記Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼを前記脂肪族アミノ酸に対して作用させて、該脂肪族アミノ酸の水酸化物を得るステップとを含むことを特徴とする、Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法。
【請求項４】
前記Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは、
（１）配列番号２、４、６又は８のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号２、４、６又は８のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号２、４、６又は８のうちいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号１、３、５又は７のうちいずれか１つのヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号１、３、５又は７のうちいずれか１つのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項３に記載のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする、形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸水酸化物の製造方法に関し、より具体的には、脂肪族アミノ酸水酸化酵素を利用する、脂肪族アミノ酸水酸化物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４-ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンをはじめとする脂肪族アミノ酸の水酸化物には、２型糖尿病治療薬としての薬効があるものが知られている。これらのうち最も有名なものは生薬胡廬巴（コロハ）又はスパイスのフェヌグリークとして知られるマメ科植物トリゴネラ・フォエナム−グラエクム（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ  Ｌ．）から精製された４−ヒドロシキ−Ｌ−イソロイシン（以下、「４−ＨＩ」という。）である（非特許文献１）。４−ＨＩはラット膵臓及びヒト膵島でインスリン分泌を促進する活性を示す。
【非特許文献１】Ｂｒｏｃａ、Ｃ．ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  、２７７：  Ｅ６１７−Ｅ６２３（１９９９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
４−ＨＩは、フェヌグリーク抽出液中のイソロイシン水酸化酵素を用いて製造することができる（非特許文献２）。しかし、当該酵素は同定されておらず、酵素はフェヌグリークの抽出液からしか得られないため、大量に取得できない。また、当該酵素は不安定であるため、フェヌグリーク抽出液中のイソロイシン水酸化酵素を用いる４−ＨＩの製造方法は、工業的生産法としては不十分である。
【非特許文献２】Ｈａｅｆｅｌｅら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  ４４：  ５６３−５６６  （１９９７）．  ４−ＨＩの製造方法として報告されているものは、他に、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸アルドラーゼと分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをカップリングさせ、アセトアルデヒドと２−オキソブタン酸から４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を経由し、４−ＨＩを合成する方法がある（特許文献１、非特許文献３及び４）。さらに、原料である２−オキソブタン酸をスレオニンデヒドラターゼによって、スレオニンから供給する方法も公開されている（特許文献２）。しかしこれらの酵素は、基質の光学的特異性が低いため、医薬品として有用な４−ヒドロキシイソロイシン：２Ｓ，３Ｒ，４Ｓのほかに生理活性がない２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ体を副生すること、多段階反応であるため反応効率が低いこと等の課題がある。
【特許文献１】特開２００８−１０９９２４号公報
【非特許文献３】Ｏｇａｗａ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７１：  １６０７−１６１５  （２００７）．
【非特許文献４】Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｓ．Ｖ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，  ２７３：７０−７７  （２００７）
【特許文献２】特開２００８−０７３０３７号公報  バチルス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のＬ−イソロイシン４−ヒドロキシラーゼ（イソロイシン  ジオキシゲナーゼ）はＬ−イソロイシンを基質として４−ＨＩを合成することができるが、この酵素は基質特異性が厳格で、Ｌ−イソロイシン以外のアミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン及びＤ−イソロイシン）と反応しないとの報告（特許文献３）がある。４−ＨＩと類似の構造を有する化合物である、γ−ヒドロキシノルバリン及びγ−ヒドロキシバリンの一部の立体異性体についても、ラット膵島でのインスリン分泌を促進する活性が示されている（非特許文献５）。今後、脂肪族アミノ酸の水酸化物の生物活性を広範に調べるためには、基質特異性の低い脂肪族アミノ酸水酸化酵素を開発し、該酵素を用いて、基質分子を替えるだけでさまざまな脂肪族アミノ酸の水酸化物を製造することができる脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法を開発する必要がある。
【非特許文献５】Ｂｒｏｃａ、Ｃ．ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  、３９０：３３９−４５（２０００）．
【特許文献３】特開２００８−１７３１１６号公報
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼを提供する。本発明の脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する。
【０００５】
本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは、（１）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１、３又は５のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１、３又は５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【０００６】
本発明は脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法を提供する。本発明の脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法は、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒するＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼと、脂肪族アミノ酸とを用意するステップと、前記Ｌ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼを前記脂肪族アミノ酸に対して作用させて、該脂肪族アミノ酸の水酸化物を得るステップとを含む。
【０００７】
前記２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼは、（１）配列番号２、４、６又は８のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号２、４、６又は８のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２、４、６又は８のうちいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１、３、５又は７のうちいずれか１つのヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１、３、５又は７のうちいずれか１つのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【０００８】
本発明は、本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【０００９】
本発明は、本発明の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
【００１０】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のタンパク質は、脂肪族アミノ酸に対するヒドロキシラーゼ活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の製造方法に使用されてもよい。
【００１１】
本明細書において、ジオキシゲナーゼ又はヒドロキシラーゼとは、基質分子のいずれかの原子を水酸化する酵素活性（以下、「ヒドロキシラーゼ活性」という。）を有するいずれかのタンパク質をいう。本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸に対してヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質は、いかなる生物種に由来するタンパク質であってもよい。本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸に対してヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質は、グレオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）等のグレオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属と、シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）等のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属と、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）等のクロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属と、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スフェリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属と、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）その他のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属と、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属と、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属とを含む細菌と、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属を含む糸状菌又は菌類と、古細菌と、植物と、動物とを含むいずれかの生物から由来する場合がある。本発明のヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質は、グレオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＰＣＣ  ７４２１由来のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｌｒ２６０２のタンパク質（以下、「ｇｌｒ２６０２タンパク質」という。）と、シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）１４４８Ａ由来のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＰＳＰＰＨ＿３９８６のタンパク質（以下、「ＰＳＰＰＨ＿３９８６タンパク質」という。）と、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＮＢＲＣ  １２６１４Ｔ由来のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＶ＿３３０８のタンパク質（以下、「ＣＶ＿３３０８タンパク質」という。）と、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７９由来のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ＿１０６１のタンパク質（以下、「ＢＣ＿１０６１タンパク質」という。）とを含むが、これに限られない。
【００１２】
ｇｌｒ２６０２タンパク質をエンコードする６５４個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号１に列挙され、ｇｌｒ２６０２タンパク質の２１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号２に列挙される。ＰＳＰＰＨ＿３９８６タンパク質をエンコードする７２０個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号３に列挙され、ＰＳＰＰＨ＿３９８６タンパク質の２３９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号４に列挙される。ＣＶ＿３３０８タンパク質をエンコードする９２４個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号５に列挙され、ＣＶ＿３３０８タンパク質の３０７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号６に列挙される。ＢＣ＿１０６１タンパク質をエンコードする７５３個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号７に列挙され、ＢＣ＿１０６１タンパク質の２５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号８に列挙される。
【００１３】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００１４】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００１５】
本明細書において「ヒドロキシラーゼ活性」とは、基質分子に作用し、該基質分子のいずれかの炭素原子を水酸化する反応を行う能力をいう。
【００１６】
本明細書において「脂肪族アミノ酸」とは、側鎖に脂肪族炭化水素を含むアミノ酸をいう。本明細書における脂肪族アミノ酸は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンのように、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸に含まれる脂肪族アミノ酸と、Ｌ−ノルバリン、Ｌ−ノルロイシンのようなＬ−アミノ酸と、これらの光学異性体である、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ノルバリン及びＤ−ノルロイシンとを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を触媒する２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼである。本発明のＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは、２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスコルビン酸及び２価の鉄イオンの存在下で脂肪族アミノ酸のＬ−体及びＤ−体の水酸化反応を行うことが好ましい。
【００１８】
本発明の製造方法により取得される脂肪族アミノ酸の水酸化物は、イオン交換樹脂その他の担体への特異的吸着、薄層クロマトグラフィ法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法その他のクロマトグラフィ法、有機溶媒による抽出、結晶化等の当業者に周知の方法により回収される。また、前記ペプチドは、ＨＰＬＣ又は質量分析（ＭＳ）法のような当業者に周知の分析技術を使用して生産量又は純度が評価される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
脂肪族アミノ酸水酸化酵素をエンコードする遺伝子のクローニング
実施例に用いた脂肪族アミノ酸水酸化酵素を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2010098975.tif 000002
【００２２】
目的とするＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼの遺伝子の増幅は、それぞれの微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いて行った。ＰＣＲは、９４°Ｃで１８０秒を１サイクルと、９４°Ｃで１５秒、５０°Ｃで１０秒及び７２°Ｃで５０秒を２５サイクルと、７２°Ｃで４２０秒を１サイクルとの反応条件で行なった（表２）。
【００２３】
【表２】
2010098975.tif 000003
【００２４】
以下の表３に脂肪族アミノ酸水酸化酵素のそれぞれのクローニング及び発現の条件を示す。それぞれの酵素の遺伝子の単離に使うプライマーの塩基配列は配列番号９−１６に列挙される。
【００２５】
【表３】
2010098975.tif 000004
【００２６】
目的とする脂肪族アミノ酸水酸化酵素の遺伝子のＰＣＲ増幅ＤＮＡ  １μｇと、ベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）  １μｇとが、ともに制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで３７°Ｃ、１６時間消化された。その後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）で精製された前記ＤＮＡは、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ）で１６°Ｃ、３時間反応することによって連結され、大腸菌ＪＭ１０９株に導入された。前記大腸菌は、ＬＢ−Ａ寒天培地（１％  トリプトン、０．５％  イーストエクストラクト、１％  塩化ナトリウム、１．５％  アガー及び１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）上で３７°Ｃ、１６時間静置培養され、組換えプラスミドを保持した大腸菌の単一コロニーが単離された。単一コロニー由来の大腸菌は、ＬＢ−Ａ液体培地（１％  トリプトン、０．５％  イーストエクストラクト、１％  塩化ナトリウム及び１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）５ｍＬ中で３７°Ｃ、１６時間培養され、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドが抽出された。抽出されたプラスミドに挿入されたＤＮＡは、ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ）で解析され、目的とする脂肪族アミノ酸水酸化酵素の遺伝子が挿入されていることが確認された。
【実施例２】
【００２７】
脂肪族アミノ酸水酸化酵素の発現及び精製
実施例１で得られた組換えプラスミドで大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）が形質転換された。前記大腸菌は、ＬＢ−ＡＣ寒天培地（１％  トリプトン、０．５％  イーストエクストラクト、１％  塩化ナトリウム、１．５％  アガー、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）を用いて３７°Ｃで一晩静置培養された。生育した単一コロニーは、ＬＢ−ＡＣ液体培地（１％  トリプトン、０．５％  イーストエクストラクト、１％  塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）５ｍＬに接種され、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで１６時間振盪培養を行った。その後前記液体培地１ｍＬが１００ｍＬの新鮮なＬＢ−ＡＣ液体培地に接種され、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで振盪培養された。Ｏ．Ｄ．６６０が０．５に達した時点で、終濃度が０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され、２５°Ｃ及び１００ｒｐｍで９時間の振盪培養により遺伝子発現が誘導された。前記液体培地から４°Ｃ及び５０００×ｇで１０分間遠心分離して回収した菌体を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁し、３分間の超音波破砕後、４°Ｃ及び２００００×ｇで３０分間遠心分離した。回収した上清（無細胞抽出液）はＨｉｓ  ｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア）を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供され脂肪族アミノ酸水酸化酵素が分離された。その後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）により緩衝液の交換を行って、精製酵素が調製された。
【実施例３】
【００２８】
各種アミノ酸に対する水酸化反応
実施例２で得られた精製酵素を用いて各種アミノ酸に対する水酸化反応が実施された。前記精製酵素は２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼであると予測されたため、２−オキソグルタル酸を含む標準反応液（１ｍＭ  アミノ酸、５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸、０．１ｍＭ  硫酸第一鉄、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、０．５  ｍｇ／ｍＬ  各種精製酵素）を用いて酵素反応は行われた。前記標準反応液の組成は以下の表４に示す。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
表４に示す標準反応液を調製し、酵素添加後、２５°Ｃ、１７０  ｒｐｍで攪拌しながら２０時間インキュベーションした。その後、前記反応液は０．４５μｍフィルターを用いてろ過され、ＬＣ／ＭＳ分析に供された。なお、陰性対照試験として２−オキソグルタル酸非添加系試験及び酵素非添加系試験も併せて行った。
【実施例４】
【００３１】
ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析は、高速液体クロマトグラフ  Ｌ２０００シリーズ（日立製作所）により、ポストカラム分析法を用いて実施された。ＨＰＬＣ分析装置の構成を図１に示す。また、ＨＰＬＣ分析条件を表５に示す。
【００３２】
【表５】
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【００３３】
ＨＰＬＣ分析は、ポンプＡ及びポンプＢのそれぞれに溶離液及び反応液を接続し、オートサンプラーで注入された試料と前記溶離液とを分析カラムに適用して分離し、溶出液と前記反応液とを反応させてから蛍光検出器で測定することによって実行された。ポンプＡ溶離液の組成は、２０ｍＭ  リン酸バッファー、５ｍＭ  １−ヘプタンスルホン酸、１０％又は２０％メタノール（ｐＨ２．５）であり、ポンプＢ反応液の組成は、２２ｇ／Ｌ  ホウ酸、１２ｇ／Ｌ  水酸化ナトリウム、０．８ｇ／Ｌ  オルトフタルアルデヒド、２ｇ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステインであった。分析カラムはコスモシール  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ  ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ  分析カラム（ナカライテスク）が用いられ、カラム温度は４０°Ｃであった（表５−ａ）。ＨＰＬＣ分析のポンププログラムは、溶離液が０．７ｍＬ／分で２０分間、反応液が０．３ｍＬ／分で２０分間とした（表５−ｂ）。蛍光は、励起波長３４０ｎｍ、検出波長４５０ｎｍで測定された。
【００３４】
反応液のＨＰＬＣ分析をおこなった結果、陰性対照との比較により基質アミノ酸、２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスコルビン酸、硫酸第一鉄、精製酵素などの全てを反応系に含む場合にのみ検出されたピークを生成物のピークと判断した。ｇｌｒ２６０２タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−及びＤ−バリンと、Ｌ−及びＤ−ロイシンと、Ｌ−及びＤ−イソロイシンと、Ｌ−及びＤ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に生成物が検出された。図３−１２は、これらの基質を含む反応液の反応後のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャートである。図の中の数値は、それぞれの基質のピークの溶出時間と、生成物の最大ピークの溶出時間とである。ＰＳＰＰＨ＿３９８６タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−及びＤ−ロイシンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−及びＤ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に未知化合物のピークが検出された。ＣＶ＿３３０８タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−及びＤ−ロイシンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に未知化合物のピークが検出された。ＢＣ＿１０６１タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−ロイシンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に未知化合物のピークが検出された。４種類のタンパク質について検出された未知化合物の最大ピークの溶出時間を表６にまとめた。
【００３５】
【表６】
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【実施例５】
【００３６】
ＭＳ分析
ＨＰＬＣ分析において未知化合物のピークが検出されたサンプルを図２に示す手順に従って固相抽出カラムにより精製し、ＬＣＱ  Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑｕｅｓｔ）を用いてＭＳ分析を実施した。ＭＳ分析条件を表７に示す。
【００３７】
【表７】
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【００３８】
イオン化法はエレクトロスプレー法を用い、サンプルはシリンジによって直接注入した。Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅは２０  ａｒｂ、Ａｕｘ  Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅは２０  ａｒｂ、Ｓｐｒａｙ  Ｖｏｌｔａｇｅは５ｋＶ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｔｅｍｐは２００°Ｃ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｖｏｌｔａｇｅは１７Ｖ、Ｔｕｂｅ  Ｌｅｎｓ  ｏｆｆｓｅｔは５Ｖの設定で分析された。
【００３９】
ＭＳ分析の結果、ｇｌｒ２６０２タンパク質による酵素反応系で、Ｌ−及びＤ−バリンと、Ｌ−及びＤ−ロイシンと、Ｌ−及びＤ−イソロイシンと、Ｌ−及びＤ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に質量数が１６大きいプロトン付加イオンが検出された。図１３−２２は、これらの基質を含む反応液の反応後のＭＳ分析結果を示すＭＳチャートである。図の中の数値は、それぞれの基質の水酸化物の質量電荷比である。同様に、ＰＳＰＰＨ＿３９８６タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−及びＤ−ロイシンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−及びＤ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に、ＣＶ＿３３０８タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−及びＤ−ロイシンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に、ＢＣ＿１０６１タンパク質による酵素反応系においては、Ｌ−ロイシンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−ノルバリンと、Ｌ−及びＤ−ノルロイシンとを基質とした場合に、それぞれ質量数が１６大きいプロトン付加イオンが検出された。検出された生成物のプロトン付加イオンの質量電荷比を表８にまとめた。この結果から、ＨＰＬＣ分析で同定された未知化合物は基質に水酸基が導入された化合物といえる。
【００４０】
【表８】
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【００４１】
Ｌ−イソロイシンからの４−ＨＩの合成は、市販の４−ＨＩ試薬と反応産物とのクロマトチャート及びＭＳチャートを比較して評価された。その結果、実施例２で得られた精製酵素によってＬ−イソロイシンから得られる反応産物は４−ＨＩであるとの結論に達した。
【００４２】
本発明の脂肪族アミノ酸ジオキシゲナーゼは脂肪族アミノ酸のＬ−体だけでなくＤ−体の水酸化反応を触媒する点で他に例がない。したがって、本発明はＬ−及びＤ−脂肪族アミノ酸の水酸化物の工業生産にとって有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＨＰＬＣ構成の模式図。
【図２】イオン交換カラムによるサンプル精製手順を示す模式図。
【図３】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−バリンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図４】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−ロイシンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図５】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−イソロイシンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図６】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−ノルバリンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図７】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−ノルロイシンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図８】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−バリンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図９】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−ロイシンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図１０】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−イソロイシンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図１１】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−ノルバリンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図１２】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−ノルロイシンの水酸化反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトチャート。
【図１３】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−バリンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１４】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−ロイシンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１５】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−イソロイシンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１６】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−ノルバリンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１７】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＬ−ノルロイシンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１８】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−バリンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１９】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−ロイシンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図２０】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−イソロイシンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図２１】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−ノルバリンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図２２】ｇｌｒ２６０２タンパク質によるＤ−ノルロイシンの水酸化反応産物のＭＳ分析結果を示すＭＳチャート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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