(57)【要約】【課題】タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示すること。【解決手段】ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）との融合タンパク質を細胞表層に提示した微生物が提供される。また、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法であって、（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程；（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程；および（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、を含む方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）との融合タンパク質を細胞表層に提示した微生物。
【請求項２】
前記微生物が、グラム陰性菌または放線菌である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記放線菌が、コリネバクテリウム属細菌またはマイコバクテリウム属細菌である、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
前記ポーリンのアミノ酸配列が、前記微生物が本来有するポーリンに由来する、請求項１から３のいずれかの項に記載の微生物。
【請求項５】
前記ポーリンが、コリネバクテリウム属細菌由来のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣおよびＰｏｒＨからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１から４のいずれかの項に記載の微生物。
【請求項６】
タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法であって、
（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程、
（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程、および
（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表層は細胞の構造や形態を保持し、細胞を外界から隔離する隔壁としてだけではなく、物質の認識、シグナルの変換や伝達、および酵素反応の場として重要な役割を果たしている。近年、酵母や細菌の細胞表層に有用なタンパク質を発現させる、細胞表層提示技術が注目されている。
【０００３】
例えば、酵母の細胞表層には、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを利用して、リパーゼ、アミラーゼ類、セルラーゼ類などの種々の酵素が提示されている（例えば、特許文献１参照）。また、酵母においては、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用した細胞表層提示技術も開発されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
細菌の細胞表層へのタンパク質の提示については、グラム陽性菌であるバシラス（Bacillus）属細菌の細胞表層に局在するポリ-γ-グルタミン酸生合成酵素の一つであるＰｇｓＡを用いて種々検討され、グラム陽性菌や大腸菌などのグラム陰性菌の細胞表層に種々の外来タンパク質が提示されている。
【０００５】
例えば、ＰｇｓＡをアンカーとして用いて、ストレプトコッカス・ボヴァイス（Streptococcus bovis）１４８株由来のα−アミラーゼ（ＡｍｙＡ）を細胞表層に提示するように組換えられた、アミノ酸発酵能を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌が開示されている（特許文献３）。
【０００６】
一方、ＰｇｓＡをアンカーとして用いて、上記ＡｍｙＡやカンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）ＣＢＳ６６７８株由来のリパーゼＢなどを細胞表層に提示するように組換えられた、大腸菌が開示されている（特許文献４）。
【０００７】
しかし、上記のようなＰｇｓＡをアンカーとして用いて、コリネバクテリウム属細菌や大腸菌の細胞表層にタンパク質を提示する方法では、タンパク質の細胞表層への提示に必要とされるＰｇｓＡのアンカー部分が約１５０アミノ酸と比較的長いアミノ酸配列からなり、表層提示可能なタンパク質の大きさが制限されるという問題がある。また、細胞表層に提示されるタンパク質の一部が細胞表層から培地中に遊離するという問題がある。
【０００８】
このように、微生物の細胞表層に提示されるタンパク質の細胞表層からの遊離がなく、比較的小さいアンカータンパク質による細胞表層提示技術が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−２９００７８号公報
【特許文献２】国際公開２００２／０８５９３５号
【特許文献３】特開２００７−０８９５０６号公報
【特許文献４】特開２００５−３１２４２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）との融合タンパク質を細胞表層に提示した微生物を提供する。
【００１２】
一つの実施態様では、上記微生物は、グラム陰性菌または放線菌である。
【００１３】
ある実施態様では、上記放線菌は、コリネバクテリウム属細菌またはマイコバクテリウム属細菌である。
【００１４】
別の実施態様では、上記ポーリンのアミノ酸配列は、前記微生物が本来有するポーリンに由来する。
【００１５】
さらに別の実施態様では、上記ポーリンは、コリネバクテリウム属細菌由来のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣおよびＰｏｒＨからなる群から選択される少なくとも１種である。
【００１６】
本発明はまた、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法であって、（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程、（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程、および（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示することができる。また、本発明によれば、従来では不可能と思われていた、サイズの大きなタンパク質を効率よく細胞表層に提示した微生物が提供される。さらに、本発明によれば、ポーリンとの融合タンパク質を強固に細胞表層に固定した微生物が提供される。このような微生物は、大量に培養することが可能であり、細胞表層に提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に用いるプラスミドの構造を示す模式図である。
【図２】菌体の細胞壁画分をウェスタンブロッティング法で解析した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】菌体および培養上清のα−アミラーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図４】凍結乾燥菌体が粗トウモロコシデンプンを還元糖へ分解する活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の微生物は、ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）との融合タンパク質を細胞表層に提示するように形質転換された微生物であり、ポーリンをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを該微生物中に保有する。すなわち、本発明では、目的のタンパク質を微生物の細胞表層に提示するためのアンカーとしてポーリンを用いる。
【００２０】
本発明の微生物において、目的のタンパク質は、Ｎ末端側でポーリンのＣ末端側と連結され、融合タンパク質として発現される。すなわち、目的のタンパク質は、Ｎ末端側でポーリンを介して細胞表層に固定される。
【００２１】
本発明で用いるポーリン（Ｐｏｒｉｎ）は、グラム陰性菌および放線菌の細胞表層に存在するタンパク質であり、親水性物質を通過させる機能を有する。
【００２２】
放線菌に属するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌の細胞壁は、菌体の内側から順にペプチドグリカン、アラビノガラクタンおよび長鎖脂肪酸であるミコール酸からなる三つの層を有している。ポーリンは、三つの層の最も外側に位置するミコール酸の層に局在する。コリネバクテリウム属細菌では、ポーリンは現在４種類（ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣおよびＰｏｒＨ）が同定されている。コリネバクテリウム属細菌のポーリンは、分子量が４．７〜１３．２ｋＤａと非常に小さいが、ミコール酸の層内で多量体を形成している。
【００２３】
一方、大腸菌などのグラム陰性菌では、ポーリンは１種類のみ知られている。大腸菌のポーリンは、分子量が約３７ｋＤａと比較的大きく、三量体の形態で外膜に局在している。大腸菌のポーリンをコードする遺伝子はｏｍｐＦと呼ばれている。
【００２４】
本発明で用いるポーリンのアミノ酸配列は、いずれの微生物のポーリンに由来してもよいが、目的のタンパク質を細胞表層に提示する微生物が本来有するポーリンに由来することが好ましい。例えば、目的のタンパク質をコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の細胞表層に提示する場合には、コリネバクテリウム・グルタミカムのポーリンであるＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣまたはＰｏｒＨをアンカーとして用いることが好ましい。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのＰｏｒＨは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。
【００２５】
本発明において、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物としては、特に限定されないが、グラム陰性菌または放線菌が好ましく、コリネバクテリウム属細菌またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌がより好ましい。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）などが挙げられる。
【００２６】
本発明において、微生物の細胞表層に提示する目的のタンパク質としては、特に限定されないが、本来当該微生物の細胞表層に局在しないタンパク質であって、当該微生物の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、酵素、分泌性タンパク質、外来タンパク質（抗体、抗原、ワクチン、リガンド、蛍光タンパク質、プロテインＡおよびその誘導体など）などが挙げられる。酵素としては、アミラーゼ類、セルラーゼ類、リパーゼなどが挙げられる。
【００２７】
本発明で用いる目的のタンパク質は、分子量が７７ｋＤａ以上であってもよい。本発明では、タンパク質を微生物の細胞表層に提示するために分子量が比較的小さいポーリンをアンカーとして用いるので、たとえサイズが７７ｋＤａ以上と大きなタンパク質であってもポーリンとの融合タンパク質として容易に微生物の細胞表層へ提示することが可能である。
【００２８】
本発明で用いる分子量７７ｋＤａ以上のタンパク質としては、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼなどの酵素、抗体などが挙げられる。
【００２９】
本発明で用いる目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、生物から単離する方法、適切なプローブまたはプライマーを用いて生物のゲノムＤＮＡから選抜する方法、あるいは既知の配列に基づいて化学合成する方法によって得られる。
【００３０】
本発明において、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法は、（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程、（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程、および（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、を含む。
【００３１】
ポーリンをコードするＤＮＡとしては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのポーリンの一つであるＰｏｒＨの遺伝子（ｐｏｒＨ）のＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列からなる。本発明で用いるポーリンをコードするＤＮＡは、ポーリンの遺伝子ＤＮＡそのものはもちろん、ポーリンとして機能するタンパク質またはポリペプチドをコードする限り、（Ａ）ポーリンの遺伝子ＤＮＡの塩基配列において１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列、（Ｂ）ポーリンの遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｃ）ポーリンの遺伝子ＤＮＡと少なくとも８０％の配列相同性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列に由来する。
【００３２】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｔ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００）、および１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５０℃にて一晩保温する条件をいう。
【００３３】
本明細書において、配列相同性とは、２つのポリヌクレオチド間の残基の配列類似性をいい、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較することにより決定され得る。配列相同性は、両方の塩基配列の同一の位置に存在する同一の塩基の数を決定し、次いで、この数の、比較対象領域内の塩基総数に対する比として算出され得る。最適なアラインメントおよび配列相同性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常用いる種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。
【００３４】
ポーリンをコードするＤＮＡ、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡ、すなわちポーリンと目的のタンパク質との融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡは、例えば、上記ｐｏｒＨ遺伝子（配列番号１）を用いて構築することができる。ｐｏｒＨ遺伝子の少なくともアンカー部分（５’末端から第１６番〜１４１番目）を含む遺伝子断片の３’末端に、目的のタンパク質の遺伝子断片を連結した融合遺伝子断片を調製し、これを適切なプラスミドに挿入する。ポーリンと目的のタンパク質とは、直接連結されてもよく、あるいは数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介して連結されてもよい。
【００３５】
上記組換えＤＮＡを有するプラスミドは、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる宿主微生物で複製することができれば、特に制限はない。このようなプラスミドは、発現プラスミドの形態で宿主微生物に導入されてもよく、あるいは全体または一部が宿主微生物の遺伝子に挿入され、または宿主微生物の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。このようにして、上記組換えＤＮＡを有するプラスミドで、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物を形質転換する。
【００３６】
上記組換えＤＮＡは、プラスミドに含まれる適切なプロモーターの下流に連結されることが好ましい。プロモーターとしては、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物で機能するものであれば、特に制限はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌では、cspBプロモーター、ＨＣＥ（high-level constitutive expression）プロモーター、カナマイシンプロモーターなどが挙げられる。例えば、大腸菌では、T7プロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターなどが挙げられる。このようにプロモーターの下流に組換えＤＮＡが挿入されたプラスミドは、組換えＤＮＡを宿主微生物内で発現させるための発現プラスミドとして機能する。
【００３７】
上記組換えＤＮＡを有するプラスミドは、さらに選択マーカーおよび大腸菌で複製できる遺伝子を有することが、プラスミドの調製および形質転換体の検出の観点から好ましい。選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられる。また、必要に応じて分泌シグナル配列を有することが好ましい。さらに、組換えＤＮＡを効率よく発現させるために、遺伝子発現を調節するオペレーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列をさらに含むことが好ましい。例えば、大腸菌で複製し、コリネバクテリウム属細菌において用いることのできる選択マーカーを持つプラスミドとしては、pHSG298、pHSG398などが挙げられる。
【００３８】
このようにして、ポーリンをコードするＤＮＡ、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡ（目的のタンパク質をコードするＤＮＡが、アンカーとして用いるポーリンをコードするＤＮＡの３’末端側に連結した組換えＤＮＡ）を有するプラスミドが得られる。これらの組換えＤＮＡの単離、合成、連結、およびプラスミドへの挿入は、当業者が通常用いる手段により行われる。このようにして調製されたプラスミドは、当業者が通常用いる手段、例えば、エレクトロポレーション、ヒートショック法、プロトプラスト法などの方法により、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物（宿主微生物）に導入される。
【００３９】
上記組換えＤＮＡを有するプラスミドにより形質転換された微生物は、適切な培地を用いて培養され、選択マーカーを用いて選択される。あるいは、目的のタンパク質の活性を測定することにより選択される。目的のタンパク質が細胞表層に提示されていることは、例えば、目的のタンパク質に対するＩｇＧ抗体と、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認できる。
【００４０】
さらに、本発明の方法は、ランダムに変異を導入した種々のタンパク質（酵素、抗体、リガンドなど）を個々の微生物（クローン）の細胞表層に提示させ、コンビナトリアルライブラリー（遺伝子レベルでランダムに変異を導入し、タンパク質の多様性を人為的に拡大した種々の変異体の集合）として使用することもできる。このようなライブラリーから、目的に応じた最適な性質を有するクローンを迅速かつ簡便に選択することも可能である。
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００４２】
実施例  コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層へのα−アミラーゼの提示：ＰｏｒＨを用いた場合
（１）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの構築
図１（ａ）にＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの模式図を示す。コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に局在するタンパク質のポーリンの一つであるＰｏｒＨの遺伝子（ｐｏｒＨ）を単離するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムを鋳型とし、配列番号３のプライマー配列（ＢａｍＨＩ−ｐｏｒＨ−Ｆ）および配列番号４のプライマー配列（ｐｏｒＨ−ＥｃｏＲＶ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を得た。このｐｏｒＨ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、コリネバクテリウム・グルタミカム−大腸菌シャトルプラスミドであるプラスミドｐＣＣ（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541）の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨを得た。
【００４３】
ストレプトコッカス・ボヴァイス（Streptococcus bovis）１４８株由来のα−アミラーゼの一つであるＡｍｙＡの遺伝子（ａｍｙＡ）が挿入されたプラスミドｐＣＣＳ−ａｍｙＡ（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541）を鋳型とし、配列番号５のプライマー配列（ＥｃｏＲＶ−ａｍｙＡ−Ｆ）および配列番号６のプライマー配列（ａｍｙＡ−ＸｈｏＩ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を得た。このａｍｙＡ遺伝子を含むＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨの制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡを得た。
【００４４】
このプラスミド中のｐｏｒＨとａｍｙＡとが連結したＤＮＡの塩基配列は、ABI PRISM（登録商標）３１０ Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて、正しいことを確認した。
【００４５】
（２）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質を細胞表層に提示するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
上記（１）で得たプラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡを用いて、リジン生産株であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｃｍ株（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541）をエレクトロポレーション法により形質転換した。エレクトロポレーション法は、Gene Pulser（Bio-Rad社製）を用いて、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡとコリネバクテリウム・グルタミカムＣｍ株とを含有する溶液で満たした電極間距離０．２ｃｍのキュベットに電気パルス（２．５ｋＶ、２００Ωおよび２５μＦ）を負荷することにより行った。得られたプラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡを保有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣｍ株形質転換体を、以下Ｃｍ−ｐｏｒＨと称する。
【００４６】
（３）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認１
上記（２）で得たＣｍ−ｐｏｒＨを、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体培地（Difco Laboratories社製）中で３０℃にて４８時間培養した。培養培地を遠心分離（４℃、３５００ｇ×５分間）して菌体を分離し、菌体を遠心分離によりＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。菌体から抽出した細胞壁画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８ｗ／ｖ％ゲル）に供して（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Apr. 74: 1213-1220参照）、ウェスタンブロッティング法により解析した。ウェスタンブロッティング法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをポリビニリデンジフルオライド膜（Millipore社製）にエレクトロブロットし、この膜に、一次抗体としてウサギ抗ＡｍｙＡ抗体（ＩｇＧ）、次いで二次抗体としてアルカリフォスファターゼで標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させることにより行った。次いで、アルカリフォスフェートバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ９．０]，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３０ｍＬにニトロブルーテトラゾリウム（Promega社製）１８０μＬ、次いで５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（Promega社製）５０μＬを添加して染色液を調製した。ウェスタンブロッティング後の膜を染色液に浸して染色した。結果を図２に示す。
【００４７】
ＰｏｒＨおよびＡｍｙＡの分子量は、それぞれ約６ｋＤａおよび約７８ｋＤａであるため、ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は約８４ｋＤａの分子量であると予想される。図２より、予想されるＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の分子量の位置に抗ＡｍｙＡ抗体で認識されるバンドが確認され（レーン３）、ＡｍｙＡ（レーン５）と比較した分子量の相違がＰｏｒＨの分子量の約６ｋＤａであるため、ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に局在していることがわかった。
【００４８】
（４）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認１
上記（２）で得たＣｍ−ｐｏｒＨを、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＢＨＩ液体培地中で３０℃にて培養し、培養開始後２４、４８および７２時間にサンプリングした。サンプリングでは、１ｍＬの培養培地を遠心分離して培養上清と菌体とに分離し、菌体は遠心分離によりＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄して、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。このようにして調製した菌体および培養上清のα−アミラーゼ活性を、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン株式会社製）を用いて測定した（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Apr. 74: 1213-1220参照）。結果を図３に示す。
【００４９】
図３より、７２時間培養したＣｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性は約５０００Ｕ／Ｌであった。一方、Ｃｍ−ｐｏｒＨの培養上清からは、いずれの培養時間においてもα−アミラーゼ活性は検出されなかった。
【００５０】
（５）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認２
上記（４）と同様に回収・分離・洗浄した菌体にＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加して、菌体濃度がＯＤ６００＝２となるように調整した。このように調製した菌体懸濁液１ｍＬにトリプリンを添加し、トリプシンの最終濃度を２０ｍｇ／Ｌに調整した。この菌体とトリプリンとを含む液を、３７℃にて３時間インキュベートした。このようにトリプシン処理した菌体のα−アミラーゼ活性を上記（４）と同様に測定した。
【００５１】
トリプリン処理の結果、α−アミラーゼ活性は、未処理の場合の約６４％まで低下していることがわかった。この結果、ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の大部分がコリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に提示されていることが推定された。
【００５２】
（６）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認２
上記（２）で得たＣｍ−ｐｏｒＨを、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＢＨＩ液体培地中で３０℃にて２４時間培養した。培養培地を遠心分離して菌体を分離し、菌体を遠心分離により２０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）で洗浄して、−８０℃で凍結させた後、真空乾燥機を用いて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥菌体１０ｍｇを２０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）４ｍＬに再懸濁し、１．２％の粗トウモロコシデンプンを含有する等量の２０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）と混合した。この混合液を１５０ｒｐｍで振盪しながら４５℃にて３時間インキュベートした。粗トウモロコシデンプンから遊離された還元糖の量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（Methods Enzymol. 1988, 160: 87-112）により測定して、グルコース当量にて評価した。結果を図４に示す。
【００５３】
図４より、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性は約２２μｍｏｌグルコース／ｇ−dry cell／ｈであった。
【００５４】
比較例  コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層へのα−アミラーゼの提示：ＰｇｓＡを用いた場合
（１）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの構築
図１（ｂ）にＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの模式図を示す。バシラス（Bacillus）属細菌の細胞表層に局在するポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素の一つであるＰｇｓＡの遺伝子（ｐｇｓＡ）が挿入されたプラスミドｐＨＬＡ（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, Aug. 20: 1-9）を鋳型とし、配列番号７のプライマー配列（ＢａｍＨＩ−ｐｇｓＡ−Ｆ）および配列番号８のプライマー配列（ｐｇｓＡ−ＳａｃＩ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を得た。このｐｇｓＡ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を、上記実施例で用いたプラスミドｐＣＣの制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡを得た。
【００５５】
上記実施例で用いたプラスミドｐＣＣＳ−ａｍｙＡを鋳型とし、配列番号９のプライマー配列（ＳａｃＩ−ａｍｙＡ−Ｆ）および配列番号６のプライマー配列（ａｍｙＡ−ＸｈｏＩ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。このａｍｙＡ遺伝子を含むＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を、プラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡの制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡａｍｙＡを得た。
【００５６】
このプラスミド中のｐｇｓＡとａｍｙＡとが連結したＤＮＡの塩基配列は、ABI PRISM（登録商標）３１０ Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて、正しいことを確認した。
【００５７】
（２）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質を細胞表層に提示するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡの代わりに、上記比較例（１）で得たプラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡａｍｙＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｃｍ株を形質転換した。得られたプラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡａｍｙＡを保有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣｍ株形質転換体を、以下Ｃｍ−ｐｇｓＡと称する。
【００５８】
（３）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認１
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、細胞壁画分を抽出し、解析した。結果を図２に示す。
【００５９】
ＰｇｓＡおよびＡｍｙＡの分子量は、それぞれ約４３ｋＤａおよび約７８ｋＤａであるため、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は約１２１ｋＤａの分子量であると予想される。図２より、予想されるＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の分子量の位置に抗ＡｍｙＡ抗体で認識されるバンドが確認されるため（レーン４）、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に局在していることがわかった。
【００６０】
しかし、予想されるＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の分子量よりも小さい位置にも抗ＡｍｙＡ抗体で認識されるバンドが複数確認されるため（図２、レーン４）、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は、分解を受けているものと推定された。
【００６１】
（４）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認１
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、α−アミラーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。
【００６２】
図３より、７２時間培養したＣｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性は約１６００Ｕ／Ｌであった。この活性は、７２時間培養したＣｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性（約５０００Ｕ／Ｌ）と比較して、約１／３であった。一方、Ｃｍ−ｐｇｓＡの培養上清からも、比較的高いα−アミラーゼ活性が検出された。したがって、Ｃｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性が、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性と比較して低いのは、主として、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質が細胞表層から培地中に遊離したためと考えられる。また、ＰｇｓＡがＡｍｙＡのα−アミラーゼ活性に何らかの悪影響を与えている可能性も考えられる。
【００６３】
（５）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認２
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、トリプシン処理を行ない、α−アミラーゼ活性を測定した。
【００６４】
トリプリン処理の結果、α−アミラーゼ活性は、未処理の場合の約６８％まで低下していることがわかった。この結果、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の大部分がコリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に提示されていることが推定された。
【００６５】
（６）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認２
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、α−アミラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。
【００６６】
図４より、Ｃｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性は約３μｍｏｌグルコース／ｇ−dry cell／ｈであった。この活性は、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性（約２２μｍｏｌグルコース／ｇ−dry cell／ｈ）と比較して、約１／７であった。このように、Ｃｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性が、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性と比較して低いのは、図３の結果を参照すると、主として、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質が細胞表層から培地中に遊離したためと考えられる。また、ＰｇｓＡがＡｍｙＡのα−アミラーゼ活性に何らかの悪影響を与えている可能性も考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示することができる。また、本発明によれば、従来では不可能と思われていた、サイズの大きなタンパク質を効率よく細胞表層に提示した微生物が提供される。さらに、本発明によれば、ポーリンとの融合タンパク質を強固に細胞表層に固定した微生物が提供される。このような微生物は、大量に培養することが可能であり、細胞表層に提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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