(57)【要約】【課題】生体分子等の試料が光を反射する基板の表面に固定されている場合でも、水等の溶媒中における試料の立体構造を解析可能な分析装置を提供すること。【解決手段】表面に試料を固定可能な基板８を設置する基板設置部３と、基板設置部３に設置した基板８に対向設置する光透過部材９と、基板８と光透過部材９との間の空間３２に試料及び溶媒を供給する供給手段９ａと、試料及び溶媒を保持しつつ空間３２の間隔を設定する間隔設定手段３０と、光透過部材９を介して試料に光を照射する光照射部と、試料の表面で反射した光を、光透過部材９を介して受光する光検出部とを備える分析装置。【選択図】図２
2010025637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に試料を固定可能な基板を設置する基板設置部と、
前記基板設置部に設置した基板に対向設置する光透過部材と、
前記基板と前記光透過部材との間の空間に試料及び溶媒を供給する供給手段と、
前記試料及び前記溶媒を保持しつつ前記空間の間隔を設定する間隔設定手段と、
前記光透過部材を介して前記試料に光を照射する光照射部と、
前記試料の表面で反射した光を、前記光透過部材を介して受光する光検出部とを備える分析装置。
【請求項２】
前記間隔設定手段が環状のスペーサであり、前記供給手段が、前記スペーサと前記基板と前記光透過部材とで囲まれた前記空間に連通するように前記光透過部材に貫通形成された流入路である請求項１に記載の分析装置。
【請求項３】
前記間隔設定手段を前記光透過部材の側に付勢する付勢手段を備える請求項１又は請求項２に記載の分析装置。
【請求項４】
前記付勢手段の付勢力を調節する付勢力調節機構を備える請求項３に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板に固定された生体分子等の試料の立体構造を測定する分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体、酵素、タンパク質又は核酸等の生体分子を表面に固定した基板を備える種々のバイオセンサーの開発が近年盛んに進められている。当該バイオセンサーによれば、生体分子による優れた分子認識機能を利用して測定対象となる物質を選択的に検出して、その濃度等を簡易に評価することができる。
一方、生体分子における立体構造（三次構造）の変化は、生体分子の分子認識機能に重大な影響を及ぼし得るものであり、例えば、立体構造が変化することによって分子認識機能が大幅に低下してしまう虞もある。
そのため、生体分子を基板に固定する際、その生体分子の立体構造変化をできる限り抑えるための工夫が必要であると共に、生体分子が基板の表面に対してどのような状態で固定されているかを正確に把握する技術がバイオセンサーを開発する上で重要となる。
基板表面に固定した生体分子の立体構造を解析可能な従来の分析装置としては、例えば、特許文献１に開示される反射吸収法を採用する赤外分光装置や、特許文献２に開示される全反射測定法を採用する赤外分光装置が知られている。
【特許文献１】特開２００４−４５３９０号公報（段落番号〔００５２〕〜〔００５４〕参照）
【特許文献２】特表２００６−５０７５０４号公報（図１参照）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
生体分子は通常生体内の水中に存在するものであり、水分子を取り除いた状態での生体分子の立体構造は、水中の生体分子の立体構造とは大きく異なることが一般的に知られている。
【０００４】
反射吸収法を採用する従来の赤外分光装置によれば、生体分子を固定する基板が、赤外光を反射する材料で構成されていれば良いので、様々な種類の基板を使用することができる。しかし、生体分子を、乾燥した真空状態で測定する必要があり、水中に存在する生体分子の立体構造を解析することができなかった。これは、生体分子の周りに大量の水分子が存在すると、水分子による赤外吸収が非常に大きく、生体分子の構造を反映する赤外吸収を検出することができなくなるためである。
【０００５】
従って、反射吸収法を採用する従来の赤外分光装置では、水中に存在する生体分子が基板に固定されることによって、その立体構造がどのように変化するかについて正確な知見を得ることができなかった。
【０００６】
一方、全反射測定法を採用する赤外分光装置によれば、水中に存在する生体分子の立体構造を解析することは可能である。しかし、生体分子を固定する基板を、赤外光が透過する材料で構成する必要があるため、使用可能な基板が制限されていた。基板毎に異なる表面の物理的な性質は固定された生体分子の立体構造に影響を与えるため、全反射測定法では実際にバイオセンサーで使用される基板上における生体分子の立体構造について正確な知見を得ることができなかった。
【０００７】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、その目的は、生体分子等の試料が光を反射する基板の表面に固定されている場合でも、水等の溶媒中における試料の立体構造を解析可能な分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するため、本発明に係る第１特徴構成は、
表面に試料を固定可能な基板を設置する基板設置部と、
前記基板設置部に設置した基板に対向設置する光透過部材と、
前記基板と前記光透過部材との間の空間に試料及び溶媒を供給する供給手段と、
前記試料及び前記溶媒を保持しつつ前記空間の間隔を設定する間隔設定手段と、
前記光透過部材を介して前記試料に光を照射する光照射部と、
前記試料の表面で反射した光を、前記光透過部材を介して受光する光検出部とを備える点にある。
【０００９】
〔作用及び効果〕
本発明の分析装置は、試料及び溶媒を保持しつつ、基板と光透過部材との間の空間の間隔を設定する間隔設定手段を備えているため、基板と光透過部材との間に非常に厚みの薄い空間を形成することができる。供給手段を介して当該空間に試料及び溶媒を供給すると、試料は基板の表面に固定されて溶媒の中に埋没する。そのため、前記空間には、試料を含む非常に薄い溶媒層が形成される。
【００１０】
溶媒層をできる限り薄くすることによって、前記空間に光を照射した際の、溶媒による光吸収の影響を最小限に抑えることができる。
【００１１】
その結果、試料の立体構造を反映する反射光を検出し易くなり、溶媒中における試料の立体構造を解析することができる。
【００１２】
本発明に係る第２特徴構成は、
前記間隔設定手段が環状のスペーサであり、前記供給手段が、前記スペーサと前記基板と前記光透過部材とで囲まれた前記空間に連通するように前記光透過部材に貫通形成された流入路である点にある。
【００１３】
〔作用及び効果〕
本発明によれば、間隔設定手段として環状のスペーサを使用することによって、試料及び溶媒を保持する空間を、基板と光透過部材との間に容易に形成することができる。
さらに、光透過部材に貫通形成された流入路を介して、試料及び溶媒を前記空間に簡便且つ確実に供給することができ操作性が向上する。
【００１４】
本発明に係る第３特徴構成は、
前記間隔設定手段を前記光透過部材の側に付勢する付勢手段を備えた点にある。
【００１５】
〔作用及び効果〕
本発明によれば、試料及び溶媒を前記空間に供給する際の圧力によって生じ得る間隔設定手段の歪みを抑えて、前記基板と前記光透過部材との間隔が変化するのを防止することができる。その結果、前記空間に形成される溶媒層の厚さを一定に維持して、試料の分析精度を向上させることができる。
【００１６】
本発明に係る第４特徴構成は、
前記付勢手段の付勢力を調節する付勢力調節機構を備える点にある。
【００１７】
〔作用及び効果〕
本発明によれば、付勢力調節機構により付勢手段の付勢力を調節することによって、基板と光透過部材との間隔をより安定化することができる。その結果、間隔設定手段に生じ得る歪みをより効果的に抑え、試料の分析精度をさらに向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
〔実施形態〕
本発明に係る分析装置について、図１乃至図５に基づいて説明する。
【００１９】
図１に示すように、分析装置１は、光を照射する光照射部としての光源２、基板を設置する基板設置部としてのサンプルホルダー３、反射光を受光する光検出部としての検出器４、ならびに、光源２からの光を順次反射して検出器４へと導く第１ミラー５ａ、第２ミラー５ｂ、第３ミラー５ｃ、第４ミラー５ｄ、第５ミラー５ｅを備えて構成されている。
【００２０】
第１ミラー５ａ及び第２ミラー５ｂは、第１チャンバー６ａの内部に設けられている。サンプルホルダー３は、第２チャンバー６ｂの内部に設けられている。第３ミラー５ｃ及び第４ミラー５ｄは、第３チャンバー６ｃの内部に設けられている。第５ミラー５ｅは第４チャンバー６ｄの内部に設けられている。検出器４は第４チャンバー６ｄの上に設けられている。尚、第１チャンバー６ａ〜第４チャンバー６ｄの夫々は真空脱気可能に構成されており、防震台７の上に設置されている。
【００２１】
図１に示される破線の矢印は、光源２から照射された光の光路Ｒを示している。
光源２から照射された光は、第１ミラー５ａ及び第２ミラー５ｂを反射し、サンプルホルダー３のプリズム９を透過して基板８の表面に照射される。基板８にて反射した光は、再びプリズム９を透過した後、順に第３ミラー５ｃ、第４ミラー５ｄ、及び第５ミラー５ｅと反射して検出器４へと導かれる。
尚、本発明の分析装置１に適用し得る光としては、例えば、赤外光、近赤外光、可視光、紫外光、テラヘルツ光等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
図２及び図３に示されるように、サンプルホルダー３は、
付勢手段としてのバネ部材１０、
小径部分１１ａと大径部分１１ｂとを有するバネホルダー１１、
外形が立方体状であって内部にバネ部材１０及びバネホルダー１１を収容可能な円柱状の収容空間１２ａを有する基板設置台１２、
基板設置台１２の上に設置した基板８に対向設置する光透過部材としてのプリズム９、
プリズム９をブロック体１３の上面に固定するための押え部材２２、
基板設置台１２が上下方向に移動可能に嵌挿される直方体状の貫通孔１３ａを中央に有する金属製のブロック体１３、
付勢力調節機構としての螺子部材１４、
中央に螺子部材１４を螺入する貫通孔を有する円盤状の螺子保持部材１９、及び
ブロック体１３と螺子保持部材１９とを支持する支持台３４、を備えて構成されている。
【００２３】
図２及び図３に示されるように、サンプルホルダー３を組み立てる際は、先ず初めに螺子保持部材１９の円盤部１９ａをボルト２８ａでブロック体１３の下面に固定する。
【００２４】
螺子保持部材１９は、円盤部１９ａと、その円盤部１９ａよりも小径の凸部１９ｂとを備えており、凸部１９ｂは円盤部１９ａの略中央に設けられている。
【００２５】
図２に示されるように、螺子保持部材１９の貫通孔２０は、円盤部１９ａと凸部１９ｂに亘って貫通している。
貫通孔２０は、円盤部１９ａ側に形成されている小径貫通部分２０ａと、小径貫通部分２０ａに連設し、その直径が小径貫通部分２０ａより大きい大径貫通部分２０ｂとを有する。大径貫通部分２０ｂの内周面には雌ねじ部２１が形成されている。
【００２６】
また、図２及び図３に示されるように、螺子部材１４は、螺子保持部材１９の貫通孔２０に先に挿入される小径螺子部分１４ａと、小径螺子部分１４ａに連設し、その直径が小径螺子部分１４ａより大きい大径螺子部分１４ｂと、大径螺子部分１４ｂに連設する頭部１４ｃとを有する。
小径螺子部分１４ａの外周には、その周方向に沿って２つの溝１５，１５が設けられており、その２つの溝１５，１５の夫々に密封用Ｏリング１６，１６が設けられている。
さらに小径螺子部分１４ａには、螺子部材１４の上方への螺入移動を制限し得るロッキングリング１７が、大径螺子部分１４ｂに当接した状態で嵌め込まれている。尚、ロッキングリング１７の外径は、貫通孔２０の大径貫通部分２０ｂの内径よりもわずかに小さく、尚且つ、小径貫通部分２０ａの内径よりも大きく設定されている。
大径螺子部分１４ｂの外周面には雄ねじ部１８が形成されている。
【００２７】
螺子部材１４の小径螺子部分１４ａを、螺子保持部材１９の大径貫通部分２０ｂより挿入し、螺子部材１４をその軸心回りに回転させることによって、螺子部材１４の雄ねじ部１８を、螺子保持部材１９の大径貫通部分２０ｂの雌ねじ部２１に螺入させる。
螺子部材１４の小径螺子部分１４ａは、小径貫通部分２０ａに嵌入して、小径螺子部分１４ａの２つの密封用Ｏリング１６，１６が小径貫通部分２０ａの内周面に密着する。
【００２８】
螺子部材１４をさらに螺入させると、螺子部材１４の小径螺子部分１４ａの先端が、螺子保持部材１９の小径貫通部分２０ａからブロック体１３の貫通孔１３ａの内部に突出するように構成されている。
【００２９】
次いで、ブロック体１３の貫通孔１３ａの中に、大径部分１１ｂを下にした状態のバネホルダー１１、バネ部材１０、及び、収容空間１２ａの開口を下にした状態の基板設置台１２を順に収容する。
このとき、図２に示されるように、バネ部材１０とバネホルダー１１とは、バネホルダー１１の小径部分１１ａがバネ部材１０の中に入り込むと共に、バネ部材１０がバネホルダー１１の大径部分１１ｂの上に設置された状態で基板設置台１２の収容空間１２ａに収容される。尚、バネホルダー１１の大径部分１１ｂの直径は、基板設置台１２の収容空間１２ａの内径よりもわずかに小さく構成されている。
【００３０】
次いで、基板８を基板設置台１２の上に設置する。基板８は、その表面に生体分子等の試料を固定可能であって、尚且つ、光を反射する材料で構成されていれば良い。代表的なものとしては、例えば、金（Ａｕ）基板等の金属基板や、埋め込み金属層基板（ＢＭＬ基板）等が挙げられる。
尚、本発明の分析装置１は、試料の表面で反射した反射光を測定する反射吸収法を採用している。反射吸収法における基板については、その表面に生体分子等の試料を固定可能であって、尚且つ、光を反射する材料で構成されていれば良い。そのため本発明においては、様々な種類の基板を使用することができる。
【００３１】
試料及び溶媒を保持しつつ、基板８とプリズム９との間の空間３２の間隔を設定する、間隔設定手段としての環状スペーサ３０を、基板８の上に設置する。環状スペーサ３０は、例えば、ニッケルやアルミニウムなどの金属で構成されることが好ましく、またその厚さは８μｍ〜１０μｍであることが好ましい。ニッケルで構成された環状スペーサ３０は、その厚さが薄くても、ある程度の硬度が保持されるため変形し難く、平滑な形状を維持し易い。
【００３２】
ブロック体１３の上面における貫通孔１３ａの外周には、液漏れ防止用のＯリング３１を収容可能な円形溝１３ｂが設けられている。
円形溝１３ｂに沿って嵌め込まれているＯリング３１と、基板８の上に設置されている環状スペーサ３０とを覆うように、断面台形錘状のプリズム９をブロック体１３の上面に設置する。
次いで、固定板２３を備える押え部材２２をプリズム９の上面に設置する。固定板２３をブロック体１３の固定柱１３ｃの上に設置してボルト２８ｂ及びナット２９で締結することによって、プリズム９を、その上方からブロック体１３の上面の所定位置に押さえ付けるようにして固定する。
【００３３】
以上の構成によって、図４に示されるように、環状スペーサ３０と基板８とプリズム９とで囲まれた、例えば、厚み８μｍ〜１０μｍという環状スペーサ３０の厚みに対応する非常に薄い空間３２が形成される。
【００３４】
図４に示されるように、プリズム９の内部には、空間３２に連通する供給手段としての流入路９ａと、同じく空間３２に連通する排出路９ｂとが貫通形成されている。
【００３５】
図２及び図４に示されるように、押え部材２２によってプリズム９をブロック体１３の上面に固定した際、流入路９ａは、押え部材２２の第１突起管２４の内部に形成されている第１管路２５と連通すると共に、排出路９ｂは、押え部材２２の第２突起管２６の内部に形成されている第２管路２７と連通するように構成されている。
【００３６】
尚、押え部材２２の第１突起管２４には、試料及び溶媒を空間３２に送り込む供給装置（図示せず）が接続される。また押え部材２２の第２突起管２６には、試料及び溶媒を吸引する吸引装置（図示せず）が接続される。
【００３７】
プリズム９は、生体分子等の試料の吸着を防ぐため、必要に応じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等でその表面を被覆しても良い。
【００３８】
次いで、図５に示されるように、試料Ｓを溶媒に溶かして調製した試料溶液を、流入路９ａを介して空間３２の内部に供給する。試料Ｓは基板８の表面に固定されて溶媒の中に埋没する。そのため、空間３２には、試料Ｓを含む非常に薄い溶媒層３３が形成される。
【００３９】
図１及び図５に示されるように、光源２から照射され第１ミラー５ａ及び第２ミラー５ｂを反射してプリズム９を透過した光は、空間３２の溶媒層３３を通過して基板８の表面に固定された試料Ｓに照射される。試料Ｓの表面で反射した光は、再び溶媒層３３を通過してプリズム９を透過し、第３ミラー５ｃ〜第５ミラー５ｅを反射して検出器４によって受光される。
【００４０】
溶媒層３３をできる限り薄くすることによって、空間３２に光を照射した際の、溶媒による光吸収の影響を最小限に抑えることが可能となる。その結果、試料Ｓの立体構造を反映する反射光を検出し易くなり、溶媒中における試料Ｓの立体構造を解析することができる。
【００４１】
尚、空間３２の内部に存在する溶媒の交換や、基板８表面に固定されていない未固定の試料の洗浄等を実施する際には、流入路９ａを介して溶媒を空間３２に供給し、排出路９ｂから溶媒を排出する。
【００４２】
本発明の分析装置１の測定対象となる試料としては、例えば、抗体、酵素、タンパク質又は核酸等の生体分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の分析装置１に適用し得る溶媒としては、例えば、軽水（Ｈ2Ｏ）、重水（Ｄ2Ｏ）、あるいはこれらをベースに塩等を溶解させて調製した生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液が挙げられる。生体分子等を赤外分光により測定する場合は、軽水が測定波長域に大きな吸収を持つことから、重水、または重水をベースに調製した溶媒が好ましい。生体分子はそれぞれ表面の親水・疎水性、等電点などが異なっていることが知られており、溶媒の塩濃度やｐＨ等の条件によっては、凝集等によりプリズムなど基板以外の部分への吸着が促進される可能性がある。このため試料毎に溶媒を選択して測定することが好ましい。
【００４４】
図２に示されるように、本実施形態の分析装置のサンプルホルダー３においては、バネ部材１０が、基板設置台１２と基板８を介して、環状スペーサ３０をプリズム９側に付勢している。バネ部材１０は、試料溶液等を空間３２に供給する際の圧力によって生じ得る環状スペーサ３０の歪みを抑えて、基板８とプリズム９との間隔が変化するのを防止することができる。その結果、空間３２に形成される溶媒層３３の厚さが一定に維持されるので、試料の分析精度が向上する。尚、バネ部材１０の付勢力については、例えば、４５０ｇｍｆ/ｍｍ程度であることが望ましい。
【００４５】
さらに、本実施形態の分析装置のサンプルホルダー３は、付勢力調節機構としての螺子部材１４を備えており、螺子部材１４の小径螺子部分１４ａの先端と、バネホルダー１１の大径部分１１ｂの下面とが当接する。このため、螺子部材１４を軸心回りに回転させて上方に螺入させることによって、バネホルダー１１を上方に移動させたり、あるいは、螺子部材１４を逆方向に回転させて下方に移動させることによって、バネホルダー１１を下方に移動させることができる。
また、螺子部材１４の小径螺子部分１４ａの先端は曲面であり、バネホルダー１１の大径部分１１ｂの下面に設けた円錐状の凹みの外周部分のみに接触して力を伝達する。その結果、螺子部材１４に軸ずれが発生しても影響を最小限に留め、バネホルダー１１に常に垂直方向の力を伝達することが可能となる。
バネ部材１０を上下に伸縮させることによってバネ部材１０の付勢力を自在に調節することが可能となり、基板８とプリズム９との間隔をより安定化することができる。その結果、環状スペーサ３０に生じ得る歪みをより効果的に抑えて、試料の分析精度をさらに向上させることができる。
【実施例】
【００４６】
本発明の分析装置の構成を備える赤外吸収スペクトル装置を以下に例示する。
（実施例１）装置構成
赤外吸収スペクトル装置：ＪＥＯＬ  ＪＩＲ−７０００  ＦＴ−ＩＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
検出器：ＭＣＴ検出器（ｍｅｒｃｕｒｙ  ｃａｄｍｉｕｍｕ  ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ）尚、ＭＣＴ検出器は、液体窒素冷却して使用した。
【００４７】
干渉計とＩＲ光学系を乾燥空気でパージした。また、ミラーやサンプルホルダーを収容したチャンバーは、ロータリーポンプ（ＲＰ）とターボモレキュラーポンプ（ＴＭＰ）で５００Ｌ/ｓで６時間真空引きし、空気中に含まれる水分子による影響を取り除いた。以降の測定中、真空度は、真空計測器（ＵＬＶＡＣ  ＧＰ２Ａ  Ｐｉｒａｎｉ  ｇａｇｅ、及びＵＬＶＣ  Ｇ１−Ｍ２  ｉｏｎ  ｇａｇｅ）を用いて測定し、常に２×１０-2ｔｏｒｒ以下となるように保持した。
【００４８】
プリズムとして潮解性の少ないフッ化カルシウムプリズム（ＣａＦ2プリズム）を使用した。環状スペーサとして厚さ８μｍのニッケルスペーサ（Ｎｉスペーサ）を使用した。基板としてＢＭＬ基板（ＳｉＯ2（１００）/ＣｏＳｉ2/Ｓｉ（１００））を使用した（ＢＭＬ基板に関しては  Ｓ．Ｙａｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，４２，３９４２−（２００３）を参照）。
【００４９】
ＢＬＭ基板は、以下の溶液で順次洗浄して使用した。
１．濃硫酸：３０％過酸化水素水＝４：１
２．２０％アンモニア水：３０％過酸化水素水：水＝１：４：２０
３．１％フッ化水素溶液（ＨＦ溶液）
４．濃塩酸：３０％過酸化水素水：水＝１：１：４
【００５０】
フッ化カルシウムプリズムは、生体分子の吸着を防ぐため、以下の方法によって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でその表面を被覆して使用した。
室温でエタノールに３０分間浸漬、水ですすぎ、乾燥窒素吹きつけの後、１０分間真空状態に置いた。調製直後の５％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ溶液（Ｇｅｌｅｓｔ／ＨＰＬＣ  ｇｒａｄｅ  エタノール（和光純薬））４ｍＬ〜５ｍＬをフッ化カルシウムプリズムの表面に重層し、４時間後に同じ５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ溶液に置き換え、終夜放置した。過剰量のエタノール、超純水に順次浸漬して洗浄して乾燥窒素を吹き付けた後、１０分間真空状態に置いた。
【００５１】
（参考例１）ベースラインの安定性の評価
上記実施例１に記載される赤外吸収スペクトル装置において、ベースラインの安定性を以下の手順に沿って測定した。
１．フッ化カルシウムプリズム、厚さ８μｍのニッケルスペーサー、及びＢＭＬ基板を装置にセットする。
２．重水を注入する。
３．チャンバーを６時間真空引きする。
４．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定（ＢＧ）する。
５．注入速度を２ｍＬ/時間、５ｍＬ/時間、１０ｍＬ/時間と変えて、各注入速度で１０分間注入して５分間静止した後、ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定（シグナルＳ１〜Ｓ３）する。
６．それぞれのシグナルについて、−ｌｏｇ10（Ｓｎ／ＢＧ）、ｎ＝１〜３を計算する。
結果を図６に示す。図６に示されるように、タンパク質等の生体分子の吸収が認められ得る波数１５００ｃｍ-1〜１８００ｃｍ-1付近のベースラインの変動は小さくフラットであり、非常に安定していた。
【００５２】
（参考例２）チャンバー内の真空度による影響
上記実施例１に記載される赤外吸収スペクトル装置において、チャンバーの真空度が高い状態と低い状態におけるベースラインの変動を以下の手順で評価した。
１．フッ化カルシウムプリズム、厚さ８μｍのニッケルスペーサー、及びＢＭＬ基板を装置にセットする。
２．重水を注入する。
３．チャンバーを２時間（真空度が低い状態）、あるいは６時間（真空度が高い状態）真空引きする。
４．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定（ＢＧ）する。
５．一定時間間隔でＦＴ−ＩＲスペクトルを測定（シグナルＳｎ、ｎ＝１〜）する。
６．それぞれのシグナルについて、−ｌｏｇ10（Ｓｎ／ＢＧ）を計算する。
図７は、真空度が低い状態でのベースラインの変動を１時間毎に測定したものである。また、図８は、真空度が高い状態でのベースラインの変動を１５分毎に測定したものである。図７及び図８に示されるように、波数１５００ｃｍ-1〜１８００ｃｍ-1付近のベースラインは、真空度が低い状態の方は変動が大きく不安定であった。特に、測定を開始してから１時間後のベースラインを比較するとその差は明らかであった。
【００５３】
（参考例３）環状スペーサによる違いの評価
上記実施例１に記載される赤外吸収スペクトル装置において、環状スペーサによる違いを参考例１に記載の手順に沿って測定した。
厚さ８μｍのニッケルスペーサーに代えて厚さ１２μｍのアルミ製の環状スペーサを使用し、重水の注入速度を０．５ｍＬ/時間、１．０ｍＬ/時間と変えた。結果を図９に示す。ベースラインの変動に対して影響の小さい遅い注入速度に変えたにも関わらず、図９に示されるように、波数１５００ｃｍ-1〜１８００ｃｍ-1付近のベースラインの変動が非常に大きく不安定であった。
【００５４】
（実施例２）溶媒中のフィブロネクチンの赤外吸収スペクトル測定
上記実施例１に記載される赤外吸収スペクトル装置を用いて、重水中に存在するフィブロネクチンの赤外吸収スペクトルを以下の手順に沿って測定した。
１．フッ化カルシウムプリズム、厚さ８μｍのニッケルスペーサー、及びＢＭＬ基板を装置にセットする。
２．チャンバーを１時間真空引きする。
３．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定（プリズムバックグランドＢＧＰ）して、チャンバー内の気圧を大気圧に戻す。
４．ニッケルスペーサとＢＭＬ基板とフッ化カルシウムプリズムとで囲まれた厚さ８μｍの空間の中に溶媒として重水を注入する。
５．チャンバーを６時間真空引きする。
６．バックグランドのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定してその赤外強度（ＢＧ）を得る。
７．フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を重水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に溶解して、１．１１ｎＭの濃度の試料溶液を調製する。この試料溶液１００μＬを２ｍＬ／時間で注入して３時間静止する。
８．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定して赤外強度（シグナルＳ０）を得る。
９．重水を０．５ｍＬずつ注入して合計５回の洗浄を行うと共に、洗浄毎にＦＴ−ＩＲスペクトルを測定して５種類の赤外強度（シグナルＳ１〜Ｓ５）を得る。尚、シグナルＳ１〜Ｓ５はそれぞれ、１回目〜５回目の洗浄を行ったときの赤外強度であり、例えば、Ｓ１は１回目の洗浄を行ったときの赤外強度である。
１０．バックグランド（ＢＧ）と、シグナルＳ０〜Ｓ５から−ｌｏｇ10（Ｓｎ／ＢＧ）、ｎ＝０〜５を計算してフィブロネクチンの６種類の赤外吸収スペクトルをそれぞれ算出する。結果を図１０に示す。
図１０に示されるように、重水による４回目の洗浄（Ｓ４）で赤外吸収スペクトルが安定し、空間に存在する未固定のフィブロネクチンが除去され、基板の表面に固定されたフィブロネクチンのみを測定することができた。また、波数１６３８ｃｍ-1、１６８３ｃｍ-1にフィブロネクチンのタンパク質構造由来のアミドＩバンドが観察された。
【００５５】
（比較例１）真空中のフィブロネクチンの赤外吸収スペクトル測定
次いで、比較のため真空中におけるフィブロネクチンの赤外吸収スペクトル測定を以下の手順に沿って実施した。尚、本比較例においては、上記実施形態に記載されるサンプルホルダー１３に替えて、図１６に示されるように、基板８のみを水平に設置可能な真空中測定用サンプルホルダー３５を使用した。
１．上記実施例２で使用した赤外吸収スペクトル装置のサンプルホルダーを分解し、基板を１ｍＬの重水で洗浄した後、窒素を吹き付ける。
２．サンプルホルダーを真空中測定用サンプルホルダー（図１６）に替え、先の１．で乾燥した基板をシリコングリースで貼り付ける。
３．真空状態でＦＴ−ＩＲスペクトルを測定して赤外強度（シグナルＶ）を得る。
４．紫外線照射装置３６によるＵＶ（紫外線）灰化で基板表面に固定された生体物質を除去する。
５．真空状態でバックグランドのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定してその赤外強度（ＢＧ）を得る。
６．バックグランド（ＢＧ）と、シグナルＶから−ｌｏｇ10（Ｖ／ＢＧ）を計算して真空中のフィブロネクチンの赤外吸収スペクトルを算出する。
図１１に示されるように、アミドＩバンドは観察されたが、真空中でのタンパク質構造変化によって、実施例２の図１０に示される赤外吸収スペクトルとは異なるものとなっていた。
【００５６】
（実施例３）溶媒中の抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトル測定
上記実施例１に記載される赤外吸収スペクトル装置を用いて、重水中に存在する抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトルを以下の手順に沿って測定した。ただし実施例１に記載の装置構成の内、フッ化カルシウムプリズムの表面を被覆するＰＥＧ溶液を１０％（ｖ／ｖ）に変更して使用した。
１．フッ化カルシウムプリズム、厚さ８μｍのニッケルスペーサー、及び金（Ａｕ）基板を装置にセットする。
２．チャンバーを１時間真空引きする。
３．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定（プリズムバックグランドＢＧＰ）して、チャンバー内の気圧を大気圧に戻す。
４．ニッケルスペーサと金（Ａｕ）基板とフッ化カルシウムプリズムとで囲まれた厚さ８μｍの空間の中に溶媒として重水をベースにして調製した生理食塩水を注入する。
５．チャンバーを６時間真空引きする。
６．バックグランドのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定してその赤外強度（ＢＧ）を得る。
７．マウス由来ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を重水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をベースにした生理食塩水に溶解して、３３μＭの濃度の試料溶液を調製する。この試料溶液１００μＬを２ｍＬ／時間で注入して１時間静止する。
８．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定して赤外強度（シグナルＳ０）を得る。
９．重水を０．５ｍＬずつ注入して合計５回の洗浄を行うと共に、洗浄毎にＦＴ−ＩＲスペクトルを測定して５種類の赤外強度（シグナルＳ１〜Ｓ５）を得る。尚、シグナルＳ１〜Ｓ５はそれぞれ、１回目〜５回目の洗浄を行ったときの赤外強度であり、例えば、Ｓ１は１回目の洗浄を行ったときの赤外強度である。
１０．バックグランド（ＢＧ）と、シグナルＳ０〜Ｓ５から−ｌｏｇ10（Ｓｎ／ＢＧ）、ｎ＝０〜５を計算して抗体（ＩｇＧ）の６種類の赤外吸収スペクトルをそれぞれ算出する。結果を図１２に示す。図１２に示されるように波数１６３９ｃｍ-1に抗体（ＩｇＧ）のタンパク質構造由来のアミドＩバンドが観察された。
【００５７】
（比較例２）真空中の抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトル測定
次いで、比較のため真空中における抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトル測定を以下の手順に沿って実施した。尚、本比較例においては、上記実施形態に記載されるサンプルホルダー１３に替えて、図１６に示されるように、基板８のみを水平に設置可能な真空中測定用サンプルホルダー３５を使用した。
１．上記実施例３で使用した赤外吸収スペクトル装置のサンプルホルダーを分解し、基板を１ｍＬの重水で洗浄した後、窒素を吹き付ける。
２．サンプルホルダーを真空中測定用サンプルホルダー（図１６）に替え、先の１．で乾燥した基板をシリコングリースで貼り付ける。
３．真空状態でＦＴ−ＩＲスペクトルを測定して赤外強度（シグナルＶ）を得る。
４．紫外線照射装置３６によるＵＶ（紫外線）灰化で基板表面に固定された生体物質を除去する。
５．真空状態でバックグランドのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定してその赤外強度（ＢＧ）を得る。
６．バックグランド（ＢＧ）と、シグナルＶから−ｌｏｇ10（Ｖ／ＢＧ）を計算して真空中の抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトルを算出する。結果を図１３に示す。
図１３に示されるように、アミドＩバンドは観察されたが、真空中でのタンパク質構造変化によって、上記実施例３の図１２の赤外吸収スペクトルとは異なるものとなっていた。
【００５８】
上記実施例２、実施例３、比較例１及び比較例２の結果から、本発明によって溶媒中に存在する生体分子の赤外吸収スペクトルを測定する有用性が示された。
【００５９】
（参考例４）プリズム表面に対するフィブロネクチンの吸着性評価
プリズム表面に対するフィブロネクチンの吸着性について評価した。
上記実施例１の装置構成において、以下の表１に記載される表面の被覆条件が異なる種々のフッ化カルシウムプリズムを使用すると共に、上記実施例２の手順において、７のフィブロネクチン溶液の調製で重水の代わりに同じく以下の表１に記載される塩濃度の異なる溶媒に一定量のフィブロネクチンを溶解して種々の試料溶液を調製した。実施例２の手順を行った後、さらに以下の手順に沿って測定した。
１．赤外吸収スペクトル装置のサンプルホルダーを分解し、プリズムを１ｍＬの重水で洗浄した後、窒素を吹き付け、新たな基板と共に再びサンプルホルダーを組み立て、チャンバーを１時間真空引きする。
２．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定する（吸着スペクトルＳＰｎ、ｎ＝１〜）。
３．プリズムバックグランド（ＢＧＰ）と吸着スペクトルＳＰｎから−ｌｏｇ10（ＳＰｎ／ＢＧＰ、ｎ＝１〜）を計算しフッ化カルシウムプリズムへのフィブロネクチン吸着による赤外吸収スペクトルをそれぞれ算出する。
【００６０】
【表１】
2010025637.tif 000003
【００６１】
評価方法としては、フィブロネクチンのアミドＩバンドの吸収波数域の赤外吸収を測定して評価した。即ち、仮に各プリズムに対してフィブロネクチンの吸着がないとすれば、赤外吸収は検出されない。
図１４に示されるように、条件Ｄが、最もプリズムに対するフィブロネクチンの吸着が低かった。
【００６２】
（参考例５）プリズム表面に対する抗体（ＩｇＧ）の吸着性評価
プリズム表面に対する抗体（ＩｇＧ）の吸着性について評価した。
上記実施例１の装置構成において、以下の表２に記載される表面の被覆条件が異なる種々のフッ化カルシウムプリズムを使用すると共に、上記実施例３の手順において、７の抗体（ＩｇＧ）溶液の調製で重水をベースにした生理食塩水の代わりに同じく以下の表２に記載される塩濃度の異なる溶媒に一定量の抗体（ＩｇＧ）を溶解して種々の試料溶液を調製した。実施例３の手順を行った後、さらに以下の手順に沿って測定した。
１．赤外吸収スペクトル装置のサンプルホルダーを分解し、プリズムを１ｍＬの重水で洗浄した後、窒素を吹き付け、新たな基板と共に再びサンプルホルダーを組み立て、チャンバーを１時間真空引きする。
２．ＦＴ−ＩＲスペクトルを測定する（吸着スペクトルＳＰｎ、ｎ＝１〜）。
３．プリズムバックグランド（ＢＧＰ）と吸着スペクトルＳＰｎから−ｌｏｇ10（ＳＰｎ／ＢＧＰ、ｎ＝１〜）を計算しフッ化カルシウムプリズムへのフィブロネクチン吸着による赤外吸収スペクトルをそれぞれ算出する。
【００６３】
【表２】
2010025637.tif 000004
【００６４】
評価方法としては、抗体（ＩｇＧ）のアミドＩバンドの吸収波数域の赤外吸収を測定して評価した。即ち、仮に各プリズムに対して抗体（ＩｇＧ）の吸着がないとすれば、赤外吸収は検出されない。
図１５に示されるように、条件Ｄが、最もプリズムに対する抗体（ＩｇＧ）の吸着が低かった。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明に係る分析装置の全体構成の概略を示した図
【図２】サンプルホルダーにおける要部の縦断面図（図中に示される実線の矢印は試料及び溶媒の移流方向を示す）
【図３】サンプルホルダーにおける要部の分解斜視図
【図４】サンプルホルダーを光の入射方向から見たときの要部の縦断面図（図中に示される実線の矢印は試料及び溶媒の移流方向を示す）
【図５】サンプルホルダーにおける要部を拡大した縦断面図
【図６】ベースラインの安定性を評価した赤外吸収スペクトルを示す図
【図７】真空度が低い状態でのベースライン変動を示す図
【図８】真空度が高い状態でのベースライン変動を示す図
【図９】環状スペーサによる違いを評価した赤外吸収スペクトルを示す図
【図１０】溶媒中のフィブロネクチンの赤外吸収スペクトルを示す図
【図１１】真空中のフィブロネクチンの赤外吸収スペクトルを示す図
【図１２】溶媒中の抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトルを示す図
【図１３】真空中の抗体（ＩｇＧ）の赤外吸収スペクトルを示す図
【図１４】プリズム表面に対するフィブロネクチンの吸着性を評価した赤外吸収スペクトルを示す図
【図１５】プリズム表面に対する抗体（ＩｇＧ）の吸着性を評価した赤外吸収スペクトルを示す図
【図１６】真空中測定用サンプルホルダーの斜視図
【図１７】真空中測定用サンプルホルダーの取り付け図（図中に示される破線の矢印は光源２から照射された光の光路Ｒを示す）
【符号の説明】
【００６６】
１  分析装置
２  光源（光照射部）
３  サンプルホルダー（基板設置部）
４  検出器（光検出部）
８  基板
９  プリズム（光透過部材）
９ａ  流入路（供給手段）
１０  バネ部材（付勢手段）
１４  螺子部材（付勢力調節機構）
３０  環状スペーサ（間隔設定手段）
３２  空間
Ｓ  試料
【図１】
2010025637.tif 000005
【図２】
2010025637.tif 000006
【図３】
2010025637.tif 000007
【図４】
2010025637.tif 000008
【図５】
2010025637.tif 000009
【図６】
2010025637.tif 000010
【図７】
2010025637.tif 000011
【図８】
2010025637.tif 000012
【図９】
2010025637.tif 000013
【図１０】
2010025637.tif 000014
【図１１】
2010025637.tif 000015
【図１２】
2010025637.tif 000016
【図１３】
2010025637.tif 000017
【図１４】
2010025637.tif 000018
【図１５】
2010025637.tif 000019
【図１６】
2010025637.tif 000020
【図１７】
2010025637.tif 000021