(57)【要約】      （修正有）【課題】癌細胞の増殖を阻害又は予防する方法を提供する。【解決手段】血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)と骨形態形成タンパク質１に関連する新規のポリペプチドである血管内皮性増殖因子−Ｅ(ＶＥＧＦ−Ｅ)のアンタゴニストを第二薬剤と組み合わせて投与する。第二薬剤は、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗ＶＥＧＦ抗体、ＦＧＦアンタゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、又はＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターに結合する抗体である。また、さらに第三の治療剤として、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗ＶＥＧＦ抗体、ＦＧＦアンタゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、又はＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターに結合する抗体を投与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の癌細胞の増殖を阻害又は予防する方法であって、
有効量のＶＥＧＦ−Ｅアンタゴニストを、有効量の第二薬剤と組み合わせて哺乳動物に投与し、
このとき組み合わせた投与により癌細胞の増殖が阻害又は予防される、方法。
【請求項２】
癌細胞の増殖が腫瘍増殖と関係している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物には、腫瘍についての治療が行われている腫瘍保持患者であり、該患者は該治療から更なる有益な効果を得ていない患者が含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第二薬剤が、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗ＶＥＧＦ抗体、ＦＧＦアンタゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、又はＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターに結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第二薬剤が血管新生抑制剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血管新生抑制剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦ−Ｅアンタゴニストには抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗体がヒト化抗体である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
第三の治療剤を投与することがさらに含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第三の治療剤が、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗ＶＥＧＦ抗体、ＦＧＦアンタゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、又はＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターに結合する抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第三薬剤が血管新生抑制剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
血管新生抑制剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体がヒト化抗体である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（以後、ＶＥＧＦと称することもある）および骨形成タンパク質１（以後、ＢＭＰ１と称することもある）と関連するポリペプチド（本明細書中ではＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと称する）、これをコードする核酸、ＶＥＧＦ−Ｅの製造方法およびＶＥＧＦ−Ｅを利用する方法、組成物およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の天然に存在するポリペプチドが内皮細胞の増殖を誘導することが報告されている。このようなポリペプチドには、塩基性および酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）(Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)) 、血小板誘導性内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）(Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989)) および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）がある。Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)； Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161: 851 (1989)； Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198 (1989)； １９９６年７月３１日に許可された ＥＰ ４７１７５４Ｂ。
ヘパリン結合内皮細胞増殖因子である、ＶＥＧＦは、数年前にウシ下垂体濾胞細胞又は濾胞星状(folliculo-stellate)細胞の培養培地から同定精製された。Ferrara et al., Biophys Res. Comm., 161: 851 (1989) を参照のこと。ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）ｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞で馴化した培養培地は毛細管内皮細胞の増殖を促進したが、コントロール細胞の培養培地はこれを促進しなかった。Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)。ＶＥＧＦは、濾胞細胞または濾胞星状細胞（ＦＣ）において生産され、形態学的によく特徴付けられている顆粒細胞の集団である、天然に存在する化合物である。ＦＣは分泌細胞間に細胞質プロセスを伝える星状細胞である。
【０００３】
ＶＥＧＦは、ＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる、ひとまとめにｈＶＥＧＦ関連タンパク質と称されもする複数のホモ二量体イソ型（単量体あたり１２１、１６５、１８９および２０６アミノ酸）として種々の組織で発現される。１２１アミノ酸のタンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基１１６と１５９の間の４４アミノ酸が欠失している点でｈＶＥＧＦと異なっている。１８９アミノ酸のタンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基１１６の位置に２４アミノ酸が挿入されている点でｈＶＥＧＦと異なり、ヒト血管透過性因子（human vascular permeability factor、ｈＶＰＦ）と明らかに同一である。２０６アミノ酸のタンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基１１６の位置に４１アミノ酸が挿入されている点でｈＶＥＧＦと異なっている。Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991)； Ferrara et al., J. Cell. Biochem., 47: 211 (1991)； Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13: 18 (1992)； Keck et al., Science, 246: 1309 (1989)； Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989)； １９９０年５月３０日公開の ＥＰ ３７０９８９。ＶＥＧＦ１２１はヘパリンを結合しない可溶性分裂促進因子であり、これより長い形態のＶＧＥＦは長いものほどより強い親和力でヘパリンを結合する。ヘパリン結合型のＶＥＧＦのカルボキシ末端がプラスミンによって分解されると、拡散型のＶＥＧＦが放出され得る。プラスミン分解後に同定されるカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列はＡｒｇ１１０−Ａｌａ１１１である。ホモ二量体として単離される、アミノ末端の「コア」タンパク質であるＶＥＧＦ（１−１１０）は、無傷のＶＥＧＦ１６５ホモ二量体と同様の親和力で、中和モノクローナル抗体（４．６．１および２Ｅ３）および可溶型ＦＭＳ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ−１）、キナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）および胎児肝臓キナーゼ（ＦＬＫ）レセプターと結合する。
【０００４】
記載のように、ＶＥＧＦは、それぞれＫＤＲおよびＦＬＴ−１レセプターと結合する２つのドメインを含む。これらのレセプターは内皮（血管）細胞にのみ存在する。外傷などのせいで、細胞の酸素が不足した場合、このような細胞では、ＶＥＧＦ生産が増加した後、それぞれのレセプターに結合し、最終的な生物学的作用を生じさせるシグナルを送る。次いでこのシグナルは血管の透過性を増加させ、細胞は分裂し、増殖して、新しい血管経路を形成する−血管形成および血管新生。
このように、ＶＥＧＦは、過剰な組織成長の不存在下、血管上皮細胞に対する選択的な作用が重要であるような症状、例えば、糖尿病性の潰瘍および、皮下傷害のような外傷から生じる血管損傷の処置に有用である。ＶＥＧＦは血管（動脈および静脈）内皮細胞増殖因子であり、損傷を受けた細胞を回復させ（血管形成と称される過程）、新しい血管の形成を刺激する（血管新生と称される過程）。
【０００５】
またＶＥＧＦに関しては、心筋梗塞後の脈管構造の回復における使用ならびにそれから導き出すことが可能な他の使用が見出せるであろう。これに関して、特に癌細胞における血管新生および血管形成のような過程を緩和するために、ＶＥＧＦの阻害剤が望まれることもある。
【０００６】
現在、既存の内皮細胞からの新たな血管の形成を伴う血管新生が、種々の障害の病因に関連することがよく確立されている。これらには、充実性腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼球内血管新生症候群、例えば増殖性網膜症、例えば糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植された角膜組織および他の組織の免疫拒絶、慢性関節リウマチおよび乾癬が含まれる。Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992)； Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991)； および Garner A, "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A, Klintworth GK, Eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
腫瘍の増殖の場合、血管新生は過形成から新形成への移行と、増殖する充実性腫瘍への栄養の提供に関し、極めて重要であると思われる。Folkman et al., Nature, 339: 58 (1989)。血管新生は、腫瘍細胞に、正常細胞と比べて有利な増殖と増殖自律性を獲得させる。しかるべく、乳ガンおよび他のいくつかの腫瘍において、腫瘍セクションにおける微小血管の密度と患者の生存の相関が観察された。Weidner et al., N Engl J Med, 324: 1-6 (1991)； Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992)； Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)。
【０００７】
血管新生の正の調節因子についての調査では、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、アンギオゲニン、ＩＬ−８などを含む多くの候補が得られた。Folkman et al., J.B.C., 上記、および Klagsbrun et al., 上記。これまでに同定された負の調節因子には、トロンボスポンジン (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990))、プロラクチンの１６キロダルトンＮ末端断片 (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993))、アンギオスタチン(angiostatin)(O'Reilly et al. Cell, 79: 315-328 (1994))およびエンドスタチン(endostatin)が含まれる。(O'Reilly et al, Cell, 88: 277-285 (1996))。最近数年間にわたって行われた実験では、血管上皮細胞増殖の刺激においてばかりでなく、血管透過性および血管新生の誘導においても、ＶＥＧＦの重要な役割が確立された。Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子が喪失しただけで、胎児が致死となることが発見されたことにより、この因子が血管系の発生および分化において埋め合わせのきかない役割を担っていることが示される。さらに、ＶＥＧＦは、腫瘍および眼球内障害に伴う血管新生の鍵となる中間体であることが示された。Ferrara et al., Endocr. Rev., 上記。試験されるヒト腫瘍の大多数においてＶＥＧＦｍＲＮＡは過剰発現されている。Berkman et al., J Clin Invest, 91: 153-159 (1993)； Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995)； Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993)； Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996)； Dvorak et al., Am J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)。
【０００８】
また、眼液(eye fluids)内のＶＥＧＦの濃度レベルは、糖尿病性および他の虚血関連の網膜症の患者において血管が活発に増殖していることと高度に相関する。Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994)。さらに、最近の研究では、ＡＭＤ患者は脈絡膜の血管新生膜にＶＥＧＦが局在していることが示された。Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996)。抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて種々のヒト腫瘍セルラインの増殖を抑制し(Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993)； Warren et al., J. Clin. Invest., 95: 1789-1797(1995)； Borgstroem et al., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996)； Melnyk et al., Cancer Res., 56: 921-924 (1996))、また虚血性網膜障害のモデルにおいて眼球内血管新生を阻害する。Adamis et al., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996)。したがって、抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体またはＶＥＧＦ作用の他の阻害剤は、充実性腫瘍および種々の眼球内血管新生障害を処置するための候補物質として見込みがある。このような抗体は例えば、１９９８年１月１４日公開のＥＰ８１７６４８および１９９８年４月３日提出のＰＣＴ／ＵＳ９８／０６７２４に記載されている。
【０００９】
骨形成タンパク質ファミリーに関しては、このファミリーのメンバーが軟骨の分化および血管形成および前形成されたヒドロキシアパタイトにおける骨誘導の促進に関与すると報告された。Zou, et al., Genes Dev. (U.S.), 11(17):2191 (1997)； Levine, et al., Ann. Plast. Surg., 39(2):158 (1997)。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーの全メンバーである、多数の関連する骨形成タンパク質が同定された。骨形成天然および突然変異タンパク質、これらをコードする核酸、関連化合物（レセプターを含む）、宿主細胞およびその使用は、少なくとも：米国特許第５６７０３３８号； 第５４５４４１９号； 第５６６１００７号； 第５６３７４８０号； 第５６３１１４２号； 第５１６６０５８号； 第５６２０８６７号； 第５５４３３９４号； 第４８７７８６４号； 第５０１３６４９号； 第５１０６７４８号； および第５３９９６７７号にさらに説明されている。骨形成タンパク質１と相同性を有するタンパク質であって、基質沈着(matrix deposition)の調節において重要な役割を担うプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼには特に関心がある。多数の疾患および障害において血管内皮細胞増殖および血管新生の役割を考慮すると、これらの過程を引き起こす１つまたはそれ以上の生物学的作用を減少させるか、あるいは阻害する方法を得ることが望ましい。また、正常および疾患状態、特に癌における病原性ポリペプチドの存在に関してアッセイする方法を得ることが望ましい。さらに、ある特定の側面では、心臓肥大を処置するための一般的に適用可能な治療が存在しないため、心筋細胞肥大を妨げるか、あるいは減少させることが可能な因子を同定することは、異常生理学的心臓発育を阻害する新規治療戦略の開発において最も重要である。種々の心臓血管および腫瘍学的障害に関するいくつかの処置様相が存在するが、依然としてさらなる治療アプローチが必要とされている。
【００１０】
本発明は、ＶＥＧＦおよびＢＭＰファミリーに関連する新規ポリペプチドおよび、特に細胞の生存、増殖および／または分化において役割を有するポリペプチドの同定を意図する研究に基づくものである。新規ポリペプチドが、それが相同性を有する既知のポリペプチドと同一の生物学的活性を有することを予想することはできないが、既知のポリペプチドの生物学的活性を用いれば、新規ポリペプチドにおける関連する生物学的活性を決定することができる。特に本明細書中に記載の新規ポリペプチドは、ポリペプチドが細胞の生存、増殖または分化を誘導する能力を決定するためのアッセイにおいて用いることができる。また、結果的にこれらのアッセイの結果を診断および治療目的に用いることができる。このような研究の結果は本発明の主題である。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明の１つの側面では、図２のアミノ酸残基１〜３４５（配列番号２）を含む血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供する。好ましい態様では、この核酸は図１のコード化ヌクレオチド配列（すなわち、これは配列番号１の残基２５９〜１２９３を含む）またはその相補鎖を含む。他の側面では、本発明はこの核酸、好ましくは、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されているもの含むベクター、ならびに該核酸を含む宿主細胞、好ましくは該ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。好ましくは、この宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、大腸菌細胞または酵母細胞であり、最も好ましくはバキュロウイルス感染昆虫細胞である。
もう１つの態様では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの発現に適当な条件下で上記宿主細胞を培養し、この細胞培養物からＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを回収することを含む、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの製造方法を提供する。さらに、この方法によって製造されるポリペプチドを提供する。
もう１つの態様では、本発明は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、異種アミノ酸配列と融合されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含む、キメラポリペプチドを提供する。好ましい態様では、この異種アミノ酸配列はエピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域である。
本発明のもう１つの側面では、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを担体と組み合わせて含む組成物を提供する。好ましい側面では、この組成物は治療有効量のポリペプチドを含み、ここに担体は製薬的に許容される担体である。また、この組成物がさらに、心臓血管、内皮または血管新生薬剤を含むのが好ましい。
さらなる態様では、本発明は心臓血管障害または内皮障害の処置用の組成物を製造する方法であって、治療有効量のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを担体と混合することを含む方法を提供する。
もう１つの態様では、本発明は以下のものを含む医薬品を提供する：
（ａ）上記組成物；
（ｂ）該組成物を含む容器；
（ｃ）心臓血管障害または内皮障害の処置における該ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの使用に言及する、該容器に貼られたラベル、または該医薬品に含まれるパッケージ内の印刷物。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、以下の過程を含む、ＶＥＧＦ−Ｅをコードする核酸配列の突然変異に関係する、疾患または疾患に対する罹患しやすさの診断方法を提供する：
（ａ）宿主由来のサンプルからＶＥＧＦ−Ｅをコードする核酸配列を単離し；ならびに、
（ｂ）ＶＥＧＦ−Ｅをコードする核酸配列中の突然変異を決定する。
さらなる態様では、本発明は、哺乳類の心臓血管障害および内皮障害の診断方法であって、
（ａ）哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプル中、および、
（ｂ）同細胞型の既知の正常組織細胞のコントロールサンプル中において、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子のを発現レベルを検出することを含む方法を提供し、ここでは、試験サンプル中の発現レベルがコントロールより高いか、あるいはより低い場合には、該試験組織細胞のソースである哺乳類が心臓血管または内皮の機能不全を有していることが示される。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、哺乳類の心臓血管障害または内皮障害の処置方法であって、該哺乳類に有効量のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、該障害は心臓肥大、外傷または骨関連障害である。また、該哺乳類はヒトであるのが好ましい。もう１つの好ましい態様では、障害が心臓肥大であり、それが大量のＰＧＦ２αの存在を特徴とするか、あるいは、それが心筋梗塞によって誘導されたものである（ここでは、心筋梗塞後、４８時間以内にＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの投与が開始されるのが好ましい）。もう１つの好ましい態様では、心臓血管障害または内皮障害は心臓肥大であり、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを心臓血管薬剤または内皮薬剤とともに投与する。より好ましくは、該心臓血管、内皮または血管新生薬剤は、抗高血圧薬、ＡＣＥ阻害剤、エンドセリンレセプターアンタゴニストおよび血栓溶解剤からなる群から選択される。
【００１５】
もう１つの態様では、本発明はＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、
（ａ）ポリペプチドが細胞の増殖を刺激する条件で、細胞と候補化合物を接触させ；
（ｂ）細胞増殖が該化合物によって阻害される程度を測定することを含む方法を提供する。
さらに、上記方法によって同定されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対するアゴニストを提供する。
また、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの発現または活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）化合物がポリペプチドと相互作用するのに十分な条件および時間で、候補化合物をポリペプチドと接触させ；ならびに、
（ｂ）化合物がポリペプチドと相互作用する程度を測定することを含む方法を提供する。
【００１６】
もう１つ態様では、本発明は上記方法によって同定された化合物を提供する。
さらなる態様では、本発明はＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの発現または活性を阻害する化合物を提供する。
もう１つの態様では、本発明は哺乳類の血管新生障害の処置方法であって、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対する有効量のアンタゴニストを該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。好ましい態様では、血管新生障害は癌または加齢性黄斑変性である。もう１つの好ましい態様では、該哺乳類はヒトである。さらなる好ましい側面では、有効量の血管新生薬剤を該アンタゴニストと組み合わせて投与する。
【００１７】
他の側面では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと結合する、単離された抗体を提供する。好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体である。
さらなる側面では、本発明は、哺乳類（好ましくはヒトである）の、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドによって誘導される血管新生の阻害方法であって、該哺乳類に治療有効量の抗体を投与することを含む方法を提供する。また該哺乳類は、好ましくは腫瘍または網膜障害を有する。別の好ましい側面では、該哺乳類は癌を有し、該抗体を化学療法薬、生長阻害剤または細胞毒性物質と組み合わせて投与する。
【００１８】
別の好ましい態様では、本発明はＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの存在を測定する方法であって、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含有すると推測される細胞を抗体に暴露し、細胞に対する抗体の結合を測定することを含む方法を提供する。
さらに別の好ましい側面では、本発明は、哺乳類の心臓血管障害、内皮障害または血管新生障害の診断方法であって、（ａ）抗体を、該哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプルと接触させ、（ｂ）抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体と、試験サンプル中のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの複合体形成を検出することを含む方法を供給する。
【００１９】
さらなる側面では、本発明は、適当なパッケージ中に該抗体および担体を含む癌診断キットを提供する。好ましくは、このキットはさらに、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを検出するための該抗体の使用に関する説明を含む。
さらなる態様では、本発明は以下のものを含む製品を提供する：
容器；
容器のラベル；および、
容器内に含有される抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体を含む組成物
（容器のラベルは、該組成物を治療的または診断的方法において用いることができることを示す）。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１はＶＥＧＦ−Ｅの完全長ＤＮＡ配列（配列番号１）を示し、そのうちコード化領域はヌクレオチド残基２５９〜１２９３までである。配列番号１は、the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia においてＤＮＡ２９１０１−１２７６ １９９８年３月５日として寄託されたＤＮＡ：２９１０１を表す。本明細書中、ＵＮＱ：１７４と称されることもあるＤＮＡ：２９１０１は、ＶＥＧＦ−Ｅをコードする領域を含む。開始コドンおよび終止コドンは丸で囲んであり、ＡＴＧで始まるコード領域および最後のコード化ヌクレオチドの直後にある終止コドンを示している。コード化領域は核酸１０３５個の長さであり、配列番号１の範囲内、第２５９位から第１２９３位である。配列番号１には、仮のリーダーシグナル配列またはプレタンパク質および推定の成熟タンパク質をコードする核酸が含まれる。
【図２】図２は、演繹されたＶＥＧＦ−Ｅのアミノ酸配列を記載し、本明細書中では、ＰＲＯ：２００、配列番号２と称される。この配列はＵＮＱ：１７４のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質を表す。対応する分子量は３９０２９Ｄである。ｐＩは６．０６である。ＮＸ（Ｓ／Ｔ）は３である。潜在的Ｎ−グリコシル化部位は第２５位、第５４位および第２５４位である。ＣＵＢドメインは第５２〜６５位、第１１８〜１２５位および第２６０〜２７３位である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３ＨはＨＵＶＥＣ管形成に対する、生長因子なし（図３Ａ）、１つまたはそれ以上の生長因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＰＭＡ）（図１１Ｂ〜１１Ｈ）の効果を示す。図３ＢはＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＰＭＡの組み合わせを示し、図３ＣはＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの組み合わせを示し、図３ＤはＶＥＧＦとＰＭＡの組み合わせを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３ＨはＨＵＶＥＣ管形成に対する、生長因子なし（図３Ａ）、１つまたはそれ以上の生長因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＰＭＡ）（図１１Ｂ〜１１Ｈ）の効果を示す。図３ＥはｂＦＧＦとＰＭＡの組み合わせを示し、図３ＦはＶＥＧＦのみを示し、図３ＧはｂＦＧＦのみを示し、図３ＨはＰＭＡのみを示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、ＩｇＧと共役させたＶＥＧＦ−Ｅ１％希釈物およびバッファーコントロール（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１４Ｍ ＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ６．８）１％希釈物のＨＵＶＥＣ管形成に対する効果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、ポリ−ｈｉｓと共役させたＶＥＧＦ−Ｅ１％希釈物およびバッファーコントロール（図４Ｂと同じ）１％希釈物のＨＵＶＥＣ管形成に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な記述）
Ｉ．定義
本明細書中で用いる「血管内皮細胞増殖因子−Ｅ」または「ＶＥＧＦ−Ｅ」とは、図２のヒトアミノ酸配列、ＶＥＧＦおよび骨形成タンパク質１と相同性を有しかつＶＥＧＦの生物学的活性に必要とされることが示されたすべてのＶＥＧＦシステイン残基が完全に保存されている配列を含む、本明細書中に記載の哺乳類の増殖因子を表す。ＶＥＧＦ−Ｅの発現には、ヒト胎児骨、胸腺、胃腸管、ならびに胎児精巣、肺およびリンパ節、および以下の実施例に示される他の組織における発現が含まれる。天然のＶＥＧＦ−Ｅの生物学的活性は、臍静脈内皮細胞の選択的増殖および／または生存を促進し、多能性線維芽細胞の増殖を誘導し、ヒト内皮セルラインにおいて即時型遺伝子ｃ−ｆｏｓを誘導し、心臓細胞の筋細胞肥大を引き起こし、副腎皮質毛細管内皮細胞のＶＥＧＦ刺激性増殖を阻害するか、あるいは、対応する天然ＶＥＧＦ−Ｅの少なくとも１つのエピトープに対して作成された抗体と免疫学的に交差反応性である免疫エピトープを有する、その任意のアナログまたは変異体と共有される。本明細書中のヒトＶＥＧＦ−Ｅはラットおよびマウス細胞に対して活性であり、このことから種間で保存されていることが示される。さらに本明細書中のＶＥＧＦ−Ｅは成長板領域で発現され、胎児筋細胞を取り囲むことが示された。
【００２２】
本明細書中で用いる「血管内皮細胞増殖因子」または「ＶＥＧＦ」とは、米国特許第５３３２６７１号に規定される哺乳類増殖因子を表す。天然ＶＥＧＦの生物学的活性は、ウシ角膜内皮細胞、レンズ内皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞またはケラチン生成細胞以外の、血管内皮細胞の選択的増殖を促進するか、あるいは対応する天然ＶＥＧＦの少なくとも１つのエピトープに対して作成された抗体と免疫学的に交差反応性である免疫エピトープを有する、その任意のアナログまたは変異体と共有される。
本明細書中で用いる用語「ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド」および「ＶＥＧＦ−Ｅ」には、天然配列ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドおよびＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド変異体（本明細書中でさらに定義されているもの）が含まれる。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは、ヒト組織型または他のソースのような種々のソースから単離することができ、また、組換え法あるいは合成法によって製造することができる。
【００２３】
「天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド」には、天然由来のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは、天然ソースから単離するか、あるいは組換え法または合成法によって製造可能である。詳細には、用語「天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド」には、天然に存在する、トランケートされた形態または分泌型のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの天然に存在する変異型（例えば異なってスプライシングされた形態）および天然に存在する対立性変異体(allelic variants)が含まれる。本発明の１つの態様では、天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは、図２に記載のアミノ酸１〜３４５を含む、成熟または完全長の天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドである。
【００２４】
「ＶＥＧＦ−Ｅ変異体」とは、以下に定義される、完全長の天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに関して図２に示される演繹された（推定）アミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、活性なＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを意味する。このようなＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド変異体には、例えば、図２の配列のＮ末端またはＣ末端、または配列内部で、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が添加、欠失または置換されているＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドならびにその活性断片が含まれる。
通常、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド変異体は、図２のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性を有する。
【００２５】
本明細書中で同定されるＶＥＧＦ−Ｅアミノ酸配列に関する「％アミノ酸配列同一性」とは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義する（ここでは、配列をアラインメントし、必要であれば、最大の％配列同一性を達成するようにギャップを導入するが、いかなる保存的置換をも配列同一性の部分とは考えない）。当業者の技術水準の範囲内である種々の方法、例えば、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、％アミノ酸配列同一性を測定するためのアラインメントを行うことができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定できる。
【００２６】
「％核酸配列同一性」とは、図１に示される配列（配列番号１）と同一である、それぞれの候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージとして定義する（ここでは配列をアラインメントし、必要であれば、最大の％配列同一性を達成するようにギャップを導入する）。当業者の技術水準の範囲内である種々の方法、例えば、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、％核酸配列同一性を測定するためのアラインメントを行うことができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定できる。
【００２７】
本明細書中で開示される種々のポリペプチドを記載するのに用いる「単離された」とは、その天然環境の成分から同定分離され、ならびに／あるいは回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の汚染成分は、一般にこのポリペプチドに関する診断的利用または治療的利用を妨害するであろう物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれる。好ましい態様では、（１）スピニングカップ配列決定装置を用いて、少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、あるいは（２）非還元または還元条件下、クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色剤を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質にまで、ポリペプチドを精製する。組換え細胞内インシトゥーのポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド天然環境の成分が１つも存在しないので、単離されたポリペプチドに含まれる。しかし通常、「単離された」ポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００２８】
「単離された」ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸分子は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸の天然ソースにおいて通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定分離された核酸分子である。単離されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然に見出されるような構成設定とは異なっている。したがって、単離されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸分子は、天然細胞内に存在するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸分子とはっきり区別できる。しかし、単離されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸分子には、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを通常発現している細胞であって、例えば該核酸分子が天然細胞内での位置と異なる染色体上の位置に存在する細胞内に含まれるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
【００２９】
用語「心臓血管障害および内皮障害」および「心臓血管機能不全および内皮機能不全」とは、交換可能に用いられ、血管新生および／または心臓血管形成を刺激する、一般に全身性の障害を表す。これには、脈管に影響する疾患ならびに、動脈、毛細管、静脈および／またはリンパ管のような脈管自体の疾患が含まれる。このような障害には、例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、炎症性脈管炎、レイノー(Reynaud's)病およびレイノー症状、動脈瘤、および動脈再狭窄症のような動脈疾患；血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ水腫のような静脈およびリンパ管障害；および、末梢血管疾患、外傷、例えば傷害、やけどおよび他の損傷した組織、移植片凝固、瘢痕、虚血再潅流、損傷、慢性関節リウマチ、脳血管疾患、腎疾患、例えば急性腎不全および骨粗鬆症のような他の管障害が含まれる。これにはまた、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大および心不全、例えば鬱血性心不全（ＣＨＦ）が含まれるであろう。
【００３０】
用語「血管新生障害」とは、血管新生を阻害する薬剤、例えば血管静止化合物での処置を必要とする障害を表す。このような障害には、例えば、管腫、例えば血管腫（毛細管および海面性）、糸球体腫、毛細管拡張症、桿菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫(lymphangiosarcoma)のようなタイプの癌および腫瘍血管新生が含まれる。
【００３１】
本明細書中で用いる「肥大」とは、腫瘍形成を含まない天然の生長とは無関係の、器官または構造の質量増加として定義する。器官または組織の肥大は個々の細胞の質量の増加に基づくものであるか（真の肥大）、あるいは組織を構成する細胞数の増加に基づくもの（過形成）であるか、あるいは両者に基づくものである。特定の器官、例えば心臓は生誕後短期間のうちに分裂能を失う。したがって、「心臓肥大」は心臓の質量の増加として定義され、成人では、これは、細胞分裂を伴わない心筋細胞のサイズおよび収縮性タンパク質含量の増加を特徴とする。肥大を刺激するストレスの特徴（例えば、心筋梗塞におけるような、前負荷の増加、後負荷の増加、心筋細胞の喪失、または収縮性の基本的機能低下）は応答の性質を決定するのに重要な役割を果たすと思われる。初期段階の心臓肥大は通常、形態学的に、ミクロフィブリルおよびミトコンドリアのサイズの増加、ならびにミトコンドリアおよび核の拡大を特徴とする。この段階では、筋肉細胞は正常細胞より大きいが、細胞内構成はほぼ保存されている。心臓肥大がより進んだ段階では、特定の細胞内小器官、例えばミトコンドリアのサイズまたは数が選択的に増加し、異常なことに、新たな収縮性成分が細胞の局在する領域に加えられる。長期にわたって肥大していた細胞は、非常に小さく分解された膜を有する、顕著に拡大した核を含めて、その細胞内構成がより明らかに崩壊し、ここでは、核に近接するミクロフィブリルが取り除かれ、正常なＺ帯レジストレーションの崩壊が生じる。用語「心臓肥大」は、元となる心臓障害にかかわらず、種々の程度の、心筋の構造的損傷によって特徴付けられる、この症状のすべての進行段階を含むものとして用いられる。したがって、この用語はまた、心臓肥大の発達を助長する生理的状態、例えば高血圧、大動脈狭窄または心筋梗塞を含む。
【００３２】
「心不全」とは、心臓が代謝組織の要求に必要な割合で血液を送り出さない心臓機能の異常を表す。心不全は、虚血性、先天性、リウマチ性、または特発性型を含む、多数の要因によって引き起こされ得る。
「鬱血性心不全」または「ＣＨＦ」は、進行性の病理状態であり、ここでは心臓が徐々に、末梢組織に酸素化血をデリバリーするのに適当な心臓出力（心臓によって送り出される、時間あたり血液量）を供給できなくなる。ＣＨＦが進行するにつれて、構造的および血流力学的損傷が生じる。これらの損傷はさまざまに現れるが、１つの特徴的徴候は心室肥大である。ＣＨＦは多数の種々の心臓障害の一般的な最終結果である。
【００３３】
一般に、「心筋梗塞」は、しばしば冠血栓症を併発する、冠動脈のアテローム性動脈硬化症から生じる。これは以下のような２つの主要なタイプに分類することができる：経壁性梗塞（ここでは、心筋壊死に心室壁の完全肥厚が含まれる）および心内膜下心筋梗塞(subendocargial)（非経壁性）（ここでは、壊死に心内膜下(subendocardium)、壁内心筋または両者が関与し、心室壁を通るすべての経路は心外膜まで拡大しない）。心筋梗塞は、心臓の損傷領域または健康な領域において、血流力学的作用の変化および構造の変更の両方を引き起こすことが知られている。したがって心筋梗塞は、例えば最大心臓出力および心臓の拍動容量を減少させる。また心筋梗塞に付随して、隙間でＤＮＡ合成の刺激が生じ、ならびに、病気に冒されていない心臓領域のコラーゲン形成が増加する。
【００３４】
例えばトータルの末梢抵抗の増加による長い高血圧状態において、心臓に対するストレスまたは緊張が増加した結果を受けて、長い間、心臓肥大は「高血圧」と関連付けられてきた。慢性の過負荷圧力のせいで肥大した心室の特徴は、心拡張運動障害である。Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol., 4: 1500-1506 (1984)； Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol., 5: 869-874 (1985)。初期本態性高血圧症においては、正常または正常以上の心収縮機能にもかかわらず、長い左心室の弛緩が検出された。Hartford et al., Hypertension, 6: 329-338 (1984)。しかし、血圧レベルと心臓肥大の間に密接な対応はない。ヒトにおいて、抗高血圧治療に応じて左心室機能の改善が報告された一方、利尿剤（ヒドロクロロチアジド）、β−遮断剤（プロプラノロール）またはカルシウムチャンネル遮断剤（ジルチアゼム）でさまざまに処置された患者は左心室肥大の回復を示したが、心拡張機能の改善を示さなかった。Inouye et al., Am. J. Cardiol., 53: 1583-7 (1984)。
【００３５】
心臓肥大に付随する別の複雑な心臓疾患は「肥大性心筋症」である。この症状は、形態学的、機能的および臨床的特徴に大きな多様性があることが特徴的であり(Maron et al., N. Engl. J. Med., 316: 780-789 (1987)； Spirito et al., N. Engl. J. Med., 320: 749-755 (1989)； Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36: 275-308 (1994)； Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995))、その異質性は、すべての年代の患者を苦しめるという事実によって強調される。Spirito et al., N. Engl. J. Med., 336: 775-785 (1997)。肥大性心筋症の原因はまた、その多様性とほとんど理解されていないことでもある。一般に、筋節タンパク質をコードする遺伝子の突然変異は肥大性心筋症と関連する。最近のデータでは、β−ミオシン重鎖突然変異が家族性の肥大性心筋症のうち約３０〜４０％の原因であり得ることが示されている。Watkins et al., N. Engl. J. Med., 326: 1108-1114 (1992)； Schwartz et al, Circulation, 91: 532-540 (1995)； Marian and Roberts, Circulation, 92: 1336-1347 (1995)； Thierfelder et al., Cell, 77: 701-712 (1994)； Watkins et al., Nat. Gen., 11: 434-437 (1995)。β−ミオシン重鎖に加えて、遺伝的突然変異の他の位置には、心臓トロポニンＴ、αトポミオシン(topomyosin)、心臓ミオシン結合プロテインＣ、本態性(essential)ミオシン軽鎖および調節性(regulatory)ミオシン軽鎖が含まれる。Malik and Watkins, Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-302 (1997)を参照のこと。
【００３６】
心臓弁上膜(Supervelvular)「大動脈弁狭窄症」は、上行大動脈の狭窄を特徴とする遺伝的血管障害であり、肺動脈を含む他の動脈が影響を受けていることもある。大動脈弁狭窄症を未処置にしておくと、心臓内圧の増加を導き、心筋肥大および、ついには心臓機能不全および死を招き得る。この障害の病因は完全には理解されていないが、内側平滑筋の肥大および、可能性としては過形成もが、この障害の顕著な特徴である。エラスチン遺伝子の分子的変異体が大動脈弁狭窄症の発達および病因に関与することが報告された（１９９７年７月２２日発行の米国特許第５６５０２８２号）。
【００３７】
「弁閉鎖不全」は心臓疾患の結果として生じ、心臓弁の障害を引き起こす。リウマチ熱様の種々の疾患は、弁口を萎縮させ、あるいは引きちぎる原因になり得り、また他の疾患は心内膜炎、心内膜または房室口の内膜の炎症および心臓の手術を招くかもしれない。弁狭窄症の狭窄化または弁の閉鎖不全のような障害は、心臓腔に血液を蓄積させるか、あるいは弁を通る血液を逆流させる。治療しないと、長期の弁狭窄症または不全症は、心臓肥大および関連する心筋への損傷を生じさせ、ついには弁の交換を必要とするかもしれない。
これらすべてに対する処置および、心臓肥大を伴ってもよいし、伴わなくてもよい他の心臓血管障害および内皮障害に対する処置は本発明に包含される。
【００３８】
用語「癌」「癌の」および「悪性の」とは、典型的には調節不能の細胞増殖を特徴とする哺乳類の生理的状態を意味し、あるいは説明する。癌の例には、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫および白血病を含む癌腫が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のさらなる具体例には、扁平上皮癌、小細胞型肺癌、非小細胞型肺癌、胃腸管系癌、ホジキン型および非ホジキン型リンパ腫、膵臓癌、グリア芽細胞腫、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、例えば肝癌および肝細胞腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、例えば腎細胞腫およびウィルムス腫瘍(Wilms' tumors)、基底細胞腫、黒色腫、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、および種々のタイプの頭部および頚部の癌が含まれる。本明細書中の処置に好ましい癌は乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌および、上記の血管性腫瘍を含む他のものである。
【００３９】
本明細書中で用いる用語「細胞毒性物質」とは、細胞の機能を阻害するか、あるいは防止し、ならびに／あるいは細胞の崩壊を引き起こす物質を表す。この用語には放射性同位体（例えば１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅ）、化学療法薬および毒素、例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素またはその断片が含まれるものとする。
【００４０】
「化学療法薬」は、癌の処置に有用な化学化合物である。化学療法薬の例には、アルキル化剤、葉酸剤アンタゴニスト、核酸代謝の抗−代謝産物、抗生物質、ピリミジンアナログ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドまたはコルチコステロイドが含まれる。具体例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、タキソテレ(Taxotere)、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４６７５１８７号参照）、メルファラン、および他の関連ナイトロジェンマスタードが含まれる。また、この定義範囲内には、腫瘍に対するホルモン活性を調節し、あるいは阻害するように作用するホルモン性物質、例えばタモキシフェンおよびオナプリストン(onapristone)が含まれる。
【００４１】
本明細書中で用いる「増殖阻害剤」とは、インビトロまたはインビボにおいて、Ｗｎｔ過剰発現癌細胞のような細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を表す。したがって、増殖阻害剤はＳ期にある悪性細胞のパーセンテージを有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例には、セルサイクルの進行を（Ｓ期以外の時点で）遮断する物質、例えばＧ１停止またはＭ期停止を誘導する物質が含まれる。伝統的なＭ期遮断剤には、ニチニチソウ属（ｖｉｎｃａｓ、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソールおよびトポＩＩ阻害剤(topo II inhibitors)、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンが含まれる。Ｇ１停止させる物質、例えば、タモキシフェン、プレドニソン、デカルバジン(decarbazine)、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤の場合でも、Ｓ期停止にずれ込むことがある。さらなる情報については、Murakami et al. The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 特にｐ．１３に見出すことができる。さらなる例には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性または塩基性のＦＧＦまたは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の血管新生活性を阻害または中和することができる抗体、組織因子、プロテインＣまたはプロテインＳの凝固剤活性を阻害あるいは中和することができる抗体（１９９１年２月２１日公開のＷＯ ９１／０１７５３を参照）またはＨＥＲ２レセプターに結合可能な抗体（ＷＯ ８９／０６６９２）、例えば４Ｄ５抗体（およびその機能的等価物）（例えばＷＯ ９２／２２６５３）が含まれる。
【００４２】
「処置」とは、心臓血管障害、内皮障害または血管新生障害の発達を防ぐか、あるいはその病状を変更することを意図して行われる介入である。処置の概念は最も広い意味に用いられ、具体的には、すべての状態の心臓血管障害、内皮障害または血管新生障害の予防、緩和、減少および治療が含まれる。したがって、「処置」とは、治療的処置および予防的または防止的測定の両方を意味し、その目的は心臓血管障害または内皮障害、例えば肥大、または血管新生障害、例えば癌を防止し、減退（減少）させることである。処置を必要とするのは、すでに該障害を伴う患者、ならびに該障害になりやすい患者または該障害を防止すべきである患者である。この障害は、特発性、心臓栄養性(cardiotrophic)または筋肉栄養性(myotrophic)の原因、または虚血または虚血性発作、例えば心筋梗塞を含む任意の原因から生じ得る。
【００４３】
「慢性（長期）の」と投与とは、最初の効果、例えば抗肥大効果を長期間維持すべく、急性の方法とは反対の継続的方法によって薬剤を投与することを意味する。
処置を目的とする「哺乳類」とは、ヒト、およびイヌ、ウマ、ネコ、乳牛、ヒツジ、ブタなどのような家畜(domestic and farm animals)、および動物園の、競技用、もしくはペット動物を含む、哺乳類として分類されるあらゆる動物を表す。好ましくは哺乳類はヒトである。
１つまたはそれ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時に投与することおよび任意の順序で連続投与することが含まれる。
【００４４】
用語「心臓血管薬剤または内皮薬剤」とは、包括的に、心臓血管障害および／または内皮障害の処置において作用する任意の薬物を表す。心臓血管薬剤の例には、すべて心臓血管疾患において役割を有する要因である、血圧、心臓速度、心臓収縮性および、内皮および平滑筋の生物学を調節することによって血管のホメオスタシスを達成するものである。これらの具体例には、アンギオテンシン−ＩＩレセプターアンタゴニスト；エンドセリンレセプターアンタゴニスト、例えばＢＯＳＥＮＴＡＮ（登録商標）およびＭＯＸＯＮＯＤＩＮ（登録商標）；インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）；デス−アルパルテート−アンギオテンシンＩ；血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡおよび、より長い半減期および非常に高いフィブリン特異性を有するように特別に設計されたｔ−ＰＡ変異体、ＴＮＫ ｔ−ＰＡ（Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ ｔ−ＰＡ変異体、Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670-3674 (1994)；変力剤または高血圧剤、例えばジゴキシゲニンおよびβ−アドレナリン作動性レセプター遮断剤、例えばプロプラノロール、マレイン酸チモロール(timolol)、テルタロロール(tertalolol)、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール(betaxolol)、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロールおよびカルベジロール；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、例えばキナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル(ramipril)、ベナゼプリル(benazepril)、フォシノプリル(fosinopril)およびリシノプリル；利尿剤、例えばクロロチアジド(chorothiazide)、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメタジド(hydroflumethazide)、メチルクロチアジド(methylchlothiazide)、ベンズチアジド(benzthiazide)、ジクロルフェナミド(dichlorphenamide)、アセタゾルアミドおよびインダパミド；およびカルシウムチャンネル遮断剤、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、ニカルジピンが含まれる。このタイプのうち好ましい範疇の１つは、心臓肥大または、心臓肥大の発達を助長する生理的条件、例えば高血圧、動脈狭窄または心筋梗塞を処置するために用いられる治療薬である。
【００４５】
「血管新生薬剤」および「内皮薬剤」は、それぞれ血管新生(angiogenesis)および内皮細胞増殖、あるいは、適用可能であれば、血管形成(vasculogenesis)を促進する活性な薬剤である。これには、傷害治癒を促進する因子、例えば成長ホルモン、インシュリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＥＧＦ、ＶＩＧＦ、ＰＤＧＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ＦＧＦおよびＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βが含まれるであろう。
【００４６】
「血管静止剤」は、血管新生または血管形成を阻害し、また癌細胞の増殖を阻害あるいは防止する活性な薬剤である。具体例には、上に定義される血管新生剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体が含まれる。これにはさらに、細胞治療剤、例えば細胞毒性物質、化学療法薬、増殖阻害剤、アポトーシス剤および、癌を処置する他の薬剤、例えば抗ＨＥＲ−２、抗ＣＤ２０および他の生物活性物質および有機化学物質が含まれる。
【００４７】
薬理学的意味において、本発明の明細書中、活性な薬剤（ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドまたはそのアンタゴニスト）の「治療有効量」とは、心臓血管障害、内皮障害および血管新生障害の処置に有効な量を表す。
【００４８】
用語「アンタゴニスト」は最も広義に用いられ、これには、本明細書中に開示される、１つまたはそれ以上の天然ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの生物学的活性、例えば、適用可能であれば、その有糸分裂促進活性または血管新生活性を部分的または完全に遮断、阻害あるいは中和する任意の分子が含まれる。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが細胞のレセプターに結合するのを妨げるか、あるいはＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドによって活性化された細胞を無能化するか、あるいは殺すか、あるいはＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが細胞のレセプターに結合した後の血管内皮細胞の活性化を妨げることによって作用し得る。このようなＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドアンタゴニストが介入するポイントは、本発明の目的に関して同等であると考える。このアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの有糸分裂促進活性、血管新生活性、または他の生物学的活性を阻害し、これゆえ、例として、腫瘍、および特に充実性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後部線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺性過形成（thyroid hyperplasias、グレーヴズ病を含む）、角膜および他の組織の移植および慢性炎症を含む、望ましくない過剰な新血管新生を特徴とする疾患または障害の処置に有用である。このアンタゴニストはまた、脳腫瘍関連浮腫、悪性腫瘍関連腹水症、メーグス症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心嚢貯留液（例えば心膜炎に関連するもの）および胸水のような望ましくない過剰の血管透過性を特徴とする疾患または障害の処置にも有用である。
【００４９】
同様に、用語「アゴニスト」は最も広義に用いられ、これには、本明細書中に開示される、生物学的に活性な天然のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを模倣する任意の分子が含まれる。具体的に、適当なアゴニストまたはアンタゴニスト分子には、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体断片、断片、または天然ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などが含まれる。
【００５０】
「小分子」とは、本明細書中では、約５００ダルトン以下の分子量を有するものと定義する。
【００５１】
本明細書中で用いる用語「ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドレセプター」とは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対する細胞レセプター、通常、血管上皮細胞に見られる細胞表面レセプター、ならびにその変異体であって、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド結合能を保持しているものを表す。
【００５２】
用語「抗体」は最も広義に用いられ、具体的には、単一の抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体組成物を含む。本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質の抗体集団から得られる抗体を意味し、すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、天然に少量存在し得る突然変異を除いて同一である。
【００５３】
本発明の目的に関する「活性な」または「活性」とは、天然の、あるいは天然に存在するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの生物学的に活性を有するＶＥＧＦ−Ｅ形態を表す。
【００５４】
ハイブリダイゼーションは「ストリンジェントな条件」下で行うのが好ましく、これは、（１）洗浄に関し、低イオン強度および高温、例えば０．０１５ 塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いるか、あるいは（２）ハイブリダイゼーション時に、変性剤、例えばホルムアミド、例えば、７５０ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウムを含む０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ｎＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を伴う５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドを４２℃で用いる。別の例では、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波破砕したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ ＳＤＳおよび１０％ 硫酸デキストランを４２℃で用い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中４２℃で洗浄する。さらに別の例では、１０％ 硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ ホルムアミドのバッファーを５５℃で用いてハイブリダイゼーションし、次いでＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣ（５５℃）で高ストリンジェンシー洗浄する。以前に記載されており、周知である他の条件を用いて、高度、低度または中程度なストリンジェンシーを達成することができる。核酸分子の核酸配列が提供されている場合、上に記載する条件下でそれにハイブリダイゼーションする他の核酸分子は本発明の範囲内であると考える。好ましくは、本明細書中に提供される核酸分子の核酸配列は、配列番号１の第２５９位〜第１２９３位と７０％または８０％の核酸配列同一性を有する。最も好ましくは、この核酸配列は、配列番号１の第２５９位〜第１２９３位と９０％または９５％の核酸同一性を有する。
【００５５】
「トランスフェクション」とは、いずれかのコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを表す。例えば、ＣａＰＯ４およびエレクトロポレーションのようなたくさんのトランスフェクション方法が当業者に既知である。一般にトランスフェクションの成功は、このベクターの操作に関するいずれかの指標が宿主細胞内で生じることにより認識される。
【００５６】
「形質転換（形質導入）」とは、核酸を生物内に導入し、染色体外因子として、あるいは染色体に組み込ませることによって該核酸を複製可能にすることを意味する。用いられる宿主細胞に応じ、該細胞に適当な標準技術を用いて形質転換を行う。一般に、実質的な細胞壁障壁を有する原核生物および他の細胞に関しては、Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972) および Mandel et al., J. Mol. Biol., 53: 154 (1970) に記載の、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理を用いる。細胞壁を有さない哺乳類細胞に関しては、Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面は、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４３９９２１６号中、Ａｘｅｌ によって記載されている。酵母への形質導入は、典型的に、Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) および Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979) の方法にしたがって行う。しかし、核注入またはプロトプラスト融合のような、細胞に核酸を導入する他の方法を用いることもできる。
【００５７】
「部位特異的突然変異誘発」とは、当分野の技術標準であり、突然変異誘発されるべき一本鎖ファージ核酸と、所望の突然変異を示す一定のミスマッチを除いて相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。簡単には、この合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、このファージに対する相補鎖を合成させ、得られた二本鎖核酸をファージ支持宿主バクテリア中に形質導入する。この形質転換されたバクテリアの培養物を上層寒天にプレーティングし、ファージを宿す単一の細胞からプラークを形成させる。理論的には、新規プラークの５０％が一本鎖として突然変異型を有するファージを含み；５０％は元の配列を有するであろう。このプラークをキナーゼ処理された合成プライマーと、正確な対形成のハイブリダイゼーションを許容するが、元の鎖とのハイブリダイゼーションをミスマッチが妨げるのに十分な温度でハイブリダイゼーションさせる。次いで、該プローブとハイブリダイゼーションするプラークを選択し、培養して核酸を回収する。
【００５８】
「作動可能に連結された」とは、成分の正常な機能が行われ得るような並置を表す。したがって、制御配列に「作動可能に連結された」コード化配列とは、コード化配列がこれらの配列の制御下で発現可能であり、連結されているＤＮＡ配列が隣接し、さらに分泌リーダーの場合には、隣接し、リーディングフェイズ(reading phase)内にあるような配置を表す。例えば、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーに対する核酸をポリペプチドに対する核酸に作動可能に連結し；配列の転写に影響を与える場合は、プロモーターまたはエンハンサーを作動可能に連結し；あるいは、翻訳を促進するように配置する場合には、コード化配列に対しリボソーム結合部位を作動可能に連結する。連結は都合のよい制限部位でライゲーションすることによって行う。このような部位が存在しない場合は、慣用の実施にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを利用する。
【００５９】
「制御配列」は、特定の宿主生物内における、作動可能に連結されたコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を表す。原核生物に適当な制御配列には、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位および、可能性としては、他のまだ理解に乏しい配列が含まれる。真核生物細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００６０】
「発現系」とは、作動可能な連結物内に所望のコード化配列（コーディング配列）および制御配列を含み、これらの配列で形質転換された宿主がコード化タンパク質を生産可能であるようなＤＮＡ配列を表す。形質転換を行うために、この発現系はベクター内に含まれ得るが、次いで、関連するＤＮＡが宿主染色体に組み込まれることもある。
【００６１】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は交換可能に用いられ、これらの名称はすべて、後代を含む。したがって、「形質転換体」または「形質転換細胞」には、何回世代交代したかにかかわらず、最初の対象細胞およびそこから誘導された培養物が含まれる。また、計画的または偶然の突然変異のせいで、すべての後代のＤＮＡ含量が正確に一致するわけではないかもしれないことが理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能性を有する突然変異した後代も含まれる。はっきりと区別される名称が意図される箇所では、文脈からそれが明らかであろう。
【００６２】
「プラスミド」は、大文字および／または数字が先立つ小文字ｐおよび／または後に続く小文字ｐによって表される。本明細書中の出発プラスミドは市販されているか、制限なく公に入手可能であるか、あるいは入手可能なプラスミドから公開されている手法にしたがって構築することができる。加えて、他の等価なプラスミドは当分野に既知であり、当業者には明らかであろう。
【００６３】
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの特定部位でのみ作用する酵素でＤＮＡを触媒的に開裂させることを表す。このような酵素は制限酵素と称され、これに対してそれぞれ特異的な部位は制限部位と称される。本明細書中で用いられる種々の制限酵素は市販されており、その酵素の供給元によって確立された反応条件、補因子および他の必要物を用いる。制限酵素は一般に、各制限酵素が元々得られた微生物を表す、大文字およびそれに続く文字で構成される略語によって表され、次いで数字により特定の酵素が表される。一般に、約１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、バッファー溶液約２０ｍＬ中の酵素約１〜２ユニットとともに用いる。特定の制限酵素に対する適当なバッファーおよび基質量は製造元によって特定される。通常、３７℃で約１時間のインキュベーションを行うが、これは供給元の指示にしたがって変わり得る。インキュベーション後、フェノールおよびクロロホルムで抽出してタンパク質を除去し、消化された核酸をエタノールで沈殿させて水性フラクションから回収する。制限酵素での消化後、まれに、末端５’リン酸塩をバクテリアのアルカリホスファターゼで加水分解し、ＤＮＡ断片の２つの制限酵素開裂末端が「環化」するか、あるいは閉環ループを形成して、制限部位における別のＤＮＡ断片の挿入を妨害するのを妨げる。特に記載しない限り、プラスミドを消化した後、５’末端の脱ホスホリル化は行わない。脱ホスホリル化の手法および試薬は慣用のものである(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), pp. 133-134)。
【００６４】
制限消化物からの規定のＤＮＡ断片の「回収」または「単離」とは、電気泳動して、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で消化物を分離し、この移動度を既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度と比較して、関心ある断片を同定し、所望の断片を含むゲルセクションを切り出し、ＤＮＡからゲルを分離することを意味する。この手法は、一般に既知である。例えば、Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 (1981)、および Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980)を参照のこと。
【００６５】
「サザン分析」とは、消化物またはＤＮＡ含有組成物中にＤＮＡ配列が存在することを既知のラベル化されたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって確認する方法である。本発明の目的に関して、特に記載しないかぎり、サザン分析とは、１％ アガロース上で消化物を分離し、変性させ、Southern, J. Mol. Biol., 98: 503-517 (1975) の方法によってニトロセルロース膜に移し、Maniatis et al., Cell, 15: 687-701 (1978) に記載のようにハイブリダイゼーションさせることを意味する。
【００６６】
「ライゲーション」とは、２つの二本鎖核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させる過程を表す(Maniatis et al., 1982, 上記, p. 146)。特に記載しない限り、ライゲーションは、約等モル量の、ライゲーションされるＤＮＡ断片０．５ｍｇ当たり、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）１０ユニットを含む既知のバッファーおよび条件を用いて行い得る。
【００６７】
形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、微生物培養物からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。特に記載しない限り、Maniatis et al., 1982, 上記, p. 90 のアルカリ／ＳＤＳ法を用いてもよい。
【００６８】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（例えば、１９８８年５月４日公開のＥＰ特許公報第２６６０３２号に記載のような固相技術を用いるか、あるいは Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 (1986) に記載のデオキシヌクレオシド Ｈ−ホスホナート中間体を介する、ホスホトリエステル、亜リン酸塩またはホスホルアミダイト化学）によって化学的に合成された、長さの短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次いでこれをポリアクリルアミドゲルで精製する。
【００６９】
ＶＥＧＦ−Ｅの阻害剤には、アンチセンス分子を含む、ＶＥＧＦ−Ｅの活性または発現を減少させるか、あるいは阻害するものが含まれる。
【００７０】
略語「ＫＤＲ」とは、ＶＥＧＦ分子のキナーゼドメイン領域を表す。ＶＥＧＦ−ＥはこのドメインにおいてＶＥＧＦとの相同性を有さない。
【００７１】
略語「ＦＬＴ−１」とは、対応するＦＬＴ−１レセプターに結合することが知られている、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ結合ドメインを表す。ＶＥＧＦ−ＥはこのドメインにおいてＶＥＧＦとの相同性を有さない。
【００７２】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
Ａ．完全長ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド
本発明は、本明細書中、ＶＥＧＦ−Ｅと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定単離されたヌクレオチド配列を提供する。具体的には、以下の実施例にさらに詳細に開示されているように、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定単離した。ＢＬＡＳＴ配列アラインメントコンピュータープログラムを用い、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドがＶＥＧＦおよびＢＭＰ１と一定の配列同一性を有していることがわかった。
【００７３】
Ｂ．ＶＥＧＦ−Ｅ変異体
本明細書中に記載の、完全長の天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに加えて、ＶＥＧＦ−Ｅ変異体を調製することが可能であると考えられる。ＶＥＧＦ−Ｅ変異体は、ＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡに適当なヌクレオチド変更を導入するか、あるいは所望のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者であれば、アミノ酸変更がＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの翻訳後プロセッシング、例えばグリコシル化部位の数または位置もしくは膜アンカー性質を変化させ得ることを理解するであろう。
例えば、米国特許第５３６４９３４号に記載の保存的および非保存的突然変異に関するいずれかの技術およびガイドラインを用いて、天然の完全長配列ＶＥＧＦ−Ｅまたは、本明細書中に記載のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの種々のドメインに変異を施すことができる。変異は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であって、天然配列のＶＥＧＦ−Ｅと比べて、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じさせるものであり得る。場合により、この変異は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの１つまたはそれ以上のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が他のいずれかのアミノ酸で置換されていることによるものである。所望の活性に不都合な影響を与えることなく、いずれのアミノ酸残基を挿入、置換または欠失させることができるかの決定に関する指針は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子と比較し、高度に相同な領域内に施されるアミノ酸配列変化の数を最小にすることに見出すことができる。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造および／または化学的性質を有する別のアミノ酸と取り替えること、例えばロイシンをセリンで置換すること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、アミノ酸１〜５個の範囲内であることもある。可能な変異は、該配列にアミノ酸の挿入、欠失または置換を計画的に施し、得られた変異体を、以下の実施例に記載のインビトロアッセイにおける活性に関して試験することによって決定することができる。
【００７４】
このような変異は、当分野に既知の方法、例えばオリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング(alanine scanning)およびＰＣＲ突然変異誘発を用いて施すことができる。部位特異的突然変異誘発(Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)； Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987))、カセット突然変異誘発(Wells et al., Gene, 34:315 (1985))、制限選択的突然変異誘発(restriction selection mutagenesis, Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986))、または他の既知の技術をクローン化ＤＮＡに対して施し、ＶＥＧＦ−Ｅをコードする変異体ＤＮＡを生産する。
また、走査性アミノ酸(scanning amino acid)分析を用いて、１つまたはそれ以上のアミノ酸を、連続する配列に沿って同定することができる。好ましい走査性アミノ酸は比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが含まれる。アラニンはβ−炭素を超える側鎖がなく、変異体の主鎖のコンフォメーションを変更する可能性が低いため、この群内の一般に好ましい走査性アミノ酸である。また、アラニンは最も一般的なアミノ酸であるため、一般に好ましい。さらに、アラニンはしばしば、埋め込まれた位置および暴露された位置の両方に見られる(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976))。アラニン置換によって適量の変異が生じない場合には、イソテリックアミノ酸(isoteric amino acid)を用いることができる。
【００７５】
Ｃ．ＶＥＧＦ−Ｅの修飾
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの共有結合による修飾は本発明の範囲内に含まれる。１つのタイプの共有結合による修飾には、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの標的アミノ酸残基を、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの選択的側鎖またはＮ末端またはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化物質と反応させることが含まれる。二官能性物質での誘導体化は、例えば、抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体の精製方法での使用のために、ＶＥＧＦ−Ｅを水不溶性の支持基質または表面に架橋するのに有用であり、また逆も然りである。一般に用いられる架橋剤には、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドおよび、メチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ）プロピオイミデートのような物質が含まれる。
他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基をそれぞれ対応するグルタミルおよびアルパルチル残基に脱アミド化し、プロリンおよびリシンをヒドロキシル化し、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基をリン酸化し、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基をメチル化し(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))、Ｎ末端アミンをアセチル化し、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基をアミド化することが含まれる。
【００７６】
本発明の範囲内に含まれる、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの、別のタイプの共有結合による修飾は、このポリペプチドの天然グルコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、本発明の目的のため、天然配列のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド中に見られる１つまたはそれ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または、天然配列のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドには存在しない１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を加えることを意味するものとする。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアミノ酸配列を変更することによって、これにグリコシル化部位を加えることができる。この変更は、例えば（Ｏ結合グリコシル化に関しては）天然配列のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を加えるか、あるいは天然配列のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基で置換することによって行ってもよい。場合により、ＤＮＡレベルでの変化、特にＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするＤＮＡをあらかじめ選択された塩基の位置で突然変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることによってＶＥＧＦ−Ｅアミノ酸配列を変化させてもよい。
【００７７】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの炭水化物部分の数を増加させる別の方法は、このポリペプチドに、化学的または酵素的にグリコシドをカップリングさせることによるものである。このような方法は、当分野、例えば１９８７年９月１１日公開のＷＯ ８７／０５３３０および Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) に記載されている。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド上に存在する炭水化物部分は、化学的または酵素的に、あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異性置換によって除去することができる。化学的脱グリコシル化技術は当分野に既知であり、例えば Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) および Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981) に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分は、Thokakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987) に記載のように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いて酵素的に開裂させることができる。
【００７８】
ＶＥＧＦ−Ｅの、別のタイプの共有結合による修飾には、米国特許第４６４０８３５号、第４４９６６８９号、第４３０１１４４号、第４６７０４１７号、第４７９１１９２号または第４１７９３３７号に記載の方法により、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのいずれかと結合させることが含まれる。
本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合させたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含むキメラ分子を形成させるように修飾してもよい。１つの態様では、このようなキメラ分子は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合物を含む。このエピトープタグは一般に、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。このようなエピトープタグを付された形態のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出可能である。また、エピトープタグを提供すると、抗タグ抗体または、このエピトープタグと結合する他のタイプのアフィニティー基質を用いるアフィニティー精製により、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを容易に精製することが可能になる。別の態様では、キメラ分子は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合物を含み得る。二価形態のキメラ分子用には、該融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。
【００７９】
種々のタグポリペプチドおよびそれぞれに対する抗体は当分野に周知である。具体例には、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジングリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡ タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５(Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988))；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985))；および単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤ（ｇＤ）タグおよびその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド(Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988))；ＫＴ３エピトープペプチド(Martin et al., Science, 255:192-194 (1992))；α−チュービュリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991))；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
【００８０】
Ｄ．ＶＥＧＦ−Ｅの調製
以下の記載は主に、少なくとも、丸で囲まれた出発コドンで始まり、終止コドンの直前で終わる、図１に記載のコード化核酸を含むベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養することによってＶＥＧＦ−Ｅを生産することに関する。もちろん、当分野に周知の別の方法を用いて、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを調製してもよいと思われる。例えば、固相技術を用いる直接ペプチド合成によってＶＥＧＦ−Ｅ配列またはその一部を生産してもよい(Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)； Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) を参照のこと）。インビトロタンパク質合成は、手動の技術を用いるか、あるいは自動操作により行うことができる。自動化合成は、例えば Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA）を用い、製造元の使用説明にしたがって行うことができる。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの種々の部分を別々に化学合成し、化学的または酵素的方法を用いて結合させ、完全長ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを生産してもよい。
【００８１】
１．ＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡの単離
ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＶＥＧＦ−Ｅ ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現していると信じられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。したがって、ヒトＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡは、実施例に記載のような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡単に得ることができる。また、ＶＥＧＦ−Ｅをコードする遺伝子を、ゲノムライブラリーから得るか、あるいはオリゴヌクレオチド合成によって得てもよい。
ライブラリーは、関心ある遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するように設計されたプローブ（例えばＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対する抗体または少なくとも約１７〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いてスクリーニングできる。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に記載のような標準的手法を用い、選択されたプローブでｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことができる。ＶＥＧＦ−Ｅをコードする遺伝子を単離する別の方法は、ＰＣＲ方法論を用いるものである(Sambrook et al., 上記; Dieffenbach et al., PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995))。
【００８２】
以下の実施例はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を説明する。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最小化するのに十分な長さでかつ十分明確なものであるべきである。オリゴヌクレオチドをラベルし、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるようにするのが好ましい。ラベル化法は当分野に周知であり、これには、３２Ｐラベル化ＡＴＰのような放射性ラベル、ビオチニル化または酵素ラベル化の使用が含まれる。低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrook et al., 1989（上記）中に提供される。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列を、寄託され、ＧｅｎＢａｎｋのような公的なデータベースまたは他の私的配列データベースにおいて入手可能な他の既知の配列と比較、アラインメントすることができる。分子の規定の領域内または完全長配列にわたる（アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルでの）配列同一性は、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒおよびＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピューターソフトウェアプログラムを用いる配列アラインメントにより決定できる。
まず、本明細書中に開示される、演繹されたアミノ酸配列を用いて選択的ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、必要であれば、Sambrook et al., 1989（上記）に記載の慣用のプライマー伸張手法を用いて、ｃＤＮＡに逆転写されなかったかもしれないｍＲＮＡの前駆体およびプロセッシング中間体を検出することによって、タンパク質コード化配列を有する核酸を得ることができる。
【００８３】
２．宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中に記載の、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド生産用の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクションあるいは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅用に適当なように修飾された慣用の栄養培地中で培養する。当業者であれば、過度に実験することなしに、培地、温度、ｐＨなどのような培養条件を選択することができる。一般に、細胞培養物の生産性を最大にするための原理、プロトコルおよび実施技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) および Sambrook et al., 1989（上記）中に見出すことができる。
トランスフェクション法、例えばＣａＰＯ４およびエレクトロポレーションは当業者に既知である。用いる宿主細胞に応じ、該細胞に適当な標準的技術を用いて形質転換を行う。Sambrook et al., 1989（上記）に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは一般に、実質的な細胞壁障壁を含む原核生物または他の細胞に対して用いられる。細胞壁のない哺乳類細胞に関しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) のリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳類細胞宿主系形質転換体の一般的側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母内への形質導入は一般に、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) および Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979) の方法にしたがって行う。しかし、ＤＮＡを細胞内へ導入する他の方法、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞とのバクテリアプロトプラスト融合またはポリカチオン、例えばポリブレンまたはポリオルニチンによる方法を用いてもよい。哺乳類細胞を形質転換する種々の技術に関しては、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988) を参照のこと。
【００８４】
本明細書中のベクター内のＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適当な宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物細胞が含まれる。適当な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれるがこれらに限定されない。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）およびＫ５ ７７２（ＡＴＣＣ ５３，６３５）のような種々の大腸菌株が公に利用可能である。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば繊維状真菌または酵母は、ＶＥＧＦ−Ｅをコードするベクターの適当なクローニング宿主または発現宿主である。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は一般に用いられる低級真核宿主微生物である。
【００８５】
グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｅの発現に適当な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、ショウジョウバエＳ２、およびスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９のような昆虫細胞ならびに植物細胞が含まれる。有用な哺乳類宿主セルラインの例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＣＯＳ細胞が含まれる。より詳細な例には、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１ライン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓ライン（２９３または懸濁培養物中での生育に関してサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；およびマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が含まれる。適当な宿主細胞の選択は当業者の技術水準の範囲内であると考えられる。
【００８６】
３．複製可能なベクターの選択および使用
所望のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、クローニング（ＤＮＡの増幅）用または発現用の複製可能なベクターに挿入することができる。種々のベクターが公に利用可能である。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。種々の手法により、適当な核酸配列をベクターに挿入することができる。一般には、当分野に既知の技術を用い、ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ部位（群）に挿入する。ベクター成分には一般に、１つまたはそれ以上のシグナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーターおよび転写終結配列が含まれるがこれらに限定されない。１つまたはそれ以上のこれらの成分を含む適当なベクターの構築には、当業者に既知の標準的ライゲーション技術を用いる。
所望のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを、直接組換え生産するだけでなく、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え生産してもよい。一般には、シグナル配列はベクターの成分であり得、あるいはベクターに挿入されたＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は例えば、酵母インベルターゼリーダー、（サッカロミセスおよびクルイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダー（後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている）を含む）α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ ３６２１７９）または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ ９０／１３６４６に記載のシグナルであってよい。哺乳類細胞の発現では、哺乳類のシグナル配列、例えば同種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダーを用いて、タンパク質を分泌させることができる。
【００８７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは両者とも、１つまたはそれ以上の選択された宿主細胞内で該ベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。このような配列は種々のバクテリア、酵母およびウイルスに関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点はほとんどのグラム陰性バクテリアに適当であり、２μプラスミド起点は酵母に適当であり、また種々ウイルス（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）の起点は、哺乳類細胞内のクローニングベクターに有用である。
発現ベクターおよびクローニングベクターは一般に、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、あるいは（ｃ）複合培地からは利用可能でない重要な栄養素、例えば、バチルス(Bacilli)用のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【００８８】
哺乳類細胞に適当な選択可能マーカーの例は、ＶＥＧＦ−Ｅをコードする核酸を取り込む能力を有する細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼである。野生型ＤＨＦＲを用いる場合に適当な宿主細胞は、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980) に記載のように調製培養されたＤＨＦＲ活性を欠損しているＣＨＯセルラインである。酵母において使用するのに適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７上に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)； Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)； Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980))。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン内での生育能を欠いている酵母突然変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１に関する選択マーカーを提供する(Jones, Genetics, 85:12 (1977))。
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、ｍＲＮＡ合成のための、ＶＥＧＦ−Ｅをコードしている核酸配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。種々の潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核宿主とともに用いるのに適当なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系(Chang et al., Nature, 275:615 (1978)； Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)； ＥＰ ３６７７６）およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))が含まれる。バクテリア系で使用するためのプロモーターはまた、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするＤＮＡと作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【００８９】
酵母宿主とともに使用するのに適当なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセラートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980))または他の糖分解酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)； Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978))、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェイトイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェイトイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。
生育条件によって制御される転写に関してさらなる利点を有する誘導可能なプロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、金属結合性タンパク質、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用を行う酵素に関するプロモーター領域である。酵母内での発現において使用するのに適当なベクターおよびプロモーターはＥＰ ７３６５７にさらに記載されている。哺乳類宿主細胞におけるベクターからのＶＥＧＦ−Ｅの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス（fowlpox virus、１９８９年７月５日公開のＵＫ ２２１１５０４）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノム由来のプロモーター、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター由来、および熱ショックプロモーター由来のプロモーターによって制御される（ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合することを条件とする）。
【００９０】
高等真核生物による、ＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡの転写は、該ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用因子(cis-acting elements)で、プロモーターに作用し、その転写を増加させる。現在、哺乳類遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が既知である。しかし、一般には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。この例には、複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側に位置するポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＶＥＧＦ−Ｅコード化配列の５’側または３’側でベクターに挿入することができるが、プロモーターの５’側に位置させるのが好ましい。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの核形成細胞(nucleated cells)）内で使用する発現ベクターはまた、転写終結に必要な配列およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡ群またはｃＤＮＡ群の５’側および、時に３’側非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ＶＥＧＦ−ＥをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分に、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養物中でのＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの合成に適用するのに適当な、さらに他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)； Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)； ＥＰ １１７０６０； および ＥＰ １１７０５８ に記載されている。
【００９１】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅および／または発現は、本明細書中で提供される配列に基づく、適当なラベル化プローブを用い、例えば慣用のサザンブロッティング、ノザンブロッティングによりｍＲＮＡの転写を定量して(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、あるいはドットブロッティング（ＤＮＡ分析）またはインシトゥーハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定することができる。別法では、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質の二本鎖(DNA-protein duplexes)を含む、特異的な二本鎖を認識できる抗体を用いてもよい。次いでこの抗体をラベルし、二本鎖を表面に結合させ、表面上の二本鎖形成時に、二本鎖に結合した抗体の存在が検出可能であるようなアッセイを行ってもよい。
別法では、免疫学的方法、例えば細胞または組織セクションの免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイを用い、直接、遺伝子産物の発現を定量することによって遺伝子発現を測定することができる。免疫組織化学的染色および／またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、任意の哺乳類内で調製することができる。簡単には、天然配列のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または本明細書中に提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ポリペプチド、またはＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡおよび特定の抗体エピトープをコードするＤＮＡと融合された外因性配列に対する抗体を調製することができる。
【００９２】
５．ポリペプチドの精製
各形態のＶＥＧＦ−Ｅは培養培地または宿主細胞溶解物から回収することができる。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結解凍サイクル、超音波破砕、機械的破砕または細胞溶解剤のような種々の物理的または化学的手段によって粉砕することができる。ＶＥＧＦ−Ｅを、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドから精製するのが望ましいこともある。以下の手法は適当な精製手法の例である：イオン交換カラムでのフラクション化；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカゲルクロマトグラフィーまたはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥクロマトグラフィー；等電点電気泳動(chromatofocusing)；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過；汚染物、例えばＩｇＧを除去するためのプロテインＡセファロースカラム；およびエピトープタグを付された形態のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを結合させるための金属キレートカラム。当分野に既知であり、例えば Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)； Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) に記載されている種々のタンパク質精製方法を用いることができる。精製過程（群）は、例えば用いられる生成方法の性質および生成される特定のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに依存して選択される。
ＶＥＧＦ−Ｅは二量体に集合するため、ヘテロ二量体およびホモ二量体を提供することは本発明の範囲内である。１つまたはそれ以上のサブユニットが変異体である場合、アミノ酸配列の変化は各サブユニット鎖に関して同じこともあり、異なっていることもあり得る。ヘテロ二量体は、両サブユニットをコードするＤＮＡで宿主細胞を同時形質転換し、必要であれば、所望のヘテロ二量体を精製することによるか、あるいはサブユニットを別々に合成し、（例えば、尿素、グアニジン塩酸などのカオトロピック物質で処理することによって）サブユニットを解離させ、解離したサブユニットを混合し、次いでカオトロピック物質を透析して除くことによってサブユニットを再び会合させることによって容易に生産される。
【００９３】
Ｅ．ＶＥＧＦ−Ｅの使用および製剤化
１．心臓血管、内皮および血管新生活性に関するアッセイ
種々のアッセイを用いて、本明細書中のポリペプチドを心臓血管、内皮および血管新生活性に関して試験することができる。このようなアッセイには、以下の実施例に提供されるものが含まれる。
米国特許第５７７３４１４号に開示される、エンドセリンアンタゴニスト活性に関して試験するアッセイには、レセプターアッセイにおけるヨウ素化エンドセリン−１結合を阻害する能力に関してポリペプチドを試験する、ラット心室結合アッセイ、ウサギ腎動脈血管平滑筋細胞を用い、無傷の細胞の放射性ラベル化エンドセリン−１結合に関して試験する、エンドセリンレセプター結合アッセイ、第二のメッセンジャーの細胞内レベルを測定することによってラット−１細胞における機能活性を測定する、リン酸イノシトール蓄積アッセイ、培養血管平滑筋内において、添加化合物がエンドセリン刺激性アラキドン酸放出を減少させる能力を測定する、アラキドン酸放出アッセイ、雄性ニュージーランドウサギ由来の内皮細胞を用いるインビトロ（単離血管）試験、ならびに雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットを用いるインビボ試験が含まれる。組織生成活性に関するアッセイには、ＷＯ ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；ＷＯ ９５／０５８４６（神経、ニューロン）およびＷＯ ９１／０７４９１（皮膚、内皮）に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
傷害治癒活性に関するアッセイには、例えば、Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71:382-384 (1978) の論文によって修飾された、Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds. (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71-112 に記載されるアッセイが含まれる。
エンドセリンＢ１（ＥＴＢ１）レセプターポリペプチドと結合し、シグナル変換活性を調節する、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに関連する試験分子に関してスクリーニングするアッセイは、例えば米国特許第５７７３２２３号に記載されるように、エンドセリンＢ１レセプターポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を提供し、この細胞を試験候補物質に暴露し、エンドセリンＢ１レセプターシグナル変換活性を測定することを含む。
【００９５】
いくつかの心臓肥大アッセイが存在する。インビトロアッセイには、成体ラット心筋細胞の拡大の誘導が含まれる。このアッセイでは、Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed. (Berlin: Springer-Verlag, 1990), pp. 36-60 に詳細に記載されている手法の修飾法に本質的にしたがって、単一の（雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットから心室筋細胞を単離する。この手法は、成体心室筋細胞の単離および桿状表現型のこれらの細胞の長期間培養を可能にする。フェニレフリンおよびプロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）はこれらの成体細胞における拡大応答を誘導することが示された。次いで、ＰＧＦ２αまたはＰＧＦ２αアナログ（例えばフルプロステノール(fluprostenol)）およびフェニレフリンによって誘導される筋細胞拡大の、種々の潜在的心臓肥大阻害剤による阻害を試験する。
【００９６】
インビボアッセイの一例は、インビボでフルプロステノールによって誘導される心臓肥大の阻害に関する試験である。この薬理学的モデルは、フルプロステノール（ＰＧＦ２αのアゴニストアナログ）の皮下注射により、ラット（例えば雄性ＷｉｓｔａｒまたはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）において誘導された心臓肥大を阻害する、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの能力を試験する。心筋梗塞によって誘導された病理学上の心臓肥大を患うラットは、その心筋内において、抽出可能なＰＧＦ２α量が慢性的に増加していることが知られている。Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.), 271: H2197-H2208 (1996)。したがって、インビボの心筋細胞増殖に対するフルプロステノールの作用を阻害可能な因子は、心臓肥大の処置に関して潜在的に有用である。心臓肥大に対するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの効果は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを投与しないフルプロステノール処置ラットと比較した、（体重によって標準化した）心臓、心室および左心室重量を測定することによって決定する。
インビボアッセイの別の例は、圧力過負荷心臓肥大アッセイである。インビボ試験に関しては、試験動物の腹部大動脈を締め付けることによって圧力過負荷心臓肥大を誘導するのが一般的である。典型的なプロトコルでは、ラット（例えば雄性ＷｉｓｔａｒまたはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）を麻酔下で処置し、各ラットの腹部大動脈を横隔膜直下で締め付ける。Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1955)。外科的切開によってこの動脈を暴露させ、短い太針を管に隣接して設置する。針の周りを絹糸で縛ってこの動脈を締め付け、針をすぐに除去して、動脈の管腔を針の直径にまで小さくする。このアプローチは、例えば Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) および O'Rourke and Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992) に記載されている。
【００９７】
さらに別のインビボアッセイでは、実験的に誘導された心筋梗塞（ＭＩ）後の心臓肥大に対する作用を測定する。左冠動脈を縛ることによって急性ＭＩを誘導し、心電計検査によって確認する。偽手術群の動物をコントロール動物として調製する。早期のデータでは、体重に対する心臓の重量比が１８％増加したことによって示されるように、ＭＩを患う動物の群には心臓肥大が伴うことが示された。Lai et al.（上記）。心臓肥大の候補遮断剤、例えばＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドでこれらの動物を処置すると、試験された候補物質の治療的潜在能力についての貴重な情報が得られる。心臓肥大の誘導に関する、さらなるこのようなアッセイ試験の１つは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットを用いる、米国第５７７３４１５号に開示されているものである。
癌に関し、種々の周知の動物モデルを用いて、本明細書中で同定された遺伝子の、腫瘍の発達および病因に関する役割をさらに理解し、天然ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの抗体および他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む、候補治療薬の効力を試験することができる。このようなモデルのインビボ性質から、ヒト患者における応答を具体的に予測することができる。腫瘍および癌（例えば乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルには、組換えされていない動物および組換え（トランスジェニック）動物の両方が含まれる。組換えされていない動物モデルには、例えば齧歯動物、例えばマウスモデルが含まれる。このようなモデルは、標準的技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植またはオルトピン(orthopin)移植を利用し、腫瘍細胞を同系マウスに導入する（例えば大腸癌細胞を結腸組織内に移植する）ことによって調製することができる。例えば、１９９７年９月１８日公開のＰＣＴ公報第ＷＯ ９７／３３５５１号を参照のこと。
【００９８】
腫瘍学研究において最もよく用いられるであろう動物種は免疫機能不全マウス、特にヌードマウスである。胸腺減形成／無形成のヌードマウスは、ヒト腫瘍異種移植片の宿主として首尾よく働くことが観察され、このような目的に幅広く使用されることになった。常染色体劣性形質ｎｕ遺伝子が、例えばＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩおよびＳＪＬを含む、非常に多数の明確な共通遺伝子系統ヌードマウスに導入された。さらに、ヌードマウス以外の遺伝的な免疫学的欠損を有する、他の広範な種々の動物を作成し、腫瘍異種移植片の受容体として用いた。さらに詳細には、例えば The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991) を参照のこと。
該動物に導入される細胞は、上に列記される腫瘍セルラインおよび、例えばＢ１０４−１−１セルライン（ｎｅｕ原腫瘍遺伝子でトランスフェクションされた安定ＮＩＨ−３Ｔ３セルライン）；ｒａｓトランスフェクション ＮＩＨ−３Ｔ３細胞；Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７）；または適度によく分化したグレードＩＩヒト結腸腺癌セルライン、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）のような既知の腫瘍／癌セルラインまたは別の腫瘍および癌から誘導可能である。腫瘍または癌細胞のサンプルは、液体窒素中での凍結および保存を含む標準的条件を用い、手術を受けている患者から得ることができる。Karmali et al., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983)。
【００９９】
種々の手法により、腫瘍細胞を動物、例えばヌードマウスに導入することができる。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）スペースは腫瘍の移植に非常に適している。腫瘍は、固形ブロックとして、トロカールの使用により針状バイオプシーとして、あるいは細胞懸濁物として皮下移植することができる。固形ブロックまたはトロカール移植用には、適当なサイズの腫瘍組織断片を皮下スペースに導入する。細胞懸濁物は、最初の腫瘍または安定な腫瘍セルラインから新たに調製し、皮下注射する。また、腫瘍細胞を皮下移植片として注射することもできる。この位置において、移植片は皮膚結合組織の下部と皮下組織の間に沈着する。
乳癌の動物モデルは、本質的には Drebin et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986) に記載のように、例えばラット神経芽腫細胞（ここからｎｅｕ腫瘍遺伝子が最初に単離された）またはｎｅｕトランスフェクション ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することによって製造できる。
同様に、大腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに大腸癌細胞を継代し、これらの動物に腫瘍を出現させることによって製造できる。ヌードマウスにおけるヒト大腸癌の正所性移植モデルは、例えば Wang, et al., Cancer Research, 54: 4726-4728 (1994) および Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995) に記載されている。このモデルは、AntiCancer,Inc.(SanDiego,California)から市販されている、いわゆる”ＭＥＴＡＭＯＵＳＥ”（登録商標）に基づくものである。
【０１００】
動物内に生じた腫瘍を取り出し、インビトロで培養することができる。次いで、インビトロ培養物由来の細胞を動物に継代(passage)することができる。このような腫瘍は、さらなる試験または薬物スクリーニング用の標的として働き得る。別法として、継代により得られた腫瘍を単離し、継代前の細胞および１回またはそれ以上の継代後に単離された細胞由来のＲＮＡを関心ある遺伝子の差異発現に関して分析することができる。このような継代技術は、いずれかの既知の腫瘍または癌セルラインを用いて行うことができる。
例えばＭｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１およびＷＥＨＩ−１６４は化学的に誘導された、ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスの繊維肉腫であり(DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1977))、これは、種々の物質の抗腫瘍活性を研究するための、高度に制御可能なモデル系を提供する。Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987)。簡単には、細胞培養物中、インビトロで腫瘍細胞を増殖させる。動物への注射前に、このセルラインを洗浄し、バッファー中に、約１０×１０６〜１０×１０７細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁する。次いでこの動物に、細胞懸濁液１０〜１００μＬを皮下感染させ、１〜３週間で腫瘍を出現させる。
【０１０１】
さらに、最もよく研究された実験的腫瘍の１つである、マウスのルイス肺（３ＬＬ）癌を、研究用の腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルにおける効力は、肺の小細胞型癌（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の処置における有益な効果と相関した。病気に冒されたマウス由来の腫瘍断片または培養物中に維持された細胞を注射することによって、この腫瘍を正常マウスに導入することができる。Zupi et al., Br. J. Cancer, 41: suppl. 4, 30 (1980)。腫瘍は単一の細胞の注射から出発したものでさえあり得、非常に高い割合の感染腫瘍細胞が生存していることを示す証拠がある。この腫瘍モデルについてのさらなる情報に関しては、Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986) を参照のこと。
移植された腫瘍を有する動物モデルにおける、試験化合物の効力を評価する１つの方法は、処置前後の腫瘍のサイズを測定することである。伝統的に、移植された腫瘍のサイズはノギスを用いて二次元または三次元で測定されてきた。二次元に限定された測定では、腫瘍のサイズが正確に反映されない；したがって、通常は、数式を用いてこれを対応する容量に変換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。薬物候補の治療的効果は、処置誘導性の増殖遅延および特定の増殖遅延によってより首尾よく記載することができる。腫瘍増殖の記載における別の重要な変数は腫瘍容量倍増時間である。腫瘍増殖の計算および記載用のコンピュータープログラム、例えば Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p.301 によって報告されているプログラムもまた、利用可能である。しかし、処置後の壊死および炎症応答は、少なくとも最初は、実際に腫瘍サイズの増加を生じさせ得ることに注意したい。したがって、これらの変化については、形態計測法およびフローサイトメトリー分析を組み合わせて、慎重にモニターする必要がある。
【０１０２】
さらにまた、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドまたはいずれかのその修飾形態をコードする核酸を用いて、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用なトランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を作成することができる。トランスジェニック動物（例えばマウスまたはラット）とは、動物または出生前、例えば胎児期の原型動物に導入された導入遺伝子を含有する細胞を有する動物である。導入遺伝子は、そこからトランスジェニック動物が発育してなる細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。したがって、トランスジェニック動物を作成するための標準的技術を用い、本明細書中で同定されるＶＥＧＦ−Ｅをコードする遺伝子のコード化部分を関心ある動物のゲノムに導入することによって、組換え（トランスジェニック）動物モデルを工作できる。トランスジェニック操作の標的となり得る動物には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびヒト以外の霊長類、例えばヒヒ、チンパンジーおよびサルが含まれるが、これらに限定されない。一態様では、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするｃＤＮＡを用い、確立されている技術にしたがって、ＶＥＧＦ−ＥをコードするゲノムＤＮＡをクローニングすることができ、このゲノム配列を用いて、ＶＥＧＦ−Ｅコード化ＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を作成できる。該動物に導入遺伝子を導入する、当分野に既知の技術には、前核(pronucleic)マイクロインジェクション（米国特許第４８７３１９１号）；胚ラインへのレトロウイルス媒介性遺伝子転移(例えば Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985))；胎児幹細胞における遺伝子ターゲティング(Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989))；胎児のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983))；および精子媒介性の遺伝子転移が含まれる。Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989)。総括に関しては、例えば米国特許第４７３６８６６号を参照のこと。特にトランスジェニックマウスまたはラットのようなトランスジェニック動物の作成方法は当分野に一般的であり、例えば米国特許第４７３６８６６号および第４８７０００９号に記載されている。典型的には、組織特異的エンハンサーを伴うＶＥＧＦ−Ｅ導入遺伝子の包含に関して、特定の細胞を標的化する。胎児期に動物の胚ラインに導入された１コピーのＶＥＧＦ−Ｅコード化導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を用いて、ＶＥＧＦ−Ｅコード化ＤＮＡの発現増加作用を試験することができる。例えばその過剰発現に関連する病的症状からの保護を提供すると思われる試薬についてのテスター動物として、このような動物を用いることができる。本発明のこの側面では、動物を試薬で処置し、導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して病的症状の発生率が減少したならば、これが該病的症状に対する有望な治療的介入であることが示されるであろう。
【０１０３】
本発明の目的に関し、トランスジェニック動物には、その細胞の一部にのみ導入遺伝子を保持しているもの（「モザイク動物」）が含まれる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として組み込むか、あるいはコンカテマー(concatamers)内、例えばヘッドトゥヘッドまたはヘッドトゥテイル縦列(head-to-head or head-to-tail tandems)として組み込むことができる。また、例えば Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992) の技術にしたがって、特定の細胞タイプに導入遺伝子を選択的に導入することも可能である。トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は標準的技術によってモニターできる。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅を用いて、導入遺伝子の組み込みを確認できる。次いで、インシトゥーハイブリダイゼーション、ノザンブロット分析、ＰＣＲまたは免疫細胞化学のような技術を用い、ｍＲＮＡ発現レベルを分析できる。腫瘍または癌の発達徴候に関して、この動物をさらに試験する。
【０１０４】
また、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする内因性遺伝子と、動物の胎児細胞内に導入された、同ポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡ間で相同組換えを生じさせ、本明細書中で同定されるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする、欠損または変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築できる。例えば特定のＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするｃＤＮＡを用い、確立されている技術にしたがって、該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングできる。特定のＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させるか、あるいは他の遺伝子、たとえば選択可能マーカーをコードする遺伝子であって、これを用いて組み込みをモニターできるもので置換することができる。典型的には、（５’末端および３’末端の両方の）数キロ塩基の非翻訳フランキングＤＮＡをベクターに含ませる。相同組換えベクターの説明に関しては、例えば Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) を参照のこと。このベクターは（例えばエレクトロポレーションによって）胎児幹セルラインに導入され、導入ＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされている細胞が選択される。例えば Li et al., Cell, 69: 915 (1992) を参照のこと。次いで、選択された細胞は動物（例えばマウスまたはラット）の胚盤胞に注射され、キメラ集団を形成する。例えば Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152 を参照のこと。次いで、キメラ胎児は適当な偽妊娠雌性培養動物(foster animal)に移植され、この胎児を一定期間生育させて、「ノックアウトマウス」を創出できる。胚細胞内に相同組換えされたＤＮＡを宿す後代を標準的技術によって同定し、これを用いて、全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含有する動物を作成できる。ノックアウト動物は、例えば特定の病的症状に対する保護能力およびＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの不存在に基づく病的症状の発達によって特徴付けることができる。
【０１０５】
また、本明細書中で同定されるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを特異的に結合する抗体および他の薬物候補の効力は、自然発生した動物腫瘍の処置において試験することができる。このような研究に適当な標的はネコ口内扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）である。ネコ口内ＳＣＣは高度に侵襲性の、最も一般的なネコ口内悪性疾患である悪性腫瘍であり、これはこの種において報告される、口内腫瘍のうち６０％を超えるものの原因である。これはめったに遠隔部位に転移しないが、転移の発生率が低いのは単に、この腫瘍を患うネコの生存期間が短いことを反映しているにすぎないかもしれない。これらの腫瘍は、主としてネコ口腔の解剖であるため、通常は手術されない。現在、この腫瘍に対する有効な処置はない。この実験に入る前に、各ネコは完全臨床検査およびバイオプシーを受け、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）によってスキャンされる。舌下口内扁平上皮細胞腫瘍と診断されたネコは、この研究から排除する。この腫瘍のせいで舌が麻痺する可能性があり、処置によって腫瘍を殺生した場合でさえ、動物はひとりでえさを食べることができないこともある。長期間にわたって、各ネコを繰り返し処置する。処置期間中毎日、腫瘍の写真をとり、その後再検査する。処置後、それぞれのネコはもう一度ＣＴスキャンを受ける。ＣＴスキャンおよび胸部Ｘ線写真は、その後８週間毎に評価される。コントロール群と比較した、生存、応答および毒性の差異に関してデータを評価する。陽性応答には、好ましくは生活の質の改善および／または寿命の増加を伴う腫瘍緩解の証拠が必要とされ得る。
【０１０６】
さらに、他の自然発生的な動物腫瘍、例えばイヌ、ネコおよびヒヒの繊維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫または平滑筋肉腫を試験することができる。これらのうち、イヌおよびネコの乳腺癌は、その発症および性質がヒトのものと非常に類似しているので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は、動物においてこのタイプの腫瘍がまれにしか存在しないことによって制限される。
当分野に既知の他のインビトロおよびインビボ心臓血管、内皮および血管新生試験もまた、本発明において適当である。
【０１０７】
２．組織分布
本明細書中の心臓血管、内皮および血管新生アッセイの結果は、さらなる研究、例えば種々のヒト組織においてｍＲＮＡ発現を測定することによって確認することができる。
上に記載のように、種々の組織における遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、本明細書中に提供される配列に基づく適当なラベル化プローブを用い、慣用のサザンブロッティング、ノザンブロッティングによりｍＲＮＡの転写を定量し(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、あるいはドットブロッティング（ＤＮＡ分析）またはインシトゥーハイブリダイゼーションによって測定することができる。別法として、抗体を用いて、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識することができる。
また、種々の組織における遺伝子発現を免疫学的方法、例えば組織セクションの免疫組織化学的染色、および細胞培養物または体液のアッセイにより、遺伝子産物の発現を直接定量することによって測定してもよい。免疫組織化学的染色および／またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡単には、天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドまたは、本明細書中に提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドまたは、ＶＥＧＦ−ＥをコードするＤＮＡおよび特異的抗体エピトープをコードするＤＮＡと融合された外因性配列に対して、抗体を調製することができる。抗体を作成する一般的技術および、インシトゥーハイブリダイゼーションに関する特別なプロトコルは、本明細書中、以下に提供する。
【０１０８】
３．抗体結合実験
心臓血管、内皮および血管新生(angiogenic)研究の結果は、抗体結合実験によってさらに確認することができ、ここでは、抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体が、内皮細胞または、心臓血管、内皮および血管新生アッセイにおいて使用される他の細胞に対するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの作用を阻害する能力について試験される。抗体の例には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体およびヘテロ共役抗体(heteroconjugate antibodies)が含まれ、その製造方法は、本明細書中以下に記載される。
抗体結合実験は、任意の既知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈澱アッセイにおいて行うことができる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp.147-158。
【０１０９】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合に関して、ラベル化標準物質が試験サンプル被検体と競合することができる能力に依存する。試験サンプル中の標的タンパク質の量は、該抗体と結合する標準物質の量と反比例する。結合する標準物質量の測定を容易にするため、競合前または競合後に、抗体を不溶化し、抗体と結合している標準物質および被検体を、未結合の標準物質および被検体から簡単に分離することができるようにする。
サンドイッチアッセイには、それぞれが、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合することができる、２つの抗体の使用が含まれる。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル被検体を、固形支持体に固定化した第一の抗体に結合させ、その後、第二の抗体がこの被検体に結合し、これにより不溶性の三者複合体が形成される。例えば米国特許第４３７６１１０号を参照のこと。第二の抗体自体を検出可能な部分でラベルしておく（直接サンドイッチアッセイ）か、あるいは検出可能な部分でラベルされている抗免疫グロブリン抗体を用いて測定（間接サンドイッチアッセイ）してもよい。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、ここでは検出可能部分が酵素である。
免疫組織化学では、組織サンプルは、例えば、新鮮なものか、あるいは凍結されたものか、あるいはパラフィン中に包埋され、保存剤、例えばホルマリンで固定されているものであってよい。
【０１１０】
４．細胞に基づく腫瘍アッセイ
細胞に基づくアッセイおよび、心臓血管、内皮および血管新生障害、例えば腫瘍に関する動物モデルを用いて、本明細書中における、心臓血管、内皮および血管新生アッセイの発見を確認し、さらに本明細書中で同定された遺伝子と望ましくない心臓血管、内皮および血管新生細胞増殖の発達および病因との関係を理解することができる。望ましくない心臓血管、内皮および血管新生細胞増殖、例えば腫瘍細胞の発達および病理学に関する、本明細書中で同定された遺伝子産物の役割は、本明細書中で、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドによって刺激されるか、あるいは阻害されるものとして同定された細胞またはセルラインを用いて試験することができる。このような細胞には、例えば、以下の実施例に記載のものが含まれる。
別のアプローチでは、特定の心臓血管、内皮および血管新生障害に関与することが知られている細胞型の細胞を、本明細書中に記載のｃＤＮＡでトランスフェクションし、これらのｃＤＮＡが過剰の増殖を誘導するか、あるいは増殖を阻害する能力を分析する。心臓血管、内皮および血管新生障害が癌である場合、適当な腫瘍細胞には、例えば、Ｂ１０４−１−１セルライン（ｎｅｕ原腫瘍遺伝子でトランスフェクションされた安定ＮＩＨ−３Ｔ３セルライン）およびｒａｓトランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞のような安定腫瘍セルラインが含まれ、これを所望の遺伝子でトランスフェクションし、腫瘍形成性増殖に関してモニターできる。次いで、このようなトランスフェクションされたセルラインを用い、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗体組成物が、形質転換された細胞の増殖に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害性（細胞毒性）活性を行使するか、あるいは抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介することによって、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する能力を試験することができる。さらに、本明細書中で同定された遺伝子のコード化配列でトランスフェクションされた細胞を用いて、心臓血管、内皮および血管新生障害、例えば癌の処置用の薬物候補を同定することができる。
さらには、安定セルラインのほうが好ましいけれども、（上に記載されるような）トランスジェニック動物において腫瘍から誘導される最初の培養物を、本明細書中の細胞に基づくアッセイに用いることができる。トランスジェニック動物由来の継代セルラインを誘導する技術は当分野に周知である。例えば Small et al., Mol. Cell. Biol. 5: 642-648 (1985) を参照のこと。
【０１１１】
５．遺伝子治療
本発明にしたがい、本明細書中のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドおよびポリペプチド性アゴニストおよびアンタゴニストをインビボで発現させて用いることができ、このことはしばしば遺伝子治療と称される。
核酸（場合により、ベクターを含む）を患者の細胞に導入するためには、２つの主用なアプローチ：インビボおよびエクスビボがある。インビボデリバリー用には、核酸を、通常は患者の、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを必要としている部位、すなわち、既知であれば、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの合成部位およびＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位（例えば傷害部位）に直接注入する。エクスビボ処置用には、患者の細胞を取り出し、これらの単離された細胞に核酸を導入し、この修飾された細胞を直接患者に投与するか、あるいは、例えば多孔性膜内に包んで患者に移植する（例えば米国特許第４８９２５３８号および第５２８３１８７号を参照のこと）。
生存能力のある細胞に核酸を導入するための種々の利用可能な技術が存在する。この技術は、核酸を意図される宿主のインビトロ培養細胞に移すのか、あるいはインビボ細胞に移すのかに依存して変化する。核酸をインビトロ哺乳類細胞に移すのに適当な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法の使用などが含まれる。形質導入には、複製欠損性組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子を細胞レセプターと結合させ、次いで粒子内に含まれる核酸を細胞に導入することが含まれる。遺伝子のエクスビボデリバリー用に一般に用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【０１１２】
現在の好ましいインビボ核酸輸送技術には、ウイルス性または非ウイルス性ベクター（例えばアデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））でのトランスフェクションおよび脂質に基づく系（遺伝子の脂質媒介性輸送に有用な脂質は例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである；例えば Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) を参照のこと）が含まれる。遺伝子治療に用いるのに最も好ましいベクターはウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス性ベクター、例えばレトロウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定因子(locus-defining element)（群）、または、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾のような他の手段によって遺伝子発現を制御する他の因子が含まれる。さらに、ウイルス性ベクター、例えばレトロウイルスベクターには、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子の存在下で転写される場合、それに作動可能に連結されており、翻訳開始配列として作用する核酸分子が含まれる。このようなベクターコンストラクトにはまた、用いられるウイルスに適当な、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ群）またはその一部、およびポジティブおよびネガティブ鎖プライマー結合部位が含まれる（これらが該ウイルス性ベクターに存在しない場合）。さらに、このようなベクターには、典型的に、ベクターを含む宿主細胞からＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを分泌するためのシグナル配列が含まれる。本発明の目的のために好ましいシグナル配列は哺乳類のシグナル配列であり、最も好ましくは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの天然シグナル配列である。場合により、このベクターコンストラクトには、ポリアデニル化用のシグナル、ならびに１つまたはそれ以上の制限部位および翻訳終結配列が含まれることもある。例示として、このようなベクターには典型的に、５’ＬＴＲ，ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはその一部が含まれる。非ウイルス性の他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマー(dendrimers)を用いることもできる。
【０１１３】
いくつかの状況では、標的細胞を標的とする物質、例えば細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞のレセプターに対するリガンドなどを核酸ソースに提供することが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質、例えば特定の細胞タイプに向性があるキャップシッドタンパク質またはその断片、循環中に内面化(internalization)を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的化し、細胞内半減期を高めるタンパク質を、標的化のために用い、ならびに／あるいはこれを用いて取り込みを促進してもよい。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)； および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990) に記載されている。現在既知の遺伝子マーキング(gene marking)および遺伝子治療プロトコルの総括に関しては、Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992) を参照のこと。また、ＷＯ ９３／２５６７３およびその引用文献を参照のこと。
適当な遺伝子治療およびレトロウイルス粒子および構造タンパク質の作成方法は、例えば米国特許第５６８１７４６号に見出すことができる。
【０１１４】
６．診断薬としての遺伝子の使用
本発明はまた、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子の、診断薬としての使用に関する。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドにおける突然変異は腫瘍を生じさせることがあるため、突然変異型のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを検出することにより、心臓血管、内皮および血管新生疾患を診断するか、あるいは心臓血管、内皮および血管新生疾患、例えば腫瘍に対する罹患しやすさを診断することができる。
ヒトＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子に突然変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシーおよび解剖物質から得ることができる。ゲノムＤＮＡを直接、検出用に用いるか、あるいは、分析前に、ＰＣＲ(Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986))を用いてこれを酵素的に増幅してもよい。また、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じ目的で用いてもよい。例として、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする核酸と相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの突然変異を同定し、分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子型との比較において増幅産物のサイズ変化により検出可能である。点突然変異は、増幅されたＤＮＡを、放射性ラベルされた、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするＲＮＡまたは放射性ラベルされた、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするアンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせることによって同定可能である。完全に合致する配列は、ＲＮＡアーゼＡ消化または融解温度の差異によってミスマッチ二重鎖とはっきり区別することができる。
【０１１５】
変性剤の存在または不存在下、ゲル中のＤＮＡ断片の、電気泳動による移動度の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝子試験を行うことができる。小配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって明視化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、異なるＤＮＡ断片の移動度が、その特定の融解温度または部分的融解温度にしたがい、ゲル上の異なる位置で阻止される、変性ホルムアミジン濃度勾配ゲルにおいて区別することができる。例えば Myers et al., Science, 230: 1242 (1985) を参照のこと。
また特定の位置における配列の変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮＡアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法、例えば Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985) によっても示され得る。
したがって、ハイブリダイゼーション、ＲＮＡアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用、例えば制限断片長多型（ＲＦＬＰ）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法によって、ＤＮＡ配列を詳細に検出することができる。
【０１１６】
７．ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドレベルを検出するための使用
より一般的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加え、インシトゥー分析によっても突然変異を検出できる。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド発現は、腫瘍形成に基づく血管疾患または新血管新生に関連し得る。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドがシグナル配列を有し、ｍＲＮＡが内皮細胞において高度に、また平滑筋細胞においてはより少ない程度に発現されていることは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが血清中に存在していることを示す。したがって、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのレベル変化は腫瘍形成に伴う血管疾患または新血管新生の指標であり得るため、抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド抗体を用いて該疾患を診断することができる。
競合アッセイを用いてもよく、ここでは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに特異的な抗体を固形支持体に結合させ、ラベルしたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと宿主由来のサンプルを固形支持体に通した結果、固形支持体に結合し、検出されたラベル量がサンプル中のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド量と相関し得る。
【０１１７】
８．プローブおよび免疫アッセイ
天然ＶＥＧＦに対して作成した抗体と免疫学的に交差反応性である、ＶＥＧＦ−Ｅアミノ酸変異体配列および誘導体は、ＶＥＧＦ−Ｅに関する免疫アッセイにおいて、標準物質としてか、あるいは、ラベル化されている場合は競合試薬として有用である。
完全長ヌクレオチド配列、配列番号１またはその一部をｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして用い、完全長ＶＥＧＦ−Ｅ遺伝子を単離するか、あるいは、図１に開示されるＶＥＧＦ−Ｅ配列（配列番号１）と望ましい配列同一性を有する、さらに他の遺伝子（例えば、天然に存在するＶＥＧＦ−Ｅの変異体または他の種由来のＶＥＧＦ−Ｅをコードするもの）を単離することができる。プローブの長さは約１７〜約５０塩基であってよい。ハイブリダイゼーションプローブは、図１に示される配列番号１のヌクレオチド配列からか、あるいは、プロモーター、エンハンサー因子および天然配列ＶＥＧＦ−Ｅコード化ＤＮＡのイントロンを含むゲノム配列から誘導することができる。例示的に、スクリーニング方法には、既知のＤＮＡ配列を用いてＶＥＧＦ−Ｅ遺伝子のコード領域を単離し、約４０塩基の選択されたプローブを合成することが含まれる。ハイブリダイゼーションプローブは、放射性ヌクレオチド、例えば３２Ｐまたは３５Ｓ、または酵素的ラベル、例えばアビジン／ビオチンカップリング系によりプローブとカップリングしたアルカリホスファターゼを含む、種々のラベルでラベル化することができる。本発明のＶＥＧＦ−Ｅ遺伝子と相補的な配列を有するラベル化プローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、該ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイゼーションするかを決定することができる。ハイブリダイゼーション技術については、以下の実施例にさらに詳細に記載する。
また、このプローブをＰＣＲ技術において用い、密接に関係するＶＥＧＦ−Ｅ配列の同定に関して配列のプールを作成することができる。
【０１１８】
９．染色体マッピング
また、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子のマッピング用および遺伝的障害を有する個体の遺伝的分析用のハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。既知の技術、例えばインシトゥーハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析およびライブラリーを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングを用いて、本明細書中に提供されるヌクレオチド配列を染色体および染色体の特定領域にマッピングすることができる。
染色体同定では、配列は特異的に標的化され、個々のヒト染色体上の特定位置とハイブリダイゼーション可能である。さらに、染色体上の特定部位を同定する必要が存在している。染色体位置をマーキングするのに利用可能な、実際の配列データに基づく染色体マーキング物質（反復多型）は、現時点ではほとんどない。本発明にしたがってＤＮＡを染色体にマッピングすることは、疾患と関連する遺伝子とその配列を相関させる重要な第一段階である。簡単には、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって配列を染色体にマッピングできる。３’非翻訳領域に対するコンピューター分析を用い、増幅工程を面倒にするような、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをまたぐことのない、プライマーを迅速に選択する。次いでこれらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニング用に用いる。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドだけが増幅断片を生産する。
【０１１９】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てる迅速な手法である。本発明を同一オリゴヌクレオチドプライマー群とともに用い、特定の染色体群由来断片のパネルあるいは大きなゲノムクローンのプールを同様に用いてサブローカライゼーション(sublocalization)することができる。染色体にマッピングするために同様に用いることができる他のマッピング戦略には、インシトゥーハイブリダイゼーション、ラベル化されたフローソート染色体(flow-sorted chromosomes)でのプレスクリーニングおよびハイブリダイゼーションによる前選択によって染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築することが含まれる。
有糸分裂中期の拡大した染色体に対するｃＤＮＡクローンの蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、正確な染色体位置を一回の工程で提供することができる。この技術は５００または６００塩基程の短いｃＤＮＡとともに用いることができるが、２０００ｂｐより大きなクローンのほうが、簡単な検出のための十分なシグナル強度を伴って、唯一の染色体位置に結合する可能性がより高い。ＦＩＳＨは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子の元となるクローンの使用を必要とし、クローンは長いほどよい。例えば２０００ｂｐで良好、４０００ｂｐでより良好であり、時間当たりの妥当なパーセンテージの良好な結果を得るために４０００以上はおそらく必要ない。この技術の総括に関しては、Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988) を参照のこと。
【０１２０】
配列を染色体位置に正確にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置は遺伝的地図データと相関し得る。このようなデータは、例えば V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Library からオンラインで入手可能）に見出すことができる。次いで、連鎖分析(linkage analysis)（物理的に隣接する遺伝子の共同相続性）により同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の関係を同定する。
次に、病気に冒された個体とそうでない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異を測定することが必要である。病気に冒された個体のいくつかあるいはすべてにおいてはある突然変異が観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、この突然変異は疾患の原因物質である可能性が高い。
物理的マピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の分解能では、疾患に関連する染色体領域を正確に起源とするｃＤＮＡは５０〜５００の潜在的原因遺伝子のうちの１つであり得る（これは１メガ塩基のマッピング分解能および２０ｋｂ当たりに１遺伝子を仮定している）。
【０１２１】
１０．薬剤候補のスクリーニング分析
天然ＶＥＧＦ−Ｅ、または、ＶＥＧＦ−Ｅの受容体の生物学的活性を模倣するリード化合物を見つけるために、スクリーニング分析を設計することができる。このようなスクリーニング分析には、ハイスループットスクリーニングで化学ライブラリーを分析でき、それにより小分子の薬剤候補を同定するのに特に適合された分析を含むであろう。意図された小分子には合成有機化合物、または、無機化合物が含まれる。分析は、蛋白質−蛋白質結合分析、生化学的スクリーニング分析、免疫分析、および、細胞を基礎とした分析を含む、当分野においてよく特性付られた種々の形式で行われ得る。
よって、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを模倣する（アゴニスト）、または、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの効果を妨げる（アンタゴニスト）化合物を同定する、化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬剤候補のスクリーニング分析は、本明細書中で同定される遺伝子によりコードされるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに結合、若しくは、それと複合体形成する化合物、または、そうでなければコードされるポリペプチドの他の細胞性蛋白質との相互作用を妨げる化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニング分析には、ハイスループットスクリーニングにより化学ライブラリーを分析できる分析を含み、それは特に小分子の薬剤候補を同定するのに適当である。
【０１２２】
分析は、蛋白質−蛋白質結合分析、生化学的スクリーニング分析、免疫分析、および、細胞を基礎とした分析を含む、当分野においてよく特性付られた種々の形式で行われ得る。
アンタゴニストについての全ての分析は、薬剤候補と、本明細書中に同定される核酸によりコードされるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドとを、これらの２成分の相互作用が可能な条件下、および時間、接触させること必要とする点で共通する。
結合分析では相互作用は結合であり、形成された複合体は反応混合物中で単離、または、検出され得る。特定の態様では、本明細書中で同定される遺伝子によりコードされたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、薬剤候補は、例えば、マイクロタイタープレート等の固相上に、共有、若しくは非共有結合により固定される。非共有結合は一般に、固体表面をＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの溶液で被覆し、乾燥することによって達成される。代わりに、固定化されるべきＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに特異的な、例えばモノクローナル抗体である固定化抗体を、それを固体表面に固定化するのに用い得る。検出可能な標識により標識化されていてもよい非固定化成分を、例えば、固定化された成分を含むコートされた表面である固定化された成分に添加することにより分析を行う。反応が終了したら、例えば洗浄により未反応の成分を除去し、固体表面に固定化された複合体を検出する。当初は固定化されていない成分が検出可能な標識を有する場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体形成が起こったことを示す。当初は固定化されていない成分が標識を有さない場合には、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識化された抗体を用いて複合体形成は検出され得る。
【０１２３】
候補化合物が本明細書中で同定される遺伝子によりコードされる特定のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと相互作用はしても、結合はしない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、蛋白質−蛋白質相互作用を検出するための周知の方法により分析され得る。このような分析には、例えば、架橋法、共免疫沈降法、および、勾配またはクロマトグラフィーカラムによる共同精製等の伝統的な手法が含まれる。さらに、蛋白質−蛋白質相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者(Fields and Song, Nature(London), 340:245-246(1989)；Chien et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88:9578-9582(1991))により記載される、および、Chevray and Nathans(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5789-5793(1991))により記述される酵母を用いた遺伝子系を用いてモニターされ得る。酵母のＧＡＬ４等の多くの転写活性化物質は、一方がＤＮＡ結合ドメインとして働き、もう一方が転写活性化ドメインとして機能する２つの物理的に別個のモジュールドメインから成る。前述の文献に記載の酵母発現系（一般に、「ツーハイブリッドシステム」と呼ばれる）は、この特性を利用し、１個は標的蛋白質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合された蛋白質、および、もう一方は候補活性化蛋白質が活性ドメインに融合された蛋白質である、２個のハイブリッド蛋白質を利用する。ＧＡＬ４−活性化プロモーターの制御下のＧＡＬ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、蛋白質−蛋白質相互作用によるＧＡＬ４活性の再構築に依存する。相互作用性のポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼのための色原性の基質により検出される。ツーハイブリッド技術を用いた、２つの特異的な蛋白質間の蛋白質−蛋白質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（登録商標））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより市販されている。この系はまた、特異的な蛋白質相互作用に関与する蛋白質ドメインの位置付け、同じく、これらの相互作用に重要なアミノ酸残基の位置を正確に決定に拡張して用い得る。
【０１２４】
本明細書中で同定されるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子と、他の細胞内、または、細胞外成分との相互作用を妨げる化合物は、以下のように試験され得る：通常、遺伝子の産物、および、細胞内、または、細胞外成分を含む反応混合物が、２つの産物の相互作用、および結合を可能にする条件下、並びに、可能にする時間をかけて調製される。結合を阻害する候補化合物の能力を試験するために、反応を試験化合物の不在下、および、存在下で行う。さらに、陽性コントロールとして、第３の反応混合物にプラシーボを添加し得る。混合物中に存在する試験化合物、および、細胞内または細胞外成分の間の結合（複合体形成）を、上述のようにモニターする。試験化合物を含む反応混合物中では形成されない、コントロール反応中の複合体の形成は、試験化合物とその反応相手との相互作用を試験化合物が妨げることを示す。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが、共マイトジェンＣｏｎＡの存在下で内皮細胞増殖を刺激する能力を有するのであれば、スクリーニング方法の１例は、この能力を利用する。特に、増殖分析では、ヒト臍帯血管の内皮細胞を得、９６ウェル平底培養プレート(Costar,Camgridge,MA)中で培養し、細胞増殖を促進するのに適当な反応混合物を補う。その混合物は、Ｃｏｎ−Ａ(Calbiochem, La Jolla, CA)を含む。Ｃｏｎ−Ａ、および、スクリーニングされる化合物を添加し、３７℃で培養した後、培養物に３−Ｈ−チミジンを適用し、グラスファイバーフィルター(ｐｈＤ；Cambridge Technology,Watertown,MA)上に採収する。３連の培養物の平均３−（Ｈ）チミジン結合（ｃｐｍ）は、液体シンチレーションカウンター(Beckman Instruments,Irvine,CA)を用いて決定される。有意の３−（Ｈ）チミジン結合は、内皮細胞増殖の活性化を示す。
【０１２５】
アンタゴニストを分析するため、上述の分析を行う：しかしながら、この分析では、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドがスクリーニングされる化合物と一緒に添加され、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド存在下で、３−（Ｈ）チミジン結合を阻害する化合物の能力は、化合物がＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアンタゴニストであることを示唆する。代わりに、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドとアンタゴニストとなり得るものを、膜結合ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド受容体、または、組換え受容体と、競合阻害分析に適当な条件下で一緒にすることによっても、アンタゴニストは検出され得る。受容体に結合したＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド分子の数を、アンタゴニストとなり得るものの有効性を決定するのに用い得るよう、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを放射能等により標識化することができる。例えばリガンド選別、および、ＦＡＣＳ分取等、当業者に公知の多数の方法により、受容体をコードする遺伝子を同定し得る(Coligan et al., Current Protocols in Immun.,1(2)：第５章(1991))。ポリアデニル酸化ＲＮＡがＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに反応性の細胞から調製された場合には、好ましくは発現クローニングが採用され、このＲＮＡから製造されたｃＤＮＡライブラリーはプールに分けられ、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに反応性でないＣＯＳ細胞、または他の細胞をトランスフェクトするのに用いられる。スライドガラス上で生育されたトランスフェクトされた細胞を、標識されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに曝露する。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは、ヨード化、または、部位特異的蛋白質キナーゼのための認識部位を含めることを含む種々の手段により標識され得る。固定化、および培養に続き、スライドをオートラジオグラフィー分析に付す。陽性のプールを同定し、サブプールを調製し、相互作用サブ−プーリング、および再スクリーニング工程を用いて再トランスフェクトし、最終的に、推定される受容体をコードする単一のクローンが得られる。
【０１２６】
受容体同定の別の方法として、標識されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを、受容体分子を発現する細胞膜、または、抽出調製物と光親和性結合させ得る。架橋された材料をＰＡＧＥにより分解し、Ｘ線フィルムに曝露する。受容体を含有する標識された複合体を、削り取り、ペプチド断片に分解し、蛋白質マイクロシークエンシングに付し得る。マイクロシークエンシングにより得られたアミノ酸配列は、推定される受容体をコードする遺伝子を同定用の、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するのに用いられるであろう。
【０１２７】
アンタゴニストのための別の分析では、哺乳細胞、または、受容体を発現する膜調製物は、候補化合物の存在下で、標識されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドとインキュベートされるであろう。その後、この相互作用を増幅、または、阻害する化合物の能力を測定し得る。心血管、内皮、および、血管新生系の疾患の処置に有用な組成物には、これらに限定されるわけではないが、抗体、小さい有機および無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンスおよびリボザイム分子、三重らせん分子等の標的遺伝子産物の発現、および／または、活性を阻害するものが含まれる。
アンタゴニストとなり得るもののより具体的な例には、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリン融合体、並びに、これらに限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および、抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、および、このような抗体若しくは断片のキメラまたはヒト化形体、ヒト抗体、および、抗体断片を含む、抗体が特に含まれる。或いは、アンタゴニストとなり得るものは、例えば、受容体を認識するが何の効果も与えず、それによりＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの活性を競合的に阻害するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの変異形体である、密接に関連した蛋白質であり得る。
【０１２８】
別のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドアンタゴニストとなり得るものは、アンチセンス技術により調製されたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、蛋白質の翻訳を阻害することにより直接ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように働く。三本鎖形成、または、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡによって、アンチセンス技術は遺伝子発現を調製するのに用いることができ、どちらの方法もポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでは成熟ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、遺伝子の転写に関る領域に相補的に設計され（三本鎖―Leeet al., Nucleic Acids Res., 6:3073(1979）；Cooney et al., Science, 241:456(1988)；Dervan et al., Science, 251:1360(1991)参照）、それによりＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの転写、および、産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドへの転写を妨げる（アンチセンス―Okano, Neurochem., 56:560(1991)；「Origodeoxynulcleotide as Antisense Inhibitors of Gene Expression」(CRC Press:Boca Raton, FL, 1988))。また、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイン・ビボでＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの産生を阻害するように発現されるように、上記オリゴヌクレオチドは細胞へ届けられ得る。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０および＋１０位の間である翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２９】
アンタゴニストとなり得るものには、活性部位、受容体結合部位、若しくは、成長因子に結合する小分子、または、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのその他の関連結合部位が含まれ、それによりＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの通常の生物学的活性を阻害する。小分子の例には、これらに限定されるわけではないが、小型のペプチド、またはペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および、合成非ペプチド有機、若しくは、無機化合物が含まれる。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーションに続く、内ヌクレオチド結合分解性開裂により機能する。標的ＲＮＡとなり得るもの内部の特異的リボザイム開裂部位は、公知の技術により同定され得る。詳細については、例えば、Rossi(Current Biology, 4:469-471(1994))、および、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日公開）参照。
【０１３０】
転写を阻害するのに用いられる三本鎖ヘリックス形成における核酸分子は、一本鎖で、デオキシヌクレオチドにより構成されているべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に二本鎖のうちの一本の上に相当な長さのプリン、または、ピリミジンを必要とするフーグスティーン型塩基対則をにより三本鎖ヘリックス形成を促進するように設計される。さらなる、詳細については、例えば前述のＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３５５１号参照。
これらの小分子は、上述のスクリーニング分析のいずれか１つ、若しくは、それ以上により、および／または、当業者に公知のその他のいずれかのスクリーニング技術により同定され得る。
【０１３１】
１１．処置されるべき心血管、内皮、および、血管新生系疾患の型
本明細書中に記載の心血管、血管新生、および、内皮分析において活性を有するか、および／または、その遺伝子産物が心血管系に局在することが見つけられているＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアゴニスト若しくはアンタゴニストは、真性糖尿病等の血管に作用する循環器系疾患を含む種々の心血管、内皮、および、血管新生系疾患において治療上の有用性を有する可能性がある。本発明のＶＥＧＦ−Ｅ分子は細胞の生存、増殖、および／または、分化に関連した多数の治療上の有用性を有する。このような有用性には、ＶＥＧＦ−Ｅの立証されたヒト臍帯血管内皮細胞の生存増幅能力を考慮して、臍帯血管内皮細胞の処置が含まれる。血管が外傷を受けた場合、または、例えば、それが弱っているか、病気にかかっているか、人工的なマトリックスを基礎とするか、または、人工的な環境中にある場合等の臍帯血管の生存を増幅する人工的な手段が採用されるような状況で、処置が必要とされ得る。ＶＥＧＦ−Ｅの選択的マイトジェン特性により改善され得る、その他の物理的状態もまた本発明に含まれる。線維芽細胞の増殖、および、筋細胞中の肥大を誘導する、立証されたＶＥＧＦ−Ｅの能力に基づき、線維芽細胞および筋細胞の処置も有用性に含まれる。特に、ＶＥＧＦ−Ｅは創傷治療、組織成長、並びに、筋肉産出、および再生に用い得る。
その治療上の有用性は、動脈、毛細血管、静脈、および／または、リンパ管の疾病を含み得る。以下の処置例には、筋肉衰弱疾病の処置、骨粗鬆症の処置、移殖の周囲の細胞の成長を刺激して、それにより意図された部位へのその付着を容易にする移殖定着における補助、可能であれば、組織または血清におけるＩＧＦ安定性の増加、および、ＩＧＦ受容体への結合の増加（ＩＧＦは、イン・ヴィトロでヒト骨髄赤芽球および顆粒球始原細胞の成長を増幅することが示されているので）が含まれる。
【０１３２】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアゴニスト、若しくは、アンタゴニストはまた創傷治療、または、組織再生、並びに、結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺、または、腎臓等の組織の再成長に関係した治療、血管新生の刺激、血管新生の促進、内皮細胞の遊走の刺激若しくは阻害、血管平滑筋の遊走、並びに、内皮細胞の産生のための、赤血球生成若しくは顆粒球生成の刺激において用い得る。ＶＥＧＦ−Ｆポリペプチド、または、アンタゴニストにより仲介される血管新生の増加は、虚血組織、および、冠動脈狭搾に続いて起こる心臓中の側枝冠動脈発生に有益である。例えば、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが創傷治療、または肺繊維症における過剰な結合組織の産生を促進する場合には、このような産生を制限する等、アンタゴニストはこのポリペプチドの活性を阻害するのに用いられる。これには、急性心筋梗塞、および、心不全の処置が含まれる。
【０１３３】
さらに、本発明は、その原因によらず、治療的に有効な用量のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアゴニスト若しくはアンタゴニストを投与する心肥大の処置に関する。目的がヒト患者の処置であれば、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは好ましくは、組換えヒトＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド（ｒｈＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド）である。心肥大の処置は、心肥大、高血圧、肥大型心筋症、および、心臓弁膜逆流(valvular regurgitation)を含む、多様な異なる病理学的状態に由来し得る、その種々のいずれかの段階で行われ得る。処置は、潜在的な心臓病に関らず、心筋の組織的損傷を伴うか、または、伴わない心肥大の進行における全ての段階に拡張される。
いずれかの特定の適応症に、その分子のアンタゴニストではなく分子自体、または、そのアゴニストを、使用すべきかの判断は主に、この分子が心血管新生、内皮細胞の生成、若しくは、血管新生を促進するか、または、これらの症状を阻害するかに依存する。例えば、分子が血管新生を促進するのであれば、そのアンタゴニストは、血管新生を制限または防止するのが望まれる疾患を処置するのに有用であろう。このような疾患の例には、血管腫(haemangioma)、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症、早熟児網膜症、若しくは黄斑変性に伴う網膜、脈絡膜若しくは角膜における新血管新生、および、増殖性ガラス体網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管新生を伴う子宮内膜症、気球血管新生による再狭窄(restenosis)、例えば、手術後に形成されるケロイド、心筋梗塞後の繊維症、若しくは、肺繊維症に伴う繊維症病変に見られる瘢痕組織過剰生成が含まれる。
しかしながら、もし分子が血管新生を阻害するのであれば、それを直接、上記症状の処置に使用することが期待される。
【０１３４】
他方、分子が血管新生を刺激するのであれば、それ自身（または、そのアゴニスト）が、末梢血管疾病、高血圧、炎症性脈管炎、レイノー病およびレイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎、リンパ水腫、創傷治療および組織治療、虚血再灌流障害、アンギナ、急性心筋梗塞等の心筋梗塞、慢性心臓症状、鬱血性心不全等の心不全、および、骨粗鬆症等の血管新生が望まれる適応症に用いられる。
【０１３５】
以下、本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストが、血管関連薬剤ターゲティング、または、疾患の処置若しくは予防のための治療ターゲットとして有用な特定の型の疾病を記載する。アテローム性動脈硬化症は、脂質の蓄積、平滑筋細胞の増殖、および、動脈壁における繊維組織の形成に起因する、動脈での脈管内膜肥厚のプラークの蓄積により特性付られる疾病である。疾病はいずれかの器官の大きい、中くらい、および、小さい動脈を襲い得る。内皮、および、血管平滑筋細胞機能における変化が、これらのプラークの蓄積、および、退縮を調節するのに重要な役割を果たすことが知られている。
【０１３６】
高血圧は、全身の動脈、肺動脈、または、門脈静脈系における血圧の上昇により特性付られる。血圧の上昇は内皮機能障害、および／若しくは、血管疾病に起因するか、または、それらに帰着するかも知れない。
【０１３７】
炎症性脈管炎には、巨細胞動脈炎、高安動脈炎、結節性多発性動脈炎（細血管障害性を含む）、川崎病、微細多脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、および、多様な感染関連血管疾患（（シェーンライン・ヘノッホ紫斑病を含む）が含まれる。これらの疾病において、変化した内皮細胞機能が重要であることが示されている。
【０１３８】
レイノー病、および、レイノー現象は、冷気への曝露による四肢の循環の間欠性の異常障害により特性付られる。内皮細胞機能の変化が、この疾病において重要であることが示されている。
【０１３９】
動脈瘤は、内皮細胞、および／または、血管平滑筋細胞の変化に伴う、動脈性、または静脈性樹枝状分岐の嚢状、または、紡錘状拡張である。
【０１４０】
動脈再狭窄（動脈壁の再狭窄）は、内皮および血管平滑筋細胞の機能、および、増殖における変化の結果として、血管形成に続いて起こり得る。
【０１４１】
血栓静脈炎、および、リンパ管炎は各々、静脈およびリンパ管の炎症疾患であり、内皮細胞機能の変化に起因、および／または、それに帰着し得る。同様に、リンパ水腫は、内皮細胞機能に起因するリンパ管障害を含む症状である。
【０１４２】
良性、および、悪性血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞要素の異常な増殖、および、成長により特性付られる。例えば、リンパ管腫は、一般に新生児に見られるリンパ管系の良性腫瘍であり、先天性の、しばしば嚢胞性の、リンパ管の奇形である。嚢胞性腫瘍は、隣接する組織へと成長する傾向がある。通常、嚢胞性腫瘍は子宮頸、および、腋窩領域で起こる。四肢の柔組織中でも起こり得る。主な徴候は、結合組織により取り巻かれた、拡張した、場合により網状の組織リンパ管、および、リンパ球である。リンパ管腫は、不規則に結合された胎児リンパ系、または、その欠乏症により起こると推定されている。その結果は、局所リンパ排液障害(impaired local lymph drainage)である(Griener et al., Lymphology, 4:140-144(1971)。
【０１４３】
本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストの別の使用法は、腫瘍の成長、および／または、転移を可能にする腫瘍の血管新生を含む、腫瘍血管新生の防止での使用である。この過程は、新しい血管の成長に依存する。腫瘍血管新生を伴う腫瘍、および、関連する症状の例には、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、莢膜細胞種、セルトリ・間質細胞腫瘍、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部および頚部癌、微咽腔癌、喉頭癌、肝臓芽細胞腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿性血管腫、血管芽細胞腫、膵癌、網膜芽腫、星状細胞腫、膠芽腫、シュワン鞘細胞腫、乏突起細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に伴う異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に伴うもの等）、および、メーグス症候群が含まれる。
【０１４４】
年齢と関連した黄斑変性（ＡＭＤ）が、年配の集団における重篤な視覚消失の主要な原因である。ＡＭＤの滲出形体は、脈絡膜新血管新生、および、網膜色素内皮細胞剥離により特性付られる。脈絡膜新血管新生は予後における劇的な悪化と関連しているので、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはＡＭＤの重篤さを減らすのに有用であると期待される。
【０１４５】
創傷治療、および、組織修復等の外傷の治療もまた、本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドまたはそのアンタゴニストの目的とされる使用である。新しい血管の形成および復帰は、組織治療および修復に必須である。この範疇には、骨、軟骨、腱、靭帯、および／若しくは、神経組織の成長、または、再生、同様に、創傷治療、組織修復、および、置換、並びに、火傷、切断および潰瘍の処置におけるものが含まれる。骨が正常に形成されない状況における軟骨、および／または、骨の成長を誘導するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、ヒト、および、他の動物における骨折、および、軟骨損傷、または、欠損の治療に適用され得る。このようなＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストを用いた製剤は、閉鎖骨折、および複雑骨折整復、並びに、また人工的な関節の改善された固定において、予防的に使用し得る。骨形成剤により誘導された新たな骨形成は、先天的な、外傷により誘導された、または、腫瘍学的な、切除により誘導された頭蓋および顔面の傷を修復するのに寄与し、また、美容形成外科でも有用である。
【０１４６】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、これらに限定されるわけではないが、圧迫性潰瘍(pressure ulcer)、血管不全、手術による傷、および外傷に伴う潰瘍等を含む、未回復創傷のより良い、または、より早い閉鎖を促進するのに有用であり得る。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、若しくは、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋、若しくは、心筋）、並びに、血管（血管内皮を含む）組織等の他の組織の生成、若しくは、再生、または、このような組織を含む細胞の成長を促進する活性を示し得る。所望の効果の一部は、正常な組織の再生を可能にする繊維症瘢痕の防止、または、モジュレーションであり得る。
【０１４７】
本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、消化管の保護、または、再生、並びに、肺若しくは肝臓繊維症、種々の組織における再灌流障害、および、全身性のサイトカイン損傷による症状の処置において有用であり得る。また、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、先駆組織若しくは細胞からの上述の組織の分化を促進、若しくは、阻害する、または、上述の組織の成長の阻害において有用であり得る。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、歯周病の処置、および、その他の歯治療方法で用いられ得る。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供するか、骨形成細胞の成長を刺激するか、または、骨形成の原細胞の分化を誘導し得る。血管は骨の再編成、および、成長に重要な役割を果たすので、本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、骨および／若しくは軟骨修復の刺激、または、炎症、若しくは、炎症過程により仲介される組織破壊の過程（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等）の阻害等を介した、骨粗鬆症、または、骨関節症の処置において有用で有り得る。
【０１４８】
本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストに帰し得る組織再生活性のその他の範疇は、腱／靭帯形成である。腱／靭帯様組織、または、他の組織の形成を、通常このような組織が形成されない条件下で誘導する蛋白質は、ヒトおよび他の動物において、腱または靭帯の炸裂、変形、並びに、他の腱または靭帯欠損の治療に適用できる。このような製剤は、腱または靭帯組織における損傷を予防する予防的な有用性、並びに、腱または靭帯の骨または他の組織への改善された固着化、および、腱または靭帯組織の欠損の修復における有用性を有し得る。本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストの組成物により誘導される新しい腱／靭帯様組織形成は、先天的な、外傷により誘導された、または、他の原因による腱若しくは靭帯の欠損の修復に寄与し、そしてまた、腱若しくは靭帯の固着または修復のための整形形成外科に有用である。本発明の組成物は、腱若しくは靭帯形成細胞を誘引し、腱若しくは靭帯形成細胞の成長を刺激し、腱若しくは靭帯形成原細胞の分化を誘導し、または、組織を修復するようイン・ビボに戻すための、エクス・ビボにおける腱／靭帯細胞若しくは始原細胞の成長を誘導する環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、手根管症候群、および、その他の腱、または靭帯の欠損を処置するのに有用であり得る。組成物はまた、当分野において周知のように、適当なマトリックス、および／または、分離剤(sequestering agent)を含み得る。
【０１４９】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、神経細胞の増殖、並びに、神経および脳組織の再生、即ち、中央および末梢神経系疾病、並びに、神経障害、同じく、神経細胞、若しくは神経組織の変性、死、または外傷に伴う機構性、および外傷性の疾患において有用であり得る。より具体的には、ＶＥＧＦ−Ｅまたはそのアンタゴニストは、末梢神経傷害、末梢神経障害、および、局部神経障害等の末梢神経系の疾病、および、アルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および、シャイ・ドレーガー症候群等の中央神経系の疾病の処置において使用され得る。本発明と関連して処置される得るその他の症状には、脊髄疾患、頭部外傷、および、卒中等の脳血管疾病等の機構性、および、外傷性疾患が含まれる。化学療法、または、他の医学的治療による末梢神経障害はまた、本発明のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドまたはそのアンタゴニストを用いて処置し得る。
【０１５０】
虚血再灌流障害は別の適応症である。内皮細胞機能不全は、虚血再灌流障害に続いて起こる後遺症の始まり、および、調節の両方において重要であり得る。
【０１５１】
慢性関節リウマチは、さらなる適応症である。脈管構造を介した血管の成長、および、炎症細胞のターゲティングが、リウマチ、および、血清反応陰性の関節炎の病因において重要な要素である。
【０１５２】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、症状の進行を抑制し、無症候性の患者の死を含む突然死を予防するため心肥大の患者に、予防的に投与され得る。このような予防的治療は、広範性左心室心肥大(massive left venticular cardiac hypertrophy)（成人では、最大３５ｍｍ若しくはそれ以上の壁厚、または、子供ではそれに匹敵する値）と診断された患者の場合、または、心臓への血流負荷が特に強いような場合に特に確かなものである。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、肥大型心筋症と診断された患者における、実質的に発達する心房細動の治療において有用であり得る。
【０１５３】
さらなる適応症にはアンギナ、急性心筋梗塞等の心筋梗塞、鬱血性心不全等の心不全が含まれる。その他の非腫瘍性の症状には乾癬、未熟児の網膜症を含む糖尿病性、若しくは、その他の増殖性網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜、若しくは、他の組織移殖、慢性炎症、肺炎、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水症、心膜滲出（心膜炎に伴うもの等）、および、胸膜滲出が含まれる。
上述の記載を考慮し、本明細書中に記載の内皮細胞の機能、増殖、および／若しくは形体を変化させるか、または、それらに影響するＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアゴニスト、若しくはアンタゴニストは、上述の多くの、若しくは全ての疾患の病因、または、病原で重要な役割を果たすかも知れず、このためこれらの過程を増大、若しくは阻害する治療ターゲットとして、または、これらの疾患における血管関連薬剤ターゲティングにおいて機能し得る。
【０１５４】
１２．投与プロトコル、スケジュール、用量、および、製剤
本発明の分子、並びに、そのアゴニスト、およびアンタゴニストは、上述のような種々の疾患および疾病に対する予防、および、治療薬剤として医薬的に有用である。
本発明のＶＥＧＦ−Ｅは、医薬的に有用な組成物の調製において公知の方法に従って製剤され得、本発明のＶＥＧＦ−Ｅは、医薬的に許容される担体ビヒクルと混合物として一緒にされる。適当な担体ビヒクル、および、例えば、ヒト血清アルブミン等の他のヒト蛋白質を含み得るその製剤は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第１６版（１９８０年）（Mack Publishing Co., Osloら編）に記載される。本発明のＶＥＧＦ−Ｅは、心血管疾患、若しくは心血管病を患う患者に非経口で、または、その血流への有効な形体での運搬を保証する他の方法により投与され得る。
【０１５５】
本発明の実施で用いられた本発明のＶＥＧＦ−Ｅの臨床投与に特に適した組成物には、例えば、滅菌水溶液、または、凍結乾燥された蛋白質等の滅菌された水和し得る粉末が含まれる。一般的に、製剤中にさらに医薬的に許容される塩を、一般には製剤を等張にするのに有効な量である適当な量で含むことが望ましい。アルギニン塩基、およびリン酸等のｐＨ調節剤もまた、一般に５．５〜７．５である適当なｐＨを維持するのに有効な量で、典型的には含まれる。さらに、水性製剤の貯蔵寿命、または、安定性を改善するため、グリセロール等の薬剤をさらに含むことが望ましい。このように、異なるＶＥＧＦ−Ｅ製剤が、非経口投与、および、特に静脈内投与に適当とされる。
【０１５６】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、アゴニスト、または、アンタゴニストの治療用組成物が、適当な純度を有する所望の分子を、任意の医薬的に許容される担体、賦形剤、または、安定剤（「Remington's Pharmaceutical Sciences」第１６版，Osloら編（１９８０年））と、凍結乾燥製剤、または、水溶液の形体で混合することにより貯蔵用に調製される。許容される担体、賦形剤、または、安定剤は、採用される用量および濃度で受容者にとって非毒性で、リン酸、クエン酸、および、他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル アンモニウム クロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、または、ベンジルアルコール；メチル、または、プロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；および、ｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは、免疫グロブリン等の蛋白質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくは、リシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくは、デキストリンを含む単糖、二糖、および、他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、若しくは、ソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−蛋白質複合体）；並びに／または、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、若しくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５７】
このような担体のさらなる例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レクチン、ヒト血清アルブミン等の血清蛋白質、リン酸、グリシン、ソルビン酸等の緩衝物質、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等の電解質、コロイドシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースをベースとした物質、および、ポリエチレングリコールを含む。局所用、または、ゲルを基本とした形体のアンタゴニストのための担体には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、または、メチルセルロース等の多糖、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および、木蝋アルコールが含まれる。全ての投与について、慣用のデポー形体が好適に使用される。このような形体には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏、吸入形体、鼻スプレー、舌下錠剤、および、徐放性製剤が含まれる。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、アゴニスト、または、アンタゴニストは、このようなビヒクル中に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で典型的には製剤されるであろう。
【０１５８】
別の製剤は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストを形作られた物品中に混合することを含む、このような物品は、内皮細胞成長、および、血管新生を調節するのに用い得る。さらに、これらの物品により腫瘍浸潤、および転移を調節し得る。
治療用に投与されるＶＥＧＦ−Ｅは無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）で濾過することにより容易に行われる。通常、ＶＥＧＦ−Ｅは、熱的および酸化的変性に対して非常に安定であれば、凍結乾燥形体、または、水溶液として貯蔵される。ＶＥＧＦ−Ｅ製剤のｐＨは、場合によってはより高い、または、より低いｐＨ値が適当であるが、典型的には約６〜８である。前述の或る種の賦形剤、担体、または、安定剤の使用により、ＶＥＧＦ−Ｅの塩が形成されるであろうことが理解されるであろう。
【０１５９】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストの水性組成物の等張性を確保するために、等張剤が存在し得、そして、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、および、マンニトール等の三価の、または、より高価の糖アルコールである多価糖アルコールが含まれる。これらの糖アルコールは、単独、または、組合わせて用い得る。代わりに、溶液を等張にするのに塩化ナトリウム、または、他の適当な無機塩を用い得る。
緩衝液は、例えば、所望のｐＨに応じて、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、または、リン酸塩緩衝液であり得る。本発明の１つの型の液体製剤のｐＨは、約４〜８の範囲に、好ましくは、およそ生理的なｐＨに緩衝化される。
保存剤のフェノール、ベンジルアルコール、および、ベンゼトニウムのハロゲン化物、例えば、塩化物が採用され得る公知の抗菌剤である。
【０１６０】
治療用ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド組成物は、一般的に無菌の出入口を有する容器、例えば、皮下注射針が貫通し得る栓を有する静脈注射溶液のバック、または、ガラス瓶中に入れられる。製剤は好ましくは、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、若しくは、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射として繰り返し投与されるか、または、経鼻、若しくは、経肺運搬に適したエアロゾル製剤（経肺運搬については、例えば、ＥＰ２５７９５６号参照）として投与される。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドはまた、除放性製剤の形体で投与され得る。除放性製剤の適当な例には、蛋白質を含む固体の親水性ポリマーからなる半透性マトリックスを含む。マトリックスは、例えばフィルム、マイクロカプセル等の付形された物品の形体である。除放性マトリックスの例には、ポリエステル、Langer et al.,(J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981))に記載されるようなヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、ポリアクチド(polyactide)（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸、および、γエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体(Sidman et al., Biopolymers,22:547-556(1983))、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer et al.,前述）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸共重合体、および、酢酸ロイプロリド(leuprolide)から成る注射可能なマイクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びに、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８号）が含まれる。
【０１６１】
エチレン−酢酸ビニル、および、乳酸−グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上にわたって放出することを可能にするが、或る種のヒドロゲルは、より短い期間で蛋白質を放出する。カプセルに包まれた蛋白質が体内に長期間残ると、それらは、３７℃での湿気への曝露により変性、または、凝集し得、それにより生物学的活性を失い、免疫原性も変わることがあり得る。関連する仕組みに依存して、蛋白質の安定化のため合理的な方法を工夫することができる。例えば、もし凝圧機構が、チオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたのならば、安定化は、メルカプト残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、含湿量の調節、適当な添加剤の使用、および、特異的ポリマーマトリックス組成物の開発により達成され得る。除放性ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド組成物にはまた、リポソームによりトラップされたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが含まれる。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含むリポソームは、本質的に公知の方法により調製される：ＤＥ第３２１８１２１号；Epstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:3688-3692(1985)；Hwang et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:4030-4034(1980)；ＥＰ第５２３２２号；ＥＰ第３６６７６号；ＥＰ第８８０４６号；ＥＰ第１４３９４９号；ＥＰ第１４２６４１号；日本特開昭第５８−１１８００８号；米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号、並びに、ＥＰ第１０２３２４号。通常、リポソームは、小型（約２００〜８００オングストローム）の単層状型であり、脂質含量は約３０モル％コレステロールより大きく、選択された部分は、最適の治療のため調節される。
【０１６２】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストの治療上有効な量は当然、処置（予防を含む）される病理学条件、投与方法、処置に用いられる化合物の型、いずれかの一緒に行われる治療、患者の年齢、体重、一般的医療コンディション、病歴等の要因に依存して異なり、そしてその決定は、担当医の技術範囲内にある。よって、治療専門家は、最大の治療効果を得るのに必要とされる用量を滴定し、投与経路を加減することが必要である。もし、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが、狭いホスト範囲を有するのであれば、ヒト患者の処置にはヒトＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、より好ましくは天然配列ヒトＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含む製剤が好まれる。臨床医は、問題の症状について所望の治療効果を達成する用量に達するまで、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを投与するであろう。例えば、目的がＣＨＦの処置であれば、その量は、この症状に伴う進行性の心肥大を防止する量であろう。この治療の経過は、超音波心臓検査により容易にモニターされる。同様に、肥大型心筋症の患者においては、経験に基づいてＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが投与され得る。
上述のガイドラインについて、一般的な有効量は約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０１６３】
成人高血圧を処置における非経口使用のためには、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを体重１ｋｇ当り約０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは約０．０５〜２０ｍｇ、最も好ましくは１〜２０ｍｇの注射の形体で１日に１〜３回、静脈注射により投与することが有利である。経口投与のためには、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをベースとした分子は、体重１ｋｇ当り約５ｍｇ〜１ｇ、好ましくは約１０〜１００ｍｇで、日に１〜３回投与される。エンドトキシンの混入が安全なレベルの最小限、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇ蛋白質より少なく、抑えられることが望ましい。さらに、ヒトにおける投与のため、製剤はＦＤＡ局および生物学的基準で要求される無菌性、発熱性、全般的安全性、並びに、純度に適合する。
組織再生に用いられるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含む医薬組成物の用量レジメは、担当医により、例えば、所望の形成される組織重量、損傷の部位、損傷された組織の状態、創傷の大きさ、損傷を受けた組織の型（例えば、骨）、患者の年齢、性別、および、食餌、いずれかの感染症の重篤度、投与の時間、並びに、その他の臨床的要因等のポリペプチドの活性を変える種々の要因を考慮して決定される。再構成に用いられるマトリックスの型、および、医薬組成物内のその他の蛋白質の含有により用量は異なる。例えば、ＩＧＦ−Ｉ等のその他の公知の成長因子の最終組成物への添加もまた、用量に影響するであろう。経過は、組織／骨成長、および／または修復の周期的な評価、例えば、Ｘ線、組織形態学的測定、および、テトラサイクリン標識によりモニターされ得る。
【０１６４】
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、アンタゴニスト、または、アゴニスト投与の経路は以下のように、例えば、静脈内、筋肉内、脳内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所、若しくは吸入経路の注射、若しくは、点滴、または、除放性系等の公知の方法に適合する。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、腫瘍内、腫瘍周囲、損傷内、または、損傷周辺経路によっても適切に投与され、局所的、および、全身性の治療効果を発揮する。腹膜内経路は、例えば、卵巣腫瘍の処置において、特に有用であると期待される。
ペプチド、または、小型の分子がアンタゴニスト、または、アゴニストとして用いられた場合、それは好ましくは経口、または非経口で、液体、または固体形体で、哺乳動物に投与される。
塩を形成し、ここで有用な分子の薬理学的に許容される塩の例には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩）、アンモニウム塩、有機塩基塩（例えば、ピリジン塩、トリエチルアミン塩）、無機酸塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩）、および、有機酸の塩（例えば、酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩）が含まれる。
【０１６５】
骨、軟骨、腱、または、靭帯の生成に有用な、本発明の組成物については、治療方法において組成物を局所的、全身的、または、インプラント、若しくは、装置により局部的に投与することを含む。投与される場合、使用される治療的組成物は、発熱原を含まず、生理的に許容される形体である。さらに、組成物は望ましくはカプセルに含まれるか、または、骨、軟骨、または組織の損傷部位に運搬される粘性形体で注射され得る。局所的投与は、創傷治療、および組織修復に適当であり得る。好ましくは、骨、および／または軟骨形成のため、組成物は蛋白質含有組成物を骨、および／または軟骨の損傷部位へ運搬できるマトリックスを含み、骨および軟骨を作る構造を提供し、好ましくは体に再吸収され得る。このようなマトリックスは、他の移殖用の医療適用で現在用いられる材料より形成され得る。
マトリックス材料の選択は生体適合性、生分解性、物理的特性、整形的様相、および界面特性に基づく。組成物の特定の適用は、それに適当な製剤を明確にするであろう。組成物のマトリックスとなり得るものは生分解性で、化学的に明らかな、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、および、ポリ無水物であり得る。その他の材料となり得るものは、骨、または、皮膚コラーゲン等の生分解性で、生物学的に明確なものである。さらなるマトリックスは、純粋な蛋白質、または、細胞外マトリックス成分から成る。他のマトリックスとなり得るものは、燒結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、または、他のセラミックス等の非生物分解性で化学的に明確なものである。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンとリン酸三カルシウム等、上述の型の材料のいずれかの組合わせから成ってもよい。生体セラミックは、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩中のように組成が変えられていてもよく、孔の大きさ、粒子径、粒子形、および、生分解性を変えるために加工されているもよい。
【０１６６】
一つの特定の態様は、１５０〜８００ミクロンにわたる直径を有する多孔性粒子の形体の乳酸、および、グリコール酸の５０：５０（モル重量）の共重合体である。幾つかの応用法では、カルボキシメチセルロース、または、自己由来血餅等の分離剤をポリペプチド組成物がマトリックスから分離するのを防ぐために使用することが有益である。
分離剤の１つの好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、カルボキシメチルセルロースを含むアルカリセルロース（ヒドロキシアルカリセルロースを含む）であり、好ましいのは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩である。その他の好ましい分離剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレン グリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、および、ポリ（ビニルアルコール）が含まれる。ここで有用な分離剤の量は総製剤重量に基づいて、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、これはポリマーマトリックスからのポリペプチド（または、そのアンタゴニスト）の脱着を防止し、そして、組成物の適当な使い易さを提供するのに必要な量であり、マトリックスに原細胞が浸潤するのを妨げるほど多くはなく、それにより原細胞の骨形成活性をポリペプチド（または、そのアンタゴニスト）が補助する機会を提供する量である。
一般に、疾患が許せば、ＶＥＧＦ−Ｅを部位特異的運搬用に製剤し、投与すべきである。これは、創傷および潰瘍の場合に重宝である。
【０１６７】
局所的に適用する場合、ＶＥＧＦ−Ｅは、担体、および／または、アジュバンド等の他の成分と適当に組合される。このような他の成分の性質について、それらが医薬的に許容され得るものであり、目的とされる投与について効能を有し、組成物中の活性成分の活性を弱めるものでないという以外は、限定はない。適当なビヒクルの例には、精製されたコラーゲンを含むか、または、含まない軟膏、クリーム、ゲル、または、懸濁剤が含まれる。組成物はまた、好ましくは液体、または、半液体形体で経皮パッチ、バンソウコウ、および、包帯にしみ込ませてもよい。ゲル製剤を得るために、液体組成物中に製剤されたＶＥＧＦ−Ｅは、有効量の水溶性多糖類、または、ポリエチレングリコール等の合成ポリマーと、局所的に適用するのに適切な粘性のゲルを形成するために混合され得る。使用し得る多糖類には、例として、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、並びに、アルキルヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化されたセルロース誘導体等のセルロース誘導体；澱粉、および、分別された澱粉；寒天；アルギン酸、および、アルギン酸塩；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲーニン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；および、合成生物ポリマー；そしてまた、キサンタンゴム、グアールガム、イナゴマメゴム、アラビアゴム、トラガカントゴム、および、梧桐ゴム等のゴム；並びに、それらの誘導体および混合物が含まれる。
好ましくは、多糖類はエーテル化されたセルロース誘導体、より好ましくは、例えば、メチルセルロース、および、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、および、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のヒドロキシアルキルセルロース誘導体等の明確で、精製され、そしてＵＳＰに載ったものである。ここで、最も好ましいのはメチルセルロースである。
【０１６８】
ゲル化するのに有用なポリエチレングリコールは、典型的には、適切な粘性を達成する低分子量、および、高分子量のポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量４００〜６００のポリエチレングリコールと、分子量１５００のものとの混合物が、ペーストを得るのに適当な割合で混合されれば、この目的に有効であろう。
多糖類、および、ポリエチレングリコールに関しての「水溶性」という用語は、コロイド溶液および分散液を含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解性は、エーテル基の置換の度合いにより決定され、本発明で有用な安定化誘導体は、セルロース鎖中の各無水グルコース単位当りこのようなエーテル基を十分量有するべきである。一般に、各無水グルコース単位当り少なくとも０．３５個のエーテル基によるエーテル置換の程度が十分である。さらに、セルロース誘導体は、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、ＫまたはＣｓ塩等のアルカリ金属塩の形体であり得る。
ゲル中でメチルセルロースが用いられる場合、それは、ゲルの好ましくは約２〜５％、より好ましくは約３％を構成し、ＶＥＧＦ−Ｅは、ゲル１ｍｌ当り約３００〜１０００ｍｇの量で存在する。
【０１６９】
１３．組合せ治療
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアゴニスト若しくはアンタゴニストの、問題となる疾患を予防、若しくは処置する効力は、その活性な薬剤を、連続して、または、その目的に有効な他の剤と組合わせた一つの組成物として、若しくは、別々の組成物として投与することにより改善され得る。よって、ＶＥＧＦ−Ｅ治療をＶＥＧＦ−Ｅを含むいずれかの成長因子の細胞増殖、生存、分化および修復を増進する活性を増幅するため、他の新規、若しくは慣用の治療（例えば、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、蛋白同化ステロイド、ＥＧＦ、または、ＴＧＦ−α）と組合わせることは本発明の範囲内に含まれる。このような共同治療の薬剤自体が組成物中に含まれることは、本発明において必要ではないが、このような薬剤が蛋白質性である場合には都合がよい。このような混合物は、ＶＥＧＦ−Ｅを単独で用いる場合と同様の方法で、同様の目的のために適切には投与される。
【０１７０】
心肥大の処置のため、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド治療は、例えば、フェニレフリン等のα−アドレナリン作用性アゴニストの阻害剤；ＢＯＳＥＮＴＡＮ（登録商標）、および、ＭＯＸＯＮＯＤＩＮ（登録商標）等のエンドセリン−１阻害剤；ＣＴ−１に対する阻害剤（米国特許第５６７９５４５号）；ＬＩＦに対する阻害剤；ＡＣＥ阻害剤；デス−アスパラギン酸−アンギオテンシンＩ阻害剤（米国特許第５７７３４１５号）、および、アンギオテンシンＩＩ阻害剤等の公知の心筋細胞肥大因子の阻害剤の投与と組合わせ得る。
【０１７１】
高血圧に伴う心肥大の処置では、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは、例えば、プロパノール、チモロール、テルタロロール(tertalolol)、カルテオロール(carteolol)、ナドロール(nadolol)、ベタキソロール(betaxolol)、ペンブトロール(penbutolol)、アセトブトロール(acetobutolol)、アテノロル、メトプロロール、若しくは、カルベジロール(carvedilol)等のβ−アドレナリン作用性受容体のブロッキング剤；例えば、キナプリル(quinapril)、カプトプリル、エナラプリル(enalapril)、ラミプリル(ramipril)、ベンアゼプリル(benazepril)、フォシノプリル(fosinopril)、若しくは、リシノプリル(lisinopril)等のＡＣＥ阻害剤；例えば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメタジド(hydroflumethazide)、メチルクロチアジド(methylchlothiazide)、ベンズチアジド(benzthiazide)、ジクロフェンアミド(dichlorphenamide)、アセタゾルアミド、若しくは、インダパミド(indapamide)である利尿剤；並びに／または、例えば、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、若しくは、ニカルジピン(nicardipine)であるカルシウムチャネル遮断剤と組合わせて投与され得る。本明細書において、一般名ＶＥＧＦ−Ｅと同定された治療剤を含む医薬組成物は、市販されており、用量、投与、有害作用、禁忌等については製造者の指示にしたがって投与されるべきである（例えば、「Physicians' Desk Reference」(Medical Economics Data Production Co.:Montvale, N.J., 1997)第５１版参照）。
【０１７２】
肥大型心筋症の処置における組合わせ治療のための好ましい候補は、β−アドレナリン作用性阻止剤（例えば、プロプラノロール、チモロール、テルタロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロル、メトプロロール、または、カルベジロール）、ベラパミル、ジフェジピン(difedipine)、または、ジルチアゼムである。高血圧に伴う肥大の処置には、例えば、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、若しくは、ニカルジピン等のカルシウムチャンネル遮断剤；β−アドレナリン作用性阻止剤；例えば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメタジド、メチルクロチアジド、ベンズチアジド、ジクロフェンアミド、アセタゾルアミド、または、インダパミド等の利尿剤；並びに／または、例えば、キナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベンアゼプリル、フォシノプリル、若しくは、リシノプリル等のＡＣＥ−阻害剤を用いた、抗高血圧薬物治療を必要とし得る。
他の適応症について、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、問題となる骨、および／または、軟骨の欠陥、創傷、若しくは、組織の処置に有用な他の薬剤と組み合わせ得る。これらの薬剤には、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、若しくは、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＦＧＦ、および、ＣＴＧＦ等の種々の成長因子が含まれる。
【０１７３】
さらに、癌を処置するのに使用されるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、上述のように細胞毒性薬、化学療法薬、または、成長阻害薬と組合わせ得る。また、癌処置のため、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、放射性物質の照射、若しくは、投与のどちらかを含む放射線治療と連続して、または、組合わせて適切に投与される。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアンタゴニストと組合わせて投与される治療薬の有効量は医師、または、獣医の裁量に任される。投薬投与、および、調整は、処置されるべき症状の最大の処置を達成するように行われる。例えば、高血圧を処置するためのこれらの量では、理想的には利尿剤、または、ジギタリスの使用、および、高血圧、若しくは低血圧、腎傷害等の症状が考慮される。用量はさらに、使用される治療薬の型、処置される特定の患者等の要因に依存する。典型的には、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドなしで投与される治療薬において使用されるのと同じ用量が採用される。ＶＥＧＦ−Ｅの二次成長因子に対する有用なモル比は典型的には、１：０．１〜１０であり、等モル量が好ましい。
【０１７４】
１４．製品
上述の疾患の診断または処置に有用なＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、若しくは、そのアンタゴニストを含むキット等の製品は、少なくとも１つの容器、および、１枚のラベルを含む。適当な容器には、例えば、瓶、ガラス瓶、シリンジ、および、試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料より形成され得る。容器には、症状を診断または処置するのに有効な組成物が保持され、無菌の出入口（例えば、容器は、皮下注射針が貫通し得る栓を有する、静脈注射用の溶液バックまたはガラス瓶であり得る）を有し得る。組成物中の活性剤はＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、そのアゴニスト、若しくは、アンタゴニストである。容器上のラベル、または、それに関連するラベルは、組成物が選ばれた症状を診断、または、処置するのに用いられることを示す。製品はさらに、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液、および、デキトロース溶液等の医薬的に許容される緩衝液を含む第２の容器を含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および、使用のための指示が記されたパッケージ内の印刷物を含む、商業および使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。製品はまた、上述のように別の活性剤を含む第２または第３の容器を含んでもよい。
【０１７５】
Ｆ．抗−ＶＥＧＦ−Ｅ 抗体
本発明によりさらに、抗−ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド抗体が提供される。抗体の例には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、および、異結合抗体を含む。
【０１７６】
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗−ＶＥＧＦ−Ｅ抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者には周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤、および、望ましければアジュバンドの１若しくは複数回の注射により、哺乳動物中で生じさせ得る。典型的には、免疫化剤、および／または、アジュバントは、哺乳動物に複数の皮下、または、腹膜内注射により注入される。免疫化剤には、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、その融合蛋白質が含まれ得る。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが知られている蛋白質に結合することは有用であり得る。このような免疫原性の蛋白質の例には、これらに限定されるわけではないが、スカシガイのヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および、ダイズトリプシン阻害剤が含まれる。採用され得るアジュバントの例には、フロイントの完全アジュバント、および、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。免疫化方法は、過度の実験をすることなく当業者により選択され得る。
【０１７７】
２．モノクローナル抗体
代わりに、抗−ＶＥＧＦ−Ｅ抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein(Nature,256:495(1975))に記載される方法等のハイブリドーマ法により調製され得る。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または、他の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を産生できる、または、産生する能力を有するリンパ球を誘導する免疫化剤で典型的には免疫化される。或いは、リンパ球はイン・ヴィトロで免疫化され得る。
免疫化剤には、典型的にはＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド、または、その融合蛋白質が含まれる。一般的に、ヒト起源のものが望ましければ末梢血リンパ球（ＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)）、または、非ヒト哺乳動物起源のものが望ましければ脾臓細胞、若しくは、リンパ節細胞のどちらかが用いられる。その後リンパ球は、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて、不死化セルラインと、ハイブリドーマ細胞を形成するよう融合される（Goding,「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」(Academic Press,(1986)）第５９−１０３頁）。不死化セルラインは通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、および、ヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット、または、マウスミエローマセルラインが採用される。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の成長、または、生存を阻害する、１若しくはそれ以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、および、チミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０１７８】
好ましい不死化セルラインは、効率良く融合し、選択された抗体産生細胞における抗体の安定で、高レベルの発現を維持し、そして、ＨＡＴ培地等の培地に感受性のものである。より好ましい不死化セルラインは、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego,California)、および、American Type Culture Collection(Manassas, Virginia)から入手可能なマウスミエローマラインである。ヒトモノクローナル抗体産生のための、ヒトミエローマおよびマウス−ヒトへテロミエローマセルラインについても記載されている(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」Marcel Dekker, Inc., New York(1987)第５１−６３頁）。
その後、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について評価し得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、放射免疫分析（ＲＩＡ）、または、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）等の免疫沈降、または、イン・ヴィトロ結合分析により決定される。このような技術、および、分析は公知である。例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson et al., Pollardのスカッチャード分析により決定され得る(Anal.Biochem.,107:220(1980))。
【０１７９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させ得る（Goding、前述）。この目的に適した培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、および、ＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。代わりに、ハイブリドーマ細胞をイン・ビボで、哺乳動物中の腹水として生じさせ得る。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または、アフィニティークロマトグラフィー等の慣用の免疫グロブリン精製方法により培養培地、または、腹水液から精製され得る。
【０１８０】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４８１６５６７号等に記載の組換えＤＮＡ技術によっても作られ得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは慣用の手法（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いること）により容易に単離、および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい源となる。一度単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、その後、そうしない場合には免疫グロブリン蛋白質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、ミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体が合成されるようにする。ＤＮＡはまた、例えば、相当するマウス配列をヒトの重鎖、および、軽鎖定常部位のコード配列で置換すること（米国特許第４８１６５６７号）、または、免疫グロブリンコード配列の全て、若しくは、一部を非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列と共有結合することにより改変し得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換、または、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、キメラ二価抗体を形成し得る。
抗体は一価抗体であり得る。一価抗体を調製する方法は当分野において周知である。例えば、一つの方法には免疫グロブリンの軽鎖、および改変された重鎖の組換え発現が含まれる。重鎖の架橋を妨げるように、一般に、重鎖はＦｃ領域のいずれかの部分が切断されている。代わりとしては、架橋を妨げるように関連するシステイン残基は別のアミノ酸残基で置換されるか、または、欠失されている。
イン・ヴィトロの方法もまた一価抗体を調製するのに適当である。その断片、特にＦａｂ断片を製造するための抗体の消化は、当分野においての公知のルーチンな技術により行われ得る。
【０１８１】
３．ヒト化抗体
本発明の抗−ＶＥＧＦ−Ｅ抗体は、さらにヒト化抗体、または、ヒト抗体を含み得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形体は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または、その断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または、その他の抗体の抗原結合配列等）である。ヒト化抗体には、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特異性、親和性、および、能力を有するマウス、ラット、若しくはウサギ等の非ヒト種のＣＤＲからの残基（供与抗体）により置換されたヒト免疫グロブリン（受容抗体）が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、受容抗体、または導入されたＣＤＲ、若しくは、フレームワーク配列中のどちらにも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部、若しくは、実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全部、若しくは、実質的に全部がヒト免疫グロブリン定常配列のもにである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも１部を含むであろう(Jones et al., Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al., Nature,332:323-329(1988)；および、Presta et al., Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。
【０１８２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「導入(import)」残基と呼ばれ、典型的には「導入」可変ドメイン由来である。ヒト化は実際に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法(Jones et al., Nature, 321:522-525(1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988)；および、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988))に従って、げっ歯類ＣＤＲ、または、ＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列により置換することにより行われ得る。よって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、実質的に完全なヒト可変ドメインより少ない部分が、非ヒト種の対応配列により置換されたものである。実務では、ヒト化抗体は、典型的には、ＣＤＲ残基、および、場合によりいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の相似部位からの残基により置換されたヒト抗体である。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol., 227:381(1991)；Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581(1991))を含む、種々の公知の技術を用いて製造され得る。Cole et al.および、Boerner et al.の技術もまたヒトモノクローナル抗体の調製に使用し得る(Cole et al., 「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」, Alan R. Liss, 第77頁(1985)、および、Boerner et al., J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。
【０１８３】
４．両特異性(bispecific)抗体
両（二）特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体であり、好ましくはヒト又は擬人化モノクローナル抗体である。本発明の場合には、結合特異性のうち一つは、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対するものであり、他は任意の他の抗原に対するものであるが、好ましくは細胞表面タンパク又は受容体又は受容体サブユニットに対するものである。
両特異性抗体の作成法は当該技術分野で既知である。伝統的には、両特異性抗体の組換え生産は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアーの共−発現(co-expression)に基いている。ここで、２個の重鎖は異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の種類がランダムなので、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子のタンパク混合物を生産する可能性があり、そのうち、唯一つが正しい両特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィー工程で達成される。同様の方法はＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびTraunecker et al., (EMBO J. 10: 3655-3659 (1991))に開示されている。
【０１８４】
所望の結合特異性を有する抗体の可変部（可変ドメイン）（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常部（定常ドメイン）の配列と融合させることができる。少なくともヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常部との融合が好ましい。軽鎖の結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を融合の少なくとも１つに存在させておくことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質導入（コトランスフェクション）する。両特異性抗体の生成の詳細については、例えば、Suresh et al.のMethods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照。
【０１８５】
５．異種複合（ヘテロコンジュゲート）抗体
異種複合抗体も本発明の範囲内である。異種複合抗体は２つの共有結合で結合した抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞を標的化するため（ＵＳＰ ４６７６９８０）、ＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０； ＷＯ９２／２００３７３； ＥＰ ０３０３９）のために、提案されている。抗体は合成タンパクの化学、例えば架橋剤を含めて、において既知の方法を用い、インビトロで調製できると考えられる。例えば、抗毒素は、ジスルフィド−交換反応を用いるかチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適当な試薬にはイミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダート、並びに米国特許４６７６９８０号に記載の試薬が含まれる。
【０１８６】
６．エフェクター機能工学
本発明の抗体をエフェクター機能、例えば癌の治療における抗体の有効性、に関して改良することが望ましいであろう。例えば、システイン残基（単数又は複数）をＦｃ領域に挿入することによりこの領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させうる。このようにして生成されたホモ二量体抗体では内部移行（インターナリゼーション）能力が改良されおよび／又は補体を介する細胞死滅化および抗体依存性の細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増大されうる。Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) 参照。高められた抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Wolff et al., (Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))が記載したように、異種両機能性クロスリンカーを用いても調製することができる。別法として、二重Ｆｃ領域を有し、それにより高められた補体溶解性とＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計（工作）することができる。Stevenson  et al., (Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989))参照。
【０１８７】
７．免疫複合体（イムノコンジュゲート）
本発明はまた以下の物質と結合（共役）した抗体からなる免疫複合体に関する；化学療法剤、毒素（例、酵素的に活性な、細菌、真菌、植物、動物起源の毒素若しくはそのフラグメント）、又は放射性同位体（即ち、放射性複合体）。そのような免疫複合体の製造に有用な化学療法剤は上記したとおりである。使用し得る酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントにはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディ(Aleurites fordii)タンパク、ディアンシン(dianthin)タンパク、フィトラーカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよび ＰＡＰ−Ｓ）、ノモルディカ・カランティア(nomordica charantia)インヒビター、クルシン(crucin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン類(tricothecene)が含まれる。放射性複合抗体を得るために、様々な放射性核種を使用することができる。例として２１２Ｂｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１８８】
抗体と細胞毒性物質との複合体（抱合体）は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二価性誘導体（例、ジメチルアジピミダートＨＣｌ(dimethyl adipimidate HCl)）、活性エステル類（例、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド類（例、グルタレルデヒド(glutareldehyde)）、ビス−アジド化合物（例、ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム化合物（例、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアナート類（例、トリエン ２，６−ジイソシアナート）および二価活性フッ素化合物（例、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等の様々な二価性(bifunctional)タンパク−カップリング剤を用いて作成される。例えば、リシン抗毒素（イムノトキシン）は記載の方法(Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1997))に従って調製することができる。１４Ｃ−標識 １−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレン トリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合(conjugate)させるためのキレート化剤の一例である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備的なターゲッティングに用いるために、抗体を「受容体」（例、ストレプトアビジン）と結合させる。この場合、抗体―受容体複合体を患者に投与したのち、清掃剤(clearing agent)を用いて循環中から非結合複合体を除去し、次いで細胞毒性物質（例、放射性ヌクレオチド）と結合した「リガンド（例、アビジン）」を投与する。
【０１８９】
８．免疫リポソーム
本明細書に開示した抗体は免疫リポソームとしても製剤化することができる。抗体含有リポソームは当該技術分野で既知の方法により調製することができる（Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)； Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)； 米国特許４４８５０４５号および ４５４４５４５号）。循環時間を増加したリポソームは米国特許５０１３５５６号に記載されている。
特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用い、逆相蒸発法で生成させることができる。リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押し出し成形し、所望の直径のリポソームを得る。Martin et al.が記載した方法(Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982))で、互換反応により本発明の抗体のＦａｂ´フラグメントをリポソームに結合させることができる。場合により化学療法剤（ドキソルビシンなど）をリポソームに含有させる。Gabizon  et al.のJ. National Cancer Inst., 81: 1484 (1989)参照。
【０１９０】
Ｇ．抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体の用途
本発明の抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体は様々な用途を有する。例えば、抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体は、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの診断アッセイ、例えば、特異的な細胞、組織又は血清中での発現の検出に用いることができる。当該技術分野で既知の様々な診断検定法が使用可能であり、例えば、異種又は同種相で実施される競合的結合アッセイ、直接又は間接的なサンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどがある(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158)。診断アッセイで用いる抗体を検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は直接又は間接的に、検出可能なシグナルを生産しうるはずである。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光性又は化学発光性化合物、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。例えば、文献(Hunter et al., Nature 144: 945 (1962)； David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974)； Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981)； およびNygren, J. Histochem. And Cytochem., 30: 407 (1982)等)に記載された方法を含む、当該技術分野で既知の、抗体を検出可能な部分に結合させるための方法を適宜用いることができる。
抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体はまた、組換え細胞培養又は天然起源からのＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法では、当該技術分野で周知の方法により、ＶＥＧＦ−Ｅに対する抗体を、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭレジンやろ紙などの適当な支持体に固定化する。次いで、固定化抗体を精製すべきＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含有する試料と接触させたのち、支持体に結合した、試料中のＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを除く全物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを放出させる他の適当な溶媒で洗浄する。
【０１９１】
１．抗体の医薬組成物
本発明で同定したＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと結合する抗体、並びに後述のスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、様々な上記および下記の疾患（障害）の治療に医薬組成物の形で投与することができる。
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが細胞内にあって、全抗体をインヒビターとして用いる場合、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、抗体又は抗体フラグメントを細胞内にを到達させるために、リポフェクチンやリポソームも使用できる。抗体フラグメントを用いる場合、標的タンパクの結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基いて、標的タンパクとの結合能力を維持しているペプチド分子をデザインすることができる。そのようなペプチドは化学的に合成するか、および／又は組換えＤＮＡ技術で製造することができる。例えば、Marasco et al.のProc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 参照。本発明の処方はまた、治療すべき特定の兆候（適応）に対して必要ならば１以上の、好ましくは相互に不利な影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性物質を含有していても良い。別法として、あるいは、付加的に、組成物は、その機能を高める物質、例えば、細胞毒性物質、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害物質など、を含有していてもよい。意図する目的に有効な量のそのような分子を一緒に適切に含有させる。
【０１９２】
活性成分はまた、コロイド性薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロカプセル、ミクロエマルション、ナノ−粒子、およびナノカプセルなど）又はマクロエマルション中、例えば、それぞれ、コアセルベーション法又は界面重合法によって製造された、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシラート）(poly-(methylmethacylate) マイクロカプセルに取込むことができる。そのような技術は文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、前掲）に記載されている。
インビボ投与のために用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、容易に達成される。
【０１９３】
徐放性製剤も調製できる。適切な例の徐放性製剤は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、このマトリックスはフィルムやマイクロカプセル等の成形品の形である、を含む。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ （乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリド(leuprolide acetate)から構成される注射用ミクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは分子を１００日間にわたって放出することができるが、ある種のヒドロゲルはタンパクをより短時間の間放出する。被包された抗体が体内に長時間維持された場合、３７℃で水分に暴露されて変性するか凝集し、結果として生物学的活性を失い免疫原性が変化するかもしれない。関与する機構に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かれば、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量のコントロール、適当な添加物の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の使用によって達成することができる。
【０１９４】
２．抗体を用いる治療方法
ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対する抗体は前記のごとく、様々な心血管、内皮、および血管形成障害の治療に用いることができる。
抗体は、ボーラス静脈内投与、又はある期間の連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所などの投与経路又は吸入経路などの既知の方法で哺乳類、好ましくはヒトに投与される。抗体は静脈内投与が好ましい。
他の治療レジメも上記の本発明の抗体と一緒に投与することができる。例えば、抗体が癌の治療のためのものであれば、そのような抗体で治療される患者は放射線治療をも受けるであろう。別法として、あるいは付加的に患者に化学療法剤を投与することができる。そのような化学療法剤の調製および投与スケジュールは、業者の指示に従うか、熟練した医師によって経験的に決定される。そのような化学療法剤の調製および投与スケジュールは専門書(Chemotherapy Service, M.C.Perry編(Williams & Wilkins: Baltimore, M.D., 1992))にも記載されている。化学療法剤は、抗体の投与に先立って、或いは後に、又は同時に投与することができる。抗体は、タモキシフェン又はＥＶＩＳＴＡＴＭのような抗−エストロゲン物質、又はオナプリストン（ＥＰ ６１６８１２参照）のような抗プロゲステロン物質と、それらの分子に関して既知の用量で併用することができる。
【０１９５】
抗体を癌の治療に用いる場合、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦ受容体（群）の１又はそれ以上と結合する抗体のような、他の腫瘍−関連抗原に対する抗体をも投与することが望ましいかもしれない。これらは上記の物質（剤）をも含有する。また、抗体は、放射線照射又は放射活性物質の投与のいずれかの放射線医学療法と連続的に又は組合わせて投与するのにも適する。別法として、あるいは付加的に、本明細書に開示した、同一の、又は２又はそれ以上の異なる抗原と結合する２又はそれ以上の抗体を患者に共−投与してもよい。患者に１又はそれ以上のサイトカインを投与することが有利な場合もある。好ましい態様では、本明細書に開示した抗体は成長−阻害物質と一緒に共−投与する。例えば、まず成長阻害剤を投与し、次いで本発明の抗体を投与する。しかしながら、抗体を同時、又は先に投与することも想定されている。成長阻害剤の適当な用量は現在使用されている用量であり、成長阻害剤と本発明の抗体の協同作用（相乗的）によって減量することができる。
一つの態様では、併用治療で腫瘍の血管形成を攻撃する。例えば、腫瘍患者に、腫瘍又はその転移巣（あれば）の壊死を観察することにより、決定された治療有効量の抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと他の抗体（例、抗−ＶＥＧＦ）を投与する。この治療法はさらに有利な効果が観察されなくなるまで、又は臨床検査で腫瘍又はあらゆる転移病巣の痕跡が示されなくなるまで継続する。次いで、ＴＮＦを単独又は補助剤、又は熱又は照射と一緒に与える。補助剤には、α−、β−若しくはγ−インターフェロン、抗ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、Ｄ因子、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又は腫瘍内での微小血管凝集を促進する他の物質、例えば抗プロテインＣ抗体、抗プロテインＳ抗体又はＣ４ｂ結合タンパク（ＷＯ９１／０１７５３（１９９１年２月２１日公開）参照）が含まれる。
【０１９６】
補助剤の効果は様々なので、常法に従い、腫瘍マトリックススクリーニングによってそれらの腫瘍に対する影響力を比較することが望ましい。抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド抗体とＴＮＦの投与は、所望の臨床効果が達成されるまで繰り返される。別法として、抗抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド抗体をＴＮＦ、および場合により、補助剤（類）と一緒に投与する。固形腫瘍が四肢、又は他の全身循環系から隔離されうる部位に存在する場合、本明細書に記載した治療剤を隔離された腫瘍又は器官に投与する。他の態様では、抗ＦＧＦ抗体又は抗ＰＤＧＦ中和抗体のようなＦＧＦ又はＰＤＧＦアンタゴニストを抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド抗体と連結して投与する。抗ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド抗体による治療は、傷治癒又は所望の新血管新生の間維持することが好ましい。
心血管、内皮、および脈管形成障害の予防又は治療のための本発明抗体の適当な用量は上で明らかにしたように、治療すべき障害（疾患）のタイプ、疾患の重篤度、および経過、抗体を予防又は治療のいずれの目的で投与するか、治療歴、患者の病歴および抗体に対する反応、および担当医師の判断に依存する。抗体は一回で、又は一連の治療を通して患者に適宜投与される。
【０１９７】
例えば、疾患の型および重篤度に応じ、患者への初期投与量として約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体を一回又はそれ以上の回数に分けて、又は連続注入によって投与することが挙げられる。典型的な１日又は１週間の用量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ又はそれ以上である。数日又はそれ以上の間の反復投与のためには、症状に応じて、疾患症状の所望の抑制が起るまで、治療を繰り返すか、維持する。しかしながら、他の投与レジメも有用である。この治療法の進行は、例えば、Ｘ線による腫瘍イメージング(radiographic tumor imaging)などの通常の方法およびアッセイで容易にモニターすることができる。
【０１９８】
３．抗体を伴う製品
抗体と標識を備えた容器を含む製造品も提供される。活性物質として抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体を含有するそのような製品は上に記載されている。
【０１９９】
４．抗体を用いる腫瘍の診断および予防
抗体を使用すべき指示が癌である場合、細胞表面タンパク、例えば、ある種の腫瘍内で過剰発現している成長レセプター、は薬物候補又は腫瘍（例、癌）治療の優れた標的であるが、同タンパクはまたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドと一緒に腫瘍の診断および予防にも付加的な用途を有する。例えば、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対する抗体は腫瘍診断薬又は予防薬として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体を、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現を定量的又は定性的に検出するために用いることができる。抗体は検出可能な標識を有し（例、蛍光性ラベル）、結合を光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光分析法、又は当該技術分野で既知の他の方法で観察し得ることが好ましい。そのような結合アッセイは基本的に上記のようにして実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインシトゥー検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡検査で行うことができる。この目的には、患者から組織学的標本を取り、標識した抗体を、好ましくは抗体を生物学的標本に重層することにより、適用する。この方法によって、検査した組織内でのマーカー遺伝子産物の分布を決定することもできる。当業者には明らかであろうが、インシトゥー検出には広範な組織学的な方法を容易に用いることができる。
【０２００】
以下の実施例は単に例示のためのものであって、いかなる意味でも本発明を限定するものではない。
本明細書中で参照した全ての特許および文献は、その全体を本明細書に引用して組み込まれる。
【実施例】
【０２０１】
実施例中で言及されている市販の試薬は、特に記載しない限り、製造元の使用説明にしたがって用いた。以下の実施例、および本明細書を通して、ＡＴＣＣ受入れ番号により同定される細胞の供給元は、the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia である。
【０２０２】
実施例Ｉ：ＶＥＧＦ関連タンパク質（ＶＥＧＦ−Ｅ）をコードするクローンの同定
ＶＥＧＦとの相同性により、the Incyte Pharmaceuticals データベースから同定された、発現配列タグ（expressed sequence tag、ＥＳＴ）に基づくプローブを用いて、ヒト神経膠腫セルラインＧ６１由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。具体的には、Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｌｏｎｅ ”ＩＮＣ１３０２５１６”を用いて以下の４つのプローブを製造した：
（配列番号３）５’−ＡＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＧＧ；
（配列番号４）５’−ＧＡＡＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣ；
（配列番号５）５’−ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＣＡＧＧ； および
（配列番号６）５’−ＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣ。
９個のポジティブを同定し、特徴付けした。３個のクローンは完全コード化領域を含み、配列が同一であった。また、胎児肺ライブラリーから部分的クローンを同定した。これは、コード化されるアミノ酸を変化させない１個のヌクレオチド変化を除いて、神経膠腫由来配列と同一であった。
【０２０３】
実施例２：発現コンストラクト
哺乳類タンパク質の発現のため、完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＣＭＶに基づく発現ベクターにクローン化した。エピトープタグ（ＦＬＡＧ（登録商標）、Ｋｏｄａｋ）およびヒスチジンタグ（Ｈｉｓ８）をこのＯＲＦと終止コドンの間に挿入した。ＶＥＧＦ−Ｅ−Ｈｉｓ８およびＶＥＧＦ−Ｅ−ＦＬＡＧを、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）(Qiagen)によってヒト胎児腎臓２９３細胞にトランスフェクションし、（３５Ｓ）メチオニンおよび（３５Ｃ）システインで３時間パルスラベルした。１５倍濃縮された、血清を含まない条件培地２０μＬを、ドデシル硫酸ナトリウムサンプルバッファー中、ポリアクリルアミドゲル(Novex)上で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）すると、両方のエピトープタグを付されたタンパク質はいっしょに移動した。ＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧ発現プラスミドは、このＯＲＦをヒトＦｃ（ＩｇＧ）配列の前にクローニングすることによって構築した。
このＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧプラスミドを、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（登録商標）ＤＮＡ(Pharmingen)とともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）(GibcoBRL)を用いて、１０％ウシ胎児血清を補った Ｈｉｎｋ’ｓ（登録商標）ＴＮＭ−ＦＨ培地(JRH Biosciences)中で培養された１０５Ｓｆ９細胞中に同時トランスフェクションした。細胞を２８℃で５日間インキュベーションした。上清を回収した後、これを感染多重度（ＭＯＩ）約１０でＳｆ９細胞に感染させることによって最初のウイルス増幅用に用いた。細胞を３日間インキュベーションした後、上清を回収し、上清１ｍＬを Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂビーズ(Pharmacia)３０μＬに結合させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析して組換えプラスミドの発現を測定した。最初の増幅上清を用い、ＥＳＦ−９２１培地(Expression Systems LLC)中で培養されたＳｆ９細胞の攪拌培養物５００ｍＬを感染多重度約０．１で感染させた。回収された上清を滅菌ろ過したことを除いて、上記のように細胞を処理した。特異的タンパク質を Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）(Pharmacia)カラムと結合させて精製した。
【０２０４】
実施例３：ノザンブロット分析
複数の成人および胎児組織および腫瘍セルラインからのヒトポリ（Ａ）＋ＲＮＡのブロットは、Clontech(Palo Alto, CA)から得られたものである。完全コード化領域を含む３２Ｐ−ラベル化プローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６３℃で洗浄した。
ＶＥＧＦ−Ｅ ｍＲＮＡは、胎児肺、腎臓、脳および肝臓、ならびに成人心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓において検出可能であった。またＶＥＧＦ−Ｅ ｍＲＮＡは、Ａ５４９肺腺癌(lung adenocarcinoma)およびＨｅＬａ頸部腺癌(cervical adenocarcinoma)セルラインにおいても見られた。
【０２０５】
実施例４：インシトゥーハイブリダイゼーション
インシトゥーハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内の核酸配列の検出および局在部位決定(localization)に関する強力で用途の広い技術である。これは、例えば遺伝子発現部位を同定し、転写の組織分布を分析し、ウイルス感染を同定し、その局在部位を決定し、特定のｍＲＮＡ合成の変化を追跡し、染色体マッピングを援助するのに有用であり得る。
Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994) のプロトコルの最適化バージョンにしたがい、ＰＣＲ作成３３Ｐラベル化リボプローブを用いてインシトゥーハイブリダイゼーションを行った。簡単には、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されたヒト組織をセクション化し、パラフィン除去し、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍＬ）中、３７℃で１５分間タンパク質除去し、さらに、Lu and Gillett,（上記）に記載のように、インシトゥーハイブリダイゼーション用にプロセッシングする。（以下に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて）９８０ｂｐのＰＣＲ産物から（３３−Ｐ）ＵＴＰラベル化アンチセンスリボプローブを製造し、５５℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。このスライドグラスを ＫＯＤＡＫ ＮＴＢ２（登録商標）核追跡エマルジョン(nuclear track emulsion)中に浸し、４週間暴露した。
【０２０６】
３３Ｐリボプローブ合成
３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２， ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）６．０μＬ（１２５ｍＣｉ）を急速減圧乾燥した。乾燥３３Ｐ−ＵＴＰを含むそれぞれの試験管に以下の成分を加えた：
５×転写バッファー ２．０μＬ
ＤＴＴ（１００ｍＭ） １．０μＬ
ＮＴＰ ｍｉｘ（２．５ｍＭ：１０ｍＭ ＧＴＰ，ＣＴＰおよびＡＴＰ各１０μＬ＋Ｈ２Ｏ １０μＬ） ２．０μＬ
ＵＴＰ（５０μＭ） １．０μＬ
ＲＮＡｓｉｎ １．０μＬ
ＤＮＡ鋳型 １．０μＬ（１μｇ）
Ｈ２Ｏ １．０μＬ
ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ産物に関してＴ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ） １．０μＬ。
【０２０７】
この試験管を３７℃で１時間インキュベーションした。トータルで１．０μＬのＲＱ１ ＤＮアーゼを加えた後、３７℃で１５分間インキュベーションした。トータルで９０μＬのＴＥ（１０ｍＭ トリス ｐＨ７．６／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加え、混合物をＤＥ８１ペーパー上にピペッティングした。残りの溶液をＭＩＣＲＯＣＯＮ−５０（登録商標）限外ろ過ユニットに載せ、プログラム１０を用いて回転させた（６分間）。ろ過ユニットを逆さにして第二の試験管に注ぎ、プログラム２を用いて回転させた（３分間）。最後に回転(spin)させて回収した後、トータル１００μＬのＴＥを加えた。次いで最終産物１μＬをＤＥ８１ペーパー上にピペッティングし、ＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩ（登録商標）６ｍＬ中でカウントした。
このプローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で電気泳動した。トータル１〜３μＬのプローブまたは５μＬのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩをローディングバッファー(loading buffer)３μＬに加えた。９５℃の熱ブロック(heat block)上で３分間加熱した後すぐに、このゲルを氷上に置いた。ゲルのウェルを洗い流し、サンプルを載せ、１８０〜２５０ボルトで４５分間、電気泳動した。このゲルをプラスチックラップ（ＳＡＲＡＮ（登録商標）ブランド）で覆い、ＸＡＲフィルムに暴露し、−７０℃フリーザー内で１時間〜一晩補力スクリニング(intensifying screen)した。
【０２０８】
３３Ｐハイブリダイゼーション
Ａ．凍結セクションの前処理
スライドグラスをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレーに載せ、室温で５分間解凍した。このトレーを５５℃のインキュベーター内に５分間置き、曇り(condensation)を減少させた。このスライドグラスを、換気フード内、氷上の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、室温下の０．５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ ２５ｍＬ＋ｓ．ｃ．Ｈ２Ｏ ９７５ｍＬ）中で５分間洗浄した。０．５μｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ（前もってあたためておいたＲＮＡｓｅを含まないＲＮＡｓｅバッファー２５０ｍＬ中の１０ｍｇ／ｍＬ ストック １２．５μＬ）中、３７℃で１０分間、タンパク質除去を行った後、セクションを０．５×ＳＳＣ中、室温で１０分間洗浄した。このセクションを、７０％、９５％および１００％エタノール中で、それぞれ２分間脱水した。
【０２０９】
Ｂ．パラフィン包埋セクションの前処理
このスライドグラスをパラフィン除去し、ｓ．ｃ．Ｈ２Ｏ中に置き、室温で各５分間、２×ＳＳＣで２回すすいだ。セクションを、ヒト胎児組織用には、２０μｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ中（ＲＮＡｓｅを含まないＲＮＡｓｅバッファー２５０ｍＬ中の１０ｍｇ／ｍＬ ５００μＬ；３７℃、１５分間）、あるいはホルマリン組織用には、８×プロテイナーゼＫ（ＲＮＡｓｅバッファー２５０ｍＬ中の１００μＬ、３７℃、３０分間）中でタンパク質除去した。次いで、上記のように０．５×ＳＳＣ中ですすぎ、脱水した。
【０２１０】
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
このスライドグラスを、Ｂｏｘバッファー（４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で満たされたプラスチックボックスに移した。ろ紙を浸した。この組織を、ハイブリダイゼーションバッファー（硫酸デキストラン３．７５ｇ＋ｓ．ｃ．Ｈ２Ｏ ６ｍＬ）５０μＬで覆い、ボルテックスし、キャップを緩めて電子レンジで２分間加熱した。氷上で冷却した後、ホルムアミド １８．７５ｍＬ、２０×ＳＳＣ ３．７５ｍＬおよびｓ．ｃ．Ｈ２Ｏ ９ｍＬを加え、この組織を十分にボルテックスし、４２℃で１〜４時間インキュベートした。
【０２１１】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
スライドグラス当たり１．０×１０６ｃｐｍプローブおよびｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍＬ ストック）１．０μＬを９５℃で３分間加熱した。このスライドグラスを氷上で冷却し、スライドグラス当たりハイブリダイゼーションバッファー４８μＬを加えた。ボルテックスした後、スライドグラス上のプレハイブリダイゼーション物５０μＬに３３Ｐ ｍｉｘ ５０μＬを加えた。このスライドグラスを５５℃で一晩インキュベートした。
【０２１２】
Ｅ．洗浄
室温で２×１０分間、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡで洗浄し（２０×ＳＳＣ ４００ｍＬ＋０．２５Ｍ ＥＤＴＡ １６ｍＬ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いで３７℃で３０分間ＲＮＡｓｅＡ処理した（ＲＮＡｓｅバッファー ２５０ｍＬ中の１０ｍｇ／ｍＬ ５００μＬ＝２０μｇ／ｍＬ）。このスライドグラスを、室温で２×１０分間、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡで洗浄した。ストリンジェンシーな洗浄条件は以下のものであった：５５℃で２時間、０．１× ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０×ＳＳＣ ２０ｍＬ＋ＥＤＴＡ １６ｍＬ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
【０２１３】
Ｆ．オリゴヌクレオチドプライマー
本明細書中に開示される、ＤＮＡ２９１０１配列に対してインシトゥー分析を行った。これらの分析用のリボプローブを製造するために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは以下のものであった。
Ｐ１： ５’−ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＴＣ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＡＧ （配列番号７）
Ｐ２： ５’−ＣＴＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＧＣＧ ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＣ （配列番号８）。
【０２１４】
Ｇ．結果
インシトゥー分析から得られた結果は次のようであった。
ヒト胎児下肢では、軟骨原基の縁(edge)（すなわち外縁の周り）にある発達中の下肢骨、発達中の腱、血管の平滑筋および、発達中の骨格筋の筋細胞および筋管を含む細胞内でＶＥＧＦ−Ｅの発現が見られた。発現は、骨端成長板でも観察された。ヒト胎児リンパ節では、発達中のリンパ節の辺縁洞(marginal sinus)にＶＥＧＦ−Ｅの発現が見られた。ヒト胎児胸腺では、胸腺皮質の莢膜下領域(subcapsular region)、可能性としては、この領域に見られる莢膜下上皮細胞、または増殖中のダブルネガティブな胸腺細胞で発現が見られた。ヒト胎児脾臓は発現に関してネガティブであった。
気管では、ヒト胎児組織の平滑筋でＶＥＧＦ−Ｅの発現が観察された。ヒト胎児脳（大脳皮質）では、皮質性ニューロン(cortical neurons)に集中してＶＥＧＦ−Ｅの発現が見られた。ヒト胎児脊髄はネガティブであった。ヒト胎児小腸では、平滑筋でＶＥＧＦ−Ｅの発現が見られた。さらに、ヒト胎児甲状腺では、甲状腺上皮全般にわたってＶＥＧＦ−Ｅの発現が見られた。ヒト胎児副腎(adrenal gland)はネガティブであった。肝臓では、ヒト胎児管板細胞(ductal plate cells)でＶＥＧＦ−Ｅの発現が観察され、ならびに、ヒト胎児胃では壁平滑筋で、ヒト胎児皮膚では扁平上皮の基底層で発現が見られた。さらに、ヒト胎児胎盤では栄養膜絨毛内の間質細胞でＶＥＧＦ−Ｅの発現が見られ、ヒト胎児索状組織(cord)では、動脈壁および静脈壁で発現が見られた。
【０２１５】
過排卵させたラット卵巣において試験した場合、すべてのセクション、コントロールおよび過排卵させた卵巣は、アンチセンスおよびセンスプローブの両者に対してネガティブであった。このモデルでは、メッセンジャーが発現されなかったか、あるいはこのヒトプローブはラットと交差反応性でないかである。
さらに以下の部位では、ＶＥＧＦ−Ｅの高度な発現が観察された：
チンパンジー(chimp)卵巣−成熟した濾胞の顆粒膜細胞、包膜細胞(thecal cells)での低い強度のシグナルが観察された。
チンパンジー副甲状腺(parathyroid)−主細胞での高度な発現。
ヒト胎児精巣−発達中の尿細管を取り囲む間質細胞での中程度の発現。
ヒト胎児肺−発達中の気管支の軟骨細胞での高度な発現および、分岐する気管上皮での低レベルの発現。
腎細胞癌、胃癌および大腸癌に対しては特異的な発現が観察されなかった。
【０２１６】
上記実験で試験された胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）には以下のものが含まれる：
胎盤、臍帯(umbilical cord)、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁(body wall)、骨盤および下肢。
上記実験で試験された成人組織には以下のものが含まれる：
肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、小脳（ｒｍ）、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、大腸、大腸癌および軟骨肉腫ならびに、アセトミノフェン(acetominophen)誘導性の肝臓傷害および肝硬変を有する組織。
まとめると、この発現パターンによって、ＶＥＧＦ−Ｅが細胞の分化および／または増殖に関与し得ることが示される。発達中の骨格筋での発現パターンにより、このタンパク質が筋芽細胞の分化および／または増殖に関与し得ることが示される。
【０２１７】
実施例５：筋細胞肥大アッセイ
新生児 Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ラット心室（妊娠２３日）由来の筋細胞を、９６ウェルプレートに７５０００細胞／ｍＬで２回(in duplicate)配置した。細胞を、２０００、２００、２０または２ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧで４８ｈ処理した。筋細胞をクリスタルバイオレットで染色して形態を明視化し、３〜７の尺度で評価した（３は未刺激のものであり、７は完全膨張（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）肥大のものである）。
２０００ｎｇ／ｍＬおよび２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ｅは評価５の肥大を生じさせた。
【０２１８】
実施例６：細胞増殖アッセイ
マウス胎児線維芽細胞Ｃ３ＨｌＯＴ１／２細胞（ＡＴＣＣ）を、５０：５０ Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２：１０％ウシ(calf)胎児血清（ＦＣＳ）を含む低グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞を２４ウェルプレートに１０００、２０００および４０００細胞／ウェルで２回(in duplicate)配置した。４８時間後、２％ＦＣＳを含む培地に細胞を移し、２００、８００または２０００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ−Ｅと、あるいは増殖因子を加えずに、７２時間インキュベーションした。
２００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ−Ｅの存在下では、３つの細胞濃度すべてで、その不存在下と比べて約１．５倍多い数の細胞が測定された。
【０２１９】
実施例７：内皮細胞生存アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Cell Systems）を Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉａ(Cell Systems)中で維持し、４８ウェルプレート中、２００００細胞／ウェルで血清を含まない培地（０．１％ＢＳＡを含む Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉａ、Cell Systems）に３回(in triplicate)配置した。細胞を、２００または４００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧ、１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ−Ｅ、２０ｎｇ／ｍＬ 塩基性ＦＧＦと、あるいは何も添加せずに５日間インキュベーションした。
ＶＥＧＦ−Ｅを加えると、増殖因子を添加しなかった場合と比べて生存率が２〜３倍高くなった。ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦはポジティブコントロールとして加えられたものである。
【０２２０】
実施例８：内皮管(endothelial tube)形成の刺激
このアッセイは Davis and Camarillo, Experimental Cell Research, 224:39-51 (1996) に記載のアッセイにしたがうか、あるいはそれを以下のように修飾して用いた：
プロトコル：ＨＵＶＥＣ細胞（最初からの継代数８以下）を、６×１０５細胞／ｍＬの密度で最終濃度２．６ｍｇ／ｍＬのタイプＩラット尾コラーゲンと混合し、９６ウェルプレートにウェルあたり５０μＬを配置する。このゲルを３７℃で１ｈｒ固化させ、次いで１％ＦＢＳおよびＶＥＧＦ−Ｅサンプルを（それぞれ１％、０．１％および０．０１％希釈で）補ったウェルあたり５０μＬのＭ１９９培養培地を１μＭ ６−ＦＡＭ−ＦＩＴＣ色素とともに加え、空胞(vacuoles)をその形成時に染色する。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８ｈｒインキュベーションし、室温で１０分間、３．７％ホルマリンで固定し、ＰＢＳで５回洗浄し、次いで４℃で一晩、Ｒｈ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色した後、４μＭ ＤＡＰＩで核を染色する。
【０２２１】
１．アポトーシスアッセイ
このアッセイでは、外因性増殖因子（ＰＭＡを含まないＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の存在下において、三次元基質(3-dimensional matrix)中で細胞の生存を促進する因子を同定する。
ポジティブな結果は１であるか、あるいは１以下である。０＝アポトーシスなし、１＝２０％以下の細胞がアポトーシス、２＝５０％以下の細胞がアポトーシス、３＝５０％以上の細胞がアポトーシス。この系におけるアポトーシスの刺激剤はアポトーシス因子であると予想され、阻害剤はアポトーシスを防止または減少させることが予想される。
【０２２２】
２．空胞アッセイ
このアッセイでは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）の存在下における内皮空胞形成および管腔(lumen)形成を刺激する因子を同定する。
ポジティブな結果は２であるか、あるいは２以上である。１＝２０％以下の細胞内に空胞が存在、２＝２０〜５０％の細胞内に空胞が存在、３＝５０％以上の細胞内に空胞が存在。このアッセイは、ピノサイトーシス、イオンポンプ作用、透過性および接合部（junction)形成の刺激に関与する因子を同定するように設計されている。
【０２２３】
３．管形成アッセイ
このアッセイは、三次元基質内における内皮管形成を刺激する因子を同定するためのものである。このアッセイは、外因性増殖因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の存在下、内皮細胞を刺激して、三次元基質内で管様構造に分化させる因子を同定する。
ポジティブな結果は２であるか、あるいは２以上である。１＝細胞はすべて丸型、２＝細胞は伸長、３＝細胞はいくつか連結して管を形成中、４＝細胞は複雑な管状ネットワークを形成中。このアッセイは、トラッキング、走化性または内皮細胞形変化の刺激に関与し得る因子を同定するであろう。
【０２２４】
この結果を図３から図５に示す。図３Ａは増殖因子不存在下でのＨＵＶＥＣ管形成を示す。図３ＢはＶＥＧＦ／ｂＦＧＦおよびＰＭＡ存在下、図３ＣはＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ存在下、図３ＤはＶＥＧＦおよびＰＭＡ存在下、図３ＥはｂＦＧＦおよびＰＭＡ存在下、図３ＦはＶＥＧＦ存在下、図３ＧはｂＦＧＦ存在下、ならびに図３ＨはＰＭＡ存在下でのＨＵＶＥＣ管形成を示す。
図４Ａおよび４Ｂはそれぞれ、ＨＵＶＥＣ管形成に対するＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧ １％希釈物の作用およびバッファーコントロール（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１４Ｍ ＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ６．８）１％希釈物の作用を示す。図５Ａおよび５Ｂはそれぞれ、ＨＵＶＥＣ管形成に対するＶＥＧＦ−Ｅ−ポリ−ｈｉｓ １％希釈物の作用およびＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧ用バッファーコントロール１％希釈物の作用を示す。
この結果により、ＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧおよびＶＥＧＦ−Ｅ−ポリ−ｈｉｓサンプルを用いると、バッファーコントロールの場合より複雑な管形成が生じることをはっきりと示される。
【０２２５】
実施例９：トランスジェニックマウス
皮膚での発現を生じさせるケラチンプロモーター(Xie et al., Nature, 391: 90-92 (1998))の制御下にＶＥＧＦ−ＥをコードするｃＤＮＡを含むマイクロインジェクションに適当なベクターを用い、Ｃ５７Ｂｌ／６／ＳＪＬ Ｆ２マウス胚（ＤＮＡＸ）をマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを作成した。
トランスジェニックイヌは生誕時にはしわがあって、光沢を示し(shiny)、毛が生えるのが遅かった。マウスは齢２週間までにその表現型を喪失した。ヒストパシックな(histopathic)変化は検出できなかった。
【０２２６】
実施例１０：抗体の生産
雌性ニュージーランド白色ウサギ内で、ヒトＶＥＧＦ−Ｅに対するポリクローナル抗血清を作成した。このタンパク質を最初のインジェクション用に Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ 完全アジュバントと、以後すべての追加免疫(boost）用には、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ 不完全アジュバントとホモジナイゼーションした。最初の免疫化および最初の追加免疫に関しては、Bennett et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-23067 (1991)； および Sigel, Sinha and VanderLaan, "Production of Antibodies by Inoculation into Lymph Nodes" in Methods in Enzymology, vol. 93 (New York: Academic Press, 1983) にしたがって、体重１ｋｇあたり３．３μｇを膝窩リンパ節に直接インジェクションした。以後すべての追加免疫に関しては、体重１ｋｇあたり３．３μｇを皮下および筋肉内部位にインジェクションした。インジェクションは３週間毎に行い、各インジェクション後、２週間を経過した時点で採血した。このように得られたポリクローナル抗血清は、免疫沈澱実験によって示されるようにＶＥＧＦ−Ｅと結合する抗体を含んでいた。
【０２２７】
実施例１１：ＶＥＧＦ刺激性内皮細胞（ＡＣＥ細胞）増殖の阻害
（最初の培養物由来、最大１２〜１４継代）ウシ副腎皮質毛細管内皮細胞（ＡＣＥ細胞）を９６ウェルプレートに１００μＬあたり５００細胞／ウェルで配置した。アッセイ培地には、低グルコースＤＭＥＭ、１０％ウシ(calf)血清、２ｍＭ グルタミンおよび１×ペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾン(fungizone)が含まれていた。コントロールウェルには以下のものが含まれていた：（１）ＡＣＥ細胞を添加せず；（２）ＡＣＥ細胞のみ；（３）ＡＣＥ細胞＋５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ；（４）ＡＣＥ細胞＋３ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ；（５）ＡＣＥ細胞＋３ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ＋１ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−ベータ；および（６）ＡＣＥ細胞＋３ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ＋５ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦ。次いで試験サンプル、ポリ−ｈｉｓタグを付されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド（上記実施例に記載されているもの；１００μＬ容量）を（それぞれ１％、０．１％および０．０１％希釈で）ウェルに加えた。この細胞培養物を３７℃／５％ＣＯ２で６〜７日間インキュベーションした。インキュベーション後、ウェル中の培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１×洗浄した。次いで酸ホスファターゼ反応混合物（１００μＬ；０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェイト）を各ウェル加えた。３７℃で２時間インキュベーションした後、１Ｎ ＮａＯＨ １０μＬを加えて、この反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。
ＶＥＧＦ−Ｅの活性を、（ＯＤ４０５ｎｍでの酸ホスファターゼ活性によって測定される、）刺激しない細胞と比較した、ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）刺激性増殖の阻害パーセントとして計算した。ＴＧＦ−ベータは、活性リファレンスとして用いた−ＴＧＦ−ベータは１ｎｇ／ｍＬでＶＥＧＦ刺激性ＡＣＥ細胞増殖の７０〜９０％を遮断する。観察された阻害が＞３０％であった場合、このアッセイの結果は「ポジティブ」であると判断される。
最初のアッセイ実行では、ＶＥＧＦ−Ｅは、１％、０．１％および０．０１％希釈物で、それぞれ５２％、９０％および９６％阻害を示した。２回目のアッセイ実行では、ＶＥＧＦ−Ｅは、１％、０．１％および０．０１％希釈物で、それぞれ５７％、９３％および９１％阻害を示した。
【０２２８】
物質の寄託
以下の物質は the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia USA (ATCC) に寄託された：
材料                          ＡＴＣＣ寄託番号      寄託日
ＤＮＡ２９１０１−１２７２    ２０９６５３          １９９８年３月５日
この寄託は、the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder （ブダペスト条約） の規定下で行われたものである。これは寄託物の生存培養物を、その寄託の日から３０年間維持することを保証する。この寄託物は、ブダペスト条約の条件下、ＡＴＣＣによって利用可能にされ、Genentech, Inc. とＡＴＣＣ間の同意に付され、これにより、いずれが先になるとしても、当米国特許の発行時か、あるいはいずれかの米国または外国特許出願の公開時に、公に対する、寄託物の後代培養物の、恒久的で非制限的な利用可能性が保証され、the U.S. Commissioner of Patents and Trademarks（米国特許および商標庁の長官）によって決定された、３５ ＵＳＣ §１２２およびそれにしたがう長官の規則(the Commissioner's rules)（３７ ＣＦＲ §１．１４、特に８８６ ＯＧ ６３８を含む）により権利を有する者に対する後代の利用可能性が保証される。
本出願の代理人は、この寄託時の物質の培養物が、適当な条件下で培養された場合に、死ぬか、あるいは失われるか、あるいは破壊されたならば、この物質を、通知時において迅速に、別の同物質で置き換えることに同意した。この寄託物質の利用可能性は、いずれかの政府の、その特許法にしたがう権限下に認められた権利に違反して、本発明を実施するためのライセンスとして考えられるべきではない。
【０２２９】
上に記載の明細書は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分であると考える。寄託された態様は、本発明のある側面の１つの例示として意図されるものであるため、本発明は、寄託された構築物によってその範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価なすべての構築物が本発明の範囲内である。本明細書中の物質の寄託は、本明細書中に含まれる記載が、その最良の様式を含む本発明の任意の側面の実施を可能にするのに不十分であることを認めるためのものではなく、また、請求の範囲を、それが代表するような特定の例示に限定するものとして考えられるべきでもない。実際、本明細書中に示され、記載されるものに加えて、当業者には、本発明の種々の修飾が上の記載から明らかであり、このような修飾は添付の請求の範囲に含まれるものである。
【０２３０】
１．  図２のアミノ酸残基１〜３４５（配列番号２）を含む血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
２．  図１のヌクレオチド２５９〜１２９３の配列（配列番号１）またはその相補鎖を含む、請求項１に記載の核酸。
３．  ストリンジェンシーな条件下で、請求項１に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
４．  請求項１に記載の核酸を含むベクター。
５．  請求項１に記載の核酸を含む宿主細胞。
６．  チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、大腸菌細胞または酵母細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
７．  バキュロウイルス感染昆虫細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
８．  請求項５に記載の宿主細胞をＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの発現に適当な条件下で培養し、細胞培養物からＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを回収することを含む、血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドの製造方法。
９．  請求項８に記載の方法によって製造されたポリペプチド。
１０．図２のアミノ酸残基１〜３４５（配列番号２）を含むＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド。
１１．（ａ）図２のアミノ酸残基１〜３４５（配列番号２）を含むポリペプチドおよび（ｂ）生物学的に活性な（ａ）のポリペプチド断片からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド。
１２．ＡＴＣＣ寄託番号第２０９６５３号のヌクレオチド配列挿入物によってコードされるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド。
１３．異種アミノ酸配列と融合された請求項１０に記載のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。
１４．異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
１５．担体とともに請求項１０に記載のポリペプチドを含む組成物。
１６．担体が製薬的に許容される担体であり、治療有効量の該ポリペプチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
１７．（ａ）請求項１５に記載の組成物；
（ｂ）該組成物を含む容器；および、
（ｃ）心臓血管障害または内皮障害の処置におけるＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの使用に言及する、該容器に貼られたラベルまたは医薬品に含まれるパッケージ内の印刷物を含む医薬品。
１８．哺乳類の心臓血管障害または内皮障害の処置方法であって、請求項１５に記載の組成物の有効量を該哺乳類に投与することを含む方法。
１９．障害が心臓肥大、外傷または骨関連障害である、請求項１８に記載の方法。
２０．心臓肥大が高レベルのＰＧＦ２αの存在を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
２１．心臓肥大が心筋梗塞によって誘導されたものである、請求項１９に記載の方法。
２２．心筋梗塞後、４８時間以内にＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの投与を開始する、請求項２１に記載の方法。
２３．（ａ）宿主由来のサンプルからＶＥＧＦ−Ｅをコードする核酸配列を単離し；
（ｂ）ＶＥＧＦ−Ｅをコードする核酸配列中の突然変異を測定することを含む、血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）をコードする核酸配列の突然変異に関係する疾患または疾患に対する罹患しやすさの診断方法。
２４．（ａ）哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプル中、および（ｂ）同細胞タイプの既知の正常組織細胞のコントロールサンプル中の、血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出し、試験サンプル中の発現レベルがコントロールより高いか、あるいは低ければ、該試験組織細胞の供給元の哺乳類が心臓血管機能不全または内皮機能不全を有していることが示されることを含む、哺乳類の心臓血管障害および内皮障害の診断方法。
２５．血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、
（ａ）該ポリペプチドが細胞の増殖を刺激可能な条件下で細胞と候補化合物を接触させ；
（ｂ）この化合物によって細胞の増殖が阻害された程度を測定することを含む方法。
２６．請求項２５の方法によって同定されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドに対するアゴニスト。
２７．血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドの発現または活性を阻害する化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物が該ポリペプチドと相互作用するのに十分な条件および時間で、候補化合物を該ポリペプチドと接触させ；
（ｂ）この化合物が該ポリペプチドと相互作用する程度を測定することを含む方法。
２８．請求項２７に記載の方法によって同定された化合物。
２９．血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドと結合する、単離された抗体。
３０．モノクローナル抗体である、請求項２９に記載の抗体。
３１．ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを含有する可能性がある細胞を、請求項２９に記載の抗体に暴露し、この細胞と抗体の結合を測定することを含む、血管内皮細胞増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）ポリペプチドの存在を測定する方法。
３２．（ａ）請求項２９に記載の抗体を哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプルと接触させ、（ｂ）試験サンプル中の抗ＶＥＧＦ−Ｅ抗体とＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド間の複合体形成を検出することを含む、哺乳類の心臓血管障害、内皮障害または血管新生障害の診断方法。
３３．容器；
容器のラベル；および、
容器内に含まれる、請求項２９に記載の抗体を含む組成物を含む製品（容器のラベルは、治療的または診断的方法における該抗体の使用に関する説明を示す）。
【図１】
2010001292.tif 000002
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2010001292000001.app
【外国語明細書】
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