(57)【要約】      （修正有）【課題】血液より核酸を抽出する方法の提供。【解決手段】血液細胞（好ましくは、溶解後）をあるｐＨで活性化固相と接触し核酸を固定化する工程、次に、電荷が反転または中性化した場合により高いｐＨにおいて核酸を取り除く工程を包含する、血液より核酸を抽出する方法。この固相は、結合剤としてヒスチジンによって活性化されるガラスビーズであり得る。このビーズは、ビーズを含むカラムを通して空気で血液を吸引することによって流動し得、接触を改善し、かつ詰まりを防ぐ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料由来の生体分子の抽出のための方法であって、ここで該方法は、第１のｐＨにおいて該生体分子を固相に結合し得る該固相と該生物学的材料を接触する工程、次いで第２のｐＨにおいて溶出溶媒を使用する溶出によって、該固相に結合する該生体分子を抽出する工程、を包含する方法。
【請求項２】
前記生体分子が核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的材料が血液である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体分子が、前記ＤＮＡを前記固相に結合するために６未満のｐＨにおいて該固相に接触し、そして該ＤＮＡが８より大きいｐＨにおいて該固相から放出される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子が、前記ＤＮＡを前記固相に結合するために実質的に中性ｐＨにおいて該固相に接触し、そして該ＤＮＡが１０より大きいｐＨにおいて該固相から放出される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項６】
前記血液中の細胞が溶解されて核酸を放出する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、イオン性界面活性剤もしくは非イオン性界面活性剤、塩の低張溶液、タンパク質分解酵素、カオトロピック剤と接触することによってか、またはｐＨ変化もしくは熱を使用することによって溶解される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血液が、処理および注入をより容易にするために、水または他の希釈剤で希釈される、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１０倍までの希釈が使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的材料が接触される前記固相が、核酸に対する天然の親和性を有する材料から形成される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的材料が接触される前記固相が、核酸を該固相に結合させる薬剤か、または核酸に対する該固相の親和性を増大する薬剤で処理された表面を有する材料から形成される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体材料の前記表面が、前記固相上に正電荷または親水性表面もしくは疎水性表面を導入し得る物質で処理される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記使用される結合剤が、正に荷電された固相のｐＫａを越えるかまたは下まわるようにｐＨを変化することによって反転または中性化され得る、該正に荷電された固相を使用する荷電が切替え可能なイオン交換樹脂である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合剤がヌクレオチド、ポリアミン、またはイミダゾール部分を含む化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸が前記固相内に取り込まれるインターカレーティング化合物を使用するインターカレーションによって結合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記色素がアクチノマイシンＤまたはエチジウムブロマイドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記固体材料の表面がヒスチジンまたはポリヒスチジンで処理される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記固相が、制御された細孔のガラス、ポリサッカライド、セラミック材料または多孔性のプラスチック材料である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固相が、ポリスチレンのビーズまたは常磁性材料のビーズを含有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記固相が、官能基を含むために修飾されたプラスチック表面を含有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プラスチックがポリプロピレンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリプロピレン表面が、カルボキシル化された表面を作製するために酸化剤を用いて該表面を酸化することによって修飾される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルボキシル基が、イミダゾールもしくはポリヒスチジンまたは任意の強イオン交換体もしくは弱イオン交換体のようなアニオン基と共有結合的にカップリングすることによってさらに修飾され、電荷相互作用による核酸の結合を可能にする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記官能基が、前記核酸を結合するように正または負に荷電される、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記官能基が、他のリガンドまたはポリマーに対して共有結合的にカップリング可能な化学基である、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記固体材料が、単一に成形された部分であるか、または容器中の挿入物である多孔性のプラスチックプラグである、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プラスチックがプラスチック成形物中にある、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記固体材料がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）チューブである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固体材料が深いウェルのプレートである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記チューブまたは前記ウェルを使用して、少量のＤＮＡまたはＲＮＡを単離および固定化し、それに続くＰＣＲまたは他の遺伝子的分析および操作のための純粋な鋳型を生成する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記固相が顆粒状の固体材料を含有し、該固体材料が混合/撹拌デバイス中で該固体材料と混合されるか、該固相上を血液サンプルを通過させるか、あるいは該固相が磁性化支持体上で操作され、該血液サンプルと接触される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記容器が多重ウェルプレート中のウェルであり、そして異なるサンプル由来のＤＮＡの一連の抽出が実質的に同時に行われる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記固相がカラム中で顆粒状形態であり、そして前記血液サンプルが該カラムを通して適用される圧力差によって該カラムを通して吸い上げられる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記血液サンプルが、空気を用いて吸い上げられ、そして前記顆粒状固体材料が流動化されるようになる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体分子が、低塩緩衝溶液または水を用いた溶出によって取り除かれる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的材料、特に血液から、核酸および他の生体分子を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一連の目的のためのＤＮＡ分析に対する非常に大きな需要があり、そしてこのことは、ＤＮＡおよび他の核酸の単離および精製に対する、迅速で、安全で、高い処理能力のある方法に対する要求をもたらしている。
【０００３】
ＤＮＡの同定または分析において使用されるサンプルは、生物学的材料（例えば、動物細胞および植物細胞）、糞便、組織などのような広範囲な供給源から採取され得、またサンプルは、土壌、食品、水などからも、採取され得る。
【０００４】
既存のＤＮＡの抽出方法には、フェノール／クロロホルムの使用、塩析、カオトロピック塩およびシリカ樹脂の使用、アフィニティー樹脂の使用、イオン交換クロマトグラフィーならびに磁気ビーズの使用が挙げられる。複数の方法は、米国特許第５，０５７，４２６号(特許文献１)、同第４，９２３，９７８号(特許文献２)、欧州特許第０，５１２，７６７号、  Ａ１号(特許文献３)および欧州特許第０，５１５，４８４Ｂ号(特許文献４)ならびにＷＯ  ９５/１３３６８号(特許文献５)、ＷＯ  ９７/１０３３１号(特許文献６)およびＷＯ ９６/１８７３１号(特許文献７)に記載される。これらの特許および特許出願は、核酸を固体支持体上に吸着し、次いで核酸を単離する方法を開示する。この以前に使用された方法は、核酸を単離するためにいくつかの型の溶媒を使用し、そしてこれらの溶媒は、引火性、可燃性または毒性である。
【０００５】
血液は、血液サンプルが広範囲な理由のために慣習的に得られるので、ＤＮＡ分析に対する最も豊富なサンプル供給源の１つである。しかし、公知のＤＮＡ抽出方法に使用される血液の粘稠性質およびタンパク様性質のために、比較的少量のＤＮＡを含む大容量を取り扱う困難さに起因して、自動操作の使用を達成することは困難であることが判明している。これまで核酸の抽出は、危険な試薬の使用によってのみ部分的に自動化され、そしてゆっくりとしたプロセス時間であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，０５７，４２６号
【特許文献２】米国特許第４，９２３，９７８号
【特許文献３】欧州特許第０，５１２，７６７Ａ１号
【特許文献４】欧州特許第０，５１５，４８４Ｂ号
【特許文献５】ＷＯ  ９５/１３３６８号
【特許文献６】ＷＯ  ９７/１０３３１号
【特許文献７】ＷＯ  ９６/１８７３１号
【発明の概要】
【０００７】
本発明者は、今や、血液および他の生物学的材料由来の核酸および他の生体分子の抽出のための改良された方法を発明した。
【０００８】
本発明に従って、生物学的材料由来の生体分子の抽出方法を提供する。この方法は、第１のｐＨにおいて固相に生体分子が結合し得る固相に、生物学的材料を接触させる工程、次いで第２のｐＨにおいて溶出溶媒を使用する溶出によって、固相に結合する生体分子を抽出する工程を包含する。
【０００９】
この方法は、特に生物学的材料が血液である場合に有用であるが、しかしこの方法は、プラスミドおよびベクターの単離および植物ＤＮＡの抽出のような一連の適用材料について使用され得る。
【００１０】
好ましくは、血液中の細胞は、核酸を放出するために溶解され、そして公知の溶解剤および方法、例えば、イオン性および非イオン性界面活性剤、低浸透圧性溶液の塩、タンパク質分解酵素、カオトロピック剤、溶媒との接触、ｐＨ変化または熱の使用、が用いられ得る。核酸を単離するために細胞を溶解する方法は、ＷＯ  ９６/００２２８号に記載される。
【００１１】
生物学的材料が血液からなる場合、このサンプルは、操作および処理をより容易にするために、必要に応じて水または他の希釈液で希釈され得る。
【００１２】
１０倍までの希釈が使用され得、そして一般には、それ以上の希釈がより良好であり得、そして血液の少ない希釈を可能とさせることが、本発明の特徴である。
【００１３】
血液が接触する固相は、核酸に対して天然の親和性を有する材料から形成され得るか、あるいは、核酸を固相に結合させるか、または核酸に対する親和性を増加させる薬剤で処理された固相表面を有する材料から形成され得る。適切な材料には、制御された細孔ガラス、ポリサッカライド（アガロースまたはセルロース）、他の型のシリカ／ガラス、セラミック材料、多孔性のプラスチック材料（例えば、単一の成形部分中の多孔性のプラスチックプラグまたは標準的なチューブ中への挿入物）、ポリスチレンビーズ、常磁性ビーズなどが挙げられる。この大きさおよび多孔度は重要ではなく、そして変化し得、そして特定の適用について選択され得る。
【００１４】
固相の表面を処理するため、または誘導化するための適切な手段には、例えば、表面上に正電荷のような電荷を、または固相上に親水性もしくは疎水性表面（例えば、ヒドロキシル基、硝酸基、自己反応性基、色素、および他の芳香族化合物）を導入し得る材料でそれを処理することが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、固相は、あるｐＨにおいて血液サンプル中の混入物よりはむしろＤＮＡを固相に結合させ、そして異なるｐＨにおいて溶出剤と接触される場合に、結合された核酸を放出することを可能にする。この系は、ヒスチジンまたはポリヒスチジン（これは低いｐＨ（例えば、６より小さい）で核酸に結合する傾向にあり、次いでｐＨが増大する場合（例えば８より大きい）、結合した核酸を放出する）を組み込む固相を用いて使用され得る。あるいは、核酸は、実質的に中性ｐＨにおいてアミノ化された表面で結合し、そして非常に高いｐＨにて放出される。
【００１６】
本発明の別の実施態様において、プラスチック成形は、結合剤（例えば、プレート中のウェルなどにおいて）を組み込み得る。その結果、この結合剤は、その表面に組み込まれ、 次いで血液サンプルを、核酸が表面に結合されるように表面に接触する。次いで、この血液サンプルが除去され、そしてこの表面は、結合した核酸を放出するために溶出剤で処理される。表面が多重ウェルプレート中のウェルの一部である場合、この全体の系は、容易に迅速な大量サンプリングおよび抽出技術に適合し得る。
【００１７】
使用され得る結合剤は、可逆的であり得、結合剤のｐＫａを越えるｐＨに変化することによって反転され得るか、または中性になり得る正に荷電した固相（例えば、適切なｐＫａ値を有するヌクレオチド、ポリアミン、イミダゾール基および他の同様な試薬）を使用する、電荷が切替え可能なイオン交換樹脂を含む。
【００１８】
また、核酸は、固相内に組み込まれる多種のインターカレーティング化合物（例えば、アクチノマイシンＤ、エチジウムブロマイドなど）を使用するインターカレーションによっても結合され得る。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様において、プラスチック表面は、官能基を含むように修飾され得る。このプラスチックは、サンプルを含むために使用される任意のプラスチック（例えば、ポリプロピレン）であり得る。この官能基は、適切な緩衝液中で核酸に結合するように正または負に荷電され得る。
【００２０】
あるいは、この官能基は、他のリガンドまたはポリマーに共有結合的にカップリングする能力を有する化学基であり得る。
【００２１】
プラスチックが、プラスチック成形（例えば、プレート中のウェルにおいて）において、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）チューブとして使用される場合、このプラスチックの表面の特徴は、成形化合物（例えば、注入成形化合物中のように）中に適切な化学物質を含めることによって、または添加することによって、本発明において使用するために適切に修飾され得る。
【００２２】
これが、ＰＣＲチューブ中で、または深いウェルのプレート中で使用される場合、このチューブまたはウェルを使用して、少量のＤＮＡまたはＲＮＡを単離および固定化し得、それに続くＰＣＲまたは他の遺伝子の分析および操作のための純粋な鋳型を生成し得る。
【００２３】
プラスチックがポリプロピレン（例えば、それは薄壁のＰＣＲチューブの形態である）である場合、このポリプロピレン表面は、酸化剤（例えば、過マンガン酸カリウムおよび硫酸）を用いてこの表面を酸化することによって修飾して、カルボキシル化された表面（ＣＯＯＨ基）を生成し得る。次いで、このチューブを使用して、溶液からまたは粗サンプル（例えば、血液）からのＤＮＡの単離を改良し得る。ｐＨ、誘電率、溶解度またはイオン強度を調整することによって、このＤＮＡまたはＲＮＡは、チューブの壁面に固定化され、混入物を洗浄して除去し、ＰＣＲまたは他の分析技術について使用可能となり得る。
【００２４】
このカルボキシ基は、アニオン基（例えば、イミダゾールまたはポリヒスチジンあるいは任意の強イオン交換体もしくは弱イオン交換体）を共有結合的にカップリングすることによってさらに修飾され得、電荷相互作用によって核酸の結合を可能にする。次いで、このチューブを使用して、溶液からまたは粗サンプル（例えば、血液）からのＤＮＡの単離を改良し得る。ｐＨ、誘電率、またはイオン強度を再び調整することによって、このＤＮＡまたはＲＮＡは、チューブの壁面に固定化され、混入物を洗浄して除去し、ＰＣＲまたは他の分析技術について使用可能となり得る。
【００２５】
この核酸は、低塩緩衝液中で溶出され得、その結果、ＰＣＲまたは他の分析について使用可能である。
【００２６】
この固相は、混合／撹拌装置中で固相と混合することによるか、固相上を血液サンプルを通過することによるか、あるいは固相が常磁性であり、磁場によって操作され得、血液サンプルに接触され得る。本発明は、特に血液由来の核酸の分離または単離について適切であるが、これは、特に細胞壁の細片または不溶性粒子の除去が必要である一連の生体分子とともに使用され得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様において、この固相は、カラム中で顆粒状の形態であり、そしてこの血液サンプルは、カラムを通して適用される圧力差によって、カラムを通して吸い上げられる。この血液サンプルは、空気で吸い上げられ、そして顆粒状固体材料が流動化されるようになり得、従って混合および接触速度が増大し、そして目詰まりを最小にする。
【００２８】
本発明の方法は、一連の異なるサンプルからの抽出が、実質的に同時に行われ得る場合、多重ウェル形式における使用において適切であり、そしてこのことは、迅速な高処理能力の抽出を行うことを可能にする抽出過程の自動化を容易にし、そしてコンビナトリアル化学の実行を可能にする。これは、標準的なウェル配列において高処理能力を有することを可能にし（例えば、８×１２配列）、その結果、多数のサンプル型が、同時に自動的に処理され得る。
【実施例】
【００２９】
本発明は、実施例において記載される。
【００３０】
（実施例１）
（全血由来の核酸の抽出）
電荷が切替え可能なイオン交換体を、１グラムのアミノ化されたガラスビーズを２０ｍｇのポリヒスチジンを含む０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８）中の０．０１％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドと混合することによる、グルタルアルデヒドを使用する１００（ｍ  ガラスビーズとのポリヒスチジンの共有結合的カップリングによって、調製した。一晩インキュベート後、このビーズを徹底的に洗浄して非共有的に結合した材料を除去し、そして０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５）中で保存した。
【００３１】
約３００ｍｇの１００（ｍ  誘導体化ガラスビーズを、両端で閉じられた１ｍｌのプラスチックカラムに添加した。
【００３２】
血液サンプルを、等量の１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５）（１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、タンパク質分解酵素（２００（ｇ／ｍｌ）および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む)とインキュベートした。消化が完了した後、この血液をガラスビーズを含むカラムに吸い上げて、ＤＮＡを固定化した。この工程は、混入するタンパク質が廃液に素通りすることを可能にした。
【００３３】
固定化されたＤＮＡを含むガラスビーズを、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５（１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む)を含む緩衝液で洗浄し、そしてこれを洗浄溶液が無色になるまで繰り返した。
【００３４】
洗浄後、このビーズを風乾し、そしてＤＮＡを少量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．５で溶出し、そして分析に使用可能に滅菌チューブ中に回収した。従って、このＤＮＡを、血液から分離した。
【００３５】
異なる生体分子について、緩衝液などを適切に変更し得る。
【００３６】
（実施例２）
１グラムのカルボキシル化された常磁性ビーズを、５０ｍＭ  イミダゾール緩衝液（ｐＨ６）中で洗浄し、次いで５０ｍｌの５０ｍＭ  イミダゾール緩衝液（ｐＨ６）中の１００ｍｇのポリヒスチジンと混合した。化学的カップリング剤（ＥＤＣ）を最終濃度を５ｍｇ／ｍｌとして添加し、そして一晩混合した。このビーズを水、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄し、そして１０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５）中で保存した。
【００３７】
血液由来のＤＮＡの抽出のために、１ｍｇのビーズを２５ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを有する１０％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５）中で希釈された血液と混合した。このビーズを、磁石で分離し、そして１ｍＭ  ＭＥＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で再懸濁することによって洗浄した。ＤＮＡを溶出するために、このビーズを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で再懸濁し、そして溶液中のＤＮＡを残すように、磁石を用いて分離した。