(57)【要約】【課題】試料中に含まれる基質濃度によって検量範囲を所望の範囲に設計することができ、かつ、所望の範囲で精度よく基質濃度を測定する。【解決手段】バイオセンサ１は、絶縁性基板１０と、作用極１０２と、作用極１０２とは異なる作用極２０２と、を含む電極系５０と、絶縁性基板１０に設けられ、試料が導入される濃度測定領域と、を有する。濃度測定領域は、相対的に低い基質濃度を測定する反応セル２１と、相対的に高い基質濃度を測定する反応セル１１と、からなる。反応セル２１には、反応層２０３が作用極２０２に接するように設けられている。反応セル１１には、反応層１０３とは異なる反応層１０３が作用極１０２に接するように設けられている。反応層２０３は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含んでいる。反応層１０３は、第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、反応層２０３に含まれる酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含んでいる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサであって、
基板と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系と、
前記基板に設けられ、前記試料が導入される濃度測定領域と、
を有し、
前記濃度測定領域は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層が前記第一作用極に接するように設けられており、
前記第二測定領域には、第二反応層が前記第二作用極と接するように設けられており、
前記第一反応層は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含み、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含むことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記第一または／および前記第二電子受容体の酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記第一電子受容体は、１，１'−ジメチルフェロセン、フェロセン酢酸、ヒドロキシエトキシテトラシアノキノジメタン、および、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記第二電子受容体は、テトラチオフルバレン、フェロセニルトリメチルアンモニウム、および、テトラシアノキノジメタンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記電極系は、対極と参照極とをさらに有し、
前記第一測定領域において、前記第一反応層が前記対極および前記参照極のそれぞれに接しており、
前記第二測定領域において、前記第二反応層が前記対極および前記参照極のそれぞれに接していることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記電極系は、
第一対極と、
前記第一対極とは異なる第二対極と、
参照極と、
をさらに有し、
前記第一測定領域において、前記第一反応層が前記第一対極および前記参照極のそれぞれに接しており、
前記第二測定領域において、前記第二反応層が前記第二対極および前記参照極のそれぞれに接していることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記電極系は、対極と参照極とをさらに有し、
前記対極および前記参照極はいずれも前記第一反応層に接しておらず、かつ、前記対極および前記参照極はいずれも前記第二反応層に接していないことを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記電極系を覆う絶縁膜と、
前記第一反応層が露出している第一開口部と、
前記第二反応層が露出している第二開口部と、
をさらに有し、
前記絶縁膜を介して前記第一開口部と前記第二開口部とが分離されていることを特徴とする請求項５または６に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記第一測定領域および前記第二測定領域にわたって取り付けられている取り外し可能な蓋部材を前記基板にさらに有し、
前記蓋部材は、
前記試料を導入する試料導入口と、
前記第一測定領域および前記第二測定領域のそれぞれに前記試料を導く流路と、
前記流路に設けられる少なくとも二つの空気孔と、
を形成し、
前記空気孔は、前記第一測定領域側と前記第二測定領域側にそれぞれ形成されることを特徴とする請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記第一電子受容体が前記第二測定領域の前記電極に固定化されていることを特徴する請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記第一および／または前記第二反応層が、シクロデキストリンを含むことを特徴とする請求項１乃至１０いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記第一および／または前記第二反応層が、トレハロース、スクロース、ラフィノース、アルギニン、および、グルコサミンからなる群から選択される安定化剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１１いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記第一および／または第二反応層に界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１２いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記界面活性剤は、トライトンＸ−１００（登録商標）、ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルホン酸、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、および、ポリアクリル酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記酸化還元酵素は、グルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素であることを特徴とする請求項１乃至１４いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記試料が尿であることを特徴する請求項１乃至１５いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサの製造方法であって、
基板を用意する工程と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系を形成する工程と、
前記基板に、前記試料が導入される濃度測定領域を設ける工程と、
を有し、
前記濃度測定領域を設ける工程は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域を形成する工程と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域を形成する工程と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層を前記第一作用極に接するように形成し、
前記第二測定領域には、第二反応層を前記第二作用極と接するように形成し、
前記第一反応層に、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含ませ、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含ませることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１６いずれかに記載のバイオセンサの使用方法であって、
前記第一反応層および前記第二反応層にそれぞれ試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と酸化還元酵素とを反応させるステップと、
前記第二反応層で反応した前記酸化還元酵素と前記第二反応層の電子受容体とを反応させるステップと、
前記第一反応層が設けられた第一測定領域で発生する電流と前記第二反応層が設けられた第二測定領域で発生する電流とをそれぞれ測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法。
【請求項１９】
０〜５ｇ／ｄｌの範囲の基質濃度を定量することを特徴とする請求項１８に記載のバイオセンサの使用方法。
【請求項２０】
前記第二測定領域において、０．２〜５ｇ／ｄｌの基質濃度を定量することを特徴とする請求項１８または１９に記載のバイオセンサの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサ、その製造方法、その使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のバイオセンサとしては、例えば特許文献１〜４に記載されたものがある。
【０００３】
特許文献１では、グルコースを含有する試料をグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウムと接触させる電流滴定バイオセンサーシステムを開示している。
【０００４】
特許文献２には、電極上にフェロセン化合物を含有する光硬化性樹脂膜と順次作用する作用極を備えたグルコースセンサが開示されている。
【０００５】
特許文献３には、電極上にフェロセン化合物を蒸着させた層と、蒸着層上にＧＯＤを固定化した層とを有する作用極を備えたグルコースセンサが開示されている。
【０００６】
特許文献４には、作用極上にＧＯＤとフェロセン化合物とを担持した識別層と作用極付近の温度を所定温度に維持する温度維持手段とを備えたグルコースセンサが開示されている。
【０００７】
特許文献１乃至４に記載のグルコースセンサによってグルコースを測定するメカニズムは以下のとおりである。
【０００８】
すなわち、グルコース１分子がＧＯＤによって酸化されるのに、２電子の作用極への移動がおこなわれる。そこで、これを電流値として検出する。この際、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウムやフェロセン化合物が電子受容体として機能する。
【特許文献１】国際公開第８６／０７６３２号パンフレット
【特許文献２】特開平０２−２４０５５５号公報
【特許文献３】特開平０２−９９８５１号公報
【特許文献４】特開平０５−２５６８１２号公報
【特許文献５】特開平０９−２１０９４８号公報
【特許文献６】特開平０９−１５９６４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、広範囲の基質濃度を精度よく測定することが難しかった。
【００１０】
たとえば、酸化還元酵素としてＧＯＤを用いるグルコースセンサの場合、特許文献５に開示されているように、グルコースがＧＯＤの作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生する過酸化水素を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定する。こうすることにより、グルコース濃度を間接的に求めることができる。しかしながら、測定液が水で希釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素濃度に律速される。そのため、グルコース濃度が約１００ｍｇ／ｄｌ程度迄しか直線検量範囲を示さないという問題があった。
【００１１】
そこで、特許文献５では、溶液中濃度が有限である酸素の代わりに、フェロシアン化カリウムやパラベンゾキノン等の電子受容体をＧＯＤ等と共に用いることで、検量範囲を１０００ｍｇ／ｄＬまで拡大させている。しかしながら、電子受容体の測定電位が＋０．６Ｖと高いため、干渉物質の影響を受けやすいという問題がある。
【００１２】
また、特許文献６では、ＧＯＤを光架橋樹脂膜に包括固定化させるという構成をとることによって、検量範囲を２０００ｍｇ／ｄＬまで拡大させている。しかしながら、特許文献６では、電子受容体を用いていないため、上記説明したように、溶存酸素量に依存してしまうという問題がある。
【００１３】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、試料中に含まれる基質濃度の検量範囲を広範囲に設計することができ、かつ、精度よく基質濃度を測定することを可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサであって、
基板と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系と、
前記基板に設けられ、前記試料が導入される濃度測定領域と、
を有し、
前記濃度測定領域は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層が前記第一作用極に接するように設けられており、
前記第二測定領域には、第二反応層が前記第二作用極と接するように設けられており、
前記第一反応層は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含み、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含むことを特徴とするバイオセンサ
が提供される。
【００１５】
また、本発明によれば、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサの製造方法であって、
基板を用意する工程と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系を形成する工程と、
前記基板に、前記試料が導入される濃度測定領域を設ける工程と、
を有し、
前記濃度測定領域を設ける工程は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域を形成する工程と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域を形成する工程と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層を前記第一作用極に接するように形成し、
前記第二測定領域には、第二反応層を前記第二作用極と接するように形成し、
前記第一反応層に、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含ませ、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含ませることを特徴とするバイオセンサの製造方法
が提供される。
【００１６】
さらに本発明によれば、上記のバイオセンサの使用方法であって、
前記第一反応層および前記第二反応層にそれぞれ試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と酸化還元酵素とを反応させるステップと、
前記第二反応層で反応した前記酸化還元酵素と前記第二反応層の電子受容体とを反応させるステップと、
前記第一反応層が設けられた第一測定領域で発生する電流と前記第二反応層が設けられた第二測定領域で発生する電流とをそれぞれ測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法
が提供される。
【００１７】
この発明によれば、第一反応層と第二反応層とが互いに同一の酸化還元酵素を含み、互いに異なる電子受容体を含んでいる。これにより、試料中の同一の基質と反応した酸化還元酵素が特性の異なる電子受容体と反応することができる。したがって、酸化還元酵素に対する電子受容体の反応速度の違いによって、第一測定領域では相対的に低濃度範囲の基質濃度を定量し、第二測定領域では相対的に高濃度範囲の基質濃度を定量することができる。よって、所望の検量範囲を有する電子受容体を適宜選択することで、バイオセンサの検量範囲を使用目的に併せて任意に設計することができ、検量範囲を拡大して精度よく基質濃度を測定することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、試料中に含まれる基質濃度の範囲によって所望の検量範囲を設計することができ、検量範囲を拡大して精度よく基質濃度を測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２０】
図１は、本実施形態のバイオセンサ１を示す図である。図１（ａ）はバイオセンサ１の平面図である。図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図１（ｃ）は図１（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。バイオセンサ１は、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定する。
【００２１】
図１で示すように、バイオセンサ１は、絶縁性基板１０と、作用極１０２（第二作用極）と、作用極１０２とは異なる作用極２０２（第一作用極）と、を含む電極系５０と、絶縁性基板１０に設けられ、試料が導入される濃度測定領域と、を有する。濃度測定領域は、相対的に低い基質濃度を測定する反応セル（第一測定領域）２１と、相対的に高い基質濃度を測定する反応セル（第二測定領域）１１と、からなる。反応セル２１には、反応層（第一反応層）２０３が作用極２０２に接するように設けられている。反応セル１１には、反応層１０３（第二反応層）が作用極１０２に接するように設けられている。反応層２０３は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含んでいる。反応層１０３は、第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、反応層２０３に含まれる酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含んでいる。
【００２２】
絶縁性基板１０には、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料を使用することができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド及びポリカーボネードなどの合成樹脂板を用いることができる。
【００２３】
絶縁性基板１０には対極３０１および参照極３０２が設けられている。このような三極式を採用することにより、安定した応答電流が得られ、測定精度を安定化させることができる。作用極１０２、２０２、対極３０１および参照極３０２は、導電性材料を用いて形成させることができる。導電性材料とは、炭素、またはパラジウム、銀、白金、金、銅、ニッケル、これらの合金等の金属材料である。作用極１０２、２０２、対極３０１および参照極３０２は、１種の導電性材料により形成させてもよいし、２種以上の導電性材料により形成させてもよい。これにより、安定した応答電流が得られ、精度がさらに安定化する。作用極１０２、２０２、対極３０１および参照極３０２は、スクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法により絶縁性基板１０に塗布することにより形成させることができる。
【００２４】
反応セル２１において、反応層２０３は、対極３０１および参照極３０２のそれぞれに接している。一方、反応セル１１において、反応層１０３は対極３０１および参照極３０２のそれぞれに接している。
【００２５】
バイオセンサ１は、電極系５０を覆う絶縁膜３０と、反応層２０３が露出している第一開口部と、反応層１０３が露出している第二開口部と、をさらに有している。第一開口部は反応セル２１に設けられ、第二開口部は反応セル１１に設けられている。図１（ｂ）で示すように、反応層１０３は絶縁膜３０で覆われていない。また、図１（ｃ）で示すように、反応層２０３は絶縁膜３０に覆われていない。図１（ａ）で示すように、絶縁膜３０を介して第一開口部と第二開口部とが分離されている。
【００２６】
反応層１０３、２０３は、少なくとも１種の酸化還元酵素を含有する。
【００２７】
酸化還元酵素は、測定対象となる様々な基質と反応して酸化または還元される。酸化された酵素が再び還元され、または、還元された酵素が再び酸化されるとき、生じる電流の変化を検出することで基質濃度を測定することができる。
【００２８】
たとえば、酸化還元酵素には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。また、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）、およびこれらの組合せを用いることができる。
【００２９】
バイオセンサ１をグルコースセンサとする場合、酸化還元酵素として、ＧＯＤまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。
【００３０】
（反応式１）
グルコース  ＋  ＧＯＤ（酸化体）  →  グルコン酸  ＋  ＧＯＤ（還元体）
【００３１】
反応式１で示すように、測定試料中のグルコースは、ＧＯＤの触媒反応によりＧＯＤを還元させることで、グルコースがグルコン酸に酸化される。そして反応セル２１では、作用極２０２に電圧が印加されることで、ＧＯＤ（還元体）からＧＯＤ（酸化体）に酸化させる。
【００３２】
反応層１０３、２０３中の酸化還元酵素の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができる。たとえば、ＧＯＤを用いる場合、その含有量は、０．１〜４０ユニット／μＬが好ましい。ここで、「１ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で酸化させるために必要な、酸化還元酵素の量をいう。
【００３３】
ところで、反応式１による電流の変化を検出することで試料中のグルコース量を測定することができる。また、試料中に溶存する酸素によって生成された過酸化水素を電極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することによりグルコース濃度を求めることもできる。しかしながら、酸化還元酵素の酸化還元反応による電流の変化を直接検出する方法では、溶存酸素に依存したり、干渉物質の影響を受けたりしてしまう。干渉物質はフィルター構造を設けることで除去できるが、バイオセンサの構造が複雑になる。そこで、電子受容体を添加することで、シンプルな構造で基質量を精度よく測定することができる。
【００３４】
反応層１０３は、少なくとも１種以上の電子受容体を含んでいる。反応層１０３に含ませる電子受容体は、酸化還元電位の低いものを選択する。具体的には、電子受容体として酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖであるものを選択する。こうすることにで、反応層１０３における酵素と電子受容体との反応が試料中の干渉物質による影響を受けにくくなる。したがって、精度よく試料中の基質濃度を測定することができる。
【００３５】
より具体的には、反応層１０３に含ませる電子受容体は、テトラチアフルバレン（ＴＴＦ）化合物、フェロセニルトリメチルアンモニウム、テトラシアノキノジメタンからなる群から選択することができる。ＴＴＦ化合物として、テトラチアフルバレン、４−エトキシカルボニル−４，５，５'−トリメチルテトラチアフルバレン、８−メルカプトオクチルテトラチアフルバレンカルボキシレートなどを例示することができる。ＴＴＦ化合物は、酸化還元電位が０〜＋０．３Ｖであり、特に好ましい。
【００３６】
反応層１０３中の電子受容体は作用極１０２に電位が印加されることで、酸化型へと変化する。そして、酸化型の電子受容体がＧＯＤと反応し、還元される。酸化還元酵素としてＧＯＤ、電子受容体としてＴＴＦを用いたときの反応層１０３における反応メカニズムを反応式２に示す。
【００３７】
（反応式２）
グルコース  ＋  ＧＯＤ（酸化体）  →  グルコン酸  ＋  ＧＯＤ（還元体）
ＧＯＤ（還元体）  ＋  酸化型ＴＴＦ  →  ＧＯＤ（酸化体）＋ＴＴＦ
【００３８】
酵素反応により酸化型ＴＴＦから生成されたＴＴＦに電位を印加し、再酸化して酸化型ＴＴＦを生成する。この際の応答電流を検出することで、グルコース濃度を測定することができる。
【００３９】
一方、反応層２０３は、反応層１０３の電子受容体とは異なる電子受容体を少なくとも１種以上含んでいる。反応層２０３の電子受容体として、酵素との反応効率が、反応層１０３の電子受容体よりも相対的に低いものを選択する。また、反応層２０３の電子受容体として、酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖであるものを選択する。こうすることにで、反応層２０３における酵素と電子受容体との反応が試料中の干渉物質によって影響されにくくなる。したがって、精度よく試料中の基質濃度を測定することができる。
【００４０】
具体的には、反応層２０３に含ませる電子受容体には、フェロセン誘導体、ヒドロキシエトキシテトラシアノキノジメタン、および、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）からなる群から選択することができる。フェロセン誘導体として、１，１'−ジメチルフェロセン（以下単にジメチルフェロセンという）、フェロセンの他にフェロセンカルボン酸、１，１'−フェロセンジカルボン酸、フェロセンメタノール、１，１'−フェロセンジメタノール、フェロセンエタノール、メチルフェロセン、フェロセン酢酸を例示することができる。
【００４１】
反応層２０３の電子受容体もまた作用極２０２によって印加された電位により、酸化型へと変化する。酸化還元酵素としてＧＯＤ、電子受容体としてジメチルフェロセンを用いたときの反応層２０３における反応メカニズムを反応式３に示す。
【００４２】
（反応式３）
グルコース  ＋  ＧＯＤ（酸化体）  →  グルコン酸  ＋  ＧＯＤ（還元体）
ＧＯＤ（還元体）  ＋  酸化型ジメチルフェロセン  →  ＧＯＤ（酸化体）＋ジメチルフェロセン
【００４３】
酵素反応により酸化型ジメチルフェロセンから生成されたジメチルフェロセンに電位を印加し、再酸化して酸化型ジメチルフェロセンを生成する。この際の応答電流を検出することで、グルコース濃度を測定することができる。
【００４４】
測定試料として、血液、尿、唾液、汗、涙等の体液等や、果汁等の食品を例示することができる。尿は、０〜５ｇ／ｄｌの広範囲のグルコースを含有し、かつ、干渉物質を多く含む。しかしながら、バイオセンサ１を用いることで尿糖を精度よく測定することができる。
【００４５】
たとえば、電子受容体として、ＴＴＦ化合物やフェロセニルトリメチルアンモニウムを用いることで、０．２〜５ｇ／ｄＬの検量範囲でグルコース量を測定することができる。また、ジメチルフェロセンや１−メトキシ−ＰＭＳを用いることで０〜０．２ｇ／ｄＬの検量範囲でグルコース濃度を測定することができる。したがって、反応層１０３中の電子受容体をＴＴＦ化合物とし、反応層２０３中の電子受容体をジメチルフェロセンとすることで、生体試料中に含まれる０〜５ｇ／ｄｌの範囲のグルコース濃度を高い精度で測定することができる。
【００４６】
反応層１０３、２０３は、シクロデキストリンを含んでいてもよい。これにより親水性が向上するため、作用極１０２、２０２に塗布しやすくなる。
【００４７】
シクロデキストリンとしては、特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリン等を使用することができる。また、化学修飾されたシクロデキストリンであってもよく、例えば、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ｈｐ−β−ＣＤ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン等の化学修飾体があげられ、中でも、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが好ましい。これらは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４８】
電子受容体は１モルあたり、例えば、０〜４０重量％のシクロデキストリンによって包接されていることが好ましく、より好ましくは０．１〜２０重量％であり、特に好ましくは１〜１０重量％である。多すぎると粘性が高くなるという点で問題があり、少なすぎると可溶化が難しくなるという点で問題がある。
【００４９】
電子受容体は、シクロデキストリンを用いた公知の包接方法により包接することができる。例えば、シクロデキストリンを水性溶媒に溶解したシクロデキストリン溶液と、電子受容体を懸濁した懸濁液と、を準備し、両者を混合させることで当該電子受容体を包接させることができる。
【００５０】
シクロデキストリン溶液に対する電子受容体の割合は、電子受容体を溶解することができれば特に制限されないが、たとえば、０〜４０重量％のシクロデキストリンの溶液に当該電子受容体を５ｍＭとなるように溶解させることができる。シクロデキストリンの溶液は、１〜１０ｍＭであるとより好ましい。
【００５１】
水性溶媒としては、たとえば、水、緩衝液等が使用できる。緩衝液としては、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液などを用いることができる。緩衝液は、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。
【００５２】
溶媒のｐＨは４〜８とすると好ましい。ｐＨが大きすぎたり小さすぎたりすると酵素が失活してしまうため好ましくない。
【００５３】
また、反応層１０３、２０３は、安定化剤を含んでいてもよい。安定化剤として、トレハロース、スクロース、ラフィノース、アルギニン、および、グルコサミンからなる群から選択することができる。
【００５４】
また、反応層１０３、２０３は、界面活性剤を含むことができる。
【００５５】
電子受容体は、水に対する溶解度が低い。そのため、測定試料中に含まれる水によって電子受容体が反応層上に析出することがある。そこで、反応層に界面活性剤を含ませることにより、水に対する溶解性を向上させることができる。
【００５６】
界面活性剤としては、たとえば、レシチン、オクチルチオグルコシド、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、トライトン−Ｘ１００（登録商標）、Ｌｕｂｒｏｌ  ＰＸ（登録商標）、ＤＫ−エステル（登録商標）、ＢＩＧＣＨＡＰ（登録商標）、ＤｅｏｘＣＨＡＰ（登録商標）、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルホン酸、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアクリル酸およびＴｗｅｅｎ２０（登録商標、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を用いることができる。トライトン−Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ、およびＴｗｅｅｎ２０を用いると特に好ましい。
【００５７】
つづいて、バイオセンサ１の製造方法の一例について説明する。
【００５８】
まず、基板を準備し、試料がそれぞれ投入される反応セル２１および反応セル１１を設ける。反応セル２１には、作用極２０２を形成し、反応セル１１には、作用極１０２を形成する。また、作用極１０２、２０２に並列するように、対極３０１および参照極３０２を設ける。作用極１０２、２０２、対極３０１、および参照極３０２は、スクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法等、公知の方法により形成させることができる。ついで、基板上に絶縁性ペーストをスクリーン印刷して絶縁膜３０を形成し、絶縁性基板１０を得る。絶縁膜３０は作用極１０２、２０２の外周を覆うように形成させる。ただし、反応セル１１、２１の各領域には絶縁膜３０は形成しない。これにより、反応セル１１には第二開口部が設けられ、反応セル２１には第一開口部が設けられる。
【００５９】
その後、反応セル２１に反応層２０３を形成し、反応セル１１に反応層１０３を形成する。
【００６０】
具体的には、反応層１０３および反応層２０３は以下のように形成する。反応セル１１の作用極１０２、対極３０１および参照極３０２のそれぞれに酸化還元酵素およびＴＴＦなどの電子受容体を含む溶液を塗布する。また、反応セル２１の作用極２０２、対極３０１および参照極３０２のそれぞれに酸化還元酵素およびジメチルフェロセンなどの電子受容体を含む溶液を塗布する。このとき、反応セル１１および反応セル２１において、それぞれ塗布した溶液がコンタミネーションしないように留意する。コンタミネーションすると、バイオセンサ１の測定精度が低下するため好ましくない。ピペッターやディスペンサーを用いることで反応セル１１および反応セル２１のそれぞれの電極系５０に選択的に溶液を塗布することができる。こうすることで、反応層１０３、２０３を形成する。
【００６１】
なお、電子受容体、シクロデキストリン、界面活性剤及び酸化還元酵素を水性溶媒に混合調整し、反応セル１１、２１の電極系５０のそれぞれの表面に塗布することで反応層１０３、２０３を形成させてもよい。
【００６２】
以上のように、反応層１０３、２０３を形成した後、乾燥させてバイオセンサ１を完成させる。乾燥は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下で行うと好ましい。
【００６３】
つづいて、バイオセンサ１を用いて試料中に含まれる基質濃度を測定する方法について説明する。
【００６４】
まず、反応層１０３および反応層２０３に試料をそれぞれ添加し、所定時間放置する。こうすることで、添加された試料中の基質と酸化還元酵素とが反応し、ついで、酸化還元酵素と反応層１０３、２０３中のそれぞれの電子受容体とが反応する。その後、電極系５０に電圧を印加し、反応セル１１および反応セル２１から発生する応答電流をそれぞれ公知の方法で測定する。そして、あらかじめ既知の濃度の基質を用いて作成した基質濃度と応答電流値との検量線を用いて、得られた応答電流値から基質濃度を求める。
【００６５】
なお、測定試料の添加により、反応層１０３、２０３は溶解する。しかしながら、反応層１０３と反応層２０３とが混合すると測定精度が低下するため好ましくない。これを避けるため、バイオセンサ１では、図１（ａ）で示すように、反応セル１１と反応セル２１とを並列させない構成となっている。
【００６６】
また、反応層１０３と反応層２０３との混合をより確実に防止するため、取り外し可能な蓋部材を絶縁性基板１０に取り付けてもよい。
【００６７】
図２には、蓋部材６０とバイオセンサ１とを模式的に示している。図２（ａ）は、バイオセンサ１の斜視図である。図２（ｂ）は、蓋部材を取り付けたバイオセンサ１の平面図である。図２（ｃ）は、蓋部材を取り付けたバイオセンサ１のＣ−Ｃ'断面図である。図２（ｄ）は、蓋部材を取り付けたバイオセンサ１の側面図である。
【００６８】
図示するように、蓋部材６０は、反応セル１１、２１にわたって取り付けられる。蓋部材６０は、試料を導入する試料導入口６１と、導入された試料を反応セル１１および反応セル２１に導く流路６３と、流路６３に設けられる少なくとも二つの空気孔６４と、を形成する。空気孔６４は、反応セル２１側と反応セル１１側にそれぞれ形成されるが、図２（ｄ）では、反応セル１１側の空気孔６４を示している。
【００６９】
絶縁膜３０が流路６３の一部を構成することで試料導入口６１から導入された試料は二分割される。空気孔６４が反応セル２１側と反応セル１１側にそれぞれ形成されているため、毛細管現象によって反応セル２１および反応セル１１に分割された試料がそれぞれ導かれる。
【００７０】
なお、蓋部材６０は試料と接する面に親水性のコーティング膜を覆うことができる。コーティング膜は、コーティング剤の塗布、表面重合やプラズマ重合、プラズマ処理等で形成させることができる。蓋部材６０の表面をコーティング膜で覆うことで、各測定領域における気泡の付着を防止することができ、測定精度の低下を防止することが可能となる。
【００７１】
つづいて、バイオセンサ１の作用及び効果について図１を用いつつ説明する。
【００７２】
バイオセンサ１によれば、反応層２０３と反応層１０３とが互いに同一の酸化還元酵素を含み、互いに異なる電子受容体を含んでいる。これにより、試料中の同一の基質と反応した酸化還元酵素が特性の異なる電子受容体と反応することができる。したがって、酸化還元酵素に対する電子受容体の反応速度の違いによって、反応セル２１では相対的に低濃度範囲の基質濃度を定量し、反応セル１１では相対的に高濃度範囲の基質濃度を定量することができる。よって、所望の検量範囲を有する電子受容体を適宜選択することで、バイオセンサの検量範囲を使用目的に併せて任意に設計することができ、検量範囲を所望の範囲に拡大して精度よく基質濃度を測定することができる。
【００７３】
また、第一電子受容体および第二電子受容体はそれぞれ酸化還元電位が低いものを選択することができる。これにより、干渉物質の影響を受けにくくし、精度よく広範囲の基質濃度を測定することができる。
【００７４】
従来、０〜１０００ｍｇ／ｄｌ程度の広範囲のグルコース濃度を測定可能なバイオセンサは開発されていた（たとえば、特許文献５、６）。しかしながら、従来のバイオセンサでは、試料中の干渉物質の存在が考慮されていなかった。干渉物質はバイオセンサの測定精度に影響を与えるため、検量範囲を著しく低下させる要因ともなっていた。
【００７５】
たとえば、生体試料には、尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸、アセトアミノフェンなどの干渉物質が含まれる。特に尿はこれら干渉物質を多く含んでいる。そこで、干渉物質を取り除くためのフィルターを反応層に設ける構成を採用することも考えられる。
【００７６】
しかしながら、反応層にフィルターを設ける構成は、バイオセンサの構造を複雑にする。そのため、ディスポーザブル式のバイオセンサにかかる構成を採用することはコストの面や携帯性の観点から好ましくない。
【００７７】
そこで、バイオセンサ１では、酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖの電子受容体を用いる構成を採用することができる。これにより、干渉物質の影響を受けにくくし、基質濃度を精度よく測定することができる。したがって、フィルターを不要とし、バイオセンサの構造をシンプルにすることができる。よって、バイオセンサ１をディスポーザブル式のバイオセンサとして好適に用いることができる。
【００７８】
また、高濃度の基質量を精度よく測定できる電子受容体を反応層１０３に担持し、低濃度の基質量を精度よく測定できる電子受容体を反応層２０３に担持することで、所望の検量範囲のバイオセンサ１を設計することができる。たとえば、酸化還元酵素としてグルコースオキシダーゼを採用し、反応層１０３にＴＴＦ化合物、反応層２０３にフェロセン化合物を採用することで、生体試料に含まれる０〜５ｇ／ｄＬのグルコース濃度を定量することができる。このバイオセンサは、干渉物質の影響も受けにくく、かつ、広範囲のグルコース濃度を測定でき、構造をシンプルにすることができる。そのため、ディスポーザブル式の尿糖バイオセンサとして好適に用いることができる。
【００７９】
ところで、バイオセンサ１では、反応セル１１と反応セル２１とで異なる反応層が設けられている。そのため、両領域の反応層のコンタミネーションにより測定精度が低下してしまうという問題も考えられる。
【００８０】
そこで、バイオセンサ１では、反応セル１１と反応セル２１とを並列させない構成を採用する。また、反応セル１１と反応セル２１とを絶縁膜３０で分離する。これにより、反応層２０３および反応層１０３の混合を防止することができる。
【００８１】
さらに、バイオセンサ１では、図２で示す蓋部材を基板に設ける構成を採用することができる。これにより、反応セル１１および反応セル２１にそれぞれ均等に試料を導くことができ、かつ、反応層２０３および反応層１０３の混合を確実に防止することができる。
【００８２】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００８３】
たとえば、図３には、本実施の形態の第一の変形例であるバイオセンサ２を示している。図３（ａ）はバイオセンサ２の平面図である。図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図３（ｃ）は図３（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。
【００８４】
バイオサンサ２は、電極系５０が、対極２０４（第一対極）と、対極２０４とは異なる対極１０４（第二対極）と、参照極３０２と、を有している。バイオセンサ２では、対極３０１のかわりに、対極が２つ（対極１０４、２０４）設けられている。また、反応セル２１において、反応層２０３が対極２０４および参照極３０２のそれぞれに接している。そして、反応セル１１において、反応層１０３が対極１０４および参照極３０２のそれぞれに接している。
【００８５】
このように、２つの電極系を採用し、参照極を共通にすることで、電流の出力を安定にすることができる。したがって、精度良く基質濃度を測定することができる。
【００８６】
また、図４には、本実施の形態の第二の変形例であるバイオセンサ３を示している。図４（ａ）はバイオセンサ３の平面図である。図４（ｂ）は図４（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。
【００８７】
バイオセンサ３では、反応セル２１と反応セル１１とが並列している構成を採用している。バイオセンサ１とは異なり、対極３０１および参照極３０２はいずれも反応層２０３に接しておらず、かつ、反応層１０３にも接していない。この構成では、反応層２０３中に担持される第二電子受容体を作用極２０２に固定化し、反応層１０３中に担持される第一電子受容体を作用極１０２に固定化する。これにより、反応層１０３と反応層２０３とのコンタミネーションを防止できる。
【００８８】
具体的には、電子受容体を作用極１０２、２０２にそれぞれ固定化させることができる。固定化は、電子受容体を高分子化合物に混ぜ込んで作用極１０２、２０２に塗布することにより行うことができる。高分子化合物として、たとえばナフィオン（登録商標）、スルホイソフタル酸コポリエステル、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、シリコンオイルなどを例示することができる。スルホイソフタル酸コポリエステルは、たとえば、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から"Ｅａｓｔｍａｎ  ＡＱ−５５Ｄ"の名で市販されているものを用いることができる。また、電子受容体として機能する官能基を組み込んだポリマーを調製し、これをそれぞれの作用極に固定化させてもよい。
【００８９】
なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本発明を満足する範囲で各種に変更することができる。
【実施例】
【００９０】
（バイオセンサの作製方法）
本実施例では、図１で示すバイオセンサ１の構成を有するグルコースセンサを用いた。以下、本実施例のグルコースセンサの作製方法について説明する。まず、ポリエチレンテレフタレート基板上に銀/塩化銀をスクリーン印刷し、参照極３０２を形成させた。その後、伝導性炭素ペーストを利用してスクリーン印刷して作用極１０２，２０２および対極３０１を形成後、絶縁高分子ペーストを使用して絶縁膜３０を形成した。ついで、４ｍＭ  ＴＴＦ水溶液、５％ｈｐ−β−ＣＤ、１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０Ｕ／μＬＧＯＤを１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に混合調製し、得られた溶液（５μＬ）を反応セル１１の作用極１０２、参照極３０２および対極３０１に塗布して反応層１０３を形成した。また、４ｍＭジメチルフェロセン、５％ｈｐ−β−ＣＤ、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００、１０  Ｕ／μＬ  ＧＯＤを１５０ｍＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で混合調整し、反応セル２１の作用極２０２、参照極３０２および対極３０１に塗布して反応層２０３を形成した。その後、２４時間以上冷蔵庫にて乾燥させた。
【００９１】
（電気化学測定）
標準サンプルとして、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．５）で調製したグルコース溶液を用意した。また、ボランティアによって採取されたヒト尿、およびこのヒト尿にグルコースを添加したものを尿サンプルとして用意した。サンプル５μＬを反応層１０３、２０３にそれぞれ添加し、サンプル添加後１０秒後に、対極３０１に対して作用極１０２、２０２にアノード方向に電圧（＋０．３Ｖ／ｖｓ）を印加し、応答電流の測定を開始した。開始後１分の電流値を測定値とした。測定に用いたグルコースセンサは測定ごとに交換した。
【００９２】
図５に結果を示す。図５（ａ）は標準サンプルの結果を示す図である。図５（ｂ）は図５（ａ）の拡大図である。図５（ｃ）は尿サンプルの結果を示す図である。図５（ｄ）は図５（ｃ）の拡大図である。図５（ａ）、（ｂ）で示すように、ジメチルフェロセンを備える反応セル２１では、検量範囲が０〜０．２ｇ／ｄＬであった。一方、ＴＴＦを備える反応セル１１では、検量範囲が０．２〜２ｇ／ｄＬであった。図５（ｃ）、（ｄ）で示すように、尿サンプルでは標準サンプルと比べて検量範囲が狭くなったが、反応セル１１の検量範囲は、０．２〜１ｇ／ｄＬであり、反応セル２１の検量範囲は０．０４〜０．１ｇ／ｄＬであるという結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施の形態に係るバイオセンサを示す図である。図１（ａ）は、実施の形態に係るバイオセンサの平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図１（ｃ）は、図１（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。
【図２】蓋部材を取り付けたバイオセンサを模式的に示す図である。
【図３】実施の形態に係るバイオセンサの変形例を示す図である。図３（ａ）は、実施の形態に係るバイオセンサの平面図である。図３（ｂ）は、図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図３（ｃ）は、図３（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。
【図４】実施の形態に係るバイオセンサの変形例を示す図である。図４（ａ）は、実施の形態に係るバイオセンサの平面図である。図４（ｂ）は、図４（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。
【図５】実施例の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９４】
１    バイオセンサ
２    バイオセンサ
３    バイオセンサ
１０    絶縁性基板
１１    反応セル
２１    反応セル
３０    絶縁膜
５０    電極系
６０    蓋部材
６１    試料導入口
６３    流路
６４    空気孔
１０２    作用極
１０３    反応層
１０４    対極
２０２    作用極
２０３    反応層
２０４    対極
３０１    対極
３０２    参照極
【図１】
2010054379.tif 000003
【図２】
2010054379.tif 000004
【図３】
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【図４】
2010054379.tif 000006
【図５】
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