(57)【要約】      （修正有）【課題】動物において活性な免疫を誘導するための方法および試薬の提供。【解決手段】ヘルペスウイルスに対する免疫を誘導し得る外来ＤＮＡを有する組換えヘルペスウイルス。その外来ＤＮＡの供給源。それらの欠失したゲノムの部分を有する変異体ヘルペスウイルス。鳥類ヘルペスウイルスのＵＬ５４．５オープンリーディングフレームまたはマレク病ウイルスのＵＬ４３オープンリーディングフレームにおいて、外来性ＤＮＡが導入されるか、またはゲノムの一部が欠失される、組換えヘルペスウイルス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の組換えヘルペスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、動物のワクチン接種のためのウイルスベクターに関する。詳細には、本発明は、外来ＤＮＡの導入のための遺伝子挿入部位を有するウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
マレク病は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起こされるニワトリのリンパ球増殖性疾患である。ＭＤＶ（天然に存在するヘルペスウイルス）は、ニワトリの嚢由来リンパ球および胸腺由来リンパ球に感染し、そして引き続き胸腺由来リンパ球のリンパ腫を誘導し得る。ＭＤＶは、鳥類ヘルペスウイルスファミリーの１つの名称である。例えば、ＭＤＶ１は、ニワトリにおけるヘルペスウイルスの病原性株であり、ＭＤＶ２は、ニワトリにおける自然に弱毒化されたヘルペスウイルス株であり、そしてＭＤＶ３は、シチメンチョウの非病原性ヘルペスウイルスである。
【０００３】
マレク病は、伝染病なので、特に大規模な飼育環境（例えば、養鶏業）において、そのウイルスはニワトリの重要な病原体になっている。現在、マレク病は、ふ卵の１７〜１９日目の胚または１日齢ニワトリ（ｏｎｅ−ｄａｙ−ｏｌｄ  ｃｈｉｃｋ）のワクチン接種によって制御される。
【０００４】
一般的に、動物ウイルスに対する組換えＤＮＡ技術の適用は、最近の歴史を有する。操作されるべき第１のウイルスは、最も小さなゲノムを有するウイルスである。例えば、パポバウイルスの場合において、これらのウイルスは、たいへん小さく、そして多くの余分なＤＮＡを収容し得ないので、遺伝子工学におけるそれらの用途は、欠損レプリコンとしてであった。従って、これらのウイルスに由来する外来ＤＮＡ配列発現は、野生型のヘルパーウイルスを必要とし、そして細胞培養系に制限される。他方では、アデノウイルスについて、外来配列によって置換され得る少量の非必須ＤＮＡが存在する。この技術はまた、鳥類のヘルペスウイルスにおけるヘルペスウイルスゲノムの部分に適用されている（Ｃｏｃｈｒａｎらに対する米国特許第５，８５３，７３３号を参照のこと）。
【０００５】
ヘルペスウイルスへの遺伝子の欠失または挿入という実例が、組換えＤＮＡ技術によって、ヘルペスウイルスゲノムを遺伝子的に操作することが可能であるということを実証する。過去において、遺伝子を挿入するために使用されてきた方法は、プラスミド内にクローン化されたウイルスＤＮＡと、同じ動物細胞内にトランスフェクトされた精製されたウイルスＤＮＡとの間の相同組換えを含む。しかし、欠失の位置および外来ＤＮＡ配列の挿入のための部位を一般化し得る程度が、これらのこれまでの研究から公知ではない。
【０００６】
鳥類のヘルペスウイルスにおける適切なＤＮＡ配列挿入部位の同定が、新たなワクチンの開発のために役立つ。しかし、（ｉ）適切なウイルスおよび（ｉｉ）外来ＤＮＡ配列発現のためのベクターを作製するための挿入部位として使用するためのゲノムの特定部分の選択は、重要な課題をもたらす。詳細には、その挿入部位は、ウイルスの生存可能な複製ならびに組織培養およびインビボにおけるその作動のために非必須でなくてはならない。さらに、その挿入部位は、新たな遺伝子材料を受容し得なければならないのと同時に、ウイルスが複製し続けることを保証し得なければならない。
【０００７】
必要とされることは、新規なウイルスおよび新規なウイルスベクターの作製のための遺伝子挿入部位の同定である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ヘルペスウイルスゲノム内の部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む変異体および組換えヘルペスウイルスを提供する。１つの実施形態において、その部位は、ウイルス複製のために非必須である。好ましい実施形態において、外来ＤＮＡ配列は、組換えヘルペスウイルスおよびその発現物で感染された宿主細胞において発現され得る。特に好ましい実施形態において、外来ＤＮＡ配列はまた、その外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。本発明は、挿入または欠失のための特定部位に限定されない。１つの実施形態において、欠失および／または挿入は、マレク病ウイルスのＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内に存在する。別の実施形態において、欠失および／または挿入は、マレク病ウイルスのＵＬ４３オープンリーディングフレーム内に存在する。好ましい実施形態において、挿入物は、１型マレク病ウイルスのゲノム内に存在する。
【０００９】
挿入されたＤＮＡの特定の型に限定されないが、本発明の１つの実施形態において、ヘルペスウイルスゲノム内に挿入された外来ＤＮＡ配列はポリペプチドをコードする。好ましくは、そのポリペプチドは、組換えヘルペスウイルスが導入される動物に対して免疫原性である。好ましくは、この免疫原性ポリペプチドは、抗体を産生するように動物を刺激する、１０個より多くのアミノ酸がペプチド結合により連結された線状ポリマーである。好ましい実施形態において、この外来ＤＮＡ配列はまた、検出マーカーをコードする。好ましくは、検出マーカーは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ−ガラクトシダーゼである。
【００１０】
好ましい実施形態において、この組換えヘルペスウイルスは、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性ファルビキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）または伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列に由来する免疫原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列を含む。別の好ましい実施形態において、この外来ＤＮＡは、サイトカインをコードする。本発明はまた、１つの抗原または複数の抗原をコードする１つよりも多くの外来ＤＮＡ配列を有する組換えヘルペスウイルスを意図する。
【００１１】
本発明の組換えヘルペスウイルスの外来ＤＮＡ配列が、伝染性ファルビキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドが、ＩＢＶＤ、ＶＰ２、ＶＰ３もしくはＶＰ４タンパク質、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列であることが好ましい。外来ＤＮＡ配列が、ＭＤＶ由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、好ましくは、その免疫原性ポリペプチドは、ＭＤＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、もしくは糖タンパク質Ａ（ｇＡ）、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列である。
【００１２】
外来ＤＮＡ配列が、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドは、ＮＤＶ融合（Ｆ）タンパク質またはＮＤＶ血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列であることが好ましい。
【００１３】
外来ＤＮＡ配列が、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドは、ＩＬＴＶ糖タンパク質「Ｂ」（ｇＢ）、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、もしくはＩＬＴＶ糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列であることが好ましい。
【００１４】
外来ＤＮＡ配列が、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドは、ＩＢＶスパイクタンパク質、ＩＢＶマトリックスタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列であることが好ましい。
【００１５】
挿入された外来ＤＮＡ配列の発現は、外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターに制御され得る。好ましくは、そのプロモーターは、ヘルペスウイルスプロモーターである。より好ましくは、そのプロモーターは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーター、ＭＤＶ  ｇＢプロモーター、ＭＤＶ  ｇＡプロモーター、ＭＤＶ  ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）プロモーターおよび／または実質的に相同な配列からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、ヘルペスウイルスゲノム内に外来ＤＮＡ配列を挿入することによって組換えヘルペスウイルスを産生するための相同ベクターをさらに提供する。１つの実施形態において、相同ベクターは、本質的に二本鎖外来ＤＮＡ配列からなる二本鎖ＤＮＡ分子を含み、その外来ＤＮＡ配列の１つの末端において、ヘルペスウイルスゲノムの非必須部位の一方の側に位置するゲノムＤＮＡと相同である二本鎖ＤＮＡを有し、そしてその外来ＤＮＡ配列のもう１つの末端において、同じ部位のもう一方の側に位置するヘルペスウイルスゲノムＤＮＡ配列と相同である二本鎖ＤＮＡを有する。そのような実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメント内に存在するＤＮＡ配列と相同であり得る。好ましくは、プロモーターに対応するＤＮＡ配列は、その外来ＤＮＡ配列の上流に位置し、その発現を制御する。同様に、外来ＤＮＡ配列は、免疫原性ポリペプチドをコードすることが好ましい（例えば、上記のポリペプチド）。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、二本鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ＭＤＶヘルペスウイルスゲノムのＢａｍＨＩ「Ｂ」フラグメント内に存在するＤＮＡ配列と相同である。好ましくは、その二本鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ４３タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム内に存在するＤＮＡ配列と相同である。本発明の別の実施形態において、二本鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ヘルペスウイルスゲノムのＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグメント内に存在するＤＮＡ配列と相同である。好ましくは、二本鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ５４．５遺伝子コード領域内に存在するＤＮＡ配列と相同である。
【００１８】
本発明は、免疫化に効果的な量の本発明の組換えヘルペスウイルスまたは変異体ヘルペスウイルスおよび適切なキャリアを含むワクチンをさらに提供する。
【００１９】
本発明は、動物を免疫化する方法をさらに提供する。免疫化されるべき好ましい動物は、ニワトリである。
【００２０】
本発明はまた、インビボにおいてニワトリを免疫化する方法を提供する。本発明の目的のために、これは伝染性ファルビキウス病ウイルス、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスまたは伝染性気管支炎ウイルスに対して、ニワトリを免疫化することを含む。好ましくは、その方法は、効果的に免疫化する本発明のワクチンの用量をニワトリに投与する工程を包含する。そのワクチンは、当業者に周知の方法（例えば、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射または静脈内注射による）のいずれかによって投与され得る。あるいは、そのワクチンは、鼻腔内、経口または眼内的に投与され得る。
【００２１】
本発明はまた、本発明の組換えヘルペスウイルスで感染された宿主細胞を提供する。好ましくは、その宿主細胞は、鳥類の細胞である。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）マレク病ウイルス（ＭＤＶ）のＵＬ５４．５オープンリーディングフレームに挿入された外来性ＤＮＡ配列を含む、組換え鳥類ヘルペスウイルス。
（項目２）前記外来性ＤＮＡがポリペプチドをコードする、項目１に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目３）前記ポリペプチドが１０より多いアミノ酸を含有する、項目２に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目４）前記ポリペプチドが抗原性である、項目２に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目５）前記鳥類ヘルペスウイルスが、Ｉ型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）を含む、項目１に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目６）項目５に記載の組換えヘルペスウイルスであって、ここで前記外来性ＤＮＡ配列が、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するヘルペスウイルスプロモーターの制御下にあり、そして、該外来性ＤＮＡ配列が、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、ＭＤＶ  ｇＢプロモーター、ＭＤＶ  ｇＡプロモーター、ＭＤＶ  ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、ＨＣＭＶ最初期プロモーター、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、組換えヘルペスウイルス。
（項目７）項目５に記載の組換えヘルペスウイルスであって、ここで前記外来性ＤＮＡ配列が、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイルス、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、および実質的に相同な配列からなる群より選択されるウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする、組換えヘルペスウイルス、
（項目８）項目７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡ配列が、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、伝染性ファルビキウス病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
（項目９）項目７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡが、Ｂ糖タンパク質、Ｄ糖タンパク質、Ａ糖タンパク質、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、マレク病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
（項目１０）項目７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡ配列が、Ｆ、ＨＮ、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
（項目１１）項目７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡが、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリックスタンパク質、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、伝染性気管支炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
（項目１２）マレク病ウイルス（ＭＤＶ）のＵＬ５４．５オープンリーディングフレームの少なくとも一部の欠失を含む、変異体鳥類ヘルペスウイルス。
（項目１３）前記ＵＬ５４．５オープンリーディングフレームが完全に欠失している、項目１２に記載の変異体ヘルペスウイルス。
（項目１４）マレク病ウイルスのＵＬ４３オープンリーディングフレームに挿入されている外来性ＤＮＡ配列を含む、組換え鳥類ヘルペスウイルス。
（項目１５）前記外来性ＤＮＡがポリペプチドをコードする、項目１４に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目１６）前記ポリペプチドが１０より多いアミノ酸を含む、項目１５に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目１７）前記ポリペプチドが抗原性である、項目１５に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目１８）前記鳥類ヘルペスウイルスがＩ型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）を含む、項目１７に記載の組換えヘルペスウイルス。
（項目１９）項目１４に記載の組換えヘルペスウイルスであって、ここで前記外来性ＤＮＡ配列が、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するヘルペスウイルスプロモーターの制御下にあり、そして、該外来性ＤＮＡ配列は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、ＭＤＶ  ｇＢプロモーター、ＭＤＶ  ｇＡプロモーター、ＭＤＶ  ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、ＨＣＭＶ最初期プロモーター、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、組換えヘルペスウイルス。
（項目２０）項目１９に記載の組換えヘルペスウイルスであって、ここで前記外来性ＤＮＡ配列が、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイルス、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする、組換えヘルペスウイルス。
【００２２】
（定義）
本発明の目的では、「宿主細胞」は、ベクターおよびその挿入物を増幅するために使用される細胞である。この細胞の感染は、当業者に周知の方法（例えば、以下のＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １１）に記載されるような方法）によって達成され得る。
【００２３】
用語「動物」とは、動物界における生物のことをいう。従って、この用語は、ヒトならびに他の生物を含む。好ましくは、この用語は、脊椎動物をいう。より好ましくは、この用語は鳥類である動物をいう。
【００２４】
本発明の組換えヘルペスウイルスの「免疫化有効量」は、１０2〜１０9プラーク形成単位（ＰＦＵ）／用量の範囲内である。
【００２５】
本発明の目的では、「相同性ベクター」は、ヘルペスウイルスのゲノム上の特定の部位において外来ＤＮＡ配列を挿入するために構築されたプラスミドである。
【００２６】
「外来ＤＮＡ配列」は、組換え技術を使用して別のＤＮＡ分子に結合されているか、または結合されるＤＮＡのセグメントであり、ここでこの特定のＤＮＡセグメントは、天然において他のＤＮＡ分子に関連して見出されていない。このような外来ＤＮＡの供給源は、このＤＮＡが配置される生物とは、別の生物由来であってもよいし、そうでなくてもよい。この外来ＤＮＡはまた、ネイティブ遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列であり得る。組換え技術の例としては、ＤＮＡを繋ぎ合わせるための制限酵素およびリガーゼの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「挿入部位」は、ＤＮＡ分子における、外来ＤＮＡが挿入され得る制限部位である。
【００２８】
「複製可能ウイルス」は、野生型のこの生物において見出されているように、遺伝物質にウイルスの複製のために必要なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の全てが含まれるウイルスである。従って、複製可能ウイルスは、複製をするためにウイルスで欠損しているものまたはウイルスから欠けているものを補充する第２のウイルスも細胞株も必要としない。「ヘルペスウイルスゲノムにおける非必須部位」は、ヘルペスウイルスゲノムにおいて、その領域のポリペプチド産物が、ウイルスの感染にも複製にも必要ではない領域を意味する。
【００２９】
「ベクター」は、別のＤＮＡ配列が、結合したＤＮＡ配列の発現を達成するように結合され得る、プラスミド、ファージ、コスミドまたはウイルスのようなレプリコンである。
【００３０】
「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、その正常な二本鎖ヘリックスにおけるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態をいう。この用語は、この分子の一次構造および二次構造のみをいい、そして任意の特定の３次形態には限定されない。従って、この用語は、直鎖状ＤＮＡ分子において見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば、ウイルス、プラスミドおよび染色体由来のＤＮＡの制限フラグメント）を含む。
【００３１】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれる場合、インビボで転写およびポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、ウイルスＤＮＡ、およびさらに合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、コード配列に対して３’に配置され得る。
【００３２】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼまたは補助タンパク質を結合し得、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の定義の目的で、プロモーター配列は、コード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）が３’末端に近接しており、そしてバックグラウンドよりも上で検出可能なレベルでの転写を容易にするのに必要な最少の塩基数またはエレメントを含むように上流（５’方向）に広がっている。プロモーター配列内には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物プロモーターはしばしば（しかし、いつもではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを含み、これらは、多くの真核生物のプロモーター領域において見出されている保存配列である。
【００３３】
ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーター配列と直接的または間接的に相互作用し、そしてコード配列のｍＲＮＡへの転写を生じ、次いで、ｍＲＮＡが、そのコード配列によってコードされるポリペプチドへと翻訳される場合、コード配列は、細胞において制御配列に「作動可能に連結」されているかまたは制御配列の「制御下」にある。
【００３４】
２つのポリペプチド配列は、この分子の規定された長さにわたって少なくとも約８０％（好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％）のアミノ酸が一致する場合、「実質的に相同」である。
【００３５】
２つのＤＮＡ配列は、これらが同一であるか、またはそのヌクレオチドの４０％より多く、より好ましくは、そのヌクレオチドの約２０％より多く、そして最も好ましくはそのヌクレオチドの約１０％より多くにおいて異ならない場合、「実質的に相同」である。
【００３６】
外来ＤＮＡ配列がそのゲノムに挿入されているウイルスは、「組換えウイルス」であるが、一方、そのゲノムの一部が故意の欠失（例えば、遺伝子操作）によって除去されているウイルスは、「変異ウイルス」である。
【００３７】
用語「ポリペプチド」は、その最も広い意味で使用される（すなわち、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチド以上））。従って、用語「ポリペプチド」としては、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、アナログ、ムテイン、融合タンパク質などが挙げられる。
【００３８】
「抗原性の」とは、１つ以上のエピトープを含む分子の、動物免疫系またはヒト免疫系を刺激して体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答を起こす能力をいう。「抗原」は、抗原性ポリペプチドである。
【００３９】
組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワクチンに対する宿主における細胞媒介免疫応答および／または抗体媒介免疫応答の発生である。通常、このような応答は、目的の組成物またはワクチンに含まれる抗原に特異的に指向される抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞が被験体によって産生されることからなる。
【００４０】
用語「免疫原性ポリペプチド」および「免疫原性アミノ酸配列」とは、ウイルス感染性を中和する、および／または抗体補体依存性細胞傷害性もしくは抗体依存性細胞傷害性を媒介して免疫された宿主の防御を与える抗体を惹起するそれぞれポリペプチドまたはアミノ酸配列をいう。本明細書中で使用される場合、「免疫原性ポリペプチド」は、所望のタンパク質またはその免疫原性フラグメントの全長（または全長に近い）配列を含む。
【００４１】
「免疫原性フラグメント」によって、１つ以上のエピトープを含み、従って、ウイルス感染性を中和する、および／または抗体補体依存性細胞傷害性もしくは抗体依存性細胞傷害性を媒介して免疫された宿主の防御を与えるポリペプチドのフラグメントを意味する。このようなフラグメントは通常、少なくとも約５アミノ酸長、そして好ましくは少なくとも約１０〜１５アミノ酸長である。このフラグメントの長さには、臨界的な上限はなく、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含み得るか、または２つ以上の抗原のフラグメントを含む融合タンパク質さえ含み得る。
【００４２】
「感染性の」によって、細胞へウイルスゲノムを送達する能力を有することを意味する。
【００４３】
用語「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、発現される場合、特定の遺伝子についての、完全タンパク質および特定のポリペプチド鎖タンパク質を産生し得る遺伝子コード領域として定義される。
【００４４】
用語「鳥類ヘルペスウイルス」は、鳥類宿主において複製し得、かつ他の宿主動物において自然には複製しない、ヘルペスウイルスを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素地図であり、特に「Ｍ」フラグメントの位置を示している。
【図２】図２は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグメントにおけるオープンリーディングフレームを示す地図である。
【図３】図３は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素地図であり、特にＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩＩフラグメントの位置を示している。
【図４】図４は、ＭＤＶゲノムのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩＩフラグメントにおけるオープンリーディングフレームを示す地図である。
【図５】図５は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素地図であり、特に「Ｇ」フラグメントの位置を示している。
【図６】図６は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ「Ｇ」フラグメントにおけるオープンリーディングフレームの地図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
この開示を通じて、種々の刊行物、特許および特許出願を参考とした。これらの刊行物、特許および特許出願の開示は、本明細書中で参考として援用される。
本発明の方法および組成物は、挿入、欠失、１つまたは複数の塩基の変化によって、種々の原核生物供給源および真核生物供給源由来のクローン化ＤＮＡ配列を改変する工程、および引き続くこれらの改変した配列をヘルペスウイルスのゲノムに挿入する工程を包含する。１つの例は、ヘルペスウイルスＤＮＡの一部を細菌におけるプラスミドにクローニングする工程、ウイルスＤＮＡが特定の配列の欠失を含むようにクローン化状態においてウイルスＤＮＡを再構築する工程、および／またはその上、その欠失の代わりか、もしくはその欠失以外の部位かのいずれかに外来ＤＮＡ配列を付加する工程を包含する。本発明の方法および組成物としてはまた、変異ウイルスを産生する、ヘルペスウイルスのゲノムの一部の欠失を含む。
【００４７】
一般的に、外来遺伝子構築物は、全ヘルペスウイルスゲノムの一部だけに相当するヌクレオチド配列にクローン化される。このヌクレオチド配列は、１つ以上の適切な欠失を有し得る。このキメラＤＮＡ配列は通常、この配列の複数コピーを産生する好首尾なクローニングを可能にするプラスミド中する。次いで、このクローン化された外来遺伝子構築物は、例えば、ＤＮＡ媒介同時トランスフェクション技術後のインビボ組換えによって完全ウイルスゲノムに含まれ得る。複数のコピーのコード配列または１つより多くのコード配列は、組換えベクターが、１つより多くの外来タンパク質を発現し得るように挿入され得る。外来遺伝子は、付加、欠失または置換を有して、発現したタンパク質の発現および／または免疫学的効果を増強し得る。
【００４８】
遺伝子の好首尾な発現を起こすために、遺伝子は、エンハンサーエレメントおよびポリアデニル化配列を含む適切なプロモーターとともに発現ベクターに挿入され得る。哺乳動物細胞における外来遺伝子の好首尾な発現を提供する多数の真核生物プロモーターおよびポリアデニル化配列ならびに発現カセットを構築する方法は、当該分野で、例えば、米国特許第５，１５１，２６７号において公知である。このプロモーターは、免疫原性タンパク質の最適な発現を与えるように選択され、この免疫原性タンパク質は、次に公知の基準に従って体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答および粘膜免疫応答を満足に引き起こす。
【００４９】
組換えウイルス感染細胞におけるインビボ発現によって産生される外来タンパク質は、それ自体が免疫原性であり得る。１つより多くの外来遺伝子をウイルスゲノムに挿入し、１つより多くの効果的なタンパク質の好首尾な産生が得られ得る。
【００５０】
従って、変異ヘルペスウイルスの使用または外来ＤＮＡ配列のヘルペスウイルスのゲノムへの付加の１つの有用性は、動物を予防接種することである。例えば、変異ウイルスを動物に導入して、その変異ウイルスに対する免疫応答を誘発し得る。
【００５１】
あるいは、ポリペプチドをコードするゲノムに挿入された外来ＤＮＡ配列を有する組換えヘルペスウイルスはまた、動物において外来ＤＮＡ配列、外来ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド、および／またはヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発することに作用し得る。このようなウイルスをまた使用して、外来ＤＮＡおよびその産物を宿主動物に導入して、宿主動物における欠損ゲノム状態を軽減し得る。これらの組換えヘルペスウイルスは、宿主動物において外来ＤＮＡを保有し得るウイルスである場合、ウイルスベクターといわる。
【００５２】
本発明は、特定のヘルペスベクターの使用に限定されない。ウイルスベクターとしての使用のために適切な１つの鳥類ヘルペスウイルスはＭＤＶである。マレク病に対するベクターおよびワクチンとしてＭＤＶを提供するために、ＭＤＶゲノム内に、ウイルスの複製および機能のために必須でなく、かつその中にＭＤＶ抗原をコードする１つ以上の内因性遺伝子を挿入して、コードされた抗原に対する免疫応答をさらに刺激し得る部位を配置することが望ましい。他方で、多価ワクチンとして使用するためのウイルスベクターまたは発現ベクターとしてのＭＤＶを提供するために、ＭＤＶゲノム内に、ウイルスの複製および機能のために必須でなく、かつその中にＭＤＶ以外の家きん類病原体の抗原をコードする１つ以上の内因性遺伝子を挿入して、ＭＤＶおよびこのような他の家きん類病原体に対する免疫応答をさらに刺激し得る部位を配置することが望ましい。あるいは、内因性遺伝子のコピーおよび内因性遺伝子のコピーの組み合わせは、このようなウイルスベクターの非必須的な領域に挿入され得る。
【００５３】
ＭＤＶゲノムが使用される場合、弱毒化１型ＭＤＶ株を使用することが好ましい。Ｒｉｓｐｅｎｓ  ＣＶＩ−９８８は、ＭＤＶの非常に有毒な株に対する防御を提供するために使用され得る、弱毒化１血清型ＭＤＶワクチン株である。
【００５４】
このＭＤＶゲノムは、２つの独特な領域（独特な短い領域（ＵＳ）、および独特な長い領域（ＵＬ））からなる直鎖状１８０ｋｂ塩基対の二本鎖分子である。各々の独特な領域は、逆方向反復（ＵＬについては、長い末端反復（ＴＲＬ）および内部の長い逆方向反復（ＩＲＬ）、そしてＵＳについては、短い内部の逆方向反復（ＩＲＳ）および短い末端反復（ＴＲＳ））に隣接している。
【００５５】
本発明は、特定のＤＮＡ欠失部位および／またはＤＮＡ挿入部位に限定されないが、一方、鳥類ヘルペスウイルスのＵＬ４３領域およびＵＬ５４．５領域は、欠失および挿入のために適切な部位を含むことが発見されている。例えば、鳥類ヘルペスウイルスのＵＬ４３領域内、特にＭＤＶゲノム内にＸｈｏＩ部位が存在する。ＵＬ５４領域およびＵＬ５５領域に隣接しているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もまた存在する。ＵＬ５４．５と称されるこのＯＲＦは、欠失および挿入のために適切なＮｄｅＩ部位を含む。
【００５６】
詳細には、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩの部分フラグメントがある。ＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩの部分フラグメント内の好ましい欠失部位および／または挿入部位は、ヘルペスウイルスＵＬ４３をコードするオープンリーディングフレーム内に位置し、そしてそのオープンリーディングフレーム内の好ましい挿入部分は、ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００５７】
同様に、欠失および／または挿入は、ヘルペスウイルスゲノムのＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメント内に位置され得る。ＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメント内の好ましい挿入部位は、ヘルペスウイルスＵＬ５４．５をコードするオープンリーディングフレーム内に位置し、そしてそのオープンリーディングフレーム内の好ましい挿入部位は、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。特に好ましい実施形態において、ＵＬ５４．５オープンリーディングフレームの産物は、ウイルスの複製のために必須ではない。
【００５８】
種々の外来ＤＮＡ配列またはコード配列（ウイルス、原核生物、および真核生物）を、本発明に従ってヘルペスウイルスヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）において挿入して、特に広範の疾患に対する防御を提供し得る。そして多くのこのような遺伝子は、当該分野ですでに公知である。任意の特定の外来ＤＮＡ配列に限定されないが、代表的には、目的の外来ＤＮＡ配列は、家きん産業に経済的な影響を有する疾患を鳥類において引き起こす病原体由来である。この遺伝子は、既存のワクチンが存在する生物由来であり得、そしてベクター化（ｖｅｃｔｏｒｉｎｇ）技術の新規の利点のために、このヘルペスウイルス由来ワクチンは優れている。また、目的の遺伝子は、現在ワクチンはないが、疾患の制御が必要とされている病原体由来であり得る。代表的には、目的の遺伝子は、病原体の免疫原性ポリペプチドをコードし、そして表面タンパク質、分泌タンパク質および構造タンパク質を示し得る。
【００５９】
ヘルペスウイルスベクター化のための標的である関連鳥類病原体は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。ＩＬＴＶは、ヘルペスウイルス科のメンバーであり、そしてこの病原体は、呼吸低下、伝染性気管支炎および観血性滲出液の喀出によって特徴付けられるニワトリの急性疾患を引き起こす。
【００６０】
ヘルペスウイルスベクター化アプローチの別の標的は、ニューカッスル病である。ニューカッスル病は、高伝染性でかつ消耗性の感染性疾患であり、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって引き起こされる。ＮＤＶは、パラミクソウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＮＤＶの種々の病原型（短潜伏期性、亜病原性、レント原性）は、この疾患の重篤度、特異性、および症状に関しては異なるが、ほとんどの型は、呼吸系および神経系に感染するようである。ＮＤＶ科は、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の鳥類種に感染する。
【００６１】
本発明はまた、生物由来の特定のＤＮＡ配列の使用には限定されない。しばしば、ヘルペスウイルスゲノムへの挿入のための外来ＤＮＡ配列の選択は、それがコードするタンパク質に基づく。好ましくは、外来ＤＮＡ配列は、免疫原性ポリペプチドをコードする。本発明のウイルス系によって発現される好ましい免疫原性ポリペプチドは、抗原をコードする全長（または全長に近い）配列を含む。あるいは、免疫原性である（すなわち、１つ以上のエピトープをコードする）より短い配列が使用され得る。より短い配列は、中和エピトープをコードし得、このエピトープは、インビトロアッセイにおいてウイルス感染性を中和する抗体を誘発し得るエピトープとして定義される。好ましくは、このペプチドは、宿主において防御免疫応答（すなわち、感染から免疫された宿主を保護する抗体媒介性免疫応答および／または細胞媒介性免疫応答）を惹起し得る防御エピトープをコードするべきである。いくつかの場合、特定の抗原の遺伝子は、多数のイントロンを含み得るか、またはＲＮＡウイルス由来であり得、これらの場合、相補ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）が、使用され得る。
【００６２】
野生型生物において見出されたような完全配列ではなく、遺伝子のヌクレオチド配列のフラグメントのみを、使用し得ることも可能である（これらが、防御免疫応答を生成するのに十分である場合）。入手可能である場合、合成遺伝子またはそのフラグメントもまた、使用され得る。しかし、本発明は、広範な種々の遺伝子、フラグメントなどを用いて使用され得、そして本明細書中に記載の遺伝子、フラグメントなどには、限定されない。
【００６３】
従って、本発明において使用される外来ＤＮＡ配列によってコードされる抗原は、ネイティブまたは組換えの免疫原性ポリペプチドまたはフラグメントのいずれかであり得る。それらは、部分配列、全長配列、または融合体（例えば、組換え宿主に適切なリーダー配列を有するか、または別の病原体についてのさらなる抗原配列を有する）でさえあり得る。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明の変異ウイルスおよびウイルスベクターは、複製可能である。このように、ヘルペスウイルスゲノムからの欠失および／またはこのゲノムへの挿入は、ヘルペスウイルスの複製能力を破壊しない。しかし、欠失および／または挿入が、ヘルペスウイルスの複製能力を破壊または十分に阻害する場合、本発明は、本発明のヘルペスウイルスを含む発現カセットを構築し、そしてこのカセットで宿主細胞を形質転換して欠失または破壊されたＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質を発現する細胞株または培養物を提供することによる組換え細胞株の使用を包含する。
【００６５】
これらの組換え細胞株は、複製コンピテントではない組換えヘルペスウイルスが、その組換えヘルペスウイルス内にコードされる所望の外来ＤＮＡ配列またはそのフラグメントを複製および発現可能にすることができる。これらの細胞株はまた、インビボ組換え、続くＤＮＡ媒介同時トランスフェクションによって組換えヘルペスウイルスを作製することに非常に有用である。
【００６６】
本発明の方法および組成物がワクチン接種に使用される場合、任意の特定の投与に制限されない。１つの例は、非経口投与である。非経口投与される場合、ワクチンはワクチンキャリアの使用を含み得る。ワクチンキャリアは、当該分野で周知である：例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＨＬＨ）。好ましいキャリアタンパク質であるロタウイスルＶＰ６は、欧州特許公開第０２５９１４９号に開示される。
【００６７】
ワクチンはまた、腸溶性投薬形態のような適切な経口キャリア中で、経口投与され得る。経口処方物としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤が挙げられる。経口ワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり得、約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含む。経口ワクチンは、全身性免疫と組み合わせた粘膜免疫を惹起することに好ましくあり得、これは、病原体の胃腸管感染に対する防御に重要な役割を果たす。
【００６８】
さらに、ワクチンは坐剤へと処方される。坐剤に関して、ワクチン組成物はポリアルカリグリコールまたはトリグリセリドのような従来の結合剤およびキャリアを含む。そのような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。
【００６９】
本発明のワクチン組成物を動物に投与するためのプロトコールは、本開示を考慮して当業者の範囲内である。当業者は、免疫原性フラグメントに対して抗体および／またはＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するのに有効な用量でワクチン組成物の濃度を選択する。広い範囲において、この投薬量は、重要であると考えられていない。
【００７０】
代表的に、ワクチン組成物は、好都合な体積のビヒクル（例えば、約１〜１０ｃｃ）中にて約１から約１０００μｇの間のサブユニット抗原を送達する様式で投与される。好ましくは、単一免疫における投薬量は、約１から約５００μｇのサブユニット抗原、より好ましくは約５〜１０から約１００〜２００μｇ（例えば、５〜２００μｇ）のサブユニット抗原を送達する。
【００７１】
投与の時期もまた、重要であり得る。例えば、一次接種は、好ましくは、必要な場合、後のブースター接種が続き得る。必要に応じてではあるが、二次のブースター免疫を、最初の免疫の数週間から数ヶ月間後に、動物に投与することもまた、好ましくあり得る。疾患に対する高レベルの防御の維持を確実にするためには、一定の間隔（例えば、数年毎に１回）で動物にブースター免疫を再投与することが有益であり得る。あるいは、最初の用量は経口投与され、続いて後に接種され得るか、またはその逆もあり得る。好ましいワクチン接種プロトコールは、慣用的なワクチン接種プロトコールの実験を介して確立され得る。
【００７２】
本発明の組換えヘルペスウイルスはまた、本発明のワクチンによってワクチン接種された動物を、天然に存在する野生型伝染性ヘルペスウイルスまたは他の病原体によって感染された動物から区別する方法を提供し得る。これは、組換えヘルペスウイルスが、対応する病原体に対する防御免疫を与えるのに必要である上記のウイルス由来の限定数の抗原をコードする外来ＤＮＡを含むので、可能である。結果的に、これらの組換えヘルペスウイルスを用いてワクチン接種された宿主動物は、野生型伝染性ファルビキウス病ウイルス（ｂｕｒｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスまたは伝染性気管支炎ウイルスによって感染された宿主動物から、野生型ウイルスに通常存在する抗原が存在しないことによって、区別され得る。さらに、ヘルペスウイルスベクターが、免疫原性ポリペプチドをコードするそのゲノムの部分の欠失を含む場合、欠失された部分の産物に対してワクチン接種された動物からの免疫応答が欠失することによって、ワクチン接種された動物が示される。
【００７３】
本発明はまた、遺伝子欠損を制御するための遺伝子治療が必要である動物に、遺伝子治療を提供するための方法を含み、この方法は、この動物に、生組換えヘルペスウイルス（これは、非欠失形態の上記遺伝子をコードする外来ヌクレオチド配列を含む）を、組換えウイルスベクターのゲノムが、上記の哺乳動物のゲノム中に組み込まれるかまたは独立して染色体外的に保持されるかして、標的器官または組織において目的の遺伝子の発現を与える条件下で、投与する工程を包含する。
【００７４】
欠失遺伝子またはその部分を置換するためのこれらの種類の技術は、当業者によって使用される。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第５，３９９，３４６号）は、遺伝子治療に関する技術を記載する。さらに、好都合な遺伝子治療に使用するために組み込まれ得る、外来ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列またはその部分の例としては、嚢胞性線維症膜貫通調節遺伝子（ＣＦＴＲ遺伝子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ））、ヒトミニジストロフィン遺伝子、α−抗トリプシン遺伝子などが挙げられる。
【００７５】
組換えヘルペスウイルスの構築、選択および精製に関する方法は、以下の実施例に詳述される。以下の実施例は、特定の好ましい実施形態および本発明の局面を示すために役立ち、本発明の範囲を制限するを解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
（マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）ストックの調製）
マレク病ウイルスストックサンプルは、２ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００ユニット／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＨＡＭ’Ｓ  Ｆ１０および１９９培地の１：１混合物（これらの成分は、Ｓｉｇｍａまたは同等の供給者から得、そしてこれより後は、完全ＤＭＥ培地として呼ぶ）（１％ウシ胎仔血清を含む）中、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で組織培養細胞を感染させることによって調製した。細胞変性効果が完了した後、培地および細胞を回収し、そして細胞を、臨床遠心分離機中、３０００ｒｐｍ、５分間でペレットにした。感染された細胞は、２０％ウシ胎仔血清、１０％  ＤＭＳＯを含む完全培地中に再懸濁し、そして−７０℃で凍結保存した。
【００７７】
（実施例２）
（マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）ＤＮＡの調製）
マレク病ウイルスの全ての操作は、菌株ＧＡ５（ＡＴＣＣ  ＃６２４）またはＲｉｓｐｅｎｓ  ＣＶＩ−９８８（Ｖｉｎｅｌａｎｄ  Ｌａｂｓ）を用いて行った。感染された細胞の細胞質からのＭＤＶウイルスＤＮＡの調製に関して、初代ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の過剰増殖前に、広範な細胞変性効果が起こるに十分なＭＯＩで感染させた。全てのインキュベーションは、５％  ＣＯ2空気中の加湿インキュベーターにおいて、３９℃で行った。最高のＤＮＡ収量は、最大に感染されたが、不完全な細胞溶解を示す単層を収集することによって得た（代表的に５〜７日）。感染された細胞は、細胞スクレーパを用いて培地中に細胞をこすり取ることによって収集した。この細胞懸濁液を、ＧＳ−３ローター中、３０００ｒｐｍ、１０分間、５℃で遠心分離した。
【００７８】
生じたペレットを、冷ＰＢＳ（２０ｍｌ／ローターボトル）中に再懸濁し、そして冷やしながら３０００ｒｐｍで１０分間さらに遠心分離に供した。ＰＢＳをデカントした後、その細胞ペレットをＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の４ｍｌ／ローターボトル中に再懸濁した。ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０；Ｓｉｇｍａ）を、時々混合しながら０．５％の最終濃度までサンプルに添加した。そのサンプルを、冷やしながら１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、核をペレットにし、そして細胞の細片を除去した。上清の流体を注意深く１５ｍｌのＣｏｒｅｘ遠心分離チューブに移した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ  ｐＨ  ８．０）およびＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム；２０％保存）の両方を、それぞれ、最終濃度が５ｍＭおよび１％までサンプルに添加した。１００μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をサンプル４ｍｌ当たりに添加し、混合し、そして４５℃で１〜２時間インキュベートした。この期間の後、等量の飽和フェノールをサンプルに添加し、そして手で穏やかに混合した。このサンプルを臨床遠心分離機中、５分間、３０００ｒｐｍで回転させ、相を分離させた。酢酸ナトリウム（保存溶液は３Ｍ  ｐＨ５．２）を０．３Ｍの最終濃度で水相に添加し、そして核酸を２．５容量の冷無水エタノールを添加した後に−７０℃で３０分間沈澱させた。サンプル中のＤＮＡは、ＨＢ−４ローター中５℃で、２０分間、８０００ｒｐｍで回転させることによってペレットにした。上清を注意深く除去し、そしてＤＮＡペレットを２５ｍｌの８０％エタノールを用いて１回洗浄した。ＤＮＡペレットを真空によって簡単に乾燥させ（２〜３分間）、そして５０μｌ／感染された細胞のローターボトルのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。代表的には、ウイルスＤＮＡの収量は、５〜１０μｇ／感染された細胞のローターボトルの間の範囲であった。全てのウイルスＤＮＡは、約１０℃で保存した。
【００７９】
（実施例３）
（ＤＮＡ配列決定）
ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；製造者らの指示書に従って）を用いた蛍光標識ジデオキシ配列決定反応をし、そして製造者らの指示書に従ってＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシークエンサーＭｏｄｅｌ  ３７３Ａ上で電気泳動することによって、実施した。ｄＧＴＰ混合物およびｄＩＴＰ混合物の両方を用いた反応を、圧縮の領域を明確にするために実施した。あるいは、圧縮領域は、ホルムアミドゲル上で分離させた。テンプレートは、二本鎖プラスミドサブクローンまたは一本鎖Ｍ１３サブクローンであり、そしてプライマーは、配列決定される挿入物のちょうど外側のベクターか、または以前に得られた配列のいずれかに対して作製した。得られた配列を集め、そしてＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて比較した。
【００８０】
（実施例４）
（分子生物学的技術）
細菌およびＤＮＡの操作に関する技術（制限エンドヌクレアーゼを用いた消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼを用いたリン酸化、ホスファターゼを用いた処理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡを用いた細菌の形質転換、および他の分子生物学的方法のような手順を含む）は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ’ｓ，Ｉｎｃ．によって記載される。記載される以外、これらは、少し改変して使用した。
【００８１】
（実施例５）
（ポリメラーゼフィルイン反応）
ＤＮＡを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および４００μＭの４つのデオキシヌクレオチド各々を含む緩衝液中に再懸濁した。１０ユニットのＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を添加し、そして反応を１５分間室温で進行させた。次いで、このＤＮＡをフェノール抽出し、そして上記のようにエタノール沈殿した。
【００８２】
（実施例６）
（ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、種々のＤＮＡの操作に簡便な制限部位を導入した。使用した手順は、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、８４−９１、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０）によって記載される。一般的に、増幅されたフラグメントは、サイズが５００塩基対未満であり、そして増幅されたフラグメントの重要な領域は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。各場合に使用したプライマーは、以下の相同性ベクターの構築の説明に詳述する。
【００８３】
（実施例７）
（感染された細胞の溶解物の調製）
２５ｃｍ2フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿中の、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）ニワトリ胚線維芽細胞のコンフルエントな単層を、１００μｌのウイルスサンプルを用いて感染させた。細胞変性効果が完全になった後、培地および細胞を収集し、そして細胞を、臨床遠心分離機中、３０００ｒｐｍ、５分間でペレットにした。この細胞ペレットを２５０μｌの破壊緩衝液（２％  ドデシル硫酸ナトリウム、２％  β−メルカプトエタノール）中に、再懸濁した。このサンプルを、氷上で３０秒間超音波処理し、そして−２０℃で保存した。
【００８４】
（実施例８）
（ウエスタンブロット手順）
溶解物のサンプルおよびタンパク質標準物質を、Ｌａｅｍｎｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：６８０の手順に従ってポリアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルを電気泳動した後、このタンパク質を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従って、トランスファーし、そして処理した。一次抗体は、Ｔｒｉｓ−塩化ナトリウムおよびアジ化ナトリウム（ＴＳＡ：１ｌのＨ2Ｏ当たり６．６１ｇ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．９７ｇ  Ｔｒｉｓ塩基、９．０ｇＮａＣｌおよび２．０ｇ  アジ化ナトリウム）中の５％脱脂粉乳を用いて１：１００希釈した。二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合体化し、そしてＴＳＡを用いて１：１０００希釈した。
【００８５】
（実施例９）
（ｃＤＮＡクローニング手順）
ｃＤＮＡクローニングとは、最新技術の手順に従ってＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に変換するために使用される方法をいう。出願人の方法は、（Ｕ．ＧｕｂｌｅｒおよびＢ．Ｊ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ  ２５，２６３−２６９）に記載される。Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、出願人によって使用された手順と非常に類似し、そして我々の結果の再現に使用され得る試薬および手順のセットを含むｃＤＮＡクローニングキットを設計した。
【００８６】
ウイルスｍＲＮＡ種のクローニングに関して、ウイルスによる感染に感受性な宿主細胞株を、細胞当たり５〜１０プラーク形成単位で感染させた。細胞変性効果が明白な場合であるが全て破壊する前に、培地を除去し、そして細胞を１０ｍｌの溶解緩衝液（４Ｍ  グアニジンチオシアネート、０．１％  アンチフォームＡ（ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ）、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ７．０、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール）中に溶解した。細胞溶解物を滅菌したＤｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーに注ぎ、そして溶液が均質になるまで、氷上で８〜１０分間ホモジナイズした。ＲＮＡ精製に関して、８ｍｌの細胞溶解液を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１遠心分離チューブ中、３．５ｍｌのＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ  ＣｓＣｌ、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ７．０）上に穏やかに重層した。サンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ローター中、２０℃で３６０００ｒｐｍ、１８時間遠心分離した。このチューブを氷上に置き、そしてチューブからの上清を注意深く吸引によって除去し、ＲＮＡペレットを乱さないようにした。ペレットを４００μｌのガラス蒸留水中に再懸濁し、そして２．６ｍｌのグアニジン溶液（７．５Ｍ  グアニジン−ＨＣＬ、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ７．０、５ｍＭ  ジチオトレイトール）に添加した。０．３７容量の１Ｍ酢酸を添加し、続いて０．７５容量の冷エタノールを添加し、そしてサンプルを−２０℃に１８時間置いてＲＮＡを沈澱させた。沈澱物は、ＳＳ３４ローター中、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機で１０分間、４℃、１００００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。そのペレットを１．０ｍｌの滅菌水に溶解し、１３０００ｒｐｍで再び遠心分離し、そして上清を保存した。ＲＮＡをそのペレットから上記のように０．５ｍｌの滅菌水を用いてさらに２回再抽出し、そして、上清をプールした。０．１容量の２Ｍ  酢酸カリウム溶液をサンプルに添加し、続いて２倍の冷エタノールを添加し、そしてサンプルを−２０℃で１８時間置いた。沈澱したＲＮＡをＳＳ３４ローター中、４０℃、１０分間、１００００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。そのペレットを１ｍｌの滅菌水に溶解し、そして濃度は、Ａ２６０／２８０の吸収によって得た。このＲＮＡは、−７０℃で保存した。
【００８７】
ポリアデニル化テイル（ｐｏｌｙ−Ａ）を含むｍＲＮＡを、オリゴｄＴセルロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＃２７  ５５４３−０）を用いて選択した。３ｍｇの総ＲＮＡを煮沸し、そして冷却し、結合緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０、０．１％  ドデシル硫酸リチウム）中、１００ｍｇオリゴｄＴセルロースカラムに適用した。保持されたポリ−Ａ  ＲＮＡを、溶出緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）を用いてカラムから溶出した。このｍＲＮＡを結合緩衝液中、オリゴｄＴカラムに再び適用し、そして溶出緩衝液を用いて再び溶出した。このサンプルを２００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２容量の冷エタノールを用いて−２０℃、１８時間で沈澱させた。このＲＮＡは、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。
【００８８】
１０μｇのポリ−Ａ  ＲＮＡを、２０ｍＭの水酸化メチル水銀中、６分間、２２℃で変性させた。β−メルカプトエタノールを７５ｍＭまで添加し、そしてそのサンプルを５分間、２２℃でインキュベートした。第１鎖のｃＤＮＡ合成のための０．２５ｍｌの反応混合物は、１μｇ  オリゴ−ｄＴプライマー（Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）もしくは１μｇの合成プライマー、２８ユニットの胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  ＃５５１８ＳＡ）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．８ｍＭ  ＤＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１００マイクロキューリーの32Ｐ−標識ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ＃ＮＥＧ−０１３Ｈ）ならびに１８０ユニットのＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ＃ＭＧ  １０１）を含んだ。この反応液を４２℃で９０分間インキュベートし、次いで２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０を用いて終了させた。このサンプルを、等量のフェノール／クロロホルム（１：１）を用いて抽出し、そして２Ｍ  酢酸アンモニウムおよび２容量の冷エタノールを用いて−２０℃、３時間で沈澱させた。沈澱および遠心分離後、このペレットを１００μｌの滅菌水に溶解した。サンプルを、緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中、１５ｍｌ  Ｇ−１００  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロードした。抽出されたＤＮＡ画分の立ち上がり（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）をプールし、そしてＤＮＡを、体積が約１００μｌになるまで凍結乾燥することによって濃縮し、次いでＤＮＡを上記のように酢酸アンモニウムおよびエタノールを用いて沈澱させた。
【００８９】
第１鎖のサンプル全体を、５０μｇ／ｍｌ  ｄＮＴＰ、５．４ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＃６４２−７１１）、および１００ユニット／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃２０５）（総体積  ５０μｌ）を使用する以外はＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（前出）の方法に従う、第２鎖反応に使用した。第２鎖合成の後、そのｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、そして沈澱させた。ＤＮＡを１０μｌの滅菌水に再懸濁し、１μｇ  ＲＮａｓｅ  Ａを用いて１０分間、２２℃で処理し、そして４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート  ｐＨ  ６．８５中、アガロースゲル（シグマ  Ｔｙｐｅ  ＩＩアガロース）を介して電気泳動させた。そのゲルをエチジウムブロマイドを用いて染色し、そして予想のサイズの範囲のＤＮＡをゲルから切除し、そして８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート  ｐＨ  ６．８５中で電気溶出した。電気溶出したＤＮＡを約１００μｌまで凍結乾燥し、そして酢酸アンモニウムおよびエタノールを用いて上記のように沈澱させた。このＤＮＡを２０μｌの水に再懸濁した。
【００９０】
オリゴｄＣテールを、クローニングを容易にするために、そのＤＮＡに付加した。この反応は、そのＤＮＡ、１００ｍＭカコジル酸カルシウム（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ  ジチオスレイトール、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、８０μｍｏｌ  ｄＣＴＰ、および２５単位の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ＃Ｓ１００１）を、５０μｌ中に含んだ。３７℃で３０分後、この反応を１０ｍＭ  ＥＤＴＡで終了させ、そしてそのサンプルを、上記のようにフェノール／クロロホルム抽出し、そして沈殿させた。
【００９１】
ｄＣテール化ＤＮＡサンプルを、２００μｌの０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中で、オリゴｄＧテール（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  ＃５３５５  ＳＡ／ＳＢ）を含む２００ｎｇのプラスミドベクターｐＢＲ３２２に、６５℃で２分間、次いで５７℃で２時間、アニーリングさせた。Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６６、５５７〜５８０、１９８３により記載されるように、新鮮なコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ−１細胞を調製し、そして２００μｌの細胞アリコート２０個においてこのアニールしたｃＤＮＡサンプルの半分を使用して、形質転換した。形質転換した細胞を、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬブロス寒天プレート上に配置した。コロニーを、Ａｍｐｓｃｒｅｅｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  ＃５５３７  ＵＡ）を使用して、アンピシリン遺伝子へのインサートの存在についてスクリーニングし、そして陽性コロニーを分析用に拾った。
【００９２】
（実施例１０）
（組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション）
この方法は、以下の改変を加えた、ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２〜１１７４（１９８４）のポリブレン−ＤＭＳＯ手順に基づく。組換えＭＤＶウイルスの生成は、ＭＤＶウイルスＤＮＡと、適切なヘルペスウイルスのクローン配列が隣接する所望の外来ＤＮＡを含むプラスミド相同性ベクターとの間の、相同組換えに依存する。トランスフェクションを、５０％コンフルエントな一次ニワトリ胚線維芽（ＣＦＦ）細胞の６ｃｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｐｌａｓｔｉｃ）にて実行した。この細胞は、４μｇ／ｍｌポリブレン（１×ＨＢＳＳ中４ｍｇ／ｍｌのストック）を含む、ＣＥＦ増殖培地（１×Ｆ１０／１９９、５％ウシ胎仔血清、２％グルタミン、１％非必須アミノ酸、および２％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に前日に配置した。ＣＥＦ細胞への同時トランスフェクションのために、５μｇのインタクトＭＤＶ  ＤＮＡを、３０μｇ／ｍｌポリブレン（１×ＨＢＳＳ中４ｍｇ／ｍｌのストック）を含む１ｍｌのＣＥＦ培地中に懸濁した。次いで、このＤＮＡ−ポリブレン懸濁物（１ｍｌ）を、培地を吸引したＣＥＦ細胞の６ｃｍプレートに添加し、そして３９℃で３０分間インキュベートした。このプレートをこの時間の間周期的に揺り動かし、接種物を再分布させた。この期間の後、４ｍｌのＣＥＦ増殖培地を、プレートを洗浄するために直接添加し、そして３９℃でさらに２．５時間インキュベートした。この時点で、この培地を各プレートから除去し、そして細胞に、１×ＨＢＳＳ中３０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）２ｍｌを用いて、室温で４分間ショックを与えた。この３０％  ＤＭＳＯを注意深く除去し、そして単層を、室温にて、１×ＨＢＳＳで１回洗浄した。次いで、細胞に、５ｍｌのＣＥＦ増殖培地を添加した後、３９℃でこの細胞をインキュベートした。翌日、培地を交換して、ＤＭＳＯの最後の残渣まで取り除き、そして細胞増殖を刺激した。ウイルスからの細胞変性効果は、６日間以内に明らかになる。高力価ストック（８０％〜９０％  ＣＰＥ）の生成は、通常は、この日から１週間以内に行い得る。ＭＤＶストックサンプルを、２０％ウシ胎仔血清、１０％  ＤＭＳＯを含むＣＥＦ増殖培地中に感染した細胞を再懸濁することによって調製し、そして−７０℃にて貯蔵した。
【００９３】
（実施例１１）
（β−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＣアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ））
Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組換えウイルスに組み込んだ場合、その組換え体を含むプラークを、簡単な２つの方法のうちの１つにより視覚化した。第１の方法において、化学物質ＢｌｕｏｇａｌTM（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を、プラークアッセイの間にアガロース重層物に組み込んだ（２００μｇ／ｍｌ）。そして活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークは、青色に変化した。次いで、この青色プラークを新鮮なＣＥＦ細胞へと拾い、そしてさらなる青色プラーク単離により精製した。第２の方法において、ＣＰＲＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、プラークアッセイの間にアガロース重層物に組み込んだ（４００μｇ／ｍｌ）。活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークは、赤色に変化した。次いで、この赤いプラークを新鮮なＣＥＦ細胞へと拾い、そしてさらなる赤色プラーク単離によって精製した。両方の場合において、代表的には、ウイルスを、３回〜４回のプラーク精製により精製した。
【００９４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子を組換えウイルスに組み込んだ場合、この組換えウイルスを含むプラークを、発色性基質Ｘ−β−Ｄ−ｇｌｕＵＡ  ＣＨＸ（Ｘ−ＧＬＵＣ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ；Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、プラークアッセイの間にアガロース重層物に組み込んだ（２００μｇ／ｍｌ）。そして活性なβ−グルクロニダーゼを発現するプラークは、青色に変化した。次いで、その青色プラークを新鮮なＣＥＦ細胞へと拾い、そしてさらなる青色プラーク単離によって精製した。
【００９５】
（実施例１２）
（黒色プラークアッセイを使用する、組換えマレク病ウイルスにおける外来ＤＮＡ配列発現についてのスクリーニング）
組換えＭＤＶウイルスにより発現される外来抗原の発現を分析するために、ＣＥＦ細胞の単層を組換えＭＤＶに感染させ、栄養アガロース培地を重層し、そして３９℃で４〜５日間インキュベートする。一旦プラークが発色すると、アガロース重層物をディッシュから除去し、単層を１×ＰＢＳでリンスし、室温で１０分間１００％メタノールで固定し、そして細胞を風乾する。プレートをＰＢＳで再水和した後、一次抗体を適切な希釈物までＰＢＳで希釈し、そして室温にて２時間〜一晩、細胞単層とともにインキュベートする。次いで、非結合抗体を、ＰＢＳによる室温にて３回の洗浄によって細胞から除去する。アルカリホスファターゼ結合体化二次抗体をＰＢＳで希釈し、そして室温にて２時間細胞とともにインキュベートする。次いで、非結合二次抗体を、室温にてＰＢＳを用いて３回細胞を洗浄することによって除去する。次いで、単層を発色緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中でリンスし、次いで、新たに調製した基質溶液（発色緩衝液中、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｎｉｔｒｏ  Ｂｌｕｅテトラゾリウム＋０．１５ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ）とともに、１０分間〜一晩、室温でインキュベートする。最後に、反応を、基質溶液をＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に置換することによって停止する。正しい抗原を発現するプラークは、黒色に染まる。
【００９６】
（実施例１３）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ５４．５に外来ＤＮＡを挿入されたプラスミド）
プラスミド４４０−２９．２を、１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。このプラスミドは、１型マレク病ウイルスの、約２５９６塩基対のＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメント（配列番号１）を含む。このＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグメント中の３つのオープンリーディングフレームは、ＵＬ５４（ＩＣＰ２７）ＯＲＦ（配列番号１の１位〜１３５３位）、以前に未同定であったＯＲＦ（従ってＵＬ５４．５と名付けた）（配列番号１の２１８７位〜１４８３位）およびＵＬ５５（配列番号１の２４５９位〜２５９３位）のヘルペスウイルスホモログである（表１および表２を参照のこと）。ＭＤＶ−１  ＵＬ５４（ＩＣＰ２７）遺伝子に広がるＤＮＡ配列（１４９２塩基対）は、公開されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９４年１０月；２０４（１）：２４２〜５０）。ＭＤＶ  ＩＣＰ２７（ＨＳＶ−１  ＩＣＰ２７に対する有意な類似性に基づく）は、１４１９ヌクレオチド長であり、かつ４７３アミノ酸（５４．５ｋＤａ）をコードする。ＵＬ５５  ＯＲＦは短縮型であり、そしてこのタンパク質の最初の４９アミノ酸のみしか含まない。ＵＬ５とＵＬ５５との間に位置する潜在的ＯＲＦを同定した。このＯＲＦは、７０５塩基対長であり、そしておそらく、サイズが２３５アミノ酸のタンパク質をコードする。このＵＬ５４．５アミノ酸配列を使用してのタンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索によって、ＭＤＶ−２中に類似の遺伝子を同定した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９４年５月１５日；２０１（１）：１４２〜６）。このＭＤＶ−２遺伝子が、１型ウマヘルペスウイルスの第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ−１）と低い相同性を共有することが注目された。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ５４．５タンパク質の類似性指標は、１７０アミノ酸のコンセンサス長にわたって、６３％である。ＵＬ５４．５は、ＵＬ５４およびＵＬ５５に対して、反対の方向で転写される。
【００９７】
ＵＬ５４．５  ＯＲＦは、非必須であり、そしてこのＯＲＦ中またはこれらのＯＲＦ間の遺伝子間領域に、外来ＤＮＡが挿入される。この領域中のすべての制限部位が、外来ＤＮＡのための挿入部位として有用である。唯一ではないこの領域中の制限酵素部位は、その部位を唯一の制限酵素認識配列へと変換するＤＮＡリンカーの挿入によって変更する。好ましくは、外来ＤＮＡの挿入のために使用する制限酵素部位は、この２５９６塩基対のＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメント中約ヌクレオチド２５９６にある、ＮｄｅＩ部位である。この挿入部位は、ＵＬ５４．５  ＯＲＦ中で、このオープンリーディングフレームのアミノ酸４とアミノ酸５との間にある。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約３０４５塩基対のＢａｍＨＩ制限フラグメントに由来した。フラグメント１は、１型マレク病ウイルスの約２５９６塩基対の、ＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグメントである。プラスミド４４０−２９．２を使用して、組換えマレク病ウイルス中への外来ＤＮＡの挿入のための相同性ベクターを作製した。
【００９８】
（実施例１４）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ５４．５に伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡが挿入されたプラスミド）
プラスミド９８０−８５．１を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）中に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。このプラスミドは、ＭＤＶ−１  ＤＮＡが隣接する、ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組み込む。これらの遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換した唯一のＮｄｅＩ部位に挿入した。この外来ＤＡＮ配列の上流は、ＭＤＶ  ＤＮＡの約４２２塩基対フラグメントである。この外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ  ＤＮＡの約２１７４塩基対フラグメントである。ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子ならびにＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の転写の方向は、ＭＤＶのＵＬ５４  ＯＲＦおよびＵＬ５５  ＯＲＦの転写の方向と反対である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイルスを生成するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）、ならびにβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＣアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）に従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。ＩＬＴＶ  ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、それらの遺伝子自身の各内因性ＩＬＴＶプロモーターからの重複転写物として発現され、そしてそれらの自身の内因性ポリアデニル化シグナルを共有し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーターから転写され、それにＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。
【００９９】
プラスミド９８０−８５．１を、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、以下の供給源由来の制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築した。ＩＬＴ  ｇＤ、ｇＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換した唯一のＮｄｅＩ部位に、相同性ベクター４４０−２９．２へのカセットとして挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約３０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。フラグメント１は、ＭＤＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメントＭの、約４１８塩基対のＢａｍＨＩ〜ＮｄｅＩ制限サブフラグメントである。フラグメント２は、ＩＬＴ  Ａｓｐ  ７１８１ゲノムフラグメント＃８（１０．６ｋｂ）の、約３５５６塩基対のＳａｌＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃１０の、約４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラグメント４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩゲノムフラグメント＃７の、約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント６は、ＭＤＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメントＭの、約２１７４塩基対のＮｄｅＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。
【０１００】
（実施例１５）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ５４．５にニューカッスル病ウイルスＤＮＡが挿入されたプラスミド）
プラスミド９８０−４６．７４を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）中に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。このプラスミドは、ＭＤＶ  ＤＮＡが隣接する、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子ならびにニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆ遺伝子を組み込む。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子ならびにＮＤＶ  Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換した唯一のＮｄｅＩ部位に、相同性ベクター４４０−２９．２（実施例１３）へのカセットとして挿入した。
【０１０１】
この外来ＤＡＮ配列の上流は、ＭＤＶ  ＤＮＡの約４２２塩基対フラグメントである。この外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ  ＤＮＡの約２１７４塩基対フラグメントである。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子ならびにＮＤＶ  Ｆ遺伝子の転写の方向は、ＭＤＶのＵＬ５４  ＯＲＦおよびＵＬ５５  ＯＲＦの転写の方向と反対である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイルスを生成するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）、ならびにβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＣアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）に従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあり、それにＨＳＶ  ＴＫポリアデニル化シグナルが続く。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーターから転写され、ＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。
【０１０２】
プラスミド９８０−８５．１を、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、以下の供給源由来の制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子ならびにＮＤＶ  Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換した唯一のＮｄｅＩ部位に、相同性ベクター４４０−２９．２（実施例１３）へのカセットとして挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約３０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。フラグメント１は、ＭＤＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメントＭの、約４１８塩基対のＢａｍＨＩ〜ＮｄｅＩ制限サブフラグメントである。フラグメント２は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃１０の、約４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラグメント３は、プラスミドｐＪＦ７５１の、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメントである。フラグメント４は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７の、約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント５は、ＨＣＭＶゲノムのＸｂａＩ  Ｅフラグメントの、約１１９１塩基対のＰｓｔＩ〜ＡｖａＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント６は、全長ＮＤＶ  Ｆ  ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の、約１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラグメントである。フラグメント７は、ＨＳＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱの、約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。最後のフラグメントは、ＭＤＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント「Ｍ」の、約２１７４塩基対のＮｄｅＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。
【０１０３】
（実施例１６）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入された外来ＤＮＡを有するプラスミド）
プラスミド９６２−８０．１を、１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）中に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。これは、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメント（配列番号２）を含む。３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメント内の３つのオープンリーディングフレームは、ＵＬ４２  ＯＲＦ（配列番号２の３５位〜１１４４位）、ＵＬ４３（配列番号２の１３０４位〜２５６６位）、およびＵＬ４４（ｇＣ）（配列番号２の２７８６位〜３２２０位）のヘルペスウイルスホモログである（図３および図４を参照のこと）。ＭＤＶ−１  ＵＬ４４（ｇＣ）遺伝子およびプロモーター領域にわたるＤＮＡ配列（７３２塩基対）が、公開されている（Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ３，１２５〜１３７（１９８９））。ＭＤＶ−２  ＵＬ４２、ＵＬ４３およびＵＬ４４遺伝子のＤＮＡ配列が、公開されている（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９（Ｐｔ  ８），１９９７〜２００１（１９９８））。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ４２タンパク質の類似性指数は、３６９アミノ酸のコンセンサス長に対して７４パーセントである。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ４３タンパク質の類似性指数は、４０１アミノ酸のコンセンサス長に対して５４パーセントである。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ４４タンパク質の類似性指数は、１４５アミノ酸のコンセンサス長に対して４５パーセントである。ＭＤＶ−１  ＵＬ４３  ＯＲＦは、非必須であり、そして外来ＤＮＡを、このＯＲＦ内に、またはＯＲＦ間の遺伝子間領域中に挿入する。この領域内の任意の制限部位は、外来ＤＮＡの挿入部位として有用である。唯一ではないこの領域内の制限酵素部位を、ＤＮＡリンカーの挿入によって変更する。このＤＮＡリンカーによって、この部位が唯一の制限酵素認識配列に変換される。好ましくは、外来ＤＮＡの挿入に使用される制限酵素部位は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメントにおけるおよそヌクレオチド１３８６でのＸｈｏＩ部位である。この挿入部位は、ＵＬ４３  ＯＲＦ内に、このオープンリーディングフレームのアミノ酸２９と３０との間にある。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のおよそ３０４５塩基対のＢａｍＨＩ制限フラグメントに由来した。フラグメント１は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメントである。プラスミド９６２−８０．１を使用して、組換えマレク病ウイルス中への外来ＤＮＡの挿入のための相同ベクターを作製した。
【０１０４】
（実施例１７）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入された感染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡを有するプラスミド）
プラスミド９８０−８５．２２を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。これは、ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子ならびにＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＭＤＶ−１  ＤＮＡに隣接して組み込んでいる。これらの遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用して、ＰａｃＩ部位に変換した唯一のＸｈｏＩ部位に挿入した。外来ＤＮＡ配列の上流は、ＭＤＶ  ＤＮＡのおよそ１３８６塩基対のフラグメントである。外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ  ＤＮＡのおよそ１８２６塩基対のフラグメントである。ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子ならびにＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の転写方向は、ＭＤＶ  ＵＬ４２およびＵＬ４３  ＯＲＦと同じ転写方向である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）およびβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣｐｒｇアッセイ）、またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）に従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。ＩＬＴＶ  ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、それら独自のそれぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターから重複転写物として発現され、そしてそれら独自の内因性ポリアデニル化シグナルを共有し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ  ｇＸプロモーターから転写して、そしてＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。
【０１０５】
プラスミド９８０−８５．２２を、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して、以下の供給源からの制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築した。ＩＬＴ  ｇＤ、ｇＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、唯一のＸｈｏＩ部位（これは、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位に変換された）にて、相同ベクター９６２−８０．１に、カセットとして挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のおよそ３０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。フラグメント１は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ１３８６塩基対のＳａｃＩ〜ＸｈｏＩ制限サブフラグメントである。フラグメント２は、ＩＬＴＡｓｐ７１８Ｉゲノムフラグメント番号８（１０．６キロベース）のうちの、およそ３５５６塩基対のＳａｌＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント番号１０のうちの、およそ４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラグメント４は、プラスミドｐＪＦ７５１のうちの、およそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメントである（１１）。フラグメント５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント番号７のうちの、およそ７５４塩基対のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント６は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ１８２６塩基対のＸｈｏＩ〜ＢｇｌＩＩ制限サブフラグメントである。
【０１０６】
（実施例１８）
（オープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入された感染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡを有する組換え１型マレク病ウイルス）
Ｓ−ＭＤＶ−００６は、３つの外来ＤＮＡ配列を発現する１型マレク病ウイルスである。ＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩの遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、唯一のＰａｃＩ制限部位（１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメントのＵＬ４３  ＯＲＦ中の独特なＸｈｏＩ制限部位に挿入されたＰａｃＩリンカー）に挿入した。ＩＬＴＶ  ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、それらの独自のそれぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターから重複転写物として発現され、そしてそれら独自の内因性ポリアデニル化シグナルを共有し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ  ｇＸプロモーターから転写させ、そしてＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。Ｓ−ＭＤＶ−００６は、Ｓ−ＭＤＶ−００２（ＭＤＶ−１；ＣＶＩ−９８８  Ｒｉｓｐｅｎｓ）由来であった。組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション手順（実施例１０）において、相同ベクター９８０−８５．２２およびウイルスＳ−ＭＤＶ−００２を利用して、これを達成した。同時トランスフェクションストックを、β−グルクロニダーゼによってスクリーニングした（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）。赤色プラーク精製の最終的な結果は、Ｓ−ＭＤＶ−００６と命名される組換えウイルスであった。このウイルスを、実施例１１に記載されるように青色プラークアッセイによってモニターされるβ−ガラクトシダーゼの発現、純度、および複数の継代によるインサートの安定性についてアッセイした。最初の４回の精製後に、観察された全てのプラークは、青色であり、このことは、このウイルスが純粋であり、安定であり、そして外来ＤＮＡ配列を発現していることを示す。
【０１０７】
Ｓ−ＭＤＶ−００６を、黒色プラークアッセイを使用する組換えマレク病ウイルスにおける外来ＤＮＡ配列の発現についてのスクリーニング（実施例１２）を使用して、ＩＬＴ特異的抗原の発現についてアッセイした。ポリクローナルニワトリ抗ＩＬＴ血清（ＳＰＡＦＡＳ）は、Ｓ−ＭＤＶ−００６プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＭＤＶ−００２陰性コントロールプラークと特異的に反応しなかったことが示された。全てのＳ−ＭＤＶ−００６の観察されたプラークは、ポリクローナル血清と反応し、このことは、このウイルスが、ＩＬＴ外来ＤＮＡ配列を安定に発現していたことを示す。本明細書に記載されるアッセイを、ＣＥＦ細胞で行い、このことにより、ＣＥＦ細胞は、ＭＤＶ組換えワクチンの産生に適切な培養基であることが示された。
【０１０８】
Ｓ−ＭＤＶ−００６は、ＩＬＴ  ｇＤタンパク質およびｇＩタンパク質を発現し、かつＩＬＴ感染におけるワクチンとして有用である、組換え１型マレク病ウイルスである。Ｓ−ＭＤＶ−００６もまた、ＩＬＴ  ｇＤタンパク質およびｇＩタンパク質の発現に有用である。
【０１０９】
（実施例１９）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入されたニューカッスル病ウイルスＤＮＡを有するプラスミド）
プラスミド９８０−６０．０２を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆ遺伝子を、ＭＤＶ  ＤＮＡに隣接して組み込んでいる。このＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位に変換された唯一のＸｈｏＩ部位に、相同性ベクター９６２−８０．１へのカセットとして挿入した。
【０１１０】
外来ＤＮＡ配列の上流は、ＭＤＶ  ＤＮＡのおよそ１３８６塩基対のフラグメントである。外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ  ＤＮＡのおよそ１８２６塩基対のフラグメントである。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子の転写方向は、ＭＤＶ  ＵＬ４２およびＵＬ４３  ＯＲＦと同じ転写方向である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）およびβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣｐｒｇアッセイ）、またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）に従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあり、そしてＨＳＶ  ＴＫポリアデニル化シグナルが続く。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ  ｇＸプロモーターから転写させ、そしてＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。
【０１１１】
プラスミド９８０−８５．１を、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して、以下の供給源からの制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位に変換した唯一のＸｈｏＩ部位にて、相同ベクター９６２−８０．１中にカセットとして挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のおよそ３０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。
【０１１２】
フラグメント１は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ１３８６塩基対のＳａｃＩ〜ＸｈｏＩ制限サブフラグメントである。
【０１１３】
フラグメント２は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント番号１０のうちの、およそ４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラグメント３は、プラスミドｐＪＦ７５１のうちの、およそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメントである。フラグメント４は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメント番号７のうちの、およそ７５４塩基対のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント５は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ  Ｅフラグメントのうちの、およそ１１９１塩基対のＰｓｔＩ〜ＡｖａＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント６は、全長ＮＤＶ  Ｆ  ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のうちの、およそ１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラグメントである。フラグメント７は、ＨＳＶ  ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱのうちの、およそ７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。最後のフラグメントは、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ１８２６塩基対のＸｈｏＩ〜ＢｇｌＩＩ制限サブフラグメントである。
【０１１４】
（実施例２０）
（オープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入されたニューカッスル病ウイルスＤＮＡを有する組換え１型マレク病ウイルス）
Ｓ−ＭＤＶ−００４は、２つの外来ＤＮＡ配列を発現する１型マレク病ウイルスである。ニューカッスル病ウイルス融合物（Ｆ）の遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、唯一のＰａｃＩ制限部位（１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれるおよそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメントのＵＬ４３  ＯＲＦ中の唯一のＸｈｏＩ制限部位に挿入したＰａｃＩリンカー）中に挿入する。このＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあり、そしてＥ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ  ｇＸプロモーターから転写させ、そしてＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。Ｓ−ＭＤＶ−００４は、Ｓ−ＭＤＶ−００２（ＭＤＶ−１；ＣＶＩ−９８８  Ｒｉｓｐｅｎｓ）に由来する。組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）において、相同ベクター９８０−６０．０２およびウイルスＳ−ＭＤＶ−００２を利用して、これを達成する。同時トランスフェクションストックを、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣｐｒｇアッセイ）、またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終的な結果は、Ｓ−ＭＤＶ−００４と命名される組換えウイルスであった。このウイルスを、実施例１１に記載されるように青色プラークアッセイによってモニターされるβ−ガラクトシダーゼの発現、純度、および複数の継代によるインサートの安定性についてアッセイする。最初の４回の精製後に、観察された全てのプラークは、青色であり、このことは、このウイルスが純粋であり、安定であり、そして外来ＤＮＡ配列を発現していることを示す。
【０１１５】
Ｓ−ＭＤＶ−００４を、黒色プラークアッセイを使用する組換えマレク病ウイルスにおける外来ＤＮＡ配列の発現についてのスクリーニング（実施例１２）を使用して、ＮＤＶ特異的抗原の発現についてアッセイする。ＮＤＶ  Ｆに特異的なモノクローナル抗体は、Ｓ−ＭＤＶ−００４プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＭＤＶ−００２陰性コントロールプラークと特異的に反応しないことが示される。全てのＳ−ＭＤＶ−００４の観察されたプラークは、ポリクローナル血清と反応し、このことは、このウイルスが、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子を安定に発現していることを示す。本明細書に記載されるアッセイを、ＣＥＦ細胞で行い、このことにより、ＣＥＦ細胞は、ＭＤＶ組換えワクチンの産生に適切な培養基であることが示される。
【０１１６】
Ｓ−ＭＤＶ−００４は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質を発現し、ＮＤＶ感染におけるワクチンとして有用である、組換え１型マレク病ウイルスである。Ｓ−ＭＤＶ−００４もまた、Ｆタンパク質の発現に有用である。
【０１１７】
（実施例２１）
（１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ７、ならびに／あるいはオープンリーディングフレームＵＬ８およびＵＬ７の間に挿入された外来ＤＮＡを有するプラスミド）
プラスミドを、１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）中に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築する。これは、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｇ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ７３１６塩基対のサブフラグメント（配列番号３）を含む。７３１６塩基対のサブフラグメント内の５つのオープンリーディングフレームは、ＵＬ９  ＯＲＦ（配列番号３の１位〜４２５位）、ＵＬ８（配列番号３の４３９位〜２７４８位）、ＵＬ７（ｇＣ）（配列番号３の３６９９位〜２７８２位）、ＵＬ６（配列番号３の５７０４位〜３５３６位）、およびＵＬ５（配列番号３の５７７２位〜７３１６位）のヘルペスウイルスホモログである（図５および図６を参照のこと）。ＯＲＦ  ＵＬ８およびＵＬ７（配列番号３の２７４９位〜２７８１位）と、ＯＲＦ  ＵＬ６と重複しないＯＦＲ７の部分（配列番号３の２７８２位〜３５３５位）との間の領域は、ウイルス複製に必須ではなく、そして変異ウイルスおよび／または組換えウイルスを作製するために使用され得る。
【０１１８】
本発明の多くの改変およびバリエーションは、当業者に明らかなように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲が権利を付す均等物の全範囲とともに、このような特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。
［配列表］
【数１】
2010187679.tif 000002
【数２】
2010187679.tif 000003
【数３】
2010187679.tif 000004
【数４】
2010187679.tif 000005
【数５】
2010187679.tif 000006
【数６】
2010187679.tif 000007
【数７】
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【数８】
2010187679.tif 000009
【図１】
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【図２】
2010187679.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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