(57)【要約】【課題】煩雑な温度制御を行なわず、また特殊な酵素や特殊なプライマーを使用せずに実施可能な、核酸の増幅方法を提供すること。【解決手段】下記の工程（１）及び（２）を含む、核酸の増幅方法。（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を温度（T1）でインキュベートする工程；及び（２）工程（１）に連続して、温度（T1）よりも高い温度であって５０℃以上１００℃以下の温度（T2）でインキュベートする工程：【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（１）及び（２）を含む、核酸の増幅方法。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を温度（T1）でインキュベートする工程；及び
（２）工程（１）に連続して、温度（T1）よりも高い温度であって５０℃以上１００℃以下の温度（T2）でインキュベートする工程：
【請求項２】
温度（T1）が、１０℃以上５０℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温度（T1）と温度（T2）の温度差が５℃以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（１）が６０分以内で行なわれる、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
工程（２）が６０分以内で行なわれる、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端領域のみが鋳型となる核酸断片と実質的に相補的である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型となる核酸断片と連続した１箇所でのみ実質的に相補的である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反応溶液が、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤をさらに含む、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、又はポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
反応溶液が、２価の陽イオンをさらに含む、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項１から１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが、バチルス  ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ  、サーモコッカス  リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びアリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応溶液をインキュベートすることによってポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究においては、核酸の増幅は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法で行われている。核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く知られている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
【０００３】
そこで、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。
【０００４】
SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
【０００５】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
【０００６】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後、RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
【０００７】
特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。
【０００８】
特開２００２−２３３３７９号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特開２００２−２３３３７９号公報に記載の方法では、非特異的な増幅産物の生成が顕著であるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−１３０８７０号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９４０６号号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３７９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)
【非特許文献２】Bio Industry,第18巻、2号（2001）
【非特許文献３】Nature,350,91〜(1991)
【非特許文献４】J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、煩雑な温度制御を行なわず、また特殊な酵素や特殊なプライマーを使用せずに実施可能な、核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、反応速度のばらつきを抑えた核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、増幅反応の特異性が高い温度（T1）で反応溶液をインキュベートし、その後に連続して、増幅反応の効率が高い温度（T2）で反応溶液をインキュベートすることによって、標的核酸配列を特異的に増幅し、さらに増幅速度のばらつきを抑えることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明によれば、下記の工程（１）及び（２）を含む、核酸の増幅方法が提供される。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を温度（T1）でインキュベートする工程；及び
（２）工程（１）に連続して、温度（T1）よりも高い温度であって５０℃以上１００℃以下の温度（T2）でインキュベートする工程：
【００１４】
好ましくは、温度（T1）は１０℃以上５０℃以下である。
好ましくは、温度（T1）と温度（T2）の温度差は５℃以上である。
好ましくは、工程（１）は６０分以内で行なわれる。
好ましくは、工程（２）は６０分以内で行なわれる。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端領域のみが鋳型となる核酸断片と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸断片と連続した１箇所でのみ実質的に相補的である。
【００１５】
好ましくは、反応溶液は、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤をさらに含む。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、又はポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれる。
【００１６】
好ましくは、反応溶液は、２価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。
【００１７】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。
好ましくは、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼは、バチルス  ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ  、サーモコッカス  リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びアリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、増幅反応の特異性が高い温度（T1）で反応溶液をインキュベートし、その後、増幅反応の効率が高い温度（T2）で反応溶液をインキュベートすることにより、標的核酸配列の増幅における特異性を高めることが可能である。さらに、反応の特異性が高まったことの結果として、増幅産物が検出されまでの時間のばらつきを小さくすることが可能である。しかも、本発明によれば、複雑な温度制御、特殊な酵素の使用、複雑なプライマー設計も必要とせずに標的核酸配列を増幅することが可能であるため、簡便、迅速、高感度な核酸の増幅方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例で用いたプライマーのCYP2C9遺伝子に対する位置関係を示す。
【図２】図２は、反応液Ａ（工程（１）のインキュベーション無し）を、６０℃で６０分反応させ経時的に蛍光検出を行った結果を示す。
【図３】図３は、反応液Ｂ（工程（１）のインキュベーション(T1=25℃)が１０分間）を、６０℃(=T2)で６０分反応させ経時的に蛍光検出を行った結果を示す。
【図４】図４は、反応液Ｃ（工程（１）のインキュベーション(T1=25℃)が２０分間）を、６０℃(=T2)で６０分反応させ経時的に蛍光検出を行った結果を示す。
【図５】図５は、反応液Ｄ（工程（１）のインキュベーション(T1=25℃)が３０分間）を、６０℃(=T2)で６０分反応させ経時的に蛍光検出を行った結果を示す。
【図６】図６は、反応液Ａ（工程（１）のインキュベーション無し）を６０℃(=T2)で６０分反応させた後のサンプルについて電気泳動を行った結果を示す。
【図７】図７は、反応液Ｂ（工程（１）のインキュベーション(T1=25℃)が１０分間）を６０℃(=T2)で６０分反応させた後のサンプルについて電気泳動を行った結果を示す。
【図８】図８は、反応液Ｃ（工程（１）のインキュベーション(T1=25℃)が２０分間）を６０℃(=T2)で６０分反応させた後のサンプルについて電気泳動を行った結果を示す。
【図９】図９は、反応液Ｄ（工程（１）のインキュベーション(T1=25℃)が３０分間）を６０℃(=T2)で６０分反応させた後のサンプルについて電気泳動を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、下記の工程（１）及び（２）を含む。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を温度（T1）でインキュベートする工程；及び
（２）工程（１）に連続して、温度（T1）よりも高い温度であって５０℃以上１００℃以下の温度（T2）でインキュベートする工程：
【００２１】
本発明において、温度T1は、増幅反応効率が低く、温度T2は増幅反応効率が高い。同時に温度T1は鋳型となる核酸断片へのオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションの特異性が高いことが重要である。このような条件から、温度T1と温度T2の関係はT1＜T2となる。好ましくは、温度T1と温度T2の差は5℃以上である。より好ましくは、温度T1と温度T2の差は10℃以上である。さらに好ましくは、温度T1と温度T2の差は20℃以上である。
温度T2は５０℃以上１００℃以下である。
また温度T1は特には限定されないが、好ましくは１０℃以上５０℃以下である。
【００２２】
好ましくは、工程（１）は６０分以内で行なわれる。工程（１）は、より好ましくは５分以上６０分以内、さらに好ましくは１０分以上６０分以内、さらに好ましくは１５分以上６０分以内で行われる。
好ましくは、工程（２）は６０分以内で行なわれる。工程（２）は、より好ましくは５分以上６０分以内、さらに好ましくは１０分以上６０分以内、さらに好ましくは１５分以上６０分以内で行われる。
【００２３】
本発明における増幅方法は、温度（T1）と温度（T2）の両方で進行すればどのような機構で起こっても良い。例えば、プライマーに挟まれた領域のみが増幅されてもよい。または、プライマーによって伸長された核酸配列を介した組換え現象によって高分子量産物が増幅されてもよい。または、プライマーに付加されたTag配列を介した組換え現象によって高分子量産物が増幅されてもよい。
【００２４】
以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００２５】
また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。
【００２６】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いることが好ましい。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス  ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ  、サーモコッカス  リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
【００２７】
（３）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩、カルシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００２８】
（４）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、しょ糖脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ20、Ｔｗｅｅｎ40、Ｔｗｅｅｎ60、Ｔｗｅｅｎ80等）、脂肪酸アルカノールアミド、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ35、Ｂｒｉｊ58、等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎX-100、ＴｒｉｔｏｎX-114、Nonidet P40、等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。
【００２９】
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
【００３０】
【化１】
2010161935.tif 000002
【００３１】
（式中、ｘ + y + z + w = 20  であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００３２】
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
【００３３】
【化２】
2010161935.tif 000003
【００３４】
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。
【００３５】
（５）オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
【００３６】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、３'末端領域のみが鋳型となる核酸断片と実質的に相補的である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸断片と連続した１箇所でのみ実質的に相補的である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、このオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（オリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列がタグとして付加されている。
【００３７】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。
【００３８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
【００３９】
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。
【００４０】
（６）鋳型となる核酸断片
本発明において鋳型となる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡのいずれでもよい。鋳型となる核酸を含む可能性のある試料から調製した核酸を使用してもよいし、鋳型となる核酸を含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となる核酸を含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、精液、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、スワブ、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料から核酸を調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。核酸の試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
【００４１】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施することができる。逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは６から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは９から５０ヌクレオチド程度である。逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
【００４２】
本発明においては、ゲノムＤＮＡや核酸増幅断片のような二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして使用できる。上記二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに変性してから本発明の方法に使用してもよいし、このような変性を行うことなく本発明の方法に使用することもできる。
【００４３】
（７）鋳型となる核酸断片の前処理
本発明において鋳型となる核酸は、前処理工程を経た後に増幅鋳型として用いても良い。
前処理用の試薬は、例えば、界面活性剤、血液凝固防止剤、タンパク分解酵素、脂質分解酵素を含んでいてもよい。液性としては、酸性あるいはアルカリ性であってもよい。
前処理工程としては、高温（例えば９８℃）に加熱することや変性処理剤で処理する工程を含んでよい。また、高温に加熱後、４℃以下に急冷する工程を含んでもよい。
【００４４】
（８）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。
【００４５】
（９）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。
【００４６】
（１０）蛍光色素
本発明における反応溶液には、蛍光色素を含めることができる。蛍光色素としては、特に限定はないが、例えばSYBR Green Iなどを使用することができる。
【００４７】
（１１）本発明による核酸の増幅方法の利用
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出（一塩基多型の検出などを含む）などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
【００４８】
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。TaqmanプローブやMolecular Beaconを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、SPRを用いて増幅産物を検出してもよい。
【００４９】
ピロリン酸マグネシウムを検出することによっても核酸増幅の検出を行うことができる。この場合、濁度による検出など、その他の当業者に公知の方法により検出できる。
【００５０】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１＞核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ヒト血液由来のＤＮＡ３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、CYP2C9遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００５２】
＜プライマー＞
プライマーは、CYP2C9遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGTCCAGAGATACC−３'      （配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CAGGCTGGTGGGGAGA−３'   （配列番号２）
上記プライマーのCYP2C9遺伝子に対する位置関係の詳細を図１に示した。
【００５３】
（２）反応液の調製
以下に示す組成で反応液を調製した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                           １．０μＬ
100mM MgSO4                                  ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20                             ０．１μＬ
100% DMSO                                    ０．５μＬ
25mM dNTP each                               ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍希釈）                   ０．２μＬ
50μM primer(1)                              ０．６４μＬ
50μM primer(2)                              ０．６４μＬ
Bst. Polymerase                              ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料                       ３．０ｎｇ
精製水                                       ４．９６μＬ      
１０．０μＬ
【００５４】
（３）反応液のインキュベーション（工程（１））
前記（２）において調製した反応液を室温（T1＝２５℃）で０分から３０分インキュベートした。
反応液Ａ：インキュベーション無し（０分）
反応液Ｂ：１０分間インキュベーション
反応液Ｃ：２０分間インキュベーション
反応液Ｄ：３０分間インキュベーション
【００５５】
（４）核酸の増幅反応（工程（２））
前記（３）における反応液を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて６０℃（＝T2）、６０分反応させ、経時的に蛍光検出を行った。反応液Ａに対する結果を図２、反応液Ｂに対する結果を図３、反応液Ｃに対する結果を図４、反応液Ｄに対する結果を図５に示す。なお、実験はN=4で行った（４つの同一サンプルについて実験を行った）。
【００５６】
核酸試料由来のサンプルからの核酸増幅反応をリアルタイムに検出できることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出したところ、表１のような結果になった。
【００５７】
【表１】
2010161935.tif 000004
【００５８】
インキュベーション時間をおくことで、Ct値のばらつきが小さくなった。即ち、増幅速度のばらつきが小さくなった。
【００５９】
（５）増幅産物の電気泳動
増幅反応後のサンプルについて、３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。反応液Ａに対する結果を図６、反応液Ｂに対する結果を図７、反応液Ｃに対する結果を図８、反応液Ｄに対する結果を図９に示す。
【００６０】
インキュベーション時間を置かないサンプル（図６）では、N=4でばらばらのバンドパターンを示した。一方、インキュベーション時間が10分のサンプル（図７）では、４つのサンプルのうち２つ（サンプルa、d）で同様のバンドパターンを示した。さらに、インキュベーション時間が20分のサンプル（図８）、30分のサンプル（図９）では、N=4でほぼ同様のバンドパターンを示した。
【００６１】
電気泳動パターンから、インキュベーションによって生成する増幅産物も均一になることがわかった。即ち、増幅反応の特異性が高まったことがわかった。
【００６２】
＜実施例２＞インキュベーション温度の変更
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ヒト血液由来のＤＮＡ３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、CYP2C9遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００６３】
＜プライマー＞
プライマーは、CYP2C9遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGTCCAGAGATACC−３'      （配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CAGGCTGGTGGGGAGA−３'   （配列番号2）
上記プライマーのCYP2C9遺伝子に対する位置関係の詳細を図１に示した。
【００６４】
（２）反応液の調整
以下に示す組成で反応液を調整した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                           １．０μＬ
100mM MgSO4                                  ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20                             ０．１μＬ
100% DMSO                                    ０．５μＬ
25mM dNTP each                               ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍希釈）                   ０．２μＬ
50μM primer(1)                              ０．６４μＬ
50μM primer(2)                              ０．６４μＬ
Bst. Polymerase                              ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料                       ３．０ｎｇ
精製水                                       ４．９６μＬ      
１０．０μＬ
【００６５】
（３）反応液のインキュベーション（工程（１））
前記（２）において調整した反応液を(T1=)３０℃、４０℃、５０℃で５分、１０分、１５分インキュベートした。
【００６６】
（４）核酸の増幅反応（工程（２））
前記（３）における反応液を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて６０℃(=T2)、６０分反応させ、経時的に蛍光検出を行った。実験はN=4で行った（４つの同一サンプルについて実験を行った）。
【００６７】
核酸試料由来のサンプルからの核酸増幅反応をリアルタイムに検出できることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出したところ、表２から４のような結果になった。
【００６８】
増幅速度のばらつきをCt値の標準偏差で評価すると、30℃、40℃、50℃での15分以内のインキュベーションにより、インキュベーションしない場合の標準偏差（3.6分）よりも小さくなった。即ち、インキュベーションにより増幅速度のばらつきが小さくなった。
【００６９】
【表２】
2010161935.tif 000005
【００７０】
【表３】
2010161935.tif 000006
【００７１】
【表４】
2010161935.tif 000007
【図１】
2010161935.tif 000008
【図２】
2010161935.tif 000009
【図３】
2010161935.tif 000010
【図４】
2010161935.tif 000011
【図５】
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【図６】
2010161935.tif 000013
【図７】
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【図８】
2010161935.tif 000015
【図９】
2010161935.tif 000016
【配列表】
2010161935000001.app