(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸分析のための改良方法の提供。【解決手段】（ａ）少なくとも１つの発光部分で標識された標的核酸分子１００と相補的であるかまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド。（ｂ）前記標識オリゴヌクレオチドからの発光を、前記オリゴヌクレオチドの標識断片からの発光よりも強度に修飾する少なくとも１つの可溶性発光修飾剤１０８を準備すること。（ｃ）前記標的核酸または前記標的核酸のアンプリコンとハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドが開裂して少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチド断片を産生するように、前記選択条件を含んで成る増幅反応において前記標識オリゴヌクレオチドと前記可溶性修飾剤の存在下前記試料中の核酸を増幅すること；および（ｄ）（ｃ）の間少なくとも前記標識オリゴヌクレオチド断片からの発光を検出し、それによって、前記標識核酸を検出すること、を含んで成る方法。【選択図】図１Ａ
2010162027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出する方法であって：
（ａ）少なくとも１つの発光部分で標識された少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、当該標識オリゴヌクレオチドの少なくとも部分配列は、当該標識オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの選択条件下で標的核酸及び／又は標的核酸のアンプリコンとハイブリダイズするように、少なくとも１つの標的核酸の少なくとも部分配列及び／又は標的核酸のアンプリコンの少なくとも部分配列と十分相補的である；
（ｂ）前記標識オリゴヌクレオチドからの発光を、前記オリゴヌクレオチドの標識断片からの発光よりも強度に修飾する少なくとも１つの可溶性発光修飾剤を準備すること；
（ｃ）前記標的核酸または前記標的核酸のアンプリコンとハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドが開裂して少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチド断片を産生するように、前記選択条件を含んで成る増幅反応において前記標識オリゴヌクレオチドと前記可溶性修飾剤の存在下前記試料中の核酸を増幅すること；および
（ｄ）（ｃ）の間少なくとも前記標識オリゴヌクレオチド断片からの発光を検出し、それによって、前記標識核酸を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記増幅反応が実質的にエチジウムブロマイドを欠いている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標識オリゴヌクレオチドが５’−ヌクレアーゼプローブを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記発光修飾剤がジアジン色素およびチアジン色素から成る群から選択される１又は複数の色素を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ジアジン色素が、アゾカルミン色素、フェナジン色素、オキサジン色素、およびジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリドから成る群から選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記チアジン色素が、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１，９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ，アズールＢおよびアズールＣから成る群から選択される請求項４記載の方法。
【請求項７】
標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる方法であって、
（ａ）少なくとも２つの標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、前記標識部分の少なくとも１つが発光性である；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのジアジン色素及び／又はチアジン色素に接触させ、それによって、前記標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させること、を含んで成る方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドとジアジン色素及び／又はチアジン色素とを、実質的にエチジウムブロマイドを欠いている反応混合物中で接触させる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ジアジン色素が、アゾカルミン色素、フェナジン色素、オキサジン色素、およびジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリドから成る群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記チアジン色素が、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１，９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ、アズールＢおよびアズールＣから成る群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドとジアジン色素及び／又はチアジン色素とを、少なくとも約４０℃の温度で接触させる請求項７記載の方法。
【請求項１２】
（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドとジアジン色素及び／又はチアジン色素とを接触させることを含んで成る請求項７記載の方法。
【請求項１３】
（ｂ）の前、（ｂ）の間及び／又は（ｂ）の後で前記標識オリゴヌクレオチドからの発光を検出することを含んで成る請求項７記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）が少なくとも１つの標的核酸を増幅することを含んで成り、前記標識オリゴヌクレオチドが当該標的核酸及び／又は当該標的核酸のアンプリコンと少なくとも１つの選択条件下でハイブリダイズするように、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも部分配列が、前記標的核酸の少なくとも部分配列及び／又は前記標的核酸のアンプリコンの少なくとも部分配列と十分相補的である、請求項７記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が、前記標的核酸のコピーを含んで成る対象の少なくとも１つの遺伝障害及び／又は少なくとも１つの病状の診断と相関している請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが５’−ヌクレアーゼプローブを含んで成り、かつ、前記方法が、５’−ヌクレアーゼプローブが開裂する条件下で前記標的核酸を増幅することを含んで成る請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記５’−ヌクレアーゼプローブの開裂を検出することを含んで成る請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
（ｂ）が、複数のオリゴヌクレオチドを前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素と接触させることを含んで成る請求項７記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが別のオリゴヌクレオチドの標識部分と異なる少なくとも１つの標識部分を含んで成る請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記の異なる標識部分が、異なる発光標識部分を含んで成り、かつ、前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素が前記オリゴヌクレオチドのそれぞれからのベースライン発光を低下させる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも２つの標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記標識部分の少なくとも１つが発光性であるオリゴヌクレオチド；および
前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる少なくとも１つのジアジン色素及び／又はチアジン色素、
を含んで成る反応混合物。
【請求項２２】
前記反応混合物が実質的にエチジウムブロマイドを欠いている請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、５’−ヌクレアーゼプローブを含んで成る請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２４】
前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素が、少なくとも約４０℃の温度で前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２５】
前記ジアジン色素が、アゾカルミン色素、フェナジン色素、オキサジン色素、およびジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリドから成る群から選択される請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２６】
前記チアジン色素が、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１，９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ，アズールＢおよびアズールＣから成る群から選択される請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２７】
１又は複数の緩衝液、塩、金属イオン、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するヌクレオチド取り込み生体触媒、ピロホスファターゼ、プライマー核酸、鋳型核酸、アンプリコン、ヌクレオチド、グリセロール、ジメチルスルホキシド、またはポリｒＡを含んで成る請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２８】
キットに梱包されている請求項２１記載の反応混合物。
【請求項２９】
複数のオリゴヌクレオチドを含んで成る請求項２１記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが別のオリゴヌクレオチドの標識部分と異なる少なくとも１つの標識部分を含んで成る請求項２９記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記異なる標識部分が、異なる発光標識部分を含んで成り、かつ、前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素が、前記オリゴヌクレオチドのそれぞれからのベースライン発光を低下させる請求項３０記載の反応混合物。
【請求項３２】
（ａ）少なくとも１つの発光標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも１つのジアジン色素及び／又はチアジン色素；並びに
（ｃ）前記オリゴヌクレオチド及び／又は前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの断片からの発光を検出する少なくとも１つの検出器、
を含んで成るシステム。
【請求項３３】
前記検出器と作用可能に接続した少なくとも１つのロジックデバイスであって、検出された発光を互いに相対的に増減(scale)させる１又は複数のインストラクションセットを含んで成る請求項３２記載のシステム。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが５’−ヌクレアーゼプローブを含んで成る請求項３２記載のシステム。
【請求項３５】
少なくとも１つの容器が、前記オリゴヌクレオチド並びに前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素を含んで成る請求項３２記載のシステム。
【請求項３６】
（ｄ）前記容器内温度を調節するために前記容器と熱的に連通する少なくとも１つの熱調節器；及び／又は
（ｅ）流体を前記容器へ及び／又は前記容器から移動させる少なくとも１つの流体移動コンポーネント、
を含んで成る請求項３５記載のシステム。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチド並びに前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素が溶液中に存在している請求項３５記載のシステム。
【請求項３８】
前記容器が、１又は複数の緩衝液、塩、金属イオン、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するヌクレオチド取り込み生体触媒、ピロホスファターゼ、プライマー核酸、鋳型核酸、アンプリコン、ヌクレオチド、グリセロール、ジメチルスルホキシド、またはポリｒＡを含んで成る請求項３５記載のシステム。
【請求項３９】
安定化した核酸の二本鎖を産生させる方法であって、
（ａ）（ｉ）標的核酸分子を含有するかまたは含有する疑いのある試料；（ｉｉ）前記標的核酸分子と相補的であるかまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）前記標的核酸分子と前記オリゴヌクレオチドの間に形成された二本鎖を有効に安定化する濃度で存在する少なくとも１つのチアジン色素、を準備すること；並びに
（ｂ）（ｉ）前記チアジン色素存在下で前記標的核酸とオリゴヌクレオチドをアニーリングさせること；または（ｉｉ）前記標的核酸とオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた後、塩基対形成が起こり少なくとも安定化した核酸の二本鎖が産生される条件下で前記チアジン色素と混合すること、
を含んで成る方法。
【請求項４０】
（ｂ）の前記核酸二本鎖の安定性が、前記チアジン色素不在下または低濃度のチアジン色素のもとでの前記標的核酸と前記オリゴヌクレオチドを含んで成る核酸二本鎖の安定性と比較して向上する、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸二本鎖の前記安定性が、前記チアジン色素の存在下、不在下または低濃度のもと、（ｉ）融解温度（Ｔｍ）、（ｉｉ）ＣT決定または（ｉｉｉ）５’−ヌクレアーゼアッセイ、によって測定される請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
（ｃ）安定性向上をもたらす条件下で前記安定化した核酸の二本鎖を検出することをさらに含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
前記安定化した核酸の二本鎖が、１又は複数の核酸塩基ミスマッチを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記安定化した核酸の二本鎖が、２個以上の核酸塩基ミスマッチを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記安定化した核酸の二本鎖が、３個以上の核酸塩基ミスマッチを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
前記標的核酸分子および前記オリゴヌクレオチドの前記準備が、１個の核酸分子の準備を含んで成り、前記核酸分子が分子ビーコンである請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
前記標的核酸分子および前記オリゴヌクレオチドの前記準備が、少なくとも２個の核酸分子の準備を含んで成り、前記核酸分子および前記オリゴヌクレオチド残基が、異なる核酸分子上にある請求項３９記載の方法。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸にアニーリングした場合、核酸伸長反応開始に有効である請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
さらに、前記標的核酸分子と相補的であるかまたは部分的に相補的である第２のオリゴヌクレオチドを含んで成り、前記オリゴヌクレオチドのそれぞれが、前記標的核酸にアリーリングした場合、核酸伸長反応開始に有効である請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
さらに、前記標的核酸分子と相補的であるかまたは部分的に相補的である標識オリゴヌクレオチドを含んで成る請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
前記標的核酸がアンプリコンである請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記オリゴヌクレオチドが、１又は複数の天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１又は複数の非天然塩基、非天然ヌクレオチド間結合、非天然ヌクレオチド骨格、またはその任意な組み合わせを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項５３】
前記チアジン色素が、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ，アズールＢ、アズールＣおよび１，９−ジメチルメチレンブルーから成る群から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項５４】
前記チアジン色素がメチレンブルーを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１つのチアジン色素が、少なくとも濃度１０μｇ／ｍＬで存在する請求項３９記載の方法。
【請求項５６】
前記アニーリングが、約１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの間の濃度のチアジン色素存在下でアニーリングすることを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項５７】
前記アニーリングが、約１０μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの間の濃度のチアジン色素存在下でアニーリングすることを含んで成る請求項３９記載の方法。
【請求項５８】
前記アニーリングが、約４０μｇ／ｍＬ濃度のチアジン色素存在下でアニーリングすることを含んで成る請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および核酸化学の分野に関する。ある態様において、標識核酸からの発光を修飾する方法および試薬が、単一標識プローブを用いた核酸配列のリアルタイムホモジニアス検出、分析および定量目的のため提供される。さらに、これらの発光修飾剤のバックグランド低下における用途および他の用途もまた記載されている。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術（ＮＡＴ）の開発は、遺伝子分析およびエンジニアリングサイエンスに革命を起こした。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば診断、法医学または他の適用の一部として標的核酸検出を促進するため、選択したプライマー核酸を用いて特定の標的核酸を増幅するために頻繁に使用されている。プライマーは、通常、互いに伸長するように設計されている対として機能し、選択した標的領域をカバーする。典型的ＰＣＲサイクルには、高温（例えば、８５℃以上）の変性段階で二本鎖核酸の鎖が互いに別々になる段階、低温（例えば、４５−６５℃）アニーリング段階でプライマーが別々になった一本鎖とハイブリダイズする段階、および中温（例えば、７２℃位）伸長段階で核酸ポリメラーゼが前記プライマーを伸長させる段階を含む。２種の温度による熱サイクル操作も用いられる。これらは、一般に、高温変性段階と低温アニール伸長段階を含む。検出量の特定のＰＣＲ産物またはアンプリコンを作製するため、これらのサイクルは、通常、約２５−４５回繰り返す。
【０００３】
ＰＣＲはまた、多くの異なる米国特許に記載されており、例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３を含み、それらは、それぞれ引用により組み入れられる。さらに、ＰＣＲ関連技術もまた、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４のようなさまざまな他の公報で記載されており、それらは、それぞれ引用により組み入れられる。
【０００４】
ＰＣＲの多くのバリエーションならびに他の核酸増幅技術もまた、開発されている。これらの例には、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（非特許文献５および非特許文献６）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（非特許文献７），ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（非特許文献８），ギャップ−ＬＣＲ（非特許文献９），鎖置換増幅（非特許文献１０），連結直線状増幅（ＬＬＡ）（非特許文献１１），ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（非特許文献１２），転写媒介増幅（ＴＭＡ）（非特許文献１３），核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（非特許文献１４および非特許文献１５），および自己持続配列複製（３ＳＲ）（非特許文献１６）が含まれ、それらはそれぞれ引用により組み入れられる。
【０００５】
増幅産物検出のためのさまざまなストラテジーが開発されており、多くのもののなかでも５’ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコン、またはスコーピオン（ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標））プライマーを必要とするものが含まれる。例示すると、５’ヌクレアーゼアッセイは、通常、あるＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）過程において５’ヌクレアーゼプローブを開裂する。これらのアッセイでは、標的の増幅と標識の放出の両者を検出のために必要とし、通常、増幅産物を何回も処理する段階を要さない。ある５’ヌクレアーゼプローブは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素のような標識部分を含む。前記プローブが未変性である時、レポーター色素がクエンチャー色素に近接していると、通常、レポーター蛍光が抑制されることになる。しかし、多くの場合、未変性プローブがある量の残留またはベースライン蛍光を生ずる。５’ヌクレアーゼ反応において、前記プローブを開裂した場合、レポーター色素とクエンチャー色素が互いに分離し、その結果、レポーターからの蛍光が増加することになる。ＰＣＲ産物またはアンプリコンの集積は、通常、蛍光のこうした増加をリアルタイムにモニタリングすることによって間接的に検出する。
【０００６】
多くの既存の核酸増幅検出フォーマットは簡易でしかも確実であるものの、問題が残されている。たとえば、これらの検出フォーマットの多くは二重標識プローブを用いている（例えば、ドナーおよびアクセプター部分を含むプローブ）。これらの二重標識プローブの製造には、合成、精製および品質管理プロセスが必要であり、これらは、複雑で、労力を要しかつ高価である。さらに、二重標識プローブのベースラインの蛍光は、通常、最適パフォーマンスの特定の範囲に入らなければならない。さらに、ある二重標識プローブは、不安定という問題があり、その結果ベースラインの変動が起こり、保存期間にマイナスの影響を与える。さらに、内部標識挿入は、ハイブリダイゼーション時に二本鎖を不安定にし、この状態は通常補正される必要がある。
【０００７】
これらの問題の全ては、非クエンチ型一重標識プローブを核酸増幅反応の産物検出に用いる場合、回避できる。たとえば、エチジウムブロマイドおよび２−３の他のＤＮＡ結合色素を用いてオリゴヌクレオチドの蛍光を長さに応じてクエンチさせることが述べられている。しかし、これらの色素は通常、リアルタイム検出には使用できず、例えば、高温でそれらのＤＮＡ結合アフィニティが低いことによる。したがって、リアルタイム検出のために通常使用される高温で一重標識プローブを結合しクエンチさせる能力を有する核酸増幅反応混合物添加剤が必要とされている。
【０００８】
さらに、他の検出方法の中でも５’ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコン、またはＦＲＥＴプローブを用いた多重核酸増幅検出には、通常、例えばある反応においてシングルプローブを利用するプロトコールに対してアッセイ処理量を改善するため、クエンチまたは非クエンチ蛍光プローブをプールすることが含まれる。例示すると、多重アッセイが、診断操作の一部として患者から得た試料中の複数遺伝子型マーカーまたは病原体を検出するために用いられる。これらのフォーマットにおいて、プールしたプローブからの全体のベースラインまたはバックグランド蛍光は、プローブの数が反応混合物中で増えるに伴い相加的に増加する。このベースライン蛍光は、また、シングルプローブの量が増加する時、基本的に任意なアッセイシステムで増加する。ベースライン蛍光は、通常、例えば、検出感度およびアッセイの動的範囲を低下させることによって与えられたアッセイの挙動に悪影響を与える。したがって、ベースライン蛍光は、蛍光プローブの総数及び／又は特定のアッセイに付加できる一定プローブの量を有効に限定する。
【０００９】
広範囲のＤＮＡハイブリダイザーションおよび増幅ストラテジーが当業界で知られているが、幾つかの課題がまだ残されている。たとえば、ＨＩＶ，ＨＣＶおよびＨＰＶのようなＲＮＡ／ＤＮＡウイルスにおける高レベルの配列多様性（すなわち、配列不均質性）により、核酸増幅、遺伝子型決定及び／又は検出のための方法を標準化することが特に困難となっている。このウイルス配列不均質性により、異なるウイルス遺伝子型およびサブタイプ全てについて一様に高い感度を有するアッセイを開発できなくなっている。実験的標的およびプライマー及び／又はプローブ（例えば、ウイルス検出及び／又は遺伝子型決定のためのプローブ）間の配列差の結果二本鎖ミスマッチが起こるが、こうした差によりアッセイパフォーマンスが損なわれ、偽陰性の結果または誤分類が結果として起こることになる。多数の関連ウイルス遺伝子型を検出不可能であることは、特に臨床試料のスクリーニングのような適用において重大な陰性結果を有することになる。
【００１０】
増幅／検出の効率が低いのは試料中の標的量が（決定的遺伝子型情報がない場合）少ないからであると誤って考えられると、定量的アッセイ（例えば、ウイルス量評価のためのアッセイ）は、分析物質の配列不均質性の影響を大きく受けることになる。核酸ベースのアッセイはハイブリダイゼーションに依存しているので、プライマー／プローブミスマッチは、定量の正確さを有意に低下させることになる。
【００１１】
こうした差を最小にするため、プライマーおよびプローブは、好適には、ウイルスゲノムの保存領域から選択される。しかし、これは、２個の主な要因、（ｉ）例えばＨＩＶおよびインフルエンザのような多くのウイルスが高速の変異誘発およびゲノム進化を示すこと、および（ｉｉ）公知のウイルス遺伝子型およびサブタイプの数がまだ増え続けていること、そして、新しく発見された単離物が、公知のゲノム多様性範囲を拡大し続けていることにより、ますますむずかしくなっている。数例において、ウイルス遺伝子型情報を振り分けることが、ウイルス遺伝子型に基づく治療に対する応答に差異が見られるので、患者の分類および治療決定にとって重要である。これらの場合において、さまざまな遺伝子型を適切に識別するため、ウイルスゲノムの比較的保存がよくない領域を増幅しかつ検出することが望ましい。
【００１２】
プライマー／プローブミスマッチは、遺伝子型特異的プライマーおよびプローブを複数含ませることによって、またはこれとは別に、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖の安定性を増加させる塩基類似体を取り込ませることによって、ある程度は克服できる。しかし、これらの溶液は、用途が限られており、その結果アッセイの複雑性とコストが極めて増大することになる。配列決定により遺伝子型振り分けに非常に高い分解能が付与されるが、高処理量の臨床設定にそれを適用することは、まだ、可能となっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｉｎｎｉｓら（編著）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｏｏｋｓ（１９９０）
【非特許文献２】Ｉｎｎｉｓら（編著）ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）
【非特許文献３】Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．（２００４）
【非特許文献４】Ｒａｐｌｅｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（２００４）
【非特許文献５】Ｊｏｙｃｅ（２００２）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９３：８３−９２
【非特許文献６】Ｅｍｒｉｃｈら（２００２）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ，ｏｎｌｉｎｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９１：９９−１０８
【非特許文献７】Ｌｅｅ（１９９６）“Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４（３）：１９７−９
【非特許文献８】Ｂａｒａｎｙら（１９９１）“Ｔｈｅ  ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ＰＣＲ  ｗｏｒｌｄ”，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１（１）：５−１６
【非特許文献９】Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｇａｐ−ＬＣＲ）”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（４）：６７５−８２
【非特許文献１０】Ｗａｌｋｅｒ（１９９３）”Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ“，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３（１）：１−６
【非特許文献１１】Ｋｉｌｌｅｅｎら（２００３）”Ｌｉｎｋｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｍｏｓｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ“，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４９（７）：１０５０−７
【非特許文献１２】Ｎｉｌｓｓｏｎら（２００２）”Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｄｅｓｉｇｎ“，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（１４）：ｅ６６
【非特許文献１３】Ｅｍｅｒｙら（２０００）”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ａ，Ｃ，ａｎｄ  Ｄ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｋｅｎｙａ“，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：２６８８−２６９５
【非特許文献１４】Ｍａｎｉら（１９９９）”Ｐｌａｓｍａ  ＲＮＡ  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１“，Ｊ  Ａｃｑｕｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ  Ｓｙｎｄｒ  ２２：２０８−２０９
【非特許文献１５】Ｂｅｒｎｄｔら（２０００）”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ＨＩＶ  ＲＮＡ  ｌｏａｄ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ“，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８９：１７７−１８１
【非特許文献１６】Ｍｕｅｌｌｅｒら（１９９７）”Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＰＣＲ“，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８：４３１−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述のように、当業界において核酸分析のための改良方法が必要となっている。特に配列不均質性と二本鎖ミスマッチが現在使用されている方法を妨害する場合に、たとえば核酸検出、同定、増幅、特性解析（例えば、Ｔｍ決定）および定量のための改良された方法が必要とされる。上記考察において、核酸分析の問題が、ウイルス標的の増幅、検出および遺伝子型決定という状況で例示されている。しかし、これらの問題はウイルス標的に独自のものではなく、実際に、微生物病原体試験、遺伝的試験および環境試験のような広範な核酸分析適用に関連が見られる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、５’−ヌクレアーゼプローブを含む標識核酸からの発光（例えば、ベースライン発光）を修飾する方法を提供する。たとえば、本明細書に記載の発光修飾剤は、高温の溶液中で且つリアルタイム検出に通常使用されるその他の反応条件下で、標識プローブからの発光を低下させる。さらに、さまざまな他の既知の溶液クエンチャーと異なり、本発明の発光修飾剤は、核酸増幅反応の挙動にとって障害をもたらすこともなく、且つこれらの反応で頻繁に利用される高温において十分な核酸結合アフィニティを保持しており、その結果、リアルタイム検出が可能となる。本明細書に記載のリアルタイム検出に対するアプローチには、一重標識プローブ、多重標識プローブまたは両タイプのプローブを一定の反応混合物中で使用することを含んで成る反応混合物および標識プローブからの発光修飾方法に加えて、関連キットおよびシステムもまた提供される。
【００１７】
１つの観点において、本発明は、少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドを含んで成る反応混合物を提供する。前記オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド等）は、少なくとも１つの発光部分（例えば、蛍光色素等）により標識される。前記反応混合物には、また、標識オリゴヌクレオチドからの発光を修飾する（例えば、低下させる）少なくとも１つの可溶性発光修飾剤を含む。態様によっては、前記標識オリゴヌクレオチドは、５’−ヌクレアーゼプローブを含んで成る。
【００１８】
別の観点において、本発明は、少なくとも２つの標識部分のうち少なくとも１つが発光性である少なくとも２つの標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んで成る反応混合物を提供する。態様によっては、例えば、前記オリゴヌクレオチドは、５’−ヌクレアーゼプローブを含む。前記反応混合物は、また、少なくとも約４０℃の温度で前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を修飾する少なくとも１つの発光修飾剤（例えば、可溶性発光修飾剤等）を含む。ある態様において、前記発光修飾剤は、前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる。
【００１９】
別の観点において、本発明は、少なくとも２つの標識部分のうち少なくとも１つが発光性である少なくとも２つの標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）を含んで成る反応混合物に関する。この反応混合物はまた、前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる少なくとも１つのジアジン色素及び／又はチアジン色素を含む。通常、前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素は、少なくとも約４０℃の温度で前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる。
【００２０】
態様によっては、本明細書に記載の前記反応混合物は、例えば、多重５’−ヌクレアーゼ反応または他の適用の一部として使用される複数のオリゴヌクレオチドを含む。これらの態様において、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一般に、別のオリゴヌクレオチドの標識部分とは異なる少なくとも１つの標識部分を含む。典型的には、前記の異なる標識部分は、異なる発光標識部分（例えば、異なる蛍光色素等）を含み、前記発光修飾剤（例えば、ジアジン色素、チアジン色素及び／又はその他など）は、それぞれのオリゴヌクレオチドからのベースライン発光を修飾する（例えば、低下させる）。態様によっては、本発明の反応混合物は、キット内に梱包される。
【００２１】
本明細書に記載の反応混合物は、任意に、さまざまな他の成分を含む。態様によっては、例えば、反応混合物は、緩衝液、塩、金属イオン、５’−３’ヌクレアーゼ活性（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、ピロホスファターゼ、プライマー核酸、鋳型核酸、アンプリコン、ヌクレオチド、グリセロール、ジメチルスルホキシド、ポリｒＡ（または別の担体核酸）等のうちの１又は複数のような核酸増幅／検出アッセイの実施に有用な成分を含む。この反応混合物および本発明の他の関連の観点は、通常、エチジウムブロマイドを実質的に欠いている。
【００２２】
１つの観点において、本発明は、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。前記方法には、（ａ）少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチド（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）を準備することを含む。前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの発光部分により標識される。さらに、標識オリゴヌクレオチドの少なくとも部分配列(subsequence)は、少なくとも１つの標的核酸に対して及び／又は標的核酸のアンプリコンの少なくとも部分配列に対して相補的で、少なくとも１つの選択条件（例えば、アニーリング温度、伸長温度、及び／又はその他等）の下で、標的核酸及び／又は標的核酸のアンプリコンとハイブリダイズするようにする。また、本方法は、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの標識断片からのものに比べて標識オリゴヌクレオチドからの発光を大幅に修飾する少なくとも１つの可溶性発光修飾剤を含む。さらに、前記方法は、（ｃ）標的核酸または標的核酸のアンプリコンとハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドが開裂され少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチド断片を産生するように、選択条件を含む増幅反応において標識オリゴヌクレオチドおよび可溶性発光修飾剤の存在下で試料中の核酸を増幅すること、を含む。前記方法はさらに、（ｄ）例えばリアルタイムモニタリングプロセスの一部として（ｃ）の間に少なくとも標識オリゴヌクレオチド断片からの発光を検出すること、を含む。
【００２３】
別の観点において、本発明は、標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を修飾する方法を提供する。前記方法には、（ａ）少なくとも２つの標識部分のうち少なくとも１つが発光性である少なくとも２つの標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを準備することを含む。前記方法は、また、（ｂ）少なくとも約４０℃の温度で（例えば、リアルタイム検出条件下等）前記オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を修飾する少なくとも１つの発光部分（例えば、ジアジン色素、チアジン色素等）に前記オリゴヌクレオチドを接触させることを含む。ある態様において、（ｂ）は、前記オリゴヌクレオチドと発光修飾剤とを溶液中で接触させることを含む。通常、前記方法には、また、（ｂ）の前、（ｂ）の間及び／又はその後に、前記標識オリゴヌクレオチドからの発光を検出することを含む。
【００２４】
さらに別の観点において、本発明は、標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させる方法を提供する。前記方法には、（ａ）少なくとも２つの標識部分のうち少なくとも１つが発光性である少なくとも２つの標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを準備することを含む。前記方法にはさらに、（ｂ）少なくとも１つのジアジン色素及び／又はチアジン色素に前記オリゴヌクレオチドを接触させ、それによって前記標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を低下させることを含む。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドとジアジン色素及び／又はチアジン色素とを、少なくとも約４０℃の温度で接触させる。通常、（ｂ）には、前記オリゴヌクレオチドとジアジン色素及び／又はチアジン色素とを溶液中で接触させることを含む。さらに、前記方法には、また、（ｂ）の前、（ｂ）の間及び／又はその後に、前記標識オリゴヌクレオチドからの発光を検出することを含む。
【００２５】
本明細書に記載の方法のある態様において、前記方法には、少なくとも１つの標的核酸を増幅することを含む。典型的には、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも部分配列は、少なくとも１つの標的核酸に対して及び／又は標的核酸のアンプリコンの少なくとも部分配列に対して十分相補的であり、その結果、前期オリゴヌクレオチドは前記標的核酸及び／又は標的核酸のアンプリコンとハイブリダイズする。前記態様の一部において、例えば、前記オリゴヌクレオチドは、５’−ヌクレアーゼプローブを含み、前記方法は、５’−ヌクレアーゼプローブが開裂する条件下で前記標的核酸を増幅することを含む。これらの態様において、前記方法は、通常、５’−ヌクレアーゼプローブの開裂を検出することを含む。前記標的核酸は、典型的には、前記標的核酸のコピーを含んで成る対象について少なくとも１つの遺伝的障害及び／又は少なくとも１つの疾患状態の診断に相関する。
【００２６】
本明細書に記載の方法のいくつかの重複態する様において、前記方法には、複数のオリゴヌクレオチドを前記発光修飾剤（例えば、ジアジン色素、チアジン色素及び／又はなどなど）に接触させることを含む。これらの態様において、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個は、典型的には、別のオリゴヌクレオチドの標識部分と異なる少なくとも１つの標識部分を含む。異なる標識部分は、一般に、異なる発光標識部分を含んで成り、そして、前記発光修飾剤は、オリゴヌクレオチドのそれぞれからのベースライン発光を修飾する（例えば、低下させる）。
【００２７】
さらに例示すると、本明細書に記載の方法の一部の態様は、１又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）を発光修飾剤（例えば、ジアジン色素、チアジン色素、及び／又はなどなど）と接触させることを含む。典型的には、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの標識部分は発光性で、前記発光修飾剤は、発光性一本鎖オリゴヌクレオチドからの発光を修飾する（例えば、低下させる）。
【００２８】
本発明は、別の観点において、（ａ）少なくとも約４０℃の温度で標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を修飾する少なくとも１つの発光修飾剤（例えば、ジアジン色素、チアジン色素等から選択した１又は複数の色素）を含むキットを提供する。前記キットはまた、（ｂ）少なくとも１つの発光性標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからの発光（例えば、ベースライン発光等）を前記発光修飾剤で修飾するための説明書を含む。通常、前記キットは、前記発光修飾剤及び／又は説明書を梱包するための少なくとも１つの容器を含む。
【００２９】
本発明は、さらに別の観点において、（ａ）少なくともジアジン色素及び／又はチアジン色素を含むキットを提供する。前記キットはまた、（ｂ）少なくとも１つの発光性標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからの発光を前記発光修飾剤で修飾するための説明書を含む。通常、前記キットはまた、前記ジアジン色素及び／又はチアジン色素及び／又は説明書を梱包するための少なくとも１つの容器を含む。
【００３０】
態様によっては、本明細書に記載のキットは、また、さまざまな他の成分を含む。例えば、これらのキットは、任意に、標的核酸の少なくとも部分配列に少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つのプライマー核酸を含む。ある態様において、前記キットには、前記オリゴヌクレオチドを含む。任意に、前記オリゴヌクレオチドは、５’−ヌクレアーゼプローブを含む。態様によっては、前記キットには、発光性標識部分を含んで成る少なくとも１つの一本鎖標識オリゴヌクレオチドを含む。たとえば、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、任意に、少なくとも１つの標的核酸の少なくとも部分配列に少なくとも部分的に相補的なプライマー核酸を含む。プライマー核酸を含むこれらのキットの態様において、前記キットはまた、典型的には、前記標的核酸の１又は複数のセグメントを、前記プライマー核酸、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレオチド取り込み生体触媒、および１又は複数のヌクレオチドにより増幅するための説明書が含まれる。これらの態様において、前記キットは、通常は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレオチド取り込み生体触媒及び／又は１又は複数のヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明は、別の観点において、（ａ）少なくとも１つの発光性標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）を含むシステムを提供する。前記システムはまた、（ｂ）少なくとも約４０℃の温度で標識オリゴヌクレオチドからのベースライン発光を修飾する少なくとも１つの発光修飾剤（例えば、ジアジン色素、チアジン色素等から選択した１又は複数の色素）を含むキットを提供する。さらに、前記システムはまた、（ｃ）前記オリゴヌクレオチドからの発光を検出する少なくとも１つの検出器及び／又は前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。
【００３２】
本発明は、さらに別の観点において、（ａ）少なくとも１つの発光性標識部分を含んで成る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）を含むシステムを提供する。さらに、前記システムはまた、（ｂ）少なくとも１つのジアジン色素及び／又はチアジン色素、および（ｃ）前記オリゴヌクレオチドからの発光を検出する少なくとも１つの検出器及び／又は前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。
【００３３】
ある態様において、本明細書に記載のシステムには、他の成分も含まれる。たとえば、前記システムには、任意に、前記検出器と作用可能に接続した少なくとも１つのロジックデバイスを含む。前記ロジックデバイスには、通常、検出した発光を互いに相対的に増減(scale)させる１又は複数のインストラクションセットが含まれる。これらのシステムの態様によっては、少なくとも１つの容器は、前記オリゴヌクレオチドと前記発光修飾剤（例えば、少なくとも１つのジアジン色素、チアジン色素等）を含む。これらの態様において、前記システムには、典型的には、（ｄ）前記容器と熱的に連通しており容器内温度を調節する少なくとも１つの熱調節器及び／又は（ｅ）流体を容器に及び／又は容器から移動させる少なくとも１つの流体移動コンポーネントを含む。通常、前記オリゴヌクレオチドおよび発光性標識部分は溶液中に存在している。態様によっては、前記容器にはまた、緩衝液、塩、金属イオン、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するヌクレオチド取込み生体触媒、ピロホスファターゼ、プライマー核酸、鋳型核酸、アンプリコン、ヌクレオチド、グリセロール、ジメチルスルホキシド、ポリｒＡ等のうちの１又は複数のようなさまざまな核酸増幅ベースのアッセイの実施に用いることができる成分を含む。
【００３４】
本明細書に記載の反応混合物、方法、キットおよびシステムに利用した発光修飾剤は、通常、可溶性クエンチャー部分を含む。態様によっては、発光修飾剤は、少なくとも選択した発光検出条件下（例えば、検出波長６００ｎｍ以下等）で固有の蛍光を実質的に有していない。典型的には、本明細書に記載の発光修飾剤は、本明細書に記載の５’−ヌクレアーゼプローブのようなオリゴヌクレオチドと会合（例えば、挿入、結合等）する。ある態様において、例えば、発光修飾剤は、例えば、ジアジン色素、チアジン色素等から選択した１又は複数の色素を含む。例示的なジアジン色素には、アゾカルミン色素、フェナジン色素、オキサジン色素、ジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリド（すなわち、ヤヌスグリーンＢ）等を含む。適切なチアジン色素の例には、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１、９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン(bernthsen)、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ等が含まれる。
【００３５】
本発明は、核酸の検出、増幅および分析に用途を見出せるさまざまな組成物および方法を提供する。さらに具体的には、これらの方法では、チアジンおよびジアジン色素のまだ確認されていない有用な性質を利用する。
【００３６】
態様によっては、本発明の方法は、これまで確認されていない、チアジン色素の核酸二本鎖を安定化する能力を有効に利用している。この方法は、二本鎖核酸分子及び／又はハイブリダイゼーション方法論を利用する全ての核酸操作に広く適用可能である。本質的に、安定化した核酸の二本鎖を産生する方法では、（ａ）標的核酸分子を含有するかまたは含有する疑いのある試料；前記標的核酸分子と相補的であるかまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド；および前記標的核酸分子と前記オリゴヌクレオチドの間に形成された二本鎖を有効に安定化する濃度で存在する少なくとも１つのチアジン色素、を準備すること；（ｂ）これとは別に（ｉ）前記チアジン色素存在下で前記標的核酸とオリゴヌクレオチドをアニーリングさせること；または（ｉｉ）前記標的核酸とオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた後、二本鎖が形成して少なくとも安定化した核酸の二本鎖が産生される条件下で、前記チアジン色素と混合することの段階を利用する。これらの方法では、（ｂ）の核酸二本鎖の安定性は、チアジン色素不在下または低濃度のチアジン色素のもとでの前記標的核酸と前記オリゴヌクレオチドを含む同一核酸二本鎖の安定性と比較して、向上している。これらの方法では、任意に、チアジン色素存在下、不在下または低濃度下において核酸二本鎖の安定性を明らかにすることを含み、このことは、例えば、（ｉ）融解温度（Ｔｍ分析）、（ｉｉ）ＣT決定または（ｉｉｉ）５’−ヌクレアーゼアッセイを含む全ての適切な方法によって達成できる。前記方法は、いくつかの観点において、任意に、安定性の向上をもたらす条件下で安定化された核酸二本鎖を検出する方法を含む。
【００３７】
安定化された二本鎖のタイプ、性質、立体配置、構造または配列は、任意の観点で限定されることは意図していない。たとえば、これらの方法では、安定化した核酸二本鎖は、１個以上、２個以上、または３個以上のヌクレオ塩基ミスマッチを含むことがある。完全にマッチした二本鎖は安定化できる。安定化二本鎖中のオリゴヌクレオチドは、いくつかの観点において、標的核酸にアニーリングした場合核酸伸長反応を有効に開始させる。態様によっては、前記ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ増幅反応の一部であり、１対のオリゴヌクレオチドを標的核酸分子とのハイブリダイゼーションに用い、オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれは、標的核酸にアニーリングした時、核酸伸長を有効に開始させる。いくつかの観点において、前記ハイブリダイゼーション反応には、標的核酸分子と相補的であるかまたは部分的に相補的である標識オリゴヌクレオチドプローブを含む。いくつかの観点において、標的核酸分子は、アンプリコンである。
【００３８】
本発明の方法で用いる核酸は、天然のオリゴマー構造または天然の塩基に限定されない。たとえば、前記二本鎖中の１又は複数の分子は、１又は複数の天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１又は複数の非天然塩基、非天然インターヌクレオチド結合、非天然ヌクレオチド骨格またはその任意な組み合わせをも含むことができる。
【００３９】
典型的には、核酸二本鎖安定化方法において、安定化ハイブリダイゼーション複合体は、分子間ハイブリダイゼーション複合体であり、ここで、逆平行にハイブリダイズしている鎖は、２個の別個の核酸分子である。しかし、核酸二本鎖安定化方法のある適応において、前記の安定化ハイブリダイゼーション複合体は、分子内ハイブリダイゼーション複合体であり、ここで、逆平行にハイブリダイズしている鎖は、実際には単一の核酸分子上にあり、例えば、これは分子ビーコンタイプ立体配置の場合である。
【００４０】
二本鎖安定化のためのこれらの方法で必要とされるのはチアジン色素の存在である。任意のチアジン色素を使用することができ、例えば、限定しないが、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、および１、９−ジメチルメチレンブルーが含まれる。二本鎖の安定性の向上に使用する色素の濃度は、特に限定されない。いくつかの観点において、少なくとも１つのチアジン色素が少なくとも１０μｇ／ｍｌ濃度で存在する。いくつかの観点において、前記アニーリングは、約１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの間の濃度、またはこれとは別に、約２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌの間の濃度におけるチアジン色素存在下でのアニーリングを含む。いくつかの態様において、前記チアジン色素は、約４０μｇ／ｍｌの濃度で使用される。
【００４１】
本発明は、態様によっては、核酸二本鎖安定化のための方法実施用キットを提供する。これらのキットには、二本鎖安定化のための方法のいずれかに必要であるかまたはそれを簡易にするための任意な試薬または他の成分も含むことができる。いくつかの観点において、これらのキットには、注目の標的核酸分子と相補的であるかまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド；および前記標的核酸分子とオリゴヌクレオチドの間に形成された二本鎖を安定化させるために有効な濃度で存在する少なくとも１つのチアジン色素、を含むことができる。本発明のキットには、キットユーザー用の説明書が含まれ、さらに、前記キットの全てまたは任意のサブセットをも入れるための１又は複数の容器が含まれる。
【００４２】
本発明は、いくつかの観点において、核酸二本鎖を安定化するための方法の実施のための統合システムを提供する。前記システムには、特に採取データをアルゴリズム及び／又は電子保存情報を用いるその後の分析に供する場合（例えば、採取蛍光データの分析等）には、この採取データを解釈しかつ分析するための機器および手段が含まれうる。統合システムの各部分は、機能的に内部接続しており、ある場合には、物理的に連結している。態様によっては、前記統合システムは自動化されており、前記方法の開始後オペレータによる試料または機器の操作が全く必要でない。本発明のシステムには、機器を含めることができる。たとえば、本発明は、蛍光検出器（例えば、蛍光分光分析計）および熱サイクル装置すなわちサーモサイクラーのような検出器を含むことができる。態様によっては、前記熱サイクル装置および検出器は統合機器であり、熱サイクルと発光検出（例えば、蛍光検出）が同一機器で行われる。例えば蛍光分光分析計のような検出器を、分光分析計操作パラメータの制御及び／又は検出器から採取したデータ保存のため、コンピュータに接続できる。前記コンピュータは、また、熱サイクル機器に機能的に連結させ、システムの温度、タイミング及び／又は温度変化速度を制御する。組込コンピュータにはまた、検出器からのデータを分析するための“相関モジュール”を含むことができる。いくつかの態様において、前記相関モジュールは、計算するコンピュータプログラムを含む。
【００４３】
本明細書では、チアジン色素およびジアジン色素の可溶性発光修飾剤としてのさまざまな用途を示す。本発明の方法は、１つの観点において、ドナー／アクセプター対において可溶性クエンチャーとしてチアジンおよびジアジン色素を用いることによって、前記色素のこれまで確認されていない発光を修飾する性質を有効利用する。伝統的なＦＲＥＴ立体配置では、ＦＲＥＴクエンチャー部分は、典型的には、ＦＲＥＴドナーのような同一の核酸分子に取り込ませるか、またはこれとは別に、別々の核酸分子に取り込ませる。本発明は、当業界で使用されてきた方法を簡易化した方法を提供し、ここで、本発明は、チアジン色素またはジアジン色素でありうる可溶性クエンチャー分子、あるいは必要な光クエンチング性質を保持しそれに構造上関連する全ての分子によってクエンチャー部分が置換されている方法を提供する。チアジン色素およびジアジン色素の可溶性クエンチャーとしての用途範囲は、限定されておらず、実際、伝統的クエンチング部分を使用するほとんどの場合の用途のために適応させることもできる。
【００４４】
たとえば、本発明は、いくつかの観点において、ハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）発光部分を含んで成るプローブ；（ｉｉ）前記プローブに対して相補的であるかまたは部分的に相補的であるハイブリダイゼーション標的；および（ｉｉｉ）チアジン色素またはジアジン色素を含む可溶性発光修飾剤であって、前記発光部分をクエンチングできる前記可溶性発光修飾剤、を準備し；
（ｂ）前記プローブと前記ハイブリダイゼーション標的とを、塩基対形成が起こり標的ハイブリダイゼーション複合体を形成できる条件下でアニーリングすること；
（ｃ）前記可溶性発光修飾剤存在下で標的ハイブリダイゼーション複合体の温度を変化させ前記発光部分の放出を測定すること；
（ｄ）前記発光部分の測定放出を前記標的ハイブリダイゼーション複合体の存在と温度関数として相関させ、それによって測定された放出に基づき標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定すること、
を含んで成る方法を提供する。
【００４５】
これらのＴｍ決定方法において、発光部分は、ドナー部分であってもよく、前記発光修飾剤は、クエンチャーであってもよい。これらの方法において、温度を変化させるとは、温度（融解曲線）を上昇させることまたは温度（アニーリング曲線）を下降させることである。ある面において、ある温度範囲が測定段階で使用され、例えば、約２０℃〜約９５℃の温度範囲である。
【００４６】
いくつかの観点において、前記ハイブリダイゼーション標的は、核酸標的に対応するアンプリコンであり、前記アンプリコンは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応によって（例えば、非対称ＰＣＲ増幅において）産生される。ＰＣＲを用いるほとんどの場合において、ＰＣＲ増幅は、注目の標的核酸に特異的な増幅プライマー対、熱安定ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および適切なＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液を用いる。態様によっては、前記アンプリコン産生は、ＲＮＡ核酸標的を逆転写することおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅することによって行う。
【００４７】
Ｔｍ分析用標的はあらゆる面で限定されない。態様によっては、前記核酸標的は、ウイルスゲノムである。前記核酸標的は、任意に、例えばヒト血液、血清または血漿である試料中に供与される。
【００４８】
Ｔｍ決定のための方法は、ジアジン色素またはチアジン色素であってもよい少なくとも１つの可溶性クエンチャーを含むことができ；例えば、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、１、９−ジメチルメチレンブルー、アゾカルミン色素、フェナジン色素、オキサジン色素およびジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリド等であるが、それらに限定されない。
【００４９】
本発明の方法でＴｍ決定のために使用した核酸は、天然のオリゴマー構造または天然の塩基に限定されない。たとえば、二本鎖となっている１又は複数の分子は、１又は複数の天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１又は複数の非天然塩基、非天然インターヌクレオチド結合、非天然ヌクレオチド骨格、またはその任意の組み合わせをも含む。
【００５０】
態様によっては、前記方法は、Ｔｍ決定のための方法の実施のためのキットを提供する。これらのキットは、Ｔｍ決定のための方法に必要とされる任意の試薬またはその方法の使用を簡易にするために必要とされる任意の試薬を含んでもよい。態様によっては、これらの方法は、（ａ）発光部分を含む少なくとも１つのプローブであって、注目のハイブリダイゼーション標的と相補的であるかまたは部分的に相補的であるプローブ；（ｂ）チアジン色素またはジアジン色素を含む少なくとも１つの可溶性発光修飾剤であって、発光部分をクエンチングできる可溶性発光修飾剤；および（ｃ）前記プローブ、前記可溶性発光修飾剤、またはプローブと発光修飾剤の両者を含む１又は複数の容器を含む。いくつかの観点において、前記発光部分は、ＦＲＥＴドナー部分である。いくつかの観点において、発光修飾剤は、ＦＲＥＴクエンチャーである。態様によっては、前記キットはまた、前記プローブおよびハイブリダイゼーション標的を含むハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定するための説明書を含む。
【００５１】
任意に、本発明のＴｍ決定用キットは、逆転写酵素、ＲＮＡ標的からの逆転写酵素開始に適した少なくとも１つのプライマー、熱安定ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性（すなわち、逆転写酵素）で且つポリメラーゼ活性である酵素、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標準化用試料、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料、酵素反応に適した緩衝液、試料採取試験管および増幅反応試験管から選択した１又は複数の追加成分を含むことができる。
【００５２】
いくつかの観点において、本発明は、Ｔｍ決定用方法実施のための統合システムを提供する。特に前記採取データをアルゴリズム及び／又は電子保存情報を用いるその後の分析に供する場合（例えば採取蛍光データがＴｍ値に変換される場合）には、前記システムは、採取データ解釈および分析のための機器および手段が含む。統合システムの各部分は、機能的に内部接続しており、ある場合には、物理的に連結している。ハイブリダイゼーション複合体のＴｍ決定の実施のための本発明システムは：
（ａ）（ｉ）シグナル放出発光部分を含んで成る核酸プローブ；（ｉｉ）前記核酸プローブと相補的であるかまたは部分的に相補的な標的核酸；並びに（ｉｉｉ）チアジン色素またはジアジン色素、を含んで成る試料または反応混合物；
（ｂ）（ｉ）本質的に全プローブ分子が所定のハイブリダイゼーション条件下で前記ハイブリダイゼーション標的とアニーリングする温度；（ｉｉ）標的ハイブリダイゼーション複合体の５０％が前記ハイブリダイゼーション条件で解離する温度；および（ｉｉｉ）本質的にどのプローブ分子も前記ハイブリダイゼーション標的と前記ハイブリダイゼーション条件下でアニーリングしておらず、且つ、本質的にどのハイブリダイゼーション複合体も前記ハイブリダイゼーション条件で存在していない温度、を含む温度範囲にわたり試料または反応混合物の温度を制御するための熱制御デバイス；
（ｃ）前記温度範囲にわたり試料からのシグナルを測定するための検出器；および
（ｄ）前記検出器と作用可能に連結し、且つ前記温度範囲でシグナル測定値を受け取る相関モジュールであって、シグナル強度を前記プローブとハイブリダイゼーション標的を含むハイブリダイゼーション複合体の存在とチアジン色素またはジアジン色素との混合物中で温度関数として相関させ、それによって前記標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定する相関モジュール、
を含む。
【００５３】
いくつかの観点において、前記発光部分がＦＲＥＴドナー部分である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】本発明の１態様による発光修飾剤を含むアッセイを図示する。
【図１Ｂ】本発明の１態様による発光修飾剤を含むアッセイを図示する。
【図２Ａ】本発明の１態様による発光修飾剤を含むアッセイを図示する。
【図２Ｂ】本発明の１態様による発光修飾剤を含むアッセイを図示する。
【図３】本発明の１態様による代表的システムを示したブロックダイアグラムである。
【図４】別々の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖（ＲＴ−ＰＣＲ）混合物における増加量のニューメチレンブルーによる一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡおよびチミジンダイマーの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲ混合物の全成分を含むカクテルにおける増加量の６種の異なるチアジン色素によるｓｓＤＮＡの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲ混合物の全成分を含むカクテルにおける増加量の６種の異なるチアジン色素によるｄｓＤＮＡの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）。
【図７】ＲＴ−ＰＣＲ混合物の全成分を含むカクテルにおける増加量の６種の異なるチアジン色素によるジヌクレオチドＤＮＡの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。
【図８】ポリｒＡを含むかまたは含まないＲＴ−ＰＣＲ混合物の全成分を含むカクテルにおける増加量の６種の異なるチアジン色素によるｓｓＤＮＡの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）。
【図９】さまざまな濃度のアズールＢ存在下における一重標識ＨＣＶプローブによるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１０】さまざまな濃度のアズールＢ存在下におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）動的ＰＣＲ反応における一重標識ＨＣＶプローブを用いたサイクル数関数として蛍光を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１１】さまざまな濃度のアズールＢ存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１２】さまざまな濃度のニューメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１３】さまざまな濃度のニューメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１４】さまざまな濃度の１，９ジメチルメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１５】さまざまな濃度の１，９ジメチルメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１６】さまざまな濃度のアズールＡ存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１７】さまざまな濃度のアズールＣ存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１８】さまざまな濃度のチオニン存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図１９】さまざまな濃度のメチレングリーン存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図２０】アズール色素濃度４０μｇ／ｍＬ存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出におけるアズールＡ，アズールＢおよびアズールＣの比較を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図２１】チアジン色素濃度４０μｇ／ｍＬ存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出におけるアズールＡ，アズールＢ、アズールＣ、メチレンブルー、トルイジンブルー、チオニンおよびメチレングリーンの比較を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図２２Ａ】２０，０００コピーのＨＣＶ  ＤＮＡ，さまざまなプローブおよびさまざまな量のメチレンブルーによるＨＣＶ  ＰＣＲ反応の分析を示したポリアクリルアミドゲルの写真で、パネルＢと、二重反応を示している。
【図２２Ｂ】２０，０００コピーのＨＣＶ  ＤＮＡ，さまざまなプローブおよびさまざまな量のメチレンブルーによるＨＣＶ  ＰＣＲ反応の分析を示したポリアクリルアミドゲルの写真で、パネルＡと、二重反応を示している。
【図２３】さまざまな濃度のメチレンブルー存在下におけるＨＥＸ標識一重標識プローブによるＩＱＳ（内部定量化標準）ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図２４】さまざまな濃度のメチレンブルー存在下におけるＦＡＭ−およびＨＥＸ標識一重標識プローブ組み合わせによるＨＣＶおよびＩＱＳ  ＤＮＡの同時ＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図２５】発光修飾剤不在下において一重標識プローブおよび二重標識プローブから得たシグナルの比較を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）であり、前記アッセイは、担体核酸ポリｒＡ存在下または不在下実施した。
【図２６】発光修飾剤アズールＢ３０μｇ／ｍＬ存在下で一重標識プローブおよび二重標識プローブから得たシグナルの比較を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）であり、前記アッセイは、担体核酸ポリｒＡ存在下または不在下実施した。
【図２７】発光修飾剤アズールＢ３０μｇ／ｍＬ存在下で一重標識プローブおよび二重標識プローブから得たシグナルの比較を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）であり、前記アッセイは、担体核酸ポリｒＡ存在下または不在下実施した。
【図２８】一重標識プローブとメチレンブルーを含むＤＮＡ鋳型滴定から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図２９】一重標識プローブとメチレンブルーを含むＲＮＡ鋳型滴定から得たデータをそれぞれ示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図３０】２−２００，０００導入コピーのＨＩＶ  ＤＮＡ検出アッセイにおいて４０μｇ／ｍＬの発光修飾剤メチレンブルー存在下における一重標識プローブと二重標識プローブから得たシグナルの比較を示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図３１Ａ】４０μｇ／ｍＬのメチレンブルー存在下における２−２００，０００導入コピーのＤＮＡによるＨＣＶおよびＨＩＶのＰＣＲ検出を示したポリアクリルアミドゲルの写真で、パネルＡは、ＨＣＶを示している。
【図３１Ｂ】４０μｇ／ｍＬのメチレンブルー存在下における２−２００，０００導入コピーのＤＮＡによるＨＣＶおよびＨＩＶのＰＣＲ検出を示したポリアクリルアミドゲルの写真で、パネルＢは、ＨＣＶを示している。
【図３２】さまざまな濃度のニューメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）で、蛍光は４０℃で測定した。
【図３３】さまざまな濃度のニューメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）で、蛍光は４０℃で測定した。
【図３４】４０μｇ／ｍＬのニューメチレンブルー存在下における一重標識プローブによるＨＣＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出の比較を示した増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）で、蛍光は２種の異なる温度、５８℃または４０℃で測定した。
【図３５】ＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得たベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図３６】図３５に示したアッセイで使用したものの２倍量のＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得たベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図３７】２種の異なるレベルのＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得たベースライン蛍光レベルの比較を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図３８】ＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得た相対的蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図３９】ＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のジメチルメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得たベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図４０】ＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のジメチルメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得た相対的蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図４１】ＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のニューメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得たベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図４２】ＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブとさまざまな量のニューメチレンブルーによるＨＣＶ検出のための５’−ヌクレアーゼ反応で得た相対的蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）。
【図４３】ＨＥＸ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のメチレンブルーによるＩＱＳ  ＤＮＡ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、未加工の蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図４４】ＨＥＸ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のメチレンブルーによるＩＱＳ  ＤＮＡ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られた相対的蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、相対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図４５】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のヤヌスグリーンＢによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図４６】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られた相対的蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図４７】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のビクトリアピュアブルーＢＯによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図４８】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のアズールＡによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図４９】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のメチレングリーンによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図５０】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のチオニンによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図５１】ＦＡＭ−ＣＹ５二重標識プローブとさまざまな量のアズールＢによるＨＣＶ検出用５’−ヌクレアーゼアッセイで得られたベースライン蛍光レベルを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）。
【図５２Ａ】ＦＡＭ標識ＨＣＶ特異的プローブのヌクレオチド配列を示す。
【図５２Ｂ】図５２Ａに示した一重標識ＨＣＶ遺伝子型決定用プローブと合成核酸標識を用いた温度関数としてプロットした未加工の蛍光を示した融解曲線（Ｔｍ）解析を示す。融解反応には、可溶性クエンチャーを含まない。蛍光は、励起フィルター４８５ｎｍと２０ｎｍバンド幅を用い、発光フィルター５２０ｎｍと１０ｎｍバンド幅を用いて測定した。７種の別々の実験結果を同一グラフ二重ねて示した。代表的データセットを示した。
【図５３】一重標識ＨＣＶ遺伝子型決定用プローブと合成核酸標識を用いた温度関数としてプロットした未加工の蛍光を示した融解曲線解析を示す。実験条件は、図５２Ｂに示したものと同一であるが、ただし、反応には、可溶性発光修飾剤（すなわち、可溶性クエンチャー）メチレンブルー１０μｇ／ｍＬを含めた。
【図５４】図５３と同一の条件を用いた融解曲線解析を示し、ただし、反応には、可溶性クエンチャーメチレンブルー２０μｇ／ｍＬを含めた。
【図５５】図５４に示した融解曲線分析の一次導関数プロットを示し、ＨＣＶ遺伝子型と実験的に観察されたＴｍ値は、示されている。
【図５６】ＦＡＭ一重標識ＨＣＶ遺伝子型決定用プローブ、ＨＣＶ遺伝子型１ａ／ｂに対応する合成核酸標的、および４種の濃度増加性のメチレンブルーを用いた融解曲線（Ｔｍ）解析の一次導関数プロットを示す。プローブと合成鋳型の配列を示し、それらは、完全なマッチ二本鎖を形成する。４種の別々の実験結果を同一グラフに重ねる。代表的データセットを示す。
【図５７】ＦＡＭ一重標識ＨＣＶ遺伝子型決定用プローブ、ＨＣＶ遺伝子型６に対応する合成核酸標的、および４種の濃度増加性のメチレンブルーを用いた融解曲線（Ｔｍ）解析の一次導関数プロットを示す。プローブと合成鋳型の配列を示し、それらは、完全なマッチ二本鎖を形成する。４種の別々の実験結果を同一グラフに重ねる。代表的データセットを示す。
【図５８】ＦＡＭ一重標識ＨＣＶ遺伝子型決定用プローブ、ＨＣＶ遺伝子型５に対応する合成核酸標的、および４種の濃度増加性のメチレンブルーを用いた融解曲線（Ｔｍ）解析の一次導関数プロットを示す。プローブと合成鋳型の配列を示し、それらは、２個のミスマッチ位置を有する二本鎖を形成する。４種の別々の実験結果を同一グラフに重ねる。代表的データセットを示す。
【図５９】ＦＡＭ一重標識ＨＣＶ遺伝子型決定用プローブ、ＨＣＶ遺伝子型２ａ／ｃに対応する合成核酸標的、および４種の濃度増加性のメチレンブルーを用いた融解曲線（Ｔｍ）解析の一次導関数プロットを示す。プローブと合成鋳型の配列を示し、それらは、完全なマッチ二本鎖を形成する。４種の別々の実験結果を同一グラフに重ねる。代表的データセットを示す。
【図６０】示したさまざまなＨＣＶ合成鋳型により示したＨＣＶプローブを用いてＴｍを決定した棒グラフ要約を示している。Ｔｍ決定は、示したようにさまざまな濃度のニューメチレンブルー可溶性クエンチャーを用いて行い、Ｔｍ決定の１セットでは、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンインディケータとともに非標識プローブを用いた。
【図６１】図５２Ａに示したＨＣＶプローブとさまざまなミスマッチ組み合わせの単一塩基ミスマッチを含む工学的に作製した鋳型を用いて決定したＴｍの棒グラフ要約を示している。Ｔｍ決定は、示したように２種の異なる濃度のメチレンブルー可溶性クエンチャーを用いて行った。棒グラフにはまた、Ｖｉｓｕａｌ  ＯＭＰ  ソフトウェア（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）により作製したさまざまな二本鎖の（メチレンブルー不在下における）予測Ｔｍ値が示されている。
【図６２】本発明により用途がわかったヌクレオチド配列で前記ＨＩＶゲノムに対応するかまたはそれに由来する配列を示す。前記配列には、ＳＫ１４５前方ＨＩＶ増幅プライマー領域、ＧＡＧ１５２逆増幅プライマー領域の逆相補体、およびＨＩＶ  ＧＡＧ１０８ＦＢＨＱ２９Ｉ  ５’−ヌクレアーゼ定量化プローブ領域の逆相補体を含む。これらの配列下には、公知ＨＩＶサブタイプ単離物由来の対応する相補性ドメインがある。可変位置を示した。
【図６３】ＳＫ１４５ＢＵおよびＧＡＧ１５２ＢＵ増幅プライマーおよびＧＡＧ１０８ＦＢＨＱ２９Ｉ  ５’−ヌクレアーゼ定量化プローブを用いたＨＩＶ  ＲＮＡ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）定量化結果のグラフを示す。さまざまなＨＩＶ  ＲＮＡ鋳型（各１０6コピー）を、示したように、前記増幅反応で用いた。チアジン色素が全く存在していない。各遺伝子型分析結果を、同一グラフ二重ねた。標的データセットを示した。さまざまな試験したＨＩＶ遺伝子型のＣT数を示した。
【図６４】図６３に記載のものと同等のＨＩＶ  ＲＮＡ増幅定量化結果のグラフを示すが、ただし、反応物のそれぞれは、ニューメチレンブルー５０μｇ／ｍＬを含む。
【図６５】ＳＫ１４５ＢＵおよびＧＡＧ１５２ＢＵ増幅プライマーおよびＧＡＧ１０８ＦＢＨＱ２９Ｉ  ５’−ヌクレアーゼ定量化プローブを用いたＨＩＶ  ＲＮＡ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）定量化結果のグラフを示す。ＨＩＶ遺伝子型１１０−５に対応するＲＮＡ鋳型（各１０6コピー）を、前記増幅反応で用いた。この遺伝子型の結果、総数６個のミスマッチが前方プライマー下で生じ、また、５’−ヌクレアーゼ定量化プローブ下で１個のミスマッチが生じる。反応では、濃度増加性のニューメチレンブルーを用いる。各分析結果を、同一グラフ二重ねた。さまざまな増幅反応のそれぞれのＣT数を示した。
【図６６】ＳＫ１４５ＢＵおよびＧＡＧ１５２ＢＵ増幅プライマーを用いたＨＩＶ  ＲＮＡ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）定量化結果のグラフを示す。ＨＩＶ遺伝子型１１０−５に対応するＲＮＡ鋳型（１０6コピー）を、前記増幅反応で用いる。アンプリコン検出および定量は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを反応物に添加することによって行う。異なる濃度のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（ＳＹＢＲ（登録商標）色素原液の１：１０，０００希釈である１×、および色素原液の１：２５００希釈である４×）およびニューメチレンブルー（０−５０μｇ／ｍＬ）をこの反応物中で用いる。各分析結果を、同一グラフ二重ねた。代表的データセットを示した。各反応で観察したＣT数を示した。
【００５５】
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定のオリゴヌクレオチド、方法、組成物、キット、システム、コンピュータ、またはコンピュータ可読媒体に限定されず、もちろんそれらは変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用した用語は、特定の態様のみを説明する目的のためであり、限定することを意図していない。さらに、特に断りがなければ、本明細書に記載の全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該領域における当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本発明の説明および請求において、下記の用語および文法上の変化も、下文に記載の定義に従い用いられることがある。
【００５６】
用語“５’−３’ヌクレアーゼ活性”とは、ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端から連続的に取り除かれる核酸ポリメラーゼ、開裂が５’末端から複数のホスホジエステル結合（ヌクレオチド）で起こる５’−３’ヌクレアーゼ活性、またはその両者の活性のようなあるヌクレオチド取り込み生体触媒に関連する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を指す。プローブ−鋳型ハイブリダイゼーション複合体上での５’−３’エンドヌクレアーゼ活性依存性開裂のための例示的な基質は、フォーク様構造の置換された一本鎖核酸であり、この置換領域と鎖の塩基対形成部分とを結びつけるホスホジエステル結合で加水分解が起こり、これは、例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７２７６−８０に記載されており、これは引用により組み入れられる。
【００５７】
“５’−ヌクレアーゼプローブ”とは、少なくとも１つの発光標識部分を含んで成り、かつ５’−ヌクレアーゼ反応で使用して標的核酸検出を実行するオリゴヌクレオチドを指す。態様によっては、例えば、５’−ヌクレアーゼプローブは、唯一の発光部分（例えば、蛍光色素等）を含む。ある態様において、例えば、５’−ヌクレアーゼプローブには、このプローブが選択条件下でヘアピン構造を形成できるように自己相補性領域を含む。典型的には、本明細書に記載の発光修飾剤は、インタクトな、全長５’−ヌクレアーゼプローブからの発光を、このようなプローブの標識断片からの発光に比べてはるかに強く修飾し、ここで、前記断片は、５’−ヌクレアーゼ反応のエクソ及び／又はエンドヌクレオ分解性開裂段階時に全長プローブから産生される。さらに例示すると、態様によっては、５’−ヌクレアーゼプローブは、少なくとも２つの標識部分を含み、前記２個の標識体のひとつが開裂するかまたは前記オリゴヌクレオチドから分離した後で、高強度の放射線を放出する。ある態様において、例えば、５’−ヌクレアーゼプローブは、例えば、５’末端レポーター色素および３’末端クエンチャー色素または部分のような２種の異なる蛍光色素で標識する。態様によっては、５’−ヌクレアーゼプローブは、末端位置以外の１又は複数の位置でまたは末端位置に加えて１又は複数の位置で標識する。前記プローブがインタクトである時、エネルギー移動は、通常、前記レポーター色素からの蛍発光が少なくとも部分的にはクエンチングされるように前記２個の蛍光団の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長段階で、例えば、鋳型核酸に結合した５’−ヌクレアーゼプローブを、前記レポーター色素の蛍発光がもはやクエンチングされないように例えばＴａｑポリメラーゼまたはこの活性を有する別のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により開裂する。例示的な５’−ヌクレアーゼプローブはまた、例えば、米国特許５，２１０、０１５、標題“ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＡＳＳＡＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＮＵＣＬＥＡＳＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  Ａ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ”，１９９３年５月１１日発行（Ｇｅｌｆａｎｄら）、米国特許５，９９４、０５６、標題“ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ”，１９９９年１１月３０日発行（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、および米国特許６，１７１、７８５、２００１年１月９日発行（Ｈｉｇｕｃｈｉ）された標題“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＦＯＲ  ＨＥＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ”に記載されており、それらは、引用により組み入れられる。他の態様において、２種の異なるプローブを用い、一方はレポーター色素で標識され、他方はクエンチャー色素で標識され、これらは、両者を標的核酸とハイブリダイズした場合に蛍光共鳴エネルギー移動が起こるような配置とされる。さらに別の態様において、５’−ヌクレアーゼプローブは、２種以上の異なるレポーター色素と３’末端クエンチャー色素または部分で標識できる。
【００５８】
標的または鋳型、プライマーおよびプローブ（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）核酸の“５’−ヌクレアーゼ反応”または“５’−ヌクレアーゼアッセイ”は、前記プライマーを、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するヌクレオチド取り込み生体触媒によってさらに下文に記載のように伸長させる時、前記鋳型核酸とハイブリダイズしたプローブの分解を指す。また、５’−ヌクレアーゼ反応は、米国特許６，２１４、９７９、標題“ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＡＳＳＡＹ  ＳＹＳＴＥＭ”，２００１年４月１０日発行（Ｇｅｌｆａｎｄら）、米国特許５，８０４、３７５、標題“ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ”，１９９８年９月８日発行（Ｇｅｌｆａｎｄら）、米国特許５，４８７、９７２、標題“ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＢＹ  ＴＨＥ  ５’−３’ＥＸＯＮＵＣＬＥＡＳＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  ＡＣＴＩＮＧ  ＯＮ  ＡＤＪＡＣＥＮＴＬＹ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＥＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ”、１９９６年１月３０日発行（Ｇｅｌｆａｎｄら）、米国特許５，２１０、０１５、同上に記載されており、それらは本明細書でそれぞれ引用により組み入れられる。
【００５９】
“アンプリコン”とは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または他の核酸増幅技術のような核酸増幅反応において起こるような核酸分子増幅により作製した分子を指す。通常、アンプリコンとは、選択した核酸（例えば、鋳型または標的核酸）のコピーであるかまたはそれと相補的である。
【００６０】
“増幅反応”とは、１又は複数の標的核酸配列またはそれに対する相補体の複製を伴う反応を指す。例示的な増幅反応には、多くの中でも、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が含まれる。
【００６１】
標識オリゴヌクレオチドの文脈における用語“ベースライン発光”とは、発光修飾剤と接触する前のオリゴヌクレオチドからの検出可能な発光を指す。例えば、ある５’−ヌクレアーゼプローブは、プローブデザインに取り込まれた１又は複数のクエンチャー部分の存在にもかかわらず、検出量の残留光を放出する。このベースラインすなわちバックグランド発光は、５’−ヌクレアーゼ反応のシグナル対ノイズ比を限定する傾向がある。さらに、ベースライン発光は通常、複数標識プローブを互いにプールしている多重検出フォーマットにおいて相加的に増加する。ベースライン発光におけるこの相加的増加は、シングルプローブの量が所定の適用において増加する場合に起こる。
【００６２】
５’−ヌクレアーゼ反応の文脈における用語“開裂”とは、これらの反応で通常使用されるさまざまなポリメラーゼと関連した５’−３’ヌクレアーゼ活性による５’−ヌクレアーゼプローブの分解または断片化（加水分解）を指す。
【００６３】
核酸の“相補体”とは、核酸の少なくとも部分配列と逆平行な関係で結合するかまたはハイブリダイズすることができる少なくとも核酸セグメントを指す。前記逆平行関係は、例えば、核酸内部のヘアピンループ形状となった分子内であるかまたは２個異常の一本鎖核酸が互いとハイブリダイズする時のような分子間であってもよい。天然の核酸には余り見られないある塩基も、本明細書で記載の核酸に含めることができ、例えば、イノシン、７−デアザグアニンおよび下文に記載のものを含めることができる。相補性は完全である必要がなく；例えば、安定な二本鎖は、塩基対ミスマッチまたは未マッチ塩基を含むことがある。核酸技術の当業者は、例えば、相補性領域の長さ、相補性領域におけるヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の頻度を含むいくつかの可変数を実験的に考慮することによって、二本鎖の安定性を決定できる。
【００６４】
“対応する”とは、核酸中ヌクレオチドの設計配列と同一であるかまたは相補性であることを意味する。前記用語の正確な適用は、用語を使用する文脈から当業者にとって明らかであろう。
【００６５】
“ジアジン色素”とは、炭素原子の内の２個が窒素原子により置き換えられたベンゼン環を有する有機化学化合物クラスのいずれかを意味する。例示的なジアジン色素には、アゾカルミン色素、フェナジン色素、オキサジン色素、およびジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリド（ヤヌスグリーンＢまたはジアジングリーン５）が含まれる。
【００６６】
核酸対の相補性一本鎖が二本鎖核酸配列を生成する時、核酸は“ハイブリダイズ”している。ハイブリダイゼーションは、水素結合、溶媒排除、および塩基スタックのようなさまざまな十分特性解析された要因により起こる。核酸ハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２、“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）でわかるであろう。
【００６７】
句“溶液中”とは、アッセイすなわち反応の成分が液体媒体中の固体支持体に結合していないアッセイまたは反応条件を意味する。
【００６８】
“標識”または“標識部分”とは、分子に（共有結合でまたは非共有結合で）付着しているかまたは付着できる部分を意味し、この部分は、前記分子についての情報（例えば、分子についての記述的な情報、同定等の情報）または標識分子が相互作用する（例えば、ハイブリダイズ等）別の分子についての情報を提供するか、又は提供することができる。例示的な標識には、蛍光標識（例えば、クエンチャーまたは吸収剤を含む）、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾標識、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等を含む）等を含む。さらに例示すると、蛍光標識には、フルオロセイン族の色素のような負電荷の色素、またはローダミン族の色素のような中性電荷の色素、またはシアニン族の色素のような正電荷の色素が含まれる。フルオロセイン族色素には、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮおよびＺＯＥが含まれる。ローダミン族の色素には、例えば、テキサスレッド、ＲＯＸ，Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ，およびＴＡＭＲＡが含まれる。ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ、ＺＯＥ，ＲＯＸ、Ｒ１１０，Ｒ６ＧおよびＴＡＭＲＡは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されており、および、テキサスレッドは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されている。シアニン族の色素には、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７が含まれ、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ、ＵＳＡ）から市販されている。他の標識物も本明細書で引用されており、そうでなければ当業界で知られている。
【００６９】
“発光修飾剤”とは、混合物中の核酸に非共有結合で結合する物質であって、当該物質が放射線源に近接した場合核酸に結合した放射線源からの検出可能な放射線放出を変化させる物質を指す。態様によっては、例えば、本明細書に記載の発光修飾剤は、この発光修飾剤をオリゴヌクレオチドに接触させると、少なくとも１つの発光部分（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）を含むオリゴヌクレオチドから他の方法で放出される発光（例えば、ベースライン発光）を低下させるかまたはクエンチさせる。発光修飾剤は、通常可溶性で、これらの態様において、“可溶性クエンチャー”または“可溶性発光修飾剤”とも称される。さらに、いかなる特定の理論にも限定されることなく、発光修飾剤は、通常、長さ依存性により短い核酸よりも長い核酸に結合する。したがって、発光修飾剤がある標識核酸からの発光を修飾する程度は、典型的には、その核酸の長さに比例する。たとえば、標識オリゴヌクレオチドが５’−ヌクレアーゼ反応で開裂した場合、特定の発光修飾剤が通常、前記オリゴヌクレオチドの標識断片からの発光を、インタクトなオリゴヌクレオチドからの放出に比較してよりわずかしか修飾しない（例えば、クエンチング等）。例示的な発光修飾剤は、さまざまなジアジンおよびチアジン色素を含み、それらはさらに本明細書で説明する。
【００７０】
“発光標識部分”とは、検出可能な放射線または光を産生するかまたは産生可能な標識部分を指す。ある発光標識部分は、例えば、蛍光、化学発光、生物発光等により光を産生する。
【００７１】
“混合物”とは、２種以上の異なる成分の組み合わせを指す。“反応混合物”とは、ある反応に関与できるか及び／又はそれを促進できる分子を含む混合物を指す。例示すると、増幅反応混合物は、通常、増幅反応実施に必要な反応試薬を含む溶液を含み、典型的には、適切な緩衝液中にプライマー、核酸ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ，および二価の金属カチオンを含んで成る反応混合物は、それが、反応実施に必要な全ての試薬を含む場合には完全と称され、必要な試薬のサブセットのみを含む場合、不完全と称される。反応成分は、利便性、保存安定性、または成分濃度を適用に応じて調整する必要性から、それぞれが全成分のサブセットを含む別々の溶液として通常保存されること、および、反応成分を反応前に組み合わせ完全反応混合物を作成することは、当業者に理解されるであろう。反応成分はまた、例えば錠剤のような乾燥形状で製剤化でき、次に、使用前に再構成できる。さらに、反応成分を別々に梱包して市販できること、および、有用な市販キットは、本発明の修飾剤プライマーを含む反応成分サブセットを全て含むことができることが、当業者にはわかるであろう。
【００７２】
“部分”または“基”とは、分子のようなあるものが分類される（例えば、官能基、置換基等）部分のうちのひとつを指す。たとえば、プローブは、クエンチャー部分、標識部分等を任意に含むオリゴヌクレオチドとみなすことができる。
【００７３】
用語“核酸”とは、リボース核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマーに対応させることができるモノマーのポリマーまたはその類似体を指す。これには、ＲＮＡおよびＤＮＡのようなヌクレオチドポリマー、ならびに、その修飾形状、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ（登録商標））等が含まれる。ある適用において、前記核酸は、複数のモノマータイプを含むポリマー、例えばＲＮＡおよびＤＮＡサブユニットの両者であってもよい。核酸は、例えば、染色体または染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、アンプリコン、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ等であるかまたはそれを含む。核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖である。特に断らない限り、特定の核酸配列は、明示的に示した任意の配列に加え、相補配列を任意に含んで成るかまたはそれをコードしている。
【００７４】
核酸は、典型的には、一本鎖または二本鎖であり、通常、ホスホジエステル結合を含むであろうが、本明細書で概説するように、場合によっては、別の骨格を有する核酸類似体も含まれ、例えば、ホスホラミダイト（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９（１０）：１９２５およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９）、ホスホロチオアート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７および米国特許５，６４４、０４８）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｃｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２））、およびペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６５：５６６；およびＣａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７）が含まれるがそれらに限定されず、これらの文献は、それぞれ引用により組み入れられる。他の類似体核酸には、正電荷骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７）；非イオン性骨格を有するもの（米国特許５，３８６、０２３、５，６３７、６８４、５、６０２、２４０、５，２１６、１４１、および４、４６９、８６３；Ａｎｇｅｗ（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒｓ２および３、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および米国特許５，２３５，０３３および５，０３４，５０６、およびＣｈａｐｅｒｓ６および７、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ���ｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載のものを含む非リボース骨格が含まれるが、それらに限定されず、これらの文献はそれぞれ、引用により組み入れられる。１又は複数の炭素環糖類を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる（引用により組み入れられるＪｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ１６９−１７６）。数種の核酸類似体もまた、例えば、本明細書で引用により組み入れられるＲａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５ページに記載されている。前記リボース−リン酸骨格のこのような修飾は、標識部分のような付加的部分の付加を促進するため、または生理的環境におけるこのような分子の安定性と半減期を変えるために行うことができる。
【００７５】
核酸に典型的に見られる天然の複素環塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）に加えて、核酸類似体にはまた、非天然複素環または他の修飾塩基を有するものが含まれ、それらの多くは本明細書で記載されるかまたは引用されている。特に、多くの非天然塩基は、さらに、例えばＳｅｅｌａら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７４：１７９０、Ｇｒｅｉｎら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１−９７６、およびＳｅｅｌａら（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８２：１６４０に記載されており，それらはそれぞれ引用により組み入れられる。さらに例示すると、融解温度（Ｔｍ）修飾剤として作用するヌクレオチドで使用したある塩基もまた任意に含まれる。たとえば、これらの一部には、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン類、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ等）等が含まれる。たとえば、引用により組み入れられる米国特許５，９９０、３０３号、標題“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ７−ＤＥＡＺＡ−２´−ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ“、１９９９年１１月２３日発行（Ｓｅｅｌａ）を参照のこと。他の代表的複素環塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ−８−アザ−誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピオニルウラシル等が含まれる。
【００７６】
修飾塩基およびヌクレオチドの他の例はまた、米国特許５，４８４、９０８、標題“ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ５−ＰＲＯＰＹＮＹＬ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ”、１９９６年１月１６日発行（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら）、米国特許５，６４５、９８５、標題“ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＴＲＩＰＬＥ−ＨＥＬＩＸ  ＡＮＤ  ＤＯＵＢＬＥ−ＨＥＬＩＸ  ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ”、１９９７年７月８日発行（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら）、米国特許５，８３０、６５３号、標題“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＩＮＧ  ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ”、１９９８年１１月３日発行（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら）、米国特許６，６３９、０５９号、標題“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ”、２００３年１０月２８日発行（Ｋｏｃｈｋｉｎｅら）、米国特許６，３０３、３１５標題“ＯＮＥ  ＳＴＥＰ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＩＮ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥＳ”、２００１年１０月１６日発行（Ｓｋｏｕｖ）、および米国特許出願公報２００３／００９２９０５、２００３年５月１５日公開のＫｏｃｈｋｉｎｅらによる標題“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ”にも記載されており、それらは、それぞれ引用により組み入れられる。
【００７７】
“ヌクレオチド”とは、ヌクレオシドのエステルを称し、例えば、ヌクレオシドのリン酸エステルである。例えば、ヌクレオチドには、ヌクレオシドの糖部分の５’位置に共有結合で結合した１個，２個，３個以上のリン酸基を含むことができる。
【００７８】
“ヌクレオチド取り込み生体触媒”とは、核酸へのヌクレオチドの取り込みを触媒する触媒を指す。ヌクレオチド取り込み生体触媒は、典型的には、酵素である。“酵素”とは、他の化合物または“基質”を伴う化学反応の活性化エネルギーを低下させるように作用するたんぱく質ベースの触媒である。“ヌクレオチド取り込み酵素”とは、ヌクレオチドの核酸への取り込みを触媒する酵素を指す。例示的なヌクレオチド取り込み酵素には、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ等が含まれる。他の生体触媒には、ＤＮＡベース（“ＤＮＡザイム”）であるかまたはＲＮＡベース（“ＲＮＡザイム”）であってもよい。”熱安定性酵素“とは、熱に対して安定で、熱耐性で、かつ、選択した期間高温に曝した場合に十分な触媒活性を保持する酵素を指す。たとえば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性を進めるだけ十分な時間高温に供した場合に以降のプライマー伸長反応を実行するだけ十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な熱条件は、当業界において周知である、米国特許４，６８３，２０２号、標題”ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ“、１９８７年７月２８日発行（Ｍｕｌｌｉｓ）、および米国特許４，６８３、１９５号、標題”ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ、ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ、ＡＮＤ／ＯＲ−ＣＬＯＮＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ“、１９８７年７月２８日発行（Ｍｕｌｌｉｓら）に例示されており、これらは両者とも、引用により組み入れられる。本明細書で使用する熱安定性ポリメラーゼは、典型的には、ＰＣＲまたは５’−ヌクレアーゼ反応のような温度サイクル反応に使用するのに適している。熱安定性ポリメラーゼの場合、酵素活性とは、鋳型核酸と相補的なプライマー伸長生成物形成に適したようにヌクレオチドの重合を触媒することを指す。
【００７９】
“オリゴヌクレオチド”または“ポリヌクレオチド”とは、少なくとも２個の、典型的には３個超の、さらに典型的には１０個超の核酸モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、通常、前記オリゴヌクレオチドの最終的機能または用途を含むさまざまな要因に依存している。オリゴヌクレオチドは、任意に、いかなる適切な方法によっても調製され、それには、既存のまたは天然配列の単離、ＤＮＡ複製または増幅、逆転写、適切な配列のりクローニングおよび制限酵素消化、またはＮａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト方法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１のトリエステル方法；自動化合成方法；または米国特許４，４５８、０６６、標題”ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ“、１９８４年７月３日発行（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）の固体支持体方法が含まれるが、それらに限定されない。
【００８０】
用語“プローブ核酸”または“プローブ”とは、適切な条件下で標的または鋳型核酸に選択的にハイブリダイズ可能な標識または非標識オリゴヌクレオチドを指す。典型的には、プローブは、核酸試料に含まれる特定の標的配列に十分と相補的で、限定するわけではないがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のような選択したハイブリダイゼーション条件で標的配列と安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成する。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記プローブを用いて実施したハイブリダイゼーションアッセイは、特定の標的配列の選択的検出を可能とする。用語“ハイブリダイゼーション領域”とは、標的配列に正確にまたは実質的と相補的でそれゆえにそれとハイブリダイズする核酸の領域を指す。配列の単一ヌクレオチドにおける差を識別するためハイブリダイゼーションアッセイで使用するため、ハイブリダイズする領域は、典型的には、長さが約８〜約１００個のヌクレオチドを指す。前記のハイブリダイズする領域は通常全オリゴヌクレオチドを指すが、前記プローブは、例えば、機能してプローブを固体支持体等に結合させる部位を提供するためのリンカー結合部位として、他のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位として、制限酵素部位として、または他の核酸結合酵素等の結合部位として機能する追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。ある態様において、本発明のプローブは、試料中のプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するためにも利用できる５’−ヌクレアーゼプローブ、ＦＲＥＴプローブ、分子ビーコン等のような１又は複数の標識物（例えば、レポーター色素、クエンチャー色素等）を含む核酸中に含まれるある態様において、プローブのハイブリダイズする領域は、前記標的配列に完全と相補的である。しかし、一般に、完全な相補性は、必要ではない（すなわち、核酸は、互いに、部分的に相補的であってもよい）；安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基または非ミスマッチ塩基を含むことがある。ストリンジェントな条件の修飾は、１又は複数の塩基対ミスマッチまたは非ミスマッチ塩基との安定ハイブリダイゼーション二本鎖を可能とするために必要である。本明細書で引用により組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）は、適切な修飾のための指針を示している。標的／プローブ二本鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、温度、およびイオン条件を含むいくつかの変動要因に依存する。当業者は、通常、一定プローブの正確な相補体が同様にプローブとして有用であることを認識するであろう。当業者は、また、ある態様において、プローブ核酸がまた、プライマー核酸として使用できることを認識するであろう。例示的なプローブ核酸には、当業者に公知の多くのもののなかでも５’−ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコンが含まれる。
【００８１】
“プライマー核酸”または“プライマー”とは、標的または鋳型核酸とハイブリダイズし、例えば、ポリメラーゼのようなヌクレオチド取り込み生体触媒を適切な反応条件下で用いて鎖進展または伸長を可能とする核酸である。プライマー核酸は、典型的には、天然または合成オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド等）である。他のプライマー核酸長さも任意に用いられるが、それらは、典型的には、長さが約８個〜約１００個のヌクレオチド範囲のハイブリダイズ領域を含む。短いプライマー核酸は、通常、より低い温度を利用し、鋳型核酸と十分に安定なハイブリッド複合体を形成する。鋳型核酸の部分配列に少なくとも部分的に相補的なプライマー核酸は、典型的には、鋳型とハイブリダイズして伸長させるのに十分である。所望の場合、プライマー核酸は、例えば、分光分析、光化学、生物化学、免疫化学、化学または他の技術によって検出可能な標識物を取り込むことによって、標識できる（例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマー等）。例示すると、有用な標識物には、放射性同位元素、蛍光色素、電子稠密試薬、（ＥＬＩＳＡに通常使用されるもののような）酵素、ビオチン、または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびたんぱく質が含まれる。これらの多くおよび他の標識物はさらに本明細書に記載されており、そして／あるいは当業界で知られている。当業者は、ある態様においてプライマー核酸もまた、プローブ核酸として使用できることがわかるであろう。
【００８２】
“クエンチャー部分”または“クエンチャー”は、例えば、特定のλｍａｘにおいてそうでなければこの放射線を放出したであろうある線源（“ドナー”）からの蛍光または発光放射線のような検出可能な放射線の放出を低下させるか及び／又は低下させることができる部分を指す。典型的には、クエンチャーは、前記線源により放出された検出可能な放射線を少なくとも５０％、典型的には少なくとも８０％、さらに典型的には少なくとも９０％だけ低下させる。あるクエンチャーは、クエンチャーに特徴的なシグナルで例えば蛍光色素から吸収されたエネルギーを再度放出させ、したがって、クエンチャーはまた、“ラベル”であってもよい。この現象は、通常、蛍光共鳴エネルギー移動すなわちＦＲＥＴとして公知である。これとは別に、クエンチャーは、光以外の形態で例えば熱として蛍光色素から吸収エネルギーを放出することもできる。ＦＲＥＴに頻繁に使用される分子には、例えば、フルオロセイン、ＦＡＭ，ＪＯＥ，ローダミン、Ｒ６Ｇ，ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ，ＤＡＢＣＹＬ，およびＥＤＡＮＳが含まれる。蛍光色素がドナーであるかまたはアクセプターであるかは、その励起および放出スペクトル、およびそれが対となる蛍光色素によって決定される。たとえば、ＦＡＭは、波長４８８ｎｍの光で最も効率的に励起され、５００〜６５０ｎｍのスペクトルで光を放出し、放出最大が５２５ｎｍにある。ＦＡＭは、例えばＴＡＭＲＡとともにクエンチャーとして使用するために適切なドナーラベルであり、それは、その励起最大が５１４ｎｍである。蛍光色素から吸収エネルギーを放出する非蛍光またはダーククエンチャー例には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）により市販されているＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）、およびＥＣＬＩＰＳＥ（登録商標）Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｒｌｌ，ＷＡ，ＵＳＡ）が含まれる。前記のＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）は、置換または未置換アリールまたはヘテロアリール化合物またはその組み合わせから選択した少なくとも３個のラジカルを含む構造であり、ここで、前記残基のうちの少なくとも２個は環外ジアゾ結合により結合されている（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ０１／８６００１、標題“ＤＡＲＫ  ＱＵＥＮＣＨＥＲＳ  ＦＯＲ  ＤＯＮＯＲ−ＡＣＣＥＰＴＯＲ  ＥＮＥＲＧＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ”、２００１年１１月１５日Ｃｏｏｋらにより公表。引用により組み入れられる）。例示的なクエンチャーは、また、例えば、引用により組み入れられる、米国特許６，４６５，１７５、標題”ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＲＯＢＥＳ  ＢＥＡＲＩＮＧ  ＱＵＥＮＣＨＡＢＬＥ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＬＡＢＥＬＳ、ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ“、２００２年１０月１５日発行（Ｈｏｒｎら）、に示されている。クエンチャーは、吸収光を長波長の光として再放出しないか（非蛍光）または検出可能な範囲以外の波長で光を再放出する（蛍光）ことによる分子の両者に適用される。
【００８３】
広い意味では、クエンチャーは、発光を低下することができるあらゆる分子を指す。クエンチャーは必ずしもＦＲＥＴクエンチャーである必要がない場合もあることに留意されたい。クエンチャーは厳密な“ＦＲＥＴ”メカニズムにより作用する必要はなく、実際、クエンチャーは、いかなるメカニズムでも機能できる。蛍光団とクエンチャーとの間にスペクトル上の重複がある必要はない。クエンチングがダイナミッククエンチング（Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｄｅｘｔｅｒ等）および静的クエンチング（基底状態複合体）を含むことができることに留意されたい。クエンチングメカニズムには、エネルギー移動、光電子移動、プロトン結合電子移動、近接配置蛍光団の間での二量体形成、過渡的励起状態相互作用、衝突クエンチング、または非蛍光基底状態種の形成を伴う。たとえば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｌａｋｏｗｉｃｚによる；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ、  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈａｕｇｌａｎｄによる、を参照のこと。
【００８４】
核酸の“配列”とは、核酸中のヌクレオチドの順番と種類を指す。配列は、通常、５’から３’方向に読み取られる。
【００８５】
“一重標識オリゴヌクレオチド”とは、わずかに一つの標識部分を含むオリゴヌクレオチドを指す。ある態様において、前記標識部分は、発光性である。
【００８６】
物質は、溶液中で遊離することができる場合“可溶性”である。たとえば、可溶性発光修飾剤は、典型的には、それらが溶液中で遊離している時核酸と非共有結合で相互作用する。
【００８７】
用語“ストリンジェント”または“ストリンジェントな条件”とは、本明細書で、低イオン強度と高温条件下のハイブリダイゼーション条件を意味するものとして使用し、それは、当業界で周知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編著、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７）；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），同上を参照のこと。これらのそれぞれは、引用により組み入れられる。通常、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱的融解温度（Ｔｍ）よりも低い約５−３０℃であるように選択される。これとは別に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列のＴｍよりも低い約５−１５℃であるように選択される。前記Ｔｍは、標的と相補的なプローブの５０％が平衡（標的配列がＴｍで過剰に存在する時、プローブの５０％は平衡状態でハイブリダイズする）で標的配列とハイブリダイズする温度（一定イオン強度、ｐＨおよび核酸濃度）である。
【００８８】
“対象”とは生物を指す。典型的には、前記生物は、哺乳類であり、特にヒトである。ある態様において、例えば、対象は、遺伝障害、病状または他の状態を有する疑いのある患者である。
【００８９】
“部分配列”、“セグメント”または“断片”とは、全核酸配列の任意の部分を指す。
【００９０】
“チアジン色素”とは、三環性芳香族融合環系を含む有機化学化合物のクラスの任意のものを指し、ここで、中央の環の炭素の２個が窒素原子と硫黄原子で置き換えられている。例示的なチアジン色素には、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１、９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ，ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ等が含まれる。
【００９１】
用語“鋳型核酸”または“標的核酸”とは、増幅、検出、又は分析される核酸を指す。
【００９２】
熱エネルギーが物体間を移動するかまたは移動可能である時互いに物体が“熱的に連通”する。本明細書に記載のシステムのある態様において、例えば、熱調節器は、熱的に容器内部と連通しており、容器中の温度を調節する。
【００９３】
本明細書では、用語“Ｔｍ”とは、“融解温度”を指すものとして使用する。融解温度とは、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖となっている二本鎖ポリヌクレオチドまたはヌクレオ塩基オリゴヌクレオチド（例えば、ハイブリダイゼーション複合体）の集団の半分が一本鎖に解離する温度である。二本鎖ポリヌクレオチドのＴｍの予測には、塩基配列ならびに構造および配列特徴およびオリゴマー結合の性質を含む他の要因を考慮する。Ｔｍの予測ならびに実験的決定のための方法は、当業界で知られている。
【００９４】
たとえば、Ｔｍは、融解曲線で伝統的に決定されており、二本鎖核酸分子は制御温度プログラムで加熱しており、前記二本鎖中の２個の一本鎖の結合／解離状態を、前記２個の鎖が完全解離する温度に到達するまでモニタリングしプロットする。Ｔｍは、この読み取り曲線から読み取られる。これとは別に、Ｔｍは、アニーリング曲線から決定することもでき、二本鎖核酸を、前記２個の鎖が完全解離する温度まで加熱する。次に温度を制御温度プログラムで低下させ、前記２個の一本鎖の結合／解離状態を、前記２個の鎖が完全にアニーリングする温度に到達するまでモニタリングしプロットする。
【００９５】
本発明をＴｍ決定の特定の方法に限定することを意図してはいない。Ｔｍの実験的決定方法は、当業界で広く公知であり、例えば、Ｌｉｅｗら、“Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ａｍｐｌｉｃｏｎｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５０（７）：１１５６−１１６４（２００４）；Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｗｅｒ，“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０（１０：１７４８−１７５４（２００４）；Ｚｈｏｕら，”Ｃｌｏｓｅｄ−Ｔｕｂｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ａ  Ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｄｙｅ“，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５０（８）：１３２８−１３３５（２００４）；およびＺｈｏｕら、”Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ“，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ６４：１５６−１６４（２００４）のようなさまざまな文献に記載されている。融解温度／アニール曲線分析機器は、さまざまな製造業者から市販されている。
【００９６】
本明細書では、用語”試料”とは、その広い意味で使用されており、分析に供されるいかなる材料をも意味する。用語“試料”とは、通常は、生物起源の任意のタイプの材料を指し、例えば、動物または植物から得られた任意のタイプの材料を指す。試料とは、例えば、血液または血清のような体液または組織であってもよく、さらに、ヒト血液またはヒト血清であってもよい。試料は、培養細胞または組織、（原核生物または真核生物の）微生物の培養物、または、（生きているかまたはかつて生きていた）生物材料から産生されたかまたはそれに由来する任意の分画または生成物であってもよい。任意に、試料は、精製、部分精製、未精製、高含量にするかまたは増幅することもできる。試料を精製するかまたは高含量とする場合、前記試料は、主に１成分、例えば核酸を含むことができる。さらに具体的には、例えば、精製または増幅試料は、全細胞性ＲＮＡ，全細胞性ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたは増幅されたそれに由来する産物を含むことができる。
【００９７】
本発明の方法で使用した試料は任意の起源由来であることもでき、そして限定されない。このような試料は、個人または個人等から単離した一定量の組織または体液であってもよく、例えば、皮膚、血漿、血清、全血、血液製剤、脊髄液、唾液、腹膜液、リンパ液、水性または粘性体液、滑膜液、尿、涙液、血液細胞、血液製剤、精液、精液、膣液、胚浸出液、奨膜液、臓器、気管支−肺胞洗浄、腫瘍、パラフィン包埋組織等が含まれるが、それらに限定されない。試料はまた、インビトロ細胞培養物の構成成分および成分を含み、細胞培養培地中の細胞増殖による順化培地、組み換え細胞、細胞成分を含むがそれらに限定されない。
【００９８】
本明細書では、“Ｃ型肝炎ウイルスタイプ”とは、そのゲノム編成に基づくＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の分類を指すものとして使用する。ＨＣＶ単離物の特定のタイプのカテゴリーへの分類化は、他のＨＣＶ単離物に対するゲノム上での関連性とその他のＨＣＶ単離物に対する相対的関連性の低さを反映する。本明細書では、ＨＣＶ分類の命名法は、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１９：１３２１−１３２４によって提唱され広く採用されている命名法に従っている。また、Ｚｅｉｎ（２０００）“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ”、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３（２）：２２３−２３５；Ｍａｅｒｔｅｎｓ  ａｎｄ  Ｓｔｕｙｖｅｒ（１９９７）“Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ”、ｐ．１８２−２３３、Ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ（編著）、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ．）を参照のこと。Ｓｉｍｍｏｎｓら（１９９４）のシステムでは、公知のＨＣＶ単離物を１１種の（１１）ＨＣＶゲノタイプすなわちゲノタイプ１から１１のひとつに分類している。各ゲノタイプをさらに、同一ゲノタイプの株での関連性を反映するサブタイプと称するグループ分けに小分類した。ＨＣＶサブタイプは、遺伝子タイプ下の小文字のローマ字により示され、例えば、サブタイプ１ａ、サブタイプ１ｃ、サブタイプ６ａ等である。各単離物内にみられた遺伝的変異体は、擬似種と命名した。約７８種のＨＣＶサブタイプが全１１種のゲノタイプを網羅し、これらが、世界中で公知である；サブタイプの数は、一定しているわけではない；ＨＣＶ単離物がより多く研究され配列決定されるに伴い、さらにサブタイプ（およびゲノタイプもおそらく）が見出される可能性がある。本明細書では、用語“ウイルスタイプ”とは、ゲノタイプまたはサブタイプのいずれかを指す。
【００９９】
いくつかのレポート（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４３（１２）：２４９３−２５０３）では、ウイルスゲノム編成は、一部のＨＣＶゲノタイプが他のＨＣＶゲノタイプよりも互いに関連性が強いという観察を反映するウイルスクレードを新しく設けることで非常によく表されると、示唆している。このシステムでは、クレード１，２，４および５は、ゲノタイプ１，２，４および５に対応しており、クレード３は、ゲノタイプ３および１０を含み、クレード６は、ゲノタイプ６，７，８，９および１１を含む。本発明の記載は、クレード命名法を使用していない。
【０１００】
本明細書では、“〜由来”との表現は、特定の試料、分子、生物または特定の分子または生物由来情報から単離したかまたはそれらを用いて作製した成分を指す。たとえば、Ｃ型肝炎ウイルスに由来する核酸分子は、例えば、ＨＣＶゲノムの分子であるか、あるいはこれとは別に、ＨＣＶゲノムからの転写物であるか、またはこれとは別に、ＨＣＶポリヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド配列を含む合成核酸であってもよい。
【０１０１】
本明細書では、用語“モニターする”とは、定期的または連続的サーベイランス、試験、データ採取及び／又は定量化を指すものとして使用する。モニタリングは自動化でき、モニタリング時に得た情報は印刷できるか、または、コンピュータ読み取り可能及び／又はコンピュータ保存可能フォーマットとして蓄積できる。
【０１０２】
本明細書では、用語“相関する”とは、２個以上の可変数、値または実体物間の関連を見出すことを指すものとして使用する。２個の可変数が相関する場合、それらの可変数のひとつを同定しそれを用いて、残りの可変数の値を決定できる。
【０１０３】
本明細書では、用語“キット”とは、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析または操作を促進する製品の組み合わせを言及するものとして使用する。キットには、キット使用法を記載した説明書（例えば、本発明の方法を説明した説明書）、前記方法に必要な化学試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、ならびに、任意の他の成分も含むことができる。
【０１０４】
本明細書では、“非対称ＰＣＲ”とは、プライマー対中のプライマーのモル濃度を修飾してそれらが等価でないようにすることによって、ＤＮＡ標的の鎖１個を優先的にＰＣＲ増幅することを指す。非対称ＰＣＲ反応では、プライマー濃度が同等でないことの結果として主に一本鎖産物と少量の二本鎖産物を産生する。非対称ＰＣＲが進行するに伴い、低濃度のプライマーが定量的に二本鎖ＤＮＡアンプリコンに取り込まれるが、高濃度のプライマーはＤＮＡ合成をさらにプライミングし続け、その結果、一本鎖産物が連続的に蓄積することになる。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
序説
本発明は、標識核酸からの発光修飾のための簡易で優れた方法とそれに関連した面を述べる。例示すると、５’−ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコン、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマー、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブ等のような標識核酸は、当業者に周知の多くのなかでも遺伝子型分類、診断、法医学を含むさまざまな適用において核酸を検出するために頻繁に用いられる。これらのプローブの多くは、蛍光レセプター色素、および２個の部分が互いに適当に近接している時発光性部分からの検出可能な発光を低下させるクエンチャー部分のような発光性標識部分を含む。これらのクエンチャー部分は、検出可能な発光を低下させるが、この低下はしばしば不完全である。すなわち、これらの多重標識プローブは、頻繁に、関連の残留またはベースライン発光を有する。反応混合物中でプローブ量が増加するに伴い、多重適用における異なるプローブの複数セット使用によるのかまたは基本的に任意の適用においてもあるプローブの量が多いことによるのか、このベースライン発光はまた、増大する傾向がある。これらのようなベースライン発光は、典型的には、例えば、感度（すなわち、分析物質濃度のわずかの差異を識別するアッセイ能力）およびダイナミックレンジ（すなわち、定量的測定ができる最低濃度（定量限界すなわちＬＯＱ）から校正曲線が直線性を逸脱する濃度（直線性限界すなわちＬＯＬ）まで広がるアッセイの有用範囲）を限定することによって、これらのプローブを用いるアッセイパフォーマンスにマイナスの影響を及ぼす。したがって、本明細書に記載のある発光修飾剤は、消滅させるというまでにはいかないが、これらのベースライン発光をいくつかの態様でさらに低下させるために用いられ、これらのタイプの標識プローブを伴うアッセイパフォーマンスを向上させる。
【０１０６】
レポーターおよびクエンチャー部分のペアを有するもののような複数標識物を含むプローブからの発光を修飾する手法提供に加えて、本発明はまた、それぞれが唯一の発光部分しか有していないプローブからの発光を修飾することを規定する。これらのアプローチをまた、標的核酸のリアルタイム検出を実行するために使用でき、高感度検出に適したシグナルダイナミックレンジでリアルタイム逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応ベースの（動的ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを含む。本明細書に記載の他の多重アプローチと同様、ある態様において、複数標的核酸の同時検出を実施する同一反応混合物中に異なる発光性部分を有する一重標識プローブをクエンチするために用いることができる。さらに、一重標識プローブは、典型的には、複数標識プローブよりも合成が容易でかつ生産コストも安い。
【０１０７】
要約すると、本発明は、発光性標識オリゴヌクレオチド（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）およびこのオリゴヌクレオチドからの発光を修飾する発光修飾剤（例えば、可溶性発光修飾剤）を含んで成る反応混合物を提供する。例示的な発光修飾剤には、さまざまなジアジンおよびチアジン色素が含まれる。ある態様において、これらの反応混合物またはその成分は、キットに含まれる。例えば標的核酸をリアルタイムに検出する核酸増幅アッセイの一部として標識オリゴヌクレオチドからの発光を修飾する方法もまた、提供される。さらに、本明細書に記載の前記反応混合物中の標識オリゴヌクレオチドからの発光を検出するシステムもまた、提供される。これらおよび本発明のさまざまな他の面および特徴も、本開示を完全に読めば明らかであろう。
【０１０８】
例示すると、図１Ａおよび１Ｂは、唯一の発光性部分（例えば、蛍光色素等）で標識されている５’−ヌクレアーゼプローブからの発光を実質的にクエンチングさせるために発光修飾剤を用いるアッセイを図示している。図１Ａに示したように、反応混合物は、標的核酸１００、プライマー１０２、プローブ１０４、およびポリメラーゼ１１０（５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する）を含む。蛍光団１０６は、プローブ１０４の５’末端でまたはその近くで共有結合により結合している。さらに例示すると、この反応混合物には、また、発光修飾剤１０８を含み、これは非共有結合で、標的核酸１００およびプライマー１０２と結合している。発光修飾剤１０８はまた、非共有結合でプローブ１０４に結合しており、プローブ１０４から放出された蛍光を実質的にクエンチングしている。図１Ｂに示したように、アッセイ進行に伴い、ポリメラーゼ１１０はプローブ１０４から断片を開裂し、それは、標的核酸１００に結合する。このプロセスにおいて、蛍光団１０６を含む断片が残りのプローブ１０４部分から放出される。結果として、断片からの蛍光団１０６により放出された蛍光が開裂前のプローブ１０４からのものよりもクエンチングされる程度が低いので、検出可能な蛍光増加が起こる。すなわち、本明細書に記載の発光修飾剤は、典型的には、長さ依存性に標識核酸からの発光をクエンチさせるかまたは低下させる。
【０１０９】
さらに例示すると、図２Ａおよび２Ｂは、二重標識５’−ヌクレアーゼプローブからのベースライン発光を低下させるために用いるアッセイを図示している。図２Ａに示したように、反応混合物は、標的核酸２００、プライマー２０２、プローブ２０４、およびポリメラーゼ２１２（５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する）を含む。蛍光団２０８は、プローブ２０４の５’末端でまたはその近くで共有結合により結合しており、クエンチャー２０６は、共有結合で、プローブ２０４の３’末端に結合している。本明細書には示さないが、蛍光団２０８またはクエンチャー２０６は任意に、プローブ２０４の内部残基に結合することもできる。さらに示したように、前記反応混合物には、発光修飾剤２１０を含み、これは、非共有結合で標的核酸２００およびプライマー２０２と結合している。発光修飾剤２１０はまた、非共有結合でプローブ２０４に結合しており、プローブ２０４から放出されたベースライン蛍光を低下させる。図２Ｂに示すとおり、分析が進むにつれポリメラーゼ２１２は標的核酸２００に結合したプローブ２０４から断片を開裂する。図１Ａおよび１Ｂに関して上記で述べたプロセスと同様、蛍光団２０８を含む断片が放出され、その結果、検出可能な蛍光の増加が起こる。
【０１１０】
反応混合物
本発明の反応混合物は、標識核酸からの発光を修飾するのが望ましいさまざまな用途において使用できる。態様によっては、例えば、特に複数の標識プローブをプールした多重フォーマットにおいて本明細書に記載の反応混合物をホモジニアス増幅／検出アッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲ等）を実施する際に利用する。本明細書に記載の発光修飾剤のあるものは、温度を変えかつ多くのこれまでの公知の化合物と異なりこれらのアッセイタイプで典型的に使用される反応条件下で、標識プローブからのベースライン発光を低下させる。発光修飾剤および標識オリゴヌクレオチドのほかに、任意に本発明の反応混合物に含められる他の試薬もさらに詳細に下文で説明する。
【０１１１】
発光修飾剤
本発明の反応混合物および他の面で使用する発光修飾剤には、さまざまなタイプの核酸増幅反応およびアッセイにおいて標識プローブからの発光を修飾するかまたは修飾するのに非常に適するようにしたさまざまな性質を含む。例えば、これらの発光修飾剤は、典型的には、一本鎖核酸（例えば、一本鎖プローブ）と二本鎖核酸（例えば、標的核酸とハイブリダイズした一本鎖プローブ）の両者に結合する。あらゆる特定の理論に限定されることなく、本明細書に記載の発光修飾剤は、さらに、核酸に通常結合し核酸に結合した標識物からの発光を長さ依存的に修飾する。すなわち、ある標識オリゴヌクレオチドからの発光を発光修飾剤が修飾する程度は、典型的には、そのオリゴヌクレオチドの長さに比例している。例えば、特定の発光修飾剤は、通常、オリゴヌクレオチドの標識断片からの発光を、インタクトなすなわち全長のオリゴヌクレオチド、例えば、５’−ヌクレアーゼ反応における開裂前のものからの発光よりも低い程度にまで修飾する。ある発光修飾剤は、また、典型的には、さまざまな異なる発光性部分からの発光を有効に修飾できる。すなわち、これらの発光修飾剤によって実行される前記修飾（すなわち、クエンチング）は、通常、スペクトル重複に依存せずすなわち普遍的であり、いかなる特定の作用理論にも限定されるわけでもないが、基底状態複合体形成を経由して出現する可能性がある。これは、例えば異なる蛍光団または他の標識部分で標識した複数のプローブを通常使用する多重アッセイにおいて、重要な性質である。
【０１１２】
さらに例示すると、本発明の発光修飾剤は、例えば動的ＰＣＲモニタリング（例えば、２段階ＰＣＲについて約３５℃から約６０℃の間のアニーリング温度、約６５℃から約８０℃の伸長温度、約３５℃から約８０℃の間のアニール−伸長段階温度等）において頻繁に使用される温度において、例えば全長プローブに結合したまま留まりかつそれからの発光を修飾する。適切なＰＣＲ反応条件もまた、下文でまた本明細書で引用により組み入れられるＧｅｌｆａｎｄら（編著）、ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｏｏｋｓ（１９９９）に記載されている。さらに、本発明の発光修飾剤は、緩衝液、塩、金属イオン、プライマー、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、または他のターミネーターヌクレオチド、グリセロール、ＤＭＳＯ，ポリｒＡ等のようなさまざまな他のＰＣＲ成分を含んで成る反応混合物中の全長プローブに結合する能力を有しかつそれからの発光を修飾する。本明細書に記載の発光修飾剤は、また、通常、ＰＣＲに用いられる段階（例えば、アニーリング、伸長、変性）のいずれをも、認識可能な程には妨害しない。ＲＴ−ＰＣＲ適用において、本明細書に記載の発光修飾剤は、また、典型的には、逆転写段階を有意には阻害しない。これらの発光修飾剤のもうひとつの利点は、それらが、これらのＰＣＲ産物にほとんど分類されない大量の蓄積しているアンプリコンの存在下でも、全長プローブからの発光を修飾し続けることである。さらに例示すると、本明細書に記載の発光修飾剤はまた、さもなければアッセイ検出を干渉し又は偏らせることがある蛍光であって、もしあったとしても固有の蛍光を可視スペクトルのある領域でほとんど有していない。これらの性質の多くは、また、下文または本明細書で言及した実施例に例示する。
【０１１３】
多くの異なる発光修飾剤は、本発明の反応混合物および他の面における用途に適している。典型的には、発光修飾剤は、５’−ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコン等のような標識オリゴヌクレオチドからの発光を、リアルタイムＰＣＲ反応段階を実施する際に多く用いる少なくとも約４０℃のアニーリング温度のような反応温度で発光を修飾可能な可溶性核酸結合化合物である。態様によっては、例えば、本発明の発光修飾剤には、さまざまなジアジンおよびチアジン色素が含まれる。発光修飾剤として使用できる例示的なジアジン色素には、例えば、アゾカルミン色素（例えば、アゾカルミンＡ，アゾカルミンＢ（Ｃ28Ｈ17Ｎ3Ｏ9Ｓ3Ｎａ2），アゾカルミンＧ（Ｃ28Ｈ18Ｎ3Ｏ6Ｓ2Ｎａ）等）、フェナジン色素、オキサジン色素（例えば、セレスチンブルー（Ｃ17Ｈ18ＣｌＮ3Ｏ4）等）、ジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリド（すなわち、ヤヌスグリーンＢまたはジアジングリーン５（Ｃ30Ｈ31Ｎ6Ｃｌ）等が含まれる。これらのジアジン色素の化学構造を表Ｉに示す。
【０１１４】
【表１】
2010162027.tif 000003
【０１１５】
さらに例示すると、発光修飾剤として使用できる例示的なチアジン色素には、例えば、メチレンブルー（Ｃ16Ｈ18ＣｌＮ3Ｓ）、メチレングリーン（Ｃ16Ｈ17ＣｌＮ4Ｏ2Ｓ）、チオニン（Ｃ12Ｈ10ＣｌＮ3Ｓ）、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ（Ｃ15Ｈ16Ｎ3ＳＣｌ），ニューメチレンブルー（Ｃ18Ｈ22ＣｌＮ3Ｓ）、メチレンバイオレットベルンスセン、アズールＡ（Ｃ14Ｈ14ＣｌＮ3Ｓ）、アズールＢ（Ｃ15Ｈ16ＣｌＮ3Ｓ）、アズールＣ（Ｃ13Ｈ12ＣｌＮ3Ｓ）等が含まれる。これらのチアジン色素の一部の化学構造を表ＩＩに示す。
【０１１６】
【表２】
2010162027.tif 000004
【０１１７】
ある反応混合物に含まれる特定の発光修飾剤の量は、通常、求める修飾度合いに依存する。典型的には、発光修飾の度合いは、反応混合物中に存在する発光修飾剤の量に比例している。他の量も任意に用いられるが、発光修飾剤は、通常、反応混合物の約５μｇ／ｍＬから反応混合物の約１００μｇ／ｍＬであり、さらに典型的には反応混合物の約１０μｇ／ｍＬから反応混合物の約７５μｇ／ｍＬであり、またさらに典型的には反応混合物の約１５μｇ／ｍＬから反応混合物の約５０μｇ／ｍＬである（例えば、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ等）。態様によっては、反応混合物には、アンプリコン濃度に対して過剰の発光修飾剤濃度を含んで成る反応混合物中のさまざまな発光修飾剤濃度の影響は、さらに、下文に示した実施例で示す。態様によっては、１超の発光修飾剤を同一反応混合物中で使用できる。これらの態様において、異なる発光修飾剤は、任意に、特定の反応混合物中に同一濃度でまたは異なる濃度で存在する。一例として、反応混合物には、反応混合物当たり２０μｇ／ｍＬのニューメチレンブルーと反応混合物当たり３０μｇ／ｍＬのメチレンブルーを含むことができる。発光修飾剤は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ、ＵＳＡ）のようなさまざまな商業的な供給業者から容易に入手できる。
【０１１８】
標識オリゴヌクレオチド
本発明の反応混合物は、発光修飾剤に加えて標識オリゴヌクレオチドを含む。さまざまな手法が、プローブ（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコン、ＦＲＥＴプローブ等）及び／又はプライマーとして利用される。例示すると、ＤＮＡＳＴＡＲ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手可能なＤＮＡｓｔａｒソフトウェアパッケージを配列アラインメントに使用できる。たとえば、個別ファイルとして標的核酸配列および非標的核酸配列をＤＮＡｓｔａｒ  ＥｄｉｔＳｅｑプログラムに、例えば、これらの配列における低配列類似性を有する領域を同定するプロセスの一部としてアップロードすることができる。さらに例示すると、配列ファイルペアをＤＮＡｓｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎ配列アラインメントプログラムで開いて、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント方法を適用できる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントに用いたパラメータは、任意に、前記ソフトウェアのデフォルト設定である。ＭｅｇＡｌｉｇｎは、典型的には、２個の配列間の同一性パーセントの要約を示すことはない。これは、通常、手作業で計算される。前記アラインメントから、例えば互いに選択した同一性パーセント未満である領域を典型的に同定し、これらの領域におけるオリゴヌクレオチド配列を選択できる。多くの他の配列アラインメントアルゴリズムおよびソフトウェアパッケージもまた、任意に利用される。配列アラインメントアルゴリズムは、また、例えば、引用により組み入れられるＮｏｔｒｅｄａｍｅら（２０００）“Ｔ−ｃｏｆｆｅｅ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：２０５−２１７、Ｅｄｇａｒ（２００４）“ＭＵＳＣＬＥ：ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｉｍｅ  ａｎｄ  ｓｐａｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ”、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５：１１３、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）。
【０１１９】
さらに例示すると、比較用配列の最適アラインメントは、例えば、引用により組み入れられるＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３による相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性方法用サーチによって、およびこれらのアルゴリズムのコンピュータ実施によって（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中のＴＦＡＳＴＡ）または視覚検査によってさえも実施できる。
【０１２０】
配列同一性パーセント決定に適した別のアルゴリズム例は、例えば、引用により組み入れられるＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析のバージョン実施用ソフトウェアは、２００５年６月３０日付けｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のワールドワイドウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公に入手できる。
【０１２１】
有用な配列アラインメントアルゴリズムの他の例は、ＰＩＬＥＩＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレシブな、ペアワイズアラインメントを用いる関連配列のグループから複数配列アラインメントを作製する。それはまた、前記アラインメントを作るために使用したクラスター形成関連を示すツリーを図示する。ＰＩＬＥＵＰは、引用により組み入れられるＦｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレシブなアラインメント方法を簡易化したものを使用している。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、基本的に任意の公知の技術を用いて任意に調製する。ある態様において、例えば、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、基本的に任意の核酸合成方法を用いても化学的に合成され、例えば、引用により組み入れられるＢｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２により記載された固相ホスホラミダイト方法を含む。さらに例示すると、オリゴヌクレオチドは、また、トリエステル方法によって合成することもできる（両者ともに引用により組み入れられる、例えばＣａｐａｌｄｉら（２０００）“Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（９）：ｅ４０およびＥｌｄｒｕｐら（１９９４）“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ  ｂｙ  ａ  ｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１０）：１７９７−１８０４を参照のこと）。当業界で既知の、例えば本明細書で引用により組み入れられるＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８に記載のように、自動合成器を用いることを含む他の合成技術も利用できる。実に広範囲のさまざまな設備が、自動オリゴヌクレオチド合成のために市販されている。複数のヌクレオチド合成手法（例えば、トリヌクレオチド合成等）もまた、任意に、利用される。さらに、前記のプライマー核酸には、任意に、さまざまな修飾体も含む。ある態様において、例えば、プライマーには、例えば、以下のアンプリコンクローニング等を促進するために制限酵素部位リンカーを含む。さらに例示すると、プライマーはまた任意に修飾して、例えば本明細書で引用により組み入れられる米国特許６，００１，６１１号、標題“ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＰＲＩＭＥＲＳ”、１９９９年１２月１４日発行（Ｗｉｌｌ）に記載の増幅反応の特異性を高める。プライマーおよびプローブは、また、本明細書で記載のようにまたは当業界で既知のようにさまざまな他の修飾（例えば、制限酵素部位、酵素結合部位等）を有するように合成できる。
【０１２３】
本発明の反応混合物、方法および他の面で利用するプローブ及び／又はプライマーは、典型的には標識して、プローブ−標識ハイブリダイゼーション二本鎖の検出を可能とする。通常、標識は、核酸に結合できかつ検出可能なシグナル（例えば、定量可能なシグナル）を示す任意の部分であってもよい。標識は、当業界で既知のさまざまな技術によって、直接的にまたは間接的にオリゴヌクレオチドに結合することもできる。例示すると、使用した標識タイプに応じて、前記標識は、末端（オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブの５’または３’末端）または非末端ヌクレオチドに結合でき、さまざまな大きさで組成のリンカーまたはスペーサーアームを介して間接的に結合できる。市販のホスホラミダイト試薬を用いて、適当に保護したホスホラミダイトにより５’または３’末端のいずれかに部分（例えば、チオールまたは一級アミン）を含むオリゴヌクレオチドを産生でき、例えば、本明細書で引用により組み入れられるＩｎｎｉｓら（編著）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｏｏｋｓ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）に記載のプロトコールを用いて上記オリゴヌクレオチドを標識できる。
【０１２４】
基本的に任意の標識部分を任意に用いて、当業界で周知の技術により、プローブ及び／又はプライマーを標識する。態様によっては、例えば、標識は、蛍光色素（例えば、ローダミン色素（例えば、Ｒ６Ｇ，Ｒ１１０，ＴＡＭＲＡ，ＲＯＸ等）、フルオレセイン色素（例えば、ＪＯＥ，ＶＩＣ，ＴＥＴ，ＨＥＸ，ＦＡＭ等）、ハロフルオレセイン色素、シアニン色素（例えば、ＣＹ３，ＣＹ３．５，ＣＹ５，ＣＹ５．５等）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素（例えば、ＦＬ，５３０／５５０、ＴＲ，ＴＭＲ等）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素（例えば、４８８、５３２、５４６、５６８、５９４、５５５、６５３、６４７、６６０、６８０等）、ジクロロローダミン色素、エネルギー移動色素（例えば、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ１色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ２色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ３色素等）、Ｌｕｃｉｆｅｒ色素（例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒイエロー等）、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標），Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ等を含む。蛍光色素の他の例は、例えばそれぞれ引用により組み入れられるＨａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版（２００３）およびその改訂版に示されている。蛍光色素は、通常、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等を含むさまざまな商業的な供給業者から容易に入手できる。他の標識には、例えば、ビオチン、弱蛍光標識（Ｙｉｎら（２００３）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（７）：３９３８、Ｂａｂｅｎｄｕｒｅ等（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１７（１）：１、およびＪａｎｋｏｗｉａｋ等（２００３）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６（３）：３０４）、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識（Ｗｉｌｓｏｎ等（２００３）Ａｎａｌｙｓｔ．１２８（５）：４８０およびＲｏｄａ等（２００３）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ１８（２）：７２）、ラマン標識、電気化学標識、生物発光標識（Ｋｉｔａｙａｍａら（２００３）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７７（３）：３３３、Ａｒａｋａｗａら（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１４（２）：２０６、およびＭａｅｄａ（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．３０（６）：１７２５）、および、例えば２００２年１１月２２日出願の米国仮特許出願６０／４２８、４８４に記載のアルファ−メチル−ＰＥＧ標識用試薬が含まれ、これらの文献は、それぞれ、引用により組み入れられる。核酸標識は、また、下文でさらに説明する。
【０１２５】
さらに、蛍光色素がドナーであるのかアクセプターであるのかは、その励起および発光スペクトル、およびそれが対を形成する蛍光色素により通常規定される。プローブおよびプライマー中のクエンチャー部分として頻繁に使用される蛍光分子には、例えば、フルオレセイン、ＦＡＭ，ＪＯＥ，ローダミン、Ｒ６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ＲＯＸ，ＤＡＢＣＹＬ，およびＥＤＡＮＳが含まれる。これらの化合物の多くは、上記に引用した商業的な供給業者から入手できる。蛍光色素から吸収したエネルギーを放出する例示的な非蛍光すなわちダーククエンチャーには、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）すなわちＢＨＱ（商標）が含まれ、これらは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）から市販されている。
【０１２６】
さらに例示すると、基本的に任意の核酸（および、標準または非標準のいずれであってもよい実質的に任意の標識核酸）も、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ、Ｉｎｃ．，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｒｏｌｉｇｏ  ＬＬＣおよびその他多くの会社のようなさまざまな商業的な供給業者のいずれかからでも、カスタム注文できるしまたは普通に注文できる。
【０１２７】
ある態様において、修飾ヌクレオチドは、プローブおよびプライマーに含まれる。例示すると、オリゴヌクレオチド配列に修飾ヌクレオチド置換物を導入した場合、例えば、前記オリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させることができる。態様によっては、これにより、標的核酸と特定のオリゴヌクレオチドとの間に１又は複数のミスマッチが存在していても対応する非修飾オリゴヌクレオチドと比較して高い感度をもたらすことができる。オリゴヌクレオチドに置換できるかまたは付加できる例示的な修飾ヌクレオチドには、例えば、Ｃ５−エチル−ｄＣ，Ｃ５−エチル−ｄＵ，２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ，Ｃ７−プロピニル−ｄＡ，Ｃ７−プロピニル−ｄＧ，Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＣ，Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＵ，Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＡ，Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、偽−ｄＵ，ニトロピロール、ニトロインドール、２´−０−メチルリボ−Ｕ，２´−０−メチルリボ−Ｃ，８−アザ−ｄＡ，８−アザ−ｄＧ，７−デアザ−ｄＡ，７−デアザ−ｄＧ，Ｎ４−エチル−ｄＣ，Ｎ６−メチル−ｄＡ等が含まれる。さらに例示すると、修飾オリゴヌクレオチドの他の例には、１又は複数のＬＮＡ（商標）モノマーを有するものが含まれる。これらのようなヌクレオチド類似体は、例えば、本明細書でそれぞれ引用により組み入れられる米国特許６，６３９、０５９、標題“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  〔２．２．１〕ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ”、２００３年１０月２８日発行（  Ｋｏｃｈｋｉｎｅら）、米国特許６，３０３，３１５、標題“ＯＮＥ  ＳＴＥＰ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＩＮ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥＳ”、２００１年１０月１６日発行（Ｓｋｏｕｖ）、および米国特許出願広報２００３／００９２９０５、標題“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  〔２．２．１〕ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ”、２００３年５月１５日公表及び発行（Ｋｏｃｈｋｉｎｅら）、に記載されている。ＬＮＡ（商標）モノマーを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ（Ｖｅｄｂａｅｋ、ＤＫ）を介して市販されている。他のオリゴヌクレオチド修飾体は、上記に述べた定義中のものを含めて、本明細書に記載されている。
【０１２８】
５’−ヌクレアーゼプローブ、ハイブリダイゼーションプローブ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマー、および分子ビーコンのような標識オリゴヌクレオチドは、本明細書でさらに説明する。
【０１２９】
核酸増幅試薬
本発明の反応混合物は、本明細書で述べたように選択した量の発光修飾剤と標識オリゴヌクレオチドを含む。さらに、反応混合物はまた、通常、リアルタイムＰＣＲモニタリングまたは５’−ヌクレアーゼアッセイのようなプローブ核酸増幅または検出反応実施において有用なさまざまな試薬を含む。例示的な核酸増幅試薬には、例えば、プライマー核酸、鋳型または標的核酸、ヌクレオチド取り込み生体触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等）、伸長可能なヌクレオチド、ターミネーターヌクレオチド、緩衝液、塩、アンプリコン、グリセロール、金属イオン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリｒＡ（低コピー標的用担体核酸）等を含む。態様によっては、例えば、核酸増幅反応は、これらの反応混合物を用いて実施し、例えば、疾患の診断及び／又は予後を助けるために試料中の標的核酸の検出を行う。核酸増幅および検出方法もまた、下文でさらに説明する。
【０１３０】
反応混合物は、通常、選択した発光修飾剤と標識オリゴヌクレオチドを選択した特定の核酸増幅方法実施に十分な量の核酸増幅試薬と組み合わせることによって作られる。ある反応混合物に含まれる核酸増幅試薬の量は、選択した核酸増幅方法を考慮すれば、当業者に周知である。しかし、例示すると、プライマー核酸および伸長可能なヌクレオチド（例えば、４種のｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）が、それぞれ、ある態様において反応混合物中で大過剰のモルで存在する。本発明の混合物中で利用できるプローブおよびプライマー核酸は、本明細書で記載されている。適切な伸長可能なヌクレオチドは、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）等のような多くの異なる商業的な供給業者から容易に入手可能である。
【０１３１】
本発明の反応混合物および他の面で利用されるヌクレオチド取り込み生体触媒は、典型的には、ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ等のような酵素を含む。ある態様において、例えば、前記酵素は、５’−３’ヌクレアーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含み、及び／又は熱安定性酵素である。前記酵素は、任意に、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ    ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ１７，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ，Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ，Ｂａｃｉｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の生物由来である。
【０１３２】
ある態様において、追加の試薬もまた、本発明の反応混合物に添加される。例示すると、反応混合物は任意に、例えばピロリン酸分解を最小とするために使用するピロホスファターゼ（例えば、熱安定性ピロホスファターゼ）、例えばキャリーオーバーコンタミネーションに対して保護するためのｄＵＴＰおよびウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（例えば、熱安定性ＵＮＧ）を任意に含む。
【０１３３】
標識オリゴヌクレオチドからの発光修飾方法
本発明はまた、標識オリゴヌクレオチドからの発光（例えば、ベースライン発光）を修飾する方法を提供する。典型的には、これらの方法は、例えば、標的核酸が由来する対象についての診断、遺伝または他の情報を提供するため、標的核酸の検出を伴うアッセイの部分として行われる。態様によっては、これらの方法で用いた発光修飾剤は、標識オリゴヌクレオチドからの発光を低下させる。これは、通常、本明細書で記載の発光修飾剤を利用する特定のアッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲ技術）の感度およびダイナミックレンジのようなパフォーマンス特性を向上させる。これらの面はまた、下記の実施例でも例示されている。
【０１３４】
本発明の方法の実施において、分子生物学の多くの従来技術が任意に利用される。これらの技術は周知であり、例えば、すべてを引用により組み入れられるＡｕｓｕｂｅｌら（編著）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ，  ＩＩ，  およびＩＩＩ（１９９７）（Ａｕｓｕｂｅｌ  １）、Ａｕｓｕｂｅｌら（編著）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）（Ａｕｓｕｂｅｌ  ２）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｇｅｒ）、Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，＃６０、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）、Ｇａｉｔ（編著）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８４）、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）、およびＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（編著）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８４）に説明されている。
【０１３５】
本発明の反応混合物中におけるかまたはそれに由来する標的核酸の分析に使用できるかまたはそれに使用するために適応させることができる核酸分析技術の一般的タイプの例には、さまざまな核酸増幅アッセイが含まれる。核酸増幅アッセイに共通の特徴は、それらが、典型的に、検出する生物に特異的な核酸配列を増幅するために設計されていることである。核酸増幅試験は、通常、核酸分析に対する他の手法よりも高い感度を有している。この感度はさらに本発明の発光修飾剤を用いることで改良され、典型的には、標的核酸の唯一のコピーほどのわずかのものからプラスのシグナルを産生できるそれらの能力に起因する。標的核酸検出に任意に用いられるかまたはそれに適応させた増幅方法は、例えば、さまざまなポリメラーゼ、リガーゼまたは逆転写酵素媒介増幅方法を含み、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＳＤＡ等のようなものである。これらおよび他の増幅方法の使用に関する他の詳細およびこれらのアッセイのための試料調製のさまざまな手法は、例えば、上記で述べたＢｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ  １および２、およびＩｎｎｉｓを含むさまざまな標準的参考書のいずれでも調べることができる。本発明の発光修飾剤および方法で使用するために任意に適応させたさまざまな市販の核酸増幅アッセイは、通常、増幅方法とそれらの標的核酸配列で異なっている。これらの市販試験の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）およびＣＯＢＡＳ  ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ、ＵＳＡ）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いるＬＣｘ（登録商標）試験（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ、ＵＳＡ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）を用いるＢＤＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ試験（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）；核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いるＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱアッセイ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）；および転写媒介増幅（ＴＭＡ）を用いるＡＰＴＩＭＡ（商標）アッセイ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）が含まれる。核酸増幅および検出については、さらに下文で説明する。
【０１３６】
ある態様において、例えば、本発明の発光修飾剤は、さまざまな５’−ヌクレアーゼ反応において使用され、５’−ヌクレアーゼプローブからの発光を修飾する（例えば、低下させる）。多くの５’−ヌクレアーゼアッセイが当業者に周知である。このような反応の例は、例えば、引用により組み入れられる米国特許５，２１０，０１５、６，２１４，９７９、５，８０４，３７５および５，４８７，９７２同上において記載されている。簡単に述べると、５’−ヌクレアーゼ反応において、プライマーおよびプローブが標的核酸の鎖とハイブリダイズする条件下で前記標的核酸を前記プライマーおよびプローブ（例えば、５’−ヌクレアーゼプローブ等）に接触させる。前記標的核酸、プライマーおよびプローブは、また、選択した量の発光修飾剤および５’から３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼに接触させる。５’から３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼは、前記プライマーの下流で標的核酸とハイブリダイズした前記プローブを開裂できる。前記プライマーの３’末端は、ポリメラーゼの最初の結合部位を提供する。結合したポリメラーゼは、プローブの５’末端に遭遇した場合、プローブから断片を開裂する。
【０１３７】
前記プライマーおよびプローブは、核酸ポリメラーゼのプライマー３’末端に対する結合が、プライマー伸長がない状態でそれをプローブ５’末端に接触させるように標的核酸の非常に近くにアニーリングする。用語“重合非依存性開裂”とは、このプロセスを指す。これとは別に、前記プライマーとプローブが標的核酸に対してさらに遠くの領域にアニーリングする場合、典型的には、重合は、核酸ポリメラーゼがプローブ５’末端に遭遇する前に起こる。重合が継続するに伴い、ポリメラーゼは断片をプローブ５’末端から準じ開裂していく。この開裂は、プローブの残りが鋳型分子から解離する程度まで脱安定化されるまで継続する。用語“重合依存性開裂”とは、このプロセスを指す。
【０１３８】
重合非依存性開裂のひとつの利点は、核酸増幅の必要性がなくなることにある。プライマーとプローブが核酸に対して隣接して結合した場合、プローブのアニーリングと断片開裂の次の回が起こることになる。したがって、十分量の断片が産生され、重合が存在していなくても検出が可能となる。
【０１３９】
いずれのプロセスにおいても、標的核酸を含むと考えられる試料を提供する。試料に含まれる標的核酸は、最初にもし必要ならばｃＤＮＡに逆転写され、次に、当業者に公知の物理的、化学的または酵素方法を含む任意の適切な変性方法を用いても変性させることができる。鎖の分離を行う例示的な物理的方法では、核酸が完全に（＞９９％）変性するまで加熱することが必要になる。典型的熱変性では、約８５℃から約１０５℃の範囲の温度を、約１〜約１０分間必要とする。変性の別法では、核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのような一本鎖形態で試料中に存在することもできる。
【０１４０】
変性標的核酸鎖は、典型的には、プライマー、プローブ、および選択した発光修飾剤と、プライマーおよびプローブが標的核酸に結合でき前記発光修飾剤が少なくとも前記プローブに結合できるハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションする。態様によっては、２個のプライマーを用いて標的核酸を増幅できる。前記２個のプライマーは、典型的には、標的核酸に対するそれらの相対的位置が、伸長産物がその鋳型（相補体）から分離した場合１個のプライマーから合成された伸長産物が他のプライマーの伸長のための鋳型として作用し、一定長さの複製鎖を生ずるように、選択される。多重フォーマットにおいて、複数のプローブは、典型的には、単一の反応容器で使用され、同時に複数の標的核酸を検出する。
【０１４１】
相補鎖は典型的には、プローブまたはプライマーよりも長いので、前記鎖は、より多くの接触点を有し、従って、ある一定の時間で互いに結合する機会が高くなる。したがって、大幅にモル過剰であるプローブとプライマーを典型的には利用することで、鋳型鎖の再アニーリングよりもプライマーとプローブのアニーリングを優先させることができる。
【０１４２】
プライマーは、通常、それらが重合非依存性開裂または重合依存性開裂が進行できるような選択条件下で選択的に標的核酸に結合するために十分な長さと相補性を有している。プライマーの正確な長さと組成は、多くの因子、例えばアニーリング反応の温度、プライマーの由来および組成、プライマーアニーリング部位に対するプローブアニーリング部位の近さ、およびプライマー：プローブの比に依存するであろう。たとえば、標的配列がどれだけ複雑であるかによって、プライマーはより多くのまたはより少ないヌクレオチドを含むこともできるが、典型的には約１５−３０個のヌクレオチドを含む。
【０１４３】
前記プローブは、通常、核酸ポリメラーゼが標的核酸の領域に遭遇しそれによって、酵素の５’から３’ヌクレアーゼ活性によってプローブから断片を開裂できる前に、その相補性標的核酸にアニーリングする。ポリメラーゼがハイブリダイゼーション領域に到達する前にプローブがその標的核酸にアニーリングする可能性を高めるため、さまざまな手法が用いられる。たとえば、短いプライマーは、通常、核酸と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。したがって、前記プローブは、プライマーよりも長くなるように設計され、その結果、前記プローブはプライマーアニーリングに対して高い温度で標的核酸に優先的にアニーリングする。さらに例示すると、異なる温度安定性を有するプライマーおよびプローブを、使用することもできる。たとえば、プローブのヌクレオチド組成を、Ｇ／Ｃ含量がより高く、その結果、プライマーよりも高い熱安定性を有するように選択できる。任意に、修飾したヌクレオチドも、プライマーまたはプローブに取り込ませることができ、非修飾ヌクレオチドしか有していないプライマーまたはプローブに比較して熱安定性が高いかまたは低くなるようにすることもできる。例示的な修飾ヌクレオチドは、上記でさらに詳細に説明してある。熱サイクルパラメータもまた変えることができ、プローブとプライマーの異なる熱安定性を利用することもできる。たとえば、熱サイクル変性段階の後、プローブ結合を可能とするがプライマー結合を不可能とする中間温度を導入することもできる。プライマーの前にプローブの結合を優先的に進めるため、プライマー濃度に対して大過剰モルのプローブも使用できる。このようなプローブ濃度は、典型的には、通常約０．５−５×１０-7Ｍであるそれぞれのプライマー濃度の約２〜約２０倍高い範囲にある。
【０１４４】
鋳型依存性プライマー伸長は、通常、適当量の４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）または類似体の存在下で、発光修飾剤および適当な塩、金属カチオン、および緩衝液も含んで成る反応混合物中のヌクレオチド取り込み生体触媒（例えば、ポリメラーゼ等）によって触媒される。反応混合物については、上文に記載してある。適切なヌクレオチド取り込み生体触媒は、プライマーおよび鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒し５’から３’ヌクレアーゼ活性を有することが公知の酵素である。このタイプの例示的なＤＮＡポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は、当業界で周知である。典型的には、ヌクレオチド取り込み生体触媒は、プローブを効率的に開裂し、標識断片を放出し、その結果検出可能なシグナルが直接または間接的に生ずる。
【０１４５】
合成の産物は、通常、鋳型鎖とプライマー伸長鎖を含む二本鎖分子である。この合成の副産物は、プローブ断片であり、モノ−、ジ−およびそれ以上のヌクレオチド断片の混合物を含むことができる。変性、プローブおよびプライマーアニーリングおよびプライマー伸長の繰り返しサイクルとプローブ開裂の結果、プライマーによって規定される領域の指数関数的蓄積と標識断片の指数関数的生成が起こる。十分なサイクルを行い、検出量のプローブ断片を達成し、それは、通常、バックグランドシグナルよりも数桁以上大きい。本明細書に記載の発光修飾剤の使用により、検出可能なシグナルが生ずるまでのサイクル試行回数は、これらのバックグランドシグナルを低下させないアッセイと比較して、有効に低下しうる。
【０１４６】
ある態様において、ＰＣＲ反応は、熱安定性酵素を用いる自動プロセスとして実行される。このプロセスにおいて、反応混合物は、変性段階、プローブおよびプライマーアニーリング段階、および開裂と置換がプライマー依存性鋳型伸長と同時に起こる合成段階を介して、サイクルさせる。態様によっては、本明細書に記載の方法は、システムを用いて実施される。このようなシステムは、下文でさらに詳細に説明する。任意に、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されているもののようなサーマルサイクラーは熱安定酵素による使用のために設計されており、これらを利用することもできる。
【０１４７】
熱安定ポリメラーゼは、典型的には、二本鎖伸長産物をＰＣＲサイクル時に高温（例えば、約９５℃）にさらすことによってそれらの変性を促す自動化プロセスにおいて使用される。たとえば、引用により組み入れられる米国特許４，８８９、８１８、標題“ＰＵＲＩＦＩＥＤ  ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ  ＥＮＺＹＭＥ”１９８９年１２月２６日発行（Ｇｅｌｆａｎｄら）において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離した代表的熱安定酵素を開示している。他の代表的熱安定ポリメラーゼオリゴヌクレオチドには、例えば、熱安定菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（他の列挙したものに比べてやや低い最適温度を有する）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ，Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ，およびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓから抽出したポリメラーゼが含まれる。
【０１４８】
標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションは、適切なハイブリダイゼーション条件を選択することによって、達成できる。プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性は、典型的には、アッセイおよび洗浄条件と両立するように選択され、その結果、プローブと標的核酸との間でのみ安定、検出可能なハイブリッドが形成される。１又は複数の異なるアッセイパラメータの操作により、特定のハイブリダイゼーションアッセイの正確な感度と特異性が決定される。
【０１４９】
さらに詳細に述べると、ＤＮＡ、ＲＮＡ，ＰＮＡまたはＤＮＡ，ＲＮＡおよびＰＮＡの組み合わせの相補性塩基間でのハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度、緩衝液組成等において変動する広範囲のさまざまな条件下で起こる。これらの条件とそれらを適用するための方法の例は、例えば、両者ともに引用により組み入れられるＴｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｖｏｌ．２４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）およびＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ、同上に記載されている。通常、ハイブリダイゼーションは、約０℃と約７０℃の間で約１分から約１時間の間で起こり、ハイブリダイズさせる配列の性質とその長さに依存している。しかし、ハイブリダイゼーションが秒または時間で、反応条件に応じて起こるうることが、わかっている。例示すると、２種の２０量体の典型的ハイブリダイゼーション条件は、前記混合物を６８℃に置き、ついで、室温（２２℃）まで５分間冷却し、または、２マイクロリットルで２℃のような非常に低い温度で冷却する。核酸間のハイブリダイゼーションは、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＨＥＰＥＳのような緩衝液、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ、ＣａＣｌ2）または他の水溶液、試薬および化学物質を用いて促進することもできる。これらの試薬の例には、Ｒｅｃ  Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ  一本鎖結合タンパク質および主要なまたはマイナーな核酸溝結合タンパク質のような一本鎖結合タンパク質を含む。このような試薬および化学物質の他の例には、二価のイオン、多価イオンおよびエチジウムブロマイド、アクチノマイシンＤ、乾癬、およびアンゲリシンのような相互作用性の物質が含まれる。
【０１５０】
標的核酸検出のために基本的に任意の利用可能な方法も、本発明で使用できる。一般的手法には、５’−ヌクレアーゼプローブ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマー、または分子ビーコンによるリアルタイム増幅検出、相互作用性色素の検出、例えば取り込まれなかった標識からの増幅産物の電気泳動分離の後の増幅プローブまたは増幅核酸それ自体に取り込まれた標識物の検出、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ（例えば、アレイベースのアッセイ）、及び／又は核酸に結合した二次的試薬の検出を含む。たとえば、５’−ヌクレアーゼプローブまたは分子ビーコンは、任意に、特定の核酸（例えば、多くの他のものの中でもＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、パピローマウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の核酸）を標的にするオリゴヌクレオチド配列を含むように設計される。分子ビーコンおよび５’−ヌクレアーゼプローブは、下文でさらに説明する。これらの一般的手法はまた、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ  １および２で記載されている。
【０１５１】
ある態様において、１又は複数の５’−ヌクレアーゼプローブを含むリアルタイムＰＣＲアッセイシステムは、本明細書に記載の発光修飾剤の存在下増幅させた標的核酸を検出するために用いられる。上述のように、これらのシステムは、あるポリメラーゼの内因性ヌクレアーゼ活性を用いてクエンチャーおよび標識を含むプローブからクエンチャーまたは他の標識を開裂して遊離させ、その結果、標識はクエンチングされない。ポリメラーゼは、典型的には、複製開始時にすなわちオリゴヌクレオチドが鋳型に結合しポリメラーゼがプライマーを伸長させる場合に、クエンチャーまたは標識を開裂できるだけである。したがって、適切に標識したプローブ核酸と適切なヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを用いて注目の標的核酸を検出できる。たとえばＦＲＥＴ等（および関連の動的逆転写ＰＣＲ）によるリアルタイムＰＣＲ産物分析は、さまざまな状況で使用されてきたリアルタイムＰＣＲモニタリングに周知の技術で、それは、本明細書に記載の方法により使用に適応させることができる（例えば、全て引用により組み入れられるＬａｕｒｅｎｄｅａｕら（１９９９）“ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ＩＮＫ４  ｌｏｃｕｓ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ”  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４５（７）：９８２−６；Ｌａｕｒｅｎｄｅａｕら（１９９９）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＹＣ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ”  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５９（１２）：２７５９−６５；およびＫｒｅｕｚｅｒら（１９９９）“ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｒ／ａｂ１  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９（１３）：３１７１−４を参照のこと）。
【０１５２】
本明細書に記載の反応混合物を用いて標的核酸を検出するために任意に利用する例示的な市販のシステムには、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から入手可能なＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム、ＣＯＢＡＳ  ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）システム、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）から入手可能なＬＵＭＩＮＥＸ  １００（商標）システム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、ＵＳＡ）から入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００システム等が含まれる。システムはまた、下文で説明する。
【０１５３】
分子ビーコンは、標的核酸のリアルタイム検出および定量化のために設計されたオリゴヌクレオチドである。分子ビーコンの５’および３’末端は、分子ビーコンの検出可能な性質を付与する部分の対をまとめて含んで成る。一方の末端には蛍光団が結合しており、他方には、蛍光団の蛍発光をクエンチングできるクエンチャー分子に結合している。例示すると、蛍光団−クエンチャー対のひとつの例は、例えば５’末端上でＥＤＡＮＳまたはフルオロセインのような蛍光団を使用し、Ｄａｂｃｙｌのようなクエンチャーを例えば３’末端上で使用している。分子ビーコンが溶液中遊離状態で存在する時、すなわち、第２の核酸とハイブリダイズしていない時、分子ビーコンのステムは、相補性塩基対形成によって安定化される。この自己相補性対形成の結果、分子ビーコンについて“ヘアピンループ”構造が出現し、ここで、蛍光団とクエンチング部分が互いに近接している。この立体構造では、蛍光部分が、クエンチング部分によってクエンチングされる。分子ビーコンのループは、典型的には、オリゴヌクレオチドプローブを含んで成り、従って、標的核酸中で検出される配列に対して相補的であり、標的中の相補配列に対して前記ループがハイブリダイズした場合、ステムの解離を促し、それによって、蛍光団とクエンチャーが互いに遠くなる。この結果、蛍光団がクエンチングされず、分子ビーコンの蛍光が増大することになる。
【０１５４】
分子ビーコンを作製し使用する標準的方法に関する詳細は、文献で十分に確立されており、分子ビーコンは、いくつかの商業的な試薬供給業者から入手可能である。分子ビーコン製造方法およびその用途に関するさらなる詳細は、例えば、全て引用により組み入れられるＬｅｏｎｅら（１９９５）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＡＳＢＡ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２１５０−２１５５；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（１９９８）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｌｅｌｅｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８−１２２９；Ｆａｎｇら（１９９９）“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２９２１−２９２２；およびＭａｒｒａｓら（１９９９）“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ”Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４：１５１−１５６でわかる。さまざまな商業的な供給業者が、標準的およびカスタム分子ビーコンを供給しており、Ｏｓｗｅｌ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．（ＵＫ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ分社、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ、ＵＳＡ）、ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ，ＵＳＡ）およびＧｏｒｉｌｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＬＬＣ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む。分子ビーコンを使用したさまざまなキットもまた、市販されており、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ＫｉｔｓおよびＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＳＡ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＩｓｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のさまざまなキットが含まれる。
【０１５５】
ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマーは、ＰＣＲ産物の特異的検出のための蛍光ベースの手法において使用される（本明細書でそれぞれ引用により組み入れられるＷｈｉｔｃｏｍｂｅら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８０４−８０７、Ｗｈｉｔｃｏｍｅら（１９９９）Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５：２３３３、およびＴｈｅｌｗｅｌｌら（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３７５２−３７６１）。ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマーは、通常、プローブの５’および３’側にある相補的なステム配列によってヘアピンループ立体構造に保持される特異的プローブ配列を含む。５’末端に結合した蛍光標識は、ループの３’末端に結合したクエンチャー部分によってクエンチングされる。ヘアピンループは、典型的にはＰＣＲストッパーによりプライマーの５’末端に連結される。ＰＣＲ増幅時においてプライマーが伸長した後、特異的プローブ配列は、ＤＮＡの同一鎖内部のその相補体に結合できる。このハイブリダイゼーションの事象は、ヘアピンループを開き、その結果、蛍光がもはやクエンチングされずシグナル増強が観察される。ＰＣＲストッパーは、読み過ごしを防止し、特異的標的配列が不在の場合前記ヘアピンループを開放することにつながる。このような読み過ごしは、プライマーダイマーまたはミスプライミング事象のような非特異的ＰＣＲ産物の検出につながるであろう。ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プライマーはまた、例えば、それぞれ引用により組み入れられるＨｕａｎｇら（２００４）“Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２６（１１）：８９１−８９５，Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓら（２００３）“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ  Ｙ１”，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１８（２）：２２１−２２９，およびＮｕｏｖｏら（１９９９）“Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ”  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７（３）：２７３−２８０に記載されている。
【０１５６】
システム
本発明はまた、標的核酸検出のためのシステムを提供する。前記システムには、本明細書で記載したように１又は複数の標的ヌクレオチドおよび１又は複数の発光修飾剤が含まれる。ある態様において、前記オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に並べられ、一方、他では、それらは、例えば溶液中でオリゴヌクレオチドこなれるアッセイのために１又は複数の容器中に提供される。前記システムにはまた、試料中から核酸及び／又はそのアンプリコンとオリゴヌクレオチドの間の結合を検出する少なくとも１つの検出器（例えば、分光計等）が含まれる。さらに、前記システムにはまた、任意に、前記容器または固体支持体上で種以上の核酸増幅技術及び／又は核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行うために、前記容器または固体支持体と作用可能に接続した容器内または固体支持体上の温度を調節するための少なくとも１つの熱調節器（例えば、熱サイクルデバイス等）、及び／又は前記容器または固体支持体へまたはそれからの流体を移動させる少なくとも１つの流体移動コンポーネント（例えば、自動化ピペット等）が含まれる。
【０１５７】
検出器は典型的には、例えば、（例えば、容器中、固体支持体上等における）あるアッセイシステムの別の成分中またはそれに近接して産生された検出可能シグナルを検出するような構造となっている。任意に利用されるかまたは使用のために適応させた適切なシグナル検出器は、ここで、例えば、蛍光、リン光、放射能、吸光度、屈折率、発光、質量等を検出する。検出器は、任意に、あるアッセイ段階のパフォーマンスの上流及び／又は下流からの１個または複数のシグナルをモニタリングする。たとえば、検出器は、任意に、位置的に“リアルタイム”な結果に相当する複数の光シグナルをモニタリングする。例示的な検出器またはセンサーは、光増倍管、ＣＣＤアレイ、光センサー、温度センサー、圧力センサー、ｐＨセンサー、伝導度センサー、スキャン検出器等を含む。本発明の方法実施に任意に利用されるさらに具体的な例示的な検出器には、例えば、共鳴光分散検出器、発光分光器、蛍光分光器、リン光分光器、発光分光器、分光光度計類、光度計類等が含まれる。当該検出器は、また、例えば、両者ともに引用により組み入れられるＳｋｏｏｇら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第５版、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８）およびＣｕｒｒｅｌｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）に記載されている。
【０１５８】
本発明のシステムにはまた、典型的には、１又は複数のシステムコンポーネント（例えば、検出器、熱調節器、流体移動コンポーネント等）と作用可能に接続したコントローラが含まれ、前記コンポーネントの稼動を制御する。さらに詳細に述べると、コントローラは、通常、例えば、検出器からのデータの受け取り、容器中温度の促進及び／又は制御、選択した容器へのまたはそれからの流体流れの促進及び／又は制御等のために利用される別々のまたは統合したシステムコンポーネントとして含まれる。コントローラ及び／又は他のシステムコンポーネントは、任意に、適当にプログラミングされたプロセッサー、コンピュータ、デジタルデバイスまたは他の情報家電（例えば、必要に応じてアナログからデジタルまたはデジタルからアナログコンバーターを含む）に結合させ、それは、事前にプログラミングされたかまたはユーザー入力指示に従ってこれらの機器の稼動を指示し、これらの機器からデータおよび情報を受け取り、およびこの情報を解釈し、操作しかつユーザーに報告するように作動する。適切なコントローラは、通常当業界で公知であり、さまざまな商業的な供給業者から入手可能である。
【０１５９】
コントローラまたはコンピュータはいずれも任意にモニターを含み、それは、しばしば、陰極線管（“ＣＲＴ”）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ等）等である。コンピュータ回路をボックス中に入れ、それには、マイクロプロセッサー、メモリ、インターフェース回路、等のような多数の集積回路チップが含まれる。前記ボックスはまた、任意に、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、書き込み可のＣＤ−ＲＯＭのような高容量リムーバブルドライブ、および他の通常の末端要素類が含まれる。キーボードまたはマウスのような入力デバイスは、任意に、ユーザーからの入力のために提供される。これらのコンポーネントは、さらに下文で例示する。
【０１６０】
前記コンピュータは、典型的には、例えばＧＵＩにおいてパラメータフィールドセットへのユーザー入力の形態または例えばさまざまな異なる具体的操作のために事前にプログラミングされたプログラム済指示の形態のいずれかにおいて、ユーザー指示を受け取るための適切なソフトウェアを含む。次に、前記ソフトウェアは、これらの指示を適切な言語に変換し、１又は複数のコントローラの作動を指示し、所望の操作を行う。次に、コンピュータは、例えば、システム内部のセンサー／検出器からデータを受け取りこのデータを解釈し、ユーザーが理解できるフォーマットでそれを提供するか、または、このデータを用いて重量尺度等から得た流体重量データに対応して流体流れ制御器を制御することのようにさらにコントローラ指示を開始する。
【０１６１】
図３は、本発明のさまざまな面を態様化できるロジックデバイスを含む代表的なシステムを示す略図である。本明細書に述べた教示から本技術における実行者には明らかであろうが、本発明は、任意に、ハードウェア及び／又はソフトウェアにおいて実施される。態様によっては、本発明の異なる面をクライアントサイドロジックまたはサーバーサイドロジックにおいて実施する。当業界で明らかであるように、本発明またはそのコンポーネントは、適切に組み立てたコンピュータデバイスにロードした場合、このデバイスを本発明にしたがって稼動させるようにするロジックインストラクション及び／又はデータを含むメディアプログラムコンポーネント（例えば、固定媒体コンポーネント）として例示することもできる。当業界で明らかであるように、また、ロジックインストラクションを含む固定媒体は、使用者のコンピュータに物理的にロードするための固定媒体上で使用者に伝達されるか、または、ロジックインストラクションを含む固定媒体は、リモートサーバー上において、使用者がプログラムコンポーネントをダウンロードするために通信媒体を介してアクセスする。
【０１６２】
特に、図３は、検出器３０２、流体移動コンポーネント３０４および熱調節器３０８が作用可能に接続しているコンピュータ３００を、図示している。任意に、１又は複数のこれらのコンポーネントを稼動可能なようにコンピュータ３００に、サーバー（図３に示さず）により接続する。稼動時、流体移動コンポーネント３０４は、典型的には、反応混合物またはその成分をマルチウェルコンテナー３０６に移送する。熱サイクルが、典型的には、熱調節器３０８により実行され、それは、マルチウェルコンテナー３０６に熱的に連通している。検出器３０２は、典型的には、熱サイクル反応で産生された検出可能シグナル（例えば、蛍発光等）を検出する。
【０１６３】
キット
本発明の方法で用いた反応混合物またはその成分（例えば、プローブまたは発光修飾剤）は、任意にキットに梱包される。さらに、前記キットには、また、標的核酸ハイブリダイゼーション、増幅、および検出のために必要な緩衝液、酵素、ＤＮＡスタンダード、塩、金属イオン、プライマー、伸長可能ヌクレオチドまたはターミネーターヌクレオチド、グリセロール、ジメチルスルホキシド、ポリｒＡ等のような適切に梱包された試薬および材料、ならびに、特定のアッセイを行うための説明書も含まれる。プローブおよび発光修飾剤のようなキット成分は、典型的には、１又は複数の容器で提供される。これらの態様の一部で、前記キットはさらに、例えばピロリン酸分解を最小にするために使用する少なくとも１つのピロホスファターゼ（例えば、熱安定性ピロホスファターゼ）、及び／又はキャリーオーバーコンタミネーションに対する保護が望ましい適用で使用するためのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を含む。前記キット成分の２個以上は、同一容器に梱包することもできる。
【０１６４】
Ｔｍ決定における可溶性発光修飾剤の使用
本発明は、ハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定するための方法を提供し、これらの方法では、本明細書で教示の可溶性発光修飾剤技術を用いる。Ｔｍ決定では、可溶性発光修飾剤（すなわち、可溶性クエンチャー）システムを用いて、二本鎖融解曲線またはアニーリング曲線をモニタリングする。
【０１６５】
本質的に、適切な発光部分（例えば、ドナー）により標識したプローブは、標的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる。生成したハイブリダイゼーション二本鎖（例えば、標的ハイブリダイゼーション複合体）は、完全な相補性（すなわち、１００％）を有するかまたは部分的な相補性（すなわち、１００％未満）を有することができる。（完全または部分相補性を有する）任意の核酸二本鎖も、所定のハイブリダイゼーション条件下で特定のＴｍを特徴とする。診断のような適用（例えば、ＳＮＰ検出、変異体検出および変異スキャニング、ウイルス遺伝子型決定、薬物耐性株試験等）においてＴｍ決定を有用にするのは、この特性である。
【０１６６】
二本鎖形成前、形成時またはその後において、前記反応物を、適切な可溶性クエンチャーと混合する。この可溶性クエンチャーは、チアジン色素またはジアジン色素を含み、ここで、この可溶性クエンチャーは、プローブ上における発光部分をクエンチング可能（従って、ドナー−アクセプターペアを形成可能）である。本明細書に示した任意のチアジン色素またはジアジン色素は、本発明のＴｍ決定方法に使用できる。チアジン、フェノチアジン、カチオン性チアジン、チアジニウムおよびフェノチアジニウムは、全て、中央環に窒素および硫黄を含む融合三環芳香族系を有する色素族の一般名称の類義語である。さらに、本明細書で教示した特定のチアジンおよびジアジン構造に加えて、可溶性クエンチャー性質を保持するこれらの分子の関連構造変化体も、本発明の方法で使用でき、かつ、本発明の範囲に包含される。
【０１６７】
チアジン色素またはジアジン色素可溶性クエンチャーは、一本鎖および二本鎖核酸の両者に結合することによって作用するが、一本鎖核酸へのアフィニティは小さい。一本鎖核酸への結合は、ランダムコイル状態における部分的二次的構造によるのであろうと考えられる。いかなる特定の理論にも限定されるわけではないが、主な結合様式は挿入によると考えられ、ただし、マイナーなおよび主要な溝結合もまた、配列文脈およびハイブリダイゼーション条件によっては可能である（Ｒｏｈｓら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：２８６０−２８６６；およびＴｕｉｔｅら（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１６：７５４８−７５５６を参照のこと）。したがって、標的ヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成するプローブに結合した蛍光ドナー標識は、プローブ上でのドナー部分に対してクエンチャーが非常に近接していることで二本鎖核酸にアフィニティを有する挿入可溶性クエンチャーによってクエンチング効果を受ける。しかし、クエンチング現象の分子機構を理解することは、本発明の作成または使用に必要ではない。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション複合体を含む溶液を（融解曲線Ｔｍ分析におけるように）加熱した場合、前記プローブは最終的に標的ポリヌクレオチドから解離し、それによって、核酸に対するクエンチャーのアフィニティを低下させ、その結果、プローブドナーに対する可溶性クエンチャーの近接性低下とドナーからの蛍光増強が観察される。したがって、反応におけるハイブリダイゼーション複合体の形成／解離は、可溶性クエンチャーを有するシステムを使用することで、モニタリングできる。
【０１６９】
塩基対形成が起こる条件下における二本鎖形成後、標的ハイブリダイゼーション複合体反応の温度を高め、ドナーからの放出をある温度範囲で測定しかつモニタリングし、従って、融解曲線を作成する。例えば約２０℃〜約約９５℃の温度範囲を使用できる。これとは別に、プローブ、可溶性クエンチャーおよび標的を高温（例えば、約９５℃）で開始させ、反応温度を下げながら（例えば、約２０℃まで）ドナー放出をモニタリングし、従って、アニーリング曲線を作成する。
【０１７０】
本明細書に述べたＴｍ決定を示す実施例では、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いており、前記プローブは、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）で標識するが、それは、可溶性クエンチャーとともにドナー／クエンチャー対における発光ドナー部分として作用する。本発明はドナー部分としてＦＡＭの使用に限定されているわけではないことが当業者に明らかであろう。実際、当業界では、他の標識部分の記載がたくさんあり、それらの全てが、発光ドナー部分として本発明で用途を見出す。これらの他の発光部分もまた、本発明の範囲に入ることは明らかである。
【０１７１】
アニーリング曲線又は融解曲線のいずれの場合においても、ドナーからの測定した放出を特定の二本鎖結合／解離値と相関させ、そしてＴｍが導かれる（ここで、Ｔｍとは、ハイブリダイゼーション複合体群の半分が一本鎖に解離する温度である）。
【０１７２】
本発明は、本発明の可溶性クエンチャーシステムを用いるＴｍ決定の多数の例を示している。たとえば、実施例１９−２２を参照のこと。本明細書に示した実施例の多くは、例えば、ＨＣＶ遺伝子型決定のようなウイルス遺伝子型決定方法において可溶性クエンチャー試薬を用いる。これらの方法において、さまざまなウイルスゲノム配列を、発光部分で標識したプローブ（例えば、ＦＡＭのようなドナー）に対するハイブリダイゼーション標的として用いている。これらの方法を適応させたものは、患者試料のような臨床試料中のウイルス検出および遺伝子型決定において特定の用途を見出す。しかし、本発明のＴｍ決定方法がウイルス遺伝子型決定適用に限定されるわけではない。すなわち、ハイブリダイゼーション標的がウイルス材料またはウイルス材料由来の核酸であるとは考えていない。実際、ウイルス遺伝子型決定のほかにさまざまな広範囲の適用が、当業者にはすぐに明らかであろう。たとえば、可溶性クエンチャー試薬を用いるＴｍ決定は、閉管フォーマットにおいて且つ一重標識プローブを使用して、増幅、検出、分析の組み合わせに用いることができる。これらの方法では、ＳＮＰおよび変異検出、ハプロタイピング、マイクロサテライト検出、病原体遺伝子型特性解析、および薬物耐性株の特性解析のような適用のごとく広範囲の適用に用途を見出すが、これらに限定されるわけではない。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション標的の性質は、特に限定されているわけではない。ある面において、ハイブリダイゼーション標的は、アンプリコン、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって産生されるアンプリコンであってもよい。場合によっては、ＰＣＲ増幅は非対称増幅を用いることができる。注目の標的核酸がＲＮＡ分子である場合、ＰＣＲ増幅では、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることができる。
【０１７４】
Ｔｍ決定のためのキット
本発明は、例えば、Ｔｍ決定実施するための方法のような本発明の方法を促進するためのキットのような製造された製品を提供する。これらのキットは、本明細書に記載の方法を用いてＴｍ決定を行うために必要な材料を提供する。これらのキットは、例えばウイルス遺伝子型決定を行うためにＴｍ評価を使用できる臨床医のための用途を見出す。これらの方法を実行するための材料および試薬は、本方法実施を促進するキットで提供できる。
【０１７５】
態様によっては、Ｔｍ決定キットは、診断キットであり、本キットで可能となった方法を実施することで得られる情報を、例えば、患者から採取した試料中のウイルスの遺伝子型を同定するために使用する。
【０１７６】
ある態様において、本発明は、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ試薬を取り込むことによってＴｍ決定を標的とすることに加えて、標的増幅を実施するために適したキットを提供する。
【０１７７】
態様によっては、本発明は、特定のハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定するためのキットを提供し、ここで、Ｔｍ決定には、可溶性発光修飾剤（例えば、可溶性クエンチャー）システムを用いて、二本鎖融解曲線またはアニーリング曲線をモニタリングする。これらのキットには、（ｉ）適切な発光部分で標識した少なくとも１つのプローブ（例えば、ドナー）、（ｉｉ）チアジン色素またはジアジン色素のような可溶性発光修飾剤で、前記色素が、発光部分をクエンチング可能であり、および（ｉｉｉ）前記プローブ、前記可溶性クエンチャー、またはプローブとクエンチャーの両者を含むが、それらに限定されない。
【０１７８】
キットには、また、任意に、試料採取（例えば、血液試料の採取）のための試薬、血液からのＲＮＡの採取と精製のための試薬、逆転写酵素、例えば、ウイルスアンプリコン作製のための逆転写および第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成（すなわち、逆転写酵素開始）に適したプライマー、熱安定ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。態様によっては、逆転写酵素活性と熱安定ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む酵素は、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．ＺＯ５ポリメラーゼまたはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼのような同一酵素である。本発明のキットは、また、任意に、標準化試料（例えば、Ｔｍ法の感度を評価するための公知濃度の標準化核酸鋳型）；ポジティブコントロール試料（例えば、公知でかつ先に決定したＴｍ価を有する明らかな配列核酸鋳型）、ネガティブコントロール試料（例えば、緩衝液または核酸標的を全く含まない反応混合物）、酵素反応に適した緩衝液、試料採取管および増幅反応管を含むことができる。
【０１７９】
Ｔｍ決定システム
態様によっては、本発明は、Ｔｍ決定を行うための統合システムを提供する。前記システムは、特にＴｍ誘導手段がアルゴリズム及び／又は電子的に保存された情報（例えば、採取蛍光データ、既定のＴｍ相関等）を含む場合、採取データの解釈および分析のための機器および手段を含むことができる。統合システムの各部分は、機能的に内部で接続されており、場合によっては、物理的に接続されている。態様によっては、統合システムは自動化され、Ｔｍ分析開始後、試料または機器のオペレータによるいかなる操作も必要としていない。
【０１８０】
本発明のシステムは、機器を含むことができる。たとえば、本発明は、蛍光検出器（例えば、蛍光分光光度計）のような検出器を含むことができる。検出器または検出器は、本発明と関連され、例えばＴｍプローブ上で発光部分からの放出をモニタリング／測定するために使用できる。検出器は、Ｔｍアッセイの高処理能を促進するためにマルチウェルプレートリーダーの形態であってもよい。
【０１８１】
態様によっては、統合システムには、熱サイクリングデバイスすなわちサーモサイクラーがＴｍ融解分析の温度を制御する目的で含まれている。態様によっては、熱サイクリングデバイスおよび検出器は、統合機器であり、熱サイクルと発光検出（例えば、蛍光検出）が、同一デバイスで行われる。
【０１８２】
例えば蛍光分光光度計のような検出器は、分光光度計オペレーションパラメータ（例えば、励起波長及び／又は検出された発光波長）を制御するため及び／又は検出器から採取したデータ（例えば、融解曲線分析時における蛍光測定値）保存のため、コンピュータに接続できる。前記コンピュータは、また、熱サイクリングデバイスに作用可能に接続することもでき、システム内の温度、タイミング、及び／又は温度変化速度を制御する。統合コンピュータはまた、“相関モジュール”を含むことができ、ここで、検出器から採取したデータを分析し、標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを（電子的に）決定する。態様によっては、相関モジュールは、検出器からの蛍光読み取り値に基づいてＴｍを計算し、場合によっては、Ｔｍ結果に基づき未知試料のウイルス遺伝子型情報を誘導するコンピュータプログラムを含む。態様によっては、相関モジュールは、未知試料のＴｍを公知ウイルスタイプのＴｍ価のデータベースと比較し、未知試料のＴｍと未知試料のウイルス遺伝子型の相関を得る。
【０１８３】
いくつかの観点において、本発明のハイブリダイゼーション複合体のＴｍ決定のためのシステムは、（ｉ）シグナルを放出する発光部分を含んで成る核酸プローブ；（ｉｉ）核酸プローブと相補的であるか部分的に相補的であるハイブリダイゼーション標的核酸；並びに（ｉｉｉ）チアジン色素またはジアジン色素を含んで成る反応混合物（例えば、試料を含んでいても含まなくてもよい）を含む。前記システムはまた、ある温度範囲で融解反応温度を制御するための熱コントロールデバイスを含み、ここで、温度範囲は、所定のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーション標的に基本的に全てのプローブ分子がアニーリングする温度、標的ハイブリダイゼーション複合体の５０％が解離する温度、および基本的に任意のプローブ分子もハイブリダイゼーション標的にアニーリングせずかつ基本的に任意のハイブリダイゼーション複合体も前記ハイブリダイゼーション条件下で存在しない温度を含む。前記システムは、さらに、前記温度範囲で融解反応からのシグナルを測定するための検出器を含むことができ；および、検出器に作動可能なように連結され前記温度範囲でシグナル測定値を受け取る相関モジュールも含むことができ、ここで、相関モジュールは、シグナル強度をチアジン色素またはジアジン色素との混合物中にプローブとハイブリダイゼーション標的を含むハイブリダイゼーション複合体の存在と、温度の関数として相関させ、それによって、標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定する。いくつかの観点において、前記プローブ上の発光部分は、ＦＲＥＴドナー部分である。
【０１８４】
チアジン色素の二本鎖安定化のための用途
さまざまな核酸技術が、核酸の増幅及び／又は検出において配列ミスマッチを起こしている。本発明は、この問題に対する解決策を提供し、本発明は、核酸二本鎖を安定化させる方法を提供する。これらの核酸二本鎖安定化方法は、単一のミスマッチ位置ならびに複数のミスマッチ位置を含む核酸二本鎖安定化に有効である。実際、本明細書に記載の方法は、さらに、マッチした核酸二本鎖を完璧に安定化させることさえできる。完璧にマッチした二本鎖のそれ以上の安定化は、二本鎖がそうでなければ解離した場合思われる条件下でインタクトな核酸二本鎖の保存を可能とするであろう。
【０１８５】
本開示で示したように、核酸二本鎖に結合できその中のミスマッチを有意に安定化できるいくつかの化合物を本明細書で同定する。これらは、例えば、チオニン（チオニンとしても公知）、メチレンブルー、ニューメチレンブルー、１，９−ジメチルジメチレンブルー、メチレングリーン、アズールＡ，アズールＢ、アズールＣ、およびトルイジンブルーのようなチアジン色素族のメンバーであるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本明細書に示した任意のチアジン色素も、本発明の二本鎖安定化方法に使用できる。さらに、本明細書で教示した特定のチアジン構造のほかに、基本的な安定化性質を保持しているこれらの分子の関連構造変化体もまた、本発明の方法に使用できる。これらの関連分子も、本発明の範囲に含まれる。
【０１８７】
チアジン色素および関連化合物をハイブリダイゼーション反応に対する添加剤として使用することによって、核酸増幅および検出は、多型が前記プローブ及び／又はプライマー下で存在する状況で大きく向上させることができる。これらは現実に、安定化添加物が酵素活性（例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅）に悪影響を及ぼしてはいけない非常に要求が厳しい利用である。ミスマッチの安定化が必要とされる任意の利用も、これらのプロトコールで利益を受けるであろう。さらに、完全にマッチした二本鎖の安定化向上がある適用も、また、これらのプロトコールで利益を受けるであろう。核酸ハイブリダイゼーション複合体を生ずるいかなるタイプの核酸ハイブリダイゼーションは、本発明の方法から利益を受けることができる。これには、例えば、１又は複数の酵素伸長可能なＰＣＲプライマーを標的配列にハイブリダイゼーションさせること；ハイブリダイゼーション部位が核酸伸長反応を有効に開始させる開始点として作用する全ての核酸分子のハイブリダイゼーション；標的への５’−ヌクレアーゼプローブのハイブリダイゼーション；サザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおいて使用されるような標的への任意のタイプの標識（または未標識）プローブのハイブリダイゼーション；複合およびゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリスクリーニングにおけるような任意のタイプのスクリーニングにおいても核酸プローブを使用することを含むが、それらに限定されない。態様によっては、前記ハイブリダイゼーションにおける標的核酸分子は、アンプリコンである。
【０１８８】
いくつかの観点において、ハイブリダイゼーション反応に対する添加物としてチアジン色素および関連化合物を用いることによって、核酸増幅および検出は、多型が前記プローブ及び／又はプライマー下で存在する例えばウイルス遺伝子型決定分析のような状況で大きく向上させることができる。
【０１８９】
本発明は、チアジン色素を用いる二本鎖安定化の多数の例を示している。たとえば、実施例２０−２５を参照のこと。本明細書に示した実施例の多くは、ＨＣＶまたはＨＩＶウイルスモデルシステムを用いて、二本鎖安定化に関して本発明の方法の有益な性質を例示している。しかし、本発明の二本鎖安定化方法が、ウイルスハイブリダイゼーションへの適用に限定されるとは限らない。すなわち、安定化二本鎖がウイルス材料またはウイルス材料由来核酸を含んで成るとは限らない。実際、広範囲のさまざまな他の適用が、ウイルス遺伝子分析のほかに当業者にはすぐにわかるであろう。
【０１９０】
基本的に、核酸二本鎖を安定化させる方法は、前記核酸二本鎖を安定化用チアジン色素に曝露させることから構成される。前記チアジン色素は、任意の時点で、例えば、二本鎖形成前または二本鎖形成後でも、前記二本鎖と混合できる。前記チアジンは、二本鎖を形成する２個以上の一本鎖核酸のアニーリング時には存在していても存在していなくてもよい。チアジン色素が二本鎖形成時に存在していない場合、前記色素は、二本鎖形成後に添加できる。
【０１９１】
本発明の安定化方法を用いる二本鎖の安定化の向上は、二本鎖の安定性を調べる任意の適切なアッセイを用いることによっても観察できる。たとえば、チアジン色素不在下でも核酸二本鎖のＴｍは、同一ハイブリダイゼーション条件下におけるチアジン色素存在下での同一核酸二本鎖のＴｍに匹敵する。これとは別に、ＣT成長曲線（例えば、５’−ヌクレアーゼアッセイプローブを使用するＣT成長曲線）は、同様の条件下で実施でき、チアジン色素不在下でのＣT価が、チアジン色素存在下でのＣT価に匹敵する。ＣT価を用いて二本鎖安定性を示す時、このＣT価は、増幅プライマーのいずれかまたは両者の二本鎖安定性を反映でき、さらに、また、アンプリコン蓄積をモニタリングするために使用する任意のプローブ含有二本鎖（例えば、５’−ヌクレアーゼアッセイにおける５’−ヌクレアーゼプローブ）の安定性も反映する。ＣT決定が二本鎖安定性を評価するために行われる時、５’−ヌクレアーゼアッセイを、必ずしもアンプリコン蓄積をモニタリングするために使用する必要がない。実施例２５に例示したように、プローブがないモニタリングシステムも、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンのような二本鎖核酸インディケータを用いるアンプリコン蓄積をモニタリングすることによってのように、使用できる。
【０１９２】
色素不在下対色素存在下システム中での二本鎖安定性を比較するためのこれらの方法はまた、例えば、高濃度や低濃度のようなチアジン色素の異なる２種の濃度により安定化される二本鎖安定性を比較することに適用される。
【０１９３】
本発明は、核酸二本鎖安定化のための方法を提供し、ここで、前記二本鎖は、完全にマッチした二本鎖であってもよく、または、任意の数のミスマッチ位置を含むことができる。たとえば、核酸二本鎖安定化のためのこれらの方法は、１又は複数のミスマッチ位置、２個以上のミスマッチ位置または３個以上のミスマッチ位置を含む核酸二本鎖の安定化において有効である。
【０１９４】
核酸二本鎖安定化の前記方法において、前記方法において使用されるチアジン色素の濃度は、特に限定されない。いくつかの観点において、少なくとも１０μｇ／ｍＬの濃度が使用される。他の観点において、ある濃度範囲内の任意の濃度も使用され、例えば、約１０μｇ／ｍＬと約５０μｇ／ｍＬの間の濃度が使用される。これとは別に、約２０μｇ／ｍＬと約４０μｇ／ｍＬの間の濃度範囲が使用される。いくつかの観点において、約４０μｇ／ｍＬのチアジン色素濃度が使用される。
【０１９５】
典型的には、核酸二本鎖安定化方法において、安定化ハイブリダイゼーション複合体は、分子間ハイブリダイゼーション複合体であり、ここで、逆平行ハイブリダイゼーション鎖は、２個の別個の核酸分子である。しかし、核酸二本鎖安定化方法のいくつかの適応において、安定化ハイブリダイゼーション複合体は、分子内ハイブリダイゼーション複合体であり、ここで、逆平行ハイブリダイゼーション鎖は、実際に、分子ビーコンタイプの立体構造の場合のように単一の核酸分子上にある。
【実施例】
【０１９６】
本明細書に記載の実施例および態様は、単に例示目的のためであって、請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。また、本明細書に記載の実施例および態様に鑑みさまざまな修飾または変更も当業者に明らかであり、本出願および付属の請求の範囲の精神および範囲に含まれることに留意されたい。
【０１９７】
これらの実施例では、本発明の発光修飾剤を使用したある５’−ヌクレアーゼアッセイのために得られたパフォーマンスデータを示している。
【０１９８】
実施例１
蛍光クエンチングアッセイのための全般プロトコール
この章に含めた表は、特に断りがなければ下文に示した実施例で言及した分析において使用したそれぞれの反応成分、条件、および操作を記載している。通常、標識オリゴヌクレオチドの蛍光は、可溶性クエンチャー存在下および不在下で溶液中で測定した。ある分析では、例えば、５’末端においてＦＡＭ標識したプローブシリーズは、ＰＣＲ反応緩衝液（下文で説明）およびさまざまな濃度の可溶性クエンチャーを含む溶液４００μＬ中で測定した。それらの分析においてＦＡＭ標識の蛍光検出のため、励起光の波長は、４８５ナノメータとなるように選択し、蛍光は、波長５２０ナノメータで測定した。
【０１９９】
表ＩＩＩ
ＰＣＲ評価に用いた一般的方法
一本鎖蛍光オリゴヌクレオチドを用いたクエンチング分析用反応混合物
【表３】
2010162027.tif 000005
【０２００】
表ＩＶ
二本鎖蛍光オリゴヌクレオチドを用いたクエンチング分析用反応混合物
【表４】
2010162027.tif 000006
【０２０１】
表Ｖ
蛍光ジヌクレオチドを用いたクエンチング分析用反応混合物
【表５】
2010162027.tif 000007
【０２０２】
表ＶＩ
配列情報
【表６】
2010162027.tif 000008
【０２０３】
表ＶＩＩ
ＨＩＶ配列
【表７】
2010162027.tif 000009
【０２０４】
表ＶＩＩＩ
定量標準（ＱＳ）
【表８】
2010162027.tif 000010
【０２０５】
表ＩＸ
一本鎖蛍光プローブを用いたＨＣＶ  ＰＣＲ用反応混合物
【表９】
2010162027.tif 000011
【０２０６】
表Ｘ
クエンチングした５’ヌクレアーゼプローブを用いたＨＣＶ  ＰＣＲ用反応混合物
【表１０】
2010162027.tif 000012
【０２０７】
表ＸＩ
一本鎖蛍光プローブを用いたＨＩＶ  ＰＣＲ用反応混合物
【表１１】
2010162027.tif 000013
【０２０８】
表ＸＩＩ
一本鎖蛍光プローブを用いたＨＣＶ  ＲＴ−ＰＣＲ用反応混合物
【表１２】
2010162027.tif 000014
【０２０９】
表ＸＩＩＩ
一本鎖蛍光プローブを用いたＨＩＶ  ＲＴ−ＰＣＲ用反応混合物
【表１３】
2010162027.tif 000015
【０２１０】
熱サイクル条件
下記の表、表ＸＩＶ−ＸＶＩＩは、本発明で使用した代表的なＰＣＲ熱サイクル反応を開示している。各表において、サイクリング反応は、両端に矢印をつけた線で示してあり、この反応は、示した総数のサイクルだけ繰り返した。温度範囲を示したところでは、その範囲内の単一の温度値を用いて異なる実験を行ったことを示している。反応完了時に、試料を４℃にいつまでも保持した。
【０２１１】
【表１４】
2010162027.tif 000016
【０２１２】
【表１５】
2010162027.tif 000017
【０２１３】
【表１６】
2010162027.tif 000018
【０２１４】
【表１７】
2010162027.tif 000019
【０２１５】
実施例２
一重標識プローブ
蛍光クエンチング
この実施例および以下の実施例では、本明細書に記載の発光修飾剤およびいろいろな種類の一重標識プローブの使用を要するアッセイのさまざまなパフォーマンス特性を示している。この実施例は、本発明のさまざまな発光修飾剤による蛍光クエンチングを示している。
【０２１６】
図４は、さまざまな濃度のニューメチレンブルーによる異なる一重標識核酸からの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）である。グラフに付した説明にも示したように、プロットは、示したニューメチレンブルー濃度における３１個のヌクレオチドの配列（すなわち、３１量体（ＧＡＧ１０８ＡＦ；ＥＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡＰ、ここでＥ＝ＦＡＭでありＰ＝リン酸である（配列番号１３））を有する一重標識、一本鎖オリゴヌクレオチド、一重標識二本鎖３１量体、一重標識ジヌクレオチドまたはダイマーについてである。これらの核酸のそれぞれは、５’末端ＦＡＭ標識を有している。
【０２１７】
図５は、別々の分析で行ったさまざまな発光修飾剤を用いた蛍光クエンチングを示すグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）である。５’末端ＦＡＭ標識を含む一本鎖３１量体をこれらの分析において使用した（すなわち、上記のＧＡＧ１０８ＡＦ）。プロットに付した説明にも示したように、使用した異なる発光修飾剤は、メチレンブルー（Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、ニューメチレンブルー（Ｎ  Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、アズールＢ，チオニン、ジメチルメチレンブルー（ＤＭ  Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、およびトルイジンブル（Ｔ  Ｂｌｕｅ）であった。
【０２１８】
図６は、さまざまな発光修飾剤による一重標識二本鎖核酸からの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）である。すなわち、これらの別々の分析で用いた二本鎖３１量体のひとつの鎖の５’末端は、ＦＡＭで標識した。プロットに付した説明にも示したように、用いた異なる発光修飾剤は、メチレンブルー（Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、ニューメチレンブルー（Ｎ  Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、アズールＢ，チオニン、ジメチルメチレンブルー（ＤＭ  Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、およびトルイジンブルー（Ｔ  Ｂｌｕｅ）であった。
【０２１９】
図７は、さまざまな発光修飾剤による標識ジヌクレオチド（チミジンダイマー（ＴＴ））からの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）である。これらの分析で使用したジヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシ−フルオロセイン）により標識した。プロットに付した説明にも示したように、使用した異なる発光修飾剤は、メチレンブルー（Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、ニューメチレンブルー（Ｎ  Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、アズールＢ，チオニン、ジメチルメチレンブルー（ＤＭ  Ｍｅ  Ｂｌｕｅ）、およびトルイジンブルー（Ｔ  Ｂｌｕｅ）であった。
【０２２０】
図８は、さまざまな条件下においてメチレンブルーによる標識一本鎖オリゴヌクレオチドからの蛍光クエンチングを示したグラフ（縦軸は蛍光パーセントを示し、横軸は、発光修飾剤濃度（μｇ／ｍＬ）を示している）である。これらの分析では、５’末端ＦＡＭ標識を含む一本鎖３１量体を用いた。プロットに付した説明にも示したように、一つのトレースで示した反応混合物は、ポリｒＡを含み、一方、他のトレースで示した反応混合物は、ポリｒＡを欠いていた。それは、担体核酸として作用し、試料調製後の標的核酸の損失を最小にすることによって、アッセイ感度を高める。ポリｒＡは、典型的には、相対的に高い濃度で用いる。図８に示した分析では、ポリｒＡが、例えば、それに結合しかつ利用されなくすることによって、可溶性クエンチャーの有効性を妨害するかどうかを評価した。
【０２２１】
実施例３
一重標識プローブおよびアズール色素を用いたポリメラーゼ連鎖反応
この実施例では、一重標識プローブと本発明の発光修飾剤によるリアルタイム検出を述べた態様を例示している。
【０２２２】
図９は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとさまざまな濃度のアズールＢを含む５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらのトレースで示される反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。また、この反応混合物は、ポリｒＡを含んでいた。トレースを付したラベルは、これらの反応混合物のそれぞれで用いたアズールＢの濃度を示している。これらの反応について発光修飾剤濃度の関数としての相対的蛍光を、図１１にプロットした。このプロットは、例えば、発光修飾剤濃度上昇に伴い、相対的蛍光が増加することを示している。
【０２２３】
図１０は、ＨＩＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとさまざまな濃度のアズールＢを含む５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらのトレースで示される反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。また、この反応混合物は、ポリｒＡを含んでいた。トレースを付したラベルは、これらの反応混合物のそれぞれで用いたアズールＢの濃度を示している。ＨＣＶプローブをＨＩＶ増幅システムで用いる時、示したように、前記プローブは開裂されず、増殖曲線もまったく観察されなかった。この分析は、観察された増殖曲線がプローブ加水分解に特異的でありアンプリコン中への可溶性クエンチャーの分配によるものではないことを示している。
【０２２４】
実施例４
一重標識プローブとニューメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図１２は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識ヌクレアーゼプローブとニューメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたアニーリング温度は、５８℃であった。これらの反応で用いたニューメチレンブルー濃度は、プロットに示したラベルで示されている。図１３の増幅プロットは、このデータについての相対的蛍光を示している。
【０２２５】
実施例５
二重標識プローブと１，９−デメチルメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図１４は、ＨＣＶ検出アッセイにおける二重標識５’−ヌクレアーゼプローブと１，９−ジメチルメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた二重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、ＦＡＭとＢＨＱ（商標）で標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたアニーリング温度は、５８℃であった。これらの反応で用いたニューメチレンブルー濃度は、プロットに示したラベルで示されている。図１５の増幅プロットは、このデータについての相対的蛍光を示している。
【０２２６】
実施例６
一重標識プローブとアズールＡおよびＣを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図１６は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとアズールＡを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたアズールＡ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２２７】
図１７は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識ヌクレアーゼプローブとアズールＣを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたアズールＣ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２２８】
実施例７
一重標識プローブとチオニンを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図１８は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識ヌクレアーゼプローブとチオニンを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２２９】
実施例８
一重標識プローブとメチレングリーンを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図１９は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとメチレングリーンを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたメチレングリーン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２３０】
実施例９
一重標識プローブとさまざまな発光修飾剤を用いたポリメラーゼ連鎖反応
図２０は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブと異なるアズール色素を含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡとＨＣＶ由来の標的核酸を２００，０００コピー含んでおいた。これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。これらの分析で用いた色素は、プロットに示したラベルで示したように、アズールＡ、アズールＢおよびアズールＣであり、それらは、それぞれ、濃度４０μｇ／ｍＬでそれぞれの反応混合物中に存在していた。
【０２３１】
図２１は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブと異なるアズール色素を含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡとＨＣＶ由来の標的核酸を２００，０００コピー含んでおいた。これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの分析で用いた色素は、プロットに示したラベルで示したように、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、メチレンブルー、トルイジンブルー、チオニン、およびメチレングリーンであり、それらは、それぞれ、濃度４０μｇ／ｍＬでそれぞれの反応混合物中に存在していた。
【０２３２】
実施例１０
さまざまな濃度のメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図２２（パネルＡとＢ）は、標的ＨＣＶ  ＤＮＡ，さまざまなプローブおよびさまざまな量のメチレンブルーによるＰＣＲ反応をポリアクリルアミドゲルで分析したものの写真である。ゲル中レーン上に示した数は、特定の反応混合物中に含まれたメチレンブルー濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。０（−）で示したレーンは、ネガティブコントロールを流したものである。各反応混合物中は、ポリｒＡとＨＣＶ  ＤＮＡの２０，０００コピーを含んでいた。さらに、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。示したように、用いたプローブは、ＳＴ６５０＿５’−ＦＡＭ＆ＳＴ２３２５＿５’−ＨＥＸ、デュアルＳＴ６５０、およびデュアルＳＴ２５３５であり、それらは上文で説明してある。パネルＡとＢは、二重反応を示している。この分析は、ＰＣＲ増幅が、発光修飾剤量が増え存在していても比較的影響を受けないことを示した。
【０２３３】
図２３は、ＱＳ−ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ２５３５プローブ（配列番号１２に対応）は、５’末端でＨＥＸにより標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＱＳ  ＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの分析で用いたメチレンブルー濃度は、４０μｇ／ｍＬであった。プロットに示したラベルは、各トレースで示した反応混合物中で用いたメチレンブルー濃度を示している。この分析は、例えば、（例えば、ＦＡＭの他に）異なる蛍光団をクエンチさせるチアジン色素の能力を明らかにした。
【０２３４】
図２４は、ＱＳ−ＨＣＶ検出アッセイにおける複数の一重標識ヌクレアーゼプローブとメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの多重分析で用いた一重標識プローブは、５’−ＦＡＭおよび５’−ＨＥＸ標識オリゴヌクレオチドであった。これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＱＳ  ＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらのプローブ対による反応混合物中で用いたメチレンブルー濃度は、プロットに示したラベルに示してある。この分析は、一重標識プローブによる多重検出で用いたチアジン色素の能力を示している。
【０２３５】
実施例１１
アズールＢを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図２５は、ＨＣＶ検出アッセイにおいてアズールＢ不在下で実施した５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらのトレースで示した反応混合物は、アズールＢを含まず、ＨＣＶ由来の標的核酸の２０，０００コピーを含んでいた。これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。付したトレースラベルに示したように、反応混合物中には、５’末端においてＦＡＭで標識したプローブ（すなわち、５’−ＦＡＭ）またはデュアル標識プローブ（すなわち、デュアル）を含み、ポリｒＡを含んでいるかまたは欠いていた。示したように、非クエンチ一重標識プローブからのわずかの蛍発光があった。これは、前記プローブ中のなんらかのＧ−クエンチングによるのかもしれない。対照的に、二重標識プローブは、良好なシグナルを産生した。さらに、可溶性クエンチャー存在下で、一重標識プローブはまた、良好なシグナルを産生した（例えば、下文に示した図２６および２７を参照のこと）。
【０２３６】
図２６および２７は、ＨＣＶ検出アッセイにおいてアズールＢを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光（図２６）または標準蛍光（図２７）を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらのトレースで示した反応混合物は、アズールＢ  ３０μｇ／ｍＬとＨＣＶ由来の標的核酸の２０，０００コピーを含んでいた。これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。付したトレースラベルに示したように、反応混合物中には、５’末端においてＦＡＭで標識したプローブ（すなわち、５’−ＦＡＭ）またはデュアル標識プローブ（すなわち、デュアル）を含み、ポリｒＡを含んでいるかまたは欠いていた。
【０２３７】
実施例１２
メチレンブルーを用いた追加の増幅反応
図２８と２９は、ＨＣＶ検出アッセイにおいて一重標識ヌクレアーゼプローブとメチレンブルーを含むＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型滴定から得たデータをそれぞれ示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらのトレースで示した一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。これらのトレースで示した反応混合物はポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。これらの反応混合物で用いたメチレンブルー濃度は、４０μｇ／ｍＬであった。プロットに付したラベルは、ＨＣＶ由来の標的ｃＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数を、各トレースについての他の反応条件とともに示した。これらの分析では、例えば、高感度で定量的なＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ検出が、これらの方法を用いて達成できることを示している。
【０２３８】
図３０は、ＨＩＶ検出アッセイにおいて一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを、それぞれ示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＧＡＧ１０８プローブ（配列番号９に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示した反応混合物はポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。これらの反応混合物で用いたメチレンブルー濃度は、４０μｇ／ｍＬであった。各反応混合物中に存在するＨＣＶ  ｃＤＮＡコピー数は、プロットに付したラベルに示してある。これらの分析では、例えば、高感度で定量的なＰＣＲ検出が、これらの方法を用いて達成できることを示している。
【０２３９】
図３１は、標的核酸コピー数がメチレンブルー存在下で変化する５’−ヌクレアーゼアッセイにおける検出感度を示したアガロースゲルの写真である。ゲル中レーン上に示した数は、特定の実験試行に用いた標的核酸コピー数を示している。（−）または色素なし（−）で示したレーンは、ネガティブコントロールを流したものである。各反応混合物中は、ポリｒＡを含み、これらの反応で用いた変性温度（Ｔden）は、９５℃であった。反応混合物中のメチレンブルー濃度は、４０μｇ／ｍＬであった。パネルＡに示した反応において、標的核酸はＨＣＶ由来であり、プローブは、ＳＴ６５０（配列番号５に対応）であった。パネルＢに示した反応において標的核酸は、ＨＩＶ由来であり、プローブは、ＧＡＧ１０８（配列番号９に対応）であった。これらのアッセイは、例えば、可溶性クエンチャー存在下でＰＣＲ効率と検出感度に有意な悪影響がないことを示している。
【０２４０】
実施例１３
一重標識プローブとニューメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
図３２は、ＨＣＶ検出アッセイにおける一重標識５’−ヌクレアーゼプローブとニューメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたアニーリング温度は、４０℃であった。これらの反応混合物中で用いたニューメチレンブルーチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２４１】
図３３は、５’−ＦＡＭ標識ヌクレアーゼプローブとニューメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。本明細書に記載の他のものとともにこのプロットは、温度による相対的蛍光シグナル修飾を示している。さらに具体的には、蛍光は、これらの反応混合物中においてアニーリング温度４０℃で検出した。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたニューメチレンブルーチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２４２】
図３４は、５’−標識ヌクレアーゼプローブとニューメチレンブルーを含むさまざまな５’−ヌクレアーゼ反応で異なるアニール温度を用いたデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。これらの反応混合物中で用いた一重標識ＳＴ６５０プローブ（配列番号５に対応）は、５’末端においてＦＡＭで標識した。さらに、これらのトレースで示される反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ  ｃＤＮＡの２０，０００コピーが存在していた。これらの反応で用いたニューメチレンブルーチオニン濃度は、４０μｇ／ｍＬであった。各反応混合物に関連するアニーリング温度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２４３】
実施例１４
多重標識プローブとメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
この実施例および下記の他の実施例は、多重標識プローブの使用を含む５’−ヌクレアーゼアッセイにおける蛍光の修飾を示している。この実施例では、５’−ヌクレアーゼ反応においてメチレンブルーを使用して、５’−ヌクレアーゼプローブからのベースライン発光が修飾されることを示している。
【０２４４】
図３５は、さまざまなメチレンブルー濃度存在下で実施した５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記プローブは、それぞれ、ＦＡＭとＢＨＱ（商標）で標識した。特定のメチレンブルー濃度は、プロットに付したラベルに示されている。
【０２４５】
図３６は、各反応で用いたプローブ濃度を２倍にしたことを除いて図３５に関して述べた反応に用いた同一条件下で実施した５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。各トレースに関連する特定のメチレンブルー濃度と相対的プローブ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２４６】
図３７は、プローブプーリングをシミュレーションした５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。各トレースに関連する特定のメチレンブルー濃度および相対的プローブ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２４７】
図３８は、さまざまなメチレンブルー濃度存在下でＦＡＭ−ＢＨＱ二重標識プローブを用いて実施した５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示す）である。各トレースに関連する特定のメチレンブルー濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２４８】
実施例１５
多重標識プローブと１，９−ジメチルメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
この実施例は、５’−ヌクレアーゼプローブからのベースライン発光を修飾するための５’−ヌクレアーゼ反応における１，９−ジメチルメチレンブルーの使用を示している。
【０２４９】
図３９は、さまざまな１，９−ジメチルメチレンブルー濃度存在下で実施した５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ由来の標的核酸の２０，０００コピーが存在していた。ＳＴ６５０プローブ（配列番号３に対応）は、ＦＡＭおよびＢＨＱ（商標）で標識した。これらの反応で用いたアニーリング温度は、５８℃であった。特定の１，９−ジメチルメチレンブルーチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。図４０の増幅プロットは、このデータについての相対的蛍光を示している。
【０２５０】
実施例１６
多重標識プローブとニューメチレンブルーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
この実施例は、５’−ヌクレアーゼプローブからのベースライン発光を修飾するための５’−ヌクレアーゼ反応におけるニューメチレンブルーの使用を示している。
【０２５１】
図４１は、さまざまなニューメチレンブルー濃度存在下で実施した５’−ヌクレアーゼ反応から得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＨＣＶ由来の標的核酸の２０，０００コピーが存在していた。ＳＴ６５０プローブ（配列番号３に対応）が、ＦＡＭとＢＨＱ（商標）で標識した。特定のニューメチレンブルーチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。これらの反応で用いたアニーリング温度は、５８℃であった。図４２の増幅プロットは、このデータについての相対的蛍光を示している。
【０２５２】
実施例１７
ＨＥＸ標識プローブを用いた定量化標準増幅と検出
この実施例では、ＨＣＶ定量化標準（ＨＣＶ−ＱＳ）増幅および検出アッセイにおけるＨＥＸ標識５’−ヌクレアーゼプローブからのベースライン発光を修飾するメチレンブルー使用を示している。ＨＣＶ  ＱＳ  ＤＮＡは、ＨＣＶプライマー結合配列と独自のＱＳ特異的プローブ結合領域を含んでいた。反応混合物は、ＨＣＶ  およびＨＣＶ  ＱＳ  ＤＮＡに特異的なプライマーペアを含んでおり、増幅ＤＮＡの検出は、増幅時に標的特異的ＱＳプローブから放出される蛍光レポーター色素の発光強度を測定することによって、実施し、それにより、ＨＣＶとＨＣＶ  ＱＳをそれぞれ別々に識別できた。
【０２５３】
さらに詳細に述べると、図４３は、さまざまのメチレンブルー濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応で得たデータを示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ポリｒＡを含んでおり、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。各反応混合物中にはＳＴ２５３５ＣＹ５Ｈ１４プローブ（配列番号１２に対応）とＱＳ−ＤＮＡの２０，０００コピーを含んでいた。用いた特定のニューメチレンブルーチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。図４４の増幅プロットは、このデータについての相対的蛍光を示している。
【０２５４】
実施例１８
ＨＣＶ核酸検出におけるベースライン発光の修飾
この実施例では、ＨＣＶ核酸検出を必要とするアッセイにおいて５’−ヌクレアーゼプローブからのベースライン発光を修飾するさまざまな発光修飾剤の使用を示している。
【０２５５】
図４５は、さまざまのヤヌスグリーンＢ濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ＳＴ６５０ＡＣＹ５Ｆ１４ＩＮプローブ（配列番号４に対応）と標的ＨＣＶ核酸の２０，０００コピーを含んでいた。用いた特定のヤヌスグリーンＢ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２５６】
図４６は、さまざまのトルイジンブルー濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ＳＴ６５０ＡＣＹ５Ｆ１４ＩＮプローブ（配列番号４に対応）と標的ＨＣＶ核酸の２０，０００コピーを含んでいた。用いた特定のトルイジンブルー濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２５７】
図４７は、さまざまのビクトリアピュアブルーＢＯ濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。用いた特定のビクトリアピュアブルーＢＯ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２５８】
図４８は、さまざまのアズールＡ濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。用いた特定のアズールＡ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２５９】
図４９は、さまざまのメチレングリーン濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。反応混合物は、ＳＴ６５０ＡＣＹ５Ｆ１４ＩＮプローブ（配列番号４に対応）と標的ＨＣＶ核酸の２０，０００コピーを含んでいた。用いた特定のメチレングリーン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２６０】
図５０は、さまざまのチオニン濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。反応混合物は、ＳＴ６５０ＡＣＹ５Ｆ１４ＩＮプローブ（配列番号４に対応）と標的ＨＣＶ核酸の２０，０００コピーを含んでいた。用いた特定のチオニン濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２６１】
図５１は、さまざまのアズールＢ濃度存在下で実施する５’−ヌクレアーゼ反応におけるＨＣＶ核酸検出を示す増幅プロット（縦軸は、絶対蛍光を示し、横軸は、サイクル数を示している）である。前記反応混合物は、ポリｒＡを含み、これらの反応で用いたＴdenは、９５℃であった。反応混合物は、ＳＴ６５０ＡＣＹ５Ｆ１４ＩＮプローブ（配列番号４に対応）と標的ＨＣＶ核酸の２０，０００コピーを含んでいた。用いた特定のアズールＢ濃度は、プロットに示したラベルで示されている。
【０２６２】
実施例１９
ＨＣＶモデルシステムにおける可溶性発光修飾剤と結合させた一重標識プローブを用いた融解曲線分析（Ｔｍ決定）
本実施例では、可溶性発光修飾剤と結合させた一重標識プローブを用いた融解曲線分析（すなわち、Ｔｍ決定）を述べている。ＨＣＶプローブとＨＣＶ合成鋳型を、実験システムで用いる。一重常識プローブを可溶性クエンチャーとともに用いることの有効性を明らかにする。
【０２６３】
ＨＣＶタイピングプローブを設計合成し（配列番号１４）、図５２Ａに示したように単一フルオレセイン（ＦＡＭ）標識を含んでいる。このプローブは、ＨＣＶゲノムのヘテロ５’−ＵＴＲ内部のドメインとハイブリダイズする。このプローブは、これとは別に、下記の表に示したようなさまざまなＨＣＶ下のタイプに対応する異なる合成一本鎖鋳型とハイブリダイズした。
【０２６４】
【表１８】
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【０２６５】
前記プローブは、別々の反応で前記の合成鋳型のそれぞれにアニーリングした。融解分析のため、さまざまなハイブリダイゼーション混合物を９５℃で２分間加熱し、その後２０℃まで冷却し、アニーリングさせハイブリダイゼーション複合体を形成させた。ハイブリダイゼーション複合体を含む反応物を次に約７６サイクル加熱させ、ここで、各サイクルは、温度を１℃だけ３０秒間増加させる。蛍光は、各３０秒サイクルの終点で５０ミリ秒だけ測定した。融解反応は、９６ウェルのマイクロタイタープレートで行い、蛍光は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ＲＴＭ７７００シークエンスディテクションシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてモニタリングした。蛍光は、この実験で（およびＦＡＭ標識プローブを用いた全ての実験で）２０ｎｍのバンド幅を有する４８５ｎｍの励起フィルターとバンド幅１０ｎｍで発光フィルター５２０ｎｍを用いて測定した。
【０２６６】
この混合物中のハイブリダイゼーション複合体の形成／解離は、可溶性クエンチャーシステムを用いてモニタリングした。前記プローブに結合させたＦＡＭ標識は、適切なドナー発光を示した。クエンチング作用は、可溶性クエンチャーであるメチレンブルーによって示された。メチレンブルーは、チアジンおよびジアジン色素構造に基づく可溶性クエンチャー族のメンバーである。メチレンブルークエンチャーは、二本鎖ＤＮＡに対して結合アフィニティを有しており、プローブが標的と二本鎖構造である時プローブ上の蛍光標識に近接していればクエンチング効果を発揮する。しかし、可溶性クエンチャーは、一本鎖ＤＮＡに対してアフィニティが低下している。したがって、プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を含む溶液を加熱しその後それが解離した場合、核酸に対するクエンチャーのアフィニティは低下し、その結果、蛍光が増強されることになる。
【０２６７】
蛍光データは、温度関数として未加工の蛍光値をプロットすることによって、グラフで示すことができる。対照実験において、メチレンブルー可溶性クエンチャーは、融解反応から除外された。別々の実験（前記プローブと各ＨＣＶ合成鋳型を用いた融解分析）の結果を、同一プロット上二重ねて、図５２Ｂに示した。これらの実験において、複数の別々の実験結果を同一グラフ上二重ねる。代表的データセットを示した。可溶性クエンチャー不在下で予測されるように、ＦＡＭ蛍光に有意な変化はなく、実施例のそれぞれにおいて二本鎖から一本鎖状態への遷移を示唆しており、それは、ＤＮＡ二本鎖のアニーリングと融解を結果として生じる温度サイクリングプログラムにもかかわらず、クエンチング部分の不在によるのであろう。
【０２６８】
次に、同一試薬を新しい分析に用いて、メチレンブルーを濃度１０μｇ／ｍＬで融解反応物に添加した。融解分析結果を図５３に示した。明らかであるように、各プローブ／鋳型複合体は再度、加熱により明らかな解離プロフィールを示し、異なる遺伝子型に対応する明らかなＴｍ値を示唆していた。
【０２６９】
次の実験において、メチレンブルーを濃度２０μｇ／ｍＬの融解反応物に添加した。融解分析結果は、図５４に示した。明らかであるように、各プローブ／鋳型複合体は再度、加熱により明らかな解離プロフィールを示し、異なるＨＣＶ遺伝子型に対応する明らかなＴｍ値を示唆していた。
【０２７０】
図５４のデータは、同一データの最初の誘導プロートを用いることによって、さらに容易に解釈できる。図５５は、最初の誘導プロットとして図５４におけるデータを示している。各曲線のピークはそれらの特定のハイブリダイゼーション条件下におけるハイブリダイゼーション複合体のＴｍを示している。明らかであるように、各ＨＣＶ遺伝子型のＴｍは、グラフ上で容易に識別できる。したがって、可溶性クエンチャーチアジン色素アズールＢは、融解曲線Ｔｍ決定において使用され、成果を収めることができる。
【０２７１】
実施例２０
ＨＣＶモデルシステムを用いたチアジン存在下における核酸二本鎖安定化の実証
本実施例は、チアジン色素の二本鎖安定化性質を示している。ＨＣＶプローブとＨＣＶ合成鋳型を実験システムで用い、形成されたさまざまなハイブリダイゼーション複合体のＴｍを測定することによって、二本鎖安定化を実証する。
【０２７２】
融解曲線反応は、図５６に示したように一重標識プローブ（配列番号１４）とＨＣＶタイプ１ａ／ｂ合成鋳型（配列番号１５）を用いて確立した。この分析では、上記実施例で述べたのと同一の方法論を用いた。プローブとＨＣＶ遺伝子型１ａ／ｂ鋳型のこの特定の組み合わせは、完全な並びを生ずる（ミスマッチゼロ）。これらの融解分析反応ではこれとは別に、１０−４０μｇ／ｍＬからの範囲のチアジン色素メチレンブルーの４種の増加性の濃度を含んでいた。融解データは、蛍光対温度の最初の誘導プロットとして図５６に示した。４種の異なる実験結果は、同一グラフ上二重ねる。データの代表的セットを示した。図からわかるように、濃度増加性のメチレンブルーは、完全マッチ二本鎖の安定性増加となり、メチレンブルー濃度増大に伴いＴｍ値の高さに反映された。
【０２７３】
二本鎖が１個、２個または３個のミスマッチを含む場合に３種の追加実験を行い、二本鎖安定性に及ぼすメチレンブルーの効果を評価した。これらの実験の第１において、融解曲線反応は、図５６で使用したものと同じＨＣＶ遺伝子型決定プローブと図５７に示したようなＨＣＶ遺伝子型６（配列番号２０）に対応するＨＣＶ合成鋳型を用いて確立した。プローブと遺伝子型６鋳型のこの特定の組み合わせにより、１個のミスマッチ位置を含む核酸二本鎖が生じる。先の実験におけるのと同様、融解反応物は、これとは別に、１０−４０μｇ／ｍＬからの範囲のチアジン色素メチレンブルーの４種の増加性の濃度を含んでいた。融解データは、蛍光対温度の最初の誘導プロットとして図５７に示した。４種の異なる実験結果は、同一グラフ上二重ねる。データの代表的セットを示した。図５７からわかるように、濃度増加性のメチレンブルーは、完全マッチ二本鎖の安定性増加につながり、メチレンブルー濃度増大に伴いＴｍ値の高さに反映された。
【０２７４】
同様に、融解曲線反応は、また、同一ＨＣＶ遺伝子型決定プローブと図５８に示したようなＨＣＶ遺伝子型５（配列番号１９）に対応するＨＣＶ合成鋳型を用いて、確立した。プローブと遺伝子型５鋳型のこの組み合わせにより、２個のミスマッチ位置を含む核酸二本鎖が生じる。この融解反応物は、これとは別に、チアジン色素メチレンブルーの４種の増加性の濃度を含んでいた。融解データは、蛍光対温度の最初の誘導プロットとして図５８に示した。４種の異なる実験結果は、同一グラフ上二重ねる。データの代表的セットを示した。図５８からわかるように、濃度増加性のメチレンブルーは、完全マッチ二本鎖の安定性増加につながり、メチレンブルー濃度増大に伴いＴｍ値の高さに反映された。
【０２７５】
同様に、融解曲線反応は、また、ＨＣＶプローブと鋳型により確立し、図５９に示したような３個のミスマッチ位置を含む核酸二本鎖が生じた。これらの反応では、ＨＣＶ遺伝子型２ａ／ｃに対応するＨＣＶ合成鋳型（配列番号１６）を用いた。融解反応物は、これとは別に、チアジン色素メチレンブルーの４種の増加性の濃度を含んでいた。融解データは、蛍光対温度の最初の誘導プロットとして図５９に示し、ここで４種の異なる実験結果は、同一グラフ上二重ねる。データの代表的セットを示した。図５９からわかるように、濃度増加性のメチレンブルーは、完全マッチ二本鎖の安定性増加につながり、メチレンブルー濃度増大に伴いＴｍ値の高さに反映された。
【０２７６】
安定化度合いは、メチレンブルー濃度増大に伴いさらに顕著になること、および、増大する数のミスマッチを含む二本鎖がＴｍによって測定したように安定化程度が高くなることを記載するのは重要である。たとえば、二本鎖中にミスマッチが存在しないと（図５６）、メチレンブルー１０μｇ／ｍＬ対メチレンブルー４０μｇ／ｍＬを用いた場合のＴｍ値の差は、２．０℃である。しかし、二本鎖中に３個のミスマッチが存在した場合（図５９）、メチレンブルー１０μｇ／ｍＬ対メチレンブルー４０μｇ／ｍＬを用いた場合のＴｍ値の差は、より顕著になり、それらの反応条件下で１２．４℃にわたる。１個および２個のミスマッチ存在を有する二本鎖（図５７および５８）は、中等度の二本鎖安定化を示す。
【０２７７】
実施例２１
複数ＨＣＶ鋳型標的を用いたチアジン色素存在下における核酸二本鎖安定化
チアジン色素の二本鎖安定化特徴を、さらに図６０の棒グラフに示した。この棒グラフは、示したＨＣＶ遺伝子型に対応するヌクレオチド配列を有するさまざまな合成核酸で示唆したＨＣＶプローブを用いてＴｍ決定した要約を示している。この分析ではメチレンブルーの効果を調べ、融解曲線分析においてこれとは別にメチレンブルーゼロ、メチレンブルー１０μｇ／ｍＬ、メチレンブルー２０μｇ／ｍＬを使用した。
【０２７８】
これらの決定は、２種の異なる方法論のひとつを用いて行った。ひとつの実験セットにおいて、Ｔｍ決定は、ニューメチレンブルー不在下で行った。その場合、一重標識ＦＡＭプローブは、二本鎖形成／解離をモニタリングするために適切なドナー／クエンチャーペアが存在していないので、Ｔｍ決定において有効でなかった。その場合、ＦＡＭ標識を有さないプローブを合成し（配列番号２２）、融解曲線とＴｍ決定は、反応にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを含ませることによって実施した。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染色は、二本鎖ＤＮＡにとって特異的であり、従って、二本鎖結合／解離のための有効なモニターである。これとは別に、メチレンブルーが融解反応に存在する時、一重標識ＦＡＭプローブ（配列番号１４）は、先に述べたように使用した。これらの実験において、２種の異なるプローブのヌクレオチド配列は、同一であった；前記２種のプローブの唯一の差は、ＦＡＭ標識があるかないかであった。
【０２７９】
生成した二本鎖は、下文に示したようにさまざまな数のヌクレオチドミスマッチを含んだ：
【表１９】
2010162027.tif 000021
【０２８０】
さまざまなＨＣＶ  遺伝子型／サブタイプに対応する７種の異なる合成鋳型を用いたこの種の分析結果を、図６０に要約し、二本鎖安定化効果の全般的効果を明らかにした。代表的データセットを示した。このデータはまた、下記の表に要約してある。
【０２８１】
【表２０】
2010162027.tif 000022
【０２８２】
この図において２種の明確な傾向が観察でき、メチレンブルーの二本鎖安定化効果を示している。第１に、いずれか１種のＨＣＶ遺伝子型解析において、増大するメチレンブルー濃度を添加することで、二本鎖安定性が高まる。これは、完全マッチ二本鎖（遺伝子型１ａ／ｂ）についてもならびに１又は複数のミスマッチを含む二本鎖（他の全ての遺伝子型）についても、真実である。第２に、多数のミスマッチを含む二本鎖は、融解分析に対してメチレンブルー添加により、通常、（Ｔｍの変化によって測定される）最大度の安定化を示した。たとえば、ＨＣＶ遺伝子型１ａ／ｂ（完全マッチ、まったくミスマッチを有していない）を含むメチレンブルー添加により実験的に観察したＴｍ価においてわずかの上昇しか示さなかった。対照的に、１又は複数のミスマッチヌクレオチド位置を有する二本鎖は、ニューメチレンブルー添加により二本鎖の安定性の向上において大きなレベルを示した。同様の効果は、また、チアジン色素メチレンブルーを用いた時にも観察された。
【０２８３】
図６０に要約した実験の場合、メチレンブルーは、２個の機能を果たしていることを指摘するのは、重要である。単一ＦＡＭ標識プローブを融解分析に使用する場合、ニューメチレンブルーは、第１に、二本鎖結合／解離をモニタリングするためＦＡＭ標識プローブを有する可溶性クエンチャーとして作用する。第２に、本明細書にも示したように、ニューメチレンブルーは、二本鎖安定化のために作用し、最も重要なこととして、ヌクレオチドミスマッチを含む二本鎖を安定化させるために作用する。この比較において、ゼロ色素（ニューメチレンブルー）対照についてのデータは、Ｔｍ決定のために非標識プローブとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出を用いて得る。
【０２８４】
実施例２２
チアジン色素存在下における単一ヌクレオチドミスマッチ安定化の実証
本実施例は、さらに、８種の異なるヌクレオチドミスマッチに対する安定化影響を実証することによって、チアジン色素の単一ヌクレオチドミスマッチ安定化性質を例示する。ＨＣＶプローブおよび合成鋳型を、実験システムで用い、単一ヌクレオチドミスマッチ安定化は、形成されたさまざまなハイブリダイゼーション複合体のＴｍを測定することによって、実証する。
【０２８５】
融解曲線反応は、図５２Ａに示した一重標識ＦＡＭプローブとこのプローブにハイブリダイゼーションした時にさまざまな単一塩基ミスマッチを含むように処理した合成鋳型を用いて、確立した。これらの工学的に処理した鋳型が任意な特定のＨＣＶ遺伝子型にも相関しないこと、および、それらが例示的な目的のみのために構築されたことに留意。これらの工学的に作製した鋳型を下文に示す。プローブにアニーリングした場合ミスマッチとなるヌクレオチド位置を、下段に示す。鋳型のひとつは、ミスマッチを有さないように設計した。
【０２８６】
【表２１】
2010162027.tif 000023
【０２８７】
これらのプローブおよび鋳型組み合わせは、図６１に示した単一ヌクレオチドミスマッチを生じた。プローブとのミスマッチを全く生じない（すなわち、Ａ：Ｔ完全マッチ）ハイブリダイゼーション鋳型のみを含めた。各融解分析反応は、これとは別に、メチレンブルー１０μｇ／ｍＬまたはメチレンブルー４０μｇ／ｍＬを含んでいた。
【０２８８】
このＴｍ融解データを、図６１の棒グラフに要約した。代表的データセットを示した。また、棒グラフには、それぞれのハイブリダイゼーション複合体の（メチレンブルー不在下における）予測Ｔｍを示した。これらの計算値は、視覚的ＯＭＰソフトウェア推定値（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から誘導した。
【０２８９】
図からわかるように、融解反応物にメチレンブルーを添加した場合、メチレンブルー不在下での予測Ｔｍ値に比較してそれらのそれぞれのＴｍ値によって決定した場合、ミスマッチ二本鎖を安定化した。さらに、メチレンブルー４０μｇ／ｍＬ添加は、二本鎖安定化においてメチレンブルー１０μｇ／ｍＬよりもより効果的であるようである。これらのメチレンブルー安定化効果は、また、完全マッチ二本鎖においても観察された。これらのデータは、二本鎖安定化効果が、任意な特定のミスマッチタイプにも限定されず、一般的現象である。場合によっては、安定化度は、ミスマッチタイプに依存する。
【０２９０】
実施例２３
ＨＩＶモデルシステムを用いたチアジン色素存在下における改良サブタイプ堅守の実証
本実施例では、ウイルス標的の増幅および検出におけるチアジン色素の二本鎖安定化性質の利点を示す。ミスマッチ二本鎖安定化のチアジン色素の能力により、多型サブタイプの検出感度が、通常、増幅及び／又は検出効率向上により大きく改善できることがわかる。先の実施例と対照的に、この実施例では、さまざまなＴａｑＭａｎ増幅反応のＣT値を用いて、二本鎖安定性増強の利点を明らかにする。ＨＩＶ増幅プライマー、ＨＩＶ二重標識５’−ヌクレアーゼ定量化プローブおよびＨＩＶ合成鋳型を、図６２に示したように実験モデルシステムで用いた。図６２のプライマーおよびプローブ配列の下に、公知のＨＩＶ単離物由来の対応する相同ドメインを示し、可変位置も示した。
【０２９１】
アンプリコン産物のリアルタイム定量化のための単一管ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応は、下文に示した増幅プライマーを用いて確立した。
【０２９２】
【表２２】
2010162027.tif 000024
【０２９３】
増幅反応はまた、配列：
ＦＡＭ−ＴＣＴＧＣＡＧＣＴＢＨＱ２ＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡ−ＰＯ4（配列番号２５）
を有する二重標識５’−ヌクレアーゼプローブＧＡＧ１０８ＦＢＨＱ２９Ｉを含んでおり、ここで、ＦＡＭは、蛍光標識であり、ＰＯ4は、末端リン酸であり、ＢＨＱ２は、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ（商標））−２である。増幅反応はまた、サブクローニングし単離したＨＩＶ遺伝物質のインビトロ転写とオリゴ−ｄＴ−セファロースクロマトグラフィによって産生させた合成ＨＩＶ  ＲＮＡ分子を含んでいた。特定のＲＮＡ転写物の１００万コピーを各反応で使用した。ＰＣＲ反応では、下記のサイクリングプログラムを用いた：
５０℃／５分；５９℃／３０分；９５℃／２分；９５℃→５８℃（２サイクル）；９１℃→５８℃（６０サイクル）。
【０２９４】
第１実験では、ＳＫ１４５ＢＵおよびＧＡＧ１５２ＢＵ増幅プライマーおよびＧＡＧ１０８ＦＢＨＱ２９Ｉ  ５’−ヌクレアーゼ定量化プローブを用いたＨＩＶ  ＲＮＡ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）定量化を確立した。実験結果を図６３に示した。さまざまなＨＩＶ  ＲＮＡ鋳型（各１０6コピー）を、示したように、別々の増幅反応で用いた。前方プライマー、逆プライマーおよび５’−ヌクレアーゼプローブにおけるヌクレオチドミスマッチの数は、下記の表で、試験した各ＨＩＶサブタイプについて示した。チアジン色素は全く、反応に存在していない。代表的標的データセットを示した。各ＨＩＶサブタイプについて得られたＣT数についても、示した。図６３と表からわかるように、試験した各ＨＩＶ遺伝子型は、明確なＣT数を有している。
【０２９５】
図６３に示したＨＩＶ  ＲＮＡ増幅定量化分析を、図６４に示した実験で繰り返したが、ただし、反応物にニューメチレンブルー５０μｇ／ｍＬを添加したことを除く。明らかであるように、ニューメチレンブルー添加により、検出レベルが向上し、ＣT値は、チアジン色素添加により低下した。これらの結果は、以下の通り要約した：
【０２９６】
【表２３】
2010162027.tif 000025
【０２９７】
図６３と６４に示しかつ上記表で要約したように、チアジン色素の二本鎖安定化性質がこのモデルシステムで実証され、おそらく、プライマー−鋳型二本鎖とアンプリコン−ヌクレアーゼプローブ二本鎖を両者ともに安定化することによるのであろう。この安定化により、多型サブタイプに対する検出感度が向上することになる。
【０２９８】
実施例２４
ＨＩＶモデルシステムを用いたさまざまな濃度のチアジン色素存在下における用量依存性核酸二本鎖安定化の実証
本実施例では、色素をある濃度範囲で使用し、チアジン色素の二本鎖安定化性質を示している。この実施例では、実施例２３に記載のものと同一のＨＩＶ実験モデルシステムと試薬を用いる。
【０２９９】
ＨＩＶ増幅産物のリアルタイム定量化のための増幅反応は、ＨＩＶ増幅プライマーＳＫ１４５ＢＵ（配列番号２３）およびＧＡＧ１５２ＢＵ（配列番号２４）および５’−ヌクレアーゼ定量化プローブＧＡＧ１０８ＦＢＨＱ２９Ｉ（配列番号２５）を用いて、確立した。この実施例における増幅反応は、ＨＩＶ遺伝子型１１０−５合成ＲＮＡ鋳型（１０6コピー）を標的にした。ＨＩＶ遺伝子型、増幅プライマーおよびヌクレアーゼプローブのこの特定の組み合わせにより、前方プライマー下で６個のミスマッチを、５’−ヌクレアーゼ定量化プローブ下で１個のミスマッチが生じた。
【０３００】
前記の増幅および定量化反応に、これとは別に、さまざまな濃度のニューメチレンブルーを１０−５０μｇ／ｍＬから添加した。全くメチレンブルーを有していない反応もまた、行った。結果は、アンプリコン増殖曲線とＣT値として示した。結果を図６５に示した。代表的データセットを示した。図から明らかにわかるように、ニューメチレンブルー添加により増幅および定量化アッセイの感度が向上し、それは、チアジン色素濃度上昇に伴いＣT値が低下したことで証明される。これは、おそらく、プライマー−鋳型二本鎖とアンプリコン−ヌクレアーゼプローブ二本鎖を両者ともに安定化することによるのであろう。このデータは、このＨＣＶサブタイプの検出感度に及ぼすニューメチレンブルーの有益な効果を、色素濃度増大の関数として明確に示している。
【０３０１】
実施例２５
ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン  アンプリコン検出を用いたチアジン色素の核酸二本鎖安定化の実証
本実施例では、チアジン色素の二本鎖安定化性質を示し、ここで、モデルシステムＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを用いてアンプリコン蓄積をモニタリングしている。ＨＩＶ増幅産物のリアルタイム定量化のための増幅反応は、ＨＩＶ増幅プライマーＳＫ１４５ＢＵ（配列番号２３）およびＧＡＧ１５２ＢＵ（配列番号２４）を用いて行った。この実施例では、増幅反応は、ＨＩＶ遺伝子型１１０−５合成ＲＮＡ鋳型（１０6コピー）を標的にした。全反応物に、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを添加し、二本鎖アンプリコン産物の蓄積をモニタリングした。５’−ヌクレアーゼ定量化プローブは用いなかった。
【０３０２】
前記増幅反応では、これとは別に、ニューメチレンブルー３０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬを添加した。全くメチレンブルーを有していない反応もまた、行った。反応にニューメチレンブルーを全く使用しない時、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの１：１０，０００希釈物（１×濃度）を用いた。３０および５０μｇ／ｍＬニューメチレンブルーを用いた時、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの１：２，５００希釈物は．（４×濃度）であった。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光は、ＦＡＭ標識と同一波長で測定した。ニューメチレンブルーの反応物への添加は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン放出蛍光を低下させる効果を有していた。これを補うため、ニューメチレンブルーを含む反応物では、高濃度のＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを用いた。このＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの濃度増大は、増幅効率にマイナスの影響を有することが公知である。しかし、このマイナスの効果にかかわらず、ニューメチレンブルーの二本鎖安定化に及ぼす有益な効果が、明確にわかる。
【０３０３】
このアッセイ結果を図６６に示した。結果を、アンプリコン増加曲線とＣT値として示した。代表的データセットを示した。図から明らかにわかるように、ニューメチレンブルー添加により、増幅および定量化アッセイの感度が向上し、それは、チアジン色素濃度上昇に伴いＣT値が低下したことで証明される。おそらく、ＨＩＶ標的鋳型と増幅プライマーとの相互作用をチアジン色素が安定化しているのであろう。さらに、この実施例は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン検出システムをＤＮＡ二本鎖安定化のためにチアジン色素とともに使用できることを示している。
【０３０４】
明確にするためおよび理解させるために、本発明を詳細に説明してきたが、本開示を読めば、当業者には、形態および詳細をさまざまな変化させることが本発明の真の範囲から逸脱することなく可能であることが明らかであろう。たとえば、上述の全ての技術および装置は、さまざまな組み合わせで用いることができる。全ての科学的出版物、全ての種類の特許公報、発行特許類、係属特許出願、及び／又は本出願で引用した他の文献は、それぞれの出版物、特許、特許出願、及び／又は他の文献がそれぞれ全ての目的のため引用により組み入れられると示されているのと同程度に、全ての目的のために、その全文を引用により組み入れられる。
【符号の説明】
【０３０５】
１００    標的核酸
１０２    プライマー
１０４    プローブ
１０６    蛍光団
１０８    発光修飾剤
１１０    ポリメラーゼ
２００    標的核酸
２０２    プライマー
２０４    プローブ
２０６    クエンチャー
２０８    蛍光団
２１０    発光修飾剤
２１２    ポリメラーゼ
３００    コンピュータ
３０２    検出器
３０４    流体移動コンポーネント
３０６    マルチウェルコンテナー
３０８    熱調節器
【図１Ａ】
2010162027.tif 000026
【図１Ｂ】
2010162027.tif 000027
【図２Ａ】
2010162027.tif 000028
【図２Ｂ】
2010162027.tif 000029
【図３】
2010162027.tif 000030
【図４】
2010162027.tif 000031
【図５】
2010162027.tif 000032
【図６】
2010162027.tif 000033
【図７】
2010162027.tif 000034
【図８】
2010162027.tif 000035
【図９】
2010162027.tif 000036
【図１０】
2010162027.tif 000037
【図１１】
2010162027.tif 000038
【図１２】
2010162027.tif 000039
【図１３】
2010162027.tif 000040
【図１４】
2010162027.tif 000041
【図１５】
2010162027.tif 000042
【図１６】
2010162027.tif 000043
【図１７】
2010162027.tif 000044
【図１８】
2010162027.tif 000045
【図１９】
2010162027.tif 000046
【図２０】
2010162027.tif 000047
【図２１】
2010162027.tif 000048
【図２３】
2010162027.tif 000049
【図２４】
2010162027.tif 000050
【図２５】
2010162027.tif 000051
【図２６】
2010162027.tif 000052
【図２７】
2010162027.tif 000053
【図２８】
2010162027.tif 000054
【図２９】
2010162027.tif 000055
【図３０】
2010162027.tif 000056
【図３２】
2010162027.tif 000057
【図３３】
2010162027.tif 000058
【図３４】
2010162027.tif 000059
【図３５】
2010162027.tif 000060
【図３６】
2010162027.tif 000061
【図３７】
2010162027.tif 000062
【図３８】
2010162027.tif 000063
【図３９】
2010162027.tif 000064
【図４０】
2010162027.tif 000065
【図４１】
2010162027.tif 000066
【図４２】
2010162027.tif 000067
【図４３】
2010162027.tif 000068
【図４４】
2010162027.tif 000069
【図４５】
2010162027.tif 000070
【図４６】
2010162027.tif 000071
【図４７】
2010162027.tif 000072
【図４８】
2010162027.tif 000073
【図４９】
2010162027.tif 000074
【図５０】
2010162027.tif 000075
【図５１】
2010162027.tif 000076
【図５２Ａ】
2010162027.tif 000077
【図５２Ｂ】
2010162027.tif 000078
【図５３】
2010162027.tif 000079
【図５４】
2010162027.tif 000080
【図５５】
2010162027.tif 000081
【図５６】
2010162027.tif 000082
【図５７】
2010162027.tif 000083
【図５８】
2010162027.tif 000084
【図５９】
2010162027.tif 000085
【図６０】
2010162027.tif 000086
【図６１】
2010162027.tif 000087
【図６２】
2010162027.tif 000088
【図６３】
2010162027.tif 000089
【図６４】
2010162027.tif 000090
【図６５】
2010162027.tif 000091
【図６６】
2010162027.tif 000092
【図２２Ａ】
2010162027.tif 000093
【図２２Ｂ】
2010162027.tif 000094
【図３１Ａ】
2010162027.tif 000095
【図３１Ｂ】
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【配列表】
2010162027000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月11日(2010.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）発光部分を含んで成るプローブ；
（ｉｉ）前記プローブに対して相補的であるかまたは部分的に相補的であるハイブリダイゼーション標的；および
（ｉｉｉ）チアジン色素またはジアジン色素を含む可溶性発光修飾剤であって、前記発光部分をクエンチングできる前記可溶性発光修飾剤、
を準備すること；
（ｂ）前記プローブと前記ハイブリダイゼーション標的とを、塩基対形成が起こり標的ハイブリダイゼーション複合体を形成できる条件下でアニーリングすること；
（ｃ）前記可溶性発光修飾剤存在下で標的ハイブリダイゼーション複合体の温度を変化させ前記発光部分の放出を測定すること；
（ｄ）前記発光部分の測定された放出を前記標的ハイブリダイゼーション複合体の存在と温度関数として相関させ、それによって測定された放出に基づき標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション標的の準備が核酸標的に対応するアンプリコンの産生を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンプリコンの産生がポリメラーゼ連鎖反応、好ましくは非対称ポリメラーゼ反応による核酸の増幅を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定段階がある温度範囲、好ましくは２０℃〜９５℃の温度範囲での放出の測定を含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定するキットであって、
（ａ）発光部分を含む少なくとも１つのプローブであって、ハイブリダイゼーション標的と相補的であるかまたは部分的に相補的であるプローブ；
（ｂ）可溶性のチアジン色素またはジアジン色素を含む少なくとも１つの可溶性発光修飾剤であって、発光部分をクエンチングできる可溶性発光修飾剤；および
（ｃ）（ａ）、（ｂ）又は（ａ）及び（ｂ）を含む１又は複数の容器、
を含むキット。
【請求項６】
ハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定するシステムであって：
（ａ）（ｉ）シグナルを放出する発光部分を含んで成る核酸プローブ；
（ｉｉ）前記核酸プローブと相補的であるかまたは部分的に相補的な標的核酸；並びに
（ｉｉｉ）可溶性のチアジン色素またはジアジン色素、
を含んで成る試料；
（ｂ）（ｉ）本質的に全プローブ分子が所定のハイブリダイゼーション条件下で前記ハイブリダイゼーション標的とアニーリングする温度；
（ｉｉ）標的ハイブリダイゼーション複合体の５０％が前記ハイブリダイゼーション条件で解離する温度；および
（ｉｉｉ）本質的にどのプローブ分子も前記ハイブリダイゼーション標的と前記ハイブリダイゼーション条件下でアニーリングしておらず、且つ、本質的にどのハイブリダイゼーション複合体も前記ハイブリダイゼーション条件で存在していない温度、
を含む温度範囲にわたり試料の温度を制御するための熱制御デバイス；
（ｃ）前記温度範囲にわたり前記試料由来のシグナルを測定するための検出器；および
（ｄ）前記検出器と作用可能に連結し、且つ前記温度範囲でシグナル測定値を受け取る相関モジュールであって、シグナル強度を前記プローブとハイブリダイゼーション標的を含むハイブリダイゼーション複合体の存在とチアジン色素またはジアジン色素との混合物中で温度関数として相関させ、それによって前記標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定する相関モジュール、
を含む、システム。
【外国語明細書】
2010162027000001.pdf