(57)【要約】【課題】細胞等の被観察物（位相物体）を移動させることなく観察可能な観察装置を提供する。【解決手段】観察装置１が、ステージ１０に支持された細胞６等の被観察物５に対し、明部２２と暗部２３とが交互に繰り返し配置された照明光を照射する照明部２０と、被観察物５を透過した照明光を反射させる反射面１１と、ステージ１０に対して照明部２０と同じ側に配設され、反射面１１で反射した照明光が照射される被観察物５からの散乱光を撮像面３１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる結像光学系３０と、結像光学系３０により撮像面３１ａ上に結像された被観察物５の像を撮像する撮像素子３１と、を備えている。【選択図】図１
2010054465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステージに支持された被観察物に対し、明部と暗部とが交互に繰り返し配置された照明光を照射する照明部と、
前記被観察物を透過した前記照明光を反射させる反射面と、
前記ステージに対して前記照明部と同じ側に配設され、前記反射面で反射した前記照明光が照射される前記被観察物からの散乱光を所定の撮像面上に導いて、前記被観察物の像を結像させる結像光学系と、
前記結像光学系により前記撮像面上に結像された前記被観察物の像を撮像する撮像部と、を備えることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記結像光学系の物体側開口数をαとし、前記被観察物と前記反射面との間隔をｄとし、前記照明光の中心波長をλとしたとき、次式
ｄ≦λ／α2
の条件を満足することを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
ステージに支持された被観察物に対し、照明光を照射する照明部と、
前記被観察物を透過した前記照明光を反射させる反射部と、前記被観察物を透過した前記照明光を透過もしくは吸収させる非反射部とが交互に繰り返し配置された反射部材と、
前記ステージに対して前記照明部と同じ側に配設され、前記反射部で反射した前記照明光が照射される前記被観察物からの散乱光を所定の撮像面上に導いて、前記被観察物の像を結像させる結像光学系と、
前記結像光学系により前記撮像面上に結像された前記被観察物の像を撮像する撮像部と、を備えることを特徴とする観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞等の微小な位相物体を広い視野で観察する観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の培養に際して、培養状況や培養容器中の細胞の分布や量を確認するための観察が行われている。細胞の多くは光の吸収がほとんどない位相物体であるため、通常の観察によって細胞の有無を観察するのは困難であり、光学顕微鏡を用いた暗視野観察または位相差観察により光の細胞透過による位相変化を明暗変化に変換することで細胞等の観察が行われる。
【０００３】
しかしながら、顕微鏡の視野は数ｃｍ以上のサイズを持つ培養容器に比べて小さいため、被観察物の全体を見るためには視野を多数回移動させる必要があり、多大な観察時間が掛かってしまう。また、視野の大きな観察装置を作成しようとすると、被観察物を照明する照明装置が大掛かりになるうえ、細胞の培養容器の端部付近では培養容器の側壁が障害となって観察が難しくなる。
【０００４】
そこで、明部と暗部とを繰り返し配置してなる照明（ストライプ照明）で被観察物上を照明してストライプ状の暗視野像を生成し、透明な被観察物の広視野観察を可能とした観察装置が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００７−１７８４２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のような方法では、細胞等が収められた培養容器を搬送して観察装置のステージ上に載置し、観察後に容器を再び元の場所に戻すことになる。しかしながら、細胞培養時の環境を保つためには、培養容器を手動で搬送することは好ましくなく、培養容器の自動搬送装置を設置しようとすると、多大なコストが掛かってしまう。
【０００６】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、細胞等の被観察物（位相物体）を移動させることなく観察可能な観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的達成のため、本発明を例示する第１の態様に従えば、ステージに支持された被観察物に対し、明部と暗部とが交互に繰り返し配置された照明光を照射する照明部と、前記被観察物を透過した前記照明光を反射させる反射面と、前記ステージに対して前記照明部と同じ側に配設され、前記反射面で反射した前記照明光が照射される前記被観察物からの散乱光を所定の撮像面上に導いて、前記被観察物の像を結像させる結像光学系と、前記結像光学系により前記撮像面上に結像された前記被観察物の像を撮像する撮像部と、を備えることを特徴とする観察装置が提供される。
【０００８】
また、本発明を例示する第２の態様に従えば、ステージに支持された被観察物に対し、照明光を照射する照明部と、前記被観察物を透過した前記照明光を反射させる反射部と、前記被観察物を透過した前記照明光を透過もしくは吸収させる非反射部とが交互に繰り返し配置された反射部材と、前記ステージに対して前記照明部と同じ側に配設され、前記反射部で反射した前記照明光が照射される前記被観察物からの散乱光を所定の撮像面上に導いて、前記被観察物の像を結像させる結像光学系と、前記結像光学系により前記撮像面上に結像された前記被観察物の像を撮像する撮像部と、を備えることを特徴とする観察装置が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞等の被観察物（位相物体）を移動させることなく観察することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。第１実施形態の観察装置１は、図１に示すように、ステージ１０上に載置された被観察物５に照明光を照射する照明部２０と、照明光が照射される被観察物５からの散乱光を撮像面３１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる結像光学系３０と、結像光学系３０により撮像面３１ａ上に結像された被観察物５の像を撮像する撮像素子３１と、演算処理部３２および画像表示装置３３とを主体に構成される。
【００１１】
被観察物５は、透明もしくは半透明の位相体であり、本実施形態においては、無染色の細胞６および当該細胞６が収められた透明な培養容器（シャーレ）７等から構成される。なお、ある物体に光が入ったとき、その光に位相変化を与える物体を位相物体（例えば、無色透明な標本、生体細胞、細菌等）という。被観察物５が載置されるステージ１０の表面は平面状に形成され、このステージ１０の表面近傍（内側）には、被観察物５を透過した照明光を反射させる反射面１１が形成されている。なお、本実施形態において、被観察物５である細胞６の下面（すなわち、培養容器７の底面）と反射面１１との間の距離を２ｍｍとする。
【００１２】
照明部２０は、照明光源としての液晶ディスプレイ２１と、液晶ディスプレイ２１から発せられた照明光を集光する集光レンズ２４と、ハーフミラー２５とを有して構成され、これらはステージ１０の上方に配設される。液晶ディスプレイ２１は、図２にも示すように、液晶ディスプレイ２１の発光部である明部２２と、非発光部である暗部２３とが交互に繰り返し配置された縞状の白色光を照明光として横方向に発光する。なお、本実施形態において、明部２２と暗部２３のデューティ比は１：１とする。
【００１３】
集光レンズ２４は、ハーフミラー２５を介して、液晶ディスプレイ２１から発せられた照明光をステージ１０上の被観察物５に向けて集光する。このとき、集光レンズ２４によって、被観察物５の近傍に液晶ディスプレイ２１の像（すなわち、縞状の照明パターン）が結像されるようになっている。すなわち、被観察物５の近傍に液晶ディスプレイ２１の像（縞状の照明パターン）の共役面Ｅが位置するようになっている。なお、本実施形態において、共役面Ｅはステージ１０の反射面１１から上方へ２５ｍｍ離れた位置に形成されるものとし、当該共役面Ｅにおいて結像される照明パターンのピッチは２ｍｍになるとする。また、集光レンズ２４には開口絞りＳが設けられており、これにより、液晶ディスプレイ２１から射出された不要な方向への光を除去できるので、迷光を減らす効果が期待できる。
【００１４】
ハーフミラー２５は、ステージ１０の上方に配設され、液晶ディスプレイ２１から集光レンズ２４を透過して横方向に進む照明光をステージ１０に向けて下方へ反射させる。これにより、照明光をステージ１０の上方から照射することが可能になる。また、このような照明部２０により照明光が照射されて生じる被観察物５からの散乱光の一部は、ハーフミラー２５を透過して結像光学系３０に達する。
【００１５】
結像光学系３０は、ハーフミラー２５（ステージ１０）の上方に配設され、ハーフミラー２５を透過した被観察物５からの散乱光を撮像素子３１の撮像面３１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる。また、結像光学系３０は、物体側がほぼテレセントリックで、ステージ１０の反射面１１で反射する前の照明光による散乱光と、反射面１１で反射した後の照明光による散乱光がほぼ同じ位置に見えるものを使用する。また、結像光学系３０の物体側焦点はステージ１０の反射面１１上に合わせるものとし、結像光学系３０の物体側開口数は０．０１とする。
【００１６】
撮像素子３１は、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ等から構成され、その表面に被観察物５の像を撮像するための撮像面３１ａが形成される。そして、撮像素子３１は、結像光学系３０により撮像面３１ａ上に結像された被観察物５の像を光電変換して、画像信号を演算処理部３２に出力する。演算処理部３２は、撮像素子３１から出力される画像信号に基づいて、被観察物５の画像を取り込み、取り込んだ被観察物５の画像を画像表示装置３３に表示させる。
【００１７】
以上のように構成される観察装置１において、液晶ディスプレイ２１から横方向に発せられた照明光は、集光レンズ２４を透過してハーフミラー２５で下方へ反射し、被観察物５近傍の共役面Ｅにおいて液晶ディスプレイ２１の像（縞状の照明パターン）を結像してから、ステージ１０上の被観察物５に達する。このとき、被観察物５が位相物体であるため、照明光の殆どは被観察物５を透過し、照明光が被観察物５を透過する際、被観察物５から斜光照明による第１の散乱光が生じる。被観察物５を透過した照明光は、ステージ１０の反射面１１で上方へ反射して再び被観察物５を透過し、照明光が再び被観察物５を透過する際、被観察物５から斜光照明による第２の散乱光が生じる。
【００１８】
このようにして被観察物５で生じた第１および第２の散乱光は、ハーフミラー２５を透過して結像光学系３０に達し、結像光学系３０は、第１および第２の散乱光を撮像素子３１の撮像面３１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる。また、被観察物５近傍の共役面Ｅにおいて液晶ディスプレイ２１の像（縞状の照明パターン）が結像されるため、ステージ１０の反射面１１で反射して再び被観察物５を透過した照明光は、ハーフミラー２５を透過して結像光学系３０に達し、結像光学系３０は、ステージ１０の反射面１１で反射した照明光を撮像素子３１の撮像面３１ａ上に導いて、ぼやけた液晶ディスプレイ２１の像（縞状の照明パターン）を結像させる。
【００１９】
そのため、撮像素子３１が被観察物５の像を撮像すると、液晶ディスプレイ２１によるぼやけた照明パターンがバックグラウンドとして撮像される。このとき、照明パターンの明部および暗部の幅がともに約０．５ｍｍであり、両者の中間の光強度が変化する部分の幅が０．５ｍｍ程度である。そして、被観察物５である細胞６等が照明パターンの暗部と重なっている場合はその場所が明るくなり、明部と重なっている場合はその場所が暗くなるため、明部や暗部内での周囲との像強度変化を検出することにより、被観察物５である細胞６等の分布を観察測定することが可能になる。さらに、液晶ディスプレイ２１により照明パターンをシフトさせて複数回の撮像を行うことにより、広い視野（実視野Ｙ１）において抜けのない情報を得ることができる。
【００２０】
ところで、従来の観察装置においては、被観察物に対して下方から照明を行い、被観察物の上方から観察を行うという構成を取っていたために、当該観察装置のステージ上に被観察物を移動させる必要があった。これに対し、照明および観察をともに被観察物の上方から行う（結像光学系をステージ、被観察物に対して照明部と同じ側に配置する）ようにすれば、装置の構成要素を全て被観察物の上方に配置することが可能となるため、固定されている十分に大きな台の上に置いてある被観察物をそのまま移動させることなく観察できるようになる。しかし、細胞のような位相物体では後方散乱光が極めて小さいため、反射側に出た散乱光を検出するのは困難である。
【００２１】
そこで、第１実施形態の観察装置１においては、ステージ１０上に載置された被観察物５に対し、ステージ１０の上方から照明光を照射し、ステージ１０の上方に配設され結像光学系３０等により、被観察物５を透過した照明光をステージ１０の反射面１１で反射させて上方へ導くとともに、当該反射面で反射した照明光により得られる散乱光を撮像面２１ａ上に導いている。そして、撮像面３１ａ上に結像された被観察物５の像を撮像素子３１により撮像して画像表示装置３３に表示される被観察物５の画像を観察することにより、反射面１１以外の光学要素をすべて被観察物５の上方に配置することができる。このようにすれば、細胞６等の被観察物５（位相物体）を移動させることなく観察することが可能になる。
【００２２】
なお、この方式においては、照明光源である液晶ディスプレイ２１が結像光学系３０の光路に干渉するのを避けるため、液晶ディスプレイ２１と被観察物５との間の光学距離を長くする必要がある。しかし、距離が長くなりすぎると、被観察物５を観察した際の液晶ディスプレイ２１の像（縞状の照明パターン）のボケ量が大きくなり、暗視野となる部分がなくなってしまう。そこで、周期光源で直接物体を照明するのではなく、図１に示すように、集光レンズ２４等によって被観察物５の近傍に液晶ディスプレイ２１の像（縞状の照明パターン）を結像することが好ましい。
【００２３】
また、第１実施形態の観察装置１において、照明光は、反射面１１に対する反射の前後で２回、被観察物５を透過することになる。両者の散乱光はともに観察できるので、この方式を用いれば散乱光の検出効率を向上させることができる。ただし、被観察物５と反射面１１との間隔が大きすぎると、両者の散乱光のうち少なくとも一方の散乱光による像は撮像面３１ａ上で大きくボケてしまうことになる。
【００２４】
そこで、被観察物５と反射面１１との間隔はできるだけ小さく、結像光学系３０の被写界深度の２倍程度以下であることが好ましい。照明光の中心波長をλとし、結像光学系３０の物体側開口数をαとすると、点像強度のピーク値が理想的な場合のおよそ８０％となる被写界深度は、λ／（２α2）であるので、被観察物５と反射面１１との間隔をｄとした場合、上記の条件は、次の（１）式で表される条件であることに相当する。
【００２５】
ｄ≦λ／α2      …（１）
【００２６】
本実施形態において、前述したように、被観察物５と反射面１１との間隔ｄ（細胞６の下面と反射面１１との間の距離）は２ｍｍであり、結像光学系３０の物体側開口数αは０．０１である。そのため、照明光の中心波長λを５００ｎｍとすると、λ／α2＝５ｍｍとなり、（１）式で表される条件を満たしていることがわかる。
【００２７】
次に、観察装置の第２実施形態について図３を参照しながら説明する。第２実施形態の観察装置５１は、ステージ６０上に載置された被観察物５に照明光を照射する照明部７０と、照明光が照射される被観察物５からの散乱光を撮像面８１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる結像光学系８０と、結像光学系８０により撮像面８１ａ上に結像された被観察物５の像を撮像する撮像素子８１と、演算処理部３２および画像表示装置３３とを主体に構成される。なお、被観察物５、演算処理部３２、および画像表示装置３３の構成は、第１実施形態の場合と同様の構成であるため、同じ符号を付して詳細な説明を省略する。
【００２８】
ステージ６０は透明な平板状に形成されており、ステージ６０の上面に被観察物５が載置される。ステージ６０の下面には、幅１．２５ｍｍの金属薄膜が２．５ｍｍピッチで蒸着されていて、周期的に繰り返された反射面を形成している。また、金属が蒸着されていない部分は黒く着色されていて、入射した光は吸収される。すなわち、透明なステージ６０の下面には、交互に繰り返し配置された、被観察物５およびステージ６０を透過した照明光を反射させる反射部６１および、被観察物５およびステージ６０を透過した照明光を吸収させる非反射部６２が形成されることになる。なお、本実施形態において、ステージ６０の反射面（反射部６１）と被観察物５との間の距離は２５ｍｍになるようにする。
【００２９】
照明部７０は、照明光源としての液晶ディスプレイ７１と、ハーフミラー７５とを有して構成され、これらはステージ６０の上方に配設される。液晶ディスプレイ７１は、均一な白色の光を照明光として横方向に発光する。ハーフミラー７５は、ステージ６０の上方に配設され、液晶ディスプレイ７１から横方向に発せられた照明光をステージ６０に向けて下方へ反射させる。これにより、照明光をステージ６０の上方から照射することが可能になる。また、このような照明部７０により照明光が照射されて生じる被観察物５からの散乱光の一部は、ハーフミラー７５を透過して結像光学系８０に達する。
【００３０】
結像光学系８０は、ハーフミラー７５（ステージ１０）の上方に配設され、ハーフミラー７５を透過した被観察物５からの散乱光を撮像素子８１の撮像面８１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる。また、結像光学系８０は、入射瞳が被観察物５から１００ｍｍ上方の位置に存在し、物体側開口数が０．０１になるように構成されている。
【００３１】
撮像素子８１は、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ等から構成され、その表面に被観察物５の像を撮像するための撮像面８１ａが形成される。そして、撮像素子８１は、結像光学系８０により撮像面８１ａ上に結像された被観察物５の像を光電変換して、画像信号を演算処理部３２に出力する。
【００３２】
以上のように構成される観察装置５１において、液晶ディスプレイ７１から横方向に発せられた照明光は、ハーフミラー７５で下方へ反射し、位相物体である被観察物５および透明のステージ６０を透過する。被観察物５およびステージ６０を透過した照明光の半分は、ステージ６０下面の反射部６１で上方へ反射し、残りの半分は非反射部６２で吸収される。そのため、ステージ６０の下面で反射した照明光は、明部と暗部とが交互に繰り返し配置された縞状の照明パターンとなって、再びステージ６０および被観察物５を透過し、照明光が再び被観察物５を透過する際、被観察物５から斜光照明による散乱光が生じる。
【００３３】
このようにして被観察物５で生じた散乱光は、ハーフミラー７５を透過して結像光学系８０に達し、結像光学系８０は、被観察物５からの散乱光を撮像素子８１の撮像面８１ａ上に導いて、被観察物５の像を結像させる。また、ステージ６０の下面（反射部６１）で反射して再びステージ６０および被観察物５を透過した照明光は、ハーフミラー７５を透過して結像光学系８０に達し、結像光学系８０は、ステージ６０の下面（反射部６１）で反射した照明光を撮像素子８１の撮像面８１ａ上に導いて、ぼやけた縞状の照明パターンを結像させる。
【００３４】
そのため、撮像素子８１が被観察物５の像を撮像すると、ステージ６０の反射部６１および非反射部６２によるぼやけた照明パターンがバックグラウンドとして撮像される。このとき、（被観察物５の位置での大きさに換算して）照明パターンのピッチは2mmであり、照明パターンの明部および暗部の幅がともに約０．５ｍｍであり、両者の中間の光強度が変化する部分の幅が０．５ｍｍ程度である。そして、被観察物５である細胞６等が照明パターンの暗部と重なっている場合はその場所が明るくなり、明部と重なっている場合はその場所が暗くなるため、明部や暗部内での周囲との像強度変化を検出することにより、被観察物５である細胞６等の分布を観察測定することが可能になる。
【００３５】
なお、本実施形態においては、縞状の照明パターンを生じさせる構造がステージ６０側に形成されるので、照明パターンをシフトさせることは困難である。そこで、照明部７０、結像光学系８０、および撮像素子８１からなるユニット全体を、照明パターンの繰り返し方向に２．５ｍｍ移動させるようにすれば、結像光学系８０の入射瞳が有限の位置に位置するため、被観察物５と照明パターンとの相対位置関係を変えることができ、このように被観察物５と照明パターンとの相対位置関係を変えて複数回の撮像を行うことにより、広い視野（実視野Ｙ２）において抜けのない情報を得ることができる。
【００３６】
このように、第２実施形態の観察装置５１においても、ステージ６０上に載置された被観察物５に対し、ステージ６０の上方から照明光を照射し、ステージ６０の上方に配設され結像光学系８０等により、被観察物５を透過した照明光をステージ６０の下面（反射部６１）で反射させて上方へ導くとともに、ステージ６０の下面（反射部６１）で反射した照明光により得られる散乱光を撮像面８１ａ上に導いている。そのため、第１実施形態の場合と同様に、反射部６１（および非反射部６２）以外の光学要素をすべて被観察物５の上方に配置することができることから、細胞６等の被観察物５（位相物体）を移動させることなく観察することが可能になる。
【００３７】
なお、この構成では、被観察物５の下側に設けられる反射面（反射部６１および非反射部６２）の構造はやや複雑になってしまうが、その代わりに、液晶ディスプレイ７１の発光面は、周期構造を持たない均一な発光面とすることができる。さらに、被観察物５の下側に設けられるステージ６０の反射部６１および非反射部６２が実質的な照明光源となるので、液晶ディスプレイ７１と被観察物５との間の光学距離が長い場合においても、結像光学系（例えば、第１実施形態における集光レンズ２４）を用いる必要は生じない。
【００３８】
なお、上述の各実施形態において、照明光のパターンとして縞状の照明パターンを用いているが、これに限られるものではなく、例えば、同心円状の照明パターンを用いるようにしてもよく、市松模様の照明パターンを用いるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】第１実施形態の観察装置を示す概略構成図である。
【図２】第１実施形態における液晶ディスプレイの正面図である。
【図３】第２実施形態の観察装置を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００４０】
１  観察装置（第１実施形態）
５  被観察物
６  細胞                                ７  培養容器
１０  ステージ                          １１  反射面
２０  照明部                            ２１  液晶ディスプレイ
２２  明部                              ２３  暗部
３０  結像光学系                        ３１  撮像素子（３１ａ  撮像面）
５１  観察装置（第２実施形態）
６０  ステージ
６１  反射部                            ６２  非反射部
７０  照明部                            ７１  液晶ディスプレイ
８０  結像光学系                        ８１  撮像素子（８１ａ  撮像面）
【図１】
2010054465.tif 000003
【図２】
2010054465.tif 000004
【図３】
2010054465.tif 000005