(57)【要約】      （修正有）【課題】ＢＣＩＰ及びＮＢＴを組み合わせたイムノクロマトグラフィー法においてＳＮ比を向上させて高精度に定量できる光学的定量装置を提供する。【解決手段】ＢＣＩＰ及びＮＢＴの反応により生成する沈殿色素９１を光学的に定量する定量装置であって、４７０ｎｍ超５７３ｎｍ未満に発光波長をもつＬＥＤ１０と光センサ３０と光センサ３０の出力信号から沈殿色素９１の量を導出する換算手段５と、ＬＥＤ１０からの発光を沈殿色素９１に照射し、その反射光を光センサ３０に導く光学系２０とを有する。ＢＣＩＰ及びＮＢＴの反応により生成する沈殿色素が特異的に吸収する波長の範囲を検討・発見すると共に、その波長の光を選択的に放出できるＬＥＤを組み合わせることにより、高い精度でその沈殿色素の定量ができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブロモクロロインドリルリン酸からなる基質とニトロブルーテトラゾリウムからなる発色剤との反応により生成する沈殿色素を光学的に定量する光学的定量装置であって、
４７０ｎｍ超５７３ｎｍ未満に発光波長をもつＬＥＤと、
前記発光波長に感度を有する光センサと、
前記光センサの出力信号から前記沈殿色素の量に対応する値を導出する換算手段と、
前記ＬＥＤからの発光を前記沈殿色素に照射し、前記沈殿色素からの反射光を前記光センサに導く光学系と、
を有することを特徴とする光学的定量装置。
【請求項２】
前記ＬＥＤの発光波長は５００ｎｍ以上５４０ｎｍ以下である請求項１に記載の光学的定量装置。
【請求項３】
前記ＬＥＤの発光波長は５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５１７ｎｍ，５１８ｎｍ、５２２ｎｍ又は５２３ｎｍである請求項２に記載の光学的定量装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の反応により沈殿、生成する色素を光学的に定量する定量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微量の化学物質を定量する方法としては、大型機器を用いる質量分析や（高速）液体クロマトグラフィーなどが知られている。また、生物学的反応を利用して微量成分の定量、検出を行うバイオアッセイが知られている。バイオアッセイの１つとしてＥＬＩＳＡ法が知られている。ＥＬＩＳＡ法は感度が高く、種々の検査法において公定法として数多く採用されており、その特長としては、検出感度が概ね良好で、試験群にコントロールを加えることで定量が可能である点である。しかしながら、操作が煩雑であり、測定者の熟練度による誤差・ばらつきが大きい欠点がある。また、作業時間が数時間と長く使用する反応試薬や溶液量が多く必要である。
【０００３】
そこで、現場にてすぐに結果が判断できる手法の開発が進んでいる。例えば、抗原抗体反応を利用し、被検査液を滴下するだけでその中に含有される被検物質を特異的に検出できるイムノクロマトグラフィー法、酵素を用いて被検物質の検出を行うグルコースセンサー、表面プラズモン共鳴を用いるＳＰＲなどが挙げられる。中でもイムノクロマトグラフィー法は操作が簡便であり、妊娠検査薬など一般消費者向けの製品にも応用されている。
【０００４】
イムノクロマトグラフィー法は免疫抗体や免疫抗原を固定した固相担体に、反応液を毛細管現象により浸透させて抗原抗体結合反応を行い、その結合量を何らかの方法により測定するものである。イムノクロマトグラフィー法では被検物質を含む被検査液を含む複数の処理液を順次、滴下していくことにより、被検物質に特有な抗原抗体反応が進行する。イムノクロマトグラフィー法ではこの抗原抗体反応の進行に伴い色調などが変化するような可視化反応が進行するような構成が組み込まれており、変化する色調などを検査することにより被検物質の有無や量を検出する。イムノクロマトグラフィー法では被検物質の存在のみならず、被検物質の量についても色調変化として検出することが行われている。
【０００５】
最終的に検出する色調変化をもたらすための可視化反応には種々の反応系、標識が用いられている。例えば、油溶性染料により着色したラテックスの粒子を標識に採用する方法が挙げられている（特許文献１）。この方法は反応前後の明度、彩度の変化により定性判定を行う方法である。
【０００６】
また、抗体又はその抗原結合性断片を結合させたラテックス粒子、そのラテックス粒子を浮遊させる媒体と、糖類及び多価アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１種の凝集防止剤と、タンパク質と、緩衝剤とを含む、ｐＨが９．０〜９．８である免疫測定用ラテックス組成物が開示されている（特許文献２）。この方法は目視による定性的な判定を行っている。
【０００７】
そして、有機高分子物質と、前記有機高分子物質中に分散径１〜３０ｎｍで分散した磁性体とからなる磁性内包粒子であって、平均粒子径が５０〜３００ｎｍ、かつ、０．０１Ｎの塩化ナトリウム水溶液中で測定されるゼータ電位が−１０〜−５０ｍＶである磁性体内包粒子が開示されている（特許文献３）。この磁性体内包粒子に抗原又は抗体を結合させることによりイムノクロマトグラフィー法の標識に適用される。磁性を測定することにより判別するものと考えられる。
【０００８】
更に、酵素を用いて基質を発色させるイムノクロマトグラフィー法の測定方法が開示されている（特許文献４）。酵素を用いる方法としては、抗原抗体反応に関与する光源又は抗体を酵素にて修飾し、その酵素を用いた酵素反応による基質変化を色調変化として検出する方法がある。この方法は検出対象である被検物質の量が微量であっても高精度に測定可能である。採用される酵素としてはアルカリフォスファターゼが汎用されている。アルカリフォスファターゼを用いた定量方法に適用できる発色反応としてはブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）からなる基質とニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）からなる発色剤との反応が汎用されている。アルカリフォスファターゼの量に応じて沈殿色素が生成する量も変化するため、反応により生成する沈殿色素を定量することにより、アルカリフォスファターゼの存在量が定量できる。
【特許文献１】特許２９５５４０５号公報（請求項１など）
【特許文献２】特開２００７−３１５８８３号公報（請求項１など）
【特許文献３】特開２００６−１４５２５６号公報（請求項１など）
【特許文献４】特開平１０−３００７５０号公報（請求項１など）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１〜３の技術では定性的な判断が為されているだけであり定量が困難であること、特許文献４の技術ではＣＣＤカメラを用いて得られた２次元画像を解析することにより色調変化を解析しており機器が複雑になるばかりか解析も煩雑であることなどの問題がある。
【００１０】
また、イムノクロマトグラフィー法は反応液が浸透（移動）しながら反応するため、固相担体を平均化することが困難であり、沈殿色素を検出する際のバックグランドが高くなってＳＮ比が低くなり、十分な測定精度の確保が困難になる。
【００１１】
本発明は上記実情に鑑みなされたものであり、ＢＣＩＰ及びＮＢＴを組み合わせたイムノクロマトグラフィー法においてＳＮ比を向上させて高精度に定量できる光学的定量装置を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決する請求項２に係る本発明の光学的定量装置の特徴は、請求項１において、前記ＬＥＤの発光波長は５００ｎｍ以上５４０ｎｍ以下であることにある。
【００１３】
上記課題を解決する請求項３に係る本発明の光学的定量装置の特徴は、請求項２において、前記ＬＥＤの発光波長は５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５１７ｎｍ，５１８ｎｍ、５２２ｎｍ又は５２３ｎｍであることにある。
【発明の効果】
【００１４】
上記のように構成した請求項１に係る光学的定量装置においては、ＢＣＩＰ及びＮＢＴの反応により生成する沈殿色素が特異的に吸収する波長の範囲を検討・発見すると共に、その波長の光を選択的に放出できるＬＥＤを組み合わせることにより、高い精度でその沈殿色素の定量ができる。ＬＥＤが放射する光はほぼ単波長であるため、沈殿色素が特異的に吸収することができる波長の光を選択的に照射可能であり、余分な波長の光を照射することによるノイズの発生が抑制できる。特に、請求項２に規定する波長範囲を採用することにより沈殿色素の定量精度が向上できる。更には請求項３に規定するように、市販されているＬＥＤの波長を採用することで容易に高いＳＮ比での測定が実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明の光学的定量装置について実施形態に基づき詳細に説明する。本実施形態の光学的定量装置は、ＢＣＩＰを基質としＮＢＴを発色剤とする反応により生成する沈殿色素の量を光学的に定量するための装置である。ＢＣＩＰ及びＮＢＴは標識酵素としてアルカリフォスファターゼを採用した反応系に対して組み合わせる。ＰＣＢなどの被検物質に応じて採用される抗体又は抗原に対してアルカリフォスファターゼにて修飾を行い、固相担体上に固定した後、被検物質を含む処理液を流し、抗原抗体反応を進行させる。その後、ＢＣＩＰがアルカリフォスファターゼの基質として作用し、ＮＢＴが発色剤として作用する。具体的な呈色反応としてはＢＣＩＰがアルカリフォスファターゼにより加水分解されて中間体が生成し、この中間体とＮＢＴとが反応することで中間体が二量化する。この二量体は青〜紫色の沈殿物を生じる。以下、生成した沈殿物（沈殿した色素）を沈殿色素と称する。この沈殿色素はニトロセルロース膜やナイロン膜などの上に付着させることができ、それらの上に沈殿色素として沈殿した状態で測定する。
【００１６】
本実施形態の光学的定量装置は光学的に沈殿色素の量を測定する装置である。沈殿色素にＬＥＤが発光する光を照射し、その反射光の大きさを測定することにより定量する。沈殿色素が沈殿した場所とその周辺の沈殿色素が沈殿していない場所とにおけるそれぞれの反射光を測定・比較したり、照射した光と反射光とを測定・比較することにより、光が吸収された量が算出できる。このように、ＬＥＤが発光する光を沈殿色素に照射し、その反射光を測定するための光学系をもつ。例えば、外部からの光を遮断した暗箱を形成し、その中に被測定対象である試料を配置できるようにし、レンズなどを単独又は組み合わせて形成した光学系を採用することができる。
【００１７】
ＬＥＤの発光波長は４７０ｎｍ超５７３ｎｍ未満である。特に５００ｎｍ以上５４０ｎｍ以下であることが望ましく、発光波長は５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５１７ｎｍ、５１８ｎｍ、５２２ｎｍ、又は５２３ｎｍであることがより望ましい。なお、発光波長にはある程度の幅があるため、本明細書における「発光波長」はそのＬＥＤのスペクトルのピーク位置（発光強度が一番高い位置）にて特定する。ＬＥＤの発光波長はそのＬＥＤを構成する半導体が形成するｐｎ結合のバンドギャップによって決まる。バンドギャップの大きさは半導体を構成する材料の種類及び添加する不純物の種類・量によって制御できる。半導体を構成する材料としてはリン化ガリウム（ＧａＰ）、インジウム窒化ガリウム／窒化ガリウム／アルミニウム窒化ガリウム（ＩｎＧａＮ／ＧａＮ／ＡｌＧａＮ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）、アルミニウムインジウムガリウムリン（ＡｌＧａＩｎＰ）、ガリウムヒ素リン（ＧａＡｓＰ）が例示できる。
【００１８】
光センサとしては採用されたＬＥＤの発光波長において感度を有するものであり、光強度に応じた出力信号を取り出すことが可能なセンサである。光センサを例示すると、フォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＭＯＳセンサ、光電子増倍管、ＣｄＳなどのフォトレジスタがある。また、ＣＣＤやＣＭＯＳなどを採用したエリアセンサやラインセンサ、フォトダイオードアレイなどの形態を採用することもできる。
【００１９】
換算手段は光センサからの出力信号に基づき沈殿色素の量に対応する値を導出する手段である。出力信号をＡＤ変換器によりデジタルデータにした後に演算により沈殿色素の量を算出する方法が挙げられる。
【００２０】
具体的な測定方法としては沈殿色素が付着することが想定される測定部位の反射光の強度とそれ以外の沈殿色素が付着することが想定されない対照部位の反射光とを測定し、対照部位の反射光の強度をバックグラウンドとして測定部位の反射光の強度を算出した後、予め作成した検量線に基づいて沈殿色素の量を算出する手法が例示できる。また、沈殿色素が付着している部位とその近傍の対照部位について連続的に反射光の強度を測定した上でピーク強度を算出することもできる。更に、対照部位の反射光を測定することなく、測定部位における反射光を測定することのみで沈殿色素の量を定量することもできる。
【実施例１】
【００２１】
以下、実施例に基づき本発明の光学的定量装置について詳細に説明する。なお、本実施例にて用いている図面は模式図であり、説明の都合上、その縮尺、各部材の大きさの比などは現実の大きさを反映していない部分があり、また、各部材の形状は一部省略して記載している部分がある。図１に示すように、本実施例の光学的定量装置１は、ＬＥＤ１０と光学系２０（照射用レンズ２１及び集光用レンズ２２）とフォトダイオード３０と制御手段４０とを有し、試験試料片９０上に付着した沈殿色素９１の量を定量する装置である。ＬＥＤ１０から照射される光を照射用レンズ２１により集光して試験試料片９０に付着する沈殿色素９１に照射する。沈殿色素９１からの反射光を集光用レンズ２２にて集光し、フォトダイオード３０に集光する。制御手段４０はＬＥＤ１０の発光の制御を行うＬＥＤ制御手段と、フォトダイオード３０が検出した光の強度の測定を行う測定手段と、その測定手段により測定した測定値から沈殿色素９１の量に対応する値を導出する換算手段とをもつ。試験試料片９０は沈殿色素９１が照射用レンズ２１及び集光用レンズ２２の焦点に位置するように配置する。本光学的定量装置１は、沈殿色素９１に隣接する対照部位９２及び９３についても測定を行う。換算手段は沈殿色素９１における反射光の強度と対照部位９２及び９３における反射光の強度とから沈殿色素９１の量に対応する値を算出する。
【００２２】
本実施例ではこの装置を用いて沈殿色素９１が付着した試験試料片９０の表面を１２ｍｍの長さで連続的に測定した。試験試料片９０は２つ用意した（試料１及び２）。この試験試料片９０上には線状に沈殿した沈殿色素９１が測定方向に並列して２箇所（間隔は５ｍｍ強、測定開始部位から４ｍｍ程度（Ａ）と９ｍｍ程度（Ｂ））付着しており、その並列方向に連続して１２ｍｍの長さの測定を行った。ＬＥＤ１０の発光波長として，青色（品番：E1L53-3B0A2-02、豊田合成製、ドミナント発光波長が４６５ｎｍ〜４７０ｎｍ）、緑色（品番：UG5305S、スタンレー電気製、ピーク発光波長が５１７ｎｍ）、黄色（品番：NSPY500S、日亜化学製、ドミナント発光波長が５７３ｎｍ〜５７７ｎｍ）、赤色（品番：NSPR510CS、日亜化学製、ドミナント発光波長が６１５ｎｍ〜６３５ｎｍ）の４種類を採用して試験を行った。ここで、 ピーク発光波長とは、ＬＥＤが放出する光の中で最も出力の高い波長を表し、 ドミナント発光波長とは、発光するＬＥＤの光を人間の目で見た色目をそのまま数値化した波長を表す。
【００２３】
実際の測定結果を図２（試料１）及び図３（試料２）に、沈殿色素９１の部分と対照部位９２及び９３とにおける反射光の強度から求めた沈殿色素の光線吸収の程度を表１に示す。図２及び３ではＬＥＤの各発光波長毎にバックグラウンドの程度が同程度になるように所定の係数を乗じている。表１においては、バックグラウンドの値（ＢＧ）からピークの値（Ｐ）を引いたピーク強度の値（ＢＧ−Ｐ）が大きいほどＳＮ比が高くなる。なお、表１におけるバックグラウンドの値はピークを除いたバックグラウンドと思われる近似線を作成し、その近似線におけるピークの先端部に相当する位置（長さ方向において相当する位置）の値をバックグラウンドとした。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１、図２及び３より明らかなように、試料１及び２のそれぞれにおける沈殿色素Ａ及びＢの何れにおいてもＢＧ−Ｐの値が大きい方から緑色（発光波長５１７ｎｍ）、青色、黄色、赤色の順となり、この順でＳＮ比が優れていることが明らかになった。特に５１７ｎｍの発光波長（緑色）を採用すると、青色の場合と比較して２割程度ピーク強度が大きくなっている。緑色の結果は、黄色、赤色の結果と比較しても３割（黄色）、３〜４割（赤色）となっており、青色、黄色、赤色の間における相互比較した結果は１〜２割程度の差があるのみで５１７ｎｍ（緑色）を中心として突出したピーク強度を示すことが明らかになった。また、青色や黄色よりも緑色の波長に近い、５１７ｎｍを中心に±２０ｎｍ、±５ｎｍ程度の幅でも高いピーク強度が得られるものと考えられる。
【００２６】
ここで、ＢＣＩＰ及びＮＢＴの反応前後における吸光度の変化を測定した。反応前の単なる混合物について吸光度を測定した結果を図４に、反応させた後の沈殿色素について吸光度を測定した結果を図５にそれぞれ示す。図４及び５の比較から、反応により５００ｎｍ〜７００ｎｍの間における吸光度が上昇していることが明らかになった。特に、５８０ｎｍ程度にピークを有することが分かった。この結果について前述のＳＮ比の結果と照合すると、吸光度が大きい波長に発光波長をもつ黄色のＬＥＤよりもピークの裾部分に発光波長をもつ緑色のＬＥＤのＳＮ比が高いことになり、緑色のＬＥＤには、吸光度の大きさ以外にＳＮ比向上に及ぼす要因があることが明らかになった。これは沈殿色素の量を反射光により定量していることに起因しているものと推測される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例における光学的定量装置の概略図である。
【図２】実施例における試料１の試験結果を示す図である。
【図３】実施例における試料２の試験結果を示す図である。
【図４】ＢＣＩＰとＮＢＴとの混合物の可視光吸収スペクトルを示す図である。
【図５】ＢＣＩＰとＮＢＴとの反応物（沈殿色素）の可視光吸収スペクトルを示す図である。
【符号の説明】
【００２８】
１…光学的定量装置
１０…ＬＥＤ    ２０…光学系（２１：照射用レンズ、２２：集光用レンズ）    ３０…フォトダイオード（光センサ）    ４０…制御手段（換算手段を含む）
９０…試験試料片    ９１…沈殿色素    ９２、９３…対照部位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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