(57)【要約】      （修正有）【課題】多成分遺伝子免疫原の一部としてｖｉｆ（ビリオン感染性因子）補助遺伝子を含む、安全で有効な遺伝子抗ＨＩＶワクチンを設計する方法を提供する。【解決手段】単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体であって、特定の配列：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび他の特定の配列：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の７５％が保存されており、天然の病原体を破壊することができるＶｉｆ−特異性の体液性および／または細胞性の免疫応答性を誘導することができ、そして野生型Ｖｉｆと比較してビリオン活性が存在しないか又は減じられている、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体。【選択図】図１
2010001290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体であって、配列ＩＤ番号：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび配列ＩＤ番号：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の７５％が保存されており、天然の病原体を破壊することができるＶｉｆ−特異性の体液性および／または細胞性の免疫応答性を誘導することができ、そして野生型Ｖｉｆと比較してビリオン活性が存在しないか又は減じられている、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は病原性遺伝子のための遺伝子ワクチンとしての弱毒化、非機能性ＨＩＶ ｖｉｆ免疫化カセットの製造および使用に関している。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種および免疫化とは一般的に、個体の免疫系に免疫応答を起こすことができ、病原体の攻撃に対しての防御に利用できるであろう非毒性作用剤の導入を意味している。免疫系は主として個体中に通常は存在しないタンパク質および他の大きな分子を同定することにより侵襲している”外来”組成物および作用剤を同定する。外来タンパク質とは、それに対して免疫応答が起こる標的を意味している。
【０００３】
免疫系は外来であると同定された標的を除去するための多数の手段を提供できる。これらの手段には抗原認識および除去に関与する体液性および細胞性応答が含まれる。手短に言えば、体液性応答には、抗原へ特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞が関係している。細胞性免疫応答には二つの武器がある。第一は、サイトカインを産生して免疫応答への別の免疫細胞の関与を惹起するヘルパーＴ細胞が関係している。第二は、抗原を認識でき、および抗原（抗原が結合されている細胞または粒子を含んで）を攻撃できる、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られているキラーＴ細胞が関係している。
【０００４】
ワクチン接種はいくつかのヒト病原体に対して保護を与えることに非常に貢献してきた。ウイルス、細菌および感染性真核生物体のような感染性病原性作用因子に対して個体を免疫化するための安全で有効なワクチンの研究において、今までいくつかの戦略が用いられてきた。各々の戦略は、免疫応答を惹起できる、病原体に関連する標的タンパク質を個体に投与することにより、病原体感染に対して個体を保護する目的を達成することをめざしている。従って、個体が感染性病原体で攻撃された場合、個体の免疫系は該タンパク質を認識でき、感染に対する有効な防御を準備できる。病原性タンパク質を提供するいくつかのワクチン戦略が存在し、それには非感染性またはより低い感染性作用剤の一部として、または非顕在性タンパク質組成物としてタンパク質を提供することが含まれる。
【０００５】
感染に対して免疫化するための一つの方法では死菌または不活性化ワクチンを使用して、個体の免疫系に病原性タンパク質を存在させる。そのようなワクチンにおいては、病原体は例えば、加熱または化学物質の様な手段を用いて殺されているかまたはさもなくば不活性化されている。個体内への殺されたまたは不活性化された病原体の投与は、非感染性型で個体の免疫系へ病原体を存在させ、それにより個体はそれに対する免疫応答を準備できる。殺されたまたは不活性化された病原体ワクチンは、病原体免疫原に対するＴヘルパーおよび体液性免疫応答を直接的に発生させることにより保護を行う。病原体は殺されているか、さもなくば不活性化されているため、感染の恐れはほとんどない。
【０００６】
病原体に対するワクチン接種の別の方法は、弱毒化ワクチンを提供することである。弱毒化ワクチンは本質的には弱められた感染性を示す、生きているワクチンである。弱毒化ワクチンはその子孫がもはや有害でなくなるまで許容宿主で病原体をいくつかの世代にわたって経過させることによりしばしば製造される。弱毒化ワクチンを用いると、限られた感染性を示す作用因子が病原体に対する免疫応答を惹起するのに用いられるであろう。あるレベルの感染性を維持することにより、弱毒化ワクチンは低レベルの感染を引き起こし、死菌または不活性化ワクチンよりも強い免疫応答を惹起することができる。例えば、ポリオウイルスおよび痘瘡ワクチンのような生きている弱毒化ワクチンは、宿主の非病原性的感染の間に保護的Ｔヘルパー、Ｔ細胞毒性および体液性免疫性を刺激する。
【０００７】
病原体に対して免疫化する別の手段は組換えワクチンによるものである。組換えワクチンには二つの型がある：一つは生じる作用因子を無毒にするために特定の遺伝子が欠損されている病原体である。本質的には、この型の組換えワクチンは設計により弱毒化されており、活性で無毒な感染性作用因子の投与を必要とし、それは宿主中で確立されると免疫応答を惹起するために使用される抗原を産生するようになる。組換えワクチンの第二の型は、標的抗原をコードする遺伝子材料が挿入されている感染性非毒性ベクターを用いている。この型の組換えワクチンは同様に活性で無毒な感染性作用因子の投与を必要とし、それは宿主中で確立されると免疫応答を惹起するために使用される抗原を産生するようになる。そのようなワクチンは本質的に感染性で無毒な作用因子を用いて病原体抗原を提供し、それはその後、抗病原体免疫応答のための標的として働くことができる。例えば、ワクチン接種のための発現系としてのワクチン開発は、より広いＴ細胞免疫応答を持つ感染性ワクチン接種戦略の安全性および開発を理論的に単純化した。
【０００８】
感染に対する免疫化の別の方法はサブユニットワクチンを使用する。サブユニットワクチンは一般的に病原体に由来する一つまたはそれ以上の単離されたタンパク質から成っている。これらのタンパク質は個体により免疫応答が準備されるであろう標的抗原として作用する。病原体により個体が感染された場合、個体免疫系が病原体を認識しおよびそれに対する防御を準備するように、サブユニットワクチンのために選択されたタンパク質は病原体により呈示される。サブユニットワクチンは全感染作用因子ではないので、感染性になることはできない。従って、それらは他の型のワクチンに付随する望ましくない有害な感染性の危険を持っていない。肝炎Ｂ表面抗原ワクチン（ＨＢｓＡｇ）のような組換えサブユニットワクチンは単一の抗原に対してより特異的な保護的Ｔヘルパーおよび体液性免疫応答を刺激することが報告されている。しかしながら、多様な病原体に対する広範囲の保護を刺激するためのこの技術の使用は確認されなければならない。
【０００９】
有効なワクチンの構築は、病原体の病理生物学および宿主免疫応答の特異性を含むいくつかの因子のため複雑化されている。最近、これらの相互作用における免疫成分を理解するための新規の道具が遺伝子免疫化またはＤＮＡワクチン接種の形で利用可能になってきた。Ｔａｎｇ，ｅｆａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５６，１５２；Ｆｙｎａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，１１４７８；Ｕｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９，１７４５；およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，４１５６。この方法の能力はＨＩＶ−１の構造的および酵素的遺伝子産物に対する広範囲な免疫応答を産生することにより示されており、ＨＩＶ−１のための可能な予防的ワクチン開発のための方法が概説されている。この方法はｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖならびにｅｎｖ／ｒｅｖをコードしている多遺伝子発現カセットおよび遺伝子およびアクセサリー遺伝子免疫原を利用している。研究は齧歯類および霊長類ではＨＩＶ−１構造およびエンベロープ遺伝子によりうまく免疫化できることを示している。Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，４１５６およびＷａｎｇ，ｅｔａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７９９。種々の病原体に対するＤＮＡ免疫原を使用するために広範囲に応用できる病原性遺伝子からの免疫原発現カセット構築のための遺伝子的戦略が必要とされている。
【００１０】
霊長類レンチウイルスゲノムは新規調節および補助タンパク質並びに構造的および酵素的機能を持つタンパク質をコードしている。調節遺伝子ｔａｔおよびｒｅｖ、および補助遺伝子ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｖｐｘはＨＩＶおよびＳＩＶを含む多くのレンチウイルスでよく保存されている。これらの遺伝子がよく保存されていることは、これらのタンパク質産物がインビボにおけるウイルス発病の中心的役割を果たしていることを暗示している。最初のインビトロ実験はｔａｔおよびｒｅｖはウイルス複製に必須であるが、一方、補助遺伝子は必須ではないと考えられたことを示しているようである。Ｃｕｌｌｅｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，４２３およびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９２，８，４１１。しかしながら、さらなる分析により補助遺伝子内の欠陥はインビトロ(Ｇａｂｕｄｚａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，６４８９およびＧｉｂｂｓ，ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９４，１０，３４３)およびインビボ（Ａｌｄｒｏｖａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９６，７０，１５０５）におけるウイルス複製の高度の障害または遅延を生じさせることを明らかにした。負の欠陥補助遺伝子がインビトロで報告されており、有効な宿主免疫応答の最終生成物であるようである。それ故、補助遺伝子は現在の所、ウイルス毒性の決定基であると考えられている。Ｔｒｏｎｏ，Ｃｅｌｌ，１９９５，８２，１８９。それらは二三の”ホットスポット”を含んでおり、および”逸脱”ウイルス変異体の生成を導く突然変異に対する感受性が多分低いので、ウイルス生活環における重要性が強調されている。加えて、これらの遺伝子のタンパク質産物はインビボで免疫原性である。群として、それらは可能な抗ウイルス免疫標的の２０パーセントである。Ａｍｅｉｓｅｎ，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ：ＡＩＤＳ，１９８９，５，５３３およびＬａｍｈａｒｎｅｄｉ−Ｃｈｅｒｒａｄｉ，ｅｔａｌ．，ＡＩＤＳ，１９９２，６，１２４９。それらの免疫原性および低い機能的変異原性を合わせると、補助遺伝子は将来の抗ウイルス免疫治療の設計における魅力的な要素である。しかしながら、ウイルス毒性決定基としての補助遺伝子タンパク質産物の役割のため、補助遺伝子免疫原の生成はウイルスワクチン設計に特異的免疫学的および病理学的複雑化を生じさせる。有力なアクセサリー遺伝子に基づいた遺伝子ワクチンは、ウイルス複製を促進させることなく天然のウイルス補助遺伝子産物に対する宿主免疫応答に受け入れ可能である必要がある。従って、主たるゴールは、多成分遺伝子免疫原の一部としてｖｉｆ（ビリオン感染性因子）補助遺伝子を含む、安全で有効な遺伝子抗ＨＩＶワクチンを設計することである。
【００１１】
ｖｉｆ遺伝子は一回スプライスされたｒｅｖ依存性５ｋｂ転写体からの２３ｋＤａ後期ウイルスタンパク質（ｖｉｆ）をコードしている。Ａｒｙａ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３，２２０９；Ｇａｒｒｅｔｔ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１６５３；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，１８３，６７７；およびＳｏｄｒｏｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３１，１５４９。ｖｉｆは単離されたＨＩＶ−１間で高度に保存されており、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ビスナウイルス、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのような他のレンチウイルスにも存在している。Ｍｙｅｒｓ，ｅｆａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．ＡＩＤＳ，１９９１およびＳｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，２０４，８６０。インビボｖｉｆ遺伝子変異の初期の分析は、ほとんどのｖｉｆ配列は無傷の読み枠であり、無傷のｖｉｆの存在は疾病状態とは相関しないことを示した。Ｓｏｖａ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，２５５７およびＷｉｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，２０３，４３。しかしながら、ＨＩＶ−１感染長期経過者からのｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子を含んでいる領域の配列分析はクローンの６４％における不活性化突然変異の存在を明らかにした。Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９５，６９，４２２８。ＨＩＶ−１感染患者は組換えｖｉｆタンパク質を認識する抗体を持っていることが示されており（Ｋａｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３１，１５５３；Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，３６，１４２；およびＷｉｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，ＡｌＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，１９９１，７，８６１）、該タンパク質が発現され、天然の感染の間に免疫原性であることを示唆している（Ｖｏｌｓｋｙ，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１９３，１５７）。
【００１２】
トランスでウイルス複製を活性化するｖｉｆの能力のため、毒性ウイルス、細菌または寄生虫成分から誘導されたワクチンの製造に利用されている設計と類似の弱毒化遺伝子ワクチン設計が本発明で用いられた。ＨＩＶ−１感染患者に由来するｖｉｆ遺伝子中に潜在的に存在する配列変異および免疫原性が分析された。プロトタイプ遺伝子変異が選択され、体液性および細胞性免疫応答を誘導するクローンの能力が動物で研究された。選択されたｖｉｆ遺伝子変異はまた、ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１クローンで感染された細胞を利用するトランス相補性アッセイにより機能的に特徴付けられた。弱毒化、非機能性ｖｉｆクローンは天然の病原体を破壊できる免疫応答を誘導することが示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，１０８，９２１号
【特許文献２】米国特許第５，５９３，９７２号
【特許文献３】米国特許第５，５８９，４６６号
【特許文献４】米国特許第４，９４５，０５０号
【特許文献５】米国特許第５，０３６，００６号
【特許文献６】ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１１０９２
【特許文献７】ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／１７７０６
【特許文献８】ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／２３５５２
【特許文献９】ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／１６７３７
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔａｎｇ，ｅｆ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５６，１５２
【非特許文献２】Ｆｙｎａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，１１４７８
【非特許文献３】Ｕｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９，１７４５
【非特許文献４】Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，４１５６
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７９９
【非特許文献６】Ｃｕｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，４２３
【非特許文献７】Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９２，８，４１１
【非特許文献８】Ｇａｂｕｄｚａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，６４８９
【非特許文献９】Ｇｉｂｂｓ，ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９４，１０，３４３
【非特許文献１０】Ａｌｄｒｏｖａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９６，７０，１５０５
【非特許文献１１】Ｔｒｏｎｏ，Ｃｅｌｌ，１９９５，８２，１８９
【非特許文献１２】Ａｍｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ：ＡＩＤＳ，１９８９，５，５３３
【非特許文献１３】Ｌａｍｈａｒｎｅｄｉ−Ｃｈｅｒｒａｄｉ，ｅｔａｌ．，ＡＩＤＳ，１９９２，６，１２４９
【非特許文献１４】Ａｒｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３，２２０９
【非特許文献１５】Ｇａｒｒｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１６５３
【非特許文献１６】Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，１８３，６７７
【非特許文献１７】Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３１，１５４９
【非特許文献１８】Ｍｙｅｒｓ，ｅｆ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．ＡＩＤＳ，１９９１
【非特許文献１９】Ｓｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，２０４，８６０
【非特許文献２０】Ｓｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，２５５７
【非特許文献２１】Ｗｉｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，２０３，４３
【非特許文献２２】Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９５，６９，４２２８
【非特許文献２３】Ｋａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３１，１５５３
【非特許文献２４】Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，３６，１４２
【非特許文献２５】Ｗｉｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，ＡｌＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，１９９１，７，８６１
【非特許文献２６】Ｖｏｌｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１９３，１５７
【非特許文献２７】Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２，２８１７
【非特許文献２８】Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３４，４４４
【非特許文献２９】Ｍｅｙｅｒｈａｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，９０１
【非特許文献３０】Ｐｉｒｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６，６２９
【非特許文献３１】Ｒｅｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８８，５４，５７
【非特許文献３２】Ｗｏｌｆｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，１８５，１９５
【非特許文献３３】Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，，ＡＩＤＳ，１９９５，９（Ｓｕｐｐｌ Ａ），Ｓ１５９
【非特許文献３４】Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８，７０４
【非特許文献３５】Ｌａｍｈａｍｅｄｉ−Ｃｈｅｒｒａｄｉ，ｅｔａｌ．，ＡＩＤＳ，１９９２，６，１２４９
【非特許文献３６】Ｂｏｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，２０５８
【非特許文献３７】Ｓａｋａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，１６６３
【非特許文献３８】Ｖｏｎ Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，４９４５
【非特許文献３９】Ｂｌａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，ｌ９３，１８６−１９２
【非特許文献４０】Ｈｅｖｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１９９４，３３，２６９
【非特許文献４１】Ｖｅｌｐａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，５７１
【非特許文献４２】Ｎａｇａｓｈｕｎｍｕｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，３５３
【非特許文献４３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
【非特許文献４４】Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【非特許文献４５】Ｖｅｌｐａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９０，２９，２９１
【非特許文献４６】Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８７，５２，７１−８２
【非特許文献４７】Ｒａｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１３，２７７−２８４
【非特許文献４８】Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，２１４，６４７
【非特許文献４９】Ｃｈａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３４０９
【非特許文献５０】Ｏｂｅｒｓｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，１９９２，６，９５
【非特許文献５１】Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．ＡＩＤＳ，１９８８
【非特許文献５２】Ｇｕｙ，ｅｌ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１３２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は精製され、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質に関している。
本発明は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むｖｉｆタンパク質に関している。
【００１６】
本発明は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる単離された核酸分子に関している。
本発明は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子に関している。
【００１７】
本発明は配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、配列ＩＤ番号：４３，配列ＩＤ番号：４４、配列ＩＤ番号：４５および配列ＩＤ番号：４６から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子に関している。
【００１８】
本発明は医薬として受容可能な担体または希釈剤中に、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいる医薬組成物に関している。
本発明は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子を含む組換え発現ベクターに関している。
本発明は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいる組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関している。
【００１９】
本発明は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質に方向付けられた精製抗体に関している。
本発明は哺乳類に弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を該哺乳類の細胞に投与することをから成る、ウイルスに対して哺乳類を免疫化する方法に関しており、ここで該核酸分子は該細胞中で発現される。
発明の詳細な説明
ＡＩＤＳ研究の一つの主要なゴールはＨＩＶ−１ウイルスに対するワクチンを開発することである。有効なワクチンは強い体液性応答に加えて、有効で広範囲のＣＴＬ応答を惹起しなければならない。このことはＨＩＶ−１ウイルスの遺伝子異質性のため面倒なことである。ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）は間違いを起こしがちであり、および校正する能力が欠如しており、ゲノム当たり、サイクル当たりで１０-4の突然変異率を示している。Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２，２８１７。ＨＩＶ−１ゲノム配列変異が、異なった個体から単離されたウイルス並びに異なった時間点で単一の個体から単離されたウイルスで観察されている。Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３４，４４４およびＭｅｙｅｒｈａｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，９０１。多数の配列分析データに基づくと、中和抗体および／またはＣＴＬエピトープを変化させることにより患者における逸脱変異体ウイルスを導く突然変異の主たる標的は構造遺伝子ｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌであることは明らかである。Ｐｉｒｃｈｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６，６２９；Ｒｅｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８８，５４，５７；およびＷｏｌｆｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，１８５，１９５。このことにもかかわらず、初期の実験はＨＩＶ−１の構造および酵素遺伝子は異なった動物モデルにおける核酸に基づいたワクチンとして成功裡に使用できることを示しており（Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，４１５６；およびＷａｎｇ，ｅｔａｌ．，，ＡＩＤＳ，１９９５，９（Ｓｕｐｐｌ Ａ），Ｓ１５９）、ＤＮＡワクチンのための予防的並びに治療的研究が開始された。本発明は免疫原カセットとしてのｖｉｆ（ＨＩＶ−１補助遺伝子）の開発に関している。他のＨＩＶ−１遺伝子と併せて使用した場合、すべてのウイルス成分に対する広範囲な免疫応答が誘導され、生きている弱毒化ワクチンにより誘導される免疫応答の多くの様相を模倣している。
【００２０】
本発明において、注射されたＤＮＡ濃度および追加免役された回数に直接的に相関して、マウスにおけるｖｉｆ特異的体液性および細胞性免疫応答の誘導が観察されている。類似の結果がＴ細胞およびＣＴＬアッセイで観察されており、ｖｉｆ遺伝子はインビボにおいて免疫原性であることを示している。ｖｉｆは可溶性および膜結合形の両方で存在することが知られている。Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８，７０４。抗ｖｉｆ抗体およびｖｉｆ特異的ＣＴＬ応答がＨＩＶ−１陽性患者で示されているが、免疫系へのｖｉｆの提示に関与するエピトープは未だに決定されていない。Ｌａｍｈａｍｅｄｉ−Ｃｈｅｒｒａｄｉ，ｅｔａｌ．，ＡＩＤＳ，１９９２，６，１２４９。これらの研究ではどのようにしてｖｉｆが体液性免疫系に暴露されるようになるのかは不明瞭である。本発明のクローンにおいて観察された異なった免疫応答は、Ｔ−３５、Ｎ−１５およびｐＣＶｉｆでの突然変異は抗体／ＣＴＬ応答の変化に関連するであろうことを示唆している。すべてのＴまたはＮ誘導クローンに存在する点突然変異のいくつかは、これらの突然変異が観察された相補性および／または免疫応答の相違に関係することを示していることに注目するのは重要である。ｖｉｆのさらなる突然変異分析は相補性に関連する領域の答えを解明することを助けている。ｖｉｆ活性の提案された部位にはウイルスＤＮＡ合成、ｇｐ１２０合成および輸送およびｇａｇプロセッシングが含まれている。Ｂｏｒｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，２０５８；Ｓａｋａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，１６６３；およびＶｏｎ Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，４９４５。ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１プロウイルスおよび野生型ＨＩＶ−１ｖｉｆ発現細胞株のトランス相補性実験は、ｖｉｆがウイルス複製／成熟の後期段階で作用していることおよびｖｉｆトランス相補性がＨＩＶ−１株を通して起こっていることを示している。Ｂｌａｎｃ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，ｌ９３，１８６およびＨｅｖｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１９９４，３３，２６９。初期の実験は非伝播患者（ＮＩ）からの血清はエンベロープタンパク質および非複製ウイルスに対する高い抗体力価を含んでいるが、一方、伝播患者（ＴＩ）からの血清はエンベロープタンパク質および高度に複製しているウイルスに対して非常に低い抗体力価を含んでいることを示している。Ｖｅｌｐａｎｄｉ，ｅｔａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，５７１。これらの結果は本発明で観察されたトランス相補性の結果と相関している。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】ｖｉｆクローンの発現 ｖｉｆ発現レベルを評価するために、各々の群からの５クローンに対してインビトロ転写／翻訳が実施された結果を示す。
【図３】５０かまたは１００μｇのｖｉｆ ＤＮＡが注射された４匹のマウスからの血清について、ｖｉｆタンパク質への特異的反応性をＥＬＩＳＡ測定により示す。
【図４】ｖｉｆＤＮＡ免疫化および自然のマウスからの脾臓細胞による特異的標的溶解を示す。
【図５】図５（Ａ−Ｄ）は、ＣＴＬアッセイの結果を示している。ｖｉｆ特異的溶解を示す各々のＤＮＡ構築物を注射したマウスから脾臓細胞が得られた。クローンＴ−３５、Ｎ−１５およびｐＣＶｉｆは５０：１のエフェクター：標的比で各々２７、２６および２４％溶解を示した。２５：１の比では３つすべてのクローンが２０％溶解を示した。このことは、天然のＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答はｖｉｆ発現ベクターによる遺伝子ワクチン接種により発生できることを示している。
【図６】図６は、異なったｖｉｆ構築物の増殖指数に対するＤＮＡ注射濃度を示している。結果はＭＨＣクラスＩＩ依存性Ｔh（ヘルパー）細胞応答は用量依存性であることを示している。各々の構築物について、刺激指数は５０μｇのｖｉｆＤＮＡを注射したマウスより１００μｇのｖｉｆＤＮＡを注射したマウスの方がほとんど２倍高かった。３つの異なったｖｉｆ構築物の比較もまた、各々の注射濃度で、クローンＴ−３５はＮ−１５またはｐＣＶｉｆよりも高い刺激指数を誘導することを示している。
【図７Ａ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７Ｂ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７Ｃ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７Ｄ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７Ｅ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７Ｆ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の好適な核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｂ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の好適な核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｃ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の好適な核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｄ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の好適な核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｅ】弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の好適な核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる単離された核酸分子に関している。本明細書で使用される場合、用語”弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質”とは野生型ｖｉｆと比較してビリオン感染機能がないかまたは弱められているｖｉｆタンパク質を示していることを意味している。本発明のいくつかの実施態様において、核酸分子は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしており、ここでヌクレオチド配列は欠失、付加、点突然変異、多置換またはより短いタンパク質にするための停止コドンの導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、本発明の単離された核酸分子は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むｖｉｆタンパク質をコードしている。本発明の別の好適な態様において、単離された核酸分子はｖｉｆタンパク質をコードしており、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、配列ＩＤ番号：４３，配列ＩＤ番号：４４、配列ＩＤ番号：４５および配列ＩＤ番号：４６から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる。
【００２３】
本発明の核酸分子は下記の実施例のようにヒト免疫不全ウイルスで感染された患者から得られるであろう。もしくは、本発明の核酸分子は野生型ｖｉｆヌクレオチド配列を使用して調製されるであろう。ｖｉｆ発現プラスミドｐＣＶｉｆは、Ｎａｇａｓｈｕｎｍｕｇａｍ，ｅｔａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，３５３（本明細書において援用される）に記載されているような主鎖プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期プロモーターの調節下にあるよく特徴付けられたＨＩＶ−１分子クローンからのｖｉｆ遺伝子、ｐＨＸＢ２、を含んでいる。この核酸分子は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている追加の核酸分子を製造するために使用されるであろう。
【００２４】
野生型核酸分子の特異的突然変異を設計するために多くの方法が使用でき、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子が製造される。例えば、オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発は通常、その配列が既知であるＤＮＡセグメント中の付加、欠失または置換に使用される。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ページ１５．５１から１５．７３（本明細書において援用される）から知ることができる。手短に言えば、オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発のためのプロトコールは以下の工程を含んでいる：１）バクテリオファージＭ１３ベクター内への、ｃＰＶｉｆ発現プラスミドからのｖｉｆヌクレオチド配列のような適当なＤＮＡ断片のクローニング；２）組換えバクテリオファージＭ１３からの一本鎖ＤＮＡの調製；３）突然変異誘発オリゴヌクレオチドの設計および合成；４）標的ＤＮＡへの突然変異誘発オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション：５）ＤＮＡポリメラーゼによるハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの伸張；６）感受性細菌のトランスフェクション；７）所望の突然変異を運んでいるバクテリオファージプラークのスクリーニング；８）突然変異した組換えバクテリオファージからの一本鎖ＤＮＡの調製；９）突然変異した組換えバクテリオファージＭ１３ＤＮＡが所望の突然変異を運んでおり、他の突然変異を持っていないことを配列決定により確認；１０）組換えバクテリオファージＭ１３からの二本鎖複製可能形からの突然変異したＤＮＡ断片の回収；および１１)突然変異した断片と所望の発現ベクター中の野生型ＤＮＡの対応するセグメントの置換。
【００２５】
ｖｉｆをコードしている核酸分子中の、所望の突然変異へ仕立てられる突然変異誘発オリゴヌクレオチドの設計および合成は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ページ１５．５４から１５．５６（本明細書において援用される）に詳述されている。例えば、野生型ｖｉｆヌクレオチド配列内で一つのヌクレオチドを置換、付加または欠失させるには、中央にまたは中央のすぐ３’側の二つのヌクレオチド位の一つに不適正を持つ約１７−１９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが製造される。野生型ｖｉｆヌクレオチド配列内で二つまたはそれ以上の連続したヌクレオチドを置換、付加または欠失させるには、２５またはそれ以上のヌクレオチド長を持つオリゴヌクレオチドが製造される。これらのオリゴヌクレオチドは、付加されたまたは置換されたヌクレオチドを含んでいる中心ループ外領域の両側に約１２から１５の完全一致ヌクレオチドを含んでいるか、またはループ外である野生型ＤＮＡの一部を意味している。上記のような方法を用い、当業者は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードし、欠失、付加、置換または未熟な停止コドンを持っている核酸分子を製造できる。オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発法は当業者には広く知られている。
【００２６】
もしくは、本発明の核酸分子は標準ＤＮＡ方法論によるＤＮＡ合成機を用いて製造できる。当業者は、遺伝子コードは縮重されているので同一のタンパク質をコードしている多数のＤＮＡ配列が製造できることを容易に理解しているであろう。加えて、当業者はアミノ酸は保存的置換ができるように他のアミノ酸に置換できることを容易に理解しているであろう。従って、当業者は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の核酸分子を製造できる。
【００２７】
弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている本発明の好適な核酸分子は表１のアミノ酸（ａ．ａ）およびヌクレオチド配列（ｎ．ｔ．）（特定の配列ＩＤ番号により示されている）を持っている。特別のアミノ酸配列は図１および図７Ａ−７Ｆに示されている。特別のヌクレオチド配列は図８Ａ−８Ｅに示されている。
【００２８】
【表１】
2010001290.tif 000003
【００２９】
本発明はまた弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むベクターまたは組換え発現ベクターにも関している。本明細書で使用される場合、”組換え発現ベクター”とは、適当な宿主に導入された場合、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているコード配列の発現を指示するのに必要な遺伝子要素を含んでいる。本発明のいくつかの態様において、ベクターまたは組換え発現ベクターは弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしており、ここでヌクレオチド配列は欠失、付加、点突然変異、多置換またはより短いタンパク質にするための停止コドンの導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、本発明のベクターまたは組換え発現ベクターは、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むｖｉｆタンパク質をコードしている。本発明の別の好適な態様において、本発明のベクターまたは組換え発現ベクターは、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、配列ＩＤ番号：４３，配列ＩＤ番号：４４、配列ＩＤ番号：４５および配列ＩＤ番号：４６から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいる。
【００３０】
当業者は標準技術および容易に入手可能な出発材料を用いて、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子を単離でき、発現ベクター内へ挿入できる。コード配列は必要な調節配列へ作動可能なように連結される。発現ベクターはよく知られており容易に入手可能である。発現ベクターの例にはプラスミド、ファージ、ウイルスベクターおよび他の核酸分子または宿主細胞を形質転換し、コード配列の発現を容易にするために有用な媒介体を含んでいる核酸分子が含まれる。本発明の組換え発現ベクターは弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質を発現する宿主を形質転換するために有用である。
【００３１】
本発明はまた弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含んでいる宿主細胞にも関している。本発明のいくつかの態様において、宿主細胞は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているベクターまたは組換え発現ベクターを含んでおり、ここでヌクレオチド配列は欠失、付加、点突然変異、多置換またはより短いタンパク質にするための停止コドンの導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、宿主細胞は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいるｖｉｆタンパク質をコードしているベクターまたは組換え発現ベクターを含んでいる。本発明の別の好適な態様において、該宿主細胞は配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、配列ＩＤ番号：４３，配列ＩＤ番号：４４、配列ＩＤ番号：４５および配列ＩＤ番号：４６から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むベクターを含んでいる。タンパク質生産のために既知の組換え発現系で使用する宿主細胞はよく知られており、容易に入手可能である。
【００３２】
もっとも普通に使用される原核生物系は大腸菌であるが、枯草菌およびシュードモナスもまた有用である。原核生物系に適した調節配列はｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター、ラムダファージＰ１プロモーターを含む構成性および誘導可能プロモーターの両方が含まれる。一般に、異種タンパク質は融合または成熟タンパク質としてこれらの宿主中で産生されるであろう。所望の配列が成熟タンパク質として産生された場合、産生された配列にはメチオニンが前に付いているであろうが、それは取り除く必要はない。従って、本明細書で請求されるペプチドおよびタンパク質は細菌中で製造された場合、Ｎ−末端Ｍｅｔが先立っているであろう。さらに、タンパク質の分泌を生じさせる作動可能なシグナルペプチドがペプチドのコード配列に先立っている構築物が作製されるであろう。この様式で原核生物宿主において産生される場合、シグナル配列は分泌により除去される。原核生物宿主細胞には大腸菌のような細菌細胞およびＳ．セレビジエのような酵母細胞が含まれる。
【００３３】
広範囲な真核生物宿主もまた、組換え異種タンパク質の生産に現在利用可能である。細菌におけるように、真核生物宿主は所望のタンパク質を産生する発現系で直接的に形質転換されるが、より普通にタンパク質の分泌を達成するためにシグナル配列が提供される。真核生物系は、より高等な生物体のタンパク質をコードしているゲノム配列中に見いだされるであろうイントロンを処理することができるという更なる利点を持っている。真核生物系はまた、例えば、グリコシル化、カルボキシ末端アミド化、ある種のアミノ酸残基の酸化または誘導体化、コンホメーション調節などを生じる種々のプロセッシング機構も提供する。通常使用される真核生物系には酵母、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞および高等植物の細胞が含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明の好適な態様において、Ｓ．フルギペルダのような昆虫細胞、非ヒト哺乳類組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒーラー細胞のようなヒト組織培養細胞が宿主細胞として使用される。適したプロモーターは入手可能であり、それらは宿主型の各々ならびに終止配列およびエンハンサーと一致しておりおよび作動可能である、例えば、バキュウロウイルスポリへドロンプロモーター。前記のように、プロモーターは構成的でも誘導可能でもよい。例えば哺乳類系において、マウスメタロチオネインプロモーターは重金属イオンの添加により誘導できる。
【００３４】
いくつかの態様において、例えば、当業者はよく知られた技術を用いて、よく知られた発現系で使用するため、市販品として入手可能な発現ベクター内へＤＮＡ分子を挿入することができる。例えば、市販品として入手可能なプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）が大腸菌における弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質の生産に使用される。例えば、市販品として入手可能なプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）は酵母のＳ．セレビジエ株においての生産に使用される。例えば、市販品として入手可能なＭＡＸＢＡＣTM完全バキュウロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は昆虫細胞においての生産に使用される。例えば、市販品として入手可能なｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）はチャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳類細胞においての生産に使用される。当業者はルーチン技術および容易に入手可能な出発材料を用い、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質を生産するためにこれらの市販の発現ベクターおよび系またはその他を使用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（本明細書において援用される）を参照されたい。
【００３５】
当業者は他の市販品として入手可能な発現ベクターおよび系を使用してもよいし、よく知られた方法および容易に入手可能な出発材料を使用してベクターを製造してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、および好適にはエンハンサーのような必須の調節配列を含んでいる発現系は容易に入手可能であり、種々の宿主について本分野では知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。
【００３６】
遺伝子構築物の例では、構築物がトランスフェクトされる細胞株で機能的であるプロモーターへ作動可能に連結された弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質コード配列が含まれている。構成的プロモーターの例にはサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０からのプロモーターが含まれる。誘導可能プロモーターの例にはマウス乳房白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが含まれる。当業者は容易に入手可能な出発材料から、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているＤＮＡによる細胞のトランスフェクションに有用な遺伝子構築物を容易に製造できる。そのような遺伝子構築物は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質の製造に有用である。
【００３７】
弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子は、組換えウイルス発現ベクターまたは他の適した送達手段のような種々の送達要素の一つを用いて、適合宿主細胞でのそれらの導入および発現に影響するように細胞内へ送達される。一般に、ウイルスベクターは組換えアデノウイルスおよび組換えワクシニアウイルスのようなＤＮＡウイルス、または組換えレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスであろう。他の組換えベクターには細胞に感染でき、組換え遺伝子を発現できる組換え原核生物が含まれる。組換えベクターに加えて、リポソームでのカプセル化、トランスフェリン仲介トランスフェクションおよび他のレセプター仲介手段のような他の送達手段も企図される。本発明は、等価な機能で働くおよびこれに関して続いて本分野で知られるようになる、発現ベクターのそのような他の形および他の適した送達手段を含んでいるつもりである。
【００３８】
本発明の好適な態様において、ＤＮＡはアデノウイルス法により適格性宿主細胞へ送達される。当業者はそのような手段により宿主細胞へＤＮＡを送達するこの技術を容易に理解するであろう。本発明では好適にはアデノウイルスが含まれているが、本発明は等価な機能で働く任意のウイルスを含んでいるつもりである。
【００３９】
本発明の別の好適な態様において、ＲＮＡはレトロウイルスの手段により適格性宿主細胞へ送達される。当業者はそのような手段により宿主細胞へＲＮＡを送達するこの技術を容易に理解するであろう。ＲＮＡによりコードされているタンパク質を発現させるのに働く任意のレトロウイルスが本発明に含まれていることが意図されている。
【００４０】
本発明の別の好適な態様において、核酸は葉酸レセプター法により送達される。宿主細胞へ送達されるべき核酸配列はポリリジンへ結合され、複合体は葉酸レセプター法により腫瘍細胞へ送達される。１９９２年４月２８日に公開された米国特許第５，１０８，９２１号（本明細書において援用される）はそのような送達構成要素を記載している。
【００４１】
本発明はまた精製され、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質にも関している。本発明のｖｉｆタンパク質は野生型ｖｉｆタンパク質と比較して弱毒化されおよ非機能的であるペプチドを生産するために欠失、付加、点突然変異、多置換または停止コドン導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、本発明の弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいる。本発明の別の好適な態様において、本発明の弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいる。本発明のｖｉｆタンパク質は前記のように、容易に入手可能な出発材料を使用したルーチン法により製造されるであろう。
【００４２】
望ましい宿主に適した発現系構築の詳細は当業者には既知であり、前に説明されている。タンパク質の組換え生産のためには、それをコードしているＤＮＡは適切に選択された発現ベクター内へ結合されており、適合宿主を形質転換するために使用され、続いて異種遺伝子の発現が起こる条件下で培養および維持する。そのようにして産生された本発明のタンパク質は、当業者に理解されおよび知られているように細胞を溶解することによりまたは培養培地から回収される。当業者は、よく知られた技術を使用して、そのような発現系を用いて生成された弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質を単離できる。弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた天然の供給源から弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質を精製する方法は、組換えＤＮＡ方法論により生成された弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質の精製に等しく応用できるであろう。
【００４３】
組換え技術によりこれらのタンパク質を製造することに加え、自動化アミノ酸合成機もまたｖｐｒタンパク質を製造するために使用されるであろう。もし本明細書のタンパク質が合成的に作製されるならば、遺伝子によりコードされていないアミノ酸による置換もまた行われることにさらに注目されたい。代替残基には、例えば、式Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ（式中、ｎは２−６である）のωアミノ酸が含まれる。サルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）およびノルロイシン（Ｎｌｕｅ）のような中性、非極性アミノ酸が存在している。例えば、フェニルグリシンはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅと置換できる、芳香族中性アミノ酸；シトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）は極性であるが中性であり、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）は中性および非極性であり、システイン酸（Ｃｙａ）は酸性であり、およびオルニチン（Ｏｒｎ）は塩基性である。もしこれらの一つまたはそれ以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）で置換されているならば、コンホメーション授与プロリン残基特性が得られるであろう。
【００４４】
本発明に従った医薬組成物は弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質かまたはそれをコードしている本発明の核酸分子と組み合わされた医薬として受容可能な担体を含んでいる。本発明の好適な態様において、医薬組成物は配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０，配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２および配列ＩＤ番号：２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいるｖｉｆタンパク質をコードしている組換え発現ベクターを含んでいる。
【００４５】
本発明の別の好適な態様において、医薬組成物は配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、配列ＩＤ番号：４３，配列ＩＤ番号：４４、配列ＩＤ番号：４５および配列ＩＤ番号：４６から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むｖｉｆタンパク質をコードしている核酸配列を含んでいる。医薬処方はよく知られており、本発明の化合物を含んでいる医薬組成物は当業者により日常的に処方されるであろう。適した医薬担体はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ａ．Ｏｓｏｌ（この分野での標準参考本、本明細書において全文が援用される）に記載されている。
【００４６】
本発明はまた、医薬として受容可能な担体および本発明の化合物を含む注射可能な医薬組成物にも関している。本発明の化合物は好適に滅菌され、滅菌医薬担体と混合される。いくつかの態様において、例えば、本発明の化合物は医薬として受容可能な賦形剤とともに溶液、懸濁液、乳剤または凍結乾燥粉末として処方できる。そのような賦形剤の例は水、塩溶液、リンガー液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび固定油のような非水賦形剤もまた使用されるであろう。賦形剤または凍結乾燥粉末はその等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、緩衝液および保存剤）を維持する添加物を含んでいる。処方は通常使用される技術により滅菌される。
【００４７】
注射可能な組成物は、例えば、滅菌水、電解質／デキストロース、野菜起源の脂肪油、脂肪エステル、またはプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのようなポリオールのような希釈剤中に本発明の化合物を含んでいる。注射可能物は無菌で発熱性物質なしでなければならない。
【００４８】
局所投与のための処方には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、座薬、スプレー、液剤および散剤が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉体または油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましいであろう。経口投与のための組成物には散剤または顆粒剤、水性または非水媒質の懸濁剤または液剤、カプセル、サシェまたは錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散剤または結合剤が望ましい。非経口、鞘内または脳室内投与のための組成物には、緩衝剤、希釈剤および他の適した添加物を含んでいるであろう無菌水性溶液が含まれる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、活性成分が哺乳類体内の薬剤作用部位へ到達することを可能にする任意の手段により投与される。本発明の医薬組成物は局所または全身的処置が望ましいか、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投与される。投与は局所（眼、膣、直腸、鼻孔内、経皮を含む）、経口または非経口であろう。非経口投与には点滴静注、皮下、腹腔内または筋肉内注射、肺投与（例えば、吸入または吹送による）または鞘内または脳室内投与投与が含まれる。
【００５０】
用量は特定の薬剤の薬力学的特性および投与様式および経路；受容者の年齢、健康状態および体重；徴候の性質および程度、同時に行っている処置、処置の頻度および望まれる結果の様な既知の因子に依存して変化する。治療組成物の処方およびその後の投与は当業者の範囲内であると思われる。
【００５１】
本発明に従うと、本発明のｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいる医薬組成物は個体内へ直接投与されるか、または生体外で個体の取り除かれた細胞へ送達され、それは投与後に再移植される。どちらの経路にせよ、遺伝子材料が個体の体内に存在する細胞内へ導入される。好適な投与経路には筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注射が含まれる。もしくは、医薬組成物は個体から取り除かれた細胞内へ種々の手段により導入されるであろう。そのような手段には、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび微小弾丸衝撃法が含まれる。核酸分子が細胞により取り込まれた後、それらは個体内へ再移植される。
【００５２】
本発明のこの態様に従った医薬組成物は約０．１から約１０００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、医薬組成物は約１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、医薬組成物は約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。最も好適には、医薬組成物は約１００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。
【００５３】
本発明のこの態様に従った医薬組成物は、使用されるべき投与様式に従って処方される。当業者は本発明のｖｉｆタンパク質をコードしている核酸分子を容易に処方できる。投与様式に筋肉内注射が選択された場合、等張処方が使用される。一般に、等張性のための添加物には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含ませることができる。リン酸緩衝液のような等張溶液を使用してもよい。安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
【００５４】
ＤＮＡに基づいた医薬品は新世代のワクチンとして発展している。ＤＮＡ治療剤は典型的には、特定の病原体または望まれない細胞からの一つまたはそれ以上の遺伝子を含む一つまたはそれ以上のＤＮＡワクチンを含んでいるプラスミドである。注射されると、ＤＮＡワクチンのコード配列が患者またはワクチン接種者でタンパク質産物として発現され、タンパク質産物に対する免疫応答が誘導される。本発明での使用に適用できるＤＮＡ送達のためのプロトコールの例はＷｅｉｎｅｒにより１９９７年１月１４日に公開された米国特許第５，５９３，９７２号、Ｆｅｌｇｎｅｒらにより１９９６年１２月１４日に公開された米国特許第５，５８９，４６６号、Ｓａｎｆｏｒｄらにより１９９０年７月３１日に公開された米国特許第４，９４５，０５０号、Ｓａｎｆｏｒｄらにより１９９１年７月３０日に公開された米国特許第５，０３６，００６号、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１１０９２、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／１７７０６、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／２３５５２およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／１６７３７（これらは）各々本明細書において援用される）に記載されている。
【００５５】
本発明の好適な態様において、弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子を含む医薬組成物が、ｖｉｆタンパク質への体液性および／または細胞性免疫応答を誘導するために前記の方法により哺乳類へ投与される。本発明の別の態様において、本発明の医薬組成物は追加の化合物と同時投与できる。そのような追加の化合物には、例えば、異なったウイルスタンパク質または異なったウイルスタンパク質をコードしている異なった核酸分子が含まれる。異なったウイルスタンパク質には、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｔａｔなどが含まれる。そのような惹起免疫応答はＨＩＶまたは関連する動物ウイルスに対して保護的である。
【００５６】
本発明はまた弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質に向けられた抗体にも関している。本明細書で使用される場合、用語”抗体”とは完全で無傷な抗体およびそれらのＦａｂおよびＦ（ａｂ）2断片を意味している。完全で無傷な抗体にはマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体のようなモノクローナル抗体が含まれる。いくつかの態様において、該抗体はｖｉｆまたは弱毒化された非機能性ｖｉｆのエピトープへ特異的に結合する。エピトープに結合した抗体は、アフィニティークロマトグラフィーのようなよく知られた技術を用いる、天然の供給源または組換え発現系の両方からのタンパク質の単離および精製に有用である。そのような抗体は、試料中のそのようなタンパク質の存在の検出および細胞がそのタンパク質を発現しているかどうかの決定に有用である。
【００５７】
ｖｉｆタンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマおよび抗体それ自身は、ｖｉｆおよび弱毒化された非機能性ｖｉｆおよびｖｉｆまたは弱毒化された非機能性ｖｉｆを含むタンパク質複合体の単離および精製に有用である。加えて、抗体はｖｉｆ活性の特異的阻害剤であろう。ｖｉｆまたは弱毒化された非機能性ｖｉｆに特異的に結合する抗体はよく知られた技術および容易に利用可能な出発材料を用いて、天然起源のタンパク質を精製するために使用される。そのような抗体はまた、組換えＤＮＡ方法論によりタンパク質を製造した場合に存在する材料からタンパク質を精製するためにも使用される。
【００５８】
抗体の製造および完全で無傷な抗体、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片のタンパク質構造、およびそのような分子をコードしている遺伝子配列の構成はよく知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書において援用される）に記載されている。手短に言えば、例えば、ｖｉｆまたは弱毒化された非機能性ｖｉｆまたはそれらの免疫原性断片をマウスに注射する。マウスの脾臓を取り除き、脾臓細胞を単離し、不死化マウス細胞と融合させる。ハイブリッド細胞（またはハイブリドーマ）を培養し、抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、もしｖｉｆまたは弱毒化された非機能性ｖｉｆに特異的に結合することが観察されたら、それらを産生するハイブリドーマを培養し、抗体の持続的供給を行う。
【００５９】
本発明はさらに以下の実施例により例示されるが、それらはいかなる点でも制限的であることは意図されていない。本出願で引用されたすべての参考文献は全文が援用される。
【実施例】
【００６０】
実施例１：患者 一人のＨＩＶ−１陽性伝播母親（Ｔ１）および一人のＨＩＶ−１陽性非伝播母親（Ｎ１）からのウイルスが本発明で使用された。患者の３番目の３半期の間に得られた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）はＭｏｔｈｅｒＩｎｆａｎｔ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙ，Ｖｉｒａｌ ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙＢｒａｎｃｈ，ＮＣＩ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）により提供された。伝播状態を決定するため、患者およびその子についての追跡試験が実施された。
【００６１】
実施例２：ＨＩＶ−１単離 感染一次リンパ球は、ＰＨＡ刺激正常供与者リンパ球と２週間一緒に培養された。ウイルス産生は１）細胞内ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）のレベルを測定することにより（Ｖｅｌｐａｎｄｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９０，２９，２９１；本明細書において援用される）および２）ｐ２４抗原キット（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；使用説明書に従って使用された）を用いて培地内に放出されたＨＩＶ−１ｐ２４抗原量を測定することによりモニターした。
実施例３：ＤＮＡ調製およびＰＣＲ増幅 高分子量（ゲノム）ＤＮＡは感染ＰＢＬから調製され、Ｖｅｌｐａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９０，２９，２９１（本明細書において援用される）に記載されているようなＰＣＲ技術により増幅された。手短に言えば、ＰＣＲ混合物は５から１０μｇのゲノムＤＮＡ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．５単位Ｔａｑポリメラーゼ、２０ｐｍｏｌオリゴヌクレオチドプライマーおよび二重脱イオン水（ｄｄＨ2Ｏ）（最終容量を１００μｌとする）を含んでいる。反応温度およびサイクル時間は以下のようである：９４℃−変性（１分）、５５℃−アニーリング（１．５分）および７２℃−伸張（２分）。サイクルは３５回繰り返された。プライマー配列は以下のようである：Ｖｉｆ（＋）５’−ＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧ−３’（５０４６−５０６５）（配列ＩＤ番号：２）；およびＶｉｆ（−）５’−ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＣＴＣ−３’（５６０９−５６２６）（配列ＩＤ番号：３）。クローニング目的のためプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ボールド体）が設けられた。
【００６２】
実施例４：クローニングおよび配列決定 ＰＣＲ増幅生成物はＶｅｌｐａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，５７１（本明細書において援用される）に記載されているようにクローニングに使用された。ｖｉｆ遺伝子について陽性なプラスミドＤＮＡは少量調製（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）により精製され、挿入物の配列決定の準備として分光学的に定量された。配列決定反応はＡＢＴ自動化シークエンサーおよびＤｙｅＤｅｏｘｙ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施された。
【００６３】
実施例５：配列分析 配列アラインメントはペンシルバニア大学ＶＡＸシステムのＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙを通して得たＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアーパッケージを用いて構築された。アミノ酸のホモロジー比較は配列アラインメントプログラムにより実施された。
【００６４】
実施例６：ｖｉｆ欠損プロウイルスの構築 ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ、ｐＺｒ６がＮａｇａｓｈｕｎｍｕｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，３５３（本明細書において援用される）に記載されているようなｖｉｆ欠損突然変異体の構築に使用された。得られたプロウイルスクローン、ｐ９１１は、３’読み枠に影響しないｖｉｆ遺伝子中の８０アミノ酸欠損を含んでいた。手短に言えば、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡｐＺｒ６はＳｒｉｎｉｖａｓａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８７，５２，７１−８２（本明細書において全文が援用される）に記載されているようにＨＩＶZr6に感染した一次血液リンパ球から誘導された。ｐ９１１を調製するためにｐＺｒ６内へ欠損が導入された。突然変異は上流ｐｏｌ遺伝子または下流ｖｐｒ遺伝子を妨害しないように構築された。プラスミドｐＺｒ６はｖｉｆ遺伝子のヌクレオチド位４７６および７１６に二つのＮｄｅＩ部位を含んでいる。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８７，５２，７１−８２。ＮｄｅＩ断片（４７７−７１６）がｐＺｒ６から欠損され、末端は再結合されてｐ９１１（ｖｉｆタンパク質の中心領域に欠損した８０アミノ酸を持つ読み枠内突然変異体）が構築された。
【００６５】
実施例７：ｖｉｆ発現ベクターの構築 ｖｉｆ発現プラスミド、ｐＣＶｉｆは、Ｎａｇａｓｈｕｎｍｕｇａｒｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，３５３（本明細書において援用される）に記載されているように、主鎖プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期プロモーターの制御下にある、よく特徴付けられたＨＩＶ−１分子クローン、ｐＨＸＢ２からのｖｉｆ遺伝子を含んでいる。母親の試料からのｖｉｆ遺伝子はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ発現ベクター、ｐＣＤＮＡ３内へクローン化され、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。ｖｉｆ読み枠は順プライマーＴ７、および逆プライマーＳＰ６を使用する配列分析により確認された。手短に言えば、ｖｉｆ発現ベクター（ｐＣＶｉｆ）を構築するため、ｐＨｘＢ２からのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ１．１ｋｂ断片（地図座標５，６４７−５，７４２；Ｒａｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１３，２７７−２８４、本明細書において全文が援用される）はサイトメガロウイルス即時早期プロモーターの制御下でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られたプラスミドｐＣＤＮＡ３内へクローン化された。この断片はまたｐｏｌおよびｖｐｒ遺伝子の一部からの隣接配列も含んでいるが、Ｂｌａｎｃら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９３，１８６−１９２）により類似の構築物で示されたように、転写的に活性ではない。
【００６６】
実施例８：ｖｉｆのインビトロ翻訳 １μｇのｖｉｆ発現構築物に対するインビトロ転写および翻訳がＴ７ＲＮＡポリメラーゼを製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の説明書に従って使用することにより実施された。５μｌのインビトロ翻訳反応生成物を５００μｌのラジオイムノ沈殿アッセイ緩衝液と混合し、説明されているように（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，２１４，６４７）ウサギ抗ｖｉｆ抗血清で免疫沈殿された。
【００６７】
実施例９：細胞 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られた横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンおよび１％Ｌ−グルタミンを補給したダルベッコ改良イーグル培地中、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下にて単層で増殖させた。ＡＴＣＣから得られたリンパ球様細胞株は１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＬ−グルタミン（５４０μｇ／ｍｌ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下にて懸濁培養物として維持された。フィトヘマグルチニン刺激（１０）μｇ／ｍｌ）ＰＢＬは１０％Ｔ細胞増殖因子を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で維持された。
【００６８】
実施例１０：ｖｉｆ構築物によるマウスの免疫化 マウスでの免疫化実験のためには、３つの異なったｖｉｆ構築物が使用された。選択されたｖｉｆクローンはＴ−３５（伝播者から）、Ｎ−１５（非伝播者から）およびｐＣＶｉｆ（ＨＩＶ−１SF-2のｖｉｆ遺伝子）であった。ｐＣＤＮＡ３ベクターＤＮＡは陰性対照として使用された。ＤＮＡ取り込みを促進させるため、ＤＮＡ注射の４８時間前、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿四頭筋に１００μｌの０．２５％ブピバカインが注射された。４匹の各々に１００μｌの最終容量で、５０または１００μｇの各々のｖｉｆ発現プラスミドが注射された。動物は２週間間隔で３回追加免役した。
【００６９】
実施例１１：ｒｖｉｆタンパク質へのマウス血清のＥＬＩＳＡ結合 マウス血清に対するＥＬＩＳＡはＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ，１９９５，９（ＳｕｐｐｌＡ），Ｓ１５９に説明されているように実施された。手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレートは結合アッセイのため、１００ｎｇ／ウェルの濃度で組換えｖｉｆ（ｒｖｉｆ）タンパク質で被覆された。マウス血清はブロッキング緩衝液で希釈し（１：１００および１：５００）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された抗マウスＩｇＧでタグを付け、ＴＭＢｌｕｅ基質で検出した。非特異的結合および出血前血清結合はＤＮＡ注射動物血清の特異的結合から差し引かれた。
【００７０】
実施例１２：ワクシニア発現ｖｉｆを用いるＣＴＬアッセイ ＤＮＡ注射マウスは最初の免疫化の７週後に殺し、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７９９に説明されているようなＣＴＬおよびＴ細胞増殖アッセイのために脾臓を除去した。手短に言えば、ｖｉｆ発現ワクシニア（ＶＶ：ｇａｇＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＰｒｏｇｒａｍにより親切にも提供された）で感染させたＰ８１５細胞が標的細胞として使用された。１ｘ１０6／ｍｌの標的細胞に１０μＣｉのＮａ2ＣｒＯ4（5lＣｒ，５３４ｍＣｉ／ｍｇ，Ｄｕｐｏｎｔ Ｃｏ．）を加え、その後室温で２時間インキュベートした。細胞を無血清培地で３回洗浄し、１ｘ１０5細胞／ｍｌの容量までＲＰＭＩ１６４０／１０％ ウシ血清で希釈した。エフェクター脾臓細胞は１回洗浄し、再懸濁して１ｘ１０7細胞／ｍｌＲＰＭＩ培地の濃度まで希釈した。この貯蔵細胞溶液から１：２の連続希釈液が作製された（５ｘ１０6、２．５ｘ１０6および１．２５ｘ１０6細胞／ｍｌ）。これらのエフェクター細胞溶液の１００μｌを９６ウェルマイクロタイター平底プレート内へ加えた。各々のウェルに１００μｌの標的細胞溶液を加えた。生じるエフェクター−標的細胞比は１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１であった。自発的および最大クロム放出を決定するため、標的細胞は各々１００μｌの培地のみまたは１％トリトン−Ｘと混合された。エフェクターおよび標的細胞は５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で５時間インキュベートされた。各々のウェルから上清液１００μｌを採り、ガンマカウンターで放出された５１Ｃｒ量が測定された。特異的ＣＴＬ放出計算のための式は以下のようである：１００ｘ［（実験での放出−自発的放出）／最大放出−自発的放出］。注：最大放出は１％トリトンＸ−１００中での標的細胞の溶解により決定された。
【００７１】
実施例１３：臨床ＨＩＶ−１単離物を用いたＣＴＬアッセイ マウスＭＨＣ−Ｉを発現しているヒーラーＣＤ４＋細胞をＨＩＶ−１臨床単離物で感染させ、ＣＴＬアッセイにおける標的細胞として使用した。ＣＴＬアッセイはＣｈａｄａ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３４０９に説明されているように実施された。
【００７２】
実施例１４：Ｔ細胞増殖アッセイ アッセイは３重に実施された。脾臓細胞は前記のように単離され、ＲＰＭＩ１６４０に懸濁して３．３ｘ１０細胞／ｍｌの濃度まで希釈した。１５０μｌを９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各々のウェルにすぐに加えた。５０μｌのタンパク質またはペプチドを、１０．０、１．０または０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように各々のウェルへ加えた。細胞は５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で３日間インキュベートされた。１μＣｉのトリチウム化チミジンを各々のウェルへ加え、細胞は同一条件下で一夜インキュベートした。細胞を自動細胞ハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）で採取し、取り込まれたトリチウム化チミジン量をベータカウンターで測定した。細胞が健康であることを確認するため、陽性対照試料中、５ｍｇ／ｍｌのＰＨＡを非特異的刺激剤として使用した。
【００７３】
実施例１５：ｖｉｆ欠損プロウイルスＤＮＡと母親試料からのｖｉｆ遺伝子のトランス相補性Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのリポフェクチンを用いて、ＲＤ細胞（１ｘ１０6）を１０μｇのｖｉｆ欠損プロウイルスクローン（ｐ９１１）および１０μｇのｐＣＶｉｆまたは伝播または非伝播被験者からのｖｉｆ発現プラスミドで共トランスフェクトした。共トランスフェクトされた細胞は８時間インキュベート後に洗浄し、ＤＭＥＭ培地に再懸濁した。培養上清液を７２時間インキュベート後に集め、遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍフィルターを通過させ、ｐ２４生成をアッセイした（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ＰＢＭＣ（１ｘ１０7）を１００ｎｇのｐ２４抗原と等しいウイルス量で感染させた。ウイルスが接種された細胞は３７℃および５％ＣＯ2で４−６時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄して１０ｍｌの新鮮なＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。培地中へのｐ２４抗原放出量を測定することによりウイルス産生を定量するために、培養上清液の一部を３日毎に集めた。
【００７４】
実施例１６：患者から単離されたウイルスの特徴付け 本発明で取り扱われたＨＩＶ−１陽性伝播または非伝播母親はＡＩＤＳコホート研究から選択された。母親および非伝播母親は各々Ｔ１およびＮ１で示されている。被験者の臨床状態および単離されたウイルスの複製動力学は表２に示されている。インビトロ選択条件により修飾されていない野生型配列を得るために各々の被験者からの非培養リンパ球が使用された。ＰＢＭＣ共培養アッセイにおいて、Ｔ１ウイルス試料は正常供与者ＰＢＬで非常によく複製した；一方、Ｎ１ウイルス試料は一次リンパ球またはマクロファージの両方で複製しなかった。
【００７５】
【表２】
2010001290.tif 000004
【００７６】
実施例１７：インビボにおけるｖｉｆ遺伝子の配列変異 これらの被験者のｖｉｆ遺伝子の遺伝子変異性を調べるため、各々の被験者からの１０のクローンが配列決定され、相同性の程度に従ってコンピューターで並べられた。続いてヌクレオチド配列はタンパク質配列に翻訳された。すべてのヌクレオチド配列変化がアミノ酸配列変化を生じるわけではないので、演繹されたアミノ酸配列が最終比較で使用された。これらの患者からのアミノ酸配列を並べたものが図１に示されている。呼称”Ｔ”および”Ｎ”を持つクローン番号は各々伝播および非伝播母親から単離された変異体を意味している。配列アラインメントは各々の被験者はそのウイルスプール内に独特および高度に保存された配列の組を持っていることを明らかにした。ヌクレオチド変化のほとんどは、一般的にタンパク質配列内の置換（重複または挿入に対して）を生じる点突然変異であった。３つのクローンが弱毒化タンパク質をコードしていた。クロ−ンＴ−４２は未熟な停止コドンにより、３’末端に５アミノ酸欠損を持っていた。クローンＮ−１３は２つの停止コドン（３１および４１位）を持ち、およびＴ−４は単一の停止コドン（７７位）を持っていた；それらの各々は３つのヌクレオチドの組内に導入されており、読み枠は無傷なまま突然変異の３’に保っている。クローンの大多数（２０の内１７）は完全長配列をコードしているという事実は、これらの患者のウイルスプール内には欠損ｖｉｆ遺伝子はわずかしか存在しないことを示唆している。ｖｉｆ点突然変異のほとんどは３’領域というよりも遺伝子の５’位に存在していることは注目に値する。２０、２７、３１、３６、３７、４５、６０、７４、１２７、１３６、１４０および１５０位で著しい相違がクローン間で観察された。
【００７７】
インビボにおけるｖｉｆ遺伝子の性質および配列変異を決定するため、ＨＩＶ−１陽性被験者からの非培養ＰＢＭＣ中に存在するｖｉｆ配列をクローン化し、分析した。２人の被験者からの２０の異なったｖｉｆ配列（各々の被験者から１０）の分析は、ｖｉｆは特定の患者内では与えられた時間点で高度に保存されている（約９０％）ことを明らかにした。Ｗｉｅｌａｎｄらは（Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，２０３，４３）ｖｉｆ遺伝子の３’部分は高度に変異性であると報告しているけれども、本発明の結果は５’部分（ａａ２０−８５）がより変異的であり、および３’部分はよく保存されていることを示している。本明細書の結果を支持して、従来の突然変異誘発実験はｖｉｆのＣ末端（ａａ１７１から１９２）は膜とｖｉｆの安定な会合に必須であることが示されている。Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６６，７０４。我々が分析した２０の配列の中で、２つのクローンのみが未熟な停止コドンを持っていたことは、単離されたｖｉｆ遺伝子の９０％はインビボで無傷であることを示している。この結果ならびに以前に公表されたデータは完全なｖｉｆ遺伝子がインビボでのウイルス複製に必須であることを示唆している。Ｇａｂｕｄｚａ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，６４８９；およびＳｏｖａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，２５５７。
【００７８】
これらのクローンからの２０の演繹されたｖｉｆタンパク質配列は全長（１９２ａａ）で７５％の保存（２５％変異）を示した。特に、ＨＩＶ−１陽性血清により認識される（Ｗｉｅｌａｎｄ，ｅｔａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，１９９１，７，８６１）２つの抗原的ドメイン、ａａ８７−９４（ＩＥＷＲＫＫＲＹ）（配列ＩＤ番号：２４）およびａａ１７２−１７８（ＤＲＷＮＫＰＱ）（配列ＩＤ番号：２５）は２０すべてのクローンでよく保存されている。これら２つの領域のよく保存された性質は、これらのクローンにより示される交差抗原性特性に関係しているであろう。加えて、３４／３８レンチウイルスｖｉｆで保存されている配列、ＳＬＱＹＬＡ（１４４−１４９）（配列ＩＤ番号：２６）（Ｏｂｅｒｓｔｅ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，１９９２，６，９５）もまた本発明で配列決定された２０のｖｉｆクローンの各々で保存されている。従来の研究において、コンピューターアラインメント分析は、ｖｉｆのアミノ酸２１から３０、１０３から１１５および１４２から１５０はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ間で高度に保存されていることが示されている。Ｍｙｅｒｓ，ｅｔａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．ＡＩＤＳ，１９８８。しかしながら、本発明で分析されたクローンは一般的にａａ１０３−１１５およびａａ１４２−１５０内は保存された配列であったが，ａａ２１−３０はそうではなかった。ｖｉｆタンパク質は、Ｃｙｓ１１４が活性部位であり、およびＨｉｓ４８が活性に重要であると考えられているシステインプロテアーゼとして特徴付けられている。Ｇｕｙ，ｅｌａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１３２５。本発明の配列において、Ｃｙｓ１１４ならびにＣｙｓ１３３（ｖｉｆにおける唯一の別のシスチン）およびＨｉｓ４８はよく保存されていた。
【００７９】
進化系統樹分析（データは示されていない）は２０の患者クローン内に３つの主ファミリーを観察した。Ｎ由来クローンの９０％がファミリーを形成し、およびＴ由来クローンの８０％がファミリーを形成するが、一方、残りのクローンＮ−３０、Ｔ−３およびＴ−３８はよりたくさんの多様性を示し、別の群を形成する（データは示されていない）。距離比較が行われた場合、伝播クローン間の患者内変異は１２％であったのに対し、非伝播クローン間は１０％の変異であった。被験者の変異体クローンの類似性、および確立された実験室分子クローンＨＩＶSF-2、ＨＩＶNL43およびＨＩＶZr6もまた評価された。被験者単離物は、実験室維持ウイルス単離物よりもそれらの伝播状態群内の他のクローンとより高い程度の相同性を共有していた。それらの配列変異体に基づき、各々の患者から４つのクローンが予備的翻訳／免疫化実験に選択された（下記参照）。
【００８０】
進化系統樹分析はまた、患者内変異にもかかわらず、伝播および非伝播被験者からのクローンは別々に群れをなしていることも示している。８構築物の（各々の被験者から４）インビトロ転写／翻訳は、未熟な停止コドンを持つＮ−１３の場合を除いて、２３ＫＤａタンパク質の発現を生じた。このことはこれらのｖｉｆ構築物中に存在する種々の突然変異は発現動力学およびタンパク質の安定性には影響しないことを示唆している。
【００８１】
実施例１８：ｖｉｆクローンの発現 ｖｉｆ発現レベルを評価するために、各々の群からの５クローンに対してインビトロ転写／翻訳が実施された。結果は図２に示されている。インビトロ翻訳反応の生成物はｖｉｆ抗血清で免疫沈降され、ゲル電気泳動にかけられた。ｐＣＶｉｆ（ＨＩＶ−１株ＳＦ２からの完全長ｖｉｆ）およびｐ９１１（ｖｉｆ突然変異体）プロウイルスは各々陽性および陰性対照として使用された。ｐＣＶｉｆおよび完全長ｖｉｆ発現プラスミドによるインビトロ翻訳は２３ＫＤａタンパク質を生成する；一方、クローンｐ９１１およびＮ−１３は多分未熟な停止コドンの存在により、２３ｋＤａサイズのタンパク質生成物を生じない。各々の被験者群からの２つのクローンが、類似の血清学的特性に基づいて（データは示されていない）さらなる評価のため選択された。各々の群を代表するように選択された患者クローンはＴ−３５（伝播）およびＮ−１５（非伝播）であった。これらのクローンの各々はその特定の群に特徴的な突然変異を持っており、これらの群内の最も高いレベルの多様性を示す。クローンＮ−１５内の突然変異は完全長遺伝子を通して分散しているが、一方、クローンＴ−３５内の突然変異は遺伝子の５’末端に群をなしていることは注目に値する。
【００８２】
実施例１９：インビボでの体液性応答の誘導 特異的抗ｖｉｆ免疫応答はＴ−３５、Ｎ−１５およびｐＣＶｉｆ発現プラスミドで免役したマウスから集められた血清では明らかであったが、ｐｃＤＮＡ３ベクター単独で免疫されたマウスからの血清ではそうではなかった。免疫応答の誘導はＤＮＡ注射濃度ならびに追加免疫間の回数および時間間隔に相関していた。ＥＬＩＳＡで測定した場合、５０かまたは１００μｇのｖｉｆ ＤＮＡが注射された４匹のマウスからの血清はｖｉｆタンパク質への特異的反応性を持っていた（図３）。体液性応答誘導は容量−および時間依存性であった。５０μｇのＤＮＡ注射は一回目の注射の１５日後にＥＬＩＳＡで検出可能な免疫応答を誘導した。この応答は続いての追加免疫後に増加し、２回の追加免疫４５日後に最高レベルに到達した（パネルＡ）。１００μｇのＤＮＡ注射は、一回の注射わずか２８日後に最高レベルに到達した（パネルＢ）。加えて、抗体応答はＤＮＡの１回の追加免疫を行う３回の注射２１９日後でも上昇できる（データは示されていない）。抗体応答のレベルはｖｉｆクローン間で変化した。最も重要なことは、非伝播クローンＮ−１５は伝播クローンＴ−３８またはｐＣＶｉｆよりも高い血清学的応答を誘導する。このことは非伝播ｖｉｆは、マウスのこの株において、伝播ｖｉｆよりもより有効なＢ−Ｔヘルパー依存性応答を誘導できることを示唆している。
【００８３】
実施例２０：ワクシニア発現ｖｉｆを用いるインビボでの、細胞性応答の誘導 ｖｉｆ構築物の一つで各々免役した４匹のマウスに１回目の注射１５日後にさらなる追加免疫が与えられた。２匹のマウスがその後に殺され、その脾臓細胞は細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイに使用された。ｖｉｆ発現ワクシニアで感染させたｐ８１５細胞が標的細胞として使用された。ｖｉｆＤＮＡ免疫化および自然のマウスからの脾臓細胞による非特異的溶解は、標的細胞として非ｖｉｆ発現ワクシニアで感染させたｐ８１５細胞を使用して測定された。特異的標的溶解は図４に示されている。特異的ＣＴＬ活性のレベルはｖｉｆ構築物間で変化した。クローンｐＣＶｉｆで免疫したマウスからの脾臓細胞は、１００：１のエフェクター：標的比で４５％の溶解を示した。クローンＴ−３５およびＮ−１５は同一の比で各々１７および１２％を示した。これらの結果は、ｖｉｆＤＮＡ免疫化は特異的ＣＴＬ応答を誘導していることを明らかに示している。ｖｉｆ遺伝子接種により誘導されたＣＴＬ活性レベルにおける種々の患者クローン間の相違は、ワクチン標的により発現されたＣＴＬエピトープ内の突然変異またはハロタイプの免疫応答性の相違によるものであろう。
実施例２１：臨床ＨＩＶ−１単離物で感染させたヒト標的を用いるインビトロでの細胞性応答の評価ウイルス感染標的の溶解を誘導するｖｉｆクローンの能力を評価するため、ＣＴＬアッセイの標的として、ＣＤ４レセプターおよびマウスクラスＩＨ−２Ｄd制限要素の両方を発現するＨＩＶ−１感染可能ヒーラーＣＤ４／Ｄd細胞が使用された。これらの細胞は７日間、症候性ＡＩＤＳの患者から誘導されたＨＩＶ−１単離物で感染させた。図５（Ａ−Ｄ）はＣＴＬアッセイの結果を示している。ｖｉｆ特異的溶解を示す各々のＤＮＡ構築物を注射したマウスから脾臓細胞が得られた。クローンＴ−３５、Ｎ−１５およびｐＣＶｉｆは５０：１のエフェクター：標的比で各々２７、２６および２４％溶解を示した。２５：１の比では３つすべてのクローンが２０％溶解を示した。このことは、天然のＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答はｖｉｆ発現ベクターによる遺伝子ワクチン接種により発生できることを示している。
【００８４】
実施例２２：抗原特異的Ｔ細胞増殖の誘導 ＨＩＶ−１ ｖｉｆタンパク質に対する特異的Ｔ細胞増殖応答もまたＤＮＡ免疫動物で研究された。ｖｉｆ免疫マウスからのリンパ球はｖｉｆタンパク質に対して著しい増殖応答を示した。図６は異なったｖｉｆ構築物の増殖指数に対するＤＮＡ注射濃度を示している。結果はＭＨＣクラスＩＩ依存性Ｔh（ヘルパー）細胞応答は用量依存性であることを示している。各々の構築物について、刺激指数は５０μｇのｖｉｆＤＮＡを注射したマウスより１００μｇのｖｉｆＤＮＡを注射したマウスの方がほとんど２倍高かった。３つの異なったｖｉｆ構築物の比較もまた、各々の注射濃度で、クローンＴ−３５はＮ−１５またはｐＣＶｉｆよりも高い刺激指数を誘導することを示している。
【００８５】
実施例２３：ｖｉｆ発現プラスミドによるＨＩＶ−１ｖｉｆプロウイルスのトランス相補性予期されるように、ＨＩＶ−１（ｖｉｆ−）プロウイルスＤＮＡおよびｖｉｆ発現プラスミドによるＲＤ細胞の過渡的トランスフェクションは、Ｔ−誘導、Ｎ−誘導または対照プラスミド間のウイルス産生の相違をよく調べられない（データは示されていない）。ｖｉｆ機能の相違は新しい感染のレベルで示されるであろう。しかしながら、レスキューウイルスが一次リンパ球を感染させるのに使用された場合、Ｔ−、Ｎ−誘導または対照プラスミド間に、ウイルス病因論に著しい相違が観察された（表３）。ｖｉｆ陰性プロウイルスクローン（ｐ９１１）単独では無細胞ウイルスのように一次ＰＢＬに感染することができなかった。トランス相補性ウイルス（ｐ９１１＋ｐＣＶｉｆ）がＰＢＬを感染させるのに使用された場合、感染力は野生型ウイルスの５分の１であった。対照的に、試験されたＴ−誘導クローンの各々は（ｖｉｆ−）突然変異を助けることができた（約１００％陽性ウイルス対照）。しかしながら、Ｎ−誘導クローンのどれも無細胞ウイルスのようにＰＢＬに効果的に感染できなかった。従って、Ｎ−１５および類似のＮ−誘導クローンは機能性が欠如したまま、マウスにおいて抗ＨＩＶ−１免疫応答を誘導できた。
【００８６】
【表３】
2010001290.tif 000005
【００８７】
ＲＤ細胞は１０μｇのｐＺｒ６、ｖｉｆ突然変異体ｐ９１１、ｐ９１１および異なった患者試料からのｖｉｆ発現プラスミドでトランスフェクトされた。ウイルスプールはトランスフェクション７２時間後に集められた上清から調製された。１００ｎｇのｐ２４抗原と等しい量のウイルスが１０ｘ１０6ＰＢＭＣを感染させるのに使用された。感染はｐ２４抗原産生によりモニターされた。
【００８８】
実施例２４：観察 Ｎ−誘導クローンは、ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１プロウイルスをトランス相補するその能力が弱められた。分析された一つのクローン，Ｎ−１５、もまた免疫学的に機能性であり、野生型ＨＩＶ−１ウイルスに対する免疫応答を発生することができる。本発明のＮ−１５のような非機能性であるがしかし免疫原性のクローンはＨＩＶ−１に対する遺伝子ワクチンの有効な成分であり得る。本発明において、ｖｉｆ単独でインビトロにおいて天然のＨＩＶ−１に対して有効な応答を発生できる。そのような免疫原は、天然のｖｉｆ発現ウイルスに対する免疫応答を標的とする治療セッティングに有用であろう。逸脱変異体が生じることはありそうなことであるが、この選択のために欠損ｖｉｆを発現しているウイルスはインビボで弱められた増殖動力学を示すであろう。同様の様式で、ｖｉｆを含む予防的ワクチンは、ウイルス逸脱を制限するために、および感染の初期の間にウイルスセットポイントを下げることに寄与するように働くことができるであろう。
【図３】
2010001290.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月3日(2009.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ２４，Ｎ２７，Ｎ２６，Ｎ１５，Ｎ１７，Ｎ２３，Ｎ２９，Ｎ１３，Ｎ２２，Ｔ３９，Ｔ４４，Ｔ４３，Ｔ３７，Ｔ４０，Ｔ３５，Ｔ４，Ｔ３，Ｔ３８及びＴ４２からなる群から選択される、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体。
【請求項２】
Ｎ２４，Ｎ２７，Ｎ２６，Ｎ１５，Ｎ１７，Ｎ２３，Ｎ２９，Ｎ１３，Ｎ２２，Ｔ３９，Ｔ４４，Ｔ４３，Ｔ３７，Ｔ４０，Ｔ３５，Ｔ４，Ｔ３，Ｔ３８及びＴ４２からなる群から選択される、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項２記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項２記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
Ｎ２４，Ｎ２７，Ｎ２６，Ｎ１５，Ｎ１７，Ｎ２３，Ｎ２９，Ｎ１３，Ｎ２２，Ｔ３９，Ｔ４４，Ｔ４３，Ｔ３７，Ｔ４０，Ｔ３５，Ｔ４，Ｔ３，Ｔ３８及びＴ４２からなる群から選択される、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体に対する精製された抗体。
【請求項６】
Ｎ２４，Ｎ２７，Ｎ２６，Ｎ１５，Ｎ１７，Ｎ２３，Ｎ２９，Ｎ１３，Ｎ２２，Ｔ３９，Ｔ４４，Ｔ４３，Ｔ３７，Ｔ４０，Ｔ３５，Ｔ４，Ｔ３，Ｔ３８及びＴ４２からなる群から選択される、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月7日(2009.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体の、免疫応答性を誘導するための医薬の製造における使用であって、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体が、配列ＩＤ番号：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび配列ＩＤ番号：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の９０％が保存されている、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体の使用。
【請求項２】
単離された核酸の、免疫応答性を誘導するための医薬の製造における使用であって、単離された核酸が、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体が、配列ＩＤ番号：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび配列ＩＤ番号：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の９０％が保存されている、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸の使用。
【請求項３】
請求項２記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターの、免疫応答性を誘導するための医薬の製造における使用。
【請求項４】
請求項２記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞の、免疫応答性を誘導するための医薬の製造における使用。
【請求項５】
弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体の存在を検出する方法であって、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質変異体を含む試料を、配列ＩＤ番号：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび配列ＩＤ番号：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の９０％が保存されている、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質に向けられた精製抗体に接触させることによる、検出方法。
【請求項６】
核酸がプラスミドである、請求項２記載の核酸分子の使用。
【請求項７】
非ヒト動物のウイルスに対する免役応答性を誘導する方法であって、
配列ＩＤ番号：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび配列ＩＤ番号：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の９０％が保存されている、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、非ヒト動物の細胞に投与すること
を含む方法。
【請求項８】
非ヒト動物のウイルスに対して免役する方法であって、
配列ＩＤ番号：１の８７−９４位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒおよび配列ＩＤ番号：１の１７２−１７８位：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎおよび図１のコンセンサス配列の３７位にアミノ酸残基：ＧｌｕまたはＬｙｓを含み、野生型Ｖｉｆ配列の９０％が保存されている、単離され、弱毒化された、非機能性ｖｉｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、非ヒト動物の細胞に投与すること
を含む方法。