(57)【要約】      （修正有）【課題】ｓｉＲＮＡの有効性を増大するためのキット、ｓｉＲＮＡおよび方法を提供する。【解決手段】少なくとも２つのｓｉＲＮＡ二重鎖のプールからなり、その各々が１つ以上の標的メッセンジャーＲＮＡの配列の一部に相補的である配列からなり、効率的な配列特異的遺伝子サイレンシングをおこなう。特に哺乳動物系において、ＲＮＡｉの有効性を増大する。【選択図】図１
2010187668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）二重鎖領域と、（ｂ）オーバーハング領域なしか、または少なくとも１個のオーバーハング領域とからなるｓｉＲＮＡ分子であって、
各オーバーハング領域は、６個またはそれ以下のヌクレオチドを含み、前記二重鎖領域は、センス領域と、アンチセンス領域からなり、該センス領域と、該アンチセンス領域が一緒になって前記二重鎖領域を形成し、該二重鎖領域は、１９〜３０塩基対の長さであり、そして前記アンチセンス領域は、配列番号  ３０４、配列番号  ３０１、配列番号  ３０３、配列番号  ３０７、配列番号  ３０９、配列番号  ３０２、配列番号  ３０５、配列番号  ３０６および配列番号  ３０８から選択される配列の補体である配列を含むことを特徴とする前記ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項２】
アンチセンス領域およびセンス領域が、各々１９〜２５塩基の長さである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
アンチセンス領域およびセンス領域が、各々１９塩基の長さである、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡ分子が、少なくとも１個のオーバーハング領域を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡ分子が、オーバーハング領域を有さない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡ分子が、２個のオーバーハング領域を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項７】
少なくとも２個のｓｉＲＮＡのプールであって、
該プールは、第１のｓｉＲＮＡと、第２のｓｉＲＮＡを含み、該第１のｓｉＲＮＡは、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子であり、前記第１のｓｉＲＮＡの二重鎖領域は、第１の二重鎖領域であり、前記第２のｓｉＲＮＡは、第２の二重鎖領域と、オーバーハング領域なしか、または少なくとも１個のオーバーハング領域とからなり、各オーバーハング領域は、６個またはそれ以下のヌクレオチドを含み、前記第２のｓｉＲＮＡの第２の二重鎖領域は、センス領域と、アンチセンス領域を含み、前記第２のｓｉＲＮＡの該センス領域と、該アンチセンス領域が一緒になって前記第２の二重鎖領域を形成し、該第２の二重鎖領域は、１９〜３０塩基対の長さであり、そして前記第２の二重鎖領域のアンチセンス領域は、配列番号  ３０４、配列番号  ３０１、配列番号  ３０３、配列番号  ３０７、配列番号  ３０９、配列番号  ３０２、配列番号  ３０５、配列番号  ３０６および配列番号  ３０８から選択される配列からなる群より選択される配列の補体である配列を含むことを特徴とする前記プール。
【請求項８】
第１の二重鎖領域および第２の二重鎖領域が、各々１９〜２５塩基対の長さである、請求項７に記載のプール。
【請求項９】
第１の二重鎖領域および第２の二重鎖領域が、各々１９塩基対の長さである、請求項８に記載のプール。
【請求項１０】
第１の二重鎖領域が、オーバーハング領域を有さない、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプール。
【請求項１１】
第２の二重鎖領域が、オーバーハング領域を有さない、請求項１０に記載のプール。
【請求項１２】
第１の二重鎖領域が、少なくとも１個のオーバーハング領域を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプール。
【請求項１３】
第２の二重鎖領域が、少なくとも１個のオーバーハング領域を有する、請求項１２に記載のプール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、その開示全体が本開示において参考として援用されている、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｒｉａｌ  Ｐｏｏｌｉｎｇ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ」と題された２００２年１１月１４日提出の米国仮出願番号６０／４２６，１３７号、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ」と題された２００３年９月１０日提出の米国仮出願番号６０／５０２，０５０号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）に関する。
【背景技術】
【０００３】
比較的最近、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）がタンパク質発現を阻害するために用いることができるということが研究者によって観察された。これが遺伝子をサイレンシングする能力は、ヒト疾患を処置するのに広範な能力を有しており、そして多くの研究者および業者が現在、この技術に基づく治療を開発するのにおいてかなりの原資を投資している。
【０００４】
二本鎖ＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングは、少なくとも３つの異なるレベルで生じ得る：（ｉ）ＲＮＡ誘導性のＤＮＡまたはヒストンのメチル化をいう、転写不活性化；（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ誘導性のｍＲＮＡ変性；そして（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ誘導性の転写減衰。
【０００５】
哺乳動物細胞におけるＲＮＡ誘導性サイレンシング（ＲＮＡ干渉、またはＲＮＡｉ）の主な機構はｍＲＮＡ変性であると一般に考えられている。哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを用いる最初の試みは、長鎖のｄｓＲＮＡの使用に対して集中していた。しかし、タンパク質合成の標的特異的な阻害とは対照的に、一般的に生じるインターフェロン応答の誘導に一部は起因して、ＲＮＡｉを誘導するこれらの試みの成功は限定されたものである。従って、長いｄｓＲＮＡは、哺乳動物系におけるＲＮＡｉのための実行可能な選択肢ではない。
【０００６】
さらに最近では、短い（１８〜３０ｂｐ）ＲＮＡ二本鎖が培養中の哺乳動物細胞に導入される場合、標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害は、インターフェロン応答を誘導することなく実現できることが示されている。特定のこれらの短いｄｓＲＮＡは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれ、モル未満の濃度で触媒的に作用して、細胞中の標的ｍＲＮＡの９５％より多くを切断し得る。ｓｉＲＮＡ活性の機構の詳細、およびその適用のいくつかは、Ｐｒｏｖｏｓｔら、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．，２００２  Ｎｏｖ．１；２１（２１）：５８６４〜５８７４；Ｔａｂａｒａら、Ｔｈｅ  ｄｓＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲＤＥ−４  Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＲＤＥ−１，ＤＣＲ−１およびＤｅｘＨ−ｂｏｘ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｔｏ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，Ｃｅｌｌ  ２００２，Ｊｕｎｅ  ２８；１０９（７）：８６１〜７１；Ｋｅｔｔｉｎｇら、Ｄｉｃｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｉｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｉＲＮＡｓ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ＲＮＡｉ，Ｃｅｌｌ  ２００２，Ｓｅｐｔ．６；１１０（５）：５６３；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ＆Ｚａｍｏｒｅ，Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｎ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ＲＮＡｉ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９７：２０５６に記載されている。
【０００７】
機構的な見通しから、植物および無脊椎動物細胞への長い二本鎖ＲＮＡの導入は、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される。Ｓｈａｒｐ，ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１，１５：４８５。ＤｉｃｅｒはリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であって、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする。Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｃａｕｄｙ，Ｈａｍｍｏｎｄ，＆Ｈａｎｎｏｎ，Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４０９：３６３。次いで、ｓｉＲＮＡをＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組みこみ、ここで１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる。Ｎｙｋａｎｅｎ，Ｈａｌｅｙ，＆Ｚａｍｏｒｅ，ＡＴＰ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ，Ｃｅｌｌ  ２００１，１０７：３０９。適切な標的ｍＲＮＡに結合する際、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼがサイレンシングを誘導する標的を切断する。Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，およびＴｕｓｃｈｌ，ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−ａｎｄ  ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００１，１５：１８８，図１。
【０００８】
この干渉効果は、長期にわたることが可能であり、そして多数の細胞分裂の後にも検出可能であり得る。さらに、ＲＮＡｉは、配列特異性を示す。Ｋｉｓｉｅｌｏｗ，Ｍら、（２００２）Ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｈｃＡ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６３：１〜５。従って、ＲＮＡｉ機構は１つの型の転写を特異的にノックダウンし得るが、密接に関連するｍＲＮＡには影響しない。これらの特性によって、ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を阻害すること、および遺伝子機能を研究すること、および薬物標的のバリデーションために強力に有効なツールとなる。さらに、ｓｉＲＮＡは、：（１）遺伝子の過剰発現または誤った発現によって生じる疾患；および（２）変異を含む遺伝子の発現によってもたらされる疾患、に対する治療剤として潜在的に有用である。
【０００９】
首尾よいｓｉＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングは、多数の要因に依存する。ＲＮＡｉにおける最も異論のある問題の１つは、ｓｉＲＮＡデザイン、すなわち、用いられるｓｉＲＮＡの配列を考慮することの必要性の疑問である。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよび植物での初期の研究によって、長いｄｓＲＮＡを誘導することによりデザインの問題を回避した（例えば、Ｆｉｒｅ，Ａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６〜８１１を参照のこと）。この原始的な生物体では、長いｄｓＲＮＡ分子は、ＤｉｃｅｒによってｓｉＲＮＡに切断され、これによって二重鎖の多様な集団が生成されて、これが転写物全体を潜在的にカバーし得る。これらの分子のいくつかの画分は機能的ではない（すなわち、サイレンシングをほとんど誘導しないかまたは全く誘導しない）が、１つ以上が高度に機能的である能力を有し、それによって目的の遺伝子をサイレンシングして、ｓｉＲＮＡデザインの必要性を軽減する。不幸にも、インターフェロン応答に起因して、この同じアプローチは、哺乳動物系には利用できない。この効果は、Ｄｉｃｅｒ切断工程を迂回することおよびｓｉＲＮＡを直接導入することによって回避され得るが、この方策は、選択されたｓｉＲＮＡ配列が非機能的または半機能的であるかもしれないという危険性を伴う。
【００１０】
ｓｉＲＮＡデザインがＲＮＡｉの重要な要素ではないという見解が多数の研究者によって表明されている。他方では、当該分野の他の研究者らは、ＲＮＡｉがｓｉＲＮＡのデザインに対して注意を払うことによって、さらに効率的にできるという可能性を検討し始めている。不幸にも、受容可能なレベルの機能性を有するｓｉＲＮＡを確実に選択するために満足なスキームを提供している方法は全く報告されていない。従って、受容可能なレベルの機能性を有するｓｉＲＮＡを選択するため、およびこの改善されたレベルの機能性を有するｓｉＲＮＡを同定するため、ならびに超機能的であるｓｉＲＮＡを同定するために合理的な基準を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、特に哺乳動物系において、ＲＮＡｉの有効性を増大することに関連する。従って、本発明は、ｓｉＲＮＡの有効性を増大するためのキット、ｓｉＲＮＡおよび方法を提供する。
【００１２】
１つの実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングのためのキットを提供するが、このキットは、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ二重鎖のプールからなり、その各々が１つ以上の標的メッセンジャーＲＮＡの配列の一部に相補的である配列からなる。
【００１３】
第二の実施形態によれば、本発明は、以下の式：
式Ｉ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／３）＋（ＡＵ１５−１９）−（Ｔｍ２０℃）＊３−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）＋（Ｕ１０）＋（Ａ１４）−（Ｕ５）−（Ａ１１）；
式ＩＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／３）＋（ＡＵ１５−１９）＊３−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）；
式ＩＩＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／３）＋（ＡＵ１５−１９）−（Ｔｍ２０℃）＊３；
式ＩＶ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝
−（ＧＣ／２）＋（ＡＵ１５−１９）／２−（Ｔｍ２０℃）＊２−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）＋（Ｕ１０）＋（Ａ１４）−（Ｕ５）−（Ａ１１）；式Ｖ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）＋（Ｕ１０）＋（Ａ１４）−（Ｕ５）−（Ａ１１）；
式ＶＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）；
式ＶＩＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／２）＋（ＡＵ１５−１９）／２−（Ｔｍ２０℃）＊１−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊３＋（Ａ３）＊３＋（Ｕ１０）／２＋（Ａ１４）／２−（Ｕ５）／２−（Ａ１１）／２；であって、ここで式Ｉ〜ＶＩＩにおいて：
ＴＭ２０℃＝Ｔｍが２０℃より大きい場合は１であり；
Ａ１９＝Ａがセンス鎖上の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
ＡＵ１５−１９＝位置１５〜１９におけるセンス鎖におけるＡまたはＵの塩基の数に依存して０〜５であり；
Ｇ１３＝Ｇがセンス鎖の１３位で塩基である場合は１であり、さもなければその値は０でああり；
Ｇ１９＝Ｃがセンス鎖の１９位で塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
ＧＣ＝センス鎖全体におけるＧおよびＣ塩基の数であり；
Ａ３＝Ａがセンス鎖上の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１１＝Ａがセンス鎖上の１１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１４＝Ａがセンス鎖上の１４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１０＝Ｕがセンス鎖上の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ５＝Ｕがセンス鎖上の５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０である；
式Ｉ〜ＶＩＩか、または
式ＶＩＩＩ  ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝
（−１４）＊Ｇ１３−１３＊Ａ１−１２＊Ｕ７−１１＊Ｕ２−１０＊Ａ１１−１０＊Ｕ４−１０＊Ｃ３−１０＊Ｃ５−１０＊Ｃ６−９＊Ａ１０−９＊Ｕ９−９＊Ｃ１８−８＊Ｇ１０−７＊Ｕ１−７＊Ｕ１６−７＊Ｃ１７−７＊Ｃ１９
＋７＊Ｕ１７＋８＊Ａ２＋８＊Ａ４＋８＊Ａ５＋８＊Ｃ４＋９＊Ｇ８＋１０＊Ａ７＋１０＊Ｕ１８＋１１＊Ａ１９＋
１１＊Ｃ９＋１５＊Ｇ１＋１８＊Ａ３＋１９＊Ｕ１０−Ｔｍ−３＊（ＧＣｔｏｔａｌ）−６＊（ＧＣ１５−１９）−３０＊Ｘ；および
式ＩＸ  ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝
（１４．１）＊Ａ３＋（１４．９）＊Ａ６＋（１７．６）＊Ａ１３＋（２４．７）＊Ａ１９＋（１４．２）＊Ｕ１０＋（１０．５）＊Ｃ９＋（２３．９）＊Ｇ１＋（１６．３）＊Ｇ２＋（−１２．３）＊Ａ１１＋（−１９．３）＊Ｕ１＋（−１２．１）＊Ｕ２＋（−１１）＊Ｕ３＋（−１５．２）＊Ｕ１５＋（−１１．３）＊Ｕ１６＋（−１１．８）＊Ｃ３＋（−１７．４）＊Ｃ６＋（−１０．５）＊Ｃ７＋（−１３．７）＊Ｇ１３＋（−２５．９）＊Ｇ１９−Ｔｍ−３＊（ＧＣｔｏｔａｌ）−６＊（ＧＣ１５−１９）−３０＊Ｘであって、
ここで
Ａ１＝Ａがセンス鎖の１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ２＝Ａがセンス鎖の２位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ３＝Ａがセンス鎖の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ４＝Ａがセンス鎖の４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ５＝Ａがセンス鎖の５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ６＝Ａがセンス鎖の６位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ７＝Ａがセンス鎖の７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１０＝Ａがセンス鎖の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１１＝Ａがセンス鎖の１１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１３＝Ａがセンス鎖の１３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１９＝Ａがセンス鎖の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければ別の塩基が存在するかもしくはこのセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、その値は０であり；Ｃ３＝Ｃがセンス鎖の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ４＝Ｃがセンス鎖の４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ５＝Ｃがセンス鎖の５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ６＝Ｃがセンス鎖の６位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ７＝Ｃがセンス鎖の７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ９＝Ｃがセンス鎖の９位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ１７＝Ｃがセンス鎖の１７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ１８＝Ｃがセンス鎖の１８位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ１９＝Ｃがセンス鎖の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければ別の塩基が存在するかもしくはこのセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、その値は０であり；Ｇ１＝Ｇがセンス鎖の１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ２＝Ｇがセンス鎖の２位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ８＝Ｇがセンス鎖の８位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１０＝Ｇがセンス鎖の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１３＝Ｇがセンス鎖の１３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１９＝Ｇがセンス鎖の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければ別の塩基が存在するかもしくはセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、その値は０であり；
Ｕ１＝Ｕがセンス鎖の１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ２＝Ｕがセンス鎖の２位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ３＝Ｕがセンス鎖の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ４＝Ｕがセンス鎖の４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ７＝Ｕがセンス鎖の７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ９＝Ｕがセンス鎖の９位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１０＝Ｕがセンス鎖の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１５＝Ｕがセンス鎖の１５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１６＝Ｕがセンス鎖の１６位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１７＝Ｕがセンス鎖の１７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１８＝Ｕがセンス鎖の１８位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
ＧＣ１５−１９＝センス鎖の１５〜１９位内、もしくはこのセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、１５〜１８位内のＧおよびＣ塩基の数であり；
ＧＣｔｏｔａｌ＝センス鎖のＧおよびＣ塩基の数であり；
Ｔｍ＝標的部位が４塩基より長い逆方向反復を含む場合１００であり、さもなければその値は０であり；そして
Ｘ＝１行中に４回以上同じヌクレオチドが繰り返す回数である、
式ＶＩＩＩおよび式ＩＸ、
から選択される式（またはアルゴリズム）に従って最適化される１つ以上のｓｉＲＮＡを用いることによってＲＮＡ干渉を最適化するための方法を提供する。
【００１４】
第三の実施形態によれば、本発明は、上記の式のうちの１つに従って最適化される配列を含む少なくとも１つのｓｉＲＮＡからなるキットに関する。好ましくは、このキットは少なくとも２つの最適化されたｓｉＲＮＡを含み、その各々が二重鎖を含み、各々の二重鎖のうちの１つの鎖が、標的メッセンジャーＲＮＡの領域に相補的な少なくとも１８の連続する塩基を含む。哺乳動物の系では、ｓｉＲＮＡは好ましくは１８〜３０のヌクレオチド塩基対を含む。
【００１５】
配列特異的でも種特異的でもない、上記のアルゴリズムを用いる能力によって、特定の標的配列のために最適化されたｓｉＲＮＡの費用効率の高い選択が可能になる。従って、ｓｉＲＮＡ技術の使用においては、さらに大きい有効性および信頼性がある。
【００１６】
第四の実施形態によれば、本発明によって、所定の配列のために機能的なおよび超機能的なｓｉＲＮＡを選択するためのｓｉＲＮＡアルゴリズムを開発する方法が提供される。この方法は、以下：
（ａ）１セットのｓｉＲＮＡを選択する工程と；
（ｂ）このセット由来の各々のｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能力を測定する工程と；
（ｃ）各々のｓｉＲＮＡの相対的機能性を決定する工程と；
（ｄ）総ＧＣ含量、ｓｉＲＮＡの融解温度、１５〜１９位のＧＣ含量、特定の位置での特定のヌクレオチドの有無、および同じヌクレオチドが所定の配列内で反復する回数からなる群より選択される少なくとも１つの変数の有無によって改善された機能性の量を決定する工程と；
（ｅ）工程（ｄ）の情報を用いてアルゴリズムを展開する工程と；
を包含する。
【００１７】
この実施形態によれば、好ましくはｓｉＲＮＡのセットは、それぞれ、少なくとも１つの遺伝子由来の少なくとも９０ｓｉＲＮＡ、より好ましくは少なくとも２つの異なる遺伝子由来の少なくとも１８０ｓｉＲＮＡ、そして最も好ましくは少なくとも３つおよび４つの異なる遺伝子由来の少なくとも２７０および３６０ｓｉＲＮＡを含む。さらに、工程（ｄ）では、この決定は、変数のうち好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つ、そして最も好ましくは全てを用いて行なわれる。得られたアルゴリズムは、標的配列特異的ではない。
【００１８】
第五の実施形態では、本発明は上記の式を用いて同定された合理的にデザインされたｓｉＲＮＡを提供する。
【００１９】
第六の実施形態では、本発明は、超機能性ｓｉＲＮＡに関連する。
【００２０】
他のそしてさらなる利点および実施形態とともに、本発明をさらに良好に理解するために、その範囲が添付の請求項の範囲に示される、実施例と組み合わせた以下の説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ相互作用についてのモデルを示す。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子のいずれかの末端と相互作用する能力を有する。結合後、二重鎖は巻き戻され、その関連の標的が同定され、切断されて、遊離される。
【図２】図２は、ヒトサイクロフィリン、ヒトジアゼパム結合インヒビター（ＤＢ）およびホタルルシフェラーゼを標的とするように生成された２７０個のｓｉＲＮＡ二重鎖の機能性の図示である。
【図３−１】図３ａは、３つの異なる細胞株、ＨＥＫ２９３、ＤＵ１４５およびＨｅｌａにおける３０個のｓｉＲＮＡのサイレンシング効果の図示である。
【図３−２】図３ｂは、ＧＣ含量に基づく、異なる機能的基（＞９５％サイレンシング（黒）、＞８０％サイレンシング（灰色）、＞５０％サイレンシング（ダークグレイ）、および＜５０％サイレンシング（白色））の頻度を示す。所定のバーに特定のＧＣ割合がない場合、特定の群についてｓｉＲＮＡは同定されなかった。図３ｃは、融解温度（Ｔｍ）に基づく異なる機能的群の頻度を示す。ここでも、各々の群は４つの異なる区分を有する：＞９５％サイレンシング（黒）、＞８０％サイレンシング（灰色）、＞５０％サイレンシング（ダークグレイ）、および＜５０％サイレンシング（白）。
【図４】図４は、サイレンシングと、ｓｉＲＮＡの５つの配列関連特性である、（Ａ）センス鎖の１９位のＡ、（Ｂ）センス鎖の３位のＡ、（Ｃ）センス鎖の１０位のＵ、（Ｄ）センス鎖の１３位のＧ以外の塩基、および（Ｅ）センス鎖の１９位以外の塩基との間の相関を表す統計的解析の図示である。全ての変数は、ホタルルシフェラーゼおよびヒトサイクロフィリンのｓｉＲＮＡサイレンシングと相関した。基準を満たすＳｉＲＮＡは、左（選択された）側に分類されるが、満たしていないものは、右側（排除した）に分類している。Ｙ軸は、「コントロールのサイレンシング％」である。Ｘ軸上の各々の位置は固有のｓｉＲＮＡに相当する。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、式ＶＩＩＩを用いて機能性および予測値に従って分類したホタルルシフェラーゼおよびサイクロフィリンｓｉＲＮＡパネルの図示である。輪の中にみられるｓｉＲＮＡは、ゼロを超える式ＶＩＩＩ値（ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭ）を有するものである。示した領域以外のＳｉＲＮＡは、ゼロ未満である式ＶＩＩＩ値を算出した。Ｙ軸は、「発現（コントロール％）」である。Ｘ軸上の各々の位置は固有のｓｉＲＮＡに相当する。
【図６ａ】図６ａは、３つの別の遺伝子からとった２７０個のｓｉＲＮＡ由来の平均内部安定プロフィール（ａｖｅｒａｇｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ）（ＡＩＳＰ）の図示である（サイクロフィリンＢ、ＤＢＩおよびホタルルシフェラーゼ）。グラフは高度に機能的な、機能的な、そして非機能的なｓｉＲＮＡのＡＩＳＰ値に相当する。
【図６ｂ】図６ｂは、天然に由来するＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのＡＩＳＰ（黒い四角）と、アンチセンス鎖について９０％を超えるサイレンシング特性を有する（白抜き）、サイクロフィリンＢ、ＤＢＩおよびルシフェラーゼ由来のｓｉＲＮＡのＡＩＳＰとの間の比較である。「ＤＧ」は、自由エネルギーΔＧの記号である。
【図７】図７は、塩基対ミスマッチの導入の際の二重鎖機能性の相違を示すヒストグラムである。Ｘ軸は、ｓｉＲＮＡに導入されたミスマッチ、および導入される位置を示す（例えば、８Ｃ＿＞Ａは、８位（通常はＣを有する）がＡに変化されていることを示す）。Ｙ軸は、「サイレンシング％（コントロールに対して標準化）（％Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ））」。
【図８ａ】図８ａは、機能性に対する、２’−Ｏ−メチル化による５’センスおよびアンチセンス鎖改変の効果を示すヒストグラムである。
【図８ｂ】図８ｂは、ＩＧＦ１Ｒ−３および２’−Ｏ−メチルＩＧＦ１Ｒ−３のセンス鎖オフターゲット効果の比較を示す発現プロフィールである。センス鎖オフターゲット（下の白いボックス）は、センス鎖の５’末端が２’−Ｏ−メチル基で改変された場合は導入されない（上部の白いボックス）。
【図９】図９は、３０個の異なる遺伝子に対する３６０個を超えるｓｉＲＮＡについての、ＲＮＡｉサイレンシング値に対するＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭのグラフを示す。垂直な線の右側に対するＳｉＲＮＡは、所望のＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭを有するｓｉＲＮＡに相当する。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｅは、種々の数の無作為に選択されたｓｉＲＮＡ、および式ＶＩＩＩに記載されるアルゴリズムを用いて選択された４つの合理的に設計された（ＳＭＡＲＴ−選択）ｓｉＲＮＡによって、５つの異なる遺伝子（ＳＥＡＰ、ＤＢＩ、ＰＬＫ、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌａルシフェラーゼ）のＲＮＡｉを比較する。さらに、４つのＳＭＡＲＴ−選択  ｓｉＲＮＡのプールによって誘導されたＲＮＡｉは、２つの異なる濃度（１００ｎＭおよび４００ｎＭ）で報告される。１０Ｆは、無作為に選択されたＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡのプール（プール１）とＳＭＡＲＴ選択ＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡのプール（プール２）との間の比較である。プール１、Ｓ１−Ｓ４およびプール２  Ｓ１−Ｓ４は、各々のそれぞれのプールを作製する個々のメンバーに相当する。無作為ｓｉＲＮＡのメンバーが二重鎖のセンス鎖の５’末端の位置に相当することに注意のこと。Ｙ軸は、コントロール（単数または複数）の発現％に相当する。Ｘ軸はコントロールの発現パーセントである。
【図１１】図１１は、クラスリン依存性エンドサイトーシス経路に関与する１２の異なる遺伝子（ＣＨＣ、ＤｙｎＩＩ、ＣＡＬＭ、ＣＬＣａ、ＣＬＣｂ、Ｅｐｓ１５、Ｅｐｓ１５Ｒ、Ｒａｂ５ｂ、Ｒａｂ５ｂ、Ｒａｂ５ｃ、ＡＰ−２のβ２サブユニットおよびＥＥＡ．１）に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞から得られたウエスタンブロットを示す。ＳｉＲＮＡは、式ＶＩＩＩを用いて選択した。「プール」は、二重鎖１〜４の混合物に相当する。プールにおける各々のｓｉＲＮＡの総濃度は２５ｎＭである。総濃度＝４×２５＝１００ｎＭ。
【図１２】図１２は、１０の異なる遺伝子（ヒトおよびマウスのサイクロフィリン、Ｃ−ｍｙｃ、ヒトのラミンＡ／Ｃ、ＱＢ（ユビキノール−チトクロームｃリダクターゼコアプロテインＩ）、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２、ＡＴＥ１（アルギニル−ｔＲＮＡタンパク質ルシフェラーゼ）、ＧＡＰＤＨおよびＥｇ５）に対する無作為に選択されたｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能力の図示である。Ｙ軸は、コントロールの発現パーセントである。数１、２、３および４は、個々の合理的に選択されたｓｉＲＮＡに相当する。「プール」は、４つの個々のｓｉＲＮＡの混合物である。
【図１３】図１３は、式ＶＩＩＩによって決定される上の１０個のＢｃｌ２  ｓｉＲＮＡｓの配列である。配列は５’から３’に挙げられる。
【図１４】図１４は、上の１０個のＢｃｌ２  ｓｉＲＮＡによる１００ｎＭ濃度でのノックダウンである。Ｙ軸は、非特異的（ｎｓ）およびトランスフェクション混合物コントロールに対する発現の量である。
【図１５】図１５は、ルシフェラーゼ遺伝子の領域のあらゆる他の塩基対で開始するｓｉＲＮＡがルシフェラーゼ遺伝子をサイレンシングする能力について試験される、機能的ウォークである。Ｙ軸は、コントロールに対する発現のパーセントに相当する。Ｘ軸は各々の個々のｓｉＲＮＡの位置に相当する。
【図１６】図１６は、図１５に記載されるウォークからとった２および３のｓｉＲＮＡ二重鎖のプールによる標的遺伝子発現の阻害を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、コントロールに対する発現パーセントに相当する。Ｘ軸は、対のプールにおける第一のｓｉＲＮＡの一部、またはｓｉＲＮＡの三つ組みの位置に相当する。例えば、第一の対のプールはｓｉＲＮＡの１および３を含む。第二の対のプールは、ｓｉＲＮＡの３および５を含む。プール３（対のプールの）は、ｓｉＲＮＡの５および７などを含む。
【図１７】図１７は、４および５のｓｉＲＮＡの二重鎖のプールによる標的遺伝子発現の阻害を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、コントロールに対する発現パーセントに相当する。Ｘ軸は各々のプールにおける第一のｓｉＲＮＡの位置に相当する。
【図１８】図１８は、１０塩基対および２０塩基対離れているｓｉＲＮＡによって標的遺伝子発現の阻害を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、コントロールに対する発現パーセントに相当する。Ｘ軸は各々のプールにおける第一のｓｉＲＮＡの位置に相当する。
【図１９】図１９は、プールにおける最高のｓｉＲＮＡよりもよく（または良好に）機能するｓｉＲＮＡのプール（ダークグレーのバー）を示す。Ｙ軸は、コントロールに対する発現パーセントに相当する。Ｘ軸は各々のプールにおける第一のｓｉＲＮＡの位置に相当する。
【図２０】図２０は、いくつかの半機能的なｓｉＲＮＡ（ダークグレー）の組み合わせが個々の（半機能的；明るいグレー）ｓｉＲＮＡを越える遺伝子発現阻害の有意な改善を生じることを示す。Ｙ軸は、コントロールに対する発現パーセントに相当する。
【図２１】図２１は、β−ガラクトシダーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼおよびＳＥＡＰ（アルカリホスファターゼ）の遺伝子発現の阻害における両方のプール（ライブラリー、Ｌｉｂ）および個々のｓｉＲＮＡを示す。Ｘ軸の数は、二重鎖のセンス鎖の最も５’側のヌクレオチドの位置を示す。Ｙ軸は、コントロールに対する各々の遺伝の発現パーセントに相当する。ライブラリーは、以下のヌクレオチドで開始するｓｉＲＮＡを含む：Ｓｅａｐ：Ｌｉｂ  １：２０６、７６６、８１２、９２３、Ｌｉｂ  ２：１１１７、１２８０、１３００、１４８７、Ｌｉｂ  ３：２０６、７６６、８１２、９２３、１１１７、１２８０、１３００、１４８７、Ｌｉｂ  ４：２０６、８１２、１１１７、１３００、Ｌｉｂ  ５：７６６、９２３、１２８０、１４８７、Ｌｉｂ６：２０６、１４８７；Ｂｇａｌ：Ｌｉｂ  １：９７９、１３３９、２０２９、２５９０、Ｌｉｂ  ２：１０８７、１７８３、２３９９、３２５７、Ｌｉｂ  ３：９７９、１７８３、２５９０、３２５７、Ｌｉｂ  ４：９７９、１０８７、１３３９、１７８３、２０２９、２３９９、２５９０、３２５７、Ｌｉｂ  ５：９７９、１０８７、１３３９、１７８３、Ｌｉｂ  ６：２０２９、２３９９、２５９０、３２５７；Ｒｅｎｉｌｌａ：Ｌｉｂ  １：１７４、３００、４３２、５６８、Ｌｉｂ  ２：５９２、６３３、７２９、８６７、Ｌｉｂ  ３：１７４、３００、４３２、５６８、５９２、６３３、７２９、８６７、Ｌｉｂ  ４：１７４、４３２、５９２、７２９、Ｌｉｂ  ５：３００、５６８、６３３、８６７、Ｌｉｂ  ６：５９２、５６８。
【図２２】図２２は、単一の遺伝子ノックダウンを行なった場合、ＥＧＦＲおよびＴｆｎＲの内部移行の結果を示す。Ｙ軸は、コントロールに対する内部移行のパーセントに相当する。
【図２３】図２３は、複数の遺伝子がノックダウンされる場合（例えば、Ｒａｂ５ａ、ｂ、ｃ）のＥＧＦＲおよびＴｆｎＲの内部移行アッセイの結果を示す。Ｙ軸は、コントロールに対する内部移行のパーセントに相当する。
【図２４】図２４は、４つの異なる遺伝子の同時のノックダウンを示す。Ｇ６ＰＤ，ＧＡＰＤＨ、ＰＬＫおよびＵＢＱに対するｓｉＲＮＡを細胞に同時に導入した。２４時間後、培養物を回収して、４つの遺伝子の各々についてｍＲＮＡ標的レベルについてアッセイした。個々のｓｉＲＮＡ対、４つ全ての遺伝子に対するｓｉＲＮＡのプールでトランスフェクトした細胞の間で比較を行なう。
【図２５】図２５は、１０個のｓｉＲＮＡの機能性を０．３ｎＭ濃度で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（詳細な説明）
（定義）
他に言及しない限り、以下の用語および句は、以下に示される意味を有する：
（ｓｉＲＮＡ）
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害性ＲＮＡ二重鎖をいう。これらの分子は、極めて長く（一般には１８〜３０塩基対）てもよく、そしてアンチセンス鎖においてそれらの標的ｍＲＮＡに対して種々の程度の相補性を含む。全てではないがある程度のｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に不対のオーバーハングした塩基を有する。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、２つの別の鎖の二重鎖、および二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を包含する。
【００２３】
ＳｉＲＮＡは、培養された細胞株においてそれが誘導するサイレンシングのレベルまたは程度に基づいて、５つの（５）グループに分けられる（非機能的、半機能的、機能的、高度に機能的、および超機能的）。本明細書において用いる場合、これらの定義は、ｓｉＲＮＡがこの細胞株に１００ｎＭの濃度でトランスフェクトされ、そしてサイレンシングのレベルがトランスフェクション後ほぼ２４時間で、かつトランスフェクション後７２時間を超えない時点で試験されるという設定条件に基づく。この状況では、「非機能的ｓｉＲＮＡ」とは、５０％未満（＜５０％）の標的サイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡとして規定される。「半機能的ｓｉＲＮＡ」は、５０〜７９％の標的サイレンシングを誘導する。「機能的ｓｉＲＮＡ」とは、８０〜９５％の遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「高度に機能的なｓｉＲＮＡ」とは、９５％を超える遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「超機能的ｓｉＲＮＡ」とは、特別なクラスの分子である。本明細書の目的に関しては、超機能的ｓｉＲＮＡとは、（１）ナノモル未満の濃度（すなわち、１ナノモル未満）でトランスフェクトされる場合、特定の標的の９５％を超えるサイレンシングを誘導するか；および／または（２）９６時間を超えてサイレンシングの機能的（または良好な）レベルを誘導する分子として規定される。これらの相対的な機能性（ただし絶対的を意味しない）を用いて、機能的ゲノミクス、標的同定および治療などの適用のための特定の標的に対してｓｉＲＮＡを比較するために使用し得る。
【００２４】
（ｍｉＲＮＡ）
「ｍｉＲＮＡ」という用語はマイクロＲＮＡを指す。
【００２５】
（遺伝子サイレンシング）
「遺伝子サイレンシング」という句は、特定の遺伝子産物の発現が減少されるかまたは減弱されるプロセスをいう。遺伝子サイレンシングは、種々の経路によって生じ得る。本明細書において用いる場合、他に特定しない限り、遺伝子サイレンシングとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）から生じる遺伝子産物発現の低下をいう。この経路は規定されているが部分的に特徴付けられた経路であり、それによって低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、宿主タンパク質（例えば、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体、ＲＩＳＣ）と呼応して機能して、配列依存性の様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する。遺伝子サイレンシングのレベルは、限定はしないが、ノーザンブロット分析による転写レベルの測定、Ｂ−ＤＮＡ技術、転写感受性レポーター構築物、発現プロファイリング（例えば、ＤＮＡチップ）および関連の技術などの種々の方法で測定できる。あるいは、サイレンシングのレベルは、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを評価することによって測定できる。これは、ウエスタン分析、例えば蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）もしくは酵素的活性（例えば、アルカリホスファターゼ）を有するレポータータンパク質の発現のレベルを測定すること、またはいくつかの他の手順を含む多数の研究を行なうことによって達成できる。
【００２６】
（トランスフェクション）
「トランスフェクション」という用語は、因子が細胞に導入されるプロセスをいう。トランスフェクトされ得る因子のリストは多く、限定はしないが、ｓｉＲＮＡ、センス配列および／またはアンチセンス配列、１つ以上の遺伝子をコードして、発現プラスミド、タンパク質、タンパク質フラグメントなどに組織化されるＤＮＡが挙げられる。細胞に因子をトランスフェクトするためには複数の方法があり、これには限定はしないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランベースのトランスフェクション、脂質ベースのトランスフェクション、分子結合ベースのトランスフェクション（例えば、ポリリジン−ＤＮＡ結合体）、マイクロインジェクションなどが挙げられる。
【００２７】
（標的）
「標的」という用語は、本明細書を通じて種々の異なる形態で用いられ、そしてこれが用いられる状況によって規定される。「標的ｍＲＮＡ」とは、所定のｓｉＲＮＡが直接指向され得るメッセンジャーＲＮＡをいう。「標的配列」および「標的部位」とは、ｍＲＮＡ内の配列であって、これに対してｓｉＲＮＡのセンス鎖が種々の程度の相同性を示し、アンチセンス鎖が種々の程度の相補性を示す配列をいう。「ｓｉＲＮＡ標的」という用語は、ｓｉＲＮＡがそれに対して指向される遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を指してもよい。同様に、「標的サイレンシング」とは、遺伝子、または対応するｍＲＮＡもしくはタンパク質の状態を指し得る。
【００２８】
（オフターゲットサイレンシングおよびオフターゲット干渉）
「オフターゲットサイレンシング」および「オフターゲット干渉」という句は、二次的ｍＲＮＡメッセージとの重複および／または部分的相同性に起因する、意図した標的ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡの分解として規定される。
【００２９】
（ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭ）
「ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭ」という用語は、所定のｓｉＲＮＡ配列に対して式Ｉ〜式ＩＸのいずれかを適用することによって規定される値をいう。「ＳＭＡＲＴ選択された（ＳＭＡＲＴ−選択）」または「合理的に選択された」または「合理的選択」という用語は、それらのＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭに基づいて選択されているｓｉＲＮＡについていう。
【００３０】
（相補性）
「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドがもう一方と塩基対を形成する能力をいう。塩基対は代表的には、逆平行のポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位の間の水素結合によって形成される。相補的なポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック方式（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の方式で塩基対合し得る。当業者は、ＤＮＡとは対照的にＲＮＡを用いる場合、チミンではなくウラシルがアデノシンに対して相補的であると考えられる塩基であると認識している。しかし、本発明の状況でＵを示す場合、他に言及しない限り、Ｔが代用できることが暗示される。
【００３１】
完全相補性または１００％相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖の各々のヌクレオチド単位が第二のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合し得る状況をいう。完全には至らない相補性とは、２つの鎖のヌクレオチド単位のうち全部ではないがいくつかがお互いと水素結合し得る状況をいう。例えば、２つの２０マーについては、各々の鎖において２つの塩基対しかお互いに水素結合できない場合、このヌクレオチド鎖は１０％相補性を示す。同じ例では、各々の鎖上の１８塩基対がお互いと水素結合し得る場合、このポリヌクレオチド鎖は９０％相補性を示す。「実質的な相補性」とは、非相補的であるように選択されるオーバーハングのようなポリヌクレオチド鎖の領域を除いて、７９％以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖をいう。（「実質的な類似性」とは、類似でないように選択されるオーバーハングのようなポリヌクレオチド鎖の領域を除いて、７９％以上の類似性を示すポリヌクレオチド鎖をいう。）従って、例えば、２９ヌクレオチド単位のうち２つのポリヌクレオチドは各々、二重鎖領域が２７塩基にまたがるように３’末端でｄｉ−ｄＴを各々が含み、そして各々の鎖上の二重鎖領域の２７塩基のうちの２６が相補的であるが、これは実質的に相補的である。なぜなら、それらはｄｉ−ｄＴオーバーハングを除いた場合、９６．３％相補的であるからである。
【００３２】
（デオキシヌクレオチド）
「デオキシヌクレオチド」という用語は、糖部分の２’および／または３’位置でヒドロキシル基（ＯＨ基）を欠くヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。代わりに、デオキシヌクレオチドは、２’および／または３’炭素に対して結合した水素を有する。１つ以上のデオキシヌクレオチドを含むＲＮＡ分子内では、「デオキシヌクレオチド」とは、糖部分の２’位でＯＨ基を欠き、代わりに２’炭素に対して直接水素結合を有する。
【００３３】
（デオキシリボヌクレオチド）
「デオキシリボヌクレオチド」および「ＤＮＡ」とは、その２’および／または３’位置でＯＨではなくＨを有する少なくとも１つの糖部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。
【００３４】
（実質的に類似）
「実質的に類似」という句は、この配列の塩基の同一性に関する少なくとも９０％の類似性をいう。
【００３５】
（二重鎖領域）
「二重鎖領域」という句は、相補的であるかまたは実質的に相補的であるポリヌクレオチド鎖の間で、ワトソン−クリック塩基対合または安定化された二重鎖を可能にする任意の他の方式によってお互いと塩基対を形成する、２つの相補的または実質的に相補的なポリヌクレオチドにおける領域をいう。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のポリヌクレオチドと塩基対合し得るが、各々の鎖の上の１９塩基のみが相補的または実質的に相補的であれば、「二重鎖領域」は１９塩基対を有する。残りの塩基は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二重鎖領域内では、１００％の相補性は必要ではない；実質的な相補性は二重鎖領域内で許容できる。実質的な相補性とは、７９％以上の相補性をいう。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域におけるミスマッチによって９４．７％の相補性が得られ、実質的に相補性の二重鎖領域が得られる。
【００３６】
（ヌクレオチド）
「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの改変型、そしてそれらのアナログをいう。ヌクレオチドとしては、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにそれらの誘導体およびアナログ、そしてピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミンおよびそれらの誘導体およびアナログを含む種が挙げられる。
【００３７】
ヌクレオチドアナログとしては、塩基、糖および／またはリン酸塩の化学構造における改変、限定はしないが、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、シトシン環外アミンの改変、および５−ブロモ−ウラシルの置換；ならびに２’位糖改変であって、限定はしないが、２’−ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮのような基で置換されており、Ｒがアルキル部分である糖改変リボヌクレオチドが挙げられる改変を有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドアナログとはまた、塩基、例えば、イノシン、キュエオシン、キサンチン、糖、例えば、２’−メチルリボース、天然にはないホスホジエステル連結、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、およびペプチドを有するヌクレオチドを包含することを意味する。
【００３８】
改変された塩基とは、ヌクレオチド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシンおよびキュエオシンなどであって、１つ以上の原子または基の置換または付加によって改変されているものをいう。塩基部分に関して改変されているヌクレオチドを含み得る改変のいくつかの型の例は、限定はしないが、アルキル化、ハロゲン化、チオレート化、アミノ化、アミド化またはアセチル化された塩基を、個々にまたは組み合わせて含む。さらに特異的な例としては、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン，２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジンおよび５位に改変を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２−チオウリジンおよび４−チオウリジンおよび２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キュエオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび改変フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして機能する改変シトシン、８−置換アデニンおよびグアニン、５−置換ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。改変ヌクレオチドとしてはまた、糖部分に関して改変されているヌクレオチド、ならびにリボシルではない、その糖およびアナログを有するヌクレオチドが挙げられる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボースおよび他の糖、複素環または炭素環であってもそれに基づいてもよい。
【００３９】
ヌクレオチドという用語は、ユニバーサル塩基として当該分野で公知であるものを包含することを意味する。例えば、ユニバーサル塩基としては、３−ニトロピロール、５−ニトロインドールまたはネブラリンが挙げられるがこれらに限定されない。「ヌクレオチド」という用語はまた、アミン基でのリボシル３’酸素の置換から生じるＮ３’〜Ｐ５’ホスホラミデートを包含することを意味する。
【００４０】
さらに、ヌクレオチドという用語はまた、このヌクレオチドに結合された検出可能な標識、例えば、放射性部分もしくは蛍光部分、または質量標識などを有する種を包含する。
【００４１】
（ポリヌクレオチド）
「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーをいい、これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリツドが挙げられるがこれらに限定されず、これには規則的におよび／または不規則的に交互であるデオキシリボシル部分およびリボシル部分のポリヌクレオチド鎖（すなわち、ここでは交互のヌクレオチド単位が−ＯＨを、次に−Ｈを、次に−ＯＨを、次に−Ｈなどを糖部分の２’位置で有する）、ならびにこれらの種類のポリヌクレオチドの改変であって、このヌクレオチド単位に対する任意の位置での種々の実体または部分の結合が含まれる改変を含む。
【００４２】
（ポリリボヌクレオチド）
「ポリリボヌクレオチド」という用語は、２つ以上の改変されたまたは未改変のリボヌクレオチドおよび／またはそれらのアナログを含むポリヌクレオチドをいう。「ポリリボヌクレオチド」という用語は、「オリゴリボヌクレオチド」という用語と交換可能に用いられる。
【００４３】
（リボヌクレオチドおよびリボ核酸）
「リボヌクレオチド」という用語および「リボ核酸（ＲＮＡ）」という句は、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位を含む改変された、または未改変のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の１’位においてＮ−グリコシド結合に結合した窒素含有塩基を有するリボシル部分の２’位に連結したヒドロキシル基、および別のヌクレオチドに対する連結を可能にするかまたは連結を妨げる部分を含む。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの効率性を改善することに関する。特定の遺伝子に対して標的される複数のｓｉＲＮＡ配列を含むことおよび／または特定の所定の基準に基づくｓｉＲＮＡ配列の選択によって、効率性の改善が達成され得る。
【００４５】
本発明はここで、好ましい実施形態と組み合わせて記載されている。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提示されており、いかなる方法でも本発明を限定すると意図されず、そのように解釈されるべきではない。本開示を読み取る際に当業者に明らかになり得る全ての変更、改変および等価物は、本発明の趣旨および範囲内に包含される。
【００４６】
さらに、本開示は、ＲＮＡ干渉に対する入門書ではない。当業者に公知の基本的な概念は、詳細には記載されていない。
【００４７】
（ｓｉＲＮＡを最適化する）
１つの実施形態によれば、本発明は、最適のｓｉＲＮＡの選択を通じて特定の遺伝子をサイレンシングする使用のための遺伝子サイレンシングの有効性を改善する方法を提供する。本方法に従って選択されたｓｉＲＮＡは、個々に、または第一の実施形態と組み合わせて、すなわち、１つ以上の他のｓｉＲＮＡであってその有効性を最大化するためにその各々がこの基準によって選択されてもよいし、されなくてもよいＲＮＡとともに用いられ得る。
【００４８】
これらの基準を最大に活用する所定のｍＲＮＡのｓｉＲＮＡを選択できる程度は、ｍＲＮＡ自体の配列に依存する。しかし選択基準は、標的配列に依存する。この方法によれば、ｓｉＲＮＡは、合理的なデザインを用いることによって所定の遺伝子について選択される。とはいうものの、合理的なデザインは、種々の方法で記載され得る。合理的なデザインとは、簡単に言えば、機能的または超機能的なｓｉＲＮＡを同定する確率を増強する、実績のある１セットの基準の適用である。１方法では、合理的にデザインされたｓｉＲＮＡは、以下の基準の１つ以上を最大化することによって同定できる：
１．低ＧＣ含量、好ましくは約３０〜５２％の間。
【００４９】
２．センス鎖のｓｉＲＮＡの１５位〜１９位における、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのＡまたはＵ塩基。
【００５０】
３．センス鎖の１９位におけるＡ塩基。
【００５１】
４．センス鎖の３位におけるＡ塩基。
【００５２】
５．センス鎖の１０位におけるＵ塩基。
【００５３】
６．センス鎖の１４位におけるＡ塩基。
【００５４】
７．センス鎖の１９位のＣ以外の塩基。
【００５５】
８．センス鎖の１３位のＧ以外の塩基。
【００５６】
９．二重鎖の１つの鎖についての分子内構造または分子間構造を生じる内部反復の特徴を指すＴｍであって、好ましくは５０℃より上では安定ではなく、さらに好ましくは３７℃より上では安定ではなく、さらに好ましくは３０℃より上では安定ではなく、そして最も好ましくは２０℃より上では安定ではない、Ｔｍ。
【００５７】
１０．センス鎖の５位のＵ以外の塩基。
【００５８】
１１．センス鎖の１１位のＡ以外の塩基。
【００５９】
５、６、１０および１１の基準は、マイナーな基準であるが、それにもかかわらず所望される。従って、好ましくはｓｉＲＮＡは前述の基準のできるだけ多くを、さらに好ましくは少なくとも１〜４および７〜９、そして最も好ましくは全ての基準を満たす。
【００６０】
基準に関しては、ＧＣ含量および１５〜１９位の多数のＡＵが、二重鎖のｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻しの緩和に重要であり得る。二重鎖巻き戻しは、インビボにおけるｓｉＲＮＡ機能性に重要であることが示されている。
【００６１】
基準９に関しては、内部構造は、ｓｉＲＮＡの一本鎖の融解温度に換算して測定されるが、融解温度とは分子のうち５０％が変性する温度である。２〜８および１０〜１１の基準に関しては、位置とは、ｍＲＮＡと同一の鎖であるセンス鎖の配列位置をいう。
【００６２】
１つの好ましい実施形態では、少なくとも基準１および８は満足される。別の好ましい実施形態では、少なくとも基準７および８が満足される。さらに別の好ましい実施形態では、少なくとも基準１、８および９が満足される。
【００６３】
配列位置に関する前述の基準の全てが特定するのはセンス鎖の５’末端に関するものであるということが注目されるべきである。ほとんどのデータベースはｍＲＮＡの情報を記載する情報を含むので、センス鎖に対して言及する。本発明によれば鎖は、１８〜３０塩基長であり得、そして上述の基準は、１９塩基対長の鎖を仮定しているので、正しい塩基に適用可能な上述の基準を維持することが重要である。
【００６４】
わずか１８塩基しかない場合、センス鎖の３’位置に位置する塩基対が存在しない塩基対である。２０〜３０塩基が存在すれば、センス鎖の５’末端にさらなる塩基が付加され、−１〜−１１位を占める。従って、配列番号０００１ＮＮＡＮＡＮＮＮＮＵＣＮＡＡＮＮＮＮＡおよび配列番号００２８ＧＵＣＮＮＡＮＡＮＮＮＮＵＣＮＡＡＮＮＮＮＡに関しては両方とも、３位にＡを、５位にＡを、１０位にＵを、１１位にＣを、そして１３位にＡを、１４位にＡおよび１９位にＡを有する。しかし、配列番号００２８はまた、−１位にＣを−２位にＵを、そして−３位にＧを有する。
【００６５】
１９塩基対のｓｉＲＮＡについて、鎖の一方の最適の配列は、以下に示されるものであってもよく、ここでＮは任意の塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである：
【００６６】
【数１】
2010187668.tif 000003
１実施形態では、ｓｉＲＮＡとして用いられる配列は、式Ｉ〜ＶＩＩによって示される以下の７つのアルゴリズムのうちの１つに従って最高のスコア付けをするｓｉＲＮＡを選択することによって選択される：
式Ｉ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／３）＋（ＡＵ１５−１９）−（Ｔｍ２０℃）＊３−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）＋（Ｕ１０）＋（Ａ１４）−（Ｕ５）−（Ａ１１）
式ＩＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／３）＋（ＡＵ１５−１９）＊３−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）
式ＩＩＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／３）＋（ＡＵ１５−１９）−（Ｔｍ２０℃）＊３式ＩＶ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝
−ＧＣ／２＋（ＡＵ１５−１９）／２−（Ｔｍ２０℃）＊２−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）＋（Ｕ１０）＋（Ａ１４）−（Ｕ５）−（Ａ１１）
式Ｖ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）＋（Ｕ１０）＋（Ａ１４）−（Ｕ５）−（Ａ１１）
式ＶＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊２＋（Ａ３）式ＶＩＩ
ｓｉＲＮＡの相対的機能性＝−（ＧＣ／２）＋（ＡＵ１５−１９）／２−（Ｔｍ２０℃）＊１−（Ｇ１３）＊３−（Ｃ１９）＋（Ａ１９）＊３＋（Ａ３）＊３＋（Ｕ１０）／２＋（Ａ１４）／２−（Ｕ５）／２−（Ａ１１）／２；
であって、ここで式Ｉ〜ＶＩＩにおいて：
Ａ１９＝Ａがセンス鎖上の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
ＡＵ１５−１９＝１５位〜１９位におけるセンス鎖におけるＡまたはＵの塩基の数に依存して０〜５であり；
Ｇ１３＝Ｇがセンス鎖の１３位で塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１９＝Ｃがセンス鎖の１９位で塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
ＧＣ＝センス鎖全体におけるＧおよびＣ塩基の数であり；
ＴＭ２０℃＝Ｔｍが２０℃より大きい場合は１であり；
Ａ３＝Ａがセンス鎖上の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１０＝Ｕがセンス鎖上の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１４＝Ａがセンス鎖上の１４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ５＝Ｕがセンス鎖上の５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；そして
Ａ１１＝Ａがセンス鎖上の１１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０である。
【００６７】
式Ｉ〜ＶＩＩによって機能性に関して相対的な情報が得られる。２つの配列についての値を所定の式に関して比較した場合、相対的機能性が確認される；正の数が高値であるほど、機能性が大きいことを示す。例えば、多くの適用では、５以上の値が有益である。
【００６８】
さらに多くの適用では、これらの式の２つ以上によって、潜在的なｓｉＲＮＡ配列の相対的機能性に関して有用な情報が得られる。しかし、２つ以上の型の式を有することが有利である。なぜなら、潜在的なｓｉＲＮＡ配列の間を区別することをあらゆる式が補助できるわけではないからである。例えば、特に高いＧＣ  ｍＲＮＡでは、そのパラメーターを考慮する式は、有用ではなく、そしてＧＣの要素を欠く式（例えば、式ＶおよびＶＩ）の適用によって、二重鎖機能性についてさらに大きい洞察が得られるかもしれない。同様に、式ＩＩは、二重鎖でヘアピン構造が観察されない状況で用いられ得、そして式ＩＶは、さらに高いＡＵ含量を有する配列に適用可能であるかもしれない。従って、これらのアルゴリズムのうちの２つ以上または全てに照らして、特定の配列を考慮して、配列の間の最高の相違を得ることができる。いくつかの場合には、所定のアルゴリズムの適用によって、異常に多数の潜在的なｓｉＲＮＡ配列を同定することが可能であり、そしてそのような場合には、その配列を例えばさらに厳密な第二のアルゴリズムを用いて再分析することが適切であるかもしれない。あるいは、所定の式を用いる配列の分析では受容可能なｓｉＲＮＡ配列が得られないことが考えられる（すなわち、低いＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭ）。この状況では、例えば厳密性の低い第二のアルゴリズムを用いてその配列を再分析することが適切であるかもしれない。さらに他の場合には、２つの別の式を用いた単一の配列の分析によって、矛盾する結果が生じるかもしれない（すなわち、１つの式によって高いＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭを有する１セットのｓｉＲＮＡが得られるが、他の式によって低いＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭを有する１セットのｓｉＲＮＡが同定される）。これらの場合には、どの重み付け要因（例えば、ＧＣ含量）が相違に寄与しているかを決定すること、そしてこれらの要因が含まれるべきか含まれないべきかを決定するために配列を評価することが必要であるかもしれない。あるいは、この配列は、合理的にデザインされた１セットのｓｉＲＮＡを同定する３、４または５番目のアルゴリズムによって分析され得る。
【００６９】
上述の基準は、表Ｉに示されるプール技術と組み合わせて用いられる場合に特に有利である：
【００７０】
【表１】
2010187668.tif 000004
【００７１】
「現行」という用語は、Ｔｕｓｃｈｌの従来のｓｉＲＮＡのパラメーターをいう（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００２）「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９〜２１３）。「新」とは、式Ｉ〜ＶＩＩに記載されたデザインパラメーターをいう。「ＧＣ」とは、ＧＣ含量のみに基づいてｓｉＲＮＡを選択する基準をいう。
【００７２】
表Ｉに示すように、さらに機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を選択する場合、＜７０％のサイレンシングを生じるｓｉＲＮＡは、２３％から８％に低下し、＞８０％のサイレンシングを生じるｓｉＲＮＡ二重鎖の数は、５０％から８８．５％に増える。さらに、＞８０％のサイレンシングを有するｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、これらのｓｉＲＮＡのうちの大部分が標的発現の＞９５％を実際にサイレンシングする（新しい基準によって、この部分は３３％〜５０％に増える）。プールされたｓｉＲＮＡにおけるこの新しい基準を用いて、プールすることによって、９５％を超えるサイレンシングの量が７９．５％から９３．８％に増大して、７０％未満のサイレンシングからｓｉＲＮＡプールを本質的に排除することが示される。
【００７３】
表ＩＩは、前述の基準と組み合わせたプールの特に有利な結果を同様に示す。しかし、前述の変数の各々の量を採用する表ＩＩによって、機能性のさらに高い程度の改善が実証される。
【００７４】
【表２】
2010187668.tif 000005
【００７５】
「機能的」、「平均」および「非機能的」という用語は、それぞれ＞８０％、＞５０％および＜５０％の機能性を示すｓｉＲＮＡをいう。基準１および４は、上記の特定の基準をいう。
【００７６】
上記のアルゴリズムは、ｍＲＮＡの配列の入力を可能にして、最適のｓｉＲＮＡを自動的に出力するコンピュータープログラムを用いても用いなくてもよい。このコンピュータープログラムは、例えば、国際的ネットワークまたはインターネットにまたがる、ローカル端末またはパーソナルコンピューターからアクセス可能である。
【００７７】
上記の式に加えて、ｓｉＲＮＡを選択するためには、さらに詳細なアルゴリズムを用いてもよい。好ましくは１８〜３０塩基対の少なくとも１つのＲＮＡ二重鎖を、以下から選択される式に従って最適化されるように、選択する：
式ＶＩＩＩ：（−１４）＊Ｇ１３−１３＊Ａ１−１２＊Ｕ７−１１＊Ｕ２−１０＊Ａ１１−１０＊Ｕ４−１０＊Ｃ３−１０＊Ｃ５−１０＊Ｃ６−９＊Ａ１０−９＊Ｕ９−９＊Ｃ１８−８＊Ｇ１０−７＊Ｕ１−７＊Ｕ１６−７＊Ｃ１７−７＊Ｃ１９
＋７＊Ｕ１７＋８＊Ａ２＋８＊Ａ４＋８＊Ａ５＋８＊Ｃ４＋９＊Ｇ８＋１０＊Ａ７＋１０＊Ｕ１８＋１１＊Ａ１９＋
１１＊Ｃ９＋１５＊Ｇ１＋１８＊Ａ３＋１９＊Ｕ１０−Ｔｍ−３＊（ＧＣｔｏｔａｌ）−６＊（ＧＣ１５−１９）−３０＊Ｘ；および
式ＩＸ：（１４．１）＊Ａ３＋（１４．９）＊Ａ６＋（１７．６）＊Ａ１３＋（２４．７）＊Ａ１９＋（１４．２）＊Ｕ１０＋（１０．５）＊Ｃ９＋（２３．９）＊Ｇ１＋（１６．３）＊Ｃ２＋（−１２．３）＊Ａ１１＋（−１９．３）＊Ｕ１＋（−１２．１）＊Ｕ２＋（−１１）＊Ｕ３＋（−１５．２）＊Ｕ１５＋（−１１．３）＊Ｕ１６＋（−１１．８）＊Ｃ３＋（−１７．４）＊Ｃ６＋（−１０．５）＊Ｃ７＋（−１３．７）＊Ｇ１３＋（−２５．９）＊Ｇ１９−Ｔｍ−３＊（ＧＣｔｏｔａｌ）−６＊（ＧＣ１５−１９）−３０＊Ｘであって、
ここで
Ａ１＝Ａがセンス鎖の１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ２＝Ａがセンス鎖の２位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ３＝Ａがセンス鎖の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ４＝Ａがセンス鎖の４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ５＝Ａがセンス鎖の５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ６＝Ａがセンス鎖の６位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ７＝Ａがセンス鎖の７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１０＝Ａがセンス鎖の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１１＝Ａがセンス鎖の１１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１３＝Ａがセンス鎖の１３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ａ１９＝Ａがセンス鎖の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければ別の塩基が存在するかもしくはこのセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、その値は０であり；Ｃ３＝Ｃがセンス鎖の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ４＝Ｃがセンス鎖の４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ５＝Ｃがセンス鎖の５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ６＝Ｃがセンス鎖の６位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ７＝Ｃがセンス鎖の７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ９＝Ｃがセンス鎖の９位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ１７＝Ｃがセンス鎖の１７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ１８＝Ｃがセンス鎖の１８位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｃ１９＝Ｃがセンス鎖の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければ別の塩基が存在するかもしくはセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、その値は０であり；
Ｇ１＝Ｇがセンス鎖の１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ２＝Ｇがセンス鎖の２位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ８＝Ｇがセンス鎖の８位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１０＝Ｇがセンス鎖の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１３＝Ｇがセンス鎖の１３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｇ１９＝Ｇがセンス鎖の１９位の塩基である場合は１であり、さもなければ別の塩基が存在するかもしくはセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、その値は０であり；
Ｕ１＝Ｕがセンス鎖の１位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ２＝Ｕがセンス鎖の２位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ３＝Ｕがセンス鎖の３位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ４＝Ｕがセンス鎖の４位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ７＝Ｕがセンス鎖の７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ９＝Ｕがセンス鎖の９位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１０＝Ｕがセンス鎖の１０位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１５＝Ｕがセンス鎖の１５位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１６＝Ｕがセンス鎖の１６位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１７＝Ｕがセンス鎖の１７位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
Ｕ１８＝Ｕがセンス鎖の１８位の塩基である場合は１であり、さもなければその値は０であり；
ＧＣ１５−１９＝センス鎖の１５〜１９位内、もしくはこのセンス鎖が１８塩基対の長さしかない場合は、１５〜１８位内のＧおよびＣ塩基の数であり；
ＧＣｔｏｔａｌ＝センス鎖のＧおよびＣ塩基の数であり；
Ｔｍ＝ｓｉＲＮＡオリゴが４塩基対より長い逆方向反復を含む場合１００であり、さもなければその値は０であり；そして
Ｘ＝１行中に４回以上同じヌクレオチドが繰り返す回数である、
式ＶＩＩＩおよび式ＩＸ。
【００７８】
上記の式ＶＩＩＩおよびＩＸ、ならびに式Ｉ〜ＶＩＩによって、遺伝子サイレンシングの効率を増大するためのｓｉＲＮＡを選択するための方法が得られる。いずれの式の変数のサブセットを用いてもよいが、少ない変数を用いる場合は、最適化の序列は信頼性が劣る。
【００７９】
上述の式の変数に関して、添え字を伴うＡまたはＣまたはＧまたはＵの１文字は、二値状態をいう。二値状態は、特定の塩基がその特定の位置に存在する（ここでこの値は「１」）か、またはその塩基が存在しない（ここでその値は「０」である）かのいずれかの条件である。位置１９が随意である、すなわち、わずか１８塩基しかないかもしれないので、１８塩基しかない場合は、上記の式において１９の添え字を有する塩基はいずれもそのパラメーターについてゼロ値を有する。各々の変数の前後は＊を伴う数であり、これはこの変数の値にその数が掛けられるかまたは加重されることを示す。
【００８０】
式ＶＩＩＩおよびＩＸにおける変数ＡまたはＧまたはＣまたはＵに先行する数（または式Ｉ〜ＶＩＩにおける変数の後の数）は、機能的ｓｉＲＮＡおよび総ｓｉＲＮＡにおける種々の位置での個々の塩基の頻度の相違を比較することによって決定された。詳細には、所定の塩基が機能的な群において特定の位置で観察される頻度を、同じ塩基が全ての無作為に選択されたｓｉＲＮＡセットにおいて観察された頻度と比較した。機能値と総値との間の相違の絶対値が６％より大きいとみられた場合、そのパラメーターをこの等式に含めた。従って、例えば、１３位で「Ｇ」を見つける（Ｇ１３）頻度が、所定の機能的な群において６％であることが見出される場合、ｓｉＲＮＡの総集団におけるＧ１３の頻度は、２０％であり、２つの値の間の相違は、６％−２０％＝−１４％である。上記の値は６より大きいので、この因子（−１４）は、この式に含まれる。従って式ＶＩＩＩでは、検討中のｓｉＲＮＡが１３位にＧを有する場合、正確な値は、（−１４）＊（１）＝−１４である。対照的に、Ｇ以外の塩基が１３位で見出される場合、正確な値は（−１４）＊（０）＝０である。
【００８１】
ｓｉＲＮＡを最適化する手段を開発するとき、本発明者らは、５’アンチセンス（ＡＳ）末端での二重鎖の低い内部熱力学的安定性への偏りが、天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体の特徴であることを観察した。本発明者らは、この観察を、それについての機能性が組織培養中で評価されているｓｉＲＮＡに拡大した。
【００８２】
パラメーターＧＣ１５〜１９に関して、０〜５の値は、１５位〜１９位におけるＧまたはＣ塩基の数に依存して記載される。１８塩基対しかない場合、その値は０〜４の間である。
【００８３】
ＧＣｔｏｔａｌ含量という基準に関しては、０〜３０の数に基づき、これは、オーバーハングを除くセンス鎖のＧおよびＣヌクレオチドの総数に関する。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、ＧＣ含量（および式ＩＩＩ〜ＶＩＩのパラメーターである１５〜１９位におけるＡＵ含量）の意味は、二本鎖ｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻しの緩和に関するということが想定される。二重鎖巻き戻しはインビボにおけるｓｉＲＮＡ機能性および全体的な低い内部安定性に重要であると考えられ、特に第一の巻き戻された塩基対の低い内部安定性は、ＲＩＳＣ複合体誘導性二重鎖巻き戻しの十分な進化性を維持するのに十分であると考えられる。この二重鎖が１９塩基対を有する場合、センス鎖の１５位〜１９位の二重鎖は、この分子がその位置で十分に低い内部安定性を示す場合、最初に巻き戻す。当業者が承知しているとおり、ＲＩＳＣがほぼ２０個のタンパク質の複合体であり；Ｄｉｃｅｒは、この複合体内の唯一ではないが１つのヘリカーゼである。従って、ＧＣパラメーターは、Ｄｉｃｅｒとの活性に関すると考えられるが、それらはまた他のＲＩＳＣタンパク質との活性についても重要である。
【００８４】
パラメーターＴｍの値は、ｓｉＲＮＡ二重鎖に存在する４塩基対よりも長い（かまたは４塩基対に等しい）内部リピートがない場合、０であり；さもなければこの値は１である。従って、例えば、配列ＡＣＧＵＡＣＧＵまたは任意の他の４つ（またはそれ以上）のヌクレオチドの回文構造（パリンドローム）がその構造内に存在する場合、この値は１である。あるいは、構造ＡＣＧＧＡＣＧまたは任意の他の３つ（またはそれ以下）のヌクレオチドの回文構造（パリンドローム）が存在する場合、この値はゼロ（０）である。
【００８５】
変数「Ｘ」は、同じヌクレオチドが４つ以上単位のストレッチで連続して生じる回数をいう。例えば、４つの連続するＡがその配列の一部に、そしてその配列のどこか他に４つ連続するＣが存在する場合、Ｘ＝２である。さらに、ある列に同じヌクレオチドの４つまたは同じヌクレオチドの８つ以上の２つの別の連続するストレッチが存在する場合、Ｘ＝２である。しかし、Ｘは５つ、６つまたは７つ連続するヌクレオチドについては増えない。
【００８６】
ここでも、所定のｍＲＮＡ（「標的ＲＮＡ」または「標的分子」）に式ＶＩＩＩまたは式ＩＸを適用する場合、１８〜３０塩基対のあらゆる配列または固定長のみの配列、例えば１９塩基対についての基準を評価するためにコンピュータープログラムを用いてもよい。好ましくは、コンピュータープログラムを設計して、その結果、どの配列が最高値を生じるかによってランク付けした、１８〜３０塩基対の潜在的ｓｉＲＮＡの全てのランク付けの報告が得られる。高い値ほど、特定の標的遺伝子についてさらに効率的なｓｉＲＮＡを指す。用いることができるコンピュータープログラムは、ヌクレオチド配列をスコア付けするために有用であることが公知の任意のコンピューター言語で開発されてもよいし、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ’ｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ．ｎｅｔ．のような市販の製品の補助によって開発されてもよい。さらに、１つの式および／または別の式によってあらゆる配列を実行するのではなく、配列のサブセットを比較することができるが、これは例えばサブセットが１つしか利用できない場合に所望され得る。例えば、最初にＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ．Ｌｏｃａｌ．Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）検索を行って他の標的に対して相同性を有さない配列を同定することが所望され得る。あるいは、この配列をスキャンして、中程度のＧＣ含量の領域を同定して、次いで、これらの領域の上で上記の式の１つを用いて関連の計算を行なうことが所望され得る。これらの計算は、手動でまたはコンピューターの補助によって行なうことができる。
【００８７】
式Ｉ〜ＶＩＩのように、式ＶＩＩＩまたは式ＩＸのいずれかを所定のｍＲＮＡ標的配列に用いることができる。しかし、どれか一方の式に従えば、２つ以上のｓｉＲＮＡが同じ値を有する可能性がある。従って、第二の式を有して、これによって式を識別することが有利である。式ＩＸを式ＶＩＩＩと同様の方式で誘導し、ただしさらに大きいデータセットを用い、これによって高度に機能的な二重鎖に対してさらに高い統計的相関を有する配列を得た。それに割り当てられた最高値を有する配列を、「第一最適化二重鎖」と呼んでもよい。それに割り当てられた二番目に高い値を有する配列を「第二最適化二重鎖」と呼んでもよい。同様に、それに与えられた３番目および４番目に高い値を有する配列を、それぞれ第三最適化二重鎖および第四最適化二重鎖と呼んでもよい。２つ以上の配列が同じ値を有する場合、それらの各々は、例えば、第一最適化二重鎖配列と呼ばれても、または同時第一最適化二重鎖と呼ばれてもよい。
【００８８】
式ＶＩＩＩを用いて同定されたｓｉＲＮＡは、同封のコンパクトディスク内に含まれる。同封のコンパクトディスク上に含まれるデータは以下にさらに詳細に記載される。このコンパクトディスクに含まれる、式ＶＩＩＩによって同定された配列は、遺伝子サイレンシング適用に用いられ得る。
【００８９】
式ＶＩＩＩおよびＩＸについては、上述の基準の全てが、他に特定されない限り、式Ｉ〜ＶＩＩと関連して同定されたとおり、５’から３’の方向で方向付けられた場合、センス鎖上に位置するとして同定されることに注意すべきである。
【００９０】
式Ｉ〜ＩＸを１つまたは２つ以上のｓｉＲＮＡを選択または評価するために用いて、サイレンシングを最適化することができる。好ましくは、これらの式のうち少なくとも１つに従って選択されている少なくとも２つの最適化ｓｉＲＮＡを用いて、ある遺伝子、さらに好ましくは少なくとも３つ、そして最も好ましくは少なくとも４つをサイレンシングする。ｓｉＲＮＡは、個々に用いられてもよく、またはプールもしくはキット中で一緒に用いられてもよい。さらに、それらは、細胞に同時にまたは別々に適用されてもよい。好ましくは、少なくとも２つのｓｉＲＮＡを、同時に適用する。多くの研究適用についてはプールが特に有利である。しかし、治療のためには、本出願のいずれか他に記載されるように単一の超機能的ｓｉＲＮＡを使用することがさらに所望され得る。
【００９１】
遺伝子サイレンシングを行うことを計画して、２つ以上のｓｉＲＮＡの間で選択する必要がある場合、ｓｉＲＮＡが上記の式の１つに供される場合、相対的な値を比較することによって、そうしなければならない。一般に、さらに高くスコア付けされたｓｉＲＮＡを用いなければならない。
【００９２】
有用な適用としては、標的のバリデーション、遺伝子機能分析、薬物の研究開発、遺伝子治療および治療薬が挙げられるがこれらに限定されない。これらの適用においてｓｉＲＮＡを用いるための方法は、当業者には周知である。
【００９３】
ｓｉＲＮＡが機能する能力は、ＲＮＡの配列に依存し、それが導入される種には依存しないので、本発明は、全ての哺乳動物種、例えば、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ハムスター、チンパンジーおよびゴリラを含むがこれらに限定されない広範な種、ならびに細菌、ウイルス、昆虫、植物およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのような他の種および生物体にまたがって適用可能である。
【００９４】
本発明はまた、ヒトゲノムのうちほぼ４５，０００遺伝子を含むがこれらに限定されない、そして糖尿病、アルツハイマー病、ガンのような疾患に関連する遺伝子の場合は特定の関係を有する、広範な遺伝子、ならびに前述の生物体のゲノムの全ての遺伝子をサイレンシングするための使用に適用可能である。
【００９５】
前述の基準または前述のアルゴリズムのうちに１つに従って選択されたｓｉＲＮＡはまた、例えば、ハイスループットストラテジーを用いる、同時スクリーニングおよび複数の遺伝子および遺伝子ファミリーの機能的分析において、ならびに直接遺伝子抑制またはサイレンシングにおいて、有用である。
【００９６】
（アルゴリズムの開発）
機能性を促進するｓｉＲＮＡ配列の特徴を同定するため、そして特定の現在受容される従来の要因（例えば、Ｇ／Ｃ含量および標的部位接触性）の重要性を定量するため、本発明者らは、３つの遺伝子である、ヒトサイクロフィリン、ホタルルシフェラーゼ、およびヒトＤＢＩを標的とする２７０個のｓｉＲＮＡからなるｓｉＲＮＡパネルを作成した。３つ全ての場合において、ｓｉＲＮＡは、各々の遺伝子の特定の領域にたいこうする指向された。ヒトサイクロフィリンおよびホタルルシフェラーゼについては、９０個のｓｉＲＮＡが、各々のそれぞれのｍＲＮＡの１９９ｂｐのセグメントに対して指向された。ＤＢＩについては、９０個のｓｉＲＮＡが、それより小さいｍＲＮＡの１０９塩基対の領域に対する。ｓｉＲＮＡが指向する配列を以下に示す。
【００９７】
特定の配列には「ｔ」が存在することに注意のこと。この理由は多くのデータベースがこの方式で情報を含むためである。しかし、ｔは、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡにおけるウラシル残基を示す。いずれのアルゴリズムでも、他に特定しない限り、ｔは、配列中ではｕとして処理する。
【００９８】
（ヒトサイクロフィリン：１９３〜３９０，Ｍ６０８５７）
配列番号２９
【００９９】
【数２】
2010187668.tif 000006
【０１００】
（ホタルルシフェラーゼ：１４３４〜１６３１，Ｕ４７２９８（ｐＧＬ３，Ｐｒｏｍｅｇａ））
配列番号３０
【０１０１】
【数３】
2010187668.tif 000007
【０１０２】
（ＤＢＩ，ＮＭ＿０２０５４８（２０２−３１０）（あらゆる位置））
配列番号００３１
【０１０３】
【数４】
2010187668.tif 000008
【０１０４】
ｓｉＲＮＡのリストは表ＩＩＩにみられる（実施例の節の実施例ＩＩを参照のこと）。
【０１０５】
二重鎖のセットを、ｓｉＲＮＡの機能性と他の生物物理学的または熱力学的特性との間の関係を同定するために分析した。ｓｉＲＮＡパネルを機能的および非機能的なサブグループにおいて分析した場合、特定のヌクレオチドが、機能的または非機能的な群において特定の位置でかなり豊富であった。さらに詳細には、高度に機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖における各々の位置での各々のヌクレオチドの頻度を、非機能的な二重鎖の頻度と比較して、あらゆる位置での任意の所定のヌクレオチドについての優先度を評価した。これらの分析を用いて、ｓｉＲＮＡアルゴリズム（式ＶＩＩＩおよびＩＸ）に含まれるべき重要な基準を決定した。
【０１０６】
データセットをまた、機能的な群におけるｓｉＲＮＡの生物物理学的特性、例えば、ＧＣ含量の最適パーセント、内部構造の性向および局所の熱力学的安定性を識別するために分析した。所定の基準のうち、いくつかは二重鎖の認識、ＲＩＳＣ活性化／二重鎖巻き戻しおよび標的切断触媒作用に関与する。
【０１０７】
統計学的に導かれた基準のソースである、もとのデータセットを図２に示す。さらに、この図によって、ＨＥＫ２９３細胞を用いた組織培養において測定された場合、予測不能でかつ広範に異なるサイレンシング効力を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を無作為な選択が生じることが示される。この図では、二重鎖をプロットして、その結果、各々のｘ軸チエックマークが個々のｓｉＲＮＡに相当し、ここで各々の引き続くｓｉＲＮＡはヒトサイクロフィリンおよびホタルルシフェラーゼについては２ヌクレオチドずつ、そしてヒトＤＢＩについては１ヌクレオチドずつ標的位置で異なる。さらにｙ軸は、細胞への二重鎖のトランスフェクションおよび標的の引き続くサイレンシングの後に残る標的発現のレベルを示す。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡは、本明細書において、広範な細胞型において同等に十分に同定して最適化した。図３ａは、種々の組織由来の３つの細胞株におけるＤＢＩ遺伝子を標的とする３０個のｓｉＲＮＡの評価を示す。各々のＤＢＩ  ｓｉＲＮＡは、Ｂ−ＤＮＡアッセイによって決定した場合、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３、ヒト胚の腎臓）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２、子宮頸部上皮腺癌）およびＤＵ１４５（ＨＴＢ−８１、前立腺）細胞において極めて同様の機能性を示す。従ってｓｉＲＮＡの機能性は、ｓｉＲＮＡの一次配列によって決定されるのであり、細胞内環境によって決定されるのではない。さらに、本発明によって、所定の標的についてｓｉＲＮＡの機能性の決定が得られるが、同じｓｉＲＮＡが、２つ以上の遺伝子をサイレンシングし得ることに注意のこと。例えば、サイレンシングｓｉＲＮＡの相補的配列は、２つ以上の遺伝子に存在し得る。従って、これらの状況では、最高のＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭを有するｓｉＲＮＡを使用することは望ましくないかもしれない。このような状況では、二番目に最高のＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭを有するｓｉＲＮＡを使用することが望ましいかもしれない。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡ機能におけるＧ／Ｃ含量の関連性を決定するために、このパネルにおける各々の二重鎖のＧ／Ｃ含量を算出し、ｓｉＲＮＡの機能的クラス（＜Ｆ５０、≧Ｆ５０、≧Ｆ８０、≧Ｆ９５であって、ここでＦは遺伝子サイレンシングパーセントを指す）をそれに従って分類した。高度に機能的なｓｉＲＮＡのほとんど（≧Ｆ９５）が３６％〜５２％というＧ／Ｃ含量範囲内におさまる（図３Ｂ）。２倍程度多い非機能的（＜Ｆ５０）二重体は、３６％〜５２％の群に比較して高いＧ／Ｃ含量の群（＞５７％ＧＣ含量）におさまる。極度に低いＤＣ含量（２６％以下）を有する群は、非機能的ｓｉＲＮＡのさらに高い割合を含み、そして高度に機能的なｓｉＲＮＡは含まなかった。従って、３０％〜５２％というＧ／Ｃ含量の範囲は、Ｇ／Ｃ範囲３０％〜７０％が効率的なＲＮＡｉ標的化を促進するという観察と整合する、ｓｉＲＮＡ機能性についての基準Ｉとして選択された。この基準単独での適用では、パネルから機能的なｓｉＲＮＡを選択する確率のわずかな増大しか得られなかった：Ｆ５０およびＦ９５のｓｉＲＮＡの選択は、それぞれ３．６％および２．２％まで改善された。ここに提示するｓｉＲＮＡのパネルによって、以前に用いられた分析および定量よりも、この基準の重要性のさらに体系的な分析および定量が可能になった。
【０１１０】
局所的な内部安定性の相対的な測定は、Ａ／Ｕ塩基対（ｂｐ）含量である；従って、Ａ／Ｕｂｐの頻度を、パネル中の全てのｓｉＲＮＡの二重鎖の５つの末端位置の各々について決定した（５’センス（Ｓ）／５’アンチセンス（ＡＳ））。次いで、二重鎖をセンス鎖の１〜５および１５〜１９位におけるＡ／Ｕｂｐの数によって分類した。二重鎖５’末端（位置１〜５；Ｓ）の熱力学的可撓性は、サイレンシング能力とは感知できるほど相関していないようであったが、３’末端（位置１５〜１９；Ｓ）の熱力学的可撓性は効率的なサイレンシングと相関していた。１５〜１９位置でＡ／Ｕを欠く二重鎖で機能的なものはなかった。この領域での１つのＡ／Ｕｂｐの存在によってある程度の機能性が付与されたが、３つ以上のＡ／Ｕの存在が好ましく、従って基準ＩＩとして規定された。試験パネルに適用した場合、機能的なｓｉＲＮＡ選択の確率ではわずかな増大しか達成されなかった：Ｆ５０およびＦ９５の二重鎖について、それぞれ１．８％および２．３％増大（表ＩＶ）。
【０１１１】
内部反復またはパリンドロームを含むｓｉＲＮＡの相補鎖は、内部折り返し構造を形成し得る。これらのヘアピン様構造は、機能的な二重鎖の濃度を効率的に減らす二重鎖型と平衡して存在する。内部ヘアピンおよびそれらの相対的安定性を形成する性向は、予測される溶融温度によって推定できる。高いＴｍは、ヘアピン構造を形成する傾向を反映する。Ｔｍ値が低いほど、ヘアピンを形成する傾向が乏しいことが示される。ｓｉＲＮＡの機能的なクラスがＴｍによって分類された場合（図３ｃ）、以下の傾向が同定された：安定な内部反復を欠く二重鎖は最も強力なサイレンサーであった（予測ヘアピン構造Ｔｍ＞６０℃を有するＦ９５二重鎖はない）。対照的に、算出されたＴｍ値が２０℃未満である内部ヘアピンを有する群での二重鎖の約６０％がＦ８０であった。従って、内部反復の安定性は、サイレンシング効果に対して反比例して、基準ＩＩＩ（予測ヘアピン構造Ｔｍ≦２０℃）として規定される。
【０１１２】
（ｓｉＲＮＡ機能性の配列に基づく決定）
ｓｉＲＮＡのパネルを機能的な群および非機能的な群に分類した場合、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖における各々の位置での特定のヌクレオチドの頻度を、非機能的な二重鎖のものと比較して、特定のヌクレオチドについてまたは特定のヌクレオチドに対して評価した。図４は、これらの問い合わせの結果およびこのデータセット（図２由来）の引き続く再分類を示す。このデータは、２つのセットに分けられる：この基準を満たす二重鎖であって、左側（選択された）に分類された特定の位置の特定のヌクレオチド、および右側（除外された）に分類されていない二重鎖。この二重鎖はさらに最も機能的なものから最も機能的でないものに分類され、図４ａ〜ｅのｙ軸は、発現の％、すなわち、この二重鎖によって誘発されるサイレンシングの量に相当する（注：Ｘ軸上の各々の位置は、種々の二重鎖に相当する）。統計的分析によって、ｓｉＲＮＡのサイレンシングといくつかの配列関連特性との間の相関が明らかになった。図４および表ＩＶは、ｓｉＲＮＡの以下の５つの配列関連特性についての定量的分析を示す：（Ａ）センス鎖の１９位のＡ；（Ｂ）センス鎖の３位置におけるＡ；（Ｃ）センス鎖の１０位におけるＵ；（Ｄ）センス鎖の１３位におけるＧ以外の塩基；および（Ｅ）センス鎖の１９位におけるＣ以外の塩基。
【０１１３】
パネル中のｓｉＲＮＡをセンス鎖の１９位におけるＡの存在について評価した場合、非機能的二重鎖の割合は２０％から１１．８％に低下し、Ｆ９５二重鎖の割合は、２１．７％から２９．４％に増えた（表ＩＶ）。従って、この位置におけるＡの存在を基準ＩＶとして規定した。
【０１１４】
サイレンシングに相関する別の配列関連特性は、センス鎖の３位におけるＡの存在であった（図４ｂ）。無作為に選択されたｓｉＲＮＡでの２１．７％に比べて、Ａ３を有するｓｉＲＮＡのうち３４．４％がＦ９５であった。センス鎖の１０位におけるＵ塩基の存在によってさらに大きい影響が示された（図４ｃ）。この群における二重鎖のうち４１．７％がＦ９５であった。これらの特性を、それぞれ基準ＶおよびＶＩとした。
【０１１５】
同定された２つの負の配列関連基準をまた、図４に示す。センス鎖の１３位にＧが存在しないことによって、機能的な二重鎖を選択することのわずかな増大が得られる（図４ｄ）。同様に、センス鎖の１９位にＣが欠けることはまた、機能性と相関した（図４ｅ）。従って、機能的な二重鎖の間で、１９位はＡによって占有される可能性が最も高く、Ｃで占有されることはまれであった。これらの規則を、それぞれ基準ＶＩＩおよびＶＩＩＩとして規定した。
【０１１６】
各々の基準の適用によって個々に、強力なｓｉＲＮＡを選択する確率におけるわずかだが統計的に有意な増大が得られた。結果は有益であったが、本発明者らは、効力を最大化しようとして、従って複数の基準またはパラメーターを考慮した。治療剤を開発する際には最適化は特に重要である。興味深いことに、各々の熱力学的基準に基づいて機能的ｓｉＲＮＡを選択する確率は、無作為よりも２％〜４％高いが、配列関連決定については４％〜８％高かった。おそらく、これらの配列関連増大は、ＲＮＡｉ機構の複雑性およびＲＮＡｉ媒介性サイレンシングに関与するタンパク質ＲＮＡ相互作用の多さを反映する。
【０１１７】
【表４】
2010187668.tif 000009
【０１１８】
（ｓｉＲＮＡ選択アルゴリズム）
選択をさらに改善する労力において、限定はしないが表ＩＶに挙げられた基準を含む全ての同定された基準を、式ＶＩＩＩおよび式ＩＸにおいて具体化したアルゴリズムに組み合わせた。次いで各々のｓｉＲＮＡに、この式に由来する値に従ってスコア（ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭと呼ばれる）を割り当てた。式ＶＩＩＩおよびＩＸについてそれぞれ０または２０より高くスコア付けされた二重鎖によって１セットの機能的なｓｉＲＮＡを効率的に選択して、全ての非機能的なｓｉＲＮＡを排除した。反対に、式ＶＩＩＩおよびＩＸに従ってそれぞれ０または２０より低くスコア付けされた全ての二重鎖は、いくつかの機能的なｓｉＲＮＡを含んだが、全ての非機能的なｓｉＲＮＡを含んだ。この選択のグラフ的な提示を図５に示す。
【０１１９】
表ＩＶに具体化された７つの基準を含むための方法は、式ＶＩＩＩおよびＩＸの情報を発展するために用いたプロセスの結果の図示である。このように同様の技術を用いて、他の変数およびそれらの乗数を確認した。上記のように、基本的な統計的方法を用いてこれらの乗数の相対的な値を決定した。
【０１２０】
「無作為（ランダム）を超える改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｖｅｒ  ｒａｎｄｏｍ）」の値を決定するため、特定の位置での所定の特性（例えば、ＧＣ含量、塩基優先度）の頻度の相違を、個々の機能的な群（例えば、＜Ｆ５０）と試験された総ｓｉＲＮＡ集団（例えば、無作為に選択された２７０個のｓｉＲＮＡ分子）との間で決定する。従って、例えば、基準Ｉ（３０％〜５２％のＧＣ含量）において、＜Ｆ５０群のメンバーを観察して、この場合の１６．４％では３０〜５２％のＧＣ含量を有することが観察された。対照的に、２７０個のｓｉＲＮＡの総ての群が、この範囲で時間のうち２０％のＧＣ含量を有した。従ってこの特定の特性については、３０％〜５２％のＧＣ含量とこの機能的な群との間にわずかな負の相関がある（すなわち、１６．４％〜２０％＝−３．６％）。同様に、基準ＶＩ（センス鎖の１０位における「Ｕ」）については、＞Ｆ９５の群はこの時間のうち４１．７％がこの位置において「Ｕ」を含んだ。対照的に、２７０個のｓｉＲＮＡの総ての群が、その時点の２１．７％でこの位置において「Ｕ」を有し、従って、無作為を超える改善は、２０％（または４１．７％〜２１．７％）であると算出される。
【０１２１】
（強力なｓｉＲＮＡの平均内部安定性プロフィールを同定する）
強力なｓｉＲＮＡの特徴である内部の安定性プロフィールを同定するため、サイクロフィリンＢ、ジアゼパム結合インヒビター（ＤＢＩ）およびルシフェラーゼ遺伝子由来の２７０個の種々のｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に個々にトランスフェクトして、それらがそれぞれの遺伝子のＲＮＡｉを誘導する能力について試験した。インビボアッセイにおけるそれらの能力に基づいて、次いで配列を以下の３つの群に小分割した、（ｉ）＞９５％のサイレンシング；（ｉｉ）８０〜９５％のサイレンシング；および（ｉｉｉ）５０％未満のサイレンシング。５１〜８４％のサイレンシングを示す配列をさらなる考慮から除外して、関連する熱力学的パターンを同定することを簡単にした。
【０１２２】
３つの群へのｓｉＲＮＡの分割後、各々の群の各々のメンバーに対して統計的分析を行なって、ｓｉＲＮＡの平均内部安定性プロフィール（ＡＩＳＰ）を決定した。これを達成するために、Ｏｌｉｇｏ  ５．０  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅおよび他の関連の統計的パッケージ（例えば、Ｅｘｃｅｌ）を開発して、Ｆｒｅｉｅｒら（１９８６）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｒｅｅ−ｅｎｅｒｇｙ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３（２４）：９３７３〜７に記載される再近接法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてパラメーターの内部安定性を決定した。次いで、各々の位置における各々の群についての値を平均して、得られたデータを、ΔＧ（自由エネルギー）値をｋｃａｌ／モルで表すＹ軸、および５’末端に対する塩基の位置を同定するＸ軸を用いる直線座標系上でグラフ化した。
【０１２３】
分析の結果、首尾よい遺伝子サイレンシングに重要なｓｉＲＮＡ分子における複数の重要な領域を同定した。センス鎖の最も３’末端で（アンチセンスの５’）、高度に機能的なｓｉＲＮＡ（＞９５％遺伝子サイレンシング、図６ａを参照のこと、＞Ｆ９５）は、低い内部安定性（１９位でのＡＩＳＰ＝約−７．６ｋｃａｌ／モル）を有する。対照的に、低い有効性のｓｉＲＮＡ（すなわち、５０％未満のサイレンシングを示すもの、＜Ｆ５０）は、同じ位置について高いΔＧ値（約−８．４ｋｃａｌ／モル）を有する、明確に異なるプロフィールを示す。５’（センス鎖）方向へ動けば、高度に有効なｓｉＲＮＡの内部安定性が向上し（位置１２＝約−８．３ｋｃａｌ／モル）、次いで再度低下し（７位置＝約−７．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、その後５’末端について約−８．１ｋｃａｌ／モルの値で安定状態になる。サイレンシング能力の劣るｓｉＲＮＡは、明瞭に異なるプロフィールを示す。１２位でのＡＩＳＰ値は強力なｓｉＲＮＡの値とほぼ同一であるが、７位および８位での値は、かなり上昇し、約−９．０ｋｃａｌ／モルの高さでピークに達する。さらに、この分子の５’末端では、強力なｓｉＲＮＡおよび弱いｓｉＲＮＡのＡＩＳＰプロフィールは劇的に異なる。９５％より大きいサイレンシング群におけるｓｉＲＮＡによって示される比較的強い値とは異なり、乏しいサイレンシング活性を示すｓｉＲＮＡは、弱いＡＳＩＰ値を有する（１位、２位および３位で、それぞれ−７．６、−７．５および−７．５ｋｃａｌ／モル）。
【０１２４】
強力なｓｉＲＮＡおよび弱いｓｉＲＮＡの両方の全体的プロフィールによって、お互いにほぼ１８０°位相の異なる正弦形状が形成される。これらの熱力学的な記載は強力なｓｉＲＮＡの原型のプロフィールを規定するが、このプロフィールにおける重要な位置について与えられるΔＧ値も、Ｙ軸（すなわちΔＧ軸）に沿ったプロフィールの絶対的位置も絶対ではないという状況の可能性が高い。上向きまたは下向きにシフトされた（すなわち、あらゆる位置で平均、高い値または低い値を有する）プロフィールであって、ただしＸ軸に沿ってこのプロフィールの相対的形状および位置を保持するプロフィールは、本明細書に記載されるモデルプロフィールとして同等に有効であることが予見され得る。さらに、強力であるかさらに強力な遺伝子特異的サイレンシング効果を有するｓｉＲＮＡは、重要な位置で誇張された（さらに高いかまたは低い）ΔＧ値を有し得る可能性が高い。従って、例えば、センス鎖の最も５’側の位置（１９位）が７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌまたはそれより低いΔＧを有し得、さらに、例えば、Ｇ−Ｃ→Ｇ−Ｔ／Ｕミスマッチが１９位で置換され、二重鎖安定性を変更した場合、強力なｓｉＲＮＡであるという可能性がある。同様に、位置１２および位置７は、分子のサイレンシング有効性を減少することなく、それぞれ８．３ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えて、および７．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の値を有し得る。従って、例えば１２位で、化学的改変を安定化すること（例えば、糖骨格の２’位の化学的改変）を加えてもよく、これがその位置における平均内部安定性を増大させる。同様に、７位置では、以前に記載されたミスマッチと同様のミスマッチが、導入されてもよく、これがその位置でΔＧを低くする。
【０１２５】
最後に、機能的ｓｉＲＮＡおよび非機能的ｓｉＲＮＡは、特定のサイレンシング特性を有する分子としてもともと規定されたが、さらに広範なパラメーターまたはさらに制限されたパラメーターの両方とも、これらの分子を規定するために用いることができるということに注目することが重要である。本明細書において用いる場合、他に特定しない限り、「非機能的ｓｉＲＮＡ」は、５０％未満（＜５０％）の標的サイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡとして、「半機能的ｓｉＲＮＡ」は、５０〜７９％の標的サイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡとして規定され、「機能的ｓｉＲＮＡ」は、８０〜９５％の遺伝子サイレンシングを誘導する分子であり、そして「高機能的ｓｉＲＮＡ」は、９５％より大きい遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。これらの定義は、強固であることは意図されず、そして本出願のデザインおよび必要性に依存して変化してもよい。例えば、機能的アッセイを用いる染色体に対して遺伝子をマッピングさせる研究者らの試みは、遺伝子活性を３０％しか低下しないｓｉＲＮＡを同定し得るという可能性がある。このレベルの遺伝子サイレンシングは、例えば治療的必要性について「非機能性」であってもよいが、遺伝子マッピングの目的には十分であり、これらの使用および条件のもとでは「機能的」である。これらの理由のために、機能的ｓｉＲＮＡとは、１００ｎＭのトランスフェクション条件で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％より大きいサイレンシング能力を有する分子として規定されてもよい。同様に、本研究および／または出願の必要性に依存して、非機能的および半機能的ｓｉＲＮＡは、異なるパラメーターを有するとして規定されてもよい。例えば、半機能的ｓｉＲＮＡは、１００ｎＭのトランスフェクション条件で、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％のサイレンシングを誘導する分子として規定されてもよい。同様に、非機能的ｓｉＲＮＡは、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％またはそれ未満まで遺伝子発現をサイレンシングする分子として規定されてもよい。それにもかかわらず、他に言及しない限り、本明細書の「定義」の節で言及される説明があてはめられるべきである。
【０１２６】
機能的属性は、強力なｓｉＲＮＡのＡＩＳＰにおける重要な位置の各々に対して割り当てられ得る。強力なｓｉＲＮＡの低い５’（センス鎖）ＡＩＳＰ値は、分子のどの末端がＲＩＳＣ複合体に入るかを決定するために必要であり得る。対照的に、分子の中央領域で観察される高いＡＩＳＰ値および低いＡＩＳＰ値は、それぞれｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡ相互作用および産物放出について重要であり得る。
【０１２７】
上記のＡＩＳＰ値が強力なｓｉＲＮＡの熱力学的パラメーターを正確に規定する場合、同様のパターンが天然から単離された強力なｓｉＲＮＡにおいて観察されることが予想される。天然のｓｉＲＮＡは、過酷な、Ｒｎａｓｅリッチな環境に存在し、そしてＲＩＳＣについて増強された親和性を示すｓｉＲＮＡ（すなわち、強力なｓｉＲＮＡにおいて観察されるものと類似の平均内部安定性プロフィールを示すｓｉＲＮＡ）のみが細胞内環境で生き残るという仮説が成り立ち得る。この仮説を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａから単離したＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを用いて試験した。Ｌｌａｖｅら（２００２）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ
ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４，１６０５〜１６１９は、長い二本鎖ＧＦＰコードＲＮＡを植物に導入して、引き続き組織からＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを再単離した。これらのＧＦＰ−ｓｉＲＮＡのうち５９個のＡＩＳＰを決定し、平均して、その後、９０％を超えるサイレンシング特性を有するサイクロフィリンＢ／ＤＢＩ／ルシフェラーゼｓｉＲＮＡから得たＡＩＳＰプロフィールと平行してプロットした（図６ｂ）。２つの群の比較によって、プロフィールがほぼ同一であることが示される。この知見によって、内部安定性プロフィールによって得られる情報が確証され、そして：（１）サイクロフィリンＢ／ＤＢＩ／ルシフェラーゼ  ｓｉＲＮＡの分析によって同定されたプロフィールが遺伝子特異的でないこと；および（２）ＡＩＳＰ値が、種々の種における強力なｓｉＲＮＡについて検索するために用いられ得ること、が実証される。
【０１２８】
化学的改変および塩基対ミスマッチの両方をｓｉＲＮＡに組み込んで、二重鎖のＡＩＳＰおよび機能性を変更してもよい。例えば、センス鎖の１位または２位におけるミスマッチの導入によって、センス鎖の５’末端を不安定化し、そして分子の機能性を増大する（Ｌｕｃ，図７を参照のこと）。同様に、センス鎖の１位および２位に対する２’−Ｏ−メチル基の付加はまた、ＡＳＩＰを変更し得、そして（結果として）分子の機能性を向上させ、かつ関連のない標的とのセンス鎖相同性から生じるオフターゲット効果を排除する（図８ａ、８ｂ）。
【０１２９】
（生物学的状況における基準の論理的根拠）
ＲＮＡｉ経路におけるｓｉＲＮＡの運命は、５つの主な工程において記載することができる：（１）二重鎖認識およびプレＲＩＳＣ複合体形成；（２）ＡＴＰ依存性二重鎖巻き戻し／鎖選択およびＲＩＳＣ活性化；（３）ｍＲＮＡ標的同定；（４）ｍＲＮＡ切断、および（５）産物の放出（図１）。各々の工程における核酸−タンパク質相互作用のレベルを考慮すれば、ｓｉＲＮＡ機能性は、多成分の複合体の状況内で有効な相互作用を促進する特定の生物物理学的および分子特性によって影響される可能性が高い。実際、ｓｉＲＮＡ試験セットの体系的な分析によって、機能性とよく相関する複数の要因を同定した。単一のアルゴリズムへ組み合わせる場合、それらが活性なｓｉＲＮＡを選択することにおいて極めて有効であることが証明された。
【０１３０】
本明細書に記載される要因はまた、ＲＮＡｉにおける各々の工程について重要な機能的な関連の指標であり得る。例えば、内部ヘアピン構造の潜在的形成は、ｓｉＲＮＡ機能性と負に相関した。安定な内部反復を有する相補的な鎖は、安定なヘアピンとして存在して、これによって機能的二重鎖形態の有効な濃度を低下させる可能性が高い。これによって、二重鎖は内部のプレＲＩＳＣ関連について好ましい高次構造であることが示唆される。実際、単一の相補鎖は遺伝子サイレンシングを誘導し得るが、必要な有効濃度は、二重鎖形態の濃度よりも少なくとも２倍大きい。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡ−プレ−ＲＩＳＣ複合体形成の後に、ＡＴＰ依存性二重鎖巻き戻し工程およびＲＩＳＣの「活性化」が続く。ｓｉＲＮＡ機能性は、二重鎖の全体的な低い内部安定性、および３’センス末端（鎖選択に影響して、ＲＩＳＣへ入り得る）の低い内部安定性（または３’センスの異なる内部安定性は、５’センス鎖に対して比較する）と相関することが示された。センス鎖の３’末端における全体的な二重鎖安定性および低い内部安定性はまた、ｓｉＲＮＡ機能性と相関した。興味深い事に、極めて高いそして極めて低い全体的安定性プロフィールを有するｓｉＲＮＡは、非機能的な二重鎖と強力に相関する。１つの解釈は、内部安定性が高ければ有効な巻き戻しを妨げるが、安定性が極めて低ければｓｉＲＮＡ標的親和性およびＲＩＳＣによる引き続くｍＲＮＡ切断を低下させるということである。
【０１３２】
いくつかの基準は、センス鎖の特定の位置における塩基優先度を記載しており、標的認識およびｍＲＮＡ切断におけるその潜在的機構の役割を考慮した場合、さらに興味深い。Ｃではないが、センス鎖の１９位におけるＡの塩基優先度は、特に興味深い。なぜなら、それらは天然に存在するｍＲＮＡ前駆体について観察された同じ塩基優先度を反映するからである。すなわち、報告されたｍｉＲＮＡ前駆体配列のうち７５％が１位においてＵを含み、これがｓｉＲＮＡのセンス鎖の１９位におけるＡに相当するが、ＧはｍｉＲＮＡ前駆体の同じ位置では少ないと見積もられた。これらの観察によって、ｍｉＲＮＡ前駆体およびｓｉＲＮＡ二重鎖の両方は、タンパク質機構が同定されない場合、極めて類似にまでプロセシングされるという仮説が支持される。Ｕ／Ａ塩基対の優勢度の機能的解釈は、これが、ｓｉＲＮＡ二重鎖およびｍｉＲＮＡ前駆体の両方の５’アンチセンス末端において可撓性を促進し、有効な巻き戻しおよび活性化ＲＩＳＣへの選択的鎖の入力を促進するということである。
【０１３３】
ｍＲＮＡ切断、または可能性としては産物の遊離に影響する可能性が高い塩基優先度に関連する基準のなかで、センス鎖の１０位でのＵの優先度は、最高の影響を示し、Ｆ８０配列を選択する確率は１３．３％まで増強された。活性化ＲＩＳＣは、相補的標的鎖の５’末端に対して、ヌクレオチド１０と１１との間で標的ｍＲＮＡを優先的に切断する。従って、この位置で最もエンドリボヌクレアーゼについて好ましい塩基であるＵがさらに有効な切断を支持するということがあり得る。あるいは、標的ｓｉＲＮＡ鎖とその同族の標的ｍＲＮＡとの間のＵ／Ａｂｐは、ＲＩＳＣ関連「スライシング」活性について最適の高次構造を作製し得る。
【０１３４】
（プール）
別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡのプールを、好ましくはキットまたは治療薬の形態で提供するが、ここでｓｉＲＮＡの各々の１つの鎖のうちセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ内の配列に実質的に類似である配列を含む。反対の鎖であるアンチセンス鎖は好ましくは、標的ｍＲＮＡの配列に実質的に相補的な配列を含む。さらに好ましくは、各々のｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的ｍＲＮＡに含まれる配列に同一である配列を含む。最も好ましくは、各々のｓｉＲＮＡは、１９塩基対の長さであり、ｓｉＲＮＡの各々の１つの鎖は、標的ｍＲＮＡの一部に対して１００％相補的である。
【０１３５】
プールまたはキットを用いて特定の標的に対して指向されるｓｉＲＮＡの数を増大させることによって、満足な機能性を有する少なくとも１つのｓｉＲＮＡが含まれる確率を上昇させること、そして相加的または相乗的効果によって利益を得ることの両方が可能である。さらに、単一の遺伝子に対する２つ以上のｓｉＲＮＡが単独では機能性の満足なレベルを有さない場合、組み合わせれば、それらは、標的メッセンジャーＲＮＡの分解を満足に促進し、翻訳を首尾よく阻害し得る。このシステムに複数のｓｉＲＮＡを含むことによって、サイレンシングの確率の増大だけでなく、異なるｓｉＲＮＡを連続して加えることに比べて、操作の経済性も改善される。これは、複数のｓｉＲＮＡの同時の使用が遺伝子サイレンシングに負に影響するという従来の見識（例えば、Ｈｏｌｅｎ，Ｔら（２００３）「Ｓｉｍｉｌａｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈｅｙ  ａｃｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ＲＮＡｉ  ｐａｔｈｗａｙ」ＮＡＲ  ３１：２４０１〜２１４０７）とは反対である。
【０１３６】
実際、２つのｓｉＲＮＡを一緒にプールした場合、２つのｓｉＲＮＡのプールのうち５４％が、９５％を越える遺伝子サイレンシングを誘導した。従って、機能性の割合における２．５倍の増大は、２つのｓｉＲＮＡを無作為に合わせることによって達成された。さらに、２つのｓｉＲＮＡを含むプールのうち８４％以上が８０％を超える遺伝子サイレンシングを誘導した。
【０１３７】
さらに好ましくは、キットは少なくとも３つのｓｉＲＮＡからなり、ここで各々のｓｉＲＮＡのうち１方の鎖が標的ｍＲＮＡの配列に実質的に類似の配列を含み、そしてもう一方の鎖が、標的ｍＲＮＡの領域に実質的に相補的である配列を含む。少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含むキットと同様、さらに好ましくは１方の鎖は、ｍＲＮＡに含まれる配列に同一の配列を含み、そしてもう一方の鎖が、このｍＲＮＡに含まれる配列に対して１００％相補的である。実験中に、３つのｓｉＲＮＡを一緒に組み合わせれば、プールのうち６０％が９５％を超える遺伝子サイレンシングを誘導し、そしてプールのうち９２％が８０％を超える遺伝子サイレンシングを誘導した。
【０１３８】
さらに、より好ましくは、キットは少なくとも４つのｓｉＲＮＡからなり、ここでは、各々のｓｉＲＮＡのうち一方の鎖は、標的ｍＲＮＡの配列の領域に実質的に類似である配列を含み、もう一方の鎖は標的ｍＲＮＡの領域に対して実質的に相補的である配列を含む。少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含むキットまたはプールと同様に、さらに好ましくはｓｉＲＮＡの二重鎖の各々の一方の鎖は、ｍＲＮＡに含まれる配列に同一である配列を含み、もう一方の鎖はこのｍＲＮＡに含まれる配列に対して１００％相補的である。
【０１３９】
さらに、少なくとも５つ、少なくとも６つ、および少なくとも７つのｓｉＲＮＡを有するキットおよびプールはまた、本発明で有用であり得る。例えば、５つのｓｉＲＮＡのプールは、７７％の確率で９５％遺伝子サイレンシングを、９８．８％の確率で８０％サイレンシングを誘導した。従って、ｓｉＲＮＡを一緒にしたプールによってほぼ９９％の確率で機能性である標的特異的サイレンシング試薬が作製できる。このような高レベルの成功は、ｓｉＲＮＡのこのようなプールを用いて達成できるという事実によって、費用がかさみかつ時間を浪費する標的特異的なバリデーション手順なしですませることが可能になる。
【０１４０】
この実施形態、および他の前述の実施形態については、プール内のｓｉＲＮＡの各々が好ましくは１８〜３０塩基対、より好ましくは１８〜２５塩基対、そして最も好ましくは１９塩基対を含む。各々のｓｉＲＮＡにおいて、好ましくはアンチセンス鎖のうち少なくとも１８連続する塩基は、標的ｍＲＮＡに対して１００％相補的である。さらに好ましくは、アンチセンス鎖のうち少なくとも１９連続する塩基は、標的ｍＲＮＡに対して１００％相補的である。さらに、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにオーバーハングが存在し得、そしてこれらのオーバーハングは、いずれかの鎖の５’末端または３’末端のいずれであってもよく、例えば、１〜６塩基の１つ以上のオーバーハングであってもよい。オーバーハングが存在する場合、塩基対の数の算出には含まれない。２つのヌクレオチドの３’オーバーハングは天然のｓｉＲＮＡを模倣し、そして通常用いられるが、必須ではない。好ましくは、このオーバーハングは、標的配列に対して相補的ではないセンス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端において、２つのヌクレオチドから、ほとんどの場合は、ｄＴｄＴまたはＵＵから構成されるべきである。ｓｉＲＮＡは、現在公知であるか、または二本鎖ＲＮＡを合成するために公知となる、本発明において有用であることを当業者が理解している、任意の方法によって産生されてもよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎの独自のＡＣＥ（登録商標）技術によって生成される。しかし、ｓｉＲＮＡを合成するための他の方法は、当業者に周知であり、そしてこれには、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの任意の化学合成、さらに短いオリゴヌクレオチドの連結、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ転写、細胞内の発現のためのベクターの使用、組み換えＤｉｃｅｒ産生、およびＰＣＲ産生が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡの前述のプール内のｓｉＲＮＡ二重鎖は、特定のｍＲＮＡ内の重複配列、またはｍＲＮＡの重複しない配列に相当し得る。しかし、好ましくは、それらは、重複しない配列に相当する。さらに、各々のｓｉＲＮＡは、無作為に選択されてもよいし、または１つ以上のｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡの有効性を最大化するために上で考察された基準に従って選択されてもよい。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡの定義に含まれるのは、置換されたか、および／または標識されたヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡである。標識されたヌクレオチドとは、例えば、放射線、蛍光または質量によって標識されてもよい。最も一般的な置換は、リボース糖の２’位置であり、ここではＨ（水素）Ｆ、ＮＨ３、ＯＣＨ３および他のＯ−アルキル、アルケニルおよびオルトエステルのような部分が置換されてもよいし、またはリン酸骨格では、イオウ、アミンまたは炭化水素が、ホスホジエステル結合における非架橋原子の架橋について置換されてもよい。改変ｓｉＲＮＡの例は、本明細書において参考として援用される、２００３年７月１日出願の同一出願人による米国特許出願番号１０／６１３，０７７号にさらに詳細に説明される。
【０１４３】
さらに、上述のように、ｓｉＲＮＡが導入されている細胞型は、ｓｉＲＮＡが細胞に入る能力に影響し得る；しかし、これは、ｓｉＲＮＡが一旦細胞に入ればｓｉＲＮＡが機能する能力に影響しないようである。種々の細胞型への二重鎖ＲＮＡの導入のための方法は、当業者に周知である。
【０１４４】
当業者が承知しているとおり、特定の種において、ＲｄＲＰ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのようなタンパク質の存在がｓｉＲＮＡの活性を触媒的に増強し得る。例えば、ＲｄＲＰは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよび他の非哺乳動物生物体においてＲＮＡｉの効果を拡大する。実際、これらのタンパク質を含む生物体では、ｓｉＲＮＡは遺伝され得る。十分研究されており、その機構の一部であることが公知の他の２つのタンパク質は、ＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリーおよびＤｉｃｅｒのメンバー、ならびにそれらのホモログである。ＲＩＳＣ複合体がリボソームと関連し得、そのためさらに効率的に翻訳されたｍＲＮＡは他のものよりもサイレンシングにさらに感受性であるという初期の証拠も存在する。
【０１４５】
ｓｉＲＮＡの有効性における別の極めて重要な要因は、ｍＲＮＡ局在化である。一般には、細胞質ｍＲＮＡのみが、任意の感知できる程度までＲＮＡｉに対して接近可能であると考えられる。しかし、適切にデザインされたｓｉＲＮＡ、例えばヌクレオチド間連結によって改変されたｓｉＲＮＡは、核において作用することによってサイレンシングを生じることができる。これらの型の改変の例は、各々が参考として本明細書に援用される、同一出願人の米国特許出願番号１０／４３１，０２７および１０／６１３，０７７号に記載されている。
【０１４６】
上記のように、少なくとも２つのｓｉＲＮＡを無作為に選んだ場合でさえ、この２つの有効性は、２つの個々のｓｉＲＮＡの有効性に基づいて予想されるよりも大きくあり得る。この相加効果または相乗効果は特に、少なくとも３つのｓｉＲＮＡに対する１つの増大として注目すべきであり、少なくとも４つのｓｉＲＮＡに対する１つの動きとしてさらに注目すべきである。驚くべき事に、非機能的ｓｉＲＮＡおよび半機能的ｓｉＲＮＡ、特に６つ以上のｓｉＲＮＡのプールによって、任意の１つの特定の機能的ｓｉＲＮＡよりも有効でないかのような有効性のサイレンシング混合物がもたらされ得る。
【０１４７】
本発明のキット内では、好ましくは各々のｓｉＲＮＡが、０．００１〜２００μＭ、より好ましくは０．０１〜２００ｎＭ、そして最も好ましくは０．１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【０１４８】
好ましくは少なくとも４つのまたは５つのｓｉＲＮＡを含むことに加えて、本発明のキットはまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖を安定に保つ緩衝液を含む。当業者は、ｓｉＲＮＡを安定に保つのに適切な緩衝液を承知している。例えば、緩衝液は、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．５、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されてもよい。あるいは、キットは、ヌクレアーゼによる分解から因子を保護する多数の化学的改変（例えば、２’−Ｏ−ＡＣＥ）のうちのいずれか１つを含む相補鎖を含んでもよい。この場合、使用者は、２つの相補鎖を一緒にアニーリングする前に、改変保護基を除去（例えば、脱保護する）してもよいし（または取り除かなくてもよい）。
【０１４９】
例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖のプールが特定の遺伝子セットのため、または関連しない遺伝子のためのウェルまたはドロップのアレイまたはマイクロアレイに提供されるように、キットを組織化してもよい。このアレイは、例えば、現在公知の技術または当業者に公知となっている技術を用いてプラスチックプレートまたはガラススライドに配置された、９６ウェル、３８４ウェルまたは１２８４ウェルであり得る。アレイ内には、好ましくは、目的の遺伝子に特異的ではない機能的な抗ラミンＡ／Ｃ、サイクロフィリンおよび２つのｓｉＲＮＡ二重鎖のようなコントロールが存在する。
【０１５０】
使用の前にｓｉＲＮＡプールの安定性を保証するため、それらが使用のために準備されるまで、−２０℃で凍結乾燥型として保持してもよい。使用の前に、それらは再懸濁しなければならない；しかし、例えば、前出の緩衝液における１回の再懸濁でさえ、それらは使用まで−２０℃で保持しなければならない。前述の緩衝液は、使用前には、約４℃または室温で保管してもよい。トランスフェクションを行なうのに有効な温度は、当業者には周知であって、これには、例えば室温が挙げられる。
【０１５１】
キットはインビボで適用されても、インビトロで適用されてもよい。好ましくは、プールまたはキットのｓｉＲＮＡは、標準的なトランスフェクションプロトコールを使用して、トランスフェクションを通じて細胞に適用される。これらの方法は、当業者に周知であり、そしてこれには、脂質ベースのキャリア、エレクトロポレーション、陽イオン性キャリアおよびマイクロインジェクションの使用が挙げられる。さらに、ｓｉＲＮＡ配列の代わりに等価なＤＮＡ配列を（２つの別の相補鎖として、またはヘアピン分子として）合成すること、およびそれらをベクターによって細胞に導入することによって本発明を適用することができる。一旦細胞に入れば、このクローニングされたＤＮＡは、転写され得、それによって細胞がｓｉＲＮＡを生成することを強制する。本発明での使用に適切なベクターの例としては、標準的な一過性の発現ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスベースのベクター、および他の伝統的な発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。十分なｓｉＲＮＡ発現およびプロセッションモジュールを有する任意のベクターが用いられ得る。さらに、他の分子に対する結合体が挙げられるがこれらに限定されない、ｓｉＲＮＡに対する特定の化学的改変を用いて送達を促進してもよい。特定の適用については、生理学的に受容可能な溶液における簡単な処方によってトランスフェクションなしに分子を送達することが好ましいかもしれない。
【０１５２】
本実施形態は、前述の実施形態のいずれかと関係して用いられ得る。従って、任意のプール内の配列は、合理的なデザインによって選択され得る。
【０１５３】
（多重遺伝子サイレンシング）
単一の遺伝子に対する複数のｓｉＲＮＡを含むキットを開発することに加えて、別の実施形態は、複数の遺伝子を標的とする同時のｓｉＲＮＡの使用を包含する。複数の遺伝子は、高機能的または超機能的なｓｉＲＮＡの使用を通じて標的とし得る。効力の増大を示す高機能的または超機能的なｓｉＲＮＡは、所望の表現効果（すなわち治療効果）を誘導するのに必要な濃度が低い。これによってＲＩＳＣ飽和が回避される。従って、１つの遺伝子のノックアウトまたはノックダウン発現に必要な単一ｓｉＲＮＡの濃度が低いならば、残りの（複合体化されていない）ＲＩＳＣは、２、３、４またはそれ以上の遺伝子に対するｓｉＲＮＡと相互作用するのに自由でかつ利用可能である。従ってこの実施形態では、著者らは、３つの別の遺伝子をノックアウトする高度に機能的な、または超機能的なｓｉＲＮＡの使用を記載する。さらに好ましくは、このような試薬は、４つの異なる遺伝子をノックアウトするために組み合わされ得る。さらに好ましくは、高度に機能的な、または超機能的なｓｉＲＮＡは、５つの別個の遺伝子をノックアウトするために用いられ得る。最も好ましくは、この型のｓｉＲＮＡを用いて、６つ以上の遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることができる。
【０１５４】
（超機能的なｓｉＲＮＡ）
超機能的ｓｉＲＮＡ（ｈｆ−ｓｉＲＮＡ）という用語は、長時間にわたって低ナノモルまたはナノモル未満の濃度で細胞中にＲＮＡｉを誘導するｓｉＲＮＡ集団のサブセットを指す。これらの形質、強調された効力およびＲＮＡｉ表現型の寿命の延長は、治療の観点から高度に魅力的である。さらに高い効力を有する因子は、所望の生理学的応答を得るのに必要な分子の量が少なく、これによって「オフターゲット」干渉に起因する副作用の可能性を減らす。超機能的ｓｉＲＮＡに関連する潜在的な治療的利点に加えて、ｈｆ−ｓｉＲＮＡは経済的見解からも所望される。超機能的ｓｉＲＮＡは、処置あたりの費用を低下させ得、これによって製造業者および消費者の両方に対する全体的支出が低下する。
【０１５５】
超機能的ｓｉＲＮＡの同定は、個々のｓｉＲＮＡ因子の濃度および／または寿命のプロフィールを試験するように設計されている複数の工程を包含する。１つの非限定的な例では、単一の遺伝子に対して指向されたｓｉＲＮＡの集団を、以前に記載されたアルゴリズム（式ＶＩＩＩ）を用いて最初に分析する。次いで、個々のｓｉＲＮＡを試験細胞株に導入して、標的ｍＲＮＡを分解する能力について評価する。この工程を行なう場合に、ｓｉＲＮＡの全てを試験する必要はないということに注意することが重要である。代わりに、最高のＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭ（すなわち、ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭ＞−１０）を有するｓｉＲＮＡのみを試験することが十分である。引き続き、遺伝子サイレンシングデータをＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭに対してプロットする（図９を参照のこと）。（１）高い程度の遺伝子サイレンシングを誘導し（すなわち、それらは８０％を超える遺伝子ノックダウンを誘導する）、そして（２）優れたＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭ（すなわち、ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭ＞−１０、このことは所望の平均内部安定性プロフィールを示唆する）を有する、ｓｉＲＮＡを、分子の効力および寿命をさらによく理解するためにデザインされたさらなる検討のために選択する。分子の効力を理解することに専念する、１つの非限定的な研究では、ｓｉＲＮＡを、１つ（またはそれ以上）の細胞型に徐々に濃度を低下させながら（例えば、３．０→０．３ｎＭ）導入する。引き続き、各々の濃度によって導入される遺伝子サイレンシングのレベルを試験して、超機能的な効力を示すｓｉＲＮＡ（すなわち、例えばピコモル濃度で、８０％サイレンシングまたはそれ以上を誘導するｓｉＲＮＡ）を同定する。第二の研究では、高い（＞−１０）ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭおよび８０％を超えるサイレンシングを有するｓｉＲＮＡの寿命のプロフィールを試験する。これを達成する方法の１つの非限定的な例では、ｓｉＲＮＡを、試験細胞株に導入して、ＲＮＡｉのレベルを長時間にわたって（例えば、２４〜１６８時間）測定する。例えば、１２０時間より長い時間にわたって強力なＲＮＡ干渉パターン（すなわち、＞８０％干渉）を示すｓｉＲＮＡをこのようにして同定する。上記の研究と類似の研究を、本明細書に含まれる任意のおよび＞１０６の全てのｓｉＲＮＡにおいて行なって、任意の所定の遺伝子の最も機能的な分子をさらに規定することができる。１つまたは両方の特性（長い寿命および増強された効力）を保有する分子は、標識された「超機能的なｓｉＲＮＡ」であり、将来の治療研究のための候補として注目されている。
【０１５６】
上記の例は、超機能性ｓｉＲＮＡが単離され得る１つの手段を記載しているが、アッセイ自体も用いられる選択パラメーターも融通がきき、ｓｉＲＮＡの各々のファミリーでは変化し得る。ｓｉＲＮＡのファミリーは、単一の遺伝子に対する、または関連の遺伝子ファミリーに対するＲＮＡを含む。
【０１５７】
任意の所定の遺伝子について達成可能な最高量のｓｉＲＮＡはかなり変化し得る。従って、例えば、１つの遺伝子（遺伝子Ｘ）の場合、上記のような厳正な研究によって、ピコモル濃度で１０日間にわたって９９＋％のサイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡの同定が可能になり得る。しかし、第二の遺伝子（遺伝子Ｙ）の同定研究は、高ナノモル濃度（例えば、１００ｎＭ）で２日間にわたって７５％のサイレンシングしか誘導しないｓｉＲＮＡを生じ得る。両方の分子とも、それらのそれぞれの遺伝子標的について極めて最適のｓｉＲＮＡに相当し、従って「超機能的」と命名される。さらに、標的濃度、ｓｉＲＮＡ安定性、細胞型、オフターゲット干渉およびその他が挙げられるがこれらに限定されない種々の要因に起因して、等価なレベルの効力および寿命は達成不能である。従って、これらの理由のために、前述のアッセイに記載されたパラメーターは変化し得る。最初のスクリーニングによって、−１０を超えるＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭおよび８０％を超える遺伝子サイレンシング能力を有するｓｉＲＮＡを選択したが、さらに強力な（またはさらに弱い）パラメーターを有する選択を実行することができる。同様に、高い効力および寿命を有する分子を同定するようにデザインされた引き続く研究では、所望のカットオフ基準（すなわち、所望のレベルの干渉を誘導する最低濃度、または干渉する最長期間が観察され得る）は変化し得る。
【０１５８】
本出願の合理的基準の適用に引き続き、例えば、治療用途のために適切な超機能的ｓｉＲＮＡを得ることを試みている実験は、有意に少なくなる。例えば、本明細書で記載される型のさらなる実験が本開示に関する当業者によって適用される場合、超機能的なｓｉＲＮＡは容易に同定される。
【０１５９】
ｓｉＲＮＡは、現在公知であるか、または公知になっているか、そして本開示を読めば当業者が決定できる、ｓｉＲＮＡが細胞膜を横切ることを可能にするのに本発明と関連して有用である任意の方法によって細胞に導入され得る。これらの方法としては、任意の様式のトランスフェクション、例えば、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、リン酸カルシウム、陽イオン性脂質／リポソーム；ミセル、圧力の操作、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノポレーションを使用するトランスフェクション、ベクター、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、バクテリオファージの使用、細胞融合、および特定の結合体またはリガンド、例えば抗体、抗原またはレセプターに対するポリヌクレオチドの結合、受動的導入、ｓｉＲＮＡの取り込みを促進する部分をｓｉＲＮＡへ付加することなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
ある程度の特異性によって本発明を記載してきたが、ここでは実施例を提供する。これらの例は、いかなる方法でも特許請求の範囲を意図しないし、それを限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６１】
（一般的技術および命名法）
（ｓｉＲＮＡ命名法）全てのｓｉＲＮＡ二重鎖を、センス鎖によって言及する。センス鎖の５’末端の第一のヌクレオチドは１位であり、これが１９マーのアンチセンス鎖の１９位に対応する。ほとんどの場合、種々の実験からの結果を比較するために、感染２４時間後、ｓｉＲＮＡ濃度を１００ｎＭで一定に保ったまま、特定の転写ｍＲＮＡレベルまたは特定の転写レベルに関連する酵素活性を測定することによって、サイレンシングを決定した。全ての実験について、他に特定されない限り、トランスフェクション効力が９５％を超えることが確認され、検出可能な細胞毒性は観察されなかった。以下のシステムの命名法を用いて、ｓｉＲＮＡサイレンシング機能性：「Ｆ」、続いて最小ノックダウンの程度を比較して報告する。例えば、Ｆ５０は、少なくとも５０％ノックダウンを示し、Ｆ８０は少なくとも８０％を意味する、など。この研究については、全てのＦ５０未満のｓｉＲＮＡを非機能的とみなした。
【０１６２】
（細胞培養およびトランスフェクション）９６ウェルプレートを５０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ  ポリＬリジン（Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間コーティングし、次いで蒸留水を用いて３回洗浄して、その後に２０分間乾燥させる。ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３Ｌｕｃｓまたは目的の任意の他の細胞型は、トリプシン処理によってその固体支持体から遊離させ、３．５×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、続いて１ウェルあたり１００μＬの細胞を添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。トランスフェクション手順は、細胞型およびトランスフェクション試薬に依存して広範に変化し得る。１つの非限定的な例では、２ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、８０μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５μＬ  ＳＵＰＥＲＮａｓｉｎ  ２０Ｕ／μｌ（Ａｍｂｉｏｎ）、および１．５μｌのレポーター遺伝子プラスミド１μｇ／μｌからなるトランスフェクション混合物を、５ｍｌのポリスチレン丸底試験管中で調製する。次いで、１００μｌのトランスフェクション試薬を、ポリスチレンのディープ・ウェル・タイター・プレート（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で１００μｌのｓｉＲＮＡと組み合わせて、室温で２０〜３０分間インキュベートする。次いで、５５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを各々のウェルに添加して、最終のｓｉＲＮＡ濃度を１００ｎＭにする。次いで、プレートをパラフィルムで密閉して、混合する。培地をＨＥＫ２９３細胞から取り除いて、９５μｌのトランスフェクション混合物で置き換える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
【０１６３】
（遺伝子ノックダウンの定量）種々の定量手順を用いて、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡプールによって導入されるサイレンシングのレベルを測定することができる。１つの非限定的な例では：トランスフェクションの２４時間後ｍＲＮＡレベルを測定するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｂｒａｂｃｈｅｄ−ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）キット（Ｂａｙｅｒ）（Ｗａｎｇら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｅＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７、９４：４３６０）を製造業者の指示に従って用いる。ルシフェラーゼ活性を測定するために、トランスフェクション２４時間後にＨＥＫ２９３細胞から培地を取り除いて、５０μｌのＳｔｅａｄｙ−ＧＬＯ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加する。５分後、プレートリーダー上でプレートを分析する。
【０１６４】
（実施例Ｉ．アルゴリズムを展開するために用いられる配列）
抗ホタルｓｉＲＮＡおよび抗サイクロフィリンｓｉＲＮＡのパネル（図５ａ、ｂ）は、式ＶＩＩＩの予測値を用いて分類した。０より大きい（式ＶＩＩＩ）および２０より大きい（式ＩＸ）全てのｓｉＲＮＡスコアリングは完全に機能的である。各々の遺伝子（およびＤＢＩ）について９０個全ての配列を以下の表ＩＩＩに示す。
【０１６５】
【表３−１】
2010187668.tif 000010
【０１６６】
【表３−２】
2010187668.tif 000011
【０１６７】
【表３−３】
2010187668.tif 000012
【０１６８】
【表３−４】
2010187668.tif 000013
【０１６９】
【表３−５】
2010187668.tif 000014
【０１７０】
【表３−６】
2010187668.tif 000015
【０１７１】
【表３−７】
2010187668.tif 000016
【０１７２】
（実施例ＩＩ．ＤＢＩ、ルシフェラーゼ、ＰＬＫ，ＥＧＦＲおよびＳＥＡＰを用いる、アルゴリズムのバリデーション）
アルゴリズム（式ＶＩＩＩ）は、５つの遺伝子であるヒトＤＢＩ、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）、ヒトＰＬＫおよびヒト分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）についてのｓｉＲＮＡを同定した。４つの個々のｓｉＲＮＡを、式ＶＩＩＩを用いるそれらの配列の分析によって誘導したそれらのＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭに基づいて選択し（全てのｓｉＲＮＡは同様に式ＩＸを用いて選択する）、そしてそれらの標的の発現をサイレンシングする能力について分析した。スコアリングに加えて、ＢＬＡＳＴ検索を各々のｓｉＲＮＡについて行なった。オフターゲットサイレンシング効果についての能力を最小化するため、未関連の配列に対して４つ以上のミスマッチを有する標的配列のみを選択した。Ｓｅｍｉｚａｒｏｖら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００：６３４７．これらの二重鎖を個々に、そして４つのプール中で分析して、無作為に選択したいくつかのｓｉＲＮＡと比較した。コントロールに比較した標的遺伝子ノックダウンの割合として機能性を測定した。この方法によって記載されたとおり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてＨＥＫ２９３中に１００ｎＭを超える濃度で、全てのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。標的遺伝子発現のレベルを上記のようにＢ−ＤＮＡによって評価して、非特異的コントロールに対して標準化した。図１０は、本明細書に開示したアルゴリズムによって選択されたｓｉＲＮＡが無作為に選択されたｓｉＲＮＡよりも有意に強力であったことを示す。このアルゴリズムによって、Ｆ５０  ｓｉＲＮＡを同定する機会は４８％から９１％に増大し、Ｆ８０  ｓｉＲＮＡについては１３％から５７％に増大した。さらに、ＳＭＡＲＴ
ｓｉＲＮＡのプールは、選択された標的を無作為に選択されたプールよりも良好にサイレンシングする（図１０Ｆを参照のこと）。
【０１７３】
（実施例ＩＩＩ．クラスリン依存性エンドサイトーシスに関与する遺伝子を用いるアルゴリズムのバリデーション）
クラスリン媒介性エンドサイトーシス経路の成分は、細胞内シグナル伝達を調節するのに重要であり、疾患において重要な役割を果たす。混合系統白血病（Ｍｉｘｅｄ−Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＭＬＬ）遺伝子とＣＡＬＭ（クラスリンアセンブリリンパ系骨髄系白血病遺伝子（Ｃｌａｔｈｒｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｇｅｎｅ）との間の融合転写物を生じる染色体再配列は、白血病誘発においてある役割を果たすと考えられる。同様に、エンドサイトーシスに関与すると考えられる遺伝子である、Ｒａｂ７およびＲａｂ９、ならびにＨＩＰ１（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ相互作用タンパク質）における分裂は、それぞれ脂質貯蔵および神経性疾患を生じる病気の原因である可能性が高い。これらの理由によって、クラスリンおよびクラスリン媒介性エンドサイトーシス経路に関与する他の遺伝子に対して指向されるｓｉＲＮＡは、潜在的に重要な研究および治療のツールである。
【０１７４】
クラスリン媒介性エンドサイトーシス経路に関与する遺伝子に対して指向されるｓｉＲＮＡは、式ＶＩＩＩを用いて選択された。標的された遺伝子は、クラスリン重鎖（ＣＨＣ、アクセッション番号ＮＭ＿００４８５９）、クラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＣａ、ＮＭ＿００１８３３）、クラスリン軽鎖Ｂ（ＣＬＣｂ、ＮＭ＿００１８３４）、ＣＡＬＭ（Ｕ４５９７６）、ＡＰ−２のβ２サブユニット（β２、ＮＭ＿００１２８２）、Ｅｐｓ１５（ＮＭ＿００１９８１）、Ｅｐｓ１５Ｒ（ＮＭ＿０２１２３５）、ダイナミンＩＩ（ＤＹＮＩＩ、ＮＭ＿００４９４５）、Ｒａｂ５ａ（ＢＣ００１２６７）、Ｒａｂ５ｂ（ＮＭ＿００２８６８）、Ｒａｂ５ｃ（ＡＦ１４１３０４）およびＥＥＡ．１（ＸＭ＿０１８１９７）であった。
【０１７５】
各々の遺伝子について、最高のスコアを有する４つのｓｉＲＮＡ二重鎖を選択して、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴデータベースを用いてそれらの各々についてＢＬＡＳＴ検索を行った。オフターゲットサイレンシング効果の能力を最小限にするため、未関連の配列に対して４つ以上のミスマッチを有する配列のみを用いた。２’−ＡＣＥ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０００，３１７：３の変法を用いて、全ての二重鎖をＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．で３’−ＵＵオーバーハングを有する２１マーとして合成して、アンチセンス鎖を化学的にリン酸化して活性の最大化を保証した。
【０１７６】
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、抗生物質およびグルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。トランスフェクションの前に、ｓｉＲＮＡ二重鎖を１×ｓｉＲＮＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）中に２０μＭまで再懸濁した。４μｌの２０μＭ  ｓｉＲＮＡ二重鎖を含む３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタミン）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、１２ウェルプレート中のＨｅＬａ細胞を、２４時間の間隔で２回トランスフェクトした。単一のｓｉＲＮＡでのトランスフェクションと総量が同じになるように、２または３つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むトランスフェクションについては、各々の二重鎖の量を減らした。実験の１２時間前に細胞を正常な培養培地中にプレートし、そして最初の感染後２または４日後にタンパク質レベルを測定した。
【０１７７】
当量の溶解液を電気泳動によって分離して、ブロットして、標的タンパク質に特異的な抗体、ならびに未関連のタンパク質であるＰＰ１ホスファターゼおよびＴｓｇ１０１に対して特異的な抗体を用いて染色した（図示せず）。この細胞を以前に記載されたように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／グリセロール可溶化緩衝液中に溶解した。Ｔｅｂａｒ、Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ、＆Ｓｏｒｋｉｎ，Ｃｌａｔｈｒｉｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＡＬＭ）Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｌｏｃａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ−ｃｏａｔｅｄ  Ｐｉｔｓ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｌａｔｈｒｉｎ、ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｆｆｉｃ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ａｕｇ  １９９９，１０：２６８７。細胞溶解物を電気泳動して、ニトロセルロース膜に転写して、いくつかの抗体を用いてウエスタンブロットを行い、続いて増感化学発光システム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ）を用いて検出した。いくつかのｘ線フィルムを分析して、化学発光シグナルの直線的範囲を決定して、デンシトメトリーおよびＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ｖ５．５ソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて定量を行なった。Ｅｐｓ１５Ｒ標的化ｓｉＲＮＡを用いた実験では、細胞溶解液をＡｂ８６０を用いる免疫沈降に供して、上記のようにウエスタンブロットによって、Ｒｐｓ１５Ｒを免疫沈降で検出した。
【０１７８】
ウエスタンブロットによって各々のタンパク質のレベルを評価するための抗体は以下の供給源から得た：クラスリン重鎖に対するモノクローナル抗体（ＴＤ．１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した；ダイナミンＩＩに対するポリクローナル抗体は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）から入手した；ＥＥＡ．１およびＲａｂ５ａに対するモノクローナル抗体は、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した；Ｔｓｇ１０１に対するモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した；ＧＦＰに対するモノクローナル抗体は、ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）からであった；ウサギポリクローナル抗体である、αアダプチンに特異的なＡｂ３２およびＣＡＬＭに特異的なＡｂ２０は、以前にＳｏｒｋｉｎら、Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＡＰ−２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｎ  １９９５，２７０：６１９に記載されており、クラスリン軽鎖ＡおよびＢに対するポリクローナル抗体は、Ｆ．Ｂｒｏｄｓｋｙ博士（ＵＣＳＦ）から寄贈された；ＰＰ１（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびα−アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するモノクローナル抗体は、Ｍ．Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ）から寄贈された；Ｅｐｓ１５  Ａｂ５７７およびＥｐｓ１５Ｒ  Ａｂ８６０は、Ｐ．Ｐ．Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ博士（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から寄贈された。
【０１７９】
図１１は、１２の遺伝子を標的とする式ＶＩＩＩ（それらのほとんどが、式ＩＸによって組み込まれる基準を同様に満たす）を用いて選択された４８個の個々のｓｉＲＮＡのインビボ機能性を実証する。ｓｉＲＮＡ二重鎖（Ｄｕｐ１−４）またはｓｉＲＮＡ二重鎖のプール（Ｐｏｏｌ）を用いて種々の細胞株をトランスフェクトして、ＣＡＬＭ（２日後）およびβ２（４日後）以外はトランスフェクションの３日後に細胞を溶解した。
【０１８０】
β２アダプチンよりもわずかに遅く流れるβ１アダプチンバンド（ＡＰ−１ゴルジアダプター複合体の一部）に注意のこと。ＣＡＬＭは、２つのスプライスバリアントである６６ｋＤおよび７２ｋＤを有する。全長Ｅｐｓ１５Ｒ（約１３０ｋＤの２倍）および約１００ｋＤおよび約７０ｋＤのいくつかの短縮スプライシング形態をＥｐｓ１５Ｒ免疫沈降で検出した（矢印で示す）。細胞をトランスフェクションの３日後に溶解した。等量の溶解物を電気泳動によって分離して、標的とされるタンパク質に特異的な抗体（ＹＦＰ融合タンパク質のＧＦＰ抗体）および未関連のタンパク質ＰＰ１ホスファターゼまたはα−アクチンに特異的な抗体、およびＴＳＧ１０１とともにブロットした。各々の特異的なバンドにおけるタンパク質の量を、ゲルの各々のレーンにおける非特異的なタンパク質の量に対して標準化した。それらのうちのほぼ全てが機能的であるようであり、これによって式ＶＩＩＩおよびＩＸを用いて、ゲノムワイドの様式で一般にｓｉＲＮＡの機能性を予測できることが確立される。
【０１８１】
Ｒａｂ５ｂまたはＲａｂ５ｃを有する黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）（ＹＦＰ−Ｒａｂ５ｂまたはＹＦＰ−Ｒａｂ５ｃ）の融合を行なうため、５’末端に導入されたＳａｃＩ制限部位および３’末端に導入されたＫｐｎＩ部位を有するＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるＰＣＲによって、全長ヒトＲａｂ５ｂまたはＲａｂ５ｃをコードするＤＮＡフラグメントを得て、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にクローニングした。ＧＦＰ−ＣＡＬＭおよびＹＦＰ−Ｒａｂ５ａは、以前にＴｅｂａｒ、Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ、＆Ｓｏｒｋｉｎ，Ｃｌａｔｈｒｉｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＡＬＭ）Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｌｏｃａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｃｏａｔｅｄ  Ｐｉｔｓ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｌａｔｈｒｉｎ、ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｆｆｉｃ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ａｕｇ  １９９９，１０：２６８７に記載されている。
【０１８２】
（実施例ＩＩＩ．Ｅｇ５、ＧＡＤＰＨ、ＡＴＥ１、ＭＥＫ２、ＭＥＫ１、ＱＢ、ラミンＡ／Ｃ、ｃ−ｍｙｃ、ヒトサイクロフィリンおよびマウスサイクロフィリンを用いるアルゴリズムのバリデーション）
疾患の病因において潜在的に重要な役割を果たすとして、多数の遺伝子が同定されている。正常なおよび疾患状態の腎臓の発現プロフィールは、一般的な腎糸球体疾患である免疫グロブリンＡ神経障害に関与するＥｄｇ５を有する。Ｍｙｃ１、ＭＥＫ１／２および他の関連のキナーゼは１つ以上のガンに関連しているが、ラミンは、筋ジストロフィーおよび他の疾患に関与している。これらの理由のために、これらのクラスの分子をコードする遺伝子に対向されるｓｉＲＮＡは、重要な研究および治療のツールである。
【０１８３】
図１２は、式ＶＩＩＩに従って選択され、個々にそしてＨＥＫ２９３細胞におけるプールとしてアッセイされた１０個の異なる遺伝子（配列およびアクセッション番号の情報については表Ｖ）を標的とする４つのｓｉＲＮＡを図示する。ｓｉＲＮＡが誘導したサイレンシングのレベルは、Ｂ−ＤＮＡアッセイを用いて測定した。これらの研究によって、試験した４０個の個々のＳＭＡＲＴ選択ｓｉＲＮＡのうち３６個が機能的であり（９０％）、そして１０個全てのプールが完全に機能的であることを示した。
【０１８４】
（実施例Ｖ．Ｂｃｌ２を用いるアルゴリズムのバリデーション）
Ｂｃｌ−２は、約２５ｋＤで、２０５〜２３９アミノ酸の抗アポトーシスタンパク質であって、これはＢＣＬＸ、ＭＣＬ１、ＢＡＸ、ＢＡＤおよびＢＩＫを含むＢＣＬファミリーの他のメンバーとかなりの相同性を有する。このタンパク質は、少なくとも２つの形態で存在し（膜固定のための疎水性テールを有するＢｃｌ２ａ、および疎水性テールを欠くＢｃｌ２ｂ）、そしてミトコンドリア膜に主に局在する。Ｂｃｌ２発現は広範に分布しているが、Ｂ細胞およびＴ細胞におけるこの分子の発現に対して特に関心が集中している。Ｂｃｌ２発現は、正常な胚中心Ｂ細胞でダウンレギュレートされるが、濾胞性リンパ腫では高い割合で、Ｂｃｌ２発現が上昇することが観察されている。細胞研究によって、これらのリンパ腫のうち高い割合（＞７０％）で共通の転位（（１４；１８）（ｑ３２；ｑ３２））が同定されている。この遺伝子病変は、配列をコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子（ＩｇＨ）に対して近位にＢｃｌ２遺伝子を置き、そして不適切なレベルの遺伝子発現を強制し、胚中心Ｂ細胞におけるプログラムされた細胞死に対して耐性であると考えられる。他の場合、Ｂｃｌ２プロモーターの低メチル化によって、発現の増大、およびここでもアポトーシスの阻害がもたらされる。Ｂｃｌ２の無調節の発現は、ガンに加えて、複数の硬化症および種々の神経学的疾患と相関している。
【０１８５】
Ｂｃｌ−２転位とガンとの間の相関によって、この遺伝子はＲＮＡｉに対する魅力的な標的となる。ｂｃｌ２転写物（またはＢｃｌ２−ＩｇＨ融合物）に対するｓｉＲＮＡの同定によって、Ｂｃｌ２遺伝子機能についての本発明者らの理解はさらに深まり、この遺伝子の発現または機能の変化から生じる疾患と戦う次世代の治療因子が得られる可能性がある。
【０１８６】
（機能的なｓｉＲＮＡのインシリコ同定）
Ｂｃｌ２遺伝子に対する機能的および超機能的なｓｉＲＮＡを同定するために、Ｂｃｌ−２の配列をＮＣＢＩ  Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースからダウンロードして、式ＶＩＩＩのアルゴリズムを用いて分析した。これらの手順の結果として、Ｂｃｌ２  ｓｉＲＮＡの配列およびＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭの両方を得て、その機能性に従ってランク付けした。引き続き、これらの配列をＢＬＡＳＴ（データベース）に供して、選択された配列が特異的であり、未関連の遺伝子との重複は最小限にしか含まないことを確認した。上の１０個のＢｃｌ−２  ｓｉＲＮＡについてのＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭを図１３に特定する。
【０１８７】
（Ｂｃｌ−２  ＳｉＲＮＡのインビトロ試験）
上の１０個のＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭを有するＢｃｌ−２  ｓｉＲＮＡを選択して、機能的なアッセイで試験してサイレンシング効力を決定した。これを達成するために、２’−Ｏ−ＡＣＥ化学を用いて各々１０個の二重鎖を合成して、１００ｎＭ濃度で細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞抽出物でアッセイを行なって、標的サイレンシングの程度を調べた。これらの実験で用いたコントロールは、ニセ（ｍｏｃｋ）のトランスフェクトされた細胞、および非特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトされた細胞を含んだ。
【０１８８】
これらの実験の結果を以下（および図１４）に示しており、選択されたｓｉＲＮＡのうち１０個全てが１００ｎＭの濃度でＢｃｌ２メッセンジャーの８０％以上のサイレンシングを誘導することを示す。これらのデータによって、このアルゴリズムが機能的Ｂｃｌ２
ｓｉＲＮＡを首尾よく同定して、実験および治療の環境で用いることができる１セットの機能的因子を提供することを証明する。
【０１８９】
【数５】
2010187668.tif 000017
【０１９０】
Ｂｃｌ２  ｓｉＲＮＡ：センス鎖、５’→３’
（実施例ＶＩ．アルゴリズムによって選択される配列）
対応するランク付けを用いて式（アルゴリズム）ＶＩＩＩおよび式ＩＸを用いて選択したｓｉＲＮＡの配列であって、本研究においてインビボでサイレンシング活性を評価した配列（それぞれ、式ＶＩＩＩおよびＩＸ）。
【０１９１】
【表５−１】
2010187668.tif 000018
【０１９２】
【表５−２】
2010187668.tif 000019
【０１９３】
【表５−３】
2010187668.tif 000020
【０１９４】
【表５−４】
2010187668.tif 000021
【０１９５】
（実施例ＶＩＩ．アルゴリズムのゲノムワイドの適用）
上記の実施例によって、このアルゴリズムは機能的ｓｉＲＮＡを首尾よく同定できること、およびこれらの二重鎖を用いて転写ノックダウンまたはノックアウトの所望の表現型を誘導することを示す。各々の生物体における各々の遺伝子または遺伝子ファミリーは、生理学的ホメオスターシスを維持するのに重要な役割を果たし、このアルゴリズムは、各々の遺伝子に対して機能的な、高度に機能的な、または超機能的なｓｉＲＮＡを開発するのに用いることができる。ヒトゲノムについてこれを達成するために、オンラインｎｃｂｉ  ｒｅｆｓｅｑデータベース全体をＥｎｔｒｅｚ（ｅｆｅｔｃｈ）によってアクセスした。このデータベースを、式ＶＩＩＩによって処理した。各々の遺伝子についてｓｉＲＮＡのトップの８０〜１００のスコアを得て、ＢＬＡＳＴして、選択された配列が選り抜きの遺伝子を標的とするのに特異的であることを確認した。これらの配列を、電子的形態で同封のＣＤに提供する。従って、出願人らは、これとともに提出される物質を参考として、ＣＯＰＹ１−ＴＡＢＬＥＳ  ＰＡＲＴ、ＤＩＳＫ  １／１、ＴＡＢＬＥＳ  １２〜１５、ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）のもとでＲＯ／ＵＳで提出した、オペレーティング・システム：ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標），ＣＯＰＹ  ２−ＴＡＢＬＥＳ  ＰＡＲＴ，ＤＩＳＫ  １／１、ＴＡＢＬＥＳ  １２〜１５、ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）のもとでＲＯ／ＵＳで提出した、オペレーティング・システム：ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＣＯＰＹ  ３−ＴＡＢＬＥＳ  ＰＡＲＴ，ＤＩＳＫ  １／１、ＴＡＢＬＥＳ  １２−１５、ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）のもとでＲＯ／ＵＳで提出した、オペレーティング・システム：ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）と表示したコンパクトディスクに複製して組み込む；このコピーは、３１，０４５ｋｂのサイズを有する、作成日２００３年６月２６日のＴａｂｌｅ＿１２．ｔｘｔ；７８，４５１ｋｂのサイズを有する、作成日２００３年１１月１３日のＴａｂｌｅ＿１３．ｔｘｔ；４５４ｋｂのサイズを有する、作成日２００３年１１月１３日のＴａｂｌｅ＿１４．ｔｘｔ；１，６９０ｋｂのサイズを有する、作成日２００３年１１月１３日のＴａｂｌｅ＿１５．ｔｘｔと題されたファイル；において同一である。
【０１９６】
このディスクに関して、各々のディスクコピーに４つの表がテキスト形式で存在する：表ＸＩＩ−ＸＶ。Ｔａｂｌｅ＿１２．ｔｘｔ．と題されたファイルにある表ＸＩＩは、分析された標的について最高の相対的ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭを有するとして式ＶＩＩＩによって同定された、各々の標的についての８０〜１００の配列のリストを示す。Ｔａｂｌｅ＿１３．ｔｘｔ．と題されたファイルに位置する表ＸＩＩＩは、ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅＴＭを示しており、そして各々の遺伝子について、４つの配列までのプールのピックアップを示す。（表ＸＩＩＩにおける「１」という表示は、これが１プールのピックアップであることを意味する）。これらのプールのピックアップの配列は、対応する標的の最も機能的なｓｉＲＮＡを示す。プールのピックアップ配列のうちいずれの１、２、３または４を遺伝子サイレンシングに用いてもよい。さらにプールのピックアップ配列として示されないが、ただしコンパクトディスクに含まれる配列も単独で、または他の配列と組み合わせてのいずれかで遺伝子サイレンシングに用いることができる。しかし、それらの個々の相対的機能性は、プールのピックアップ配列の機能性よりも低い。Ｔａｂｌｅ＿１４．ｔｘｔ．と題されたファイルに位置する表ＸＩＶは、アクセッション番号による遺伝子の同定を示しており、そしてＴａｂｌｅ＿１５．ｔｘｔ．と題されたファイルにある表ＸＶは、このディスクで同定される遺伝子の短い名前を示す。このディスクに含まれる情報は、本特許出願の一部であり、本明細書に参考として援用される。機能的であるとして挙げられている目的の遺伝子およびｓｉＲＮＡを簡単にみつけることにより、本明細書に提供される遺伝子の機能的ｓｉＲＮＡを同定するために、これらの表を用いることができる。好ましくは、目的の標的について最も適しており、プールのピックアップとして示されるｓｉＲＮＡの１つ以上を選択する。
【０１９７】
表ＸＩＩ：式ＶＩＩＩによって選択されたｓｉＲＮＡ
ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）に従ってＣＤ−ＲＯＭに同封して提出されたデータを参照のこと。
【０１９８】
表ＸＩＩＩ：ＳＭＡＲＴｓｃｏｒｅｓＴＭ
ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）に従ってＣＤ−ＲＯＭに同封して提出されたデータを参照のこと。
【０１９９】
表ＸＩＶ：標的の同定
ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）に従ってＣＤ−ＲＯＭに同封して提出されたデータを参照のこと。
【０２００】
表ＸＶ：標的の説明
ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）に従ってＣＤ−ＲＯＭに同封して提出されたデータを参照のこと。
【０２０１】
開示されたｓｉＲＮＡが関係する遺伝子の多くが、疾患の病因論において重要な役割を果たす。この理由によって、添付のコンパクトディスクに挙げたｓｉＲＮＡは、治療剤として作用する可能性がある。多数の予言的な実施例によれば、添付のＣＤで同定されるｓｉＲＮＡの観点が理解できるはずである。これらのｓｉＲＮＡを単離するため、各々の遺伝子についての適切なメッセンジャー配列を、前述の式のうちの１つ（特に式ＶＩＩＩ）を用いて分析して、潜在的なｓｉＲＮＡ標的を同定する。引き続き、これらの標的をＢＬＡＳＴに供して、潜在的にオフターゲットとの相同性を排除する。
【０２０２】
潜在的な疾患標的のリストは広範囲である。例えば、Ｂｃｌ１０の過剰発現は、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連のリンパ組織のリンパ腫）の発達に関与しており、従って、その遺伝子に対して指向する機能的、高度に機能的、または超機能的なｓｉＲＮＡ
【０２０３】
【数６】
2010187668.tif 000022
は、この障害の処置に寄与し得る。
【０２０４】
別の例では、グルタミン：フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ（ＧＧＡ）を阻害する分子は、ＩＩ型糖尿病によって被る症状を制限するように作用し得るということが研究によって示されている。従ってＧＦＡに対向する機能的、高度に機能的、または超機能的なｓｉＲＮＡ（以下としても公知である：
【０２０５】
【数７】
2010187668.tif 000023
は、この障害の処置に寄与し得る。
【０２０６】
別の実施例では、ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）腫瘍サプレッサーは、散発性腎臓明細胞癌（ＲＣＣ）およびＶＨＬ病に関連するＲＣＣにおいて高頻度で不活性化されることを観察した。ＶＨＬ腫瘍サプレッサーは、ユビキチン化および分解のための、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現を誘導し得る転写因子である低酸素誘導性因子−１α（ＨＩＦ−１α）を標的とする。ＶＨＬの不活性化は、ＨＩＦ−１αのレベルの増大、および引き続くＶＥＧＦ過剰発現をもたらし得る。ＶＥＧＦのこのような過剰発現は、ＲＣＣにおいて観察される血管分布の増大（そしておそらくは必須）を説明するために用いられている。従って、いずれかのＨＩＦ−１α
【０２０７】
【数８】
2010187668.tif 000024
に対して指向する機能的、高度に機能的、または超機能的なｓｉＲＮＡは、腎細胞癌の処置に有用であり得る。
【０２０８】
別の実施例では、血小板由来増殖因子ＡおよびＢ（ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂ）の遺伝子発現は、糖尿病性ネフロパシーを有する患者から採取した腎組織において、コントロールと比較した場合、それぞれ２２倍および６倍増大していることを観察している。これらの知見によって、ＰＤＧＦ  ＡおよびＢの過剰な発現が、ヒト糖尿病性腎疾患を特徴付ける進行性の線維症の発達においてある役割を果たし得るということが示唆される。従って、ＰＤＧＦ  Ａ
【０２０９】
【数９】
2010187668.tif 000025
または
ＰＤＧＦ  Ｂ
【０２１０】
【数１０】
2010187668.tif 000026
のいずれかに対して指向する機能的、高度に機能的、または超機能的なｓｉＲＮＡは、この形態の腎障害の処置に有用であり得る。
【０２１１】
別の例では、グルコーストランスポーター（例えば、ＧＬＵＴ１２）の過剰発現と癌細胞との間に強力な相関関係が存在する。制御されない細胞増殖を受けている細胞がＧＬＵＴ分子をアップレギュレートし、その結果ＧＬＵＴ分子は増殖および転移の速度の上昇に関連した高調されたエネルギー必要性に対処できるということを予想する。従って、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１：ｓｉＲＮＡ＝
【０２１２】
【数１１】
2010187668.tif 000027
としても公知）
ＧＬＵＴ１２（ＳＬＣ２Ａ１２：ｓｉＲＮＡ＝
【０２１３】
【数１２】
2010187668.tif 000028
としても公知）、および他の関連のトランスポーターのような分子を標的とするｓｉＲＮＡベースの治療剤は、多数の悪性腫瘍を処置するのに有用なものであり得る。
【０２１４】
上記に列挙したｓｉＲＮＡを、５’→３’のセンス鎖方向に提示する。さらに、上記に挙げた標的に対抗するｓｉＲＮＡ、ならびに他の標的に対向するｓｉＲＮＡおよび添付のコンパクトディスクに挙げたｓｉＲＮＡは、治療剤として有用であり得る。
【０２１５】
（実施例ＶＩＩＩ．プールの利点に関する証拠）
プールの利点についての証拠を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼを用いて実証している。標準的なレポーター遺伝子の１つ：ホタルルシフェラーゼに対してＤｈａｒｍａｃｏｎ独自のＡＣＥ（登録商標）化学を用いて、９０個のｓｉＲＮＡ二重鎖を合成した。この二重鎖は、２塩基対離れて開始して、かつルシフェラーゼ遺伝子の約１８０塩基対をカバーするように設計した（表ＩＩＩの配列を参照のこと）。引き続き、標準的なトランスフェクションプロトコールを用いてｓｉＲＮＡ二重鎖をルシフェラーゼ発現レポータープラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトして、ルシフェラーゼ活性を２４時間および４８時間でアッセイした。
【０２１６】
個々のｓｉＲＮＡのトランスフェクションによって、阻害効果の標準的な分布が示した。いくつかの二重鎖は活性であったが、その他は活性ではなかった。図１５は、２塩基対離れて位置する９０個のｓｉＲＮＡ二重鎖（配列番号００３２〜０１２０）の代表的なスクリーニングを示す。図に示唆されるとおり、ｓｉＲＮＡ二重鎖の機能性は、遺伝子内の相対的なオリゴヌクレオチド位置またはｍＲＮＡの過剰に鋭敏な部分によってよりも、オリゴヌクレオチドの特定の配列によって決定され、これは伝統的なアンチセンス技術に重要である。
【０２１７】
２つの連続するオリゴヌクレオチドを一緒にプールした場合、遺伝子サイレンシング活性の有意な増大を観察した（図１６を参照のこと）。ｓｉＲＮＡの数が３および４に増えた場合、プールの機能性の有効性および頻度の漸増を観察した（図１６、１７）。さらに、プール内のオリゴヌクレオチドの相対的位置では、特定のプールが機能的であるか否かは決定しなかった（図１８を参照のこと。ここでは、２塩基、１０塩基および２０塩基対ずつ隔たったオリゴヌクレオチドのプールのうち１００％が機能的であった）。
【０２１８】
しかし、それにもかかわらず、相対的な位置づけは、影響を有し得る。機能性の増大は、ｓｉＲＮＡが連続して頭からつまさきに位置する（一方の５’末端が他方の３’末端に直接隣接する）場合に存在し得る。
【０２１９】
さらに、試験されたｓｉＲＮＡのプールは、実験条件下でプール中の少なくともそして最高のオリゴヌクレオチドを示し、その結果を図１９に示している。さらに、以前に同定した非機能的およびわずかに（半）機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を、ある時点で５つの群に一緒にプールして、有意な機能的協調作用を観察した。（図２０を参照のこと）。実際、半活性なオリゴヌクレオチドのプールは、プール中のほとんどの強力なオリゴヌクレオチドよりも５〜２５倍機能的であった。従って、いくつかのｓｉＲＮＡ二重鎖を一緒にプールすることは、プール内の最も強力なｓｉＲＮＡの機能性を妨害せず、プールすることによって全体的な機能性の予期せぬ有意な増大が得られる。
【０２２０】
（実施例ＩＸ．種にまたがるプール）
以下の遺伝子：β−ガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、および分泌アルカリホスファターゼで実験を行ない、これによってプールすることの利点を実証する（図２１を参照のこと）。上記で特定された遺伝子をサイレンシングするようにデザインされた個々のｓｉＲＮＡのうち約５０％が機能的であったが、同じｓｉＲＮＡ二重鎖を含むプールのうち１００％が機能的であった。
【０２２１】
（実施例Ｘ．高度に機能的なｓｉＲＮＡ）
各々の２つのｓｉＲＮＡが１０〜９０％重複する５つのｓｉＲＮＡのプールで、９８％機能的な物体（＞８０％サイレンシング）が得られた。約２０〜２０００塩基対の範囲をカバーする、均一に間隔を空けたｍＲＮＡを通じて分布されたｓｉＲＮＡのプールも機能的であった。ｓｉＲＮＡのプールが、ｍＲＮＡ配列に対して連続的にヘッドからテールに位置して、Ｄｉｃｅｒが切断した長い二本鎖ＲＮＡの天然の産物を模倣した場合、プールの９８％が高い機能的な活性を証明した（＞９５％サイレンシング）。
【０２２２】
（実施例ＸＩ．ヒトサイクロフィリン）
上記の表ＩＩＩは、ヒトサイクロフィリンタンパク質のｓｉＲＮＡ配列を挙げている。特に機能的なｓｉＲＮＡを、上記の式Ｉ〜式ＶＩＩのいずれかに対してこれらの配列を適用することによって選択し得る。
【０２２３】
あるいは、これらの配列のうち２、３、４、５またはそれ以上をプールして、遺伝子をサイレンシングするためのキットを作製することができる。好ましくは、このキット内には、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを適用した場合、比較的高い予測機能性を有する少なくとも１つの配列が存在する。
【０２２４】
（実施例ＸＩＩ．ｓｉＲＮＡのサンプルのプールおよびヒト疾患に対するそれらの適用）
ヒトの疾患の背景にある遺伝的基礎は、十分考証されており、そしてｓｉＲＮＡを、検索または診断ツールおよび治療剤の両方として、個々にまたはプール中のいずれかで用い得る。シグナル伝達、免疫応答、アポトーシス、ＤＮＡ修復、細胞周期制御および種々の他の生理学的機能に関与する遺伝子は、臨床的な関連性を有し、そしてこれらの遺伝子の発現を調節し得る治療剤は、関連する症状のいくつかまたは全てを軽減し得る。いくつかの場合には、これらの遺伝子を、遺伝子の多数のファミリーまたはクラスとして記載し得、そしてｓｉＲＮＡ（無作為に、組み合わせて、または合理的にデザインされた）は、このファミリーのうち１つまたは複数のメンバーに対向して所望の結果を誘導し得る。
【０２２５】
各々の遺伝子に対して合理的にデザインしたｓｉＲＮＡを同定するために、式ＶＩＩＩを用いて配列を分析して、機能的な配列を含むＳＭＡＲＴプールを同定した。これらの配列の活性を確認するために、ｓｉＲＮＡを選り抜きの細胞型（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞）に導入して、当該分野で立証したいくつかの技術のうちの１つを用いて、適切なメッセンジャーのレベルを分析する。増強されたレベルの効力を有するｓｉＲＮＡは、前述の二重鎖の各々を徐々に制限する濃度で試験することによって同定できる。同様に、寿命のレベルが増大しているｓｉＲＮＡは、細胞へ各々の二重鎖を導入すること、およびトランスフェクションの２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間および１９２時間後に機能性を試験することによって同定できる。ナノモル未満の濃度で９５％を超えるサイレンシングを誘導し、そして／または９６時間の間、機能的なレベルのサイレンシングを誘導する因子を、超機能的であるとみなす。
【０２２６】
以下は、本明細書において記載するｓｉＲＮＡがそれに対して標的されるタンパク質のファミリーの非限定的な例である：
（トランスポーター、ポンプおよびチャネル）
トランスポーター、ポンプおよびチャネルは、ｓｉＲＮＡに対する魅力的な標的である遺伝子の１クラスを示す。トランスポーター分子の主な１つのクラスは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターである。現在のところ、ほぼ５０個のヒトＡＢＣトランスポーター遺伝子を、特徴付けており、胆汁塩、ヌクレオシド、塩化物イオン、コレステロール、毒素などの輸送を含む種々の生理学的機能に関与することを示す。この群のなかで主なものは、ＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質、ＮＰ＿０００９１８をコードする）、ＭＤＲ関連タンパク質（ＭＲＰ１−７）および乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）である。一般に、これらのトランスポーターは、共通の構造を共有し、すなわち各々のタンパク質が、１対のＡＴＰ結合ドメイン（ヌクレオチド結合領域）、ＮＢＦとしても公知）および２セットの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含み、その各々が代表的には６回膜貫通αヘリックスを含む。このクラスのトランスポーターをコードする遺伝子は、完全なトランスポーター（すなわち、２つのＴＭおよび２つのＮＢＦドメインを含む）として、またはハーフトランスポーター（ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとしてアセンブルして機能的トランスポーターを作製する）としてのいずれかで編成される。全体として、ファミリーのメンバーは、ゲノム全体に広く分布しており、真核生物の間で高い程度のアミノ酸配列同一性を示す。
【０２２７】
ＡＢＣトランスポーターは、いくつかのヒト疾患に関与している。例えば、この型の分子流出ポンプは、種々のガンおよび病原性の微生物によって示される薬物耐性の発達において主な役割を果たす。ヒトのガンの場合、ＭＤＲ１遺伝子および関連のポンプの発現の増大は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、コルヒチンを含む通常用いられる化学療法剤の広範なコレクションに対する薬物耐性が生じることを観察している。これらのトランスポーターが多剤耐性の発症に寄与することに加えて、１４の異なるトランスポーターを欠くことに関連する１３のヒトの遺伝的疾患が現在存在する。これらの条件のうち最も一般的なものとしては、嚢胞性線維症、スタルガルト病、加齢性黄斑変性症、副腎白質萎縮症、タンジール病、デュービン・ジョンソン症候群および進行性家族性肝内胆汁うっ滞が挙げられる。この理由のために、このメンバー、および関連のファミリーに対するｓｉＲＮＡは、潜在的に有益な研究および治療のツールである。
【０２２８】
チャネルに関して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ変異体の分析は、カリウム（Ｋ＋）チャネルを含む（ただしそれに限定されない）いくつかの異なるチャネルの内部の分子単離および特徴づけを可能にした。この列挙としては、電圧活性化Ｋ＋チャネルをコードするシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）（Ｓｈ）、スローポーク（ｓｌｏｗｐｏｒｋ）（Ｓｌｏ）、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルおよびエーテル（ｅｔｈｅｒ）−ａ−ｇｏ−ｇｏ（Ｅａｇ）が挙げられる。Ｅａｇファミリーはさらに３つのサブファミリー（Ｅａｇ、Ｅｌｋ（ｅａｇ様Ｋチャネル）およびＥｒｇ（Ｅａｇ関連遺伝子））に分類される。
【０２２９】
Ｅｒｇサブファミリーは、電圧活性化Ｋ＋チャネルのｓｈファミリーに遠い関連のある３つの別のファミリーメンバー（Ｅｒｇ１−３）を含む。ｓｈ同様、ｅｒｇポリペプチドは、Ｋ＋チャネルの古典的な６回膜貫通構造（Ｓ１−Ｓ６）を含むが、各々がサイクリックヌクレオチド結合ドメイン（ｃＮＢＤ）に相同なＣ末端細胞質領域に関連したセグメントを含むという点で異なる。多くの単離されたイオンチャネル変異体と同様、ｅｒｇ変異体は、ニューロンにおける自発性の反復性の発火（機能亢進）および神経筋接合部での増強されたトランスミッター放出によって生じる、温度感受性麻痺性の表現型である。
【０２３０】
ｅｒｇサブファミリーの３つのメンバー全ての組織分布に対する初期の研究によって、発現の２つの一般的パターンを示す。ｅｒｇ１およびｅｒｇ３は、ニューロン系全体にわたって広範に発現されて、心臓、上腸間膜動脈神経節、腹腔神経節、網膜および脳において観察される。対照的に、ｅｒｇ２は、かなり限定された発現パターンを示し、腹腔神経節および上腸間膜動脈神経節においてのみ観察する。同様に、３つのｅｒｇカリウムチャネルの動態的特性は、相同ではない。ｅｒｇ１チャネルおよびｅｒｇ２チャネルは比較的遅い活性化遅延整流器であるが、ｅｒｇ３電流は、急速に活性化して、次いで主に一過性の成分を示し、これが持続性のプラトーに減衰する。３つ全てのチャネルの電流特性は、メタンスルホン酸塩化物に感受性であり、これによって、３つ全てのタンパク質の細孔構造における高い程度の保存を示唆する。
【０２３１】
近年、Ｋ＋チャネルのｅｒｇファミリーを、ヒト疾患に結び付ける。ｅｒｇ１が心臓で発現されるという観察に一致して、一本鎖高次構造の多形性およびＤＮＡ配列の分析によって、心室性頻脈による突然死を生じる遺伝性の障害である６つのＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）ファミリーにおいてＨＥＲＧ（ヒトｅｒｇ１）変異体が同定されている。従って、この群の分子（例えば、ＫＣＮＨ１−８）に対向するｓｉＲＮＡは、極度の治療価値のものである。
【０２３２】
ｓｉＲＮＡの潜在的な標的であるチャネルの別の群は、種々の組織におけるＣａ２＋活性化Ｃｌ−伝導性を媒介するＣＬＣＡファミリーである。現在まで、２つのウシ（ｂＣＬＣ１；ｂＣＬＣＡ２（Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１））、３つのマウス（ｍＣＬＣＡ１；ｍＣＬＣＡ２；ｍＣＬＣＡ３）および４つのヒト（ｈＣＬＣＡ１；ｈＣＬＣＡ２；ｈＣＬＣＡ３；ｈＣＬＣＡ４）のＣＬＣＡファミリーのメンバーを単離しており、そしてトランスフェクトされたヒト胚性腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞を用いたパッチクランプ研究によって、ｂＣＬＣＡ１、ｍＣＬＣＡ１およびｈＣＬＣＡ１は、アニオンチャネルブロッカーＤＩＤＳおよび還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって阻害され得るＣａ２＋活性化Ｃｌ−伝導性を媒介することを示している。
【０２３３】
タンパク質のサイズ、構造およびプロセシングは、異なるＣＬＣＡファミリーメンバーの間で同様であるとみられ、Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１について最も詳細に研究されている。Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１オープンリーディングフレームは、１３０ｋＤａの前駆体糖タンパク質をコードし、これが９０ｋＤａのアミノ末端切断産物および一群の３０〜４０ｋＤａの糖タンパク質にプロセシングされるが、これはそのカルボキシ末端に由来する単一のポリペプチドのグリコシル化改変体である。両方のサブユニットが細胞外面に関連するが、９０ｋＤａのサブユニットのみが４つの膜貫通ドメインを介して細胞膜に結合されると考えられる。
【０２３４】
タンパク質のプロセシングおよび機能は、ＣＬＡＣホモログの間で保存されるようであるが、その組織発現パターンには有意な相違が存在する。例えば、ウシＬｕ−ＥＣＡＭ−１は、主に血管内皮において発現され。ｂＣＬＣＡ１は、気管において排他的に検出され、そしてｈＣＬＣＡ１はヒト腸上皮細胞のサブセットにおいて選択的に発現される。従って、新しい図は、電位依存性Ｃｌ−チャネルのＣＩＣファミリーと同様の、高度に組織特異的な膜を有する多重遺伝子ファミリーのものである。このヒトチャネルであるｈＣＬＣＡ２は、医学的および薬理学的観点から特に興味深い。ＣＬＣＡ２は、肺血管内皮の管腔表面において発現し、肺の転移性癌細胞について接着性分子として機能し、従って血管の阻害および肺のコロニー形成を媒介する。正常な哺乳動物上皮におけるこの分子の発現は、ヒト乳癌において、そしてほぼ全ての腫瘍化乳癌細胞株において一貫して失われている。さらに、ヒト乳癌細胞におけるｈＣＬＣＡ２の再発現は、ヌードマウスにおける腫瘍形成能を抑止し、このことは、ｈＣＬＣＡ２が乳癌において腫瘍サプレッサーとして機能するということを意味する。これらの理由によって、ＣＬＣＡファミリーメンバーおよび関連のチャネルに対向するｓｉＲＮＡは、研究および治療の立場で有用であることが証明され得る。
【０２３５】
（シナプス伝達に関与するトランスポーター）
シナプス伝達は、シナプス間隙への神経伝達物質の放出、シナプス後レセプターとのその伝達物質の相互作用、および間隙からの神経伝達物質の引き続く除去に関与する。ほとんどのシナプスでは、シグナルは、シナプス前末端への神経伝達物質の急速な再蓄積によって終結される。このプロセスは、シナプス前細胞の原形質膜を横切るナトリウムの電気化学的勾配によってしばしば活発にされる特定の神経伝達物質トランスポーターによって特徴付けられる。
【０２３６】
アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、中枢神経系における主な阻害性神経伝達物質である。ＧＡＢＡの阻害性作用は、ＧＡＢＡＡ／ＧＡＢＡＢレポーターを通じて媒介されて、そして、ＧＡＢＡトランスポーター（ＧＡＴ）、ニューロンのシナプス周囲に位置する一体型膜タンパク質、およびグリアによって調節される。これまでのところ、４つの異なるキャリア（ＧＡＴ１〜ＧＡＴ４）がクローニングされており、その細胞分布が部分的に解明されている。比較配列分析によって、ＧＡＢＡトランスポーターは、ガンマアミノ酪酸トランスポーター、ノモアミントランスポーター、アミノ酸トランスポーター、特定の「オーファン」トランスポーター、および近年発見された細菌のトランスポーターを含む神経伝達物質取り込みに関与するいくつかの他のタンパク質に関連することが明らかになっている。これらのタンパク質の各々は、類似の１２膜貫通ヘリックスのトポロジーを有し、輸送機能のためのＮａ＋／Ｃｌ−勾配に依存する。輸送速度は、基質濃度に依存性であり、輸送のための最大半減有効濃度は、マイクロモル未満から低いマイクロモルの範囲で頻繁に生じる。さらに、輸送機能は、双方向性であり、伝達物質の非小胞性の流出は、周囲の細胞外伝達物質のレベルに寄与し得る。
【０２３７】
近年の証拠によって、ＧＡＢＡトランスポーターおよび神経伝達物質トランスポーターが一般に、神経のシグナル伝達の調節において受動的な働くものではなく；むしろ、トランスポーター機能は、種々の開始要因およびシグナル伝達カスケードによって変更され得るということが示唆される。一般に、この機能的な調節は、トランスポーターを通じる伝達物質の流入の速度の変化すること、または原形質膜における機能的なトランスポーターの数を変化することのいずれかによる、２つの方法で生じる。トランスポーター調節における再発生のテーマは、細胞内位置と細胞表面との間のトランスポータータンパク質の急速な再分布である。一般に、この機能的な調節は、キナーゼ、ホスファターゼ、アラキドン酸およびｐＨのような第二のメッセンジャーの活性化を通じて部分的には生じる。しかし、トランスポーターリン酸化およびトランスポーター再分布の背景にある機構は、まだ完全には解明されていない。
【０２３８】
ＧＡＢＡトランスポーターは、側頭葉てんかんを含む多数のヒト疾患において病態生理学的な役割を果たし、薬理学的な介入の標的である。てんかん発作感受性動物における研究によって、ＧＡＴトランスポーターのいくつか（ただし全てではない）が、てんかん発作の前後の時点で発現のレベルを変更したことが示され、このことは、このクラスのトランスポーターがてんかん発作に影響し得ること、およびてんかん発作後の変化がてんかん発作活性を調節することに対する代償性の応答であり得ることを示唆する。これらの理由のために、この遺伝子のファミリーのメンバー（ＳＬＣＧ６Ａ１−１２を含むがこれに限定されない）に対向するｓｉＲＮＡは、価値のある研究および治療のツールであることが証明され得る。
【０２３９】
（有機性イオントランスポーター）
ヒトの身体は、食物、薬物、職業および環境を介して、多様な生体異物に継続して曝されている。腎臓、肝臓、および腸のような排泄器官は、これらの化合物の潜在的に有害な影響に対して、それらを活性の低い代謝物に変換して、それを引き続き身体系から分泌させることによって、身体を防御する。
【０２４０】
生体異物およびその代謝物のキャリア媒介性の輸送は、有機のアニオンおよび陽イオンの能動的な分泌のために存在する。両方のシステムは、重複する基質特異性を有する複数のトランスポーターの存在から生じる特性である、高いクリアランス能力および受容される物質の膨大な多様性によって特徴付けられる。有機アニオン性トランスポーターのクラスは、その多くは腎臓に特に有害である、多数の薬物（例えば、抗生物質、化学療法剤、利尿薬、非ステロイド性抗炎症薬、造影剤、細胞増殖抑制剤）；薬物代謝物（特に、グルタチオン、グルクロニド、グリシン、硫酸塩、酢酸塩を有する結合体産物）；ならびに毒薬およびその代謝物（例えば、マイコトキシン、除草剤、可塑剤、ポリハロアルカンのグルタチオンＳ結合体、ポリハロアルケン、ヒドロキノン、アミノフェノール）の排出において重要な役割を果たす。
【０２４１】
過去数年間にわたって、同定されたアニオン輸送分子の数は、大いに増えている。側底膜を横切る有機アニオン（ＯＡ−）の取り込みは、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ１）を介したαケトグルタル酸塩（α−ＫＧ２−）／ＯＡ−交換、およびＮａ＋／ジカルボキシレート同時トランスポーター（ＳＤＣＴ２）を介したナトリウム−ケトグルタル酸同時輸送を包含する、古典的なナトリウム依存性有機アニオン輸送系によって媒介される。有機アニオン輸送ポリペプチドであるＯａｔｐ１、ならびに腎特異的ＯＡＴ−Ｋ１およびＯＡＴ−Ｋ２は、促進されたＯＡ−流入を媒介する潜在的分子とみられているが、交換機構を介した再吸収にも関与し得る。最後に、ＰＥＰＴ１およびＰＥＰＴ２は、ペプチド薬の管腔取り込みを媒介し、一方、ＣＮＴ１およびＣＮＴ２は、ヌクレオシドの再吸収に関与する。
【０２４２】
有機性アニオン輸送ポリペプチド１（Ｏａｔｐ１）は、ラット肝臓からもともとクローニングされた、Ｎａ＋−およびＡＴＰ−依存性トランスポーターである。Ｏａｔｐ１遺伝子産物の組織分布および輸送特性は複雑である。Ｏａｔｐ１は、肝細胞の側底膜に局在して、Ｓ３尿細管の頂端膜に見出される。一過性にトランスフェクトされた細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）を用いた研究によって、Ｏａｔｐ１が、タウロコール酸塩、エストロン−３−硫酸塩、アルドステロン、コルチゾールなどを含む種々の分子の輸送を媒介することが示されている。Ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞において発現されたＯａｔｐ１によるタウロコール酸塩の観察された取り込みは、ＧＳＨの流入を伴い、これによって、この分子による輸送がグルタチオン依存性であり得ることが示唆される。
【０２４３】
コンピューターモデリングによって、Ｏａｔｐファミリーのメンバーが高度に保存され、疎水性であり、そして１２回膜貫通ドメインを有することが示唆される。Ｏａｔｐファミリー膜の発現の低下は、胆汁うっ滞性肝疾患およびヒト肝芽腫に関連しており、これによって、このファミリーのタンパク質は、研究者および医学分野にとって重要な目的となる。これらの自由のために、ＯＡＴファミリーメンバー（ＳＬＣ２１Ａ２、３、６、８、９、１１、１２、１４、１５および関連のトランスポーターが挙げられるがこれらに限定されない）に対向するｓｉＲＮＡは、研究および治療のツールとして潜在的に有用である。
【０２４４】
（ヌクレオシドトランスポーター）
ヌクレオシドトランスポーターは、生理学的および薬理学において重要な役割を果たす。外因性のヌクレオシドの取り込みは、プリン生合成の新生経路を欠く、骨髄および腸管上皮のような組織、ならびに特定の寄生生物体におけるヌクレオシド合成の重要な第一の工程である。ヌクレオシドトランスポーターはまた、その細胞表面レセプターの近傍におけるアデノシンの細胞外濃度をコントロールして、神経伝達および心血管の活性のようなプロセスを調節する。アデノシン自体が、心臓不整脈を処置するために臨床的に用いられ、そしてヌクレオシドは、冠血管拡張薬として機能するジピリダモール、ジラゼプおよびドラフラジンのようなインヒビターを輸送する。
【０２４５】
哺乳動物では、ヌクレオシドの原形質膜輸送は、集中的なＮａ＋依存性（ＣＮＴ）および平衡的Ｎａ＋−非依存性（ＥＮＴ）ヌクレオシドトランスポーターファミリーのメンバーによって生じる。ＣＮＴは、組織特異的様式で発現される；ＥＮＴは、ほとんど潜在的にすべての細胞型に存在し、親水性ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログがその濃度勾配を下げるという動きを担う。さらに、ＥＮＴファミリーメンバーの構造／機能の研究によって、これらの分子が、細胞内のアミノ末端および細胞外のカルボキシ末端を有する１１回膜貫通らせんセグメントを含むことが予想された。このタンパク質は、ＴＭ１と２との間の大型にグリコシル化ループ、そしてＴＭ６と７との間に大型の細胞質ループを有する。最近の研究では、ＴＭの３〜６領域は、溶質認識に中心的な役割を果たすとみなされている。ＥＮＴファミリーのタンパク質の医学的重要性は広範である。ヒトにおいては、アデノシンは、ある範囲の心保護的効果を発揮し、そしてＥＮＴのインヒビターは、種々の心臓／心血管栄養物を軽減するのに価値があると思われる。さらに、ヌクレオシドアナログ薬物に対する応答は、例えば、ガン患者のなかでかなり異なっていることが観察されている。薬物耐性のいくつかの形態は、ＡＢＣトランスポーター（例えば、ＭＤＲ１）の上方制御に関連することが示されているが、耐性は薬物取り込みの減少（すなわち、ＥＮＴ発現の減少）の結果でもあり得る。従って、ＥＮＴトランスポーターのさらに明確な理解によって、広範な悪性腫瘍を被る患者の薬物処置を最適化することが補助され得る。これらの理由のために、このクラスの分子（ＳＬＣ２８Ａ１−３、ＳＬＣ２９Ａ１−４および関連の分子を含む）に対向するｓｉＲＮＡは、治療および研究のツールとして有用であり得る。
【０２４６】
（硫酸塩トランスポーター）
全ての細胞が正常な機能のために無機硫酸塩を必要とする。硫酸塩は、ヒト血漿において４番目に豊富なアニオンであり、多くの生物体における硫黄の主な供給源である。細胞外マトリックスタンパク質の硫酸化は、正常な軟骨代謝を維持するために重要であり、そして硫酸塩は、脳に見出されるミエリン膜の重要な成分である。
【０２４７】
硫酸塩は、細胞膜の脂質二重層を受動的に横切ることができない親水性アニオンであるので、最適な供給を保証するためには全ての細胞が硫酸塩の流入および流出のための機構を要する。現在までに、多くの起源に由来する組織において、種々の硫酸塩トランスポーターが同定されている。これらとしては、腎臓硫酸塩トランスポーター（ＮａＳｉ−１およびＳｔａｔ−１）、偏在性に発現される変形性異形成硫酸塩トランスポーター（ｄｉａｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）（ＤＴＤＳＴ）、内部硫酸塩トランスポーター（ＤＲＡ）および赤血球アニオン交換体（ＡＥ１）が挙げられる。全部ではないが、これらの分子のほとんどが、アニオントランスポータースーパーファミリーのメンバーの間で通常見出される古典的な１２回膜貫通ドメイン構造を含む。
【０２４８】
近年、３つの異なる硫酸塩トランスポーターが、特定のヒト遺伝子疾患と関連している。ファミリーのメンバーである、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ２６Ａ３およびＳＬＣ２６Ａ４は、それぞれ、変形性異形症、先天性クロール下痢症（ＣＬＤ）、およびペンドレッド症候群（ＰＤＳ）において変異した疾患遺伝子として認識されている。ＤＴＤＳＴは特に複雑な障害である。この分子をコードする遺伝子は、染色体５ｑにマッピングして、代替的なエキソンの使用に起因して２つの別個の転写物をコードする。他の硫酸塩トランスポーター（例えば、Ｓａｔ−１）とは対照的に、ＤＴＤＳＴタンパク質によるアニオンの動きは、細胞外塩化物または重炭酸塩のいずれかによって顕著に阻害される。ＤＴＤＳＴ遺伝子産物の障害された機能によって、プロテオグリカンの過少硫酸化、ならびに小人症、脊椎変形、および特定の関節異常を包含する臨床的な特徴を有する劣性遺伝の骨軟骨形成異常（軟骨無発生症１Ｂ型、骨発生不全症ＩＩ型および変形性異形成）の複雑なファミリーがもたらされるが、これらに限定されない。興味深いことに、疫学的研究によって、この疾患はほとんどの集団において生じることが示されているが、明白な創始者効果のせいで特にフィンランドにおいて蔓延している。これらの理由のために、このクラスの遺伝子（ＳＬＣ２６Ａ１−９および関連の分子が挙げられるがこれらに限定されない）に対向するｓｉＲＮＡは、治療および研究の現場において潜在的に有用であり得る。
【０２４９】
（イオン交換体）
細胞内ｐＨ調節機構は、無数の細胞プロセスの維持に重要である。例えば、筋細胞では、収縮性プロセスおよび代謝性反応はｐＨによって影響される。エネルギー需要の増大および虚血の期間、筋細胞は、大量の乳酸を生じ、これは急速かつ効率的な排出がなければ筋形質の酸性化を生じる。
【０２５０】
いくつかの異なる輸送機構が進化して、比較的一定の細胞内ｐＨが維持されている。これらのプロセスの各々の相対的寄与は細胞型、細胞の代謝要件、および局所環境条件によって変化する。機能的に特徴付けられている細胞内のｐＨ調節プロセスとしては、Ｎａ＋／Ｈ＋交換、Ｎａ（ＨＣＯ３）ｎ同時輸送、およびＮａ＋−依存性および−非依存性Ｃｌ−／塩基交換体が挙げられるが、これらに限定されない。重炭酸塩およびＣＯ２は、生物学的液体の主なｐＨ緩衝剤を含むので、重炭酸ナトリウム同時輸送（ＮＢＣ）が重要である。研究によって、これらの分子が、腎臓、脳、肝臓、核膜、心臓および肺を含む多数の組織に存在することが示されており、このことはＮＢＣが上皮細胞および非上皮細胞の両方におけるＨＣＯ３−輸送を媒介するのに重要な役割を果たすことを示唆する。
【０２５１】
近年の分子クローニング実験によって、４つのＮＢＣアイソフォーム（ＮＢＣ１、２、３および４）および２つのＮＢＣ関連タンパク質であるＡＥ４およびＮＣＢＥ（アニオン交換体４およびＮａ依存性塩素イオン−重炭酸イオン交換体）の存在が同定されている。このファミリーの二次構造分析および疎水性親水性プロフィールによって、それらが１２の推定膜貫通ドメインを有する内在性膜タンパク質であることが予想され、そしていくつかのファミリーメンバーは、Ｎ連結グリコシル化部位、プロテインキナーゼＡおよびＣ、カゼインキナーゼＩＩおよびＡＴＰ／ＧＴＰ結合コンセンサスリン酸化部位、ならびにミリストイル化およびアミド化のための潜在的部位を提示する。ＡＥ４はこのファミリーのタンパク質に比較的最近追加されており、そして他のファミリーのメンバーと３０〜４８％の相同性を示す。ＣＯＳ−７細胞およびＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において発現ｎされる場合、ＡＥ４は、ナトリウム依存性およびＤＩＤＳ非感受性アニオン交換活性を提示する。交換体は種々のヒト疾患の原因であることが示されている。例えば、アニオントランスポーターファミリー（ＳＬＣ）の３つの遺伝子における変異は、軟骨形成不全（ＳＬＣ２６Ａ２、ＤＴＤ）、下痢（Ａ３、腺腫／塩素イオン損失下痢タンパク質においてダウンレギュレートされた：ＤＲＡ／ＣＬＤ）、および甲状腺腫／難聴症候群（Ａ４、ペンドリン（ｐｅｎｄｒｉｎ））を含む公知の遺伝性疾患を生じると考えられている。さらに、Ｎａ＋／ＨＣＯ３同時トランスポーターにおける変異はまた、種々のヒトの疾患に関連している。これらの理由のために、この種類の遺伝子（例えば、ＳＬＣ４Ａ４−１０および関連の遺伝子）に対向するｓｉＲＮＡは、治療目的および研究目的に有用であり得る。
【０２５２】
（シナプス伝達に関与するレセプター）
全ての脊椎動物において、高速の阻害性シナプス伝達は、神経伝達物質グリシン（Ｇｌｙ）およびγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）とそのそれぞれのレセプターとの間の相互作用の結果である。ストリキニーネ感受性グリシンレセプターは、哺乳動物の脊髄および脳幹で機能して、運動行動の調節において十分確立された役割を有するという点で特に重要である。
【０２５３】
グリシンレセプターは、ニコチン性アセチルコリンレセプター、アミノ酪酸レセプターＡ型（ＧＡＢＡＡＲ）およびセロトニンレセプター３型（５−ＨＴ３Ｒ）サブユニットを含むいくつかの他のレセプターに相同な重要な配列を提示する。リガンド依存性イオンチャネルのスーパーファミリーのメンバーとして、これらのポリペプチドは共通の位相学的特徴を共有する。グリシンレセプターは、五量体超構造に編成された２つの型のグリコシル化一体型膜タンパク質（α１−α４およびβ）から構成される。αサブユニットは大型の細胞外Ｎ末端ドメインをコードするが、これがアゴニストおよびアンタゴニスト結合に必須の構造的決定基、続いて４回膜貫通領域（ＴＭ１−ＴＭ４）を担持し、このＴＭ２は塩素イオンチャネルの内壁を形成するという重要な役割を果たす。
【０２５４】
グリシン神経伝達物質レセプターの密度、位置およびサブユニット組成は、発達の経過につれて変化する。ＧｌｙＲ遺伝子翻訳の量（Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞への発生中のラット大脳皮質ｍＲＮＡの注射によって評価した）は年齢とともに低下するが、ＧＡＢＡＲｓの遺伝子翻訳の量は増えるということが観察されている。さらに、ＧｌｙＲをコードするｍＲＮＡの型および位置は、発達の経過につれて変化する。例えば、ラットにおけるα１およびα２サブユニットの発現の研究では、（胚性期間Ｅ１１〜１８において）外套帯にはα１  ｍＲＮＡが欠けているが、胚の領域（細胞間質層）は、Ｅ１１〜１４でさらに高レベルのメッセンジャーを発現したということが観察された。出生後０日（Ｐ０）では、α１シグナルは、脊髄の灰白質全体にわたって顕著になった。対照的に、脊髄組織はＰ０において最高レベルのα２  ｍＲＮＡを提示し、これは出生後の発達とともに低下した。
【０２５５】
ヒトおよびマウスの変異体株の両方とも、ＧｌｙＲサブユニット遺伝子の変異体は、強調された驚愕応答によって特徴付けられる遺伝性の運動不全および筋緊張の増大を生じる。Ｇｌｒａ１遺伝子の病理学的対立遺伝子は、マウスの表現型である（オシレーター）ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ（ｓｐｄｏｔ）および（けいれん性）ｓｐａｓｍｏｄｉｃ（ｓｐｄ）と関連する。同様に、Ｇｌｒｂの変異体対立遺伝子は、けいれん性（ｓｐａｓｔｉｃ）マウス（ｓｐａ）の分子病理の背景であることが見出されている。マウスの状況に似て、種々のＧＬＲＡ１変異体対立遺伝子は、ヒト神経学的障害である驚愕過多症または驚愕病と関連していることが示されている。これらの理由のために、グリシンレセプター（ＧＬＲＡ１−３、ＧＬＲＢおよび関連の分子）、グルタミン酸レセプター、ＧＡＢＡレセプター、ＡＴＰレセプターおよび関連の神経伝達物質レセプター分子に対向するｓｉＲＮＡは、有用な治療および研究の試薬であり得る。
【０２５６】
（プロテアーゼ）
（カリクレイン）
プロテアーゼの重要なクラスの１つは、カリクレイン、セリンエンドペプチダーゼであり、これは、内部のアルギニルおよびリシル残基のＣ末端側で優先的にペプチド基質を切断する。カリクレインは一般に、２つの別個の群である、血漿カリクレインおよび組織カリクレインに分けられる。組織カリクレインは、遺伝子レベルおよびタンパク質レベルの両方で実質的な類似性を有する多数の群の酵素である。この群をコードする遺伝子は頻繁に、単一の染色体上で見出され、クラスターに組織化され、そして広範な組織（例えば、膵臓、卵巣、乳房）において発現される。対照的に、酵素の血漿型は、ヒトの染色体４ｑ３４−３５に位置している単一の遺伝子（例えば、ＫＬＫ３）によってコードされる。血漿カリクレインをコードする遺伝子は、肝臓において単独で発現され、これは１５エキソンを含み、そしてプレカリクレインと呼ばれるプレタンパク質として翻訳される糖タンパク質をコードする。
【０２５７】
カリクレインは、宿主の生理学的事象において重要な役割を果たすと考えられる。例えば、血漿プレカリクレイン活性化の直接的な結果は、高分子量キニノーゲン（ＨＫ）の切断、および炎症性応答の重要なメディエーターである９アミノ酸血管作動性ペプチドであるブラジキニンの引き続く遊離である。同様に、血漿カリクレインは、血液凝固および創傷治癒に重要な事象である、短鎖ウロキナーゼ活性化、ならびに引き続くプラスミノーゲン活性化を促進する。
【０２５８】
カリクレインの機能の崩壊は、腎機能および炎症性プロセスにおける不均衡を含む、種々の生理学的プロセスに関係している。この理由のために、このクラスの遺伝子（例えば、ＫＬＫ１−１５）に対向するｓｉＲＮＡは、研究および治療の両方の設定において有用であることが判明し得る。
【０２５９】
（ＡＤＡＭタンパク質）
受精の過程は、一連の別個の工程で生じ、それによって精子は、ｉ）卵丘細胞およびそれらが埋め込まれているヒアルロン酸細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、ｉｉ）ｚｏｎａ  ｐｅｌｌｕｃｉｄａ（ＺＰ）と呼ばれる卵自体のＥＣＭ、およびｉｉｉ）卵原形質膜と相互作用する。これらの相互作用の経過の間、精子の頭部の先体小胞のエクソサイトーシス（開口分泌）である「先体小胞反応」が誘導され、これによって精子はＺＰに進入して、卵黄周囲腔に近づくことが可能になる。このプロセスによって、最初の配偶子膜結合に参加し得る精子の頭部の領域である、内部先体膜および赤道部分を含む、精子の膜の新しい部分が露出する。
【０２６０】
配偶子原形質膜の相互作用は、複数のリガンドおよびレセプターに関与するようであり、そして白血球内皮相互作用に頻繁に比較される。これらの相互作用は、まとめて卵子活性化として公知の、卵における一連のシグナル伝達事象をもたらし、そして細胞内カルシウム濃度の動揺の開始、減数分裂からの退出、初回胚分裂への進行、および卵子の表層粒からのＺＰ改変酵素の放出を介した多精受精へのブロック形成を包含する。最終的に、精子および卵は、お互いに対して結合するだけではなく、膜融合も開始して、２つの細胞から１つの細胞（接合体）を作製する。
【０２６１】
精子−卵子相互作用の過程に対する研究によって、受精に重要な多数のタンパク質が同定されている。ＡＤＡＭファミリー（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ））と呼ばれるタンパク質の１クラスは、精子形成および受精、ならびに筋形成および神経発生を含む種々の発生系に重要であることが見出されている。ファミリーのメンバーは、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン（従って、（潜在的に）両方の細胞接着およびプロテアーゼ活性を有する）、ならびにシステインリッチ領域、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、膜貫通領域および細胞質テールを含む。現在、ＡＤＡＭ遺伝子ファミリーは、２９のメンバーを有して、構成要素は、脳、精巣、精巣上体、卵巣、乳房、胎盤、肝臓、心臓、肺、骨および筋肉を含む多くの組織に広範に分布する。
【０２６２】
ＡＤＡＭファミリーのうち最も研究されたメンバーの１つは、フェルチリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）である、ヘテロ二量体タンパク質は、少なくとも２つのサブユニットである、フェルチリンαおよびフェルチリンβから構成された。フェルチリンβ遺伝子（ＡＤＡＭ２）は、フェルチリンβディスインテグリンドメインをコードするエキソンに対応する標的遺伝子構築物で中断されている。この領域における中断のための雄性ホモ接合体由来の精子は、その全てが雄性生殖に寄与する、子宮から卵管への精子通過のレベルの減少、精子−ＺＰ結合の減少、および精子−卵子結合の減少を含む、精子機能の多数の面において欠損を示す。
【０２６３】
現在、４つの新規なＡＤＡＭファミリーのメンバー（ＡＤＡＭ２４−２７）が単離されている。推定アミノ酸配列によって、４つ全てがＡＤＡＭファミリーメンバーに共通の完全なドメイン組織化を含むことが示され、そしてノーザンブロット分析によって、４つ全てが精巣に特異的であることが示されている。このクラスの遺伝子（例えば、ＡＤＡＭ２および関連のタンパク質）に対抗するｓｉＲＮＡは、受精および出生コントロールに対する研究ツールおよび治療剤として有用であり得る。
【０２６４】
（アミノペプチダーゼ）
アミノペプチダーゼは、タンパク質成熟、その最終段階でのタンパク質消化、ホルモンレベルの調節、選択的または恒常性のタンパク質代謝回転、およびプラスミド安定化のようなプロセスにおいて重要な役割を果たすプロテアーゼである。これらの酵素は一般に、広範な基質特異性を有し、いくつかの形態で存在して、生理学的ホメオスターシスにおいて主な役割を果たす。例えば、ブラジキニン、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および他の血管作動性分子の効果は、内部位置でこの分子を切断して、それが同族のレセプター（例えば、ブラジキニンについて、Ｂ２レセプター）に結合する能力を排除するいくつかのペプチダーゼの１つによって弱められる。
【０２６５】
なかでもブラジキニンを切断し得る酵素は、アミノアシルプロリンアミノペプチダーゼとも呼ばれる膜結合アミノペプチダーゼＰ、プロリンアミノペプチダーゼ；Ｘ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ（真核生物）およびＸＰＮＰＥＰ２である。アミノペプチダーゼＰは、ＮＨ２末端Ｘａａ−プロリン結合に特異的なアミノアシルプロリンアミノペプチダーゼである。酵素は、ｉ）他の亜鉛メタロプロテイナーゼにおいて見出された代表的な金属結合モチーフのいずれかを欠く１亜鉛含有分子であり、ｉｉ）ＭＧペプチダーゼファミリーの他のメンバーの立体配置と類似の活性部位立体配置を有し、そしてｉｉｉ）限定はしないが肺、腎臓、脳および腸を含む種々の組織に存在する。
【０２６６】
アミノペプチダーゼは、ヒト疾患の多様な状態で重要な役割を果たす。アミノペプチダーゼＰの低い血漿濃度は、ＡＣＥインヒビターで処置した患者における血管性浮腫の発症の潜在的な素因であり、そしてアミノペプチダーゼＰのインヒビターは、限定はしないが心筋梗塞を含む他の疾患形態に対する心保護因子として機能し得る。これらの理由のために、このタンパク質ファミリー（ＸＰＮＰＥＰ１および関連のタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない）に対向するｓｉＲＮＡは、研究および治療のツールとして有用であり得る。
【０２６７】
（セリンプロテアーゼ）
プロテアーゼの１つの重要なクラスは、セリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、その活性部位において３つのアミノ酸の共通の触媒性の三つ組みを共有し（セリン（求核性）、アスパラギン酸塩（求電子性）およびヒスチジン（塩基））、そして遷移状態の共有的な触媒および優先的結合の機構を利用するエステル結合またはペプチド結合のいずれかを加水分解し得る。それらのイントロンの位置に基づいて、セリンプロテアーゼは最低４つの群に分類されているが、この群としては、１）遺伝子が触媒性の三つ組みをコードするエキソンを中断するイントロンを有さない（例えば、ハプトグロビン遺伝子）；２）各々の遺伝子が、その活性部位でヒスチジン残基のコドンからすぐ下流のイントロン、その活性部位のアスパラギン酸残基を含むエキソンから下流の第二のイントロン、および活性部位のセリンを含むエキソンからすぐ下流の第三のイントロンを含む（例えば、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カリクレインおよびプロエラスターゼ）；３）遺伝子が触媒性領域をコードするエキソンを中断するいくつかのイントロンを含む（例えば、哺乳因子Ｂ遺伝子）；そして４）遺伝子が大型のエキソンを生じる２つのイントロンを含み、これが活性部位アスパラギン酸およびセリン残基の両方を含む（例えば、第Ｘ因子、第ＩＸ因子およびプロテインＣの遺伝子）という群が挙げられる。
【０２６８】
細胞傷害性リンパ球（例えば、ＣＤ８（＋）細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）は、ウイルス感染および形質転換された細胞に対する高等生物の主な防御を形成する。これらの細胞の重要な機能は、それらがアポトーシスを受けるように誘導することによって潜在的に有害な細胞を感知して排除することである。これは、２つの原始的な経路を通じて達成されるが、その両方ともキラー細胞とその標的との間の直接だが一過性の接触を必要とする。最初の経路は、Ｆａｓ／ＣＤ９５のようなＴＮＦレセプター様分子のその同族のリガンドへの連結を含み、結果としてプロアポトーシスカスパーゼの活性化を中心とするプログラムされた細胞死の経路である従来の流動を生じる。第二の機構は、専門的なクラスの分泌小胞の毒性成分が標的細胞に導入される経路からなる。ここ２０年にわたる研究によって、毒性成分は、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって排他的に発現されるセリンプロテアーゼのファミリーである、グランザイムとして同定されている。これらの因子は特殊化した溶解性の顆粒に貯蔵されて、エンドサイトーシスを介して標的細胞に入る。カスパーゼ同様、アポトーシスにおいて重要な役割を果たすシステインプロテアーゼであるグランザイムは、酸性の残基、特にアスパラギン酸の後ろでタンパク質を切断して、レシピエント細胞においてアポトーシスを誘導し得る。
【０２６９】
グランザイムは、基質特異性に従って３つのサブファミリーに分類されている。セリンプロテアーゼキモトリプシンに類似の酵素活性を有するグランザイムファミリーのメンバーは、「チマーゼ遺伝子座」と命名された遺伝子クラスターによってコードされる。同様に、トリプシン様の特異性を有するグランザイムは、「トリプターゼ遺伝子座」によってコードされ、第三のサブファミリーは、未分枝の疎水性残基、特にメチオニンの後ろで切断して、「Ｍｅｔ−ａｓｅ遺伝子座」によってコードされる。全てのグランザイムは、チモーゲンとして合成されて、リーダーペプチダーゼのクリッピング後に、最大酵素活性が得られ、アミノ末端ジペプチドの除去に続く。
【０２７０】
グランザイムは、細胞内病原体に対する防御、宿主対移植片病、移植可能および自然発生の悪性腫瘍に対する感受性、リンパ球恒常性および自己免疫疾患の傾向を含む、多数の重要な生物学的機能において重要であることが見出されている。これらの理由のために、グランザイム（例えば、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＨＫ、ＧＺＭＭ）に対向するｓｉＲＮＡおよび関連のセリンプロテアーゼは、有用な研究および治療の試薬であり得る。
【０２７１】
（キナーゼ）
プロテインキナーゼ（ＰＫ）は、多数の生物学的プロセスに関与している。キナーゼ分子は、細胞の生理学および発達の決定を調節するのに中心的な役割を果たし、ガン、糖尿病などを含むヒト疾患の多数のリストにかかわっている。
【０２７２】
ここ３０年間にわたって、１００を超える別個のタンパク質キナーゼが同定されており、その全てに特定の細胞機能が推定されている。これらの酵素のうちの２〜３個は、インビトロの研究を行なうのに十分な純度まで単離されているが、細胞中にこれらの分子の量が少ないせいで、ほとんどは未解明のままである。この技術的な困難性に対向するために、触媒性ドメインの保存された配列を利用して密接に関連したホモログを単離する分子クローニングストラテジーによって、多数のタンパク質キナーゼが単離されている。あるいはいくつかのキナーゼが他の分子との相互作用に基づいて精製されている（そして引き続き研究されている）。
【０２７３】
ｐ５８は、ｐ３４ｃｄｃ２関連超遺伝子ファミリーのメンバーであって、細胞分裂制御キナーゼｃｄｃ２に対して高度に相同である大きなドメインを含む。この新規な細胞分裂制御関連プロテインキナーゼはもともと、半精製されたガラクトシルトランスフェラーゼの成分として同定された；従って、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ−関連プロテインキナーゼ（ＧＴＡ−キナーゼ）と呼ばれている。ＧＴＡ−キナーゼは、成体および胚の組織の両方で発現されることが見出されており、ヒストンＨ１およびカゼインを含む多数の基質をリン酸化することが公知である。十分興味深いことに、ＣＨＯ細胞におけるこの分子の過剰な発現によって、ｐ５８のレベルの上昇が分裂終期の後期および早期Ｇ１期の延長を生じることが示されており、これによって細胞終期調節におけるＧＴＡ−キナーゼの重要な役割が示唆される。
【０２７４】
（サイクリン依存性キナーゼ）
サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋｓ）は、複製の間に生じる細胞周期変遷の多くを媒介する、高度に保存されたセリン／トレオニンキナーゼのファミリーである。これらのＣｄｋ触媒性サブユニットの各々が、特有の細胞周期事象を実行するように一般に機能する別個のＣｄｋサイクリンキナーゼ複合体を生成する、サイクリンと命名された調節性サブユニットの特定のサブセットに関連する。
【０２７５】
細胞の変遷の間のＣｄｋサイクリンキナーゼの活性化は、種々の調節機構によって制御される。Ｃｄｃ２サイクリンＢ複合体については、Ｓ期およびＧ２の間のキナーゼ活性の阻害は、ＡＴＰ結合の裂け目内に位置する２つのＣｄｃ２残基、Ｔｈｒ１４およびＴｙｒ１５のリン酸化によって達成される。Ｔｈｒ１４および／またはＴｙｒ１５のリン酸化は、この裂け目内に存在するＡＴＰの方向を乱すことによって分子の触媒活性を抑制する。対照的に、Ｃｄｃ２５ホスファターゼによるこれらの残基の急激な脱リン酸化によって、Ｃｄｃ２−サイクリンＢキナーゼ活性の急速な活性化および引き続く下流の有糸分裂事象が生じる。この経路の正確な詳細はすでに解明されているが、Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５リン酸化は、細胞が不活性なＣｄｋ−サイクリン複合体の臨界濃度を保持することを可能にするように機能して、活性化の際に、急速かつ完全な細胞終期変遷を誘導するということが提唱されている。さらに、哺乳動物細胞においては、Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５リン酸化はまた、ＤＮＡ損傷後のＣｄｋ活性化を遅延させるように機能するという証拠がある。
【０２７６】
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｗｅｅ１の遺伝子産物は、Ｃｄｃ２においてＴｙｒ１５をリン酸化できる同定された最初のキナーゼである。Ｗｅｅ１キナーゼのホモログが引き続いて、ヒト、マウス、カエル、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａを含む広範な種から同定されて、生物学的に特徴付けられている。Ｃｄｃ２におけるＴｈｒ１４もリン酸化される脊椎動物の系では、Ｗｅｅ１キナーゼは、Ｔｙｒ１５上でＣｄｃ２をリン酸化できたが、Ｔｈｒ１４上ではできなかった。これによって、別のキナーゼがＴｈｒ１４リン酸化を担っていることが示された。この遺伝子であるＭｙｔ１キナーゼは、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵抽出物の膜画分から最近単離されて、Ｃｄｃ２において、Ｔｈｒ１４をリン酸化できること、そしてより少ない程度でＴｙｒ１５をリン酸化できることが示されている。同様の特性を示すヒトＭｙｔ１ホモログ、およびＴｈｒ１４キナーゼ活性を有する非膜結合分子が同様に単離されている。
【０２７７】
過去１０年間にわたって、ガンはサイクリンのような正の調節因子の過剰発現に、または負の調節因子の過少発現に由来し得る（例えば、ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）、ｐ１５（ＩＮＫ４ｂ）、ｐ２１（Ｃｉｐ１））ということが示されている。Ｍｙｔ１のようなインヒビターは、多くのガン研究の焦点である。なぜなら、それらのインヒビターは、ガンの処置の聖杯と現在みなされている細胞周期増殖を制御できるからである。これらの理由のために、限定はしないがＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫ１、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＢＬＫ、ＢＭＸ、ＢＴＫ、Ｃ２０ｏｒｆ６４、ＣＳＦ１Ｒ、ＳＣＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＤＫＦＺｐ７６１Ｐ１０１０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＥＲ、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＲＫ、ＦＹＮ、ＨＣＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＳＲ、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ１０７９、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＬＴＫ、ＬＹＮ、ＭＡＴＫ、ＭＥＲＴＫ、ＭＥＴ、ＭＳＴ１Ｒ、ＭＵＳＫ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＫ６、ＰＴＫ７、ＰＴＫ９、ＰＴＫ９Ｌ、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＳＲＣ、ＳＹＫ、ＴＥＣ、ＴＥＫ、ＴＩＥ、ＴＮＫ１、ＴＸＫ、ＴＹＫ２、ＴＹＲＯ３、ＹＥＳ１および関連のタンパク質を包含するキナーゼおよびキナーゼインヒビターに対向するｓｉＲＮＡは、研究および治療の目的のために有用であり得る。
【０２７８】
（Ｇタンパク質共役レセプター）
ｓｉＲＮＡが指向し得る遺伝子の重要な１クラスは、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＣＲは、感覚的刺激および化学刺激、例えば、光、臭気、味覚、フェロモン、ホルモンおよび神経伝達物質の多様な配置に応答する７回膜貫通タンパク質のスーパーファミリーを構成する。ＧＰＣＲは、細胞増殖、分化において中心的な役割を果たし、疾患の病因に関与している。
【０２７９】
Ｇタンパク質共役レセプターが細胞外シグナルを細胞変化に翻訳する機構は初期には簡易な直線モデルとして認識された。アゴニスト結合によるレセプターの活性化によって、ヘテロ三量体のＧＴＰ結合Ｇタンパク質（Ｇｓ、ＧｉまたはＧｑ）がそのαおよびβ／γサブユニットに解離され、その両方が種々の下流エフェクター分子を活性化または阻害し得る。より詳細には、ＧＰＣＲの活性化は、Ｇαサブユニットにおける立体配置の変化を誘導し、これによってＧＤＰが遊離され、ＧＴＰがその位置に結合される。次いで、ＧαおよびＧβγサブユニットが、レセプターから解離して、種々のエフェクター分子と相互作用する。例えば、Ｇｓファミリーの場合、主な機能は、細胞質のＡＴＰの二次メッセンジャーサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）への変換を触媒する、細胞内メッセンジャーアデニレートサイクラーゼ（ＡＣ）を刺激することである。対照的に、Ｇｉファミリーは、この経路を阻害して、ＧｑファミリーはホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化し、これがホスファチジルイノシトール４，５，ビスホスフェート（ＰＩＰ２）を切断して、イノシトール−１，４，５−ホスフェート（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成する。
【０２８０】
さらに近年では、ＧＰＣＲの機能はＧタンパク質上におけるその作用に限定されないこと、およびレセプター分子の多様な群と膜結合タンパク質の第二のクラス、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）との間にかなりの混在が存在することが研究によって示されている。エンドセリン−１、トロンビン、ボンベシンおよびドーパミンレセプターのような多数のＧＰＣＲが、ＲＴＫ／Ｒａｓ経路の下流エフェクターであるＭＡＰＫを活性化し得る。興味深い事に、これらの２つのファミリーの間の相互作用は、１方向性ではなく、ＲＴＫはまた、ＧＰＣＲに結合するリガンドによって排他的に制御されると伝統的に考えられているシグナル伝達経路の活性も調節し得る。例えば、ＥＧＦレセプターを介してＭＡＰＫカスケードを正常に活性化するＥＧＦは、Ｇαｓを活性化することによってアデニレートサイクラーゼ活性を刺激し得る。
【０２８１】
過去１０年間において顕著な薬物標的として判明しているＧタンパク質共役レセプターファミリーの多数のメンバーが存在する。潜在的なＧＰＣＲ−ｓｉＲＮＡ標的の１つの非限定的リストは以下のとおりである：
ＣＭＫＬＲ１
ＣＭＬ１／ＣＭＫＬＲ１（アクセッション番号Ｑ９９７８８）は、ＧＰＣＲのケモカインレセプターファミリーのメンバーであり、炎症および免疫学的応答に関与する疾患（例えば、喘息、関節炎）を含む多数の疾患において役割を果たし得る。この理由のために、このタンパク質に対向するｓｉＲＮＡは、重要な治療薬であることが証明され得る。
【０２８２】
進行性の神経変性によって特徴付けられる小児脳症の最も一般的な形態である、若年発症神経性セロイド・リポフスチノーシス（ＪＮＣＬ，バッテン病）の研究によって、これは新規なリソソーム膜タンパク質（ＣＬＮ３）における変異によってもたらされることが示される。ＪＮＣＬに関与していることに加えて、ＣＬＮ３（ＧＰＣＲ様タンパク質、アクセッション番号Ａ５７２１９）発現研究によって、ＣＬＮ３  ｍＲＮＡおよびタンパク質が多数のガン（例えば、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、ならびに前立腺、卵巣、乳房および結腸のガン）において高度に過剰発現されることが示されており、これによって、腫瘍増殖に対するこの遺伝子の潜在的な寄与が示唆される。この理由によって、このタンパク質に対向するｓｉＲＮＡは、重要な治療薬であることが証明され得る。
【０２８３】
ＣＬＡＣＲ
カルシトニンレセプター（ＣＴＲ／ＣＡＬＣＲ、アクセッション番号ＮＭ＿００１７４２）は、副甲状腺ホルモン、セクレチン、グルカゴンおよび血管活性腸管ポリペプチドのような調節性ペプチドを代表的に認識するＧＰＣＲの「Ｂファミリー」に属する。ＣＴレセプターは代表的には、主に甲状腺によって生成される３２アミノ酸のペプチドホルモンであるカルシトニン（ＣＴ）に結合するが、このレセプターとＲＡＭＰ（レセプター活性調節タンパク質）との会合によって、このレセプターは、アミリン（ＡＭＹ）および他のＣＴ遺伝子関連ペプチド（例えば、αＣＧＲＰおよびβＣＧＲＰ）を含むカルシトニンペプチドファミリーの他のメンバーに容易に結合することができる。カルシトニンレセプターの主な機能は、破骨細胞媒介性骨再吸収を調節することおよび腎臓によるＣａ２＋排出の増強に関するが、最近の研究によって、ＣＴおよびＣＴＲは、種々のプロセスにおいて、胚性／胎児性発達および精子の機能／生理学と同じく広範囲に重要な役割を果たし得ることが示されている。さらに、特定のＣＴＲ遺伝形質を有する患者は、骨量の損失に対して高いリスクであり得ること、およびこのＧＰＣＲがシュウ酸カルシウム尿路結石の形成に寄与し得ることが研究によって示されている。この理由のために、ＣＴＲに対向するｓｉＲＮＡは、治療薬として有用であり得る。
【０２８４】
ＯＸＴＲ
ヒトオキシトシンレセプター（ＯＴＲ、ＯＸＴＲ）は、７回膜貫通ドメイン構造を示し、Ｇタンパク質共役レセプターのクラスＩ（ロドプシン型）ファミリーに属する、３８９アミノ酸ポリペプチドである。ＯＴＲは、発達を通じて広範な種々の組織において発現され、Ｇ（ｑ）タンパク質およびホスホリパーゼＣ−βを通じた生理学的変化を媒介する。オキシトシンおよびオキシトシンレセプターの機能に対する研究によって、職務の広範なリストが明らかになっている。ＯＴおよびＯＴＲは、卵生、出生、乳汁排出、給餌、グルーミング、記憶および学習を含む、多数の性別、母性および社会的な挙動において役割を果たす。さらに、オキシトシン−ＯＴＲレセプターリガンドシステムの機能性における異常によって、強迫性挙動、摂食障害（例えば、拒食症）、抑うつ、および種々の形態の神経変性疾患を含む多数の変則性がもたらされ得る。これらの理由によって、この遺伝子（ＮＭ＿０００９１６）に対向するｓｉＲＮＡは、ＯＴＲ関連疾患と戦うために重要な役割を果たし得る。
【０２８５】
ＥＤＧ  ＧＰＣＲ
リゾホスファチジン酸および他の脂質ベースのホルモン／増殖因子は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を通じてシグナル伝達経路を活性化することによってその効果を誘導し、そしてガン、喘息および血管の病理を含む多数のヒト疾患において重要な役割を果たすことが観察されている。例えば、免疫グロブリンＡ腎症（ＩｇＡＮ）の研究の間、研究者らは、ＥＤＧ５（ＮＰ＿００４２２１）の発現の増強を観察しており、これによって、ＩｇＡＮの発生におけるこの遺伝子産物の寄与が示唆されている。その理由のために、Ｅｄｇ５（ＮＭ＿００４２３０）、Ｅｄｇ４（ＮＭ＿００４７２０）、Ｅｄｇ７（Ｎｍ＿０１２１５２）および関連の遺伝子に対抗するｓｉＲＮＡは、ヒト疾患と戦うのに重要な役割を果たし得る。
【０２８６】
コレステロールシグナル伝達および生合成に関与する遺伝子
ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのような遺伝子モデルの生物体における研究によって、初期の発生に必須である遺伝子の過剰が確認されている。変異体分析および異所性発現の研究によって、これらの遺伝子の多くを別個のシグナル伝達経路に分類することが可能になり、これらの要素がパターン形成および細胞分化において重要な役割を果たすことが示されている。発生の初期段階の間のこれらの遺伝子の一つ以上の破壊によって頻繁に出生異常がもたらされるが、寿命の後期段階での遺伝子機能の変更では、腫瘍形成が生じ得る。
【０２８７】
無脊椎動物および脊椎動物の両方において存在することが公知の相互作用の１つの重要なセットは、ソニック・ヘッジホッグ・パッチド・グリ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ−Ｐａｔｃｈｅｄ  Ｇｌｉ）経路である。もともと、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ断片化変異体として文書化され、いくつかの研究室によって、多くの経路のメンバーのヒトおよびマウスのホモログが最近同定されており、公知の疾患に対するこれらの遺伝子において首尾よく関連する破壊を有する。経路の活性化は、ソニック・ヘッジホッグの分泌で開始される。Ｓｈｈファミリー（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｄｅｓｅｒｔ、ａｎｄ  Ｉｎｄｉａｎ）の３つの密接に関連するメンバーが存在し、Ｓｈｈは、この群の最も広範に発現される形態である。Ｓｈｈの遺伝子産物は小さいプロシグナル分子として分泌される。その発生の役割を首尾よく開始するために、Ｓｈｈを最初に切断し、すぐにＮ末端短縮フラグメントをコレステロールで共有結合的に改変する。ステロール部分の付加によって、Ｓｈｈとその同族の膜結合レセプター、Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）との間の相互作用が促進される。Ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子には少なくとも２つのアイソフォームであるＰｔｃｈ１およびＰｔｃｈ２がある。両方のアイソフォームともステロール感知ドメイン（ＳＳＤ）を含む；コレステロール生合成、小胞輸送、シグナル伝達、コレステロール輸送、およびステロール恒常性に関与する分子を含む少なくとも数個の異なるクラスの分子で見出される、ほぼ１８０のアミノ酸のクラスター。Ｓｈｈの非存在下では、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は、この経路の負の調節因子である。対照的に、Ｐａｔｃｈｅｄレセプターに対するＳｈｈコレステロールの結合によって、負の阻害が解放され、その分子がＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄとして公知のＧタンパク質共役レセプターに強制する。Ｓｍｏｏｔｈｅｄｅｄの引き続く活性化（直接または間接的）によって、Ｇｌｉファミリーに属する転写因子の３つ組みの誘発がもたらされる。３つの因子全てが比較的大きく、特徴的なＣ２−Ｈ２ジンク−フィンガー五量体を含み、２つのコンセンサス配列（配列番号０４６３ＧＡＣＣＡＣＣＣＡまたは配列番号０４６４ＧＡＡＣＣＡＣＣＣＡ）の１つを認識する。Ｓｈｈの非存在下で、Ｇｌｉタンパク質は、プロテオソームによって切断され、そしてＣ末端短縮フラグメントが核に転位して、ドミナントな転写リプレッサーとして機能する。Ｓｈｈ−コレステロールの存在下では、Ｇｌｉリプレッサー形成は、阻害されて、全長Ｇｌｉは、転写の活性化因子として機能する。
【０２８８】
ＳｈｈおよびＳｈｈ−ＰＡＴＣＨ−Ｇｌｉ経路の他のメンバーは、広範な組織（例えば、脊索、神経管の底板、脳および腸）において、発生の初期段階で発現される。驚くべきことではないが、変化したタンパク質発現または機能をもたらす変異体は、発生の異常を誘導することが示されている。ヒトＳｈｈ遺伝子における欠損は、全前脳症、口唇口蓋裂として現われる正中線欠損、ＣＮＳの中隔形成および広範な他の表現型を生じることが示されている。興味深いことに、コレステロール生合成の欠損によって同様のＳｈｈ様障害（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｌｅｍｌｉ−Ｏｐｉｔｚ症候群）が生じ、このことは、Ｓｈｈ遺伝子産物のコレステロール改変が、経路の機能に重要であることを示唆する。Ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子およびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ遺伝子の両方とも、ＰＴＣＨ−１およびＰＴＣＨ−２と同様に、いくつかの形態の成体腫瘍の原因因子であると考えられる、オンコジーンとして現在認識されているＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄと臨床的に関連していることが示されている。これらの理由のために、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ、ＮＭ＿００５６３１、Ｐａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣＨ、ｎｍ＿０００２６４）およびコレステロールシグナル伝達、生合成および分解に参加するさらなる遺伝子に対抗するｓｉＲＮＡは、潜在的に有用な研究および治療の適応を有する。
【０２８９】
（標的とされる経路）
タンパク質のファミリーの一つ以上に対してｓｉＲＮＡを標的とすることに加えて、ｓｉＲＮＡは経路のメンバーに対抗し得る。従って、例えば、ｓｉＲＮＡは、シグナル伝達経路（例えば、インスリン経路、これにはＡＫＴ１−３、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＯＸＯ３Ａ、ＦＲＡＰ１、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＫ３Ｂ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ１、ＭＬＬＴ７、ＰＤＰＫ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＲＰＳＫＡ１、ＲＰＸ６ＫＡ３、ＳＧＫ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２およびＸＰＯ１を含む）、アポトーシス経路（ＣＡＳＰ３、６、７、８、９、ＤＳＨ１／２、Ｐ１１０、Ｐ８５、ＰＤＫ１／２、ＣＡＴＥＮＩＮ、ＨＳＰ９０、ＣＤＣ３７、Ｐ２３、ＢＡＤ、ＢＣＬＸＬ、ＢＣＬ２、ＳＭＡＣなど）、ＤＮＡ損傷、細胞周期および他の生理学に関与する経路（ｐ５３、ＭＤＭ２、ＣＨＫ１／２、ＢＲＣＡ１／２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｐ１５ＩＮＫ４、Ｐ２７、Ｐ２１、ＳＫＰ２、ＣＤＣ２５Ｃ／Ａ、１４−３−３、ＰＬＫ、ＲＢ、ＣＤＫ４、ＧＬＵＴ４、Ｉｎｏｓ、Ｍｔｏｒ、ＦＫＢＰ，ＰＰＡＲ、ＲＸＲ、ＥＲ）のメンバーを指向し得る。同様に、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−ＩＲ、ＩＲＡＫ１／２、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＩＫＫε、ＩＫＫγ、ＩＫＫβ、ＩＫＫα、ＩｋＢα、ＩｋＢβ、ｐ５０、ｐ６５、Ｒａｃ、ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２、ＲＯＣＫ、Ｐａｋ１／２／３／４／５／６、ｃＩＡＰ、ＨＤＡＣ１／２、ＣＢＰ、β―ＴｒＣＰ、Ｒｉｐ２／４などを含む免疫系機能に関与する遺伝子はまた、本明細書において記載されるｓｉＲＮＡの重要な標的であり、免疫系障害を処置するのに有用であり得る。アポトーシスに関与する遺伝子、例えば、Ｄｓｈ１／２、ＰＴＥＮ、ｐ１１０（ｐａｎ）、ｐ８５、ＰＤＫ１／２、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ（ｐａｎ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３β、ＰＰ２Ａ（ｃａｔ）、βカテニン、ＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７／ｐ５０、ｐ２３、Ｂａｄ、ＢｃｌｘＬ、Ｂｃｌ２、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、およびＡｓｋ１は、プログラムされた細胞死の欠陥（例えば、ガン）に関与する疾患の処置において潜在的に有用であるが、ｐ５３、ＭＤＭ２、Ｃｈｋ１／２、ＢＲＣＡ１／２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｐ１５ＩＮＫ４、Ｐ２７、Ｐ２１、Ｓｋｐ２、Ｃｄｃ２５Ｃ／Ａ、１４−３−３σ／ε、ＰＬＫ、Ｒｂ、Ｃｄｋ４、Ｇｌｕｔ４、ｉＮＯＳ、ｍＴＯＲ、ＦＫＢＰ，ＰＰＡＲγ、ＲＸＲα、ＥＲαおよび関連の遺伝子に対抗するｓｉＲＮＡ因子は、ＤＮＡ修復および細胞周期異常における破壊に関連する複合疾患において重要な役割を果たし得る。
【０２９０】
以下の表ＶＩ〜表Ｘは、ヒトインスリン経路およびチロシンキナーゼ経路における種々の遺伝子、細胞周期に関与するタンパク質、核レセプターの産生、および他の遺伝子を阻害するための有用なツールの例を示す。これらの特定のプールは、ヒトにおいて特に有用であるが、ほぼ相同なｍＲＮＡを生成する任意の種で有用である。さらに、列挙されたプールの各々のうちでは、任意の１つの配列が独立して用いられてもよいが、好ましくは列挙された配列のうち少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、そして最も好ましくは所定の遺伝子について列挙された配列の全てが存在する。
【０２９１】
【表６−１】
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【０２９２】
【表６−２】
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【０２９３】
【表６−３】
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【０２９４】
【表７−１】
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【０２９５】
【表７−２】
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【０２９６】
【表７−３】
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【０２９７】
【表７−４】
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【０２９８】
【表７−５】
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【０２９９】
【表７−６】
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【０３００】
【表７−７】
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【０３０１】
【表７−８】
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【０３０２】
【表８−１】
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【０３０３】
【表８−２】
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【０３０４】
【表８−３】
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【０３０５】
【表８−４】
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【０３０６】
【表８−５】
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【０３０７】
【表８−６】
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【０３０８】
【表８−７】
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【０３０９】
【表８−８】
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【０３１０】
【表８−９】
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【０３１１】
【表８−１０】
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【０３１２】
【表８−１１】
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【０３１３】
【表９−１】
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【０３１４】
【表９−２】
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【０３１５】
【表９−３】
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【０３１６】
【表９−４】
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【０３１７】
【表９−５】
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【０３１８】
【表９−６】
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【０３１９】
【表１０−１】
2010187668.tif 000057
【０３２０】
【表１０−２】
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【０３２１】
【表１０−３】
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【０３２２】
【表１０−４】
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【０３２３】
【表１０−５】
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【０３２４】
【表１０−６】
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【０３２５】
【表１０−７】
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【０３２６】
【表１０−８】
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【０３２７】
【表１０−９】
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【０３２８】
【表１０−１０】
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【０３２９】
【表１０−１１】
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【０３３０】
【表１０−１２】
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【０３３１】
【表１０−１３】
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【０３３２】
【表１０−１４】
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【０３３３】
【表１０−１５】
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【０３３４】
【表１０−１６】
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【０３３５】
【表１０−１７】
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【０３３６】
【表１０−１８】
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【０３３７】
さらに、遺伝子のファミリーまたは経路に対して機能的なｓｉＲＮＡを同定するために、特定の疾患に関与することが公知の遺伝子に対する二重鎖をデザインすることが可能である。例えば、アレルギーに関連するヒトの障害を処置する場合、限定はしないが以下を包含する多数の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを開発することが有利である：
【０３３８】
【数１３】
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【０３３９】
【数１４】
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【０３４０】
【数１５】
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【０３４１】
【数１６】
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【０３４２】
【数１７】
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【０３４３】
さらに、合理的にデザインされたｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡプールは、貧血、血友病または高コレステロール血症に関与する遺伝子に対向し得る。このような遺伝子としては、限定はしないが以下が挙げられる：
【０３４４】
【数１８】
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【０３４５】
【数１９】
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【０３４６】
さらに、合理的にデザインされたｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのプールは、脳および神経系の障害に関与する遺伝子に対向し得る。このような遺伝子としては、限定はしないが以下が挙げられる：
【０３４７】
【数２０】
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【０３４８】
【数２１】
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【０３４９】
さらに、合理的にデザインされたｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのプールは、高血圧および関連の障害に関与する遺伝子に対向し得る。このような遺伝子としては、限定はしないが、以下が挙げられる：
アンジオテンシンＩＩ  １型レセプター
【０３５０】
【数２２】
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および他の関連の標的。
【０３５１】
（実施例ＸＩＩＩ：Ｒａｂ５およびＥｐｓを用いる多重遺伝子ノックアウトのバリデーション）
類似の重複する機能を有する２つ以上の遺伝子はしばしば、遺伝的な重複性をもたらす。例えば、１対のこのような遺伝子のうちの１つだけをノックアウトする変異（ホモログとも呼ばれる）は、残りのインタクトな遺伝子が破壊された対応物の役割を満たすことができるという事実に起因して、表現型をほとんど生じないか、または全く生じない。細胞病理学においてこのような遺伝子の機能を完全に理解するために、両方のホモログを同時にノックアウトするかまたはノックダウンすることがしばしば必要である。不幸にも、２つ以上の遺伝子の同時のノックダウンは高等動物（例えば、マウス）においては達成することが困難であることが多く、従って、遺伝子機能を解明する新規な技術を導入することが必要である。複数の遺伝子を同時にノックダウンするこのようなアプローチの１つは、ｓｉＲＮＡを用いることによる。例えば、図１１は、クラスリン媒介性エンドサイトーシス経路に関与する多数の遺伝子に対向する合理的にデザインされたｓｉＲＮＡが、有意なレベルのタンパク質減少を生じた（例えば、＞８０％）ことを示した。クラスリン関連エンドサイトーシスでノックダウンされた遺伝子の効果を決定するために、上皮細胞成長因子およびトランスフェリンを用いて内部移行アッセイを行なった。詳細には、マウスレセプター等級のＥＧＦ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）および鉄飽和ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）を、以前に記載されたとおりにヨウ素化した（Ｊｉａｎｇ，Ｘ、Ｈｕａｎｇ，Ｆ、Ｍａｒｕｓｙｋ、Ａ＆Ｓｏｒｋｉｎ、Ａ（２００３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，８５８〜７０）。１２ウェルディッシュで増殖させたＨｅＬａ細胞を１２５Ｉ−ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）または１２５Ｉ−トランスフェリン（１μｇ／ｍｌ）を含有する結合培地（ＤＭＥＭ、０．１％ウシ血清アルブミン）とともに３７℃でインキュベートして、内部移行した放射能および表面の放射能の比を５分経過の間に決定して、以前に記載されたとおり、内部移行率比定数ｋｅを算出した（Ｊｉａｎｇ  Ｘら）。取り込み動態に対する再循環の影響を回避するために短時間経過アッセイを用い、そしてクラスリン依存性経路の飽和を回避するために低リガンド濃度を用いて、放射性トランスフェリンおよびＥＧＦの取り込みの測定を行なった（ＥＧＦについては、Ｌｕｎｄ、Ｋ．Ａ．Ｏｐｒｅｓｋｏ，Ｌ．Ｋ．Ｓｔｒａｒｂｕｃｋ，Ｃ．Ｗａｌｓｈ，Ｂ．Ｊ．＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｈ．Ｓ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１５７１３〜１３７２３）。
【０３５２】
Ｒａｂ５ａ、５ｂ、５ｃ、ＥｐｓまたはＥｐｓ１５Ｒ（個々に）をノックダウンすることの効果は、図２２に示しており、これによって単一の遺伝子の破壊によってＥＧＦの内部移行に対しても、Ｔｆｎの内部移行に対しても効果がほとんどないか、または全くないことが実証される。対照的に、Ｒａｂ５ａ、５ｂおよび５ｃ、またはＥｐｓおよびＥｐｓ
１５Ｒの同時のノックダウンによって、別個の表現型がもたらされる（注：これらの実験におけるｓｉＲＮＡの総濃度は、単一のｓｉＲＮＡを導入した実験での濃度と一定のままであった。図２３を参照のこと）。これらの実験によって、複数の遺伝子をノックダウンするように合理的にデザインされたｓｉＲＮＡを用いることの有効性が実証され、遺伝的重複性を無効にするこれらの試薬の有効性が確証される。
【０３５３】
（実施例ＸＩＶ。Ｇ６ＰＤ、ＧＡＰＤＨ、ＰＬＫおよびＵＱＣを用いる多重遺伝子標的化のバリデーション）
合理的にデザインされたｓｉＲＮＡを用いて複数の遺伝子の発現をノックダウンする能力のさらなる実証を、４つの別の遺伝子に対向するｓｉＲＮＡのプールを用いて行なった。これを行なうために、ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトして（総ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭ）、Ｂ−ＤＮＡによって２４時間後にアッセイした。図２４に示す結果によって、合理的にデザインされた分子のプールが、４つの異なる遺伝子を同時にサイレンシングできることが示す。
【０３５４】
（実施例ＸＶ．遺伝子発現プロファイリングによって実証されるような多重遺伝子のノックアウトのバリデーション、予言的な実施例）
複数の遺伝子標的の発現を同時にノックダウンする能力をさらに実証するために、遺伝子のコレクション（例えば、４、８、１６または２３の異なる標的）に対する単一のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのプールを細胞へ同時にトランスフェクトして、２４時間培養する。引き続き、処理した（および未処理の）細胞からｍＲＮＡを回収して、２つの蛍光プローブ色素（例えば、処理した細胞には赤色蛍光プローブ、コントロール細胞には緑色蛍光プローブ）のうちの１つを用いて標識する。次いで、各々のサンプル由来の等量の標識ＲＮＡを一緒に混合して、固体支持体に連結されている配列に対してハイブリダイズする（例えば、スライド、「ＤＮＡ  ＣＨＩＰ」）。ハイブリダイゼーション後、このスライドを洗浄して、分析して、ｓｉＲＮＡによって誘導された標的遺伝子のレベルの変化を調べる。
【０３５５】
（実施例ＸＶＩ．超機能的ｓｉＲＮＡを同定する）
（超機能的なＢｃｌ−２  ｓｉＲＮＡの同定）
１０個の合理的にデザインされたＢｃｌ２  ｓｉＲＮＡ（図１３、１４において同定された）を試験して、超強力な試薬を同定した。これを達成するために、１０個のＢｃｌ−２  ｓｉＲＮＡの各々を個々に、３００ｐＭ（０．３ｎＭ）の濃度で細胞へトランスフェクトした。２４時間後、Ｂ−ＤＮＡアッセイによって転写レベルを評価して、関連のコントロールと比較した。図２５に示すとおり、Ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡのほとんどがこの濃度で機能的なレベルのサイレンシングを誘導できなかったが、ｓｉＲＮＡ１および８は、＞８０％のサイレンシングを誘導し、そしてｓｉＲＮＡ  ６は、このナノモル未満の濃度で９０％より大きいサイレンシングを示した。
【０３５６】
予言的実施例の目的で、実施例ＶＩＩまたは実施例ＶＩＩＩに記載した合理的にデザインした遺伝子の任意の群を用いて同様のアッセイを行なうことができる。従って、例えば、以下：
【０３５７】
【数２３】
2010187668.tif 000085
に対向する合理的にデザインしたｓｉＲＮＡ配列を、徐々に制限される濃度で細胞に導入して、任意の二重鎖が超機能的であるか否かを決定することができる。同様に、以下：
【０３５８】
【数２４】
2010187668.tif 000086
に対向する合理的にデザインされた配列を、徐々に制限される濃度で細胞に導入して、超機能的な二重鎖をスクリーニングすることができる。
【０３５９】
（実施例ＸＶＩＩ：遺伝子サイレンシング：予言的実施例）
以下は、細胞へトランスフェクトする方法の実施例である。
【０３６０】
ａ．細胞株を選択する。細胞株の選択を通常、所望の適用によって決定する。ＲＮＡｉに対する最も重要な特徴は、目的の遺伝子の発現のレベルである。ｓｉＲＮＡトランスフェクション条件を特定して確証している細胞株を使用することを極めて推奨する。
【０３６１】
ｂ．細胞をプレートする。トランスフェクションの約２４時間前、細胞がトランスフェクションの時点で約７０〜９０％コンフルエントに、または約１×１０５細胞／ｍｌになるように細胞を適当な密度でプレートする。細胞濃度が低すぎれば、トランスフェクション試薬−ｓｉＲＮＡ複合体の過剰な露出および取り込みに起因して毒性がもたらされ得る。細胞密度が高すぎれば、低いトランスフェクション効率がもたらされて、サイレンシングはほとんどまたは全くもたらされないかもしれない。細胞を一晩インキュベートさせる。哺乳動物細胞の標準的なインキュベーション条件は５％ＣＯ２で３７℃である。他の細胞型、例えば昆虫細胞は、当業者によって容易に確認できる、異なる温度およびＣＯ２濃度を要する。目的の細胞型に適切な条件を用いる。
【０３６２】
ｃ．ｓｉＲＮＡ再懸濁物。各々のｓｉＲＮＡに対して２０μｌのｓｉＲＮＡユニバーサル緩衝液を添加して５０μＭの最終濃度を得る。
【０３６３】
ｄ．ＳｉＲＮＡ脂質複合体形成。ＲＮａｓｅを含まない溶液および試験管（チューブ）を用いる。以下の表、表ＸＩを用いる：
【０３６４】
【表１１】
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【０３６５】
（トランスフェクション）滅菌ポリスチレンチューブ中で特定量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地およびトランスフェクション試薬を合わせることによって混合物１を作製する。滅菌１ｍｌチューブ中で特定量の各々のｓｉＲＮＡとＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を合わせることによって混合物２を作製する。特定量の混合物１および混合物２を合わせることによって混合物３を作製する。穏やかに混合し（ボルテックスしない）、そして室温で２０分間インキュベートする。特定量の混合物３を完全培地に合わせることによって混合物４を作製する。各々の細胞培養ウェルに適切な容積を添加する。細胞をトランスフェクション試薬混合物とともに３７℃で２４〜７２時間インキュベートする。このインキュベーション時間は融通が利く。サイレンシングの比は、経過中の任意の時点で一定のままである。適切な検出方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、表現型分析、質量分析、蛍光、放射性崩壊、または現在公知であるか、または当該分野においておよび本開示を読むことから当業者に公知になっている任意の他の方法を用いる遺伝子サイレンシングのためのアッセイは、本発明で有用である。ノックダウン表現型を観察するための最適のウインドウは、目的の遺伝子のｍＲＮＡ代謝回転に関連しているが、２４〜７２時間が標準である。最終容積は、所望の細胞培養形式について各々のウェルに必要な量を反映する。ストック混合物のための容積を調節する場合、ピペッティングなどにおける変動を適合させるために、さらに１０％を用いるべきである。可能であれば、二連または三連のアッセイを行なうべきである。
【０３６６】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、公知であるか、または本発明が属する当該分野で慣行となっている場合、そして本明細書において前記される本質的な特徴に加えられ得る場合、そして添付の特許請求の範囲に従う場合においてさらなる改変が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般に従い、そして、本開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、用途または適合をカバーすることを意図することが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【外国語明細書】
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