(57)【要約】      （修正有）【課題】胚幹細胞を神経及び運動細胞へと分化させる方法を提供する。【解決手段】一実施の形態で、神経管様ロゼット形態を特徴とし、且つＰａｘ６+／Ｓｏｘ１+である同調化した神経幹細胞の集団を創出する方法。初期ロゼット形態を特徴とし、且つＳｏｘ１-，Ｐａｘ６+である細胞を、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８又はレチノイン酸の存在下で４〜６日間培養する工程を含む。神経幹細胞集団の例として、中脳ドーパミンニューロンの集団、脊髄運動ニューロンの集団、前脳ドーパミンニューロンの集団等をあげることができる。【選択図】図１
2010162024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経管様ロゼット形態を特徴とするＰａｘ６+／Ｓｏｘ１+同調神経幹細胞の集団を創出
する方法であって、
初期ロゼット形態のＳｏｘ１-，Ｐａｘ６+細胞を、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８又はＲＡの存在
下で４〜６日間培養する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記培養が４〜６日間である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法により創出される細胞の集団。
【請求項４】
前記細胞が、ＦＧＦ８を用いて培養されたＥＮ１+である請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞が、ＦＧＦ２を用いて培養されたＢｆ１+である請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が、ＲＡを用いて培養されたＨｏｘ+である、請求項３に記載の細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の細胞をＦＧＦ８の存在下にＳＨＨへ培養する工程を含む、中脳ドーパ
ミンニューロンの集団を創出する方法であって、
得られた細胞が、ＴＨ、ＡＡＤＣ、ＥＮ−１、ＶＭＡＴ２及びＤＡＴを発現するが、Ｄ
ｂＨ及びＰＮＭＴを発現せず、そして、前記細胞が、ドーパミンを生産することを特徴と
する方法。
【請求項８】
ＳＨＨへの前記培養が６〜７日間である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により創出される細胞の集団。
【請求項１０】
ＳＨＨを用いて請求項６に記載の細胞を培養する工程を含む、脊髄運動ニューロンの
集団を単離する方法であって、
得られた細胞が、ＨＢ９、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８、ＣｈＡ
Ｔ及びＶＡＣｈＴを発現し、且つアセチルコリンを生産することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記細胞を６〜７日間前記ＳＨＨへ接触させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法により創出される細胞の集団。
【請求項１３】
ＳＨＨを用いて請求項５に記載の細胞を培養する工程を含む、前脳ドーパミンニュー
ロンの集団を創出する方法であって、
得られた細胞が、ＴＨ、ＡＡＤＣ、Ｂｆ１、Ｏｔｘ２を発現するが、ＤＢＨ及びＰＮＭ
Ｔを発現せず、そして、前記細胞が、ドーパミンを生産することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記細胞を６〜７日間前記ＳＨＨへ接触させる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法により創出される細胞の集団。
【請求項１６】
神経細胞発生を攪乱させる能力に関して試験化合物を検査する方法であって、
前記試験化合物を請求項９に記載の細胞へ接触させる工程と、前記試験化合物に接触
していない細胞の対照集団を比較して接触の結果を検査する工程と、を含むことを特徴と
する方法。
【請求項１７】
神経細胞発達を攪乱させる能力に関して試験化合物を検査する方法であって、
前記試験化合物を請求項１２に記載の細胞へ接触させる工程と、前記試験化合物に接触
していない細胞の対照集団を比較して接触の結果を検査する工程と、を含むことを特徴と
する方法。
【請求項１８】
神経細胞発達を攪乱させる能力に関して試験化合物を検査する方法であって、
前記試験化合物を請求項１５に記載の細胞へ接触させる工程と、前記試験化合物に接触
していない細胞の対照集団を比較して接触の結果を検査する工程と、を含むことを特徴と
する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００１年１０月３日に出願された米国特許出願第０９／９７０，３８２号
（本明細書中に援用される）の一部継続出願であり、同様に２００３年８月２９日に出願
された米国仮特許出願第６０／４９８，８３１号（本明細書中に援用される）及び２００
３年９月２日に出願された米国仮特許出願第６０／４９９，５７０号（本明細書中に援用
される）に対して優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府により後援される研究又は開発に関する記述］
本発明は、米国政府の後援を受けずに行われた。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
ヒト幹細胞（ＥＳ）細胞は、着床前の胚の内細胞塊に由来する多分化能性細胞である（
Thomson，J.A.，et  al.，Science  282：1145-1147，1998）。マウスＥＳ細胞に類似し
て、ヒトＥＳ細胞は、様々な体細胞タイプの３つすべての胚葉へ分化するそれらの潜在性
を維持しながら多数に増殖させることができる（上述のThomson，J.A.，et  al.，1998；
Reubinoff，B.E.，et  al.，Nat．Biotech．18：399，2000；Thomson，J.A.  and  Odori
co，J.S.，Trends  Biotech  18：53-57，2000；Amit，M.，et  al.，Dev．Biol．227：2
71-278，2000）。ＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化は、初期発生の細胞上及び分
子機構及び移植治療用の供与細胞の産生について、新たな展望を提供するものである。実
際に、マウスＥＳ細胞は、造血細胞（Wiles，M.V.  and  Keller，G.，Development  111
：259-267，1991）、心筋細胞（Klug，M.G.，et  al.，J．Clin．Invest．98：216-224，
1996）、インスリン分泌細胞（Soria，B.，et  al.，Diabetes  49：157-162，2000）並
びにニューロン及びグリア（Bain，G.，et  al.，Dev．Biol．168：342-357，1995；Okab
e，S.，et  al.，Mech．Dev．59：89-102，1996；Mujtaba，T.，et  al.，Dev．Biol．21
4：113-127，1999；Brustle，O.，et  al.，Science  285：754-756，1999）を含む多く
の臨床的に意義ある細胞型へｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化することがわかっている。げっ歯類
中枢神経系（ＣＮＳ）への移植後に、ＥＳ細胞由来の神経前駆体(precursor)は、宿主組
織へ統合し、場合によっては、機能的改善をもたらすことがわかっている（McDonald，J.
W.，et  al.，Nat．Med．5：1410-1412，1999）。ヒトＥＳ細胞の臨床的用途は、特定の
組織及び器官用の高度純度のドナー細胞の産生を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
分化ヒトＥＳ細胞培養物からの移植可能な神経及び運動ニューロン前駆体の単離に関す
る簡素でさらには効率的な戦略が、当該技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施の形態では、本発明は、神経管様ロゼット形態を特徴とし、且つＰａｘ６+／
Ｓｏｘ１+である同調化した神経幹細胞の集団を創出する方法である。初期ロゼット形態
を特徴とし、且つＳｏｘ１-，Ｐａｘ６+である細胞を、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８又
はＲＡの存在下で４〜６日間培養する工程を含む方法。本発明はまた、この方法により創
出される細胞の集団である。
【０００６】
一実施の形態では、初期ロゼット細胞は、ＦＧＦ８を用いて、好ましくは４〜７日間培
養され、ＥＮ１+である。別の実施の形態では、細胞は、ＦＧＦ２を用いて、好ましくは
４〜７日間培養され、Ｂｆ１+である。別の実施の形態では、細胞は、ＲＡを用いて、好
ましくは４〜７日間培養され、Ｈｏｘ+である。
【０００７】
別の実施の形態では、本発明は、上記の細胞をＦＧＦ８の存在下でＳＨＨを用いて培養
する工程を含む、中脳ドーパミンニューロンの集団を単離する方法である。得られる細胞
は、ＴＨ、ＡＡＤＣ、ＥＮ−１、ＶＭＡＴ２及びＤＡＴを発現するが、ＤｂＨ及びＰＮＭ
Ｔを発現しない。本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。
【０００８】
別の実施の形態では、本発明は、上記の細胞をＳＨＨを用いてＲＡの存在下で前述の細
胞を培養する工程を含む、脊髄運動ニューロンの集団を単離する方法である。得られる細
胞は、ＨＢ９、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８、ＣｈＡＴ及びＶＡＣ
ｈＴを発現する。本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。
【０００９】
別の実施の形態では、本発明は、上記の細胞をＳＨＨを用いて培養する工程を含む、前
脳ドーパミンニューロンの集団を単離する方法である。本発明はまた、この方法により創
出される細胞の集団である。
【００１０】
本発明はまた、正常なヒト神経発達に影響を及ぼす能力に関して作用物質をスクリーニングするための、上記の細胞集団を試験する方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、分化ヒトＥＳ細胞培養物からの移植可能な神経及び運動ニューロン前駆体の単離に関する簡素でさらには効率的な戦略を提供する。
【００１２】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、明細書、特許請求の範囲及び図面を参照した後に
明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜図１。ＥＳ細胞からの神経前駆体の分化及び単離。（図１Ａ）ＦＧＦ２の存在下で５日間成長させた付着ＥＢは、外縁での扁平な細胞を及び中心に集まった小伸長細胞を示す。（図１Ｂ）７日目までには、多くのロゼット形成（矢印）が分化ＥＢ中心に出現した。右上部の挿入図は、トルイジンブルーで染色したロゼットの１μｍ切片であり、管状構造に整列された円柱状細胞を示す。バー＝２０μｍ。（図１Ｃ〜図１Ｅ）ロゼットのクラスター（左下）及び小形成ロゼット（中心）における細胞は、ネスチン（図１Ｃ）及びＭｕｓａｓｈｉ−１（図１Ｄ）に関して陽性であるのに対して、周辺扁平細胞は陰性である。（図１Ｅ）図１Ｃ及び図１Ｄと、ＤＡＰＩで標識したすべての細胞核との複合画像である。（図１Ｆ）ディスパーゼで２０分間処理した後、ロゼット形成は退縮したのに対して、周辺扁平細胞は、付着したままであった。（図１Ｇ〜図１Ｉ）単離細胞は、繊維状パターンにおいてネスチン（図１Ｇ）、細胞質においてＭｕｓａｓｈｉ−１（図１Ｈ）及び主として膜上でＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図１Ｉ）に関して陽性に染色される。核をすべて、ＤＡＰＩで染色する。バー＝１００μｍ。
【図２】図２Ａ〜図２Ｇ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ細胞由来の神経前駆体の特性化。（図２Ａ）解離されたＥＳ細胞由来の神経前駆体によるＢｒｄＵ取り込みは、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で上昇するが、上皮成長因子（ＥＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）又は白血病阻害因子（ＬＩＦ）（５ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合は上昇しない。これは、３回の反復実験のうちの１つからの代表データである。*は、実験群と対照群との間の差を示す（ｐ＜０．０１、ｎ＝４、スチューデントｔ検定）。（図２Ｂ）ＥＳ細胞に由来する神経前駆体のクラスターの３週間の分化は神経突起束を示し、細胞はそれらと一緒に遊走する。（図２Ｃ）３週の分化後の免疫染色は、細胞の大部分がβIII−チューブリン+ニューロン（赤色）であること、またほんのわずかな細胞がＧＦＡＰ+アストロサイト（緑色）であることを示す。（図２Ｄ）４５日の分化後、さらに多くのＧＦＡＰ+アストロサイト（緑色）が、ＮＦ２００+神経突起（赤色、緑色のＧＦＡＰとの重複のため黄色がかっている）と一緒に出現する。（図２Ｅ〜Ｇ）様々な形態を有するＥＳ由来のニューロンは、グルタメート（図２Ｅ）、ＧＡＢＡ（図２Ｆ）及び酵素チロシンヒドロキシラーゼ（図２Ｇ）のような別個の神経伝達物質を発現する。Ｏ４+オリゴデンドロサイト（矢印）は、グリア分化培地における２週の分化後に観察される。バー＝１００μｍ。
【図３】図３Ａ〜図３Ｋ。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＳ細胞由来の神経前駆体の取り込み及び分化。移植細胞は、ヒトａｌｕ反復要素に対するプローブ（図３Ａ〜図３Ｅ、図３Ｇ）又はヒト特異的核抗原に対する抗体（図３Ｆ）を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法により検出される。（図３Ａ）８週齢のレシピエントの宿主皮質における個々のドナー細胞（矢印）。（図３Ｂ）海馬形成におけるＥＳ細胞由来の神経前駆体の広範囲にわたる取り込み。ヒトａｌｕプローブとハイブリダイズさせた細胞は、赤色ドットで標識される（偽性有色）。（図３Ｃ）Ｐ１４での海馬錐体層の近傍で取り込まれたヒト細胞。（図３Ｄ）４週齢のレシピエントマウスの中隔におけるＥＳ細胞由来の細胞。（図３Ｅ）視床下部における個々のドナー細胞の高倍率図である。隣接する未標識宿主細胞間のとぎれのない取り込みに留意されたい。（図３Ｆ）ヒト特異的核抗原に対する抗体を用いて検出される４週齢の宿主の線条におけるドナー細胞。（図３Ｇ）水道から背側中脳への移植細胞の広範囲にわたる遊走。（図３Ｈ）極形態及び長い突起を示す２週齢の宿主の皮質におけるヒトＥＳ細胞由来のニューロン。細胞は、ヒト特異的核マーカー（緑色）及びβIII−チューブリン（赤色）に対する抗体で二重標識される。（図３Ｉ）ヒト神経フィラメントに対する抗体で同定した海馬の采におけるドナー由来の軸索のネットワーク。（図３Ｊ）ＭＡＰ２のａ及びｂアイソフォームを認識する抗体で二重標識したドナー由来の多極ニューロン（図３Ｋ）ヒト特異的核マーカー（緑色）及びＧＦＡＰに対する抗体（赤色）で二重標識した４週齢の動物の皮質におけるＥＳ細胞由来のアストロサイト。二重標識はすべて、共焦点画像であり、単一光切断により確認されることに留意されたい。バー：図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｇ  ２００μｍ、図３Ｃ、図３Ｄ  １００μｍ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｈ〜図３Ｋ  １０μｍ。
【図４】神経外胚葉細胞の産生及び局所的特定化。図４Ａ。円柱状細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の存在下での９日目に分化ＥＳ細胞コロニーにおいて出現した。図４Ｂ。円柱状細胞は、１４日目に神経管様ロゼットを形成した。図４Ｃ。円柱状形態を有するロゼットにおける細胞は、Ｓｏｘ１（赤色）に対して陽性であった。図４Ｄ。ＦＧＦ２で処理した培養物における神経ロゼット細胞は、Ｂｆ１（赤色）を発現したが、Ｅｎ−１（緑色）は発現しなかった。図４Ｅ。Ｅｎ−１（緑色）発現は、９日目に線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）（１００ｎｇ／ｍｌ）で６日間処理し、ＦＧＦ８中で４日間増殖させた後、ラミニン基質上でさらに６日間ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理したネスチン+（赤色）神経外胚葉細胞において観察された。図４Ｆ。これらのＥｎ−１+細胞（緑色）は、図４Ｅのように処理した培養物においてＢｆ１（赤色）に対して陰性であった。細胞核は、ヘキスト（ｃ、ｄ；青色）で染色した。バー＝５０μｍ。
【図５】ＤＡニューロンの分化。図５Ａ。分化した細胞の約１／３は、３週間の分化後にＦＧＦ８、ＳＨＨ及びアスコルビン酸（ＡＡ）で処理した培養物においてチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性であった。図５Ｂ。培養物におけるＴＨ+細胞（赤色）はすべて、ニューロンマーカーβIII−チューブリン（緑色）で陽性に染色された。図５Ｃ〜図５Ｅ。培養物におけるＴＨ+細胞（ｄ、緑色）はすべて、芳香族酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）（ｄ及びｅ、赤色）で陽性に染色されたが、幾つかのＡＡＤＣ+細胞は、ＴＨ-であった（ｅ、矢じり）。図５Ｆ。ＴＨ+細胞は、ノルアドレナリン作動性ニューロンマーカードーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤβＨ）（緑色）に対して陰性であった。挿入図は、ＤβＨが成体ラット脳幹の切片における細胞を陽性に染色することを示した。細胞核は、ヘキスト（ａ、ｂ、ｆ；青色）で染色した。バー＝５０μｍ。
【図６】ヒトＥＳ細胞由来のＤＡニューロンの特性化。図６Ａ。分化ＤＡニューロンは、ＲＴ−ＰＣＲにより現される中脳発生運命の特徴である遺伝子を発現した。ＥＢ：胚様体、ＮＥ：神経外胚葉細胞、３ｗ：３週間分化させたＤＡ培養物、ＮＣ：陰性対照。図６Ｂ。培養物におけるＴＨ+細胞（赤色）の大部分は、中脳マーカーＥｎ−１（緑色）を発現した。図６Ｃ。ＧＡＢＡ発現細胞（赤色）は、培養物中に存在したが、極わずかのＴＨ+細胞（緑色）がＧＡＢＡ（赤色、挿入図）を共発現した。図６Ｄ。ＴＨ+細胞（赤色）は、カルビンジン（緑色）に対して陰性であった。バー＝５０μｍ。
【図７】ヒトＥＳ細胞由来のＤＡニューロンにおける受容体及び輸送体の発現。図７Ａ〜図７Ｃ。ＴＨ+細胞（ａ、緑色）はすべて、ｃ−Ｒｅｔ（赤色）を発現した。図７Ｄ〜図７Ｆ。ＴＨ+細胞（ｄ、緑色）は、ＶＭＡＴ２（ｅ及びｆ；赤色）を共発現した。図７Ｇ〜Ｉ。ＴＨ+ニューロン（ｊ、緑色）は、シナプトフィジン（ｋ及びｌ、赤色）を共発現した。バー＝２５μｍ。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生したＤＡニューロンの機能的特徴。図８Ａ。三週間の分化後の対照及び処理培養物における自発的及び脱分極（ＨＢＳＳ中の５６ｍＭＫＣｌ）誘導性ＤＡ放出。データは、３回の実験からの平均値±ＳＤとして提示した。*ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定により対照に対して）。図８Ｂ。３０日間分化させた２つのニューロンにおいて電流段階（０．２ｎＡ）を脱分極させることにより誘起される活動電位。受動膜特性：（ｉ）Ｖrest−４９ｍＶ、Ｃm１５．５ｐＦ、Ｒm５．０ＧΩ、（ｉｉ）Ｖrest−７２ｍＶ、Ｃm  ４５ｐＦ、Ｒm８８５ＧΩ；図８Ｃ。３６日間分化させたニューロンにおける自発的シナプス後電位。図８Ｄ。培養に３０日間維持されたニューロンにおける自発的なシナプス後電位。ニューロンは、Ｋ−グルコナートベースのピペット溶液を用いて−４０ｍＶで電圧固定した。外向き電流は、阻害性事象を反映し、内向き電流は、この低塩化物記録溶液において興奮性事象を反映する。（ｉｉ）パネル（ｉ）で示される細胞からの平均事象。加重減衰時間定数は、阻害（ｎ＝１７事象）及び興奮性（ｎ＝１４事象）電流に関して、６１．４ｍｓ及び９．９ｍｓである。図８Ｅ〜図８Ｇ。免疫染色は、記録されたニューロン（ｆ、緑色）がＴＨ+（ｅ及びｇ、赤色）であることを示した。バー＝５０μｍ。
【図９】ＦＧＦ２により誘導される神経外胚葉細胞は、吻状表現型を示す。ＦＧＦ２中で１０日間分化させたＥＳ細胞は、コロニー中心で小円柱状形態を示し、ロゼット形成へと体系化した。ロゼットにおける円柱状細胞は、Ｐａｘ６に対して陽性であり、Ｓｏｘ１に対して陰性であったが、周辺の扁平細胞はそうではなかった（Ａ）。１４日目までに、円柱状細胞は、神経管様ロゼットを形成し（Ｂ）、Ｐａｘ６（Ｃ）及びＳｏｘ１（Ｄ）の両方に対して陽性であった。ロゼットにおけるＰａｘ６+細胞（Ｅ）はまた、Ｏｔｘ２+（Ｆ）であったが、Ｅｎ−１-（Ｇ）であった。神経管様ロゼットにおける細胞は、Ｏｔｘ２に対して陽性であり、ＨｏｘＣ８に対して陰性であった（Ｈ）。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。
【図１０】神経外胚葉細胞からの運動ニューロンの産生。（Ａ）２週間のＳｏｘ１+神経外胚葉細胞の分化（一番上の行）は、成長領域における広範囲にわたるニューロン産生、Ｉｓｌ１の発現を明らかにしたが、ＨＢ９+細胞はわずかであることを明らかにした。Ｐａｘ６+／Ｓｏｘ１-神経外胚葉細胞の処理（二番目の行）は、わずかに遊走している細胞を伴う広範囲にわたる神経突起成長、Ｉｓｌ１の発現及び大比率のＨＢ９+細胞をもたらした。初期神経外胚葉細胞から分化したＩｓｌ１／２+の約５０％はまた、ＨＢ９+であった（Ｂ）。ＨＢ９+細胞はまた、βIII−チューブリンに対して陽性であった（Ｃ）。クラスターにおける細胞の約２１％は、培養物がレチノイン酸（ＲＡ）及びＳＨＨの両方の存在下で分化された場合にはＨＢ９+であったのに対して、ＲＡ単独若しくはＳＨＨ単独で、又はともに存在せずに培養される場合にはわずかなＨＢ９+細胞が観察された。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。
【図１１】神経外胚葉細胞におけるＲＡ、ＦＧＦ２及びＳＨＨの影響。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＲＡ又は２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を用いて神経誘導培地中で１週間培養された初期ロゼット細胞からの吻側尾側遺伝子の変動を示した。（Ｂ）ＲＡ０．１μＭで１週間処理した初期及び後期神経外胚葉細胞におけるホメオボックス遺伝子発現の比較。ＲＡで処理した後、１２日間分化させた初期神経外胚葉細胞は、Ｏｔｘ２に対して大部分陰性となった（Ｃ）が、ＨｏｘＣ８に対して陽性となった（Ｄ）。ＨｏｘＣ８+細胞はすべて、βIII−チューブリン+（Ｅ）であった。Ｐａｘ６発現神経外胚葉細胞は、Ｏｌｉｇ２に対して陰性であった（Ｆ）。ＲＡによる１週間の処理及びＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での２週間の分化後に、多くの細胞は、Ｏｌｉｇ２を発現した（Ｇ）。後期神経外胚葉細胞をＲＡで処理した後、同培養条件下で分化させた場合、わずかなＯｌｉｇ２+細胞が観察された（Ｈ）。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。
【図１２】培養における運動ニューロンの成熟。ＣｈＡＴ発現細胞は、クラスターにおいて大部分は局在化され（Ａ）、大きな多極細胞であった（Ｂ）。共焦点画像は、３週間の培養物において、神経細胞体及び突起内のＣｈＡＴ、並びに核におけるＨＢ９の共局在化を示した（Ｃ）。クラスターにおけるほとんどの細胞が、ＶＣｈＡＴを発現した（Ｄ）。多くのＣｈＡＴ+細胞はまた、培養における５週間後に神経細胞体及び突起内のシナプシンに対して陽性であった（Ｅ）。（Ｆ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける電流段階（０．１５ｎＡ）を脱分極させることにより誘起されるＡＰ。静止膜電位（Ｖｍ）−５９ｍＶ（ｆｉ）及び７０ｍＶ（ｆｉｉ）。（Ｇ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける自発的ＡＰ。Ｖｍ−５０ｍＶ。（Ｈ）対照条件下でＫ−グルコネートベースのピペット溶液を用いた−４０ｍＶでの自発的内向き及び外向きシナプス電流（Ｈｉ）。ビククリン（２０μＭ）及びストリキニーネ（５μＭ）の両方の適用は、外向き電流を阻止した（ＩＰＳＣ、Ｈｉｉ）。ＡＰ−５（４０μＭ）及びＣＮＱＸ（２０μＭ）の続く適用は、残存する内向き電流を阻止した（ＥＰＳＣ、Ｈｉｉｉ）。（ｉ）パネルＨで示される細胞からの平均ｓＩＰＳＣ及びｓＥＰＳＣ。（Ｊ）ビオチン（記録用電極から）及びＣｈＡＴに関する二重免疫染色。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された運動ニューロンの電気生理学的特性化。（Ａ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける電流段階（０．１５ｎＡ）を脱分極させることにより誘起されるＡＰ。静止膜電位（Ｖｍ）−５９ｍＶ（ａｉ）及び７０ｍＶ（ａｉｉ）。（Ｂ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける自発的ＡＰ。Ｖｍ−５０ｍＶ。（Ｃ）対照条件下でＫ−グルコネートベースのピペット溶液を用いた−４０ｍＶでの自発的内向き及び外向きシナプス電流（ｃｉ）。ビククリン（２０μＭ）及びストリキニーネ（５μＭ）の両方の適用は、外向き電流を阻止した（ＩＰＳＣ、ｃｉｉ）。ＡＰ−５（４０μＭ）及びＣＮＱＸ（２０μＭ）の続く適用は、残存する内向き電流を阻止した（ＥＰＳＣ、ｃｉｉｉ）。（Ｄ）パネルｃで示される細胞からの平均ｓＩＰＳＣ及びｓＥＰＳＣ。（Ｅ及びＦ）記録後に、カバーガラスクラスターをＣｈＡＴで免疫染色し、ビオチン充填したニューロンはＣｈＡＴに対して陽性であることを示した。バー＝５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本発明における出願人等は、ヒト胚幹細胞からのドーパミン（前脳及び中脳）並びに運
動神経の発生方法を開示する。好ましい方法は概して、以下に、及び表１〜表３に記載さ
れる。
【００１５】
具体的には、出願人等は、ＥＳ細胞から、胚様体中間体を通じて初期ロゼット（Ｐａｘ
６+／Ｓｏｘ１-）を分化させる方法を開示する。差次的処理(differential  treatment)
により、出願人等は、これらの初期ロゼットを、３つの異なる形態の神経管様ロゼットへ
分化させることができ、続いて３つの異なる形態の神経管様ロゼットは、前脳ドーパミン
ニューロン、中脳ドーパミンニューロン又は運動ニューロンへの発達に適している。
【００１６】
【表１】
2010162024.tif 000003
【００１７】
出願人等は、ドーパミン及び運動ニューロンを産生するための相１及び相２について記
載している以下の表２について言及する。表２はまた、出願人等が適切な発達のマーカー
であるとみなす様々な中間産生物についても記載している。
【００１８】
【表２】
2010162024.tif 000004
【００１９】
上述のように、本発明は、２つの主な実施形態を包含する。１つの実施形態は、神経管
様ロゼットの形態の神経幹細胞（又は神経上皮細胞）の同調集団の産生、及び神経上皮マ
ーカーＰａｘ６、Ｓｏｘ１、ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ−１の発現に関する手順である。
本明細書中で使用する場合、「同調する」は、異種分化をもたらすＲＡにより誘導される
ものに対比して、同じ発達段階にある細胞の集団を意味する。すなわち、培養物は、前駆
体(progenitor)から分化ニューロンへの発達段階にある細胞を含有する。本発明の場合で
は、本発明者等は、初期段階にあるＰａｘ６+／Ｓｏｘ１-初期神経上皮細胞、又は後期段
階にあるＰａｘ６+／Ｓｏｘ１+神経上皮細胞のいずれかを想定する。いずれの段階でも、
本発明者等は、いかなる分化ニューロンも想定しない。この同調化された発生は、本願で
記載されるように、特殊ニューロンへ直接の分化を可能にする。
【００２０】
第２の実施形態は、特殊ニューロン（例えば、中脳ドーパミンニューロン、前脳ドーパ
ミンニューロン及び脊髄運動ニューロン）への神経上皮細胞のさらなる分化方法である。
【００２１】
以下の表３は、本発明の細胞を得る好ましい方法について記載している。表３は、類似
した培養ブロスで置き換えることができる一般的な培養ブロス構成成分、並びに重要な成
長因子及びタイミング構成成分の両方を包含する。出願人等が神経細胞培地について言及
する場合、多くの培養構成成分が適切である。以下のセクションは、正確な分化に必要な
培養構成成分を強調している。
【００２２】
概して、適切な培地は、神経細胞を成長させるのに使用される任意の培地である。以下
の参照文献（上述のBain，G.，et  al，1995；上述のOkabe，S.，et  al.，1996；上述の
Mujtaba，T.，et  al.，1999；上述のBrustle，O.，et  al.，1999；Zhang，S.-C.，et
al.，J．Neurosci．Res．59：421-429，2000；Zhang，S.-C.，et  al.，Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA  96：4089-4094，1999；Svendsen，C.N.，et  al.，Exp．Neurol．137：376
-388，1996；Carpenter，M.K.，et  al.，Exp．Neurol．158：265-278，1999；Vescovi，
A.L.，et  al.，Exp．Neurol．156：71-83，1999）は、同じか、又は類似した培地を使用
している。
【００２３】
１．ヒトＥＳ細胞からの神経上皮細胞（神経幹細胞）の分化
神経上皮細胞の産生は、初期コロニーの中心にある細胞が円柱状となり、且つロゼット
形態へ体系化する(organize)場合に、４〜６日間の懸濁培養、続く成長因子、好ましくは
ＦＧＦ２又はＦＧＦ８の存在下で４〜５日間の付着培養における胚様体の形成に関与する
（図１Ａ、図４Ａ、図９Ａ、図９Ｂ）（Zhang，et  al.，Nature  Biotechnol.，2001を
参照）。ＦＧＦ４及びＦＧＦ９もまた、適切な成長因子である。
【００２４】
これらのロゼットにおける円柱状細胞は、神経転写因子Ｐａｘ６を発現するが、別の神
経転写因子Ｓｏｘ１を発現しない（図９Ｃ、図９Ｄ）。本発明者等は、これらのロゼット
が初期に出現して、管腔なしの円柱状細胞の単層により形成されるため、「初期ロゼット
」と称する。あらゆる単一コロニーは、初期ロゼットを保有する。これらの初期ロゼット
の総比率(total  population)は、総細胞の少なくとも７０％である。
【００２５】
これらの初期ロゼットの４〜６日間のさらなる培養は、神経管様ロゼットの形成を招く
（図１Ｂ、図４Ｂ、図９Ｅ）。神経管様ロゼットは、明らかな管腔を伴う円柱状細胞の多
層により形成される。ロゼットにおける細胞は、Ｐａｘ６のほかにＳｏｘ１を発現する（
図４Ｃ、図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ）。初期ロゼットから神経管様ロゼットへの進行には、
本発明者等の無血清培養条件下で、１０〜２０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧ
Ｆ８、ＦＧＦ９又は０．００１〜１μＭでのＲＡの存在下で、約４〜６日かかる。
【００２６】
ＥＳ細胞から神経管様ロゼットの形成への神経上皮分化のプロセスには、１４〜１６日
かかる。ヒトＥＳ細胞は、５．５日齢のヒト胚に由来する（上述のThomson，J.A.，et  a
l.，1998）。したがって、本発明者等の培養系におけるヒトＥＳ細胞からの神経上皮細胞
の発達は、ヒト胚において発達にかかる１９〜２１日に十分に匹敵する。正常なヒト発達
では、神経管は、２０〜２１日目に形成される。したがって、ヒトＥＳ細胞からの神経上
皮分化は、正常なヒト胚発達を反映する（Zhang，S.C.，J．Hematother．Stem  Cell  Re
s．12：625-634，2003）。
【００２７】
形態変化及び明快な遺伝子発現パターンにより明らかであるような２段階の神経上皮発
達は、先に記載されていない。Ｐａｘ６及びＳｏｘ１は、神経管がカエル、ゼブラフィッ
シュ、ヒヨコ及びマウスにおいて同時に形成される場合、神経上皮細胞により発現される
ことが示されている（Pevny，et  al.，Development  125：1967-1978，1998）。したが
って、本発明者等は、ヒトＥＳ細胞における神経上皮分化に沿った順次Ｐａｘ６及びＳｏ
ｘ１発現の見解は新規であり、ヒトにとって特有であり得ると考える。Ｐａｘ６＋／Ｓｏ
ｘ１−神経上皮細胞は、最古の神経上皮細胞を表し、したがってはるかに（far）同定さ
れている。これらの細胞の機能的有意性は、初期ロゼットにおけるＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１
−神経上皮細胞が前脳以外のニューロン保有位置的(carrying  positional)アイデンティ
ティー（例えば、中脳ドーパミンニューロン及び脊髄運動ニューロン）となるように効率
的に誘導され得るが、神経管様ロゼットにおけるＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１＋神経上皮細胞は
、効率的に誘導され得ない（表１、上記を参照）という点で、本発明に関連している。
【００２８】
あらゆる分化しているＥＳ細胞コロニーは、神経管様ロゼットを形成する。神経上皮細
胞は、総分化した細胞の少なくとも７０〜９０％を表す。
【００２９】
神経管様ロゼットの形態の神経上皮細胞は、低濃度のディスパーゼによる処理及び差次
的接着により精製することができる（米国特許第０９／９６０，３８２号に記載）。
【００３０】
２．中脳ドーパミンニューロンの産生
潜在的な治療上の用途を有する機能的ニューロンは、ニューロンであることのほかに、
少なくとも２つのさらなる特徴を保有しなくてはならない：特異的な位置的アイデンティ
ティー並びに神経伝達物質を合成、放出及び取り込む能力。
【００３１】
中脳ドーパミンニューロンを産生する際の第１の工程は、中脳アイデンティティーの誘
導である。ＦＧＦ８（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）による６〜７日間のＰａｘ６+／Ｓｏｘ
１-初期ロゼット細胞の処理は、中脳転写因子エングレイルド１（Ｅｎ−１）及びＰａｘ
２を発現し（図４Ｅ、図４Ｆ）、且つ前脳マーカーＢｆ−１をダウンレギュレートする（
図４Ｄ）前駆体への細胞の効率的な分化をもたらすが、Ｐａｘ６+／Ｓｏｘ１+神経管様ロ
ゼット細胞はもたらさない。
【００３２】
第２の工程は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で
６〜７日間、続いて正規のニューロン分化培地（例えば、表３に記載するもの）中でさら
に２週間、ドーパミンニューロンが発生するまで中脳前駆体を培養することである。好ま
しくは、総分化細胞の少なくとも３５％が、ドーパミンニューロンとなる。
【００３３】
好ましい分化培地は、表３に記載している。
【００３４】
ドーパミンニューロンは、ドーパミンの合成を可能にするが、ノルエピネフリン又はネ
フリンへのさらなる代謝を可能にしないＴＨ、ＡＡＤＣを発現するが、ＤｂＨ及びＰＮＭ
Ｔを発現しない（図５）。
【００３５】
ドーパミンニューロンは、中脳ドーパミンニューロン発達に必要とされる転写因子であ
るＥｎ−１、ｐｔｘ３、Ｎｕｒｒ１及びＬｍｘ１ｂを発現する（図６Ａ、図６Ｂ）。
【００３６】
ドーパミンニューロンは、ＧＡＢＡを発現しない（図６Ｃ）。ＧＡＢＡとの共発現は、嗅球におけるドーパミンニューロンの特徴である。
【００３７】
ドーパミンニューロンは、カルビンジンを発現しない（図６Ｄ）。カルビンジンとの共
発現は、中脳の被蓋(tegamental)野におけるドーパミンニューロンの特徴である。
【００３８】
総合して、上記特徴は、本発明者等の培養系で産生されるドーパミンニューロンが中脳
ドーパミンニューロン、パーキンソン病において損失されるドーパミンニューロンである
黒質のより綿密に類似した中脳ドーパミンニューロンである。
【００３９】
ドーパミンニューロンは、ドーパミンニューロンの生存及び機能に必要とされる成長因
子であるＧＤＮＦに対する受容体であるｃ−ｒｅｔを保有する（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ
）。
【００４０】
ドーパミンニューロンはまた、ドーパミンの貯蔵及び放出に必要とされる輸送体である
ＶＭＡＴ２を発現する（図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ）。ドーパミンニューロンはまた、放出
後のドーパミン取り込みに必要な輸送体であるＤＡＴ（図７Ｇ、図７Ｈ、図７Ｉ）を発現
する。したがって、本発明者等の培養系において産生されるドーパミンニューロンは、伝
達物質ドーパミンの合成、貯蔵、放出及び取り込みに必須の機構を保有する。
【００４１】
ドーパミンニューロンは、シナプスの形成のためのシナプトフィジンを発現する（図７
）。ドーパミンニューロンは、刺激に応答して、活動電位を興奮（誘発：fire）させるこ
とができ、ドーパミンを分泌することができる（図８）。したがって、ドーパミンニュー
ロンは機能的である。
【００４２】
３．脊髄運動ニューロンの産生
脊髄運動ニューロンを産生する際の第１の工程は、脊髄（仙骨）アイデンティティーの
誘導である。ＲＡ（０．００１〜１μＭ）で６〜７日間のＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１−初期ロ
ゼット細胞の処理は、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８のような脊髄転
写因子であるＨｏｘ遺伝子を発現するが、前脳マーカーであるＯｘｔ２及びＢｆ−１又は
中脳マーカーであるＥｎ−１を発現しない（図１１Ａ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ）
前駆体への細胞の効率的な分化をもたらすが、Ｐａｘ６＋／Ｓｏｘ１＋神経管様ロゼット
細胞はもたらさない（図１０Ａ）。
【００４３】
第２の工程は、唯一腹側神経前駆体により発現される転写因子であるＯｌｉｇ２の発現
から明らかであるような腹側化前駆体の特質を誘導するためにソニックヘッジホッグ（Ｓ
ＨＨ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で６〜７日間、続いて正規のニューロン分化培
地中でさらに７〜１０日間、脊髄運動ニューロンが発生するまで脊髄前駆体を培養するこ
とである。
【００４４】
好ましい分化培地は、表３に記載している。
【００４５】
好ましい実施形態では、総分化細胞の少なくとも２２％が、脊髄運動ニューロンとなる
。運動ニューロンは、脊髄運動ニューロンにより特異的に発現される転写因子であるＨＢ
９、ｉｓｌｅｔ１／２及びＬｉｍ３を発現する（図１０）。運動ニューロンはまた、Ｈｏ
ｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８を発現するが、前脳マーカーであるＯｔｘ
２及びＢｆ−１又は中脳マーカーであるＥｎ−１は発現しない（図１１Ａ、図１１Ｃ、図
１１Ｄ、図１１Ｅ）ことから、運動ニューロンは脊髄運動ニューロンであることを示す。
【００４６】
運動ニューロンは、運動ニューロン伝達物質アセチルコリンを合成するのに必要な酵素
であるＣｈＡＴを発現する（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ）。運動ニューロ
ンはまた、ＶＡＣｈＴを発現し（図１２Ｅ）、運動ニューロンが、伝達物質アセチルコリ
ンを貯蔵することができ、且つ取り込むことができることを示唆する。
【００４７】
さらに、運動ニューロンは、シナプスの形成のためのシナプシン（図１２Ｆ）を発現す
る。運動ニューロンは、活動電位を興奮させることができる（図１３）。したがって、運
動ニューロンは機能的である。本発明者等は、運動ニューロンが、ＨＰＬＣにより分析さ
れるように、アセチルコリンを放出することを示すデータを有する。
【００４８】
４．前脳ニューロンの産生
別の実施形態では、本発明は、前脳ドーパミンニューロン、好ましくは神経系修復に適
した移植可能な神経前駆体へと霊長類ＥＳ細胞（好ましくは、ヒトＥＳ細胞）を分化させ
る方法である。好ましくは、中脳ドーパミンニューロン産生に関して上述するような方法
を開始するであろう。前脳ニューロンを産生するために、Ｐａｘ６+／Ｓｏｘ１-細胞をＦ
ＧＦ２でさらに４〜６日間処理した後、ＳＨＨで処理する。前脳ドーパミンニューロンを
産生する際の工程及びドーパミンニューロンの特質を決定するための分析は、中脳ドーパ
ミンニューロンに関して記載するものと同様である。主な差異は、特定の期間でのモルフ
ォゲンの使用及びドーパミンニューロンの特徴である。
【００４９】
前脳ドーパミンニューロンを産生する際の第１の工程は、中脳アイデンティティーの誘
導である。ＦＧＦ２（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）による６〜７日間のＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１
−初期ロゼット細胞の処理は、前脳転写因子であるＢｆ−１及びＯｔｘ２を発現する前駆
体への細胞の効率的な分化をもたらす。
【００５０】
第２の工程は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で
６〜７日間、続いて正規のニューロン分化培地中でさらに２週間、ドーパミンニューロン
が発生するまで前脳前駆体を培養することである。総分化細胞の３５％が、ドーパミンニ
ューロンとなる。米国特許出願第０９／９７０，３８２号から得た以下の説明は、好まし
い方法について記載している。
【００５１】
まず、霊長類ＥＳ細胞系、好ましくはヒトＥＳ細胞系を獲得して増殖させる。Thomson
，J.A.，et  al.，Science  282：1145-1147（1998）並びに米国特許第５，８４３，７８
０号及び同第６，２００，８０６号に記載される方法で、ＥＳ細胞（系）を得てもよいし
、または、正常な核型（karyotype)を有しており、少なくとも１１ヶ月、好ましくは１２
ヶ月間の連続培養後に未分化状態で増殖する能力を有するＥＳ細胞系を得るのに適した他
の方法により、ＥＳ細胞（系）を得てもよい。胚幹細胞系はまた、培養全体にわたって、
トロホブラスト（栄養芽細胞）を形成し、且つ３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚
葉）に由来する組織へ分化する能力を保持する。
【００５２】
続いて、細胞を培養する。本発明の好ましい実施形態では、細胞は、好ましくは以下に
また上述のThomson，J.A.，et  al.，1998並びに米国特許第５，８４３，７８０号及び同
第６，２００，８０６号に開示されるように、照射した哺乳類、好ましくはマウス胚線維
芽細胞のフィーダー（支持）細胞層上で増殖させる。本発明者等はまた、細胞がフィーダ
ー細胞層なしで増殖され得ることも想定する。
【００５３】
ＥＳ細胞コロニーは通常、ディスパーゼによる処理により接着細胞から無傷で取り出さ
れ、以下に記載するように胚様体（ＥＢ）と呼ばれる浮動性ＥＳ細胞凝集体として懸濁液
中で好ましくは４日間成長される。
【００５４】
続いて、ＥＢを、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌでＦＧＦ２を含有する培地中で培養して、
初期ロゼット細胞を産生する。培地の他の好ましい構成成分は、表３に記載している。し
かしながら、多くの他の培地構成成分が適切である。概して、適切な培地は、神経細胞を
成長させるのに使用される任意の培地である。以下の参照文献（上述のBain，G.，et  al
，1995；上述のOkabe，S.，et  al.，1996；上述のMujtaba，T.，et  al.，1999；上述の
Brustle，O.，et  al.，1999；Zhang，S.-C.，et  al.，J．Neurosci．Res．59：421-429
，2000；Zhang，S.-C.，et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  96：4089-4094，1999；
Svendsen，C.N.，et  al.，Exp．Neurol．137：376-388，1996；Carpenter，M.K.，et  a
l.，Exp．Neurol．158：265-278，1999；Vescovi，A.L.，et  al.，Exp．Neurol．156：7
1-83，1999）は、同じか、又は類似した培地を使用している。
【００５５】
培地中のおよそ５日の培養後に、平板培養されたＥＢは、扁平な細胞の成長(outgrowth
)を生み出し、７日目までには、中心小伸長細胞は、図１Ｂに見られるようなロゼット形
成を生み出す。これらの形成は、初期神経管に類似している（図１Ｂの挿入図）。以下に
記載するように、形態学により、又はネスチン及びＭｕｓａｈｉ  Ｉのような神経マーカ
ー抗原を用いた免疫蛍光分析により、神経前駆体の存在を確認し得る。好ましくは、神経
前駆体は、総細胞の少なくとも７２％、最も好ましくは少なくとも８４％を構成する。
【００５６】
以下で実施例に記載するように、好ましくは差次的酵素処理及び接着により、神経管様
ロゼットをさらに単離し得る。簡潔に述べると、ディスパーゼによる処理は、中枢神経上
皮島の優先的な脱離を招く。ロゼット細胞のクラスターを、周辺扁平細胞から分離するた
めに、８〜１０日間培養した分化ＥＢを、好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ  ディス
パーゼ（Gibco  BRL，Lifetechnologies，Rochville，MD）とともに、３７℃で１５〜２
０分間インキュベートする。あるいは、０．２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼを使用してもよ
い。ロゼットクランプは退縮するのに対して、周辺扁平細胞は、接着したままである。こ
の時点で、ロゼットクランプは、フラスコを揺らすことにより取り外され(dislodge)得て
、扁平細胞は接着した状態のままである。クランプをペレット化して、５ｍｌピペットで
穏かに粉砕して、培養フラスコへ３０分間平板培養し、混入している個々の細胞を接着さ
せる。続いて、浮遊しているロゼットクランプを、好ましくは結合を妨げるためにポリ（
２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）でコーティングされた新たなフラスコへ移して
、ヒト神経前駆体で使用される培地中で、ＦＧＦ２（通常２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培
養する。以下で実施例に記載するように、ディスパーゼによる処理、続く差次的接着は、
通常少なくとも９０％で、最も好ましくは少なくとも９６％で、神経前駆体細胞の高度に
濃縮された集団を生じる。さらに、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する抗体を使用した免疫分離の
ような他の方法を使用して、神経前駆体細胞を分離してもよい。
【００５７】
以下の実施例は、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体が３つすべてのＣＮＳ細胞型をｉｎ  
ｖｉｔｒｏで産生することができることを実証する。
【００５８】
以下の表は、本発明の本実施形態の様々な態様のフローチャートである：
【００５９】
【表３】
2010162024.tif 000005
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも７２％、好ましくは８４％の神経前駆体細胞
を含む細胞集団である。これらの神経前駆体細胞は、ネスチン及びＭｕｓａｓｈｉ  Ｉ陽
性であることにより規定され得る。図１Ｂは、これらの細胞を特性化しているロゼット形
成を示す。ロゼット形成とは、本発明者等は、細胞が円柱形状であり、管状（ロゼット）
構造に整列され、身体中の神経管（発達中の脳）に類似していることを意味する。円柱状
細胞形態及び管状構造は、図１Ｂの挿入図に示される。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の神経
前駆体細胞を含む細胞集団である。好ましくは、以下で実施例に記載するように、差次的
酵素処理及び接着後にこれらの細胞を得る。
【００６２】
５．本発明の細胞集団の使用
特異的な伝達物質表現型及び特有の位置的アイデンティティーを有する特殊ヒトニュー
ロン細胞型の産生は、神経障害における治療のための移植可能な細胞の供給源、例えばパ
ーキンソン病のための中脳ドーパミンニューロン、精神的疾患のための前脳ドーパミンニ
ューロン、脊髄障害及び運動ニューロン疾患（ＡＬＳを含む）のための脊髄運動ニューロ
ンを提供する。
【００６３】
ヒト胚幹細胞をまず神経上皮細胞へ、続いて特殊ニューロンへと指向性分化させるため
の段階的且つ化学的に規定される培養系の確立はまた、毒性及び治療剤のスクリーニング
に前例のない新しい系を提供する。現在では、毒物学的及び治療用薬物のスクリーニング
は、動物、動物細胞培養物又は遺伝的に異常なヒト細胞系を用いて実施される。ヒト胚幹
細胞及び特殊ニューロン細胞へのそれらの分化は、ヒト神経発達の正常なプロセスを表す
。したがって、本明細書中に記載する本発明は、正常なヒト神経発達に影響を及ぼす作用
物質、又は異常な脳発達を潜在的にもたらす作用物質、並びに罹患状態におけるニューロ
ン型の再生を刺激し得る作用物質をスクリーニングに適しているであろう。さらに、上述
の系は、ドーパミンニューロンの死（パーキンソン病で見られるような）又は運動ニュー
ロンの死（ＡＬＳで見られるような）を招く病理学的プロセスを模倣するように容易に修
飾することができ、これらの疾患を治療するように設計される治療用作用物質をスクリー
ニングするのに有効に使用され得る。
【００６４】
本発明のこの実施形態の好ましい方法では、本発明の細胞集団の１つを試験化合物に接
触させて、かかる接触の結果を、接触させていない対照細胞集団と比較する。培養物の特
徴を検査すること及びそれらを本出願内に含まれる既知の発達的特徴と比較することによ
り、特定の試験化合物が細胞集団に影響を及ぼしたかどうかを理解することができる。
【００６５】
【表４】
2010162024.tif 000006
【００６６】
【表５】
2010162024.tif 000007
【００６７】
【表６】
2010162024.tif 000008
【００６８】
【表７】
2010162024.tif 000009
【実施例１】
【００６９】
前脳ドーパミン作動性ニューロンの産生
結果
ヒトＥＳ細胞は、ＦＧＦ２の存在下で分化して、神経管様構造を形成する。ヒトＥＳ細
胞系であるＨ１、Ｈ９及びＨ９に由来するクローン細胞であるＨ９．２（上述のAmit，M.
，et  al.，2000）を、照射したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で増殖させた
（上述のThomson，J.A.，et  al.，1998）。分化を開始させるために、ＥＳ細胞コロニー
を剥離させて、胚様体（ＥＢ）として懸濁液中で４日間成長させた。続いて、ＥＢを組織
培養処理フラスコにおいて、ＦＧＦ２を含有する化学的に規定される培地（Zhang，S.-C.
，et  al.，J．Neurosci．Res．59：421-429，2000；Zhang，S.-C.，et  al.，Proc．Nat
l．Acad．Sci．USA  96：4089-4094，1999）中で培養した。ＦＧＦ２は、Peprotech，Inc
.，Rocky  Hill，NJから入手した。ＦＧＦ２中での５日の培養後に、平板培養されたＥＢ
は、扁平な細胞の成長をもたらした。同時に、小伸長細胞の数の増大が、分化ＥＢの中心
で観察された（図１Ａ）。規定培地中で７日までには、中心小伸長細胞は、ロゼット形成
を生み出し(generate)（図１Ｂ）、トルイジンブルー染色した切片により示されるように
、初期神経管に類似していた（図１Ｂの挿入図）。免疫蛍光分析は、神経マーカー抗原ネ
スチン及びＭｕｓａｓｈｉ−１（Lendahl，U.，et  al.，Cell  60：585-595，1990；Kan
eko，Y.，et  al.，Dev．Neurosci．22：139-153，2000）の発現が、ロゼット中の細胞に
主として制限されるが、分化ＥＢ細胞の周辺における扁平細胞には制限されないことを明
らかにした（図１Ｃ〜図１Ｅ）。未分化ＥＳ細胞は、これらのマーカーに対して免疫陰性
であった。神経管様構造の形成は、ＦＧＦ２の存在下でＥＢの大部分で観察された（Ｈ９
及びＨ９．２系から総３５０ＥＢの９４％、３回の別個の実験）。ＦＧＦ２の非存在下で
は、十分体系化された(organized)ロゼットは観察されなかった。
【００７０】
神経管様ロゼットは、差次的酵素処理及び接着により単離することができる。ＦＧＦ２
への連続接触により、円柱状ロゼット細胞は増殖して、多層を形成した。円柱状ロゼット
細胞は、高い頻度で、ＥＢの大部分を構成し、周辺扁平細胞とはっきり分けられた。ディ
スパーゼによる処理は、中枢神経上皮島の優先的な脱離を招き、周辺細胞は主として接着
したままであった（図１Ｆ）。混入している単細胞は、細胞培養皿への短期間の接着によ
り分離した。この単離及び濃縮手順直後に実施した細胞計数により、単離された神経上皮
クラスターに関連する細胞が、分化ＥＢ培養物における細胞の７２〜８４％を構成するこ
とが示された。免疫細胞化学分析により、４回の別個の実験で検査された１３，３２４個
の細胞に基づいて、単離ロゼット細胞の９６±０．６％が、ネスチンに関して陽性に染色
されることが示された。これらの細胞の大多数はまた、Ｍｕｓａｓｈｉ−１及びＰＳＡ−
ＮＣＡＭに関しても陽性であった（図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ）。
【００７１】
ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体は、３つすべてのＣＮＳ細胞型をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産
生する。単離した神経前駆体細胞は、ヒト胎児脳組織に由来する「ニューロスフェア」培
養物に類似して、懸濁培養で浮動性細胞凝集体として増殖させた（上述のZhang，S.-C.，
et  al.，2000；上述のSvendsen，C.N.，et  al.，1996；上述のCarpenter，M.K.，et  a
l.，1999；上述のVescovi，A.L.，et  al.，1999）。ＢｒｄＵ取り込み試験は、前駆体細
胞増殖の刺激が、ＦＧＦ２に依存性であり、ＥＧＦ又はＬＩＦ単独により誘発され得ない
ことを明らかにした。さらに、ＦＧＦ２をＥＧＦ及び／又はＬＩＦと組み合わせた場合、
相加効果又は相乗効果は観察されなかった（図２Ａ）。
【００７２】
ＥＳ細胞由来の神経前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、ＦＧＦ２の除去並びにオルニチ
ン及びラミニン基質上での平板培養により誘導された。数日以内に、個々の細胞及び無数
の成長円錐体が球体から生じ、スターバーストの外観を呈した。平板に播種後７〜１０日
までには、球体から発した突起は、顕著な線維束を形成した。高い頻度で、小遊走細胞は
、線維と密接に関連して観察された（図２Ｂ）。分化した培養物の免疫蛍光分析は、成長
領域における細胞の大多数が、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２ａｂ及びβIII−チュ
ーブリンを発現したことを明らかにした（図２Ｃ）。低分子量神経線維（ＮＦ）と高分子
量ＮＦの発現が、平板培養後７〜１０日目まで及び１０〜１４日目までのそれぞれにおい
て観察された（図２Ｄ）。様々な神経伝達物質に対する抗体を使用して、ＥＳ細胞由来の
ニューロンをさらに特性化した。ニューロンの大部分がグルタミン酸作動性表現型を示し
た（図２Ｅ）のに対して、より小比率が、ＧＡＢＡに対する抗体で標識された。高い頻度
で、これらのニューロンは、極形態を示した（図２Ｆ）。少数のニューロンが、ドーパミ
ン合成に関する律速酵素であるＴＨを発現することがわかった（図２Ｇ）。ＧＦＡＰ+ア
ストロサイトは、成長因子退薬後の最初の２週間以内にはまれにしか見出されなかった（
図２Ｃ）が、長期にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化後にはより頻繁になった。４週までには
、ＧＦＡＰ+アストロサイトは、分化されたニューロンの真下に広範囲にわたる層を形成
した（図２Ｄ）。オリゴデンドロサイトは、標準的な培養条件下では観察されなかったの
に対して、細胞を血小板由来成長因子Ａ（上述のZhang，S.-C.，et  al.，2000）の存在
下で２週間以上培養した場合に、典型的なオリゴデンドロサイト形態を有するわずかなＯ
４−免疫反応性細胞が観察された（図２Ｈ）。したがって、ＥＳ細胞由来の神経前駆体は
、ＣＮＳの３つすべての主要な細胞型を産生する。
【００７３】
ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで遊走し、合体して、且つ分化する
。ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏでの分化を評価するために、本発明者
等は、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体を新生マウスの側脳室へ移植した（Flax，J.D.，et
al.，Nat．Biotech．16：1033-1039，1998）。移植された細胞は、脳室系の様々な領域
でクラスターを形成し、大量に各種宿主脳領域へ取り込まれた。移植の１週後と４週後と
の間で分析した２２個の脳のうち、脳室内クラスター及び取り込まれた細胞は、それぞれ
１９個及び１８個のレシピエント脳において見出された。より長期間後に分析した個々の
動物により、移植された細胞が、移植の少なくとも８週間後に検出可能であることが示さ
れた。クラスター内の細胞は、ネスチン、βIII−チューブリン及びＭＡＰ２ａｂに対す
る抗体に対して強力な免疫反応性を示した。凝集体におけるほんのわずかな細胞がＧＦＡ
Ｐを発現した。未分化ＥＳ細胞及び非神経上皮で通常発現されるマーカーであるアルカリ
ホスファターゼ及びサイトケラチンは、クラスター内では検出されなかった。奇形腫形成
は観察されなかった。
【００７４】
ヒト特異的プローブによるＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法及びヒト核特異
的抗原の免疫組織化学的検出は、多数の脳領域において移植された細胞の存在を明らかに
した。広範囲に及ぶドナー細胞取り込みを示す灰白質領域は、皮質（図３Ａ）、海馬（図
３Ｂ、図３Ｃ）、嗅球、中隔（図３Ｄ）、視床、視床下部（図３Ｅ）、線条（図３Ｆ）及
び中脳（図３Ｇ）を包含した。白質領域への取り込みは、脳梁、内包及び海馬線維路で最
も顕著であった。形態学的には、取り込まれたヒト細胞は、周辺宿主細胞と区別できず、
ヒト特異的マーカーを用いることでのみ検出可能であった（図３）。細胞型特異的抗体に
よる二重標識は、取り込まれた細胞が、ニューロン及びグリアの両方へ分化したことを明
らかにした。ヒトＥＳ細胞由来のニューロンは、βIII−チューブリン及びＭＡＰ２に対
する抗体を用いてはっきりと描写することができた（図３Ｈ、図３Ｊ）。高い頻度で、ヒ
トＥＳ細胞由来のニューロンは、長い突起を伴う極形態を示した（図３Ｈ）。さらに、多
極及び未熟単極形態を有するニューロンが見出された（図３Ｊ）。ドナー由来のニューロ
ンは、宿主脳へと長距離を突出させる無数の軸索を産生し、灰白質及び白質の両方で検出
された。ドナー由来のニューロンは、脳梁、前交連及び海馬采のような線維路内で特に豊
富であり、そこではドナー由来のニューロンは、しばしば、単一切片内の数百マイクロメ
ートルにわたって見出され得た（図３Ｉ）。
【００７５】
ニューロンのほかに、少数のＥＳ細胞由来のアストロサイトが、宿主脳組織内に検出さ
れた。少数のＥＳ細胞由来のアストロサイトは、星状形態を示し、ＧＦＡＰの強力な発現
を示した（図３Ｋ）。対比して、ミエリンタンパク質に対する抗体による取り込まれたヒ
ト細胞の二重標識は、成熟オリゴデンドロサイトを検出することができなかった。宿主脳
へ遊走したドナー細胞の幾つかは、移植の最大４週間でさえ、ネスチン陽性表現型を保持
した。これらの細胞の多くは、血管周囲位置に見られた。
【００７６】
論考
本研究は、成熟ニューロン及びグリアを産生することが可能な移植可能な神経前駆体が
、高収率でヒトＥＳ細胞から産生することができることを示している。本明細書中に記載
されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化手順である成長因子媒介性増殖／分化、並びに神経前駆体細
胞の差次的接着を利用することは、神経発達の研究に関する新たな土台、及び神経系修復
のためのドナー細胞の産生を提供する。
【００７７】
この研究の重要な見解は、ヒトＥＳ細胞からの神経前駆体の分化が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
で神経管様構造の形成を伴う神経系発達の初期工程を反復するようであるということの観
察である。この現象はここでは、制御された条件下でヒト神経発達の初期段階を研究及び
実験的に操作するのに利用することができる。化学的に規定された培養系は、ｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏでのヒト神経上皮増殖及び特定化に対する単一因子の影響を探索するための特有の
機会を提供する。発達中のヒト脳に由来する前駆体と同様に、ヒトＥＳ細胞由来の前駆体
は、ＦＧＦ２に対して強力な増殖性応答を示す（上述のFlax，J.D.，et  al.，1998）。
しかしながら、増殖に対する相加効果も相乗効果も、ＥＧＦ又はＬＩＦにより誘発され得
ない。この見解は、初代細胞を用いて得られるデータ（上述のZhang，S.-C.，et  al.，2
000；上述のSvendsen，C.N.，et  al.，1996；上述のCarpenter，M.K.，et  al.，1999；
上述のVescovi，A.L.，et  al.，1999）と異なり、ＥＳ細胞由来の神経前駆体の増殖が、
胎児ヒト脳に由来する前駆体細胞よりも多くの未熟段階を表すということを示唆すること
ができる。げっ歯類細胞に関する研究は実際に、初期神経発生から単離された神経幹細胞
が、増殖に関してＦＧＦ２に依存し、ＦＧＦに対する応答性が、神経前駆体細胞分化の後
期段階でのみ獲得されるということを示している（Kalyani，A.D.，et  al.，Dev．Biol
．186：202-223，1997；Fricker，R.A.，et  al.，J．Neurosci．19：5990-6005，1999）
。
【００７８】
神経管様構造のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生及びそれらの差次的接着に基づいてこれらの
構造を単離することができることは、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体を高純度で産生する
ための簡素だが効率的なアプローチを提供する。具体的には、神経上皮構造内の強力な細
胞間及び組織培養基材へのそれらの低い接着性が、未分化ＥＳ細胞又は他の体細胞系の細
胞の著しい混入を伴わずに神経細胞の選択的単離を可能にする。この手順の高い効率は、
単離細胞の９５％以上がネスチン陽性表現型を示し、ＥＳ細胞又は非神経上皮が移植レシ
ピエントにおいて検出不可能であるという事実により反映される。未分化ＥＳ細胞及び他
の系統に対する前駆体は、腫瘍及び外来組織を形成し得るため、精製された体細胞集団の
産生が、ＥＳ細胞ベースの神経移植戦略の開発にとって重要な前提条件である。
【００７９】
新生児マウス脳への移植後、ＥＳ細胞由来の神経前駆体は、多種多様の脳領域へ取り込
まれ、そこでＥＳ細胞由来の神経前駆体は、ニューロン及びグリアへ分化した。ｉｎ  ｖ
ｉｖｏで成熟をオリゴデンドロサイト検出することができないことは、それらのげっ歯類
相当物と対比して、ヒト神経前駆体の低いオリゴデンドロサイト分化効率に起因する可能
性が高い（Svendsen，C.N.，et  al.，Brain  Pathol．9：499-513，1999）。意外にも、
ドナー由来のニューロンは、生後の神経発生を示す部位に制限されず、脳の多くの他の領
域にも見出された。同様のデータが、成体げっ歯類脳へのヒトＣＮＳ由来の前駆体の移植
に関与する研究で得られた（Tropepe，V.，et  al.，Dev．Biol．208：166-188，1999）
。有糸分裂後脳領域への個々の前駆体細胞の取り込みは、成体脳及び脊髄における細胞置
換に関して特に関連性が高い。さらに、取り込まれた細胞が、領域特異的特性を獲得して
、機能的に活性となるかどうか、並びに取り込まれた細胞が、どの程度まで領域特異的特
性を獲得して、機能的に活性となるかを決定するのに、より詳細な研究が必要とされる。
【００８０】
成熟及び未熟の神経上皮細胞から構成される脳室内クラスターを除いて、占拠性病変は
、宿主脳内では検出されなかった。最も顕著なことに、奇形腫形成は、最大８週間の術後
期間中観察されなかった。特に非ヒト霊長類におけるより厳格な長期安全性研究が、潜在
的な臨床用途を検討するまえに必要とされることが明らかであるが、本発明者等のデータ
は、分化ヒトＥＳ細胞培養物から単離された神経前駆体が神経修復用の有望なドナー供給
源を表すことを示している。
【００８１】
実験プロトコル
ＥＳ細胞の培養。ＥＳ細胞であるＨ１（継代１６〜３３）、Ｈ９（ｐ３４〜５５）及び
Ｈ９に由来するクローン細胞であるＨ９．２（ｐ３４〜４６）（上述のAmit，M.，et  al
.，2000）を、過去に記載されたように（上述のThomson，J.A.，et  al.，1998）、照射
したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）／Ｆ１２、２０％血清代替物（Gibco）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、
２μｇ／ｍｌヘパリン、及び４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Pepro  Tech  Inc.，Rochy  Hill
，NJ）から構成される培地を毎日交換して培養した。核型分析により、所定の継代での系
は二倍体であることが示された。
【００８２】
ＥＳ細胞培養物の分化。ＥＳ細胞培養物を、ディスパーゼ（Gibco  BRL、０．１ｍｇ／
ｍｌ）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、無傷のＥＳ細胞コロニーを取り出し
た。ＥＳ細胞コロニーをペレット化して、ＦＧＦ２なしのＥＳ細胞培地中に再懸濁させて
、毎日培地交換しながら２５ｃｍ2組織培養フラスコ（Nunc）において４日間培養した。
ＥＳ細胞コロニーは、浮遊ＥＢとして成長したのに対して、あらゆる残存フィーダー細胞
は、フラスコに接着した。ＥＢを新たなフラスコへ移すことにより、フィーダー細胞を除
去した。続いて、ＥＢ（およそ５０個／フラスコ）を２５ｃｍ2組織培養フラスコ（Nunc
）において、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、
プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（６０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎ
Ｍ）及びヘパリン（２μｇ／ｍｌ）を補充（添加）したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、ＦＧＦ２
（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で平板培養した（上述のZhang，S.-C.，et  al.，2000、上
述のZhang，S.-C.，et  al.，1999）。
【００８３】
神経前駆体細胞の単離及び培養：周辺扁平細胞からロゼット細胞のクラスターを分離す
るために、培養物を０．１ｍｇ／ｍｌのディスパーゼとともに３７℃で１５〜２０分間イ
ンキュベートした。ロゼットクランプは退縮したのに対して、周辺扁平細胞は、付着した
ままであった。この時点で、ロゼットクランプは、フラスコを揺らすことにより取り外さ
れ、扁平細胞は接着した状態のままであった。クランプをペレット化して、５ｍｌピペッ
トで穏かに粉砕して、培養フラスコへ３０分間平板培養して、混入している個々の細胞を
接着させた。続いて、浮遊しているロゼットクランプを、結合を妨げるためにポリ（２−
ヒドロキシエチル−メタクリレート）でコーティングされた新たなフラスコへ移して、ヒ
ト神経前駆体で使用される培地中（上述のZhang，S.-C.，et  al.，2000）、ＦＧＦ２（
２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。神経分化及び単離の効率を定量化するために、分
離したての細胞クラスター及び残された扁平細胞をトリプシン（０．１％ＥＤＴＡ中０．
０２５％）で解離（分離）させて、計数した。ＥＳ細胞から分化した総細胞間での推定神
経前駆体（ロゼット細胞）の割合は、Ｈ９及びＨ９．２系に関する３回の別個の実験に基
づいて得られた。ＥＳ細胞由来の神経前駆体の分化潜在性の分析のために、細胞をオルニ
チン／ラミニン基質上で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２サプリメント（Gibco）、ｃＡＭＰ（
１００ｎｇ／ｍｌ）及びＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、PeproTech）から構成される培地中
で、ＦＧＦ２の存在なしで培養した。突起膠細胞分化に関しては、記載されるように（上
述のZhang，S.-C.，et  al.，2000）、ＥＳ細胞由来の神経前駆体を、Ｎ１（Gibco）及び
血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦＡ）（２ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した
。形態学的観察並びに前駆体及びより成熟した神経細胞に関するマーカーによる免疫染色
は、分化の過程中に実施された。
【００８４】
組織化学的及び免疫組織化学的染色。ロゼット形成をより良好に可視化するために、ロ
ゼットを伴う培養物を、ＰＢＳ中ですすいで、４％パラホルムアルデヒド及び０．２５％
グルタルアルデヒド中で１時間固定した。続いて、記載されるように（上述のZhang，S.-
C.，et  al.，1999）、固定した細胞をプラスチック樹脂中に包埋するために加工した。
続いて、培養細胞を１μｍ厚に切片化して、トルイジンブルーで染色した。免疫染色に関
して、他の箇所で詳述される適切な蛍光二次抗体（上述のZhang，S.-C.，et  al.，2000
、Zhang，S.-C.，et  al.，1999）により検出される以下の一次抗体で、カバーガラス培
養物を免疫染色した：抗ネスチン（ポリクローナル、ＮＩＮＤＳのDr．R．McKayから贈与
、１：１，０００）、抗ポリシアル酸化ニューロン細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、マ
ウスＩｇＭ、フランスのマルセイユ大学のDr．G．Rougonから贈与、１：２００）、抗Ｍ
ｕｓａｓｈｉ−１（ラットＩｇＧ、日本の東京大学のDr．H．Okanoから贈与、１：５００
）、抗ＧＦＡＰ（ポリクローナル、Dako、１：１，０００）、抗ヒトＧＡＦＰ（スタンバ
ーグポリクローナル、１：１０，０００）、Ｏ４（マウスＩｇＭ、ハイブリドーマ上清、
１：５０）、抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、Pel  Freez、１：５００）。残りの抗
体は、Sigmaからのものであった：抗βIII−チューブリン（マウスＩｇＧ，１：５００）
、抗神経フィラメント（ＮＦ）６８（マウスＩｇＧ、１：１，０００）、抗ＮＦ２００（
ポリクローナル、１：５，０００）、抗ＭＡＰ２ａｂ（マウスＩｇＧ、１：２５０）、抗
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ、ポリクローナル、１：１０，０００）、抗グルタメート（マ
ウスＩｇＧ、１：１０，０００）。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに関し
て、各群における４つのカバーガラス培養物を２μＭのＢｒｄＵとともに１６時間インキ
ュベートした後、培養物を４％パラホルムアルデヒド中で固定して、１Ｎ  ＨＣｌで変性
させて、免疫標識及び細胞計数用に加工した（上述のZhang，S.-C.，et  al.，2000、Zha
ng，S.-C.，et  al.，1999）。
【００８５】
脳室内移植及びｉｎ  ｖｉｖｏ分析。神経前駆体の凝集体をトリプシンで解離させた後
（０．１％ＥＤＴＡ中０．０２５％、３７℃で５〜１０分間）、１００，０００個の生細
胞／μｌの懸濁液を、Ｌ１５培地（Gibco）中に調製した。頭部の下方から照明を使用し
て、寒冷麻酔をした新生マウス（Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ）の側脳室それぞれに、細胞懸濁液
２〜３μｌをゆっくりと注射した。移植された動物を、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋ
ｇ、ｉ．ｐ．）の毎日の注射により免疫抑制した。移植の１週後、２週後、４週後及び８
週後に、リンゲル液、続いて４％パラホルムアルデヒドを経心的にマウスに灌流させた。
脳を切開して、使用するまで同じ固定液中で４℃にて後固定させた。ドナー細胞は、ヒト
ａｌｕ反復要素に対するジゴキシゲニン標識プローブ（Brustle，O.，et  al.，Nat．Bio
tech．16：1040-1044，1998）又はヒト特異的核抗原に対する抗体（ＭＡＢ１２８１、Che
micon、１：５０）を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイションにより、５０μ
ｍの冠状ビブラトーム切片で同定された。免疫陽性細胞を、ＧＦＡＰ（１：１００）、ネ
スチン、βIII−チューブリン（ＴＵＪ１、BabCo、１：５００）、ＭＡＰ２ａ（Sigma、
クローンＡＰ−２０及びＨＭ−２、１：３００）及びリン酸化中程度分子量ヒト神経フィ
ラメント（クローンＨＯ−１４、１：５０、J．Trojanowskiから贈与）に対する抗体で二
重標識した。一次抗体を、適切なフルオロフォア結合二次抗体で検出した。切片を、Ｚｅ
ｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２及びＬｅｉｃａレーザスキャン顕微鏡上で分析した。
【実施例２】
【００８６】
中脳ドーパミンニューロンの産生
神経学的状態における幹細胞療法の潜在的適用に対する第１の工程は、正確なアイデン
ティティー及び伝達物質の表現型を有する神経細胞の有向性分化である。ここでは、本発
明者等は、モルフォゲン作用の特異的配列によるヒト胚幹（ＥＳ）細胞からの機能的ドー
パミン作動性（ＤＡ）ニューロンの頑強な産生を示す。Ｓｏｘ１を発現する前に、初期段
階でヒトＥＳ由来の神経外胚葉細胞をＦＧＦ８によって処理することは、正確な中脳ＤＡ
突出ニューロン表現型を有するＤＡニューロンの特定化に必須である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
で産生されたＤＡニューロンは、毒物学的且つ薬学的スクリーニングに、及びパーキンソ
ン病における潜在的細胞療法に使用され得る。
【００８７】
パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳、特に黒質におけるＤＡニューロンの進行性退化に起
因する。ＰＤに対する現在の療法は、主として、レバドパのようなＤＡ前駆体の全身投与
による症状軽減に依存する。かかる療法は、最初の数年間は有効であるが、ほぼ必ずその
有効性を失い、重症の副作用を生じる。グリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の
ような成長因子の投与は、小規模の臨床試験において有効であることが示されている（Gi
ll，S.S.，et  al.，Nat．Med．9：589-595，2003）。この療法は、十分数の生存ＤＡニ
ューロンに依存し、その長期にわたる治療上の可能性は、いまだ調査されていない。ニュ
ーロン退化の限局的性質のため、細胞移植が代替的療法として提唱されている（Bjorklun
d，A．and  Lindvall，O.，Nat．Neurosci．3：537-544，2000）。幾つかの成功事例では
、移植された胎児中脳細胞は、１０年にわたって生存し、症状の軽減に寄与する（Kowdow
er，J.H．et  al.，N．Engl．J．Med．332：1118-1124，1995；Piccini，P.，et  al.，N
at．Neurosci．2：1137-1140，1999）が、最近規制された臨床試験では、ＰＤに対する胎
児組織移植療法の有効性に疑問を投じている（Freed，C.R.，et  al.，N．Engl．J．Med
．344：710-719，2001；Olanow，C.W.，et  al.，Ann．Nuerol．54：403-414，2003）。
これらの現象は、ＰＤの複雑さを示している。機能的ヒト中脳ＤＡニューロンの信頼性高
い再生可能な供給源は、ＤＡ系の起源、ＤＡニューロンの生存及び機能に影響を及ぼす発
病プロセス並びにＰＤに対する持続可能な治療法の開発に関する系統だった研究に緊急に
必要とされる。
【００８８】
ＤＡニューロンは、マウスＥＳ細胞から効率的に産生することができることが示されて
おり、マウスＥＳ細胞は、胚盤胞段階での着床前胚の内細胞塊に由来する（Evans，M.J．
and  Kaufman，M.H.，Nature  292：154-156，1981；Martin，G.R.，Proc．Natl．Acad．
Sci．USA  78：7634-7638，1981）。マウスＥＳ細胞はまず、ＦＧＦ２により（Lee，S.H.
，et  al.，Nat．Biotechnol．18：675-679，2000）、或いは間質細胞由来の誘導活性に
より（Kawasaki，H．，et  al.，Neuron  28：31-40，2000；Barberi，T.，et  al.，Nat
．Biotechnol．21：1200-1207，2003）、神経外胚葉細胞へと誘導される。続いて、神経
外胚葉細胞を、ＤＡニューロン誘導のためにＦＧＦ８、続いてＳＨＨに接触させる。この
研究では、本発明者等は、ヒトＥＳ細胞（Thomson，J.A.，et  al.，Science  282：1145
-1147，1998）を誘導して、ＦＧＦ８及びＳＨＨに応答して中脳突出特徴を有する大比率
のＤＡニューロンを産生する神経外胚葉細胞（Zhang  S.C.，et  al.，Nat．Biotechnol
．19：1129-1133，2001）へ分化させるための頑強な系を確立した。本発明者等は、中脳
突出ニューロン表現型を有するＤＡニューロンを産生するために、前駆体細胞がＳｏｘ１
+発現神経外胚葉細胞となる前に、ヒトＥＳ細胞をＦＧＦ８へ接触することが必要である
ことを見出した。
【００８９】
結果
ヒトＥＳ由来の神経外胚葉細胞は、前脳特質を示す
フィーダー細胞層から剥離させたＥＳ細胞コロニーを、ＥＳ細胞成長培地中で４日間、
凝集体として懸濁液中で培養した後、接着性培養器で、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含
有する化学的に規定される神経細胞用培地中で成長させた（上述のZhang，S.C．et  al.
，2001）。コロニー中心における細胞は、円柱状形態を現し、およそ９日目にロゼット形
成で整列した（図４Ａ）。これらの円柱状細胞は、Ｐａｘ６に対して陽性であったが、汎
神経転写因子であるＳｏｘ１に対して陰性であり（図示せず）、初期神経外胚葉細胞を示
している。さらに５〜６日にわたって（１４〜１５日目）、円柱状細胞は増殖して、神経
管様ロゼットへと体系化して（図４Ｂ）、神経管閉鎖中に最終的な神経外胚葉細胞により
発現される転写因子であるＳｏｘ１（Pevny，L.H.，et  al.，Development  125：1967-1
978，1998）を発現した（図４Ｃ）。円柱状細胞は、前脳細胞により発現される転写因子
である脳因子（Ｂｆ１）（Tao．W．and  Lai，E．Neuron  8：057-966，1992）に対して
陽性であったが、中脳により発現される転写因子であるエングレイルド１（Ｅｎ−１）（
Davidson，D.，et  al.，Development  104；305-316，1988；Wurst，W.，et  al.，Deve
lopment  120：2065-2075，1994）に対して陰性であり（図４Ｄ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
産生された神経外胚葉細胞の前脳アイデンティティーを示唆した。
【００９０】
中脳表現型の誘導は、ＦＧＦ８の初期作用を要する
ＤＡニューロンの分化のために、神経管様ロゼットにおける神経外胚葉細胞は、差次的
酵素及び接着処理により濃縮され（上述のZhang，S.C.，et  al.，2001）、ＦＧＦ２を用
いて懸濁液中で凝集体として４日間増殖(expansion)させた後、ラミニン基質上に平板培
養し、ＳＨＨ（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ８（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）で６
日間処理した。免疫細胞化学分析により、大多数の神経外胚葉細胞が、Ｂｆ１に対して依
然として陽性であるが、Ｅｎ−１対しては陽性でないことが示された（図示せず）。
【００９１】
ＦＧＦ８が、Ｓｏｘ１+神経外胚葉細胞にＥｎ−１を発現させるよう誘導することがで
きないことは、Ｓｏｘ１−発現神経外胚葉細胞が、パターニングシグナルに対して不応性
であり得ることを示唆する。Ｓｏｘ１−発現細胞は、ヒトＥＳ細胞の分化の２週後（６日
齢の胚に相当（上述のThomson，J.A.，et  al.，1998）に産生され、神経管様構造を形成
するため、Ｓｏｘ１−発現細胞は、神経外胚葉細胞がＳｏｘ１を発現し、且つ局所的に特
定化される神経管閉鎖での神経外胚葉細胞に相当し得る（Lumsden，A．and  Krumlauf，R
.，Science  274：1109-1115，1996）。このことは、本発明者等に、神経外胚葉細胞がＳ
ｏｘ１を発現する前にＦＧＦ８が中脳特定化を促進し得ると仮定するに至らせた。したが
って、本発明者等は、コロニー中心における細胞が９日目に円柱状になった時点で、ＦＧ
Ｆ８（１００ｎｇ／ｍｌ）を適用した。６日後に、コロニー中心における細胞は、ＦＧＦ
２の存在下で見られるように、神経管様細胞に発生した。これらの神経外胚葉細胞は同様
に濃縮されて、ＦＧＦ８中で４日間増殖された(expanded)後、ラミニン基質上で６日間、
ＳＨＨで処理した。この培養条件下では、Ｅｎ−１発現は、ネスチン発現神経外胚葉細胞
で観察された（図４Ｅ）が、依然としてＢｆ１を発現する細胞が存在した（図４Ｆ）。し
たがって、神経外胚葉細胞は、それらがＳｏｘ１+となる前に、効率的に局所化された。
【００９２】
局所化された神経外胚葉細胞は、ＤＡニューロンへ分化する
神経外胚葉細胞を解離して、神経分化培地中で分化させた。神経外胚葉細胞は、未分化
ヒトＥＳ細胞により高度に発現される糖タンパク質である段階特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ
４）を発現しなかった。最初に均一に分布させた脱凝集神経外胚葉細胞は、平板培養の３
〜５日後に、ロゼットを再形成した。続いて、脱凝集神経外胚葉細胞は、突起を伸長して
、極形態を示した。分化後３週目に、総分化細胞集団の約３分の１（４回の実験から計数
された１７，９６５個の細胞のうち３１．８±３．１％のＴＨ+細胞）が、チロシンヒド
ロキシラーゼ（ＴＨ）に対して陽性であった（図５Ａ）。同様の割合のＴＨ+細胞が、Ｈ
９及びＨ１ヒトＥＳ細胞系の両方から得られた。たいていのＴＨ発現細胞は、直径が１０
〜２０μｍであった。たいていのＴＨ発現細胞は、分化可能な軸索及び樹状突起を有する
極形態を示した（図５Ａ）。ＴＨ+細胞はすべて、ニューロンマーカーであるβIII−チュ
ーブリン+ニューロンで陽性に染色され、約５０％がＴＨ+であった（図５Ｂ、４回の実験
からの１２，８５９個のβIII−チューブリン+ニューロンのうち６，３８３個がＴＨ+細
胞）。
【００９３】
モノアミンの生合成において、ＴＨは、チロシンをＬ−ＤＯＰＡへと加水分解し、続い
てＬ−ＤＯＰＡは、ＡＡＤＣにより脱カルボキシル化されてＤＡとなる。別の２つの酵素
であるＤβＨ及びフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）
は、それぞれ、ＤＡをノルエピネフリンへ変換し、ノルエピネフリンをエピネフリンへと
触媒する。免疫染色により、ＴＨ+細胞はすべて、ＡＡＤＣである（図５Ｃ〜図５Ｅ）が
、幾つかのＡＡＤＣ+細胞は、ＴＨに対して陰性である（図５Ｅ）ことが示された。しか
しながら、ＴＨ+細胞は、ＤβＨ（図５Ｅ）及びＰＮＭＴ（図示せず）に対して陰性であ
ったが、ＤβＨは、成体ラット及び胚サル脳幹においてノルアドレナリン作動性ニューロ
ンを強力に染色した（図５Ｆにおける挿入図）。これらのデータは、ＴＨ発現ニューロン
が、ドーパミン合成に必要である両方の酵素を保有すること、及びこれらのニューロンが
、ノルアドレナリン作動性及びアドレナリン作動性ニューロンではなくＤＡニューロンで
あることを示唆する。
【００９４】
ＥＳ細胞により産生されたＤＡニューロンは、中脳表現型を示す
ＲＴ−ＰＣＲ分析により、中脳ＤＡニューロン発達に関与するＮｕｒｒ１、Ｌｉｍｘ１
ｂ、Ｅｎ−１及びＰｔｘ３（Zetterstrom，R.H.，et  al.，Science  276：248-259，199
7；Smidt，M.P.，et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  94：13305-13310，1997；Sauc
edo-Cardenas，O.，et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  95：4013-4018，1998；Wall
en，A.，et  al.，Exp．Cell  Res．253：737-746，1999；Smidt，M.P.，et  al.，Nat．
Neurpsci．3：337-341．2000；Simon，H.H.，et  al.，J．Neruosci．21：3126-3134，20
01；Van  den  Munckhof，P.，et  al.，Development  130：2535-2542，2003；Nunes，I
.，et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  100：4245-4250，2003）は、神経外胚葉細胞
がＤＡニューロンに分化されるまで、高レベルでは発現されなかったことが示された（図
６Ａ）。免疫染色は、多数の突起を有するほとんどのＴＨ+細胞が、核において中脳マー
カーＥｎ−１を共発現することを明らかにした（図６Ｂ）。したがって、上記アプローチ
を用いて産生されたＤＡニューロンは、中脳位置的アイデンティティーを保有する。
【００９５】
嗅球におけるＤＡニューロンは、多くの場合、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を共発現す
る（Kosaka，T.，et  al.，Exp．Brain  Res．66：191-210，1987；Gall，C.M.，et  al.
，J．Comp．Neurol．266：307-318，1987）。ＴＨ及びＧＡＢＡの二重免疫染色により、
ＤＡニューロンのほとんどが、ＧＡＢＡに対して陰性であるが、ＧＡＢＡ+ニューロンは
、培養物中に見出されることが示された（図６Ｃ）。すべてのＴＨ+細胞のうち、８％の
ＴＨ+細胞（８．７±３．９％、４回の実験から計数される６，５２０個のＴＨ+細胞）が
ＧＡＢＡを共発現した。これらの二重陽性細胞の多くが、小さな二極細胞であった（図６
Ｃにおける挿入図）。幾つかの中脳ＤＡニューロン、特に腹側被蓋領域における中脳ＤＡ
ニューロンは、ＴＨと一緒にコレシストキニンオクタペプチド（ＣＣＫ８）又はカルビン
ジンを共発現する（McRitchie，D.A.，et  al.，J．Comp．Neurol．364：121-150，1996
；Hokfelt，T.，et  al.，Neurosci．5：2093-2124，1980）。免疫組織化学分析により、
ＴＨ+ニューロンが観察されることが示された（図６Ｄ）。これらのカルビンジンニュー
ロンは、主として小さな細胞であった。ＣＣＫ８陽性細胞は、培養物中で検出されなかっ
た。
【００９６】
ＥＳ細胞により産生されるＤＡニューロンは、生物学的に機能的である
免疫染色により、すべてのＴＨ+ニューロンが、ＧＤＮＦ用の受容体の構成成分である
ｃ−Ｒｅｔを発現した（図７Ａ〜図７Ｃ）。ＴＨ+細胞の大部分、特に分岐状神経突起を
有するＴＨ+細胞は、モノアミンニューロンにおける細胞内コンパートメントへドーパミ
ンをパッケージングすることに関与する小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２、図７Ｄ〜
図７Ｆ）（Nirenberg，M.J.，et  al.，J．Neurosci．16：4135-4145，1996）を発現した
。さらに、ＴＨ+ニューロンは、シナプス形成に必須の膜糖タンパク質であるシナプトフ
ィジン（Calakos，N．and  Scheller，R.H.，J．Biol．Chem．269：24534-24537，1994）
を発現した（図７Ａ〜図７Ｉ）。
【００９７】
ドーパミン放出は、ＤＡニューロンの機能的特徴である。高速液体クロマトグラフィ（
ＨＰＬＣ）分析は、アスコルビン酸（ＡＡ）、ＦＧＦ８及びＳＳＨで処理した培養物中で
は２３０．８±４４．０ｐｇ／ｍｌで、またＡＡ、ＦＧＦ８及びＳＨＨの処理なしの対照
培養物中では４６．３±９．２ｐｇ／ｍｌで、ＤＡ分化培養物の培地中におけるドーパミ
ンの存在を明らかにした（図８Ａ）。培養細胞を洗浄して、ＨＢＳＳ中で１４分間インキ
ュベートした場合、ドーパミンレベルは、２つの培養物間で類似していた（図８Ａ）。し
かしながら、ＨＢＳＳ中での５６ｍＭ  ＫＣｌによる培養ニューロンの脱分極は、ＤＡの
量を有意に増加させた（ＡＡ、ＦＧＦ８及びＳＨＨ処理なし及びありで、それぞれ培養物
中に３５．８±９．２及び１１１．０±１５．０ｐｇ／ｍｌ、図８Ａ）。これらの観察は
、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＤＡニューロンがＤＡを分泌することができ、ＤＡの放
出が活性依存的であることを示唆する。
【００９８】
電気生理学的記録を使用して、ＥＳにより産生されたＤＡニューロンが機能的に活性で
あるかどうかを決定した。３０〜３８日間培養物中に維持した細胞（ｎ＝１４）において
、静止膜電位（Ｖrest）は、−３２〜−７２ｍＶ（−５４±２．９ｍＶ）の範囲であり、
細胞静電容量（Ｃm）は、１１〜４５ｐＦ（２１±２．７ｐＦ）の範囲であり、入力抵抗
（Ｒin）は、４８０〜３５００ＭΩ（１５０６±２８２ＭΩ）の範囲であった。脱分極性
電流段階（０．２ｎＡ×２００〜５００ｍｓ）は通常、単一活動電池を誘発したが、幾つ
かの場合では、減少しつつある一連の活動電位が観察された（図８ｂｉ及び図８ｂｉｉ）
。活動電位（ＡＰ）閾値は、−２６〜ー５．２ｍＶ（−１７．４±２．１ｍＶ）の範囲で
あり、−９．６〜３０ｍＶでピークに達した。最大５０．２ｍＶのＡＰが観察された（３
２±２．８ｍＶ）。ＡＰ持続期間は、３〜２０．６ｍｓ（７．２±１．３ｍｓ）の範囲で
あった。自発興奮が、２つの細胞で観察された（図８Ｃ）。
【００９９】
電圧クランプ様式では、内向き及び外向き電流の両方が、細胞すべてにおいて観察され
た（図示せず）が、それらの相対規模は、大幅に変化した。内向き電流は、迅速に活性化
され（１ｍｓ未満）、１〜３ｍｓ以内にピークに達した。活性化閾値は、−３０±１．１
ｍＶであり、最大ピーク電流振幅は、−１３±１．９ｍＶの平均電圧で得られ、電流は、
テトロドトキシン（ＴＴＸ、ｎ＝３）により完全に阻止された。これらの特性は、活動電
位発生を引き起こす電圧作動型ナトリウムチャネルの存在と一致した。３つの細胞におい
て、本発明者等は、迅速な上昇及びよりゆっくりとした減衰相を含むシナプス電流の特徴
を有する自発的過渡電流を観察した。３つの記録のうちの１つは、Ｋ−グルコネートベー
スのピペット溶液を用いて行われ、この細胞を−４０ｍＶで保持することにより、本発明
者等は、外向き（阻害性）及び内向き（興奮性）電流の両方を観察することが可能であっ
た（図８ｄｉ及び図８ｄｉｉ）。１４個の細胞すべてにビオシチンを注入したが、免疫染
色手順の完了後、たった５個の細胞が回収されたに過ぎなかった。しかしながら、５個の
ビオシチン充填細胞はすべて、ＴＨ標識された（図８Ｅ〜図８Ｇ）。
【０１００】
論考
本発明者等は、中脳ニューロン突出特徴を有する機能的ＤＡニューロンが、３つの簡素
な非遺伝的工程：ＦＧＦ２による神経外胚葉細胞の誘導、神経外胚葉形成中のＦＧＦ８及
びＳＳＨによる腹側中脳アイデンティティーの特定化及び局所的に特定化された前駆体の
ＤＡニューロンへの分化により、ヒトＥＳ細胞から効率的に産生することができることを
実証した。中脳特徴を有するＤＡニューロンが、増殖された神経外胚葉細胞から産生する
ことができるというマウスＥＳ細胞研究から得られる見解（上述のLee，S.H.，et  al.，
2000）と異なり、本発明者等は、前駆体細胞がＳｏｘ１+神経外胚葉細胞となる前にＦＧ
Ｆ８により特定化又は局所化することが、正確な中脳及び機能的表現型を有するヒトＤＡ
ニューロンの頑強な産生に必須であることを見出した。
【０１０１】
幹細胞生物学の観点から、Mckayと共同研究者等によって開発された段階的プロトコル
であるマウスＥＳ細胞を神経外胚葉細胞へ誘導し(direct)、それらを増殖させて、それら
をＦＧＦ８及びＳＨＨにより局所化又は特定化し、続いてそれらをＤＡニューロンへ分化
させることは、非常に論理的であるように思われる（上述のLee，S.H.，et  al.，2000）
。本発明者等は、同じ原理がヒト霊長類に適用できるはずであると仮定した。実際に、本
発明者等は、Ｓｏｘ１を発現し、且つＦＧＦ２の存在下で神経管様ロゼットへと体系化す
る神経外胚葉細胞へヒトＥＳ細胞を分化させること（上述のZhang，S.C.，et  al.，2001
）、神経外胚葉細胞をＦＧＦ８及びＳＨＨで処理して、腹側中脳発生運命を誘導すること
、及び最終的に細胞をニューロンへ分化させることにより、多数のＤＡニューロンを産生
することが可能である。しかしながら、このようにして産生されたＤＡニューロンの多く
は、中脳突出ＤＡニューロンの重要な特徴、例えば、複雑な形態を伴う大きなサイズ、及
びタンパク質レベルでの中脳転写因子の発現を欠如している。Ｓｏｘ１陽性神経外胚葉細
胞は、ＦＧＦ８及びＳＨＨによる処理後でさえも、依然としてＥｎ−１に対して陰性であ
るが、Ｂｆ１に対しては陽性であり、Ｓｏｘ１発現神経外胚葉細胞が、中脳発生運命への
特定化に不応性であることを示唆している。本発明者等の培養系中でのヒトＥＳ細胞から
の神経外胚葉細胞分化のプロセスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ発達中に見られるものに匹敵する（
上述のZhang，S.C.，2003）。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、神経管は、ヒト妊娠の３週目の最後
に形成し、Ｓｏｘ１は、マウス発生学的研究に基づいて、神経管閉鎖中に神経外胚葉細胞
により発現される（Pevny，L.H.，et  al.，Development  125：1967-1978，1998）。培
養では、神経外胚葉細胞は、神経管様ロゼットを形成し、６日齢のヒト胚に相当するヒト
ＥＳ細胞からの２週間の分化後に、Ｓｏｘ１を発現する（上述のThomson，J.A.，et  al.
，1998）。中脳ＤＡニューロンを含む突出ニューロンは、初期段階で神経管において神経
外胚葉細胞から分化され、これらの神経外胚葉細胞細胞は、神経管閉鎖のプロセス中にす
でに局所的に特定化されている（上述のLumsden，A．and  Krumlauf，R.，1996）。この
ことは、前脳表現型を保有するヒトＥＳ細胞により産生されたＳｏｘ１発現神経外胚葉細
胞が、中脳表現型を有するＤＡニューロンを産生するためのモルフォゲンに反応しない理
由を説明し得る。ＦＧＦ８が、中脳アイデンティティーを選択(adopt)するように初期前
駆体を指示し得るという本発明者等の仮定は、初期ロゼットにおけるＳｏｘ１-円柱状細
胞をＦＧＦ８で処理した後の、突出ニューロンの特徴（例えば、複雑な突起を有する大き
な細胞体及び中脳間マーカーであるＥｎ１の発現）を有するＤＡニューロンの産生により
確認される。
【０１０２】
ＦＧＦ２により誘導されるマウスＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞が、増殖後に効率的に
局所化され得るが、ヒトＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞はそうではない理由は現在明らか
ではない。マウス脊髄から単離された神経前駆体の背側又は腹側アイデンティティーが、
特にＦＧＦ２の存在下で、培養時に調節解除され得るという最近の徴候が見られ（Gabay
，L.，et  al.，Neuron  40：485-499，2003）、これは、増殖したマウスＥＳ細胞由来の
神経外胚葉細胞が再び特定化する能力を一部について説明し得るかもしれない。脊髄運動
神経のような他の突出したニューロンの分化に関する本発明者らの研究は、大きな突出し
たニューロンの産生がモルフォルゲンの初期の作用を必要とするという今回の観察と一致
する。
【０１０３】
ＤＡニューロンは、中脳、視床下部、網膜及び嗅球を含む脳の幾つかの領域に存在する
。この研究におけるヒトＥＳ細胞により産生されるＤＡニューロンは、中脳突出ＤＡニュ
ーロンに類似している。ＤＡニューロンのほとんどが、ＧＡＢＡを共発現しないが、ＧＡ
ＢＡ及びＴＨの共発現は、嗅覚ＤＡ介在ニューロンの主な特徴である（上述のKosaka，T.
，et  al.，18987；上述のGall，C.M.，et  al.，1987）。中脳では、ＤＡニューロンの
少なくとも２つの主要な群、すなわち黒質におけるもの（Ａ９）及び腹側被蓋領域におけ
るもの（Ａ１０）（それぞれ異なる標的を有する）が存在する（Bjorklund，A．and  Lin
dvall，O.，Handbook  of  Chemical  Neuroanatomy，Vol.2：Classical  Transmitters
in  the  CNS（Bjorklund，A.，Hokfelt，T.，eds），Amsterdam，Elsevier  Science
Publishers，pp.55-111，1984）。腹側被蓋領域におけるほとんどのＤＡニューロンは
、カルビンジン又はＣＣＫを発現するのに対して、黒質におけるものは、ほとんど発現し
ない（McRitchie，D.A.，et  al.，J．Comp．Neurol．364：121-150，1996；Horkfelt，T
.，et  al.，Neurosci．5：2093-2124，1980；Haber，S.N.，et  al.，J．Comp．Neurol
．362：400-410，1995）。ヒトＥＳ細胞により産生されるＤＡニューロンが、ＣＣＫ８又
はカルビンジンとともにＴＨを共発現しないという本発明者等の観察は、これらのＤＡニ
ューロンが、黒質ＤＮＡニューロンとより密接に類似していることを示唆する。
【０１０４】
ヒトＥＳ細胞の、適切な局所的アイデンティティーを有する大きな突出ニューロン（例
えば、中脳ＤＡニューロン）を産生する頑強な能力は、ヒトＥＳ細胞系を使用して神経発
達の初期段階を精査するための空前の機会を広げる。本発明者等のデータは、初期に生み
出される中脳突出ＤＡニューロンの産生に関して、特定化されていない初期神経外胚葉細
胞に作用するモルフォゲン（例えば、ＦＧＦ８）に対する要件を示している。このことは
、すでに特定化されている胚及び成体哺乳類脳から単離並びに増殖させた幹細胞又は前駆
体は、突出ニューロンを産生するのに不応性である（Svendsen，C.N.，et  al.，Exp．Ne
urol．148：135-146，1997；Daadi，M.M．and  Weiss，S.，J．Neurosci．19：4484-4497
，1999；Storch，A.，et  al.，Exp．Neurol．170：317-325，2001）理由を説明し得る。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたヒトＤＡニューロンはまた、ヒトＤＡニューロンに影響を
及ぼし得る化学物質及び薬物に関する毒物学的並びに薬学的スクリーニング用の系を提供
する。培養ペトリ皿中で産生されたこれらのヒトＤＡニューロンが、ＰＤ動物モデルにお
いて機能的であるかどうかを決定するための研究は進行中である。
【０１０５】
方法
ＥＳ細胞培養。ヒトＥＳ細胞系である、Ｈ９（ｐ２１〜５６）及びＨ１（ｐ３５〜４０
）を、Thomsonにより記載されるように（上述のThomson，J.A.，et  al．1998）、ダルベ
ッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（Gibco）、２０％血清代替物（Gibco）、１
ｍＭ  グルタミン（Sigma）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Gibco）、２μｇ／ｍｌのヘパ
リン（Sigma）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Sigma）及び４ｎｇ／ｍｌのＦ
ＧＦ２（R＆D  Systems）から構成されるＥＳ細胞成長培地を毎日交換しながら、照射し
たマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で週に１度、培養（細胞）を継代した。分化したコロ
ニーは、湾曲状のパスツールピペットを用いて物理的に取り出して、未分化状態のＥＳ細
胞は、典型的な形態学並びにＯｃｔ４及びＳＳＥＡ４による免疫染色により確認した。
【０１０６】
神経外胚葉細胞の分化及び濃縮。ヒトＥＳ細胞コロニーは、０．２ｍｇ／ｍｌのディス
パーゼ（Roche  Diagnostitics）による培養物の処理により、ＭＥＦ層から剥離させ、Ｅ
Ｓ細胞培地を毎日交換しながら、４日間、浮遊性細胞凝集体（胚様体）として成長させた
。続いて、それらを、Ｎ２（Gibco）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２μｇ／ｍｌヘパリ
ンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（２：１）から構成される神経培地中で、１日おきに培地
を交換しながら、接着基材において成長させた。ＥＳ細胞凝集体は、結合して、およそ６
日目に個々のコロニーを形成した。神経管様ロゼットへ体系化する円柱状細胞により示さ
れる神経外胚葉細胞は、およそ１４日目に発生した（上述のZhang，S.C.，et  al.，2001
）。神経ロゼットを、差次的酵素応答により単離した（上述のZhang，S.C.，et  al.，20
01）。成長因子は、分化の過程中に添加して、局所化に影響を与えた（結果を参照）。
【０１０７】
ＤＡニューロン分化。濃縮された神経外胚葉細胞は、ＰＢＳ中、３７℃で１０〜１５分
間の０．０２５％トリプシン及び０．２７ｍＭ  ＥＤＴＡにより解離させ、１２ｍｍカバ
ーガラス（１００μｇ／ｍｌのポリオルニチン及び１０μｇ／ｍｌのラミニンで予めコー
ティングした）上へ、４０，０００〜５０，０００個の細胞／カバーガラスの密度で播取
た。ニューロン分化培地は、Ｎ２、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭグルタメート
、１μｇ／ｍｌのラミニン、１μＭのｃＡＭＰ、２００μＭのＡＡ（Sigma）、１０ｎｇ
／ｍｌのＢＤＮＦ（R＆D  Systems）及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（R＆D  Systems）を
補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Gibco）から構成された。細胞を、１日おきに培地
交換しながら３〜４週間培養した。
【０１０８】
免疫細胞化学及び細胞定量化。カバーガラス培養物をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒ
ド中で１０〜２０分間、又はメタノール（−２０℃）中４％パラホルムアルデヒド中で５
分間固定化して、免疫染色用に加工した（上述のZhang，S.C.，et  al.，2001）。以下の
一次抗体を使用した：マウス抗ＳＳＥＡ４（１：４０）、マウス抗Ｅｎ−１（１：５０）
及びマウス抗Ｐａｘ６（１：５０００、すべてDevelopmental  studies  hybridoma  ban
kから）、ウサギ抗Ｓｏｘ１（１：５００）、ウサギ抗ヒトネスチン（１：２００）、ウ
サギ抗ＡＡＤＣ（１：１，０００）、ヒツジ抗ＤβＨ（１：４００）、マウス抗シナプト
フィジン（１：５００）及びウサギ抗ＣＣＫ８（１：２０００、すべてChemiconから）、
マウス抗ＴＨ（１：１，０００）、マウス抗βＩＩＩチューブリン（１：５００）、ウサ
ギ抗ＧＡＢＡ（１：５０００）及びマウス抗カルビンジン（１：４００、すべてSigmaか
ら）、ウサギ抗ＴＨ（１：５００）及びウサギ抗ＶＭＡＴ２（１：５００、すべてPel-Fr
eezから）、ヤギ抗ｃ−Ｒｅｔ（１：４００）及びマウス抗Ｏｃｔ４（１：１，０００、
ともにSanta  Cruzから）、ウサギ抗Ｂｆ１（１：５０００、Lorenz  Studerから贈与）
。抗体−抗原反応は、適切な蛍光結合二次抗体により明らかとなった。細胞核は、ヘキス
ト３３３４２で染色した。染色は、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡で可視化した。成体ラット及び
Ｅ３８胎性サルからの脳切片を、ニューロンタイプ及び神経伝達物質に対する多くの抗体
に対する陽性対照として使用した。陰性対照はまた、免疫染色手順における一次又は二次
抗体を省略することにより設定した。細胞計数は、接眼レンズ上のレチクル及び４０×対
物レンズを使用することにより無分別(randomly)に達成された。１０個の視野における細
胞を無作為に選択して、各カバーガラスから計数した。
【０１０９】
ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Tel-Test，Friendswood，TX）を用いて培養細
胞から抽出し、続いてＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡフリー、Ambicon）で処理した。ｃＤＮＡの
合成は、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて、製造業者の指示に従って行った。
ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（Promega）により、標準的な手順を用いて実施した
。サイクル数は、特定のｍＲＮＡ存在量(abundance)に応じて、９４℃で１５秒間の変性
、プライマーにより５５℃又は６０℃の温度で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で４
５秒間の伸長を伴って、２５〜３５サイクルまで様々であった。陰性対照は、逆転写中の
転写酵素又はＰＣＲ中のｃＤＮＡサンプルを省略することにより達成した。プライマー及
び産生物長は、以下の通りであった：
【化１】
2010162024.tif 000010
【０１１０】
ＤＡ測定
ＤＡニューロン分化の２１日後に、４８時間のコンディションメディウムを収集した。
培養細胞からの活性依存性ドーパミン放出は、まずハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で
１５分間、培養細胞を調整し、続いて５６ｍＭのＫＣｌを含有するＨＢＳＳでそれを３７
℃で１４分間取り換えることにより測定した。培地中又はＨＢＳＳ中のドーパミンは、安
定化緩衝液（０．１ＭのＮａＯＨ１０ｍｌ中ＥＧＴＡ９００ｍｇ及びグルタチオン７００
ｍｇ）２０μｌを添加することにより安定化し、サンプルを−８０℃で保管した。ＨＰＬ
Ｃキット（Chromsystems）を使用して、モノアミンを抽出した。モノアミンのレベルは、
電気化学的検出器（ＣｏｕｌｏｃｈｅｍＩＩ，ESA  Inc.）に結合させたＨＰＬＣ（モデ
ル５０８オートサンプラー及びモデル１１８ポンプ、Beckman）により、ＭＤ−ＴＭ移動
相（ESA  Inc.）を使用して決定した。各群における培養は三重反復され、データは、３
回の別個の実験から収集された。
【０１１１】
電気生理学的記録
ヒトＥＳ細胞から分化したＤＡニューロンの電気生理学的特性は、全細胞パッチ−クラ
ンプ記録技法を用いて調べた（Hammill，O.P.，et  al.，Pflugers  Arch．391：85-100
，1981）。ピペットに、（ｍＭ）ＫＣｌ  １４０又はＫ−グルコネート  １４０、Ｎａ+
−ＨＥＰＥＳ  １０、ＢＡＰＴＡ  １０、Ｍｇ2+−ＡＴＰ  ４を含有する細胞内溶液（ｐ
Ｈ７．２、２９０ｍＯｓｍ、２．３〜５．０ＭΩ）を充填した。ビオシチン（０．５％、
Sigma）を記録溶液に添加して、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｒ  ４８８（１
：１０００、Molecular  Probes）による続く標識及びＴＨに対する抗体を使用して、Ｄ
Ａニューロンを同定した。バス溶液は、（ｍＭで）ＮａＣｌ  １２７、ＫＨ2ＰＯ4  １．
２、ＫＣｌ  １．９、ＮａＨＣＯ3  ２６、  ＣａＣｌ2  ２．２、ＭｇＳＯ4  １．４、
グルコース  １０、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2を含有していた（ｐＨ７．３、３００ｍＯｓｍ
）。幾つかの実験に関して、ＴＴＸ（１μｍ）をバス溶液中で適用して、電圧作動型ナト
リウム電流を阻止した。
【０１１２】
電流クランプ及び電圧クランプ記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ａ増幅器（Axon
Instruments）を用いて実施した。シグナルは、４ｋＨｚでフィルタリングして、Ｄｉ
ｇｉｄａｔａ  １３２２Ａアナログ−ディジタル変換器（Axon  Instruments）を用いて
１０ｋＨｚでサンプリングして、市販のソフトウェア（ｐＣｌａｍｐ９、Axon  Instrume
nts）を用いて、コンピュータハードディスクに蓄積(acquire)及び格納された。アクセス
抵抗は通常、８〜１８ＭΩであり、増幅器回路を用いて５０〜８０％相殺した。電圧は、
＋１３ｍＶの液相界面電位に関して補正した（Neher，E.，Methods  Enzymol．207：1213
-131，1992）。Ｖrest及び活動電位は、電流クランプモードで検査した。自発的興奮性（
内向き）及び阻害性（外向き）シナプス電流は、Ｋ−グルコネートベースのピペット溶液
及びＶhold＝−４０ｍＶを用いて、電圧クランプモードで特性化した。シナプス事象は、
テンプレート検出アルゴリズム（Ｍｉｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ４．６
．２８、Synaptosoft）を用いて検出し、脱活性化相は、Levenberg-Marquardtアルゴリズ
ムを用いて、二重指数関数へ適合させた。データは、平均値±ＳＥとして提示される。
【実施例３】
【０１１３】
運動ニューロンの産生
脊椎動物における運動ニューロンの産生は、少なくとも３つの工程：外胚葉細胞の神経
誘導、神経外胚葉細胞の尾側化(caudalization)及び尾側化された神経前駆体の腹側化(ve
ntralization)を包含する（Jessell，T.M.，Nat．Rev．Genet．1：20-29，2000）。本発
明者等はまず、脊椎動物神経外胚葉がＦＧＦ及び／又は抗ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シ
グナルに応答して発生するという原理（Wilson，S.I.and  Edlund，T.，Nat．Neurosci．
4：Suppl.：1161-1168，2001）に基づいて、ＦＧＦ２の存在下での接着コロニー培養（Zh
ang，S.C.，et  al.，Nat．Biotechnol．19：1129-1133，2001）を用いて、ｈＥＳ細胞（
Thomson，J.A.，et  al.，Science  282：1145-1147，1998）（Ｈ１及びＨ９系統）から
の効率的な神経神経外胚葉分化のための培養系を樹立した。神経分化の最初の徴候は、Ｅ
Ｓ細胞を分化のためにフィーダー細胞から取り外した８〜１０日後に、コロニーの中心で
ロゼットを形成する円柱状細胞の出現であった。ロゼットにおける円柱状細胞は、神経外
胚葉マーカーであるＰａｘ６を発現したが、神経管形成中に神経上皮細胞により発現され
る汎神経外胚葉転写因子であるＳｏｘＩを発現しなかったが（Pevny，L.H.，et  al.，De
velopment  125：1967-1978，1998）、成長領域における平坦細胞はそうではなかった（
図９Ａ）。同じ培地中でさらに４〜５日間のさらなる培養により、円柱状細胞は、管腔を
伴う神経管様ロゼットへと体系化して（図９Ｂ）、Ｐａｘ６及びＳｏｘ１の両方を発現し
た（図９Ｃ、図９Ｄ）。したがって、ｈＥＳ細胞からの神経外胚葉細胞の分化は、少なく
とも２つの特徴的な段階、すなわち神経誘導の８〜１０日後の初期ロゼットにおけるＰａ
ｘ６+／Ｓｏｘ１-円柱状細胞、及び誘導の１４日後の神経管様後期ロゼットを形成するＰ
ａｘ６+／Ｓｏｘ１+細胞を包含する。
【０１１４】
免疫細胞化学分析は、Ｐａｘ６（図９Ｅ）、Ｓｏｘ１及びネスチンを発現するロゼット
細胞が、前脳及び中脳細胞により発現されるホメオドメインタンパク質であるＯｔｘ２に
対して陽性である（図９Ｆ、図９Ｈ）であるが、脊髄における細胞により生産されるホメ
オドメインタンパク質であるＨｏｘＣ８に対しては陰性である（図９Ｈ）ことを明らかに
した。これらのロゼット細胞は、中脳細胞により発現されるＥｎ１に対しても陰性であっ
た（図９Ｇ）。これらの結果は、神経神経外胚葉細胞が、初期のｉｎ  ｖｉｖｏでの発達
中に神経外胚葉細胞により初期に獲得される前脳表現型に類似した前脳表現型を保有する
ことを示唆する（Stem，D.C.，Nat．Rev．Neurosci．2：92-98，2001）。
【０１１５】
神経外胚葉細胞から運動ニューロンを分化させるために、神経管様ロゼットにおけるＳ
ｏｘ１+神経外胚葉細胞を、酵素処理（Zhang，S.C.，et  al.，Nat．Biotechnol．19：11
29-1133，2001）により単離して、レチノイン酸（ＲＡ、０．００１〜１μＭ）、尾側化
試薬（Blumberg，B.，et  al.，Development  124：373-379，1997）及びＳＨＨ（５０〜
５００ｎｇ／ｍｌ）、腹側化モルフォゲン（Jessell，T.M.，Nat．Rev．Genet．1：20-29
，2000；Briscoe，J．and  Ericson，J.，Curr．Opin．Neurobiol．11：43-49，2001）の
存在下で、ラミニン基質上で分化させた。平板に播種後１４日目までに、成長領域におけ
る多数の細胞が、それらの突起を通じてネットワークを形成した（図１０Ａ）。免疫染色
分析により、分化細胞が、ニューロンマーカーであるβIII−チューブリン及びＭＡＰ２
に対して陽性であることが示された。それらの大部分（５０％を超える）はまた、運動ニ
ューロン発生に関連する転写因子であるＩｓｌ  １（図１０Ａ）及びＬｉｍ３（図示せず
）に対しても陽性であった（上述のJessell，T.M.；上述のBriscoe，J．and  Eriscon，J
.，2001；Shirasaki，R．and  Pfaff，S.L.，Annu．Rev．Neurosci．25：251-281，2002
）。しかしながら、１〜３週間の培養物におけるほんの数少ない細胞が、運動ニューロン
特異的転写因子であるＨＢ９を発現した（Arber，S.，et  al.，Neuron  23：659-674，1
999）（図１０Ａ）。これらは、Ｓｏｘ１+神経外胚葉が、運動ニューロン誘導に対して不
応性であり得ることを示唆する。
【０１１６】
Ｓｏｘ１発現細胞は、３週齢のヒト胚に相当する時期での神経管様ロゼットの形成及び
Ｓｏｘ１の発現を仮定すると、神経管における神経外胚葉細胞に相当し得る。神経管にお
ける神経外胚葉細胞は、局所的に特定化される（Lumsden，A．and  Krumlauf，R.，Scien
ce  274：1109-1115，1996）。この考慮により、本発明者等に、神経外胚葉細胞がＳｏｘ
１を発現する前に、ＲＡが尾側化及び／又は運動ニューロン特定化を促進し得るというこ
とを仮定するに至らせた。したがって、本発明者等は、より初期段階で、すなわち円柱状
細胞がロゼットへ体系化し始め、且つＰａｘ６を発現した場合に、神経外胚葉細胞をＲＡ
（０．００１〜１μＭ）で処理した。このようにして６日間処理した培養物は、神経管様
ロゼットへと発生して、Ｓｏｘ１を発現し、ＦＧＦ２処理した培養物と区別できなかった
。ロゼットクラスターを単離して、ラミニン基質へ接着させた後、平板に播種後の２４〜
４８時間程度と初期に、無数の神経突起(neurites)がクラスターから伸長した。平板に播
種後１４日目までに、神経突起成長領域は、カバーガラスをほぼ全体（直径１１ｍｍ）覆
ったが、成長領域におけるニューロン細胞体の数は限られていた（図１０Ａ）。細胞の大
部分が、Ｉｓｌ  １／２に対して陽性であり、それらのうち、約５０％はまた、ＨＢ９+
であり（図１０Ｂ）、これらの二重陽性細胞が運動ニューロンであることを示唆した。Ｉ
ｓｌ  １／２+及びＨＢ９-細胞は、介在ニューロンである可能性が高かった。
【０１１７】
ＨＢ９発現細胞はまず、６日目に出現して、神経ロゼットを分化のために平板に播種後
したおよそ１０〜１２日後に、高比率に到達した。ＨＢ９発現細胞は、主としてクラスタ
ーへと局在化され、クラスターでは総細胞の約２１％であり、成長領域では数少ない細胞
が見られた（図１０Ａ、図１０Ｄ）。最も高い比率のＨＢ９+細胞は、０．１〜１．０μ
ＭのＲＡの存在下で誘導された。１．０μＭを超える用量でのＲＡは、本発明者等の化学
的に規定される接着培養において、幾つかの細胞に退化（又は変質）をもたらした。ＲＡ
又はＳＨＨ、或いは両方の非存在下では、ほんわずかなＨＢ９+細胞しか存在しなかった
（図１０Ｄ）。ＨＢ９発現細胞はすべて、βIII−チューブリンで染色された（図１０Ｃ
）。したがって、初期神経外胚葉に対するＲＡによる処理は、運動ニューロンの効率的な
誘導に必要とされる。
【０１１８】
ＲＡが初期神経外胚葉細胞を運動ニューロンへと分化させるが、後期神経外胚葉細胞は
分化させない理由を理解するために、本発明者等はまず、神経外胚葉細胞の尾側化に対す
るＲＡの影響を検査した。ＲＡ（０．００１〜１．０μＭ）又はＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍ
ｌ）による７日間の初期ロゼット細胞（Ｐａｘ６+／Ｓｏｘ１-）の処理は、用量依存的様
式で、Ｏｔｘ２の発現の減少、並びにＨｏｘ遺伝子（例えば、Ｈｏｘ  Ｂ１、Ｂ６、Ｃ５
及びＣ８）の発現の増加をもたらした（図１１Ａ）。より多くの尾側細胞により発現され
る遺伝子が、より高い用量のＲＡにより誘導された。ＲＡによる１週間の後期ロゼット細
胞（Ｐａｘ６+／Ｓｏｘ１+）の処理は、ＦＧＦ２により誘導されるＨｏｘ遺伝子発現パタ
ーンを変更させなかった（図示せず）。ニューロン分化培地中で単離及び培養したＲＡ処
理した初期ロゼット細胞は、免疫細胞化学により明らかであるように、まず分化の６日後
に、及び大部分が分化の１０〜１２日後にＨｏｘＣ８タンパク質を発現した（図１１Ｄ）
。この段階の細胞は、Ｏｔｘ２発現を欠如していた（図１１Ｃ）。ＨｏｘＣ８+細胞はす
べて、βIII−チューブリン+ニューロンであった（図１１Ｅ）。対比して、ＲＡで１週間
処理した後、２週間分化させた後期ロゼット細胞は、数少ないＨｏｘＣ８+細胞を生じた
が、Ｏｔｘ２発現細胞は減少した（図示せず）。したがって、ＲＡによる初期神経外胚葉
細胞の処理は、脊髄運動ニューロンに関連するＨｏｘＣタンパク質の発現を伴う効率的な
尾側化をもたらすが、ＲＡによる後期神経外胚葉細胞の処理はもたらさない（Liu，J.P.
，et  al.，Neuron  32：997-1012，2001）。
【０１１９】
続いて、本発明者等は、腹側化に関する初期及び後期神経外胚葉細胞に対するＳＨＨの
影響を比較した。ｈＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞は、それらがＰａｘ６+であってもＳ
ｏｘ+であっても、脊髄において運動ニューロン及びオリゴデンドロサイトとなる運命に
ある腹側神経前駆体細胞において発現されるホメオドメインタンパク質であるＯｌｉｇ２
を発現しなかった（Lu，Q.R.，et  al.，Cell  109：75-86，2002；Zhou，Q.，et  al.，
Neuron  31：791-807，2001）（図１１Ｆ）。Ｐａｘ６+／Ｓｏｘ-神経外胚葉細胞をＲＡ
の存在下で１週間培養した後、単離して、ＳＨＨの非存在下でさらに２週間、さらに分化
させた場合、ほんの数少ない細胞が、Ｏｌｉｇ２を発現した（図示せず）。しかしながら
、ＳＨＨ（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下では、多くの細胞が、核においてＯｌｉｇ
２を発現した（図１１Ｇ）。対比して、同条件下で２週間分化させたＰａｘ６+／Ｓｏｘ+
神経外胚葉細胞は、数少ないＯｌｉｇ２発現細胞を産生した（図１１Ｈ）。したがって、
初期段階でＲＡにより処理した神経外胚葉細胞は、ＳＨＨに応答して、腹側神経前駆体発
生運命へと効率的に誘導させることができるが、後期段階でＲＡにより処理した神経外胚
葉細胞はできない。
【０１２０】
ＦＧＦ２も尾側発生運命を誘導する（図１１Ａ）にもかかわらず、運動ニューロン特定
化に初期ＲＡ処理が必要とされる理由をさらに認識するために、本発明者等は、脊髄にお
いて前駆体ドメインを精製するのに重要であるクラスＩ（Ｉｒｘ３、Ｐａｘ６）及びクラ
スＩＩ（Ｏｌｉｇ２、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１）分子の発現を検査した（上述のJess
ell，T.M.，2000；上述のBriscoe，J.，and  Ericson，J.，2001）。ＲＡは、後期神経外
胚葉細胞よりも初期神経外胚葉細胞において、ＳＨＨ及びクラスＩＩ遺伝子、特にＯｌｉ
ｇ２及びＮｋｘ６．１のかなり活発な(robust)発現を誘導した（図１１Ｂ）。したがって
、初期神経外胚葉細胞は、運動ニューロン特定化に必須であるＳＨＨ及びクラスＩＩ因子
の発現をアップレギュレートする際に、ＲＡに対してより応答性である。
【０１２１】
コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現する細胞は、尾側化された神経
外胚葉細胞を運動ニューロン分化のために平板に播種した３週後に出現し、これらの細胞
は、本研究で分析した最長の培養期間である７週間に至るまで着実に増加した（図１２Ａ
）。ＣｈＡＴ発現細胞は、主としてクラスターへと局在化され（図１２Ａ）、ＨＢ９+細
胞の局在化に相当する。これらの細胞は、主に多極細胞であり、直径１５〜２０μｍの大
きな細胞体(somas)を有し、幾つかは、３０μｍ程度と大きかった（図１２Ａ、図１２Ｂ
）。核におけるＨＢ９及び体細胞と突起におけるＣｈＡＴの共発現が、培養３週間後に観
察された（図１２Ｃ）。ニューロンの多くはまた、アセチルコリンの貯蔵及び放出に必須
である小胞アセチルコリン輸送体（ＶＡＣｈＴ、図１２Ｄ）に関して陽性に染色された。
多くのＣｈＡＴ+細胞は、特に培養の５週後に、細胞体及び突起上のシナプシンに関して
陽性に標識された（図１２Ｅ）。
【０１２２】
本発明者等は、電気生理学的技法を用いて機能的成熟を評価した（ｎ＝２８個の細胞）
。平均静止電位は、−３６．９±２．６ｍＶであり、入力抵抗は、９２０±５７ＭΩであ
った。単一活動電位（ＡＰ、図１２Ｆｉ）又は減少する過程（図１２Ｆｉｉ）は、試験し
た１３個のニューロンのうち１１個において、脱分極性電流工程（０．１５〜０．２ｎＡ
×１ｓ）より誘発された。自発的脱分極性シナプス入力により誘発される自発的ＡＰも観
察された（図１２Ｇ）。すべての細胞が、記録、続く免疫組織化学分析を生き残るわけで
はないが、ビオシチン及びＣｈＡＴによる二重免疫染色により、本発明者等が記録した細
胞の多くは、運動ニューロンであることが実証された（図１２Ｊ）。
【０１２３】
電圧クランプ分析により、ナトリウム及び遅延整流性カリウム電流と一致した時間及び
電圧依存性内向き並びに外向き電流が示された。内向き電流及び活動電位は、１．０μＭ
のテトロドトキシン（ＴＴＸ、ｎ＝３）により阻止され、電圧作動型ナトリウムチャネル
の存在を確認した。外向き電流は、さらに特性化されなかった。本発明者等はまた、シナ
プス電流も観察した（図１２Ｈ、試験した２３個の細胞のうちｎ＝２１）。これらは、１
．０μＭのＴＴＸにより、振動数が減少されたが、排除はされず、機能的に無傷のシナプ
ス神経伝達の存在を実証した。Ｃｓグルコネートベースのピペット溶液を用いると、外向
き（阻害性）電流はゆっくりと減衰し（１３．６ｍｓ、ｎ＝１０回の事象）、ストリキニ
ーネ及びビククリンの組合せにより阻止されたのに対して、残存する内向き（興奮性）電
流は、迅速に減衰し（２．１ｍｓ、ｎ＝１７回の事象）、Ｄ−ＡＰ５及びＣＮＱＸの組合
せにより阻止され（図１２Ｈ、図１２Ｊ）、阻害性（ＧＡＢＡ／グリシン）及び興奮性（
グルタメート）神経伝達が、無傷脊髄で見られるのと同様に行われることを実証した（Ga
o，B.X.，et  al.，J．Neurophysiol．79：2277-2287，1998）。
【０１２４】
本発明者等の本研究は、機能的運動ニューロンが、ＦＧＦ２による神経外胚葉分化、神
経誘導の後期相中のＲＡによる特定化及び／又は尾側化、並びに腹側化用モルフォゲンＳ
ＨＨの存在下での有糸分裂後運動ニューロンへの続く分化により、ヒトＥＳ細胞から効率
的に産生することができることを実証する。したがって、動物から学んだ神経発達の基本
原理をヒト霊長類へ適用させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで反復させ得る。マウスＥＳ細胞から
の運動ニューロン分化の最近の実証（Wichterle，H.，et  al.，Cell  110：385-397，20
02）と対比して、本発明者等は、神経外胚葉分化のプロセスを細かく調べて、前駆体がＳ
ｏｘ１-発現神経外胚葉細胞となる前に、初期に生み出される突出ニューロン（例えば、
脊髄運動ニューロン）の特定化がモルフォゲンによる処理を必要とすることを発見した。
【０１２５】
マウスＥＳ細胞はまず、神経外胚葉細胞へと導かれた。続いて、神経外胚葉は、ドーパ
ミン作動性ニューロンへの分化に関してはＦＧＦ８及びＳＨＨ（Barberi，T.，et  al.，
Nat．Biotechnol．21：1200-1207，2003；Lee，S.H.，et  al.，Nat．Biotechnol．18：6
75-679，2000）又は運動ニューロン分化に関してはＲＡ及びＳＨＨ（上述のWichterle，H
.，et  al.，2002）のようなモルフォゲンで処理する。これらの観察は、ニューロンが神
経管における上皮から特定化されるという概念に適合するようである。本発明者等の本観
察により、前脳表現型も保有するｈＥＳ由来のＳｏｘ１発現神経外胚葉細胞は、脊髄運動
ニューロンを産生するのに不応性であることが示される。本発明者等の培養系においてｈ
ＥＳ細胞から産生されるＳｏｘ１発現細胞は、それらが神経管様構造を形成し、且つ６日
齢のヒト胚に相当するｈＥＳ細胞からの分化の２週後に、Ｓｏｘ１を発現するため、神経
管におけるものと類似している（Zhang，S.C.，J．Hematother．Stem  Cell  Res．12：6
25-634，2003）。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、神経管は、ヒト妊娠の第３週目の最後に形成され
（Wood，H.B．and  Episkopou，V.，Mech．Dev．86：197-201，1999）、Ｓｏｘ１は、動
物において神経管の形成中に神経外胚葉により発現される（Pevny，L.H.，et  al.，Deve
lopment  125：1967-1978，1998；上述のWood，H.B．and  Episkopou，V.，1999）。本発
明者等の見解は、幹細胞がＳｏｘ１−発現神経外胚葉細胞となる前に、ニューロンの種類
、すなわち少なくとも大きな突出ニューロン（例えば、運動ニューロン）の特定化が開始
することを示唆し、したがって脳由来の神経上皮細胞が、異なる局所的アイデンティティ
ーの突出ニューロンを産生することができない理由を説明し得る。
【０１２６】
ｈＥＳ細胞の再生可能な供給源からの機能的運動ニューロンは、ＡＬＳのような運動ニ
ューロン関連障害を治療するように設計される医薬品をスクリーニングするための包括的
なヒト運動ニューロンを提供する。これらの細胞はまた、運動ニューロンに対する実験的
細胞代替物のための有用な供給源を提供し、将来、運動ニューロン疾患又は脊髄障害を伴
う患者における適用を導き得る。
【０１２７】
方法
ＥＳ細胞の培養及び神経分化
ヒトＥＳ細胞（系統Ｈ１及びＨ９、継代１９〜４２）を、記載されるように（上述のTh
omson，J.A.，et  al.，1998）、照射した胚マウス線維芽細胞のフィーダー層上で週に１
度継代培養した。未分化状態のＥＳ細胞は、典型的な形態並びにＯｃｔ４及びＳＳＥＡ４
の発現により確認された。神経外胚葉は分化に関して、ｈＥＳ細胞を４日間凝集させた後
、Ｎ２、ヘパリン（２ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）又はＲＡを補充した
Ｆ１２／ＤＭＥＭ中で１０日間、接着性プラスチック表面上で培養した（上述のZhang，S
.C.，et  al.，2001）。
【０１２８】
運動ニューロン誘導に関して、モルフォゲン処理した神経外胚葉細胞を、Ｎｅｕｒｏｂ
ａｓａｌ培地（Gibco）、Ｎ２サプリメント及びｃＡＭＰ（Sigma、ＩｇＭ）から構成され
るニューロン分化培地中のオルニチン／ラミニンコーティングしたカバーガラス上へ、Ｒ
Ａ（０．１μＭ）及びＳＨＨ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、R＆D）の存在下で１週間平板培
養した。その後、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ１）（１０
ｎｇ／ｍｌ、PeproTech  Inc.）を培地に添加して、ＳＨＨの濃度を５０ｎｇ／ｍｌへ低
減させた。
【０１２９】
免疫細胞化学及び顕微鏡法（上述のZhang，S.C.，et  al.，2001）
この研究で使用される一次抗体としては、ニューロンクラスＩＩＩβ−チューブリンに
対するポリクローナル抗体（Convance  Research  Products，Richmond，CA、１：２，０
００）、ネスチン（Chemicon，Temecula，CA、１：７５０）、Ｓｏｘ１（Chemicon、１：
１０００）、シナプシンＩ（Calbiochem，Darmstadt，German、１：５００）、ＣｈＡＴ
（Chemicon、１：５０）及びＶＡＣｈＴ（Chemicon、１：１０００）、Ｉｓｌｌ／２（S
．Pfaff）、Ｏｔｘ２（F．Vaccarino）及びＯｌｉｇ２（M．Nakafuku）が挙げられる。Ｍ
ＮＲ２又はＨＢ９（８１．５Ｃ１０）、Ｉｓｌｅｔ１（４０．２Ｄ６）、Ｌｉｍ３（６７
．４Ｅ１２）、Ｐａｘ６及びＮｋｘ２．２に対する抗体は、Developmental  Studies  Hy
bridoma  Bank（ＤＳＨＢ、Iowa  City，IA）から購入し、抗ＨｏｘＣ８は、Convance  R
esearch  Products（１：２００）から購入した。電気生理学的に記録される細胞の識別
のために、ビオシチン（Molecular  Probes）充填細胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴ
Ｃ（Sigma、１：２００）で標識して、ＣｈＡＴで染色した。画像は、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕
微鏡６００（FRYER  INC，Huntley，IL）又は共焦点顕微鏡（Nikon，Tokyo，Japan）上へ
取り付けたＳｐｏｔディジタルカメラを使用して収集した。本来は非霊長類組織に対して
開発された運動ニューロン転写因子及びホメオドメインタンパク質に対する抗体の特異性
を、胎性（Ｅ３４又はＥ３６）アカゲザル脊髄及び脳組織（Wisconsin  Primate  Resear
ch  Centerにより提供）において確証された。
【０１３０】
定量化
総分化細胞のうちのＨＢ９発現細胞の集団（ヘキスト標識した）は、Ｍｅｔｈａｍｏｒ
ｐｈソフトウェア（Universal  Imaging  Corporation，Downingtown，PA）を用いて手動
により、或いは立体解析学的測定により、実験群を知らされていない人物により計数され
た。測定されるべき面積は、トレーサーにより輪郭が描かれ、Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓ
ｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（MicroBrightField  Inc，Williston，VT）により作動され
る自動段階移動(automated  stage  movement)を用いて、スコープが無作為に測定部位を
サンプリングするように、計数用フレームの数を予め設定した。重複細胞を伴う計数領域
に関しては、顕微鏡は、異なる層における陽性細胞上で上下に移動して焦点を合わせるよ
うに予め設定され、クラスターにおける総細胞数は、ソフトウェアにより推定された。各
群における３〜４個のカバーガラスを計数し、データは、平均値±ＳＤとして表した。
【０１３１】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、異なる段階でのｈＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞及び運動ニュー
ロン分化培養物から実施した。
【化２】
2010162024.tif 000011
【０１３２】
電気生理学的記録
ｈＥＳ細胞由来の運動ニューロンの電気生理学的特性は、全細胞パッチ−クランプ記録
技法（Gao，B.X.，et  al.，J．Neurophysiol．79：2277-2287，1998）を用いて、５〜６
週間分化させた培養物において研究した。テトロドトキシン（ＴＴＸ、１μＭ、Sigma）
、ビククリン（２０μＭ、Sigma）、ストリキニーネ（５μＭ、Sigma）、Ｄ−２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰ−５、４０μＭ、Sigma）又は６−シアノ−７−ニトロキノ
キサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ、２０μＭ、RBI，Natick，MA）をバス溶液に適用
させて、電圧作動型又はシナプス電流のアイデンティティーを確認した。幾つかの実験に
関して、１％ビオシチンを記録溶液に添加した。電流及び電圧クランプ記録は、Ｍｕｌｔ
ｉＣｌａｍｐ  ７００Ａ増幅器（Axon  Instruments，Union  City，CA）を用いて実施し
た。シグナルは、４ｋＨｚでフィルタリングして、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａアナロ
グ−ディジタル変換器（Axon  Instruments）を用いて１０ｋＨｚでサンプリングして、
市販のソフトウェア（ｐＣｌａｍｐ９、Axon  Instruments）を用いて、コンピュータハ
ードディスクに蓄積及び格納された。アクセス抵抗は通常、８〜１５ＭΩであり、増幅器
回路を用いて５０〜８０％相殺した。自発的シナプス電流は、テンプレート検出アルゴリ
ズム（Ｍｉｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ５．６．２８、Synaptosoft，Dec
atur，GA）を用いて検出し、Levenberg-Marquardtアルゴリズムを用いて、単一指数関数
へ適合させた。結果は、平均値±ＳＥとして提示される。
【図１】
2010162024.tif 000012
【図２】
2010162024.tif 000013
【図３】
2010162024.tif 000014
【図４】
2010162024.tif 000015
【図５】
2010162024.tif 000016
【図６】
2010162024.tif 000017
【図７】
2010162024.tif 000018
【図８】
2010162024.tif 000019
【図９】
2010162024.tif 000020
【図１０】
2010162024.tif 000021
【図１１】
2010162024.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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