(57)【要約】      （修正有）【課題】副作用が少なく、多くの癌細胞に対して効果のある、血管内皮細胞増殖因子阻害剤、及び抗癌剤を提供する。【解決手段】ウシのアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ、又はそれに相同性のある新規タンパク質、並びにそれらの部分ポリペプチドを有効成分として含む血管内皮細胞増殖因子阻害剤及び抗癌剤によって解決することができる。具体的には、特定のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む血管内皮細胞増殖因子阻害剤、又は抗癌剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド、あるいは、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む、血管内皮細胞増殖因子阻害剤。
【請求項３】
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む、抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシのアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ、又はそれに相同性のある新規タンパク質、並びにそれらの部分ポリペプチドを有効成分として含む血管内皮細胞増殖因子阻害剤及び抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は日本人の死亡原因の第１位であり、現在では全死亡者の約３０％が癌により死亡している。癌の治療法としては、手術による治療、放射線療法、及び抗癌剤による化学療法などが用いられている。これらの癌の治療法のうち、抗癌剤による化学療法は、術後の転移や再発を防ぐために、補助的に用いられることや、放射線療法と組み合わせて用いられることもある。また、癌の種類によっては、抗癌剤が第一選択の治療法として選択されることもあり、例えば、白血病やリンパ腫などは、手術による治療がほとんど不可能であり、従って抗癌剤による化学療法が治療の中心となっている。
【０００３】
癌治療において大きな役割を果たしている抗癌剤は、癌細胞の細胞分裂過程において、癌細胞の増殖機構を阻害し、直接癌細胞を死滅させるものが多い（例えば、特許文献１）。すなわち、細胞分裂が活発である癌細胞は、細胞分裂を阻害する抗癌剤の効果が得られやすく、癌細胞が障害されやすい。
しかしながら、このような抗癌剤は、癌細胞に特異的に障害を起こさせるものではなく、生体内で分裂している正常な細胞にも障害を起こすことがある。具体的には、正常な状態で細胞分裂を行っている骨髄の造血細胞、口腔の粘膜細胞、消化管の粘膜細胞、毛根細胞などは、抗癌剤の影響を受けやすく、それらの細胞が障害を受けることによって、貧血、出血、脱毛、吐き気、下痢、口内炎、皮膚の障害などの副作用が発生する。このような副作用は、治療を受けている癌患者の負担となり、また副作用が重篤な場合には、治療を継続することが困難になる。従って、副作用の少ない抗癌剤の開発が、望まれている。
【０００４】
一方、癌細胞が生体内で癌組織として増殖するためには、癌組織において血液による栄養分や酸素の供給が必要である。癌細胞は、癌組織において酸素や栄養分を取得するために、自ら血管新生因子を分泌し、癌細胞の周囲に血管新生を誘導し、それによって癌細胞の爆発的な増殖を起こしていることが報告された（非特許文献１）。このことは、逆に癌細胞からの血管新生因子の分泌を阻害することにより、癌細胞の増殖を抑えることができる可能性を示しており、癌細胞から分泌される血管新生因子を阻害する抗癌剤の研究が進められている。このような血管新生因子を阻害する抗癌剤は、多くの固形癌に対して有効である可能性があり、また、癌細胞自体に対する直接的な障害（殺作用）によって癌の増殖を抑えるわけではないので、重篤な副作用が軽減されると考えられた。
しかしながら、血管新生阻害剤としては、Genentech社が開発していた血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）に対する抗体医薬であるアバスチン［Avastin：ビーバキズマブ（Bevacizumab）］が、米国のＦＤＡから認可されたのみであり、副作用が少なく、多くの癌細胞に有効な血管新生阻害剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−１１６４９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）１９８７年、第２３５巻、ｐ．４４２−４４７
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ベテリナリー・メディカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（日本）２００１年、第６３巻、ｐ．５９７−６０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、生体の癌に対する免疫作用に着目し、副作用が少なく、多くの癌細胞に対して効果のある、生体由来の抗癌剤について鋭意研究を進めてきた。その過程で、ウシ血清中の分子量分布が約５０，０００以下の糖タンパク質Ｓ３が、メラノーマ細胞に対して直接的な障害活性を示し、メラノーマ細胞の担癌マウスの生存率を延長させることができることを見出した（特許文献１）。しかしながら、この糖タンパク質Ｓ３は癌細胞を、直接障害する物質であり、癌患者に対して抗癌剤として使用した場合、残念ながら生体内で副作用を生じると考えられた。
前記糖タンパク質Ｓ３は、ウシ血清を硫安沈殿し、更にリン酸ナトリウム緩衝液を用いたShodex GFA-50Pカラム及びShodex GS-310Pカラムによる分画を行い、分子量２１，０００をピークとする凸の分画を回収することによって得られる。特許文献１には、得られたＳ３がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、分子量約１０，０００、約３６，０００、約４２，０００及び約５０，０００のバンドを含むことが示されているが、本発明者は、更にこのＳ３について研究を進めたところ、Ｓ３を構成する４つのタンパク質の分子量は、実際には約２９，０００、約５２，０００、約６４，０００、及び約１００，０００であり、糖タンパク質Ｓ３はＶＥＧＦ産生阻害活性を示さないことがわかった。そして、分子量約２９，０００のタンパク質は、ＰＭＦ（ペプチドマスフィンガープリンティング）法により、アミノ酸配列を決定したところ、トランスサイレチン（分子量約１５，０００）の２量体であることを同定した。しかしながら、このトランスサイレチンには、メラノーマ細胞に対する障害活性は見られず、前記糖タンパク質Ｓ３の中の約５２，０００、約６４，０００、及び約１００，０００のいずれかのタンパク質が、メラノーマ細胞に対する障害活性を示すものと考えられた。
本発明者は、更に副作用が少なく、多くの癌細胞に対して効果のある、生体由来の抗癌剤について、鋭意研究した結果、ウシ血漿中の分子量約７，５００のタンパク質に、血管内皮細胞増殖因子を阻害する活性があることを見出した。そして、このタンパク質は、メラノーマ細胞に対して、直接的な障害活性は示さないが、肺転移モデルマウスにおいて、メラノーマ細胞の転移及び増殖を抑制することを見出した。そして、このタンパク質について、ＰＭＦ（ペプチドマスフィンガープリンティング）法によりアミノ酸配列を決定したところ、ウシのアポリポプロテインＣ−ＩＩＩの第８７番のセリンがロイシンに置き換わったアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ−８７Ｌ変異体の第２４〜８９番の６６アミノ酸からなる部分フラグメントであることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明の目的は、副作用が少なく、多くの癌細胞に対して効果のある、血管内皮細胞増殖因子阻害剤、及び抗癌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、（１）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド、あるいは、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む、血管内皮細胞増殖因子阻害剤に関する。
また、本発明は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む、抗癌剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤によれば、血管の異常増殖を原因とする疾患、例えば癌の治療を行うことができる。また、本発明の抗癌剤によれば、抗癌作用の１つのメカニズムとして、血管内皮細胞増殖因子を阻害する機能を有しているため、多くの固形癌の増殖を抑制することが可能であり、更に、メラノーマ細胞への直接的な障害作用（殺作用）がないため、患者に使用した場合にも重篤な副作用を示さないものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のポリペプチドを、マルチモード用カラムにより分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動を行ったものである。レーンｈの分画を回収した。約６６ＫＤａのタンパク質は、アルブミンである。
【図２】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた質量分析により、アミノ酸組成を分析したポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動である。７．５Ｋタンパク質は、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇである。
【図３】Ｂ１６メラノーマ細胞と７．５Ｋタンパク質とを接触させ、２４時間後及び４８時間後の培養上清中のＶＥＧＦ活性を、ＥＬＩＳＡ法で測定し、その結果をまとめたものである
【図４】Ｂ１６メラノーマ細胞と７．５Ｋタンパク質とを接触させ、４８時間後の培養上清中のＶＥＧＦ活性を、ＥＬＩＳＡ法で測定し、その結果をまとめたものである。
【図５】Ｂ１６メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種し、接種の一日後から本発明の抗癌剤を５００μｇ／ｈｅａｄで、週２回投与し、Ｂ１６メラノーマ細胞接種２１日後の肺での腫瘍結節数をまとめたものである。
【図６】Ｂ１６メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種し、接種の一日後から本発明の抗癌剤を５００μｇ／ｈｅａｄで、週２回投与し、Ｂ１６メラノーマ細胞接種２１日後の肺での腫瘍結節を示す写真である。
【図７】Ｂ１６メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種し、接種の３日前から本発明の抗癌剤を５００μｇ／ｈｅａｄで、週２回投与し、Ｂ１６メラノーマ細胞接種２１日後の肺での腫瘍結節数をまとめたものである。
【図８】Ｂ１６メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種し、接種の３日前から本発明の抗癌剤を５００μｇ／ｈｅａｄで、週２回投与し、Ｂ１６メラノーマ細胞接種２１日後の肺での腫瘍結節を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド（以下、配列番号１で表されるアミノ酸配列由来のポリペプチドを、「機能的等価改変体１」と、配列番号２で表されるアミノ酸配列由来のポリペプチドを、「機能的等価改変体２」と称する）、あるいは、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド（以下、「機能的等価改変体」と称し、本「機能的等価改変体」は、前記「機能的等価改変体１」及び「機能的等価改変体２」を含む）、
が含まれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００１３】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、具体的には、
EEGSLLDKMQ GYVKEATKTA KDALSSVQES QVAQQARDWM TESFSSLKDY WSSFKGKFTD FWELATで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ウシのアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（以下、ＢａｐｏＣ−ＩＩＩと称する）と相同性のある新規なポリペプチド（配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）の部分ポリペプチドフラグメントである。
ヒトのアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）画分に分布しており、リポプロテインの代謝に関連していると考えられている。一方、ＢａｐｏＣ−ＩＩＩは、主に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に分布しているが、その機能はほとんど知られていない（非特許文献２）。
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記ＢａｐｏＣ−ＩＩＩ、すなわち配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの第８７番のセリンがロイシンに置き換わったアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ−８７Ｌ変異体（以下、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩと称する）の第２４〜８９番の部分ポリペプチドフラグメント（以下、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇと称する）である。
【００１４】
前記配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、具体的には、EEGSLLDKMQ GYVKEATKTA KDALSSVQES QVAQQARDWM TESFSSLKDY WSSFKGKFTD FWESATで表されるアミノ酸からなるポリペプチドであり、ウシのアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ（配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）の部分ポリペプチドフラグメントであり、すなわち、ＢａｐｏＣ−ＩＩＩの第２４〜８９番の部分ポリペプチドフラグメント（以下、ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇと称する）である。
【００１５】
本発明のポリペプチドである「配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、前記の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇ）を含み、更に、
（２ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド；
（２ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号３で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列（すなわち、Ｎ末端が配列番号３の第１番〜第２３番のアミノ酸のいずれかである）、及び／又はＣ末端に配列番号３で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列（すなわち、Ｃ末端が、配列番号３の第９０番〜９６番のアミノ酸のいずれかである）［以下、「配列番号３で表されるアミノ酸配列、そのＮ末端欠失配列及び／又はＣ末端欠失配列」と称する］を有し、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド；並びに
（２ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、そのＮ末端欠失配列及び／又はＣ末端欠失配列において、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド、
などが含まれる。
前記（２ｂ）のポリペプチドには、例えば、
MQPRLLLLAA FLALLVLPEA TKAEEGSLLD KMQGYVKEAT KTAKDALSSV QESQVAQQAR DWMTESFSSL KDYWSSFKGK FTDFWELATS PTQSPPで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、すなわち、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩが含まれる。
【００１６】
本明細書において、「血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示す」か否かを判定する方法（以下、「血管内皮細胞増殖因子阻害活性の判定方法」は、血管内皮細胞増殖因子の作用を阻害するか否か、あるいは血管内皮細胞増殖因子を産生及び／又は分泌する細胞における、血管内皮細胞増殖因子の産生及び／又は分泌を阻害するか否かを判定することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、血管内皮細胞増殖因子と試験するポリペプチドを混合して、直接血管内皮細胞増殖因子の作用を抑制されるか否か、又は前記の試験ポリペプチドと血管内皮細胞増殖因子を産生及び／又は分泌する細胞を接触させ、細胞の血管内皮細胞増殖因子の産生及び／又は分泌が抑制されるか否かで確認することができる。より具体的には、後述の実施例１に記載のように、ＶＥＧＦを産生するＢ１６メラノーマ細胞に試験するポリペプチドを混合し、産生されるＶＥＧＦの濃度をＥＬＩＳＡで測定することによって、確認することができる。
血管内皮細胞増殖因子（以下、ＶＥＧＦと称する）は、血管形成において、血管内皮細胞に特異的に作用する重要な増殖因子であり、血管透過性亢進の作用も有している。ＶＥＧＦは、更に管腔形成の促進、内皮細胞の遊走、及び腫瘍血管における病的血管新生などの作用も有している。ＶＥＧＦには、スプライシングの違いにより、いくつかのサブタイプがあり、１２１、１６５、１８９アミノ酸のタイプが知られている。これらのうち、１６５アミノ酸のサブタイプ（ＶＥＧＦ１６５）が量的に多く存在し、マウスの実験では、ＶＥＧＦ１６５が最も効率よく腫瘍血管を誘導することが報告されている。
【００１７】
本明細書において、「抗腫瘍活性を示す」か否かを判定する方法（以下、「抗腫瘍活性の判定方法」は、生体内及び／又は試験内において腫瘍細胞の増殖、腫瘍細胞の転移、特定のタンパク質の産生／分泌、などを阻害、又は抑制するか否かを判定することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、マウスに癌細胞を移植した担癌マウスに、前記試験ポリペプチドを投与し、移植された癌細胞の増殖、転移などが抑制されたか否かで確認することができる。より具体的には、後述の実施例２に記載のように、Ｂ１６メラノーマ細胞をマウスに接種し、試験するポリペプチドをマウスに投与することによって、１６メラノーマ細胞の生体における増殖が抑制されるか否かで確認することができる。
【００１８】
本発明のポリペプチドにおける前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行うための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、ｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００１９】
本発明の「機能的等価改変体１」及び「機能的等価改変体２」は、それぞれ配列番号１及び配列番号２で表されるアミノ酸配列における、１又は複数の箇所において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個（例えば、１〜数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もウシに限定されるものではない。
また、本発明の「機能的等価改変体」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１又は複数の箇所において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個（例えば、１〜数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もウシに限定されるものではない。但し、本発明の「機能的等価改変体」は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く。
【００２０】
本発明の「機能的等価改変体」には、例えば、前記機能的等価改変体１及び機能的等価改変体２を含み、更に、
（４ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド；
（４ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端に、配列番号３で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列、及び／又はＣ末端に配列番号３で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列を有し、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示すポリペプチド；並びに
（４ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端に、配列番号３で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列、及び／又はＣ末端に配列番号３で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列であって、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド、
などが含まれる。
【００２１】
本発明の機能的等価改変体には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのウシにおける変異体が含まれるだけでなく、ウシ以外の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ウシ由来の変異体、あるいは、ウシ以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、例えば、ウシの血液から分離及び精製することができる。具体的には、例えば、前記８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇは、以下のような方法で製造することができる。
ウシの血漿から本発明のポリペプチド以外のタンパク質を除くために、硫安沈殿による分画を行う。例えば、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加してウシ血漿を沈殿し、上清を回収する。更に得られた上清を８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿し、沈殿物を回収する。得られた沈殿物は、そのまま、次の工程であるカラムによる分画に用いてもよいが、透析により脱塩を行い、凍結乾燥したものをカラムによる分画の工程に用いてもよい。
カラムによる分画は、本発明のポリペプチドを分離及び精製することができる限り、限定されるものではなく、公知の方法を用いること可能である。例えば、ゲルろ過カラム、イオン交換カラム、疎水性カラム、逆相カラムなどを単独で、又は組み合わせて用い、本発明のポリペプチドを分離精製することができる。
分離及び精製方法に用いるカラムの例として、ゲルろ過、疎水性相互作用、イオン交換相互作用を併せ持つ、マルチモード用カラムを用いることができ、例えば、Shodex社のＧＳ−ＨＱシリーズのカラムを挙げることができる。具体的には、凍結乾燥したサンプルを、溶媒に溶解し、高速液体クロマトグラフィーにより分画する。サンプルを溶解する溶媒は、公知のものを使用することができるが、前記マルチモードカラムを用いる場合は、クエン酸ナトリウムを用いることにより、効率よく本発明のポリペプチドを回収することができる。クエン酸ナトリウムの濃度は、ゲルろ過に用いることができる限り特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜１５％であり、より好ましくは、０．０５〜５．０％である。回収する分画は、本発明のポリペプチドが多く含まれる分画であるが、特には分子量約７．５ｋＤａの８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇが多く含まれる分画を回収することが好ましい。回収した分画は、透析により脱塩し、本発明のポリペプチドとして用いることができる。
ウシの血液から本発明のポリペプチドを製造（分離及び精製）する場合には、適宜、それぞれの精製工程のサンプルの「血管内皮細胞増殖因子阻害活性」及び／又は「抗腫瘍活性」を確認することが好ましい。
【００２３】
また、本発明のポリペプチドは、遺伝子工学的に製造することもできる。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ウシ、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ、若しくはｍＲＮＡ分画、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例１に記載の方法により、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、本発明の「機能的等価改変体」は、前記配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドが含まれるが、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例１に記載の方法により、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２４】
また、本発明のポリペプチドは、化学合成によって製造することもできる。ペプチドの化学合成法としては、液相法及び固相法があり、本発明のポリペプチドのように比較的長いポリペプチドの合成には、固相法が好ましい。固相法としては、Ｆｍｏｃ固相合成法、Ｂｏｃ固相合成法を挙げることができ、合成したペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の公知の方法で精製することができる。特に、７０アミノ酸を超えるポリペプチドは、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて、２つの合成したポリペプチド鎖を結合させることにより、高収率で合成することができる。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、後述の「血管内皮細胞増殖因子阻害剤」及び／又は「抗癌剤」の有効成分として使用することができる。具体的には、本発明のポリペプチドを、薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することによって、血管内皮細胞増殖因子阻害剤」及び／又は「抗癌剤」として使用することができる。
【００２６】
［２］本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む。
前記本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドは、具体的には、
（１）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド、あるいは、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド、
を挙げることができる。
【００２７】
そして、更に、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド、及び
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド、
を挙げることができる。
【００２８】
本発明の本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド」は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇ）を含み、更に、
（５ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示す融合ポリペプチド；
（５ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列（すなわち、Ｎ末端が配列番号４の第１番〜第２３番のアミノ酸のいずれかである）、及び／又はＣ末端に配列番号４で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列（すなわち、Ｃ末端が、配列番号４の第９０番〜９６番のアミノ酸のいずれかである）［以下、「配列番号４で表されるアミノ酸配列、そのＮ末端欠失配列及び／又はＣ末端欠失配列」と称する］を有し、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド；並びに
（５ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、そのＮ末端欠失配列及び／又はＣ末端欠失配列において、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示す融合ポリペプチド、
などが含まれる。
【００２９】
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド」には、例えば、前記機能的等価改変体２を含み、更に、
（６ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示す融合ポリペプチド；
（６ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列、及び／又はＣ末端に配列番号４で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列を有し、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド；並びに
（６ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列、及び／又はＣ末端に配列番号４で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列であって、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示す融合ポリペプチド、
などが含まれる。
【００３０】
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、癌細胞からの血管内皮細胞増殖因子の産生及び／又は分泌を抑制することが可能であるので、「血管新生阻害剤」として用いることもできる。従って、本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、例えば、血管内皮細胞の異常な増殖に関連する疾患の治療又は予防に有用である。このような対象疾患としては、例えば、癌（例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、悪性リンパ腫、肝臓癌、肺癌、若しくは胃癌）、又は、膠原病、バセドウ病、リウマチ様関節炎、カポジ肉腫、乾癬、アテローム性動脈硬化症、強皮症、アルツハイマー病、糖尿病、糖尿病性網膜症、若しくは緑内障などを挙げることができる。
【００３１】
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、前記の本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。
【００３２】
投与剤型としては、特に限定はなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤などの経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、ゼリー、ジェル、ペースト、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００３３】
前記経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００３４】
非経口投与方法としては、クリーム又は軟膏等による局所投与、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、有効成分としてのポリペプチドの他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤等を任意に用いることができる。
【００３５】
また、本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤を徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００３６】
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、これに限定されるものではないが、ポリペプチドを、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
【００３７】
本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などにより異なり、当業者が適宜決定することができる。更に、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００３８】
《作用》
本発明の「血管内皮細胞増殖因子阻害剤」は、後述のようにＶＥＧＦの産生及び分泌細胞の培養上清中の、ＥＬＩＳＡ法によって測定されるＶＥＧＦの量を抑制するものである。ＶＥＧＦを阻害する方法は、ＶＥＧＦの産生を抑えること、ＶＥＧＦの分泌を抑えること、及びＶＥＧＦの活性を抑えること（例えば、ＶＥＧＦの活性の発現に係るエピトープ又はドメインと結合して覆い隠すこと）のいずれか１つの方法でもよく、それらの組み合わせによりＶＥＧＦを阻害するものでもよい。また、本発明の「血管内皮細胞増殖因子阻害剤」は、「血管新生阻害剤」として働くものである。
【００３９】
［３］抗癌剤
本発明の抗癌剤は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを、有効成分として含む。
【００４０】
前記本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドは、具体的には、
（１）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、抗腫瘍活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、抗腫瘍活性を示すポリペプチド、あるいは、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、抗腫瘍活性を示すポリペプチド、
を挙げることができる。
【００４１】
そして、更に、
（７）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、抗腫瘍活性を示すポリペプチド、及び
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、抗腫瘍活性を示すポリペプチド、
を挙げることができる。
【００４２】
本発明の抗癌剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性を示すポリペプチド」は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇ）を含み、更に、
（７ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド；
（７ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列（すなわち、Ｎ末端が配列番号４の第１番〜第２３番のアミノ酸のいずれかである）、及び／又はＣ末端に配列番号４で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列（すなわち、Ｃ末端が、配列番号４の第９０番〜９６番のアミノ酸のいずれかである）［以下、「配列番号４で表されるアミノ酸配列、そのＮ末端欠失配列及び／又はＣ末端欠失配列」と称する］を有し、抗腫瘍活性を示すポリペプチド；並びに
（７ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、そのＮ末端欠失配列及び／又はＣ末端欠失配列において、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド、
などが含まれる。
【００４３】
本発明の抗癌剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、抗腫瘍活性を示すポリペプチド」には、例えば、前記機能的等価改変体２を含み、更に、
（８ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド；
（８ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列、及び／又はＣ末端に配列番号４で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列を有し、抗腫瘍活性を示すポリペプチド；並びに
（８ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更にそのＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２３番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＮ末端から１〜２２個のアミノ酸が欠失した配列が付加された配列、及び／又はＣ末端に配列番号４で表されるアミノ酸配列における第９０番〜第９６番のアミノ酸配列からなる配列又はそのＣ末端から１〜５個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列であって、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、抗腫瘍活性を示す融合ポリペプチド、
などが含まれる。
【００４４】
本発明の抗癌剤は、癌細胞の増殖及び転移を抑制することが可能であるので、例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、悪性リンパ腫、肝臓癌、肺癌、胃癌、などの治療又は予防に有用である。
【００４５】
本発明の抗癌剤は、前記の本発明の抗癌剤の有効成分として用いることのできるポリペプチドを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。
【００４６】
投与剤型としては、特に限定はなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤などの経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、ゼリー、ジェル、ペースト、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００４７】
前記経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００４８】
非経口投与方法としては、クリーム又は軟膏等による局所投与、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、有効成分としてのポリペプチドの他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤等を任意に用いることができる。
【００４９】
また、本発明の抗癌剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の血抗癌剤を徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００５０】
本発明の抗癌剤は、これに限定されるものではないが、ポリペプチドを、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
【００５１】
本発明の抗癌剤の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などにより異なり、当業者が適宜決定することができる。更に、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
《作用》
本発明の抗癌剤は、後述の実施例２に記載のように、Ｂ１６メラノーマ細胞の肺における増殖を顕著に抑制することができる。この抗腫瘍作用のメカニズムの１つは、血管内皮細胞増殖因子の阻害であることが考えられるが、これに限定されるものではなく、有効成分として含まれているポリペプチドのその他の作用によって抗腫瘍作用が発揮されている可能性も高いと考える。すなわち、本発明の抗癌剤は、メラノーマ細胞に対する試験管内での直接的な障害作用は有さないものと考えられるが、例えば、他の癌細胞への直接的な障害作用がないこと、生体内での癌細胞への直接的な障害作用がないことを示すものではなく、更に抗腫瘍効果が得られる他の作用を有している可能性もある。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
《製造例》
［Ａ］ウシ血漿からの７．５ＫＤａのタンパク質の分離及び精製
ウシの血漿約１，０００ｍＬに、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを少量ずつ添加し、４℃で、３０分間撹拌した。その後、４℃で、３０分間以上静置した後に、冷却遠沈機により、４℃で、１０，０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し上清を回収した。この操作により、グロブリン以上の大きさのタンパク質の多くを取り除いた。
得られた上清に、更に、８０％飽和となるように、硫酸アンモニウムを少量ずつ添加し、溶解後、４℃で３０分間撹拌した。更に２０％酢酸を用いてｐＨ＝５．０に調整し、４℃の保冷庫で一夜静置した。冷却遠沈機により、４℃で、１０，０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、沈殿物を回収した。透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ  ３；分画分子量３，５００ＭＷ）に沈殿物を入れ、外液に０．０４％クエン酸ナトリウムを用いて６時間、透析脱塩を行った。更に、外液を交換し、８時間の透析脱塩を３回繰り返した。得られたタンパク質溶液をＳｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＶ  ０．２２μｍフィルター（MILLIPORE社）でろ過後、凍結乾燥機（ＦＤ−８１；ＥＹＥＬＡ社）を用いて凍結乾燥し、約３０ｇの粉末を得た。
得られた粉末を０．１％クエン酸ナトリウム溶液６００ｍＬに溶解し、０．１％クエン酸ナトリウム溶液をキャリア液として使用し、ＨＰＬＣで分画した。カラムは、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−５２０  ２０Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ社製、マルチモード用分取カラム）を用い、分子量７．５ｋＤａのタンパク質を最も多く含む分画を回収した。
得られた分画を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（バイオマックス−５分画分子量５ｋＤａ、MILLIPORE社製）にて脱塩濃縮した。この分画を、更に、０．１％クエン酸Ｎａ溶液をキャリア液として使用し、ＨＰＬＣで分画した。ゲルろ過カラムは、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−３２０  ２０Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ社製、マルチモード用分取カラム）を用い、分子量７．５ｋＤａのタンパク質を最も多く含む分画を回収した。カラムを用いて分画したそれぞれの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動した写真を図１に示す。回収した画分は、図１のレーンｈの画分であり、約７．５ｋＤａのバンドを確認することができる。なお、約６６ＫＤａのタンパク質は、アルブミンである。
得られた分画を、ビバスピン２０（Sartorius社製、分画分子量  ３，０００）にて脱塩、濃縮を行い、更に、MILLIPORE社マイクロコンＹＭ−３にて脱塩、濃縮し、合計で約３０ｍｇのタンパク質を含む溶液を得た。これを使用するまで−２０℃にて凍結保存した。
得られたタンパク質を、７．５ｋタンパク質と称する。
【００５４】
［Ｂ］７．５ｋＤａのタンパク質の質量分析
得られた７．５ｋタンパク質を、ＰＭＦ（ペプチドマスフィンガープリンティング）法により、アミノ酸配列を解析した。具体的には、ＭＡＬＤＩ（Matrix-assisted Laser dissorption ionization）−ＴＯＦ（Time of Flight）−ＭＳを用いた質量分析によりアミノ酸組成を分析し、データベースサーチにより、タンパク質を同定した。
５〜２０％グラジェントのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、約７．５ｋＤａのタンパク質のバンドを切り出した。得られたタンパク質をトリプシンで、切断後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでアミノ酸組成の分析を行い、タンパク質データベースから、タンパク質を同定した。実際の分析は、（株）島津製作所プロテオーム解析センターに依頼して行った。
その結果、約７．５ｋタンパク質は、ウシのアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩの第８７番のセリンがロイシンに置き換わったアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩの変異体（８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩ）の第２４〜８９番の部分ポリペプチドフラグメント（８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇ）であることがわかった。以下に、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇのアミノ酸配列を示す。分子量は７５４４である。
EEGSLLDKMQ GYVKEATKTA KDALSSVQES QVAQQARDWM TESFSSLKDY WSSFKGKFTD FWESAT
【００５５】
［Ｃ］注射液の製造
実施例１（Ａ）で得られた７．５ｋタンパク質５０ｍｇを生理食塩水１０ｍＬに溶解し、５ｍｇ／ｍＬの注射液を作成した。
【００５６】
《参考例１：８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇによるＢ１６メラノーマ細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける障害活性》
本参考例では、Ｂ１６メラノーマ細胞に対する、前記８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける障害活性（殺作用）を調べた。
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清（COSMO BIO社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０Ｌｉｑｕｉｄ「ニッスイ」（日水製薬社製；以下、ＲＰＭＩ培地と称する）を用いて、３日間培養した。Ｂ１６メラノーマ細胞を遠心分離によって回収し、トリパンブルー染色を行い、細胞数をカウントした。滅菌済みの９６ウェルマイクロプレートを用意し、１ウェル当たり、細胞１×１０４個を分注した。
実施例１（Ａ）で得られた７．５ｋタンパク質を、ＲＰＭＩ培地を用いて希釈し、２００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬの濃度の溶液を調整し、Ｂ１６メラノーマ細胞が分注されたウェルに添加した。コントロールとして、ＲＰＭＩ培地（７．５ｋタンパク質０μｇ／ｍＬ）のみを加え、培養開始から４８時間後の細胞の生存率を測定した。細胞の生存率は、各ウェルの細胞を４８時間後に、トリパンブルー染色液で染色し、生きている細胞数を全体の細胞数で割ったものを生存率とした。試験は、それぞれの濃度について４ウェルで行い、平均を計算した。
培養を開始してから４８時間後における、生存率はコントロールが９２．１％、であるのに対して、２００μｇ／ｍＬ投与したものは９２．３％、１０００μｇ／ｍＬが９１．４％、５０００μｇ／ｍＬが９１．０％の生存率であり、７．５ｋタンパク質のＢ１６メラノーマ細胞に対する殺細胞作用（障害活性）は、認められなかった。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
《実施例１：８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇによるＶＥＧＦの分泌阻害》
Ｂ１６メラノーマ細胞を、ＲＰＭＩ培地を用いて培養し、対数増殖期にあるＢ１６メラノーマ細胞を、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＰＢＳで処理し、回収した。遠心分離機で、１，２００ｒｐｍで６分間、遠心した後、ＲＰＭＩ培地に再懸濁し細胞数をカウントした。
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１×１０４／１００μＬ／ｗｅｌｌに調整し、９６穴マイクロプレートに撒いた。実施例１（Ａ）で得られた７．５ｋタンパク質を、ＲＰＭＩ培地を用いて、１０μｇ／１００μＬ（Ａ）、１００μｇ／１００μＬ（Ｂ）、５００μｇ／１００μＬ（Ｃ）の濃度に溶解し、それぞれのウェルに１００μＬずつ加えて培養した。コントロールは、ＲＰＭＩ培地のみで培養し、２４時間後と４８時間後の培養上清を回収した。
培養上清中のＶＥＧＦの濃度をQuantikine Mouse VEGF Immunoassayキット（R&D systems社）とBIO-KINETICS READER EL312e（BIO-TEK INSTRUMENT社）を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。試験は、それぞれ２ウェルで行い平均を計算した。結果を図３に示す。２４時間後の培養上清中には、ＶＥＧＦの分泌は少なく、７．５ｋタンパク質の添加により、ＶＥＧＦの分泌に、顕著な差は見られなかったが、４８時間後の培養上清中に産生されたＶＥＧＦの値は、７．５ｋタンパク質の用量依存的に抑制された。
確認のために、同じ実験を繰り返し、４８時間後の培養上清を回収し、培養上清中のＶＥＧＦの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図４に示す。コントロールでは、培養上清中に約３００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦの分泌が見られたが、７．５ｋタンパク質を添加した培養上清では、１００ｐｇ／ｍＬ以下に抑制されていた。
【００５９】
《実施例２：８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍作用》
本実施例２では、実験的肺転移モデルを用いて、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの抗腫瘍作用を検討した。マウスＢ１６メラノーマ細胞は、皮膚癌由来の癌細胞であり、マウスに投与することにより、高い確率で血行性転移を起こすことが知られている。この細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈より静注し実験的肺転移腫瘍を作り、腫瘍の肺転移と増殖に対する８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの効果を検討した。
７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌性マウス（日本クレア社）１０匹を、１週間の予備飼育をした後、８週齢に実験に用いた。飼育期間中、飼料および飲料は自由摂取とした。
腫瘍細胞として、対数増殖期にあるＢ１６メラノーマ細胞を０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて回収し、１，２００ｒｐｍで６分間、遠沈後、ＰＢＳに再懸濁し細胞数をカウントした。Ｂ１６メラノーマ細胞を、ＰＢＳにて５×１０４／１００μＬに調整し、Ｃ５７ＢＬ／６  マウスの尾静脈より、１００μＬずつ静脈内接種した。
８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの投与は、前記製造例［Ｃ］で製造した注射剤を用いて、Ｂ１６メラノーマ細胞の接種１日後から、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇを、５００μｇ／１００μＬ／ｈｅａｄで、１週間に２回、尾静脈より投与した（実験群Ｉ）。対照群の１０匹マウスには１００μＬの生理食塩水のみを同様に投与した。
Ｂ１６メラノーマ細胞の接種から２１日目に、マウスを安楽死させた後、それぞれの肺を摘出した。肺を１０％ホルマリン液で固定し、肺に形成された腫瘍結節数を顕微鏡下で外側より観察した。結果を表２及び３、並びに図５及び６に示す。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
【表３】
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【００６２】
実験群Ｉにおいては、コントロールの腫瘍結節数の平均８３．３個に対して、投与群は２１．６個であり、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの投与によって、コントロールと比較して、腫瘍結節数が約１／４に抑制された。すなわち、Ｂ１６メラノーマ細胞接種の翌日からの８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの投与によって、Ｂ１６メラノーマ細胞の肺での増殖が抑えられた。
【００６３】
《実施例３：８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍作用》
前記製造例［Ｃ］で製造した注射剤を用いて、Ｂ１６メラノーマ細胞の接種３日前から、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇを、５００μｇ／１００μＬ／ｈｅａｄで、１週間に２回、尾静脈より投与した（実験群II）ことを除いては、実施例２の工程を繰り返した。結果を表４及び５、並びに図７及び８に示す。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
【表５】
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【００６６】
実験群IIでは、コントロールの腫瘍結節数の平均２７．３個に対して投与群は１．１個であり、８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの投与によって、コントロールと比較して、腫瘍結節数が約１／２０にまで抑制された。また、実験群IIの投与群１０匹のうち６匹には結節が全く無く、Ｂ１６メラノーマ細胞接種の３日前からの８７Ｌ−ＢａｐｏＣ−ＩＩＩｆｒａｇの投与によって、Ｂ１６メラノーマ細胞の肺での増殖が、顕著に抑えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖因子阻害活性、及び／又は抗腫瘍活性を有するので、血管内皮細胞増殖因子阻害剤、又は抗癌剤の有効成分として有用である。
また、本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、血管内皮細胞などの異常増殖を伴う疾患の予防や治療に用いることができる。更に、本発明の抗癌剤は、癌の化学療法において、術後の転移や再発を防ぎ、また、放射線療法などとも組み合わせて用いることができ、特に固形癌においては、癌の組織の増殖と転移を効果的に抑制することができる。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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