(57)【要約】      （修正有）【課題】粒子（例えば、細胞、ウイルス、オルガネラ、ビーズおよび／または小胞）の微小流体操作および／または分析のための新規な方法を提供する。【解決手段】細胞および／またはビーズの様な粒子の、微小流体操作および／または検出のための装置、方法およびキットを備える。細胞、ウイルス、オルガネラ、ビーズ、および／または小胞のような粒子の微小流体操作および／または分析のための装置、方法およびキットを備え、これらの操作および分析を実行するための微小流体メカニズム。これらのメカニズムは、粒子のコントロールされたインプット、移動／配置、保持／局在化、処理、測定、放出、および／またはアウトプットを可能にする。さらに、これらのメカニズムは、システム中で任意の適切な順序で組み合わされ得、任意の適切な回数利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を試薬で灌流するための方法であって：
（ａ）以下を有する微小流体デバイスを提供する工程；
（ｉ）細胞成長チャンバであって、該チャンバと細胞入口が連絡し、該細胞入口がそれと作動可能に連絡している入口バルブを有して該チャンバ中への該細胞入口を通る流体流れをコントロールし、該入口バルブが開いているとき該細胞が該細胞入口を通って該チャンバ中に通過し得るが、該入口バルブが閉じているとき該細胞入口を通過し得ない、細胞成長チャンバ；および
（ｉｉ）該試薬を該チャンバ中にインプットするための試薬入口であって、該試薬入口を通り該チャンバ中への流体流れをコントロールするために該試薬入口と作動可能に連絡している試薬バルブを有し、該細胞入口および／または該チャンバが、該試薬バルブが開いているとき、該チャンバ中への該試薬の流れを許容しながら、該細胞を該チャンバ中に保持するための保持メカニズムを有する、試薬入口；ここで、該細胞が該チャンバ中に装填され、そして該入口バルブが閉じるとき、該細胞が該チャンバに、該試薬バルブが開きそして閉じている間、該保持メカニズムによって保持される；
（ｂ）該細胞入口バルブを開き、そして該細胞を該チャンバ中に導入する工程；
（ｃ）該細胞入口バルブを閉じる工程；
（ｄ）該試薬を該チャンバ中に導入するために該試薬バルブを開く工程；および
（ｅ）該チャンバの内側に該細胞を保持しながら該チャンバ中に該試薬を導入する工程であって、それによって該細胞を該試薬で灌流する工程、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、米国仮特許出願第６０／３６９，５３８号（２００２年４月１日出願）および同第６０／３７８，４６４号（２００２年５月６日出願）（これらはともに、全ての目的ならびに本明細書中およびその特許出願に記載される目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される）に対する優先権の利益を主張する。本出願はさらに、米国特許法第１２０条に基づいて、非仮特許出願（Ｃｈｏｕらによる２００３年３月３１日出願の、標題「ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＰａｒｔｉｃｌｅ−Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」（代理人整理番号１３９Ｆ．３１０ＵＳ）の一部継続出願（これは、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される）として、優先権を主張する。
【０００２】
（特許出願に対する引用）
本出願は、米国特許出願第０９／６０５，５２０号（２０００年６月２７日出願）；同第０９／７２４，７８４号（２０００年１１月２８日出願）；同第０９／７２４，９６７号（２０００年１１月２８日出願）；同第０９／７９６，３７８号（２００１年２月２８日出願）；同第０９／７９６，６６６号（２００１年２月２８日出願）；同第０９／７９６，８７１号（２００１年２月２８日出願）；同第０９／８２６，５８３号（２００１年４月６日出願）；および同第０９／７２４，７８４号（２００１年１１月２８日出願、標題「ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＥＤＥＬＡＳＴＯＭＥＲＩＣ ＶＡＬＶＥ ＡＮＤ ＰＵＭＰ ＳＹＳＴＥＭＳ」および発明者、Ｍａｒｃ Ａ．Ｕｎｇｅｒ、Ｈｏｕ−Ｐｕ Ｃｈｏｕ、Ｔｏｄｄ Ａ． Ｔｈｏｒｓｅｎ、ＡｘｅｌＳｃｈｅｒｅｒ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｒ． Ｑｕａｋｅ、Ｊｉａｎ Ｌｉｕ、Ｍａｒｋ Ｌ． Ａｄａｍｓ、およびＣａｒｌ Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ）を全ての目的で、その全体を本明細書中に参考として援用する。
【０００３】
（他の文献に対する引用）
本出願は、以下の刊行物を、全ての目的で本明細書中に参考として援用する：Ｊｏｅ ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００）；ならびにＲ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第４版、２０００）。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、粒子の操作および／または検出のためのシステムに関する。より具体的には、本発明は、粒子（例えば、細胞および／またはビーズ）の操作および／または検出のための微小流体システムに関する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
生物学的システムが分子分析および細胞分析を行う能力は、過去３０年間で爆発的に成長した。特に、分子技術および細胞技術（例えば、ＤＮＡ配列決定、遺伝子クローニング、モノクローナル抗体生成、細胞トランスフェクション、増幅技術（例えば、ＰＣＲ）、およびトランスジェニック動物の成立）の出現および洗練は、この爆発的な成長を刺激した。これらの技術は、圧倒的多数の同定遺伝子、コードタンパク質、操作された細胞型、ならびにこれらの遺伝子、タンパク質、および細胞型を研究するためのアッセイを生み出した。サンプル、試薬、およびアッセイのあり得る組み合わせの数がほとんど計算できないほどになるにつれて、特に妥当な時間的制限および金銭的制限内で、この複雑性を理解し始めるためにも、新規なアプローチが必要なことがますます明らかになってきている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの困難性に対する１つのアプローチは、アッセイのスケールを縮小することであった。従って、実質的な取り組みは、アッセイ方法および高密度マイクロタイタープレート用器具を開発することに関していた。しかし、高密度マイクロタイタープレートにおける非常に少ないアッセイ容積（特に細胞を用いるアッセイ）は、多くの欠点があり得る。例えば、細胞は、ウェルから容易になくなり得、急速な流体の蒸発による不都合があり得、ウェルの近くで汚染があり得、そしてさらなる分析または培養のためにウェルから効率的に回収することが困難であり得る。従って、細胞および他の小粒子（例えば、ビーズ）を少量で効率的に操作および分析し得るシステムが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、粒子（例えば、細胞および／またはビーズ）の微小流体操作および／または検出のためのシステム（装置を含む）、方法、およびキットを提供する。
より特定すれば、本願発明は以下の項目に関し得る。
（項目１）
粒子を処理するための微小流体デバイスであって、上記デバイスが、以下：
（ａ）粒子を含む流体サンプルを導入するためのインプットメカニズム；
（ｂ）上記インプットメカニズムと流体連絡している微小流体通路；
（ｃ）上記微小流体通路と流体連絡している配置メカニズムであって、上記配置メカニズムが、上記流体サンプル中に含まれる上記粒子を上記微小流体通路中に配置させるための配置メカニズム；
（ｄ）配置手段により配置されている上記粒子を保持するための保持メカニズム；
（ｅ）上記保持メカニズム中に保持されている上記粒子を選択的に処理して処理応答を生じるための、上記保持メカニズムと連絡している処理メカニズム；および
（ｆ）上記粒子の処理応答を、存在する場合、測定するための測定メカニズム
を備える、デバイス。
（項目２）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、上記粒子を上記保持メカニズムから放出するための放出メカニズムをさらに備える、デバイス。
（項目３）
項目２に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、上記粒子を上記微小流体デバイスからアウトプットするためのアウトプットメカニズムをさらに備える、デバイス。
（項目４）
項目２に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、上記粒子を培養するための培養メカニズムをさらに備える、デバイス。
（項目５）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、上記サンプル流体または他の流体の流量または流路の局面を決定するためのコントロールメカニズムをさらに備える、デバイス。
（項目６）
項目５に記載の微小流体デバイスであって、上記コントロールメカニズムが、上記微小流体通路と連絡しているバルブである、デバイス。
（項目７）
項目６に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体デバイスが、多層エラストマーブロックから形成され、上記バルブが、上記エラストマーブロック中のエラストマー膜から形成される、デバイス。
（項目８）
項目６に記載の微小流体デバイスであって、上記コントロールメカニズムが、上記微小流体通路と連絡しているポンプである、デバイス。
（項目９）
項目８に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体デバイスが、多層エラストマーブロックから形成され、上記ポンプが、上記エラストマーブロック中のエラストマー膜から形成される、デバイス。
（項目１０）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体デバイスが、流体層中の上記微小流体通路中に偏向可能なエラストマー膜を有するコントロール層を有する多層エラストマーブロックを備え、上記微小流体通路中の流体の流速または流路を決定する、デバイス。
（項目１１）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体デバイスが、エラストマー、ポリジメチルシロキサン、プラスチック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラス、セラミック、シリコン、ゾルゲル、金属、メタロイド、金属酸化物、生物学的ポリマー、これらの混合物、粒子、タンパク質、ゼラチン、ポリリシン、血清アルブミン、コラーゲン、核酸、および微生物からなる群から選択される物質を含む層を含む、デバイス。
（項目１２）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体通路が、約５００マイクロメートル幅未満である、デバイス。
（項目１３）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体通路が、連結または分岐にて上記微小流体通路に結合する隣接する通路をさらに備え、上記隣接する通路が、入口通路、出口通路、粒子通路、試薬通路、および廃棄物通路からなる群から選択されている、デバイス。
（項目１４）
項目１３に記載の微小流体デバイスであって、上記隣接する通路が、行き止まりの通路である、デバイス。
（項目１５）
項目１３に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、上記粒子を操作する上記隣接する通路をさらに備える、デバイス。
（項目１６）
項目１５に記載の微小流体デバイスであって、上記粒子操作が、配置、分類、保持、処理、検出、増殖、蓄積、混合および放出の群から選択される、デバイス。
（項目１７）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記粒子が、細胞、真核生物細胞、原核生物細胞、植物細胞、動物細胞、ハイブリドーマ細胞、細菌細胞、酵母細胞、ウイルス、オルガネラ、ビーズおよび小胞からなる群から選択される、デバイス。
（項目１８）
項目１７に記載の微小流体デバイスであって、上記粒子が、複数の粒子または粒子の集合体である、デバイス。
（項目１９）
項目１８に記載の微小流体デバイスであって、上記複数の粒子が、異なる粒子を含む複合体混合物である、デバイス。
（項目２０）
項目１９に記載の微小流体デバイスであって、上記異なる粒子を含む複合体混合物が、全血または血清または体液である、デバイス。
（項目２１）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記粒子が、卵または胎芽である、デバイス。
（項目２２）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記インプットメカニズムが、上記微小流体通路と流体連絡している、容器または壁である、デバイス。
（項目２３）
項目２２に記載の微小流体デバイスであって、上記インプットメカニズムが、上記微小流体通路により規定される容積よりも大きな容積を有する、デバイス。
（項目２４）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、上記インプットメカニズムと連絡しているまたは上記インプットメカニズム上で作動している促進メカニズムをさらに備える、デバイス。
（項目２５）
項目２４に記載の微小流体デバイスであって、上記促進メカニズムが、重力、流体圧、遠心圧、ポンプ圧、および流体陰圧からなる群から選択される、デバイス。
（項目２６）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記配置メカニズムが、直接配置メカニズムまたは間接配置メカニズムである、デバイス。
（項目２７）
項目２６に記載の微小流体デバイスであって、上記直接配置メカニズムが、光学、電気、磁気および重力からなる群から選択される力である、デバイス。
（項目２８）
項目２７に記載の微小流体デバイスであって、上記電気的力が、電気泳動、電気浸透、および誘電泳動からなる群から選択される、デバイス。
（項目２９）
項目２６に記載の微小流体デバイスであって、上記間接配置メカニズムが、縦間接配置メカニズムまたは横間接配置メカニズムである、デバイス。
（項目３０）
項目２９に記載の微小流体デバイスであって、上記間接配置メカニズムが、上記微小流体デバイスと結合したポンプまたはバルブにより促進される、デバイス。
（項目３１）
項目２９に記載の微小流体デバイスであって、上記横間接配置メカニズムが、通路連結、減少した流体流の左右に配置される領域、またはチャネル屈曲での流体流により促進される、デバイス。
（項目３２）
項目３１に記載の微小流体デバイスであって、上記通路連結が、統合または分割している、デバイス。
（項目３３）
項目２９に記載の微小流体デバイスであって、上記横配置メカニズムが、層流に基づく横配置手段である、デバイス。
（項目３４）
項目２９に記載の微小流体デバイスであって、上記横間接配置メカニズムが、推計学的横配置メカニズムである、デバイス。
（項目３５）
項目３４に記載の微小流体デバイスであって、上記推計学的横配置メカニズムが、上記サンプル流体中の上記粒子の主な流れの領域から減少した流れの領域への左右の分離により、粒子の集団から上記粒子を無作為に選択する、デバイス。
（項目３６）
項目２９に記載の微小流体デバイスであって、上記横間接配置メカニズムが、遠心力に基づく横配置メカニズムである、デバイス。
（項目３７）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記保持メカニズムが、上記微小流体デバイス中の予め選択された領域で上記粒子を選択的に保持する、デバイス。
（項目３８）
項目３７に記載の微小流体デバイスであって、上記保持メカニズムが、上記配置メカニズムにより引き起こされる力に打ち勝つまたは打ち消すことにより上記粒子を保持する、デバイス。
（項目３９）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記保持メカニズムが、トラップまたは障壁に基づく保持メカニズムである、デバイス。
（項目４０）
項目３９に記載の微小流体デバイスであって、上記障壁に基づく保持メカニズムが、上記微小流体通路中のまたは上記微小流体通路に隣接する上記粒子の縦移動を制限する、デバイス。
（項目４１）
項目３８に記載の微小流体デバイスであって、上記保持メカニズムが、固定してまたは一時的に、上記微小流体通路中にまたは上記微小流体通路に隣接して延び、上記粒子の縦移動を制限する突起部である、デバイス。
（項目４２）
項目２６に記載の微小流体デバイスであって、上記直接配置メカニズムが、化学的保持メカニズムである、デバイス。
（項目４３）
項目４２に記載の微小流体デバイスであって、上記化学的保持メカニズムが、上記粒子と上記保持メカニズムとの間の特異的な親和力に基づく、デバイス。
（項目４４）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記処理メカニズムが、流体媒介メカニズムまたは非流体媒介メカニズムである、デバイス。
（項目４５）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記処理メカニズムが、上記粒子を試薬または物理的条件に曝す、デバイス。
（項目４６）
項目４５に記載の微小流体デバイスであって、上記試薬が、化学的変調器、生物学的変調器、アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、リガンド、低分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、レセプター、栄養素、毒素、薬物、化学物質、化合物、イオン、ポリマー、核酸、物質、複合体、混合物、集合体、色素、染料、蛍光色素、検出剤、アッセイ剤、基質、基質阻害剤、抗体、標識物質、および生物学的粒子からなる群から選択される、デバイス。
（項目４７）
項目４６に記載の微小流体デバイスであって、上記試薬が、上記粒子を引きつけるまたは反発する、デバイス。
（項目４８）
項目４５に記載の微小流体デバイスであって、上記試薬が、細胞粒子増殖を誘発または阻害する、デバイス。
（項目４９）
項目４５に記載の微小流体デバイスであって、上記試薬が、細胞傷害性である、デバイス。
（項目５０）
項目４４に記載の微小流体デバイスであって、上記流体媒介メカニズムが、流体処理をさらに備え、そして上記粒子が、上記流体処理に導入される、デバイス。
（項目５１）
項目４４に記載の微小流体デバイスであって、上記流体媒介メカニズムが、上記配置メカニズムの機能と結合して機能する、デバイス。
（項目５２）
項目５１に記載の微小流体デバイスであって、上記配置メカニズムが、上記粒子を、上記流体媒介メカニズム中におよび上記流体媒介メカニズム外に移動させ、上記粒子の処理流体への曝露を調節する、横配置メカニズムである、デバイス。
（項目５３）
項目４５に記載の微小流体デバイスであって、上記物理的条件が、熱、光、放射能、亜原子粒子、電場、磁場、圧力、音波圧、重力、および微重力からなる群から選択される、デバイス。
（項目５４）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記測定メカニズムが、上記粒子の特性または上記粒子により引き起こされる特性を検出する上記微小流体デバイスと結合される検出器である、デバイス。
（項目５５）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、分光器、電気的センサー、流体力学的センサー、画像化システム、および光子検出器からなる群から選択される、デバイス。
（項目５６）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、複数のバルブを検出する、デバイス。
（項目５７）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、時間に依存しない様式、時間依存様式、および平均化様式からなる群から選択される検出様式を使用する、デバイス。
（項目５８）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、吸収、ルミネセンス、光ルミネセンス、化学ルミネセンス、エレクトロルミネセンス、磁気共鳴、原子核共鳴、電子スピン共鳴、散乱、電子散乱、光散乱、中性子散乱、回折、円偏光二色性、施光度、蛍光強度、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光極性、蛍光寿命、全内部反射蛍光、蛍光相関分光学、光退色後の蛍光回復、蛍光活性化細胞分類および燐光性からなる群から選択される型の生じるシグナルを検出する、分光学的検出器である、デバイス。
（項目５９）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、電流、電圧、抵抗、静電容量、および電力から選択されるシグナルを検出し得る、電気的検出器である、デバイス。
（項目６０）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器は、上記粒子と流体、別の粒子または上記微小流体通路との流体力学的相互作用を検出する、流体力学的検出器である、デバイス。
（項目６１）
項目６０に記載の微小流体デバイスであって、上記相互作用が、クロマトグラフィー、沈殿、粘度計、電気泳動からなる群から選択される流体力学的相互作用を含んだ、デバイス。
（項目６２）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、上記粒子の画像を作り出し、そして分析するための画像化検出器である、デバイス。
（項目６３）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、上記粒子により生じる生物学的応答を検出する、デバイス。
（項目６４）
項目６３に記載の微小流体デバイスであって、上記生物学的応答が、化学走性、細胞間相互作用、老化、アポトーシス、増殖、分化、形態学的変化、ｐＨ変化、およびカルシウム摂取からなる群から選択される、デバイス。
（項目６５）
項目１に記載の微小流体デバイスであって、上記デバイスが、検出部位をさらに備え、上記粒子または上記粒子の生成物が、上記検出器により検出される、デバイス。
（項目６６）
項目６５に記載の微小流体デバイスであって、上記検出部位が、上記微小粒体デバイス中にある、デバイス。
（項目６７）
項目６５に記載の微小流体デバイスであって、上記検出部位が、上記微小流体デバイスに対して外部に位置される、デバイス。
（項目６８）
項目５４に記載の微小流体デバイスであって、上記検出器が、上記粒子の特性を直接的または間接的に検出し、上記特性が、粒子固有性、粒子数、粒子濃度、組成物、構造、配列、活性、分子特性、形態学、表現型、遺伝子型、増殖、アポトーシス、壊死、溶解、生存率／死亡率、細胞周期での位置、シグナル経路の活性、分化、転写活性、基質結合、細胞−細胞相互作用、翻訳活性、複製活性、形質転換、熱ショック応答、運動性、拡散、膜完全性、化学走性、および神経突起生長からなる群から選択されている、デバイス。
（項目６９）
項目２に記載の微小流体デバイスであって、上記放出メカニズムが、上記保持メカニズムにより引き起こされる保持力を除去することにより作動する、デバイス。
（項目７０）
項目２に記載の微小流体デバイスであって、上記放出メカニズムが、上記保持メカニズムにより引き起こされる保持力に打ち勝つことにより作動する、デバイス。
（項目７１）
項目２に記載の微小流体デバイスであって、上記放出メカニズムが、上記保持メカニズムにより引き起こされる保持力に無力にさせることにより作動する、デバイス。
（項目７２）
項目２に記載の微小流体デバイスであって、上記粒子を上記微小流体デバイス内または上記微小流体デバイスの外部の別の領域に向ける工程をさらに包含する、デバイス。
（項目７３）
項目７２に記載の微小流体デバイスであって、上記別の領域が、第２の配置メカニズム、第２の検出メカニズム、第２の保持メカニズム、およびアウトプットメカニズムからなる群から選択される、デバイス。
（項目７４）
項目７３に記載の微小流体デバイスであって、上記第２の保持メカニズムが、細胞培養チャンバである、デバイス。
（項目７５）
項目３に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体デバイスが、内部シンクおよび外部シンク、廃棄部位、収集部位、細胞増殖チャンバ、ならびに外部細胞培養プレートからなる群から選択される位置に上記粒子をアウトプットする、上記アウトプットメカニズムをさらに備える、デバイス。
（項目７６）
細胞を試薬に浸み込ませるための方法であって、上記方法が、以下の工程：
（ａ）微小流体デバイスを提供する工程であって、上記デバイスが、以下：
（ｉ）細胞増殖チャンバ
細胞入口が上記チャンバと連絡しており、上記細胞入口が上記細胞入口を通り上記チャンバ中への流体流をバルブで調節する上記細胞入口と作動可能に連絡しているバルブを有し、入口バルブが開いている場合、細胞が上記細胞入口を通り上記チャンバ中に通り得、しかし上記入口バルブが閉じている場合、上記細胞が、上記細胞入口を通ることが出来ない、細胞増殖チャンバ；および
（ｉｉ）上記チャンバ中に上記試薬をインプットするための試薬入口であって、上記試薬入口が、上記試薬を通り上記チャンバ中への流体流をバルブ調節するための上記試薬入口と作動可能に連絡している試薬バルブを有し、上記入口または上記チャンバが、上記チャンバ中の上記細胞を保持するための保持メカニズムを有する一方、上記試薬バルブが開いている場合、上記試薬の上記チャンバ中への流れを可能にする、試薬入口を有し；
上記細胞が上記チャンバ中に装填される場合、上記細胞バルブが閉まり、上記細胞が上記チャンバ中に保持される一方、上記試薬バルブは、開きおよび閉まっている、工程；
（ｂ）上記細胞入口バルブを開き、かつ上記細胞を上記チャンバ中に導入する工程；
（ｃ）上記細胞入口バルブを閉める工程；
（ｄ）上記試薬バルブを開き、上記試薬を上記チャンバ中に導入する工程；
（ｅ）上記試薬を上記チャンバ中に導入する一方、上記細胞を上記チャンバ内に保持し、それにより上記細胞を上記試薬に浸み込ませる工程
を包含する、方法。
（項目７７）
粒子を処理するための方法であって、上記方法が、以下の工程：
（ｉ）微小流体デバイスを提供する工程であって、上記微小流体デバイスが、以下：
（ａ）粒子を含む流体サンプルを導入するためのインプットメカニズム；
（ｂ）上記インプットメカニズムと流体連絡している微小流体通路；
（ｃ）上記微小流体通路と流体連絡している配置メカニズムであって、上記配置メカニズムが、上記流体サンプル中に含まれる上記粒子を上記微小流体通路中に配置させるための配置メカニズム；
（ｄ）配置手段により配置されている上記粒子を保持するための保持メカニズム；
（ｅ）上記保持メカニズム中に保持されている上記粒子を選択的に処理して処理応答を生じるための上記保持メカニズムと連絡している処理メカニズム；および
（ｆ）上記粒子の処理応答を、存在する場合、測定するための測定メカニズム
を備える、工程；
（ｉｉ）上記粒子を含むサンプル流体を上記インプットメカニズム中に導入する工程；
（ｉｉｉ）上記粒子を上記配置メカニズムを用いて配置させ、その結果、上記粒子が、上記保持メカニズムによって保持可能である、工程；
（ｉｖ）上記粒子を上記保持メカニズムを用いて保持する、工程；
（ｖ）上記粒子を上記処理メカニズムにより上記処理に曝露する、工程；
（ｖｉ）上記処理への曝露の際に上記粒子により直接または間接で引き起こされる上記処理応答を測定する工程
を包含する、方法。
（項目７８）
項目７７に記載の方法であって、上記微小流体デバイスが、上記粒子を上記保持メカニズムから放出するための放出メカニズムをさらに備え、上記方法が、上記粒子を上記保持メカニズムから放出する工程をさらに包含する、方法。
（項目７９）
項目７８に記載の方法であって、上記微小流体デバイスが、上記粒子を上記微小流体デバイスからアウトプットするためのアウトプットメカニズムをさらに備え、上記方法が、上記粒子を上記微小流体デバイスから上記アウトプットメカニズムによりアウトプットする工程をさらに包含する、方法。
（項目８０）
項目７８に記載の方法であって、上記微小流体デバイスが、上記粒子を培養するための細胞培養メカニズムをさらに備え、上記方法が、上記粒子を上記細胞培養メカニズム中で培養する工程をさらに包含する、方法。
（項目８１）
項目７７に記載の方法であって、上記微小流体デバイスが、上記サンプル流体または他の流体の流量または流路の局面を決定するためのコントロールメカニズムをさらに備え、そして上記方法が、上記サンプル流体または他の流体の流速または流路を上記コントロールメカニズムにより決定する工程をさらに包含する、方法。
（項目８２）
項目８１に記載の方法であって、上記コントロールメカニズムが、上記微小流体通路と連絡しているバルブであり、そして上記方法が、上記サンプル流体または他の流体を上記バルブで調節する工程をさらに包含する、方法。
（項目８３）
項目８２に記載の微小流体デバイスであって、上記微小流体デバイスが、多層エラストマーブロックから形成され、そして上記バルブが、上記エラストマーブロック中のエラストマー膜から形成され、そして上記バルブ調節が、上記エラストマー膜を上記微小流体通路中に偏向させることにより起こる、デバイス。
（項目８４）
項目８２に記載の方法であって、上記コントロールメカニズムが、上記微小流体通路と連絡しているポンプであり、そして上記サンプル流体の流量または流路の上記決定が、上記ポンプの作動により起こる、方法。
（項目８５）
項目８４に記載の方法であって、上記微小流体デバイスが、多層エラストマーブロックから形成され、上記ポンプが、上記エラストマーブロック中のエラストマー膜から形成され、そして上記ポンプが、一連のエラストマー膜を、選択された配列における上記微小流体通路中に偏向させることにより作動させる、方法。
（項目８６）
項目７７に記載の方法であって、上記微小流体デバイスが、流体層中の上記微小流体通路中に偏向可能なエラストマー膜を有するコントロール層を有する多層エラストマーブロックを備え、上記微小流体通路中の流体の流速または流路を選択的に決定する、方法。
（項目８７）
項目７７に記載の方法であって、上記微小流体通路が、連結または分岐にて上記微小流体通路に結合する隣接する通路をさらに備え、上記隣接する通路が、入口通路、出口通路、粒子通路、試薬通路、および廃棄物通路からなる群から選択されており、そして上記方法が、上記隣接する通路に対して上記粒子の通路を選択的に決定する工程をさらに包含する、方法。
（項目８８）
項目８７に記載の方法であって、上記隣接する通路が、行き止まりの通路であり、そして上記選択的に決定する工程が、上記サンプル流体を上記行き止まりの通路中に導入する工程を包含し、上記サンプル流体が、上記行き止まりの通路における気体（存在する場合）と置換して、上記行き止まりの通路を上記サンプル流体で満たす、方法。
（項目８９）
項目８７に記載の方法であって、上記方法が、上記粒子を操作する上記隣接する通路をさらに備える、方法。
（項目９０）
項目８９に記載の方法であって、上記粒子操作が、上記粒子を配置、分類、処理、検出、増殖、蓄積、混合または放出のいずれかに加えて上記粒子を保持する工程を包含する、方法。
（項目９１）
項目７７に記載の方法であって、上記粒子が、細胞、真核生物細胞、原核生物細胞、植物細胞、動物細胞、ハイブリドーマ細胞、細菌細胞、酵母細胞、ウイルス、オルガネラ、ビーズおよび小胞からなる群から選択され、上記処理工程が、上記粒子を処理する、方法。
（項目９２）
項目９１に記載の方法であって、上記粒子が、複数の粒子または粒子の集合体であり、上記方法が、所望される粒子を上記複数の粒子から分類および分離または単離する分類工程をさらに包含し、そして上記処理工程が、上記分離されたまたは単離された粒子を処理する、方法。
（項目９３）
項目９２に記載の方法であって、上記複数の粒子が、異なる粒子を含む複合体混合物であり、そして上記分類工程が、少なくとも１つの型の粒子を上記複合体混合物中の他の異なる粒子から分類する、方法。
（項目９４）
項目９３に記載の方法であって、上記異なる粒子を含む複合体混合物が、全血または血清または体液であり、上記分類工程が、少なくとも１つの型の細胞を上記全血または血清から選択する、方法。
（項目９５）
項目７７に記載の方法であって、上記粒子が、卵または胎芽であり、上記処理が、上記卵または胎芽を、それぞれインビトロで受精または操作することに対する工程である、方法。
（項目９６）
項目７７に記載の方法であって、上記インプットメカニズムが、上記微小流体通路と流体連絡している、容器または壁であり、そして上記方法が、上記流体サンプルを上記容器中に導入する工程をさらに包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおける粒子の操作および／または検出のための方法の工程の間の潜在的な時間的関係を示すフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の局面に従う、インプット粒子のサブセットを保持および分析するための微小流体システムの平面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の局面に従う、インプット粒子のサブセットを保持および分析するための別の微小流体システムの平面図である。
【図３】図３は、本発明の局面に従う、インプット粒子のサブセットを保持および分析するためのなお別の微小流体システムの部分平面図である。
【図４】図４は、粒子の位置づけおよび保持の間の、図３のシステムの図であり、本発明の局面に従う、粒子がたどる種々の流路を示す。
【図５】図５は、本発明の局面に従う、粒子群を位置づけおよび保持するため、および選択された試薬で保持された群を覆うための、微小流体システムの部分平面図である。
【図６】図６は、本発明の局面に従う、図５のシステムに従って製造されたチップの一部の写真である。
【図７】図７は、図６の画像の模式的解釈であり、本発明の局面に従う、粒子保持チャンバまたは粒子捕捉チャンバに関する流体流および粒子運動の経路を示す。
【図８】図８は、図５のシステムの完全平面図である。
【図９】図９は、本発明の局面に従う、溶解した細胞を染色するためにトリパンブルーに曝した後であるが、細胞固定の前の、保持チャンバ中の細胞の写真である。
【図１０】図１０は、本発明の局面に従う、細胞を溶解および固定するためにメタノールに曝した後の、図９の細胞およびチャンバの別の写真である。
【図１１】図１１は、本発明の局面に従う、１）細胞を溶解および固定するためにメタノール、２）溶解した細胞を染色するためにトリパンブルー、および３）過剰なトリパンブルーを除去するために洗浄緩衝液、に曝した後の、図９の細胞およびチャンバのなお別の写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明の局面に従う、図８のシステムの二重バージョンに基づいて細胞−細胞連絡を測定するための微小流体システムの部分平面図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本発明の局面に従う、図１１Ａのシステムの別の実施形態の選択された部分の平面図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、本発明の局面に従う、微小流体システムにおいて使用され得る粒子捕捉チャンバの２次元アレイの平面図である。
【図１２】図１２は、本発明の局面に従う、２セットの粒子を並行して保持および灌流するための微小流体システム部分平面図である。
【図１３】図１３は、図１２のシステムの選択された部分の図であり、本発明の局面に従う、２つの隣接する保持チャンバに関する流体流および粒子運動のための経路を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の局面に従う、２つの粒子をチャネル内の間隔を空けた位置で保持し、その保持された粒子を異なる試薬で灌流するための微小流体システムの平面図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本発明の局面に従う、図１３Ａのシステムの選択された部分の平面図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、本発明の局面に従う、図１３Ａのシステムの別の実施形態の選択された部分の平面図である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、本発明の局面に従う、図１３Ａのシステムに従って構築されたチップを使用して、間隔を空けた処理メカニズムによって送達された緑色色素に曝している２つのビーズの写真である。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、本発明の局面に従う、間隔を空けた処理メカニズムによって送達された赤色色素および緑色色素に曝している間の、図１３Ｄの２つのビーズの別の写真である。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、本発明の局面に従う、間隔を空けた処理メカニズムによって送達された赤色色素および黄色色素に曝している間の、図１３Ｄの２つのビーズの別の写真である。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、本発明の局面に従う、図１３Ａのシステムに従って構築されたチップ中の別の保持位置で保持された、２つの細胞の写真である。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、本発明の局面に従う、間隔を空けた処理メカニズムによって送達された青色色素に曝している間の、図１３Ｇの２つの細胞の写真である。
【図１３Ｉ】図１３Ｉは、本発明の局面に従う、有機固定剤で細胞のうちの１つのみを処理している間の、図１３Ｇの２つの細胞の写真である。
【図１３Ｊ】図１３Ｊは、本発明の局面に従う、１つの細胞の固定の後、かつ間隔を空けた処理メカニズムによって送達された青色色素に曝している間の、図１３Ｉの２つの細胞の写真である。
【図１３Ｋ】図１３Ｋは、本発明の局面に従う、図１３Ａのシステムに従って構築されたチップを使用して、２つの保持位置で保持され、間隔を空けた処理メカニズムによって送達された蛍光色素および発色色素に個々に曝されたが、スペーサー緩衝液は使用していない、２つの蛍光ビーズの写真である。
【図１３Ｌ】図１３Ｌは、本発明の局面に従う、線形トラップアレイの別個にアドレス可能なセットを有する微小流体システムの部分平面図である。
【図１４】図１４は、本発明の局面に従う、一連の粒子のアレイを保持するため、およびこのアレイのメンバーを別個にかつ並行して灌流するための微小流体システムの平面図である。
【図１５】図１５は、図１４のシステムの選択された部分の平面図であり、本発明の局面に従う、保持された粒子を別個にかつ並行して処理するための流体層およびコントロール層ネットワークを示す。
【図１６】図１６は、図１４のシステムに由来する単一保持ネットワークの一部の平面図であり、本発明の局面に従う、流体流の選択された経路を例示する。
【図１７】図１７は、本発明の局面に従う、単一の粒子または粒子群のアレイを形成するための微少流体デバイスの部分平面図である。
【図１８】図１８は、別個の部位のアレイに移され得る保持された粒子のアレイを形成するための微少流体デバイスの１対の部分平面模式図であり、それぞれ左側および右側に、本発明の局面に従う、粒子保持構成および移動構成を示す。
【図１９】図１９は、別個のアレイに移され得る保持された粒子のアレイを形成するための別の微少流体デバイスの１対の部分平面模式図であり、それぞれ左側および右側に、本発明の局面に従う、粒子保持構成および移動構成を示す。
【図２０】図２０は、本発明の局面に従う、別個の部位のアレイに移され得る保持された粒子のアレイを形成するための、なお別の微少流体デバイスの部分平面模式図である。
【図２１】図２１は、本発明の局面に従う、システムの床から完全に間隔を空けられた粒子保持チャンバを使用して、粒子を保持するための微小流体システムの選択された部分を示す平面図および断面図の合成図である。
【図２２】図２２は、本発明の局面に従う、システムの床から部分的に間隔を空けられた粒子保持チャンバを使用して粒子を保持するための微小流体システムの選択された部分を示す、平面図および断面図、ならびに写真の複合図である。
【図２３】図２３は、本発明の局面に従う、システムの床から完全に間隔を空けられた粒子保持チャンバを使用して粒子を保持するための別の微小流体システムの選択された部分を示す、平面および断面図、ならびに２つの写真の複合図である。
【図２４】図２４は、本発明の局面に従う、単一の粒子の繰り返し保持、処理および放出のための、再使用可能微小流体システムの部分平面図である。
【図２５】図２５は、本発明の局面に従う、図２４のシステムの選択された部分、特に粒子放出メカニズムの図である。
【図２６】図２６は、本発明の局面に従う、粒子群の繰り返し保持、処理および放出のための、再使用可能微小流体システムの部分平面図である。
【図２７】図２７は、本発明の局面に従う、図２４および図２６のシステムの選択された部分、特に粒子収集メカニズムの図である。
【図２８】図２８は、本発明の局面に従う、粒子懸濁メカニズムを備えるインプットメカニズムの部分平面図である。
【図２９】図２は、本発明の局面に従う、隣接する希釈メカニズムの部分平面図である。
【図３０】図３０は、本発明の局面に従う、別の隣接する希釈メカニズムの部分平面図である。
【図３１】図３１は、本発明の局面に従う、遠心力に基づくソートメカニズムを有する微小流体システムの平面図である。
【図３２】図３２は、本発明の局面に従う、より詳細にソートメカニズムを示す図３１のシステムの部分図である。
【図３３】図３３は、本発明の局面に従う、遠心力に基づくソートメカニズムを有する別の微小流体システムの部分平面図である。
【図３４】図３４は、本発明の局面に従う、遠心力に基づくソートメカニズムを有するなお別の微小流体システムの部分平面図である。
【図３５】図３５は、より詳細にソートメカニズムを示す図３４のシステムの部分図である。
【図３６】図３６は、図３４および図３５のソートメカニズムにより分離されている蛍光ビーズおよび粒子の写真である。
【図３７】図３７は、図３４および図３５のシステムを用いたソートの間に、経時的に細胞：ビーズの比をブロットするグラフである。
【図３８】図３８は、図３１および図３２のシステムを用いたソートの間に、経時的に細胞：ビーズの比をブロットするグラフである。
【図３９】図３９は、本発明の局面に従う、細胞の微少流体操作のための種々の細胞−チャンバネットワークの平面複合図である。
【図４０】図４０は、本発明の局面に従う、細胞の微少流体操作のための種々の細胞−チャンバネットワークの平面複合図である。
【図４１】図４１は、本発明の局面に従う、細胞の微少流体操作のための種々の細胞−チャンバネットワークの平面複合図である。
【図４２】図４２は、本発明の局面に従う、細胞の微少流体操作のための種々の細胞−チャンバネットワークの平面複合図である。
【図４３】図４３は、本発明の局面に従う、細胞の微少流体操作のための種々の細胞−チャンバネットワークの平面複合図である。
【図４４】図４４は、本発明の局面に従う、別個の分離可能な細胞−チャンバネットワークの並行アレイを備える微小流体システムの平面図である。
【図４５】図４５は、本発明の局面に従う、並行流体回路により供給または迂回され得る分離可能な細胞チャンバを備える微小流体システムの平面図である。
【図４６】図４６は、本発明の局面に従う、ループを形成する細胞チャンバを有する微小流体システムの平面図である。
【図４７】図４７は、本発明の局面に従う、共通細胞チャンバで粒子および試薬ネットワークが横切る微小流体システムの平面図である。
【図４８】図４８は、図４７のシステムに従って製造されたチップの試薬ネットワークに含まれるサイズ選択チャネルを備えるフィルタリングメカニズムの写真である。
【図４９】図４９は、図４７のシステムに従って製造されたチップの試薬ネットワークに含まれるサイズ選択チャネルを備えるフィルタリングメカニズムの写真である。
【図５０】図５０は、図４７のシステムに従って製造されたチップの細胞チャンバ中で培養された細胞を示す２つの写真の合成図である。
【図５０Ａ】図５０Ａは、本発明の局面に従う、非直線的非対称流路に基づく、細胞チャンバ中に細胞をインプットするためのシステムの部分平面図である。
【図５０Ｂ】図５０Ｂは、図５０Ａのシステムの変形版の部分平面図であり、このシステムにおいて試薬は、本発明の局面に従って、細胞チャンバを通って再循環され得る。
【図５０Ｃ】図５０Ｃは、本発明の局面に従う、半径方向に並べられた、サイズ選択的チャネルのセットによって接続される２つの異なる区画を有する細胞チャンバの平面図である。
【図５０Ｄ】図５０Ｄは、本発明の局面に従う、２つの区画をより完全に相互連結するために改変された、図５０Ｃの細胞チャンバのバージョンの平面図である。
【図５１】図５１は、本発明の局面に従う、細胞のアレイに対して電気生理学的分析を行うための微小流体システムの同寸法の模式図である。
【図５２】図５２は、本発明の局面に従う、単一細胞に対して電気生理学的分析を行うための微小流体システムの平面図である。
【図５３】図５３は、図５２のシステムに関連する微小流体システムの部分平面図であり、本発明の局面に従う、改変集束メカニズムを示す。
【図５４】図５４は、本発明の局面に従う、保持された細胞を有する図５２のシステムの選択された部分の平面図である。
【図５５】図５５は、本発明の局面に従う、本発明の局面に従う、保持された細胞の灌流の間の、図５２のシステムの選択された部分の平面図である。
【図５６】図５６は、本発明の局面に従う、図５２のシステムの選択された部分の別の平面図である。
【図５７】図５７は、本発明の局面に従う、図５２のシステムの選択された部分のなお別の平面図である。
【図５８】図５８は、図５２のシステムに従って製造されたチップの一部の写真である。
【図５９】図５９は、本発明の局面に従う、胃細胞のパッチ−クランプ分析を行うための微少流体デバイスの抽象的な図である。
【図６０】図６０は、本発明の局面に従う、複数ある個々の細胞のパッチ−クランプ分析を行うための微少流体デバイスの部分平面図である。
【図６１】図６１は、分析される開口部(チャネル)の数および首尾良い読み取りを与える個々の開口部の割合の両方の関数として、電気生理学的読み取りを首尾良く得る確率９５％を示すグラフである。
【図６２】図６２は、本発明の局面に従う、パターン化可能で選択的に取り外し可能な材料の第１層でスピンコーティングされた微小流体型の部分側面図である。
【図６３】図６３は、本発明の局面に従う、第１層のパターン化された取り外しの後の、図６２の型の部分側面図である。
【図６４】図６４は、本発明の局面に従う、パターン化可能で選択的に取り外し可能な材料の第２層でスピンコーティングされた、図６３の型の部分側面図である。
【図６５】図６５は、本発明の局面に従う、第２層のパターン化された取り外しの後の、図６４の型の部分側面図である。
【図６６】図６６は、本発明の局面に従う、第２層の残りの部分を丸くするために高温で加熱した後の、図６５の型の部分側面図である。
【図６７】図６７は、本発明の局面に従う、パターン化可能な選択的に取り外し可能な材料の第３層でスピンコーティングされた図６６の型の部分側面図である。
【図６８】図６８は、本発明の局面に従う、第３層のパターン化された取り外しの後の、図６７の型の部分側面図である。
【図６９】図６９は、本発明の局面に従う、流体層膜の補足的表面特徴を成形するように作用する、図６８の型の部分側面図である。
【図７０】図７０は、本発明の局面に従う、１）図６２〜６８に示される方法を使用して形成される流体層型、および２）この流体層型から形成される対応する成形チップの合成写真である。
【図７１】図７１は、本発明の局面に従う、１）図６２〜６８に示される方法を使用して形成される流体層型、および２）この流体層型から部分的に形成される対応する成形チップの合成写真である。
【図７１Ａ】図７１Ａは、本発明の局面に従う、異なる光強度で励起されている発蛍光団についての蛍光発光 対 時間のグラフである。
【図７１Ｂ】図７１Ｂは、本発明の局面に従う、励起光源の変調および変調に基づいて検出されるシグナルの復調によって検出されるシグナルのシグナル−対−ノイズ比を増大するための方法の一実施形態の模式図である。
【図７１Ｃ】図７１Ｃは、本発明の局面に従う、微小流体システムにおける図７１Ｂの変調−復調方法の実施なし（上）およびあり（下）の、時間依存的に測定されたノイズおよび測定されたシグナル＋ノイズの一対のグラフである。
【図７１Ｄ】図７１Ｄは、本発明の局面に従う、微小流体システムにおけるストレプトアビジン色素結合体に、ビオチン化ビーズを曝すサイクルの前およびそのサイクルの間に測定された、蛍光強度対 時間のグラフである。
【図７１Ｅ】図７１Ｅは、本発明の局面に従う、微小流体システムにおいて図７１Ｂの方法を使用して、カルシウムセンサ色素を予備負荷された、保持された細胞にイオノマイシン（ionomcyin）を曝す前およびそのサイクルの間に測定された、蛍光強度対 時間のグラフである。
【図７１Ｆ】図７１Ｆは、本発明の局面に従う、色素に曝す前および曝す間に、微小流体システム内の位置で測定された蛍光強度 対 時間のグラフである。
【図７２】図７２は、本発明の局面に従う、微小流体システムを通る血球の、サイズ選択的流れを記録する写真の経時的セットである。
【図７３】図７３は、ビオチンの構造およびストレプトアビジンに結合するその様式を示す図である。
【図７４】図７４は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおけるビーズ上の特異的結合対の相互作用を記録する写真の経時的セットである。
【図７５】図７５は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおけるイオンフラックスの刺激を記録する写真の経時的セットである。
【図７６】図７６は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおけるアポトーシスおよび壊死を記録する写真の経時的セットである。
【図７７】図７７は、実施例２２の分析において使用した膜色素の構造およびこの色素に対する励起／発光スペクトルを示す図である。
【図７８】図７８は、実施例２２の分析において使用した膜色素の構造およびこの色素に対する励起／発光スペクトルを示す図である。
【図７９】図７９は、非微小流体環境における細胞膜の首尾良い染色を記録する写真である。
【図８０】図８０は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおける予め選択された部位での単一の細胞の保持を記録する写真の経時的セットである。
【図８１】図８１は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおける予め選択された部位での細胞群の保持を記録する写真の経時的セットである。
【図８２】図８２は、本発明の局面に従う、いくつかの細胞を既に保持している保持チャンバへの蛍光細胞のインプットを記録する写真の経時的セットである。
【図８３】図８３は、本発明の局面に従う、微小流体システムにおける保持された細胞の固定および染色を記録する写真の経時的セットである。
【図８４】図８４は、本発明の局面に従う、サイズ選択的細胞セットを分析するための微小流体システムの平面図であり、このシステムは、連続的に配置された濾過および保持メカニズム、灌流システム、ならびに流れベースの検出メカニズムを備える。
【図８５】図８５は、図８４の微小流体システムの別の平面図であり、本発明の局面に従う、レザバおよびバルブのための同定標識を示す。
【図８６】図８６は、図８４のシステムの選択された部分の平面図であり、本発明の局面に従う、濾過メカニズムを含む選択された局面を例示する。
【図８７】図８７は、本発明の局面に従う、図８４のシステムの選択された部分の別の平面図である。
【図８８】図８８は、本発明の局面に従う、図８４のシステムの選択された部分のなお別の平面図である。
【図８９】図８９は、異なる試薬または異なる試薬濃度のアレイに粒子を曝すための灌流デバイスの平面図である。
【図９０】図９０は、化学走性誘引物質に対する細胞の走化性応答を測定するために使用されているデバイスの平面図を示す。
【図９１】図９１は、化学走性誘引物質に対する細胞の走化性応答を測定するために使用されているデバイスの平面図を示す。
【図９２】図９２は、化学走性誘引物質に対する細胞の走化性応答を測定するために使用されているデバイスの平面図を示す。
【図９３】図９３は、化学走性誘引物質に対する細胞の走化性応答を測定するために使用されているデバイスの平面図を示す。
【図９４】図９４は、化学走性誘引物質に対する細胞の走化性応答を測定するために使用されているデバイスの平面図を示す。
【図９５】図９５は、関連したバルブシステムを備える灌流チャンバの拡大平面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（詳細な説明）
本発明は、粒子（例えば、細胞、ウイルス、オルガネラ、ビーズおよび／または小胞）の微小流体操作および／または分析のためのシステム（装置を含む）、方法およびキットを提供する。本発明はまた、これらの操作および分析を実施するための微小流体メカニズムを提供する。これらのメカニズムは、粒子のコントロールされたインプット、運動／位置づけ、保持／配置、処理、測定、放出、および／または排出を可能にし得る。さらに、これらのメカニズムは、任意の適切な順番で組み合わされるか、そして／またはシステム内で任意の適切な回数にわたって採用され得る。従って、これらの組み合わせは、単一の粒子、混合された粒子群、粒子のアレイ、不均質粒子セット、および／または均質粒子セットとして、とりわけ連続してそして／あるいは並行して、とりわけ、粒子のソート、培養、混合、処理、および／またはアッセイを可能にし得る。さらに、これらの組み合わせは、微小流体システムの再使用を可能にし得る。さらに、これらの組み合わせは、処理に対する粒子の応答を、以前に可能であったものより、より短い時間枠で測定することを可能にし得る。さらに、本発明のシステムは、細胞および粒子のアッセイの広い範囲（例えば、とりわけ、薬物スクリーニング、細胞特徴付け、研究、および／または臨床的分析）を、微小流体サイズに縮小することを可能にし得る。このように縮小されたアッセイは、類似の微小流体アッセイよりも、より少ないサンプルおよび試薬を使用し得、あまり労働集約的でなく、そして／またはより有益であり得る。
【００１０】
本発明のさらなる局面は、以下の節において記載されている：（Ｉ）微小流体システム、（ＩＩ）流体ネットワークの物理的構造、（ＩＩＩ）粒子、（ＩＶ）インプットメカニズム、（Ｖ）位置づけメカニズム、（ＶＩ）保持メカニズム、（ＶＩＩ）処理メカニズム、（ＶＩＩＩ）測定メカニズム、（ＩＸ）放出メカニズム、（Ｘ）排出メカニズム、（ＸＩ）細胞培養メカニズム、（ＸＩＩ）粒子ベースの操作、および（ＸＩＩＩ）実施例。
【００１１】
（微小流体システム）
（定義および概説）
粒子の操作および分析は、微小流体システムにおいて行われる。微小流体システムは、一般に、非常に少量の流体が保存および操作される（概して、約５００μｌ未満、代表的には、約１００μｌ未満、およびより代表的には、約１０μｌ未満）任意のシステムを含む。微小流体システムは、１以上の微小流体経路を通って予め規定された経路に流体を運ぶ。微小流体経路は、最小限の寸法、一般には、約２００、１００または５０μｌ未満の高さまたは幅を有し得る。経路は、以下の第ＩＩ節により詳細に記載される。
【００１２】
微小流体システムは、相互接続してほぼ閉鎖した微小流体ネットワークを形成する、１つ以上の組の通路を含み得る。そのような微小流体ネットワークは、ネットワーク端部またはネットワークの中間部に、外界と接続する１つ、２つまたはそれ以上のアパチャーを備え得る。そのようなアパチャーは、一般に、流体を受容し得、保持し得、そして／または分配し得る。流体の供給は、この微小流体ネットワーク中に直接であり得るか、またはこの微小流体システムの外部にある部位へであり得る。そのようなアパチャーは、下記第ＩＶ節および第Ｘ節においてより詳細に記載されるインプットメカニズムおよび／またはアウトプットメカニズムにおいて機能し、下記第ＩＩ節においてより詳細に記載されるレザバを備え得る。
【００１３】
微小流体システムはまた、流体、試薬、および／または粒子の操作または分析に寄与する他の任意の適切な特徴またはメカニズムを備え得る。例えば、微小流体システムは、流体の流速および／または経路の局面を決定する調節メカニズムまたはコントロールメカニズムを備え得る。そのような調節メカニズムに関与し得るバルブおよび／またはポンプは、下記第ＩＩ節においてより詳細に記載される。あるいは、またはさらに、微小流体システムは、流体温度、流体圧力、流体流速、光への曝露、電界への曝露、磁界強度などを、決定、調節、および／または検知するメカニズムを備え得る。従って、微小流体システムは、ヒーター、クーラー、電極、レンズ、格子、光源、圧力センサー、圧力トランスデューサー、マイクロプロセッサー、マイクロエレクトロンなどを備え得る。さらに、各微小流体システムは、所定のシステムを同定するためのコードとして作用する、１つ以上の特徴を備え得る。これらの特徴は、特徴的な位置、正体、および／または特性（例えば、光学特性）を有する、任意の検出可能な形状もしくはシンボル、または形状のセットまたはシンボルのセット（例えば、白黒バーコードまたは有色バーコード、言語、数など）を備え得る。
【００１４】
（材料）
微小流体システムは、任意の適切な材料または適切な材料の組合せから形成され得る。適切な材料としては、エラストマー（例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）；プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）；ガラス；セラミック；ゾル−ゲル；シリコンおよび／または他のメタロイド；金属または金属酸化物；生物学的ポリマー、混合物および／または粒子（例えば、タンパク質（ゼラチン、ポリリジン、血清アルブミン、コラーゲンなど）、核酸、微生物など）などが挙げられ得る。
【００１５】
微小流体システムについての例示的材料は、上記の相互参照の下に列挙される特許出願（これらは、本明細書中に参考として援用される）において、より詳細に記載される。
【００１６】
（製造方法）
微小流体システム（チップとも呼ばれる）は、任意の適切な構造を有し得る。そのようなシステムは、単一成分から単位構造としてか、または２つ以上の構成成分の多成分構造として、製造され得る。この２つ以上の構成成分は、任意の適切な相対空間的関係を有し得、そして任意の適切な結合メカニズムによって、互いに結合され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記成分のうちの２つ以上は、比較的薄い層（これは、向かい合わせに配置され得る）として製造され得る。この比較薄い層は、機能に基づいて、別個の厚さを有し得る。例えば、いくつかの層の厚さは、とりわけ、約１０〜２５０μｍ、２０〜２００μｍ、または約５０〜１５０μｍであり得る。他の層は、実質的にもっと厚いものであり得、いくつかの場合、これは、そのシステムに機械的強度を提供する。そのような他の層の厚さは、とりわけ、約０．２５〜２ｃｍ、０．４〜１．５ｃｍ、または０．５〜１ｃｍであり得る。１つ以上のさらなる層が、基材層として機能する実質的に平坦な層で有り得、いくつかの場合、これは、いくつかまたはすべての微小流体通路に対して床部分（ｆｌｏｏｒｐｏｒｔｉｏｎ）を与える。
【００１８】
微小流体システムの成分は、このシステムのために望ましい適用および製造において使用される材料に基づいて、任意の適切なメカニズムによって製造され得る。例えば、１つ以上の成分が、適切な型を使用して、成形、スタンピング（ｓｔａｍｐ）、および／またはエンボス加工され得る。そのような型は、とりわけ、微細加工、エッチング、ソフトリソグラフィー、材料配置（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、切断、および／またはパンチングによって、任意の適切な材料から形成され得る。あるいは、または、さらに、微小流体システムの成分は、エッチング、微細加工、切断、穿孔、および／または材料配置によって、型を用いずに製造され得る。
【００１９】
微小流体成分は、別個に製造され得、結合され得、そしてさらに適切なように改変され得る。例えば、別個の層として製造される場合、微小流体成分は、一般的には、向かい合わせて、結合され得る。これらの別個の成分は、例えば、反応性化学物質で表面処理されて、表面化学を、粒子結合剤、分析を容易にするための試薬などで改変され得る。そのような表面処理は、その表面の別個の部分に局在化され得るか、または比較的非局在的であり得る。いくつかの実施形態において、別個の層が、製造され得、その後、穿孔され、そして／または切断されて、さらなる表面構造が生成され得る。そのような穿孔および／または切断は、別個の成分が結合される前および／または後に実施され得る。
【００２０】
微小流体システムを製造するための例示的方法は、上記の相互参照において同定された特許出願においてより詳細に記載される。それらの特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【００２１】
（流体ネットワークの物理構造）
（概説）
微小流体システムは、少量の流体の統合した操作（流体、ならびに粒子アッセイにおける使用のためのその流体に関連する粒子の、移動および／または保持を含む）のための任意の適切な構造を備え得る。この構造としては、とりわけ、通路、レザバ、および／またはレギュレーターが挙げられる。
【００２２】
（通路）
通路は、一般には、その中、その上、またはそれに沿って、物質（例えば、流体、粒子、および／または試薬）が流体システムにおいて通過し得る、任意の適切な経路（ｐａｔｈ）、チャネル、またはダクトを包含する。まとめて、一般にはチャネルの形態の流体連絡している通路のセットが、微小流体ネットワークと呼ばれ得る。いくつかの場合において、通路は、床（ｆｌｏｏｒ）、天井（ｒｏｏｆ）、および壁を形成する表面を有するものとして記載され得る。通路は、任意の適切な寸法および外形（とりわけ、幅、高さ、長さ、および／または断面プロフィールが挙げられる）を有し得、そして任意の適切な経路（ｐａｔｈ）（とりわけ、直線形、環状、および／または曲線状を包含する）に従い得る。通路はまた、任意の適切な表面輪郭（凹部、凸部、および／またはアパチャーが挙げられる）を有し得、そしてチャネル内の任意の適切な位置にて任意の適切な表面化学または透過性を有し得る。適切な表面化学は、通路形成の前、その間、および／またはその後に、化学物質および／または試薬を添加することおよび／またはそれらによる処理による、表面改変を包含する。
【００２３】
いくつかの場合、通路（特に、チャネル）は、機能に従って記載され得る。例えば、通路は、特定の適用において物質の流れの方向、特定の参照構造に対する関係、および／または保有される物質の型に従って記載され得る。従って、通路は、インプット通路（またはチャネル）（これは、一般には、ある部位へ向かう物質を保有する）およびアウトプット通路（またはチャネル）（これは、一般には、ある部位から出る物質を保有する）であり得る。さらに、通路は、粒子通路（またはチャネル）、試薬通路（またはチャネル）、集束（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）通路（またはチャネル）、灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）通路（またはチャネル）、廃棄物（ｗａｓｔｅ）通路（またはチャネル）などと呼ばれ得る。
【００２４】
通路は、枝分かれ、結合、および／または行き止まりになって、任意の適切な微小流体ネットワークを形成し得る。従って、通路は、とりわけ、粒子の配置、選別、保持、処理、検出、伝播、保持、混合、および／または放出において機能し得る。
【００２５】
通路のさらなる局面は、この詳細な説明全体を通じて、および上記の相互参照にて同定される特許出願（これらは、本明細書中で参考として援用される）において、包含される。
【００２６】
（レザバ）
レザバは、一般には、処理操作（例えば、測定および／または処理）の前、処理操作期間、処理操作の間、および／または処理操作の後に、物質（例えば、流体、粒子、および／または試薬）を保持するための任意の適切な容器またはチャンバを含む。レザバ（ウェルとも呼ばれる）は、インプットレザバ、中間レザバ、および／またはアウトプットレザバを包含し得る。インプットレザバは、物質（例えば、流体、粒子、および／または試薬）をチップの微小流体ネットワーク部分へとインプットする前にその物質を保持し得る。対照的に、中間レザバは、処理操作期間および／または処理操作の間に、物質を保持し得る。最後に、アウトプットレザバは、チップから、例えば、外部プロセッサーまたは廃棄物へと出す前（すなわち、そのチップの廃棄前）に、物質を保持し得る。
【００２７】
レザバのさらなる局面が、上記の相互参照にて同定される特許出願（これらは、本明細書中で参考として援用される）において、包含される。
【００２８】
（レギュレーター）
レギュレーターは、一般には、物質（例えば、流体、粒子、および／または試薬）の移動を生成および／または調節するための任意の適切なメカニズムを包含する。適切なレギュレーターとしては、とりわけ、バルブ、ポンプ、および／または電極が挙げられ得る。レギュレーターは、流れを能動的に促進すること、および／または能動的流れもしくは受動的流れを制限することによって、作動し得る。レギュレーターによって媒介される適切な機能としては、流体ネットワークの混合、保持、結合（または分離）などが挙げられ得る。
【００２９】
レギュレーターのさらなる局面（特に、バルブおよびポンプの、構造、製造および操作）は、上記の相互参照にて同定される特許出願（これらは、本明細書中で参考として援用される）、および第ＸＩＩＩ節（特に実施例８）において、包含される。
【００３０】
（粒子）
（概説）
微小流体システムは、粒子を操作および／または分析するために使用され得る。粒子は、一般には、流体に関連している微小流体ネットワーク内にインプットされそして操作されるために充分に小さいが、その流体と区別可能であるために充分に大きい、任意の物質を包含する。粒子とは、本明細書中で使用される場合、代表的には、顕微鏡で見える程度またはほぼ顕微鏡で見える程度であり、直径約０．００５〜１００μｍ、０．１〜５０μｍ、または約０．５〜３０μｍを有し得る。あるいは、またはさらに、約１０−２０〜１０−５ｇ、１０−１６〜１０−７ｇ、または１０−１４〜１０−８ｇの質量を有し得る。例示的な粒子としては、細胞、ウイルス、オルガネラ、ビーズ、および／または小胞、ならびにそれらの凝集物（例えば、二量体、三量体など）が挙げられ得る。
【００３１】
（細胞）
（概説）
細胞とは、本明細書中で使用される場合、一般には、自己複製する膜結合型の任意の生物学的実体、またはその複製しない膜結合型の任意の子孫を包含する。複製しない子孫とは、老いた細胞、最終分化した細胞、細胞キメラ、血清枯渇細胞、感染細胞、非複製変異体、無核細胞などであり得る。
【００３２】
微小流体システムにおいて粒子として使用される細胞は、とりわけ、任意の適切な起源、遺伝的背景、健康状態、固定状態、膜透過性、事前処理、および／または集団純度を有し得る。細胞起源は、真核生物起源、原核生物期限、古細菌起源などで有り得、そして動物由来、植物由来、真菌由来、原生生物由来、細菌由来などであり得る。細胞は、野生型であり得；天然変異体、化学変異体、もしくはウイルス変異体で有り得；操作した変異体（例えば、トランスジェニックなどであり得る。さらに、細胞は、とりわけ、増殖中であり得、静止状態であり得、老化状態であり得、形質転換されており得、そして／または不死化されており得る。細胞は、固定されていても、そして／または固定されていなくてもよい。生きている固定細胞もしくは死んでいる固定細胞、または生きている非固定細胞もしくは死んでいる非固定細胞は、インタクトな膜を有し、そして／または鉄、標識、色素、リガンドなどの取込みを可能にするかまたは細胞内容物の放出を可能にするように透過処理／破壊された膜を有する。細胞は、微小流体システムへの導入の前に、任意の適切な処理工程によって、事前処理されており得る。そのような処理工程は、調節因子処理、トランスフェクション（感染、注入、粒子ボンバードメント、リポフェクション、共沈トランスフェクションなどを包含する）、アッセイ試薬（例えば、色素または標識）による処理などが挙げられ得る。さらに、細胞は、一般には、単細胞または非常に類似する細胞の小さいセットからのクローン集団として誘導された単一培養物であり得；任意の適切なメカニズム（例えば、親和性結合、ＦＡＣＳ、薬物選択など）によって事前選別され得；そして／または別個の細胞型の混合集団もしくは不均質集団であり得る。
【００３３】
（真核生物細胞）
真核生物細胞、すなわち、１つ以上の核を有する細胞、またはその無核誘導物は、任意の適切な供給源（初代細胞、樹立された細胞、および／または患者サンプルが挙げられ得る）から得られ得る。そのような細胞は、任意の細胞型または細胞型の混合物由来、任意の発生段階由来、および／または任意の遺伝的背景由来であり得る。さらに、真核生物細胞は、接着性であっても、そして／または非接着性であってもよい。そのような細胞は、任意の適切な真核生物（動物、植物、真菌、および／または原生生物が挙げられる）由来であり得る。
【００３４】
真核生物細胞は、動物（すなわち、脊椎動物または無脊椎動物）由来であり得る。脊椎動物としては、哺乳動物（すなわち、霊長類（例えば、ヒト、サル（ａｐｅ）、サル（ｍｏｎｋｅｙ）など）または非霊長類（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、有袋類、齧歯類など））が挙げられ得る。非哺乳動物脊椎動物としては、鳥類、爬虫類、魚類（例えば、マス、サケ、キンギョ、ゼブラフィッシュなど）および／または両生類（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ種のカエル、Ｒａｎａ種のカエルなど）が挙げられ得る。無脊椎動物としては、節足動物（例えば、蛛形動物、昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）など）軟体動物（例えば、二枚貝、巻貝など）、環形動物（例えば、ミミズなど）、棘皮動物（例えば、とりわけ、種々のヒトデ）、腔腸動物（例えば、クラゲ、サンゴなど）、海綿動物（海綿）、扁形動物（サナダムシ）、線形動物（扁虫）などが挙げられ得る。
【００３５】
真核生物細胞は、任意の適切な植物（例えば、とりわけ、単子葉類、双子葉類、裸子植物、被子植物、シダ類、蘚類、地衣、および／または藻類）由来であり得る。例示的な植物としては、穀物植物（例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、ジャガイモなど）、研究用植物（例えば、Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ、テーダマツなど）、園芸的に価値がある植物（観賞用ヤシ、バラなど）などが挙げられ得る。
【００３６】
真核生物細胞は、任意の適切な真菌（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ門、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ門、および／または酵母の成員が挙げられる）に由来し得る。例示的な真菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒａｌｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、マッシュルーム、パフボール、不完全菌、カビなどが挙げられ得る。
【００３７】
真核生物細胞は、任意の適切な原生生物（原生動物）（アメーバ、繊毛虫、鞭毛虫、球胞子虫、微胞子虫などが挙げられる）に由来し得る。例示的な原生生物としては、とりわけ、Ｇｉａｒｄｉａｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、および／またはＮ．ｆｏｗｌｅｒｉが挙げられ得る。
【００３８】
粒子は、初代（すなわち、生物または天然から直接採取しており、その後、インビトロで増殖していない）真核生物細胞を含み得る。例えば、その細胞は、患者サンプル（例えば、全血、充填赤血球（ｐａｃｋｅｄｃｅｌｌ）、白血球、尿、痰、糞便、粘液、髄液、腫瘍、罹患組織、骨髄、リンパ、精液、胸膜液、出生前サンプル、吸引液、生検、分離した組織、表皮細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、腎細胞、前立腺細胞、肝細胞、幹細胞、骨芽細胞など）から得られ得る。とりわけ、ヒトボランティア、ヒト集団の選択された成員、法医学的サンプル、動物供給源、植物供給源、および／または天然供給源（水、土壌、空気など）由来の同様のサンプルが、操作および／または分析され得る。
【００３９】
あるいは、またはさらに、粒子は、樹立された真核生物細胞を含み得る。そのような細胞は、任意の適切な処理（ウイルス感染、核酸トランスフェクション、化学処理、長期継代および選択、放射線曝露などが挙げられる）によって、不死化および／または形質転換され得る。そのような樹立された細胞は、種々の系統（例えば、とりわけ、神経芽細胞、ニューロン、線維芽細胞、筋芽細胞、筋管、軟骨芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、腎細胞、肝細胞、リンパ細胞、顆粒球、および／またはマクロファージ）を包含し得る。例示的な樹立された細胞株としては、Ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＶ−１、Ｃ２Ｃ１２、ＭＤＣＫ、ＰＣ１２、ＳＡＯＳ、ＨｅＬａ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＳＬ２などが挙げられ得る。
【００４０】
（原核生物細胞）
粒子は、原核生物細胞（すなわち、膜結合型オルガネラを欠く、自己複製する膜結合型微生物）またはその複製しない子孫であり得る。原核生物細胞は、任意の門（とりわけ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉａ、Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ、および／またはＸｅｎｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる）に由来し得る。そのような細菌は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、有害細菌、有益細菌、および／または病原性細菌であり得る。例示的な原核生物細胞としては、とりわけ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓおよび／またはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓが挙げられ得る。
【００４１】
（ウイルス）
ウイルスは、微小流体システムにおいて粒子として操作および／または分析され得る。ウイルスは、一般には、タンパク質および／または膜コートを含み、かつ宿主細胞なしでは複製不可能である、細胞（動物細胞、植物細胞、真菌細胞、原生生物細胞、および／または細菌細胞）の顕微鏡で見える程度／顕微鏡でも見えない程度の任意の寄生生物を包含する。ウイルスは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、ビリオン、ビロイド、プリオンなどを包含し得る。例示的なウイルスとしては、ＨＩＶ、ＲＳＶ、狂犬病ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ライノウイルス、バクテリオファージ、種々の疾患（ＣＪＤ（クロイツフェルト−ヤーコプ病、クールー、ＧＳＳ（ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群）、ＦＦＩ（致死性家族性不眠症）、アルパーズ症候群など）を引き起こすプリオンなどが挙げられ得る。
【００４２】
（オルガネラ）
オルガネラは、微小流体システムにおいて操作および／または分析され得る。オルガネラは、一般には、細胞の任意の粒子状構成成分を包含する。例えば、オルガネラとしては、核、ゴルジ装置、リソソーム、エンドソーム、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、小胞体、食胞、小胞、クロロプラストなどが挙げられ得る。
【００４３】
（ビーズ）
粒子アッセイは、ビーズを用いて実施され得る。ビーズは、一般には、製造された任意の適切な粒子を包含する。ビーズは、無機材料、または化学合成、酵素合成、および／もしくは生物合成された材料から、製造され得る。さらに、ビーズは、任意の適切な孔性を有し得、そして固体またはゲルとして形成され得る。適切なビーズ組成としては、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、デキストラン、ガラス、セラミック、ゾル−ゲル、エラストマー、シリコン、金属、および／またはバイオポリマー（タンパク質、核酸など）が挙げられ得る。ビーズは、任意の適切な粒子直径または粒子直径範囲を有し得る。従って、ビーズは、狭い直径範囲を有する実質的に均一な集団であり得るか、またはビーズは、広い直径範囲または２つ以上の別個の直径を有する不均質集団であり得る。
【００４４】
ビーズは、任意の適切な物質と結合され得る。それらの物質としては、とりわけ、化合物、ポリマー、複合体、混合物、ファージ、ウイルス、および／または細胞が挙げられ得る。例えば、ビーズは、特定の結合対の成員（第ＶＩ節を参照のこと）（例えば、レセプター）、リガンド、核酸、化合物ライブリーの成員などと結合され得る。ビーズは、いくつかの場合は別個の物質を保有する、別個のビーズの混合物であり得る。その別個のビーズは、任意の適切な局面（例えば、サイズ、形状、関連コード、および／またはそのビーズが保有する物質）が異なり得る。いくつかの実施形態において、その局面は、結合している物質を同定し得る。コードは、以下の第ＸＩＩ節においてさらに記載される。
【００４５】
（小胞）
粒子は、小胞であり得る。小胞は、一般的には、脂質エンベロープによって規定される任意の非細胞由来粒子を包含する。小胞は、そのエンベロープまたは内部部分中に任意の適切な構成成分を含み得る。適切な構成成分としては、とりわけ、化合物、ポリマー、複合体、混合物、凝集物、および／または粒子が挙げられ得る。例示的な化合物としては、タンパク質、ペプチド、小さい化合物、薬物候補、レセプター、核酸、リガンドなどが挙げられ得る。
【００４６】
（インプットメカニズム）
（概説）
微小流体システムは、その微小流体ネットワークと境界を接する、１つ以上のインプットメカニズムを備え得る。インプットメカニズムは、一般には、微小流体チップの微小流体ネットワークへと物質（例えば、粒子、流体、および／または試薬）をインプットするための任意の適切なメカニズム（選択的（すなわち、成分ごとの）メカニズムおよび／またはバルク（ｂｕｌｋ）メカニズムが挙げられる）を包含する。
【００４７】
（内部供給源／外部供給源）
このインプットメカニズムは、内部供給源（すなわち、微小流体チップ中に含まれるレザバ）からの物質および／または外部供給源（すなわち、そのチップとは離れている、すなわち、そのチップの外部にある、レザバ）からの物質を受容し得る。
【００４８】
内部供給源からの物質をインプットするインプットメカニズムは、その物質を保持および分配するために任意の適切な容器を使用し得る。適切な容器としては、チップ中に形成された間隙が挙げられ得る。そのような間隙は、そのチップの外側から、例えば、流体ネットワークとの流体連絡から延びる穴を通ってそのチップの外部表面（例えば、上部表面）へと直接接近可能であり得る。その容器は、その流体ネットワークの流体容量と比較して比較的大きい流体容量を有し得、その結果、その容器は、迅速には排出されない。例えば、その流体容量は、少なくとも約１、５、１０、２５、５０、または１００μＬであり得る。従って、物質は、望ましい場合には、標準的実験室装置（例えば、マイクロピペット、シリンジなど）を使用して、その容器中へと分配され得る。
【００４９】
外部供給源から物質をインプットするインプットメカニズムもまた、その物質を保存および分配するために任意の適切な容器およびメカニズムを使用し得る。しかし、その外部供給源が物質を流体ネットワークに直接インプットする場合、その外部供給源は、その流体ネットワークと、例えば、接触分配メカニズムおよび／または非接触分配メカニズムを使用して、有効に境界を接する必要があり得る。従って、外部供給源からのインプットメカニズムは、その流体ネットワーク中に正確に流体を導くためのキャピラリーまたは針を使用し得る。あるいは、またはさらに、外部供給源からのインプットメカニズムは、非接触分配メカニズム（例えば、スピッティング（ｓｐｉｔｔｉｎｇ））を使用し得、その非接触分配メカニズムは、インクジェットプリンターの作動と匹敵し得る。さらに、外部供給源からのインプットメカニズムは、粒子の弾道的推進力（例えば、遺伝子銃によって媒介される）を使用し得る。
【００５０】
（促進（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ）メカニズム）
微小流体システム中に物質をインプットすることは、任意の適切な促進メカニズムを使用して、促進および／または調節され得る。そのような促進メカニズムは、例えば、インプットレザバがアウトプットレザバよりも大きな流体の高さを有する場合に、重力流れを包含し得る。促進メカニズムはまた、物質を流体ネットワークへと押す陽圧（例えば、機械的圧力もしくは気体圧力、または遠心力）；流体をアウトプットメカニズムに向かって引き込むアウトプットメカニズムにおける陰圧；および／または流体ネットワーク内で作用する配置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）メカニズムを包含し得る。この配置メカニズムは、ポンプおよび／または動電（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）メカニズムを包含し得る。配置メカニズムは、以下の第Ｖ節においてさらに記載される。いくつかの実施形態において、この促進メカニズムは、例えば、実施例７に記載されるように、インプットする前に、粒子（例えば、細胞）を懸濁物中に維持するための懸濁メカニズムを包含し得る。
【００５１】
（配置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）メカニズム）
（概説）
微小流体システムは、１つ以上の配置メカニズムを備え得る。配置メカニズムは、一般には、インプット後にチップ上の選択された位置に、例えば、とりわけ、保持、増殖、処理、および／または測定のために、粒子を配置するための任意のメカニズムを包含する。配置メカニズムは、種々の様式で、例えば、その起源および／または操作原理（直接的および／または間接的、流体媒介性および／または非流体媒介性、外部および／または内部などが挙げられる）を反映するように分類され得るが、それに限定されない。これらの分類は、相互排除的ではない。従って、所定の配置メカニズムは、２つ以上の様式で粒子を配置し得る。電場は、粒子を、直接（例えば、電気泳動を介して）および間接的（例えば、電気浸透を介して）配置し得る。
【００５２】
この配置メカニズムは、粒子の位置を、長手方向および／または横方向に規定するように作用し得る。用語「長手方向位置」とは、微小流体チャネルの長軸および／またはこのチャネル内の流体流れストリームと平行であるかまたはそれに沿っている、位置を示す。対照的に、用語「横方向（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ）位置」とは、チャネルの長軸および／または関連する主要な流体流れストリームと、直交する位置を示す。長手方向位置および横方向位置は、曲線状チャネルにおいて「長軸」を「接線」と同等視することによって、局所的に規定され得る。
【００５３】
この配置メカニズムは、単独で、および／または組み合わせて、使用され得る。組合せて使用される場合、これらのメカニズムは、連続的（ｓｅｒｉａｌｌｙ）（すなわち、逐次的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ））および／または並列して（すなわち、同時）に、使用され得る。例えば、間接的メカニズム（例えば、流体流れ）が、大雑把な配置のために使用され得、そして直接的メカニズム（例えば、光ピンセット）が、最終的配置（および／または本明細書中の他の場所に記載されるような、その後の保持）のために使用され得る。
【００５４】
この節の残りは、直接的メカニズムおよび間接的メカニズムとして大雑把に選別された、種々の例示的配置メカニズムを、限定することなく記載する。
【００５５】
（直接的配置メカニズム）
直接的配置メカニズムは、一般には、微小流体ネットワーク内に粒子を配置するようにその粒子に対して直接力が作用する、任意のメカニズムを包含する。直接的配置メカニズムは、任意の適切なメカニズム（とりわけ、光ベースの力、電気ベースの力、磁気ベースの力、および／または重力ベースの力が挙げられる）に基づき得る。光学的配置メカニズムは、粒子の配置を媒介するかまたは少なくとも促進するために、光を使用する。適切な光配置メカニズムとしては、「光ピンセット」が挙げられ、これは、適切に集束された移動可能な光源を使用して、粒子に対して配置力を付与する。電気的配置メカニズムは、粒子を配置するために電気を使用する。適切な電気的メカニズムとしては、「エレクトロキネシス（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）」が挙げられ、これはすなわち、微小流体ネットワークのうちのいくらかまたはすべてを通る電圧および／または電流の印加であり、これは、上記のように、荷電した粒子を、直接（例えば、電気泳動を介する）および／または流体におけるイオンの移動を介して間接的に（例えば、電気浸透を介する）移動させ得る。磁気的配置メカニズムは、磁気的相互作用に基づいて、粒子を配置するために磁気を使用する。適切な磁気的メカニズムは、流体ネットワーク中または流体ネットワーク周囲に磁界を印加して、その粒子中または粒子の周囲にある強磁性物質および／または常磁性物質とその磁界との関係を介して、粒子を配置することを包含する。重力ベースの配置メカニズムは、粒子を配置して、例えば、接着細胞を細胞培養物の位置にて基材と接触させるために、重力を使用する。
【００５６】
（間接的配置メカニズム）
間接的配置メカニズムは、一般的には、粒子に対して間接的に、例えば流体を介して力が作用して、微小流体ネットワーク内にあるその粒子を、長手方向および／または横方向に移動させる、任意のメカニズムを包含する。
【００５７】
（長手方向間接的配置メカニズム）
長手方向間接的配置メカニズムは、一般的には、チャネルおよび／または他の通路に沿った流体流れによって、生成および／または調節され得る。従って、長手方向配置メカニズムは、流速および／または通路を調節するバルブおよび／またはポンプによって、促進および／または調節され得る。いくつかの場合、長手方向配置メカニズムは、電気浸透配置メカニズムによって、促進および／または調節され得る。あるいは、またはさらに、長手方向配置メカニズムは、インプットベースであり得る（すなわち、インプットメカニズム（例えば、圧力ベースのメカニズムまたは重力ベースのメカニズム（流体柱の等しくない高さによって生じる圧力水頭を含む））によって促進および／または調節され得る）。
【００５８】
（横方向間接的配置メカニズム）
横方向間接的配置メカニズムは、一般的に、チャネル連結部、減少した流体フローの外側に配置された領域、および／またはチャネル湾曲部において、流体フローストリームによって生成および／またはコントロールされ得る。チャネル連結部は、一体化部位または分岐部位であり得、これは、流体をこれらの部位から輸送するチャネルの数に対する、これらの部位へ流体を輸送するチャネルの数に基づく。横方向間接的配置メカニズムは、とりわけ、層流、確率的分離、および／または遠心力に基づき得る。
【００５９】
（層流ベースの横方向配置メカニズム）
微小流体システム中の粒子および／または試薬の横方向の配置は、少なくとも部分的に、層流ベースのメカニズムによって媒介され得る。層流ベースのメカニズムは、一般的に、任意の配置メカニズムを含み、ここで、チャネル内の注入フローストリームの位置は、このチャネル内のさらなるフローストリームの存在、非存在および／または相対位置によって決定される。このような層流ベースのメカニズムは、一体化部位であるチャネル連結部によって規定され得、この部位において、２つ、３つまたはそれ以上のチャネルからの、この連結部に向かって流れる注入フローストリームは、一体化して、この連結部から流れるより少数（好ましくは１つ）の流出フローストリームを形成する。微小流体スケールにおけるフローストリームの層流特性に起因して、この一体化部位は、相乗流出フローストリームとして一体化した後に、注入フローストリームの相対分布を維持し得る。従って、粒子および／または試薬は、任意の選択された１つ以上の層流ストリームに局在化されたままであり得、このことに基づいて、注入チャネルは粒子および／または試薬を輸送し、従って、これらの粒子および／または試薬を横方向に配置する。
【００６０】
各注入フローストリームの相対サイズ（または流速）および位置は、粒子および／または試薬を輸送するフローストリームの横位および相対幅の両方を決定し得る。例えば、比較的小さく（狭く）、２つの大きい（幅広い）フローストリームが隣接している粒子／試薬のための注入フローストリームは、１つの流出チャネル中の狭い中心位置を占め得る。反対に、比較的大きく（幅広く）、匹敵するサイズのフローストリームおよび小さな（狭い）フローストリームが隣接した、粒子／試薬のための注入フローストリームは、より小さなフローストリームに向かって横方向に付勢されたより幅広い位置を占め得る。いずれの場合においても、層流ベースのメカニズムは、集束メカニズムと呼ばれ得る。なぜなら、粒子／試薬は、流出チャネルの断面領域のサブセットに「集束」されるからである。層流ベースのメカニズムは、粒子および／または試薬を複数の異なる保持部位に個々にアドレスするために使用され得る。例示的な層流ベースの配置メカニズムは、以下で、とりわけ実施例２〜４、７、９、１１および２６でさらに記載される。
【００６１】
層流ベースのメカニズムは、粒子／試薬の横位を変化させる種々のメカニズムであり得る。上記のように、各注入ストリームの相対的な寄与は、粒子／試薬のフローストリームの横位を決定し得る。任意の注入フローストリームの変更されたフローは、流出フローストリームに対するその寄与を変更し得、その結果、粒子／試薬のフローストリームをシフトさせる。極端な場合（灌流メカニズムと称される）において、試薬（または粒子）のフローストリームは、隣接する注入フローストリームからのフローの存在または非存在に基づいて、保持された粒子（試薬）と接触して、またはこの粒子（試薬）から離れてのいずれかで、横方向に移動し得る。このようなメカニズムはまた、粒子の可変またはコントロールされた横方向の配置を行い、例えば、粒子を異なる横位を有する保持部位に方向付け得る。例示的な可変またはコントロールされた横方向配置メカニズム（灌流メカニズムと称される）は、以下に、とりわけ、実施例２〜４、６、７、１１および２６にさらに記載される。
【００６２】
（確率的横方向配置メカニズム）
微小流体システムにおける粒子および／または試薬の横方向配置は、少なくとも部分的に、確率的（または、分配フロー）配置メカニズムによって媒介され得る。確率的横方向配置メカニズムは、一般に、任意の配置メカニズムを含み、ここで、共有された粒子または試薬の少なくとも部分的にランダムに選択されたサブセットは、主要フローストリームからチャネル内の減少した流体フローの領域まで（または、潜在的に、異なるチャネル）横方向に分配される。減少したフローの領域は、粒子の保持、処理、検出を促進し、粒子の損傷を最小限にし、そして／または粒子と基材との接触を促進し得る。確率的配置メカニズムは、とりわけ、フロー部位および／または局所的に幅広いチャネルを分けることによって決定され得る。
【００６３】
分岐フロー部位は、流体の減少した流速の形成による確率的配置を果たし得る。分岐フロー部位は、一般に、任意のチャネル連結部を含み、ここで、１つ（好ましい）またはそれ以上の注入チャネルからの注入フローストリームが、より多数（２、３またはそれ以上）の流出チャネルに分岐される。このような分岐部位は、粒子のサブセット（これは統計的におよび／または粒子の特性（例えば、質量）に基づいて選択され得る）を、この連結部または連結部付近で形成される減少した流速の領域または半停滞フローの領域に送達し得る。このサブセットによって表される粒子のフラクションは、注入チャネルに対する流出チャネルの相対フロー方向に基づき得る。これらのフロー方向は、一般に、反対方向に方向つけられている注入フローストリームに対してほぼ直角であり得、「Ｔ連結部」を形成する。あるいは、流出フロー方向は、９０°未満および／または９０°より大きい角度を形成し得る。例示的な減少した速度の分岐フロー配置メカニズムは、以下に、とりわけ、実施例１、２、３、４、６、７および２６でさらに記載される。
【００６４】
２つ以上の流出チャネルを有する分岐フロー配置メカニズムは、分配フローメカニズムとして使用され得る。詳細には、チャネル連結部に輸送される流体、粒子および／または試薬は、２つ以上の流出チャネルを通って、流体フローに従って分配される。従って、２つ以上のチャネルに入る粒子および試薬の画分数または容量は、チャネルの相対サイズおよび／またはチャネルを通る流体の流速によってコントロールされ得、これは対で、バルブ、または他の適切なフローコントロールメカニズムによってコントロールされ得る。第１セットの実施形態において、流出チャネルは、非常に不規則なサイズであり得、その結果、少量の粒子および／または試薬しかより小さいチャネルに方向付けられない。第２のセットの実施形態において、所望の試薬の希釈物を形成するために、バルブが使用され得る。第３セットの実施形態において、粒子を２つ以上の流体パスの１つに選択的に方向付けるために、バルブが使用され得る。これらの３セットの実施形態の例は、以下で、とりわけ、実施例、１１、８および７でさらに記載される。
【００６５】
局所的に幅広いチャネルは、主要フローストリームに対して側方の減少した流速の領域を生成することによって、確率的配置を促進し得る。減少した流速は、減少した流速の領域において、供給された粒子のサブセットを堆積させ得る。このような幅広のチャネルは、ある角度で湾曲または曲がった非線形チャネルを含み得る。あるいは、またはさらに、幅広の領域は、チャネル壁、チャネルと交差するチャンバなど、特に、湾曲したかまたは曲がったチャネルの外縁部に形成された凹部によって形成され得る。例示的な局所的に幅広のチャネル（これは、確率的横方向配置を促進する）は、実施例１０にさらに記載される。
【００６６】
（遠心力ベースの横方向配置メカニズム）
粒子および／または試薬の横方向配置はまた、遠心配置メカニズムによって少なくとも部分的に媒介され得る。遠心配置メカニズムにおいて、粒子は、例えば、流体パス中の屈曲部を通って移動することによる速度の変化によって決定される遠心力を受ける。粒子のサイズおよび／または密度は、速度変化の速さを決定し得、異なるサイズおよび／または密度の粒子を異なる横位に分配する。例示的な遠心配置メカニズムは、以下の実施例９でさらに記載される。
【００６７】
（保持メカニズム）
（概説）
微小流体システムは、１つ以上の保持メカニズムを含み得る。保持メカニズムは、一般に、粒子を、微小流体ネットワークのあらかじめ選択された位置または領域に保持（または、維持、捕獲、またはトラップ）して、連続しておよび／または並行して作動するための任意の適切なメカニズム（単一または複数のメカニズムを含む）を含む。保持メカニズムは、流体フローによって及ぼされる配置力を超えるように作用し得る。さらに、保持メカニズム（捕獲メカニズムまたはトラップメカニズムとも称される）は、任意の適切な数の粒子（単一の粒子または粒子の群／集団を含む）を保持し得る。適切な保持メカニズムは、とりわけ、フローと関連した物理的バリア、化学的相互作用、真空力、ループ中の流体フロー、重力、遠心力、磁力、電力、および／または必要に応じて発生された力に基づき得る。
【００６８】
保持メカニズムは、選択的であっても非選択的であってもよい。選択的メカニズムは、部分的に選択的であり得、すなわち、供給された粒子のすべてより少ないもの（サブセット）を保持する。部分選択的メカニズムは、少なくとも部分的に、確率的配置メカニズム（例えば、実施例２で例示されるもの）に依存し得る。あるいは、またはさらに、選択的メカニズムは、粒子依存性であり、すなわち、供給された粒子の１つ以上の特性（例えば、サイズ、表面化学、密度、磁気特性、電荷、光学特性（例えば、反射率）など）に基づいて粒子を保持する。
【００６９】
（物理的バリアベースの保持メカニズム）
保持メカニズムは、少なくとも部分的に、微小流体ネットワークに配置された任意の適切な物理的バリアと接触した粒子に基づき得る。このような粒子−バリアの接触は、一般に、流体フローの方向に沿った長手軸方向の粒子の運動を制限し、フロー補助型制限を生じる。フロー補助型粒子−バリア接触はまた、側面から側面／垂直（横方向）の運動を制限し得る。適切な物理的バリアは、チャネルの任およびの部分または他の通路（例えば、壁、天井および／または床）から内向きに伸びる突出部によって形成され得る。例えば、これらの突出部は、固定され得、そして／または可動であり、これには、とりわけ、カラム、ポスト、ブロック、バンプ、壁および／または部分的／完全に閉じられたバルブが挙げられる。いくつかの物理的バリア（例えば、バルブ）は、移動または調節可能である。あるいは、またはさらに、物理学的バリアは、チャネルまたは他の通路中に形成される凹部、または流体透過性部材によって規定され得る。他の物理的バリアはが、通路断面寸法に基づいて形成され得る。例えば、サイズ選択的チャネルは、チャネルに入るには大きすぎる粒子を保持し得る（サイズ選択的チャネルはまた、フィルターチャネル、マイクロチャネル、または粒子制限チャネルもしくは粒子選択的チャネルとも称される）。
【００７０】
物理学的バリアおよびサイズ選択的チャネルのさらなる局面は、以下の第ＸＩＩＩ章、相互参照に記載の特許出願（これらは本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００７１】
（化学的保持メカニズム）
化学的保持メカニズムは、化学的相互作用に基づいて粒子を保持し得る。この化学的相互作用は、共有結合的および／または非供給結合的相互作用であり得、とりわけ、イオン的相互作用、静電的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用および／または金属配位相互作用を含む。化学的相互作用は、選択的および／または非選択的に粒子を保持し得る。選択的または非選択的な保持は、粒子と通路表面との間の特異的および／または非特異的な化学的相互作用に基づき得る。
【００７２】
化学的相互作用は、特異的であり得る。特異的メカニズムは、例えば、それぞれ、粒子および通路表面に配置された第１および第２のＳＢＰメンバーとの特異的結合対（ＳＢＰ）を使用し得る。例示的なＳＢＰは、ビオチン／アビジン、抗体／抗原、レクチン／糖などを含み得る。これらおよびさらなる例示的なＳＢＰは、以下の表１に列挙され、ここで第１および第２の表示は任意である。ＳＢＰメンバーは、ネットワークの形成の前、間および／または後に、微小流体ネットワーク内に局所的に配置され得る。例えば、基材および／または流体層構成要素の表面は、この基材および流体層構成要素が連結される前に、ＳＢＰメンバーを接着／結合することによって、局所的に改変され得る。あるいは、またはさらに、ＳＢＰメンバーは、例えば、ＳＢＰメンバーとネットワークとの局所的化学反応（例えば、光の局所的照射によって触媒される）によってネットワークが形成された後に、微小流体ネットワークの一部と局所的に会合し得る。
【００７３】
（表１．代表的な特異的結合対）
【００７４】
【表１】
2010042020.tif 000002
化学的相互作用はまた、比較的非特異的であり得る。非特異的相互作用メカニズムは、微小流体ネットワークの表面化学の局所的差異に基づき得る。このような局所的差異は、上記のように、通路／微小流体ネットワークの形成の前、間および／または後に生じ得る。局所的差異は、局在化した化学反応から生じて、例えば、疎水性領域または親水性領域、および／あるいは材料の局在化結合を生じ得る。結合材料としては、とりわけ、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリエチレンイミン、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブリリン、エラスチン、ヘパリン、硫酸ケラタン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸および／または細胞外マトリクス抽出物／混合物が挙げられ得る。
【００７５】
（他の保持メカニズム）
他の保持メカニズムが、物理的バリアベースの保持および／または化学的相互作用ベースの保持の代替として、またはこれらに加えて使用され得る。これらのメカニズムおよび／または上記のメカニズムのいくつかまたは全ては、少なくとも部分的に、粒子と通路との間の摩擦に依存して、保持を補助し得る。
【００７６】
保持メカニズムは、真空力、流体フローおよびまたは重力に基づき得る。真空ベースの保持メカニズムは、例えば、チャネルから外向きに方向付けられた力を使用して、粒子を通路表面と密に接触するように引っ張る力を及ぼし得る。真空の適用および／または粒子の保持は、チャネルまたは他の通路の壁における開口部／オリフィスによって補助され得る。対照的に、流体フローベースの保持メカニズムは、ループのような流体フローパス（これが粒子を保持する）を生成し得る。これらの流体フローパスは、出口を有さない閉鎖チャネル回路によって（例えば、バルブの閉鎖および能動的ポンピングによって）、またはエディー（例えば、凹部内のほぼ円形の流体フローによって生成されるもの）によって形成され得る。重量ベースの保持メカニズムは、通路の底面に対して粒子を保持し得、従って、摩擦と一緒になって粒子の運動を制限する。重力ベースの保持は、凹部および／または減少した流体の流速によって促進され得る。さらに、真空ベースの保持メカニズムおよび流体フローベースの保持メカニズムは、それぞれ、以下の実施例１１および１２、ならびに実施例１０に記載される。
【００７７】
保持メカニズムは、遠心力、磁力、および／または光学的に生成された力に基づき得る。遠心力に基づく保持メカニズムは、粒子を通路表面に対して押すことによって、代表的には、流体フローに対してほぼ垂直の力を粒子に与えることによって、粒子を保持し得る。このような力は、微小流体チップの遠心分離によって、および／または流体フローパス内の粒子の移動によって及ぼされ得る（実施例９を参照のこと）。磁力ベースの保持メカニズムは、微小流体システムの外部および／または内部で生成した磁場を使用して粒子を保持し得る。この磁場は、粒子の強磁性部分および／または常磁性部分と相互作用し得る。例えば、ビーズが、少なくとも部分的に強磁性材料から形成され得るか、またはセルが、表面結合粒子または内在強磁性粒子を含み得る。電力ベースの保持メカニズムは、電場を使用して荷電した粒子および／または集団を保持し得る。対照的に、光学的に生成された力に基づいて作動する保持メカニズムは、粒子を保持するために光を使用し得る。このようなメカニズムは、とりわけ、光学ピンセットの原理に基づいて作動し得る。
【００７８】
別の形態の保持メカニズムは、ブラインド充填（ｂｌｉｎｄ−ｆｉｌｌ）チャネルであり、ここでチャネルは、入り口を有するが、出口を有さず、固定されているかまたは一時的であるかのいずれかである。例えば、微小流体デバイスが、気体透過性材料（例えば、ＰＤＭＳ）から作製される場合、行き止まりチャネル中に存在する気体は漏れるか、または入り口を通る流体の流入によって外に出される場合、この気体透過性材料を通ってチャネルから押し出される。これはブラインド充填の好ましい例である。ブラインド充填は、入り口およびゲート付きかもしくはバルブにより調節される出口を有するチャネルまたはチャンバと共に使用され得る。この例において、気体を充填したチャネルまたはチャンバのブラインド充填は、このチャネルまたはチャンバを入り口を介して充填しつつ、出口バルブが閉鎖される場合に生じる。入り口もまた、バルブを有する場合、このバルブは、ブラインド充填が完了した後に閉鎖され得、そして出口が開かれて、このチャネルまたはチャンバの内容物を別のチャネルまたはチャンバに暴露し得る。第３の入り口がチャネルまたはチャンバと連絡している場合、この第３の入り口は、別の流体、気体または液体をチャネルまたはチャンバに導入して、このチャネルまたはチャンバから追い出すべきブラインド充填液体を、測定量追い出し得る。結果は、ＨＰＬＣのサンプルループシステムと類似している。
【００７９】
保持メカニズムのさらなる局面は、第Ｖ章および第ＸＩＩＩ章に記載される。
【００８０】
（処理メカニズム）
（概説）
処理メカニズムは一般に粒子を試薬および／または物理的条件に暴露するための任意の適切なメカニズム（流体媒介メカニズムおよび非流体媒介メカニズム）を含む。
【００８１】
（試薬）
粒子は、試薬に暴露され得る。試薬は一般に、とりわけ、任意の化学物質、化合物、イオン、ポリマー、材料、複合体、混合物、凝集物、および／または生物学的粒子を含み、これは微小流体システム中の粒子または粒子集団と接触する。試薬は、粒子分析（化学的／生物学的変調器（相互作用試薬）、検出／アッセイ試薬、溶媒、緩衝液、媒体、洗浄溶液などとしての作用を含む）において役割を果たし得る。
【００８２】
化学的変調器または生物学的変調器は、粒子との相互作用について試験される任意の試薬を含み得る。相互作用としては、一般に、粒子への特異的結合、ならびに／または粒子（または変調器）に対する検出可能な遺伝子効果および／もしくは表現型効果が挙げられ得る。適切な相互作用および／または遺伝子／表現型効果のさらなる局面は、以下の第ＸＩＩ章に記載される。
【００８３】
化学的変調器としては、レセプターと相互作用するリガンド（例えば、アンタゴニスト、アゴニスト、ホルモンなど）が挙げられ得る。リガンドは、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、脂質などであり得る。リガンドおよびレセプターのさらなる局面、ならびに相互作用を測定する際のそれらの使用、またはシグナル伝達経路に対する効果は、以下の第ＸＩＩ章に記載される。
【００８４】
あるいは、またはさらに、化学的変調器は核酸であり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、改変された核酸、および／またはそれらの混合物であり得、そして一本鎖、二本鎖および／または三本鎖であり得る。核酸は、化学合成、酵素的合成、および／または生合成によって生成され得、そしてプラスミド、フラグメント、センス／アンチセンス発現ベクター、レポーター遺伝子、ゲノムの組込み／改変（例えば、核酸／ベクターの標的化（ノックアウト／ダウン／インについて））のためのベクター、ウイルスベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ヌクレオザイムなどであり得る。核酸試薬としてはまた、細胞による核酸の取り込みを促進するトランスフェクション試薬、例えば、脂質試薬（例えば、リポフェクタミン）、沈殿物形成剤（例えば、リン酸カルシウム）、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、核酸をパッケージングするウイルス被覆などが挙げられ得る。
【００８５】
変調器は、種々雑多の化学物質および／または生物学的実態であり得る。種々雑多の化学的変調器は、イオン（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、水素（ｐＨ）、塩化物、フッ化物、ヨウ化物など）、溶解気体（ＮＯ、ＣＯ２、Ｏ２など）、糖、脂質、有機物、ポリマーなどであり得る。いくつかの実施形態において、生物学的変調器は、細胞に暴露されて、例えば、細胞を感染し得、細胞−細胞相互作用を測定し得るなどする。生物学的変調器としては、上記の第ＩＩＩ章に記載されるように、任意の細胞、ウイルス、またはオルガネラが挙げられ得る。
【００８６】
試薬は、検出／アッセイ試薬であり得る。検出／アッセイ試薬は一般に、任意の試薬を含み、これは粒子と接触して、粒子（または成分）のあらかじめ存在するかまたは新たに作成された局面の検出のために、粒子（または粒子成分）の処理を促進する。検出／アッセイ試薬としては、とりわけ、色素、酵素、基質、補因子、および／またはＳＢＰメンバーが挙げられ得る（上記の表１および第ＶＩ章を参照のこと）。色素（標識とも称される）としては、一般に、任意の工学的に検出可能な試薬が挙げられる。適切な色素は、発光団、蛍光団、色素原、発色団などが挙げられる。適切な色素は、ＳＢＰメンバーに結合体化され得るか、またはＳＢＰメンバーであり得；酵素基質として作用し得；細胞または細胞構造（例えば、ＤＮＡ色素、膜色素、輸送色素など）を固有に標識し得；インジケータ色素（例えば、カルシウムインジケータ、ｐＨインジケータなど）として作用し得るなどである。酵素は、色素を生成物に組み込むことによって、および／またはとりわけ、後に色素を用いて検出され得る生成物を生成することによって、粒子アッセイにおいて作用し得る。適切な酵素としては、とりわけ、ポリメラーゼ（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、ＶＥＮＴなど）、ペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、キナーゼ、メチラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ（例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼなど）、トランスフェラーゼ（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、オキシドレダクターゼ（例えば、ルシフェラーゼ）、および／またはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅなど）が挙げられ得る。ＳＢＰメンバー（例えば、抗体、ジゴキシゲニン、核酸など）は、色素、酵素、および／または他のＳＢＰメンバーに直接結合体化され得；色素および／または酵素（予め結合されるかまたはさらなる暴露工程で結合される）に非共有結合され得るなどである。検出／アッセイ試薬のさらなる局面（これらの試薬が使用され得るタイプのアッセイを含む）は、以下の第ＸＩＩ章に記載される。
【００８７】
（流体媒介メカニズム）
処理メカニズムは、粒子を試薬に暴露する流体媒介メカニズムを使用し得る。例えば、粒子が保持される場合、試薬が粒子と接触され得るか、または例えば、試薬が流体ネットワークの特定の部分に存在する（必要に応じて保持される）場合、粒子が試薬に接触され得る。
【００８８】
流体媒介メカニズムは、とりわけ、フローベース、場ベース、および受動的であり得る。フローベースの処理メカニズムは、例えば、重力フローまたは能動的フロー（ポンピング）によって媒介される流体フローによって作動されて、試薬を粒子に（またはその逆も可）輸送し得る。いくつかの実施形態において、フローベースの処理メカニズムは、上記／下記の第Ｖ章および第ＸＩＩＩ章に記載されるように、コントロールされた横方向（側面から側面）の配置によって作動して、試薬（または粒子）の粒子（または試薬）への暴露を正確にコントロールし得る。対照的に、場ベースのメカニズムは、電場で試薬（または粒子）を移動させることによって、粒子と試薬を合わせ得る。電場はまた、任意の適切な動電学的効果（例えば、電気泳動、誘電泳動、電気浸透など）を生じ得る。あるいは、またはさらに、試薬は、この試薬の拡散によって粒子と合わされ得る。
【００８９】
（非フロー媒介メカニズム）
微小流体システム中の粒子は、非流体媒介メカニズムを使用して物理的変調器／条件に暴露され得る。しかし、これらの「非流体媒介」メカニズムは、それらの作動を補助する（例えば、熱エネルギーまたは圧力を流体を介して粒子に伝達する）ために流体の性質を使用する。物理的変調器／条件は、微小流体システムの外部および／または内部の供給源からの粒子に適用され得る。例示的な物理的変調器／条件としては、熱エネルギー（熱）、放射線（光）、放射線（粒子）、電場、磁場、圧力（音を含む）、重力場などが挙げられる。
【００９０】
（処理標的）
処理メカニズムは、任意の適切な粒子（例えば、上記の第ＩＩＩ章に記載される粒子のいずれかを含む）に対して作用し得る。この粒子は、インタクトであり、透過され、そして／または溶解され得る。従って、処理メカニズムは、解放された細胞成分に対して作用し得る。粒子は、アレイ中で、例えば、共通処理メカニズムを使用して連続的に、ならびに／または、例えば、異なるおよび／もしくは共通の処理メカニズムを使用して並行して、処理され得る。
【００９１】
処理メカニズムのさらなる局面は、上記の第Ｖ章（試薬／流体／粒子の配置）および以下の第ＸＩＩＩ章に記載される。
【００９２】
（測定メカニズム）
（概説）
微小流体システムによって製造される粒子は、１つ以上の測定部位において１つ以上の測定メカニズムによって分析され得る。この分析メカニズムは、一般的に、あらかじめ選択された粒子または粒子の特性（例えば、とりわけ、粒子、粒子成分および／またはアッセイ産物によって提供される）を検出するための任意の適切な装置または方法を含む。これらの測定部位は、一般に、測定が実施され、システムの内部および／または外部である、任意の適切な粒子位置（単数または複数）を含む。
【００９３】
（検出方法）
測定メカニズムは、サンプルを定性的および／または定量的に分析するための任意の適切な検出方法を用い得る。適切な検出方法としては、とりわけ、分光法、電気的方法、水力学的方法、画像化方法および／または生物学的方法、特に、粒子の分析に適合されたかまたは適合可能なものが挙げられ得る。これらの方法は、とりわけ、単一または複数の値、時間依存性または時間非依存性（例えば、定常状態または終点）の値、および／または平均化（時間的におよび／または空間的に）または分布した値の検出を包含し得る。これらの方法は、アナログおよび／またはデジタルの値を測定および／またはアウトプットし得る。
【００９４】
分光法は、一般に、光（または波様粒子）の任意の特性、特に、サンプルとの相互作用を介して変化する特性の検出を包含し得る。適切な分光法としては、とりわけ、吸収、発光（光発光、化学発光および電気化学発光を含む）、磁気共鳴（核スピン共鳴および電子スピン共鳴を含む）、散乱（光散乱、電子散乱、中性子散乱を含む）、回折、円偏光二色性、および旋光性が挙げられ得る。適切な光発光法としては、とりわけ、蛍光強度（ＦＬＩＮＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、およびそれらのリン光および他の類似物が挙げられ得る。
【００９５】
電気的方法は、一般に、任意の電気パラメーターの検出を包含し得る。適切な電気的パラメーターとしては、とりわけ、電流、電圧、抵抗、キャパシタンスおよび／または電力が挙げられ得る。
【００９６】
水力学的方法は、一般に、とりわけ、粒子（またはその成分または誘導体）と、その隣接物（例えば、他の粒子）、溶媒（任意のマトリクスを含む）、および／または微小流体システムとの間の相互作用の検出を包含し得、そして分子のサイズおよび／または形状を特徴付けるため、あるいはサンプルをその成分に分離するために使用され得る。適切な水力学的方法としては、とりわけ、クロマトグラフィー、沈殿、粘度測定および電気泳動が挙げられ得る。
【００９７】
画像化方法は一般に、代表的に、サンプルまたはその成分を可視化するために空間的に分布したシグナルを検出することを包含し得、これにはとりわけ、光学顕微鏡および電子顕微鏡が挙げられる。
【００９８】
生物学的方法は一般に、上記のように、代表的には別の方法を使用して、粒子によって伝導、媒介および／または影響されるある生物学的活性を検出することを包含し得る。適切な生物学的方法は、以下の第ＸＩＩ章に詳細に記載される。
【００９９】
（検出部位）
測定メカニズムは、微小流体システムの内部および／または外部の任意の適切な検出部位で、粒子および／または粒子特性を検出するために使用され得る。
【０１００】
適切な内部検出部位は、微小流体システム（チップ）の中または上の任意の部位を含み得る。これらの部位は、チャネル、チャンバおよび／またはトラップ、ならびにそれらの部分を含み得る。粒子（または解放された成分／アッセイ産物）が静止しているかまたは移動している間、粒子または粒子特性が検出され得る。静止粒子は、粒子の保持（例えば、細胞チャンバにおける細胞増殖）の後に衝突し得る。移動中の粒子は、粒子の保持の前および／または後、あるいはある領域に拘束された際に、衝突し得る。特に、粒子は、任意の適切な配置メカニズムによって（例えば、流体フロー（フローベースの検出）によって）検出部位を通過して移動され得る。
【０１０１】
適切な外部検出部位は、微小流体システムから離れたかまたはこれから独立した任意の部位を含み得る。外部検出部位は、微小流体システムから粒子（または粒子成分）を除去した後に、粒子または粒子特性を検出するために使用され得る。これらの外部部位は、内部部位の代わりに、および／または内部部位に加えて使用され得、粒子（または粒子成分）のさらなる操作および／または検出を可能にする。これらのさらなる操作および／または検出方法は、微小流体システムで実施される操作および／または方法（とりわけ、質量分析法、電気泳動、遠心分離、ＰＣＲ、生物への導入、臨床的処置における使用および／または細胞培養が挙げられる）と重なり得るが、好ましくは相補的であり得る。
【０１０２】
（検出される特性）
測定方法は、粒子の任意の適切な特性を、直接的および／または間接的（例えば、レポーター分子を介して）のいずれかで、検出および／またはモニタリングし得る。適切な特性としては、とりわけ、粒子の同一性、数、濃度、位置（絶対または相対）、組成、構造、配列および／または活性が挙げられ得る。検出される特性としては、分子または超分子の特性（例えば、とりわけ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、酵素、脂質、糖、イオン、代謝産物、オルガネラ、加えられた試薬（結合）および／またはそれらの複合体の、存在／非存在、濃度、局在化、構造／改変、配置、形態、活性、数および／または運動）が挙げられ得る。これらの検出される特性としてはまた、とりわけ、細胞特性（例えば、任意の安定な細胞遺伝子型または表現型（形態、増殖、アポトーシス、壊死、溶解、生存／死、細胞周期における位置、シグナル伝達経路の活性、分化、転写活性、基質の結合、細胞−細胞相互作用、翻訳活性、複製活性、形質転換、熱ショック応答、運動性、拡散、膜完全性および／または神経突起成長を含む））が挙げられる。
【０１０３】
検出される特性および粒子アッセイにおけるその使用のさらなる局面は、以下の第ＸＩＩ章および第ＸＩＩＩ章に記載される。
【０１０４】
（放出メカニズム）
（概説）
微小流体システムは、任意の適切な数の粒子放出メカニズムを含みえる。放出メカニズムは一般に、保持された粒子を、これが保持される予め選択された部位／領域から移動させる（粒子を保持する保持メカニズムを除去し、これに打ち勝ち、そして／または無効にすることを含む）ための任意のメカニズムを含む。適切な放出メカニズムは、少なくとも部分的に、保持力に基づいて選択され得る。解放後、粒子（または粒子成分）は、任意の適切な目的場所を有し得る。
【０１０５】
（保持力の除去）
放出メカニズムは、保持力を除去することによって作動し得る。従って、特定のメカニズムによって保持された粒子は、このメカニズムを終了することによって解放され得る。例えば、化学的相互作用／結合によって保持された粒子は、この結合を、例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）で切断することによって、または他の場合には、例えば、（例えば、ＥＤＴＡを用いて）変更されたイオン条件またはｐＨ、あるいは過剰なＳＢＰメンバーとの相互作用を破壊することによって、解放され得る。同様に、物理的バリア（例えば、閉鎖バルブ）によって保持された粒子は、このバリアを移動／除去することによって解放され得る。さらに、流体フロー、真空、光、電場、磁場および／または遠心力によって保持された粒子は、対応するフロー、力、場などを除去／再方向付けすることによって解放され得る。
【０１０６】
（保持力の克服）
放出メカニズムは、より大きな力で保持力を克服することによって作動し得る。従って、粒子は、保持力より大きな力を適用する任意の位置付けメカニズムによって放出され得る。例えば、保持される粒子は、放出流によって放出され得る。放出流れは、例えば、粒子が弱く保持される（例えば、重力／摩擦、または弱い化学相互作用によって）場合、バルク流体流の方向に増加した流速であり得る。あるいは、放出流は、保持流に対向して作用し得る（例えば、保持流に対して直角または正反対に）。例えば、放出流は、粒子を、保持物理バリアとの接触から外になるように位置を変え得る（実施例７を参照のこと）。代替的に、または加えて、保持される粒子は、十分な力を発生し得る任意の他の適切な位置付けメカニズム（セクションＶにおいて上記される）によって放出され得る。
【０１０７】
（保持力を無効化）
放出メカニズムは、粒子における保持力を無効化することによって操作し得る。このような放出メカニズムは、粒子の成分を放出することによって操作し得る。例えば、保持される細胞は、細胞内成分を放出するために溶解され得、溶解物を生成し得るか、あるいはビーズが、関連する物質を放出および／またはビーズを断片化／崩壊するように処理され得る。溶解は、一般的に、細胞表面膜の完全性の任意の部分的または完全な破壊を含み、そして温度、界面活性剤、リガンド、化学処理、イオン強度の変化、電場などによって生成され得る。
【０１０８】
（放出される粒子／成分の目的地）
放出される粒子および／または粒子成分は、任意の適切な目的地を有し得る。適切な直接目的地は、位置付けメカニズムおよび／または粒子を取り囲む流体を含み得る。放出後、粒子は、非選択的または選択的のいずれかで、位置付けメカニズムで位置を変えられ得る。選択的位置付けは、測定される特徴に基づいて粒子を位置付け得る。位置付けは、第２の保持メカニズム（および／または培養チャンバ）へ、検出メカニズム（例えば、流れベースのメカニズム）へ、および／またはアウトプットメカニズムへであり得る。粒子を取り囲む流体は、粒子成分（例えば、細胞溶解物および／またはビーズ成分）が、検出／アッセイ試薬と接触されるための適切な目的地であり得る。あるいは、細胞溶解物および／またはビーズ成分は、インタクトな粒子で位置を変えられ得る。
【０１０９】
放出メカニズムおよび放出される粒子／成分の目的地のさらなる局面は、セクションＸＩＩＩにおいて以下に記載される。
【０１１０】
（アウトプットメカニズム）
微小流体システムは、微小流体ネットワークと接する１つ以上のアウトプットメカニズムを備え得る。アウトプットメカニズムは、一般的に、物質（例えば、流体、粒子、および／または試薬）を、微小流体システムまたはその一部（選択的および／またはバルクメカニズムを含む）からアウトプットするための任意の適切なメカニズムを備える。アウトプットメカニズムは、アウトプットされた物質を任意の適切な位置（例えば、内部シンクおよび／または外部シンク）に方向付け得る。シンクは、一般的に、廃棄するため（例えば、廃棄部位）またはさらに研究もしくは操作するため（例えば、収集部位）に、アウトプットされた物質を受容するための任意のレセプタクルまたは他の部位を備える。微小流体システムからの物質のアウトプットは、任意の適切な促進メカニズム（例えば、内圧および／または外部減圧の供給源）を使用して促進および／または調節され得る。アウトプットメカニズムは、選択メカニズム（例えば、フィルター）を備え得、これは、任意の基準（例えば、物質が粒子であるかまたは流体であるか）に基づいてアウトプットされる物質を選択する。
【０１１１】
（細胞培養メカニズム）
（概説）
細胞は、微小流体システムにおいて細胞培養メカニズムを使用して培養され得る。細胞培養メカニズムは、一般的に、細胞を増殖（ｇｒｏｗｉｎｇ）させるための任意の適切なメカニズム（維持および／または増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を含む）を備える。
【０１１２】
（構造の問題）
微小流体システムの細胞培養メカニズムは、細胞を培養する１つ以上の培養チャンバを備え得る。培養チャンバは、とりわけ、培養される細胞の数、細胞のサイズ、細胞に実施されるアッセイ、および／または細胞の増殖特性に基づいて、任意の適切なサイズ、形状、組成、および／または微小流体システムの他の局面との関係を有し得る。培養チャンバのサイズは、１つの細胞、数個の細胞またはそれ以上（２〜５０）、または多くの細胞（５０〜１０００以上）の所定の細胞のサイズを保持するのに十分なサイズであり得る。従って、培養チャンバは、通路の選択された部分、通路全体、またはセットの通路によって規定され得る。いくつかの実施形態において、培養チャンバは、実質的に拡大されたチャネルによって形成され得る。培養チャンバは、目的の細胞がチャンバに入り得る任意の適切な高さを有し得る。この高さは、微小流体ネットワークの他の部分より大きい、小さいおよび／または等しくあり得る。培養チャンバの表面のいくらかまたは全て（例えば、壁、屋根、および／または基板）は、細胞培養の局面（特に、とりわけ、特異的または非特異的細胞付着、細胞生存、細胞増殖、および／または細胞分化（またはその欠失））を促進するために処理または改変され得る。通路処理および処理剤の適切な方法は、化学保持メカニズムに関するセクションＶＩにおいて上記される。
【０１１３】
（培養条件）
細胞培養メカニズムは、適切な環境コントロールメカニズムを使用して、任意の適切な環境条件下で細胞を培養し得る。適切な環境条件としては、所望のガス組成、温度、培地交換の速度および頻度などが挙げられ得る。環境コントロールメカニズムは、微小流体システムの内部および／または外部で操作し得る。内部メカニズムは、オンボード（ｏｎ−ｂｏａｒｄ）ヒーター、ガス導管、および／または培地レザバを含み得る。外部メカニズムは、大気および／または温度コントロールインキュベーター／熱源、および／またはシステムに対して外部の培地供給源を含み得る。大気コントロールインキュベーターは、システムがガス透過性物質（例えば、ＰＤＭＳ）から少なくとも部分的に形成される場合、より適切であり得る。培地（ガス調整培地を含む）は、任意の適切なインプットメカニズム（手動ピペッティング、自動ピペッティング、非接触スピッティングなどを含む）によって外部供給源から導入され得る。いくつかの実施形態において、チップは、培地で予めインキュベートされ得、次いで、これは、細胞および／または他の生物材料の導入の前に捨てられ得る。
【０１１４】
細胞培養メカニズムのさらなる局面について、培養チャンバおよび培養条件は、実施例１０において以下に記載され、そしてこの物質は、相互参照（特に、Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（４ｔｈ ｅｄ．２０００）（これは、本明細書中において参考として援用される）に列挙される。
【０１１５】
（粒子に基づく操作）
（概説）
微小流体システムは、粒子操作のために使用される。粒子操作は、一般的に、所望の機能またはアッセイを実行するために、任意の適切な配列の単位操作を含む。単位操作は、とりわけ、セクションＩＶ〜Ｘにおいて上記されるメカニズムのそれぞれによって実行され得る。
【０１１６】
（操作の例示的な配列）
図１は、本発明のシステムを用いる粒子の微小流体操作および分析のための例示的な方法１００を示す。方法１００の各工程は、適用に基づいて、以下に記載されるように、任意の適切な回数および任意の適切な順序で繰り返され得る。工程の例示的な配列は、矢印で示される。
【０１１７】
粒子は、代表的には、１０１に示されるように、インプット工程において最初にインプットされる。粒子インプットは、粒子を微小流体システムに導入し、そしてセクションＩＶにおいて上記される任意のインプットメカニズムによって媒介され得る。
【０１１８】
粒子は、次に、代表的に、１０２に示されるように位置付けられる。位置づけによって、粒子は、通路にそって選択された位置に（長手方向位置付け）、および／または長軸に対して実質的に直交した１つ以上の軸に沿った選択された位置（横方向位置付け）に移動する。これらの粒子の移動の一方または両方を媒介する適切な位置付けメカニズムは、セクションＶにおいて上記される。
【０１１９】
粒子位置付けは、１０３および１０４に示される２つの経路の１つに導き得る。経路１０３は、１０５に示される粒子アウトプットに導く。粒子アウトプットは、セクションＸにおいて上記されるアウトプットメカニズムの１つによって媒介され得、そしてとりわけさらなる分析のために粒子を捨てる、収集する、および／または移動するために使用され得る。経路１０４は、３つの操作（粒子保持１０６、粒子処理１０７、および／または粒子測定／検出１０８）のうちの１つ以上を導く。これらの操作は、任意の所望の数の回数の間、任意の適切な順序で実行され得る。粒子保持メカニズム、処理メカニズム、および測定メカニズムは、セクションＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩにおいてそれぞれ上記される。
【０１２０】
粒子の処理および／または測定の工程は、粒子保持を伴うかまたは伴わないで実行され得る。従って、粒子の処理および／または測定の工程は、さらなる位置付け１０２によって直接的に続き得るか、または粒子が保持されている場合、最初に、１０９に示されるように、放出工程を使用し得る。適切な放出メカニズムは、セクションＩＸにおいて上記される。あるいは、微小流体システムは、粒子が放出される、さらなる位置付けおよび／またはアウトプットの前に捨てられ得る。
【０１２１】
経路１０４に入った後の位置付け工程に戻された粒子は、さらに操作され得る。これらの粒子のいくつかまたは全ては、アウトプット１０５される経路１０３に位置を変えられ得る。代替的にまたは加えて、これらの粒子のいくつかまたは全ては、さらに処理、保持、および／または測定されるように、経路１０４に戻されるように方向付けられ得る。従って、方法１００は、微小流体システム内に１つの位置または複数の位置における粒子操作および分析の任意の適切な配列を可能にする。
【０１２２】
操作の例示的な配列は、以下のようにさらに説明され得る。以下の考察について、方法１００の工程によって実行される操作は、以下の一本の下線文字：Ｉｎｐｕｔ、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ、Ｒｅｔａｉｎ、Ｔｒｅａｔ、Ｍｅａｓｕｒｅ、ｒＥｌｅａｓｅ、およびＯｕｔｐｕｔで略される。
【０１２３】
微小流体分析の基礎的な操作は、ＩＰである。この工程の配列は、アウトプット（ＩＰＯ）または（経路１０４）に導き得、基礎的な配列ＩＰＲ、流れに基づく測定、ＩＰＭまたは流れに基づく処理、ＩＰＴを導き得る。
【０１２４】
保持された粒子は、任意の適切なさらなる工程に供され得る。粒子は、処理（ＩＰＲＴ）、測定（ＩＰＲＭ）、反復した経時の測定（ＩＰＲＭＭＭ．．．）、処理次いで測定（ＩＰＲＴＭ）、または反復的に処理および測定（ＩＰＲＴＭＴＭＴＭ．．．）であり得る。保持粒子は、任意の処理および／または測定後に放出され得る（ＩＰＲ．．．Ｅ）。放出される粒子は、位置を変えられ、次いで、アウトプットされ得る（ＩＰＲ．．．ＥＰＯ）；流れの間に測定され得る（ＩＰＲ．．．ＥＰＭ）；処理され得る（ＩＰＲ．．．ＥＰＴ）；処理および測定され得る（ＩＰＲ．．．ＥＰＴＭ）；保持および処理され得る（ＩＰＲ．．．ＥＰＲＴ）；保持、処理、および測定され得る（ＩＰＲ．．．ＥＯＰＲＴＭ）など。
【０１２５】
（細胞に基づくアッセイ／方法）
本発明の微小流体システムは、それぞれ、セクションＩＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩにおいて上記される、任意の適切な細胞アッセイまたは方法（細胞、細胞選択の任意の組合せを含む）（選択保持による）、処理、および／または測定のために使用され得る。
【０１２６】
細胞アッセイは、修飾因子の添加を伴うかまたは伴わないのいずれかで、細胞を特徴付け得る。細胞アッセイは、細胞の遺伝子型、表現型、および／または修飾因子との相互作用を測定し得る。これらのアッセイは、任意の適切なサイズの個々の細胞および／または細胞集団／群を特徴付け得る。細胞は、細胞自体の１つ以上の特徴を規定するために、追加される修飾因子の非存在下で特徴付けられ得る。代替的に、または加えて、細胞は、細胞と修飾因子との間の相互作用を測定するために追加される修飾因子の存在において特徴付けられ得る。さらに、細胞は、選択された濃度の試薬、または複数の濃度の試薬に曝露され得る。他の実施形態において、細胞は、このような細胞が、このような試薬の量を増加させることによって、引き寄せられるかまたは押し返されるかを決定するために、勾配濃度の試薬に曝露される。
【０１２７】
他の実施形態において、一定量の細胞は、最初に、測定チャンバを充填することによって、測定され得、この測定チャンバは、少なくとも１つの入口を有し、この入口は、少なくとも１つのバルブを有し、ここで、このバルブは開き、細胞が、好ましくは、行き止まり（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）チャンバをブラインド充填することにより、またはチャンバと連絡する出口に出口バルブを開くことによりチャンバに導入され、この出口は、細胞がチャンバから出ることを妨げるために、保持メカニズムを有する。次いで、測定量の細胞は、培養のための培養領域に配置される。
【０１２８】
他の実施形態において、第１の型の細胞は、第２の型の細胞と流体連絡して増殖し、ここで、第１の型の細胞は、好ましくは、同時培養またはフィーダー型関係として、第２の型の細胞の存在によって影響する。第１の型の細胞および第２の型の細胞は、保持メカニズムによって互いに分離され続けるが、流体（好ましくは液体）は、各型の細胞と結合接触され得、その結果、亜細胞または生化学材料は、細胞型の間で交換され得る。
【０１２９】
（遺伝型アッセイ）
遺伝型アッセイは、細胞の遺伝的構成を測定するために、微小流体システム内の細胞で実行され得る。遺伝型アッセイは、任意の適切な細胞または細胞集団（例えば、患者サンプル、出生前サンプル（例えば、胚、胎児、絨毛膜絨毛など）など）で実施され得る。このような遺伝型の局面は、核および／またはミトコンドリア遺伝子、ゲノム領域、および／または染色体領域（例えば、テロマー、セントロメア、反復配列など）のコピー数（例えば、複製、欠失、増幅など）および／または構造（例えば、再配置、融合、反復数（例えば、ジヌクレオチド、３重繰り返し、テロメア反復など）、変異、遺伝子／偽遺伝子、特定の対立遺伝子、単一ヌクレオチド多型の存在／非存在／頻度、統合部位、染色体／エピソームなど）が挙げられ得る。遺伝型アッセイのための方法は、インサイチュでの核酸ハイブリダイゼーション（インタクトな細胞／核）または細胞から放出されるＤＮＡ（例えば、細胞の溶解による）を含み得る。核酸を用いる核酸ハイブリダイゼーションは、色素標識プローブ、特定の結合対で標識されたプローブ（セクションＶＩを参照のこと）、エネルギー移動対を有するステム−ループプローブ（例えば、「分子ビーコン」）、および／またはハイブリダイゼーション後に酵素的に標識されたプローブ（例えば、ポリメラーゼを用いたプライマー伸長、末端トランスフェラーゼを用いた改変など）を用いて実行され得る。代替的に、または加えて、遺伝型アッセイのための方法は、例えば、熱サイクリング（ＰＣＲ）によって、または等温鎖置換法によって、核酸のポリメラーゼ媒介増幅を含み得る。いくつかの実施形態において、ゲノム型アッセイは、核酸の分析を補助するために電気泳動を使用し得る。関連する遺伝子ベースのアッセイは、類似のアッセイ方法、および適切なプローブまたはＤＮＡ色素（例えば、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔなど）を使用して、遺伝子領域、遺伝子、染色体領域、染色体全体、またはゲノムの他の局面を測定し得る。これらの他の局面は、ＤＮＡ含有量全体（例えば、二倍体、四倍体、または倍数体の遺伝子型および／または細胞周期分布を測定するための２Ｎ、４Ｎ、８Ｎなど）、特定の染色体の数または位置、および／または特定の遺伝子の位置（例えば、核膜に隣接、別の核構造など）を含み得る。
【０１３０】
（表現型アッセイ）
表現型アッセイは、遺伝的マークアップおよび／または環境の影響（例えば、修飾因子の存在）に基づいて、微小流体システムにおいて細胞を特徴付けるために実行され得る。これらのアッセイは、細胞全体、細胞オルガネラ、および／または内因性（ネイティブ）もしくは外因性（外来）細胞構成要素／成分を測定し得る。
【０１３１】
細胞全体または細胞集団全体の局面としては、数、サイズ、密度、形状、分化状態、伝播、運動性、翻訳活性、転写活性、有糸分裂活性、形質転換、１つ以上のシグナル伝達経路の状態、プロセスの存在／非存在、インタクト／溶解、生／死、アポトーシスまたは壊死の頻度／程度、基質（または通路）への付着の存在／非存在／効率、増殖速度、細胞周期分布、ＤＮＡを修復する能力、熱ショックに対する応答、細胞−細胞接触の性質および／または頻度などが挙げられ得る。
【０１３２】
細胞オルガネラの局面は、とりわけ、細胞（または細胞集団）の核、細胞表面膜、リソソーム、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、ペルオキシソーム、核膜、エンドソーム、分泌顆粒、細胞骨格、アクソン、および／または神経突起の数、サイズ、形状、分布、活性などを含み得る。
【０１３３】
細胞構成要素／構成成分の局面は、とりわけ、任意の核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、イオン、小分子、ホルモン、代謝産物、および／またはその複合体の存在／非存在またはレベルを含み得る。存在／非存在ま他はレベルは、例えば、修飾因子のありまたは無しで、他の細胞または細胞集団と比較して測定され得る。局在化は、細胞全体または個々の細胞オルガネラまたは成分に対してであり得る。例えば、局在化は、とりわけ、細胞質、核、膜関連、細胞表面関連、細胞外、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム、ペロキシソーム、などであり得る。例示的な細胞質／核局在化は、これら２つの配置間で転座する転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）、ＮＦＡＴ、ステロイドレセプター、核ホルモンレセプター、および／またはＳＴＡＴを含み得る。移動は、細胞内輸送（例えば、特定の細胞オルガネラへ標的化するタンパク質）、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、リサイクルなどを含み得る。例示的な移動は、構成的またはリガンド結合に応答してのいずれかで、細胞表面レセプターまたは関連するタンパク質（例えば、ＧＰＣＲ、レセプターチロシンキナーゼ、アレスチンなど）のエンドサイトーシスを包含し得る。活性は、機能的または光学的活性、例えば、酵素活性、蛍光（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、レポータータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（および関連する誘導体）など）などを含み得る。改変は、任意の共有結合された部分の存在／非存在、位置および／またはレベルを含み得る。このような改変は、とりわけ、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、カルボキシル化、および／またはファルネシル化を含み得る。構造としては、例えば、プロセシング（例えば、切断または結合）後の一次構造、二次構造または三次構造（例えば、コンフォメーション）、および／または四次構造（例えば、細胞内、細胞上または細胞周囲のパートナーとの関連）が挙げられ得る。改変および／構造を測定するための方法は、とりわけ、標識された試薬、エネルギー移動測定（例えば、ＦＲＥＴ）、表明プラスモン共鳴、および／または酵素フラグメント補体またはツーハイブリッドアッセイを含み得る。
【０１３４】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ファージＤＮＡ、合成ＤＮＡ、トランスフェクトされたＤＮＡ、レポーター遺伝子ＲＮＡなどを含み得る。代替的にまたは追加して、核酸は、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、リボソーム、構造ＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＲＮＡ、遺伝子特異的ＲＮＡ、レポーターＲＮＡ（レポーター遺伝子から発現される）などを含み得る。核酸をアッセイするための方法は、遺伝子型アッセイ下で上に列挙された技術のいずれかを含み得る。さらに、核酸をアッセイするための方法は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを含み得る。
【０１３５】
ポリペプチドは、任意のタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、プロテオリピドなどを含み得る。例示的なポリペプチドとしては、レセプター、リガンド、酵素、転写因子、転写補因子、リボソーム成分、調節タンパク質、細胞骨格タンパク質、構造タンパク質、チャネル、トランスポーター、レポータータンパク質（例えば、レポーター遺伝子から発現される上記のもの）などが挙げられる。ポリペプチドを測定するための方法は、とりわけ、酵素アッセイおよび／または特定の結合メンバー（例えば、抗体、レシチンなど）が挙げられる。特定の結合メンバーは、セクションＶＩに記載される。
【０１３６】
炭水化物、脂質、イオン、小分子、および／またはホルモンは、任意の化合物、ポリマー、または複合体を含み得る。例えば、炭水化物は、単純な糖、二糖、多糖、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、などを含み得る。脂質は、とりわけ、コレステロールおよび／またはイノシトール脂質（例えば、ホスホイノシチド）を含み得る；イオンは、とりわけ、カルシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、鉄、亜鉛、水素、マグネシウム、重金属、および／またはマンガンを含み得る；小分子および／またはホルモンは、代謝産物、および／または第二メッセンジャー（例えば、とりわけｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ）などを含み得る。鉄の濃度勾配および／または移動は、例えば、実施例１１および１２に記載されるように、パッチ−クランプ分析による電気的測定を提供し得る。
【０１３７】
（相互作用アッセイ）
相互作用は、一般的に、調節因子の細胞または細胞の集団への任意の特異的結合、あるいは、調節因子に応答した特徴的な細胞における任意の検出可能な変化を含む。特異的結合は、主に細胞内、細胞上または細胞の集団にある所定のパートナーである任意の結合である。特異的な結合は、約１０−３Ｍ以下の所定のパートナーとの結合係数を有し得、約１０−４Ｍ、１０−６Ｍ、または１０−８Ｍ以下が好ましい特異的結合係数である。あるいは、相互作用は、修飾因子に応答して、上記の表現型または遺伝子型における任意の変化であり得る。
【０１３８】
相互作用アッセイは、任意の適切な測定方法を使用して実行され得る。例えば、修飾因子は、例えば、光学的に検出可能な色素で標識され得、そして細胞との相互作用後に二次的に標識され得る。従って、細胞への色素の結合は、定量化され得る。代替的にまたは追加的に、細胞は、処理されるかまたはそれ以外で処理されて、上およびセクションＶＩＩＩに詳細に記載されるように、修飾因子の接触によって生成される表現型特性の測定を可能にし得る。
【０１３９】
細胞および／または細胞集団は、修飾因子のライブラリーを用いてスクリーニングされて、所望の表現型効果（例えば、レポーター遺伝子応答、ネイティブな遺伝子／タンパク質の発現レベルの変化、電気物理学的効果など）および／または結合係数を同定し得る。ライブラリーは、一般的に、構造または機能のような共通の特徴を共有する１セットの二つ以上のメンバー（修飾因子）を含む。従って、ライブラリーは、とりわけ、２つ以上の小分子、２つ以上の核酸、２つ以上のウイルス、２つ以上のファージ、２つ以上の異なる型の細胞、２つ以上のペプチド、および／または２つ以上のタンパク質を含み得る。
【０１４０】
（シグナル伝達アッセイ）
細胞および／または集団の微小流体アッセイは、シグナル伝達経路の活性を測定し得る。活性は、活性の任意のレベルに対して、他の細胞および／または集団に対して（以下を参照のこと）、ならびに／あるいは細胞との修飾因子の相互作用の測定として（上記を参照のこと）、測定され得る。
【０１４１】
シグナル伝達経路は、一般的に、細胞内の任意の情報の流れを含む。多くの場合において、シグナル伝達経路は、膜を通して、リガンドまたは他の修飾因子の形態で、細胞外の情報を移動して、細胞内シグナルを生成する。細胞外情報は、少なくとも部分的に、細胞表面レセプター（例えば、とりわけ、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）、チャネル結合レセプター、レセプターチロシンキナーゼ、レセプターセリン／トレオニンキナーゼ、および／またはレセプターホスファターゼ）に結合することによって、膜においてまたは膜の近くで事象を誘発することによって作用し得る。これらの事象は、チャネル活性の変化、レセプタークラスター化、レセプターエンドサイトーシス、レセプター酵素活性（例えば、キナーゼ活性）、および／または第２メッセンジャー産生（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ジアシルグリシエロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｃｙｅｒｏｌ）、ホスファチジルイノシトールなど）含み得る。このような事象は、調節事象（例えば、リン酸化・脱リン酸、複合体形成、分解など）のカスケードを導き、これは、最終的に、変化した遺伝子発現を生じ得る。他の場合において、調節因子は、膜を通過し、例えば、核レセプター（例えば、とりわけ、ステロイドレセプター（ＧＲ、ＥＲ、ＰＲ、ＭＲなど）、レチノイドレセプター、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）、甲状腺ホルモンレセプター、ペロキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）、および／または生体異物レセプター）を有する細胞内レセプターに直接結合する。従って、この情報の流れの任意の適切な局面は、特定のシグナル伝達経路をモニターするために測定され得る。
【０１４２】
測定される活性は、少なくとも部分的に、アッセイされるシグナル伝達経路のタイプに基づき得る。従って、シグナル伝達経路アッセイは、リガンド結合；レセプターインターナリゼーション、膜電流の変化；別の因子（例えば、アレスチン、小Ｇ様タンパク質（例えば、ｒａｃ、またはｒｈｏなど））；カルシウムレベル；キナーゼ（例えば、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ＣａＭキナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、ＰＩ３−キナーゼなど）の活性；ｃＡＭＰレベル；ホスホリパーゼＣ活性；タンパク質の亜細胞分布（例えば、とりわけ、ＮＦ−κＢ、核レセプター、および／またはＳＴＡＴ）。代替的にまたは追加的に、シグナル伝達アッセイは、シグナル伝達経路の活性を報告するネイティブな標的遺伝および／または外来レセプター遺伝子の発現を測定し得る。発現は、上記のように、とりわけ、ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物、または酵素活性の存在／非存在またはレベルとして測定され得る。
【０１４３】
（細胞および／または細胞集団の比較）
細胞に基づくアッセイは、細胞および／または細胞の集団の遺伝子型、表現型、および／または調節因子相互作用を比較するために使用され得る。細胞および／または集団は、異なる微小流体システム内または同じ微小流体システム内で比較され得る。同じ微小流体システム内での比較は、並んだ構成を使用して並行して（実施例３によって例示される）、単離部位で並行（実施例４によって例示される）、および／または直列して（実施例５によって例示される）実行され得る。
【０１４４】
（単一細胞アッセイ）
微小流体システムは、単一細胞アッセイを実行するために使用され得、これは、一般的に、好ましくはまたは必ず一度に１つの細胞で実行される任意のアッセイを含む。単一細胞アッセイの例としては、パッチ−クランプ分析、単一細胞ＰＣＲ、単一細胞蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、タンパク質の亜細胞分布、および／または分化アッセイ（異なる細胞型への変換）が挙げられる。いくつかの場合において、単一細胞アッセイは、群の１つのメンバーの個々の特徴を測定することによって、２つ以上の細胞の保持された群で実行され得る。他の場合において、単一細胞アッセイは、例えば、細胞がアッセイの前に溶解される場合、単一の細胞の保持を必要とし得る。
【０１４５】
（分類／選択）
微小流体システムは、単一の細胞および／または細胞集団を分類または選択するために使用され得る。分類／選択される細胞または集団は、確率的なメカニズム（実施例２を参照のこと）、サイズ、密度、磁力特性、細胞表面特性（すなわち、基質に付着する能力）、増殖および／または生存能力によって選択され得、ならびに／あるいは細胞または集団の測定された特徴（例えば、リガンド、特定の表現型などに対する応答）に基づき得る。細胞および／または集団は、微小流体システムにおける操作および／または分析の間、１回より多く分類され得る。特に、細胞の異種集団（例えば、血液サンプルまたは臨床生検、特に、トランスフェクトされたかまたは分化した細胞集団、脱凝集した組織、天然サンプル、法医学サンプルあんど）は分類／選択され得る。細胞分類ならびに適切な細胞および細胞集団のさらなる局面は、セクションＩＩＩおよび以下の実施例９、１５、２３、および２６に記載される。
【０１４６】
（保存／維持）
微小流体システムは、細胞の保存および／または維持を実行し得る。従って、細胞は、微小流体システムに導入され得、そして長期間（例えば、１週間、１ヶ月、３ヶ月、および／または１年より長い）培養され得る。細胞の保存および／または維持のために微小流体システムを使用することは、より少ない量の媒体および空間を消費し得、そして他の保存／維持方法よりも生存可能な状態で細胞を維持し得る。微小流体システムにおいて細胞を保存および維持するさらなる局面は、上記セクションＸＩおよび以下の実施例１０に含まれる。
【０１４７】
（他の粒子を用いたアッセイ／方法）
微小流体システムは、任意の適切なウイルスに基づく、細胞オルガネラに基づく、ビーズに基づく、および／または小胞に基づくアッセイおよび／または方法のために使用され得る。これらのアッセイは、これらの他の粒子のいずれかの内／上に存在するか、または関連する１つ以上の物質（化合物、ポリマー、混合物、細胞など）に調節因子（化合物、混合物、ポリマー、生体分子、細胞など）の結合（または効果）を測定し得る。代替的にまたは追加的に、これらのアッセイは、活性（例えば、酵素活性）における変化、光学的特性（例えば、とりわけ、化学発光、蛍光、または吸収）、ならびに／あるいは相互作用によって誘導されるコンフォメーションの変化を測定し得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ビーズは、検出可能なコードを含み得る。このようなコードは、検出可能な特性（例えば、光学的特性（例えば、スペクトル、強度、およびまたは蛍光励起／発光の程度、吸収、反射、屈折率など））を有する１つ以上の物質によって与えられ得る。１つ以上の物質は、非空間的な情報を提供し得るか、または各コードのコード局面に寄与する異なる空間的位置を有し得る。コードによって、異なるサンプル（例えば、細胞、化合物、タンパク質など）が、異なるコードを有するビーズと会合し得る。次いで、異なるサンプルは、各ビーズのコードを読むことによって、組み合わされ得、一緒にアッセイされ得、そして同定され得る。細胞に会合するビーズに適切なアッセイは、上記細胞アッセイのいずれかを含み得る。
【０１４９】
このセクションに記載されるアッセイのいくつかを実行するための適切なプロトコールは、Ｊｏｅ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２０００）に含まれ、これは、本明細書中において参考として援用される。
【０１５０】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の選択された局面および実施形態を記載し、これは、微小流体システムを作製、統合および使用する方法、およびデバイス、ならびに粒子を操作および分析するためのメカニズムを含む。これらの実施例は、説明のために含まれ、本発明の範囲全体を制限または規定することは意図されない。
【０１５１】
以下に呈示される実施例の多くは、カラーコードされた鋳型、流体層、および／またはコントロール層を示す図を含む。鋳型および流体層またはコントロール層は、相補的なパターンを有するので、カラーコードスキームは、一般的に、鋳型および流体層またはコントロール層の両方を表すが、一方または他方は、しばしば対応する記載で指定される。これらの実施例全体を通して、鋳型および／または流体層のカラーは、以下の意味を有する：赤の領域は、約２０μｍの高さ、および矩形の断面形状を有する；青色の領域は、約２０μｍの高さ、および半円／弓形の断面形状を有する；青緑色の領域は、約５μｍの高さ、および矩形の断面形状を有する；そして白色の領域は、鋳型の一般的な表面から上がっておらず、および／または流体層の基材接触表面の一部を形成しない。これらの領域の幅は、一般的に文章中に引用される。
【０１５２】
これらの実施例で提示される寸法および断面形状は例示に過ぎず、直径が約８〜１２μｍの粒子のために設計されている。従って、任意の絶対的または相対的な寸法または断面形状が、適用および分析されているインプット粒子のサイズを基に選択され得る。従って、赤および青の領域は、約０．５〜１００、１〜７５、または２〜５０μｍの高さを有し得る。青緑色の領域は、約０．１〜５０、０．２〜２５、または約０．５〜２０μｍの高さを有し得る。さらに、これらの領域は、適用に基いて任意の適切な断面形状を有し得る。さらに、赤および青の領域は、それらの機能に基く任意の適切な幅を有し得る。例えば、粒子配置のために用いられる赤の領域は、少なくとも約２、１０、２０、または５０μｍの幅を有し得る。対照的に、試薬分与のために用いられる赤の領域は、少なくとも約０．２、１、２、または５μｍのより小さな幅を有し得る。青の領域は、少なくとも約５、１０、２０、または５０μｍのより小さな幅を有し得る。
【０１５３】
（実施例１．細胞配置、および保持メカニズム）
この実施例は、分岐流体経路に少なくとも一部基づいて単一の粒子または粒子の群を配置および／または保持するための微小流体システムを記載する；図２４を参照のこと。
【０１５４】
（背景）
単一細胞または小群の細胞の正確な配置および保持から利益を受けるか、またはそれを必要とする多くの細胞分析がある。特に、配置および保持された細胞は、リアルタイムで処理されるか、または観察され得る。しかし、細胞を配置および保持するための現在利用可能なメカニズムは、高価かつ労働集約的であるか、または不正確および細胞に有害であるかのいずれかである。例えば、マイクロマニピュレーターは、ユーザーが単一細胞を選択かつ正確に配置することを可能にする。しかし、マイクロマニピュレーターは高価であり、そしてユーザーが微小操作の全体で細胞を観察することを要求する。それ故、ユーザーは、一度に１つの細胞を配置し得るのみである。その他の極端な手段では、フィルターが、細胞を配置かつ保持するための粗いがより安価かつ迅速なメカニズムを提供する。しかし、フィルターは多くの欠点を有している。例えば、それらは、詰まり易く、コントロールが困難で（特に、多数の保持された細胞について）、そしてフィルターを横切る圧損に起因して、細胞のような粒子には潜在的に有害である。従って、経済的で、光学的モニタリングなくして自動的に案内され、および／または細胞を実質的に損傷することなくそれらを穏やかに操作し得る細胞配置および保持システムに対する必要性が存在する。
【０１５５】
（説明）
この実施例は、光学的モニタリングを必要とすることなく、細胞および／またはビーズのような粒子を配置および／または保持するためのメカニズムを記載する。一旦保持されると、これら粒子は、特に光学的方法および電気的方法を含む任意の適切な方法によって分析され得る。説明されるメカニズムは、分岐して分岐の位置でほぼ停滞した流体領域を形成する微小流体流路を用いる。微小流体システムからこのほぼ停滞した流体領域に入る粒子は、速度の減少を経験し、これは、適切な保持構造またはトラップでそれらの「軟着陸」を行うことを開発し得る。従って、これら保持された粒子は、損傷されず、そして次の分析に適切である可能性がより高い。
【０１５６】
（実施形態１）
図２Ａは、本発明の局面による粒子の微小流体操作および／または分析のためのシステム１１０を示す。システム１１０は、（１）インプットレザバ１１２、（２）３つの流体チャネル１１６、１１８、１２０を有する微小流体ネットワーク１１４、および（３）２つのアウトプットまたは廃棄レザバ１２２、１２４を含む。粒子は、一般に懸濁物としてインプットレザバ中１１２に装填される。この装填された粒子は、インプットレザバと廃棄レザバとの間の流れストリーム１２６、１２８、１３０として示されるような、正味の流体流れに応答してネットワーク１１４に侵入し得る。この正味の流体流れは、例えば、それぞれ、ポンプ輸送および／または重力によって仲介される能動的および／または受動的流れによって決定され得る。
【０１５７】
流れストリーム１２８、１３０への流体流れストリーム１２６の二分岐は、配置メカニズム１３２を生成する。この配置メカニズムは、点線矢印として示されるような減少速度流れストリームを用い、流れストリーム１２６の延長部を通る粒子のフラクションを穏やかに配置する。
【０１５８】
粒子は、流れストリーム１３４によって、適切な保持メカニズム１３６中に運搬される。システム１１０において、この保持メカニズムは、減少速度流れストリーム１３４の末端部近傍の対向する壁１４０中に形成される凹部１３８を含む。凹部１３８は、１つの粒子または２つ以上の粒子の群を収容する幅および深さを有し得る。凹部１３８は、ほぼ流れストリーム１２８、１３０の方向にある、保持された粒子の移動をブロックする保持構造１４２を含む。一般に壁１４０から離れた、保持構造１４２の任意の延長部と連結する凹部１３８の深さは、保持される粒子の数、およびそれらの関連する保持効率を決定し得る。従って、保持メカニズム１３６は、粒子の安定または一時的保持を行い得る。一時的保持は、処理および／または分析に適切である占有の平均時間を提供し得、確率論な損失および減少速度流れストリーム１３４に沿って侵入するその他の粒子による粒子（単数または複数）の置換が起こる。
【０１５９】
保持メカニズム１３６によって保持された粒子は、処理および／または分析され得る。いくつかの実施形態では、保持された粒子は、例えば、電極１４３を用いて電気的に分析される。あるいは、またはさらに、保持された粒子は処理および／または分析され、そして次に適切な放出メカニズム１４４によって移動され得る。例えば、システム１１０では、この放出メカニズムは、流れストリーム１３４に対向する、保持細胞上への取り外し圧力を付与する。放出メカニズムは、上記のセクションＩＸおよび以下の実施例７および２６中でさらに説明されている。
【０１６０】
（実施形態２）
図２Ｂは、本発明の局面による粒子の微小流体操作および／または分析のための別のシステム１１０’を示す。図２Ｂのシステム１１０’の作動原理は、図２Ａのシステム１１０のそれと類似している。しかし、チャネル１１８’および１２０’は、システム１１０におけるそれらの直交する相当物とは対照的に、システム１１０’ではチャネル１１６’から９０゜未満で分岐している。その結果、粒子のより大きなフラクションが、システム１１０中の流れストリーム１３４よりシステム１１０’中の流れストリーム１３４’中に配置され得るが、より大きな取り外し力もまた存在し得る。その他の実施形態では、このアウトプットチャネルは、９０゜より大きいを含む任意の角度の分岐を有し得、および／またはそれらは等しくない角度の分岐を有し得る。２つの流体経路における分岐の角度および任意の非対象性は改変され得て、トラップおよび／または保持される粒子の数、およびトラップ内のそれらの位置を選択する。
【０１６１】
（実施形態３）
図３は、本発明の局面による、粒子の微小流体操作および／または分析のためのなお別のシステム１７０を示す。システム１７０は、（１）チャネル１７４、１７６、１７８の流体ネットワーク１７２および（２）保持メカニズムまたはトラップ１８０を含む。流れストリーム１８１は、インプットサンプルおよび流体を、Ｔ継手１８２にもたらし、そこで、ストリーム１８１は、直交して方向付けられる一次流れストリーム１８４、１８６に分割される。図２Ａおよび２Ｂのシステム１１０、１１０’におけるように、減少した速度の配置流れストリーム１８８は、一次ストリーム１８４、１８６間のストリーム１８１から、対向する壁１８８に向かって延びる。しかし、システム１１０および１１０’とは異なり、システム１７０はまた、矩形ブロックの形態にある区画１９２、１９４（それぞれ「Ｐ」および「Ｑ」）を含む。区画１９２、１９４は、一次チャネルを分割し、一次チャネル１７６、１７８にほぼ平行に延びる第２のチャネル１９６、１９８を生成する。これらの第２のチャネルは、配置流れストリーム１８８を分割し、そしてそれを、二次流れストリーム２００、２０２によって示されるように、反対方向に直角に向ける。二次流れストリームは、流体を、ネットワーク１７２内のそれらの位置のために、一次ストリーム１８４、１８６より遅い速度で輸送する。
【０１６２】
図４は、トラップ１８０による区画１９２、１９４間の単一粒子２０４の配置および保持後の粒子インプットの間のシステム１７０を示す。ネットワーク１７２に侵入する粒子２０６は、一般に、チャネル１７４内の中央位置および側方位置の両方で、流れストリーム１８１に沿って進行する。細胞２０８のような側方に配置された細胞は、チャネル１７６、１７８に沿って一次流れストリーム１８４、１８６に従う。対照的に、２１０のような中央に配置された細胞は、区画１９２、１９４間のスロットまたはギャップ２１２に向かう配置ストリーム１８８に従う。この実施形態では、ギャップ２１２は、細胞２０６の直径よりわずかに広く、その結果、それは、１つの細胞のみを受容する。その他の実施形態、および／またはその他の細胞については、ギャップ２１２は、２つ以上の細胞を受容するに十分広くあり得る。ギャップ２１２の幅がどうであれ、壁１９０および区画１９２、１９４は、保持部位２１４を形成し、そこで、細胞２０４または複数の細胞が安定に保持され得る。一旦細胞２０４が、トラップ１８０によって保持部位で配置されると、その存在は、二次チャネル１９６、１９８を通り、二次ストリーム２００、２０２に沿って流体流れをブロックまたは消滅する傾向があり得る（図３を参照のこと）。従って、二次ストリーム２００、２０２は、区画１９２、１９４間にさらなる細胞を引っ張る能力を消滅している。その結果、いくつかの実施形態では、トラップ１８０は、配置および／または保持の間に光学的モニタリングを何ら必要とすることなく、１つだけの細胞を自動的に優先して保持し得る。従って、保持部位２１４は、保持される細胞のサイズに基づく寸法であり得る。例えば、真核生物細胞は、代表的には、直径が約２〜１０μｍであり、そこでギャップ２１２は、この直径よりもわずかに広くし得、その一方、二次チャネル１９６、１９８は、この直径よりわずかに狭くし得、これらチャネル中への細胞の侵入を防ぎ得る。
【０１６３】
保持された細胞２０４は、セクションＶＩＩＩで上記に記載したような細胞特徴の光学的および／または電気的検出のような任意の適切な方法を用いて、処置および／または分析され得る。この処置および／または分析は、壁１９０からチャンバ２１８に外向きに延びる微小チャネル２１６により促進され得る。微小チャネル２１６は、保持された細胞２０４の直径より小さく、そして、特に、実施例１１および１２で以下に記載されるように、保持された細胞上に陽圧および／または陰圧を奏するため、保持された細胞を横切る電位および／または電流を付与および／または測定するために用いられ得る。
【０１６４】
（実施例２．粒子を捕捉および灌流するための微小流体システム）
この実施例は、単一の粒子または粒子のセットを配置かつ保持し、そして保持された粒子または粒子のセットの試薬を用いた迅速で正確な灌流を可能にする微小流体システムを記載する；図５〜１１Ｃを参照のこと。
【０１６５】
（背景）
多くの細胞研究は、細胞の集団の分析からの利益を受ける。この集団は、集団の個々の細胞からの別個の情報、および全体の集団からの平均化された情報を提供し得る。従って、細胞の集団は、この集団が不均質であるとき、別個のタイプの細胞の、またはこの集団が均質またはクローン性であるとき細胞表現型または応答の範囲の同時分析を可能にし得る。従って、微小流体環境中の細胞の研究は、微小流体チップ上の予備選択された部位にある細胞のセットを自動的に配置および／または保持する微小流体システムからの利益を受け得る。さらに、これらの研究は、保持された細胞のセットが、コントロール可能かつ規定可能な様式で、薬物、試験化合物、または標識のような選択された試薬で灌流されるようにするメカニズムから利益を受け得る。
【０１６６】
（説明）
この実施例は、ユーザーが、細胞保持チャンバ内に複数の細胞を捕捉し、そしてコントロールされた間隔の試薬で捕捉された細胞を灌流することを可能にする微小流体を記載する。これらのシステムは、例えば、以下の実施例１３、およびこの詳細な説明のいずれかに、ならびに上記の相互参照の下で列挙され、そして本明細書中に参考として援用された特許出願中に記載のように製作された鋳型を用いるフォトレジストの多層を含む多層ソフトリソグラフィーを含む、任意の適切な方法により形成され得る。従って、いくつかの実施形態では、流体チャネルの断面形状は、流れチャネルにおける矩形と、バルブの位置における弓状との間で変動し得る。
【０１６７】
（実施形態１）
図５〜１１は、細胞集団の微小流体分析のためのシステム２５０を示す。このシステムは、以下に詳細に記載され、（ａ）システム説明、（ｂ）システム生産、（ｃ）システム操作、および（ｄ）システムプロトコールを含む。
【０１６８】
（ａ）システム説明
図５は、細胞集団の微小流体分析のためのシステム２５０の一部分を示す。システム２５０は、微小流体層２５２およびコントロール層２５４を含む。微小流体層２５２は、青およびオレンジで描写される相互接続チャネルの微小流体ネットワーク２５６を形成する。コントロール層２５４は、この微小流体層の上に配置され、かつそれに接しており、そして紫で描写されるバルブおよびポンプを含む（図８もまた参照のこと）。システム２５０のために以下に提示される例示の寸法は、約８〜１２μｍの細胞直径に基づいている。
【０１６９】
上記微小流体層は、別個の形状および機能をもつ微小流体チャネルを含む。青の流れチャネル２５８は、半円形または弓状の断面プロフィールを有し、そして、一般に、以下に記載される、細胞配置、保持、および／または処置のためのメカニズムの上流および下流に配置される。これらの流れチャネルは、チャネルが、コントロール層２５４中に存在するバルブおよびポンプによって効率的に作動され得るようにする断面プロフィールを有する。この実施例では、流れチャネルは、約２００μｍ幅および２０μｍ高さである。対照的に、オレンジの細胞チャネル２６０は、矩形のプロフィールを有する。この実施例では、細胞チャネルは、約１００μｍ幅および２０μｍ高さである。チャネル高さは、少なくとも一次のオーダーでは、側方移動を制限しないため、細胞または粒子は、壁に従って、または粒子状細胞もしくは粒子を運搬する特定の層流流れストリームに基づいてより中央位置で細胞チャネル内を自由に進行し得る。従って、これらの細胞チャネルは、細胞を、微小流体ネットワークの予備選択された層流流れストリームおよび予備選択された領域に配置するために用いられる。以下により詳細に記載される灌流チャネル２６２もまた、オレンジで示され、そして保持された細胞をコントロール可能に灌流するために機能する。この特定の実施例では、灌流チャネルは、約１０μｍ幅である。
【０１７０】
システム２５０は、インプットメカニズム２６３、配置メカニズム２６４、保持メカニズム２６６、および灌流メカニズム２６８を含む。配置メカニズムおよび保持メカニズムは、一緒になって機能し、保持または捕捉チャンバ２７０中に細胞を配置し、かつ捕捉する。灌流メカニズムは、代表的には細胞保持後、保持チャンバ２７０中の細胞に試薬の送達を行うために機能する。
【０１７１】
インプットメカニズム２６３は、以下に記載されるように、インプットレザバまたはウェルを用いてシステム中に粒子を導入する（図８を参照のこと）。
【０１７２】
配置メカニズム２６４は、インプット細胞が保持チャンバに入る可能性を増加するように作動する。メカニズム２６４は、合わさるが、層分布で分離したままである収束流れストリームを通じて作動する。インプット流れストリーム２７２、２７４、２７６は、流体を、流れチャネル２７８、２８０、２８２にそれぞれ沿って流体を運搬する。しかし、チャネル２８０もまた、細胞を運搬し得、その一方、隣接チャネル２７８、２８２は、一般にそうはしない。その結果、合流２８４では、流れストリーム２７４は、流れストリーム２７２、２７６が隣接する中央部分を占領する。従って、伴う細胞は、組み合わせストリーム２８６の中央部分に集められる。いくつかの実施形態では、追加の流れストリームが含められ得るか、および／または実施例３で以下に例示されるように、細胞は、その他の流れストリーム中に含められ得る。
【０１７３】
図６および７は、それぞれ、図５の保持メカニズムまたはトラップ２６６の対応する実際の図および概略図を示す。この保持メカニズムは、部分的に閉鎖された保持または捕捉チャンバ２７０を含む。チャンバ２７０は、約６０〜１００μｍ長、５０〜１００μｍ幅、および２０μｍ高さのサイズを有し得る。チャンバ２７０は、チャネル壁２８８、前面壁２９０、側壁２９２、２９４、および上壁２９２および底壁（図示せず）を対向させることによって形成される。前面壁は、細胞が組み合わせストリーム２８６から延びる減少速度ストリーム２９８からチャネルに入るアパーチャー２９８を含む。この減少速度ストリームは、このチャンバに入る細胞への障害をより少なくし、生存率および実り豊かな分析の可能性を増加する。アパーチャー２９６は、約５〜２０μｍ幅であり、いくつかまたはすべてのチャネルの高さに対応する高さを有し得る。ストリーム２９８の一部分としてアパーチャー２９６に入る流体は、側壁チャネル３００を通過し得る。この実施例では、各側壁は、３つの側壁チャネル３００を含み、これらは、約１０μｍ幅および５μｍ高さの矩形プロフィールを有する。一般に、この側壁チャネルは、流体またはより小さいな細胞または粒子を通過させながら、目的の細胞または粒子を選択的に保持するような寸法である。従って、チャンバ２７０は、フィルターとして機能する。しかし、標準的なフィルターとは対照的に、インプット細胞の一部分のみが、チャンバ２７０に入る。この一部分は、特に、保持チャンバの設計、インプット流体ストリームの速度、ならびに粒子のサイズおよび密度に依存して、特に、１０中の約１、１００中の約１、または１０００中の約１より小さくあり得る。
【０１７４】
図７は、チャンバ２７０に向かって流れる細胞３０２の集中ストリームを示す。細胞３０２は、アパーチャー２９６に入るか、またはチャネル３０４、３０６によって直角に運搬される。チャンバ２７０内で、微小ストリーム３０８は、側壁チャネル３００でチャンバ２７０を接続する。
【０１７５】
灌流メカニズム２６８は、チャンバ２７０内で捕捉された細胞に対し試薬への正確にコントロールされた曝露を提供する。図５は、灌流メカニズムの一般的な設計を示す。捕捉された細胞は、２つまたはそれ以上の灌流チャネル３１０、３１２のうちの１つによって運搬される緩衝液または試薬ストリームに選択的に曝される。培地、緩衝液、および／また試薬のような流体は、灌流チャネル３１０および／または３１２を通じて流れ、そして集束緩衝液ストリーム３１４に合わさる。灌流の間、集束緩衝液ストリーム３１４は、以下により詳細に説明される、単一ストリーム中のチャンバ２７０を超えて流れる、１つ以上のインプットレザバ「Ｂ」からのインプット流体により生成される。従って、図７に示されるように、細胞配置および保持の間にストリームの分割はもはや起こらない。層流および灌流チャネル３１０、３１２の位置に起因して、これらチャネルのいずれか１つからの流体は、一次流れストリームの最も近いチャンバ２７０の側方で一次流れストリーム３１４に合わさるように侵入する。従って、捕捉された細胞は、灌流チャネル３１０または３１２からの流体に曝される。しかし、流体が、両方の灌流チャネルから流れる場合、灌流チャネル３１２からの流体は、試薬のような、灌流チャネル３１０から流れる流体から、捕捉された細胞を遮蔽する。従って、灌流チャネル３１２の内容物は、遮蔽流体または遮蔽緩衝液と称され得る。両灌流チャネルから同時に流れる場合、細胞は、チャネル３１２からの流れを停止することにより、灌流チャネル３１０からの試薬に迅速に曝され得る。灌流緩衝液の流れを停止することは、細胞を、いくつかの場合には、流れを停止した後、約１５０ミリ秒の非常に短い時間内で試薬に曝し得る。従って、迅速細胞応答を測定するために試薬曝露の正確なコントロールを必要とする細胞分析が、この微小流体システムによって与えられる迅速応答時間で再現性良く実施され得る。
【０１７６】
灌流メカニズム２６８は、類似の灌流を達成するため、または曝露応答時間を変更するために改変され得る。例えば、同様の灌流は、横方向チャネル３１６の対向する側面上に灌流チャネルを配置することか、または両方の灌流チャネルを対向する壁２８８上に配置することにより得られ得る。あるいは、またはさらに、曝露時間は、灌流チャネル３１０を一次流れストリーム３１４により近く、またはそれからさらに遠く移動することにより増加または減少され得る。実施例３は、集束緩衝液ストリームに直接注ぐ灌流チャネルを示す。
【０１７７】
図８は、微小流体システム２５０のさらなる局面を示す。これらのさらなる局面は、微小流体レザバ、ならびに微小流体ネットワーク内の流体流れをコントロールするコントロール層のバルブおよび／またはポンプを含む。
【０１７８】
微小流体レザバは、システム２５０が顕微鏡的世界とインターフェースすることを可能にする。各レザバまたはウェルは、少なくとも１つの微小流体チャネルに直接接続される流体入口または出口として機能する。３３０で示される流体入口ウェルＡは、一般に細胞懸濁物として、粒子インプットを提供する。３３２で示される流体入口ウェルＢは、最終的に集束流れストリーム２７２、２７６を形成する２つの集束チャネル３３４、３３６に分割される集束緩衝液を保持する。３３８で示される流体出口ウェルＣは、システムを通って流れる一般に廃棄流体である出口流体を保持する。ウェルＣは、流体チャネル３４０、３４２の１つまたは両方からの流体を受容する。３４４および３４６で示される流体入口ウェルＤおよびＥは、捕捉細胞への曝露のための第１および第２の試薬を保持し得る。３４８で示される流体入口ウェルＦは、所望されるまで試薬の曝露をブロックする遮蔽緩衝液を保持する。
【０１７９】
コントロール層インターフェースは、１から１１まで番号付けされる。各インターフェースは、１つ以上のバルブの開放および閉鎖を調節するためのガス入口として作用する。インターフェース７は、細胞インプットバルブ３５０をコントロールする。同様に、インターフェース８は、流体チャネル３４０をコントロールし、一次流れストリーム３１４が分岐するか、または単一ストリームであるか否かを決定する。インターフェース９、１０、および１１は、バルブ３５２、３５４、３５６をコントロールし、これらは、それぞれ、流体入口Ｄ、ＥおよびＦからの試薬または遮蔽緩衝液の流入を調節する。インターフェース１〜３および４〜６は、それぞれ３５８および３６０で示されるバルブのセットをコントロールする。各セット内のバルブは、入口Ｂ（バルブセット３６０）またはＤ−Ｆ組み合わせ（バルブセット３５８）から、蠕動によって液体をポンプ輸送する規定されたシークエンスで作動される。
【０１８０】
（システム生産）
システム２５０は、任意の適切な方法を用いて形成され得る。例示のアプローチでは、このシステムは、微小流体層２５２、コントロール層２５４、および、例えば、カバーガラス（図示せず）により形成される基板層を積層および融合することにより形成される。詳細には、このアプローチでは、微小流体層およびコントロール層がソフトリソグラフィーによって成形され、そして次に融合される。次いで、得られる融合多層構造が、カバーグラス基板層に結合される。最後に、微小流体チャネルが脱イオン水で湿される。
【０１８１】
（システム作動）
システム２５０は、任意の適切な方法を用いて、細胞のような粒子を装填、配置、および／または保持するために用いられ得る。例示のアプローチでは、バルブ７、９、１０、１１は閉鎖され、そしてポンプバルブを含む残りのバルブは開放される。ウェルＢおよびＦは、集束緩衝液および遮蔽緩衝液でそれぞれ装填され、ウェルＤおよびＥは試薬で装填され、そしてウェルＡは細胞懸濁物で装填される。次いで、廃棄ウェルＣが少なくとも部分的に空であり、細胞がウェルＣに向かって流れることを可能することを確認した後、バルブ７が開放される。この時点で、ウェルＤ、Ｅ、およびＦから流れる液体はない。緩衝液はウェルＢからウェルＣに流れ、そして細胞はウェルＡからウェルＣに流れる。ウェルＡから流れる細胞は、ウェルＢから来る流体ストリームを集めることにより、組み合わせ流れストリーム２８６の中心に集められ（図７を参照のこと）、それによってウェルＡから流れる細胞を隣接させる。集束流れストリーム２７２、２７６は、インプット細胞が、集束が生じる近傍に配置される保持チャンバ２７０に入る可能性を増大する。細胞の集束したストリームは、保持チャンバに隣接する２つのストリームに分割される。各ストリームは、上記のように、集束されたストリームに直交し、そして互いに対向する方向に流れる。トラップが、ストリームが分割する場所の下の流れストリームの点に配置され、その結果、流れの速度は、チャネルの残りにおけるより低くなり、それ故、保持された細胞が生存している可能性を増加する。一旦、十分な数の細胞が捕捉されると、バルブ７は閉鎖され、ウェルＡからの細胞の流れを停止する。
【０１８２】
（システムプロトコール）
システム２５０は、配置されおよび／または保持された粒子を含む任意の適切なプロトコールまたは手順のために用いられ得る。例示のプロトコールでは、細胞は、以下に記載されるように、ウェルＤおよび／またはＥ中で試薬に曝される。このプロトコールは、それぞれ、死滅／固定細胞に特異的な細胞染色ならびに細胞固定液のような第１および第２の試薬への保持細胞の連続的曝露により例示される；図９〜１１を参照のこと。
【０１８３】
このシステムは、以下のように灌流について準備される。第１にバルブ８が閉鎖され、その結果、ウェルＢからの集束緩衝液の流れは、もはや保持チャンバ２７０に隣接して分割されない。その結果、集束緩衝液は、分岐されない一次流れストリーム３１４に沿って優勢にまたは排他的に移動する（図５を参照のこと）。次に、バルブセット３５４、３５６をコントロールするポンプが作動され、そして全体プロトコールを通じて稼動する。バルブ閉鎖のために適切な周波数は約６０Ｈｚである。
【０１８４】
遮蔽緩衝液流れは以下のように開始される。最初に、バルブ７〜１１は閉鎖位置にあり、その結果、集束緩衝液のみがウェルＢから廃棄ウェルＣに向かって流れる。次に、バルブ１１が開放され、その結果、蔽緩衝液が、ＦからＣに流れ、そして集束緩衝液がＢからＣに流れる。
【０１８５】
この場合トリパンブルーである第１試薬の流れは、以下のように開始される。バルブ９が開放され、その結果、流体は、バルブ９および１１の両方を通じて流れる。バルブ７、８、および１０は、それらの閉鎖位置に維持される。遮蔽緩衝液が流れているので、第１の試薬は、遮蔽緩衝液によって細胞保持チャンバから間隔がある。従って、この構成は、システムに灌流の準備をさせ、そして細胞を第１の試薬および第２の試薬のいずれかに曝すことなく流体ネットワークを洗浄するために用いられ得る。
【０１８６】
第１の試薬の灌流は、以下のように開始される。一旦、流体ラインが第１の試薬で洗浄されると、遮蔽緩衝液がオフにされ、そして細胞は、既に流れている第１の試薬に迅速に曝される。詳細には、バルブ１１が閉鎖され、既に閉鎖されたバルブ７、８、および１０に合わさる。対照的に、バルブ９は開放されたままである。このようにして、遮蔽緩衝液は、第１の試薬および細胞保持チャンバの流れストリームをもはや分割せず、第１の試薬に細胞を灌流させる。
【０１８７】
適切な曝露時間の後、第１の試薬は以下のように細胞保持チャンバから洗浄される。バルブ１１が開放され、遮蔽緩衝液の流れを再開する。さらに、バルブ９が閉鎖され、第１の試薬の流れを停止し、既に閉鎖されているバルブ７、８および１０に合わさる。いくつかの場合には、バルブ９は、開放されたままであり得、短い時間間隔に亘って第１の試薬への細胞の繰り返し曝露を容易にする。図９は、固定細胞を染色する色素トリパンブルー、およびこの色素を洗い流す遮蔽緩衝液への曝露後の保持チャンバ２７０中の約１２のＪｕｒｋａｔ細胞３８０を示す。残渣３８２は染色されるが、細胞３８０は染色されない。
【０１８８】
この場合メタノールである第２の試薬の流れは、以下のように開始される。バルブ１０は開放され、既に開放されているバルブ１１に合わさる。バルブ７、８、および９は閉鎖されたままである。この構成を用いて、第２の試薬で、捕捉された細胞をこの試薬に曝すことなく流体ネットワークを洗浄する。
【０１８９】
第２の試薬の灌流は、以下のように開始される。バルブ１１が閉鎖され、遮蔽緩衝液の流れをオフにし、既に閉鎖されたバルブ７、８、および９に合わさる。バルブ１０は開放されたままであり、細胞３８０を、この場合メタノールである第２の試薬に曝し、それ故細胞を固定する。図１０は、メタノールで灌流される細胞３８０を示す。メタノール３８６と集束緩衝液３８８との間には、それらの別個の屈折率によって引き起こされる光学的に検出可能な境界３８４がある。
【０１９０】
適切な曝露時間の後、第２の試薬は、以下のように、細胞保持チャンバから洗浄される。バルブ１１が開放されて遮蔽緩衝液の流れを開始する。対照的に、バルブ１０が閉鎖され、既に閉鎖されたバルブ７、８、および９に合わさる。
【０１９１】
細胞３８０は、次に、第１の試薬に第２回目に曝され、次いで、遮蔽緩衝液で以下のように洗浄される。バルブ操作のシークエンスは、上記に記載のようであるが、バルブ９は、遮蔽緩衝液での洗浄の間開放したままであり、第１の試薬の遮蔽された流れ経路を示すことが異なる。ここで、細胞は固定され、そしてメタノールにより透過処理されているので、それらは、第１の試薬中で運搬される色素で染色される。図１１は、トリパンブルーへの第２番目の曝露および次の遮蔽緩衝液での洗浄後、青に染色された細胞３８０を示す。トリパンブルーである第１の試薬の遮蔽された流れ経路３９０は、遮蔽緩衝液３９２および集束緩衝液３８８の間に集束して見える。
【０１９２】
本明細書に示される微小流体システムは、細胞の小集団に対して化合物をスクリーニングするような任意の適切なアッセイのために用いられ得、小集団のサイズは、統計学的に細胞挙動の代表であるように選択される。これら粒子は、特に、細胞および／またはビーズを含み得る。細胞は、微小流体システムによって提供される懸濁液中または基板に付着した非接着性および／または接着性細胞であり得る。同様に、ビーズは、非接着性または接着性であり得、そしてサンプル、試薬、および／または、特に、細胞を運搬するために用いられ得る。
【０１９３】
（実施形態２）
図１１Ａおよび１１Ｂは、分離されてはいるが近接する粒子間の相互作用を測定するためのシステム４００を示す。このような相互作用は、第１の粒子（または粒子集団）によって放出され、そして第２の分離された粒子（または粒子集団）によって受容される拡散可能な物質によって提供され得る。これらの拡散可能な物質は、細胞が分泌するホルモン、ウイルス粒子、細胞溶解により放出される細胞成分などを含み得る。この拡散可能な物質は、細胞同一性、遺伝子発現、アポトーシス、ホルモン分泌、成長などのような任意の測定可能な粒子または集団特徴に関連する第２の粒子または粒子集団中の変化を生成し得る。あるいは、または、さらに、このような伝達は、軸索および／または樹状突起のような、細胞から延びる長く薄いプロセスを含み得る。例示の粒子特徴は、上記のセクションＶＩＩＩおよびＸＩＩでさらに説明されている。
【０１９４】
システム４００は、システム２５０の２つのバージョンをテールとテールを並べる形態に配置することによって形成され得る。従って、各々の個々のサブシステム２５０は、保持メカニズム２６６、捕獲された粒子の各群に試薬を導入するための個々にコントロールされた灌流メカニズム２６８、およびこの保持メカニズムに粒子および／または緩衝液を運搬するためのインプット流れストリーム２７４を含み得る。しかし、システム４００はまた、各保持メカニズム２６６と保持チャンバ２７０との間の流体伝達を提供する伝達通路４０２を含む。
【０１９５】
伝達通路４０２は、各サブシステム２５０間で、一般に細胞である保持された粒子の移動を防ぐように構成されたサイズ選択的チャネルであり得る。しかし、通路４０２は、保持された粒子から放出される任意のより小さな物質（例えば、分子、ポリマー、分子複合体、および／またはウイルスのようなより小さな粒子）、または保持された細胞に延びるか、それらから延びるか、および／またはそれら間に延びる軸索および／または樹状突起のｐｒｏｃｅｓｓ移動または通過を可能にするように構成される。さらに、灌流メカニズム２６８は、通路４０２によって媒介される細胞−細胞伝達に対する試薬の効果を決定するために用いられ得る。
【０１９６】
図１１Ｂは、対をなす保持メカニズム２６６、システム４００中に含められ得るメカニズム４０４の代替の実施形態を示す。メカニズム４０４は、単一粒子４０８を捕捉する寸法である対をなす保持メカニズム４０６を含む。保持メカニズム４０６は、伝達通路４０２を通じて流体的にカップルされる。従って、単一細胞間の伝達は、メカニズム４０４を用いて分析され得る。
【０１９７】
（実施形態３）
図１１Ｃは、システム２５０、または保持された粒子の配置された二次元アレイを形成する任意のその他の適切な微小流体システムで用いられ得る保持メカニズム４１０を示す。メカニズム４１０は、入口チャネル４１４からの粒子を受容するよう配向された個々のトラップ４１２のアレイを含む。トラップ４１２は、粒子保持部位の二次元アレイを形成する。トラップ４１２は、本明細書で示されるようなねじれ型の行、直交して配置された行と列、または不規則形態を含む任意の適切な形態を有し得る。（いくつかの実施形態では、トラップ４１２のいくつかは、代替の平面中（例えば、図面の平面の前および／または後にある）に配置され得、保持された粒子の三次元アレイを形成する）。各トラップ４１２は、１つまたは複数の粒子を保持する寸法であり得、そしてサイズ選択的チャネルまたは類似の特徴を含み得、流体がこのトラップの一部を通過することを可能にする。トラップ４１８は、入口チャネルに加えて出口のないチャンバ内、または特に上記に記載の横方向チャネル３１６のようなチャネル内の、（上記のチャンバ２７０、または以下の実施例１０のチャンバ１９７０のような）単一または複数の出口チャネル４１８を有する共通チャンバ４１６内に配置され得る。
【０１９８】
（実施例３．粒子の並行保持および／または処理のための微小流体システム）
この実施例は、複数の粒子および／または試薬を、別個の横断領域および流路においてチャネルまたはフローストリーム内に配置する、微小流体メカニズムおよびシステムを記載する；図１２〜１３Ｋを参照のこと。この配置は、異なる粒子の、不連続ではなく隣接した部位での並行保持、および／またはこれらの部位での粒子の、別個の試薬への並行曝露を可能にし得る。
【０１９９】
（背景）
生物学的分析は、２つ以上の細胞または細胞の群の表現型を、類似の処理レジメンまたは別個の処理レジメンのもとで直接比較する能力から利益を得る。しかし、微視的世界において、このような細胞または細胞の群は、しばしば、不連続な、比較的広く広がった部位（例えば、異なる組織培養ディッシュまたはマイクロタイタープレートのウェル）において処理され、潜在的に、これらの細胞を、処置条件における望ましくない差異に曝露する。従って、このような分析は、意味のある結果を達成するために、多くの実験にわたって平均される必要があり得る。従って、微視的レベルにおいて互いに隣接した粒子または粒子の群を、配置し、処理し、そして分析する微小流体システムを有し、より一貫した、効率的な並列した比較を可能にすることが望ましい。
【０２００】
（説明）
この実施例に記載される微小流体システムは、複数の粒子（もしくは粒子集団）および／または試薬を、チャネルまたはフローストリーム内の不連続な、横方向に配置された流路または領域に沿って配置する。横方向に配置された流路は、粒子および／または試薬を保有する別個の入口チャネル（または入口フローストリーム）を合わせることによって、粒子および／または試薬を不連続な層流路に沿って、導入することによって、規定され得る。これらの流路は、互いに接し得るか、または１つもしくは複数のスペーサー流体（例えば、緩衝液）によって分離され得る。これらのスペーサー流体は、１つまたは複数の入口チャネルによって形成される、粒子および／または試薬を保有する入口チャネルの間に介在する１つまたは複数の介在する流路を辿り得る。
【０２０１】
横方向に配置される流路は、別個の（または類似の）粒子を、チャネル内の不連続な保持部位またはチャンバに運ぶために使用され得る。これらの不連続な保持領域は、別個の（または類似の）粒子を、同じ試薬への曝露のために保持し得る。例えば、別個の粒子は、これらの粒子の特徴（例えば、調節因子に対する応答、標識特徴など）を比較するために、調節因子および／または標識のような試薬に曝露され得る。従って、各保持部位の位置は、その位置に保持される対応する粒子を同定するために使用され得る。例えば、１つの保持部位は、参照としてコントロール粒子を保持するために使用され得、そして別の保持部位は、目的の粒子を保持するために使用され得、コントロール粒子および目的の粒子が直接比較されることを可能にする。あるいは、１つの保持部位は、試薬を保有するビーズを保持し得、そして別の部位は、分析されるべき細胞を保持し得る。次いで、このアプローチにおいて、細胞の溶解または分泌によって放出される細胞成分が、ビーズによって保持される試薬との相互作用について分析され得る。
【０２０２】
あるいは、またはさらに、横方向に配置された流路は、類似の（または別個の）粒子を別個の試薬に曝露して、各試薬または曝露された粒子を、位置に基づいて同定するために使用され得る。粒子は、位置が不連続な保持部位に保持され得、別個のレザバまたは単一のレザバのいずれかからインプットされ得る。次に、保持された粒子は、横方向に配置された流路によって、不連続な部位に保有される別個の試薬と接触され得る。横方法に配置された流路は、これらの粒子を導入する入口チャネルとは別個の、そして／またはこのチャネルと重なる、一連の入口チャネルによって形成され得る。保持される粒子の位置は、これらの粒子に曝露される別個の試薬の各々を同定する。いくつかの実施形態において、別個の試薬は、参照として働く既知の活性を有する化合物、および比較のための１つ以上の試験化合物を含有し得る。
【０２０３】
この実施例の微小流体システムは、粒子および／または試薬の比較分析のための、微小流体空間のより効率的かつより意味のある使用を可能にし得る。
【０２０４】
特定の実施形態において、２つの入口と１つの出口との間の接合は、粒子（好ましくは、細胞）を、選択された試薬と共に一時的に曝露または灌流するために使用され得る。プラスの試薬フローとマイナスの試薬フローとの間の入口フローを変化させることによって、出口の下流の条件が、両方の入口の間のフローの速度に比例して変化する。
【０２０５】
（実施形態１）
図１２および１３は、粒子の別々の集団を保持し、そしてこれらの集団を、１つ以上の選択された試薬に曝露するための、微小流体システム４２０（実施形態１）を示す。
【０２０６】
（実施形態１の説明）
システム４２０は、多層ソフトリソグラフィーによって、一般に、実施例２において上に（システム２５０について）および以下の実施例１３に記載されるように、作製される。ここで、粒子配置領域４２２は、赤色の長方形で、インプット／集束チャネル４２４は青色領域として、そして灌流チャネル４２６は赤色の線として、示される。各領域もしくはチャネルの寸法、および／またはチャネルの数は、とりわけ、粒子のサイズ、試薬送達体積、および／または保持される別々の集団の数に基づいて、選択され得る。
【０２０７】
システム４２０は、実施例２のシステム２５０と、いくつかの局面において異なる。第一に、システム４２０は、粒子を保持および導入するための、１つより多くのレザバを備える。従って、入口１および２（それぞれ４２８、４３０で示される）は、粒子インプットチャネル４３２、４３４に接続する。第二に、システム４２０は、３つの集束チャネル４３６、４３８、４４０、および緩衝液を保持するための対応するレザバまたは入口（図示せず）を備える。これらの集束チャネル（スペーサーチャネルともまた称される）は、粒子インプットチャネルを隣接または分離するために使用され得る。第三に、システム４２０は、１つより多くの保持チャンバ４４２を有し、このチャンバは、一般に、他の下方の合流点４４４（ここで、インプットされたフローストリーム４４６が統合される）に隣接して配置される。第四に、システム４２０は、保持チャンバ４４２を壁４４８から離し、従って、それぞれ近位に分岐したフローストリーム４５０および遠位に分岐したフローストリーム４５２を形成する。
【０２０８】
（実施形態１の適用）
システム４２０は、以下のように使用され得る。入口１および２に、粒子の別個の懸濁物（例えば、異なる細胞型）が充填され、そして集束チャネル４３６、４３８、４４０に対応する入口に、集束緩衝液が充填される。集束緩衝液のフローを集束チャネルに通して送達するポンプが始動される。入口１および２からの粒子の流れをコントロールするバルブが開かれる。粒子が合流点４４４に入るが、集束チャネルまたはスペーサーチャネルからの流れによって、図１３に示される、間隔を空けた断続的な層流ストリーム４５４、４５６に集束される。保持チャンバのアパチャー４５８、４６０は、それぞれ、粒子フローストリーム４５４、４５６と整列して、１つ以上の粒子を、対応するフローストリームから受容する。システム４２０における流体の層流の特性を利用することによって、５つのストリームが一緒に流れるが、実質的に別個のままである。これらの流体の混合は、拡散が制限されており、この拡散は、ビーズまたは細胞のような大きい粒子の拡散の場合には、非常にゆっくりである。
【０２０９】
図１３は、合流点４４４から分岐接合部４６２を通って延びる層流パターンを示す。集束フローストリーム４６４、４６６、４６８は、粒子ストリーム４５４、４５６に隣接し、そしてこれらのストリームを分離し、これによって、これらのストリームによって運ばれる粒子を、保持チャンバ４４２の方へと案内する。接合部４６２において、フローストリームは、保持チャンバ４４２の上方（４６４、４６８）、下方（４６６）、および／または内部（４７０）に分岐し得る。各保持チャンバ内のマイクロチャネル４７２は、流体を通すが、粒子を残す。
【０２１０】
十分な数の粒子が各保持チャンバ４４２に入った後に、これらの粒子の分析が開始し得る。入口１および２からのフローが終了され得、そしてフローが、実施例２のシステム２５０の作動について上に記載されたように、バルブ４７４を閉じることによって、分岐パターンから単一流路に変換され得る。次に、トラップされた粒子が、灌流チャネル４２６からの緩衝液／試薬で灌流され得る。システム４２０において、灌流チャネル４７６は、流体を、保持チャンバのすぐ上流に排出する。この構成は、上述の実施例２のシステム２５０よりもより迅速な試薬によるトラップされた粒子の、灌流を提供し得る。なぜなら、チャネル４７６の出口端部が、保持チャンバに非常に近く、集束緩衝液によって生じる均一な流路に、より直接的に供給するからである。
【０２１１】
システム４２０は、種々のパラメータを変更することによって、改変され得る。例えば、さらなる粒子集団または個々の粒子をトラップするために、粒子インプットストリームおよび／または集束ストリームの数が、保持チャンバの数とともに変化され得る。従って、３つ以上の粒子インプットストリームが、３つ以上の型の粒子を、３つ以上の保持チャンバにトラップするために使用され得る。これらの３つ以上の保持チャンバは、任意の適切な配置（直状および蛇行（例えば、三角形の構成）が挙げられる）で配置され得る。いくつかの実施形態において、保持チャンバのサイズが変化され得、例えば、その結果、１つのみまたは非常に少数のみの粒子が、各チャンバにトラップされる（この実施例の実施形態２、ならびに以下の実施例４〜７、１１、および１２を参照のこと）。さらに、以下に記載されるように、集束ストリームおよびスペーサーチャネルは、いくつかの場合には、粒子ストリームと保持部位との間での粒子の相互汚染が実質的になしで、排除され得る。
【０２１２】
（実施形態２および３）
図１３Ａ〜Ｃは、システム４２０の２つの代替の実施形態である、システム４８０（実施形態２）および４８０’（実施形態３）を示す。これらは、粒子を別々であるが隣接する部位で保持および処理するためのものである。上記システム４２０と同様に、システム４８０または４８０’は、１つまたは複数の粒子を、チャネル内での流れの方向を横断する不連続な位置に位置する、複数の保持部位の各々において選択的にインプットおよび保持するために使用され得る。しかし、システム４８０または４８０’はまた、保持された粒子を、別個の試薬と、不連続な保持部位において別々に接触させるために使用され得る。
【０２１３】
（実施形態２および３の説明）
システム４８０は、インプットメカニズム４８２、集束または横方向配置メカニズム４８４、保持メカニズム４８６、排出メカニズム４８８、複数の個々にコントロール可能かつ別個の処理メカニズム４９０、４９２、および放出メカニズム４９４を備える。図１３Ａおよび１３Ｂを参照のこと。
【０２１４】
インプットメカニズム４８２は、システム４２０について上に記載されたものと同様の、粒子インプットチャネル４９６、４９８、および集束またはスペーサーチャネル１７６２、１７６４、１７６６、を備える。粒子（例えば、細胞）が、インプットレザバ「細胞１」および「細胞２」から、粒子インプットチャネル４９６、４９８を介して、配置チャネル１７６８へとインプットされ得る。インプットメカニズム４８２はまた、集束流体またはスペーサー流体、好ましくは緩衝液を、緩衝液レザバ１７７０、１７７２、１７７４（それぞれ、「緩衝液１」、「緩衝液２」、および「緩衝液３」）から、それぞれのスペーサーチャネル１７６２、１７６４、１７６６を介して、配置チャネル１７６８へと導入し得る。
【０２１５】
横方向配置メカニズム４８４は、入口チャネルによって決定され得る。より具体的には、入口チャネル４９６、４９８、１７６２〜１７６６が配置チャネル１７６８と接合する相対的空間配置が、これらの入口チャネルのサイズおよび／または入口チャネルからの流量とともに、横方向配置メカニズム４８２を提供する。配置メカニズム４８４は、各入口チャネルからの各個々のフローストリームを、この空間的配置に基づく層流通路に配置する。従って、レザバ細胞１および細胞２からの粒子は、上でシステム４２０について記載されたように、入口チャネル１７６４からの緩衝液によって、配置チャネル１７６８内の中心で、互いから間隔を空けられ、そして入口チャネル１７６２、１７６６からの緩衝液によって、各チャネルから横方向に間隔を空けられる。
【０２１６】
保持メカニズム４８６は、複数の単一粒子保持部位（本明細書中で、「トラップＡ」および「トラップＢ」と称される）を備える（図１３Ｂを参照のこと）。トラップＡおよびトラップＢの各々は、２つの粒子レザバ細胞１および細胞２のうちの１つによって導入され、そして配置チャネル１７６８に沿った、対応して不連続な横方向配置で運ばれる、粒子を保持する；図１３Ｂを参照のこと。従って、トラップＡは、細胞１から導入された粒子を保持し、そしてトラップＢは、細胞２から導入された粒子を保持する。保持されない粒子は、保持メカニズム４８６を超えて排出メカニズム４８８へと、中心出口（廃液）チャネル１７７６または隣接出口（廃液）チャネル１７７８に沿って、運ばれ得る。
【０２１７】
処理メカニズム４９０、４９２は、保持された粒子の、別個の試薬（試薬１〜４として示される）への曝露を提供する；図１３Ｂを参照のこと。トラップＡに保持される粒子は、試薬１および／または試薬２（バルブＶ２およびＶ３によってコントロールされる）に曝露され、そしてトラップＢに保持される粒子は、試薬３および／または試薬４（バルブＶ６およびＶ７によってコントロールされる）に曝露され得る。これらの試薬は、任意の適切なメカニズム（例えば、上記実施例２および以下の実施例８に記載されるもの）を使用して、（連続的におよび／または同時に、任意の所望の割合で、任意の所望の時間にわたって）保存および送達され得る。各処理メカニズムからの試薬は、試薬フローストリーム侵入位置チャネル１７６８の横方向の配置によって、対応する保持部位に、別々にアドレスされ得る。試薬は、中心出口チャネル１７７６の方へと流れるが、層流に起因して、配置チャネル１７６８および横方向チャネル１７８０内のフローストリーム全体の不連続な部分を占有する。従って、処理メカニズム４９０からの試薬は、図１３Ｂの配置チャネル１７６８の左側（および従って、トラップＡ）に制限され得、一方で、処理メカニズム４９２からの試薬は、このチャネルの右半分（および従って、トラップＢ）に制限され得る。必要に応じて、中心レザバ１７７２（緩衝液２）からのスペーサー緩衝液が、処理メカニズムによって送達される試薬の間に流れ得、任意の試薬が、対応しない保持部位と交差し、従って対応する保持部位を汚染する可能性を、低下させる。
【０２１８】
放出メカニズム４９４は、保持された粒子を解放させる。解放後、解放された粒子は、さらに分析され得、そして／または収集され得、そして／あるいは保持部位は、別の回の処理および分析のために、新たなセットの粒子を受容し得る。放出メカニズム４９４は、バルブＶ４によって作動されて、保持された粒子を保持部位から推進する、局在化した逆流または追い出しフローを生じる。放出メカニズム４９４は、以下の実施例７に記載される放出メカニズムと類似している。しかし、以下に記載される放出メカニズムとは対照的に、本実施例の保持部位は、逆流チャネル１７８２から間隔を空けている。
【０２１９】
図１３Ｃは、システム４８０の改変されたバージョンであるシステム４８０’の、選択された部分を示す。システム４８０’は、少なくとも２つの局面において、システム４８０と異なる。第一に、保持メカニズム１７８４が、システム４８０の保持部位より大きい保持チャンバ１７８６、１７８８を備え、従って、複数の粒子を保持し得る。第二に、処理メカニズム１７９０、１７９２は、試薬を配置チャネル１８００ではなく、横方向チャネル１７９８に導入する試薬入口チャネル１７９４、１７９６を備える。この試薬入口チャネルの変更された位置は、試薬を保持粒子からさらに遠くに移動させるが、曝露後に、試薬を出口チャネル１８０２の方へと洗い出すことを容易にし得る。しかし、処理の間、入口チャネル１７９４、１７９６からの試薬は、依然として、中心出口チャネル１８０４に向かう流体フローの一般的な方向に対して横方向に位置する。従って、試薬入口チャネルは、試薬の層流に基づく局在を可能にする任意の適切な部位で、試薬を送達し得る。
【０２２０】
システム４８０および４８０’は、任意の適切な局面において改変され得る。例えば、粒子の単一の集団（例えば、単一のインプットレザバから）が、複数の不連続な保持部位（例えば、トラップＡおよびトラップＢ）に保持され得、次いで、これらの部位が別々に、別個の処理メカニズムによって導入される別個の試薬に曝露され得る。あるいは、またはさらに、処理メカニズムによって提供される入口チャネルおよび粒子インプットメカニズムは、共通の配置チャネル（例えば、配置チャネル１７６８または１８００）の上流で、重なるかまたは収束し得る。
【０２２１】
（実施形態２の適用）
システム４８０の例示的な作動が、細胞を使用して以下に記載される。システム４８０は、他の実施例に記載されるように、インプットレザバに、細胞および緩衝液を充填し、そしてチャネルを緩衝液で平衡化することによって、作動の準備がされ得る。
【０２２２】
トラップＡおよびトラップＢは、以下のように充填され得る：バルブＶ１、Ｖ４およびＶ５が開かれ、そしてバルブＶ２、Ｖ３、Ｖ６、およびＶ７が閉じられる。５つのレザバの各々から来る５つのフローストリームが、配置チャネル１７６８内のトラップＡおよびトラップＢの前で合流する。レザバ細胞１および細胞２からの細胞が、これらのそれぞれのトラップＡおよびトラップＢに方向付けられる。流体および保持されていない細胞は、保持部位を通って、分岐流路に沿って、複数の出口チャネル１７７６、１７７８の方へと流れる。
【０２２３】
一旦、細胞が各保持部位に保持されると、バルブＶ４は開いたままにされ、そしてバルブＶ１およびＶ５が閉じられる。バルブＶ１を閉じることによって、さらなる細胞のインプットを遮断し、そして横方向の緩衝液レザバ１７７０、１７７４からの流れを停止させる。バルブＶ５を閉じることによって、分岐フローを停止させ、その結果、緩衝液（中心緩衝液レザバ１７７２（緩衝液２）から）が、単一の通路に沿って、中心出口チャネル１７７６へと流れる。
【０２２４】
別個の試薬が、以下のように、保持された細胞へと送達され得る。バルブＶ４が開いたままにされ、そして他のバルブ全てが閉じたままにされる。両方のポンプが稼動している。バルブＶ２および／またはバルブＶ３は、開かれて、試薬１および／または２をトラップＡへとアドレスし得る。バルブＶ６および／またはバルブＶ７は、開かれて、試薬３および／または４をトラップＢへとアドレスし得る。バルブは、実施例８に記載されるように、部分的に開かれて、試薬の所望の混合物を提供し得る。レザバ１７７２からの緩衝液は、トラップＡおよびトラップＢを通って出口チャネル１７７６へと流れ、そしてトラップＡおよびトラップＢにアドレスされる試薬のストリームの間の障壁として使用され得る。任意の適切な時点で、バルブＶ５は閉じられて、保持された細胞を解放し得る。
【０２２５】
（実施形態２に従って製造されたチップを用いる例示的な結果）
システム４８０を、以下に記載されるように試験した。微小流体チップを、図１３Ａのシステム４８０に従って作製し、そして着色色素および／または蛍光色素を用いて、フローのパターンおよび粒子処理効率の分析のために使用した。
【０２２６】
図１３Ｄ〜Ｆは、各処理メカニズムを使用して導入される着色色素、および試薬を分離するための流動するスペーサー緩衝液によって形成される、色素パターンを示す。各図において、トラップＡは、１０μｍのビーズを保持し、そしてトラップＢは、２つの６μｍのビーズを保持する。図１３Ｄは、各処理メカニズムから送達される緑色色素、およびレザバ１７７２によって送達される、橙色色素で標識されたスペーサー緩衝液によって形成される、色素パターンを示す。橙色のスペーサー緩衝液は、２つの緑色色素を分離し、そして各緑色色素は、その対応する入口チャネル１８０６、１８０８から出口チャネル１７７６へと流れる。いくらかの緑色色素はまた、横方向チャネル１７８０に沿ってゆっくりと移動する。図１３Ｅは、処理メカニズム４９０から送達される赤色色素、メカニズム４９２からの緑色色素、および緩衝液レザバ１７７２からの橙色色素によって形成される、色素パターンを示す。図１３Ｆは、処理メカニズム４９０から送達される赤色色素、メカニズム４９２からの黄色色素、および緩衝液レザバ１７７２からの橙色色素によって形成される、色素パターンを示す。
【０２２７】
図１３Ｇ〜１３Ｊは、トラップＡおよびトラップＢの各々に捕捉された、単一のＪｕｒｋａｔ細胞の処理効率の分析を示す。図１３Ｇは、処理の前の、２つの保持された細胞１８１０、１８１２を示す。単一のＪｕｒｋａｔ細胞の処理効率の分析を示す。図１３Ｈは、各細胞の、別個の処理メカニズムによって送達されるトリパンブルー色素への曝露を示す。スペーサー緩衝液は、トラップＡおよびトラップＢを囲む２つの青色領域の間の流体１８１４の無着色カラムを形成する。両方の細胞の膜はインタクトであるので、いずれも、これらの色素で効率的に染色されない。図１３Ｉは、トラップＢにおける細胞１８１２が緩衝液でアドレスされている間の、トラップＡにおける細胞１８１０の、メタノールへの曝露（細胞を固定するため）を示す。図１３Ｊは、細胞１８１０の固定の後に、青色色素に曝露される２つの細胞を示す。細胞１８１０は、もはや青色色素を排除せず、そして青色に染色される。細胞１８１２は、メタノールに接触しておらず、そして染色されない。
【０２２８】
図１３Ｋは、スペーサー緩衝液が、粒子の充填および／または試薬への曝露の間に、粒子および／または試薬の相互汚染を防止するために、必要とされないかもしれないことを示す。各トラップは、蛍光ビーズ１８１６、１８１８を充填されている。それぞれ処理メカニズム４９０、４９２を使用して、ビーズ１８１６は、蛍光色素であるフルオレセインでアドレスされ、そしてビーズ１８１８は、トリパンブルーでアドレスされる。スペーサー緩衝液ストリームが、これらの２つの試薬ストリームを分離せず、これらの試薬は、実質的に交差せず、そして他のトラップを汚染しない。試薬（または粒子）が、それらの層流ストリームを横切って拡散する時間は、この層流ストリームがトラップＡおよびトラップＢを通過する前に接触する比較的短い時間によって、制限される。従って、分析は、スペーサーストリームありまたはなしで実施され得、ここで、スペーサーストリームは、相互汚染の可能性を低下させるために使用される。
【０２２９】
（実施形態４）
図１３Ｌは、粒子および／または試薬を、粒子トラップのセットに別々にアドレスするために使用され得る、微小流体システム１８２０の一部を示す。システム１８２０は、複数の直列に配列された、粒子トラップ１８２６のセット１８２２、１８２４を備える。各セット１８２２、１８２４は、流体フローストリーム（この場合、チャネル１８２８によって規定される）とは不連続な横方向部分に配置される。従って、粒子を運ぶ層流ストリーム（１８３０、１８３２）または試薬を運ぶ層流ストリーム（１８３４、１８３６）は、チャネル１８２８の不連続な横方向領域に分離され得、その結果、各セット１８２２、１８２４は、個々にアドレスされる。代替の実施形態において、トラップ１８２６は、横方向チャネル（例えば、チャネル１９７８）またはチャンバ（例えば、周囲にサイズ選択的チャネルを有する細胞チャンバ）内に配置される。
【０２３０】
（実施例４．アレイにおける粒子の多重分析のための微小流体システム）
この実施例は、粒子保持部位の直列して分布されるセットに粒子を充填し、そしてこれらの部位の各々に対して試薬を別個に並行してアドレスする微小流体システムを記載する；図１４〜１６を参照のこと。
【０２３１】
（背景）
細胞分析は、しばしば、細胞のアレイまたは細胞集団の使用を包含する。これらのアレイは、マイクロタイタープレート内に形成され得、その結果、このアレイ内の個々のウェルは、例えば、異なる試験化合物を用いて、異なって処理され得る。処理の間に、マイクロプレートアレイは、各個々のウェル内の細胞の特性を測定するために、多重に分析される。しかし、このようなアレイは、単細胞または細胞の小さい群が各ウェルに配置される場合、マイクロタイタープレートを用いて再現可能に形成することが困難である。マイクロタイタープレート内に形成される場合でさえも、このようなマイクロタイタープレート中の細胞の迅速な処理、およびこのような処理に短時間で引き続く測定は、かなりの技術的困難を提示する。従って、個々の細胞または細胞の小さい群の、より再現性のあるアレイを、別の位置で形成し、そしてこれらの異なる位置での細胞の分離、迅速な処理および分析を可能にする、微小流体システムが必要とされる。
【０２３２】
（説明）
この実施例は、粒子の小さいセットを、システム内の予め選択された位置に連続的にトラップし、トラップされた粒子の、所望の試薬での並行した処理を可能にする、微小流体システムを記載する。インプットされた粒子の連続したトラップに起因して、１つの入口への粒子の単一の充填が、トラップのアレイ全体に粒子を供給するために使用され得る。従って、この設計は、多数のトラップを単一のシステムに統合するために使用され得る。この微小流体システムはまた、必要とされるコントロールラインの数を減少させる。なぜなら、単一のコントロールラインが、トラップの各々と個々にインターフェースする流体チャネル（例えば、注入チャネル）のセットを調節するからである。従って、単一のコントロールラインが、トラップの各々への流体送達またはトラップの各々からの流体排出の、平行コントロールを提供する。このような並行コントロールは、各トラップによって保持される類似の粒子が、別個の試薬で個々に処理されることを可能にする。さらに、このような並行コントロールは、粒子充填の間、すべてのトラップが流体接続させるが、次いで、粒子の処理および測定の間、これらのトラップを流体的に隔離されることを可能にする。トラップのこの配置は、ハイスループットの薬物発見における使用に適切であり得る、大きな微小流体システムの製造を可能にする。例えば、システム５１０は、２×４ｃｍのフットプリントを有する。この密度をいくらか増加させ、そしてトラップの数を２０倍より大きく増加させることによって、少なくとも１２８個のトラップが、８×１２ｃｍの単一の基板上に配置され得、これらの１２８個のトラップの各々が、２つの別個の試薬（１つの基板あたり合計２４５の試薬）によってアドレスされることを可能にする。
【０２３３】
図１４は、粒子のアレイを形成および分析するための微小流体システム５１０を示す。システム５１０は、任意の適切な技術（例えば、多層ソフトリソグラフィー）によって、少なくとも２つの別個の層（（１）青色および橙色で示される微小流体ネットワーク層５１２、ならびに（２）桃色で示されるコントロール層５１４）を備えるように形成され得る。異なる幅および／または断面形状を有するチャネルが、例えば、実施例１７に記載されるように作製された鋳型を使用して、各層に形成され得る。
【０２３４】
微小流体層５１２は、２つの直交した方向のネットワークを備える。粒子充填ネットワーック５１６は、粒子をインプットおよび配置するために使用され、その結果、これらの粒子は、粒子トラップ５１８の直線状アレイに保持される。粒子処理システム５２０は、平行な個々の灌流ネットワーク５２２のアレイであり、これは、個々の粒子トラップ５１８において、充填ネットワーク５１６と交差する。
【０２３５】
粒子充填ネットワーク５１６は、入口５２４、出口５２６、およびこれらの間に延びる充填チャネル５２８を備える。入口ウェル５２４（Ｃで示される）は、ネットワーク５１６に導入されるべき粒子懸濁液を受容し、そして保持するレザバである。出口ウェル５１６（Ｗで示される）は、ネットワーク５１６を通して移動した流体および保持されない粒子を受容および保持する、廃液レザバである。充填チャネル５２８は、入口ウェル５２４と出口ウェル５２６との間で、チャネル５２８に沿って配置された複数の粒子トラップ５１８の各々に粒子を運ぶ。流体は、３バルブポンプ５３０（「ポンプ１」で示される）によって、ネットワーク５１６に沿って能動的に輸送される。このポンプは、ネットワーク５１６の末端近くに位置し、そしてこのネットワークを通して流体を引く。トラップの後にポンプを配置することによって、粒子が全ての粒子トラップ５１８を通るまで、もろい粒子に対する潜在的な損傷（例えば、閉じるバルブの圧縮に起因する）を遅らせる。
【０２３６】
各灌流ネットワーク５２２は、流体を、灌流入口５３２、トラップ５１８、および処理出口５３４の間で方向付ける。灌流入口５３２は、２つの主要な型のものである：緩衝液入口ウェル５３６（「Ｂ」で示される）および試薬入口ウェル５３８（「Ｒｘｙ」で示される）。緩衝液入口ウェルは、緩衝液または他の洗浄液もしくはメンテナンス液（例えば、水または溶媒）を保持する。粒子処理システム５２０内でのそれらの位置に基づいて、緩衝液入口ウェルは、末端入口ウェル５４０または中間入口ウェル５４２のいずれかである。末端入口ウェル５４０は、１つのみのトラップに流体を供給し、一方で、中間入口ウェル５４２は、２つの隣接するトラップの間で共有される。これらが中間入口ウェルであるか末端入口ウェルであるかに基づいて、緩衝液入口ウェルは、主ストリームおよび／または遮蔽ストリームを供給する。これらの２つのストリームのコントロールおよび機能は、以下でさらに詳細に記載される。試薬入口ウェルは、個々のトラップに正確に曝露され得る２つ（以上）の試薬（または試薬混合物）の１つを保持する。試薬入口ウェルは、「Ｒｘｙ」で示され、ここで、「ｘ」は、トラップ５１８のアレイに関連するトラップの割当てを表し、そして「ｙ」は、与えられたトラップに方向付けられ得る２つの試薬のうちの１つを表す。例えば、試薬入口ウェルＲ１２は、複数のトラップのうちの第一のもの（入口Ｃに最も近い）に、そのトラップのために選択された２つの試薬のうちの第二のものを供給する。各トラップ５１８を通過する流体は、対応する処理出口ウェル５３４または廃液ウェル（ここではＷ１〜Ｗ６で示される）に方向付けられ得る。例えば、試薬入口Ｒ４１およびＲ４２からの試薬は、トラップ番号４を通過し、そして／または通り、そして-廃液ウェルＷｘ（ここで、ｘ＝４である）に収集される。
【０２３７】
コントロール層５１４は、灌流入口ウェル５３２からの流体フローを、多くの流体チャネル５４４に並行して作用する制限された数のコントロールラインで調節する；図１４および１５を参照のこと。３バルブポンプ５４６「ポンプ２」は、灌流入口ウェル５３２から延びる全ての入口チャネル５４４と同時に作用して、これらの入口ウェルからトラップ５１８へ、そしてトラップ５１８を通して廃液出口ウェル５３４へと、流体を能動的に駆動する。４つの灌流バルブＶ１〜Ｖ４の各々の開放または閉鎖は、流体が、灌流システム内の特定の種類の入口チャネル５４４の各々を通って実際に流れるか否かを決定する。バルブＶ１は、複数の個々のバルブを備えるコントロールライン５４８を調節し、これらのバルブの各々は、入口チャネル５４４の間に備えられる対応する複数の集束チャネル５５０の上に配置される。同様に、バルブＶ２は、複数の第一の試薬チャネル５５４の各々をコントロールするバルブを備えるコントロールライン５５２を調節し、バルブＶ３は、対応する複数の第二の試薬チャネル５５８の各々をコントロールするライン５５６を調節し、そしてバルブＶ４は、対応する複数の遮蔽チャネル５６２の各々をコントロールするライン５６０を調節する。従って、バルブＶ１〜Ｖ４の各々の開放または閉鎖は、複数のトラップの各々への個々の入口のフローに対する、単一の並行したコントロールを提供する。
【０２３８】
図１５は、切り換えバルブの設計および原理をより詳細に説明するために、トラップ２、３、および４を備えるシステム５１０の一部を示す。絶縁バルブ５６４は、コントロール層において、粒子充填ネットワーク５１６と粒子処理システム５２０との間の切り換えを媒介するように機能する。絶縁バルブＶ５は、充填チャネル５２８に沿ったフローを、粒子入口５２４（入口Ｃ）およびトラップの下流の位置でブロックするバルブのセットをコントロールする。従って、バルブＶ５の始動は、各トラップを流体的に隔離し、そしてシステム５１０を、粒子充填構成から灌流構成へと変換する。対照的に、絶縁バルブＶ６は、各個々の処理出口５３４へのフローをブロックするバルブのセットをコントロールして、バルブＶ６が閉じている場合、粒子充填の間に処理出口への粒子の分岐を防止する。従って、バルブＶ５およびＶ６は、システム５１０の並行対直列の使用の主要な決定因子である。
【０２３９】
図１５および１６は、充填メカニズムの詳細を示す。充填チャネル５２８は、分割された流路５６４を、各トラップ５１８において形成する。従って、粒子ストリーム５６６は、各トラップ５１８のすぐ上流で、Ｔ字型接合部５６８において、分割された流路５６４に従って分岐し、次いで、収束して、再統合された粒子ストリーム５６６を形成する。各Ｔ字型接合部５６８において、粒子のサブセットは、分割した流路５６４に従わず、その代わりに、フローは、トラップ５１８へと直接流入する。従って、各トラップは、実施例２で上記されたように、分岐フローメカニズムを使用して充填されるが、システム５１０においては、チャネル５２８内での集束粒子フローへの粒子充填の間、収束緩衝液ストリームを使用しない。この実施例において、トラップ５１８は、実施例２の図５〜８の保持チャンバ２７０に類似の保持チャンバを備える。しかし、任意の適切なトラップ（例えば、実施例４〜７、１１、および１２において以下に記載されるような、単一粒子トラップ）が、使用され得る。
【０２４０】
トラップされた粒子の引き続く灌流は、実施例２のものと類似のシールディングメカニズムおよび灌流メカニズムを使用する。各緩衝液入口５３６からの緩衝液のフローは、図５の集束緩衝液ストリーム３１４に類似の、図１６に破線の通路として示される、集束チャネル５５０に沿って流れて充填チャネル５２８に入り、そして統合された流路５７２内のトラップ５１８を通過する。統合された流路５７２は、種々の機能（例えば、処理の間のトラップされた粒子の浸漬、灌流の間のトラップされた粒子に対する保持力の提供、ならびに流入する試薬および遮蔽緩衝液の、それらの層流ストリームでの、トラップされた粒子への集束）を実施し得る。同様に、組み合わせられた第一および第二の試薬チャネル５５４／５５８、ならびに遮蔽チャネル５６２は、実施例２において上記されたように、第一の試薬および第二の試薬に対する正確な曝露を決定する。
【０２４１】
（適用）
システム５１０の、粒子を充填し、そして粒子を異なる試薬に曝露するための例示的な使用が、以下に記載される。システム５１０は、この詳細な説明における他の箇所で記載されるように形成され、そして使用について読み取られる。
【０２４２】
トラップ５１８の各々への粒子の充填は、以下のように実施され得る。バルブ１から４および６が閉じられ、そしてバルブ５が開かれる。ポンプ１は作動しており、そしてポンプ２は作動していない。緩衝液入口ウェルＢ（５３６で示される）に緩衝液が充填され、入口ウェルＲｘｙの各々に試薬が充填され、そして入口ウェルＣに細胞懸濁液が充填される。廃液入口ウェル５２６が空になったことを確認した後に、ポンプ１に、粒子をトラップへと引かせる。
【０２４３】
充填構成から灌流構成への変換は、以下のように実施され得る。一旦、各々のトラップがその所望の占有率を有し、および／または充満すると、ポンプ１が停止され、バルブＶ５が閉じられる。ここで、各トラップが隔離される。次いで、バルブＶ６が開放され、廃棄出口ウェル５３４への流体接近を可能にする。次いで、バルブＶ１が開放され、各入口ウェル５３６からの緩衝液の流れを可能にする。
【０２４４】
トラップされた粒子は、第１の試薬および第２の試薬の各々と共に、以下のように灌流される。ポンプ２が始動され、約６０Ｈｚの周波数で作動する。このポンプは、以下の処理を通して作動する。ポンプ２のポンピング作動は、集束チャネル５５０を通して、単一流路５７２に沿って、各トラップ５１８を通過し、廃棄出口ウェル５３４に向かって緩衝液を駆動する。灌流の前に、バルブＶ２、Ｖ３およびＶ４が閉じられ、その結果、遮蔽チャネル５６２または試薬チャネル５５４、５５８に沿って流体は流れない、第１の試薬および遮蔽緩衝液の流れは、バルブＶ３を閉じたままで、バルブＶ２およびＶ４を開くことによって開始される。このバルブ配置が使用され、トラップされた粒子が第１の試薬に曝露されることなく、流体ネットワークを洗浄する。なぜなら、遮蔽緩衝液が、トラップされた粒子から分離され間隔のあいた流路に、第１の試薬ストリームを指向するからである。一旦、流体ラインが各々の第１の試薬で洗浄されると、バルブＶ４が閉じられ、遮蔽緩衝液を停止し、第１の試薬の各々がトラップされた粒子に接触するのを可能にする。各第１の試薬に対する所望の時間の曝露の後、バルブＶ２が閉じられ、遮蔽緩衝液が試薬を洗い流すのを可能にし、迅速に曝露を終了する。トラップされた粒子は、各第２の試薬に対して、平行に曝露され得、続いて、Ｖ２の代わりにバルブＶ３を開放し、次いで閉鎖する工程を同等に繰り返され得る。代替の灌流ストラテジ−において、粒子は、バルブＶ２およびＶ３の両方を共に開放することによって、第１の試薬および第２の試薬の両方に対して同時に曝露され得る。さらに、粒子は、以下の実施例７に記載されるように、バルブＶ２および／またはＶ３を部分的に閉鎖することによって、任意の比率の第１および第２の試薬に対して曝露され得る。
【０２４５】
（実施例５．「細胞コーム（ｃｏｍｂ）」を使用して、粒子の列を形成し、分析するための微小流体デバイス）
この実施例は、少量の粒子（例えば、細胞）の列を形成し、分析するための微小流体デバイスを記載する；図１７〜２０を参照のこと。
【０２４６】
（背景）
多くの適用において、細胞分析チャンバの列（各チャンバは、同じ数の細胞を含む）を形成することが必要である。これらのチャンバにより、複数の実験（例えば、薬物スクリーニング）を、一定かつ比較可能な様式で平行して行うことが可能である。現在、標準的な分析は、細胞チャンバとしてマイクロタイタープレートのウェルを使用し、各ウェルに当量の細胞懸濁液を分配する。これらのチャンバのサイズ、従って分析される細胞の数は、これらの分析における空間、試薬、および細胞の使用を軽減するための努力に応じて、減少してきている。不幸なことに、これらの分析の結果は、ウェルあたりの平均細胞数が減少するにつれて、漸次的に変動しやすくなる。例えば、９６ウェルのマイクロタイタープレートを用いる場合、ウェルの底には、一般に、約３０００〜５０００個の細胞が存在する；３８４ウェルのマイクロタイタープレートを用いる場合、この数は、約１０００個の細胞に減少する；そして、研究者がより小さなアッセイ容量を求めるにつれて（例えば、１５３６ウェルのプレート）、この数は、さらに約２５０個の細胞のみにまで減少する。これらの小さな平均細胞数によって、ウェルの間の実際の細胞数には、最大２０％の変動が生じ得る。このような変動によって、検出される反応信号に大きな誤差が生じる。従って、ウェルあたりの細胞数が少量である場合、例えば、単一の細胞のアッセイを行う場合、または目的の細胞が限定的な供給状態にある場合には、マイクロタイタープレートは、細胞が、ウェルあたり等しい数で配置されているとみなされない限り、適当な細胞分析チャンバを提供しない。そのような場合でさえ、マイクロタイタープレートは、迅速な実験操作を行うためには欠陥がある。例えば、薬物による処置への初期の応答は、マイクロタイタープレートを用いて検出することが困難である。なぜなら、これは、添加および混合の工程が、非常に急速に行うことができないためである。そのため、多くの細胞分析は、少量の細胞の効率的な充填、迅速な処理、および分析のためのシステムを利用する。
【０２４７】
（説明）
図１７は、単一の粒子または粒子の小さなグループの列を形成するための、微小流体デバイス６１０を示す。デバイス６１０は、インプットチャネル６１２、廃棄チャネル６１４、およびインプットチャネルとチャネルとの間を延びる濾過チャネル６１６の列を備える。デバイス６１０はまた、各濾過チャネル６１６中に形成された一定体積の粒子チャンバ６１８、およびサンプル操作（下を参照のこと）のためのバルブの集合を備える。デバイス６１０は、「細胞コーム」と呼ばれ得る。なぜなら、これは、細胞（粒子）フローの経路が、コームの形状（チャンバ６１４が、コームの歯を示す）を有するためである。
【０２４８】
細胞コームの成分はそれぞれ、異なる機能を有する。インプットチャネル６１２は、インプット粒子（例えば、粒子６２０）を各濾過チャネル６１６に運ぶ。濾過６２２は、各濾過チャネル中に配置されるか、または各濾過チャネルと隣接する。濾過６２２によって、流体が廃棄チャネル６１４内を通過することが可能であるが、チャンバ６１８に対応する濾過チャネル６１６の一部に粒子６２０を保持する。
【０２４９】
濾過６２２は、これらの壁に対して濾過チャネル６１６の壁とは別の構成要素（単一または複数）、および／または、これらの壁と一体である構成要素（単一または複数）である場合、種々の形態を取り得る。例えば、フィルター６２２は、各チャンバ６１８に特異的であるか、あるいは、２つ以上または全てのチャンバ６１８によって共有される多孔性の膜によって形成され得る。あるいは、フィルター６２２は、濾過チャネル６１６内のより小さな「リーク」チャネルによって、あるいはポスト、障害物、または突起（濾過チャネル６１６の一部に延びるか、または濾過チャネルの端部に隣接して（ａｄｊｏｉｎｉｎｇ）、または隣接して（ａｄｊａｃｅｎｔ）配置される）によって、形成され得る。この小さなチャネルの直径、すなわちポスト／障害物の間隔によって、チャンバ６１８に保持される粒子のサイズが決定される。従って、これらの小さなチャネルの直径、すなわちこれらのポスト／障害物の間の最大間隔が、保持されるべき粒子の直径よりも十分に小さい限り、流体が廃棄チャネル６１４を容易に通過している間、粒子は、チャンバ６１８に制限される。さらに、フィルターを通る流体の通過によって、粒子のインプットチャネル６１２内への戻りを軽減または防止するために、保持力が提供される。
【０２５０】
各チャンバ６１８の容量および保持能力は、少なくとも部分的には、濾過チャネル６１６およびフィルター６２２によって規定される。濾過チャネル６１６に対してフィルター６２２の位置で結合している、濾過チャネル６１６の直径および長さが、チャンバ６１８の容量を規定する。従って、チャンバ６１８は、固定した数のインプット粒子６２０（例えば、単一の粒子）を受容するように寸法取りされ得る。このようなインプット粒子は、均質な細胞集団に由来する細胞のように、共通のサイズを有し得るか、または、それらは、血液に由来する細胞のように、一定の範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態において、濾過チャネル６１６の直径により、単一の粒子のサイズ選択的な保持が可能である。例えば、直径は、不均一な粒子集団中の特定の粒子（例えば、赤血球細胞）を受容するために、十分に大きいが、他のもの（例えば、白血球細胞）を除外するために、十分に小さいかもしれない。フィルター６２２もまた、上述のように、サイズ選択的に作用し、そのために、チャンバ６１８と組合わせた場合、個々の濾過チャネル６１６が、規定されたサイズ範囲内の単一の細胞を保持するように設計され得る。あるいは、個々の濾過チャネルは、２つ以上の細胞のグループ（各細胞は、フィルター６２２に保持される最小のサイズを有する）を保持するように設計され得る。
【０２５１】
デバイス６１０内の圧力差によって、粒子６２０に対する配置力および保持力が生成される。インプットチャネル６１２と廃棄チャネル６１４との間のフローによって、インプットチャネルと廃棄チャネルとの間に濾過チャネル６１６を挟んで、正の圧力差が生成される。結果として、粒子は、流体によってチャンバ６１８に運ばれ、非常に迅速に各チャンバを満たす。粒子がチャンバ６１８のいくつかまたは全てを満たした後で、バルブのセットが、各チャンバ６１８を単離するために使用され得る（以下を参照のこと）。特に、このようなバルブの閉鎖により、各細胞チャンバが、固定数の分析のための粒子を有する、孤立した反応チャンバに変換される。
【０２５２】
図１８〜２０は、バルブ、さらなるフィルター、および個々のチャンバ６１８の内容物を操作するためのデバイス６１０と共に、またはデバイス６１０に加えて使用され得る分析部位を示す。
【０２５３】
図１８は、デバイス６１０と類似するが、各チャンバ６３６と対向する別個の分析部位６３２を備えるデバイス６３０を示す。部位バルブ６３４は、分析部位６３２へのアクセスをコントロールし、１対のインプットバルブ６３６が、インプットチャネル６１２に沿って各チャンバ６１８を孤立させる。図１８の左のパネルは、バルブ６３４、６３６の各々についての充填形態を示す。ここで、部位バルブ６３４は、インプット粒子６２０が未成熟なままで分析部位に進入することを防止するために、閉じており（「Ｘ」で示される）、インプットチャネル６３６は、粒子が各チャンバ６１８にアクセルすることを可能にするために、開いている。図１８の右のパネルは、保持されている粒子６２０の分析部位６３２への再配置を示す。ここで、部位バルブ６３４は、開いているが、インプットバルブ６３６は、閉じている。濾過チャネル６１６を挟んで、インプットチャネルではなく廃棄チャネル６１４から流体が逆に流れることによって、粒子６２０がチャンバ６１８から取り除かれる。インプットバルブ６３６は閉じているので、流体および粒子６２０は、インプットチャネル６１２へ、そして分析部位６３２内へと一方向に流れる。粒子６２０が分析部位６３２に送達された後で、部位バルブ６３４が閉じられ、粒子を他の粒子から流体的に孤立させる。他の実施形態において、さらなる流体ラインが、試薬を分析部位６３２へと送達するために使用され得るか、または分析部位６３２が、このような試薬で予め充填されたブラインドチャネルであり得る。
【０２５４】
図１９は、図１８のデバイス６３０と類似するが、切替可能なフィルター６５２を備えるデバイス６５０を示す。切替可能なフィルター６５２は、閉じた濾過位置（左に示される）と開いた非濾過位置（右に示される）との間で切替えられ得る。粒子を充填した後で、粒子６２０を分析部位へと向けるために、切替可能なフィルター６５２が開かれる。このような切替可能なフィルターの設計により、濾過チャネル６１６を挟む１方向のフローが、粒子６２０を保持すること、および放出することが可能となる。従って、インプットチャネルからの流体フローは、保持の間の粒子を含む流体、および放出の間の粒子を含まない流体を用いて、保持および放出の両方を行う。粒子６２０を分析部位６５６へ向けるために切替可能なフィルター６５２が開く前は、廃棄バルブ６５４は閉じている。切替可能な／調節可能なフィルターは、バルブ膜上に形成されるサイズ選択的チャネルによって，形成され得る。この配置において、バルブ膜の変形により、コントロール層を介して発生する圧力によって、濾過位置の中へ、または濾過位置の外へとサイズ選択チャネルが移動させられる。代替的に、または付加的に、サイズ選択性チャネルは、以下、実施例２６で記載されるように、バルブ膜に隣接するかもしれないし、またはその側方に配置されるかもしれない。
【０２５５】
図２０は、切替可能なフィルター６５２を有する別のデバイス６６０を示す。デバイス６６０において、廃棄チャネル６１４は、デバイス６５０の廃棄バルブ６５４の位置で機能する一連の廃棄フィルター６６２を備える。廃棄フィルター６６２は、粒子６２０を分析部位６６６に向けながら、廃棄物が廃棄チャネル６６４へと流れ落ちることを可能とする場合に、２つの機能を果たす。分析部位６６６の通路は、廃棄チャネルとして作用し得る。
【０２５６】
（適用）
この実施例で記載される細胞コームは、種々の適応において有用であり得る。例えば、細胞コームは、薬物の発見において有用であり得、細胞アッセイにおいてマイクロタイタープレートの代替物として作用し，細胞数のより緻密なコントロールを提供する。現在の技術を用いて、細胞コームデバイス中での各細胞チャンバの製造は、正確に行われ得る。そのために、細胞アッセイは、このデバイスを用いて形成された細胞の列を用いて、単一細胞アッセイと用いた場合でさえ、チャンバからチャンバへの信号の変動が軽減されて、行われ得る。細胞コームは、より一般的には、種々のミクロンサイズの粒子（細胞に加えて、例えば、蛍光的にまたは酵素的にコーティングされたビーズ）と共に使用され得る。このデバイスはまた、目的の粒子のサイズが濾過ユニットのポアサイズよりも大きい限りは、気相でも行われ得る。細胞コームはまた、連結され得、それによって、異なるサイズの物体が異なる段階で濾過される。
【０２５７】
（実施例６．粒子保持メカニズム）
この実施例は、対応する基板から間隔を置いた粒子トラップを使用して、粒子を保持するためのメカニズムを記載する；図２１〜２３を参照のこと。
【０２５８】
（背景）
微小流体システムの１つの目的は、後での処理および分析のために所定の位置で粒子を保持する能力である。このような保持機能を行うトラップは、それらが流体フローに対して最小の効果を有する場合に、最適に機能する；そうでなければ、このトラップの周りのフローのパターンが破壊され得、粒子および試薬のトラップ中への進入が遅れるか、または軽減される。上述の実施例１および２では、単一の粒子または粒子のグループを保持するために使用され得るトラップを記載する。しかし、これらのトラップは、このトラップそのものを通るフローを制限する。例えば、実施例１のトラップ１８０は、保持される単一の粒子のいずれかの側面上での交差フローを軽減または防止するブロックＰおよびＱを備える。同様に、実施例２の保持チャンバ２７０は、流体フローを実質的に制限し得る比較的狭い微小チャネル３００を備える。従って、試薬フローの流れまたは洗浄用フローの流れによって、より急速で、より効果的なアクセスを可能にしつつ、フローのパターンを破壊せずに、粒子のインプットフローの流れのより近くに配置され得る代替的なトラップについての必要性が存在する。
【０２５９】
（説明）
この実施例は、改良された粒子フロー特性を有する保持メカニズムを記載する。これらのメカニズムは、粒子フローの流れの下流に配置され、その位置の近くで、粒子フローの流れが、Ｔ接合部で分岐する。これらのメカニズムは、単一の粒子を捕捉するように寸法取りされる。しかし、代替的に、それらは２つ以上の粒子を捕捉するように寸法取りされる。例示される各保持メカニズム、特に配置メカニズム２６４および灌流メカニズム２６８に関連する微小流体システムが、実施例２で上述されている。この初期の実施例は、適切な流体フロー経路、ならびに配置メカニズムおよび灌流メカニズムの操作を記載する。しかし、この実施例で提供される保持メカニズムは、粒子分析のための任意の他の適切な微小流体メカニズムと組合せられ得る。
【０２６０】
（実施形態１）
図２１は、本発明の局面に従う、単一の粒子を配置、保持、および／または灌流するための微小流体システム７１０を示す。異なるフォトレジスト層から成形されたシステム７１０の部分は、上述のように（実施例の導入セクションを参照のこと）、異なる色で示される。保持メカニズム７１２は、遠位壁７１６から間隔を置いた関係でＴ−接合部の中央に配置されたトラップ７１３（青緑色で示される）を備える。ここで、右上のビュー７１８は、トラップ７１３の概略的な例示であり、断面図の視点で示されている；右の中間のビュー７２０は、保持メカニズム７１２の側部により近い水平断面図である；そして右下のビュー７２２は、保持メカニズム７１２の側部により近い垂直断面図である。トラップ７１３は、Ｕ形状ブロック７２６として、ルーフ７２４から下方向に延びる。このブロックは、単一の粒子のための保持部位として作用する、くぼみ７２８を備える。ブロック（この場合においては、ガラスで形成される）は、基材７３０へと延びるが、間隔を置いた関係のままであり（この場合においては、基材から約５μｍ離れている）、ブロックの全ての下に延びるフローチャネル７３２を形成する。従って、ブロック７２６は、その全体の底部表面７３４の下をフローが流れる可能性のある、鍾乳石ベースのトラップを形成する。
【０２６１】
（実施形態２）
図２２は、本発明の局面に従う、単一の粒子を配置、保持、および／または灌流するための別の微小流体システム７４０を示す。ビュー７４２は、システム７４０の色で標識された概略図を示し、一方、ビュー７４４は、ビュー７４２に従って形成された実際の微小流体システムの写真を示すが、水平方向に反転されている。システム７４０は、Ｔ接合部７１４の中央に配置されたトラップ７４６を備える。トラップ７４６は、遠位壁７１６から間隔を置いており、非常に迅速に試薬に曝露するために、保持された任意の粒子を灌流チャネル７４８のすぐ近くに配置する（灌流メカニズムのより完全な説明については、実施例２を参照のこと）。トラップ７４６は、トラップチャネル７５２の側方に位置し、トラップ７４６のエッジへと延びる、粒子を保持するための保持部位７５０（青緑色）を備える。従って、流体は、保持部位７５０に進入し、トラップチャネルを迂回して流れ得る。ビュー７５４は、トラップ７４６の構造を概略的に示す。トラップ７４６は、基材７３０へと下方向へ延び（基材７３０から下方向へ５μｍ延びる）、チャネル形成部７５８によって架橋される、３つの長方形のカラム７５６（ビュー７５４において破線の輪郭で示される）を備える。断面図７６２、７６４、７６６は、トラップ７４６の構造をより詳細に示す。
【０２６２】
（実施形態３）
図２３は、本発明の局面に従う、単一の粒子を配置、保持、および／または灌流するためのなお別の微小流体システム７９０を示す。システム７９０は、遠位壁７１６に接し、インプットチャネル７９６の下に集束された粒子の流れ７９４と並ぶ、粒子保持メカニズムであるトラップ７９２を備える。トラップ７９２は、保持部位７９８を備える。この保持部位７９８は、高さが２０μｍで、約５μｍで基材７３０から間隔を置いた保持ブロック８００の側方に配置されている。ビュー８０２は、トラップ７９２の線表示を示すが、遠位壁７１６の外の微小流体システムの一部８０４を含む。断面図８０６、８０８は、保持ブロック８００が、トラップの全底部表面８１４の下に延びるトラップチャネル８１２を形成しない場合に、どのようにして、遠位壁７１６およびチャネルルーフ８１０から外方向で、かつ下方向へ延びるのかを示す。従って、トラップ７９２は、鍾乳石のような構造をしている。
【０２６３】
ビュー８１６、８１８は、異なる焦点深度で撮った、２つのトラップ７９２の写真である。ビュー８１６において、焦点面は、基材表面の近くであり、角８２０に鋭利な線を示し、ここで、微小流体層８２２が基材７３０に接触している。ブロック８００の底部ペリメータ８２４は、底部表面８１４が基材７３０上で隆起しているので（ビュー８０６、８０８も参照のこと）、ぼやけている。ビュー８１８において、焦点面は少し高く（約５μｍ隆起している）、底部ペリメータ８２４に焦点におかれている。ここで、角８１８は、焦点の外である。
【０２６４】
（実施例７．再利用可能な微小流体システムのためのメカニズム）
この実施例は、微小流体システムの再利用を促進するメカニズム（粒子の放出、収集、および／または再懸濁のためのメカニズムを含む）を記載する；図２４〜２８を参照のこと。
【０２６５】
（背景）
微小流体システムは、しばしば、１回の使用のために設計される。このような１回の使用のためのシステムは、単一の細胞または複数の細胞を保持および分析するために使用され得るが、１個または複数個の細胞が、新たに導入される細胞の分析を妨害するので、その後、それらは再利用されないか、またはできない。従って、その後、これらの１回の使用のためのシステムは捨てられ、さらなる１回の使用のためのシステムが、さらなる分析のために初期化されなければならない。このアプローチは、１回の使用のためのシステムの効果的な使用ではない。さらに、このアプローチは、微視的な量の細胞および試薬を浪費し、初期化に時間がかかる。従って、分析の後で保持した粒子を放出し、さらなる分析のためにシステム（または細胞）を解放する、再利用可能な微小流体システムに対する必要性が存在する。
【０２６６】
（説明）
この実施例は、再利用可能な微小流体システムの形成を可能にする微小流体メカニズムを記載する。これらの微小流体メカニズムは、（１）粒子放出メカニズム、（２）粒子収集メカニズム、および（３）粒子懸濁メカニズムを備える。粒子放出メカニズムにより、一般的には、トラップ中での処理および／または分析の後で、粒子がトラップから取り除かれる。放出メカニズムは、任意の選択した時間に粒子をトラップの外へと駆り立てる力を提供する。粒子収集メカニズムは、放出メカニズムによって放出された粒子を収集するために使用され得る。収集された粒子は、培養され、測定され、処理され、および／または捨てられ得る。粒子懸濁メカニズムは、インレットウェルに定着する粒子を減少させ、その結果、インレットウェルの中への粒子の１回の充填により、一定時間にわたるインレットウェルからの比較的一定の粒子フローを生成する。これらの３つのメカニズムは、単独で、または任意の適切な組合せで、粒子分析のための微小流体システムの効率的で、経済的な使用を可能にする。
【０２６７】
（実施形態１）
図２４は、本発明の局面に従う、粒子放出メカニズム８５２および粒子収集メカニズムを有する微小流体システム８５０を示す。システム８５０の一般的な設計は、実施例２、およびこの「詳細な説明」の他の箇所に記載したとおりであり、粒子集束メカニズム８５６、粒子保持メカニズムすなわちトラップ８５８、および灌流メカニズム８６０を備える。これらの粒子集束および灌流メカニズムは、それぞれ配置メカニズム２６４および灌流メカニズム２６８（実施例２の図５に示される）と少なくとも実質的に等価である。システム８５０は、この「詳細な説明」の他の箇所に記載されるように形成され得る。システム８５０の各色付け領域の意味もまた上述されており、そのため、ここでは繰り返さない。
【０２６８】
図２５は、トラップ８５８をより詳細に示す。トラップ８５８は、単一の粒子を捕捉するために寸法取りされ、チャネル７５２を遠位壁７１６から間隔を置いて離すトラップ７４６とは対照的に、トラップ８５８は遠位壁８６４にチャネル８６２を配置するという点を除いて、上述の図２２のトラップ７４６と類似する。
【０２６９】
粒子の保持および処理は、本質的には、上で実施例２について説明された通りであるが、ここでは、少し異なるコントロール層８６６の操作が明確に説明される。コントロール層８６６は、バルブＶ１〜Ｖ４を備える。バルブＶ１は、上述の図８のバルブ８に対応し、分岐フロー経路と統一フロー経路との間を変換するために使用される。バルブＶ２は、粒子放出メカニズム８５２をコントロールする；その機能については以下に記載する。バルブＶ３はおよびＶ４は、それぞれ廃棄レザバ８６８および粒子収集メカニズム８５４への流体フローをコントロールする。粒子がトラップ８５８２充填されている間は、バルブＶ１、Ｖ２、およびＶ３は開いており、バルブＶ４は閉じている。灌流メカニズム８６０による試薬の送達の間は、バルブＶ１およびＶ４は閉じており、バルブＶ２およびＶ３は開いている。
【０２７０】
粒子放出メカニズム８５２は、任意の時間に、特に灌流メカニズム８６０の使用および／またはトラップされた粒子の測定の後で、粒子を放出するために使用され得る。放出メカニズム８５２は、フローを移動させて、保持されている粒子をトラップ８５８での閉じ込めから解放されるように駆り立てることによって作動する（図２４および図２５を参照のこと）。移動されたフローは、サイズ選択性チャネル８７２を使用してトラップ８５８に流体的に接続されたレザバチャネル８７０で始まる。サイズ選択的チャネル８７２は、粒子の侵入は予防するが、レザバチャネル８７０への流体、またはレザバチャネル８７０からの流体の通過を制限しない、直径を有する。
【０２７１】
サイズ選択的チャネル８７２を通り、従って、粒子が放出される流体フローは、バルブＶ２によってコントロールされる（図２４を参照のこと）。バルブＶ２は、レザバチャネル８７０上に配置されたコントロール層バルブである。バルブＶ２が閉じている場合、レザバチャネルが圧縮され、流体が、サイズ選択的チャネル８７２を通って、トラップ８５８へと外へと押し出される。これにより、トラップされた粒子が放出され、それらはトラップ８５８を出て、フローの流れ（例えば、図２５に示される主要なフローの流れ８７４）に入るように駆り出され、このフローの流れによって、粒子を運んで、トラップ８５８から離す。代表的には、使用時には、集束用緩衝液ポンプが駆動され、試薬バルブが閉じており、および、遮蔽緩衝液が流される。従って、主要なフローの流れが、緩衝液ウェルから細胞培養領域（下で記載する）へと進む。バルブＶ２が開いている場合、レザバチャネル８７０は、流体をサイズ選択的チャネル８６８の中へと運び、レザバチャネルを再充填する。
【０２７２】
（実施形態２）
図２６は、本発明の局面に従う、粒子のグループを保持および放出するためのシステム８８０を示す。システム８８０は、一般的に、システム８５０と類似するが（図２５と比較のこと）、いくつかの例外はある。第１に、トラップ８８２は、粒子のグループを保持し得る、トラップ８５８よりもはるかに大きな保持部位８８４を備える。従って、壁８８６は、実質的に交差チャネル８８８内に延び、それぞれの壁は、３つのサイズ選択的チャネル８９０を備え、トラップ８５８に存在する１つとは異なる。さらに、トラップ８８２は、トラップ８５８よりも広く、そのために、複数の放出チャネル８９２は、トラップ８８２中への閉じ込めから粒子を放出するために使用され、これも１つではない。第２に、トラップ８８２中の全ての粒子に、確実に試薬が効果的に送達されるように、灌流チャネル８９４は、移動されて、集束チャネル８９６から少し離れる。
【０２７３】
放出された粒子は、一般的に、任意のトラップのサイズまたは形態について、捨てられ得るか、またはさらなる処理および／または分析のために保存され得る。捨てられるべき粒子は、バルブＶ３を開き、バルブＶ１およびＶ４を閉じることによって、廃棄レザバ８６８に向かって運ばれ得る（図２４を参照のこと）。あるいは、保存されるべき粒子は、粒子の放出の間、バルブＶ４を開き、バルブＶ３およびＶ１を閉じることによって、粒子収集メカニズム８５４へ向かって運ばれ得る。従って、バルブＶ３およびＶ４は、各個々の粒子または粒子のグループを選択的に捨てるか、または収集するための選別メカニズム８９８を提供する。
【０２７４】
一旦、保持された粒子が放出されると、システム８５０は、別の粒子を捕捉するように用意され得る。これを終わらせるために、粒子放出の間にバルブＶ４が開いている場合には、バルブＶ４は閉じられ、バルブＶ１、Ｖ２およびＶ３が開かれる。次いで、システム８５０は、別の粒子を受容するように用意する。
【０２７５】
（実施形態３）
図２４はおよび２７は、本発明の局面に従う、粒子収集メカニズム８５４を示す。収集メカニズム８５４は、インレットチャネル９０４、保持領域９０６、濾過チャネル９０８、およびアウトレット９１０を備える。インレットチャネル９０４は、放出の間にバルブＶ４が開いている場合、放出された粒子を保持領域９０６に向かって運ぶ。流体は、濾過チャネル９０８を通過することによって、保持領域９０６を通って、アウトレット９１０へと流れ、この濾過チャネル９０８は、放出された粒子が、アウトレットへと流れるのを防止するサイズ選択的チャネルとして作用する。従って、放出された粒子は、保持領域９０６に収集される。収集された粒子が細胞である場合、保持領域は、細胞を培養し、細胞の成長、分化、および／または、処理（例えば、灌流メカニズム８６０による処理）への応答を促進させるために、使用され得る。あるいは、保持領域は、粒子の分析のための測定システムに作動可能に接続され得るか、および／または、粒子の溶解またはさらなる処理の部位であり得る。いくつかの実施形態において、インレットチャネル９０４は、他のチャネル（示さず）に接続され得、それによって、試薬が、トラップ８５８での粒子の保持、処理、および分析から分離された保持領域９０６に導入されることを可能にする。代替的に、または付加的に、試薬は、灌流メカニズム８６０および／または収束チャネル８９６によって、導入され得る。保持領域９０６に収集された粒子は、粒子をインレットチャネル９０４へと運ぶための逆向きのフローによって、または収集メカニズム８５４を形成し、その結果、１つまたは複数のバルブが濾過チャネルのいくつかを変位させることによって、放出され得る。
【０２７６】
（実施形態４）
標準的な粒子インプットメカニズム（例えば、図８のインレットウェル３３０）は、一回の使用のための微小流体システムのために重要である。しかし、これらのメカニズムは、再利用可能なシステムにとって不適切であり得る。再利用可能なシステムでは、分析の開始において、粒子の懸濁液を１つまたは複数のインレットレザバ中に充填し、次いで、その同じ懸濁液を複数の粒子の充填および粒子の分析のための供給源として使用することが、望ましいかもしれない。不幸なことに、このような拡張した分析の間、粒子は、代表的には、懸濁液の外に定着し、その結果、その粒子のインプット濃度は経時的に減少し、粒子を充填するために必要である時間の量が増大する。従って、延長分析の間にインレットレザバに懸濁液の粒子を維持し、この懸濁液からの粒子の充填および分析の繰り返しを可能にするためのメカニズムについての必要性がある。
【０２７７】
図２８は、再利用可能な微小流体システム（例えば、上述のシステム８５０および８８０）に統合され得る粒子懸濁メカニズム９２０を示す。この懸濁メカニズムは、粒子が懸濁液中に維持されることを補助する、および／または、再利用可能な微小流体システムによる分析の間に定着した粒子を再懸濁することを補助する。メカニズム９２０は、インレットレザバ９２２、再循環チャネル９２４、およびポンプバルブ９２６を備える。インレットレザバ９２２は、分析の間に粒子を受容し貯蔵する。従って、レザバ９２２は、微視的世界と連絡相互し得る。再循環チャネル９２４は、各端部９２８でレザバの底と接合されているが、中間部９３０ではレザバから間隔を置いている。ポンプバルブ９２６は、コントロール層によって調節されており、この「詳細な説明」中のどこかに記載されているように、再循環チャネル９２４を通る蠕動性のポンプ流体に協調されている。従って、レザバ９２２中の流体は、レザバ９２２から流れ、次いでレザバ９２２に戻り、循環的に機能して、レザバ９２２の内容物を混合し、従って、粒子を懸濁液中に維持する。それにより、一定期間にわたり、より安定な濃度の粒子が、アウトレット９３２から流れる。
【０２７８】
（実施例８．調整可能な試薬送達のための微小流体メカニズム）
この実施例は、一定の範囲の試薬濃度（例えば、勾配として）で、試薬が粒子に送達され得るように試薬を調節可能に希釈するためのメカニズムを記載する；図２９〜３０を参照のこと。
【０２７９】
（背景）
細胞の研究は、細胞が一定の範囲の試薬（例えば、薬物）にどのように応答するのかを決定するために、頻繁に、用量応答分析を伴う。これらの用量応答分析は、種々の定性的情報および／または定量的情報を決定するために使用され得、有効用量、反応用量の半分の最大値、致死用量、より特異的な応答を生じるための用量などが挙げられる。多くの分析において、目的の試薬は、高濃度のストック溶液として調製され、次いで、種々の容量の試薬が調合され、一定の範囲の用量を提供する。しかし、このアプローチは、微小流体システムに適していないかもしれない。なぜなら、微小流体システムにおいて、一定量を調合することは現実的ではないかもしれないためであり、および混合するために混合器が必要であるかもしれず、従って、このような調合された体積が希釈されるかもしれないためである。従って、少数の試薬ストックを用いて、予め混合された試薬を一定の範囲の選択した濃度で調合する、微小流体メカニズムの必要性が存在する。
【０２８０】
（説明）
この節は、独立コントロール（実施形態１）および協働コントロール（実施形態２）を有する、２つの例示的な希釈メカニズムを記載する。
【０２８１】
（実施形態１）
図２９は、本発明の局面に従って、第一の試薬および第二の試薬を、ある範囲の濃度で混合するための調節可能な希釈メカニズム９６０を示す。希釈メカニズム９６０は、第一および第二の試薬レザバ９６４、９６６、ならびにこれらのレザバのための出口として働く、第一および第二のコントロール可能なフローチャネル９６８、９７０を有する、微小流体層９６２を備える。このコントロール可能なフローチャネルは、接合部９７２において狭くなり、そして合流して、共通の混合チャネル９７４を形成する。試薬は、混合または拡散チャネル９７４において、一般に、隣接するフローストリームへの試薬の拡散によって、混合される。従って、混合チャネル９７４は、フローチャネル９６８、９７０よりかなり狭く、一般に、約１〜２０μｍである。対照的に、フローチャネル９６８、９７０は、バルブによってコントロールされるために十分に広く、弓形の断面を有する。ここで、各レザバからの流体フローは、コントロール層９７６によって、３バルブポンプ９７８および遮断バルブ９８０を介して、独立してコントロールされる；しかし、他の実施形態における流体フローは、他のコントロールメカニズムによってコントロールされ得る。
【０２８２】
希釈メカニズム９６０は、各ポンプが流体をフローチャネル９６８、９７０を通して移動させる速度に基づいて、第一の試薬Ｒ１および第二の試薬Ｒ２を、所望の比で混合するために使用される。従って、試薬Ｒ１は、ポンプ９７６および９７８をそれぞれ１：０、１：１、１：４、１：９、および０：１の相対ポンピング流量で作動させることによって、例えば、レザバ９６４の濃度の１００％、５０％、２０％、１０％および０％で導入され得る。バルブ９８０は、以下に記載されるように、ポンプをオーバーライドするため、および／または特定のポンプ速度の効果を改変するために使用され得る。コントロールを改善するために、調節可能な希釈メカニズムは、ポンプ速度の比較的正確なコントロールおよびコントロール層における多数のコントロールラインを使用し得る。
【０２８３】
（実施形態２）
図３０は、本発明の局面に従って、第一の試薬および第二の試薬をある範囲の濃度で混合するための、別の調節可能な希釈メカニズム９９０を示す。希釈メカニズム９９０は、同じ番号付けを有する構成要素によって示されるように、希釈メカニズム９６０と同様に構成される。しかし、希釈メカニズム９９０は、単一のポンプ９７８（一般に、一定のポンピング速度である）を使用して、両方の試薬のフローを協働して駆動する。さらに、メカニズム９９０は、遮断バルブではなく、調節バルブ９９４、９９６を使用する。調節可能なバルブの閉鎖は、調節可能なバルブを変形させるために使用される圧力を調節することによって、コントロール可能である。従って、各調節可能なバルブは、適切な圧力を用いて独立して調節され、フローチャネル９６８、９７０に対する所望の部分的閉塞、ならびに従って、拡散チャネル９７４における所望の流量および試薬混合を提供し得る。第一の試薬の単純な希釈は、第二の試薬として、適切な溶媒または緩衝液を使用することによって、実施され得る。
【０２８４】
（適用）
上記希釈メカニズムは、任意の適切な適用のために、任意の適切な微小流体デバイスの部品として使用され得る。例えば、希釈メカニズム９９０は、実施例２の図８における微小流体システム２５０において使用されて、実験的に決定された圧力をバルブ９および１０に提供することによって、粒子の灌流のための試薬の所望の混合物を調製および送達し得る。
【０２８５】
（実施例９．遠心力に基づく微小流体選別メカニズム）
この実施例は、粒子を、その質量、密度、および／または他の特性に基づいて選別するためのメカニズムを記載する；図３１〜３８を参照のこと。
【０２８６】
（背景）
粒子の微小流体分析は、粒子の粗製または不均一のインプット集団を、それらの成分に選別することから利益を得ることができるか、またはこの選別を必要とさえし得る。例えば、インプット集団は、単細胞の混合物、細胞クラスター、および／または細胞細片であり得る。あるいは、またはさらに、インプット集団は、別個の細胞型の混合された集団であり得る。これらの場合に、選別は、クラスターまたは細片から単細胞を分離し得、そして１つの型の細胞を別の型の細胞から分離し得る。光学システムが、個々の粒子を、それらの異なる光学特性（例えば、蛍光強度）に従って能動的に選別するために使用され得る。しかし、これらの光学システムは、インプットされる粒子が一定してモニタリングされ、そして光学特性に基づいて、別個の選別ビンに能動的に方向付けられることを必要とする。従って、別個の粒子を、潜在的に受動的に、別個の粒子の異なる物理的特性に基づいて分離する、微小流体システム選別メカニズムに対する必要性が存在する。
【０２８７】
（説明）
この実施例は、粒子の間の物理的差異（例えば、とりわけ、質量、密度、形状、および／または表面特性）に基づいて、粒子を能動的に選別するためのメカニズムを記載する。これらのメカニズムは、受動的であり、能動的なモニタリングおよび切換えではなく、方向の鋭利な変化の間に流動する粒子に対して付与される遠心力を利用する。これらのメカニズムは、バルブおよび他の機能的メカニズムを欠く、単純化された流体システムの一部として記載および実証される。その代わりに、流体は、これらのシステムを、インプットレザバおよび排出レザバにおいて異なる高さを有する液体カラムによって生じる、圧力差によって移動する。しかし、これらの選別メカニズムは、任意の適切な微小流体システムに統合され得る。
【０２８８】
（実施形態１）
図３１および３２は、本発明の局面に従って、粒子の間の物理的差異に従って粒子を分離する、選別メカニズム１０２２を有する微小流体システム１０２０を示す。ここで、メカニズム１０２２は、粒子を、入口レザバ１０２４から、３つの出口または選別チャネル１０２６へと選別する。これらの選別チャネルは、別個の出口レザバ１０２８（出口１〜３で示される）に導く。この実施形態の選別チャネルは、約５０μｍの最小幅および約１７〜１８μｍの高さを有する。しかし、より一般的には、メカニズム１０２２は、任意の適切な寸法で形成され得る。さらに、メカニズム１０２２は、粒子を、任意の適切な供給源（例えば、微小流体処理または分析）から、任意の所望の数の出口チャネルおよび／または他の微小流体メカニズムもしくは構造体（例えば、培養チャンバ、保持メカニズム、灌流メカニズムなど）へと選別し得る。
【０２８９】
メカニズム１０２２は、フローストリームに連続的に沿って作動する構造体を備える。第一に、液圧集束領域１０３０は、粒子を、粒子入口チャネル１０３２から狭くなったストリームへと集束するように働く。各々が集束流体（例えば、緩衝液）で満たされている２つの側部レザバ１０３４、１０３６は、集束チャネル１０３８、１０４０を使用して、入口チャネル１０３２に接続される。集束チャネル１０３８、１０４０は、異なる幅を有し得、従って、異なる流量を有し得、狭いストリームを入口チャネルにおいて非対称的に配置する。第二に、加速領域１０４２が、チャネルの幅を狭くして、流束を増加させ、そしてさらに、粒子を単一のストリームに集束する。第三に、湾曲した領域１０４４が鋭利に曲がって、インプットされる粒子に角速度および半径方向の加速を与える。第四に、分離領域１０４６は、湾曲した領域１０４４の後に配置される。分離領域１０４６は、選別ビンとして働く受容チャネルまたは選別チャネル１０２６の数とともに、より大きいチャンバへと広がり、選別された粒子を発散させる。分離領域１０４６において、粒子は、それらの質量（重量）に基づいて分配される。粒子が真っ直ぐな線として移動し続ける傾向は、質量と共に増加し、その結果、より重い粒子は、フローストリームの外側に移動し、そしてより軽い粒子は、フローストリームの中心近くに残る。従って、この実施形態において、最も重い粒子は、受容チャネル１０４８により多く分配される傾向があり、最も軽い粒子は、受容チャネル１０５０に最も多く分配される傾向があり、そして中間の質量の粒子は、受容チャネル１０５２に最も多く分配される傾向がある。いくつかの場合において、粒子の他の物理的特性（例えば、とりわけ、密度、形状、および／または表面特性）もまた、これらの受容チャネルの間での粒子の相対的分配に寄与し得る。
【０２９０】
選別メカニズム１０２２の選別能力は、いくつかの潜在的な選別パラメータの１つ以上を変更することによって、改変され得る。これらの選別パラメータとしては、とりわけ、加速領域が狭くなる程度、湾曲した領域の曲率半径、分離領域が広くなる角度、および／または受容チャネル／ビンの数が挙げられ得る。これらのパラメータは、改善された分解能、異なる数の選別チャネル（ビン）への分離、および／または粒子の重量、密度の異なる範囲の分解能のような能力に、影響を与え得る。
【０２９１】
（実施形態２）
図３３は、本発明の局面に従う、改変された選別パラメータを有する選別メカニズム１０６２を有する、微小流体システム１０６０を示す。選別メカニズム１０６２は、選別メカニズム１０２２の加速領域１０４２より狭い加速領域１０６４を有し、潜在的に、粒子に対するより大きい速度、および従って、より良好な集束を与える。さらに、選別メカニズム１０６２は、選別メカニズム１０２２の湾曲した領域１０４４に対して異なる曲率半径を有する、湾曲した領域１０６６を有する。さらに、選別メカニズム１０６２は、選別メカニズム１０２２の分離領域１０４６より大きい分離角度（対の角度）を有する分離領域１０６８を有し、３つではなく４つの選別チャネル１０７０に接続されている。
【０２９２】
（実施形態３）
図３４および３５は、本発明の局面に従う、改変された選別パラメータを有する選別メカニズム１０８２を有する、別の微小流体システム１０８０を示す。選別メカニズム１０８２は、領域１０４２または領域１０６４のいずれよりも狭い加速領域１０８４を有し、より大きい速度および集束を提供する。さらに、選別メカニズム１０８２は、図３１〜３３の湾曲した領域１０４４および１０６６より小さい曲率半径を有する、湾曲した領域１０８６を有する。さらに、選別メカニズム１０８２は、領域１０４６および１０６８と比較して、さらにより大きい角度の分離を有する分離領域１０８８を有する。
【０２９３】
（適用）
図３６〜３８は、システム１０２０および１０６０が粒子の混合された集団を選別する能力を実証する、実験結果を示す。これらの実験において、混合された粒子の集団が、インプットレザバに充填される前に、２つのサイズ（および型）の粒子（約１μｍの平均直径を有するビーズ、および約１０μｍの平均直径を有するＪｕｒｋａｔ細胞）を使用して、形成された。これらの２つのサイズの粒子を、異なる蛍光色素で区別可能に標識する：ビーズは、緑色光を発光し、そして細胞は、赤色光を発光する。
【０２９４】
図３６は、この実施例に記載されるような選別メカニズムを使用して選別される粒子の画像を示す。これらの粒子は、分離領域において、２つのストリーム１１００に分離される。下のストリームは、細胞（赤色）が濃縮され、そして上のストリームは、ビーズ（緑色）が濃縮されている。このシステムを通る粒子の流れは、入口レザバにおいて、１ｃｍの高さのカラムの流体によって、力を加えられる。
【０２９５】
図３７および３８は、それぞれ、システム１０８０および１０２０を用いて、各々が上記のような混合されたビーズおよび細胞の集団を選別する場合の、得られたデータのグラフを示す。これらのグラフは、２つの受容チャネルの各々に入った粒子の相対数を計数することによって、作成された。これらのグラフの各々は、それぞれ、選別チャネル１１０２または１０４８のいずれかの下の受容チャネルに分配される細胞（青色の菱形）およびビーズ（桃色の正方形）の画分をプロットする。下の受容チャネルにおける細胞対ビーズの比は、黄色でプロットされる。両方のシステム１０８０および１０２０において、ビーズより大きい細胞の画分が、下の受容チャネルに入る。システム１０８０において、ビーズより２倍多くの細胞が、下の受容チャネルに入った。システム１０２０において、この比はわずかにより低く、そしてより変動的であった。
【０２９６】
（要約）
この実施例に示されるシステムは、粒子の物理的特性を区別する選別メカニズムに基づいて、粒子を受動的に濃縮する能力を有する。これらのシステムを使用して得られる、およそ２倍の濃縮は、いくつかの微小流体分析を容易にするかまたは改善するために十分であり得る。さらに、これらのシステムの各々は、改変および洗練され得、そして／または所望の粒子の改善された濃縮を改善するために、直列に接続され得る。
【０２９７】
（実施例１０．粒子のセットを操作するための微小流体システム）
この実施例は、比較的大きいチャンバを有する微小流体システムを記載する。このシステムにおいて、より大きい粒子のセット（例えば、癒着性細胞および／または非癒着性細胞）が、保持され得、保存され得、培養され得、処理され得、そして／または放出され得る：図３９〜５０Ｄを参照のこと。
【０２９８】
（背景）
微視的／巨視的界面での、微小流体システムへの粒子の導入、および／または微小流体システムからの粒子の除去は、不十分でありそして／または有害であり得る。導入については、粒子は、懸濁液中に配置されなければならず、そしてしばしば、入口レザバを通して導入される。この充填プロセスの間、粒子のかなりの画分か失われ得、このことは、粒子が高価であり、そして／または制限された供給にある場合（例えば、臨床サンプルまたは法医学的サンプル由来の細胞を用いる場合）に、問題であり得る。さらに、導入および／または除去の間、粒子は、例えば、汚染性の微生物への曝露によって汚染され得、そして／または例えば、入口レザバもしくは出口レザバの液体の蒸発によって損傷を受け得る。従って、連続するセットの分析の間、粒子を繰り返し微小流体システムに導入し、そしてこのシステムから除去することを回避することが望ましい。従って、特に、特定の集団の連続的分析のための、粒子（例えば、細胞）を保存し、処理し、維持し、測定し、そして／または特に、増幅（すなわち、培養）するためのチャンバに対する必要性が存在する。このようなチャンバを用いて、これらの連続分析は、集団を分析の間で巨視的環境に移すことなく、実施され得る。
【０２９９】
しかし、このようなチャンバは、細胞を用いるそれらの使用に関する多数の課題または問題に取り組む必要がある。第一に、これらのチャンバは、チャンバ内での細胞の移動を妨害しない天井高さを必要とし得る。具体的には、より大きいチャンバの天井（特に、エラストマー材料から形成されるもの）は、たるむ傾向があり得、細胞の移動を妨害し得る。第二に、これらのチャンバは、癒着性細胞が使用される場合、このような細胞の癒着、生存、および増殖を促進する基板を必要とし得る。多くの癒着性細胞は、これらが基板に付着するまで、正常に挙動しない。第三に、これらのチャンバは、細胞の損失または損傷なしで、チャンバ内の細胞にわたって培地および／または試薬を通す必要があり得る。流体を循環させるポンプは、もろい真核生物細胞を破砕し得、そして細胞の移動を制限するいくつかのフィルタは、細胞によって詰まり得、そして／または細胞を通し得る。第四に、これらのチャンバは、気体が細胞チャンバに拡散して、細胞増殖の間、適切なｐＨを維持する能力を必要とし得る。
【０３００】
（説明）
本実施例は、上に記載された問題および課題のいくつかまたは全てに取り組み、そして解決する、種々の微小流体システムを記載する。これらの微小流体システムは、詳細な説明の他の箇所および引用文献に記載されるように、多層ソフトリソグラフィーを使用して形成され得る。粒子の貯蔵、処理、分析、および細胞増殖のためのチャネルまたはチャンバは、実施例１３に一般的に記載されるように作製された鋳型を使用して、必要な場合、複数のフォトレジストの層を使用して、形成される。このような鋳型は、細胞が侵入および増殖するために十分に大きいチャネル（例えば、約２００μｍの幅×約２０〜３５μｍの高さ）を構築するために使用され得る。さらに、以下に記載されるように、このような鋳型は、種々の寸法の粒子チャンバを形成するために使用され得る。これらのチャネルおよび／またはチャンバは、とりわけ、バルブ、ポンプ、回転ミキサ、フィルタ、ソーター、倍増管、灌流メカニズム、および／またはさらなる粒子保持部位を備える微小流体システムに統合されて、粒子の任意の適切な分析を実施し得る。
【０３０１】
（実施形態１）
図３９〜４３は、本発明の局面に従う、粒子を保持するための比較的大きいチャンバ１１３２を備える例示的な微小流体ネットワーク１１３０を示す。これらのネットワークは、多層ソフトリソグラフィーを使用して作製され、ここで、大きいチャンバはつぶれなかった。これらのチャンバは、約３６ミクロンの高さを有する。これらのチャンバは、鋳型を使用する改変されたプロセスによって、形成され、このプロセスにおいて、２つの層（各々が約１８ミクロン）が基板の頂部に連続的に層状にされ、そして細胞チャンバが形成された位置で選択的に維持された。これらのチャンバは、丸くされた。このプロセスは、ほぼ弓形（弓様）の断面形状を生じ、これは、安定性を増大させ得る。その結果、このプロセスは、幅対高さの比が約１０：１未満のチャンバの形成を可能にし、このチャンバは、つぶれなかった。対照的に、標準的なソフトリソグラフィープロセスによって形成される、１０：１より大きい幅対高さの比を有する微小流体チャネルは、より頻繁につぶれ得る。
【０３０２】
大きいチャンバは、インプットレザバ１１３４および排出レザバ１１３６に接続され得る。インプットレザバは、入口チャネル１１３８（これは、１１４０に示されるように、二又である）に接続されて、フローを２つのチャネル１１４２の各々に方向付け得る。排出チャネル１１４４は、チャンバの各対から延びて、排出レザバ１１３６に接合し、そして排出レザバ１１３６に流体を運ぶ。空間およびインプットレザバのより効率的な使用のために、いくつかのシステム（例えば、システム１１４６）は、共通の入口レザバ１１４８を、２対のチャンバに対して共有する。従って、粒子は、入口レザバ１１４８内に充填されて、これらの粒子を４つのチャンバの各々に分配し得る。他の実施形態において、インプットレザバは、任意の適切な数のチャネルを使用して、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのチャンバに流体接続され得る。これらのチャネルは、粒子レザバと細胞チャンバとの間に直接延び得るか、またはこれらは、任意の所望の数の位置において、任意の所望の回数で分枝し得る。これらのチャンバを通る流体の移動は、任意の適切なメカニズム（例えば、とりわけ、バルブおよび／またはポンプ）によってコントロールされ得る。例えば、図４４は、ネットワーク１１３０のアレイが、各チャンバ１１３２に隣接するバルブ１１５６を調節するコントロールライン１１５２、１１５４によって、並行してコントロールされるシステム１１５０を示す。この場合には、示される８つのバルブの各々が、コントロールポート１１５８の作動を介して並行して解放または閉鎖され、それぞれ、粒子充填のための開いたチャンバを提供するか、または粒子単離のための閉じたチャンバを提供するかの、いずれかである。
【０３０３】
チャンバ１１３２は、任意の所望の形状およびサイズを有し得る。適切な断面形状としては、菱形１１６０（図３９および４１）、矩形１１６２（図３９、４２、および４３）、正方形１１６４（図３９）、円形１１６６（図３９および４０）、楕円形または長円形１１６８（図３９、４０、および４１）などが挙げられ得る。適切なサイズは、粒子の型、アッセイなどに依存して、直径が約１００ミクロン〜約１センチメートルである。図３９〜４３に示される、首尾よく構築された特定のチャンバは、約０．９ｍｍ〜２．６ｍｍの直径を有する。
【０３０４】
チャンバは、その内部の基板から完全に隔離され得るか、またはこれらは、カラム、ポート、もしくは他の構造体によって支持され得る。これらのカラムまたはポートは、チャネルの屋根から下方に突出して、基板に接触し得、一般に、この層の製造の間に、微小流体層に一体的に形成される。あるいは、またはさらに、これらのカラムまたはポートは、基板から上方に突出し得、基板の一部としてもしくは基板に加えて形成される。有効であるためには、これらのカラムまたはポートは、このチャネルを通る細胞の移動の遮断を回避するために、十分に間隔を空けるべきであるが、より厳密に間隔を空けた構造体が、細胞ペンまたは他のサブチャンバを形成するために使用され得る。
【０３０５】
（実施形態２）
図４５は、流体の流れがより融通してコントロールされる微小流体ネットワーク１１３０を有する、微小流体システム１１８０を示す。具体的には、チャンバ１１３２を通って流れる流体が、チャンバ１１３２の両側に設置される、２つの入れ子状のセットの隣接コントロールバルブ１１８２、１１８４によってコントロールされる。平行ポンピング回路１１８６が、平行な流路１１８８として配置され、これは、ポンプ１１９０を有し、そして入れ子状のバルブセット１１８２、１１８４の間の中間の入れ子状位置において、細胞チャンバ１１３２の上流および下流から延びる。
【０３０６】
システム１１８０は、以下のように作動し得る。細胞（粒子）の充填の間、入れ子状のバルブセット１１８２、１１８４は開かれ、そして流体が、インプットレザバ１１３４から排出レザバ１１３６へと受動的に流れ、細胞をチャンバ１１３２に運ぶ。所望の数の細胞がチャンバ１１３２に入ると、バルブセット１１８２、１１８４のうちの一方または両方が閉じられて、チャンバ１１３２を隔離する。バルブセット１１８２のみが閉じられる場合、ポンプ１１９０は、始動されて、チャンバ１１３２および代替の流路１１８８を備えるループに通して流体を循環させ、基板への細胞癒着を防止し得るか、また癒着した細胞の上での流体フローを維持し得る。あるいは、バルブセット１１８４のみが閉じられ得、代替の平行流路１１８８を使用して、流体が、インプットレザバと排出レザバとの間に流れることを可能にして、チャンバ１１３２を通る通路を排除し得る。従って、流体チャネルは、任意の所望の試薬でフラッシュされ得、そして再平衡化され得る。一旦、流体チャネルが再平衡化されると、所望の試薬、バルブセット１１８２が閉じられ、そして所望のバルブセット１１８４が開かれて、所望の試薬を、チャンバ１１３２を含む閉ループ内で能動的にポンピングし得る。例えば、試薬は、トリプシンおよびＥＤＴＡ、または別の適切な検出試薬の混合物であり得る。トリプシンおよびＥＤＴＡの混合物の、閉ループを通してのポンピングは、癒着した細胞を脱着させる。バルブセット１１８２を開くことによって、次いで、脱着された細胞が、詳細な説明を通して記載されるように、システムから、排出レザバ１１３６またはさらなる微小流体メカニズムもしくはメカニズムのセットのいずれかに、フラッシュされることを可能にする。
【０３０７】
（実施形態３）
図４６は、本発明の局面に従う、ループしたチャネルまたはリング構造体として形成された、細胞チャンバ１２１２を有する、微小流体システム１２１０を示す。細胞（または粒子）が、チャンバ１２１２に導入され、そしてここで、インプットレザバ１２１４と排出レザバ１２１６との間の流体高さのバランスをとることによって、あるいは、これらのレザバを相互接続する１つ以上のバルブ１２１８を閉じることによってのいずれかで、保持される。バルブ１２１８（特に、チャンバ１２１２に隣接するかこのチャンバの中のバルブ）の部分的閉鎖は、このバルブを通る細胞の流れを防止しながら、流体の流れを可能にするために使用され得る。一旦、細胞がチャンバ１２１２に充填されると、４つのバルブ１２２０が、適切な順序で始動されて、流体をチャンバ１２１２の周りで移動させ得る。
【０３０８】
（実施形態４）
図４７〜４９は、本発明の局面に従う、ループしたチャネルまたはリング構造体として形成されたチャンバ１２４２を有する、別の微小流体システム１２４０を示す。システム１２４０は、粒子の流入／流出のため（粒子ネットワーク１２４４）および試薬の流入／流出のため（試薬ネットワーク１２４６）の、異なるネットワークを与える。これらの異なるネットワークは、チャンバ１２４２において重なる。
【０３０９】
粒子ネットワーク１２４４は、チャンバ１２４２に粒子を充填するため、およびチャンバ１２４２から流れる粒子を受容するために使用される。粒子は、最初、インプットレザバ１２４８に充填され、このレザバは、これらの粒子を、インプットチャネル１２５０に供給する。インプットチャネル１２５０は、チャンバ１２４２に流入する。チャンバ１２４２は、二股になり、そして出口チャネル１２５２において再接合する。出口チャネル１２５２は、流体を、排出レザバ１２５４に運ぶ。レザバ１２４８と１２５４との間の流体フローは、バルブ１２５６および１２５８のうちの一方または両方を閉じることによって、任意の選択された時点で終結され得る。両方のバルブを閉じることによって、チャンバ１２４２を、粒子ネットワーク１２４４の残りの部分から流体的に隔離する。
【０３１０】
試薬ネットワーク１２４６は、流体（特に、試薬を運ぶ流体）を、チャンバ１２４２に通して移動させ、一方で、粒子を選択的に残す。試薬ネットワーク１２４６は、流体および試薬を、１つ以上の試薬レザバ１２６０から入口チャネル１２６２を通して、チャンバ１２４２へと方向付ける。各試薬レザバ１２６０からのフローは、独立して、バルブ１２６４によって調節され、このバルブは、単一の試薬または試薬の混合物のフローをコントロールする。試薬の所望の比および／または希釈が、例えば、実施例８において上記されるように、各バルブを通る流量を正確にコントロールすることによって、形成され得る。入口チャネル１２６２からチャンバ１２４２に入る試薬は、出口チャネル１２６６において再接合する二股経路を辿る。出口チャネル１２６６は、流体を、廃液レザバ１２６８に運ぶ。流入または流出は、バルブ１２７０、１２７２によって調節され得、これらは、特に粒子の充填および／または除去の間、チャンバ１２４２を試薬ネットワーク１２４６から隔離するために、閉じられ得る。さらに、試薬ポンプ１２７４は、試薬を、試薬レザバ１２６０から廃液レザバ１２６８へと引くために使用され得る。
【０３１１】
試薬ネットワーク１２４６は、粒子のサイズに基づいて、チャンバ１２４２から（およびチャンバ１２４２へ）粒子が出ること（および入ること）をブロックする。これを達成するために試薬ネットワーク１２４６は、濾過メカニズム１２７６を使用して、チャンバ１２４２とインターフェースする。図４８および４９は、出口チャネル１２６６内にチャンバ１２４２に隣接して配置された、サイズ選択チャネル１２７８の写真を示す。
【０３１２】
チャンバ１２４２は、チャンバポンプ１２８０（図４７を参照のこと）を備える。チャンバポンプ１２８０は、流体を、チャンバ１２４２に通して循環させ、例えば、（１）細胞を懸濁させ得（例えば、トリプシンと癒着した細胞の脱着の間）、（２）細胞を濾過メカニズム１２７６から移動させて、このメカニズムの閉塞を減少または防止し得、（３）チャンバ１２４２内での混合を促進し得る、などである。
【０３１３】
細胞をチャンバ１２４２に供給するための例示的な方法は、以下である。試薬レザバ１２６０のうちの１つに、約２０μＬの媒体を充填し、そして廃液レザバ１２６８に、約１０μＬの媒体（または緩衝液）を充填する。これらのレザバは、同じ直径を有し、従って、この非対称な充填は、試薬レザバ１２６０に、約１０μＬの流体液面を提供する。引き続いて、流体液面を等しくするための流れが、約５μＬの媒体を、チャンバ１２４２を通して廃液レザバ１２６８へと、約３０分間にわたって移動させる。チャンバ１２４２内の細胞が癒着性である場合、粒子ネットワーク１２４４が、代わりにまたは加えて使用され得る。
【０３１４】
システム１２４０は、癒着精細胞の延長した培養を可能にする。図５０は、チャンバ１２４２内で生存し、そして癒着し、そして播種後３週間の、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞１２９０を示す。示される細胞の場は、生存度について試験され（上のパネル）、そして明視野照射によって一般的形態について可視化された（下のパネル）。エチジウムホモダイマー染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ；Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）の欠失によって証拠付けられるように、かなり大部分の細胞が、生存しており、そして通常の形態を有すると決定された。３週間のインキュベーションの間、細胞１２９０は、上記受動フロー供給レジメンに供され、２日ごとに１回繰り返した。
【０３１５】
（実施形態５）
図５０Ａは、非対称的に配置された流路に基づいて、微小流体チャンバ１９１２内に細胞（または他の粒子）を配置するためのシステム１９１０を示す。粒子および流体は、入口チャネル１９１４からチャンバ１９１２内へと流れる。粒子および流体は、複数の別個の流路１９１６、１９１８を辿って、それぞれ出口チャネル１９２０、１９２２に向かい得る。１つ以上のバルブ１９２４が、これらの流路の一方または両方を選択するために使用され得る。
【０３１６】
非対称的に配置された流路１９１６の選択は、インプットされる細胞のサブセットが、チャンバ１９１２内に配置されることを可能にする。主要流路１９１６は、非対称的に配置され得、かつ非線状であり得る。このような流路は、主要流路１９１６に対応する、最速の主要ストリームを規定する。しかし、流体のいくらかはまた、チャンバ１９１２内でより遠位に、擬似滞流領域１９２６に配置される、より低い速度の補助ストリーム（より弱いフローストリーム）に従う。従って、チャンバ１９１２内の補助的なストリームに従う細胞のサブセットは、沈降してチャンバ１９１２によって規定される基板と接触することによって、チャンバ１９１２内に沈着する傾向がある。このような接触は、流体フローが沈降した細胞を移動させる能力を低下させ、そして沈降した細胞と基板との間のさらなる相互作用（例えば、分泌された細胞外マトリックスの形成）を促進し得る。他の実施形態において、沈着する細胞のサブセットは、任意の適切なパラメータ（流路１９１６の非線形性の程度、チャンバに対する流路１９１６の位置、チャンバの寸法、流体の流量などが挙げられる）を変化させることによって、決定され得る。
【０３１７】
（実施形態６）
図５０Ｂは、システム１９１０に基づくがさらなるメカニズムおよび特徴を備えるシステム１９３０を示す。システム１９３０は、インプットメカニズム１９３２、排出メカニズム１９３４、および処理メカニズム１９３６を備える。インプットメカニズム１９３２は、細胞および／または流体（例えば、緩衝液または培地）を導入するためのインプットレザバ１９３８を備える。排出メカニズム１９３４は、それぞれ流路１９１８および／または１９１６によって提供される流体を、出口チャネル１９４２および／または１９４４から受容し得る、排出レザバ１９４０を備える。バルブ１９２４は、通路１９１８に沿ってフローをブロックするように作動され得、一方で、バルブ１９４８は、いずれかの流路から出口レザバ１９４０へのフローをブロックするために作動され得る。処理メカニズム１９３６は、複数の試薬レザバ１９５０、バルブ１９５２（これは、各試薬レザバからのフローを調節する）、およびバルブ１９５４（処理メカニズム１９３６全体とチャンバ１９１２との間の連絡を調節する）を備え得る。
【０３１８】
システム１９３０は、細胞を沈着させるために、以下のように使用され得る。細胞が、インプットメカニズム１９３２によって、一般に、バルブ１９４８が開き、そしてバルブ１９２４が閉じた状態で、インプットされる。細胞は、流路１９１６に沿って移動し、サブセットが、補助的なフローストリームを辿り、上記のように、擬似滞流領域１９２６に沈着される。
【０３１９】
一旦、十分な数の細胞がチャンバ１９１２内に沈着されると、沈着された細胞は、以下のように、さらに操作され得る。バルブ１９５６が閉じられ得、そしてインプットレザバ１９３８の内容物が、培地で置き換えられて、排出レザバ１９４０の流体液面とおよそ等しい流体液面を達成し、レザバの間での正味の流れを生じず（「バランスフロー」状態）、次いで、バルブ１９５６が再度開かれ得る。沈着された細胞は、適切な時間（例えば、一晩）インキュベートされ得、この間に、これらの細胞は、インキュベーションによって、チャンバによって規定される基板に癒着し得る。このような癒着した細胞は、チャンバ１９２６内に維持される。あるいは、癒着していない細胞が、チャンバ１９１２への付着なしで使用され得る。
【０３２０】
癒着した（または癒着していない）細胞は、試薬レザバ１９５０からの試薬を用いて、処理メカニズム１９３６を作動させることによって、処理され得る。第一に、試薬が、１つ以上のバルブ１９５２および１９５４を開いて、選択された試薬を流路１９５８に沿って、流路１９１６の逆に沿って、そして／または出口チャネル１９４４に沿って、方向付けることによって、チャンバ１９１２に導入され得る。次に、チャンバ１９１２は、バルブ１９４８、１９５４、および１９５６を閉じることによって、閉ループ内に配置され得る。ポンプ１９６０が始動されて、試薬を、閉ループの周りに循環させ得、チャンバ１９１２内の細胞を試薬で連続的に灌流する、混合作用を生じる。
【０３２１】
（実施形態７）
図５０Ｃは、細胞を１つ以上の区画１９７２、１９７４内に沈着（および保持）するために使用され得る、細胞チャンバ１９７０を示す。区画１９７２、１９７４は、半径方向に配置されたサイズ選択チャネル１９７６に接続されて、「スポーク付き車輪」の構造を形成し得る。細胞（または他の粒子）が、第一のインプットチャネル１９７８からインプットされ得、そして区画１９７２内に配置され得る。流体は、サイズ選択チャネル１９７６を通って第二のインプットチャネル１９８０へと流れ得る。あるいは、またはさらに、第一のインプットチャネル１９７８の方へと流れる流体を用いて、さらなる細胞（例えば、別個の細胞型）が、第二のインプットチャネル１９８０からインプットされて、外側の区画１９７４内に堆積し得る。２つの区画の各々が異なる細胞集団によって占有された状態で、細胞−細胞連絡が、放出された細胞成分（または拡張した細胞構造体）の、２つの区画の間のサイズ選択チャネルの通過によって、分析され得る。代替の実施形態において、第一の区画および第二の区画は、任意の適切な幾何学的形状（例えば、とりわけ、くし型のフィンガーまたは噛み合ったスパイラル）を有して、これらの２つの区画の間の連絡の面積を増加させ得る。さらに、さらなる区画が加えられて、さらなる細胞型の間の相互作用を測定し得る。
【０３２２】
（実施形態８）
細胞チャンバ１９９０は、オーバーフロー能力を備えるチャンバ１９７０の改変されたバージョンである。ここで、内側の区画１９７２は、サイズ選択チャネル１９７６に加えて、横方向の通路１９９４によってオーバーフロー区画１９９２に接続されるチャンバとして働く。従って、インプットチャネル１９７８は、インプットされた細胞（または他の粒子）の大部分を、入口１９９６を使用して、内側区画１９７２内へと方向付けるために使用され得る。しかし、一旦、内側の区画１９７２が満たされると、さらなる細胞が横方向通路に沿って流れ、オーバーフロー区画１９９２を通り、そして出口チャネル１９９８から出得る。
【０３２３】
（適用）
本明細書に記載される微小流体システムは、接着細胞および非接着細胞の操作に用いられ得る。例えば、チャンバへの導入後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、基板に接着し、チャンバ内に細胞を効率的に保持する。一旦接着すると、これらの細胞は、流体流れがそれらの上に受動的および／または能動的に向かうとき、基板上に接着する。これら細胞は、所定範囲の流速およびバルブ閉鎖圧力で生存して残る。しかし、細胞生存率は、より高いバルブ作動閉鎖圧力が用いられるとき損なわれ得る。なぜなら、より高い圧力は完全バルブ閉鎖に至るからである。細胞の上で閉鎖するバルブは、それをつぶし得る。特に、高いポンプ輸送回数では、リング内側の集団内のすべての細胞がつぶされ得る。なぜなら、それらは、つぶされる高い確率を有するからである。この場合、リングは、細胞残渣で満たされるようになり得、これは、細胞成分に関するアッセイの出発点であり得る。核膜はこの処理によって損なわれるかも知れないし、損なわれないかも知れない。
【０３２４】
一般に、チップ上の接着細胞の操作は、以下の様式で達成される。接着細胞は、シードフラスコから細胞を離脱することにより（例えば、トリプシン処理、その後の洗浄、遠心分離、およびＤＭＥＭまたはＲＰＭＩのような標準的な組織培養培地における再懸濁により、フラスコから細胞を放出することによる）調製される。一旦所望の濃度が達成されると、細胞は、手動ピペッターを用いてインプットウェル中に充填され、そして、細胞は、液体のカラムにより生成されるヘッドフローの下で微小流体チャネル構造中に流れる。一旦接着すると、接着細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡまたはその他の細胞離脱薬剤の添加によって微小流体チャネル中に再懸濁され得る。
【０３２５】
微小流体層および基板は、細胞流れ、細胞生存率、細胞接着または細胞非接着、細胞増殖、および／またはその他を促進するために処理され得る（または処理されないままにする）。流体チャネルおよび／または基板は、ＴＷＥＥＮのような非イオン性界面活性剤；結成アルブミン（例えば、ＢＳＡ）のような血清タンパク質；任意の適切な動物からの全血清または分画血清；コラーゲン、ポリリジン、ＳＩＧＭＡＣＯＴＥ、ＭＡＴＲＩＧＥＬなどのような細胞外マトリックス抽出物、成分、または混合物；および／またはその他で処理され得る。
【０３２６】
（実施例１１．微小流体環境における細胞の電気生理学的分析のためのシステム）
この実施例は、細胞を配置し、保持し、処理し、および／または測定するため、特に、電気生理学的分析のための微小流体システムを記載する；図５１〜５８を参照のこと。
【０３２７】
（背景）
細胞表面膜は、すべての細胞の必須部分であり、それらの広がりを規定し、そして細胞内部（細胞質）と細胞外環境との間を分割し、そして差異を維持する。従って、イオンチャネルおよびトランスポーターによって媒介される膜透過性および膜を横切るイオン移動の選択性をコントロールすることは、細胞生存、細胞生理、および信号伝達メカニズム、特に神経伝達の基礎である。従って、多くの細胞表面レセプターは、イオンチャネルおよびトランスポーターとカップルし、膜電流の測定を、非常に迅速に、そして細胞生理学およびレセプター活性の高感度の指標にする。従って、イオン電流からの利益を受けるまたはいくつかの場合、イオン電流に対する薬物の影響の測定を必要とする多くの薬物アッセイは、電気生理学と称される。
【０３２８】
細胞膜の電気生理学的分析を行うための好適な方法は、個々の細胞の「パッチクランプ」分析である。代表的には、このアプローチでは、約０．１〜１μｍの直径をもつガラス電極が、細胞上の膜「パッチ」を取り囲む単一細胞の膜に対して電気的にシールされる。このパッチは、次に、所望される情報のタイプに基づき、インタクトなままで残されるか、チャネル形成試薬で「穿孔される」か、または貫通されて細胞から分離され得る。インタクトなパッチおよび細胞から分離されたパッチの両方で、膜中のパッチのサイズおよびチャネルの密度は、分析されているチャネルの数を決定する。従って、異なるサイズのパッチは、膜の小領域からの「単一チャネル記録」、または「マクロパッチ記録」における多くのチャネルからの記録を可能にし得る。あるいは、膜パッチは、「全細胞」パッチクランプ研究において、全体の細胞膜の電気的性質を測定するために穿孔または貫通され得る。穿孔されたパッチは、抗生物質ナイスタチンまたはアンホテリシンＢのようなチャネル形成薬剤を、膜中に導入する。穿孔されたパッチは、より大きな細胞質成分の損失とともにチャネル活性の全体細胞記録を可能にする。穿孔されたパッチは、電極を細胞内側に配置し、その結果、この電極および細胞の細胞質は連続している。従って、穿孔されたパッチはまた、全体細胞パッチクランプ記録を可能にする。
【０３２９】
アッセイツールとしての電気生理学の重要性、および膜における電気的活性を測定するために利用可能な種々のパッチクランプ法にもかかわらず、これらの方法は、それらの適切な実行のために実質的な時間および技能を必要とする。特に、これらの方法の各々は、一般に、高度に熟練した電気生理学者によって手動で実施される。この電気生理学者は、各細胞の膜に対して電極を正確に配置し、そしてこの電極および／または細胞をさらに操作してキガシールを形成し、および／または細胞を貫通しなければならない。従って、この電気生理学者は、パッチクランプ法の実行にかなりの時間およびエネルギーを向けなければならず、サンプルが研究されなければならないスクリーニング適用にそれらを高価および不向きにする。従って、細胞操作を単純にし、そしてパッチ形成を少なくとも自動化するより自動化されたシステムに対する必要性が存在している。
【０３３０】
（説明）
この実施例は、イオンチャネル活性の測定を可能にする微小流体デバイスを記載する。これらのデバイスは、アパーチャーと接して単一細胞を、細胞の膜が、アパーチャーの周りに、ギガシールと呼ばれるギガオームの高抵抗性を形成するように配置される。このギガシールは、「全体細胞」パッチ−クランプ記録によって、測定されるべき細胞膜を横切るチャネル電流を可能にする。チャネルとカップルするレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストのような、チャネル活性の潜在的な変調器の存在下または非存在下における電流の測定は、これら変調器を試験するための迅速かつ高感度の方法を提供する。チャネル電流における変化はしばしば一過性であるので、このデバイスはまた、潜在的な変調器および洗浄溶液による細胞の迅速な灌流を容易にする。これは、ジュレーターの迅速な曝露および除去を可能にする。このデバイスは、１つより多い単一細胞を同時および／または連続的に分析するシステムとして構成され得る（とりわけ、実施例１２を参照のこと）。
【０３３１】
（実施形態１）
図５１は、本発明の局面による、イオン電流を測定するための微小デバイス１３１０を示す。デバイス１３１０は、ほぼ３つの層：基板層１３１２、流体層１３１４、およびベース層１３１６からなる平坦なパッチクランプ電極を含む。
【０３３２】
基板層１３１２は、約０．１〜５μｍ、または約１〜５μｍ直径の１つ以上のパッチ可能なオリフィス１３１８を含む。各オリフィスの全周は、分析されている単一細胞の膜とギガシールを形成する。従って、基板層１３１２は、高度に抵抗性のシールを形成し得る任意の非伝導性材料から製作され得、比較的硬質であり得る。基板層のために適切な材料は、特に、ガラス、シリコン、および／またはプラスチックを含む。
【０３３３】
基板層は、流体層１３１４およびベース層１３１６を分離する。流体層およびベース層は各々、分析されている単一細胞の外部環境および内部環境をそれぞれ模倣する１つ以上の緩衝液で満たされる。これらの緩衝液溶液は、それぞれ、外部緩衝液および内部緩衝液と称され得る。細胞膜を通るイオンの移動は、流体層とベース層との間で、高感度増幅装置を用いて測定され得る電流を効率的に生成する。流体層は、例えば、この詳細な説明のいずれに記載されるような、多層ソフトリソグラフィーのような任意の適切な技法によって形成され得る。流体層は、上にある微小流体コントロール層１３２０のような任意の適切なコントロールメカニズムによってコントロールされ得る。ベース層は、特に、ガラス、プラクチック、および／またはエラストマー材料のような任意の適切な材料から形成され得る。このベース層は、特に、切断（穿孔）、成形、エッチング、および／またはエンボスされ得、基板層１３１２との緊密なシールを形成し（１）、そして各オリフィスと流体接触しており、しかも、代表的には適切な刺激および記録装置に接続される電極および／または電極プレートを受容する内部緩衝液を保持するレザバを形成する（２）。好ましい実施形態では、パッチクランプチャネルのボアは、流体流れがパッチクランプチャネルのボアを通じて反対になるとき、パッチクランプから粒子を転位または取外すに十分大きくあり得る。
【０３３４】
（実施形態２）
図５２〜５８は、本発明の局面による、単一細胞パッチクランプ記録のための微小流体システム１３４０を示す。システム１３４０は、流体層ネットワーク１３４２および流体コントロール層１３４４を含み、この両方は、例えば、この詳細な説明のいずれに記載のような、多層ソフトリソグラフィーによって形成される。ネットワーク１３４２およびコントロール層１３４４は、基板層によって形成されるパッチ可能なオリフィスまたはアパーチャー上に単一細胞を配置する（以下を参照のこと）。単一細胞を配置することは、図５１について上記で説明されるように、流体層ネットワーク１３４２とベース層流体チャンバとの間に適切な緩衝液勾配を確立する。一旦、高抵抗性シールが、オリフィスの周りで、配置された細胞と基板との間に形成されると、システム１３４０は、この配置された細胞が、薬物、リガンド（リガンドゲートチャネルの場合について）、別個のイオン組成物をもつ緩衝液、および／または洗浄溶液のような試薬の１つ以上のセットで灌流されることを可能にする。これら試薬の灌流は、細胞の電気的活性に対するこれら試薬の影響の迅速測定を可能にする。
【０３３５】
これらの機能を実施するために、システム１３４０は、連続的および／または平行に協働するいくつかのメカニズムを含む。細胞操作メカニズム１３４６は、単一細胞をインプットし、配置、および保持する。細胞灌流メカニズム１３４８は、試薬−インプットネットワークのセットを用い、正確にコントロールする様式で保持された単一細胞を曝し、かつ洗浄する。電気的モニタリングメカニズム１３５０は、流体層ネットワーク１３４２およびベース層流体チャンバ（図示せず）の両方を電気的に接触し、所望の試薬への曝露および／または電気的操作の前、その間、および／またはその後に、保持された単一細胞の電流、電圧、および／または抵抗を測定する。
【０３３６】
細胞操作メカニズム１３４６それ自身は、細胞インプットメカニズム１３５２、細胞配置メカニズム１３５４、および細胞保持メカニズム１３５６を含む、メカニズムのセットを含む。これらのメカニズムは、調和する様式で、パッチクランプ実験のために単一細胞を操作するよう作用する。
【０３３７】
細胞インプットメカニズム１３５２は、一般に、インプットレザバ１３５８を通じて作用する任意のメカニズムを備え得、細胞を流体層ネットワーク１３４２中に導入する。インプットメカニズム１３５２は、実施例２のインプットメカニズム２６３に類似している。その他の適切なインプットメカニズムは、セクションＩＶで上記に記載されている。
【０３３８】
細胞配置メカニズム１３５４は、一般に、微小流体ネットワーク１３４２内に単一細胞を配置するよう作用する任意のメカニズムを備える。単純流れチャネルに加え、細胞配置メカニズムは、集束メカニズム１３６０を含み得る。集束メカニズム１３６０は、集束レザバ１３６６、１３６８からの集束流れストリームが隣接する「Ｅ１」と標識され、「Ｆ１」および「Ｆ２」と標識される、入口チャネル１３６４の中央部分で、インプットストリーム１３６２中にインプット細胞を配置する。メカニズム１３６０は、インプットおよび集束レザバ１３５８、１３６６、１３６８からの流れを、３つの直交する方向から接続部１３７０方向付ける。図５３は、代替の細胞集束メカニズム１３７２を示し、そこでは、細胞インプットおよび集束ストリームは、鋭角で接続され、「アローヘッド」形態を形成する。集束メカニズム１３６０および１３７２は、実施例２の配置メカニズム２６３の局面に類似している。
【０３３９】
細胞配置メカニズム１３５４は、集束メカニズム１３６０または１３７２から下流の分割流れメカニズム１３７４を用いて、単一細胞を確率論的に分離する；図５４を参照のこと。詳細には、集束された細胞は、下に向けて入口チャネルＥ１に方向付けられ、そして分割流れ経路１３７６と遭遇する。分割流れ経路１３７６は、流体を、出口チャネル１３８０、１３８２（図５４でそれぞれ「Ｗ１」および「Ｗ２」と標識される）を通じ、廃棄レザバ１３７８（図５２および５３を参照のこと）に向ける。これらの出口チャネルは、各対応する出口チャネルを通る相対的流速を決定する狭くなる部分１３８４およびサイズ制限チャネル１３８６を含む。狭くなる部分１３８４は、サイズ選択チャネル１３８６より実質的に大きい直径を有し、その結果、流れる流体（および細胞）の大部分は狭くなる部分１３８４を通過する。しかし、いくらかの流体は、サイズ制限チャネル１３８６を通過し、最終的に、単一細胞１３８８をチャネルの口に至らせる。
【０３４０】
細胞保持メカニズム１３５６は、一般に、一般にはオリフィスおよび／または電極（単数または複数）に隣接する所望の位置に細胞を保持するための任意のメカニズムを備える。ここで、この細胞保持メカニズムは、チャネルの口で機能する；図５４および５７を参照のこと。特に、細胞１３８８は、サイズ制限チャネル１３８６には侵入できない。なぜなら、細胞は大きすぎるからである。しかし、サイズ制限チャネル１３８６を横切る圧力低下は、細胞１３８８をチャネルの口に対して引っ張り、細胞１３８８をその場に保持する。配置された細胞１３８８は、サイズ制限チャネル１３８６を通る流れを制限またはブロックし得、その結果、さらなる細胞はもはや、チャネル１３８６に向かって押されない。細胞１３８８はまた、基板層によって規定されるオリフィス１３９０（図５６を参照のこと）の上に配置される。代替の実施形態では、単一細胞は、例えば、この詳細な説明中のいずれかに記載のような任意の適切な配置、および／または保持メカニズムによって、オリフィス上に配置され、かつ保持され得る。
【０３４１】
細胞１３８８をオリフィス１３９０上の位置にして、インプットレザバ１３５８からの流れは終了するが、集束レザバＦ１および／またはＦ２からの流れは継続する。連続する流れＦ１および／またはＦ２は、さらなる細胞が、測定を妨害し得る細胞１３８８近傍において停止するのを防止するために用いられ得る。さらに、Ｆ１および／またはＦ２からの継続する流れは、細胞１３８８を取り囲む領域中の緩衝液がリフレッシュされることを確実にする。全体細胞記録を実施するために、レザバレザバＦ１および／またはＦ２、および一般にインプットレザバ１３５８は、外部緩衝液で満たされ、その結果、流体ネットワーク１３４２のすべては、外部緩衝液で平衡化される。対照的に、オリフィス１３９０の下のベース層チャンバは、一般に細胞インプットの前に、ベース層の下面（または側面）からの内部緩衝液で満たされる。これらレザバの内容物は、細胞が、アパーチャーの対向する側面上に配置されるか、または実験デザインの理由のために保持され得る。
【０３４２】
配置された細胞１３８８は、ベース層チャンバから減圧を付与することにより、オリフィス１３９０に対して引っ張られる。これは、高度に抵抗性のシールを確立し、その形成は、各チャンバにおける電極を用い、流体層ネットワーク１３４２とベース層チャンバ（オリフィス１３９０の下）との間の抵抗を増加として測定され得る。一般に、流体層ネットワーク１３４２は、接地として供され、そして記録電極は、ベース層チャンバ中に配置される。一旦シールが形成されると、得られるパッチ細胞は、そのベースライン電気的活性または性質について測定され得る。
【０３４３】
このベースラインが確立された後、および／または平均または算出ベースラインを用い、薬物のような試薬の影響が、灌流メカニズム１３４８を用いて試験され得る。図５２は、メカニズム１３４８の一般的なレイアウトを示し、これは、遮蔽または洗浄レザバ１３９４、および一連の試薬レザバ１３９６（この場合、Ｄ１〜Ｄ５と標識された５つのレザバ）を含む。レザバ１３９４、１３９６から延びる入口チャネル１３９８を通る流れは、コントロール層１３４４中のポンプ１４００によって能動的に促進される。ポンプ１４００は、すべての入口チャネル１３９８に対して一斉に作用し、試薬および洗浄緩衝液を送達するための均一な力を提供する。対照的に、各個々の入口チャネル１９３８を通る流れは、流体が入口チャネル１３９８を流れるか否かを決定する対応するコントロールバルブ１４０２によって調節される。バルブ１４０２は、図５３、５４、５６〜５８中により詳細に示され、ここで、これらのバルブは、洗浄レザバ（「Ｗ」）および試薬シザーバーＤ１〜Ｄ５のコントロールに対応して、それぞれＶｗ、およびＶ１〜Ｖ５と標識される。
【０３４４】
図５５は、灌流メカニズム１３４８をより詳細に示す。灌流メカニズム１３４８は、実施例２の灌流メカニズム２６８について説明されたのと同様の調節可能な流体シースまたは遮蔽を用い、各選択された試薬への細胞１３８８の曝露をコントロールする。洗浄レザバＷは、外部緩衝液で満たされ、そしてこの緩衝液は、バルブＶｗを開放することにより洗浄入口チャネル１４０４から細胞１３８８を超えて流れる。詳細には、チャンバＥ１に侵入するＦ１および／またはＦ２からの集束緩衝液は、洗浄緩衝液を、層流パターンまたはシース流れ１４０６で細胞１３８８上を壁１４０８に対して押す。洗浄入口チャネル１４０４は、試薬入口チャネル１３９８のいずれもより細胞１３８８に近いので、シース流れ１４０６は、任意の試薬入口チャネルから流れた試薬と間隔をあけ、かつその接触を防ぐ。バルブＶｗを閉鎖するとき、任意の流れる試薬は細胞に迅速に接触し、そして記録が所望のようになされ得る。従って、細胞１３８８は、バルブＶｗおよびＶ１〜Ｖ５を選択的に開閉することにより、レザバＤ１〜Ｄ５中に任意の試薬にコントロールされた様式で迅速に曝され得、対応する迅速な時間フレームで電気的応答の測定を可能にする。従って、レザバＤ１〜Ｄ５を通じて導入されたリガンドは、特に、リガンドゲートチャネルに対するそれらのアンタゴニストまたはアゴニスト活性を研究するために用いられ得る。
【０３４５】
微小流体システム１３４０は、多くの適切な方法で構成され得る。例えば、試薬入口チャネルは、実施例２のシステム２５０に示されるような、共通ポートを通る侵入チャンバＥ１に合体し得る（図８を参照のこと）。このようにして、各試薬は、洗浄緩衝液のシース流れ１４０６によって等しく間隔を置いて配置され、そしてそれ故、シース流れが終了するときと同時に細胞１３８８に到達する。さらに、このようなデザインは、実施例８で上記に記載されるように、試薬混合および希釈を可能にし得る。あるいは、またはさらに、ポンプが、インプットレザバ１３５８および集束レザバ１３６６、１３６８からの流れを駆動するために含められ得る。さらに、システム３１４０は、実施例７に記載のような、細胞除去メカニズムを含めることにより再利用可能であるように改変され得る。システム１３４０は、さらに、またはあるいは、例えば、実施例３〜５で上記、または実施例１２で以下に記載されるように、保持／分析部位の平行または連続アレイを含むように改変され得る。
【０３４６】
（実施例１２．パッチクランプによる多重分析のための微小流体システム）
この実施例は、単一細胞のセットから、１つ以上の細胞に対する電気生理学的分析を実施するための微小流体システムを記載する；図５９〜６１を参照のこと。
【０３４７】
（背景）
パッチクランピングは、生物学的膜（例えば、細胞）とアパーチャーとの間のシールの形成に依存する電気生理学的方法である。このシールは、膜を横切るイオンの通過によって生成される小電流の測定を容易にし得る。しかし、このシールは、一般に、緊密であるべきである。なぜなら、シールの周りの電流の漏れは、膜を横切る小電流の測定を妨害、またはさせなくし得るからである。
【０３４８】
シール形成の効率は、細胞に対する電気生理学的影響に基づく薬物スクリーニングのための自動化高スループットデバイスの開発の重要な論点である。手動パッチクランプシステムでは、細胞が首尾よく分析され得る効率は変動し得るが、非常に熟練した技術者は、代表的には、約５０％の最適の効率でシールされたパッチを達成する。自動化デバイスにより達成される同様の効率は、薬物スクリーニングにおける使用のための適正にシールされたパッチを含むウェルの「いいものだけを選ぶ（ｃｈｅｒｒｙ−ｐｉｃｋ）」必要があり得、そのようなデバイスの有用性を制限する。さらに、適正にシールされたパッチが形成されるときでさえ、１つより多い細胞が、代表的または平均の細胞応答を識別するために分析される必要があり得る。従って、複数細胞の平均化された分析を容易にし、そして電気生理学的応答における細胞による変動にともなう問題を減少する、細胞に対するシールされたパッチをより効率的に形成する自動化デバイスの必要性が存在している。
【０３４９】
（説明）
この実施例は、規定された数（「ｎ」）の個々にコントロール可能なアパーチャーをもつ、単一アパーチャー微小流体デバイスの多重バージョンを提供する。各個々にコントロール可能なアパーチャーは、パッチクランプ法によって単一細胞を分析するために用いられ得る。１つのパッチされた細胞のみが、各実験について有効なシールを形成することを要求されるので、複数アパーチャーの使用は、デバイスとこのシールを形成する確立を増加する。さらに、このデバイスは各アパーチャー、およびその関連する細胞を、分析に含められるようにするか、または分析から排除されるようにする。従って、信号は、各対応するアパーチャーを電気的に絶縁することにより首尾良くシールされている各個々の細胞から得られ得る。あるいは、またはさらに、「平均化された」信号は、２つ以上の個々にコントロール可能なアパーチャーから、別個の測定を平均することによるか、２つ以上のアパーチャーから同時に測定することによるかのいずれかによって得られ得る。平均化された信号は、任意の得られるデータの健全さを改善し得る。
【０３５０】
（単一アパーチャー実施形態）
図５９は、どのようにｎのアパーチャーが構築されるかを示すために、１アパーチャーデバイス１４３０を示す。デバイス１４３０は、単一細胞１４３２をアパーチャー１４３４と隣接するように向ける。アパーチャー１４３４は、チャンバ１４３６、１４３８を接続する。これらの内部チャンバおよび外部チャンバ、１４３６および１４３８は、それぞれ、それらの組成が、細胞１４３２の内部（細胞質）および外部（細胞外）環境のそれにそれぞれ似る緩衝液を保持する。減圧が、細胞１４３２をアパーチャー１４３４に向けて引っ張るために内部チャンバ１４３６に付与され得、細胞とアパーチャーとの間にシールを形成する。細胞膜のシーリングおよび破壊（全体細胞の占有（ｅｎｔｒｙ））は、細胞１４３２の内側を内部チャンバ１４３６と電気的に連続にする。その他の実施形態では、膜は非破壊のままにされ得るが、例えば、内部チャンバ１４３６にチャネル形成剤の添加により穿孔され得るか、または、膜は非破壊および非穿孔のままであり得る。
【０３５１】
電気的測定が、次いで、得られ得る。外部チャンバ１４３８は接地に接続され得るが、内部チャンバ１４３６は、一般に増幅器に接続されている記録電極を保持し得る。細胞１４３２の膜を通過するイオンは、増幅器での増幅後に測定され得る電流を生成する。デバイス１４３０を用い、潜在的な薬物候補またはその他の変調器の存在下でイオンチャネル関連電流および／またはトランスポーター関連電流における変化を測定し得る。
【０３５２】
（複数アパーチャー実施形態）
図６０は、本発明の局面による、デバイス１４３０の多重バージョンである微小流体デバイス１４５０を示す。デバイス１４５０は、デバイス１４５０の周のまわりに延びる共有内部チャンバ１４５２を含み得る。内部チャンバ１４５２は、この場合４つの複数のアパーチャー１４５６を用い、共有外部チャンバ１４５４に接続され得る。各アパーチャーは、コントロールバルブ１４５８（ＶＮ、ＶＳ、ＶＥおよびＶＷ）を用いて、電気的および流体的に、両方で隔離可能であり得る。さらに、各アパーチャーは、保持部位またはトラップ１４６０のような細胞保持メカニズムにすぐ隣接して配置され得る。トラップ１４６０は、細胞の単一懸濁物（１つのレザバ）から、または細胞の複数懸濁物（複数レザバ）からの平行装填を容易にするように配置され得る。内部チャンバ１４５２は、減圧源に接続され得、そして記録電極および接地が、外部チャンバおよび内部チャンバ、１４５２および１４５４にそれぞれ接続され得る。
【０３５３】
デバイス１４５０は、以下のように準備され、そして用いられ得る。最初に、内部チャンバ１４５２は、内部チャンバポート１４６２（ポートＩ）で、内部緩衝液がアパーチャー１４５６まで装填されるように内部緩衝液を装填され得る。次に、開放バルブＶＮ、ＶＳ、ＶＥ、およびＶＷが閉鎖され得、そして細胞が、共通インプットポート１４６４（ポートＣ）でインプットメカニズムを用いて懸濁物として装填され得る。次いで、この細胞懸濁物は、ポートＣからアウトプットレザバ１４６６（「出口」）まで流れ得る。単一細胞は、本詳細な説明のいずれか、例えば、実施例１〜３に記載のような任意の適切な配置メカニズムおよび保持メカニズムを用い、各トラップ１４６０（Ｎ、Ｓ、Ｅ、Ｗ）で配置かつ保持され得る。一旦、所望の数の細胞が、保持メカニズムによって保持されると、デバイス１４５０は、細胞分析のために用いられ得る。減圧源がオンにされ得、そして１つ以上のバルブが一度に開放され得、対応するアパーチャー１４５６を通じて内部チャンバと外部チャンバとの間の電気的接続を形成する。この接続の抵抗は、アパーチャーにおいて、保持された細胞の膜との十分なシールが生成されたか否かを決定するために用いられ得る。そうであれば、記録が開始され得る。
【０３５４】
デバイス１４５０は、本詳細な説明で記載されるような、任意の適切な微小流体メカニズムを取り込んで、任意の適切な様式で改変され得る。例えば、デバイス１４５０は、実施例３〜５で上記に記載のように、連続的および／または平行して細胞を装填するように構成され得る。あるいは、またはさらに、デバイス１４５０は、実施例２および８に記載のもののような、灌流メカニズムを含み得、個々の細胞または複数の細胞に選択された試薬の正確な送達を可能にする。同様に、デバイス１４５０は、細胞の電気的パラメーターを測定し得、すなわち、一度にまたは平行して１つのアパーチャーによって、一度に２つ以上のアパーチャーを用いることによって測定し得、すべての接続されたアパーチャーの合計された読み取り値を得る。
【０３５５】
図６１は、簡単な統計的分析からのデータを示し、システム１４５０のような、多重化されたパッチクランプシステムのいくつかの利点を示す。アパーチャーＰｎを含むウェル中でシールを首尾よく得る部分確率は、単一のアパーチャーにおいて、失敗するシール形成の部分確率Ｐｆに等式Ｐｎ＝１−Ｐｆｎによって関係付けられる。単一のアパーチャーについて成功するシール形成の確率Ｐｓは、等式Ｐｆ＋Ｐｓ＝１によってＰｆに関係付けられる。従って、シールが５０％の試行で首尾よく得られる場合、そのときは、４つのアパーチャーでは、Ｐ４＝１−（０．５）４＝１−０．０６２５＝０．９３７５である。これは、４つのアパーチャーの中で少なくとも１つのシールを得る９３．７５％の機会に対応する。図６１は、ｎ（ｘ軸）とＰｓ（ｙ軸）との間の関係をグラフ表示し、曲線１４７４は、ｎアパーチャーの少なくとも１つが成功するシールを形成する９５％の確率を与える（ｎ、Ｐｓ）ペアを示す。（アパーチャーは、図６１では「チャネル」と呼ばれる。）Ｐｓおよび／またはｎとしてのＰｎ接近ユニティーは増加する。
【０３５６】
（実施例１３ 変化する高さおよび／または断面形状の成形微小流体構造の多層成形製作法）
この実施例は、ソフトリソグラフィーにより、微小流体ネットワーク内および／またはそれらの間の断面形状および／または構造の高さが変動する微小流体デバイスを生成する方法を記載する；図６２〜７１を参照のこと。
【０３５７】
（背景）
微小流体ネットワークは、種々の機能を有する構造を含み得る。例えば、調節可能なチャネルは、偏向可能なバルブを含み得、部分的または完全にチャネルを閉鎖するよう、および／またはチャネルを通じて流体を推進するよう作用する。これらチャネルは、一般に、半円形または弓状の断面形状で形成され、効率的なバルブ閉鎖を可能にする。対照的に、粒子配置チャネルは、主に、流体により保持される粒子のための導管として作用し得る。これらの粒子配置チャネルは、一般に、粒子運動を可能にするに十分な高さを有する。従って、粒子配置チャネルは、矩形断面から利益を受け得、粒子がチャネル内で（横方向に）並んで制限されずに移動することを可能にする。このような制限されない動きは、弓状チャネルでのように、粒子が、中央部分のみよりはむしろ、チャネルの幅のより大きい部分を占領することを可能にし得る。その他のチャネルは、サイズ選択的であるか、または粒子制限的であり得、所定サイズより大きい粒子の侵入を防ぐ。これらの粒子選択的チャネルは、目的の粒子直径より小さい高さを有し得る。さらに、微小流体ネットワークは、実施例１０に記載のような、より狭いチャネルより大きい天井高さをもつ細胞／培養チャンバを含み得、チャンバの機能を改善する。従って、これら構造および本詳細な説明のいずれに記載されるその他の構造は、適正に機能するために変動する天井高さから利益を受けるか、またはそれを必要とし得る。
【０３５８】
単層鋳型は、基板上の所望の厚みのフォトレジストを用いてしばしば形成される。フォトレジストは、フォトレジストのパターン化された領域の選択的感光および光感作を可能にする対応するテンプレートを用いてパターン化される。フォトレジストがポジティブまたはネガティブであるかに依存して、これらの選択的に曝された領域は、それぞれ耐性または感受性のいずれかであり、適切な現像主薬を用いる現像の間に次に除去される。この現像は、一般に、基板の下に向かって、すべての感作領域を非特異的に除去する。抵抗性領域は、断面が一般に矩形であるが、それらのエッジを面取りするために、丸い／弓状形態に加熱され得る。従って、これらの得られる鋳型の残りの領域は、ソフトリソグラフィーを用いて、相補的構造の微小流体チャネルを生成し得る。その他の実施形態では、フォトレジストの多層が、逐次的コーティング、マスキングなどによって構築され得る。
【０３５９】
微小流体ネットワークを横切る高さおよび／または断面形状を変動する重要性にかかわらず、フォトレジストのような、選択的に除去可能な材料の単一層から形成される鋳型は、この鋳型から形成される微小流体ネットワークの構造で十分な可撓性を可能にしないかも知れない。例えば、単層が除去され得る深さは、この単層の厚さにほぼ等しい単一の高さの特徴を生成して、容易に変化されないかも知れない。同様に、断面形状は、鋳型の単一層内で変化することは困難であるかも知れない。加熱のような断面形状を改変する処理はまた、単一層を横切って非選択的に作用し得る。従って、複数選択的に除去可能な層を用いて鋳型を形成するための方法が必要である。
【０３６０】
（方法の説明）
この実施例に記載される方法は、微小ネットワーク内の別個の位置で異なる断面形状および／または高さをもつチャネルを形成するために用いられ得る。鋳型は、各々が個々にパターン化され、このパターンに従って選択的に除去され、そして必要に応じて加熱によって面取りされた複数層のフォトレジストを用いて製作される。従って、複数層の各々は、得られる鋳型のサブセットのみに寄与し得、その結果、鋳型のリリーフパターンは、複数層の各々からの残りの部分の合計である。微小流体ネットワークを形成するために鋳型を用いることは、種々のタイプの形成されるチャネルまたはその他の通路を可能にする。面取りされ／弓状の断面形状をもつチャネルは、バルブが必要とされるネットワークのセクションで形成され得る。これらのセクションは、矩形のプロフィールを有して形成されるネットワークのその他の部分と接続され得、粒子運動を促進し、そして１つ以上の粒子の微小流体ネットワークの特異的領域への正確な送達を可能にする。この特異的領域は、細胞のような、単一粒子の寸法と同じ程小さくあり得る。これらの構造およびその他の適切な微小流体構造は、以下に記載の方法を用いて生成され得る。この方法は、流体層の形成に焦点を当てているが、コントロール層またはベース層を含む、微小流体システムの任意の部分（単数または複数）に適切であり得る（実施例１１を参照のこと）。
【０３６１】
流体層の鋳型は、マイクロマシン技法による第１のシリーズのステップで製作される。流体層の鋳型は、次いで、以下に記載のように、第２のシリーズのステップで用いられ得、ソフトリソグラフィーにより、相補的微小流体層を成形する。図６２〜６８は、流体層１４８０が、どのように、シリコンウェーハー近傍にフォトレジストの３つの層を連続的に配置し、パターニングし、および選択的に除去することにより形成され得るかを示す。各層は、フォトレジストを付与することによって所望の厚さで形成され、そして次に規定された回転プロフィールに従ってこのウェーハーを回転し、図６２、６４、および６７の構造を生成する。次に、ＵＶ光に曝すことにより、フォトレジストを焼き、パターン化し、そして次に現像して、図６３、６５、および６８に示されるように、各層の部分を選択的に除去する。閉鎖可能なチャネルを成形するために、フォトレジスト層は、高温で焼かれ得、図６６に示されるように、残りの部分を面取りする。各々の個々のステップは以下にさらに詳細に記載される。
【０３６２】
第１の層は、裸のシリコンウェーハー（基板）に直接付与され得る。この第１の層は、任意の適切な厚さを有し得（この場合５μｍ）、そしてネガティブフォトレジストＳＵ８２００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような任意の適切な材料で形成され得る。ネガティブフォトレジストの適用後、ウェーハーは、適切な回転プロトコールに従って回転され得、所望の厚さおよび一貫性を達成する。例えば、ウェーハーは以下のように回転され得る：５００ｒｐｍで５秒以上回転、５００ｒｐｍで５秒間維持、３０００ｒｐｍに上げ８秒以上、そして次にこの速度で３０秒間維持する。次に、回転を止め、そしてウェーハーは、適切な加熱プロトコールに従って加熱される。例えば、ウェーハーは、６５℃で１分間、９５℃で２分間、そして最後に６５℃で３０秒間加熱され得る。この加熱プロセスは、フォトレジストが供給され得る溶媒を奪い得る。図６２は、第１の層１４８４を保持する基板１４８２をもつ鋳型１４８０を示す。ここでの、および関連する図６３〜６９におけるコンポーネントの相対サイズは、スケール通りではない。
【０３６３】
この第１の層は、以下のようにパターン化され、かつ選択的に除去される。所望のテンプレートは、第１の層と接触して配置され得、そして次にＵＶ光 １６０Ｊ／ｃｍ２に曝され得る。次に、基板／第１の層は、適切な加熱プロトコール、例えば：６５℃で１分間、９５℃で２分３０秒、そして６５℃で３０秒、に供され得る。未重合（未感光）の第１の層は、（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍによって供給される展開液のような）任意の適切な展開液で洗浄され得、次に、アセトンその後のイソプロパノールでの洗浄が続く。次いで、第１の層は、適切な現像後の加熱プロトコール（例えば、６５℃で１分、９５℃で５分、そして次に６５℃で３０秒）に供され得る。この加熱プロトコールの後に、ＵＶ光４００Ｊ／ｃｍ２での現像後曝露が続き得る。図６３は、鋳型１４８０を示し、第１の層１４８４は、第１の層のリリーフ構造１４８６（残存する第１の層）に寄与し、これは、５μｍの高さを有し得る。
【０３６４】
第２の層が次に付加され得、そして任意の適切な厚さを有し得、この場合、スピンコーティングにより形成された２０μｍの厚さである。最初に、鋳型１４８０は、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）で１０分間処理され得る。次に、ポジティブフォトレジストである、ＰＬＰ１００（ＡＺＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ／Ｃｌａｒｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような、適切なパターン化され得る材料が付与され得る。付与は、以下のような任意の適切なプロトコールを用いてスピンコーティグによってであり得る：５００ｒｐｍでウェーハーをスピンし、ポジティブフォトレジストをウェーハー／残存する第１の層に１４秒に亘って分与し、１５秒スピンし、２０００ｒｍｐまで上げ５秒以上、そしてこの速度を３０秒間維持する。次いで回転を停止し得、そして第２の層を１００℃で２分間焼き得る。図６４は、第１の層のリリーフ構造１４８６を覆う第２の層１４８８を保持する、この中間ステージにおける鋳型１４８０を示す。
【０３６５】
第２層は、以下のようにパターン形成され、選択的に除去され得る。任意の適切な鋳型が第２層に接触して配置され得、ＵＶ光（４５０Ｊ／ｃｍ２）に曝露され得る。次に、第２層は、任意の適切なプロトコル（例えば、脱イオン水を用いたＡＺ４００Ｋ １／３での３分間の処理）によって展開され（選択的に除去され）得る。図６５は、第１層１４８４および第２層１４８８の両方をパターン除去した後の鋳型１４８０を示す。第１層レリーフ構造１４８６および第２層レリーフ構造１４９０は、それらが形成されるフォトレジストの厚さに基づいて異なる高さを有し得る。
【０３６６】
第２層レリーフ構造１４９０は、任意の適切な加熱プロトコルによって円形にされ得る。例えば、構造１４９０は、以下の加熱プロトコルによって円形にされ得る：７０℃から１００℃にまで（１℃／ｍｉｎ）上げる（１℃／ｍｉｎ）、１００℃で６０分間維持する、２００℃にまで上げる（１℃／ｍｉｎ）、２００℃で６０分間維持する、そして４０℃にまで下げる（１℃／ｍｉｎ）。図６６は、どのようにして、この加熱プロトコルが長方形の第２層レリーフ構造１４９０（図６５）を円形の第２層レリーフ構造１４９２に変換し得るかを示す。
【０３６７】
次に、第３層が加えられ得、任意の厚さ（例えば、２０μｍの厚さ）を有し得る。適切な選択的除去が可能な材料（例えば、ネガティブフォトレジスト ＳＵ８ ２０５０（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ））は、残留第１層および残留第２層を保持するウエハーに塗布され得る。スピンコーティングは、以下のプロトコルによって達成され得る：ウエハーを５秒間かけて５００ｒｐｍにする、この速さで５秒間維持する、１７秒間かけて５０００ｒｐｍにまで上げる、そしてこの高速で３０秒間維持する。回転を止める。次に、第３層が任意の適切なプロトコル（例えば、６５℃で２分間、９５℃で３分間、そして６５℃で３０秒間）によって加熱され得る。図６７は、第３層１４９４を示し、この層は、この段階で第１層レリーフ構造１４８６および第２層レリーフ構造１４９２を覆う。
【０３６８】
第３層は、以下のようにパターン形成され、選択的に除去され得る。所望の鋳型が第２層に接触して配置され得、ＵＶ光（３１０Ｊ／ｃｍ２）に曝露され得る。曝露された層は、任意の適切なプロトコル（例えば、６５℃で１分間、９５℃で４分間、そして６５℃で３０秒間）によって加熱され得る。次に、第３層は、任意の適切なデベロッパー（例えば、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍのデベロッパー）によって選択的に除去され得、次いで、アセトン、その後にイソプロパノールで洗浄され得る。続いて、第３層は、適切な展開後加熱プロトコル（例えば、６５℃で１分間、９５℃で５分間、そして６５℃で３０秒間）に供され得る。最終的に、第３層は、展開後曝露において、５００Ｊ／ｃｍ２のＵＶ光に曝露され得る。図６８は、第３層レリーフ構造１４９６を有する鋳型１４８０を示す。
【０３６９】
上記の方法の任意の適切な局面は、改変され得、そして、任意のパターン形成が可能で選択的に除去可能な材料が使用され得る。さらに、任意の適切な数の層が使用され得る。さらに、各層は、所望のレリーフ構造の高さに従って、任意の所望の厚さを有し得る。光学的にパターン形成が可能な層が使用される場合、各層は、ネガティブフォトレジストまたはポジティブフォトレジストであり得、そして、長方形または円形の断面プロフィールを形成するために使用され得る。異なる層によって形成されたレリーフ構造は、鋳型の特定の領域または全領域において、非重複性、部分的重複性、および／または完全重複性であり得る。従って、レリーフ構造は、多数の選択的に除去された層の合計を示し得る。
【０３７０】
コントロール層鋳型を形成するための例示的な方法は、以下の通りである。この鋳型は、ポジティブフォトレジストの単層から製造され得る。流体層鋳型の第２層について上述したように、適切なフォトレジスト（例えば、ポジティブフォトレジストＰＬＰ１００）の２０μｍ層が、塗布され得、パターン形成され得、選択的に除去され得、そして円形にされ得る。
【０３７１】
第３層鋳型および上述のように製造されたコントロール層鋳型は、任意の適切な材料、特にエラストマー性材料（例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））を使用して、微小流体チップを成形するために使用され得る。例示的なＰＤＭＳエラストマーは、プレポリマー／触媒および架橋剤の二成分混合物から生産される、ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ ＲＴＶ６１５である。この二成分混合物において、プレポリマー／触媒（成分Ａ）は、ビニル基を保持するポリジメチルシロキサンおよび白金触媒であり、そして架橋剤（成分Ｂ）は、水素化ケイ素（Ｓｉ−Ｈ）基を保持する。これらの特定の化合物を使用する場合、成分ＡおよびＢは、約１０：１（Ａ：Ｂ）に比において最適に機能し得る。しかし、この比より上または下の「オフ比」が、後の結合を促進するために、流体層膜およびコントロール層に使用され得る。例えば、コントロール層は、剛性、したがって機械的安定性を提供するために、約４：１の比で形成され得、流体層膜は、約３０：１の比で形成され得る。これらの２層中の成分ＡまたはＢの過剰量は、膜表面付近では反応性のままである。従って、これらの２層は、焼付けて、これらの層を融合させて一体構造にするという後硬化によって、接触させられ、結合され得る。
【０３７２】
流体層鋳型およびコントロール層鋳型は、以下のように製造され、連結される。トリクロロメチルシラン（ＴＣＭＳ）での処理後、比較的薄いＰＤＭＳ膜（例えば、約５０〜１５０μｍ）が、完成した流体層鋳型１４８０状でスパンされ得る。図６９は、流体層鋳型１４８０上に形成されている膜１４９８を示す。さらに、より厚いＰＤＭＳ層（例えば、およそ５〜１０ｍｍ）が、コントロール層鋳型上に形成され得る。適切な第１段階硬化（例えば、８０℃で９０分間）の後で、コントロール層は、鋳型から取り外され得、切断され得、そしてコントロール層のコントロールラインを適当に有するインターフェースへとパンチされ得る。次いで、このコントロール層は、流体層と並べられ得、一方、流体層膜１４９８は、まだ流体層鋳型に接着している。一旦、組み立てられると、流体層およびコントロール層は、８０℃で約３時間の加熱という後硬化工程を使用して、２回硬化させられて、化学的に結合され得る。後硬化の後で、得られたチップは、流体層鋳型から取り外され得、切断され得、そしてパンチされ得て、所望の位置でチャネルと接続される流体レザバーが製造される。最終的に、チップが、適切な基板（例えば、カバーガラス）に結合されて、流体チャネルが完成する。
【０３７３】
後硬化工程は、細胞との適合性を増強するように改変され得る。ＰＤＭＳ成分ＡとＢのより低い比（例えば、４：１（Ａ：Ｂ））は、細胞（特に細胞培養の間）に毒性である傾向がある。この毒性は、コントロール層中の拡散性の毒性材料に起因し得る。従って、ずっと厚いコントロール層（４：１の比で形成）が、薄い流体層膜（３０：１の比で形成）と融合された場合、生じる一体化構造は、流体層部内ですら、４：１層の毒性特徴を有し得る。しかし、コントロール層（単独か、流体層膜と接触してるかのいずれか）の適切な処理によって、この毒性特徴が軽減または除去される。毒性材料を除去または改変する適切な処理としては、熱、化学物質（例えば、気体、液体、プラズマなど）照射、光、および／またはそのようなものが挙げられ得る。（このような処理はまた、チップ中のチャネルまたはその構成成分の中の流体の運動を軽減し得る。）いくつかの実施形態において、高い温度でのより長い後硬化によって、毒性材料が除去または改変され得、生じるチップの細胞実験についての効率を増強する。このようなより長い後硬化工程は、約８０℃で、約６時間、約１２時間、または、さらに好ましくは約２４時間以上で行われ得る。
【０３７４】
（鋳型およびチップの画像）
図７０および７１は、流体鋳型および、これらの鋳型から形成された対応する微小流体チップの写真画像を示す。ここに示される微小流体ネットワークは、実施例１１のシステム１３４０（図７０）、および改変形態として実施例７のシステム８５０（図７１）において示され、記載されている。各鋳型および流体層の異なる領域は、文字Ａ、ＢおよびＣで示される。領域Ａは、上記の円形の第２層レリーフ構造１４９２に対応する。これらの領域は、上記の図の多くにおいて、青で色付けされている。領域Ａのチャネルは、約２００μｍの幅、およそ２０μｍの高さである。領域Ａは、この領域を有するコントロール層からの重複性コントロールラインによって、バルブおよびポンプを形成するために使用され得る（例えば、図７１のバルブ１５００）。領域Ｂは、第３層レリーフ構造１４９６に対応する。これらの領域は、上記の図の多くにおいて、赤で色付けされている。領域Ｂのチャネルは、長方形プロフィール、およそ１００μｍの幅および２０μｍの高さを有する。これらのチャネルは、正確な粒子コントロールを可能とする。これは、壁および／または流体ストリームの中央に続いて、チャネルの幅を越えて、粒子が分布することを可能にするためである。このようなチャネルは、各チップの正確な領域へと粒子を駆動するために使用され得る領域Ｃは、第１層レリーフ構造１４８６に対応する。これらの領域は、上記の図のいくつかにおいて、青緑で色付けされている。これらのチャネルは、長方形プロフィール、１０μｍの幅および５μｍの高さを有する。この型の小さなチャネルは、細胞またはビーズを捕捉するために、領域ＡまたはＢのチャネルと組合わせて使用される。流体は、これらのチャネル中を流れ得、細胞またはビーズの進入を制限し得る。
【０３７５】
（実施例１４ 微小流体システムにおける速度論的分析のための検出システム）
この実施例は、微小流体システム内の粒子を伴う速度論的反応の分析のための、変調／復調方法およびトレーサー材料を含む検出システムを記載する（図７１Ａ〜Ｆを参照のこと）。
【０３７６】
（背景）
微小流体システムは、細胞内代謝の多くの局面の速度論を測定するために使用され得る。しかし、生理学的に重要な代謝プロセスは、実質的に異なる速度で、マイクロ秒（１０−６秒）以下〜数日（１０５秒）以上の範囲であり得る特徴的な時間で起こり得る。そのため、これらの大きく異なる速度で起こる細胞内事象を測定するための検出方法が、必要とされている。
【０３７７】
時間分解蛍光顕微鏡法は、細胞内速度論研究についての最もポピュラーなアプローチの１つである。代表的には、色素分子が細胞に導入され、その分子からの発光を強い光源（例えば、アークランプまたはレーザー）による励起によって生じさせる。この発光の強度を分析経過の間にわたってモニタリングし、研究対象のプロセスの速度論が与えられる。しかし、色素分子の発光強度は、光退色によって、時間が経過するにつれて減少または消失し得る。結果として、比較的長い期間にわたって起こる、いくつかの細胞内プロセスは、この光退色に起因して、微小流体システムにおいてモニタリングすることがより困難であり得る。
【０３７８】
光退色の速度は励起光の強度と関連するため、より弱い光源がこの速度を軽減するために使用され得る。例えば、図７１Ａは、比較的強いレーザー（１，６ｍＷ）および比較的弱いレーザー（１．６μＷ）を使用した光退色速度対時間の比較を示す。しかし、発光シグナルは照射強度に比例するので、この励起光源は、発光シグナルおよびシグナル／ノイズ比の減少を生じた。そのため、微小流体分析は、光退色を軽減し、シグナル／ノイズ比を増大させ、および／または速いプロセスおよび遅いプロセスの両方の速度論的分析を可能とする、検出システムを利用する。
【０３７９】
（検出システムの説明）
この実施例は、本発明の局面に従う、微小流体アッセイと共に使用するための例示的検出システムを記載する。この検出システムは、変調／復調メカニズムを含む（図７１Ｂ−７１Ｅを参照のこと）。このメカニズムは、シグナル／ノイズ比を改善し得、より弱い光源の使用を可能とする、および／または光退色を軽減し得、より強い光源の使用を可能とする。この検出システムはまた、粒子との速い速度の反応の開始を検出するためにトレーサー染料を使用する方法を含み得る（図７１Ｆを参照のこと）。
【０３８０】
（光検出デバイス）
図７１Ｂは、サンプルからの光学的シグナルを検出するための例示的システム２０１０を示す。システム２０１０は、光源２０１２、光学素子２０１４、検出器２０１６、デジタル式記憶デバイス２０１８、および変調／復調メカニズム２０２０を備え得る。
【０３８１】
光源２０１２は、粒子を可視化するため、および／またはアッセイを行うために１種類以上の粒子に光を照射するために使用され得る。光源は、一般的に、所望の特徴を有する光を発生させるための任意のメカニズムを備え得、時間依存的光源および／または連続的光源が挙げられる。適切な例は、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはランプなどを備え得る。
【０３８２】
光学素子２０１４は、光源２０１２からの光を受容し、光を粒子に向けるため、および／または粒子からの光を受容して、それを検出器２０１６に向けるために使用され得る。光学素子は、光の任意の適切な変化（屈折、反射、回折、偏光、減衰、スペクトル変化、および／または散乱など）を媒介して、分析を容易にし得る。適切な光学素子としては、レンズ、鏡、光ファイバー、フィルター、格子、エタロン、および／またはそのようなものが挙げられ得る。例示的な光学素子としては、微小流体システムから分離されるか、あるいは微小流体システムと部分的または全体的に一体化されている、従来の顕微鏡または他の適切な光学的デバイスが挙げられ得る。
【０３８３】
変調／復調メカニズム２０２０は、変調器２０２２および／または復調器２０２４を備え得る。変調器２０２２は、一般的に、光源２０１２へのサンプルの曝露の強度に時間依存性の変化を提供するための任意のメカニズムを含む。この変化は、光源にとって内因的および／または外因的であり得る。例えば、パルスレーザーまたはストロボレーザー（例えば、ダイオードレーザー）を使用して、光源自身が強度を変化させる場合に、内因性変調が生じる。このようなパルスレーザーは、１秒間に１００万パルスまでで非常に高速にパルスされ得、粒子の高周波照射を可能にする。光源は連続的（または準連続的）であるが、下流のメカニズムがサンプル上に光が当たる前に光の強度を変える場合に、外因性変調が生じる。適切な外因性変調器としては、光学的チョッパ、ホイール、ポッケルスセル、カール（Ｋｅｒｒ）セル、音−光（ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃ）変調器、ならびに／または電気−音変調デバイスおよび他の変調デバイスが挙げられる。対照的に、復調器は、一般的に、変調器の活動に基づいて検出器２０１６からのシグナルを解釈するための任意のメカニズムを有する。変調器と復調器との間のコントロールおよび相互連絡（ｉｎｔｅｒｐｌａｙ）は、任意の適切なメカニズム（例えば、カスタム設計されたデバイスおよび／または市販のデバイスを使用するロックイン（ｒｏｃｋ−ｉｎ）増幅）を使用して行われ得る。
【０３８４】
検出器２０１６は、迅速および／または繰り返して、光を検出し、検出した光を代表的な電気シグナルに変換するために使用され得る。このような検出器は、光源２０１２に照射された粒子によって生成された光シグナルを迅速に検出する能力を提供する、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、および／または他の光検出器を備え得る。光ファイバーを通って光電子増倍管または他の光検出器へと発光を収集することにより、量的情報を収集するために、光子を電子に変換することが可能となり得る。
【０３８５】
デジタル式記憶デバイス２０１８は、検出器２０１６から受容した電気シグナルをデジタル化および／または記憶し得る。これらの記憶されたシグナルは、所望されるように、検索され得、訂正され得、および／あるいは、さもなければ変換され得るか、または操作され得、ならびに印刷され得るか、または表示され得る。
【０３８６】
（微小流体分析のための変調−復調メカニズムを使用した例示的結果）
図７１Ｃは、光源およびシグナルの変調−復調をしない場合（上）とする場合（下）の経時的なシグナル／ノイズ比の比較を示す。この例において、変調−復調メカニズム２０２０の実施形態が、２０００倍以上の係数でシグナル／ノイズ比を上昇させる。従って、より弱い光源が使用され得、発せられる蛍光シグナルがより長い時間経過にわたり測定され得る。
【０３８７】
図７１Ｄは、１つの実験において、試薬−粒子相互作用が起きる速度を決定するためのメカニズム２０２０の実施形態の使用を示す。ここでは、ビオチン化ビーズを微小流体チップ（例えば、実施例２のシステム２５０に従って設計されたチップ）上のトラップに充填した。染料で標識したストレプトアビジン（試薬）を、コントロールバルブの自動操作によってコントロールされる染色と洗浄のサイクルを使用して、脈動の様式でこのビーズに曝露する。この場合、各１０秒のサイクルは、試薬の２秒間の曝露、続く８秒間の洗浄バッファーへの曝露を含む。各サイクルは、蛍光強度にスパイク（ｓｐｉｋｅ）を生じる。しかし、平均蛍光強度は、約２０サイクルでほぼ最大レベルを達成する。従って、最大の染色は、約４０秒で生じる（２０サイクル×２秒／サイクル）。そのため、フローベースの曝露および洗浄は、時間集約的および労働集約的な標識化工程および洗浄工程を避けるように、ならびに試薬の使用を最小にするように最適化され得る。ここで例示した脈動的曝露は、相互作用が起こる速度を測定するために、任意の適切な粒子および染料の組み合わせと共に使用され得る。
【０３８８】
図７１Ｅは、微小流体検出システムの実施形態の細胞内シグナル伝達の速度論的反応を測定する能力を示す。カルシウムセンサー染料であるＦｌｕｏ−３を細胞に充填し、その細胞を微小流体チップ（例えば、実施例２のシステム２５０に従って設計されたチップ）にトラップした。トラップした細胞を、時間＝約１２０秒の時点でイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）で刺激して、細胞内カルシウムの放出を促進した。グラフは、細胞内カルシウム濃度に対応する蛍光の強度対時間のグラフを示す。このような分析は、個々の細胞の反応を測定し、そのため、カルシウムレベルの代償的振動が見られる。
【０３８９】
（トレーサー染料を使用する方法）
最も迅速な反応または事象は、開始点が正確に定義されない限り、測定することが困難であるか、または不可能である。従って、トレーサー材料（例えば、トレーサー染料）が、トレーサー染料および試薬を含む流体が粒子と接触した時間を示すために、目的の試薬中に含まれ得る。従って、粒子と接触しているトレーサー染料の最初の検出によって、反応または事象が開始した０時点が定義される。
【０３９０】
トレーサー染料は、任意の光学的に検出可能な特性を有し得、不活性または反応性であり得る。適切な光学的に検出可能な特性は、セクションＶＩＩにおいて上述である。不活性染料は、一般的に、検出されるアッセイ結果に直接的に寄与しない。そのため、不活性染料は、一般的に、細胞内代謝に影響を与えず、粒子についての情報を測定するために使用される試薬染料を光学的または化学的に妨害し得ない。不活性染料は、非結合性であってもいいし、結合性であってもいい。非結合性染料は、粒子に結合せず、流体の体積を単純に標識し得る。結合性染料は、粒子に結合し得るが、粒子から検出される結果に直接的に寄与しない。対照的に、反応性染料は、粒子と反応し、検出結果に寄与する。適切な反応性染料は、最初に粒子と結合した場合に検出可能であり得るが、アッセイの間に光学的特性に変化を示し得る。不活性染料または活性化染料は、細胞から排除され得るか、粒子に分配され得るか、または細胞の内部に輸送され得る。適切であり得る不活性染料または活性化染料は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲによって販売されている。
【０３９１】
この例に記載されるトレーサー染料および検出システムと結合された迅速な還流メカニズム（例えば、上述の実施例２の還流メカニズム２６８）は、非常に迅速な分析が粒子に対して行われることを可能とする。このような迅速な分析によって、約２秒、１秒、または５００ミリ秒未満で起こる事象が測定され得る。さらに、これらの迅速な分析は、他の方法では容易に検出できない細胞反応を測定するために、生きている細胞に対して行われ得る。
【０３９２】
図７１Ｆは、試薬が粒子に曝される速度を測定するための、微小流体システムにおける変調−復調メカニズム２０２０およびトレーサー染料の実施形態の使用を示す。還流メカニズム（例えば、メカニズム２６８）が、保持部位を蛍光染料に曝露するために使用され得る。生じた蛍光の増加を経時的に測定する。時間「Ｔ」で、電気シグナルがバルブコントローラーに送られた。約５ｍｓｅｃの短い機械的遅延の後で、保持部位で測定された蛍光が増大し始め、１００ミリ秒未満で最大値に到達する。従って、本明細書に記載される微小流体システムを使用して、１ミリ秒の時間のスケールでの迅速な速度論的分析が行われ得る。
【０３９３】
（実施例１５． 不均一な粒子集団の微小流体分析 − パートＩ）
この実施例は、粒子のサイズの相違に基づいて、粒子、特に細胞の不均一な集団を分別および分析するための微小流体デバイスを記載する（図７２を参照のこと）。
【０３９４】
（背景）
不均一な細胞集団（例えば、血液）が、迅速な分析にとっての挑戦すべき課題を提供する。血液中の目的の細胞は、一般的に、あまり目的ではない他の細胞から分離して、これらの他の細胞からの妨害を避ける必要がある。従って、血液は、血液内で特定の細胞を選択的に溶解する、凝固させる、ペレット化する、結合させる、および／または改変するなどのために処置／操作される必要がある。訓練された職員、高価な装置、長いインキュベーション、相対的に大量の試薬またはサンプルの繰り返しの移転、および／またはそのようなものを伴うために、このような操作は血液の分析に要する時間と費用を増大させる。さらに、このような操作は、血液中の感染性因子への曝露についてのより高い危険性に職員をさらす。結果として、全血を使用する多くの診断手順が、高価で遅い。そのため、微小流体のスケールで不均一な細胞集団を自動的に分別および分析する一体化システムが、必要とされている。
【０３９５】
（説明）
この実施例は、個々の粒子の直径に従って、血液細胞および他の不均一な粒子集団を分別する微小流体システムを記載する。こららのシステムにおいては、非常に微量の血液が、統計学的に有意な診断または予後判定にとって十分であり得る。このようなシステムは、改良されたスピード、正確性、安全性、および／またはコストなどを有する、患者のサンプルの分析を容易にし得る。
【０３９６】
図７２は、細胞を分別する微小流体システム１５２０を示す。システム１５２０は、実施例２のシステム２５０に基づき、実施例に記載される配置メカニズム２６４および保持メカニズム２６６を備える。血液サンプルをシステム１５２０に導入し、保持チャンバ２７０へと向ける。このサンプル中の細胞１５２２は、赤血球細胞と血小板を含むが、検出可能な白血球（そのより大きな直径に起因して、保持メカニズムによって保持される）は含まない。細胞１５２２は、チャンバ２７０に入るが、サイズ選択的な側壁チャネル３００を通って出て行く。図７２Ａ〜Ｄは、チャンバ２７０中の細胞およびチャネル３００中の細胞を含む時間差ビデオ画像を示す。白血球細胞（例えば、リンパ球、単球、および顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球））は、存在する場合、チャンバ２７０に保持される。これらの白血球細胞は大きすぎて、チャネル３００を通過できない。そのため、システム１５２０は、システムにおける白血球細胞（または、赤血球細胞）の選択的分析のために、白血球から赤血球および血小板を分離するために使用され得る。
【０３９７】
システム１５２０は、異なるサイズの複数の粒子集団を選択するために、改変され得る。例えば、システムは、保持メカニズムの一連のセットを備えるように改変されえる。各保持メカニズム２７０のためのサイズ選択性チャネル３００を通るアウトフローは、連続的保持メカニズムのインプット部位に対して、部分的または完全に向けられ得る。各連続的メカニズムは、小さな直径のチャネル３００を有し得、そのため、小さな直径の粒子が各連続的メカニズムに保持される。この配置によって、より大きな粒子はメカニズムの連続体のより早くに保持され、一方、より小さな分子は連続体のより後に保持される。任意の適切な保持メカニズムが、この連続体の各位置で使用され得る。
【０３９８】
システム１５２０または関連するシステムの保持メカニズムに保持された粒子は、処理され、分析され得る。粒子は、例えば、実施例２の還流メカニズム２６８を使用して、所望の試薬に対して曝露することで、または、システム１５２０に備えられた任意の他のレザバーから試薬を導入することによって、処理され得る。従って、実施例４に記載したように、異なる保持メカニズムに保持された粒子は、単離されて、異なる試薬に曝露され得る。システム（例えば、システム１５２０）は、オンチップでの染色および洗浄を可能とし、操作および検出の間の多数のピペット操作および／または遠心分離工程についての必要性を取り除く。
【０３９９】
保持された粒子の適切な特徴は、フローサイトメトリーまたは走査式サイトメトリーなどによって検出され得る。フローサイトメトリーにおいて、粒子は、検出メカニズム（例えば、光検出器と結合した光源）を通り越して流れる間に検出され得る。従って、粒子は、例えば、放出メカニズム（例えば、実施例７で上述のもの）を使用して、各保持メカニズムから放出され得、検出器を通り越して流れる。代替的または付加的に、粒子の特徴が検出され得るか、さもなければ粒子が相対的に静止している（例えば、チャンバ２７０に局在化された場合）間に検出され得る。光子は、光電子増倍管、アバランシェ光ダイオード、ＣＣＤ、または類似の技術を使用して、電子に変換され得る。染料からの発光は、単一ＣＣＤを使用して検出するために十分に明るくあり得るし、散乱光は、機能的情報と組合わせた場合に、粒子の型および状態を特異的に識別するために十分な粒子の構造情報を与え得る。
【０４００】
不均一な粒子集団を分別することの更なる局面が、下の実施例２６に記載される。
【０４０１】
（実施例１６． ビーズ上での特異的な結合対の微小流体的相互作用）
この実施例は、微小流体システムにおける、ビーズ上での特異的な結合対（ビオチンとアビジン）の間の相互作用の検出を記載する；図７３〜７４を参照のこと。
【０４０２】
（背景）
ビーズは、薬に関する会社およびバイオテクノロジーに関する会社によって、頻繁に、薬物標的、薬物候補、化学合成、免疫アッセイ、クロマトグラフィーのためのキャリアとして使用される。しかし、少しの数のビーズは、操作すること、特に迅速に起きる反応を検出することが困難である。結果として、現在利用可能な技術を使用することによって、ビーズを使用したアッセイは、一般的に、比較的大きなスケールで行われており、高価な試薬を浪費する、および／または価値のあるより初期の反応情報を損なっている反応終点を測定し得る。そのために、少しの数のビーズを使用して、相互作用（迅速な相互作用を含む）を研究するためのシステムが必要とされている。
【０４０３】
特異的な結合対であるビオチン／ストレプトアビジンをビーズ上での反応のために選択した；図７３を参照のこと。ビオチンは、２４４ダルトンの分子量を有するビタミンである。そのパートナーであるアビジンは、強烈な粘着性でビオチンと結合し（既知の最も強い非共有結合である）、結合定数は１０１５Ｍ−１である。この結合反応は、長年にわたって強く研究されており、豊富な文献が存在する。この結合の大きな強度は、それが、一般的に、生物学的な結合反応の研究のための良いモデル系であり得ることを示唆する。それはまた、研究および臨床的仕事の両方のための多くの検出およびシグナル増幅戦略についての基礎を形成してきた。
【０４０４】
アビジンおよびストレプトアビジンは、それぞれ脊椎動物のビオチンおよび細菌のビオチンのパートナーである。アビジンは、約６８キロダルトンの分子量を有するタンパク質であり、それぞれが１２８アミノ酸長である４つのサブユニット鎖を含む。アビジンは、鳥類、両生類、および爬虫類の卵白に主に見出される。タンパク質であるストレプトアビジンは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉによって生産され、アビジンと非常に類似した構造を有し、またビオチンとも強固に結合する。しかし、ストレプトアビジンは、しばしば、低い非特異的結合を示し、従って、アビジンの代替として頻繁に使用される。
【０４０５】
（方法）
ビオチン／アビジン相互作用を測定するための材料は、以下の通りであった。微小流体チップを実施例２のシステム２５０に基づいて製造した。ビーズ（６．７ミクロンのビオチン化ポリスチレン微小球）をＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。他のバッファーおよび試薬として、０．５％ ＢＳＡ（滅菌濾過してある）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびストレプトアビジンと結合体化した蛍光発色団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）である、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ３５０、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８、およびストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｙｎ）（それぞれ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓから入手）を含んでいた。ビデオカメラに接続した転化（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）蛍光顕微鏡によって、結合反応をモニタリングした。
【０４０６】
以下の番号をつけた工程に従って、分析を行った。
【０４０７】
チップの流体ネットワークは、水、次いでＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
【０４０８】
保持チャンバを使用して、ビーズをチップ上に捕捉した。
【０４０９】
ストレプトアビジン結合体をチップ上の反応ウェルに充填した（１ｍｌのＰＢＳ中に各結合体を２μＬ）。
【０４１０】
捕捉したビーズを結合体の各々に曝露した。
【０４１１】
蛍光シグナルを最大化するために、転化蛍光顕微鏡上に６３×の油浸レンズを使用した。青および緑／赤のフィルターセットを使用した。
【０４１２】
いくつかの場合において、検出メカニズムによる光退色の速度は、蛍光結合体がビーズによって捕捉される速度を超えた。これらの場合において、ＵＶへの一定の曝露をなくし、結合を裏付けるために十分な長さでのみＵＶシャッターを開けて、この手順を繰り返した。
【０４１３】
（結果）
図７４は、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８結合体の保持ビーズへの曝露の間の選択したビデオフレームとしての分析の一部の結果を示す。図７４Ａでは、ビーズは、チャンバ２７０に充填されているが、検出可能な量の結合体とは結合しておらず、検出不能である。図７４Ｂでは、ビーズ１５５０は、バックグラウンドを超えて検出可能である。図７４Ｃは、ビーズを局在化させるための明視野照射の下でのビーズ１５５０を示し、チャンバ中の全てのビーズが結合体で染色されていることを実証している。
【０４１４】
他の結合体への同様の曝露は、より弱い染色を与えた。ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ３５０による検出可能な染色が見られたが、ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＰＥは検出可能なシグナルを生じなかった。しかし、より高感度の検出メカニズム（例えば、レーザー走査サイトメーター）は、ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＰＥの結合の検出を可能にし得る。
【０４１５】
（実施例１７．微小流体システムを使用する細胞におけるイオン流速の測定）
この実施例は、微小流体システムを使用した細胞内イオン濃度（例えば、カルシウムイオン濃度）の分析を記載する；図７５を参照のこと。
【０４１６】
（背景）
カルシウムは、非常に重要な細胞内イオンである。それは、細胞膜から細胞質および核へのシグナルの伝達において極めて重要な働きをする。細胞内カルシウムレベルの変化は、その細胞が刺激に対応しているということを示す。多くの刺激は、細胞外の媒体からの流入または細胞内プールからの放出のいずれかのカルシウムの可動化を起こす。蛍光性のカルシウム指示薬は、この可動化を観察することを可能にする。
【０４１７】
（方法）
細胞内カルシウムレベルを測定するために使用した材料は、以下の通りである。微小流体チップは、実施例７のシステム８５０の改変バージョンに基づいて構築した。Ｆｌｕｏ３／ＡＭ（蛍光性のＣａ２＋指示染料）をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手し、５ｍＭストックとして使用した。イオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）（遊離酸の形態）もまた、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。細胞は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞であり、ＲＰＭＩ培地で増殖させた。
【０４１８】
以下の番号をつけた工程に従って、分析を行った。
【０４１９】
細胞をＲＰＭＩ培地で培養した。
【０４２０】
細胞／培地（５ｍＬ）を１０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。
【０４２１】
細胞を、５μＭのＦｌｕｏ−３を含有するＲＰＭＩ培地（１０ｍＬのＲＰＭＩ ＋ ８μＬのＦＬＵＯ−３ ＡＭ）に再懸濁した。
【０４２２】
細胞／Ｆｌｕｏ−３混合物を３７℃で、３０分間インキュベートして、指示染料を細胞に充填した。
【０４２３】
細胞をペレット化し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＢＳ）（１０ｍＬのＨＢＢＳ中に２００μＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ）で２回洗浄した。
【０４２４】
この細胞を、チップのインプットレザバに配置した。
【０４２５】
顕微鏡およびビデオカメラをセットアップした。
【０４２６】
試薬への曝露を調節するために、遮蔽緩衝液として機能するＨＢＢＳ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液を、細胞の向こう側にポンプで送った。
【０４２７】
遮蔽緩衝液によって細胞から間隔をあけた層において、イオノマイシンを含むＨＢＢＳ／Ｈｅｐｅｓを細胞を通過してポンプで送った。
【０４２８】
遮蔽緩衝液流動の流れを打ち切り、この細胞をイオノマイシンに曝露した。
【０４２９】
イオノマイシンがこの細胞と接触した場合、カルシウム流動をビデオカメラで記録した。
【０４３０】
（結果）
図７５は、イオノマイシンへのＪｕｒｋａｔ細胞の曝露の前後の、標識染色を用いてロードした分析の結果を、選択したビデオフレームとして示す。図７５Ａは、保存部位１５７２で獲得され、明視野照明下で視覚化された２つの細胞１５７０を示す。図７５Ｂにおいて、これらの細胞は、イオノマイシン曝露前に蛍光を欠失する。対照的に、図７５Ｃは、イオノマイシン曝露の後にすぐの、細胞１５７０の蛍光（緑のシグナル）を表す。ネガティブコントロールは、イオノマイシンがこの蛍光のために必要とされたことを明らかにした（これは、示していない）。
【０４３１】
（実施例１８．細胞表面マーカーの微小流体分析）
本実施例は、標識した抗体を用いて、培養したＴ細胞上の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４およびＣＤ８）の検出方法について説明する。
【０４３２】
（背景）
ＣＤ４分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩ分子と相互作用する抗原を認識し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する一次レセプターである（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、１９８４；Ｍａｄｄｏｎら、１９８６）。この抗原の細胞質部分は、プロテインチロシンキナーゼｐ５６ｌｃｋに関連する（Ｒｕｄｄら、１９８９）。ＣＤ４抗原は、ＣＤ３抗原／Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）複合体の機能を調節し得る（Ｋｕｒｒｌｅら、１９８９）。ＣＤ４抗体は、ヘルパーＴリンパ球／インデューサーＴリンパ球より小さい抗原密度を有する、単球／マクロファージと反応する（Ｗｏｏｄら、１９８３）。
【０４３３】
ＣＤ８抗原は、ヒトのサプレッサーＴリンパ球／細胞傷害性Ｔリンパ球のサブセット上（Ｅｖａｎｓら、１９８１；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９８１）およびナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球のサブセット上（Ｌａｎｉｅｒら、１９８３）に存在する。ＣＤ８抗原決定基は、クラスＩＭＨＣ分子と相互作用し、ＣＤ８＋Ｔリンパ球と標的細胞との間の増強された結合をもたらす（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８７；Ｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８７；Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、１９８８）。クラスＩＭＨＣ分子へのＣＤ８抗原の結合は、休止Ｔリンパ球の活性を増強する。ＣＤ８は、ジスルフィド結合した二分子複合体の３２ｋＤａのαサブユニット上に発現された抗原を認識する（Ｍｏｅｂｉｕｓ、１９８９）。ＣＤ８抗原のαサブユニットの細胞質ドメインは、プロテインチロシンキナーゼｐ５６ｌｃｋに関連する（Ｒｕｄｄら、１９８９；Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、１９８９）。
【０４３４】
ＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球の割合を決定することは、免疫不全疾患、自己免疫疾患または免疫応答を有する患者の免疫状態をモニターするのに有用であり得る。先天性免疫不全または後天性免疫不全（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ））を有する多くの患者において、ＣＤ４＋サブセットの相対的な割合は抑制され、そして、ＣＤ８＋サブセットの相対的な割合は増加する（Ｓｃｈｍｉｄｔ、１９８９；Ｇｉｏｒｇｉ、１９９０）。
【０４３５】
サプレッサー／細胞傷害性リンパ球の割合は、いくつかの自己免疫疾患（Ａｎｔｅｌら、１９８６）および特定の免疫応答（例えば、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応）（Ｇｒａｔａｍａら、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐら、１９８６）において、正常基準値外であり得る。ＣＤ８＋リンパ球集団の相対的な割合は、活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）においてしばしば減少し得るが、また、ステロイド療法を受けるＳＬＥ患者において増加し得る（Ｗｏｌｄｅ−Ｍａｒｉａｍら、１９８４）。
【０４３６】
ＣＤ４＋／ＣＤ８＋（ヘルパー／サプレッサー）リンパ球比（ＣＤ４フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）陽性リンパ球対ＣＤ８フィコエリトリン（ＰＥ）陽性リンパ球の比として定量化される）は、自己免疫疾患もしくは免疫不全を有する患者または自己免疫疾患もしくは免疫不全の発現の疑いのある患者の免疫状態を評価するために使用されている（Ａｎｔｅｌら、１９８６；Ｗｏｌｄｅ−Ｍａｒｉａｍら、１９８４；Ｓｍｏｌｅｎら、１９８２）。多くの場合、免疫不全状態においてヘルパーリンパ球の相対的な割合は低下し、そして、サプレッサーリンパ球は増加する。これらの状態はまた、Ｔ細胞リンパ球減少によって特徴付けられ得る（Ｏｈｎｏら、１９８８）。さらに、この割合は、急性ＧＶＨＤの発症について、骨髄移植患者をモニターするために使用されている（Ｇｒａｔａｍａら、１９８４）。
【０４３７】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト成熟白血病細胞株）は、休止ヒトＴリンパ球と表現型上類似し、Ｔ細胞の生理学を研究するために広範に使用されている。これらの細胞は、懸濁液において丸いか、単一で増殖するかまたは凝集する。これらは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する（１９７６年に最初に再発）１４歳の少年の末梢血におけるヒトＴ細胞白血病から樹立された。この細胞株はまた、「ＪＭ」（ＪＵＲＫＡＴおよびＪＭは、同じ患者由来で、姉妹クローンである）と呼ばれる。時々ＪＭは、ＡＳＴ、ＬＤＨおよびＮＰのＩＥＦを有するヒトで確認された、いくらか異なる特徴を有するサブクローンであり得る。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、以下の一般的な制限特性を有する：ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ５＋、ＣＤ６＋、ＣＤ７＋、ＣＤ８−、ＣＤ１３−、ＣＤ１９−、ＣＤ３４＋、ＴＣＲα／β＋およびＴＣＲγ／δ−。
【０４３８】
（方法）
ＣＤ４およびＣＤ８の分析に使用した材料は、以下の通りであった。微小流体チップを、実施例７のシステム８５０の改変したバージョンに基づいて構築した。ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、ＲＰＭＩに培養した。蛍光標識結合抗体（ＣＤ４−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＣＤ８−フィコエリトリン（ＰＥ））を使用した。希釈、集束、洗浄などのための緩衝液は、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳであった。ビデオカメラを装備している倒立蛍光顕微鏡を用いて、データを集めた。
【０４３９】
以下の番号付き工程に従って、分析を行った。
【０４４０】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩで増殖し、次いで、ペレット（１０ｍＬの培地／細胞）にした。
【０４４１】
この細胞を、１ｍＬの０．５％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに再懸濁した。
【０４４２】
抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体複合体および抗ＣＤ８−ＰＥ抗体複合体を、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、１：１００に希釈した。
【０４４３】
脱イオン水を微小流体ネットワークに流すことによってチップを調製し、次いで、倒立蛍光顕微鏡の上でマウントした。蛍光シグナルを最大にするために、１００×または６３×の油浸レンズを使用した。
【０４４４】
細胞をチップ上にロードし、配置しそして保持した。
【０４４５】
希釈した抗体複合体を、チップの別個の試薬インプットウェルにロードした。
【０４４６】
光退色を避けるために、ＵＶランプからの光照射を最小にした。
【０４４７】
抗ＣＤ４−ＦＩＴＣを、２分間、細胞に曝露した。
【０４４８】
ＣＤ４抗体複合体の流動を調節するバルブを閉じた。
【０４４９】
非結合性の抗体を除去するために、遮蔽緩衝液流動ラインを開けた。
【０４５０】
ＵＶ励起シャッターを開け、細胞蛍光を記録した。
【０４５１】
蛍光が弱いかまたは目に見えなかった場合、ＵＶシャッターを閉じ、そして、工程８から工程１１を繰り返した。
【０４５２】
蛍光が観察され、記録されるまで、工程１２を繰り返した。
【０４５３】
ネガティブコントロールとして、抗ＣＤ８−ＰＥを用いて、工程８から工程１２を繰り返した。
【０４５４】
（結果）
抗ＣＤ８抗体結合体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合せず、従って、抗ＣＤ４抗体結合体の緑色の蛍光を視覚化するために必要な時間内において、赤色蛍光はほとんどまたは全く目に見えなかった。リアルタイムで抗体の結合を観察するために、連続したＵＶ曝露を用いて、この手段を繰り返し得る。
【０４５５】
（参考文献）
【０４５６】
【数１】
2010042020.tif 000003
【０４５７】
【数２】
2010042020.tif 000004
【０４５８】
【数３】
2010042020.tif 000005
（実施例１９．微小流体システムにおける細胞溶解の測定）
本実施例は、細胞の獲得、溶解および染色について説明する。
【０４５９】
（背景）
アクリジンオレンジ（ＡＯ）を染色のために使用した。ＡＯは、二量体として一本鎖の核酸に結合（これは、赤色で蛍光を発する）し、そして、単量体として二本鎖の核酸に結合（これは、緑色で蛍光を発する）する。蛍光波長におけるこの差異は、核酸結合部位へのＡＯ分子の異なる接近性によって引き起こされる。また、ＡＯ蛍光はまた、酸性の細胞オルガネラ（例えば、リソソーム）をオレンジに染色する、ｐＨ感受性である。
【０４６０】
（方法）
溶解を測定するために使用した材料は、以下の通りであった。微小流体チップを、実施例２のシステム２５０に基づいて構築した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＲＰＭＩに培養した。アクリジンオレンジを、５μｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解した。溶解細胞に対する溶液または液体は、０．０５％過酸化水素含有ＰＢＳ、脱イオン水、２％ＴＷＥＥＮ２０（０．２μｍのフィルターにかけた）含有ＰＢＳおよびＷＩＮＤＥＸを含んだ。ビデオカメラを装備している倒立蛍光顕微鏡で、データを集めた。
【０４６１】
以下の番号付き工程に従って、分析を行った。
【０４６２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩで増殖し、次いで、ペレット（１０ｍＬの培養培地／細胞）にした。
【０４６３】
５ｍＬのＰＢＳ（５μｇ／ｍｌアクリジンオレンジ含有）で細胞を再懸濁するか、またはコントロールチップ上で使用するために、細胞を染色しないままにした。コントロールチップに関しては、工程５に移る。
【０４６４】
この細胞を、室温で１０分インキュベートした。
【０４６５】
この細胞を、ペレットにし、ＰＢＳで二回洗浄した。
【０４６６】
この細胞を、１ｍＬのＰＢＳで再懸濁した。
【０４６７】
微小流体ネットワークを脱イオン水で洗浄することによって、チップを調製し、次いで、倒立蛍光顕微鏡の上でマウントした。蛍光シグナルを最大にするために、顕微鏡の６３×の油浸レンズを使用した。
【０４６８】
細胞をチップ上にロードし、配置しそして保持した。
【０４６９】
ペルオキシド含有ＰＢＳを、このチップの試験ウェルにロードした。
【０４７０】
光退色を最小にするために、ＵＶランプからの光に対するチップの曝露を最小にした。
【０４７１】
蛍光灯に染色細胞を曝露するために、ＵＶシャッターを開けた。
【０４７２】
２分間の間、または溶解もしくは光退色が生じるまで、この細胞にペルオキシド含有ＰＢＳをポンプで注入した。
【０４７３】
次いで、２％ ＴＷＥＥＮ−２０含有ＰＢＳ、ＷＩＮＤＥＸおよび最終的に水に対して、細胞を連続して曝露した。
【０４７４】
（結果）
この実験の最初の試みの際、ペルオキシド、ＴＷＥＥＮおよびＷＩＮＤＥＸの条件は、この細胞を溶解しなかった。その後、細胞溶解を示すために、水を首尾よく使用した。溶解はおそらく、他の条件下で生じたが、明らかではなかった。Ｊｕｒｋａｔ細胞はかなり強いため、この実験のための良いモデル細胞株ではないかもしれない。
【０４７５】
（実施例２０.微小流体環境における細胞アポトーシスの誘導および検出）
本実施例は、微小流体システムにおける細胞アポトーシスの誘導および検出について説明する；図７６を参照のこと。
【０４７６】
（背景）
アポトーシス（プログラム細胞死ともいう）は、正常な発生の一部分として生じる、慎重に調節された細胞死のプロセスである。不適切に調節されたアポトーシスは、疾患状態（例えば、アルツハイマー病および癌）に関係する。アポトーシスは、特徴的な形態学的変化および生化学的変化（核クロマチンのコンパクションおよび断片化、細胞質の収縮ならびに膜非対称の減少を含むｌ〜５）によって、壊死または偶発的な細胞死と区別される。
【０４７７】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）分布はまた、アポトーシスのマーカーとして作用し得る。正常な生存可能な細胞において、ホスファチジルセリンは、細胞膜の細胞質側に位置する。しかし、アポトーシス細胞において、ＰＳは、原形質膜の内側から外側の小葉状部分に転位置し、従って、細胞外側にＰＳを曝露する６。白血球のアポトーシスにおいて、細胞表面外側のＰＳは、マクロファージによる認識および食作用のための細胞を標識する７，８。ヒト抗凝血物質（アネキシンＶ）は、ＰＳに対して高い親和性を有する、３５〜３６ｋＤのＣａ＋２依存性リン脂質結合タンパク質である９。アネキシンＶは、外側の小葉状部分に曝露されたＰＳと結合することによって、アポトーシス細胞を同定し得る１０。結合されたアネキシンＶは、色素、アネキシンＶに結合された特異的結合メンバー、抗アネキシンＶ抗体などを介して検出し得る。
【０４７８】
過酸化水素は、培養細胞におけるアポトーシスのマーカー（例えば、ＰＳの転位）を誘導することが示された。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の細胞毒性は、酸化ストレスによって開始され、その結果、細胞質構成要素の急速な変化、細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）およびＡＴＰの欠乏、ＮＡＤ＋レベルの減少、遊離細胞基質Ｃａ２＋の増加ならびに脂質過酸化を生じる１１。Ｈ２Ｏ２はまた、ミトコンドリア透過性遷移細孔およびシトクロムｃの放出を活性化する１２。細胞質において、シトクロムｃ（Ａｐａｆ−１との組み合わせにおいて）は、カスパーゼ９を活性化し、カスパーゼ３の活性化およびその後のアポトーシスへと導く１３〜１５。
【０４７９】
（方法）
本実施例は、微小流体システムにおける細胞アポトーシスの誘導および検出を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、微小流体システムに配置し、保持し、次いで、過酸化水素へのこれらの細胞の曝露によって、プログラム細胞死を開始する。外膜小葉状部分へのＰＳの転位は、アポトーシスを測定するために、アネキシンＶを用いてモニターする。同時に、ヨウ化プロピジウムに細胞を曝露する（これは、崩壊した膜を有する細胞を染色し、アポトーシスというよりむしろ壊死の指標である）。
【０４８０】
使用した材料は以下の通りであった。微小流体チップを、実施例２のシステム２５０に基づいて構築した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＲＰＭＩに培養した。ＶＹＢＲＡＮＴアポトーシスアッセイキット＃２を、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ,Ｅｕｇｅｎｅ,ＯＲから獲得した。このキットは、蛍光標識結合アネキシンＶ（緑）およびヨウ化プロピジウム（赤）を含む。ビデオカメラを装備している倒立蛍光顕微鏡で、データを集めた。
【０４８１】
以下の番号付き工程に従って、分析を行った。
【０４８２】
ビデオカメラのスイッチを入れた。
【０４８３】
チップの保持チャンバに、この細胞をトラップした。
【０４８４】
アネキシンＶ結合体を、チップの試薬ウェル＃１へロードした。
【０４８５】
ヨウ化プロピジウムを、チップの試薬ウェル＃２ヘロードした。
【０４８６】
結合緩衝液（ＢＢ）を、チップの遮蔽緩衝液ウェルへロードした。
【０４８７】
この細胞を、５分間、ＢＢで灌流した。
【０４８８】
この細胞を、５分間、アネキシンＶ結合体で灌流した。
【０４８９】
染色について、細胞をチェックした（注意：これはネガティブコントロールである。細胞がアポトーシスしていなかったので、この状態での染色は生じなかった。）
遮蔽緩衝液および試薬ウェルの流動を調節するバルブを、それぞれ閉じた。
【０４９０】
ＢＢを８００μＭ Ｈ２Ｏ２含有ＰＢＳに置き換えた。
【０４９１】
遮蔽緩衝液の流動を調節するバルブを開けることによって、この細胞をＨ２Ｏ２／ＰＢＳに曝露した。
【０４９２】
アポトーシスの誘導の間、細胞を光学顕微鏡下で観察した。
【０４９３】
１５分後、遮蔽緩衝液の流動を調節するバルブを閉じた。このウェルをＢＢで洗浄し、次いで、ＢＢに置き換えた。
【０４９４】
次いで、５分間、この細胞をＢＢで灌流した。
【０４９５】
アネキシンＶ結合体についてのバルブを開き、遮蔽緩衝液のバルブを閉じた。
【０４９６】
５分間、この細胞をアネキシンＶ結合体に曝露した。
【０４９７】
アネキシンＶ結合体をコントロールするバルブを閉じ、また、細胞を洗浄するためにＢＢバルブ開いた。
【０４９８】
顕微鏡シャッターを開けることによって、この細胞を励起光に曝露した。緑色の蛍光は、ホスファチジルセリンについての陽性反応を示した。
【０４９９】
ヨウ化プロピジウムの流動を調節するバルブ（「ＰＩバルブ」）を開き、その一方で、ＢＢを調節するバルブ（「ＢＢバルブ」）を閉じた。
【０５００】
２分後、ＢＢバルブを再び開き、ＰＩバルブを閉じた。
【０５０１】
５分間の洗浄後に、赤いフィルタセットを使用している間、蛍光シャッターを顕微鏡上で開けた。
【０５０２】
最後に、ＢＢを水に置き換え、この細胞を溶解し、次いで、ＰＩに再び曝露した。
【０５０３】
（結果）
図７６は、この分析から選択されたビデオフレームを示す。パネルＡにおいて、細胞１５９０は、チャンバ２７０にトラップされており、明視野照明下で視覚化し得る。パネルＢおよびパネルＣは、過酸化水素曝露前（Ｂ）および過酸化水素曝露後（Ｃ）の、アネキシンＶ結合体を用いた細胞標識を比較する。細胞１５９０は、過酸化水素曝露前に、アネキシン結合体で標識していない（パネルＢ）が、弱いアネキシン結合体のシグナルが、過酸化水素曝露後に検出可能であり（パネルＣ）、これは、少なくともいくつかの細胞がアポトーシスを開始したことを示す。パネルＤ〜Ｆは、分析の間の異なる時間において、細胞１５９０のヨウ化プロピジウム染色を比較する。パネルＤおよびパネルＥは、過酸化水素曝露によるアポトーシスの誘導前または誘導後のいずれかにおいて、ヨウ化プロピジウム染色がないことを示す。対照的に、パネルＦは、細胞の水への曝露後の、検出可能なヨウ化プロピジウム染色を示す（これは、細胞壊死を示す）。
【０５０４】
（参考文献）
【０５０５】
【数４】
2010042020.tif 000006
（実施例２１．微小流体システムにおける水生微生物の分析）
本実施例は、微小流体システムを使用する、水生微生物（例えば、プランクトン）の捕獲および可視化について説明する。
【０５０６】
（背景）
プランクトンは、それらの生活の少しまたは全てを水中で漂流して過ごす、非常に多様な海洋生物および淡水生物群である。プランクトンは、動物界および植物界の両方に位置し、サブミクロンから１センチメートルを超えるまでの様々なサイズを含む。これらの表面上無関心な生物は、他の水生生物の繁栄だけではなく、地球の大気の組成という点で、ポジティブとネガティブの両方において、重要な役割を果たす。例えば、これらの生物は、地球の酸素の大部分を産生すると考えられる。さらに、これらは、世界的な二酸化炭素の交換において重要な役割を果たす（化石燃料を燃焼することによって産生される過剰な二酸化炭素の多くを除去し、この二酸化炭素を海底に送る）。対照的に、経済へのそれらのネガティブな影響において、いくつかのプランクトンは悪名高い。例えば、藻類プランクトンの爆発的な集団増加は、魚介類を毒殺する有毒な「赤潮」を産生する。しかし、赤潮の発生は予測することおよび／または予防することが困難であり、その結果、大規模な魚の死滅およびビーチの閉鎖を生じ、大きい経済影響をもたらす。従って、環境に役立つかまたは悪影響を与える実験室個体群または自然個体群を含むプランクトンを操作し、処理しそして分析するためのシステムが必要とされる。
【０５０７】
（方法および結果）
本実施例は、小さいプランクトン（特に、ピコプランクトン（０〜２μｍ）、極微プランクトン（２〜５μｍ）および／またはナノプランクトン（５〜６０μｍ））を操作し、検出し得る微小流体システムを提供する。プランクトンは、統合した微小流体環境で保持され、処置され、そして／または検出され得る。
【０５０８】
以下のように、プランクトンを微小流体システムで操作し、検出した。海水のサンプルを、サンフランシスコ湾から集め、サンプル内の生物を濃縮するために遠心分離した。２０μＬアリコートの濃縮サンプルを、上記の実施例２に記載される、微小流体システム２５０のインプットレザバにロードした。天然蛍光プランクトンを、チャンバ２７０に保持し、蛍光顕微鏡によって首尾よく検出した（これは、示していない）。
【０５０９】
本実施例のこの方法は、任意の適切なパラメータを変えることによって、変更され得る。例えば、プランクトンを、淡水供給源から収集し得るかもしくは培養し得、水性プランクトンサンプルを濃縮しないで、微小流体環境に直接的にロードし得、そして／または保持したプランクトンを、任意の適切な試薬に曝露し得る。あるいはまたはさらに、物理的な特性（例えば、とりわけ、サイズまたは密度）あるいは測定特性／特徴（例えば、色素および／または特異結合メンバーを用いて標識する）に従って、プランクトンの異種集団をソートする微小流体システムを使用し得る。
【０５１０】
（実施例２２．膜色素を用いた微小流体システムにおける膜輸送の分析）
本実施例は、膜標識色素で処理した細胞における、膜輸送経路の微小流体分析について説明する。
【０５１１】
（背景）
小胞輸送の研究はしばしば、膜を標識する、光学的に検出可能な色素に依存する。このような色素への細胞の短時間の曝露は、これらの細胞の膜表面の標識をもたらす。内部膜へのその後の色素移動（例えば、エンドソーム、ゴルジ装置、リソソームおよび／または小胞体）は、細胞内小胞輸送経路を介して、とりわけ、膜表面、レセプターおよび／またはリガンドの対応する経路を通る。この手法を使用して、細胞エンドサイトーシス、再循環、分解および／または分泌経路を、モニターし得、そして分析し得る。
【０５１２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能ないくつかの「ＦＭ」色素は、細胞膜に結合する。これらは一般に非毒性であるので、従って、これらのＦＭ膜色素をエンドサイトーシスのための汎用性プローブとして使用し得る。ＦＭ膜色素は、水溶液中で実質的に非蛍光性であるが、膜と結合すると激しく蛍光を発する。
【０５１３】
（目的および方法）
この分析の目的は、以下を含んだ。Ｉ）Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた、２個のＦＭ膜色素（ＦＭ １−４３およびＦＭ４−６４）のための染色条件の定義。図７７および図７８は、これらの色素の構造および励起／発光スペクトルを示す。これらの２つＦＭ色素は、実質的に非オーバーラップの発光スペクトルを有する。ＩＩ）染色の背景濃度を規定するために、ＰＤＭＳで形成した微小流体チップに対するＦＭ色素の親和性試験。ＩＩＩ）微小流体チップにおけるＪｕｒｋａｔ細胞のトラップおよび２つのＦＭ膜色素を用いた細胞の二重染色の実施。
【０５１４】
この分析に使用した材料は、以下を含んだ。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓからＦＭ１−４３およびＦＭ４−６４を獲得した。微小流体チップを、実施例２のシステム２５０に基づいて産生した。ビデオカメラを装備している倒立蛍光顕微鏡を用いて、結果を集め、記録した。
【０５１５】
ＦＭ膜色素を用いてＪｕｒｋａｔ細胞を標識するための条件を、以下の標識プロトコールを用いて決定した。
【０５１６】
培養したＪｕｒｋａｔ細胞（５ｍＬ（細胞／培地））を１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット状にした。
【０５１７】
細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。
【０５１８】
細胞ペレットを２ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
【０５１９】
得られた細胞懸濁物のアリコート（５００μＬ）を４つの遠心チューブに分けた。
【０５２０】
以下のように各４つのチューブに色素を添加した：チューブ＃１には色素を添加せず、チューブ＃２にはＦＭ１−４３を添加し、チューブ＃３にはＦＭ４−４６を添加し、そして、チューブ＃４にはＦＭ１−４３およびＦＭ４−６４の両方を添加した。各色素の最終色素濃度は、２μＭであった。
【０５２１】
細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【０５２２】
各染色状態をデジタル画像ファイルを保存することによって文書化した。
【０５２３】
バックグラウンドシグナルを決定するためのＦＭ膜色素での微小流体チップの標識を以下のようにして行った。
【０５２４】
各色素をＰＢＳ中２μＭの最終濃度まで希釈した。
【０５２５】
ＦＭ１−４３（５μＬ）を第１のチップに導入した。
【０５２６】
ＦＭ４−６４（５μＬ）を第２の利用可能なチップに導入した。
【０５２７】
ＦＭ１−４３および４−６４色素（１：１）の混合物を第３のチップに導入した。
【０５２８】
各色素充填チップを、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０５２９】
バックグラウンド染色のレベルを、上記Ａ部においてＦＭ色素で染色された細胞の蛍光強度に対して決定した。
【０５３０】
細胞を、以下のようにして微小流体システム中でＦＭ色素で標識した。
【０５３１】
未標識のＪｕｒｋａｔ細胞を充填し、ＰＢＳをキャリア緩衝液として用いて微小流体チップに捕捉した。
【０５３２】
各ＦＭ膜色素（５μＬ）をチップ上の２つの試薬ウェルのうちの１つに配置した。
【０５３３】
チップの特徴および細胞を最低限の白熱光を用いて可視化した。
【０５３４】
ビデオカメラの電源をつけ、蛍光顕微鏡の１００×油液浸対物レンズを用いた。
【０５３５】
第１のＦＭ膜色素（１−４３）を細胞に送達した。
【０５３６】
蛍光シグナルを観察した。
【０５３７】
第２のＦＭ膜色素（４−６４）を細胞に送達した。
【０５３８】
蛍光シグナルを観察した。
【０５３９】
シグナル強度が最大になるまで、工程５〜８を必要なだけ繰り返した。
【０５４０】
（結果）
３つのプロトコルの結果は以下の通りである。
【０５４１】
プロトコルＡは、室温で５分間のインキュベーションの後、色素でのＪｕｒｋａｔ細胞の顕著な標識化を生じた。各色素は、蛍光顕微鏡を用いて可視化するのに十分な強度で細胞を染色した。例えば、図７９は、ＦＭ１−４３で染色されたＪｕｒｋａｔ細胞を示す。しかし、各色素の発光プロフィールを、Ｌｅｉｃａ顕微鏡に配置した緑色／赤色フィルターを用いて、分離した色素としては区別できなかった。適切に選択されたフィルターセットは、これらの色素を用いる２色アッセイを可能にし得る。
【０５４２】
プロトコルＢは、いずれかの色素を用いて、ＰＤＭＳにより形成された微小流体チップの顕著なバックグラウンド標識を生じた。ＰＤＭＳは、チップへのこれらの色素の結合を最小限にするために表面修飾され得る。
【０５４３】
プロトコルＣは、ＰＤＭＳに結合する色素によって産生される高いバックグラウンドにより挫折した。シグナル細胞をチップ内に捕捉した後、ＦＭ１−４３は捕捉された細胞の膜よりも効率的にチップに結合した。
【０５４４】
（実施例２３：単一細胞または複数細胞の微小流体チャンバへの細胞の捕捉）
この実施例は、微小流体システム中の単一の細胞または細胞集団の捕捉を記載する；図８０〜８２を参照のこと。
【０５４５】
図８０は、概ね実施例７のシステム８５０に従って加工されたチップを用いる、保持部位で捕捉される単一細胞を示す。図８０Ａにおいて、細胞１６１０は、保持部位１６１２上の反対方向に伸びる、分かれた流体経路を流れる。図８０Ｂでは、捕捉された細胞１６１４が保持部位に位置する。
【０５４６】
複数の細胞が、概ね実施例２のシステム２５０に従って加工されたチップによって形成されるより大きな保持チャンバに捕捉された。図８１Ａ、８１Ｂおよび８１Ｃは、それぞれ、空のチャンバ２７０、２つの細胞を含むチャンバ、および６つの細胞を含むチャンバを示す。図８２は、同様に捕捉された細胞を示すが、ここでは、細胞は、蛍光色素で前もって標識されており、従って、細胞は、蛍光顕微鏡を用いて、明るい緑色として容易に可視である。図８２Ａおよび８２Ｂは、それぞれ、３つのみの細胞を含むチャンバおよび４つの細胞が入る期間を示す。
【０５４７】
（実施例２４：微小流体システム中の細胞の固定および染色）
この実施例は、有機溶媒（メタノール）で細胞を固定し、アクリジンオレンジで細胞を標識するための微小流体システムの使用を記載する；図８３を参照のこと。
【０５４８】
全ての細胞操作および処理は、実施例２に記載されている通りであった。図８３Ａは、保持部位１６３２の底部で保持されている単一の細胞１６３０を示す。細胞は、用いた光のレベルが低いため、ほとんど可視化されない。細胞を、メタノールで灌流して細胞を固定し、目に見える細胞の収縮が明らかであった（示さず）。図８３Ｂは、細胞が蛍光を示さないことを示す。しかし、細胞がアクリジンオレンジの溶液で灌流された後、細胞は明るく蛍光を発する（図８３Ｃを参照のこと）。
【０５４９】
（実施例２５：細胞分泌の測定のための微小流体メカニズム）
この実施例は、細胞からの分子、複合体および／または小さい粒子の分泌を測定するための、ソフトリソグラフィーベースの微小流体システムの構造および使用を記載する。
【０５５０】
多くの細胞分析は、細胞からの物質の放出および／または分泌を測定する。いくつかの場合、細胞は自然に物質を分泌する。例えば、ニューロンを、神経シナプスにおいて神経伝達物質を分泌する能力について分析し；内分泌細胞を、内分泌ホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、ステロイドホルモンなど）の分泌について分析し；そして、広範囲の細胞型を、サイトカインの分泌について分析する。他の場合、細胞は、その内容物の局面を決定するための溶解される。しかし、これらの場合のいずれにおいても、分泌または放出された目的の物質は、もはや、細胞によって固定される位置で保持され得ず、従って、周囲の溶液中に自由に拡散し得る。従って、このような分泌または放出された物質は、それらを濃縮せずにか、および／または、例えば、ＥＬＩＳＡにて、固定化された高親和性結合パートナーを用いることなく、分析することは困難であり得る。
【０５５１】
微小流体システムは、細胞から放出された物質を測定することに関して、いくつかの問題を改善し得るが、さらなる検討事項を生じ得る。微小流体システムにおいて、細胞は、上記の実施例１０のように、小さな容量を有する別々のチャンバ中で増殖させられ得る。チャンバは、放出された物質を小さな容量中に維持し得、その後の分析を促進し得る。しかし、放出された物質を濃縮された状態で維持するために、チャンバは、微小流体ネットワークの他の部分から隔離され得る。物質は、分析用試薬から隔離され得、そして、放出された物質を実質的に希釈することなく回収することは困難であり得るため、このような隔離されたチャンバは、放出された物質の容易な分析を促進しない。従って、微小流体メカニズムは、細胞から放出された物質が、微小流体システムの主要な流体層部分ではない、別個の流体コンパートメントに回収され、そして／または分析されることを可能にすることが必要である。
【０５５２】
この実施例は、細胞チャンバおよび、半透膜を介して流体接触している別々の物質回収コンパートメントを備える微小流体システムを提供する。半透膜は、細胞から分泌／放出された物質の移動を可能にするが、細胞自体の動きは妨げる。これらの膜は、流体層の一部を形成し得るか、または、流体層の上および／または下の流体層と接触し得る。下に配置される場合、膜は、流体層のための基板のいくらかまたは全てを形成し得る。従って、分泌／放出された物質は、流体層の別のコンパートメント、流体層の上のコンパートメントおよび／または基板の下のコンパートメントでの回収および／または分析のために膜を通過し得る。例えば、微小流体システムは、実施例１１のベース層（ｂａｓｅｌａｙｅｒ）と類似する層を備え得る。
【０５５３】
（実施例２６：不均一な粒子集団の微小流体分析−第ＩＩ部）
この実施例は、粒子の不均一な集団（例えば、血液サンプル）を、粒子サイズの差異に基づいて選別および分析するための微小流体システムを記載する；図８４〜８８を参照のこと。実施例２６は、上記実施例１５の局面についてさらに詳述する。
【０５５４】
（説明）
この実施例は、より大きい粒子およびより小さい粒子の混合物から、より大きい粒子を選択的に保持し、分析する微小流体システム１６５０を提供する；図８４および８５を参照のこと。システム１６５０は、とりわけ、インプットメカニズム１６５２、配置メカニズム１６５４、濾過メカニズム１６５６、保持メカニズム１６５８、灌流メカニズム１６６０、放出メカニズム１６６２、および流れベースの検出メカニズム１６６４を備える。これらのメカニズムは、サンプルをインプットし、そして、サンプルのサイズを選択するための第１のセットと、サイズ選択されたサンプルを保持し、処理し、測定し、そしてアウトプットするための第２セットとに分類され得る。
【０５５５】
メカニズムの第一セットは、機能的に、以下のように連結し得る。インプットメカニズム１６５２は、粒子インプットレザバ１６６６中に設置された粒子サンプルからシステム１６５０の微小流体ネットワーク１６６８へ、粒子を導入する。粒子は、注入チャネル１６７０に沿った流動によって、配置メカニズム１６５４によってろ過メカニズム１６５６へ移動する。ろ過メカニズム１６５６は、サイズ依存性かつ調節可能な保持メカニズム、またはインプットされた粒子からより大きい粒子を保持したままで、より小さい粒子を除去するプレフィルターとして機能し得る。適切なろ過後、より大きい粒子を、ろ過メカニズム１６５６から放出し得、配置メカニズム１６５４によって、保持メカニズム１６５８に向かって移動させ得る。
【０５５６】
メカニズムの第二セットは、機能的に、以下のように連結し得る。配置メカニズム１６５４は、粒子を保持メカニズム１６５８に集束させ、方向付けるために、第一の集束メカニズム１６７２を使用し得る。保持メカニズム１６５８により保持された粒子を、灌流メカニズム１６６０から所望の試薬とともに灌流させ得、次いで、放出メカニズム１６６２により放出し得る。放出された細胞を、配置メカニズム１６５４によって流動ベースの検出メカニズム１６６４へ移動させ得る。配置の間、細胞を第二の集束メカニズム１６７４によって、粒子の単一の流れに集束し得る。最後に、検出された細胞は、アウトプットメカニズム１６７６を通過し得る。
【０５５７】
システム１６５０は、多数の調節装置またはバルブを備え得、それは、上に記載したメカニズムの種々の局面を調節し得る；図８５を参照のこと。バルブＶ１は、インプットメカニズム１６５２を調節し得る。バルブＶ２は、代替インプットメカニズム１６７８を調節し得る。代替インプットメカニズム１６７８は、インプット流体の代替源を提供し得、ろ過メカニズムから第一集束メカニズム１６７２へ、および保持メカニズム１６５８上に粒子を運搬するために、ならびに／またはその他のために、ろ過メカニズム１６５８を洗浄するための粒子を含まない流体を供給するように使用され得る。バルブＶ３は、第一試薬レザバ１６８０からのインプットを調節し得る。バルブＶ４は、第二試薬レザバ１６８２からのインプットを調節し得る。バルブＶ５は、開始処理の所望の時まで、保持された粒子から試薬を隔てるために、保護緩衝液の流量を調節し得る。Ｖ６は、第一廃棄チャネル１６８４を通る流量を調節し得る。Ｖ７は、放出メカニズム１６６２を調節し得る。Ｖ８は、第二廃棄チャネル１６８６を通る流量を調節し得る。Ｖ９は、検出メカニズム１６６４に向かう流量を調節し得る。最後に、Ｖ１０は、調節可能な保持メカニズム１６５６からの粒子の放出を調節するろ過−放出メカニズム１６８８を調節し得る。
【０５５８】
インプットメカニズム１６５２、配置メカニズム１６５４、保持メカニズム１６５８、灌流メカニズム１６６０、放出メカニズム１６６２およびアウトプットメカニズム１６７６のさらなる局面は、ＸＩＩＩ節の他のところで記載する。
【０５５９】
（適用）
以下の記載は、全血のサンプルからの白血球の分離および分析についてのシステム１６５０の使用を例証する。しかし、システム１６５０は、粒子の任意の不均質な（または均質な）分布を伴なった使用に適切であり得る。
【０５６０】
システム１６５０は最初に、より小さい赤血球および血小板から白血球を分離する。これらの分離された白血球を、保持部位に方向付け、保持し、次いで、保持された白血球を染色するために、灌流メカニズムによってプロセスする。これらの染色された細胞を、次いで、保持部位から放出し、次いで、分離流動ベースの検出部位へと配置する。検出部位は、次いで、使用した染色方法／試薬に基づいて、染色された細胞の特徴を検出する。
【０５６１】
システム１６５０に従って、組み立てたチップは、以下のように使用のために準備され得る。第一に、チップに、水をロードし得る。次に、全てのチャネルが満たされる場合、その水を、緩衝溶液で置換し得る。この時点で、以下バルブ：Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ９およびＶ１０は一般に、閉鎖している。それに対して、以下のバルブ：Ｖ６、Ｖ７およびＶ８は一般に、開放している。全てのインプットレザバに、それぞれの緩衝液／試薬をロードし得る。しかし、代表的には、粒子インプットレザバ１６６６はまだロードしない。各廃棄レザバ１６９２、１６９４、１６９６および１６９８を空にし得る（または既に空である）。
【０５６２】
全血のサンプルを以下のようにロードし、ろ過し得る。血液のアリコートを、粒子インプットレザバ１６６６にロードする。バルブ１を開放し、血液をろ過メカニズム１６５６内へ、流動させ得る。図８６は、ろ過メカニズム１６５６の動作をより詳細に示す。第一セットの粒子選択性チャネル１７００（例えば、幅約７μｍおよび高さ約５μｍのチャネルである）を、吸込チャネル１７０２の壁に沿って配列し得る。第二セットの粒子選択性チャネルまたはチャンバチャネル１７０４をまた、捕捉チャンバ１７０６の周囲付近に配置し得る。従って、赤血球は、通気型電離チャンバ１７０８に移動し得、次いで、吸込チャネル１７０２およびチャンバ１７０６によって形成されるかなりの範囲に沿った廃棄レザバ１６９２、１６９４に移動する。特に、粒子選択性チャネル１７００を介した吸込チャネル１７０２からの赤血球の移動は、チャンバチャネル１７０４の目詰まりを回避し得る。しかし、白血球は、チャネル１７００を通過できないために、チャンバ１７０４内に保持され得、そして、ろ過−放出メカニズム１６８８（バルブＶ１０）が閉鎖しているために、チャンバ１７０４を過ぎて移動し得ない。
【０５６３】
捕捉チャンバ１７０６中に捕捉された白血球を、以下のように洗浄し得る。適切な数の白血球が、チャンバ１７０６に入った後、さらなる全血が吸込チャネル１７０２およびチャンバ１７０６に入らないように、バルブＶ１を閉鎖し得る。次いで、バルブＶ２を開放し、代替インプットメカニズム１６７８によって供給された運搬緩衝液が、チャンバ１７０６からの赤血球残留物を洗浄することを可能にする。この時点で、チャンバ１７０６内への赤血球の逆流を回避するために、廃棄レザバ１６９２、１６９４を空にし得る。
【０５６４】
ろ過された白血球を、以下のように、保持メカニズム１６５８によって保持し得る；図８５〜８７を参照のこと。バルブＶ１０を開放し、ろ過した白血球をチャンバ１７０６から放出し得る。放出された細胞を、第一集束メカニズム１６７２によって集束し、保持部位１７１０に向かって運搬し得る（図８７を参照のこと）。代替インプットメカニズム１６７８からの運搬緩衝液の流動は、このプロセスの間、白血球をチャンバ１７０６から保持部位１７１０に移すために作用し得る。
【０５６５】
保持された白血球は、以下の試薬で染色され得る。バルブＶ１０は、さらなる白血球がチャンバ１７０６から出て、保持部位１７１０へと流入するのを防止するために、閉鎖し得る。次に、灌流メカニズム１６６０による、保持された白血球に向かう流動通路に沿った、薬剤の方向付けを促進するために、バルブＶ６を閉鎖し得る。次に、白血球を染色し得、そうでなければ、ＸＩＩＩ節の他のところ（特に、実施例２）で記載したように、灌流メカニズム１６６０を使用して処理し、プロセスし得る。粒子処理の間に、試薬、緩衝液および／または流体を能動的に移動するために、ポンプＰ１が灌流メカニズム１６６０によって使用され得る（図８５を参照のこと）。この時点で、バルブは、以下の配置であり得る。バルブＶ１、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ９およびＶ１０は閉鎖している。バルブＶ２、Ｖ７およびＶ８は開放している。細胞処理が完結した後、灌流メカニズム１６６０の作用を終結させるために、ポンプＰ１を停止し、バルブＶ３、Ｖ４およびＶ５を閉鎖し得る。
【０５６６】
処理した／プロセスした細胞は、以下のように放出され、検出され得る：図８４、８５、８７および８８を参照のこと。ポンプＰ２を作動し得る。このポンプを使用して、検出メカニズム１６６４および廃棄（アウトプット）レザバ１６９８の方へ、流体、粒子および／または反応生成物を吸引し得る。次に、バルブＶ８が閉鎖され得、バルブＶ９が開放され得る（図８７を参照のこと）。このバルブ配置で、流体および粒子を、廃棄レザバ１６９６ではなく、廃棄レザバ１６９８に向かって方向付けられ得る（図８５を参照のこと）。この時点で、各集束レザバ１７１２、１７１４、１７１６、１７１８は、緩衝液で再充填され得、廃棄レザバ１６９８が空にされ得る。次いで、部分的にまたは完全に閉鎖したバルブＶ７を使用し、白血球を保持メカニズム１６５８から放出し得る。放出の間、レザバ１７１２、１７１４または代替インプットメカニズム１６７８から流動する緩衝液を使用して、放出された白血球を検出メカニズム１６６４の方へ運搬し得る。レザバ１７１６、１７１８から流動する緩衝液は、排出口チャネル１７２０の所望の横断面位置（一般には、中央位置）に、放出された細胞を配置する（集束する）ように、第二の集束メカニズム１６７４内で作用し得る（図８８を参照のこと）。細胞の集束後、排出口チャネル１７２０は、狭くなったチャネル１７２２に圧縮し得、それにより、細胞を一列に配置する（つまり、群としてではなく、検出部位１７２４に一つずつ）ことを促進し得る。
【０５６７】
患者、研究被験体、志願者、法医学的研究、死体などからのサンプルを含む、血液サンプルまたは他のインプットされた粒子集団の任意の適切な局面を測定するために、システム１６５０が、使用され得る。適切な局面としては、白血病、貧血症、血液異常、血液健康状態遺伝的疾患、感染症、特定の血液型の割合、非血液細胞の存在などの分析が挙げられ得る。例示的な白血病としては、とりわけ、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病および／または若年性骨髄腫リンパ球性白血病などが挙げられ得る。例示的な貧血症および／または遺伝的疾患としては、再生不良性貧血、ファコーニ貧血症（Ｆａｃｏｎｉａｎｅｍｉａ）、鎌状血球貧血症などが挙げられ得る。分析に適し得る血球（または他の外来性の粒子集団）の他の局面または特徴は、上のＶＩＩＩ節およびＸＩＩ節に記載されている。
【０５６８】
図８９は、粒子を、個々の試薬または個々の試薬濃度のアレイに露出するための灌流デバイスの平面図である。ここで、微小流体通路デバイス２０００は、コントロールインプット２０７０と操作可能に連結し、かつ作動した場合に、各チャンバ２０３０を相互に単離するバルブライン２０２０によってコントロールされるローディング通路２０１０を介して、ロードする粒子（例えば、細胞）のための複数の増殖／灌流チャンバ２０３０を提供する。次いで、粒子は、開放バルブライン２０２０およびローディング通路２０１０から各チャンバ２０３０を介して出口通路２０８０の方へ圧縮される流体によって、チャンバ２０３０から流れ出し得る。一旦各チャンバ２０３０に、粒子（例えば、細胞）がロードされ、単離されると、コントロールインプット２１４０と操作可能に連結しているバルブライン２０４０は、流動ライン２１２０（希釈剤レザバ２１１０から始まる、さらに必要に応じて試薬レザバ２１００（粒子に露出するための試薬を保持し得る）から始まる）を介して、試薬および希釈剤（例えば、培地または試薬を希釈する流体）の流動を可能にするように開放する。希釈剤の試薬に対する比率は、バルブによって、または好ましくは、流動ライン２１２０に希釈剤レザバ２１１０を接続し、そして流動ライン２１２０に試薬レザバ２１００を接続する管路の内径をコントロールすることによって、コントロールされ得る。希釈剤および試薬は次いで、例えば、ぜん動性ポンプ２０９０（これは、ポンプインプットライン２１５０ａ〜ｃによって作動され、従って粒子は、試薬／希釈剤とともに灌流される）によって引き起こされるポンプ作用によって、チャンバ２０３０に送り込まれる。希釈剤（細胞の場合）は、細胞培養培地であり得る。チャンバ２０３０からの流出物は、廃棄レザバ２０５０中に回収され得る。
【０５６９】
図９０〜９４は、化学誘引物質に対する細胞の応答を測定するために使用されるデバイスの平面図を示す。微小流体通路デバイス２２００は、試薬ローディングチャンバ２２３０を提供し、ここで、バルブ２２１０を開放し、試薬を試薬チャンバ２３００中に盲目的に充填することにより、試薬が試薬チャンバ２３００中で測定される。一旦試薬チャンバ２２３０が満たされると、次いで、粒子２３２０（例えば、細胞）（これは、前もって粒子チャンバ２３００中に導入されていた）は、好ましくは、勾配の形成の間は閉鎖しているバルブ２２２０、バルブ２２１０の開放によって、試薬の勾配に露出される。図９１は、勾配形成メカニズム２２５０（粒子チャンバ２３２０への試薬の流動を制限するためのチャネル２２７０を有する）への試薬の流入を示す。図９２は、粒子チャンバ２３００への試薬の進行を描く。図９３および９４は、粒子２３２０のチャネル２２７０への動きを描き、ここで、化学誘引試薬は、拡散される。
【０５７０】
図９５は、バルブシステムと結合した灌流チャンバの拡大平面図である。粒子（例えば、細胞）を、開放単離バルブライン２４３０（閉鎖している場合、各チャンバ２４５０を相互に単離する）によって、一連の粒子チャンバ２４５０中にロードされ得る。粒子は、スクリーンまたはコーム２４９０（それぞれの障害は、スクリーンまたはコーム２４９０の片側で粒子を保持するように、粒子のサイズより小さい距離で、他から空間をあけて離れている）によってチャンバ２４５０中に保持されるので、流動ライン２４６０へは入らない。使用の場合、粒子が貫流し、各チャンバ２４５０を満たすことを可能にする単離バルブライン２４３０の開放によって、粒子は、チャンバ２４５０中に導入され得る。一旦、所望の量の粒子で満たされると、単離バルブ２４３０は、各チャンバ２４５０を相互に単離するために閉鎖され、次いで、粒子を試薬で灌流するために、チャンバ２４５０を介する試薬の流動を可能にするように、流動バルブ２４４０を開放する。一旦実験が完結すると、流動バルブ２４４０は次いで、閉鎖され、単離バルブ２４３０が次いで開放され、粒子を流し出し得る。粒子が接着細胞である場合、接着している場合、このような接着細胞を細胞除去試薬（例えば、トリプシン）に露出することによって、このような細胞を遊離し得る。一旦遊離すると、細胞は、システムから流し出され得、そしてシステムは、再利用され得る。
【０５７１】
上に示した開示は、独立した有用性を伴なった一つ以上の別個の発明を包含し得る。これらの発明のそれぞれは、その好ましい形態で開示されている。本明細書中に開示し、例示したようなその特定の実施形態を含む、これらの好ましい形態は、多数のバリエーションが可能であるので、意味を限定して考えることは意図されない。本発明の主題は、本明細書で開示された種々の要素、特徴、機能および／または特性の全ての新規でかつ非自明な組み合わせおよびサブコンビネーションを包含する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010042020.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010042020.tif 000013
【図７】
2010042020.tif 000014
【図８】
2010042020.tif 000015
【図９】
2010042020.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３Ａ】
2010042020.tif 000024
【図１３Ｂ】
2010042020.tif 000025
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７１Ｃ】
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【図７１Ｄ】
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【図７１Ｅ】
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【図７１Ｆ】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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