(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸の多重鎖（例：三本鎖）を中性領域で安定に形成させるシンプルな方法を提供する。【解決手段】核酸鎖間のフーグスティーン型塩基対に於いて、グアニンのN7とシトシンのN3との間で形成された水素結合を銀イオンを介した塩基対形成によって安定化された多重鎖核酸を調製する方法に関し、三本鎖核酸と銀イオンとを溶液中で混合する方法よりなる、フーグスティーン型多重鎖核酸塩基対の結合を安定化させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の結合を安定化させる方法であって、
前記塩基対の水素結合に関与する水素イオンを銀イオンで置換する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記水素結合が、グアニンのN7とシトシンのN3との間の水素結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
核酸の三本鎖構造を安定化させる方法であって、
フーグスティーン型の塩基対の水素結合に関与する水素イオンを銀イオンで置換する工程を含む、方法。
【請求項５】
前記三本鎖核酸と前記銀イオンとを溶液中で接触させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液のpHが、６を超えるpHである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記水素結合が、グアニンのN7とシトシンのN3との間の水素結合である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記核酸がＤＮＡである、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の結合が、銀イオンを介した塩基対形成によって安定化されている多重鎖核酸。
【請求項１０】
前記多重鎖核酸が三本鎖核酸である、請求項９に記載の多重鎖核酸。
【請求項１１】
前記金属イオンがグアニンのN7とシトシンのN3との間を架橋している、請求項１０に記載の多重鎖核酸。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１０または１１に記載の多重鎖核酸。
【請求項１３】
フーグスティーン型の塩基対の水素結合が形成されている三本鎖核酸と金属イオンとを溶液中で混合する工程を含む、三本鎖核酸の製造方法。
【請求項１４】
前記金属イオンが、銀イオン（Ａｇ＋）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記水素結合が、グアニンのN7とシトシンのN3との間で形成された水素結合を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液のpHが、６を超えるpHである、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属イオンにより核酸の多重鎖構造を安定化させる方法に関する。特に、本発明は、銀イオンにより核酸の三本鎖構造を安定化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAの二本鎖に対して、もう一本のDNAが塩基配列特異的にハイブリダイズし、三本鎖構造を形成することが知られている。二本鎖がワトソン−クリック（Watson-Crick）型の水素結合で形成されるのに対して、三本目のDNAは、２重らせんDNAの主溝に沿ってフーグスティーン（Hoogsteen）型の相補的な水素結合を形成することによって配列特異的に結合する。その高い配列特異性から、配列特異的な標識、遺伝子発現制御（アンチジーン法）、DNAの化学修飾、遺伝子センシング、さらに最近ではDNAを基体としたナノ構造体の構築等に利用されている（非特許文献１）。
【０００３】
三本鎖は２通りに形成され得る。１つは、プリン塩基の連続配列（purine tract）を有する鎖（プリン鎖）に対して平行に、オリゴピリミジン鎖がHoogsteen型塩基対を使用して二本鎖の主溝に結合する。もう一つは、オリゴプリンが、逆Hoogsteen型塩基対を使用して逆平行にプリン鎖に結合する。
【０００４】
平行モチーフ（ピリミジンモチーフ）では、Hoogsteen型の相補的な水素結合を形成するには三本目のDNA鎖の中のシトシンのN3部位がプロトン化する必要がある（単独のシトシンN3部位のpKaは約4.3）。すなわち、二本鎖中のグアニンのN7、および三本目の鎖のシトシンのN3位のプロトンがそれぞれ水素結合のアクセプターとドナーとなり、CG.C+の塩基トリプレット（triplet）を形成する（図１（Ａ）の左図）。従って、三本鎖を安定に形成させるためにはpH5-6の弱酸性の条件下で実験を行う必要がある。
【０００５】
このように、CG.C+を含有するトリプレットの安定性は溶液のpHに大きく依存する。TA.Tトリプレットのみで構成されるものよりは安定であるが、その安定性は生理学的条件下では非常に低いものである。
【０００６】
この制限を克服するために多くの研究者が、三本鎖に特異的に結合する有機分子を開発し、三本鎖を安定に形成する非天然型のDNAを提案している（非特許文献２〜１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Soyfer, V. N.; Potaman, V. N. Triple-Helical Nucleic Acids; Springer: New York, 1995
【非特許文献２】Rusling, D. A. et al., Sequence-specific DNA Binding Agents; Waring, M, Ed.; RSC Publishing: Cambridge, 2006; pp 1-22
【非特許文献３】Pilch, D.S.; Breslauer, K. J. Proc. Natl. Acsd. Sci. USA 1994, 91, 9332-9236
【非特許文献４】Silver, G. C. et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 263-268
【非特許文献５】Trkulja, I.; Haner, R. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 289-292
【非特許文献６】Li, H. et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1561-1567
【非特許文献７】Kumar, N. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 14-15
【非特許文献８】Alam, M. R., Biochemistry 2007, 46, 10222-10233
【非特許文献９】Rahman, S. M. A. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4306-4309
【非特許文献１０】Shinozuka et al., Chem. Commun. 2002, 2712-2713
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況下、核酸の多重鎖（例：三本鎖）を中性領域で安定に形成させる新たな手法が求められている。例えば、三本鎖を中性領域で安定に形成することができれば、三本鎖の応用範囲を広げることができ、様々な分野での大きな波及効果が期待できる。
【０００９】
この数年、金属イオン架橋型の塩基対形成を利用した幾つかの核酸構造が報告されている。多くの場合、Cu2+、Ag+などの比較的ソフトな特定の金属イオンとの組み合わせを想定した上で非天然の塩基を設計し、その構造を組み込んだDNAを化学合成している（Tanaka，K. et al., Science 2003, 299, 1212-1213；Clever，G. H; Carell, T，Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 250-253；Yang, H.; Sleiman, H.F. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2443-2446；Ihara, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1772-1773；Ihara, T. et al., Nucleos. Nucleot. Nucl. 2008, 27, 1084-1096を参照）。また、天然型の塩基においても、Ag+およびHg2+がそれぞれC-C、T-Tミスマッチを含む二本鎖（ヘアピン構造を含む）を著しく安定化することが報告されている。これらの系においては、それぞれ、C-Ag+-C、T-Hg2+-Tの金属イオン架橋型の新しい塩基対が形成されていることが示されている（Miyake, Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2172-2173；Ono, A. et al., Chem. Commun. 2008, 4825-4827を参照）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、このような金属イオン架橋型の塩基対形成の技術から得た知見を、核酸の三本鎖構造の形成技術に応用することを試みた。そして、鋭意研究を重ねた結果、三本鎖中に形成されるCG.C+トリプレット中のシトシンN3プロトンをAg+で置き換えることによりDNAの三本鎖が著しく安定化することを見出した（図３（Ａ）を参照）。すなわち、三本鎖中に銀イオンによって架橋された新しいCG.CAg+トリプレット（図１（Ａ）の右図を参照）を形成し、pHに依存しない（図３（Ｂ）を参照）安定な三本鎖を作ることができた。
【００１１】
したがって、本発明は以下の三本鎖核酸構造の安定化法、鎖間のフーグスティーン型の塩基対構造が安定化された多重鎖（例：三本鎖）核酸、およびその製造方法を提供する。
【００１２】
（１）核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の結合を安定化させる方法であって、
上記塩基対の水素結合に関与する水素イオンを銀イオンで置換する工程を含む、方法。
（２）上記水素結合が、グアニンのN7とシトシンのN3との間の水素結合である、上記（１）に記載の方法。
（３）上記核酸がＤＮＡである、上記（１）または（２）に記載の方法。
【００１３】
（４）核酸の三本鎖構造を安定化させる方法であって、
フーグスティーン型の塩基対の水素結合に関与する水素イオンを銀イオンで置換する工程を含む、方法。
（５）上記三本鎖核酸と上記銀イオンとを溶液中で接触させる工程を含む、上記（４）に記載の方法。
（６）上記溶液のpHが、６を超えるpHである、上記（５）に記載の方法。
（７）上記水素結合が、グアニンのN7とシトシンのN3との間の水素結合である、上記（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）上記核酸がＤＮＡである、上記（４）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（９）核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の結合が、銀イオンを介した塩基対形成によって安定化されている多重鎖核酸。
（１０）上記多重鎖核酸が三本鎖核酸である、上記（９）に記載の多重鎖核酸。
（１１）上記金属イオンがグアニンのN7とシトシンのN3との間を架橋している、上記（１０）に記載の多重鎖核酸。
（１２）上記核酸がＤＮＡである、上記（１０）または（１１）に記載の多重鎖核酸。
【００１５】
（１３）フーグスティーン型の塩基対の水素結合が形成されている三本鎖核酸と金属イオンとを溶液中で混合する工程を含む、三本鎖核酸の製造方法。
（１４）上記金属イオンが、銀イオン（Ａｇ＋）である、上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記水素結合が、グアニンのN7とシトシンのN3との間で形成された水素結合を含む、上記（１３）または（１４）に記載の方法。
（１６）上記溶液のpHが、６を超えるpHである、上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
これまで、有機合成化学の粋を集めて様々な工夫がなされて三本鎖の安定化が達成されてきたのに対して、本発明は、三本鎖を形成するシトシンの数に対応する金属イオン（例：銀イオン、Ag+）を溶液に添加するだけという極めて簡便なやり方で同等以上の効果を達成できる。
【００１７】
これまでに、特定の金属イオンを介した塩基対形成によって三本鎖構造を安定化した報告はない。本発明によれば、想定されるCG.C+トリプレットと等量の金属イオン（例：Ag+）を溶液に添加するだけという極めて簡便な操作により中性〜弱塩基性領域で安定な三本鎖を形成させることができる。本発明の方法は、これまで盛んに行われてきた、多段階に及ぶ有機合成を経て作製された分子を利用する方法とは対照的に、極めて簡易であり、時間的、労力的および経済的コストを大幅に節約できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（Ａ）左図：関連技術のCG.C+の塩基トリプレットを示す図である。右図：本発明のCG.CAg+トリプレットを示す図である。（Ｂ）本発明で用いられるオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮｓ）配列を示す図である。バーおよびドットは、それぞれWatson-Crick型およびHoogsteen型の塩基対を示す。
【図２】（Ａ）トリプルへリックスT11/A11/T11のＵＶ融解曲線（黒）およびトリプルへリックスTC11/AG11/TC11のＵＶ融解曲線（赤）を示す。（Ｂ）CG.C+トリプレットについての１．５倍量のAg+存在下でのmt31（上段）およびms31（下段）のESI-TOFマススペクトルを示す。
【図３】（Ａ）種々の量のAg+の存在下で得られたdY21/dR21/tY15のUV融解曲線を示す図である。各鎖を200μM NaNO3および0-17.5μM AgNO3を含有するリン酸緩衝液中に溶解した。（Ｂ）tY15中のシトシンと等モル量のＡｇ＋の存在下および非存在下において融解するdY21/dR21/tY15のt-d転移のＴｍａｘのｐＨ依存性を示すグラフである。
【図４】（A）Ag+の非存在下、および（B）Ag+の存在下での、pH7におけるdY21/dR21/tY15のCDスペクトルを示すグラフである。280Ｋ（赤）および300Ｋ（黒）で測定した。二本鎖および第三鎖の和スペクトル（黒点線）を比較のために示した。
【図５】DFT計算（B3LYP/6-31G*//3-21G）により最適化されたAg+仲介塩基トリプレット、CG.CAg+の立体視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は１つの実施形態において、核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の結合を安定化させる方法を提供する。この方法は、核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の水素結合に関与する水素イオンを金属イオン（例：銀イオン）で置換する工程を含む。
【００２０】
本発明は別の実施形態において、核酸の三本鎖構造を安定化させる方法を提供する。この方法は、フーグスティーン型の塩基対の水素結合に関与する水素イオンを金属イオン（例：銀イオン）で置換する工程を含む。
【００２１】
好ましい実施形態では、上記フーグスティーン型の塩基対の水素結合に関与する水素イオンを金属イオン（例：銀イオン）で置換する工程は、三本鎖核酸と前記金属イオン（例：銀イオン）とを溶液中で接触させることにより行われる。
【００２２】
本発明はなおさらに別の実施形態において、フーグスティーン型の塩基対の水素結合が形成されている三本鎖核酸と金属イオン（例：銀イオン）とを溶液中で混合する工程を含む、三本鎖核酸の製造方法を提供する。
【００２３】
上記各実施形態における溶液のｐＨは特に制限はないが、好ましくは、ｐＨの下限は例えば、ｐＨ５、６、７、８、９等であり、上限は例えば、ｐＨ１０、９、８、７、６等である。好ましいｐＨ範囲は５〜９であり、より好ましくは６〜８、さらにより好ましくは、６．５〜７．５であり、最も好ましくは、６．８〜７．２（例えば、ｐＨ７）である。
【００２４】
本発明はさらに別の実施形態において、核酸鎖間のフーグスティーン型の塩基対の結合が、金属イオンを介した塩基対形成によって安定化されている多重鎖核酸を提供する。多重鎖の鎖数に特に制限はないが、三本鎖以上が典型的であり、最も好ましい多重鎖核酸は、三本鎖核酸である。
【００２５】
上記各本発明の好ましい実施形態において、上記水素結合には、グアニンとシトシンとの間、アデニンとチミンとの間、またはアデニンとウラシルとの間の水素結合が含まれるが、好ましくは、グアニンとシトシンとの間の水素結合であり、最も好ましくは、グアニンのN7とシトシンのN3との間の水素結合である。
【００２６】
好ましい実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、最も好ましくは、ＤＮＡである。
【００２７】
本発明において用いられる核酸鎖の塩基長は、フーグスティーン型の塩基対を形成し得る限り特に限定されないが、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０塩基長またはそれより長い。
【００２８】
本発明において使用される金属イオンは、核酸鎖間のフーグスティーン型塩基対の水素結合に関与する水素イオンを置換し、鎖間の結合を安定化し得るものであれば、特に限定されないが、好ましくは、銀イオン（Ａｇ＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）、水銀イオン（Ｈｇ２＋）等のHSAB則におけるソフトな金属イオンであり、最も好ましくは、銀イオンである。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３０】
図１（B）は、本発明において使用したオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮｓ）の配列を示す。まず、三本鎖T11/A11/T11およびTC11/AG11/TC11に対して、Ag+の存在下、および非存在下でpH8.5でＵＶ融解実験を行った。TC11/A11/T11は、１１個のTA.Tトリプレットからなる。TC11/AG11/TC11では、中心の１つのTA.Tトリプレットのみが、CG.C+により置換されている。
【００３１】
図２（A）は、融解曲線を示す。三本鎖の融解は、Ag+の非存在下で２つのステップに分解することができた。低温および高温での転移は、三本鎖−二本鎖（ｔ−ｄ）転移および二本鎖−コイル（ｄ−ｃ）転移にそれぞれ起因する。TC11/AG11/TC11へのAg+の付加により、ｔ−ｄ転移はほとんど消失し、ｄ−ｃ転移に統合された。この効果は、CG.C+トリプレットに対して等モル量のAg+が添加された時に既に顕著であったが、ｔ−ｄ転移付近の曲線の形は、さらにAg+を添加することによりさらにわずかに変化した。他方、T11/A11/T11の融解曲線はAg+によってほとんど変化しなかった。銀イオンはいずれのトリプレットについてもｄ−ｃ転移には影響を及ぼさなかった。したがって、Ag+は、CG.C+トリプレット中のHoogsteen水素結合にのみ作用するようである。
【００３２】
CG.C+とAg+との間の特異的相互作用を確認するために、３つのCG.C+トリプレットを含む分子内三本鎖構造を形成するmt31を、CG.C+トリプレットの1.5倍量のAg+の存在下で、質量分析（ESI-TOF）に供した。図２Bは、そのスペクトルを示す。ほとんど全てのmt31が、特定の数のAg+を有するAg-付加物、mt31・Ag+、mt31・2Ag+、およびmt31・3Ag+として検出された。一方、スクランブル配列（同じ塩基組成であるが配列をランダムにしたもの）を有するコントロールとしての31mer ODNであるms31は、mt31と全く同じ条件下、おもにAg+の結合しない幾つかのNa-付加物として検出された。ms31の配列は、CG.C+トリプレットを含む分子内三本鎖を形成しないように設計されているので、この結果は、Ag+とCG.C+トリプレットとの特異的な（しかし、それほど強くないと推測されるが）相互作用を示唆している。
【００３３】
三本鎖の安定性に対するAg+の効果を、配列中に複数のCG.C+トリプレットを有するdY21/dR21/tY15を用いて調べた。pH 7においてUV融解実験を、種々の量のAg+の存在下で行った（図３（A））。銀イオンは、ｔ−ｄ転移を鈍く（ブロードニング）させるとともに温度Tmaxを上昇させ、最終的にはシトシンと等モル量点で50℃付近に新たな変曲点を与えた。第三鎖(tY15)の結合に対するAg+による安定化効果、ΔTmaxは、30℃を超えた。一方、ｄ−ｃ転移は、この濃度範囲のAg+添加によってはほとんど影響を受けなかった。このことは、かなり高い熱安定性をもつ特定の構造を有するAg+-三本鎖複合体が、等モル量点で形成し、その複合体中で、Ag+はCG.C+トリプレット中のHoogsteen塩基対に対してのみ影響を及ぼすことを意味する。Tmaxに対するpHの影響を、Ag+の存在下および非存在下で測定した。Tmaxは、Ag+の非存在下でpHの上昇とともに単調減少したが、Ag+存在下ではTmaxは、pHに依存しない２つの領域からなる独特の挙動を示した。Tmax対pHのプロットの勾配は、ある構造のDNAが融解する時に放出されるプロトンの数に関連している。本発明者が予測したように、Ag+は、pH7未満で、CG.C+中のシトシンのN3プロトンを置換し、新たなトリプレットであるCG.CAg+を形成する。一方、シトシンの環外アミノ基のプロトンはpH>7.0でAg+の存在下、解離することが知られている。したがって、pH>8.0では、CG.C−Ag+とCG + C−Ag+との間の別のpH非依存的平衡が存在すると考えられる。Ag+が（５つのシトシンに対して）飽和する前に、ｔ−ｄ転移において観察されたブロードニングは、この間、異なる５つのシトシン上に種々の数のAg+が結合した多くの三本鎖の混合物が生じていることを示唆している。なぜなら、これらの三本鎖は、それぞれが互いに異なる固有の熱安定性を有すると考えられるからである。したがって、銀イオンはおそらく、dY21/dR21/tY15の５つの結合ポケット（５つのCG.C+トリプレット）にかなり（all or noneでなく）独立に取り込まれる。
【００３４】
三本鎖の構造についての情報を得るために、dY21/dR21/tY15を、CD測定に供した（図４）。7℃および27℃で測定されたスペクトルは、Ag+非存在下で特に短波長領域で異なるが、対応するスペクトルはAg+の存在下でほぼ同一である。これは、図３Aに示した融解実験の結果と一致する。しかし、Ag+の存在下でのCDスペクトルの形は、DNA三本鎖の典型的なスペクトルとはかなり異なる。N-Ag+-Nにおける配位距離（coordination distance）は、CG.C+におけるHoogsteen水素結合の距離よりも長い。両者の結合距離の違いから、第３鎖のシトシンは、CG.CAg+トリプレットのワトソン−クリックGC対の平面からねじれることを余儀なくされていることがモデル研究から明らかになった（図５を参照）。dY21/dR21/tY15におけるこの５つのCG.CAg+トリプレットの非平面性は、トリプルへリックスの全体構造を異常に変化させ、そのためにこの複合体が、独特のCDスペクトルを与えたものと考えられる。
【００３５】
本発明により、平行モチーフDNA三本鎖の構造を、Ag+が著しく安定化させることが示された。DNA三本鎖に結合するいくつかのリガンドが開発されているが、Ag+の安定化効果は、これらのリガンドと比較しても遜色がない。本発明の非常にシンプルな方法は、DNA三本鎖の安定化のための代替手法として非常に優れた選択肢の１つである。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、ＤＮＡ三本鎖を安定的に形成するためのシンプルな方法として有用である。本発明は、例えば、生体外でのDNA三本鎖形成に利用可能である。すなわち、例えば、in vitroでの遺伝子発現系を利用した様々な化学種のセンシング系において、アンチジーン効果をAg+によって制御することができる。また、本発明は、特定の構造を安定化する非常に簡便で有力な手段として、DNAを構成要素としたDNAナノマシーンに利用可能である。
【図１】
2010187551.tif 000002
【図２】
2010187551.tif 000003
【図３】
2010187551.tif 000004
【図４】
2010187551.tif 000005
【図５】
2010187551.tif 000006