(57)【要約】【課題】精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法、並びに該方法に用いられるポリヌクレオチド及び妊孕性診断キットの提供。【解決手段】ヒトから採取された生体サンプルを用いて、ヒトにおけるＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする妊孕性診断方法、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列または当該遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、妊孕性と相関性の高い一塩基置換変異の変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、
前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の、第３２位の塩基、第３８位の塩基、第４１位の塩基、第１１５位の塩基、第１５７位の塩基、第１６９位の塩基、第２１４位の塩基、第２８５位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第４４２位の塩基、第４４５位の塩基、第４９７位の塩基、第５７７位の塩基、第５８９位の塩基、第７１９位の塩基、第９３７位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９５３位の塩基、第９９８位の塩基、第９９９位の塩基、及び第１０４０位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法。  
【請求項２】
前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の、第３８位の塩基、第１５７位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第５８９位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９９８位の塩基、及び第９９９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１記載の妊孕性診断方法。
【請求項３】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第３８位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第３８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列において、１０７番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項４】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第１５７位の塩基がアデニンからグアニンに置換されており、当該第１５７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列において、２２６番目の塩基がアデニンからグアニンに置換されており、当該２２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項５】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第４０７位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第４０７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第４０９位の塩基がアデニンからシトシンに置換されており、当該第４０９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がアデニンからシトシンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項７】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第４１７位の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該第４１７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１１１番目の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該１１１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項８】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第５８９位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第５８９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列において、１１３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１１２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項９】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第９３９位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９３９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号８で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１０】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第９４４位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第９４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号８で表される塩基配列において、１０８番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１１】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第９９８位の塩基がチミンからシトシンに置換されており、当該第９９８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号８で表される塩基配列において、１６２番目の塩基がチミンからシトシンに置換されており、当該１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１２】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第９９９位の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該第９９９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号８で表される塩基配列において、１６３番目の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該１６３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１３】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第３８位の塩基がアデニン、第１５７位の塩基がグアニン、第４０７位の塩基がチミン、第４０９位の塩基がシトシン、第４１７位の塩基がグアニン、第５８９位の塩基がチミン、第９３９位の塩基がアデニン、第９４４位の塩基がアデニン、第９９８位の塩基がシトシン、又は第９９９位の塩基がグアニンの塩基がアデニンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第３２位の塩基がアデニン、第４１位の塩基がアデニン、第１１５位の塩基がアデニン、第１６９位の塩基がアデニン、第２１４位の塩基がアデニン、第２８５位の塩基がチミン、第４４２位の塩基がアデニン、第４４５位の塩基がグアニン、第４９７位の塩基がアデニン、第５７７位の塩基がチミン、第７１９位の塩基がチミン、第９３７位の塩基がアデニン、第９５３位の塩基がアデニン、又は第１０４０位の塩基がアデニンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項１７】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおいて発現しているＩｚｕｍｏポリペプチドの変異の有無を、請求項１６に記載の抗体によって検出する検出工程を有することを特徴とする、妊孕性診断方法。
【請求項１８】
ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１９】
前記変異が、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位の塩基、第３８位の塩基、第４１位の塩基、第１１５位の塩基、第１５７位の塩基、第１６９位の塩基、第２１４位の塩基、第２８５位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第４４２位の塩基、第４４５位の塩基、第４９７位の塩基、第５７７位の塩基、第５８９位の塩基、第７１９位の塩基、第９３７位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９５３位の塩基、第９９８位の塩基、第９９９位の塩基、及び第１０４０位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１８記載の妊孕性診断キット。
【請求項２０】
前記試薬が、抗Ｉｚｕｍｏ抗体であることを特徴とする請求項１９記載の妊孕性診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものである。具体的には、妊孕可能性と相関性のある遺伝子の欠損又は変異を検出し、妊孕可能性を診断する方法、並びに、該方法に用いることができるキット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。実際に、非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないことが報告されており、有効な不妊治療法の開発が強く望まれている。
【０００３】
近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっている。しかしながら、不妊の背後にある分子メカニズムの詳細は依然として明らかになっておらず、このため、適切な治療法の選択が困難な場合がある。
【０００４】
一方で、非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
【０００５】
精子と卵子の融合において、精子は卵丘細胞によって分泌されるヒアルロン酸含有のマトリクスを通過するが、卵子の外殻（ｚｏｎａ  ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）との相互作用によって精子の先体反応内容物が分泌され、精子と卵子の結合と融合に必要とされるＦｅｒｔｉｌｉｎαβやＣｙｒｉｔｅｓｔｉｎ分子が精子表面に現れるとされている（非特許文献３，４）。
【０００６】
同様な分子として、Ｉｚｕｍｏ分子が精子と卵子の融合を阻害するモノクローナル抗体に対する抗原分子として同定された（非特許文献５）。
Ｉｚｕｍｏは、新規な免疫グロブリンスーパーファミリーで、推定上のグリコシル化部位を有する細胞外免疫グロブリンドメインを有したＩ型膜タンパク質をコードしている。Ｉｚｕｍｏの発現は精子特異的であり、新鮮な精子表面には検出されず、先体反応後にのみ検出される。Ｉｚｕｍｏ遺伝子のノックアウトマウス（−／−）のメスには受胎能力があるが、オスは正常な交尾と射精にも関わらず妊孕性が消失する。また、本ノックアウトマウスの精子は、大部分が交尾後採取した卵子の卵黄周囲腔に認められることから、精子の移動ではなく、融合に異常があると考えられる。また、ｚｏｎａ−ｆｒｅｅのハムスター卵母細胞とヒト精子との結合・融合を抗体が抑制することから、Ｉｚｕｍｏがヒトにおける融合過程においても機能していることが示唆されている。
【０００７】
このように、Ｉｚｕｍｏ分子は、卵子との融合に必須な膜タンパク質であることが明らかであるため、当該分子の異常又は発現の低下は、ヒトにおける男性不妊症の原因の１つであると考えられる。男性不妊症者において、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の多型が調べられたが、症例数が少なく不妊症と関連付けられた多型はまだ見出されていない（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450.
【非特許文献２】Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4(Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40.
【非特許文献３】Primakoff P et al., J Cell Biol. 1987; 104: 141-149.
【非特許文献４】Yuan R et al., J Cell Biol. 1997; 137: 105-112.
【非特許文献５】Inoue N et al., Nature. 2005 Mar; 434(7030): 234-238.
【非特許文献６】G-Gonzalez V et al., Fertil Steril. 2007 Dec 13.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法は未だ十分に確立されていない。男性不妊の原因は生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる診断法が望まれている。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、抗Ｉｚｕｍｏ抗体が精子と卵子の融合を阻害すること、Ｉｚｕｍｏ遺伝子が欠損したマウスが不妊症になることから、Ｉｚｕｍｏ分子は精子と卵子の融合に関わる分子であり、Ｉｚｕｍｏ分子が妊孕性に関連し、Ｉｚｕｍｏタンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考え、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子配列を解析し、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の、第３２位の塩基、第３８位の塩基、第４１位の塩基、第１１５位の塩基、第１５７位の塩基、第１６９位の塩基、第２１４位の塩基、第２８５位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第４４２位の塩基、第４４５位の塩基、第４９７位の塩基、第５７７位の塩基、第５８９位の塩基、第７１９位の塩基、第９３７位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９５３位の塩基、第９９８位の塩基、第９９９位の塩基、及び第１０４０位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位の塩基、第１５７位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第５８９位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位、第９９８位の塩基、及び第９９９位の塩基の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第３８位の塩基がアデニン、第１５７位の塩基がグアニン、第４０７位の塩基がチミン、第４０９位の塩基がシトシン、第４１７位の塩基がグアニン、第５８９位の塩基がチミン、第９３９位の塩基がアデニン、第９４４位の塩基がアデニン、第９９８位の塩基がシトシン、及び第９９９位の塩基がグアニンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列において、第３２位の塩基がアデニン、第４１位の塩基がアデニン、第１１５位の塩基がアデニン、第１６９位の塩基がアデニン、第２１４位の塩基がアデニン、第２８５位の塩基がチミン、第４４２位の塩基がアデニン、第４４５位の塩基がグアニン、第４９７位の塩基がアデニン、第５７７位の塩基がチミン、第７１９位の塩基がチミン、第９３７位の塩基がアデニン、第９５３位の塩基がアデニン、又は第１０４０位の塩基がアデニンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キットを提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の妊孕性診断方法や妊孕性診断キットを用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を、高精度かつ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子構造と配列解析に用いたＰＣＲのアンプリコンを示す物理地図である。
【図２】インベーダー法の原理を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする。ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損や特定の塩基の変異は、男性不妊との相関性が高い。したがって、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＩｚｕｍｏ遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００１６】
配列番号１は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＮＴ＿０１１１０９．１５で登録されている野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、野生型ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子は、１０５３ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、野生型ヒトＩｚｕｍｏタンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００１７】
図１は、野生型ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の構造を示す模式図である。図中、太い線は転写される領域（エクソン）を表し、Ａはタンパク質をコードしない領域を表し、Ｂはタンパク質をコードする領域を表し、細い線は転写されない領域（イントロン）を表し、ＭＥＴは開始コドン（ＡＴＧ）を表し、ＴＥＲは終止コドンを表し、太い線直下の数字はエクソンの番号を表し、アンプリコン（Ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）は記載のプライマーによって増幅される複製単位を表し、数字は転写開始点を１としたときの塩基数を表す。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子は、ヒト１９番染色体長腕に位置している（１９ｐ１３．１１）。
【００１８】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域において塩基が置換している患者がいることを見出した。一方、これらの塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では殆ど見られなかった。
【００１９】
ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子に上記の置換変異が起こると、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＩｚｕｍｏタンパク質の翻訳量が低下することにより、或いは、変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００２０】
本発明において、変異とは、遺伝子の塩基配列において、塩基が欠失・置換・挿入されていることを意味する。本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において検出されるＩｚｕｍｏ遺伝子の変異は、男性不妊との相関性が高い変異である。具体的には、以下に述べるＸＸ個の変異を検出することにより、検出工程に用いられた生体サンプルを採取されたヒトが、妊孕させやすいか否か、不妊症であると診断されている場合には、不妊症の原因がＩｚｕｍｏ遺伝子の変異によるものであるか否かを判断することができる。なお、「Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」とは、「翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」を意味する。
【００２１】
男性不妊との相関性が高い変異として、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１位のアラニンがグルタミン酸にコードされるようになる。
【００２２】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３位のアラニンがアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００２３】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４位のグリシンがアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００２４】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１１５位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３９位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。
【００２５】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１５７位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第５３位のメチオニンがバリンにコードされるようになる。
【００２６】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１６９位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第５７位のバリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００２７】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２１４位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７２位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。
【００２８】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２８５位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第９５位のリジンがアスパラギンにコードされるようになる。
【００２９】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０７位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３６位のプロリンがロイシンにコードされるようになる。
【００３０】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０９位のアデニンがシトシンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３７位のアスパラギンがヒスチジンにコードされるようになる。
【００３１】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１７位のチミンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３９位のシステインがトリプトファンにコードされるようになる。
【００３２】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４２位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４８位のトリプトファンがアルギニンにコードされるようになる。
【００３３】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４５位のチミンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４９位のシステインがグアニンにコードされるようになる。
【００３４】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４９７位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１６６位のグリシンがグルタミン酸にコードされるようになる。
【００３５】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５７７位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９３位のロイシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
【００３６】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５８９位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９７位のセリンがシステインにコードされるようになる。
【００３７】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第７１９位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２４０位のセリンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
【００３８】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３７位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１３位のフェニルアラニンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００３９】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３９位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１３位のフェニルアラニンがロイシンにコードされるようになる。
【００４０】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９４４位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１５位のアルギニンがグルタミンにコードされるようになる。
【００４１】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９５３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１８位のバリンがグルタミン酸にコードされるようになる。
【００４２】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９８位のチミンがシトシンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３３３位のバリンがアラニンにコードされるようになる。
【００４３】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９９位のチミンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３３３位のバリンもしくはアラニンは変化しない。
【００４４】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１０４０位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４７位のセリンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００４５】
本発明に係る妊孕性診断方法においては、特に、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位の塩基、第１５７位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第５８９位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位、第９９８位の塩基、又は第９９９位の塩基を検出することが好ましい。より妊孕性との相関性が高いためである（第１５７位の塩基はホモ接合型であるため）。また、本発明に係る妊孕性診断方法においては、上記の変異のうち、１種類の変異を検出するものであってもよく、複数種類の変異を検出するものであってもよい。
【００４６】
本発明に係る妊孕性診断方法は、これらの一塩基変異を、妊孕性の遺伝子マーカーとして用いるものである。たとえば、これらの塩基の変異が検出されなかった場合、検出工程に用いられた生体サンプルが回収された被験者は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。一方、変異が検出された場合は、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異により、Ｉｚｕｍｏ分子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。したがって、そのような被験者に対して、たとえばＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｓｐｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；精巣生検−顕微授精）等の適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。すなわち、本発明に係る妊孕性診断方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえるものであり、該方法により、不妊症の診断を行う上で重要な情報が提供されるため、被験者に対して、現存の治療法の中から適格な選択を提示することができる。このため、本発明に係る妊孕性診断方法等は、低妊孕性又は不妊症の診断において好ましく用いることができる。
【００４７】
本発明に係る妊孕性診断方法において用いられる生体サンプルは、ヒトから採取されたものであって、Ｉｚｕｍｏ遺伝子由来の核酸やタンパク質を含有することが期待できるサンプルであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、血液、血清、血漿、頬の内側等の粘膜、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を挙げることができる。ここで、Ｉｚｕｍｏ遺伝子由来の核酸とは、Ｉｚｕｍｏ遺伝子のゲノムＤＮＡや、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ等を意味する。また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子由来のタンパク質とは、Ｉｚｕｍｏ遺伝子から発現されるタンパク質であるＩｚｕｍｏ分子やその分解物等を意味する。特に、Ｉｚｕｍｏ遺伝子由来のタンパク質を検出対象とする場合には、生体サンプルとして、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を用いることが好ましい。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊等されることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。
【００４８】
なお、生体サンプルを適宜希釈等することによりそのまま検出工程に用いてもよく、該生体サンプルから予め抽出したゲノムＤＮＡ等のＤＮＡを用いてもよい。また、該生体サンプルからｍＲＮＡ等のＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により該ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを検出工程に用いてもよい。
【００４９】
本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、たとえば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎプローブ法、ＳＭＭＤ法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＡＳＡ法、及び塩基伸長法、並びにそれらを改変した方法等を用いることができる。検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法等のように、変異部位を特異的に認識する塩基配列を有するプローブやプライマーを用いて検出する方法であることが好ましい。
【００５０】
ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプローブやプライマーは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子及びその周辺の塩基配列に基づき、常法により設計し、合成することができる。なお、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子及びその周辺の塩基配列は、たとえばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（ＮＣＢＩ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）等の公知のデータベースから当業者であれば容易に入手することができる。
【００５１】
たとえば、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３８位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第３８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じくヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、当該第３８位の塩基がシトシンであり、当該第３８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第３８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０７番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０７番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１５７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１５７位の塩基がアデニンからグアニンに置換されており、当該第１５７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１５７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１５７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第１５７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、２２６番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１５７位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１５７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、２２６番目の塩基がアデニンからグアニンに置換されており、当該２２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１５７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、２２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。  
【００５３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４０７位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第４０７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４０７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４０７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号４で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０７位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４０７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。  
【００５４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４０９位の塩基がアデニンからシトシンに置換されており、当該第４０９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４０９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４０９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号４で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０３番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０９位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０３番目の塩基がアデニンからシトシンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４０９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４１７位の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該第４１７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４１７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４１７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号４で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１１１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１７位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１１１番目の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該１１１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４１７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１１１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５８９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第５８９位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第５８９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第５８９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５８９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第５８９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号６で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１１３番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５８９位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５８９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１１３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１１３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５８９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１１３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９３９位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９３９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９３９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第９３９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０３番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３９位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０３番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９３９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９４４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４４位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第９４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９４４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第９４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０８番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９４４位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９４４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０８番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９９８位の塩基がチミンからシトシンに置換されており、当該第９９８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９９８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第９９８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１６２番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９８位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１６２番目の塩基がチミンからシトシンに置換されており、当該１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９９８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９９９位の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該第９９９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９９８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第９９９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１６３番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９９位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１６３番目の塩基がチミンからシトシンに置換されており、当該１６３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９９９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１６３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３２位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第３２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第３２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４１位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第４１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１１０番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１１０番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１１０番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４１位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１１０番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１１５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１１５位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第１１５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１１５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１１５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第１１５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１８４番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１１５位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１１５位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１８４番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１８４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１１５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１８４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１６９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１６９位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第１６９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１６９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１６９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第１６９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、２３８番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１６９位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１６９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、２３８番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１９８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１６９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、２３８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２１４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第２１４位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第２１４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第２１４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２１４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第２１４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号３で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、２８３番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２１４位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２１４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、２８３番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該２８３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２１４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、２８３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４４２位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第４４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号５で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４２位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４４２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４４５位の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該第４４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号５で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０４番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４５位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４５位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０４番目の塩基がチミンからグアニンに置換されており、当該１０４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４４５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４９７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第４９７位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第４９７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第４９７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４９７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第４９７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号５で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１５６番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４９７位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４９７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１５６番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１５６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第４９７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１５６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５７７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第５７７位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第５７７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第５７７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５７７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第５７７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号６で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５７７位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５７７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５７７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００７０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第７１９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７１９位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第７１９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７１９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第７１９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第７１９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号７で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第７１９位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第７１９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７１９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００７１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９３７位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９３７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９３７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第９３７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３７位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９３７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００７２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９５３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９５３位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９５３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９５３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９５３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第９５３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、１１７番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９５３位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９５３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１１７番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１１７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９５３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１１７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００７３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１０４０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０４０位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第１０４０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０４０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１０４０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列中の当該第１０４０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号８で表される塩基配列は、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の部分塩基配列であって、２０４番目の塩基が、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１０４０位の塩基に相当する。すなわち、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１０４０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、２０４番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該２０４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０４０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、２０４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００７４】
このように、上述する各変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることができる。また、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子のゲノムＤＮＡにおいて、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることもできる。これらのポリヌクレオチドの長さとしては、１０〜７０塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましく、１０〜３０塩基長であることがさらに好ましい。なお、変異の有無の検出精度が改善されるため、該ポリヌクレオチド中、変異部位の塩基と対合し得る塩基の位置は特に限定されるものではないが、３’末端から１〜５塩基以内にあることが好ましく、３’末端にあることがより好ましい。
【００７５】
なお、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キットを用いることにより、本発明に係る妊孕性診断方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る妊孕性診断キットとしては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位の塩基、第３８位の塩基、第４１位の塩基、第１１５位の塩基、第１５７位の塩基、第１６９位の塩基、第２１４位の塩基、第２８５位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第４４２位の塩基、第４４５位の塩基、第４９７位の塩基、第５７７位の塩基、第５８９位の塩基、第７１９位の塩基、第９３７位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９５３位の塩基、第９９８位の塩基、第９９９位の塩基、及び第１０４０位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることが好ましく、第３８位の塩基、第１５７位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第５８９位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９９８位の塩基、及び第９９９位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがより好ましい。また、これらの変異のうちの、１種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよく、複数種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよい。
【００７６】
これらの塩基の変異を検出するための試薬としては、たとえば、当該塩基を含む核酸領域をＰＣＲ等により増幅させるためのプライマーの組と、得られた増幅産物の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。該塩基配列決定試薬としては、たとえば、上述したヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列又はその翻訳領域の塩基配列において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、予め蛍光色素等により標識したハイブリダイゼーションプローブ等が挙げられる。その他、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異を検出する方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である場合には、該ＲＦＬＰ法において用いられる制限酵素であってもよい。
【００７７】
また、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。例えば、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＩｚｕｍｏ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよく、被験者のヒトＩｚｕｍｏ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
例えば、上述する変異の存在を検出するものである場合、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、これらの変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、これらの変異の非存在を検出するものである場合、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、これらの変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。
【００７８】
より具体的には、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子内の領域のうち、上記の各変異部位のうちの少なくとも一方（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【００７９】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行うことにより、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、たとえば、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.）等を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
【００８０】
また、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のプライマーを、塩基配列の決定に用いられるプライマーとして用いてもよい。すなわち、妊孕性診断キットには、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組と、塩基配列の決定に用いられるプライマーとを含んでいてもよい。
【００８１】
上記のＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【００８２】
また、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００８３】
なお、それぞれのプライマーは、Ｉｚｕｍｏ遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。Ｉｚｕｍｏ遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の各変異部位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【００８４】
上記のプライマーの組としては、たとえば、それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８で表される塩基配列からなるプライマー（図１の１、２ｒ、３、４ｒ、５．１、６．１ｒ、７、９．５ｒ、９．８及び８ｒ）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）等を用いてプライマーを設計することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【００８５】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。
【００８６】
一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無を、インベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００８７】
図２は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ２及びアレルオリゴ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、５’ ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【００８８】
従って、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無をインベーダー法により検出するものであってもよい。この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、インベーダープローブ２、アレルオリゴ３及びフレットプローブ５等が含まれることが好ましい。
【００８９】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合には、インベーダープローブ２は、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の各変異型塩基と対応するように設計される（但し、相補的でない）。また、アレルオリゴ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の上記の変異型塩基と相補するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記アレルオリゴ３が変異型Ｉｚｕｍｏ遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ２による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
上記の構成により、被験者のＩｚｕｍｏ遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＩｚｕｍｏ遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。
【００９０】
また、上記の例では、被験者の有するＩｚｕｍｏ遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＩｚｕｍｏ遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。
なお、上記の各方法において、Ｉｚｕｍｏ遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【００９１】
本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無をタンパク質レベルで検出するものであってもよい。すなわち、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて、正常なヒトＩｚｕｍｏタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、異常なヒトＩｚｕｍｏタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。ここで、正常タンパク質とは、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。一方、異常タンパク質とは、たとえば、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、上述するいずれかの一塩基置換変異が生じているポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。具体的には、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、第３８位の塩基がアデニン、第１５７位の塩基がグアニン、第４０７位の塩基がチミン、第４０９位の塩基がシトシン、第４１７位の塩基がグアニン、第５８９位の塩基がチミン、第９３９位の塩基がアデニン、第９４４位の塩基がアデニン、第９９８位の塩基がシトシン、及び第９９９位の塩基がグアニンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。また、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第３２位の塩基がアデニン、第４１位の塩基がアデニン、第１１５位の塩基がアデニン、第１６９位の塩基がアデニン、第２１４位の塩基がアデニン、第２８５位の塩基がチミン、第４４２位の塩基がアデニン、第４４５位の塩基がグアニン、第４９７位の塩基がアデニン、第５７７位の塩基がチミン、第７１９位の塩基がチミン、第９３７位の塩基がアデニン、第９５３位の塩基がアデニン、又は第１０４０位の塩基がアデニンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドであってもよい。
【００９２】
なお、生体サンプル中に含まれているヒトＩｚｕｍｏタンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出する方法としては、特に限定されるものではない。たとえば、第１０４０位の変異のように、正常タンパク質と異常タンパク質とが明らかに分子量が異なる場合には、電気泳動法等により生体サンプル中に含まれているヒトＩｚｕｍｏタンパク質の大きさを調べることによって、異常タンパク質が存在しているか否かを検出することができる。また、抗体を用いることにより、生体サンプル中に含まれているヒトＩｚｕｍｏタンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを、より高精度に検出することもできる。
【００９３】
具体的には、たとえば、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程は、上述した各変異のうちの少なくとも１種の変異を含むヒト変異型Ｉｚｕｍｏ遺伝子によってコードされるヒト変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質（正常タンパク質）と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中に異常タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＩｚｕｍｏの異常タンパク質と結合し、かつ、正常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いてもよい。なお、このような抗体は、ヒトＩｚｕｍｏの異常タンパク質を抗原として、常法により作製したポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の中から、ヒトＩｚｕｍｏの正常タンパク質と交差しないものを選択することにより、得ることができる。
【００９４】
より具体的には、本発明に係る抗体は、上述したアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型Ｉｚｕｍｏポリペプチドまたは変異部分を含むそのフラグメントを抗原として実験動物を免疫処置することにより、製造することができる（たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354n (1985)を参照のこと。）
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型Ｉｚｕｍｏポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型Ｉｚｕｍｏポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。
【００９５】
このように、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、上述した各変異のうち少なくとも一方の塩基置換を含むヒト変異型Ｉｚｕｍｏ遺伝子によってコードされるヒト変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。
上記抗体を用いてヒト変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
【００９６】
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトＩｚｕｍｏタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＩｚｕｍｏタンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗Ｉｚｕｍｏ抗体）を用いてもよい。
抗Ｉｚｕｍｏ抗体を用いてヒトＩｚｕｍｏタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒトＩｚｕｍｏタンパク質が発現していないと判定された場合は、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＩｚｕｍｏタンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
【００９７】
抗体を用いて、生体サンプル中のヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質またはヒト変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質を検出する手法は、特に限定されず、公知のいずれの手法を用いてもよい。たとえば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型Ｉｚｕｍｏタンパク質抗体または抗Ｉｚｕｍｏ抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
【実施例】
【００９８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９９】
［実施例１］
本実施例においては、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子配列を解析し、ヒトＩｚｕｍｏ遺伝子に男性不妊症に関連した変異の検出を行った。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝１０００以上）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。コントロール群（Ｎ＝２００以上）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。
【０１００】
［変異スクリーニング］
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
Ｉｚｕｍｏ遺伝子は図１に示すように１０個のエクソンからアミノ酸コード領域が形成されるが、それぞれのエクソンを増幅させるため、図１に示すように、５つの複製単位（アンプリコン）に分け、ＰＣＲ用プライマーをデザインした。表１にそれぞれのプライマーを、表２にＰＣＲの反応条件を示す。
【０１０１】
【表１】
2010187556.tif 000003
【０１０２】
【表２】
2010187556.tif 000004
【０１０３】
これらのプライマーを用いて表２記載の反応条件でＰＣＲ反応を行い。得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＭＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。この精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを鋳型とし、それぞれのアンプリコンを増幅した際に使用したプライマーを用いて、シーケンシング反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３７３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０１０４】
［シークエンス解析結果］
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、プライマー１と２ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー３と４ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー５．１と６．１ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー７と９．５ｒで増幅されるアンプリコン、及びプライマー９．８と８ｒで増幅されるアンプリコンの、それぞれの塩基配列を解析したところ、表３に示すように、既知のＳＮＰｓ（３ヶ所）を含めた置換変異が合計２６個検出された。このうちアミノ酸の変化を伴う２２個の置換変異が不妊症被験者に検出され、妊孕性確認被験者からはこれらの置換変異は全く検出されず、妊孕性との相関性があることが確認された。以下、この２２個の置換変異及び不妊症被験者にマイナーホモ接合型が多く集積された既知ＳＮＰｓ（ｒｓ２３０７１９とｒｓ２３０７１８）について、それぞれ説明する。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３２位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１位のアラニンがグルタミン酸にコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１０７】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第３８位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に４人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３位のアラニンがアスパラギン酸にコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１０８】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４位のグリシンがアスパラギン酸にコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１０９】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１１５位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３９位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１０】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１５７位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第５３位のメチオニンがバリンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１１】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１６９位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第５７位のバリンがイソロイシンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１２】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２１４位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７２位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１３】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第２８５位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者７８２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第９５位のリジンがアスパラギンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７２人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１４】
Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０７位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者６９４人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３６位のプロリンがロイシンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６９人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１５】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４０９位のアデニンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者６９４人の中に３人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３７位のアスパラギンがヒスチジンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６９人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１６】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４１７位のチミンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者６９４人の中に２７人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３９位のシステインがトリプトファンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６９人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１７】
Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４２位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３５０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４８位のトリプトファンがアルギニンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７０人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１８】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４４５位のチミンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３５０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４９位のシステインがグリシンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７０人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１１９】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第４９７位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３５０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１６６位のグリシンがグルタミン酸にコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１７０人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２０】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５７７位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３５０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９３位のロイシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６７人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２１】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第５８９位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３５０人の中に２６人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９７位のセリンがシステインにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６７人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２２】
Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第７１９位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者１３２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２４０位のセリンがフェニルアラニンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１５８人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２３】
Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３７位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１３位のフェニルアラニンがイソロイシンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６８人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２４】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９３９位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に２０人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１３位のフェニルアラニンがロイシンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６８人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２５】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９４４位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に２４人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１５位のアルギニンがグルタミンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６８人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２６】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９５３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１８位のバリンがグルタミン酸にコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６８人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１２７】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９８位のチミンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に４９人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３３３位のバリンがアラニンにコードされるようになる。一方、妊孕性確認被験者１６８人には、この置換変異を持った人が２名見出された。
【０１２８】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第９９９位のチミンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に５１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３３３位のアミノ酸は変化しない。一方、妊孕性確認被験者１６８人には、この置換変異を持った人が２名見出された。
【０１２９】
また、Ｉｚｕｍｏ遺伝子の翻訳領域の第１０４０位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している塩基配列を持った被験者が、不妊症被験者３６７人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１８位のセリンがコードされなくなる（終止コドン）。一方、妊孕性確認被験者１６８人からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０１３０】
これらの置換変異の中でも、特に、第３８位の塩基、第４０７位の塩基、第４０９位の塩基、第４１７位の塩基、第５８９位の塩基、第９３９位の塩基、第９４４位の塩基、第９９８位の塩基、又は第９９９位の塩基の置換変異の出現率が高く、男性不妊症との相関性が高かった。
【０１３１】
上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＩｚｕｍｏのタンパク質の翻訳量が低減したことにより、或いは、変異型Ｉｚｕｍｏタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、Ｉｚｕｍｏタンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。一方第１５７位、及び第３３３位の置換変異はホモ接合型であり、正常型Ｉｚｕｍｏタンパク質の機能に何らかの変化が生じていると推定された。
【０１３２】
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＩｚｕｍｏ遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明に係る妊孕性診断方法等を用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を行うことができ、妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。
【０１３４】
本発明によれば、不妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１３５】
１…ターゲット遺伝子、１ａ…変異（又は一塩基多型）検出部位、２…インベーダーオリゴ、３…アレルオリゴ、３ａ…ヌクレオチド、３ｂ…フラップ、３ｃ…フラップ遊離体、４…フラップエンドヌクレアーゼ、５…フレットプローブ、５ａ…ヌクレオチド、５ｂ…蛍光色素、５ｃ…クエンチャー（発光抑制体）。
【図１】
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【図２】
2010187556.tif 000007
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月17日(2009.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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