(57)【要約】【課題】中枢性疲労度、さらには被検物質の抗中枢性疲労作用を簡便に、且つ経時的に１個体で評価する。【解決手段】非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度を測定することで、上記課題を解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度を測定することを特徴とする中枢性疲労度の評価方法。
【請求項２】
非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度を経時的に測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物の脳内グルタミン酸濃度の変化を測定することを特徴とする、被検物質の抗疲労作用評価方法。
【請求項４】
前記非ヒト動物がラットである請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記非ヒト動物がラットである請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便でかつ効率のよい中枢性疲労度の評価方法または被検物質の抗疲労作用の評価方法に関する。具体的には非ヒト動物の脳内グルタミン酸の濃度を測定することで、前記評価方法を行うことができる発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労とは、過度の肉体的および精神的活動によってその活動力や仕事の能率が低下した状態である。疲労は経日的に蓄積されればＱＯＬが低下するばかりでなく作業効率を下げ、慢性疲労への進行や免疫力低下の引き金になる。従って、疲労の警告である疲労感に早く対処することが重要である。
【０００３】
疲労は誰もが日常経験することであるが、疲労発現のメカニズムを一義的に明らかにすることは困難である。その理由として、身体疲労の延長線上に中枢で捉えられる疲労感、身体疲労を伴わない中枢での疲労感、および身体だけの疲労を区別して考える必要があり、完全にそれらの間に境界線を設けることは不可能である。
身体だけの疲労、すなわち筋肉などに由来する疲労を、非ヒト動物を用いて客観的に評価する方法は、いくつか報告されている（例えば、非特許文献１）。また、中枢が主体となって感じている疲労は一般に「中枢性疲労」と呼ばれ、数多くの研究報告がなされている。これまでに報告されている疲労感に関する仮説として、ＴＧＦβ、ＩＬ−６などのインターフェロン、アセチルカルニチン、トリプトファンおよびセロトニンなどの疲労候補物質に焦点をあて疲労発現が論じられている。
【０００４】
【非特許文献１】只野  武「ドリンク剤で「疲れ」はとれるか？−疲労回復メカニズム−」Biophilia Vol.1 No.4 p33-39,(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの疲労候補物質は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法や病理学的方法で捉えて評価してきたために疲労負荷中或いは負荷後ごとに非ヒト動物の脳を摘出する必要があった。この場合、疲労候補物質の経時的な変化を同じ個体で追跡することができず、またポイント毎に複数の非ヒト動物を使用しなければならない。
【０００６】
通常、脳内の神経伝達物質として、アミン類、アミノ酸類、神経ペプチドなど多種多様なものが知られている。その中でも、グルタミン酸は脳内の情報伝達に重要な働きがあることが近年指摘されている。特に、グルタミン酸が記憶や運動の情報伝達に重要な役割を果たすとされている。そして、脳内グルタミン酸の活性の低下が記憶障害を起こすこと、もしくはグルタミン酸の過剰な活性がてんかん等などの運動障害の原因となることが指摘されている（特開平１０−５３５２１号公報）。
しかしながら、脳内グルタミン酸が疲労、特に中枢性疲労に寄与していることを示す、研究等は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、先の課題を踏まえ鋭意検討の結果、脳内のグルタミン酸濃度が疲労負荷された非ヒト動物において低くなることを見出した。具体的には、疲労負荷を与えた非ヒト動物に抗疲労作用を有することが確認されている薬剤を投与した群と、水のみ投与した群とを比較すると水のみ投与した群は脳内グルタミン酸の濃度が有意に低くなることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００８】
具体的には、本発明は、
（１）非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度を測定することを特徴とする中枢性疲労度の評価方法、
（２）非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度を経時的に測定することを特徴とする（１）に記載の方法、
（３）非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物の脳内グルタミン酸濃度の変化を測定することを特徴とする、被検物質の抗疲労作用評価方法、
（４）前記非ヒト動物がラットである（１）または（２）に記載の方法、および
（５）前記非ヒト動物がラットである（３）に記載の方法、である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明を使用することで、一個体の中枢性疲労をリアルタイムに追跡することができて、少数の被検動物による評価が可能であり、また、中枢性疲労のメカニズムの解明、さらには脳内の疲労に関するメカニズムの解明に寄与することができる。さらに、被検物質の抗疲労効果を的確に評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度を測定することにより中枢性疲労度を評価する。
本発明で使用することができる非ヒト動物としては、哺乳類動物であれば特に制限はないが、特に実験の利便性から動物実験に汎用されるラット、マウス、モルモット等の齧歯類が好ましく、脳に電極を取り付ける等の手術を行う都合上ラットが特に好ましい。
【００１１】
本発明は、上記動物の脳内グルタミン酸濃度を測定する。さらに詳しくは、上記動物の内側前頭前皮質(medial prefrontal cortex)内のグルタミン酸の濃度を測定する。
グルタミン酸の測定方法は、上記動物の脳内アミノ酸を測定できる方法であれば特に限定されないが、上記動物１個体よりリアルタイムで測定できる方法が好ましい。
具体的には、麻酔下、上記動物の頭部に小さな穴を開けて、グルタミン酸バイオセンサープロルーブを挿入して、そこから得られるグルタミン酸濃度シグナルを特定のプログラムを用いてパーソナルコンピューターによりデータ解析されて算出される。
【００１２】
本発明は中枢性疲労の疲労度を評価することができる。一般に疲労は、「末梢性疲労」と「中枢性疲労」に分類される。末梢性疲労とは、脳以外の身体（末梢）、すなわち筋肉などに由来する疲労感覚を感じる状態いい、中枢性疲労とは、脳が主体となって疲労を感じている状態である。末梢性疲労は運動等による肉体の疲労が原因であり、中枢性疲労は、デスクワーク等の長時間の脳の使用によるものと、運動に起因するものとが原因として挙げられる。
従来は、中枢性疲労の一つの原因として、運動時に脳内のセロトニンが増加することが考えられていた。しかしながら、本発明は抗疲労効果の認められている薬剤を投与して運動負荷をかけた動物、水のみ投与して運動負荷をかけた動物、および運動負荷をかけなかった動物の脳内グルタミン酸濃度を比較し、水のみ投与して運動負荷をかけた動物の脳内グルタミン酸濃度が非常に低くなることがわかった。つまり、脳内のグルタミン酸濃度が中枢性疲労の指標となることがわかった。
【００１３】
本発明は、中枢性疲労の評価に脳内グルタミン酸濃度が指標となる知見に基づいて、非ヒト動物に被検物質を投与し、その動物の脳内グルタミン酸濃度の変化を測定する被検物質の抗疲労作用評価方法も含む。  
被検物質投与前もしくは投与後に、上記動物に強制歩行等のストレスを与え、水投与群もしくは非ストレス負荷群と脳内グルタミン酸濃度を比較する。
上述のように、動物の頭部に小さな穴を開けて、グルタミン酸バイオセンサープローブを挿入し、そこから発するシグナルを計算してグルタミン酸濃度を測定するものである。その結果、本法はBrain microdialysis法と異なり、free movingの状態で動物１個体から連続的にまた経時的にグルタミン酸濃度を測定することが出来る。
【００１４】
また、本発明は被検物質を投与した非ヒト動物の脳内グルタミン酸濃度の変化を測定することで、被検物質の中枢性疲労に対する効果、すなわち抗中枢性疲労作用を評価することが出来る。
被検物質は特に限定されないが、洋薬類、生薬類、ハーブ類、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸等を単独で投与することができ、またこれらの配合物として被検物質とすることが出来る。投与方法は、特に限定されず、経口投与または、注射等の当業者に既知の非経口投与を用いることができる。
【実施例】
【００１５】
以下に試験例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。
実験材料および方法
１．使用動物
雄性（２〜３ヶ月齢；体重２５０〜３５０ｇ）Sprague-Dawleyラットを用いた。飼育条件として、明暗１２時間サイクル（明期  ７：００−１９：００）、室温２３±１℃、湿度５２±１％で一定に保ち、ラット２，３匹を１ケージに固形飼料および水道水を自由に摂取させて飼育した。
【００１６】
２．被検物質および調整法
被検薬物の中枢性疲労の抗疲労作用を評価するために、１５種類の生薬、２種類のビタミン、タウリンおよびカフェイン（詳細は下記表１）を含む滋養強壮作用を有するドリンク剤を使用した。
【００１７】
【表１】
2010066005.tif 000002
【００１８】
３．グルタミン酸バイオセンサーの装着法
ラットをペントバルビタール（pentbarbital:50mg/kg, i.p.）で麻酔後、脳定位固定装置に固定した。その後、頭皮を切開し内側前頭前皮質(medial prefrontal cortex)（Bregma+2.8mm、AP,+0.5mm ML）に直径１ｍｍ程の穴を開け、センサーを挿入するためのガイドカニューレを挿入する。ガイドカニューレとワイヤレスポテンシオスタットを設置するためのシェル底部を歯科用セメントで頭蓋に固定する。セメントが固まったのを確認して、シェル頭部をネジで固定させる。手術後ラットは１匹ずつケージに飼育し、これらの手術の回復期間として１週間飼育した。
【００１９】
強制歩行ストレス負荷前日に、ラットを上述と同様に麻酔し、グルタミン酸バイオセンサープローブ（Pinnacle Technology, Lawrence, KS）を注意深く挿入した（Bregma+2.8mm、AP,＋0.5mm  ML,-5mm DV）。プローブの先端はガイドカニューレの先端より１ｍｍ出るように予め調節してある。
プローブ挿入後、プローブとガイドカニューレを固定し、ワイヤレスポテンシオスタット（Model 3102RH;Pinnacle Technology, Lawrence, KS）をシェル底部に設置する。プローブ末端とポテンシオスタットのコネクト部分を接続後、シェル頭部でポテンシオスタット部分を覆い、その後ラットは個別にケージに戻した。
【００２０】
４．強制歩行負荷の測定法
強制歩行ストレス施行は、直径３７ｍｍ×横３５．５ｃｍの電動式回転カゴにラット１−２匹入れ、１回転／２５秒で６時間強制歩行させることにより与える。
【００２１】
強制歩行ストレス施行前日にバイオセンサーを挿入した。翌日９：００〜１０：００の間にラットをケージに飼育したままの状態で、３０分以上、ベースとなるグルタミン酸濃度を測定した。その後、グルタミン酸濃度を測定しながらラットを回転カゴに移し、６時間の強制歩行負荷、その後、測定用の空ケージ（サイズは飼育ケージと同じものを使用する）に移した。１５分間環境に適用させた後、薬物を経口投与し、９０分間グルタミン酸濃度推移を観察した。９０分経過後、ラットを飼育ケージに移動させ、その後翌日１０：００過ぎまでグルタミン酸濃度を測定した。グルタミン酸濃度シグナル測定は、０．６７Ｈｚ間隔のデータ取得プログラム(Pinnacle Acquisition Laboratory, version 1.3.2, Pinnacle Technology, Lawrence, KS)を用いて、パーソナルコンピューターでデータ解析を行った。
【００２２】
５．結果
午前９時３０分より２４時間、内側前頭前皮質（medial prefrontal cortex)におけるグルタミン酸濃度を経時的に測定した。その結果、強制歩行負荷を行わない正常ラットのグルタミン酸濃度は明期で１００％のベースライン（base line)付近を維持したが、暗期では１２０〜１３０％近くの高い濃度を維持した（図１、逆黒三角）。このように、ラット内側前頭前皮質のグルタミン酸濃度は昼間に比べて夜間に高くなる日内リズムが存在することが認められた。
【００２３】
６時間の強制歩行負荷を与えるとその負荷後４時間後までにグルタミン酸濃度が１０〜１３％上昇し、歩行負荷を中止するとその後徐々に減少した。３時間後にはグルタミン酸濃度は約１０％低下し、それ以降プラトーな状態を示した。すなわち、グルタミン酸濃度は強制歩行負荷による身体疲労負荷を加えている間は若干上昇し、負荷を中止すると経時的に３時間後まで減少した。そして、正常ラットと比較するとグルタミン酸濃度の差は約４０％（負荷中止から１３時間後）にまで開いた（図１、黒四角）。このような疲労負荷解除のグルタミン酸濃度の減少は、疲労感あるいは中枢性疲労として評価される。
【００２４】
次に、既に抗疲労効果が認められている、上記表１の成分を含むドリンク剤を投与した。このドリンク剤を負荷解除直後に投与したところ、グルタミン酸濃度は３時間後まで徐々に上昇し、その後プラトーな状態を示した（図１、黒三角）。図１に示すように、ドリンク剤投与後のグルタミン酸濃度の経時的曲線は、強制歩行を負荷しない正常ラットとほぼ同じパターンを示した。
【００２５】
以上より、強制歩行負荷後のグルタミン酸濃度の減少は疲労感を反映したものであり、滋養強壮ドリンク剤はその疲労感を改善する機序としてグルタミン酸濃度を正常レベルまで回復されることが立証された。
なお、先の研究で強制歩行負荷による筋肉疲労は大腿四頭筋の炎症誘発性酵素であるヒスタミン脱炭酸酵素の推移および自発運動量の行動薬理学的実験結果により明らかにされており、その場合の滋養強壮ドリンク剤の抗疲労効果も認めている（只野  武「ドリンク剤で「疲れ」はとれるか？−疲労回復メカニズム−」Biophilia Vol.1 No.4 p33-39,(2005)）。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】正常ラット（逆黒三角）（ｎ＝６）、疲労負荷後に水を経口投与したラット（黒四角）（ｎ＝３）、疲労負荷後にドリンク剤を経口投与したラット（黒三角）（ｎ＝２）の脳内グルタミン酸濃度を経時的に示した図である。
【図１】
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