(57)【要約】【課題】食品由来の安全素材であって、より優れた美肌作用を有する素材、該素材を含有する美肌用組成物、並びに該美肌用組成物を含有する飲食品及び皮膚外用剤の提供。【解決手段】ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用組成物、並びに前記５菌株からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用飲食品及び美肌用皮膚外用剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする皮膚細胞のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする皮膚細胞のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする皮膚の水分含有量増大剤。
【請求項５】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする皮膚の水分蒸散抑制剤。
【請求項６】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用飲食品。
【請求項７】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用皮膚外用剤。
【請求項８】
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）。
【請求項９】
ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）。
【請求項１０】
ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）。
【請求項１１】
ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）。
【請求項１２】
ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とする美肌用組成物、該美肌用組成物を含有する飲食品又は皮膚外用剤、及び該美肌用組成物の有効成分として好適な乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性にとって肌のトラブルは重大な問題である。皮膚組織においてその保水性や弾力性に大きく関与している成分としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などの酸性ムコ多糖やコラーゲンなどが知られている。しかし、加齢や生活習慣などによりこれらの量が減少すると、皮膚の保水性や弾力性が失われてしまい、肌荒れや小じわなどの肌トラブルが生じやすい。
【０００３】
このため、このような肌トラブルを解消し得る安全な素材の開発が強く求められている。このような美肌効果を有する化粧品や飲食品としては、たとえば、ヒアルロン酸やコラーゲン等の皮膚組織を構成する成分を多く含むものが知られている。
【０００４】
一方、乳酸菌は、整腸作用や免疫賦活作用を有する安全な素材として知られており、これらの乳酸菌を大量に含むヨーグルト等が、健康と美容によい飲食品として女性消費者に広く支持されている。また、皮膚の状態は、紫外線等の外的要因のみではなく、便通や疲労、健康状態等の内的要因にも大きく左右される。このため、皮膚状態の改善を目的とした飲食品や化粧品の原料として、乳酸菌やその培養物を用いることが行われている。
【０００５】
たとえば、（１）免疫調節作用の高いラクトバチルス属菌を含んでなる美容組成物（例えば、特許文献１参照。）や、（２）セラミドと乳酸菌、好ましくはペプチドを組み合わせることにより肌の状態の相乗的改善効果を有する美容食品（例えば、特許文献２参照。）が開示されている。また、（３）燕の酵素分解物、コラーゲン、ＳＯＤ活性物質、ラクトフェリン、乳酸菌・酵母を含む美肌促進剤が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。さらに、（４）美肌効果・治療効果の高いサーモフィラス菌ＯＬＳ３０５９やその培養物を用いた組成物や、サーモフィラス菌ＯＬＳ３０５９とブルガリア菌を用いて調製した発酵乳が開示されている（例えば、特許文献３参照。）。
【特許文献１】特開２００８−１７９６０１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５４６３２号公報
【特許文献３】特開２００３−９５９６１号公報
【特許文献４】特開２００７−３９４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の組成物は、いずれも経口摂取することにより、ある程度の皮膚状態の改善効果が奏されるものの、その効果は未だ不十分である。さらに、上記（１）の美容組成物、（２）の美容食品、（３）の美肌促進剤に原料として添加されている乳酸菌は、主に、乳酸菌が有する一般的な整腸作用や免疫賦活作用等により便通等の健康状態を改善することを目的として添加されており、皮膚状態の改善に直接作用効果を奏するものではない。一方、上記（４）の組成物は、美肌効果等の高い特定の乳酸菌株を使用しているものの、該乳酸菌の摂取した場合にどのような作用機序により皮膚状態の改善効果が得られるのかについては、具体的な記載は一切ない。
【０００７】
本発明は、食品由来の安全な素材であって、より優れた美肌作用を有する素材、該素材を含有する美肌用組成物、並びに該美肌用組成物を含有する飲食品及び皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、食品由来の特定の乳酸菌の中に、皮膚細胞に対するコラーゲン産生促進作用、皮膚細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用、皮膚の水分含有量増大作用、及び皮膚の水分蒸散抑制作用が有ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＦＢＡ２株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４９）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＦＢＡ１株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６４８）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＦＢＡ５株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５２）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＦＢＡ４株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５１）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＦＢＡ３株（受託番号  ＮＩＴＥ Ｐ−６５０）からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用組成物を提供するものである。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ３株、ラクトバチルス・サケイＦＢＡ５株、及びロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする皮膚細胞のコラーゲン産生促進剤、皮膚細胞のヒアルロン酸産生促進剤、皮膚の水分含有量増大剤、又は皮膚の水分蒸散抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株、及びラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする美肌用飲食品又は美肌用皮膚外用剤を提供するものである。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株、又はラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の美肌用組成物は、食品由来の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とするため、非常に安全摂取することができる。また、本発明の美肌用組成物の有効成分である特定の乳酸菌の菌体又は培養物は、皮膚細胞に対するコラーゲン産生促進作用、皮膚細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用、皮膚に対する保水作用、及び皮膚に対する水分蒸散抑制作用からなる群より選択される１以上の作用を少なくとも有するため、非常に優れた美肌効果を奏する。さらに、前記乳酸菌の菌体又は培養物は、経口摂取のみならず、皮膚へ直接塗布する等の経皮摂取した場合にも効果を奏し得ることから、飲食品や皮膚外用剤に好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の美肌用組成物、皮膚細胞のコラーゲン産生促進剤、皮膚細胞のヒアルロン酸産生促進剤、皮膚の水分含有量増大剤、及び皮膚の水分蒸散抑制剤（以下、美肌用組成物等、ということがある。）は、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株、及びラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることを特徴とする。これらの乳酸菌は、食品から分離された乳酸菌であり、皮膚細胞に対するコラーゲン産生促進作用、皮膚細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用、皮膚に対する保水作用、及び皮膚に対する水分蒸散抑制作用からなる群より選択される１以上の作用を有する。このため、これらの乳酸菌を有効成分とする本発明の美肌用組成物は、コラーゲン産生能力、ヒアルロン酸産生能力、及び水分含有量を向上させ、水分蒸散量を抑制させる等の皮膚機能の改善を図ることができ、優れた美肌効果を奏することができる。
【００１２】
ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株、及びラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株は、乳酸菌１９１株に対するヒト皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン産生促進作用のスクリーニング、及び乳酸菌６６株に対するヒト皮膚由来線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進作用のスクリーニングを行い、ヒト皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン産生促進作用又はヒアルロン酸産生促進作用を有する乳酸菌を選抜することにより得られた。以下、詳細に説明する。
【００１３】
１．コラーゲン産生促進作用を有する乳酸菌のスクリーニング
表１に示した乳酸菌１９１株を供試菌株とした。これらの乳酸菌を、ＭＲＳ培地にて培養し殺菌後、凍結乾燥した。その後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬）により３，１０，３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁したものを、乳酸菌懸濁液とした。該乳酸菌懸濁液を、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＫＵＲＡＢＯ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．０７０５１８−９０１，２０歳女性皮膚由来）に３，１０，３０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４時間培養後に培養上清を回収した。陽性対照として、乳酸菌懸濁液に換えて同濃度のアスコルビン酸（ＡｓＡ、和光純薬）を用いた。回収した培養上清をミリＱ水で一晩透析した後、凍結乾燥し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）により１０倍濃縮した試料を調製した。これらの試料を用いて、Ｉ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６００−４０１−１０３−０）を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより、コラーゲン量を測定した。画像の数値化はソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を用いて行った。
【００１４】
【表１】
2010143885.tif 000002
【００１５】
図１はウェスタンブロッティングの結果を示した図であり、図２は、図１の結果を画像解析により数値化した結果を示した図である。この結果、ＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ３株、ＦＢＡ４株、ＦＢＡ５株由来の乳酸菌懸濁液を添加したヒト皮膚由来線維芽細胞では、アスコルビン酸（ＡｓＡ）を添加した細胞と同様に、濃度依存的なコラーゲン産生促進作用が認められた。
【００１６】
２．ヒアルロン酸産生促進作用を有する乳酸菌のスクリーニング
表２に示した乳酸菌６６株を供試菌株とした。上記１と同様にして調製した乳酸菌懸濁液を、ヒト皮膚由来線維芽細胞に３，１０，３０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、４８時間培養後に培養上清を回収した。陽性対照として、乳酸菌懸濁液に換えて同濃度のＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。回収した培養上清をミリＱ水で一晩透析した後、凍結乾燥し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）により１０倍濃縮した試料を調製した。ヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキット（生化学工業，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８０５６６）を用いて、これらの試料中のヒアルロン酸量を測定した。測定はＮ＝３で実施し、平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。
【００１７】
【表２】
2010143885.tif 000003
【００１８】
測定結果を図３に示す。図３中、「０」はＮ−アセチルグルコサミンと乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、ＦＢＡ１株、ＦＢＡ４株由来の乳酸菌懸濁液を添加したヒト皮膚由来線維芽細胞では、３、１０、３０μｇ／ｍｌで濃度依存的に有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。ＦＢＡ５株由来の乳酸菌懸濁液を添加したヒト皮膚由来線維芽細胞では、１０、３０μｇ／ｍｌで有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。ＦＢＡ２株、ＦＢＡ３株由来の乳酸菌懸濁液を添加したヒト皮膚由来線維芽細胞では、３０μｇ／ｍｌで有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００１９】
３．マウスに経口摂取させた場合の美肌効果
ヒト皮膚由来線維芽細胞に対するコラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用が確認されたＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ３株、ＦＢＡ４株、及びＦＢＡ５株をマウスに経口摂取させた場合の美肌効果について調べた。
具体的には、６週齢の雌性ＨＲ−１マウスを、１２％カゼイン食餌摂取にて７日間馴化飼育後、１２％カゼイン食餌摂取群（普通食摂取群）及び６％カゼイン食餌摂取群（低タンパク食摂取群）に分け、各群に各乳酸菌懸濁液を２００又は６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで６週間、毎日強制経口投与した。陽性対照として、乳酸菌に換えて、グルコサミン塩酸塩（Ｇｌｃ、和光純薬）を４００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ又はアスコルビン酸（ＡｓＡ）を６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで６週間、毎日強制経口投与した。なお、各摂取群を構成するマウスは５匹とした。
【００２０】
・水分蒸散量の測定
薬剤を６週間強制経口投与後、各群のマウスの背部皮膚における水分蒸散量を測定した。皮膚水分蒸散量は、肌のバリア機能の状態の指標とすることができる。皮膚水分蒸散量の測定は、ＶａｐｏＭｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用いて、背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０．５ｃｍの部位の水分蒸散量（ｇ／ｍ２ｈ）を３回測定して平均を求めた。各群５匹の平均値からその群の平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。測定結果を図４に示す。図４中、「０」はグルコサミン塩酸塩、アスコルビン酸、及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取群では水分蒸散量が有意に増加したが、５株全ての投与群において、陽性対照であるグルコサミン塩酸塩を投与した群やアスコルビン酸を投与した群と同程度に有意な水分蒸散量の抑制が認められた。
【００２１】
・コラーゲン量の測定
薬剤を６週間強制経口投与後、各群のマウスの背部皮膚０．２ｇを切除し、凍結乾燥したものに１ｍｌの抽出バッファー（１％ＳＤＳ含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を加えてマルチビーズショッカー（ＭＢ６０１（Ｓ）型、安井器械）にて１，５００ｒｐｍ、１分処理して懸濁液を得た。懸濁液を４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心後、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過してタンパク質抽出物を得た。このタンパク質抽出物を用いてＩ型コラーゲン量を上記１と同様にウェスタンブロッティングで測定し、皮膚機能向上作用を評価した。画像の数値化はソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を用いて行い、各群５匹の平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。図５はウェスタンブロッティングの結果を示した図であり、図６は、図５の結果を画像解析により数値化した結果を示した図である。図６中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取群ではＩ型コラーゲン量が有意に低下したが、ＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ５株の投与群において、特に有意なＩ型コラーゲン産生促進作用が認められた。
【００２２】
・ヒアルロン酸量の測定
薬剤を６週間強制経口投与後、各群のマウスの背部皮膚中のヒアルロン酸量を測定した。ヒアルロン酸量の測定は、各群のマウスの背部皮膚から抽出したタンパク質抽出物を用いて、上記２と同様にしてヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、各群５匹の平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。測定結果を図７及び８に示す。図７及び８中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取群ではヒアルロン酸量が有意に低下したが、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ５株、ＦＢＡ３株、ＦＢＡ４株の投与群において、有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。特に、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ５株の投与群においては、普通食と同等までヒアルロン酸量が回復した。
【００２３】
・皮膚水分含有量の測定
さらに、薬剤を６週間強制経口投与後、各群のマウスの皮膚水分含有量を測定した。水分含有量の測定は、モイスチャーチェッカー（スカラ製，ＭＹ−８０８Ｓ）を用い、背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０．５ｃｍの部位の水分量（％）を３回測定して平均を求めた。各群５匹の平均値からその群の平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。測定結果を図９に示す。図９中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、ＦＢＡ２株投与群において、有意な水分含有量の増大が認められた。
【００２４】
４．ＦＢＡ２株をマウスに経口摂取させた場合の美肌効果に必要な用量の設定
ＦＢＡ２株をマウスに経口摂取させた場合の美肌効果について、必要な用量を調べた。具体的には、６週齢の雌性ＨＲ−１マウスを、１２％カゼイン食餌摂取にて３週間馴化飼育後、１２％カゼイン食餌摂取群（普通食摂取群）及び６％カゼイン食餌摂取群（低タンパク食摂取群）に分け、各群にミリＱ水で懸濁した乳酸菌懸濁液を４０、６０、１００又は２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで６週間、毎日強制経口投与した。陽性対照として、乳酸菌に換えて、グルコサミン塩酸塩（Ｇｌｃ、和光純薬）を４００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで６週間、毎日強制経口投与した。なお、各摂取群を構成するマウスは５匹とした。
【００２５】
・水分蒸散量の測定
ＦＢＡ２株を６週間強制経口投与後、各群のマウスの背部皮膚における水分蒸散量を測定した。皮膚水分蒸散量の測定は、上記３と同様にして行った。測定結果を図１０に示す。図１０中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取により有意に水分蒸散量が増加したが、ＦＢＡ２株を１００又は２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口投与した群においては、低タンパク食摂取による水分蒸散量増加を有意に抑制する作用が認められた。
【００２６】
・皮膚水分含有量の測定
ＦＢＡ２株を６週間強制経口投与後、各群のマウスの皮膚水分含有量を測定した。水分含有量の測定は、上記３と同様にして行った。測定結果を図１１に示す。図１１中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取により水分量が低下したが、ＦＢＡ２株を２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口投与した群においては、低タンパク食摂取による水分量低下を有意に回復する作用が認められた。
【００２７】
・コラーゲン量の測定
ＦＢＡ２株を６週間強制経口投与後、各群のマウスの背部皮膚０．２ｇを切除し、凍結乾燥したものに１ｍｌの抽出バッファー（１％ＳＤＳ含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を加えてマルチビーズショッカー（ＭＢ６０１（Ｓ）型、安井器械）にて１，５００ｒｐｍ、１分処理して懸濁液を得た。懸濁液を４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心後、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過してタンパク質抽出物を得た。このタンパク質抽出物を用いてＩ型コラーゲン量をコラーゲンＥＬＩＳＡキット（エーシーバイオテクノロジーズ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ１−Ｅ１０５）を用いて行い、各群５匹の平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。測定結果を図１２に示す。図１２中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取により有意にコラーゲン量が低下したが、ＦＢＡ２株を１００又は２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口投与した群においては、低タンパク食摂取によるコラーゲン量低下を有意に回復する作用が認められた。
【００２８】
・ヒアルロン酸量の測定
ＦＢＡ２株を６週間強制経口投与後、各群のマウスの背部皮膚中のヒアルロン酸量を測定した。ヒアルロン酸量の測定は、各群のマウスの背部皮膚から抽出したタンパク質抽出物を用いて、上記２と同様にしてヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、各群５匹の平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。測定結果を図１３に示す。図１３中、「０」はグルコサミン塩酸塩及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。この結果、低タンパク食摂取により有意にヒアルロン酸量が低下したが、ＦＢＡ２株を１００又は２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口投与した群においては、低タンパク食摂取によるヒアルロン量低下を有意に回復する作用が認められた。
【００２９】
以上の結果より、低タンパク食摂取による皮膚機能低下動物モデルにおいて、ＦＡＢ２株の水分蒸散量抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸促進作用に必要な用量は１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上であることが明らかになった。動物およびヒトでの経口投与による美肌作用が知られている食品素材として、アスコルビン酸およびグルコサミン塩酸塩が知られており、アスコルビン酸は動物では６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、ヒトでは３００ｍｇ／ｄａｙで、グルコサミン塩酸塩は動物では４００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、ヒトでは２００ｍｇ／ｄａｙで有効性が確認されている。これらの知見から鑑みて、ＦＢＡ２株をヒトに経口投与した場合は、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上であれば有意な効果が期待できる。
【００３０】
５．三次元皮膚モデルに経皮摂取させた場合の美肌効果
ヒト皮膚三次元モデルはヒトの皮膚の疑似モデルとして、安全性評価や有効性評価に広く用いられている。ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｄ）（東洋紡績）を用いた。ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｄ）の外側のウェルに培地を添加し、２４時間培養した。その後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬）により１，３，１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁した乳酸菌懸濁液を１，３，１０μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加し、角質層上部のアッセイリング内の組織上に６０μｌ添加し、２４時間培養した。その後、角質層上部の培地を除去後、紫外線照射機器（クリニカル・サプライ，デルマレイ−２００）を用いてＵＶＡおよびＵＶＢをそれぞれ１０Ｊ／ｃｍ２および３００ｍＪ／ｃｍ２で照射した。紫外線強度は紫外線強度測定計ＶＬＸ３Ｗ（ＶＩＲＢＥＲ  ＬＯＵＲＭＡＴ）で測定した。対照としてＵＶＡおよびＵＶＢを照射しない群のヒト皮膚三次元モデルも作製した。その後、培養液を交換するとともに、各乳酸菌懸濁液を添加した培地を角質層上部のアッセイリング内の組織上に６０μｌ再添加し、２４時間培養した。組織を回収し、組織抽出用溶液｛５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５％（Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）｝を加え、ホモジナイザーでホモジナイズした。１０，０００×Ｇ、３０分間遠心して組織片を除去した後、蒸留水中で４℃、一晩透析した。その後、凍結乾燥により水分を除いた。２０倍濃縮になるように組織抽出用溶液を加え、三次元皮膚モデル抽出サンプルとして用いた。
【００３１】
・コラーゲン量の測定
コラーゲン量の測定は、三次元皮膚モデル抽出サンプルを用いて、コラーゲンＥＬＩＳＡキット（エーシーバイオテクノロジーズ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ１−Ｅ１０５）を用いて測定した。測定はＮ＝３で実施し、平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。紫外線非照射の測定結果を図１４に、紫外線照射の測定結果を図１５に示す。図１４及び１５中、「０」はアスコルビン酸（ＡｓＡ）及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。
この結果、紫外線非照射時のＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ３株の経皮摂取においては１，３，１０μｇ／ｍｌで濃度依存的に有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。ＦＢＡ４株の経皮摂取においては３，１０μｇ／ｍｌで有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。ＦＢＡ５株の経皮摂取においては１０μｇ／ｍｌで有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。また、紫外線照射により傷害を与えた場合には、紫外線非照射時に比べてコラーゲン量が有意に低下したが、ＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株、ＦＢＡ３株の経皮摂取においては１，３，１０μｇ／ｍｌで濃度依存的に有意に紫外線照射によるコラーゲン産生低下を回復する作用が認められた。ＦＢＡ４株の経皮摂取においては３，１０μｇ／ｍｌで有意に紫外線照射によるコラーゲン産生低下を回復する作用が認められた。ＦＢＡ５株の経皮摂取においては１０μｇ／ｍｌで有意に紫外線照射によるコラーゲン産生低下を回復する作用が認められた。
【００３２】
・ヒアルロン酸量の測定
上記コラーゲン量測定と同様の三次元皮膚モデル抽出サンプルを用いてヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキット（生化学工業，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８０５６６）により測定した。測定はＮ＝３で実施し、平均値±標準誤差（ＳＤ）を算出した。２群間の有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（有意水準ｐ＜０．０５）で実施した。紫外線非照射の測定結果を図１６に、紫外線照射の測定結果を図１７に示す。図１６及び１７中、「０」はＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）及び乳酸菌のいずれも投与していない無処理群を示す。
この結果、紫外線非照射時のＦＢＡ１株の経皮摂取においては１，３，１０μｇ／ｍｌで濃度依存的に有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。ＦＢＡ２株、ＦＢＡ４株、ＦＢＡ５株の経皮摂取においては３，１０μｇ／ｍｌで有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。ＦＢＡ３株の経皮摂取においては１０μｇ／ｍｌで有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。また、紫外線照射により傷害を与えた場合には、紫外線非照射時に比べてヒアルロン酸量が有意に低下したが、ＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株の経皮摂取においては１，３，１０μｇ／ｍｌで濃度依存的に有意に紫外線照射によるヒアルロン酸産生低下を回復する作用が認められた。ＦＢＡ３株、ＦＢＡ４株、ＦＢＡ５株の経皮摂取においては３，１０μｇ／ｍｌで有意に紫外線照射によるヒアルロン酸産生低下を回復する作用が認められた。
【００３３】
以上の結果より、これら５株の乳酸菌は、皮膚細胞に対するコラーゲン産生促進作用とヒアルロン酸産生促進作用とを有していること、及び、これらの作用は、皮膚に直接塗布する等により経皮摂取した場合と経口摂取した場合とのいずれの場合でも作用効果を発揮し得ることが確認された。
【００３４】
ＦＢＡ２株は大根人参ぬか漬けから単離同定されたラクトバチルス・カルバタスに属する乳酸菌であり、ＦＢＡ１株は白菜浅漬けから単離同定されたラクトバチルス・パラプランタラムに属する乳酸菌であり、ＦＢＡ５株はやぎ乳から単離同定されたストレプトコッカス・ボビスに属する乳酸菌であり、ＦＢＡ３株は高知たかなから単離同定されたラクトバチルス・サケイに属する乳酸菌であり、ＦＢＡ４株はたくあん古漬けから単離同定されたロイコノストック・メセンテロイデスに属する乳酸菌である。すなわち、いずれも食品から単離同定された乳酸菌であり、安全に摂取し得ることが明らかである。
【００３５】
各乳酸菌を、３７℃で２日間、ＭＲＳ寒天培地で培養した場合に形成されるコロニーの形態を表３に示す。これらの形態学的特徴は、各株の同属の乳酸菌と同様であった。
【００３６】
【表３】
2010143885.tif 000004
【００３７】
また、各乳酸菌の菌学的性質を表４〜６に示す。なお、糖資化性は、ＡＰＩ５０ＣＨＬキット（日本ビオメリュー製）を用いて測定した。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
【表５】
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【００４０】
【表６】
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【００４１】
ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株、及びラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株（以下、本発明の乳酸菌ということがある。）は、新規に単離同定された乳酸菌であり、皮膚細胞に対するコラーゲン産生促進作用とヒアルロン酸産生促進作用とを有する非常に有用な新規乳酸菌である。そこで、本発明者らは、これらの乳酸菌を、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に新規菌株として寄託した。受託番号は、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株がＮＩＴＥ Ｐ−６４９、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株がＮＩＴＥ Ｐ−６４８、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株がＮＩＴＥ Ｐ−６５２、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株がＮＩＴＥ Ｐ−６５１、及びラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株がＮＩＴＥ Ｐ−６５０である。なお、寄託日は、いずれも平成２０年９月２５日である。
【００４２】
本発明の美肌用組成物等の有効成分として含有させる本発明の乳酸菌の菌体は、生菌であってもよく、死菌であってもよい。生菌を含有させた美肌用組成物を経口摂取することにより、本発明の美肌効果のみならず、他の乳酸菌を摂取した場合と同様に、より効果的な整腸作用や免疫賦活作用等も期待できる。一方、生菌を殺菌処理等することにより得られた死菌であってもよい。該殺菌処理としては、本発明の乳酸菌が有する皮膚に対するコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、保水作用、又は水分蒸散抑制作用等の美肌作用を損なうことなく処理し得る方法であれば、特に限定されるものではなく、例えば、１２５℃、４０秒間の加熱処理、ＵＶ照射処理、ホルマリン処理、酵素処理、破砕処理等がある。
【００４３】
本発明の乳酸菌の菌体は、他の乳酸菌と同様に、菌末として用いることができる。菌末を調製する方法は、特に限定されるものではなく、フリーズドライ法、スプレードライ法、ドラムドライ法等の一般的に乳酸菌の菌末を調製する方法から適宜選択して用いることができる。生菌の状態で菌末とし得ること、乳酸菌が有する美肌作用に対する影響を抑えることができることから、フリーズドライ法により調製することが好ましい。
【００４４】
本発明の美肌用組成物等の有効成分として含有させる本発明の乳酸菌の培養物は、乳酸菌を培地中で培養して得られるものであれば特に限定されるものではなく、菌体を培地中で増殖させて得られる培養液であってもよく、培養液の上清（遠心分離処理等により培養液から菌体等の固形成分を除いたもの）であってもよく、培養液の濃縮物であってもよく、培養液に菌体破砕処理等を施したものであってもよく、培養液から菌体内成分を抽出したものであってもよい。また、本発明の乳酸菌は、適当な培地中で培養することにより、他の乳酸菌と同様に発酵乳等の発酵物を調製することができるため、本発明の美肌用組成物等の有効成分として、本発明の乳酸菌の発酵乳等の発酵物やその調製物（例えば、乾燥物、濃縮物、抽出物等）を含有させてもよい。なお、遠心分離処理、濃縮方法、菌体破砕処理、抽出方法、発酵方法等は、公知の方法から適宜選択して常法により行うことができる。
【００４５】
本発明の乳酸菌を培養する培地は、各乳酸菌株が生育し得る培地であれば、特に限定されるものではなく、乳酸菌の培養において一般的に用いられる培地やその改変培地等から適宜選択して用いることができる。本発明の乳酸菌を培養する培地に含有される炭素源としては、例えば、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、乳糖、糖蜜等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。また、窒素源としては、ペプトン、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー、ホエー分解物等からなる群より選択される１種類又は２種類以上を用いることができる。また、その他の栄養素の供給源としては、コーンスティプリカー（ＣＳＬ）、酵母エキス、肉エキス、肝臓エキス、トマトジュース等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。さらに、本発明の乳酸菌を培養するための培地には、Ｌ−システイン等の還元剤等；ビタミン、核酸関連物質、酢酸塩やクエン酸塩、脂肪酸エステル、特に好ましくはツイーン８０等の生育促進因子；リン酸塩等の緩衝能を付与し得る化合物等が、適宜添加されても良い。このような培地として、例えば、ＭＲＳ培地等の合成培地や、野菜や果物等の搾汁等、牛乳、豆乳、還元脱脂粉乳培地等の発酵乳の製造に一般的に用いられる培地等が挙げられる。
【００４６】
培養形式は、特に限定されるものではなく、培養スケール、得られた乳酸菌培養物の使用用途、該培養物が添加される美肌用組成物等の種類等を考慮して適宜決定することができる。例えば、寒天平板培地に塗布して培養してもよく、液体培地中で培養してもよい。液体培地における培養形式として、静置培養、回分培養等が挙げられる。例えば、継代培養の場合には、簡便であるため、寒天平板培地上で培養することや、適当な液体培地中で静置培養、回分培養することが好ましい。
【００４７】
また、本発明の乳酸菌の培養条件は、特に限定されるものではなく、乳酸菌を培養する場合に一般的に用いられる条件により培養することができる。例えば、培養温度は２０〜４０℃であることが好ましく、２５〜３７℃であることがより好ましく、３０℃であることがさらに好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜８．０であることが好ましく、４．０〜７．０であることがより好ましい。特に、乳酸菌の培養においては、該乳酸菌が産生する乳酸により培地のｐＨが低下するため、培養開始時の培地のｐＨは６．０〜７．０であることが好ましい。その他、本発明の乳酸菌は、他の乳酸菌と同様に嫌気的条件で培養することが好ましい。
【００４８】
本発明の美肌用組成物等の有効成分である乳酸菌の菌体又は培養物は、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、ストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株、ロイコノストック・メセンテロイデスＦＢＡ４株、又はラクトバチルス・サケイＦＢＡ３株のいずれか１種類の乳酸菌のみの菌体又は培養物からなるものであってもよく、これら５種類のうちの２種類以上の乳酸菌の菌体又は培養物の混合物であってもよい。なかでも、本発明の美肌用組成物等としては、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株、ラクトバチルス・パラプランタラムＦＢＡ１株、及びストレプトコッカス・ボビスＦＢＡ５株からなる群より選択される１種以上の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とすることが好ましく、ラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株の菌体又は培養物を有効成分とすることが特に好ましい。
【００４９】
本発明の美肌用組成物等は、本発明の乳酸菌の菌体又は培養物のみからなるものであってもよく、本発明の乳酸菌の菌体又は培養物による皮膚細胞や皮膚に対する効果を阻害しない程度において、その他の物質を含有するものであってもよい。例えば、本発明の乳酸菌の菌体等に加えて、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸、セラミド、ＳＯＤ活性物質、ラクトフェリン、ビタミン、ポリフェノール等の美肌作用を有する公知物質を含有させることにより、より高い美肌効果を得ることが期待できる。
【００５０】
本発明の美肌用組成物等は、経口摂取するものであってもよく、経皮摂取するものであってもよい。経口摂取するものとしては、具体的には、飲食品であることが好ましい。なお、本発明における飲食品には、そのまま喫食可能な食品や飲料に加えて、食品添加物も含まれる。また、経皮摂取するものとしては、皮膚外用剤が好ましい。皮膚外用剤として、具体的には、化粧品、医薬部外品、医薬品等が挙げられるが、化粧品であることがより好ましい。
【００５１】
本発明の美肌用組成物等を経口摂取するものとして用いる場合には、例えば、乳酸菌の菌体等に、必要に応じて助剤、保存料、抗酸化剤、安定化剤、調味料、香料等を適宜配合し、常法により製造することができる。具体的には、乳酸菌の菌体等に、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸等の適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、ゲル状、錠剤、カプセル、キャプレット、ペースト等に成形して健康補助食品、保健機能食品等とすることができる。
【００５２】
また、本発明の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とする美肌用飲食品の形態は、特に限定されるものではなく、種々の形態をとることができる。美肌用飲食品の形態として、例えば、飲料、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等が挙げられる。具体的には、例えば、本発明の乳酸菌の菌体又は培養物を、種々の食品、例えば、ヨーグルト等の発酵乳製品、クッキー、ビスケット、パン、ゼリー等の菓子類、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、バター、粉乳等に原料として添加してもよく、ヨーグルトドリンク、水、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲料に添加して使用してもよい。
【００５３】
本発明の美肌用組成物等を皮膚外用剤等の経皮摂取するものとして用いる場合には、例えば、乳酸菌の菌体等に、小麦胚芽油、オリーブ油等の油分を添加して、皮膚外用剤等を製造することができる。また、本発明の美肌用組成物等や、本発明の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とする美肌用皮膚外用剤等は、美肌効果が期待できる外用可能なあらゆる剤形、例えば、クリーム、乳液、ローション、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、ハップ剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション等として使用することができる。本発明の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とする皮膚外用剤等を製造する場合には、その種類、剤形等に応じた公知の成分を配合できる。例えば、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤等の成分を配合することができる。
【００５４】
本発明の美肌用組成物等や、本発明の美肌用飲食品又は美肌用皮膚外用剤の有効成分である本発明の乳酸菌の菌体又は培養物の含有量は、本発明の乳酸菌による皮膚に対する効果を奏し得る濃度である限り、特に限定されるものではなく、菌体や培養物の種類・状態、美肌用組成物の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、本発明の美肌用組成物等や美肌用飲食品等が経口摂取するものである場合には、０．０１〜２０重量％であることが好ましく、０．１〜１０重量％であることがより好ましい。本発明の美肌用組成物等や美肌用皮膚外用剤等が経皮摂取するものである場合には、０．０１〜５重量％であることが好ましく、０．１〜１重量％であることがより好ましい。
【００５５】
本発明の美肌用組成物等、並びに本発明の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とする美肌用飲食品の一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであり特に限定されないが、低タンパク食摂取による皮膚機能低下動物モデルに乳酸菌を経口投与した試験結果を鑑みると、ヒト成人一人の一日当たりの摂取量として３０ｍｇ以上であることが好ましく、５０ｍｇ以上であることがより好ましい。この一日量を、一度に摂取してもよく、２〜４回に分割して摂取することもできる。
【００５６】
本発明の美肌用組成物等、並びに本発明の乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とする美肌用皮膚外用剤の一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであり特に限定されないが、例えばヒト成人一人の一日当たりの顔への皮膚塗布量として、０．０１〜５重量％で配合された皮膚外用剤０．０１〜５ｇを均一に塗布することが好ましく、０．１〜０．５ｇを均一に塗布することがより好ましい。この一日量を、一度に摂取してもよく、２〜４回に分割して摂取することもできる。
【００５７】
なお、乾燥菌体重量とは、菌体を乾燥させた後の重量を意味する。乾燥後の菌体重量は、例えば、まず、乳酸菌の培養物を遠心分離処理することにより、菌体を沈殿として回収する。回収した菌体を遠心分離操作により２回水洗した後、１０５℃で５時間乾燥させた後の重量を測定することにより、求めることができる。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５９】
［製造例１  乳酸菌ＦＢＡ２株菌体末の調製］  
ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社）を１２１℃にて１５分間で滅菌後、乳酸菌ＦＢＡ２株を接種し、３０℃にて１８時間静置培養した液を前培養液とした。２Ｌのジャーファーメンターを用いて、１Ｌの滅菌ＭＲＳ培地に本前培養液を１％となるように接種し、３０℃にて２４時間、ｐＨ６．０に調整しながら培養した。培養終了後、菌体を蒸留水にて１回洗浄した後、６０００ｒｐｍにて１５分間で遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を再度水に懸濁し、１００℃にて３０分間加熱殺菌した後、凍結乾燥を行い、乳酸菌ＦＢＡ２株の乾燥死菌体１．２５ｇを得た。
【００６０】
［製造例２  乳酸菌ＦＢＡ１株菌体末の調製］  
乳酸菌ＦＢＡ２株に換えて乳酸菌ＦＢＡ１株を用いた以外は、製造例１と同様にして、乳酸菌ＦＢＡ１株の乾燥死菌体３．１４ｇを得た。
【００６１】
［製造例３  乳酸菌ＦＢＡ３株菌体末の調製］  
乳酸菌ＦＢＡ２株に換えて乳酸菌ＦＢＡ３株を用いた以外は、製造例１と同様にして、乳酸菌ＦＢＡ３株の乾燥死菌体２．３６ｇを得た。
【００６２】
［製造例４  乳酸菌ＦＢＡ４株菌体末の調製］  
乳酸菌ＦＢＡ２株に換えて乳酸菌ＦＢＡ４株を用いた以外は、製造例１と同様にして、乳酸菌ＦＢＡ４株の乾燥死菌体０．８１ｇを得た。
【００６３】
［製造例５  乳酸菌ＦＢＡ５株菌体末の調製］  
乳酸菌ＦＢＡ２株に換えて乳酸菌ＦＢＡ５株を用いたこと、培養温度を３０℃から３７℃に変更したこと以外は、製造例１と同様にして、乳酸菌ＦＢＡ５株の乾燥死菌体１．２９ｇを得た。
【００６４】
［製造例６  醗酵人参汁の調製］  
乳酸菌ＦＢＡ２株、乳酸菌ＦＢＡ１株、乳酸菌ＦＢＡ３株、乳酸菌ＦＢＡ４株、又は乳酸菌ＦＢＡ５株を用いて、滅菌濃縮人参果汁を発酵させ、醗酵人参汁を調製した。
各乳酸菌を、それぞれ５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌し、３０℃にて２４時間、アネロパックを用いて静置嫌気培養を行った。本培養液から、遠心分離機にて菌体を回収し、滅菌生理食塩水にて１回洗浄した後、ＯＤ６６０＝１．０となるように滅菌生理食塩水に懸濁し、菌懸濁液を調製した。Ｂｒｉｘ２０となるように希釈した滅菌濃縮人参果汁２００ｍＬに、得られた菌懸濁液を２ｍＬ植菌し、３０℃にて醗酵させた。醗酵終了後の濃縮人参汁を、Ｂｒｉｘ６となるように希釈して、各乳酸菌による醗酵人参汁をそれぞれ作成した。
【００６５】
［処方例１  錠剤］
常法に従って、表７記載の成分を混合し、打錠して錠剤を得た。なお、乳酸菌菌体末は、製造例１で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株菌体末を用いた。
【００６６】
【表７】
2010143885.tif 000008
【００６７】
［処方例２  ジュース］
常法に従って、表８記載の組成のジュースを製造した。なお、乳酸菌菌体末は、製造例１で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株菌体末を用いた。
【００６８】
【表８】
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【００６９】
［処方例３  人参醗酵飲料］
常法に従って、表９記載の組成の人参醗酵飲料を製造した。なお、醗酵人参汁は、製造例６で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株の醗酵人参汁を用いた。
【００７０】
【表９】
2010143885.tif 000010
【００７１】
［処方例４  ゼリー］
常法に従って、表１０記載の組成のゼリーを製造した。なお、乳酸菌菌体末は、製造例１で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株菌体末を用いた。
【００７２】
【表１０】
2010143885.tif 000011
【００７３】
［処方例５  ゼリー飲料］
常法に従って、表１１記載の組成のゼリー飲料を製造した。なお、乳酸菌菌体末は、製造例１で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株菌体末を用いた。
【００７４】
【表１１】
2010143885.tif 000012
【００７５】
［処方例１２  皮膚外用クリーム］
表１２記載の成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とした。成分（１１）〜（１３）を７０℃に加熱溶解し水相とした。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。なお、乳酸菌菌体末は、製造例１で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株菌体末を用いた。
【００７６】
【表１２】
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【００７７】
［処方例７  皮膚外用乳液］
表１３記載の成分（１）に（２）を加え、８０℃に加熱溶解した。成分（３）〜（８）を加え、８０℃に加熱溶解し油相とした。成分（９）〜（１１）を７０℃に加熱溶解し水相とした。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら３０℃まで冷却した。さらに、成分（１２）及び（１３）を（１４）に加えて攪拌溶解したものを加え、３攪拌冷却して乳液を得た。なお、乳酸菌菌体末は、製造例１で得たラクトバチルス・カルバタスＦＢＡ２株菌体末を用いた。
【００７８】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の美肌用組成物は、食品由来乳酸菌の菌体又は培養物を有効成分とするため、非常に安全であり、かつ、皮膚に対するコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、保水作用、及び水分蒸散抑制作用からなる群より選択される１以上の作用を少なくとも有するものであり、特に皮膚状態の改善、美肌効果を期待して利用される飲食品や皮膚外用剤の製造分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ヒト皮膚由来線維芽細胞に本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液を添加して培養した後の培養上清中のコラーゲン量をウェスタンブロッティングにより測定した結果を示した図である。
【図２】図１の結果を画像解析により数値化した結果を示した図である。
【図３】ヒト皮膚由来線維芽細胞に本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液を添加して培養した後の培養上清中のヒアルロン酸量を測定した結果を示した図である。
【図４】本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合の、マウス背部皮膚中の水分蒸散量を測定した結果を示した図である。
【図５】本発明のＦＢＡ１株、ＦＢＡ２株、及びＦＢＡ５株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合の、マウス背部皮膚中のコラーゲン量をウェスタンブロッティングにより測定した結果を示した図である。
【図６】図５の結果を画像解析により数値化した結果を示した図である。
【図７】本発明のＦＢＡ２株、ＦＢＡ５株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合の、マウス背部皮膚中のヒアルロン酸量を測定した結果を示した図である。
【図８】本発明のＦＢＡ３株、ＦＢＡ４株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合の、マウス背部皮膚中のヒアルロン酸量を測定した結果を示した図である。
【図９】本発明のＦＢＡ２株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合の、マウス背部皮膚中の皮膚水分量を測定した結果を示した図である。
【図１０】本発明のＦＢＡ２株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合のマウス背部皮膚中の水分蒸散量を測定した結果を示した図である。
【図１１】本発明のＦＢＡ２株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合のマウス背部皮膚中の水分量を測定した結果を示した図である。
【図１２】本発明のＦＢＡ２株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合のマウス背部皮膚中のコラーゲン量を測定した結果を示した図である。
【図１３】本発明のＦＢＡ２株の乳酸菌懸濁液をマウスに経口摂取させた場合のマウス背部皮膚中のヒアルロン酸量を測定した結果を示した図である。
【図１４】本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液を三次元皮膚モデルに経皮摂取させた場合のコラーゲン量を測定した結果を示した図である。
【図１５】本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液を紫外線照射した三次元皮膚モデルに経皮摂取させた場合のコラーゲン量を測定した結果を示した図である。
【図１６】本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液を三次元皮膚モデルに経皮摂取させた場合のヒアルロン酸量を測定した結果を示した図である。
【図１７】本発明の５菌株の乳酸菌懸濁液を紫外線照射した三次元皮膚モデルに経皮摂取させた場合のヒアルロン酸量を測定した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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