(57)【要約】      （修正有）【課題】病原体感染／ヒト疾患に対し予防的または治療的に個体を免疫化するのに有効促進された弱毒化生ワクチン、無発病性ベクターを使用する組換えワクチンおよびＤＮＡワクチンの開発。【解決手段】制御要素に作動可能なように連結された免疫原、および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドであって、免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＩＬ−１８、ＣＤ４０、血管成長因子、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、等より選択される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドであって、免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、血管成長因子、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥから成る群より選択される、プラスミド。
【請求項２】
免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
免疫原が病原体抗原である請求項１に記載のプラスミド。
【請求項４】
免疫原がＨＩＶ−１抗原である請求項１に記載のプラスミド。
【請求項５】
制御要素に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる請求項１に記載のプラスミド。
【請求項６】
請求項１のプラスミドを含んでいる注射可能な医薬組成物。
【請求項７】
免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される請求項１に記載のプラスミド。
【請求項８】
制御要素に作動可能なように連結された単純ヘルペス抗原をコードしているヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドであって、免疫調節タンパク質は：ＩＬ−８、およびＲＡＮＴＥＳから成る群より選択される、プラスミド。
【請求項９】
単純ヘルペス抗原がＨＳＶ２ｇＤである請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプラスミドを含んでいる注射可能な医薬組成物。
【請求項１１】
単純ヘルペスウイルス感染に対して個体を免疫するために使用される請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１２】
二つのプラスミドを含む組成物であって、
第一のプラスミドは制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり；および
第二のプラスミドは制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり、免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、血管成長因子、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥから成る群より選択される、組成物。
【請求項１３】
免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫原が病原体抗原である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫原がＨＩＶ−１抗原である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
制御要素に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる請求項１２に記載の組成物であって、第一のプラスミド、第二のプラスミドまたは第三のプラスミドはＣＤ８６タンパク質をコードしている上記ヌクレオチド配列を含んでいる、組成物。
【請求項１７】
請求項１２に記載の組成物を含んでいる注射可能な医薬組成物。
【請求項１８】
免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
二つのプラスミドを含む組成物であって、
第一のプラスミドは制御要素に作動可能なように連結された単純ヘルペス抗原をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり；および
第二のプラスミドはＩＬ−８、またはＲＡＮＴＥＳをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、
組成物。
【請求項２０】
単純ヘルペス抗原がＨＳＶ２ｇＤである請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１９に記載の組成物を含んでいる注射可能な医薬組成物。
【請求項２２】
単純ヘルペスウイルス感染に対して個体を免疫するために使用される請求項１９に記載のプラスミド。
【請求項２３】
制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチンであって、免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、血管成長因子、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥから成る群より選択される、
組換え体ワクチン。
【請求項２４】
免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
【請求項２５】
免疫原が病原体抗原である請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
【請求項２６】
制御要素に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
【請求項２７】
免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
【請求項２８】
組換え体ワクチンが組換え体ワクシニアワクチンである請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
【請求項２９】
免疫原が病原体抗原である請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
【請求項３０】
免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される請求項２８に記載の組換え体ワクチン。
【請求項３１】
制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む生きている弱毒化した病原体であって、免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、血管成長因子、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥから成る群より選択される、
生きている弱毒化した病原体。
【請求項３２】
病原体に対して個体を免疫するために使用される請求項３１に記載の生きている弱毒化した病原体。
【請求項３３】
免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される、以下：
免疫原および／または免疫原をコードしているヌクレオチド配列を制御要素に作動可能なように連結して含んでいる核酸分子
；および
免疫調節タンパク質および／または免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を制御要素に作動可能なように連結して含んでいる核酸分子
の組み合わせであって、
但し、免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、血管成長因子、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥから成る群より選択される、
免疫原および／または核酸分子、および免疫調節タンパク質および／または核酸分子の、組み合わせ。
【請求項３４】
免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である、請求項３３に記載の、免疫原および／または核酸分子、および免疫調節タンパク質および／または核酸分子の、組み合わせ。
【請求項３５】
免疫原が病原体抗原である、請求項３３に記載の、免疫原および／または核酸分子、および免疫調節タンパク質および／または核酸分子の、組み合わせ。
【請求項３６】
免疫原がＨＩＶ−１抗原である、請求項３３に記載の、免疫原および／または核酸分子、および免疫調節タンパク質および／または核酸分子の、組み合わせ。
【請求項３７】
ＣＤ８６タンパク質または制御要素に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の、免疫原および／または核酸分子、および免疫調節タンパク質および／または核酸分子の、組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改良されたワクチン、免疫原に対して個体を予防的および／または治療的に免疫化するための改良された方法、および改良された免疫療法組成物および改良された免疫療法に関している。
【背景技術】
【０００２】
本出願は１９９８年２月２８日に”改良されたワクチン”と題して出願された仮出願第６０／０７６，２０７号（本明細書において援用される）に対して優先権を請求する。免疫療法とは身体の免疫応答を調節して望まれる治療効果を与えることを指している。免疫療法剤とは、個体に投与された場合、望ましくない免疫応答により起こされる症状および症状の原因を減少させ、または望ましい免疫応答を増加させることにより症状を緩和または症状の原因を除去／減少させるのに十分なように個体の免疫を調節するような組成物を指している。いくつかの場合、免疫療法はワクチン接種プロトコールの一部であり、そこでは個体にワクチンが投与されて個体が免疫原にさらされる。そのような場合、免疫療法は特定の状態、感染または疾患を処置または予防するのに望ましい免疫応答を増加させおよび／または免疫応答の一部を選択的に促進させる。いくつかの場合、免疫療法剤は免疫原なしで送達される。そのような場合免疫療法剤は、免疫応答を減少または抑制させ、免疫応答を促進または増加させ、免疫応答の一部を減少または抑制させ、または免疫応答の一部を促進または増加させることにより免疫系を調節するために提供される。いくつかの場合、免疫療法剤は抗体を含んでおり、それはインビボで投与された場合に免疫応答調節に関係するタンパク質に結合する。抗体およびそのようなタンパク質の相互作用は免疫応答の変化を生じさせる。もしタンパク質が自己免疫疾患に関係しているならば、抗体は自己免疫疾患におけるタンパク質の活性を阻害でき、症状または疾患を軽減または除去できる。
【０００３】
ワクチンはアレルゲン、病因抗原またはヒト疾患に関係する細胞に関連した抗原のような標的抗原に対して個体を免疫化するのに有用である。
そのようなワクチンの設計においては、ワクチン接種された個体の細胞中に標的抗原を産生するようなワクチンは免疫系の細胞兵器誘導に有効であることが認められている。特に、弱毒化ワクチン、無発病性ベクターを使用する組換えワクチンおよびＤＮＡワクチンはすべてワクチン接種された個体の細胞に抗原の産生を導き、免疫系の細胞兵器を誘導する。一方、タンパク質および殺したまたは不活性化したワクチンのみから成り、ヒトでの応答を誘導しないサブユニットワクチンは良好な細胞性免疫応答を誘導しない。
【０００４】
細胞性免疫応答はしばしば、病原体感染に対しての保護に、および病原体感染、癌または自己免疫疾患を処置するための有効な免疫仲介治療に必要とされる。従って、弱毒化生ワクチン、無発病性ベクターを使用する組換えワクチンおよびＤＮＡワクチンのような、ワクチン接種された個体の細胞中に標的抗原を産生するようなワクチンが好まれている。
【０００５】
そのようなワクチンはしばしば、病原体感染またはヒト疾患に対して予防的または治療的に個体を免疫化するのに有効であるので、改良されたワクチンが必要とされている。促進された免疫応答を産生する組成物および方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許番号第０８／００８，３４２号、
【特許文献２】米国特許番号第０８／０２９，３３６号
【特許文献３】米国特許番号第０８／１２５，０１２号
【特許文献４】国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号
【特許文献５】米国特許番号第０８／２２１，５７９号
【特許文献６】米国特許第４，７７２，８４８号
【特許文献７】米国特許第５，０１７，４８７号
【特許文献８】米国特許第５，０７７，０４４号
【特許文献９】米国特許第５，１１０，５８７号
【特許文献１０】米国特許第５，１１２，７４９号
【特許文献１１】米国特許第５，１７４，９９３号
【特許文献１２】米国特許第５，２２３，４２４号
【特許文献１３】米国特許第５，２２５，３３６号
【特許文献１４】米国特許第５，２４０，７０３号
【特許文献１５】米国特許第５，２４２，８２９号
【特許文献１６】米国特許第５，２９４，４４１号
【特許文献１７】米国特許第５，２９４，５４８号
【特許文献１８】米国特許第５，３１０，６６８号
【特許文献１９】米国特許第５，３８７，７４４号
【特許文献２０】米国特許第５，３８９，３６８号
【特許文献２１】米国特許第５，４２４，０６５号
【特許文献２２】米国特許第５，４５１，４９９号
【特許文献２３】米国特許第５，４５３，３６４号
【特許文献２４】米国特許第５，４６２，７３４号
【特許文献２５】米国特許第５，４７０，７３４号
【特許文献２６】米国特許第５，４８２，７１３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０９２１−１０９２５
【非特許文献２】Ｐａｌｉａｒｄ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２５−３２９
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３２６−３３３
【非特許文献４】Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１６−１０１９
【非特許文献５】Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４５：３４４−３４６
【非特許文献６】Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ
【非特許文献７】Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６
【非特許文献８】Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ，（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，５２６−５３２
【非特許文献１０】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０８９−１１０３
【非特許文献１１】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，１１１２−１１２４
【非特許文献１２】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ．１５，６４１−６４５
【非特許文献１３】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３−２５２
【非特許文献１４】Ｏｓｂｏｍ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｃｅｌｌ．５９：１２０３−１２１１
【非特許文献１５】Ｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．１９９０ Ｃｅｌｌ．６０：５７７−５８４
【非特許文献１６】Ｐａｃｈｕｋ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２６，７９
【発明の概要】
【０００８】
本発明は免疫応答を促進および／または調節する免疫調節タンパク質またはそれをコードしている核酸分子を含む組成物、ならびにそのようなタンパク質および核酸分子の使用法に関している。免疫調節タンパク質の送達は免疫療法ならびにワクチン送達に関連した免疫応答を促進またはさもなければ適合させることに有用である。免疫調節タンパク質とは以下のものであろう：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカイン；Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのようなセレクチンを含む接着分子、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１のようなムチン様分子、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテグリンファミリーの一員；およびＰＥＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ類（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３）、ＣＤ２およびＬＦＡ−３のようなイムノグロブリンスーパーファミリーの一員；Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形のようなサイトカイン；ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌのような共刺激分子；血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子および血管内皮細胞増殖因子を含む増殖因子；Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６を含むレセプター分子；カスパーゼ（ＩＣＥ）を含むその他のもの。
【０００９】
本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドに関している。免疫原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１０】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドを個体に投与する工程から成る、免疫原に対して個体の免疫応答を誘導する方法に関している。
【００１１】
本発明はまた、個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドを個体に投与する工程から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法に関しており、ここで、免疫原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１２】
本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラスミドおよび真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドを含んでいる組成物に関している。いくつかの好適な態様において、免疫原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１３】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラスミドおよび個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドを含んでいる組成物を個体に投与する工程から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法に関しており、ここで、免疫原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１４】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラスミドおよび個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドを含んでいる組成物を個体に投与する工程から成る、免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関している。
【００１５】
本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された標的抗原をコードしているヌクレオチド配列を含む改良された組換え体ワクチンに関している。好適な態様において、標的抗原は病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１６】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された標的抗原をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチンベクターを個体に投与する工程から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法に関しており、ここで、標的抗原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１７】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された標的抗原をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチンベクターを個体に投与する工程から成る、標的抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関している。
【００１８】
本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む改良された弱毒化生ワクチンに関している。
【００１９】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む弱毒化されたワクチンを個体に投与する工程から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法に関している。
【００２０】
本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む弱毒化されたワクチンを個体に投与する工程から成る、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関している。
【００２１】
本発明は個体の免疫系を調節するための組成物および方法に関している。本発明の方法はタンパク質の投与、または発現ベクターまたは発現可能な形で個体へヌクレオチド配列を送達できる他の運搬体の一部として免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の投与により個体へ免疫調節タンパク質を送達することから成っている。
【００２２】
本発明は自己免疫疾患を持つ個体を処置する組成物および方法に関している。本発明の方法はそのような個体へＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカインへ特異的に結合する抗体を含んでいる組成物を投与することから成っている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは実施例２で議論されるような再加工されたおよび成熟ＩＬ−１８を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは実施例２で議論されるような再加工されたおよび成熟ＩＬ−１８を示している。
【図２】図２はｐＣＤＮＡ３発現ベクター内へクローン化されたＩＣＡＭ−１（ｐＣＩＣＡＭ−１）、ＬＦＡ−３（ｐＣＬＦＡ−３）およびＶＣＡＭ−１（ｐＣＶＣＡＭ−１）の遺伝子を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は特定のタンパク質が免疫応答を促進および／または調節するという発見から考え出された。従って、そのようなタンパク質は免疫療法剤としてまたはワクチン中の成分として送達されるであろう。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語”免疫調節タンパク質”とは、免疫応答を促進および／または調節する本発明に従ったタンパク質および核酸分子発現産物を指すことを意味している。従って、免疫調節タンパク質は免疫療法剤としてまたはワクチン中の成分として送達されるであろう。
【００２６】
免疫調節タンパク質にはケモカイン、接着分子、サイトカイン、共刺激分子、増殖因子およびレセプター分子が含まれる。
免疫調節タンパク質であるケモカインにはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１が含まれる。
【００２７】
免疫調節タンパク質である接着分子にはセレクチンファミリー構成物、ムチン様分子、インテグリンファミリー構成物およびイムノグロブリンスーパーファミリー構成物が含まれる。
【００２８】
免疫調節タンパク質であるセレクチンファミリー構成物にはＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンが含まれる。
ムチン様分子はセレクチンファミリー構成物のリガンドである。免疫調節タンパク質であるムチン様分子にはＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１が含まれる。
【００２９】
免疫調節タンパク質であるインテグリンファミリーの構成物にはＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５が含まれる。
免疫調節タンパク質であるイムノグロブリンスーパーファミリー構成物にはＰＥＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ類、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３が含まれる。
【００３０】
免疫調節タンパク質であるサイトカインにはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−１８の突然変異形（タンパク質の前形には存在するが成熟形には存在しない最初の約３５アミノ酸残基の欠失を含んでいる）が含まれる。
【００３１】
免疫調節タンパク質である共刺激分子にはＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）が含まれる。免疫調節タンパク質である増殖因子には血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子および血管内皮細胞増殖因子が含まれる。
【００３２】
免疫調節タンパク質であるレセプター分子にはＦａｓ”致死遺伝子”発現産物、腫瘍壊死因子ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６が含まれる。
【００３３】
他の分子としてはカスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。
本発明のいくつかの態様によると、免疫調節タンパク質は核酸分子（それは細胞に取り込まれた場合、発現されて免疫調節タンパク質を発現する）を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質はタンパク質それ自身を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸かまたはタンパク質を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸およびタンパク質を同時に投与することにより送達される。
【００３４】
本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質（タンパク質またはタンパク質をコードしている核酸分子として）は組成物またはさもなくばワクチン組成物とともに補給物として投与される。ワクチンはサブユニット、不活性化ワクチン、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、または核酸またはＤＮＡワクチンのいずれかであろう。弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、または核酸またはＤＮＡワクチンの場合、免疫調節タンパク質はこれらのワクチンの核酸分子によりコードされているであろう。
【００３５】
免疫調節タンパク質は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導および促進し、および／または抗体応答を誘導および促進し、および／またはＴ細胞増殖応答を誘導および促進するのに有用である。
【００３６】
ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、細胞内病原体に対する、または自己免疫疾患または癌に関係する細胞に対するワクチンとともにまたはそのの一部として投与された場合に特に有用である。ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、および核酸／ＤＮＡワクチンとともに投与された場合に特に有用である。もしくは、ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、癌または細胞内感染を患っている患者に投与される免疫療法剤として有用である。ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の患者に投与された場合に有用である。
【００３７】
抗体応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は細菌、他の細胞外病原体、またはＢ型肝炎ウイルスのような抗体応答が保護的であるウイルスに対するワクチンとともにまたはその一部として投与された場合に特に有用である。抗体応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、サブユニットワクチンとともに投与された場合に特に有用である。もしくは、抗体応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、望ましくないＣＴＬ免疫応答を示している患者に投与される免疫療法剤として有用である。抗体応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の患者に投与された場合に有用である。
【００３８】
Ｔ細胞増殖応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、ワクチンとともにまたはその一部として投与された場合に特に有用である。もしくは、Ｔ細胞増殖応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫療法剤として有用である。Ｔ細胞増殖応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の患者に投与された場合に有用である。
ケモカイン： ケモカインまたはケモカインをコードしている核酸分子の投与は細胞によるケモカインの発現を増加させる。
【００３９】
ＭＣＰ−１はＣＤ８＋ＣＴＬを誘導および促進するのに特に有用である。ＭＩＰ−１αは抗体の誘導に特に有用である。ＩＬ−８は抗体の誘導に特に有用であり、Ｔヘルパー応答の強力な誘導剤である。
ＲＡＮＴＥＳはＴＨ１ならびにＣＴＬ応答を誘導する。
ＭＩＰ−１β（ｐＣＤＮＡ３内へクローン化されｐＣＤＮＡ３−ＭＩＰ−１βを発生させた構築物として）も使用されるであろう。
接着分子： セレクチンファミリー構成物Ｌ−セレクチン Ｐ−セレクチン Ｅ−セレクチン。
【００４０】
ムチン様分子 ＣＤ３４ ＧｌｙＣＡＭ−１（ｐＣＤＮＡ３内へクローン化されｐＣＤＮＡ３−ＧｌｙＣＡＭ−１を発生させた構築物として）
ＭａｄＣＡＭ−１。
【００４１】
インテグリンファミリー構成物 ＬＦＡ−１ＶＬＡ−１ Ｍａｃ−１ ｐ１５０．９５。
イムノグロブリンスーパーファミリー構成物 ＰＥＣＡＭ−１ ＩＣＡＭ類 ＩＣＡＭ−１ＩＣＡＭ−２ ＩＣＡＭ−３ ＣＤ２ ＬＦＡ−３。
【００４２】
接着分子は核酸分子として投与された場合に最も有用である。
接着分子は核酸分子として、ワクチン、特に弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、および核酸／ＤＮＡワクチンとともにまたはその一部として投与された場合に最も有用である。
【００４３】
接着分子は核酸分子として腫瘍内または病巣内に送達された場合に有用である。
好適な接着分子にはＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＥ−セレクチンが挙げられる。
ＩＣＡＭ−１はＣＴＬ増殖には最適である。
サイトカイン： Ｍ−ＣＳＦ Ｇ−ＣＳＦ ＧＳＦ ＩＬ−４ＩＬ−１８の突然変異形。
共刺激分子： ＣＤ４０（ＣＤ４０をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へクローン化され、ｐＣＤＮＡ３−ＣＤ４０を発生させた構築物として使用される）ＣＤ４０Ｌ。
増殖因子： 血管成長因子（血管成長因子をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へクローン化され、ｐＣＤＮＡ３−ＶＧＦを発生させた構築物として使用される）
ＩＬ−７ 神経成長因子 血管内皮細胞増殖因子。
レセプター分子： Ｆａｓ”致死遺伝子”発現産物 ＴＮＦレセプター ＦｌｔＡｐｏ−１ ｐ５５ ＷＳＬ−１ ＤＲ３ ＴＲＡＭＰＡｐｏ−３ ＡＩＲ ＬＡＲＤ ＮＧＲＦ ＤＲ４ＤＲ５ ＫＩＬＬＥＲ ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ ＴＲＩＣＫ２ ＤＲ６。
その他 カスパーゼ（ＩＣＥ）。
【００４４】
表１は前記免疫調節タンパク質の各々のおよびＣＤ８６（Ｂ７．２）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のためのＧＥＮＢＡＮＫ受託番号および引用雑誌が一覧表になっている。
【００４５】
ＤＮＡワクチンはＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２３３８、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４８１３１およびＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９に記載されており、優先出願がそこに引用されている（それらは各々本明細書において援用される）。これらの出願に記載されている送達プロトコールに加え、ＤＮＡ送達の別の方法が米国特許第４，９４５，０５０号および５，０３６，００６号（両方とも本明細書において援用される）に記載されている。
【００４６】
本発明のいくつかの態様は遺伝子構成要素によりコードされているタンパク質およびペプチドに対する免疫応答を誘導するために、個体の細胞内へ遺伝子構成要素を導入する方法に関している。本方法は所望のペプチドまたはタンパク質をコードしているヌクレオチド配列および免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単一の核酸分子、または二つの核酸分子（一つは所望のペプチドまたはタンパク質をコードしてヌクレオチド配列を含んでおりおよび一つは免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる）を持っている組成物を該個体の組織へ投与する工程を含んでいる。核酸分子はプラスミドＤＮＡ（組換え体ベクターの核酸分子）として、または弱毒化または細胞ワクチンに含まれる遺伝子構成要素の一部として提供されるであろう。もしくはいくつかの態様においては、免疫調節タンパク質はタンパク質として送達されるであろう。
【００４７】
いくつかの態様によると、二つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組み合わせが個体に投与される。いくつかの態様において、二つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組み合わせをコードしている遺伝子が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質および免疫調節タンパク質をコードしている遺伝子の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、二つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。
【００４８】
いくつかの態様によると、免疫調節タンパク質は共刺激分子ＣＤ８６（Ｂ７．２）と組み合わせて個体へ投与される。いくつかの態様において、ＣＤ８６および一つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組み合わせをコードしている遺伝子が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、ＣＤ８６タンパク質および免疫調節タンパク質をコードしている遺伝子の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質およびＣＤ８６タンパク質をコードしている遺伝子の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、ＣＤ８６および一つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、ＣＤ８６および一つまたはそれ以上のケモカインおよび／または接着分子の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ−１の組み合わせをコードしている遺伝子が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。
【００４９】
本発明のいくつかの態様によると、病原体または異常な疾患関連細胞に対して個体を予防的におよび／または治療的に免疫化する組成物および方法が提供される。ペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子構成要素は標的とされるべき病原体または細胞に観察される免疫原性タンパク質および免疫調節タンパク質をコードしている遺伝子構成要素と少なくともエピトープを共有している。もしくは、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質はタンパク質として送達されるであろう。
【００５０】
遺伝子構成要素は個体の細胞で発現され、免疫応答が惹起される免疫原性標的として働く。生じる免疫応答は広範囲のものである：体液性免疫応答に加え、細胞性免疫応答の両方の力が惹起される。本発明の方法は予防的および治療的免疫性を与えるのに有用である。従って、免疫化の方法には、免疫原に対して免疫化しおよび従って例えば、病原体攻撃または特定の細胞の存在または増殖から個体を保護する方法、ならびに病原体感染、過増殖性疾患または自己免疫疾患を患っている個体を処置する方法の両方が含まれている。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語”標的タンパク質”とは免疫応答の標的タンパク質として働く本発明の遺伝子構築物によりコードされているペプチドおよびタンパク質を指していることを意味している。用語”標的タンパク質”および”免疫原”は相互交換的に使用され、それに対して免疫応答が惹起できるタンパク質を指している。標的タンパク質は、免疫化が必要とされる病原体または癌細胞または自己免疫疾患に関係している細胞のような望まれない細胞型のタンパク質と少なくともエピトープを共有している免疫原性タンパク質である。標的タンパク質に対する免疫応答は、標的タンパク質が関係する特定の感染または疾患から個体を保護し、それらを患っている個体を処置できるであろう。
【００５２】
本発明は標的タンパク質に対する広い免疫応答を惹起するのに有用である、即ち、特に病原体、アレルゲンまたは個体自身の”異常な”細胞に関係するタンパク質。本発明は病原体タンパク質に対する免疫応答が病原体に対する保護的免疫性を与えるように、病原性因子および生物体に対して個体を免疫化するのに有用である。本発明は、特に過増殖性細胞に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を惹起することにより、癌のような過増殖性疾患および障害と戦うのに有用である。本発明は特に自己免疫状態に関与する細胞関連の標的タンパク質に対する免疫応答を惹起することにより、自己免疫疾患および障害と戦うのに有用である。
【００５３】
本発明のいくつかの態様によると、標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡが個体の組織細胞内へ導入され、そこで発現され、標的タンパク質を生成する。標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡ配列は個体の細胞中での発現に必要とされる制御要素に連結されている。ＤＮＡ発現のための制御要素にはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、コザック領域のような他の要素もまた遺伝子構築物に含まれているであろう。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語”遺伝子構築物”とは、標的タンパク質をコードし、およびワクチン接種された個体の細胞内での発現を指示できる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含んでいる制御要素に作動可能なように連結された開始および終止シグナルを含むヌクレオチド配列、および／または免疫調節タンパク質をコードし、およびワクチン接種された個体の細胞内での発現を指示できる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含んでいる制御要素に作動可能なように連結された開始および終止シグナルを含むヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの態様において、標的タンパク質をコードしている発現可能形配列および免疫調節タンパク質をコードしている発現可能形配列は同一の核酸分子上に存在しており、それが個体へ送達される。いくつかの態様において、標的タンパク質をコードしている発現可能形配列は、免疫調節タンパク質をコードしている発現可能形配列を含む核酸分子とは別の核酸分子上に存在する。そのような場合、両方の分子が個体へ送達される。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語”発現可能形”とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるであろうように、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードしているコード配列へ作動可能に連結された必要制御要素を含んでいる遺伝子構築物を指している。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語”エピトープを共有している”とは、別のタンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質を指している。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語”実質的に同じであるエピトープ”とは、タンパク質のエピトープとは同一の構造を持ってはいないが、それにも関わらず、そのタンパク質と交叉反応する細胞性または体液性免疫応答を引き起こすエピトープを指すことを意味している。
【００５８】
遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要とされる制御要素に作動可能なように連結された標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる。本発明によると、標的タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の発現可能形から成る遺伝子構築物および免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の発現可能形から成る遺伝子構築物を含む遺伝子構築物の組み合わせが提供される。遺伝子構築物の組み合わせを含むＤＮＡまたはＲＮＡの生きている細胞内への取り込みにより、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現および標的タンパク質および免疫調節タンパク質の産生が生じる。標的タンパク質に対する促進された免疫応答が生じる。
【００５９】
細胞により取り込まれた場合、遺伝子構築物は機能的染色体外分子として残存し、および／または細胞の染色体ＤＮＡへ組み込まれる。ＤＮＡは細胞内へ導入され、プラスミド形の別の遺伝子成分として残っているかもしれない。もしくは、染色体内へ組み込むことができる直鎖状ＤＮＡが細胞内へ導入されてもよい。ＤＮＡが細胞内へ導入された時、染色体内へのＤＮＡ組込みを促進する試薬が加えられる。組込みを促進するために有用なＤＮＡ配列はＤＮＡ分子に含まれていてもよい。もしくは、ＲＮＡが細胞に投与されてもよい。遺伝子構築物は動原体、テロメアおよび複製起点を含んでいる線状ミニクロモソームとして提供されることも意図されている。遺伝子構築物は弱毒化生ワクチンまたは組換え体微生物ベクター中に遺伝子構成要素の一部として残存し、細胞中で生きている。遺伝子構築物は組換え体ウイルスワクチンのゲノムであってもよく、遺伝子構成要素は細胞の染色体内へ組み込まれるかまたは染色体外に残存する。
【００６０】
遺伝子構築物は核酸分子の遺伝子発現に必要な制御要素を含んでいる。その要素には：プロモーター、開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードしている配列の遺伝子発現にエンハンサーがしばしば必要とされる。これらの要素は所望のタンパク質をコードしている配列へ作動可能なように連結されていること、および制御要素はそれらが投与された個体で作動可能であることが必要である。
【００６１】
開始コドンおよび停止コドンは一般的に所望のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の一部であると考えられている。しかしながら、これらの要素は遺伝子構築物が投与された個体中で機能的であることが必要である。開始および停止コドンはコード配列の読み枠内に存在しなければならない。
【００６２】
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能的でなければならない。
本発明の実施に有用なプロモーターの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶ長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのような）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター類、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーター類が挙げられるが、これらに制限されるわけではない。
【００６３】
本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド中に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される）が使用される。
【００６４】
ＤＮＡ発現に必要とされる制御要素に加え、他の要素もＤＮＡ分子に含まれているであろう。そのような追加の要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのようなウイルスエンハンサーから成る群より選択されるであろうが、それらに制限されるわけではない。
【００６５】
遺伝子構築物を染色体外に維持するためおよび細胞中で構築物の多数のコピーを生成するために、構築物は哺乳類複製起点とともに提供できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４はエプスタインバーウイルス複製起点および組込みなしで高コピーエピソーム複製を生み出す核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へ挿入される。
【００６６】
免疫化応用に関するいくつかの好適な態様において、標的タンパク質、免疫調節タンパク質、およびそのうえにそのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに促進するタンパク質のための遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子が送達される。そのような遺伝子の例はα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のような他のサイトカインおよびリンホカインをコードしているものである。いくつかの態様において、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子が免疫化組成物で使用される遺伝子構築物に含まれていることが好適である。
【００６７】
何らかの理由で遺伝子構築物を受けている細胞を除去することが望ましいのであれば、細胞破壊の標的として働く追加の要素が加えられるであろう。発現可能形のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を遺伝子構築物に含ませることができる。薬剤ガングシクロビルが個体へ投与でき、本薬剤はｔｋを産生している細胞を選択的に殺すので、遺伝子構築物を含む細胞を選択的に破壊する手段が提供される。
【００６８】
タンパク質産生を最大にするため、構築物が投与される細胞内での遺伝子発現に適した制御配列が選択される。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンが選択されるであろう。当業者は細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を製造できる。
【００６９】
投与経路には筋肉内、鼻腔内、腹腔内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口ならびに局所、経皮、吸入または坐剤により、または膣、直腸、尿管、口腔および舌下組織への潅注によるような粘膜組織へなどが含まれるが、それらに制限されるわけではない。好適な投与経路には粘膜組織、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注射が挙げられる。遺伝子構築物は伝統的注射器、針無し注入装置または”微小弾丸衝撃遺伝子銃”を含む（それらに制限されるわけではない）手段によって投与されてもよい。
【００７０】
本発明による医薬組成物は約１ナノグラムから約２０００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、本発明による医薬組成物は約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、本発明による医薬組成物は約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、本発明による医薬組成物は約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、本発明による医薬組成物は約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。本発明による医薬組成物は約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。本発明による医薬組成物は約１００から約２００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。
【００７１】
本発明の医薬組成物は使用されるべき投与様式に従って処方される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、発熱物質および粒子状物質を含んでいない。好適には等張処方が使用される。一般に、等張性のための添加物には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが使用できる。いくつかの場合、リン酸緩衝液のような等張溶液が好適である。安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの態様において、処方に血管収縮剤が添加される。
【００７２】
いくつかの態様において、核酸分子はポリヌクレオチド機能促進剤または遺伝子ワクチン助長剤の投与と連結して細胞へ送達される。ポリヌクレオチド機能促進剤は１９９３年１月２６日に出願された米国特許番号第０８／００８，３４２号、１９９３年３月１１日に出願された米国特許番号第０８／０２９，３３６号、１９９３年９月２１日に出願された米国特許番号第０８／１２５，０１２号、および１９９４年１月２６日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（これらは各々が本明細書において援用される）に説明されている。遺伝子ワクチン助長剤は１９９４年４月１日に出願された米国特許番号第０８／２２１，５７９号（本明細書において援用される）に説明されている。核酸分子とともに投与される共薬剤は核酸分子との混合物として投与されるか、または核酸分子と同時に、投与前にまたは投与後に別々に投与される。さらに、トランスフェクト剤および／または複製剤および／または催炎物質として機能するであろう、およびＧＶＦと共投与されるであろう他の物質にはα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のような成長因子、サイトカインおよびリンホカインが含まれ、ならびに線維芽細胞成長因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミールペプチド、キノン類似体およびスクアレンおよびスクアレンのようなベシクル、およびヒアルロン酸もまた遺伝子構築物とともに投与されるのに使用されるであろう。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質はＧＶＦとして使用されるであろう。
【００７３】
本発明により細胞へ送達される核酸分子は、予防的および／または治療的免疫化剤として機能するタンパク質のための鋳型として働くであろう。好適な態様において、核酸分子は動物の細胞内でのコード領域の転写および翻訳のために必要な制御配列を含んでいる。
【００７４】
本発明はウイルス、原核生物および真核生物体（単細胞病原性生物体および多細胞寄生虫のような）のようなすべての病原体に対して個体を免疫化するために使用されるであろう。本発明は細胞に感染し、およびウイルスおよび原核生物（淋菌、リステリアおよび赤痢菌のような）のような被包性でない病原体に対して個体を免疫化するのに特に有用である。加えて、本発明はまた、それらが細胞内病原体である生活周期の段階を含む原虫に対して個体を免疫化するのにも有用である。本明細書で使用される場合、用語”細胞内病原体”とはその生殖または生活周期の少なくとも一部で、宿主細胞内に存在しおよびそこで病原タンパク質を産生するまたは産生する原因となるウイルスまたは病原性生物体を指すことを意味している。表２は本発明によるワクチンが作製できるいくつかのウイルスファミリーおよび属のリストである。表に掲げた抗原のような病原体抗原上に示されるエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードしているＤＮＡ配列含有ＤＮＡ構築物はワクチンに有用である。さらに、本発明はまた、原核生物および真核生物を含む他の病原体ならびに表３に掲げてあるような多細胞寄生虫に対して個体を免疫化するのにも有用である。
【００７５】
病原体感染に対して保護する遺伝子ワクチンを製造するため、保護的免疫応答が準備できる免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子構成要素は、標的のためのコード配列として遺伝子構築物中に含まれていなければならない。病原体感染が細胞内（それに対して本発明は特に有用である）であるにせよまたは細胞外であるにせよ、すべての病原体抗原が保護的応答を惹起することはありそうもない。ＤＮＡおよびＲＮＡは両方とも比較的小さくおよび比較的容易に製造できるので、本発明は多病原体抗原を含むワクチン接種を可能にするさらなる利点を提供する。遺伝子ワクチンに使用される遺伝子構築物は多くの病原体抗原をコードしている遺伝子構成要素を含むことができる。例えば、数個のウイルス遺伝子を単一の構築物に含ませてもよく、それにより複数の標的を持つものが提供される。
【００７６】
表２および３は、感染から個体を保護するために遺伝子ワクチンが製造されるいくつかの病原性因子および生物体のリストである。いくつかの好適な態様において、病原体に対して個体を免疫化する方法はＨＩＶ、ＨＴＬＶまたはＨＢＶに向けられたものである。
【００７７】
本発明の別の態様は、過増殖性疾患に特徴的である過増殖している細胞に対する広範囲な保護的免疫応答を与える方法、および過増殖性疾患を患っている個体を処置する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語”過増殖性疾患”とは細胞の過増殖により特徴付けられるような疾患および障害を指していることを意味している。過増殖性疾患の例にはすべての形の癌および乾癬が含まれる。
【００７８】
免疫原性の”過増殖している細胞”関連タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体の細胞内へ導入すると、ワクチン接種された個体の細胞にこれらのタンパク質が産生されることが見いだされている。本明細書で使用される場合、用語”過増殖性関連タンパク質”とは過増殖性疾患に関連するタンパク質を指していることを意味している。過増殖性疾患に対して免疫するため、過増殖性疾患に関連したタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が個体に投与される。
【００７９】
過増殖性関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるようにするため、それは正常な細胞と比較して、過増殖性細胞中で独占的にまたは高レベルで産生されるようなタンパク質でなければならない。標的抗原にはそのようなタンパク質に観察される少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質、それらの断片およびペプチドが含まれる。いくつかの場合、過増殖性関連タンパク質はタンパク質をコードしている遺伝子の突然変異による生成物である。突然変異した遺伝子は正常のタンパク質とほとんど同じであるが、正常タンパク質では観察されない異なったエピトープを生じるわずかに異なったアミノ酸配列を持つタンパク質をコードしている。そのような標的タンパク質にはｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子、および転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされているようなタンパク質が含まれる。標的抗原としての癌遺伝子生成物に加え、抗癌処置および保護的計画のための標的タンパク質には、Ｂ細胞リンパ球により作られる抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ球のＴ細胞レセプター可変領域が含まれ、それらはいくつかの態様において自己免疫疾患のための標的抗原としても使用される。腫瘍細胞において高レベルで観察されるタンパク質（モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるタンパク質および葉酸結合タンパク質を含む）のような他の腫瘍関連タンパク質が標的タンパク質として使用できる。
【００８０】
本発明は一つまたはそれ以上の癌のいくつかの形に対して個体を免疫化するために使用されるであろうが、本発明は特定の癌が発現しやすい人または以前に癌を発病し、従って再発しやすい人のような個体を予防的に免疫化するのに特に有用である。遺伝学および技術ならびに疫学の発展は、個体における癌発生の可能性および危険事前評価の決定を可能にしている。遺伝子スクリーニングおよび／または家族健康履歴を用いて、特定の個人がいくつかの型の癌のどれか一つを発生する可能性を予測することが可能である。
【００８１】
同様に、すでに癌が発生している、および癌を取り除く処置を受けたまたは寛解期にある個体は特に再発しやすい。処置計画の一部として、そのような個体は再発と戦うために、持っていると診断された癌に対して免疫できる。従って、個体が癌の一つの型を持っていたことがあり、再発の危険性があることが解ったら、癌の将来の出現と戦う免疫系を準備するために免疫化できる。
【００８２】
本発明は過増殖性疾患を患っている個体を処置する方法を提供する。そのような方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を産生する過増殖性細胞と戦うために個体の免疫系を向けさせるおよび促進する免疫療法剤として働く。
【００８３】
本発明は、自己免疫性に関係し、細胞レセプターおよび”自己”指向性抗体を産生する細胞を含んだ標的に対して広範囲な保護的免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害を患っている個体を処置するための方法を提供する。
【００８４】
Ｔ細胞仲介自己免疫疾患にはリウマチ様関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェグナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連した炎症性カスケードを開始させるＴ細胞レセプターにより特徴付けられる。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチン接種はＣＴＬが関与する免疫応答を惹起し、これらのＴ細胞を除去する。
【００８５】
ＲＡにおいて、この疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のいくつかの特異的可変領域が同定されている。これらのＴＣＲにはＶβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７、およびＶα−１７が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードしているＤＮＡ構築物でのワクチン接種はＲＡに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Ｈｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．ｅｔａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０９２１−１０９２５；Ｐａｌｉａｒｄ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２５−３２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３２６−３３３（これらの各々は本明細書において援用される）を参照されたい。
【００８６】
ＭＳにおいて、この疾患に関与する抗体のいくつかの特異的可変領域が同定されている。これらのＴＣＲにはＶβ−７、およびＶα−１０が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードしているＤＮＡ構築物でのワクチン接種はＭＳに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１６−１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４５：３４４−３４６（これらの各々は本明細書において援用される）を参照されたい。
【００８７】
強皮症において、この疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のいくつかの特異的可変領域が同定されている。これらのＴＣＲにはＶβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４、およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８、およびＶα−１２が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードしているＤＮＡ構築物でのワクチン接種は強皮症に関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。
【００８８】
Ｔ細胞仲介自己免疫疾患を患っている患者を処置するためには（特にＴＣＲの可変領域がまだ同定されていない場合）、滑液生検が実施できる。存在するＴ細胞の試料を取り出すことができ、それらのＴＣＲの可変領域が標準法を使用して同定される。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
【００８９】
Ｂ細胞仲介自己免疫疾患には狼蒼（ＳＬＥ）、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症、および悪性貧血が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連した炎症性カスケードを開始させる抗体により特徴付けられる。抗体の可変領域に対するワクチン接種はＣＴＬが関与する免疫応答を惹起し、この抗体を産生するＢ細胞を除去する。
【００９０】
Ｂ細胞仲介自己免疫疾患を患っている患者を処置するためには、自己免疫活性に関与する抗体の可変領域を同定しなければならない。生検が実施でき、炎症部位に存在する抗体の試料を取り出すことができる。抗体の可変領域が標準法を使用して同定できる。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
【００９１】
ＳＬＥの場合、一つの抗原がＤＮＡであると信じられている。従ってＳＬＥに対して免疫化されるべき患者においては、血清を抗ＤＮＡ抗体でスクリーニングし、血清中に観察されたそのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードしているＤＮＡ構築物を含むワクチンが製造できる。
【００９２】
ＴＣＲおよび抗体両方の可変領域間に共通の構造的特色はよく知られている。特定のＴＣＲまたは抗体をコードしているＤＮＡ配列は一般的にＫａｂａｔ，ｅｔａｌ．，１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ（本明細書において援用される）に説明されているようなよく知られた方法に従って見出すことができる。加えて、抗体からの機能的可変領域クローニングの一般法はＣｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１０６６（本明細書において援用される）に見ることができる。
【００９３】
遺伝子ワクチンを改良するために免疫調節タンパク質コード配列の発現可能形を使用するのに加え、本発明は抗原をコードしている外来遺伝子を送達するために改良された弱毒化生ワクチンおよび組換え体ベクターを使用する改良されたワクチンに関している。外来抗原を運ぶための弱毒化生ワクチンおよび組換え体ベクターを使用するワクチンの例は米国特許第４，７７２，８４８；５，０１７，４８７；５，０７７，０４４；５，１１０，５８７；５，１１２，７４９；５，１７４，９９３；５，２２３，４２４；５，２２５，３３６；５，２４０，７０３；５，２４２，８２９；５，２９４，４４１；５，２９４，５４８；５，３１０，６６８；５，３８７，７４４；５，３８９，３６８；５，４２４，０６５；５，４５１，４９９；５，４５３，３６４；５，４６２，７３４；５，４７０，７３４および５，４８２，７１３号（これらの各々は本明細書において援用される）に説明されている。発現を達成するためにワクチン中で機能できる制御配列へ作動可能なように連結されている免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。遺伝子構築物は弱毒化生ワクチンおよび組換え体ワクチンへ取り込まれて本発明に従った改良されたワクチンが製造される。
【００９４】
本発明は、ワクチン組成物（ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチンおよび組換え体ワクチンを含む）の一部として個体の細胞へ遺伝子構築物を送達する工程から成る、個体を免疫化する改良された方法を提供する。遺伝子構築物は免疫調節タンパク質をコードしおよびそれが発現を達成するためにワクチン中で機能できる制御配列へ作動可能なように連結されているヌクレオチド配列から成っている。改良されたワクチンは高められた細胞性免疫応答を生じる。
【００９５】
本発明の別の態様は強い抗体応答またはヘルパーＴ細胞応答が特に望まれるＤＮＡワクチンと組み合わされたＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦをコードしている核酸分子またはそれらの両方の使用に関している。そのようなワクチンの一つの例はＢ型肝炎に対するワクチンである。他の例としては細胞外病原体およびアレルゲンが挙げられる。ＤＮＡワクチンと組み合わされたＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦをコードしている核酸分子またはそれらの両方の投与はまた免疫無防備状態であると同定された個体のワクチン接種にも有用である。
【００９６】
本発明の別の態様は自己免疫疾患を患っている患者を処置するための抗ケモカイン抗体の使用に関している。自己免疫疾患は前に簡単に説明されている。抗ケモカイン抗体にはＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳに特異的な抗体が含まれる。抗ケモカイン抗体はそのような疾患を患っていると疑われる患者に症状を軽減または緩和するのに十分な量で投与されるであろう。
【００９７】
自己免疫疾患を処置するために医薬組成物はケモカインに特異的な抗体および医薬として受容可能な担体を含んでいる。無菌で、発熱物質および粒子状物質を含んでいない注射可能組成物は一つまたはそれ以上のケモカインに特異的な抗体および医薬として受容可能な担体または注射賦形剤を含んでいる。
【００９８】
抗体はモノクローナル抗体を製造するための通常の方法に従って作製される。担体は当業者にはよく知られているものから選択される。担体の一つの例は無菌塩類溶液である。
当業者は標準技術および容易に入手可能な材料を用いてＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳに特異的に結合するモノクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体を製造するための技術はＨａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ，（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ（本明細書において援用される）に説明されており、ハイブリドーマおよび標的タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体製造のための詳細な手引きが示されている。
【００９９】
簡単には、ケモカインをマウスに注射する。マウスの脾臓を除去し、脾臓細胞を単離して不死化マウス細胞と融合させる。ハイブリッド細胞（またはハイブリドーマ）を培養し、抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、問題とするタンパク質に特異的に結合することが観察されたら、それらを産生するハイブリドーマを培養して抗原特異的抗体を連続的に供給する。
【０１００】
本発明に従うと、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳに特異的な抗体は自己免疫疾患を処置するために使用される。従って、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳはハイブリドーマを発生させるために使用される。これらのタンパク質をコードしている遺伝子は広く知られており、当業者は容易に入手可能である。従って、当業者は本発明の実施に有用な抗体を作製できる。齧歯類抗体に加えて、本発明はヒト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂｓおよびキメラ抗体に関しており、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳに特異的に結合するＦａｂｓは当業者により日常的に製造されているであろう。
【０１０１】
当業者は自己免疫疾患を患っているまたは疑われる患者を容易に同定できる。
組成物はそれをより有効にするための追加の成分を含んでいてもよい。例えば、本発明の組成物は異なったケモカインに特異的な抗体および同一のケモカインの異なったエピトープに特異的な抗体を含む多数の抗ケモカイン抗体を含んでいてもよい。
【０１０２】
約５μｇから５０００ｍｇの抗体が投与されるであろう。いくつかの好適な態様においては、５０μｇから５００ｍｇの抗体が投与されるであろう。別の好適な態様においては、５００μｇから５０ｍｇの抗体が投与されるであろう。好適な態様においては、５ｍｇの抗体が投与される。
【０１０３】
組成物は、例えば、経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内または皮下投与のような適した経路により投与されるであろう。いくつかの態様において、静脈内投与が好適である。
最初の投与に続いて、個体は再投与により追加免疫されるであろう。いくつかの好適な態様において、多数回投与が実施される。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
序 
免疫応答におけるケモカインの特異的役割を分子的に詳細に検討するため、α−ケモカインＩＬ−８をコードしているｃＤＮＡならびにβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１をコードしているｃＤＮＡを個々に発現ベクター内へクローン化し、ＨＩＶ−１エンベロープまたはｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードしているＤＮＡ免疫原と一緒に共免疫感作した。モデル抗原としてこれらのＤＮＡワクチン構築物を用い、そのような免疫感作に続いて誘導された抗原特異的体液性および細胞性免疫応答の分析を通して免疫応答の発生に果たすケモカイン遺伝子発現の特異的役割を検討した。ケモカインは抗原特異的免疫応答の活性化および調節に特異的で同定可能な役割を持っていることが観察された。
【０１０５】
結果
ＤＮＡワクチン接種によるケモカインの誘導 
マウスを５０μｇのｐＣＤＮＡ３（対照）、ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した。２週間後、マウスを殺し、それらの脾臓をとり、リンパ球を単離した。これらの細胞は抗原特異的刺激（固定化組換え体ワクシニア感染刺激細胞を用いて）によりインビトロで５日間刺激した。エフェクター細胞からの培養上清液を集め、ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの放出を試験した。ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌによるＤＮＡ免疫感作は対照ベクターと比較してβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳ発現レベルの著しい増加を誘導した。この増加は最初の免疫感作後早くも２週間で存在しており、β−ケモカインがインビボで免疫応答を調節できたことを示唆している。抗原特異的応答に対するケモカインの影響を決定するため、次にＤＮＡワクチンにより誘導される免疫応答に対するそれらの影響を調べた。
【０１０６】
ケモカイン発現カセットの構築
ケモカインＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１α、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳ遺伝子をＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｄ／Ｂ／Ｗｅｉｎｅｒ（１９９７）ＳｐｒｉｎｇｅｒＳｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ１９，１７４−１９５；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ．１５，６４１−６４５；およびＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，８１６−８２６（これらの各々は本明細書において援用される）に説明されている方法を用いてｐＣＤＮＡ３プラスミド発現ベクター内へ個々にクローン化した。これらのケモカイン発現カセットは全挿入物（５’および３’両方の隣接配列を含んで）の配列分析により確認された。加えて、これらのケモカイン構築物はインビトロでＲＤ細胞へトランスフェクトされ、これらの構築物の発現が関連抗体を使用する免疫沈降により、またはケモカインＥＬＩＳＡにより確認された。ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳのための発現構築物はまたワクチンとしても使用され、マウスを免疫した。材料および方法に説明されているインビボ発現技術により、これらの構築物はインビボでマウス筋肉組織中にそれらがコードしているケモカインを発現したことが決定された。
【０１０７】
ＩＬ−８はＴヘルパー応答の強力な誘導剤である
ワクチン誘導応答に対する種々のケモカインの影響が個々に分析された。ｐＣＥｎｖおよびｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８免疫マウスからの抗血清を集め、ＥＬＩＳＡによりＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質に対する特異的抗体応答を分析した。ＤＮＡ免疫感作後０、２、４および６週に集められた血清からのｇｐ１２０特異的抗体力価が測定された。１：１２８希釈において、ｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８で免疫した群からの血清はｇｐ１２０タンパク質に対する抗体応答を示し、それはｐＣＥｎｖ単独で免疫した群からの応答よりも高かった。同様の結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で観察された。さらに、ＩＬ−８遺伝子の共投与により誘導されたｇｐ１２０特異的ＩｇＧのサブクラスが決定された。ＩｇＧ１型の生成はＴｈ２型サイトカインにより誘導されるが、ＩｇＧ２型の生成はＴｈ１型サイトカインにより誘導される。ＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１（Ｔｈ１に対するＴｈ２）の相対比が測定された。ｐＣＥｎｖ免疫化群はＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比が１．３であった。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８の共注射は相対比を０．９に減少させ、Ｔｈ１型応答への移行を示している。従って、ＩＬ−８は抗原特異的応答の質および量の両方に影響を及ぼした。
【０１０８】
Ｔヘルパー細胞増殖応答に対するＩＬ−８発現の影響もまた試験された。ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＩＬ−８の共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の劇的なレベルを生じた。増殖の増加は４から６倍の間であった（抗原特異的応答の著しい亢進）。加えて、誘導されたＣＴＬ応答に対するＩＬ−８共発現の影響も調べられた。対照動物からはバックグラウンドレベルの特異的溶解が観察されたが、ｐＣＥｎｖ単独で免疫した動物は小さいが、しかし一貫したレベルのＣＴＬ応答を示した。ＩＬ−８共投与は抗原特異的ＣＴＬ応答に対して促進効果を持っていなかった。同様なＣＴＬ結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＬ−８共免疫感作で観察された。
【０１０９】
サイトカインは免疫応答の間、免疫細胞の方向付けおよび標的化に鍵となる役割を果たしている、例えば、ＩＦＮ−γはＴ細胞仲介細胞障害性免疫応答の制御に複雑に関与しており、一方、ＩＬ−４はＢ細胞仲介免疫応答において支配的な役割を果たしている。ＴＮＦ−αは活性化マクロファージおよび単球、好中球、活性化リンパ球およびＮＫ細胞により産生され、他の前炎症性サイトカイン合成の制御に中枢の役割を果たしていると示唆されている。我々はＣＴＬアッセイのためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清を分析し、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの放出を試験した。ＩＬ−８発現はＴＮＦ−αレベルをほんのわずか増加させたが、サイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−４レベルには影響しなかった。体液性応答に対するＩＬ−８の共送達の劇的な影響は、ＩＬ−４に対する顕著な影響を持っていることを期待させるのでこのことは幾分驚くべきことである。しかしながら、それは観察されなかった。
【０１１０】
ＭＩＰ１−αは抗体応答の強力な誘導剤である
ＭＩＰ１−αの共発現は抗原特異的体液性応答の誘導においてＩＬ−８よりも劇的な影響を示した。ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１α共免疫感作はエンベロープ特異的抗体応答の劇的な促進を生じた。同様な結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で観察された。ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αを共投与した後のＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の相対比が決定された。ｐＣＥｎｖ免疫群はＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比が１．３であった。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αの同時注射は相対比を１．７に上昇させ、Ｔｈ２型応答への移行を示している。ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＭＩＰ−１αの共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の促進を生じた。対照的に、ＭＩＰ−１α免疫感作は抗原特異的ＣＴＬ応答またはサイトカイン誘導にはほとんど影響しなかった。ＩＬ−８の分析で観察されたように、サイトカイン産生に対する影響については、ＩＬ−４レベルには再び何の影響も観察されなかった。
【０１１１】
ＲＡＮＴＥＳはＴｈ１ならびにＣＴＬ応答を誘導する 
次にワクチン誘導免疫応答に対するＲＡＮＴＥＳ共送達の影響が試験された。ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αと異なりｐＣＥｎｖとＲＡＮＴＥＳの共発現はＨＩＶ−１エンベロープ特異的抗体応答を促進しなかった。加えて、ｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳ共免疫感作は、ｐＣＥｎｖ単独での免疫化群と比較した場合、ＩｇＧ１−ＩｇＧ２ａ比に対して何の影響も与えなかった。抗体応答とは対照的に、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＲＡＮＴＥＳの共ワクチン接種は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の著しい増加を生じた。さらに、ｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳを共投与した群からは２倍高いレベルのＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α発現が観察された。ＣＴＬ活性には極微の影響しか与えないｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８またはｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αでの共注射と異なり、ＨＩＶ−１エンベロープを発現しているワクシニア（ｖＭＮ４６２）感染標的の特異的溶解のより劇的な増加がｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳの共注射後に観察された。５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳを共注射後、標的細胞の３６％を超える特異的溶解が観察された。同様に、ｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ＲＡＮＴＥＳで免疫したマウスではＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌを発現しているワクシニア（ｖＶＫ１）感染標的の抗原特異的ＣＴＬ溶解が著しく促進された。ＲＡＮＴＥＳ共送達は生じる応答をＴｈ１型表現型に偏らせるが、再び、ＩＬ−４に対しては影響を及ぼさなかった。
【０１１２】
ＭＣＰ−１はＣＴＬ応答を誘導する 
次にＭＣＰ−１ ｃＤＮＡのアジュバント特性が観察された。ＭＣＰ−１はｐＣＥｎｖ免疫感作により誘導される特異的抗体結合プロフィールには極微の影響しか及ぼさないようである。さらに、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＭＣＰ−１の共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の促進に対して陽性ではあるが比較的小さな（２倍）促進を示した。ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１を共投与した後のＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の相対比が決定された。ｐＣＥｎｖ免疫群はＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比が１．３であった。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１の共注射は相対比を１．０に減少させ、Ｔｈ１型応答への移行を示している。ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１の共注射後に特異的溶解のより劇的な増加が観察された。５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１を共注射後、標的細胞の３６％を超える特異的溶解が観察された。同様に、ｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ＭＣＰ−１で免疫したマウスではＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌを発現している標的の抗原特異的ＣＴＬ溶解が著しく促進された。ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１免疫マウスによるＩＦＮ−γ放出レベルは、ｐＣＥｎｖ免疫または対照群よりも著しく高かった。再び、すべての群からのＩＬ−４放出レベルは同様であった。さらに、ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１免疫マウス群によるＴＮＦ−α放出レベルは、ｐＣＥｎｖ免疫または対照群よりも著しく高かった。これらのサイトカイン放出データはＣＤ８+ ＣＤＬの活性化におけるＭＣＰ−１の役割を明瞭にする我々のＣＴＬ結果を支持している。
【０１１３】
ＣＴＬ応答におけるＣＤ８制限の決定 
ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳでの共発現によるＣＴＬ応答の増加がＣＤ８+Ｔ細胞に制限されていたかどうかを決定するため、ｂａｌｂ／ｃマウスでＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬの特異的エピトープであることが示されているＨＩＶ−１エンベロープペプチド（ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）を用いてＣＴＬアッセイが実施された。マウスは５０μｇの各々のＤＮＡ構築物で２週間あけて免疫感作し、第二の免疫感作１週間後に脾臓を採取した。ＣＴＬアッセイはインビトロでエンベロープ特異的ペプチドを用いて刺激した後に脾臓細胞に対して実施された。ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳでの共注射後の両方において、５０：１のＥ：Ｔ比で各々３５％および２６％特異的溶解でのＣＴＬ応答の著しい促進が観察された。補体溶解によりエフェクター細胞集団からＣＤ８+Ｔ細胞を除去した後にＣＴＬ活性を測定することにより前記の観察を確認した。ＣＤ８+Ｔ細胞の除去はＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳでの共注射後に観察された抗原特異的ＣＴＬ促進を抑制した。これらの結果は、細胞溶解活性の促進は抗原特異的、クラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存的であったことを示している。
【０１１４】
ケモカイン発現の促進 
これらの特異的ケモカイン抗原増強免疫原のケモカイン産生それ自身に対する影響を決定するのは重要である（もしあれば）。免疫化動物から集められた刺激された細胞によるケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１の発現を調べた。ケモカイン共注射はケモカイン特異的パターンでケモカイン産生を調節した。いくつかの重要な観察が行われた。さらに、ケモカイン遺伝子との共免疫感作により刺激された細胞によるケモカイン発現が増加することが観察された。例えば、ＭＩＰ−１α発現はｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１の共免疫感作により、ｐＣＥｎｖ免疫感作単独により発現されたレベルより劇的に促進できたことが観察された。加えて、ＭＩＰ−１β発現はｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１およびｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳ免疫感作（二つの最も顕著なＣＴＬ応答の誘導剤）により劇的に促進されたことも観察された。さらに、ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１α、ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１およびｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳ共免疫感作は刺激された細胞によるＲＡＮＴＥＳ発現を著しく促進させた。最後に、ＭＣＰ−１の発現はｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αおよびｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１共免疫感作で最も高かった。
【０１１５】
考察
炎症性反応の免疫の開始は、細胞性接着分子、サイトカインおよびケモカインの厳しく調整された発現を含んだ複雑な過程である。ケモカインは血管から宿主防御の末端部位への白血球やりとりの分子的制御に特に重要である。ケモカインのスーパーファミリーは２０を超す関連タンパク質のアレイから成っている。ケモカインは保存されているシステイン残基の存在および位置に基づいて大きく三つのファミリー、Ｃ−Ｘ−Ｃ（α）、Ｃ−Ｃ（β）およびＣ（γ）、に分割される。αファミリー構成物においては、最初の二つのシステインが別のアミノ酸により引き離されており、一方βファミリー構成物ではお互いに隣に置かれている。これまでのところ、γファミリーは二つの構成物しか同定されていないが、それらの両方ともそのＮ末端には二つのシステインの代わりに一つのシステインしか含まれていない。
【０１１６】
各々のサブファミリーの構成物は独特のならびに重複する活性を持っている。正確な生理学的および病理学的機能は未だに明確には定義されていないが、文献からある種の簡単な一般性は作成することができる。一般に、Ｃ−Ｘ−Ｃファミリー構成物は、好中球、好酸球および好塩基球を含む多形核白血球の化学誘引剤および活性化剤であると報告されている。対照的に、Ｃ−Ｃファミリーは単球およびリンパ球のような単核細胞の走化性因子として働く。一方、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、ＩＬ−８およびＩＬ−１０はＴリンパ球の走化性因子として伝えられており、Ｃ−Ｃケモカイン、ＭＣＰ−１、ＭＰＣ−３、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αもまた好塩基球の走化性因子である。一般に、ケモカインの機能は炎症部位での白血球の補充および活性化であるようである。
【０１１７】
炎症性および免疫応答におけるそれらの機能に加え、いくつかのケモカインはＡＩＤＳの原因であるＨＩＶ−１および２の伝播および進行に重要な役割を果たしている。１０年の間、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４０への結合はウイルス融合および進入には十分ではないと予想されており、ＨＩＶ感染のための追加の細胞表面補因子の必要性が示唆されている。最近の研究からＴ細胞指向性およびマクロファージ指向性ウイルスとそれらの標的細胞の融合に必要とされる補レセプターは各々ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５であると同定された。
【０１１８】
ＣＸＣＲ−４（ＬＥＳＴＲとしても知られている）は元々ケモカインレセプターと構造類似性を持つオーファンレセプターとして発見された。ＣＸＣＲ−４は続いてＴ細胞指向性ＨＩＶウイルスのＣＤ４+細胞内への侵入のために必要な補因子として同定された。β−ケモカインＳＤＦ−１はＣＸＣＲ−４のリガンドであり、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１株による感染の強力な阻害剤である。同様に、β−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ−５の天然のリガンドであり、マクロファージ指向性（しかしＴ細胞指向性ではない）ＨＩＶ単離物のためのＣＤ８+Ｔ細胞により産生される主ＨＩＶ抑制因子の一つである。
【０１１９】
これらの研究において、ＤＮＡ免疫原を注射した後に著しいレベルのケモカイン発現が観察されている。これらの結果は、免疫応答の重要な活性化剤および制御剤としてのケモカインの潜在的役割を暗示している。免疫誘導および調節におけるこれらのケモカインの特異的役割を評価するため、抗原送達モデルとしてケモカインＤＮＡ発現カセットの共送達を利用した。ＤＮＡワクチンはＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路を経て体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導するので、ＤＮＡ共免疫感作はケモカインのインビボでの機能を調べるのに適したモデルである。さらに、我々および他の研究者はＤＮＡワクチンに対する抗原特異的免疫応答が、共刺激性分子およびサイトカイン遺伝子とＤＮＡ免疫原カセットを共注射することにより調節できることを示している。従って、ケモカイン発現ベクターとＨＩＶ−１ＤＮＡ免疫原を共免疫感作し、免疫活性化に対するケモカイン発現の影響を調べた。α−ケモカインＩＬ−８およびβ−ケモカインＭＩＰ１−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は抗原特異的免疫応答の活性化に特異的で同定可能な役割を持っていた。
【０１２０】
例えば、ＩＬ−８は好中球の走化性因子であり、それらを血流中から放出して周囲の組織へ移行させる。ＩＬ−８はＣＤ４+Ｔ細胞の強力な誘導剤であることが観察され、それは強いＴヘルパー細胞増殖応答ならびに抗体応答により示された。ＩＬ−８共発現はまた、免疫応答型のＴｈ−１型への移行を調節し、それはＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比の減少および促進されたＩＦＮ−γ発現により示された。一方、ＩＬ−８共発現はＣＴＬ応答に対して何の促進効果を持っていなかったので、ＣＤ８+Ｔ細胞に対しては注目に値する影響を及ぼさない。
【０１２１】
ＭＩＰ−１αは好酸球を化学誘引および脱顆粒できる。ＭＩＰ−１αはまた、好塩基球および肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導し、好塩基球およびＢ細胞の走化性因子でもある。これらの報告はＭＩＰ−１αが抗体応答に対して最も大きな効果を持っているという我々の観察を支持している。加えて、ＭＩＰ−１αはまたＣＤ４+Ｔ細胞の強力な誘導剤でもあり、良好なＴヘルパー細胞増殖応答を示した。ＭＩＰ−１α共発現はまた、免疫応答のＴｈ−２型への移行も調節し、それはＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比の増加により示された。対照的に、ＭＩＰ−１α共発現はＣＤ８+Ｔ細胞に対しては軽微な影響しか示さなかった。
【０１２２】
ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αの効果と異なり、ＲＡＮＴＥＳ共免疫感作は抗体応答に対して軽微な影響しか示さなかった。ＲＡＮＴＥＳは単球化学誘引剤である。加えて、ＲＡＮＴＥＳは非刺激ＣＤ４+／ＣＤ４５ＲＯ+記憶Ｔ細胞および刺激ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を化学誘引できる。ＤＮＡ免疫感作部位へＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を化学誘引するＲＡＮＴＥＳの能力がＴヘルパー細胞増殖応答およびＣＴＬ応答の誘導において重要な役割を果たすことが観察された。Ｔｈ１応答の促進された活性化は、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α発現の増加により支持された。ＲＡＮＴＥＳ発現により誘導された高レベルのＣＴＬ応答は、クラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存性であることから決定された。
【０１２３】
単球の強力な走化性因子であるので、ＭＣＰ−１は慢性炎症性疾患の最も重要なケモカインの一つと考えられる。ＭＣＰ−１は単球を血流から移動させて組織マクロファージにすることを誘導する。ＭＣＰ−１は活性化された記憶サブセットのＴリンパ球を化学誘引することが観察されている。試験されたすべてのケモカインの中で、ＭＣＰ−１はＣＤ８+ＣＴＬの最も強力な活性化剤である。ＭＣＰ−１発現により誘導されるＣＴＬ応答の促進は、クラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存性であると決定された。促進されたＣＴＬ結果はＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α発現の増加およびＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比の減少により支持される。ＲＡＮＴＥＳと異なり、ＭＣＰ−１は陽性、しかし中程度のＴヘルパー細胞増殖応答に対する効果を持っていた。この比較から、体液性ＴヘルパーおよびＴ細胞毒性応答はお互いに独立して調節できることが強調される。
【０１２４】
免疫応答に対する直接的な影響に加え、ケモカイン遺伝子の共発現は自己分泌様式での発現が増加した。例えば、ＭＩＰ−１α発現がｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αで共免疫感作することにより、ｐＣＥｎｖ免疫感作単独で発現されるレベルよりも劇的に促進できたことが観察された。ＲＡＮＴＥＳの同様の増加がＲＡＮＴＥＳ共送達で観察され、ＭＣＰ−１が増加した。
【０１２５】
さらに、ケモカインの共発現でもまた他のケモカインの発現が促進された。これらの結果は、これらのケモカインは免疫応答を調節する直接的な役割を持っているばかりではなく、他のケモカインの産生を制御するようにも働くことを暗示している。
【０１２６】
重要な観察は、ケモカインＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１がＴＮＦ−α発現を誘導する役割であった。ＴＮＦ−αは活性化マクロファージおよび単球、好中球、活性化リンパ球およびＮＫ細胞により産生され、一方ＴＮＦ−βはリンパ球により産生される。ＴＮＦ−αはまたグラム陰性細菌感染後の敗血症性ショックおよびリウマチ様関節炎にも暗示されている。さらに、ＴＮＦ−αは他の前炎症性サイトカイン合成の制御に中枢の役割を果たしている。種々の病気におけるＴＮＦ−αの決定的な役割を仮定し、リウマチ様関節炎のような状態の処置可能性として、インビボでＴＮＦ−αレベルを低下させることが努力されてきた。我々の実験において、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＣＰ−１の共発現はＴＮＦ−α発現の促進が生じることが観察された。これらの結果は、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を阻害することで、インビボでＴＮＦ−α発現を変化させるための適切な戦略を組み立てることができることを暗示している。
【０１２７】
Ｔｈ１対Ｔｈ２表現型は独立して他の免疫機能を分離するように見えることは興味が持たれる。ＩＬ−８は体液性応答を押し上げるが、これらの応答をＴｈ１型の方へ駆り立て、ＩｇＧ／ＩｇＧ２ａ比を半分にする。一方、ＭＩＰ−１α（多分血清学での最も多くの駆動体）はＩｇＧ／ＩｇＧ２ａ比を劇的にＴｈ２応答の方へ変化させる。この操作はお互いに独立して、一次抗原特異性免疫応答の誘導を所望の表現型ならびにイムノグロブリンアイソタイプへ方向付けることができることは明らかである。さらに、細胞性に対してより高い体液性応答の誘導は比較的偏向された免疫機能であるようである。それらのケモカインは体液性応答に対して最も劇的な効果を示す。ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αはＣＴＬ応答に対してはほとんど影響を与えないが、一方、ＣＴＬ応答に対して最も劇的な影響を仲介するもの、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は血清学的には極微の影響しか与えない。同一のＣＴＬ駆動ケモカインＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は両方ともＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを刺激し、その間、体液性応答発生剤は免疫活性化のこれらのサイトカイン刺激剤に対して極微の影響しか及ぼさない。
【０１２８】
実施例２
ＩＬ−８をコードしているヌクレオチド配列がワクチンまたは免疫療法剤の一部としてある種の細胞へ送達された場合、完全長形では不活性であり成熟形にプロセッシングされた場合にのみ活性になるのであまり有効ではない。図１Ａに示したように、ＩＬ−８の最初の３５アミノ酸はカスパーゼ−１（ＩＣＥ）により切断される。突然変異体ＩＬ−１８ヌクレオチド配列が構築され、それは図１Ｂに示した突然変異体ＩＬ−１８へ翻訳される。このＩＬ−１８の突然変異体形は本発明による有効な免疫調節タンパク質として働く。免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされた突然変異体ＩＬ−１８をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。突然変異体形をコードしているヌクレオチド配列はｐＣＤＮＡ３内へ挿入されるであろう。
【０１２９】
実施例３
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＣＤ４０をコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３０】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＣＤ４０をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＣＤ４０Ｌをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３１】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＦａｓをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＣＡＭ−１をコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３２】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＣＡＭ−１をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＬＦＡ−３をコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３３】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＬＦＡ−３をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＶＣＡＭ−１をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１３４】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＰＥＣＡＭ−１をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＥ−セレクチンをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１３５】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭ−ＣＳＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＧ−ＣＳＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３６】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭ−ＣＳＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＧ−ＣＳＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１３７】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−４をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＥ−セレクチンをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１３８】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−７をコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＮＧＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３９】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＶＥＧＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−７をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１４０】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＮＧＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＶＥＧＦをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１４１】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１をコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＲＡＮＴＥＳをコードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１４２】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＲＡＮＴＥＳをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１４３】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＩＰ−１αをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−８をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１４４】
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−８の任意の一つの送達により抗体応答が促進される。
ＭＣＰ−１またはＲＡＮＴＥＳの任意の一つの送達によりＴＮＦ−α産生が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−８の任意の一つの送達によりＩＦＮ−γ産生が促進される。
【０１４５】
実施例４
Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ−コロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球−ＣＳＦ）およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／単球−ＣＳＦ）のための遺伝子発現カセットならびにＨＩＶ−１ＤＮＡ免疫原構築物の共送達後の抗原特異的免疫応答に対する影響を試験した。これらのサイトカインのための遺伝子は個々にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター制御下の発現ベクター内へクローン化した。遺伝子プラスミド発現カセットは次にＨＩＶ−１免疫原のためのＤＮＡワクチンカセットとともにマウスに注射された。抗原特異的免疫応答の方向性および程度に対するこれらの遺伝子アジュバントカセットでの共注射の免疫学的効果を分析した；これらの結果は原型Ｔｈ１およびＴｈ２型サイトカイン（各々ＩＬ−１２およびＩＬ−４）遺伝子の共送達で観察された結果と比較された。モデル抗原としてこれらのＤＮＡワクチン構築物を用い、ＣＳＦがインビボで抗原特異的免疫応答を劇的におよび明白に制御でき、およびワクチン特異的様式でβ−ケモカイン産生を駆動していることが観察された。
【０１４６】
材料および方法ＤＮＡプラスミド
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｐＣＥｎｖ）およびｇａｇ／ｐｏｌタンパク質（ｐＣＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現しているＤＮＡワクチンはＢｏｙｅｒ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，５２６−５３２（本明細書において援用される）に説明されているように製造された。ヒトＧ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦならびにマウスＧＭ−ＣＳＦのための遺伝子はＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０８９−１１０３およびＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，１１１２−１１２４（本明細書において援用される）に説明されているようにｐＣＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。ヒトＧ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦはマウス細胞中で活性であることが報告されている。きれいなプラスミドは細菌中で製造され、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）を用いて精製された。
【０１４７】
試薬および細胞株
マウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞株はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＨＩＶ−１エンベロープ（ｖＭＮ４６２）、ｇａｇ／ｐｏｌ（ｖＶＫ１）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｖＳＣ８）を発現している組換え体ワクチンはＮＩＨＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲｅａｇｅｎｔＰｒｏｇｒａｍから入手した。組換え体ｇｐ１２０またはｐ２４タンパク質はＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。
【０１４８】
マウスのＤＮＡ接種
６から８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の大腿４頭筋にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）および０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に処方した問題とする各々のＤＮＡ構築物５０μｇを注射した。種々の遺伝子発現カセットの投与は、注射前に選択されたプラスミドを混合することにより行った。対照マウスは５０μｇのｐＣＤＮＡ３ベクターで免疫した。各々の研究の組は３度実施され、代表的な組の結果が示されている。マウスには２回の免疫感作（各々５０ｍｇ）を２週間の間隔で行った。追加注射１週間後、マウスを殺し、脾臓を採取してリンパ球を単離し、細胞応答を試験した（ＴｈまたはＣＴＬ）。すべての動物は温度制御し、明暗を反復させたペンシルバニア大学の施設で飼い、それらの世話は米国国立保健研究所およびペンシルバニア大学のガイドラインに沿っていた。
【０１４９】
ＥＬＩＳＡ
０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈した１５μｇのｐ２４またはｇｐ１２０タンパク質を４℃で一夜、マイクロタイターウェルに吸着させた。プレートはＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０で洗浄し、３７℃で１時間３％ＢＳＡのＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０溶液でブロックした。マウス抗血清は０．０５％トウィーン−２０で希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、次にＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートした。プレートを洗浄し、３’３’５’５’ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）緩衝溶液で発色させた。ｇｐ１２０特異的ＩｇＧサブクラスの相対レベルの決定には、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結合ＨＲＰ（Ｚｙｒｎｅｄ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に置換した。続いてＡＢＴＳ基質溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）が添加された。各々の工程において、プレートは洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％トウィーン−Ｘ）で３回洗浄された。プレートはＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ５０００プレートリーダー上、４５０ｎｍの光学密度が読みとられた。
【０１５０】
Ｔヘルパー細胞増殖アッセイ
リンパ球は脾臓から採取され、赤血球を除去することによりおよび新鮮な培地で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製された。単離された細胞懸濁液は５ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５ｘ１０5細胞を含んでいる１００μｌをすぐに９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各々へ加えた。５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度で組換え体ｐ２４またはｇｐ１２０タンパク質をウェルに３重に加えた。細胞は５％ＣＯ2中、３７℃で３日間インキュベートした。各々のウェルに１ｍＣｉのトリチウム化チミジンを加え、細胞は３７℃で１２から１８時間インキュベートした。プレートをとり、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をＢｅｔａＰｌａｔｅリーダー（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。刺激指数は式：刺激指数（ＳＩ）＝（実験的カウント／自発的カウント）から決定された。自発的カウントウェルは不適切タンパク質対照として働く１０％ウシ胎児血清を含んでいる。
【０１５１】
細胞障害性Ｔリンパ球アッセイ
ワクシニア感染標的を使用して５時間の51Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイが実施された。アッセイはインビトロでのエフェクター刺激で実施され、エフェクターは適切なワクシニア感染細胞（エンベロープに対してはｖＭＮ４６２およびｇａｇ／ｐｏｌに対してはｖＶＫ１）で刺激され、それは５日間、ＣＴＬ培養培地中５ｘ１０6細胞／ｍｌで、０．１％グルタルアルデヒドを用いて固定された。エフェクターはＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびＣｏｎ Ａを含まない１０％ＲＡＴ−Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から成るＣＴＬ培養培地で２日間、非特異的に刺激された。ワクシニア感染標的は３７℃で５から１２時間、１０−２０の感染多重度（ＭＯＩ）で３ｘ１０6のＰ８１５細胞を感染させることにより調製された。標準クロム放出アッセイが実施され、そこで標的細胞は１００ｍＣｉ／ｍｌＮａ251ＣｒＯ2で６０から１２０分間標識され、刺激エフェクター脾臓細胞と３７℃で６時間インキュベートされた。ＣＴＬ溶解は５０：１から１２．５：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で決定された。上清を採取し、ＬＫＢＣｌｉｎｉＧａｍｍａガンマ−カウンターで計数された。パーセント特異的溶解は式：
１００ｘ実験的放出−自発的放出／最大放出−自発的放出
から決定された。最大放出は１％トリトンＸ−１００含有培地中の標的細胞の溶解により決定された。”自発的放出”のカウントが”最大放出”の２０％を超えたならば、アッセイは正当とは考えられなかった。
【０１５２】
ＣＤ８+Ｔ細胞の補体溶解
ＣＤ８+Ｔ細胞はα−ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウサギ補体（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で４５分間インキュベートした。
【０１５３】
サイトカイン／ケモカイン発現分析
ＣＴＬアッセイのために刺激されたエフェクターからの上清が６日目に集められ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＭＩＰ−１α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＭＩＰ−ｌβおよびＲＡＮＴＥＳ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐａｃｅ，ＮＹ）のためのＥＬＩＳＡキットを使用してサイトカインおよびケモカインプロフィールが試験された。
【０１５４】
結果サイトカイン発現カセットの構築
サイトカイン遺伝子は個々にｐＣＤＮＡ３プラスミド発現ベクター内へクローン化された。サイトカイン構築物がそれらの適切なタンパク質を発現しているかどうかを試験するため、それらをＲＤ筋肉細胞株内へトランスフェクトし、これらの構築物の発現をサイトカインＥＬＩＳＡにより分析した。結果は各々の発現カセットが特異的サイトカインを産生していることを示している（Ｇ−ＣＳＦ〜４０−６０ｐｇ／ｍｌ；ＧＭ−ＣＳＦ ＞７０ｐｇ／ｍｌ；Ｍ−ＣＳＦ 〜６０−７０ｐｇ／ｍｌ）。
【０１５５】
Ｇ−ＣＳＦはＴヘルパー応答の促進を誘導する
Ｇ−ＣＳＦはマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞および骨髄間質細胞により産生される増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦは好中球、内皮細胞および血小板を活性化するが、抗原提示細胞には直接的な影響をほとんど及ぼさないと考えられている。抗原特異的抗体応答に対するＧ−ＣＳＦ共発現の影響が試験された。ｐＣＥｎｖおよびｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦ免疫マウスからの抗血清を集め、ＥＬＩＳＡによりＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質に対する特異的抗体応答を分析した。ＤＮＡ免疫感作６週間後に集められた血清からのｇｐ１２０特異的抗体力価が測定された。Ｇ−ＣＳＦ共免疫感作はｇｐ１２０特異的抗体応答レベルには有意な影響を与えなかった。同様な結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で観察された。さらに、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の共投与により誘導されたｇｐ１２０特異的ＩｇＧのサブクラスが決定された。ＩｇＧ１型の産生はＴｈ２型サイトカインにより誘導され、一方、ＩｇＧ２ａ型の産生はＴｈ１型サイトカインにより誘導されることが報告されている。ＩｇＧ１（Ｔｈ２）に対するＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１）の相対比が測定された。ｐＣＥｎｖ免疫群は０．８のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの比を持っていた。一方、原型Ｔｈ１サイトカインＩＬ−１２遺伝子の共免疫感作は比を１．２８に増加させ、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４遺伝子は比を０．６８に減少させた。Ｇ−ＣＳＦの共投与は比を１．１に増加させ、Ｔｈ１型応答への移行を示している。
【０１５６】
Ｔヘルパー細胞増殖応答に対するＧ−ＣＳＦの影響もまた試験された。Ｔヘルパーリンパ球はＢ細胞を経る体液性免疫応答およびＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞を経る細胞性免疫応答の両方に決定的な役割を果たしている。ＩＬ−１２遺伝子の共免疫感作は抗原特異的Ｔｈ増殖応答レベルを劇的に促進した。対照的に、ＩＬ−４遺伝子の共注射はＴｈ増殖応答に極微な影響しか及ぼさなかった。ＨＩＶ−１免疫原とのＧ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の正の促進を生じた。
【０１５７】
加えて、ＣＴＬ応答に対するサイトカイン共発現の影響も調べられた。対照動物からはバックグラウンドレベルの特異的溶解が観察されたが、ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した動物は小さいがしかし陽性のレベルの抗原特異的ＣＴＬ応答を示した。ＩＬ−１２遺伝子の共注射は抗原特異的ＣＴＬ応答のレベルを劇的に促進した。対照的に、ＩＬ−４遺伝子の共免疫感作はこの応答には極微な影響しか及ぼさなかった。同様に、Ｇ−ＣＳＦ共投与は抗原特異的ＣＴＬ応答に何の促進効果も持っていなかった。
【０１５８】
サイトカインは免疫応答の間、免疫細胞の方向付けおよび標的化に鍵となる役割を果たしている、例えば、ＩＦＮ−γはＴ細胞仲介細胞障害性免疫応答の制御に複雑に関与しており、一方、ＩＬ−４はＢ細胞仲介免疫応答において支配的な役割を果たしている。ＣＴＬアッセイのためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清液を分析し、サイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の放出を試験した。Ｇ−ＣＳＦ発現はＩＦＮ−γレベルを増加させるが（２倍）、ＩＬ−４産生には影響しないことが見いだされた。
【０１５９】
ＧＭ−ＣＳＦは抗体およびＴヘルパー応答の強力な誘導剤である
ＧＣ−ＣＳＦは顆粒球細胞を活性化および分化させ、内皮細胞、赤血球系細胞、巨核球およびＴヘルパー細胞の増殖因子として働くことができる。ＧＭ−ＣＳＦがキラーＴ細胞に影響を及ぼすことができるかどうかは明確ではない。Ｇ−ＣＳＦ共発現と対照的に、ＧＭ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的体液性応答の誘導において著しい促進効果（すべての群で最も高い）を持っていた。ＩＬ−４共注射と同様に、ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作は最も高いレベルのエンベロープ特異的抗体応答を生じさせた。同様な結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で観察された。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作はｐＣＥｎｖ単独で免疫した群と比較した場合、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比には何の影響も及ぼさなかった。さらに、ＩＬ−１２共免疫感作とともに、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とのＧＭ−ＣＳＦ共発現は最も高いレベルの抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答を生じた。ＧＭ−ＣＳＦ発現はＩＦＮ−γレベルを増加させるが（２倍）、ＩＬ−４産生には影響しないことも観察された。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作は抗原特異的ＣＴＬ応答にはわずかな影響しか及ぼさなかった。
【０１６０】
Ｍ−ＣＳＦはＣＴＬ応答の強力な誘導剤である
Ｍ−ＣＳＦはマクロファージならびにマクロファージ前駆細胞の強力な活性化剤である。Ｍ−ＣＳＦレセプターは制限された発現パターンを持っており、再びマクロファージに限られている。そういうものであるので、このＡＰＣ集団に対するＭ−ＣＳＦ共送達の直接効果が評価できる。ＧＭ−ＣＳＦと異なり、ｐＣＥｎｖとのＭ−ＣＳＦの共発現はＨＩＶ−１エンベロープ特異的抗体応答に対して陽性の促進効果を持っていた（しかしＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦよりは小さい）。ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦでの共投与後のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの相対比が決定された。ｐＣＥｎｖ免疫群は０．８のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの比を持っていた。一方、ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦの共注射は比を１．２に増加させ、Ｔｈ１型応答への強い移行を示している。さらに、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とのＭ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の著しい増加を生じた。ＣＴＬ活性にほとんど影響を及ぼさないｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦまたはｐＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共注射と異なり、ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共注射後に、ＨＩＶ−１エンベロープを発現しているワクシニア感染標的（ｖＭＮ４６２）の特異的溶解における、より劇的な増加が生じた。５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でのｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共注射後に、標的細胞のほとんど４０％の特異的溶解が観察された。同様に、ｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋Ｍ−ＣＳＦで免疫したマウスでは、ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌを発現しているワクシニア感染標的（ｖＶＫ１）の抗原特異的ＣＴＬ溶解の著しい促進が生じた。ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦで免疫したマウスによるＩＦＮ−γ放出レベルは、ｐＣＥｎｖ免疫または対照群よりも著しく高かった。一方、これらの群のＩＬ−４レベルは類似していた。
【０１６１】
Ｍ−ＣＳＦ共免疫感作によるＣＴＬ応答の促進はＣＤ８Ｔ細胞制限的である
Ｍ−ＣＳＦ共発現を経るＣＴＬ応答の増加がＣＤ８+Ｔ細胞に制限されているかどうかを決定するため、ｂａｌｂ／ｃマウスでＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬの特異的エピトープであることが示されているＨＩＶ−１エンベロープペプチド（ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）を用いてＣＴＬアッセイが実施された。マウスは５０μｇの各々のＤＮＡ構築物で２週間あけて免疫感作し、第二の免疫感作１週間後に脾臓を採取した。ＣＴＬアッセイは前記のようにインビトロでエンベロープ特異的ペプチドを用いて刺激した後に単離脾臓細胞に対して実施された。Ｍ−ＣＳＦ両方の共注射後、５０：１のＥ：Ｔ比で４０％の特異的溶解を示すＣＴＬ応答の著しい促進が観察された。補体溶解によりエフェクター細胞集団からＣＤ８+Ｔ細胞を除去した後にＣＴＬ活性を測定することによりこの観察を確認した。ＣＤ８+Ｔ細胞の除去はＭ−ＣＳＦの共注射後に観察された抗原特異的ＣＴＬ促進を抑制した。これらの結果は、細胞溶解活性の促進は抗原特異的、クラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存的であったことを示している。
【０１６２】
Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の共送達は刺激されたＴ細胞によるβ−ケモカイン産生を調節する
刺激されたＴ細胞からのβ−ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＲＥＳ）発現プロフィールが試験された。これらのβ−ケモカインはマクロファージ指向性（しかしＴ細胞指向性ではない）ウイルスに対してＣＤ８+Ｔ細胞により産生される主ＨＩＶ抑制因子である。さらに、これらのＣＤ８+Ｔ細胞産生ケモカインは末梢における細胞性免疫展開に決定的な役割を果たしていることが示されている。特に、我々はｐＣＥｎｖによるＤＮＡ免疫感作はβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＲＥＳを誘導することを観察した。さらに、造血サイトカイン遺伝子による共免疫感作は、刺激されたＴ細胞によるケモカインの発現を増加させることが観察された。例えば、ＭＩＰ−α発現はｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦによる共免疫感作により、ｐＣＥｎｖ単独の免疫感作により発現されるレベルよりも劇的に促進できることが観察された。加えて、ＭＩＰ−β発現はｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共免疫感作により劇的に促進されることが観察された。一方、ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ、ｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦおよびｐＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作は、刺激されたエフェクター細胞によるＲＡＮＴＥＳ発現の促進を、ＤＮＡワクチンカセット単独により誘導されるレベルよりも著しく高めなかった。しかしながら、興味あることに、Ｍ−ＣＳＦは遺伝子免疫感作それ自身により誘導されるよりも低いレベルにＭＩＰ−１αを下方調節するようである。このデータはＭＩＰ−１αはＣＴＬ応答の駆動に直接的に関与しているのではなく、実際にはその誘導を妨害しているのであろう。
【０１６３】
考察
局所免疫環境（注入部位または筋肉中の局所リンパ節の末梢）の処置は免疫応答の程度および方向性の両方に影響されるであろう。ＤＮＡワクチンのための分子アジュバントとしてＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ遺伝子共送達により引き出される免疫効果が試験された。
【０１６４】
Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ構築物はすべてＤＮＡワクチンの免疫プロフィールを独自に調節することが観察された。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球系列の造血細胞の増殖、分化および活性化に特異的効果が最も知られている多面発現性サイトカインである。それは主として、エンドトキシン、ＩＬ−１，ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γを含む種々の刺激による活性化により単球およびマクロファージで産生される。それは好中性顆粒球前駆体の増殖および成熟を制御し、成熟好中球に直接的に作用して食細胞活動、ＡＤＣＣ、スーパーオキシド発生、細胞遊走および細胞表面接着分子の発現を促進する。Ｇ−ＣＳＦのインビトロ投与は、骨髄造血前駆細胞からの好中球コロニー形成を刺激できる。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦは化学療法および放射線療法誘導好中球減少症の処置のために最も普通に投与される。Ｇ−ＣＳＦ共免疫感作は抗体応答全体にほとんど影響を及ぼさないことが観察された。Ｇ−ＣＳＦ共発現は免疫応答をＴｈ１型への移行を調節し、それはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の増加およびＩＮＦ−γの促進された発現により示された。総合的にいえば、Ｇ−ＣＳＦは直接的に抗原提示には影響しないが、最善の状態では抗原特異的免疫応答に中程度の効果を持っている。
【０１６５】
ＧＭ−ＣＳＦは種々の造血細胞の増殖、成熟および機能を刺激できる多面発現性サイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは最初は好中球、単球／マクロファージおよび好酸球コロニー形成を刺激するその能力で認知された。それはサイトカインまたは免疫および炎症性刺激に応答して、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含む種々の細胞型により産生される。ＧＭ−ＣＳＦはＣＤ４＋Ｔｈ細胞の強力な誘導剤であることが観察され、それは強いＴヘルパー増殖応答ならびに抗体応答の強い押し上げにより示された。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作はＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比に対しては何の効果も持っていなかった。加えて、ＧＭ−ＣＳＦ共投与はＣＤ８+Ｔ細胞に対して注目に値する影響を及ぼさないようであり、そらは抗原特異的ＣＴＬ応答誘導に対して影響を及ぼさないことにより示された。従って、このサイトカインによるワクチン補助は全面的にＴヘルパー細胞に焦点が当てられる。これらの結果は、分子アジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ構築物の使用に関する以前の研究を支持および拡張するものである。狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現しているプラスミドおよびマウスＧＭ−ＣＳＦをコードしているプラスミドの筋肉内共接種はＢおよびＴヘルパー細胞活性を促進したことが報告されている。同様に、我々はＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡとＤＮＡワクチン構築物の共免疫感作は抗原特異的抗体およびＴｈ細胞増殖応答を増加させたことを報告した。対照的に、これらの研究ではＧＭ−ＣＳＦ遺伝子ではＣＴＬ誘導に対してはほとんど効果がなかったことが観察されている。同様な発見がインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードしているＤＮＡ免疫原とのＧＭ−ＣＳのＦ共送達を用いて報告されている。我々はまたＨＳＶ−２ｇＤタンパク質をコードしているＤＮＡ発現構築物とＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ構築物を共送達した。生じる免疫表現型およびＨＳＶ致死的感染後の免疫化動物の死亡率および罹患率が分析された。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子共投与は生存率を高めるだけでなく、膣内ＨＳＶ感染に続くヘルペス性病変の頻度および重症度が減少することが観察された。
【０１６６】
Ｍ−ＣＳＦは単核食細胞の成長、分化および機能の制御因子であることが示されている。それはまた、接着分子およびＦｃレセプターの発現を増加させ、殺腫瘍性活性を増加させ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βを含むサイトカインの二次放出を促進する。Ｍ−ＣＳＦは元々血清、尿および他の生物学的液体中に、骨髄造血前駆細胞からのマクロファージコロニー形成を刺激できる因子として発見された。線維芽細胞、子宮内膜の分泌上皮細胞、骨髄間質細胞、脳アストロサイト、骨芽細胞、腎メサンギウム細胞、ケラチノサイトおよびＬＳＰまたはサイトカイン活性化マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞および内皮細胞を含む多くの細胞がＭ−ＣＳＦを産生できる。試験されたＣＳＦの中で、Ｍ−ＣＳＦは最も強力なＣＤ８+ＣＴＬの活性化剤であった。Ｍ−ＣＳＦ発現により誘導されたＣＴＬ応答の促進は、ＭＨＣクラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞両方に依存性であった。促進されたＣＴＬの結果は、促進されたＩＮＦ−γの産生および増加したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比により支持された。ＧＭ−ＣＳＦの影響と異なり、Ｍ−ＣＳＦ共発現は抗体応答には弱い影響しか及ばさなかった。ＧＭ−ＣＳＦの影響と同様に、ＨＩＶ−１免疫原とのＭ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の増加を生じた（ただしより低い程度で）。ＣＴＬ経路はこのサイトカインにより特に影響を受けるようである。
【０１６７】
Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインおよびＣＳＦ遺伝子の免疫調節効果を比較するのは興味を持たれた。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ共注射は、ＩＬ−４共免疫感作と同様に抗体応答レベルを正に調節した。一方、ＩＬ−４共免疫感作はＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の劇的な減少に見られるように、より高いＴｈ２型応答を導いた。さらに、Ｔｈ増殖性応答に対するＧＭ−ＣＳＦ共注射の劇的な促進効果は、ＩＬ−１２共投与の効果とのみ一致した。一方、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の共送達は、ＣＤ８+Ｔ細胞制限ＣＴＬ応答の著しい促進を生じたが、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦでは生じなかった。これらの結果は、免疫活性化部位でのこれらの増殖因子の産生がインビボでＤＮＡワクチン誘導免疫応答レベルを制御できることを示している。さらに、これらの結果はこれらの増殖因子は、伝統的なＴｈ１およびＴｈ２型サイトカインの分野で以前に考えられていた免疫応答カスケードにおける役割よりもより活性な役割を果たすことができることを暗示している。
【０１６８】
細胞に基づいた応答の分析に加え、ＣＳＦ遺伝子の共発現により生じるケモカイン産生の調節も試験された。ケモカインは免疫および炎症性応答の重要な調節因子である。それらは血管から宿主防御末梢部位への白血球やりとりの分子調節に特に重要である。さらに、いくつかのケモカインは末梢における免疫発現の制御に決定的な役割を果たしていることが示されている。ＣＤ８+エフェクターＴ細胞はケモカイン発現を上昇させる間にそれらは免疫応答を開始することが観察され、抗原特異的免疫応答の拡大段階におけるこれらの最終段階エフェクター細胞に対する制御的役割を示唆している。炎症性および免疫応答におけるそれらの機能に加え、いくつかのケモカインはＡＩＤＳの伝播および進行に重要な役割を果たしているであろう。１０年の間、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４０への結合はウイルス融合および進入には十分ではないと予想されており、ＨＩＶ感染のための追加の細胞表面補因子の必要性が示唆されている。最近の研究からＴ細胞指向性およびマクロファージ指向性ウイルスとそれらの標的細胞の融合に必要とされる補レセプターは各々ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５であると同定された。β−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ−５の天然のリガンドであり、マクロファージ指向性（しかしＴ細胞指向性ではない）ＨＩＶ単離物のためのＣＤ８+Ｔ細胞により産生される主ＨＩＶ抑制因子の一つである。
【０１６９】
インビボ刺激細胞によるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの発現が試験され、ＣＳＦ遺伝子の共免疫感作により抗原刺激Ｔ細胞によるケモカイン発現の増大が生じることが観察された。ＭＩＰ−１α産生はｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦによる共免疫感作により、ｐＣＥｎｖ単独の免疫感作により産生されるレベルよりも劇的に促進することができることが観察された。特に、ＭＩＰ−１β発現はｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共免疫感作により劇的に促進されたことが見いだされた。対照的に、刺激されたエフェクター細胞によるＲＡＮＴＥＳ発現の有意な促進は共注射法のいずれによっても生じなかった。観察された別の一つの新規効果はＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βの劇的な上昇、および同じ時期のＭＩＰ−１αの減少であった。実際、Ｍ−ＣＳＦにより誘導されたＭＩＰ−１αレベルは本当に対照レベルより低かった。このデータはＣＣＲ１、ＣＣＲ４およびＣＣＲ５を通したＭＩＰ−１α信号伝達は、ＣＣＲ３またはＣＣＲ９を通して送達される信号とは異なった信号を生じていることを示唆している。この発見から免疫応答に対するこれらの推定レセプター効果が識別されるかもしれない。
【０１７０】
これらの結果は増殖因子ｃＤＮＡ構築物の共送達は体液性および細胞性（ケモカインの産生を含んで）免疫応答の両方を調節することを示している。特に、Ｍ−ＣＳＦの共注射は抗原特異的ＣＴＬ誘導およびケモカイン産生に最も大きい制御効果を持っていた。
【０１７１】
実施例５：ＩＣＡＭ−１はＴ細胞共刺激およびケモカイン産生を提供する
ケモカインにより密接に制御されている三つの特異的接着分子の免疫調節効果が試験された。インビボでの免疫活性化におけるＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の役割を探査するためにＤＮＡワクチン技術を利用した。特定的に、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の遺伝子を個々にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある発現ベクター内へクローン化した。これらの構築物は次にＨＩＶ−１エンベロープまたはｇａｇ／ｐｏｌ抗原をコードしているＤＮＡ免疫原とともに共免疫感作された。抗原特異的免疫応答レベルに対するこれらの接着分子カセット共注射の免疫学的影響が分析された。
【０１７２】
抗原特異的Ｔ細胞応答がＤＮＡ免疫原と接着分子ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の共発現により促進できた。しかしながら、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３は抗原特異的体液性応答の発現には何の役割も果たしていないようである。ＬＦＡ−３はＣＤ４+Ｔ細胞応答を促進し、ＣＤ８+Ｔ細胞機能にはほとんど影響を及ぼさなかった。より重要なことは、ＩＣＡＭ−１共投与はＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を劇的に増加させた。ＩＣＡＭ−１共発現はまた、抗原特異的β−ケモカイン産生を劇的に促進し、末梢Ｔ細胞展開におけるＬＦＡ−１の結合に対する重要な役割を示唆している。これらの分子の活性化表現型は原型ＣＤ８０／ＣＤ８６共刺激分子とは異なっているようである。これらの結果は、サイトカイン、ケモカインおよび接着分子の末梢ネットワークがエフェクター機能部位でエフェクターＴ細胞応答を整合的に制御していることを支持している。
【０１７３】
材料および方法ＤＮＡプラスミド
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｐＣＥｎｖ）およびｇａｇ／ｐｏｌタンパク質（ｐＣＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現しているＤＮＡワクチンはＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ．１５，６４１−６４５（本明細書において援用される）に説明されているように製造された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の遺伝子はｐＣＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化され、きれいなプラスミドＤＮＡはＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０８９−１１０３に説明されているように製造された。
【０１７４】
試薬および細胞株
ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）およびマウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞株はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＨＩＶ−１エンベロープ（ｖＭＮ４６２）、ｇａｇ／ｐｏｌ（ｖＶＫ１）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｖＳＣ８）を発現している組換え体ワクチンはＮＩＨＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲｅａｇｅｎｔＰｒｏｇｒａｍから入手した。組換え体ｇｐ１２０またはｐ２４タンパク質はＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。
【０１７５】
接着分子発現構築物の発現
ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、およびＶＣＡＭ−１構築物の発現はそれらをＲＤ細胞へトランスフェクトすることにより分析された。細胞はトランスフェクション７２時間後に採取し、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１のためのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で分析された。
【０１７６】
マウスのＤＮＡ接種
６から８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の大腿４頭筋にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）および０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に処方した問題とする各々のＤＮＡ構築物５０μｇを注射した。種々の遺伝子発現カセットの投与は、注射前に選択されたプラスミドを混合することにより行った。対照マウスは５０μｇのｐＣＤＮＡ３ベクターで免疫した。各々の研究の組は３度実施され、代表的な組の結果が示されている。マウスには２回の免疫感作（各々５０ｍｇ）を２週間の間隔で行った。追加注射１週間後、マウスを殺し、脾臓を採取してリンパ球を単離し、細胞応答を試験した（ＴｈまたはＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球））。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡ
０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈した１５μｇのｐ２４またはｇｐ１２０タンパク質を４℃で一夜、マイクロタイターウェルに吸着させた。プレートはＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０で洗浄し、３７℃で１時間３％ＢＳＡのＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０溶液でブロックした。マウス抗血清は０．０５％トウィーン−２０で希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、次にＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートした。プレートを洗浄し、３’３’５’５’ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）緩衝溶液で発色させた。プレートはＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ５０００プレートリーダー上、４５０ｎｍの光学密度が読みとられた。
【０１７８】
Ｔヘルパー細胞増殖アッセイ
リンパ球を脾臓から採取し、赤血球を除去することによりおよび新鮮な培地で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製された。単離された細胞懸濁液は５ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５ｘ１０5細胞を含んでいる１００μｌをすぐに９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各々へ加えた。５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度で組換え体ｐ２４またはｇｐ１２０タンパク質をウェルに３重に加えた。細胞は５％ＣＯ2中、３７℃で３日間インキュベートした。各々のウェルに１ｍＣｉのトリチウム化チミジンを加え、細胞は３７℃で１２から１８時間インキュベートした。プレートを採取し、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をＢｅｔａＰｌａｔｅリーダー（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。刺激指数は式：刺激指数（ＳＩ）＝（実験的カウント／自発的カウント）から決定された。自発的カウントウェルは不適切タンパク質対照として働く１０％ウシ胎児血清を含んでいる。加えて、ｐＣＥｎｖまたは対照免疫動物は決まりきってＰｒ５５タンパク質に対して１のＳＩを持っている。同様に、ｐＣＧａｇ／ｐｏｌまたは対照は決まりきってｇｐ１２０タンパク質に対して１のＳＩを持っている。細胞が健康であるのを確かめるため、ＰＨＡまたはｃｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）がポリクローナル刺激物質陽性対照として使用された。ＰＨＡまたはｃｏｎＡ対照試料は２０−４０のＳＩを持っていた。
【０１７９】
細胞障害性Ｔリンパ球アッセイ
ワクシニア感染標的を使用して５時間の51Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイが実施された。アッセイはインビトロでのエフェクター刺激で実施され、エフェクターは適切なワクシニア感染細胞（エンベロープに対してはｖＭＮ４６２およびｇａｇ／ｐｏｌに対してはｖＶＫ１）で刺激され、ＣＴＬ培養培地中（５ｘ１０6細胞／ｍｌ）で、０．１％グルタルアルデヒドを用いて５日間固定された。エフェクターはＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびＣｏｎ Ａを含まない１０％ＲＡＴ−Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から成るＣＴＬ培養培地で２日間、非特異的に刺激された。ワクシニア感染標的は３７℃で５から１２時間、１０−２０の感染多重度（ＭＯＩ）で３ｘ１０6のＰ８１５細胞を感染させることにより調製された。標準クロム放出アッセイが実施され、そこで標的細胞は１００ｍＣｉ／ｍｌＮａ251ＣｒＯ2で６０から１２０分間標識され、刺激エフェクター脾臓細胞と３７℃で６時間インキュベートされた。ＣＴＬ溶解は５０：１から１２．５：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で決定された。上清を採取し、ＬＫＢＣｌｉｎｉＧａｍｍａガンマ−カウンターで計数された。パーセント特異的溶解は式：
１００ｘ実験的放出−自発的放出／最大放出−自発的放出
から決定された。最大放出は１％トリトンＸ−１００含有培地中の標的細胞の溶解により決定された。”自発的放出”のカウントが”最大放出”の２０％を超えたならば、アッセイは正当とは考えられなかった。
【０１８０】
ＣＤ８+Ｔ細胞の補体溶解
ＣＤ８+Ｔ細胞はα−ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウサギ補体（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で４５分間インキュベートした。
【０１８１】
サイトカイン／ケモカイン発現分析
ＣＴＬアッセイのために刺激されたエフェクターからの上清が６日目に集められ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４、およびＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−ｌβおよびＲＡＮＴＥＳのためのＥＬＩＳＡキットを使用して発現が試験された（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）。
【０１８２】
結果
ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１はトランスフェクトされた細胞により発現できる
ＩＣＡＭ−１（ｐＣＩＣＡＭ−１）、ＬＦＡ−３（ｐＣＬＦＡ−３）およびＶＣＡＭ−ｌ（ｐＣＶＣＡＭ−１）遺伝子は個々にｐＣＤＮＡ３発現ベクター（図２）内へクローン化された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１構築物がそれらの適切なタンパク質を発現できるかどうかを試験するため、それらをヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞株内へトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析を使用し、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１発現カセットのトランスフェクションが、各々ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の特異的発現を生じさせたことが観察された。また、二つのＤＮＡ発現カセットの筋肉内共免疫感作により、同じ筋肉細胞内で両方のコードされたタンパク質が共発現していることもインビボで観察した。
【０１８３】
接着分子の共発現はＡｇ特異的体液性免疫応答に影響しない
次に、抗原特異的免疫応答の誘導に対する接着分子共発現の影響を調べた。すべての実験において、５０μｇの各々のＤＮＡ発現構築物が、週０および２にＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉内へ注射された。調べられた第一の免疫パラメーターは抗原特異的体液性応答であった。週０、２および６に免疫マウスからの抗血清が集められ、ＥＬＩＳＡによりＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質に対する特異的抗体応答が分析された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の共発現はｐＣＥｎｖ免疫感作により誘導された特異的抗体結合プロフィールに極微の影響しか及ぼさなかったようである。同様の結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで共免疫した群で観察された。
【０１８４】
ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現はＡｇ特異的Ｔｈ増殖性応答を促進する
細胞性免疫応答の程度に対する接着分子共発現の影響もまた調べられた。ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞増殖性応答の誘導は、Ｔｈ細胞がＢ細胞を経る体液性免疫応答およびＣＤ８+Ｔ細胞を経るＣＴＬ応答の両方に決定的な役割を果たしているので重要である。ｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫したマウスのＴｈ増殖性応答およびＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１で共免疫した該応答が測定された。組換え体ｇｐ１２０ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）がＴ細胞増殖の特異的刺激のために各々のウェルに加えられた。また、無関係なタンパク質を用いてＴ細胞の非特異的刺激をこれらの群で分析し、非特異的抗原はインビトロでＴ細胞増殖性応答を誘導しないことを観察した。バックグラウンドレベルの増殖が対照ベクターで免疫した対照群で観察され、中レベルの増殖がｐＣＥｎｖ単独で免疫した群で観察された。対照的に、ｐＣＩＣＡＭ−１またはｐＣＬＦＡ−３で共免疫した群は著しく高いレベルの増殖性応答を持っていた。一方、ＶＣＡＭ−１遺伝子で共免疫した群は抗原特異的Ｔｈ応答の促進を示さなかった。同様の結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで共免疫した群で観察された。どちらか一方の免疫原を使用した反復実験で、ｐＣＩＣＡＭ−１またはｐＣＬＦＡ−３の共送達は抗原特異的増殖性応答の３から４倍の増加を生じた。
【０１８５】
ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現はＡｇ特異的ＣＴＬ応答を促進する
細胞免疫性の促進をさらに調べるため、ｐＣＥｎｖおよびｐＣＧａｇ／ｐｏｌで共免疫したマウスの脾臓細胞を使用してＣＴＬアッセイを実施した。特異的および非特異的ワクシニア感染またはペプチド処理標的からのクロム放出測定に先立ってエフェクター脾臓細胞のインビトロ刺激が実施された。標的の特異的溶解を計算するため、特異的標的のパーセント溶解から無関係標的のパーセント溶解が差し引かれた。バックグラウンドレベルの特異的溶解がｐＣＤＮＡ３、ｐＣＩＣＡＭ−１、ｐＣＬＦＡ−３またはｐＣＶＣＡＭ−１で免疫感作した対照動物で観察され、ｐＣＥｎｖで免疫感作した動物は低レベルのＣＴＬ応答を示した。一方、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＩＣＡＭ−１による共免疫感作はＣＴＬ活性の劇的な増加を生じた。ＨＩＶ−１エンベロープワクシニア（ｖＭＮ４６２）感染標的の４０％を超える特異的溶解が、５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でのｐＣＥｎｖ＋ｐＣＩＣＡＭ−１による共免疫感作後に観察された。ＣＴＬ活性は１２．５：１のＥ：Ｔ比では２０％特異的溶解に減少した。対照的に、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＬＦＡ−３による共免疫感作はＣＴＬ活性のより穏やかな増加を生じた。同様のＣＴＬの結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ｐＣＩＣＡＭ−１およびｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ｐＣＬＦＡ−３による共免疫感作後に観察された。
【０１８６】
ｐＣＩＣＡＭ−１およびｐＣＬＦＡ−３の共発現を経るＣＴＬ応答の増加がＣＤ８+Ｔ細胞に限定されているかどうかを決定するため、補体溶解によりエフェクター細胞集団からＣＤ８+Ｔ細胞を除去してまたは除去しないでＣＴＬ活性を測定することによるＣＴＬアッセイが実施された。ＣＤ８+Ｔ細胞の除去はｐＣＩＣＡＭ−１およびｐＣＬＦＡ−３の共注射後に観察された抗原特異的ＣＴＬ促進の抑制を生じた。これらの結果は細胞溶解性活性の促進は抗原特異的およびＣＤ８+Ｔ細胞依存的であったことを示している。
【０１８７】
ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現は刺激Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を増加させる
免疫化動物における刺激ＣＴＬによるサイトカイン産生の分析は観察されたＣＴＬの結果を支持している。サイトカインは免疫応答発生の間、免疫細胞の方向付けおよび標的化に鍵となる役割を果たしている、例えば、ＩＦＮ−γはＴ細胞仲介細胞障害性免疫応答の制御に複雑に関与しており、一方、ＩＬ−４はＢ細胞仲介免疫応答において支配的な役割を果たしている。ＣＴＬアッセイのためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清液を分析し、サイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の放出を試験した。ｐＣＩＣＡＭ−１の共注射はＩＦＮ−γレベルを著しく増加させることが観察された。ｐＣＬＦＡ−３の共注射ではＩＦＮ−γ産生の増加はより穏やかなものであった。一方、すべての群から放出されたＩＬ−４のレベルは同様であった。
【０１８８】
ＩＣＡＭ−１の共発現は刺激Ｔ細胞によるβ−ケモカイン産生を増加させる
最近、我々は感染末梢部位での特定のケモカイン産生を通してインビボでのＣＤ８+エフェクターＴ細胞が抗原特異的応答を拡大させることを報告した。従って、刺激ＣＴＬによるβ−ケモカインの産生を分析した。ＣＴＬのためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清を分析し、β−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの放出が試験された。前に観察されたように、ｐＣＥｎｖでのＤＮＡ免疫感作は、対照ベクターよりも著しく高いＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳ発現レベルを誘導した。さらに、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＬＦＡ−３の共注射は、ｐＣＥｎｖ免疫群よりもβ−ケモカイン産生レベルを増加させた。なおさらに著しいことに、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＩＣＡＭ−１による共免疫感作ではｐＣＥｎｖ免疫群よりもβ−ケモカイン産生の劇的な促進が生じた。対照的に、ｐＣＩＣＡＭ−１による共投与はケモカイン発現を促進しなかった。これらの結果は、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３は直接的Ｔ細胞共刺激を提供するということを支持している。
【０１８９】
ＩＣＡＭ−１およびＣＤ８６の共発現はＡｇ特異的ＣＴＬ応答を相乗的に促進する
Ｂ７（ＣＤ８０およびＣＤ８６）経路はＴ細胞応答を開始および拡大するための決定的な第二のシグナル送達のための主共刺激経路であると考えられている。これらの分子はＤＮＡワクチン関連では調節因子として試験されてきた。この関連において、ＣＤ８６分子はワクチンアジュバントとして送達された場合、ＣＤ８+細胞障害性Ｔリンパ球の抗原特異的誘導に突出した役割を果たしているようである。ＤＮＡ免疫原とともにＣＤ８６ｃＤＮＡを共投与すると抗原特異的ＣＤ８+ＣＴＬ応答が劇的に増加した。ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の効果はＢ７−ＣＤ２８シグナル依存的であるかもしれないし、またはインビボでＣＴＬ誘導を駆動するための別の相乗的経路を代表しているかもしれない。従って、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３分子がＣＤ８６分子と共発現された場合、ＣＴＬ誘導レベルを相乗的に促進することができるかどうかをさらに探査した。ＩＣＡＭ−１およびＣＤ８６分子の共発現は抗原特異的ＣＴＬ応答を相乗的に促進できることが観察された。一方、ＬＦＡ−３およびＣＤ８６分子の共発現はＣＴＬ応答レベルを改良しなかった。これらの結果は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３経路はＣＤ８６／ＣＤ２８経路と独立したＴ細胞共刺激シグナルを提供することを示しており、インビボではそれらはＴ細胞応答を拡大するために相乗的に働いているのであろう。
【０１９０】
刺激されたＣＴＬによるＩＦＮ−γおよびβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳ産生レベルはさらにこれらの結果を支持しており、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１シグナルはＣＤ８６／ＣＤ２８シグナルと独立して働き、Ｔ細胞応答を拡大するために調和して働くことを示している。前記の方法を用いてエフェクターＴ細胞からの上清を分析した場合、ＬＦＡ−３およびＣＤ８６の共投与は劇的に高いレベルのＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳを生じさせた。これらの結果はさらにＴ細胞活性化におけるＩＣＡＭ−１およびＣＤ８６の相乗的性質を暗示している。
【０１９１】
考察 
免疫または炎症性反応の間、抗原がふれた部位へリンパ球が運ばれる。リンパ球および内皮細胞の接着分子が、直接の細胞接触および白血球の移動の方向付けに重要な役割を果たしている。加えて、接着分子はＡＰＣへのＴリンパ球の結合に重要な役割を果たしている。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）は９０−１１４ｋＤの分子であり、内皮細胞、マクロファージおよび樹状細胞上に発現され、ＬＦＡ−１およびＭａｃ−１に結合する。Ｔリンパ球を含むほとんどすべての白血球はＬＦＡ−１を発現するが、Ｍａｃ−１発現は単球、マクロファージおよび顆粒球に制限されている。ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）はＡＰＣを含む種々の細胞型により発現される５５−７０ｋＤの表面分子である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，ｅｔａｌ．１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３−２５２、本明細書において援用される）。血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は活性化内皮細胞および平滑筋細胞上に発現される１１０ｋＤの表面分子である（Ｏｓｂｏｍ，Ｌ．，ｅｔａｌ．１９８９．Ｃｅｌｌ．５９：１２０３−１２１１、本明細書において援用される）。ＶＣＡＭ−１は、好酸球、リンパ球、単球および好塩基球を含むほとんどの単核白血球で構成的に発現される最後期抗原−４（ＶＬＡ−４）を認識し結合するが、好中球には存在しない（Ｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ．１９９０ Ｃｅｌｌ．６０：５７７−５８４、本明細書において援用される）。ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用は白血球移動および血管外遊出に重要な役割を果たしている。
【０１９２】
本研究においては、Ｔ細胞活性化および展開に必要とされる刺激シグナルの提供におけるこれらの細胞表面接着分子の役割を調べるためにＤＮＡ免疫原モデルが利用された。二つのシグナルＴ細胞活性化モデルにおいて、第一の活性化シグナルはＴ細胞レセプターへの抗原性ペプチド−ＭＨＣ複合体の結合により仲介される。第二の共刺激シグナルはＣＤ８０／ＣＤ８６共刺激分子とＴ細胞上に存在するそれらのレセプター（ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４）との結合を通して提供される。この２シグナルモデルは概念的に簡単であり、実験結果からよく支持されているが、Ｔ細胞活性化過程間に供給される共刺激シグナルはＢ７（ＣＤ８０／ＣＤ８６）分子のみに制限されているわけではない。ＡＰＣ上の接着分子のような追加の細胞表面分子もまた共刺激の提供に重要な機能を持っているであろうが、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞への直接的シグナルの提供におけるそれらの役割は調査中である。
【０１９３】
接着分子は白血球のやりとり、炎症性細胞の補充および免疫監視に重要である。最近、Ｔ細胞活性化における接着分子の役割が示唆された。接着分子のサブセット（すべてＴ細胞上のリガンドに結合する）を使用してその役割が調べられた。三つの関連分子ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）が選択された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１をコードしているＤＮＡ発現カセットをＤＮＡ免疫原とともに利用し、抗原に加えた接着分子の共発現の特異的効果を捜し求めた。抗原特異的Ｔ細胞（ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方）応答はＤＮＡ免疫原および接着分子ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の共発現により促進できたことが観察された。ＤＮＡ免疫原に加えたＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現はＴｈ細胞増殖性応答の著しい促進を生じた。加えて、ｐＣＩＣＡＭ−１の共免疫感作はＣＤ８限定ＣＴＬ応答の劇的な促進を生じた（ｐＣＬＦＡ−３ではより穏やかな）。これらの観察結果は、ＬＦＡ−３の共注射で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γならびにβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの産生レベルが増加したという発見によりさらに支持された。より印象的なことは、ＩＣＡＭ−１の共免疫感作はＩＦＮ−γおよびβ−ケモカインのより劇的な促進が生じたことである。増加した細胞接触または細胞の並置だけでは抗原特異的Ｔ細胞仲介応答を促進するには十分でないことに注目するのも重要である。ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１は同じような分子量を持ってはいるが、ＶＣＡＭ−１の共注射はＴ細胞応答に測定可能な影響を与えなかった。一方、ＩＣＡＭ−１共発現はＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方のレベルを劇的に促進させた。これらの結果はＴ細胞刺激効果はそれらの接着特性または分子の大きさに固有のものではないことを暗示している。ＣＴＬを促進する両方のＣＴＬ駆動接着分子（ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）が種々のＡＰＣで発現されるのは興味深い。実際、最も良好なＣＴＬ促進接着分子、ＩＣＡＭ−１、は樹状細胞上で発現されていることは重要なことであろう。
【０１９４】
促進されたＣＴＬ誘導と、ＣＤ８６発現で促進されたＣＴＬ誘導を比較した。ＣＤ８６分子とＩＣＡＭ−１の発現を一緒にすると抗原特異的ＣＴＬ応答を促進できた（ＬＦＳ−３分子ではできなかった）ことが観察された。これらの結果は末梢で免疫活性化の重要な役割を果たしているＩＦＮ−γならびにβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの著しく促進された産生によりさらに支持された。これらの分子の生物学的重要性の評価はさらなる研究を必要とするけれども、最近の研究でケモカインＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳとＣＴＬ応答間の関係が見いだされている。追加の研究がこれらの分子の共刺激的役割についてのさらなる見識を提供することができるであろうが、これらの結果はＩＣＡＭ−１分子はＣＤ８６とは独立した経路でＴ細胞共刺激シグナルを提供でき、Ｔ細胞へ提供される共刺激シグナルの全体のレベルを相乗的に増幅するように働くことを示している。全体として、これらの結果は接着分子、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３は重要な共刺激シグナルを提供できることを支持しており、Ｔ細胞活性化の単純２シグナルモデルは不十分であり（しかしながら概念的には有用である）、共刺激の多供給源を持つより新しいモデルをさらに考慮および研究すべきであることを示している。これらの結果はまた、他の表面分子のＴ細胞共刺激機能を利用することを目的としたさらなる研究を保証している。
【０１９５】
これらの研究に関した一つの重要な論点はまさにこれらの分子が細胞性免疫応答を促進するように機能しているかどうかである。最近の研究で、プラスミドＤＮＡの注射がマクロファージおよび樹状細胞を含む定住ＡＰＣをトランスフェクトできることが報告されている。これらの結果はさらに、ＤＮＡ免疫応答を起動させるために骨髄由来細胞の要求性を例示する骨髄キメラを使用した研究によりさらに支持される。本研究で観察されたいくつかの共刺激がトランスフェクションおよび定住する専門のＡＰＣにより起動される増強されたＴ細胞を通して起こすことができることは文献と一致している。
【０１９６】
従来の報告とともに、これらの結果はＴ細胞共刺激におけるＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の役割を支持している。ＬＦＡ−３はクラスＩＩ応答に特別な効果を持っており、一方、一般にＩＣＡＭ−１はβ−ケモカインの促進された産生により示されるようにＣＴＬ誘導およびＣＤ８+エフェクター機能の劇的に強力な駆動剤であった。これらの結果もまた、末梢におけるＴ細胞エフェクターの補充および拡大の調和仮説を支持している。最近我々はそれらの化学誘引機能に加えて、ケモカインが末梢部位での抗原特異的免疫応答の調節および拡大を制御することを報告している。ＣＤ８+Ｔエフェクター細胞は免疫応答を起動する間に、ケモカイン発現レベルを制御することを我々は観察している。従って、走化性において、ケモカインは濃度勾配によりリンパ球の移動を制御している。さらに、リンパ球の末梢への方向付けにおいて、接着分子拡大の相応の再分布が直接的細胞−細胞接触を行わせる。加えて、接着分子の発現は種々の炎症性サイトカインおよびケモカインにより調節されている。例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αは内皮および筋肉細胞上のＩＣＡＭ−１発現を上方制御することが示されている。
【０１９７】
従って、ＣＤ８+Ｔエフェクター細胞はケモカインを生産し、それは炎症部位により多くのＡＰＣおよびＴ細胞を補充するであろう。これらのＴ細胞はβ−ケモカイン産生により刺激され、ＩＦＮ−γ産生を駆動しおよびＴ細胞共刺激を可能にするように働くことができる接着分子の発現を促進する。従って、炎症部位で、エフェクター機能のレベルを拡大するであろう特異的ケモカインおよび接着分子の発現を通してこれらのエフェクターＣＴＬはさらに制御されるであろう。これらの結果は、抗原特異的免疫応答の拡大期における最終段階エフェクターＴ細胞はこれらの分子の調和した発現および放出により運命が方向付けできることをさらに支持している。
【０１９８】
実施例６：接着および共刺激分子は異なった抗原特異的免疫応答を誘導し、インビボでヘルペス単純ウイルス−２に対する保護的免疫性を増強する
Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンドおよび白血球機能関連タンパク質（ＬＦＡ）は各々ＡＰＣ上のＣＤ４０および細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）と相互作用する。共刺激分子ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド、および接着分子ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を共免疫感作し、ｇＤプラスミドワクチンおよびＨＳＶ−２による致死的感染に対する保護についての免疫調節効果を分析した。全身的ｇＤ特異的ＩｇＧ産生がＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドおよびＩＣＡＭ−１の共注射により著しく促進されたことが観察された。しかしながら、ＩｇＧ産生の変化はＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドおよびＩＣＡＭ−１の共注射によってもほとんど観察されなかった。さらに、Ｔｈ１型細胞性応答がＣＤ４０リガンドにより起こり、これに対し、Ｔｈ１およびＴｈ２型免疫応答の両方がＬＦＡ−３により起こされた。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３の共送達はまた、致死的ＨＳＶ−２感染での生存率を高めた。これらの研究は共刺激および接着分子は異なった共刺激経路を持っており、それらは保護的抗原特異的免疫性の発生に重要な役割を果たすことを示している。
【０１９９】
抗原特異的免疫応答の誘導における共刺激および接着分子の特異的役割、ならびにマウスＨＳＶ−２感染モデル系におけるＤＮＡワクチン誘導保護的免疫性を駆動するためのプラスミド送達の一部として共刺激および接着分子を使用するワクチン効果が試験された。共刺激および接着分子は特異的に抗原特異的免疫応答を調節した。特に、共刺激分子（ＣＤ４０リガンド）および接着分子（ＬＦＡ−３）の共送達は抗原依存性様式で著しいＣＤ４+Ｔ細胞活性を誘導し、致死的ＨＳＶ−２感染での生存率を高めた。
【０２００】
材料および方法
マウス
メス４−６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）から購入された。それらは米国国立保健研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）およびペンシルバニア大学ＩＡＣＵＣ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）のガイドラインに沿って世話された。
【０２０１】
試薬
ＨＳＶ−２株１８６（Ｐ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、ペンシルバニア大学、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、から親切にも寄贈された）はベロ細胞株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）中で繁殖させた。組換え体ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質が本研究で組換え体抗原として使用された。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞株はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）から入手した。
【０２０２】
プラスミドおよびＤＮＡ調製
ＤＮＡワクチン、ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質をコードしているｐＡＰＬ−ｇＤ２はＰａｃｈｕｋ，ｅｔａｌ．１９９８ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２６，７９（本明細書において援用される）に記載されているように調製された。ｐＣＤＮＡ３−ＣＤ４０、ｐＣＤＮＡ３−ＣＤ４０リガンド、ｐＣＤＮＡ３−ＬＦＡおよびｐＣＤＮＡ３−ＩＣＡＭ−１を作製するためにＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡの各々が発現ベクターｐＣＤＮＡ３内へクローン化された。プラスミドＤＮＡは細菌中で産生され、二重バンドＣｓＣｌ処方により精製された。
【０２０３】
ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド遺伝子構築物のインビトロ発現
ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１構築物の発現はそれらをＲＤ細胞内へトランスフェクトすることにより分析された。細胞はトランスフェクション７２時間後に採取し、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンドのためのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）によるＦＡＣＳ分析を使用して発現が試験された。
【０２０４】
マウスのＤＮＡ接種
ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿４頭筋に１００μｌのリン酸緩衝液および０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）に処方したｇＤＤＮＡ構築物を２８ゲージ注射針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）を通して注射した。種々のケモカインおよびサイトカイン遺伝子発現カセット試料は注射前にｐｇＤプラスミド溶液と混合させた。
【０２０５】
ＥＬＩＳＡ
ｇＤ特異的ＩｇＧサブクラスの相対レベルを決定するため、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）がＨＲＰと結合された抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＤ２ａ（Ｚｙｒｎｅｄ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して実施された。ＥＬＩＳＡ力価は天然マウス血清と同一の光学密度を示している最も高い血清希釈を基準にして決定された。
【０２０６】
ケモカイン、Ｔｈ１およびＴｈ２型サイトカイン
６ｘ１０6脾臓細胞を含んでいる１ｍｌを２４ウェルプレートに加えた。次に、各々のウェルに１μｇのＨＳＶ−２ｇＤを加えた。５％ＣＯ2中、３７℃で２日間インキュベートした後、細胞上清液を確保し、細胞外液体をサイトカインまたはケモカイン特異的ＥＬＩＳＡプレートに加えることにより市販のサイトカインキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｔｌ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａ．およびＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｄ．）を使用してＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−ｌおよびＭＩＰ−１αのレベルを検出するために使用した。
【０２０７】
膣内ＨＳＶ−２感染
ウイルスを接種する前に。膣内領域を０．１ＭＮａＯＨ溶液に浸した綿付き塗布具（ＨａｒｄｗｏｏｄＰｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｕｉｆｏｒｄ，ＭＥ）でふきとり、乾燥綿付き塗布具で清浄した。マウスは生存率を評価するため毎日検査された。
【０２０８】
統計分析
統計分析は対応のあるスチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡを用いて行われた。異なった免疫感作群間の値が比較された。ｐ値＜０．０５が有意であると考えられた。
【０２０９】
結果
ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１はトランスフェクトされた細胞により発現できる
ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１は個々にｐＣＤＮＡ３発現ベクター内へクローン化された。ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１構築物がそれらの適切なタンパク質を発現することができるかどうかを試験するため、それらをインビトロでヒトＲＤ細胞内へトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析を用い、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１発現カセットが各々ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１の特異的発現を生じていることが観察された。ＲＤ細胞はｐＣＤＮＡ３（対照）またはＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を発現しているｐＣＤＮＡ３でトランスフェクトされた。トランスフェクションして３日後、細胞をプレートから除き、トランスフェクトされた遺伝子産物の発現を検出するため、α−ＣＤ４０、α−ＣＤ４０リガンド、α−ＬＦＡ−３およびα−ＩＣＡＭ−１抗体を用いるＦＡＣＳ分析により分析した。
【０２１０】
ＬＦＡ−３は全身的ＩｇＧ応答を促進する
ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１発現ベクターとｇＤ遺伝子ワクチンの共注射がｇＤに対する全身的ＩｇＧ応答に影響するかどうかを決定するため、ＤＮＡ接種後の血清の１００倍希釈液がＥＬＩＳＡで試験された。マウスの各々の群（ｎ＝８）を共刺激分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（６０μｇ）で２回免疫した。２回目のＤＮＡ注射から２週間後にマウスから採血し、血清をｇＤとの反応のために１：１００に希釈した。ＣＤ４０またはＣＤ４０リガンドプラスミドＤＮＡ（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μｇ）の共注射は全体のＩｇＧレベルにはほとんど影響しなかった。群当たり等しくプールした血清はＥＬＩＳＡ力価を決定するために連続的に希釈した。均等にプールされた第二の免疫感作２週間後のＥＬＩＳＡ力価もまた６，４００（ＣＤ４０）、６，４００（ＣＤ４０リガンド）および６，４００（ｇＤＤＮＡワクチン単独）であることが決定された。これらの共刺激分子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（マウス当たり１０μｇ）で１回共注射して１ヶ月後に得られた血清を試験した場合にも同様の結果が得られた。
【０２１１】
マウスの各々の群（ｎ＝８）をＬＦＡ−３接着分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ）で０および２週目に免疫した。２週間ごとにマウスから採血し、血清をｇＤとの反応のために１：１００に希釈した。ＬＦＡ−３ｃＤＮＡとの共注射はｇＤ ＤＮＡワクチン単独よりも著しく高く全身性ＩｇＧ応答を促進したが、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡとの共注射ではほとんど変化は観察されなかった。群当たり均等にプールした血清はＥＬＩＳＡ力価を決定するために連続的に希釈した。光学密度は４０５ｎｍで測定された。値およびバーは平均値（ｎ＝８）および標準偏差を示している。ＥＬＩＳＡ力価は天然マウス血清と同一の光学密度を示している最も高い血清希釈を基準にして決定された。均等にプールされた第二の免疫感作２週間後のＥＬＩＳＡ力価もまた２５，６００（ＬＦＡ−３）、６，４００（ＩＣＡＭ−１）および６，４００（ｇＤＤＮＡワクチン単独）であると決定された。
【０２１２】
ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はＩｇＧアイソタイプパターンに影響する
ＩｇＧサブクラスは誘導された免疫応答のＴｈ１対Ｔｈ２特性の指標を与える。ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１での共注射により誘導されたＩｇＧサブクラスを分析した。ＤＮＡベクターで免疫されたマウスにおけるｇＤ特異的ＩｇＧアイソタイプレベルが測定された。マウスの各々の群（ｎ＝８）を共刺激分子遺伝子（４０μｇ）かまたは接着分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（６０μｇ）で２回免疫した。２回目のＤＮＡ注射から２週間後にマウスから採血し、群当たり均等にプールした血清をｇＤとの反応のために１：１００に希釈した。光学密度は４０５ｎｍで測定された。ＣＤ４０リガンド遺伝子での共注射はＩｇＧ１に対するｇＤ特異的ＩｇＧ２ａの相対的産生を増加させたが、ＣＤ４０遺伝子での共注射はｇＤＤＮＡワクチン単独と類似のＩｇＧアイソタイプパターンを示した。ＩｇＧ産生におけるこの移行は、より高いＴｈ１型応答はＣＤ４０リガンドＤＮＡでの共注射でのみ誘導されることを示している。しかしながら、ＬＦＡ−３の共注射は、ｇＤＤＮＡワクチン単独またはＩＣＡＭ−１共注射よりもＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ両方を著しく高く増加させた。この増加はＬＦＡ−３ｃＤＮＡでの共注射によりＴｈ１およびＴｈ２型応答の両方が誘導されたことを示している。
【０２１３】
ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はＴｈ細胞増殖応答を促進する
Ｔヘルパー細胞はＡｇ刺激Ｂ細胞の増殖およびＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を経る各々体液性および細胞性免疫応答の惹起に重要な役割を果たしている。ＣＤ４活性化の特異的指標としてＴ細胞増殖が試験された。インビトロにおいて特異的抗原で刺激された場合、サイトカイン遺伝子による共免疫感作後に得られるＴ細胞の増殖レベルを測定することが重要である。ｇＤ−２タンパク質（１および５μｇ／ｍｌ）がＴ細胞の抗原特異的刺激に使用された。陽性対照として、５μｇ／ｍｌＰＨＡがポリクローナル刺激剤として使用された。陰性対照では低いバックグラウンドレベルのＴｈ細胞増殖が観察された。しかしながら、ｇＤＤＮＡワクチン接種は陰性対照よりも高いＴｈ細胞増殖応答を誘導した。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３ｃＤＮＡで共注射した場合、Ｔｈ細胞増殖レベルはさらに後押しされた。しかしながら、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１が共注射された動物ではＴｈ細胞応答の増加はほとんど検出されなかった。この傾向は試験された二つの異なった抗原濃度で観察され、この効果はＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３仲介であることを反映している。ｇＤプラスミドワクチン接種は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴＬエピトープの欠損のためＣＴＬ応答を生じなかった。しかしながら、細胞性効果をより詳細に評価するため、サイトカイン産生プロフィールを次に試験した。
【０２１４】
ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はＴｈ１およびＴｈ２型サイトカインの産生に影響する
Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）は免疫応答偏向についての我々の理解における主な支えであってきた。Ｔｈ１免疫応答は細胞免疫性の誘導を駆動すると考えられ、一方、Ｔｈ２免疫応答は優先的に体液性免疫を駆動する。従って、共刺激分子とのまたはそれなしでのｇＤＤＮＡワクチン接種がＴｈ１またはＴｈ２免疫応答を誘導するかどうかを試験した。共刺激分子または接着分子で共免疫されたマウスの脾臓細胞からのＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１の産生レベルが測定された。マウスの各々の群（ｎ＝２）を共刺激分子遺伝子かまたは接着分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（６０μｇ）で０および２週目に免疫した。最後にＤＮＡ注射して２週間後、２匹のマウスを殺し、脾臓細胞をプールした。脾臓細胞は１μｇ／ｍｌのｇＤ−２タンパク質で２日間刺激した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生はＣＤ４０リガンドｃＤＮＡの共注射により著しく促進されたが、ＩＬ−１０産生はこの共注射で減少した。しかしながら、ＣＤ４０にｇＤ遺伝子を加えたものの共注射はこのアッセイにおいてＩＦＮ−γをわずかに増加させた。しかしながら、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ産生がＬＦＡ−３ｃＤＮＡの共注射により、ｇＤ ＤＮＡワクチンよりも著しく高くすべて促進されたが、ＩＣＡＭ−１にｇＤ遺伝子を加えた共注射はこのアッセイにおいてわずかな増強効果しか持っていなかった。このことはＣＤ４０リガンドはＴｈ１表現型に対して免疫応答を駆動するが、ＬＦＡ−３はインビボにおいてＴｈ１およびＴｈ２の両方に影響することを支持している。
【０２１５】
ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はβ−ケモカインの産生に影響する
ＲＡＮＴＥＳ（活性化が制御されている、正常Ｔ細胞から発現および分泌値される）、ＭＩＰマクロファージ炎症性タンパク質）−１αおよびＭＣＰ（単球走化性タンパク質）−１を含むベータケモカイン（ＣＣ型）は特に単球性食細胞を化学誘引し、Ｔ細胞、好塩基球、好酸球および単核食細胞ならびに他の可溶性免疫調節物質を活性化する。ＭＣＰ−１と比較して、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αはまた主ＨＩＶ抑制因子であると報告されている。これらの分子は炎症性免疫応答の調節に重要であると考えられている。しかしながら、感染性疾患におけるそれらの直接的役割は研究中である。インビボにおけるケモカイン産生に対して、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１分子のワクチンアジュバントとしての関係は知られていない。ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡを加えたｇＤ ＤＮＡワクチンの共注射により誘導されるケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１α）のレベルが調べられた。ｇＤＤＮＡワクチン単独でＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１αの産生を抗原特異的様式で促進した。さらに、ＣＤ４０リガンドｃＤＮＡの共注射はＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α産生をｇＤ ＤＮＡワクチン単独よりも著しく高く促進した。対照的に、ＣＤ４０分子の共注射はβ−ケモカイン産生に対してわずかな増強効果しか示さなかった。ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの共注射はＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α産生をｇＤ ＤＮＡワクチン単独よりも著しく高く促進したデータが得られた。同様に、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの産生はＩＣＡＭ−１共注射により促進された。対照的に、ＭＣＰ−１産生はＩＣＡＭ−１共注射により阻害された。この調節は共刺激および接着分子はβケモカインファミリーの個々の構成物の産生に特異的効果を持つことができることを支持している。
【０２１６】
ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３は膣内（ｉ．ｖａｇ．）ＨＳＶ感染の保護を促進する
ＨＳＶ−２（１８６）の致死量（ＬＤ50）は以前に測定されている。ｇＤ ＤＮＡワクチンに分子アジュバントとしてＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡを使用するとＨＳＶ−２感染の保護に影響できるかどうかを決定するため、マウスをＤＮＡワクチンおよび個々の共刺激および接着分子ｃＤＮＡの両方で免疫し、続いて４ＬＤ50のＨＳＶ−２でｉ．ｖａｇ．感染させた。膣内感染経路は、ＨＳＶ−２が粘膜を通して感染し、泌尿性器感染を起こすので選択された。共刺激および接着分子遺伝子を加えたｇＤＤＮＡワクチンを２倍量にして免疫したマウスの生存率が測定された。マウスの各々の群（ｎ＝１０）を共刺激または接着分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（１０μｇ）で１回免疫した。ＤＮＡ免疫感作４週間後、マウスを４ＬＤ50のＨＳＶ−２株１８６（１．４ｘ１０4ｐｆｕ）でｉ．ｖａｇ．感染させた。マウスをｇＤ ＤＮＡワクチンで免疫した場合、６０％の生存が記録されたが、すべての天然のマウスはウイルス感染後１３日以内に死亡した。ＣＤ４０リガンドの共注射は生存率を１００％に上げたが（保護率の４０％の上昇）、ＣＤ４０ｃＤＮＡの共注射はｇＤＤＮＡワクチン単独と比較して極微の保護効果しか示さなかった。さらに、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの共注射は生存率を９０％に上げた。しかしながら、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡの共注射はＨＳＶ−２感染にわずかに良好な効果を示しただけであった。
【０２１７】
考察 
抗原提示の間、ＡＰＣの共刺激分子はＴ細胞応答の開始および分化に重要である。特に、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用はＡＰＣからのＢ７およびＩＬ−１２発現を誘導する。ＩＬ−１２はまたＴ細胞からのＣＤ４０リガンド発現を促進させるが、一方、ＩＦＮ−γはＣＤ４０リガンド発現を阻害し、それらはＴ細胞上のＣＤ４０リガンド誘導の自己制御機構であるらしいことを示している。さらに、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−４もまた抗ＣＤ３刺激Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド発現を促進し、インビボでの免疫応答の仲介における共刺激分子およびサイトカイン間の協調制御が存在することを示している。さらに、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用はＴｈ細胞依存性抗体応答、前炎症性サイトカイン産生を増加させ、マクロファージの殺腫瘍性および殺微生物活性に必要とされる。特に、ＣＤ４０リガンドは休止Ｔ細胞では発現されないが、ＣＤ３−ＴＣＲが引き金を引く過程により誘導される。ＣＤ４０（４５−５０ｋＤ糖タンパク質）はＴＮＦレセプタースーパーファミリーの構成物であり、Ｂ細胞、単球および樹状細胞上に発現される。しかしながら、そのリガンド、ＣＤ４０リガンド（ｇｐ３９）はＴＮＦ−αと配列相同性を持つタイプＩＩ膜内外タンパク質であり、活性化Ｔ細胞上に過渡的に発現される。接着分子の相互作用、Ｔ細胞上のＬＦＡ−３とＡＰＣ上のＩＣＡＭ−１、はＩＣＡＭ−１に高い親和性および結合活性を持つＬＦＡ−３のコンホメーション変化により高度に制御されている。ＣＤ３モノクローナル抗体またはクラスＩＩと抗原に関係したＬＦＡ−３の共刺激はＴ細胞増殖およびＴ細胞からの種々のサイトカインのより高い産生を生じることが知られている。さらに、ＬＦＡ−３とＩＣＡＭ−１の相互作用はシグナル経路の引き金を引く。共刺激性ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド分子と比較して、これらの接着分子および抗ＣＤ３または抗ＴＣＲ抗体の表面上での共局在化がＴ細胞への適切なシグナリングに必要とされる。
【０２１８】
ＤＮＡワクチンと一緒のＡＰＣ刺激または誘引分子の共注射は、免疫性の両方向のより有効な誘導を生じる。筋肉内（ｉ．ｍ．）注射では、ＤＮＡは筋繊維内へ取り込まれ、続いての内因性発現で免疫系へ天然形抗原の提示を導く。分泌された抗原は食作用により摂取され、次にペプチド−ＭＨＣＩＩ複合体としてマクロファージにより提示され、それは一次活性化シグナル、天然のＴ細胞の刺激に必要な共刺激性リガンドおよびサイトカインを提供できる。最近の実験的証拠もまた、ＤＮＡのｉ．ｍ．または皮膚送達に続くインビボでのＡＰＣ直接的トランスフェクションを支持している。ＤＮＡワクチンとＢ７．１およびＢ７．２のような共刺激分子の共注射は、Ｔｈ細胞増殖性応答および細胞障害性Ｔ細胞活性のような抗原特異的細胞性免疫応答を劇的に促進した。同様に、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の共注射はウイルスＤＮＡワクチンモデルにおいて抗体および細胞性免疫応答の両方を促進する。ｐＬａｃＺにＣＤ４０リガンドｃＤＮＡを加えた共注射は体液性および細胞性免疫応答の両方を、特にＣＴＬを抗原依存性様式で促進する。しかしながら、共刺激および接着分子の共送達によるＨＳＶ感染研究は存在しない。ＨＳＶ−２に対する抗原特異的免疫応答および保護的免疫性の誘導におけるこれら二つの異なった経路を比較することも興味が持たれる。
【０２１９】
ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド遺伝子によるワクチン修飾によってはｇＤ特異的抗体産生の有意な増加は観察されなかった。しかしながらこのことは、ＤＮＡベクター（β−ガラクトシダーゼ）で送達された場合、ＣＤ４０リガンドの共注射が抗原に対する抗体産生を促進するという以前の発見と一致していない。この矛盾は試験された抗原の性質によるものであろう。しかしながら、ＣＤ４０リガンド共注射により同様のＩｇＧアイソタイプ産生パターンが誘導されたという類似の発見も存在する。我々の研究において、ＣＤ４０リガンド共注射は、Ｔｈ１型免疫応答により仲介されると信じられているＩｇＧ１アイソタイプと比較して、ＩｇＧ２ａ産生の著しい増加を誘導した。このことは、ＣＤ４０リガンドの発現を駆動するプラスミドベクターを共注射することによりＴｈ１型へのｇＤ特異的免疫応答の偏向が達成されることを暗示している。対照的に、ｇＤＤＮＡワクチン単独またはＩＣＡＭ−１共注射と比較して、ＬＦＡ−３の共注射によりｇＤ特異的ＩｇＧ産生の著しい増加が観察された。このことは、ＬＦＡ−３はインビボで抗体応答を促進できることを示している。また、ＬＦＡ−３共注射はＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプの増加した産生により示されるＴｈ１およびＴｈ２両方の産生を促進し、ＬＦＡ−３はインビボでＴｈ１およびＴｈ２両方の免疫応答を駆動できることを暗示している。
【０２２０】
増加したＴｈ細胞増殖はＣＤ４０リガンドをコードしているプラスミドＤＮＡの共注射により達成された。このことは再び、ＣＤ４０リガンド分子は抗原特異的Ｔｈ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生ならびにＣＴＬ応答を増加させるという他のモデルにおける以前の発見と一致している。このパターンは、ＣＤ４０リガンドｃＤＮＡの共注射はＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を促進させるが、ＩＬ−１０産生を阻害することが観察されたサイトカイン産生レベルと一致している。従って、ｇＤＤＮＡワクチン接種におけるＣＤ４０リガンドｃＤＮＡの使用は、Ｔｈ１型へ免疫応答を偏向させ、細胞仲介免疫性を増加させることに有効である。しかしながら、ＬＦＡ−３の共注射はＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの産生を促進し、ＩＣＡＭ−１の共注射はサイトカイン産生をわずかに促進する。このことは、ＬＦＡ−３はＴｈ１およびＴｈ２表現型の両方へ免疫応答を駆動するＩｇＧアイソタイプパターンを支持している。
【０２２１】
ケモカインは免疫および炎症性応答においてサイトカインをしのばせる様式で重要な役割を果たしていると最近報告されている。ＨＳＶ感染により仲介される眼性炎症疾患がＴｈ２型サイトカインタンパク質（ＩＬ−１０）の局所投与により抑制された。この適用はケモカイン産生の抑制を生じた。この疾患（眼の炎症）はまた抗ＭＩＰ−１αの注射（しかしＭＣＰ−１ではない）でも改善され、ＭＩＰ−１αがＴｈ１型ケモカインとして区別されることを再び示している。しかしながら、感染性状態に対するケモカインの役割は研究中である。本研究において、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの産生がＣＤ４０リガンドの共送達によりＣＤ４０より高く促進され、ＣＤ４０リガンド分子はＴ細胞からのβケモカイン産生の制御に重要な役割を果たしていることを示唆している。ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１の両方がＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの産生を促進した。対照的に、ＭＣＰ−１産生はＬＦＡ−３には影響を受けず、またはＩＣＡＭ−１では阻害され、接着分子はまたインビボでβケモカイン産生を制御できることを示している。
【０２２２】
体液性、細胞性または両方がＨＳＶ感染に対する保護的免疫性に関与できることが報告されている。ＨＳＶ特異的モノクローナル抗体による受動免疫法は致死的ＨＳＶ感染からの保護を行った。ウイルス感染の間、中和抗体は遊走性ウイルス粒子を不活性化できるが、細胞内ＨＳＶ感染を阻害することはできない。抗体依存性補体仲介および抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）はＨＳＶ感染を制御するには不十分なようである。従って、ＨＳＶ特異的細胞仲介免疫性がＨＳＶ感染細胞を撲滅するおよびＨＳＶ感染を制御するための主たるエフェクター機能を果たすであろうことが示唆されている。ＨＳＶ感染の制御に対するＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞により仲介される細胞性免疫応答の重要性がよく記述されている。
【０２２３】
ＣＤ４０リガンド分子の共注射はＨＳＶ−２感染により生じる死亡からの著しく増強された保護を誘導することが観察された。このことは、保護的免疫性とＴｈ１型細胞性免疫性の間の正の相関があることを示唆しており、それはＣＤ４０リガンド分子と共注射された場合の増加したＴｈ細胞増殖性応答およびＩＦＮ−γ産生により支持される。我々の観察は、ＣＤ４０リガンド共注射がリーシュマニアメジャーまたは抗原を発現している転移性腫瘍からの攻撃に対する保護的免疫性を増強するという以前の発見と一致している。ＬＦＡ−３はＨＳＶ−２感染により生じる死亡からの著しく増強された保護を誘導することが観察された。細胞性および／または体液性免疫性のＬＦＡ−３増強はこの系におけるＨＳＶ−２由来死亡率を減少することに関係しているように思われる。ＣＤ４０リガンドまたはＬＦＡ−３誘導ＩＦＮ−γがインビボで抗ＨＳＶ−２活性に部分的に関与することも可能である。従って、ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３駆動細胞性または体液性仲介免疫性はＨＳＶ感染の保護と関係しているようである。
【０２２４】
最後に、本明細書に示されたデータは共刺激および接着分子は抗原特異的免疫応答の誘導において異なった共刺激性経路を持っていることを示唆している。特に、ＣＤ４０リガンドは免疫応答をＴｈ１型へ向け、それに対し、ＬＦＡ−３はＴｈ１およびＴｈ２免疫型の両方を援助する。そのような活性は従来サイトカインのみに付随していたものである。これらのデータは共刺激分子は抗原特異的免疫性の誘導におけるサイトカインのような中心的な役割を持っていることを示している。また、ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はｇＤＤＮＡワクチン接種において致死的ＨＳＶ−２感染に対する増強された保護を仲介する。この発見は感染性疾患のための我々の武器を豊富にしている。
【０２２５】
実施例７
免疫表現型およびＨＳＶ−２による致死的感染に対する保護についてのケモカイン（ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１α）の調節効果が分析された。ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ共注射は抗原特異的免疫応答および致死的ＨＳＶ−２感染からの保護を劇的に促進した。しかしながら、ＩＬ−８およびＩＰ−１０による共注射は感染マウスの死亡率を増加させた。これらの研究は、保護的抗原特異的免疫性の発生に重要な役割を果たしているサイトカインをより思い出させる様式で、ケモカインが免疫応答を支配および駆動できることを示している。
【０２２６】
免疫および炎症性反応の開始は共刺激分子、細胞性接着分子、サイトカインおよびケモカインの厳しく調整された発現を含んだ複雑な過程である。特に、ケモカインは血管から宿主防御の末端部位への白血球やりとりの分子的制御に重要である。ケモカインのスーパーファミリーは二つのシステイン残基を分離している一つのアミノ酸配列の存在（αファミリー）または不在（βファミリー）に基づく二つのサブファミリーから成っている。αおよびβケモカインは好中球、好酸球、好塩基球および単球を含む種々の免疫細胞型の直接的遊走を誘導することが示されている。最近、ケモカインファミリー（ＣＸＣ型）、インターロイキン（ＩＬ−８）およびインターフェロン−γ−誘導可能タンパク質（ＩＰ−１０）、およびβケモカインファミリー（ＣＣ型）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化が制御されている、正常Ｔ細胞発現および分泌）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）およびマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１α）がＴリンパ球を化学誘引することが示されている。特に、ＩＬ−８およびＩＰ−１０は好中球を化学誘引し、血流からそれらの放出を誘導して周囲の組織へ移行させることが知られている。同様に、ＲＡＮＴＥＳは単球（ＣＤ４+／ＣＤ４５ＲＯ+記憶Ｔ細胞）を化学誘引し、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を刺激する。ＭＩＰ−１αは好酸球を化学誘引および脱顆粒することが知られている。ＭＩＰ−１αはまた、好塩基球および肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導し、好塩基球およびＢ細胞を化学誘引する。ＭＣＰ−１は慢性炎症性疾患で重要なケモカインである。ＭＣＰ−１は単球が血流から移行して組織マクロファージになるのを誘導する。ＭＣＰ−１はまた活性化記憶サブセットのＴリンパ球を化学誘引する。最近の研究は、ケモカインレセプターはＴ細胞サブセットに印を付けることおよびケモカインは抗原特異的免疫応答の発生に関与していることを支持している。
【０２２７】
免疫応答の調節および保護的免疫性を調べるため、ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質をコードしているＤＮＡ発現構築物とケモカイン（ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α）をコードしているプラスミドを共送達した。次に、それらの抗原特異的免疫誘導および感染に対する保護における調整効果を分析した。第一に、抗原特異的抗体応答の誘導に対する選択されたケモカインのインビボでの効果が調べられた。対照として、ｇＤワクチンおよび二つの前炎症性サイトカイン、ＴＮＦファミリー遺伝子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）で動物を免疫した。これらの前炎症性サイトカインは、初期免疫応答に同様に関与し、陽性対照として働くに違いないと考えられたので研究された。ＤＮＡベクターで免疫したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）における全身性ｇＤ特異的ＩｇＧレベルを測定するためにＥＬＩＳＡが使用された。マウスの各々の群（ｎ＝１０）を０および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）またはＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μｇ）で免疫した。ｇＤ抗原およびケモカインを発現するＤＮＡ構築物は以前にクローン化されている（Ｐａｃｈｕｋ，ｅｔａｌ．１９９８ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２６，７９；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，１１１２；およびＫｉｍ，ｅｔａｌ．１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０８９）。２回目の免疫感作２週間後にマウスから採血し、群当たり均等にプールした血清をｇＤとの反応のために連続的に希釈した。ＥＬＩＳＡ力価は天然のマウスの血清と同一の光学密度を示している最も希釈した血清を基準にして決定された。吸光度（Ｏ．Ｄ．）は４０５ｎｍで測定された。２回目の免疫感作２週間後に集められた均等にプールした血清のＥＬＩＳＡ力価はＩＬ−８に対しては１２．０００、ＩＰ−１０に対しては６，４００、ＲＡＮＴＥＳに対しては６，４００、ＭＣＰ−１に対しては６，４００、ＭＩＰ−１αに対しては１２．０００、ＴＮＦ−αに対しては２５，６００、ＴＮＦ−βに対しては６，４００およびｇＤＤＮＡワクチン単独に対しては６，４００であると決定された。このことはＩＬ−８およびＭＩＰ−１α遺伝子の共注射で中程度の、しかし著しくはないｇＤ特異的ＩｇＧ抗体促進を示している。対照的に、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＣＰ−１はｐｇＤワクチン接種単独と同じレベルの抗体応答を示した。ＴＮＦ−αｃＤＮＡ対照は、ｇＤＤＮＡワクチン単独のレベルよりも著しく高い全身性ＩｇＧレベルを生じた。
【０２２８】
ＩｇＧ１アイソタイプの誘導はＴｈ２型サイトカインにより誘導され、一方、ＩｇＧ２ａアイソタイプ産生はインビボでＴｈ１型サイトカインにより影響および駆動されることが報告されている。このことは、免疫応答がＴｈ１またはＴｈ２サイトカインのどちらの制御下にあるのかを決定するための指標として使用されてきた。共注射により誘導されたＩｇＧサブクラスが分析された。各々の免疫感作群により誘導されたＩｇＧアイソタイプが測定された。マウスの各々の群（ｎ＝１０）を０および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）またはＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μｇ）で免疫した。最後の免疫感作２週間後にマウスから採血し、血清をｇＤとの反応のために１：１００に希釈した。ｇＤ特異的ＩｇＧサブクラスの相対レベルを決定するため、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰをＨＲＰと結合された抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に置換した。吸光度（Ｏ．Ｄ．）は４０５ｎｍで測定された。相対光学密度は、各々のＩｇＧサブクラスの光学密度／全体の光学密度で計算された。ラインは各々のマウスＩｇＧサブクラスの光学密度の平均（ｎ＝１０）を示している。ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａ（Ｔｈ２に対するＴｈ１）の相対比が測定された。ｐｇＤ免疫群は０．６２のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａ比を持っていた。ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳまたはＴＮＦ−α遺伝子での共注射はＩｇＧ１に対するｇＤ特異的ＩｇＧ２ａの相対比を０．８に増加させた。一方、ＩＰ−１０およびＭＩＰ−１αによる共注射はＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの相対比を減少させ（０．３および０．４）、ＭＣＰ−１またはＴＮＦ−β遺伝子はｐｇＤワクチン接種単独と同じＩｇＧサブタイプパターンを生じた。この分析はＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳがインビボでγ−ＩＦＮ型サイトカインと同様の様式でＴｈ１表現型の方へ免疫応答を動かすことを支持している。それ故、これらの結果は、Ｔｈ１またはＴｈ２への体液性免疫応答の移行はケモカインにより調節できるというＨＩＶモデルの以前の発見に拡張され、ケモカインがインビボでサイトカイン産生を調節できるということを再び示唆している。
【０２２９】
細胞増殖は、細胞仲介免疫性の能力を評価するために使用される標準パラメーターである。ケモカイン遺伝子での共免疫感作に続くＴｈ細胞増殖性応答が、免疫動物からの脾臓細胞をインビトロでｇＤタンパク質により刺激することにより測定された。α−ケモカインｃＤＮＡ、β−ケモカインｃＤＮＡおよびＴＮＦ対照で共免役したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）におけるインビトロｇＤ刺激後の脾臓細胞のＴｈ細胞増殖レベル。マウスの各々の群（ｎ＝２）を０および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）またはＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μｇ）で免疫した。最後のＤＮＡ注射２週間後に２匹のマウスを殺し、脾臓細胞を増殖アッセイにためにプールした。脾臓細胞はｍｌ当たり１および５μｇのｇＤ−２タンパク質、および陽性対照としてｍｌ当たり５μｇのＰＨＡで刺激された。刺激して３日後、細胞を採取し、ｃｐｍが計数された。試料は３重にアッセイされた。ＰＨＡ対照試料は４０−５０の刺激指数を示した。ｐｇＤＤＮＡワクチン接種単独でｇＤ特異的Ｔｈ細胞増殖性応答を生じた。ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−αｃＤＮＡの共注射によりｇＤＤＮＡワクチン単独よりも著しく促進されたＴｈ細胞増殖性応答も観察された。ＴＮＦ−β遺伝子の共注射では増殖のわずかな促進が観察された。対照的に、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１α遺伝子の共免疫感作はＴｈ細胞増殖性応答レベルにほとんど影響を及ぼさないようである。しかしながら、共注射はＰＨＡ誘導非特異的Ｔｈ細胞増殖性応答には何の影響も与えなかった（Ｓ．Ｉ．範囲は４０から５０であった）。ｇＤプラスミドワクチン接種はＢａｌｂ／ｃマウスにＣＴＬエピトープが存在しないためＣＴＬ応答を生じなかった。しかしながら、細胞性効果をより詳細に評価するため、サイトカイン産生プロフィールを次に試験した。
【０２３０】
Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）は免疫応答偏向についての我々の理解における主な支えであってきた。Ｔｈ１免疫応答は細胞免疫性の誘導を駆動すると考えられ、一方、Ｔｈ２免疫応答は優先的に体液性免疫を駆動する。ＩｇＧ表現型の結果に基づいて、直接的サイトカイン放出を分析することによりＴｈ１対Ｔｈ２問題をさらに評価した。表４に示したように、ＩＬ−８ｃＤＮＡの共注射によりＩＬ−２産生がほとんど７倍に劇的に増加した。ＩＬ−２はまたＴＮＦ−αｃＤＮＡの共注射およびＭＩＰ−１αカセットの共注射によっても誘導された。特に、ＩＦＮ−γ産生はＲＡＮＴＥＳ（２０倍）およびＩＬ−８（６倍）の共送達により最も著しく促進され、さらにアイソタイプ分類結果を支持し、およびＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳがＴｈ型細胞性免疫応答を抗原依存性様式で仲介していることを示している。ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β共注射もまたＩＬ−１０産生をｐｇＤワクチン単独よりも著しく高く促進した。このことはＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳはＴｈ２型よりも主としてＴｈ１型で動かしていることを示している。
【０２３１】
ケモカイン共注射がβケモカイン産生を抗原依存性様式で誘導できるかどうかを決定するため、共免疫し、および次に組換え体ｇＤ抗原または対照抗原でインビトロ刺激後の脾臓細胞のβケモカイン放出レベルを分析した。表５に示されているように、ＭＣＰ−１産生はＩＬ−８ｃＤＮＡの共注射では劇的に増加したが、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αカセットの共注射では減少した。特に、ＭＩＰ−１αの産生はＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−８の共送達により最も著しく促進された。ＲＡＮＴＥＳの場合、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ共注射はＲＡＮＴＥＳ産生をｐｇＤワクチン単独よりも高く促進した。このことは、ＲＡＮＴＥＳはＨＳＶモデルにおけるＩＬ−８とは異なるように抗原特異的免疫応答を調節することを示している。このことはケモカイン分子がそれら自身の産生を調節することも支持している。
【０２３２】
ＨＳＶは口唇ヘルペス、眼性感染、脳炎および生殖器感染のようなヒト疾患スペクトルの原因因子である。ＨＳＶはウイルス潜伏を確立でき、宿主でしばしば再発する。ウイルス感染の間、中和抗体はウイルス粒子を不活性化できるが、細胞内ＨＳＶ感染を制御することはできない。むしろ、細胞仲介免疫性がインビボでＨＳＶ感染細胞の撲滅およびＨＳＶ拡大の主たるエフェクター機能を果たしている。ＨＳＶに対して高められた細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の適応輸送は動物における致死的ＨＳＶ感染からの完全な保護を生じる。さらに、Ｔｈ１型ＣＤ４+Ｔ細胞がＨＳＶ−２感染の保護により決定的な役割を果たしているといういくつかの報告がある。ＣＤ４+Ｔ細胞がインビボで枯渇した場合、ＨＳＶに対する保護的免疫性が喪失した。さらに、Ｔｈ１型ＣＤ４+Ｔ細胞は大量のＩＦＮ−γを発生する。ＩＦＮ−γはＨＳＶ感染細胞上のクラスＩおよびＩＩ発現を上方制御し、細胞障害性ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+ＣＴＬによるより良好な認識を可能にするので、直接的抗ＨＳＶ効果を持っている。Ｔｈ１型サイトカインｃＤＮＡの共送達は致死的ＨＳＶ感染からの生存を促進したが、Ｔｈ２型サイトカインｃＤＮＡの共送達は疾患状態を悪化させた。同様に、原型Ｔｈ１型サイトカインＩＬ−１２ｃＤＮＡの共送達により促進された保護はＨＳＶ感染モデルのＴｈ１型ＣＤ４+Ｔ細胞により仲介され、ＨＳＶ感染に対するＴｈ１型Ｔ細胞仲介保護的免疫性の重要性を強調している。
【０２３３】
抗原特異的免疫調節が病原体複製に影響することが重要である。α−ケモカインｃＤＮＡ、β−ケモカインｃＤＮＡおよびＴＮＦ対照を加えたｇＤＤＮＡワクチンで免疫したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の生存率が測定された。マウスの各々の群（ｎ＝８）を０および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）またはＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μｇ）で免疫した。第二の免疫感作して３週間後、マウスを２００ＬＤ50のＨＳＶ−２株１８６（７ｘ１０5ｐｆｕ）でｉ．ｖａｇ．感染させた。ウイルスを接種する前に。膣内領域を０．１ＭＮａＯＨ溶液に浸した綿付き塗布具（ＨａｒｄｗｏｏｄＰｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｕｉｆｏｒｄ，ＭＥ）でふきとり、乾燥綿付き塗布具で清浄した。マウスは生存率を評価するため毎日検査された。生き残っているマウスはウイルス感染に続く６１日にわたって計数した。これは一度繰り返され、期待された結果が得られた。マウスヘルペス感染モデルにおけるケモカイン共注射の保護的有効性を分析した。マウスはｉ．ｍ．で０および２週目にＤＮＡベクターで共免疫され、続いて第二の免疫感作３週間後にＨＳＶ−２を感染させた。ＨＳＶ−２が粘膜を経て感染するので膣内感染経路が選択された。ｇＤＤＮＡワクチン単独では、２００ＬＤ50のＨＳＶ−２膣内感染で６３％のマウスの生存が得られた。ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ ｃＤＮＡの共注射は生存率を８８％に上げ、保護率をほとんど３０％上昇させたが、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０の共投与は生存率を２５％に減少させ、ｇＤワクチン単独から全体の生存を５０％以上減少させた。同様に、ＭＩＰ−１α共投与もワクチン接種動物の生存率に負に影響した。これらの観察結果は、各々のケモカイン群で試験された動物の総数を考えると印象的である（ｇＤ単独の生存率、１８匹中の１１匹、６１％；ＩＬ−８の生存率、１８匹中の１７匹、９４％；ＩＰ−１０の生存率、１８匹中の５匹、２８％；ＲＡＮＴＥＳの生存率、１８匹中の１７匹、９４％；ＭＣＰ−１の生存率、１８匹中の６匹、３３％；ＭＩＰ−１αの生存率、１８匹中の８匹、４４％）。このことは、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳケモカイン遺伝子の共注射は致死的ＨＳＶ感染からの保護を促進するが、それに対し、ＩＰ−１０およびＭＣＰ−１の共注射は動物に免疫応答を誘導する代わりにウイルス感染に対してより感受性を高くした（ＭＩＰ−１αはより少ない程度で）。これはケモカインＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳが抗原特異的免疫調節を通してＨＳＶ−２感染からの保護を促進したことを支持している。これらの研究は、ケモカインが重要な免疫応答および疾患進行をサイトカインを思わせる様式（Ｔｈ１対Ｔｈ２）で働くおよび調節できることを支持している。有意な免疫調節が共送達されたケモカインｃＤＮＡの使用を通して達成でき、免疫応答だけでなく疾患保護にも影響を与えている。さらに、ケモカイン遺伝子送達アジュバントの使用（特に、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ）は、より有効なワクチン技術またはＨＳＶのための免疫治療に重要にちがいない。我々は以前に、Ｔｈ１型サイトカイン遺伝子の共注射は致死的ＨＳＶ感染からの保護率を増加させるが、それに対���、Ｔｈ２型サイトカイン共注射はウイルス感染に対する動物の感受性を増加させることを報告している。病因論研究において、病原感染抵抗性に対するＴｈ１様サイトカイン応答の重要性が報告されている。それ故、Ｔｈ１および／またはＴｈ２型免疫応答はこれらのケモカインにより駆動されており、免疫応答の質に基づいてＨＳＶ感染性攻撃からの保護に影響を生じているようである。
【０２３４】
ヘルペス感染モデルにおけるＴＮＦファミリー共注射の保護的効能を比較した。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β遺伝子両方の共注射もまた感染マウスの生存率を２５％に低下させた（ｇＤワクチン単独より全体で５０％以上の低下）。ＴＮＦ−αを共注射したマウスのｇＤ特異的抗体およびＴｈ細胞増殖レベルならびにサイトカイン産生レベル（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０）はｇＤＤＮＡワクチン接種単独よりも高かったが、ＨＳＶ−２感染に対するＴＮＦサイトカイン仲介感受性がこれらの動物で観察された。この観察結果の理由は不明瞭であるが、応答の質が病原体感染の制御に特に重要であることを支持している。
【０２３５】
最後に、本明細書に示されたデータはケモカインが抗原依存性様式でＴｈ１および／またはＴｈ２型への免疫応答を調節することができることを示している。そのような活性は従来はサイトカインに付随するものとして存在し、ケモカインは抗原特異的免疫性の誘導にサイトカインのような中心的な役割を持っていることを暗示している。免疫治療およびワクチン接種のために免疫応答を調節するケモカインの使用はさらに研究するのに相応しいものである。
【０２３６】
【表１】
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【０２３７】
【表２】
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【０２３８】
【表３】
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【０２３９】
【表４】
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【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
【表６】
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【０２４２】
【表７】
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【０２４３】
【表８】
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【０２４４】
【表９】
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【０２４５】
【表１０】
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【０２４６】
【表１１】
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【０２４７】
【表１２】
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【０２４８】
【表１３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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