(57)【要約】      （修正有）【課題】ウシ胚の培養工程、保存工程において熱ストレスの影響を受けにくい新規培地組成物を提供する。【解決手段】アスタキサンチン等のキサントフィルを含有する人工受精（体外受精）用培地組成物、および該組成物を用いて、人工受精後のウシ胚の培養及び保存を行う方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントフィルを含有することを特徴とする人工受精用培地組成物。
【請求項２】
キサントフィルがアスタキサンチンであることを特徴とする請求項１記載の培地組成物。
【請求項３】
人工受精が体外受精であることを特徴とする請求項１又は２記載の培地組成物。
【請求項４】
人工受精後のウシ胚の培養に用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地組成物。
【請求項５】
人工受精後の胚の培養において、キサントフィルを含有する培地を用いることを特徴とする胚の培養方法。
【請求項６】
キサントフィルがアスタキサンチンであることを特徴とする請求項５記載の胚の培養方法。
【請求項７】
人工受精が体外受精であることを特徴とする請求項５又は６記載の胚の培養方法。
【請求項８】
胚がウシ初期胚であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の胚の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工受精用培地組成物、特にウシ胚の培養又は保存の際に使用する体外受精用培地組成物及びこれを用いた体外受精後のウシ胚の培養・保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシは通常分娩で雌１頭が残せる子孫の数が生涯で最大１０頭程度と限定されている。効率よく優良な子牛を生産するために、優良な雌牛に対して排卵誘発剤により排卵を誘発し、優良な雄牛の精子を用いて体内人工授精を行った後、子宮から胚を採取し保存して、他の雌牛の卵管又は子宮に胚を移植するという体内人工授精法が広く用いられており、現在世界で新鮮胚から２７万頭、凍結保存胚から２８万頭の胚移植が実施されている（非特許文献１）。
【０００３】
さらに効率よく優良な子牛を生産するために、食肉市場で肉牛の卵巣から未成熟卵子を採取し、培養液中、in vitroにおいて卵子と精子を受精させ胚を発生させた後、ウシ胚を保存し、乳牛の卵管又は子宮に胚を移植する体外受精法が広く行われている。体外受精法は通常は廃棄される卵巣１０個から約１００個の未成熟卵子が採取され、約１０頭の子ウシが生産できるため、体内人工授精より量産化に適した方法として知られ、日本では年間約２０００頭の子ウシが誕生している（非特許文献１）。また、超音波診断装置を用いて生きたウシから採取した卵子を用いた体外受精も実用化段階に入っている（非特許文献１）。
【０００４】
体外受精において胚の培養液での培養及び保存は生産効率に大きく影響を与えることから、体外受精用の培地として２３種類のアミノ酸からなる組成物（特許文献１）、メタロプロテナーゼインヒビターを含む培地（特許文献２）、カゼインホスホペプチドを含む培地（特許文献３）、シクロヘキシミドを含有する培地（特許文献４）、グルタミンを実質的に含まない培地（特許文献５）が知られているが、胚の培養、保存時の熱ストレス耐性を付与する培地は知られていない。
【０００５】
キサントフィルは、カロテノイドのうち炭素、水素、酸素から構成されるものをいう。アスタキサンチンは、エビ、カニなどに見られる赤色色素であり、アスタキサンチンを含むキサントフィル類は、抗酸化作用をはじめとする優れた生理活性を持つことが明らかになっている。また、家畜の精液生産効果があることから飼料に用いられているが（特許文献６、特許文献７）、受精した胚に関する影響は知られておらず、培地添加物としても知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３６６００２６号公報
【特許文献２】特公平７−３４６９８号公報
【特許文献３】特開平６−１９７６６５号公報
【特許文献４】特開２００１−８９３０２号公報
【特許文献５】特開２００１−１７１６０号公報
【特許文献６】特許第３８９７９７８号公報
【特許文献７】特許第３６２０８５８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】入谷明、最新発生工学総論、ｐ２８〜６２、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高温による直接的な熱ストレスがウシ初期胚の発生を阻害し、人工受精における胚発生率や受胎率を下げることが問題とされていた。このため、ウシ胚の培養工程、保存工程において熱ストレスの影響を受けにくい新規培地組成物の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは鋭意検討することにより、ウシ胚の培養工程において、培養液にキサントフィルを添加することにより、熱ストレスに強く、受胎率の向上に役立つ培地が提供されることを発見した。
【００１０】
本発明は、（１）キサントフィルを含有することを特徴とする人工受精用培地組成物、（２）キサントフィルがアスタキサンチンであることを特徴とする前記（１）記載の培地組成物、（３）人工受精が体外受精であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の培地組成物、並びに（４）人工受精後のウシ胚の培養に用いることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか１に記載の培地組成物に関する。
【００１１】
本発明はまた、（５）人工受精後の胚の培養において、キサントフィルを含有する培地を用いることを特徴とする胚の培養方法、（６）キサントフィルがアスタキサンチンであることを特徴とする前記（５）記載の胚の培養方法、（７）人工受精が体外受精であることを特徴とする前記（５）又は（６）記載の胚の培養方法、並びに（８）胚がウシ初期胚であることを特徴とする前記（５）〜（７）のいずれか１に記載の胚の培養方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の培地組成物は、ウシ胚の培養及び保存工程における培養液にキサントフィルを添加することにより、胚が熱ストレスの影響を受けにくくなる効果を有する。したがって、このようなキサントフィルを含有する本発明の培地組成物は、人工受精における受胎率及び胚発生率の向上に有利な効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、キサントフィルとしては、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン等が挙げられ、とりわけアスタキサンチンを用いることが好ましい。アスタキサンチンとしては、化学合成により得られたアスタキサンチン、オキアミ等の水産物から抽出したアスタキサンチン、藻類から抽出したアスタキサンチン、ファフィアロドチーマ等の酵母から抽出したアスタキサンチン等が挙げられる。培地組成物におけるキサントフィルの濃度は、２．５ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは２．５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、とりわけ好ましくは２５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍである。
【００１４】
人工受精用培地とは、卵細胞を培養できる培地、体外における卵細胞の受精に用いることができる培地、又は体内人工授精により採取あるいは体外受精により作出した胚を培養できる培地等をいう。具体的には、１９９培地、ＢＭＥ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＭＥＭ培地、マッコイ−５Ａ培地、ウェイマウス培地、トロウェルＴ−８培地、ハム培地、ライボビッツＬ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、ウィリアムス−Ｅ培地、ケイン・アンド・フット（Kane and Foote）培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ブリンスター（Brinster）培地、ｍ−タイロード培地、ＢＷＷ培地、ウィッテン（Whitten）培地、ＴＹＨ培地、ホップス・アンド・ピット（Hoppes ＆ Pitts）培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＢＯ培地、Ｔ６培地、ＨＴＦ培地、ＧＰＭ培地、合成卵管液（ＳＯＦ）、Charles Ronsenkrans培地又はこれらの修正培地等が挙げられる。
【００１５】
前記培地には、必要に応じてアミノ酸、糖質、電解質、ビタミン類、微量金属元素、ホルモン、細胞成長因子、脂質又はその構成成分、担体蛋白質、細胞外基質成分（接着因子）、還元物質等を添加してもよい。
【００１６】
アミノ酸としては、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、タウリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−アスパラギン等が挙げられる。
【００１７】
糖質としては、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、トレハロース等が、電解質としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム等が挙げられる。
【００１８】
ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ類、ビタミンＥ、ニコチン酸、ビオチン、葉酸等が、微量金属元素としては、亜鉛、鉄、マンガン、銅、ヨウ素、セレン、コバルト等が挙げられる。
【００１９】
ホルモンとしては、インスリン、ハイドロコーチゾン、デキサメサゾン、トリヨードサイロニン等が、細胞成長因子としては、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、成長ホルモン等が挙げられる。
【００２０】
脂質又はその構成成分としては、オレイン酸、リノール酸又はリノレン酸等の必須不飽和脂肪酸、コレステロール、エタノールアミン、コリン等が、担体蛋白質としては、血清アルブミン、トランスフェリン等が、細胞外基質成分（接着因子）としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられ、還元物質としては、２−メルカプトエタノール（ＭＥ）、ジチオトレイトール、還元型グルタチオン等が挙げられる。
【００２１】
また前記培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン等の抗生物質、アンホテリシンＢ、ナイスタチン等の抗かび剤、メタロプロテアーゼインヒビター、シクロホスファミド、カゼインペプチド等の受精促進剤を適宜添加してもよい。
【００２２】
本発明の培地組成物は、人工受精における胚の培養又は保存に用いることができる。人工受精における胚の培養又は保存とは、体外受精においては動物卵細胞の培養、その受精時又は受精後の胚の培養又は培養後の保存をいい、体内人工授精においては、発生した胚の子宮等から採取した後の培養又は保存をいう。
【００２３】
胚は動物胚であればヒト、ウシ等どのような動物でもよいが、哺乳動物が好ましく、ウシ、ブタ、ヒツジ等の家畜動物がより好ましく、とりわけウシが好ましい。
【００２４】
本発明における、卵細胞の培養及び受精時の胚の培養においては、人工受精が体外受精の場合は、未成熟卵子に対してキサントフィルを含有する本発明の培地を加え、卵細胞の培養を行う。次いで、一般に３７〜３９℃、好ましくは３８．５℃、５％炭酸ガス／９５％空気中あるいは５％炭酸ガス／５％酸素／９０％窒素中、加湿環境中で、精子を添加し受精を行い、本発明の培地中で約１日間培養する。
【００２５】
本発明における、人工受精後の胚の培養において、キサントフィルを含有する培地を用いることを特徴とする胚の培養方法は、以下のように行う。人工受精によって得られた受精卵を、裸化すなわち顆粒膜細胞を除去し、この裸化受精卵を本培地中で培養する。２〜３日毎に培地を置換する。上記の培養は通常３７℃〜３９℃、好ましくは３８．５℃にて、５％炭酸ガス／５％酸素／９０％窒素中、加湿環境で行なわれる。通常７〜８日間の培養の後、受精卵は胚盤胞に達する。
【００２６】
発生した胚は、液体窒素中で保存することができる。体内人工授精においては子宮から採取した胚を、本発明の培地に加え、液体窒素中で保存することができる。
【００２７】
キサントフィル、胚等の定義は前記と同義である。
【００２８】
本明細書における、「受精」とは、雌雄の生殖細胞が接合する生物学的な現象をいい、「授精」とは、受精を人為的に起こさせることをいう。また、本明細書における、「人工授精」とは、人為的に精液を生殖器に注入する、授精のための技術をいい、「体外受精」とは、体外で精子と卵子を融合する、授精のための技術をいい、「人工受精」とは、人工授精及び体外受精を包含する授精のための技術をいう。
【００２９】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００３０】
ＴＣＭ１９９培地の組成（Kurihara T, Kurome M, Wako N, Ochiai T, Mizuno K, Fujimura T, Takahagi Y, Murakami H, Kano K, Miyagawa S, Shirakura R, Nagashima H. Developmental competence of in vitro matured porcine oocytes after electrical activation. J Reprod Dev. 2002; 48: 271-279）を参考にして、以下の組成の培地(組成物１)を製造する：
ＣａＣｌ２（無水）  ２００．００ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ  ０．７２ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ４００．００ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４（無水）  ９７．６７ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ６８００．００ｍｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １４０．００ｍｇ／Ｌ、アデノシン硫酸  １０．００ｍｇ／Ｌ、ＡＴＰ（２Ｎａ塩）  １．００ｍｇ／Ｌ、アデニル酸  ０．２０ｍｇ／Ｌ、コレステロール  ０．２０ｍｇ／Ｌ、デオキシリボース  ０．５０ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース  １０００．００ｍｇ／Ｌ、グルタチオン（ＧＳＨ）  ０．０５ｍｇ／Ｌ、グアニン・ＨＣｌ  ０．３０ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン（Ｎａ塩）  ０．３５４ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド  ２０．００ｍｇ／Ｌ、リボース  ０．５０ｍｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム  ５０．００ｍｇ／Ｌ、チミン  ０．３０ｍｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）  ２０．００ｍｇ／Ｌ、ウラシル  ０．３０ｍｇ／Ｌ、キサンチン（Ｎａ塩）  ０．３４４ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−アラニン  ５０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ  ７０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−アスパラギン酸  ６０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  ０．１１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ  ２６．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−グルタミン酸・Ｈ２Ｏ  １５０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン  １００．００ｍｇ／Ｌ、グリシン  ５０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  ２１．８８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒドロキシプロリン  １０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−イソロイシン  ４０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−ロイシン  １２０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン・ＨＣｌ  ７０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン  ３０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−フェニルアラニン  ５０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン  ４０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−セリン  ５０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−トレオニン  ６０．００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン  ２０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン（２Ｎａ塩）  ５７．８８ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−バリン  ５０．００ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸  ０．０５ｍｇ／Ｌ、α−トコフェロールホスフェート（２Ｎａ塩）  ０．０１ｍｇ／Ｌ、ｄ−ビオチン  ０．０１ｍｇ／Ｌ、カルシフェロール  ０．１０ｍｇ／Ｌ、ｐ−パントテン酸カルシウム  ０．０１ｍｇ／Ｌ、塩化コリン  ０．５０ｍｇ／Ｌ、葉酸  ０．０１ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール  ０．０５ｍｇ／Ｌ、メナジオン  ０．０１ｍｇ／Ｌ、ナイアシン  ０．０２５ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド  ０．０２５ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸  ０．０５ｍｇ／Ｌ、ピリドキサール・ＨＣｌ  ０．０２５ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン・ＨＣｌ  ０．０２５ｍｇ／Ｌ、リボフラビン  ０．０１ｍｇ／Ｌ、チアミン・ＨＣｌ  ０．０１ｍｇ／Ｌ、ビタミンＡ（アセテート）  ０．１４ｍｇ／Ｌ、アスタキサンチン（富士化学工業製）  ２５ｍｇ／Ｌ。
【実施例２】
【００３１】
前記組成物１においてアスタキサンチンの濃度を５０ｍｇ／Ｌに代える以外は同一の組成をした培地（組成物２）を製造する。
【実施例３】
【００３２】
前記組成物１においてアスタキサンチンの濃度を１００ｍｇ／Ｌに代える以外は同一の組成をした培地（組成物３）を製造する。
【実施例４】
【００３３】
前記組成物１に２０％ＮＢＳ（新生子牛血清）を加えた培地（組成物４）を製造する。
【実施例５】
【００３４】
前記組成物４に０．１ｍＭ  β−ＭＥを加える以外は同様の方法により培地（組成物５）を製造する。
【実施例６】
【００３５】
基礎培地の作製：修正合成卵管液（Takahashi Y, First NL. In vitro development of bovine one-cell embryos: influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins. Theriogenology 1992; 37: 963-978）の組成を参考にして、以下の組成の培地（基礎培地）を作製した：
ＮａＣｌ  ６２９４．００ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ５３４．００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １６２．００ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２（６水和物）  ９９．６０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２（２水和物）  ２５１．４０ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３  ２１０６．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ  ２１．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン  １２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン  ８．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン  ２６．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン  ２６．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン・ＨＣｌ  ３６．９８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン  ７．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン  １６．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トレオニン  ２４．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン  ４．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン  １８．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン  ２３．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン  １４６．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニン  ８．９０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン（１水和物）  １５．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸  １３．３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸  １４．７０ｍｇ／Ｌ、グリシン  ７．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン  １１．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン  １０．５０ｍｇ／Ｌ、ビルビン酸ナトリウム  ５５．００ｍｇ／Ｌ、乳酸ナトリウム  ３７０．００ｍｇ／Ｌ、ウシ血清アルブミン  ３０００．００ｍｇ／Ｌ、ペニシリン１０００００．００単位／Ｌ、ストレプトマイシン  １００ｍｇ／Ｌ、アンホテリシンＢ  ０．２５ｍｇ／Ｌ。
【００３６】
未成熟卵子の回収と成熟培養：食肉市場において解体されたウシからウシ卵巣を回収し、生理食塩水の入ったデュワー瓶に移し研究室まで輸送した。解体後６時間以内にウシ卵巣表面の直径２〜８ｍｍの卵胞から２１Ｇ注射針を付けた１０ｍｌシリンジを用いて卵胞内容物を吸引し、その内容物から顆粒膜細胞付着卵子を回収した。基礎培地においてウシ血清アルブミンを添加せず、Ｄ−グルコース  １０００．００ｍｇ／Ｌ、卵胞刺激ホルモン  ２００ＩＵ／Ｌ及びウシ胎仔血清  １０％（Ｖ／Ｖ）を添加する以外は同一の組成をした培地(卵子成熟用培地)を作製し、その培地で、６０×１５ｍｍペトリディッシュ上に５０μｌのドロップを作製し、流動パラフィンを被せた。回収した顆粒膜細胞付着卵子を１ドロップあたり１０個ずつ移し、３８．５℃、飽和湿度、５％炭酸ガス、５％酸素、９０％窒素のインキュベーター内で２２時間培養した。
【００３７】
成熟卵子の体外受精：基礎培地においてへパリン  ２０ｍｇ／Ｌを添加する以外は同一の組成をした培地を作製し６０×１５ｍｍペトリディッシュ上に４５μｌのドロップを作製し流動パラフィンを被せ、卵子待機用ドロップとした。黒毛和種の凍結精液(０．５ｍｌ)を、３７℃の温水中で融解させ、１５ｍｌ Conical Tube内に調製した９０％パーコール  ２ｍｌ、４５％パーコール  ２ｍｌの重層の上に乗せた。２５℃、７００ｇ、３０分の遠心分離を行い、上清を吸引除去した。残った精子の沈殿を基礎培地１０ｍｌに懸濁し、１０分の遠心分離後、上清を吸引除去した。これを洗浄精子とし、血球計算板で精子濃度を計測し、精子濃度２×１０６ｓｐｅｒｍ／ｍｌになるように基礎培地で希釈した。成熟培養後の顆粒膜細胞付着卵子を卵子待機用ドロップに１ドロップあたり１０個ずつ移し、精子希釈液を５０μｌずつ顆粒膜細胞付着卵子の入った卵子待機用ドロップに投入し、３８．５℃、飽和湿度、５％炭酸ガス、５％酸素、９０％窒素のインキュベーター内で２０時間培養した。
【００３８】
体外受精胚の培養：基礎培地においてＤ−グルコース  ２７０．００ｍｇ／Ｌ、ジメチルスルホキシド  ０．０２５％（ｖ／ｖ）を添加する以外は同一の組成をした培地（組成物６）を作製した。前記組成物６においてアスタキサンチン（マリンケミカル研究所）２．５ｐｐｍを添加する以外は同一の組成をした培地（組成物７）を作製した。前記組成物７においてアスタキサンチンの濃度を２５ｐｐｍに代える以外は同一の組成をした培地（組成物８）を作製した。体外受精開始後２０時間に顆粒膜細胞付着卵子から顆粒膜細胞を除去し、１細胞期胚を得た。得られた１細胞期胚を通常処理においては３８．５℃の温度条件下で培養し、暑熱処理においては培養開始後０〜１０時間及び２４〜３４時間の２回、４０．５℃に温度設定したインキュベーターで培養した。いずれのインキュベーターも飽和湿度、５％炭酸ガス、５％酸素、９０％窒素に設定した。それぞれの温度条件下における培地は、組成物６、組成物７あるいは組成物８を４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μｌで入れたものとした。すなわち通常処理かつアスタキサンチン無添加(通常−無添加区)、通常処理かつアスタキサンチン２．５ｐｐｍあるいは２５ｐｐｍ添加(通常−Ａｘ２．５区あるいは通常−Ａｘ２５区)、暑熱処理かつアスタキサンチン無添加(暑熱−無添加区)、暑熱処理かつアスタキサンチン２．５ｐｐｍあるいは２５ｐｐｍ添加(暑熱−Ａｘ２．５区あるいは暑熱−Ａｘ２５区)の６区に分けて培養した。体外受精の開始日を０日目とし、３日目に基礎培地においてＤ−グルコース  ２７０．００ｍｇ／Ｌを添加する以外は同一の組成をした培地に交換した。さらに５日目に基礎培地においてＤ−グルコース  ２７０．００ｍｇ／Ｌ、β−ＭＥ  ０．１ｍＭ及びウシ胎仔血清  １０％（ｖ／ｖ）を添加する以外は同一の組成をした培地に交換した。３日目以後の培地は、６０×１５ｍｍペトリディッシュ上に５０μｌのドロップを作製し、流動パラフィンを被せた状態で用いた。３日目における分割率と５−８細胞期への発生率及び８日目における胚盤胞発生率を計測した。分割率及び発生率は１元配置の分散分析後Sidak法を用いて多重比較を行った。その結果、通常−無添加区と比較して、暑熱−無添加区では分割率、５−８細胞期及び胚盤胞への発生率が有意に低下した。一方、暑熱−Ａｘ２．５区あるいは暑熱−Ａｘ２５区では、アスタキサンチンの濃度依存的に胚発生率が回復し、暑熱−Ａｘ２５区においては、通常−無添加区との間に有意差が見られなかった。以上の結果より、生理的な暑熱条件によってウシ初期胚発生が直接阻害されることが示され、その発生阻害をアスタキサンチンが緩解しうることが示された(表１)。
【００３９】
【表１】
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