(57)【要約】      （修正有）【課題】サンマウロコの蛋白質分解酵素の分解液から、プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する新規なペプチドを提供する。【解決手段】プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、かつ生体内での抗健忘症効果を有し、毒性も極めて低いペプチド、Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを、サンマウロコから蛋白質分解酵素等で処理して得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチド。
【請求項２】
次式；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項３】
次式；Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチド。
【請求項４】
次式；Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項５】
次式；Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチド。
【請求項６】
次式；Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項７】
次式；Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチド。
【請求項８】
次式；Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、新規なペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】新規なペプチドは、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤及び抗健忘症剤としての利点を持つ。
【特許文献１】特開２００３−２６７９９５
【特許文献２】特開２００３−３０６４９８
【特許文献３】特開２００５−２０６４６９
【特許文献４】特開２００６−１９９６７１
【特許文献５】特開２００６−１９９６７２
【非特許文献１】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０巻，３５８−３５９頁（１９９６年）．
【非特許文献２】Ｋｉｍｕｒａ，Ｋ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１巻，１７５４−１７５６頁（１９９７年）．
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．等：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６９巻，１８４−１８９頁（１９７９年）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】老人性痴呆症はアルツハイマー病と、脳血管痴呆症は脳梗塞や脳内出血、くも膜下出血などが起因となる脳血管性痴呆との２種類に大別される。健忘症や痴呆症の患者の脳内では、プロリルエンドペプチダーゼという酵素の活性が亢進していると報告され、この酵素の働きを弱めれば健忘症や痴呆症の予防や治療が期待できる［非特許文献１］［非特許文献２］。一方、これまで発明者は、水産加工廃棄物として処理されてきた魚ウロコを酵素分解して得られる魚ウロコ由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ及びＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献１］、同じく、魚ウロコ由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ及びオクタペプチドＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕに活性化酸素阻害能を見出してきた［特許文献２］。更に、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献３］、同じく、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎに活性化酸素阻害能を見出し［特許文献４］、又、鰻骨由来トリペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出してきた［特許文献５］。しかしながら、魚ウロコ由来のコラーゲンペプチドに関するプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用並びに経口投与による抗健忘症効果については未だ不明であり、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明者は、前記の課題を解決するために鋭意研究した結果、魚ウロココラーゲンから得られた本発明に係る新規なペプチドが抗健忘症効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、魚ウロコ由来のコラーゲンペプチドから薬理作用を有する物質を検索し、この新規な魚ウロコ由来のコラーゲンペプチドが強いプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有することを見出した。そして、この新規な魚ウロコ由来のコラーゲンペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行い、その結果、この新規な魚ウロコ由来のコラーゲンペプチドが抗健忘症効果を有し、天然物由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る魚ウロコ由来のコラーゲンペプチドは、次式、
（１）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
（２）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（３）Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（４）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なペプチドであり常温における性状は白色の粉末である。【０００５】本発明に係る新規なペプチドは化学的に合成する方法又はサンマウロコの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新規なこれらペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常のペプチド合成法によってポリマー性の固相支持体へペプチドのＣ末端（カルボキシル末端側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合していくのがよい。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた通常の方法で精製することができる。【０００６】上記したように、本発明に係る新規なペプチドは、サンマＣｏｌｏｌａｂｉｓ  ｓａｉｒａ（ｍａｃｋｅｒｅｌ  ｐｉｋｅ）ウロコの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば、以下のようにして行うことができる。上記の新規なこれらペプチドを含有しているサンマウロコを粉末化して加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等の蛋白質分解酵素で加水分解する場合は、サンマウロコ粉末を必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解液を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で充分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ等）にかけ、その吸着画分からプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する成分を含有する画分を得、得られたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５等）によって分画し、得られた活性化酸素阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。【０００７】本発明に係る新規なペプチドの製法において用いる魚類ウロコは、本発明の目的を達成できる限りいかなる魚類ウロコを用いても良いが、好ましくはサンマウロコを用いるのが良い。以上のようにして得られた本発明に係る新規なペプチドは、静脈内への繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさない。又これらペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することができる。投与法としては、通常は哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当た���ペプチド０．０１−１０ｍｇの量である。投与回数は、通常、１日１回から４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調製することができる。【０００８】上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては、でんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等；崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；滑沢剤としては、ステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類をあげることができる。又、製剤の調製にあたっては、必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なペプチドを、注射用水、生理食塩液及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発明に係る新規なペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液にて溶解して用いることもできる。【０００９】本発明に係る新規なペプチドは、優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、抗健忘症効果、抗痴呆症効果を示す。従って、軽度から中程度のアルツハイマー型痴呆症、及び脳梗塞後遺症としての脳血管型痴呆症の痴呆症状の進行を遅らせることができることから、健忘症の予防剤又は症状改善剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】本発明は、医薬品としての有用性を有する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプチド及びこれらペプチドを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
（１）ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
（２）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（３）Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（４）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】製造例１
サンマウロコを漁港から収集後、目視検査で異物を取り除いた。０．２％の食品用合成洗剤（ポリリン酸カリウム、ショ糖脂肪酸エステル）を入れて１，４３０回転（ｒｐｍ）、４分間攪拌した。その後、洗剤が無くなるまで十分、水洗浄してから、次亜塩素酸ナトリウムを加えて殺菌洗浄した。殺菌剤が無くなるまで十分、水洗浄した後、８０℃で４０分間、乾燥し、更に、７０℃で１００分間、乾燥を行った。乾燥後、粉砕機ジェットミルを用いて粉砕し、サンマウロコ粉末を得た。このようにして得られたウロコ粉末の一般成分分析は、水分７．８ｇ／１００ｇ、タンパク質３６ｇ／１００ｇ、脂肪０．１ｇ／１００ｇ、灰分５６．１ｇ／１００ｇであった。サンマウロコ粉末５００ｇに２規定のアンモニア水５Ｌを加え、室温で、１週間ゆっくり攪拌しながら酢酸抽出を行った。攪拌後、東洋濾紙Ｎｏ．２を用いて濾紙濾過し、濾液を得た。濾液を透析チューブに詰め流水に対して２日間透析を行った。透析内液を減圧濃縮した後、凍結乾燥して、サンマウロコ粉末由来のタンパク質粉末２０ｇを得た。これは、サンマウロコ粉末に対して回収率４％であった。タンパク質粉末２０ｇに脱イオン水５００ｍＬを加え、ｐＨを２．０に調整した後、ペプシン０．６ｇを加え、酵素分解（３７℃、２４時間）した。分解後、分解液を透析チューブに詰め脱イオン水６Ｌに対して２日間透析を行った。透析外液を減圧濃縮した後、凍結乾燥して、酵素分解エキス粉末４．８ｇを得た。これは、タンパク質粉末に対して回収率２３．９％であった。酵素分解エキス粉末４．８ｇに脱イオン水１００ｍＬを加え、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ×４（Ｈ＋）を充填したカラム（カラムサイズ；４．０×５５ｃｍ）を用いてクロマトグラフィーした。脱イオン水で水洗した後、２規定のアンモニア水で溶出し溶出液を濃縮した。この濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したカラム（カラムサイズ；２．６×１３３ｃｍ）を用いてクロマトグラフィーした。その際のクロマトグラフィーの条件は、流速２０ｍＬ／ｈ、各画分３ｍＬで行った。ペプチド画分として分画番号２４から３５を集めて濃縮した。更に、この濃縮液をＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（Ｈ＋）を充填したカラム（カラムサイズ；２×４８．５ｃｍ）を用いてクロマトグラフィーした。脱イオン水１Ｌから３％食塩水１Ｌでの濃度勾配法による溶出を、流速６０ｍＬ／ｈ、各画分５ｍＬのクロマトグラフィー条件で行った。各ペプチド画分としてＳＰ−１画分（分画番号３１〜４５）、ＳＰ−２画分（分画番号４６〜７０）及びＳＰ−３画分（分画番号７１〜１００）を集めて濃縮、凍結乾燥して、各ペプチド粉末（ＳＰ画分）を得た。このようにして分画して得たペプチド粉末（ＳＰ画分）の中で、プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の高かったＳＰ−３画分のペプチド粉末７ｍｇを脱イオン水２５μＬに溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。ＨＰＬＣ条件は、カラムとして野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（φ４．６ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相として０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡでの濃度勾配法により、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでクロマトグラフィー処理し、溶出時間２１．０分（１）、２６．７分（２）、４２．９分（３）及び５３．１分（４）に強いプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有するペプチドフラグメントを得た。
このようにして得られたプロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、次式（１）（２）（３）及び（４）
（１）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
（２）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（３）Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
（４）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なペプチドをプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼ペプチド１０ｇ、▲２▼乳糖８０ｇ、▲３▼コーンスターチ２０ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．０ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び２０ｇのコーンスターチを混和し、８ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に６ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏの合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のプロリンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が４２分間で８０％−５５％の濃度勾配法により流速１．８ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィー処理した。紫外部波長２１７ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを得た。
【００１３】Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のプロリンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が５１分間で７９％−６５％の濃度勾配法により流速１．９ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィー処理した。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを得た。
【００１４】Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のプロリンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が４１分間で７９％−６３％の濃度勾配法により流速１．７ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィー処理した。紫外部波長２１７ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを得た。
【００１５】Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のプロリンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が４３分間で８３％−６９％の濃度勾配法により流速２．１ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィー処理した。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを得た。
【００１６】このように合成によって得られた本発明に係る新規なペプチドは、以下に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）試験によってプロリルエンドペプチダーゼ阻害能が確認された。
試験例１（プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性測定法）
酵素：プロリルエンドペプチダーゼ（生化学工業社製、酵素番号ＥＣ３．４．２１．２６）０．１Ｕ／ｍＬ、合成基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（生化学工業社製）２ｍＭを用い、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ等の方法［非特許文献３］に準じて測定した。すなわち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０００μＬ、被検液（合成ペプチド）１００μＬ、酵素溶液（４０％ジオキサンを含む）１００μＬを順次加え、３０℃で５分間プリインキュベーションした。更に、基質溶液１００μＬを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした。その後、１Ｎ  ＨＣｌ  ５００μＬを加えることにより反応を止め、４１０ｎｍの吸光度を測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、プロリルエンドペプチダーゼの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な被検液の濃度（Ｍ）で示した。
【００１７】前記合成によって得られた本発明に係る新規なペプチドをマススペクトル及びアミノ酸分析により分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するペプチドであることが確認された。このマススペクトル及びアミノ酸分析の結果は表１に示す通りである。同時に、前記合成によって得られた本発明に係る新規なペプチドのプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性値を表１に示した。
【表１】
2010001280.tif 000002
前記合成によって得られた本発明に係る新規なペプチドは、以下に示すｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）試験によって薬理効果が確認された。
【００１８】試験例２（ラットによる抗健忘症効果試験）
前記合成によって得られた本発明に係る新規なペプチドの抗健忘症効果試験は、ラットの受動的回避学習装置、すなわちフットショックストレス・システム（室町機械社製、ＭＦＳ−０１型）を用いて行った。実験動物は（株）九動より４週令雄性ラット（平均体重１６０ｇ）３群各３匹を購入後、受動的回避学習試験を行った。インタクト・コントロールとして生理食塩水を経口投与したラット（生理食塩水群）、コントロールとして塩酸ドネペジル（エーザイ社製）を０．２ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（塩酸ドネペジル群）、及び合成ペプチドを２００ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（合成ペプチド群）を用いて実験を行った。これら３群のラット各々を台上に乗せ、床に降りた瞬間から電流を流し、電気ショックを避けるために台上に戻り、もはや床へ降りなくなるまでの受動的回避学習をさせる。次に、これら３群のラットに、痴呆症を引き起こすスコポラミン２０ｍｇ／ｋｇ投与すると、先の電気ショックを忘れ、床に降りるようになる。ラットが床へ降りるまでの滞在時間（秒）を測定することにより、学習前に投与した合成ペプチドがこの記憶喪失をどの程度予防するかをみた。以上の試験の結果を表２に示した。
【表２】
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本発明に係る新規なペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な抗健忘症効果を示すことが確認された。従って、本発明に係る新規なペプチドは痴呆症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明に係る新規なペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。