(57)【要約】【課題】    ナラノヤエザクラからリンゴ酸、コハク酸の生成能が高く、ワインをイメージさせるような酸味を持たせることができる今般の嗜好に適合した新たな酵母を分離し、新たな酒類及び飲食物を製造する。【解決手段】  ナラノヤエザクラの花より採取されたサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母を、分離選抜し、これを用いて従来よりリンゴ酸、コハク酸が多く、ワインをイメージさせるような酸味を持たせることができる今般の嗜好に適合した新たな酒類及び飲食物を製造する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコールを３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ナラノヤエザクラ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株を選択することを特徴とする、ナラノヤエザクラの花から分離した前記酵母の取得方法。
【請求項２】
ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコールを３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母を選択することによって、ナラノヤエザクラの花から分離された酵母から選択され、そして、コハク酸、リンゴ酸の生産が多く且つアルコール生産能が１６容積％以下で、甘みがあり、フルーティーな酸味をもつ清酒を製造することができることを特徴とする、酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ナラノヤエザクラ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株。
【請求項３】
請求項２に記載された酵母を用いて醸造することを特徴とする、清酒の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載された酵母を用いることを特徴とする、フルーティーな酸味を持つ飲食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナラノヤエザクラ（学名：Ｐｒｕｎｕｓ  ｖｅｒｅｃｕｎｄｅ  ’Ａｎｔｉｑｕａ’）の花から分離され、甘くフルーティーな酸味を持つ清酒醸造用酵母及びその取得方法並びに清酒その他の飲食品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全国の清酒の消費量の推移を見ると、最も消費された昭和５０年には１，６７５千ｋｌ消費されたのが、平成１８年には６８８千ｋｌと約４１％程度にまで減少している。これは、清酒の仕込み配合等が旧態依然であり、清酒のほとんどのものが、既存の醸造協会系酵母を使用して製造され、その個性がなくなっていること、さらに果汁を使用した低アルコール飲料を飲みなれているため、清酒に抵抗感のある若年層の清酒離れが進んでいることに代表されるように、消費者の嗜好の変化に十分対応しきれていないことが要因として考えられる。
【０００３】
このような課題を解消するために、例えば、特許第３８４６６２３号、特許第４１３０２４６号、特開平１１−５６３３７号公報等に示された新たな酵母が開発されている。
なお、以下の説明において『やまぐち』とあるのは特許第３８４６６２３号（特許文献１）に記載の桜の花から分離した『やまぐち・桜酵母』を、『三菱』とあるのは特許第４１３０２４６号（特許文献２）に記載された海水から分離した酵母を、『三共』とあるのは特開平１１−５６３３７（特許文献３）に記載された海藻から分離した酵母をそれぞれ示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３８４６６２３号公報
【特許文献２】特許第４１３０２４６号公報
【特許文献３】特開平１１−５６３３７公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今般の嗜好に適合した新たな清酒用酵母として、低アルコールでありながら、ワインをイメージさせるような酸味を持つ酵母が求められている。しかしながら、上記のいずれの酵母も、アルコール濃度が１７％以上と高い。
【０００６】
そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、奈良県の県花でもあり、奈良を代表するナラノヤエザクラの花から、低アルコール生産性でありながら、特にリンゴ酸、コハク酸の生成能が高い清酒製造用の酵母としても利用できる新規な酵母、すなわち、酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）『ナラノヤエザクラ酵母』（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株を分離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る酵母の取得方法は、ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコールを３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）『ナラノヤエザクラ酵母』（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株を選択している。
【０００８】
また、本発明に係る酵母は、ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコールを３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母を選択することによって、ナラノヤエザクラの花から分離された酵母から選択され、そして、コハク酸、リンゴ酸の生産が多く且つアルコール生産能が１６容積％以下で、甘みがあり、フルーティーな酸味をもつ清酒を製造することができる酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）『ナラノヤエザクラ酵母』（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株である。
【０００９】
さらに、本発明に係る清酒の製造方法は、前記酵母（『ナラノヤエザクラ酵母』）を用いて醸造することを特徴とし、本発明に係る飲食物の製造方法は、前記酵母（『ナラノヤエザクラ酵母』）を用いることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る酵母の取得方法は  ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコールを３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ナラノヤエザクラ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株を選択する。
【００１１】
本発明に係る酵母は、ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコールを３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母を選択することによって、ナラノヤエザクラの花から分離された酵母から選択され、そして、コハク酸、リンゴ酸の生産が多く且つアルコール生産能が１６容積％以下で、甘みがあり、フルーティーな酸味をもつ清酒を製造することができることを特徴とする、酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ナラノヤエザクラ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株である。
【００１２】
本発明に係る清酒の製造方法は、前記酵母（酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ナラノヤエザクラ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）株を用いて行われる。
【００１３】
本発明に係る飲食物の製造方法は、前記酵母（酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ナラノヤエザクラ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４）を用いて行われる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】『ナラノヤエザクラ酵母』、日本醸造協会７号酵母（以下、『Ｋ７』とする。）、日本醸造協会酵母７０１号（以下、『Ｋ７０１』とする。）、日本醸造協会９０１号酵母（以下、『Ｋ９０１』とする。）、Ｘ２１８０−Ｄ酵母、ＹＰＨ１４９酵母の染色体電気泳動核型（パルスフィールド電気泳動法）を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
自然界の花には多様な酵母が付着していることが知られている。そこで、奈良県の県花でもあり、奈良県を代表する花『ナラノヤエザクラ』の花から清酒醸造に適した酵母を分離することを行った。
まず、主として奈良公園内に自生するナラノヤエザクラのうち、延べ５０本のナラノヤエザクラから約５６０個の花を採取した。この花を無菌的に１本の５０ｍｌのチューブに３つずつ入れ、調製した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、３０℃で培養した（第１次選択）。
さらに、２次選択として、クロラムフェニコールを添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ２６、ｐＨ３．５）を用いて３０℃で培養した。
さらに、３次選択の１として、２次選択で発泡或いは白濁したサンプルを麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１４．７、ｐＨ３．６、エタノールが５容積％）を用いて１５℃で嫌気状態で培養した。
さらに、３次選択の２として、３次選択で発泡したサンプルを麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１４．７、ｐＨ３．６、エタノールが５容積％）を用いて１０℃で嫌気状態で培養した。
３次選択の２で発泡した懸濁培養液を、無菌的にＴＴＣ寒天下層培養地に塗抹し３０℃で培養した単一コロニーを分離株とした。
【００１６】
なお、前記麹汁液体培地は、米麹１ｋｇに水３０００ｍｌを加えて５５℃で一晩加温後ろ過搾汁して得られた麹汁を目標とするＢｒｉｘとなるように水で希釈した後、乳酸でｐＨを調整してからオートクレーブで滅菌し、必要に応じてエタノールを無菌的に添加したものである。
【００１７】
上述した第１次選択から第３次選択の２の作業を行うことにより、８株の分離株を採取することができた。このうちの１株をＤＮＡシーケンサー法にかけて、属種をサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）と特定した。
【００１８】
なお、このＤＮＡシーケンサー法では，、２８ｓｒＲＮＡ  Ｄ１／Ｄ２領域塩基配列を決定し、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＤＮＡデータベースでの相同試験を行った結果、『ナラノヤエザクラ酵母』の帰属分類群がサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）と特定された。
【００１９】
『ナラノヤエザクラ酵母』、日本醸造協会７号酵母（以下、『Ｋ７』とする。）、日本醸造協会酵母７０１号（以下、『Ｋ７０１』とする。）、日本醸造協会９０１号酵母（以下、『Ｋ９０１』とする。）、Ｘ２１８０−Ｄ酵母、ＹＰＨ１４９酵母の染色体電気泳動核型（パルスフィールド電気泳動法）を図１に示す。
【００２０】
『ナラノヤエザクラ酵母』は、他の酵母と比較して、２４５〜４６０ｋｂ、６３０ｋｂ部分の染色体ＤＮＡバンドが他の酵母と明かに異なるため、これらとは異なる酵母であることが確認された。
【００２１】
また、『ナラノヤエザクラ酵母』の炭素源資化性を、『やまぐち』、『三菱』、『三共』、『Ｋ７０１』、『Ｋ９０１』との比較で表１に示す。
なお、表１における『＋』は資源性がある、『−』は資源性がない、『×』はそれぞれの公報に記載されていなかったものである。
【００２２】
炭素源資化性
【表１】
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【００２３】
このようにして、ナラノヤエザクラの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５〜３０、ｐＨ２以上５以下）を使用して５〜３５℃で増殖させ、次にアルコール（エタノール）を３〜１５容積％添加した麹汁液体培地を使用して５〜２０℃の嫌気状態で培養し、育成旺盛で高濃度のアルコール生産性を示す酵母が得られた。
この酵母は、コハク酸、リンゴ酸の生産が多く且つアルコール生産能が１６容積％以下で、甘みがあり、フルーティーな酸味をもつ清酒を製造に適した酵母である。
【００２４】
発明者はこの酵母を『ナラノヤエザクラ酵母』と命名した。この『ナラノヤエザクラ酵母』は、下述するサッカロマイセスセレビッシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する菌株である。
この『ナラノヤエザクラ酵母』は、以下の特性を有している。
（１）『Ｋ７０１』や『Ｋ９０１』といった既存の清酒酵母に対して無害（キラー因子を持たない）。
ＹＥＰＤ培地にメチレンブルーを０．００３％添加した寒天平板に協会酵母を１０6 ｃｆｕ／ｇ塗布し、『ナラノヤエザクラ酵母』を植菌し、２５℃で２４時間培養した。
その結果、微小コロニーが培地一面に発生したときに現れるクリアーゾーンを観察したところ、阻止円ができていないことが確認された。
なお、前記ＹＥＰＤ培地は、酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％、寒天１．５％で１Ｍクエン酸水溶液でｐＨ４．７に調整したものである。
参考文献：河野勇人他、醸造協会誌、８３，５，３４４（１９８８）
【００２５】
（２）コハク酸、リンゴ酸の生成が多く、酸味があり、低アルコールでワインをイメージする清酒を製造することができる。
【００２６】
ＴＴＣ染色
すなわち、古川、秋山の方法（古川敏郎、秋山裕一：農化, 37, 398(1963))に従ってＴＴＣ染色性試験、すなわち菌体を適当に希釈し（１プレートに約２００程度となるよう）、ＴＴＣ下層培地に３０℃で２日間プレート培養したコロニー上へ、ＴＴＣ寒天を溶解後４５℃程度にしてから静かに重層し、固まった後３０℃で２〜３時間放置し、コロニーの染色性を観察したとき、ピンク色を示した。
なお、前記『Ｋ７０１』や『Ｋ９０１』といった既存の清酒酵母のＴＴＣ染色は赤色を示した。
【００２７】
この『ナラノヤエザクラ酵母』は、醸造用酵母（サッカロマイセスセレビッシエ）であって下記の菌学的性質を有する菌株である。
ＧＹＰ培地を用いて３０℃で２日間培養したときの菌の形態
栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ
栄養細胞の形状：卵型
増殖の形態：出芽
なお、前記ＧＹＰ培地は、Ｄ−（＋）グルコースが２％、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔが０．５％、Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎが０．５％である。
【００２８】
ＧＹＰ寒天培地を用いて３０℃で２日間培養したときのコロニーの形態
形態：円
隆起：凸円状
周縁：全縁                                                                      大きさ（直径）：２〜３ｍｍ
色調：白色で不透明
表面：円滑で光沢あり
【００２９】
『ナラノヤエザクラ酵母』の糖の発酵性の結果を次に示す。
【００３０】
グルコース  ＋
グリセリン  −
Ｌ−アラビノース  −
Ｄ−キシロース  −
アドニット  −
Ｄ−ガラクトース  ＋
イノシトール  −
Ｄ−ソルビトール  −
α−メチル−Ｄ−グルコシド  ＋
Ｇ−セロビオース  −
ラクトース  −
マルトース  ＋
スクロース  ＋
Ｄ−トレハロース  −
Ｄ−メレチトース  −
Ｄ−ラフィノース  ＋
メリビオース  −
【００３１】
次に、この『ナラノヤエザクラ酵母』を用いた清酒の製造について説明する。
酵母数が１０8 ｃｆｕ／ｍｌとなるように培養した麹汁液体培地（ボーメ度１０）４０ｍｌを乳酸とともに、汲水、α化米、乾燥麹米に添加し、三段仕込みで醸造を行った。『ナラノヤエザクラ酵母』では１８日、『Ｋ７０１』、『Ｋ９０１』は１５日で清酒が製造できた。
【００３２】
総米１０ｋｇで清酒を仕込んだ。
この仕込み配合を表２に示す。
【００３３】
総米１０ｋｇの清酒仕込み配合
【表２】
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【００３４】
まず、汲水２．２９ｋｇに乳酸５．７ｍｌ、乾燥麹米（歩留８６％）０．４３ｋｇ、酵母数が１０8 ｃｆｕ／ｍｌとなるように培養した麹汁液体培地（ボーメ度１０）４０ｍｌを加え、水温１０℃となるように１〜３時間浸漬した。
【００３５】
次に、その浸漬した液に、α化米（歩留９７％）１．２２ｋｇを加え初添とした。
【００３６】
１日後、汲水５．２９ｋｇと乾燥麹米（歩留８６％）０．６９ｋｇを加えて、１〜３時間経過後、α化米（歩留９７％）２．３２ｋｇを加えて仲添とした。
【００３７】
さらに１日後、汲水８．０４ｋｇと乾燥麹米（歩留８６％）０．８６ｋｇを加えて、１〜３時間経過後、α化米（歩留９７％）３．６４ｋｇを加えて留添とした。
【００３８】
なお、初添は１５℃、仲添は１２℃、留添は１０℃を目標として仕込みを行った。
【００３９】
留添以降、品温が１１〜１４℃になるように温度管理を行い、『ナラノヤエザクラ酵母』では１８日間、『Ｋ７０１』では１５日間、『Ｋ９０１』では１５日間醸造を行った。
【００４０】
その後、念入りに洗浄した酒袋を用いて袋吊りで上槽を行った。
【００４１】
このような一般的な清酒の製造工程を経て製造された清酒は以下のようなものであった。『Ｋ７０１』、『Ｋ９０１』との比較で示す。なお、表３における『ナラノヤエザクラ酵母』、『Ｋ７０１』及び『Ｋ９０１』のデータは、発明者が表２に示す条件と同一の条件で製造した清酒の分析結果である。
【００４２】
清酒分析値
【表３】
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【００４３】
有機酸データ（ｍｇ／１００ｍｌ）
【表４】
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【００４４】
なお、表４における『やまぐち』は特許第３８４６６２３号（特許文献１）に記載の桜の花から分離した『やまぐち・桜酵母』であり、『三菱』は特許第４１３０２４６号（特許文献２）に記載された海水から分離した酵母であり、『三共』は特開平１１−５６３３７（特許文献３）に記載された海藻から分離した酵母である。
【００４５】
それぞれの酵母の有機酸データのうち、『ナラノヤエザクラ酵母』、『Ｋ７０１』及び『Ｋ９０１』のデータは発明者が製造した清酒を分析結果であり、『やまぐち』、『三菱』及び『三共』は、各公報に記載されていたものを転記した。
【００４６】
また、表３で示した清酒分析値からは、『ナラノヤエザクラ酵母』を用いて製造した清酒は、他の酵母を用いて製造した清酒より低アルコール（１６％以下）であり、日本酒度が低い甘口であることがわかる。
【００４７】
さらに、表４で示した清酒の有機酸データからすると、『ナラノヤエザクラ酵母』を用いて製造された清酒は、他の酵母を用いて製造された清酒と比較すると、リンゴ酸、コハク酸が圧倒的に多く含まれていることがわかる。
リンゴ酸は、『やまぐち』の酵母を用いた製造された清酒の約３倍、『三菱』の酵母を用いて製造された清酒の約６．７倍、『三共』の酵母も用いて製造された清酒の約４．０倍も含まれている。
また、コハク酸は、『やまぐち』の酵母を用いた製造された清酒の２．２倍、『三菱』の酵母を用いて製造された清酒の約１４．２倍、『三共』の酵母も用いて製造された清酒の約１２．６倍も含まれている。  
【００４８】
これらをまとめると、『ナラノヤエザクラ酵母』を用いて製造された清酒は、他の酵母を用いて製造された清酒より甘口で、且つリンゴ酸やコハク酸が多く、ワインに似たフルーティーな酸味をもったものといえよう。
【００４９】
これまで、『ナラノヤエザクラ酵母』を用いた清酒の製造について説明したが、この『ナラノヤエザクラ酵母』は清酒のみならず、一般的な酵母と同様に食酢、パン、味噌、醤油等の飲食物の製造に用いることができる。
【００５０】
この『ナラノヤエザクラ酵母』は、上述したように、コハク酸、リンゴ酸の生産性が高いので、製造された各種飲食物、例えば、食酢、パン、味噌、醤油等は、この『ナラノヤエザクラ酵母』特有のフルーティーな味わいを持つことになる。
【００５１】
例えば、この『ナラノヤエザクラ酵母』を用いたパンは以下のようにして製造される。
ボールに強力小麦粉１５０ｇ、麹汁で１晩培養した『ナラノヤエザクラ酵母』が入った麹汁１０ｍｌ、砂糖２０ｇ、食塩２．５ｇを混ぜ合わせた後、かき混ぜながら水８５ｍｌを数回に分けて加えてこねあげる。
【００５２】
こねあがった生地を丸めて表面をなめらかにしてボールに入れ、乾燥しないように食品ラップを被せて、３０℃の恒温状態で５０〜６０分間かけて一次発酵させる。
一次発酵が終わった生地を適宜分割し、表面がなめらかになるように丸めて布巾をかけて１０分間ねかせる。
【００５３】
その後、生地を棒でのばし，適当な形に整える。
これをオーブンで３７℃程度で４０分間、二次発酵を行う。なお、この二次発酵の際には、生地を載せるオーブン用シートに油をひき、生地には霧吹きで水を吹きかけておく。  この二次発酵が終わった後、オーブンを１８０℃に加温し、１８分間かけて生地を焼いてパンとする。
【００５４】
なお、上述したパンの製造方法は、この『ナラノヤエザクラ酵母』に特有のものではなく、ごく一般的なパンの製造方法である。
【受託番号】
【００５５】
特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６８４
【図１】
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