(57)【要約】      （修正有）【課題】網膜症のような眼の血管の疾患を特異的に治療する方法の提供。【解決手段】単離された、哺乳動物の骨髄に由来する、系統陰性の造血幹細胞集団（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）の使用。該造血幹細胞集団は網膜の血管を形成することができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含有し、その少なくとも約５０％はＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔ細胞表面マーカーを有している。最大約８％の細胞がＳｃａ−１細胞マーカーを有し、最大約４％の細胞がＦｌｋ−１／ＫＤＲマーカーを有することができる。治療上有用な遺伝子をトランスフェクトされた、単離されたＬｉｎ  ＨＳＣ集団も提供され、これは細胞を用いた遺伝子治療において眼に遺伝子を送達するのに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約５０％の細胞が細胞マーカーＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔを含む内皮前駆細胞を含む、単離された、哺乳動物の、骨髄由来である系統陰性の造血幹細胞集団。
【請求項２】
少なくとも約７５％の細胞が細胞マーカーＣＤ３１を含む、請求項１に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３】
少なくとも約６５％の細胞が細胞マーカーｃ−ｋｉｔを含む、請求項１に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項４】
少なくとも約８０％の細胞がＣＤ３１細胞マーカーを含み且つ少なくとも約７０％の細胞がｃ−ｋｉｔ細胞マーカーを含む内皮前駆細胞を含む、単離された、哺乳動物の、骨髄由来である、系統陰性の造血幹細胞集団。
【請求項５】
前記細胞がマウスの細胞である、請求項１に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項６】
前記細胞がヒトの細胞である、請求項１に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項７】
最大約８％の細胞が細胞マーカーＳｃａ−１も含み且つ最大約４％の細胞が細胞マーカーＦｌｋ−１／ＫＤＲも含む、請求項１に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項８】
最大約１％の細胞がＴｉｅ−２細胞マーカーを含む、請求項７に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項９】
約５０％から約８５％の細胞がＣＤ３１マーカーを含み、約７０％から約７５％の細胞がｃ−ｋｉｔマーカーを含み、約４％から約８％の細胞がＳｃａ−１マーカーを含み、約２％から約４％の細胞がＦｌｋ−１／ＫＤＲマーカーを含む内皮前駆細胞を含む、単離された、哺乳動物の、骨髄由来である造血幹細胞集団。
【請求項１０】
さらに細胞培養培地を含む、請求項１に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項１１】
前記幹細胞が哺乳動物の骨髄に由来する、請求項１０に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項１２】
前記幹細胞がヒトの骨髄に由来する、請求項１０に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項１３】
（ａ）哺乳動物から骨髄を抽出する工程と、
（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離する工程と、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記複数の単球を標識する工程と、
（ｄ）前記複数の単球からＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に関して系統陽性であった単球を除去して、内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を得る工程と
を包含する、内皮前駆細胞を含む、骨髄由来である、系統陰性の造血幹細胞を単離する方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物が成体の哺乳動物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記系統陰性の造血幹細胞集団の少なくとも約５０％がＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔ細胞マーカーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記系統陰性の造血幹細胞集団が、損傷した成体の網膜のグリアに富む領域を標的化し得る内皮前駆細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法によって作製される、単離された、哺乳動物の、骨髄由来である系統陰性の造血幹細胞集団。
【請求項２０】
少なくとも約５０％の細胞が細胞マーカーＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔを含む、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２１】
少なくとも約７５％の細胞が細胞マーカーＣＤ３１を含む、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２２】
少なくとも約６５％の細胞が細胞マーカーｃ−ｋｉｔを含む、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２３】
少なくとも約８０％の細胞がＣＤ３１細胞マーカーを含み且つ少なくとも約７０％の細胞がｃ−ｋｉｔ細胞マーカーを含む、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２４】
最大約８％の細胞が細胞マーカーＳｃａ−１も含み且つ最大約４％の細胞が細胞マーカーＦｌｋ−１／ＫＤＲも含む、請求項２３に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２５】
最大約１％の細胞がＴｉｅ−２細胞マーカーを含む、請求項２４に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２６】
約５０％から約８５％の細胞がＣＤ３１マーカーを含み、約７０％から約７５％の細胞がｃ−ｋｉｔマーカーを含み、約４％から約８％の細胞がＳｃａ−１マーカーを含み、約２％から約４％の細胞がＦｌｋ−１／ＫＤＲマーカーを含む、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２７】
前記細胞がマウスの細胞である、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２８】
前記細胞がヒトの細胞である、請求項１９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項２９】
哺乳動物において網膜の新生血管形成を増強する方法であって、網膜の新生血管形成が必要である哺乳動物の眼に請求項１に記載の系統陰性の造血幹細胞集団を硝子体内注入することを包含し、ここで該幹細胞は細胞を眼に注入される種と同じ種の哺乳動物の骨髄に由来する、方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物がマウスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
患者の骨髄から内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を単離すること、及び、眼疾患を阻止するのに十分な数の単離された幹細胞を患者の眼の硝子体内に注入すること、を包含する、患者の眼疾患を治療する方法。
【請求項３３】
幹細胞の数が患者の眼にある網膜の損傷を修復するのに有効である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
幹細胞の数が患者の眼にある網膜の新生血管構造を安定化するのに有効である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
幹細胞の数が患者の眼にある網膜の新生血管構造を成熟させるのに有効である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）哺乳動物から骨髄を抽出すること、
（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離すること、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記複数の単球を標識すること、及び、
（ｄ）前記複数の単球からＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に関して系統陽性であった単球を除去して、内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を得ること、
により、系統陰性の造血幹細胞の集団を単離する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
単離された系統陰性の造血幹細胞集団の少なくとも約５０％が細胞マーカーＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患が網膜変性疾患である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患が網膜血管変性疾患である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が虚血性網膜症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が血管出血である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が血管漏出である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患が脈絡膜症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患が加齢黄斑変性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が糖尿病性網膜症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患が推定眼ヒストプラスマ症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が未熟児網膜症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患が鎌状赤血球貧血である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患が色素性網膜炎である、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
治療上有用なペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた請求項１に記載の幹細胞集団を含む、トランスフェクトされた系統陰性の造血幹細胞集団。
【請求項５１】
前記治療上有用なペプチドが抗血管新生ペプチドである、請求項５０に記載のトランスフェクトされた幹細胞集団。
【請求項５２】
前記抗血管新生ペプチドが蛋白質のフラグメントである、請求項５１に記載のトランスフェクトされた幹細胞集団。
【請求項５３】
前記蛋白質のフラグメントがＴｒｐＲＳの抗血管新生フラグメントである、請求項５２に記載のトランスフェクトされた幹細胞集団。
【請求項５４】
前記ＴｒｐＲＳのフラグメントがＴ２−ＴｒｐＲＳである、請求項５３に記載のトランスフェクトされた幹細胞集団。
【請求項５５】
請求項４９に記載のトランスフェクトされた幹細胞集団を患者の眼に硝子体内注入することを包含する、網膜の血管新生を阻害する必要のある患者の眼の中で網膜の血管新生を阻害する方法。
【請求項５６】
（ａ）哺乳動物から骨髄を抽出すること、
（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離すること、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記複数の単球を標識すること、及び、
（ｄ）前記複数の単球からＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に関して系統陽性であった単球を除去して、内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を得ること、
により、トランスフェクトされた系統陰性の造血幹細胞集団を調製する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
単離された系統陰性の造血幹細胞集団の少なくとも約５０％が細胞マーカーＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
骨髄に由来するトランスフェクトされた系統陰性の造血幹細胞集団を患者の眼に硝子体内注入することを包含し、前記幹細胞集団が治療上有用な遺伝子でトランスフェクトされている、導入遺伝子を患者の網膜血管構造に送達する方法。
【請求項５９】
（ａ）哺乳動物から骨髄を抽出すること、
（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離すること、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記複数の単球を標識すること、及び、
（ｄ）前記複数の単球からＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に関して系統陽性であった単球を除去して、内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を得ること、
により、トランスフェクトされた系統陰性の造血幹細胞を調製する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
単離された系統陰性の造血幹細胞集団の少なくとも約５０％が細胞マーカーＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記遺伝子が網膜の新生血管形成を阻害するのに有用である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
内皮前駆細胞を含有する単離された、哺乳動物の骨髄に由来する、系統陰性の造血幹細胞集団の中から神経栄養性の救出を誘導する数の細胞を哺乳動物の罹患した眼に投与することを包含し、前記幹細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔに関する細胞マーカーを含む、網膜変性疾患を罹っている哺乳動物の網膜において神経栄養性の救出を誘導する方法。
【請求項６３】
（ａ）哺乳動物から骨髄を抽出すること、
（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離すること、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記複数の単球を標識すること、及び、
（ｄ）前記複数の単球からＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に関して系統陽性であった単球を除去して、内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を得ること、
により、幹細胞集団が単離される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が硝子体内注入によって投与される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年７月２５日に出願された仮特許出願第６０／３９８，５２２号及び２００３年５月２日に出願された仮特許出願第６０／４６７，０５１号の利益を主張するものであり、両出願を参考として本明細書に援用する。
【０００２】
本明細書に記載されている研究の一部は、国立癌研究所からのグラント第ＣＡ９２５７７号及び国立衛生研究所からのグラント第ＥＹ１１２５４号、ＥＹ１２５９８号、ＥＹ１２５９９８号による補助を受けて為されたものである。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、骨髄に由来する、単離された、哺乳動物の、系統陰性の造血幹細胞（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）に関する。本発明は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ及びトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣの網膜への投与により眼の血管の疾患を治療することにも関する。
【背景技術】
【０００４】
加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）と糖尿病網膜症（ＤＲ）は先進国における主要な失明の原因であり、網膜での異常な新生血管形成の結果として発生する。網膜は、明瞭に区切られたニューロン、グリア及び血管要素の層からなり、血管増殖や浮腫に見られるような比較的小さな障害が視覚機能の著しい損失を起こし得る。色素性網膜炎（ＲＰ）等の遺伝性の網膜変性もまた、細動脈の狭窄や血管の萎縮という血管の異常に関連している。血管新生を促進及び阻害する因子の同定には著しい進歩があったが、眼の血管の疾患を特異的に治療する方法は現在のところ得られていない。
【０００５】
何年もの間、幹細胞の集団が正常な成体の循環器及び骨髄に存在することが知られてきた。これらの細胞の様々な副集団は、造血性の系統陽性（Ｌｉｎ＋）又は非造血性の系統陰性（Ｌｉｎ−）の系列に沿って分化することができる。さらに、近年では、系統陰性の造血幹細胞（ＨＳＣ）集団はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで血管を形成することができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含有することが示された（Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ９６４−７  （１９９７））。これらの細胞は、肝細胞（Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ６，１２２９−３４  （２０００）を参照）、ミクログリア（Ｐｒｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，１３５６−６１  （２００２）を参照）、心筋細胞（Ｏｒｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８，１０３４４−９  （２００１）を参照）及び上皮細胞（Ｌｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，１１９４−２０１  （２００１）を参照）を含む様々な非内皮細胞型に分化するとともに、正常及び病的な生後の血管新生に関与することができる（Ｌｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，１１９４−２０１  （２００１）、Ｋａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９７，３４２２−７  （２０００）；及びＫｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，４３０−６  （２００１）を参照）。これらの細胞は血管新生のいくつかの実験的モデルにおいて使用されてきたが、ＥＰＣが新生血管を標的とするメカニズムは不明であり、特定の血管構造に寄与する細胞の数を効果的に増加させるという戦略は明かになっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ９６４−７  （１９９７）
【非特許文献２】Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ６，１２２９−３４  （２０００）
【非特許文献３】Ｐｒｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，１３５６−６１  （２００２）
【非特許文献４】Ｏｒｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８，１０３４４−９  （２００１）
【非特許文献５】Ｌｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，１１９４−２０１  （２００１）
【非特許文献６】Ｋａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９７，３４２２−７  （２０００）
【非特許文献７】Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７，４３０−６  （２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、活性化された網膜星状膠細胞を選択的に標的とする内皮先祖細胞（ＥＰＣ、内皮前駆細胞とも言う）を含有する、骨髄に由来する、単離された、哺乳動物の、系統陰性の造血幹細胞集団（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）を提供する。本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団の細胞のうち、少なくとも約５０％はＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔに関する細胞マーカーを有する。
【０００８】
本発明の系統陰性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＨＳＣ集団に含まれるＥＰＣは発生過程にある網膜の脈管に広く取り込まれ、眼の新生血管構造に安定に取り込まれた状態となる。本発明の、単離された、系統陰性のＨＳＣ集団は、哺乳動物の変性した網膜血管構造を救出し安定化させるために使用することができる。本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団の実施形態の１つでは、細胞を治療上有用な遺伝子でトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は選択的に新生血管を標的とすることができ、細胞に基づく遺伝子治療によって、すでに確立している脈管に影響を与えることなく新たな脈管形成を阻害できる。血管新生阻害ペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた、本発明の単離された系統陰性ＨＳＣ集団からの細胞は、ＡＲＭＤ、ＤＲ及び異常な血管構造に関連する特定の網膜変性等の疾患で、異常な血管成長を調節するのに有用である。
【０００９】
本発明の、単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団で眼を治療することの特別な利点は、硝子体内的にＬｉｎ−ＨＳＣ処理した眼で観察される血管栄養性及び神経栄養性の救出効果である。本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣで治療された眼では、網膜のニューロン及び光受容体が保持され、視覚機能は維持される。
【００１０】
本発明は、また、骨髄、好ましくは成体の骨髄から内皮前駆細胞を含有する系統陰性の造血幹細胞集団を単離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、内皮前駆細胞を含有する、単離された、哺乳動物の、骨髄由来である系統陰性の造血幹細胞集団を提供する。本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、好ましくは少なくとも約５０％の細胞がＣＤ３１及びｃ−ｋｉｔ細胞マーカー抗原を含有するＨＳＣを含む。好ましい実施形態では、少なくとも約７５％のＨＳＣ細胞、より好ましくは約８１％の細胞がＣＤ３１マーカーを含む。別の好ましい実施形態では、少なくとも約６５％の細胞、より好ましくは約７０％の細胞がｃ−ｋｉｔ細胞マーカーを含む。
【００１２】
本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団の特に好ましい実施形態では、約５０％から約８５％の前記細胞がＣＤ３１マーカーを含み、約７０％から約７５％の細胞がｃ−ｋｉｔマーカーを含み、約４％から約８％の細胞がＳｃａ−１マーカーを含み、約２％から約４％の細胞がＦｌｋ−１／ＫＤＲマーカーを含む。
【００１３】
本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団はまた、Ｔｉｅ−２抗原マーカーを有する細胞を最大約１％まで含み得る。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団はマウス又はヒトの骨髄に、好ましくはヒトの骨髄に由来する。
【００１５】
本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団が、細胞を単離した種と同じ種の哺乳動物の眼に硝子体内注入されると、網膜の新生血管構造を選択的に標的とし、新生血管構造に取り込まれる。
【００１６】
本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、内皮細胞に分化し網膜内で血管構造を生じるＥＰＣ細胞を含有する。特に、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は、網膜の新生血管及び網膜の血管変性疾患の治療、並びに、網膜の血管傷害の修復に有用である。
【００１７】
本発明はまた、患者の骨髄から内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を単離すること、及び、疾患を阻止するのに十分な数の単離された幹細胞を患者の眼の硝子体内に注入することを包含する、患者の眼疾患を治療する方法を提供する。本方法は、網膜変性疾患、網膜血管変性疾患、虚血性網膜症、血管からの出血、血管からの漏出及び脈絡膜症等の眼の疾患の治療に利用することができる。これらの疾患の例には、網膜傷害の他、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）、推定眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、鎌状赤血球貧血及び色素性網膜炎が含まれる。
【００１８】
眼に注入される幹細胞数は、患者の眼の病状を抑止するのに十分な数である。例えば、細胞の数は、患者の眼における網膜の損傷を修復し、網膜の新生血管構造を安定化し、網膜の新生血管構造を成熟させ、血管からの漏出や出血を防止又は修復するのに効果的な数であり得る。
【００１９】
本発明の単離されたＬｉｎ−ＨＳＣ集団に存在する細胞は、細胞に基づく眼の遺伝子治療で用いられる抗血管新生蛋白質をコードする遺伝子等の、治療上有用な遺伝子でトランスフェクトすることができる。
【００２０】
トランスフェクトされた細胞には、網膜障害の処置に治療上有用である任意の遺伝子を含有させることができる。好ましくは、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ集団中のトランスフェクトされた細胞は、ＴｒｐＲＳ等の抗血管新生ペプチド、蛋白質若しくは蛋白質フラグメント又はＴｒｐＲＳのＴ１及びＴ２フラグメント等のＴｒｐＲＳの抗血管新生フラグメントをコードする遺伝子を含む（これらは同じ出願人の同時係属している米国特許出願第１０／０８０，８３９号に詳細に記載されており、その開示内容は参考として本明細書に援用される）。
【００２１】
本発明はまた、内皮前駆細胞を含有する系統陰性の造血幹細胞集団を骨髄から単離する方法を提供する。本方法は、（ａ）哺乳動物から骨髄を抽出すること、（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離すること、（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記単球を標識すること、及び（ｄ）前記複数の単球からＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１及びＴＥＲ−１１９に関して陽性である単球を除去して、内皮前駆細胞を含有する系統陰性の造血幹細胞集団を得ること、という工程を包含する。
【００２２】
本発明はまた、前記細胞を眼に硝子体内注入して本発明のトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物を投与することによって、眼の血管新生の疾患を治療する方法を提供する。このようなトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は、抗血管造影遺伝子産物をコードする遺伝子等の治療上有用な遺伝子でトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣを含む。
【００２３】
好ましくは、少なくとも約１ｘ１０５のＬｉｎ−ＨＳＣ細胞又はトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ細胞が、網膜変性疾患を罹っている眼に硝子体内注入によって投与される。注入される細胞の数は、網膜変性の重症度、患者の年齢及び網膜疾患を治療する当業者にとって容易に理解できるその他の要因に依存することがある。治療を担当する医師の決定に従って、Ｌｉｎ−ＨＳＣは単回投与してもよいし、あるいは一定の期間にわたって複数回投与してもよい。
【００２４】
本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、網膜血管構造の中断又は分解に関わる網膜の傷害及び欠損の治療に有用である。
【００２５】
本発明のトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、網膜、特に網膜の血管構造に治療用遺伝子を送達するのに有用である。
【００２６】
本発明の遺伝子送達方法の好ましい実施形態では、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ集団中の細胞はトリプトファンＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の抗血管新生フラグメント等の抗血管新生ペプチドをコードする遺伝子をトランスフェクトされる。特に好ましいＴｒｐＲＳフラグメントには、ＴｒｐＲＳのＴ１及びＴ２フラグメントが挙げられる。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物に含まれ抗血管新生ペプチドをコードするトランスフェクト細胞は、糖尿病網膜症や類似疾患等の異常な血管の発生を伴う網膜疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１−１】図１（ａ及びｂ）は発生過程にあるマウス網膜の概略図を示す。（ａ）第一叢の発生。（ｂ）網膜での脈管形成の第２段階。ＧＣＬ神経節細胞層、ＩＰＬ内網状層、ＩＮＬ内顆粒層、ＯＰＬ外網状層、ＯＮＬ外顆粒層、ＲＰＥ網膜色素上皮、ＯＮ視神経、Ｐ末梢。図１ｃは骨髄に由来するＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーによる特性決定を表す。上列、抗体で標識されていない細胞のドットプロット分布。その中で、Ｒ１はＰＥ染色陽性の定量可能なゲート領域を表しており、Ｒ２はＧＦＰ陽性を示している。中列、Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）、それぞれの細胞系は、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ結合抗体で標識された。Ｔｉｅ−２のデータはＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスより得られた。百分率は全Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団の中で標識された陽性細胞のパーセントを示す。
【図１−２】図１（ａ及びｂ）は発生過程にあるマウス網膜の概略図を示す。（ａ）第一叢の発生。（ｂ）網膜での脈管形成の第２段階。ＧＣＬ神経節細胞層、ＩＰＬ内網状層、ＩＮＬ内顆粒層、ＯＰＬ外網状層、ＯＮＬ外顆粒層、ＲＰＥ網膜色素上皮、ＯＮ視神経、Ｐ末梢。図１ｃは骨髄に由来するＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーによる特性決定を表す。上列、抗体で標識されていない細胞のドットプロット分布。その中で、Ｒ１はＰＥ染色陽性の定量可能なゲート領域を表しており、Ｒ２はＧＦＰ陽性を示している。中列、Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）、それぞれの細胞系は、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ結合抗体で標識された。Ｔｉｅ−２のデータはＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスより得られた。百分率は全Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団の中で標識された陽性細胞のパーセントを示す。
【図２−１】図２は発生過程にあるマウス網膜へのＬｉｎ−ＨＳＣ細胞の移植を表す。（ａ）注入４日後（Ｐ６）では、硝子体内に注入されたｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は網膜上に接着し分化する。（ｂ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス、β−ｇａｌ抗体で染色される）はコラーゲンＩＶ抗体で染色される血管構造の先端に定着する（＊は血管構造の先端を示す）。（ｃ）Ｌｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ＋）の大部分は注入４日後（Ｐ６）の時点では分化できなかった。（ｄ）注入４日後（Ｐ６）のｅＧＦＰ＋マウス腸間膜ＥＣ。（ｅ）成体マウスの眼に注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスですでに存在している星状細胞の鋳型に定着しそれに沿って分化しているｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（矢印）を低倍率で示す。（ｇ）Ｌｉｎ−細胞（ｅＧＦＰ）とその下に存在する星状細胞（矢印）の関係を高倍率で示す。（ｈ）対照となる注入されていないＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウス。（ｉ）注入４日後（Ｐ６）、ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は将来の深層叢となる領域に移動し分化する。左図は全体的にマウントされた網膜でのＬｉｎ−ＨＳＣ細胞の動きを捕らえている。右図は網膜（上は硝子体側、下は強膜側）内でのＬｉｎ−細胞（矢印）の局在を示している。（ｊ）αＣＤ３１−ＰＥ及びαＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重染色。注入後７日目、注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤）は血管構造（ＣＤ３１）中に取り込まれた。矢印は取り込まれた領域を示している。（ｋ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は注入１４日後（Ｐ１７）に脈管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内注入は第一叢（ｌ）及び深層叢（ｍ）の両者で脈管が無傷であり機能的であることを示す。
【図２−２】図２は発生過程にあるマウス網膜へのＬｉｎ−ＨＳＣ細胞の移植を表す。（ａ）注入４日後（Ｐ６）では、硝子体内に注入されたｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は網膜上に接着し分化する。（ｂ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス、β−ｇａｌ抗体で染色される）はコラーゲンＩＶ抗体で染色される血管構造の先端に定着する（＊は血管構造の先端を示す）。（ｃ）Ｌｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ＋）の大部分は注入４日後（Ｐ６）の時点では分化できなかった。（ｄ）注入４日後（Ｐ６）のｅＧＦＰ＋マウス腸間膜ＥＣ。（ｅ）成体マウスの眼に注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスですでに存在している星状細胞の鋳型に定着しそれに沿って分化しているｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（矢印）を低倍率で示す。（ｇ）Ｌｉｎ−細胞（ｅＧＦＰ）とその下に存在する星状細胞（矢印）の関係を高倍率で示す。（ｈ）対照となる注入されていないＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウス。（ｉ）注入４日後（Ｐ６）、ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は将来の深層叢となる領域に移動し分化する。左図は全体的にマウントされた網膜でのＬｉｎ−ＨＳＣ細胞の動きを捕らえている。右図は網膜（上は硝子体側、下は強膜側）内でのＬｉｎ−細胞（矢印）の局在を示している。（ｊ）αＣＤ３１−ＰＥ及びαＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重染色。注入後７日目、注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤）は血管構造（ＣＤ３１）中に取り込まれた。矢印は取り込まれた領域を示している。（ｋ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は注入１４日後（Ｐ１７）に脈管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内注入は第一叢（ｌ）及び深層叢（ｍ）の両者で脈管が無傷であり機能的であることを示す。
【図３】図３（ａ及びｂ）は、レーザーで（ａ）及び機械的に（ｂ）成体網膜に与えた傷害（＊は傷害部位を示している）によって誘導されるグリオーシス（ＧＦＡＰ発現星状細胞によって示される、最も左の画像）にｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞が定着することを示している。最も右の画像はさらに高い倍率であり、Ｌｉｎ−ＨＳＣと星状細胞の密な関係を示している。目盛は２０μＭを示す。
【図４】図４は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞が網膜変性マウスの血管構造を救出することを示している。（ａ−ｄ）コラーゲンＩＶ染色された注入２７日後（Ｐ３３）の網膜。（ａ）及び（ｂ）Ｌｉｎ＋ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）を注入された網膜の血管構造は正常なＦＶＢマウスと比べて相違がなかった。（ｃ）及び（ｄ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｃ）を注入された網膜は野生型マウスに類似する豊富な血管ネットワークを示した。（ａ）及び（ｃ）ＤＡＰＩ染色された網膜全体（上は硝子体側、下は強膜側）の凍結切片。（ｂ）及び（ｄ）全体的にマウントされた網膜の深層叢。（ｅ）棒グラフは、深層の血管叢における血管分布の増加がＬｉｎ−ＨＳＣ細胞を注入された網膜（ｎ＝６）で起きたことを示している。深層での網膜血管新生の程度はそれぞれの画像内で脈管の全長を計算することにより定量化された。Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ又は対照の網膜について、高倍率の視野（μ単位）での脈管の全長の平均が比較された。（ｆ）ｒｄ／ｒｄマウスから得たＬｉｎ−ＨＳＣ（Ｒ、右眼）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ（Ｌ、左眼）細胞を注入後の深層血管叢の長さの比較。独立した６匹のマウスの結果を示す（一色につき一匹のマウスを表している）。（ｇ）及び（ｈ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）はＰ１５の眼に注入されたときでもｒｄ／ｒｄマウスの血管構造を救出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｇ）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ（Ｈ）細胞が注入された網膜（注入後１ヶ月）の中間及び深層血管叢を示す。
【図５】図５はマウス網膜組織の顕微鏡写真を示す。（ａ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（緑）を注入してから５日後（Ｐ１１）に、全体的にマウントされた網膜（ｒｄ／ｒｄマウス）の深層。（ｂ）及び（ｃ）Ｐ６にＢａｌｂ／ｃ  Ｌｉｎ−細胞（Ａ）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（Ｂ）を注入されたＴｉｅ−２−ＧＦＰ（ｒｄ／ｒｄ）マウスのＰ６０における網膜血管構造。血管構造はＣＤ３１抗体により染色され（赤）、内因性の内皮細胞のみが緑の色を示した。矢印はＣＤ３１で染色されたがＧＦＰでは染色されなかった脈管を示す。（ｄ）Ｌｉｎ−ＨＳＣを注入された網膜及び対照網膜のαＳＭＡ染色。
【図６】図６は、Ｔ２−ＴｒｐＲＳをトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣがマウス網膜血管構造の発生を阻害することを示す。（ａ）ヒトＴｒｐＲＳ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ及びＮ末端にＩｇｋシグナル配列を有するＴ２−ＴｒｐＲＳの概略図。（ｂ）網膜に注入されたＴ２−ＴｒｐＲＳトランスフェクトＬｉｎ−細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでＴ２−ＴｒｐＲＳ蛋白質を発現する。１、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたＴ２−ＴｒｐＲＳ組換体。２、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたＴ２−ＴｒｐＲＳ組換体。３、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたＴ２−ＴｒｐＲＳ組換体。４、対照である網膜。５、Ｌｉｎ−ＨＳＣ＋ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（ベクターのみ）を注入された網膜。６、Ｌｉｎ−ＨＳＣ＋ｐＫＬｅ１３５（ｐＳｅｃＴａｇ内にＩｇｋ−Ｔ２−ＴｒｐＲＳ有する）を注入された網膜。（ａ）、内因性ＴｒｐＲＳ。ｂ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ組換体。ｃ、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注入された網膜のＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ−ｆ）注入７日後の典型的な損傷網膜の第一（表面）及び第二（深層）叢。（ｃ）及び（ｄ）空のプラスミドをトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣを注入された眼は正常に発生した。（ｅ）及び（ｆ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳをトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣを注入された眼の大部分では深層叢の阻害が見られた。（ｃ）及び（ｅ）第一（表面）叢。（ｄ）及び（ｆ）第二（深層）叢。Ｆで観察される脈管のぼやけた輪郭は（ｅ）に見られる一次ネットワークの脈管の「血流（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」像である。
【図７−１】図７はＨｉｓ６−タグの付いたＴ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図７−２】図７はＨｉｓ６−タグの付いたＴ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図８】図８はＨｉｓ６−タグの付いたＴ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図９】図９は、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ及びＬｉｎ＋ＨＳＣ（対照）を眼に注入されたマウスから採取した網膜の顕微鏡写真及び網膜電位図（ＥＲＧ）を示す。
【図１０】図１０は、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処理されたｒｄ／ｒｄマウス眼の中間（Ｉｎｔ．）及び深層の血管層において、ニューロンの救出（ｙ軸）と血管の救出（ｘ軸）の間に相関が見られることを示す、統計学的プロットである。
【図１１】図１１は、Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処理されたｒｄ／ｒｄマウス眼のニューロンの救出（ｙ軸）と血管の救出（ｘ軸）の間には相関が見られないことを示す、統計学的プロットである。
【図１２】図１２は、注入後１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、６ヶ月（６Ｍ）時点における、Ｌｉｎ−ＨＳＣ処理（黒い棒）及び未処理（白い棒）のｒｄ／ｒｄマウスの眼について、血管長（ｙ軸）を任意の比較単位で表した棒グラフである。
【図１３】図１３は、注入後１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、６ヶ月（６Ｍ）におけるｒｄ／ｒｄマウス外側神経層（ＯＮＲ）の核の数を表す３つの棒グラフであり、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（白い棒）で処理された対照の眼と比較してＬｉｎ−ＨＳＣ（黒い棒）で処理された眼の核の数が顕著に増加していることを示している。
【図１４】図１４は、左眼（Ｌ、Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処理された対照の眼）に対して、右眼（Ｒ、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処理された）を、（注入後）１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、６ヶ月（６Ｍ）の時点で比較し、個々のｒｄ／ｒｄマウスについて外側神経層の核数をプロットしたものである。プロット中のそれぞれの線は個々のマウスの眼を比較している。
【００２８】
方法
【実施例１】
【００２９】
細胞の単離と濃縮、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団Ａ及び集団Ｂの調製
一般的な手順
全てのｉｎ  ｖｉｖｏ評価は、実験動物の飼育と使用についてのＮＩＨの指針にしたがって行い、全ての評価手順はＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＴＳＲＩ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）の動物の飼育及び使用に関する委員会から承認を受けた。骨髄細胞をＢ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６、Ｔｉｅ−２ＧＦＰ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ、ＦＶＢ／ＮＪ（ｒｄ／ｒｄマウス）又はＢａｌｂ／ｃＢＹＪ成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＭＥ）から抽出した。
【００３０】
次いで、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって単球を分離し、Ｌｉｎ−を選択するためにビオチン結合系統パネル抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１、ＴＥＲ−１１９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ））で標識した。磁性分離装置ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商品名）ソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を用いて系統陽性（Ｌｉｎ＋）細胞をＬｉｎ−ＨＳＣから分離し取り出した。さらにＦＡＣＳ（商品名）  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）を使用し、以下の抗体、すなわちＰＥが結合したＳｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ、及びＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて、内皮前駆細胞を含有する得られたＬｉｎ−ＨＳＣ集団を更に特性決定した。Ｔｉｅ−２の特性決定には、Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ骨髄細胞を用いた。
【００３１】
成体マウス内皮細胞を採取するために、腸間膜組織をＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから外科的に取り除き、組織を消化するためにコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｌａｋｅｗｏｏｄ，  ＮＪ）中に置いた後、４５μｍフィルターを用いてろ過した。ろ液を集め内皮細胞成長培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）とともにインキュベートした。形態学的に丸石状の外見が観察されること、ＣＤ３１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色されること、及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商品名）マトリックス（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）中で培養物が管状構造を形成するか試験することによって、内皮細胞の特徴を確認した。
【００３２】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団Ａ
骨髄細胞をＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから上記の一般的手順により抽出した。ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−１及びＴｉｅ−２細胞表面抗原マーカーに対するＦＡＣＳフローサイトメトリーによって、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞の特性決定を行った。結果を図１ｃに示す。Ｌｉｎ−ＨＳＣの約８１％はＣＤ３１マーカーを、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約７０．５％はｃ−ｋｉｔマーカーを、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約４％はＳｃａ−１マーカーを、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約２．２％はＦｌｋ−１マーカーを、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞の約０．９１％はＴｉｅ−２マーカーを提示した。これに対して、これらの骨髄細胞から単離されたＬｉｎ＋ＨＳＣは有意に異なる細胞マーカーのプロフィール（すなわちＣＤ３１は３７．４％、ｃ−ｋｉｔは２０％、Ｓｃａ−１は２．８％、Ｆｌｋ−１は０．０５％）を有していた。
【００３３】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団Ｂ
ＢａｌｂＣ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ及びＣ３Ｈマウスから、上記の一般的手順によって骨髄細胞を抽出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を細胞表面マーカー（Ｓｃａ１、ＫＤＲ、ｃＫｉｔ、ＣＤ３４、ＣＤ３１及び様々なインテグリンα１、α２、α３、α４、α５、α６、αＭ、αＶ、αＸ、αＩＩｂ、β１、β２、β３、β４、β５及びβ７）の存在について分析した。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2010285434.tif 000002
【実施例２】
【００３５】
細胞の硝子体内投与
Ｐ２からＰ６の眼球を露出するために、鋭利な刃によって、眼瞼に裂け目を入れた。本発明の系統陰性ＨＳＣ集団Ａ（細胞培養培地約０．５μｌから１μｌ中におよそ１０５細胞）を３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｒｅｎｏ，  ＮＶ）の針の付いたシリンジで硝子体内に注入した。
【実施例３】
【００３６】
ＥＰＣトランスフェクション
製造業者のプロトコールに従い、ＦｕＧＥＮＥ（商品名）６トランスフェクト試薬（Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を用いて、ＴｒｐＲＳのＴ２フラグメントをコードしＨｉｓ６タグを封入するＤＮＡ（配列番号１、図７）でＬｉｎ−ＨＳＣ（集団Ａ）をトランスフェクトした。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物からの細胞（１ｍｌあたり約１０６細胞）を幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を含有するｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中に懸濁した。次いで、ＤＮＡ（約１μｇ）及びＦｕＧＥＮＥ試薬（約３μｌ）の混合物を添加し、混合物を約３７℃で約１８時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗浄し回収した。このシステムのトランスフェクション効率は、ＦＡＣＳ分析で確認したところ、およそ１７％であった。Ｔ２の生産をウエスタンブロッティングにより確認した。Ｈｉｓ６タグ化Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列を配列番号２、図８に示す。
【実施例４】
【００３７】
免疫組織化学及び共焦点分析
網膜をさまざまな時点で採取し、全体的マウント又は凍結切片作製のための調製を行った。全体的マウントのためには、網膜を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５０％牛胎児血清（ＦＢＳ）及び２０％正常ヤギ血清中において１時間周囲の室温でブロッキングした。網膜を一次抗体で処理し、二次抗体で検出した。使用した一次抗体は、抗コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）、抗β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）、抗α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ，  Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であった。使用した二次抗体をＡｌｅｘａ４８８又は５９４蛍光マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）に結合した。画像はＭＲＣ１０２４共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で撮影した。全体的マウントした網膜中での血管の発生について３つの異なる層を調べるために、ＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて三次元画像を作製した。共焦点顕微鏡よって区別される、増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マウスとＧＦＡＰ／ｗｔＧＦＰマウスの間のＧＦＰ画素強度の相違を利用して３Ｄ画像を作製した。
【実施例５】
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの網膜の血管新生定量アッセイ
Ｔ２−ＴｒｐＲＳ分析のために、第一及び深層の叢を三次元画像から再構築した。第一叢を二つのカテゴリー、正常発生又は停止した血管発生に分けた。深層での血管発生阻害についてのカテゴリーは、以下の基準を含む血管阻害の百分率に基づいて解釈した。深層叢形成の完全阻害を“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ”と、正常血管発生（２５％未満の阻害を含む）を“Ｎｏｒｍａｌ”と、残りを“Ｐａｒｔｉａｌ”と分類した。ｒｄ／ｒｄマウスの救出データを得るために、全体的マウントした網膜それぞれについて、さらに深層の叢の４つの独立した領域を１０Ｘレンズで捉えた。血管構造の全長を各画像について計算し、まとめ、グループ間で比較した。正確な情報を得るために、Ｌｉｎ−ＨＳＣを一方の眼に、Ｌｉｎ＋ＨＳＣを同じマウスのもう一方の眼に注入した。注入しない対照網膜は同じ親から生まれたマウスより得た。
【実施例６】
【００３９】
成体網膜の傷害モデル
ダイオードレーザー（１５０ｍＷ、１秒、５０ｍｍ）を用いて又は２７ゲージ針で機械的に網膜に穴を開けることによって、レーザー及び傷跡のモデルを作製した。傷をつけてから５日後、細胞を硝子体内法を用いて注入した。眼を更にその５日後採取した。
【実施例７】
【００４０】
網膜再生の神経栄養性救出
成体の骨髄由来の系統造血幹細胞（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）は網膜変性のマウスモデルにおいて血管栄養と神経栄養性の救出効果を有している。１０日齢マウスの右眼に本発明のＬｉｎ−ＨＳＣを約１０５個含有する約０．５μｌを硝子体内に注入し、２ヶ月後網膜の血管構造の存在及び神経層の核数について評価した。同じマウスの左眼にほぼ同じ数のＬｉｎ＋ＨＳＣを対照として注入し、同様に評価した。図９に示すように、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処理された眼では、網膜の血管構造はほぼ正常なようであり、内顆粒層はほぼ正常、外顆粒層（ＯＮＬ）は約３から約４の核層を有していた。対照的に、Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処理された反対側の眼では、網膜血管の中間層が著しく萎縮し、網膜血管の外層は完全に萎縮し、内顆粒層は著しく萎縮し、外顆粒層は完全に消失していた。これはマウス３及びマウス５で顕著に示された。マウス１では、救出効果はなく、これは注入されたマウスのおよそ１５％で観察された。
【００４１】
視覚機能を網膜電位図（ＥＲＧ）で評価すると、血管及び神経の両者が救出された時（マウス３及び５）に陽性ＥＲＧの回復が観察された。陽性ＥＲＧは、血管又は神経の救出がない時（マウス１）には観察されなかった。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣによってｒｄ／ｒｄマウスの眼において血管栄養及び神経栄養性の救出の間にこの相関が見られたことは、図１０の回帰分析プロットによって示される。神経（ｙ軸）及び血管（ｘ軸）の回復の間に見られる相関は中間の血管構造型（ｒ＝０．４５）及び深層の血管構造（ｒ＝０．６７）で観察された。
【００４２】
図１１に示すように、Ｌｉｎ＋ＨＳＣによる血管と神経の救出の間にはいかなる統計的に有意な相関も存在しない。血管の救出を定量化し、そのデータを図１２に示す。図１２に示す注入後１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）及び６ヶ月（６Ｍ）のマウスのデータによれば、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処理された眼（黒い棒）では、同じマウスの処理されていない眼（白い棒）の血管長と比べて、特に注入後１ヶ月及び２ヶ月で、血管長が顕著に増加したことが実証される。Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣの注入後約２ヶ月に内顆粒層及び外顆粒層の核を数えることにより、神経栄養性の救出効果を定量化した。結果を図１３及び１４に示す。
【００４３】
結果
マウス網膜血管の発生；眼の血管新生についてのモデル
マウスの眼は、ヒトの網膜血管発生のような哺乳動物の網膜血管の発生に関する研究に対して容認されるモデルである。マウスの網膜血管構造が発生する時期において、虚血を起こした網膜血管は星状細胞と密接な関係で発生する。これらグリアの要素は、妊娠後期のヒト胎児又は新生児期のげっ歯類の網膜上へ視神経円板から神経節細胞層に沿って移動し、放射状に広がる。マウスの網膜血管構造が発生するにつれて、内皮細胞はこのすでに確立された星状細胞の鋳型を利用し、網膜の血管パターンを決定する（図１ａ及びｂ参照）。図１（ａ及びｂ）は発生過程にあるマウス網膜の概略図を表している。図１ａは星状細胞の鋳型（明るい線）上に重なっている第一叢（図の左上の暗い線）の発生を表しており、図１ｂは網膜の脈管形成の第二段階を表している。図中、ＧＣＬは神経節細胞層、ＩＰＬは内叢層、ＩＮＬは内顆粒層、ＯＰＬは外叢層、ＯＮＬは外顆粒層、ＲＰＥは網膜色素上皮、ＯＮは視神経及びＰは末梢を意味する。
【００４４】
出生時、網膜の血管構造は実質的に存在しない。出生後１４日（Ｐ１４）までに物が見え始めるのと一致して、網膜は網膜脈管からなる複雑な第一（表面）及び第二（深部）層を発達させる。初めに、車輪のスポーク状をした乳頭周囲の脈管が、末梢に向かって、すでに存在している星状細胞のネットワーク上を放射状に成長し、続いて毛細管状の叢を形成することで次第に相互に連結するようになる。これらの脈管はＰ１０まで神経線維内で単層として成長する（図１ａ）。Ｐ７からＰ８の間に側副枝がこの第一叢から芽を出し始め、網膜を通り外叢状の層へと貫通し、そこで第二のすなわち深層の網膜叢を形成する。Ｐ２１までにネットワーク全体が広範囲の再構築を行い、第三すなわち中間の叢が内顆粒層の内側表面に形成される（図１ｂ）。
【００４５】
新生児期のマウス網膜の血管新生モデルはいくつかの理由から眼の血管新生におけるＨＳＣの役割の研究に有用である。この生理学上実用的なモデルでは、内在性の血管の出現前に大きな星状細胞の鋳型が存在し、新生血管の形成過程における細胞−細胞間の標的化の役割を評価することを可能にしている。さらに、この新生児期の網膜血管の一貫した再現性のある形成過程は低酸素により起こることが知られており、この点において虚血が役割を担っていることが知られる多くの網膜疾患と類似点がある。
【００４６】
骨髄からの内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の濃縮
細胞表面マーカーの発現はＨＳＣの調製物に見られるＥＰＣ集団について広く評価されてきたが、ＥＰＣを一意的に同定するマーカーはいまだ十分に定義されていない。ＥＰＣを濃縮するために、造血性の系統マーカー陽性細胞（Ｌｉｎ＋）、すなわちＢリンパ球（ＣＤ４５）、Ｔリンパ球（ＣＤ３）、顆粒球（Ｌｙ−６Ｇ）、単球（ＣＤ１１）及び赤血球（ＴＥＲ−１１９）を骨髄単核細胞から除いた。ＥＰＣをさらに濃縮するためにＳｃａ−１抗原を使用した。同数のＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋細胞又はＬｉｎ−細胞を硝子体内に注入後に得られた結果を比較したところ、２つのグループ間で違いは検出されなかった。事実、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−細胞のみが注入されると、発生過程の血管にずっと多く取り込まれるのが観察された。
【００４７】
本発明のＬｉｎ−ＨＳＣは機能的アッセイに基づきＥＰＣについて濃縮される。その上、Ｌｉｎ＋集団はＬｉｎ−ＨＳＣ集団とは機能的に全く異なる振る舞いをする。（以前に報告されたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特性決定の研究に基づく）各画分について、ＥＰＣを同定するのに広く用いられるエピトープも評価した。Ｌｉｎ−画分のみに見られるマーカーはなかったが、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ画分と比較して、Ｌｉｎ−ＨＳＣでは、全てのマーカーが約７０から約１８００％増加した（図１ｃ）。図１ｃは骨髄由来の分離されたＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ細胞に対して行ったフローサイトメトリーによる特性決定を図示している。図１ｃ上列は非抗体標識細胞の造血幹細胞のドットプロット分布を示している。Ｒ１はＰＥ染色陽性が定量可能なようにゲーティングされた領域を表し、Ｒ２はＧＦＰ陽性を表している。Ｌｉｎ−ＨＳＣのドットプロットを中列に示し、Ｌｉｎ＋ＨＳＣのドットプロットを下列に示す。Ｃ５７Ｂ／６細胞をＰＥに結合したＳｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対する抗体で標識した。Ｔｉｅ−２のデータをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。ドットプロットの角に記載されている百分率は全Ｌｉｎ−又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団のうち陽性に標識された細胞のパーセントを示す。興味深いことに、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２及びＳｃａ−１のような許容されるＥＰＣマーカーはほとんど発現しておらず、このため、さらに分画するためには使用しなかった。
【００４８】
硝子体内に注入されたＨＳＣ  Ｌｉｎ−細胞は、星状細胞を標的とし発生過程にある網膜血管構造に取り込まれるＥＰＣを含有する
硝子体内に注入されたＬｉｎ−ＨＳＣが網膜の特異的な細胞型を標的とし、星状細胞の鋳型を利用して網膜の血管新生に関与しうるか否かを調べるために、成体（ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニック）マウスの骨髄から単離された本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物からのおよそ１０５個の細胞、又はＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（対照、約１０５細胞）を出生後２日（Ｐ２）のマウスの眼に注入した。注入から４日後（Ｐ６）、ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニックマウスから採取された、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物からの多くの細胞は網膜に付着し、内皮細胞が示す特徴的な伸張した外観を有した（図２ａ）。図２は発生過程にあるマウス網膜へのＬｉｎ−細胞の移植を表している。図２ａに示すように、注入後４日（Ｐ６）で硝子体内に注入されたｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣは網膜上に接着し分化する。
【００４９】
網膜の多くの領域で、ＧＦＰ発現細胞はその下部に存在する星状細胞に適合するパターンで配置され、血管に似ていた。これらの蛍光細胞は内在性の発生過程にある血管ネットワークの先端に観察された（図２ｂ）。反対に、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（図２ｃ）又は成体マウスの腸管膜内皮細胞（図２ｄ）は少数が網膜表面に接着しているにすぎなかった。注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞が網膜のすでに確立している脈管にも同様に接着できるか否かを調べるために、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を成体の眼に注入した。興味深いことに、細胞は網膜にも付着しておらず、確立している正常な網膜血管中にも取り込まれていないことが観察された（図２ｅ）。このことは、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物が正常に発生した血管構造を妨害せず、正常に発生した網膜で異常な血管新生を起こさないことを示している。
【００５０】
注入された本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物と網膜星状細胞との関係を調べるために、グリア線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ、星状細胞のマーカー）及びプロモーター誘導緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスから得たＬｉｎ−ＨＳＣを注入された、これらのＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの網膜を調べたところ、注入されたｅＧＦＰ  ＥＰＣと既存の星状細胞とが同じ場所に局在していた（図２ｆ−ｈ、矢印）。ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣの突起は、その下に位置する星状細胞ネットワークに適合していることが観察された（矢印、図２ｇ）。これらの眼の試験は、注入された標識細胞のみが星状細胞に接着することを示していた。Ｐ６マウスの網膜では、網膜の末梢はまだ内因性の脈管を有さないが、注入された細胞はこれらのまだ血管形成されていない領域の星状細胞に付着するのが観察された。驚くべきことに、注入された標識細胞は網膜のさらに深い層の正しい場所（そこには後に正常な網膜の脈管が発生する）に観察された（図２ｉ、矢印）。
【００５１】
本発明の注入されたＬｉｎ−ＨＳＣが発生過程にある網膜血管構造中に安定に取り込まれるか調べるために、その後、複数の時点で網膜の脈管を調べた。早くもＰ９（注入後７日）には、Ｌｉｎ−ＨＳＣはＣＤ３１＋構造中に取り込まれ（図２ｊ）。Ｐ１６（注入後１４日）までには、既に細胞は網膜の血管様構造中に広く取り込まれた（図２ｋ）。動物を屠殺する前に（機能的な網膜血管を同定するため）ローダミン−デキストランを硝子体内に注入すると、Ｌｉｎ−ＨＳＣの大部分は開通した脈管に沿って整列していた（図２ｌ）。標識細胞の分布には２つのパターンが観察された。（１）一方のパターンでは、細胞は標識されていない内皮細胞の間を脈管に沿って点在していた。（２）もう一方のパターンでは脈管は専ら標識細胞で構成されていた。注入された細胞はまた深層の血管叢の脈管にも取り込まれていた（図２ｍ）。Ｌｉｎ−ＨＳＣ由来のＥＰＣが新生血管へ散在して取り込まれることは以前より報告されてきたが、専らこれらの細胞で構成される血管ネットワークがあることについてはこれが初めての報告である。このことは、硝子体内に注入された本発明の骨髄由来のＬｉｎ−ＨＳＣ集団からの細胞が形成過程にある網膜血管叢のいずれの層にも効率よく取り込まれ得ることを示している。
【００５２】
網膜以外の組織（例えば、脳、肝臓、心臓、肺、骨髄）の組織学的な試験は、硝子体内注入から５日後又は１０日後まではＧＦＰ陽性細胞のいかなる存在も示さなかった。このことは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ画分内の細胞の副集団は網膜星状細胞を選択的に標的とし、発生過程にある網膜血管構造中に安定に取り込まれることを示している。これらの細胞は内皮細胞の多くの特徴を有している（網膜星状細胞との結合、伸張した形態、開通した脈管への安定した取り込み及び血管外に存在しないこと）ので、これらの細胞はＬｉｎ−ＨＳＣ集団に存在するＥＰＣであることを意味している。標的とされた星状細胞は、多くの低酸素網膜症で観察されるものと同じタイプである。グリア細胞が、ＤＲや他の形態の網膜傷害で観察される、葉状の新生血管の主な構成要素であることはよく知られている。反応性グリオーシス及び虚血により誘導される新生血管形成の状況下では、ヒトを含む多くの哺乳動物種で新生児期に網膜血管の鋳型が形成される時と同様に、活性化された星状細胞が増殖し、サイトカインを生産し、ＧＦＡＰをアップレギュレートする。
【００５３】
本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物が新生児期の眼と同様に成体マウスの眼でも活性化された星状細胞を標的とするか否かを試験するために、光凝固（図３ａ）又は針先（図３ｂ）で傷つけられた網膜を有する成体マウスの眼にＬｉｎ−ＨＳＣ細胞を注入した。両者のモデルにおいて、顕著にＧＦＡＰ染色された細胞集団が傷害部位周辺でのみ観察された（図３ａ及びｂ）。注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞は傷害部位に局在し、ＧＦＡＰ陽性星状細胞と特異的に結合したままであった（図３ａ及びｂ）。これらの部位では、新生児期における深層の網膜血管構造の形成時に見られるのと同様のレベルまで、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞が網膜のより深い層に移動するのが観察された（データ示さず）。傷害されなかった網膜部分には、正常で傷つけられていない成体網膜にＬｉｎ−ＨＳＣを注入したときに観察されるのと同様に、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は含有されていなかった（図２ｅ）。これらのデータは、血管形成している新生児期の網膜と同様に、グリオーシスを有する損傷した成体網膜においても活性化したグリア細胞を、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物が選択的に標的としうることを示している。
【００５４】
硝子体内に注入されたＬｉｎ−ＨＳＣは変性している血管構造を救出し安定化できる
硝子体内に注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は星状細胞を標的とし正常な網膜血管構造中に取り込まれるので、これらの細胞はグリオーシスや血管変性を伴う虚血性疾患又は変性網膜疾患に見られる変性した血管構造も同様に安定化する。ｒｄ／ｒｄマウスは、出生後１ヶ月までに光受容体と網膜血管層に甚大な変性を示す網膜変性のモデルである。これらマウスの網膜血管構造は、より深層の血管叢が退行するＰ１６までは正常に発生し、ほとんどのマウスでＰ３０までに深層及び中間の叢がほぼ完全に変性する。
【００５５】
ＨＳＣが退行した脈管を救出できるか否かを調べるために、（Ｂａｌｂ／ｃマウスから得た）Ｌｉｎ＋又はＬｉｎ−ＨＳＣをＰ６にｒｄ／ｒｄマウスの硝子体内に注入した。Ｌｉｎ＋細胞注入後、Ｐ３３までに、網膜の最も深い層の脈管はほぼ完全に消失した（図４ａ及びｂ）。対照的に、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注入されたほとんどの網膜はＰ３３までにきちんと形成された３つの平行な血管層を備えたほぼ正常な網膜血管構造を有していた（図４ａ及び４ｄ）。この効果の定量化により、Ｌｉｎ−を注入されたｒｄ／ｒｄマウスの眼の深層血管叢における脈管の平均の長さは、未処理又はＬｉｎ＋細胞処理の眼に比べてほぼ３倍長いことが明らかとなった（図４ｅ）。驚くべきことに、ｒｄ／ｒｄ成体マウス（ＦＶＢ／Ｎ）の骨髄に由来するＬｉｎ−ＨＳＣ組成物の注入も同様に、ｒｄ／ｒｄ新生児期マウスの変性している網膜血管構造を救出した（図４ｆ）。ｒｄ／ｒｄマウスの眼における血管構造の変性は、早くも出生後２−３週には観察された。Ｐ１５という遅い時期にＬｉｎ−ＨＳＣを注入しても、少なくとも１ヶ月間はｒｄ／ｒｄマウスの変性している血管構造は部分的に安定化された（図４ｇ及び４ｈ）。
【００５６】
より若い（例えば、Ｐ２）ｒｄ／ｒｄマウスに注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物も同様に、表面上で発生している血管構造中に取り込まれた。Ｐ１１までに、これらの細胞は血管叢の深層レベルに移動し、野生型の外網膜血管層で見られるものと同じパターンを形成することが観察された（図５ａ）。注入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞がｒｄ／ｒｄマウスの変性している網膜血管構造に取り込まれ、これを安定化する様子をより詳しく記載するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物をＴｉｅ−２−ＧＦＰ  ＦＶＢマウスの眼に注入した。ＦＶＢマウスはｒｄ／ｒｄ遺伝子型を有しており、Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ融合蛋白質を発現するので、すべての内因性の血管は蛍光を有している。
【００５７】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の未標識細胞が新生児期のＴｉｅ−２−ＧＦＰ  ＦＶＢマウスの眼に注入され、続いて発生過程にある血管構造に取り込まれると、注入され組み込まれた未標識Ｌｉｎ−ＨＳＣに対応する内因性のＴｉｅ−２−ＧＦＰ標識された脈管内に未標識の間隙が存在するはずである。続いて他の血管マーカー（例えば、ＣＤ−３１）で染色することにより脈管全体の輪郭を描けば、非内因性の内皮細胞が血管構造の一部であるか否かを明らかにすることができる。注入から２ヵ月後、ＣＤ３１陽性Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ陰性の脈管がＬｉｎ−ＨＳＣ組成物を注入された眼の網膜で観察された（図５ｂ）。興味深いことに、救出された脈管の大部分はＴｉｅ−２−ＧＦＰ陽性細胞を含んでいた（図５ｃ）。平滑筋アクチンの染色によって決定された周皮細胞の分布は、血管の救出があるか否かにかかわらず、Ｌｉｎ−ＨＳＣの注入によっては変化しなかった（図５ｄ）。これらのデータは明らかに、硝子体内に注入された本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物が、網膜へと移動し、正常な網膜血管の形成に関与し、遺伝的に欠損のあるマウスにおいて内因性の変性している血管構造を安定化することを示している。
【００５８】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ由来のトランスフェクトされた細胞による網膜血管新生の阻害
網膜血管の疾患の大部分は変性よりもむしろ異常な血管増殖を伴う。星状細胞を標的とするトランスジェニック細胞は抗血管新生蛋白質を送達し血管新生を阻害するのに使用することができる。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物から得た細胞にＴ２−トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）をトランスフェクトした。Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、網膜の血管新生を強く阻害するＴｒｐＲＳの４３ｋＤフラグメントである（図６ａ）。Ｐ２に対照プラスミドでトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ遺伝子を有さない）を注入された眼の網膜は、Ｐ１２において正常な第一（図６ｃ）及び第二（図６ｄ）網膜血管叢を有していた。本発明のＴ２−ＴｒｐＲＳでトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物をＰ２の眼に注入し１０日後に評価すると、一次ネットワークは著しい異常を有し（図６ｅ）、深層の網膜血管構造の形成はほぼ完全に阻害された（図６ｆ）。これらの眼で観察された少数の脈管は、脈管の間の大きな間隙で著しく細くなっていた。Ｔ２−ＴｒｐＲＳを分泌しているＬｉｎ−ＨＳＣ細胞によって阻害される程度を表２に詳述する。
【００５９】
Ｔ２−ＴｒｐＲＳはＬｉｎ−ＨＳＣ組成物中の細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産され分泌される。これらのトランスフェクトされた細胞を硝子体内に注入すると、Ｔ２−ＴｒｐＲＳの３０ｋＤフラグメントが網膜で観察された（図６ｂ）。この３０ｋＤフラグメントは本発明のトランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣを注入された網膜でのみ特異的に観察された。組換体すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成された蛋白質に比べてこの見かけの分子量の減少はｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ２−ＴｒｐＲＳのプロセッシング又は分解によるものかもしれない。これらのデータはＬｉｎ−ＨＳＣ組成物が、活性化された星状細胞を標的とすることにより網膜血管構造へ、血管新生抑制分子を発現する遺伝子のような機能的に活性な遺伝子を送達するのに使用できることを示している。観察された血管新生抑制効果が細胞の仲介する活性による可能性もあるが、これはほとんど起こりそうもない。なぜなら、Ｔ２でトランスフェクトされていない同一のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物で処理された眼は正常な網膜血管構造を有していたからである。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
硝子体内に注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は網膜の星状細胞に局在し、脈管に組み込まれる。そして、多くの網膜疾患の治療に有用であるはずである。注入されたＨＳＣ組成物から得られるほとんどの細胞は星状細胞の鋳型に付着する一方、少数の細胞は網膜の深層へと移動し、後に深層血管ネットワークが発生する領域に定着する。たとえ出生後４２日より前にこの領域にＧＦＡＰ陽性星状細胞は観察されなかったとしても、ＧＦＡＰ陰性のグリア細胞がすでに存在しＬｉｎ−ＨＳＣの局在のためのシグナルを提供している可能性を排除しない。以前の研究により多くの疾患が反応性グリオーシスと関連があることが明らかとなっていた。特にＤＲでは、グリア細胞とその細胞外マトリックスが病的な血管新生と関連している。
【００６２】
傷害の種類に関わらず、注入されたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物の細胞は特異的にＧＦＡＰ発現グリア細胞に接着したので、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は網膜に血管新生が起こる前の病巣を標的とするために使用することができる。例えば糖尿病のような虚血性網膜症では、新生血管は低酸素への応答によるものである。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を病的な新生血管部位へ誘導することにより、発生過程にある新生血管構造を安定化することができ、（ＤＲに付随する失明の原因である）出血又は浮腫などの新生血管の異常を防止し、当初は新生血管生成を刺激していた低酸素状態を緩和できる可能性がある。異常な血管を正常な状態に回復することができる。さらに、トランスフェクトされたＬｉｎ−ＨＳＣ組成物の使用及びレーザーで誘導される星状細胞の活性化により、Ｔ２−ＴｒｐＲＳのような血管新生抑制蛋白質を病的な血管新生部位へと送達することができる。レーザー光凝固は臨床眼科学で広く使用されており、このアプローチは多くの網膜疾患に用途がある。細胞に基づくこのようなアプローチは癌治療において探求されてきたが、目の疾患にこれらを使用することはより多くの利点を有している。なぜなら、眼内注入によれば多数の細胞を直接疾患部位に送達することが可能だからである。
【００６３】
Ｌｉｎ−ＨＳＣによる神経栄養性及び血管栄養性の救出
上述の、増強された緑蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）、Ｃ３Ｈ（ｒｄ／ｒｄ）、ＦＶＢ（ｒｄ／ｒｄ）マウスの骨髄からＬｉｎ−ＨＳＣを分離するのに、ＭＡＣＳを用いた。これらマウスから得たＥＰＣを含有するＬｉｎ−ＨＳＣをＰ６のＣ３Ｈ又はＦＶＢマウスの眼の硝子体内に注入した。網膜を注入後の様々な時点（１ヶ月、２ヶ月及び６ヶ月）で回収した。ＣＤ３１に対する抗体で染色した後、走査型レーザー共焦点顕微鏡で血管構造を観察し、ＤＡＰＩによる核染色後に網膜を組織学的に分析した。様々な時点で網膜から採取したｍＲＮＡのマイクロアレイ遺伝子発現分析を、この効果に関与している可能性のある遺伝子を同定するために用いた。
【００６４】
ｒｄ／ｒｄマウスの眼はＰ２１までに網膜の感覚神経及び血管構造の両者に甚大な変性を有していた。Ｐ６にＬｉｎ−ＨＳＣで処理されたｒｄ／ｒｄマウスの眼は６ヶ月間、正常な網膜血管構造を維持した。全ての時点（１Ｍ、２Ｍ及び６Ｍ）で対照と比較すると、深層及び中間層の両者が著しく改善していた（図１２参照）。さらに、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処理された網膜も、対照としてＬｉｎ＋ＨＳＣで処理された眼と比較して、より厚くなり（１Ｍで１．２倍、２Ｍで１．３倍、６Ｍで１．４倍）、外顆粒層により多くの細胞を有していた（１Ｍで２．２倍、２Ｍで３．７倍、６Ｍで５．７倍）のが観察された。対照（未処理又は非Ｌｉｎ−処理）と比較して「救出された」（例えば、Ｌｉｎ−ＨＳＣ）ｒｄ／ｒｄ網膜について大規模なゲノム分析をしたところ、表３に示される因子を含む、血管及び神経の救出に相関する特異的な増殖因子及びｓＨＳＰｓ（小分子の熱ショック蛋白質）をコードする遺伝子の顕著な発現誘導（アップレギュレーション）が明らかとなった。
【００６５】
本発明の骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣは、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて、顕著にかつ再現性よく正常な血管構造の維持を誘発し、劇的に光受容体及び他のニューロン細胞層を増加させる。この神経栄養の救出効果は小分子熱ショック蛋白質及び成長因子の著しい発現誘導に相関しており、このため、現在治療できない網膜変性疾患について治療上のアプローチに対する洞察を与える。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
考察
ＥＰＣを含有する骨髄由来のＬｉｎ−ＨＳＣ集団を陰性に選択するように、系統として分類する（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）造血細胞に関するマーカーを使用した。ＥＰＣとして働くことができる骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣ副集団は、一般に用いられる細胞表面マーカーによっては特徴づけられないが、これらの細胞の挙動は、発生過程の又は傷害を受けた網膜血管構造において、Ｌｉｎ＋又は成体の内皮細胞集団で観察される挙動とは全く異なっている。さらに、Ｓｃａ−１等のマーカーを用いてＨＳＣをさらに分画しても、Ｌｉｎ−Ｓｃａ１＋細胞はＬｉｎ−ＨＳＣ細胞を単独で使用した場合に比べて実質的な相違は示さないことが明らかとなった。これらの細胞は、網膜の血管新生部位を選択的に標的とし、開通した血管の形成に関与する。
【００６８】
遺伝性の網膜変性疾患はしばしば網膜の血管構造の消失に伴って起こる。これらの疾患の効果的な治療は、複雑な組織の構造を維持することと同様に、機能の回復を必要とする。最近のいくつかの研究では、栄養性因子又は幹細胞それ自身を、細胞に基づく送達を使用することについて探求してきたが、両者をある程度結合させることが必要であるかもしれない。例えば、網膜変性疾患を治療するために増殖因子療法を使用すると、結果として血管の無秩序な過剰増殖を引き起こし、正常な網膜組織の構造をひどく破壊した。網膜変性疾患を治療するために神経又は網膜幹細胞を使用すると、神経機能を再構成できるかもしれないが、網膜機能を完全な状態に保つためには、機能的な血管構造も必要となるであろう。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞がｒｄ／ｒｄマウス網膜の脈管に取り込まれると、網膜の構造を破壊することなく変性した血管構造を安定化した。この救出効果は細胞をＰ１５のｒｄ／ｒｄマウスに注入した時にも観察された。血管の変性はｒｄ／ｒｄマウスにおいてＰ１６に始まるので、この観察結果は効果的なＬｉｎ−ＨＳＣ処理について治療上の窓口を広げる。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣを注入された眼では、網膜のニューロン及び光受容体が保護され、視覚機能は維持される。
【００６９】
本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は、反応性星状細胞を標的とすることによって血管新生を促進でき、網膜構造を破壊することなく確立された鋳型に取り込まれ得るＥＰＣ集団を含んでいる。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣはまた網膜変性を患っている眼に驚くほど長期間にわたって神経栄養性の救出効果を与える。さらに、遺伝子的に修飾された、ＥＰＣを含有する自己由来のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は虚血性の眼又は異常な血管形成が起きた眼に移植することが可能であり、新たな脈管に安定に取り込まれて、治療のための分子を局所的に長期間継続的に送達することができる。このように、生理学的に意味のある用量で薬理活性を示す因子を発現する遺伝子を局所的に送達することは、現在治療できない眼の疾患を治療することに関して新たな理論的枠組を提示する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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