(57)【要約】【課題】外因性の抗原をサイトゾルに運搬する方法、新規な融合タンパク質、およびその使用を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題は、標的抗原を二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含むが対応する防御抗原は含まない輸送因子に結合させることによって、外因性タンパク質をサイトゾルに運搬する方法により解決された。好ましくは、標的抗原は、輸送因子に融合している。好ましい輸送因子は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓからの致死因子（ＬＦｎ）の防御抗原結合ドメインが挙げられ、該ドメインは、アミノ酸１〜２５５，好ましくはＬＦｎに対して少なくとも８０％のホモロジーを示す少なくとも８０アミノ酸の断片、および、ＰＡに結合しないカルボキシ部分からの約１０５アミノ酸の断片を含む。標的抗原は、ＣＭＩ応答を引き出すことが望ましいいかなる分子でもよく、例えばウイルス性抗原および腫瘍抗原である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立医療研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａ
ｌｔｈ）の助成ＡＩ４７５３９により支持されたものであり、米国政府は、特定の権利を
それに与えている。
【０００２】
発明の分野
本願は、外因性タンパク質をサイトゾルへ運搬する方法、新規な融合タンパク質、およ
び、その使用に向けられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多くの注目が、免疫反応を発生させる方法に集中している。外因性の抗原に対する免疫
反応の１つのクラスは、抗体生産であり、一般的に体液性免疫と呼ばれている。免疫反応
の第二の形態は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示に起因する。このタイプの免疫
反応は、概して、細胞性免疫（ＣＭＩ）、またはＴ細胞応答と呼ばれる。双方のタイプの
免疫反応が重要であるにもかかわらず、近年、相当な労力がＣＭＩにおかれている。ヒト
免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）により引き起こされるＡＩＤＳのような感染症を扱う際、ウ
イルスとその部分に対する抗体応答は、免疫性を論議するのに十分な程証明されていない
。同様に、多くの悪性病変に関連する外因性タンパク質を扱う際も、抗体応答は、十分に
証明されていない。従って、推測は、ＣＭＩ応答を発生させることに重点をおいている。
【０００４】
ＣＭＩを発生させるために、抗原は、ＡＰＣ表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ク
ラスＩまたはＩＩ分子に結合しなければならない。一般的にクラスＩ分子は、外部的に抗
原（例えば内在性タンパク質、ウイルス感染から生じた抗原、および腫瘍抗原）を提示す
る。一般的に、病原体により誘導された（またはガン性の）ペプチドエピトープ（通常、
８〜１０個のアミノ酸）が宿主クラスＩＭＨＣによりコードされた分子により提示される
場合、抗原特異的Ｔ細胞は感染した標的細胞を認識する（７）。これらエピトープは、プ
ロテオソームにより小さいペプチド断片に分割された細胞質のタンパク質から誘導される
。次にこれらは、小胞体（ＥＲ）の内腔に輸送され、そこでそれらは新たに合成されたＭ
ＨＣ−Ｉ分子と複合体を形成し、その後、細胞表面に輸送され、そこでＴ細胞による認識
が起こる（８〜１３）。一般的に、細胞外の液体中の抗原（外因性の抗原）は、殆どの細
胞において、この処理区画に接近しない。従って、ワクチンを用いてＣＭＩを引き出すこ
とに対する意義深いチャレンジは、ＭＨＣクラスＩ分子による提示のために、外因性の抗
原をサイトゾルに運搬することである。ＨＩＶのような多種多様の感染症、同様に前立腺
ガン、乳ガンおよび黒色腫のようなガンに対するワクチンを生成可能であることが望まし
い。
【０００５】
例えば、顕著になりつつある証拠によれば、ＨＩＶ感染の制御においてＣＭＩが主要な
役割を有することが示される（Ｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０
３−６（１９９８）；Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８５７
−６０（１９９９），Ｂｒｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：３４−４１（
１９９９））。ＨＩＶに晒されたが未感染のままの個体は、しばしば抗ウイルス性ＣＭＩ
を起こすが、抗体応答は起こさない。一次感染のウイルス血症は、特異抗体の発達前のウ
イルス特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発達と分析されている（Ｌｅｔｖｉｎ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１８７５−９６（１９９８））。これらデータは、ＨＩＶ感
染の制御においてＣＭＩが果たす中心的な役割を説明する。
【０００６】
多くの腫瘍は、特定のタンパク質の発現および／または特定のタンパク質の過剰発現に
関連する。例えば、前立腺ガンは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のようなタンパク質のレ
ベルが上昇することに関連する。乳ガンは、Ｈｅｒ−２、Ｍｕｃ−１、ＣＥＡなどのよう
なタンパク質の発現および／または過剰発現に関連する。従って、相当な労力が、免疫反
応を発生させようとする試み、特にこのような悪性病変の治療においてこのような抗原に
対するＣＭＩを開発することに向けられている。
【０００７】
細胞性免疫を感染症に対して開発するアプローチは、例えば、遺伝子操作した不活性化
ウイルスを作成すること、または、不活性化感染因子を用いることによって、感染因子全
体を用いることが含まれていた。他のアプローチは、サブユニットワクチンであり、これ
は、１またはそれ以上の抗原（ただしウイルス全体ではない）を被験者に提示する。
【０００８】
ＣＭＩを発生させるために、抗原は、細胞内部に運搬されなければならない。外因性タ
ンパク質は、細胞に吸収されにくい。従って、好ましい方法は、ウイルスベクター、リポ
ソーム、裸のＤＮＡのような方法、または類似のアプローチを用いることであった。しか
しながら、このようなアプローチは、多くの不利益がある。例えば、多くの組換えウイル
スは、繰り返しの投与でそれ自身が抗原反応を起こす。一般的に、免疫反応を発生させる
標準的な形態は、初期注入（仕込み（ｐｒｉｍｅ）と呼ばれる）と、後続注入（ブースト
と呼ばれる）とを良好な免疫性を達成させるために必要とするため、これは深刻な問題と
なり得る。その上、多くの労力がウイルスベクターの安全性を高めることに置かれてはい
るが、ある程度の危険は常に存在する。例えば、ＨＩＶ感染固体群のような標的個体群の
多くは、弱まった免疫系を有する可能性がある。従って、多くの個体において完全に安全
な特定のウイルスベクターは、これら個体にある程度の危険を与える可能性がある。現時
点で、タンパク質を細胞に運搬する方法も、完全に満足行くほど解明されていない。従っ
て、ＣＭＩを刺激するための、抗原をサイトゾルに運搬する新規で簡単な方法が必要であ
る。
【０００９】
ＣＭＩ応答を開発する試みにおいて、これら応答を測定することの難しさに関する技術
的な問題も存在する。
細胞性免疫反応を検出する現在利用可能な実験分析は、特に様々な臨床条件における大
規模なワクチン効率試験に適用する場合に、深刻な短所がある。これは、当分野において
、現在の技術を用いてＣＭＩを測定するのに必要な利用可能な器具と技術的サポートが、
それらが必要とされる環境においてしばしば最小限であるためである。ＣＴＬは、ＨＩＶ
−１感染の制御において重大な役割を有すると考えられており、多くのＨＴＶ−１ワクチ
ン候補が、Ｔ細胞応答を刺激し、同様に抗体を中和するように設計される（１〜６）。し
かしながら、ＨＩＶ−特異的ＣＴＬのようなＣＭＩを検出するための標準的な実験方法は
複雑で、時間がかかり、しばしば極めて特殊化された設備に制限される。Ｔ細胞応答を測
定する改良方法は、全てのＴ細胞依存性ワクチンまたは免疫療法の開発に重要な効果を持
ち得る。この方策は、ＣＭＩ応答が、病気の予防およびコントロールにおいて重要な役割
を有することが知られているようなその他の研究分野に、適用可能であるかもしれない。
【００１０】
インビトロでＣＭＩ応答を確実に検出することにおける一つの問題は、抗原提示に関す
る特有な必要性に起因する。上述したように、ＭＨＣクラスＩ分子によりＴ細胞へ提示さ
せるための、外因性タンパク質のサイトゾルへの運搬は、意義深いチャレンジを象徴する
。この物理的なクラスＩ経路の区画は、インビトロでＴ細胞応答を検出するための主要な
バリアーであった。その結果として、ＣＭＩ測定における現在の実験方法の多くは、抗原
をサイトゾルへ運搬するのに生きたウイルスベクターまたは細菌ベクターを利用しており
、その際、ワクシニアウイルスのような組換えｐｏｘが最も一般的に使用される。他のア
プローチは、既知のＣＴＬエピトープから誘導された合成ペプチド（１０〜２０個のアミ
ノ酸）と共に、ＭＨＣ−Ｉ分子を標的細胞の表面に外部的にローディングさせることであ
る。これら方法は、一般的な臨床的使用において深刻な制限がある。組換えワクシニアウ
イルスのような生きたウイルスベクターの使用は、訓練を積み、かつ免疫された実験技師
、加えて、予防面で安全な処置として最低限遮蔽された施設を必要とする。合成ペプチド
は、法外に高価であるだけでなく、様々な個体群で様々なＭＨＣ−Ｉ分子に適合する「ユ
ニバーサル」ペプチドのプロファイル設計が極めて難しい。それゆえに、Ｔ細胞応答を測
定する分析の開発に関するチャレンジは、生きた組換えウイルスベクターまたは細菌ベク
ターに頼ることなく大きな外因性の抗原をサイトゾルに運搬することである。
【００１１】
従って、インビトロでＣＭＩを測定するのに使用可能なキットを有することが望ましい
。ＨＩＶに対するワクチンのような多数のワクチン候補を試験する多くの提案があるアフ
リカ、インドおよびアジアのような遠隔地で容易に使用可能なキットを有することが、特
に望ましい。
【００１２】
我々は、ここで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのような二量体（ｂｉｐａｒ
ｔｉｔｅ）タンパク質エキソトキシンのファミリーが、タンパク質のような外因性の抗原
をサイトゾルに運搬するのに用いることができる断片を含むことを見出した。これらタン
パク質からの１つの好ましいタンパク質断片は、防御抗原（ＰＡ）結合ドメインを含むＮ
末端部分から得られるが、それらの細胞に対して毒性となる部分からは得られない。より
好ましくは、該断片は、ＰＡに結合する特異的なドメインを除去するように改変されてい
る。
【００１３】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓは、動物およびヒトにおける炭疽の原因物質である。Ｂ．ａｎ
ｔｈｒａｃｉｓにより生産される毒素は、２種の二量体タンパク質エキソトキシンと、致
死性毒（ＬＴ）と、浮腫毒とからなる。ＬＴは、防御抗原（ＰＡ）と致死因子（ＬＦ）と
から成り、一方で浮腫毒は、ＰＡと浮腫因子（ＥＦ）とからなる。これら３種の成分、Ｐ
Ａ、ＬＦ、およびＥＰのうちいずれも単独では毒性ではない。しかしながら、１度組み合
わさると、動物およびヒトにおいて、浮腫毒は浮腫を引き起こし、ＬＴは全身性ショック
による死を引き起こす。双方の毒の形成におけるその重要な役割と一致して、ＰＡは、炭
疽に対するワクチンにおける防御成分として同定されている。目下、炭疽毒作用の分子メ
カニズムは、以下のように推測される：ＰＡは、細胞性受容体により哺乳動物細胞の表面
に結合する７３５個のアミノ酸ポリペプチドである。１度結合したら、ＰＡは、細胞性プ
ロテアーゼによる、標的細胞の細胞質膜におけるリング型７量体を形成することができる
６３ｋＤａ分子へのタンパク分解性の開裂によって活性化される（図１）（６，７）。次
にＰＡ７量体は、ＥＦまたはＬＰのいずれかに結合し、エンドサイトーシスにより吸収さ
れる。エンドソーム酸性化の後、おそらくは７量体により形成された孔により、ＰＡは、
ＥＦまたはＬＦをサイトゾルに入れさせることができる。サイトゾル内部で、ＥＦはアデ
ニレートシクラーゼとして作用し（８）、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換させる。異常に上昇し
たｃＡＭＰレベルにより、細胞の代謝がかき乱される。
【００１４】
サイトゾルにおけるＬＦの作用は、宿主細胞の死を招くが、そのメカニズムは十分に理
解されていない。ＬＦは、多数のリンフォカインの過剰生産を誘導し（９）、宿主動物に
おいて致死的な全身性ショックに寄与する。最近の研究はまた、ＬＦが２種の酵素活性を
有することを示している：ＬＦは、亜鉛メタロプロテアーゼとして作用可能であり（１０
）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを不活性化する（１１）。ＬＦのこれら２種
の酵素活性がどのように関連しているのか未だはっきりしていないが、双方ともＬＰ毒性
に必要である。以前に、炭疽毒Ｂの一部分が、ＰＡ存在下で免疫系により順番に抗体応答
を引き出すエピトープ（ｅｐｔｉｏｐｅ）を運搬するのに用いることができるということ
が報告されている（ＷＯ９７／２３２３６）。
【００１５】
ＬＦは、７９６個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、双方の酵素活性に関する機
能的ドメインはアミノ酸３８３と７９６との間に位置する（図２Ａ）（１２）。ＰＡと混
合され、培養マクロファージに添加された場合、または、動物に注入された場合、この触
媒ドメインを含まないＮ末端平滑化ＬＦは、いかなる毒作用も完全に欠如されている。し
かしながら、ＬＦは、実際上、ＰＡに結合したままである。ＬＦのＰＡ結合ドメイン（Ｌ
Ｆｎ）は、アミノ酸１〜２５５からなる（図２Ｂ）（１２）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要約
本発明は、外因性の抗原をサイトゾルに運搬する方法、新規な融合タンパク質、および
その使用を提供する。
【００１７】
我々は、現在、毒性ドメインを不活性化するように改変された致死因子である輸送因子
、ＬＦｎおよびＬＦｎの断片のようなその断片（これは例えば、輸送因子として該断片の
カルボキシ部分を含み、抗原をサイトゾルに運搬するためのＰＡを用いずに標的抗原に融
合した断片である）が使用可能であることをさらに見出した。好ましくは、輸送因子は、
ＬＦｎまたはその断片である。１つの好ましい群は、ＰＡ結合ドメインを含まないＬＦｎ
断片である。より好ましくは、輸送因子は、ＬＦｎ断片である。例えば、ＬＦｎの６０個
のカルボキシ主成分アミノ酸は、輸送因子として用いることができる；さらにより好まし
くは、８０個のカルボキシ主成分アミノ酸である。また、他の断片を用いることもできる
。例えば、毒素部分が不活性化されるのであれば、より多くの致死因子タンパク質を含む
断片を用いることができる。好ましくは、輸送因子断片は、ＬＦｎの８０個のカルボキシ
主成分アミノ酸残基の部分を含み、毒性を含むその部分が除去されているのであれば、該
断片の他の部分を含む。好ましくは、該断片は、３５０個またはそれ未満のアミノ酸であ
り、さらにより好ましくは３００個またはそれ未満のアミノ酸であり、さらにより好まし
くは２５０個またはそれ未満のアミノ酸である。１つの好ましい断片は、１０５個または
それ未満のアミノ酸である。より好ましい断片は、８０個またはそれ未満のアミノ酸であ
る。次にこの輸送因子は、サイトゾルへ運搬することが望まれる抗原に結合する。これは
、当業界周知の技術によりなされ得る。例えば、抗原を含む融合タンパク質、または、細
胞のサイトゾルへ運搬することが望まれる抗原を調製することができる。
【００１８】
本発明の好ましい方法は、処理した動物において、細胞性免疫反応の形成が引き起こさ
れる新規なポリペプチドによって特徴付けられる。
本発明は、本発明の新規な融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、当該ＤＮＡ配列
によって特徴付けられる組換えＤＮＡ分子、当該ＤＮＡ配列および分子で形質転換された
単細胞宿主、ならびに、新規なポリペプチドおよび本発明の望ましい抗原に対するＣＭＩ
免疫反応を発生させるための、当該配列、分子および宿主を用いる方法を提供する。
【００１９】
他の好ましい実施形態において、本発明は、１またはそれ以上の本発明の新規な融合ペ
プチドを含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、細胞性免疫反応を引き起こす
のに有効である。１つの好ましい実施形態において、該組成物は、ワクチンとして用いる
ことができる。他の実施形態において、これら融合タンパク質は、生産細胞、好ましくは
多種多様なタンパク質、特にこのような細胞で発現させることが困難であることが証明さ
れているタンパク質の細菌の生産細胞を作成するのに用いることができる。
【００２０】
他の好ましい実施形態において、本発明は、細胞性免疫反応を測定する方法を提供する
。
さらに好ましい実施形態において、本発明は、インビトロで細胞性免疫反応を測定する
キットを提供する。
【００２１】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬する方法であって、標的抗原を輸送因子に結合させ
ることを含み、輸送因子は、細胞に対して毒性ではない二量体タンパク質エキソトキシン
の断片を含み、防御抗原（ＰＡ）は用いられない、前記方法。
（項目２）
輸送因子が、配列番号２（ＬＦｎ）またはその部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
輸送因子が、配列番号２のＰＡに結合する部分を含まない断片である、項目２に記載
の方法。
（項目４）
輸送因子が、ＬＦｎの８０個のカルボキシ主成分アミノ酸である、項目３に記載の方
法。
（項目５）
輸送因子が、配列番号２のアミノ酸１〜１４９を含まない、項目３に記載の方法。
（項目６）
輸送因子が、配列番号３によりコードされる、項目３に記載の方法。
（項目７）
輸送因子が、配列番号２と少なくとも８０％のホモロジーを有する少なくとも８０アミ
ノ酸の断片である、項目１に記載の方法。
（項目８）
輸送因子が、３５０個またはそれ未満のアミノ酸の断片である、項目１に記載の方法
。
（項目９）
輸送因子が、３００個またはそれ未満のアミノ酸である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
輸送因子が、２５０個またはそれ未満のアミノ酸である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
輸送因子が、１０５個またはそれ未満のアミノ酸である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
輸送因子が、配列番号２の、１５０〜２５３個またはそれ未満のアミノ酸である、請求
項１１に記載の方法。
（項目１３）
標的抗原が、ウイルス性抗原、細菌の抗原、および腫瘍抗原からなる群より選択される
、項目１に記載の方法。
（項目１４）
ウイルス性抗原がＨＩＶ抗原である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
輸送因子が、融合ポリペプチドの発現により標的抗原に結合し、単一の核酸コーディン
グ配列により輸送因子と標的抗原との双方がコードされる、項目１に記載の方法。
（項目１６）
輸送因子が、化学結合により標的抗原に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
輸送因子が、細胞に対して毒性ではない二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含み
、標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬するように機能する、標的抗原と輸送因子とを含む
単離されたポリペプチド。
（項目１８）
輸送因子が、対応する防御抗原（ＰＡ）に結合するドメインを含まない、項目１７に
記載の単離されたポリペプチド。
（項目１９）
項目１８に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。
（項目２０）
ペプチドの発現のための少なくとも１つのプロモーター配列を含む５’−フランキング
領域をさらに含む、項目１６に記載の単離されたＤＮＡ。
（項目２１）
項目２０に記載の単離されたＤＮＡを含むベクター。
（項目２２）
標的抗原と輸送因子とを含む単離されたポリペプチドの免疫原性の量を含む医薬組成物
であって、輸送因子は、細胞に対して毒性ではない二量体タンパク質エキソトキシンの断
片を含み、標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬するように機能し、対応する防御抗原が存
在しない、前記医薬組成物。
（項目２３）
アジュバントをさらに含む、項目２２に記載の医薬組成物。
（項目２４）
アジュバントがミョウバンである、項目２３に記載の医薬組成物。
（項目２５）
哺乳動物に項目２２に記載の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物において細
胞性免疫反応を発生させる方法。
（項目２６）
医薬組成物が、皮下または筋肉内投与により投与される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
医薬組成物が、口での摂取により投与される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
項目１８に記載の単離された核酸を細胞中で発現させることを含む、タンパク質を生
産する方法。
（項目２９）
細胞が、細菌の細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求
項２８に記載の方法。
（項目３０）
細胞が細菌の細胞である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
細胞性免疫反応分析において項目１７に記載のポリペプチドを用いることを含む、細
胞性免疫反応を測定する方法。
（項目３２）
細胞性免疫反応分析が、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析、および、フローに基づく細胞内のサイト
カイン分析からなる群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目１７に記載の新規なポリペプチドを含む、インビトロでの細胞性免疫反応を測定
するキット。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】エンドサイトーシスを介した細胞へのＬＦｎのＰＡ介在の侵入と、それに続くＭＨＣクラスＩ分子による提示とを描写する図面である。
【図２】様々な致死断片（ＬＦ）ポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。図２Ａは、ＬＦの全長アミノ酸配列を示す。図２Ｂは、ＬＦｎの最初の２８９アミノ酸のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。図２Ｃは、致死因子のアミノ酸１８５〜２８９の配列（場合によっては断片３と呼ばれる）を示す（配列番号３）。
【図３Ａ】標的のＬＦｎ提示がＰＡ非依存性であることを示すグラフである。標準的なクロム放出分析で、よく特徴付けられたＣＴＬクローンの活性を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）を１０：１で試験した。標的は、ＰＡの存在または非存在下でＬＦＮで一晩感作したＨＬＡ−適合ＥＢＶ−形質転換細胞系であった。用いられたコントロールは、組換えワクシニアベクター（コントロールとしてＮＹＣＢＨ、および、適切なクローンとしてｒＶＶ−ＮｅｆまたはＥｎｖペプチド）であった。図３Ａは、Ｎｅｆ組換えワクシニアベクター、ＰＡおよびＬＦｎＮｅｆまたはＬＦｎＮｅｆ単独と共に一晩インキュベートしたＢ６０制限標的細胞に対する、Ｎｅｆ特異的クローン（ＫＭ）の活性を試験したことをを示す。各標的に関するバックグラウンド／コントロールが含まれる（コントロール，ＰＡ−ＬＦｎ，ＬＦｎ）。
【図３Ｂ】標的のＬＦｎ提示がＰＡ非依存性であることを示すグラフである。標準的なクロム放出分析で、よく特徴付けられたＣＴＬクローンの活性を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）を１０：１で試験した。標的は、ＰＡの存在または非存在下でＬＦＮで一晩感作したＨＬＡ−適合ＥＢＶ−形質転換細胞系であった。用いられたコントロールは、組換えワクシニアベクター（コントロールとしてＮＹＣＢＨ、および、適切なクローンとしてｒＶＶ−ＮｅｆまたはＥｎｖペプチド）であった。図３Ｂは、Ｅｎｖ特異的ＣＴＬクローン（ＳＰ５１１）がＬＦｎＥｎｖで標識した標的を用量に依存して認識し、再びＰＡ非依存性であったことを示す。用いられたコントロールは、ペプチドＥｎｖ１０６Ｂ（１００μｇ／ｍｌ）であった。ＬＦｎ構築物の用量は、μｇ／ｍｌ（ＬｆｎＥｎｖ５＝５μ／ｍｌのＬｆｈＥｎｖ）として列挙される。
【図４Ａ】ＬＦｎ−ＨＩＶ認識がＨＬＡで制限されることを示すグラフである。４Ａは、ＨＬＡ−Ｂ１４制限Ｇａｇクローン（ＡＣ１３）の活性を、ＬＦｎＰ２４で感作したＨＬＡ適合および非適合Ｂ−ＬＣＬを用いて試験し、標準的なクロム放出分析で試験したことを示す。Ｒｖｖ−Ｇａｇは、コントロールとして用いられた。
【図４Ｂ】ＬＦｎ−ＨＩＶ認識がＨＬＡで制限されることを示すグラフである。２Ｂは、Ｂ６０Ｎｅｆクローン（ＫＭ）に対するＨＬＡ制限は、ＬＦｎＮｅｆで感作したＨＬＡ適合および非適合標的を用いて示されたことを示す。ＴＡＰ欠失（Ｔ２）、ＨＬＡ−Ｂ６０標的細胞をＬＦｎＮｅｆと最適なＮｅｆペプチドとで感作し、溶解に関して試験した。Ｔ２ＬＦｎＮｅｆ標的細胞に関する活性の欠失は、プロテオソームプロセシングの必要性を示している。全てのクローンをＥ：Ｔ＝１０：１で用い、溶解レベルをバックグラウンドコントロールのレベルから引算した。ＮＹＣＢＨを組換えワクシニアウイルスコントロールとして用い、ＬＦｎ単独をＬＦｎＰ２４およびＬＦｎＮｅｆとして用いた。ポジティブコントロールとしては、Ｎｅｆペプチド１８０および組換えワクシニアベクターＧａｇ（ｒｖｖ−Ｇａｇ）が含まれる。
【図５Ａ】ＬＦｎ−ＨＩＶの内部移行とプロセシングとを示すグラフである。５Ａは、ブレフェルジンＡ、サイトカラシンＢおよびクロロキンの存在下での、ＬＦｎＮｅｆで感作したＨＬＡ−適合標的細胞のＮｅｆ特異的クローン（ＫＭ）溶解を、ＬＦｎＮｅｆ単独と比較して示す。サイトカラシンＢおよびブレフェルジンＡとのコ−インキュベーションにより、Ｎｅｆ特異的クローンによる認識が失われたが、クロロキンでは失われなかった。
【図５Ｂ】ＬＦｎ−ＨＩＶの内部移行とプロセシングとを示すグラフである。５Ｂは、Ｎｅｆを発現する組換えワクシニアウイルスで一晩で感染させた標的、または、最適なエピトープペプチドＮｅｆ１８０単独で感作した標的を用いた、または、クロロキン、サイトカラシンＢまたはブレフェルジンＡの存在下での、同じＮｅｆクローンの活性を示す。標的細胞とＣＴＬクローンを、サイトカラシンＢ、クロロキンまたはブレフェルジンＡの存在下でインキュベートした場合、活性の顕著な減少は見られなかった。示された溶解レベルを、１０％未満のバックグラウンド溶解から引算する。
【図６】Ｅｌｉｓｐｏｔ分析におけるＬＦｎ−ＨＩＶ発現を示したグラフである。既知のＨＴＶ特異的ＣＴＬ活性またはエピトープを有するＨＴＶ−１感染個体からの凍結保存されたＰＢＭＣを、組換えワクシニアウイルスまたはＬＦｎ−ＨＩＶを用いたＥｌｉｓｐｏｔ分析で用いた。ＬＦｎ単独およびＮＹＣＢＨは、コントロールとして用いられた。二連のウェルにおいて、ウェル当たり１００Ｋ個の細胞を用いた。結果を、ＳＦＣ／１００万（１００万当たりのスポット形成細胞）として報告する。
【図７】ＦＡＣＳプロットであり、細胞内のフローに基づく分析においてＬＦｎ−ＨＩＶ発現を示す。Ｎｅｆ特異的クローンにおける細胞内のＩＦＮ−γ生産（ＫＭ）（Ａ）、同様に、Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ活性を有する血清陽性の個体（ＡＣ２）のＰＢＭＣからの細胞内のＩＦＮ−γ生産（ＫＭ）（Ｂ）である。刺激していない細胞をネガティブコントロールとして用い（１）、組換えワクシニアウイルスをポジティブコントロールとして用い（２）、ＬＦｎＮｅｆとＬｆａＥｎｖとをそれぞれ用いた（３）。
【図８】ＬＦｎ融合タンパク質を描写する図面である。
【図９】ＬＦｎ融合タンパク質を描写する一連の図面である。
【図１０ＡＢＣＤＥＦ】ＬＦｎ−ＧＦＰのＣＨＯ細胞への細胞摂取を示す。ＣＨＯ細胞を、コラーゲン処理したチャンバースライドで８０％の群集になるように培養し、続いて精製したＬＦｎ−ＧＦＰと共に１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ、および、プロテアーゼを添加したＰＢＳでよく洗浄し、膜結合タンパク質を除去した。次に、細胞を抗トランスフェリン抗体で染色し、パラホルムアルデヒドで固定した。そのスライドを共焦点顕微鏡法で、それぞれ緑色（ＧＦＰ、図１０Ａ〜Ｄで示される）、および、赤色（抗トランスフェリン、図１０Ｅ〜Ｈで示される）に関して試験した。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージと共に（図１０Ｉ〜Ｌ）示される。その結果として、黄色のスポットは、ＧＦＰがトランスフェリンタンパク質と同じスポットにあることを示し、従って細胞内部のＧＦＰの位置の参照を提供する。図１０Ａ〜Ｄで示したように、相当数の緑色のスポットが、ＬＦｎ−ＧＦＰで標的化された細胞中で１時間で可視化され、これはＬＦｎ−ＧＦＰが実際に細胞に侵入できることを示す。
【図１０ＧＨＩＪＫＬ】ＬＦｎ−ＧＦＰのＣＨＯ細胞への細胞摂取を示す。ＣＨＯ細胞を、コラーゲン処理したチャンバースライドで８０％の群集になるように培養し、続いて精製したＬＦｎ−ＧＦＰと共に１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ、および、プロテアーゼを添加したＰＢＳでよく洗浄し、膜結合タンパク質を除去した。次に、細胞を抗トランスフェリン抗体で染色し、パラホルムアルデヒドで固定した。そのスライドを共焦点顕微鏡法で、それぞれ緑色（ＧＦＰ、図１０Ａ〜Ｄで示される）、および、赤色（抗トランスフェリン、図１０Ｅ〜Ｈで示される）に関して試験した。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージと共に（図１０Ｉ〜Ｌ）示される。その結果として、黄色のスポットは、ＧＦＰがトランスフェリンタンパク質と同じスポットにあることを示し、従って細胞内部のＧＦＰの位置の参照を提供する。図１０Ａ〜Ｄで示したように、相当数の緑色のスポットが、ＬＦｎ−ＧＦＰで標的化された細胞中で１時間で可視化され、これはＬＦｎ−ＧＦＰが実際に細胞に侵入できることを示す。
【図１１ＡＢＣＤＥ】図１０で説明した条件を用いた、ＧＦＰのＣＨＯ細胞への細胞摂取を示す。図１１Ａ、Ｄ、およびＧは、ＣＨＯ細胞をＧＦＰと共に１時間インキュベートした結果を示す；図１１Ｂ〜Ｃ、Ｅ〜Ｆ、およびＨ〜Ｉは、ＣＨＯ細胞をＧＦＰと共に２時間インキュベートした結果を示す。図１１Ａ〜Ｃは、緑色（ＧＦＰ）に関して共焦点顕微鏡法で試験された細胞のフィールドを示す；図１１Ｄ〜Ｆは、それぞれ赤色（抗トランスフェリン）に対応する、共焦点顕微鏡法で試験されたフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１１Ｇ〜Ｉ）と共に示される。ＧＦＰ処理細胞において、緑色のスポットはほとんど示されなかった（図１１）。
【図１１ＦＧＨＩ】図１０で説明した条件を用いた、ＧＦＰのＣＨＯ細胞への細胞摂取を示す。図１１Ａ、Ｄ、およびＧは、ＣＨＯ細胞をＧＦＰと共に１時間インキュベートした結果を示す；図１１Ｂ〜Ｃ、Ｅ〜Ｆ、およびＨ〜Ｉは、ＣＨＯ細胞をＧＦＰと共に２時間インキュベートした結果を示す。図１１Ａ〜Ｃは、緑色（ＧＦＰ）に関して共焦点顕微鏡法で試験された細胞のフィールドを示す；図１１Ｄ〜Ｆは、それぞれ赤色（抗トランスフェリン）に対応する、共焦点顕微鏡法で試験されたフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１１Ｇ〜Ｉ）と共に示される。ＧＦＰ処理細胞において、緑色のスポットはほとんど示されなかった（図１１）。
【図１２ＡＢＣＤＥＦ】図１０で上述したのと同一の実験方法を用いて、ＧＦＰの共存（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）、および、リソソームを示すＬＡＭＰ−２免疫蛍光を示す。図１２Ａ〜Ｄは、赤色（ＬＡＭＰ−２）に関して共焦点顕微鏡法で試験された細胞のフィールドを示す；図１２Ｅ〜Ｈは、を示す緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して共焦点顕微鏡法で試験された対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１２Ｉ〜Ｌ）と共に示される。
【図１２ＧＨＩＪＫＬ】図１０で上述したのと同一の実験方法を用いて、ＧＦＰの共存（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）、および、リソソームを示すＬＡＭＰ−２免疫蛍光を示す。図１２Ａ〜Ｄは、赤色（ＬＡＭＰ−２）に関して共焦点顕微鏡法で試験された細胞のフィールドを示す；図１２Ｅ〜Ｈは、を示す緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して共焦点顕微鏡法で試験された対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１２Ｉ〜Ｌ）と共に示される。
【図１３ＡＢＣＤＥＦ】図１０で上述したのと同一の実験方法を用いて、ＧＦＰの共存、および、エンドソームを示すＥＥＡ−１に対する免疫蛍光を示す。図１３Ａ〜Ｄは、共焦点顕微鏡法で試験された赤色（ＥＥＡ−１）に関する細胞のフィールドを示す；図１３  Ｅ〜Ｈは、共焦点顕微鏡法で試験されたに関して緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１３Ｉ〜Ｌ）と共に示される。
【図１３ＧＨＩＪＫＬ】図１０で上述したのと同一の実験方法を用いて、ＧＦＰの共存、および、エンドソームを示すＥＥＡ−１に対する免疫蛍光を示す。図１３Ａ〜Ｄは、共焦点顕微鏡法で試験された赤色（ＥＥＡ−１）に関する細胞のフィールドを示す；図１３  Ｅ〜Ｈは、共焦点顕微鏡法で試験されたに関して緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１３Ｉ〜Ｌ）と共に示される。
【図１４ＡＢＣ】図１０で上述したのと同一の実験方法を用いた、ＧＦＰと抗ゴルジ抗体との共存を示す。図１４Ａ−Ｂは、共焦点顕微鏡法で試験された赤色（抗ゴルジ抗体）に関する細胞のフィールドを示す；図１４Ｃ〜Ｄは、共焦点顕微鏡法で試験された緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１４Ｅ〜Ｆ）と共に示される。
【図１４ＤＥＦ】図１０で上述したのと同一の実験方法を用いた、ＧＦＰと抗ゴルジ抗体との共存を示す。図１４Ａ−Ｂは、共焦点顕微鏡法で試験された赤色（抗ゴルジ抗体）に関する細胞のフィールドを示す；図１４Ｃ〜Ｄは、共焦点顕微鏡法で試験された緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１４Ｅ〜Ｆ）と共に示される。
【図１５ＡＢＣＤＥＦ】プロテオソームを示すＧＦＰの共存、および、抗２０ｓ免疫蛍光を示す。ＨｅＬａ細胞を４０μｇ／ｍｌのＬＮｇｆｐと共に２時間インキュベートしたことを除いては、図１０で用いられた条件と類似の条件を用いた。図１５Ａ〜Ｄは、共焦点顕微鏡法で試験された赤色（抗２０ｓ抗体）に関する細胞のフィールドを示す；図１５Ｅ〜Ｈは、それぞれ共焦点顕微鏡法で試験された緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１５Ｉ〜Ｌ）と共に示される。図１２〜１５の異なるイメージを比較することにより、最も黄色のスポットを含む過剰露出したイメージは図１５で示したイメージであって、それにおいて、細胞内のＬＦｎ−ＧＦＰを示す緑色のスポットが、細胞性プロテオソームを示す赤色のスポットと顕著にオーバーラップしている。
【図１５ＧＨＩＪＫＬ】プロテオソームを示すＧＦＰの共存、および、抗２０ｓ免疫蛍光を示す。ＨｅＬａ細胞を４０μｇ／ｍｌのＬＮｇｆｐと共に２時間インキュベートしたことを除いては、図１０で用いられた条件と類似の条件を用いた。図１５Ａ〜Ｄは、共焦点顕微鏡法で試験された赤色（抗２０ｓ抗体）に関する細胞のフィールドを示す；図１５Ｅ〜Ｈは、それぞれ共焦点顕微鏡法で試験された緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１５Ｉ〜Ｌ）と共に示される。図１２〜１５の異なるイメージを比較することにより、最も黄色のスポットを含む過剰露出したイメージは図１５で示したイメージであって、それにおいて、細胞内のＬＦｎ−ＧＦＰを示す緑色のスポットが、細胞性プロテオソームを示す赤色のスポットと顕著にオーバーラップしている。
【図１６ＡＢＣＤＥＦ】図１５で用いた条件と類似した条件下でＰＡ添加しても、細胞内部の緑色のスポットの数がＰＡ非存在下での数と比較して増加しなかったことを示す。図１６Ａ〜Ｆは、ＰＡ非存在下での、ＬＮ−ＧＦＰを伴うＨｅＬａ細胞のインキュベーションを示す；図１６Ｇ〜Ｌは、ＰＡ存在下でＨｅＬａ細胞のインキュベーションを示す。図１６Ａ〜ＢおよびＧ〜Ｈは、赤色（抗２０ｓ抗体）に関して共焦点顕微鏡法で試験された細胞のフィールドを示す；図１６Ｃ〜ＤおよびＩ〜Ｊは、それぞれ緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して共焦点顕微鏡法で試験された対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１６Ｅ〜ＰおよびＫ〜Ｌ）と共に示される。
【図１６ＧＨＩＪＫＬ】図１５で用いた条件と類似した条件下でＰＡ添加しても、細胞内部の緑色のスポットの数がＰＡ非存在下での数と比較して増加しなかったことを示す。図１６Ａ〜Ｆは、ＰＡ非存在下での、ＬＮ−ＧＦＰを伴うＨｅＬａ細胞のインキュベーションを示す；図１６Ｇ〜Ｌは、ＰＡ存在下でＨｅＬａ細胞のインキュベーションを示す。図１６Ａ〜ＢおよびＧ〜Ｈは、赤色（抗２０ｓ抗体）に関して共焦点顕微鏡法で試験された細胞のフィールドを示す；図１６Ｃ〜ＤおよびＩ〜Ｊは、それぞれ緑色（ＬＮ−ＧＦＰ）に関して共焦点顕微鏡法で試験された対応するフィールドを示す。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージ（図１６Ｅ〜ＰおよびＫ〜Ｌ）と共に示される。
【図１７】ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つのグループ（各グループ中４匹）を、それぞれ異なる抗原配合（１５μｇのＬＦｎ−ｐ２４＋４μｇのＰＡ、１５μｇのＬＰｎ−ｐ２４＋４μｇのＰＡ＋ミョウバン、１５ＬＦｎ−ｐ２４単独＋ミョウバン）で腹腔内に免疫した。免疫化後１週間で、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓の単核細胞を、ＣＴＬ源として用いた。脾臓培養物中のＣＴＬを、非免疫化動物のガンマ放射したペプチドパルスＢＡＬＢ／ｃ脾細胞と培養することによりインビトロで活性化した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで６日培養した後、成熟ＣＴＬ（エフェクター細胞）を、５１Ｃｒ標識化Ｐ２０ペプチドパルスＰ８１５細胞（ポジティブ標的）または５１Ｃｒ標識化媒体パルス細胞（ネガティブ標的）のいずれかを溶解させるそれらの能力に関して試験した。示された溶解の割合を、ネガティブ標的のバックグラウンド溶解から引算し、各グループの平均として示した。
【図１８】ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つのグループ（各グループ中４匹）を、それぞれ１５μｇのＬＦｎ−ｐ２４、１５μｇのＭＬＦｎ−ｐ２４、および１５μｇのｐ２４で腹腔内に免疫した。脾臓組織中のＣＴＬを、免疫化の後連続して試験した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
我々は、ここで、防御抗原（ＰＡ）の非存在下で、標的抗原（例えばタンパク質）を二
量体タンパク質エキソトキシンの断片を含む輸送因子に結合させることによって、外因性
タンパク質をサイトゾルに運搬する方法を見出した。好ましくは、該標的抗原は、輸送因
子に融合される。好ましくは、該輸送因子は、アミノ酸１〜２８８からなる（配列番号２
）Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓからの致死因子の防御抗原結合ドメインであるか、または、カ
ルボキシ部分のようなＰＡ結合ドメインを含まないその断片である。例えば、輸送因子に
関するアミノ酸ＬＦｎ１アミノ酸断片の好ましい群の、約８０個のカルボキシ主成分アミ
ノ酸の断片は、デフォルト設定におけるＢｌａｓｔで配列番号２に少なくとも８０％のホ
モロジーを示す少なくとも８０アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、該断片は、それ
に対して少なくとも９０％のホモロジーを有し、さらにより好ましくは、それに対して少
なくとも９５％のホモロジーを有する。好ましくは、上記断片は、ＰＡ結合ドメインを含
まない。好ましい輸送因子は、ＬＦｎ断片またはその部分である。より好ましくは、該輸
送因子は、少なくともＬＦｎの６０個のカルボキシ主成分アミノ酸を含むが、ＰＡ結合ド
メインは含まない。１つの好ましい断片は、配列番号２のカルボキシ部分からの約１０５
個またはそれ未満のアミノ酸を含む。
【００２４】
該標的抗原としては、ＣＭＩ応答を引き出すのに望ましいと思われる全ての分子が可能
であり、例えばウイルス性抗原および腫瘍抗原である。
本発明の一実施形態は、発生させるための新規な融合ポリペプチドを含む組成物を提供
する。本発明の他の実施形態は、外因性タンパク質をサイトゾルに運搬することによって
ＣＭＩ応答を測定するための分析を含む。好ましい実施形態は、ＣＭＩ応答を測定するた
めのキットを提供する。
【００２５】
本発明の新規な融合ポリペプチドは、標的抗原に結合した輸送因子を含む。該輸送因子
は、いかなる毒性の断片も含まない、防御抗原の非存在下でタンパク質をサイトゾルに運
搬するいかなる二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含み得る。この輸送方法は、Ｐ
Ａ関連経路に非依存性であり、従って、ＰＡは不必要である。好ましいエキソトキシンは
、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの致死因子（ＬＦ）である（配列番号１）（図２Ａ）。ＬＦの
ＰＡ結合ドメインは、細胞膜を貫通可能なＬＦｎの部分またはその断片であり、アミノ酸
１〜２５５（配列番号２）（図２Ｂ）からなる。ＬＦｎのいかなる断片も、輸送因子とし
て用いることができる。好ましくは、それが、ＰＡ結合ドメイン（ＬＦｎのＮ末端の半分
（アミノ酸１〜１４９）に存在する）を含まない。１つの好ましい断片は、配列番号２の
カルボキシ部分からの１０５個またはそれ未満のアミノ酸を含む。好ましくは、６０個の
カルボキシ主成分アミノ酸であり、さらにより好ましくは、８０個のカルボキシ主成分ア
ミノ酸である。好ましい輸送因子は、断片３である（配列番号３）（図２Ｃ）。
【００２６】
輸送因子として他の断片を用いることもできる。該輸送因子は、好ましくは３５０個ま
たはそれ未満のアミノ酸であり、さらにより好ましくは３００個またはそれ未満のアミノ
酸であり、さらにより好ましくは２５０個またはそれ未満のアミノ酸である。
【００２７】
輸送因子として好ましいその他の断片は、ＬＦｎの断片３に対して少なくとも５５％の
ホモロジーを有する（配列番号３）（図２Ｃ）。例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの浮腫
因子の断片は、デフォルト設定におけるＢｌａｓｔを用いて、断片３ｇに対して約５７％
のホモロジーを有する。より好ましくは、それに対して少なくとも６５％のホモロジーを
有し；さらにより好ましくは、それに対して少なくとも７５％のホモロジーを有し；さら
により好ましくは、それに対して少なくとも８０％のホモロジーを有し；さらにより好ま
しくは、それに対して少なくとも９０％のホモロジーを有し；さらにより好ましくは、そ
れに対して少なくとも９５％のホモロジーを有する。
【００２８】
該輸送因子は、サイトゾルへの運搬が望まれるいかなる抗原に結合させることができる
。好ましくは、結合は、融合タンパク質の形態である。しかしながら、当業界既知のその
他のリンカーを生成することができる。例えば、リンカーユニットは、次に化学的に標的
抗原に結合できる輸送体の部分であり得る。好ましい抗原としては、ウイルス抗原、細菌
の抗原、寄生虫の抗原、および腫瘍関連抗原が挙げられる。好ましいウイルス性抗原とし
ては、細胞性免疫反応が望ましい場合、いずれのウイルスからのタンパク質が挙げられる
。特に好ましいウイルスとしては、ＨＩＶ−１、ＨＴＶ−２、肝炎ウイルス（肝炎Ｂおよ
びＣを含む）、エボラウイルス、西ナイルウイルス、およびＨＳＶ−２のようなヘルペス
ウイルスが挙げられる。好ましい細菌の抗原としては、Ｓ．ｔｙｐｈｉおよびマイコバク
テリア（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からの抗原が挙げられる。好ましい寄生虫の抗
原としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含む）からの抗原が挙
げられる。
【００２９】
好ましい腫瘍抗原としては、Ｔ細胞応答の誘発において認識されるエピトープが挙げら
れ、例えば、これらに限定されないが、以下が挙げられる：前立腺ガン抗原（例えばＰＳ
Ａ、ＰＳＭＡなど）、乳ガン抗原（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｍｉｎｉ−ＭＵＣ、ＭＵＣ
−１、ＨＥＲ２受容体、ｍａｍｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎｅ、ＳＣ
Ｐ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、Ｎ末端がブロックされた可溶性サイトケラチン
、４３ｋＤのヒトガン抗原、ＰＲＡＴ、ＴＵＡＮ、Ｌｂ抗原、癌胎児性抗原、ポリアデニ
ル酸ポリメラーゼ、ｐ５３、ｍｄｍ−２、ｐ２１、ＣＡ１５−３、オンコプロテイン１８
／スタスミン、およびヒト腺性カリクレイン）、黒色腫抗原などである。
【００３０】
好ましくは、被験者において免疫反応を発生させようと試みる場合に免疫アジュバント
を用いてもよい。アジュバントは当業界既知であり、サイトカイン、例えばＩＬ−２、Ｉ
ｇ−ＩＬ−２、ＣＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、ＲＩＢＬ  Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、不完全フロイ
ントアジュバントなどが挙げられる。我々は、意外にも、実際にミョウバンがＣＴＬ誘導
を阻害することができるが、本システムにおいて、特異的なＣＴＬを刺激するのにミョウ
バンが好ましいことを見出した。
【００３１】
本発明の方法はまた、以下で説明するように、輸送因子と融合した腫瘍抗原のライブラ
リーをＣＭＩ分析と併せて作成することによって追加のガン抗原を同定するのに用いるこ
とができる。
【００３２】
標的抗原のサイズは、サイトゾルへの運搬が可能であればどのようなサイズでもよい。
好ましくは、標的抗原は、７５０個未満のアミノ酸、さらにより好ましくは、６００個未
満のアミノ酸、さらにより好ましくは、５００個未満のアミノ酸である。本発明の新規な
融合ポリペプチドは、単一の融合タンパク質の部分として、単一の標的抗原、または、複
数の標的抗原を含み得る。好ましい融合ポリペプチドとしては、いくつかのＨＩＶ−１タ
ンパク質の断片、例えばＧａｇおよびｎｅｆが挙げられる（図８、９）。
【００３３】
また、ＨＩＶのような感染性ウイルスの複数の系を用いてエピトープを作成することも
できる（図９を参照）。
新規な融合ポリペプチドは、組換えにより製造される、または、化学的に合成される大
きい多量体分子の部分でもよい。このような多量体はまた、脂質および炭水化物などのア
ミノ酸以外の成分に融合または結合したポリペプチドでもよい。
【００３４】
好ましくは、多量体タンパク質は、同じ分子内で、ランダムに、または、間にスペーサ
ー（アミノ酸など）を含んで繰り返される複数のＴ細胞エピトープからなる。
これら新規な融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、容易に製造することができる
。例えば、ＬＦｎをコードする配列は周知であり、既知の技術によって改変することがで
き、例えば望ましくない領域（例えば可変ループ）を除き、追加の望ましいコーディング
配列（例えばリンカーセグメント）のいずれかを挿入することによって改変することがで
きる。様々な標的抗原をコードする配列も当業界既知である。加えて、様々なアミノ酸残
基に関するコドンが知られており、標準的な技術により代わりのコーディング配列を容易
に調製することができる。
【００３５】
新規な融合タンパク質を発現させるために、ＤＮＡ配列を各種動物で用いることができ
、それにより、以下で説明するワクチン組成物やＣＭＩ分析などの多種多様な用途に用い
ることができる。
【００３６】
新規な融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、多種多様の宿主／ベクターの組み合
わせで発現させることができる。ベクターとしては、ＷＯ９３／０４７０１で説明されて
いるような化学的な共役（これはターゲティング部分（例えば細胞表面受容体に対するリ
ガンド）および核酸結合部分（例えばポリリシン）を有する）、ウイルスベクター（例え
ばＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、プラスミド、ファージなどが挙げられる。該
ベクターは、染色体系、非染色体系または合成であり得る。
【００３７】
真核性宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイル
ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルスおよびレトロウイルス
からの発現コントロール配列を含むベクターが挙げられる。細菌の宿主に有用な発現ベク
ターとしては、細菌のプラスミド、例えばＥ．ｃｏｌｉからのプラスミド、例えばｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ
３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、幅広い宿主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、
ファージＤＮＡ類、例えば多数のファージラムダ誘導体、例えばラムダ．ＧＴ１０および
ラムダ．ＧＴ１１、ならびにその他のファージが挙げられる。酵母細胞に有用な発現ベク
ターとしては、２ミクロン、プラスミドおよびその誘導体が挙げられる。昆虫細胞に有用
なベクターとしては、ｐＶＬ９４１が挙げられる。
【００３８】
好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、および、化学的な共
役が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、お
よび、ＨＩＶベースのウイルスが挙げられる。１つの好ましいＨＩＶベースのウイルスベ
クターは、少なくとも２つのベクターを含み、ここでｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶ
ゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子が他のウイルス由来である。ＤＮＡウイルスベクターが
好ましい。これらベクターとしては、ヘルペスウイルスベクター、例えば単純ヘルペスＩ
ウイルス（ＨＳＶ）ベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ  ６４：４８７，１９９５；Ｌｉｍ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ
．Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：７６０３，１９９３；
Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，Ｉ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：
１１４９，１９９０）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８，１９９３；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．
，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ３：２１９，１９９３；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６９：２００４，１９９５）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ
，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ８：１４８，１９９４）が挙げられる
。ＤＮＡ配列は、宿主細胞中での発現を可能にするプロモーターに実施可能に結合してい
る。このようなプロモーターは当業界で周知であり、容易に選択することができる。
【００３９】
多種多様の単細胞宿主細胞が、本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これ
ら宿主としては、周知の真核および原核宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ系、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ系、Ｂａｃｉｌｌｕｓ系、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ系、菌類、酵母、昆虫細胞、
例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）、動物細胞、例えばＣＨ
Ｏおよびマウス細胞、アフリカミドリザル細胞、例えばＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、
ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０、ならびに、ヒト細胞、同様に、組織培養における植物細
胞が挙げられる。本発明の分子は、各種生産細胞を作成するのに用いることができる。こ
れは特に、細胞中で大量に発現させることが目下困難な特定のタンパク質に関して有用で
ある。
【００４０】
本発明のＤＮＡ配列でコードされる新規な融合ポリペプチドを含む分子を、多種多様な
通常の方法のいずれかを用いて発酵または細胞培養物から単離し、精製しすることができ
、該方法としては、：液体クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを用いた
、通常の液体クロマトグラフィーまたは逆相液体クロマトグラフィー）；アフィニティー
クロマトグラフィー（例えば無機リガンドまたはモノクローナル抗体を用いたもの）；サ
イズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動；
などが挙げられる。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく最も適切な単離
と精製技術とを選択することができる。
【００４１】
これら新規な融合タンパク質の安定型を、例えば、ポリ(アルキレンオキシド)の共役の
ような共役により、容易に作成することができる。共役は、好ましくは、ポリ(アルキレ
ンオキシド)のヒドロキシル末端と、そのコンフォメーションに影響を及ぼすことのない
融合タンパク質の部分中の遊離アミノ基とを共有結合させることにより形成される。その
他の当業界で認められた、これら材料を共役させる方法としては、アミドまたはエステル
結合が挙げられる。共有結合、同様に、親油性または親水性相互作用のような非共有結合
の共役も用いることができる。
【００４２】
共役は、非抗原性の高分子物質、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、多糖類
、スターチ、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、または、その他の実質的に非
免疫原性（immunogenic）のポリマーで構成することができる。ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）が好ましい。その他のポリ（アルキレンオキシド）としては、モノメトキシ−
ポリエチレングリコールポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールのブロック
コポリマー、およびポリプロピレングリコールなどが挙げられる。該ポリマーはまた、モ
ノメトキシ基の代わりにＣ１〜４のアルキルで末端をキャップすることができる。用いら
れるポリ（アルキレンオキシド）は、室温で、液体に可溶性でなければならない。従って
、それらは、好ましくは、約２００〜約２０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０
００〜約１０，０００、さらにより好ましくは約５，０００の分子量を有する。
【００４３】
当業界で標準的な技術を有するものであれば、多種多様な可能な成分が結果生じる本発
明の新規な融合タンパク質にカップリングされ得ることを理解できるだろう。例えば、“
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ
．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ．），Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，
１９８９が参照され、その全内容は引用により本発明に加入される。
【００４４】
カップリングは、新規な融合タンパク質と他の成分とがそれらそれぞれの活性が保持さ
れさえすれば、２種の分子を結合させ得るいかなる化学反応によって達成することができ
る。この結合としては、多くの化学的メカニズム、例えば共有結合、親和性結合、相互作
用、配位結合および錯化が挙げられる。しかしながら、好ましい結合は共有結合である。
共有結合は、存在する側鎖の直接の縮合、または、外部の架橋分子の組み込みのいずれか
により達成することができる。多くの二価または多価リンキング剤が、本発明の抗体のよ
うなタンパク質分子を他の分子にカップリングするのに有用である。例えば、代表的なカ
ップリング剤としては、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイ
ミドエステル、ジイソシアネート（disocyanates）、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼ
ン、および、ヘキサメチレンジアミンが挙げられる。この列挙は、当業界既知のカップリ
ング剤の様々なクラスを包括することを意図しているのではなく、むしろ、より一般的な
カップリング剤の例である（Ｋｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｍｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３３：１３３５−２５４９，１９８４；Ｊａｎｓｅｎ，Ｆ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，
Ｉｍｍ．Ｒｅｖ．６２：１８５−２１６，１９８２；およびＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ
．（上述した通り）を参照）。
【００４５】
好ましいリンカーが文献で説明されている。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．
，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４）（ＭＢＳ（
Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を説明する
）を参照。また、Ｕｍｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０３０，７１９号（オ
リゴペプチドリンカーにより抗体に結合したハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用
を説明する）を参照。特に好ましいリンカーとしては、：（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−ス
クシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチ
オ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）；（ｉｉ
ｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピロンアミド］
ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ＃２１６５１０）；（ｉｖ）
スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プ
ロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．Ｃａｔ．＃２１６５
−Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣに共役したスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシ
ンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．＃２４５１０）が挙げられる。
【００４６】
上述のリンカーは、異なる特性を有する成分を含み、それにより異なる生理化学的な特
性を有する共役を得る。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは
、芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルより安定である。ＮＨＳ−エステル
含有リンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルより可溶性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴ
は、立体的に込み合ったジスルフィド結合を含み、共役を形成し安定性を増加させること
ができる。ジスルフィド結合は、一般的に、他の結合に比べて不安定であり、なぜなら、
ジスルフィド結合はインビトロで開裂し、利用可能な共役がわずかしか生じないためであ
る。スルホ−ＮＨＳは、特に、カルボジイミド（carbodimide）カップリングの安定性を
増強することができる。カルボジイミド（carbodimide）カップリング（例えばＥＤＣ）
は、スルホ−ＮＨＳと併用される場合、カルボジイミド（carbodimide）カップリング反
応単独よりも加水分解に対して耐性なエステルを形成する。
【００４７】
本発明の新規な融合タンパク質は、安定なタンパク質発現のために用いることができる
。例えば、特定のタンパク質は、特定の発現系、例えば細菌の発現系において発現させる
ことが難しい。ＬＦｎのような輸送因子への融合により、特定のこのようなタンパク質を
安定化することができる。我々は、輸送因子が、好ましくは２５０個またはそれ未満のア
ミノ酸、さらにより好ましくは１５０個またはそれ未満のアミノ酸、より好ましくは１０
５個またはそれ未満のアミノ酸、さらにより好ましくは８０個またはそれ未満のアミノ酸
であることを見出した。
【００４８】
本発明の新規な融合タンパク質は、免疫反応を発生させるのに用いることができる。例
えば、ワクチンとしてである。
代表的な医薬組成物は、治療上有効な量の新規な融合タンパク質であり、該融合タンパ
ク質は、免疫反応を誘導することができ、それにより予防の免疫原として作用し、必要に
応じて製薬上許容でき、かつ適合可能な担体に含ませる。本明細書で用いられ、以下でよ
り詳細に説明される「製薬上許容でき、かつ適合可能な担体」という用語は、（ｉ）ヒト
または他の動物への投与に適切な、１またはそれ以上の適合可能な固体または液体、充填
剤、希釈剤または封入物質、および／または（ｉｉ）分子を標的細胞に運搬することがで
きるシステム、を含む。従って、本発明において「担体」という用語は、有機または無機
成分、天然または合成を示し、適用を容易にするために本発明の分子はそれらと結合する
。「治療上有効な量」という用語は、治療しようとする特定の状態において望ましい結果
が生じる、または望ましい影響を働かせる本発明の医薬組成物の量である。例えば、免疫
反応を発生させるのに必要な量は、予防的な保護を提供することができる。一般的に、本
組成物が予防の免疫原として用いようとする場合、少なくとも１つの「ブースト」が、第
１回目の投与の後、定期的な間隔で投与され得る。同じ成分を含む組成物を調製する際に
、様々な濃度を用いることができ、治療しようとする患者の年齢、状態の重症度、治療期
間および投与様式におけるバリエーションを提供する。
【００４９】
好ましい実施形態において、免疫原性ポリペプチドでもある本発明の新規な融合ポリペ
プチドは、その他の免疫原性ポリペプチドを含み得る多成分ワクチンに含ませる。多成分
ワクチンは、Ｔ細胞応答を引き出す本発明の新規な融合タンパク質、同様にＢ細胞応答を
引き出すその他の抗原を含み得る。
【００５０】
一つの好ましい免疫化方法において、新規な融合タンパク質を提供し、次に異なる新規
な融合タンパク質で追加免疫する。
また、多種多様な異なる新規な融合タンパク質を含むカクテルを提供し、多種多様な異
なる新規な融合タンパク質または複数の抗原を含む融合タンパク質のいずれかで追加免疫
してもよい（図８、９）。
【００５１】
新規な融合タンパク質は、多種多様な抗原（例えば異なるＨＴＶ系からの抗原）を認識
し、相互作用する各種Ｔ細胞を発生させるのに用いることができる。新規な融合タンパク
質をコードするＤＮＡ配列もまた、サブユニットワクチンとして用いることができる。
【００５２】
例えばワクチン組成物を用いて免疫反応を発生させる試みにおいて、アジュバントを用
いることも好ましい。アジュバントとしては、これらに限定されないが、ミョウバン、Ｒ
ＩＢＩ  Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＱＳ２１（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および不完全フロイントアジュバントが挙げられる。ミ
ョウバンは好ましいアジュバントである。アジュバントのその他のグループとしては、免
疫促進物質、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−４のようなサイトカイン、および、Ｂ７のような
副刺激分子が挙げられる。免疫促進効果を有する様々な分子が知られており、例えばＩＣ
ＡＭおよびＬＦＡのようなアクセサリー分子である。好ましい実施形態において、ＧＭ−
ＣＳＦは、第１回目の免疫投与の前に患者に投与される。ＧＭ−ＣＳＦは、医薬製剤中の
ウイルスベクターまたは単離タンパク質を用いて投与され得る。アジュバントのみ合わせ
（例えばＣＭ−ＣＳＦ、Ｉ  ＣＡＭおよびＬＦＡ）を用いることができる。一般的に感染
症抗原に対して強い免疫反応が発生する一方で、一般的に腫瘍関連抗原に対してはより弱
い免疫反応が発生する。従って、上述したような免疫促進物質は、それらと共に用いられ
ることが好ましい。上述したように、ミョウバンが好ましいアジュバントである。
【００５３】
本発明の免疫刺激組成物は、他の治療の処方計画（regiment）を用いて有利に使用でき
る。例えば、該システムは、ガンのための従来の治療選択肢（手術、放射線療法、化学療
法およびホルモン療法など）と併せて用いることができる。例えば、新規な本発明の融合
タンパク質を含む乳ガンワクチンは、エストロゲン活性に干渉するクエン酸タモキシフェ
ンと併用することができる。該システムはまた、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（ＴＭ）（ｔ
ｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＨＥＲ２受容体をブロックするように開発された抗ＨＥＲ２ヒ
ト化モノクローナル抗体を用いた免疫療法；骨髄移植と併用することもでき；および、末
梢血液幹細胞療法も用いることができる。本発明の組成物と併用できる他の好ましい治療
の処方計画（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）としては、血管新生、阻害剤および細胞毒性の薬剤が挙
げられる。
【００５４】
「適合可能な（compatible）」という用語は、本明細書で用いられるように、医薬組成
物の成分が、本発明の小さい分子、核酸および／またはポリペプチドを、互いに望ましい
医薬的な効能を実質的に損なわないような方法で混合することができる、ということを意
味する。
【００５５】
本発明の医薬組成物の用量は、被験者および用いられる特定の投与経路に応じて変更す
ることができる。投与量は、１日当たり０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ、より好まし
くは１〜１０，０００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。本組成物の好ましい用量は、好まし
くは少なくとも２μｇ／ｍｌである。単に例として、例えば、約１μｇ〜約３００μｇの
全用量の範囲が、ヒト用途で用いることができる。この用量は、本組成物に基づき、定期
的な間隔で運搬することができる。例えば、少なくとも２回の別々の機会において、約４
週間の間隔をあけることが好ましい。その他の化合物を毎日投与してもよい。本発明の医
薬組成物はまた、多種多様なその他のよく特徴付けられたプロトコールに従って被験者に
投与することもできる。例えば、特定の現在容認された免疫化の処方計画は、以下のもの
を含んでよい：（ｉ）投与時間は、選択された日程に第１回の用量；第１回の用量から１
ヶ月後に第２回の用量；および、それに続く日程、例えば第２回の用量から５ヶ月後に第
三の用量、である。製品情報、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
，Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ（１９９０），ａｔ  １４４２−４３を参照（例
えば肝炎Ｂワクチン型プロトコール）；（ｉｉ）例えば他のワクチンに関して、子供の推
奨投与は、選択された日程に第１回の用量（６週齢またはそれ以上）；第１回の用量から
４〜８週間後に第２回の用量；第２回の用量から４〜８週間後に第三の用量；第三の用量
から６〜１２ヶ月後に第４回の用量；４〜６歳で第５回の用量；および、最後の用量から
１０年ごとにさらなる追加免疫、である。製品情報、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ（１９９０）、ａｔ  ８７
９（例えばジフテリア、破傷風および百日咳型ワクチンプロトコール）を参照。特定の組
成物の複数の用量を運搬するのに望ましい時間間隔は、たんに慣例的な実験法を実施でき
る当業界の通常のスキルを有するものにより、決定することができる。
【００５６】
本発明の新規な融合タンパク質はまた、それ自体で（そのものの（ｎｅａｔ））、また
は、製薬上許容できる塩の形態で投与することができる。医薬で用いる場合、該塩は、製
薬上許容できるものであるべきだが、製薬上許容できない塩も製薬上許容できるその塩を
調製するのに都合よく用いることができ、本発明の範囲から排除されない。このような製
薬上許容できる塩としては、これらに限定されないが、以下の酸から調製される塩が挙げ
られる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−
トルエン−スルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク
酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、製薬上許容できる
塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することができ、例えばカルボン酸
基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩である。従って、本発明はまた、医薬的な
使用のための医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、１またはそれ以上の製薬上許容でき
るその担体、および、必要に応じてその他のいかなる治療成分と共に、本発明の核酸およ
び／またはポリペプチドを含む。
【００５７】
該組成物としては、全て本発明の材料を用いる投与経路として用いることが可能な、口
、直腸、膣内、局所的、鼻、眼、または、非経口投与に適切な組成物が挙げられる。その
他の適切な投与経路としては、脊髄液に直接のクモ膜下投与（ＣＳＰ）、動脈表面への直
接注入、および、器官の標的領域へ直接の実質内注入が挙げられる。非経口投与に適切な
組成物が好ましい。「非経口の」という用語は、皮下注入、静脈内、筋肉内、胸骨内注入
または点滴技術を含む。筋肉内投与が好ましい。
【００５８】
該組成物は、都合よく単位供与量形態で存在させることができ、薬学分野で周知の方法
のいずれかによって調製することができる。一般的に、方法は、本発明の活性成分を１ま
たはそれ以上の補助的な成分で構成される担体と結合させる工程を含む。
【００５９】
経口投与に適切な本発明の組成物は、カプセル、カシェ剤、錠剤またはロゼンジのよう
な個別のユニットとして提供でき、それぞれ予め決められた量の本発明の核酸および／ま
たはポリペプチドを、リポソーム中に含むか、または、シロップ、エリキシル、または乳
濁液のような水性の水剤または非水性の液体中の懸濁液として含む。
【００６０】
非経口投与に適切な好ましい組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張な本発明
の分子の滅菌水性製剤を都合よく含む。この水性調製は、既知の方法に従って、適切な分
散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて配合することができる。滅菌注射用製剤はまた
、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であ
り得る（例えば１，３−ブタンジオール溶液）。使用され得る許容できる賦形剤および溶
媒としては、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌
した不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として慣例的に用いられる。この目的において、合
成モノまたはジグリセリドなどの無刺激の不揮発性油のいずれかを用いることができる。
加えて、注射可能な製剤において、オレイン酸のような脂肪酸の使用が見出されている。
【００６１】
さらに改良するために、本発明により提供されるような細胞媒介応答、本発明のヌクレ
オチド配列によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を発生させる可能性が、受容
体結合に関連する可能性のある望ましいアミノ酸配列の部分を同定するために分析され得
る。例えば、ポリペプチド配列は、このような部位を同定するために、コンピューター分
析にかけることができる。
【００６２】
本発明の分子と形成される複合体は、ＣＭＩ分析（以下で説明する）のような適切な分
析、および、その他の通常のタイプの免疫分析により、検出することができる。
本発明は、インビトロで細胞性免疫反応を測定するための分析を提供する。ＣＭＩ応答
を検出する現在利用可能な実験分析は、特に様々な臨床条件における大規模なワクチン効
率試験に適用する場合に、深刻な短所がある。これは、利用可能な器具と技術的サポート
が最小限であるためである。上述したように、ＨＴＶ−１感染の制御においてＣＴＬが重
要な役割を有するという確信において、多くのＨＩＶ−１ワクチン候補が、Ｔ細胞応答を
刺激し、同様に抗体を中和するように設計される（１〜６）。
【００６３】
本発明のＴ細胞応答を測定する方法は、全てのＴ細胞依存性ワクチンまたは免疫療法の
開発において、顕著な効果を有する。この方策は、病気の予防および制御においてＣＭＩ
応答が重要な役割を有するような他の研究分野に適用可能である。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析における新規な融合ポリペ
プチドの使用を提供する。Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の主な利点は、大勢のヒトにおいて多数の
ＣＴＬ応答が効果的かつ効率的に評価できる点である（例えば、Ｌａｌｖａｎｉ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−６５（１９９７）を参照）。Ｅｌｉｓｐ
ｏｔ分析は、いかなる標準的な細胞、例えば凍結保存されたＰＢＭＣ、同様にＣＤ８＋Ｃ
ＴＬ細胞が使用可能である。例えば、ＨＩＶ−１陽性個体からのＣＤ８＋ＣＴＬクローン
である。
【００６５】
他の好ましい実施形態は、フローに基づく細胞内サイトカイン分析における新規な融合
ポリペプチドのの使用を提供する。フローサイトメトリーに基づく分析は、インビトロで
の抗原特異的Ｔ細胞を刺激した後のサイトカイン細胞内の集積を検出する。ＣＴＬは、抗
原で刺激され、ブレフェルジンＡ（これは、タンパク質輸送し、サイトカインのような新
たに合成されたタンパク質を細胞内に集積させる）とインキュベートする。表面マーカー
（ＣＤ８，ＣＤ３）およびＩＦＮ−γおよびＣＤ６９の細胞内の染色により、特徴付けら
れていないＭＨＣバックグラウンドに照らした、抗原性のエピトープに対して特異的な細
胞群の検出および定量が可能になる。
【００６６】
本発明の新規な融合ポリペプチドを用いたＣＭＩ分析を、多様なウイルス性抗原、細菌
の抗原、および腫瘍抗原に対する細胞性免疫反応を評価するのに用いることができる。該
分析を、ワクチン効率を評価すること、または、感染性病原体による感染の像（ｓｔａｔ
ｕｅｓ）を阻止することのいずれかにおいて用いることができる。
【００６７】
本発明の新規な融合ポリペプチドを用いたＣＭＩ分析はまた、ガン抗原を検出するため
の初期診断キットとして用いることができる。
本発明はまた、ＣＭＩ応答を検出するためのキットを提供する。１つの好ましいキット
は、これらチューブ、ウェル等の中に新規な融合タンパク質を含む。該キットは、好まし
くは、インビトロでＣＭＩ応答を検出するためのウイルスまたは腫瘍含有試薬を含む。好
ましくは、該キットは、血液のような生物学的な検体を採取するための装置を含む。好ま
しい実施形態において、該キットは、ＣＭＩ応答を検出するための使用説明書を含む。好
ましくは、該キットは、新規な融合タンパク質を凍結乾燥形態でを含む。
【００６８】
好ましいキットは新規な融合タンパク質を含み、該タンパク質は、凍結乾燥され、血液
回収に用いられたチューブの内部にコーティングされる。それにより、血液を個体から直
接チューブに引き込み、数時間（例えば４時間）インキュベートし、続いて固定すること
ができる。このような固定化サンプルは、長時間（例えば２週間）のＣＭＩ分析で使用し
ても安定である。該キットは、例えば一般的に遠隔地で行われるワクチン効率試験の際に
、現地でサンプルを回収するのに特に有用である。同様に、他の好ましい実施形態は、少
量の生物学的な検体の添加が可能なディッシュ、ウェル、またはチューブのようないずれ
かの表面にコーティングされた、凍結乾燥されたタンパク質を含む。好ましい生物学的な
検体としては、血液、尿、痰、便、脳脊髄液の上清、および細胞サンプルが挙げられる。
【００６９】
特定の実施例において、上述のしたようなＬＦｎのカルボキシ部分のみを含むＬＦｎ融
合タンパク質は、ＰＡ非存在下でＣＴＬ標的細胞を、ＭＨＣ−Ｉ制限した方法で感作させ
ることができる。この、外因性タンパク質抗原をＭＨＣ−Ｉ経路に提示させる新規な方法
において、抗原のサイトゾルへの運搬は、生きたウイルスベクターまたは細菌ベクターを
頼ることなく、細胞内の抗原プロセシングに関連する機能的輸送に依存する。これらＬＦ
ｎ断片は、サイトゾルからＭＨＣ−Ｉ経路に入る新しいタンパク質クラスの一例である。
例えば、ＬＦｎがＰＡ非存在下でＨＩＶ−１抗原をサイトゾルに運搬することができると
いう事実は、炭疽の致死性の毒がどのように働くかという現在の仮説に反する（３２）。
通常のケースにおいて、ＬＦ（炭疽致死因子）は、その毒作用を働かせるために、ＰＡに
依存し、場合によってはＬＦの毒性ドメインは細胞の侵入を防ぐ未知の機能を有する可能
性がある。
【００７０】
加えて、ＬＦｎ−ＨＩＶのような融合タンパク質は、ワクチン試験においてＴ細胞応答
を検出する方法を洗練し、簡便化するためのツールとして用いることができる。この方法
はまた、ウイルス性肝炎、ＴＢ、およびマラリアのような、他の細胞内のウイルスの病気
または細菌の病気の研究に有用でもある。本発明は、現在のＣＭＩ分析における生きた組
換えワクシニアウイルスを用いる必要性を回避することができる。本発明はまた、高価な
上に、ＨＬＡ−Ｉ多様性を有する異なる個体群のそれらの理論上の範囲が未だ証明されて
いないオーバーラップする合成ペプチドに対して、いくつかの利点を有する。新規な抗原
の運搬は、現場使用に広く適用可能な簡易化したＣＭＩ分析を提供する。その上、これら
ＬＦｎ融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで容易に生産され、比較的簡単な方法で精製され
、さらに安定である。
【００７１】
本発明で提供される全ての新規な融合ポリペプチド、およびそれをコードするＤＮＡ配
列は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの防御抗原またはその断片を実質的に含ないので、宿主へ
の故意でないダメージの危険なく、多種多様な用途で安全に用いることができる。従って
、本発明の新規な融合ポリペプチドは、多様な標的抗原への細胞性応答を発生させる組成
物および方法において特に有利である。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明を制限することはいかなる
方法によっても意図されない。
実施例１
材料および方法
ＬＦｎ−ＨＩＶ融合タンパク質
ＨＩＶ−ＨＸＢからのｅｎｖ  ｇｐ１２０、ｇａｇ  ｐ２４をコードするＤＮＡ断片を
ＰＣＲで増幅し、ＬＦｎ発現プラスミドｐＥＴ１５ｂＬＦｎにクローニングし、ＬＦｎと
ＨＩＶコーディング配列との間のインフレーム融合を検証するために配列解析する。Ｎｅ
ｆコーディング配列をＨＩＶ−ＥＬＬから増幅した。ＬＦｎのタンパク質発現ベクターお
よびその融合誘導体は、ｐＥＴ１５ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）である。このベクター系の主要な特徴は、誘導性Ｔ７プロモーター、タンパク質精製
のための内部のＨｉｓ−Ｔａｇ、および複数のクローニング部位が挙げられる。組換えＬ
Ｆｎは、そのＮ末端に６個のタンデムヒスチジン残基を有する細胞内の可溶性タンパク質
としてＥ．ｃｏｌｉで発現される（１４）。１０リットルのＢｉｏｆｌｏｗ  ２０００  
ｂｅｎｃｈ  ｔｏｐ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ，ＮＪ）で細菌を培養した。Ｈｉｓ標識タンパク質を、市販のキットを用いて
製造者プロトコールに従って精製した（Ｎｏｖａｇｅｎ）。ＬＦｎの断片は、ＬＦｎコー
ディング領域を既知の技術により改変することにより作製できる。
【００７３】
試薬
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のペプチドシンセサイザー（モデル４３０Ａ
）で合成ペプチドを合成した。用いられた組換えワクシニアウイルスは、コントロールワ
クシニアベクターとしてＮＹＣＨを含む、ｖＡｂＴ１４１（Ｇａｇ）、ｖＡｂＴ２９９（
Ｅｎｖ）、およびＮｅｆ（１５）であった。ブレフェルジンＡ、サイトカラシンＢおよび
クロロキン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、細胞培養物に２時間加え、２回
洗浄した後、細胞に添加し返した。フロー分析用の抗体をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から得た。
【００７４】
フローに基づく細胞内のサイトカイン染色
凍結保存されたＰＢＭＣを、ＬＦＮ−ＨＩＶ（３０μｇ／ｍｌ）、組換えワクシニアベ
クター（ＭＯＩ３〜５）またはペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で、５％ＣＯ
２で、一晩インキュベートした。自己由来Ｂ−ＬＣＬを、最適なペプチド（１０μｇ／ｍ
ｌ）、ＬＦｎ−ＨＩＶ（１０μｇ／ｍｌ）または組換えワクシニアウイルス（ＭＯＩ３〜
５）と共に、一晩インキュベートし、２回洗浄し、副刺激の抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９
ｄ（１μｇ／ｍｌ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の存
在下でＥ：Ｔ比が１０：１でエフェクター細胞に加えた。その後、ブレフェルジンＡ（１
０μｌのＩｍｇ／ｍｌ）を加え、細胞培養物を３７℃で６時間インキュベートし、アイソ
タイプコントロール（ＡＰＣ，ＰＥ，ＰｅｒＣＰに対してはＩｇＧＩ、および、ＦＩＴＣ
に対してはＩｇＧ２ｂ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ＣＤ３モノクローナル
抗体（Ｍａｂ）、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＤＳ  Ｍａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）の飽和溶液で染色した。暗所で４℃で２０分間インキュベートした後、
細胞をＦＡＣＳ洗剤で２回洗浄した。１００μｌの試薬Ａ（Ｆｉｘ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍ  
ｋｉｔ，Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）を加え、暗所で室
温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ洗剤で２回洗浄した。次に
、１００μｌの試薬Ｂ（Ｆｉｘ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍ  ｋｉｔ）を加え、細胞をＲＴで５分
間インキュベートした。ＦＩＴＣ−ＩＦＮガンマおよびペリディニンクロロフィルタンパ
ク質（ＰｅｒＣＰ）共役ＣＤ６９Ｍａｂ（ＣＤ６９ｐｅｒＣＰ）抗体を加え、暗所で４℃
でインキュベートした後、その細胞をＦＡＣＳ洗剤で２回洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ社製のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅ
ｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【００７５】
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
とＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた４色
染色でサンプルを分析した。用いられたネガティブおよびポジティブコントロールは、刺
激していない細胞、同様に、それぞれマイトジェンフェマトヘマグルチニン（ｐｈｅｍａ
ｔｏｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）ＰＨＡ（０．２５μｇ／ｍｌ，Ｍｕｒｅｘ  Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ）で刺激した細胞であった。
【００７６】
細胞系および培養条件
自己由来エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系、同様
にＴ１およびＴ２（ＨＬＡ−Ｂ６０）細胞系を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた。標
的細胞を適切なインデックスペプチドまたはＬＦｎ−ＨＩＶ構築物でパルスするか、また
は、一晩組換えワクシニアウイルスに感染させた。ＡＣ１３（ＨＬＡ  Ｂ１４制限ｐ２４
［ＤＲＦＹＫＴＬＲＡ］）およびＫＭ（ＨＬＶ  Ｂ６０制限Ｎｅｆ［ＫＥＫＧＧＬＥＧＬ
］）は、ＧａｇおよびＮｅｆ特異的クローン（それぞれ）、および、ＡＣ２（ＨＬＡ  Ｂ
４４制限ｇｐ１２０［ＡＥＮＬＷＶＴＶＹ］）である。全て、ＨＩＶ感染個体（該固体の
ＣＴＬ応答はよく特徴付けられている）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏ
ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）から得られ、および、Ｅｎｖ特異クローン（ＳＰ５１１）は血
清陽性のウガンダ人から生成された（１６）。Ｅｌｉｓｐｏｔ研究で用いられたＰＭＢＣ
は、セネガルおよびウガンダからのＨＴＶ−１感染個体であった（１５，１６）。ＬＦｎ
−ＨＩＶのＭＨＣクラスＩ制限提示におけるブレフェルジンＡ、サイトカラシンＢまたは
クロロキンの効果を調べるために：，ＡＰＣをタンパク質構築物で標識し、ＲＰＭＩ１６
４０ｍ１０％ＦＣＳで培養し、各試薬と共に１時間共培養し、続いて洗浄し、標準的なク
ロム放出分析で試験した。
【００７７】
Ｅｌｉｓｐｏｔ
凍結保存されたＰＢＭＣでＥｌｉｓｐｏｔ分析を行った。９６−ウェルニトロセルロー
スプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ
，ＭＡ）を、０．５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体１−Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｔ
ｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）で４℃で一晩プレコーティングした。次にそのプレート
をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で６回洗浄し、ＰＢＭＣを、それぞれ二連のウェルに加え
、５０，０００細胞／ウェルおよび２５，０００細胞／ウェルにした。そのプレートを、
５％ＣＯ２で、３７℃で一晩インキュベートし、続いてビオチン化モノクローナル抗体の
抗ＩＦＮ−Ｍａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を０．５ｍｇ／ｍｌで加え（１００分間）、続いて
ストレプトアビジン−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を室温で加えた（１時間）。そのプレー
トをＰＢＳで３回洗浄し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩およびニト
ロブルー（Ｓｉｇｍａ）を加えて反応を進行させた。１５分後にＴａｐ  ｗａｔｅｒを加
えて反応を止めた。個々のサイトカイン生産細胞が黒いスポットとして検出され、黒いス
ポットは可視化され、ＳＦＣ／ウェル（スポット形成コロニー／ウェル）として定量され
た。ＣＴＬ頻度（ＣＴＬｐ）を、コントロールウェルから差し引きされ、４つのウェルを
平均したスポット数から計算した。最終的なＣＴＬｐを１０６細胞あたりの平均頻度とし
て報告した。ＳＦＣがコントロールの少なくとも２倍であれば、応答を陽性とみなした。
バックグラウンドＳＦＣは、平均して１５／ウェル未満であった。
【００７８】
クロム放出分析：
ＣＤ８＋ＣＴＬクローンを、組換えＩＬ−２の存在下で、抗ＣＤＳモノクローナル抗体
（１２Ｆ６）で刺激し、７日以内に活性を試験した。自己由来Ｂ−ＬＣＬまたはＨＬＡ適
合ＡＰＣを含む標的細胞を、ＨＴＶ−１遺伝子産物を発現する組換えワクシニアウイルス
（感染多重度は３〜５）またはＬＦｎタンパク質（５〜３０μｇ／ｍｌ）で一晩感染させ
、放射性クロム（５１Ｃｒ）で標識した。二連のウェルで行われた全ての分析に関して、
最終容量２００μｌ中、エフェクター：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）は１０：１であった。４
時間後に上清液を回収し、特異的な溶解のパーセントを、式：１００×［（実験での放出
−自発的放出）／（最大放出−自発的な放出）］により決定した。ＨＩＶ−特異的ＣＴＬ
活性を、バックグラウンド／コントロールを超えて１０％と定義した。全ての分析に関し
て、自発的な放出は最大放出の＜３０％であった。
【００７９】
ＬＦｎ−ＨＩＶ介在ＨＴＶ−ｌ抗原侵入およびＰＡなしのプロセシング：
ＬＦｎ−ＨＩＶが細胞表面でＭＨＣ−Ｉ分子と結合するための能力を評価するために、
リンパ芽球様Ｂ細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）をＰＡの存在または非存在下でＬＦｎ−ＨＩＶで感
作し、いくつかのよく特徴付けられたＨＩＶ−特異的ＣＴＬクローンを用いて標準的なク
ロム放出分析で試験した（図３）。我々は、ＣＴＬが、ＰＡの存在または非存在下で同等
にＬＦｎ−ＨＩＶで感作した標的細胞を認識することを見出した。溶解レベルは、用量依
存性であり、Ｂ−ＬＣＬを同じＨＴＶ抗原を発現する組換えワクシニアウイルスで感染さ
せた場合のポジティブコントロールに匹敵するレベルを達成した。ＨＴＶ−特異的ＣＴＬ
活性は、標的がＬＦｎ−ＨＩＶとより長い時間（１時間に対して８時間）インキュベーシ
ョンされる場合にのみ明らかであり（データは示さず）、これは、表面抗原の出現におけ
る遅れと、細胞内プロセシングの必要性とを示す。
【００８０】
ＬＦｎ−ＨＩＶは、典型的なＭＨＣ−Ｉ経路において提示される
次に我々は、これら構築物のＣＴＬによる認識がＨＬＡ−Ｉ制限であることを実証する
ことによって、ＬＦｎ−ＨＩＶが典型的なＭＨＣ−Ｉ経路により提示されることを確認し
た（図４）。２つのＮｅｆ−（ＫＭ）およびＧａｇ特異的（ＡＣ１３）クローン（それぞ
れＨＬＡ  Ｂ６０制限およびＢ１４制限）を、ＬＦｎＮｅｆまたはＬＦｎ−ｐ２４を提示
するＨＬＡ適合および非適合標的で試験した。ＨＬＡ−適合標的のみが顕著な溶解を示し
、ＬＦｎ−ＨＩＶのＭＨＣ−Ｉ提示が確かめられた。
【００８１】
我々は、ＬＦｎ−ＨＩＶの摂取およびプロセシングの可能性のあるメカニズムをさらに
試験した。表面でのＬＦｎ−ＨＴＶの内部移行が活発に処理されるかどうかを調べるため
に、我々は、Ｂ−ＬＣＬを、１００μＭのサイトカラシンＢ（１７，１８）、食細胞活動
阻害剤と共にプレインキュベーションし、その後、ＬＦｎ−ＨＩＶ抗原を加えた。ＣＴＬ
認識はサイトカラシンＢの存在下で失われたことから、エンドサイトーシス介在内部移行
による処理が示された。
【００８２】
外因性ＬＦｎ融合タンパク質が導入され、その後サイトゾルで処理される場合、ＴＡＰ
タンパク質（抗原プロセシングに関連する輸送体）は、ＭＨＣ−Ｉに結合させるためにペ
プチドをＥＲ内腔に輸送する必要性がある（１９〜２１）。エンドサイトーシス後に抗原
によるプロセシングが必要かどうかを評価するために、我々は、Ｂ６０発現細胞系Ｔ１お
よびＴ２を感作し、ＣＴＬにより溶解させるＬＦｎ−ＨＩＶ融合タンパク質の能力を試験
した。Ｔ２細胞（２２〜２４）は、ＭＨＣ−Ｉに結合させるためにペプチドをプロテオソ
ームからＥＲ内腔へ輸送するＴＡＰ機能を欠くＴ１細胞誘導体である（１９，２０）。Ｔ
２細胞での認識は失われ（図４Ｂ）、これは、プロセシング後にエピトープを輸送する必
要性を示す。同じクローンによるこのＴＡＰ欠失標的の認識は、細胞内プロセシングの必
要性を通過して細胞が最適なエピトープペプチドで表面が「空の」ＭＨＣ−Ｉ分子に直接
パルスされた場合、維持される。
【００８３】
外因性タンパク質のＭＨＣクラスＩ経路への侵入メカニズムをさらに検証するために、
標的細胞をブレフェルジンＡ（ＥＲおよびゴルジ体からのタンパク質のエキソサイトーシ
スを阻害し、新しく構築されたペプチド−ＭＨＣ複合体が細胞表面に達することを防ぐ）
で処理した（２５）。標的細胞をＬＦｎ−ＨＩＶで提示させる前のブレフェルジンＡ添加
は、効果的にＣＴＬによる認識をブロックする（図５）。この発見は、ＨＬＡ制限および
ＴＡＰ必要性に関する上記の実証と共に、ＭＨＣクラスＩ経路でＬＦｎ−ＨＩＶが処理さ
れ、Ｂ−ＬＣＬにより提示されることが確かめられた。
【００８４】
ＬＦｎ−ＨＩＶのプロセシングはクロロキン非感受性である
ＭＨＣ−Ｉ分子上での多くの外因性の抗原の提示は、細胞内区画でのタンパク質分解を
伴い（２６〜２８）、その後、ペプチドはサイトゾルに接近し、そこでＭＨＣクラスＩ経
路に侵入する。ＬＦｎ介在抗原提示が酸性ベシクルでのタンパク質分解を必要とするかど
うかを調べるために、我々は、ＬＦｎ−ＨＩＶへ晒す際に、Ｂ−ＬＣＬをクロロキンで処
理した（図５）。クロロキンは、エンドソーム区画およびリソソーム区画でｐＨを高め、
それにより、活性のために酸性環境が必要なカテプシンによるタンパク質加水分解を抑制
することが知られている（２９，３０）。我々の発見によれば、漏れやすい性質を有する
ファゴソームが、ＬＦｎ−ＨＩＶのサイトゾルへの侵入に必要ないというこが示される。
【００８５】
標的がその表面で最適な８−ｍｅｒエピトープでパルスされた場合、サイトカラシンＢ
、ブレフェルジンＡまたはクロロキンのいずれかを添加しても標的細胞の認識および溶解
に影響を及ぼさなかったが、これは、これら試薬がＣＴＬ機能にも標的の生存能力にも影
響を及ぼさなかったことを示す（図５）。
【００８６】
様々なＣＭＩ分析におけるＬＦｎ−ＨＩＶと組換えワクシニアウイルスとの比較
ＭＨＣ−Ｉ分子を用いて細胞表面でＣＴＬエピトープを提示するＬＦｎ−ＨＩＶの能力
を実証したことから、我々は、酵素結合スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）分析やフローに基づ
く細胞内インターフェロン分析などの様々なＣＭＩ分析におけるＬＦｎ融合タンパク質の
適応性の試験を続行した。これら分析は、より簡単でより迅速なＴ細胞応答の推測を提供
し、理論上より大規模な臨床試験に（特にワクチン研究に関する）適している。Ｅｌｉｓ
ｐｏｔ分析の主な利点は、ＨＩＶ−特異的ＣＴＬ応答が効果的に評価でき、大勢のヒトで
も効率的に評価できることである（３１）。目下、ＨＩＶ抗原を発現する組換えワクシニ
アウイルスまたはオーバーラッピング合成ペプチドなどの様々な抗原刺激がこの分析で用
いられている。凍結保存されたＰＢＭＣ、同様にいくつかのＨＴＶ−１陽性個体からのＣ
Ｄ８＋ＣＴＬクローンを、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析で、ＬＦｎ−ｇｐ１２０に対してＬＦｎ−
ｐ２４、ＬＦｎＮｅｆを用いて、同じ抗原を発現する組換えワクシニアウイルスと並行し
て試験した。比較のスポット形成コロニーがＬＦｎ−ＨＩＶに関して観察され、いくつか
の例において、明らかにバックグラウンドスポットが組換えワクシニアウイルスの場合よ
り少なかった（図６）。
【００８７】
インビトロで抗原特異的Ｔ細胞を刺激した後に細胞内のサイトカイン集積が、フローサ
イトメトリーに基づく分析で検出される。ＣＴＬを抗原で刺激し、でブレフェルジンＡ（
タンパク質輸送を阻害し、新しく合成されたサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を細胞内
に集積させる）でインキュベートする。表面マーカー（ＣＤ８，ＣＤ３）およびＩＦＮ−
γおよびＣＤ６９の細胞内の染色により、特徴付けられていないＨＬＡ−Ｉバックグラウ
ンドに対して抗原性のエピトープに特異的なＴ細胞群を検出することができる。Ｎｅｆ特
異的クローン（ＫＭ）をＬＦｎＮｅｆで刺激し、その後、細胞内でのインターフェロン生
産をフロー分析により評価した（図７Ａ）。Ｎｅｆ特異的応答がＬＦｎＮｅｆを用いて検
出され、同様にＣＤ８＋の細胞群でＮｅｆを発現する組換えワクシニアウイルスが検出さ
れた。既知のｇｐ１２０エピトープを有する個体（ＡＣ２）からの、新しく単離した刺激
していないＰＢＭＣを、ＬＦｎ−Ｅｎｖで、同様にＥｎｖを発現する組換えワクシニアウ
イルス（ｒＶＶ−Ｅｎｖ）で感作した。ＣＤ８＋細胞群における細胞内のＩＦＮ−γのパ
ーセンテージは、ＬＦｎ−Ｅｎｖに晒された細胞において、ｒＶＶ−Ｅｎｖと共にインキ
ュベートした細胞より高かった（図７Ｂ）。
【００８８】
実施例２
ＰＡ非存在下のＬＰｎ融合タンパク質はまた、ＭＨＣが制限された方法で、ＣＴＬ標的
細胞を感作することができる。このＬＦｎ融合タンパク質のサイトゾル運搬は、抗原提示
細胞内部の細胞内の抗原プロセシングに関連する機能的輸送に依存する（Ｃａｏ  Ｈ，Ａ
ｇｒａｗａｌ  Ｄ，Ｋｕｓｈｎｅｒ  Ｎ，Ｔｏｕｚｊｉａｎ  Ｎ，Ｅｓｓｅｘ  Ｍ、およ
び、Ｌｕ  Ｙ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１８５：２４４−２５１（２００２））。目
下我々は、ＬＦｎに融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がＰＡ非存在下で細胞に侵入
できることを実証し、我々はさらに、この、外因性ＧＦＰのＰＡ非依存性ＬＦｎ運搬は、
細胞性プロテオソームに関連すると考えられることを示し、これはこれまでの観察と一致
する。
【００８９】
ＬＦｎ−ＧＦＰおよびＧＦＰの構築および精製
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＧＦＰオープンリーディングフレームを
ＬＦｎ発現ベクターに挿入することによって、ＬＦｎ−ＧＦＰ融合タンパク質を構築した
（過去の研究で説明される）（Ｌｕ，Ｙ．，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８０２７−３２（２０００））。
【００９０】
融合タンパク質は、細菌の細胞抽出物中に可溶性であり、一工程のアフィニティークロ
マトグラフィーで精製できる。精製した融合タンパク質は、約５５ｋＤの分子量であり、
その溶液は明るい緑色である（データは示さず）。実験に適切なコントロールを得るため
に、発現、精製、ならびにＧＦＰおよびＬＦｎ−ＧＦＰの使用における唯一の違いがＧＦ
ＰでのＬＦｎ配列の欠失であるようにＧＦＰ単独を同じ細菌発現ベクター（ｐＥＴ１５ｂ
）に構築した。
【００９１】
ＬＦｎ−ＧＦＰはＣＨＯ細胞に侵入するが、一方でＧＦＰは侵入できない
ＣＨＯ細胞をコラーゲン処理したチャンバースライドで８０％の群集になるように培養
し、続いて精製ＬＦｎ−ＧＦＰと共に１または２時間インキュベートし、続いてＰＢＳ、
および、プロテアーゼを添加したＰＢＳでよく洗浄し、膜結合タンパク質を除去した。次
に、細胞を抗トランスフェリン抗体で染色し、パラホルムアルデヒドで固定した。そのス
ライドを、共焦点顕微鏡法でそれぞれ緑色（ＧＦＰ）および赤色（抗トランスフェリン）
に関して試験した。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメ
ージにより、同じ細胞の赤色のイメージと共に示される。その結果として、黄色のスポッ
トは、ＧＦＰがトランスフェリンタンパク質と同じスポットにあることを示し、従って細
胞内部のＧＦＰの位置の参照を提供することを示す。図１０で示したように、相当数の緑
色のスポットが、ＬＦｎ−ＧＦＰで標的化された細胞中で１時間で可視化され、これはＬ
Ｐｎ−ＧＦＰが実際に細胞に侵入できることを示す。まったく同じ実験条件で、ＧＦＰ処
理細胞において、緑色のスポットはほとんど示されなかった（図１１）。
【００９２】
標的細胞内部のＬＦｎ−ＧＦＰの位置
図１０〜１１で上述したのと同一の実験方法を用いて、我々は、抗トランスフェリン抗
体を、それぞれ抗リソソーム抗体（図１２）、抗エンドソーム抗体（図１３）、抗ゴルジ
抗体（図１４）、および抗プロテオソーム抗体（図１５）で置き換えた。これら様々なイ
メージを比較すると、最も黄色のスポットを含む過剰に露出したイメージは、図１５で示
されるイメージであり、それにおいて、緑色のスポットは、細胞性プロテオソームを示す
赤色のスポットと顕著にオーバーラップした細胞内のLFn-GFPを示す。
【００９３】
ＰＡの存在はＬＦｎ−ＧＦＰの細胞摂取を増強しない
我々は、さらに、ＰＡの存在が、図１０〜１５に関して用いられた実験条件でＬＦｎ−
ＧＦＰ摂取を増強するかどうかを試験した。図１６に示すように、ＰＡ添加は、ＰＡ非存
在下でのスポットの数と比較して、細胞内部の緑色のスポットの数を増加させなかった。
その上、ＰＡの存在は、黄色のスポットの量を減少させたようにみえる。明らかに、これ
らの条件下で、これら黄色のスポットはそれでもＰＡ非依存性のＬＦｎ−ＧＦＰ侵入を示
している。
【００９４】
実施例３
ＬＦｎのＮ末端の半分の欠失、およびＬＦｎ免疫化におけるミョウバンのアジュバント
効果
追加の動物免疫化データは、ＬＦｎのＮ末端の半分（ＰＡ結合ドメインを含む）は、抗
原運搬に否定的な影響を与えることなく欠失させることができることを示す。まったく意
外にも、我々は、ミョウバン添加により、ＬＦｎ融合タンパク質によるＣＴＬ誘導を顕著
に増強させ得ることを見出した。
【００９５】
過去２年間、多く試みが不成功であったが、我々は、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスにおい
て、ＰＡ存在下でのＬＦｎ−ｐ２４がＣＴＬを刺激できることを示すことができなかった
。以前の研究は、ＬＦｎ−Ｖ３、ＬＦｎ−ＬＬＯ、およびＬＦｎ−ＯＶＡのようなＬＦｎ
融合タンパク質は、マウスで、特異的なＣＴＬを刺激することができることを示している
（Ｌｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８０
２７−３２（２０００）；Ｂａｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１２５３１−１２５３４（１９９６）；Ｂａｌｌａ
ｒｄ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６，６１５−６１９（１
９９８））。これら融合タンパク質は、わずか１２〜３３個のアミノ酸しか有さないが、
一方でＬＦｎ−ｐ２４は約２３０個のアミノ酸を有する。従って、挿入された抗原の大き
さは、相違を成し得る。我々は、免疫アジュバントの添加によりＬＦｎ−ｐ２４の免疫原
性を改善できるかどうかを試験することに決めた。我々が試験した試薬は、組換えＩＬ２
，Ｉｇ−ＩＬ２、ＣｐＧ、ミョウバンなどである。意外にも、ミョウバンが最良のアジュ
バント活性を示した。ＱＳ２１およびＰＣＰＰのような特定の実験アジュバントは細胞性
免疫反応を増強させるが、一方で、ミョウバンはＣＴＬ誘導を実際には阻害することが広
く信じられている（Ｓｃｈｉｅｍｂｅｃｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５２：１１１０−１１１９（１９９４）；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２９０：４８６（２０００）；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０−８７６（１９９８）；Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ
．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：７９−８７（１９９８））。
【００９６】
図１７において、ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つのグループ（各グループ中４匹）を、それ
ぞれ異なる抗原配合（１５μｇのＬＦｎ−ｐ２４＋４μｇのＰＡ、１５μｇのＬＦｎ−ｐ
２４＋４μｇのＰＡ＋ミョウバン、１５ＬＦｎ−ｐ２４単独＋ミョウバン）で腹腔内に免
疫した。免疫化後１週間で、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓の単核細胞を、ＣＴＬ源と
して用いた。脾臓培養物中のＣＴＬを、非免疫化動物のガンマ放射したペプチドパルスＢ
ＡＬＢ／ｃ脾細胞と培養することによりインビトロで活性化した。３７℃のＣＯ２インキ
ュベーターで６日培養した後、成熟ＣＴＬ（エフェクター細胞）を、５１Ｃｒ標識化Ｐ２
０ペプチドパルスＰ８１５細胞（ポジティブ標的）または５１Ｃｒ標識化媒体パルス細胞
（ネガティブ標的）のいずれかを溶解させるそれらの能力に関して試験した。示された溶
解の割合を、ネガティブ標的のバックグラウンド溶解から引算し、各グループの平均とし
て示した。
【００９７】
図１７で示すように、ミョウバン添加に関して、我々は、免疫化マウスで、ＬＦｎ−ｐ
２４が、ＰＡの存在または非存在下で特異的なＣＴＬを刺激できることを示すことができ
た。これら結果は、ＰＡの存在はインビボでの抗原運搬に必要でないことをさらに示す。
【００９８】
ＬＦｎのＮ末端の半分が欠失したＬＦｎ融合タンパク質はそれでも活性である
マウスで、ＬＦｎ−ｐ２４がＰＡ非存在下でＣＴＬを引き出すことができることを確か
めるために、我々は、ＰＡに結合するその能力を失わせるためにＬＦｎのＮ末端の半分（
１〜１４９）を欠失させた変異ＬＦｎ融合タンパク質（ＭＬＦｎ−ｐ２４）を構築した。
我々は、ＰＡ依存性の膜移動を試験するために特別に設計された実験方法を用いてこれを
確認した。簡単に言えば、トリプシンでニックを入れたＰＡをＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に４
℃で２時間インキュベートした。次にその細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、３５Ｓ標識ＬＦｎ−
ＮＧまたはＬＦｎ−ＥＮＶで４℃で２時間インキュベートした。その細胞をよく洗浄し、
ＭＥＳ／グルコナート緩衝液（ｐＨ４．８）に３７℃で２分間晒した。次にプロナーゼＥ
または緩衝液を加えて、吸収されていないＬＦｎ融合タンパク質を結合させた表面を消化
した。次に、その細胞を再び洗浄し、溶解し、計数した。ＰＡで移動したタンパク質の割
合を以下の式に従って計算した。割合＝１００×（ＰＡ存在下でのカウントおよびプロナ
ーゼ処理細胞−ＰＡ非存在下でのカウントおよびプロナーゼ処理細胞）／（ＰＡおよびｍ
ｏｃｋ処理細胞存在下でのカウント−ＰＡおよびｍｏｃｋ処理細胞非存在下でのカウント
）。この特定の分析において、ＰＡは、７２％もの膜結合型ＬＦｎを細胞に移動させ、一
方でＰＡにより移動したＭＬＦｎの量は検出されなかった。
【００９９】
続いて我々は、免疫化マウスで、ＬＦｎ−ｐ２４によるＣＴＬ誘導と、ＭＬＦｎ−ｐ２
４によるＣＴＬ誘導とを比較した。図１８において、ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つのグルー
プ（各グループ中４匹）を、それぞれ１５μｇのＬＦｎ−ｐ２４、１５μｇのＭＬＦｎ−
ｐ２４、および１５μｇのｐ２４で腹腔内に免疫した。脾臓組織中のＣＴＬを、免疫化の
後連続して試験した。
【０１００】
図１８で示すように、ＬＦｎ−ｐ２４とＭＬＦｎ−ｐ２４との双方が、たった１回の免
疫化の後で、顕著にＣＴＬ活性を刺激した。実際に、我々は、改善されたＭＬＦｎ−ｐ２
４によるＣＴＬ誘導をＬＦｎ−ｐ２４で誘導されたＣＴＬ誘導と比較して、繰り返して観
察した。
【０１０１】
この実験はまた、抗原（ｐ２４）からのＭＬＦｎ配列の欠失により有効なＣＴＬ誘導が
失われているため、ＬＦｎのＣ末端の半分（１５０〜２５３）が、細胞内の抗原運搬に実
際に関与することを示す。
【０１０２】
参考文献
【０１０３】
【表１】
2010042008.tif 000002
【０１０４】
【表２】
2010042008.tif 000003
【０１０５】
【表３】
2010042008.tif 000004
【０１０６】
【表４】
2010042008.tif 000005
【０１０７】
【表５】
2010042008.tif 000006
【０１０８】
【表６】
2010042008.tif 000007
［００１］本明細書に記載された全ての参考文献は、引用により本明細書に加入される
。
【図１】
2010042008.tif 000008
【図２】
2010042008.tif 000009
【図３Ａ】
2010042008.tif 000010
【図３Ｂ】
2010042008.tif 000011
【図４Ａ】
2010042008.tif 000012
【図４Ｂ】
2010042008.tif 000013
【図５Ａ】
2010042008.tif 000014
【図５Ｂ】
2010042008.tif 000015
【図６】
2010042008.tif 000016
【図７】
2010042008.tif 000017
【図８】
2010042008.tif 000018
【図９】
2010042008.tif 000019
【図１０ＡＢＣＤＥＦ】
2010042008.tif 000020
【図１０ＧＨＩＪＫＬ】
2010042008.tif 000021
【図１１ＡＢＣＤＥ】
2010042008.tif 000022
【図１１ＦＧＨＩ】
2010042008.tif 000023
【図１２ＡＢＣＤＥＦ】
2010042008.tif 000024
【図１２ＧＨＩＪＫＬ】
2010042008.tif 000025
【図１３ＡＢＣＤＥＦ】
2010042008.tif 000026
【図１３ＧＨＩＪＫＬ】
2010042008.tif 000027
【図１４ＡＢＣ】
2010042008.tif 000028
【図１４ＤＥＦ】
2010042008.tif 000029
【図１５ＡＢＣＤＥＦ】
2010042008.tif 000030
【図１５ＧＨＩＪＫＬ】
2010042008.tif 000031
【図１６ＡＢＣＤＥＦ】
2010042008.tif 000032
【図１６ＧＨＩＪＫＬ】
2010042008.tif 000033
【図１７】
2010042008.tif 000034
【図１８】
2010042008.tif 000035