(57)【要約】【課題】本発明は、カロテノイドを有効成分として含有する一重項酸素消去剤であって、その効果がさらに改善されたものを提供する。【解決手段】本発明の一重項酸素消去剤は、（Ａ）クロセチンと（Ｂ）キサントフィルとを有効成分として含有すると共に、当該（Ａ）及び（Ｂ）のモル比（Ａ）／（Ｂ）が０．４〜２０である。本発明の一重項酸素消去剤は、優れた一重項酸素消去能を有し、一重項酸素が関与する各種障害又は疾患の予防に利用し得る。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）下記（１）式で表されるクロセチンと（Ｂ）キサントフィルとを有効成分として含有する一重項酸素消去剤であって、当該（Ａ）及び（Ｂ）のモル比（Ａ）／（Ｂ）が０．４〜２０であることを特徴とする一重項酸素消去剤。
【化１】
2010285364.tif 000011
【請求項２】
前記キサントフィルが、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、カプサンチン、カプソルビン、ビキシン及びノルビキシンの群から選ばれる一種又は二種以上である請求項１に記載の一重項酸素消去剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一重項酸素消去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素の一種である一重項酸素（1O2）が老化や様々な疾患に関与することが注目されている。例えば、目や皮膚のように太陽光に直接曝される部位では一重項酸素が特に発生し易いため、このような部位で発生する一重項酸素が白内障や加齢黄斑変性、皮膚の老化などの原因になると考えられている。そこで、このような疾患や障害の予防を目的として、一重項酸素を消去する方法がいくつか提案されている。
【０００３】
例えば、コエンザイムＱ１０からなる一重項酸素消去剤（特許文献１参照）、焙煎植物繊維物質熱水抽出エキスの有機溶媒抽出物を有効成分として含有する一重項酸素消去剤（特許文献２参照）、Ｄ−システノール酸を有効成分として具備する一重項酸素産生抑制剤（特許文献３参照）などが提案されている。
【０００４】
一方、カロテノイドの一種でありクチナシの果実やサフランの雌しべなどに含まれるクロセチンなどが一重項酸素消去剤としての効果を発揮することが知られている（特許文献４参照）。しかし、このような一重項酸素消去剤は、その効果において必ずしも満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２１３６６０号公報
【特許文献２】特開２００５−３２５０３４号公報
【特許文献３】特開２００１−２８８０７８号公報
【特許文献４】特開平０５−３２００３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カロテノイドを有効成分として含有する一重項酸素消去剤であって、その効果がさらに改善されたものを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カロテノイドの一種であるクロセチンとルテインとを併用した場合に顕著な一重項酸素消去能が発揮されることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
［１］．（Ａ）下記（１）式で表されるクロセチンと（Ｂ）キサントフィルとを有効成分として含有する一重項酸素消去剤であって、当該（Ａ）及び（Ｂ）のモル比（Ａ）／（Ｂ）が０．４〜２０であることを特徴とする一重項酸素消去剤、
【０００８】
【化１】
2010285364.tif 000002
［２］．前記キサントフィルが、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、カプサンチン、カプソルビン、ビキシン及びノルビキシンの群から選ばれる一種又は二種以上である［１］に記載の一重項酸素消去剤、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一重項酸素消去剤は、優れた一重項酸素消去能を有する。
本発明の一重項酸素消去剤は、一重項酸素が関与する各種障害又は疾患の予防に利用し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で（Ａ）成分として用いられるクロセチンは、下記（２）式で表される化合物（分子量３２８．４０）である。
【００１１】
【化２】
2010285364.tif 000003
【００１２】
このクロセチンは、通常、カロテノイド系の黄色色素であるクロシン（クロセチンのジゲンチオビオースエステル）を加水分解することにより得られる。クロシンは、アカネ科クチナシ（Ｇａｒｄｅｎｉａ  ａｕｇｕｓｔａ  ＭＥＲＲＩＬ  ｖａｒ．  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  ＨＯＲＴ．，Ｇａｒｄｅｎｉａ  ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ  ＥＬＬＩＳ）の果実、サフランの柱頭の乾燥物などに含まれる。クロシンを得るための工業的原料としてはクチナシの果実が好ましく用いられる。
【００１３】
上記クチナシの果実からクロシンを抽出する方法に制限はなく、例えば、クチナシの乾燥果実を粉砕し、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノールなど） またはそれらの混合液を用いて抽出するなどの公知の方法が用いられる。抽出条件は、例えば水・アルコール混合液（１：１）を用いる場合、室温（約０〜３０℃）〜５０℃で約１〜１８時間が好ましく、約３０〜４０℃で約２〜４時間がより好ましい。乾燥果実の粉砕物からのクロシンの抽出率をより高めるため、抽出操作は通常複数回繰り返される。クロシンを含む抽出液は自体公知の方法により濃縮され、通常、濃縮液として冷蔵保存される。
【００１４】
クロシンの加水分解は、定法に従って行われてよく、通常、酸、アルカリまたは適当な加水分解酵素を用いて行われる。ここで酸としては、例えば塩酸、硫酸およびリン酸などが挙げられる。アルカリとしては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムなどが挙げられる。また加水分解酵素としては、β−グルコシダーゼなどが挙げられる。
【００１５】
工業的には、クロシンの加水分解は通常アルカリを用いて行われる。一例を示すと、前記クロシンを含む濃縮液に過剰量の水酸化ナトリウム水溶液を加え、好ましくは攪拌下、室温（約０〜３０℃）〜７０℃で約１〜２４時間、好ましくは約４０〜６０℃で約３〜５時間反応する。
【００１６】
アルカリによる加水分解終了後、反応液に塩酸、硫酸またはリン酸などの無機酸、もしくはクエン酸などの有機酸の水溶液を適量加え、液性をｐＨ約４．０以下、好ましくはｐＨ約１．０〜３．０にすることによりクロセチンの結晶を析出させる。これとは別に、反応液を塩酸、硫酸またはリン酸などの無機酸、もしくはクエン酸などの有機酸の水溶液に加えて、クロセチンの結晶を析出させてもよい。その後、クロセチンの結晶を含む混合液を固液分離することにより、クロセチンの結晶を含む懸濁液またはスラリーが得られる。
【００１７】
また、クロシンの加水分解が酸を用いて行われる場合、通常、加水分解と同時にクロセチンの結晶が析出するため、反応液はクロセチンを含む懸濁液として得られる。反応終了後、得られた懸濁液を固液分離することにより、クロセチンの結晶を含む懸濁液またはスラリーが得られる。
【００１８】
上記のようにして得られたクロセチンの結晶を含む懸濁液またはスラリーには、クロセチンの結晶と共に、酸、中和塩および原料由来の不純物などが混ざり合っているため、これらを除去する目的で、洗浄処理が行われる。該処理は、例えば、上記懸濁液またはスラリーを十分量の水、アルコールまたはそれらの混合液を用いて洗浄するなど、公知の方法にて行ってよい。洗浄処理は、所望する純度が得られるまで、通常複数回繰り返される。洗浄処理後、クロセチンの結晶を含む懸濁液またはスラリーを、例えば真空乾燥機などを用いて約５０℃を越えない温度で乾燥し、精製クロセチンを得る。精製クロセチンは、窒素ガスなど不活性ガスで置換された容器に密封され、保存されるのが好ましい。
【００１９】
本発明で用いられるクロセチンの含有量は、クロセチンを含む試料の色価から次式に基づいて算出される。
【００２０】
【数１】
2010285364.tif 000004
【００２１】
尚、上記色価は、以下の［色価測定方法］に基づき測定される。
【００２２】
［色価測定方法］
１）測定する吸光度が０．３〜０．７の範囲になるように、試料を精密に量り、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして正確に１００ｍｌとする。
２）その５ｍｌを正確に量り、Ｋｏｌｔｈｏｆｆ氏緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ−５０ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3，ｐＨ１０．０）を加えて５０ｍｌとする。
３）その５ｍｌを正確に量り、Ｋｏｌｔｈｏｆｆ氏緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えて５０ｍｌとする。
４）その５ｍｌを正確に量り、Ｋｏｌｔｈｏｆｆ氏緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えて５０ｍｌとし、試験溶液とする。
５）Ｋｏｌｔｈｏｆｆ氏緩衝液（ｐＨ１０．０）を対照とし、液層の長さ１ｃｍで４２０ｎｍ付近の極大吸収部における吸光度Ａを測定し、次式により色価を求める。
【００２３】
【数２】
2010285364.tif 000005
【００２４】
本発明の（Ａ）成分としては、クロセチンの薬理学的に許容しうる塩を用いても良い。そのような塩としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどの第１族元素の塩、マグネシウム、カルシウムなどの第２族元素の塩、ピリジン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミンなどの医薬的に許容される有機アミノ化合物の塩などが挙げられる。
【００２５】
本発明で（Ｂ）成分として用いられるキサントフィルとしては、例えばルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、カプサンチン、カプソルビン、ビキシン及びノルビキシンの群から選ばれる一種又は二種以上が好ましく、ルテインが特に好ましい。
【００２６】
キサントフィルは、本発明の目的に沿うものであれば化学合成したものでも良いし、天然物由来のものでも良い。化学合成したキサントフィルとしては、自体公知の方法により合成したものであれば特に限定されない。天然物由来のキサントフィルとしては、例えばキク科マリーゴールド（Tagetes erecta WILLD）の花を工業的原料とするルテインが挙げられる。
【００２７】
キサントフィルには、その水酸基に脂肪酸がエステル結合したエステル体のもの（例えば、ルテイン脂肪酸エステルなど）と、脂肪酸が結合していないフリー体のものが存在するが、本発明ではこれらのうちいずれも好ましく用いられる。該エステル体を構成する脂肪酸は、例えばパルミチン酸、ミリスチン酸、アラキドン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、リノレン酸、オレイン酸またはリノール酸などである。
【００２８】
本発明の（Ｂ）成分としてフリー体のルテイン（分子式Ｃ40Ｈ56Ｏ2、分子量５６８．８７）を用いる場合、その含有量は、フリー体のルテインを含む試料について下記方法を実施することにより測定することができる。
【００２９】
[フリー体のルテイン含有量測定方法]
試料約０．１ｇを正確に秤量し、エタノールに溶解し１００ｍｌとする。これを吸光度が０．３〜０．７になるようにエタノールで希釈し、この希釈液の４４５ｎｍ近辺の極大吸収での吸光度を分光光度計にて測定し、次式により含有量を計算する。
【００３０】
【数３】
2010285364.tif 000006
【００３１】
なお、上記式中「２５５０」は４４５ｎｍにおけるフリー体のルテインの吸光係数である。
【００３２】
本発明の（Ｂ）成分としてエステル体のルテイン（ルテイン脂肪酸エステル）を用いる場合、ルテインの含有量は、エステル体のルテインを含む試料について下記方法を実施することにより測定することができる。下記方法によれば、けん化処理によりエステル体のルテインが加水分解されてフリー体のルテインになるため、フリー体のルテインとしての含有量を測定できる。
【００３３】
[けん化処理によるフリー体のルテイン含有量測定方法]
試料約０．１ｇを正確に秤量して１００ｍＬ容量のメスフラスコに入れ、３０ｍＬのｎ−ヘキサン／アセトン／エタノール／トルエン混合液（１０：７：６：７）を加えて混合する。これに２ｍＬの４０％水酸化カリウム−メタノール溶液を加えて混合した後、メスフラスコを７０度のウォーターバスに静置し、２０分間加熱する。加熱後、ウォーターバスからメスフラスコを取り出して室温まで冷却し、暗所に１時間静置する。次いで３０ｍＬのｎ−ヘキサンを加えて混合し、さらに１０％硫酸ナトリウム溶液を加えて全量を１００ｍＬとする。得られた混合液を攪拌した後、暗所に１時間静置して、メスフラスコの内容物を上層（５０ｍＬ）と下層（５０ｍＬ）に分離させる。上層を吸光度が０．３〜０．７になるようにエタノールで希釈し、この希釈液の４３７〜４４５ｎｍ近辺の極大吸収での吸光度を分光光度計にて測定し、次式により含有量を計算する。
【００３４】
【数４】
2010285364.tif 000007
【００３５】
なお、上記式中「２５５０」はフリー体のルテインの吸光係数である。
【００３６】
本発明の一重項酸素消去剤は、上記（Ａ）及び（Ｂ）成分をそのまま、あるいは医薬品添加物、食品添加物および食品素材などを適宜配合し、常法に従い、例えば液剤（例えばドリンク剤など）、散剤、顆粒剤、錠剤、マイクロカプセル、ソフトカプセル、ハードカプセル、油脂組成物、Ｏ／Ｗ型乳化液、Ｗ／Ｏ型乳化液または可溶化液などの形状の製剤として製造され得る。
【００３７】
上記製剤の製造に用いられる医薬品添加物、食品添加物および食品素材としては、例えば賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルなど）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、アラビアガム液など）、溶解補助剤（アラビアガム、ポリソルベート８０など）、甘味料（砂糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、アスパルテームなど）、着色料（β−カロテン、食用タール色素、リボフラビンなど）、保存料（ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、亜硫酸ナトリウムなど）、増粘剤（アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェロールなど）、香料（ハッカ、ストロベリー香料など）、酸味料（クエン酸、乳酸、ＤＬ−リンゴ酸など）、調味料（ＤＬ−アラニン、５´−イノシン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムなど）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなど）、ｐＨ調整剤（クエン酸、クエン酸三ナトリウムなど）、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類などが挙げられる。
【００３８】
上記製剤１００質量％中、上記（Ａ）成分と（Ｂ）成分の合計の含有量は、通常約０．０００１〜５０質量％、好ましくは約０．００１〜２０質量％、より好ましくは約０．０１〜１０質量%である。
【００３９】
更に、本発明の一重項酸素消去剤は、飲食品の形態をとることが可能である。該飲食品としては、例えば清涼飲料、ドロップ、キャンディ、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ゼリー菓子、クッキーなどが挙げられる。
【００４０】
本発明の一重項酸素消去剤を経口摂取する場合、上記（Ａ）成分の成人１日当たりの用量は、約０．１〜５００ｍｇの範囲であり、また、上記（Ｂ）成分の成人１日当たりの用量は、約１〜１００ｍｇの範囲である。但し、実際の用量は、目的や摂取者の状況（性別、年齢、健康状態など）を考慮して決められるべきである。
【００４１】
本発明の一重項酸素消去剤は、一重項酸素消去能に優れているため、一重項酸素が関与する様々な障害又は疾患（例えば、白内障、加齢黄斑変性症、網膜血管閉塞症など）の予防に利用し得る。
【００４２】
以下に本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
[試験例]
[一重項酸素消去能の評価]
【００４４】
クロセチンとルテイン及びルテイン脂肪酸エステルとを併用する場合の一重項酸素消去能をＥＳＲ法により評価した。
【００４５】
（１）サンプル溶液の調製
（ａ）精製クロセチン（クロセチン含有量９９％）３．３ｍｇを１０ｍＬの１００％ＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭのクロセチン溶液を調製した。
（ｂ）ルテイン（製品名；ルテイン含有量９８％；EXTRASYNTHESE社製）５．７ｍｇを１０ｍＬの１００％ＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭのルテイン溶液を調製した。
（ｃ）クロセチン溶液及びルテイン溶液を表１に示す割合で各々混合し、サンプル溶液１〜８を調製した。
【００４６】
【表１】
2010285364.tif 000008
【００４７】
（２）評価検体の調製
以下の１）〜５）を混合して評価検体を調製した。また、対照として、４）のサンプル溶液５０μＬに替えて上記クロセチン溶液５０μＬを用いて同様に評価検体を調製した。
１）リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）            ７００μＬ
２）ローズベンガル（５０μＭ）            １００μＬ
３）４−ＯＨ−ＴＥＭＰ                    １００μＬ
４）サンプル溶液（１〜８のうちいずれか）  ５０μＬ
５）超純水                                ５０μＬ
なお、ローズベンガルは、光照射により一重項酸素を発生させるために用いた。また、４−ＯＨ−ＴＥＭＰ（2,2,6,6-tetramethyl-4-hydroxyl-piperidine）は、一重項酸素の補足剤として用いた。
【００４８】
（３）ＥＳＲ装置による測定
（２）で得た評価検体をフラットセルに回収し、このフラットセル内の評価検体に対し光照射（１８０００ｌｕｘ、５分間）を行った。光照射の直後にこの評価検体をＥＳＲ装置（型式：ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ；日本電子社製）に供して以下の条件でＥＳＲシグナル強度を測定した。
[ＥＳＲ測定条件]
Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｉｅｌｄ：                ３３５．９ｍＴ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｄｔｈ：        ７９μＴ
Ｓｗｅｅｐ  Ｗｉｄｔｈ：                  ５．０ｍＴ
Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ：              ０．０３ｓｅｃ
Ｓｅｅｐ  Ｔｉｍｅ：                      １．０ｍｉｎ
Ｇａｉｎ：                                ４００
【００４９】
（４）結果
（１）〜（３）を３回繰り返し実施して得られたＥＳＲシグナル強度及び次式に基づいて一重項酸素消去率（％）を求め、該一重項酸素消去率（％）の平均値±標準偏差を算出した。結果を表２に示す。
【００５０】
【数５】
2010285364.tif 000009
【００５１】
尚、上記式中、Ｓ1は、評価検体について測定されたＥＳＲシグナル強度であり、Ｓ2は、サンプル溶液に替えて５％ＤＭＳＯを用いて調製した評価検体について測定したときのＥＳＲシグナル強度である。
【００５２】
【表２】
2010285364.tif 000010
【００５３】
表２の結果は、（Ａ）クロセチンと（Ｂ）ルテインとを併用してモル比（Ａ）／（Ｂ）を０．４以上にする場合、クロセチンを単独で使用する場合に比べて統計的に有意な一重項酸素消去活性が得られることを示すものである。
【００５４】
[実施例]
クロビットＰ（製品名；クロセチン含有量７５％；理研ビタミン社製）５０ｇ及びルテイン２０（製品名；ルテイン含有量２０％；協和発酵バイオ社製）１５０ｇをMCT（製品名；アクターＭ１；理研ビタミン社製）８００ｇに加え、ミキサー（型式ウルトラタラックスＴ−２５ベーシック；ＩＫＡジャパン社製）を用いて加熱・攪拌して溶解し、得られた溶解液を真空脱泡処理して室温まで冷却した。次にこの溶液を、常法に従い、ゼラチンを主成分とする皮膜で包み込むことによりソフトカプセル状の一重項酸素消去剤を製造した。この一重項酸素消去剤は、１カプセル当たり（Ａ）クロセチン約７．５ｍｇ、（Ｂ）ルテイン６ｍｇを含有する。また、この一重項酸素消去剤に含有される上記（Ａ）及び（Ｂ）のモル比（Ａ）／（Ｂ）は２．２である。