(57)【要約】      （修正有）【課題】胎児喪失、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療を必要とする動物にてその免疫系の抑制方法を提供する。【解決手段】門脈免疫化についで発現の増加を示す遺伝子の１つが１ｇスーパーファミリーに属し機能が未知の分子であるＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量を投与。ここでＯＸ−２タンパク質が可溶性融合タンパク質であり、可溶性融合タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域に連結したＯＸ−２の細胞外ドメインを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児喪失を予防または抑制するための医薬の製造におけるＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の使用。
【請求項２】
自己免疫疾患を予防または治療するための医薬の製造におけるＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の使用。
【請求項３】
アレルギー疾患を予防または治療するための医薬の製造におけるＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の使用。
【請求項４】
ＯＸ−２タンパク質が図８に示すアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する請求項１〜３いずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ＯＸ−２タンパク質が可溶性融合タンパク質である請求項１〜４いずれか１項記載の使用。
【請求項６】
可溶性融合タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域に連結したＯＸ−２の細胞外ドメインを含む請求項５記載の使用。
【請求項７】
ＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列が図７に示す配列またはそのフラグメントを有する請求項１〜３いずれか１項記載の使用。
【請求項８】
免疫応答抑制を予防するための医薬の製造におけるＯＸ−２を阻害する有効量の薬剤の使用。
【請求項９】
薬剤がＯＸ−２タンパク質と結合する分子である請求項８記載の使用。
【請求項１０】
分子が抗体である請求項９記載の使用。
【請求項１１】
薬剤がＯＸ−２遺伝子からの塩基配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項８記載の使用。
【請求項１２】
ＯＸ−２を阻害する薬剤の有効量をその必要のある動物に投与することを含む免疫応答抑制予防に使用するための医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤がＯＸ−２タンパク質と結合する分子である請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
分子が抗体である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
薬剤がＯＸ−２遺伝子からの塩基配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児喪失、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を処理する方法および組成物に関する。本発明は胎児喪失、自己免疫疾患およびアレルギー疾患を処理するタンパク質ＯＸ−２の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は身体を感染因子および疾患から防御し、我々の生存に不可欠である。しかし、ある例では、免疫系は病気の原因となりうる。一例は、免疫系がそれ自身の宿主組織を攻撃し、多くの例において衰弱させる病気を引き起こし、ときには死に至らせる自己免疫疾患である。自己免疫疾患の例は、多発性硬化症、１型インシュリン依存性糖尿病、紅斑性狼瘡、関節炎を包含する。免疫系が病気を引き起こす第２の例は組織または器官移植におけるものである。一卵性双生児のごとき遺伝的に同一な動物の場合を除き、組織および器官移植は受容者の免疫系によって異物として拒絶される。移植に対する免疫応答は種を超えた移植または異物移植においても報告されている。免疫系が宿主を害する第３の例は、通常無害な抗原が引き起こす炎症およびいくつかの場合における組織損傷によって免疫系が活性化されるアレルギー反応におけるものである。
【０００３】
移植、自己免疫疾患およびアレルギー反応における有害な免疫応答を抑制するために、免疫抑制剤（シクロスポリンＡ（cyclosporin A）、タクロリマス（tacrolimas）およびコルチコステロイド（corticosteroid）または抗体治療（抗Ｔ細胞抗体のごとき）が施される。残念ながら、これらの非特異的方法の免疫抑制は一般的に好ましくない副作用を有する。たとえば、シクロスポリンは腎機構の低下、高血圧、毒性を引き起こしえ、また、患者の生涯にわたって投与しなければならない。コルチコステロイドは感染に対する抵抗力の低下、痛みを伴う関節炎、骨粗鬆症および白内障を引き起こしうる。抗Ｔ細胞抗体は発熱、高血圧、下痢または無菌性髄膜炎を引き起こしえ、また極めて高価である。
【０００４】
免疫抑制に関する問題から、宿主における、移植に対して、自己免疫疾患における「自己の」組織に対して、およびアレルギーに関する無害な抗原に対しての無応答性または寛容性を誘導する方法または治療の開発に関心がもたれている。特に、動物同種異系移植片モデルにおいて、発明者は、レシピエント動物にドナー動物由来の照射を受けた脾臓細胞の門脈経由前移植注入を行うと移植生存を増加されられることを示した。これに対し、尾静脈経由移植前注入では移植生存が延びなかった。
【０００５】
門脈（ｐｖ）免疫化に続く寛容性の誘導に関する分子機構の理解は、移植、自己免疫疾患およびアレルギーに有用たりうる免疫寛容性の誘導方法の開発を導く。
【０００６】
本発明者は門脈免疫化についで発現の増加を示す遺伝子を同定した。単離された該遺伝子の１つはＩｇスーパーファミリーに属し、機能が未知の分子であるＯＸ−２をコードする。発明者は、ＯＸ−２に対する抗体の投与が通常ｐｖ免疫化についで観察される移植生存を阻害することを示した。発明者はまた、ＯＸ−２のレベルと胎児喪失のリスクとの間に負の相関があることも示した。発明者はさらに、ＯＸ−２が細胞障害性細胞とＩＬ−２生産を抑制し、ＩＬ−４生産を誘導することも示した。これら総ての結果はＯＸ−２が免疫抑制に関与することを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、広義には、本発明はかかる治療を必要とする動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列の有効量の投与を含んでなる免疫系の抑制方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１の具体例において、本発明は、組織または器官の移植前のレシピエント動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列の有効量の投与を含んでなる、レシピエント動物における移植組織または器官に対する免疫寛容性の誘導方法を提供する。
【０００９】
別の具体例においては、本発明は、レシピエント動物における移植前の組織または器官へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列の有効量の投与を含んでなる、組織または器官移植を受けるレシピエント動物における移植片対宿主疾患の予防または抑制方法を提供する。
【００１０】
さらに別の具体例においては、本発明は、その必要にある動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質の有効量をコードする核酸配列の投与を含んでなる、胎児喪失の予防または抑制方法を提供する。
さらに別の具体例においては、本発明は、自己免疫疾患を有する、有する疑いのあるまたは有する可能性のある動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質の有効量をコードする核酸配列の投与を含んでなる、自己免疫疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１１】
さらに別の具体例においては、本発明は、アレルギーを有する、または有すると推測される動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列の有効量の投与を含んでなる、アレルギーの予防または治療方法を提供する。
【００１２】
本発明は、移植または自己免疫疾患における寛容性の誘導に使用する、ＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列を含有する医薬的組成物も包含する。発明者は、ネズミＯＸ−２をクローニングし、配列決定した。したがって、本発明はネズミＯＸ−２遺伝子をコードし、図７に示した配列および配列番号１を有する単離された核酸配列ならびに図８に示したアミノ酸配列および配列番号２を有する単離されたＯＸ−２タンパク質を包含する。
【００１３】
上記のように、ＯＸ−２を使用し、免疫抑制を誘導できる。したがって、ＯＸ−２阻害は免疫抑制の予防にも有用でありうる。
【００１４】
したがって、別の態様では、本発明は、その必要のある動物へのＯＸ−２阻害剤の有効量の投与を特徴とする免疫抑制の予防方法を提供する。好ましい具体例において、ＯＸ−２阻害剤はＯＸ−２に結合する抗体またはＯＸ−２の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１５】
１の具体例において、本発明は、その必要のある動物へのＯＸ−２阻害剤の有効量の投与を含んでなる胎児喪失の誘導方法を提供する。
【００１６】
本発明は、免疫応答の誘導および増強に使用する、有効量のＯＸ−２阻害剤を含有する医薬的組成物を包含する。
【００１７】
その他の本発明の特徴および効果を、以下の記載から明らかにする。しかしながら、以下の詳細な記載や具体例、さらに示されている好ましい実施態様は説明の目的でのみ記載していると理解されるべきである。開示した発明の精神や範囲内での様々な変更や修飾は、以下の詳細な記載を読むことにより当業者にとっては容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はβ−アクチンプライマーを用いた抑制差引きハイブリダイゼーションのＰＣＲ確認である。
【図２】図２はＩＬ−１０プライマーを用いた抑制差引きハイブリダイゼーションのＰＣＲ確認である。
【図３】図３は差引きハイブリダイゼーション法で得られた４クローンからの32Ｐ−標識プローブを用いたオートラジオグラフである。
【図４】図４は脾臓付着細胞のフローサイトメトリープロフィールである。
【図５】図５ＡおよびＢはｐｖ免疫化後のＯＸ−２抗原の増加した発現を示すウエスタンブロットである。図５Ａは対照マウス抗体、抗マウスＣＤ８での呈色、図５Ｂは抗ラットＭＲＣ  ＯＸ−２での呈色を示す。
【図６】図６は％生存  対  腎移植後日数を示すグラフである。
【図７】図７はラット、マウスおよびヒトＭＲＣ  ＯＸ−２のｃＤＮＡ配列を示す。
【図８】図８はラット、マウスおよびヒトＭＲＣ  ＯＸ−２タンパク質の推定アミノ酸配列を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは肝臓ＮＰＭＣを用いる同種異系ＤＣによる刺激後のサイトカイン生産と細胞増殖を示す棒グラフである。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは肝臓ＮＰＭＣによる細胞増殖およびサイトカイン生産の抑制を示す棒グラフである。
【図１１】図１１はＮＰＣの副次集団におけるＯＸ−２発現を示すＦＡＣＳデータの棒グラフ分析である。
【図１２】図１２は種々の肝臓ＮＰＭＣ細胞フラクションにおけるＢ７−１、Ｂ７−２およびＯＸ−２のｍＲＮＡ発現のＰＣＲ分析を示す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｆｌｔ３Ｌ処理マウスからのＮＰＭＣによる増殖およびサイトカイン生産を示す棒グラフである。
【図１４】図１４はＣ５７ＢＬ１６腎同種移植片を有するＣ３ＨマウスおよびＦｌｔ３処理Ｃ５７ＢＬ１６ドナーからのサイトカイン生産を示す棒グラフである。
【図１５】図１５はＦｌｔ３処理マウスからのＮＰＣでの移植片拒絶反応抑制を示す棒グラフである。
【図１６】図１６は抗−ＯＸ−２がＮＰＣによる抑制を逆転することを示すグラフである。一次同種刺激に対する抗−Ｂ７−１、抗−Ｂ７−２および抗−ＯＸ−２の影響を示す。
【図１７】図１７は抗−ＯＸ−２  ｍＡｂがＮＰＣによる抑制を逆転し、免疫調節細胞のを阻害することを示すグラフである。
【図１８】図１８Ａは、胎児喪失を受けたマウスからの８〜１１日胎盤におけるアンチセンス抗ＯＸ−２とのｉｎ  ｓｉｔｕｅハイブリダイゼーションを示す写真である。図１８Ｂは、自然胎児喪失の疑いのないマウスからの８〜１１日胎盤におけるアンチセンスＯＸ−２とのｉｎ  ｓｉｔｕｅハイブリダイゼーションを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者は門脈免疫化についで発現の増加を示す遺伝子を同定した。これらの遺伝子は免疫抑制または寛容性の発達に役割を果たし、移植拒絶反応、胎児喪失、自己免疫疾患またはアレルギーの予防または治療の治療法の開発に有用でありうる。
【００２０】
サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（suppression subtractive hybridization）（ＳＳＨ）を使用し、発明者は、前移植ドナー特異的免疫化に沿って同種異系腎移植を受けたマウスで選択的に発現し、タンパク質ＯＸ−２をコードするクローンを単離した。ラットのＯＸ−２タンパク質（ＭＲＣ  ＯＸ−２としても知られる）は、胸腺細胞、濾胞樹状細胞、内皮、Ｂ細胞および神経細胞の細胞表面に発現する４１Ｋｄ−４７Ｋｄ糖タンパク質として記載されている。異なる組織における見かけ上の分子量の違いはおそらくグリコシル化機能の違いである。該分子の機能は未知だったが、ＤＮＡおよびアミノ酸配列分析は、リンパ球抗原認識および細胞−細胞相互作用において重要な分子（例えば、ＣＤ４、ＩＣＡＭｓ、ＶＣＡＭｓ）、ならびに神経系の付着レセプター分子（ＮＣＡＭｓ）を包含する免疫グロブリン遺伝子ファミリーの分子と高度の相同性を有することを示している。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、少なくとも免疫系内において、細胞認識、転移およびリンパ球認識レパートリーの規則正しい発達（胸腺内選択を調整による）に重要な役割を果たすとも考えられるインテグリンおよびセレクチンファミリーの他の分子と区別される。
発明者は、ＯＸ−２に対する抗体の投与が、通常前移植ｐｖ免疫化についで観察される移植生存を抑制することを示した。発明者はまた、ＯＸ−２のレベルと胎児喪失のリスクとの間に負の相関があることも示した。発明者はさらに、ＯＸ−２が細胞障害性細胞とＩＬ−２生産を抑制し、ＩＬ−４生産を誘導することも示した。これら総ての結果はＯＸ−２が免疫抑制に関与することを示す。
【００２１】
治療方法
免疫抑制の誘導
１の態様において、本発明は、かかる治療を必要とする動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列の有効量の投与を含んでなる免疫応答の抑制方法を提供する。
【００２２】
「ＯＸ−２」なる用語は、完全長ＯＸ−２タンパク質と該タンパク質の断片または部分とを包含する。好ましい該タンパク質の断片または部分は免疫応答の抑制に十分なものである。該ＯＸ−２タンパク質は抗体調製に使用できる断片も包含する。
【００２３】
好ましい具体例において、ＯＸ−２タンパク質は可溶性の融合タンパク質として調製される。該融合タンパク質は免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域に結合したＯＸ−２の細胞外ドメインを含有しうる。該ＯＸ−２融合は当業者に既知の技術を使用して調製できる。通常、ＯＸ−２の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列はＩｇのＦｃをコードするＤＮＡ配列と結合していて、ＯＸ−２−該ＦｃＩｇ誘導タンパク質を生産する適当な発現系で発現する。ＯＸ−２タンパク質を既知の配列から得、または組換えＤＮＡ技術を使用して調製できる。該タンパク質はＯＸ−２のあらゆる既知の公開された配列を有しうる。（該配列はＧｅｎＢａｎｋから入手できる。ヒト配列受け入れ番号Ｍ１７２２６  Ｘ０５２３；ラット配列受け入れ番号Ｘ０１７８５；およびマウス配列受け入れ番号ＡＦ０２９２１４。）該タンパク質を修飾して、該タンパク質の免疫抑制特性を変化させないアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含ませることができる。保存的アミノ酸置換は、ＯＸ−２アミノ酸配列の１以上のアミノ酸を電荷、大きさおよび／または疎水度の性質が類似するアミノ酸と置き換えることを含む。保存的置換のみがなされた場合、結果として生じるアナログは機能的にＯＸ−２タンパク質と同等である。非保存的置換は、、ＯＸ−２アミノ酸配列の１以上のアミノ酸を非類似の電荷、大きさおよび／または疎水度の性質を有するアミノ酸と置き換えることを含む。
【００２４】
ＯＸ−２タンパク質を修飾し、より治療上有効または適当にすることができる。例えば、環化はペプチドにより好ましいコンフォメーションをとらせるので、ＯＸ−２ペプチドを環化できる。当業者に既知の技術を用いてＯＸ−２ペプチドの環化をなすことができる。とくに、適切な間隔をあけた遊離スルフヒドリル基を有するコンポーネントの間にジスルフィド結合を形成できる。該結合は、アミノ酸、非アミノ酸コンポーネントまたは両者の組み合わせの側鎖間で形成されうる。さらに、塩酸、硫酸、臭化水素、リン酸などを包含する無機酸、またはギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、オギザル酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸およびトルエンスルホン酸を包含する有機酸との反応によってＯＸ−２タンパク質または本発明のペプチドを医薬上の塩に変換できる。ＯＸ−２タンパク質および本発明の核酸の投与の「有効量」は、意図する結果をなすために必要な投与量と期間で、有効な量をいう。ＯＸ−２タンパク質および本発明の核酸の有効量動物の疾患状態、年齢、性別および体重によって変化する。投与量を調節して最適な治療応答を得ることができる。例えば、毎日いくつかに分割して投与し、または治療状態の緊急性に応じて投与量を減少させうる。
【００２５】
本明細書で使用する「動物」なる用語は、動物界を構成するヒトを含むすべてを包含する。
【００２６】
１の具体例では、本発明は、器官または組織の移植前にレシピエント動物にＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量を投与することを特徴とする、レシピエント動物における移植した器官または組織に免疫寛容を導入する方法を提供する。本発明は移植した器官または組織に免疫寛容を導入するためのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列の有効量の使用を包含する。
【００２７】
「免疫寛容の導入」なる用語は、持続性で汎発性の免疫不全の導入なしに、特定の抗原に対して免疫系を無応答性にすることをいう。「抗原」なる用語は、免疫反応を導入できる物質をいう。自己免疫疾患の場合、免疫寛容は、宿主が異物であると認識して自己免疫応答を引き起こす自己抗原に対して、免疫系を無応答性にすることを意味する。アレルギーの場合、免疫応答は、通常宿主に免疫応答を生じさせるアレルゲンに対して、免疫系を無応答性にすることを意味する。移植の場合、免疫応答は、移植における抗原に対して、免疫系を無応答性にすることを意味する。同種異系抗原は、血液グループ抗原のごとき、種の一部のメンバーにのみ見出される抗原をいう。異種抗原は、１の種のメンバーには存在するが、別の種のメンバーには存在しない抗原をいう。これに対応し、同種異系移植片は同種のメンバー間の移植片をいい、異種移植片は異種のメンバー間の移植片をいう。
【００２８】
レシピエントは、ネズミ、ブタ、イヌ、反芻動物、ヒトでない霊長類および好ましくはヒトを含む動物界の任意のメンバーであってよい。移植される器官または組織は、レシピエントと同種由来であってよく（同種移植片）、別の種由来であってよい（異種抗原）。組織または器官は、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓島、脳組織、角膜、骨、腸、皮膚および造血細胞を含む任意の組織または器官であってよい。
【００２９】
本発明の方法は移植組織の免疫細胞がレシピエントの免疫系に免疫攻撃を開始する移植片対宿主疾患の予防に使用できる。これは、例えば白血病、再生不能性貧血および酵素または免疫不全治療での、骨髄またはリンパ組織のごとき免疫際像を含む移植組織が移植された場合に起こりうる。
【００３０】
したがって、別の具体例において、本発明は、レシピエント動物に移植前に、移植する器官または組織にＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量を投与することを特徴とする該器官または組織の移植を受けるレシピエント動物における移植片対宿主疾患の予防または抑制方法を提供する。
【００３１】
本発明者は、ＯＸ-２発現レベルと生殖能力との間に関係があることを示した。特に、本発明者は低レベル（または無のレベル）のＯＸ−２が胎児喪失と関係することを示した。したがって、本発明は、ＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量を必要ある動物に投与することを特徴とする胎児喪失の予防または抑制方法を提供する。本発明は、胎児喪失の予防または抑制のためのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の使用を包含する。
【００３２】
上記のとおり、本発明は自己免疫疾患の治療または予防のためにも使用できる。自己免疫疾患においては、宿主の免疫系が特定の抗原を「自己」と誤認して、該抗原を発現する宿主組織に対して免疫反応が開始される。通常、免疫系はそれ自身の宿主組織に対して寛容であり、自己免疫は免疫寛容系の故障であると考えられる。
【００３３】
したがって、さらなる具体例においては、本発明は、自己免疫疾患を有する、有する疑いのあるまたは有する可能性のある動物にＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量を投与することを特徴とする自己免疫疾患の予防または治療方法を提供する。本発明は、自己免疫疾患の予防または治療のための、ＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の使用もまた包含する。
【００３４】
本発明に従って治療または予防される自己免疫疾患は、１型インシュリン依存性糖尿病、成人呼吸障害症候群、炎症性の腸疾患、皮膚炎、髄膜炎、血栓性の血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球付着不全、慢性関節リウマチ、リューマチ熱、ライター症候群、乾癬関節炎、進行性全身性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性の血管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、中枢神経系炎症障害、抗原抗体複合体媒介疾患、自己免疫溶血性貧血、橋本病、グレーヴズ病、習慣性の自然流産、ルナール症候群、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、ＡＩＤＳの自己免疫合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎およびアジソン病を包含するが、これに限定されるものではない。
【００３５】
上記のように、本発明の方法はアレルギー反応の治療または予防のために使用できる。アレルギー反応においては、免疫系は通常無害な抗原またはアレルゲン
に対して攻撃を開始する。本発明の方法を使用して予防または治療できるアレルギーは、枯草熱、喘息、アトピー性の湿疹を、ウルシおよびキヅタ、ハウスダスト、ダニ、ハチの花粉、豆、甲殻類などに対するアレルギーを同様に包含するが、これに限定されるものではない。
【００３６】
したがって、さらなる具体例において、本発明は、アレルギーを有するまたは有する疑いのある動物にＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量を投与することを特徴とするアレルギーの予防または治療方法を提供する。本発明は、アレルギーの予防または治療のためのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の使用を包含する。
【００３７】
免疫抑制の予防
別の態様において、本発明は、その必要にある動物へのＯＸ−２タンパク質またはＯＸ−２タンパク質をコードする塩基配列の有効量の投与を含んでなる免疫抑制の予防方法を提供する。
【００３８】
これに限定するものではないが、感染、癌および後天性免疫不全症候群を包含する免疫抑制の予防が望まれる多くの状況がある。
【００３９】
１の具体例では、本発明は、その必要にある動物へのＯＸ−２に結合する薬剤の有効量の投与を含んでなる免疫抑制の予防方法を提供する。
【００４０】
好ましい具体例においては、ＯＸ−２に結合する薬剤はＯＸ−２特異性抗体である。本発明者は例４および５に記載したＯＸ−２に対する抗体を調製した。ＯＸ−２に対する抗体を、出典明示により本明細書に取り込む、KohlerおよびMilstein、Nature 256、495 (1975)ならびにU.S. Patent Nos. RE 32,011; 4,902,614; 4,543,439;および4,411,993に記載された技術のごとき当業者に既知の技術を使用して、調製することもできる。(出典明示により本明細書に取り込む、Monoclonal Antibodies、Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses、Plenum Press、Kennett、McKearn、およびBechtol（編）、1980、およびAntibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびLane（編）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988も参照)。
本発明の本文においては、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（FabおよびF(ab')2）および組換えにより生産された結合パートナーを包含するものと理解される。
【００４１】
別の具体例においては、ＯＸ−２抑制剤はＯＸ−２の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ＯＸ−２遺伝子由来の核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＸ−２を抑制する本発明の方法に使用できる。本発明者は、例３に記載したＯＸ−２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製した。
【００４２】
したがって、本発明は、その必要にある動物へのＯＸ−２由来核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量の投与を含んでなる免疫抑制の予防方法を提供する。
【００４３】
本明細書において使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドなる用語はその標的に相補的な核酸配列をいう。
【００４４】
本発明の１の具体例においては、ＴがＵであってよい図７記載の配列を有する核酸分子、またはその断片に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４５】
「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドのオリゴマーもしくはポリマーまたはヌクレオチドモノマーをいう。該用語は天然には存在しないモノマーを含んでなる修飾または置換オリゴマー、または類似に機能するその一部もまた包含する。かかる修飾または置換オリゴヌクレオチドは、細胞取り込みの向上やヌクレアーゼ存在化での安定性の増加のごとき性質ゆえに、天然に存在する形態より好ましいことがありうる。該用語は２以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドもまた包含する。たとえば、キメラオリゴヌクレオチドは有益な性質を与える（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加）少なくとも１の修飾ヌクレオチド領域を含みえ、または本発明の２以上のオリゴヌクレオチドが結合してキメラオリゴヌクレオチドを形成しうる。
【００４６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレチドまたはデオキシリボヌクレオチド核酸であってよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然に存在する塩基を含有してよい。オリゴヌクレオチドはまた、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、２−プロピルアデニンおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換グアニン、アザウラシル、デアザウラシル、アザチミジン、デアザチミジン、アザシトシン、デアザシトシン、アザアデニン、デアザアデニン、アザグアニンおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンのごとき修飾塩基も含有してよい。
【００４７】
本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環糖間結合における修飾リン、酸素ヘテロ原子も含有してよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホネートおよびホスホロジチオアートを包含してよい。本発明の具体例においては、ホスホロチオアート結合は４〜６の３’末塩基間に結合する。別の具体例では、ホスホロチオアート結合は総てのヌクレオチドに結合する。
【００４８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療または実験薬剤にとしてより適切なヌクレオチドアナログも含んでよい。オリゴヌクレオチドアナログの例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ)のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格がペプチドに見出されたものと類似のポリアミド骨格と置換したペプチド核酸（ＰＮＡ）である（P.E. Nielsenら、Science 1991、254、1497）。ＰＮＡアナログは、インビボおよびインビトロで酵素による分解に抵抗性を有し、寿命が長いことが示されている。ＰＮＡ鎖はまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間の電荷反発の欠如のため、相補ＤＮＡ配列により強固に結合する。他のオリゴヌクレオチドは、ポリマー骨格、環状骨格または非環状骨格を有するヌクレオチドを含有しうる。例えば、ヌクレオチドはモルホリノ骨格構造を有しうる（米国特許第5,034,506号）。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するグループ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するグループであるレポーターグループのごときグループも含有しうる。
【００４９】
当業者に既知の方法を使用する化学合成および酵素的なライゲーション反応を用いて、アンチセンス核酸分子を構成できる。天然に存在するヌクレオチド、または分子の生化学的安定性を増加させるためまたはｍＲＮＡもしくは天然の遺伝子で形成された２本鎖の物理的安定性を増加させるためにデザインされた様々な修飾ヌクレオチド、たとえば、ホスホロチアート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて、本発明のアンチセンス核酸分子またはその断片を化学的に合成できる。アンチセンス配列が高効率制御領域の調節下で生産され、ベクターを導入する細胞型によって活性が決定される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態で細胞に導入した発現ベクターを用いて、生化学的にアンチセンス配列を生産することもできる。
【００５０】
組成物
本発明は、免疫抑制の予防において使用するＯＸ−２抑制剤を含有する医薬組成物と同様に、免疫四癖において使用するＯＸ−２タンパク質または核酸を包含する医薬組成物も包含する。
【００５１】
かかる医薬組成物は、病巣内、血管内、血管内、局所的、直腸、非経口、吸入または皮下、皮内、筋肉内、髄膜下、経腹膜、経口および大脳内に使用できる。該組成物は、液体、固体または半固体形態、例えば、ピル、錠剤、クリーム、ゼラチンカプセル、カプセル、坐剤、ソフトゼラチンカプセル、ゲル、膜、チューブレット（tubelet)、溶液または懸濁液であってよい。
【００５２】
本発明の上記医薬組成物は、ヒトまたは動物への投与を目的とできる。投与量は個々の必要性、目的の効果および投与経路の選択に依存する。
【００５３】
患者に投与できる医薬上許容される組成物の既知の調製方法、ペルセ（per se）によって上記医薬組成物を調製でき、活性物質の有効量が医薬上許容されるビヒクルと結合して混合物になる。適当なビヒクルは、例えば Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、USA 1985）に記載されている。
【００５４】
これに基づき、上記医薬組成物は、排他的なものではないが、１以上の医薬上許容されるビヒクル、希釈剤に関連し、安定したｐＨを有し、生理学的な流体と等張である緩衝溶液に含まれた活性化合物または物質を包含する。医薬組成物は所望により免疫抑制薬または免疫寛容を向上させる抗体または免疫応答を向上させる免疫調節薬剤のごとき他の薬剤を含有してよい。
【００５５】
１の具体例では、免疫寛容の導入に使用する医薬組成物は、医薬上許容される希釈剤または担体との混合物でのＯＸ−２タンパク質の有効量を含んでなる。該ＯＸ−２タンパク質は患者に投与できる可溶性の形態での免疫付着分子として調製されることが好ましい。組織または器官移植の場合、組成物は、静脈注入または移植部位での直接潅流が可能な可溶性の形態で、ＯＸ−２タンパク質を含むことが好ましい。
【００５６】
別の具体例では、免疫寛容の導入に使用する医薬組成物は、医薬上許容される希釈剤または担体との混合物でのＯＸ−２タンパク質をコードする核酸分子の有効量を含んでなる。
【００５７】
遺伝子治療において免疫寛容を導入するために本発明のＯＸ−２タンパク質をコードする核酸分子を使用できる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターのごときデリバリービヒクルを使用して、ＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列、またはその断片を含んでなる組換え分子をインビボで細胞または組織に直接導入できる。これらを、マイクロインジェクションやエレクトロポレーションのごとき物理的技術または共沈およびリポソームへのＤＮＡの取り込みのごとき化学的方法を使用して、インビボで細胞に導入することもできる。組換え分子は、エアゾールの形態または洗浄によってもデリバリーされうる。細胞への直接注入のごとき、細胞外的にも本発明の核酸分子を投与できる。免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域をコードする核酸分子との融合体としてＯＸ−２をコードする核酸分子を調整することが好ましい。
【００５８】
別の態様では、免疫抑制の予防に使用する医薬組成物は、医薬上許容される希釈剤または担体との混合物でのＯＸ−２抑制剤の有効量を含んでなる。単独または他の活性薬剤または抗体との組み合わせのどちらかでワクチンとしてかかる組成物を投与できる。組み合わせで使用する場合、ＯＸ−２抑制剤はワクチン中の抗原に対する潜在的な免疫応答によって補助剤様に作用しうる。
【００５９】
１の具体例では、免疫抑制に使用する医薬上の組成物は、医薬上許容される希釈剤または担体との混合物でのＯＸ−２に対する抗体の有効量を含んでなる。抗体は静脈内でデリバリーされる。
【００６０】
別の具体例では、医薬上許容される希釈剤または担体との混合物でのＯＸ−２遺伝子由来の核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド核酸の有効量を含んでなる。該オリゴヌクレオチド分子はＯＸ−２核酸配列を含む組成物のために上記のように投与されうる。
【００６１】
ネズミＯＸ−２
本発明者はネズミＯＸ−２遺伝子をクローニングし、配列決定した。したがって、本発明はしたがって、本発明はネズミＯＸ−２遺伝子をコードし、図７に示した配列および配列番号１を有する単離された核酸配列を包含する。
【００６２】
「単離」なる用語は、組換えＤＮＡ技術により生産した場合には細胞物質もしくは培地を、または化学合成した場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない核酸をいう。「核酸」なる用語はＤＮＡおよびＲＮＡを包含することを意図し、２本鎖または１本鎖のいずれでもありうる。
好ましくは、精製され単離された本発明の核酸分子は、（ａ）ＴがＵであってよい、配列番号１に示した核酸配列；（ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；（ｃ）少なくとも１５塩基、好ましくは２０〜３０塩基で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）もしくは（ｂ）とハイブリダイスする（ａ）もしくは（ｂ）の断片；または、（ａ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列における（ａ）または（ｂ）のいずれとも異なる核酸配列、を含んでなる。
【００６３】
下記のように、本発明は、本発明のネズミＯＸ−２タンパク質のトランケーション（truncation）、本発明のタンパク質のアナログおよびホモログならびにそのトランケーション（truncation）をコードする核酸分子を包含することが理解されよう。さらに、本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる本発明の核酸分子の様々な形態が本発明に包含されることも理解されよう。
【００６４】
単離された本発明のＤＮＡである核酸分子は、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法を使用して本発明の新規なタンパク質をコードする核酸を選択的に増幅することによって単離したものであってよく、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであってよい。ＰＣＲで使用するために図７に示した核酸分子から合成オリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることができる。このオリゴヌクレオチドと標準的なＰＣＲ増幅技術とを使用してｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから核酸を増幅できる。このようにして増幅した核酸を適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけできる。様々な技術、たとえば、Chirgwinらのグアニジン−チオシアネート抽出法、Biochemistry、18、5294-5299（1979）によって全細胞ｍＲＮＡの単離することにより、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製できることが理解されよう。ついで、リバーストランスクリプターゼ（例えば、Gibco/BRL、Bethesda、MDから入手可能なMoloney MLV reverse transcriptaseまたはSeikagaku America, Inc.、St. Petersburg、FLから入手可能なAMV reverse transcriptase).を使用してｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成できる。
【００６５】
単離された本発明のＲＮＡである核酸分子は、本発明のＯＸ−２タンパク質をコードするＲＮＡ分子を生産するために、本発明の新規なタンパク質をコードするｃＤＮＡをｃＤＮＡの転写を行わせる適当なベクターへクローニングすることによって単離であってよい。例えば、ｃＤＮＡをベクターノバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の下流にクローニングし、Ｔ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写させ、標準的な技術によって結果物であるＲＮＡを単離できる。標準的な技術を使用して本発明の核酸分子を化学的に合成することもできる。商業的に入手可能なＤＮＡシンセサイザー（例えば、Itakuraら、米国特許第4,598,049号；Caruthersら、米国特許第4,458,066号；およびItakura米国特許第4,401,796号および第4,373,071号を参照）に完全に自動化されている、ペプチド合成類似の、固相合成を包含する様々な化学的ポリヌクレオチド合成法が知られている。本発明の核酸分子配列を、転写のために通常表されるものに対して逆にして、アンチセンス核酸分子を生産することができる。開始コドンより先の領域または非保存領域を逆にすることによって、アンチセンス配列を構成することが好ましい。とくに、本発明の核酸分子またはその断片に含まれる核酸配列、好ましくは図７に示した核酸配列を、転写のために通常表されるものに対して逆にして、アンチセンス核酸分子を生産することができる。
【００６６】
天然に存在するヌクレオチド、または分子の生化学的安定性を増加させるためまたはｍＲＮＡもしくは天然の遺伝子で形成された２本鎖の物理的安定性を増加させるためにデザインされた様々な修飾ヌクレオチド、たとえば、ホスホロチアート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて、本発明のアンチセンス核酸分子またはその断片を化学的に合成できる。アンチセンス配列が高効率制御領域の調節下で生産され、ベクターを導入する細胞型によって活性が決定される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態で細胞に導入した発現ベクターを用いて、生化学的にアンチセンス配列を生産することもできる。
【００６７】
本発明は、本発明のＯＸ−２タンパク質と選択されたタンパク質、または選択マーカータンパク質とを含んでなる融合タンパク質をコードする核酸もまた提供する。
【００６８】
本発明はさらに、図８および配列番号２に示したアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質を包含する。本発明の本文において、本発明のタンパク質は、性化学的活性を保持する様々な構造形態の１次タンパク質を包含しうる。例えば、本発明のタンパク質は、酸性もしくは塩基性塩または中性の形態であってよい。さらに、個々のアミノ酸残基は酸化または還元によって修飾されていてよい。
【００６９】
本明細書に記載したように、完全長アミノ酸配列（図８）に加えて、本発明のタンパク質は該タンパク質のトランケーション（truncation）、ならびに該タンパク質のアナログおよびホモログ、ならびにそのトランケーション（truncation）も包含しうる。トランケーションされた（truncated）タンパク質は少なくとも１５アミノ酸残基のペプチドを含みうる。
【００７０】
本明細書に記載したように、図８に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をアナログ、および／またはそのトランケーション（truncation）は、以下に限定されるものではないが、１以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含むアミノ酸配列を包含しうる。アミノ酸置換は性質を保存する、または保存しないものであってよい。保存的アミノ酸置換は、本発明のタンパク質の１以上のアミノ酸を電荷、大きさおよび／または疎水度の性質が類似するアミノ酸と置き換えることを含む。保存的置換のみがなされた場合、結果として生じるアナログは機能的に同等である。非保存的置換は、ＯＸ−２アミノ酸配列の１以上のアミノ酸を非類似の電荷、大きさおよび／または疎水度の性質を有するアミノ酸と置き換えることを含む。１以上のアミノ酸挿入を図８のアミノ酸配列に導入できる。アミノ酸挿入は単一のアミノ酸残基または２〜１５アミノ酸の長さで変化する連続したアミノ酸からなりうる。
【００７１】
欠失は、図８に示したアミノ酸配列の１以上のアミノ酸または個々の部分の除去を含みうる。欠失アミノ酸は隣接するものであっても、隣接しないものであってもよい。欠失の結果として生じるアナログの長さの下限は約１０アミノ酸、好ましくは１００アミノ酸である。
【００７２】
該タンパク質をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することにより、本発明のタンパク質のアナログを調製できる。本発明のタンパク質のアナログの発現のために構築されたヌクレオチド配列の変異はコード配列のリーディングフレームを保存するものでなければならない。さらに、変異によって、レセプターｍＲＮＡの翻訳に不利に作用する、ループまたはヘアピン構造のごとき、二次ｍＲＮＡ構造を生じさせる相補領域がつくられないことが好ましい。天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位が側方にある変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、変異を所定の部位に導入できる。ライゲーションについで、結果として生じた再構築配列は、目的のアミノ酸挿入、置換または欠失を有するアナログをコードする。
【００７３】
別法として、オリゴヌクレオチドディレクテッド部位特異的変異法を用いて、目的の置換、欠失または挿入によって変化した特定のコドンを有する変化した遺伝子を得ることができる。目的の欠失に適した便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して本発明のタンパク質の欠失またはトランケーション（truncation）を構築できる。上記の改変を行う具体的な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）によって開示されている。
【００７４】
本発明は、本発明のタンパク質のアイソフォームもまた意図している。アイソフォームは本発明のタンパク質とアミノ酸の数および種類が同じものを含むが、分子構造が異なる。本発明が意図するアイソフォームは、本明細書に記載した半発明のタンパク質と同じ性質を有するものである。
【００７５】
本発明は、選択されたタンパク質または選択マーカータンパク質と結合して融合タンパク質を生産する、本発明のタンパク質もまた包含する。さらに、本発明のタンパク質の免疫原性の部分も本発明の範囲内である。
【００７６】
組換えＤＮＡ法を使用して、本発明のタンパク質（トランケーション（truncation）、アナログなどを含む）を調製できる。したがって、既知の方法で、本発明のタンパク質をコードする配列を有する本発明の核酸分子を、確実に該タンパク質を発現させる適当な発現ベクターに組み込むことができる。ベクターが使用する宿主細胞と両立できるかぎりにおいて、可能性のある発現ベクターは、以下に限定されるものではないが、コスミド、プラスミドまたは修飾をうけたウイルス（例えば、複製に血管のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含する。「宿主細胞の形質転換に適当な」発現ベクターは、本発明の核酸分子と、該核酸分子と有効に結合し、発現に使用するために宿主細胞に基づいて選択した調節配列とを含む発現ベクターをいう。有効に結合した、とは、核酸が該核酸を発現させるように調節配列に結合していることをいう。
【００７７】
したがって、本発明は本発明の核酸分子、またはその断片、および挿入されたタンパク質配列の転写と翻訳に必要な調節配列を含む本発明の組換え発現ベクターを意図している。かかる発現ベクターは、ＯＸ−２タンパク質をコードする核酸配列を使用する上記の治療に有用である。細菌、真菌またはウイルス遺伝子を包含する様々なソースから、適当な調節配列を得ることができる（例えば、Goeddel、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、CA (1990)に記載された調節配列を参照）。適当な調節配列の選択は選択した宿主細胞に依存し、また当業者は容易に理解できる。かかる調節配列の例は、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボゾーム結合配列を包含する。さらに、選択した宿主細胞および使用するベクターに依存して、複製起点、付随的なＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写誘導性を与える配列を発現ベクターに組み込むことができる。天然のタンパク質および／またはその側方の領域によって必要な調節配列を得られることが理解されよう。さらに、本発明は、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明の核酸分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、該ＤＮＡ分子は該ＤＮＡ分子の転写によって、図７に示したヌクレオチドを含んでなる核酸配列に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子を発現するように、調節配列に有効に結合している。アンチセンスＲＮＡ分子の連続する発現を導く、該アンチセンス核酸に結合した調節配列を選択できる。
【００７８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子を用いて形質転換または形質移入された宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子もまた含みうる。選択マーカー遺伝子の例は、Ｇ４１８およびハイグロマイシン（hygromycin）のごとき特定の薬物に対する耐性を与えるタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼのごとき選択マーカータンパク質濃度の変化によってモニターされる。選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性のごとき抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする場合、Ｇ４１８を用いて形質転換細胞を選択できる。選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残り、他の細胞は死滅する。これにより、本発明の組換え発現ベクターの発現の可視化とアッセイが可能になり、特に発現および表現型における変異の効果の測定が可能になる。選択マーカーを目的の核酸由来の分離マーカーに導入できることが理解されよう。
【００７９】
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現を増加させ；組換えタンパク質の溶解度を増加させ；アフィニティー精製におけるリガンドとして作用して標的組換えタンパク質の精製を助ける融合部をコードする遺伝子もまた含みうる。例えば、融合タンパク質の精製に続いて融合部から組換えタンパク質分離するために、タンパク質加水分解の開裂部位を表駅組換えタンパク質に付加することができる。
【００８０】
組換え発現ベクターを宿主細胞へ導入して形質転換宿主細胞を生産できる。「形質転換宿主細胞」なる用語は、本発明の組換え発現ベクターを用いて形質転換または形質移入された原核および真核細胞を包含することを意図する。「を用いて形質転換された」、「を用いて形質移入された」、「形質転換」および「形質移入」なる用語は当業者に既知の多くの可能な技術の１つによって細胞へ核酸(例えば、ベクター）を導入することを包含することを意図する。例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換によって核酸を用いて原核細胞を形質転換できる。リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質移入、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのごとき慣用技術によって核酸を哺乳動物細胞へ導入できる。宿主細胞の適切な形質転換および形質移入方法を、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）、および他の実験書に見出すことができる。
【００８１】
適当な宿主細胞は広範囲の原核および真核宿主細胞を包含する。例えば、イー・コリのごとき細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞中で本発明のタンパク質を発現させられる。他の適当な宿主細胞を、Goeddel、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、CA (1991)に記載された調節配列を参照）に見出すことができる。
【００８２】
固相合成（Merrifield、1964、J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154）または均一溶液中での合成（Houbenweyl、1987、Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I and II、hieme、Stuttgart）のごときタンパク質化学において周知の技術を用いて、化学合成によって本発明のタンパク質を調製することもできる。
【００８３】
下記の非制限的な実施例は本発明を説明するものである。
【００８４】
実施例
例１
この実施例は、ｐｖ免疫化に続く特定の遺伝子の発現の増加を示す。
ネズミ：
ｃ３Ｈ／ＨＥＪおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをザ・ジャクソン・ラボラトリー（The Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME.）から購入した。マウスを５匹／ケージで飼育し、餌および水を自由に摂食させた。すべてのマウスを８〜１２週齢で使用した。
【００８５】
モノクローナル抗体
下記のファーミンジェン（Pharmingen）（San Diego、CA）から入手したモノクローナル抗体を使用した：抗−ＩＬ−２（JES6-1A12；ビオチニル化  JES6-5H4）;抗−ＩＬ−４（11B11；ビオチニル化  BVD6-24G2）；抗−ＩＦＮγ（R4-6A2；ビオチニル化  XMG1.2）；抗−ＩＬ−１０（JES5-2A5；ビオチニル化  SXC-1、Pharmingen、San Diego、CA)；マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン107.3、ＢＡＬＢ／Ｃ−抗−ＴＮＰ）。ストレプトアビジン  西洋ワサビペルオキシダーゼおよび組換えマウスＧＭ−ＣＳＦもまたファーミンジェン（Pharmingen）（San Diego、CA）から入手した。
【００８６】
ＮＬＤＣ−１４５（抗マウス樹状細胞）、およびF(ab')2ウサギ抗ラットIgG FITC複合体（マウスIgGと非交差）、またはF(ab')2ウサギ抗ラットIgG PEをセロテック（Serotec、Canada）から入手した。
【００８７】
ウサギ補体、L3T4、抗−thy1.2、抗−Ly2.2、抗−Ly2.1（マウスIgG3）、FITC-MAC-1 およびマウスＩｇＧ１抗−ラットＯＸ−２をシダーレーンラボ（Cedarlane Labs、Hornby、Ontario.）から入手した。
抗−CD28 (PV-1)および抗−CTLA (UC10-4F10-11)をそれぞれシー・ジューン博士（Drs. C. June）およびジェイ・ブルーストーン博士（J. Bluestone）から入手し、抗−Ｂ７−１、抗−Ｂ７−２をジー・パワーズ博士（Dr. G. Powers）から入手した。高力価の後者４つのすべての抗体を、セルマックスシステム（CELLMAX system）（CELLCO Inc.、Germantown、MD、USA）中でインビトロ培養により生産した。
【００８８】
細胞調製
各実験において、異なる治療グループの個々のマウスから、脾臓、パイエル板（ＰＰ）および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞懸濁液を無菌的に調製した。
【００８９】
インビトロで骨髄細胞の培養により樹状細胞を入手した際は、下記の技術を用いた（Gorczynskiら、1996a）。
ドナー雄性Ｃ５７ＢＬ／６（またはＢＡＬＢ／ｃ）マウスの大腿骨から骨髄プラグを吸引し、洗浄し、αF10に再懸濁した。細胞を逐次的に抗体（L3T4、抗−thy1.2、抗−Ly2.2）の混合物とウサギ補体で処理し、マウスリンホパクー（lymphopaque）（Cedarlane Labs、Ontario）を通して遠心分離して死細胞を除去した。細胞をαF10中で３回洗浄し、組織培養フラスコ内αＦ１０  １０ｍｌ中で培養した。３６時間間隔で新しいGM-CSFを添加した。培養３．５日目と７日目にリンホパクー（lymphopaque）を通して細胞を分離し、組換えGM-CSFとともにαF10中で再培養した。１０日目にサンプルの一部を、NLDC-145およびＦＩＴＣ抗ラットＩｇＧ、抗−ＯＸ−２およびＰＥ抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ抗−Ｂ７−１またはＦＩＴＣ抗−Ｂ７−２で着色した。かかる培養から得た細胞を使用したこれらの抗体の着色の平均値は、それぞれ９３％±７％、１４％±５％、７８％±９％および２７％±６％であった。残った細胞を洗浄し、上記のように門脈に注入した。
【００９０】
門脈免疫化および腎移植
上記のように、ｐｖ免疫化および腎移植を実施した（Gorczynskiら、1994）。すべてのＣ３Ｈマウスを、15ｘ106 C57BL/6 １０日培養、骨髄由来、樹状細胞を用いてｐｖ／ｉｖ免疫化し、ついでC57BL/6腎移植をした。移植日に、動物にシクロスポリンＡ（cyclosporin A）  10mg/Kgの１回の筋肉内注射をした。マウスを移植5日後の組織採取とＲＮＡ調製に供した。他の研究では、本文中に記載したように動物を供した。
【００９１】
モノクローナル抗体を移植を受けたマウスに注入した際は、移植２時間以内に開始し、２日間隔（ｘ４注入）で１００ｍｇ静脈内に注入した。
【００９２】
移植を受けたマウスの脾臓細胞からのサイトカイン生産
サイトカイン生産の導入を評価するために用いた培養においては、αＦ１０中、３連で、照射を受けた(2000R)Ｃ５７ＢＬ／６脾臓刺激細胞によって刺激した脾臓応答細胞を使用した。多数の研究において、移植を受けたマウスの脾臓、リンパ節またはパイエル板からのサイトカイン生産に定量的または定性的な有意差は観察されていなかった（Gorczynskiら、1994b）。レプリケートウエル（replicate well）から４０時間目に上清をプールし、ＥＬＩＳＡアッセイでリンホカイン生産を３連でアッセイした。すべてのキャプチャー（capture）抗体、ビオチニル化検出抗体および組換えサイトカインは、ファーミンジェン（Pharmingen）（San Diego、CA−上記参照）から入手した。
【００９３】
IFNγアッセイでは、100 ng/ml R4-6A2でコートした平底９６穴ヌンク（Nunc）プレート（Gibco、BRL）を使用した。３連で、様々な容量の上清を結合させ、４℃で、３回洗浄し、ビオチニル化抗IFNγ（XMG1.2）を添加した。洗浄後、洗浄後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Cedarlane Labs）とともにプレートをインキュベートし、適当な基質を用いて顕出させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＯＤ405を測定した。JES5-2A5をキャプチャー抗体とし、ビオチニル化SXC-1を顕出（developing）抗体として、同じＥＬＩＳＡシステムを用いてＩＬ−１０を分析した。各アッセイ信頼性は0.01〜0.1 ng/mlの範囲でサイトカインレベルを検出した。ＩＬ−２およびＩＬ−４のＥＬＩＳＡアッセイでは、JES6-1A12および11B11をキャプチャー抗体として使用し、ビオチニル化JES6-5H4またはBVD6-24G2を顕出抗体をして使用した。
各サイトカインの検出感度は10pg/mlであった。
【００９４】
オリゴヌクレオチドプライマー
β−アクチンおよび他のサイトカインのＰＣＲ増幅に使用したプライマーは以前の刊行物（Gorczynski、R.M.、1995a；Gorczynski、R.M.、1995b；Gorczynski、R.M.、1996a）に記載されている。
さらに、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
２本鎖ｃＤＮＡ（ＤＰ）を得るためのｃＤＮＡ合成プライマ−：
5'-TTTTGTACAAGCTT30-3'
アダプター１(Ａｄ１):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
アダプター２（Ａｄ２）:
5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'
ＰＣＲプライマー１（Ｐ１）：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
ネステッドプライマー１（ＮＰ１）：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
ＰＣＲプライマー２（Ｐ２）：5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3'
ネステッドプライマー１（ＮＰ２）：5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'
【００９５】
ドライバーおよびテスターの調製
ｉｖまたはｐｖ免疫化し、腎移植したマウスのグループ当り５のプールした腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）およびパイエル板（ＰＰ）からＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡをドライバー（ｉｖ）グループから調製し、１ｎｇＤＰプラーマ−とともに２本鎖ｃＤＮＡを使用し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼとともにｃＤＮＡ合成キット（Clontech）を使用した。最終的なｃＤＮＡ調製物をＲｓａＩで３時間、酵素（GIBCO）１５単位を含む反応混合物５０ｍｌ中で消化し、ｃＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿し、７ｍｌの脱イオン水中に再懸濁した（濃度約300ｎｇ／ｍｌ）。
【００９６】
ＲｓａＩ消化テスターｃＤＮＡ（ｐｖグループ）を同じ形式で調製した。ＴＥ緩衝液に希釈した50ｎｇのテスターｃＤＮＡを、50単位／ｍｌ  Ｔ４リガーゼを使用して１８時間、１６℃で分離ライゲーション反応において、２ｍｌのＡｄ１およびＡｄ２（各１０ｍＭ）に連結した。ついで、0.2Ｍ  ＥＤＴＡ  １ｍｌを添加し、混合物を７０℃、５分間加熱し、リガーゼを不活性化し、生産物を-70℃で保存した。
【００９７】
差し引きハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅
ｐｖ２本鎖にされたＡｄ１−連結ｃＤＮＡおよびＡｄ２−連結ｃＤＮＡを20ｎｇ含む２本の試験管の各々にドライバー（ｉｖ）２本鎖ｃＤＮＡ  600ｎｇを添加した。標準的な方法で、試料を撹拌し、エタノールで沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁し、鉱物油を上載し、変性させ、アニーリングさせた。ついで、２の独立した試料を一つにし、200ｎｇの新しいドライバーｃＤＮＡを添加して、ｍＲＮＡの特異的な発現を高め、再び混合物を１０時間、６８℃で変性させ、アニーリングさせた。最終的な試料をＥＤＴＡを含むＨｅｐｅｓ緩衝液で希釈し、−２０℃で保存した。
【００９８】
差し引き後、差し引きしたｃＤＮＡに２回のＰＣＲ増幅を実施した。１回目では、差し引きしたｃＤＮＡ  １ｍｌを、Ｐ１およびＰ２の各１ｍｌを用いて増幅した。増幅の条件はディアトチェンコ（Diatchenko）によって記載された通りである。増幅した生産物を脱イオン水で１０倍に希釈し、生産物１ｍｌをネステッドプライマー（ＮＰ１およびＮＰ２）を使用し１０サイクルの増幅反応を行うさらなる増幅のために使用した。「ハウスキーピング遺伝子」として知られる対照オリゴヌクレオチドプライマー（β−アクチン）、およびｉｖ／ｐｖ免疫化マウスで発現が異なることが既に公開されている遺伝子用のプライマーとともに、もとのドライバー／テスターおよび差し引きしたｃＤＮＡの部分試料をＰＣＲ反応に使用した。これらのデータを図１および図２に示した。
【００９９】
図１はβ−アクチンプライマーを用いた抑制差引きハイブリダイゼーションのＰＣＲ確認を示す。差し引きしていない（レーン１、３、５および７）または差し引きした（レーン２、４、６および８）ｍＲＮＡ由来の試料を逆転写し、異なるＰＣＲサイクル回数で、β−アクチンプライマーを使用してＰＣＲで試験した。レーン１および２：１５サイクル；レーン３および４：２０サイクル；レーン５および６；２５サイクル；レーン７および８：３０サイクル。
【０１００】
図２はＩＬ−１０プライマーを用いた抑制差引きハイブリダイゼーションのＰＣＲ確認を示す。使用したプライマーがＩＬ−１０用のものであり、異なるサイクル回数が下記の通りである以外は、図１と同様に、差し引きしていない（レーン２および４）または差し引きした（レーン３および５）ｍＲＮＡ由来の試料を
試験した。レーン２および３：２０サイクル；レーン４および５：３０サイクル；レーン１：分子量標準。
【０１０１】
さらに、下記のように差し引きしたｃＤＮＡのクローニングを実施した。
【０１０２】
差し引きしたｃＤＮＡのクローニングとさらなる分析
ＴＡクローニングキット（Invitrogen、California）を用いて、ＰＣＲIIベクターへの直接結合とにより、ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡをクローニングした。挿入断片：ベクター比３：１、Ｔ４リガーゼ（３Ｕ／μl）を含む１×ライゲーション緩衝液中で、一晩１４℃で、ライゲーションを実施した。ついで、標準的な形質転換プロトコールを用いて、ライゲーション産物をINFαF'コンピテント大腸菌（Escherichia Coli）へ挿入し、Ｘ−ｇａｌ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-D-ガラクトシダーゼ)を含んだプレートにおいてアンピシリンを用いて選択した。プラスミド抽出・スピンキット（Plasmid extraction Spin kit）（Qiagen、Germany）を用いてミニプレップ（miniprep）プラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素EcoR Iで切断し、該プラスミドが目的の挿入断片を含むか否かを確認した。Ｔ７シーケンシングキット（T7 sequencing kit）（Pharmacia Biotech、Canada）を用いた（T7 sequencing kit）ジデオキシ配列決定法によって挿入断片を有するプラスミドを配列決定した。バイオテクノロジー情報国立センター（NIH、Bethesda、USA）のＢＬＡＳＴプログラムを用いて核酸相同姓検索を行った。ノザンハイブリダイゼーションを用いて、下記のようにクローニングした物のさらなる分析を行った。ネステッドＰＣＲプライマーを用いてpCRII中の挿入断片を１２サイクル増幅した。キアキック・スピン・ＰＣＲ精製キット（Qiaquick Spin PCR Purification Kits）（Qiagen）を用いて増幅した物を精製し、ランダムプライミングによって32Ｐ標識し、もとの（および新しい）ｉｖまたはｐｖ全ＲＮＡの試料20mgをノザンハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。ｃＤＮＡプローブ  100ng当り最低５×１０6cpm、0.1mg/ml 超音波処理熱変成サケ精子ＤＮＡを含むエクスプレスＨｙｂ溶液（ExpressHyb solution）（Clontech）中でハイブリダイゼーションを行った。１×ＳＳＣと0.1％ＳＤＳで１５分間、２７℃でフィルターを４回洗浄し、ついで、0.2×ＳＳＣと0.1％ＳＤＳで３０分間、４２℃で高度にストリンジェントな洗浄を行った。曝露時間は１８時間〜６日で変化させた。図３は上記の差引きハイブリダイゼーション法（pv cDNAをテスター物質として、iv cDNAをドライバー物質をして使用した）で得られた４クローンからの32Ｐ−標識プローブを用いたオートラジオグラフを示す。β−アクチン用の標識対照プローブをＰＣＲ複製で調製した。ｉｖまたはｐｖ免疫化を受けたマウスから全ＲＮＡを調製し、１８時間（クローン＃２８）〜６日（＃７１）顕出させたゲルを用い、図示したように同型レーンに等量を荷した。クローン８はマウスポリ（Ａ）結合タンパク質と最も高い相同性を有する。クローン１６はラットＭＲＣ  ＯＸ−２と最も高い相同性を有する。クローン２８はヒト  ジンクフィンガータンパク質と最も高い相同性を有する。
【０１０３】
ウエスタン  ブロッティング  プロトコール
使用した技術は実質的にサンドフ（Sandhu）らによって記載され（1991）、ブロンステイン（Bronstein）らによって改良されたものである。図５に記載したグループを用いて、試料を腎移植１４日後に得た。新しいラット胸腺細胞を対照として用いた。一次抗体の添加前に、試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Novex Co.、San Diego、CA）に移した。市販の抗−ラット  ＯＸ−２を試験試薬として使用し、マウスＣＤ８ａに対する抗体を対照抗体にした。使用した顕出（developing）抗体は市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗−マウスＩｇＧであった。総ての試薬は、シダーレーンラボ（Hornby、Ontario、Canada）から入手した。
【０１０４】
ＤＮＡ配列相同性比較
ＤＮＡＳＩＡプログラム（バーション２．０）を用いて、B7-1、B7-2、CD28およびCTLA-4について、既知のｃＤＮＡ配列とのマウスＯＸ−２の比較を行った。
【０１０５】
結果
抑制差引きハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）技術の評価
使用したＳＳＨ技術の有効性を評価するため、ＰＣＲ分析によって、ｐｖ免疫化マウス由来のリンパ組織においてＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現が明らかに増加したという、以前の証拠を用いた。したがって、β−アクチンおよびＩＬ−１０用のＰＣＲプライマーを用いて、テスター、ドライバーおよび差し引きした物質由来のｃＤＮＡの希釈分析を行った。図１に示したように、ＳＳＨ後、３５サイクルの増幅の後に、差し引きした物質においてβ−アクチンのシグナルが検出された。対照によって、差し引きしていない物質においてはシグナルはわずか１５サイクル後に存在している。さらに鋳型の定量的分析を用いて、β−アクチンｍＲＮＡの約1000〜10,000の欠乏に対応することを見出した。別の研究において、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡを分析し（図２）、差し引きした／差し引きしていない物質における３０サイクル増幅での検出の比較により、有意にＩＬ−１０  ｍＲＮＡが多いことを見出した（図２、レーン４および５）。
【０１０６】
差引き（subtraction）の有意性のさらなる試験において、差し引きしていないおよび差し引きしたテスター（ｐｖ）ｃＤＮＡの混合物を標識し、ｉｖ（テスター）およびｐｖ（ドライバー）全ＲＮＡのノザンブロットにハイブリダイズさせた。その結果（データは示してしない）は差し引きしたテスターｃＤＮＡプローブはテスターＲＮＡとともに有意に強いシグナルを確かに生じることを示した。ノザンブロットにおいてシグナルを生じる総てのｃＤＮＡ種がｃＤＮＡ混合物中の０．１〜０．３％以上の濃度を示す証拠が与えられ、これらのデータは、テスター（ｐｖ）物質とドラーバー（ｉｖ）物質との間に共通する豊富なｃＤＮＡにおける付随的な減少とともに、ｐｖ特異的ｃＤＮＡの高度の豊富化を生じたこととさらに矛盾しない。
【０１０７】
ｐｖ免疫化マウス由来の組織における特徴的なｃＤＮＡ断片の検出
ｐｖ免疫化マウス由来の組織試料に特徴的なｃＤＮＡ断片の検出のためのＳＳＨの有意性と妥当性を、さらに選択したテスター特異的ｃＤＮＡのクローニングと配列分析の後に確認した。（配列決定した６６のうちの）１０の無作為に選択したｃＤＮＡクローンをプローブに用いて、ｐｖまたはｉｖ全ＲＮＡの多様な調製物を調べた。明らかになったすべての特徴的なｍＲＮＡはｐｖ試料中で特異的に発現した。β−アクチンプローブを対照として、これらのノザンブロットの４のオートラジオグラムを図３に示した。１８時間〜６日の異なる曝露時間を用い、目的の試料におけるｐｖ特異的ｃＤＮＡの異なる存在量を示した。
【０１０８】
図示した４クローンのｃＤＮＡ挿入断片を、他の６２クローンとともに、部分的に配列決定し、GenBankおよびＥＭＢＬデータベースにおいて相同性分析した。これらのデータの概略を表１に示した。約３０のｃＤＮＡ断片が他の記載配列と少なくとも５０％以上の相同性（少なくとも５０ntにわたり、ＢＬＡＳＴスコア＞２５０）を有した。さらに１４クローンは既知のラット／ヒト遺伝子と同様の相同性を示した。双方の組は、異なる遺伝子ファミリーのメンバーを表しうる。さらに２２クローンはデータベースに登録されたものと有意な一致を示さず、したがって、ｐｖ免疫化後に上方制御された新規の遺伝子を表しうる。分析した６６クローンのいずれにおいてもＩＬ−４またはＩＬ−１０遺伝子配列（ｐｖ免疫化後に続いてｍＲＮＡが過剰発現することが知られている、図２も参照）との相同性が検出されなかった事実から、示したデータは、かかる特異的に発現した遺伝子の最小限の概算であることは明らかである。
【０１０９】
図３に示したクローンに対する配列相同性（比較した配列にわたり、＞８０％相同性）から、これらのクローンはさらに特徴づけられる。クローン８はマウスポリ（Ａ）結合タンパク質と最も高い相同性を有することが示され；クローン１６はラットMRC OX-2と最も高い相同性を有することが示され；クローン２８はヒト  ジンクフィンガータンパク質と最も高い相同性を有することが示された。クローン７１に対して相同性を有する配列は見出されなかった。下記のデータにおいて、ラットｃＤＮＡに対して（ラット胸腺細胞および樹状細胞において選択的に発現するものとして既に特徴付けられた分子、ＯＸ−２について）相同性を示したこれらのクローンの１つの分析を記載した。このクローンのさらなる研究の根本的理由は、門脈を介した樹状細胞の注入が我々のモデル系において同種異系移植片生存を延ばす有効な方法であることを示すデータにある。しかし、門脈を介して注入された骨髄由来樹状細胞自身がＯＸ−２を発現するのに対し（上記参照）、初期の研究（１〜５）のように照射を受けた樹状細胞（ＦＡＣＳ分析によりＯＸ−２-）を門脈を介してうけたマウスから得た組織を用いて、図３に示したものと同じデータが得られていることを特記する。さらに、両方の条件で、我々が移植０．５〜２．５日後に得た組織を使用した場合、この抑制差引きハイブリダイゼーション法によってＯＸ−２  ｍＲＮＡは検出されなかった。これらの結果は、検出されたＯＸ−２シグナルがｐｖ免疫化についでの細胞における新規の発現の増加の結果であるとする考えに一致する。
【０１１０】
ラットＯＸ−２のネズミ等価物の発現のためのｐｖ免疫化マウス組織由来のｃＤＮＡライブラリーのプローブ探索
ｃＤＮＡライブラリーを、材料と物質に記載したように、クロンテック（ClonTech）から購入したキットを使用し、腎移植前に２５×１０6照射（2000Rads）C57BL/6骨髄細胞を用いたｐｖ免疫化を受けたＣ３Ｈマウスの５匹のプールから調製したｍＲＮＡから構築した。クローンをＬＢ培地にまき、ラットＯＸ−２との相同性を示す32gＰ標識アンプリコンを用いてプローブ探索した。1.3Kbクローンを検出し、増幅し、特異的に発現した産物を検出するために32Ｐ標識した後にノザンゲル分析によって示した。自動ＤＮＡシーケンサーおよび蛍光標識デオキシヌクレオチドを用いて配列決定した後に、この1.3kb断片が、ラットＯＸ−２のGeneBank配列から決定したラットＯＸ−２  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域をコードする領域と＞９５％の相同性を有することを見出した。
【０１１１】
プライマー構築プログラムを用いて、ラットGeneBank配列の１〜１９位（５’非翻訳領域とリーダー配列の部分に応答する）を表す５’ＰＣＲプライマーおよび我々の特徴付けたマウス配列に基づく３’プライマーを合成し、長距離増幅を実施して、ラットＯＸ−２遺伝子のネズミ等価物のオープン・リーティング・フレーム（ＯＲＦ）をコードすると予測されるアンプリコンを生産した。このアンプリコンは約1.4Kb長（予測通り）であることを確認した。自動シーケンシングで、３’非翻訳領域とともに、対応するラット産物と＞９０％の相同性を有するＯＲＦを含む、ラットＭＲＣ  ＯＸ−２遺伝子のマウスホモログの完全長配列を得た。この配列をGeneBankに提出した（受け入れ番号AF004023）。
【０１１２】
DNASISプログラムを用い、予測したマウスのタンパク質配列は、Ｂ７−１およびＢ７−２と５１％の相同性を、ＣＤ２８と４８％の相同性およびＣＴＬＡ４と５４％の相同性を有していた（非開示）。
【０１１３】
ｐｖ免疫化後の延長された移植片生存において発現したＯＸ−２ホモログ重要な役割の証明
ＯＸ−２遺伝子によってコードされる生産物の潜在的な重要性を明確にすることを試み、ｐｖ免疫化と腎移植を受けたマウスの移植モデルにおいて市販のラットＯＸ−２に対する抗体を用いた。第１のかかる研究においては、ｐｖ免疫化後のＯＸ−２分子の発現の特異的な増加があるかどうかを調べた。肝単核細胞および脾臓細胞のＯＸ−２およびNLDC145の２重着色を用いたＦＡＣＳ分析によって、ｉｖおよびｐｖ免疫化マウス由来の肝臓または脾臓のNLDC145+細胞の数は類似するが、ｐｖ免疫化後のOX-2+NLDC145+の数は４倍であることを見出した。図４はｉｖ免疫化／移植マウス（パネルＡおよびＢ）またはｐｖ免疫化／移植マウス（パネルＣおよびＤ）由来の脾臓付着細胞のフローサイトメトリープロフィールである。移植７日後に細胞を採取し、対照（クローン107.3）マウスIgG1血清（左側パネル）または抗−ＯＸ−２（右側パネル）およびF(ab')2PE−抗−マウスIgGと同様に、NLDC145およびF(ab')2FITC−抗−ラットＩｇＧで着色した。データは３つの別個の研究のうちの１つを表したものである。示した値は、各象限の全細胞数を表す。ｐｖ免疫化マウスの肝臓または脾臓の２重陽性細胞の無名数（×１０5）は各３．２±０．５および３９±８であった（図４の脾臓付着細胞のＦＡＣＳプロフィール参照）。この４倍の増加は、ｐｖ免疫化に使用した細胞、骨髄由来樹状細胞（約２０％  ＯＸ−２+  上記）または照射全脾臓リンパ細胞（ＯＸ−２-）のいずれか、に無関係であると考えられ、生存ＯＸ−２+（ドナー）細胞の検出のみならず、インビボにおけるＯＸ−２の新規の発現を示唆している。
【０１１４】
ウエスタンブロット、図５、はｐｖ免疫化後のＯＸ−２抗原の増加した発現を示す。ウエスタンブロッティングに用いた技術は既に記載した。図６に記載したグループを用い、腎移植１４日後に試料を得た。新しいラット胸腺細胞（レーン５）を対照として用いた。レーン１および２は３ドナー／グループ（各々、ｉｖ免疫化；ｐｖ免疫化＋抗−ＯＸ−２注入）からプールした試料を表す。レーン３および４の試料はｐｖ免疫化と腎移植のみ（抗体処理なし）を受けた個々のマウス由来のものである。抗−ラットＭＲＣ  ＯＸ−２による着色を図５Ｂに示し；対照抗体（マウスＬｙ２．１に対する）、抗マウスｃＤ８ａによる着色を図５Ａに示した。使用した顕出（developing）抗体は市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗−マウスＩｇＧである。マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照クローン107.3を使用した場合、シグナルは見られなかった（データは示していない）。データは３つの同等の研究のうちの１つを表している。
【０１１５】
腎移植１４日後のｉｖ対ｐｖ免疫化および移植されたマウスの移植脾臓から調製した試料のウエスタン・ブロッティング（図５Ａおよび５Ｂ参照）で、分子量４３Ｋｄと概算された移動バンドの着色が現れ、他で報告されているラット胸腺から単離されたこの分子の広範なグリコシル化のデータに一致した。抗−ＯＸ−２でのインビボ処理とともにｐｖ免疫化を受けたマウスにおいては、ウエスタンブロットにおいて検出可能なシグナルは見られなかった（図５、レーン２参照）。ネズミＩｇＧ１アイソタイプ対照（BALB/C  抗−ＴＮＰ、クローン107.3：未公開）では、着色がみられず、観察されたバンドはＦｃレセプターではないと考えられる。
【０１１６】
図６は移植片％生存  対  腎移植後日数を示す。市販の抗−ＯＸ−２モノクローナル抗体は、ドナー特異的ｐｖ免疫化後の移植片延長を解除するが、抗−マウスＣＤ２８または抗−マウスCTLA4は、解除しない。Ｃ５７ＢＬ／６腎同種異系移植片を受けたＣ３Ｈマウスの６匹のグループは、その他の処理を受けず（シクロスポリンＡのみ―◇―）、または、さらに上記のように１５×１０6Ｃ５７ＢＬ／６骨髄由来樹状細胞によるｐｖ免疫化を受けた（−□−）。これら後者のマウスの一部は、市販の抗−ラットＯＸ−２モノクローナル抗体（−黒三角−）、アイソタイプ対照（クローン107.3、−▽−）、またはマウスに対する抗体ＣＤ２８（−・−）もしくはＣＴＬＡ４（−＊−）の、１００ｍｇ／マウスのｉｖ注入（隔日、×４注入）を受けた。示した異なるグループの生存動物を２の研究からプールした。マウスアイソタイプ対照自身は、ｐｖ免疫化後の増加した腎移植片生存に変化を与えないことを特記する。（p<0.002、マン−ホイットニー、Ｕ検定）。
【０１１７】
最後の２の研究では、上記のようにマウスにｐｖ免疫化および移植をしたが、ここでは市販の抗−ラットＯＸ−２（×４注入；１００ｍｇ／マウス、２日間隔）のｉｖ注入も行った。図５ＡおよびＢならびに６で示したように、これらの抗−ＯＸ−２の注入は、ｐｖ免疫化後にみられる、移植片生存の延長を有意に減少させ（図６）およびＯＸ−２抗原の発現を有意に増加させた（ウエスタンブロッティング、図５Ａおよび５Ｂ）。抗−ＣＤ２８／抗−ＣＴＬＡ４（図６参照）、または、この研究では示していないが、抗−Ｂ７−１もしくは抗−Ｂ７−２を使用した場合、ｐｖ免疫化後の移植片生存に撹乱は見られなかった。
【０１１８】
別個の実験においては、示したように（表２参照）モノクローナル抗体を用いた付加的な治療とともにｐｖ免疫化を受けたマウスから細胞を採取した。抗−ＯＸ−２を用いた治療後は、動物にｐｖ−ドナー特異的移植前免疫化を行った多種のモデル系において発明者が記載したサイトカイン生産の変化（ＩＬ−４およびＩＬ−１０を生産する極性化）はもはや無かった。試験した他の４のモノクローナル抗体のいずれかを用いた処理ではｐｖ免疫化後に見られるサイトカイン生産の極性化における逆転は生じず、ｐｖ免疫化を欠くこれらのモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）単独の使用では、ｐｖ免疫化自身によるものと類似して、移植片生存を増加させる傾向を生じ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を増加させるサイトカイン生産における有意な極性化を生じた（表２上半分）。
【０１１９】
ＯＸ−２は、ラット胸腺細胞および樹状細胞において選択的に発現するものとして、既にバークレー（Barclay）らによって特徴付けられた分子である（1981、1982）。樹状細胞はリンパ球への重要なシグナル伝達細胞であり、サイトカイン生産および移植片拒絶を調節する可能性もあり、また樹状細胞の注入はｐｖ慣用を導入する有効な手段である。発明者は、ｐｖ免疫化後にＯＸ−２発現が増加することを確認し、さらにこれが機能的な結果を有するかどうかを研究した。増加した移植片生存およびサイトカイン生産における極性化とともに（図６および表２）、図４および５に示したように、実際にｐｖ免疫化マウスから単離した脾臓細胞ではＯＸ−２の増加した発現があった。対照的に、インビボの抗−ＯＸ−２の導入は、増加した移植片生存を完全に失わせ、同時に増加した移植片生存と観察された変化したサイトカインプロフィールを逆転した。このデータは、移植片生存の促進におけるＯＸ−２+細胞の可能性のある機能と一致する。
【０１２０】
記載した研究において、門脈を介して注入したドナー樹状細胞はそれ自身ＯＸ−２+である（上記材料と方法の記載を参照）。しかし、ｐｖ注入に照射全脾臓細胞（ＦＡＣＳにより、ＯＸ−２-）を使用した研究において、ＦＡＣＳ分析（図４）およびウエスタンブロット（図５）において、ならびに抑制差引きハイブリダイゼーション（図３）から、同一の結果が得られた。このことは、上記のごとく、移植後初期（１〜２日）の増加したｍＲＮＡ発現の証拠に欠けることに矛盾しない。したがって、ｐｖ免疫化マウスの脾臓において検出された「ＯＸ−２シグナル」は、必然的に注入したＯＸ−２+細胞に由来するものではなく、新たな発現に由来するものであると考えられる。しかし、ＯＸ−２の多形マーカーが無い場合、増加した発現がドナー細胞由来か宿主由来（または双方）かを決定できない。実際に多少驚くべきことに、ラットＯＸ−２に対するネズミ抗体は記載した形式でネズミＯＸ−２と交差反応する。ＯＸ−２のインビボの役割の信頼性の高い分析は、ネズミＯＸ−２ホモログに対して生じた抗体を使用した上記と同様の研究を必要とし、これらの実験は現在進行中である。ｐｖ免疫化は、腎臓／肝臓（本文と図４参照）の検出可能なOX-2+NLDC145+細胞の無名数の４倍の変化のみを導くが、この４倍の相違にも関わらず、移植片生存におけるこの定量的な相違（図６）の役割の証明とともに、ｐｖ対ｉｖ免疫化マウス由来のＲＮＡを使用したノザンゲルにおけるＯＸ−２シグナルの明白な相違（図３）が確認されたことを指摘することも重要である。おそらく、これらの結果は各々、使用したノザンアッセイの感度に対する制限、およびＯＸ−２：ＯＸ−２リガンド相互作用後に生じる「協同刺激」の量的な機能を反映するものである。
【０１２１】
ネズミＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４（Borrielloら、1997）との予測したネズミＯＸ−２タンパク質配列の相同性は約５０％だが、後者の分子に対する抗体はｐｖ免疫化後の延長された移植片生存および変化したサイトカイン生産を逆転させない（図６、表２、および（Castleら、1993）を参照）。実際、ｐｖ免疫化無しに注入された後者の抗体自身が、ｐｖ免疫化によって導入されたサイトカイン生産における同じ変化の一部を生じる。
【０１２２】
例２
ネズミＯＸ−２
この例はネズミＭＲＣ  ＯＸ−２のクローニングおよび配列決定を記載する。
キャップ・ファインダーＰＣＲ  ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Cap Finder PCR cDNA library construction kit）（Clontech）を使用し、５日前に１０×１０6同種異系Ｂ１０．ＢＲ骨髄由来樹状細胞同種異系細胞を門脈（ｐｖ）経由で予め免疫化した生体Ｃ３Ｈマウス由来のＭＬＮ細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築した。本発明者は、ＰＣＲ−選択ｃＤＮＡ差引きハイブリダイゼーションキット（PCR-Select cDNA subtraction hybridization kit）（Clontech）およびｐｖ経路または側方尾静脈を介して免疫化したマウスのプールしたＭＬＮから得たＲＮＡを使用し、既にラットＭＲＣ  ＯＸ−２  ｃＤＮＡの３’非翻訳領域と９８％以上の相同性を有する３５０ｂｐアンプリコンを得ていた。ノザンブロット分析によって、このアンプリコンがｉｖ対ｐｖ免疫化マウスから調整したＲＮＡ中の特異的発現産物を検知することを確認した。このアンプリコンを用いて、増幅ライブラリーの５×１０5クローンをスクリーニングした。ｃＤＮＡクローンの配列は、アプライド・バイオシステム３７７自動シーケンサー（Applied Biosystems 377 Automated Sequencer）を用い、ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング法（Dye Terminator Cycle Sequencing method）（Applied Biosystems, Foster City, CA）を利用して確立した。本明細書で報告したヌクレオチド配列を、GenBank/EMBLデータバンクに受け入れ番号AF004023で提示した。
【０１２３】
図７に示したｃＤＮＡは８３７塩基対のオープンリーディングフレームであり、推定アミノ酸配列は２４８アミノ酸であり、３０が開裂リーダー配列を表す。この、ならびにラットおよびヒトにおける等価分子の予測分子量は、分子に等しく、約２５ｋＤａである。該分子は高度にグリコシル化されており、ラット胸腺における測定分子量は４７ｋＤａである。
【０１２４】
ネズミＭＲＣ  ＯＸ−２は、ラットまたはヒトにおける等価分子との、それぞれ約９２％および７７％の、アミノ酸レベルでの全体にわたる相同性を示す。ラット分子について述べられているように、２０３〜２２９の配列は架橋ドメイン（高度に疎水的な領域）を表していると考えられ、２２９〜２４８の領域は細胞質内領域と考えられ、Ｃ末に隣接した２２９位までの高度に塩基性残基の伸長部がある。
【０１２５】
結合貫通膜およびＣ末領域においては、ラットおよびヒトとの相同性はそれぞれ約９８％および８５％であった。Ｉｇスーパーファミリーの構成員から予測されるように、Ｉｇ様ドメインのβ鎖間にジスルフィド結合を形成する多数の保存Ｃｙｓ残基があり（それぞれ、２１と９１；１３０と１８４）；残基９１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー内で最も高度に保存されたものであることが既に見出されていた。ラットおよびヒトとの、Ｎ末Ｉｇドメイン間の相同性は、隣のＩｇドメインに対し、それぞれ８８％および８２％、または９７％および７３％であった。これらの種における分子に対するリガンド特異性が明らかになれば、Ｖ末Ｉｇドメインにおけるラットとマウス間可変性におけるこの相対的集中はさらに理解可能になりうる。分子の推定細胞外部（１〜２０２）は種にわたって保存されている多数のＮ−グリコシル化部位（４４、６５、7３、８０、９４、１２７、１３０および１５１）を含むことを特記する。これは、腺で発現した物質の測定サイズから推測され、既にラットｃＤＮＡについて報告されている。上記分子の細胞質内領域は既知のシグナル伝達キナーゼと配列相同性を有さず、免疫レセプターチロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ：DXXYXXLXXXXXXXYDXL）の周知の共通配列を有さない。さらに、該分子は、活性化カスケードに他のタンパク質キナーゼを順番に取り込みうるアダプター分子の「ドッキング部位」として働く典型的なＳＨ２またはＳＨ３領域を欠く。したがって、細胞外ドメインのリガンド結合活性は上記分子の生物学的に重要な領域をあらわすと考えられる。ＯＸ―２とのリガンド相互作用に属するいくつかの可能性のある機能を、文献の他のデータから推測できる。相同的な分子、Ｎｇ−ＣＡＭはＮ−結合オリゴ糖残基に結合することが報告されており、プロテインチロシンホスファターゼ免疫応答において重要な調節の役割を果たすことが知られている。さらに最近、Ｉｇスーパーファミリーの別の付着分子メンバーであるＡＬＣＡＭは、その遺伝子がヒトの第３染色体のＯＸ−２遺伝子の近くに位置し、ＣＤ６（スカベンジャーレセプターシステインリッチファミリー、ＳＲＣＲのメンバー）に結合し、ＣＤ６に対する抗体自身が免疫機能調節に役割を果たすことができることが示された。
例３
ＯＸ−２陽性細胞の１型サイトカイン生産阻害
本発明者は、肝臓単核、非実質性細胞（ＮＰＣ）が、同種異系Ｃ５７ＢＬ／６樹状細胞（ＤＣ）をＣ３Ｈ脾臓応答細胞とともにインキュベーションした場合に見られる免疫応答を阻害できることを示した。本発明者は、樹状細胞のＯＸ−２の増加した発現がサイトカイン生産と腎同種異系移植片拒絶反応に関連することもまた見出した。本発明者はさらに肝臓ＮＰＣによる阻害がこれらの細胞によるＯＸ−２発現の機能であることを明らかにした。
【０１２６】
新しいＣ５７ＢＬ／６脾臓由来ＤＣをＣ３Ｈ脾臓応答細胞および他の推定共調節細胞ととのみ培養した。後者は新しいＣ３ＨもしくはＣ５７ＢＬ／６肝臓ＮＰＣ由来、またはヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の静脈内注入によって１０日間処理したＣ３ＨもしくはＣ５７ＢＬ／６マウス由来である。（ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ）を含む骨髄培養由来のネズミ骨髄由来樹状細胞の異なる群をまた、推定調節細胞のソースとして使用した。刺激した全培養の上清の、異なるサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ）の機能的発現を試験した。新しいＣ５７ＢＬ／６脾臓由来ＤＣはＩＬ−２生産を誘導し、ＩＬ−４生産を誘導しないことを見出した。上記ソース由来の細胞はＩＬ−２抑制およびＩＦＮγ生産、ならびにＩＬ−４生産促進およびＴＧＦβ生産促進を示した。阻害は、半定量的ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析によって明らかにしたように、これらの細胞のＯＸ−２の増加した発現に関連した。サイズ分割により、ＯＸ−２発現細胞はＮＬＤＣ１４５+細胞の部分群であった。このデータは慣用の同種異系刺激ＤＣによるサイトカイン生産誘導の調整におけるＯＸ−２発現細胞の役割を暗示する。
【０１２７】
材料および方法
マウス：雄性および雌性Ｃ３Ｈ／ＨＥＪおよびＢ１０.ＢＲ（Ｈ−２k/k）、Ｂ１０.Ｄ２（Ｈ−２d/d）およびＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b/b）をザ・ジャクソンラボラトリーズ、バーハーバー、メイン（the Jackson laboratories、Bar Harbour、Maine）から購入し、５匹／ケージで飼育し、餌および水を自由に摂食させた。すべてのマウスを８〜１２週齢で使用した。
【０１２８】
モノクローナル抗体
特に明記した場合を除き、すべてファーミンジェン（Pharmingen）（San Diego、CA、USA）から入手したモノクローナル抗体（以下、Ｍａｂｓという）を使用した：抗−ＩＬ−２（JES6-1A12；ビオチニル化、JES6-5H4）;抗−ＩＬ−４（11B11；ビオチニル化、BVD6-24G2）；抗ＩＦＮγ（R4-6A2；ビオチニル化、XMG1.2）；抗−ＩＬ−１０（JES5-2A5；ビオチニル化、SXC-1、Pharmingen、San Diego、CA)；マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン107.3、ＢＡＬＢ／Ｃ−抗−ＴＮＰ）；ＰＥ抗−Ｂ７−１／Ｂ７−２(Cedarlane Labs、Hornby、Ontario、Canada）。
【０１２９】
ラット抗−マウスＯＸ−２モノクローナル抗体は、ＬＰＳ刺激ネズミＤＣの粗精製の膜抽出物を用いたラットの免疫化、ついで非分泌ラットミエローマ親細胞ライン（YB2/3Hl.P2.G11.16Ag.20）との融合によってイムノ・プレサイス・アンチボディ（Immuno-Precise Antibodies Ltd.）（Victoria, BC, Canada）が調製したものである。ハイブリドーマ上清を予めウエスタンゲルに流したＤＣ抽出物の４０から４５Ｋｄ調製物でコートしたプレートを使用し、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした（Barclay, A.N. 1981.  Immunology  44:727；Barclay, A.N.およびH.A. Ward.  1982.  Eur. J. Biochem.  129:447）。陽性クローンを完全長ネズミＯＸ−２をコードするｃＤＮＡクローンで形質導入したＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析を使用して再度スクリーニングした（Chen, Z., H. ZengおよびR. M. Gorczynski. 1997. BBA. Mol. Basis Dis. 1362:6-10）。
セロテック、カナダ（Serotec、Canada）から入手したＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ’）2ウサギ抗−ラットＩｇＧ（マウスＩｇＧと非交差応答)を２次抗体として使用した。さらなる分析（Ｍ３Ｂ５）のために選択したＭａｂをセルマックスシステム（CELLMAX system）(Cellco Inc.、Germantown、MD)のバルク中で成長させた。ラット免疫グロブリン粗精製調製物（３０％飽和硫酸アンモニア調製）を対照Ｉｇとして使用した。
【０１３０】
アッセイの特異性を確かめるために抗−サイトカインＭａｂを用いた組織培養アッセイにおいて、使用した関連Ｍａｂ  １０μｇ／ｍｌが試験した５．０ｎｇ／ｍｌまでのサイトカインを中和することを見出した。
【０１３１】
ＮＬＤＣ１４５（抗−マウスＤＣ）もまたセロテック（Serotec）から入手した。組換えマウスＩＬ−４をＬ．ヤング博士（Dr. L. Yang）（The Toronto Hospital）から入手し；マウスｒＧＭ−ＣＳＦをファーミンジェン（Pharmingen） から購入した。組換えヒトＦｌｔ３Ｌ（ＣＨＯ細胞由来）をＡ．Ｂ．トルート博士、イムネックス社、シアトル、ワシントン、ＵＳＡ（Immunex Corp.、Seattle、Washington、USA）から入手した。
【０１３２】
腎移植
腎移植を、実質的に（Gorczynski, R.M.ら、1994a.  Transplantation 58:816-820）の記載と同様に実施した。ハロセインと一酸化二窒素との組み合わせを用いて動物を麻酔し、手術後の微麻酔にノボジェシック（novogesic）を使用した。慣用方法を用いて同所性の腎移植を実施した。要するに、ドナー動物に２００単位のヘパリン（heparin）を与え、除去と左腎摘出したレシピエント動物への移植の前に、腎臓に２ｍｌの氷冷ヘパリン化生理食塩水溶液を流した。移植腎動脈をレシピエントの腹部大動脈に吻合術によって結合し、腎動脈をレシピエントの下大静脈に吻合術によって結合した。手術日とその後２日間、レシピエントにセフォテタン（cefotetan）３０ｍｇ／ｋｇをｉｍ注入した。特に明記しない限り、残った宿主の腎臓を手術２日後に除去した。個々の研究に記載したように、ｐｖ免疫化による、モノクローナル抗体による、または経口免疫化によるレシピエントの処理を行った。
【０１３３】
門脈および経口免疫化
既に記載（Gorczynski, R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231；Gorczynski, R.M.ら.  Transplantation 62:1592-1600）されたように、門脈および経口免疫化を実施した。すべての動物をネンブタル（nembutal）によって麻酔した。正中線腹部切開し、内臓をさらした。３０ゲージ針を用い、上腸間膜動脈を通して、０．１ｍｌで細胞を注入した。注入後、針を直ちに引き出し、２ｍｍ３ゲル泡を用いた穏やかな加圧により血腫形成無しに確実に止血した。
【０１３４】
ｐｖ免疫化用の骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を、ｒＩＬ−４およびｒＧＭ−ＣＳＦとともにインビトロのＴ枯渇骨髄細胞の培養から得た（Gorczynski, R.M.ら.  Transplantation 62:1592-1600）。培養１０日目に、培養ＮＬＤＣ１４５およびＦＩＴＣ抗−ラットＩｇＧ、またはＦＩＴＣ抗−ＣＤ３で着色し、＞９５％ ＮＬＤＣ１４５＋および＜５％ ＣＤ３＋細胞であることを確認した（Gorczynski, R.M.ら. Transplantation 62:1592-1600）。これらの細胞を洗浄し、マウスに注入、または混合白血球培養に用いた。
【０１３５】
細胞調製：
核実験において、個々のマウスから脾臓および骨髄細胞（Gorczynski, R.M.ら. Transplantation 62:1592-1600）懸濁液を無菌的に調製した。肝臓単核非実質性細胞（ＮＰＣ）を実質的に（Gorczynski, R.M.  1994b.  Immunology 81:27-35）の記載と同様に調製した。まず、マウス・リンホパーク（Cedarlane Labs）を通した分離（１５分間、17,000ｒｐｍ、室温）の前に、組織を３７℃、４５分間コラゲナーゼ／ジスパーゼの混合物とともに、消化した。単核細胞を２−めるかぷ戸エタノールおよび１０％胎児子牛血清（ａＦ１０）を添加したａ−最小必須培地（Minimal Essential Medium）に再懸濁した。Ｆｌｔ３Ｌを注入したマウスから細胞を採取し、動物を１０日間毎日Ｆｌｔ３Ｌ  １０ｍｇ／マウスのｉｖ注入で処理した。酵素消化後、これらのマウス由来の肝臓／脾臓細胞の回復は、生理食塩水注入対照と比較して著しく増加した（それぞれ、１２０×１０6、３９０×１０6対７×１０6および１２０×１０6）。
【０１３６】
細胞毒性およびサイトカインアッセイ：
細胞毒性またはサイトカイン生産の誘導を評価するために使用した培養において、３連で、αＦ１０中で照射（２０００Ｒ）刺激細胞で応答細胞を刺激した。サイトカインアッセイのために４０時間目に上清をレプリケートウエル（replicate well）からプールした。刺激の３６および５４時間目の間にアッセイした培養からは、サイトカインレベルにおける再現性のある相違は検出されなかった。いくつかの実験においては、培養に１μＣｉ／ウエル（７２時間目）の3ＨＴｄＲを与え、１４時間後の細胞採取とウエル型βカウンターでの計数により増殖を評価した。
【０１３７】
細胞を５日目の同等培養から培養採取し、プールし、計数し、51Ｃｒ  ＥＬ４（Ｈ２b/b）またはＰ８１５（Ｈ２d/d）とともに異なるエフェクター：標的で再培養して、細胞毒性を測定した。４時間目の上清を採取し、特異的な細胞毒性を評価した。
【０１３８】
ＩＬ−２／ＩＬ−４依存セルライン、ＣＴＬＬ−２およびＣＴ４．Ｓを用いたバイオアッセイによりＩＬ−２およびＩＬ−４活性を分析した。分析の標準化用の組換えサイトカインをジェンザイム（Genzyme）（Cambridge、MA）から購入した。１１Ｂ１１存在下でＩＬ−２分析を構成して、ＩＬ−４とＣＴＬＬ−２の潜在的な刺激を遮断した；Ｓ４Ｂ６存在下でＩＬ−４分析を構成し、ＩＬ−２媒介刺激を遮断した。ＩＬ−２およびＩＬ−４分析において、培養に付加された５０ｐｇの組換えリンホカインを再現性よく検出した。
【０１３９】
さらに、ＥＬＩＳＡアッセイによりＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０を分析した。ＩＦＮγのアッセイでは、Ｒ４−６Ａ２  １００ｎｇ／ｍｌでコートした平底ヌンク（Nunc）プレートを用いた。３連で、様々な希釈率の上清を結合させ、４℃で３回洗浄し、ビオチニル化  抗−ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）を添加した。洗浄後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼとともにプレートをインキュベートし、適当な物質で縣出させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ405を測定した。標準化用組換えＩＦＮγをファーミンジェン（Pharmingen）から入手した。ＪＥＳ５−２Ａ５をキャプチャー抗体として、ビオチニル化ＳＸＣ−１を縣出（developing）抗体として使用し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０を同様に分析した。標準化用ｒＩＬ−１０をペプロ・テック社（Pepro Tech Inc.）（Rocky Hill, NJ）から入手した。各分析で、サイトカイン  ０．１ｎｇ／ｍｌを検出した。ＩＬ−２およびＩＬ−４のＥＬＩＳＡアッセイではＪＥＳ６−１Ａ１２および１１Ｂ１１をキャプチャー抗体として使用し、ＪＡＳ６−５Ｈ４またはＢＶＤ６−２４Ｇ２を縣出（developing）抗体として使用した。各サイトカインの縣出感度は２０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−２およびＩＬ−４のバイオアッセイとＥＬＩＳＡとの間の相関性を確認したところ、良好であった（ｒ＞０．９０）。以下に報告したすべての研究においては、ＥＬＩＳＡアッセイのみのデータを示した。いくつかの研究（例えば、図１４、１６、１７）からサイトカインデータを蓄積したところ、サイトカイン生産の確かな値は上記のように分析の標準化に市販の組換えサイトカインを用いて得られた。Ｃ３Ｈ抗−Ｃ５７ＢＬ／６培養からの上清は、上記の条件下で、再現性よくそれぞれ、９５０±２００ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−２および８０±２５ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含んでいた。
【０１４０】
ＲＮＡ調製
ＲＮＡ抽出のために、（Gorczynski, R. M. 1995a.  Cell. Immunol. 160:224-231）の記載のように、雄性マウス由来のＤＣおよび腎臓同種異系移植片を与えた腎臓同種異系雌性マウス由来の組織の異なるソースを採取した。各試料のＯＤ２８０／２６０を測定し、オリゴ（ｄＴ）プライマー（27-7858：Pharmacia、USA）を用いて逆転写を実施した。水でｃＤＮＡを希釈して、全容量１００ｍｌとし、ネズミＧＡＰＤＨ、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＯＸ−２用プライマーを用いたＰＣＲに使用するまで−７０℃で凍結した。センス（ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）プライマーの合成は、開示された配列を用いて、バイオテクノロジー・サービス・センター、小児病院、トロント（the Biotechnology Service Centre、Hospital for Sick Children、Toronto）によって行われた。５’プライマーを３２Ｐ末端標識し、エタノール沈殿による精製後の特異的活性レベルと同等にした。ＰＣＲによって５ｍｌｃＤＮＡを３５サイクル増幅し、試料を１２．５％ポリアクリルアミドゲルで分析し、オートラジオグラフィーのために一晩（１８時間）曝露した。Ｈ−Ｙプライマーセットを用いた対照研究において、この技術の信頼性は、１：１０５の濃度で雄性細胞を添加した雌性脾臓細胞の抽出物由来のＨ−ＹｍＲＮＡを検出するものである（Gorczynski, R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski, R.M.ら.  Transplantation 62:1592-1600）。異なるＰＣＲ産物の発現の定量的な比較には、オートラジオグラムの濃度スキャンを用いた。
ＧＡＰＤＨセンス：   5'TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3'
ＧＡＰＤＨアンチセンス：   5'TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT3' 
Ｂ７−１センス：   5'CCTTGCCGTTACAACTCTCC3'
Ｂ７−１アンチセンス：   5'CGGAAGCAAAGCAGGTAATC3'
Ｂ７−２センス：   5'TCTCAGATGCTGTTTCCGTG3'
Ｂ７−２アンチセンス：   5'GGTTCACTGAAGTTGGCGAT3'
ＯＸ−２センス：   5'GTGGAAGTGGTGACCCAGGA3'
ＯＸ−２アンチセンス：   5'ATAGAGAGTAAGGCAAGCTG3'
【０１４１】
統計学的分析：
多様な群の研究で、ＡＮＯＶＡを実施し、有意性を比較した。いくつかの場合では（個々の状況による）、ついで群間の対の比較も実施した。
【０１４２】
結果
抗原刺激は、肝臓ＮＰＣ存在下において、養子移入での増殖とＩＬ−２生産を促成する能力を有する細胞群の発達を誘導する：
以前の原稿（Gorczynski, R. M.ら、Transplantation. 66: 000-008）において、同型のＮＰＣおよび同種異系(Ｃ５７ＢＬ／６)ＤＣ存在下で刺激したＣ３Ｈ樹状細胞が、Ｃ５７ＢＬ／６ＤＣで刺激した新しい樹状細胞由来のＩＬ−２精製を抑制し、およびインビボのＣ５７ＢＬ／６腎同種異系移植拒絶反応の抑制の可能性を有する細胞群を生じることを報告した。このＮＰＣの機能がＭＨＣ限定のものかどうかを確かめるために、下記の研究を実施した。
【０１４３】
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b/b）脾臓細胞をインビトロで、これにつづくＮＰＣ：Ｃ５７ＢＬ／６；Ｂ１０．ＢＲ；Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ−２d/d）存在下／非存在下で、Ｂ１０.ＢＲ（Ｈ−２k/k）骨髄由来ＤＣで刺激した。さらに、対照培養をＮＰＣのみとともにインキュベートした。これらのもとの部分試料で、増殖およびＩＬ−２／ＩＬ−４性酸を測定した。さらに、５日目に。もとの培養の他の組から細胞を採取し、洗浄し、２×１０5細胞を５×１０6の新しいＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞およびＢ１０．ＢＲ  ＤＣを含む培養に添加した。標準的な形式でこれらの後者の培養の増殖およびサイトカイン生産を測定した。３つの同等の研究から蓄積したデータを図９のパネルＡ）およびＢ）に示した。
【０１４４】
図９は本明細書に記載した方法に従った肝臓ＮＰＣを用いる同種異系ＤＣによる刺激後のサイトカイン生産と細胞増殖の調節を示す棒グラフである。
パネルＡ）では、５×１０6  Ｃ５７ＢＬ／６応答脾臓細胞単独（群１）、または２×１０5Ｂ１０．ＢＲ  ＤＣ（群２）とともに、培養を開始した。別の群（それぞれ、３〜５および６〜８）はＣ５７ＢＬ／６応答細胞、および、それぞれ（３〜５）Ｃ５７ＢＬ／６；Ｂ１０．ＢＲ；Ｂ１０．Ｄ２由来の２×１０5ＮＰＣを含み、またはこれらと同一のＮＰＣおよびＢ１０．ＢＲ  ＤＣ（６〜８）を含んだ。データは、３つの別個の研究における３連の培養から得た増殖およびサイトカイン生産の平均値を示す。パネルＢ）では、３連で、２×１０5Ｂ１０．ＢＲ  ＤＣ単独で、または上パネルに示した培養から採取した２×１０5細胞も加えて刺激した５×１０6Ｃ５７ＢＬ／６応答脾臓細胞の培養の増殖およびサイトカイン生産を示す。さらに、データは、３つの別個の実験の算術平均値を示す。*Ｐ＜０．００５  対照培養（各パネルの左端）と比較。
【０１４５】
多くの興味深い点がある。上記のように、同種異系（Ｂ１０．ＢＲ）ＤＣで刺激した細胞への脾臓応答細胞（この場合Ｃ５７ＢＬ／６）と同系のＮＰＣの添加は、ＤＣ単独で刺激した細胞と比較して、上記応答細胞の増殖とＩＬ−２生産の減少を導いた（図９の上パネル、パネルＡ）の群６と２を比較）。対照のＩＬ−４生産は促進された。ＮＰＣ単独では、応答細胞と同系か異系かに関わらず、明確な効果を生じなかった（図９のパネルＡ）、群３〜５）。さらに、ＤＣ＋ＮＰＣ混合物を与えた１次培養由来の細胞は、同じ（Ｂ１０．ＢＲ）ＤＣとの２次培養において、刺激した新しい脾臓細胞の増殖とＩＬ−２生産を抑制できた（ＩＬ−４生産の促進に対し）（図９のパネルＢ参照）。しかし、この図のデータには別の重要な点がある。Ｂ１０．ＢＲ  ＮＰＣ（ＤＣ刺激−図９パネルＡ）群８とＭＨＣ一致）、または第三者Ｂ１０．Ｄ２  ＮＰＣ（脾臓応答細胞および同種異系刺激ＤＣ−図９パネルＡ）群７の双方とＭＨＣ不一致）とともに、のどちらを使用しても同じ１次培養での増殖／ＩＬ−２生産の抑制が観察された。さらに、Ｂ１０．ＢＲまたはＢ１０．Ｄ２  ＮＰＣ単独で刺激した培養（群４および５）では明確な効果は観察されなかった。最終的に、Ｂ１０．ＢＲまたはＢ１０．Ｄ２のいずれか由来のＤＣおよびＮＰＣで刺激した１次培養から採取した細胞もまた、Ｂ１０．ＢＲ  ＤＣで刺激した２次Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞培養の増殖／ＩＬ−２生産を抑制した。さらに、ＮＰＣ単独での１次培養から採取した細胞はかかる抑制を生じなかった（図９パネルＢ参照）。したがって、１次培養において２次培養で測定された抑制の誘導と同様に、増殖／ＩＬ−２生産の抑制およびＩＬ−４生産の促進が観察され、ＮＰＣによってすべてが誘導され、ＭＨＣ制限的ではなかった。
【０１４６】
肝臓ＮＰＣによる阻害／抑制の特異性
図９などに示したデータの解釈は、ＮＰＣがＤＣ刺激した細胞へ、ＤＣ自身による抗原シグナルとは区別されるシグナルを伝達するというものである（および、ＭＨＣ非制限的）。このシグナルはＤＣによる抗原特異的シグナルを調節する。図９に示した免疫調節の抗原特異性を評価するために、下記の実験を実施した
【０１４７】
Ｂ１０．ＢＲまたはＢ１０．Ｄ２マウス由来のＮＰＣの存在下／非存在下で、Ｂ１０．Ｄ２またはＢ１０．ＢＲ骨髄由来ＤＣを用いＣ５７ＢＬ／６脾臓応答細胞を刺激した。上記のように、これらの培養の部分試料で増殖およびサイトカイン生産を測定した。さらに、これらの１次培養から採取した細胞のさらなる部分試料を、Ｂ１０．ＢＲ（図１０パネルＢ））またはＢ１０．Ｄ２（図１０パネルＣ）ＤＣで刺激した新しいＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞の培養に添加した。さらに、増殖およびサイトカイン生産を測定した。３つのかかる研究から蓄積したデータを図１０に示した。
【０１４８】
図１０Ｃは肝臓ＮＰＣによる増殖およびサイトカイン生産の抑制の特異性を示す（詳細は、図９および図９の記載を参照）。パネルＡ）では、３連で、３日間２×１０5Ｂ１０．ＢＲまたはＢ１０．Ｄ２  ＤＣと、Ｂ１０．ＢＲまたはＢ１０．Ｄ２マウス由来のＮＰＣとで／または該ＮＰＣなしで、Ｃ５７ＢＬ／６樹状細胞５×１０6を刺激した。データは３回繰り返した研究の算術平均を示す。パネルＢ）およびＣ）では、３連で、Ｂ１０．ＢＲ  ＤＣ（パネルＢ）またはＢ１０．Ｄ２  ＤＣ（パネルＢ）のいずれかと、１次培養由来の付加的細胞２×１０5とともに／または該細胞なしで、新しいＣ５７ＢＬ／６応答脾臓細胞を培養した。さらに、データは３つの研究の増殖／サイトカイン生産の算術平均を表す。
*Ｐ＜０．００５  対照培養（各パネルの左端）と比較。
【０１４９】
１次培養（パネルＡ））のデータは、図９での観察を再現し、抗原およびＭＨＣ−非制限的形式で、ＮＰＣがＤＣで刺激した応答細胞の増殖およびＩＬ−２生産を抑制することを示す。しかし、この図のパネルＢ）およびＣ）のデータは、これらの１次培養由来の細胞を用いた抑制の養子移入が、抑制の誘導に用いたＮＰＣではなく、１次培養に用いたＤＣの抗原特異性に影響を受け、抗原制限的形式で起こることを明確に示している。したがって、ＮＰＣ群のこれらの補助的細胞は、「抑制誘導の促進細胞」である機能的性質を有する。他の研究（データは示さず）において、最終的な分析系が同種異系標的細胞に対する細胞毒性の測定を含むところ、ＤＣおよび肝臓ＮＰＣで刺激した１次培養から採取した細胞を使用し、同様の溶解（サイトカイン生産以外に）の抑制が観察されたことを特記する（Gorczynski, R. M., et al. 1998a. Transplantation. 66: 000-008参照）。
【０１５０】
Ｆｌｔ３Ｌ処理マウスからの肝臓細胞長調製物は潜在的なＤＣおよび「促進」細胞のソースである：
同種異系抗原のｐｖ注入、または肝臓由来同種異系単核細胞のｉｖ注入がレシピエント動物に有効な非応答性を導入することを十分に報告した（Gorczynski, R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231；Gorczynski, R.M. ら.  Transplantation 62:1592-1600；Gorczynski, R.M. ら. 1994a.  Transplantation 58:816-820.；Gorczynski, R. M., および D. Wojcik. 1992. Immunol. Lett. 34:177-182；Gorczynski, R. M. ら. 1995b. Transplantation. 60:1337-1341）。正常なマウスから回収した全肝臓単核細胞の数は、５×１０6細胞／マウスであった。回収率を増加させ、肝臓自身が同種異系刺激ＤＣおよび「促進」細胞の双方のソースとなる可能性を探索するため、２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに１０日間毎日、既知のＤＣの増殖因子（Steptoe, R. J. ら. 1997. J Immunol. 159:5483-5491）であるヒトＣＨＯ由来Ｆｌｔ３Ｌ  １０ｍｇ／マウスをｉｖ注入した。これらのドナーから肝臓組織を採取し、プールし、上記、材料および方法の部分に記載したように単核細胞を調製した（平均１３０×１０6細胞／ドナー）。単位重力沈降技術（Miller, R. G., および R. A. Phillips. 1969. J. Cell. Comp. Physiol. 73:191-198）を用いて大きさによりさらに副次分割した。回収した細胞の典型的な大きさのプロフィールを図１１に示した（３つの研究のうちの１つ）。
【０１５１】
図１１はＮＰＣの副次集団におけるＯＸ−２発現を示す。これは、Ｆｌｔ３Ｌ−処理Ｃ５７ＢＬ／６マウスから１０日目に単離した細胞の沈降分析（細胞プロフィール）およびＦＡＣＳ分析である。２匹のＣ５７ＢＬ／６７マウスに毎日１０日間Ｆｌｔ３Ｌ  １０μｇ／マウスをｉｖ注入した。肝臓ＮＰＣを４℃で、３時間沈降させ、示した分画を回収した（それぞれ、分画１〜４は、沈降速度２．５〜３．８、３．８〜５．１、５．１〜６．４および６．４〜８．０ｍｍ／ｈｒ）。３連で、細胞の部分試料を示したＭａｂで着色した。細胞のリマインダーを図１２〜１４で用いた。データは３つの研究から蓄積した。
【０１５２】
これらの同じ研究において、図１１に示した種々の分画を下記のように試験した。まず、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＮＬＤＣ１４５に対する、ＦＩＴＣ−標識Ｍａｂで細胞を標識し、ラット抗−マウスＯＸ−２（Ｍ３Ｂ５）をＦＩＴＣ抗−ラットＩｇＧを２次抗体として用いて着色した。さらに、異なる細胞試料から抽出したｍＲＮＡのＧＡＰＤＨ、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＯＸ−２の発現をＰＣＲで分析した。データを図１１に示した（３つの別個の研究から蓄積）および図１２（代表的なＰＣＲデータは１の実験のものである）。
【０１５３】
図１２は肝臓ＮＰＭＣにおけるＢ７−１、Ｂ７−２およびＯＸ−２のＰＣＲ検出を示す。これはＦｌｔ３Ｌ処理マウス（図１１）から単離した種々の肝臓ＮＰＭＣ細胞分画におけるＯＸ−２、Ｂ７−１およびＢ７−２のｍＲＮＡ発現のＰＣＲ分析である。データは３つの研究のうちの１つの代表的なものである。
【０１５４】
さらに上記細胞の部分試料を用いて、培養中の新しいＣ３Ｈ脾臓応答細胞を刺激した。上記のように（図９参照）、増殖およびサイトカイン分析を実施し、さらにこれらの１次培養から細胞を採取し、Ｃ３Ｈ脾臓応答細胞およびＣ５７ＢＬ／６骨髄由来ＤＣの新しい２次培養に添加した。さらに、これらの２次培養の増殖およびサイトカイン生産を分析した。このタイプの３つの研究から蓄積したデータを図１３（パネルＡ）およびＢ））に示した。
【０１５５】
図１３は、Ｆｌｔ３Ｌ処理マウス由来の肝臓ＮＰＭＣがＩＬ−２およびＩＬ−４生産の結果を与えたことを示す。Ｆｌｔ３Ｌ処理マウス由来ＮＰＣによる増殖／サイトカイン生産の刺激、およびその抑制（別個のＤＣ集団によって刺激を導入する場合）は、異なる細胞集団の機能である（詳細には、本文および図１１〜１２参照）。Ｆｌｔ３Ｌ処理Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝臓ＮＰＣ分画を引き出し、３連で、これを単独で、または骨髄由来Ｃ５７ＢＬ／６  ＤＣ存在下で用いてＣ３Ｈ脾臓細胞を刺激した（パネルＡ参照）。さらに、これらの１次培養から採取した細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６  ＤＣを用いて刺激した新しいＣ３Ｈ脾臓細胞に添加し（パネルＢ参照）、さらに増殖／サイトカイン生産を分析した。*Ｐ＜０．００５  対照培養（各パネルの左端）と比較。
【０１５６】
最後に、様々な分画由来の細胞を、抗原チャレンジとしてＣ５７ＢＬ／６腎臓同種異系移植片も与えたＣ３Ｈマウス  ２匹／群に注入した。移植１０日後に、これらの個々のマウスから脾臓細胞を採取し、サイトカインとともにＣ５７ＢＬ／６またはＢ１０．Ｄ２  ＤＣを用いて、培養中、再刺激し、４０時間目にサイトカインを測定した（図１４）。
【０１５７】
図１４は、Ｃ５７ＢＬ／６腎同種移植片を有するＣ３ＨマウスおよびＦｌｔ３処理Ｃ５７ＢＬ／６ドナー由来ＮＰＣからの細胞のサイトカイン生産を示す棒グラフである。腎移植同種異系移植片レシピエントへｉｖ注入したＯＸ−２+ＮＰＣは、それらのマウスから採取しインビトロで再刺激した脾臓細胞における極性化を導いた。標準的な形式（材料および方法を参照）で、Ｆｌｔ３Ｌ処理Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＮＰＣ分画を、Ｃ５７ＢＬ／６腎臓同種異系移植片（ＣｓＡとともに）を与えたＣ３Ｈレシピエント  ２匹／群へｉｖ注入した。移植１４日後のマウスを使用し、３連で、脾臓細胞をＣ５７ＢＬ／６  ＤＣ刺激細胞を用いてインビトロで刺激した。６０時間目にこれらの培養の上清のサイトカインを分析した。データは、このタイプの３つの研究における培養から蓄積した算術平均を示す。*Ｐ＜０．００５  対照培養（各パネルの左端）と比較。
【０１５８】
図１１のデータは、Ｂ７−１および／またはＢ７−２発現細胞との比較で、遅沈降細胞の明確な副次集団がＦｌｔ３Ｌ処理マウスから採取した細胞においてＯＸ−２を発現することを示す。通常のＯＸ−２およびＢ７−２の発現は同等の副次集団で起こった。速沈降細胞（図１１、分画３および４）は、ＮＬＤＣ１４５の着色で、主にＢ７−１について陽性であり、Ｂ７−２またはＯＸ−２については陽性でなかった。細胞集団のＦＡＣＳ分析（図１１）およびｍＲＮＡのＰＣＲ分析（図１２）の双方で同様の結論が得られた。
【０１５９】
これらの異なる細胞集団の機能的能力を調査し、最適な直接刺激（または増殖およびＩＬ−２生産）はＢ７−１発現細胞（図１３のパネルＡ）、分画３および４）で観察され、ＯＸ−２発現細胞のみが２段階培養系（図１３パネルＢ））において初期に明確な（図９および１０）抑制効果を生じさせられることを見出した。これらの同一の細胞（分画１および２）は順に、ｉｖ注入後、インビトロの刺激において腎同種異系移植片を与えたマウス由来の細胞を極性化し、優勢的にＩＬ−４，ＩＬ−１０およびＴＧＦβ生産を生じることができた（図１４）。これらのデータは、マウスのＦｌＴＬ処理後、肝臓で、免疫調製を促進する別個の（促進）細胞集団も含む免疫刺激ＤＣ集団の拡大が生じるという考えに一致する。
【０１６０】
Ｆｌｔ３Ｌ処理マウス肝臓由来の「促進」活性を有する細胞集団がインビボの移植片生存を延長することの証明
ＩＬ−２生産を減少させ、再刺激した細胞のＩＬ−４生産を増加させる処理（ｐｖ免疫化のごとき）と移植片生存の延長との間に高い相関関係があること（Gorczynski, R. M., および D. Wojcik. 1994. J. Immunol. 152:2011-2019；Gorczynski, R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231；Gorczynski, R.M. ら.  Transplantation 62:1592-1600）、また、ＯＸ−２の発現の増加もまた、どくりつしてｐｖ免疫化後の移植片生存の増加に関係すること、（Gorczynski, R. M. ら. 1998b. Transplantation. 65:1106-1114）はよく報告されている。次なる疑問は、インビトロで抑制機能を導入し（図９、１０および１３）、増加した量のＯＸ−２を発現する（図１１、１２）、Ｆｌｔ３Ｌ処理マウスから単離した細胞
自身がインビボの移植片生存の増加を促進する能力を有するかどうかである。
【０１６１】
上記のように、２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、１０日間  Ｆｌｔ３Ｌ  １０ｍｇ／マウスのｉｖ注入を行った。酵素消化によりその肝臓から細胞を単離し、単位重力沈降により分画した。細胞４プールを回収し、上記のように抗−ＯＸ−２を用いたＦＡＣＳにおいて部分試料を着色した。Ｃ３Ｈマウス２匹の群に、４つの別個のプールからの１０×１０6細胞ｉｖを行った。対照群には生理食塩水注入のみを行った。つづく４８時間にわたり、すべてのマウスにＣ５７ＢＬ／６腎移植をおこなった。移植日にすべてのマウスにＣｓＡ（１０ｍｇ／Ｋｇ）を与えた。図１５のデータは、このタイプ（６マウス／群を表す）の３つの研究から蓄積したものであり、これら５つの異なる群の動物生存を示す。
【０１６２】
図１５は、レシピエントＣ３Ｈマウスにｉｖ注入した、Ｆｌｔ３Ｌ処理Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＮＰＣがＣ５７ＢＬ／６腎臓同種異系移植片拒絶反応を抑制することを示す。２のマウス群に図１１および１２に示したＦｌｔ３Ｌ処理マウス由来のＮＰＣの異なる副次集団を与えた。分画１および２はＯＸ−２+である。マウスに、ＣｓＡとともにＣ５７ＢＬ／６腎臓同種異系移植片を与えた（材料および物質参照）。再終点として、動物生存をたどった。示したデータは、このタイプの３つの研究から蓄積したものである。*Ｐ＜０．００５  ＣｓＡのみ与えたマウス（黒四角）と比較。
【０１６３】
この図から、ＯＸ−２を発現する肝臓細胞のみがｉｖ仲丹生後の移植片生存の増加を促進する能力を有することが明らかである（図１１および１２の分画１および２参照）。図１３のデータとのこれらのデータの比較により、２段階分析系を使用し、これらの細胞集団を機能的「促進」活性を有する細胞として同定できることが確かめられた（図９および１０も参照）。これらの分画におけるＯＸ−２発現の比較的等価なレベルにおいて、この実験で、ＮＰＣ−Ｆｘ１またはＮＰＣ−Ｆｘ２を与えた群の間で、生存の有意な差はなかった（図１１）。
【０１６４】
インビトロで、抗−ＯＸ−２モノクローナル抗体は、肝臓ＮＰＣによって導入された調節を逆転する：
最終的な研究は、Ｃ３Ｈ脾臓応答細胞の培養に添加した抗−ＯＸ−２モノクローナル抗体Ｍ３Ｂ５、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の同種異系（Ｃ５７ＢＬ／６）ＤＣおよびＮＰＣが、２次培養において新しく刺激した応答細胞（図９、１０および１３参照）のかかるサイトカイン応答を抑制できるかどうかに関した。図１６および１７のデータは、このタイプの３つの研究から蓄積したものである。
【０１６５】
図１６は一次同種刺激に対する抗−Ｂ７−１、抗−Ｂ７−２および抗−ＯＸ−２の影響を示す。これは、抗−ＯＸ−２  Ｍａｂが、Ｃ５７ＢＬ／６  ＤＣによるＣ３Ｈ応答脾臓細胞の刺激後、ＩＬ−２サイトカイン生産を増加させたことを示している。６０時間目にサイトカインを分析した。すべてのデータは３回繰り返した研究から蓄積した算術平均である。*Ｐ＜０．００５  対照培養（左端）と比較。
【０１６６】
図１７は、抗−ＯＸ−２がＮＰＣによる抑制を逆転することを示す棒グラフである。それは、肝臓ＮＰＣと一緒にインキュベーション後、抗−ＯＸ−２Ｍａｂが免疫調節細胞の発達をイン・ビトロで抑制することを示す。Ｃ３Ｈ応答脾臓細胞を３連でＮＰＣに加えてＣ５７ＢＬ／６ ＤＣと一緒にインキュベートした（図９および１０参照）。これらの培養物の小群は、示されるモノクローナル抗体を含有した。培養物中、６０時間でサイトカインをアッセイした（パネルＡ）。さらに、全群から細胞を採取し、洗浄し、新しいＣ３Ｈ応答脾臓細胞およびＣ５７ＢＬ／６ ＤＣに加えた（パネルＢ）。６０時間後、これらの群中のサイトカインをアッセイした。全データは、３回実験を繰り返してまとめた計算平均を示す。*Ｐ＜０．０５は、モノクローナル抗体を加えないＮＰＣ培養物由来の対照群と比較した（図の一番左、図１６も参照のこと）。
【０１６７】
一次培養物は、Ｃ３Ｈ応答脾臓細胞およびＣ５７ＢＬ／６ＤＣのみを含有するもの（図１６）、またはＣ５７ＢＬ／６ＮＰＣを加えた同一混合物の２つのタイプがあった。これらの培養のサブセットは、さらに、５μｇ／ｍｌの抗−Ｂ７−１、抗−Ｂ７−２または抗−ＯＸ−２のいずれかを含有した。ＤＣのみの存在で刺激された応答細胞由来の上澄液をサイトカイン産生について６０時間後にアッセイした（図１６）。ＤＣおよびＮＰＣの両方と一緒にインキュベートした一次培養物の場合、上澄液を６０時間で採取し、サイトカイン産生について試験した（図１７Ａ）。さらに、細胞を５日後に採取し、洗浄し、新しいＣ５７ＢＬ／６ ＤＣを含有する新しいＣ３Ｈ応答細胞の２次培養液に加えた。該２次培養段階ではモノクローナル抗体を加えなかった。これらの２次培養物のサイトカイン産生についてのデータを図１７Ｂに示す。
【０１６８】
抗−Ｂ７−１または抗−Ｂ７−２をＤＣで刺激された脾臓培養物へ添加すると、サイトカイン産生の抑制が導かれたが（図１６）、対照的に、抗−ＯＸ−２モノクローナル抗体はこれらの一次培養物中のＩＬ−２産生の増加を導いた（図１６）。発明者らは、同様の知見を報告している（Raghebら、submitted for publication）。興味深いことに、抗−ＯＸ−２は、これらの一次培養物においてＮＰＣによって引き起こされたサイトカイン産生の抑制を破壊した（図１７Ａ参照、また、図９、１０および１３も参照のこと）。さらに、抗−ＯＸ−２は、サイトカイン産生の抑制を新たに刺激された脾臓細胞に移入できる細胞集団の機能的発達を妨げた（図１７Ｂ）。
【０１６９】
考察
抗原特異的寛容の状態をリンパ系集団において誘導できるメカニズムの理解において、考慮すべき理論的で実際的な興味が存在する。一例ではあるが、寛容の効果的な誘導は、より成功的な異種性（および外来性）移植に対する主要な挑戦を示す（Akatsuka, Y., C. Cerveny, and J. A. Hansen. 1996. Hum. Immunol. 48:125-134）。移植前（または中）のドナー特異的免疫化がどうのようにかかる状態を生ずるのかを探求するにあたり、著しい努力が注ぎ込まれてきた（Qian, J. H. et al. 1985. J. Immunol. 134:3656-3663; Kenick, S., et al. 1987.   Transpl. Proc. 19:478-480; Gorczynski, R. M. 1992.  Immunol. Lett. 33:67-77; Thelen, M., and U. Wirthmueller. 1994.  Curr. Opin. Immunol. 6:106-112; Akolkar, P. N. et al. 1993. J. Immunol. 150 (April 1):2761-2773; Ahvazi, B. C. et al.  J. Leu. Biol. 58 (1):23-31; Albina, J. E. et al. 1991.  J. Immunol. 147:144-152）。門脈（ｐｖ）免疫化がどうにか寛容誘導を導くという好ましい証拠があり、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮγの産生減少およびＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＧＦβの増加を伴う宿主細胞由来のサイトカイン産生の変化を追跡することによって、この免疫調節を明らかにモニターすることができる（Thelen, M., and U. Wirthmueller. 1994.  Curr. Opin. Immunol. 6:106-112; Gorczynski, R. M. et al. 1998a. Transplantation. 66: 000-008）。にもかかわらず、これらのサイトカインのうちどれが直接および偶然に関わるのかは、不明なままである。
【０１７０】
ｐｖ免疫化後に寛容を誘導できる細胞集団のさらなる分析は、ドナー樹状（ＤＣ)細胞が優れた寛容化（tolerizing）集団を示したという多少逆説的な観察を導いた（Gorczynski, R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski, R.M. et al.  Transplantation 62:1592-1600）。抗原を間欠的に投与したＤＣは通常、最良の免疫化計画を示すと考えられるので、ＤＣ ｐｖ免疫化後に活性化され、寛容を導いたメカニズム（Gorczynski, R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski, R.M. et al.  Transplantation 62:1592-1600）は、興味深かった。起源、細胞表面表現型、イン・ビボでの反転およびおそらく機能に関して、ＤＣ自体が極端に異種性の集団を示すことはすでに明白である（Salomon, B. et al. 1998. J. Immunol. 160:708-717; Leenen, P.J.M. et al. 1998. J. Immunol. 160:2166-2173）。マウスリンパ節において、少なくとも３つの別個の集団が同定され、その１つは、おそらくリンパ性起源の未熟な表現型を有する小型ＣＤ８α+ＮＬＤＣ１４５+細胞を含み、その数はイン・ビボでのＦｌｔ３Ｌ処理後に大いに増加した（ｘ１００）（Salomon, B. et al. 1998.  J. Immunol. 160:708-717）（後者の投与は樹状細胞および造血起源の他の細胞の増殖を導くと報告されている（Maraskovsky, E. et al. 1996.  J. Exptl. Med. 184:1953-1962））。これらの細胞は、脾臓白色髄のＴ細胞領域に見られる指状構造ＤＣに似ており、他の（脊髄由来）ＤＣによって誘導される免疫の調節に関係していた（Salomon, B. et al. 1998.  J. Immunol. 160:708-717; Kronin, V. et al. 1996. J. Immunol. 157:3819-3827; Suss, G., and K. Shortman. 1996. J. Exptl. Med. 183:1789-1796）。
【０１７１】
種々の他の研究は、抗原提示後の免疫（対 寛容）の誘導が、ＤＣの表面の他のシグナル性リガンド（細胞表面の適当なカウンター−リガンド（例えば、刺激性Ｔ細胞）と相互作用する）の共存に本質的に依存したことを示した（Larsen, C. P. et al. 1994. J. Immunol. 152:5208-5219; Lenschow, D. J. et al. 1996. Annu. Rev. Immunol. 14:233-258; Larsen, C. P., and T. C. Pearson. 1997. Curr. Opin. Immunol. 9:641-647）。門脈を介したＤＣの注入が、抗原が別の免疫原ＤＣと共に提示されたとき、その生物学的機能が免疫ではなく寛容の誘導を促進する特有の細胞表面リガンドの発現によって区別できる別の細胞集団を取り込むことによって、寛容を誘導すると推測された。この仮説を支持するいくつかの予備的な証拠が近年報告された（Gorczynski, R. M. et al. 1998a.  Transplantation. 66: 000-008）。本明細書において、これを促進細胞と称する。さらに、ｐｖ免疫化は新規分子、ＯＸ−２（ＤＣ上に発現されることが以前に報告されている）の発現増加に関連することが示されたので（Barclay, A.N. 1981.  Immunology  44:727; Barclay, A.N., and H.A. Ward.  1982.  Eur. J. Biochem.  129:447; Chen, Z. et al. 1997. BBA. Mol. Basis Dis. 1362:6-10; Gorczynski, R. M. et al. 1998b. Transplantation. 65:1106-1114）、該分子は実際、記載の仮説的促進細胞の「マーカー」として働くと推測された。本明細書に報告される実験は、かかる仮説と一致する。
【０１７２】
本明細書には、肝臓ＮＰＣ集団内にＭＨＣに制限されない方法で同種異系ＤＣによる刺激を抑制することができ（図９および１０参照）、抗原特異的免疫調節細胞集団のイン・ビトロでの発達を誘導することができる（図９および１０参照）細胞のサブセットが存在することが示される。該「促進細胞」相互作用のＭＨＣに制限されない性質は、それが共同刺激相互作用の最初の記載（Jenkins, M. K. et al. 1988. J. Immunol. 140:3324-3329）に類似の方法で、記載の同種異系混合白血球反応においてＴ細胞を刺激するＤＣに補助的なシグナル（共同刺激シグナルではなく調節シグナル）を提供することによって機能することを示す。結果として、刺激されたリンパ球はそれらのサイトカイン産生プロファイルを改変し（ＩＬ−２産生および増殖の減少を伴う）、新たに刺激されるリンパ球に見られる免疫応答を調節することができるようになる（図９および１０のパネルＢ参照）。最も興味深いことに、Ｆｌｔ３Ｌ処理によるイン・ビボでのＤＣの膨張後、実際、肝臓自体が免疫刺激集団（速度沈降分析による巨大細胞）と該推定「促進細胞」集団の両方を含有することが示される（図１１−１５参照）。さらに、後者の生物学的活性は、細胞表面Ｂ７−２とＯＸ−２の両方を優先的に発現するゆっくりと沈降する（小さいサイズの）ＮＬＤＣ１４５+細胞集団内に属する（図１１および１２参照）。細胞の該同一集団がイン・ビボでの移植片寛容の調節に活性であるかを調べたとき、先のＦｌｔ３Ｌ処理の後に、肝臓が腎移植片許容の増加を移入し（図１５）、同時に、免疫化マウスのサイトカイン産生プロファイルをＩＬ−４およびＴＧＦβ産生の増加ならびにＩＬ−２およびＩＦＮγ産生の減少の方向へ改変する（図１４）細胞の集団を含有しことがさらに見出された。
【０１７３】
該調節機能におけるＯＸ−２発現自体に関する役割を探求するための最終的な試みにおいて、新鮮な脾臓細胞をＤＣ単独または抗−Ｂ７−１、抗−Ｂ７−２または抗−ＯＸ−２の存在下で刺激した。他の研究（データは示さない）により、使用した骨髄由来ＤＣまでも少数のＯＸ−２+細胞を含有することが確認されたことに注目されたい（ＲＭＧ−未発表）。サイトカイン産生を減少させた抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−２、共同刺激分子としてのこれらの仮説的役割と一致する結果（Hancock, W. W. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13967-13972; Freeman, G. J. et al. 1995. Immunity. 2:523-532; Kuchroo, V. K. et al. 1995.  Cell. 80:707-718）とは異なり、抗−ＯＸ−２は該系においてＩＬ−２産生の少量ではなくかなりの（３つの研究において１．７−２．５倍）増加を生じた（図１６）。しかしながら、外来性「促進細胞」が加えられた系（ＮＰＣ由来）において抗−ＯＸ−２Ｍａｂの最も重要な包含は、かかる培養物において通常見られる抑制の誘導を完全に遮断したことである（図９および１０；図１７の下方パネルと比較する）。これらのデータは、ＯＸ−２が共同刺激ではなく調節シグナルをこの状況で伝達するという考えに一致する。
【０１７４】
現存のデータは、ＤＣの異種性における理解の枠組みの発展内にどのように適合するのか？上記のように、Ｆｌｔ３Ｌに応答して増殖するリンパ性起源のＣＤ８α+ＮＬＤＣ１４５+ＤＣの別の集団が免疫調節の原因であるかもしれないという推測が存在する。他のデータは、増加量のＢ７−２を発現し、寛容を誘導できる集団にＤＣの発達／成熟を修飾しうるサイトカインとしてＩＬ−１０を関連させた（Steinbrink, K. et al. 1997. J Immunol. 159:4772-4780）。これに関して制御特性としてＦａｓの発現の調節の役割は、探求されていない（Suss, G., and K. Shortman. 1996. J. Exptl. Med. 183:1789-1796）。本明細書に開示されるデータは、もう１つ別の分子、ＯＸ−２をおそらく、Ｂ７−２、Ｆａｓ等の発現の改変と関連して、寛容化（torelizing）シグナルの伝達に関連させる最初のものである。明らかに自己寛容の調節において胸腺内ＤＣに関する重要な役割がある一方で（Banchereau, J., and R. M. Steinman. 1998. Nature. 392:245-252）、胸腺ＤＣ上のＯＸ−２の自然発現が初めて記載されたことは興味深い（脳内と同様に）（Barclay, A.N. 1981.  Immunology  44:727）。このことが該場所におけるＯＸ−２の機能的に関連した発現を示すことを示唆するという証拠は未だにない。しかしながら、他の独立したデータもまた、発現したＯＸ−２の存在／不在下で刺激された細胞由来のイン・ビトロでのサイトカイン産生の改変によってアッセイした場合のように、ＯＸ−２発現に関する免疫調節的役割を暗示した（Borriello, F. et al.  1997.  J. Immuno. 158:4548）。
【０１７５】
ｐｖ免疫化後、移植片生着の増加を未経験のレシピエントに養子的移入できる多数のγδＴＣＲ+細胞集団において適度の膨張があることが報告された（Gorczynski, R. M. et al. 1996c. Immunology. 87 (3):381-389）。これらの細胞によって認識される抗原の性質に関して、および集団としてなぜそれらの数がｐｖ免疫化後に優先的に増加するのかは、ほとんど知られていない。これは、ＯＸ−２発現後に伝達される免疫調節シグナルに対するγδＴＣＲ+対αβＴＣＲ+細胞の特異的感受性によって、最終的に説明できるかもしれないと推測される。
【０１７６】
結論として、発明者は、ＤＣプールにおける機能的異種性を細胞表面でのＯＸ−２の特異的発現によって理解できうることを初めて報告した。該分子の発現は、免疫調節、腎移植片生着の増加（およびイン・ビボおよびイン・ビトロの両方でのサイトカイン産生の改変）を誘導する能力を細胞に与えるようである。本発明は、かかるＯＸ−２発現細胞を「促進細胞」（寛容誘導に関して）と称することを提案する。
【０１７７】
実施例４
ネズミ抗体の調製
マウス、ラットおよびヒト由来の哺乳動物組織において、胸腺において、樹状細胞の副次集団上に、および脳において発現される４３Ｋｄ分子に対するマウスおよびラットのハイブリドーマを調製した。関連するＯＸ−２遺伝子のｃＤＮＡ構築物を発現するアデノウイルスベクターで一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いて、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は該構築物（各々、ラットＯＸ−２（ｒＯＸ−２）、マウスＯＸ−２（ｍＯＸ−２）およびヒトＯＸ−２（ｈｕＯＸ−２））によってコードされる分子を検出する。さらに、少なくともいくつかの抗−ラットＭａｂはネズミＯＸ−２分子上に発現される決定基を検出する。
【０１７８】
材料および方法
組織由来の抗原調製物およびウェスタンブロッティングをGorczynski et al., Transplantation, 1998, 65:1106-1114に記載のとおりに行った。
脾臓細胞（ヒト試料を移植のための器官回収時に死体から入手した）を樹状細胞／マクロファージの調製に用いた。組織は、コラゲナーゼおよびディスパーゼの混合物で消化し、ｌｙｍｐｈｏｐａｑｕｅを用いて遠心分離した。細胞を３７℃で２時間付着させ、勢いよく洗浄し、３７℃で１４時間インキュベートした。樹状細胞を非付着細胞として単離した（Gorczynski et al., Transplantation, 1996.  62:1592-1600）。一晩インキュベーション前および後でのＮＬＤＣ−１４５およびＦＩＴＣ抗−ラットＩｇＧまたはＦＩＴＣ−ＭＡＣ−１を用いるマウス脾臓細胞の慣用的な染色は、これらの付着細胞において以下の染色パターンを生じた：各々、８％±２％、９０％±１１％および９２％±９％、９％±３％。粗（非付着）樹状細胞調製物を溶菌バッファーで抽出し、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌまで滴定し、免疫化に用いた。次いで、同一材料のいくつかをＥＬＩＳＡのスクリーニングに用いた（下記）。
【０１７９】
脳組織をウェスタンゲル分析に用いた場合、全組織抽出物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Novex Co., San Diego, CA）に転移させた。推定の抗−ＯＸ−２Ｍａｂを試験物質として用い、アイソタイプ抗体（ＥＬＩＳＡ試験で陰性）を対照として用いた。抗−ラットまたは抗−マウスのいずれかの西洋ワサビペルオキシダーゼおよび適当な基質を用いて、膜を展開させた。
【０１８０】
免疫化およびＭａｂの産生：
４匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを始めに、フロイントの完全アジュバント中１ｍｇのヒトまたはラット樹状抗原の腹膜内注射によって免疫した。３回の続く追加免疫を３週間の間隔を開けて、フロイントの不完全アジュバントを用い、上記のように投与した。ＥＬＩＳＡにより測定して、血清力価が免疫前血清試料の１０倍以上に上昇したとき、２つの最も高い応答個体を静脈内により追加免疫した。３日後、ドナーマウスを殺し、脾臓細胞を採取し、プールした。脾臓細胞とＸ６３−Ａｇ８．６．５．３ＢＡＬＢ／ｃ親ミエローマ細胞の融合を、ハイブリドーマの１段階選択およびクローニングを０．８％メチルセルロース培地（Immuno-Precise Antibodies Ltd., Victoria, BC）中で行う以外は以前の記載（Kohler, G. and C. Milstein.  1975. Nature. 25: p. 256-259）のとおりに行った。この特許のある半固体培地は、１段階でＨＡＴ選択およびクローニングを可能にし、おそらく望ましくない成長の早いハイブリドーマによって、ゆっくりと成長する所望のクローンの過度の成長を排除する。クローンを取り上げ、９６ウェル組織培養プレートのウェル中で、１％ヒポキサンチン／チミジン、２０％胎児ウシ血清、１％ＯＰＩおよび１ｘ１０6／ｍｌ ＢＡＬＢ／ｃ胸腺細胞を含有する２００μｌのＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。４日後、上澄液を免疫抗原で被覆したプレート上でＥＬＩＳＡによって抗体活性についてスクリーンした。推定の陽性ハイブリドーマは、限界希釈クローニングによって再クローン化してモノクローナル性を確実にし、ＦＡＣＳ中、脳組織から調製した抽出物上でスクリーンした（下記）。
【０１８１】
ラットｍＡｂの産生の場合、２匹のＦｉｓｈｅｒラットを上記のようにマウス抗原で免疫した。融合に用いた親細胞系統がＹＢ２／０であった以外は本質的に同じ方法にしたがった。
【０１８２】
推定ＭａｂのＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析：
ＥＬＩＳＡアッセイは、１００ｎｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジンで予め被覆したポリスチレンプレートを用い、次いで、粗樹状細胞抗原（免疫化に用いた）１０ｍｇ／ｍｌと一緒に一晩インキュベートした。上記の抗−ラット／抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体を用いるハイブリドーマ上澄液の結合後にウェルを展開し、プレートを自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（TiterTek Multiskan, MCC/340, FlowLabs, Mississauga, Ontario, Canada）中で分析した。
【０１８３】
推定の抗−ＯＸ−２Ｍａｂおよび以下の細胞を用いてＦＡＣＳ分析を行った。ラット／マウスｌｙｍｐｈｏｐａｑｕｅ（Cedarlane laboratories）またはＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ヒト）によって単離した新鮮な末梢血白血球（ＰＢＬ）；新鮮な脾臓樹状細胞（上記のように、付着および一晩インキュベーション後に単離した）；および公表された配列（Chen, Z. et al. 1997. BBA. Mol. Basis Dis. 1362:6-10; McCaughan, G.W., et al.  1987.  Immunogenetics. 25: p. 133-135）により関連の種特異的ＯＸ−２をコードするｎｏｔ１／ｂａｍＨ１部位中に挿入されたｃＤＮＡの単一コピーを含有するように操作されたウイルスベクター、または対照ベクターのみで形質導入されたＣＨＯ細胞。ＦＩＴＣ抗−マウス（または抗−ラット）ＩｇＧを二次抗体として用いた。
【０１８４】
混合白血球反応（ＭＬＲ）およびサイトカイン産生：
２．５ｘ１０6応答細胞ＰＢＬおよびマイトマイシンＣ処理した刺激細胞ＰＢＬの１：１混合物を用いる同種異系ＭＬＲ培養を２４ウェル培養プレート中、１０％ＦＣＳを補足した１ｍｌのａＭＥＭ培地中で開始した。細胞をＣ３Ｈ応答マウス（刺激細胞Ｃ５７ＢＬ／６）、Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ）ラット（ブラウン・ノルウェー、ＢＮ、刺激細胞として）および個々のヒトドナーから得た。培養上澄液を６時間目に採取し、以前に記載されたＥＬＩＳＡアッセイ（マウス）を用い、またはＣＴＬＬ−２を全応答細胞源由来のＩＬ−２産生についてのバイオアッセイとして用いて、異なるサイトカインについて試験した（Gorczynski, R.M., et al. 1998c. Immunology. 93: p. 221-229）。
【０１８５】
結果
新鮮なＰＢＬまたは脾臓中の細胞集団の染色についてのいくつかのＭａｂの評価：
本明細書に記載の実験において試験した全Ｍａｂは、上記の材料および方法に記載のように予めスクリーンされ、脳抽出物のウェスタンゲル中、分子量４２−４５Ｋｄを有する分子を検出し、また、ＯＸ−２をコードしているウイルスベクターによって形質導入されたＣＨＯを染色した。表３のデータは、新鮮な細胞を用いるこれらのＭａｂについてのＦＡＣＳ分析を示す。データは、ラット、マウスまたはヒトＯＸ−２に向けられたいくつかのＭａｂを用い、新鮮なＰＢＬまたは脾臓から採取した細胞の染色についてのいくつかの独立した分析にわたってまとめられた（付着細胞だけを後者について試験した：これらは全ての場合、全細胞集団の約５％−８％を示した）。
【０１８６】
表３から、ＦＡＣＳ分析により試験した全ての種においてＰＢＬが約１．３％−２．５％ ＯＸ−２+細胞を含有したこと、および脾臓付着細胞が同様に４％−８％ＯＸ−２+細胞を含有したことは明らかである。発明者の以前の研究を確認するように、２０ｘ１０6（または各々、５０ｘ１０6）のＣ５７ＢＬ／６（またはＢＮ）骨髄細胞での門脈免疫化によって４日前に処理したＣ３ＨマウスまたはＬＥＷラットから得られた脾臓付着細胞は、ＯＸ−２+細胞において約３．５−５倍の上昇を示した（表３参照）。これらの条件下、その後に同種移植された細胞／組織の生着において特異的な増加が報告された（Gorczynski, R.M. et al.  1996a.  Transplantation 62:1592-1600）。
【０１８７】
ＭＬＲにおいてイン・ビトロでサイトカイン産生を調節する抗−ＯＸ−２Ｍａｂの能力：
最終的な研究において、これらのＭａｂが同種混合白血球反応（ＭＬＲ）においてイン・ビトロで刺激された細胞の免疫応答（サイトカイン産生によってアッセイしたとき）を修飾できるかという論点に注意が向けられた。発明者は、以前に、門脈同種異系免疫化によって予め処理されたマウスから得た細胞が主に２型サイトカインを産生したこと、および抗−ＯＸ−２Ｍａｂが明らかにサイトカイン産生におけるこの偏りを逆転できたこと（および実際に、かかるマウスにおいて見られる移植片生着の増加を破壊する）を示した。表４のデータは、マウスＯＸ−２に対する３つの独立したＭａｂを用いるこれらの結果を確認する。さらに、抗−ラット（またはヒト）ＯＸ−２の存在下で刺激されたラットまたはヒト細胞は、同様に、サイトカイン産生の全体的な増加を伴わずに（いずれの群においてもＩＬ−６産生に変化がないことによってここに分析されるように）、アイソタイプ対照Ｉｇ（またはＩｇなし）の存在下で刺激された細胞よりも著しいＩＬ−２産生を示す。
【０１８８】
考察
該実施例のデータにおいて、ヒト、ラットまたはマウスＯＸ−２に対する種特異的Ｍａｂを用いて、宿主樹状細胞の表面で検出される分子に対するＭａｂがイン・ビトロでの異物刺激後のサイトカイン産生を調節する役割を果たしうること、より詳細には、ＯＸ−２発現を機能的に遮断することが異物刺激後のＩＬ−２産生（１型サイトカイン）を増加させることを確認する（表４）。また、Borrielloらは、近年、ＯＸ−２発現がＩＬ−２およびＩＦＮγ合成の誘導のための共同刺激物質でなかったことを報告した（Borriello, F. et al.  1997.  J. Immuno.. 158:4548）−それに関する発明者らのデータは、実際、１型サイトカイン産生に関して陰性シグナルである。門脈によって予め免疫化されたマウスにおいて、初期の報告のように、ＰＢＬおよび脾臓におけるＯＸ−２発現細胞の４倍増加、およびＯＸ−２の存在下で細胞刺激後、サイトカイン産生における偏りの逆転（２型サイトカインから１型サイトカインへ）がある（表３および４参照）（Gorczynski, R. M. et al. 1998b. Transplantation. 65:1106-1114）。
【０１８９】
実施例５
ラット抗体の調製
５匹のラットをＧＥＲＢＵアジュバント（GERBU Biotechnik, Gaiberg, Germany）を用い、マウス樹状細胞（ＤＣ）系統ＤＣ２．４（ハーバードのK. Rockから贈呈）から精製した５００μｇの膜タンパク質で免疫した。これらのラット由来の血清を３回目の免疫化の７日後に試験し、ウェスタンブロットから溶出される分子量４０Ｋｄ−４５Ｋｄのプレート結合物質およびＡｌｋ Ｐａｓｅ抗−ラットＩｇを用いるＥＬＩＳＡにおいて以前に免疫化した試料と比較した。高力価抗体を有する２匹のラットを再免疫し、ハイブリドーマの調製のための脾臓細胞とＨＡＴ感受性Ｓｐ２／０親細胞の融合のために、４日後に殺した。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡによってスクリーンし（５６／９６０＋ｖｅ）、サブクローン化し、冷凍した（−７０℃）。さらなる抗−ＯＸ−２Ｍａｂの特異性試験のため、CHO細胞をＯＸ−２を発現するｐＢＫ真核生物発現ベクター（Stratagene, CA）でトランスフェクトできる。リーダー配列を含む全長ＯＸ−２ｃＤＮＡを、ベクター中での指向性クローニングのためにそれらの５’末端に各々Ｓｐｅ１またはＸｂａ１部位を有するように構築されたセンスおよびアンチセンスプライマーを用いて、ＤＣ２．４細胞から増幅した。予想サイズ（８４９ｂｐ）のバンドがアガロースゲル電気泳動で得られた。クローン化されたｃＤＮＡの配列は、自動ＤＮＡシークエンサーを用いる配列決定によって確認された（Chen, Z. and Gorczynski, R.M.  1997.  Biochem. Biophys. Acta. 100, in press）。ＣＨＯ細胞をエレクトロポレーションによって（０．５ｍｌ中５ｘ１０6細胞を９６０ＭＨｚおよび１２０Ｖにて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてパルスした）、ピューロマイシン耐性をコードするプラスミドと一緒に全長ＯＸ−２発現プラスミドを用いて（１００：１比）トランスフェクトし、次いで、ピューロマイシン選択した（１２μｇ／ｍｌで４日間）。ピューロマイシン耐性細胞を限界希釈によってクローン化した。ＰＣＲによって確認されたｍＲＮＡ ＯＸ−２を発現する５個のＣＨＯトランスフェクトクローンが得られた。推定のラット抗−マウスＯＸ−２Ｍａｂをスクリーンするために、これらのクローンを用いることができる。
【０１９０】
（ａ）ｐｖ免疫化マウス由来細胞の抗−マウスＯＸ−２でのＦＡＣＳ染色
ｐｖ免疫化マウス由来の脾臓および肝臓ＮＬＤＣ１４５＋（樹状細胞マーカー）細胞の抗−ラットＯＸ−２９０での染色において、４倍の増加が観察された。ｐｖ免疫後の種々の時間（１２時間；２、７および１４日）でのマウスの脾臓および肝臓組織を切片に切り、抗−ＮＬＤＣ１４５、抗−ＯＸ−２Ｍａｂを用いて免疫組織化学によって染色した。同一組織由来の単一細胞懸濁液を３色ＦＡＣＳを用い、ＦＩＴＣ−抗−マウスＯＸ−２、げっ歯類−抗−ＮＬＤＣ１４５およびフィコエリトリン−抗−Ｔ２００（マウスリンパ球マーカー）を用いて、染色することができる。全ての場合（ＦＡＣＳおよび免疫組織化学の両方）、適当な無関係なアイソタイプ対照抗体が包含される。腎移植片のみを受けているかまたは付加的なｉｖ免疫化後の対照マウス由来の組織もまた、試験することができる。ＯＸ−２の発現増加を示すＮＬＤＣ１４５＋（および／またはＭＡＣ−１＋）細胞の検出は、ｐｖ免疫化マウスのみにおいて予想される（Gorczynski, R.M. et al. 1998. J. Immunol. 160, in press参照）。発明者は、ＤＣ−関連抗原が生着している移植片を有する動物においてのみ存続することを示した（Gorczynski, R.M., Chen, Z., Zeng, H. and Fu, X.M.  1998.  Transplantation submitted）。また、移植後の異なる時間に注入された抗−ＯＸ−２が拒絶を引き起こすかどうかを評価した（ｂ）。
【０１９１】
（ｂ）抗−マウスＯＸ−２による移植片拒絶およびサイトカイン産生の調節
Ｃ３Ｈマウスは、培養したＣ５７ＢＬ／６骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）、ＣｓＡおよび腎同種異系移植片でのｐｖ免疫を受ける。マウスの群は、移植後の異なる時間で開始する種々のラット抗−マウスＯＸ−２Ｍａｂ（１００−５００μｇ／マウス、ｘ５、２日間隔）の静脈内注入を受ける（これは（ａ）由来のデータによって導かれる）。血清クレアチニンおよび動物生存が後に続く。Ｍａｂ処理マウス由来の血清を、ＯＸ−２を発現するＣＨＯトランスフェクト細胞（上記）を用いてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって試験して、抗体過剰を確認する。ＯＸ−２発現がｐｖに誘導される移植片生着の増加に重要ならば、抗−ＯＸ−２処理したｐｖ免疫化マウスは、１型サイトカインのサイトカイン産生の同様な偏りを伴って、未処理対照のように移植片拒絶するであろう（培養し、再刺激した細胞を用いてＰＣＲ；ＥＬＩＳＡによってアッセイした）。対照としてｐｖ免疫化され、移植されたマウスが抗−ＣＤ２８および抗−ＣＴＬＡ４を受ける場合、これらのＭａｂは、移植片生着またはサイトカイン産生における偏りによってアッセイされるｐｖ免疫化の効果を修飾しない。他のＭａｂではなくＯＸ−２処理が同時に、ｐｖ免疫化後のγδＴＣＲ＋細胞の膨張を破壊することが予想される。
【０１９２】
実施例６
ＯＸ−２の細胞外ドメインをマウスＦｃに結合している融合タンパク質の調製
その全てが哺乳動物細胞中またはバキュロウイルス系において発現している免疫アドヘシン（Immunoadhesin）（ここに、付着分子の細胞外ドメイン（ＥＤ）とＩｇＧ Ｈ鎖のカルボキシル末端が融合することによってｃＤＮＡレベルでハイブリッド分子が生産される）は、関連の付着分子のためのカウンターリガンドの同定および単離における強力な手段である。ＴＮＦＲファミリーのいくつかのメンバーのためのリガンドは、この方法で同定された（Goodwin, R.G.ら、1993. Eur. J. Immunol. 23, 2631-2641; Gruss, H.およびDower, S. 1995. Blood 85, 3378-3404）。免疫アドヘシンの治療薬としての潜在的な応用に興味が持たれている。Ｂ７−１およびＢ７−２の両方に結合できる能力を有するＣＴＬＡ４免疫付着がＴ細胞共同刺激の抑制および拒絶の緩和に用いられた（Larsen, CPら、1996. Nature 381, 434-438）。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４がＯＸ−２８９のカウンターリガンドでないということに注目されたい。融合タンパク質は、サイトカイン産生を改変し（ＩＬ−４、ＩＬ−１０の増加；ＩＬ−２、ＩＮＦγの減少）、ｐｖ免疫化のように腎移植片生着を増加させると推測される。発明者らは、共同刺激の共同的な遮断（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃによる）および共同調節経路の誘発（ＯＸ−２ＥＤ−Ｆｃによる）が寛容を誘導し、限界のない移植片生着を生じると予測する。
【０１９３】
ａ）ネズミＩｇＧＦｃ２ａとのＯＸ−２融合タンパク質の構築
ＯＸ−２の細胞外領域（ＯＸ−２ＥＤ）をコードしているｃＤＮＡを、Ｖ−領域配列の開始部分に隣接する５’部分にＳａｌ１部位を挿入する５’オリゴヌクレオチドプライマーおよび３’末端（Ｆｃとの結合部位）にＢａｍＨ１部位を生じる３’プライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。マウスＣｏｎＡ活性化脾臓細胞から調製されたｃＤＮＡを用い、Ｓｐｅ１部位を含有する５’プライマーおよびＳａｌ１部位を含有する３’プライマーを用いて、ＩＬ−６のシグナルペプチド（ＳＰ−ＩＬ−６）をＰＣＲによって増幅し、ＯＸ−２ＥＤアンプリコンに連結した。フレーム交差連結反応（frame ligation across）において、ＳＰ−ＩＬ−６およびＯＸ−２ＥＤの結合を手動配列決定によってチェックした。５’ＳＰ−ＩＬ−６プライマーおよび３’ＯＸ−２ＥＤプライマーによって増幅された最終的なｃＤＮＡは予想通り６９５ｂｐであった。ヒンジ領域の最初のコドンにまたがる特有のＢａｍＨ１部位を生じるように修飾され、３’末端コドンに特有のＸｂａ１部位を有するネズミＩｇＧＦｃ２ａ（Ｆｃγ２ａ）を発現するプラスミドをＴｅｒｒｙ Ｓｔｒｏｍ博士から入手した（Zheng, X.X.ら、1995. Journal of Immunology. 154, 5590-5600）。該挿入部分におけるＩｇＧＦｃ２ａは、さらに、Ｃ１ｑ結合モチーフ（それを非分解性にする）を置換し、ＦｃγＲ１結合部位を不活性化するように修飾された(Zheng, X.X.ら、1995. Jourmal of Immunology. 154, 5590-5600）。正確なリーディング・フレームにおけるＢａｍＨ１部位でのＯＸ−２ＥＤとＩｇＧＦｃ２ａの連結反応は、単一の４７８アミノ酸ポリペプチド（２４アミノ酸ＩＬ−６シグナルペプチドを含む）をコードしている１４４６ｂｐの長いオープン・リーディング・フレームを生じる。ホモ２量体は、グリコシル化を除いて推定分子量１０５ｋＤａを有する。次いで、融合遺伝子をＳｐｅ１−Ｘｂａ１カセットとして真核生物発現プラスミドｐＢＫ／ＣＭＶ（Stratagene, CA）中でクローン化する。該プラスミドは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびＧ４１８を用いる選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を有する。ＯＸ−２ＥＤ−Ｆｃの適当な遺伝子構築物は、プラスミドベクター中でのクローニング後に直接配列決定をすることによって確認できる（Chen, Z.およびGorczynski, R.M. 1997. Biochem. Biophys. Acta. 100, in press−上記も参照）。プラスミドはエレクトロポレーションによってＣＨＯ細胞中にトランスフェクトされ（上記参照）、１．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Geneticin: Life Tschnologies, Inc.）を含有する倍地中で選択する。サブクローニング後、抗−ＯＸ−２Ｍａｂを捕獲抗体として用い、Ａｌｋ Ｐａｓｅ結合抗−ＩｇＧＦｃ２ａを検出抗体として用いるＥＬＩＳＡにおいて培養上澄液をスクリーニングすることによって、高生産クローンを選択する。ＯＸ−２ＥＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養上澄液から精製し、ＰＢＳに対して透析し、フィルター滅菌し、アリコートに分けて−２０℃で保管する。サイズおよび分泌産物のＯＸ−２（＋ＩｇＧＦｃ２ａ）特異性は、還元（＋ＤＴＴ）および非還元（−ＤＴＴ）条件下、ＯＸ−２に対するＭａｂおよびラットモノクローナル抗−マウスＩｇＧＦｃ２ａ（Pharmingen）を用い���ウェスタンブロット分析を用いて確認できる。生産物は、ＯＸ−２に対するラットＭａｂをプローブとして用いるＯＸ−２発現ＣＨＯ細胞（上記参照）のＦＡＣＳ染色に対する阻害物質として滴定できる。イン・ビボでＯＸ−２ＥＤ−Ｆｃを用いる研究（下記）の先駆けとして、６ ８週Ｃ３Ｈマウス群の注射後のマウス血清における半減期（ｔ１／２）が研究されるであろう。これは、マウスを５０μｇまたは１０μｇのＯＸ−２ＥＤ−Ｆｃのｉｖ注射に付すことによって行われ、０．３、１、６、２４、４８、７２および９６時間目に一連の５０μｌ血液試料を得る。血清は、捕獲抗体として抗−ＯＸ−２で被覆したプレートおよびＡｌｋ Ｐａｓｅ結合モノクローナル抗体抗−ＩｇＧＦｃ２ａを検出にを用いるＥＬＩＳＡにおいて分析する（よって、アッセイは、確実に、ＯＸ−２またはＩｇＧＦｃ２ａのみではなく、ＯＸ−２ＥＤ−Ｆｃのみを検出する）。イン・ビボでの半減期を延長するためにＦｃ融合タンパク質が用いられた初期のデータ（Zheng, X.X.ら、1995. Journal of Immunology. 154, 5590-5600）に基づいて、３０−４０時間の範囲のｔ１／２が予想される。
【０１９４】
ｂ）ＯＸ−２：ＩｇＧＦｃ免疫付着がＭＬＲを抑制する
ＣＨＯ細胞を、ＯＸ−２：Ｆｃ ｃＤＮＡ挿入を担持するベクターで形質導入した。上澄液を７日目のＣＨＯ細胞から採取し、５ｘ１０6ＬＥＷ脾臓および２．５ｘ１０6照射ＬＢＮＦＩ脾臓細胞と一緒に培養した。上澄液は、５０ｎｇ／ｍｌ ＯＸ−２：Ｆｃを含有した。
表５に示す結果は、可溶性ＯＸ−２：Ｆｃ免疫付着がＩＬ−２産生および細胞障害性Ｔ細胞の発生を抑制し、ＩＬ−４産生を誘導することを示す。これらの結果は、ＯＸ−２の免疫抑制剤としての使用を支持する。
【０１９５】
ｃ）移植片拒絶の予防のためのＯＸ−２：Ｆｃのイン・ビボでの使用
（ｂ）において、５０ｎｇ／ｍｌ ＯＸ−２：Ｆｃの存在下でのインキュベーションがイン・ビトロでのＭＬＲ反応を抑制できることが示された。イン・ビボでの移植片拒絶の抑制を検出するために、Ｃ３Ｈマウスは、ＯＸ−２：Ｆｃのｉｖ注射（５０μｇ／マウス）の２日毎に４回の注射と一緒にＣ５７ＢＬ／６皮膚移植片を受けた。１０日後から毎日、移植片を拒絶について調べた。別の研究では、３匹のマウス／群（セーラインまたはＯＸ−２：Ｆｃを受けている）を１０日目に殺し、サイトカイン産生の分析のために脾臓細胞をイン・ビトロで再刺激した（ｘ４８時間）。これらの研究のデータを表６および７に示す。これらのデータから、ＯＸ−２：Ｆｃが移植片許容を延長するための免疫抑制剤として使用できる可能性を有することは明らかである。さらに、該モデルにおける移植片生着の増加に関連して、門脈ドナー特異的免疫化についてすでに記載されているように、ＯＸ−２：Ｆｃはサイトカイン産生における偏りを改変する。
【０１９６】
実施例７
ＯＸ−２は胎児喪失を予防する
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、発明者は、ＯＸ−２が胎児喪失の可能性の高いマウスの胎盤には発現しないことを示した。対照的に、ＯＸ−２は、正常な流産しないマウスの胎盤に発現する。
【０１９７】
ＣＢＡ／ＪおよびＤＢＡ／２Ｊマウスを用いた。ＣＢＡ／Ｊ（雌）とＤＢＡ／２Ｊ雄の交配は、逆の交配とは異なり、胎児喪失の高い発生率を示す（＞８０％）。胎盤組織は、妊娠８−１１日目のマウスから得た。子宮をスナップ冷凍し、５μｍ小片に切断し、ネズミＯＸ−２に対するビオチン化アンチセンスプローブで染色した。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるデータは、流産しない系統の組み合わせにおいて、ＯＸ−２ｍＲＮＡ（ｉｎ ｓｉｔｕ標識）の発現の増加を示し、流産する組み合わせにおいて本質的に発現しないことを示す。これらのデータは、ＯＸ−２発現が自然発生的な胎児喪失症候群を予防するという考えに一致する。
【０１９８】
本発明は、好ましい実施例であると現在考えられているものに関して記載しているが、本発明は開示される実施例に限定されないことを理解されるべきである。反対に、本発明は、付随の請求の範囲の精神および範囲内に包含される種々の修飾および同等のアレンジを含むことが意図される。
全ての出版物、特許および特許出願は、出典明示により、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が特別に出典明示により完全に含まれることが指示されているように、同一範囲まで完全に本明細書中に含まれる。
【０１９９】
表１
ｐｖ免疫化マウス由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて検出された配列およびクローンの要約
【表１】
2010155846.tif 000002
脚注：
遺伝子は、最小５０ｂｐ配列を用いてＢＬＡＳＴスコア＞２５０で「一致する」と考えられた。
【０２００】
表２
ｐｖ免疫化および抗−ラットＯＸ−２を受けているマウスの細胞由来のサイトカイン産生
【表２】
2010155846.tif 000003
【０２０１】
脚注：
ａ．  １群あたり３匹のＣ３Ｈマウスを各実験に用いた。全動物は、材料および方法に記載のとおりに、ＣｓＡおよびＣ５７ＢＬ／６腎移植を受けた。表の下半分のマウスは、また、移植日に１５ｘ１０6Ｃ５７ＢＬ／６骨髄由来樹状細胞のｐｖ注入を受けた。モノクローナル抗体を投与する場合、１００ｍｇ／マウスの投与量で２日間隔で４回投与した。全マウスを移植１４日後に殺した。個々の動物由来の脾臓細胞を３連で、照射Ｃ５７ＢＬ／６脾臓刺激細胞との１：１混合物中で４０時間培養した。
ｂ．  最初の列に記載の動物の個々の試料由来の３つの測定値の計算平均（±ＳＤ）。全サイトカインをＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、ｐｇ／ｍｌで示し、ＩＦＮｇはｎｇ／ｍｌで示す。データはこのような２つの研究（１群あたり全部で６種類のマウスを試験した）からまとめられる。
＊は、Ｍａｂを与えない対照群との有意差を示す（＜０．０２）。
【０２０２】
表３
抗−ＯＸ−２Ｍａｂを用いる、異なる種におけるＰＢＬおよび脾臓付着細胞のＦＡＣＳ染色
【表３】
2010155846.tif 000004
【０２０３】
脚注：
ａ．  新鮮な細胞は、正常なヒトドナー（ＰＢＬ）、死体移植ドナー（ヒト脾臓）から、あるいは成体（８−１０週）マウスまたはラットドナーから得られた。同一の３つの別個の組織ドナーを各Ｍａｂ試験に用いた。
ｂ．  ドナー前処理は、ＰＢＬまたは脾臓の採取４日前に、同種異系骨髄細胞を門脈へ注入することをいう（Ｃ３Ｈマウスドナーの場合、Ｃ５７ＢＬ／６；ＬＥＷラットドナーの場合、ＢＮ）（テキストおよび（６）参照）。
ｃ．  ３つの独立したアッセイにおいて染色された細胞パーセントについての計算平均（±ＳＤ）。対照抗体（抗−ヒトまたは抗−ラットＭａｂの場合、ＦＩＴＣ抗−マウスＩｇＧ、または抗−マウスＭａｂの場合、ＦＩＴＣ抗−ラットＩｇＧ）は、バックグラウンド以上に有意に染色されなかった（＜０．２％）。
【０２０４】
表４
ＭＬＲ培養における１型サイトカイン産生は、抗−ＯＸ−２Ｍａｂによって増加する。
【表４】
2010155846.tif 000005
【０２０５】
脚注：
ａ．  ＭＬＲ培養は材料および方法の記載通りに開始した。ヒトＭＬＲ培養の場合、同じ３個の異なる応答細胞調製物を各Ｍａｂについて用い、マイトマイシンＣで処理した脾臓刺激細胞のプール（６個の脾臓ドナーの無作為混合物由来）で刺激した。マウス（Ｃ３Ｈ抗−Ｃ５７ＢＬ／６）およびラット（ＬＥＷ抗―ＢＮ）ＭＬＲ培養の場合、全アッセイを各Ｍａｂについて３連で開始した。応答細胞を注射しなかったＣ３Ｈマウス由来である（なし＊＊）として示されるデータを除いて、マウス応答脾臓細胞は、４日前にＣ５７ＢＬ／６骨髄細胞の門脈注入によって処理したマウスから得た。Ｍａｂは、３０％上澄濃縮液として添加された。上澄液は、サイトカインアッセイのために６０時間目に採取された。
ｂ．  データは、各Ｍａｂについて計算平均（±ＳＤ）を示す。マウスアッセイの場合、全上澄液をいくつかのサイトカインについてアッセイし（ＥＬＩＳＡ）、ＩＬ−２／ＩＬ−６の場合、バイオアッセイを用いる（各々、ＣＴＬＬ−２、Ｂ９の増殖）。ラット／ヒト培養物由来の上澄液は、バイオアッセイのみでアッセイした。アイソタイプ対照Ｉｇと一緒にインキュベートした細胞（ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによる非反応性）は、Ｍａｂの不在下でインキュベートした培養物と見分けがつかないサイトカインデータを与えた。Ｍａｂなしの培養物と比べてｐ＜０．０５。
【０２０６】
表５
ＯＸ−２：ＦＣ免疫付着素はイン・ビトロで混合白血球反応を抑制する
【表５】
2010155846.tif 000006
脚注：
ａ  上澄液は、対照ｐｂＫベクターまたはネズミＦｃに結合したＯＸ−２をコードしているｃＤＮＡ挿入部分を担持しているベクターで形質導入したＣＨＯ細胞から７日目に採取した。上澄液の１：１混合物を５ｘ１０6ＬＥＷ脾臓および２．５ｘ１０6照射ＬＢＮＦ１脾臓細胞を含有する培養物中に用い；これは５０ｎｇ／ｍｌ ＯＸ−２：Ｆｃに対応した。
ｂおよびｃ  １ｘ１０4 51Ｃｒ ＢＮ脾臓ＣｏｎＡ標的細胞を用いる、５日目の細胞の溶菌パーセント。６０時間目の培養上澄液中のサイトカイン。
【０２０７】
表６
ＯＸ−２：Ｆｃによる皮膚移植片拒絶の抑制
マウスの処理 皮膚移植片の拒絶（日）（平均＋ＳＤ）
ＮＩＬ                      １２＋３．８
ＯＸ−２：Ｆｃ              １９＋４．２
脚注：
６匹マウス／群を示されるように処理した。
ＮＩＬは正常なマウスＩｇＧのみの注入を示す。
群につき移植片生着の計算平均（＋ＳＤ）。
【０２０８】
表７
皮膚同種異系移植片を受けているマウス中に注入したＯＸ−２：Ｆｃはサイトカイン産生の偏りを逆転する。
マウスの処理        ４８時間目の培養上澄液中のサイトカイン
（ｐｇ／ｍｌ）
ＩＬ−２              ＩＬ−４
ＮＩＬ              １２５０＋１６０        ８０＋２０
ＯＸ−２：Ｆｃ        ３５０＋８５        ２４５＋５０
脚注：
３匹マウス／群は、セーラインまたはＯＸ−２：Ｆｃ（５０ｍｇ／マウス）のｉｖ注入をＣ５７ＢＬ／６皮膚の移植から２日毎に４回受けた。マウスを１０日目に殺し、脾臓細胞を照射Ｃ５７ＢＬ／６脾臓刺激細胞でイン・ビトロで刺激した。
４８時間目の上澄液中のＩＬ−２／ＩＬ−４の計算平均（＋ＳＤ）。データは、各マウス脾臓について３連の培養物からまとめられた。
【０２０９】
本明細書に引用された参考文献の完全な列記
Ahvazi, B. C., P. Jacobs, and M. M. Stevenson. 1995. Role of macrophage-derived nitric oxide in suppression of lymphocyte proliferation during blood-stage malaria. J. Leu. Biol. 58 (1):23-31.
Akatsuka, Y., C. Cerveny, and J. A. Hansen. 1996. T cell receptor clonal diversity following allogeneic marrow grafting. Hum. Immunol. 48:125-134.
Akolkar, P. N., B. Gulwani-Akolkar, R. Pergolizzi, R. D. Bigler, and J. Silver. 1993. Influence of HLA genes on T cell receptor V segment frequencies and expression levels in peripheral blood lymphocytes. J. Immunol. 150 (April 1):2761-2773.
Albina, J. E., J. A. Abate, and W. L. Henry. 1991. Nitric oxide production is required for murine resident peritoneal macrophages to suppress mitogen-stimulated T cell proliferation. J. Immunol. 147:144-152.
Banchereau, J., and R. M. Steinman. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392:245-252.
【０２１０】
Barclay, A.N. 1981.  Different reticular elements in rat lymphoid tissue identified by localization of Ia, Thy-1 and MRC OX-2 antigens.  Immunology  44:727
Barclay, A.N., and H.A. Ward.  1982.  Purification and chemical characterization of membrane glycoproteins from rat thymocytes and brain, recognized by monoclonal antibody MRC OX-2.  Eur. J. Biochem.  129:447.
Borriello, F., J. Lederer, S. Scott, and A.H. Sharpe.  1997.  MRC OX-2 defines a novel T cell costimulatory pathway.  J. Immuno.. 158:4548.
Brasel, K., H. J. McKenna, K. Charrier, P. J. Morrissey, D. E. Williams, and S. D. Lyman. 1997. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90:3781-3788.
Bronstein, I., J.C. Voyta, O.J. Murphy, L. Bresnick, and L.J. Kricka.  1992.  Improved chemiluminescence Western blotting procedure.  Biotechniques  12:748.
Castle, B.E., K. Kishimoto, C. Stearns, M.L. Brown, and M.R. Kehry.  1993.  Regulation of the expression of the ligand for CD40 on T helper lymphocytes.  J. Immunol.  151:1777.
Chen, Z., H. Zeng, and R. M. Gorczynski. 1997. Cloning and characterization of the murine homologue of the rat/human MRC OX-2 gene. BBA. Mol. Basis Dis. 1362:6-10.
【０２１１】
Chen, Z. and Gorczynski, R.M.  1997.  Biochem. Biophys. Acta. 100, in press
Freeman, G. J., V. A. Boussiotis, A. Anumanthan, G. M. Bernstein, X. Y. Ke, P. D. Rennert, G. S. Gray, J. G. Gribben, and L. M. Nadler. 1995. B7-1 and B7-2 do not deliver identical costimulatory signals, since B7-2 but not B7-1 preferentially costimulates the initial production of IL-4. Immunity. 2:523-532.
Garside, P., and A. M. Mowat. 1997. Mechanisms of oral tolerance. Crit. Rev. Immunol. 17:119-137.
Goodwin, R.G., Din, W.S., Davis-Smith, T. et al.  1993.  Eur. J. Immunol. 23, 2631-2641
Gorczynski, R. M. 1992. Immunosuppression induced by hepatic portal venous immunization spares reactivity in IL-4 producing T lymphocytes. Immunol. Lett. 33:67-77.
Gorczynski, R. M., and D. Wojcik. 1992. Antigen presentation by murine splenic, but not hepatic, antigen-presenting cells to induce IL-2/IL-4 production from immune T cells is regulated by interactions between LFA-1/ICAM-1. Immunol. Lett. 34:177-182.
Gorczynski, R. M., and D. Wojcik. 1994. A role for non-specific (cyclosporin A) or specific (monoclonal antibodies to ICAM-1, LFA-1 and interleukin-10) immunomodulation in the prolongation of skin allografts after antigen-specific pre-transplant immunization or transfusion. J. Immunol. 152:2011-2019.
【０２１２】
Gorczynski, R.M., Z. Chen, S. Chung, Z. Cohen, G. Levy, B. Sullivan, and X.-M. Fu. 1994a.  Prolongation of rat small bowel or renal allograft survival by pretransplant transfusion and/or by varying the route of allograft venous drainage.  Transplantation 58:816-820.
Gorczynski, R.M.  1994b.  Adoptive transfer of unresponsiveness to allogenic skin grafts with hepatic γδ＋ T cell.  Immunology 81:27-35.
Gorczynski, R. M. 1995a. Regulation of IFNg and IL-10 synthesis in vivo, as well as continuous antigen exposure, is associated with tolerance to murine skin allografts. Cell. Immunol. 160:224-231.
Gorczynski, R. M., N. Hozumi, S. W. Wolfe, and Z. Chen. 1995b. Interleukin-12, in combination with anti-interleukin-10, reverses graft prolongation after portal venous immunization. Transplantation. 60:1337-1341.
Gorczynski, R.M., Z. Cohen, X.M. Fu, Z. Hua, Y.L. Sun, and Z.Q. Chen.  1996a.  Interleukin-13, in combination with anti interleukin-12, increases graft prolongation after portal venous immunization with cultured allogenic bone marrow-derived dendritic cells.  Transplantation 62:1592-1600.
Gorczynski, R. M., Z. Cohen, G. Levy, and X. M. Fu. 1996b. A role for gamma delta TCR(+) cells in regulation of rejection of small intestinal allografts in rats. Transplantation. 62:844-851.
【０２１３】
Gorczynski, R. M., Z. Chen, Y. Hoang, and B. RossiBergman. 1996c. A subset of gamma delta T-cell receptor-positive cells produce T-helper type-2 cytokines and regulate mouse skin graft rejection following portal venous pretransplant preimmunization. Immunology. 87 (3):381-389.
Gorczynski, R. M., Z. Chen, H. Zeng, and X. M. Fu. 1998a. A role for persisting antigen, antigen presentation and ICAM-1 in the increased renal graft survival following oral or portal vein donor-specific immunization. Transplantation. 66: 000-008.
Gorczynski, R. M., Z. Chen, X. M. Fu, and H. Zeng. 1998b. Increased expression of the novel molecule Ox-2 is involved in prolongation of murine renal allograft survival. Transplantation. 65:1106-1114.
Gorczynski, R.M., et al. 1998c.  Analysis of cytokine production and V beta T-cell receptor subsets in irradiated recipients receiving portal or peripheral venous reconstitution with allogeneic bone marrow cells, with or without additional anti-cytokine monoclonal antibodies. Immunology. 93: p. 221-229.
Gorczynski, R.M., Chen, Z., Fu, X.M. and Zeng, H.  1998.  J. Immunol. 160, in press
Gorczynski, R.M., Chen, Z., Zeng, H. and Fu, X.M.  1998. Transplantation submitted 
Gruss, H. and Dower, S.  1995.  Blood 85, 3378-3404
【０２１４】
Hancock, W. W., M. H. Sayegh, X. G. Zheng, R. Peach, P. S. Linsley, and L. A. Turka. 1996. Costimulatory function and expression of CD40 ligand, CD80, and CD86 in vascularized murine cardiac allograft rejection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13967-13972.
Jenkins, M. K., J. D. Ashwell, and R. H. Schwartz. 1988. Allogeneic non-T spleen cells restore the responsiveness of normal T cell clones stimulated with antigen and chemically modified antigen-presenting cells. J. Immunol. 140:3324-3329.
Kenick, S., R. P. Lowry, R. D. S. Forbes, and R. Lisbona. 1987. Prolonged cardiac allograft survival following portal venous inoculation of allogeneic cells: What is "hepatic tolerance?". Transpl. Proc. 19:478-480.
Kohler, G. and C. Milstein.  1975.  Preparation of monoclonal antibodies. Nature. 25: p. 256-259.
Kronin, V., K. Winkel, G. Suss, A. Kelso, W. Heath, J. Kirberg, H. vonBoehmer, and K. Shortman. 1996. Subclass of dendritic cells regulates the response of naive CD8 T cells by limiting their IL-2 production. J. Immunol. 157:3819-3827.
Kuchroo, V. K., M. P. Das, J. A. Brown, A. M. Ranger, S. S. Zamvil, A. Sobel, H. L. Weiner, N. Nabavi, and L. H. Glimcher. 1995. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80:707-718.
Larsen, C. P., S. C. Ritchie, R. Hendrix, P. S. Linsley, K. S. Hathcock, R. J. Hodes, R. P. Lowry, and T. C. Pearson. 1994. Regulation of immunostimulatory function and costimulatory molecule (B7-1 and B7-2) expression on murine dendritic cells. J. Immunol. 152:5208-5219.
【０２１５】
Larsen, C.P., Elwood, E.T., Alexander, D.Z. et al.  1996.  Nature 381, 434-438
Larsen, C. P., and T. C. Pearson. 1997. The CD40 pathway in allograft rejection, acceptance, and tolerance. Curr. Opin. Immunol. 9:641-647.
Leenen, P. J. M., K. Radosevic, J. S. A. Voerman, B. Salomon, N. vanRooijen, D. Klatzmann, and W. vanEwijk. 1998. Heterogeneity of mouse spleen dendritic cells: In vivo phagocytic activity, expression of macrophage markers, and subpopulation turnover. J. Immunol. 160:2166-2173.
Lenschow, D. J., T. L. Walunas, and J. A. Bluestone. 1996. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu. Rev. Immunol. 14:233-258.
Maraskovsky, E., K. Brasel, M. Teepe, E. R. Roux, S. D. Lyman, K. Shortman, and H. J. McKenna. 1996. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt 3 Ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. J. Exptl. Med. 184:1953-1962.
Mayer, L. 1996. Yin and Yang of mucosal immunology. Transpl. Proc. 28:2435-2437.
McCaughan, G.W., et al.  1987.  The gene for MRC OX-2 membrane glycoprotein is localized on human chromosome 3. Immunogenetics. 25: p. 133-135.
Miller, R. G., and R. A. Phillips. 1969. The separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell. Comp. Physiol. 73:191-198.
【０２１６】
Preston, S., et al.  1997.  The leukocyte/neuron cell surface antigen OX2 binds to a ligand on macrophages. Eur J Immunol. 27(8): p. 1911-8.
Qian, J. H., T. Hashimoto, H. Fujiwara, and T. Hamaoka. 1985. Studies on the induction of tolerance to alloanatigens. I. The abrogation of potentials for delayed-type hypersensitivity responses to alloantigens by portal venous inoculation with allogeneic cells. J. Immunol. 134:3656-3663.
Rosenzwajg, M., S. Camus, M. Guigon, and J. C. Gluckman. 1998. The influence of interleukin (IL)-4, IL-13, and Flt3 ligand on human dendritic cell differentiation from cord blood CD34(+) progenitor cells. Exp. Hematol. 26:63-72.
Salomon, B., J. L. Cohen, C. Masurier, and D. Klatzmann. 1998. Three populations of mouse lymph node dendritic cells with different origins and dynamics. J. Immunol. 160:708-717.
Sandhu, G.S., B.W. Eckloff, and B.C. Kline.  1991.  Chemiluminescent substrates increase sensitivity of antigen detection in Western blots.  Biotechniques 11:14.
Schwartz, R.H.  1996.   Models of T cell anergy: Is there a common molecular mechanism? J Exp Med. 184: p. 1-8.
Steinbrink, K., M. Wolfl, H. Jonuleit, J. Knop, and A. H. Enk. 1997. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells. J Immunol. 159:4772-4780.
【０２１７】
Steptoe, R. J., F. M. Fu, W. Li, M. L. Drakes, L. A. Lu, A. J. Demetris, S. G. Qian, H. J. McKenna, and A. W. Thomson. 1997. Augmentation of dendritic cells in murine organ donors by Flt3 ligand alters the balance between transplant tolerance and immunity. J Immunol. 159:5483-5491.
Suss, G., and K. Shortman. 1996. A subclass of dendritic cells kills CD4+ T cells via Fas/Fas-ligand-induced aoptosis. J. Exptl. Med. 183:1789-1796.
Swain, S. L. 1995. Who does the polarizing? Curr. Biol. 5:849-851.
Thelen, M., and U. Wirthmueller. 1994. Phospholipases and protein kinases during phagocytic activation. Curr. Opin. Immunol. 6:106-112.
Zheng, X.X., Steele, A.W., Nickerson, P.W. et al.  1995.  Journal of Immunology 154, 5590-5600.
【図１】
2010155846.tif 000007
【図２】
2010155846.tif 000008
【図３】
2010155846.tif 000009
【図４】
2010155846.tif 000010
【図５】
2010155846.tif 000011
【図６】
2010155846.tif 000012
【図７】
2010155846.tif 000013
【図８】
2010155846.tif 000014
【図９】
2010155846.tif 000015
【図１０】
2010155846.tif 000016
【図１１】
2010155846.tif 000017
【図１２】
2010155846.tif 000018
【図１３】
2010155846.tif 000019
【図１４】
2010155846.tif 000020
【図１５】
2010155846.tif 000021
【図１６】
2010155846.tif 000022
【図１７】
2010155846.tif 000023
【図１８】
2010155846.tif 000024
【配列表】
2010155846000001.app