(57)【要約】      （修正有）【課題】多発性骨髄腫を治療するための医薬組成物の提供。【解決手段】アルファ４サブユニット含有インテグリンおよびアルファ４サブユニット含有インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストを治療的に有効な量で含む医薬組成物。該アンタゴニストが、アルファ４インテグリン結合剤であり、該アルファ４インテグリン結合剤は、ａ）ＶＬＡ−４およびアルファ４ベータ７両方と、それぞれのアルファ４リガンドとの相互作用に拮抗する抗体相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）；ｂ）ＶＬＡ−４とそのアルファ４リガンドの相互作用に拮抗する抗体相同体；およびｃ）アルファ４ベータ７とそのアルファ４リガンドの相互作用に拮抗する抗体相同体、からなる群より選択されることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫を治療するための医薬組成物であって、アルファ４サブユニット含有インテグリンおよびアルファ４サブユニット含有インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストを治療的に有効な量で含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
アンタゴニストがアルファ４インテグリン結合剤である、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
アンタゴニストがアルファ４インテグリンリガンド結合剤である、請求項１の医薬組成物。
【請求項４】
アルファ４インテグリン結合剤が；ａ）ＶＬＡ−４およびアルファ４ベータ７両方と、それぞれのアルファ４リガンドとの相互作用に拮抗する抗体相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）；ｂ）ＶＬＡ−４とそのアルファ４リガンドの相互作用に拮抗する抗体相同体；およびｃ）アルファ４ベータ７とそのアルファ４リガンドの相互作用に拮抗する抗体相同体、からなる群より選択される、請求項２の医薬組成物。
【請求項５】
抗体相同体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項４の医薬組成物。
【請求項６】
アルファ４インテグリンリガンド結合剤が抗ＶＣＡＭ−１抗体相同体である、請求項３の医薬組成物。
【請求項７】
抗体相同体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項６の医薬組成物。
【請求項８】
アンタゴニストが小分子である、請求項１の医薬組成物。
【請求項９】
組成物が、約０．１ないし約２０  ｍｇ／ｋｇ体重を提供するような投薬量で投与される、請求項１の医薬組成物。
【請求項１０】
骨髄の腫瘍と関連する骨吸収を阻害するための医薬組成物であって、アルファ４サブユニット含有インテグリンおよびアルファ４サブユニット含有インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストを、前記骨吸収の阻害を提供するのに有効な量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１１】
アンタゴニストがアルファ４インテグリン結合剤である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
アンタゴニストがアルファ４インテグリンリガンド結合剤である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１３】
アルファ４インテグリン結合剤が抗ＶＬＡ−４抗体相同体または抗アルファ４ベータ７抗体相同体である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１４】
抗体相同体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
アルファ４インテグリンリガンド結合剤が抗ＶＣＡＭ−１抗体相同体である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１６】
抗体相同体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項１５の医薬組成物。
【請求項１７】
アンタゴニストが小分子である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１８】
個体の体重に基づき、アンタゴニストが、約０．１ないし約２０  ｍｇ／ｋｇを提供するような投薬量で投与される、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１９】
アンタゴニストが、約０．１−３０  ｍｇ／ｋｇ体重の小分子の投薬量を提供するのに有効な量で投与される、請求項１７の医薬組成物。
【請求項２０】
破骨細胞形成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の存在により特徴付けられる障害を有する患者を治療する医薬組成物であって、アルファ４サブユニット含有インテグリンおよびアルファ４サブユニット含有インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストを、破骨細胞形成を抑制するのに十分な量で含む、前記医薬組成物。
【請求項２１】
アンタゴニストがアルファ４インテグリン結合剤である、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２２】
アンタゴニストがアルファ４インテグリンリガンド結合剤である、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２３】
アルファ４インテグリン結合剤が抗ＶＬＡ４抗体相同体または抗アルファ４ベータ７結合剤である、請求項２１の医薬組成物。
【請求項２４】
抗体相同体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項２３の医薬組成物。
【請求項２５】
アルファ４インテグリンリガンド結合剤が抗ＶＣＡＭ−１抗体相同体である、請求項２２の医薬組成物。
【請求項２６】
抗体相同体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項２５の医薬組成物。
【請求項２７】
アンタゴニストが小分子である、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２８】
アンタゴニストが、約０．１ないし約２０  ｍｇ／ｋｇ体重を提供するような投薬量で投与される、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２９】
アンタゴニストが、約０．１−２０  ｍｇ／ｋｇ体重の小分子の投薬量を提供するのに有効な量で投与される、請求項２７の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、多発性骨髄腫、およびヒトにおける骨髄腫の主な副作用である、重症の骨損失を生じる、骨髄腫細胞による骨吸収因子の放出の治療に関する。より詳細には、本発明は、多発性骨髄腫細胞の骨髄への誘導；該細胞の続くインテグリン依存生存；および多発性骨髄腫患者において骨破壊を生じる、該細胞のインテグリン依存骨吸収因子放出に関連する、こうした接着の生物学的影響を阻害する、アルファ４含有インテグリンのアンタゴニストなどのインテグリンアンタゴニストに関する。
発明の背景
多発性骨髄腫は、二番目によく起こる血液学的悪性疾患であり、米国において、毎年、１５，０００の新規に診断される症例があり、そして毎年、３０，０００ないし４０，０００の骨髄腫患者が存在する（ＭｕｎｄｙおよびＢｅｒｔｏｌｉｎｉ、１９８６）。患者の８０パーセントは、破骨細胞（ＯＣＬ）形成および活性の増加により引き起こされる壊滅的な骨溶解性の骨破壊を患う（ＭｕｎｄｙおよびＢｅｒｔｏｌｉｎｉ、１９８６）。この骨破壊は、激しい苦痛を与える骨の痛み、病的骨折、脊髄圧迫、および生命を脅かす高カルシウム血症を引き起こす可能性がある。多発性骨髄腫は、標準的な化学療法または幹細胞移植により治癒することが不可能であるため（Ａｔｔａｌら、１９９６）、そして骨髄腫骨疾患に関連し、重症の病的状態および死亡の可能性があるため、骨髄腫増殖自体、および特に、これらの患者で発生する骨溶解性骨破壊を調節する治療戦略が、非常に重要である。
【０００２】
しかし、多発性骨髄腫患者における破骨細胞活性の増加に責任がある病理学的機構は、未知である（Ｍｕｎｄｙ、１９８８）。骨損傷は、いくつかのパターンで発生する。時に、患者は孤立したプラズマ細胞腫と関連した、分離した骨溶解性損傷を発展させる。ある患者は、骨粗鬆症の外観を模倣し、そして体軸骨格全体に骨髄腫細胞が広く伝播するためである、拡散した骨減少症（ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）を有する。ほとんどの患者で、骨髄腫細胞の巣に隣接して発生する多発性の別個の溶解性損傷が存在する。高カルシウム血症は、進行した疾患を有する患者の約３分の１で、骨破壊の結果として発生する。まれに、骨髄腫を有する患者は、溶解性損傷または骨損失を持たず、むしろ、骨髄腫細胞の周りに新規骨形成の増加を有する。このまれな状況は、骨硬化性骨髄腫として知られる。
【０００３】
骨溶解性骨損傷は、断然、骨髄腫患者における最も一般的な骨格的発現である（Ｍｕｎｄｙ、１９９８）。正確な分子的機構は不明のままであるが、１５年にわたる観察により：１）骨髄腫において、骨が破壊される機構は、正常骨吸収細胞である破骨細胞を介し；２）破骨細胞は、骨髄腫細胞の集合に隣接する骨髄腫の骨吸収表面上に集積し、そして骨髄腫において、破骨細胞が刺激される機構は、局所のものであるようであり；３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト骨髄腫細胞を培養すると、リンホトキシン−アルファ（ＬＴ−ａ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む、いくつかの破骨細胞活性化因子が産生されることが長年知られてきており；４）高カルシウム血症は、該疾患の経過中のある時点で、骨髄腫の患者のおよそ３分の１で発生し、高カルシウム血症は、常に、顕著に増加した骨吸収と、そしてしばしば、糸球体濾過の欠陥と関連し；５）骨髄腫における破骨細胞骨吸収の増加は、通常、骨芽細胞機能の顕著な欠陥と関連する、ことが示されてきている。血清におけるアルカリホスファターゼ活性は、他の種類の骨溶解性骨疾患の患者とは異なり、減少するかまたは正常範囲内であり、そして放射性核種スキャンは、取り込み増加の徴候を示さず、欠陥がある骨芽細胞が、骨吸収の増加に反応することが示される。
【０００４】
上に列挙される、多様な仲介因子が多発性骨髄腫患者における破骨細胞活性の刺激に関連付けられているが、骨髄腫細胞により産生される因子の報告は一致しておらず、そしていくつかの研究は、多発性骨髄腫細胞集団中の、間質細胞およびマクロファージを含む、他の混入細胞種の存在のため、結論が出ていない。ＩＬ−６は、いくつかの骨髄腫細胞株および患者由来の新鮮な単離骨髄腫細胞の増殖を亢進する主な骨髄腫増殖因子である（Ｂａｔａｉｌｌｅら、１９８９）。ＩＬ−６産生は、ＰＣＲにより、新鮮な単離骨髄腫細胞の約４０％で検出することが可能であるが、免疫細胞化学またはＥＬＩＳＡアッセイによると、研究した１５０人の患者中、わずか１人でのみ検出可能なＩＬ−６産生が示される（Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９９２）。ＩＬ−６受容体は、多発性骨髄腫患者由来の１３試料のうち、６つでしか検出されなかった（Ｂａｔａｉｌｌｅら、１９９２）。さらに、成熟骨髄腫細胞は、ＩＬ−６に対し、最小限の増殖反応しか示さないことが報告されてきている。インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）は、プラズマ細胞腫に対し、ＩＬ−６様活性を有するが、現在まで、骨髄腫細胞がＩＬ−１１を産生することを立証した研究者はいない。Ｂａｔａｉｌｌｅおよび同僚ら（１９９５）は、難治性骨髄腫の５人の患者にＩＬ−６に対する抗体を灌流すると、これらの患者の２人のみで、骨髄腫細胞負荷の大きさが減少したことを示してきている。ＩＬ−１は非常に強力な骨吸収剤であり、動物モデルにおいて、腎不全の非存在下で、高カルシウム血症を誘導する（Ｂｏｙｃｅら、１９８９）。対照的に、高カルシウム血症は、腎不全を起こしていない骨髄腫患者ではまれにしか起こらない。より重要なことに、非常に精製された骨髄腫細胞では、ＩＬ−１産生は検出不能であり、そしてＴＮＦ−ａ産生はまれにしか検出されず、他の混入細胞種、例えばマクロファージがＩＬ−１およびＴＮＦ−ａの供給源である可能性があることが示唆される（Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９９２）。同様に、ＬＴ−ａは、大部分のヒト骨髄腫細胞株により産生される（Ｂａｔａｉｌｌｅら、１９９５）が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、骨髄腫細胞により産生されないようである（Ａｌｓｉｎａら、１９９６）。ＩＬ−１、ＴＮＦ−ａ、ＬＴ−ａおよびＩＬ−６に加え、骨髄腫細胞は、生物学的に活性がある、Ｍ−ＣＳＦの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型を産生するが、Ｍ−ＣＳＦは、ヒト骨髄培養において、独力で高カルシウム血症を引き起こさず、または破骨細胞形成を誘導しない（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、１９８６）。
【０００５】
したがって、骨髄腫患者の骨溶解性骨疾患におけるこれらの因子のいずれの役割も、ｉｎ  ｖｉｖｏで明確に立証されてきておらず、したがって、明らかに、既知のサイトカイン類がこれらの患者に見られる骨吸収を完全に説明するわけではない。
【０００６】
骨髄腫骨疾患における接着分子相互作用の役割
Ａｎｄｅｒｓｏｎおよび同僚らは、骨髄腫細胞および骨髄微小環境における細胞の間の接着相互作用の重要性を、骨髄腫細胞の増殖および骨溶解性骨疾患の発展の両方において立証した、最初のグループであった。多発性骨髄腫細胞は、細胞表面接着分子、ＣＤ２９（ＶＬＡ−４）、ＬＦＡ−１、およびＣＤ４４を発現する（Ｃｈａｕｈａｎら、１９９５）。これらの研究者らは、骨髄腫細胞が、細胞外マトリックスタンパク質および骨髄間質細胞の間の特異的な接着相互作用を介し、骨髄に配置されると示唆した。彼らはさらに、多発性骨髄腫細胞の間質細胞に対する接着が、正常および多発性骨髄腫骨髄由来間質細胞の両方によるＩＬ−６分泌を誘発し、そしてＩＬ−６仲介腫瘍細胞増殖を増加させたことを示した。しかし、ＣＤ２９、ＬＦＡ−１またはＣＤ４４に対する抗体は、骨髄腫細胞に反応する、骨髄間質細胞によるＩＬ−６産生を減少させず、別のリガンド・受容体相互作用が、骨髄腫細胞に結合した骨髄間質細胞によるＩＬ−６分泌を誘発したことが示唆された。可能性がある接着経路を単に同定しただけでは、必ずしも該経路が重要であることを意味しない。この場合、関連付けられた経路のいずれも、ＩＬ−６産生には役割を果たしていない。
【０００７】
Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら（１９９７）はまた、ネズミ骨髄腫のモデルにおいて、ネズミ５Ｔ２細胞および５Ｔ３３骨髄腫細胞の表現型的接着プロフィールも調べた。これらの研究者らは、これらの細胞株がＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＬＦＡ−１、およびＣＤ４４を発現することを示し、そしてこれらの接着相互作用が、骨髄腫細胞が骨髄間質細胞に結合するのに重要である可能性があると示唆した。
【０００８】
多くの実験が進行したのにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨髄腫における増加した破骨細胞性骨破壊の根底にある基本的な機構は、ほとんど理解されないままである。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた接着相互作用に関するデータを、容易にｉｎ  ｖｉｖｏの環境に転換することが不可能であることに反映される。例えば、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、骨髄間質に対する造血幹細胞の接着において、インテグリンＶＬＡ−４およびインテグリンＬＦＡ−１両方を関連付けている（ＰａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕおよびＮａｋａｍｏｔｏ、１９９３に概説される）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、どちらかの経路が、ｉｎ  ｖｉｖｏで遮断された場合、その結果、造血幹細胞が骨髄から末梢血に移動するであろうことを予測するであろう。しかし、霊長類の研究において、ＶＬＡ−４に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は幹細胞を有効に末梢に移動させたが、ＬＦＡ−１のベータ２インテグリン鎖に対するモノクローナル抗体は、好中球計数が増加し、したがって、ｍＡｂの有効性が立証されたにも関わらず、効果がなかった（ＰａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕおよびＮａｋａｍｏｔｏ、１９９３）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果は、実際、ｉｎ  ｖｉｖｏの関連性を正確に予測することが不可能であったことを示す。
【０００９】
リンパ腫などの白血病を含む、多発性腫瘍の転移におけるインテグリンＶＬＡ−４の役割が研究されてきており、相反する結果が出ていることに注目すべきである。上に述べたように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのヒトアルファ４鎖のトランスフェクションは、ＶＬＡ−４発現を生じ、そしてこれらの細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで骨髄に移動する能力を与え、この現象はＶＬＡ−４に対するｍＡｂにより阻害された（Ｍａｔｓｕｕｒａら、１９９６）。対照的に、ＶＬＡ−４でリンパ腫細胞をトランスフェクションすると、肝臓、肺および腎臓への転移が強力に阻害され、そして骨髄への誘導および骨髄における増殖に影響を及ぼさなかった（Ｇｏｓｓｌａｒら、１９９６）。さらに、非常に転移性のネズミ黒色腫細胞上でのＶＬＡ−４の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏで肺転移の形成を強力に阻害し（Ｑｉａｎら、１９９４）、そして黒色腫を骨髄に転移しやすくしなかった。
【００１０】
要約すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づき、接着経路のｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を、信頼性を持って予測する方法は明らかでない。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究が行われた際も、生じるデータは、一定しない。多発性骨髄腫の分野における、わかりにくい不一致の１つの主な理由は、現在利用可能な動物モデルが、ヒト疾患の優れた予測材料でないことである。多発性骨髄腫の場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖することが可能であるヒトおよびネズミ骨髄腫細胞株が、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨破壊と関連することはまれである（Ｍｕｎｄｙ、１９９８）。
【００１１】
これらの骨吸収因子の産生を阻害し、したがって進行性骨破壊を停止し、そして骨髄腫患者の生活の質を改善する、化合物またはアンタゴニストを同定することが、非常に望ましいであろう。
発明の概要
我々は、最近開発された、マウスがヒト疾患のすべての特徴を持つ重症の骨溶解を発展させる、多発性骨髄腫のネズミモデルを用いた（Ｇａｒｒｅｔｔ、１９９７）。本細胞株および動物モデルを用い、我々は、アルファ４インテグリン／アルファ４インテグリンリガンド経路の阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏで多発性骨髄腫細胞が増殖するおよび／または生存する能力の減少につながることを立証した。我々は、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１相互作用を介した骨髄腫細胞および骨髄間質細胞の間の細胞・細胞付着は、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨微小環境の破骨細胞性骨吸収を刺激する活性の産生を増加させるのに必要であることを示す。
【００１２】
我々は、本相互作用が、骨髄腫細胞の骨髄区画への誘導、該細胞の続く生存および増殖、究極的な骨髄腫誘導骨溶解の進行に重要であることを提唱する。我々はこれを動物モデルで試験し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで、アルファ４サブユニット含有インテグリンＶＬＡ−４のアンタゴニストが、ＩｇＧ２ｂサブタイプの抗体の産生を強力に阻害することを見出した。このアイソタイプは、５ＴＧＭ１細胞株に産生されるものと同一であり、そしていかなる時点でも、骨髄区画における骨髄腫細胞の数の正確な代用物である。したがって、ＶＬＡ−４経路の遮断は、ＩｇＧ２ｂ産生を非常に強力に阻害し、そして骨髄腫負荷のレベルを阻害することが示唆される。
【００１３】
本発明の１つの側面は、多発性骨髄腫を治療するための方法であって、アルファ４サブユニット含有インテグリン（例えばＶＬＡ−４）および本インテグリンのリガンド（例えばＶＣＡＭ−１）の間の相互作用のアンタゴニストを含む組成物を、治療的に有効な量、個体に投与することを含む、前記方法である。本アンタゴニストは、アルファ４インテグリン結合剤またはアルファ４インテグリンリガンド結合剤であってもよい。好ましい剤は、抗ＶＬＡ−４または抗アルファ４ベータ７抗体相同体（ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片）；抗ＶＣＡＭ−１抗体相同体（ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片）；およびアルファ４サブユニット含有インテグリンとそれらのリガンドの相互作用の小分子阻害剤である。組成物は、約０．１ないし約２０  ｍｇ／ｋｇ体重を提供するような投薬量で投与してもよい。特に、好ましい剤は：ａ）ＶＬＡ−４およびアルファ４ベータ７両方をひとまとめにし、それらのそれぞれのアルファ４リガンドとの；またはｂ）ＶＬＡ−４とそのアルファ４リガンドとのみの；またはｃ）アルファ４ベータ７とそのアルファ４リガンドとのみの、相互作用に拮抗することが可能である。
【００１４】
本発明の別の側面は、骨髄の腫瘍と関連する骨吸収を阻害するための方法であって、前記腫瘍を持つ哺乳動物に、ＶＬＡ−４などのアルファ４サブユニット含有インテグリンおよびＶＣＡＭ−１などのアルファ４サブユニット含有インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストを、前記骨吸収の阻害を提供するのに有効な量、投与することを含む、前記方法である。本アンタゴニストは、ＶＬＡ−４結合剤などのアルファ４インテグリン結合剤またはＶＣＡＭ−１結合剤などのアルファ４インテグリンリガンド結合剤であってもよい。好ましい剤は、抗ＶＬＡ４または抗アルファ４ベータ７抗体相同体（ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片）；抗ＶＣＡＭ−１抗体相同体（ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片）；およびアルファ４サブユニット含有インテグリンとそれらのそれぞれのリガンドの相互作用（例えばＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用）の小分子阻害剤である。アンタゴニストは、約０．１ないし約２０  ｍｇ／ｋｇ体重を提供するような投薬量で投与してもよい。
【００１５】
本発明のさらに別の側面は、破骨細胞形成の存在により特徴付けられる障害を有する患者を治療する方法であって、該患者に、アルファ４サブユニット含有インテグリンおよびアルファ４サブユニット含有インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストを、破骨細胞形成を抑制するのに十分な量、投与することを含む、前記方法である。同様に、該アンタゴニストは、アルファ４結合剤またはアルファ４リガンド結合剤であってもよい。好ましい剤は、抗ＶＬＡ−４または抗アルファ４ベータ７抗体相同体（ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片）；抗ＶＣＡＭ−１抗体相同体（ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片）；およびアルファ４サブユニット含有インテグリンとそれらのそれぞれのリガンドの相互作用（例えばＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用）の小分子阻害剤である。組成物は、約０．１ないし約２０  ｍｇ／ｋｇ体重を提供するような投薬量で投与してもよい。別に明記されない限り、すべての参考文献は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】５ＴＧＭ１細胞および骨髄細胞の共培養における、ＴＲＡＰ陽性多核ＯＣ様細胞形成に対する中和抗体の影響。懸濁中の５ＴＧＭ１細胞（１  ｅ  ３）および骨髄細胞（１  ｅ  ６）の混合物を、４８ウェル培養プレートに蒔き、そして１０μｇ／ｍｌの抗ＶＣＡＭ−１抗体（ＶＣＡＭ−１  Ａｂ）、抗アルファ４ベータ１抗体（α４β１１Ａｂ）、抗ＩＣＡＭ−１抗体（ＩＣＡＭ−１  Ａｂ）またはコントロールとしてのラットＩｇＧを含み、または含まず培養した。培養６日後、培養を固定し、そしてＴＲＡＰ陽性多核ＯＣ様細胞（ＴＲＡＰ（＋）ＭＮＣ）の数を測定した。ＶＣＡＭ−１  Ａｂおよびアルファ４ベータ１  ＡｂはどちらもＴＲＡＰ（＋）ＭＮＣ形成を阻害する一方、ＩＣＡＭ−１  Ａｂは影響を及ぼさなかった。データは平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）で表す。＊＝ＩｇＧコントロールと有意に異なる。
【図２】ラット胎児長骨の器官培養における骨吸収に対する、５ＴＧＭ１およびＳＴ２馴化培地の影響。ＳＴ２単独、５ＴＧＭ１単独、並びにＳＴ２および５ＴＧＭ１の共培養から得られた馴化培地（４８時間）を、４５カルシウム標識ラット胎児長骨の器官培養における骨吸収活性に関し、アッセイした。標識ラット胎児長骨を、馴化培地（４０％ｖ／ｖ）またはコントロール培地の存在下で、１２０時間培養した。データは、コントロール培地中のものに対するカルシウム放出のパーセンテージ増加として表す。ＳＴ２間質細胞の馴化培地からの放出は、白い棒で示す。５ＴＧＭ１からの放出は斜線の棒で示す。５ＴＧＭ１およびＳＴ２の共培養から採取した馴化培地からの放出は黒い棒で示す。データは平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝４）で表す。＊＝ＳＴ２単独と有意に異なる。＊＊＊＝５ＴＧＭ１単独と有意に異なる。
【図３】５ＴＧＭ１細胞による破骨細胞形成活性の産生に対する、組換え可溶性ＶＣＡＭ−１（ｓＶＣＡＭ−１）の影響。ｓＶＣＡＭ−１（１  ｘ  １０−８ないし１  ｘ  １０−７モル）の存在下または非存在下で２４時間培養した、５ＴＧＭ１細胞から、馴化培地を採取した。これらの馴化培地の破骨細胞形成活性を、マウス骨髄培養でアッセイした。骨髄細胞（１ｅ６／ウェル）を４８ウェルプレートに蒔き、そして馴化培地（斜線の棒）または同濃度のｓＶＣＡＭ−１を含むコントロール培地（ＩＭＤＭ）（白い棒）の存在下で培養した。６日後、培養を固定し、そしてＴＲＡＰ陽性多核ＯＣ様細胞（ＴＲＡＰ＋  ＭＮＣ）の数を測定した。１  ｘ  １０−７ＭのｓＶＣＡＭ−１で処理した５ＴＧＭ１細胞由来の馴化培地はＴＲＡＰ（＋）ＭＮＣ形成を増加させた。データは平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）で表す。＊＝コントロールと有意に異なる。
【図４】５ＴＧＭ１を持つマウスにおける血清ＩｇＧ２ｂ上昇に対する、ＶＬＡ−４に対するｍＡｂ  ＰＳ２の影響。マウスに１ｅ５の５ＴＧＭ１細胞を注入し、骨髄にコロニーを形成させた。マウスを３匹ずつ２群に分け、１つはコントロール群として用い、そして第二の群は、第８、１１、１４、１７および２０日に、８０μｇのｍＡｂ  ＰＳ／２（〜４  ｍｇ／ｋｇ）で処置した。５ＴＧＭ１骨髄腫細胞により産生される抗体アイソタイプである、ＩｇＧ２ｂのレベルを、第１ないし６週に、毎週測定した。ｍＡｂ処置は、強力にＩｇＧ２ｂ産生を阻害し、骨髄腫細胞の生存および増殖のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害を示した。
【図５】５ＴＧＭ１を持つマウスにおける血清ＩｇＧ２ｂ上昇に対する、ＶＣＡＭ−１に対するｍＡｂ  Ｍ／Ｋ−２．７の影響。図４に記載されるように、マウスに５ＴＧＭ１細胞を注入し、骨髄にコロニーを形成させた。マウスを４または５匹ずつ群に分け、１つはコントロール群（白い正方形）として用い、そして第二／第三の群は、予防的に、８０μｇ（白いひし形）および１６０μｇ（白い円）のｍＡｂ（〜４ないし８  ｍｇ／ｋｇ）で処置し、第四の群は、治療的に１６０μｇのｍＡｂ（三角）で処置した。５ＴＧＭ１骨髄腫細胞により産生される抗体アイソタイプである、ＩｇＧ２ｂのレベルを測定した。ｍＡｂ処置は、非常に強力にＩｇＧ２ｂ産生を阻害し、骨髄腫細胞の生存および増殖のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害を示した。
【図６】多発性骨髄腫を持つマウスの生存に対する、抗アルファ４インテグリン抗体の影響。発明の詳細な説明  本発明は、とりわけ、多発性骨髄腫を予防するための処置に関する。より詳細には、本発明の方法は、多発性骨髄腫の治療における、アルファ４サブユニットを含むインテグリンおよび本インテグリンのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストの使用に関する。「多発性骨髄腫」という用語は、プラズマ細胞の腫瘍性疾患を有する個体における医学的状態を意味するよう意図され、腫瘍性クローンは、患者間のプラズマ細胞系譜における異なる段階の細胞を表す（Ｍｕｎｄｙ、１９９８）。
【００１７】
アルファ４ベータ１インテグリンは、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチンおよびおそらく、アルファ４ベータ１インテグリンと結合する、または別の方式で相互作用する他の分子の細胞表面受容体である。これに関し、アルファ４サブユニット含有インテグリンと結合する、または別の方式で相互作用するこうした分子は、個々にそして集合的に「アルファ４リガンド（類）」と称される。したがって、本明細書において、ａ４ｂ１インテグリン（「ＶＬＡ−４」または「ａ４ｂ１」または「ａ４ｂ１インテグリン」は交換可能に用いられる）という用語は、ＶＣＡＭ−１および細胞外マトリックスタンパク質のメンバー、特にフィブロネクチン、あるいはそれらの相同体または断片に結合することが可能であるポリペプチドを指すが、一般の当業者には、ＶＬＡ−４の他のリガンドが存在する可能性があり、そして慣用法を用い解析することが可能であることが認識されるであろう。
【００１８】
にもかかわらず、アルファ４サブユニットがベータ１に加え、他のベータサブユニットと関連するであろうことが知られ、したがって、「アルファ４インテグリン」という用語を、アルファ４サブユニットがベータサブユニットの１つまたは別のものと関連するインテグリンと定義することが可能である。「アルファ４」インテグリンのさらなる例はアルファ４ベータ７である（Ｒ．  ＬｏｂｂおよびＭ  Ｈｅｍｌｅｒ、１９９４）。本明細書において、「アルファ４インテグリン（類）」は、ＶＬＡ−４と共に、ベータ１、ベータ７または他のいかなるベータサブユニットでもよいものを持つインテグリンを意味する。
【００１９】
本明細書に論じられるように、本発明の方法に用いられるアンタゴニストは、特定の種類または構造の分子に限定されず、したがって、本発明の目的のため、アルファ４サブユニットを含むいかなるインテグリン、例えばＶＬＡ−４を持つ細胞の表面上のＶＬＡ−４および／またはアルファ４ベータ７を持つ細胞の表面上のアルファ４ベータ７インテグリン（ＬｏｂｂおよびＨｅｍｌｅｒ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９４：１７２２−１７２８（１９９４））に、および／またはそれらのそれぞれのアルファ４リガンド、例えばそれぞれＶＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭを持つ細胞の表面上のＶＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭに結合することが可能であり、そしてＶＬＡ−４（またはアルファ４ベータ７）またはＶＣＡＭ−１（またはＭａｄＣＡＭ）を有効に遮断するまたは被覆する、いかなる剤も、本明細書の実施例に用いられるアンタゴニストの同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）と見なされる。
【００２０】
インテグリン「アンタゴニスト」には、アルファ４インテグリン（類）がアルファ４インテグリンリガンドおよび／または受容体と結合することを阻害する、いかなる化合物も含まれる。抗インテグリン抗体または抗体相同体含有タンパク質（以下に論じられる）と共に他の分子、例えばインテグリンのリガンドタンパク質の可溶性型が有用である。アルファ４インテグリンのリガンドタンパク質の可溶性型には、可溶性ＶＣＡＭ−１またはコラーゲンペプチド、ＶＣＡＭ−１融合タンパク質、または二官能性ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質が含まれる。例えば、アルファ４インテグリンリガンドの可溶性型またはその断片を投与し、インテグリンに結合させ、そして好ましくは細胞上のインテグリン結合部位に関し競合させ、それにより、抗アルファ４インテグリン（例えばアルファ４ベータ７抗体および／またはＶＬＡ−４抗体）などのアンタゴニストの投与と類似の効果を導いてもよい。特に、アルファ４インテグリンリガンドと結合するが、インテグリン依存情報伝達を引き出さない、可溶性アルファ４インテグリン突然変異体が、本発明の範囲内に含まれる。こうした突然変異体は、野生型インテグリンタンパク質の競合的阻害剤として利用することが可能であり、そして「アンタゴニスト」と見なされる。本発明の方法に用いられる他のアンタゴニストは、以下に定義されるような「小分子」である。
【００２１】
本発明に含まれるのは、１つ以上のアルファ４インテグリンの作用に拮抗する剤、例えばいくつかのアルファ４インテグリン、例えばＶＬＡ−４およびアルファ４ベータ７、または他の組み合わせのアルファ４インテグリン類に拮抗する、単一の小分子または抗体相同体を用いる方法である。やはり本発明の範囲内に含まれるのは、組み合わされた活性が１つ以上のアルファ４インテグリンの作用に拮抗するように、異なる分子の組み合わせを用いる方法、例えば組み合わせてアルファ４インテグリンＶＬＡ−４およびアルファ４ベータ７、または他の組み合わせのインテグリン類に拮抗する、いくつかの小分子または抗体相同体を用いる方法である。
【００２２】
本明細書に論じられるように、特定のインテグリンアンタゴニストを、例えば免疫グロブリンまたはその断片などの抗体相同体に融合させまたは別の方式で結合させてもよく、そして該アンタゴニストは、特定の種類または構造のインテグリンまたはリガンドまたは他の分子に限定されない。したがって、本発明の目的のため、融合タンパク質（以下に定義されるようなもの）を形成することが可能であり、そしてアルファ４インテグリンリガンドに結合することが可能であり、そしてアルファ４ベータ７および／またはＶＬＡ−４インテグリンを有効に遮断するまたは被覆する、いかなる剤も、本明細書の実施例に用いられるアンタゴニストの同等物と見なされる。
【００２３】
本発明の目的のため、「アルファ４インテグリンリガンド／アルファ４インテグリン相互作用のアンタゴニスト」は、アルファ４リガンド（例えばＶＣＡＭ−１）および／またはアルファ４インテグリン（例えばアルファ４ベータ７またはＶＬＡ−４）仲介結合を阻害するまたは遮断することが可能である、あるいは例えば、アルファ４リガンド仲介アルファ４インテグリン情報伝達またはアルファ４リガンド仲介アルファ４リガンド情報伝達を阻害するまたは遮断することにより、アルファ４リガンドおよび／またはアルファ４インテグリン機能を別の方式で調節することが可能であり、そして好ましくは抗アルファ４インテグリン抗体と同じ方式で、多発性骨髄腫の治療に有効である、剤、例えばポリペプチドまたは他の分子を指す。
【００２４】
特に、ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用のアンタゴニストは、以下の特性の１つまたはそれ以上を有する剤である：（１）該剤は、ＶＬＡ−４リガンド／ＶＬＡ−４相互作用、例えば骨間質細胞および骨髄腫細胞の間のＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用を阻害するのに、十分な特異性を持って、ＶＬＡ−４を持つ細胞（例えば骨髄腫細胞）の表面上のＶＬＡ−４を被覆するまたは該ＶＬＡ−４に結合する；（２）該剤は、ＶＬＡ−４仲介シグナルの伝達、例えばＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１仲介情報伝達を修飾するのに、そして好ましくは阻害するのに、十分な特異性を持って、ＶＬＡ−４を持つ細胞（すなわち骨髄腫細胞）の表面上のＶＬＡ−４を被覆するまたは該ＶＬＡ−４に結合する；（３）該剤は、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ相互作用を阻害するのに、十分な特異性を持って、骨間質細胞上のＶＬＡ−４リガンド（例えばＶＣＡＭ−１）を被覆するまたは該リガンドに結合する；（４）該剤は、ＶＬＡ−４リガンド仲介ＶＬＡ−４情報伝達、例えばＶＣＡＭ−１仲介ＶＬＡ−４情報伝達を修飾するのに、そして好ましくは阻害するのに、十分な特異性を持って、骨間質細胞上のＶＬＡ−４リガンド（例えばＶＣＡＭ−１）を被覆するまたは該リガンドに結合する。好ましい態様において、アンタゴニストは特性１および２の１つまたは両方を有する。他の好ましい態様において、アンタゴニストは特性３および４の１つまたは両方を有する。さらに、１つ以上のアンタゴニストを患者に投与してもよく、例えばＶＬＡ−４に結合する剤を、ＶＣＡＭ−１に結合する剤と組み合わせてもよい。
【００２５】
例えば、抗体または抗体相同体（以下に論じられる）と共に、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１に対する天然結合タンパク質の可溶性型が有用である。ＶＬＡ−４に対する天然結合タンパク質の可溶性型には、可溶性ＶＣＡＭ−１ペプチド、ＶＣＡＭ−１融合タンパク質、二官能性ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質、フィブロネクチン、選択的スプライシングされた非ＩＩＩ型連結部分を有するフィブロネクチン、およびアミノ酸配列ＥＩＬＤＶまたは類似の保存的置換アミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチドが含まれる。ＶＣＡＭ−１に対する天然結合タンパク質の可溶性型には、可溶性ＶＬＡ−４ペプチド、ＶＬＡ−４融合タンパク質、二官能性ＶＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質およびそれらに匹敵するものが含まれる。本明細書において、「可溶性ＶＬＡ−４ペプチド」または「可溶性ＶＣＡＭ−１ペプチド」は、膜にそれ自体を係留する（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）ことが不可能なＶＬＡ−４またはＶＣＡＭ−１ポリペプチドである。こうした可溶性ポリペプチドには、例えば、該ポリペプチドを係留する膜貫通ドメインの十分な部分を欠くまたは膜貫通ドメインが非機能的であるように修飾されているＶＬＡ−４およびＶＣＡＭポリペプチドが含まれる。これらの結合剤は、ＶＬＡ−４に対する細胞表面結合タンパク質と競合することにより、または別の方式でＶＬＡ‐４機能を改変することにより、作用することが可能である。例えば、ＶＣＡＭ−１の可溶性型（例えば、Ｏｓｂｏｒｎら，  １９８９，  Ｃｅｌｌ，  ５９：１２０３−１２１１）またはその断片を投与し、ＶＬＡ−４に結合させ、そして好ましくは骨髄腫細胞上のＶＬＡ−４結合部位に関し競合させ、それにより小分子または抗ＶＬＡ−４抗体などのアンタゴニストの投与に類似の効果を導いてもよい。
【００２６】
別の例において、ＶＣＡＭ−１、またはＶＬＡ−４を持つ骨髄腫細胞の表面上のＶＬＡ−４に結合することが可能なその断片、例えばＶＣＡＭ−１の２つのＮ末端ドメインを含む断片を、第二のペプチド、例えばＶＣＡＭ−１部分の可溶性またはｉｎ  ｖｉｖｏ存続時間を増加させるペプチドに融合させてもよい。第二のペプチドは、可溶性ペプチド、好ましくはヒトペプチド、より好ましくは血漿タンパク質、または免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの断片であってもよい。特に好ましい態様において、第二のペプチドはＩｇＧあるいはその一部または断片、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、そして少なくともヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
【００２７】
本発明の方法に有用な他のアンタゴニストには、限定されるわけではないが、例えば細胞表面上のＶＬＡ−４受容体に結合することによりＶＬＡ−４を遮断する、または細胞表面上のＶＣＡＭ−１受容体に結合することによりＶＣＡＭ−１を遮断することにより、アルファ４インテグリン／アルファ４インテグリンリガンド相互作用を破壊することが可能なペプチド（「小分子」と呼ばれる有機分子）の作用を模倣する剤が含まれる。これらの「小分子」は、それ自体、小さいペプチドであってもよいし、あるいはより大きいペプチド含有有機化合物または非ペプチド性有機化合物であってもよい。本明細書において、「小分子」は、抗体または抗体相同体を含むことを意図しない。こうした「小分子」の分子量は、一般的に２０００未満であるが、我々は、この数を分子量の絶対的な上限として適用することを意図しない。
【００２８】
例えば、ＶＬＡ−４リガンドの結合ドメインを模倣し、そしてＶＬＡ−４の受容体ドメインに適合する、オリゴ糖などの小分子を使用してもよい。すべて本明細書に援用される、Ｊ．Ｊ．  Ｄｅｖｌｉｎら，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４００−４０６（１９９０）、Ｊ．Ｋ．  ＳｃｏｔｔおよびＧ．Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０、および米国特許４，８３３，０９２（Ｇｅｙｓｅｎ）を参照されたい。逆に、ＶＣＡＭ−１リガンドの結合ドメインを模倣し、そしてＶＣＡＭ−１の受容体ドメインに適合する、小分子を使用してもよい。
【００２９】
本発明に有用な他の小分子の例は、Ｋｏｍｏｒｉｙａら（“Ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ（ＣＳ１）  Ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｉｓ  Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｖａｌｉｎｅ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６（２３），  ｐｐ．１５０７５−７９（１９９１））に見出すことが可能である。彼らは、ＶＬＡ−４に結合するのに必要な最小限の活性アミノ酸配列を同定し、そして特定の種のフィブロネクチンのＣＳ−１領域（ＶＬＡ−４結合ドメイン）のアミノ酸配列に基づき、多様な重複ペプチドを合成した。彼らは、フィブロネクチン依存細胞接着に対し阻害活性を有する、８アミノ酸ペプチド、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒと共に、２つのより小さい重複ペンタペプチド、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒを同定した。続いて、ＬＤＶ配列を含む、より長い特定のペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで活性があることが示された（Ｔ．Ａ．  Ｆｅｒｇｕｓｏｎら，  “Ｔｗｏ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｂｒｏｇａｔｅ  Ｔ−Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ｐｐ．８０７２−７６（１９９１）；およびＳ．Ｍ．  Ｗａｈｌら，  “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ”，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９４，  ｐｐ．６５５−６２（１９９４）。フィブロネクチンに対するＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５接着両方を阻害することが可能な、環状ペンタペプチド、Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−ＴＰｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｐｒｏは４−チオプロリンを示す）もまた記載されてきている（例えば、Ｄ．Ｍ．  Ｎｏｗｌｉｎら，  “Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｌｐｈａ４Ｂｅｔａ１  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８（２７），  ｐｐ．２０３５２−５９（１９９３）；およびＰＣＴ公告ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４８６２を参照されたい）。本ペンタペプチドは、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質の認識部位における共通モチーフとして知られてきていたＦＮ由来のトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐに基づいた。
【００３０】
他の小分子ＶＬＡ−４阻害剤の例は、例えば、細胞接着阻害活性を有するベータアミノ酸を含む直線ペプチジル化合物を記載する、Ａｄａｍｓら，  “Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、ＰＣＴ  ＵＳ９７／１３０１３に報告されてきている。国際特許出願ＷＯ  ９４／１５９５８およびＷＯ  ９２／００９９５は、細胞接着阻害活性を持つ環状ペプチドおよびペプチド模倣化合物を記載する。国際特許出願ＷＯ  ９３／０８８２３およびＷＯ  ９２／０８４６４は、グアニジニル、尿素、チオ尿素含有細胞接着阻害化合物を記載する。米国特許第５，２６０，２７７号は、グアニジニル細胞接着調節化合物を記載する。
【００３１】
こうした小分子模倣剤は、複数のペプチド、半ペプチド性化合物または非ペプチド性有機化合物を合成することにより産生し、そしてその後、アルファ４インテグリン／アルファ４インテグリンリガンド相互作用を阻害する能力に関し、これらの化合物をスクリーニングしてもよい。一般的には、米国特許第４，８３３，０９２号、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，  “Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ｐｐ．３８６−９０（１９９０）、およびＤｅｖｌｉｎら，  “Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  Ａ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ｐｐ．４０４０７（１９９０）を参照されたい。
【００３２】
他の好ましい態様において、細胞表面アルファ４インテグリンおよび／またはアルファ４インテグリンリガンドに、遮断または被覆を含め、結合するため、本発明の方法で用いられる剤は、抗ＶＬＡ−４および／または抗アルファ４ベータ７モノクローナル抗体または抗体相同体である。治療、特にヒト治療に好ましい抗体および相同体には、ヒト抗体相同体、ヒト化抗体相同体、キメラ抗体相同体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）抗体断片、並びに抗体重鎖または軽鎖の単量体または二量体あるいはそれらの混合物が含まれる。ＶＬＡ−４に対するモノクローナル抗体は、本発明の方法における好ましい結合剤である。
【００３３】
本明細書において、「抗体相同体」という用語には、ジスルフィド結合を介し連結される免疫グロブリン軽鎖および重鎖からなる、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体が含まれる。「抗体相同体」という用語はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖および１つ以上の抗原に結合することが可能なそれらの抗原結合断片から選択される、１つまたはそれ以上のポリペプチドを含むタンパク質を含むよう、意図される。１つ以上のポリペプチドで構成される抗体相同体の構成要素ポリペプチドは、所望により、ジスルフィド結合または別の方式で共有架橋されていてもよい。
【００３４】
したがって、「抗体相同体」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ種（と共にそれらのサブタイプ）の損なわれていない免疫グロブリンを含み、ここで免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ種であってもよい。
【００３５】
「抗体相同体」にはまた、抗原結合特異性を保持する、損なわれていない抗体の一部、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ｖ）断片、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、１つの重鎖および１つの軽鎖からなる二量体、並びにそれらに匹敵するものが含まれる。したがって、上述の抗体由来の抗原結合断片と共に、全長二量体または三量体ポリペプチドは、それ自体、有用である。
【００３６】
本明細書において、「ヒト化抗体相同体」は、組換えＤＮＡ技術により産生される抗体相同体であり、抗原結合に必要でないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくつかまたはすべてが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸に対し、置換されている。
【００３７】
本明細書において、「キメラ抗体相同体」は、組換えＤＮＡ技術により産生される抗体相同体であり、免疫グロブリン軽鎖、重鎖または両方のヒンジおよび定常領域のすべてまたは一部が、別の免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来の対応する領域に対し、置換されている。別の側面において、本発明は：（１）ＶＬＡ−４標的化部分、例えばＶＬＡ−４を持つ骨髄腫細胞の表面上の抗原（すなわちＶＬＡ−４）に結合することが可能なＶＣＡＭ−１部分；（２）所望により、第二のペプチド、例えばＶＬＡ−４標的化部分の可溶性またはｉｎ  ｖｉｖｏ存続時間を増加させるもの、例えば免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーあるいはその断片または一部、例えばＩｇＧの一部または断片、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、例えばＣＨ２およびＣＨ３ヒンジ領域；および毒性部分を含む、キメラ分子の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を特徴とする。ＶＬＡ−４標的化部分は、いかなる天然発生ＶＬＡ−４リガンドまたは断片、例えばＶＣＡＭ−１ペプチド、または類似の保存的置換アミノ酸配列であってもよい。好ましい標的化部分は、可溶性ＶＣＡＭ−１断片、例えばＶＣＡＭ−１分子のＮ末端ドメイン１および２である。キメラ分子を用い、ＶＬＡ−４、および好ましくは活性化ＶＬＡ−４を持つ骨髄腫細胞の存在により特徴付けられる障害、例えば多発性骨髄腫のリスクがある患者、例えばヒトを治療してもよい。
【００３８】
本明細書において、「ヒト抗体相同体」は、組換えＤＮＡ技術により産生される抗体相同体であり、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸はすべて、ヒト供給源に由来する。
【００３９】
抗ＶＬＡ−４抗体相同体を作成する方法
モノクローナル抗体相同体を産生するための技術が周知である。簡潔には、不死細胞株（典型的には骨髄腫細胞）を、既定の抗原、例えばＶＬＡ−４を発現する全細胞で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾臓細胞）に融合させ、そして生じたハイブリドーマ細胞の培養上清を、該抗原に対する抗体に関し、スクリーニングする。一般的には、Ｋｏｈｌｅｒら，  １９７５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２６５：２９５−２９７を参照されたい。
【００４０】
免疫感作は、標準法を用い、達成することが可能である。単位用量および免疫感作計画は、免疫される哺乳動物種、その免疫状態、該哺乳動物の体重などに応じる。典型的には、免疫哺乳動物を出血させ、そして適切なスクリーニングアッセイを用い、各血液試料由来の血清を、特定の抗体に関しアッセイする。例えば、抗ＶＬＡ−４抗体は、ＶＬＡ−４発現細胞由来の１２５Ｉ標識細胞溶解物の免疫沈降により、同定することが可能である。（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら，  １９８６，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６：１３４３−１３４９およびＨｅｍｌｅｒら，  １９８７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２，  １１４７８−１１４８５を参照されたい）。抗ＶＬＡ−４抗体はまた、フローサイトメトリーにより、例えばＶＬＡ−４を認識すると考えられる抗体とインキュベーションしたＲａｍｏｓ細胞の蛍光染色を測定することにより、同定することも可能である（Ｅｌｉｃｅｓら，  １９９０，  Ｃｅｌｌ，  ６０：５７７−５８４を参照されたい）。ハイブリドーマ細胞の産生に用いられるリンパ球は、典型的には、こうしたスクリーニングアッセイを用い、抗ＶＬＡ−４抗体の存在に関し、血清がすでに陽性に試験されている免疫動物から単離する。
【００４１】
典型的には不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、１５００分子量ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ  １５００」）を用い、マウス脾臓細胞に融合させる。融合から生じるハイブリドーマ細胞を、その後、未融合および非生産的に融合している骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を用いて選択する（未融合脾臓細胞は、形質転換されていないため、数日後に死ぬ）。望ましい抗体を産生するハイブリドーマを、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、検出する。例えば、抗ＶＬＡ−４抗体を産生するよう調製されたハイブリドーマは、ハイブリドーマ培養上清を、組換えアルファ４サブユニット発現細胞株に結合する能力を有する分泌抗体に関し、試験することにより、スクリーニングすることが可能である（Ｅｌｉｃｅｓら、上記を参照されたい）。
【００４２】
損なわれていない免疫グロブリンである抗ＶＬＡ−４抗体相同体を産生するため、こうしたスクリーニングアッセイで陽性と試験されたハイブリドーマ細胞を、ハイブリドーマ細胞が培地にモノクローナル抗体を分泌するのを可能にする条件下でそして十分な時間、栄養培地中で培養した。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術および培地は周知である。馴化ハイブリドーマ培養上清を集め、そして所望により、周知の方法により、抗ＶＬＡ４抗体をさらに精製してもよい。
【００４３】
あるいは、非免疫マウスの腹腔にハイブリドーマ細胞を注入することにより、望ましい抗体を産生してもよい。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し、抗体を分泌し、抗体は腹水として集積する。シリンジで腹腔から腹水を引き取ることにより、抗体を採取してもよい。
【００４４】
いくつかのマウス抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体が、先に記載されてきている。例えばＳａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、１９８６、上記；Ｈｅｍｌｅｒら、１９８７、上記；Ｐｕｌｉｄｏら，  １９９１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６（１６），  １０２４１−１０２４５を参照されたい。これらの抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体、例えばＶＬＡ−４のＰ鎖を認識することが可能な、ＨＰ  １／２および他の抗ＶＬＡ−４抗体（例えばＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５、Ｐ４Ｃ２、Ｐ４Ｇ９）は、本発明にしたがった治療法に有用であろう。ＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチンリガンドに対する結合に関与するＶＬＡ−４アルファ４鎖エピトープを認識するであろう抗ＶＬＡ−４抗体（すなわち、リガンド認識に関与する部位でＶＬＡ−４に結合し、そしてＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチン結合を遮断することが可能である抗体）が好ましい。こうした抗体は、Ｂエピトープ特異的抗体（Ｂ１またはＢ２）と定義されてきており、そしてまた本発明にしたがった抗ＶＬＡ−４抗体でもある。
【００４５】
ＶＬＡ−４に対する完全なヒトモノクローナル抗体相同体は、本発明の方法において、ＶＬＡ−４抗原を遮断するまたは被覆する可能性がある、別の好ましい結合剤である。これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７，  ８６−９５に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプライム化（ｐｒｉｍｅｄ）ヒト脾臓細胞を用い、その損なわれていない型で調製することが可能である。あるいは、これらは、ヒトＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記載する、Ｐｅｒｓｓｏｎら，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：２４３２−２４３６に、またはＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４１，  ２２７−２３６、米国特許５，７９８，２３０（１９９８年８月２５日、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ”）に記載されるように、レパトア・クローニングにより調製してもよい。本方法にしたがい、エプスタイン・バーウイルス、またはエプスタイン・バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するその誘導体での感染により、ヒト抗体産生Ｂ細胞を不死化する。不死化に必要とされるＥＢＮＡ２の機能は、続いて停止され、抗体産生の増加を生じる。
【００４６】
完全なヒト抗体を産生するためのさらに別の方法において、米国特許５，７８９，６５０（１９９８年８月４日、“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）は、異種抗体を産生することが可能なトランスジェニック非ヒト動物および不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を記載する。内因性免疫グロブリン遺伝子は、アンチセンスポリヌクレオチドにより、および／または内因性免疫グロブリンに対して向けられる抗血清により、抑制される。異種抗体は、その種の非ヒト動物のゲノムに通常見られない免疫グロブリン遺伝子によりコードされる。非再編成異種ヒト免疫グロブリン重鎖の配列を含む、１つまたはそれ以上の導入遺伝子を、非ヒト動物に導入し、それにより機能的に導入遺伝子免疫グロブリン配列を再編成し、そしてヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる多様なアイソタイプの抗体レパトアを産生することが可能な、トランスジェニック動物を形成する。こうした異種ヒト抗体は、Ｂ細胞で産生され、該Ｂ細胞をその後、例えば、骨髄腫などの不死化細胞株と融合させることにより、または完全なモノクローナル異種ヒト抗体相同体を産生することが可能な細胞株を永続させるための他の技術で、こうしたＢ細胞を操作することにより、不死化する。
【００４７】
大きな非免疫化ヒトファージライブラリーもまた、標準的ファージ技術を用い、ヒト治療薬として発展させることが可能な高親和性抗体を単離するのに用いてもよい（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６）。本発明の方法において、ＶＬＡ−４抗原を遮断するまたは被覆する可能性がある、さらに別の好ましい結合剤は、抗ＶＬＡ−４特異性を有するヒト化組換え抗体相同体である。キメラ抗体の調製のための初期の方法に続く、新たなアプローチが、ＥＰ  ０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載された。該方法では、抗体を、１つの種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別のもの由来のものに関し、置換することにより、改変する。本方法は、例えば、ヒト重鎖および軽鎖Ｉｇ可変領域部分を、ネズミ可変領域ドメイン由来の代替ＣＤＲで置換するのに用いてもよい。これらの改変Ｉｇ可変領域は、続いて、ヒトＩｇ定常領域と組み合わせ、置換ネズミＣＤＲ以外は、組成が完全にヒトである抗体を生成することが可能である。こうしたＣＤＲ置換抗体は、かなり少ない非ヒト構成要素を含むため、キメラ抗体に比べ、ヒトにおいて免疫反応を引き出す可能性がより低いと予測されるであろう。ＣＤＲ「移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」を介したモノクローナル抗体のヒト化のための方法は、「再成形（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」と名付けられている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，  ３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，  １５３４−１５３６）。
【００４８】
典型的には、特定の抗原に結合するマウス抗体の領域であるのはＣＤＲである（３つは抗体重鎖に、３つは抗体軽鎖にある）ため、ネズミ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域上に移植する。ＣＤＲの移植は、遺伝子操作により達成され、これにより、ネズミ重鎖および軽鎖可変（Ｖ）領域遺伝子部分のクローニングによりＣＤＲ  ＤＮＡ配列が決定され、そしてその後、部位特異的突然変異誘発により、対応するヒトＶ領域に移される。該方法の最終段階で、望ましいアイソタイプのヒト定常領域遺伝子部分（通常ＣＨに関しガンマＩおよびＣＬに関しカッパ）を添加し、そしてヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞で共発現し、可溶性ヒト化抗体を産生する。
【００４９】
これらのＣＤＲのヒト抗体への転移は、本抗体に、元来のネズミ抗体の抗原結合特性を与える。ネズミ抗体における６つのＣＤＲは、構造的にＶ領域「枠組み」領域に乗っている。ＣＤＲ移植が成功する理由は、マウスおよびヒト抗体の間の枠組み領域が、ＣＤＲが交換可能であるように、非常に類似の３−Ｄ構造を有し、ＣＤＲに対する付着点が類似である可能性があることである。こうしたヒト化抗体相同体は、Ｊｏｎｅｓら，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，  ５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，  ３２３−３２７；Ｑｕｅｅｎら，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  １００２９；およびＯｒｌａｎｄｉら，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  ３８３３に例示されるように、調製してもよい。
【００５０】
にもかかわらず、枠組み領域内の特定のアミノ酸は、ＣＤＲと相互作用し、そして抗原結合親和性全体に影響を及ぼすと考えられる。ヒトＶ領域枠組みにいかなる修飾も加えない組換えヒト化抗体を産生する、ネズミ抗体由来のＣＤＲの直接転移は、しばしば、結合親和性の部分的または完全な欠失を生じる。いくつかの場合、結合活性を得るためには、受容抗体の枠組み領域の残基を改変することが必須であるようである。
【００５１】
Ｑｕｅｅｎら、１９８９（上記）およびＷＯ  ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）は、ネズミＭＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲをヒト免疫グロブリン枠組みおよび定常領域と組み合わせることにより、受容抗体の枠組み領域に修飾残基を含む、ヒト化抗体の調製を記載してきている。彼らは、ヒトＶ領域枠組み残基のいかなる修飾も伴わない、直接ＣＤＲ転移からしばしば生じる、結合親和性の損失の問題に対する１つの解決を示してきている；彼らの解決は、２つの重要な段階を伴う。まず、コンピューターアナリストにより、元来のネズミ抗体、この場合、抗Ｔａｃ  ＭＡｂのＶ領域枠組みに対する最適タンパク質配列相同に関し、ヒトＶ領域枠組みを選択する。第二の段階において、ネズミＣＤＲと相互作用するようである枠組みアミノ酸残基を視覚化するため、コンピューターにより、ネズミＶ領域の三次構造をモデル化し、そしてその後、これらのネズミアミノ酸残基を、相同ヒト枠組み上に補充する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ、米国特許５，６９３，７６２も参照されたい。
【００５２】
異なるアプローチ（Ｔｅｍｐｅｓｔら，  １９９１，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  ２６６−２７１）を用い、そして、マウス残基の根本的な導入を伴わないＣＤＲ移植のため、それぞれＮＥＷＭおよびＲＩＥ重鎖および軽鎖由来のＶ領域枠組みを、標準として利用してもよい。ＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づくヒト化抗体を構築する、Ｔｅｍｐｅｓｔらのアプローチを用いる利点は、ｘ線結晶学により、ＮＥＷＭおよびＲＥＩ可変領域の３次元構造が知られており、そしてしたがって、ＣＤＲおよびＶ領域枠組み残基の間の特異的な相互作用をモデル化することが可能であることである。
【００５３】
取られるアプローチに関係なく、現在までに調製された初期のヒト化抗体相同体の例は、これが容易な過程ではないことを示してきている。一方、こうした枠組みの改変が必要であろうことを知っていても、利用可能な先行技術に基づき、あるとすれば、どの枠組み残基が、望ましい特異性を持つ機能するヒト化組換え抗体を得るために改変する必要があるであろうか予測するのは不可能である。これまでの結果は、特異性および／または親和性を保持するのに必要な変化は、大部分、既定の抗体に特有であり、そして異なる抗体のヒト化に基づき予測することは不可能であることを示す。
【００５４】
本発明に有用な好ましいアンタゴニストには、調製されてきているＢエピトープ特異性を有するキメラ組換えおよびヒト化組換え抗体相同体（すなわち損なわれていない免疫グロブリンおよびその一部）が含まれ、そして１９９３年１月１２日に提出された同時係属米国特許出願第０８／００４，７９８号、１９９４年１月７日に提出されたＰＣＴ公告ＵＳ  ９４／００２６６に記載される。キメラ（マウスＶ−ヒトＣ）およびヒト化抗ＶＬＡ−４抗体相同体の調製のための出発物質は、先に記載されるように、ネズミモノクローナル抗ＶＬＡ−４抗体、商業的に入手可能なモノクローナル抗ＶＬＡ−４抗体（例えばＨＰ２／１、Ａｍａｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．、メイン州ウェストブルック）、または本明細書の解説と一致して調製された抗ＶＬＡ−４抗体であってもよい。例えば、抗ＶＬＡ−４抗体ＨＰ１／２の重鎖および軽鎖の可変領域がクローンされ、配列決定され、そしてヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域と組み合わせ発現されてきている。こうしたＨＰ１／２抗体は、ネズミＨＰ  １／２抗体と、特異性および強度が類似であり、そして本発明にしたがった治療法に有用である可能性がある。
【００５５】
他の好ましいヒト化抗ＶＬＡ４抗体相同体は、Ａｔｈｅｎａ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．により、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１２１９（１９９５年７月２７日）に記載される。これらのヒト化抗ＶＬＡ−４抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を含む。ヒト化軽鎖は、マウス２１−６免疫グロブリン軽鎖の対応する相補性決定領域由来のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および少なくとも１つの位で、アミノ酸位が、マウス２１．６免疫グロブリン軽鎖可変領域枠組みの同等の位に存在するのと同じアミノ酸により占められることを除き、ヒトカッパ軽鎖可変領域枠組み配列由来の可変領域枠組みを含む。ヒト化重鎖は、マウス２１−６免疫グロブリン重鎖の対応する相補性決定領域由来のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および少なくとも１つの位で、アミノ酸位が、マウス２１−６免疫グロブリン重鎖可変領域枠組みの同等の位に存在するのと同じアミノ酸により占められることを除き、ヒト重鎖可変領域枠組み配列由来の可変領域枠組みを含む。
【００５６】
治療的適用
本発明の第一の側面にしたがった本方法において、ＶＬＡ−４結合剤、特にＶＣＡＭ融合体および抗ＶＬＡ−４抗体相同体は、好ましくは非経口的に投与される。「非経口」という用語は、本明細書において、皮下、静脈内、筋内、関節腔内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝臓内、病変内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）、頭蓋内注射または注入技術を含む。
【００５７】
ＶＬＡ−４結合剤は、好ましくは、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらに匹敵するもの、またはそれらの組み合わせなどの、多くの周知のキャリアーのいずれでもよい、薬学的に許容しうるキャリアーを含む、無菌薬剤組成物として投与される。本発明の化合物は、無機または有機酸および塩基由来の薬学的に許容しうる塩の形で用いてもよい。こうした酸性塩に含まれるのは以下のものである：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫化水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、カンホスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、メタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート（ｐａｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラートおよびウンデカン酸塩。塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウムおよびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩、有機塩基を含む塩、例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンおよびアミノ酸、例えばアルギニン、リジンなどを含む塩が含まれる。また、塩基性窒素含有基を、ハロゲン化低級アルキル、例えば塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピル、およびブチル；硫酸ジアルキル、例えば硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル、ハロゲン化長鎖アルキル、例えば塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル、ハロゲン化アラルキル、例えば臭化ベンジルおよびフェネチルおよび他のもので四級化（ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅｄ）してもよい。それにより水または油可溶性または分散可能産物を得る。
【００５８】
本発明の薬剤組成物は、本発明のいかなる化合物、または薬学的に許容しうるその誘導体を、いかなる薬学的に許容しうるキャリアーと共に含んでもよい。「キャリアー」という用語は、本明細書において、許容しうるアジュバントおよびビヒクルを含む。本発明の薬剤組成物に用いてもよい薬学的に許容しうるキャリアーには、限定されるわけではないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝基質、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド性シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく基質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート類、ワックス類、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー類、ポリエリレングリコールおよび羊毛脂が含まれる。
【００５９】
本発明にしたがい、薬剤組成物は、無菌注射可能調製、例えば無菌注射可能水性または油性懸濁物の形であってもよい。本懸濁物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用い、当業に知られる技術にしたがい、処方してもよい。無菌注射可能調製はまた、非毒性の非経口的に許容しうる希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または懸濁物、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用してもよい許容しうるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液および等張塩化水素溶液がある。さらに、溶媒または懸濁媒体として、無菌不揮発性油を慣用的に使用する。本目的のため、合成モノまたはジグリセリド類を含む、いかなる刺激がない（ｂｌａｎｄ）不揮発性油を使用してもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射可能剤の調製に有用であり、天然の薬学的に許容しうる油、例えば、特にそのポリオキシエチレン化型のオリーブ油またはひまし油も同様である。これらの油溶液または懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばＰｈ．  Ｈｅｌｖまたは類似のアルコールも含んでもよい。
【００６０】
本発明の薬剤組成物、特にＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１相互作用の小分子アンタゴニストは、非経口的にまたは経口的に投与してもよい。経口的に投与する場合、限定されるわけではないが、カプセル、錠剤、水性懸濁物または溶液を含む、経口的に許容しうるいかなる投薬型で投与してもよい。経口使用のための錠剤の場合、通常用いられるキャリアーには、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもまた、典型的に添加される。カプセル型の経口投与の場合、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが含まれる。経口使用に水性懸濁物が必要とされる場合、活性成分を乳化剤および懸濁剤と組み合わせる。望ましい場合、特定の甘味料、香料または着色料もまた添加してもよい。局所経皮パッチもまた用いてもよい。本発明の薬剤組成物はまた、鼻エアロゾルまたは噴霧器使用を通じた吸入、乾燥粉末吸入器または用量測定吸入器により、投与してもよい。こうした組成物は、薬剤処方の当業に周知の技術にしたがい調製し、そしてベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物学的利用能を亢進する吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の慣用的な可溶化剤または分散剤を使用し、生理食塩水中の溶液として調製してもよい。
【００６１】
別の態様にしたがい、本発明の化合物を含む組成物はまた、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫抑制剤、代謝拮抗剤、および免疫調節剤からなる群より選択される、さらなる剤も含んでもよい。これらの種類の各々に含まれる特定の化合物は、その開示が本明細書に援用される、“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，英国オックスフォード，ｐｐ．９７０−９８６（１９９０）の適切なグループ表題下に列挙されるいかなるものから選択してもよい。やはり本グループ内に含まれるのは、テオフィリン、スルファサラジンおよびアミノサリチル酸塩（抗炎症剤）；シクロスポリン、ＦＫ−５０６、およびラパマイシン（免疫抑制剤）；シクロホスファミドおよびメトトレキセート（代謝拮抗剤）；ステロイド類（吸入、経口または局所）およびインターフェロン類（免疫調節剤）である。
【００６２】
キャリアー成分と組み合わせてもよい、単回投薬型を産生する活性成分の量は、治療される宿主、および投与の特定の方式に応じ、変化するであろう。しかし、いかなる特定の患者のための特定の投薬および治療処方計画も、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、食餌、投与時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、および治療する医師の判断および治療しようとする特定の疾患の重症度を含む、多様な要因に応じるであろう。活性成分の量はまた、あるとすれば、該成分と共投与される、治療または予防剤にも応じるであろう。
【００６３】
細胞接着を妨げる、抑制するまたは阻害するのに有効な本発明の化合物の投薬および投薬速度は、多様な要因、例えば阻害剤の性質、患者の大きさ、治療目的、治療しようとする病理の性質、用いられる特定の薬剤組成物、および治療する医師の判断に応じるであろう。活性成分化合物は、１日当たり約０．００１および約１００  ｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは１日当たり約０．１および約５０  ｍｇ／ｋｇ体重の間の投薬レベルが有用である。最も好ましくは、ＶＬＡ−４結合剤は、抗体または抗体誘導体の場合、約０．１  ｍｇ／ｋｇ体重／日および約２０  ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の範囲、好ましくは約０．１  ｍｇ／ｋｇ体重／日および約１０  ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の範囲の用量で、１−１４日ごとの間隔で、投与されるであろう。非抗体または小分子結合剤の場合、用量範囲は、好ましくは、抗体のこれらの量に対しモル等量の量の間であるべきである。好ましくは、抗体の血漿レベル、少なくとも１  ｍｇ／ｍｌを提供するのに有効な量で、抗体組成物を投与する。投薬量の最適化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで既定の用量を投与した後の時間に渡り、結合剤の投与後、剤によるＶＬＡ−４陽性細胞の被覆の評価を行うことにより、決定することが可能である。
【００６４】
個体の末梢血（または骨髄細胞）試料に含まれる骨髄腫細胞は、投与剤を検出する第二の試薬を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（またはｅｘ  ｖｉｖｏ）で剤の存在に関し、探査する（ｐｒｏｂｅ）べきである。例えば、これは投与剤に特異的な蛍光色素標識抗体であってもよく、これをその後、標準的ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）解析により測定する。あるいは、投与剤の存在は、個体の細胞が、それ自体（例えば蛍光色素により）標識されている同じ剤に結合することが不可能であるまたは結合する能力が減少していることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（またはｅｘ  ｖｉｖｏ）で検出することが可能である。好ましい投薬量は、大部分のＶＬＡ−４陽性細胞の検出可能な被覆を生じるべきである。好ましくは、被覆は、抗体相同体の場合、１−１４日の期間、維持される。
【００６５】
動物モデル：
動物モデルが詳細に記載されてきている（Ｇａｒｒｅｔｔ、１９９７）。簡潔には、Ｒａｄｌら（１９８８）は、加齢Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに自発的に発生する骨髄腫のネズミモデルを記載してきている。この状態は、加齢につれ、２００の動物中およそ１匹に発生し、そしてヒト疾患のいくつかの特徴を持つ、単一クローン性高ガンマグロブリン血症を導いた（Ｒａｄｌ、１９８８）。より優れたそしてより再現可能な動物モデルを開発するため、我々は、本ネズミ骨髄腫から５ＴＧＭ１と称する細胞株を樹立し、そしてサブクローニングし、そして該細胞株が、マウスにおいて、ヒト骨髄腫に特徴的な損傷、例えば重症の骨溶解および肝臓および腎臓を含む非骨器官の関与を引き起こすことを見出した（Ｇａｒｒｅｔｔ、１９９７）。培養細胞を接種されたマウスは、非常に予測可能でそして再現可能な方式で、疾患を発展させ、これには、単一クローン性高ガンマグロブリン血症の形成および放射線学的骨損傷が含まれる。さらに、いくつかのマウスは高カルシウム血症になり、そして骨損傷は、破骨細胞活性の増加により特徴付けられる。したがって、５ＴＧＭ１を持つマウスにおける罹患器官の組織学的検査およびＩｇＧ２ｂ血清レベルの増加に基づき、５ＴＧＭ１は、ヒト疾患の特徴を正確に反復するネズミ骨髄腫と定義される。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに例示することを意図し、そして限定することをまったく意図しない。以下の実施例において、必要な制限酵素、プラスミド、および他の試薬および材料は、商業的供給源から入手してもよく、そしてクローニング、連結および他の組換えＤＮＡ方法論は、当業に周知の方法により、行ってもよい。
【実施例】
【００６７】
実施例１：材料および方法
５ＴＧＭ１骨髄腫細胞
５ＴＧＭ１骨髄腫細胞は、元来、加齢Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに自発的に発生する骨髄腫に由来した（Ｇａｒｒｅｔｔ、１９９７、Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎ、１９９７）。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｕｍｍｉｔ、コロラド州フォートコリンズ）および１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州グランドアイランド）を補ったＩｓｏｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイザーズバーグ）中で、５％  ＣＯ２大気中、３７℃で増殖させた。以下に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験には、継代２５および３０の間の５ＴＧＭ１細胞を用いた。
【００６８】
抗体、可溶性ＶＣＡＭ−１
ネズミＶＣＡＭ−１（Ｍ／Ｋ−２．７）、インテグリンＶＬＡ−４（ＰＳ／２）、および細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１、ＹＮ１／１．７）に対する中和抗体は、Ｋｅｎｓｕｋｅ  Ｍｉｙａｋｅ博士（Ｓａｇａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、日本・佐賀）の好意により寄贈された。ヒトＶＣＡＭ−１の７細胞外ドメインを含む、組換え可溶性ＶＣＡＭ−１（Ｌｏｂｂら、１９９１）はＲｏｙ  Ｌｏｂｂ博士、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジより寄贈された。
【００６９】
逆転写・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
我々は、ＲＴ−ＰＣＲを用い、それぞれ骨髄間質細胞および５ＴＧＭ１におけるＶＣＡＭ−１およびインテグリンアルファ４の発現を確認した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いた一段階ＲＮＡ単離法により、５ＴＧＭ１、骨髄間質細胞の初代培養およびＳＴ２骨髄間質細胞株（理研細胞バンク、日本・つくば）から、総ＲＮＡを抽出した。３μｇのＲＮＡを５０  ｎｇのランダム六量体と、７０℃で１０分間インキュベーションし、そして氷上で冷却し、その後、製造者の指示にしたがい、逆転写酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ニュージャージー州ブランチバーグ）を用い、第一鎖ｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下のとおりであった：ネズミＶＣＡＭ−１  ５’プライマー；５’−ＯＨ−ＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣ−３’−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）；ネズミＶＣＡＭ−１  ３’プライマー；５’−ＯＨ−ＡＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＧＴＧ−３’−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）；ネズミインテグリンアルファ４  ５’−プライマー；５’−ＯＨ−ＣＣＣＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧ−３’−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）；ネズミインテグリンアルファ４  ３’−プライマー；５’−ＯＨ−ＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＡＧＣＡＡＣＡＣＴＧＣ−３’−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）。
【００７０】
９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間からなる３０周期で、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物（総容量５０μｌ）は１０マイクロリットルを含んだ。第一鎖ｃＤＮＡ、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、デオキシ−ＮＴＰ混合物（各０．２  ｍＭ）、プライマー対（各０．１５マイクロモル）および２  Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ニュージャージー州ブランチバーグ）。ＰＣＲ産物をエチジウムブロミドを含む２．５％アガロースゲル上で分離し、そして紫外線光下で視覚化した。断片の大きさは、分子量マーカーを参照することにより、確認した。
【００７１】
骨髄間質細胞上への５ＴＧＭ１の付着
ヘテロタイプな細胞・細胞接着アッセイのため、ＳＴ２細胞（５  ｅ  ４／ウェル）を４８ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に蒔き、そして１０％ＦＢＳを補ったアルファＭＥＭ中で、集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｎｃｙ）になるまで４８時間培養した。５ＴＧＭ１細胞（５  ｅ  ６）は培地中で、１０マイクロＣｉ[メチル−３Ｈ]チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）と３７℃で２４時間インキュベーションすることにより、標識した。ＳＴ２単層が形成された後、該細胞を血清不含アルファＭＥＭ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）とインキュベーションし、そしてトリチウム標識５ＴＧＭ１細胞を該単層上に蒔いた。ＶＣＡＭ−１またはアルファ４ベータ１インテグリンに対する抗体の非存在下または存在下で、系を３７℃で１時間インキュベーションした。５％トリクロロ酢酸で２回、そしてＰＢＳで２回、洗浄することにより、非接着細胞を除去し、そして接着細胞を３００マイクロリットルの０．２５  ｍＭ  ＮａＯＨ中で可溶化し、同体積の０．２５  ｍＭ  ＨＣｌで中和し、そして液体シンチレーションカウンター中で放射能を測定した。
【００７２】
５ＴＧＭ１およびマウス骨髄細胞の共培養における破骨細胞形成アッセイ
マウス骨髄細胞は、以前記載されたように、５週齢オスＣ５７ＢＬマウスから得た（Ｙｏｎｅｄａ、１９９３）。大腿骨および脛骨を無菌的に切断し、そして両端を切り落とした。骨髄細胞を流し出し、収集し、そして１００  ｍｍ培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）中の、１０％ＦＳＢ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）および１％ペニシリン・ストレプトマイシンを補ったアルファＭＥＭ中で、３７℃で２時間インキュベーションした。造血性破骨細胞前駆体を含む非接着細胞および間質細胞を採取した。培地３００マイクロリットル中の骨髄細胞（１  ｅ  ６）および５ＴＧＭ１細胞（１  ｅ  ３）を４８ウェル培養プレート上に蒔いた（第０日）。第２日、新鮮な培地３００マイクロリットルを各ウェルに穏やかに添加し、そして第４日、消耗した培地３００マイクロリットルを、同体積の新鮮な培地と置き換えた。第６日、培養を固定し、そして商業的キット（Ｓｉｇｍａ）を用い、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に関し染色した。３より多い核を持つＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞様（ＯＣ様）細胞と定義し、そして顕微鏡下で手で計数した。これらのＯＣ様細胞が骨を吸収する能力を有することを確認するため、５ＴＧＭ１細胞および骨髄細胞を、同一条件下で、５  ｘ  ５  ｍｍのクジラ（ｗｈａｌｅ）象牙質スライス上で共培養し、そしてこれらの象牙質スライス上に形成された吸収穴を、記載されるように、走査型電子顕微鏡により、調べた（Ｙｏｎｅｄａ、１９９２）。
【００７３】
いくつかの実験において、５ＴＧＭ１骨髄腫細胞および骨髄細胞の共培養は、これらの２種の細胞の間の直接的な接触を妨げるため、ウェル間挿入物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）を用い、行った。（２  ｅ  ６、２４ウェルプレート、Ｃｏｓｔａｒ）。骨髄細胞を下のチャンバーに蒔き、そして５ＴＧＭ１骨髄腫細胞（２  ｅ  ３）を、その後、下（直接的な接触）または上（接触なし）のチャンバーに蒔いた。
【００７４】
４５Ｃａ標識ラット胎児長骨の器官培養
以前記載されたように、４５Ｃａ標識ラット胎児長骨の器官培養により、５ＴＧＭ１培養から採取した馴化培地を、骨吸収活性に関しアッセイした（Ｍｂａｌａｖｉｅｌｅ、１９９５）。妊娠ラットに、妊娠１８日目に、２５０μＣｉの４５Ｃａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を注射した。顕微解剖により、１９日齢胎児から橈骨および尺骨幹を得て、そしてステンレスメッシュグリッド上で気相および液層の間で、０．１％ＢＳＡを補ったＢＧＪ培地（Ｓｉｇｍａ）中で２４時間プレ培養した。その後、骨を馴化培地（５０％  ｖ／ｖ）またはコントロール培地の存在下で、１２０時間培養した。４８時間で培地を一度交換した。培養の終わりに、骨を氷冷５％トリクロロ酢酸で２時間インキュベーションし、そして骨および培地中の４５Ｃａ放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。骨吸収は：（培地中の４５Ｃａカウント）／（培地および骨中の４５Ｃａカウント）ｘ  １００により計算されるように、骨から培地に放出された４５Ｃａのパーセンテージとして定量化した。
【００７５】
５ＴＧＭ１骨髄腫細胞とマウス間質細胞株ＳＴ２細胞の共培養
ＳＴ２細胞（０．５  ｅ  ６）および５ＴＧＭ１（４  ｅ  ６）細胞を１０％ＦＢＳ補足ＩＭＤＭ中で、６０  ｍｍ培養プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に共に蒔き、そして一晩培養し、血清不含ＩＭＤＭで２回洗浄し、そして５  ｍｌの血清不含ＩＭＤＭ中でインキュベーションした。４８時間後、馴化培地を採取し、そして使用まで−７０℃で貯蔵した。
【００７６】
５ＴＧＭ１を持つマウスにおける血清ＩｇＧ２ｂ上昇に対する、ＶＬＡ−４に対するｍＡｂ  ＰＳ２の影響
マウスに１  ｅ  ５の５ＴＧＭ１細胞を注射し、骨髄にコロニーを形成させた。マウスを３匹ずつ２群に分け、１つはコントロール群として用い、そして第二の群は、第８日から開始し、週２回、８０μｇのｍＡｂ  ＰＳ／２（４  ｍｇ／ｋｇ）で処置した。５ＴＧＭ１骨髄腫細胞により産生される抗体アイソタイプである、ＩｇＧ２ｂのレベルを、第１ないし６週に、毎週測定した。
【００７７】
結果
ＶＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４の発現、およびＳＴ２単層への５ＴＧＭ１付着に対する、ＶＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４に対する抗体の影響
我々は、ＲＴ−ＰＣＲを用い、それぞれ骨髄間質細胞および骨髄腫細胞におけるＶＣＡＭ−１およびインテグリンＶＬＡ−４の発現を確認した。期待されるように、ＳＴ２間質細胞株および初代骨髄間質細胞はＶＣＡＭ−１を発現したが、５ＴＧＭ１はしなかった。対照的に、５ＴＧＭ−１骨髄腫細胞は、インテグリンＶＬＡ−４を発現したが、間質細胞株はしなかった（データ未提示）。さらに、抗ＶＣＡＭ−１抗体（１０μｇ／ｍｌ）およびＶＬＡ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）は共に、ＳＴ２単層に対する５ＴＧＭ１細胞の付着を部分的に阻害し（５０−８０％）、これらの細胞上に発現されるＶＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４インテグリンが生物学的に機能があり、そしてこれらの抗体が中和活性を有することを示した（データ未提示）。
【００７８】
マウス骨髄細胞と５ＴＧＭ１骨髄腫細胞の共培養中のＯＣ様細胞形成
５ＴＧＭ１細胞およびマウス骨髄細胞の共培養の第６日、多くのＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞様（ＯＣ様）細胞が形成された。これらのＯＣ様細胞は、象牙質スライス上に吸収穴を示し、これらの細胞が骨を吸収することが可能であり、そして破骨細胞表現型を持つことを立証した。ウェル間挿入物を用いた実験では、５ＴＧＭ１細胞を骨髄細胞と直接接触させて培養した際、ＯＣ様細胞の形成が観察された。対照的に、ウェル間膜により、５ＴＧＭ１細胞が骨髄細胞から分離された際、最小限の数のＯＣ様細胞しか形成されなかった。このように、５ＴＧＭ１細胞は、混合骨髄培養において、破骨細胞形成を誘導し、そして本誘導は、直接的な細胞・細胞接触を必要とする。
【００７９】
５ＴＧＭ１および骨髄細胞の共培養におけるＯＣ様細胞形成に対する、ＶＣＡＭ−１およびインテグリンＶＬＡ−４に対する抗体の影響
抗ＶＣＡＭ−１抗体（ＶＣＡＭ−１  Ａｂ、１０μｇ／ｍｌ）および抗ＶＬＡ−４インテグリン抗体（アルファ４ベータ１  Ａｂ、１０μｇ／ｍｌ）は共に、ＯＣ様細胞形成を劇的に阻害した。対照的に、間質／骨髄腫相互作用に関連付けられる、骨髄間質細胞上の別の接着分子、ＩＣＡＭ−１に対するｍＡｂは、ＯＣ様細胞形成にいかなる影響も持たなかった（図１）。
【００８０】
ＶＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４  ｍＡｂによる本阻害が、５ＴＧＭ１誘導ＯＣ様細胞形成に特異的であり、そして細胞毒性のためでないかどうかを決定するため、マウス骨髄細胞培養における破骨細胞形成の広く用いられる刺激剤である、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、１９８８）により誘導されるＯＣ様細胞形成に対する、これらの抗体の影響を調べた。ＶＣＡＭ−１  ＡｂまたはＶＬＡ−４  ｍＡｂのどちらも、それ自体間質細胞におけるＶＣＡＭ−１発現に対し影響を持たないビタミンＤ３により誘導されるＯＣ様細胞形成を阻害しなかった。
【００８１】
骨吸収に対する、５ＴＧＭ１およびＳＴ２の共培養から採取した馴化培地の影響
５ＴＧＭ１細胞およびＳＴ２細胞の共培養由来の馴化培地は、ラット胎児長骨アッセイにおける骨吸収の顕著な増加を示した（図２）が、５ＴＧＭ１の馴化培地は、コントロール培地に比べ、最小限の増加しか引き起こさなかった。ＳＴ２細胞由来の馴化培地は、骨吸収にいかなる増加も示さなかった。したがって、ＶＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４を介した直接的な細胞・細胞接触は、共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、破骨細胞様細胞および骨吸収因子の産生を誘導する。
【００８２】
５ＴＧＭ１細胞による骨吸収および破骨細胞形成活性の産生に対する、組換え可溶性ＶＣＡＭ−１（ｓＶＣＡＭ−１）の影響
ＶＣＡＭ−１の可溶性組換え型（ｓＶＣＡＭ−１）で処理した５ＴＧＭ１の馴化培地は、用量依存方式で、ラット胎児長骨における骨吸収を増加させたが、未処理５ＴＧＭ１のみから得られた馴化培地は、最小限にしか骨吸収を増加させなかった。可溶性ＶＣＡＭ−１自体は骨吸収にいかなる影響も持たない（データ未提示）。マウス骨髄培養系において、ｓＶＣＡＭ−１で処理した５ＴＧＭ１細胞から採取した馴化培地は、ＯＣ様細胞形成活性の増加を示したが、未処理５ＴＧＭ１の馴化培地は、ＯＣ様細胞形成の最小限の活性しか示さなかった（図３）。
【００８３】
ネズミ骨髄腫細胞の存在下および非存在下で培養した骨髄間質細胞（ＳＴ２）におけるＲａｎｋリガンドｍＲＮＡの発現
Ｒａｎｋリガンドは、ＯＣＬ形成の重要な仲介因子であるようであり、そしてＯＣＬ形成に対する破骨細胞形成性サイトカインの影響に関する、最後の共通の経路である可能性があるため、我々は、個々に、そして共培養した際の、５ＴＧＭ１およびＳＴ２細胞におけるＲａｎｋリガンドの発現を調べた。我々は、５ＴＧＭ１およびＳＴ２細胞の共培養が、ＳＴ２細胞においてＲａｎｋリガンドｍＲＮＡを誘導することを見出した。さらに、５ＴＧＭ１細胞はＲａｎｋリガンドを発現しないが、ｓＶＣＡＭ−１で処理した際、該リガンドを発現する（未提示）。最後に、ｓＶＣＡＭ−１で処理した５ＴＧＭ１細胞由来の馴化培地は、ＳＴ２細胞においてＲａｎｋリガンドｍＲＮＡを誘導し、ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４経路が、骨髄腫細胞においてサイトカインを産生し、該サイトカインが骨髄間質細胞によるＲａｎｋリガンド発現を亢進することを示唆する（データ未提示）。
【００８４】
要約すると、我々は、５ＴＧＭ１細胞単独では、ＯＣ様細胞形成および骨吸収を刺激する活性を最小限の量しか産生しないことを示す。しかし、５ＴＧＭ１骨髄腫細胞を造血性破骨細胞前駆体および間質細胞を含む骨髄細胞と共培養すると、該細胞は間質細胞に強く接着し、そしてＯＣ様細胞形成を増加させた。５ＴＧＭ１細胞が間質細胞と接触するのを妨げられた共培養では、ＯＣ様細胞は形成されなかった。さらに、ラット胎児長骨の器官培養において、５ＴＧＭ１骨髄腫細胞およびＳＴ２骨髄間質細胞の共培養から採取した馴化培地は、ＳＴ２または５ＴＧＭ１単独の馴化培地に比べ、増加した骨吸収活性を有した。これらのデータは、破骨細胞刺激および骨吸収活性の産生に、骨髄間質細胞と５ＴＧＭ１細胞の直接的な細胞・細胞接触が必要であるという見解と一致する。そこで、我々は、どの細胞接着分子が、破骨細胞形成活性の産生に必要な、５ＴＧＭ１細胞および骨髄間質細胞の間の直接的な細胞・細胞相互作用に関与したか決定した。２つの接着分子、ＶＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４インテグリンが共培養におけるＯＣ様細胞形成を非常に減少させるため、我々のデータは、ＶＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４インテグリンが、この細胞・細胞相互作用に役割を果たしていることを示す。ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４インテグリン相互作用は、破骨細胞形成および骨吸収活性産生の増加を導く、骨髄間質細胞および５ＴＧＭ１骨髄腫細胞の間の細胞・細胞情報伝達に責任がある。最後に、本骨吸収活性は、部分的にＲａｎｋリガンドの誘導による。
実施例２：ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、骨髄腫細胞上のＶＬＡ−４と骨髄間質細胞上のＶＣＡＭ−１の間の相互作用が、骨髄腫による骨吸収活性の誘導に重要な役割を果たしている可能性があることが示唆される。我々は、ヒト疾患を正確に反映する動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでこの仮説を試験する、重要な段階を行った。
【００８５】
Ａ．本実験において、マウスに１  ｅ  ５の５ＴＧＭ１骨髄腫細胞を注射し、骨髄にコロニーを形成させた。マウスを３匹ずつ２群に分け、１つはコントロール群として用い、そして第二の群は、第８日から開始し、週２回、ｍＡｂ  ＰＳ／２で処置した。５ＴＧＭ１骨髄腫細胞により産生される抗体アイソタイプである、ＩｇＧ２ｂのレベルを、第１ないし６週に、毎週測定した。注射当たり８０μｇ（〜４  ｍｇ／ｋｇ）の用量のｍＡｂで週２回処置すると、強力にＩｇＧ２ｂ産生が阻害され、骨髄腫細胞の生存および増殖のｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な阻害が示された（図４）。さらに、処置マウスは、対麻痺発生率の減少を示した（３匹の未処置動物すべてが第４２日に対麻痺を示した一方、処置動物は１匹のみが対麻痺を示した）。対麻痺を示さなかった２匹の処置動物はまた、脾臓および肝臓重量の減少も示し、これもまた腫瘍負荷と相関する。最後に、処置動物は、脛骨および大腿骨における組織学による腫瘍領域の減少を示した（６．７１±１．７４から０．０５±０．０８平方ミリメートル）。血清カルシウムレベルに対する処置の影響はなかった（データ未提示）。
【００８６】
Ｂ．同様の実験で、４０μｇのＰＳ／２での週２回の処置は、ＩｇＧ２ｂレベルに対し影響を及ぼさなかった（未提示）。これらのデータは、ＶＬＡ−４に対するｍＡｂ  ＰＳ／２が、用量依存的方式で、樹立骨髄腫細胞の増殖を強力に阻害することを示す。
【００８７】
Ｃ．別のｉｎ  ｖｉｖｏ実験において、第０日に、１８匹のＳＣＩＤマウスに５ＴＧＭ１骨髄腫細胞を注射した。第１日から開始し３日ごとに（すなわち第１、２、５、８、および１１日に）、４匹のマウスはＰＢＳで処置し；４匹のマウスは、予防的プロトコルで、マウスＶＣＡＭ１に対して反応性であるｍＡｂ  Ｍ／Ｋ−２．７で、８０μｇ（〜４  ｍｇ／ｋｇ）の用量で処置した。同じプロトコルを用いた同様の実験で、５匹のマウスを１６０μｇのｍＡｂ  Ｍ／Ｋ−２．７で処置した。さらに、５匹のマウスを、治療的プロトコルで、第８日から開始し（すなわち第８、１１、１４、１７、および２０日に）、１６０μｇのｍＡｂ  Ｍ／Ｋ−２．７で処置した。第２１、２８、および３５日に、すべてのマウスから血清を採取し、そして動物をＸ線検査し、その後、第３５日に組織学のため屠殺した。３つの処置群はすべて、血清ＩｇＧ２ｂレベルの減少を示し、骨髄腫細胞負荷の減少を示した（図５）。低用量予防プロトコルで、コントロールに比べ、脾臓重量に関しても、有意な影響が観察された（コントロール０．２３±０．１４  ｇに対し処置０．０８±０．０４）。予防的高用量群において、５匹の動物のうち４匹は、脾臓重量の明らかな減少を示したが、１匹の動物の脾臓重量が大きかったため、全体の値は有意ではなかった（データ未提示）。
【００８８】
Ｄ．アルファ４インテグリンアゴニストの初回多量（ｈｉｇｈ  ｂｏｌｕｓ）用量に続く維持用量が、有効性を改善するかどうか調べてもよい。骨髄腫細胞は、骨髄区画にすでに確立されており、そしてＶＬＡ−４に依存するＶＣＡＭ−１とのその緊密な相互作用を阻害する必要がある。さらに、おそらく確立骨髄腫細胞の数が多ければ、細胞を末梢循環に流し出すのに必要とされる初回用量も上昇するであろう。
【００８９】
したがって、抗ＶＬＡ−４抗体ＰＳ／２を用いた、より大規模な研究を行った。第０日に、２８匹のＳＣＩＤマウスに５ＴＧＭ１骨髄腫細胞を注射した。９匹のマウスには処置をせず；９匹のマウスにはアイソタイプ一致コントロールＩｇＧ  ｍＡｂを投与し；１０匹のマウスは、アルファ４インテグリンに対するｍＡｂ  ＰＳ／２で処置した。異なる治療処置計画を行い、第４、５、および６日に、マウスに高用量のｍＡｂ（２００μｇ）を投与した後、第８日から開始し、３日ごとに８０μｇ（〜４  ｍｇ／ｋｇ）の維持用量を投与した。
【００９０】
第３および４週に、処置群を、未処置またはコントロールＩｇＧ処置群のいずれかと比較した際、血清ＩｇＧ２ｂの統計的に有意な減少があった（データ未提示）。重要なことに、処置群を未処置またはコントロールＩｇＧ処置群と比較した際、生存に対し、明確な影響があった（図６）。
実施例３：他のｉｎ  ｖｉｖｏ実験
本明細書に初めて提示された情報に基づき、一般の当業者は、記載されるネズミ動物モデルを用い、多発性骨髄腫におけるアルファ４インテグリンおよびそのリガンドの重要性を容易に確認し、そして敷衍することが可能である。
【００９１】
以下の一連の実験は、本開示に基づき、十分に当業の技術レベルの範囲内であるが、単に例示のために提供され、そして研究の種類を限定するためではない。
１）最適週２回維持用量を決定するためのｍＡｂ  ＰＳ／２に対する用量反応。８０μｇが優れた有効性を示したが、４０μｇは効果がなかった。最適用量を決定するため、週２または３回、２０  ｍｇ／ｋｇまでの、より高い用量を調べる。
【００９２】
２）患者は、増加した腫瘍負荷と結びついた、重症度の異なる段階の疾患を示す。疾患の確立後、異なる時点で投与されるｍＡｂ  ＰＳ／２の有効性を調べる、すなわち、第８日の処置開始（例えば図４を参照されたい）と、接種２、３、４および５週間後の開始を比較し、症状のある程度の緩和を提供するのにどのくらい遅くｍＡｂを投与してもよいか観察する。
【００９３】
３）ＶＬＡ−４に対するｍＡｂに関し上に概略されるのと同じパラメーター（用量、投与時期）にしたがい、ネズミＶＣＡＭ−１に対するｍＡｂ  ＭＫ−２の影響を調べる。有効性が確認されるのに、同様の用量レベルが必要とされるであろうことが予期される。
【００９４】
４）骨髄および髄外部位両方の腫瘍負荷、組織形態計測による骨格の放射線学的解析による骨損傷の定量化；血漿におけるコラーゲン架橋の評価による骨吸収速度の測定；血漿における単一クローン性タンパク質産生の測定；存在する場合、高カルシウム血症；および死亡率を含む、骨髄腫進行のさらなるマーカーを調べる。
【００９５】
５）多発性骨髄腫は、現在、標準的な化学療法治療計画で有効に治療されない。適切な化学療法治療計画と組み合わせた、あるいは該計画前または後の、最適用量のｍＡｂの累積的または相乗効果を調べる。
【００９６】
６）特定の１つのアルファ４インテグリンに選択的な、または同時にいくつかのアルファ４インテグリンに選択的な、小分子アルファ４インテグリン阻害剤が、あるいはこうした阻害剤の組み合わせが、ｍＡｂの効果を模倣しそして骨髄腫進行を遮断する能力を、上述のプロトコルおよび所産を用い、調べる。小分子阻害剤は、０．１ないし３０  ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日１または２回、あるいは毎週２または３回、非経口または経口で搬送する。
参考文献
【００９７】
【表１】
2010235620.tif 000002
【００９８】
【表２】
2010235620.tif 000003
【００９９】
【表３】
2010235620.tif 000004
【０１００】
【表４】
2010235620.tif 000005
【０１０１】
【表５】
2010235620.tif 000006
【図１】
2010235620.tif 000007
【図２】
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【図３】
2010235620.tif 000009
【図４】
2010235620.tif 000010
【図５】
2010235620.tif 000011
【図６】
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【配列表】
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