(57)【要約】      （修正有）【課題】患者数が多く、難治性で再発しやすい白癬に対し、新しい治療法または薬剤の開発を効率的に進めることを可能とする、新しい白癬動物モデルを提供する。【解決手段】マウスの耳介部または耳管に白癬菌を接種し、耳介部および外耳道に感染を成立させる白癬動物モデル。マウスに白癬菌を接種する際、精神安定剤または麻酔薬を投与して動物を麻痺させる。また接種直後、耳管口を絆創膏等で塞ぎ、さらにそれを外されないように頸部にネックレスを装着させることによって、菌の漏出を防ぎ、感染を安定して成立させる。マウスは従来のモデル動物であるモルモットに比較して、宿主の免疫学的、遺伝学的解析が容易であり、それらの解析によって病態に関する新たな知見に結びつく可能性がある。また菌接種部位の挺毛などを必要とせず、動物や組織に過剰なストレスを与えることなく感染が成立するため、より自然に近い病態での研究や評価が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスの耳介部または外耳道に白癬菌を接種し、耳介部および外耳道に感染を成立させることを特徴とする白癬動物モデル
【請求項２】
請求項１に記載したマウスに白癬菌を接種する際、精神安定剤または麻酔剤を投与して動物を麻痺させておくことを特徴とする白癬動物モデル
【請求項３】
請求項１に記載したマウスに白癬菌を接種した後、耳管を塞いで接種した菌の漏出を防ぐことを特徴とする白癬動物モデル
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、マウスの耳介部または外耳道に白癬菌を接種し、耳介部および外耳道に感染を成立させることを特徴とする新しい白癬の動物モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】  白癬は、トリコフィトン属、エピデルモフィトン属、およびミクロスポルム属真菌の感染によって引き起こされるが、起因菌としてはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｕｓｕｍの順に多い。白癬菌は角化した皮膚の組織、すなわち角質層や毛髪および爪に侵入・発育し、局所の感染（白癬）を引き起こす。
白癬はあらゆるヒトの疾患の中でもっとも罹患率が高く、ほぼ世界のすべての地域において人口の１０％以上が常時罹患しているといわれ、日本においても患者数は１千万人を超えるものと推定されている。患者数がもっとも多いのが俗に「水虫」といわれている足白癬で、次いで爪白癬が多い。
白癬の治療は、一般的には抗真菌薬を直接患部に接触させることによってなされているが、難治性でありかつ再発を繰り返しやすい。そのため各種の抗真菌剤が入手可能な現在においても、患者数が減少するには至っていない。したがって新しい発想に基づく治療法や薬剤の開発に対する社会的な必要性は極めて高い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  現在でも患者数が極めて多く、難治性で再発しやすい白癬に対し、新しい治療法および薬剤の開発は重要な社会的課題であり、その課題に取り組む上で、感染動物モデルの使用は必要不可欠である。これまで白癬菌感染のモデル実験は専らモルモットを用いて行われてきたが、当該動物では感染および病態に関する宿主側の免疫学的解析、遺伝学的解析が充分かつ効率的には行われ難いという問題点があった。それらの解析は、それらによって新たな生化学的、医学的知識が生み出され、白癬の新しい治療法や薬剤の開発に結びつく可能性がある。そのため、それらの解析をより容易に行うことができる新しい感染動物モデルの開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  本発明者らは、マウスを用いて白癬菌の感染方法を種々検討した結果、当該動物の耳介部または外耳道に白癬菌を接種すると、耳介部および外耳道に感染が成立することを発見した。さらに白癬菌接種の際、精神安定剤または麻酔剤を投与してマウスを麻痺させておくこと、また接種後、マウスの耳管口を絆創膏等で塞いで菌の漏出を妨げること、それらをマウスに施すことによって、それぞれ感染が安定して成立することを確認し本発明を完成させた。
マウスは、モルモットに比較して免疫学的解析、遺伝学的解析が容易であり、それらの解析によって新たな知見が生み出され、従来にない治療法や薬剤の開発に結びつく可能性がある。またモルモットの場合、白癬菌接種のための皮膚局所を挺毛する必要があり、それによって動物および皮膚に過度なストレスを与え、病態の成立や評価に好ましくない影響を与える懸念が残されていた。本発明は、動物または局所に過度なストレスを与えることなく感染を成立させた病態モデルであり、より自然に近い病態での解析、評価が可能である。さらに、マウスは多数飼育が容易であり、研究の効率化や経費の節減が可能である。上記の通り、数々の利点があるマウスの耳介部および外耳道を用いた白癬モデルはこれまでに報告がなく、本発明は新規である。
【発明の効果】
【０００５】  本発明のマウスを用いた白癬モデルにおいては、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色といった研究手法を駆使し、宿主の免疫機能を担っている各種のサイトカイン、ケモカイン、細胞表面抗原といった重要な分子を計測して病態における免疫機能の役割や変化を詳しく解析することが可能になる。
またマウスには、感染に対する抵抗性に差がある各種の遺伝系統があり、それらを入手して比較研究をおこなえば、白癬菌に対する防御反応を遺伝学的に解析することが可能である。さらに特定の遺伝子を人工的に欠落させたノックアウトマウスを作成することも可能であり、それによって当該遺伝子の感染における役割を明確にすることができる。
以上の研究手法によって、白癬の病態に対して免疫学的、遺伝学的な解析を加え、それらの解析によって生み出された新たな知見は、従来にない治療法や薬剤の開発に結びつく可能性が高いものと考えられる。
以上の研究手法の実施は、モルモットを用いた従来の病態モデルでは著しく困難であり、専らマウスを用いた病態モデルによって始めて可能になるものである。したがって本発明の産業的な価値は極めて高い。
また本発明は、白癬菌接種のための局所を挺毛する必要がなく、それによって動物または局所に過度なストレスを与えることなく感染を成立させた病態モデルであり、より自然に近い病態での研究、評価が可能となる。さらに、マウスは多数飼育が容易であり、研究の効率化や経費の節減が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】  本発明の白癬動物モデルは、白癬菌をマウスの耳管内へ接種して作成する。その際、マウスに精神安定剤または麻酔剤を事前に投与して動物を一定時間麻痺させておくことにより、感染率が向上して安定した病態モデルの作成が可能となる。
本発明に用いられる白癬菌の菌液は、培養した白癬菌を蒸留水または生理食塩水に回収し、菌数を１０６〜１０８個／ｍｌに調整して用いる。
白癬菌の接種は、菌液１０〜５０ｕＬをマイクロピペット等を用いてマウスの耳管内へ注入しておこなう。その後、耳管口を絆創膏等で塞ぎ、さらに、それを脚で外されないよう小動物用ネックレスを頸部に装着することなどを施せば、菌液の耳管からの流出を防ぎ、それによっても感染率が向上する。
本発明に用いられる精神安定剤としては、フェノチアジン系（塩酸クロルプロマジン等）、ブチロフェン系（ハロペリドール等）、その他の系（オキシペルチン等）が、また麻酔剤としては、ペントバルビタール、フローセン、エトレン、笑気ガスなどがあげられる。
これら麻痺を目的とする薬剤の投与量は、薬剤の種類、投与方法、動物の種類、週齢、性別、麻痺を維持させる時間等によって適宜設定する必要があるが、マウスに塩酸クロルプロマジンを投与する場合、通常０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、必要な時間、麻痺を維持することができる。さらに接種された白癬菌の感染率を高める方法として、副腎皮質ホルモン等の免疫抑制剤を投与する方法もある。
成立した感染は、以下の方法により確認することができる。
１．白癬菌接種２日〜７日後、安楽死させたマウスから耳管を摘出し、それを洗浄して      回収した洗浄液または耳管の細切片を寒天培地上で培養し、生育してくる白癬菌を      肉眼または顕微鏡によって観察する。
２．摘出した耳管の一部をスライドグラス上に貼付し、ＰＡＳ染色を行った後、白癬菌      の生育像を顕微鏡によって確認する。
３．摘出した耳管を前処理し、走査型電子顕微鏡によって白癬菌の生育像を観察する。
上記の方法は、本発明のモデルによって薬剤の治療効果を評価する場合にも利用することができる。その場合、洗浄液中の白癬菌の菌数や、感染成立以後、白癬菌消失までの日数短縮などが治療効果の指標となる。
【実施例】
【０００７】  本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．【０００８】  ＩＣＲ雌マウス（５週齢、日本チャールス・リバー（株）より購入）６匹を、１週間予備飼育して供試した。白癬菌接種前日に、抗炎症ステロイド剤プレドニゾロン（ミタカ製薬社製）１００ｍｇ／ｋｇ体重を腹部皮下に注射し、その日から、塩酸テトラサイクリン（武田薬品社製）を濃度１５ｇ／Ｌ水道水に溶解した給水液を飼料同様に自由摂取させ、実験期間中継続して与えた。
接種当日は、精神安定剤クロルプロマジン塩酸塩（和光純薬社製）を濃度１２ｍｇ／Ｌになるよう生理食塩水に溶解し、その１００ｕＬを菌接種３０分前にマウスの左右大腿部筋肉に分けて注射し、動物を麻痺させた。白癬菌は、菌数を５．０×１０８個／ｍＬに調整し、その５０μＬをマイクロピペットに採り、マウス耳管内へ接種した。白癬菌は、帝京大学医真菌センター保存の菌株Ｔｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（Ｔｍｋｕ８０）をサブロー・デキストロース（ＳＤ）寒天平板上で２８℃、７日間培養し、蒸留水中に回収して菌数を調整し供試した。
接種した白癬菌の漏出を防ぐため、マウスの耳管口を絆創膏で塞ぎ、その絆創膏が脚で外されることを防ぐため、さらにマウス用ネックレス（夏目製作所製）を頸部に装着した。
接種４日後に、マウスを安楽死させて耳管（鼓膜から耳介部）を剖出し、以下の評価によって感染の成立を確認した。
１．細切した耳管をＳＤ寒天平板上で培養し（２８℃、４８時間）、白癬菌のコロニー      形成を肉眼的に確認し
２．耳管を生理食塩水で洗浄し、その洗浄液をＳＤ寒天平板上で培養し（２８℃、４８      時間）、白癬菌のコロニー形成を肉眼的に確認し、顕微鏡観察よってもその生育像      を確認した。
３．耳管を細切りして、その一部をスライドグラス上に貼付してＰＡＳ染色し、顕微鏡      によって観察して白癬菌の組織への侵入像を確認した。
４．耳管を前処理して走査型電子顕微鏡によって観察し、耳管内腔表層に、菌糸形の白      癬菌および層を形成している胞子の像を確認した。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】は、実施例の評価項目４に記載した、走査型電子顕微鏡によって観察したマウス耳管内腔表層の画像である。画面の中の粒子状および紐状の構造物は、それぞれ白癬菌の胞子および菌糸である。
【図１】
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