(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内の、特に酸性領域を、ｐＨ依存的に蛍光イメージングする。【解決手段】下記式で表されるビスアクリジンペプチド誘導体。2010143883.tif 000005（Ｘ１、Ｘ２はアミノ基又はジメチルアミノ基、ｌ、ｍ、ｎは１〜４の整数。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でｐＨ依存的に蛍光を発する、下記式（化１）で表されるビスアクリジンペプチド誘導体。
【化１】
2010143883.tif 000004
（式中、Ｘ１、Ｘ２は同一又は異なり、アミノ基又はジメチルアミノ基を表し、ｌ、ｍ、ｎは１〜４の整数を表す。）
【請求項２】
前記式（化１）中、Ｘ１が６−ジメチルアミノ基、Ｘ２が３−ジメチルアミノ基、ｌ＝４、ｍ＝２、ｎ＝１であるビスアクリジンペプチド誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２記載のビスアクリジンペプチド誘導体を主成分として含むｐＨセンサ試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内でｐＨ依存的に、特に酸性領域で蛍光を発するビスアクリジンペプチド誘導体と、それを主成分するｐＨセンサ試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞の細胞内膜系のオルガネラ、即ち、ゴルジ体、分泌小胞、被覆小胞、エンドソーム、リソソーム等の内腔は酸性に保たれていることからも示唆されるように、細胞が細胞の内外に形成している酸性環境は、個体における多くの生理機能と関係している。そして、酸性のオルガネラの作用や機能を研究するために、酸性オルガネラを標識して蛍光を画像化するための蛍光プローブ（試薬）が市販されている。また、酸性オルガネラ内をアクリジンオレンジで染色し、オルガネラ内のｐＨ変化を蛍光顕微鏡で観察する手法も知られている。また、酸性条件下で蛍光を発する蛍光プローブを、がんに特異的なモノクローナル抗体と結合させたものを用いることによって、がん細胞や転移微小がんの発見が可能であることも知られている。このように、細胞内のｐＨは重要であり、その測定は、がん細胞の特定に繋がるし、細胞内の局所的ｐＨ測定は、薬剤の評価に繋がるなどの実用的な効果がある。従って、蛍光により細胞内のｐＨを測定し、これを蛍光でイメージングする方法に用いられる蛍光プロープは重要なものである。しかしながら従来の市販のプローブは、酸性領域、特にｐＨ３〜５の酸性領域での定量的蛍光変化を示さず、ｐＨ応答域もさほど広いものではなかった。
【０００３】
本発明者は、テトラリシン鎖からなるペプチドの両端のリシン成分のε−アミノ基に、それぞれアクリジンオレンジが９位で結合しているビスアクリジンオレンジペプチドを合成した。そして、これを二重鎖ＤＮＡに結合させると、従来の蛍光染料に比べ蛍光強度が約２００倍強くなるとい事実を見出した（非特許文献１）。この化合物は、カチオン性のリジン成分を有しているので、ポリアニオンであるＤＮＡと結合するのに有利であるので、各種のＤＮＡの研究には便利なものである。しかしながら、この化合物は、ｐＨ依存的に蛍光強度が変化するというような作用・効果は有していなかった。
【非特許文献１】Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 578-580
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、前記非特許文献１のアイデアを更に展開し、細胞内の、特に酸性領域を、ｐＨ依存的に蛍光イメージングできる試薬を開発することを目的として鋭意研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、新規に設計合成したペプチド鎖にアクリジンオレンジ又はその類縁体を導入した試薬により、上記目的を実現した。即ち、本発明は、細胞内でｐＨ依存的に蛍光を発する、下記式（化１）で表されるビスアクリジンペプチド誘導体である。
【０００６】
【化１】
2010143883.tif 000002
【０００７】
上記式（化１）で表される化合物の中でも、好ましいのは、Ｘ１が６−ジメチルアミノ基、Ｘ２が３−ジメチルアミノ基、ｌ＝４、ｍ＝２、ｎ＝１であるビスアクリジンペプチド誘導体である。具体的には、２−（２−{２−[２−アセチルアミノ−６−（３，６−ビス−ジメチルアミノ−アクリジン−９−イルアミノ）−ヘキサノイルアミノ]−３−カルボキシ−プロミオニルアミノ}−３−カルボキシ−プロピオニルアミノ）−５−（３，６−ビス−ジメチルアミノ−アクリジン−９−イルアミノ）−ペンタノン酸である。
【０００８】
そして、本発明のもう一つの態様は、前記式（化１）で表されるビスアクリジンペプチド誘導体、又はその中の好ましい態様のビスアクリジンペプチド誘導体（ＢＡＯ−Ｄ）を主成分として含むｐＨセンサ試薬である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のビスアクリジンペプチド誘導体は、細胞内ｐＨを蛍光イメージング（画像化）する試薬として用いることができる。本発明のビスアクリジンペプチド誘導体は、ｐＨ３〜８の領域において、市販品の約２５０倍の蛍光変化を示し、また細胞内の強酸性オルガネラを染色することもできる。がん細胞のイメージングや細胞に対する薬の効果が細胞内ｐＨに依存しているので、本発明のビスアクリジンペプチド誘導体を主成分とするｐＨセンサ試薬は、がん細胞の発見や抗がん剤の評価への応用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、細胞内でｐＨ依存的に蛍光を発する、上記式（化１）で表されるビスアクリジンペプチド誘導体であり、式中、Ｘ１、Ｘ２は同一又は異なり、アミノ基又はジメチルアミノ基を表し、ｌ、ｍ、ｎは１〜４の整数を表す。上記式中、Ｘ１が６−ジメチルアミノ基、Ｘ２が３−ジメチルアミノ基、ｌ＝４、ｍ＝２、ｎ＝１であるビスアクリジンペプチド誘導体である、２−（２−{２−[２−アセチルアミノ−６−（３，６−ビス−ジメチルアミノ−アクリジン−９−イルアミノ）−ヘキサノイルアミノ]−３−カルボキシ−プロミオニルアミノ}−３−カルボキシ−プロピオニルアミノ）−５−（３，６−ビス−ジメチルアミノ−アクリジン−９−イルアミノ）−ペンタノン酸（以下、ＢＡＯ−Ｄと略記する）が好ましい。ＢＡＯ−Ｄは下記式（化２）で表される。
【００１１】
【化２】
2010143883.tif 000003
【００１２】
また、ＢＡＯ−Ｄを英文で表記すると以下のとおりである。
2-(2-{2-[2-Acetylamino-6-(3,6-bis-dimethylamino-acridin-9-ylamino)-hexanoylamino]-3-carboxy-propionylamino}-3-carboxy-propionylamino)-5-(3,6-bis-dimethylamino-acridin-9-ylamino)-pentanoic
acid。
【００１３】
本発明のビスアクリジンペプチド誘導体、特にＢＡＯ−Ｄは、ペプチド骨格の２、３番目をリシンからアスパラギン酸に変更することによって、分子中のアニオン部位を増やすことで細胞内への導入効率がアップしたものである。また、ｐＨに依存した分子のプロトン化によって、アクリジンオレンジ骨格部分のスタッキング構造が変化することで蛍光が大きく変化するものと考えられる。
【００１４】
ビスアクリジンペプチド誘導体の製法について、図１を用い前記ＢＡＯ−Ｄを例にとって説明する。先ず、ペプチド合成機を利用して、
（１）Resin-Linker-Lys(Boc)-Asp(OtBu)2-Lys(Boc)-Acを合成し、次に、（２）Resinからの切り出し及び側鎖の脱保護を行って、（３）
Ac-Lys(AO)-Asp2-Lys(AO)-OHの合成を行う。具体的な手順を述べると、ＢＡＯ−Ｄは、図１のスキームに従って市販のペプチド合成装置により合成することができる。この際、N末端のアミノ基は、水溶液中ではプロトン化してカチオン性となるのでアセチル化（その他の公知の保護手段も含む）することによってそれを防ぐことができる。また、カルボキシル末端は固相から切り出した際、アニオン性のカルボキシル基となるのでそのままでよい（公知の保護手段で保護してもよい）。
【００１５】
また、アクリジンオレンジ（ＡＯ）をリジンのε-アミノ末端に導入するために、ＡＯの９−-位にＣＨ３Ｓを導入した誘導体を作成し、これを反応させることによって目的のＢＡＯ−Ｄが得られる。この手法は、基本的にペプチド骨格へのＡＯの導入なのでコンビナトリアルケミストリーによって、最適な分子構造の合成が可能である。精製は、逆相ＨＰＬＣによって行うのが好ましい。本発明のＢＡＯ−Ｄ誘導体は、Ｂｏｃ法による液相合成によっても製造することができる。更に、他のＢＡＯ−Ｄ誘導体に関してはペプチド合成装置において使用するアミノ酸の組み合わせを変更し、側鎖末端のアミノ酸の保護基を選択的にはずして９−位にＲＳ基又はＰｈＯ基を有するアクリジンン誘導体を導入することにより合成ることができる。
【００１６】
本発明のビスアクリジンペプチド誘導体は、それを主成分として含むｐＨセンサ試薬、即ち、細胞内のｐＨのイメージング試薬として利用できる。本発明のｐＨセンサ試薬は、細胞内の特にｐＨ３〜５の強酸領域でｐＨ依存的に蛍光変化を示すので、実用的に非常に価値の高いものである。本発明のｐＨセンサ試薬は、ｐＨ３〜８の領域において、従来の同種の試薬の約２５０倍の蛍光変化を示す（励起光３８７ｎｍ、
蛍光４５７ｎｍ）。更に、細胞内の強酸性オルガネラの染色も可能となる。
【００１７】
本発明のｐＨセンサ試薬は、冷暗所、例えば、遮光下の４℃で冷蔵保管すれば半年以上の有効期間を有する。本発明のｐＨセンサ試薬は、有機溶媒又は水で希釈でき、適当な濃度、例えば、２０〜４０μＭの濃度で用いることができ、かかる場合、１０分程度で細胞内に導入され、例えば、励起光波長ＢＰ４２０／３０、吸収波長ＢＰ４６５／２０で、傾向フィルターキューブを用いて測定できる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。本発明は、かかる化合物及び製法に限定されるものではない。
【００１９】
[ＢＡＯ−Ｄの合成]ペプチド合成機を利用してリアクションベッセルに Fmoc-Lys(Boc)-Alko Resin 0.37 g (0.25 mmol)を入れた。そして、カートリッジの１，２番目にFmoc- Asp(OtBu)-OH 0.41 g (1 mmol)を入れ、カートリッジ３番目にFmoc-Lys(Boc)-OH 0.47 g (1 mmol)を入れた。その後、Applied Biosystems社の433A peptide synthesizer によりアミノ酸の伸長反応を行い、アセチル化を行った。合成終了後、生成物はデシケーター内で減圧乾燥することにより黄緑色粉末としてResin-Linker-Lys(Boc)-Asp(OtBu)2-Lys(Boc)-Acを得た。  
【００２０】
次の段階として、最初にクリーベッジカクテル(TFA：TIS：H2O = 95 ： 2.5 ： 2.5) 12 mlを調製した。それを、Resin-Linker-Lys(Boc)-Asp(OtBu)2-Lys(Boc)-Ac 0.43 g に加え、2時間攪拌した。その後、吸引濾過を行った。そのろ液を氷水で冷やしたジエチルエーテル 300 mlに加えた。次に、その溶液をFalconチューブに入れ、遠心分離機(8℃,5000 rpm, 10 min)にかけて、その上澄み液を取り除いた。この操作を5回行った。再びジエチルエーテル(適量)で洗浄し、ボルテックスにかけ、遠心分離機にかける操作を3 回行うことにより白色粉末としてAc-Lys-Asp2-Lys-OH（収量：0.16 g、収率：定量的）を得た。目的物の同定はMALDI TOF MASS（マトリックスは、α-CHCA）測定をより行った。  
【００２１】
得られたAc-Lys-Asp2-Lys-OH 0.16 g (0.293 mmol)にAO-SMe 0.365 g (1.172 mmol),トリエチルアミン82 μl (0.586 mmol)、メタノール 8 mlを入れて50℃で3日間加熱攪拌させた。HPLC精製を行ない、MALDI TOF MASS 測定より目的物の同定を行った。マトリックスはα-CHCAを用い、BAO-Dの合成が確認できた  
【００２２】
[ＢＡＯ−Ｄの蛍光のｐＨ依存性の測定（１）]バッファーのｐＨを３〜８の間で変化させて蛍光スペクトルの測定を行った。測定条件としては、バッファー：広域緩衝液０．１Ｍクエン酸、０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ３〜８を調製した。λｅｘ＝４１２ｎｍ、２５℃、ＰＭＶ＝７７５Ｖ、５．０μＭのＢＡＯ−Ｄで行った。測定結果は図２に示した。  
【００２３】
図２から分かるように、ｐＨを３から８に変化させると最大蛍光波長である５１３ｎｍの蛍光強度は変化しないが、４５７ｎｍ付近で新たに蛍光強度の増大が見られる。これは、側鎖のアスパラギン酸が関与しているためと思われる。５１３ｎｍの蛍光強度は変化せず４５７ｎｍの蛍光強度がｐＨに依存して変化することを利用して、蛍光強度をノーマライズ（ＦＬ（４５７ｎｍ）／ＦＬ（５１３ｎｍ））することができると考えられる。そのグラフを図３に示した。図３から、ｐＨに依存して比、ＦＬ（４５７ｎｍ）／ＦＬ（５１３ｎｍ）は大きくなり、ｐＨ３〜４付近の変化量が最も大きいことが分かる。このことは、ＢＡＯ−Ｄが低いｐＨ領域を測るセンサとして利用できる可能性を示している。また、蛍光をノーマライズできたことにより、試薬の濃度に関係なくｐＨ検出ができると考えられる。  
【００２４】
[ＢＡＯ−Ｄの蛍光のｐＨ依存性の測定（２）]
上記（１）では、ＢＡＯ−Ｄの蛍光強度の比をとることによりｐＨ検出することに成功した。本実験では、ＢＡＯ−Ｄの濃度を１０．０μＭと大きくして蛍光スペクトル測定を行った。更に、今回はｐＨ３〜４の小さな変化を検出することが出来るかを調べるために、ｐＨ３〜４の間を細かくとって測定をした。
【００２５】
測定条件としては、バッファー：広域緩衝液０．１Ｍクエン酸、０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ３〜８を調製した。λｅｘ＝４１２ｎｍ、２５℃、ＰＭＶ＝７７５Ｖ、１０．０μＭのＢＡＯ−Ｄで行った。ＦＬ（４５７ｎｍ）／ＦＬ（５１３ｎｍ）の値のｐＨ依存性の測定結果を図４に示した。
【００２６】
（１）とはＢＡＯ−Ｄの濃度が異なるために、蛍光強度は大きく変化したが（図示せず）、４５７ｎｍと５１３ｎｍの比のプロットは、（１）の場合殆ど同じであり、再現性よくｐＨ検出が出来ることが確認できた。またｐＨ３〜４の間もｐＨに応じて４５７ｎｍと５１３ｎｍの比は変化しており、本発明のＢＡＯ−Ｄが低いｐＨ領域を測るセンサとして使用できる可能性が立証された。  
【００２７】
[培養細胞のＢＡＯ−Ｄによる蛍光画像]
本発明のビスアクリジンペプチド誘導体を主成分として含むｐＨセンサ試薬は、例えば、創薬における細胞内の局所的なｐＨの検出や、細胞の酸性化を伴う癌のイメージングに用いることができる。本発明のＢＡＯ−Ｄの酸性オルガネラへの適用を試みた。培養細胞（HeLa細胞）を利用してＡＯとＢＡＯ−Ｄとの比較を位相差及び蛍光顕微鏡で検討した。図５と図６に示したように、定法によりＡＯで染色した画像（図５）と、ＢＡＯ−Ｄで染色した画像（図６）を比較したところ、ＡＯの場合には核まで染まっていたが、ＢＡＯ−Ｄの場合にはオルガネラのみの染色が観察された。画像測定の条件は以下のとおりである。
【００２８】
ＡＯ染色画像の条件
対物レンズ：２０Ｘ
ライカ社製ＤＭＩ−４０００Ｂ
蛍光フィルターキューブ（ライカ社製）  
キューブ名：I３
励起光波長：BP４５０−４９０
スプリッター波長：５１０
吸収波長：LP５１５
【００２９】
ＢＡＯ−Ｄ染色画像の条件
対物レンズ：２０Ｘ
ライカ社製ＤＭＩ−４０００Ｂ
蛍光フィルターキューブ（ライカ社製）  
キューブ名：A４
励起光波長：ＢＰ３６０/４０
スプリッター波長：４００
吸収波長：ＢＰ４７０/４０
【産業上の利用可能性】
【００３０】
細胞内の局所的ｐＨを、蛍光画像化などによってイメージングする方法は非常に重要である。例として、細胞小器官の1つであるミトコンドリアを挙げることができる。このミトコンドリアの働きには、細胞の活動に必要なエネルギーを作る機能がある。これは、直接的あるいは間接的に行われる。間接的に行われる場合、電子伝達系による酸化的リン酸化（ＡＴＰの合成）が起こる。このときのプロトンポンプによって、その部分が酸性化することが分かっている。このことより、ミトコンドリアに異変が出てくるミトコンドリア病を発見出来ると考えられる。
【００３１】
また、大変死亡率の高い病気の1つに癌がある。遺伝子変異によって正常な細胞が過形成され、それが異形成になり癌化した細胞となる。この癌化した細胞はｐＨが低い酸性側にあると言われている。これまでｐＨの変化を蛍光でイメージングすることができる色素は、フルオレセイン類、シアニン類、ローダミン類などが知られている。しかし、酸性領域（ｐＨ３〜４）での性能の良いものは知られていない。本発明のＢＡＯ−Ｄ等のビスアクリジンペプチド誘導体を主成分として含むｐＨセンサ試薬は、上記のような、創薬における細胞内の局所的なｐＨの検出や、細胞の酸性化を伴う癌のイメージングに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＢＡＯ−Ｄの合成スキームを示す図である。
【図２】実験（１）におけるＢＡＯ−Ｄの蛍光のｐＨ依存性を示す図である。
【図３】図２の蛍光強度をノーマライズ（ＦＬ（４５７ｎｍ）／ＦＬ（５１３ｎｍ）したもののｐＨ依存性を示す図である。
【図４】実験（２）における蛍光強度をノーマライズ（ＦＬ（４５７ｎｍ）／ＦＬ（５１３ｎｍ）したもののｐＨ依存性を示す図である。
【図５】ＨｅＬａ細胞を定法によりＡＯで染色した画像を示す。
【図６】ＨｅＬａ細胞を定法によりＢＡＯ−Ｄで染色した画像を示す。
【図１】
2010143883.tif 000006
【図２】
2010143883.tif 000007
【図３】
2010143883.tif 000008
【図４】
2010143883.tif 000009
【図５】
2010143883.tif 000010
【図６】
2010143883.tif 000011