(57)【要約】【課題】発酵による１−ブタノールの製造において、発酵工程における１−ブタノールの生産効率と１−ブタノールの分離・回収の効率を低下することなく、１−ブタノールの製造を連続的に長期に渡って行う手段を提供する。【解決手段】本発明は、細菌を用いた１−ブタノール発酵生成工程を発酵菌株の至適増殖温度域で行い、さらにその温度域において特定の膜厚を有するＰＶ膜を用いたパーベーパレーション分離膜法により１−ブタノールの分離回収を行う１−ブタノールの製造方法に関する。【選択図】図１
2010161987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵による１−ブタノールの製造方法において、発酵を発酵菌株の至適増殖温度域で行い、さらにその温度域において膜厚が３０〜４００μｍの分離膜を用いたパーベーパレーション分離膜法により発酵液中の１−ブタノールを分離回収する１−ブタノール回収工程を有することを特徴とする１−ブタノールの製造方法
【請求項２】
パーベーパレーション分離法で用いる分離膜の膜厚が４０〜２００μｍであることを特徴とする請求項１記載の方法
【請求項３】
パーベーパレーション分離法で用いる分離膜がシリコーンゴム膜であることを特徴とする請求項１及び２記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発酵による１−ブタノールの製造方法において発酵液から生成した１−ブタノールをパーベーパレーション膜分離法により回収する工程を含む１−ブタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノール発酵は、嫌気性菌のクロストリジウムなどの細菌を利用し、主に糖質から１−ブタノールを作る発酵である。ブタノール発酵は古くから工業的に利用され、２０世紀初頭より英国等で工業生産が開始されている。日本においても１９３０年代に盛んに工業生産された。その後石油化学工業の発展に伴い発酵によるブタノール生産は終息を迎えたが、近年の地球環境の悪化に伴い、よりクリーンな工業生産法として再び脚光を浴びている。
【０００３】
最近ではブタノール代謝遺伝子を大腸菌等に組み換えた発酵菌株（特許文献１）や、変異処理により収率が向上した発酵菌株、の開発（特許文献２）等が盛んに行なわれているものの、この発酵法では、ブタノールの蓄積濃度が低いため蒸留回収に膨大なエネルギーを要する事が問題となっていた。この問題を解決するため、培地の連続添加により発酵液中の１−ブタノールを希釈する方法（特許文献３）や、ガスストリッピングを用いる方法(非特許文献１)、溶媒によりブタノールを抽出する方法（特許文献４）などが知られているが、ガスストリッピングは培地に対して６倍の体積の窒素ガスを循環させる必要があり、溶媒抽出は溶媒自体が高額である等の問題点により実用化には至っていない。
【０００４】
ブタノールの回収方法としては上記のほか、パーベーパレーション膜分離を用いる方法が知られている（特許文献４,非特許文献２、３、４、５）。パーベーパレーション膜分離用の膜としてはゼオライトやシリコーンゴムが用いられることが多いが、ゼオライトでは発酵液中の成分により膜の目詰まりが生じやすく、シリコーンゴムでは透過流束が低いという問題があり、生産性を低下させずに連続的に製造を行うには工夫の余地があった。
【０００５】
非特許文献４はパーベーパレーション膜分離を用い、キャリアガスとしてＮ２ガスを循環させる方法で凡そ１６０時間の連続生産を実施したが、突如ブタノール生産が停止している。酸素の混入や阻害物質が蓄積されたためと推測されているが、高い透過流束を得るため循環させているN2ガス量が膨大であり、酸素混入の危険性は高かったと考えられる。またパーベーパレーション膜厚が６００μｍと厚いため、阻害物質が透過せず蓄積している可能性も高い。非特許文献５はパーベーパレーション膜を発酵槽内に組み込み、キャリアガスとしてＮ２ガスを循環する方法をとっているがブタノールの透過が不十分で長期間の培養には至っていない。
【０００６】
透過流束を向上させるために、パーベーパレーション膜分離膜に供給する液の温度を上げる方法は有効であるが、この方法では発酵菌株の至適増殖温度を超えてしまうため、ブタノールの回収効率は向上するが、発酵における１−ブタノールの時間当たりの生産速度が低下、または異常発酵が起きるといった別の問題が発生する。特許文献４は発酵槽を２段にし、１段目で増殖させた発酵菌を２段目で固定し、更に２段目で得られる液を加熱してブタノールをパーベーパレーション等で方法であるが、工程が複雑な上、発酵槽等の設備が複数となるため工業的に不利である。このため、ブタノール発酵を効率よく長期に渡って連続的に稼動するために、発酵とブタノール回収を同時に効率良く行う改良技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０４１２６９号公報
【特許文献２】米国特許ＵＳ６，３５８，７１７号公報
【特許文献３】特開昭５９−１０９１８４号公報
【特許文献４】特公平４−０２２５５号公報
【特許文献５】特表平１−５０２４７９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Appl Microbiol Biotechnol vol.63,653-658 (2004)
【非特許文献２】Biotechnol. Prog. Vol.15,594-602 (1999)
【非特許文献３】Separation Science and technology,34(14) 2803-2815 (1999)
【非特許文献４】Applied Biochemistry and Biotechnology,84-86,225-235                  (2000)
【非特許文献５】Biotechnol Bioeng Vol.30,692-696 (1987)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、発酵による１−ブタノールの製造方法において、１−ブタノール発酵における１−ブタノールの生産効率と１−ブタノールの分離・回収の効率を低下することなく、１−ブタノールの製造を連続的に長期に渡って行う手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、発酵による１−ブタノール発酵生成工程とパーベーパレーション（以下、ＰＶとも称す）膜分離による１−ブタノール回収工程を有する１−ブタノールの製造において、上記のような問題を解決し１−ブタノールの生産を長期に渡って連続的に行うことを目的として検討したところ、発酵を発酵菌株の至適増殖温度域で行い、さらにその温度域において特定の膜厚を有するＰＶ膜を用いたパーベーパレーション分離膜法により１−ブタノールの分離回収を行ったところ、発酵中の１−ブタノールの生成効率を低下させることなく、ＰＶ分離膜が目詰まりはなく高い透過流束が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、１−ブタノール発酵を発酵菌株の至適増殖温度域で行い、その温度域でＰＶを行うことにより、発酵菌にストレスを与える事無く１−ブタノールを高効率で生産することが可能となり、１−ブタノール発酵製造を連続的に長期に渡って行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１−ブタノール回収を同時に実施した１−ブタノール発酵において、発酵液からの１−ブタノール回収経過を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、発酵による１−ブタノールの製造方法において、発酵を発酵菌株の至適増殖温度域で行い、さらにその温度域において特定の膜厚の分離膜を用いたパーベーパレーション分離膜法により発酵液中の１−ブタノールを分離回収する１−ブタノール回収工程を有することを特徴とする。
【００１４】
本発明に用いるＰＶ分離膜の膜厚は３０μｍ〜４００μｍである。好適には４０μｍ〜２００μｍの膜厚が用いられる。ＰＶ膜分離法では、一般的に中空糸膜の集合結束したものを外ケースもしくはフランジ等と接着した中空糸膜モジュールを用いて分離を行うが、分離膜の厚みが薄くなると集合結束部とフランジとの接着面積が小さくなり接着部分から流体が漏洩する可能性があるため、ある程度の厚い膜厚のものが用いられていた。膜厚が厚いと透過流束が低下するので、分離効率を上げるために処理液をＰＶ膜許容使用温度範囲内でできるだけ高い温度（例えば６０℃〜８０℃）に加温して供給する方法が行われていた。本発明者等は敢えて分離膜の薄い膜を用いた中空糸膜モジュールを用いたところ、ＰＶ分離効率の低くなると思われた低い温度域、すなわち発酵菌株の至適増殖温度域で分離を行っても高い透過流束を得られることを見出した。さらに原因は明らかではないが、長期の使用においても液の漏洩が起こらず連続運転が可能となった。
【００１５】
ＰＶ分離膜の材質としてはシリコーンゴムやゼオライト等が用いられるが、シリコーンゴムは１−ブタノールの他に培地中の水や発酵で副生するアセトン等も分離できるため好適に用いられる。
【００１６】
ＰＶ分離膜の形状は特に限定はされないが、平膜の他、特に中空糸の形状となっている物が用いられ、分離に使われる表面積を大きくするために束になっており物が好適に用いられる。
【００１７】
ＰＶ分離膜モジュールの形状は特に限定されないが、例えば、前記中空糸束を筒状ケースに収納しケースの両端を配管接続具に連結した構造のものや中空糸をシート状に束ねたものが用いられる。
【００１８】
ＰＶ分離と培養の組み合わせの形態としては、例えば、筒状のモジュール等の場合は、発酵槽の外側に配置し、発酵槽から送液ポンプでモジュール側へ発酵液が導入される。１−ブタノールが分離された後の液を発酵槽へ戻すフローにすることにより１−ブタノールの連続製造が可能となる。１−ブタノールを分離した液を一旦貯蔵槽へ保存し、再度、発酵原料として用いる形態もできる。シート状のモジュールの場合は発酵槽内へ直接組込むことが可能であるため、送液ポンプ等の設備が不要となるばかりでなく、製造装置全体の設計をコンパクトにすることができる。
【００１９】
本発明においては、発酵とパーベーパレーション分離法による１−ブタノール回収工程を分けて行うこともできるが、同時に行う方が良い。発酵と１−ブタノール回収を同時に実施する場合、連続的な発酵が可能となるため、バッチ生産で必要となる培養槽洗浄作業等が不要となり、その回数が削減できるだけで大幅な製造コストの低減を図ることができるからである。さらに１−ブタノール回収工程において、回収される液の水／１−ブタノール比率は供給液の１−ブタノール濃度によって異なるが、通常１−ブタノールの８〜９倍の水を除去できるので、発酵槽への連続的な栄養源の追加供給を行ってもオーバーフローする発酵液量が減少するため、発酵液中に容易に発酵菌体を封じ込めることが可能となり、菌体のロス、排水量も少なくなるため有利となる。また回収液は清澄な液体として得られるため、１−ブタノール精製後に得られる水は培地及び発酵原料の調製のためにリサイクルすることができる。
【００２０】
パーベーパレーション分離工程に供給する液としては、増殖至適温度域で発酵が進行している液をそのまま供給できるが、発酵が終了した液でも良い。または遠心分離、膜分離、固定化等の方法により、発酵が進行している液から菌体を除去した物を用いることもできる。
【００２１】
パーベーパレーション分離工程の運転条件としては、供給液を増殖至適温度域（例えばクロストリジウム属であれば３０〜４０℃が至適温度）に保ち、１−ブタノールの蒸発を促進させるため、膜の透過蒸発側を真空に保持する。また膜の透過蒸発側をＮ２、Ｈ２、ＣＯ２ガス、またはそれらを混合したガスまたは発酵で得られたガスをキャリアガスとして膜の透過蒸発側に供給することでも同様の効果が得られる。更にキャリアガス供給と真空を同時に適用しても良い。
【００２２】
上記のパーベーパレーション分離工程を公知の１−ブタノール生産工程に組込むことにより本発明の実施が可能となる。
【００２３】
本発明においての１−ブタノール発酵とは、細菌等の微生物を利用し、１−ブタノールを作る発酵を指し、発酵菌としてはクロストリジウム属の細菌の他、１−ブタノール代謝遺伝子を大腸菌等に組み換えた発酵菌株（特許文献１）や、変異処理により収率が向上した発酵菌株、１−ブタノール耐性を高めた発酵菌株（特許文献２）が好適に用いられる。発酵に用いる培地は発酵菌株が生育及び１−ブタノール生産が可能であれば特に限定されるものではない。
【００２４】
本発明の発酵に用いる発酵原料、培養に用いる培地及び培養条件は、１−ブタノール発酵の分野で公知のものを使用できる。培養は、通常、炭素源、窒素源及び無機イオンを含む。
【００２５】
発酵原料となる炭素源としては、でんぷんや糖類、好ましくはグルコースを用いる。グルコースとともに、ラクトース、ガラクトース、フラクトース等の六炭糖類、キシロース等の五炭糖類、若しくはでんぷんの加水分解物などの糖類、ソルビトールなどのアルコール類、又はフマル酸、クエン酸若しくはコハク酸、酪酸、酢酸等の有機酸類を、併用してもよい。
【００２６】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、酢酸アンモニウム等の有機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００２７】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が添加される。有機微量栄養素としては、ビオチン、ビタミンＢ１などの要求物質又は酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
【００２８】
発酵原料として前記の他に、近年では地球環境への配慮から、バイオマスの利用が注目されている。バイオマスは大きくデンプン系とセルロース系バイオマスに大別されるが、これらバイオマスの糖化液を発酵原料としても良い。特にパーム油の原料である植物パームヤシは東南アジアを中心に体量に生産されており、パームヤシ由来バイオマス（パームヤシ古木、パーム空果房、パーム油排水、パーム油絞り粕等）の利用が可能である。
【００２９】
培養は、通常、嫌気条件下で５時間以上実施するのがよく、培養温度は通常２５〜４０℃に、培養中ｐＨは通常３〜８に制御する。ｐＨ調整には無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）モデル液からの１−ブタノール回収
本発明のパーベーパレーション分離法をモデル液を用いて行った。
方法
使用膜：永柳工業株式会社製シリコーン膜モジュールＭ４０−６０００
中空糸内径０．１７ｍｍ、膜厚０．０４ｍｍ、膜面積０．５５ｍ２（内外径中間値）
循環液量：１８０ｍＬ／ｍｉｎ
減圧：１０〜２０torr
キャリアガス：Ｎ２ガス３Ｌ／ｈｒ（１０ｔｏｒｒにおいて） 
循環液温度：３５℃
冷却温度：−７．５℃
供給液：１０ｇ／Ｌ−１−ブタノール水溶液
結果
３５℃の条件で高い透過流束を達成することができた。またこの結果より、本条件下（冷却温度−７．５℃）での回収収率は約７０％であることが分かり、減圧、冷却条件等の最適化により、更に高収率で回収できることが示唆された。
【００３２】
【表１】
2010161987.tif 000003
【００３３】
透過流束は実回収液の重量より算出した。回収収率は約７０％であるため、実際には更に高い透過流束が得られていると推測される。選択率等の算出方法は非特許文献２，３に従った。
（実施例２）発酵液からの１−ブタノール回収
方法
供給液を発酵終了後の培養液とした以外は実施例１と同様の方法で実施した。
発酵液：Clostridium. acetobutylicum ATCC824株発酵液（７２ｈｒ培養）
結果
実施例１とほぼ同様の透過流束を達成できた。従って発酵液を用いてもモデル液と同様に１−ブタノールを回収できることが示された。
【００３４】
【表２】
2010161987.tif 000004
【００３５】
透過流束は実回収液の重量より算出した。
（実施例３）１−ブタノール回収を同時に実施した１−ブタノール発酵
方法
使用菌株：Clostridium. beijerinckii NCIMB8052 ATCC51743 
培養方法：C. beijerinckii保存液それぞれ１ｍＬを表３に示す発酵培地(但し濃度は１／４とした)９ｍＬに２本に接種し、温水バス中で８０℃、１０ｍｉｎのヒートショック後直ちに氷水中で２ｍｉｎの冷却を行い、３５℃で２０ｈｒ静置培養した。その後、表３に示す発酵培地１．６Ｌを入れた２Ｌ容ジャーファーメンターにヒートショック液２０ｍＬを接種し、３５℃、３００ｒｐｍで培養した。発酵によりガス発生が盛んになるまで(１９ｈｒまで)はＮ２ガスを培地中に通気した（通気速度＞０．２ｖｖｍ）。培養１９ｈｒより、流速４．０ｇ／ｍｉｎ設定で流加用培地を添加した（７３〜１４４ｈｒ間は一時的に流速７．０ｇ／ｍｉｎ設定とした）。
１−ブタノール回収方法：循環液量：９０ｍｌ／ｍｉｎ、冷却温度−５．０℃とした以外は実施例１と同様の方法で実施した。運転は１９ｈｒより開始した。
【００３６】
【表３】
2010161987.tif 000005
【００３７】
図１に発酵液からの１−ブタノール回収経過を示した。
【００３８】
この結果、非特許文献4と比較して長期に渡って１−ブタノールが安定に回収されていることが分かった。培養は４００ｈｒ以上であり、終了時においても特に発酵液に異常が見出されることは無かった。培養トータルでの１−ブタノール回収量は約４８０ｇであった。この結果から、本発明で示される常温でのパーベーパレーションにより、発酵菌に与えるストレスが軽減され、長期安定に１−ブタノール生産ができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、細菌を用いた１−ブタノールの製造方法において、発酵菌株の増殖至適温度域での発酵と特定の厚みの分離膜を用いたパーベーパレーション膜分離法による１−ブタノールの回収を同時に実施することにより、長期に渡って連続的な１−ブタノール発酵を実施することができ、従来の方法に比べ１−ブタノールの製造が低コストで実施できる。
【図１】
2010161987.tif 000006