(57)【要約】【課題】安全性の優れている骨粗鬆剤の提供【解決手段】クミンから得られる抽出物を有効成分とする骨粗鬆症の予防又は治療用剤。【選択図】  図1
2010235534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クミンから得られる抽出物を有効成分とする骨粗鬆症の予防又は治療用剤。
【請求項２】
抽出物が、エタノール抽出物及び/又は水であることを特徴とする請求項１記載の骨粗鬆症の予防又は治療用剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された骨粗鬆症の予防又は治療用剤を含有する経口薬。
【請求項４】
請求項３に記載された経口薬を含有する錠剤又はカプセル。
【請求項５】
請求項１又は２に記載された骨粗鬆症の予防又は治療用剤を含有するペットフード。
【請求項６】
クミンから得られる抽出物を有効成分とする破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症の予防又は治療用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
閉経後の更年期障害は、老化や閉経後の女性ホルモンの低下によるホルモンバランスの不均衡が原因である。更年期障害の中で高齢化社会に伴って患者数の増加が著しい骨粗鬆症は、ＱＯＬの低下が著しくその予防が重要である。
骨粗鬆症対策は、エストロゲン製剤などのホルモン剤や植物由来の剤が提案されている。エストロゲン製剤などは、副作用がある恐れがあり、安全性が懸念されている。安全性の高い骨粗鬆対症剤が探索されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特開２００３−３１３１３７号公報）には、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｍａｃｒａｎｔｈａエキス、Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｍｅｙｅｎｉｉ Ｗａｌｐエキス、並びに、Ｅｐｉｍｅｄｉｍ ｋｏｒｅａｎｕｍエキスを含有する骨粗鬆症治療用医薬組成物が開示されている。特許文献２（特開２０００−５３５７６号公報）には、セリ科ペトロセリヌム（Petroselinum）属、キク科カーサムス（Carthamus）属、バラ科ルブス（Rubus）属、バラ科アグリモニア（Arimonia）属、クマツヅラ科ヴァーベナ（Verbena）属、およびシソ科メリッサ（Melissa）属のハーブ植物の抽出物を有効成分とする骨粗鬆症剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３１３１３７号公報
【特許文献２】特開２０００−５３５７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新たな骨粗鬆症予防又は治療剤を提供することを課題とする。特に、安全性の優れている骨粗鬆剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、骨粗鬆症の予防作用を有する物質を見出す目的で、200種類の植物エキスについて、細胞生存率及びTRPA活性を指標にスクリーニングを行った結果、クミンに強い破骨細胞への分化抑制作用があることを見出した。
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）クミンから得られる抽出物を有効成分とする骨粗鬆症の予防又は治療用剤。
（２）抽出物が、エタノール抽出物及び/又は水であることを特徴とする（１）記載の骨粗鬆症の予防又は治療用剤。
（３）（１）又は（２）に記載された骨粗鬆症の予防又は治療用剤を含有する経口薬。
（４）（３）に記載された経口薬を含有する錠剤又はカプセル。
（５）（１）又は（２）に記載された骨粗鬆症の予防又は治療用剤を含有するペットフード。
（６）クミンから得られる抽出物を有効成分とする破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制剤。
【発明の効果】
【０００７】
クミンから抽出されたエキスを用いることにより安全性の高い骨粗鬆予防、治療剤を提供することができる。特に、破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用を示し、細胞毒性が低く安全性の高い骨粗鬆予防及び治療剤である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】クミンエタノール抽出物TRAP活性を示すグラフ
【図２】クミン水抽出物TRAP活性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、植物由来の骨粗鬆対症剤を探索して得られたものである。探索手法として、破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用を指標とした骨吸収抑制物質の探索を行った。
破骨細胞は、造血幹細胞を起源とし、数個の細胞が融合し形成される高度に分化した多核巨細胞であり、細胞質に強い酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(tertrate-resistant acid phosphatase ; TRAP)活性を示す。骨芽細胞から破骨細胞前駆細胞への分化誘導シグナルであるRANKL(receptor activator of NF-κB ligand)はTNFファミリーに属し、破骨細胞前駆細胞膜上の受容体(RANK)に結合し、破骨細胞分化を誘導する。
今回の実験では、破骨細胞前駆細胞RAW264.7細胞に天然物成分を添加し、分化に伴う骨吸収マーカーのTRAP活性の抑制能を指標として骨吸収抑制作用物質をスクリーニングした。約200種の植物を対象にして、スクリーニングした結果、破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用が高い植物であって、細胞毒性が低い植物材料として、クミンを見出すことができた。
【００１０】
クミン（Cuminum cyminum .）は、セリ科（Umbelliferae）に属する一年草で、この果実をクミンと称して薬や料理、菓子の香辛料に用いる。
原産地はトルキスタンで、治療薬としては、健胃、整腸、食欲増進、鎮静、強心剤などの目的に用いられる。
香辛料としては、主にカレーやシチュー等の料理に用いられる。
【００１１】
[抽出手段]
本発明は、クミンを原料として用い、植物原料を乾燥した粉末状でも用いることは可能であるが、抽出したエキスが好ましい。抽出物は、上記植物体等の原料から、有効成分を効果的に抽出し得る溶媒を用いて抽出するか、これらを部分精製することにより得られる。
抽出溶媒は、有効成分を効果的に抽出し得る溶媒であれば特に限定されるものではないが、例えば、エタノール、メタノール、アセトン、プロパノール等の低級アルコールのように水と混和する有機溶媒、またはそれらの混液、酢酸エチル等の低級エステル、水等を用いることができる。原料をそのままこれらの溶媒で抽出することもできるが、好ましくは、抽出効率を高めるために、これらの原料を細かく裁断してから溶媒で抽出することが望ましい。更に、抽出を２〜４回繰り返して抽出効率を高めることも可能である。
好ましい抽出方法としては、細かく裁断した原料１ｇに対して５〜100ml、特に10〜20ml程度の溶媒を用いる方法が挙げられる。抽出溶媒として有機溶媒を用いる場合は、１日から１カ月間、好ましくは２〜５日間、室温で行うことが望ましい。また、抽出溶媒として水を用いる場合は、抽出効率を高めるため、加温することが望ましい。更に、抽出物中の有効成分の濃度を高めるために、所望により、得られた抽出物を更に、濃縮、液液分配、吸着クロマトグラフィー、順相もしくは逆相クロマトグラフィー等の手段に付すことも可能である。
【００１２】
[剤型]
本発明は、骨粗鬆症に対する予防剤、治療剤として用いることができる。
植物抽出物を有効成分とし、常法に従って公知の医薬品用担体と組合わせて製剤化することができる。剤型は、経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等が例示でき、非経口投与剤としては、注射剤の他、坐薬、膣坐薬等の坐剤、噴霧剤等の経鼻投与剤、軟膏、経皮吸収性テープ等の経皮吸収剤が例示できる。
ペットには、犬、猫、ハムスター、リス等の哺乳類の高齢ペットを対象として、骨粗鬆の予防や治療用として投与できる。投与は、剤そのものの他飼料に添加することができる。本発明のペットフードの形態は特に限定されるものではなく、例えばドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ビスケットタイプ、ソーセージタイプ、ジャーキータイプ、粉末、顆粒、カプセルなどが挙げられる。
発明の吸収性骨疾患の予防・治療剤は、原料乾物換算として、通常成人１日当たり１〜100ｇ、好ましくは３〜30ｇを１〜３回に分けて経口または非経口で投与できる投与単位とすれば良い。これらの投与量は、年齢、症状等により適宜増減することが可能である。
本発明で用いる原材料のクミンは、細胞毒性試験においても細胞生存率が高く、安全性を確認している。また、すでに生薬等として用いられている植物から得られるものであるので、安全性において特に問題になる点はないものである。
【００１３】
〔破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用を指標とした骨吸収抑制物質の探索〕
破骨細胞は、造血幹細胞を起源とし、数個の細胞が融合し形成される高度に分化した多核巨細胞であり、細胞質に強い酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(tertrate-resistant acid phosphatase ; TRAP)活性を示す。骨芽細胞から破骨細胞前駆細胞への分化誘導シグナルであるRANKL(receptor activator of NF-κB ligand)はTNFファミリーに属し、破骨細胞前駆細胞膜上の受容体(RANK)に結合し、破骨細胞分化を誘導する。
今回の実験では、マウス由来単球白血病細胞株である破骨細胞前駆細胞RAW264.7（ＡＴＣＣＴＩＢ-７１）細胞に天然物成分を添加し、分化に伴う骨吸収マーカーのTRAP活性の抑制能を指標として骨吸収抑制作用物質をスクリーニングした。
このＴＲＡＰ活性は骨芽細胞を破骨細胞に分化させる指標となり、ＴＲＡＰ活性が抑制されると骨破壊が抑制され、その結果骨粗鬆症が抑制される。
【００１４】
＜実験材料および方法＞
１． 使用細胞
M-CSF非存在下、RANKLのみで破骨細胞様細胞に誘導される細胞である破骨細胞前駆細胞RAW264.7細胞を用いた。以下の方法に従い、TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)活性を測定した。
破骨細胞前駆細胞RAW264.7細胞は96穴プレートを用いDulbecco’s  Modified Eagle Medium（DMEM培地）中、RANKL(100ng/ml)とクミン抽出液(10-100μg/ml)存在下３日間培養後、細胞(96well-プレート)を５分間遠心し、上清を取り除いた。10％ホルマリン溶液100μl/wellを加え、10分間固定させた。上清を取り除き、90％エタノール５μl/wellを加え、１分間乾燥させた。
クエン酸バッファー100μl/wellを加え、30分間、37℃インキュベーターで反応後、0.1N NaOH 100μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダーを用いて、415nmで吸光度を測定した。
【００１５】
細胞生存率の測定
細胞生存率は、Cell titer 96 AQuseous One Solution（Promega）法またはMTT法にて測定した。
【００１６】
Cell titer法
１）96-well  プレートに細胞（１×10３個／ml）播種し３日間培養した。
２）細胞を播種した96-wellプレートにcell titer 96 AQuseous One Solutionを10μl/well加え、15分間培養した。
３）プレートリーダーを用いて、490nmで吸光度を測定した。
【００１７】
MTT Assay
MTT試薬：５mg／ml  PBS（−）
１）96-well  プレートに細胞（１×10４個／ml）播種し３日間培養した。
２）細胞を播種した96-wellプレートにMTT試薬を10μg／mlずつ分注し
軽くshakerで振とう後、CO2incubator(37℃、５％CO2)にて４時間反応させた。
３）plateを2000rpm,10-15min 遠心後、
４）上清を捨てて、isopropanol-0.04NHCLを100μｇ／ずつ分注した。
５）shakerで振とうし３％SDSを10μｇ／mlずつ分注した。
６）shakerで振とうし  Plate  Readerで測定した。（OD595-655）
【００１８】
[クミンのエタノール抽出物のマウス由来単球白血病細胞株RAW264.7細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ-７１）における細胞毒性]
クミンのエタノール抽出物がRAW264.7細胞に対し、細胞毒性があるかを確認するためにCell proliferation assay を行なった。100％エタノールを試料と同濃度に添加した細胞をコントロールとした。
【００１９】
その結果、クミンのエタノール抽出物に細胞毒性は認められなかった。
【００２０】
[細胞毒性試験結果]
さらにＭＴＴ  assayを用いた細胞毒性について計測した。その結果を表1に示す。
【００２１】
【表１】
2010235534.tif 000003
【００２２】
クミンのエタノール抽出物では50μg/mlでコントロールと同等以上、水抽出物では100μg/mlの濃度でコントロールと大差ない細胞生存率を示した。
【００２３】
[クミン抽出物の濃度依存ＴＲＡＰ活性抑制試験]
次にクミン種子抽出物のエタノール抽出物と水抽出物を用いて、ＴＲＡＰ活性抑制試験を行った。
クミン種子エタノール抽出物の試験結果を図1に示す。クミン種子エタノール抽出物は、RANKL（＋）について見ると、コントロールに比較して25μg／mlでは、10％以下となっており、50μg／mlでは殆ど活性を抑制していると認められ、非常に優れたＴＲＡＰ活性抑制が認められる  
【００２４】
クミン種子水抽出物の試験結果を図２に示す。クミン種子水抽出物は、RANKL（＋）に
ついて見ると、コントロールに比較して30μg／mlでは、50％以下となっており、更に濃度依存的にＴＲＡＰ活性抑制を発揮することが認められる。
【００２５】
（結果）
今回の試験結果では、クミン抽出物に、細胞毒性による安全性の確認ができ、且つＴＲＡＰ活性抑制を濃度依存的に示した。
したがって、クミン抽出物は、破骨細胞の生成を抑制し骨粗鬆症予防又は治療する効果を有する。
【図１】
2010235534.tif 000004
【図２】
2010235534.tif 000005