(57)【要約】【課題】通常のリン脂質ＰＥＧと同様の添加量で使用することができるとともに、脂質小胞体の表面の水和層を増大することができ、脂質小胞体の安定性を向上させることができ、かつ、簡便に製造することができる新規な脂質誘導体を提供すること。【解決手段】グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、グルコン酸、グルコヘプトン酸から選択される化合物の残基を含む脂質誘導体を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）
【化１】
2010235450.tif 000017
で表される脂質誘導体。
（式中、Ｚは炭素数４〜８の水酸基を有する化合物の残基、又は、水酸基と共にアミノ基もしくはカルボキシル基のどちらかを１もしくは２個有する炭素数４〜８の化合物の残基であり、Ｒは炭素数４〜２４のアルキル基又はアルケニル基を示し、ｍは０〜６であり、ａは０又は１であり、ＰＯＬＹは直鎖状、又は分岐鎖状のポリオキシアルキレンであり、ＰＯＬＹの分子量は２００〜１０００００を表し、ｋ１は１又は２であり、ｋ２は３〜６であり、ｋ３は０〜３、４≦ｋ１＋ｋ２＋ｋ３≦８であり、Ｘは、Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択される基である。）
【請求項２】
Ｚがグルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、グルコン酸、グルコヘプトン酸から選択される化合物の残基である、請求項１記載の脂質誘導体。
【請求項３】
ＰＯＬＹがメトキシポリオキシエチレンである、請求項１又は２記載の脂質誘導体。
【請求項４】
ＰＯＬＹが末端にマレイミド基、アルデヒド基、Ｎ−コハク酸イミドエステル基から選択される官能基を有する直鎖状ポリオキシエチレンである、請求項１又は２記載の脂質誘導体。
【請求項５】
ＰＯＬＹが分岐鎖状ポリオキシエチレンである、請求項１又は２記載の脂質誘導体。
【請求項６】
ａ＝１である、請求項１〜５のいずれか１項記載の脂質誘導体。
【請求項７】
ｋ３が０である、請求項１〜６のいずれか１項記載の脂質誘導体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の脂質誘導体を含む脂質小胞体。
【請求項９】
下記の一般式（ＩＩ）
【化２】
2010235450.tif 000018
で表されるポリオキシアルキレン誘導体。
（式中、ｍ、ＰＯＬＹは前記と同じであり、Ｚ’は水酸基と共にアミノ基又はカルボキシル基のどちらかを１又は２個有する炭素数４〜８の化合物の残基であり、Ｘ’はＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択される基であり、ｋ４は１又は２であり、ｋ５は３〜６である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水基となるアルキル鎖を３本以上持ち、親水基としてポリエチレングリコール鎖を１本又は２本有する両親媒性化合物に関する。
【０００２】
本発明の両親媒性化合物は、脂質小胞体、細胞表面、疎水性表面に、水溶性ポリマー、多糖類、水溶性タンパク質を安定に固定するために有用である。またさらに、脂質小胞体やマイクロスフェアを修飾することにより細胞やタンパク質に対しての特異的な認識能を付与することができる。
【背景技術】
【０００３】
脂質小胞体は、生体適合性が高いといった安全性の点からドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）分野でのキャリヤーとして期待され、これまでにさまざまな研究がなされている。しかしながら、脂質小胞体は凝集や融合による不安定化が起こりやすい、あるいは血中滞留性が低いといった多くの問題があることも知られている。そこで、小胞体の構成脂質に電荷脂質やコレステロールを混合することで、凝集や融合を抑制し、脂質小胞体を安定化することが行われてきた（特許文献１）。さらにポリエチレングリコールや糖質で小胞体の表面を修飾することによってもその解決が図られてきた。ポリエチレングリコール等の水溶性高分子鎖で修飾された表面は生体適合性が高く、人工臓器、人工細胞、人工血液の素材として利用できる。さらに、ポリエチレングリコールのような水溶性高分子により周囲に水和層を形成した脂質小胞体は、血液中で、細網内皮系組織（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ；ＲＥＳ）に取り込まれにくく、血中滞留性がよいことが分かっている。血中滞留性がよい場合、血液中を循環することにより、癌細胞等の破損した細胞に集積する確率が高くなり、ＤＤＳ機能を向上させることができる。また、ポリエチレングリコールに機能性分子を導入することにより脂質小胞体に特徴のある機能を付加させることができ、患部へのターゲティングが期待できる。そのため、ポリエチレングリコール誘導体はＤＤＳ分野において有用な化合物として期待されている。
【０００４】
ポリエチレングリコール誘導体は、脂質小胞体に付与した場合、凝集等の抑制だけでなく、血中滞留性の向上といった効果があることから、ＤＤＳの素材として有用であり、これらを使用した研究は盛んに行われている。脂質小胞体へ付与されるポリエチレングリコール誘導体としては、疎水性化合物と結合させた脂質ポリエチレングリコール（脂質ＰＥＧ）が広く使用されており、その例としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンＰＥＧ（リン脂質ＰＥＧ）やコレステロールＰＥＧといったものが挙げられる。脂質ＰＥＧは、疎水性部分を脂質二重膜へ組み込み、水溶性部分であるポリエチレングリコールを脂質表面へ突き出し、表面を被覆する。そこで、血中滞留性やターゲィング能の向上のために、脂質ＰＥＧの添加量を増やすことや、ポリエチレングリコール鎖の分子量を大きくすることが検討されている。しかしながら、添加量又は分子量を上げ過ぎると、親水性・疎水性のバランスが崩れてしまい、リン脂質膜のパッキングが弱まり、脂質ＰＥＧが脂質小胞体から脱離することが報告されている（非特許文献１）。また、この脱離により、脂質小胞体の安定性が悪くなることも報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
一方、特許文献２では、脂質小胞体への表面に安定に固定するために、デンドリマーの構成単位である樹枝状構造体（デンドロン）の分岐側末端に多数の疎水性基を導入させ、コア部にある唯一の置換基に親水性基を導入した樹枝状分岐構造を有する両親媒性化合物についての記載がある。しかしながら、多数の疎水性基を有するこの化合物の合成には、第一に樹枝状構造体の分岐側末端に疎水性基を導入した際に精製し、第二に分岐を増加させるために疎水性基を導入する際にも精製が必要であり、第三にはコア部にある唯一の置換基に親水性基を導入した後も精製が必要である等、製造上、簡便に得ることができない。また、この化合物としての小胞体表面への評価はなされていない。そのため、簡便に製造することができ、脂質小胞体の表面の水和層を増大し、かつ、脂質小胞体の安定性を高めることのできる脂質誘導体を提供することが本発明の課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１４５０３８号公報
【特許文献２】特許第３１８１２７６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ． Ｒ． Ｓｉｌｖｉｕｓ ａｎｄ Ｍ． Ｊ． Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ３２巻, ３１５３頁, １９９３年
【非特許文献２】Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、７４巻、１３７１頁、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、通常のリン脂質ＰＥＧと同様の添加量で使用することができるとともに、脂質小胞体の表面の水和層を増大することができ、脂質小胞体の安定性を向上させることができ、かつ、簡便に製造することができる新規な脂質誘導体を提供することにある。
【０００９】
より具体的には脂質小胞体等ＤＤＳ分野においてだけでなく、さらに生理活性物質等の可溶化及び分散等においても好適に利用することができる脂質誘導体を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、新規な脂質誘導体を提供することに成功した。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の脂質誘導体は、脂質小胞体の二分子膜に組み込まれる疎水基を３〜６本持ち、その疎水性の相互作用により二分子膜へ組み込まれた後は、安定に膜中へ存在することができる。また、疎水性相互作用が強いため、いったん膜へ組み込まれると安定に存在することができる。そのため、水和層を増大させるためにポリエチレングリコールの鎖長を増大させても、疎水基部分が安定に膜に組み込まれているため、抜け落ちることがない。
【００１２】
したがって本発明は、以下の通りである。
〔１〕下記の一般式（Ｉ）
【００１３】
【化１】
2010235450.tif 000002
【００１４】
で表される脂質誘導体。
（式中、Ｚは炭素数４〜８の水酸基を有する化合物の残基、又は、水酸基と共にアミノ基もしくはカルボキシル基のどちらかを１もしくは２個有する炭素数４〜８の化合物の残基であり、Ｒは炭素数４〜２４のアルキル基又はアルケニル基を示し、ｍは０〜６であり、ａは０又は１であり、ＰＯＬＹは直鎖状、又は分岐鎖状のポリオキシアルキレンであり、ＰＯＬＹの分子量は２００〜１０００００を表し、ｋ１は１又は２であり、ｋ２は３〜６であり、ｋ３は０〜３、４≦ｋ１＋ｋ２＋ｋ３≦８であり、Ｘは、Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択される基である。）
〔２〕Ｚがグルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、グルコン酸、グルコヘプトン酸から選択される化合物の残基である、前記〔１〕記載の脂質誘導体。
〔３〕ＰＯＬＹがメトキシポリオキシエチレンである、前記〔１〕又は〔２〕記載の脂質誘導体。
〔４〕ＰＯＬＹが末端にマレイミド基、アルデヒド基、Ｎ−コハク酸イミドエステル基から選択される官能基を有する直鎖状ポリオキシエチレンである、前記〔１〕又は〔２〕記載の脂質誘導体。
〔５〕ＰＯＬＹが分岐鎖状ポリオキシエチレンである、前記〔１〕又は〔２〕記載の脂質誘導体。
〔６〕ａ＝１である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１に記載の脂質誘導体。
〔７〕ｋ３が０である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１に記載の脂質誘導体。
〔８〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１に記載の脂質誘導体を含む脂質小胞体。
〔９〕下記の一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化２】
2010235450.tif 000003
【００１６】
で表されるポリオキシアルキレン誘導体。
（式中、ｍ、ＰＯＬＹは前記と同じであり、Ｚ’は水酸基と共にアミノ基又はカルボキシル基のどちらかを１又は２個有する炭素数４〜８の化合物の残基であり、Ｘ’はＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択される基であり、ｋ４は１又は２であり、ｋ５は３〜６である）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
前記一般式（Ｉ）で表される本発明の脂質誘導体において、Ｚは、炭素数４〜８の水酸基を有する化合物の残基、又は、水酸基と共にアミノ基もしくはカルボキシル基のどちらかを１もしくは２個有する炭素数４〜８の化合物の残基である。
【００１８】
炭素数４〜８の水酸基を有する化合物としては、例えば、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ペンチトール、ヘキシトール、へプチトール、オクチトール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、マンニトール、ジペンタエリスルトール等が挙げられる。好ましくは、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、マンニトール、ペンチトール、へプチトールであり、より好ましくは、トリグリセリン、ペンタグリセリン、ペンチトール、へプチトールであり、さらにより好ましくはペンチトール、へプチトールである。また、これらは天然物、合成物のいずれでもよく、種々の異性体を有するが、特にペンチトールの中でもキシリトールが好ましい。また、単独で用いても２種以上の混合物で用いてもよい。
【００１９】
一方、水酸基と共にアミノ基又はカルボキシル基のどちらかを１又は２個有する炭素数４〜８の化合物としては、粘液酸（カルボキシル基：２、水酸基：４）、グルコン酸（カルボキシル基：１、水酸基：５）、グルカミン（アミノ基：１、水酸基：５）、Ｎ−メチルグルカミン（アミノ基：１、水酸基：５）、グルコヘプトン酸（カルボキシル基：１、水酸基：６）等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、グルコン酸、グルカミン、グルコヘプトン酸であり、より好ましくは、グルカミンである。
【００２０】
アミノ基又はカルボキシル基のどちらかを１又は２個有する炭素数４〜８の化合物は、構造中に１又は２個のアミノ基又はカルボキシル基を有していればよいため、例えば、上記した炭素数４〜８の水酸基を有する化合物中の３〜６個の水酸基を公知の方法により保護しておき、残存した１又は２個の水酸基を公知の方法によりカルボキシル基又はアミノ基に誘導化した後、脱保護する方法等によって得ることができる。
【００２１】
Ｒは炭素数４〜２４のアルキル基又はアルケニル基であり、好ましくは炭素数１１〜２３のアルキル基又はアルケニル基である。アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、アルケニル基中には１〜３個の二重結合があってもよい。
【００２２】
このＲは通常、脂肪酸又は脂肪族アルコールに由来するものが用いられる。ａは０又は１を表すが、ａ＝１の場合、ＲＣＯであるアシル基の具体的なものとしては、例えば酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸等の飽和及び不飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。
【００２３】
ａ＝０の場合、Ｒの具体的なものとしては、ｎ−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、２−エチルヘキサノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、ノナデカノール、イコサノール、ヘンイコサノール、ドコサノール、トリコサノール、由来のアルキル基又はアルケニル基を挙げることができ、これらは直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
【００２４】
Ｘは、炭素数４〜８の水酸基を有する化合物、又は水酸基と共にアミノ基もしくはカルボキシル基のどちらかを１もしくは２個有する炭素数４〜８の化合物のアミノ基又はカルボキシル基由来の結合であり、Ｏ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（アミド結合）、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）−（アミド結合）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（アミド結合）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−（ウレタン結合）、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ウレタン結合）、−Ｏ−（エーテル結合）である。
【００２５】
ＰＯＬＹはポリオキシアルキレンを表し、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ポリオキシトリメチレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。これらの中ではポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンが好ましく、特にポリオキシエチレン基が好ましい。このオキシアルキレン基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよく、その組み合わせ方に制限はない。またブロック状であってもランダム状であってもよい。
【００２６】
また、ＰＯＬＹは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよいポリオキシアルキレンである。
【００２７】
下記にＰＯＬＹの構造をより具体的に示すが、これらには限定されない。
【００２８】
例えば、直鎖状のポリオキシアルキレンとしては、下記に示されるポリオキシエチレン誘導体である。
【００２９】
【化３】
2010235450.tif 000004
【００３０】
ここで、ｎは、ポリオキシアルキレンの分子量が２００〜１０００００とした時の、ポリオキシアルキレンの付加モル数である。
【００３１】
また、分岐鎖状のポリオキシアルキレンとしては、例えば、下記に示されるポリオキシエチレン誘導体である。
【００３２】
【化４】
2010235450.tif 000005
【００３３】
ポリオキシアルキレンの末端は、薬物や抗体等を結合することができる反応性基でもよく、また、薬物や抗体等が結合することができない不活性な官能基であってもよい。
【００３４】
例えば、反応性基としては、マレイミド基、アセタール基、アルデヒド基、チオール基、保護されたチオール基、コハク酸コハク酸イミドエステル基、グルタル酸コハク酸イミドエステル基、アミノ基、保護されたアミノ基、オキシアミノ基、ｐ−ニトロフェニルカーボネート基、水酸基等が挙げられる。好ましくは、メトキシ基、マレイミド基、アセタール基、アルデヒド基、グルタル酸コハク酸イミドエステル基、アミノ基であり、より好ましくは、メトキシ基、マレイミド基、アセタール基、アルデヒド基、グルタル酸コハク酸イミドエステル基である。
【００３５】
不活性な官能基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基等が挙げられるが、好ましくはメトキシ基である。
【００３６】
また、ＰＯＬＹで示されるポリオキシアルキレンと反応性基、不活性基との間に、メチレン基、エチレン基、プロピレン基等のアルキレン基、アミド基やエステル基を含む連結基を有していてもよい。
【００３７】
ＰＯＬＹの分子量は、２００〜１０００００であり、好ましくは５００〜４００００であり、より好ましくは１０００〜１００００であり、さらに好ましくは１０００〜５０００である。ポリオキシアルキレンの分子量が２００より小さいと、本発明のポリオキシアルキレン−脂質誘導体を脂質小胞体への添加剤として使用した場合、疎水性が強すぎるため安定化の効果が小さい。また１０００００より大きいと、製造する際に、ポリオキシアルキレン−脂質誘導体の粘度が上昇して作業性が低下し好ましくない。
【００３８】
ｍは０〜６の整数であり、好ましくは、０〜３である。ｍが０の場合は、ＰＯＬＹとＸが直接結合していることを示す。
【００３９】
ｋ１、ｋ２、ｋ３はそれぞれ整数であり、ｋ１は１又は２であり、ｋ２は３〜６、ｋ３は０〜３、ｋ１、ｋ２、及びｋ３の合計は、３≦ｋ１＋ｋ２＋ｋ３≦６である。
【００４０】
一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の製造方法は特に限定されないが、ポリエチレングリコール化合物の活性化誘導体、例えば、ポリエチレングリコール  カーボネート誘導体、ポリエチレングリコール  カルボン酸誘導体、ポリエチレングリコール  アミン誘導体等と、水酸基と共にアミノ基又はカルボキシル基をどちらか１又は２個有する炭素数４〜８の化合物と反応させることにより、一般式（ＩＩ）で表される化合物を得た後、脂肪酸、脂肪酸クロリド、又は脂肪酸の無水物を反応することによって製造することができる。
【００４１】
一般式（ＩＩ）中、ｍ、ＰＯＬＹは前記と同じである。Ｚ’は水酸基と共にアミノ基又はカルボキシル基のどちらかを１又は２個有する炭素数４〜８の化合物の残基であり、Ｘ’はＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択される基である。ｋ４、ｋ５はそれぞれ整数であり、ｋ４は１又は２であり、ｋ５は３〜６であり、ｋ４及びｋ５の合計は、４≦ｋ４＋ｋ５≦８である。
【００４２】
本発明のポリオキシアルキレン−脂質誘導体は、リン脂質等で形成される脂質小胞体の構成成分として含有することができる。脂質膜構造体は、リン脂質、コレステロール、コレスタノール等のステロール類、その他の炭素数８〜２２の飽和及び不飽和のアシル基を有する脂肪酸類、α−トコフェロール等の酸化防止剤を含んでいてもよい。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマローゲン等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのリン脂質の脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン及び大豆レシチンのような天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
【００４３】
一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の製造方法は特に限定されないが、ポリエチレングリコール化合物の活性化誘導体、例えば、ポリエチレングリコール  カーボネート誘導体、ポリエチレングリコール  カルボン酸誘導体、ポリエチレングリコール  アミン誘導体等と、アミノ基又はカルボキシル基をどちらか１又は２個有する炭素数４〜８の化合物とを反応させた後、残存する水酸基を脂質化することにより製造することができる。
【００４４】
また、本化合物の製造方法としては、Ｚが炭素数４〜８の水酸基を有する化合物の少なくとも１つ以上を保護基により保護しておき、残存する水酸基に、例えばエチレンオキシドを重合させた後、末端水酸基を所望の官能基に変換した後、脱保護し、得られた水酸基を脂質化する方法によっても製造することができる。
【００４５】
また、本発明の脂質誘導体を用いた脂質小胞体は、医薬や生理活性物質を内包させることもできるし、脂質誘導体の官能基と反応させ、様々なタンパク質や抗体と結合させることもでき、また遺伝子を封入することもできる。これらは、医薬の種類、遺伝子の種類は特に限定されない。本発明の脂質誘導体の脂質小胞体への配合量は医薬の薬効や遺伝子を発現させるのに十分な量であればよい。
【００４６】
医薬としては例えば、抗腫瘍剤として用いられる化合物が好ましく、例えば、塩酸イリノテカン、パクリタキセル、塩酸ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、硫酸ビンクリスチン等を挙げることができる。
【００４７】
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられ、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等がある。
【００４８】
本発明の脂質誘導体を含む脂質小胞体の形態は特に限定されないが、例えば、脂質混合物をクロロホルム等の有機溶剤に溶解し、エバポレーターによって脱溶剤し乾固させた形態や、脂質混合物を水系溶剤に分散させた形態、水系溶剤に分散した小胞体を凍結乾燥させた形態を挙げることができる。
【００４９】
また、脂質混合物を水系溶剤に分散させた形態としては、例えば、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル等があり、好ましくはリポソームである。水系溶剤を使用するときは、単なる水を用いてもよいし、少量のアルコール等を含む混合溶剤であってもよい。好ましくは、局方注射用水、蒸留水等が用いられる。この時、水系溶剤に生理活性物質や、タンパク質、緩衝物質や各種の塩、血漿等を溶解させ、溶液状としたものであってもよい。
【００５０】
脂質混合物を水系溶剤に分散した形態としては、特に限定されないが、分散溶液をホモジナイザーや高圧噴射乳化機等を使用して乳化させたり、エクストルーダーやリポナイザー等により粒径の揃ったリポソームとして得ることが出来る。
【００５１】
脂質類と医薬との混合乾燥物は、例えば、使用する脂質類成分と医薬とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させ、次にこれをエバポレーターによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことにより製造することができる。
【００５２】
脂質混合物と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法としては公知の方法で行うことができ、適宜選択することができる。製造方法としてはこれらに限定されないが、例えば、脂質混合物と医薬との混合物を水系溶剤に添加し、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化させる方法、脂質乾燥物に医薬を含む水系溶剤を添加して乳化する方法、水系溶媒に分散したリポソーム、エマルション、ミセル等の脂質小胞体に医薬を含む水系溶媒を添加する方法、水系溶剤に分散させた脂質小胞体の乾燥物に医薬を含む水系溶媒を添加する方法等が挙げられる。
【００５３】
脂質小胞体の大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でエクストルーダー等を使用して押し出し慮過等を行ってもよい。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００５５】
実施例１
メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン（ＰＥＧ分子量：２０００）の合成
【００５６】
【化５】
2010235450.tif 000006
【００５７】
３００ｍＬフラスコにＤ−グルカミン（８．１５ｇ、４５ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（５０ｇ）を入れ、４０℃にて溶解した。メチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネート（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−２０Ｈ：分子量２０００、５０ｇ、２５ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１００ｇ）にて４０℃で溶解後、上記溶液に加えた。３時間反応後、溶液をサンプリングし、希釈後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）に供し、原料のモノメチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネートが消失したことを確認した。反応溶液にトルエン（３１７ｇ）を入れ、メチル  ｔ−ブチルエーテル（以下、ＭＴＢＥとする）（６１６ｇ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、酢酸エチル（８００ｇ）を入れ４５℃で昇温後、室温に冷却し、不溶物をグラスフィルター（ＧＦ−７５）にて濾過し、５℃まで冷却後、結晶を濾過した。さらに、上記の精製を繰り返した後、ヘキサン（８００ｇ）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物５０ｇを得た。得られた化合物は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）にて展開後、ヨウ素発色にて確認したところ、１スポットであった。
【００５８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ３．３８（ｓ，ＣＨ３Ｏ−，３Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、４．２２（ｍ，−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＯＣＨ２−）を確認した。
【００５９】
実施例２
メチルポリオキシエチレンオキシカルバミル  グルカミン  ペンタステアレート（ＰＥＧ分子量：２０００）の合成
【００６０】
【化６】
2010235450.tif 000007
【００６１】
３００ｍＬフラスコにステアリン酸（１０．７ｇ、３７．６ｍｍｏｌ）、トルエン（１００ｇ）を入れ、４０℃にて溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．８７ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を入れ、上記実施例１で得られたメチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン（５．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を入れ、３時間反応させた。反応液を濾過後、エバポレーターにて溶媒を留去した。残渣をアセトン（４０ｍＬ）にて溶解後、ヘキサン（２００ｍＬ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、アセトン（１００ｍＬ）、ヘキサン（２００ｍＬ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、同様にもう一回繰り返した。結晶濾過後、ヘキサン（２００ｍＬ）にて結晶洗浄、濾過、乾燥し、目的化合物５．３ｇを得た。
【００６２】
また、残存脂肪酸の分析は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）にて展開し、リン酸硫酸銅の発色にて分析した。その結果、残存ステアリン酸は、０．０５％以下であった。
【００６３】
また、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ０．８８（ｔ，ＣＨ３（ＣＨ２）１６−，１５Ｈ）、３．３８（ｓ，ＣＨ３Ｏ−，３Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）を確認した。
【００６４】
実施例３
メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン（ＰＥＧ分子量：５０００）の合成
【００６５】
【化７】
2010235450.tif 000008
【００６６】
３００ｍＬフラスコにＤ−グルカミン（２．９０ｇ、１６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（５０ｇ）を入れ、４０℃にて溶解した。メチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネート（分子量５０００、５０ｇ、１０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１３０ｇ）にて４０℃で溶解後、上記溶液に加えた。３時間反応後、溶液をサンプリングし、希釈後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）に供し、原料のモノメチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネートが消失したことを確認した。反応溶液にトルエン（２８５ｇ）を入れ、ＭＴＢＥ（５５３ｇ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、酢酸エチル（８００ｇ）を入れ４５℃で昇温後、室温に冷却し、不溶物をグラスフィルター（ＧＦ−７５）にて濾過し、５℃まで冷却後、結晶を濾過した。さらに、上記の精製を繰り返した後、ヘキサン（８００ｇ）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物４６．５ｇを得た。
【００６７】
得られた化合物は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）にて展開後、ヨウ素発色にて確認したところ、１スポットであった。
【００６８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ３．３８（ｓ，ＣＨ３Ｏ−，３Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、４．２２（ｍ，−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＯＣＨ２−）を確認した。
【００６９】
実施例４
メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン  ペンタステアレート（ＰＥＧ分子量：５０００）の合成
【００７０】
【化８】
2010235450.tif 000009
【００７１】
３００ｍＬフラスコにステアリン酸（１２．８ｇ、４５ｍｍｏｌ）、トルエン（３００ｇ）を入れ、４０℃にて溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．７０ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を入れ、上記実施例３で得られたメチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン（１５．０ｇ、３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．２ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を入れ、２時間反応させた。反応液を濾過後、エバポレーターにて溶媒を留去した。残渣をアセトン（１２０ｍＬ）にて溶解後、ヘキサン（６００ｍＬ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、アセトン（３００ｍＬ）、ヘキサン（６００ｍＬ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、同様にもう一回繰り返した。結晶濾過後、ヘキサン（６００ｍＬ）にて結晶洗浄、濾過、乾燥し、目的化合物１２．７ｇを得た。
【００７２】
残存脂肪酸の分析は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）にて展開し、リン酸硫酸銅の発色にて分析した。その結果、残存ステアリン酸は、０．０５％以下であった。
【００７３】
また、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ０．８８（ｔ，ＣＨ３（ＣＨ２）１６−，１５Ｈ）、３．３８（ｓ，ＣＨ３Ｏ−，３Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）を確認した。
【００７４】
実施例５
３−（３’−マレイミド−１’−オキソプロピル）アミノプロピル−ポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン（ＰＥＧ分子量：５０００）の合成
【００７５】
【化９】
2010235450.tif 000010
【００７６】
３００ｍＬフラスコにＤ−グルカミン（２．９０ｇ、１６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（５０ｇ）を入れ、４０℃にて溶解した。ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＡ−０５０ＴＳ（日油株式会社）（分子量５０００、５０ｇ、１０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１３０ｇ）にて４０℃で溶解後、上記溶液に加えた。３時間反応後、溶液をサンプリングし、希釈後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）に供し、原料のモノメチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネートが消失したことを確認した。反応溶液にトルエン（２８５ｇ）を入れ、ＭＴＢＥ（５５３ｇ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、酢酸エチル（８００ｇ）を入れ４５℃で昇温後、室温に冷却し、不溶物をグラスフィルター（ＧＦ−７５）にて濾過し、５℃まで冷却後、結晶を濾過した。さらに、上記の精製を繰り返した後、ヘキサン（８００ｇ）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物４５．１ｇを得た。
【００７７】
得られた化合物は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）にて展開後、ヨウ素発色にて確認したところ、１スポットであった。
【００７８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、４．２２（ｍ，−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＯＣＨ２−）、６．７１（ｓ，−ＣＨ＝ＣＨ−，２Ｈ）、を確認した。
【００７９】
実施例６
３−（３’−マレイミド−１’−オキソプロピル）アミノプロピル−ポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン  ペンタステアレート（ＰＥＧ分子量：５０００）の合成
【００８０】
【化１０】
2010235450.tif 000011
【００８１】
３００ｍＬフラスコにステアリン酸（１２．８ｇ、４５ｍｍｏｌ）、トルエン（３００ｇ）を入れ、４０℃にて溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．７０ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を入れ、上記実施例５で得られた３−（マレイミド−１−オキソプロピル）アミノプロピル−ポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン（１５．０ｇ、３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．２ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を入れ、２時間反応させた。反応液を濾過後、エバポレーターにて溶媒を留去した。残渣をアセトン（１２０ｍＬ）にて溶解後、ヘキサン（６００ｍＬ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、アセトン（３００ｍＬ）、ヘキサン（６００ｍＬ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、同様にもう一回繰り返した。結晶濾過後、ヘキサン（６００ｍＬ）にて結晶洗浄、濾過、乾燥し、目的化合物１２．７ｇを得た。
【００８２】
残存脂肪酸の分析は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー：クロロホルム／メタノール＝８５／１５）にて展開し、リン酸硫酸銅の発色にて分析した。その結果、残存ステアリン酸は、０．０５％以下であった。
【００８３】
また、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ０．８８（ｔ，ＣＨ３（ＣＨ２）１６−，１５Ｈ）、１．７５（ｑｕｉｎｔ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−，２Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、６．７１（ｓ，−ＣＨ＝ＣＨ−，２Ｈ）を確認した。
【００８４】
比較例１
モノメチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネートの合成
【００８５】
【化１１】
2010235450.tif 000012
【００８６】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＨ−１０Ｈ（分子量１０００：１００ｇ、０．１ｍｏｌ）、トルエン（１１０ｇ）を入れ、１１０℃で還流脱水し、含水トルエン（３３ｇ）を留去した。６０℃に冷却後、トリエチルアミン（１２．１ｇ、０．１２ｍｏｌ）を加え、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（２２．２ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、４時間反応させた。４０℃まで冷却後、トルエン（１２０ｇ）にて希釈し、トリエチルアミン塩酸塩を濾過した。濾液に酢酸エチル（２００ｇ）、ヘキサン（３００ｇ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、酢酸エチル（２００ｇ）に溶解後、ヘキサン（３００ｇ）を添加し、５℃まで冷却した。結晶濾過後、ヘキサン（３００ｇ）にて結晶を洗浄した。結晶濾過後、減圧乾燥し、目的物であるモノメチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネート（９６ｇ）を得た。
【００８７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ３．３８（ｓ，ＣＨ３Ｏ−，３Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、４．４３（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、２Ｈ）、７．４０（ｄ，−ＣＨ＝ＣＨ−，２Ｈ）、８．２８（ｄ，−ＣＨ＝ＣＨ−，２Ｈ）を確認した。
【００８８】
比較例２
モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
【００８９】
【化１２】
2010235450.tif 000013
【００９０】
比較例１で得られた、モノメチルポリオキシエチレン  ｐ−ニトロフェニルカーボネート（３０ｇ、０．１ｍｏｌ）、トルエン（１５０ｇ）を入れ、６８℃に昇温した。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（２６．９ｇ、０．１２ｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（６３．９ｇ、０．２０ｍｏｌ）を加え、５時間反応させた。３０℃まで冷却後、炭酸ナトリウムを濾過した。濾液をエバポレーターにて濃縮、乾固した。酢酸エチル（３０ｇ）に溶解後、メチル  ｔ−ブチルエーテル（２７０ｇ）を入れ、５℃まで冷却した。結晶濾過後、酢酸エチル（３０ｇ）／メチル  ｔ−ブチルエーテル（２７０ｇ）の晶析を２回繰り返した。結晶濾過後、ヘキサン（３００ｇ）にて結晶を洗浄した。結晶濾過後、減圧乾燥し、目的物であるモノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（４５ｇ）を得た。
【００９１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）より特徴のあるピークとしては、δ０．８８（ｓ，ＣＨ３（ＣＨ２）１６ＣＯ２−，６Ｈ）、１．２５（ｍ、ＣＨ３（ＣＨ２）１４，５６Ｈ）、３．３８（ｓ，ＣＨ３Ｏ−，３Ｈ）、３．４−３．９（ｍ，−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、５．２１（ｍ，−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ２−）２，１Ｈ）を確認した。
【００９２】
（リポソームとしての評価）
〔１〕リポソーム液の調製
水添大豆ホスファチジルコリン  ６．０５９ｇ（７．７ｍｍｏｌ）、コレステロール  １．０ｇ（２．６ｍｍｏｌ）をクロロホルム  ２００ｍＬに溶解させた後、エバポレーターにより溶剤を留去し、さらに６時間真空乾燥させた。この脂質乾燥物  ０．０７ｇを秤量し、水２０ｍＬを加えて水和させ、湯浴につけながらボルテックスミキサーにて軽く撹拌した。この脂質分散液を０．２μｍの孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いてサイジングを行い、リポソーム液を調製した（０．２μｍ×２回）。該リポソーム液を５セット調製し、それぞれをリポソーム液（ｉ）〜（ｖ）とした。
【００９３】
実施例Ａ
〔２〕ポリオキシエチレン修飾リポソーム液の調製
別に、実施例２で得られた一般式（２）で表される化合物であるメチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン  ペンタステアレート  ０．０８６ｇ（２．５７×１０−２ｍｍｏｌ）を水５ｍＬに溶解させておき、分散液(５．１ｍＭ)を調製した。この分散液をリポソーム液（ｉ）に添加し、６０℃で１時間撹拌し、ポリオキシエチレン修飾リポソーム（Ａ）を調製した。（脂質濃度  ４ｍＭ、ＰＥＧ濃度  １ｍＭ）
【００９４】
実施例Ｂ
実施例４で得られた一般式（４）で表される化合物であるメチルポリオキシエチレンオキシカルボニル  グルカミン  ペンタステアレート  ０．１６３ｇ（２．５７×１０−２ｍｍｏｌ）を水５ｍＬに溶解させておき、分散液(５．１ｍＭ)を調製した。この分散液をリポソーム液（ｉｉ）に添加し、６０℃で１時間撹拌し、ポリオキシエチレン修飾リポソーム（Ｂ）を調製した。（脂質濃度  ４ｍＭ、ＰＥＧ濃度  １ｍＭ）
【００９５】
比較例Ｃ、Ｄ、Ｅ
比較例２の一般式（８）で表される化合物、下記一般式（９）で表される化合物（ポリエチレングリコール分子量２０００）、下記一般式（１０）で表される化合物（ポリエチレングリコール分子量６１５）をそれぞれ２．５７×１０−２ｍｍｏｌ使用し（各々０．０４６ｇ、０．０７２ｇ、０．０２６ｇ）、それぞれ水５ｍＬに溶解させておき、３種類の分散液(５．１ｍＭ)を調製した。これらの分散液５ｍＬを各々リポソーム液（ｉｉｉ）〜（ｖ）に添加し、６０℃で１時間撹拌し、３種類のポリオキシエチレン修飾リポソーム（Ｃ、Ｄ、Ｅ）を調製した。（脂質濃度  ４ｍＭ、ＰＥＧ濃度  １ｍＭ）
【００９６】
【化１３】
2010235450.tif 000014
【００９７】
【化１４】
2010235450.tif 000015
【００９８】
（ポリオキシエチレン修飾リポソームの安定性の検討）
ポリオキシエチレン修飾リポソームの安定性を評価するため、実施例Ａ、Ｂ、比較例Ｃ、Ｄ、Ｅで得られた５つのポリオキシエチレン修飾リポソームを、４０℃の低温恒温器（ＬＴＩ−７００Ｅ：ＥＹＥＬＡ）に入れ、１、１．５、２、３ヶ月での安定性を評価した。結果を表に示す。
【００９９】
【表１】
2010235450.tif 000016
【０１００】
４０℃でのポリオキシエチレン修飾リポソームの安定性評価の結果、本願発明の脂質誘導体を含む、実施例Ａ、実施例Ｂのポリオキシエチレン修飾リポソーム（Ａ）、（Ｂ）は３ヶ月経過後も安定であった。
【０１０１】
一方、従来の脂質誘導体を使用したポリオキシエチレン修飾リポソーム（Ｃ）、（Ｄ）についてはそれぞれ、１．５ヶ月、２ヶ月で凝集していた。ポリオキシエチレン修飾リポソーム（Ｅ）では１ヶ月で可溶化していた。
【０１０２】
以上より、本願発明の脂質誘導体を含むポリオキシエチレン修飾リポソームは、従来の脂質誘導体を使用したポリオキシエチレン修飾リポソームよりも安定性の高いことが明らかとなった。