(57)【要約】      （修正有）【課題】チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーセットを提供する。【解決手段】チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含んでおり、前記フォワードプライマーとして、特定の配列からなる塩基配列を有しているプライマーが用いられており、前記リバースプライマーとして、前期特定の配列とは異なる特定の配列からなる塩基配列を有しているプライマーが用いられているプライマーセット。【選択図】図１
2010187576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：１に記載の塩基配列を有していることを特徴とするプライマー。
【請求項２】
チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：２に記載の塩基配列を有していることを特徴とするプライマー。
【請求項３】
チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含んでおり、前記フォワードプライマーとして、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーが用いられており、前記リバースプライマーとして、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーが用いられていることを特徴とするプライマーセット。
【請求項４】
請求項３に記載されたプライマーセットの存在下で用いられ、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのリアルタイムＰＣＲに用いられ、配列番号：３に記載の塩基配列を有していることを特徴とするＰＣＲプローブ。
【請求項５】
チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に用いられ、配列番号：１に記載の塩基配列、配列番号：２に記載の塩基配列、又は配列番号：３に記載の塩基配列のいずれか１種を有していることを特徴とするＦＩＳＨプローブ。
【請求項６】
配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーとを用いたＰＣＲによってチオシアン分解細菌の定量を実施することを特徴とするチオシアン分解細菌定量方法。
【請求項７】
配列番号：３に記載の塩基配列を有しているＰＣＲプローブをさらに用いることを特徴とする請求項６記載のチオシアン分解細菌定量方法。
【請求項８】
配列番号：１に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、及び配列番号：３に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブのうちの少なくとも１種を用いたＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によってチオシアン分解細菌の定量を実施することを特徴とするチオシアン分解細菌定量方法。
【請求項９】
チオシアンを含有する被処理水とチオシアン分解細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記チオシアン分解細菌により前記チオシアンを分解する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、
配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーとを用いたＰＣＲによって前記チオシアン分解細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴とする生物処理方法。
【請求項１０】
チオシアンを含有する被処理水とチオシアン分解細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記チオシアン分解細菌により前記チオシアンを分解する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、
配列番号：１に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、及び配列番号：３に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブのうちの少なくとも１種を用いたＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって前記チオシアン分解細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴とする生物処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）に用いられるプライマー、プライマーセットならびにプローブ、又は、fluorescence in situ hybridization（以下「ＦＩＳＨ法」という）に用いられるプローブに関し、さらには、チオシアン分解細菌定量方法、および、生物処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、難分解性であり有害なチオシアンなどを含む工場排水の排水処理においては、チオシアンなどの処理対象物質を分解させるべく、例えば、チオシアン分解細菌等の水質浄化細菌を利用した生物処理方法が採用されている。その生物処理方法としては、活性汚泥法が一般的である。
【０００３】
斯かる生物処理方法においては、例えば、処理対象となる被処理水と多種多様な細菌からなる活性汚泥を含む混合相を槽内に形成させて、水質浄化細菌により処理対象物質を分解させる生物処理を槽内で実施する。この種の生物処理方法においては、処理水の水質を一定以上に維持させるべく、槽内水の活性汚泥濃度を所定値に維持して運転している。
【０００４】
ところが、例えばコークス排水などのように、工場排水がチオシアン、フェノール類、アンモニア、又は硫化水素などの様々な有害成分を含んでいる生物処理方法においては、斯かる各種の有害物質により、チオシアン分解細菌等の水質浄化細菌の生育阻害が起こりやすく、処理水の水質を一定以上に維持させることが比較的困難である。
【０００５】
そこで、コークス排水などを対象とする生物処理方法においては、処理水の水質を安定的に維持させるべく、槽内水の活性汚泥中の水質浄化細菌数を所定数以上に維持する必要があり、そのためにも水質浄化細菌数を迅速且つ精度よく計測する必要がある。即ち、コークス排水などのような様々な有害成分を含んでいる工場排水の生物処理方法においては、例えば、チオシアンを分解し得るチオシアン分解細菌等をできるだけ迅速に精度よく検出及び定量できる定量方法が要望されている。
【０００６】
ところで、従来、チオシアン分解細菌の定量方法においては、例えば培養法が採用されており、具体的には、選択培地を用いた培養法が採用されている（非特許文献１）。斯かる定量方法においては、通常、結果が得られるまでに１０日程度の比較的長い日数を要する。従って、培養法を採用したチオシアン分解細菌の定量方法は、チオシアン分解細菌の迅速で精度よい定量を要する生物処理方法には適用しにくいという問題がある。
【０００７】
一方、近年の分子生物学的手法の発達により、チオシアン分解細菌の定量方法として、比較的簡単にかつ短時間で行えるＰＣＲ法やＦＩＳＨ法などの方法が知られてきている。
【０００８】
この種のチオシアン分解細菌の定量方法としては、例えば、代表的なチオシアン分解細菌であるThiobacillus thioparusが生成するthiocyanate hydrolase（チオシアン加水分解酵素）のサブユニットの一つをコードするｓｃｎＣ遺伝子に特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲ法（非特許文献２）が知られている。また、チオシアン加水分解酵素のサブユニットの一つをコードする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲ法（非特許文献３）が知られている。
【０００９】
しかしながら、非特許文献２のごとく、チオシアン加水分解酵素に関わるｓｃｎＣ遺伝子をターゲットとするＰＣＲ法においては、必ずしも当該細菌を検出することはできないという問題がある。また、非特許文献３のごとく、チオシアン加水分解酵素に関わる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとするＰＣＲ法においては、チオシアン分解細菌を検出することは可能であるが、ＰＣＲ産物のサイズが約６００ｂｐという比較的大きいものになり、増幅効率が比較的低いものになるという問題がある。
【００１０】
このように、ＰＣＲ法においては、１００％に近い増幅効率を得るべく８０〜１５０ｂｐ程度のＰＣＲ産物が生じるようなＰＣＲプライマー又はＰＣＲプライマーセットが適当とされているところ、チオシアン分解細菌については、ＰＣＲ用のプライマー又はＰＣＲプライマーセットとして適当なものが見出されておらず、チオシアン分解細菌の定量方法において実用的に採用可能なＰＣＲ法が確立されてはいない。
【００１１】
すなわち、従来、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＰＣＲに用いられるプライマー又はプライマーセットにおいては、チオシアン分解細菌の検出や定量に適したものが提供されていないという問題がある。また、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＦＩＳＨ法に用いられるプローブにおいても、チオシアン分解細菌の検出や定量に適したものが提供されていないという問題がある。
したがって、ＰＣＲやＦＩＳＨ法によるチオシアン分解細菌の定量方法も汎用性を有していないという問題を有している。
さらには、チオシアン分解細菌によるチオシアンの分解が行われる生物処理方法においては、処理水の水質を予測することが困難で一定以上の水質を維持させることが困難であるという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】V.L. Barbosa他、J. Appl. Microbiol.，2006年，101巻，1269〜1281ページ
【非特許文献２】Manabu Yamasaki他、Appl. Environ. Microbiol.，2002年，68巻，942〜946ページ
【非特許文献３】Michael J. Gibson他、J. Microbiol. Methods，2006年，65巻，346〜349ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーの提供を課題としている。
また、本発明は、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーセット、ＰＣＲプローブの提供を課題としている。
また、本発明は、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＦＩＳＨ法に適したＦＩＳＨプローブの提供を課題としている。
また、本発明は、チオシアン分解細菌の汎用的な定量方法の提供を課題としている。
さらには、本発明は、チオシアン分解細菌によるチオシアンの分解が行われる生物処理方法において、処理水の水質が一定以上に維持された生物処理を容易に実施させ得る生物処理方法の提供を課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＰＣＲなどに好適なプライマー等を見出し本発明の完成に到ったのである。
【００１５】
すなわち、本発明にかかる一方のプライマーは、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：１に記載の塩基配列を有していることを特徴としている。
【００１６】
また、本発明にかかる他方のプライマーは、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：２に記載の塩基配列を有していることを特徴としている。
【００１７】
また、本発明にかかるプライマーセットは、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含んでおり、前記フォワードプライマーとして、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーが用いられており、前記リバースプライマーとして、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーが用いられていることを特徴としている。
【００１８】
本発明にかかるＰＣＲプローブは、前記プライマーセットの存在下で用いられ、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのリアルタイムＰＣＲに用いられ、配列番号：３に記載の塩基配列を有していることを特徴としている。
【００１９】
本発明にかかるＦＩＳＨプローブは、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に用いられ、配列番号：１に記載の塩基配列、配列番号：２に記載の塩基配列、又は配列番号：３に記載の塩基配列のいずれか１種を有していることを特徴としている。
【００２０】
また、本発明にかかるチオシアン分解細菌定量方法は、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーとを用いたＰＣＲによってチオシアン分解細菌の定量を実施することを特徴としている。
【００２１】
前記チオシアン分解細菌定量方法においては、配列番号：３に記載の塩基配列を有しているＰＣＲプローブをさらに用いることが好ましい。
【００２２】
本発明にかかるチオシアン分解細菌定量方法は、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、及び配列番号：３に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブのうちの少なくとも１種を用いたＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によってチオシアン分解細菌の定量を実施することを特徴としている。
【００２３】
さらに、本発明にかかる生物処理方法は、チオシアンを含有する被処理水とチオシアン分解細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記チオシアン分解細菌によりチオシアンを分解する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーとを用いたＰＣＲによって前記チオシアン分解細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴としている。
【００２４】
また、本発明にかかる生物処理方法は、チオシアンを含有する被処理水とチオシアン分解細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記チオシアン分解細菌により前記チオシアンを分解する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブ、及び配列番号：３に記載の塩基配列を有しているＦＩＳＨプローブのうちの少なくとも１種を用いたＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって前記チオシアン分解細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーならびにプライマーセットを提供し得る。
本発明によれば、チオシアン分解細菌の検出または定量のためのリアルタイムＰＣＲに適し、前記プライマーセットの存在下で用いられるＰＣＲプローブを提供し得る。
また、本発明によれば、チオシアン分解細菌の検出や定量のためのＦＩＳＨ法に適したＦＩＳＨプローブを提供し得る。
本発明によれば、ＰＣＲ又はＦＩＳＨ法によるチオシアン分解細菌の定量方法の汎用性を向上させ得る。
さらには、チオシアン分解細菌によりチオシアンを分解する生物処理が実施される生物処理方法において、処理水の水質が一定以上に維持された生物処理を容易に実施させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＰＣＲを実施したときの増幅曲線。
【図２】ＰＣＲにおける検量線。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本実施形態の生物処理方法について、チオシアン、フェノール類、硫化水素などを含有するコークス排水を含む被処理水を、チオバチルス（Thiobacillus）属細菌、メチロバクテリウム（Methilobacterium）属細菌などのチオシアン分解細菌が収容されている生物処理槽に導入し、該生物処理槽において前記チオシアン分解細菌によってチオシアンを分解し、チオシアン分解物を含む処理水を排出させる生物処理方法を例に説明する。
【００２８】
本実施形態の生物処理方法においては、被処理水とチオシアン分解細菌とを含んだ混合相を前記生物処理槽内に形成させて活性汚泥状態で生物処理を実施する。
また、前記混合相が形成されている生物処理槽の槽内水を定期的にサンプリングして、該サンプリングされた槽内水中のチオシアン含有量、溶存酸素量を測定するとともに、チオシアン分解細菌の定量を実施して得られた測定結果を生物処理槽の運転条件などにフィードバックさせて、例えば、生物処理槽の槽内温度、汚泥の引抜き条件、汚泥返送条件などを調整する。
本実施形態の生物処理方法は、後述するＰＣＲ又はＦＩＳＨ法によりチオシアン分解細菌の定量を簡便且つ比較的短時間に行い得ることから、上記のようなチオシアン分解細菌の定量を実施して得られた測定結果のフィードバックを容易に実施させることができ、生物処理槽から排出される処理水の水質を一定以上に維持させることを容易に実施させ得る。
【００２９】
なお、本明細書において、“チオシアン”との用語は、チオシアン酸、チオシアン酸塩などの化合物を意味するものである。
【００３０】
前記ＰＣＲとしては、蛍光を発する色素をインターカレートさせる方法（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法）や、蛍光色素を結合させたＰＣＲプローブを用いる方法（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法等）などを採用し得る。
【００３１】
前記ＰＣＲとしては、簡便でありながら比較的高い精度で細菌の定量が可能なリアルタイムＰＣＲを実施することが好ましい。
また、前記リアルタイムＰＣＲは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施することができる。
【００３２】
前記ＰＣＲには、フォアワードプライマーとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｆ（配列番号１：５’−ＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴ−３’）（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）と、リバースプライマーとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｒ（配列番号２：５’−ＴＣＣＡＣＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＣＴＴ−３’）（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）とを含むプライマーセットを用いることができる。
前記プライマーセットを用いることにより、ｓｃｎＣ遺伝子（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）との相同性の高いＤＮＡの増幅を他の遺伝子の非特異的な増幅を抑制しつつＰＣＲを実施させることができ好適である。
【００３３】
また、前記リアルタイムＰＣＲには、ＰＣＲ用のＰＣＲプローブとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｔａｑ（配列番号３：５’−ＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣ−３’）（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）を用いることができる。
前記リアルタイムＰＣＲにおいて前記ＰＣＲプローブを用いることにより、リアルタイムＰＣＲにおけるチオシアン分解細菌の経時的な定量がより精度の高いものとなり得るという利点がある。
ＰＣＲプローブとしてのｓｃｎＣＴｔ１Ｔａｑ（配列番号３：５’−ＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣ−３’）（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）においては、５’サイトが蛍光化合物で標識され、３’サイトがクエンチング効果を有する化合物で標識されていることが好ましい。
【００３４】
このようなプライマーセットを用いたＰＣＲによるチオシアン分解細菌の定量は、汎用性にも優れており、迅速且つ精度良く実施でき、生物処理方法における処理水質の向上にも有用である。また、リアルタイムＰＣＲにおいて本実施形態のＰＣＲプローブを用いることにより、チオシアン分解細菌の定量は、より汎用性に優れ、より迅速且つ精度良く実施でき、より生物処理方法における処理水質の向上に寄与し得る。特に、このようなプライマー及びＰＣＲプローブは、チオシアン分解細菌のうち、チオバチルス属細菌、特にはチオバチルス  チオパルス（Thiobacillus thioparus）を定量するのに有用である。
【００３５】
なお、配列番号１〜３に記載の塩基配列のいずれか１種を有するＦＩＳＨプローブは、ＦＩＳＨ法用のプローブとしてＦＩＳＨ（Fluorescence in situ Hybridization）法に用いることができる。斯かるＦＩＳＨ法においては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）やＴＡＭＲＡなどの蛍光色素で標識した、配列番号１〜３に記載の塩基配列のいずれかを有する少なくとも１種のＦＩＳＨプローブを用い、斯かるＦＩＳＨプローブをｓｃｎＣ遺伝子（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）の特定部位でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズさせたものを蛍光顕微鏡、又はフローサイトメトリー等で検出することができる。斯かるＦＩＳＨ法を利用して、チオシアン分解細菌の検出又は定量を実施することができる。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
以下に、チオシアン分解細菌用ＰＣＲプライマー及びプローブの設計、設計したプライマーを用いてのリアルタイムＰＣＲ条件の検討、及び、チオシアン分解細菌の定量について説明する。
【００３８】
１）チオシアン分解細菌用ＰＣＲプライマー及びＰＣＲプローブの設計
データベース（http://www.ncbi.nml.gov/）に登録されているチオシアン分解酵素であるthiocyanate hydrolase（チオシアン加水分解酵素）をコードする遺伝子（ｓｃｎＣ）を基に、プライマー及びプローブ設計用のソフトウェアを利用して、表１に示すリアルタイムＰＣＲ用のプライマー及びプローブを設計した。そして、設計したプライマー及びプローブをＤＮＡ合成機によって合成した。
【００３９】
【表１】
2010187576.tif 000003
【００４０】
続いて、チオシアン分解細菌のｓｃｎＣ遺伝子のクローニングとシーケンスを行った。
コークス排水処理設備の生物処理槽から活性汚泥を採取し、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（Qbiogene社製）を用いＤＮＡを精製した。
なお、このＤＮＡの精製は、製造業者の推奨する方法に従って実施した。
【００４１】
この精製したＤＮＡを鋳型として、フォアワードプライマーとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｆ（配列番号１：５’−ＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴ−３’）、リバースプライマーとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｒ（配列番号２：５’−ＴＣＣＡＣＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＣＴＴ−３’）のプライマーセット（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）、及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を含む反応液を用いてチオシアン分解細菌のｓｃｎＣ遺伝子を増幅した。
なお、アガロースゲル電気泳動によって、約５０ｂｐのＰＣＲ産物が増幅していることを確認した。
【００４２】
この増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて精製後、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製）を用い、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、大腸菌を形質転換した。
なお、増幅産物の精製ならびにクローニングの方法は、各製造業者の推奨する方法に従って実施した。
【００４３】
得られた形質転換体を任意に１２個選択し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社製）を用いて組み換えプラスミドを精製した。
このプラスミドを鋳型にしてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列を決定した。
なお、この組み換えプラスミドの精製ならびにＤＮＡ配列の決定については、各製造業者の推奨する方法に従って実施した。
【００４４】
上記の１２個の形質転換体から精製したプラスミドのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列と、既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性検索（http://www.ncbi.nml.gov/）を行ったところ、ＰＣＲ増幅産物が既知のｓｃｎＣ遺伝子と相同性が高いことが確認された。また、１２個のクローン全てが目的とするｓｃｎＣ遺伝子であり（表２）、ｓｃｎＣＴｔ１Ｆ／ｓｃｎＣＴｔ１Ｒプライマーセットによって目的とする遺伝子を増幅できることが示された。
これらの１２個のクローンの中から、Thiobacillus thioparusのｓｃｎＣ遺伝子と１００％の相同性を示すクローン（表２のＮｏ．４）を選択し、これをリアルタイムＰＣＲ用のスタンダードとして使用した。
【００４５】
【表２】
2010187576.tif 000004
【００４６】
２）リアルタイムＰＣＲ条件の検討
上記１）で精製したＤＮＡを鋳型にして、フォアワードプライマーとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｆ（配列番号１：５’−ＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴ−３’）（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）、リバースプライマーとして上記ｓｃｎＣＴｔ１Ｒ（配列番号２：５’−ＴＣＣＡＣＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＣＴＴ−３’）（参考データベース：http://www.ncbi.nml.gov/）、ＴａｑＭａｎプローブとしてｓｃｎＣＴｔ１Ｔａｑ（配列番号３：５’−ＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣ−３’  ５’サイトをＦＡＭ、３’サイトをＴＡＭＲＡで標識したもの）、および、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を含む反応液を用いて、ＰＣＲの条件検討を行った。
【００４７】
ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行なった。
その結果、表３に示す条件で効率よくＰＣＲを行うことができた。
【００４８】
【表３】
2010187576.tif 000005
【００４９】
表３に示す条件でＰＣＲを行った時の増幅曲線を図１に示す。４５サイクルの反応を行っても陰性対象の増幅は認められず、特異的な増幅だけが見られた。
また、図２に１．２８×１０1、６．４×１０1，３．２×１０2，１．６×１０3，８．０×１０3および４．０×１０4 ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎのスタンダードサンプルを用いて作成した検量線を示す。Ｒ2値は０．９９８８、スロープは−３．３４、増幅効率は９９．３％となり、良好な結果が得られた。
【００５０】
３）チオシアン分解細菌の存在数量の定量
コークス排水処理設備から活性汚泥を採取し、上記１）と同様の方法で活性汚泥からＤＮＡを精製した。このＤＮＡを鋳型にして表３に示す条件でリアルタイムＰＣＲを行い、チオシアン分解細菌の存在数量を求めた。
【００５１】
検量線作成用のスタンダードサンプルは、上記１）にてクローニングしたｓｃｎＣ遺伝子を用いた。
検量線の作成には１．２８×１０1、６．４×１０1、３．２×１０2、１．６×１０3、８．０×１０3、および４．０×１０4  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎのスタンダードサンプルを用いた。
表４にコークス排水処理設備の活性汚泥に存在する、Thiobacillus thioparus（チオシアン分解細菌）数、すなわちｓｃｎＣ遺伝子のコピー数をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示す。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
その結果、コークス排水処理設備の活性汚泥には１ｍｌあたり１．４２×１０7〜６．６４×１０7コピーのｓｃｎＣ遺伝子が存在することがわかった。
【００５４】
上記のことからも、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー、これらプライマーを用いるプライマーセット、配列番号３に示す塩基配列を有するＰＣＲプローブがチオシアン分解細菌の検出や定量に好適であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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