(57)【要約】      （修正有）【課題】成熟ヒトＩＬ−１βを特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分の提供。【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列の抗体の軽鎖または重鎖、及び抗原結合部分をコードしているポリヌクレオチドを用いて、形質移入された宿主細胞から得られた単離抗体またはその抗原結合部分。これらの抗体またはその抗原結合部分、一般的に、本来の抗体と比べて高結合親和性(低ｋｏｆｆ値)、脱アミド化の低下を示し、多様な疾患、例えばリウマチ性関節炎、変形性関節症または神経炎症を処置するのに使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体は、軽鎖および重鎖を含み、
（ａ）該軽鎖が、
配列番号：１、１２、２２、２９、３１、３３、３７または３９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号：３、７、１３、１５、１７、２０、２５、３４または４１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、
（ｂ）該重鎖が、
配列番号：４または１０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号：５、８、１６、１８、２１、２３または２８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２配列および配列番号６、９、１１、１４、１９、２４、２６、２７、３０、３２、３５、３６、３８、４０または４２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、
そして、
（ｃ）該抗体は、配列番号：１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号：３の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号：４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：５の重鎖ＣＤＲ２および配列番号：６の重鎖ＣＤＲ３から構成されないものである、
ヒトＩＬ−１βを特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ヒト化抗体である請求項１記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
抗体が、
ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
配列番号：５６に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域および配列番号：６１に示されたポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域を含む、請求項３記載の抗体。
【請求項５】
配列番号：４７に示されるアミノ酸配列によってコードされている重鎖および配列番号：４８に示されるアミノ酸配列によってコードされている軽鎖を含む、請求項３記載の抗体。
【請求項６】
配列番号：６８に示されるアミノ酸配列によってコードされている重鎖および配列番号：４８に示されるアミノ酸配列によってコードされている軽鎖を含む、請求項３記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、
ａ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
配列番号：５５に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域および配列番号：６０に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域を含む、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
配列番号：４５に示されるアミノ酸配列によってコードされている重鎖および配列番号：４６に示されるアミノ酸配列によってコードされている軽鎖を含む、請求項７記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、
ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
配列番号：５７に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域および配列番号：６２に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号：４９に示されるアミノ酸配列によってコードされている重鎖および配列番号：５０に示されるアミノ酸配列によってコードされている軽鎖を含む、請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が、
ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
配列番号：５９に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域および配列番号：６３に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域を含む、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号：５１に示されるアミノ酸配列によってコードされている重鎖および配列番号：５２に示されるアミノ酸配列によってコードされている軽鎖を含む、請求項１３記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が、
ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
配列番号：５８に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域および配列番号：６４に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域を含む、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号：５３に示されるアミノ酸配列によってコードされている重鎖および配列番号：５４に示されるアミノ酸配列によってコードされている軽鎖を含む、請求項１６記載の抗体。
【請求項１９】
抗体がＩｇＧアイソタイプを有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
アイソタイプが、重鎖定常領域ＩｇＧ１およびＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項１９記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
アイソタイプが、配列番号：６５に示されるポリヌクレオチドによってコードされているＩｇＧ１である、請求項２０記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
アイソタイプが、配列番号：６６に示されるポリヌクレオチドによってコードされているＩｇＧ４である、請求項２０記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
抗体が、配列番号：６７に示されるポリヌクレオチドによってコードされている軽鎖κ鎖の定常領域を有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の軽鎖または重鎖をコードしているポリヌクレオチドを含む、単離核酸。
【請求項２５】
請求項２４記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２６】
宿主細胞が、請求項１〜２３のいずれかに記載のタンパク質を発現する、請求項２５の発現ベクターで安定に形質移入された宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞が、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＳＰ２/０骨髄腫細胞、ＮＳ０骨髄腫細胞、シリアン・ハムスター卵巣細胞および胚腎細胞からなる群から選択される、請求項２６記載の宿主細胞。
【請求項２８】
ＮＳ０骨髄腫細胞である、請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２３のいずれかに記載の有効量の抗体を対象に投与することを含む、リウマチ性関節炎または変形性関節症を処置する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれかに記載の有効量の抗体をそれらが必要な対象に投与することを含む、軟骨破壊を阻害する方法。
【請求項３２】
リウマチ性関節炎または変形性関節症罹患患者を処置するための医薬物製造のための、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項３３】
医薬物を必要とする対象において軟骨破壊を阻害するための該医薬物を製造するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項３４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の有効量の抗体を対象に投与することを含む、卒中または虚血、毒性刺激性または外傷性頭部損傷に関連のある神経炎症を処置する方法。
【請求項３５】
卒中または虚血、毒性刺激性、または外傷性頭部損傷に関連のある神経炎症に罹患した対象を処置するための医薬物の製造のための、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
インターロイキン-１β(ＩＬ−１β)は、前炎症性サイトカインである。ＩＬ−１βの過剰産生は、様々な疾患、例えば、リウマチ性関節炎および変形性関節症の病因に関連づけられてきた。ＩＬ−１βは、付着分子のアップレギュレーション、プロスタグランジおよびメタロプロテイナーゼの産生刺激、コラーゲンおよびプロテオグリカン合成の阻害、そして破骨細胞の骨再吸収の刺激によって、関節の炎症滑膜中へ細胞の移動が増加することが示されてきた。これらの特性のため、ＩＬ−１βは、関節炎において骨および軟骨破壊の第一次メディエーターの１つである。すなわち、ＩＬ−１βの活性を低下させる薬剤は、疾患、例えば関節炎について処置の可能性を示す。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１遺伝子ファミリーには３つのメンバーが存在する：ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１rａ）。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、ＩＬ−１受容体のアゴニストであるが、ＩＬ−１raは特異的受容体アンタゴニスト、すなわち内生的なＩＬ−１拮抗阻害剤である。臨床試験中の患者に組換え体ＩＬ−１raを投与すると、プラセボと比べて重篤なリウマチ性関節炎に罹患した患者において顕著な臨床的改善がもたらされた。さらに、ＩＬ−１raの投与により、進行性関節損傷の速度が低下した。しかし、不十分な薬物動力学的特性および投与しなければならない高用量により、組換え体ＩＬ−１raはあまり理想的でない治療剤となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＩＬ−１βについての高親和性中和抗体は、優れた治療剤となるであろう。高親和性結合により結合した一般的な長期排除半減期の抗体は、組換え体ＩＬ−１raと比べて、用量および頻度の低下を伴う治療法を生み出す。多くのＩＬ−１β抗体は記載されてきたが、高親和性、高特異性および強力な中和活性を持つモノクローナル抗体を同定することは非常に困難であった。
【０００４】
本発明は、ヒトＩＬ−１βに特異的なネズミ抗体Ｍｕ００７(参照ＰＣＴ／ＵＳ０２／２１２８１)から誘導されるヒト化ＩＬ−１β抗体を包含する。これらの抗体は、強力なＩＬ−１β中和活性を持つ改善された安定性を有する高親和性抗体であり、またＩＬ−１βに対する特異性が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要約
本発明は、抗体が軽鎖および重鎖を含んでおり、
該軽鎖が、配列番号：１、１２、２２、２９、３１、３３、３７または３９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号：３、７、１３、１５、１７、２０、２５、３４または４１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３；をさらに含み、
該重鎖が、配列番号：４または１０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：５、８、１６、１８、２１、２３または２８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２配列;および配列番号：６、９、１１、１４、１９、２４、２６、２７、３０、３２、３５、３６、３８、４０または４２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；をさらに含み、
該抗体は、配列番号：１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号：３の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号：４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：５の重鎖ＣＤＲ２および配列番号：６の重鎖ＣＤＲ３から構成されるものではない、
ヒトＩＬ−１βに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分を包含する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、１ｘ１０-１１Ｍあるいはそれ以下のＫｄにて成熟ヒトＩＬ−１βを結合し、１ｘ１０-３s-１またはそれ以下の表面プラズモン共鳴(HBS-EP緩衝液、２５℃でｐＨ７.４）によって決定されるｋｏｆｆ速度定数にて成熟ヒトＩＬ−１βから解離する、そして標準的なＴ１１６５.１７増殖アッセイにおいてヒトＩＬ−１β活性を中和する、抗体を包含する。
【０００７】
本発明は、さらに、抗体、好ましくはヒト化抗体、またはその抗原結合部分を提供し、ここで脱アミド化が重鎖相補性決定領域２(ＨＣＤＲ２；配列番号：４４)の位置５５で除かれて、改良された安定性を生じる。
【０００８】
本発明は、ヒト起源および３つのＣＤＲの軽鎖可変性フレームワークならびにヒト起源および配列番号：５５-６４に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲの重鎖可変性フレームワークを含んでいるヒト化抗体を包含する。
【０００９】
さらに、本発明は、ヒト起源および３つのＣＤＲの軽鎖可変性フレームワークならびにヒト起源で配列番号：４８-５４および６８に対応するアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを有する重鎖可変性フレームワークを含んでいるヒト化抗体を包含する。
【００１０】
本発明は、本明細書中および請求項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を包含する。本発明は、本明細書および請求項に記載の抗体を発現するこれらのポリヌクレオチドによって形質移入される宿主細胞を包含する。
【００１１】
本発明は、本明細書中で説明され、請求項に記載の有効量の抗体を対象に投与することを含むリウマチ性関節炎および変形性関節症を処置する方法、さらに関節炎をおこしやすいか、または関節炎に罹患している対象において生じる軟骨の破壊を阻害する方法も含む。
【００１２】
本発明は、本明細書中の記載および請求項に記載の有効量の抗体を対象に投与することを含み、卒中および虚血、毒性刺激性ならびに外傷性頭部損傷に関連のある神経炎症性を処置するための方法をさらに含む。
【００１３】
本発明は、さらに、リウマチ性関節炎または変形性関節症の罹患患者を処置するため、またはその処置が必要な対象の軟骨破壊を阻害するための医薬物の製造のための抗体の使用を含む。
【００１４】
最終的には、本発明は、さらに、卒中および虚血、毒性刺激性、または外傷性頭部損傷に関連のある神経炎症に罹患した対象を処置するための医薬物の製造のための抗体の使用を含む。
【本発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明は、Ｍｕ００７抗体（配列番号１-６)の相補性決定領域(ＣＤＲ)を実質的に含むが、該ポリペプチド構造が１以上のそのＣＤＲにおいて１以上のアミノ酸の違いを含んでいる、単離されたヒト抗体、またはその抗原結合部分を含む。フレームワークおよびこれらの抗体の他の部分は、ヒト生殖細胞系から生じ得る。Ｍｕ００７のヒト化バージョンは、高親和性、ゆっくりとしたオフ・レート（off rate）にてヒトＩＬ−１βに結合し、高い中和能を有する。本発明の多様な態様は、抗体および抗体フラグメント、ならびにそれらの医薬組成物、さらに核酸、かかる抗体およびフラグメントを作製するための組換え体発現ベクターおよび宿主細胞に関する。ヒトＩＬ−１β活性を阻害する本発明の抗体を使用する方法が、本発明に含まれる。
【００１６】
本発明がより理解され易いように、必要な用語をまず定義する。
本明細書中で使用される「抗体」なる用語は、ジスルフィド結合によって内部結合された２つの重鎖(Ｈ)および２つの軽鎖(Ｌ)の４つのポリペプチド鎖を含むイムノグロブリン分子を示すと意図される。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される)および重鎖定常領域を含む。該重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される)および軽鎖定常領域を含む。該軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。該ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変性の領域に細分され、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれるさらに保存性が高い領域に点在される。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでなり、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００１７】
軽鎖はκおよびλに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、抗体アイソタイプはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと各々定義される。軽鎖および重鎖内で、該可変性および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も包含する重鎖と結合される。
【００１８】
ＩｇＧ抗体は、血清中に最も豊富なイムノグロブリンである。また、ＩｇＧは、全てのイムノグロブリンの中での血清の最長半減期（the longest half-life）を有する。他のイムノグロブリンとは異なって、ＩｇＧはＦｃＲｎと結合した後に有効に循環される。４つのＩｇＧサブクラス、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４があり、各サブクラスは、違ったエフェクター機能を有する。Ｇ１、Ｇ２およびＧ３は、Ｃ１ｑに結合して補体を固定し得るが、Ｇ４はできない。Ｇ３は、Ｇ１以上に高効力でＣ１ｑを結合できるが、Ｇ１は補体に関する細胞分解を媒介することで効力が高い。Ｇ２は、非常に非効率的に補体を固定する。ＩｇＧ中のＣ１ｑ結合部位は、ＣＨ２ドメインのカルボキシ末端領域に位置する。
【００１９】
全てのＩｇＧサブクラスは、Ｇ２およびＧ４以上に有効であるＧ１およびＧ３を有するＦc受容体(ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４)に結合し得る。ＩｇＧのＦc受容体結合領域は、ＣＨ２ドメインのヒンジ（hinge）およびカルボキシ末端領域の両方に位置する残基によって形成される。
【００２０】
本明細書中で使用される抗体の「抗原結合部分」(または、単に「抗体部分」)なる用語は、抗原(例えば、ヒトＩＬ−１β)に特異的に結合する能力を保持する１以上の抗体のフラグメントを意味する。抗体の抗原-結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって行われる得ることが示されてきた。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆabフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦabフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦvフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al.,(1989) Nature 341：544-546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆvフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別の遺伝子によってコードされるが、組換え体方法を用いてそれらは１本のタンパク質鎖として作製され得る合成リンカーにより結合され得るし、このＶＬおよびＶＨ領域は対をなして一価分子を形成する(一本鎖Ｆv(ｓｃＦｖ)として知られている；例えば、Bird et al.(1988) Science 242：423-426: and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。このような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」なる用語のなかに含まれると意図される。一本鎖抗体の他の形態には、例えばダイアボディー（diabodies）も含まれる。ダイアボディーは、２価の多重特異性抗体であり、このなかでＶＨおよびＶＬドメインは、１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、短すぎるために同じ鎖上で２つのドメイン間の対を作ることができないリンカーを用いて、このドメインを別の鎖の相補的ドメインと対をなすように、２つの抗原結合部位を構築する(参照、例えばHolliger, P.,et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448; Poljak,R. J., et al. (1994)  Structure 2：1121-1123)。
【００２１】
またさらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と、１以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有電子対または非共有電子対の会合によって形成されるより大きな免疫付着分子の一部であり得る。かかる免疫付着分子の例には、四量体のscＦv分子を形成するためにストレプトアビジンのコア領域の使用 (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)、二価のおよびビオチン化scＦv分子を形成するためにシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジン・タグの使用が包含される(Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31：1047-1058)。抗体部分、例えば、ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)２フラグメントは、従来技術、例えば全ての抗体のそれぞれに、パパインまたはペプシン消化を用いて、全ての抗体から製造される。さらに、抗体、抗体部分および免疫付着分子は、本明細書に記載の標準的な組換え体ＤＮＡ技術を用いて得られうる。
【００２２】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体生殖細胞系から誘導された部分的または完全なアミノ酸配列または再配置された配列を含み、非ヒト相補性決定領域(ＣＤＲ)を有する抗体の配列を変化させることによって作製される抗体を意味する。可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域に置換される。本明細書中に記載したように、ヒト化抗体範囲にある抗体は、完全長抗体に限定するものではなく、フラグメントおよび一本鎖形態も包含し得る。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「組換え体ヒト抗体」は、組換え手段によって、調製され、発現され、構築されるかまたは単離される全てのヒト抗体を包含すると意図され、これには、例えば、宿主細胞中で形質移入された組換え体発現ベクターを用いて発現された抗体、組換え体、コンビナトリアル・ヒト・抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト・イムノグロブリン遺伝子について遺伝子導入された動物（例えば、マウス)から単離された抗体（例えば、Taylor、L. D., et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20：6287-6295を参照されたい）、または他のＤＮＡ配列にヒト・イムノグロブリン遺伝子配列をスプライシングすることを包含するあらゆる他の手段によって調製され、発現され、構築されるかまたは単離される抗体、を包含すると意図される。かかる組換え体ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系イムノグロブリン配列から誘導された可変および定常領域を有する。しかし、ある実施態様において、このような組換え体ヒト抗体は、イン・ビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対する遺伝子導入動物を用いる場合には、イン・ビボ体細胞突然変異誘発)に供される、すなわち組換え体抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列から誘導され、関係づけられるが、イン・ビボでのヒト抗体生殖細胞系のレパートリーの範囲内では自然に存在し得ない配列である。
【００２４】
本明細書中で使用されるような「単離抗体」は、様々な抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すと意図される（例えば、ヒトＩＬ−１βを特異的に結合する単離抗体は、ヒトＩＬ−１β以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、ヒトＩＬ−１βと特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他種からのＩＬ−１β分子に対して交差反応性を持つ。さらに、単離抗体は、他細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。
【００２５】
本明細書中で使用されるような「中和抗体」(または「ヒトＩＬ−１β活性を中和する抗体」)は、ヒトＩＬ−１βの生物学的活性の阻害を生じるヒトＩＬ−１βに結合する抗体を示すと意図される。Ｔ１１６５.１７細胞バイオアッセイまたはヒトＩＬ−１β中和プロトコールのいずれかを用いて決定されたように、ＩＬ−１βに関する１以上のインジケーターの生物学的活性を測定することにより、ヒトＩＬ−１βの生物学的活性の阻害を評価することができる。
【００２６】
成熟ヒトＩＬ−１βを「特異的に結合する」抗体は、当業者には既知のヒトＩＬ−１βの成熟形態を結合するが、成熟ヒトＩＬ−１αとは結合しない上記に定義したような抗体を包含する。成熟ヒトＩＬ−１βを特異的に結合する抗体は、他種由来の成熟ＩＬ−１βといくつかの交差反応性を示し得る。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出すること、例えばBIAcore system (Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、Sweden and Piscataway、N.J.)を用いることによって、リアルタイムでの生物特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象を示す。さらなる記載については、実施例１およびJonsson,U.,et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51：19-26; Jonsson,U.,et al. (1991) Biotechniques 11：620-627; Johnsson,B.,et al.(1995) J. Mol. Recognit. 8：125-131; and Johnnson,B.,et al. (1991) Anal. Biochem. 198：268-277を参照されたい。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「ｋｏｎ」は、単位：Ｍ−１sec-１で測定された、結合または結合反応速度定数、またはフォワード特異的反応速度、または複合体形成反応を示すと意図される。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「ｋｏｆｆ」は、単位：sec-１で測定された、解離または解離反応速度定数、または抗体/抗原複合体から抗体の解離に対する特異的反応速度を示すと意図される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「Ｋｄ」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離定数を示すと意図される。次の式によって計算される：
ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝Ｋｄ
【００３１】
本発明の抗体は、低いｋｏｆｆ値を一般的に示す強効力抗体である。本明細書の目的のために、用語「強効力」は、低いＩＣ５０(または下記にバイオアッセイにおいて３Ｈチミジン取込み量が５０％の低下を示す有効濃度)によって表される効力を示す。本発明の抗体は、中和化(標的種、例えばＩＬ−１βの破壊を引き起こす)し得る。１つの用途については中和化しない抗体が、異なる用途については中和化することもある。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を包含すると意図される。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００３３】
ヒトＩＬ−１βに結合する抗体または抗体部分(例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３)をコードしている核酸に関して、本明細書中で使用される用語「単離された核酸分子」は、抗体または抗体部分をコードしているヌクレオチド配列がヒトＩＬ−１β以外の抗原を結合する抗体または抗体部分をコードしている他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列がヒトゲノムＤＮＡ中の核酸を本来フランキングし得る、核酸分子を示すと意図される。すなわち、例えば、抗ヒトＩＬ−１β抗体のＶＨ領域をコードしている本発明の単離された核酸は、ヒトＩＬ−１β以外の抗原と結合する別のＶＨ領域をコードしているその他の配列を全く含有しない。
【００３４】
用語「脱アミドされた、または脱アミド化」は、タンパク質/ペプチド中のＡｓｎまたはＧｌｎ残基の分解を示す(Robinson,et al.(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12409-12413)。例えば、アスパラギン脱アミド化に対する分子内経路は、アスパルチルおよびイソアスパルチル残基の混合物中で生じる中間体スクシンイミドの形成を介するものである(Harris,et al.(2001) J. of Chromatography 752：233-245)。脱アミド化は、タンパク質の安定性の低下および／あるいは活性の低下または損失に導き得る。脱アミド化は、処方された治療薬調製中に、エクス・ビボで生じ得るし、それが医薬剤の製造および貯蔵中に悪影響を起こし得る。さらに、脱アミド化は、イン・ビボでも生じ、抗体効力および効果の耐容に影響し得る。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「ベクター」は、結合している他の核酸を送達し得る核酸分子を示すと意図される。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であって、別のＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状の二重鎖ＤＮＡループを指すものである。ベクターの他のタイプは、別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートし得るウイルスベクターである。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「組換え体宿主細胞」（または単に「宿主細胞」)は、組換え体発現ベクターが導入される細胞を示すと意図される。
【００３７】
Ｍｕ００７重鎖のＣＤＲ２領域中の脱アミド化部位が、このＣＤＲ２領域を含有するヒト化抗体の生物学的特性に影響を与えることがわかった（米国仮特許出願６０/３６１４２３を参照されたい)。脱アミド化を遅くさせるか排除するヒト化抗体のアナログは、改善された安定性を有する抗体を生じる。すなわち、本発明は、脱アミド化が部位特異性変化によって重鎖相補性決定領域２(ＨＣＤＲ２)のＡsn５５位置で除かれる抗体を包含する。
【００３８】
本発明の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、通常、改善された親和性(低いＫｄ値)を示し、結合特異性を有し、そして脱アミド化がＨＣＤＲ２のＡsn５５位置で除かれているＭｕ００７について観察された効力と同様の効力を有する。本発明の抗体を明確にする特性は、抗体の可変領域、より具体的には抗体のＣＤＲ領域に主に存在する。
【００３９】
他の種由来のヒト化抗体の主な刺激は、治療用としてヒト患者に注射した場合、抗体が免疫応答を引き起こす可能性を低下させることである。ヒト化抗体で用いられるヒト配列が多ければ多いほど、免疫原性のリスクが低くなる。さらに、注射されたヒト化抗体は、一般的に、注射された非ヒト抗体よりも、循環中により長い半減期を有する。さらに、エフェクター機能が望まれるなら、該エフェクター部分がヒトであるため、ヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用し得る。抗体の生物学的特性に大きく影響しない好ましい重鎖および軽鎖領域として、本明細書中に記載の配列に変化させ得る。これは、ＩＬ−１βに結合するＣＤＲの能力に影響しない抗体の定常領域および可変領域の一部に対して、特に真実である。
【００４０】
さらに、本明細書に記載したように、ヒトフレームワーク可変領域およびそれらの変異体が本発明に使用される。しかし、選択されたフレームワークに関わらず、免疫原性のリスク低下を焦点とすると、選択されたヒトフレームワークと比較した変化の数は、最小であるべきである。
【００４１】
重鎖および軽鎖可変領域のフレームワークの残基は、同じかまたは異なるヒト化抗体配列から誘導され得る。該ヒト化抗体配列は、天然のヒト抗体の配列であり得るか、またはいくつかのヒト化抗体のコンセンサス配列であり得る。本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域に対する好ましいヒトフレームワーク配列は、ＶＨセグメントＤＰ-５（Tomlinson,et al. (1992) J. Mol. Biol. 227：776-798）、およびＪセグメントＪＨ４、ＪＨ１またはＪＨ５(Ravetch,et al.(1981) Cell 27：583-591）を包含する。ＶｋセグメントＬ１(Cox,et al. (1994)Eur. J. Immunol. 24：827-836)およびＪセグメントＪｋ４(Hieter,et al. (1982) J. Biol. Chem.10：1516-1522)は、ヒト化軽鎖可変領域についてフレームワークを提供する配列が好まれる。
【００４２】
本発明のヒト化抗体の好ましいヒト重鎖定常領域ポリヌクレオチド配列は、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ４定常領域を包含する:
tccaccaagggcccatcggtcttcccgctagcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggacgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga 
ＩｇＧ１ [配列番号：６５] 
ctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaat  
ＩｇＧ４ [配列番号：６６]。
【００４３】
本発明のヒト抗体の好ましいヒト軽鎖定常領域ポリヌクレオチド配列は、κ鎖定常領域である:
cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctaa  
[配列番号：６７]。
【００４４】
本発明の好ましい抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域[配列番号：６５]またはＩｇＧ４重鎖定常領域[配列番号：６６]およびκ軽鎖定常領域[配列番号：６７]を含有し、表２に明記されたクローン(すなわち、Ｗ１３、Ｗ１７など)によって表される。本発明の抗体Ｗ１３、Ｗ１７、Ｗ１８、Ｗ２０に対する可変領域ポリヌクレオチド配列は、次の配列を包含する：
Ｗ１３-重鎖
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgaccgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagttcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcatgtactatgattacgaccagggctttgactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagc  
[配列番号：５５]
Ｗ１３-軽鎖  
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgacctggtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcatccagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaaa 
[配列番号：６０]
Ｗ１７-重鎖  
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgaccgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagttcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcatgtactatgattacgaccagggctttgacctgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagc  
[配列番号：５６]
【００４５】
Ｗ１７-軽鎖  
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgagctggtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacggtttcggcggcggcaccaaggtggagatcaaa  
[配列番号：６１]
Ｗ１８-重鎖
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgaccgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcaccattaactacaatgagaagttcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcatgtactatgattacgaccagggctttgacaactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagc  
[配列番号：５７]
Ｗ１８-軽鎖
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgagctggtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaaa  
[配列番号：６２]
【００４６】
Ｗ２０-重鎖  
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgaccgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagttcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcatgtactatgattacgaccagggctttgactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagc 
[配列番号：５９]
Ｗ２０-軽鎖  
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgagctggtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaaa 
[配列番号：６３]
Ｕ４３-重鎖
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgaccgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagttcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcatgtactatgattacgaccagggctttagcctgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagc
[配列番号：５８]
Ｕ４３-軽鎖  
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaaggcgagtcaggacattgatcgcttcctgagctggtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaaa 
[配列番号：６４]
【００４７】
別の実施態様において、本発明の抗体の成熟アミノ酸配列、Ｗ１３、Ｗ１７、Ｗ１８、Ｗ２０およびＵ４３は、次の配列を包含する： 
Ｗ１３-重鎖
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVＨNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[配列番号：４５]
Ｗ１３-軽鎖  
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLTWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCIQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 
[配列番号：４６]
Ｗ１７-ＩｇＧ１ 重鎖  
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDLW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVＨNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[配列番号：４７]
【００４８】
Ｗ１７-ＩｇＧ４ 重鎖
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFDRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGDINYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMYYDYDQGFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVＨTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVＨNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 
[配列番号：６８]
Ｗ１７-軽鎖   
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYGFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[配列番号：４８]
Ｗ１８-重鎖
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGTINY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDNW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVＨNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 
[配列番号：４９]
Ｗ１８-軽鎖  
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGE 
[配列番号：５０]
【００４９】
Ｗ２０-重鎖
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVＨNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[配列番号：５１]
Ｗ２０-軽鎖  
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 
[配列番号：５２]
Ｕ４３-重鎖
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFSLW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVＨNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[配列番号：５３]
Ｕ４３-軽鎖
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC  
[配列番号：５４]
【００５０】
本発明は、１以上の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３、または重鎖ＣＤＲ１、抗体 Ｍｕ００７の[配列番号１-４]を利用する抗体またはその抗原結合部分を包含する。本発明に含められるＣＤＲは、特異的ＩＬ−１βエピトープに抗体を結合するために多数の接触残基を提供するＭｕ００７抗体の超可変領域である。すなわち、本明細書に記載のＣＤＲは、完全長抗体だけでなく、ＣＤＲに結合した場合に、ＣＤＲを使用してタンパク質の結合親和性が成熟ＩＬ−１βに特異的であるように、ＣＤＲを活性な構造に維持する、機能的フラグメントおよびアナログまたは他のタンパク質を作成するために使用し得る。
【００５１】
Ｍｕ００７抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴(BIAcore（登録商標）)[実施例１を参照されたい]を用いて決定された。これらの実験では、抗体は、BIAcore（登録商標）チップ上でタンパク質Ａまたは抗Ｆc抗体のいずれかによって低密度で捕捉され、リガンドは流された。チップの表面上の蓄積物を測定した。この分析方法は、結合に対する親和性(Ｋｄ）を得るために結合反応速度と解離反応速度の両方を、リアルタイムで分析を可能にする。Ｍｕ００７抗体は、６.２pＭ(ピコモル)のＫｄを有する。本発明の好ましいヒト化抗体、すなわち、Ｗ１３、Ｗ１７、Ｗ１８、Ｗ２０およびＵ４３は、各々２.８pＭ、２.８pＭ、４.２pＭ、２.７pＭおよび４.７pＭのＫｄ'sを示した（実施例１、表３を参照されたい)。
【００５２】
また、本発明の抗体または抗原結合部分は、ＩＬ−１βに特異的に結合するが、ＩＬ−１ファミリーの別のメンバーまたは同じ種内で構造的に関連のあるタンパク質に結合しないことが好ましい。
【００５３】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＩＬ−１βの生物学的活性を中和させることが好ましい。２つの異なるアッセイは、Ｍｕ００７の能力を試験するために利用され、ＩＬ−１β活性を中和するために本発明の抗体が好まれる［実施例２および３を参照されたい]。
【００５４】
増殖のためにＩＬ−１βの低いレベルを必要とするネズミ細胞系、Ｔ１１６５.１７を、最初のアッセイで使用した。ヒトＩＬ−１βは、培地中に一定レベルで存在しており、各抗体の連続希釈物を添加した。増殖阻害は、ＩＬ−１受容体のＩＬ−１β活性化を遮断する抗体の能力の測定値を提供した。抗体の様々な濃度についての増殖測定は、各々Ｍｕ００７に対して２０.６pＭおよびＷ１３に対して１.２pＭ、Ｗ１７に対して１.８pＭ、Ｗ１８に対して２.０pＭおよびＵ４３に対して４.０pＭの平均ＩＣ５０値を示した(実施例２、表４を参照されたい)。
【００５５】
本発明の抗体またはその抗原結合部分はＭｕ００７の値よりも低いＩＣ５０値を有することが好ましい。本明細書で示したような「ＩＣ５０」は、ヒトＩＬ−１βの活性を阻害する抗体の効力に関する測定値である。ＩＣ５０は、単回用量試験において５０％ＩＬ−１β阻害を生じる抗体の濃度である。ＩＣ５０は、ヒトＩＬ−１β活性の阻害を検出するあらゆるアッセイによって測定され得る。しかし、得られたＩＣ５０値は、使用されるアッセイによって変化し得る。同じアッセイを用いる試験の間でいくらかの変動もあり得る。例えば、本明細書中に記載の細胞に依存するＩＬ−１βの条件は、得られるＩＣ５０値に対して影響がある。すなわち、本発明の目的についての臨界的な値は、１回の試験において、Ｍｕ００７または本発明の好ましい抗体を用いて得られたものと比べた値である。
【００５６】
利用された二番目のアッセイは、ＩＬ−６中和アッセイである。Ｍｕ００７または本発明の好ましい抗体のいずれも、イン・ビボ中和活性を試験するためのマウスモデルを使用することが困難となるマウスＩＬ−１βと交差反応をしない。しかし、ＩＬ−１βの前炎症性活性の１つの結果は、ＩＬ−６、ＩＬ−１βのいくつかの局所的でない影響を媒介する他の前炎症性のサイトカインの誘導である。ヒトＩＬ−１βは、マウスＩＬ−１β受容体と結合し、刺激し、マウスＩＬ−６を増強させ得る。こうして、中和活性を有する抗体は、ヒトＩＬ−１βの用量を与えるマウスにおけるＩＬ−６の誘導を遮断する。Ｍｕ００７および本発明の抗体の両方は、炎症性刺激のネズミモデルにおいてヒトＩＬ−１βの強力な中和を示した(実施例３を参照されたい)。
【００５７】
本発明は、発現された時に、ヒトＩＬ−１βに特異的に結合する抗体をコードする組換え体ＤＮＡに関するものである。好ましくは、ＤＮＡは、発現した時に、１以上のＭｕ００７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ[配列番号１-６]および１以上の本発明の重鎖および軽鎖ＣＤＲ[配列番号７-４２]を含む抗体をコードする。本発明の好ましい抗体の重鎖可変領域を含むポリペプチド鎖をコードする例示的なＤＮＡ配列は、発現した時に、配列番号５５-５９として示される。発現した時に、本発明の好ましい抗体の軽鎖可変領域を含むポリペプチド鎖をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号６０-６４として示される。
【００５８】
本発明の中和抗体は、適切なヌクレオチド配列を再配置すること、そして適切な細胞系でこれらを発現することによって、適切な抗体遺伝子配列、すなわちアミノ酸配列を生成することで達成される。あらゆる所望のヌクレオチド配列は、コドンベースの突然変異誘発法を用いて、例えば米国特許番号５２６４５６３および５５２３３８８に記載したとおりに生成され得る。かかる方法により、オリゴヌクレオチド内の所望の全てのコドン位置でアミノ酸残基の任意のおよび全ての頻度の製造できる。これは、所望の位置での２０個のあらゆるアミノ酸の完全なランダム置換を包含し得る。一方、この方法は、アミノ酸鎖内の所望の位置で、例えば、本発明の新規ＣＤＲ配列で特定のアミノ酸を達成するように行われ得る。要するに、所望のあらゆるアミノ酸配列を発現する適切なヌクレオチド配列は、容易に達成され、このような方法を用いて、本発明の新規なＣＤＲ配列を複製し得る。これは、ポリペプチド、例えば抗体を、あらゆる所望のアミノ酸配列によって合成する能力を生み出す。例えば、現在、選択の抗体のあらゆる所望のドメインのアミノ酸配列を決定でき、所望により、置換されたアナログの範囲を与えるように他の所望のアミノ酸に置換された１以上のアミノ酸を有する相同鎖を製造することも可能である。
【００５９】
このような方法は全ての起こり得るアミノ酸配列のマスターセットを提供し、抗体構造としての最適機能について、または他の目的のためにこれらをスクリーンするために使用され得るが、かかる方法を適用する際に、遺伝子コードの縮重により、ランダムオリゴヌクレオチド合成および部分的縮重オリゴヌクレオチド合成のような方法が、特定の位置での特定のアミノ酸残基を指定するコドンについての重複を組み込むと認識されるべきである。かかる方法は、Cwirla et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 87：6378-6382 (1990) and Devlin et al., Science 249：404-406 (1990) に記載されている。一方、このような抗体配列は、化学的に合成され得るか、または当業者には既知の他の方法で生成され得る。
【００６０】
本明細書中に開示された本発明に従って、増強された強効力の抗体は、１つのポリペプチド構造中に、本明細書中で開示された１以上の新規ＣＤＲ配列を組み合わせることによって、増強された高効力または生物学的活性、脱アミド化の低下を独立して生じることが示される。この様式において、いくつかの新規アミノ酸配列は、１つの抗体中、同じまたは異なるＣＤＲに組合され、所望の生物学的活性レベルを有する抗体を産生する。このような所望のレベルは、ｋｏｆｆ値が、好ましくは１０-３s-１以下、より好ましくは５x１０-４ s-１以下、そしてより好ましくは１x１０-４ s-１以下であるような抗体を産生することから得られることが多い。非限定的な例として、３６個の、例えば新規ＣＤＲ配列［配列番号７-４２］を用いることができ、得られる抗体は、特定の抗原構造、例えばヒトＩＬ−１βに対する高親和性を示す場合、本明細書中に記載のＴ１１６５.１７細胞バイオアッセイまたはヒトＩＬ−１β中和プロトコールのいずれかを用いて、得られる抗体の効力または生物学的活性をスクリーニングした。すなわち、総合的な結果は、種々の１つのアミノ酸置換と、段階的方法において抗原親和性および効力について得られる抗体のスクリーニングを組合せ、それによって、親和性に対して、望ましくは高いか、少なくとも最小値の犠牲なく効力が増加する反復方法であることを保証する。この反復方法は、高い親和性(ＷＯ０１/６４７５１およびＵＳ２００２/００９８１８９を参照されたい)を有する抗体についての探索に制限されるように、段階的方法において２つのおよび３つのアミノ酸置換を生成するために使用され得る。結果的に、Ｍｕ００７ 抗体の各ＣＤＲ領域のアミノ酸は、系統的に置換され、得られる抗体は抗原親和性についてスクリーンされた。軽鎖ＣＤＲ２中のいずれかの位置でアミノ酸置換をしても、一般に、抗体親和性における増加が生じないことが認められた。すなわち、本発明の軽鎖ＣＤＲ２は、このＣＤＲにおけるアミノ酸置換により高い親和性の抗体を生じなかったため、Ｍｕ００７軽鎖ＣＤＲ２配列［配列番号：２]が好まれる。
【００６１】
逆に言えば、様々な抗体ドメインの配列内の全ての位置が、特定の位置においてあらゆる種類の置換が、有用か有害であり得ることにおいて一様ではないということを評価しなければならない。さらに、特定位置でのアミノ酸の特定の種類の置換は、親和性に関してプラスまたはマイナスであり得る。例えば、特定の位置で全ての起こりうる疎水性アミノ酸をためす必要はないであろう。どのような疎水性アミノ酸でも同様の働きをすると思われる。一方、特定の位置でのアミノ酸が酸性であるかまたは塩基性であるかは、測定された親和性において大きなゆれを提供し得る。
【００６２】
すでに記載したように、Ｋｄは、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ定数の比によって測定される。例えば、３.１x１０７(M-１s-１)のｋｏｎと０.９x１０-４(s-１)のｋｏｆｆとを組み合わせると、２.９x１０-１２MのＫｄとなる。すなわち、親和性は、ｋｏｎを増加させること、またはｋｏｆｆを低下させることによって改善され得る。従って、本発明の抗体のｋｏｆｆを低下させることによって、より効果的な治療剤を生じる得る。
【００６３】
本発明に従って、その抗原親和性にかかわらず、存在する抗体の増加される効力は、該抗体の１以上のＣＤＲ領域に存在する１以上のアミノ酸への選択的変化によって達成され、これによって該アミノ酸変化によって、該抗体についてｋｏｆｆを低下させる効果、好ましくは抗体親和性の増加効果を示す。親和性が同じままであるか、多少低下している場合であっても、低いｋｏｆｆ値で高い効果が達成され得る。このような抗体は、その中に導入されている変えられたＣＤＲセグメントを含有する必要とされるポリペプチド鎖をコードしている適切なヌクレオチド配列を有する適切に設計された細胞において、合成を介する所望のポリペプチド鎖の合成によって、最も有利に産生される。また、本発明に従って、所望の効力、または生物学的活性のレベルを有する新規抗体は、明細書中に記載の遺伝子的に設計された細胞を使って、該抗体ポリペプチド鎖のＣＤＲ領域内の選択された位置で選択されたアミノ酸の導入によって、デ・ノボでまたは必要なジスルフィド結合の二次的形成と所望のポリペプチド鎖の完全な化学合成を用いて、製造され得る。
【００６４】
前記に従って、本発明の抗体は、強効力のモノクローナル抗体である。しかし、かかる抗体は、それらは１つの細胞型のクローンから誘導され得る意味においてのみモノクローナルである。しかし、これは、それらを特定の起源に限定することを意味するものではない。かかる抗体は、一般に、抗体を産生しない細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯまたはＣＯＳ細胞において容易に産生され得る。さらに、かかる抗体は、細胞の他の型、特に哺乳類および植物細胞であっても、抗体産物を形成するポリペプチド軽鎖および重鎖を発現して、会合するような細胞を遺伝子的に構築することによって、産生され得る。さらに、かかる鎖は、化学的に合成され得るが、それらはある特定の抗原決定基に対して特異的であるので、この用語が使用される意図の範囲内で、なお「モノクローナル」抗体の性質を構成している。すなわち、本明細書中で使用されるような、「モノクローナル抗体」なる用語は、該抗体の産生について用いられる単なるメカニズムよりもむしろ、抗体分子の、特異性および純度をさらに意味することを意図する。
【００６５】
また、本明細書中で使用されるような、「効力」なる用語は、その意図される治療目的に利用される場合、かかる抗体の濃度について、抗体の効果に関する依存性を説明すると意図される。すなわち、効力は、ある特定の抗原に対する生物学的活性を意味する。非限定的には、この効力、または生物学的活性、または生物学的効果は、本明細書中に記載のＴ１１６５.１７細胞バイオアッセイまたはヒトＩＬ−１β中和プロトコールのいずれかによって、抗ＩＬ−１β抗体について測定される。逆に、抗原に対する抗体親和性は、ｋｏｎ対ｋｏｆｆの比の単なる数学的計測値である。さらに、本発明の方法に従って産生される抗体のＫｄは、通常１０-１２Ｍまたはそれ以下の範囲内である。
【００６６】
１つの実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、哺乳動物、好ましくはヒトの定常領域および可変領域を通常含み、該可変領域は、該重鎖および軽鎖フレームワーク領域および重鎖および軽鎖のＣＤＲを通常含み、ここで重鎖および軽鎖フレームワーク領域は、哺乳類抗体、好ましくはヒト抗体の特徴的な配列を有し、また該ＣＤＲ配列は、ヒト以外のいくつかの種、好ましくはマウス、の抗体の配列と類似する。Ｍｕ００７のＣＤＲ配列は表１に示される。
【表１】
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【００６７】
前記に従って、ヒトＩＬ−１βに対するヒト化抗体に関して本発明に従って開示された配列をよりよく説明するために、Ｍｕ００７の軽鎖および重鎖可変領域の基本または開始配列は、軽鎖可変領域配列番号：４３および重鎖可変領域配列番号：４４に示される。また、本発明に従って、組換え体細胞において発現する場合、これらの開始配列とは異なる特定のアミノ酸を、該アミノ酸配列を生成するために設計されたヌクレオチド配列を用いて開始する組換え方法によって生成した。該細胞の生成物は、該抗体がＣＤＲＬ１については配列番号：１、ＣＤＲＬ２については配列番号：２、ＣＤＲＬ３については配列番号：３、ＣＤＲ Ｈ１については配列番号：４、ＣＤＲ Ｈ２については配列番号：５、そしてＣＤＲ Ｈ３については配列番号：６の組合せ物を持たないものである、本発明のモノクローナル抗体である。
【００６８】
本発明の１つの実施態様において、少なくとも１０-３s-１、好ましくは少なくとも５x１０-４s-１、より好ましくは少なくとも１０-４s-１までｋｏｆｆ値を低下させることにより、少なくとも１０-１１ Ｍ、好ましくは少なくとも１０-１２ＭのＫｄを有するヒトＩＬ−１βに対する中和抗体Ｆabフラグメントを用いて、効力を増加させる。かかるＦabフラグメントのＣＤＲ内に存在する該アミノ酸は、表２に示される。
【００６９】
表２は、発明の抗体を用いたＣＤＲのアミノ酸配列を示す(全配列は標準アミノ酸の１文字表記)。表２において、表１の対応するＣＤＲ(すなわち、ＣＤＲの位置はアミノ酸において異なる)においてなされた重要なアミノ酸の置換位置は、太字と下線で示される。Ｆabフラグメントを、標準的ＥＬＩＳＡによって最初にスクリーニングした。Ｔ１１６５.１７細胞増殖アッセイによって測定されたＩＣ５０値は、野生型のコントロール(wt/Faｂ）と、作製された組換え体の比較として示された。Ｆab変異体、Ｆab変異体および本発明の次の（二次）抗体は、表２からのクローン設計によって作られた。
【００７０】
表２
抗体において強効力を誘導する傾向があるＣＤＲの配列
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【００７１】
特定の実施態様において、本発明は、Ｋｄが少なくとも１０-１１Ｍ、もっとも好ましくは少なくとも１０-１２Ｍであり、そしてｋｏｆｆが少なくとも約１０-３s-１、好ましくは少なくとも約５x１０-４s-１、もっとも好ましくは少なくとも１x１０-４s-１である単離抗体に関する(それら全ての組合せ物を包含する）。
【００７２】
１x１０-１１かそれ以下のＫｄにて成熟ヒトＩＬ−１βと結合する本発明の好ましい抗体は、１x１０-３s-１かそれ以下のｋoff速度定数を有し、またヒトＩＬ−１β活性を中和し、脱アミド化はＨＣＤＲ２の位置５５で除かれており、配列番号４５-５４からなる群から選択される。
【００７３】
１つの変異体のＣＤＲライブラリィーを特徴分析し、合成するための標準的アプローチを用いた（Wu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95：6037-6042 (1998）を参照されたい）。まずヌクレオチドをアニーリングする前に各ライブラリィーについて、標的ＣＤＲを削除した。ライブラリィーの合成に対して、参照抗体のＣＤＲを、表１に定義した（図１および２を参照されたい)。本発明のＣＤＲ配列を産生するためのオリゴヌクレオチド合成についてコドンベースの突然変異誘発を用いた。
【００７４】
ライブラリィーを、捕獲リフトによって最初にスクリーニングし、最も高い親和性変異体を同定した。捕獲リフト法(Watkins, Methods Mol. Biol. 178:187-193, (2002)）は、当業者には既知であり、ＷＯ/０１６４７５１およびＵＳ２００２/００９８１８９で説明されている。続いて、これらのクローンを、捕捉ＥＬＩＳＡ、そして固定化抗原上でのタイトレーションによって、さらに特徴分析した。このようなスクリーニングの後に、該抗体を、各々のｋｏｆｆ値についてスクリーニングして、この陽性効果を効力の決定によって測定した。
【００７５】
本明細書中に記載の抗体は、相補性決定領域Ｌ１(またはＬＣＤＲ１)、Ｌ３(またはＬＣＤＲ３)、Ｈ１(またはＨＣＤＲ１)、Ｈ２(ＨＣＤＲ２)およびＨ３(またはＨＣＤＲ３)においてＭｕ００７のものと異なるＣＤＲを含む。
【００７６】
参照クローンが図１および２(各々軽鎖および重鎖配列、配列番号４３および４４)に示した重鎖および軽鎖可変領域配列を有するクローンである場合、選択されたＦabフラグメントのＣＤＲは表２に示される(図３および４のフレームワーク配列を有する全てのもの)。
【００７７】
本発明に従って、かかるアミノ酸置換を組み合わせることによって、同じ抗体分子中で生じるものよりも高いので、本明細書中で開示された抗体の効力を大きく増加することが可能である。
【００７８】
一般的には、５つまで置換されたＣＤＲを含めて１以上の有益なＣＤＲを持つ比較的低いｋｏｆｆ変異体の全てに関して、抗体効力と低いｋｏｆｆには相関関係がある。
【００７９】
表２に開示されたＣＤＲ配列の組合せ物は、全四量体の抗体分子において、または活性フラグメント、例えば、Ｆabフラグメントに存在し得る。表２に示されたクローンに対する効力データは、Ｆabフラグメントに対するものであるが、一方、表４に示されたクローンに対する効力データは、参照抗体、Ｍｕ００７と比べた全抗体分子に対するものである。
【００８０】
本発明の抗体は、比較的純粋か単離された形態で存在するだけでなく、ウェルまたはプレートで増殖した細胞から取り出した上清中に存在し得る。すなわち、本発明の抗体も、本発明の抗体を含む組成物の形態で存在し、該抗体は、薬理学的に許容し得る希釈剤や補形剤に懸濁され得る。本発明の抗体は、疾患（例えば、リウマチ性関節炎および変形性関節症を予防すること）を処置または予防する際に、治療上または薬理学的価値が存在するために充分な濃度または量で、組成物中に存在し得る。該抗体は、さらに希釈した形態の組成物に存在し得る。
【００８１】
本発明の抗体をコードしているＤＮＡは、通常、さらに、本来のまたは異種のプロモーター領域を包含する抗体コード化配列に操作可能に結合される発現制御ポリヌクレオチド配列を包含する。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換もしくは形質移入し得るベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主についての制御配列も用いうる。一旦該ベクターが適切な宿主細胞系に組込まれると、該宿主細胞は、ヌクレオチド配列を発現するため、および所望により、軽鎖、重鎖、軽鎖/重鎖ダイマーまたは無傷の抗体、結合フラグメントまたは他のイムノグロブリン形態を収集および精製するために、適切な条件下で増殖される。
【００８２】
所望の抗体を最終的に発現し得る本発明の該核酸配列は、あらゆる多様な既知の技術を用いて、多様な異なるポリヌクレオチド(ゲノムまたはｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど)および成分(例えば、Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域)から形成され得る。適切なゲノムと合成配列を結合することは、製造に関する共通方法であるが、ｃＤＮＡ配列もまた利用され得る。
【００８３】
ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、多様なヒト細胞から、しかし好ましくは不死化Ｂ細胞から既知の方法に従って単離され得る。ポリヌクレオチド配列のための適当な供給源細胞およびイムノグロブリン発現および分泌のための宿主細胞は、当業者には既知の多くの供給源から得られうる。
【００８４】
本明細書に記載のように、本明細書に記載の特異的な抗体に加えて、他の「実質的に相同な」修飾抗体は、当業者には既知の様々な組換え体ＤＮＡ技術を用いて、容易に、設計および製造され易い。例えば、該フレームワーク領域は、いくつかのアミノ酸置換、末端および中間の付加および削除などにより、一次構造レベルで本来の配列から変更し得る。さらに、多様な異なるヒトフレームワーク領域は、本発明のヒト化イムノグロブリンに対する基準として１つ、または組合せて使用され得る。通常、遺伝子の修飾は、多様な既知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発によって容易に達成され得る。
【００８５】
一方、一次抗体構造の一部分のみを含むポリペプチドフラグメントが産生され得、このフラグメントは１以上のイムノグロブリン活性（例えば、補体結合活性）を保持する。これらのポリペプチドフラグメントは、当業者には既知の方法によって無傷抗体のタンパク質の解裂により、もしくは部位特異的突然変異誘発生成を用いて、ベクター中の所望の位置に、例えばＦabフラグメントを産生するＣＨ１の後かＦ(ａｂ’)２フラグメントを産生するヒンジ領域の後にストップコドンを挿入することにより産生され得る。一本鎖抗体は、ＶＬおよびＶＨを、ＤＮＡリンカーと結合することによって産生され得る。
【００８６】
先に開示したように、該ポリヌクレオチドは、該配列が発現制御配列に操作可能なように結合された後に宿主中で発現される（すなわち、機能化を確実にするために位置付けられる）。これらの発現ベクターは、通常、宿主染色体ＤＮＡのエピソームまたは完全な部分のいずれかの宿主生物中で複製され得る。一般的に、発現ベクターは、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸還元酵素を含有し、所望のＤＮＡ配列により形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にする。
【００８７】
E. coliは、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするための特に有用な原核生物宿主である。使用に適切な他の微生物宿主は、バチリス属の細菌類、例えばBacillus subtilus、他の腸内細菌類、例えばSalmonella、Serratiaおよび種々のシュードモナス種を包含する。これらの原核生物宿主において、通常、発現ベクターを作製することも可能であり、これは宿主細胞と和合し得る発現制御配列（例えば、複製起源）を含有する。さらに、あらゆる数の既知のプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン (trp) プロモーター系、β-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーターが存在し得る。該プロモーターは、所望によりオペレーター配列により、通常発現を制御し、また転写および翻訳を開始または完了するためにリボソーム結合部位配列などを有する。
【００８８】
他の微生物、例えば酵母は発現のために使用され得る。Saccharomycesは好ましい宿主であり、発現制御配列（例えばプロモーター）を有し、３-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、複製起源、終止配列および所望のものなどを包含する適当なベクターを有する。
【００８９】
微生物に加えて、植物細胞は発現のために使用され得る。植物形質転換の最適方法は、植物のタイプによって変化する。例えば、ＷＯ００/５３７９４を参照されたい。
【００９０】
哺乳類組織細胞培養は、本発明のポリペプチドを発現および産生するために使用され得る。真核生物細胞は実際好まれる、これは無傷イムノグロブリンを分泌し得る多くの適切な宿主細胞系が当分野で開発されてきたからであり、該宿主細胞にはＣＨＯ細胞系、多様なＣＯＳ細胞系、Syrian Hamster卵巣細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系、形質転換Ｂ細胞、ヒト胚腎細胞系またはハイブリドーマが包含される。好ましい細胞系は、ＣＨＯおよびミエローマ細胞系、例えばＳＰ２/０およびＮＳ０である。
【００９１】
これらの細胞について発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起源、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を包含する。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウィルス、牛パピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどから誘導されるプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位は、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモンから誘導される配列を包含する。
【００９２】
目的とするポリヌクレオチド配列を含有するベクター（例えば、重鎖および軽鎖をコードしている配列および発現制御配列)は、細胞性の宿主タイプに依存して変化する既知の方法によって宿主細胞に伝搬され得る。例えば、塩化カルシウム・形質移入は一般的に原核生物細胞に対して利用されるが、リン酸カルシウム処置やエレクトロポーレーションは他の細胞宿主に対して使用され得る。
【００９３】
一旦発現すると、該抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、親和性(例えば、タンパク質Ａ）、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する標準的方法に従って精製され得る。医薬的使用のためには、少なくとも約９０〜９５％の純度を有する実質的に純粋なイムノグロブリンが好まれ、９８〜９９％またはそれ以上の純度が最も好まれる。一旦所望により部分的または均質に精製されると、該ポリペプチドは、本明細書に関して治療的または予防的に使用されうる。
【００９４】
この発明は、有効用量のＩＬ−１β抗体を、それを必要とする患者に投与することを含むＩＬ−１β介在炎症性障害を経験するヒトを処置する方法にも関する。本発明の抗体は結合して、ＩＬ−１βがＩＬ−１β受容体に結合してシグナルを開始することを防ぐ。様々なＩＬ−１β媒介障害は、リウマチ性関節炎(ＲＡ）、変形性関節症(ＯＡ）、アレルギー、腐敗性または内毒素ショック、敗血症、喘息、移植片対宿主疾患、クローン疾患および他の炎症性内臓疾患を包含する。さらに、ＩＬ−１βは、局所および全身性の疾患および損傷に、また神経変性疾患、例えば、卒中および虚血、毒性刺激ならびに外傷性頭部損傷における神経炎症および細胞死への宿主防御応答を媒介する。また、ＩＬ−１βは、慢性変性疾患、特に多発性硬化症、パーキンソンおよびアルツハイマー病に影響を与える。好ましくは、本発明に含まれるＩＬ−１β抗体は、ＲＡおよび／またはＯＡを処置するために使用される。
【００９５】
ＲＡに罹患した患者は、慢性的な関節の腫れおよび炎症ならびに軟骨および骨の進行性破壊を受ける。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αは、ＲＡの病因において最も重要なサイトカインである。しかし、Ｌ−１βおよびＴＮＦ−α両方が炎症を媒介する場合、ＩＬ−１βは、骨および軟骨破壊に関する第一メディエーターである。滑液組織中で活性化された単球および繊維芽細胞は、順に、別の前炎症性サイトカイン、プロスタグランジンおよびマトリックス・メタロプロテイナーゼの産生を刺激するＩＬ−１βを生成する。滑膜表層は、骨および軟骨を侵略し、むしばみ、肥大する。
【００９６】
疾患修飾抗リウマチ薬(ＤＭＡＲＤＳ)、例えばヒドロキシクロロキン、経口または注射し得る、金、メトトレキサート、アザチオプリン、ペニシラミンおよびスルファサラジンは、ＲＡの処置において穏やかな成功と共に使用されてきた。ＲＡの推移を修飾する際のそれらの活性は、炎症性メディエーター、例えばＩＬ−１βの抑制または修飾によるものであると考えられる。メトトレキサートは、例えば７.５〜１０mg／週間の用量で、ＲＡ患者のＩＬ−１β血漿濃度を低下させる。同様の結果が、コルチコステロイドを用いても見られる。すなわち、本発明のＩＬ−１β抗体は、単独で、または血漿中のＩＬ−１βタンパク質レベルを低下させるように作用し得るＤＭＡＲＤＳと組み合わせて、使用され得る。
【００９７】
本発明のＩＬ−１β抗体の有効量とは、耐容できない副作用または毒性がなく臨床的効力を提供し得る量である。ＲＡ患者についての臨床的効力は、米国リューマチ学会の診断基準 (ＡＣＲ２０) を用いて評価され得る。疼痛・圧痛関節数、腫脹関節数において２０％の改善、また患者の疼痛の評価、患者の疾患活動性の全般評価、医師の疾患活動性の全般評価、身体機能評価（ＨＡＱ）、血清Ｃ反応性タンパク質（血清ＣＲＰ値）包含するその他５つの項目のうち３つの項目においても２０％の改善を示した場合に、その患者はレスポンダーと考えられる。構造的損傷の予防は、van der Heidjiによるmodified Sharp法のＸ線評価(骨びらん、関節裂隙狭小化）によって評価され得る。
【００９８】
本発明のＩＬ−１β抗体は、変形性関節症(ＯＡ）罹患患者を処置するためにも使用され得る。ＯＡは、ヒトの関節に関するもっとも一般的な疾患であり、関節の軟骨損失および骨棘形成によって特徴付けられている。臨床的特徴は、関節痛、硬直、肥厚、不安定性、運動能力の限界および機能障害を包含する。ＯＡは、一次性および二次性タイプとして分類されてきた。膝および股関節部のＯＡの分類基準は、臨床的、Ｘ線撮影および実験パラメーターを基にした米国リュウマチ学会によって開発された。
【００９９】
本発明のＩＬ−１β抗体の有効量は、疼痛および機能における改善だけでなく構造上の損傷の予防によって測定されるＯＡ患者における臨床的効力を示す量である。疼痛および機能における改善は、ＷＯＭＡＣ ＯＡインデックスの疼痛および身体機能のサブスケールを用いて評価され得る。該インデックスにより、疼痛面積、硬直および身体機能における臨床的に重要な患者に関連のある症候を厳密に調べる。構造上の損傷の予防は、膝または股関節部の放射線写真上の関節空間の広さを測定することによって評価され得る。
【０１００】
ＩＬ−１βの高いレベルは、ヒト神経変性症状、例えば卒中および脳損傷と関与しているので(Rothwell, N. J.,et al.,TINS 23(12): 618-625,2000)、本発明によって包含される抗ＩＬ−１β抗体は、卒中および虚血、毒性刺激性、ならびに外傷性頭部損傷と関連した神経炎症性を処置するために使用され得る。
【０１０１】
発明の抗体は、標準的投与技術を用いて、静脈的、腹膜内、皮下、肺の、経皮的、筋内、鼻孔内、口内、舌下または坐薬投与によって、好ましくは末梢的（すなわち、中枢神経系への投与によってではない)に投与される。
【０１０２】
投与のための医薬組成物は、選択された投与様式に適切であるように設計され、医薬的に許容し得る賦形薬、例えば、緩衝液、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などは適宜使用され得る。Remington’s  pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.,Easton PA,latest editionを出典明示により本明細書の一部とし、従業者に広くよく知られるような製剤技術の概要を提供する。
【０１０３】
製剤中のＩＬ−１β抗体の濃度は、約０.１％程度に低い％重量から１５または２０％重量程度の量の％重量であってよく、選択された特定の投与様式に従って、液体容量、粘度、安定性などを基にして主に選択される。ＩＬ−１β抗体の好ましい濃度は、一般的に、１〜約１００ mg/mL、好ましくは１０〜約５０mg/mLの範囲である。
【０１０４】
製剤は緩衝液を包含してもよい。好ましくは、緩衝液は、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液またはそれらの組合せである。一般的には、製剤のｐＨは約４〜約８である。好ましくは、ｐＨは約５〜約７.５である。製剤のｐＨは、抗体安定性(化学的および物理的)を考慮して、投与された時に患者に快適となるように選択され得る。製剤は、塩、例えばＮａＣｌを包含し得る。さらに、該製剤は、凝集を予防するため、そして安定性の維持すを促進するために界面活性剤を包含する。
【０１０５】
該製剤は、製剤を作製した後に滅菌濾過され得るか、あるいは微生物学的に許容し得るように為される。保存剤、例えば、m-クレゾールまたはフェノール、またはその混合物が、微生物の増殖および汚染を予防するために添加され得る。
【０１０６】
通常の静脈的注射用組成物は、液体、例えば滅菌リンガー溶液の２５０ mLと同程度の容量を有し、１-１００ mg/mＬまたはそれ以上の抗体濃度を有する。本発明の治療剤は、貯蔵のために凍結されるか、凍結乾燥され、使用する前に適切な滅菌担体により溶液とし得る。凍結乾燥および溶液化は、抗体活性の損失の程度（例えば、従来のイムノグロブリンと共に、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体以上に活性損失が大きい傾向がある）を変化させ得る。用量は補うために調整され得るべきである。
【０１０７】
前記方法は、タンパク質、例えばヒト化抗体の投与に、もっとも便利かつ適切であるように思えるが、適切な適用によって、投与のための他の技術、例えば経皮投与および経口投与を、適当な製剤が設計される条件で用い得る。さらに、生物分解性フィルムやマトリックス、浸透性ミニポンプ、あるいはデキストランビーズ、アルギネートまたはコラーゲンを基にした送達システムを用いる徐放製剤を使用することも望まれ得る。要約すると、製剤は、本発明の抗体を投与するために有効であり、そして様々な選択肢から選択され得る。
【０１０８】
通常の用量レベルは、標準的臨床的技術を用いて最適化され得るし、投与様式および患者の症状に依存される。一般的に、用量は１０μg/kg/月〜１０mg/kg/月の範囲である。
【０１０９】
本発明は、下記実施例によって説明されるが、あらゆる方法において制限を意図するものではない。
【実施例１】
【０１１０】
実施例１
結合親和性および特異性
Ｍｕ００７および本発明の抗体の親和性および特異性を、ＢＩＡｃｏｒｅ測定(表３)を用いて決定した。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）は、分子相互作用を測定する自動化バイオセンサーシステムである(Karlsson, et al. (1991) J. Immunol. Metods 145: 229-240)。これらの実験において、抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）チップ上に低密度で表面に捕捉した。エチル-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド(ＥＤＣ）を用いて、タンパク質Ａに対して反応性のアミノ基をカルボキシ-メチル(ＣＭ５) ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）センサーチップのフロー・セルに結合した。タンパク質Ａを、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.５）に希釈し、１０００レスポンスユニットを得るようにＥＤＣを用いて、ＣＭ５チップのフロー・セル上で固定化した。非反応部位をエタノールアミンで遮断した。流速６０μl/分を用いた。複数の結合/溶出サイクルを、２μg/mLの本発明の抗体溶液（１０μl）、続いて各サイクル(例えば １５００、７５０、３７５、１８８、９４、４７、２３.５、１２および０ピコモル)について濃度減少時にヒトＩＬ−１βを注入した。溶出を、グリシン-ＨＣＬ（ｐＨ１.５）で行った。ＢＩＡevaluation（登録商標）を用いて、速度データを分析した。Ｍｕ００７の親和性を測定するために利用したプロトコールは、ＰＣＴ／ＵＳ０２／２１２８１に記載されているとおりである。
【０１１１】
表３. ＢＩＡｃｏｒｅ(ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、ｐＨ７.４、２５℃）により決定したヒトＩＬ−１βへの抗ＩＬ−１β抗体の結合特性
【表１０】
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【実施例２】
【０１１２】
実施例２
抗体効力
増殖のために低いレベルのＩＬ−１βを必要とするネズミ細胞を用いて、ヒトＩＬ−１βを中和するための本発明の抗体およびＭｕ００７の能力を決定した。対数増殖期ではないＴ１１６５.１７細胞を、１０％子ウシ血清(GibcoBRL Cat. # 10082-147)、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５０μＭβメルカプトエタノールおよび抗細菌/抗真菌(GibcoBRL Cat. # 15240-062)を加えたＲＰＭＩ１６４０ (GibcoBRL Cat. # 22400-089)を用いて３回洗浄した。細胞を、９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種した。ヒトＩＬ−１βは０.３ｐＭの一定レベルで存在し、抗体の連続希釈物を添加した。細胞を、２０時間、３７℃/５％ ＣＯ２インキュベーターでインキュベートし、この時点でウェルあたりに１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、プレートをインキュベーター内でさらに４時間インキュベートした。細胞を回収し、取り込んだ放射活性をシンチレーションカウンターによって決定した。表４は、Ｍｕ００７および本発明の抗体（ＩｇＧアイソタイプと示す）によるＩＬ−１β刺激性増殖の阻害を示す。
【０１１３】
【表１１】
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【実施例３】
【０１１４】
実施例３
イン・ビボでのヒトＩＬ−１βの中和
ヒトＩＬ−１βを、結合させて、マウスＩＬ−１β受容体を刺激し、マウスＩＬ−６の増加を導き得る。時間および用量範囲の実験を、ヒトＩＬ−１βの至適用量およびマウスＩＬ−６の誘導についての至適時間を同定するために行った。これらの実験は、３μg/kg用量のヒトＩＬ−１βおよびＩＬ−１β投与２時間後に、マウス血清中のＩＬ−６が最高レベルを与えることを示した。本発明の抗体を、ヒトＩＬ−１βのs.c.注射１時間前に、１３、２７、８１および２７０μg/kgでマウスにi.v.投与した。ＩＬ−１β投与２時間後に、マウスを屠殺し、ＩＬ−６レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。アイソタイプ適合抗体をネガティブコントロールとして用いた。本発明の抗体は、用量依存法(表５)において、ＩＬ−１βの効果を遮断し、マウスＩＬ−１β受容体を刺激して、マウスＩＬ−６を増加に導いた。
表５
【表１２】
2010143929.tif 000013
【実施例４】
【０１１５】
実施例４
抗体発現
下記プロトコールを、本発明の全ての抗体の発現に適用した。
リーダー配列をコードする発現ベクターおよび、κ軽鎖またはγ１重鎖に対する定常領域のいずれかを用いて、Ｆａｂ配列をクローンして完全な抗体遺伝子を得る。該ベクターを一過性および安定な発現の両方について複数の哺乳類細胞系で用い得る。
【０１１６】
該ベクター、形質移入を維持するために必要なＤＮＡの量を生成するためにスケールアップした。最終ＤＮＡは、一過性形質移入に使用した場合には閉鎖環状ベクターとして残存しており、安定な形質移入に使用した場合には直線化され得る。小スケールの一過性形質移入は、ＬＣ：ＨＣの最良の比を同定するために維持されるべきである。どちらの形質移入においても、軽鎖(ＬＣ）および重鎖(ＨＣ）をコードしているベクターを一緒に混合して、該細胞中に形質移入した。
【０１１７】
一過性形質移入を、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞中に維持する。該形質移入をスケールアップして、形質移入後に５〜７日間培養した。上清を回収し、抗体を抗体に対する従来のアプローチを用いて精製した。
【０１１８】
ＣＨＯ(チャイニーズハムスターの卵巣)-ＤＧ４４細胞中の安定な形質移入を、概説したベクターを用いて維持し得る。用いたＤＮＡの量は、２０μg〜２００μgに変え得る。該細胞(１０７)を、３６０Ｖ／９５０ｕＦに設定したBioRad Gene Pulsar IIを用いて形質移入した。該細胞を３７℃/５％ＣＯ２で２４-７２時間回復させ、次いで選択培地(培地ｗ／ｏヒポキサンチンおよびチミジン、および加圧下にメトトレキサート,ＭＴＸのレベルを変化させながら）下で培養した。
【０１１９】
ＮＳ０(マウス骨髄腫）細胞中での安定な形質移入を、ＬＣおよびＨＣに対する該遺伝子を、グルタミン合成遺伝子をコードする発現ベクター中に移動させることによって維持し得る。用いたＤＮＡの量は、全量４０ugである。該細胞(１０７)を、３００Ｖ／１０００ｕＦで設定したBioRad Gene Pulsar IIを用いて形質移入した。該細胞は、３７℃/１０％ＣＯ２で２４-７２時間回復させ、次いで選択培地(培地w/oグルタミン、加圧下にメチオニンスルホキシド,ＭＳＸと共に）下で培養した。
【０１２０】
細胞系両方のタイプについての播種を、該細胞系(５００c/w ＣＨＯ−ＤＧ４４、２０００c/w ＮＳ０)に固有の播種密度で９６-ウェルプレート中で持続した。可視コロニー形成をウェル中にみとめた時に、該プレートを、ＥＬＩＳＡビーズ法を用いて抗体生成に対してスクリーンし得る。抗体に対して陽性シグナルを持つ細胞を含有するウェルを２４ウェルプレートに広げた。耐容力価とタンパク質品質を有する候補細胞系を同定するために、発現実験下に該系を培養して、評価した。該細胞系生成努力のゴールは、耐容力価、増殖特徴および製品品質プロファイルを有する血清不含培養条件で評価され得るクローンを同定することである。
【配列表】
2010143929000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月2日(2010.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号：６０のポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域および配列番号：５５のポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域、
（ｂ）  配列番号：６１のポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域および配列番号：５６のポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域、
（ｃ）  配列番号：６２のポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域および配列番号：５７のポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域、
（ｄ）  配列番号：６３のポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域および配列番号：５９のポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域、ならびに
（ｅ）  配列番号：６４のポリヌクレオチド配列によってコードされている軽鎖可変領域および配列番号：５８のポリヌクレオチド配列によってコードされている重鎖可変領域、
からなる群から選択される、
ヒトＩＬ−１βを特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
軽鎖および重鎖を含んでおり、該軽鎖および該重鎖のアミノ酸配列が、
ａ）配列番号：４６の軽鎖および配列番号：４５の重鎖、
ｂ）配列番号：４８の軽鎖および配列番号：４７の重鎖、
ｃ）配列番号：４８の軽鎖および配列番号：６８の重鎖、
ｄ）配列番号：５０の軽鎖および配列番号：４９の重鎖、
ｅ）配列番号：５２の軽鎖および配列番号：５１の重鎖、ならびに
ｆ）配列番号：５４の軽鎖および配列番号：５３の重鎖、
からなる群から選択される、
ヒトＩＬ−１βを特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
軽鎖のアミノ酸配列が配列番号：４８に示されており、かつ重鎖のアミノ酸配列が配列番号：６８に示されている、該軽鎖および該重鎖を含むヒトＩＬ−１βを特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含有する、医薬組成物。
【請求項５】
医薬品として使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
リウマチ性関節炎または変形性関節症の処置における使用のための、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。