(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔヘルパー及びＢ細胞の共直線エピトープを含む合成免疫原性リポペプチド分子、それらの製造方法、一次及び二次免疫応答の発生における使用、並びに特定の抗原に対する動物被験体のワクチン接種における使用を提供する。【解決手段】脂質部分が内部リジン又はリジン類似体の末端側鎖基（好ましくは内部ジアミノ酸残基の末端側鎖基）に結合している、高度に可溶性のリポペプチドを提供する。好ましくは、内部リジン又はリジン類似体は、Ｔヘルパーエピトープ及びＢ細胞エピトープの間、又はＴヘルパーエピトープ内部に位置する合成免疫原性リポペプチド分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープおよびＢ細胞エピトープ（ただしＴｈエピトープのアミノ酸配列はＢ細胞エピトープのアミノ酸配列とは異なる）；
１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基；および
１個または複数の脂質部分；
を含むリポペプチドであって、
前記脂質部分が、前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基に共有結合している、
上記リポペプチド。
【請求項２】
前記１個または複数の脂質部分の各々が、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に共有結合している、請求項１に記載のリポペプチド。
【請求項３】
前記脂質が前記リジン残基のε−アミノ基に結合している、請求項１又は２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
脂質部分が結合している前記内部リジン残基が、前記Ｔｈエピトープと前記Ｂ細胞エピトープの間に位置する、請求項１から３のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項５】
脂質部分が結合している前記内部リジン残基が、前記Ｔｈエピトープ内に位置する、請求項１から３のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項６】
前記脂質部分が一般式（ＶＩＩ）：
【化１】
2010155832.tif 000018
（式中、
（ｉ）Ｘは、硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、メチレン（−ＣＨ２−）およびアミノ（−ＮＨ−）からなる群から選択され、
（ｉｉ）ｍは、１または２の整数であり、
（ｉｉｉ）ｎは、０〜５の整数であり、
（ｉｖ）Ｒ１は、水素、カルボニル（−ＣＯ−）およびＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖ）Ｒ２は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖｉ）Ｒ３は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は同じでも異なっていてもよい。）
の構造を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項７】
Ｘが硫黄であり、ｍとｎがともに１であり、Ｒ１が水素およびＲ’−ＣＯ−（式中Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３がＲ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択される、請求項６に記載のリポペプチド。
【請求項８】
Ｒ’が、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイル、デカノイルおよびコレステロールからなる群から選択される、請求項７に記載のリポペプチド。
【請求項９】
前記脂質が、Ｐａｍ１Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｃｈｏｌ２Ｌｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２ＣｙｓおよびＯｃｔ２Ｃｙｓからなる群から選択されるリポアミノ酸部分内に含まれる、請求項６から８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１０】
前記リポアミノ酸部分がＰａｍ２Ｃｙｓである、請求項９に記載のリポペプチド。
【請求項１１】
前記脂質部分が、以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化２】
2010155832.tif 000019
（式中、
（ｉ）Ｒ４は、（ｉ）約７〜約２５個の炭素原子からなるα−アシル脂肪酸残基、（ｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基、（ｉｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基のβ−ヒドロキシエステル、および（ｉｖ）リポアミノ酸残基、からなる群から選択され、
（ｉｉ）Ｒ５は、水素、またはアミノ酸残基の側鎖である。）
を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１２】
前記脂質部分が前記ペプチド部分からスペーサーによって分離されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１３】
前記スペーサーが、アルギニン、セリンまたは６−アミノヘキサン酸を含む、請求項１２に記載のリポペプチド。
【請求項１４】
前記スペーサーがセリンホモ二量体からなる、請求項１２または１３に記載のリポペプチド。
【請求項１５】
前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基が、免疫原性の低い合成アミノ酸配列内に入れ子状に置かれている、請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１６】
前記Ｔヘルパーエピトープが、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＴヘルパーエピトープ、またはイヌジステンパーウイルスＦ（ＣＤＶ−Ｆ）タンパク質のＴヘルパーエピトープである、請求項１から１５のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１７】
前記インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＴヘルパーエピトープが、配列番号１または配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のリポペプチド。
【請求項１８】
前記ＣＤＶ−Ｆタンパク質のＴヘルパーエピトープが、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のリポペプチド。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞エピトープが、ウイルスの免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質に由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項２０】
前記Ｂ細胞エピトープが、原核生物の免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質に由来する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項２１】
前記Ｂ細胞エピトープが、Ａ群ストレプトコッカスのＭタンパク質に由来する、請求項２０に記載のリポペプチド。
【請求項２２】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号１０１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のリポペプチド
【請求項２３】
前記Ｂ細胞エピトープが、真核生物の免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質に由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項２４】
前記真核生物が寄生生物である、請求項２３に記載のリポペプチド。
【請求項２５】
前記真核生物が哺乳動物である、請求項２３に記載のリポペプチド。
【請求項２６】
前記Ｂ細胞エピトープが、哺乳動物のペプチドホルモンに由来する、請求項２５に記載のリポペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチドホルモンが、消化ホルモンまたは生殖ペプチドホルモンである、請求項２６に記載のリポペプチド。
【請求項２８】
前記消化ホルモンが、ガストリンまたはペンタガストリンである、請求項２７に記載のリポペプチド。
【請求項２９】
配列番号１０２または配列番号１１３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のリポペプチド。
【請求項３０】
前記生殖ホルモンが、黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ）またはその断片である、請求項２７に記載のリポペプチド。
【請求項３１】
配列番号２または配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のリポペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、
（ｘｖ）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号５）；
（ｘｖｉ）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号７）；
（ｘｖｉｉ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号９）；
（ｘｖｉｉｉ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＧＬＲＰＧ（配列番号１３）；
（ｘｉｘ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号１０３）；
（ｘｘ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＧＬＲＰＧ（配列番号１０４）；
（ｘｘｉ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０５）；
（ｘｘｉｉ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０６）；
（ｘｘｉｉｉ）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０７）；
（ｘｘｉｖ）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０８）；
（ｘｘｖ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＧＷＭＤＦ（配列番号１０９）；
（ｘｘｖｉ）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＧＷＭＤＦ（配列番号１１０）；
（ｘｘｖｉｉ）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＧＷＭＤＦ（配列番号１１１）；および
（ｘｘｖｉｉｉ）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＧＷＭＤＦ（配列番号１１２）。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項３３】
未成熟樹状細胞（ＤＣ）上でのＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレート可能である、請求項１から３２のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項３４】
前記ＤＣがＤ１細胞である、請求項３３に記載のリポペプチド。
【請求項３５】
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープおよびＢ細胞エピトープ（ただしＴｈエピトープのアミノ酸配列はＢ細胞エピトープのアミノ酸配列とは異なる）；
１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基；および
１個または複数の脂質部分；
を含むリポペプチドであって、
前記脂質部分が、前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基に共有結合しており、
前記リポペプチドが一般式（ＶＩ）：
【化３】
2010155832.tif 000020
（式中、
一方のエピトープはＴヘルパーエピトープであり、かつ他方のエピトープはＢ細胞エピトープであり、
Ａは、存在しているかまたは存在しておらず、かつ約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、
ｎは、１、２、３または４の整数であり、
Ｘは、ＮＨ、ＯおよびＳからなる群から選択される末端側鎖基であり、
Ｙは、存在しているかまたは存在しておらず、かつ約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、
Ｚは、脂質部分である。）
を有する、上記リポペプチド。
【請求項３６】
Ａが存在しない、請求項３５に記載のリポペプチド。
【請求項３７】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号２または配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のリポペプチド。
【請求項３８】
（ｉ）前記Ｂ細胞エピトープが配列番号１０１で示されるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）Ｙが存在し、かつセリンホモ二量体からなり、（ｉｉｉ）ＺがＰａｍ２Ｃｙｓからなる、請求項３６に記載のリポペプチド。
【請求項３９】
前記Ｔヘルパーエピトープが配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、前記脂質部分が配列番号２４内のリジン残基のε−アミノ基を介して前記ポリペプチドに結合している、請求項３８に記載のリポペプチド。
【請求項４０】
前記脂質部分が、配列番号２４のＬｙｓ−１４を介して前記ポリペプチドに結合している、請求項３８に記載のリポペプチド。
【請求項４１】
（ｉ）前記Ｂ細胞エピトープが配列番号１０２で示されるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）Ｙが存在し、かつセリンホモ二量体からなり、（ｉｉｉ）ＺがＰａｍ２Ｃｙｓからなる、請求項３６に記載のリポペプチド。
【請求項４２】
未成熟樹状細胞（ＤＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレート可能である、請求項３５から４１のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項４３】
前記ＤＣがＤ１細胞である、請求項４２に記載のリポペプチド。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれか一項に記載のリポペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む組成物。
【請求項４５】
請求項１から４１のいずれか一項に記載のリポペプチドを含む、被験体中の抗原性Ｂ細胞エピトープに対する抗体の産生を誘発する組成物であって、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する抗体の産生を誘発するのに十分な上記組成物。
【請求項４６】
高力価抗体の産生を誘発するステップを含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗原性Ｂ細胞エピトープが病原体に由来し、前記病原体に対する中和抗体を産生させるステップを含む、請求項４５または４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対するモノクローナル抗体を産生させるステップをさらに含む、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項１から１８、２３、２５から２７、３０、３２から３７、４２および４３のいずれか１項に記載のリポペプチドを含む、被験体において不妊を誘導する組成物であって、該組成物が、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する液性免疫応答を誘発するのに十分な上記組成物。
【請求項５０】
前記被験体における卵形成、精子形成、受精、着床または胚発生を阻止するのに十分な前記Ｂ細胞エピトープに対する二次免疫応答を発生させる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
抗体レベルが、免疫された雌性被験体の少なくとも単一の生殖サイクルの間持続される、請求項４９または５０に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項１から１８、２３、２５から２７、３０、３２から３７、４２および４３のいずれか一項に記載のリポペプチドを含む避妊薬であって、前記Ｂ細胞エピトープが生殖ホルモンまたはホルモン受容体に由来するものである、上記避妊薬。
【請求項５３】
請求項１から１８、２０から２２、３２から４０、４２および４３のいずれか１項に記載のリポペプチドを含む、被験体中のＡ群ストレプトコッカス抗原に対する免疫応答を誘発する組成物であって、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する液性免疫応答を誘発するのに十分な上記組成物。
【請求項５４】
Ａ群ストレプトコッカスによる感染の蔓延を防止し、かつ／またはそれに続くＡ群ストレプトコッカスへの暴露後の被験体の罹患率もしくは死亡率を低下させるのに十分な、前記Ｂ細胞エピトープに対する二次免疫応答を発生させる、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
請求項１から１８、２０から２２、３２から４０、４２および４３のいずれか一項に記載のリポペプチドを含むワクチンであって、前記Ｂ細胞エピトープがＡ群ストレプトコッカスのＭタンパク質に由来するものである、上記ワクチン。
【請求項５６】
請求項１から１８、２３、２５から２７、３２から３７および４１から４３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、被験体中のガストリンペプチドに対する免疫応答を誘発する組成物であって、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する液性免疫応答を誘発するのに十分な上記組成物。
【請求項５７】
それを必要とする動物において胃酸分泌を阻害または遮断するのに十分な前記Ｂ細胞エピトープに対する二次免疫応答を発生させる、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記動物が、高ガストリン血症、ゾリンジャーエリソン症候群、胃潰瘍、十二指腸潰瘍およびガストリノーマからなる群から選択される症状に罹患している、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１から１８、２３、２５から２９、３２から３７および４１から４３のいずれか一項に記載のリポペプチドを含むワクチンであって、前記Ｂ細胞エピトープがガストリンポリペプチドに由来するものである、上記ワクチン。
【請求項６０】
前記抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧからなる群から選択される免疫グロブリンを含む、請求項４５から４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２bおよびＩｇＧ３からなる群から選択される、請求項６０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に免疫学の分野に関し、より詳細には、ペプチド免疫原に対して抗体および／または細胞性応答を発生させる試薬、ならびに被験体の免疫応答を高める前記試薬の使用方法、あるいは被験体のワクチン接種のための前記試薬の使用方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、免疫原性活性が増強された新規リポペプチド、例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた前記リポペプチドを含む製剤およびワクチン組成物、ならびに本発明の製剤およびワクチン組成物の製造および使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．概記
本明細書は、要約書の後ろに、ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１を使用して作成されたアミノ酸配列情報を含む。各配列は、配列表中で数値標識とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって区別されている。各配列の長さおよび供給源生物は、それぞれ数値標識フィールド＜２１１＞および＜２１３＞中に提供される情報によって示される。本明細書中で参照する配列は、「配列番号」とそれに続く配列識別子によって定義される（例えば、配列番号１は、＜４００＞１と命名された配列である）。
【０００３】
本明細書で使用する「由来する」という用語は、指定された完全体（integer）を特定の供給源から、必ずしもその供給源から直接に得なくても、得ることができることを示すものと解釈すべきである。
【０００４】
本明細書を通して、特別な場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、規定されたステップまたは構成要素または整数、あるいはステップまたは構成要素または整数のグループを含むことを意味するが、他のステップまたは構成要素または整数、あるいは構成要素または整数のグループを排除するものではないことを理解されたい。
【０００５】
本明細書に記載する本発明は、具体的に記載されたもの以外の変更形態および改変形態が可能であることを当業者であれば理解しうる。本発明は、このような変更形態および改変形態のすべてを含むと理解すべきである。本発明は、本明細書中で参照するまたは示すステップ、特徴、組成物および化合物のすべてを個々にまたは包括的に含み、前記ステップまたは特徴のあらゆる組合せまたは任意の２つ以上も含む。
【０００６】
本発明は、本明細書に記載する具体例によって範囲が限定されるべきではない。機能的に等価な生成物、組成物および方法が、本明細書に記載する本発明の範囲内にあるのは明らかである。
【０００７】
本願に引用するすべての参考文献を参照により本明細書に援用する。
【０００８】
本発明は、特に示さない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成および免疫学の従来技術を使用して、過度の実験を行うことなく実施される。このような手順は、例えば、参照により本明細書に援用する以下のテキストに記載されている。
【０００９】
2010155832.tif 000002
2010155832.tif 000003
2010155832.tif 000004
【００１０】
関連技術の記載
免疫療法またはワクチン接種は、多様な障害、例えば、ある種の感染症、癌などの予防または治療に有用である。しかし、このような治療の適用および成功は、標的抗原の免疫原性が低いためにある程度制限を受ける。多数のペプチド、糖ペプチド、脂質、リポペプチド、炭水化物などは免疫原性が低い。ペプチド免疫原に対する被験体の免疫応答を高めるためにいくつかの技術が使用されている。
【００１１】
例えば完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）などのペプチド免疫原に対して外来的なアジュバント製剤を利用して、ペプチド免疫原に対する被験体の免疫応答を高めることが知られている（すなわち、使用前に免疫原と混合される）。しかし、現在利用可能なアジュバントの多くは、ヒトに使用するには毒性が強すぎるか、単に無効である。さらに、このタイプのアジュバントは、投与直前にペプチド免疫原と予め製剤化することを必要とする。このような製剤は、可溶性が低く、または不溶性であることが多い。
【００１２】
アジュバントとして作用することが知られている脂質部分がペプチド免疫原に共有結合しているリポペプチドは、外来的なアジュバントの不在下で、さもなければ免疫原性の低いペプチドの免疫原性を高めることができる[Jung et al.、Angew Chem、Int Ed Engl 10、872、(1985)；Martinon et al.、J Immunol 149、3416、(1992)；Toyokuni et al.、J Am Chem Soc 116、395、(1994)；Deprez、et al.、J Med Chem 38、459、(1995)；およびSauzet et al.、Vaccine 13、1339、(1995)；Benmohamed et al.、Eur.J.Immunol.27、1242、(1997)；Wiesmuller et al.、Vaccine 7、29、(1989)；Nardin et al.、Vaccine 16、590、(1998)；Benmohamed、et al.Vaccine 18、2843、(2000)；およびObert、et al.、Vaccine 16、161、(1998)]。適切なリポペプチドは、アジュバント製剤に伴う有害な副作用を示さず、リポペプチドに対して抗体と細胞の両方の応答が認められる。
【００１３】
脂質部分に使用される様々な脂肪酸がいくつか知られている。代表的な脂肪酸としては、これらだけに限定されないが、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基およびデカノイル基が挙げられ、より一般的には、あらゆるＣ２〜Ｃ３０飽和、一不飽和または多価不飽和の脂肪アシル基が有用と考えられる。
【００１４】
リポアミノ酸のＮ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインは、Ｐａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨとしても知られ（Wiesmuller et al.、Z.Physiol.Chem.364(1983)、p593）、グラム陰性菌の内膜から外膜に及ぶブラウンのリポタンパク質のＮ末端部分の合成品である。Ｐａｍ３Ｃｙｓは、式（Ｉ）の構造を有する：
【化１】
2010155832.tif 000005
【００１５】
Ｍｅｔｚｇｅｒらの米国特許第５，７００，９１０号（１９９７年１２月２３日）は、合成アジュバント、Ｂリンパ球刺激薬、マクロファージ刺激薬または合成ワクチンとして使用されるリポペプチドの調製において中間体として使用されるいくつかのＮ−アシル−Ｓ−（２−ヒドロキシアルキル）システインを記載している。Ｍｅｔｚｇｅｒらは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨの合成におけるこのような化合物の中間体としての使用（Wiesmuller et al.、Z.Physiol.Chem.364、p593、1983）、およびＮ末端にこのリポアミノ酸またはその類似体を含むリポペプチドの使用も教示している。
【００１６】
Ｐａｍ３Ｃｙｓは、適切なエピトープに結合すると、インフルエンザウイルス感染細胞に対してウイルス特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）応答を刺激することができ(Deres et al.、Nature 342、561、1989)、口蹄疫に対する感染防御抗体を誘発すること（Wiesmuller et al.、Vaccine 7、29、1989；Jung et al.の米国特許第6024964号、2000年2月15日）が示されている。
【００１７】
最近、Ｐａｍ３Ｃｙｓの類似体であるＰａｍ２Ｃｙｓ（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインとしても知られる）が合成され（Metzger,J.W.、A.G.Beck-Sickinger、M.Loleit、M.Eckert、W.G.Besser、and G.Jung.1995.J Pept Sci 1:184）、マイコプラズマから単離されたマクロファージ活性化リポペプチドＭＡＬＰ−２の脂質部分に相当することが判明した（Sacht,G.、A.Marten、U.Deiters、R.Sussmuth、G.Jung、E.Wingender、and P.F.Muhlradt.1998.Eur J Immunol 28:4207:Muhlradt,P.F.、M.Kiess、H.Meyer、R.Sussmuth、and G.Jung.1998.Infect Immun 66:4804：Muhiradt,P.F.、M.Kiess、H.Meyer、R.Sussmuth、and G.Jung.1997.J Exp Med 185:1951）。Ｐａｍ２Ｃｙｓは式（ＩＩ）の構造を有する：
【化２】
2010155832.tif 000006
【００１８】
Ｐａｍ２Ｃｙｓは、Ｐａｍ３Ｃｙｓよりも強力な脾細胞およびマクロファージの刺激物質であると報告されている（Metzger et al.、J Pept.Sci 1、184、1995；Muhlradt et al.、J Exp Med 185、1951、1997；およびMuhlradt et al.、Infact Immun 66、4804、1998）。
【００１９】
所与の抗原に対して抗体応答を発生させるためには、強いＴヘルパー細胞応答を発生させる必要がある。したがって、抗原を少なくとも１個のＴヘルパー細胞エピトープとともに投与することが望ましい（Vitiello et al.、J.Clin.Invest 95、341〜349、1995；Livingston et al.、J.Immunol.159、1383〜1392、1997）。しかし、Ｔヘルパー細胞応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子としてペプチド抗原断片を認識するＣＤ４＋  Ｔ細胞によって付与されるので、加工された形のペプチド抗原の大部分は、ＭＨＣハプロタイプの１個または少数の対立遺伝子によってのみ提示される。これによって、所与の抗原性ペプチドに対するＴヘルパー応答が、個体の厳密な遺伝的制御下に置かれることになる。
【００２０】
ある抗原に対する所与の個体集団の免疫応答における大きな遺伝的変異を防止するために、ある範囲のＴヘルパーエピトープを有する大きなタンパク質とともに抗原を投与する。
【００２１】
あるいは、乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープ含有ペプチドを抗原とともに投与する。乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープ含有ペプチドは、圧倒的多数がＭＨＣクラスＩＩハプロタイプとして提示されるので、非近交系ヒト集団の大多数において強いＣＤ４＋  Ｔヘルパー応答を誘発する。乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープの例は、破傷風トキソイドペプチド、プラスモディウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）ｐｆｇ２７、乳酸デヒドロゲナーゼおよびＨＩＶｇｐ１２０である（Contreas et al.、Infect.Immun、66、3579〜3590、1998；Gaudebout et al.、J.A.I.D.S.Human Retrovirol 14、91〜101、1997；Kaumaya et al.、J.Mol.Recog.6、81〜94、1993；およびFern and Good J.Immunol.148、907〜913、1992）。また、Ghosh et al.、Immunol 104、58〜66、2001および国際特許出願第PCT/AU00/00070号（WO 00/46390）は、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ−Ｆ）融合タンパク質に由来するＴヘルパーエピトープを記載している。ある種の乱交雑Ｔヘルパーエピトープは、所与の抗原に対する強いＢ細胞応答を誘発し、ある種のハプロタイプに限定された免疫応答を回避することができる（Kaumaya et al.、J.Mol.Recog.6、81〜94、1993）。
【００２２】
ワクチン製剤は、常に、Ｔヘルパー細胞エピトープおよび抗原エピトープを含むポリペプチドの混合物を含むが、Ｔヘルパーエピトープと抗原エピトープの両方を含む単一ポリペプチドを投与することも知られている（例えば、Ghosh and Jackson、Int.Immunol.11、1103、1999）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第5,700,910号明細書
【特許文献２】米国特許第6,024,964号明細書
【特許文献３】国際公開第00/46390号パンフレット
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vol I, II, およびIIIのテキスト全体
【非特許文献２】DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, テキスト全体
【非特許文献３】Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach  (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, テキスト全体及び特に以下の論文, Gait, pp1-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp 83-115; and Wu et al., pp 135-151
【非特許文献４】Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, テキスト全体
【非特許文献５】Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R.W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, テキスト全体
【非特許文献６】Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, テキスト全体
【非特許文献７】Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)
【非特許文献８】Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 全巻
【非特許文献９】J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis” In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)
【非特許文献１０】Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342
【非特許文献１１】Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154.
【非特許文献１２】Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York.
【非特許文献１３】Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Methoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart.
【非特許文献１４】Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
【非特許文献１５】Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
【非特許文献１６】Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474.
【非特許文献１７】Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
【非特許文献１８】Jung et al.、Angew Chem、Int Ed Engl 10、872、(1985)
【非特許文献１９】Martinon et al.、J Immunol 149、3416、(1992)
【非特許文献２０】Toyokuni et al.、J Am Chem Soc 116、395、(1994)
【非特許文献２１】Deprez、et al.、J Med Chem 38、459、(1995)
【非特許文献２２】Sauzet et al.、Vaccine 13、1339、(1995)
【非特許文献２３】Benmohamed et al.、Eur.J.Immunol.27、1242、(1997)
【非特許文献２４】Wiesmuller et al.、Vaccine 7、29、(1989)
【非特許文献２５】Nardin et al.、Vaccine 16、590、(1998)
【非特許文献２６】Benmohamed、et al.Vaccine 18、2843、(2000)
【非特許文献２７】Obert、et al.、Vaccine 16、161、(1998)
【非特許文献２８】Wiesmuller et al.、Z.Physiol.Chem.364(1983)、p593
【非特許文献２９】Deres et al.、Nature 342、561、1989
【非特許文献３０】Metzger,J.W.、A.G.Beck-Sickinger、M.Loleit、M.Eckert、W. G.Besser、and G.Jung.1995.J Pept Sci 1:184
【非特許文献３１】Sacht,G.、A.Marten、U.Deiters、R.Sussmuth、G.Jung、E.Wingender、and P.F.Muhlradt.1998.Eur J Immunol 28:4207
【非特許文献３２】Muhlradt,P.F.、M.Kiess、H.Meyer、R.Sussmuth、and G.Jung.1998.Infect Immun 66:4804
【非特許文献３３】Muhiradt,P.F.、M.Kiess、H.Meyer、R.Sussmuth、and G.Jung.1997.J Exp Med 185:1951
【非特許文献３４】Vitiello et al.、J.Clin.Invest 95、341〜349、1995
【非特許文献３５】Livingston et al.、J.Immunol.159、1383〜1392、1997
【非特許文献３６】Contreas et al.、Infect.Immun、66、3579〜3590、1998
【非特許文献３７】Gaudebout et al.、J.A.I.D.S.Human Retrovirol 14、91〜101、1997
【非特許文献３８】Kaumaya et al.、J.Mol.Recog.6、81〜94、1993
【非特許文献３９】Fern and Good J.Immunol.148、907〜913、1992
【非特許文献４０】Ghosh et al.、Immunol 104、58〜66、2001
【非特許文献４１】Ghosh and Jackson、Int.Immunol.11、1103、1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明に至る研究において、本発明者らは、脂質部分と、免疫応答が望まれるＴヘルパーエピトープと抗原性Ｂ細胞エピトープの両方を含むポリペプチド部分とを有する高免疫原性リポペプチドを製造しようとした。本発明のリポペプチドは、ポリペプチド部分の内部リジンまたは内部リジン類似体、例えば、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸などの末端側鎖アミノ基を介して結合している脂質部分を有する。これは、既報のＮ末端結合ともＣ末端結合とも異なる（Grass-Masse et al.Vaccine、14、375、1996）。
【００２６】
したがって、前記１個または複数のリジン残基またはリジン類似体残基をペプチド合成中にポリペプチド内の所定の位置に置くことによって、脂質の結合部位を容易に指定することができる。したがって、リポペプチド中の脂質部分の位置は、ワクチンまたはアジュバント製剤用最終産物の有用性を高めることを目標に決定される。
【００２７】
驚くべきことに、本発明者らは、Ｔヘルパーエピトープと抗原の各アミノ酸配列間に位置する内部リジン残基の側鎖ε−アミノ基または内部リジン類似体残基の末端側鎖基を介して脂質部分が結合すると、多くの例においてリポペプチド産物の可溶性が高くなることを見出した。
【００２８】
本発明のリポペプチドによって提供される１つの利点は、これらのリポペプチドを含むワクチン製剤中に外来的なアジュバントを含めることが一般に不要なほどに十分な免疫原性を有することである。
【００２９】
本発明が、Ｔヘルパーエピトープまたは抗原のアミノ酸配列中に存在する内部リジン残基のε−アミノ基または内部リジン類似体残基の末端側鎖基を介した脂質部分の結合を包含することは明白であり、唯一の要件は脂質部分がペプチドのＮ末端にもＣ末端にも結合していないことである。本明細書に例示するとおり、本発明者らは、例えば、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置するリジンのεアミノ基に脂質が付加したリポペプチドと比較して、対象リポペプチドの免疫応答発生能力を損なわずに、Ｔヘルパーエピトープ内の内部リジン残基のεアミノ基に脂質が結合できることを明確に示した。
【００３０】
「内部」とは、Ｔヘルパーエピトープおよび抗原性Ｂ細胞エピトープを含むポリペプチドのＮ末端またはＣ末端以外の位置を意味する。
【００３１】
脂質部分は、Ｔヘルパーエピトープと抗原性Ｂ細胞エピトープの各アミノ酸配列間に位置するリジン残基のεアミノ基、または内部リジン類似体残基の末端側鎖基を介してペプチド部分に結合することが好ましい。
【００３２】
当業者には知られているとおり、商業ベースでワクチン製剤を製造するためには、抗原の可溶性は極めて望ましい。この点で、本発明者らは、本発明の最も有効なリポペプチドが高度に可溶性であることを見出した。外部アジュバントの不在下で抗体応答を誘発する本発明のリポペプチドの相対能力は、未成熟樹状細胞（ＤＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレートする能力によって示された。
【００３３】
本明細書に例示するとおり、脂質部分の構造は、得られるリポペプチドの活性には本質的ではなく、パルミチン酸、ラウリン酸、ステアリン酸またはオクタン酸を含む脂質部分を、免疫原性を損なうことなく使用することができる。したがって、本発明は、特に指定しない限り、または特段の必要性がない限り、脂質部分の構造に限定されるべきではない。
【００３４】
同様に、複数の脂質部分をペプチド部分に付加することは一般に不要であるが、特に指定しない限り、または特段の必要性がない限り、本発明に包含される。本明細書に例示するとおり、ペプチド部分、例えば、Ｔヘルパーエピトープ内部の位置、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間の位置などへの複数の脂質部分の付加は、単一の結合脂質部分しか持たないペプチドと比較して、リポペプチドのＩｇＧ産生刺激能力に悪影響を及ぼさない。
【００３５】
ポリペプチドが好都合には単一アミノ酸鎖として合成され、そのため両方のエピトープを組み込む合成後の改変が不要であることは以上のことから明らかである。
【００３６】
場合によっては、例えば、ＴヘルパーとＢ細胞エピトープの間などの脂質部分が結合する内部リジンまたはリジン類似体のどちらか一方の側に、アミノ酸スペーサーを付加してもよい。
【００３７】
本明細書に例示するとおり、本発明者らは、合成ペプチド部分中のＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する内部リジン残基の露出したε−アミノ基に、スペーサーとともにまたはスペーサーなしで脂質部分を結合させることによって本発明のリポペプチドを製造した。この状況において特に好ましいスペーサーは、セリン二量体、三量体、四量体などである。
【００３８】
従来の任意のタイプのスペーサーを、脂質部分とポリペプチド部分の間に付加することもできる。本発明において特に好ましいスペーサーは、アルギニン、またはセリン二量体、三量体、四量体などである。あるいは、６−アミノヘキサン酸スペーサーを使用することができる。
【００３９】
別のスペーサーも企図される。例えば、スペーサーを、脂質部分に付加する前に、内部リジンの露出したεアミノ基、または内部リジン類似体の末端側鎖基に付加することができる。
【００４０】
あるいは、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のリポアミノ酸を、内部リジン残基のεアミノ基、または内部リジン類似体の末端側鎖基に直接付加することができる。
【００４１】
やはり本明細書に例示するとおり、本発明のリポペプチドは、動物被験体に投与すると、Ｂ細胞エピトープ部分に対する高力価抗体の産生を、類似の抗体価を得るためにアジュバントを必要とすることなく誘導する。この有用性は、対象リポペプチドの投与後に樹状細胞の成熟が促進される（すなわち、脂質がＮ末端に結合したリポペプチドと比較して抗原提示が増強される）ことによって裏付けられる。
【００４２】
やはり本明細書に例示するとおり、ＬＨＲＨの抗原性Ｂ細胞エピトープを含む本発明のリポペプチドは、不妊を誘発すべき他の哺乳動物を代表するマウスモデルにおいて、不妊を誘発することができる。本発明のリポペプチドによってＬＨＲＨに対する抗体が持続的に産生されることは、液性免疫の誘導における対象リポペプチドの一般的有用性、およびワクチン製剤中の活性剤としての対象リポペプチドの一般的有用性を示している。
【００４３】
やはり本明細書に例示するとおり、Ａ群ストレプトコッカス（Streptococcus）（本明細書では「ＧＡＳ」）のＭタンパク質の抗原性Ｂ細胞エピトープを含む本発明のリポペプチドは、ＧＡＳに対するワクチン接種が必要なヒトおよび他の哺乳動物の代表であるマウスモデルにおいて保護作用を誘導することができる。本明細書が提供するデータによれば、本発明のリポペプチドは、ＧＡＳに対する抗体（血清ＩｇＧと唾液および糞便ＩｇＡの両方）の持続的産生、およびＧＡＳのオプソニン化を誘導することができ、その後のＧＡＳ曝露に対して動物を延命させることができる。これらのデータは、液性免疫の誘導における対象リポペプチドの一般的有用性、およびＧＡＳに対するワクチン製剤中の活性剤としての対象リポペプチドの一般的有用性を示している。
【００４４】
やはり本明細書に例示するとおり、ガストリン（「ペンタガストリン」）の抗原性Ｂ細胞エピトープを含む本発明のリポペプチドは、胃酸分泌の阻害が必要な他の哺乳動物のマウスモデルにおいて、ガストリンおよび／またはコレシステキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｅｋｉｎｉｎ）に対する抗体の持続的産生を誘導することができる。本明細書が提供するデータは、ガストリンに対する液性免疫およびガストリンの免疫中和を誘導し、それによって、高ガストリン血症、ゾリンジャーエリソン症候群、胃酸の過剰および無秩序な分泌による胃潰瘍または十二指腸潰瘍に罹患している動物における胃酸分泌を遮断し、膵臓または十二指腸におけるガストリン依存性腫瘍の形成を抑制または防止（すなわち、ガストリノーマの予防および／または治療）する対象リポペプチドの一般的有用性を実証している。
【００４５】
当業者には明白であるとおり、ＴヘルパーおよびＢ細胞エピトープの性質は、本発明においては重要でない。構築体のポリペプチド部内の１個または複数の内部リジン残基またはリジン類似体残基のεアミノ基に脂質部分を結合させる新規な手法は、広範な応用分野を有する。したがって、本明細書が提示する結果に基づいて、多様なＴヘルパーエピトープおよびＢ細胞エピトープをリポペプチド構築体に使用できることを理解されたい。
【００４６】
実際に、本明細書が例示する広範な応用例は、抗原性Ｂ細胞エピトープに対する免疫応答の発生が必要なヒトおよび他の哺乳動物においていくつかの様々な症状の予防および治療における本発明のリポペプチドの一般性を示している。したがって、本発明は、特定の症状、不調または病態の治療だけに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】合成ペプチドおよびリポペプチド（左）の構造、ならびに生理食塩水中のこれらのペプチドおよびリポペプチドの相対的な可溶性（右）を示した図である。
【図２】図１において［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］（左）およびＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］（右）と命名されたリポペプチドの可溶性を示す写真である。
【図３】図１に示すペプチドおよびリポペプチドの各々を用いて得られる抗ＬＨＲＨ抗体価を示すグラフである。
【図４】リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］（配列番号７）の接種後の二次抗体応答中に得られたまたは誘発された、各抗ＬＨＲＨ抗体アイソタイプ（すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３および総Ｉｇ）（横軸）に対する抗ＬＨＲＨ抗体価（ｌｏｇ１０）（縦軸）を示すグラフである。
【図５】図１に示したペプチドおよびリポペプチド（すなわち、配列番号５または配列番号７）が、樹状細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を増強させる相対能力を示すグラフである。
【図６】脂質付加［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］によって誘発される抗ＬＨＲＨ抗体応答を示すグラフである。
【図７ａ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｂ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｃ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｄ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｅ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｆ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｇ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図７ｈ】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図８】ペプチドと脂質部分の間にＳｅｒ−Ｓｅｒスペーサーを有する図７の説明に示すリポペプチドの免疫原性を示すグラフである。
【図９】脂質部分とペプチド部分の間に位置する様々なスペーサーを有する図７のリポペプチド免疫原の免疫原性を示すグラフである。
【図１０】リポペプチド構築体［Ｔｈ］（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の品質管理データを示すグラフである。
【図１１】図１０の説明に記載したリポペプチド免疫原の免疫原性を、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する内部リジン残基に付加した脂質部分を有するリポペプチド免疫原と比較して示すグラフである。
【図１２】ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＡ群ストレプトコッカスＢ細胞エピトープ（「Ｊ１４」；配列番号１０１）を含み、配列番号１０６のアミノ酸配列、ならびに１個または２個の脂質部分を有するリポペプチドのマウスにおける血清ＩｇＧ誘導能力を示すグラフである。
【図１３】図１２の説明に示した非脂質付加ペプチドおよびリポペプチドによって誘発される抗血清のオプソニン化能力を示すグラフである。
【図１４】図１２の説明に示した非脂質付加ペプチドおよびリポペプチドがマウスにおいて唾液ＩｇＡを誘発する能力を示すグラフである。
【図１５】図１２の説明に示した非脂質付加Ｊ１４含有ペプチドおよびＪ１４含有リポペプチドがマウスにおいて糞便ＩｇＡを誘発する能力を示すグラフである。
【図１６】図１２の説明に示した非脂質付加ペプチドおよびリポペプチドを接種した後の細菌を用いた生存試験に対するマウスの能力を示すグラフである。
【図１７】ガストリンに基づくリポペプチド免疫原の免疫原性を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）のグループ（５動物／グループ）に、ペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを尾の付け根に皮下接種した。
【００４８】
図面の説明
図１は、合成ペプチドおよびリポペプチド（左）の構造、ならびに生理食塩水中のこれらのペプチドおよびリポペプチドの相対的な可溶性（右）を示した図である。ペプチドを以下のとおり命名した：
（１）インフルエンザウイルス赤血球凝集素の軽鎖（配列番号１）またはＣＤＶ−Ｆに由来するペプチドＰ２５（配列番号２４）からのＣＤ４＋  Ｔヘルパーエピトープから構成される［Ｔｈ］、
（２）ＬＨＲＨの残基１〜１０（配列番号２）、ＬＨＲＨの残基２〜１０（配列番号３）、またはＬＨＲＨの残基６〜１０（配列番号４）からなるＢ細胞エピトープ；Ａ群ストレプトコッカスのＭタンパク質のＢ細胞エピトープ（「ペプチドＪ１４」；配列番号１０１）；あるいはガストリンのＣ末端５残基内に含まれるガストリン（すなわち、「ペンタガストリン」）のＢ細胞エピトープ（配列番号１０２）から構成される［Ｂ］、
（３）（１）と（２）を有するポリペプチド（例えば、配列番号５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０９または１１１）から構成される［Ｔｈ］−［Ｂ］、および
（４）リジン残基によって分離された（１）と（２）を有するポリペプチド（例えば、配列番号７、９、１３、１０６、１０８、１１０または１１２）から構成される［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］。
【００４９】
リポペプチドを以下のとおり命名した：
（１）上記ペプチド［Ｔｈ］−［Ｂ］のＮ末端（すなわち、例えば、配列番号５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０９または１１１のいずれか１個のＮ末端）にコンジュゲートされた式（Ｉ）の脂質から構成されるＰａｍ３Ｃｙｓ−［Ｔｈ］−［Ｂ］、
（２）上記ペプチド［Ｔｈ］−［Ｂ］のＮ末端（すなわち、例えば、配列番号５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０９または１１１のいずれか１個のＮ末端）にコンジュゲートされた式（ＩＩＩ）のリポアミノ酸から構成されるＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］、
（３）上記ペプチド［Ｔｈ］−［Ｂ］のＮ末端（すなわち、例えば、配列番号５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０９または１１１のいずれか１個のＮ末端）にコンジュゲートされた式（ＩＩ）の脂質から構成されるＰａｍ２Ｃｙｓ−［Ｔｈ］−［Ｂ］、
（４）上記ペプチド［Ｔｈ］−［Ｂ］のＮ末端（すなわち、例えば、配列番号５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０９または１１１のいずれか１個のＮ末端）にコンジュゲートされた式（ＩＶ）の脂質から構成されるＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］、
（５）ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］（例えば、配列番号７、９、１３、１０６、１０８、１１０または１１２のいずれか１個）と前記ペプチドの内部リジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基にコンジュゲートされた式（Ｉ）の脂質とから構成される［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］、
（６）ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］（例えば、配列番号７、９、１３、１０６、１０８、１１０または１１２のいずれか１個）と前記ペプチドの内部リジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基にコンジュゲートされた式（ＩＩ）の脂質とから構成される［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］、および
（７）内部リジン（Ｌｙｓ）のεアミノ基を介してセリンホモ二量体（すなわち、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、次いで式（ＩＩ）の脂質に順次コンジュゲートされたペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］（例えば、配列番号７、９、１３、１０６、１０８、１１０または１１２のいずれか１個）から構成される［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］。したがって、この分枝リポペプチドを製造するために、リジン残基のε−アミノ基に２個のセリン残基を付加した後に脂質部分を結合させた。
【００５０】
インフルエンザウイルス赤血球凝集素Ｔヘルパーエピトープ（配列番号１）およびＬＨＲＨ１〜１０ Ｂ細胞エピトープ（配列番号２）に基づくペプチドおよびリポペプチドの低可溶性（−）から高可溶性（＋＋＋＋）までの相対的な可溶性を図の右側に示す。
【００５１】
図２は、図１において［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］（左）およびＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］（右）と命名されたリポペプチドの可溶性を示す写真である。ここで、ポリペプチド部分は、それぞれ配列番号７および配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する。両方の溶液は、約１ｍｇ／ｍｌのリポペプチド生理食塩水である。リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］を含む溶液の高い透明性は、リポペプチドＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］よりも高度に可溶性であることを示している。
【００５２】
図３は、図１に示すペプチドおよびリポペプチドの各々を用いて得られる抗ＬＨＲＨ抗体価を示すグラフである。ここで、ポリペプチド部分は、配列番号５または配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する。Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４で示される陰性対照リポペプチドは、アミノ酸配列がＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１７）のペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた式（Ｉ）の脂質から構成された。一次接種（白丸）と二次接種（黒丸）の両方ですべてのペプチドおよびリポペプチドを生理食塩水に溶解して皮下（ｓ．ｃ．）投与した。２個の非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］および［Ｔｈ］−［Ｂ］を、一次接種では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に入れて、二次接種では不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に入れて投与した。ペプチド［Ｔｈ］−［Ｂ］をリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓ−Ｌｙｓ４と組み合わせて投与する場合には、ペプチドを生理食塩水に溶解し、図示したように１：１または１：５モル比でリポペプチドと混合した。投与したペプチド免疫原およびリポペプチド免疫原の用量は２０ｎｍｏｌであった。すべての場合において、対照動物グループには、初回抗原刺激ではＣＦＡに乳化した生理食塩水、および二次接種ではＩＦＡに乳化した生理食塩水を投与した。
【００５３】
図４は、リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］（配列番号７）の接種後の二次抗体応答中に得られたまたは誘発された、各抗ＬＨＲＨ抗体アイソタイプ（すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３および総Ｉｇ）（横軸）に対する抗ＬＨＲＨ抗体価（ｌｏｇ１０）（縦軸）を示すグラフである。２回目の用量のリポペプチドワクチンの生理食塩水溶液を皮下（白四角）または鼻腔内（黒四角）投与してから２週間後にマウスから採血した。
【００５４】
図５は、図１に示したペプチドおよびリポペプチド（すなわち、配列番号５または配列番号７）が、樹状細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を増強させる相対能力を示すグラフである。ペプチドおよびリポペプチドを図１の命名法に従って各パネル中に示す。各ペプチドまたはリポペプチドに対して、８×１０４個のＤ１細胞を４．５ｆｍｏｌのペプチドまたはリポペプチドに暴露し、終夜インキュベートした。細胞を回収し、ＦＩＴＣ複合抗ｌ−Ｅｋ，ｄモノクローナル抗体で染色後にＭＨＣクラスＩＩ分子発現をフローサイトメトリーによって測定した。各試料について約３×１０４個のＤ１細胞を分析した。示したデータは、４回の独立した実験の代表的なものであり、リポペプチド、特にリポ多糖（ＬＰＳ）に曝露されたＤ１細胞で認められるレベルに近いＤ１成熟速度を誘導するリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の投与後のモノクローナル抗体による染色性の向上（すなわち、Ｄ１細胞成熟の促進）を示している。非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］を用いて得られるデータは、ペプチド、リポペプチドまたはＬＰＳを添加しない培地中でインキュベートしたＤ１細胞の場合と実質的に同じであり、これは約２６％の自然成熟速度である。
【００５５】
図６は、脂質付加［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］によって誘発される抗ＬＨＲＨ抗体応答を示すグラフである。ここで、［Ｔｈ］は、インフルエンザ赤血球凝集素の軽鎖に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ（配列番号１）からなり、［Ｂ］は、ＬＨＲＨ１〜１０（配列番号２）またはＬＨＲＨ６〜１０（すなわち、ＬＨＲＨのＣ末端５残基；配列番号４）であり、脂質部分とペプチド部分の間に位置するセリンスペーサー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）が存在してもしなくてもよい。リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−ＧｌｙＬｅｕＡｒｇＰｒｏＧｌｙは、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］に構造的に類似しているが、このリポペプチドは、配列番号２の代わりに配列番号４を含む。
【００５６】
図７は、ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＬＨＲＨ２〜１０（配列番号３）に基づく様々なリポペプチド構築体の構造データ、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルデータを示すグラフである。ここで、ペプチド部分は、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、脂質部分は、（１）Ｐａｍ２Ｃｙｓ、（２）Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、（３）Ｌａｕ２Ｃｙｓおよび（４）Ｏｃｔ２ｃｙｓからなる群から選択される。以下の様々なスペーサー、すなわち（１）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、２個のセリン残基；（２）Ａｒｇ−Ａｒｇ、２個のアルギニン残基；および（３）Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、も脂質部分とペプチド部分の間に位置した。リポペプチドの構造を左カラムに示す。各リポペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを中間のカラムに示す。質量スペクトルを図の右カラムに示す。
【００５７】
図８は、ペプチドと脂質部分の間にＳｅｒ−Ｓｅｒスペーサーを有する図７の説明に示すリポペプチドの免疫原性を示すグラフである。ここで、脂質部分は、（１）Ｐａｍ２Ｃｙｓ、（２）Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、（３）Ｌａｕ２Ｃｙｓおよび（４）Ｏｃｔ２ｃｙｓからなる群から選択される。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齡）の各グループに、一次と二次ワクチン接種の両方でペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを皮下接種した。すべてのリポペプチドを生理食塩水に溶解して投与した。対照として、非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］をＣＦＡに入れて投与した。一次ワクチン接種後４週目（白丸）および二次ワクチン接種後２週目（黒丸）に採取した血液から血清を得た。
【００５８】
図９は、脂質部分とペプチド部分の間に位置する様々なスペーサーを有する図７のリポペプチド免疫原の免疫原性を示すグラフである。特に、スペーサーは、セリンホモ二量体（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、アルギニンホモ二量体（Ａｒｇ−Ａｒｇ）または６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）からなる。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齡）の各グループに、一次と二次ワクチン接種の両方でペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを皮下接種した。すべてのリポペプチドを生理食塩水に溶解して投与した。対照として、非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］をＣＦＡに入れて投与した。一次ワクチン接種後４週目（白丸）および二次ワクチン接種後２週目（黒丸）に採取した血液から血清を得た。
【００５９】
図１０は、リポペプチド構築体［Ｔｈ］（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の品質管理データを示すグラフである。ここで、脂質部分は、配列番号１０３で示されるペプチドのヘルパーＴ細胞エピトープ内の内部リジン残基（Ｌｙｓ−１４）のε−アミノ基に結合（pendant）している。リポペプチドの構造を左カラムに示す。リポペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを中間のカラムに示す。質量スペクトルデータを図の右カラムに示す。
【００６０】
図１１は、図１０の説明に記載したリポペプチド免疫原の免疫原性を、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する内部リジン残基に付加した脂質部分を有するリポペプチド免疫原と比較して示すグラフである（すなわち、脂質部分が、配列番号９で示すアミノ酸配列に付加しており、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に付加した内部リジンを有する点で配列番号１０３とは異なる）。配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する対照の非脂質付加ペプチド（すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］）も対照として用いた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齡）の各グループに、一次と二次ワクチン接種の両方でペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを皮下接種した。すべてのリポペプチドを生理食塩水に溶解して投与した。対照の非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］をＣＦＡに入れて投与した。一次ワクチン接種後４週目（白丸）および二次ワクチン接種後２週目（黒丸）に採取した血液から血清を得た。リポペプチド構築体［Ｔｈ］（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］は、ヘルパーＴ細胞エピトープ内のリジン残基（Ｌｙｓ−１４）のε−アミノ基に結合した脂質部分を有する。リポペプチド構築体［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］は、２個のペプチドエピトープ間に位置するリジン残基のε−アミノ基に結合した脂質を有する。
【００６１】
図１２は、ＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号２４）およびＡ群ストレプトコッカスＢ細胞エピトープ（「Ｊ１４」；配列番号１０１）を含み、配列番号１０６のアミノ酸配列、ならびに１個または２個の脂質部分を有するリポペプチドのマウスにおける血清ＩｇＧ誘導能力を示すグラフである。すべての試験リポペプチドにおいて、リポアミノ酸部分Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒは、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する内部リジンに付加した。リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｊ１４］においては、これが唯一の脂質部分であるのに対して、リポペプチドＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｊ１４］においては、別のリポアミノ酸部分Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＳｅｒをＴヘルパーエピトープのＮ末端アミノ基に付加した。他の免疫原は以下のとおりであった。すなわち、Ｊ１４  Ｂ細胞エピトープ含有ペプチド（配列番号１０１）からなる非脂質付加ペプチドＪ１４、Ｔヘルパーエピトープ（配列番号２４）とＪ１４ペプチド（配列番号１０１）からなり、配列番号１０６のアミノ酸配列を有する非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−［Ｊ１４］、Ｔヘルパーエピトープ（配列番号２４）とＬＨＲＨ  Ｂ細胞エピトープ含有ペプチド（配列番号３）からなり、配列番号９のアミノ酸配列を有する脂質付加ペプチド、ならびにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であった。４〜６週齡の非近交系クァッケンブッシュ（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ）雌マウス（１５／グループ）にペプチドを主体とするワクチン６０μｇを総量３０μｌのＰＢＳに溶解して鼻腔内接種した。マウスにワクチンを２１日間隔で３回投与した。最終投与から７日後に、マウスの尾静脈から採血し、Ｊ１４特異的血清ＩｇＧを測定した。いずれかのＪ１４含有リポペプチドを与えたマウスは、対照グループよりも有意に高い（Ｐ＜０．０５）血清ＩｇＧ力価を示した。
【００６２】
図１３は、図１２の説明に示した非脂質付加ペプチドおよびリポペプチドによって誘発される抗血清のオプソニン化能力を示すグラフである。４〜６週齡の非近交系クァッケンブッシュ雌マウス（１５／グループ）に、ペプチドを主体とするワクチン６０μｇを総容積３０μｌのＰＢＳに溶解して鼻腔内接種した。マウスにワクチンを２１日間隔で３回投与した。間接的な殺菌アッセイを実施して、免疫マウスから得た血清がＭ１  ＧＡＳ系統をインビトロでオプソニン化するまたは「死滅させる」かどうかを判定した。いずれかのＪ１４含有リポペプチドで免疫されたマウスから採取した血清は、対照ペプチドまたはリポペプチドまたはＰＢＳで免疫されたマウスから採取した血清よりもＧＡＳを有意に死滅させることができた（Ｐ＜０．０５）。
【００６３】
図１４は、図１２の説明に示した非脂質付加ペプチドおよびリポペプチドがマウスにおいて唾液ＩｇＡを誘発する能力を示すグラフである。４〜６週齡の非近交系クァッケンブッシュ雌マウス（１５匹／グループ）に、各ペプチドを主体とするワクチン６０μｇを総容積３０μｌのＰＢＳに溶解して鼻腔内接種した。マウスにワクチンを２１日間隔で３回投与した。最終投与から８日後に、個々のマウスから唾液を採取し、Ｊ１４−特異的唾液ＩｇＡ平均抗体価を標準ＥＬＩＳＡによって求めた。いずれかのＪ１４含有リポペプチドを接種したマウスは、対照ペプチドまたは対照リポペプチドまたはＰＢＳで免疫された対照グループよりも有意に高い力価を示した（Ｐ＜０．０５）。
【００６４】
図１５は、図１２の説明に示した非脂質付加Ｊ１４含有ペプチドおよびＪ１４含有リポペプチドがマウスにおいて糞便ＩｇＡを誘発する能力を示すグラフである。４〜６週齡の非近交系クァッケンブッシュ雌マウス（１５匹／グループ）に、ペプチドを主体とするワクチン６０μｇを総容積３０μｌのＰＢＳに溶解して鼻腔内接種した。マウスにワクチンを２１日間隔で３回投与した。抗原の最終投与から６日後に糞便ＩｇＡを求めた。脂質部分がＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する単一脂質付加Ｊ１４含有ペプチド（すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｊ１４］）を接種したマウスのみが、有意（Ｐ＜０．０５）な糞便ＩｇＡ力価を示した。
【００６５】
図１６は、図１２の説明に示した非脂質付加ペプチドおよびリポペプチドを接種した後の細菌を用いた生存試験に対するマウスの能力を示すグラフである。抗原の最終投与から２週間後に、Ｍ１  ＧＡＳ系統をマウスに鼻腔内投与し、その後様々な時点で生存しているかどうかを確認した。脂質部分がＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する単一脂質付加Ｊ１４含有ペプチド（すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｊ１４］）を接種したマウスは、投与後最も良い生存率を示した。
【００６６】
図１７は、ガストリンに基づくリポペプチド免疫原の免疫原性を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）のグループ（５動物／グループ）に、ペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを尾の付け根に皮下接種した。使用したペプチドは、ガストリン−１７（配列番号１１３）；ペンタガストリンが（配列番号１０２）で示されるガストリンのＣ末端配列ＧＷＭＤＦである［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ペンタガストリン］（配列番号１１０）；および［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ペンタガストリン］（脂質が内部リジン残基に付加した配列番号１１０）であった。すべてのリポペプチドをＰＢＳ溶液として投与し、非脂質付加ペプチドをＣＦＡに入れて投与した。陰性対照は、ＣＦＡで乳化した生理食塩水であった。免疫から４週後にマウスから血清を得た。同時に、ほぼ同じ用量の２回目の抗原をマウスに投与した。２回目の抗原投与から２週間後に２回目の採血を行い、ペプチドガストリン−１７配列と反応可能な抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。結果を抗ガストリン−１７抗体力価として表す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
リポペプチド
本発明の一態様は、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされたポリペプチドを含む単離リポペプチドを提供する。ここで、
（ｉ）前記ポリペプチドは、
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列およびＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、ならびに
（ｂ）内部リジンまたは内部リジン類似体のε−アミノ基または末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々が共有結合するための１個または複数の前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含むアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個または複数の内部リジン残基のε−アミノ基または前記内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的または間接的に共有結合している。
【００６８】
本明細書で使用する「リポペプチド」という用語は、直接的または間接的にコンジュゲートされた１個または複数の脂質部分と１個または複数のアミノ酸配列とを含む任意の非天然組成物を意味する。前記組成物は、非特異的なコンジュゲートされていない脂質またはタンパク質を実質的に含まない。
【００６９】
「直接的に」とは、脂質部分とアミノ酸配列がスペーサー分子によって分離されていないことを意味する。
【００７０】
「間接的に」とは、脂質部分とアミノ酸配列が、１個または複数の炭素含有分子、例えば、１個または複数のアミノ酸残基などを含むスペーサーによって分離されていることを意味する。
【００７１】
アミノ酸配列は、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの両方の官能基の要件によって制約される任意の長さにすることができる。
【００７２】
本明細書で使用する、「内部リジン残基」という用語は、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの両方を含むポリペプチド中のリジン残基を意味し、前記リジンは前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基でもＣ末端残基でもない。これは、脂質部分が結合する内部リジン残基が、Ｔヘルパー細胞エピトープのアミノ酸配列、または抗原のアミノ酸配列中に存在する残基であることを意味する。また内部リジン残基は、ＴヘルパーエピトープともＢ細胞エピトープとも異なることができ、その場合には、内部リジン残基は、ポリペプチドのこれらの２個のエピトープを連結しなければならない。
【００７３】
同様に、「内部リジン類似体残基」という用語は、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの両方を含むポリペプチド中のリジン類似体残基を意味し、前記リジン類似体は前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基でもＣ末端残基でもない。リジン残基が「内部」であるかどうかを確認する判定基準は、リジン類似体が内部であるかどうかの判定を準用する。
【００７４】
「リジン類似体」とは、アミノ側鎖を有するアミノ酸類似体または非天然アミノ酸を含めて、脂質部分が結合できる適切な側鎖を有するペプチドの内部に組み込むことができる合成化合物を意味する。好ましいリジン類似体としては、以下の一般式（Ｖ）の化合物などがある：
【化３】
2010155832.tif 000007
【００７５】
〔式中、ｎは０〜３の整数であり、Ｘは、ＮＨ、ＯおよびＳからなる群から選択される、前記内部リジン類似体残基の末端側鎖基である。より好ましくは、ｎは１〜３の整数である。より好ましくは、Ｘは、アミノ基であり、リジン類似体はジアミノ化合物である。特に好ましい実施形態においては、リジン類似体は、２，３ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）および２，５−ジアミノ吉草酸［すなわち、オルニチン（Ｏｒｎ）］からなる群から選択される〕。
【００７６】
当業者は、「ε−アミノ基」という用語の意味を知っているはずである。
【００７７】
「末端側鎖基」という用語は、前記類似体のα炭素の遠位にあるリジン類似体の側鎖上の置換基、例えば、Ｄｐｒのβ−アミノ、Ｄａｂのγ−アミノ、Ｏｒｎのδ−アミノなどを意味する。
【００７８】
本発明者らは、最も有効なリポペプチドは高度に可溶性であることを見出した。外部アジュバントの不在下で抗体応答を誘発する本発明のリポペプチドの相対能力は、未成熟樹状細胞（ＤＣ）、特にWinzler et al J Exp Med 185、317、1997）に記載されたＤ１細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレートし得ることによって示された。
【００７９】
当業者には公知のとおり、リジンのεアミノ基は、このアミノ酸の側鎖の末端アミノ基である。リジンのεアミノ基またはリジン類似体の末端側鎖基を脂質部分への架橋に使用すると、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの両方を組み込んだ共直線アミノ酸配列としてのポリペプチド部分の合成が容易になる。脂質がリジン残基のεアミノ基、またはリジン類似体の末端側鎖基を介して結合したリポペプチドと、リジンのαアミノ基を介して結合した脂質を有するリポペプチドとの構造上の違いは明白である。というのは、後者のリポペプチドは、Ｎ末端残基にコンジュゲートされた脂質部分しか有することができないからである。
【００８０】
したがって、脂質部分が結合する少なくとも１個の内部リジン残基または内部リジン類似体は、免疫学的に機能するエピトープを分離するようにポリペプチド部分内に位置することが特に好ましい。例えば、内部リジン残基または内部リジン類似体残基は、各エピトープ間のスペーサーおよび／または連結残基として作用することができる。内部リジンまたは内部リジン類似体がＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する場合には、ポリペプチドのアミノ酸配列から分枝が形成されるにもかかわらず、脂質部分がこれらのエピトープ間の位置に結合することは言うまでもない。単一の内部リジン残基または内部リジン類似体を使用してＢ細胞エピトープとＴヘルパーエピトープを分離することが好ましい（例えば、配列番号７、９、１３、１０６、１０８、１１０または１１２のいずれか１個）。この場合には、脂質部分は、Ｔヘルパーエピトープと抗原性Ｂ細胞エピトープの各アミノ酸配列の間に位置するリジン残基のεアミノ基、またはリジン類似体の末端側鎖基を介して結合する。
【００８１】
内部リジンのεアミノ基、またはリジン類似体の末端側鎖基は、他のアミノ酸のα−アミノ基および側鎖官能基を保護するために使用される化学基と直交性の化学基によって保護することができる。このようにして、リジンのεアミノ基またはリジン類似体の末端側鎖基を選択的に露出させて、εアミノ基または末端側鎖基の特異的な脂質含有部分などの化学基を適宜結合させることができる。
【００８２】
Ｆｍｏｃ化学を利用したペプチド合成の場合には、適切な直交性に保護されたリジンのε基は、修飾アミノ酸残基Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−４−メチルトリチル−Ｌ−リジン）によって与えられる。類似の適切な直交性保護側鎖基、例えば、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎδ−４−メチルトリチル−Ｌ−オルニチン）、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎγ−４−メチルトリチル−Ｌ−ジアミノ酪酸）およびＦｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎβ−４−メチルトリチル−Ｌ−ジアミノプロピオン酸）が、本明細書で企図される様々なリジン類似体に利用可能である。側鎖保護基Ｍｔｔは、リジンまたはリジン類似体のαアミノ基上に存在するＦｍｏｃ基が除去される条件では安定であるが、トリフルオロ酢酸の１％ジクロロメタン溶液で選択的に除去することができる。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシ−１−イリデン）エチル−Ｌ−リジン）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシ−１−イリデン）−３−メチルブチル−Ｌ−リジン）も本発明において使用することができる。ここで、Ｄｄｅ側鎖保護基は、ペプチド合成中にヒドラジンで処理して選択的に除去される。
【００８３】
Ｂｏｃ化学を利用したペプチド合成の場合には、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを使用することができる。側鎖保護基Ｆｍｏｃは、ピペリジンまたはＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン）で処理して選択的に除去することができるが、トリフルオロ酢酸を用いてα末端からＢｏｃ基を除去するときには所定の位置に残留する。
【００８４】
本発明のリポペプチドにおけるＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの最適距離、したがって、内部リジンまたはリジン類似体残基の正確な位置および数は、Ｔヘルパーエピトープ、Ｂ細胞エピトープおよび脂質の各組合せに対して経験的に容易に決定される。合成ペプチドおよびポリペプチドの場合には、ポリペプチドを調製するのに使用される合成方法の制約によって、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの実現可能な分離、内部リジンまたはリジン類似体残基の数および位置をある程度決めることができる。
【００８５】
好ましくは、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープは、単一の内部リジン残基またはリジン類似体残基を含めて、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸残基によって分離される。
【００８６】
本発明は、ポリペプチド部分に対する複数の脂質部分の付加を明確に企図する。これを達成するために、ポリペプチドは、複数の内部リジン残基または複数の内部リジン類似体残基またはそれらの組合せを含むことができる。複数の内部リジンまたはリジン類似体残基がより近くに位置する場合には、脂質を付加する際に立体障害が起こり、それによって最終生成物の混合物が製造され、または収率が低下する恐れがある。
【００８７】
この考察に関連して、Ｔヘルパーエピトープを含むアミノ酸配列全体、またはＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列全体が免疫機能を有する必要はない。したがって、前記アミノ酸配列は、前記エピトープを含みながら、Ｔヘルパー細胞活性またはＢ細胞エピトープを含まない配列をさらに有することができる。このような追加の配列が１個または複数の内部リジンまたはリジン類似体残基を含む場合には、このような残基の末端側鎖基は、脂質部分の結合部位として働くことができる。Ｔヘルパー機能およびＢ細胞エピトープ機能を保持することが必須であることは言うまでもない。
【００８８】
脂質部分が結合する内部リジン残基または内部リジン類似体の位置も、脂質部分の結合が、リポペプチドを投与する被験体におけるＴヘルパーエピトープまたはＢ細胞エピトープの免疫機能を妨げないように選択すべきである。例えば、脂質部分の選択によっては、Ｂ細胞エピトープ内の前記脂質の結合が抗原提示の立体障害になり得る。
【００８９】
内部リジンまたは内部リジン類似体がＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する本発明のリポペプチドの一般化された好ましい形態は、一般式（ＶＩ）によって示される：
【化４】
2010155832.tif 000008
【００９０】
〔式中、
エピトープは、ＴヘルパーエピトープまたはＢ細胞エピトープであり、
Ａは、存在しても存在しなくてもよく、約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、
ｎは、１、２、３または４の整数であり、
Ｘは、ＮＨ、ＯおよびＳからなる群から選択される末端側鎖基であり、好ましくはＮＨからなり、
Ｙは、存在しても存在しなくてもよく、約１〜約６アミノ酸長のスペーサーからなり、前記スペーサーは、アルギニン、セリンまたは６−アミノヘキサン酸を含むことが好ましく、
Ｚは、脂質部分、好ましくはＰａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２ＣｙｓおよびＯｃｔ２Ｃｙｓからなる群から選択されるリポアミノ酸部分である〕。
【００９１】
当業者は、Ｓｔｅ２Ｃｙｓが、Ｓ−［２，３−ビス（ステアロイルオキシ）プロピル］システインまたはジステアロイル−Ｓ−グリセリル−システインとしても知られ、Ｌａｕ２Ｃｙｓが、Ｓ−［２，３−ビス（ラウロイルオキシ）プロピル］システインまたはジラウロイル−Ｓ−グリセリル−システイン）としても知られ、Ｏｃｔ２Ｃｙｓが、Ｓ−［２，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロピル］システインまたはジオクタノイル−Ｓ−グリセリル−システイン］としても知られることを知っているはずである。
【００９２】
Ｔヘルパーエピトープは、特定の標的被験体（すなわち、ヒト被験体、あるいは特定の非ヒト動物被験体、例えば、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ウマ、ブタまたはヤギ）において免疫応答を高めるための当業者に公知の任意のＴヘルパーエピトープである。好ましいＴヘルパーエピトープは、少なくとも約１０〜２４アミノ酸長、より一般的には約１５〜約２０アミノ酸長である。
【００９３】
乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープは、化学的に容易に合成され、複数のＴヘルパーエピトープを含むより長いポリペプチドを使用する必要がないので特に好ましい。
【００９４】
本発明のリポペプチドに使用するのに適した乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープの例は、以下からなる群より選択される：
（１）破傷風トキソイドペプチド（ＴＴＰ）のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ、例えば、ＴＴＰのアミノ酸８３０〜８４３など（Panina-Bordignon et al.、Eur.J.Immun.19、2237〜2242、1989）、
（２）プラスモディウム・ファルシパルムｐｆｇ２７のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ、
（３）乳酸デヒドロゲナーゼのげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ、
（４）ＨＩＶまたはＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ（Berzofsky et al.、J.Clin.Invest.88、876〜884、1991）、
（５）既知のアンカータンパク質のアミノ酸配列から予測される合成ヒトＴヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ）（Alexander et al、Immunity 1、751〜761、1994）、
（６）麻疹ウイルス融合タンパク質のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ（ＭＶ−Ｆ；Muller et al.、Mol.Immunol.32、37〜47、1995；Partidos et al.、J.Gen.Virol.、71、2099〜2105、1990）、
（７）イヌジステンパーウイルス融合タンパク質（ＣＤＶ−Ｆ）の少なくとも約１０個のアミノ酸残基、例えば、ＣＤＶ−Ｆのアミノ酸位置１４８〜２８３からの残基を含むＴヘルパーエピトープ（Ghosh et al.、Immunol.104、58〜66、2001；国際公開特許第00/46390号）、
（８）ＭＵＣ１ムチンの細胞外直列型反復ドメインのペプチド配列に由来するヒトＴヘルパーエピトープ（米国特許出願第0020018806号）、
（９）インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＩＶ−Ｈ）のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ（Jackson et al Virol.198、613〜623、1994、および
（１０）口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ−０１カウフボイレン（Kaufbeuren）系統）のＶＰ３タンパク質の残基１７３〜１７６、あるいは別の系統のＦＭＤＶの対応するアミノ酸を含むウシまたはラクダＴヘルパーエピトープ。
【００９５】
当業者には知られているとおり、Ｔヘルパーエピトープは、様々な種の１種類または複数の哺乳動物によって認識されうる。したがって、本明細書に記載のＴヘルパーエピトープの名称は、エピトープが認識される種の免疫系に限定されると考えるべきではない。例えば、げっ歯類Ｔヘルパーエピトープは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、または他のげっ歯類、あるいはヒトまたはイヌの免疫系によって認識される。
【００９６】
より好ましくは、Ｔヘルパーエピトープは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含みうる：
（１）ＩＶ−ＨのＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号１）；
（２）ＩＶ−ＨのＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号１８）；
（３）ＭＶ−ＦのＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶ（配列番号１９）；
（４）ＣＤＶ−ＦのＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡＬＨＱＳＮＬＮ（配列番号２０）；
（５）ＣＤＶ−ＦのＩＧＴＤＮＶＨＹＫＩＭＴＲＰＳＨＱ（配列番号２１）；
（６）ＣＤＶ−ＦのＹＫＩＭＴＲＰＳＨＱＹＬＶＩＫＬＩ（配列番号２２）；
（７）ＣＤＶ−ＦのＳＨＱＹＬＶＩＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥ（配列番号２３）；
（８）ＣＤＶ−ＦのＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬ（配列番号２４）；
（９）ＣＤＶ−ＦのＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＧＥＹＥＫＬＬ（配列番号２５）；
（１０）ＣＤＶ−ＦのＡＥＬＧＥＹＥＫＬＬＮＳＶＬＥＰＩ（配列番号２６）；
（１１）ＣＤＶ−ＦのＫＬＬＮＳＶＬＥＰＩＮＱＡＬＴＬＭ（配列番号２７）；
（１２）ＣＤＶ−ＦのＥＰＩＮＱＡＬＴＬＭＴＫＮＶＫＰＬ（配列番号２８）；
（１３）ＣＤＶ−ＦのＴＬＭＴＫＮＶＫＰＬＱＳＬＧＳＧＲ（配列番号２９）；
（１４）ＣＤＶ−ＦのＫＰＬＱＳＬＧＳＧＲＲＱＲＲＦＡＧ（配列番号３０）；
（１５）ＣＤＶ−ＦのＳＧＲＲＱＲＲＦＡＧＶＶＬＡＧＶＡ（配列番号３１）；
（１６）ＣＤＶ−ＦのＦＡＧＶＶＬＡＧＶＡＬＧＶＡＴＡＡ（配列番号３２）；
（１７）ＣＤＶ−ＦのＧＶＡＬＧＶＡＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡ（配列番号３３）；
（１８）ＣＤＶ−ＦのＧＩＡＬＨＱＳＮＬＮＡＱＡＩＱＳＬ（配列番号３４）；
（１９）ＣＤＶ−ＦのＮＬＮＡＱＡＩＱＳＬＲＴＳＬＥＱＳ（配列番号３５）；
（２０）ＣＤＶ−ＦのＱＳＬＲＴＳＬＥＱＳＮＫＡＩＥＥＩ（配列番号３６）；
（２１）ＣＤＶ−ＦのＥＱＳＮＫＡＩＥＥＩＲＥＡＴＱＥＴ（配列番号３７）；
（２２）ＣＤＶ−ＦのＳＳＫＴＱＴＨＴＱＱＤＲＰＰＱＰＳ（配列番号３８）；
（２３）ＣＤＶ−ＦのＱＰＳＴＥＬＥＥＴＲＴＳＲＡＲＨＳ（配列番号３９）；
（２４）ＣＤＶ−ＦのＲＨＳＴＴＳＡＱＲＳＴＨＹＤＰＲＴ（配列番号４０）；
（２５）ＣＤＶ−ＦのＰＲＴＳＤＲＰＶＳＹＴＭＮＲＴＲＳ（配列番号４１）；
（２６）ＣＤＶ−ＦのＴＲＳＲＫＱＴＳＨＲＬＫＮＩＰＶＨ（配列番号４２）；
（２７）ＣＤＶ−ＦのＴＥＬＬＳＩＦＧＰＳＬＲＤＰＩＳＡ（配列番号４３）；
（２８）ＣＤＶ−ＦのＰＲＹＩＡＴＮＧＹＬＩＳＮＦＤＥＳ（配列番号４４）；
（２９）ＣＤＶ−ＦのＣＩＲＧＤＴＳＳＣＡＲＴＬＶＳＧＴ（配列番号４５）；
（３０）ＣＤＶ−ＦのＤＥＳＳＣＶＦＶＳＥＳＡＩＣＳＱＮ（配列番号４６）；
（３１）ＣＤＶ−ＦのＴＳＴＩＩＮＱＳＰＤＫＬＬＴＦＩＡ（配列番号４７）；
（３２）ＣＤＶ−ＦのＳＰＤＫＬＬＴＦＩＡＳＤＴＣＰＬＶ（配列番号４８）；
（３３）ＭＵＣ−１のＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号４９）；
（３４）ＭＵＣ−１のＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳＳＬ（配列番号５０）；
（３５）ＭＵＣ−１のＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳＬ（配列番号５１）；
（３６）ＭＵＣ−１のＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫＫＧ（配列番号５２）；
（３７）ＭＵＣ−１のＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（配列番号５３）；
（３８）ＦＭＤＶ−ＶＰ３タンパク質のＧＶＡＥ（配列番号５４）；
（３９）ＦＭＤＶ−ＶＰ３タンパク質のＴＡＳＧＶＡＥＴＴＮ（残基１７０から１７９）（配列番号５５）；および
（４０）ＦＭＤＶのＴＡＫＳＫＫＦＰＳＹＴＡＴＹＱＦ（配列番号５６）。
【００９７】
本明細書に開示するＴヘルパーエピトープは、単に例示のためにすぎない。当業者に公知の標準ペプチド合成技術を用いて、本明細書に言及するＴヘルパーエピトープを異なるＴヘルパーエピトープと容易に置換して、本発明のリポペプチドを異なる種での使用に適合させることができる。したがって、標的種において免疫応答を誘発または増大するのに有用であることが当業者に知られている別のＴヘルパーエピトープを除外すべきではない。
【００９８】
別のＴヘルパーエピトープは、詳細な分析によって、適切な配列を特定するための成分タンパク質、タンパク質断片およびペプチドのインビトロでのＴ細胞刺激技術を用いて特定することができる（Goodman and Sercarz、Ann.Rev.Immunol.、1、465、(1983)；Berzofsky、In:「The Year in Immunology、Vol.2」page 151、Karger、Basel、1986；およびLivingstone and Fathman、Ann.Rev.Immunol.、5、477、1987）。
【００９９】
Ｂ細胞エピトープは、好都合には、限定されるものではないが、哺乳動物被験体、または細菌、真菌、原生動物、または前記被験体に感染する寄生生物に由来する抗原を含むウイルス、原核生物または真核生物の免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質のアミノ酸配列に由来する。免疫応答が望まれるイディオタイプおよび抗イディオタイプのＢ細胞エピトープが特に含まれ、脂質で修飾されたＢ細胞エピトープも含まれる。あるいは、Ｂ細胞エピトープは、炭水化物抗原、例えば、ＡＢＨ血液型抗原、移植抗原（例えば、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；Sandrin et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90、11391〜11395、1993；Galili et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84、1369〜1373、1987；Schofield et al.、Nature 418:785〜789、2002）またはそれらの複合体とすることができる。
【０１００】
Ｂ細胞エピトープは、哺乳動物に投与すると抗体、好ましくは中和抗体、より好ましくは高力価中和抗体の産生を誘導することができる。
【０１０１】
ペプチド合成を容易にするために、より短いＢ細胞エピトープが好ましい。
【０１０２】
Ｂ細胞エピトープの長さは、約３０アミノ酸長を超えないことが好ましい。より好ましくは、Ｂ細胞エピトープ配列は、約２５アミノ酸残基以下、より好ましくは２０アミノ酸残基未満、さらにより好ましくは約５〜２０アミノ酸残基長からなる。
【０１０３】
ペプチドは、Ｂ細胞エピトープが由来する天然のポリペプチドのコンホメーションを模倣したコンホメーションをとることが好ましい。
【０１０４】
寄生生物に由来する好ましいＢ細胞エピトープは、リーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ症、バベシア症、または住血吸虫病に関連するＢ細胞エピトープであり、例えば、以下からなる群より選択されるＢ細胞エピトープである：
（１）プラスモディウム・ファルシパルム（ＮＡＮＰ）３のＢ細胞エピトープ（Good et al.、J.Exp.Med.164、655 1986）、
（２）サーカムスポロゾア（Circumsporozoa）のＢ細胞エピトープ（Good et al.、Protein Sci.、235、1059、1987）、
（３）リーシュマニア・ドノヴァニ（leishmania donovani）反復ペプチドのアミノ酸残基３２６〜３４３を含むＢ細胞エピトープ（Liew et al.、J.Exp.Med.172、1359(1990)）、
（４）トキソプラズマ・ゴンヂ（Toxoplasma gondii）Ｐ３０表面タンパク質のＢ細胞エピトープ（Darcy et al.、J.Immunol.149、3636(1992)）、および
（５）シストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）Ｓｍ−２８ＧＳＴ抗原のＢ細胞エピトープ（Wolowxzuk et al.、J.Immunol 146:1987(1991)）。
【０１０５】
好ましいウイルス特異的Ｂ細胞エピトープは、ロタウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス（例えば、アフトウイルス（Aphthovirus））、呼吸器シンシチウムウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｉ型ウシヘルペスウイルス、ウシ下痢ウイルス、ウシロタウイルス、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、ウマ鼻炎Ｂウイルス（ＥＲＢＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、肝炎ウイルスなどに由来し、かつ／またはこれらに対する抗体を産生することができる。適切なウイルスのＢ細胞エピトープとしては、限定されるものではないが、以下からなる群より選択されるエピトープが挙げられる：
（１）ＨＩＶ  ｇｐ１２０  Ｖ３  ｌｏｏｐ、アミノ酸残基３０８〜３３１（Jatsushita et al.、J.Virol.62、2107(1988)）、
（２）ＨＩＶ  ｇｐ１２０アミノ酸残基４２８〜４４３（Ratner et al.、Nature 313:277(1985)）、
（３）ＨＩＶ  ｇｐ１２０アミノ酸残基１１２〜１２４（Berzofsky et al.、Nature 334、706(1988)）、
（４）ＨＩＶ逆転写酵素のＢ細胞エピトープ（Hosmalin et al.Proc.Natl Acad.Sci.(USA)87、2344(1990)）、
（５）インフルエンザウイルス核タンパク質アミノ酸残基３３５〜３４９（Townsend et al.Cell 44、959(1986)）、
（６）インフルエンザウイルス核タンパク質アミノ酸残基３６６〜３７９（Townsend et al.Cell 44、959(1986)）、
（７）インフルエンザウイルス赤血球凝集素アミノ酸残基４８〜６６（Mills et al.、J.Exp.Med.163、1477(1986)）、
（８）インフルエンザウイルス赤血球凝集素アミノ酸残基１１１〜１２０（Hackett et al.、J.Exp.Med 158、294(1983)）、
（９）インフルエンザウイルス赤血球凝集素アミノ酸１１４〜１３１（Lamb and Green、Immunology 50、659(1983)）、
（１０）エプスタインバーＬＭＰアミノ酸残基４３〜５３（Thorley-Lawson et al.、Proc.Natl Acad.Sci.(USA)84、5384(1987)）、
（１１）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原アミノ酸残基９５〜１０９（Milich et al.、J.Immunol.134、4203(1985)）、
（１２）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原アミノ酸残基１４０〜１５４、
（１３）Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｓ抗原アミノ酸残基１２０〜１３２（Milich et al.、J.Exp.Med.164、532(1986)）、
（１４）単純ヘルペスウイルスｇＤタンパク質アミノ酸残基５〜２３（Jayaraman et al.、J.Immunol.151、5777(1993)）、
（１５）単純ヘルペスウイルスｇＤタンパク質アミノ酸残基２４１〜２６０（Wyckoff et al.、Immunobiol.、177、134(1988)）、
（１６）狂犬病糖タンパク質アミノ酸残基３２〜４４（MacFarlan et al.、J.Immunol.133、2748(1984)）、
（１７）ＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくともアミノ酸残基１３４〜１６８または１３７〜１６０または残基１４２〜１６０または残基１３７〜１６２または残基１４５〜１５０、あるいは別の血清型、例えば、血清型Ａ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３、ＡＳＩＡ１などの対応するアミノ酸残基を含む主要ＦＭＤＶエピトープ（米国特許第５，８６４，００８号および同第６，１０７，０２１号）、および
（１８）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）変異体ＡＤ７８のＥ２タンパク質の超可変領域−１（ＨＶＲ１）（Zibert et al.、J.Virol.79、4123〜4127、1997）。
【０１０６】
好ましい細菌特異的Ｂ細胞エピトープは、パスツレラ（Pasteurella）、アクチノバシラス（Actinobacillus）、ヘモフィルス（Haemophilus）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、大腸菌(E.coli)、シゲラ（Shigella）などに由来し、かつ／またはこれらに対する抗体を産生することができる。適切な細菌Ｂ細胞エピトープとしては、限定されるものではないが、以下からなる群より選択されるエピトープが挙げられる：
（１）マイコバクテリウム・ツベルキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）６５Ｋｄタンパク質アミノ酸残基１１２〜１２６（Lamb et al.、EMBO J.、6、1245(1987)）、
（２）マイコバクテリウム・ツベルキュローシス６５Ｋｄタンパク質アミノ酸残基１６３〜１８４（Lamb et al.、EMBO J.、6、1245(1987)）、
（３）マイコバクテリウム・ツベルキュローシス６５Ｋｄタンパク質アミノ酸残基２２７〜２４３（Lamb et al.、EMBO J.、6、1245(1987)）、
（４）マイコバクテリウム・ツベルキュローシス６５Ｋｄタンパク質アミノ酸残基２４２〜２６６（Lamb et al.、EMBO J.、6、1245(1987)）、
（５）マイコバクテリウム・ツベルキュローシス６５Ｋｄタンパク質アミノ酸残基４３７〜４５９（Lamb et al.、EMBO J.、6、1245(1987)）、
（６）マイコバクテリウム・ツベルキュローシスＥＳＡＴ−６タンパク質残基３〜１５（Morten et al.、Infect.Immun.66、717〜723、1998）、
（７）マイコバクテリウム・ツベルキュローシスＥＳＡＴ−６タンパク質残基４０〜６２（Morten et al.、Infect.Immun.66、717〜723、1998）、
（８）マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum）α抗原残基２７９〜２９０（Mikiko et al.、Microb.Path.23、95〜100、1997）、
（９）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ヌクレアーゼタンパク質アミノ酸残基６１〜８０（Finnegan et al.、J.Exp.Med.164、897(1986)）、
（１０）大腸菌耐熱性エンテロトキシンのＢ細胞エピトープ（Cardenas et al.、Infect.Immunity 61、4629(1993)）、
（１１）大腸菌易熱性エンテロトキシンのＢ細胞エピトープ（Clements et al.、Infect.Immunity 53、685(1986)）、
（１２）シゲラ・ソンネ（Shigella sonnei）Ｉ型抗原のＢ細胞エピトープ（Formal et al.、Infect.Immunity 34、746(1981)）、
（１３）Ａ群ストレプトコッカスに由来するＢ細胞エピトープ、好ましくはＭタンパク質に由来するＢ細胞エピトープ、より好ましくはＭタンパク質のＣ末端半分に由来するＢ細胞エピトープ、ならびにより好ましくはＭタンパク質の保存Ｃ末端半分に由来し、らせん状の折りたたみ、および最小、らせん状、非宿主交差反応性ペプチド内で示される抗原性を維持するように設計された非Ｍタンパク質ペプチドを含む最小、らせん状、非宿主交差反応性ペプチドに由来するＢ細胞エピトープ。例えば、非Ｍタンパク質ペプチド（例えば、ペプチドＪ１４）は、アルカン骨格から懸垂する個々のペプチドすべてが免疫原を示すことを可能にする化学を用いて、１個または複数の血清型Ｍタンパク質ペプチドに連結することができ、それによって優れた免疫原性および保護作用が得られる（米国特許第６，１７４，５２８号；Brandt et al.、Nat.Med.6:455〜459、2000）、
（１４）コレラ（Cholera）毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、例えば、Kazemi and Finkelstein Mol.Immunol.28、865〜876、1991に記載されたコレラ毒素ＢサブユニットのＢ細胞エピトープ、
（１５）バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）（炭疽）のタンパク質のＢ細胞エピトープ、例えば、２５０ｋＤａ糖タンパク質などの炭疽の外側の外膜タンパク質に由来するＢ細胞エピトープ（Sylvestre et al.、Proc.4th Int.Conf.Anthrax、St John's College Annapolid、Mayland、CA 2001年6月10〜13日、Abstract 31 B、および
（１６）破傷風のタンパク質、例えば、破傷風トキソイドタンパク質などに由来するＢ細胞エピトープ。
【０１０７】
哺乳動物被験体から得られる好ましいＢ細胞エピトープは、腫瘍抗原に由来し、かつ／または腫瘍抗原に対する抗体を産生することができる。腫瘍抗原は、通常、生来の抗原または外来の抗原であり、その発現は腫瘍の発生、成長、存在または再発と相関がある。腫瘍抗原は、正常組織から異常組織を区別するのに有用であるので、治療介入の標的として有用である。腫瘍抗原は当分野で周知である。実際、いくつかの例が詳細に分析され、現在、腫瘍特異的療法を作成する上で大きく注目されている。腫瘍抗原の非限定的な例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）およびＭＵＣ−１などのムチンである。
【０１０８】
あるいは、哺乳動物被験体に由来する好ましいＢ細胞エピトープは、ヒト、またはブタなどの他の哺乳動物のＺＰ３（Chamberlin and Dean Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87、6014〜6018、1990）、ＺＰ３ａ（Yurewicz et al.、Biochim.Biophys.Acta 1174、211〜214、1993））などの透明帯タンパク質に由来する。このカテゴリー内の特に好ましいＢ細胞エピトープとしては、ヒトＺＰ３のアミノ酸残基３２３〜３４１（Chamberlin and Dean Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87、6014〜6018、1990）、ブタＺＰ３ａのアミノ酸残基８〜１８または残基２７２〜２８３または残基３１９〜３３０（Yurewicz et al.、Biochim.Biophys.Acta 1174、211〜214、1993）などがある。
【０１０９】
哺乳動物被験体から得られるさらに好ましいＢ細胞エピトープは、ペプチドホルモン、例えば、満腹ホルモン（例えば、レプチン）、消化ホルモン（例えば、ガストリン）、または生殖ペプチドホルモン［例えば、黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Carlsen et al.、J.Biol Chem.248、6810〜6827、1973）、あるいは、ホルモン受容体、例えば、ＦＳＨ受容体（Kraaij et al.、J.Endocrinol.158、127〜136、1998）に由来し、かつ／またはこれらに対する抗体を産生することができる。このカテゴリー内の特に好ましいＢ細胞エピトープとしては、ＬＨとは抗原性的に非交差反応性であるｂ−ｈＣＧのＣ末端部分（ＣＴＰ）などがある（Carlsen et al.、J.Biol.Chem.248、6810〜6827、1973）。
【０１１０】
特に好ましい実施形態においては、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（１）ＬＨＲＨに由来するＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（本明細書では「ＬＨＲＨ１〜１０」と称する；配列番号２）、
（２）ＬＨＲＨに由来するＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（本明細書では「ＬＨＲＨ２〜１０」と称する；配列番号３）、
（２）ＬＨＲＨに由来するＧＬＲＰＧ（（本明細書では「ＬＨＲＨ６〜１０」と称する；配列番号４）、
（３）リーシュマニア・メジャー（Leishmani major）に由来するＥＡＥＥＡＡＲＬＱＡ（配列番号５７）、
（４）以下からなる群から選択されるＦＭＤＶの非構造タンパク質３Ａ、３Ｂまたは３Ｃに由来する配列（米国特許第６，０４８，５３８号）：
ＦＲＥＲＴＬＴＧＱＲＡＣＮＤＶＮＳＥ（配列番号５８）、
ＮＰＬＥＴＳＧＡＳＴＶＧＦＲＥＲＴＬ（配列番号５９）、
ＩＲＥＴＲＫＲＱＫＭＶＤＤＡＶＮＥＹ（配列番号６０）、
ＡＫＡＰＶＶＫＥＧＰＹＥＧＰＶＫＫＰＶ（配列番号６１）、
ＡＧＰＬＥＲＱＫＰＬＫＶＫＡＫＡＰＶＶ（配列番号６２）、
ＫＶＲＡＫＬＰＱＱＥＧＰＹＡＧＰＬＥＲ（配列番号６３）、
ＧＰＹＴＧＰＬＥＲＱＲＰＬＫＶＲＡＫＬ（配列番号６４）、
ＶＧＲＬＩＦＳＧＥＡＬＴＹＫＤＩＶＶ（配列番号６５）、
ＴＫＨＦＲＤＴＡＲＭＫＫＧＴＰＶＶＧＶ（配列番号６６）、および
ＳＧＡＰＰＴＤＬＱＫＭＶＭＧＮＴＫＰＶ（配列番号６７）；
（５）ＦＭＤＶ  ＶＰ１主要エピトープに由来するＮＫＹＳＡＳＧＳＧＶＲＧＤＦＧＳＬＡＰＲＶＡＲＱＬＰＡＳＦＮＹＧＡＩＫ（米国特許第６，１０７，０２１号；配列番号６８）、
（６）ＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号６９）、ＡＶＫＶＭＤＬＰＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡ（配列番号７０）、ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳ（配列番号７１）、ＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬ（配列番号７２）、ＹＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＤＡＶＫＶＭ（配列番号７３）、ＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＹ（配列番号７４）およびＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＹ（配列番号７５）からなる群から選択される前立腺特異抗原に由来する配列（米国特許第6326471号）、
（７）ｂ−ｈＣＧに由来するＴＣＤＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号７６）、
（８）ＦＳＨ受容体に由来するＣＱＤＳＫＶＴＥＩＰＴＬＰＲＮＡＩ（配列番号７７）、
（９）ヒトＺＰ３タンパク質に由来するＮＫＧＤＣＧＴＰＳＨＳＲＲＱＰＨＶＭＳ（配列番号７８）、
（１０）ＷＬＣＦＰＬＣＬＡＬＰ（配列番号７９）ＬＧＧＬＹＣＧＰＳＳＦ（配列番号８０）、ＧＳＩＴＲＤＳＩＦＲＬＲ（配列番号８１）、ＳＡＬＰＶＮＩＱＶＦＴＬ（配列番号８２）、ＥＬＱＩＡＫＤＥＲＹＧＳ（配列番号８３）およびＶＫＬＬＲＥＰＩＹＶＥＶ（配列番号８４）からなる群から選択されるブタＺＰ３ａタンパク質に由来する配列、
（１１）癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に由来するＰＰＡＱＹＳＷＬＩＤＧＮ（配列番号８５）、
（１２）ＡＮＡＳＱＴＤＮＧＶＮＲＳＧＳＥＤＰＴＶ（配列番号８６）およびＰＥＴＫＨＰＫＫＧＶＥＫＹＧＰＥＡＳＡＦ（配列番号８７）からなる群から選択されるブドウ球菌ヌクレアーゼに由来する配列（Cone et al.、J.Biol.Chem.246、3103〜3110、1971）、
（１３）ＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬ（配列番号８８）およびＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳ（配列番号８９）からなる群から選択されるＢ型肝炎ウイルス表面抗原の配列（Kobayashi and Koike、Gene 30、227〜232、1984）、
（１４）Ｂ型肝炎ウイルス前駆体表面抗原に由来するＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬ（配列番号９０）、
（１５）ＡＡＦＥＤＬＲＶＳＳＦＩＲＧＴ（配列番号９１）およびＳＮＥＮＭＥＴＭＤＳＳＴＬＥ（配列番号９２）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス核タンパク質に由来する配列（Gregory et al.、J.Gen.Virol.82、1397〜1406、2001）、
（１６）ＨＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳ（配列番号９３）、ＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴ（配列番号９４）およびＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＳＧＴＳＫ（配列番号９５）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス赤血球凝集素に由来する配列、
（１７）ＦＭＤＶエンベロープ糖タンパク質ＶＰ１に由来するＣＫＹＳＡＳＧＳＧＶＲＧＤＦＧＳＬＡＰＲＶＡＲＣＬＰＡＳＦＮＴＧＡＩＫＮＫＹ（配列番号９６）、
（１８）ＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡ（配列番号９７）およびＡＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡ（配列番号９８）からなる群から選択されるマイコバクテリウム・ツベルキュローシスＥＳＡＴ−６タンパク質に由来する配列、
（１９）ＨＣＶに由来するＧＧＰＴＲＴＩＧＧＳＱＡＱＴＡＳＧＬＶＳＭＦＳＶＧＰＳＱＫ（配列番号９９）、
（２０）マイコバクテリウム・スクロフラセウムα抗原に由来するＫＦＱＤＡＹＮＡＡＧＧＨ（配列番号１００）、
（２１）Ａ群ストレプトコッカスのＭタンパク質（すなわち、本明細書で「Ｊ１４」と命名されたペプチド）に由来するＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０１）、および
（２２）ガストリンに由来するＧＷＭＤＦ（配列番号１０２）（すなわち、ガストリンＣ末端の５個のアミノ酸残基からなるペンタガストリン）。
【０１１１】
これまでの記載から、対象リポペプチドのポリペプチド部分が好都合には単一アミノ酸鎖として合成され、それによって、合成後に両方のエピトープを組み込む改変が不要であることが明白である。
【０１１２】
インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＴヘルパーエピトープ（例えば、配列番号１）またはＣＤＶ−ＦのＴヘルパーエピトープ（例えば、配列番号２０、２４、２６または４４）のどちらかに結合したＬＨＲＨの高免疫原性Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号２または３または４）を含むポリペプチド部分、例えば、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが特に好ましい：
（１）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号５）；
（２）ＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号６）；
（３）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号７）；
（４）ＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧＫＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号８）；
（５）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号９）；
（６）ＡＥＬＧＥＹＥＫＬＬＮＳＶＬＥＰＩＫＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号１０）；
（７）ＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡＬＨＱＳＮＬＮＫＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号１１）；
（８）ＰＲＹＩＡＴＮＧＹＬＩＳＮＦＤＥＳＫＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号１２）；
（９）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＧＬＲＰＧ（配列番号１３）；
（１０）ＡＥＬＧＥＹＥＫＬＬＮＳＶＬＥＰＩＫＧＬＲＰＧ（配列番号１４）；
（１１）ＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡＬＨＱＳＮＬＮＫＧＬＲＰＧ（配列番号１５）；
（１２）ＰＲＹＩＡＴＮＧＹＬＩＳＮＦＤＥＳＫＧＬＲＰＧ（配列番号１６）；
（１３）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号１０３）；および
（１４）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＧＬＲＰＧ（配列番号１０４）。
【０１１３】
特に好ましい実施形態においては、ＬＨＲＨエピトープ（すなわち、配列番号２で示されるＬＨＲＨ１〜１０、配列番号３で示されるＬＨＲＨ２〜１０、または配列番号４で示されるＬＨＲＨ６〜１０）は、Ｃ末端グリシン残基が露出し、または内部にならないように位置する。したがって、配列番号５、７または９〜１６のいずれか１個で示される配置が特に好ましい。
【０１１４】
例として示す一実施形態においては、ＬＨＲＨ１〜１０は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＴヘルパーエピトープ（すなわち、配列番号１）にコンジュゲートされて配列番号５または７で示される配列によって記載され、ＬＨＲＨ２〜１０またはＬＨＲＨ６〜１０は、ＣＤＶ−ＦのＴヘルパーエピトープ（すなわち、配列番号２４）にコンジュゲートされて配列番号９、１３、１０３または１０４で示される配列で記載される。他の組合せが可能であることも明白であり、本発明に包含される。
【０１１５】
別の実施形態においては、ＣＤＶ−Ｆ（例えば、配列番号２４）またはインフルエンザウイルス赤血球凝集素（例えば、配列番号１）のＴヘルパーエピトープに連結された、Ａ群ストレプトコッカスのＭタンパク質の高免疫原性Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号１０１で示されるＪ１４ペプチド）を含むポリペプチド部分、例えば、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが特に好ましい：
（１）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０５）；
（２）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０６）；
（３）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０７）；および
（４）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＫＶＫ（配列番号１０８）。
【０１１６】
さらに別の実施形態においては、ＣＤＶ−Ｆ（例えば、配列番号２４）またはインフルエンザウイルス赤血球凝集素（例えば、配列番号１）のＴヘルパーエピトープに連結された、ペンタガストリンの高免疫原性Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号１０２）を含むポリペプチド部分、例えば、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが特に好ましい：
（１）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＧＷＭＤＦ（配列番号１０９）；
（２）ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＫＧＷＭＤＦ（配列番号１１０）；
（３）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＧＷＭＤＦ（配列番号１１１）；および
（４）ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＫＧＷＭＤＦ（配列番号１１２）。
【０１１７】
当業者は、配列番号５〜１６のいずれか１個または配列番号１０３〜１１２のいずれか１個のＴヘルパーエピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを、例えば、配列番号１８〜５６のいずれか１個で示されるＴヘルパーエピトープ、配列番号５７〜１０２のいずれか１個で示されるＢ細胞エピトープなど別のＴヘルパーエピトープまたはＢ細胞エピトープで置換することによって、本明細書に例示するポリペプチド部分に加えて、対象リポペプチドに使用する別のポリペプチド部分を容易に合成することができる。さらに、免疫応答が求められる標的種および抗原に応じて、適切なＴヘルパーエピトープとＢ細胞の組合せを選択することは、本明細書の開示から当業者には容易なはずである。
【０１１８】
配列番号５〜１６および配列番号１０３〜１１２で示される例示的なポリペプチドを含めて、本明細書に記載するポリペプチド部分のアミノ酸配列は、特定の目的のために、当業者に周知の方法によって、それらの免疫機能に悪影響を及ぼさずに改変することができる。例えば、免疫応答を高めるか、またはペプチドを他の作用物質、特に脂質に結合させるために、特定のペプチド残基を誘導体化するか、または化学的に修飾することができる。ペプチドの全体構造または抗原性に支障を与えずにペプチド中の特定のアミノ酸を変えることも可能である。したがって、そのような変化は「保存的」変化と称され、残基の親水性または極性に依拠する傾向にある。側鎖の大きさおよび／または変化も、どの置換が保存的であるかを決定する関連要因である。
【０１１９】
生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドの定義に固有なのは、分子の規定された部分内でなされ、かつ許容される等価レベルの生物活性を有する分子を依然としてもたらし得る変化の数には限りがあるという概念であることを当業者は十分理解しうる。したがって、生物学的機能が等価なペプチドは、特定のアミノ酸を置換することができるペプチドと本明細書では定義される。特定の実施形態は、ペプチドのアミノ酸配列における１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の変更を含む変異体を包含する。異なる置換を含む複数の異なるタンパク質／ペプチドを本発明に従って容易に調製し、使用できることは言うまでもない。
【０１２０】
当業者は、以下の置換、すなわち、（１）アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む置換、（２）アラニン、グリシンおよびセリンを含む置換、ならびに（３）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを含む置換が許容できる保存的置換であることを十分承知している。このような保存的置換を組み込んだペプチドは生物学的機能が等価であると本明細書では定義する。
【０１２１】
相互作用性の生物学的機能をタンパク質に付与する上で疎水性親水性アミノ酸指標が重要であることは当分野では一般に理解されている（Kyte & Doolittle、J.Mol.Biol.157、105〜132、1982）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸を置換することができ、かつ類似の生物活性を維持できることが知られている。アミノ酸の疎水性親水性指標も、機能的に等価な分子を生成する保存的置換を決定する際に考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、以下の疎水性親水性指標が割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、疎水性親水性指標の指数が＋／−０．２以内のアミノ酸置換が好ましい。より好ましくは、置換は、疎水性親水性指標の指数が＋／−０．１以内、より好ましくは約＋／−０．０５以内のアミノ酸を含む。
【０１２２】
類似したアミノ酸の置換は、この場合（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）のように、特にそれによって生成される生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドを免疫学的な実施形態に用いようとする場合には、親水性に基づいて有効に行われることも当分野では十分理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に述べられているように、以下の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）が各アミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０＋／−０．１）、グルタミン酸（＋３．０＋／−０．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５＋／−０．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。親水性値が類似していることに基づいて変化させる際には、親水性値が互いに好ましくは約＋／−０．２以内、より好ましくは約＋／−０．１以内、さらにより好ましくは約＋／−０．０５以内であるアミノ酸を置換する。
【０１２３】
免疫原として使用するのに適切なペプチドが特定された場合には、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように他の立体的に類似した化合物を調製できることも企図される。ペプチドミメティックと称することができるこのような化合物は、本発明のペプチドと同様に使用することができ、したがって機能的に等価なものである。構造上機能的に等価なペプチドは、当業者に公知のモデリング技術および化学設計技術によって製造することができる。このような立体的に類似した構築体はすべて本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【０１２４】
改変ペプチドの「同等性」を決定する別の方法は機能的手法である。例えば、所与のペプチドを使用してモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。次いで、これらの抗体を使用して、数千または数十万の他のペプチドを含む縮重ペプチドのライブラリをスクリーニングし、それによって、少なくともある程度免疫学的に等価な構造を特定する。言うまでもなく、これらの構造は、抗体の産生に使用されるペプチドとある一次配列相同性を有することもできるが、まったく異なっていてもよい。
【０１２５】
ポリペプチド部分は、メリフィールド（Merrifield）合成方法（Merrifield、J Am Chem Soc、85、2149〜2154、1963）、無数の利用可能な同技術の改良法（例えば、Synthetic Peptides:A User's Guide、Grant、ed.(1992)W.H.Freeman & Co.、New York、pp.382；Jones(1994)The Chemical Synthesis of Peptides、Clarendon Press、Oxford、pp.230）；Barany,G.and Merrifield,R.B.(1979)in The Peptides(Gross,E.and Meienhofer,J.eds.)、vol.2、pp.1〜284、Academic Press、New York；Wunsch,E.、ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Methoden der Organischen Chemie(Muler,E.、ed.)、vol.15、4th edn.、Parts 1 and 2、Thieme、Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Heidelberg；Bodanszky,M.& Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int J.Peptide Protein Res.25、449〜474などの標準技術を用いて容易に合成される。
【０１２６】
脂質部分は、任意のＣ２〜Ｃ３０飽和、一不飽和または多価不飽和の線状または分枝脂肪アシル基、好ましくはパルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイルおよびデカノイルからなる群から選択される脂肪酸基を含むことができる。
【０１２７】
リポアミノ酸は、本明細書において特に好ましい脂質部分である。本明細書で使用する、「リポアミノ酸」という用語は、アミノ酸残基、例えば、システインもしくはセリンまたはリジンもしくはその類似体に共有結合した１個または２個または３個以上の脂質を含む分子を指す。特に好ましい実施形態においては、リポアミノ酸はシステインを含み、１個または２個以上のアルギニンまたはセリン残基を場合によっては含んでいてもよく、あるいは、６−アミノヘキサン酸を含む。
【０１２８】
脂質部分は、好ましくは、一般式（ＶＩＩ）の構造の化合物である：
【化５】
2010155832.tif 000009
【０１２９】
〔式中、
（ｉ）Ｘは、硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、メチレン（−ＣＨ２−）およびアミノ（−ＮＨ−）からなる群から選択され、
（ｉｉ）ｍは、１または２の整数であり、
（ｉｉｉ）ｎは、０〜５の整数であり、
（ｉｖ）Ｒ１は、水素、カルボニル（−ＣＯ−）およびＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖ）Ｒ２は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖｉ）Ｒ３は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は同じでも異なっていてもよい〕。
【０１３０】
置換基によっては、一般構造ＶＩＩの脂質部分は、完全体Ｒ１およびＲ２に直接的または間接的に共有結合した炭素原子が非対称の右旋性または左旋性（すなわち、ＲまたはＳ）立体配置である鏡像異性分子でもよい。
【０１３１】
好ましくは、Ｘは硫黄であり、ｍおよびｎはともに１であり、Ｒ１は水素およびＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３はＲ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択される。
【０１３２】
好ましくは、Ｒ’は、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイルおよびデカノイルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ’は、パルミトイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイルおよびデカノイルからなる群から選択される。
【０１３３】
前記脂質部分の各完全体Ｒ’は同じでも異なっていてもよい。
【０１３４】
特に好ましい実施形態においては、Ｘは硫黄であり、ｍおよびｎはともに１であり、Ｒ１は水素またはＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は、パルミトイル、ステアロイル、ラウロイルおよびオクタノイルからなる群から選択される）であり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれＲ’−ＣＯ−Ｏ−（式中、Ｒ’は、パルミトイル、ステアロイル、ラウロイルおよびオクタノイルからなる群から選択される）である。Ｒ’がパルミトイルである特に好ましい化合物は、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）で示される。
【０１３５】
脂質部分は、以下の一般式（ＶＩＩＩ）を有することができる：
【化６】
2010155832.tif 000010
【０１３６】
〔式中
（ｉ）Ｒ４は、（ｉ）約７〜約２５個の炭素原子からなるα−アシル脂肪酸残基、（ｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基、（ｉｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基のβ−ヒドロキシエステル（エステル基は、好ましくは、８個を超える炭素原子を含む直鎖または分枝鎖である）および（ｉｖ）リポアミノ酸残基、からなる群から選択され、
（ｉｉ）Ｒ５は、水素、またはアミノ酸残基の側鎖である〕。
【０１３７】
好ましくは、Ｒ４は、約１０〜約２０個の炭素原子からなり、より好ましくは約１４〜約１８個の炭素原子からなる。
【０１３８】
Ｒ４がリポアミノ酸残基である場合には、完全体（integer）Ｒ４およびＲ５の側鎖は共有結合を形成することもできる。例えば、Ｒ４が、リジン、オルニチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン誘導体、オルニチン誘導体、グルタミン酸誘導体およびアスパラギン酸誘導体からなる群から選択される場合には、アミノ酸または誘導体の側鎖は、アミド結合またはエステル結合によってＲ５に共有結合する。
【０１３９】
好ましくは、一般式ＶＩＩＩで示される構造は、Ｎ，Ｎ’−ジアシルリジン；Ｎ，Ｎ’−ジアシルオルニチン；グルタミン酸のジ（モノアルキル）アミドまたはエステル；アスパラギン酸のジ（モノアルキル）アミドまたはエステル；セリン、ホモセリンまたはトレオニンのＮ，Ｏ−ジアシル誘導体；およびシステインまたはホモシステインのＮ，Ｓ−ジアシル誘導体からなる群から選択される脂質部分である。
【０１４０】
両親媒性分子、特にＰａｍ３Ｃｙｓ（式（Ｉ））の疎水性を超えない疎水性を有する両親媒性分子も好ましい。
【０１４１】
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＶＩ）または式（ＶＩＩＩ）の各脂質部分は、１個または複数のスペーサー分子、好ましくは炭素を含むスペーサー、より好ましくは１個または複数のアミノ酸残基の付加によって、合成中または合成後にさらに改変される。これらを、従来の縮合、付加、置換または酸化反応において末端カルボキシ基を介して脂質構造に付加することが有利である。このようなスペーサー分子の効果は、脂質部分をポリペプチド部分から分離して、さもなければリポペプチド産物の免疫原性を低下させ得る立体障害効果を弱めることである。
【０１４２】
アルギニンまたはセリン二量体、三量体、四量体など、あるいは、６−アミノヘキサン酸は、この目的に特に好ましい。
【０１４３】
このようなスペーサーは、改変リポアミノ酸が後でポリペプチドに容易にコンジュゲートされるように末端保護アミノ酸残基を含むことが好ましい。
【０１４４】
この実施形態によって製造される代表的な改変リポアミノ酸は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表され、それぞれ式（Ｉ）および（ＩＩ）にセリンホモ二量体を付加することによって容易に得られる。本明細書に例示するとおり、式（Ｉ）のＰａｍ３Ｃｙｓまたは式（ＩＩ）のＰａｍ２Ｃｙｓは、この目的で、式（ＩＩＩ）のリポアミノ酸Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒまたは式（ＩＶ）のＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒとして合成することが有利である。
【化７】
2010155832.tif 000011
【化８】
2010155832.tif 000012
【０１４５】
スペーサーを脂質部分に付加する代わりに、ポリペプチド部分の内部リジン残基のεアミノ基またはリジン類似体の末端側鎖基に、短いペプチド、例えば、アルギニンまたはセリンホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体などとして、あるいは、アミノ酸残基の連続的付加によってスペーサーを付加し、それによって分枝ポリペプチド鎖を生成することができる。この手法は、スペーサー付加における特異性を得るために、内部リジン残基上のεアミノ基またはリジン類似体の末端側鎖基の改変された性質を適宜利用する。当然、連続的なスペーサー付加を防止するために、スペーサーの末端アミノ酸残基は、脱保護によって分枝ポリペプチドへの脂質部分のコンジュゲートが容易になるように、好ましくは保護すべきである。
【０１４６】
あるいは、従来の求核置換反応によって、ポリペプチドの非改変εアミノ基にスペーサーを付加することができる。しかし、ポリペプチドが、単一の内部リジンまたはリジン類似体残基、およびブロッキングされたＮ末端を含むアミノ酸配列を含む場合には、この手法に従うことが好ましい。
【０１４７】
脂質部分は、従来の合成手段、例えば、米国特許第５，７００，９１０号および同第６，０２４，９６４号に記載の方法、あるいは、Wiesmuller et al.、Hoppe Seylers Zur Physiol.Chem.364、593(1983)、Zeng et al.、J.Pept.Sci 2、66(1996)、Jones et al.、Xenobiotica 5、155(1975)、またはMetzger et al.、Int.J.Pept.Protein Res.38、545(1991)に記載の方法によって調製される。当業者は、このような方法を容易に改変して、ポリペプチドへのコンジュゲートに使用される所望の脂質を合成することができる。
【０１４８】
本発明のリポペプチドに使用される様々な脂質の組合せも企図される。例えば、１個または２個のミリストイル含有脂質またはリポアミノ酸を、内部リジンまたはリジン類似体残基を介してポリペプチド部分に結合させ、場合によっては、スペーサーによってポリペプチドから分離させてもよい。他の組合せも除外されない。
【０１４９】
本発明のリポペプチドは、診断目的で容易に修飾される。例えば、本発明のリポペプチドは、天然または合成ハプテン、抗生物質、ホルモン、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、ビオチン、アビジン、ポリエチレングリコール、ペプチドのポリペプチド部分（例えば、タフトシン、ポリリジン）、蛍光マーカー（例えば、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ダンシル、ルミノールまたはクマリン）、生物発光マーカー、スピン標識、アルカロイド、生体アミン、ビタミン、毒素（例えば、ジゴキシン、ファロイジン、アマニチン、テトロドトキシン）または錯形成剤を付加することによって修飾される。
【０１５０】
本明細書に例示するとおり、（ｉ）インフルエンザウイルス赤血球凝集素の軽鎖に由来するＣＤ４＋  Ｔヘルパーエピトープのアミノ酸配列（Jackson et al.Virol.198、613〜623、1994；すなわち、アミノ酸配列ＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ；配列番号１）、またはＣＤＶ−Ｆタンパク質に由来するペプチド（配列番号２４）と、（ｉｉ）黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ；Fraser et al.、J.Endocrinol.63、399(1974)；Fraser and Baker、J.Endocrinol.77、85(1978)；すなわち「ＬＨＲＨ１〜１０」、アミノ酸配列ＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ；配列番号２；「ＬＨＲＨ２〜１０」、アミノ酸配列ＨＷＳＹＧＬＲＰＧ；配列番号３、または「ＬＨＲＨ６〜１０」、アミノ酸配列ＧＬＲＰＧ；配列番号４）、Ａ群ストレプトコッカス（ＧＡＳ）Ｍタンパク質（すなわち、配列番号１０１）およびペンタガストリン（すなわち、配列番号１０２）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＢ細胞エピトープ含有ペプチドと、（ｉｉｉ）前記ＣＤ４＋  Ｔヘルパーエピトープと前記Ｂ細胞エピトープの間に位置するリジン残基と、場合によっては、（ｉｖ）前記ＣＤ４＋  Ｔヘルパーエピトープ内に位置するリジン残基、とを含むポリペプチドの内部リジン残基のεアミノ基を介してコンジュゲートされた式（Ｉ）のＰａｍ３Ｃｙｓ、または式（ＩＩ）のＰａｍ２Ｃｙｓ、またはＳｔｅ２ＣｙｓまたはＬａｕ２ＣｙｓまたはＯｃｔ２Ｃｙｓを含む高免疫原性可溶性リポペプチドが提供される。
【０１５１】
リポペプチドの調製
本発明の第２の態様は、
（ｉ）以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列およびＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｂ）１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基とを含むアミノ酸配列、
を含むポリペプチドを製造するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々を直接的または間接的に、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に共有結合させて、前記内部リジン残基のεアミノ基に結合した脂質部分を含む、または前記内部リジン類似体残基の末端側鎖基に結合した脂質部分を含むリポペプチドを製造するステップ、
を含む、リポペプチドを製造する方法を提供する。
【０１５２】
この方法はさらに脂質部分の製造も含むことが好ましい。
【０１５３】
本明細書で参照する従来の化学合成は、ポリペプチド部分および脂質部分を製造する好ましい手段である。
【０１５４】
ブロッキング基（例えば、Ｍｔｔ）を末端側鎖基、特に末端側鎖アミノ基から選択的に除去して内部リジン残基または内部リジン類似体を改変して、リポアミノ酸を含めて、アミノ酸残基、スペーサーまたは脂質部分がその位置に付加できるようにすることが好ましい。
【０１５５】
脂質をポリペプチドに結合させる場合には、ポリペプチドの官能基を、これらの基において望ましくない反応が有効な反応速度で確実に起こらないように、ペプチド合成分野で既知の方法で保護することが有利である。
【０１５６】
既知のカップリング法によって、ポリペプチドをポリマー（例えば、メリフィールド樹脂）などの固体担体または可溶性担体上で合成し、スペーサー、アミノ酸または脂質にコンジュゲート可能にする。例えば、内部リジンのεアミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基をいくつかの保護基の１個で保護する。（保護基またはマスキング基とも呼ばれる）ブロッキング基を使用して、カップリング反応に関与する活性カルボキシル基を有するアミノ酸のアミノ基を保護し、またはカップリング反応に関与するアシル化アミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基を保護する。カップリングを起こす場合には、ペプチド結合、またはペプチドの別の部分に結合した任意の保護基を切断せずにブロッキング基を除去しなければならない。
【０１５７】
固相ペプチド合成の場合には、伸長するペプチド鎖のアミノブロッキング基の除去に必要な反復処理に安定であり、かつアミノ酸カップリングの繰り返しに必要な反復処理に安定なブロッキング基を使用してアミノ酸側鎖を保護する。また、ペプチドＣ末端を保護するペプチド樹脂の足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）は、樹脂からの切断が必要になるまで合成プロセスを通して保護されなければならない。したがって、直交性に保護されたα−アミノ酸を慎重に選択することによって、脂質および／またはアミノ酸が、樹脂に付着したまま伸長するペプチドの所望の位置に付加される。
【０１５８】
好ましいアミノブロッキング基は、容易に除去可能であるが、カップリング反応および他の操作、例えば、側鎖基の修飾などに対する残存条件（ｓｕｒｖｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に十分安定である。好ましいアミノブロッキング基は、（ｉ）室温常圧の接触水素化によって、またはナトリウムの液体アンモニア溶液および臭化水素酸の酢酸溶液を用いて容易に除去されるベンジルオキシカルボニル基（Ｚまたはカルボベンゾキシ）、（ｉｉ）ｔ−ブトキシカルボニルアジドまたはジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートを用いて導入され、弱酸、例えば、トリフルオロ酢酸（５０％ＴＦＡのジクロロメタン溶液）、ＨＣｌの酢酸／ジオキサン／酢酸エチル溶液などを用いて除去されるｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、（ｉｉｉ）弱塩基、非加水分解条件下、例えば、第一級または第二級アミン（例えば、２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液）を用いて切断される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、（ｉｖ）２−（４−ビフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル基（Ｂｐｏｃ）、（ｖ）２−ニトロ−フェニルスルフェニル基（Ｎｐｓ）、および（ｖｉ）ジチア−スクシオニル基（Ｄｔｓ）からなる群から選択される。
【０１５９】
側鎖保護基は、合成するペプチドを形成するアミノ酸の官能基側鎖に応じて変わる。側鎖保護基は、一般に、Ｂｚｌ基またはｔＢｕ基に基づいている。側鎖にアルコールまたはカルボン酸を有するアミノ酸は、Ｂｚｌエーテル、Ｂｚｌエステル、ｃＨｅｘエステル、ｔＢｕエーテルまたはｔＢｕエステルとして保護される。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖を保護するには、理想的には塩基に安定であり弱酸（ＴＦＡ）に不安定なブロッキング基が必要である。例えば、リジンのε−アミノ基は、Ｍｔｔによって保護される（例えば、Ｆｍｏｃ−リジン（Ｍｔｔ）−ＯＨ）。あるいは、酸に対する高い安定性が必要な場合には、ＣＩＺなどのハロゲン化ベンジル誘導体を使用してリジン側鎖を保護する。シスチンのチオール基、ヒスチジンのイミダゾール、またはアルギニンのグアニジノ基は、一般に特別な保護を必要とする。多種多様なペプチド合成用保護基が記載されている（The Peptides、Gross et al.eds.、Vol.3、Academic Press、New York、1981）。
【０１６０】
最も広く用いられている２つの保護方法は、Ｂｏｃ／Ｂｚｌ法およびＦｍｏｃ／ｔＢｕ法である。Ｂｏｃ／Ｂｚｌでは、Ｂｏｃをアミノ保護に使用し、様々なアミノ酸の側鎖をＢｚｌまたはｃＨｅｘを基にした保護基を用いて保護する。Ｂｏｃ基は、触媒水素化条件下で安定であり、多数の側鎖基を保護するためにＺ基とともに直交性に使用される。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕでは、Ｆｍｏｃをアミノ保護に使用し、ｔＢｕを基にした保護基を用いて側鎖を保護する。
【０１６１】
ペプチドは、当分野で周知の方法によって脂質付加される。標準の縮合、付加、置換または酸化（例えば、内部リジンまたは内部リジン類似体上の末端アミノ基と、導入されるアミノ酸またはペプチドまたはリポアミノ酸カルボキシ末端基とのジスルフィド架橋形成またはアミド結合形成）反応によって、脂質がポリペプチドに付加される。
【０１６２】
別の実施形態においては、免疫原として使用される本発明のペプチドを化学選択的連結または化学結合によって製造する。このような方法は、当分野では周知であり、個々のペプチド成分を化学手段または組換え手段によって製造し、その後、適切な配置またはコンホメーションまたは順序で化学選択的に連結する（例えば、参照により本明細書に援用するNardin et al.、Vaccine 16、590(1998)；Nardin et al.、J.Immunol.166、481(2001)；Rose et al.、Mol.Immunol.32、1031(1995)；Rose et al、Bioconjug.Chem 7、552(1996）；およびZeng et al.、Vaccine 18、1031(2000))。
【０１６３】
リポペプチド製剤
リポペプチドは、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤、例えば、水性溶媒、非水性溶媒、塩、防腐剤、緩衝剤などの無毒賦形剤中に有利に処方される。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびエチルオレイン酸エステルなどの注射用有機エステルである。水性溶媒としては、水、アルコール性溶液、水溶液、食塩水溶液、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、リンゲルのデキストロースなどがある。防腐剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどがある。医薬組成物中の様々な成分ｐＨおよび正確な濃度は、当分野の常法に従って調節される。
【０１６４】
リポペプチド製剤への外来的なアジュバントの添加は一般に不要であるが、やはり本発明に包含される。このような外来的なアジュバントとしては、すべての許容される免疫賦活性化合物、例えば、サイトカイン、毒素、合成組成物などがある。例示的なアジュバントとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｕｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称する）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ）１９８３Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称する）、脂質Ａ、ＭＰＬ、細菌から抽出される３成分を含むＲＩＢＩ、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）の２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョンなどがある。
【０１６５】
生物反応修飾物質（ＢＲＭ）とリポペプチドを同時投与して、サプレッサーＴ細胞活性をダウンレギュレートすることが望ましい場合もある。例示的なＢＲＭは、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）、インドメタシン（ＩＮＤ；１５０ｍｇ／ｄ）（Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）、低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；７５、１５０または３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）などであるが、これらだけに限定されない。
【０１６６】
免疫におけるリポペプチドの使用
本発明の新規リポペプチドは、可溶性および免疫原性が高く、追加のアジュバントを投与しなくても免疫応答を誘発できる点で、抗原の公知のリポペプチド複合体とは本質的な面で異なる。したがって、本発明のリポペプチドの特別な有用性は、抗体製造、合成ワクチン製剤、抗体および抗体リガンドを使用する診断法、ならびに動物およびヒト医療用免疫療法の分野にある。
【０１６７】
より具体的には、本発明のリポペプチドは、動物被験体に投与すると、類似の抗体価を得るためにアジュバントを必要とせずに、Ｂ細胞エピトープ部分に対する高力価抗体を特異的に産生する。この有用性は、対象リポペプチドの投与後に樹状細胞の成熟が進むことによって裏付けられる（すなわち、Ｎ末端に脂質が結合したリポペプチドよりも抗原提示が増大される）。
【０１６８】
したがって、本発明の第３の態様は、抗原性Ｂ細胞エピトープに対する抗体の産生を誘導する方法であって、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する抗体の産生を誘導するのに十分な時間および条件下で、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされたポリペプチドを含む単離リポペプチドを前記被験体に投与するステップを含む方法を提供する。ここで、
（ｉ）前記ポリペプチドは、
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列およびＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｂ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合している。
【０１６９】
抗体産生に使用される有効量のリポペプチドは、免疫原性Ｂ細胞エピトープの性質、投与経路、免疫化に使用する動物、および求める抗体の性質に応じて変わる。このような変数はすべて、当分野で認められた手段によって経験的に決定される。
【０１７０】
本明細書で参照する抗体は、単独のまたは他の部分と複合されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体全体およびその一部などである。抗体部分としては、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメント、単鎖抗体などがある。抗体は、適切な実験動物においてインビボで製造することができ、あるいは、人工抗体（単鎖抗体、ＳＣＡＢＳなど）の場合には、インビトロでの組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。
【０１７１】
本発明のこの態様によれば、抗体を、被験体を免疫するために産生することができ、その場合には、Ｂ細胞エピトープに結合する高力価抗体または中和抗体が特に好ましい。免疫に適切な被験体が、免疫する抗原性Ｂ細胞エピトープに応じて決まることは言うまでもない。本発明は、多様な動物、例えば、家畜（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヒヨコ、カモ、シチメンチョウなど）、実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ）、愛玩動物（ネコ、イヌ、トリなど）、野生化したまたは野生の外来動物（例えば、オポッサム、ネコ、ブタ、バッファロー、野生のイヌなど）およびヒトの免疫に広範に適用できることが企図される。
【０１７２】
あるいは、抗体は、市販または診断目的でもよく、その場合には、リポペプチドを投与する被験体は、実験動物または家畜である可能性が最も高い。抗血清の製造には広範な動物種が使用される。一般に、抗血清の製造に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウマまたはヒヨコである。ウサギは、血液量が比較的多いので、ポリクローナル抗体を製造するのには好ましい。しかし、当業者には知られているように、マウスなどの小動物とは対照的に、大きい動物から高い抗体を得るためにはより多量の免疫原が必要である。このような場合には、免疫動物から抗体を単離することが望ましい。
【０１７３】
抗体は高力価抗体であることが好ましい。「高力価」とは、診断または治療に使用するのに適切な十分に高い力価を意味する。当分野では知られているとおり、「高力価」の考え方にはばらつきがある。ほとんどの用途では、少なくとも約１０３〜１０４の力価が好ましい。より好ましくは、抗体価は、約１０４〜約１０５であり、さらにより好ましくは約１０５〜約１０６である。
【０１７４】
より好ましくは、病原体、ウイルスまたは細菌に由来するＢ細胞エピトープの場合には、抗体は中和抗体である（すなわち、Ｂ細胞エピトープが由来する生物の感染力を中和することができる）。
【０１７５】
抗体を産生するには、リポペプチド、場合によっては、任意の適切なまたは所望の担体、アジュバント、ＢＲＭ、または薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化されていてもよいリポペプチドを、注射用組成物の形で投与することが有利である。注射は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または他の既知の経路とすることができる。本発明のリポペプチドは、鼻腔内投与すると効力を示す。静脈内注射の場合には、１個または複数の液体および栄養補充物を含めることが望ましい。抗体を調製しそれを特性決定する手段は当分野で周知である。（例えば、参照により本明細書に援用するANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照されたい)。
【０１７６】
リポペプチドの抗体産生効力は、実施例に示すように、動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギまたはブタを、リポペプチドを含む製剤で免疫し、次いでＢ細胞エピトープに対する免疫応答をモニターすることによって確認される。一次と二次免疫応答の両方をモニターする。抗体価は、従来のイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは放射性免疫測定法などによって測定される。
【０１７７】
ポリクローナル抗体の産生は、免疫後様々な時点で免疫動物の血液を採取することによってモニターすることができる。必要に応じて、第２の追加免疫注射を与えて所望の抗体価を得ることができる。追加免疫と滴定のプロセスは、適切な力価が得られるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られたときに、免疫動物から採血し、血清を単離し、保存し、かつ／または動物を使用してモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生成する。
【０１７８】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の製造には、いくつかの周知の技術のいずれか１つ、例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第４，１９６，２６５号に例示する手順を使用することができる。
【０１７９】
例えば、有効量の本発明のリポペプチドを用いて、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で、適切な動物を免疫する。マウス、ラットなどのげっ歯類は好ましい動物である。しかし、ウサギ、ヒツジまたはカエルの細胞を使用することも可能である。ラットの使用はある種の利点を提供することもあるが、マウスが好ましい。常法に従って最も使用され、一般に高い割合で安定な融合が得られる動物としてＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好ましい。
【０１８０】
免疫後に、抗体、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）を産生することができる体細胞を選択して、ＭＡｂ産生プロトコルに使用する。これらの細胞は、生検によって得られた脾臓、扁桃腺またはリンパ節、あるいは末梢血液試料から得ることができる。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。というのは、脾臓細胞は、分裂している形質芽細胞段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であり、末梢血細胞は、末梢血液が容易に入手できるからである。一団の動物が免疫され、最も抗体価の高い動物の脾臓が取り出されることが多い。脾臓リンパ球は、脾臓をシリンジを用いてホモジナイズすることによって得られる。一般に、免疫マウスから得られる脾臓は約５×１０７〜２×１０８個のリンパ球を含む。
【０１８１】
次いで、免疫動物から得られるＢ細胞を、リポペプチド製剤で免疫された動物と同じ種に通常由来する骨髄腫不死化細胞の細胞と融合する。ハイブリドーマ作製融合手順に使用するのに適した骨髄腫細胞系は、好ましくは、抗体非産生性であり、高い融合効率と、所望の融合細胞、すなわちハイブリドーマのみの増殖を支援するある種の選択培地中でその後増殖できなくする酵素欠乏を有する。いくつかの骨髄腫細胞のいずれか１個を使用することができ、これらは当業者に公知である（例えば、ネズミＰ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０；またはラットＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０；ならびにＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６）。好ましいネズミ骨髄腫細胞は、ＮＳ−１骨髄腫細胞系（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも称される）であり、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから受託番号ＧＭ３５７３で容易に入手可能である。あるいは、８−アザグアニン耐性であるネズミ骨髄腫ＳＰ２／０非産生細胞系を使用する。
【０１８２】
抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するためには、細胞膜融合を促進する（化学的または電気的）薬剤の存在下で、それぞれの体細胞を約２０：１〜約１：１の割合で骨髄腫細胞と混合する。センダイウイルスを用いた融合方法が、Kohler and Milstein、Nature 256、495〜497、1975およびKohler and Milstein、Eur.J.Immunol.6、511〜519、1976に記載されている。３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた方法が、Gefter et al.、Somatic Cell Genet 3、231〜236、1977に詳記されている。電気的に誘発される融合方法を使用することも適切である。
【０１８３】
ハイブリッドは、組織培養培地中でヌクレオチドの新規合成を遮断する薬剤を含む選択培地中で培養することによって増幅される。例示的な好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセートおよびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンとピリミジンの両方の新規合成を遮断するのに対し、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキセートを使用する場合には、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンを培地に添加する（ＨＡＴ培地）。アザセリンを使用する場合には、ヒポキサンチンを培地に添加する。
【０１８４】
好ましい選択培地はＨＡＴである。というのは、ヌクレオチド再生経路を作動させることができるハイブリドーマのみがＨＡＴ培地では生存することができるが、骨髄腫細胞は、再生経路に重要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、すなわちＨＰＲＴ）を欠いており、生存することができないからである。Ｂ細胞は、この再生経路を作動させることができるが、培養寿命が限られており、一般に約２週間以内に死滅する。したがって、この選択培地中で生存することができる唯一の細胞は、骨髄腫とＢ細胞から形成されたハイブリッドだけである。
【０１８５】
増幅されたハイブリドーマは、例えば、免疫測定法（例えば、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、細胞傷害アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなど）などによって、抗体特異性および／または力価について機能的選択に供せられる。
【０１８６】
選択されたハイブリドーマを連続希釈し、個々の抗体産生細胞系にクローン化し、次いでそのクローンを無期限に増殖させてＭＡｂを得ることができる。これらの細胞系を２つの基本的な方法でＭＡｂ製造に利用することができる。通常、体細胞と骨髄腫細胞を最初の融合に供するために使用したタイプの組織適合性動物にハイブリドーマ試料を腹腔内注射する。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生じる。次いで、血清、腹水などの動物の体液を採取して高濃度のＭＡｂを得る。個々の細胞系はインビトロで培養することもでき、ＭＡｂは培地中に自然に分泌され、そこから高濃度で容易に得られる。どちらかの手段で製造されたＭＡｂを、所望であれば、ろ過、遠心分離、およびＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いてさらに精製することができる。
【０１８７】
本発明のモノクローナル抗体は、当分野で周知の方法によって製造される抗イディオタイプの抗体も含む。本発明に用いるモノクローナル抗体は、モノクローナル異種複合体（すなわち、２個以上の抗体分子のハイブリッド）とすることもできる。別の実施形態においては、本発明に用いるモノクローナル抗体はキメラモノクローナル抗体である。一手法においては、プロモーター、リーダー、マウス抗ＰＳＡ産生細胞に由来する可変領域配列、およびヒト抗体遺伝子に由来する定常領域エキソンを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによってキメラモノクローナル抗体を操作する。このような組換え遺伝子によってコードされた抗体がマウス−ヒトキメラである。その抗体特異性は、マウス配列に由来する可変領域によって決まる。定常領域によって決まるそのアイソタイプはヒトＤＮＡに由来する。
【０１８８】
別の実施形態においては、本発明に用いるモノクローナル抗体は、当分野で周知の技術によって製造される「ヒト化」モノクローナル抗体である。すなわち、マウス相補性決定領域（「ＣＤＲ」）がマウスＩｇの重Ｖ鎖および軽Ｖ鎖からヒトＶドメインに移され、その後それらのネズミ対応部分のフレームワーク領域中の一部のヒト残基が置換される。本発明による「ヒト化」モノクローナル抗体は、インビボでの診断方法および治療方法に使用するのに特に適切である。
【０１８９】
上述したとおり、本発明に用いるモノクローナル抗体およびそのフラグメントは、当分野で周知のインビトロおよびインビボでの方法によって増幅される。インビトロでの増幅は、ウシ胎児血清などの哺乳動物血清、または微量元素および増殖維持補助剤、例えば、正常マウス腹膜しん出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージなどのフィーダー細胞を添加してもよいダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地などの適切な培地中で実施される。インビトロ製造によって比較的純粋な抗体調製物が提供され、スケールアップして多量の所望の抗体を得ることができる。組織培養条件下での大規模ハイブリドーマ培養技術は当分野で公知であり、均一な懸濁培養（例えば、エアリフト反応器中、または連続攪拌反応器中、あるいは固定化細胞培養または捕捉細胞培養）を含む。
【０１９０】
多量の本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞をインビボで増幅することによっても得ることができる。細胞クローンを、親細胞と組織適合性がある哺乳動物（例えば、同系マウスに注射して抗体産生腫瘍を増殖させる。場合によっては、注射する前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で動物を初回抗原刺激してもよい。
【０１９１】
本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体フラグメントは、上述したように製造されたモノクローナル抗体から、ペプシン、パパインなどの酵素による消化、および／または化学還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法によって得られる。
【０１９２】
本発明のモノクローナル複合体は、当分野で公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素を用いて、例えば、上述したように調製されたモノクローナル抗体を反応させることによって調製される。フルオレセインマーカーとの複合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。金属キレートとの複合体も同様に製造される。抗体が結合し得る他の部分としては、放射性核種、例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕなどがある。本発明の放射能標識モノクローナル抗体は、当分野で周知の方法によって製造される。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤と接触させることによってヨウ素化される。本発明によるモノクローナル抗体は、配位子交換方法、例えば、パーテクネート（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）をスズ溶液で還元し、還元されたテクネチウムをセファデックスカラム上にキレート化し、このカラムに抗体を適用することによって、または直接標識技術によって（例えば、パーテクネート、ＳＮＣｌ２などの還元剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液などの緩衝液、および抗体をインキュベートすることによって）テクネチウム９９で標識することができる。
【０１９３】
任意の免疫測定法を使用してリポペプチド製剤による抗体産生をモニターすることができる。最も簡単で直接的な免疫測定法は結合アッセイである。ある種の好ましい免疫測定法は、当分野で既知の様々なタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いた免疫組織化学的検出も特に有用である。しかし、検出はこのような技術だけに限定されず、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ＦＡＣＳ分析なども使用できることは容易に理解される。
【０１９４】
アッセイによって定量的な結果が得られることが最も好ましい。例えば、抗体は、簡単な競合アッセイにおいて試験される。Ｂ細胞エピトープに結合する既知の抗体試料と試験抗体を、Ｂ細胞エピトープを含む抗原組成物、好ましくは自然抗原とともにインキュベートする。本明細書で使用する「抗原組成物」とは、利用可能な形の様々なＢ細胞エピトープを含むあらゆる組成物を意味する。ＥＬＩＳＡプレートの抗原被覆ウェルが特に好ましい。一実施形態においては、抗原組成物を使用する前に、既知の抗体を様々な量（例えば、１：１、１：１０および１：１００）の試験抗体とある時間混合する。既知の抗体の１個が標識されている場合には、抗原に結合した標識を直接検出することが可能である。アッセイによって、純粋な試料と比較して、試験抗体による競合、したがって、交差反応性が求められる。あるいは、既知抗体または試験抗体のどちらかに特異的である二次抗体を用いて、競合を判定することができる。
【０１９５】
抗原組成物に結合する抗体は、既知の抗体の結合に対して有効に競合することができ、したがって、既知の抗体の結合をかなり減少させるはずである。試験抗体の不在下での既知の抗体の反応性が対照になる。試験抗体の存在下で反応性がかなり減少すれば、試験抗体がＢ細胞エピトープに結合したことを示している（すなわち、試験抗体が既知の抗体と交差反応する）。
【０１９６】
例示的なＥＬＩＳＡにおいては、Ｂ細胞エピトープに対する抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェルなどタンパク質親和性を示す選択表面上に固定される。次いで、Ｂ細胞エピトープを含む組成物をウェルに添加する。結合させ、洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後に、結合エピトープを検出することができる。検出は、一般に、Ｂ細胞エピトープに結合することが知られており検出可能な標識に連結された二次抗体を添加することによって実施される。このタイプのＥＬＩＳＡは、簡単な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、前記二次抗体を添加し、その後二次抗体に対して結合親和性を有し検出可能な標識に連結された三次抗体を添加しても実施することができる。
【０１９７】
不妊の誘発
生殖ホルモンまたはホルモン受容体の抗原性Ｂ細胞エピトープを含む適切に構成された本発明のリポペプチドは、被験体において不妊を誘導する能力がある。
【０１９８】
したがって、本発明の別の態様は、被験体において不妊を誘導する方法であって、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされたポリペプチドを含む単離リポペプチドを前記被験体に投与するステップを含む方法を提供する。ここで、
（ｉ）前記ポリペプチドは、
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列、および生殖ホルモンまたはホルモン受容体のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｂ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合しており、
（ｉｉｉ）前記リポペプチドを、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する液性免疫応答を誘発するのに十分な時間と条件下で投与する。
【０１９９】
リポペプチドは、本明細書に記載する有利なリポペプチド製剤の形で投与することができる。
【０２００】
「液性免疫応答」とは、卵形成、精子形成、受精、着床または胚発生を阻止するのに十分なＢ細胞エピトープに対する二次免疫応答が発生することを意味する。
【０２０１】
発生する液性免疫は、被験体中のＢ細胞エピトープに対する持続的なレベルの抗体を含むことが好ましい。「持続的なレベルの抗体」とは、卵形成、精子形成、受精、着床または胚発生を阻止するのに十分なレベルの、Ｂ細胞エピトープに対する循環抗体を意味する。
【０２０２】
抗体レベルは、免疫された雌被験体の少なくとも単一の生殖サイクルの間持続することが好ましく、少なくとも約６カ月間または９カ月間または１２カ月間または２年間持続することがより好ましい。
【０２０３】
Ｂ細胞エピトープは、黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒトもしくはブタなどの他の哺乳動物のＺＰ３、ＦＳＨ受容体ＺＰ３ａなどの透明帯タンパク質のアミノ酸配列に由来することが好ましい。
【０２０４】
このカテゴリー内の特に好ましいＢ細胞エピトープとしては、β−ｈＣＧのＣ末端部分（ＣＴＰ）、ヒトＺＰ３のアミノ酸残基３２３〜３４１、ブタＺＰ３ａのアミノ酸残基８〜１８または残基２７２〜２８３または残基３１９〜３３０などがある。
【０２０５】
さらにより好ましくは、Ｂ細胞エピトープは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２０６】
Ｔヘルパーエピトープは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましいが、配列番号１または１８〜５６のいずれか１つを使用することもできる。
【０２０７】
本発明の特に好ましい実施形態においては、Ｔヘルパーエピトープは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６および配列番号４４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、Ｂ細胞エピトープは、配列番号２または配列番号３または配列番号４で示されるＬＨＲＨのアミノ酸配列を含む。このような好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号５〜１６、１０３または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。また、この好ましい実施形態によれば、脂質部分が、（１）Ｐａｍ２Ｃｙｓ、（２）Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、（３）Ｌａｕ２Ｃｙｓおよび（４）Ｏｃｔ２Ｃｙｓからなる群から選択されるリポアミノ酸を含むことが（必須ではないが）好ましい。
【０２０８】
本発明のリポペプチドによってＬＨＲＨに対する抗体が持続的に産生されることは、対象リポペプチドが、不妊を誘発するワクチン製剤中の有効成分、または避妊薬として一般に有用であることを示している。
【０２０９】
したがって、本発明の別の態様は、薬学的に許容される希釈剤と、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされた単離ポリペプチドを含むリポペプチドとを含む避妊薬を提供する。ここで、
（ｉ）前記ポリペプチドは、
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列、および生殖ホルモンまたはホルモン受容体のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｂ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合している。
【０２１０】
本発明のワクチン／避妊薬は、本明細書の上記「リポペプチド製剤」の項に記載する１種または複数の担体または賦形剤または他の薬剤を含むことができる。
【０２１１】
同様に、被験体へのワクチン／避妊薬の投与は、本明細書の上記手段によって行われる。被験体は、ヒト、または動物被験体、例えば、家畜、実験動物、愛玩動物、野生化した動物、もしくは野生の外来動物が好ましい。
【０２１２】
Ａ群ストレプトコッカスに対する免疫化
Ａ群ストレプトコッカス（ＧＡＳ）は、比較的軽度の疾病、例えば、「連鎖球菌咽喉炎」および膿か疹、ならびにより稀な重症かつ生命にかかわることもある疾患、例えば、壊疽性筋膜炎および連鎖球菌毒素性ショック症候群の細菌病原体である。生命にかかわることもある重度のＧＡＳ疾患は、血液、筋肉または肺など細菌が通常存在しない体の部分に細菌が侵入したときに起こり得る「侵襲性ＧＡＳ疾患」と称する感染症である。最も重篤な形態の侵襲性ＧＡＳ疾患のうちの２つは、壊疽性筋膜炎および連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）である。壊疽性筋膜炎は、筋肉組織、脂肪組織および皮膚組織を破壊する。ＳＴＳＳは、血圧を急激に降下させ、器官（例えば、腎臓、肝臓、肺）を衰えさせる。壊疽性筋膜炎患者の約２０％、ＳＴＳＳ患者の半分以上が死亡する。他の形態の侵襲性Ａ群ストレプトコッカス疾患患者の約１０％〜１５％が死亡する。米国だけで１９９９年の侵襲性ＧＡＳ疾患は約９，４００例であった。
【０２１３】
侵襲性ＧＡＳ感染症は、細菌が感染した個体の防御を通過したとき、例えば、細菌が組織に侵入できる傷または他の皮膚損傷を負ったとき、あるいはＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めて慢性疾病または免疫系に影響を及ぼす疾病のために感染防御力が低下したときに一般に起こる。また、ＧＡＳのいくつかの溶菌系統は、他よりも重度の疾患を起こす可能性が高い。癌、糖尿病、腎臓透析などの慢性疾病患者、およびステロイドなどの薬物を使用している人はリスクがより高くなる。
【０２１４】
本明細書に例示するとおり、Ａ群ストレプトコッカス抗原、好ましくはタンパク質Ｍの抗原性Ｂ細胞エピトープを含む適切に構成された本発明のリポペプチドによって、ＧＡＳに対する免疫が動物宿主に付与され、より具体的にはＧＡＳのＭタンパク質に対して血清ＩｇＧ、唾液ＩｇＡおよび糞便ＩｇＡが誘発され、その後のＧＡＳへの暴露に対する防御免疫応答も付与され、それによってＧＡＳによる死亡率を減少させることができる。
【０２１５】
したがって、本発明の別の態様は、被験体中のＡ群ストレプトコッカス抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされたポリペプチドを含む単離リポペプチドを前記被験体に投与するステップを含む方法を提供する。ここで、
（ｉｖ）前記ポリペプチドは、
（ｂ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列、およびＡ群ストレプトコッカス抗原のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｃ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｖ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合しており、
（ｖｉ）前記リポペプチドを、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する液性免疫応答を誘発するのに十分な時間と条件下で投与する。
【０２１６】
リポペプチドは、本明細書に記載する有利なリポペプチド製剤の形で投与することができる。
【０２１７】
「液性免疫応答」とは、Ｂ細胞エピトープを含むペプチド、および／またはその後のＡ群ストレプトコッカスの暴露に対する防御免疫を提供するペプチドに対する血清ＩｇＧ、唾液ＩｇＡまたは糞便ＩｇＡを誘発するのに十分なＢ細胞エピトープに対する二次免疫応答が発生することを意味する。
【０２１８】
発生する液性免疫は、被験体中のＢ細胞エピトープに対する持続的なレベルの抗体を含むことが好ましい。「持続的なレベルの抗体」とは、引き続く暴露後のＡ群ストレプトコッカスによる感染の蔓延を防止し、かつ／またはその後Ａ群ストレプトコッカスに暴露された被験体の罹患率もしくは死亡率を低下させるのに十分なレベルの、Ｂ細胞エピトープに対する循環抗体を意味する。
【０２１９】
抗体レベルは、少なくとも約６カ月間または９カ月間または１２カ月間または２年間持続することが好ましい。
【０２２０】
Ｂ細胞エピトープは、Ａ群ストレプトコッカスのＭタンパク質アミノ酸配列に由来することが好ましい。
【０２２１】
このカテゴリー内の特に好ましいＢ細胞エピトープとしては、配列番号１０１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドなどがある。
【０２２２】
Ｔヘルパーエピトープは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましいが、配列番号１または１８〜５６のいずれか１個を使用することもできる。
【０２２３】
本発明の特に好ましい実施形態においては、Ｔヘルパーエピトープは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、Ｂ細胞エピトープは、配列番号１０１で示されるアミノ酸配列を含む。このような好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１０５〜１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。また、この好ましい実施形態によれば、脂質部分が、式（Ｉ）または（ＩＩ）のリポアミノ酸を含むことが（必須ではないが）好ましいが、本明細書に記載するあらゆる脂質が有用である。
【０２２４】
本発明のリポペプチドによってＪ１４ペプチドに対する抗体が持続的に産生されることは、対象リポペプチドが、Ａ群ストレプトコッカスに対する防御免疫を与えるワクチン製剤中の有効成分として一般に有用であることを示している。
【０２２５】
したがって、本発明の別の態様は、薬学的に許容される希釈剤および１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされた単離ポリペプチドを含むリポペプチドを含むＡ群ストレプトコッカスに対するワクチンを提供する。ここで、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドは、
（ｂ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列、およびＡ群ストレプトコッカス抗原のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｃ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｉｖ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合している。
【０２２６】
本発明のワクチンは、本明細書の上記「リポペプチド製剤」の項に記載する１種または複数の担体または賦形剤または他の薬剤を含むことができる。
【０２２７】
同様に、被験体へのワクチンの投与は、本明細書の上記手段によって、好ましくは鼻腔内経路によって行われる。被験体は、ヒト、または動物被験体、例えば、家畜、実験動物、愛玩動物、野生化した動物、もしくは野生の外来動物が好ましい。
【０２２８】
過剰で無秩序な胃酸分泌の阻害または予防
ガストリンは壁細胞による胃酸分泌を刺激することが知られている。またその活性は、ガストリンとガストリン受容体またはコレシステキニン受容体との結合によって媒介される。ガストリン末端の４〜５個のアミノ酸残基は、完全長タンパク質と同じ受容体特異性および活性をもたらす。ガストリン末端の５個のアミノ酸残基は「ペンタガストリン」と称される。無秩序なガストリン発現または分泌は高ガストリン血症を生じ、過剰で無秩序な胃酸分泌の結果、ゾリンジャーエリソン症候群、胃および十二指腸潰瘍の形成、あるいは膵臓または十二指腸におけるガストリノーマをもたらす恐れがある。ガストリンに対する抗体を用いてガストリンを免疫中和すると、ガストリンペプチドの胃内分泌に応じて胃酸の分泌が遮断されることも知られている。
【０２２９】
本明細書に例示するとおり、ガストリンペプチドの抗原性Ｂ細胞エピトープを含む適切に構成された本発明のリポペプチドは、ガストリンまたは胃酸分泌の阻害が必要な他の哺乳動物のマウスモデルにおける過剰なガストリン産生の作用に対して動物宿主を免疫することができる。本明細書が提供するデータは、ガストリンに対する液性免疫、およびガストリンの免疫中和を誘発し、それによって過剰で無秩序な胃酸分泌による高ガストリン血症、ゾリンジャーエリソン症候群、胃潰瘍または十二指腸潰瘍に罹患している動物における胃酸分泌を遮断するか、あるいは膵臓または十二指腸におけるガストリン分泌腫瘍の形成を減少または防止する（すなわち、ガストリノーマの予防および／または治療）対象リポペプチドの一般的有用性を示している。
【０２３０】
したがって、本発明の別の態様は、被験体中のガストリンペプチドに対する免疫応答を誘発する方法であって、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされたポリペプチドを含む単離リポペプチドを前記被験体に投与するステップを含む方法を提供する。ここで、
（ｖｉｉ）前記ポリペプチドは、
（ｃ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列、およびガストリンペプチド抗原のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｄ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｖｉｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合しており、
（ｉｘ）前記リポペプチドを、前記抗原性Ｂ細胞エピトープに対する液性免疫応答を誘発するのに十分な時間と条件下で投与する。
【０２３１】
リポペプチドは、本明細書に記載する有利なリポペプチド製剤の形で投与することができる。
【０２３２】
「液性免疫応答」とは、Ｂ細胞エピトープを含むガストリンペプチドに対する血清ＩｇＧを誘発するのに十分なＢ細胞エピトープに対する二次免疫応答が発生することを意味する。
【０２３３】
発生する液性免疫は、被験体中のＢ細胞エピトープに対する持続的なレベルの抗体を含むことが好ましい。「持続的なレベルの抗体」とは、ガストリンに応答した過剰または無秩序な胃酸分泌を防止するのに十分なレベルの、Ｂ細胞エピトープに対する循環抗体を意味する。
【０２３４】
抗体レベルは、少なくとも約６カ月間または９カ月間または１２カ月間または２年間持続することが好ましい。
【０２３５】
Ｂ細胞エピトープはペンタガストリンペプチド内に含まれることが好ましい。このカテゴリー内の特に好ましいＢ細胞エピトープとしては、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられるが、Ｂ細胞エピトープを含む完全長ガストリンタンパク質またはその任意の免疫原性断片も使用することができる。
【０２３６】
Ｔヘルパーエピトープは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましいが、配列番号１または１８〜５６のいずれか１個を使用することもできる。
【０２３７】
本発明の特に好ましい実施形態においては、Ｔヘルパーエピトープは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、Ｂ細胞エピトープは、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列を含む。このような好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１０９〜１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。また、この好ましい実施形態によれば、脂質部分が、式（Ｉ）または（ＩＩ）のリポアミノ酸を含むことが（必須ではないが）好ましいが、本明細書に記載するあらゆる脂質が有用である。
【０２３８】
本発明のリポペプチドによってペンタガストリンまたはガストリンに対する抗体が持続的に産生されることは、それを必要とする被験体においてガストリンの有害作用を軽減するワクチン製剤中の有効成分としての対象リポペプチドの一般的有用性を示している。
【０２３９】
したがって、本発明の別の態様は、薬学的に許容される希釈剤および１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされた単離ポリペプチドを含むリポペプチドを含む、被験体における過剰なガストリン分泌によって誘発される疾患または症状に対するワクチンを提供する。ここで、
（ｖ）前記ポリペプチドは、
（ｃ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列、およびガストリンペプチド抗原のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｄ）内部リジンのε−アミノ基または内部リジン類似体の末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々を共有結合するための１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含み、
（ｖｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的もしくは間接的に共有結合している。
【０２４０】
本発明のワクチンは、本明細書の上記「リポペプチド製剤」の項に記載する１種または複数の担体または賦形剤または他の薬剤を含むことができる。
【０２４１】
同様に、対象ワクチンの投与は、本明細書の上記手段によって行われる。被験体は、ヒトであることが好ましい。
【０２４２】
本発明を、以下の非限定的な実施例および図面を参照してさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【０２４３】
材料および方法
化学物質
別段の記載がないかぎり、化学物質は、分析グレードまたはそれと同等のグレードであった。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）を、Ａｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、ＡｕｓｔｒａｌｉａおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を、Ｂａｃｈｅｍ、（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびジエチルエーテルをＭｅｒｃｋ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．（Ｋｉｌｓｙｔｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。フェノールおよびトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）をＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｌｋｅ、ＷＩ）から、トリニトロベンジルスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）およびジアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をＦｌｕｋａから、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）をＳｉｇｍａから、パルミチン酸をＦｌｕｋａから入手した。
【０２４４】
式（Ｉ）の脂質部分の合成
Ｐａｍ３Ｃｙｓを、Zeng et al.、J Pept Sci 2,:66(1996)に記載の方法によって改変されたWeismuller et al.、Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364、593(1983)に記載された方法によって調製した。リポアミノ酸Ｐａｍ３Ｃｙｓを、Zeng et al.(上記)によって記載された手順に従ってリジンの露出したε−アミノ基に結合（couple）させる。簡単に説明すると、２倍過剰のＰａｍ３Ｃｙｓ、ＴＢＴＵおよびＨＯＢｔをＤＣＭに溶解し、３倍過剰のＤＩＰＥＡを添加した。次いで、この溶液を、樹脂に結合したペプチドに添加して、リポペプチドを製造した。
【０２４５】
式（ＩＩ）の脂質部分の合成
Ｐａｍ２Ｃｙｓおよびその誘導体Ｆｍｏｃ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＯＨを、Jones et al.、Xenobiotica 5、155(1975)およびMetzger et al.、Int J Pept Protein Res 38、545(1991)に記載の方法によって調製した。
【０２４６】
リポペプチドの合成
Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｏｃｔ２ＣｙｓまたはＬａｕ２Ｃｙｓを、Jones et al.、Xenobiotica 5、155(1975)およびMetzger et al.、Int J Pept Protein Res 38、545(1991)に記載の方法の変法を用いてペプチドに結合させた。
【０２４７】
Ｉ．Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインの合成：
トリエチルアミン（６ｇ、８．２ｍｌ、５８ｍｍｏｌ）を、Ｌ−システイン塩酸塩（３ｇ、１９ｍｍｏｌ）と３−ブロモ−プロパン−１，２−ジオール（４．２ｇ、２．３６ｍｌ、２７ｍｍｏｌ）の水溶液に添加し、その均一溶液を室温で３日間保持した。その溶液を真空中４０℃で濃縮して白色残渣とし、それをメタノール（１００ｍｌ）とともに煮沸し、遠心分離して、その残渣を水（５ｍｌ）に溶解した。この水溶液をアセトン（３００ｍｌ）に添加し、遠心分離して沈殿物を単離した。この沈殿物を、アセトンを用いて水から数回沈殿させて精製して、白色アモルファス粉末のＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（２．４ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、６４．７％）を得た。
【０２４８】
ＩＩ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ）の合成：
Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（２．４５ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を、９％炭酸ナトリウム（２０ｍｌ）に溶解した。フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．４５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液を添加し、その混合物を２時間攪拌し、次いで水（２４０ｍｌ）で希釈し、ジエチルエーテル（２５ｍｌ×３）で抽出した。その水相を濃塩酸でｐＨ２に酸性化し、次いで、酢酸エチル（７０ｍｌ×３）で抽出した。その抽出物を水（５０ｍｌ×２）および塩化ナトリウム飽和溶液（５０ｍｌ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固させた。エーテルおよび酢酸エチルから−２０℃で再結晶させて無色粉末（２．８ｇ、６．７ｍｍｏｌ、６３．８％）を得た。
【０２４９】
ＩＩＩ．樹脂に結合したペプチドへのＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨのカップリング：
Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭおよびＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ、３ｍｌ）中でＨＯＢｔ（３６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）およびＤＩＣＩ（３７ｕｌ、０．２４ｍｍｏｌ）を用いて０℃で５分間活性化した。次いで、その混合物を、樹脂に結合したペプチド（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇアミノ−ペプチド樹脂）を含む容器に添加した。２時間振とうした後に、溶液をろ過して除去し、樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦ（各３×３０ｍｌ）で洗浄した。ＴＮＢＳＡ試験を用いて反応終了をモニターした。必要に応じて、カップリングを２回実施した。
【０２５０】
ＩＶａ．Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂の２個のヒドロキシ基のパルミトイル化：
パルミチン酸（２０４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＣＩ（１５４ｕｌ、１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（９．７６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍｌおよびＤＭＦ  １ｍｌに溶解した。樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇ）をこの溶液に懸濁し、１６時間室温で振とうした。ろ過して溶液を除去し、次いで樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで十分洗浄して尿素の残渣を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去を２．５％ＤＢＵを用いて実施した（２×５分）。
【０２５１】
ＩＶｂ．Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂の２個のヒドロキシ基のステアロイル化（ｓｔｅａｒｏｙｌａｔｉｏｎ）：
ステアリン酸（約０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＣＩ（１５４ｕｌ、１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（９．７６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍｌおよびＤＭＦ  １ｍｌに溶解した。樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇ）をこの溶液に懸濁し、室温で１６時間振とうした。ろ過して溶液を除去し、次いで樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで十分洗浄して尿素の残渣を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去を２．５％ＤＢＵを用いて実施した（２×５分）。
【０２５２】
ＩＶｃ．Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂の２個のヒドロキシ基のラウロイル化（ｌａｕｒｏｙｌａｔｉｏｎ）
ラウリン酸（約０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＣＩ（１５４ｕｌ、１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（９．７６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍｌおよびＤＭＦ  １ｍｌに溶解した。樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇ）をこの溶液に懸濁し、室温で１６時間振とうした。ろ過して溶液を除去し、次いで樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで十分洗浄して尿素の残渣を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去を２．５％ＤＢＵを用いて実施した（２×５分）。
【０２５３】
ＩＶｄ．Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂の２個のヒドロキシ基のオクタノイル化（ｏｃｔａｎｏｙｌａｔｉｏｎ）
オクタン酸（約０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＣＩ（１５４ｕｌ、１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（９．７６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍｌおよびＤＭＦ  １ｍｌに溶解した。樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇ）をこの溶液に懸濁し、室温で１６時間振とうした。ろ過して溶液を除去し、次いで樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで十分洗浄して尿素の残渣を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去を２．５％ＤＢＵを用いて実施した（２×５分）。
【０２５４】
ペプチド合成
ペプチド合成に使用される一般的な手順は、Jackson et al.、Vaccine 18、355(1999)に記載されている。ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの間に脂質が結合するのを可能にするために、Ｆｍｏｃ−リジン（Ｍｔｔ）−ＯＨを、樹脂に結合したペプチドのほぼ中央の２個のエピトープ間に挿入した。ペプチド内の別の位置、例えば、配列番号２４のＬｙｓ−１４残基に脂質を付加させる場合には、Ｆｍｏｃ−リジン（Ｍｔｔ）−ＯＨもその位置に挿入した。ペプチド合成終了後に、１％ＴＦＡのジクロロメタン溶液を連続して流しながら３０〜４５分間洗浄してＭｔｔ基を除去して、リジン残基のεアミノ基を露出させた。２個のセリン残基をスペーサーとして使用する場合には、２個のセリン残基をこのεアミノ基に結合させた。あるいは、２個のアルギニン残基をスペーサーとして使用する場合には、２個のアルギニン残基をこのεアミノ基に結合させた。あるいは、６−アミノヘキサン酸をこのεアミノ基に結合させた。続いて、脂質部分、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｏｃｔ２Ｃｙｓ、またはＬａｕ２Ｃｙｓのカップリングは上述した。
【０２５５】
すべての樹脂結合ペプチド構築体を、固相支持体から試薬Ｂ（８８％ＴＦＡ、５％フェノール、２％ＴＩＰＳ、５％水）を用いて２時間かけて切断し、Zeng et al.、Vaccine 18、1031(2000)に記載されたように逆相クロマトグラフィーによって精製した。
【０２５６】
分析用逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム中に組み込まれたＶｙｄａｃ  Ｃ４カラム（４．６×２５０ｍｍ）を用いて実施し、０．１％ＴＦＡ水溶液および０．１％ＴＦＡのＣＨ３ＣＮ溶液を限界溶媒（ｌｉｍｉｔ  ｓｏｌｖｅｎｔ）として用いて流量１ｍｌ／分で展開した。すべての生成物は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって主要な単一ピークとして現れ、遅延イオン抽出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｉｏｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＢＩＦＬＥＸ装置を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析したところ、予想どおりの質量であった。免疫原の最終定量を、ペプチド構築体中のトリプトファン残基およびチロシン残基の存在を利用して２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって実施した（モル吸光係数６．６×１０３）。
【０２５７】
Ｐａｍ３Ｃｙｓ含有ペプチドおよびＰａｍ２Ｃｙｓ含有ペプチドのペプチドと脂質部分の間に２個の残基を組み込むことによるセリンの効果を検討するために、２個のセリン残基を順次ペプチドに付加してから、脂質部分を共有結合させた（その構造を図１に示す）。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析法によって実施したそれらの特性をまとめて表１および２に示す。
【０２５８】
免疫手順
６〜８週齡の５匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの各グループを０日および再度２８日に接種した。あるいは、４〜６週齡の非近交系クァッケンブッシュ雌マウスを鼻腔内免疫し、２１日間隔の一次免疫により追加免疫した。皮下（ｓ．ｃ．）接種（１００μｌ容量／用量）の場合には、リポペプチド構築体を生理食塩水中に調製し、非脂質付加ペプチドを一次注射の場合には等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、二次接種の場合には等容量の不完全フロイントアジュバントのエマルジョンとして処方した。鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種の場合には、ペントレン吸入によって麻酔したマウスの鼻孔にペプチド（生理食塩水中）５０μｌを投与した。血清を、一次接種から４週間後および二次接種から２週間後に採取した血液から調製し、あるいは、最終免疫から７日後に尾から採血して調製した。
【０２５９】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
血清試料について、被覆抗原として免疫抗原（例えば、ＬＨＲＨ、Ｊ１４またはペンタガストリン）を用いて、基本的にGhosh et al.、Int Immun.11、1103、(1999)に記載されたとおりＥＬＩＳＡアッセイを実施した。抗体力価を、０．２のＯＤが得られる血清の最高希釈度の逆数として表す。これは、抗体不在下のバックグラウンド結合の約５倍である。Ghosh et al.、Int Immun.11、1103、(1999)に記載されたように、ＬＨＲＨまたはＪ１４に特異的な抗体のアイソタイプを、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＡに対するウサギ抗血清（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）を用いて求めた。
【０２６０】
受胎能試験
ペプチド免疫原を接種し、雄マウスに暴露した後に、雌マウスが同腹子を産めるかどうか試験した。ＣＦＡ中の生理食塩水で免疫した雌マウスのグループを対照として使用した。雄マウスを、２匹または３匹の雌性のマウスを飼育するケージに入れ、各ケージ間を雄マウスを循環させて各グループの雌マウスをすべての雄に暴露した。オスおよびメスを一緒に合計３週間飼育し、その最後に雄を除去し、雌を観察しつづけた。
【表１】
2010155832.tif 000013
【表２】
2010155832.tif 000014
【０２６１】
樹状細胞培養
樹状細胞（ＤＣ）を、完全ＩＤＤＭに基づく培地中で培養した。これは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含みα−チオグリセロールまたはＬ−グルタミン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｅｎｅｘａ、ＵＳＡ）を含まず、１０％（ｖ／ｖ）熱失活（５６℃、３０分）ウシ胎児血清（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ゲンタマイシン（２４μｇ／ｍＬ）、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１８０μｇ／ｍＬ）および２−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）からなるものとした。ＤＣ産生の場合には、培養ＮＩＨ／３Ｔ３細胞から得られる３０％上清、およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をトランスフェクトしたＡｇ８６５３細胞から得られる上清の形態の５％ＧＭ−ＣＳＦを完全ＩＭＤＭにさらに添加した（ＤＣ培地）。
【０２６２】
未成熟樹状細胞の培養方法は、Winzler et al.、J.Exp Med.185、317(1997)に基づくものであった。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾臓細胞を３ｍｌ  ＤＣ培地中に１．５×１０６細胞／５５ｍｍシャーレ（Ｔｅｃｈｎｏ−Ｐｌａｓ、Ｓ．Ａ．、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で播き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培養に使用した装置はすべて発熱性物質を含んでいなかった。培地を４日ごとに交換し、全細胞をシャーレに戻した。１２日目に、懸濁した細胞と弱く接着した細胞の両方を強制的にピペットで回収し、次いで培地を吸引した。この手順をＰＢＳ  ２ｍｌを用いて繰り返した。残りの強く接着した細胞は廃棄した。回収した細胞を遠心分離によってペレットにし、新しいシャーレに再度播いた。引き続き、４日ごとの培地交換と継代の交互サイクルで細胞を維持した。連続培養１カ月後に、浮遊細胞および半接着細胞が出現し、未成熟ＤＣの染色特性を呈し、Ｄ１細胞と呼ばれるようになる。これらの継代条件下で、培養Ｄ１細胞の大多数が、中程度の発現レベルの細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を特徴とする未成熟表現型を維持する。
【０２６３】
Ｄ１細胞のフローサイトメトリー分析
Ｄ１細胞（１×１０５細胞／試料）を、ＤＣ培地１ｍｌを含む新しいシャーレに播き、リポペプチド０．００４５ｎｍｏｌとともにインキュベートし、完全ＩＭＤＭ培地に溶解した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１１１：Ｂ４から精製されたリポ多糖（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ、Ｄｒ．Ｅ．Ｍａｒｇｏｔ  Ａｎｄｅｒｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅの好意による）を５μｇ／ｍＬでＤＣ成熟の陽性対照として使用した。終夜インキュベートした後に、細胞を収集し、１％ＦＣＳを含むＰＢＳで１回洗浄した。ＦＣγＲＩＩ／ＩＩＩへの非特異的結合を防止するために、細胞を正常マウス血清２０μＬとともに５分間室温でプレインキュベートした。次いで、細胞をＦＩＴＣ複合モノクローナル抗体１４−４−４Ｓ（ＩｇＧ２ａ、抗ｌ−Ｅｋ，ｄ；Ozato et al.、J.Immunol、124、533、1980）に氷上で３０分間暴露した。インフルエンザウイルス赤血球凝集素に特異的であるモノクローナル抗体３６／１（Brown et al.、Arch Virol 114、1 1990）をアイソタイプ対照として使用した。すべての抗体を２．５μｇ／ｍＬで使用した。試料を、１％ＦＣＳを含むＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて氷上で１５分間かけて固定した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を用いて実施し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ,Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。
【実施例２】
【０２６４】
ＬＨＲＨ  Ｂ細胞エピトープを含むリポペプチドの試験
ＬＨＲＨを含むリポペプチドの可溶性
ＬＨＲＨを含む様々なリポペプチド調製物の目視検査によれば、それらは可溶性が著しく異なる（図２）。可溶性の増加は、脂質が、分子のほぼ中央にある２個のエピトープ間に結合した場合に最も明らかである。リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］は、生理食塩水に少なくとも８ｍｇ／ｍｌ（これよりも高い濃度は試験しなかった）の濃度で溶解したのに対して、配列のＮ末端に脂質が結合した構築体は、わずか０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で乳光色の溶液を形成した。
【０２６５】
脂質部分とペプチド部分の間に２個の親水性セリン残基を取り込むことによって（すなわち、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］およびＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］）、Ｎ末端に結合した脂質を含むペプチドの可溶性をさらに高めようとする努力は失敗に終わった。実際に、リポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］は、不溶性過ぎて、他のリポペプチドに使用した条件下ではＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することができなかった。本発明者らは、この構築体の不溶性は、実用的なワクチン製造案を考慮する上で支障があると考えた。
【０２６６】
ＬＨＲＨ  Ｂ細胞エピトープを含むリポペプチドの免疫原性
３個のリポペプチドＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］は、生理食塩水に溶解してｓ．ｃ．投与すると、高レベルの抗ＬＨＲＨ抗体を誘発した。実際に、これらのリポペプチドを２回投与した後に誘発される抗体価は、［Ｔｈ］−［Ｂ］または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］をＣＦＡに入れて投与したときに得られる抗体価と類似していた（図３）。Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］またはＰａｍ２Ｃｙｓ−［Ｔｈ］−［Ｂ］を与えたマウス血清中の抗ＬＨＲＨ抗体の力価はわずかに低かった。２個の可溶性リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］は、一次接種後に、他の低可溶性リポペプチド構築体の１０〜１００倍高いレベルの抗ＬＨＲＨ抗体を誘発した。［Ｔｈ］−［Ｂ］とＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４を１：１または１：５で混合して与えた５匹のマウスの２つのグループは、有意なレベルの抗ＬＨＲＨ抗体を誘発しなかった。この知見は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４をアジュバントとして用いて報告された他の結果（Jung,G.、and W.G.Bessler.(1995)「Immunological recognition of peptides in medicine and biology」、N.D.Zegers、W.J.A.Boersma、and E.Claassen（編）CRC Press、Boca、New York、London、Tokyo、p.159）とは対照的である。
【０２６７】
様々なリポペプチドを用いて二次接種した２週間後に実施した受胎能試験の結果を表３に示す。
【０２６８】
生理食塩水中の２種類の可溶性リポペプチド構築体［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］、あるいはＣＦＡ中の２種類の非脂質付加構築体［Ｔｈ］−［Ｂ］または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］を投与したマウスは妊娠しなかった。Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］を与えたグループのうちの１匹のマウス、およびＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］またはＰａｍ２Ｃｙｓ−［Ｔｈ］−［Ｂ］を与えたグループのうちの２匹のマウスは同腹仔を生んだ。ＣＦＡ中の生理食塩水、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓ−（Ｌｙｓ）４と混合したペプチド［Ｔｈ］−［Ｂ］を投与した対照マウスグループのすべてのマウスが同腹仔を生んだ。
【０２６９】
ペプチドワクチンの２回目の投与から７カ月まで抗体レベルを追跡した。リポペプチドの初回刺激を受けたマウス、およびＣＦＡ中の非脂質付加ペプチドによる初回刺激を受けたマウス中に存在する抗ＬＨＲＨ抗体の力価は、２６週間で１／４〜１／２０に低下する。二次接種から３カ月後に、すべてのマウスについて実施した受胎能試験は、免疫後２週間の試験と類似した結果であった。生理食塩水中の可溶性リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］、またはＣＦＡ中の非脂質付加［Ｔｈ］−［Ｂ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［Ｂ］を与えたマウスは不妊のままであった。
【表３】
2010155832.tif 000015
【０２７０】
Ｐａｍ２ＣｙｓはＰａｍ３Ｃｙｓよりも強力なアジュバントである
図３および表２に示す結果によれば、２個の分枝リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］は、免疫原Ｐａｍ２Ｃｙｓ−［Ｔｈ］−［Ｂ］、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］およびＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］よりも高度に可溶性であるだけでなく、高い抗体価も誘発し、特に一次抗体応答において高い抗体価を誘発する。
【０２７１】
これをさらに検討するために、本発明者らは、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］の免疫原性に対する用量減の効果を調べた。１０ｎｍｏｌおよび１ｎｍｏｌの用量では、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］は、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］よりも高い抗体価が得られた（表４）。より著しい相違が交尾試験で認められた。すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］を１０ｎｍｏｌおよび１ｎｍｏｌを与えたそれぞれ５匹のマウスのうち１匹、および５匹のマウスのうち０匹しか同腹仔を生まなかったのに対して、これらの用量の［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）−［Ｂ］を与えた５匹のうち３匹、および５匹のうち５匹のマウスが同腹仔を生んだ（表４）。これらの結果は、Ｐａｍ２Ｃｙｓ含有ペプチドがＰａｍ３Ｃｙｓ含有ペプチドよりも優れた免疫原であることを示している。
【０２７２】
２個の追加のセリン残基をＰａｍ２Ｃｙｓ含有免疫原に入れる効果は、動物の受胎能状態に対してほとんどまたはまったく影響を及ぼさなかったが、２回目の投与後に生じる抗体価が改善された（表４）。
【表４】
2010155832.tif 000016
【０２７３】
鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫後の全身的抗体応答
本発明者らは、生理食塩水中の［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］およびＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］を鼻腔内経路で接種した。同じワクチンを皮下経路でも接種し、全身的抗ＬＨＲＨ抗体応答を測定した。［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の接種に使用した溶液は透明であり、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］の接種に使用した溶液は乳光色であり、２つの調製物間の可溶性の違いを示している。
【０２７４】
２回の鼻腔内接種後に、各ワクチンは、皮下接種後の力価よりもやや低い類似した血清抗ＬＨＲＨ抗体力価をもたらした（表５）。可溶性の高い［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］は、単回投与から４週間後に、可溶性の低いＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］よりもかなり高レベルの抗ＬＨＲＨ抗体を誘発した（ｐ＝０．００００７）。実際に、これは、皮下接種後に得られる結果に類似していた。受胎能試験によれば、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］を鼻腔内投与したマウスでは５匹のうち３匹が妊娠したのに対して、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の２回の鼻腔内接種ではすべてのマウスが妊娠しなかった。
【０２７５】
２つの異なる経路によって投与された２個の構築体によって誘発される応答の長さの比較も表５に示す。２回目のワクチン投与から２６週間後には、すべてのマウスの抗体レベルは、２回目の投与から２週間後に観測された抗体レベルよりも低下した。しかし、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］を皮下投与したグループにおける抗ＬＨＲＨ抗体の低下は極めて小さく、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒが分子のほぼ中央に結合した配置がこの状況において優れていることをやはり明確に示している。
【表５】
2010155832.tif 000017
【０２７６】
本発明者らは、可溶性リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］を２回皮下または鼻腔内投与した動物から得られた、ＬＨＲＨに対する個々の抗体アイソタイプの力価も測定した（図４）。鼻腔内接種によって誘発される全Ｉｇ量は少なかったが、鼻腔内接種は、皮下接種よりも高レベルのＩｇＧ３、ＩｇＧ２ｂおよびおそらくＩｇＭを誘発すると考えられた。
【０２７７】
ＤＣをペプチドおよびリポペプチドに暴露すると、様々なレベルの細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子が誘発される
樹状細胞による二次リンパ器官中の未処置ＣＤ４＋  Ｔ細胞の初回抗原刺激後に抗原暴露するとＤＣが成熟した。この成熟は、ＤＣ表面上のＭＨＣ産物および共刺激分子のアップレギュレーションを特徴とする。したがって、本発明者らは、これらのワクチン候補の様々な免疫原性を説明するために、様々なペプチドおよびリポペプチドが樹状細胞を示差的に活性化できるかどうかを判定した。
【０２７８】
一連の未成熟ＤＣ、すなわちＤ１細胞をペプチドに暴露し、ＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現について染色し、次いでフローサイトメトリーで分析した実験の結果によれば、ＤＣ成熟には、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］が最も有効であり、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−［Ｔｈ］−［Ｂ］が最も有効でなかった（図５）。［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］のクラスＩＩ発現をアップレギュレートする能力は、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）およびＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ［Ｔｈ］−［Ｂ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］に近接し、中間の活性化レベルを示した。非脂質付加ペプチドは、Ｄ１細胞の成熟を培養では自然に起こる２６％を超えて誘発することができなかった。リポペプチドがＤ１細胞の成熟を誘発する能力は濃度に依存した（データは示さず）。これらのリポペプチドがＤ１細胞の成熟を誘発する相対能力は、それらの抗体誘発能力を直接反映しており、免疫原性の違いに対して考えられる機序を提供するものである。
【０２７９】
ＬＨＲＨのＣ末端ペンタペプチドに対する抗体応答
図６に示すように、［Ｔｈ］がインフルエンザ赤血球凝集素の軽鎖に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ（配列番号１）からなり、［Ｂ］がＬＨＲＨ１〜１０（配列番号２）またはＬＨＲＨ６〜１０（すなわち、ＬＨＲＨの最終Ｃ末端５残基；配列番号４）である脂質付加［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−［Ｂ］によって、脂質部分とペプチド部分の間に位置するセリンスペーサー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）が存在してもしなくても、ほぼ同等の抗体応答が誘発される。これらのデータは、リポペプチドの有用性が、免疫抗原として使用される任意の特定のアミノ酸配列に限定されないという提案を支持するものである。
【０２８０】
Ｐａｍ２Ｃｙｓ以外の脂質はリポペプチド構築体に有用である
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齡）の各グループに、配列番号９で示されるアミノ酸配列にコンジュゲートされた脂質部分Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２ＣｙｓまたはＯｃｔ２Ｃｙｓを含む図７に示すペプチド免疫原（すなわち、配列番号３で示されるＬＨＲＨ２〜１０にコンジュゲートされた配列番号２４のＣＤＶ−Ｆ  Ｔヘルパーエピトープを含み、内部リジン残基がこれらのエピトープ間に位置するペプチド）２０ｎｍｏｌを、一次と二次ワクチン接種の両方で皮下接種した。ペプチド構造を図７に示す。すべてのリポペプチドを生理食塩水に溶解して投与した。対照として、非脂質付加ペプチドをＣＦＡに入れて投与した。一次ワクチン接種後４週目および二次ワクチン接種後２週目に採取した血液から血清を得た。
【０２８１】
図８に示すデータによれば、リポペプチド構築体中の別の脂質部分をＰａｍ２Ｃｙｓ部分で置換すると強い一次および二次抗体応答を得ることができる。
【０２８２】
様々なスペーサーを使用してリポペプチド中のペプチドから脂質を分離することができる
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齡）の各グループに、配列番号９で示されるアミノ酸配列にコンジュゲートされ、セリンホモ二量体、アルギニンホモ二量体または６−アミノヘキサン酸からなるスペーサーを用いてそれから分離された脂質部分Ｐａｍ２Ｃｙｓを含む図７に示すペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを皮下接種した。ペプチド構造を図７に示す。すべてのリポペプチドを生理食塩水に溶解して投与した。対照として、非脂質付加ペプチドをＣＦＡに入れて投与した。一次ワクチン接種後４週目および二次ワクチン接種後２週目に採取した血液から血清を得た。
【０２８３】
図９に示すデータによれば、多種多様なスペーサーを用いてリポペプチド構築体中のペプチド部分からＰａｍ２Ｃｙｓ部分を分離したときに、強い一次および二次抗体応答を得ることができる。
【０２８４】
脂質部分は、Ｔヘルパーエピトープ内部の内部リジン残基に結合することができる
脂質部分が結合する内部リジン残基の位置決定要件の厳密性を明確にするために、本発明者らは、Ｔヘルパーエピトープ内の内部リジン残基に脂質が結合したリポペプチド構築体の免疫原性も試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（０週齢および４週齡）の各グループに、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間の配列番号９で示されるアミノ酸配列にコンジュゲートされた、あるいは、Ｔヘルパーエピトープ内部のＬｙｓ−１４の位置において配列番号１０３で示されるアミノ酸配列にコンジュゲートされた脂質部分Ｐａｍ２Ｃｙｓを含むペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを皮下接種した。ペプチド構造を図７および１０に示す。すべてのリポペプチドを生理食塩水に溶解して投与した。対照として、非脂質付加ペプチドをＣＦＡに入れて投与した。一次ワクチン接種後４週目、および二次ワクチン接種後２週目に採取した血液から血清を得た。
【０２８５】
図１１に示すデータによれば、脂質部分がどちらの位置に結合しているリポペプチドでも強い抗体応答を得ることができ、内部リジンの厳密な配置、およびその結果の脂質部分の厳密な配置は免疫原性に重要なものではないことを示唆している。
【０２８６】
考察
この研究において、本発明者らは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ、１個または複数のＢ細胞エピトープを含む自己ペプチドＬＨＲＨ、およびＰａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ２Ｃｙｓから構成される様々なリポペプチド免疫原の構築について述べる。
【０２８７】
脂質をほぼ中央に位置決定する必要性に対する厳格な要件を並べることなく、本発明者らは、脂質を、より一般的なＮ末端の位置の代わりに、Ｔ細胞エピトープとＬＨＲＨの間のペプチド免疫原のほぼ中央に配置することによって、得られるワクチンの可溶性が大きく改善されることを見出した。接種に必要な濃度の透明生理食塩水溶液を、これらの分枝構造によって容易に得ることができる。これに対して、脂質がＮ末端に結合した免疫原は可溶性が低く、濁ったまたは乳光色の生理食塩水溶液が得られた。抗体応答の検討、およびその後の受胎能試験によれば、水溶性リポペプチドは、一次接種から４週後に高い抗体価をもたらし、脂質がＮ末端に結合した可溶性の低いリポペプチドよりも効率的に妊娠を抑制した。水溶性自己アジュバント作用（ｓｅｌｆ−ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）ワクチンは、一部可溶性材料または不溶性材料よりも明らかな利点があり、製造プロセスを単純化でき、用量の計量もより正確にできる。
【０２８８】
脂質部分の位置決定要件の厳密性の検討によれば、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間ではなくＴヘルパーエピトープ内に脂質が位置するときでも免疫動物における抗体応答が観察されたことから、ある程度の自由度が予想される。
【０２８９】
リポペプチド用量を変える効果の検討によれば、Ｐａｍ２Ｃｙｓ含有リポペプチドは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ含有ペプチドよりも優れた免疫原であることが示された。しかし、他のリピドペプチド（ｌｉｐｉｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）、例えば、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ含有リポペプチド、Ｌａｕ２Ｃｙｓ含有リポペプチド、およびＯｃｔ２Ｃｙｓ含有リポペプチドも強い抗体応答を発生させるのに有用であった。
【０２９０】
本発明者らは、脂質部分とペプチド配列の間に２個のセリン残基または２個のアルギニン残基を挿入すると、得られるＰａｍ２Ｃｙｓ含有免疫原の効力が増大することを本研究で見出した。脂質がＮ末端に結合しているときには、２個のセリン残基は、脂質とペプチド配列の間の不活性スペーサーとして、またはＴヘルパー細胞エピトープの延長部分として働き、おそらく免疫学的活性を調節しうるものとなる。脂質がリジン残基のε−アミノ基に分子の中央で結合する場合には、不活性スペーサーである、６−アミノヘキサン酸から類似した結果が得られるので、２個のセリン残基または２個のアルギニン残基はスペーサーとして働く。
【０２９１】
本発明者らは、リポペプチド構築体の免疫原性が、使用したＴヘルパーエピトープまたはＢ細胞エピトープの特定のアミノ酸配列に依存しないことも見出した。これは、様々な抗原性Ｂ細胞エピトープに対する広範なリポペプチドをいくつかの異なる動物宿主において製造するために採られる手法が一般に有用であることを示すものである。
【０２９２】
マクロファージは、細胞表面受容体に結合する微生物産物によって刺激され、この結合現象から生じるシグナルはＴｏｌｌ様受容体を介して伝達され、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの産生をもたらすと理解されている。これらの受容体はＤＣ集団中にも存在し、結合すると、細胞の成熟および遊走のためのシグナル、ならびに効率的抗原提示に必要な分子の産生のためのシグナルを伝達する。
【０２９３】
この研究に使用される様々な合成リポペプチドワクチンは、ＤＣ成熟を評価するために使用されるマーカーである、未成熟ＤＣ表面上のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子のアップレギュレーションを誘発することが判明した。これに対して、非脂質付加ペプチド構築体は、ＤＣを成熟させることができず、このことは、脂質部分がその効果に寄与することを示している。リポペプチドによって誘発されるＤＣ成熟の階層は、ペプチド構築体によって示される免疫原性の階層を反映したものであり、ＤＣの成熟と相互作用し誘発するワクチンの能力が、おそらくは、成熟し排液性リンパ節に移動するシグナルを受けたＤＣによるＣＤ４＋  Ｔ細胞初回抗原刺激の効率を増加させることによって、より良好な免疫応答を導くことを意味している。
【０２９４】
リポペプチドは、追加のアジュバントの不在下で免疫応答を誘発することができ、したがって、非経口以外の経路によって送達することができる。したがって、本発明者らは、Ｐａｍ２Ｃｙｓ含有ペプチドの鼻腔内接種後の抗体応答について検討した。ここで得られた結果によれば、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］またはＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］の鼻腔内接種は全身的抗ＬＨＲＨ抗体の力価を、皮下経路接種によって誘発されるそれよりも低下させ、免疫グロブリンのアイソタイププロファイルも異なっていた。可溶性リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の鼻腔内接種は、皮下免疫よりも高レベルのＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を誘発し、低レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを誘発する。これは、２つの免疫経路がある程度異なるサブセットのＴ細胞を誘発し、異なる部位で生じる異なるＤＣ集団に部分的に起因する抗体産生を促進し得ることを示していると考えられる。これは、形状が異常な分子に対して樹状細胞が有する優先傾向を反映しているとも考えられる。
【０２９５】
水溶性ペプチド構築体［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の鼻腔内接種は、１回目のワクチン投与から４週間後の抗ＬＨＲＨ抗体価が不溶性Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−［Ｔｈ］−［Ｂ］よりも有意に高くなった。これらのマウスを用いて実施した受胎能試験によれば、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］の鼻腔内接種のみが繁殖を完全に防ぐことができたことが示された。２回目の抗原投与後の両方のグループのマウスにおける抗体価は明らかに類似していたが、抗体の高力価は、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｂ］に対する一次応答中にのみ誘発された。したがって、免疫的避妊ワクチンが有効であるためには、抗体の高力価が存在する時間が効力の重要な決定因子である可能性がある。
【０２９６】
まとめると、抗体価の測定および受胎能試験の結果によれば、Ｂ細胞エピトープとＴヘルパーエピトープの間の、完全な合成ペプチドワクチンのほぼ中央におけるＰａｍ２Ｃｙｓの配置は、可溶性とワクチンの免疫原性を高めることが示された。この改善された免疫原性は、これらの分枝ペプチドワクチンの脂質とペプチド配列の間に２個のセリン残基を導入することによってさらに改善される。脂質、自己アジュバント部分を、ペプチドを主体とするワクチンの異なる位置に組み込むと、生理学的、免疫学的および生物学的特性が大きく変わるという知見は、好結果を生むワクチン設計のための別の戦略を提供するものである。
【実施例３】
【０２９７】
Ａ群ストレプトコッカスのＭタンパク質に由来するＢ細胞エピトープを含むリポペプチドについての研究
複数の脂質の効果
リポペプチドの免疫原性が、ペプチドにコンジュゲートされた脂質の数によって決まるかどうかを試験するために、また、様々な抗原性Ｂ細胞エピトープ含有ペプチドに対して有効なリポペプチドを製剤化できることを実証するために、本発明者らは、ＣＤＶ−Ｆ  Ｐ２５ＴヘルパーエピトープおよびＡ群ストレプトコッカスＢ細胞エピトープＪ１４を含むペプチド部分（すなわち、ペプチド部分は配列番号１０５のアミノ酸配列を有する）と、１個または２個の脂質部分とを含むリポペプチドを製造した。リポアミノ酸部分Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒは、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する内部リジンに付加され、１個の構築体中で、別のリポアミノ酸部分Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＳｅｒもＴヘルパーエピトープ中のＮ末端のリジンに付加された。
【０２９８】
４〜６週齡の非近交系クァッケンブッシュ雌マウス（１５／グループ）に、ペプチドを主体とするワクチン６０μｇを総量３０μｌのＰＢＳに溶解して鼻腔内接種した。マウスにワクチンを２１日間隔で３回投与した。抗原の最終投与から６日後に糞便ＩｇＡを測定した。最終投与から７日後にマウスの尾静脈から採血し、Ｊ１４−特異的血清ＩｇＧを測定した。間接的な殺菌アッセイも実施して、免疫マウスから得た血清がＭ１  ＧＡＳ系統をインビトロでオプソニン化するまたは「死滅させる」かどうかを判定した。最終投与から８日後に個々のマウスから唾液を採取し、Ｊ１４特異的唾液ＩｇＡ平均抗体価を標準ＥＬＩＳＡによって求めた。抗原の最終投与から２週間後にＭ１  ＧＡＳ系統をマウスに鼻腔内投与し、その後様々な時点で生存しているかどうかを確認した。
【０２９９】
図１２のデータによれば、非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳと比較して、どちらのリポペプチドを用いても有意な（Ｐ＜０．０５）血清ＩｇＧ力価が誘発され、リポペプチド構築体がＴヘルパーまたはＢ細胞エピトープの選択に依存せず、単一または複数の脂質部分を含むリポペプチドを使用して鼻腔内免疫後に高い血清ＩｇＧレベルを誘発することができることを示している。
【０３００】
図１３のデータも、１個または２個の脂質部分を有するＪ１４含有リポペプチドで免疫されたマウスから採取した血清が、対照の非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳで免疫されたマウスから採取される血清と比較して、やはり有意に（Ｐ＜０．０５）ＧＡＳを死滅させることができたことを示している。
【０３０１】
図１４のデータによれば、１個または２個の脂質部分を有するＪ１４含有リポペプチドを接種したマウスは、対照の非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳで免疫された対照グループよりも有意に（Ｐ＜０．０５）高い唾液ＩｇＡ力価を示した。しかし、単一脂質付加ペプチドは、鼻腔内投与による唾液ＩｇＡレベルの誘発において、二脂質付加ペプチドよりもはるかに優れていた。
【０３０２】
ＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に脂質部分が位置する単一脂質付加Ｊ１４含有ペプチド（すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｊ１４］）を接種したマウスのみ、最終免疫から６日後に、ＰＢＳまたは非脂質付加ペプチドと比較して有意な（Ｐ＜０．０５）糞便ＩｇＡ力価を示したことは興味深い（図１５）。これは、唾液ＩｇＡまたは血清ＩｇＧレベルを測定する前に糞便ＩｇＡが測定されたので、タイミングの結果かも知れない。あるいは、これは鼻腔内投与経路の結果かもしれない。他の説明も現時点では排除できない。
【０３０３】
図１６に示すように、脂質部分がＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間に位置する単一脂質付加Ｊ１４含有ペプチド（すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［Ｊ１４］）を接種したマウスは、二脂質付加ペプチドまたは非脂質付加ペプチドと比較して、ＧＡＳを鼻腔内投与した後の生存率が最も高かった。しかし、二脂質付加ペプチドおよび非脂質付加ペプチドの両方で、Ｊ１４ペプチド単独またはＰＢＳと比較して、ある程度の防御免疫が得られた。
【０３０４】
要約すると、実施例２および３に示すデータによれば、本発明のリポペプチド製剤は、様々なＴヘルパーエピトープおよびＢ細胞エピトープを用いて、動物、特にネズミモデルにおいて強い抗体応答を誘発するのに広範に適用可能である。また、リポペプチド製剤は、鼻腔内経路によって強いＩｇＧおよびＩｇＡ応答が得られるので、特に鼻腔内投与に適している。しかし、本発明者らのデータによれば、少なくともＪ１４免疫原の場合には、一脂質付加ペプチドは、複数の脂質部分を含むリポペプチドよりも良好な粘膜アジュバントとして働くことができる。
【実施例４】
【０３０５】
ガストリンに由来するＢ細胞エピトープを含むリポペプチドについての研究
ガストリンに基づくリポペプチド免疫原の免疫原性を判定した。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの尾の付け根にペプチドまたはリポペプチド免疫原２０ｎｍｏｌを皮下接種した。すべてのリポペプチドをＰＢＳ溶液として投与し、非脂質付加ペプチドをＣＦＡに入れて投与した。ＣＦＡで乳化した生理食塩水を陰性対照として用いた。使用したペプチドは、ガストリン−１７（配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ；配列番号１１３）、ペンタガストリンがガストリン−１７のＣ末端配列ＧＷＭＤＦ（すなわち、配列番号１０２）である［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ペンタガストリン］（配列番号１１０）、および［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ペンタガストリン］であった。免疫後４週目にマウスから血清を得た。同時に、ほぼ同じ用量の２回目の抗原をマウスに投与した。２回目の抗原投与からさらに２週間後に２回目の採血を行い、ペプチドガストリン−１７配列と反応可能な抗体をＥＬＩＳＡによって求めた。結果を抗ガストリン−１７抗体力価として表す。
【０３０６】
図１７に示すように、ＣＦＡ中のガストリン−１７を接種したマウスは、陰性対照のＣＦＡ中の生理食塩水と同レベルの抗ガストリン−１７抗体を含んでいた。非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ペンタガストリン］による免疫によって、極めて低レベルの抗ガストリン−１７抗体が誘発されたが、リポペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ペンタガストリン］を投与したマウスは、ＣＦＡ中のペプチドで免疫した後に誘発されるのと類似した高い抗体価を示した。これらのデータも、本発明のリポペプチド製剤が、様々なＴヘルパーエピトープおよびＢ細胞エピトープを用いて、動物における強い抗体応答を誘発するのに広範に適用可能であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
2010155832.tif 000027
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
2010155832.tif 000031
【図７ｆ】
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【図７ｇ】
2010155832.tif 000033
【図７ｈ】
2010155832.tif 000034
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2010155832.tif 000043
【図１７】
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【配列表】
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