(57)【要約】      （修正有）【課題】インフルエンザウイルスベクターのパッケージングのためのシグナルを提供すること。【解決手段】インフルエンザウイルスベクターのパッケージング（組み込み）シグナル、ならびにこのシグナルを使用して、インフルエンザウイルスおよび外来核酸をウイルスおよび細胞に移し、維持する方法の提供。また、細胞において異種核酸セグメントを発現する方法を提供し、この方法は、組換えウイルスと接触させる工程、およびこの異種核酸セグメントにコードされる産物が細胞内で発現しているか否かを検出または決定する工程を、包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利の記述）
本発明は、少なくとも一部は、アメリカ合衆国の政府からの助成金（国立保健研究所からの助成金ＡＩ４７４４６）で行われた。政府は、本発明の一部の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インフルエンザＡおよびＢウイルスのゲノムは負の極性の８つの１本鎖ＲＮＡ断片からなり、その内の２個は、膜糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする。インフルエンザウイルスの複製は、ビリオン表面上のウイルスＨＡタンパク質の、細胞のシアル酸を含むレセプターへの結合により開始される。レセプターに結合した後、ビリオンは、エンドサイトーシスにより、宿主細胞に取り入れられる。後期エンドソーム中の酸性環境は、ＨＡの高次構造変化を引き起こし、ウイルスエンベロープとエンドソーム膜との間の融合を開始し、そして、Ｍ２イオンチャネルを活性化し、プロトンのビリオン内部への流入を生じる。ビリオン内部を低ｐＨに曝露することは、Ｍ１タンパク質とリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）との間の酸不安定な相互作用を崩壊し、ＲＮＰの細胞質への放出を沈静すると考えられる。ＲＮＰは、次いで、核に輸送され、そこで、ウイルスｍＲＮＡおよびウイルスゲノムが合成される。ｍＲＮＡは細胞質に入り、そしてウイルスタンパク質が合成される。核タンパク質（ＮＰ）は、核に入り、新規に合成されたｖＲＮＡをキャプシド形成し、そして、３個のポリメラーゼサブユニットタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）と一緒にＲＮＰを形成する。Ｍ１およびＮＳ２タンパク質の存在下で、ＲＮＰは、核から搬出される。３個の形質膜結合タンパク質（ＨＡ、ＮＡおよびＭ２）およびＲＮＰは相互作用し、そして、出芽することにより新規のビリオンを形成する。ＮＡは、シアル酸を細胞の複合糖質およびウイルス糖タンパク質から除去することにより、感染細胞からのウイルス放出の原因となる（Ｌａｍｂら、２０００）。
【０００３】
Ａ型ウイルスは、ＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１５）およびＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）抗原性に基づいてサブタイプに分類される。２個の異なるＡ型ウイルスで感染させた細胞では、遺伝子断片の種々の組み合わせを有する型内での再構築物（ｉｎｔｒａｔｙｐｉｃ  ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）が産生される（Ｗｒｉｇｈｔら、２０００）。しかし、Ａ型ウイルスとＢ型ウイルスとの間の型間での再構築物は、天然では検出されていないが、両方のウイルスともヒト集団では、共循環している。
【０００４】
研究者は、研究室でＡ型ウイルスとＢ型ウイルスとの間の再構築物を産生することを試みたが、首尾よくいかなかった。（Ｋａｖｅｒｉｎら、１９８３；Ｍｉｋｈｅｅｒａら、１９８２；Ｔｏｂｉｔａら、１９８３）。Ｍｕｓｔｅｒら（１９９１）は、ＮＡ断片の非コード領域が、Ｂ型ウイルスの非構造（ＮＳ）遺伝子の非コード領域で置換された断片を含むＡ型突然変異体ウイルスを産生した。突然変異ウイルスは、野生型よりゆっくり複製し、より低い力価を達成したけれども、そのようなウイルスの発生は、Ｂ型ＮＳ断片の非コード領域がＲＮＡ転写および複製のレベルで、インフルエンザウイルスＡ型構成要素と適合性であることを示唆した。それに対して、外来のコード断片を有するＲＮＡ断片は、インフルエンザＡウイルスＲＮＡ断片の３’および５’非コード領域により隣接され、繰り返しの継代後、ビリオン中で安定に維持されなかった（Ｌｕｙｔｊｅｓら、１９８９）。Ｍｕｓｔｅｒら（１９９１）は、また、突然変異体ウイルスは、マウス中で弱められ、そして、突然変異ウイルスで感染した動物が、野生型ウイルスによる感染に対して耐性であったことを開示した。
【０００５】
必要であるものは、インフルエンザウイルス複製の間、結合した配列の組み込みおよび／または維持するためのインフルエンザウイルス配列を同定するための方法である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、インフルエンザウイルスの組み込み配列（「パッケージシグナル」またはｖＲＮＡのキャプシド形成シグナル）および必要に応じて異種核酸断片を含む、単離された組換え核酸分子（ポリヌクレオチド）（例えば、ベクター）を提供する。一般に、組み込み配列は、各インフルエンザｖＲＮＡ断片のコード領域の１つの末端または各末端において、約１５０個〜約２５０個のヌクレオチドで存在する。１つの実施形態では、インフルエンザウイルス組み込み配列は、ＮＡコード領域のＮ末端に対応する配列を含むＮＡ  ｖＲＮＡの３’末端に対応する配列（例えば、３’非コード配列の１９個のヌクレオチドを含むＡ型ＮＡ  ｖＲＮＡの３’末端の３７個のヌクレオチドおよびＮＡに対する最初の１９個のコードするヌクレオチドに少なくとも対応するヌクレオチド）および必要に応じて、ＮＡコード領域のＣ末端に対応する配列を含むＮＡ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する組み込み配列（例えば、５’非コード配列の２８個のヌクレオチドを含むＡ型ＮＡ  ｖＲＮＡの５’末端の６７ヌクレオチドおよびＮＡの３９個の３’をコードするヌクレオチドに対応する少なくとも３９個のヌクレオチド）を含む。別の実施形態において、インフルエンザウイルス組み込み配列は、ＮＳコード領域のＮ末端に対応する配列を含むＮＳ  ｖＲＮＡの３’末端に対応する配列を含む。なお、別の実施形態においては、インフルエンザウイルス組み込み配列は、ＨＡコード領域のＣ末端に対応する配列を含むＨＡ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列（例えば、５’非コード配列の４５個のヌクレオチドを含むＡ型ＨＡ  ｖＲＮＡの５’末端の１３５個のヌクレオチドおよびＨＡの８０個の３’コードヌクレオチドに対応する少なくとも８０個のヌクレオチド）および必要に応じて、ＨＡコード領域のＮ末端に対応する配列を含むＨＡ  ｖＲＮＡの３’末端に対応する組み込み配列（例えば、３’非コード配列の３３個のヌクレオチドを含むＡ型ＨＡ  ｖＲＮＡの３’末端の３６個のヌクレオチドおよびＨＡの最初の３個のコードヌクレオチドに対応する少なくとも３個のヌクレオチド）を含む。さらなる実施形態では、インフルエンザウイルス組み込み配列は、ＰＢ２のコード領域のＣ末端に対応する配列を含むＰＢ２  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列を含む。別の実施形態では、インフルエンザウイルス組換え配列は、Ｍコード領域のＮ末端に対応する配列を含むＭ  ｖＲＮＡの３’末端に対応する配列（例えば、３’非コード領域の２６個のヌクレオチドを含むＡ型Ｍ  ｖＲＮＡの３’末端の２４７個のヌクレオチドおよびＭコード領域のＮ末端に対応する配列の２２１個のヌクレオチド）、およびＭコード領域のＣ末端に対応する組み込み配列を含むＭ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列（例えば、３’非コード配列の２３個のヌクレオチドを含むＡ型Ｍ  ｖＲＮＡの５’末端の２４２個のヌクレオチドおよびＭコード領域のＣ末端に対する少なくとも２１９個のヌクレオチドに対応する配列の２１９個のヌクレオチド）を含む。別の実施形態では、インフルエンザウイルス組換え配列は、ＮＳコード領域のＮ末端に対応する配列を含むＮＳ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列（例えば、３’非コード配列を含む配列およびＮＳコード領域のＮ末端に対応する少なくとも最初の３０個のヌクレオチド）、およびＮＳコード領域のＣ末端に対応する組み込み配列を含むＮＳ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列（例えば、５’非コード配列を含む配列およびＮＳコード領域のＣ末端に対応する配列の、少なくとも最後の３０個のヌクレオチド）を含む。１つの実施形態においては、インフルエンザウイルス組み込み配列は、ＰＢ１コード領域のＮ末端に対応する配列を含むＰＢ１  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列およびＰＢ１コード領域のＣ末端に対応する組み込み配列を含むＰＢ１  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列を含む。なお別の実施形態においては、インフルエンザウイルス組み込み配列は、ＰＡコード領域のＮ末端に対応する配列を含むＰＡ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列およびＰＡコード領域のＣ末端に対応する組み込み配列を含むＰＡ  ｖＲＮＡの５’末端に対応する配列を含む。本明細書で使用される場合、インフルエンザウイルス「組み込み配列」は、対応する（相同な）３’および５’非コード領域を有するｖＲＮＡ中に存在する場合、それらの配列を含む核酸分子のビリオン中への組み込みおよび繰り返しの継代の間、ビリオン中でのその分子の維持を生じる配列である。したがって、本発明は以下をも提供する。（１）
インフルエンザウイルス取り込み配列を含むインフルエンザウイルスベクターであって、該ベクターは、以下：
ａ）インフルエンザウイルスＮＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、３’ＮＡ組み込み配列、異種核酸セグメント、およびＮＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域；
ｂ）インフルエンザウイルスＨＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、異種核酸セグメント、５’ＨＡ組み込み配列、およびＨＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域；
ｃ）インフルエンザウイルスＭ  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、３’Ｍ組み込み配列、異種核酸セグメント、５’Ｍ組み込み配列、およびＭ  ｖＲＮＡの５’非コード領域；
ｄ）インフルエンザウイルスＮＳ  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、３’ＮＳ組み込み配列、異種核酸セグメント、およびＮＳ  ｖＲＮＡの５’非コード領域；
ｅ）インフルエンザウイルスＰＢ２  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、異種核酸セグメント、５’ＰＢ２組み込み配列、およびＰＢ２  ｖＲＮＡの５’非コード領域；
ｆ）インフルエンザウイルスＰＢ１  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、異種核酸セグメント、５’ＰＢ１組み込み配列、およびＰＢ１  ｖＲＮＡの５’非コード領域；または
ｇ）インフルエンザウイルスＰＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域に相当する配列、異種核酸セグメント、５’ＰＡ組み込み配列、およびＰＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域；
を含み、ここで、該ベクターに相当するｖＲＮＡが、インフルエンザウイルスタンパク質を発現しかつ該ベクターに相当する該ｖＲＮＡ以外のｖＲＮＡを含む細胞内に存在する場合、該ベクターに相当する該ｖＲＮＡがビリオン内にパッケージされる、インフルエンザウイルスベクター。
（２）
項目１ａ）に記載のベクターであって、前記３’ＮＡ組み込み配列が、ＮＡの最初の１９個のコードヌクレオチドに相当する少なくとも１９個のヌクレオチドを含む、ベクター。（３）
５’ＮＡ組み込み配列をさらに含む、項目２に記載のベクター。
（４）
項目３に記載のベクターであって、前記５’ＮＡ組み込み配列が、ＮＡの３９個の３’コードヌクレオチドに相当する少なくとも３９個のヌクレオチドを含む、ベクター。
（５）
項目１ａ）に記載のベクターであって、前記３’ＮＡ組み込み配列が、ＮＡの最初の９０個のコードヌクレオチドに相当する少なくとも９０個のヌクレオチドを含む、ベクター。（６）
項目１ｂ）に記載のベクターであって、前記５’ＨＡ組み込み配列が、ＨＡの８０個の３’コードヌクレオチドに相当する少なくとも８０個のヌクレオチドを含む、ベクター。
（７）
項目１ｂ）に記載のベクターであって、前記５’ＨＡ組み込み配列が、ＨＡの２９１個の３’コードヌクレオチドに相当する少なくとも２９１個のヌクレオチドを含む、ベクター。
（８）
３’ＨＡ組み込み配列をさらに含む、項目１ｂ）に記載のベクター。
（９）
項目８に記載のベクターであって、前記３’ＨＡ組み込み配列が、ＨＡの最初の３個のコードヌクレオチドに相当する少なくとも３個のヌクレオチドを含む、ベクター。
（１０）
項目８に記載のベクターであって、前記３’ＨＡ組み込み配列が、ＨＡの最初の９個のコードヌクレオチドに相当する少なくとも９個のヌクレオチドを含む、ベクター。
（１１）
前記異種核酸セグメントが、内部リボソーム侵入配列に相当する配列を含む、項目１に記載のベクター。
（１２）
前記異種核酸セグメントが、マーカー遺伝子のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１に記載のベクター。
（１３）
前記異種核酸セグメントが、免疫原性タンパク質もしくは病原体のペプチド、または治療タンパク質のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１に記載のベクター。
（１４）
組み込み配列が、Ａ型インフルエンザウイルスに由来する、項目１に記載のベクター。
（１５）
組み込み配列が、Ｂ型インフルエンザウイルスに由来する、項目１に記載のベクター。
（１６）
前記異種核酸セグメントが、他の核酸セグメントと融合して融合タンパク質をコードする、項目１に記載のベクター。
（１７）
項目１に記載のベクターに相当するｖＲＮＡを含む、組換えインフルエンザウイルス。
（１８）
前記異種核酸セグメントが、マーカー遺伝子のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（１９）
前記異種核酸セグメントが、免疫原性タンパク質もしくは病原体のペプチドのオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（２０）
前記オープンリーディングフレームが、ＨＡタンパク質をコードする、項目１９に記載の組換えウイルス。
（２１）
前記オープンリーディングフレームが、ＮＡタンパク質をコードする、項目１９に記載の組換えウイルス。
（２２）
前記異種核酸セグメントが、膜貫通タンパク質のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（２３）
前記異種核酸セグメントが、膜融合活性を有するタンパク質のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（２４）
前記異種核酸セグメントが、ウイルスカプシドタンパク質のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（２５）
前記異種核酸セグメントが、小胞性口内炎ウイルスＧタンパク質のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（２６）
前記異種核酸セグメントが、治療タンパク質のオープンリーディングフレームに相当する配列を含む、項目１７に記載の組換えウイルス。
（２７）
前記ＨＡタンパク質が、Ｂ型ＨＡタンパク質である、項目２０に記載の組換えウイルス。（２８）
細胞において異種核酸セグメントを発現する方法であって、該方法は、以下：細胞を項目１７の組換えウイルスと接触させる工程、および該異種核酸セグメントにコードされる産物が細胞内で発現しているか否かを検出または決定する工程を、包含する方法。
（２９）
ＮＡの５’コード領域に相当するインフルエンザウイルスＮＡ組み込み配列、および異種核酸セグメントを含む、単離された核酸分子。
（３０）
ＮＳの５’コード領域に相当するインフルエンザウイルスＮＳ組み込み配列、および異種核酸セグメントを含む、単離された核酸分子。
（３１）
ＨＡの３’コード領域に相当するインフルエンザウイルスＨＡ組み込み配列、および異種核酸セグメントを含む、単離された核酸分子。
（３２）
ＰＢ２の３’コード領域に相当するインフルエンザウイルスＰＢ２組み込み配列、および異種核酸セグメントを含む、単離された核酸分子。
（３３）
Ｍの３’コード領域およびＭの５’コード領域に相当するインフルエンザウイルスＭ組み込み配列、および異種核酸セグメントを含む、単離された核酸分子。
（３４）
項目１に記載のベクターであって、前記ベクターに相当するｖＲＮＡが前記細胞内に存在する場合、該ｖＲＮＡが、野生型ｖＲＮＡの少なくとも１０％に相当する効率でビリオン内にパッケージされる、ベクター。
（３５）
項目１に記載のベクターであって、前記ベクターに相当するｖＲＮＡが前記細胞内に存在する場合、該ｖＲＮＡが、野生型ｖＲＮＡの少なくとも３０％に相当する効率でビリオン内にパッケージされる、ベクター。
（３６）
項目１に記載のベクターであって、前記ベクターに相当するｖＲＮＡが前記細胞内に存在する場合、該ｖＲＮＡが、野生型ｖＲＮＡの少なくとも６０％に相当する効率でビリオン内にパッケージされる、ベクター。
（３７）
複製不完全インフルエンザ様ウイルスを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）組換え宿主細胞を、野生型ＮＳコード配列を有するｖＲＮＡを欠く組換えインフルエンザウイルス、およびリコンビナーゼの配列を含む組み換えインフルエンザウイルスと接触させる工程であって、ここで、該組換え宿主細胞は、組換え核酸分子を含み、該組換え核酸分子は、ＮＳ２オープンリーディングフレームを含むが、リコンビナーゼ５’からＮＳ２オープンリーディングフレームによって認識される２つの部位特異的組換え配列に作動可能に連結された組み込み配列を含まず、ここで、リコンビナーゼ非存在下ではＮＳ２は発現しない、工程；および
ｂ）複製不完全インフルエンザ様ウイルスを、組換え宿主細胞から単離する工程、
を、包含する、方法。
（３８）
前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅであり、そして前記部位特異的組換え配列が、ｌｏｘＰ配列である、項目３７に記載の方法。
（３９）
前記リコンビナーゼが、ＦＬＰｎｄであり、そして前記部位特異的組換え配列が、ｆｒｔ配列である、項目３７に記載の方法。
【０００７】
本明細書の以下に記載するように、ＮＡ組み込み配列は、プラスミドに基づいた逆遺伝学を使用して、短縮ＮＡ断片を有する突然変異ウイルス中で同定された。ＮＡ組み込み配列は、ＮＡ  ｖＲＮＡの３’末端を含む領域にあり、ＮＡコード領域の一部に及んだ。従って、この領域は、野生型ＮＡ  ＲＮＡならびに突然変異ＮＡ  ＲＮＡ（例えば、目的のオープンリーディングフレームの発現のための組換えＲＮＡ（例えば、目的のオープンリーディングフレームを含む異種核酸断片）を含む内側の欠失および／または挿入を有するＲＮＡ）のパッケージおよび維持に対して有用である。
【０００８】
また、本明細書に記載したように、インフルエンザＡ型ウイルスとＢ型ウイルスとの間の、型間での不適合性に対する洞察を得るために、逆遺伝学を使用し、Ａ型ウイルスバックグラウンド中にインタクトのＢ型ＨＡ断片を含む再構築物を産生した。しかし、Ｂ型ＨＡ断片が、Ａ型ポリメラーゼ複合体により転写されたという事実にもかかわらず、ウイルスは、産生されなかった。Ａ型ＨＡの非コード配列が隣接したＢ型ＨＡの完全コード配列を構成するキメラＨＡ断片を含むＡ型ウイルスは、生存し得たが、わずかにしか複製しなかった。Ａ型に基づいたウイルスのシリーズは、シグナルペプチドかまたはＡウイルスの膜貫通型／細胞質領域のいずれか、あるいは両方ともをコードする配列と共に、Ａ型非コード領域を有するキメラＨＡおよびＢ型ＨＡ由来領域の残りの領域を含んで作製された。これらのウイルスは、全て、細胞培養において、１０６より大きい、組織培養感染用量５０／ｍｌまで増殖したが、Ａ型ＨＡ配列のより多くを有するウイルスがよりよく増殖した。このことは、タンパク質−タンパク質相互作用または増加したＨＡ断片のビリオンへの組み込みの、効果的なウイルス増殖に対する役割を示唆する。これらのＡ／Ｂキメラウイルスは全て、マウス内では、野生型ＡウイルスまたはＢウイルスと比較して、弱められる。さらに、キメラウイルスを鼻腔内に免疫化した動物は、全て、野生型Ｂ型ウイルスの致死量での感染の際に生存した。このことは、新規の生ワクチンウイルスの設計のための見込みのあるアプローチを示している。
【０００９】
従って、相同な３’および５’非コード配列（領域）および異種核酸断片を含む、特定のインフルエンザウイルス断片に対する組み込み配列を含む本発明の単離された核酸分子が、ウイルスタンパク質ならびに／またはＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ（例えば、Ｍ１および／またはＭ２）および／またはＮＳの内の１個以上に対するウイルスタンパク質をコードするベクター、ならびにｖＲＮＡまたはＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ（例えば、Ｍ１およびＭ２）および／またはＮＳの内の１個以上に対するｖＲＮＡ産生のためのベクターの存在下で、ｖＲＮＡ産生に対するベクター中で細胞に導入される場合、組換えウイルスが産生される。組換えウイルスは、次いで、細胞を感染させるために使用され得る。好ましくは、本発明の核酸分子に対応するｖＲＮＡは、対応する野生型ｖＲＮＡの効率の少なくとも１０％の効率で、より好ましくは、少なくとも３０％で、およびさらにより好ましくは、少なくとも５０％かまたはそれより高くで、ビリオンに取り込まれる。１つの実施形態においては、核酸分子は、野生型ｖＲＮＡに対応する配列および異種核酸断片を含み、そこで、異種の核酸断片がそのｖＲＮＡのコード領域に対応するｖＲＮＡ中の配列に挿入され、その挿入は、好ましくは、実質的には、組み込み配列を分裂させない。例えば、異種核酸断片は、ＮＡコード領域の最初の３００個のヌクレオチドに対応する配列の後に、導入される。
【００１０】
別の実施形態において、３’ＮＡ組み込み配列は、ＮＡコード領域のＮ末端のヌクレオチドの１〜１８３、ヌクレオチド１〜９０、ヌクレオチド１〜４５、ヌクレオチド１〜２１、ヌクレオチド１〜１９または１９と１８３の間の任意の整数に対応し、そして、ＮＡ開始コドンに変異を含み得る。別の実施形態において、５’ＮＡ組み込み配列は、ＮＡのＣ末端コード領域中の配列、ＮＡコード領域のＣ末端ヌクレオチドの最も３’の３９、７８または１５７または１と１５７の間の任意の整数に対応する配列に対応する。別の実施形態において、５’ＨＡ組み込み配列は、ＨＡのＣ末端コード領域中の配列、Ｃ末端ＨＡコード領域のヌクレオチドの最も３’の７５、８０、２６８、２９１もしくは５１８または１と５１８との間の任意の整数に対応する配列に対応する。３’ＨＡ組み込み配列は、Ｎ末端ＨＡコード領域の１〜３、１〜６、１〜９、１〜１５、１〜２１６、１〜４６８か、または、１と４６８との間の任意の整数のヌクレオチドに対応する。１つの実施形態では、３’ＰＢ１組み込み配列は、Ｎ末端ＰＢ１コード領域のヌクレオチド１〜２５０、ヌクレオチド１〜２００、ヌクレオチド１〜１５０、または、１と２５０との間の任意の整数に対応する。１つの実施形態では、５’ＰＢ１組み込み配列は、Ｃ末端ＰＢＩコード領域の最も３’のヌクレオチド（例えば、３’の１〜２５０のヌクレオチド、１〜２００のヌクレオチド、ヌクレオチド１〜１５０か、または、１と２５０との間の任意の整数）に対応する。１つの実施形態では、３’ＰＡ組み込み配列は、Ｎ末端ＰＡコード領域のヌクレオチド１〜２５０、ヌクレオチド１〜２００、ヌクレオチド１〜１５０、または、１と２５０との間の任意の整数に対応する。１つの実施形態では、５’ＰＡ組み込み配列は、Ｃ末端ＰＡコード領域の最も３’のヌクレオチド（例えば、３’の１〜２５０ヌクレオチド、１〜２００ヌクレオチド、ヌクレオチド１〜１５０、または、１と２５０との間の任意の整数に対応する。別の実施形態では、３’Ｍ組み込み配列は、Ｎ末端Ｍコード領域のヌクレオチド１〜２５０、ヌクレオチド１〜２４２、ヌクレオチド１〜２４０、または、１と２５０との間の任意の整数に対応し、そしてＭ開始コドンの変異を含み得る。別の実施形態では、５’Ｍ組換え配列は、ＭのＣ末端コード領域中の配列、Ｃ末端Ｍコード領域に対する最も３’の５０、１００または２２０、もしくは、１と２５０との間の任意の整数のヌクレオチドに対応する配列に対応する。別の実施形態では、３’ＮＳ組み込み配列は、Ｎ末端ＮＳコード領域のヌクレオチド１〜２５０、ヌクレオチド１〜２００、ヌクレオチド１〜１５０、ヌクレオチド１〜３０、ヌクレオチド１〜２０または、１と２５０との間の任意の整数に対応し、そしてＮＳ開始コドンにおいて変異を含み得る。別の実施形態では、５’ＮＳ組換え配列は、ＮＳのＣ末端コード領域中の配列、Ｃ末端ＮＳコード領域に対する最も３’の１０、３０、１５０、２００または２５０、もしくは、１と２５０との間の任意の整数のヌクレオチドに対応する配列に対応する。
【００１１】
従って、本発明は、特定のｖＲＮＡの３’および５’非コード領域に対応する配列、対応するｖＲＮＡの組み込み配列および異種の核酸断片を含むインフルエンザウイルスベクターを提供する。従って、１つの実施形態では、ベクターは、ＮＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域、３’または５’ＮＡ  ｖＲＮＡ組み込み配列ならびに必要に応じて３’および５’の両方のＮＡ組み込み配列、異種核酸断片ならびにＮＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含む。別の実施形態では、ベクターは、ＨＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域、５’または３’ＨＡ  ｖＲＮＡ組み込み配列または５’および３’の両方のＨＡ組み込み配列、異種核酸断片ならびにＨＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含む。別の実施形態では、ベクターは、ＮＳ  ｖＲＮＡの３’非コード領域、ＮＳ組み込み配列、異種核酸断片ならびにＮＳ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含む。別の実施形態では、ベクターは、Ｍ  ｖＲＮＡの３’非コード領域、５’または３’Ｍ組み込み配列または５’および３’の両方のＭ組み込み配列、異種核酸配列ならびにＭ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含む。なお別の実施形態では、ベクターは、ＰＢ２  ｖＲＮＡの３’非コード領域、異種核酸断片、ＰＢ２組み込み配列、およびＰＢ２  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含む。２つの組み込み配列が、ベクター中で使用される場合、好ましくは、それらは、異種核酸断片により分離される。各ベクターは、細胞に導入するためのｖＲＮＡを調製するために、または、他のインフルエンザウイルスｖＲＮＡおよびウイルス産生に必要なタンパク質が存在する細胞中でｖＲＮＡを発現させるために使用され得る。
【００１２】
１つの実施形態では、異種核酸断片は、マーカー遺伝子に対するオープンリーディングフレームに対応する配列を含む。別の実施形態では、異種核酸断片は、治療遺伝子に対するオープンリーディングフレームに対応する配列を含む。なおさらなる実施形態では、異種核酸断片は、免疫原性ペプチドまたは病原体もしくは腫瘍細胞のタンパク質に対するオープンリーディングフレームに対応する配列（例えば、防御免疫反応を誘導するために有用な配列）を含む。例えば、異種核酸断片は、癌治療またはワクチンに有用な免疫原性エピトープをコードし得る。異種核酸断片を含むベクターは、ベクターｖＲＮＡの転写が、インフルエンザタンパク質（例えばＮＡ）との融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを生じるように準備され得る。従って、異種核酸断片が、融合タンパク質（例えば、ＮＡのＮ末端２１残基との融合物）をコードするためのウイルス組み込み配列に融合され得ることが予測される。融合タンパク質は、２個の異なるＮＡまたはＨＡタンパク質由来の配列を含む２個の異なるインフルエンザウイルスタンパク質由来の配列を含み得る。別の実施形態では、異種の核酸断片は、オープンリーディングフレームに対する５’に連結したＩＲＥＳに対応する配列を含み得る。
【００１３】
複数のインフルエンザウイルスベクターを用いたプラスミドに基づいた逆遺伝学を使用して、組換えウイルスを調製するために、ベクター中のインフルエンザウイルスＤＮＡは、プロモーターに対してセンス向きまたはアンチセンス向きであり得る。従って、ベクターは、インフルエンザウイルスタンパク質（センス）、またはインフルエンザウイルスＡ株、Ｂ株あるいはＣ株あるいは単離体のｖＲＮＡ（アンチセンス）または組換えインフルエンザウイルスをコードし得る（ＦｉｅｌｄｓのＶｉｒｏｌｏｇｙ  第４５章および第４６章（Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（１９９６）、これは、本明細書中に参考として特に援用される）を参照のこと）。ウイルスタンパク質を発現するために、任意のプロモーターが、使用され得、そして、得られたベクターは、特定のインフルエンザウイルスタンパク質のためのＤＮＡに作動可能に結合したプロモーターを含む。ｖＲＮＡをコードするベクターに対する好ましいプロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである。ｖＲＮＡをコードするベクターに対する好ましい転写末端配列としては、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写末端配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写末端配列またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写末端配列またはリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。従って、ｖＲＮＡに対するベクターは、（転写末端配列に作動可能に結合した）プロモーターに対してアンチセンス向きに、インフルエンザウイルスタンパク質に対するｃＤＮＡに、作動可能に結合したプロモーターを含む。本発明のベクターを含む組換えウイルスを産生するために、いくつかの野生型ｖＲＮＡベクターを除外し得、いくつかの、野生型ウイルスタンパク質をコードするベクターは置き換えられ得る。例えば、ＨＡ３’および５’非コード配列、５’ＨＡ組み込み配列および非インフルエンザウイルスタンパク質コード配列に対応する異種核酸断片（例えば、ＶＳＶ  Ｇタンパク質コード配列）を含むｖＲＮＡベクターに対して、ＨＡ野生型ｖＲＮＡベクターは、除外され得る。本発明のベクターは、連続的にまたは同時に細胞に導入され得る。複数の上に述べたベクター、１つ以上のこれらのベクターに接触した宿主細胞、上記方法により調製されたウイルスおよびこのウイルスで感染させた細胞を含む組成物もまた、提供される。
【００１４】
本発明の複数のベクターが、物理的に結合し得るか、または各ベクターは、個々のプラスミドまたは他の例えば直鎖状の核酸送達ビヒクル上に存在し得る。
【００１５】
本明細書の上に記載したように、組換えＤＮＡ分子を用いて増強した宿主細胞は、感染性複製欠損インフルエンザウイルスを調製するために有用である。例えば、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２をコードする組換えＤＮＡ分子を用いて安定に形質転換した宿主細胞は、多数のベクター（例えば、ＰＡを含むｖＲＮＡ、ＮＰを含むｖＲＮＡ、ＰＢ１を含むｖＲＮＡ、ＰＢ２を含むｖＲＮＡおよび必要に応じて目的の遺伝子を含むｖＲＮＡを発現するベクター；ならびにＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰをコードするベクター）により接触され得る。
【００１６】
ヘルパーウイルス感染を必要としない、本明細書に記載されたウイルスを産生する方法は、ウイルス変異誘発研究ならびにワクチン（例えば、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペスならびに肢および口の疾患に対するワクチン）および遺伝子治療ベクター（例えば、癌、ＡＩＤＳ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症および中枢神経系腫瘍に対する遺伝子治療ベクター）の産生において有用である。
【００１７】
従って、医学的治療（例えば、ワクチンまたは遺伝子治療のために）に使用するための組換えウイルスが提供される。例えば、本発明は、病原体（例えば、細菌、ウイルスまたは寄生虫）または悪性腫瘍に対して個体を免疫化する方法を提供する。その方法は、個体の免疫に十分な量の、少なくとも１つの単離された本発明のウイルス（必要に応じてアジュバントと組み合わせて）の個体への投与を含む。ウイルスは、病原体または腫瘍特異的ポリペプチドによりコードされたポリペプチドを含むｖＲＮＡを含む。
【００１８】
内因性タンパク質の量の減少または欠如により特徴付けられた適応症または疾患を有する哺乳動物中で、内因性タンパク質の発現を増強するかまたは増加させる方法もまた提供される。その方法は、哺乳動物中で内因性タンパク質の量を増強するかまたは増加させるために効果的な量の本発明の組換えウイルスの哺乳動物への投与を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００１９】
さらに、インフルエンザウイルス感染および／または複製を阻害するための方法が提供される。その方法は、インフルエンザウイルス感染および／または複製を阻害するために効果的な量で、ＮＡ、Ｍ、ＨＡ、ＮＳ、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡまたはこのような分子の任意の組合わせに対するインフルエンザウイルス組み込み配列を含む、単離された核酸分子を有する組成物との細胞の接触を含む。細胞は、非感染細胞であり得るか、またはインフルエンザウイルスで感染した細胞であり得る。組み込み配列は、ＮＡまたはＨＡの１つ以上の型に対して特異的であり得る。１つの実施形態では、細胞はさらに、Ｍ２チャンネルインヒビターまたはノイラミニダーゼインヒビターと接触する。
【００２０】
インフルエンザウイルスＲＮＡのビリオンへの取り込みを、特異的に阻害するかまたは防止する薬剤を同定する方法もまた、提供される。この方法は、インフルエンザウイルスを用いて感染させた細胞の薬剤との接触；および薬剤が、インフルエンザウイルスＲＮＡ（例えば、ＮＡ  ｖＲＮＡまたは組換えＮＡ  ｖＲＮＡ）のビリオンへの取り込みを、特異的に阻害するかまたは防止するかの検出または決定を含む。その方法により同定された薬剤およびその使用（例えば、インフルエンザウイルスの複製を阻害するかまたは防止するため）もまた、提供される。
【００２１】
（発明の詳細な記述）
本明細書で使用される場合、用語「単離されたおよび／または精製された」とは、インビトロの調製、宿主細胞または本発明のウイルスの単離および／または精製をいい、故に、インビボの物質とは関連しないか、または、実質的にインビトロの物質から精製される。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、目的種が、優性種存在であること（すなわち、モルベースで、目的種が、組成物中の他の任意の個体種より多量にある）、および好ましくは、実質的に精製された画分は、目的種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を構成する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約５０％より多くを含み、より好ましくは、約８０％より多くを含み、さらにより好ましくは、約８５％より多く、約９０％、約９５％および約９９％より多くを含む。最も好ましくは、目的種は、本質的に均質になるまで精製される（混入種は、従来の検出方法によっては、組成物中では、検出され得ない）。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「組換え核酸」または「組換えＤＮＡ配列または断片」とは、実質的に化学的にインビトロで変更され得る供給源に由来するかまたは供給源から単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）をいう。故に、その配列は、天然には存在しないか、または天然のゲノムでは位置すべきところに位置しない、天然に存在する配列に一致する。供給源に「由来する」ＤＮＡの例としては、有用なフラグメントとして同定されたＤＮＡ配列、またはＲＮＡから逆転写し、次いで本質的に精製された形態に合成したＤＮＡがある。供給源から「単離された」このようなＤＮＡの例としては、上記供給源から化学的手段（例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用により）により切除するかまたは除去し、さらに処理し得る（例えば、遺伝子工学の方法により、本発明に使用するために増幅した）有用なＤＮＡ配列がある。組換えウイルスは、組換え核酸から調製される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「異種の」核酸断片、配列または分子が、参照核酸断片、配列または分子とは異なる供給源に由来することを意味する。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス断片またはその一部は、対応するＢ型インフルエンザウイルス断片またはその一部に対して異種性であり、１つのインフルエンザ株または血清型のＮＡウイルス断片は、異なる株または血清型のＮＡウイルス断片に対して異種性であり、そして、非インフルエンザウイルス核酸分子（例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１６０）は、インフルエンザウイルス核酸分子に対して異種性である。それに対して、相同な核酸断片は、参照核酸断片と同じ供給源に由来する。従って、本発明の核酸分子は、３’非コード領域、少なくとも１個の組み込み配列および互いに相同な５’非コード配列を含むキメラ分子である。
【００２４】
本発明の文脈中の言い回し「高効率の複製」は、インビトロの組織培養系で高感染性力価（例えば、１０４〜１０１０ＰＦＵ／ｍｌおよび好ましくは、１０６〜１０９ＰＦＵ／ｍｌ）の産生として定義される。複製またはワクチンの産生に使用するためのインフルエンザウイルスのスクリーニングは、任意の公知のおよび／または当該分野において公知の適切なアッセイを使用してアッセイされ得る。スクリーニングに適したこのようなアッセイ（単独でまたは任意に組合わせて）としては、ウイルス複製、不活性化（例えば、抗血清による）、転写、複製、翻訳、ビリオン組み込み、病原性、ＨＡまたはＮＡ活性、ウイルス収量の定量的および／もしくは定性的な測定、ならびに／または逆遺伝学、再類別、相補性のような方法を使用する形態形成、ならびに／または感染が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ウイルス複製アッセイは、ウイルスの弱毒化または不活性に対するスクリーニングをするために使用され得る。例えば、Ｋｒｕｇ、Ｒ．Ｍ．（編）Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。
【００２５】
「シアル酸」は、９個またはそれより多い炭素原子を含むアミノ糖のファミリー（例えば、Ｎ−およびＯ−置換したノイラミン酸の誘導体）をいう。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「部位特異的組換え」は、以下の３つの事象：１）部位特異的組換え部位または配列（例えば、ｌｏｘ部位）が隣接した標的ＤＮＡ断片の欠損；２）部位特異的組換え部位または配列（例えば、ｌｏｘ部位）が隣接した標的ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列の反転；および３）部位特異的組換え部位または配列（例えば、異なるＤＮＡ分子上に位置するｌｏｘ部位）に隣接する標的ＤＮＡ断片の相互交換を含むことを意図する。部位特異的組換え系としては、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系（米国特許第５，６５８，７７２号）、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系（ＧｏｌｉｃおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８９）、ＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（Ｍａｅｓｅｒら、１９９１）、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｉｎリコンビナーゼ（Ｅｎｏｍｏｔｏら、１９８３）およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系（Ａｒａｋｉら、１９９２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
（本発明に使用され得る細胞株およびインフルエンザウイルス）
本発明に従って、インフルエンザウイルスの十分な複製を支持する任意の細胞を、本発明に使用し得、その細胞は、インフルエンザウイルスに対するレセプターである、１個以上のシアル酸を減少するかまたは減衰したレベルで発現する変異細胞を含む。その方法により得られたウイルスを、再類別ウイルスにし得る。
【００２８】
好ましくは、細胞は、ＷＨＯが認定した、または認定し得る連続継代細胞株である。このような細胞株の認定のために必要なこととしては、血統、生育特性、免疫学的マーカー、ウイルス感受性、腫瘍形成能および保管条件ならびに動物、卵および細胞培養中で試験することの内の少なくとも１つの点についての特徴づけが挙げられる。このような特徴づけは、細胞が検出し得る外来の薬剤を含んでいないことを確認するために使用される。いくつかの国では、核学もまた必要であり得る。さらに、腫瘍形成能は、好ましくは、ワクチン産生のために使用される細胞と同じ継代レベルである細胞において試験される。ウイルスは、ワクチン産生のために不活性化されたり、弱められたりする前に、好ましくは、一貫した結果を与えることが示されているプロセスによって精製される（例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、１９８２を参照のこと）。
【００２９】
使用される細胞株の完全な特徴づけを確立することが好ましい。故に、最終産物の精製に対する適切な試験が含まれ得る。本発明に使用される細胞の特徴付けのために使用され得るデータとしては、（ａ）その起源、派生、および継代歴についての情報；（ｂ）その増殖および形態的特長についての情報；（ｃ）外来薬剤の試験の結果；（ｄ）顕著な特徴（例えば、他の細胞株からの細胞を明確に認識することを可能にする生化学的、免疫学的および細胞発生学的傾向）；および（ｅ）腫瘍形成能試験の結果が挙げられる。使用される宿主細胞の継代レベル、集団倍化は、可能な限り低いことが好ましい。
【００３０】
細胞中で産生されたウイルスが、ワクチンまたは遺伝子治療の処方の前に高度に精製されていることが好ましい。一般に、精製手順により、細胞ＤＮＡ、他の細胞構成要素および外来の薬剤の広範囲の除去を生じる。ＤＮＡを広範囲に分解するかまたは変性する手順もまた、使用され得る。例えば、Ｍｉｚｒａｈｉ、１９９０を参照のこと。
【００３１】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、任意の病原体（例えば、１つ以上の細菌、ウイルス、酵母または菌類由来の免疫原性タンパク質）の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質を含み得る。従って、１つの実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスまたは他のウイルス性病原体に対するワクチンベクターであり得、これらのウイルス性病原体としては、例えば、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＣＭＶまたはＨＳＶ）または肢および口の疾患ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
完全なビリオンワクチンは、限外濾過により濃縮され、次いで、ゾーン遠心分離かまたはクロマトグラフィーにより精製される。精製の前か後に、例えばホルマリンまたはβ−プロピオラクトンを使用して不活性化される。  
【００３３】
サブユニットワクチンは、精製された糖タンパク質を含む。このようなワクチンは、以下のように調製され得る：界面活性剤で処理することにより、断片化したウイルス懸濁液を使用して、例えば、超遠心により表面の抗原を精製する。従って、サブユニットワクチンは、主に、ＨＡタンパク質を含み、そしてＮＡも含む。使用される界面活性剤は、例えば、カチオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ、１９７５）、アニオン性界面活性剤（例えば、アンモニウムデオキシコレート（Ｌａｖｅｒ  ＆  Ｗｅｂｓｔｅｒ、１９７６）；Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９７７；または非イオン性界面活性剤（例えば、名称ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ１００のもとで商品化されている非イオン性界面活性剤）であり得る。プロテアーゼ（例えば、ブロメリン）を用いたビリオンの処理の後、血球凝集素もまた単離され得、次いで、例えば、ＧｒａｎｄおよびＳｋｅｈｅｌ（１９７２）により記載された方法により精製される。
【００３４】
分割ワクチンは、脂質を溶解する薬剤での処理に供されたビリオンを含む。分割ワクチンは、以下のように調製され得る：上記のようにして得た精製されたウイルスの水性懸濁液（不活性化されたかまたはされていない）を攪拌しながら、脂質溶媒（例えば、界面活性剤を加えたエチルエーテルまたはクロロホルム）により処理する。ウイルス外皮脂質の溶解により、ウイルス粒子の断片化を生じる。分割ワクチンを含み、主に血液凝集素、それらの元の脂質環境が除去されたノイラミニダーゼおよびコアまたはその分解産物を構成要素とする水相を、回復する。次いで、既に感染粒子残留物の不活性化がなされていない場合、不活性化する。
【００３５】
（不活性化ワクチン）
本発明の不活性化インフルエンザウイルスワクチンは、公知の方法（例えば、ホルマリン、β−プロピオラクトン処理が挙げられるが、これらに限定されない。）を使用して本発明の複製したウイルスを不活性化することにより提供される。本発明に使用され得る不活性化ワクチン型としては、完全ウイルス（ＷＶ）ワクチンまたはサブビリオン（ＳＶ）（分割）ワクチンが挙げられ得る。ＷＶワクチンは、インタクトで、不活性なウイルスを含むが、ＳＶワクチンは、精製され、界面活性剤（脂質を含むウイルス外皮を溶解する）で分解され、その後、残留物ウイルスを化学的に不活性化したウイルスを含む。
【００３６】
さらに、使用され得るワクチンは、単離されたＨＡおよびＮＡ表面タンパク質を含むワクチン（これを、表面抗原またはサブユニットワクチンという）を含む。一般に、ＳＶおよび表面抗原（すなわち、精製されたＨＡまたはＮＡ）ワクチンに対する反応は類似している。ＮＡ抗原を含む実験的不活性化ＷＶワクチンは、免疫学的に、流行ウイルスに関連し、非関連ＨＡは、従来のワクチンより効果的でないようにみえる（Ｏｇｒａら、１９７７）。両方の関連した表面抗原を含む不活性化ワクチンが好ましい。
【００３７】
（弱毒化したウイルス生ワクチン）
弱毒化したインフルエンザウイルス生ワクチンもまた、インフルエンザウイルス感染を防止するか処置するために、公知の方法段階に従って、使用され得る。弱毒化は、好ましくは、弱毒化したドナーウイルス由来の弱毒化遺伝子を、複製した、公知の方法に従って単離したかまたは再類別したウイルスに移すことにより、１段階で達成される（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ、１９９３を参照のこと）。インフルエンザＡウイルスに対する耐性は、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質に対する免疫反応の発達によって媒介されるので、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、再類別したウイルスまたは高増殖臨床単離体に由来するはずである。弱毒化遺伝子は、弱毒化親に由来する。このアプローチでは、弱毒化を与える遺伝子は、好ましくは、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードしない。さもなければ、これらの遺伝子は、臨床ウイルス単離体の表面抗原を有する再類別体に移され得ない。
【００３８】
多くのドナーウイルスが、再生的にインフルエンザウイルスを弱毒化し得る能力について、評価されてきた。非限定的な例として、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ（ＡＡ）／６／６０（Ｈ２Ｎ２）冷適応した（ｃａ）ドナーウイルスが弱毒化ワクチン産生のために使用され得る（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ、１９９４；Ｍｕｒｐｈｙ、１９９３を参照のこと）。さらに、弱毒化再類別ウイルス生ワクチンは、ｃａドナーウイルスを本発明の悪性の複製したウイルスと交配することにより産生され得る。再類別子孫は、次いで、Ｈ２Ｎ２抗血清（弱毒化Ａ／ＡＡ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）ｃａドナーウイルスの表面抗原を有するウイルスの複製を阻害する）の存在下で、２５℃（悪性ウイルスの複製に対して制限的）で選択する。
【００３９】
Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２再類別体の大きなシリーズがヒトで評価され；血清反応陰性の小児および免疫学的に初回刺激された大人に対して（ａ）感染性であり、（ｂ）弱毒化されており、（ｃ）免疫原性であり、かつ（ｄ）遺伝的に安定であることが、申し分なく見出されている。ｃａ再類別体の免疫原性は、その複製レベルに対応する。従って、新規の野生型ウイルスによるｃａドナーウイルスの６個の伝達性の遺伝子の獲得は、ワクチン接種感受性の大人および小児に使用するために、再生的に、これらのウイルスを弱毒化した。
【００４０】
これらの変異遺伝子を有する感染ウイルスを救出するために、他の弱毒化された変異は、部位指向性の変異形成により、インフルエンザウイルス遺伝子に導入され得る。弱毒化変異はゲノムの非コード領域に導入され得、また、コード領域にも導入され得る。このような弱毒化変異は、また、ＨＡまたはＮＡ以外の遺伝子（例えば、ＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子）にも導入され得る（Ｓｕｂｂａｒａｏら、１９９３）。従って、部位指向性の変異形成により導入された弱毒化変異を有する新規ドナーウイルスもまた、産生され得、そして、このような新規ドナーウイルスは、Ａ／ＡＡ／６／６０ｃａドナーウイルスについての上記の方法と類似の方法で、弱毒化再類別Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２生ワクチン候補の減少に使用され得る。同様に、哺乳動物のワクチン接種に使用するために適切な弱毒化ワクチンを得るために、他の公知のおよび適切な弱毒化ドナー株を、本発明のインフルエンザウイルスで再類別し得る（Ｅｗａｍｉら、１９９０；Ｍｕｓｔｅｒら、１９９１；Ｓｕｂｂａｒａｏら、１９９３）。
【００４１】
このような弱毒化ウイルスが、元の臨床的単離体の遺伝子と実質的に類似した抗原決定基をコードするウイルス由来の遺伝子を維持することが好ましい。これは、弱毒化ワクチンの目的が、ウイルスの元の臨床的単離体と実質的に同じ抗原性であるが、同時に、ワクチンが、予防接種した哺乳動物への深刻な病原性状態の誘導の最小限の変化を引き起こす程度に感染性を欠如するような抗原性を供給することであるためである。
【００４２】
従って、ウイルスは、免疫反応を動物（例えば、哺乳動物）に誘導するためのワクチンとして、公知の方法に従って、弱毒化されるか、または不活性化され、処方され、そして投与され得る。このような弱毒化ワクチンまたは不活性化ワクチンが、臨床的単離体またはそれに由来する高増殖株の抗原性に対して、類似の抗原性を維持するかどうか決定する方法は、当業者に周知である。このような公知の方法としては、ドナーウイルスの抗原決定基を発現するウイルスを取り除くための抗血清または抗体の使用；化学的な選択（例えば、アマンタジンまたはリマンチジン）；ＨＡおよびＮＡの活性および阻害；そして、抗原決定基をコードするドナー遺伝子（例えば、ＨＡまたはＮＡ遺伝子）が、弱毒化したウイルス中に存在しないことを確認するためのＤＮＡスクリーニング（例えば、プローブハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ）が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８８；Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ、１９６９；Ａｙｍａｒｄ−Ｈｅｎｒｙら、１９８５；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９９２を参照のこと。
【００４３】
（薬学的組成物）
接種または非経口投与または経口投与に適した、本発明の薬学的組成物は、弱毒化したかまたは不活性化したインフルエンザウイルスを含み、必要に応じてさらに、滅菌水または非水性溶液、懸濁液およびエマルションを含む。組成物は、さらに、当該分野において公知の補助薬剤または賦形剤を含み得る。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら、１９８７；Ｇｏｏｄｍａｎら、１９９０；Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １９８７；Ｏｓｏｌ、１９８０；Ｋａｔｚｕｎｇ、１９９２を参照のこと。本発明の組成物は、一般に個体の用量（ユニット用量）の形態で提示される。
【００４４】
従来のワクチンは、一般に約０．１〜２００μｇ、好ましくは１０〜１５μｇの、それらの組成物に入れる各々の株由来の血球凝集素を含む。本発明のワクチン組成物の主要な構成物を形成するワクチンは、Ａ型ウイルス、Ｂ型ウイルスもしくはＣ型ウイルスまたはそれらの任意の組み合わせ（例えば、３つの型のうちの少なくとも２つ、異なるサブタイプのうち少なくとも２つ、同じ型の少なくとも２つ、同じサブタイプの少なくとも２つまたは異なる１つのもしくは複数の単離体または１つのもしくは複数の再類別体を含み得る。ヒトインフルエンザウイルスＡ型は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２サブタイプを含む。
【００４５】
非経口投与のための調製物としては、滅菌水性溶液、滅菌非水性溶液、懸濁液および／またはエマルションが挙げられ、これらは、当該分野で公知の補助薬剤または賦形剤を含み得る。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。皮膚透過性を増加し、抗原吸収を増強するために、キャリアまたは閉塞包帯が、使用され得る。経口投与のための液体投薬形態は、一般に、液体投与形態を含むリポソーム溶液を含み得る。リポソームを懸濁するために適切な形態としては、当該分野で一般に使用される不活性な希釈剤（例えば、精製水）を含むエマルション、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。不活性な希釈剤の他に、このような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤または甘味料、香料添加剤、または、香料もまた含み得る。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら、１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら、１９９０；Ａｖｅｒｙ’ｓ、１９８７；Ｏｓｏｌ、１９８０；およびＫａｔｚｕｎｇ、１９９２を参照のこと。
【００４６】
本発明の組成物が、個体への投与に使用される場合、それは、さらに、塩、緩衝液、アジュバントまたは組成物の効率を改善するために好ましい他の物質を含み得る。ワクチンでは、特定の免疫反応を増強し得るアジュバント、物質が使用され得る。通常、アジュバントおよび組成物は、免疫系に提示する前に混合され、または別々に提示されるが、免疫された生体の同じ部位には提示されない。ワクチン組成物に使用されるために適切な物質の例は、Ｏｓｏｌ（１９８０）により提供される。
【００４７】
少なくとも２つのインフルエンザウイルス株（例えば、２〜５０株または任意の範囲またはその中の値で）に対して複製したインフルエンザウイルスを混合することにより、ワクチン中の異質性が提供され得る。現代の抗原性組成物を有するインフルエンザＡウイルス株またはＢウイルス株が好ましい。本発明に従って、インフルエンザウイルスの一つの株中の変異に対して、当該分野で公知の技術を使用して、ワクチンを提供し得る。
【００４８】
本発明に従った薬学的組成物は、さらに、または、その上、例えば、遺伝子治療、免疫抑制剤、抗炎症剤または免疫賦活剤およびワクチン、化学治療物のための少なくとも１個の化学治療化合物を含み、このような化合物としては、γグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、チオセミダルバゾン、メチサゾン、リファンピン、リバビリン、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、フォスカーネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼインヒビターまたはガンシクロビルが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｋａｔｚｕｎｇ（１９９２）およびこの文献中の７９８〜８００ページおよび６８０〜６８１ページにそれぞれ引用された参考文献を参照のこと。
【００４９】
組成物は、また、可変であるが少量のエンドトキシンを含まないホルムアルデヒドおよび防腐剤を含み得、それらは、安全であることがわかっていて、組成物を投与した生物中で、望ましくない効果に寄与しない。
【００５０】
（薬学的目的）
組成物（またはそれが誘発する抗血清）の投与は、「予防的な」または「治療的な」目的のいずれかのためであり得る。予防的に提供される場合、本発明の組成物（ワクチンである）は、病原性感染のいかなる症状も明らかになる前に提供される。本組成物の予防的な投与は、後の感染を防止するかまたは緩和するために役立つ。治療的に提供される場合、弱毒化したかまたは不活性化したウイルスワクチンは、実際の感染の症状の検出の際に提供される。組成物の治療的投与は、実際の感染を緩和するために役立つ。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら、１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら、１９９０；Ａｖｅｒｙ、１９８７およびＫａｔｚｕｎｇ、１９９２を参照のこと。
【００５１】
従って、弱毒化したかまたは不活性化した、本発明のワクチン組成物は、感染の発症の前（予想される感染を防止するかまたは緩和するために）または実際の感染の開始後のいずれかに供給され得る。
【００５２】
同様に、遺伝子治療では、組成物は、障害または疾患の任意の症状が明白になる前にまたは、１つ以上の症状が発見された後に提供され得る。
【００５３】
組成物は、その投与が、レシピエント患者に耐性であり得る場合、「薬理学的に受容可能」であるといわれる。投与された量が、生理学的に有効である場合、このような薬剤が、「治療的有効量」で投与されるという。その存在が、レシピエント患者の生理学において、検出し得る変化を生じる場合、本発明の組成物は、生理学的に有効である（例えば、少なくとも１系統の感染性インフルエンザウイルスに対して、少なくとも１つの一次または二次の、体液性または細胞性免疫反応を増強する）。
【００５４】
提供された「防御」は、完全性を必要としない。すなわち、コントロール集団または患者の一群と比較して、実質的に顕著な改良がある場合、インフルエンザ感染が全体として防御されるか、根絶されることを必要としない。防御は、インフルエンザウイルス感染の症状の開始の重症度または速度の軽減に限定され得る。
【００５５】
（薬学的投与）
本発明の組成物は、受動免疫かまたは能動免疫のいずれかにより、１つ以上の病原体（例えば、１つ以上のインフルエンザウイルス株）に対する耐性を与え得る。能動免疫では、不活性化されたかまたは弱毒化された生存ワクチン組成物が、予防的に宿主（例えば、哺乳動物）に投与され、投与に対する宿主の免疫反応は、感染および／または疾患に対して防御する。受動免疫では、誘発された抗血清は、回復され得、および少なくとも１つのインフルエンザウイルス株により引き起こされた感染を有すると疑われるレシピエントに投与され得る。
【００５６】
２番目の実施形態では、ワクチンは、女性と胎児または新生児の両方を防御するために働く免疫反応（胎盤を通してまたは母乳中の抗体の受動的取り込みにより）の産生を引き起こすために十分な時間および量の条件下で、哺乳動物の雌性（妊娠または出産時またはその前に）に提供される。
【００５７】
本発明は、従って、障害または疾患を防御するかまたは弱化する方法（例えば、少なくとも１株の病原体による感染を含む。本明細書で使用される場合、
その投与が、症状もしくは疾患の状態の全体もしくは一部の弱化、または疾患に対する個体の全体または一部の免疫でのいずれかを生じる（すなわち、抑制）場合、ワクチンは、疾患を防止するかまたは弱めると言われる。
【００５８】
本発明の、少なくとも１個の不活性化されたかまたは弱められたインフルエンザウイルスまたはその組成物は、上記のように、薬学的組成物を使用して、意図した目的を達成する任意の手段で投与され得る。
【００５９】
例えば、このような組成物の投与は、種々の非経口経路によりよることが可能である（例えば、皮下の、静脈内の、皮内の、筋肉内の、腹腔内の、鼻腔内の、経口のまたは経皮の経路）。非経口投与は、丸薬によるかまたは時間を追って徐々に灌流することにより、行い得る。本発明の薬学的組成物を使用する好ましい形態は、筋肉内投与または皮下の投与による。Ｂｅｒｋｏｗら１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら、１９９０；Ａｖｅｒｙ、１９８７およびＫａｔｚｕｎｇ、１９９２を参照のこと。
【００６０】
病理に関して、インフルエンザウイルスを防止し、抑制し、または処置するための代表的な処方計画は、本明細書に記載されるワクチン組成物の効果的な量の投与を含み、１週間と約２４ヶ月の間で、またはその間の任意の範囲または値で、誘導するまでの期間、単回処理として投与されるかまたは増強するものとして、または追加免疫投薬量として繰り返して投与される。
【００６１】
本発明に従うと、「効果的な量」のワクチン組成物は、所望の生物学的効果を達成するために十分である組成物である。効果的な投薬量は、レシピエントの年齢、性別、健康および体重、ある程度の同時処理、もしあれば、処理の頻度および所望した効果の性質に依存する。以下に提供した効果的な投薬量の範囲は、本発明および本発明の好ましい用量範囲を限定することを意図しない。しかし、最も好ましい用量は、個体被験体に合わせて調整されることが理解され、そして、当業者により決定され得る。Ｂｅｒｋｏｗら、１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら、１９９０；Ａｖｅｒｙ’ｓ、１９８７；Ｅｂａｄｉ、１９８５およびＫａｔｓｕｎｇ、１９９２を参照のこと。
【００６２】
弱毒化したウイルスワクチンの哺乳動物（例えば、ヒト）または鳥類成体に対する投薬量は、約１０３〜約１０７プラークを形成ユニット（ＰＦＵ）／ｋｇまたは任意の範囲またはその範囲内の値であり得る。不活性化ワクチンの用量は、約０．１〜約２００の範囲であり得、例えば、５０μｇの血液凝集素タンパク質であり得る。しかし、用量は、開始点として存在するワクチンを使用した、従来的な方法により決定される安全かつ効果的な量であるべきである。
【００６３】
複製したウイルスワクチンの各用量における免疫反応性ＨＡの用量は、適切な量を含むように標準化し得、例えば、１〜５０μｇまたは任意の範囲、またはその範囲内であり得、または米国公衆衛生局（ＰＨＳ）により推奨される量であり、それは、３歳より年長の小児に対しては、通常構成要素あたり１５μｇ、３歳未満の小児に対しては、構成要素あたり７．５μｇである。ＮＡの量もまた、標準化し得るが、しかし、この糖タンパク質は、処理機精製および保管の間、不安定であり得る（Ｋｅｎｄａｌら、１９８０；Ｋｅｒｒら、１９７５）。各０．５ｍｌ用量のワクチンは、好ましくは、約１０億〜５００億個のウイルス粒子を含み、および好ましくは、１００億個の粒子を含む。  
【００６４】
本発明は、以下の非限定的な実施例により、さらに、記載される。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（材料および方法）
（ウイルスおよび細胞）
単一患者かまたはＭａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（Ａ／Ｔｏｔｔｏｒｉ／８７２／Ｋ４／９４；Ｋ４）の肺含有鶏卵（Ａ／Ｔｏｔｔｏｒｉ／ＡＴ１／ＡＭ２ＡＬ３／９４；ＡＭ１ＡＬ３）から単離されたヒトＨ３Ｎ２ウイルスを、Ｔ．Ｉｔｏ（Ｔｏｔｔｏｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｏｔｔｏｒｉ、Ｊａｐａｎ）から入手した。ウイルスストックは、０．３％のウシ血清アルブミンおよび０．５ｍｇのトリプシン／ｍｌを補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中の１０日齢の胚含有鶏卵（ＡＭＺＡＬ３  ウイルス）かまたはＭＤＣＫ細胞（Ｋ４ウイルス）上で増殖させた。ＭＤＣＫ細胞を、５％新生児子牛血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＭＥＭ中で維持した。
【００６６】
（レクチン耐性細胞株の産生）
７５％のコンフルーエンシーまで増殖したＭＤＣＫ細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、その後、０．３％子牛血清アルブミンを含むＭＥＭ中のＭａａｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）レクチン（１００ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチン（１００ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中でインキュベートした。４８時間のインキュベート後、培地を成長培地（ＭＥＭ−５％子牛胎児血清）で置き換えた。レクチン選択を、上記のようにさらに２回繰り返した。生存した細胞コロニーをクローン化し、ＳＮＡ−選択細胞株およびＭＡＡ−選択細胞株を、それぞれＭＤＣＫ−Ｓｎ１０およびＭＤＣＫ−Ｍａと名付けた。
【００６７】
（シアル酸含有量の決定のための蛍光定量的なＨＰＬＣ方法）
両方の細胞株および精製したウイルスのシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸［ＮｅｕＡｃ］およびＮ−グリコリルノイラミン酸［ＮｅｕＧｃ］）含有量を、Ｓｕｚｕｋｉら（１９９７）に記載されるように、高性能液体クロマトグラフィーにより蛍光定量的に決定した。各サンプルを５ｍｌのすりガラスのふたのバイアル中に置き、１００μｌ（２５ｍＭ）の硫酸と混合した。次いで、バイアルを６０℃で１２時間熱し、シアロ糖鎖を加水分解した。冷却後、５０μｌの１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼンを、５０μｌの加水分解質に添加し、その後、混合物を暗黒下で、６０℃で２．５時間加熱し、シアル酸の蛍光を発色させた。生じた溶液の１０μｌのアリコートを次いで、サンプル注入バルブ（モデル７１２５；Ｒｅｏｄｙｎｅ）ならびに２０μｌフローセルおよび記録計（Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃ  Ｃ−ＲＳＡ；Ｓｈｉｏｎａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）備えた蛍光分光光度計（６５０−１０５；Ｈｉｒａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を備え付けた８８０−ＰＵ高性能液体クロマトグラフ（ＪＡＳＣＯ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に注入した。蛍光分光光度計を、３７３ｎｍの励起波長および４４８ｎｍの放射波長に位置した。校正曲線を確立するために、ＮｅｕＡｃ（Ｓｉｇｍａ）およびＮｅｕＧｃ（Ｓｉｇｍａ）の標準混合物（２００ｐｍｏｌ／μｌ）を使用した。
【００６８】
（蛍光シアリダーゼ活性アッセイ）
ウイルスシアリダーゼ活性（５×１０５ＰＦＵ）を、Ｈａｒａら（１９８７）によって記載されるように、２’−（４−メチルウンベリフェリル）−αーＤ−Ｎ−アセチルノイラミニックアシッド（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いて測定した。簡単に言えば、蛍光発生的な基質を（０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）で１：２に希釈し）、等容量のウイルスサンプルに添加し、３７℃で、３０分間インキュベートした。２００ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ２（ｐＨ１０．７）により反応を止め、次いで、蛍光を３６０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの放射波長でインキュベートした。全ての反応を２組行った。
【００６９】
（ＮＡおよびＨＡ遺伝子の配列決定分析）
製造者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）により説明されるように、Ｑｉａｐｐｉｎ  ｖＲＮＡ精製キットを使用して、全ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を、ウイルスサンプルから入手した。ｃＤＮＡ産生のために、保存された１２個のインフルエンザＡウイルス遺伝子断片のｖＲＮＡ３’末端ヌクレオチドに相補的な、オリゴヌクレオチド  Ｕｎｉ−１２を、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）反応に対するプライマーとして使用した。ＮＡ遺伝子ｃＤＮＡを、ＮＡ遺伝子特異的プライマーＪＮ２−４３（５’ｃＲＮＡセンス配列：５’−ＴＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＧＣＣ−３’；配列番号１）およびＪＮ２−１４１０ｒ（３’−ｃＲＮＡアンチセンス配列：５’−ＴＴＡＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＣＧ−３’；配列番号２）および１０ＵのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、３０回のＰＣＲの間で増幅した。生じたＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）にサブクローニングし、自動蛍光配列決定に使用した。ＨＡ遺伝子特異的プライマーＪＨ３−Ｕｐ（５’ｃＲＮＡセンスプライマー配列、５’−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’；配列番号３）およびＪＨ３−Ｄｏｗｎ（３’ｃＲＮＡアンチセンスプライマー配列、５’−ＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＣＴＣ−３’；配列番号４）を用いて、ＨＡ遺伝子を同様の様式で、クローン化した。単離したそれぞれに対して、ＮＡおよびＨＡコンセンサス配列を入手するために、３個のクローンを試験した。
【００７０】
（結果）
（レクチン耐性細胞株の産生）
細胞の表面でシアル酸発現のレベルが減少した細胞株を産生するために、シアル酸結合特異性が異なる２個のレクチン（ＳＮＡおよびＭＡＡ）を使用した。ＳＮＡレクチンは、α（２−６）結合によりガラクトースまたはＮーアセチルガラクトサミンに結合したシアル酸に特異的である（Ｓｈｉｂｕｙａら、１９８７）のに対して、ＭＡＡレクチンは、α（２，３）結合によりガラクトースに結合したシアル酸に、結合する。インフルエンザウイルスの増殖を補助するＭＤＣＫ細胞株は、レクチン選択に対する親細胞として使用される。いずれかのレクチンの存在下でインキュベートした場合、細胞の多くは、１週間以内に死ぬ。耐性の細胞クローンを次いで、ストック培養のために増殖させる。ＭＡＡおよびＳＮＡレクチン選択から生じた細胞株を、それぞれ、ＭＤＣＫ−ＭａおよびＭＤＣＫ−Ｓｎ１０と名付けた。
【００７１】
ジゴキシゲニン標識したＭＡＡおよびＳＮＡレクチンを用いた蛍光活性化細胞選択（ＦＡＣＳ）（図１Ａ）は、以前記載された（Ｉｔｏら、１９９７）ように、ＭＤＣＫ細胞の両方のレクチンに対する高レベルの結合を示した。α（２，６）結合特異的レクチンを用いて選択された、ＭＤＣＫ−Ｓｎ１０細胞は、α（２，３）特異的ＭＡＡレクチンに対する強い結合を保持したが、ＳＮＡレクチン結合は、ＭＤＣＫ親の結合より弱い結合を示した。それに対して、α（２−３）結合特異的レクチンで選択されたＭＤＣＫ−Ｍａ細胞は、両方のレクチンに、ＭＤＣＫ細胞より、非常に弱く結合する。
【００７２】
（ＭＤＣＫ−Ｓｎ１０およびＭＤＣＫ−Ｍａ細胞株中でのウイルス増殖）
インフルエンザウイルスが、どのようにレセプター発現が減少した細胞に適応しているか知るために、公知のシアル酸レセプター結合特異性（Ｉｔｏら、１９９７）を用いて、２個のインフルエンザウイルス改変体（ＡＭ２ＡＬ３およびＫ４）を選択した。ＡＭ２ＡＬ３ウイルスが、ＮｅｕＡｃα（２−３）Ｇａｌに対して特異的であるのに対して、Ｋ４ウイルスは、α（２−６）結合［ＮｅｕＡｃα（２−６）Ｇａｌ］によりガラクトースに結合したＮｅｕＡｃを特異的に認識する。両方のウイルスとも、ＭＤＣＫ細胞中と同様に、ＭＤＣＫ−Ｓｎ１０細胞中でよく複製する（表１）。しかし、ＭＤＣＫ−Ｍａ細胞中での両方のウイルスの力価は、ＭＤＣＫ細胞より１桁低い。また、各ウイルスでの感染後、１０の感染の重複でさえ、少量の割合のＭＤＣＫ−Ｍａ細胞は、いかなる細胞変性効果もなく、コンフルーエンシーになるまで、増殖し続けた。ウイルスの増殖を促進するトリプシンを含む培地の置き換えによる血球凝集アッセイにより、ウイルス産生は、これらの生存する細胞中では、検出され得ない。インフルエンザウイルスＨＡおよびＮＰタンパク質の両方に対する免疫化学染色によっては、細胞は、またネガティブであった（データは示さず）、従って、細胞は、持続的に感染していないことを示している。
生存した細胞を、ＭａＫＳと名付けた。
【００７３】
【表１】
2010042023.tif 000002
ＳＮＡおよびＭＡＡレクチンの両方を使用したＦＡＣＳ分析は、それらが由来したＭＤＣＫ−Ｍａ細胞と同様に、ＭａＫＳ細胞が、α（２，６）特異的ＳＮＡレクチンに、ＭＤＣＫ細胞より弱く結合することを示している（図１Ｂ）。さらに、ＭａＫＳ細胞のＭＡＡレクチン結合の頂点は、ＭＤＣＫ−Ｍａ細胞株のそれより、非常に狭く、小さな肩ピークの喪失を伴う、より高いＭＡＡ結合集団を示す（図１）
シアル酸の量の減少が、ＭａＫＳ細胞のレクチン結合の減少の原因となっているかどうか決定するために、ＭａＫＳ細胞中でのシアル酸の存在量を、液体クロマトグラフィー分析により定量化した。ＭａＫＳ細胞株（それぞれ、８．２および０．４ｐｍｏｌ／μｇタンパク質）は、ＭＤＣＫ細胞（２１６．０および２．５ｐｍｏｌ／μｇタンパク質）より、低いレベルのＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃを示したが、ＮｅｕＧｃ量は、非常に少なかった。これらのデータは、ＭａＫＳ細胞中のシアル酸レセプター決定基の広範囲の減少を示している。
【００７４】
（ＭａＫＳ細胞中のウイルスの適応）
ＡＭ２ＡＬ３およびＫ４ウイルスが、非常に低いレベルのウイルスレセプターを発現する細胞中で、どのように増殖し、増殖を細胞に適応させているか決定するために、両方のウイルスを連続的に、液体培養中のＭａＫＳ細胞に通過させた。両方のウイルスとも、ＭＤＣＫ細胞と比較して、ＭａＫＳ細胞では、より不十分にしか複製しない（表２）ので、第１〜３継代まで、希釈せずに行い、第４〜１３継代までは、１：１０００希釈で行った。第８継代の後、いずれかの改変体により産生されたプラークの直径は、大きいもの（３ｍｍより大きい）からより小さいもの（約１ｎｍ）に変化した。第１０継代およびそれより高いものまでは、ウイルスをＭＤＣＫ細胞でアッセイした場合、より小さなプラークしか存在しなかった（データは、示さず）。１３の連続した継代の後、両方のウイルスは、ＭａＫＳ細胞で増殖し得、ならびにＭＤＣＫ細胞ではより良く増殖し得た（表２）。第１３継代の後、各改変体から産生したウイルスストックを増幅し、それぞれ、ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３と名付けた。
【００７５】
【表２】
2010042023.tif 000003
（ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子の変異分析）
レセプター濃度の減少により特徴付けられた細胞環境に対するウイルス適応の分子的基盤を決定するために、ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３ウイルスのＨＡ遺伝子を逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、その後、得られた産物を配列決定した。２個の親ウイルス由来の対応するＨＡ遺伝子と比較して、遺伝子のいずれもが、変異を含まなかった。
【００７６】
ＮＡシアリダーゼ活性中の変化が、インフルエンザＨＡレセプター結合活性中にあるので、ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３ウイルスのＮＡ配列を決定した。両方の改変体のＮＡ遺伝子の配列分析は、大きな内側の欠失を明らかにした（図２）。ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３では、欠失は、ヌクレオチド２２０〜１２５３まで広がり、リーディングフレームをシフトし、従って欠失のすぐ後にストップコドンを産生した。このＮＡのコード能力は、６６アミノ酸であり、これは、細胞質末端、膜貫通ドメイン、柄領域に対応し、ＮＡの頭領域の短い部分であった。同様に、Ｋ４（ＭａＫＳ）−１３単離体は、ＮＡ遺伝子中の塩基１３０〜１１９３まで欠失を含み、コドン３９にフレーム内で、終止コドンをもたらす。ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３ウイルスと同様に、遺伝子は、もはや全長触頭部領域をコードしていない。従って、ウイルスは、それらのＮＡ触媒活性を失った非常に低いレセプター発現を有する細胞株中を通過する。
【００７７】
この結果を確認するために、蛍光シアリダーゼ基質［２’（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミニックアシッド］を使用して、ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３改変体のシアリダーゼ活性を分析した。親ウイルスと違って、ＮＡ欠失変異体のいずれもが、検出し得るシアリダーゼ活性を有さなかった（図３）。
【００７８】
ウイルス糖タンパク質のシアル化の範囲。通常の感染の間、シアリダーゼ活性が減少したウイルスは、効率的に増殖せず、細胞表面に凝集する（Ｐａｌｅｓｅら、１９７４；Ｓｈｉｂａｔａら、１９９３）。それから、なぜ、シアリダーゼ活性を欠如するＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３ウイルスは、ＭａＫＳ細胞中で増殖するのか。１つの可能性のある説明は、これらの細胞のシアル酸量が低いので、ＨＡおよびＮＡオリゴ糖のシアル化の程度もまた低く、感染した細胞表面でのウイルスの凝集を防止し、ウイルスシアリダーゼ活性がない場合には、さらに防止するということである。この仮説を試験するために、精製したウイルス調製物中のシアル酸含有量を、ＭＤＣＫ細胞で増殖したＡＭ２ＡＬ３ウイルスとＫ４ウイルスとの間およびＭａＫＳ細胞中のＡｌ３（ＭａＫＳ）−１３ウイルスとの間で比較した。ＮｅｕＡｃ含有量は、ウイルスサンプル間で類似していたが、ＡＭ２ＡＬ３ウイルスは、他のサンプル（Ａ／Ｔｏｔｔｏｒｉ／８７２／Ｋ４／９４、３．８ｐｍｏｌのＮｅｕＡｃ／ｇのタンパク質；ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３、２．６ｐｍｏｌのＮｅｕＡｃ／ｇのタンパク質）と比較して低いシアル酸含有量（０．９ｐｍｏｌのＮｅｕＡｃ／ｇのタンパク質）を有していた。
【００７９】
従って、シアリダーゼ活性を欠如するウイルスは、ウイルス糖タンパク質が、通常の細胞株と比較して、広範囲にシアル化されておらず、ＨＡによって結合されないので、従って、ウイルス凝集を防止し、シアル酸の発現レベルが減少した細胞中で効率的に増殖し得る。
【００８０】
（考察）
本発明の研究では、外性細菌シアリダーゼ活性およびウイルスＮＡに対する抗体の存在下でのインフルエンザＡウイルスの継代が、ウイルスＮＡ遺伝子の欠失につながる（Ｌｉｕら、１９９３；Ｌｉｕら、１９９５；Ｙａｎｇら、１９９７）。さらに、このような継代により入手したＮＡ変異体は、シアル酸残基に対する分子の親和性を減少させるＨＡタンパク質中の補償的変異体（Ｈｕｇｈｅｓら、２０００）の結果として、外性のシアリダーゼ活性を欠損する細胞培養中でならびに、卵中で、マウス中で、増殖し得た。本明細書に記載したように、インフルエンザＡウイルスは、シアリダーゼ活性が消滅したＮＡ遺伝子の大きな欠失変異体により、レセプターの発現が大きく減少した細胞内での増殖に適応し得る。ウイルスレセプターの減少が、理論上、レセプター結合ＨＡタンパク質に影響し得るにもかかわらず、ＮＡ遺伝子のみが変化している。
【００８１】
この発見の分子的基盤は何か。シアル酸レセプターが大量にある通常の細胞の環境では、ＮＡ活性の喪失は、ウイルスＨＡのシアル酸に対する親和性の減少により、補償され得、宿主細胞表面からの子孫の効率的な放出を可能にし、ビリオンの凝集を防止する（Ｈｕｇｈｅｓら、２０００）。高レベルのウイルスレセプターの欠如により、発明者らのＭａＫＳ細胞では、ＨＡ親和性の減少は、ウイルス子孫の放出を必要とせず、ＮＡ欠失変異体の増殖を可能にする。実際に、ＨＡタンパク質の高親和性結合は、低レベルでウイルスレセプターを発現する細胞中でのウイルス複製の間、維持されているにちがいない。しかし、このような環境では、シアリダーゼ活性は、ビリオン放出およびビリオン凝集の防止には、必要ではなく、細胞表面分子上のシアル酸の量が、非常に低いので、ＮＡ欠失ビリオンのシアル酸含有量は、野生型ビリオンのそれと類似している。実際に、シアリダーゼ活性は、それがさらに、レセプター決定基シアル酸を、細胞表面から取り除くので、ウイルス増殖に有害なようである。最近、インフルエンザＡウイルスが、ＮＡ柄を欠失し、従って、卵中で増殖し得ず、異種のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えを介して、２２アミノ酸までの柄挿入を必要とすることが示された（Ｍｉｔｎａｕら、２０００）。まとめると、これらの発見は、インフルエンザウイルスが、大きな挿入および欠失を含む、極端な遺伝的変化を受けることにより、新規の宿主環境に適応し得ることを示している。
【００８２】
この研究および以前の研究（Ｈｕｇｈｅｓら、２０００；Ｌｉｕら、１９９３）の両方で、ウイルスは、細胞質末端および膜貫通領域をコードする断片末端を残すＮＡ遺伝子断片中の内部の欠失により、シアリダーゼ活性を喪失した。従って、これらの変異体のＮＡ遺伝子の保存された領域は、機能（例えば、ビリオンの形態形成および安定性）に必要であり得る。
【００８３】
ＭａＫＳ細胞は、それらの親（ＭＤＣＫ）細胞より低いシアル酸含有量を有する。類似した細胞株は、ＣＨＯ細胞から産生される（Ｒａｙら、１９９１）が、それらが、効率的なインフルエンザウイルスを支持し得ないので、インフルエンザウイルス研究に対して有用であることは、証明されていない。それに対して、ＭａＫＳ細胞は、インフルエンザウイルスの研究に使用される標準的細胞株であるＭＤＣＫ細胞に由来し、ウイルスレセプターに基づいた分析に有用であるはずである。例えば、外因的に、添加されたガングリオシドは、宿主細胞膜に取り込まれることが知られている（Ｃａｒｒｏｌｌら、１９８５）ので、従って、公知のガングリオシドをＭａＫＳ細胞でインキュベートし得、そして、ウイルスレセプターとしての役目を果たす能力を試験し得る。
【００８４】
前世紀の間、出現ウイルスのＨＡかまたはＨＡおよびＮＡの両方の遺伝子が、ヒト集団に導入されたときに、３個のインフルエンザＡウイルス流行病が生じた。異なる宿主動物由来のウイルスの比較研究は、これらの流行病株では、変異が、ＨＡ遺伝子に導入されたことを示唆している（Ｂｅａｎら、１９９２）。ウイルスが宿主の障壁を越えることを可能にするために、類似した変異がＮＡ中で必要かどうかは、不明なままである；しかし、ヒトウイルスＮ２  ＮＡ（鳥類のウイルスに由来する）の基質特異性は、ヒト中でのその複製の間に次第に変化した（Ｂａｕｍら、１９９１）。本明細書の上に記載した結果は、ＮＡ変異体が、実際に、新しい環境に適応するためのインフルエンザＡウイルスの能力に寄与し得ることを示している。例えば、ヒトウイルスＮＡを有する再類別ウイルスおよびアヒル中で複製できないアヒルウイルス由来の残った遺伝子（Ｈｉｎｓｈａｗら、１９８３）、鳥類ウイルスに起源するヒトウイルスのＮＡ（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋら、１９７８）でさえも挙げられる。このことは、ヒトへの適応の間に、変異がＮＡ遺伝子中で起こっているようであることを示唆している。異なる動物宿主由来のウイルスＮＡの比較研究は、最近開発されたプラスミドに基づいた逆遺伝学（Ｆｏｄｏｒら、１９９９；Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）と連動して、これらの表面糖タンパク質が、天然のインフルエンザウイルスの間での変化への適応にどのように寄与するかに対する有用な洞察を生じ得る。
【００８５】
（実施例２）
（材料および方法）
（細胞）
２９３Ｔヒト胚腎臓細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ培地中で維持し、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、５％ウシ新生児血清を補充したＥａｇｌｅ培地中で維持した。
【００８６】
（プラスミドに基づいた逆遺伝学）
ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーター（Ｐｏｌ１プラスミドと呼ばれる）の制御下で、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルス遺伝子のｃＤＮＡを有するプラスミドおよびＮｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載されたインフルエンザウイルスタンパク質を発現するｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳプラスミドを使用して、インフルエンザＡウイルスを産生した（図４Ｂ）。簡単に言えば、Ｐｏｌ１プラスミドおよびタンパク質発現プラスミドを、トランスフェクション薬剤、Ｔｒａｎｓ  ＩＴ  ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とともに混合し、室温で１０分間インキュベートし、その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で培養した１×１０６個の２９３Ｔ細胞を添加した。トランスフェクト後、４８時間で、ＨＡタンパク質を活性化するために、０．５μｇ／ｍｌのトリプシンを培地に添加し、その後、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、上清を回収した。
【００８７】
（プラスミド）
ＮＡＦＬＡＧ遺伝子は、ＮＡ  ｃＲＮＡの５’非コード領域；細胞質末端領域（６アミノ酸）膜貫通領域（２９アミノ酸）および柄領域（１６アミノ酸）に対応するＮＡの５１個のコドン（図４Ａ）；ＦＬＡＧエピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：配列番号５）；２個の連続した終止コドン（ＴＡＡ  ＴＡＧ；配列番号６）およびＮＡ  ｃＲＮＡの３’末端配列の１８５塩基を含む。この３’末端配列の長さは、短縮ＮＡ断片中で発見された最も短いものである。（Ｙａｎｇら、１９９７）。ｐＰｏｌ１−ＮＡＦＬＡＧＷＴは（ネガティブセンスＮＡＦＬＡＧ  ＲＮＡを産生し）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＮＡ（ＢｓｍＢ１部位により切断された全長Ａ／ＷＳＮ／３３  ＮＡ遺伝子を含む）中のＷＳＮ  ＮＡ遺伝子のヌクレオチド１７３〜１０７０（ポジティブセンスの）の欠失ヌクレオチドにより作成され、そして、ＦＬＡＧ配列、２個の終止コドンおよびＳｔｕＩ部位をＰＣＲにより挿入することにより作成される。このフラグメントをＳｔｕＩで消化し、自己連結させた。ＮＡＦＬＡＧ遺伝子を、ＢｓｍＢＩで切断し、ｐＨＨ２１のＢｓｍＢＩ部位に挿入した。
【００８８】
ｐＰｏｌ１−ＮＡＦＬＡＧＭ（−）（ＮＡＦＬＡＧＭ（−）ｖＲＮＡの産生のための）は、ＮＡタンパク質の開始コドンを欠いている。これは、切断したＮＡＦＬＡＧタンパク質に対するＡＴＧ開始コドンを、インビトロで、部位に関する変異形成システム（ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＧＣＧに交換することにより成し遂げた。
【００８９】
ＮＡ  ｖＲＮＡの３’非コード末端および６１個のＮ末端ＮＡコドンを有する融合タンパク質をコードする相補的配列を含むＲＮＡ、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＮＡ  ｖＲＮＡの５’末端の１８５塩基を産生するｐＰｏｌ１ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）を、逆ＰＣＲにより、ＢｇｌＩＩ部位を有するｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＮＡ中のＷＳＮ  ＮＡ遺伝子のヌクレオチド２０３〜１１０９（ポジティブセンス）を置き換えることにより産生した。ｅＧＦＰ遺伝子を、このＢｇＬＩＩ部位およびＮＡタンパク質のフレーム中の位置１２２６（野生型ＮＡ遺伝子中での）にあるＳｔｕＩ部位にクローン化した。ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）遺伝子を、次いで、ｐＨＨ２１のＢｓｍＢＩ部位に挿入した。
【００９０】
ＮＡ（０）ＧＦＰ（０）遺伝子（ＮＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域を含む）、ｅＧＦＰの相補的コード配列およびＮＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を、ＢｂｓＩ部位を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより産生した。このＰＣＲフラグメントをＢｂｓＩで切断し、ｐＨＨ２１のＢｓｍＢＩ部位に挿入した。故にプラスミドの細胞への導入により、５’および３’非コードＮＡ  ｖＲＮＡ領域が隣接した、ｅＧＦＰコード配列をネガティブセンス向きに含むＲＮＡが合成された。
【００９１】
欠失変異体のシリーズを、ＰＣＲ変異形成により産生した。ＮＡ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の欠失変異体を、ｐＴ７ｂｌｕｅベクター中のＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）遺伝子から作成した。ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）のＮＡコード領域の３’末端全体（ポジティブセンス）を欠くＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（０）遺伝子をＰＣＲ変異形成により産生した。この変異体は、５’非コード領域（ポジティブセンス）、ＮＡ配列の６１個のアミノ酸、ｅＧＦＰ遺伝子、２個の終止コドンおよび３’非コード領域を含む。ＰＣＲ変異体、ＮＡ−（９０）ＧＦＰ（０）、ＮＡ−（４５）ＧＦＰ（０）、ＮＡ−（２１）ＧＦＰ（０）およびＮＡ−（１８）ＧＦＰ（０）は、ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（０）のＮＡコード領域の３０個、１５個、７個、６個のＮ末端アミノ酸欠失をそれぞれ含む。
【００９２】
ＮＡ０Ｇ１８５遺伝子（５’非コード領域、ｅＧＦＰ遺伝子、２個の終止コドンおよびＮＡ（ポジティブセンス）の３’末端の１８５個のヌクレオチドを含む）を、ＮＡ（６１）ＧＦＰ遺伝子と同じ方法で作成した。この変異体は、ＮＡ  ｖＲＮＡ（２８ヌクレオチド）の５’非コード領域およびｖＲＮＡのＮＡ  ５’コード領域の１５７ヌクレオチドを有する。ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（７８）およびＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（３９）変異体は、ＮＡ０Ｇ１８５の欠失変異体であり、ＮＡ５’コード領域の２分の１または４分の１を、ＮＡ０Ｇ１８５としてそれぞれ有する。
【００９３】
（免疫染色）
短縮ＮＡタンパク質のＣ末端に付着したＦＬＡＧエピトープを検出するために、ＭＤＣＫ細胞を、このエピトープを有するウイルスで感染し、０．５μｇ／ｍｌのトリプシンおよび１００μＵ／ｍｌのＶｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む０．６％アガロースでオーバーレイした。感染した細胞を、３％ホルムアルデヒド溶液で固定し、３％ホルムアルデヒド溶液中の０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液を浸透させた。次いで、ベクタステインＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）および抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を一次抗体として、およびビオチン標識した抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用して、ＦＬＡＧエピトープを検出した。ＷＳＮウイルス感染した細胞を同定するために、ウサギ抗ＷＳＮ血清を一次抗体として使用した。
【００９４】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
感染細胞を、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブとハイブリダイズし、ＤＩＧ核酸検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造者のプロトコールに従って染色した。ＦＬＡＧエピトープをコードする核酸配列（ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ；配列番号７）に相補的なオリゴヌクレオチド（１００ｐｍｏｌ）を、ＤＩＧオリゴヌクレオチドテーリングキット（Ｒｏｃｈｅ）により、３７℃で６時間標識した。ウイルス感染細胞を、３％ホルムアルデヒド溶液で固定し、３％ホルムアルデヒド溶液中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で浸透させ、そしてプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、１％（検出キットの）ブロック試薬、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、０．１ｍｇ／ｍｌ（検出キットの）ポリ（Ａ）−ＤＮＡ含有）中で、６５℃で３０分間プレハイブリダイズした。オリゴヌクレオチドプローブ（１０ｐｍｏｌ）を、プレハイブリダイゼーション緩衝液に加え、そして５５℃で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズした細胞を、洗浄緩衝液（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．５））で５分間洗浄し、１％ブロック剤によって室温で３０分間ブロックし、そしてアルカリホスファターゼと結合した抗ＤＩＧ抗体（１：５００）と共に、室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、洗浄緩衝液で洗浄し、そしてニトロブルーテトラゾリウムクロリド／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）と共に、検出緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．５））中で、室温で３時間、暗所でインキュベートした。
【００９５】
（競合的継代）
ＮＡＦＬＡＧＷＴウイルスまたはＮＡＦＬＡＧＭ（−）ウイルス（３００プラーク形成単位［ＰＦＵ］）を、３×１０４ＰＦＵのＮＡ（−）ウイルスと混合し、そしてサブコンフルエントなＭＤＣＫ細胞に感染させる（０．０１の多重感染）ために使用し、そして０．５μｇ／ｍｌのトリプシンおよび１００μＵ／ｍｌのＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼを含有した倍地中で、７２時間インキュベートした。回収したウイルスを、ＭＤＣＫ細胞を感染させるために使用した。この過程を、５回繰り返した。
【００９６】
（結果）
（ＮＡ遺伝子セグメントを欠いたインフルエンザＡウイルスは、生存可能である）
短縮型ＮＡ遺伝子の繰り返し継代後の維持は、ウイルス複製のためのその重要性を示唆した。ＮＡ  ＲＮＡセグメントを有さない変異型インフルエンザＡウイルスを産生するために、２９３Ｔ細胞に、ｖＲＮＡ（ＮＡ  ｖＲＮＡを除く）を産生し、そしてその９個の構造タンパク質を発現させるために、これをプラスミドでトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞培養の上清を、ＭＤＣＫ細胞と共に、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ存在下でインキュベーションする際、プラーク（直径１８９±１５．６μｍ）が観察された。液体培養において、このウイルス（ＮＡ（−）と呼ぶ）は、ｌ０５ＰＦＵ／ｍｌまで増殖した。従って、７つのｖＲＮＡセグメントだけを有するインフルエンザＡウイルスは、生存可能であった。
【００９７】
（短縮型ＮＡセグメントは、効率的なウイルス増殖に必須である）
短縮型ＮＡ遺伝子の、繰り返し継代後の安定的な維持についての分子的機序を理解するため、短縮型ＮＡ遺伝子を含むウイルスの増殖を、ＮＡ遺伝子の開始コドンを欠きＮＡ（−）ウイルスをコードするウイルスと、比較した。変異型ウイルスＮＡＦＬＡＧＷＴを、逆遺伝学によって産生した。ＮＡＦＬＡＧＷＴは、内部欠失を有するＮＡ遺伝子、および短縮型ＮＡ遺伝子に融合したＦＬＡＧエピトープ配列を有する。ＮＡＦＬＡＧＷＴは、１０５ＰＦＵ／ｍｌまで増殖し、そして、細菌シアリダーゼ存在下で、プラークを産生した。このプラークを、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体または抗ＷＳＮポリクローナル抗体によって、免疫染色した（図４Ｃ）。ＮＡ（−）ウイルスまたはＮＡＦＬＡＧＷＴウイルスによって産生されたプラークを、抗ＷＳＮ抗体で染色したが、後者のウイルスのプラークだけが、抗ＦＬＡＧ抗体で染まった。
【００９８】
複製能力の違いを決定するため、ＮＡ（−）ウイルスおよびＮＡＦＬＡＧＷＴウイルスを、１００：１の比率で混合し、そしてこの混合物を、ＭＤＣＫ細胞と共にインキュベートした（図５）。感染後４８時間で上清を取り出し、プラークの産生のために使用した。これらのプラークを、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で免疫染色した。短縮型ＮＡセグメントを有するウイルスの感染率を、総プラーク中のＦＬＡＧ陽性プラークのパーセンテージを計算することにより、決定した。この過程を、あと４回繰り返した。図７Ｂに示すように、集団の中のＦＬＡＧ陽性プラークは、継代の間徐々に増加し、５回の継代で９０％近くに達した。この結果は、８個のセグメントを有するウイルスが、７個のセグメントを有するウイルスよりよく増殖する（短縮型ＮＡが、機能するシアリダーゼをコードしなくても）ことを示す。
【００９９】
（ウイルスＲＮＡは、効率的なウイルス増殖に重要である）
短縮型ＮＡタンパク質またはウイルスＲＮＡのどちらが、効率的なウイルス複製に重要であるかを決定するため、ＮＡ開始コドンおよび別のインフレームのＡＴＧコドン（１５番目のコドン）の両方を欠いたＮＡＦＬＡＧＭ（−）遺伝子を、構築した（図６Ａ）。ＮＡＦＬＡＧＭ（−）ウイルスによって産生されたプラークは、抗ＦＬＡＧ抗体で検出されず（図６Ｂ）、このタンパク質が翻訳されないことを示した。ＮＡＦＬＡＧＭ（−）ウイルスが、ＮＡＦＬＡＧＭ（−）遺伝子を保有することを保証するため、このウイルスによって産生されたプラーク上で、ＦＬＡＧ配列特異的プローブを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを行った。これらのプラークは、プローブに反応し、このウイルス中のＮＡＦＬＡＧＭ（−）遺伝子の存在を保証した。次いで、このウイルスの複製能力を、上述の７個のセグメントのウイルスと比較した。ＦＬＡＧ配列特異的プローブで標識したプラークのパーセンテージは、徐々に増加し（図７Ｂ）、プラークの８０％近くが、５回の継代でＦＬＡＧ配列陽性になった（図７Ａ）。継代の間、短縮型ＮＡタンパク質を発現するプラークの復帰突然変異体は存在しないことが、抗ＦＬＡＧ抗体による染色がなかったことから実証された。従って、ウイルスＲＮＡそれ自体が、効率的なウイルス複製において重要な役割を果たすように見えるが、混合感染において、ＮＡＦＬＡＧＭ（−）が優勢になる速度が、ＮＡＦＬＡＧＷＴウイルスの場合よりも遅かったため、短縮型ＮＡタンパク質もまた、効率的なウイルス複製において役割を果たし得る。
【０１００】
（ウイルスＮＡ  ＲＮＡのパッケージングシグナルは、コード配列内に及ぶ）
ＣＫ２−２９およびＥ１７Ｅウイルスの長い継代の後であってさえ（Ｈｕｇｈｅｓら，２０００）、短縮型ＮＡ遺伝子は維持された。これは、ビリオン内へのｖＲＮＡ組み込みのためのシグナル（すなわち、パッケージングシグナル）が、ＮＡ  ＲＮＡセグメントのコード領域内に存在することを示唆する。この仮説を試験するため、ｅＧＦＰコード配列を、短縮型ＮＡ遺伝子のインフレーム内の、ＮＡ配列が欠失した場所に挿入した。従って、ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）と名付けたこの組換え遺伝子は、ＮＡ  ｖＲＮＡの３’非コード末端と、ＮＡコード領域のＮ末端領域の６１組のコドンと、ｅＧＦＰコード領域と、ＮＡ  ｖＲＮＡの５’末端の１８５個のヌクレオチドを保有する。ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）遺伝子を、対応する野生型ＮＡ遺伝子の代わりに保有するウイルスを、調製し、そしてプラークアッセイを行った（図８Ａ）。プラークの９０％以上が、ｅＧＦＰを発現していた。これは、ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）遺伝子が、ビリオンに組み込まれ、そしてウイルス複製の間維持されたことを示す（図８Ｂ）。この発見は、ＮＳ非コード配列に隣接するＣＡＴ配列が、５継代より多くは維持されなかったことを考えると、興味深い（Ｌｕｙｔｊｅｓら，１９８９）。
【０１０１】
ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（１５７）とＣＡＴ構築物との間の違いは、ウイルスコード配列の存在であるので、３’ＮＡ非コード領域および５’ＮＡ非コード領域に隣接するｅＧＦＰコード配列を含むＣＡＴ構築物に類似の遺伝子（ＮＡ（０）ＧＦＰ（０））を産生した。この構築物は、ＮＡコード配列を欠く。この遺伝子によって産生されるウイルスはプラークを産生するが、プラークのわずかな割合（０．１％）だけしか、１つまたは２つのｅＧＦＰ発現細胞を有さなかった。このことは、ＮＡ（０）ＧＦＰ（０）遺伝子が、ウイルス複製の間、ウイルス内に維持されないことを示す。ウイルス産生のために１つの発現ＮＡ（０）ＧＦＰ（０）遺伝子を含むプラスミドにトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において、ｅＧＦＰは、ＮＡ（６１）ＧＦＰを発現するプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と比較して、より低い程度で発現した。ＮＡ（０）ＧＦＰ（０）のＰｏｌＩプラスミドは、１０倍に増え、ＮＡ（６１）ＧＦＰのＰｏｌＩプラスミドでトランスフェクトされた細胞と類似の数の、ｅＧＦＰ発現２９３Ｔ細胞を生じた。１０倍多い量のこの遺伝子のＰｏｌＩプラスミドによってさえ、ｅＧＦＰ陽性細胞に含まれるＮＡ（０）ＧＦＰ（０）ウイルスによるたった１％のプラークしか産生されず、これらのプラークにおけるたった数個の細胞だけしか、ｅＧＦＰを発現しなかった。これらの結果は、ウイルスＮＡ  ＲＮＡのパッケージングシグナルは、ＮＡコード配列の中に及ぶことを示した。
【０１０２】
（効率的なビリオン産生における、ＲＮＡセグメントの役割）
何故、８個のＲＮＡセグメントを有するウイルスが、７個のＲＮＡセグメントを有するウイルスよりよく増殖するのかを理解するため、感染性ビリオン産生を、６個、７個、または８個のウイルスＲＮＡセグメントを保有するウイルスの間で比較した（図９）。８個のセグメントのウイルスを産生するため、２９３Ｔ細胞を、正常なウイルス産生のための９個の構造タンパク質全てと８個のＰｏｌＩプラスミドとについてのタンパク質発現プラスミドでトランスフェクトした。また、ＮＳ２産生を消失させる２つの変異を有するＮＳ
ＰｏｌＩプラスミドを、使用した；従って、２９３Ｔ細胞から産生したウイルスは、複製の多重サイクルを受けない。さらに、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の産生をそれぞれ消失させる変異を有するＨＡ  ＰｏｌＩプラスミドおよびＮＡ  ＰｏｌＩプラスミドを、使用した。これにより、遺伝子セグメントの消失の効果が、ＲＮＡセグメントだけに制限され、遺伝子産物に波及しない。７個のセグメントのウイルスの産生のためには、ＮＡ遺伝子のＰｏｌＩプラスミドを除去し、一方、ＮＡタンパク質の発現のためのプラスミドを含めた。６個のセグメントを有するウイルスを調整するために、ＨＡ  ＲＮＡおよびＮＡ  ＲＮＡのプラスミドを省き、一方、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現のためのプラスミドを含めた。
【０１０３】
これらのウイルスの間のビリオン産生を比較するため、プラスミドでトランスフェクトした細胞から産生した感染性ビリオンの数を、これらのウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞および感染４８時間後に抗ＷＳＮ抗体で免疫染色した感染細胞によって、滴定した。図９に示すように、感染性ビリオンの効率の産生は、ウイルスＲＮＡセグメントの数と相関していた；ウイルスＲＮＡセグメントの数がより多いと、ビリオン産生がより多い。これらの結果は、効率的なビリオン産生におけるウイルスＲＮＡセグメントの役割を示す。
【０１０４】
（ＮＡ  ｖＲＮＡの３’末端は、ビリオンへのそのパッケージングのために重要である）
ＮＡ  ｖＲＮＡにおけるパッケージングシグナルに絞るため、３’コード領域または５’コード領域（ｖＲＮＡセンス）におけるさらなる欠失を含む、短縮型ＮＡ遺伝子を有するウイルスを、調製した（図８Ａ）。ＮＡ−（１８３）ＧＦＰ（０）ウイルス（ＮＡコード領域の５’末端を欠く）によって産生されるプラークのおよそ４０％が、ｅＧＦＰを発現した。一方、ＮＡ０Ｇ１８５ウイルス（ＮＡコード領域の３’末端を欠く）によって産生されるプラークの１．８％しか、ｅＧＦＰを発現しなかった。これらのデータは、ＮＡ
ｖＲＮＡコード領域の３’末端が、ビリオンパッケージングのために重要であることを示す（図８）。
【０１０５】
（考察）
欠失構築物の作製により、ビリオンへのＮＡセグメントの組み込みをもたらすＮＡコード領域を、決定した。コード領域の両端が重要であることが見出されたが、ＮＡコード配列の５’末端に対応するｖＲＮＡの３’末端は、他の端より重要であった。ＮＳセグメントについては、ＮＳコード配列の５’末端に対応するｖＲＮＡの３’末端は、他の端よりも、組み込みのために重要だと考えられる（図２２）。対照的に、ＨＡセグメント、Ｍセグメント、およびＮＰセグメントは、両端が重要であり、そしてＰＢ２については、ＰＢ２コード配列の３’末端に対応するｖＲＮＡの５’末端が、重要である。これらの結果は、ｖＲＮＡセグメント組み込みについて重要な配列が、コード領域内に配置され、従って、それぞれのセグメントに独特であることを示す。おそらく、これらの領域が、他のウイルスＲＮＡと、塩基対形成によって相互作用し、８個のｖＲＮＡセグメントのセットのビリオン内への補充を導く。ｖＲＮＡとウイルス成分との間のこの相互作用は、ウイルス特異的であり、この相互作用は、抗ウイルス化合物の開発の標的になり得る。
【０１０６】
（実施例３）
ウイルス内容物の正しい画像を得るため、電子顕微鏡断層撮影法を行った（図１１Ａ）。５０ｎｍの厚みのビリオンの画像を集めた。次いで、ビリオンの１つの分析を行い、ビリオン内容物の３Ｄ画像を再構築した。粒子内の構造（ロッド（ｒｏｄ））を、それぞれの構造を見分けるために色で示す（図１１Ｂ〜図１１Ｆ、上、横および下からの像を示す）。ロッドの像のほとんどは切断されているが、ロッドが中央に沿って切断される１つの像については、分子全体を示す。
【０１０７】
上に要約された結果（それぞれのウイルスセグメントが、独自の配列を含み、その独自の配列はビリオンへの組み込みのために重要であり、かつ、おそらくはウイルスの内容物の独自の形態学的特徴の形成に寄与するであろうことを、支持するデータを含め）に基づき、ｖＲＮＡセグメントは、インフルエンザビリオン内に、おそらく選択的に組み込まれる。この情報は、抗ウイルス化合物の開発のための標的を同定するためだけでなく、ウイルス特異的相互作用の破壊（ウイルス複製を阻害し、弱毒化を導き得る）による弱毒化生ワクチンの調製のためにもまた、有用である。
【０１０８】
（実施例４）
（材料および方法）
（細胞）
２９３Ｔヒト腎性幹細胞およびＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含有するダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ｍａｄｉｎ−Ｄｅｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、５％新生仔ウシ血清および抗生物質を含有するＭＥＭ中で培養した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２中で維持した。
【０１０９】
（プラスミドの構築）  ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩのターミネーターに隣接される、野生型Ａ／ＷＳＮ／３３のＨＡ遺伝子（Ｈ１Ｎ１）を含むウイルス（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡと名付けられる）および野生型Ｂ／Ｌｅｅ／４０を含むウイルス（ｐＰｏｌＩ−Ｂ−ＨＡと名付けられる）の、ウイルスＲＮＡ産生のためのプラスミド構築物（ｐＰｏｌＩと呼ぶ）の産生が、Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載された。一連のＡ／ＢキメラＨＡｐＰｏｌＩ構築物を、プライマーおよびＰｒｏｏｆＳｔａｒｔポリメラーゼ（ＱｉＡＧＥＮ）を用いたＰＣＲ増幅、およびその後の、野生型ＨＡ構築物を用いたライゲーションによって産生した（図１３）。全ての構築物を配列決定し、所望でない変異が含まれないことを確認した。
【０１１０】
（細胞培養中に発現されるＨＡの生物学的アッセイ）
各Ａ／ＢキメラＨＡｐＰｏｌＩ構築物（１μｇ）を、Ｔｒａｎｓ  ＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）試薬を、他の４つのｐＣＡＧＧＳベースのプラスミド（３つのポリメラーゼサブユニット（ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２）ならびにＡ／ＷＳＮウイルス（Ｎｅｕｍａｎｎら，１９９１）の核タンパク質（ＮＰ）を発現する）（各１μｇ）と共に使用して、ＣＯＳ−７細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）およびＴＰＣＫ−トリプシン（２．５μｇ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間処理した。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして抗Ｂ／ＨＡ抗体および市販のＡＢＣ検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて免疫染色した。また、赤血球吸着アッセイを行い、各ＨＡのレセプター結合特性を評価した。簡潔に言うと、トランスフェクトされた細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ニワトリ赤血球細胞懸濁液の中で、室温で３０分間インキュベートし、次いで、観察の前に５回洗浄した。さらに、融合アッセイを行った。簡潔に言うと、トランスフェクトした細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で、３７℃で５分間インキュベートし、その後、培養液中で７時間インキュベーションした。冷メタノールで固定した後、融合細胞を、上述のように免疫染色した。
【０１１１】
（逆遺伝学）
ウイルスを、Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載されるように、プラスミドベースのＡ／ＷＳＮ逆遺伝学系またはプラスミドベースのＢ／Ｌｅｅ逆遺伝学系を使用して、産生した。プラスミドから産生した野生型遺伝子型を有するウイルスを、それぞれ、Ａ／ＷＳＮ−ＲまたはＢ／Ｌｅｅ−Ｒと名付け、比較のためのコントロールとして用いた。Ａ／Ｂキメラウイルスを産生するため、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡの代わりに、キメラＨＡ  ＰｏｌＩ構築物を使用した。２９３Ｔ細胞から産生されたウイルスを、限界希釈により、生物学的に１回クローン化し、ＭＤＣＫ細胞内に、ストックウイルスを産生した。
【０１１２】
（実験的感染）
ウイルス病原性を試験するため、セボフルランで麻酔した４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ／Ｂキメラウイルスまたは野生型ウイルス（１０５ＴＣＩＤ５０／５０μ１）で鼻腔内感染させた。死亡率および体重を、感染後１４日間モニターした。感染３日後、幾匹かの感染マウスを、器官におけるウイルス力価を決定するため、安楽死させた。
【０１１３】
各キメラウイルスの、野生型誘発に対するワクチンの有効性を評価するため、マウスを、キメラウイルスまたは野生型ウイルス（１０３ＴＣＩＤ５０／５０μｌ）で、鼻腔内感染させた。３週間後、マウスの一群を安楽死させて血清を得、そしてウイルス特異的ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ抗体を検出するため、気管−鼻腔洗浄した。感染４週間後、残ったマウスを、５０ＬＤ５０の野生型ウイルス（Ｂ／Ｌｅｅ−Ｒ）で、麻酔下で鼻腔内誘発し、１４日間、死亡率および体重をモニターした。
【０１１４】
（ウイルス特異的抗体の検出）  血清および気管−鼻腔洗浄サンプルを、ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ抗体について、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、Ｋｉｄａら（１９８２）に記載のように試験した。ＨＩ抗体もまた、レセプター破壊酵素（ＲＤＥＩＩ：Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ）による処理の後、血清サンプルを使用して試験した。
【０１１５】
（結果）
（Ａ／ＢキメラＨＡ遺伝子の構築）
Ｂ型ＨＡのＡ型ウイルス成分との適合性を決定するため、Ａ／ＷＳＮ遺伝子とＢ／Ｌｅｅ  ＨＡ遺伝子との間に、一連のキメラ遺伝子を構築した（図１４）。ＲＮＡセグメントの両端における非コード配列は、おそらく、ＲＮＡ転写および複製のために、Ａ型ウイルスとＢ型ウイルスとの間で相互転換可能である（Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ−Ｃｈａｉｇｎｅら，１９９９；Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒら，１９８０；Ｍｕｓｔｅｒら，１９８１）ので、Ａ型ウイルスの非コード配列およびＢ型ウイルス由来のコード配列全体を含むキメラＨＡ遺伝子を、調製した（図１４Ａ、ＡＮＢＨ）。この構築物は、インタクトなＢ型ＨＡタンパク質を産生する。次に、Ｂ型ＨＡコード配列のシグナル配列および非コード配列がＡ型ウイルスのそれと変換されたキメラ遺伝子（ＡＮＳＢＨ）を、調製した。この構築物はまた、細胞性シグナルペプチダーゼによるＡ型シグナルペプチドの除去後、インタクトなＢ型ＨＡも産生する。同様に、キメラ遺伝子もまた、調製され、ここで、ＨＡの膜貫通領域および細胞質領域コードする配列が、Ｂ型からＡ型に変換され（ＡＮＴＢＨ）、従って、Ａ／ＢキメラＨＡタンパク質をコードする。シグナルおよび膜貫通／細胞質領域の両方をコードする配列をＢ型からＡ型に変えた別のキメラ遺伝子（ＡＮＳＴＢＨ）を、調製した。この構築物は、ＡＮＴＢＨのキメラＨＡタンパク質のシグナルペプチド除去後と同じキメラＨＡタンパク質を生成する。さらに、キメラを、全てのＢ型由来の切断部位に相当する領域の上流の配列および全てのＨＡコード配列（ＡＮＢＷ）におけるＡウイルス由来の下流領域の配列を含むように調製した。この構築物は、Ｂ型ウイルスのＨＡ１領域およびＡ型ウイルスのＨＡ２領域を含む、キメラＨＡタンパク質を生成する。最後に、ＡＮＢＷ構築物の範囲内で、シグナル配列がＢ型からＡ型に変え、ＡＮＢＷが生じるものと同じＨＡタンパク質を生じるキメラ遺伝子を、調製した。
【０１１６】
（細胞培養中に発現されるＡ／ＢキメラＨＡの生物学的特性）
キメラＨＡの機能を評価するため、各ｐＰｏｌＩ  ＨＡ構築物を、ＰＡ発現プラスミド、ＰＢ１発現プラスミド、ＰＢ２発現プラスミド、およびＮＰ発現プラスミドと共に、Ａ型ウイルスのＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。キメラＨＡ構築物の全ては、細胞表面上で発現した。これらのＨＡのレセプター結合活性を試験するため、血球吸着アッセイを、行った。トランスフェクトさせた細胞を、このアッセイの前に細菌性シアリダーゼで処理し、そのレセプター結合活性を妨害するＨＡ多糖類の側鎖における末端のシアル酸を除去した（Ｌｕｏら，１９９９）。ＡＮＢＨ発現細胞、ＡＮＳＢＨ発現細胞、ＡＮＴＢＨ発現細胞、およびＡＮＳＴＢＨ発現細胞は血球吸着したが、他の２つの発現細胞（ＡＮＢＷ発現細胞およびＡＮＳＢＷ発現細胞）は、血球吸着しなかった（表３）。同様に、前者のＨＡは細胞融合を誘導したが、後者はしなかった。これらの結果は、前者のＨＡキメラは生物学的に機能的であり、一方、後者はそうではないことを示した（おそらく、構造的変異のため）。先行の報告から予測されるように、機能性Ｂ型ＨＡは、インタクトな野生型Ｂ型ＨＡセグメントから、Ａ型ポリメラーゼ複合体およびＮＰによって生成され（表３）、Ｂ型プロモーター構造とＡ型ポリメラーゼ複合体との間の適合性を確認した。
【０１１７】
【表３】
2010042023.tif 000004
（キメラＨＡを有するウイルスの産生）
インフルエンザＡウイルス感染の間、キメラＨＡ遺伝子が機能するか否かを決定するため、ＨＡ遺伝子をＡ／Ｂ  ＨＡキメラ遺伝子に置換した変異体ＷＳＮウイルスを、調製した。プラスミドベースの逆遺伝学は、約ｌ０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有する野生型ウイルス（表３）を産生させた。ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡの代わりにｐＰｏｌＩ−Ｂ−ＨＡを使用した場合、感染性のウイルスは産生されなかった。生物学的に機能する４つのキメラＨＡ構築物（表３）を、プラスミドトランスフェクト細胞の上清におけるウイルス力価から判断して異なった効率を有するにもかかわらず、感染性Ａ型ウイルス中で首尾よくレスキューした。ＡＮＢＨ  ＨＡを保有するウイルスは、わずかしか複製されず、一方、ＡＮＳＴＢＨ  ＨＡを有するウイルスは、最高の効率で産生され、そして１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ近くまで増殖した。生物学的に機能するタンパク質を発現しない他のキメラ分子は、ウイルス産生を支持しなかった。Ａ／Ｂキメラウイルスを、ＡＮＢＨウイルス、ＡＮＳＢＨウイルス、ＡＮＴＢＨウイルス、およびＡＮＳＴＢＨウイルスと命名した。
【０１１８】
産生するウイルスが、実際にＢ型ＨＡ外部ドメインを含むことを確かめるため、ＭＤＣＫ細胞を、これらのウイルスで感染させ、Ａ型ウイルスまたはＢ型ウイルスのＨＡに対する、抗体によるその反応性について、試験した（図１４）。キメラＨＡ構築物を含むウイルスで感染させた細胞は、抗Ｂ／ＨＡ抗体および抗Ａ／ＮＰ抗体に反応したが、抗Ａ／ＨＡ抗体には反応せず、これらのウイルスがＢ型ＨＡ外部ドメインを含むことを確認した。
【０１１９】
（細胞培養中のＡ／Ｂキメラウイルスの増殖特性）
Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスの複製特性を決定するため、細胞を、０．０１のＭＯＩでウイルスに感染させ、そして生じたウイルスを、その増殖動態学について試験した（図１５）。キメラＨＡを有するウイルスで、野生型Ａウイルスよりよく増殖したウイルスはなかったが、ＡＮＳＴＢＨウイルスおよびＡＮＴＢＨウイルスは、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ近くまで増殖した。Ａ型およびＢ型の両ウイルスと違い、これらのキメラウイルスの全ては、免疫染色でのみ検出し得る正確なプラークを形成した（データは示さない）。
【０１２０】
（マウスにおけるＡ／Ｂキメラウイルス）
細胞培養中のＡ／Ｂキメラウイルスの制限された複製は、これらのウイルスが、インビボで弱毒化されたことを示唆する。従って、マウスを、Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルス（ｌ０５ＴＣＩＤ５０／５０μ１）で鼻腔内接種した。ストックの力価が低すぎた（約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）ので、ＡＮＢＨウイルスは試験しなかった。試験した他の３つのキメラウイルスのどれも、マウスに致死性ではなかった。他方、同用量の野生型Ａウイルスは、全ての感染マウスを殺傷し、同用量の野生型Ｂウイルスは、８匹の感染マウスのうち７匹を殺傷した（表４）。キメラウイルスを、接種３日後に、肺および鼻甲介から回収し、これらのウイルスがマウス内で複製されたことを示した。興味深いことに、キメラウイルスの複製は、肺において野生型ウイルスと比較してより強く制限され、そして鼻甲介において野生型ウイルスと比較してより弱く制限される。このことは、肺におけるウイルス複製レベルと致死性との間の関連性を示唆する。ＡＮＴＢＨキメラウイルスおよびＡＮＳＴＢＨキメラウイルスで感染させたマウスは、野生型Ａウイルスで感染させたマウスと比較して低い程度ではあるが、体重を減少した。合わせて、これらのデータは、Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスは、マウスにおいて弱毒化されることを示す。
【０１２１】
【表４】
2010042023.tif 000005
（Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスで免疫化されたマウスの野生型ウイルス感染に対する防御）
Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスが、Ｂ型ウイルス由来のＨＡ外部ドメインを発現するため、これらのウイルスは、野生型Ｂウイルス感染に対し、感染防御免疫応答を提供することが予測される。誘発実験の前に、抗Ｂ抗体が、キメラウイルスの感染後に、マウスにおいて誘発されるか否かを決定した。接種３週間後、キメラウイルスで感染させたマウス由来の鼻腔／気管洗浄サンプル中のＢ型ウイルス特異的ＩｇＡ抗体および血清サンプル中のＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡ試験によって検出した（図１６Ａ）。ＨＩ抗体もまた、Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルス感染マウス由来の血清サンプル中で検出した（図１６Ｂ）。従って、特定の抗体応答を、キメラウイルスで感染した全てのマウスにおいて実証した（ＡＮＳＢＨウイルスは、より低い免疫応答しか誘発しなかった）。
【０１２２】
キメラウイルス免疫化マウスを、免疫化４週間後、５０ＬＤ５０の野生型Ｂウイルスで誘発した（表５）。誘発後、全てのマウスが生存していたが、他方、野生型Ｂウイルスで誘発した際、コントロール偽免疫マウスの全ては死に、そして亜致死用量（１０３ＴＣＩＤ５０）のＷＳＮウイルスで免疫化した８匹のマウスのうち２匹だけが生き残った。このことは、野生型Ｂウイルス感染に対する、キメラウイルス免疫化の特別な防御効果を示す。さらに、Ｂ型ウイルスは、誘発３日後にキメラウイルスで事前免疫化したマウスの鼻甲介または肺から回収されなかった（ＡＮＳＢＨウイルスを受けたマウスを除く（データは示さない））。
【０１２３】
【表５】
2010042023.tif 000006
（考察）
本明細書中で記載されるように、第１回目について、Ａ型ウイルスの背景の中にＡ型ＨＡの代わりにＢ型ＨＡを有するインフルエンザウイルス（従って、Ａ型ウイルスタンパク質およびＢ型ウイルスタンパク質の両方を有する）を、産生した。何がＡ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスの産生のために不可欠であるか？このキメラ遺伝子は、ビリオンを維持するように転写され、かつ複製されなければならない。同じウイルス型で保存されているが、ＲＮＡ転写およびＲＮＡ複製において必要とされるプロモーター配列を含む非コード領域の両端における末端配列（Ｌｕｙｔｊｅｓら，１９８９）が、Ａ型ＲＮＡセグメントとＢ型ＲＮＡセグメントとの間で異なっている（Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ−Ｃｈａｉｇｎｅら，１９９９；Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒら，１９８０）。しかし、先行研究は、Ｂ型ウイルスＮＳセグメントの非コード配列に隣接されるレポーター遺伝子が、Ａ型ポリメラーゼによって転写され、そして複製されたことを示している（Ｍｕｓｔｅｒら，１９９１）。さらに、Ａ型ウイルスＮＡのコード配列およびＢ型ウイルスＮＳの非コード配列を含むキメラ遺伝子を含むキメラＡ／Ｂインフルエンザウイルスを、産生した（Ｍｕｓｔｅｒら，１９９１）。これらのデータは、Ａ型ポリメラーゼ複合体が、Ａ型ウイルス遺伝子のプロモーターより低い相同性であるにもかかわらず、Ｂ型ＮＳ遺伝子のプロモーター配列を認識したことを示した。
【０１２４】
各ＲＮＡセグメントの非コード配列は、以下の２つの構造的領域を含む：全ての８個のＲＮＡセグメントで保存されている末端配列および内部セグメント特異的配列。プロモーター活性は、主に前者の領域によって決定される（Ｐｏｒｔｅｌａら，１９９９）が、全てのＢ型セグメントは、Ａ型ポリメラーゼ複合体によって転写されやすく、複製されやすい。実際、この概念は、Ｂ型ＨＡが、ｐＰｏｌＩ−Ｂ−ＨＡを含むＢ型非コード領域とＡ型ポリメラーゼ複合体発現プラスミドおよびＮＰ発現プラスミドとで同時トランスフェクションされた細胞において発現されることを示すデータによって、支持される（表３）。従って、インタクトなＢ型ＨＡセグメントを含むウイルスを産生できないこと（すなわち、ＨＡ型間の類別）は、ＲＮＡ転写およびＲＮＡ複製の欠如によって説明できない。
【０１２５】
キメラウイルスの産生の制限は、ＲＮＡセグメントのビリオンへの取り込みのレベルに由来し得る；ウイルス産生のために、キメラセグメントは、ビリオン内にパッケージされなければならない。Ａ型ＮＳセグメントの非コード領域は、ＲＮＡパッケージングシグナルを含むことが報告されているが（Ｌｕｙｔｊｅｓら，１９８９）、インフルエンザウイルスＲＮＡセグメントのパッケージングメカニズムは、完全に明らかにされていない。ビリオン取り込みに必要であるＲＮＡセグメントの配列または構造的特徴は、ほとんど未知である；しかし、近年、Ａ型ＮＡ  ＲＮＡセグメントは、そのビリオン取り込みシグナルをコード領域の両端に保有することが示された（Ｆｕｊｉｉら，２００２および実施例２）。この研究において、ＡＮＳＢＨウイルスは、ＡＮＢＨより効率的に複製される（図１４および表３）。これらの２つのウイルスにおいて発現されるＨＡタンパク質は相同であるべきであるので、複製効率における違いは、ＲＮＡパッケージング効率からもたらされ得る。すなわち、効率的なＲＮＡパッケージングに必要な構造的特徴は、ＨＡのシグナル配列をコードする領域に存在し得る。同様に、ＡＮＴＢＨウイルスとＡＮＳＴＢＨウイルス（これらもまた同一なＨＡタンパク質を発現する）との間の複製効率の相違もまた、説明され得る。実際、Ａ型ＨＡセグメントのパッケージングシグナルは、コード領域の両端に位置する（非公開データ）。興味深いことに、Ａ型ウイルスＮＡの非コード配列およびＢ型ＮＡのコード配列を含むキメラＮＡ遺伝子は、Ａ型ウイルスにおいてレスキューされなかった（Ｇｈａｔｅら，１９９９）。この不全は、ＲＮＡパッケージングシグナルを含むＡ型ＮＡコード領域の欠損によって説明され得、上述の近年の知見と一致する（Ｆｕｊｉｉら，２００２）。
【０１２６】
Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスの産生についてのタンパク質レベルでの重要な相互作用もまた、存在する；キメラタンパク質は、ビリオン内にパッケージングされるべきであり、そしてウイルス複製のために機能的であるべきである。トランスで供給されるＢ型ＮＡタンパク質は、Ａ型ＮＡの機能に取って代わり得、そしてＡ型ビリオン内に取り込まれ得て、細胞培養物におけるＮＡ欠損Ａ型ウイルスの多周期の複製を支持する（Ｇｈａｔｅら，１９９９）。しかし、上で議論したように、Ｂ型ＮＡを含むＡ型ウイルスは、産生されなかった。キメラＡ／Ｂ  ＨＡウイルスは産生されたが、これらは、野生型ウイルスと比較して弱毒化された。この弱毒化は、Ｂ型ＨＡのレセプター結合活性とＡ型ＮＡのシアリダーゼ活性との間の最適以下のバランスに由来し得る。さらに、ＨＡにおけるシグナルペプチドおよび／または膜貫通／細胞質ドメインの置換は、その構造を改変していてもよい。例えば、ＨＡにおける膜貫通／細胞質ドメインは、効率的なビリオンアセンブリを導く他のウイルス成分（Ｍ１など）と相互作用し得る（Ａｌｉら，２０００；Ｃｅｎａｍｉら，１９９６；Ｊｉｎら，１９９７；Ｚｈａｎｇら，２０００）。従って、インタクトなＢ型ＲＮＡを保有するＡ型ウイルスの産生不能またはその逆は、ＲＮＡセグメント取り込みのレベルの制限、またはタンパク質の機能的な相互作用レベルの制限、あるいはこれら両方によって、説明され得る。
【０１２７】
Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスは、マウスにおいて、肺において複製を制限されることで弱毒化され、そしてマウスに、野生型Ｂウイルス感染に対する感染防御免疫を与える。このことは、インフルエンザワクチン開発についての新規のアプローチを示唆する。現在のところ、二価の不活性化インフルエンザワクチンの皮下投与は、世界標準であり、なおその効率は、最適以下である。このことは、主に、上気道（インフルエンザウイルスが最初に進入する）における粘膜免疫の不満足な誘導に起因する（Ｗａｖｅｎｉｎｇら，２００１）。従って、これらのワクチンは、ウイルス感染を阻害しないが、これらは質病の重篤さを低減する。これらの不活性化ワクチンと違い、生ワクチンは、粘膜免疫応答および細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答の両方を誘導する。本明細書中で記載される研究は、ＨＡ遺伝子のキメラ操作が、種々の程度のウイルス弱毒化を制御し得ることを示唆する。従って、このアプローチは、弱毒化と免疫原性との間の適切なバランスを有する生ワクチン系統の産生を許容する。あるいは、Ａ／ＢキメラＨＡは、感冒適応インフルエンザＡウイルス内に取り込まれ得、この感冒適応インフルエンザＡウイルスの弱毒化変異は、よく特徴付けられる（Ｍａａｓｓａｂら，１９９９）。現存する感冒適応ワクチンは、Ａ型ウイルスとＢ型ウイルスの混合物である。潜在的に、２つのウイルス間の干渉は、ワクチン効率に影響するが、この問題は、ウイルス用量の割合の適正化によって取り組まれている。Ａ／ＢキメラＨＡを有するＡ型ウイルスは、２つの弱毒化ウイルスよりむしろ１つの弱毒化ウイルスに基づいて、生インフルエンザワクチン産生を許容し、Ａ型ウイルスとＢ型ウイルスとの間の干渉の可能性を除去する。
【０１２８】
従って、Ａ型ウイルスとＢ型ウイルスとの混合を有する弱毒化生ワクチン（Ｂ型ワクチン系統についての弱毒化変異における限られた情報しか有さない）と対照的に、Ａ型ウイルスの背景にＢ型ＨＡおよびＢ型ＮＡを含むウイルスが、産生され得る。このアプローチは、Ａ型およびＢ型のＨＡおよびＮＡの発現について明確な弱毒化変異を有するマスターワクチン系統に基づき、ワクチン産生を許容する。さらに、ウイルスセグメントのパッケージングシグナルの知見もまた、改善型生弱毒化インフルエンザワクチンの開発を、促進する。
【０１２９】
（実施例５）
（材料および方法）
（細胞およびウイルス）
２９３Ｔヒト腎臓幹細胞（サルウイルス４０Ｔ抗原の遺伝子が挿入された２９３株の誘導体）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地内で維持した。ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、およびＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞について、５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ、ならびに１０％および５％の新生仔ウシ血清を含有するＭＥＭを、それぞれ使用した。全ての細胞を、５％ＣＯ２中で３７℃で維持した。Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＷＳＮ）ウイルスを、Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載されるように、逆遺伝学によって産生し、そしてＭＤＣＫ細胞内で増殖させた。逆遺伝学によって産生したＶＳＶインディアナ（Ｉｎｄｉａｎａ）株を、ＢＨＫ細胞内で増殖させた。
【０１３０】
（逆遺伝学）
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）および変異体インフルエンザＡウイルスの産生のために、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの制御下（ＰｏｌＩプラスミドと呼ぶ）のＷＳＮウイルス遺伝子のｃＤＮＡを有するプラスミド、および真核生物タンパク質発現ベクターｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ（ニワトリβ−アクチンプロモーターによって制御される）を、使用した。簡潔には、ＰｏｌＩプラスミドおよびタンパク質発現プラスミドを、トランスフェクション薬剤と混合した。Ｔｒａｎｓ  ＩＴ  ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、１５分間室温でインキュベートし、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中で培養した１×１０６の２９３Ｔ細胞に加えた。６時間後、ＤＮＡトランスフェクション薬剤混合物を、０．３％ＢＳＡおよび０．０１％ＦＣＳ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉと置換した。４８時間後、上清中のＶＬＰまたは変異体インフルエンザＡウイルスを、回収した。この研究において産生されたトランスフェクト体は、全て、変異体ＨＡ  ｖＲＮＡセグメントを、ＷＳＮウイルスの他のｖＲＮＡセグメントと共に含み、そして変異体ＨＡ  ｖＲＮＡセグメントの名で命名される（例えば、ＨＡ（０）ＧＦＰ（０）ＲＮＡセグメントを含むＶＬＰは、ＨＡ（０）ＧＦＰ（０）ＶＬＰと名付けられる）。
【０１３１】
（プラスミドの構築）
ＨＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域、増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の相補的コード配列、およびＨＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含むネガティブ−センスＲＮＡを産生するために、ｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＧＦＰ（０）を使用した。簡潔には、ＧＦＰ遺伝子を、ＢｓｍＢＩ部位およびＨＡの３’非コード配列または５’非コード配列を含むプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ＢｓｍＢＩで切断し、そしてＰｏｌＩプラスミドのＢｓｍＢＩ部位内にクローン化した。このプラスミドの細胞への導入は、ＧＦＰコード配列をネガティブ−センス方向でＨＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域および３’非コード領域に隣接して含むＲＮＡを生じる。
【０１３２】
ｐＰｏｌＩＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）を、以下のように作製した：ＷＳＮ  ｖＲＮＡの産生のためのｐＰｏｌＩＨＡを、背中合わせのプライマーであるＢａｍ５００Ｒ（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＴＧＡＴＡＣ−３’；配列番号６）およびＸｂａ１２１８Ｆ（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＴＧ−３’；  配列番号７）を用いた逆ＰＣＲによってまず増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、次いで、ＧＦＰ遺伝子を、ＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位内にクローン化した。生じたプラスミド、ｐＰｏｌＩＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）を、ＨＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域およびＨＡ  ｖＲＮＡの３’コード領域の４６８塩基、ＧＦＰコード配列、ＨＡ  ｖＲＮＡの５’コード領域の５１３塩基、ＨＡｖＲＮＡの５’非コード領域を含む、ネガティブ−センスＲＮＡの産生のために使用した。一連のＨＡ欠損変異体もまた、逆ＰＣＲによって、同じ様式で産生された。この変異体は、ＨＡコード領域に由来するヌクレオチドの数に従って命名した。例えば、ＨＡ（９）ＧＦＰ（８０）ＲＮＡセグメントは、３’ＨＡ非コード領域、ＨＡコード配列（Ｎ末端領域に対応する）由来の９個のヌクレオチド、ＧＦＰオープンリーディングフレーム、ＨＡコード配列由来（Ｃ末端領域に対応する）の８０個のヌクレオチド、および５’ＨＡ非コード配列を含む。全てのプラスミド構築物を配列決定し、ＰＣＲによって望まない変異が挿入されていないことを確かめた。
【０１３３】
ＨＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域、Ｖ  ＳＶＧの相補的コード配列、およびＨＡ  ｖＲＮＡの５’非コード領域を含むネガティブ−センスＲＮＡを産生するために使用したｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＶＳＶＧ（０）を、ＰＣＲによって産生した。簡潔には、ＶＳＶ  Ｇ遺伝子を、テンプレートとしてｐＣＡＧＧＳ−ＶＳＶＧを、ＢｓｍＢＩ部位およびＨＡの３’非コード配列またはＨＡの５’非コード配列を含むプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＢｓｍＢＩで切断し、そしてｐＨＨ２１ベクターのＢｓｍＢＩ部位内にクローン化した。ｐＰｏｌＩＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）を、ＶＳＶ  Ｇのコード配列の、ｐＰｏｌＩＨＡ（９）ＧＦＰ（８０）のＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位へのクローニングによって作製した。ＮＡ  ｖＲＮＡの３’非コード端および６１  Ｎ−末端ＮＡコドンを保有する融合タンパク質をコードする相補配列、ＧＦＰ、２つの連続的停止コドン（ＴＡＡ−ＴＡＧ）、ならびにＮＡ  ｖＲＮＡの５’端の１８５塩基を含むｐＰｏｌＩＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）を、以下のように作製した。ＷＳＮ
ＮＡ遺伝子の２０３〜１１０９（ポジティブセンス）に対応する、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＮＡ中の領域を、まず、逆ＰＣＲによってＢｇｌＩＩと置換した。次いで、ＧＦＰ遺伝子を、このＢＧｌＩＩ部位および１２２６位（野生型ＮＡ遺伝子において）のＳｔｕＩ部位内に、ＮＡタンパク質のインフレームでクローン化した。次いで、ＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）遺伝子を、ＰｏｌＩプラスミドｐＨＨ２１のＢｓｍＢＩ部以内に挿入した。
【０１３４】
ネガティブ−センスＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）ＲＮＡの産生のために使用したｐＰｏｌＩＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）（ＮＡタンパク質の開始コドンを欠く）を、以下のように産生した。ｐＰｏｌＩＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）におけるＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）のＡＴＧ開始コドンおよび別のＡＴＧ（１５番目のコドン）を、インビトロ部位特異的変異誘発によって、ＧＣＧに変異した（ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。生じた構築物ｐＰｏｌＩＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）は、３’ＮＡ非コード領域  （１９ヌクレオチド）、Ｎ−末端ＮＡコード領域に対応する１８３ヌクレオチド、ＧＦＰオープンリーディングフレーム２つの連続した停止コドン（ＴＡＡ−ＴＡＧ）、Ｃ−末端ＮＡコード領域に対応する１５７ヌクレオチド、および５’ＮＡ非コード領域  （２８ヌクレオチド）を含み、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの制御下である。
【０１３５】
（免疫染色アッセイ）
インフルエンザＶＬＰによる感染の１６時間後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして３．７％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で室温で２０分固定し、その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理し、そして加工した。ＶＬＰ産生の効率を試験するため、１０６個の細胞を、プラスミド−トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清０．１ｍｌと共にインキュベートし、そして免疫染色アッセイによって検出したＮＰ陽性細胞の数を、感染１６時間後に記録した。
【０１３６】
（ウエスタンブロッティング）
ＶＬＰまたは変異ウイルスを、４℃で、５０，０００×ｇで１．５時間遠心沈殿した。濃縮したＶＬＰまたは濃縮したウイルスを、溶解緩衝液（０．６Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に懸濁した。溶解緩衝液を、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに置き、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン上にエレクトロトランスファーし、ＰＢＳ中の５％スキムミルクで、４℃で一晩ブロックし、抗ＷＳＮウイルスポリクローナル抗体、抗ＨＡモノクローナル抗体、または抗ＶＳＶＧモノクローナル抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。このメンブレンを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。結合した抗体を、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）およびＫｏｎｉｃａ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｋｏｎｉｃａ）を用いて検出した。
【０１３７】
（ノーザンハイブリダイゼーション）
ＰｏｌＩプラスミドにトランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞中に存在するｖＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後、Ｉｓｏｇｅｎ  ＲＮＡ抽出キット（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。ＲＮＡを、グリオキサール／ＤＭＳＯ／リン酸緩衝液中で、５０℃で１時間グリオキシル化し、１０ｍＭリン酸化緩衝液（ｐＨ  ７．０）中で、１．０％アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。ＲＮＡを、ナイロンメンブレン上にブロットし、そしてＤＩＧオリゴヌクレオチドテーリングキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して標識したＧＦＰ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧ；配列番号８）（１０ｐｍｏｌ）で、３７℃で３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、ＧＦＰプローブを用いて、Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）中で、４２℃で一晩行った。ＲＮＡのバンドを、ＤＩＧ核酸検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、検出した。簡潔には、ハイブリダイズしたメンブレンを、洗浄緩衝液（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．５））で洗浄し、１％ブロッキング試薬で室温で３０分間ブロックし、そしてアルカリホスファターゼと結合する抗ＤＩＧ抗体（１：５０００）と共に、室温で３０分間インキュベートした。次いで、このメンブレンを、洗浄緩衝液で洗浄し、そしてニトロブルーテトラゾリウムクロリド／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）と共に、検出緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ９．５）中で、室温で暗所でインキュベートした。ＲＮＡバンドを、ＤＩＧ核酸検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、検出した。コントロールＲＮＡを、偽トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から抽出した。  
【０１３８】
（トランスフェクトウイルスの複製可能特性）
２４ウェルプレートの２連のウェル中のＢＨＫ、ＣＨＯ、またはＭＤＣＫ細胞を、ウイルスで感染させ、０．０１％ＦＣＳ含有のＭＥＭ培地をかぶせ、そして３７℃でインキュベートした。別々の時期に、上清を、ＭＤＣＫ細胞上のプラークアッセイにおいて、感染性ウイルスについてアッセイした。
【０１３９】
（結果）
（ＨＡ  ｖＲＮＡのコード領域は、ビリオン内へのＨＡセグメントの取り込みに必要である）
ＨＡ  ｖＲＮＡのコード領域が、ＮＡ  ｖＲＮＡに関して、そのビリオン取り込みに必要であるか否かを決定するため、２つのプラスミドを構築した：ＨＡ  ｖＲＮＡの３’非コード領域および５’非コード領域ならびにＧＦＰコード配列しか含まないｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＧＦＰ（０）、およびヌクレオチド５００位〜１２１８位でＨＡ配列が欠失した後でＧＦＰコード配列がＨＡ遺伝子内にインフレームで（ポジティブセンスまたはポジティブ方向で）挿入されるｐＰｏｌＩＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）（図１７）。後者の構築物は、３’ＨＡ非コード領域（３３ヌクレオチド）、Ｎ−末端コード領域に対応する４６８ヌクレオチド、停止コドンを有するＧＦＰオープンリーディングフレーム、Ｃ−末端ＨＡコード領域に対応する５１３ヌクレオチド、および５’ＨＡ非コード領域  （４５ヌクレオチド）を保有する。生じた融合タンパク質は、ＨＡのＮ−末端１５６アミノ酸およびＧＦＰ配列全長を含む。
【０１４０】
ＶＬＰを保有するこれらの変異ＨＡ  ｖＲＮＡを産生するため、２９３Ｔ細胞を、ｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＧＦＰ（０）またはｐＰｏｌＩＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）および残留インフルエンザウイルスＲＮＡセグメントの産生のための７つのＲＮＡ  ＰｏｌＩプラスミドならびに９つのウイルスタンパク質（すなわち、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＳ２）のためのタンパク質発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクト４８時間後、２９３Ｔ細胞培養物の上清中のＶＬＰを回収し、そしてＭＤＣＫ細胞を感染させるために用いた。生じたＶＬＰが変異体ＨＡを有するため、これらは、ＧＦＰおよびＨＡを除く全てのウイルスタンパク質を発現した。結果として、感染性病原ウイルスは、全く産生されなかった（データは示さない）。変異体ＨＡ  ｖＲＮＡのビリオン取り込みの効率を、感染１６時間後に、ＧＦＰ発現細胞数（すなわち、ＧＦＰ遺伝子をコードするセグメントを有するＶＬＰの数）を、ＮＰを発現する細胞数（すなわち、全ての感染ＶＬＰの数）で割ることで、決定した。ｐＰｏｌＩＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清中の全ての感染ＶＬＰの力価（すなわち、ＮＰ陽性細胞の数）は、７．４×１０５感染性ＶＬＰ／ｍｌであり、そしてＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）ＲＮＡを含むＶＬＰの力価（すなわち、ＧＦＰ陽性細胞の数）は、３．２×１０５ＶＬＰ／ｍｌであった。これらの結果は、全ての感染ＶＬＰの４２．８％が、有する変異体ＨＡ  ｖＲＮＡを産生したことを示す（図１８）。対照的に、ＶＬＰの３．９％だけしか、ＨＡ（０）ＧＦＰ（０）ＲＮＡセグメントを保有しなかった（図１８）。これらの結果は、ＨＡ  ｖＲＮＡのコード領域が、ＨＡセグメントのインフルエンザビリオンへの取り込みに必要であることを示唆した。
【０１４１】
（ＨＡ  ｖＲＮＡのコード領域の３’端および５’端の両方が、ＨＡセグメントのビリオン内への取り込みのために重要である）
以前に、ＮＡ  ｖＲＮＡコード領域の３’端が、５’端よりも、ビリオン取り込みにおけるより重要な役割を果たすことを示した。従って、３’端、５’端、または両端のいずれが、ＨＡ  ｖＲＮＡセグメントのビリオン内への取り込みに重要であるかを、決定した。この問題に取り組むために、ＨＡ  ｖＲＮＡコード領域の３’末端を欠失したＨＡ（０）ＧＦＰ（１０１１）遺伝子、およびＨＡ  ｖＲＮＡコード領域の５’末端を欠失したＨＡ（９６６）ＧＦＰ（０）遺伝子を調製し（図１７）、そしてこれらのＨＡ  ｖＲＮＡのビリオン取り込みを、上述のように試験した。プラスミド−トランスフェクト細胞中の両ｖＲＮＡの量は、ＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）  ｖＲＮＡの量に匹敵し得る（データは示さない）が、ＨＡ（０）ＧＦＰ（１０１１）およびＨＡ（９６６）ＧＦＰ（０）の両セグメント取り込み効率は、それぞれわずか６．８％および８．４％であった（図１７）。このことは、ＨＡ  ｖＲＮＡコード領域の３’末端および５’末端が、ＨＡセグメントのビリオン取り込みにおいて、重要な役割を果たすことを示す。
【０１４２】
ＨＡ  ｖＲＮＡのそのビリオン内への取り込みに重要な領域をさらに決定するため、３’コード領域および／または５’コード領域におけるさらなる欠失を有する短縮型ＨＡ  ｖＲＮＡを保有する、一連のＶＬＰを産生した（図１７）。次いで、変異体ＨＡ  ｖＲＮＡのＶＬＰへの取り込み効率を、決定した。３’端にわずか１５ヌクレオチドしか残さず、５’端に２６８ヌクレオチドを残すさらなる欠失は、ＨＡ  ｖＲＮＡ取り込みの効率に影響しなかった（ＨＡ（４６８）ＧＦＰ（５１３）をＨＡ（１５）ＧＦＰ（２６８）と比較した場合）ため、さらなる欠失構築を、ｐＰｏｌＩＨＡ（１５）ＧＦＰ（２６８）（ＨＡコード領域の３’端に１５ヌクレオチドを有し、５’端に２６８ヌクレオチドを有する）を用いて産生した。ｖＲＮＡ取り込みの程度は、欠失の程度が上がるにつれ徐々に下がったが、５’ＨＡコード領域における８０ヌクレオチドは、ＨＡ  ｖＲＮＡの効率的なビリオン取り込みに、（ＨＡ（１５）ＧＦＰ（８０）をＨＡ（１５）ＧＦＰ（７５）と比較して）最も必要でないと考えられた。さらなる欠失分析は、ＨＡ（９）ＧＦＰ（８０）（ＨＡコード領域の３’端に９ヌクレオチド残基を残す）が、ＨＡ  ｖＲＮＡの効率的なビリオン取り込み（６５％以上）をもたらすが、トランスフェクトした細胞中に存在するＨＡ（９）ＧＦＰ（８０）  ｖＲＮＡのレベルは、ＨＡ（０）ＧＦＰ（０）  ｖＲＮＡのレベルとかなり異なっていたことを実証した（図１７および図１８）。これらの結果は、ＨＡコード領域の３’端における９ヌクレオチドおよびＨＡコード領域の５’端における８０ヌクレオチドは、効率的なビリオン内へのＨＡ  ｖＲＮＡ取り込みに必要であることを示す。
【０１４３】
（そのＨＡ端およびＮＡ端が外来遺伝子のコード配列を含む、新規のインフルエンザＡウイルス）
ＨＡセグメントがビリオンに取り込まれるために必要な配列が決定されたため、これらの配列に隣接する外来遺伝子が、インフルエンザＡウイルスに取り込まれ、繰り返し継代の間維持され得るか否かを試験した。外来遺伝子のモデルとしては、ＶＳＶ  Ｇコード配列を、ＧＦＰ配列の代わりに、ｐＰｏｌＩＨＡ（９）ＧＦＰ（８０）のＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位の中に挿入した。生じた構築物を、ｐＰｏｌＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）と名付けた。これは、３’ＨＡ非コード領域（３３ヌクレオチド）、Ｎ−末端ＨＡコード領域に対応する９ヌクレオチド、停止コドンを有するＶＳＶ  Ｇオープンリーディングフレーム（１５５２ヌクレオチド）、Ｃ−末端ＨＡコード領域に対応する８０ヌクレオチド、および５’ＨＡ非コード領域（４５ヌクレオチド）を有した。コントロールとして、１つのベクターを構築した。このベクター、ｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＶＳＶＧ（０）は、３’非コード領域および５’非コード領域だけを保有し、ＨＡ  ｖＲＮＡコード領域を有さない。ＶＳＶ  Ｇタンパク質は、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の両方と置換されるべきであるため、ＮＡコード領域は、外来遺伝子と置換され得る。従って、ＧＦＰコード配列およびＮＡセグメントの効果的なビリオン取り込みに必要なＮＡコード配列を有する組換えＮＡ  ＲＮＡセグメントの産生のために、ｐＰｏｌＩＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）を、構築した。この構築物において、ＮＡオープンリーディングフレームの開始コドンを、ＡＴＧからＧＣＧへの置換によって破壊した。従って、ＧＦＰオープンリーディングフレームは、自身の開始コドンから翻訳される。
【０１４４】
２９３Ｔ細胞を、ＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）セグメントおよびＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）セグメントの両組換え体、および残りの６つのウイルスＲＮＡセグメントの産生のためのプラスミド、ならびにインフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質（ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ２、およびＶＳＶ  Ｇ）の発現のためのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクト７２時間後、２９３Ｔ細胞の上清を回収し、そしてＭＤＣＫ細胞を使用してプラークアッセイを行った。ＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）  ＲＮＡセグメントおよびＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）  ＲＮＡセグメントを有するトランスフェクト体ウイルス（ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスと名付けた）は、生存可能で、そしてトリプシン非存在化でＧＦＰを発現するプラークを産生した（図１９）。免疫染色は、プラークに含まれるＶＳＶ  Ｇは発現するが、ＨＡは発現しないことを確認した（図１９）。ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスで感染させられたがコントロールＷＳＮウイルスでは感染させられていない細胞もまた、ＧＦＰを発現した。対照的に、ｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＶＳＶＧ（０）プラスミドがｐＰｏｌＩＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）の代わりに使用された場合、プラークは観察されなかったが、ＧＦＰおよび／またはＮＰタンパク質を発現する単独の細胞を、ＭＤＣＫ細胞において検出した（データは示さない）。その上、ＶＳＶＧおよびＧＦＰの両方が、５回の連続した継代の後、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスに感染したＭＰＣＫ細胞において発現され続けることを確認した（データは示さない）。５回の継代の後で残っているＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスのＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）  ＲＮＡセグメントのＨＡ領域において、変異は検出されなかった。しかし、３つの変異が見出された。ＶＳＶＧのアミノ酸配列中の５７位においてＩｌｅからＬｅｕへ、９５位においてＧｌｎらＨｉｓへ、そして４９９位においてＧｌｎから停止コドンへ。野生型ＶＳＶ  Ｇタンパク質は、細胞質ドメインの２９残基を有するが、このドメインの最後の１３残基を、４９９位のＧｌｎから停止コドンへの変異のために欠失させた。
【０１４５】
ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスの生物学的特性。ＶＳＶ  Ｇタンパク質が他のインフルエンザウイルスタンパク質から構成されるビリオンに実際に取り込まれるか否かを決定するために、濃縮したＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスおよびＷＳＮウイルス（コントロール）に対してウェスタンブロット分析を行った。図２０に示すように、ＶＳＶ  Ｇタンパク質は、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ビリオン中で検出されたが、ＨＡは検出されず、ＶＳＶ  Ｇタンパク質のビリオンの取り込みを確認した。
【０１４６】
次に、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスの増殖特性を、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＭＤＣＫ細胞において調べた。細胞を０．００１のＭＯＩで感染させ、そして培養上清中のウイルスの収量を、ＭＤＣＫ細胞に対するプラークアッセイによって、３７℃での感染後の種々の時点で決定した。ＷＳＮウイルスの力価よりも低いとはいえ、ＢＨＫ細胞およびＭＤＣＫ細胞の両方におけるＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスの最大力価は、１ｍｌあたり少なくとも１０６ＰＦＵに達した（図２１）。ＣＨＯ細胞におけるＷＳＮウイルスの乏しい増殖とは対照的に、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスは、これらの細胞においても、試験した他の２つの細胞株と同様に増殖した（図２１）。さらに、細胞株の各々における複製の間に、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスに感染した細胞は、ＧＦＰを発現した。
【０１４７】
これらの結果は、ＨＡ（９）ＶＳＶＧ（８０）セグメントおよびＮＡ（１８３）ＧＦＰ（１５７）Ｍｅｔ（−）セグメントの両方が、インフルエンザビリオン中に効率的に取り込まれること、ならびに２つの外来遺伝子が、反復される継代の間にインフルエンザＡ  ウイルス中で安定して維持され得ることを示した。
【０１４８】
（考察）
ゲノムパッケージング機構の決定は、インフルエンザウイルスの生活環を理解するため、および外来タンパク質の発現用のインフルエンザウイルスベースのベクターの開発のために重要である。本研究では、ＨＡ  ｖＲＮＡにおけるコード領域の３’末端および５’末端の両方における配列が、このセグメントのビリオンへの効率的な取り込みに必要とされることが実証された。さらに、この知見を用いて、ＨＡ  ｖＲＮＡおよびＮＡ  ｖＲＮＡのそれぞれのビリオン取り込みに必要な配列と隣接した、ＶＳＶ  ＧおよびＧＦＰのコード配列を含む２つの組換えＲＮＡセグメントを保有する新規のインフルエンザベースのウイルスを作製して、２つの外来遺伝子の安定な発現を実証した。
【０１４９】
無関係な感染因子由来の遺伝子または遺伝子部分の発現のためのインフルエンザＡウイルスに基づくワクチンベクターの開発に関して、いくつかのアプローチが報告されている。短いポリペプチドが、ＨＡの抗原部位に挿入されて、挿入されたペプチドに対するポジティブな免疫応答がもたらされている。より大きなポリペプチドおよびタンパク質の発現に関して、これらの外来遺伝子は、インフルエンザウイルス遺伝子のうちの１つに挿入されており、インフルエンザウイルス遺伝子において、この外来タンパク質は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または口蹄疫ウイルス２Ａプロテアーゼを利用することにより発現された。ここで、ＮＡ  ｖＲＮＡおよびＨＡ  ｖＲＮＡにおいてシス作用性ビリオン取り込みシグナルを利用する、外来タンパク質の発現のための新規の系を確立した。このシステムは、インフルエンザベースのウイルスが１．５ｋｂよりも大きな外来遺伝子（例えば、ＶＳＶ  Ｇ）を取り込むことを可能にし、このベクター系の可能性を実証した。マウスにおいて複製能力のないインフルエンザＶＬＰのワクチン効力が示されているので、無関係の病原体由来の遺伝子を含む組換えＲＮＡセグメントを有する複製能力のないインフルエンザベースのＶＬＰは、有望なワクチンとして役立ち得る。この可能性は、生ワクチンウイルスの野生型への何らかの復帰変異が全く許容されないか、または不活化ワクチンの効力が、粘膜免疫応答および細胞傷害性Ｔリンパ球応答の制限された誘導に起因して制限され得る場合、ＨＩＶ感染、口蹄疫感染および他の感染に対するワクチン接種のために特に魅力的である。従って、このアプローチを用いて、インフルエンザウイルスは、ワクチンベクターとして用いられ得る。例えば、ＨＡの代わりにＨＩＶ  ｇｐ１６０コード領域、そしてＮＡの代わりにｇａｇコード領域を含むウイルスを作製し得る（図２４および図２５）。さらに、ＶＳＶ  ＧがＨＡと置き換わる場合、Ｍ２はもはや必要とされず、それゆえ、３つのウイルス遺伝子は、異種遺伝子で置換され得る。例えば、ＨＡはＨＩＶ
ｇｐ１６０で、ＮＡはｇａｇで、そしてＭ２はｎｅｆで置換され得る。得られる組換えインフルエンザウイルスは、ワクチンとして、または別のＨＩＶワクチン（例えば、ＨＩＶ  ＤＮＡワクチン）のためのブースターとして用いられて、粘膜免疫を含めて免疫を増強または誘導し得る。あるいは、ワクチンは、ＮＡコードセグメントが別の病原体のコードセグメント（例えば、ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ）で置換されている、組換えインフルエンザウイルスに基づく多価ワクチンであり得、このワクチンは、インフルエンザウイルス感染およびヘルペスウイルス感染に対する防御免疫応答をもたらし得る。
【０１５０】
アデノウイルス、レトロウイルス、およびポックスウイルスに由来するウイルスベクターは、外来遺伝子を標的細胞へと効率的に導入する。これらのウイルスは、ＤＮＡを含むか、または宿主染色体へと組み込まれ得るＤＮＡ複製中間体を有するので、有害な結果の危険性が除去され得ない。対照的に、このような組込みは、感染した細胞中でＤＮＡ相がないことに起因して、インフルエンザウイルスにおいては見込みがない。さらに、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスは、ＨＡ切断のためにトリプシンを必要としないので、代表的なインフルエンザウイルスとは異なり、これは、より広範な用途を示し得る。さらに、所望の細胞親和性を有する組換えウイルスは、ビリオン表面上の糖タンパク質を変更することにより作製され得る。従って、ビリオン取り込みのためにｖＲＮＡセグメント中のシス作用性シグナルを利用する系は、複数の外来遺伝子を標的細胞へと送達し得る組換えインフルエンザベースのウイルスベクターの設計を可能にする。
【０１５１】
上皮細胞からのウイルスのアセンブリおよび放出は、いくつかのウイルスにおいて二極化しており、先端表面または基底外側表面のいずれかにおいて選択的に生じる。二極化したウイルス出芽は、ウイルス感染の病因を決定する際に役割を果たすと考えられる。インフルエンザＡウイルスは、感染した上皮細胞から先端に出芽し、そして個々に発現されたＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびＭ２タンパク質はまた、細胞の先端表面へと標的化される。他方、ＶＳＶは、感染した細胞の基底外側表面から放出され、そしてＶＳＶ
Ｇタンパク質は、基底外側表面へと輸送される。本研究では、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の代わりにＶＳＶ  Ｇを保有する組換えＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスを、成功裏に作製した。しかし、この組換えウイルスのＶＳＶ  Ｇタンパク質は、点変異に起因して、細胞質ドメインの最後の１３残基を欠いていた。細胞質ドメインにおけるこれらの１３残基の欠失は、基底外側表面よりも先端表面へとより効率的に輸送されるタンパク質を生じることが公知である。それゆえ、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルス中のＶＳＶ  Ｇタンパク質へと導入された変異は、先端表面へのその効率的な輸送を促進して、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスの効率的な出芽をもたらすようであった。
【０１５２】
インフルエンザ汎発流行は通常、ＨＡおよび／またはＮＡが以前に循環した株のＨＡおよび／またはＮＡとは免疫学的に異なるウイルスがインフルエンザウイルスＲＮＡセグメントの再編によって出現した場合に生じる。ＨＡ  ｖＲＮＡ、ＮＡ  ｖＲＮＡ、Ｍ  ｖＲＮＡおよびＮＳ  ｖＲＮＡ内のコード領域の３’末端および５’末端における配列は、ビリオンへのそれらの効率的な組込みに必要とされる。（大概はウイルスリボ核タンパク質複合体としての）ｖＲＮＡセグメントのパッケージングは、ウイルスＲＮＡセグメント間でトランスで生じるＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって媒介される。そうであれば、各セグメント内の特異的組込みシグナルがＲＮＡセグメントの再編を制限し得る。経験的に、インフルエンザウイルスＲＮＡセグメントがランダムには再編しないことが公知である。タンパク質間の機能的相互作用（例えば、ポリメラーゼ複合体、ＨＡ−ＮＡおよび切断可能なＨＡ−Ｍ２機能的会合の形成）は、ランダムな再編を制限すると考えられる。タンパク質レベルでの再編に対するこれらの制限に加えて、類似の制限がＲＮＡレベルで存在し得る。この状況では、１９５７年および１９６８年の両方の汎発流行において、ＰＢ１遺伝子が、ＨＡ遺伝子および／またはＮＡ遺伝子に加えて、鳥類ウイルス由来のヒトウイルス中に導入されたことは興味深い。このことは、ＨＡ  ＲＮＡセグメントとＰＢ１  ＲＮＡセグメントとの間の可能な連鎖を示唆する。他のＲＮＡセグメントのビリオン組込みのための重要な領域のさらなる特徴付けは、ＲＮＡセグメントの再編を理解する手掛かりを提供して、インフルエンザＡウイルスの新たな汎発流行株の出現の予測をもたらし得る。  
【０１５３】
まとめると、ｖＲＮＡパッケージングシグナルに関する情報を用いて、新規のインフルエンザワクチンおよびインフルエンザベースのワクチンベクターが開発され得る。
【０１５４】
（実施例６）
図２６に図示されるように、タンパク質（例えば、ＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス様ＲＮＡを構成的に発現する細胞株が作製され得るが、このＲＮＡは、取り込みシグナルを欠く。ＮＳ２コード配列を欠くウイルス（ＮＳ２  ＫＯ）もまた調製され得る（Ｎｅｕｍａｎｎら，２０００；Ｗａｔａｎａｂｅら，２００２）。ＮＳ２  ＫＯウイルスが正常細胞に感染した場合、子孫のウイルスは生成されない。なぜなら、このウイルスはＮＳ２を欠くからである。対照的に、ＮＳ２  ＫＯウイルスが、ＮＳ２をコードするが取り込みシグナルを欠くインフルエンザウイルス様ＲＮＡを発現する細胞に感染した場合、ＮＳ２は、ウイルス感染の際に発現され、そして子孫ＮＳ２  ＫＯウイルスが生成される。しかし、ＮＳ２をコードするインフルエンザウイルス様ＲＮＡは、ＮＳ２  ＫＯウイルス中に組み込まれない。なぜならこれは、ビリオン取り込みシグナルを欠くからである。従って、ＮＳ２  ＫＯは、正常細胞において複製能力がないままである。この系は、複製能力のないウイルスのためのプロデューサー細胞の産生のために用いられ得る。この系を用いて、細胞に対する毒性がウイルスタンパク質を構成的に発現する細胞株の生成を代表的に抑制するウイルスタンパク質を発現するプロデューサー細胞が作製され得る。従って、本願においては、ビリオン取り込みシグナルの知見を用いて、特定のセグメントがビリオン中に組み込まれるのを可能にしない系を設計し得る。
【０１５５】
（参考文献）
【０１５６】
【表６】
2010042023.tif 000007
【０１５７】
【表７】
2010042023.tif 000008
【０１５８】
【表８】
2010042023.tif 000009
全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。上記の明細書において、本発明は、その特定の好ましい実施形態に関連して記載されており、そして多くの詳細が例示の目的のために示されているが、本発明がさらなる実施形態で可能であることおよび本明細書中に記載された詳細の特定のものが本発明の基本原則から逸脱することなくかなり変更され得ることが当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１Ａ】レクチン耐性細胞株の結合。各細胞株について、細胞をジゴキシゲニン標識したＭａａｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）またはＳａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンとともにインキュベートし、その後、フルオレセインイソチオシアネート標識した抗ジゴキシゲニン抗体とともにインキュベートし、次いでＦＡＣＳにより分析した。太線、ＭＡＡ  レクチンの結合；細線、ＳＮＡ  レクチンの結合；斜線を引いた輪郭、ネガティブコントロール（レクチン非添加）。
【図１Ｂ】レクチン耐性細胞株の結合。各細胞株について、細胞をジゴキシゲニン標識したＭａａｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）またはＳａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンとともにインキュベートし、その後、フルオレセインイソチオシアネート標識した抗ジゴキシゲニン抗体とともにインキュベートし、次いでＦＡＣＳにより分析した。太線、ＭＡＡ  レクチンの結合；細線、ＳＮＡ  レクチンの結合；斜線を引いた輪郭、ネガティブコントロール（レクチン非添加）。
【図２】ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３変異体およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３変異体のＮＡ遺伝子の構造。（Ａ）ＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３は、ＮＡ遺伝子コード配列の大部分を取り除いた９３６個のヌクレオチド欠失（塩基２２０〜１２５３）を含む。この変異はまた、欠失を超えてフレームの２塩基中にＴＡＧ終止コドンをもたらすので、遺伝子は、細胞質テイル、膜貫通領域、柄およびＮＡのヘッドの部分に対応する６６個のアミノ酸ペプチドしかコードしない。（Ｂ）Ｋ４（ＭａＫＳ）−１３  ＮＡ遺伝子は、ＮＡ遺伝子コード配列の大部分を取り除いた１，０６６ヌクレオチド欠失（塩基１３０〜１１９３）を含む。この変異は、欠失を超えてフレームの４塩基中にＴＡＧ終止コドンをもたらすので、遺伝子は、ＮＡ遺伝子の細胞質テイル、およびＮＡ遺伝子の膜貫通領域に対応する３８個のアミノ酸ペプチドしかコードしない。
【図３】親ＡＭ２ＡＬ３ウイルスおよび親Ｋ４ウイルスおよびＡＬ３（ＭａＫＳ）−１３変異体およびＫ４（ＭａＫＳ）−１３変異体のシアリダーゼ活性。各サンプルについて、ウイルス（５×１０２ＰＦＵ）を、蛍光発生的なシアリダーゼ基質（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸）の存在下で３７℃で１時間、二連でインキュベートした。放出された４−メチルウンベリフェロンの蛍光を、３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光で、蛍光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩ）を用いて決定した。
【図４Ａ】野生型およびＮＡＦＬＡＧベクターの概略図。
【図４Ｂ】ＮＡＦＬＡＧウイルス産生のための方法の概略図。
【図４Ｃ】ＮＡＦＬＡＧＷＴウイルスまたはＮＡ（−）ウイルスで感染したＭＤＣＫ細胞の免疫染色。細胞を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｍ２または抗ＷＳＮポリクローナル抗体で染色した。
【図５】組換え７断片インフルエンザウイルスおよびＮＡＦＬＡＧウイルスに対する競合分析の概略図。
【図６Ａ】ＮＡＦＬＡＧおよびＮＡＦＬＡＧＭ（−）（“−ＡＴＧ”）ベクターの概略図。
【図６Ｂ】ＮＡＦＬＡＧＭ（−）ウイルスで感染したＭＤＣＫ細胞の免疫染色。細胞を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２または抗ＷＳＮポリクローナル抗体で染色した。
【図７Ａ】ＮＡＦＬＡＧおよびＮＡＦＬＡＧＭ（−）を感染した細胞のＦＬＡＧ配列についてのインサイチュハイブリダイゼーション分析
【図７Ｂ】ＮＡＦＬＡＧＷＴウイルスまたはＮＡＦＬＡＧＭ（−）ウイルスの複製効率。
【図８Ａ】ＮＡ欠損ウイルスの概略図。
【図８Ｂ】ＮＡ欠損ウイルスのパッケージング割合。
【図９】６、７または８個の断片を有するインフルエンザウイルスの経時のウイルス力価。
【図１０】インフルエンザウイルス断片に対する組み込みシグナル（点線）を示す概略図。
【図１１Ａ】Ａ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影。Ｂ〜Ｆ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影により検出した杆体のカラー像。
【図１１Ｂ】Ａ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影。Ｂ〜Ｆ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影により検出した杆体のカラー像。
【図１１Ｃ】Ａ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影。Ｂ〜Ｆ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影により検出した杆体のカラー像。
【図１１Ｄ】Ａ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影。Ｂ〜Ｆ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影により検出した杆体のカラー像。
【図１１Ｅ】Ａ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影。Ｂ〜Ｆ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影により検出した杆体のカラー像。
【図１１Ｆ】Ａ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影。Ｂ〜Ｆ）インフルエンザビリオンの電子顕微鏡断層撮影により検出した杆体のカラー像。
【図１２Ａ】Ａ）Ａ型インフルエンザウイルスに対するウイルス断片およびそのＨＡコード配列がＢ型ＨＡで置き換えられたＡ型ウイルス。
【図１２Ｂ】Ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスに対するビリオンおよびそのＨＡコード配列が、Ｂ型ＨＡで置き換えられたＡ型ウイルス。
【図１３】Ａ／ＢキメラＨＡ構築物の図。キメラＨＡ構築物は、Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載されたｐＰｏｌＩに基づいたプラスミド（ｐＨＨ２１）中の野生型Ａ／ＷＳＮウイルスＨＡ（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ）と野生型Ｂ／ＬｅｅウイルスＨＡ（ｐＰｏｌＩ−Ｂ−ＨＡ）との間で産生された。
【図１４】Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスによるＢ型ＨＡの発現。各ウイルスで感染したＭＤＣＫ細胞を、感染後２４時間で固定し、その後、抗Ａ／ＨＡ、抗Ｂ／ＨＡまたは、抗Ａ／ＮＰ抗体で免疫染色した。
【図１５】Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスの増殖特性。ＭＤＣＫ細胞を、０．０１  ＴＣＩＤ５０のＭＯＩにて各ウイルスで感染させ、ウイルス増殖をモニタリングした。類似した結果を有する２つの独立した実験の１つを示す。
【図１６Ａ】Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスを接種したマウス中のＢ型ウイルスに対する抗体の反応。Ａ）マウス（３匹のマウス／群）に、鼻腔内に各ウイルス（１０３ＴＣＩＤ５０）を接種した。接種３週間後、鼻／気管洗浄を行い、血清サンプルをマウスから取り出し、抗Ｂウイルス特異的ＩｇＡ抗体（鼻／気管洗浄）またはＩｇＧ抗体（血清）を、ＥＬＩＳＡアッセイにより試験した。
【図１６Ｂ】Ａ／Ｂ  ＨＡキメラウイルスを接種したマウス中のＢ型ウイルスに対する抗体の反応。Ｂ）血清サンプル中のＨＩ力価もまた、試験した。各バーは、キメラウイルスで感染した個々のマウスを示す。
【図１７】変異体ＨＡ  ｖＲＮＡの概略図およびそれらのビリオン組み込みの有効性。全ての変異体ＨＡ  ＲＮＡを、ネガティブセンスの向きに示されている。各変異体は、終止コドンに隣接した、ＧＦＰオープンリーディングフレーム（ＨＡオープンリーディングフレームに、インフレームで挿入された）、３’非コード領域の３３ヌクレオチドおよびＨＡ  ｖＲＮＡ（黒色バー）の５’非コード領域の４５ヌクレオチドを含む。変異体は、ＨＡコード領域に由来する多くのヌクレオチドに従って設計された。ＨＡコード領域を、灰色のバーとして示す。水平の破線は、欠失を示す。領域の長さは、一定の割合ではない。感染１６時間後の細胞を固定した後、ＶＬＰ感染細胞中のＮＰを発現する細胞の数で、ＧＦＰを発現する細胞の数を割ることにより、変異体ＨＡ  ｖＲＮＡのＶＬＰへの組み込み効率を決定した。
【図１８】変異ＨＡ  ｖＲＮＡを発現するプラスミドで感染した２９３Ｔ細胞中のｖＲＮＡ量。２９３Ｔ細胞を、ｐＰｏｌＩＨＡ（０）ＧＦＰ（０）またはｐＰｏｌＩＨＡ（９）ＧＦＰ（８０）ならびにＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰを発現するプラスミドでトランスフェクトした。
【図１９】ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルス感染した細胞は、ＶＳＶ  ＧおよびＧＦＰを発現する。ＭＤＣＫ細胞を、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスまたはＷＳＮウイルスで感染し、１．０％アガロースをかぶせた。感染した細胞を、３７℃で４８時間インキュベートし、プラークを通常光の下で撮影し（Ａ、Ｂ）、プラークを同定するために制限した通常光をともに使用して、蛍光の下で撮影した（Ｃ、Ｄ）。細胞を３％ホルムアルデヒド溶液中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で固定し、浸透させた。ウイルスタンパク質を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して、抗ＶＳＶ  Ｇモノクローナル抗体（Ｅ，Ｆ）、抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｇ、Ｈ）または抗ＮＰモノクローナル抗体（Ｉ，Ｊ）を一次抗体およびビオチン標識した二次抗体として使用した免疫染色により検出した。
【図２０】ＶＳＶ  Ｇタンパク質のＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスへの取り込み。濃縮したＷＮＳ、ＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）およびＶＳＶウイルスをサンプル緩衝液中に溶解した。ウイルスタンパク質を、２−メルカプトエタノールで処理し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブランに移し、抗ＶＳＶ  Ｇモノクローナル抗体または抗ＷＳＮ−ＨＡモノクローナル抗体とともにインキュベートした。マーカータンパク質の分子量を左に示す。
【図２１】ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞およびＭＤＣＫ細胞中のＶＳＶＧ（ＨＡ）ＧＦＰ（ＮＡ）ウイルスの増殖曲線。ＢＨＫ（Ａ）、ＣＨＯ（Ｂ）およびＭＤＣＫ（Ｃ）細胞を０．００１のＭＯＩでウイルス感染させた。感染後の示した時間で、上清中のウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞を使用して決定した。値は、２回の実験の平均である。
【図２２】変異ＮＳ  ｖＲＮＡの概略図およびそれらの組み込み効率。
【図２３】変異Ｍ  ｖＲＮＡの概略図およびそれらの組み込み効率。
【図２４】Ａ）ウイルス断片およびＢ）２個の異種性のタンパク質を発現するビリオンの概略図。
【図２５】２個の異種性のタンパク質（ＨＩＶ  ｇｐ１６０およびｇａｇ）に対するウイルス断片を含むインフルエンザウイルスの概略図。
【図２６Ａ】Ｃｒｅ／ｌｏｘを使用した、複製能力のないウイルスの産生の概略図。
【図２６Ｂ】Ｃｒｅ／ｌｏｘを使用した、複製能力のないウイルスの産生の概略図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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