(57)【要約】  【課題】  ミトコンドリア生合成に関与する転写因子の活性化に起因する、新規のエネルギー産生向上用の経口投与組成物を提供する。  【解決手段】  バラ科植物の抽出物を含有する、エネルギー産生向上用の経口投与組成物を提供する。前記バラ科植物はハマナス（Rosa rugosa）乃至はその近縁植物が好ましく、下記一般式１に表されるクマロイルスペルミジン誘導体及び／又はその塩を含有することが好ましい。【化１】2010001257.tif 000009一般式１（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子又はクマロイル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つはクマロイル基である。）  【選択図】  図３
2010001257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科植物の抽出物を含有する、エネルギー産生向上用の経口投与組成物。
【請求項２】
前記バラ科植物はハマナス（Rosa rugosa）乃至はその近縁植物であることを特徴とする、請求項１に記載のエネルギー産生向上用の経口投与組成物。
【請求項３】
前記バラ科植物の抽出物は、下記一般式１に表されるクマロイルスペルミジン誘導体及び／又はその塩を０．０１〜２質量％含有することを特徴とする、請求項
１又は２に記載の経口投与組成物。
【化１】
2010001257.tif 000007
一般式１
（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子又はクマロイル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つはクマロイル基である。）
【請求項４】
前記一般式１に表されるクマロイルスペルミジン誘導体は、トリクマロイルスペルミジンであることを特徴とする、請求項３に記載の経口投与組成物。
【化２】
2010001257.tif 000008
トリクマロイルスペルミジン
【請求項５】
前記経口投与組成物は、食品であることを特徴とする、請求項１〜３何れか１項に記載の経口投与組成物。
【請求項６】
エネルギー産生向上作用は、ミトコンドリアの生合成に関与する転写因子の活性化によるものであることを特徴とする、請求項１〜４何れか１項に記載の経口投与組成物。
【請求項７】
エネルギー産生向上用の経口投与組成物の製造方法であって、バラ科の植物の植物体を溶媒で抽出し、所望により溶媒を除去した後、抽出物乃至はその溶媒除去物中の一般式１の化合物及び／又はその塩の含有量が０．０１〜２質量％であることを確認し、しかる後に経口投与組成物に含有させることを特徴とする、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の経口投与組成物に関し、更に詳細には、エネルギー産生向上作用を有する経口投与組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、エネルギー代謝の多くを担う重要な器官であり、ミトコンドリアにおける生合成に関与する転写因子の活性化は、ミトコンドリア数を増加させ、個体のエネルギー産生能を向上せしめると言われている。又、有酸素運動などによりエネルギー代謝効率が向上し、持久力が向上することにもミトコンドリアの生合成に関与する転写因子の活性化が寄与していると言われている。この様に、ミトコンドリアの生合成に関与する転写因子の活性化によるエネルギー代謝効率の向上は、過剰な蓄積エネルギーをエネルギー変換することにもつながるため、肥満の予防作用に有用であるし、それと同時に持久力の向上にも有用であることから活性化促進手段が求められていると言える（例えば、特許文献１、非特許文献１を参照）。
【０００３】
この様なミトコンドリアの生合成に関与する転写因子を活性化させる成分としては、例えば、クレンブテロール（例えば、特許文献１を参照）、レスベラトロール（例えば、非特許文献２を参照）などが存する。又、セレン化合物についてもこの様な作用が知られている（例えば、特許文献２を参照）。しかしながら、これらの化合物はこの様な作用以外にも、他の生理活性を有しており、その投与量はミトコンドリアの生合成に関与する転写因子活性化作用には因らない因子で規定されている。これ故、生合成に関与する転写因子の活性化能を有する新規の成分の開発が望まれていたと言える。
【０００４】
一方、後記一般式１に表される化合物については、青蒿（チンハオスー）などの植物体に含有され、該青蒿には抗ＨＩＶ作用、抗マラリア作用などが存することが知られている。（例えば、非特許文献３を参照）又、ハマナスの抽出物には、グルコシルトランスフェラーゼ阻害作用が存すること（例えば、特許文献３を参照）、メラニン産生阻害作用が存すること（例えば、特許文献４を参照）等が知られている。しかしながら、ミトコンドリアの生合成に関与する転写因子に対する作用は全く知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２１７３６８号公報
【特許文献２】特表２００４−５３７５９５号公報
【特許文献３】特開平０６−２７９３０３号公報
【特許文献４】特開２０００−１２８７６２号公報
【非特許文献１】武政徹他、Bull.Inst.Health&Sport Sci.,Univ. of Tsukuba 30:153-155,2007
【非特許文献２】Joseph A. Baur et.al.,Natur, 05354:10.1038:1-6,2006
【非特許文献３】Mao Chao-Mei et.al., Chem. Pharm. Bull.;49(2001);915-917
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこの様な状況下為されたものであり、ミトコンドリア生合成に関与する転写因子の活性化に起因する、新規のエネルギー産生向上用の経口投与組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、ミトコンドリア生合成に関与する転写因子の活性化に起因する、新規のエネルギー産生向上用の経口投与組成物を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、バラ科の植物の抽出物にペルオキシソーム・プロリフェレイター・アクチベイテド・レセプターγ・コアクチベーター１α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator 1α；ＰＧＣ−１α）等のミトコンドリア生合成に関与する転写因子を活性化させる作用が存することを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。尚、本発明においては、抽出物とは、抽出物自体、抽出物を分画、精製した画分、抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。
＜１＞バラ科植物の抽出物を含有する、エネルギー産生向上用の経口投与組成物。
＜２＞前記バラ科植物はハマナス（Rosa rugosa）乃至はその近縁植物であることを特徴とする、＜１＞に記載のエネルギー産生向上用の経口投与組成物。
＜３＞前記バラ科植物の抽出物は、下記一般式１に表されるクマロイルスペルミジン誘導体及び／又はその塩を０．０１〜２質量％含有することを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の経口投与組成物。
【０００８】
【化１】
2010001257.tif 000003
一般式１
（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子又はクマロイル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つはクマロイル基である。）
【０００９】
＜４＞前記一般式１に表されるクマロイルスペルミジン誘導体は、トリクマロイルスペルミジンであることを特徴とする、＜３＞に記載の経口投与組成物。
【００１０】
【化２】
2010001257.tif 000004
トリクマロイルスペルミジン
【００１１】
＜４＞前記経口投与組成物は、食品であることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞何れか１項に記載の経口投与組成物。
＜５＞エネルギー産生向上作用は、ミトコンドリアの生合成に関与する転写因子の活性化によるものであることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞何れか１項に記載の経口投与組成物。
＜６＞エネルギー産生向上用の経口投与組成物の製造方法であって、バラ科の植物の植物体を溶媒で抽出し、所望により溶媒を除去した後、抽出物乃至はその溶媒除去物中の一般式１の化合物及び／又はその塩の含有量が０．０１〜２質量％であることを確認し、しかる後に経口投与組成物に含有させることを特徴とする、製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ミトコンドリア生合成に関与する転写因子の活性化に起因する、新規のエネルギー産生向上用の経口投与組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の経口投与組成物は、バラ科の植物の植物体の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。前記バラ科の植物としては、例えば、バラ科キイチゴ、バラ科リンゴ、バラ科ナシ、バラ科ハマナスなどの植物が好適に例示でき、中でもバラ科ハマナス乃至はその近縁植物が更に好適に例示できる。前記バラ科ハマナスの近縁の植物としては、例えば、本州中部などの亜高山帯に生えるタカネバラ（Rosa nipponensis）と主に北海道に分布するカラフトイバラ（Rosa marretii）、本州の富士箱根地方にのみ分布するサンショウバラ（Rosa hirtula）などが好ましく例示できる。これらの何れもが利用できるが、ハマナス（Rosa rugosa）を用いることがより好ましい。かかるバラ科の植物の抽出物の作成に用いる植物部位としては、地上部が好適に例示でき、中でも花蕾が特に好ましい。抽出に際して、植物体乃至はその乾燥物は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物は、植物体乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬することにより製造することが出来る。前記抽出に用いる溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示でき、５０％含水エタノールが特に好適に例示できる。浸漬後は室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮などにより除去することが出来る。しかる後に、水と酢酸エチル、水とブタノールなどの液液抽出や、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィー等で分画精製し、所望の活性の抽出物を得ることが出来る。活性は、前記一般式１に表される化合物をマーカーとすることが出来、一般式１に表される化合物の中でもトリクマロイルスペルミジンの含有量をマーカーとして、この成分が０．０１〜２質量％程度の濃度、より好ましくは０．０５〜１質量％になるように調整することが好ましい。これは、かかる成分自体が前記ミトコンドリア生合成に関与する転写因子、取り分け、ＰＧＣ−１α活性化作用を有するとともに、前記活性化作用を有する画分が、前記の、一般式１に表される化合物、取り分け、トリクマロイルスペルミジンの含有される分画と一致するため、これの含有量を前記作用のマーカーとすることが出来るためである。この様にバラ科の植物の抽出物（上記分画精製物も包含する）で、ミトコンドリア生合成に関与する転写因子、取り分け、それらを代表する、ＰＧＣ−１αを活性化することにより、エネルギー産生量が向上し、過剰な備蓄エネルギーを熱エネルギーに変換し肥満を抑制できるとともに、過小の産量にエネルギーが抑制されていたが故に生じた冷え性などを改善し、且つ、有酸素運動と同様に持久力を生体にもたらすことが出来る。即ち、本発明のバラ科の植物の抽出物は、ミトコンドリア生合成に関与する転写因子活性化剤として、取り分け、ＰＧＣ−１α活性化剤、より具体的にはＰＧＣ−１α発現促進剤として働き、エネルギー産生を促進する有効成分としての機能を発現する。
【００１４】
前記トリクマロイルスペルミジンは公知の化合物であり、例えば桃の花蕾などに含有されており、これらの抽出物を精製分離することにより得ることが出来る。又、かかる成分については合成方法も既に知られており（例えば、Wenqing Hu,Helvetica Chimica Acta.;79(2)548-559;1996）、かかる合成方法に従えばトリクマロイルスペルミジンのみならず、種々の一般式１に表される化合物を合成することが出来る。即ち、スペルミジンに大過剰のクマロイルクロリドをアルカリの存在下反応させることによりトリクマロイルスペルミジンは得ることが出来るし、Ｂｏｃ基等の保護基を順次導入し、保護されていない水酸基にクマロイルクロリドをアルカリとともに反応させて導入すれば、種々の一般式１に表される化合物が得られる。かかる標品を用いて、高速液体クロマトグラフィーなどを用いて抽出物中のトリクマロイルスペルミジン等の一般式１に表される化合物を定量することが出来る。高速液体クロマトグラフィーの分析条件としては、例えば、炭素数３０のシリル化剤でシリル化したシリカゲルを担体として、移動相を０．１％トリフルオロ酢酸で緩衝した、１０％から５０％アセトニトリル水溶液のグラージェント条件で、紫外部３００ｎｍの吸収を検知しながら分析することが好ましく例示できる。又、ＰＧＣ−１αの活性化は、ウエスタンブロッティング法により評価した。すなわち正常ヒト細胞を培養し、核蛋白を回収し、総タンパク量を定量した後、電気泳動にて分離し、核蛋白中のＰＧＣ−１αを抗ＰＧＣ−１α抗体で反応させ、この抗体を標識二次抗体で反応後発色させ、発色度合いによってタンパク量あたりのＰＧＣ−１α量を定量し、指標とすることが出来る。
【００１５】
斯くして得られた、一般式１に表される化合物、取り分け、トリクマロイルスペルミジンを０．０１〜２質量％含有する抽出分画は、本発明の経口投与組成物に０．１〜９０質量％、より好ましくは、１〜１２質量％含有される。本発明の経口投与組成物としては、例えば、医薬、食品、飲料などが好適に例示でき、日常的に摂取できることから、食品に適用することが特に好ましい。
【００１６】
前記製剤化にあたっては、前記抽出物以外に、通常食品、医薬、飲料の製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロースなどの崩壊剤、アラビアゴムやヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸等の酸味剤、リン酸塩等の緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤などが好適に例示できる。
【００１７】
以下に、実施例を挙げて本発明について、更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例に限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００１８】
＜１＞抽出物の製造
（１）「マイカイカ」の名称でウチダ和漢薬株式会社より販売されているバラ科ハマナスの花蕾の乾燥物を１００ｇ秤取り、２Ｌの５０％エタノール水溶液を加え、ホモジナイザーでホモジナイズ処理を行い、室温で２４時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、濾液を減圧濃縮し、エタノールが除去されたのを確認し、凍結乾燥に付し、２１．９５ｇの抽出物（抽出物１）をアモルファスとして得た。
（２）抽出物１の５ｇに２００ｍｌの水と２００ｍｌのｎ−ヘキサンとを加え、液液抽出を行い、ｎ−ヘキサン相と水相とに分け、ｎ−ヘキサン相を減圧濃縮し、０．０４９ｇの抽出物２をアモルファスとして得た。
（３）（２）の水相に２００ｍｌの酢酸エチルを加え、液液抽出を行い、酢酸エチル相と水相とを分け、酢酸エチル相を減圧濃縮し、２．２８８ｇの抽出物３をアモルファスとして得た。
（４）（３）の水相に２００ｍｌのｎ−ブタノールを加え、液液抽出を行い、ｎ−ブタノール相と水相とに分けた。ｎ−ブタノール相を減圧濃縮し、０．９５ｇの抽出物４をアモルファスとして得た。又、水相を減圧濃縮し、２．７ｇの抽出物５をアモルファスとして得た。
【００１９】
＜２＞培養細胞を用いたウエスタンブロッティング
前記の抽出物１〜５について、培養細胞における、ＰＧＣ−１αの発現量への影響をウェスタンブロッティングによって調べた。詳細な手技は次に示すとおり。
【００２０】
＜細胞培養＞
細胞：正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞（HASMC、クラボウ社）を用いた。
培地：DMEM-10%FBS
１）細胞を75cm2のフラスコに細胞数2,500cells/ cm2で播種する
２）80％コンフルエントになるまで37℃・５％CO2インキュベーターにて培養する
３）80％コンフルエントになったら、上記1の条件と同様になるよう継代する
４）さらに培養し、80％コンフルエントに達したら60 cm2のディッシュに細胞数2,500cells/ cm2で播種する
５）2日後に培地交換し、さらに2日間培養する
６）ディッシュ播種から4日後にDMSOのみまたはDMSOに溶解させた検体を添加する（添加濃度はエキス1mg/10μL DMSO/10mL medium）
７）24時間後、細胞からタンパク質を回収する
【００２１】
＜核タンパク回収＞
１）60cm2のディッシュに播種した細胞をPBS1.5mLでwashする
２）PBSを0.75mL加え、スクレーパーで回収
３）上記1と2の操作を再度繰り返す
４）3,000rpm for 5min. at 4℃で遠心分離する
５）上清を捨て、1.5mLの0.25M sucrose solu.を加える
６）ホモジナイザーを１分間処置し、ホモジネートを調整する
７）4,000rpm for 10min. at 4℃で遠心分離する。
８）上清を捨て（ペレットが核分画）、適量のPRO-PREP（コスモバイオ社、Cat.No.17081）を加え、ボルテックス
９）インキュベーションする。（ for 20min. at -20℃）
10）13,000rpm for 5min. at 4℃で遠心分離する
11）上清を試験チューブに入れ核タンパク分画を回収
【００２２】
＜タンパク定量（BIO RADカタログ、Quick Startプロテインアッセイを参照）＞  
1）1.5mL 試験チューブに1×染色液を250μLずつ入れる
2）BSA standard または各種タンパクサンプルを5μLずつ入れる
3）ボルテックス後、室温で5分間インキュベーションする
4）96穴プレートに各液を200μLずつ入れ、プレートリーダーにて595nmの吸光度を測定する
5）検量線作成後、各サンプルのタンパク量を算出する
【００２３】
＜ウエスタンブロッティング＞
１）電気泳動（SDS-PAGE）…1レーンあたり4.5μgのタンパク質を泳動する
２）ブロッティング…ゲルからPVDF膜に転写する（40mA・300V/gel for 90min.）
３）ブロッキング…5％スキムミルク in 0.1%T-TBS for 1hr at RT
４）1次抗体反応…Anti-PGC-1α antibody（Cell Signaling Cat.No.2178）：T-TBS-5%BSA＝1：1000で希釈し、overnight at 4℃で反応させる
５）2次抗体反応…Anti-Rabbit IgG(H＋L),HRP Conjugate(Promega Cat.No.W4011)：ブロッキング溶液＝1：2500で希釈し、1hr at RTで反応させる
６）検出する
７）検出したバンドを画像に取込、「ＩｍａｇｅＪ」で数量化する
【００２４】
＜結果１＞
抽出物１のＰＧＣ−１α発現促進作用を、ミトコンドリア生合成に関与する転写因子の活性化作用が知られるレスベラトロールを比較例として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）添加を対照例として検討を行った。結果を図１（ウェスタンブロット）、図２（発現量の比較）に示す。同じ質量であれば、抽出物１はレスベラトロールと同程度のＰＧＣ−１α発現促進作用を有することがわかる。
【００２５】
＜結果２＞
液液抽出分画についても、同様にＰＧＣ−１α発現促進作用を調べた。結果は図３、図４に示す。酢酸エチル相に著しいＰＧＣ−１α発現促進作用が存することが判る。
【実施例２】
【００２６】
ＰＧＣ−１α発現促進作用が著しかった酢酸エチル相について、図５に示す手技に従って再度、分取高速液体クロマトグラフィー（Ｃ３０シリル化シリカゲルを担体とする）で精製、分画を行った。これらの分画の溶媒除去物について、実施例１と同様の手技でＰＧＣ−１α発現促進作用を調べた。結果を図６、図７に示す。このフラクション５について、高速液体クロマトグラフィーで分析を行い、リテンションタイムとし外部吸収特性の化合物ライブラリーとの照合により、このフラクションに特徴的な４２分付近のピークはトリクマロイルスペルミジンであることが判明した。高速液体クロマトグラムは図８に示す。照合されたトリクマロイルスペルミジンの高速液体クロマトグラムは図９に示す。
【実施例３】
【００２７】
下記に示す処方に従って、本発明の経口投与組成物である、錠剤状の食品を作成した。即ち、１０％エタノール１０質量部を噴霧しながら、処方成分１００質量部をニューマルメライザー（不二パウダル株式会社製）で造粒し、４０℃で３時間送風乾燥した後、１５０ｍｇ錠に打錠し、これに５０ｍｇ／錠のツェインをエタノール溶液を噴霧することによりコーティングした。
【００２８】
【表１】
2010001257.tif 000005
【００２９】
【表２】
2010001257.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、機能性食品などの食品に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】抽出物１のＰＧＣ−１α発現促進作用を示す図である。（図面代用写真）
【図２】抽出物１のＰＧＣ−１α発現促進作用を示す図である。
【図３】抽出物２〜５のＰＧＣ−１α発現促進作用を示す図である。（図面代用写真）
【図４】抽出物２〜５のＰＧＣ−１α発現促進作用を示す図である。
【図５】抽出物３の分画の手技を示す図である。
【図６】分画画分のＰＧＣ−１α発現促進作用を示す図である。（図面代用写真）
【図７】分画画分のＰＧＣ−１α発現促進作用を示す図である。
【図８】画分のクロマトグラムを示す図である。
【図９】トリクマロイルスペルミジンのクロマトグラムを示す図である。
【図１】
2010001257.tif 000010
【図２】
2010001257.tif 000011
【図３】
2010001257.tif 000012
【図４】
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【図５】
2010001257.tif 000014
【図６】
2010001257.tif 000015
【図７】
2010001257.tif 000016
【図８】
2010001257.tif 000017
【図９】
2010001257.tif 000018