(57)【要約】【課題】ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判定するウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法およびそれに使用するキットを提供する。【解決手段】ウシのＲＰＬ２７遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位におけるＳＮＰタイプをＰＣＲ−ＲＦＬＰで分析することによりウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子であって、第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位の塩基がＣ／Ｔホモまたはヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型。
【請求項２】
ウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位における一塩基多型（ＳＮＰ）タイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法。
【請求項３】
ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により行う請求項２記載の方法。
【請求項４】
ウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーを含む請求項２記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用キット。
【請求項５】
さらに、制限酵素を含む請求項４記載のキット。
【請求項６】
配列番号２および配列番号３に示す配列からなるウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ脂肪交雑形成に関わる一塩基多型（ＳＮＰ）およびその利用に関する。さらに詳しくは、ウシ脂肪交雑形成に関わる新規なＳＮＰに基づいてウシの遺伝子型を判定し、ウシの脂肪交雑形成能力を予測する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
「霜降り」や「サシ」と称されるウシの脂肪交雑は牛肉の肉質を評価、判定する上で重要な因子であり、脂肪交雑形成能力の高い個体とそうでない個体をウシの肥育の早期に判別し、それらの能力に合った肥育計画を立てることができれば、肉用牛の生産において非常に望ましい。さらに、その能力を早期に判定できれば、世代間隔を短縮することができ、育種改良に多大の貢献をする。
このような事情に鑑み、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判定すべく、従来から、ウシの脂肪交雑形成に関与する責任遺伝子の探索、同定が試みられている。例えば、特許文献１ではウシの脂肪細胞分化のマスターキーといわれているウシＰＰＡＲγ遺伝子の１つであるウシＰＰＡＲγ２の変異体が開示されている。
また、ウシの脂肪交雑形成に影響する遺伝子を特定することを目的として、系統的に脂肪交雑形成能力の異なることが判明しているウシ群間で、脂肪交雑形成が始まる前後８〜１４ヶ月齢の時期に発現するｍＲＮＡ量を調べ、配列既知の５つの候補遺伝子を選抜した報告（平成１７年３月２７日〜２９日開催の日本畜産学会第１０４回大会発表）や、これらの遺伝子のゲノム配列を決定し、いくつかの遺伝子において一塩基多型（ＳＮＰ）が存在するとの報告（平成１７年９月１１日、１２日開催の日本動物遺伝育種学会第６回大会ポスター発表）がある。
このように、ウシの脂肪交雑に影響する遺伝子の同定は試みられているが、脂肪交雑形成能力と統計的に有意な相関を示した遺伝子多型を同定した例は、これまで見当たらない。
本発明者らの発明に係る特許文献２には、血管伸長に関連すると推測されるウシＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐ部位と、＋３６９８ｂｐ部位にＳＮＰが存在し、それらが統計的にウシの脂肪交雑形成と相関し、ウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定に利用できることが開示されている。
さらに、本発明者らは、ウシＥＤＧ１遺伝子の他の部位、ウシＴＴＮ遺伝子の一部位、ウシＭＢＬ１遺伝子の一部位にもＳＮＰが存在し、それらが統計的にウシの脂肪交雑形成と相関し、ウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定に利用できることを見出し、特許出願した（特願２００７−２３５６２８号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−８６８８号公報
【特許文献２】特開２００７−２５２２７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主な目的は、新たなＳＮＰを見出し、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判別するウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法およびそれに使用するキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記のごとく、本発明者らは、これまでにウシ遺伝子の中で脂肪交雑形成に影響するＳＮＰを３つの遺伝子で計４部位同定し、相関解析によりこの遺伝子多型がウシの脂肪交雑能力に関与することを明らかにしてきたが、今回新たにウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子（GenBank NW_001495105）で脂肪交雑形成に関わるマーカーと考えられるＳＮＰを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）ウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子であって、第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位の塩基がＣ／Ｔホモまたはヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型、
（２）ウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位におけるＳＮＰタイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法、
（３）ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により行う上記（２）記載の方法、
（４）ウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーを含む上記（２）記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用キット、
（５）さらに、制限酵素を含む上記（４）記載のキット、
（６）配列番号２および配列番号３に示す配列からなるウシのＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーなどを提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法により、上記の新規ＳＮＰ部位についてＳＮＰタイプを判定することにより、遺伝子型が判定でき、それに基づいて脂肪交雑形成能力が予測できる。
以下の実施例に示すごとく、黒毛和種種雄牛１０１頭について、肉の脂肪交雑度が高い（評点が高い）上位１７頭のグループと、交雑度が低い（評点が低い）下位１７頭のグループとで、遺伝子のＳＮＰと脂肪交雑度合いとの相関を独立性検定により解析したところ、ＲＰＬ２７Ａ遺伝子の第１エキソン開始点から−７２７２ｂｐ部位の塩基(以下、ＲＰ−７２７２と称する）がＴアリルである場合とＣアリルである場合とでは、χ２検定で危険率０．０１％以下という相関でＴアリルの方が脂肪交雑に関する遺伝的能力すなわち育種価が高かった。次に、種雄牛１０１頭全てを使った分散分析を行ったところ、危険率０．０２％でやはりＴアリルの方が有意に育種価が高いことが示された。さらに、このＳＮＰ部位がＴＴホモである糸福の後代半きょうだい肥育牛２１７頭（ＴＴ型、ＣＴ型の遺伝子型を持つ）について解析したところ、危険率１％でＴＴ型の方がＣＴ型より脂肪交雑育種価が高かった。なお、皮下脂肪厚育種価では有意差は見られなかった。また、このＳＮＰ部位がＣＣホモである糸治の後代半きょうだい肥育牛１９５頭（ＣＴ型、ＣＣ型の遺伝子型を持つ）について解析したところ、危険率５％でＣＴ型の方がＣＣ型より脂肪交雑育種価が高かった。なお、ここでも皮下脂肪厚育種価では有意差は見られなかった。
ＲＰＬ２７Ａ遺伝子はリボゾームの構成タンパク質として公知であるが、脂肪交雑との関係は明らかにはされていなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書における、「Ｃ／Ｔホモまたはヘテロ型」なる用語は、遺伝子型がＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型のいずれかであることを示す。
また、「ウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法」なる用語は、ウシの遺伝子型の判定方法およびウシの遺伝子型を判定し、それにより脂肪交雑形成能力を予測する方法の両方を意味する。
【０００９】
配列表の配列番号１には、ＲＰ−７２７２部位を含むGenBank NW_001495105の3108901〜3117420の塩基配列を示す。第１エキソン開始点は3116809に相当し、ＲＰ−７２７２は、3109537（配列番号１中６３７番目）に相当し、その塩基ｙはｔまたはｃである。
【００１０】
本発明の方法は、ウシ個体から採取した検体から抽出した試料ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＳＮＰタイプを、例えば、制限酵素を用いてＲＦＬＰ分析により判定するものである。
検体としては、血液、精液等の生物体の一部を使用でき、これらから、常法により試料ＤＮＡを抽出して判定を行う。
用いる制限酵素としては、例えば、Ｂｓｕ３６Ｉ（ＮＥＢＪ）を用いることができる。
【００１１】
ＰＣＲは公知の方法に従って行うことができる。
ＰＣＲに使用するプライマーは、ＲＰ−７２７２部位を含む領域を増幅するための配列を適宜設計すればよい。
例えば、センスプライマーとして配列番号２、アンチセンスプライマーとして配列番号３で示す配列が挙げられる。
【００１２】
また、ＲＦＬＰ分析も公知の方法に従って行うことができる。
本発明のＳＮＰのＴアリルは制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで切断されるが、Ｃアリルは切断されない。
これにより、電気泳動で切断の有無を調べることによりＳＮＰタイプが判定できる。
【００１３】
本発明のキットは、本発明のＳＮＰ部位を含む領域の配列を増幅するプライマーを含む。好ましくは、これらのプライマーと所定の制限酵素を含むＰＣＲ−ＲＦＬＰキットとする。当該キットにはこれ以外に検体からのゲノムＤＮＡの抽出試薬や、必要な器具、判定用の説明書等が含まれていてもよい。
【００１４】
上記した本発明者らが既に明らかにした３つのＳＮＰ（特願２００７−２３５６２８号）の検出と、本発明のＳＮＰ検出を組み合わせることもできる。かかる４つの遺伝子のＳＮＰ診断は、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primer）による同時解析が可能であり、組み合わせることでより高い信頼性で脂肪交雑能力の高い個体を判別することが可能となる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる遺伝子型判定
（１）試料の採取
種雄牛については血液あるいは精液を採取、肥育牛については食肉市場で屠殺された個体から脂肪組織を採取して用いた。これらの検体から常法によりゲノムＤＮＡを抽出した。
血液からの抽出にはReadyAmpTM Genomic DNA Purification System(Promega)を、精液および脂肪組織からの抽出にはWizard SV Genomic DNA Purification System(Promega)を用いた。
（２）ＤＮＡの増幅
下記プライマーを使用し、下記反応液を、９４．０℃で２分間の加熱１サイクルと、９４．０℃で３０秒、最適アニーリング温度５７℃で３０秒、ついで７２．０℃で１分の加熱を３５サイクル繰り返し、最後に７２．０℃で５分間加熱してＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ用プライマー配列は、以下のとおりである。
cctgtttcag agaatctaag tcc（配列番号２）
ctgatcagtt tcacttctag ttcag（配列番号３）
ＰＣＲ反応液
ゲノムDNA溶液              3.0μl
プライマーミックス（最終） 0.5μM
5×Go taq buffer           4.0μl
Go taq（最終）             0.5 U
dNTPs（最終）              0.2 mM
全量                      20.0μl
（３）制限酵素処理
下記反応液を表１に示す所定温度で所定時間インキュベーションして制限酵素処理した後、制限酵素処理反応液を３％Nusieve GTGアガロースゲルで電気泳動した。
ＲＦＬＰ反応液
PCR反応液                         2.00μl
10x添付buffer                     1.00μl
制限酵素(Bsu361)                   最適酵素量
全量                             10.00μl
【表１】
2010187636.tif 000002
【実施例２】
【００１６】
統計解析
各種のウシ個体について、実施例１と同様にしてＳＮＰタイプを判定し、分散分析により脂肪交雑形成能力との相関関係を統計的に調べた。
分散分析には最小二乗分散分析法を用いて、計算はＳＡＳのＧＬＭプロシジャを用いた。独立性検定にはFisherの直接検定またはχ２検定を用いて、計算にはＦＲＥＱプロシジャを用いた。
（１）大分県種雄牛を用いた予備的相関解析
検出されたＳＮＰと脂肪交雑との相関解析を行う予備的な解析として、脂肪交雑に関する育種価が得られている大分県黒毛和種種雄牛１０１頭について、肉の脂肪交雑に関する育種価の低い下位群１７頭と、高い上位群１７頭についてＳＮＰ遺伝子型を調べた。
その結果を表２に示す。
【００１７】
【表２】
2010187636.tif 000003
【００１８】
つぎに、ＳＮＰについて、遺伝子頻度を用いた独立性検定により相関解析を行った。
その結果を表３に示す。
【表３】
2010187636.tif 000004
この結果、上位群において、危険率０．０１％以下でＴアリルの方が高いことが示され、脂肪交雑に関する遺伝的能力すなわち育種価が高いことが示された。
【００１９】
（２）大分県種雄牛１０１頭についての相関解析
上記の種雄牛１０１頭について、ＳＮＰとの相関を分散分析により解析した。また、これら１０１頭については、脂肪交雑と同じく脂肪蓄積に関連する形質である皮下脂肪厚の育種価も得られており、皮下脂肪厚の育種価についても同様に解析を行った。
結果を表４および表５に示す。
【表４】
2010187636.tif 000005
【表５】
2010187636.tif 000006
この結果、脂肪交雑の育種価についてはＴアリルの方が０．０２％水準で有意に育種価が高かった。
【実施例３】
【００２０】
上記と同様に、ＳＮＰ部位がＴＴホモである種雄牛「糸福」の後代去勢肥育牛２１７頭（ＴＴ型、ＣＴ型の遺伝子型を持つ）の脂肪交雑および皮下脂肪厚の育種価について、ＲＰ−７２７２との相関を解析した。
結果を表６および表７に示す。
【表６】
2010187636.tif 000007
【表７】
2010187636.tif 000008
この結果から、脂肪交雑の育種価については危険率１％で、ＴＴ型の方がＣＴ型より脂肪交雑の育種価が高かった。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
【実施例４】
【００２１】
上記と同様に、ＳＮＰ部位がＣＣホモである種雄牛「糸治」の後代去勢肥育牛１９５頭（ＣＴ型、ＣＣ型の遺伝子型を持つ）の脂肪交雑および皮下脂肪厚の育種価について、ＲＰ−７２７２との相関を解析した。
結果を表８および表９に示す。
【表８】
2010187636.tif 000009
【表９】
2010187636.tif 000010
この結果、危険率５％で、ＣＴ型の方がＣＣ型より脂肪交雑の育種価が高いことが示された。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
以上記載したごとく、本明細書に開示する遺伝子型を判定することにより、肥育牛の早期段階において脂肪交雑能力の高い個体とそうでない個体を判別し、それらの能力に合った肥育計画を立てることができると考えられる。また、雄牛および雌牛の脂肪交雑に関する遺伝的能力を成長の早期に判定することができ、脂肪交雑の改良を著しく促進できる。
脂肪交雑は肥育牛の価格を決める重要な因子であり、肉用牛産業に多大な貢献ができ、さらに、肥育技術への貢献のみならず、種牛雄選抜を含めた育種改良への応用も期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【００２３】
配列番号２：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine RPL27A gene
region containing RP-7272
配列番号３：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine RPL27A gene
region containing RP-7272
【配列表】
2010187636000001.app