(57)【要約】【課題】大部分のナイセリア属、特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに共有されるアミノ酸配列の伸長物を含むタンパク質を提供すること。【解決手段】最大の株間認識および反応性を確実にするために、異なるナイセリア種、血清群および株の間で保存されるタンパク質の領域が、使用され得る。本発明は、大部分のナイセリア属、特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに共有されるアミノ酸配列の伸長物を含むタンパク質を提供する。ナイセリアタンパク質のフラグメントを含むタンパク質であって、ここでこのフラグメントが、７以上の連続した保存されたアミノ酸から構成され、但し、このタンパク質は、全長ナイセリアタンパク質ではない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用する全ての文書の内容は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌由来の保存された抗原に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、非運動性のグラム陰性双球菌であり、ヒトにおいて病原体である。
【０００４】
生物の被膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２の血清群が同定されている。Ａ群は、サハラアフリカ周縁での伝染病において最も頻繁に関与している病原体である。血清群Ｂ群および血清群Ｃ群は、米国および大部分の先進国における症例の大部分の原因である。血清群Ｗ１３５およびＹは、米国および先進国における症例の残りの原因である。
【０００５】
現在使用される髄膜炎ワクチンは、血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５で構成される４価の多糖類ワクチンである。しかし、このアプローチは、髄膜炎菌Ｂには使用され得ない。なぜならばｍｅｎＢ被膜多糖類は、哺乳動物組織にもまた存在するα（２−８）−連結  Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。ｍｅｎＢワクチンに対する１つのアプローチは、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の混合物を使用する。抗原変異性を克服するために、９つまでの異なるポリンを含む多価ワクチンが構築されている（例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ．４：１３−２８）。外膜ワクチンで使用されるさらなるタンパク質は、ｏｐａタンパク質およびｏｐｃタンパク質であったが、これらのアプローチは、いずれも抗原変異性を克服し得なかった（例えば、Ａｌａ’ＡｌｄｅｅｎおよびＢｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９６）Ｔｈｅ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １  ａｎｄ  ２  ａｒｅ  ｂｏｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１）：４９−５３）。
【０００６】
多数のナイセリアタンパク質およびヌクレオチド配列が、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０およびＷＯ００／２２４３０に開示されている。これら４つの出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。株ＭＣ５８由来の保存された配列のデータは、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９−１８１５］に開示され、この内容もまた、本明細書中に参考として援用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）ナイセリアタンパク質のフラグメントを含むタンパク質であって、ここで該フラグメントが、７以上の連続した保存されたアミノ酸から構成され、但し、該タンパク質は、全長ナイセリアタンパク質ではない、タンパク質。
（項目２）前記フラグメントが、２０以上の連続した保存されたアミノ酸から構成される、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）前記保存されたアミノ酸が、少なくとも５０％以上のナイセリア属参照集団において見出される、項目１または２に記載のタンパク質。
（項目４）前記参照集団が、複数の異なるナイセリア種を含み、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含む、項目３に記載のタンパク質。
（項目５）前記参照集団が、複数の異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群を含む、項目４に記載のタンパク質。
（項目６）前記参照集団が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａ、株Ｚ２４９１；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ、株ＮＧ６／８８；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｗ、株Ａ２２；およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、株Ｎｇ  Ｆ６２を含む、項目３または４に記載のタンパク質。
（項目７）前記参照集団が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａ、株Ｚ２４９１；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ、株ＮＧ６／８８；およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｗ、株Ａ２２を含む、項目５に記載のタンパク質。
（項目８）ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０またはＷＯ００／２２４３０に開示されるタンパク質のフラグメントを含む、項目１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
（項目９）ＯＲＦ４、ＯＲＦ４０、ＯＲＦ４６、タンパク質２２５、タンパク質２３５、タンパク質２８７、タンパク質５１９、タンパク質７２６、タンパク質９１９およびタンパク質９５３のうちの１つ以上のフラグメントを含む、項目８に記載のタンパク質。
（項目１０）Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９−１８１５］に開示されるタンパク質のフラグメントを含む、項目１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１１）項目１〜１０のいずれかに記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目１２）医薬品としての使用のための、項目１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質または項目１１に記載の核酸。
（項目１３）ナイセリア細菌に起因する感染を処置または予防するための医薬品の製造における、項目１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質または項目１１に記載の核酸の使用。
（項目１４）多特異的診断試薬の製造における、項目１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質または項目１１に記載の核酸の使用。
（項目１５）以下のアミノ酸配列：
【化１】
2010187700.tif 000002
2010187700.tif 000003
の１つ以上を含む、項目１に記載のタンパク質。
（本発明の記載）
最大の株間認識および反応性を確実にするために、異なるナイセリア種、血清群および株の間で保存されるタンパク質の領域が、使用され得る。従って、本発明は、大部分のナイセリア属、特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに共有されるアミノ酸配列の伸長物を含むタンパク質を提供する。
【０００８】
本発明は、ナイセリアタンパク質のフラグメントを含むタンパク質を提供し、ここで、このフラグメントは、ｎ個の連続した保存されたアミノ酸から構成され、但し、本発明は、その範囲に全長ナイセリアタンパク質を含まない。特定のタンパク質に依存して、ｎは７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）。フラグメントは、好ましくは、ナイセリアタンパク質の抗原性領域または免疫原性領域を含む。
【０００９】
「保存された」アミノ酸とは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａにおいて少なくともｘ％で特定のナイセリアタンパク質に存在する、アミノ酸である。ｘの値は、５０％以上であり得、例えば、６６％、７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％（すなわち、アミノ酸が全Ｎｅｉｓｓｅｒｉａにおいて問題のタンパク質中に見出される）でさえあり得る。
【００１０】
アミノ酸が特定のナイセリアタンパク質に「保存されて」いるか否かを決定するためには、複数の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ由来の問題のタンパク質の配列（「参照集団」）におけるアミノ酸残基を比較することが、必要である。参照集団は、多数の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ種（特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含み得るか、または単一の種を含み得る。参照集団は、特定の種の多数の異なる血清群（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅ）または単一の血清群を含み得る。参照集団はまた、特定の血清群（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂの株ＮＧ６／８８、ＢＺ１９８、ＮＧ３／８８、２９７−０、ＢＺ１４７、ＢＺ１６９、５２８、ＢＺ１３３、ＮＧＥ３１、ＮＧＨ３８、ＮＧＨ１５、ＢＺ２３２、ＢＺ８３、および４４／７６）由来の多数の異なる株を含み得る。好ましい参照集団は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの５つの最も通常の株および／またはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの５つの最も通常の株から構成される。
【００１１】
参照集団は、好ましくは、適切な系統樹（例えば、（ａ）Ｎｉら（１９９２）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  １０９：２２７−２３９（ｂ）Ｗｏｌｆｆら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０：４６５７（ｃ）ＢｙｇｒａｖｅｓおよびＭａｉｄｅｎ（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５２３−５３１（ｄ）Ｃａｕｇａｎｔら（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６９：２７８１−２７９２に開示されるもの）のｋ個の異なる分枝から取られるκ個の株を含む。使用され得る別の系統樹を、本明細書中の図８に示し、そして別のものを図９ｂに示す。
【００１２】
特定の種、血清群または株は、問題のアミノ酸が位置するタンパク質をコードする場合にのみ、参照集団に含まれるべきであることが、理解される。例えば、以下に記載するＯＲＦ４０内のアミノ酸の場合には、参照集団は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含むべきではない。なぜなら、この種はＯＲＦ４０を含まないからである。
【００１３】
従って、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓとＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとの両方に見られるタンパク質について、好ましい参照集団は、以下を含む：
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａ、株Ｚ２９４１
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ、株ＮＧ６／８８
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｗ、株Ａ２２
・Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、株Ｎｇ  Ｆ６２。
【００１４】
これらは、（ａ）Ｓｅｉｌｅｒ  Ａ．ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（４）：８４１−８５６（ｂ）Ｍａｉｄｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３１４０−３１４５（ｃ）Ｖｉｒｊｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１２７１−１２７９（ｄ）Ｄｅｍｐｓｅｙら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：５４７６−５４８６に記載される。
【００１５】
しかし、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのみに見られるタンパク質については、好ましい参照集団は、以下を含む：
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａ、株Ｚ２９４１
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ、株ＮＧ６／８８
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｗ、株Ａ２２。
【００１６】
異なるＮｅｉｓｓｉｅｒｉａｅのアミノ酸配列を、コンピューターを使用して容易に比較し得る。これは、代表的に、ＣＬＵＳＴＡＬ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３−４６８０；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（１９９８）２３：４０３−４０５］、または好ましくは、ＰＩＬＥＵＰ［ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージの一部であり、好ましくは第９．０版］のようなアルゴリズムを使用する、多数の配列の整列を包含する。
【００１７】
保存されたアミノ酸は、複数の配列の整列により、容易に明らかとなる。すなわち、問題のアミノ酸位置において、整列した配列の大部分が、特定のアミノ酸を含む。保存されたアミノ酸は、ＢＯＸＳＨＡＤＥ［例えば、ＮＩＨにおいてオンラインで利用可能］、ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ［ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、第１０版］またはＪＡＬＶＩＥＷ［ＥＢＩにおいてオンラインで利用可能］のようなプログラムを使用することにより、より視覚的に明らかにされ得る。
【００１８】
タンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０またはＷＯ００／２２４３０に開示されるタンパク質のうちの１つのフラグメント、あるいはＴｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９−１８１５］に開示される２１５８ＯＲＦに内の１つのフラグメントを含む。より特定すると、タンパク質は、好ましくは、これらに開示されるＯＲＦ４、ＯＲＦ４０、ＯＲＦ４６、タンパク質２２５、タンパク質２３５、タンパク質２８７、タンパク質５１９、タンパク質７２６、タンパク質９１９およびタンパク質９５３の１つ以上のフラグメントを含む（本明細書中の実施例を参照のこと）。代表的に、本発明のタンパク質は、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、またはＴｅｔｔｅｌｉｎらにまさに開示されるタンパク質配列を含まない。
【００１９】
本発明はまた、図に示される配列のうちの１つを含むタンパク質を提供する。
【００２０】
本発明のタンパク質は、当然ながら、種々の手段（例えば、組換え発現、ネイティブ発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によって、そして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合など）に調製され得る。本発明のタンパク質は、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、他のナイセリアタンパク質または宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）に調製される。
【００２１】
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段によって生成され得る。
【００２２】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明が、これらの核酸に相補的な配列を含む核酸を提供することがまた認識されるべきである（例えば、アンチセンスの目的またはプローブの目的のために）。
【００２３】
さらに、本発明は、実施例において開示され、好ましくは「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ溶液中で、６５℃）でＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００２４】
本発明に従う核酸は、当然ながら、多くの様式（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体からなど）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。
【００２５】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、またそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびにまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００２６】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）およびこのようなベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
【００２７】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体および／または核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、ワクチンとして、例えば、または診断試薬として、あるいは免疫原性組成物として適切であり得る。
【００２８】
本発明はまた、医薬として（例えば、ワクチンとして）または診断試薬としての使用のための本発明に従う核酸、タンパク質または抗体を提供する。これはまた、以下の製造における本発明に従う核酸、タンパク質または抗体の使用を提供する：（ｉ）ナイセリア菌による感染を処置または予防するための医薬；（ｉｉ）ナイセリア菌の存在、またはナイセリア菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／あるいは（ｉｉｉ）ナイセリア菌に対する抗体を惹起し得る試薬。この使用は、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａのすべての種に適用可能である。
【００２９】
ナイセリアタンパク質が、ｑ％を超える保存アミノ酸を含む場合、本発明は、多くの種、血清群および系統間で交叉反応を示す非系統特異的タンパク質としてのナイセリアタンパク質、またはそのフラグメントの使用を提供する。ｑ値は、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％または１００％でさえあり得る。
【００３０】
本発明はまた、患者を処置する方法を提供する。この方法は、本発明に従う核酸、タンパク質および／または抗体の治療上有効な量を患者に投与する工程を包含する。
【００３１】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００３２】
本発明のタンパク質を産生するためのプロセスが提供され、このプロセスは、本発明に従う宿主細胞を、タンパク質発現を誘導する条件下で培養する工程を包含する。
【００３３】
本発明のタンパク質または核酸を産生するためのプロセスが提供され、ここで、このタンパク質または核酸が、化学的手段を使用して、一部または全体が合成される。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスが提供され、このプロセスは、以下：（ａ）本発明に従う核プローブを、二重鎖を形成するハイブリダイズの条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）上記の二重鎖を検出する工程を包含する。
【００３５】
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスが提供され、このプロセスは、（ａ）本発明に従う抗体を、抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）上記の複合体を検出する工程を包含する。
【００３６】
本発明を実施するために（例えば、ワクチン接種または診断目的のために、開示された配列を利用するために）利用され得る、標準的な技術および手順の概要は、以下の通りである。この概要は、本発明に対する限定ではないが、むしろ、使用され得るが必要とはされない例を提供する。
【００３７】
（概論）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物＋学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ｉｉ巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編  １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編  １９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻−第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６）。
【００３８】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、本明細書において使用される。
【００３９】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は参考としてその全体が援用される。特に、国際特許出願ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０およびＷＯ００／２２４３０の内容が、本明細書中で援用される。
【００４０】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも約９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえをも含む。
【００４１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、独占的にＸからなり得るか、またはＸにさらなる何かを含み（ｉｎｃｌｕｄｅ）得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００４２】
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるような場合、それらは共に機能し得る。別の例は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。さらなる例は、天然では見られない配列で単一のタンパク質にアセンブルする、同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００４３】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
【００４４】
「変異」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異配列との間の配列同一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、上記のようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して算出された、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより大きい）。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸配列が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは２番目の単離体のゲノム中の本質的に同じ遺伝子座で生ずる核酸分子または領域であり、そしてこれは、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号を参照のこと）。
【００４５】
（発現系）
ナイセリアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され得る。
【００４６】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る割合を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
【００４７】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広範な宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドを用いて誘導され得る。
【００４８】
上記のプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは逆の（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流もしくは下流に、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置される場合、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらが通常、より広い宿主範囲を有するので、特に有用であり得る。例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）を包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７）。
【００４９】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００５０】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸から構成される単一のペプチドをコードする。アデノウイルス３分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００５１】
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｅｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を方向づけ、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００５２】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数まで複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持することが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００５３】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。
【００５４】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
【００５５】
（ｉｉ  バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下を含む：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌ベクター）；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および生育培地。
【００５６】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００５７】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；操作可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持され得る。
【００５８】
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計され、これらのものとして、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１）が挙げられる。
【００５９】
そのプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、および大腸菌においての選抜ならびに増殖のための複製起点を有する。
【００６０】
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合は、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。発現は調節され得るか、あるいは構成的であり得る。
【００６１】
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００６２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子から由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のような）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞間で保存されると思われるために、ヒトインターフェロンα（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。
【００６３】
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得るか、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合、これらは、分泌され得る。非融合性の外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００６４】
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードしている。
【００６５】
タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｒｅｃｏｎｖｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内であり得；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に操作された制限酵素部位内であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４；９１。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合、そのＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列により５’および３’の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。
【００６６】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、引き続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％〜約５％の間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、方法には、組換えウイルスの同定が必要となる。この発現系の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。ネイティブのウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、これがまた、包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層上にプラーク形成させた。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００６７】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
【００６８】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、上記ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。
【００６９】
次いで、改変した昆虫細胞を、適切な栄養培地で増殖し、これは、その改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現が、誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環し、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給する必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製し得る。適切には、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中に分泌されるか、または昆虫細胞の溶解を生じる任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給する。
【００７０】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。
【００７１】
（ｉｉｉ  植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養物および全植物の遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養物における遺伝子発現の別の例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載されている。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても確認される；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ  ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ  １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編  １９８４  Ｐｉｔｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に確認され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は、以下である；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
【００７２】
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）配列を有する、望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターを、細菌のような元々のクローニング宿主から、所望の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴を、ベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、植物染色体へのアグロバクテリウム媒介転移のためのＴ  ＤＮＡ配列を提供する。異種遺伝子が容易に検出に従順しない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科については、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見られる。
【００７３】
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にする、相同組換え用のためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。さらなる機能をコードしている他のＤＮＡ配列もまた、そのベクターの中に存在し得、当該分野で公知である。
【００７４】
本発明の核酸分子は、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットである。組換え発現カセットは、異種タンパクのコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物５’非翻訳配列、開始コドン（構造遺伝子が開始コドンを備えているかどうかに依存して）、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’および３’末端の固有の制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
【００７５】
異種コード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパクをコードする配列は、そのタンパク質の適切なプロセッシングおよび輸送を可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得るいかなるの配列をも欠いている。大部分については、この転写開始領域は、発芽中に発現および輸送される遺伝子のためのものであるから、輸送を与えるシグナルペプチドを使用することにより、目的のタンパク質の輸送をまた提供し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞から輸送され、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過する。タンパク質が産生された細胞から、このタンパク質が分泌される必要がなくとも、このことは組換えタンパク質の分離および精製を容易にする。
【００７６】
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物細胞におけるものであるために、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのように、宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構よりプロセッシングされる配列を含むかどうかを決定することが望ましい。そのような場合、この「イントロン」領域の部位特異的変異誘発が、偽イントロンコードとしての遺伝的情報の一部の欠失を防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ  ４１：９５−１０５（１９８５）。
【００７７】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に移入するために、マイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５）。この遺伝子物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に移入され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のマトリックスの内部あるいは表面のいずれかに核酸を有する、小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６（大麦胚乳の粒子照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニック大麦を作製することを教示している））。さらに別の導入方法は、他の実体、いずれかのミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の融合可能な脂肪表面体とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００７８】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在中でエレクトロポレートされる。高い電界の強さの電気パルスにより、生体膜を可逆的に通過できるようにし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルス形成する。
【００７９】
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、移入遺伝子を保持する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、さとうきび、甜菜、綿、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞あるいは組織から再生され得る。いくつかの適応した植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ，Ｌｏｔｕｓ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ，Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ，Ｖｉｇｎａ，Ｃｉｔｒｕｓ，Ｌｉｎｕｍ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｍａｎｉｈｏｔ，Ｄａｕｃｕｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ，Ｒａｐｈａｎｕｓ，Ｓｉｎａｐｉｓ，Ａｔｒｏｐａ，Ｃａｐｓｉｃｕｍ，Ｄａｔｕｒａ，Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ，Ｓｏｌａｎｕｍ，Ｐｅｔｕｎｉａ，Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ，Ｍａｊｏｒａｎａ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ，Ｌａｃｔｕｃａ，Ｂｒｏｍｕｓ，Ａｓｐａｒａｇｕｓ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ，Ｎｅｍｅｓｉａ，Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ，Ｐａｎｉｃｕｍ，Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ，Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ，Ｓｅｎｅｃｉｏ，Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ，Ｃｕｃｕｍｉｓ，Ｂｒｏｗａａｌｉａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｌｏｌｉｕｍ，Ｚｅａ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ，Ｓｏｒｇｈｕｍ，およびＤａｔｕｒａ。
【００８０】
再生のための手段は、植物の種によって変化するが、一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織が形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根され得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特に、コーンおよびアルファルファのような種にとって有利である。シュートおよび根は、通常、同時に発生する。効果的な再生は、培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの３つの変数が制御されるならば、再生は十分に再現性がありそして反復可能である。
【００８１】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は分泌されるか、またはこのタンパク質は全植物体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これを回収し得る。あるいは、胚および胚を有さない不完全な種子または他の植物組織を機械的に破壊して、細胞と組織と間の任意の分泌タンパク質を放出させ得る。その混合物を緩衝液に懸濁して、可溶性タンパク質を回収し得る。次いで、慣用的なタンパク質の単離方法および精製方法を使用して、組換えタンパク質を精製する。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターを慣用的な方法により調整して、異種タンパク質の発現および回収を最適化する。
【００８２】
（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し得、これはＲＮＡ合成が始まる近接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、そのため特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列は、存在する場合には通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって転写を増強するかまたは低下し得る。
【００８３】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開番号０  ０３６  ７７６および１２１  ７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
【００８４】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、ある細菌あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌あるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現をもたらすために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開番号０  ２６７  ８５１）。
【００８５】
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対形成によりリボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のためには（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００８６】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ公開番号０  ２１９  ２３７）。
【００８７】
融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内在性の細菌のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結され得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（第Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰＯ公開番号０  ３２４  ６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８）。
【００８８】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位がある。
【００８９】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質についての遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開番号０  ２４４  ０４２）。
【００９０】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、頻繁に、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列が挙げられる。
【００９１】
通常、上記の構成要素（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）において安定に維持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。
【００９２】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（欧州特許公開番号０  １２７  ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【００９３】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含んで、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【００９４】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。
【００９５】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；欧州特許公開番号０  ０３６  ２５９および欧州特許公開番号０  ０６３  ９５３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；欧州特許公開番号０  ０３６  ７７６、欧州特許公開番号０  １３６  ８２９および欧州特許公開番号０  １３６  ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第４，７４５，０５６号）。
【００９６】
外因性ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ2または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；欧州特許公開番号０  ０３６  ２５９および欧州特許公開番号０  ０６３  ９５３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８４／０４５４１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］、［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］。
【００９７】
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このＵＡＳは、調節される（誘導できる）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させるかのいずれかであり得る。
【００９８】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許公開番号０  ２８４  ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許公開番号０  ３２９  ２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１）。
【００９９】
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターを含む（欧州特許公開番号０  １６４  ５５６）。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
【０１００】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【０１０１】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現において、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、欧州特許公開番号０
１９６  ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【０１０２】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コードする。
【０１０３】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開番号０  ０１２  ８７３；日本国公開公報６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許４，５８８，６８４）である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（欧州特許公開番号０  ０６０  ０５７）。
【０１０４】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントは、完全長の、プレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；欧州特許公開番号０  ３２４  ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列および第２の酵母α因子からのプロ領域を用いて作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【０１０５】
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。
【０１０６】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、このことが、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【０１０７】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座を指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
【０１０８】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞がツニカマイシンおよびＧ４１８に耐性になるようにする。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）
あるいは、上記成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーから構成される。
【０１０９】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【０１１０】
酵母宿主中に外来ＤＮＡを導入する方法は当該分野で周知であり、そして通常スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理されたインタクトな酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換手順は、通常、形質転換されるべき酵母の種で変動する。例えば、［Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ］；［Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ］；［Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ］；［Ｃｒｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．こＢａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ］；［Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５；１９２９；Ｉｏｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ］；［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ］；［Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ］。
【０１１１】
（抗体）
本明細書で用いるとき、用語「抗体」は、少なくとも１つの抗体結合部位を含むポリペプチドまたは一群のポリペプチドをいう。「抗体結合部位」は、抗体の抗原との結合を可能にする抗原のエピトープに相補的な内部表面形状および荷電分布をもつ三次元結合空間である。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
【０１１２】
本発明のタンパク質に対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアッセイ、および識別／同定ナイセリアタンパク質に有用である。
【０１１３】
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来法により調製され得る。一般に、タンパク質はまず、適切な動物、好ましくは、マウス、ラット、ウサギまたはヤギを免疫するために用いられる。ウサキおよびヤギが、得られ得る血清の容積に起因するポリクローナル血清の調製、および標識された抗ウサギおよび抗ヤギ抗体の利用可能性のために好適である。一般に、免疫化は、タンパク質を、生理食塩水中、好ましくはフロイントの完全アジュバントのようなアジュバント中に混合またはエマルジョン化すること、およびこの混合物またはエマルジョンを非経口的（一般に皮下または筋肉内）に注射することにより実施される。代表的には、５０−２００μｇ／注射の用量が十分である。一般に、免疫化は、好ましくはフロイントの不完全アジュバントを用いて、生理食塩水中のタンパク質の１回以上の注射により２−６週後ブーストされる。あるいは、当該分野で公知の方法を用いるインビトロ免疫化により抗体を生成し得、これは、本発明の目的には、インビボ免疫化に等価であると考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫した動物をガラスまたはプラスチック容器中に放血すること、この血液を２５℃で１時間インキュベートすること、次いで４℃で２−１８時間インキュベートすることにより得られる。血清は遠心分離（例えば、１，０００ｇ１０分間）により回収される。放血あたり約２０−５０ｍｌがウサギから得られ得る。
【０１１４】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６］の標準的な方法またはその改変法を用いて調製される。代表的には、マウスまたはラットは上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物を放血するより、脾臓（および必要に応じていくつかの大リンパ節）を摘出し、そして単一細胞に解離する。所望であれば、脾臓細胞は、（非特異的接着細胞の除去後）細胞をタンパク質抗原でコートされたプレートまたはウェルに付与することによりスクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、そして懸濁液の残りですすがれない。得られるＢ細胞、またはすべての解離脾臓細胞は、次いで誘導されて骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）中で培養される。得られるハイブリドーマは、制限希釈によりプレートに入れられ、そして免疫化抗原に特異的に結合する（そして非関連抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたＭＡｂを分泌するハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶または中空繊維リアクター中）またはインビボ（マウス中の腹水として）のいずれかで培養される。
【０１１５】
所望であれば、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）は従来技法を用いて標識され得る。適切な標識は、蛍光発色団、発色団、放射活性元素（特に32Ｐおよび125Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合バートナーを有するリガンドを含む。代表的には、酵素は、それらの活性により検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青色色素に変換するその能力により検出される。「特異的結合パートナー」は、例えば、抗原およびそれに特異的になモノクローナル抗体の場合のような、高特異性でリガンド分子を結合し得るタンパク質をいう。その他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡを含み、そして多くのレセプター−リガンド対が当該分野で公知である。上記の記述は、種々の標識を別のクラスにカテゴリー分けすることを意味せず、同じ標識がいくつかの異なる様式で供され得ると理解されるべきである。例えば、125Ｉは、放射活性標識として供され得るか、または電子密度試薬として供され得る。ＨＲＰは、ＭＡｂに対する酵素まは抗原として供され得る。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施における標識を必要とし：従って、ＭＡｂをビオチンで標識し得、そしてその存在を125Ｉで標識されたアビジンで検出するか、またはＨＲＰで標識された抗ビオチンＭＡｂで標識し得る。その他の順列および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で等価であると考えられる。
【０１１６】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。薬学的組成物は、請求項に記載された発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかの治療的有効量を含む。
【０１１７】
本明細書で用いる用語「治療的有効量」は、所望の疾患または状態を処置、軽減、または防ぐため、または検出可能な治療的もしくは予防的効果を示すための治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マーカーまたは抗原レベルにより検出され得る。治療的効果はまた、低下した体温のような肉体的症状における減少を含む。被験体の正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択された治療または治療の組み合わせに依存する。従って、事前に正確な有効量を特定することは有効ではない。しかし、所定の状況に対する有効量は、慣用的な実験により決定することができ、そして臨床医の判断内にある。
【０１１８】
本発明の目的には、有効用量は、投与される個体中、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物であり得る。
【０１１９】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、抗体またはポリペプチド、遺伝子、およびその他の治療剤のような治療剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受けた個体に有害な抗体の産生をそれ自身が誘導しない任意の薬学的キャリアをいい、そして過度の毒性なくして投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは当業者に周知である。
【０１２０】
薬学的に受容可能な塩類、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩類；酢酸塩、プロピオン酸塩，マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩類がその中で用いられ得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）中で入手可能である。
【０１２１】
治療組成物中の薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などのような補助物質が、このようなビヒクル中に存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液いずかのような注射物として調製される；注射の前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁物にある溶液に適切な固体形態もまた調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義内に含まれる。
【０１２２】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は被験体に直接投与され得る。処置されるべき被験体は動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１２３】
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内のいずれかにより達成されるか、または組織の間質内空間に送達される。組成物はまた、病変中に投与され得る。投与のその他の様式は、口腔および肺投与、坐剤、および経真皮または経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用、ニードル、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）。用量処置は単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。
【０１２４】
（ワクチン）
本発明によるワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染後疾患を処置する）のいずれかであり得る。
【０１２５】
このようなワクチンは、免疫化抗原（単数または複数）、免疫原（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）、タンパク質（単数または複数）または核酸を、通常、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自身誘導しない任意のキャリアを含む「薬学的に受容可能なキャリア」と組み合わせて含む。適切なキャリアは、代表的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、（油滴またはリポソームのような）脂質凝集体、および不活性ウイルス粒子のような、大きな、ゆっくり代謝される高分子である。こうのようなキャリアは当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原または免疫原は、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなど病原体からのトキソイドのような細菌トキソイドに結合され得る。
【０１２６】
組成物の有効性を増加するための好適なアジュバントは、制限されずに以下を含む：（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）例えば、（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いて、サブミクロン粒子に処方される、５％スクァレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（必要ではないけれども、必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含む）を含む、ＭＦ５９TM（ＷＯ  ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  第１０章：サブユニットおよびアジュバントアプローチ、Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、（ｂ）１０％スクァレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびサブミクロンエマルジョンに微小流動化されたかボルテックス処理されて大粒子サイズエマルジョンを生成されたかのいずれかのＭＤＰ（以下を参照のこと）を含むＳＡＦ、および（ｃ）２％スクァレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）からなる群からの１つ以上の細菌細胞成分を含むＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）のような、（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のようなその他の特定の免疫刺激剤とともにまたはなしの）水中油形エマルジョン処方物；（３）サポニンアジュバント、例えば、ＳｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｃｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）が用いられ得るか、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれから生成される粒子；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；および（６）組成物の有効性を増大する免疫刺激剤として作用するその物質。ミョウバンおよびＭＦ５９TMが好適である。
【０１２７】
上記のように、ムラミルペプチドは、制限されずに、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含む。
【０１２８】
代表的には、免疫原性組成物（例えば、免疫化抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、水，生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希釈剤を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などのような補助剤がこのようなビヒクル中に存在し得る。
【０１２９】
代表的には、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液いずかのような注射物として調製される；注射の前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁物にある溶液に適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、上記の薬学的に受容可能なキャリアの下で論議されたように、増大されたアジュバント効果のためにリポソーム中にエマルジョン化またはカプセル化され得る。
【０１３０】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原性または免疫性ポリペプチド、および必要に応じて任意のその他の上記成分を含む。「免疫学的に有効な量」は、単回用量であるか、または一連の部分としてのいずれかで個体へのその量の投与が、処置または予防に効果的であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および肉体的状態、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方物、医療状況の処置医の評価，およびその他の関係する因子に依存して変動する。この量は、慣用的な試行により決定され得る、比較的広い範囲にあると予期される。
【０１３１】
免疫原性組成物は、通常、非経口的、すなわち、皮下、筋肉内、または経真皮／経皮下的（例えばＷＯ９８／２０７３４）いずれかの注射により投与される。他の様式の投与に適切なさらなる処方物は、経口および肺処方物、坐剤、および経費適用を含む。投与量処置は、単回用量または複数用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
【０１３２】
タンパク質をベースにしたワクチンの代替として、ＤＮＡワクチン接種が採用され得る［例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ＆Ｔｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；本明細書の後半を参照のこと］。
【０１３３】
（遺伝子送達ビビクル）
哺乳動物中の発現のためにこの哺乳動物に送達される、本発明の治療剤のコード配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的または全身的のいずれかで送達され得る。これらの構築物は、インビボまたはエキソビボ様式のウイルスまたは非ウイルスベクターアプローチを利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異質プロモーターを用いて誘導され得る。インビボにおけるコード配列の発現は、構成的または調節されるかのいずれかであり得る。
【０１３４】
本発明は、意図される核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。好ましくは、この遺伝子送達ビヒクルはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはアルファウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミキソウイルス、パポバウイルス、パラミキソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルスまたはタガウイルスベクターであり得る。一般に、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８−１５３を参照こと。
【０１３５】
レトロウイルスベクターは当該分野で周知であり、そして本発明者らは、Ｂ、ＣおよびＤ型レトロウイルス、異種栄養性レトロウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０）、多種栄養性レトロウイルス、例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスを含む任意のレトロウルイス遺伝子治療ベクターが本発明で採用可能であることを意図する。ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１３６】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスからのｔＲＮＡ結合部位、マウス白血病ウイルスからのパッケージングシグナル、およびトリ白血病ウイルスからの第２鎖合成の起点に由来し得る。
【０１３７】
これらの組換えレトロウイルスベクターを用い、これらを適切なパッケージング細胞株中に導入することにより形質導入コンピテントレトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウルスベクターは、レトロウイルス粒子中へのキメラインテグラーゼ酵素の導入により、宿主細胞ＤＮＡ中への部位特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６を参照のこと）。組換えウイルスベクターは複製欠陥組換えウイルスであることが好ましい。
【０１３８】
上記のレトロウイルスベクターとの使用に適切なパッケージング細胞株は当該分野で周知であり、そして容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３およびＷＯ９２／０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子の産生のための生産体細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製するために用いられ得る。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト血清における不活性化を排除する、ヒト親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製される。
【０１３９】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のための好適なレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞病巣誘導性ウイルス、マウス肉腫ウイルス、網内症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好適なのは、４０７０Ａおよび１５０４Ａ０（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９：１９−２５）、アベルソン（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラフィー、グロス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、キルステン、ハーベイ肉腫ウイルスおよびラウシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）含むマウス白血病ウイルスを含む。このようなレトロウイルスは、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭａｒｙｌａｎｄにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）のような寄託機関またはコレクションから得られ得るか、または従来の技法を用いて既知の供給源から単離され得る。
【０１４０】
本発明で採用可能な例示の公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターは、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、米国特許第４，４０５，７１２号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第４，９８０，２８９号、米国特許第４，４７７７，１２７号、米国特許第５，５９１，６２４号に記載のようなベクターを含む。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９９３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１もまた参照のこと。
【０１４１】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明で採用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１、およびＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明で採用可能な例示の公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、上記の参照文献中、およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４中に記載のベクターを含む。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４中に記載のような死滅させたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与が採用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）ベクターを含む。本発明における使用のための優れたおよび好適な例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＷＯ９３／０９２３９に記載される、ＡＡＶ−２を基礎にしたベクターである。最も好適なＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆末端反復を含み、その中でネイティブなＤ配列が、少なくとも５のネイティブヌクレオチドであって１８までのネイティブなヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドであって１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブなヌクレオチドが保持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失しているか、またはネイティブでないヌクレオチドで置換されているように、ヌクレオチドの置換により改変されている。このＡＡＶ逆末端反復のネイティブなＤ配列は、ＨＰ形成には関与していない、各ＡＡＶ逆末端反復（すなわち、各末端に１つの配列がある）中の２０の連続ヌクレオチドの配列である。このネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置にあるネイティブＤ配列中に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。その他の採用し得る例示のＡＡＶベクターは、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、その両方は、Ｎａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２４：２５７−２６２中に開示されている。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）。別の例示のＡＡＶベクターは、ダブル−Ｄ  ＩＴＲベクターである。ダブル−Ｄ  ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている。なお別のベクターは、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａの米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅの米国特許第５，４７４，９３５号、およびＫｏｔｉｎのＷＯ９４／２８８１５７号に記載されているベクターである。本発明に採用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓で優先的に発現する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４６３−４７０に記載されている。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、米国特許第５，１３７，４１４号、米国特許第５，１３９，９４１号、および米国特許第５，２５２，４７９号に記載されている。
【０１４２】
本発明の遺伝子治療ベクターはまたヘルペスベクターを含む。優れたおよび好適な例は、米国特許第５，２８８，６４１号およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるようなチミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスベクターである。さらなる例示の単純ヘルペスウイルスベクターは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示のＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６７−１６６９中ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５中に記載のｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１−１９に記載のＨＳＶ  Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺおよびＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ）中に記載のＨＳＶ７１３４，２ＲＨ１０５およびＧＡＬ４、ならびに受託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ  ＶＲ−２６０としてＡＴＣＣに寄託されたベクターを含む。本発明で採用され得るベクターにαウイルス遺伝子治療ベクターもまた意図される。好適なαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクター、トガウイルス、セムリキフォレストウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ミドルバーグウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、および米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載のベクターである。より詳細には、１９９５年３月１５日に出願された米国特許出願第０８／４０５，６２７号、ＷＯ９４／２１７９２、ＷＯ９２／１０５７８、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，０９１，３０９号および米国特許第５，２１７，８７９号に記載のようなαウイルスベクターが採用可能である。このようなαウイルスベクターは、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅにあるＡＴＣＣのような寄託機関またはコレクションから得られ得るか、または一般に利用可能な技法を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、低減された細胞傷害性をもつαウイルスベクターが用いられる（米国特許出願第０８／６７９６４０号を参照のこと）。
【０１４３】
真核生物層状発現系のようなＤＮＡベクター系もまた、本発明の核酸を発現するために有用である。真核生物層状発現系の詳細な記載についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系は、αウイルスベクターから、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
【０１４４】
本発明における使用に適切なその他のウイルスベクターは、例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８およびＥａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １：１１５に記載のようなポリオウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｌ４０１に記載のようなリノウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ  ＶＲ−２０１０およびＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および米国特許第４，７６９，３３０号およびＷＯ８９／０１９７３中に記載のような、カナリーポックスウイルスのようなポックスウイルスまたはワクチニアウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：１５３３に記載のようなＳＶ４０ウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号中およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８７：３８０２−３８０５；Ｅｎａｍｉ＆Ｐａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５９：１１０（ＭｃＭｅｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ  Ｍｅｄ  ３０９：１３、およびＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）中に記載のような逆遺伝子技法を採用して作製された組換えインフルエンザウイルスのインフルエンザウイルス；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載のようなヒト免疫不全ウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７およびＥＰ−０４４０２１９に記載のような麻疹ウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８であるアウラウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０であるベバルウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２であるカバスウイルス；例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１であるチクングニヤウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４であるフォートモルガンウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３であるゲタウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７であるキジラガクウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６であるマヤロウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４であるムカンボウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１であるヌジュムウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５であるピクスナウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５であるトナテウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９であるトリニチウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４であるウナウイルス；例えば，ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６であるワタロ���ウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５であるＹ−６２−３３ウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２であるオニョンオニョンウイルス、東部脳炎ウイルス；例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２である西部脳炎ウイルス；ならびに、例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １２１：１９０に記載のようなコロナウイルスを含む。
【０１４５】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したポリカチオン性縮合ＤＮＡかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：１５８１−１５８５に記載される。
【０１４６】
粒子媒介遺伝子移入が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０：２５３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン、のような重合ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。
【０１４７】
裸のＤＮＡもまた、宿主細胞を形質転換するために使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。
【０１４８】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ−５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）のような合成遺伝子移入分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、手動の遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）が挙げられる。
【０１４９】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７６：４２０に記載されるものである。
【０１５０】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量の遺伝子治療ビヒクル（この用語は上記に定義されるとおりである）を含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１５１】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接）；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１５２】
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）もしくは経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、静脈内、または筋肉内の注射によって、あるいは組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、腫瘍または病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと。
【０１５３】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。
【０１５４】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
【０１５５】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
【０１５６】
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。
【０１５７】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
薬学的組成物に包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１５８】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに薬学的化合物に含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥデキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）が、薬学的化合物中に含有され得る。
【０１５９】
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
【０１６０】
脂質カプセル化は、一般的に核酸もしくはタンパク質に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉および維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
【０１６１】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１６２】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームは、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用する容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１６３】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが含まれる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１６４】
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（ＳＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９２：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ  １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１６６を参照のこと。
【０１６５】
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドと共に含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドと共に含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
【０１６６】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。
【０１６７】
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
【０１６８】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２４６５；およびＵｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：２３２に記載されている。
【０１６９】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造において補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１７０】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、ＷＯ９８／０６４３７に見い出され得る。
【０１７１】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
【０１７２】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれも有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１７３】
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を含む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１７４】
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
【０１７５】
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
【０１７６】
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTMは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
【０１７７】
（免疫診断アッセイ）
本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る（または、逆に抗Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗体は抗原レベルを検出するために使用され得る）。充分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質に対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれらは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、または免疫沈降であり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイはまた公知であり；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）である。
【０１７８】
免疫診断に適切でありそして適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびにアッセイの説明書の適切なセットと共に、本発明の組成物を含む適切な物質を詰めることによって構築される。
【０１７９】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会合をいう。代表的には、一方の配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、この２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触して配置される。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
【０１８０】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１８１】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブと検出される配列との間の相同性である。研究されるフラグメントの総量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピーの遺伝子については１０-9〜１０-8ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露回数、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い比活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして１０8ｃｐｍ／μｇのプローブを用いて４〜８時間ハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０8ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間曝露時間を生じる。
【０１８２】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはそのフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の通常直面する変数としては、ハイブリダイズする配列の長さおよび総Ｇ＋Ｃ含量、ならびにハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度およびホルムアミド含量が挙げられる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ10Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、そしてｎは塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４からわずかに改変した）。
【０１８３】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少につれて増大する。
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、ホルムアミド含量が低くされ、そして上記の式を用いてそれに応じて温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、いずれもストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び曝露され得る。曝露のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１Ａ】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ａ−１】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ａ−２】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｂ】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｂ−１】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｂ−２】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｃ】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｃ−１】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｃ−２】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｄ】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図１Ｄ−１】図１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した（ＢＯＸＳＨＡＤＥ−ｒｅｎｄｅｒｅｄ）整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ａ】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ａ−１】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ｂ】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ｂ−１】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ｂ−２】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ｃ】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図２Ｃ−１】図２は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図３Ａ】図３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図３Ａ−１】図３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図３Ｂ】図３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図３Ｂ−１】図３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図３Ｃ】図３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図４Ａ】図４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図４Ａ−１】図４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図４Ｂ】図４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図４Ｂ−１】図４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図５】図５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図５−１】図５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図５−２】図５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図６Ａ】図６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図６Ａ−１】図６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図６Ａ−２】図６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図６Ｂ】図６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図６Ｂ−１】図６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図６Ｂ−２】図６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ａ】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ａ−１】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ｂ】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ｂ−１】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ｃ】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ｃ−１】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ｄ】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図７Ｄ−１】図７は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。保存されたアミノ酸は、黒い背景を有する。
【図８】図８は、系統樹を示す。
【図９ａ】図９Ａは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ内の、ＯＲＦ４、ＯＲＦ４０、２２５、２３５、２８７、５１９および９１９についてのアミノ酸配列の変異性を図示する。これらの配列を用いて、図９Ｂに示した系統樹を構築した。
【図９ｂ】図９Ａは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ内の、ＯＲＦ４、ＯＲＦ４０、２２５、２３５、２８７、５１９および９１９についてのアミノ酸配列の変異性を図示する。これらの配列を用いて、図９Ｂに示した系統樹を構築した。
【図１０Ａ】図１０は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１０Ａ−１】図１０は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１０Ｂ−１】図１０は、ＯＲＦ４の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ａ】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ａ−１】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ｂ−１】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ｃ】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ｃ−１】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ｄ】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１１Ｄ−１】図１１は、ＯＲＦ４０の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１２Ａ】図１２は、ＯＲＦ４６の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１２Ａ−１】図１２は、ＯＲＦ４６の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１２Ａ−２】図１２は、ＯＲＦ４６の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、ＯＲＦ４６の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１３Ａ】図１３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１３Ａ−１】図１３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１３Ｂ−１】図１３は、２２５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１４Ａ】図１４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１４Ａ−１】図１４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、２３５の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ａ】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ａ−１】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｂ−１】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｃ】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｃ−１】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｄ】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｄ−１】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１５Ｅ】図１５は、２８７の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１６Ａ】図１６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１６Ａ−１】図１６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１６Ｂ】図１６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１６Ｂ−１】図１６は、５１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１７】図１７は、７２６の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１７−１】図１７は、７２６の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１８Ａ】図１８は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１８Ａ−１】図１８は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１８Ｂ】図１８は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１８Ｂ−１】図１８は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１８Ｃ】図１８は、９１９の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１９】図１９は、９５３の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図１９−１】図１９は、９５３の、ＢＯＸＳＨＡＤＥで表示した整列を示す。
【図２０Ａ】図２０は、ＯＲＦ４、２２５、２３５、５１９および９１９についてのウェスタンブロットを示す。
【図２０Ｂ】図２０は、ＯＲＦ４、２２５、２３５、５１９および９１９についてのウェスタンブロットを示す。
【図２０Ｃ】図２０は、ＯＲＦ４、２２５、２３５、５１９および９１９についてのウェスタンブロットを示す。
【図２０Ｄ】図２０は、ＯＲＦ４、２２５、２３５、５１９および９１９についてのウェスタンブロットを示す。
【図２０Ｅ】図２０は、ＯＲＦ４、２２５、２３５、５１９および９１９についてのウェスタンブロットを示す。
【実施例】
【０１８５】
（実施例）
（実施例１）
ＷＯ９９／３６５４４の実施例１は、「ＯＲＦ４０」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が開示され、そして完全なタンパク質配列は、６０１アミノ酸（ａａ）の重複部分にわたり８３．７％の同一性を示す。
【０１８６】
ＯＲＦ４０をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２１個の株の参照集団について配列決定した。
【０１８７】
【表１】
2010187700.tif 000004
これらの２１個の配列の整列を図１に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかである。例えば、最初の１７のアミノ酸は保存される（ＭＮＫＩＹＲＩＩＷＮＳＡＬＮＡＷＶ）が、残基１１のセリンは、１００％のＮｅｉｓｓｅｒｉａには存在しない。この後に保存されないアミノ酸があり、次いで、この後に、１６の保存されたアミノ酸の範囲（ＶＳＥＬＴＲＮＨＴＫＲＡＳＡＴＶ）がある。タンパク質のＣ末端は、１１６の保存されたアミノ酸からなる。
【０１８８】
本実施例において同定された保存領域は、全長ＯＲＦ４０タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０１８９】
ＯＲＦ４０を、合計で３１個の株について再配列決定し、そしてこの配列を整列させた。この結果を図１１に示す。
【０１９０】
特に興味深い保存領域は以下である：
【０１９１】
【化２】
2010187700.tif 000005
（実施例２）
ＷＯ９９／２４５７８の実施例２６は、「ＯＲＦ４」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と共に開示される。アミノ酸レベルでの配列の間の同一性は以下である：
【０１９２】
【表２】
2010187700.tif 000006
ＯＲＦ４をＮｅｉｓｓｅｒｉａの３２個の株の参照集団について配列決定した：
【０１９３】
【表３】
2010187700.tif 000007
2010187700.tif 000008
ＰＩＬＥＵＰを用いて生成した配列の整列を図２に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかである。例えば、最初の３４のアミノ酸は保存されるが、残基２６のセリンは、１００％のＮｅｉｓｓｅｒｉａには存在しない。タンパク質のＣ末端は、２２８の保存されたアミノ酸からなる。
【０１９４】
本実施例において同定された保存領域は、全長ＯＲＦ４タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０１９５】
ＯＲＦ４を、合計で３５個の株について再配列決定し、そしてこの配列を整列させた。この結果を図１０に示す。
【０１９６】
特に興味深い保存領域は以下である：
【０１９７】
【化３】
2010187700.tif 000009
（実施例３）
ＷＯ９９／５７２８０の実施例１６は、「２２５」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と共に開示される。
【０１９８】
２２５を、ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの３４個の株の参照集団について配列決定した：
【０１９９】
【表４】
2010187700.tif 000010
2010187700.tif 000011
ＰＩＬＥＵＰを用いて生成した配列の整列を図３に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかである。例えば、最初の７４のアミノ酸は保存されるが、残基５１のイソロイシンは、１００％のＮｅｉｓｓｅｒｉａには存在しない。タンパク質のＣ末端は、１４８の保存されたアミノ酸からなる。類似の整列を図１３に示す。
【０２００】
本実施例において同定された保存領域は、全長２２５タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０２０１】
（実施例４）
ＷＯ９９／５７２８０の実施例１６は、「２３５」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と共に開示される。
【０２０２】
２３５を、ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの３１個の株の参照集団について配列決定した：
【０２０３】
【表５】
2010187700.tif 000012
2010187700.tif 000013
ＰＩＬＥＵＰを用いて生成した配列の整列を図４に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかである。タンパク質は完全に保存されるが、残基１６８のセリンは、いくつかの変化を示す。
【０２０４】
本実施例において同定された保存領域は、全長２３５タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０２０５】
２３５を、合計で３５個の株について再配列決定し、そしてこの配列を整列させた。この結果を図１４に示す。
【０２０６】
（実施例５）
ＷＯ９９／５７２８０の実施例１６は、「２８７」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と共に開示される。
【０２０７】
２８７を、ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの６個の株の参照集団について配列決定した：
【０２０８】
【表６】
2010187700.tif 000014
ＰＩＬＥＵＰを用いて生成した配列の整列を図５に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかである。例えば、最初の４２のアミノ酸は十分に保存され、長い保存領域がＣ末端に見られ得る。
【０２０９】
本実施例において同定された保存領域は、全長２８７タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０２１０】
２８７を、合計で３５個の株（Ｃ１１（Ｃ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株）を含む）について再配列決定し、そしてこの配列を整列させた。この結果を図１５に示す。
【０２１１】
特に興味深い保存領域は以下である：
【０２１２】
【化４】
2010187700.tif 000015
（実施例６）
ＷＯ９９／５７２８０の実施例１６は、「５１９」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と共に開示される。
【０２１３】
５１９をＮｅｉｓｓｅｒｉａの２２個の株の参照集団について配列決定した：
【０２１４】
【表７】
2010187700.tif 000016
2010187700.tif 000017
ＰＩＬＥＵＰを用いて生成した配列の整列を図６に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかであり、そしてタンパク質はその完全な長さに沿った保存を示す。
【０２１５】
本実施例において同定された保存領域は、全長５１９タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０２１６】
５１９を、合計で３３個の株について再配列決定し、そしてこの配列を整列させた。この結果を図１６に示す。
【０２１７】
特に興味深い保存領域は以下である：
【０２１８】
【化５】
2010187700.tif 000018
（実施例７）
ＷＯ９９／５７２８０の実施例１６は、「９１９」といわれるナイセリアタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。Ａ血清型およびＢ血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と共に開示される。
【０２１９】
９１９を、ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの３５個の株の参照集団について配列決定した：
【０２２０】
【表８】
2010187700.tif 000019
2010187700.tif 000020
ＰＩＬＥＵＰを用いて生成した配列の整列を図７に示す。別の整列を図１８に示す。保存されたアミノ酸の範囲は明らかである。タンパク質は、ほとんど完全な保存を示す。
【０２２１】
本実施例において同定された保存領域は、全長９１９タンパク質のフラグメントが、多特異性ワクチンまたは診断薬として適切であることを確認する。
【０２２２】
特に興味深い保存領域は以下である：
【０２２３】
【化６】
2010187700.tif 000021
（実施例８）
ＷＯ９９／２３５７８の実施例５５は、「ＯＲＦ４６」といわれるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。血清型ＡおよびＢ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列を、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と一緒に開示する。
【０２２４】
全長ＯＲＦ４６を、血清型Ｂの６つの菌株の参照集団について配列決定した。これらの配列の整列を図１２に示し、これから保存性アミノ酸の伸展が明らかである。
【０２２５】
目的の特定の保存領域は以下である：
【０２２６】
【化７】
2010187700.tif 000022
ＯＲＦ４６における保存領域は、このタンパク質のフラグメントが多重特異性ワクチンまたは診断試薬として適切であることを確証する。
【０２２７】
（実施例９）
ＷＯ９９／５７２８０は、「７２６」といわれるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。血清型ＡおよびＢ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列を開示する。
【０２２８】
７２６を、血清型Ａ、ＢおよびＣにおける７つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の参照集団について配列決定した。これらの配列の整列を図１７に示し、これから保存性アミノ酸の伸展が明らかである。
【０２２９】
目的の特定の保存性領域は以下である：
【０２３０】
【化８】
2010187700.tif 000023
７２６における保存性領域は、このタンパク質のフラグメントが多重特異性ワクチンまたは診断試薬として適切であることを確証する。
【０２３１】
（実施例１０）
ＷＯ９９／５７２８０は、「９５３」といわれるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌタンパク質のクローニングおよび発現を開示する。血清型ＡおよびＢ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質およびＤＮＡ配列を、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列と一緒に開示する。
【０２３２】
９５３を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、ＢおよびＣの８つの菌株の参照集団について配列決定した。これらの配列の整列を図１９に示し、これから保存性アミノ酸の伸展が明らかである。このタンパク質は、十分に保存性である。
【０２３３】
目的の特定の保存性領域は以下である：
【０２３４】
【化９】
2010187700.tif 000024
９５３における保存性領域は、このタンパク質のフラグメントが多重特異性ワクチンまたは診断試薬として適切であることを確証する。
【０２３５】
（系統樹）
図８は、６つの遺伝子フラグメントのＭＬＳＴ［Ｍａｉｄｅｎら（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：３１４０から採用］に基づく、１０７のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の間の遺伝的関係を示す樹状図である。この樹状図は、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ血清型Ｂ（矢印）の代表的な菌株を選択するために使用され得る。５つの付加的な菌株（これについて、高度に病原性の系統に対する遺伝的指示（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）が、Ｗａｎｇら［Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ（１９９３）１６７：１３２０］、Ｓｅｉｌｅｒら［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）１９：８４１］、およびＶｉｒｊｉら［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：１２７１］によって独立して決定される）を、この樹状図上に上書きし、そしてアスタリスクによって示す。ＭｅｎＢの２２の菌株に加えて、ＭｅｎＡの３つの菌株、ＭｅｎＣの２つの菌株、およびＭｅｎ  Ｙ、Ｘ、ＺおよびＷ１３５の各菌株の１つを使用した。これらを、名前の前に太字の文字で示した。系統発生データが入手できない場合、菌株を樹の外側に示した。高度に病原性の菌株ＥＴ−５、ＥＴ−３７およびＩＶ−１を示した。
【０２３６】
（配列の可変性）
図９ａは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの、タンパク質２２５、２３５、２８７、５１９、９１９、ＯＲＦ４およびＯＲＦ４０についてのアミノ酸配列の可変性の概略表示である。横軸は、ＭＣ５８の配列を表す。ＭｅｎＢ菌株内のアミノ酸の差異を、横軸の上の垂直の線によって示す；血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｘ、ＺおよびＷ１３５内の差異を、この軸の下の線によって示す。この垂直の線の高さは、アミノ酸の差異を有する菌株の数を表す。従って、ピークは可変領域を示す。２２５および２８７の下のバンドは、いくつかの菌株から欠けている配列セグメントを表す。
【０２３７】
図９ｂは、同様の７つのタンパク質を使用して得られたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の樹状図である。これらの遺伝子に基づく発生系統分析は、図８に従って高度に病原性の菌株をクラスター化する樹状図を提供する。棒は、ＭＬＳＴ分析に従って１００％のブートストラップサポートをクラスター化する菌株を示す。各節の底部にある数字は、ブートストラップスコア（８０％より大きなものだけを示す）である。異なる菌株由来の遺伝子配列を、ＧＣＧパッケージからのプログラムＰＩＬＥＵＰで整列した。この系統発生分析を、ＰＨＹＬＩＰパッケージのＮＥＩＧＨＢＯＲプログラムにおいて実行される隣接接合アルゴリズム（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）［Ｓａｉｔｏｕ  ＆  Ｎｅｉ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６］を使用して行った。対合させた距離を、Ｋｉｍｕｒａ−２パラメータ［Ｋｉｍｕｒａ（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：１１１］を、３１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株上で使用して計算した。ＯＲＦ４０のＮ末端領域、２８７全体、および２５５の直列の反復を、分析から排除した。合計１０００のブートストラップ複製物を、サポートのレベルについて評価した。高度に病原性の菌株のクラスター化を、最大節減分析（ｍａｘｉｍｕｍ  ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって確認した。
【０２３８】
（ウエスタンブロット）
抗原ＯＲＦ４、２２５、２３５、５１９および９１９を、種々の菌株についてウエスタンブロットによって分析した。その結果を図２０に示す。２２５の場合、このブロットは異なる菌株における異なるサイズのフラグメントを示し、矢印は正確なサイズのバンドを示す。２２５は、規定された反復の欠失および挿入の領域を含み、そしてこのブロット上のフラグメントのサイズは、遺伝子可変性データに一致する。
【０２３９】
図２０について使用した菌株は、以下である：
【０２４０】
【表９】
2010187700.tif 000025
本発明は、実施例のみによって記載され、そして本発明の精神および範囲にある間は改変がなされ得ることが理解される。
【図１Ａ】
2010187700.tif 000026
【図１Ａ−１】
2010187700.tif 000027
【図１Ａ−２】
2010187700.tif 000028
【図１Ｂ】
2010187700.tif 000029
【図１Ｂ−１】
2010187700.tif 000030
【図１Ｂ−２】
2010187700.tif 000031
【図１Ｃ】
2010187700.tif 000032
【図１Ｃ−１】
2010187700.tif 000033
【図１Ｃ−２】
2010187700.tif 000034
【図１Ｄ】
2010187700.tif 000035
【図１Ｄ−１】
2010187700.tif 000036
【図２Ａ】
2010187700.tif 000037
【図２Ａ−１】
2010187700.tif 000038
【図２Ｂ】
2010187700.tif 000039
【図２Ｂ−１】
2010187700.tif 000040
【図２Ｂ−２】
2010187700.tif 000041
【図２Ｃ】
2010187700.tif 000042
【図２Ｃ−１】
2010187700.tif 000043
【図３Ａ】
2010187700.tif 000044
【図３Ａ−１】
2010187700.tif 000045
【図３Ｂ】
2010187700.tif 000046
【図３Ｂ−１】
2010187700.tif 000047
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2010187700.tif 000049
【図４Ａ−１】
2010187700.tif 000050
【図４Ｂ】
2010187700.tif 000051
【図４Ｂ−１】
2010187700.tif 000052
【図５】
2010187700.tif 000053
【図５−１】
2010187700.tif 000054
【図５−２】
2010187700.tif 000055
【図６Ａ】
2010187700.tif 000056
【図６Ａ−１】
2010187700.tif 000057
【図６Ａ−２】
2010187700.tif 000058
【図６Ｂ】
2010187700.tif 000059
【図６Ｂ−１】
2010187700.tif 000060
【図６Ｂ−２】
2010187700.tif 000061
【図７Ａ】
2010187700.tif 000062
【図７Ａ−１】
2010187700.tif 000063
【図７Ｂ】
2010187700.tif 000064
【図７Ｂ−１】
2010187700.tif 000065
【図７Ｃ】
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【図７Ｃ−１】
2010187700.tif 000067
【図７Ｄ】
2010187700.tif 000068
【図７Ｄ−１】
2010187700.tif 000069
【図８】
2010187700.tif 000070
【図９ａ】
2010187700.tif 000071
【図９ｂ】
2010187700.tif 000072
【図１０Ａ】
2010187700.tif 000073
【図１０Ａ−１】
2010187700.tif 000074
【図１０Ｂ】
2010187700.tif 000075
【図１０Ｂ−１】
2010187700.tif 000076
【図１１Ａ】
2010187700.tif 000077
【図１１Ａ−１】
2010187700.tif 000078
【図１１Ｂ】
2010187700.tif 000079
【図１１Ｂ−１】
2010187700.tif 000080
【図１１Ｃ】
2010187700.tif 000081
【図１１Ｃ−１】
2010187700.tif 000082
【図１１Ｄ】
2010187700.tif 000083
【図１１Ｄ−１】
2010187700.tif 000084
【図１２Ａ】
2010187700.tif 000085
【図１２Ａ−１】
2010187700.tif 000086
【図１２Ａ−２】
2010187700.tif 000087
【図１２Ｂ】
2010187700.tif 000088
【図１３Ａ】
2010187700.tif 000089
【図１３Ａ−１】
2010187700.tif 000090
【図１３Ｂ】
2010187700.tif 000091
【図１３Ｂ−１】
2010187700.tif 000092
【図１４Ａ】
2010187700.tif 000093
【図１４Ａ−１】
2010187700.tif 000094
【図１４Ｂ】
2010187700.tif 000095
【図１５Ａ】
2010187700.tif 000096
【図１５Ａ−１】
2010187700.tif 000097
【図１５Ｂ】
2010187700.tif 000098
【図１５Ｂ−１】
2010187700.tif 000099
【図１５Ｃ】
2010187700.tif 000100
【図１５Ｃ−１】
2010187700.tif 000101
【図１５Ｄ】
2010187700.tif 000102
【図１５Ｄ−１】
2010187700.tif 000103
【図１５Ｅ】
2010187700.tif 000104
【図１６Ａ】
2010187700.tif 000105
【図１６Ａ−１】
2010187700.tif 000106
【図１６Ｂ】
2010187700.tif 000107
【図１６Ｂ−１】
2010187700.tif 000108
【図１７】
2010187700.tif 000109
【図１７−１】
2010187700.tif 000110
【図１８Ａ】
2010187700.tif 000111
【図１８Ａ−１】
2010187700.tif 000112
【図１８Ｂ】
2010187700.tif 000113
【図１８Ｂ−１】
2010187700.tif 000114
【図１８Ｃ】
2010187700.tif 000115
【図１９】
2010187700.tif 000116
【図１９−１】
2010187700.tif 000117
【図２０Ａ】
2010187700.tif 000118
【図２０Ｂ】
2010187700.tif 000119
【図２０Ｃ】
2010187700.tif 000120
【図２０Ｄ】
2010187700.tif 000121
【図２０Ｅ】
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