(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍の治療、とりわけ転移性黒色腫を治療するための細胞治療方法を提供する。【解決手段】腫瘍の表面上の腫瘍抗原の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−αを、黒色腫を伴う被験体に投与すること、および、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種することの段階を含んで成る、前記被験体の細胞治療方法、並びに前記細胞傷害性Ｔリンパ球を得る方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．腫瘍の表面上の腫瘍抗原の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−αを、黒色腫を伴う被験体に投与すること；および
ｂ．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ、有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種すること
の段階を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【請求項２】
黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球のインビボ維持を高めることが可能である有効量のインターロイキン−２を前記被験体に投与することの段階をさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
インターフェロン−αが、インターフェロン−α−２ａもしくはインターフェロン−α−２ｂから選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
インターフェロン−αの有効量が１０ＭＵ／ｍ２／日であり、かつ、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して該被験体に皮下投与される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球の有効量が、注入あたり１〜１０×１０９個の細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球が：
ａ）天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは前記黒色腫と関連する１５までの異なるエピトープを同時に提示することが可能であり、かつ、各エピトープは長さ８ないし１０アミノ酸のペプチドであり）；
ｂ）前記黒色腫と関連する１５までの異なるエピトープをｎｎＡＰＣに添加すること；
ｃ）前記被験体からＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｄ）前記ＣＤ８＋細胞を、エピトープを添加されたｎｎＡＰＣ細胞系で刺激して黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を得ること；
ｅ）黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；
ｆ）前記被験体から収集されたＣＤ８枯渇末梢血単球を、ｎｎＡＰＣ添加に使用された各エピトープと混合すること；
ｇ）前記ＣＤ８枯渇末梢血単球をγ線放射で照射すること；
ｈ）接着性のＣＤ８枯渇末梢血単球を単離すること；
ｉ）前記接着性末梢血単球に、ｎｎＡＰＣ添加に使用された各エピトープを添加すること；
ｊ）黒色腫に特異的な前記ＣＤ８＋細胞を、エピトープ添加された接着性末梢血単球で再刺激すること；
ｋ）黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する地中で成長させること；ならびに
ｌ）黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＯＫＴ３抗体刺激により増大させること
の段階を含んで成る方法により得られる、請求項２記載の方法。
【請求項７】
段階（ｊ）を最低もう１回反復することができる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記天然に存在しない抗原提示細胞系が、チロシナーゼ、ｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１由来のペプチドであるエピトープを添加される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記天然に存在しない抗原提示細胞系が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含んで成るエピトープを添加される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
インターロイキン−２の有効量が３ＭＩＵ／日であり、かつ、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種した後第０日から第２８日まで連続して被験体に皮下投与される、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
該方法が２ヶ月の間隔で反復される、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
該方法が、最低２周期の間反復され、かつ、各周期後に前記被験体における応答を評価することの段階をさらに含んで成る、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ａ．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して、前記被験体に１０ＭＵ／ｍ２／日のインターフェロン−α−２ｂを皮下投与すること；
ｂ．注入あたり１〜１０×１０９個の細胞の、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に導入すること；および
ｃ．導入段階後第０日から第２８日まで連続して３ＭＩＵ／日のインターロイキン−２を被験体に皮下投与すること
の段階を含んで成る、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年２月１９日出願のＬｅＴｕｒｃｑらへの「腫瘍の治療のための細胞治療方法（Ａ  ＣＥＬＬ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ）」と題された米国特許出願第１０／０８０，０１３号明細書（これは順に米国仮出願第６０／２７０，２５２号明細書からの優先権を主張する）の一部継続出願であり、これらの出願の内容はこれによりそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
本発明は、腫瘍の治療のための細胞治療方法に関する。とりわけ、本発明は、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつエクスビボで生成された自己Ｔリンパ球を使用する黒色腫の治療レジメンに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、治療の領域でなされたかなりの進歩にもかかわらず大きな健康の問題であり続けている。化学療法、放射線治療、外科的介入および三者の組合せという標準的治療レジメンは、永続する治癒を生じさせることにしばしば失敗する。多くの場合、治療を受けた癌患者は、しばしば、いくらかの時間の期間の後に疾患状態に戻り、問題をさらに悪化させる。
【０００３】
癌治療の発展を複雑にする別の要因は、癌が単一の生物学的作用物質もしくは因子によってではなく、しかしむしろ作用物質および因子の組合せにより引き起こされることが見出されたことである。単一の原因物質もしくは事象が治療の焦点である大部分の医学的治療と異なり、癌治療は複数の生物学的因子を取り扱うことを必要とする。
【０００４】
近年、研究は患者自身の免疫系を利用する癌治療を開発することに向けられている。１つのこうしたアプローチは養子免疫療法である。養子免疫療法は、腫瘍もしくは癌細胞を治療する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成させるために患者自身の細胞を使用することを要する。
【０００５】
黒色腫は免疫応答を導き出すその潜在性について知られ、かつ、化学療法およびホルモン療法のような全身治療の現在使用されるレジメンに抵抗性であるため、免疫療法レジメンの大部分の前臨床および臨床試験はこの悪性病原を標的とする。黒色腫は重大な健康上の問題である。過去４０年にわたって、黒色腫の発生率は、いかなる他の型の癌よりも大きい速度で増大してきた。大部分の黒色腫は慣例の外科切除により管理されるとは言え、外科的摘除が容易にできない悪性黒色腫を伴う患者にとって、治療の選択肢は制限される。ダカルバジンは播種性黒色腫において選択すべき薬物のままであるが、しかし寛解は通常長続きしない。インターロイキンおよび生物化学療法が良好な結果を生じているが、しかし、この治療の恩恵を受ける患者の割合は小さい。高用量インターフェロンは若干の患者で生存率を増大させるとは言え、インターフェロンは容易に耐えられない論争の薬物のままである。連続的化学療法が見込みを有するが、しかし、転移性黒色腫に罹っている個体のための現在の治療の選択肢は満足できない。
【０００６】
転移性黒色腫を治療するための現在の免疫療法のアプローチは、単独で、または外因性のサイトカイン、遺伝子改変された腫瘍細胞、定義されるペプチドを添加された樹状細胞、もしくは内的にプロセシングされたタンパク質由来の抗原エピトープの完全な相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を提示する樹状細胞と組合せの、黒色腫関連ペプチドの投与を包含する。これらのアプローチは、該疾患を治癒させる努力においてＴおよび／もしくはＢ細胞応答を高めることを試みる。これらのアプローチは、ヒト患者の実現可能な臨床治療
レジメンとして大部分は証明されないままである。ＣＴＬを免疫化するための適正なエピトープを同定するという問題のほかに、現在のアプローチは、複数の抗原に十分に標的を定めて癌を効果的に治療するために、ＡＰＣへの十分な数の多様なエピトープの提示方法を提供しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腫瘍の治療のための細胞治療方法を提供することにより、満たされていない必要性を満たす。とりわけ、本発明は、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ、エクスビボで生成された自己Ｔリンパ球を使用する黒色腫の治療レジメンに関する。特定の時間および用量でのＩＦＮ−αもしくはＩＬ−２、または双方のサイトカインのいずれかの付随する投与が、抗原特異的Ｔ細胞による溶解のための腫瘍細胞のプライミング、およびＣＴＬのインビボ持続性に利益を与える可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、１０もしくはそれ以上までの異なるペプチドを同時に提示することが可能な天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）、ｎｎＡＣＰの製造方法、癌、とりわけ悪性黒色腫の治療のための前記ｎｎＡＣＰの使用方法を提供する。
【０００９】
第一の局面において、本発明は：
天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは、ウイルス感染と関連する約１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、前記ペプチド分子はそれぞれが長さ約６ないし１２アミノ酸であり）；
被験体もしくは適するドナーからＣＤ８＋細胞を収集すること；
前記ＣＤ８＋細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
馴化成長培地（ＣＧＭ）もしくはＩＬ−２、ＩＬ−７よりなる群から選択されるサイトカインを含有する培地に該ＣＤ８＋細胞を加えること（前記サイトカインは個別にもしくは組合せで使用することができ）；
前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球もしくはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約１ないし５０μｇ／ｍｌの、該ｎｎＡＰＣが同時に提示することができるペプチドの１種と混合すること；
該末梢血単球懸濁物を、所望の末梢血単球を除く懸濁物中の全部の成分を無効にする（ｓｔｅｒｉｌｉｚｅ）のに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること；
接着性末梢血単球を単離すること；
該接着性末梢血単球に、約１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの各ペプチドを添加すること；
ＣＤ８＋細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で接着性末梢血単球と組合せること；および
被験体にＣＤ８＋懸濁物を導入すること
を含んで成る、被験体における前記ウイルス感染の治療方法に関する。
【００１０】
本方法の一態様において、ｎｎＡＰＣは約１０までのペプチド分子を提示することが可能であり、および、好ましくは、該ペプチド分子は長さが約８ないし１０アミノ酸である。好ましくは、該分子は約１０ｎＭないし１００μＭの濃度範囲にある。また、好ましくは、サイトカイン成分はＩＬ−２もしくは組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７である。本方法の別の態様において、γ線放射の線量は約３，０００ないし７，０００ラド、および好ましくは約５，０００ラドである。
【００１１】
本発明はまた：
腫瘍の表面上の腫瘍抗原の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−α
を、黒色腫を伴う被験体に投与すること；および、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種すること
の段階を含んで成る、
前記被験体の治療方法にも関する。
【００１２】
本方法の好ましい一態様において、該方法は、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球のインビボ維持を高めることが可能である有効量のインターロイキン−２を被験体に投与することの段階をさらに含んで成る。好ましくは、インターフェロン−αはインターフェロン−α−２ａもしくはインターフェロン−α−２ｂから選択され、そして、インターフェロン−αの有効量は約１０ＭＵ／ｍ２／日であり、かつ、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して該被験体に皮下投与される。また好ましくは、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球の有効量は、注入あたり約１〜１０×１０９個の細胞である。また好ましくは、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球は：天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製することであって、ｎｎＡＰＣは黒色腫と関連する約１５までの異なるエピトープを同時に提示することが可能であり、各エピトープは長さ８ないし１０アミノ酸のペプチドであり；黒色腫と関連する約１５までの異なるエピトープをｎｎＡＰＣに添加すること；被験体からＣＤ８＋細胞を収集すること；ＣＤ８＋細胞を、エピトープを添加されたｎｎＡＰＣ細胞系で刺激して黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を得ること；黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；被験体から収集されたＣＤ８枯渇末梢血単球を、ｎｎＡＰＣに添加した各エピトープと混合すること；ＣＤ８枯渇末梢血単球をγ線放射で照射すること；接着性のＣＤ８枯渇末梢血単球を単離すること；接着性末梢血単球に、ｎｎＡＰＣに添加した各エピトープを添加すること；黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を、エピトープ添加された接着性末梢血単球で再刺激すること；黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；ならびに黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＯＫＴ３抗体刺激により増大させること、の段階を含んで成る方法により得られる。
【００１３】
好ましくは、再刺激する段階は最低もう１回反復することができる。本方法の別の好ましい態様において、該天然に存在しない抗原提示細胞系は、チロシナーゼ、ｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１由来のペプチドであるエピトープを添加され、かつ、好ましくは、該天然に存在しない抗原提示細胞系は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含んで成るエピトープを添加される。また好ましくは、インターロイキン−２の有効量は約３ＭＩＵ／日であり、かつ、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種した後第０日から第２８日まで連続して被験体に皮下投与される。また好ましくは、該方法は約２ヶ月の間隔で反復される。好ましい一態様において、該方法は、最低２周期の間反復され、かつ、各周期後に前記被験体における応答を評価することの段階をさらに含んで成る。
【００１４】
本方法のなお別の好ましい態様において、該方法は：黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して、前記被験体に１０ＭＵ／ｍ２／日のインターフェロン−α−２ｂを皮下投与すること；注入あたり約１〜１０×１０９個の細胞の、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己細胞傷害性Ｔリンパ球を注入すること；および、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種した後第０日から第２８日まで連続して約３ＭＩＵ／日のインターロイキン−２を被験体に皮下投与すること、の段階を含んで成る。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（ここで前記ｎｎＡＰＣは、癌と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０の異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、ここで各ペプチドは長さが約６ないし１２アミノ酸、好ましくは長さが約８ないし１０アミノ酸、かつ、約１０ｎＭないし１００μＭの濃度範囲にあり）；
ｂ．癌を伴う被験体もしくは適するドナーからＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８＋細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８＋細胞を、馴化成長培地（ＣＧＭ）もしくはＩＬ−２、ＩＬ−７、好ましくはＩＬ−２もしくは組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７のようなサイトカインを含有する培地に添加すること；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球、あるいはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約５ないし５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合すること；
ｆ．約３，０００ないし７，０００ラドの範囲、好ましくは約５，０００ラドの線量のような、懸濁物中のこれらの細胞の増殖を予防するために必要な十分な線量のγ線放射で、前記末梢血単球懸濁物を照射すること、あるいは、末梢血単球懸濁物は、限定されるものでないがマイトマイシンＣを挙げることができる細胞分裂抑制剤で処理してもよい；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約５μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記ペプチドのそれぞれを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８＋細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組合せること；
ｊ．場合によっては、ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記組合せられた懸濁物を約６ないし９日間刺激すること；
ｋ．場合によっては、ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．場合によっては、適するＣＴＬ活性についてＣＤ８＋懸濁物をアッセイすること、ならびに、場合によってはＣＴＬの純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体に前記ＣＤ８＋懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（ここで前記ｎｎＡＰＣは、癌と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０のペプチドを同時に提示することが可能であり、ここで各ペプチドは長さが８ないし１０アミノ酸であり）；
ｂ．癌を伴う被験体からＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８＋細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で約６ないし９日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８＋細胞を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、約１０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合すること；
ｆ．約５，０００ラドのγ線放射で、前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を照射すること；ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８＋細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組合せること；
ｊ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記組合せられた懸濁物を約６ないし９日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．適するＣＴＬの活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量について前記ＣＤ８＋懸濁物をアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８＋懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（ここで前記ｎｎＡＰＣは、黒色腫と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０のペプチドを同時に提示することが可能であり、ここで各ペプチドは長さ８ないし１０アミノ酸であり）；
ｂ．黒色腫を伴う被験体からＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８＋細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で約６ないし９日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８＋細胞を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの前記ｎｎＡＰＣが提示することができる各ペプチドと混合すること；
ｆ．約５，０００ラドのγ線放射で、前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を照射すること；ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８＋細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組合せること；
ｊ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記組合せられた懸濁物を約６ないし９日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてＣＤ８＋懸濁物をアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８＋懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、ｎｎＡＰＣが以下のペプチド、チロシナーゼ３６９−３７７、チロシナーゼ２０７−２１６、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００１５４−１６２、ＭＡＲＴ−１２７−３５、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８９−７９７、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ３６９−３７７、Ｃ−レクチン８−１６、Ｐｅｃ６０２０−２９およびＰｅｃ６０２５−３３を提示する、黒色腫の治療方法である。
【００１９】
本発明の別の態様は、クラスＩ  ＨＬＡ分子と通常は関連する不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）もしくは不十分な（ｉｎａｄａｑｕａｔｅ）免疫応答をもたらす疾患もしくは疾患状態の治療方法であって、該治療は感染したもしくは形質転換された細胞を排除する。
【００２０】
本発明の別の態様は、クラスＩ  ＨＬＡ分子と通常は関連する不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）もしくは不十分な（ｉｎａｄａｑｕａｔｅ）免疫応答をもたらす疾患もしくは疾患状態の治療方法であって、ＣＴＬによる排除を受けやすいことが示されている感染したもしくは形質転換された細胞が：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは前記疾患もしくは疾患状態と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０の異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、各ペプチドは長さが約６ないし１２アミノ酸、好ましくは長さが約８ないし１０アミノ酸、かつ、約１０ｎＭないし
１００μＭの濃度範囲にあり）；
ｂ．ＣＤ８＋細胞を前記被験体もしくは適するドナーから収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８＋細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７もしくはＣＧＭ、好ましくはＩＬ−２、もしくは組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７のようなサイトカインを含有する培地に添加すること；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球、あるいはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約５ないし５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合すること；
ｆ．前記末梢血単球懸濁物を、約３，０００ないし７，０００ラドの範囲、好ましくは約５，０００ラドの線量のような、末梢血単球の刺激能力を維持しつつ増殖を予防するのに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約５μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記各ペプチドを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８＋細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組合せること；
ｊ．場合によっては、ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記組合せられた懸濁物を、約６ないし９日間刺激すること；
ｋ．場合によっては、ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．場合によっては、適するＣＴＬ活性についてＣＤ８＋懸濁物をアッセイすること、ならびに、場合によってはＣＴＬの純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８＋懸濁物を接種すること
を含んで成る方法によって治療される。
【００２１】
本発明は、発現のためヒトクラスＩ  ＨＬＡ、結合および共刺激分子をコードするＤＮＡでトランスフェクトされたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞由来の天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）を提供し、ｎｎＡＰＣは１５までの異なるペプチド分子、好ましくは１０のペプチド分子を提示することが可能である。
【００２２】
本発明の別の態様は、被験体の治療を高める多様な所望の機能と関連するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えば、治療されている疾患もしくは疾患状態と関連するペプチドに加えて、ｎｎＡＰＣは、細胞−細胞接着を高めるもしくは付加的な細胞活性化シグナルを伝達する、リンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１および２（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２）、Ｔ細胞共刺激因子（ＣＤ４０、ＣＤ７０、、Ｂ７）のような補助分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と関連するタンパク質を発現することができる。
【００２３】
本発明の別の態様は、いくつかの型の癌と関連するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのような乳癌関連ポリペプチドと関連するもしくはそれ由来のペプチドは、ＭＡＲＴ−１もしくはＭＡＧＥのような黒色腫関連ポリペプチドと関連するもしくはそれ由来のペプチドとともに提示されるかもしれない。
【００２４】
本発明の別の態様は、１０までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能な天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）の製造方法を提供し、前記方法は、段階：
ａ．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）卵から昆虫細胞系を調製すること；あるいは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子および共刺激接着分子を発現させるための昆虫細胞系を調製すること；
ｂ．前記昆虫細胞を、昆虫細胞を成長させるのに適する培地、好ましくはシュナイダー［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］ＴＭドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地中で成長させること；
ｃ．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターからｐＲｍＨａ−３プラスミドを作成すること（前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドは、メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル酸化シグナルを担持するアルコール脱水素酵素遺伝子を包含し）；
ｄ．前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドに、ヒトクラスＩ  ＨＬＡ  Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、β−２ミクログロブリンおよびＬＦＡ−３の相補ＤＮＡを挿入すること（Ａ２．１はいずれかのヒトクラスＩ  ＤＮＡ配列で置換することができ）；
ｅ．前記昆虫細胞を、ｐｈｓｈｎｅｏプラスミド、および相補ＤＮＡを含有する前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドでトランスフェクトすること；ならびに
ｆ．前記昆虫細胞をＣｕＳＯ４と接触させて前記昆虫細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の発現を誘導することによりｎｎＡＰＣを創製すること
よりなる。
【００２５】
本発明の昆虫細胞は、昆虫細胞を成長させるのに適する培地（下で「昆虫成長培地」と引用される）中で成長させる。シュナイダー［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］ＴＭドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地、グレース昆虫培地、およびＴＣ−１００昆虫培地のような昆虫成長培地は、多数の供給元から商業的に入手可能である。あるいは、昆虫成長培地は当業者により調製することができる。典型的には、該培地は、無機塩（例えば、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム）、アミノ酸、多様な炭水化物、ならびに化学種のような、昆虫細胞の成長を促進かつ持続するのに必要な成分を包含することができる（Ｉｍｏｇｅｎｅ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．（１９６４）１５６（１）：ｐｇ．９１）。あるいは、該培地は、ビタミン、ミネラル、および昆虫細胞の成長で補助する他の成分もまた包含することができる。
【００２６】
本発明はさらに：
ａ）腫瘍の表面上の腫瘍抗原およびＨＬＡクラスＩ分子の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−αを、癌を伴う被験体に投与すること；ならびに
ｂ）癌関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種すること
の段階を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【００２７】
好ましい一態様において、該治療方法は、さらに、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己細胞傷害性Ｔリンパ球のインビボ維持を高めることが可能である有効量のインターロイキン−２を前記被験体に投与することの段階を含んで成る。
【００２８】
以下は、本明細で使用される略語および定義の一覧である。
略語
ＡＰＣ                抗原提示細胞
ＣＤ８＋              ＣＤ８＋  Ｔ細胞
ＣＴＬ                細胞傷害性Ｔリンパ球
Ｅ                    エフェクター
Ｆａｓ                ＣＤ９５としてもまた知られる、Ｔ細胞上のエピトープ
ＩＣＡＭ              細胞間接着分子
ＩＬ                  インターロイキン
ＬＡＫ                リンホカイン活性化型キラー細胞
ＬＦＡ                リンパ球機能抗原
ＭＨＣ                主要組織適合抗原複合体
ｎｎＡＰＣ            天然に存在しない抗原提示細胞
ＮＰ                  核タンパク質
ＰＢＭＣ              末梢血単核細胞
ＰＢＳ                リン酸緩衝生理的食塩水
ＰＣＲ                ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＰＭＩ              ロズウェル  パーク  メモリアル  インスティテュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
ＲＷＪＰＲＩ        Ｒ．Ｗ．ジョンソン  ファーマシューティカル  リサーチ  インスティテュート（Ｔｈｅ  Ｒ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
Ｔ                    標的
ＴＣＰ                Ｔ細胞抗原受容体
ＴＩＬ                腫瘍浸潤リンパ球
以下は、多様なペプチドエピトープについて本明細で使用される略語の一覧である。個々のアミノ酸残基は、当業者により容易に知られかつ使用される一文字記号に従って同定される。
【００２９】
【表１】
2010235611.tif 000002
【００３０】
ペプチドエピトープの略語
本明細書で使用されるところの「チロシナーゼ３６９−３７７」もしくは「チロシナーゼ３６９−３７７」という用語はアミノ酸配列ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）を指す。この定義内に、配列ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）のアミノ酸残基「Ｎ」を「Ｄ」に改変してＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）のアミノ酸配列をもたらす翻訳後事象から生じる配列ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）のペプチドもまた包含される（Ｓｋｉｐｐｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：５２７−５３４）。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「チロシナーゼ２０７−２１６」もしくは「チロシナーゼ２０７−２１６」という用語はアミノ酸配列ＦＬＰＷＨＲＬＦＬＬ（配列番号３）を指す。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「ｇｐ１００  ２０９−２１７」もしくは「ｇｐ１００２０９−２１７」という用語はアミノ酸配列ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）を指す。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「ｇｐ１００  １５４−１６２」もしくは「ｇｐ１００１５４−１６２」という用語はアミノ酸配列ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号５）を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「ＭＡＲＴ−１  ２７−３５」もしくは「ＭＡＲＴ−１２７−３５」という用語はアミノ酸配列ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号６）を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ７８９−７９７」もしくは「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８９−７９７」という用語はアミノ酸配列ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（配列番号７）を指す。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ３６９−３７７」もしくは「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ３６９−３７７」という用語はアミノ酸配列ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号８）を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるところの「Ｃ−レクチン  ８−１６」もしくは「Ｃ−レクチン８−１６」という用語はアミノ酸配列ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（配列番号９）を指す。
【００３８】
本明細書で使用されるところの「Ｐｅｃ６０  ２０−２９」もしくは「Ｐｅｃ６０２０−２９」という用語はアミノ酸配列ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（配列番号１０）を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「Ｐｅｃ６０  ２５−３３」もしくは「Ｐｅｃ６０２５−３３」という用語はアミノ酸配列ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（配列番号１１）を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるところの「ＣＤ８ペプチド  ５９−７０」もしくは「ＣＤ８ペプチド５９−７０」という用語は、ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ（配列番号１２）のアミノ酸配列を指す。
用語および定義
本明細書で使用されるところの「養子免疫療法」という用語は、疾患もしくは疾患状態の治療のためのドナーもしくは自己のＴリンパ球の投与を指し、ここで疾患もしくは疾患状態は、クラスＩ  ＨＬＡ分子と通常は関連する不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）もしくは不十分な（ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ）免疫応答をもたらす。養子免疫療法は、感染したもしくは形質転換された細胞の排除がＣＴＬにより達成されることが立証されているいかなる疾患もしくは疾患状態にも適切な治療である。例えば、疾患もしくは疾患状態は、限定されるものでないが、黒色腫、前立腺、乳房、結腸直腸、胃、咽頚部、膵、子宮頚、卵巣、骨、白血病および肺癌のような癌および／もしくは腫瘍；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス感染症；結核、らいおよびリステリア症のような細菌感染症、ならびにマラリアのような寄生虫感染症を挙げることができる。
【００４１】
本明細書で使用されるところの「Ｂ７．１、Ｂ７．２」という用語は抗原提示細胞に関連する共刺激分子を指す。
【００４２】
本明細書で使用されるところの「ＢＣＮＵ」という用語は１，３−ビス（２クロロエチル）−１−ニトロソ尿素としてもまた知られるカルムスチンを指す。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「ＢＳＥ」という用語はウシ海綿状脳症を指す。
【００４４】
本明細書で使用されるところの「ＣＤ」という用語は、抗原エピトープおよび機能によりグループ分けされる分化抗原クラスターすなわちＴリンパ球（元は）、Ｂリンパ球、単球、マクロファージおよび顆粒球を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるところの「ＤＴＩＣ」という用語は、ダカルバジンすなわち５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドを指す。
【００４６】
本明細書で使用されるところの「エクスビボ」もしくは「エクスビボ療法」という用語は、該改変された細胞により生じられる治療上の利益の長期のもしくは一定の送達により改善することができる病理学的状態を治療するのに該改変された細胞を使用することができるような生物学的材料（典型的には細胞）を患者もしくは適するドナーのような適する代替供給源から得かつ改変する治療を指す。治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は患者もしくは代替供給源のいずれかから得られた改変された生物学的材料の患者への再導入を包含する。エクスビボ療法の一利益は、治療からの望ましくない傍系の影響に患者を曝露することなく治療の利益を患者に提供する能力である。例えば、高用量のサイトカインはしばしば、患者のＣＴＬの拡張を刺激するために癌もしくはウイルス感染症を伴う患者に投与される。しかしながら、サイトカインは患者において流感様の症状の発症をしばしば引き起こす。エクスビボ手順において、サイトカインは患者の身体の外側でＣＴＬの拡張を刺激するのに使用され、そして患者はサイトカインの曝露および結果としての副作用を容赦される。あるいは、適する状況もしくは条件下で、適切な場合かつ被験体が利益を得ることができる場合、被験体を、低レベルの投薬量のγインターフェロン、αインターフェロンおよび／もしくはＩＬ−２で同時に治療することができる。インターフェロンの期待される効果は、おそらく抗原特異的ＣＴＬによる溶解に対し腫瘍細胞を感作することであり、また、ＩＬ−２の効果は、おそらく抗原特異的ＣＴＬの持続性を高めることである。
【００４７】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＰＥＳ」という用語はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’２−エタンスルホン酸緩衝液を指す。
【００４８】
本明細書で使用されるところの「ＨＬＡ−Ａ２．１」という用語は、およそ４５％の白色人種で見出されるＨＬＡクラスＩ分子を指す。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「ＭＡＲＴ−１」もしくは「（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原−１）という用語は黒色腫関連抗原を指す。この抗原のアミノ酸および核酸配列、ならびに多様な特徴は、「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年１１月３０日交付の米国特許第５，９９４，５２３号明細書；「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年２月２３日交付の米国特許第５，８７４，５６０号明細書；ならびに「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９８年１２月１日交付の米国特許第５，８４４，０７５号明細書に開示される。とりわけ、米国特許第５，９９４，５２３号明細書は、それぞれ配列番号１および配列番号２として図１にＭＡＲＴ−１の完全長の核酸およびアミノ酸配列を開示する。前述の図１は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５０】
本明細書で使用されるところの「ＭＡＧＥ」という用語は黒色腫関連抗原を指す。この抗原のアミノ酸および核酸配列、ならびに多様な特徴は、「それと関連する複数の抗原についてアッセイすることによる乳癌および黒色腫の決定方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｙ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  Ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ）」と題された２０００年１０月３１日交付の米国特許第６，１４０，０５０号明細書；「ＭＡＧＥ−ＸＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを検出することによる癌のスクリーニング方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｓｃｒｅｅｎｉ
ｎｇ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ
ｆｏｒ  ａ  ＭＡＧＥ−ＸＰ  Ｇｅｎｅ）」と題された１９９８年６月２日交付の米国特許第５，７５９，７８３号明細書；および「合成ペプチドエピトープを使用するヒトにおける抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」と題された１９９７年９月２日交付の米国特許第５，６６２，９０７号明細書に開示される。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「ＭＰＣ−１０」という用語は磁性粒子濃縮装置を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるところの「ＮＫ細胞」という用語はナチュラルキラー細胞を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるところの「ＯＫＴ３」という用語は、オルソクローン（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ）ＯＫＴ３、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「ＴＡＰ−１，２」という用語は、抗原プロセシング関連輸送タンパク−１，２を指す。
【００５５】
本明細書で使用されるところの「Ｔｈ細胞」という用語はヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋を指す。
【００５６】
本明細書で使用されるところの「チロシナーゼ」という用語は、黒色腫に関連するタンパク質を指す（Ｂｒｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：４８９−４９５；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）５４：３１２４−３１２６）。「Ｐ１５およびチロシナーゼ黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｐ１５  ａｎｄ  Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９８年１２月１日交付の米国特許第５，８４３，６４８号明細書は、図７、図ＡないしＤにチロシナーゼに関連する抗原ペプチドおよび関連するポリ核酸を開示し、前述の図は引用することにより本明細書に組み込まれる。「異常細胞上のヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）分子およびチロシナーゼ由来ペプチドを含有する複合体の検出方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａ２  （ＨＬＡ−Ａ２）  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ａ  Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」と題された１９９６年１月３０日交付の米国特許第５，４８７，９７４号明細書は、実施例９で表３にチロシナーゼおよび黒色腫と関連する付加的なペプチドを開示し、前述は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本明細書で使用されるところの「ｇｐ１００」という用語は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）により認識される黒色腫抗原を指す。ｇｐ１００を認識するＴＩＬはインビボの腫瘍拒絶と関連する（Ｂａｋｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１００５−１００９；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：３９６１−３９６８）。ｇｐ１００に関連する抗原ペプチドは、「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年１１月３０日交付の米国特許第５，９９４，５２３号明細書；「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年２月２３日交付の米国特許第５，８７４，５６０号明細書；ならびに「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９８年１２月１日交付の米国特許第５，８４４，０７５号明細書に開示される。とりわけ、米国特許第５，９９４，５２３号明細書は、それぞれ図４および５にＧＰ１００に関係する核酸およびアミノ酸配列を開示する。配列番号２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０および４１として同定されるものを包含する該アミノ酸配列由来の抗原ペプチドもまた開示される。前述の図４および５の全部、ならびに配列番号により同定されるペプチドは、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本明細書で使用されるところの「黒色腫」という用語は、限定されるものでないが黒色腫、転移性黒色腫、メラノサイトもしくはメラノサイト関連神経細胞いずれか由来の黒色腫、黒色肉腫、黒色癌腫、黒色上皮腫、黒色腫インシトゥ表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、侵襲型黒色腫もしくは家族性異型黒子・黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群を指す。哺乳動物におけるこうした黒色腫は、染色体異常、変性性の成長および発生障害、有糸分裂促進剤、紫外線放射（ＵＶ）、ウイルス感染症、遺伝子の不適切な組織発現、遺伝子の発現の変化、ならびに細胞上での提示もしくは発癌物質により引き起こされるかもしれない。前述の黒色腫は、本出願に記述される方法により診断、評価もしくは治療することができる。
【００５９】
本明細書で使用されるところの「Ｃ−レクチン」という用語は、卵巣癌に関連することが見出されている配列のペプチドを指す。
【００６０】
本明細書で使用されるところの「主要組織適合抗原複合体」もしくは「ＭＨＣ」という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を包含する多様な種で記述される組織適合抗原系を包含することを意味される包括的呼称である。
【００６１】
本明細書で使用されるところの「エピトープ」、「ペプチドエピトープ」、「抗原性ペプチド」および「免疫原性ペプチド」という用語は、哺乳動物において細胞性免疫応答を引き起こすことが可能な抗原由来のペプチドを指す。こうしたペプチドは、該ペプチドで免疫化された動物からの抗体ともまた反応性であるかもしれない。こうしたペプチドは長さが約５ないし２０アミノ酸、好ましくは長さが約８ないし１５アミノ酸、および最も好ましくは長さが約９ないし１０アミノ酸であってよい。
【００６２】
本明細書で使用されるところの「Ｐｅｃ６０」という用語は、卵巣および乳癌に関連することが見出されている配列のペプチドを指す。
【００６３】
本明細書で使用されるところの「類似物」という用語は、とりわけ１個もしくはそれ以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されかつ本明細書に記述されるところの本発明の機能的局面を表す、本明細書に示される本発明の配列に実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するいかなるポリペプチドも包含する。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１個の非極性（疎水性）残基の代わりに別のものの置換、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間のような１個の極性（親水性）残基の代わりに別のものの置換、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのような１個の塩基性残基の代わりに別のものの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸もしくは別のもののような１個の酸性残基の置換を包含する。
【００６４】
本明細書で使用されるところの「保存的置換」という用語は、誘導体化されない残基の代わりの化学的に誘導体化された残基の使用もまた包含する。
【００６５】
本明細書で使用されるところの「化学的誘導体」という用語は、官能性側基の反応により化学的に誘導体化された１個もしくはそれ以上の残基を有する主題のポリペプチドを指す。こうした誘導体化された分子の例は、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基もしくはホルミル基を形成するように誘導体化された分子を包含する。遊離カルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導体化してよい。遊離ヒドロキシル基はＯ−アシルもしくはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化してよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素はＮ−イン−ベンジルヒスチジン（ｉｍ−ｂｅｎｚｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を形成するように誘導体化してよい。２０種の標準的アミノ酸の１種もしくはそれ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するタンパク質もしくはペプチドもまた化学的誘導体として包含される。例えば：４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに用いてよく；５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに用いてよく；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに用いてよく；ホモセリンをセリンの代わりに用いてよく；そしてオルニチンをリシンの代わりに用いてよい。本発明のタンパク質もしくはポリペプチドは、欠くことのできない活性が維持される限りは、その配列が本発明の対応する核配列にコードされるであるポリペプチドの配列に関して１個もしくはそれ以上の付加および／もしくは欠失または残基を有するいかなるポリペプチドもまた包含する。
【００６６】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」という用語は、１種もしくはそれ以上の膜会合型の受容体様癌遺伝子タンパク質を発現もしくは過剰発現する癌遺伝子を指す。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現もしくは過剰発現に関連することが見出された癌は、ある種の乳房、胃、卵巣、結腸および唾液腺癌などである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子は癌遺伝子のチロシンタンパク質キナーゼファミリーの１メンバーであり、そして上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と高程度の相同性を共有する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは細胞の成長および／もしくは分化で役割を演じることが示されている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、本質的に正常な遺伝子産物の増大されたもしくは無秩序な発現から生じる量的機構により悪性病変を誘導するようである。「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子が関連する悪性病変の診断および治療のためのＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫反応性（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｗｈｉｃｈ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」と題された２０００年６月１３日交付の米国特許第６，０７５，１２２号明細書は、第１２段第３１行ないし第１３段第７行で、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を導き出すペプチドを開示し、配列番号により同定されるものは引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５）はＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物である。乳房、卵巣、結腸、肺および前立腺癌を包含する多様な癌において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が増幅されそしてＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質が過剰発現される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは悪性の形質転換と関連する。それは、非浸潤性管癌の５０％ないし６０％、および全乳癌の２０％ないし４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺で生じる腺癌のかなりの部分で見出される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、悪性の表現型のみならず、しかしまた全部の侵襲性乳癌の１／４で見出されている悪性病変の攻撃性とも緊密に関連する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、乳房および卵巣双方の癌における乏しい予後と相関する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、長さがおよそ１２５５アミノ酸（ａａ）である１８５ｋｄの相対分子量をもつ膜貫通タンパク質である。それは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に
対する４０％の相同性をもつおよそ６４５ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）、高度に疎水性の膜貫通固定ドメイン（ＴＭＤ）、およびＥＧＦＲに対する８０％の相同性をもつおよそ５８０アミノ酸のカルボキシ末端細胞質ドメイン（ＣＤ）を有する。
【００６８】
本明細書で使用されるところの「インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）」という用語は、ウイルス複製および細胞増殖を阻害しかつ免疫応答を調節する、高度に相同な種特異的タンパク質の一ファミリーを指す。本発明の方法に典型的な適するインターフェロン−αは、限定されるものでないが、シェリング  コーポレーション（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージー州ケニルワースから入手可能なイントロン−Ａ［Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ］（Ｒ）インターフェロンのような組換えインターフェロンα−２ｂ、ホフマン−ラ  ロシュ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ニュージャージー州ナットレイから入手可能なロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）インターフェロンのような組換えインターフェロンα−２ａ、ベーリンガー  インゲルハイム  ファーマシューティカル
インク（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、コネチカット州リッジフィールドから入手可能なベロフォア（Ｂｅｒｏｆｏｒ）α２インターフェロンのような組換えインターフェロンα−２ｃ、インターフェロンα−ｎ１、住友、日本から入手可能なスミフェロン（Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ）のような天然のαインターフェロンの精製された混和物、もしくはグラクソ−ウェルカム  リミテッド（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｌｔｄ．）、英国ロンドンから入手可能なウェルフェロン（Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ）インターフェロンα−ｎ１（ＩＮＳ）、または米国特許第４，８９７，４７１号および同第４，６９５，６２３号明細書（とりわけその実施例７、８もしくは９）に記述されるもののようなコンセンサスαインターフェロン、ならびにアムジェン  インク（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ニューベリーパークから入手可能な特定の生成物、またはインターフェロン  サイエンシーズ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により作成されかつアルフェロン（Ａｌｆｅｒｏｎ）の商標名でパーデュ  フレデリック  カンパニー（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃｏ．）、コネチカット州ノーウォークから入手可能な天然のαインターフェロンのインターフェロンα−ｎ３混合物を挙げることができる。インターフェロンα−２ａもしくはα−２ｂの使用が好ましい。インターフェロンα−２ｂは、全部のインターフェロンのなかで、慢性Ｃ型肝炎感染を治療するために世界中で最も広範な承認を有するため、それが最も好ましい。インターフェロンα−２ｂの製造は米国特許第４，５３０，９０１号明細書に記述される。
【００６９】
本明細書で使用されるところの「インターロイキン２（ＩＬ−２）」という用語は、免疫系を刺激し、かつ、標的細胞の表面上の特異的受容体に結合した後にその生物学的効果を発揮するサイトカインを指す。ＩＬ−２は多くの生物学的効果を有し、例えば、それは、活性化されたＢおよびＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞を包含する）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ならびにリンホカイン活性化型キラー（ＬＡＫ）細胞の刺激を誘導することが知られている。ＩＬ−２は処方薬、例えば、カイロン  コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（カリフォルニア州エメリービル）により製造されるプロリューキン［ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ］（Ｒ）として得られるかもしれない。ＩＬ−２は、多数の米国特許に開示されるとおり、多様な供給源からおよび多様な方法により製造されるかもしれない。これらの特許は、限定されるものでないが、米国特許第４，４０７，９４５号、同第４，４７３，６４２号および同第４，４０１，７５６号明細書に開示されるところのそれぞれハイブリッドマウスＴ細胞系もしくは悪性ヒトＴ細胞系のようなＴ細胞からのＩＬ−２の製造、ならびに、米国特許第４，９９２，３６７号、同第４，４０７，９４５号および同第４，４７３，６４２号明細書に開示されるところの組換えヒトＩＬ−２の製造を挙げることができる。
【００７０】
癌遺伝子を伴う進行中の研究は、悪性病変細胞中で効果をもたらしかつ形質転換の原因
であるかもしくはそれと関連する最低４０種の癌遺伝子を同定した。癌遺伝子は、（癌遺伝子により発現されるタンパク質のような）それらの遺伝子産物の推定の機能もしくは位置に基づき、多様な群に分類されている。癌遺伝子は、正常な細胞生理学のある局面に不可欠であると考えられる。
【００７１】
癌は、治療の領域でなされたかなりの進歩にもかかわらず大きな健康の問題であり続けている。化学療法、放射線治療、外科的介入および三者の組合せという標準的治療レジメンは、永続する治癒を生じさせることにしばしば失敗する。多くの場合、治療を受けた癌患者は、しばしば、いくらかの時間の期間の後に疾患状態に戻る。病状をさらに悪化させることは、患者に対するこれらの治療レジメンの苛烈さである。黒色腫の例において、転移性黒色腫の治癒は慣習的化学療法を使用して達成されていない。３５％ないし５０％の奏効率が、併用化学療法のダートマスレジメン（ＤＴＩＣ、シスプラチン、ＢＣＮＵおよびタモキシフェン）で報告されているが、しかし、生存期間は６ないし１０ヶ月に留まっている。高率の再発が、攻撃的な「高用量強度」化学療法、ならびに自己骨髄移植を伴う造血の多血症について報告されている。これらの治療された患者における生存期間の中央値は短かった（およそ４ヶ月）。
【００７２】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらは、多様な癌の治療として活性化されたリンパ球の注入を使用することを試みた。当初、リンホカイン活性化型キラー細胞（ＬＡＫ）、および後にＩＬ−２でエクスビボ活性化された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用したが、しかし、有効性の証拠は不確かである。事実、対照臨床試験は、患者へのＩＬ−２の直接投与を上回るエクスビボ活性化された細胞の使用の利点を示すことに失敗した。従って、ＬＡＫおよびＴＩＬ療法の利益はわずかであり、かつ、副作用は、典型的には、多くの試験が早期に中断されたほどひどい。
【００７３】
マウス腫瘍モデルにおける研究は、養子免疫療法すなわち腫瘍抗原（１種もしくは複数）に特異的なＴ細胞のインビボ免疫感作が最小限の毒性を伴い非常に有効であることを立証した。ヒト腫瘍の治療にこの戦略を適用するための大きな障害は、腫瘍細胞を細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性の破壊に対し感受性にする免疫原性抗原の同定である。黒色腫患者からの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離は、ＣＴＬが向けられる腫瘍抗原（エピトープ）のいくつかの同定に至った。これらは、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：４８９−４９５；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）５４：３１２４−３１２６）、ＭＡＲＴ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１８０：３４７−３５２）、ｇｐ  １００（Ｂａｋｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１００５−１００９；およびＫａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：３９６１−３９６８）、ならびにＭＡＧＥ（Ｇａｕｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：９２１−９３０）を包含する。これらのうち、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は黒色腫でほぼ普遍的に発現され、そして従って養子免疫療法についての論理的選択である。
【００７４】
近年、およそ数年の生存の大きな改善が、免疫学的療法を受けている小さな割合の黒色腫患者で示されている。これは、「癌ワクチン」での能動的特異的免疫療法、ならびにＩＬ−２、α−インターフェロンおよびγ−インターフェロンのようなサイトカインのような免疫系の非特異的補助刺激物（ｂｏｏｓｔｅｒ）の使用を包含する。しかしながら、サイトカインの利益は、悪心、発熱および流感様の症状のような、それらの使用にしばしば付随する副作用により小さくされる。
【００７５】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）はウイルス感染症に対する主要防御線である。ＣＤ８＋リンパ球はウイルスにより感染した宿主細胞を特異的に認識しかつ殺す。理論的には、癌
を包含する他の型の疾患と闘うのに免疫系を利用することが可能であるはずである。しかしながら、わずかなインビトロ／エクスビボ手順が、ＣＴＬを特異的に活性化するのに利用可能であった。上に示された重要な黒色腫抗原の同定、および下述されるＣＴＬの特異的インビトロ活性化方法は、今や、転移性黒色腫の養子免疫療法の概念の試験を可能にする。
【００７６】
すべてのナイーブなＴ細胞は、免疫応答を導き出すための活性化に２種のシグナルを必要とする。ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）について、特異性を分け与える第一のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在するクラスＩ  ＭＨＣ（ＨＬＡ）複合体に結合された抗原の免疫原性ペプチドフラグメント（エピトープ）のＣＤ８＋細胞への提示よりなる。この複合体は、シグナルを細胞内で伝えるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識される。
【００７７】
Ｔ細胞受容体への結合はＴ細胞の活性化を誘導するのに必要であるがしかし十分でなく、そして通常、細胞増殖もしくはサイトカイン分泌に至ることができない。完全な活性化は第二の共刺激シグナル（１種もしくは複数）を必要とし、これらのシグナルは活性化カスケードをさらに高めるようはたらく。抗原提示細胞上の共刺激分子のなかで、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１のような細胞接着分子（インテグリン）が、Ｔ細胞上のそれぞれＣＤ２８およびＬＦＡ−１に結合することによりこの過程で補助する。ＣＤ８＋細胞が、適切な共刺激分子の相互作用の存在下でクラスＩ  ＭＨＣ分子により結合された免疫原性ペプチド（エピトープ）を担持する抗原提示細胞と相互作用する場合に、ＣＤ８＋細胞は完全に活性化された細胞溶解性Ｔ細胞となる。
【００７８】
リンパ球に媒介される細胞殺傷は、Ｔ細胞活性化について上述された認識過程によって、抗原を担持する標的（腫瘍）細胞へのＣＤ８＋  ＣＴＬの結合で開始する、一連の生物学的事象を必要とする。
【００７９】
上述されたところの、ＣＤ８＋細胞と抗原提示細胞もしくは標的（腫瘍）細胞との間の相互作用を図１に描く。該相互作用は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）への、ＡＰＣもしくは標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子と共同しての抗原の結合で開始する。リンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２）およびＴ細胞共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のような補助分子が、細胞−細胞接着を高めるか、もしくは付加的な細胞活性化シグナルを伝達する。しかしながら、リンパ球に媒介される細胞殺傷に対する要件は、ＭＨＣ／ペプチド単独の存在下（大部分の腫瘍細胞に共通の状況）で起こることができる。
【００８０】
細胞−細胞相互作用の後に、ＣＴＬは可溶性細胞溶解メディエーター（Ｔ細胞の細胞質顆粒中に貯蔵されるパーフォリンおよびグランザイム）ならびにＣＴＬ表面分子（Ｆａｓリガンド）の作用により標的細胞を殺す。細胞溶解性の攻撃後に、標的細胞は、壊死（膜の穿孔およびオルガネラ破壊）もしくはアポトーシス（クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化および膜泡形成）により死ぬ。
【００８１】
リンパ球に媒介される細胞溶解の機構を図２にグラフィカルに描く。図２の図Ａにおいて、標的細胞に結合した後に、ＣＴＬ中の細胞質顆粒が、細胞間空隙中へのパーフォリンおよびグランザイムを含有する顆粒の放出のため、標的細胞に迅速に向け直される。これらのタンパク質分解酵素が標的細胞の原形質膜に孔を形成し、ついには細胞壊死に至る。図Ｂにおいて、標的細胞に結合した後に、ＣＴＬ上のＦａｓリガンド発現のレベルが増大する。Ｆａｓリガンドおよび標的細胞上のＦａｓ受容体の相互作用がアポトーシスにつながる。ＣＰＰ３２のようなプロテアーゼ、およびＩＬ−１ｂ変換酵素（ＩＣＥ）に関連する他者が、アポトーシスの誘導に関係している。
【００８２】
インビトロＣＤ８＋活性化に、天然に存在する抗原提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージおよび自己腫瘍細胞を使用することが可能である。しかしながら、このアプローチ後の活性化の効率は低い。これは、天然のＡＰＣのクラスＩ分子が、腫瘍エピトープ以外に多くの他の型のペプチドエピトープを含有するためである。ペプチドの大部分は正常の無害の細胞タンパク質由来であり、腫瘍に対して実際に有効であるとみられる活性の天然のＡＰＣの数の希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）をもたらす（Ａｌｌｉｓｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）７：６８２−６８６）。
【００８３】
この問題に対するより直接的かつ効率的な一アプローチは、（癌のような）特定の疾患と闘うことに関連したそれらのエピトープ、もしくは（黒色腫特異的抗原のような）腫瘍特異的抗原のみでＣＤ８＋細胞を特異的に活性化することである。この目的のため、人工産物の抗原提示細胞を、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）細胞中でＭＨＣ  クラスＩ分子を発現させることにより創製する。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は免疫系を有しないため、クラスＩ分子上にペプチドエピトープを添加することに関与するＴＡＰ−１，２ペプチド輸送タンパクが存在しない。結果として、クラスＩ分子は、空容器（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｓｓｅｌ）としてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞表面上に出現する。これらのトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を、限定されるものでないが黒色腫特異的エピトープを挙げることができる癌もしくは腫瘍特異的エピトープのようなクラスＩ分子に結合する外因性ペプチドとともにインキュベートすることにより、すべてのクラスＩ分子を同一のペプチドで占有することが可能である。これらのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＡＰＣ中に単一ペプチドを含有するクラスＩ分子の高密度発現は、抗原ペプチドに完全に特異的である細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のインビトロでの生成を可能にする。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を調製するための方法および手順は、「ヒトクラスＩ  ＭＨＣおよびβ２−ミクログロブリンを発現する昆虫細胞を使用する細胞傷害性Ｔ細胞のインビトロ活性化（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＭＨＣ
ａｎｄ  β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」と題された１９９６年６月２５日交付の米国特許第５，５２９，９２１号明細書、ならびに「ＭＨＣ  クラスＩ抗原およびβ２−ミクログロブリンをコードする遺伝子を発現しかつ空複合体を集成することが可能なショウジョウバエ細胞系、ならびに前記細胞系の作成方法（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ａｎｄ  β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｅｍｐｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｓａｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ）」と題された１９９４年５月２４日交付の米国特許第５，３１４，８１３号明細書に教示される。とりわけ、米国特許第５，５２９，９２１号明細書は、第２６段第５６行ないし第２８段第２２行で、前駆細胞の培養物の多様な分離および／もしくは濃縮方法を開示する。
【００８４】
加えて、この特徴は、高用量の多様なサイトカインでの免疫系のインビボ刺激に対する必要性を除外し、それによりサイトカインにより引き起こされる副作用をなしで済ませる治療をもたらす。あるいは、適する状況もしくは条件下で、適切な場合かつ被験体が利益を得ることができる場合、被験体を、低レベルの投薬量のαインターフェロン、γ−インターフェロンおよび／もしくはＩＬ−２で同時に治療することができる。
【００８５】
サイトカインでのインビボ刺激に対する必要性を除外することは、患者の治療の質の向上を提供する。患者へのサイトカインの投与を包含する治療レジメンは、しばしば、悪心、嘔吐および発熱のような流感様の症状を発症する患者をもたらす。これらの副反応は一
般に生命を脅かさないが、とは言え既に弱らされた状態にある患者で起こるとりわけ重症の反応は、生命を危うくする状況をもたらす可能性がある。別の考慮は、それ以外は有益な治療レジメンの患者の受容性およびコンプライアンスに対してこうした副反応が有する有害な影響である。サイトカインでのインビボ刺激に対する必要性を除去することは、患者の快適さを向上させる治療レジメンをもたらし、また、彼もしくは彼女の患者が従うことがよりありそうである有効な治療方法を臨床家に提供する。
【００８６】
腫瘍の養子免疫療法のための本方法の有用性は、ＡＰＣとしてトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスの２Ｃ系統からのＣＤ８＋細胞を使用してマウスで立証されている。この系において、精製されたＣＤ８＋  ２Ｃ細胞は、共刺激分子Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１もまた担持するＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）のトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるインビトロペプチドに高度に応答性である。プライミングされないＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激するための最小要件を規定するためのプローブとしてのトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（Ｃａｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１４７３６−１４７４１）。あるいは、分離されないマウス脾細胞を精製された２Ｃ細胞の代わりに応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として使用する場合は、共刺激分子に対する必要性は当てはまらない。この例において、脾集団中のＣＤ８＋細胞は活性化されたＢ細胞から「傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）」共刺激を受領する。この知見を利用して、ＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）のトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞が、添加されたリンホカインの非存在下にインビトロで同系のＰ８１５肥満細胞腫の腫瘍特異的ペプチドに応答するように正常ＤＢＡ／２マウス脾細胞を誘導することが可能であることを示すことが可能であった。Ｐ８１５肥満細胞腫を担持するＤＢＡ／２マウスへのこれらのＣＴＬの注入は迅速な腫瘍退縮に至った（Ｓｕｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４：５５５−５６４）。
【００８７】
手順的には、正常ＤＢＡ／２マウス脾細胞を、ＤＢＡ／２由来Ｐ８１５肥満細胞腫細胞系からの腫瘍特異的エピトープＰ１Ａ．３５−４３ペプチドを添加された、ＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）のトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞とともにインビトロで培養した。５日後に培養物から収集されたリンパ球は、インビトロでＰ８１５腫瘍細胞に対する強い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を表したが、しかし、図３、図Ａに示されるとおり、Ｐ１Ａ．３５−４３を発現しないＰ８１５の突然変異体細胞系Ｐ１０２４を溶解することに失敗した。これらのＣＴＬを、３日前にＰ８１５細胞を以前に接種されたＤＢＡ／２マウスに注入した場合、腫瘍は第一週の間に妨害を受けずに成長したが、しかし、その後、図３、図Ｂに示されるとおり、次の週内に排除された。図３、図Ｂに示されるとおり、ＣＴＬをウイルス核タンパク質ペプチドのような無関係の抗原に対してインビトロで免疫化した場合、特異性は、Ｐ８１５の成長に対するいかなる影響も非存在により立証された。要約すれば、主要組織適合抗原複合体クラスＩ（Ｌｄ）のトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、添加されたリンホカインの非存在下で、同系のＰ８１５肥満細胞腫の腫瘍特異的ペプチドにインビトロで応答するように正常ＤＢＡ／２マウス脾細胞を誘導した。Ｐ８１５肥満細胞腫を担持するＤＢＡ／２マウスへのこれらのＣＴＬの注入は迅速な腫瘍の退縮に至った（Ｗｏｌｆｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：４８９−４９５）。
インビトロのヒト研究
健康被験体からのヒトＣＴＬを、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００に対してショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上に別個に添加して、インビトロで免疫化し、ＪＹ細胞に対する溶解について評価した（図４）。同一のペプチドを、多特異的な大量の（ｂｕｌｋ）ＣＤ８調製物を生成させるために、単一のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＡＰＣに一緒に添加することができる。健康被験体からの黒色腫特異
的ＣＴＬを、完全な刺激／再刺激プロトコルを使用して誘導し、そして刺激で使用されたペプチドのそれぞれを添加されたＪｕｒｋａｔ細胞を溶解するそれらの能力について試験した（図５）。細胞系。図６は、２種の異なるインビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。複数のペプチドを個々のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上に添加しかつ一次刺激前に混合した（ｃｏｍｂｏ  ｍｉｘ）、もしくは複数のペプチドを混合しかつその後ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＡＰＣ上に添加した（ｃｏｍｂｏ  ｌｏａｄ）もの。図Ａはペプチド添加された標的細胞上でのｃｏｍｂｏ  ｍｉｘプロトコルの結果を表す。図Ｂはペプチド添加された標的細胞上でのｃｏｍｂｏ  ｌｏａｄプロトコルの結果を表す。図Ｃは双方のプロトコルから生成された黒色腫標的上での殺傷を表す。
【００８８】
インビトロで細胞傷害性Ｔリンパ球を生成させるためのいかなる天然のもしくは人工産物の抗原提示細胞（ＡＰＣ）系の使用も、これらの系が生成することが可能である抗原特異性により制限される。
【００８９】
以下のＡＰＣ系を利用して、単一エピトープに対する抗原特異的ＣＴＬを生成させた。すなわち、１）規定されたペプチドを適用された（ｐｕｌｓｅｄ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）；２）リンパ芽球に駆動されかつペプチドを適用された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）；３）天然のペプチドが酸ストリッピングされ（ａｃｉｄ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）かつ目的のペプチドが添加されたリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）；４）空のクラスＩ分子を発現するよう工作されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞；ならびにヒトクラスＩおよび共刺激分子でトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｂ．ＬａｔｏｕｃｈｅとＭ．Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０００）１８：４０５−４０９）。
【００９０】
樹状細胞（ＤＣ）は、主要な抗原細胞の提示におけるそれらの広範な応用のために、ヒトにおける主要な抗原提示細胞系とみなされる。自己もしくは外来タンパク質はＤＣ内でプロセシングされる。結果として生じるペプチドエピトープがＨＬＡ分子により提示され、そしてＤＣの表面に輸送される。しかしながら、ＤＣがインビトロで一貫して生成することができず、ＣＴＬが４種の異なるペプチドに対して方向を定めたことが見出された。これは、４種のペプチドのそれぞれに対応する活性を有するＣＴＬを提供していたであろう。加えて、ペプチドの適用の時点でのＤＣの表現型（成熟もしくは未熟）は結果を遂げなかったこともまた見出された。
【００９１】
あるいは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の刺激は、通常、１０までの異なる型のペプチドに対し向けられるＣＴＬをもたらした。これは、１０種のペプチドのそれぞれに対し活性であるＣＴＬを提供する。
【００９２】
ＣＴＬ応答を導き出すショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞およびＤＣの能力を、最初に、単一ペプチドエピトープに対し、それぞれの標準的刺激プロトコルに従って評価した。ＤＣおよびトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を比較するために、未熟ＤＣを、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で自己単球を１週間培養することにより生成させた。成熟ＤＣは、収集２４時間前の培地へのＴＮＦαの添加により、未熟ＤＣから得た。ＤＣ（未熟および成熟）を収集し、ペプチドを適用し、そしてＣＤ８細胞およびペプチドを適用されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の刺激に使用された手順に従って、精製されたＣＤ８細胞と混合した。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、図７に示されるとおり、チロシナーゼペプチドエピトープ６８９について評価される場合に、ＤＣよりも全般としてより良好な刺激物質であることが見出された。さらに、未熟もしくは成熟いずれの表現型を表すＤＣ（図８）も、規定されたペプチドを使用してＡＰＣに適用した場合に、特異的ＣＴＬ応答の
導出においてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞ほど効率的でなかった。これは、免疫系中でＤＣにより演じられる支配的役割のため、とりわけ驚くべきことである。１ドナーでの比較試験を図９に示されるとおり実施した。特異的殺傷が、刺激物質としてハエ細胞を使用する場合に４種の異なるペプチドに対して生成された一方、未熟ＤＣは無意味の特異的殺傷をもたらし、また、成熟ＤＣは刺激に使用された４種のペプチドの１種のみに対する特異的殺傷をもたらした。
細胞傷害性リンパ球の調製
抗ＣＤ８抗体での陽性選択により白血球成分分取（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）サンプルから単離されたＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２．１）、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＢ７．２を発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示される４種の異なる黒色腫関連ペプチドに対して刺激する。ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下にペプチドエピトープを添加された自己単球で２回再刺激する。ＣＴＬをＯＫＴ３およびＩＬ−２とともに非特異的に拡張する。ＣＴＬ活性をＭａｌｍｅ  ３Ｍ細胞に対して測定し、また、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーにより評価する。
【００９３】
製造過程およびプロトコルは、優良実験室規範（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）および優良製造規範（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って行う。「優良実験室規範」および「優良製造規範」は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により設定されている実験室および製造の実務の基準であり、かつ、当業者に容易に知られる。ＣＴＬは、正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、生存率、ＣＴＬ活性、無菌性およびエンドトキシン含量についてモニターする。
【００９４】
乳房および卵巣癌を治療するための本発明の方法での使用に適するペプチドエピトープの一覧を以下の表１に示す。以下の表１に列挙されるものに加えて広範なペプチドエピトープもまた、乳房および卵巣癌を治療するための本発明の方法での使用に適することができるが、但しこうしたペプチドはＴ細胞エピトープであることが、当業者に容易に明らかである。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
【表３】
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【００９７】
【表４】
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【００９８】
黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつエクスビボ生成された自己Ｔリンパ球を使用する悪性黒色腫の治療レジメン
臨床試験を、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつエクスビボ生成された自己の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を使用して、進行性転移性黒色腫患者で実施した。エクスビボ生成されたＣＴＬの少なくとも単回の注入を、治療の周期あたりに患者に投与した。特定の時間および用量での患者へのＩＦＮ−αもしくはＩＬ−２のいずれかの付随する投与が、抗原特異的ＣＴＬによる溶解に対する腫瘍細胞のプライミング、およびＣＴＬのインビボ持続性に有益であったことが示された。
インターフェロンおよびＣＴＬの併用療法
インターフェロン−α（ＩＦＮα）は、多様な悪性病変において、広範なスペクトルの免疫調節および抗増殖効果を有する。過去１０年のいくつかの臨床試験が、ＩＦＮαが黒色腫において抗腫瘍活性を有するという明白な証拠を提供した（Ｌｅｇｈａ，Ｃａｎｃｅｒ（１９８６）５７：１６７５−１６７７）。単剤療法として使用される場合に、ｒＩＦＮ−α−２ａおよびｒＩＦＮα−２ｂは、１から６０超ヶ月までの範囲にわたる応答持続期間を伴い、１５％（範囲、６％〜２７％）の平均応答率を生じた。転移性黒色腫におけるいくつかの単剤ＩＦＮ−α試験の要約を表２および３に列挙する。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
【表６】
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【０１０１】
ＩＦＮ−αの一作用機序は、黒色腫細胞上での腫瘍抗原発現のアップレギュレーションであると思われる。すなわち、それは、腫瘍の表面上での免疫学的に重要な分子の発現を高める能力を有する。こうした免疫学的に重要な分子は、限定されるものでないが、組織適合（マウスＨ−２もしくはヒトＨＬＡ）抗原、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４）のような補助分子、ならびに、腫瘍関連抗原（Ｒｏｂｉｎｃｏｎら，Ｉｍｍｕｎ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）１７２：２７５−２８２；Ｂｏｒｄｅｎら，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ＭＳ（編）：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．ニューヨーク州ニューヨーク、マグロウ−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ），（１９９２）中ｐｐ４４０−４７６）を挙げることができる。ＩＦＮ−αの免疫調節効果は、潜在的に、抗体およびリンパ球双方を包含する免疫系の、インビボで腫瘍を認識かつ攻撃する能力を向上させる可能性がある。
【０１０２】
能動的特異的免疫療法は、播種性黒色腫に治療において重要な臨床活性を立証した。免疫機能研究の結果は、黒色腫ワクチン治療が抗黒色腫ＣＴＬの頻度を増大させることを示した（Ｃａｒｒｅｌら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１５：１１８−１２３）。併用免疫療法レジメン（ＩＦＮ−αおよび黒色腫ワクチン）が、現在、播種性黒色腫の治療で使用されている（Ａｇａｒｗａｌａら，ＢｉｏＤｒｕｇｓ（１９９９）１２：１９３−２０８）。免疫療法のこれら２種の様式が相乗的に作用するかもしれないと考えられる。
【０１０３】
東部共同腫瘍学グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）（ＥＣＯＧ）は、黒色腫を伴う２８７例の患者における外科補助療法としての観察に対するインターフェロンα−２ｂ（ＩＦＮ−α−２ｂ）の前向き無作為化対照試験を完了した（Ｋｉｒｋｗｏｏｄら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９９６）１４：７−１７）。該試験で使用された用量は最大耐用量、すなわち、２０ＭＵ／ｍ２／日を静脈内に（ＩＶ）１週あたり５日を４週間、次いで１０ＭＵ／ｍ２を１週あたり３回皮下に（ＳＣ）４８週間であった。該結果は、ＩＦＮ−α−２ｂを受領する群において再発を伴わない生存および全体の生存の有意の延長が存在したことを示した。しかしながら、毒性は相当なものであり；患者の６７％が重症の（等級３）毒性を有し、かつ、９％が生命を脅かす毒性を有した。用量の変更が患者の大多数で必要とされた。治療はまた高価でもあった。ＥＣＯＧ試験に基づき、ＦＤＡは１９９６年にインターフェロンを黒色腫の外科補助治療として承認した。
【０１０４】
高危険度の黒色腫患者における大規模前向き試験、無作為試験において、６４２例の参加者が３アーム；高用量インターフェロンα−２ａ、すなわち１週あたり２０ＭＵ／ｍ２を筋肉内に３回を１２週間、低用量インターフェロンを受領するもの、もしくは観察に無作為化された。進行までの時間（ＴＩＰ）は高用量群でのみ延長したが、とは言え全体の生存は全３群について同一であった（Ｋｉｒｋｗｏｏｄら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２０００）１８：２４４４−２４５８）。世界保健機関（ＷＨＯ）は、高危険度の黒色腫を伴う４２７例の患者における補助療法としての、観察に対する低用量のインターフェロンα−２ａ、すなわち３ＭＵ／ｍ２  ＳＣを１週あたり３回、３週間の試験を実施した（Ｃａｓｃｉｎｅｌｌｉ，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，（１９９５）ｐｐ４１０（ａｂｓｔｒ））。インターフェロンを受領する患者における疾患を伴わない生存もしくは生存に差異は存在しなかった。
【０１０５】
本発明は：
ａ）腫瘍の表面上の腫瘍抗原の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−αを、黒色腫を伴う被験体に投与すること；および
ｂ）黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種すること
の段階を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【０１０６】
ＩＮＦ−α−２ａもしくはＩＮＦ−α−２ｂのいずれかを本治療方法で使用することができる。ＩＮＦ−αはＳＣ、ＩＭもしくはＩＶを介して患者に投与することができる。本方法のインターフェロン−αの有効量は、ＨＬＡ（クラスＩ）発現および黒色腫関連抗原
の発現（抗原特異的Ｔ細胞による認識および溶解に対する２つの重要な要件）の双方をアップレギュレートするのに十分であるＩＮＦ−αの量である。この有効量は当業者により決定することができる。実施例５（下）は、本治療方法で使用されるべきＩＮＦ−αの有効量の決定におけるいくつかの考慮を記述する。好ましくは、ＩＮＦ−αにより引き起こされる副作用を低下させるために、ＩＮＦ−α−２ａの有効量は約５〜２０ＭＵ／ｍ２／日であり、また、ＩＮＦ−α−２ｂの有効量は約５〜１５ＭＵ／ｍ２／日である。また好ましくは、有効量のＩＮＦ−αは、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に接種する直前に、比較的短い時間の期間、例えば３ないし７日間のみ患者に投与する。好ましい一態様において、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して前記被験体に皮下投与されるインターフェロン−αの有効量は、約１０ＭＵ／ｍ２／日である。
【０１０７】
黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球の有効量は、ＣＴＬを被験体に接種する場合に黒色腫の傷害の成長を停止させるかもしくはその大きさの減少を引き起こすのに十分である、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつエクスビボ生成されたＣＴＬの量である。好ましくは、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球の有効量は、注入あたり約１〜１０×１０９個の細胞である。
【０１０８】
黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球は：
ａ）天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは黒色腫と関連する約１５までの異なるエピトープを同時に提示することが可能であり、各エピトープは長さ８ないし１０アミノ酸のペプチドであり）；
ｂ）前記黒色腫と関連する約１５までの異なるエピトープをｎｎＡＰＣに添加すること；ｃ）前記被験体からＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｄ）前記ＣＤ８＋細胞を、エピトープを添加されたｎｎＡＰＣ細胞系で刺激して黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を得ること；
ｅ）黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；
ｆ）前記被験体から収集されたＣＤ８枯渇末梢血単球を、前記ｎｎＡＰＣに添加された各エピトープと混合すること；
ｇ）前記ＣＤ８枯渇末梢血単球を約γ線放射で照射すること；
ｈ）接着性のＣＤ８枯渇末梢血単球を単離すること；
ｉ）前記接着性末梢血単球に、前記ｎｎＡＰＣに添加された各エピトープを添加すること；
ｊ）黒色腫に特異的な前記ＣＤ８＋細胞を、γ線照射されたエピトープ添加された接着性末梢血単球で再刺激すること；
ｋ）黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；
ｌ）黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＯＫＴ３抗体刺激により拡張すること：
ｍ）拡張されたＣＤ８＋細胞を、適する細胞傷害性Ｔリンパ球の活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること
の段階を含んで成る方法により得られ；
ここで段階（ｊ）は最低もう１回反復することができる。
【０１０９】
好ましくは、天然に存在しない抗原提示細胞系は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５および配列番号６に具体的に説明されるもののような、チロシナーゼ、ｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１由来のペプチドであるエピトープを添加される。
インターフェロン、ＣＴＬおよびインターロイキン−２の併用療法
ヒト組換えインターロイキン−２は、多様な生物学的活性を表すことが示されている、組換えＤＮＡ技術により製造されるリンホカインである。インビトロで、それは、リンホカインの有糸分裂誘発を高め、リンパ球の細胞傷害性を高め、リンホカイン活性化およびナチュラル双方のキラー細胞のキラー活性を誘導することが示されており、そしてそれはインターフェロン−γ産生もまた誘導する。
【０１１０】
それは、転移性腎細胞癌、カポジ肉腫、結腸直腸癌、非ホジキンリンパ腫、ならびに転移性黒色腫の治療について臨床試験で検討された。それは単独で、あるいは化学療法、リンホカイン活性化型キラー（ＬＡＫ）細胞もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはインターフェロンのような生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）と組合せで使用された。それは高および低用量双方で、かつ、多様な注入スケジュール（ボーラスおよび連続）により投与された。奏効率は１５から２０％の範囲にわたった。
【０１１１】
１９９７年のＰｈｉｌｌｉｐによる通覧は、単剤のＩＬ−２を用いて１９９０年代に実施された１５の試験における５４０例の患者を調べた（Ｐｈｉｌｌｉｐら，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９９７）１４：Ｓｕｐｐｌ  ４：３２−３８）。投与は、１週あたり３回の１２ＭＩＵ／ｍ２のボーラスから、３から７ＭＩＵ／ｍ２／日の連続注入まで変動した。該通覧における全体の奏効率は、３〜５０％の範囲および２％の完全寛解を伴い１５％であった。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらにより報告された１３４例の患者の１９９４年の試験（ＪＡＭＡ（１９９４）２７１：９０７−９１３）において、高用量のボーラスのＩＬ−２は、９例の完全寛解（ＣＲ）を伴い７％の寛解率を生じた。ＣＲの９例のうち、８例は９〜９１ヶ月間以上疾患を伴わなかった。サイトカイン作業班（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）は、高用量のＩＬ−２のボーラス療法で治療された２６６例の患者の後向き分析を実施し、それは１６例の患者（６％）でＣＲを生じ、それらの６９％は５年で生存しかつ進行を伴わなかった（Ａｔｋｉｎｓら，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９９７）１６：４９４ａ）。
【０１１２】
組合せ剤のＩＦＮ−αおよびＩＬ−２で治療された９１１例の患者のメタ分析は１７％の奏効率を生じた（Ａｌｌｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９９７）１６：４９４ａ（１７８１））。生存の中央値は１１ヶ月であり、これは単剤療法より有意により長くない。
【０１１３】
ＩＬ−２の投与は、インビボで抗原特異的Ｔ細胞を維持するための努力において、リンパ球の有糸分裂誘発、リンパ球の細胞傷害性およびγインターフェロン産生を高めるために、ＣＴＬ注入直後に使用することができる。
【０１１４】
好ましい一態様において、本発明は：
ａ）腫瘍の表面上の腫瘍抗原の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−αを、黒色腫を伴う被験体に投与すること；
ｂ）黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種すること；および
ｃ）黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球のインビボの維持を高めることが可能である有効量のインターロイキン−２を前記被験体に投与すること
の段階を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【０１１５】
インターロイキン−２はＳＣ、ＩＭもしくはＩＶを介して患者に投与することができる。インターロイキン−２の有効量は、エクスビボ生成された抗原特異的ＣＴＬをインビボで維持するのに十分であるＩＬ−２の量である。この有効量は当業者により決定することができる。実施例５（下）は、本治療方法で使用されるべきＩＬ−２の有効量の決定にお
けるいくつかの考慮を記述する。好ましくは、ＩＬ−２により引き起こされる副作用を低下させるために、ＩＬ−２の有効量は約２〜１０ＭＩＵ／日である。また好ましくは、有効量のＩＬ−２は、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に接種した直後に患者に投与する。より好ましい一態様において、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種した後第０日から第２７日まで連続して被験体に皮下投与されるインターロイキン−２の有効量は、約３ＭＩＵ／日である。
【０１１６】
最も好ましい一態様において、本発明は：
ａ）黒色腫を伴う被験体に、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を接種する前第５日から第１日まで連続して、１０ＭＵ／ｍ２／日のインターフェロン−α−２ｂを該被験体に皮下投与すること；
ｂ）注入あたり約１〜１０×１０９個の細胞の黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を該被験体に接種すること；および
ｃ）黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種した後第０日から第２８日まで連続して約３ＭＩＵ／日のインターロイキン−２を該被験体に皮下投与すること
の段階を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【０１１７】
治療の各周期の終了時に、前記患者における完全奏効もしくは部分奏効を評価することができる。治療周期は約２ヶ月の間隔で反復することができる。
【０１１８】
本発明は、後に続く実験の詳細への参照により、より良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらは、その後に続く請求の範囲でより完全に記述されるところの本発明の具体的説明にすぎないことを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じて、多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、これにより、本発明が関する従来技術をより完全に記述するために、本出願に引用することにより組み込まれる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）抗原提示細胞の製造
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）Ｓ２細胞系を、発表された手順に従ってキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）−Ｒ）卵から調製し、そしてアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託した（ＣＲＬ  １０９７４）。Ｓ２細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充された商業的シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地中で成長させる。
【０１２０】
Ｓ２細胞中でＭＨＣクラスＩおよび共刺激タンパク質を発現させるためのｐＲｍＨａ−３プラスミドベクターは、文献に記述されるとおり構築されたｐＲｍＨａ−１発現ベクター由来であった。それは、メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル酸化シグナルを担持するアルコール脱水素酵素遺伝子を含有する。
トランスフェクションのための相補ＤＮＡを以下のとおり調製した：
ＨＬＡ−Ａ２．１およびβ−２ミクログロブリン：発表された配列由来のプライマーを使用するＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ
Ｂ７．１：発表された配列由来のプライマーを使用するＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲＩＣＡＭ−１：発表された配列由来のプライマーを使用するＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ
Ｂ７．２：発表された配列由来のプライマーを使用するＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ
ＬＦＡ−３：発表された配列由来のプライマーを使用するＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ
相補ＤＮＡは個別にｐＲｍＨａ−３ベクターに挿入した。Ｓ２細胞を、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１プラスミドＤＮＡ、ならびにｐｈｓｈｎｅｏプラスミドの混合物でトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、ジェネチシンを含有するシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）培地中で培養することにより選択した。使用２４時間前に、トランスフェクトされた遺伝子の発現をＣｕＳＯ４の添加により誘導した。発現のレベルは、抗ＨＬＡ−Ａ２．１、抗Ｂ７．１および抗ＩＣＡＭ−１抗体を使用するフローサイトメトリーにより評価した。３０％以上の細胞によるＨＬＡ発現が、ＣＤ８＋リンパ球の効率的なインビトロ活性化に必要である。
ヒトＣＤ８＋細胞の単離
ＣＤ８＋細胞は、ダイナビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ］ＴＭ単離手順（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））を使用する陽性選択により白血球成分分取サンプルから単離する。抗ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体（ヒトγグロブリン［ガンマガード（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）（Ｒ）］１ｍｌ中５０μｇ）を、１％ヒト血清アルブミン（バクスター−ハイランド（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ））および０．２％クエン酸ナトリウムを補充されたダルベッコのＰＢＳ中の洗浄された細胞に添加する。穏やかな混合を伴う４℃で４５分間のインキュベーション後に、ヒツジ抗マウスＩｇＧで被覆されたダイナル（Ｄｙｎａｌ）磁性ビーズ（ダイナビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ］ＴＭ）を含有する同一緩衝液中で、１：１のビーズ対細胞の比で洗浄かつ再懸濁する。細胞およびビーズを滅菌管に入れ、そして４℃で４５分間穏やかに混合する。この時間の終了時に、抗体結合された細胞を、製造元の説明書（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））に従ってＭＰＣ−１（Ｒ）分離装置を使用して磁気的に除去する。ＣＤ８細胞−ビーズ複合体の解離を、ＣＤ８ペプチド５９−７０（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ；配列番号１２）の存在下３７℃で４５分間のインキュベーションにより達成する。遊離ビーズを磁気的に除去し、そしてＣＤ８細胞を計数しかつフローサイトメトリーにより分析して純度を評価する。ＣＤ８＋細胞の回収は典型的に８０％より大きい。表４は、抗ＣＤ８抗体での陽性選択による正常ヒトＰＢＭＣ調製物からの１４の別個のＣＤ８＋調製物の細胞組成を要約する。
【０１２１】
【表７】
2010235611.tif 000008
【０１２２】
精製されたヒトＣＤ８＋細胞のインビトロ免疫感作
一次刺激
トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞を、１０％ウシ胎児血清およびＣｕＳＯ４を補充されたシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）培地（１０６個の細胞／ｍｌ）中、２７℃で２４時間インキュベートする。細胞を収集し、洗
浄し、そして１００μｇ／ｍｌのヒトチロシナーゼ３６６−３７７を含有する昆虫エクスプレス培地（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｘ−ｐｒｅｓｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（バイオウイタッカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））に再懸濁する。２７℃で３時間のインキュベーション後に、Ｓ２細胞を、１０％自己血清を補充されたＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中１：１０の比でＣＤ８＋細胞と混合する。細胞混合物を３７℃で４日間インキュベートし、その間にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞が死に絶える。第５日に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を添加して、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ集団を選択的に拡張する。
再刺激
白血球成分分取の時点で得られた凍結自己ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを融解し、洗浄し、そして１０％自己血清（β２ミクログロブリンの供給源として）および２０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ３６９−３７７を含有するＲＰＭＩ培地中１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁する。γ線照射（５，０００ラド）後に細胞を３７℃で２時間インキュベートする。ダルベッコのＰＢＳで洗浄することにより非接着細胞を除去する。１０％自己血清および１０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ３６９−３７７を含有するＨｅｐｅｓ緩衝ＲＰＭＩ培地中での９０分間のインキュベーションにより、接着性単球にチロシナーゼエピトープを添加する。上清を除去し、そしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）活性化されたＣＤ８＋細胞懸濁物（１０％自己血清を含むＲＰＭＩ培地中３×１０６個の細胞／ｍｌ）を、１の接着性単球に対し１０のＣＤ８＋細胞の比で加える。３７℃で３ないし４日の培養後に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を、培地交換を伴い加え、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ集団を選択的に拡張する。
非特異的拡張
エフェクター細胞を、自己血清、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ（Ｒ）３）、ＩＬ−２およびγ線照射された自己ＰＢＭＣを補充されたＲＰＭＩ培地中でそれらを培養することにより、非特異的に増大させる。
活性および純度のアッセイ
ＣＴＬアッセイ
Ｍａｌｍｅ  ３Ｍ細胞を５１Ｃｒ放出アッセイでの標的細胞として使用する。４％ウシ胎児血清、１％ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．２５％ゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ培地中の５×１０６個のＭａｌｍｅ  ３Ｍ細胞を、０．１ｍＣｉの５１Ｃｒで３７℃で１時間標識する。細胞を４回洗浄し、かつ、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））を含むＲＰＭＩ中１０５個の細胞／ｍｌに希釈する。９６穴マイクロタイタープレート中で、１００μｌのエフェクターＣＴＬおよび１００μｌのペプチド添加された５１Ｃｒ標識Ｍａｌｍｅ  ３Ｍ標的細胞を、１００：１、２０：１および４：１（エフェクター：標的）の比で組合せる。Ｋ５６２細胞を２０：１（Ｋ５６２：Ｍａｌｍｅ  ３Ｍ）の比で加えて、ナチュラルキラー細胞のバックグラウンド溶解を低下させる。非特異的溶解は非腫瘍性ＨＬＡ−Ａ２．１線維芽細胞系Ｍａｌｍｅ  ３を使用して評価する。５１Ｃｒの自発的放出および最大放出を測定するための対照を二重で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）包含する。３７℃で６時間のインキュベーション後に、プレートを遠心分離し、そして上清を計数して５１Ｃｒ放出を測定する。
【０１２３】
特異的溶解のパーセントは、以下の等式：
【０１２４】
【数１】
2010235611.tif 000009
【０１２５】
を使用して計算する。
フローサイトメトリー。
【０１２６】
インビトロ活性化の前および後のＣＤ８＋細胞を、蛍光モノクローナル抗体およびＦＡＣＳ分析を使用して、多数の細胞表面マーカーについて分析した。健康なドナーからの細胞を使用する典型的な活性プロトコルからの結果を表５に示す。
【０１２７】
【表８】
2010235611.tif 000010
【０１２８】
活性および純度に加えて、ＣＴＬ調製物を、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすることができる。
【０１２９】
【表９】
2010235611.tif 000011
【０１３０】
【表１０】
2010235611.tif 000012
【０１３１】
実施例２
黒色腫に対する細胞傷害性Ｔ細胞注入の試験
試験の目的
本実施例は、以下の因子：
１．インビトロ免疫感作後の再注入された自己ＣＴＬの安全性および忍容性；
２．制限希釈分析での全身循環の要因考慮（ｆａｃｔｏｒｉｎｇ）における注入されたＣＴＬの動力学；
３．ラジオシントグラフィーによるＣＴＬの全身の配置；
４．免疫組織学による生検された結節の細胞組成（ＣＴＬ、ＴＨ、ＮＫ、Ｂ細胞）；ならびに
５．２ヶ月にわたる測定可能な傷害の退縮および応答の持続期間
に従って評価されるところの黒色腫の治療における細胞傷害性Ｔ細胞注入の有効性を教示する。
患者集団
治療への適格性は、患者が測定可能もしくは別の方法で評価が可能であった組織学的に報告された切除不可能な悪性黒色腫、およびＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを有することを必要とした。治療前評価は、ＭＲＩもしくはＣＴスキャンによる脳の放射線学的評価、胸部および腹部のＣＴ走査、ならびに、とりわけ皮膚およびリンパ節の身体検査を包含した。治療された患者の総数は１５（９例の男性および６例の女性）であった。年齢は、５８歳の平均を伴う３３から７５歳までの範囲にわたった。転移性疾患の平均持続期間は１．５年であった。アネルギーの状態が存在したかどうかを決定するための治療前皮膚試験を１５例中１４例の患者で実施し、１４例中５例の試験結果は評価された普遍的抗原の全７種について陰性であった。患者は、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）を用いるＦＡＣＳ分析によりＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプについてスクリーニングした。サブタイプ分類（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）はＰＣＲ分析により実施した。患者の１例を除く全部がＨＬＡ−Ａ＊０２０１であり、例外（患者０８）はＨＬＡ−Ａ＊０２０５であった。エクスビボ生成された自己ＣＴＬでの治療
１５例の患者を本臨床プロトコル下に治療した。全患者は、自己ＣＴＬの少なくとも単回注入を受領した。各患者に投与された周期の数および細胞の用量は図２５に要約する。インビトロで生成された細胞の数は、アフェレーシス（ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ）処置から単離されたＰＢＭＣの数、および各ＰＢＭＣ調製物中に存在するＣＤ８＋  Ｔ細胞の数のような患者関連の因子に依存した。インビトロで生成された細胞の全部をドナーに再注入したため、各患者に投与された用量は必然的に変動した。患者間の用量を正規化する試み
において、計算された「効力」得点を各用量について記録した。該値は、細胞の総数にペプチド添加された標的細胞で得られた溶解活性を掛けることにより得た。注入されたＴ細胞の用量は、４×１０７個の最少（患者０８）から３．２×１０９個の最多（患者１３）までの範囲にわたった。患者は各周期の終了時の彼らの臨床状態に基づいて第二、第三もしくは第四の治療周期に進入した。アフェレーシスサンプルから得られたＰＢＭＣの数は、付加的周期を受けている患者で、とりわけその後の周期の開始が以前のものの終了に近かった場合に、より小さい傾向があった。これは、前の周期の間に投与されたＩＦＮα−２ｂによる持続性のリンパ球減少に帰される。単離された投薬を受けたことのないＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数はＰＢＭＣ調製物のそれぞれ中のその割合に依存した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセントは患者間で８％ないし３１％の間で変動した。得られた拡張係数は最終的な細胞数にもまた寄与し、そして０．１から６．０倍の範囲にわたった。エクスビボでＣＴＬを生成させるための手順は本明細および上の実施例１に教示される。
ＩＦＮα−２ｂに応答してのクラスＩおよび黒色腫関連抗原のアップレギュレーション
インビボで黒色腫細胞を溶解する抗原特異的ＣＴＬの能力を高める試みにおいて、低用量ＩＦＮα−２ｂを、ＣＴＬ注入前に連続して５日間、および追加の４週間に週３回投与した。サイトカインに対するインビボ応答の一測定方法は、連続的時間点で得られる生検を特異的抗体での陽性染色についての免疫組織化学的分析により評価することである。連続的生検を、クラスＩおよび抗原発現の双方の評価のため、複数の皮膚傷害を伴う１例の患者（患者０４）で得た。生検は、クラスＩおよびＭＡＲＴ−１発現がいずれの治療前も弱く陽性であったことを示した（生検Ａ）。１０ＭＵ／ｍ２の皮下注入の５日後に、これら２種のマーカーの劇的な増大が示された（生検Ｂ）。チロシナーゼおよびｇｐ１００について、免疫組織化学的染色は治療前サンプルでそれぞれ陰性ないし弱く陽性であった（生検Ａ）。最初の５日のＩＦＮα投与および１３回の追加治療後に、これらの後者の抗原の発現が、染色された組織サンプル中で増大した（生検Ｃ）。
エクスビボ生成されたＣＴＬの抗原特異性
全患者からの生成されたＣＴＬを、生検材料が系統を樹立するために利用可能であった場合に、ペプチド添加されたＴ２標的、ＨＬＡ−Ａ２黒色腫細胞系（Ｍａｌｍｅ３Ｍ）および自己黒色腫系統に対して、解放（ｒｅｌｅａｓｅ）の日に評価した。細胞の各調製された用量をその細胞溶解活性について評価した。各ペプチド単独で、もしくは全４種のペプチドを同時にのいずれかで提示するペプチド添加されたＴ２細胞を使用して、各患者について生じられるＣＴＬ応答の特異性を決定した。内因性に発現された黒色腫関連抗原を担持する細胞を溶解する能力を、ＨＬＡ−Ａ２を合致された系統もしくは自己腫瘍系統で評価した。細胞溶解活性に加え、抗原特異性を、特異的ペプチド刺激に応答して作成される細胞内γインターフェロン産生の確立された検出方法で評価した。エクスビボプロトコルの終了時に生成されたＣＴＬをこの方法により評価した。ペプチドのそれぞれに特異的な細胞の割合を個別に記録した。患者１３からの各大量の（ｂｕｌｋ）ＣＤ８培養物中の特異的細胞の総数を、Ｔ細胞のその集団中で検出されるペプチド特異性のそれぞれを加えることにより計算した。特異的細胞の総数の増大を、各連続する治療周期で検出することができた。
ＣＴＬ治療後の腫瘍生検に浸潤するＣＤ８およびＣＤ４細胞の検出
治療の前、間および後の全患者からの生検サンプルが理想的であったであろう。しかしながら、実験条件は制限された数の患者のみからの生検サンプルを見込んだ。腫瘍組織は試験に参入した１５例の患者の５例から得た。２例の患者（患者０８および１３）において、生検サンプルは、Ｔ細胞治療後それぞれ５および６週で入手可能であった。組織サンプルの検査は、浸潤するＣＤ８およびＣＤ４双方の細胞の存在を示した。腫瘍サンプルの１つは、追跡検査の時点（Ｔ細胞の第二の注入後４週間）までに大きさが増大した、頭皮の後頭部領域の皮膚傷害から採取した。該生検は、リンパ球でひどく浸潤された組織の壊死を示した。他の生検は股関節置換手術の間に取り出された大腿骨頭部からであった。患者０８からの皮膚傷害は一般的クラスＩおよび特異的ＨＬＡ−Ａ２マーカー双方について強く陽性（４＋）であった。チロシナーゼおよびｇｐ１００は弱く陽性（それぞれ１＋および２＋）であった一方、ＭＡＲＴ−１はこの同一のサンプルで陰性であった。患者１３
からの生検の領域もまた、より不均質な染色；ＨＬＡ−Ａ２．１分子の発現を欠く腫瘍細胞の明確な集団、およびＭＡＡの１種もしくはそれ以上を伴い壊死性であった。しかしながら、無傷の組織領域は強いクラスＩ（４＋）および黒色腫関連抗原の全部を示した。この後者のサンプルにおけるリンパ球浸潤は、腫瘍結節に深く浸潤するよりはむしろそれらを取り巻くようであった。しかしながら、腫瘍に直接関連した最高の割合の細胞はＣＤ８細胞であった。これらの患者の双方からの治療前生検サンプルの欠如は、治療前の組織サンプル中の類似の型の浸潤する細胞の確認を予防した。
Ｔ細胞治療後のＣＴスキャンは客観的応答を確認する
ＣＴスキャンは治療前スクリーニング基準および治療後追跡検査の一部であった。患者１０は治療前スキャン（９９年６月２３日）の５週間後に８×１０８個のＣＴＬの単回注入を受領した（９９年７月２７日）。注入１ヶ月後に胸部のＣＴスキャンを反復した場合（９９年８月２７日）に、肺傷害の大きさの劇的な減少が示された。同様に、患者１４は、６．６×１０８個の細胞での第一の注入（９９年１０月５日）の３．５週間前に参入過程の一部として胸部ＣＴスキャンを受けた（９９年９月１０日）。１１．５×１０８個の細胞での第二の注入１ヶ月後の追跡ＣＴスキャン（９９年１月７日）は３個の別個の傷害の劇的な縮化を示した。患者１３もまた前および後ＣＴスキャンで測定されたような客観的応答を有した。傍気管腺症は周期Ｉ後に７．８ｃｍ２（試験前）から４．４ｃｍ２となり、そして周期ＩＩ後に消失した。
アネルギー状態の存在はＣＴＬを生成させるもしくは臨床応答を予防する能力を排除しなかった
本プロトコル下で治療された患者の大部分は以前の医学的介入を受領していた。治療前皮膚試験を実施して、一団の７種の普遍的抗原に対するアネルギー応答が、エクスビボでＣＴＬを生成させるかもしくは報告された臨床応答を予防するかのいずれかの不能と相関したかどうかを決定した。エクスビボでＣＴＬを生成させる能力は、患者の治療前皮膚試験の結果と相関しなかった。患者０３および０４（双方とも混合型応答体（ｍｉｘｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））は、第二の周期の開始前に反復皮膚試験を有し、そしてアネルギーのままであったことが注目されるべきである。
実施例３
乳房および卵巣腫瘍細胞を溶解することが可能なＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬの生成
われわれは、全部の形態の癌にこのアプローチを用いて標的を定めることができるかどうかを決定するために、他の腫瘍型にわれわれのＣＴＬ生成技術を適用することに興味をもった。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、多くのヒトの癌、主として乳房、卵巣および結腸の腺癌において増幅かつ過剰発現されるＥＧＦＲに対する相同性をもつ癌原遺伝子である。それはしばしば攻撃的疾患と関連し、そして乏しい予後の指標となる可能性がある。それはこれらの型の癌の可能な標的としていくつかの臨床試験で研究されている。
【０１３２】
１９９０年代早期に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドエピトープが、コンピュータに補助されるペプチド結合アルゴリズム、もしくは卵巣癌患者の腹水から単離されたＣＴＬをマッピングすることのいずれかにより同定された（表６）。
【０１３３】
【表１１】
2010235611.tif 000013
【０１３４】
ペプチドの全部を合成し、同定番号（ＰＲＩ＃）を与え、そして、黒色腫関連のＴ細胞ペプチドエピトープについてわれわれが使用した同一の方法を利用してエクスビボでＣＴＬを生成させる能力について評価した。ＣＤ８細胞を正常ドナーから単離して、既知のＣＴＬペプチドエピトープを添加されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を用いてエクスビボでＣＴＬを慣例に生成させる能力を決定した。ペプチド８２６、８３５、８６１および８６３はＣＴＬ生成の最高の頻度を有した（表７）。
【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は１０種までの異なるペプチドエピトープを提示する独特の能力を有する（図１０）一方、われわれは、これらのペプチドに対するＣＴＬをエクスビボで生成することの頻度により４種のＨＥＲ−２ペプチド、８２６、８３５、８６１および８６３を選択した。これら４種の異なるＨＥＲ−２ペプチドは、トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の表面上に提示されたＨＬＡ−Ａ２．１分子への弱いないし中程度の結合体（ｂｉｎｄｅｒ）を表す。われわれは、黒色腫関連ペプチドを用いてでのわれわれの実験が、
弱いクラスＩ結合体が実際にそれらが天然のＴ細胞エピトープを表す場合に腫瘍細胞を認識する強力なＣＴＬを一般に生成することを示唆しているため、弱いＡ２結合体を包含する傾向がある。われわれが標的を定める腫瘍関連タンパク質の大多数は自己抗原であり、そしてそれ自体、ウイルスペプチドとともにみられるクラスＩ分子に対する高親和性を有することを期待することができる。低ないし中程度の結合体は、一般に、腫瘍細胞を非常に効率的に溶解するＣＴＬを生成させる。これは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に対する低親和性結合体である（図３）がそれでもなおペプチド添加された標的細胞（Ｔ２）もしくはより重要には黒色腫細胞（Ｍａｌｍｅ３Ｍ）双方を溶解することが可能な強力なＣＴＬを慣例に生成させるエピトープを表す（図１２）ＭＡＲＴ−１ペプチドで立証された。
【０１３７】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕはＥＧＦ−Ｒファミリーの１メンバーでありかつ増殖因子受容体として機能する。ＨＥＲ−２タンパク質はヒトにおいて胎児の発生の間に発現される。成体では、該タンパク質は多くの正常組織の上皮細胞中で弱く検出可能である。正常細胞において、ＨＥＲ−２遺伝子は単一コピーとして存在する。該遺伝子の増幅および／もしくは関連タンパク質の過剰発現が、乳房、卵巣、子宮、胃を包含する多くのヒト癌、および肺の腺癌で同定されている。ＨＥＲ−２とＥＧＦ−Ｒ受容体との間の配列の差異を表８に示す。われわれが評価した４種のＨＥＲ−２ペプチドの３種は、２種のタンパク質の間の３個もしくはそれ以上のアミノ酸変化を有する。単一のアミノ酸変化は２種のタンパク質を区別するのに十分である。
【０１３８】
【表１３】
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【０１３９】
ＣＴＬが４週間のエクスビボ刺激プロトコル後に生成された後、われわれは、免疫化ペプチドを用いて調製されたＨＬＡ−Ａ２．１四量体分子を使用して、ペプチド特異的細胞が存在したかどうかを評価した。図１３に立証されるとおり、ペプチド特異的ＣＴＬを生成させる能力はドナー依存性であった。図Ａ（ドナー２６１）において、該ドナーはペプチド８３５に対する強いＣＴＬ応答を作成した（３７．５５％）。図Ｂ（ドナー２６２）において、ペプチド特異的ＣＴＬを８３５および８６１双方の四量体分子で検出することができる（それぞれ３．６％および１５．１％）。これは、該刺激プロトコルの終了時にペプチド特異的ＣＴＬを保証するための複数のペプチドの使用を支持する。本エクスビボプロトコルは、多特異性ＣＴＬを比較的容易に生成させることを可能にする。
抗ペプチドおよび抗腫瘍応答
完全なエクスビボプロトコルの完了後に、生成されたＣＴＬを抗原特異性について評価した。ＣＴＬを生成させるために、第０日にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に４種のＨＥＲ−２ペプチドの組合せを添加した。４週のエクスビボ刺激プロトコルの終了時に、大量のＣＤ８培養物を抗原特異性について評価した。免疫化ペプチドのそれぞれを添加されたＴ２細胞を標的細胞として使用した。図１４に典型的な応答を描く。大量の培養物は４種のＨＥＲ−２ペプチドのそれぞれに対する特異性を含有する。抗腫瘍応答を卵巣腫瘍細胞系（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−７７）で評価した。標的細胞系がＨＬＡ−Ａ２．１拘束性でない場合、われわれは＋／−アッセイ系を有するように細胞系をトランスフェクトした。ＨＬＡ−Ａ２．１をＨＴＢ−７７系統にトランスフェクトした場合、ＣＤ８エフェクター細胞による高められた殺傷が示された（図１５、図ＡないしＤ）。個々のペプチドを代表するＨＥＲ−２特異的エフェクターを評価して、この腫瘍細胞系上でのペプチドエピトープのそれぞれの提示を確認した。
【０１４０】
ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた乳房腺癌細胞系（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−１３１）もまた、ＨＥＲ−２特異的ペプチドエフェクターでの腫瘍溶解を立証する能力について評価した。ペプチド８６１に特異的なＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合にこの腫瘍細胞系を溶解することができた（図１６）。
腫瘍細胞の溶解に必要とされるＩＦＮγ処理
ＨＴＢ−７７／Ａ２．１細胞系は、ペプチド特異的溶解を立証するためにＩＦＮγでの前処理を必要とする。細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイの開始前２４時間、５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（２５ｎｇ／ｍｌの比活性）で処理した。図１７で、ＩＦＮγの添加は、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた細胞系の高められた溶解をもたらした。ＨＬＡ−Ａ２．１およびＨＥＲ−２双方の表面発現に対するこの用量のＩＦＮγの影響を決定するために、ＦＡＣＳ分析を実施して、誘導の２４および４８時間後双方のこれらの分子のレベルを測定した。図１８、図ＡおよびＢはＦＡＣＳ分析の結果を描く。図Ａで、ＩＦＮγでの誘導後２４および４８時間に、ＨＴＢ−７７細胞の表面上でのＨＥＲ−２分子の促進は存在しなかった。ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた細胞では、ＨＥＲ−２もＨＬＡ−Ａ２．１も、類似の処理プロトコル後に表面の発現レベルの増大を立証しなかった。示されたことは、ｍＲＮＡレベルをマイクロアレイＤＮＡチップ分析により評価した場合のＴＡＰ−１の発現、ならびにＨＬＡ−ＤＭおよび−ＤＲ、カテプシンＳおよびＤならびにカスパーゼ５のレベルの増大であった（図１９）。これは、ＩＦＮγの存在下でＨＴＢ−７７／Ａ２．１細胞の促進殺傷が存在する理由を説明するとみられる。この特定の分子のアップレギュレーションは、ＨＥＲ−２分子のより効率的なプロセシングをもたらして目的のペプチドのより良好な提示を可能にするとみられる。
ペプチド
合成ペプチドはペプチド合成機（ギルソン  カンパニー  インク（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．））を使用して標準的なＦｍｏｃ化学により作成した。全部のペプチドはＣ−８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより＞９５％純度まで精製した。純度および正体は、電子スプレーイオン化を用いる質量分析計を使用して確立した。黒色腫関連ペプチドは：ペプチド８１９はＭＡＲＴ−１特異的であり（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ  配列番号６）、８１７および８５３は双方がｇｐ１００ペプチドであり（それぞれＩＴＤＱＶＰＦＳＶ  配列番号４およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ  配列番号５）、チロシナーゼ特異的ペプチドは６８９および７９２であり、７９２は、ペプチド６８９により表される天然の配列（ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ  配列番号１）の翻訳後修飾されたバージョン（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ  配列番号２）を表した、を包含した。ペプチド８２６（ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ  配列番号７）および８３５（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ  配列番号８）は、ｐ１８５タンパク質のそれぞれ細胞内および細胞外ドメインからのＨＥＲ−２／ｎｅｕ配列を表した。Ｐｅｃ６０２０（ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ  配列番号１０）Ｐｅｃ６０２５（ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ  配列番号１１）は卵巣腫瘍系統で検出される粘液素タンパク質を表す重なり合う配列であった。Ｃ−レ
クチンもまた卵巣腫瘍細胞系で検出されるタンパク質であり、そしてその配列からのペプチド（Ｃ−レクチン８）はＫＭＡＳＲＳＭＲＬ  配列番号９により表される。
インビトロ細胞傷害性アッセイ
標準的５１Ｃｒ放出アッセイを実施して、Ｔ２細胞に添加された黒色腫関連ペプチドエピトープのＣＴＬエフェクター細胞認識を測定した。収集された３×１０６個のＴ２細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ（培地）中で成長させた。０．１ｍＣｉの５１Ｃｒを加え、そして水浴中３７℃でインキュベートした。標識された細胞を１０ｍｌの４％洗浄液（ＲＰＭＩ＋４％ＦＢＳ）およびペレットに加え、追加の２回洗浄し、そして自発的対洗剤に溶解された細胞の放射活性を記録するために０．２×１０６個／ｍＬの最終濃度に培地で再懸濁した。細胞に２０μｇ／ｍＬの適切なペプチド（１種もしくは複数）を３０分間適用した。５０μＬを、１０、２、０．４および０．０８×１０６個／ｍＬのＣＤ８エフェクター細胞をそれぞれ含有する各９６穴プレートに加え、これを３７℃で６時間インキュベートし、回転しかつ上清について収集した。
フローサイトメトリーおよび四量体染色
細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３）中４℃で３０分間のインキュベーション、次いで同一緩衝液での洗浄により、ＦＩＴＣもしくはＰＥ結合モノクローナル抗体で標識した。細胞を、データ獲得およびそれのセルクェスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェアを用いるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））での分析前に０．５％ホルムアルデヒド中で固定した。非特異的染色は、精製された一次抗体を標識するのに使用された同一の二次抗体、もしくは一次抗体を直接標識した場合はアイソタイプを合致された対照を用いて測定した。四量体染色は、陰性対照として配列ＳＬＹＶＴＶＡＴＬ  配列番号４３をもつＨＬＡ−Ａ２．１特異的ＨＩＶｇａｇ四量体分子（ベックマン  コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて実施した。ＨＥＲ−２特異的四量体は、配列ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（８２６  配列番号７）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（８３５  配列番号８）もしくはＶＭＡＧＶＧＦＳＰＹＶ（８６１  配列番号１６）ペプチドを用いて作成した。ＰＥ標識四量体ＨＬＡ−Ａ２．１−ペプチド複合体を、フルオレセインイソチシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ８ａ（ＢＤ  ファーマジン（ＢＤ  ＰｈａｒＭａｇｉｎ））モノクローナル抗体とともに使用して、エピトープ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、包装挿入物に記述されたとおり染色した。サンプルをベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳｃａｎでの二色フローサイトメトリーにより分析し、そしてゲートされた（ｇａｔｅｄ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、四量体ＨＬＡ−Ａ２．１−ペプチド複合体での染色について検査した。
実施例４
本エクスビボ刺激プロトコルを用いる付加的な乳房および卵巣特異的ＣＴＬの生成
われわれは、多様な腫瘍起源の数種の腫瘍抗原の全部の既知のＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドエピトープに対するＣＴＬ応答を生成する能力を立証した。われわれの当初の研究は黒色腫に焦点を当て、ここで、われわれは、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼの黒色腫関連タンパク質に特異的な４種の異なるペプチドエピトープに特異的なＣＴＬで治療された患者における客観的臨床応答を立証することが可能であった［Ｒｉｃｈａｒｄｓら，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，カリフォルニア州サンフランシスコ（２００１年５月）］。
【０１４１】
広範な他の癌に存在する他の腫瘍抗原に対するＣＴＬを生じさせる能力を拡大するため、われわれは、数種の異なる腫瘍型に共通の腫瘍抗原に対する発表されたおよび新規の配列を選択した。これらは、ＡＥＳ、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＦＢＰ、Ｃ−レクチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｐｅｃ６０、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、テロメラーゼおよびＧ２５０を包含する。表１０はこれらの抗原、発現の頻度およびそれらを発現する癌を記述する。われわれのエクスビボ刺激プロトコルを用いてのこれらのペプチドへの応答の頻度を表９に列挙する。
【０１４２】
【表１４】
2010235611.tif 000016
【０１４３】
【表１５】
2010235611.tif 000017
【０１４４】
実施例５
インターフェロンおよびインターロイキン−２と連結されたＣＴＬ注入を使用する悪性黒色腫の治療
試験の目的
本実施例は、以下の因子：
１．ヒトクラスＩおよび共刺激分子でトランスフェクトされかつ黒色腫関連ペプチドエピトープを添加されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞でのインビトロ免疫感作後に再注入される自己ＣＴＬの有効性を確立する；
２．処方された用量およびスケジュールでの、インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞での免疫感作によりエクスビボで生成される自己ＣＴＬの投与の安全性および忍容性を確立する；
３．腫瘍浸潤Ｔ細胞が治療後に腫瘍生検中に存在するかどうかを決定する；
４．治療された患者の末梢血中の抗原特異的ＣＤ８細胞の存在および持続性を立証する；５．ＩＦＮα（１０ＭＵ／ｍ２）の５回の連続する連日の皮下注入が、インビボで黒色腫の表面上のクラスＩおよび黒色腫関連抗原をアップレギュレートすることができることを確認する
に従って評価されるところの黒色腫の治療における細胞傷害性Ｔ細胞注入の有効性を教示する。
【０１４５】
臨床試験ＣＴＬ−０３の概要を図２０に提示する。
患者集団
治療への適格性は、患者が測定可能かつ評価に容易にかけられた、組織学的に報告された切除不能の悪性黒色腫を有することを必要とした。加えて、患者はＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを有することを必要とされた。治療前評価は、ＭＲＩもしくはＣＴスキャンによる脳の放射線学的評価、胸部および腹部のＣＴ走査、ならびにとりわけ皮膚およびリンパ節の身体検査を包含した。参入されるべき患者の総数は４２である。２１例の患者は対照のサイトカインのみのアームにあり、また、２１例の患者はサイトカイン＋Ｔ細胞治療のアームにある。３１例の患者が今日までに参入した（１７例は対照アームに参入し、そして１４例がＴ細胞治療アームに参入した）。対照アームで進行する患者は、彼らが所望する場合はＴ細胞アームへの交差を提供する（１１例の患者が交差した）。今日までに治療された患者の総数は３１（１６例の男性、１５例の女性）である。年齢は、５２歳の平均を伴い２７から８０歳までの範囲にわたった。患者を、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ：ＢＢ７．２）を用いるＦＡＣＳ分析によりＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプについてスクリーニングした。サブタイプ分類をＰＣＲ分析により実施した。２例を除く全患者がＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性であった。他のＨＬＡ−Ａ２サブタイプはＨＬＡ−Ａ２＊０２０２およびＨＡＬ−Ａ２＊０２０５であった。
薬物の投与
インターフェロン−α−２ｂ（イントロン−Ａ［Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ］（Ｒ）；組換えインターフェロンα−２ｂ、シェリング  コーポレーション（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージー州ケニルワース）を、ＣＴＬ注入前の連続する５日間、１０ＭＵ／ｍ２で患者に皮下に投与した。エクスビボでショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞で活性化された自己リンパ球（１〜１０×１０９個）を、ＩＮＦ−α投与後のその日に患者に注入した。インターロイキン−２（プロリューキン［ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ］（Ｒ）；アルデスリューキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、組換えＩＬ−２、カイロン  コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ  ＣＯｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州エメリービル）を、ＣＴＬ注入直後に連日３ＭＩＵで患者に皮下に投与し、そして別の連続する２７日間継続した。
【０１４６】
表１１は、補助の設定（全部の検出可能な腫瘍の外科的除去後）のＩＦＮ−αもしくは高用量のＩＬ−２の単回投与についてＦＤＡに承認されたプロトコルで使用されるものを用いる、試験ＣＴＬ−０３で使用されたサイトカイン用量の比較を示す。
【０１４７】
【表１６】
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【０１４８】
精製されたＣＤ８細胞のインビトロ免疫感作
一次刺激
トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞を、１０％ウシ胎児血清および硫酸銅を補充されたシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）培地中（１０６個の細胞／ｍＬ）、２７〜２８℃で２４〜７２時間インキュベートする。Ｓ２細胞を収集し、洗浄し、そして、０．１μｇ／ｍＬの各ペプチド；ヒトチロシナーゼ３６９−３７７（配列番号１  ＹＭＮＧＴＭＳＱＶおよび配列番号２  ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）、ｇｐ１００  ２０９−２１７（配列番号４  ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、ｇｐ１００  １５４−１６２（配列番号５  ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ）およびＭＡＲＴ−１  ２７−３５（配列番号６  ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ならびに５μｇ／ｍＬヒトβ２ミクログロブリンを含有する昆虫エクスプレス培地（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｘ−ｐｒｅｓｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（バイオウイタッカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））に再懸濁する。室温（２３〜２５℃）で３〜４時間のインキュベーション後に、Ｓ２細胞を、５〜１０％自己血清を補充されたロズウェル
パーク  メモリアル  インスティテュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）培地（合成培地、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中１：１０の比でＣＤ８＋細胞と混合する。細胞混合物を３７℃で４日間インキュベートし、その時間の間にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞が死に絶える。第４もしくは５日に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ）を、培地の交換を伴い加えて、黒色腫関連抗原（ＭＲＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼ）に対する特異性をもつ細胞よりなる抗原特異的ＣＴＬ集団を選択的に増大させる。
再刺激
白血球成分分取の時点で得られかつ将来の使用のため凍結された自己ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣＳを融解し、洗浄し、そして、１０％自己血清、５μｇ／ｍＬ組換えヒトβ２ミクログロブリン、ならびに５〜２０μｇ／ｍＬ（添加されるべきペプチドの総数に依存する）の、上述された刺激で使用されたチロシナーゼ、ｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１を含有するＲＰＭＩ培地に１０６〜１０７個の細胞／ｍＬ（ＣＤ８単離段階の時点で収集されたＣＤ８枯渇ＰＢＭＣの数に依存する）で再懸濁する。γ線照射（５，０００ラド）後に、細胞
を３７℃で２時間インキュベートする。非接着細胞を、ダルベッコのＰＢＳで洗浄することにより除去する。接着性単球に、１％ＨＳＡ（自己血清の代わりに、血清中に存在するかもしれない潜在的プロテアーゼを導入する可能性を回避するため）中の５μｇ／ｍＬヒトβ２ミクログロブリンおよび５〜１０μｇ／ｍＬの５種のペプチドエピトープのそれぞれを含有するレイボヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ）培地中での９０分間のインキュベーションにより、上述された５種のペプチドエピトープを添加する。上清を除去し、そして、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で活性化されたＣＤ８細胞懸濁物（１０％自己血清を含むＲＰＭＩ培地中２．５×１０６個の細胞／ｍＬ）を、１の接着性単球に対し１０のＣＤ８細胞の比で加える。３７℃で３ないし４日の培養の後に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ）を、培地の交換を伴い加えて、黒色腫特異的ＣＴＬ集団を選択的に増大させる。合計で２回のこうした接着性細胞のペプチド特異的再刺激段階（一方は一次刺激後およそ１週間後、および第二のものはおよそ１週間後）が起こる。非特異的増大段階は、４週間のエクスビボプロトコルの開始時に起こる。
非特異的増大
２回の再刺激を受けたＣＤ８＋エフェクター細胞を、ＯＫＴ３抗体で刺激された後にフィーダー細胞（照射された、ＣＤ８＋選択されない細胞）とともに細胞培養袋中で増大させる。凍結されたＣＤ８＋選択されない細胞を融解し、洗浄し、そしてその後γ線照射する（３５００ラド）。４：１（フィーダー：エフェクター）の比を、ＯＫＴ３抗体で被覆されたＴ−２２５フラスコに入れる。ＯＫＴ３刺激は、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充された１０％自己血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地で実施する。２日後に、刺激されたＴ細胞を新鮮培地で希釈し、そして増大のために細胞培養袋に移す。新鮮培地およびＩＬ−２をおよそ２日ごとに補充して、迅速に拡張するＴ細胞を養う。
エクスビボ刺激プロトコル後のＣＤ８細胞の表現型分析
フローサイトメトリーにより測定されるところの表現型分析を、白血球成分分取サンプルからの単離の日、および細胞を患者に戻す注入のため解放した日に、精製されたＣＤ８＋細胞で実施した。統計学的分析を、同一のエクスビボ刺激プロトコルを受けた患者および正常ドナーからのサンプルを用いて実施した。統計学的有意差が、サンプルが患者由来であったか正常ドナー由来であったかに関係なく、投薬を受けたことのないＣＤ８＋サンプルと、エクスビボ刺激プロトコルの終了時に得られたＣＤ８＋エフェクター細胞との間で見出された。
【０１４９】
活性化マーカー（例えば、休止期のリンパ球上で発現されないがしかし活性化に際して迅速に誘導されるＣＤ６９；活性化されたＴ細胞上で発現されるクラスＩＩ分子ＨＬＡ−ＤＲ）、記憶マーカー（例えば、活性化された細胞および大部分の記憶細胞上で発現されるＣＤ４５ＲＯ）、インテグリンマーカー（例えば、炎症の部位での血液から組織へのリンパ球の移動に関与するＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）、補助分子（例えば、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８；細胞傷害性リンパ球殺傷で補助しかつ上皮を包含する多くの細胞への接着を媒介する）、ならびにサイトカイン受容体マーカー（例えば、機能的な高親和性ＩＬ−２Ｒ受容体は、非共有的に会合されたＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２ヘテロ二量体より構成される）は、全部、該エクスビボ刺激プロトコルの完了後にＣＤ８エフェクター細胞上でアップレギュレートされることが見出された。表１２は該分析の結果を要約する。
【０１５０】
【表１７】
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【０１５１】
表現型分析の結果は、ＣＤ８＋エフェクター細胞が本明細書に記述されるエクスビボプロトコルにより活性化されることを支持する。これらの活性化されたＣＤ８＋エフェクター細胞は、インビボで血液から腫瘍部位に移動することが可能であり、また、非常に強い感受性を伴い腫瘍標的細胞を殺すことが可能であり、そして、低用量のＩＬ−２の存在下で潜在的に増殖することができる（高親和性のＩＬ−２Ｒがこれらの細胞上に存在するため）。ＣＤ１２２は休止期のＴ細胞の亜集団上で構成的に発現される。表１２で、白色領域は、ＣＤ８＋エクスビボ刺激プロトコルの完了後にアップレギュレートされる統計学的に有意の値である。淡灰色領域は有意のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを示さない。濃灰色領域は、報告された分子の統計学的に有意のダウンレギュレーションを示す。これらのマーカーの調節は、表現型分析により測定されるところの、腫瘍細胞を追跡かつ溶解することが完全に可能な活性化されたＴ細胞の誘導と矛盾しない。
【０１５２】
フローサイトメトリー  ドナーの白血球成分分取からおよそ１×１０７個の精製されたＣＤ８＋細胞を得る。各サンプルを、１００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０２％ＮａＮ３）あたり１×１０６個で滅菌チューブに入れる。１００μｌの細胞懸濁物を含む各チューブに、ＦＩＴＣもしくはＰＥのいずれかで直接標識された適切な抗体１０μｌを加えるか、または、一次抗体が未標識である場合は、続けて標識二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）を加える。各抗体段階を４０℃で３０分間インキュベートする。各抗体段階の間に１〜２ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄する。細胞を６００×ｇで７分間、ペレットにする。上清を廃棄する。各細胞ペレットを、０．５ｍｌの０．５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ固定剤に再懸濁し、そして適切な設定のＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））フローサイトメーターで読取る。
ＩＦＮ−α−２ｂの添加に応答してのクラスＩおよび黒色腫関連抗原のアップレギュレーション
本明細書の実施例２に記述される臨床試験から、臨床プロトコルの第１７〜２１日に１０ＭＵ／ｍ２で皮下に投与されるＩＦＮ−α−２ｂ（イントロン−Ａ［Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ］（Ｒ））の５日のクールが、抗原特異的Ｔ細胞による認識および溶解に対する２つの重
要な要件、ＨＬＡ（クラスＩ）発現および黒色腫関連抗原発現の双方をアップレギュレートするのに十分であったことが示された。この知見は、分析に利用可能な複数の皮下の皮膚傷害を伴う単一の患者（０４−ＭＪ）から得られた連続生検で記録された。４サンプルを、（Ａ）治療前；（Ｂ）ＩＦＮα治療（５連続投与）の開始後；（Ｃ）ＣＴＬ注入１後および（Ｄ）注入２後と分類した。４種の生検サンプルからのＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ２．１）および黒色腫関連抗原（ＭＡＲＴ−１）の発現に関する免疫組織化学分析からの結果を表１３に要約し、ここで、より大きな数字はより高レベルのそれぞれのタンパク質の発現を示す。該結果は、最初の連続する５日のＩＦＮ−α治療後にＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ２．１）および黒色腫関連抗原（ＭＡＲＴ−１）の発現の付加的な増大が存在しなかったことを示し、連続する５日を越えるインターフェロン−α２ｂ治療は、至適レベルのＨＬＡ−Ａ２．１およびＭＡＲＴ−１発現に達するのに必要でなかったことを示した。
【０１５３】
【表１８】
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【０１５４】
免疫組織化学的染色  生検サンプルはＲＰＭＩ培地中４℃で一夜輸送した（ｓｈｉｐｐｅｄ）。組織を、凍結された組織試料のためのＯＣＴ（Ｒ）（ティシュー−テック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ））埋込培地に入れた。組織：ＯＣＴマトリックスを、液体ＮＯ２中の急速凍結段階の前に濾紙上に置いた。凍結されたサンプルは薄片にする前に−８０℃で保存した。クライオスタット（Ｃｒｙｏｓｔａｔ）切片（５μｍ）を、スーパーフロスト［Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ］ＴＭ（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））荷電スライドガラス上に置いた。スライドガラスを冷アセトン（−２０℃）中で固定し、そして染色されるまで−８０℃で保存した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中０．３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートすることにより封鎖した。一次抗体を加湿チャンバー中で１時間添加した。ビオチニル化二次抗体を添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰを同一条件下で添加した。ＤＡＢ基質を５分間まで添加し、
そして水中ですすいだ。スライドガラスを、４周期のアルコール（７０〜９５〜９５〜１００％）、次いで３周期のキシレンにより水和した。免疫組織化学的分析で使用された抗体は、ＡＴＣＣ（汎ＨＬＡクラスＩ、Ｗ６／３２およびＨＬＡ−Ａ２特異的、ＢＢ７．２）もしくはネオマーカー（ＮｅｏＭａｒｋｅｒ）（ＭＡＲＴ−１、Ｍ２−７Ｃ１０）からであった。
治療の反復周期での細胞数の増大
臨床試験ＣＴＬ−０３において、インビトロ培養周期の第６日に記録された細胞数が、ＣＴＬ−０２において治療の各周期で検出されたように減少したよりはむしろ増大したことが示された（図２１）。図２１Ａは、ＣＲＬ−０２試験におけるエクスビボ生成されたＣＤ８＋細胞の典型的な成長曲線を表す。第６日の典型的な下落は非特異的細胞の死滅を反映した。患者１５−ＲＴについての治療の各周期からのＣＤ８細胞は類似の成長曲線を有し、治療の各周期後に末梢血中に残存する記憶細胞が存在しなかったことを示唆した。これは試験ＣＴＬ−０３において真実でなかった。細胞数の典型的な下落は０１−ＫＮ−１で示され、第一の周期の間に得られる細胞でみられる下落を反映する。しかしながら、細胞計数を周期２および３の開始時に得られた細胞で実施した場合（図２１Ｂ；０１−ＫＮ−２および０１−ＫＮ−３）、成長曲線は記憶細胞の存在により典型的であった。これは、試験ＣＴＬ−０３において治療の第二および第三の周期からであった全患者サンプルで示された。この結果は、ＣＴＬ注入の時点およびＣＴＬ注入２７日後の患者へのＩＬ−２の添加に帰することができる。
細胞計数  トリパンブルーの０．２％溶液を調製した。細胞の計数は血球計算板を使用して実施した。最低１個の完全な正方形（合計９．１平方ｍｍ）中の最低１００個の生存可能（染色されない細胞）の数を記録した。生存細胞の数を記録し、そして完全な１ｍｍ正方形の数を計数した。細胞／正方形の数。細胞／ｍＬを決定するための計算は：（細胞数／１ｍｍ正方形）（希釈計数）（１×１０４個）＝細胞／ｍＬである。
四量体分析はＣＴＬ注入後の抗原特異的Ｔ細胞の存在を確認する
試験ＣＴＬ−０３について、ＭＡＲＴ−１もしくはｇｐ１００黒色腫関連ペプチドのいずれかを含有する四量体分子が、抗原特異的Ｔ細胞の分析に商業的に入手可能であった（ベックマン  コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）；イムノミックス（Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ））。これらの四量体分子は試験ＣＴＬ−０２に利用可能でなかった。図２２に示されるところの、試験ＣＴＬ−０３にて治療の第二の周期を受けた６例の患者で、６例中６例の患者が、第一の白血球成分分取サンプリングの時点から治療の第二の周期の開始（一般に２ヶ月の期間である）までにＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞のレベルの増大を有した。ｇｐ１００四量体分子を使用して抗原特異的Ｔ細胞を評価した場合に、６例中５例の患者が、第二の白血球成分分取の時点で上昇されたｇｐ１００特異的Ｔ細胞を有した（図２２）。白血球成分分取手順の開始は細胞治療周期の開始を示す。１例の患者（１５−ＤＣ）において、合計で６周期のＴ細胞治療を実施した。各周期はおよそ２ヶ月だけ分かれていた一方、周期４と５との間の時間枠は、患者が休暇のために休みを取ることを欲したために５ヶ月であった。周期４の開始時のＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００に対する抗原特異的Ｔ細胞はそれぞれ０．２６％および０．６５％であった。ＣＤ８細胞を周期５の開始時に評価した場合、ＭＡＲＴ−１に対する抗原特異的細胞は０．２９％、およびｇｐ１００に対して０．４６％であった。これは、抗原特異的細胞が、サイトカインおよび細胞治療を一時中止した後でさえインビボで維持されていたことを示唆することができる。
【０１５５】
四量体染色  およそ１×１０７個の精製されたＣＤ８＋細胞を、白血球成分分取によりドナーから得た。各サンプルを、１００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０２％ＮａＮ３）あたり１×１０６個で滅菌チューブに入れた。１００μｌの細胞懸濁物を含む各チューブに、５μｌのＨＬＡ−Ａ２．１−四量体−ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）標識分子（目的のペプチドの添加された（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００もしくはチロシナーゼ特異的））を加え、そして室温で３０分間インキュベートした。抗ＣＤ８＋モノクローナル抗体（ＦＩＴＣ標識）を加え、そして、インキュベーション
を追加の３０分間継続した。１〜２ｍＬの洗浄緩衝液を使用して、インキュベーション期間の終了時にサンプルを洗浄した。細胞を低速（４００×ｇ）で１０分間ペレットにし、そして上清を廃棄した。各細胞ペレットを、０．５ｍｌの０．５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ固定剤に再懸濁し、そして適切な設定のＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））フローサイトメーターで読取った。
細胞溶解活性、抗原特異性および細胞増殖を測定するのに使用された３種の異なるインビトロアッセイ間の相関
抗原特異的細胞も評価する四量体技術の到来に伴い、多くの刊行物が、黒色腫患者の末梢血中における有意な数の抗原特異的Ｔ細胞を報告した（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９）５：６７７−６８５）。これらの抗原特異的細胞を単離しかつ抗原特異的様式で細胞を増大させる試みを行った場合に、大量の失敗が存在した。四量体染色は抗原特異的Ｔ細胞の存在を検出することを可能にする一方、ＣＴＬ溶解アッセイのような付加的なアッセイは、該細胞がペプチド特異的標的を適正に殺すことができるかどうかを決定するのに有用である。細胞内インターフェロンγアッセイを使用して、細胞が抗原に応答して増殖することができるかどうかを決定することができる。これら３種のアッセイを、最終的なＣＤ８＋  Ｔ細胞生成物で行って（図２３）、検出された抗原特異的Ｔ細胞の数が、インビボで腫瘍細胞を溶解が可能でありかつ抗原刺激に応答して増殖することができるＴ細胞の数を正確に反映することを確実にした。
一次刺激後（第６日）の細胞上清中で測定されるインターフェロンγは、Ｔ細胞治療の反復周期とともに増大する
ＩＬ−２がインビボでのＴ細胞の持続性に対する劇的な影響を有していたことの別の表示は、細胞上清中のＩＦＮγ産生を測定することにより示された（図２４）。治療周期のそれぞれでのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞での一次刺激の６日後に、細胞上清を収集し、そして抗原特異的刺激に応答してＣＤ８＋細胞により放出されるサイトカイン、インターフェロンγのレベルについて評価した。４例の患者の反復周期において、ＩＦＮγ産生のレベルは、この時間枠で各回のＴ細胞治療で増大したことが示された。ＩＦＮγレベルは全例で低いないし検出不可能であった。各付加的な回のＴ細胞治療で、より高レベルのＩＦＮγが検出され、より多数の抗原特異的Ｔ細胞が、各白血球成分分取の時点で単離されたＣＤ８＋集団中に存在したことを示唆した。
腫瘍細胞に浸潤するＴ細胞の検出
ＣＴＬ−０３試験で３周期のサイトカインおよびＴ細胞治療を受けた１例の患者（０４−ＡＤ）において、皮膚傷害の生検を第三の周期の終了６週間後に得た。クラスＩならびに黒色腫関連抗原ＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００の存在は、免疫組織化学的染色分析で存在した。浸潤するＴ細胞（ＣＤ３＋）の存在もまた示された。腫瘍の陽性の免疫組織化学的染色は、クラスＩおよび黒色腫関連抗原がＩＦＮαの５日投与により維持かつ／もしくはアップレギュレートされたことを示唆する。黒色腫細胞上のこれらのマーカーの存在は、抗原特異的Ｔ細胞が抗原特異的様式で腫瘍細胞を溶解することを可能にする。Ｔ細胞注入６週間後の腫瘍塊内の浸潤するＴ細胞の存在は、Ｔ細胞が、実際にこれらのＴ細胞が注入されたＴ細胞のサブセット集団を表す場合にはインビボで持続していることを示唆する。
インビトロ細胞傷害性アッセイ  標準的５１Ｃｒ放出アッセイを実施して、Ｔ２細胞上に添加された黒色腫関連ペプチドエピトープのＣＴＬエフェクター細胞認識を決定した。３×１０６個のＴ２細胞（ＴＡＰ欠損、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）をＲＰＭＩ＋１０％ＰＢＳ（培地）中で成長させかつ収集した。標的あたり１００ｍＬの５１Ｃｒを添加し、そして水浴中３７℃でインキュベートした。標識された細胞を、１０ｍＬの４％洗浄液（４％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）の容積まで加え、そしてペレットにした。洗浄を追加の２回実施した。細胞を、０．２×１０６個／ｍＬの最終濃度まで培地に再懸濁し、そして自発的対最大の（洗剤で溶解された）細胞の放射活性を記録した。細胞に、１０〜２０μｇ／ｍＬの適切なペプチド（１種もしくは複数）を３０分間適用した。５０μＬ／それぞれ異なるエフェクター：標的比でＣＤ８＋エフェクター細胞を含有する９６穴プレート。混合物を３７℃で６時間インキュベートした。プレートを回転し、そして上清を収集する。放射活
性の上清をコブラ（Ｃｏｂｒａ）γ線計数器で計数した。特異的５１Ｃｒ放出を、式（５１Ｃｒ放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００を使用して計算した。
【０１５６】
細胞内γインターフェロンアッセイ  エフェクター細胞を、ゴルジストップ（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））の存在下で、ペプチドの適用されたＴ２細胞（ＣＤ８：Ｔ２の比は２：１であった）により５時間刺激する。刺激された細胞を抗ＣＤ８−ＰＥで表面染色し、固定し、そしてサイトフィックス（Ｃｙｔｏｆｉｘ）／サイトパーム（Ｃｙｔｏｐｅｒｍ）（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）カタログ番号２０７６ＫＫ）で浸透化し、次いで抗ＩＦＮ□−ＦＩＴＣで染色した。二重標識細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン  ディックソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）ＦＡＣＳｃａｎ）により分析し、そして最大発現のパーセントとして表した。ＩＦＮ□□の最大発現を、同一エフェクター細胞のＯＫＴ３（オルトクローン（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ））活性化に応答して発現された量として測定した。
生物学的応答調節剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）に関連する毒性
生物学的応答調節剤（例えばＩＦＮαおよびＩＬ−２）を用いる臨床研究の目的は、毒性を最小限のレベルに低下させつつ治療の利益を維持する至適条件を決定することである。とは言え、現在承認されている用量および投与スケジュールのＩＦＮ−α−２ｂは、黒色腫患者の生存を有意に延長させることができる。投与は重症の毒性もまた伴う可能性がある。高用量のＩＬ−２は低用量の連続注入より有効であるようであるが、それでもなお高用量のＩＬ−２はまたより毒性でもある。最も普遍的な副作用は流感様の症状である。最も重篤な副作用は、低血圧、毛細血管漏出症候群および低下された臓器灌流である。ＩＬ−２は、腎細胞癌および悪性黒色腫双方に臨床で使用されている。低用量皮下レジメンのＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２の組合せ剤は、他の臨床設定で記述されている（Ｐｅｃｔａｓｉｄｅｓら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９８）５５：１０−１５；Ｐｉｇａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４４：３４８−３５１）。
【０１５７】
一試験（Ｐｅｃｔａｓｉｄｅｓ，１９９８，上記）において、ＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２を、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）患者に３剤併用免疫化学療法レジメンにて投与した。フェーズＩＩ試験が、ＩＬ−２［４．５ｍＵ×２／２４時間、週３回を２週間］およびＩＦＮ−α−２ｂ［３ＭＵ／２４時間、週３回（ＩＬ−２と交互の日に）を２週間］ならびにビンブラスチン（ＶＬＢ）［４ｍｇ／ｍ２、３週間ごと］の低用量皮下投与の活性を定義するために実施された。患者はサイトカインからの１週間の休止を有し、その時点で彼らはＶＬＢを受領した。治療は、１年の最長持続期間を伴い３週間ごとに反復した。毒性は軽度ないし中程度（等級ＩおよびＩＩ）であり、＞８０％の患者での発熱、食欲不振、倦怠感および悪心−嘔吐よりなった。患者のいずれも主要なＶＬＢ関連の毒性を経験しなかった。３剤併用は、進行性ＲＣＣで控えめな毒性を伴う有望なレジメン（３８．７％の全体奏効率）であるかもしれないことが提案された。
【０１５８】
ＲＣＣにおいて低用量ＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２を評価する別の試験（Ｐｉｇａ，１９９７，上記）では、ＩＦＮ−α−２ｂ［３ＭＵ／ｍ２連日、筋肉内に継続して］ならびにＩＬ−２（第一週について第１〜５日に０．５ＭＵ／ｍ２×２／２４時間、皮下で、および後に続く３週間に１ＭＵ／ｍ２×２／２４時間、５日間）が処方された。副作用は患者の大部分で低い（等級ＩおよびＩＩ）と言われ、肝および腎機能試験での異常が示された。該レジメンは中程度の毒性のもの、低費用でありかつ入院を必要としないと言われた一方、大部分の患者で観察された流感様の症状は、患者の１／３にその後の治療を拒絶させるのに十分、十分であった。
【０１５９】
ＣＴＬ−０３試験について記述されたＩＦＮαおよびＩＬ−２レジメンからの副作用は、上で挙げられたＲＣＣの試験で検出されたものに類似の軽度ないし中程度の影響と考え
られた。しかしながら、われわれのサイトカインレジメンは合計３３日（ＩＦＮαで５日およびＩＬ−２で２８日）続き、所望の結果をこのより短い時間枠で達成することができる場合にそれをより魅力的にする。臨床試験ＣＴＬ−０２において、われわれは、連続する５日の投薬でわれわれの所望の効果に達することが可能であり、そして付加的な１１の投与は必要とされなかった。試験ＣＴＬ−０３において、該試験に参入した３１例の患者のなかで１例のみが、サイトカイン療法の単一周期を完了することを拒否した。全体に、該ＩＬ−２用量は、大部分の患者により良好に耐えられた。
所望の効果に達するために必要とされるサイトカインの量
フェーズＩ試験において、ＩＬ−２に加えて顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＦＮ−α−２ｂを投与する組合せ免疫療法プロトコルにおけるＩＬ−２の最小用量は、２〜４ＭＩＵ／ｍ２、皮下に３週間ごとに１２日間であった。免疫活性化をモニターし、そしてリンパ球、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ならびに単球ＤＲ発現の有意の増大が見出された２７。この試験でのＩＬ−２の投与は、われわれが試験ＣＴＬ−０３で使用したものに類似であった（連続する４週間、連日皮下に投与される３ＭＩＵ）が、しかしながら、われわれは、ＩＬ−２治療の開始時に有意の数の抗原特異的Ｔ細胞を患者に提供するという付加される利益を有する。
【０１６０】
別の試験を、ＩＬ−２単独での前の免疫療法の間に進行していた癌患者での、松果体ホルモンメラトニン（ＭＬＴ）および低用量ＩＬ−２の付随する投与の影響を評価するために開始した。進行性充実性腫瘍は肺、腎、胃、肝および黒色腫を包含した。ＩＬ−２は３ＭＩＵの１日用量を皮下に１週あたり６日、４週間；ＣＴＬ−０３で使用されたものにほとんど同一である投与で投与した。ＭＬＴは、ＩＬ−２の７日前に開始して、４０ｍｇ／日の１日用量で経口で投与した。客観的腫瘍退縮が１４例中３例の患者（２１％）で示された。安定した疾患を伴うかもしくは応答を立証する患者は、疾患の進行を伴う患者に関して、リンパ球および好酸球の平均数の有意により大きな増大を伴い、ＩＬ−２に抵抗性の進行性充実性新生物はＭＬＴの付随する投与によりＩＬ−２療法に応答性になるかもしれないことを示した。ＭＬＴがＩＬ−２の抗腫瘍免疫効果を高め、かつ／もしくはＩＬ−２に誘導される細胞傷害性リンパ球により媒介される細胞溶解に対する癌細胞の感受性を増大させたことが可能である。
【０１６１】
試験ＣＴＬ−０３で定義されたところのＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２の時間的調節および投与は、重要な腫瘍マーカー（クラスＩおよび黒色腫関連抗原の発現）をアップレギュレートすることにより、溶解に対して黒色腫細胞を準備しかつ抗原特異的Ｔ細胞の持続性をもたらすことがありそうである。この結論は：１）各連続する細胞療法治療（ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の開始時に検出された四量体陽性細胞の存在が検出された；２）二次もしくは記憶応答に似ている成長曲線が観察された；および３）インターフェロンγが、細胞治療の各周期のエクスビボプロトコルの第６日に評価された培養物上清中で産生された、という観察結果により支持される。ＩＬ−２およびその受容体の複合体の細胞および分子生物学の理解の進歩は、癌を伴う患者の免疫エフェクターを増大させかつ活性化するのにＩＬ−２をより良好に利用するための理論的根拠を提供した。抗原特異的Ｔ細胞を生成させるための本明細書に記述されるエクスビボプロトコルは、非常に強い選択性を伴い、腫瘍部位に通じ（ｔｒａｆｆｉｃ）、黒色腫関連抗原を発現する腫瘍細胞を認識かつ溶解するための必要な表面分子の全部を有する大量のＣＤ８＋調製物をもたらす。ＣＤ８＋細胞の表面上の高親和性ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２）の存在は、これらの細胞がインビボでより低用量のＩＬ−２に応答することが可能であることを示唆する。
【０１６２】
付加されたＴ細胞治療とともにのサイトカイン療法の組合せは、進行性転移性黒色腫を治療するための新規方法を表す。
【０１６３】
前述の明細は本発明の原理を教示し、実施例は具体的説明の目的上提供される一方、本発明の実務は、以下の請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内にあるところの通常の変形、翻案および／もしくは改変の全部を包含することが理解されるであろう。
【０１６４】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【０１６５】
１．ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは、ウイルス感染と関連する約１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、前記ペプチド分子はそれぞれが長さ約６ないし１２アミノ酸であり）；
ｂ．被験体もしくは適するドナーからＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８＋細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．馴化成長培地（ＣＧＭ）もしくはＩＬ−２、ＩＬ−７よりなる群から選択されるサイトカインを含有する培地に前記ＣＤ８＋細胞を加えること（前記サイトカインは個別にもしくは組合せで使用することができ）；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球もしくはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約１ないし５０μｇ／ｍｌの、前記ｎｎＡＰＣが同時に提示することができる前記ペプチドの１種と混合すること；
ｆ．前記末梢血単球懸濁物を、所望の末梢血単球を除く懸濁物中の全部の成分を無効にするのに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記各ペプチドを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８＋細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組合せること；および
ｊ．前記被験体にＣＤ８＋懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体における前記ウイルス感染の治療方法。
【０１６６】
２．前記ｎｎＡＰＣが約１０までのペプチド分子を提示することが可能である、１．記載の方法。
【０１６７】
３．前記ペプチド分子が長さ約８ないし１０アミノ酸である、１．記載の方法。
【０１６８】
４．前記ペプチド分子が約１０ｎＭないし１００μＭの濃度範囲にある、１．記載の方法。
【０１６９】
５．前記サイトカイン成分がＩＬ−２である、１．記載の方法。
【０１７０】
６．前記サイトカイン成分が、組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７である、１．記載の方法。
【０１７１】
７．γ線放射の線量が約３，０００ないし７，０００ラドである、１．記載の方法。
【０１７２】
８．γ線放射の線量が約５，０００ラドである、１．記載の方法。
【０１７３】
９．ａ．腫瘍の表面上の腫瘍抗原の発現を高めることが可能である有効量のインターフェロン−αを、黒色腫を伴う被験体に投与すること；および
ｂ．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ、有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種すること
の段階を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【０１７４】
１０．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球のインビボ維持を高めることが可能である有効量のインターロイキン−２を前記被験体に投与することの段階をさらに含んで成る、９．記載の方法。
【０１７５】
１１．インターフェロン−αが、インターフェロン−α−２ａもしくはインターフェロン−α−２ｂから選択される、１０．記載の方法。
【０１７６】
１２．インターフェロン−αの有効量が約１０ＭＵ／ｍ２／日であり、かつ、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して該被験体に皮下投与される、１０．記載の方法。
【０１７７】
１３．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球の有効量が、注入あたり約１〜１０×１０９個の細胞である、１０．記載の方法。
【０１７８】
１４．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球が：
ａ）天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは前記黒色腫と関連する約１５までの異なるエピトープを同時に提示することが可能であり、かつ、各エピトープは長さ８ないし１０アミノ酸のペプチドであり）；
ｂ）前記黒色腫と関連する約１５までの異なるエピトープをｎｎＡＰＣに添加すること；ｃ）前記被験体からＣＤ８＋細胞を収集すること；
ｄ）前記ＣＤ８＋細胞を、エピトープを添加されたｎｎＡＰＣ細胞系で刺激して黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を得ること；
ｅ）黒色腫に特異的なＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；
ｆ）前記被験体から収集されたＣＤ８枯渇末梢血単球を、ｎｎＡＰＣ添加に使用された各エピトープと混合すること；
ｇ）前記ＣＤ８枯渇末梢血単球をγ線放射で照射すること；
ｈ）接着性のＣＤ８枯渇末梢血単球を単離すること；
ｉ）前記接着性末梢血単球に、ｎｎＡＰＣ添加に使用された各エピトープを添加すること；
ｊ）黒色腫に特異的な前記ＣＤ８＋細胞を、エピトープ添加された接着性末梢血単球で再刺激すること；
ｋ）黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する培地中で成長させること；ならびに
ｌ）黒色腫に特異的な再刺激されたＣＤ８＋細胞を、ＯＫＴ３抗体刺激により増大させること
の段階を含んで成る方法により得られる、１０．記載の方法。
【０１７９】
１５．段階（ｊ）を最低もう１回反復することができる、１４．記載の方法。
【０１８０】
１６．前記天然に存在しない抗原提示細胞系が、チロシナーゼ、ｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１由来のペプチドであるエピトープを添加される、１４．記載の方法。
【０１８１】
１７．前記天然に存在しない抗原提示細胞系が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含んで成るエピトープを添加される、１６．記載の方法。
【０１８２】
１８．インターロイキン−２の有効量が約３ＭＩＵ／日であり、かつ、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ有効量の自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を前記被験体に接種した後第０日から第２８日まで連続して被験体に皮下投与される、１４．記載の方法。
【０１８３】
１９．該方法が約２ヶ月の間隔で反復される、１４．記載の方法。
【０１８４】
２０．該方法が、最低２周期の間反復され、かつ、各周期後に前記被験体における応答を評価することの段階をさらに含んで成る、１９．記載の方法。
【０１８５】
２１．ａ．黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に接種する前第５日から第１日まで連続して、前記被験体に１０ＭＵ／ｍ２／日のインターフェロン−α−２ｂを皮下投与すること；
ｂ．注入あたり約１〜１０×１０９個の細胞の、黒色腫関連標的抗原に対する特異性をもつ自己の細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に導入すること；および
ｃ．導入段階後第０日から第２８日まで連続して約３ＭＩＵ／日のインターロイキン−２を被験体に皮下投与すること
の段階を含んで成る、１４．記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】発明にかかる、抗原提示細胞もしくは標的細胞（この場合は腫瘍細胞）との細胞傷害性Ｔリンパ球としてもまた知られるＣＤ８＋細胞の間の相互作用のグラフィカルな描写である。
【図２】発明にかかる、リンパ球に媒介される細胞増加症の機構の２図のグラフィカルな描写である。
【図３】発明にかかる、ヒト空クラスＩ分子を発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上に複数のペプチドを添加するのに使用することができるペプチド結合体を同定するための競争アッセイで数種の異なるペプチドを試験した実験の結果を示す。
【図４Ａ】発明にかかる黒色腫ペプチドがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に単一のエピトープとして加えられた場合のＣＴＬを生じさせる能力について試験された実験の結果を示す。本ドナー（＃６０）において、単独で３種の異なるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）調製物に加えられた場合、ペプチドのそれぞれに対して、ＣＴＬ活性が導き出された。応答の特異性を、高親和性結合体、対照ＨＢｃペプチドと比較した。
【図４Ｂ】発明にかかる黒色腫ペプチドがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に単一のエピトープとして加えられた場合のＣＴＬを生じさせる能力について試験された実験の結果を示す。本ドナー（＃６０）において、単独で３種の異なるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）調製物に加えられた場合、ペプチドのそれぞれに対して、ＣＴＬ活性が導き出された。応答の特異性を、高親和性結合体、対照ＨＢｃペプチドと比較した。
【図４Ｃ】発明にかかる黒色腫ペプチドがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に単一のエピトープとして加えられた場合のＣＴＬを生じさせる能力について試験された実験の結果を示す。本ドナー（＃６０）において、単独で３種の異なるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）調製物に加えられた場合、ペプチドのそれぞれに対して、ＣＴＬ活性が導き出された。応答の特異性を、高親和性結合体、対照ＨＢｃペプチドと比較した。
【図５Ａ】発明にかかる、４種までの異なるペプチドを単独でショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に加えた実験の一連の結果を示す。表されたペプチドのそれぞれに対するＣＴＬ活性が３週間の刺激プロトコル後にみられ、そしてこの図でグラフで描く。ドナー（＃９３）からの結果を表す。
【図５Ｂ】発明にかかる、４種までの異なるペプチドを単独でショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に加えた実験の一連の結果を示す。表されたペプチドのそれぞれに対するＣＴＬ活性が３週間の刺激プロトコル後にみられ、そしてこの図でグラフで描く。ドナー（＃９４）からの結果を表す。
【図５Ｃ】発明にかかる、４種までの異なるペプチドを単独でショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に加えた実験の一連の結果を示す。表されたペプチドのそれぞれに対するＣＴＬ活性が３週間の刺激プロトコル後にみられ、そしてこの図でグラフで描く。ドナー（＃９５）からの結果を表す。
【図６Ａ】発明にかかる、２種の異なる一次インビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。
【図６Ｂ】発明にかかる、２種の異なる一次インビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。
【図６Ｃ】発明にかかる、２種の異なる一次インビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。
【図７】発明にかかる、標準的刺激プロトコル後の単一ペプチドエピトープに対するＣＴＬ応答を導き出す、樹状細胞に対するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の能力を比較する。
【図８】発明にかかる、成熟もしくは未熟いずれかの表現型を表す樹状細胞が、細胞に適用するのに規定されたペプチドを使用した場合に特異的ＣＴＬ応答の導出においてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞ほど効率的でなかったことを示す。
【図９Ａ】発明にかかる、４種のペプチドを提示するインビトロ刺激プロトコルに対して単一ドナーにより生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図９Ｂ】発明にかかる、４種のペプチドを提示するインビトロ刺激プロトコルに対して単一ドナーにより生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図９Ｃ】発明にかかる、４種のペプチドを提示するインビトロ刺激プロトコルに対して単一ドナーにより生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図１０】発明にかかる、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に組合せで添加された１０種のペプチドに対し生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図１１】発明にかかる、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ分子でトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上でのＨＥＲ−２ペプチド（８２６、８３５、８６１および８６３）のペプチド結合能力を示す。
【図１２】発明にかかる、ＭＡＲＴ−１特異的エフェクター細胞に対する抗ペプチドおよび抗腫瘍応答を立証する。Ｔ２細胞にはＭＡＲＴ−１ペプチドもしくは陰性対照（ＨＢｃ）を添加した。Ｍａｌｍｅ３Ｍは黒色腫系統であり、Ｍａｌｍｅ３は非腫瘍細胞系である。
【図１３Ａ】発明にかかる、２例の異なるドナーからのＨＥＲ−２特異的ＣＤ８エフェクター細胞の四量体染色を示す。
【図１３Ｂ】発明にかかる、２例の異なるドナーからのＨＥＲ−２特異的ＣＤ８エフェクター細胞の四量体染色を示す。
【図１４】発明にかかる、ペプチド添加されたＴ２細胞で評価されたＨＥＲ−２エフェクター細胞についての抗ペプチド応答を示す。
【図１５Ａ】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の卵巣腫瘍細胞系（ＨＴＢ−７７）の高められた殺傷を立証する。
【図１５Ｂ】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の卵巣腫瘍細胞系（ＨＴＢ−７７）の高められた殺傷を立証する。
【図１５Ｃ】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の卵巣腫瘍細胞系（ＨＴＢ−７７）の高められた殺傷を立証する。
【図１５Ｄ】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の卵巣腫瘍細胞系（ＨＴＢ−７７）の高められた殺傷を立証する。
【図１６】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の乳癌細胞系（ＨＴＢ−１３３）の高められた殺傷を示す。
【図１７】発明にかかる、腫瘍細胞系ＨＴＢ−７７／Ａ２．１の溶解を立証するのにＩＦＮγ前処理が必要とされることを示す。
【図１８】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＥＲ−２の表面発現が、２種の細胞系（ＨＴＢ−７７およびＨＴＢ−７７／Ａ２．１）でのＩＦＮγ誘導により影響を及ぼされないことを立証する。
【図１９】発明にかかる、どのタンパク質のｍＲＮＡレベルがＩＦＮγでの誘導後にＨＴＢ−７７／Ａ２．１細胞中で上昇されるかを示す。
【図２０】発明にかかる、臨床試験ＣＴＬ−０３の実験の概要を示す。
【図２１】発明にかかる、Ａ）臨床試験ＣＴＬ−０２下の１例の患者（１５−ＲＴ）から単離されたＣＴＬ細胞のインビトロ成長曲線を示す。細胞は：９９年９月２８日（１５−ＲＴ−１）、９９年１１月２２日（１５−ＲＴ−２）および９９年２月１５日（１５−ＲＴ−３）に開始する３治療周期のそれぞれの第０日に患者から単離し、そしてインビトロで培養した。Ｂ）臨床試験ＣＴＬ−０３下の１例の患者（０１−ＫＮ）から単離されたＣＴＬ細胞のインビトロ成長曲線を示す。細胞は：００年１０月３０日（０１−ＫＮ−１）、０１年１月３０日（０１−ＫＮ−２）および０１年４月９日（０１−ＫＮ−３）に開始する３治療周期のそれぞれの第０日に患者から単離し、そしてインビトロで培養した。
【図２２】発明にかかる、黒色腫抗原特異的Ｔ細胞の数が試験ＣＴＬ−０３の治療の１周期後の患者で増大したことを示す。ｇｐ１００もしくはＭＡＲＴ−１ペプチドのいずれかを用いて調製されたＨＬＡ−Ａ２．１四量体分子を使用して、白血球成分分取サンプルから得られた精製されたＣＤ８＋調製物中の抗原特異的Ｔ細胞の存在をモニターした。四量体陽性細胞のパーセント（％）は、第一（Ｉ）および第二（ＩＩ）の白血球成分分取サンプルの時点で記録し、これらは約２ヶ月離れていることができた。
【図２３】発明にかかる、ＣＴＬの細胞溶解活性、抗原特異性および細胞増殖を測定するのに使用された３種の異なるインビトロアッセイの間の相関を示す。３種の異なるアッセイを、エクスビボ刺激プロトコル（ＣＴＬ−０３）の終了時に、ＣＤ８＋  ＣＴＬ調製物の全部で実施した。全３種のアッセイは、一般に、最終的な大量の培養物の構成を決定することについて一致する。この特定の調製物において、生成物中のＴ細胞の大多数はｇｐ１００ペプチド（８１７）に向けられた。ＣＴＬ活性は細胞の細胞溶解およびエフェクター機能を規定する。四量体染色は抗原特異的細胞の頻度を決定し、また、細胞内ＩＦＮ−γ染色は特定のペプチドに応答するＴ細胞の能力を反映する。
【図２４】発明にかかる、試験ＣＴＬ−０３における治療の各反復周期を伴う周期の同一の時間点でのインターフェロンγの量の増大を示し、周期の同一の時間点での記憶Ｔ細胞の存在を示唆する。インターフェロンγは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞での一次刺激６日後のエクスビボ培養物の上清で測定した。
【図２５】発明にかかる、実施例２に記述される臨床試験で各患者に投与された周期の数および細胞の用量を具体的に説明する。各用量の効力は、ＣＤ８＋細胞の数に、標的細胞上に添加されたペプチドの組合せの溶解について記録された溶解単位を掛けることにより計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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