(57)【要約】      （修正有）【課題】心臓胸郭部の手術、例えば冠動脈バイパス移植術及び他の外科的処置を受ける患者において、特にそのような処置が心−肺バイパスのような体外循環を含む場合に、術中の失血及び／又は全身炎症反応のような患者の虚血及び／又は全身炎症反応を予防又は軽減させるための方法の提供。【解決手段】カリクレインのようなセリンプロテアーゼを阻害する特定の配列を含むポリペプチド、および、該ペプチドを含む医薬組成物とそれを含む輸液ボトル又は輸液バックなどの容器。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２のアミノ酸残基３〜６０）
を含む、カリクレインを阻害するポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列：
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２）
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列：
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２のアミノ酸残基３〜６０）
から成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列：
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２）
から成る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチド、及び１以上の医薬的に許容可能なバッファー、担体及び賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
ポリペプチドがアミノ酸配列：
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２）
を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ポリペプチドがアミノ酸配列：
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２のアミノ酸残基３〜６０）
から成る、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ポリペプチドがアミノ酸配列：
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp（配列番号２）
から成る、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物が凍結乾燥粉末である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む容器。
【請求項１１】
容器が輸液ボトル又は輸液バッグである、請求項１０に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術
本願は、２００２年６月７日に出願された米国仮出願第６０／３８７，２３９号、及び２００２年８月２８日に出願された米国仮出願第６０／４０７，００３号の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
プロテアーゼは広範な生物学的経路に関与する。特に、カリクレイン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、トロンビン、ヒトリポタンパク質結合凝固インヒビター、並びに第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子及び第ＸＩＩａ因子などの凝固因子のようなセリンプロテアーゼは、例えば全身及び局所の虚血、腫瘍浸潤、フィブリン溶解、術中の失血、並びに炎症のような血流に影響する経路に関係がある。したがって、特定のセリンプロテアーゼのインヒビターは、さまざまな虚血性疾患に対する潜在的薬物標的として注目されている。
【０００４】
そのようなインヒビターの１つである、ウシ肺から得られたアプロチニン（ウシ膵トリプシンインヒビター又はＢＰＴＩとも呼ばれる）は、術中の失血を軽減させる上での予防的使用のため、及び例えば冠動脈バイパス移植術処置の過程で心−肺バイパス術（ＣＰＢ）を受ける患者の輸血の必要性のために米国で承認されている。アプロチニンはトラジロール（登録商標）の商品名で市販されており（バイエル社医薬部門、ウエストヘーブン、コネチカット）、膵炎の治療に用いるために以前に承認されている。アプロチニンの有効性は、血漿カリクレイン及びプラスミンを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害する比較的非特異的な能力に関連している。これらのプロテアーゼは、接触活性化システム（ＣＡＳ）の多くの経路において重要である。
【０００５】
ＣＡＳは、全血が外来基質表面（例えばカオリン、ガラス、硫酸デキストラン、又は損傷を受けた骨表面）と接触したとき最初に活性化される。セリンプロテアーゼであるカリクレインは、好中球、プラスミン、凝固、及び種々のキニンの活性化をもたらすＣＡＳカスケードを開始する血漿酵素である。カリクレインは、接触活性化カスケードの初期においてタンパク質分解イベントにより活性化されるまで不活性分子として循環するチモーゲン（プレ−カリクレイン）として分泌される。カリクレインの特異的阻害は、ＣＰＢに関連する失血及び例えば種々の侵襲性外科的処置のあいだに直面するような全身炎症反応（ＳＩＲ）の発症を制御するための非常に魅力的なアプローチであることは明らかである。
【０００６】
冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）処置のためのＣＰＢにおいて術中の失血を予防するための唯一の認可化合物であるにもかかわらず、アプロチニンは期待されたほど広く使用されていない。ＣＰＢを必要とする患者へのこのウシポリペプチドの使用に関し、そして特にＣＡＢＧ処置でのこの化合物の使用に関し、深刻な懸念がある。アプロチニンはカリクレインに特異的ではなく、複数の経路で更なる酵素（例えばプラスミン）と相互作用する。したがって、アプロチニンの作用機構は非常に不確かなものであり、アプロチニン治療のあいだに何が影響されるかについての正確な理解の欠如は、治療のあいだの合併症の危険性を生ずる。しばしば引用される合併症の１つは、線溶経路に対するアプロチニン作用によるコントロール不良の血栓症である。術中の主要血管血栓症のような超急性イベントだけでなく、ＣＡＢＧ処置後の移植開存性に対しても懸念がある。更に、ウシ肺から得られた天然タンパク質として、ヒトへのアプロチニン投与は、患者への１回目の投与後、
より多くは繰り返し投与後に重篤な過敏症又はアナフィラキシー反応又はアナフィラキシー様反応を惹起し得る。これは、繰り返しＣＡＰＧ処置を受ける多数の患者に特に関心が寄せられている。更に、ウシ海綿状脳症のヒトへの伝染の潜在的ベクターとしてウシ供給源由来物質の使用に関し、公共の関心が高まっている。
【０００７】
これら関心事により、ＣＰＢ患者におけるＣＡＰＧ処置、又は股関節置換術のようにＣＡＳの活性化をもたらす外科手術を受けた患者において、術中の失血及びＳＩＲの発症を予防又は軽減させるためのより有効でより特異的な手段及び方法に関する必要性が依然としてあることは明らかである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明はセリンプロテアーゼを阻害するペプチドの発見に基づくものである。例えばカリクレインのようなセリンプロテアーゼは、例えば術中の過剰な失血及び全身炎症反応の発症をもたらす経路に関与する。好ましいカリクレインペプチドインヒビターには、Ｍａｒｋｌａｎｄらの米国特許第６，３３３，４０２号及び第６，０５７，２８７号に記載されるものが含まれる。これらの内容は本明細書中にその全体が援用される。本発明は部分的に、限定されるものではないが術中の失血及び全身炎症反応の発症を含む種々の虚血を排除又は軽減する上での使用に好適な治療方法及び組成物におけるペプチドの使用にかかるものである。術中の失血は、補体成分及び凝固／線溶系の接触活性化をもたらす侵襲性の外科的処置に起因する。より詳細には、本発明は、侵襲性外科的処置、特に心臓胸郭部の手術を受ける患者における術中の失血及び全身炎症反応を軽減又は予防するためのカリクレインインヒビターの使用方法を提供するものである。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、アミノ酸配列：Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｃｙｓ  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４  Ｘａａ２５  Ｘａａ２６  Ｘａａ２７  Ｘａａ２８  Ｘａａ２９  Ｃｙｓ  Ｘａａ３１  Ｘａａ３２  Ｐｈｅ  Ｘａａ３４  Ｘａａ３５  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３９  Ｘａａ４０  Ｘａａ４１  Ｘａａ４２  Ｘａａ４３  Ｘａａ４４  Ｘａａ４５  Ｘａａ４６  Ｘａａ４７
Ｘａａ４８  Ｘａａ４９  Ｘａａ５０  Ｃｙｓ  Ｘａａ５２  Ｘａａ５３  Ｘａａ５４
Ｃｙｓ  Ｘａａ５６  Ｘａａ５７  Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者の虚血を予防又は軽減するための方法にかかるものであり、ここで、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個別に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；Ｘａａ１０はＡｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１３はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１８及びＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２２はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２３はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓ
ｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４０はＧｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４３はＡｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４５はＰｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そしてポリペプチドはカリクレインを阻害する。
【００１０】
特定の態様において、虚血は患者に施す外科的処置による術中の失血である。外科的処置は例えば心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術のような心臓胸郭部の手術であり得る。
【００１１】
特定の態様において、配列番号１の個々のアミノ酸位置は以下の１つ以上であり得る：Ｘａａ１０はＡｓｐであり、Ｘａａ１１はＡｓｐであり、Ｘａａ１３はＰｒｏであり、Ｘａａ１５はＡｒｇであり、Ｘａａ１６はＡｌａであり、Ｘａａ１７はＡｌａであり、Ｘａａ１８はＨｉｓであり、Ｘａａ１９はＰｒｏであり、Ｘａａ２１はＴｒｐであり、Ｘａａ３１はＧｌｕであり、Ｘａａ３２はＧｌｕであり、Ｘａａ３４はＩｌｅであり、Ｘａａ３５はＴｙｒであり、Ｘａａ３９はＧｌｕである。
【００１２】
他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｃｙｓ  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４  Ｘａａ２５  Ｘａａ２６  Ｘａａ２７  Ｘａａ２８  Ｘａａ２９  Ｃｙｓ  Ｘａａ３１  Ｘａａ３２  Ｐｈｅ  Ｘａａ３４  Ｘａａ３５  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３９  Ｘａａ４０  Ｘａａ４１  Ｘａａ４２  Ｘａａ４３  Ｘａａ４４  Ｘａａ４５  Ｘａａ４６  Ｘａａ４７  Ｘａａ４８  Ｘａａ４９  Ｘａａ５０  Ｃｙｓ  Ｘａａ５２  Ｘａａ５３  Ｘａａ５４  Ｃｙｓ  Ｘａａ５６  Ｘａａ５７  Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者への外科的処置に関連する全身炎症反応の発症を予防又は軽減するための方法にかかるものであり、ここで、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個別に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；Ｘａａ１０はＡｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１３はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２２はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２３はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択される
アミノ酸であり；Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅ；Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４０はＧｌｙ及びＡｌａ；Ｘａａ４３はＡｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４５はＰｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そしてポリペプチドはカリクレインを阻害する。特定の態様において、外科的処置は例えば心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術のような心臓胸郭部の手術であり得る。特定の態様において、配列番号１の個々のアミノ酸位置は以下の１つ以上であり得る：Ｘａａ１０はＡｓｐであり、Ｘａａ１１はＡｓｐであり、Ｘａａ１３はＰｒｏであり、Ｘａａ１５はＡｒｇであり、Ｘａａ１６はＡｌａであり、Ｘａａ１７はＡｌａであり、Ｘａａ１８はＨｉｓであり、Ｘａａ１９はＰｒｏであり、Ｘａａ２１はＴｒｐであり、Ｘａａ３１はＧｌｕであり、Ｘａａ３２はＧｌｕであり、Ｘａａ３４はＩｌｅであり、Ｘａａ３５はＴｙｒであり、Ｘａａ３９はＧｌｕである。
【００１３】
更に他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者への外科的処置に関連する全身炎症反応の発症を予防又は軽減する方法にかかるものであり、ポリペプチドはカリクレインを阻害する。１つの態様において、外科的処置は例えば心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術のような心臓胸郭部の手術である。
【００１４】
他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者の虚血を予防又は軽減するための方法にかかるものであり、ポリペプチドはカリクレインを阻害する。特定の態様において、虚血は患者に施す外科的処置による術中の失血であり得る。１つの態様において、外科的処置は例えば心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術のような心臓胸郭部の手術である。
【００１５】
更に他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  （配列番号２のアミノ酸３〜６０）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者への外科的処置に関連する全身炎症反応の発症を予防又は軽減するための方法にかかるものであり、ポリペプチドはカリクレインを阻害する。１つの態様において、外科的処置は例えば心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術のような心臓胸郭部の手術である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈ
ｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  ＡｓｎＧｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ
Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ
Ａｓｐ（配列番号２のアミノ酸３〜６０）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与すること含む、患者の虚血を予防又は軽減するための方法にかかるものであり、ポリペプチドはカリクレインを阻害する。特定の態様において、虚血は患者に施す外科的処置による術中の失血であり得る。１つの態様において、外科的処置は例えば心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術のような心臓胸郭部の手術である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）処置、特にＣＡＢＧ処置が心−肺バイパス（バイパス装置）などの体外血液循環を包含する場合に関連するような軟部組織及び骨組織の外傷を受けた患者に生じ得る接触活性化システム及び全身炎症反応（ＳＩＲ）に関与する主要な複数の経路及び関連イベントの単純化した図解である。矢印は、カスケードにおける１つの成分又はイベントから他の成分又はイベントへの活性化を示す。両方向の矢印は、成分又はイベントの両方向への活性化作用を示す。破線矢印は、１つの成分又はイベントの他の成分又はイベントの活性化への起こり得る関与を示す。略語は以下の通りである：「ｔＰＡ」＝組織プラスミノーゲンアクチベーター；「Ｃ５ａ」＝補体系のタンパク質成分；「ｆＸＩＩａ」＝活性カリクレインを形成するプレカリクレインのアクチベータータンパク質；「外因性」＝外因性凝固系；「内因性」＝内因性凝固系。
【図２】図２は、プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中の本発明のＫＩポリペプチドのＤＮＡの一部及び対応の推定アミノ酸を示す。挿入ＤＮＡは、囲み領域でコードされるアミノ酸配列を有するＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドのアミノ末端にインフレームで融合させたサッカロミセス・セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチド（下線）をコードする。囲み領域に示すＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２であり、ＫＩポリペプチドの対応のヌクレオチドコード配列は配列番号３である。破線矢印は、配列決定用テンプレートの作製に用いられるＡＯＸ領域における２つのＰＣＲプライマー配列の位置及び方向を示す。図の全ヌクレオチド配列のＤＮＡ配列は、融合タンパク質の構造コード配列を含み、配列番号２７で表される。配列の２重下線部分は診断用プローブ配列を示す。ＢｓｔＢＩ及びＥｃｏＲＩは、それぞれ配列中のパリンドロームの６量体制限酵素切断部位の位置を示す。アスタリスクは翻訳終止コドンである。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の好ましい態様のアミノ酸配列アラインメント、これらの変異体が由来する天然ＬＡＣＩ配列、（配列番号３２）、及び他の公知のＫｕｎｉｔｚドメイン（配列番号２９〜３１及び３３〜５３）を示す。システイン残基をハイライトしてある。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の好ましい態様のアミノ酸配列アラインメント、これらの変異体が由来する天然ＬＡＣＩ配列、（配列番号３２）、及び他の公知のＫｕｎｉｔｚドメイン（配列番号２９〜３１及び３３〜５３）を示す。システイン残基をハイライトしてある。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の好ましい態様を以下に記載する。
本発明は、カリクレインで惹起される例えば術中の失血及び／又は全身炎症反応（ＳＩＲ）のような、特に例えば外科的処置、具体的には心臓胸郭部の手術、例えば、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）処置のような心−肺バイパス術（ＣＰＢ）を含む外科的処置を受ける患者において虚血を予防又は軽減するための改善された方法における使用を可能にする、特異的に血漿カリクレインを阻害するカリクレインインヒビター（ＫＩ）ポリペプチド群の発見に基づくものである。ＫＩは、例えば小児心臓手術、肺移植、全股関節置換術及び同所性肝移植に特異的に用いて、ＣＡＢＧ術中の発作、こうした処置中の体外膜酸素化（ＥＣＭＯ）及び脳血管障害（ＣＶＡ）を軽減又は予防することができる。
【００１９】
心臓胸郭部の手術とは胸部、最も一般的には心臓及び肺の外科手術である。心臓胸郭部の手術で治療される典型的な疾患には、冠動脈疾患；肺、食道及び胸壁の腫瘍及びがん；心血管及び弁の異常；並びに胸部又は心臓に関与する先天性異常が含まれる。心臓胸郭部の手術を治療に用いる場合、失血（例えば手術で誘発される虚血）及び全身炎症反応（ＳＩＲ）の発症の危険性を招く。手術で誘発されるＳＩＲは、重篤な臓器機能不全（全身炎症反応症候群；ＳＩＲＳ）をもたらし得る。
【００２０】
本発明に有用なポリペプチド
本発明に有用なＫＩポリペプチドはＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドを含む。１つの態様において、これらのＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒトリポタンパク質結合凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）タンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１を含むループ構造の変異体型である。ＬＡＣＩは、内部に３つの明確なペプチドループ構造を含有し、それは系列のＫｕｎｉｔｚドメインである（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．ら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８−５２０）。ＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメインは、特に優れた親和性はないが、カリクレインに結合して阻害する能力を付与する。本明細書に記載されるＬＡＣＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１の変異体はスクリーニングされ、単離されており、向上した親和性及び特異性をもってカリクレインに結合する（例えば本明細書中に援用される米国特許第５，７９５，８６５号及び第６，０５７，２８７号を参照されたい）。本発明に有用な好ましいポリペプチドの１例は、配列番号２のアミノ酸３〜６０で定義されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本発明に有用な全てのポリペプチドはカリクレインに結合し、当該技術分野に公知のカリクレイン結合及び阻害アッセイを用いて測定したところ、好ましいポリペプチドはカリクレインインヒビター（ＫＩ）でもある。本明細書に記載される変異体Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチドのカリクレインに対する向上した親和性及び特異性は、心臓胸郭部の手術、例えばＣＰＢ及び特にＣＡＢＧ外科的処置での使用の根拠を提供し、そのような処置を受けている患者の術中の失血及び／又はＳＩＲの発症を予防又は軽減させる。本発明に用いられるＫＩポリペプチドは、当初カリクレインへの結合能についてファージディスプ
レイライブラリーをスクリーニングして単離された変異体Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチドのアミノ酸配列を有するか又は含む。
【００２２】
本発明の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｃｙｓ  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４  Ｘａａ２５  Ｘａａ２６  Ｘａａ２７  Ｘａａ２８  Ｘａａ２９  Ｃｙｓ  Ｘａａ３１  Ｘａａ３２  Ｐｈｅ  Ｘａａ３４  Ｘａａ３５  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３９  Ｘａａ４０  Ｘａａ４１  Ｘａａ４２  Ｘａａ４３  Ｘａａ４４  Ｘａａ４５  Ｘａａ４６  Ｘａａ４７  Ｘａａ４８  Ｘａａ４９  Ｘａａ５０  Ｃｙｓ  Ｘａａ５２  Ｘａａ５３  Ｘａａ５４  Ｃｙｓ  Ｘａａ５６  Ｘａａ５７  Ｘａａ５８（配列番号１）
を含むＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドを含む。
【００２３】
「Ｘａａ」はペプチド鎖における位置を表し、多くのさまざまなアミノ酸のいずれでもよい。例えば本明細書に記載されるＫＩペプチドについては、Ｘａａ１０はＡｓｐ又はＧｌｕであり得る；Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ１３はＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＡｓｎであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ又はＡｌａであり得る；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌであり得る；Ｘａａ３４はＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＬｅｕであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり得る；Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＡｓｐであり得る。アミノ酸Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよい。更に、配列番号１の最初の４アミノ酸及び最後の３アミノ酸は、それぞれ任意に存在してもしなくてもよく、存在する場合は如何なるアミノ酸でもよい。
【００２４】
配列番号１に定義されるペプチドは、カリクレインに結合するポリペプチドのセットを形成する。例えば本発明の好ましい態様において、本発明の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは以下の可変位置を有する：Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり得る；Ｘａａ１３はＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＡｓｎであり得る；Ｘａａ１５はＡｒｇ又はＬｙｓであり得る；Ｘａａ１６はＡｌａ又はＧｌｙであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ又はＬｅｕであり得る；Ｘａａ２１はＴｒｐ又はＰｈｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕである；Ｘａａ３２はＧｌｕ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ３４はＩｌｅ、Ｔｈｒ又はＳｅｒであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒである；そしてＸａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ又はＡｌａであり得る。
【００２５】
請求している発明のより特定の態様は、以下の可変位置のアミノ酸で定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐである；Ｘａａ１１はＡｓｐである；Ｘａａ１３はＰｒｏ又はＡｒｇであ
り得る；Ｘａａ１５はＡｒｇである；Ｘａａ１６はＡｌａ又はＧｌｙであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａである；Ｘａａ１８はＨｉｓである；Ｘａａ１９はＰｒｏである；Ｘａａ２１はＴｒｐである；Ｘａａ３１はＧｌｕである；Ｘａａ３２はＧｌｕである；Ｘａａ３４はＩｌｅ又はＳｅｒであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒである；そしてＸａａ３９はＧｌｙである。
【００２６】
また、本発明の範囲に包含されるのは、本明細書に記載されるポリペプチドの位置を含むペプチドである。例えば、ポリペプチドは特定のカリクレインエピトープに対する結合ドメインを含むであろう。本明細書に記載されるポリペプチドのそのような断片も包含されるであろう。
【００２７】
本明細書に記載される方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドはＫｕｎｉｔｚドメインを含む。配列番号１に包含される配列のサブセットが以下に記載される（示されていない場合、「Ｘａａ」は、配列番号１について認められるのと同じセットのアミノ酸を意味する）：
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｃｙｓ  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ａｒｇ  Ｘａａ２１  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３１  Ｘａａ３２  Ｐｈｅ  Ｘａａ３４  Ｘａａ３５  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３９  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号３３）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２のアミノ酸３〜６０）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号４）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号５）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  
Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号６）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号７）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号８）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号９）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１０）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１１）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１２）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  
Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１３）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１４）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１５）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１６）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１７）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１８）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号１９）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２０）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇ１ｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２１）、
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２２）。
【００２８】
図３Ａ及び３Ｂはこれらの配列のアミノ酸配列アラインメント、これらの変異体が由来する天然のＬＡＣＩ配列（配列番号３２）、及び他の公知のＫｕｎｉｔｚドメイン（配列番号２９〜３１及び３３〜５３）を提供する。
【００２９】
本明細書に記載される方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、いずれかの標準ポリペプチド合成プロトコール及び装置を用いて合成によって作製することができる。例えば、本明細書に記載されるＫＩポリペプチドの段階的合成は、アミノ（Ｎ）端保護基を最初の（即ちカルボキシ端）アミノ酸から除去し、ポリペプチド配列中の次のアミノ酸のカルボキシ末端へカップリングすることにより行うことができる。このアミノ酸も好適に保護される。カルボジイミド、対称性酸無水物、又はヒドロキシベンゾトリアゾールエステル若しくはペンタフルオロフェニルエステルなどの「活性エステル」基の形成のような反応基の形成により、次のアミノ酸のカルボキシ基を活性化させて、結合したアミノ酸のＮ末端と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法には、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを用いるＢＯＣ法、及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを用いてアミノ酸残基のα−アミノを保護するＦＭＯＣ法が含まれる。両方法とも当業者に周知である（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．、固相ペプチド合成（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、サンフランシスコ、１９８９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．、１９６３．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．、ペプチド合成の実践（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８４）、これら文献の全体の教示は本明細書中に援用される）。所望により、更なるアミノ端及び／又はカルボキシ端アミノ酸をアミノ酸配列中にデザインし、ポリペプチド合成中に付加することができる。
【００３０】
あるいは、本発明の組成物及び方法に有用なＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチド及びＫＩポリペプチドを、多くの細胞、及び細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、ほ乳類ウイルス発現ベクター等を含むがこれらに限定されない対応する発現ベクターのいずれかを用いる組換え法により作製することができる。本発明の組成物及び方法に有用なＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチド及びＫＩポリペプチドは、本明細書に記載されるＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドのコード配列を含む核酸分子を用いて遺伝子組換えにより作製することもできる。ここで、核酸分子は、当該技術分野で利用可能な遺伝子導入法を用いて宿主動物のゲノムに統合されてそこから発現されることができる。Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチド又はＫｕｎｉｔｚドメインを含むＫＩポリペプチドのコード配列を発現ベクター中の他のコード配列に融合させて、宿主細胞で容易に発現する融合ポリペプチドを形成することが必須又は有益である場合もある。そのような融合ポリペプチドを発現する宿主細胞は融合ポリペプチドもプロセシングし、所望
のアミノ酸配列のみを含有する本発明に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドを産生することが好ましい。いずれかの他のアミノ酸が、発現したＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドに付着したままである場合、このような付加的アミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドのカリクレイン結合活性及び／又はカリクレイン阻害活性を減少させて、本発明の方法又は組成物におけるポリペプチドの使用を排除すべきではないことは明らかである。
【００３１】
本明細書に記載される方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドを作製するのに好ましい組換え発現システムは、ＫＩポリペプチド又はＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列が、同じリーディングフレームでサッカロミセス・セレビジエのｍａｔαプレプロリーダーペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と連結されるのを可能にする酵母発現ベクターであり、これは作動可能な酵母プロモーターの制御下にある。次に、得られる組換え酵母発現プラスミドは、標準方法により、適切な適合性酵母宿主の細胞に形質転換されることができ、この細胞は組換え酵母発現ベクターから組換えタンパク質を発現できる。そのような組換え発現ベクターで形質転換された宿主酵母細胞は、融合タンパク質をプロセシングして、本発明の方法及び組成物に有用な活性ＫＩポリペプチドを提供することも可能であることが好ましい。そのようなＫｕｎｉｔｚドメインを含む組換えＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチド及びＫＩポリペプチドを作製するための好ましい酵母宿主はピキア・パスアトリスである。
【００３２】
上記のように、本明細書に記載される方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、本明細書に記載されるＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドを含むことができる。ＫＩポリペプチドは、付加的なフランキング配列、好ましくは長さ１〜６アミノ酸を、このような付加的アミノ酸がカリクレイン結合親和性又はカリクレイン阻害活性を顕著に減少させて本明細書に記載される方法及び組成物における使用を排除することがないことを条件として、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端に含むことができ場合もある。このような付加的アミノ酸を、ＫＩポリペプチドを特定の組換え宿主細胞中で発現させるために意図的に付加することができ、又は更なる機能を提供するため、例えば、ＫＩポリペプチドを他の分子へ連結させるために、若しくはポリペプチドの精製を容易にする親和性部分を提供するために付加することもできる。付加的アミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメインのジスルフィド結合を妨げるシステインを含まないことが好ましい。
【００３３】
本発明の方法及び組成物に有用な好ましいＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドの例は、配列番号２の残基３〜６０のアミノ酸配列を有する。酵母融合タンパク質発現システムで（例えば統合発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２に基づいて）発現及びプロセシングさせる場合、このようなＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドは、付加的アミノ端Ｇｌｕ−Ａｌａジペプチドを、Ｓ．セレビジエのｍａｔαプレプロリーダーペプチド配列との融合から保つ。酵母宿主細胞から分泌される場合、リーダーペプチドの多くは融合タンパク質からプロセシングされて配列番号２のアミノ酸配列（図２囲み領域を参照されたい）を有する機能的ＫＩポリペプチド（以後「ＰＥＰ−１」と称する）を生ずる。
【００３４】
本明細書に記載される方法及び組成物に有用な特に好ましいＫＩポリペプチドは、カリクレインに対し、現在失血を軽減させるためにＣＡＰＧ処置に使用することが認可されているアプロチニンよりも１０００倍高いオーダーで結合親和性を有する。本明細書に記載されるこのようなＫＩポリペプチドの驚くほど高い結合親和性は、このようなＫＩポリペプチドが、他の分子標的（以下の表１を参照されたい）を除外して、カリクレインに対し高度に特異性を発揮することを示している。したがって、本発明のこのようなポリペプチドの使用は、患者における起こり得る治療標的に関し、多くの考察を軽減させる。例えばアプロチニンによって発揮されるより低度の特異性は、起こり得る多面的副作用をもたらし、治療メカニズムに関してあいまいである。
【００３５】
例えば配列番号１で定義されるポリペプチドは不変位置を含有し、例えば位置５、１４、３０、５１及び５５はＣｙｓのみであり得る。例えば位置６、７、８、９、２０、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４１、４２、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３及び５４のような他の位置は、如何なるアミノ酸（非天然アミノ酸を含む）でもよい。特定の好ましい態様において、１つ以上のアミノ酸が天然配列のアミノ酸に対応する（例えば配列番号３２、図３を参照されたい）。好ましい態様において、少なくとも１つの可変位置は天然配列とは異なる。更に他の好ましい態様において、アミノ酸はそれぞれ個別に又は集団で保存又は非保存アミノ酸置換により置換されることができる。保存アミノ酸置換は１つのアミノ酸を類似の化学構造を有する他のアミノ酸に置換し、タンパク質機能に影響を与えない。非保存アミノ酸置換は１つのアミノ酸を非類似の化学構造を有する他のアミノ酸に置換する。保存アミノ酸置換の例には、例えばＡｓｎ→Ａｓｐ、Ａｒｇ→Ｌｙｓ及びＳｅｒ→Ｔｈｒが含まれる。好ましい態様において、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び／又は２１は個別に又は集団で、如何なる組合せでも、配列番号２の対応の位置に相当するよう選択されることができる。
【００３６】
他の位置、例えば位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３及び４５は、選択されるアミノ酸セットのいずれでもよい。したがって、配列番号１は可能な配列のセットを定義する。このセットの各メンバーは、例えば、位置５、１４、３０、５１及び５５にシステイン、及び位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３及び４５にアミノ酸の特定のセットのいずれか１つを含有する。好ましい態様において、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び／又は１９は、個別に又は集団で、如何なる組合せでも、配列番号２の対応の位置に相当するよう選択されることができる。ペプチドは、配列番号２に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同であることが好ましい。
【００３７】
方法及び組成物
また、本発明は、虚血を予防又は軽減させるための方法にかかるものである。本発明において好ましいのは、特に心臓胸郭部の手術に関連した、患者の術中の失血及び／又は全身炎症反応（ＳＩＲ）を予防又は軽減させるための方法である。治療方法は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むＫＩポリペプチドの投与を包含する。この方法の１つの態様は、広範なセリンプロテアーゼ、例えばウシ肺から単離され、近年ＣＡＰＧ処置への使用が認可されたアプロチニン（トラジロール（登録商標）；バイエル社医薬部門、ウエストヘーブン、コネチカット）よりも、カリクレインに対しおよそ１０００倍以上高い親和性を有する配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチドの使用を包含する。
【００３８】
多くの外科的処置のいずれか、特に体外循環、例えば、ＣＰＢなどの心臓胸郭部の手術、及び／又は胸骨分離若しくは股関節置換術などの骨外傷に関与する処置を受ける患者には、術中の失血及び炎症の危険性がある。患者の血液と骨の切断表面又はＣＰＢ装置との接触は、接触活性化システム（ＣＡＳ）を含む１つまたはいくつかの望まれないカスケード反応を活性化させるのに十分である。これは即時輸血を必要とする術中の大量失血及び全身炎症反応（ＳＩＲ）をもたらし得、続いて組織及び臓器に永久的な損傷をもたらし得る。特定のメカニズム又は理論に限定されることを望まないが、ＣＡＢＧ処置におけるような、心臓胸郭部の手術、例えばＣＰＢに関連して起こる失血は、おそらく大量の毛細血管漏出に起因するようであり、即時輸血で元に戻さなければならない重大な失血をもたらし得る。
【００３９】
本明細書に記載される方法は、例えば、外科的処置、特に体外循環、例えば、ＣＰＢのような心臓胸郭部の手術を必要とする場合の外科的処置を受ける患者の術中の失血及びＳＩＲを含む、種々の虚血を予防又は軽減させるのに有用である。本発明の方法は、ＣＰＢ又は他の心臓手術を必要とするＣＡＢＧ処置を受ける患者の術中の失血及び／又はＳＩＲを予防又は軽減させるのに特に有用である。
【００４０】
医療用途に好ましい組成物は、本明細書に記載されるＫＩポリペプチドを含む。このような有用な組成物は、１種以上の医薬的に許容可能なバッファー、担体及び賦形剤を更に含むことができ、これらは、患者への組成物のより一層の投与、組成物のＫＩポリペプチドの増大した循環半減期、患者の血液化学への組成物の増大した適合性、組成物の増大した保存性、及び／又は患者への投与に対する組成物の増大した有効性を含むがこれらに限定されない所望の特徴を組成物に提供することができる。本明細書に記載されるＫＩポリペプチドに加え、組成物は、侵襲性外科的処置を受けた患者に更なる予防及び治療の恩恵を提供する１種以上の他の医薬的に活性な化合物を更に含むことができる。
【００４１】
本発明の方法に有用な組成物は、Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチド又は本明細書に記載されるようなＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドを含むＫＩポリペプチドのいずれかを含む。特に好ましいのは、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８アミノ酸配列を有するＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドを含むＫＩポリペプチドである。本発明の方法及び組成物に有用なこのように特に好ましいＫＩポリペプチドの例は、配列番号２の６０アミノ酸配列を有するＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドである。配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号３に提供される（例えば図２のヌクレオチド３０９〜４８８を参照されたい）。本発明は、公知の遺伝コードに基づいて、ヌクレオチド配列によってコードされるそれぞれのアミノ酸を１種以上の公知の縮重コドンで単に置き換えることにより、配列番号３のヌクレオチド配列の縮重型も提供することが理解される。配列番号３のヌクレオチド７〜１８０、及びその縮重型は、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８アミノ酸配列を有する非天然Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチドをコードする。
【００４２】
種々の核酸分子のいずれも、限定されるものではないが組換えファージゲノム、組換え哺乳動物ウイルスベクター、組換え昆虫ウイルスベクター、酵母ミニ染色体、及び種々のプラスミドを含めて、配列番号３のヌクレオチド７〜１８０のヌクレオチド配列、縮重型、及びその部分を含むことができる。このようなプラスミドには、そのようなヌクレオチドコード配列をクローニングし及び／又は発現させるのに用いられるものを含む。発現ベクターは、特定のヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができるプロモーター、及び特定のヌクレオチドコード配列を機能的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写し、更にこのｍＲＮＡを対応のポリペプチドに翻訳することが可能な適切な宿主細胞を提供する。次に、このようにして産生されるポリペプチドを宿主細胞から単離することができる。本明細書に記載されるＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子は、標準の核酸合成法、組換えＤＮＡ法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、及びそれらのいずれかの組合せで作製することができる。
【００４３】
術中の失血及び心臓の血流減少
医学の大きな進歩により、失血をもたらすか又は患者が失血する危険性の高い多くの高度に侵襲性な外科的処置が日々行われている。このような患者は正常な血液供給及び止血を回復及び維持するために注意深くモニターされなければならず、輸血を必要とするかもしれない。失血を伴う外科的処置には、心臓胸郭部の手術、例えばＣＰＢのような体外循環法を包含するものが含まれる。このような方法において、患者の心臓は停止され、循環、酸素供給、及び血量維持が体外回路及び合成膜人工肺を用いて人工的に行われる。このような技術は心臓手術に普通に用いられている。更に、ＣＡＢＧに必要とされる胸骨分離又は股関節置換術処置のように骨に大規模な外傷を伴う外科手術もＣＡＳの活性化に関連
するようであり、これは血液及び脈管系に種々の破壊をもたらし得る。
【００４４】
アテローム硬化性冠動脈疾患（ＣＡＤ）は１つまたはいくつかの冠動脈内腔の狭窄を引き起こす；これは心筋（即ち心臓の筋肉）への血流を制限し、狭心症、心不全、及び心筋梗塞を引き起こし得る。冠動脈アテローム硬化の末期では冠循環はほとんど完全に閉塞し得、生命をおびやかす狭心症又は心不全を引き起こし、死亡率が高い。ＣＡＰＧ処置は、閉塞血管を橋渡しし、心臓に血液を回復させることを必要とするかもしれない；これらは潜在的に生命を維持する。ＣＡＰＧ処置は最も侵襲性の外科手術であり、１つ以上の健常な静脈又は動脈を移植して、疾患血管の閉塞領域周辺に「バイパス」を提供する。ＣＡＰＧ処置は小さいが重大な術中の危険性を伴うが、アテローム硬化性心血管疾患の死亡率及び罹患率からの速やかな救済を患者に提供する点で非常に成功している。これらの非常に有望な結果にもかかわらず、最終的に第２回、ときに第３回の処置を受ける患者数の明らかな増加が示すように、繰り返しのＣＡＰＧ処置が必要とされることが多い。第１回目のＣＡＰＧ処置で見られる術中の死亡率及び罹患率は、こうした再処置において増加している。
【００４５】
合併症のないＣＡＤに対する低侵襲外科技術には改善点がある。しかしながら、弁膜性及び／又は先天性の心疾患、心臓移植、並びに主要な大動脈処置に対して行われるほぼ全てのＣＡＰＧ処置は、ＣＰＢで支持されている患者について依然として行われている。ＣＰＢにおいて、大きなカニューレを患者の大血管に挿入し、膜人工肺を用いて血液の機械的なポンプ作用及び血液供給を可能にしている。血液は肺を流れずに患者に戻され、この処置のあいだ血流が低下する。心臓は心筋保護液を用いて停止され、患者は脳損傷及び体外回路、即ちＣＰＢ回路によって増加される末梢循環量を妨げるのに役立つように冷却される。この体外回路はドナー血液による「プライミング」を必要とし、生理食塩水混合物が体外回路の充填に用いられる。ＣＰＢはほぼ半世紀のあいだに行われた種々の処置に大規模に用いられ、うまくいっている。人工的表面、血液細胞、血液タンパク質、損傷した血管内皮、及び骨などの血管外組織の相互作用は、止血を妨げ、頻繁にＣＡＳを活性化する。これは上記のように、血液及び脈管系に種々の混乱をもたらし得る。このような混乱は術中の過剰な出血をもたらし、即時輸血を必要とする。ＣＰＢにおける対外回路を通した全血の循環の結果には、凝固系及び補体系の接触活性化により開始される全身炎症反応（ＳＩＲ）も含むことができる。実際、一見して機械的に成功しているＣＰＢ外科的処置に関連する罹患率及び死亡率の多くは、凝固系、線溶系、又は補体系を活性化する効果の結果である。このような活性化は、肺系に損傷を与え、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、腎臓及び内臓循環の機能障害、並びに失血及び輸血の必要性をもたらす一般的な凝固障害の誘導をもたらし得る。術中の失血の危険性に加えて、ＳＩＲに関連する更なる病理には、神経認知不足、、脳卒中、腎不全、急性心筋梗塞、及び心組織損傷が挙げられる。
【００４６】
輸血にも重大な感染の危険性が存在し、ＣＡＢＧ又はＣＰＢを要する他の類似処置の費用も増加する。薬理学的診療がなければ、たとえ優れた外科技術があっても典型的には３〜７単位の血液が１人の患者に費やされなければならない。したがって、ＣＰＢ及びＣＡＰＧ処置を受ける患者において術中の出血及びＳＩＲを軽減又は予防するための新規且つ改善された薬理学的に有効な化合物の開発に関し、少なからぬ動機がある。
【００４７】
ＫＩポリペプチドの投与及び用量の検討
本明細書に記載されるＫＩポリペプチドは、医薬的に許容可能な組成物で、外科的処置の前、あいだ、及び／又は後に患者に投与することができる。「医薬的に許容可能な」組成物という用語は、本発明の化合物とともに、患者に投与される非毒性担体又は賦形剤を意味し、その担体又は賦形剤はその組成物の生物活性又は薬理活性を破壊しない。本明細書に記載されるＫＩポリペプチドは、カリクレイン阻害量のＫＩポリペプチドを患者に送達するのに好適な、例えば非経口及び吸入などの全身投与を含むがこれらに限定されない
いずれかの手段により局所的に又は全身的に投与することができる。非経口投与が特に好ましい。
【００４８】
非経口投与についは、ポリペプチドは、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下に注入することができる。静脈内投与が好ましい。典型的には、静脈投与用組成物は、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。他の医薬的に許容可能な担体には、限定されるものではないが、滅菌水、生理食塩水溶液、及び緩衝食塩水（リン酸塩又は酢酸塩のようなバッファーを含む）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン、などが含まれる。必要であれば、組成物は、活性化合物と有害に反応しない限り、可溶化剤及び注入部位の痛みを和らげるためのリドカインのような局所麻酔剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩、潤滑剤などを含むこともできる。同様に、組成物は、慣用の賦形剤、例えば非経口投与、経腸投与又は鼻腔内投与に好適な医薬的に許容可能な有機又は無機担体基剤を含むことができ、これらは活性化合物と有害に反応しない。一般に、成分は別々に又は一緒にあわせて単位剤形に供給され、例えば凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、活性物質の量を活性単位で示すアンプル又はサチェットなどの密封容器に供給されるであろう。組成物を点滴で投与する場合、滅菌医薬品グレード「注射用水」又は塩を含有する輸液ボトルで調剤することができる。組成物を注射で投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用の滅菌水又は塩のアンプルを提供することもできる。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法は、認可されたいずれかの処置にしたがい患者にＫＩポリペプチドを静脈内注射として投与することを含む。したがって、本明細書に記載されるＫＩポリペプチドは、アプロチニン投与に関し認可されたプロトコールに近年用いられているのと同様の時期に、必要数又は必要濃度のカリクレイン阻害単位（ＫＩＵ）を患者に提供するのに要する量で、ＣＡＢＧ処置を受ける患者に投与することができる。本発明によれば、本明細書に記載されるＫＩポリペプチドは、出血異常がＳＩＲの下流効果の結果として起こり得る場合、手術直後に患者に投与することもできる。例えば、ＣＰＢを含む処置において、本明細書に記載されるＫＩポリペプチドを、初期負荷用量として、例えば麻酔を導入する前に１０分のような慣用の時間有効な量で、患者に投与することができる。次に、麻酔導入時に第２用量のＫＩポリペプチドをＣＰＢプライミング溶液に注入することができる(「ポンプ・プライム容量」)。次に患者は、外科的処置のあいだ、及び指示がある場合は処置後、継続的且つ制御された静脈内注射用量に置かれることができる。
【００５０】
近年、ＣＡＢＧ処置を受ける患者へのアプロチニン投与に関し米国で認可された２つの投薬計画がある（トラジロール（登録商標）；バイエル社医薬部門、ウエストヘーブン、コネチカットの製品ラベル及び挿入物を参照されたい）。認可された投与計画の１つは、静脈内負荷用量２百万ＫＩＵ、ポンプ・プライム容量へ２百万ＫＩＵ、及び外科手術１時間当たり５００，０００ＫＩＵを用いる。認可されたもう１つの投与計画は、静脈内負荷容量百万ＫＩＵ、ポンプ・プライム容量百万ＫＩＵ、及び外科手術１時間当たり２５０，０００ＫＩＵを用いる。これらの投与計画はＫＩＵに基づいているため、特定のＫＩポリペプチドの比活性及びＫＩＵが標準アッセイで決定されれば、これらの投与計画は、本明細書に記載されるいずれのＫＩポリペプチドにも容易に適用される。本明細書に記載される代表的ＫＩポリペプチドの、アプロチニンと比較して増大した結合親和性及び阻害活性により、本発明の組成物及び方法が必要数又は必要濃度のＫＩＵを患者に提供するのに要するのは、患者当たりより少ないミリグラム（ｍｇ）であると予想される。
【００５１】
本発明の方法におけるＫＩポリペプチドを用いた投薬に関し、いくつかの考慮すべき事項は、配列番号２（分子量７，０５４ダルトン）のアミノ酸配列を有する本発明の代表的ＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドの例により具体的に示すことができる。
【００５２】
以下の表１は、カリクレイン及び他の１１の公知の血漿プロテアーゼに対するＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドの親和性（Ｋi,app）の比較を提供する。
【００５３】
【表１】
2010155842.tif 000002
【００５４】
明らかに、ＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドはヒト血漿カリクレインに対し高度に特異的である。更に、カリクレインに対するＰＥＰ−１の親和性（Ｋi,app）は、カリクレイン
に対するアプロチニンの親和性よりも１０００倍高い：カリクレインに対するＰＥＰ−１のＫi,appは約４４ｐＭであるが（表１）、カリクレインに対するアプロチニンのＫi,appは３０，０００ｐＭである。したがって、ＰＥＰ−１の用量は、分子当たりの基準で、アプロチニンに用いられるよりもおよそ１０００倍低いであろう。しかしながら、いくつかの他の因子についての検討が、ＰＥＰ−１の用量について、実践に役立つより正確な評価を与えるかもしれない。このような因子には、特定の患者においてＣＰＢのあいだ活性化されるカリクレインの量、ＳＩＲを誘引するのに要するカリクレイン濃度、並びに患者におけるＰＥＰ−１のバイオアベイラビリティ及び薬理分布が含まれる。それにもかかわらず、本発明の方法による、アプロチニンの使用に関し現在認可されている用量で提供されるＫＩポリペプチドの使用は、特異性が低く低親和性のウシアプロチニンについての現在の使用に対し、顕著な改善を提供することが依然として期待されている。
【００５５】
例えば、血漿中の循環プレカリクレインの全量はおよそ５００ｎＭであるとみられる（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，Ｍ．ら、「接触システム及びその障害」、Ｂｌｏｏｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｈａｎｄｉｎ，Ｒ．ら、編、ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ社、フィラデルフィア、１９９５）。全てのプレカリクレインが活性化されたならば、カリクレインを化学量論的に阻害するのに少な
くとも５００ｎＭのＰＥＰ−１が必要とされるであろう。したがって、５リットルの血漿を有する個人は、血漿濃度が５００ｎＭに達するのに約１８ｍｇのＰＥＰ−１を必要とするであろう。
【００５６】
考慮すべき他の要因は、患者にＳＩＲを誘発するのに要するカリクレインの閾値濃度である。活性カリクレイン濃度が例えば１ｎＭ以下に維持される必要がある場合、カリクレインに対する高親和性により、ＰＥＰ−１は、ＳＩＲを阻害するのに必要なタンパク質量で、アプロチニンよりも有意な利益を与える。特に、ＰＥＰ−１濃度１ｎＭは、１ｎＭで存在するカリクレインを９９．６％阻害するが（即ち、血中にはわずか０．４ｐＭの遊離カリクレインが残留）、アプロチニン濃度１ｎＭは、１ｎＭで存在するカリクレインを２４．５％阻害するのみである。アプロチニンが１ｎＭのカリクレインを９９％阻害するには、少なくとも３μＭの血漿アプロチニン濃度を必要とする（即ちＰＥＰ−１よりも３０００倍高濃度）。
【００５７】
ＣＰＢを受ける患者に対し、ＰＥＰ−１の初期臨床用量は、アプロチニンの上記推奨投与計画（１×１０6ＫＩＵ）から概算することができる。アプロチニンは、イヌ血圧アッ
セイを用いて測定された比阻害活性が７１４３ＫＩＵ／ｍｇであると添付文書に報告されている。したがって、１×１０6ＫＩＵのアプロチニンは１４０ｍｇのアプロチニンと等
価である（即ち１×１０6ＫＩＵ／７１４３ＫＩＵ／ｍｇ＝１４０ｍｇのアプロチニン）
。血漿容量５リットルの患者において、１４０ｍｇはおよそ４．３μＭアプロチニン（アプロチニンの分子量は６５１２ダルトンである）に相当する。ＰＥＰ−１に用いられる標準阻害アッセイにおいて、アプロチニンの比活性は０．４ＫＩＵ／ｍｇポリペプチドである。用量１４０ｍｇは、アプロチニンの負荷用量５６ＫＩＵ（１４０ｍｇ×０．４ＫＩＵ／ｍｇ＝５６ＫＩＵ）に相当するであろう。逆に、ＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドの比活性は、標準阻害アッセイにおいて１０ＫＩＵ／ｍｇであるため、アプロチニン１４０ｍｇに等価なＫＩＵ数を提供するのに必要とされるＰＥＰ−１は、わずか５．６ｍｇ用量であろう。血漿容量５リットルの患者において、これは約１６０ｎＭ  ＰＥＰ−１（ＰＥＰ−１の分子量は７０５４ダルトンである）に相当する。但し、全ての血漿カリクレイン（５００ｎＭ）が活性化される場合及び／又はこのＫＩポリペプチドが患者にほとんど分散していない場合には、高用量のＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドが必要とされ得る。
【００５８】
更に、ＫＩポリペプチドは、上記のように非天然のものでもよく、また、合成又は組換えにより作製することもでき、それにより、ウシ肺から単離されるアプロチニンの場合のように自然の動物供給源からのタンパク質の単離中に起こり得る伝染性疾患による潜在的汚染を避けることができる。ポリペプチドを含む治療又は医薬組成物についての行政上及び公共の容認のための高まる重要性は、種々の病理物質の起こり得る汚染の回避及びヒト患者への伝染である。ウシ組織から単離したタンパク質の安全性についての特別の関心事は、ウイルス介在疾患、細菌介在疾患、及び、特に伝染性ウシ海綿状脳症に曝露され得る危険性を排除することである。
【００５９】
ヒトＬＡＣＩタンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１の変異体のように、ＫＩポリペプチドを患者に投与することからは、ウシタンパク質であり、特に、２度目のＣＡＰＧ処置のような繰り返し投与において、患者にアナフィラキシー反応及びアナフィラキシー様反応を引き起こすことが立証されているアプロチニンと比較して、副作用はほとんど予想されない。更に、本明細書に記載されるＫＩポリペプチドのカリクレインに対する高度に特異的な結合は、アプロチニンで観察される血栓傾向を有効に制限又は排除し、且つＣＡＰＧ処置後の移植開存性とともに観察される問題を軽減させるであろう。
【００６０】
以下の非限定的実施例を参照して本発明を更に説明する。本明細書で引用する全ての特許、特許出願及び他の全ての出版物及びウェブサイトの教示は、本明細書にその全体が援
用される。
【実施例１】
【００６１】
代表的ＫＩポリペプチド
本発明の組成物及び方法に有用な非天然ＫＩポリペプチド（ＰＥＰ−１）を、ファージディスプレイライブラリーの組換えファージに提示されたカリクレイン結合ポリペプチドとして同定した。ＰＥＰ−１は以下のアミノ酸配列を有する：Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２）。ＰＥＰ−１の分子量は７，０５４ダルトンである。
【００６２】
ＰＥＰ−１アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸３〜６０）をコードする組換えファージＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を単離し、組換えファージＤＮＡから決定された標準的方法で配列決定した。ＰＥＰ−１は、酵母株ピキア・パストリスのＨｉｓ４-
表現型宿主細胞中で、更なる特徴付けに有用な量で組換えタンパク質として産生した。
【実施例２】
【００６３】
ＫＩポリペプチドを発現させるための組換えプラスミドの構築
開始プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２はアンピシリン耐性であり、Ｐ．パストリスに由来する野生型アレルのＨｉｓ４を含有する。組換え発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中にｍａｔαプレプロ−ＰＥＰ−１融合タンパク質のコード配列を含む最終ＤＮＡ配列を図２に示す。以下のようにｐＨＩＬ−Ｄ２のＤＮＡ配列を改変してｐＰＩＣ−Ｋ５０３を作製した。
【００６４】
１．  ｐＨＩＬ−Ｄ２の３’ＡＯＸ１領域におけるＢｓｔＢＩ部位は、Ｈｉｓ４遺伝子の下流に位置するが、部分的制限消化、フィルイン、及びライゲーションにより除去し、ＴＴＣＧＡＡ（配列番号２３）からＴＴＣＧＣＧＡＡ（配列番号２４）へ配列変更した。この改変は、プラスミドへの発現カセットのクローニングを容易にし、管理するために行った。
【００６５】
２．  Ｈｉｓ４の下流に位置するｂｌａ遺伝子を有するＡａｔＩＩ部位は、制限消化、フィルイン、及びライゲーションにより除去し、ＧＡＣＧＴＣ（配列番号２５）からＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣ（配列番号２６）へ配列を改変した。この改変は、ＡａｔＩＩ部位を有する発現カセットのプラスミドへのクローニングを容易にするために行った。オリジナルのカリクレイン結合ディスプレイファージからのヌクレオチド配列に基づき、４５０塩基対（ｂｐ）から成るＰＥＰ−１をコードするＤＮＡを合成した。ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミド中の挿入物の最終ＤＮＡ配列は、５’ＡＯＸ１配列及び３’ＡＯＸ１配列（図２に示す部分）が側面にあり、ＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドの構造コード配列に融合したＳ．セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする。酵母宿主細胞からのＰＥＰ−１の分泌を容易にするためにシグナルペプチドを付加した。挿入物を形成するためのオリゴヌクレオチドは、合成され、又は商業的に得た（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｌａｂｓ、ウッドランド、テキサス）。挿入物はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作製した。次にｍａｔαプレプロ／ＰＥＰ−１融合タンパク質をコードする連結した合成ＤＮＡを、ライゲーションにより改変ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミドのＢｓｔＢＩ部位とＥｃｏＲＩ部位のあいだに導入した。
【００６６】
連結産物を用いて大腸菌株ＸＬ１  Ｂｌｕｅを形質転換した。ＰＣＲアッセイを用い、所望のプラスミド構築物について大腸菌の形質転換体をスクリーニングした。細胞抽出物由来のＤＮＡを、５’ＡＯＸ１配列及び３’ＡＯＸ１配列（上記及び図２を参照されたい）を含有するプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。正確な塩基対数のＰＣＲ産物を配列決定した。更に、クローニング部位の両側およそ２０〜５０ｂｐについて配列決定し、推定配列を得た。ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミド中の挿入物の最終ＤＮＡ配列（プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３を産生するためのもの）を、５’及び３’ＡＯＸ１フランキング配列の一部、並びにＰＥＰ−１  ＫＩポリペプチドの構造コード配列に融合したＳ．セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチドを含む融合タンパク質の対応のアミノ酸配列とともに図２に示す。所望の発現プラスミド構築物による形質転換体であるプラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３を、ＰＥＰ−１の日常的産生用酵母細胞株を調整するために選択した。
【実施例３】
【００６７】
組換え酵母細胞株からのＰＥＰ−１の製造
Ｈｉｓ４-表現型を有するＰ．パストリスのスフェロプラストＧＳ  １１５を、発現プ
ラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３（上記）をＳａｃＩ部位で直線化してこのプラスミドＤＮＡを宿主５’ＡＯＸ１部位へ相同組換えした後に、これを用いて形質転換した。産生株の表現型はＨｉｓ４+である。全プラスミドを酵母の５’ＡＯＸ１ゲノム配列へ挿入した。
【００６８】
形質転換からの単離物を、単一炭素源としてメタノールを用い、外来ヒスチジン非存在下での増殖についてスクリーニングした。形質転換体の９５％以上は、単一炭素源としてメタノールを用いて増殖する野生型の能力を保持しおり、プラスミドがトランス置換ではなく相同組換えで宿主ゲノムに挿入されたことを示した。これらの形質転換体は増殖に外来ヒスチジンを必要とせず、プラスミドが宿主ゲノムに統合されたことを示した。選択したコロニーをクローニングした。小規模培養発現実験を行い、高レベルの活性ＰＥＰ−１を培地へ分泌するクローンを同定した。精製培養上清溶液中のＰＥＰ−１分泌レベルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でＰＥＰ−１レベルについて定量し、カリクレイン阻害を評価した。サンプルされた培養間で高レベルのＰＥＰ−１発現に基づき、ＰＥＰ−１産生について酵母クローンを選択した。
【００６９】
ＰＥＰ−１を産生するＰ．パストリスのマスター及び作業用細胞バンクを商業的に準備した（ＭＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ボセル、ワシントン）。酵母におけるＰＥＰ−１の標準的産生は、以下の３工程を含む：（１）種培養の準備、（２）発酵、及び（３）培養物の回収。
【００７０】
種培養工程は、滅菌接種材料ブロス（酵母窒素塩基、リン酸カリウム、及びグリセロール、ｐＨ＝５）を含有する６つのフラスコ（それぞれ３００ｍＬ）の接種から成り、内容物はＰＥＰ−１を産生するＰ．パストリスの作業用細胞バンクのバイアル１本である。フラスコをオービタルシェーカー（３００ｒｐｍ）中、３０℃±２℃でおよそ１３時間接種した。
【００７１】
滅菌ブロスを充填した１００リットルの密封式ブラウン発酵槽中で発酵を行った。６つの種培養フラスコの内容物を発酵槽に移して各々の発酵を開始した。およそ２４時間後、発酵槽中のグリセロールが消耗し、追加のグリセロールを更におよそ８時間加えた。
【００７２】
次に、混合供給相を、これはおよそ８３時間続いたが、グリセロール及びメタノール原材料の添加により開始した。この時間の終了後、発酵を止め、発酵槽の内容物を精製水で希釈した。ＰＥＰ−１の精製及び処理は以下の５工程から成る：（１）展開（expanded）ベッドクロマトグラフィ、（２）陽イオン交換クロマトグラフィ、（３）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、（４）限外ろ過及びダイアフィルトレーション、並びに（
５）最終ろ過及び包装。
【００７３】
最初の精製工程は展開ベッドクロマトグラフィから成る。希釈した発酵培養物を、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ樹脂（アマシャム・ファルマシア  Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ２００
クロマトグラフィカラム、アマシャム・ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージ）を充填した平衡化カラムにかけた。次にカラムを上向きモードで洗浄し（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ＝３．０〜３．５）、展開ベッドからの酵母細胞を水で洗い流した。展開ベッドが洗浄を促進するところまでトップアダプターを上げた。流れを止め、ベッドを静置させた。アダプターを、静置したベッドのわずかに上になるように下げた。流れを逆向きにした。溶出液を回収した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０を用いて、下向きモードで洗浄を継続した。溶出液を回収した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０を用いてＰＥＰ−１をカラムから溶出させた。溶出液を５０リットル容器に回収した。次に溶出液を０．２２μフィルターに通して精製部位に位置する清潔な容器にろ過した。ＰＥＰ−１濃度を測定するために更にサンプルを回収した。次に展開ベッドカラムからのろ過した溶出液を用いて陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行った。１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ６．２でＰＥＰ−１をカラムから溶出させた。
【００７４】
付加的なタンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）でＰＥＰ−１調整品から除去した。ＨＩＣの前に、陽イオン交換カラムからの溶出液を硫酸アンモニウムで希釈した。溶出液をカラムにかけ、リン酸カリウム（１００ｍＭ）中の硫酸アンモニウム（０．５７２Ｍ）、ｐＨ７．０でＰＥＰ−１を溶出させた。溶出液をＡ２８０値に基づきフラクションに回収した。全画分を予め秤量した滅菌ＰＥＴＧボトルに回収した。
【００７５】
選択した画分を清潔な容器にプールした。このプールを限外ろ過で濃縮した。濃縮したＰＥＰ−１調整品を１０倍量のＰＢＳ、ｐＨ７．０で直ちにダイアフィルトレーションした。
【００７６】
バルクＰＥＰ−１の汚染微生物数を最小限にするため、包装前に最終ろ過工程を行った。バルク溶液を０．２２μフィルターでろ過し、予め秤量した滅菌ＰＥＴＧボトルに回収した。ロット放出試験のためにサンプルを取り出した。バルクの残りを滅菌ＰＥＴＧボトルに無菌的に分注し、−２０℃で保存した。
【実施例４】
【００７７】
カリクレイン阻害アッセイ
カイネティック試験を用いてＰＥＰ−１などのＫＩポリペプチドの阻害活性を測定した。このカイネティックアッセイは、基質プロリルフェニルアラニルアルギニル  アミノ  メチル  クマリンのカリクレインによる切断後に蛍光を測定する。公知量のカリクレインを、マイクロタイタープレート上の好適な反応バッファー中で、連続的に希釈したＫＩポリペプチド標準リファレンス又は連続的に希釈したＫＩポリペプチド試験サンプルとともにインキュベートした。各サンプルについて３回実行した。基質溶液を加え、励起波長３６０ｍｎ及び蛍光波長４６０ｎｍを用いて直ちにプレートを読んだ。標準リファレンス曲線及びサンプル曲線のそれぞれうち少なくとも２つは、有効とみなされるＲ2値０．９５
を有することが必要とされる。
【００７８】
本発明を、好ましい態様を参照して具体的に示して説明するが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形式的に及び細部に種々の改変がなされ得ることが当業者には理解されるであろう。
【００７９】
［態様１］
アミノ酸配列：Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｃｙｓ  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４  Ｘａａ２５  Ｘａａ２６  Ｘａａ２７  Ｘａａ２８  Ｘａａ２９  Ｃｙｓ  Ｘａａ３１  Ｘａａ３２  Ｐｈｅ  Ｘａａ３４  Ｘａａ３５  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３９  Ｘａａ４０  Ｘａａ４１  Ｘａａ４２  Ｘａａ４３  Ｘａａ４４  Ｘａａ４５  Ｘａａ４６  Ｘａａ４７  Ｘａａ４８  Ｘａａ４９  Ｘａａ５０  Ｃｙｓ  Ｘａａ５２  Ｘａａ５３  Ｘａａ５４  Ｃｙｓ  Ｘａａ５６  Ｘａａ５７  Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者の虚血を予防又は軽減するための方法であって、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個別に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；
Ｘａａ１０はＡｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３はＡｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５はＰｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そして、
ポリペプチドがカリクレインを阻害する、前記方法。
【００８０】
［態様２］
虚血が、患者に施す外科的処置による術中の失血である、態様１に記載の方法。
［態様３］
外科的処置が心臓胸郭部の手術である、態様２に記載の方法。
【００８１】
［態様４］
心臓胸郭部の手術が心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術である、態様３に記載の方法。
【００８２】
［態様５］
Ｘａａ１０がＡｓｐである、態様１に記載の方法。
［態様６］
Ｘａａ１１がＡｓｐである、態様１に記載の方法。
【００８３】
［態様７］
Ｘａａ１３がＰｒｏであり、Ｘａａ１５がＡｒｇであり、Ｘａａ１６がＡｌａであり、Ｘａａ１７がＡｌａであり、Ｘａａ１８がＨｉｓであり、そしてＸａａ１９がＰｒｏである、態様１に記載の方法。
【００８４】
［態様８］
Ｘａａ２１がＴｒｐである、態様１に記載の方法。
［態様９］
Ｘａａ３１がＧｌｕである、態様１に記載の方法。
【００８５】
［態様１０］
Ｘａａ３２がＧｌｕである、態様１に記載の方法。
［態様１１］
Ｘａａ３４がＩｌｅである、態様１に記載の方法。
【００８６】
［態様１２］
Ｘａａ３５がＴｙｒである、態様１に記載の方法。
［態様１３］
Ｘａａ３９がＧｌｕである、態様１に記載の方法。
【００８７】
［態様１４］
アミノ酸配列：Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｃｙｓ  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４  Ｘａａ２５  Ｘａａ２６  Ｘａａ２７  Ｘａａ２８  Ｘａａ２９  Ｃｙｓ  Ｘａａ３１  Ｘａａ３２  Ｐｈｅ  Ｘａａ３４  Ｘａａ３５  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３９  Ｘａａ４０  Ｘａａ４１  Ｘａａ４２  Ｘａａ４３  Ｘａａ４４  Ｘａａ４５  Ｘａａ４６  Ｘａａ４７  Ｘａａ４８  Ｘａａ４９  Ｘａａ５０  Ｃｙｓ  Ｘａａ５２  Ｘａａ５３  Ｘａａ５４  Ｃｙｓ  Ｘａａ５６  Ｘａａ５７  Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者への外科的処置に関連する全身炎症反応の発症を予防又は軽減するための方法であって、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個別に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；
Ｘａａ１０はＡｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３はＴｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３はＡｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５はＰｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そして、
ポリペプチドがカリクレインを阻害する、前記方法。
【００８８】
［態様１５］
外科的処置が心臓胸郭部の手術である、態様１４に記載の方法。
［態様１６］
心臓胸郭部の手術が心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術である、態様１５に記載の方法。
【００８９】
［態様１７］
Ｘａａ１０がＡｓｐである、態様１４に記載の方法。
［態様１８］
Ｘａａ１１がＡｓｐである、態様１４に記載の方法。
【００９０】
［態様１９］
Ｘａａ１３がＰｒｏであり、Ｘａａ１５がＡｒｇであり、Ｘａａ１６がＡｌａであり、Ｘａａ１７がＡｌａであり、Ｘａａ１８がＨｉｓであり、そしてＸａａ１９がＰｒｏである、態様１４に記載の方法。
【００９１】
［態様２０］
Ｘａａ２１がＴｒｐである、態様１４に記載の方法。
［態様２１］
Ｘａａ３１がＧｌｕである、態様１４に記載の方法。
【００９２】
［態様２２］
Ｘａａ３２がＧｌｕである、態様１４に記載の方法。
［態様２３］
Ｘａａ３４がＩｌｅである、態様１４に記載の方法。
【００９３】
［態様２４］
Ｘａａ３５がＴｙｒである、態様１４に記載の方法。
［態様２５］
Ｘａａ３９がＧｌｕである、態様１４に記載の方法。
【００９４】
［態様２６］
アミノ酸配列：
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  
Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者の虚血を予防又は軽減するための方法であって、
ポリペプチドがカリクレインを阻害する、前記方法。
【００９５】
［態様２７］
虚血が、患者に施す外科的処置による術中の失血である、態様２６に記載の方法。
［態様２８］
外科的処置が心臓胸郭部の手術である、態様２７に記載の方法。
【００９６】
［態様２９］
心臓胸郭部の手術が心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術である、態様２８に記載の方法。
【００９７】
［態様３０］
アミノ酸配列：
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者への外科的処置に関連する全身炎症反応の発症を予防又は軽減するため方法であって、
ポリペプチドがカリクレインを阻害する、前記方法。
【００９８】
［態様３１］
外科的処置が心臓胸郭部の手術である、態様１４に記載の方法。
［態様３２］
心臓胸郭部の手術が心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術である、態様１５に記載の方法。
【００９９】
［態様３３］
アミノ酸配列：
Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２のアミノ酸３〜６０）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者の虚血を予防又は軽減するための方法であって、
ポリペプチドがカリクレインを阻害する、前記方法。
【０１００】
［態様３４］
虚血が、患者に施す外科的処置による術中の失血である、態様３３に記載の方法。
［態様３５］
外科的処置が心臓胸郭部の手術である、態様３４に記載の方法。
【０１０１】
［態様３６］
心臓胸郭部の手術が心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術である、態様３５に記載の方法。
【０１０２】
［態様３７］
アミノ酸配列：
Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  
Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列番号２のアミノ酸３〜６０）から成るポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む、患者への外科的処置に関連する全身炎症反応の発症を予防又は軽減するための方法であって
ポリペプチドがカリクレインを阻害する、前記方法。
【０１０３】
［態様３８］
外科的処置が心臓胸郭部の手術である、態様３７に記載の方法。
［態様３９］
心臓胸郭部の手術が心−肺バイパス術又は冠動脈バイパス移植術である、態様３８に記載の方法。
【図１】
2010155842.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2010155842.tif 000006