(57)【要約】【課題】セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を提供する。【解決手段】カバノキ科カバノキ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物、発酵茶葉由来成分及び／又はテアフラビン類をセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤とし、該活性阻害剤を外用剤に配合することで、肌荒れ予防、肌荒れ緩和及び／又は肌荒れ症状改善効果、色素沈着予防、色素沈着緩和及び／又は色素沈着改善効果、しわ形成予防、しわ形成緩和、及び／又はしわ改善等を可能ならしめる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノキ科カバノキ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物、発酵茶葉由来成分及び／又はテアフラビン類から選ばれる１種または２種以上を有効成分とするセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤。
【請求項２】
前記カバノキ科カバノキ属に属する植物がヨーロッパシラカバ及び／又はシラカバであり、アカネ科カギカズラ属に属する植物がガンビールノキであり、発酵茶葉が紅茶であることを特徴とする請求項１に記載のセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤。
【請求項３】
更に、抗酸化剤、細胞賦活剤よりなる群から選択された薬効剤の少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１又は２のいずれか一項に記載のセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤に関する。また、このセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を皮膚外用剤中に配合することで、肌荒れ、色素沈着及び／又はしわ形成を抑制及び改善ならしめるものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、常に外界にさらされており、加齢とともにシワ、タルミ、くすみ、色素沈着などが生じる。その一因が、酸化的、心因性等のストレスにより誘起される炎症性因子の活性化によりもたらされるものであることが近年広く知られるようになった。例えば、老化、癌化、色素沈着、炎症等においては、その原因としてＩＬ−１α、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α等の炎症性因子やコラゲナーゼ等の細胞外マトリクス分解酵素が深く関与しており、これらの炎症性因子の放出を抑制する有効成分についての研究がおこなわれている。
【０００３】
セリンプロテアーゼは、活性部位にセリン残基のあるプロテアーゼであり、代表的なものに、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エステラーゼなどがある。高等動物の消化酵素の大部分がこれにあたるが、セリンプロテアーゼは消化器官以外に皮膚表皮細胞にも存在しており、皮膚の健康状態と密接に関係していることが知られている。
【０００４】
例えば、皮膚角質層ではセリンプロテアーゼが細胞間接着蛋白質に作用し角層細胞の剥離に作用していること、また、セリンプロテアーゼの活性変化に起因する種々の皮膚疾患などが報告されていることから、セリンプロテアーゼの活性を適切に調整することが皮膚の健康を保ち、老化を防止するのに有効であるとされている。
【０００５】
近年の研究では、セリンプロテアーゼを皮膚角質層に供給して、異常角化や角層ターンオーバーの異常をコントロールすることができる不活性単体固定化セリンプロテアーゼ（特許文献１）、皮膚の老化防止効果を有するセリンプロテアーゼ阻害剤（トリプシン及びエラスターゼなど）として、ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物（特許文献２）、セリンプロテアーゼの一つであるエラスターゼの過剰発現を抑制することで、エラスチンの変性や破壊を防止し、皮膚の老化を防止するセージ属およびクワ属エキス（特許文献３）、荒れ性等の改善・予防に優れた効果を有するセリンプロテアーゼ（特にはプラスミン等の繊維素溶解系に関わるもの）活性阻害剤としてバラ科植物、カロフィラム・ブラジリエンセ、ミルキア・スファエロカルパ及びヒプティス・クレナタ（特許文献４、５）などが報告されている。
【０００６】
一方、本発明者らが着目したセリンプロテアーゼＨｔｒＡは、哺乳類に存在するタンパク質であって、これまでに４種、すなわちＨｔｒＡ１、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３およびＨｔｒＡ４が知られている。その中でもＨｔｒＡ１及びＨｔｒＡ２は皮膚表皮組織においても発現が認められる。
【０００７】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡについては近年、その生理的活性を明らかにする研究が進められており、ＴＧＦ−βファミリータンパク質活性調節剤して肺繊維症や肝硬変などの疾患を防止するためのセリンプロテアーゼＨｔｒＡの利用（特許文献６）、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ３を利用したアポトーシス誘導剤（特許文献７）などが報告されている他、皮膚に適用することに関する特定のプロテアーゼ（特許文献８）が報告されているのみで、植物由来成分を有効成分とするＨｔｒＡ１及びＨｔｒＡ２の活性阻害剤についての研究はこれまでにない。
【０００８】
なお、今回本発明者らが着目した植物エキスについては、エラスターゼ阻害剤として紅茶エキス、アセンヤク抽出物、シラカバ抽出物を利用しているものはあるが（特許文献９、〜１１）、いずれもセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤ではない。
【特許文献１】特開平０８−０３８１７５号公報
【特許文献２】特開平１１−１２４３２５号公報
【特許文献３】特開平１１−１４７８３４号公報
【特許文献４】特開２０００−３２７５５５公報
【特許文献５】特開２００１−２４０５５１公報
【特許文献６】特開２００５−１５４３９９公報
【特許文献７】特開２００４−２４８６６８公報
【特許文献８】特表２００７−５２２１５０公報
【特許文献９】特開２００６−１０４１１７公報
【特許文献１０】特開平１１−２６３７２０号公報
【特許文献１１】特開平１１−１７１７５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２活性化と肌荒れ、色素沈着及び／又はしわ形成の関連性、及び、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤について鋭意研究した結果、紅茶抽出物、アセンヤク抽出物、シラカバ抽出物及びテアフラビンはセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害作用が顕著に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち本発明は、カバノキ科カバノキ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物、発酵茶葉由来成分及び／又はテアフラビン類から選ばれる１種または２種以上を有効成分とするセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を配合することで、肌荒れ、色素沈着及び／又はしわ形成抑制及び改善効果を発揮する外用剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
【００１４】
本発明に係わるセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤は、カバノキ科カバノキ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物、発酵茶葉由来成分及び／又はテアフラビン類から選ばれる１種または２種以上を有効成分とするものである。本発明に係わるセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤は、皮膚に適用することでその効果を発現することができる。
【００１５】
本発明に係わるカバノキ科植物カバノキ属植物は、北半球の温帯から亜寒帯に約６０種が分布している落葉の低木あるいは高木である。カバノキ科植物カバノキ属植物としてはダケカンバ（Betula ermanii）、ミズメ（Betula grossa）、ベツラレンタ（Betula lenta、北米東部に分布）、ウダイカンバ（Betula maximowcziana）、シラカバ（シラカンバともいう、Betula platyphylla Sukatchev var.japonica Hara）、ヨーロッパシラカバ（Betula alba L.）、ベツラペンデュラ（Betula pendula Roth、ヨーロッパからモンゴルにかけて分布）、等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。本発明に係わるカバノキ科植物カバノキ属植物の種類は、特に限定されるものではないが、ヨーロッパシラカバ（Betula alba L.）及び／又はシラカバ（Betula platyphylla Sukatchev var.japonica Hara）が好ましい。カバノキ科植物カバノキ属植物の葉、芽、樹皮、樹液等には薬効があり、使用部位についても特に限定されるものではないが、ベチュラトリテルペノイド（ベツリン）、精油成分、タンニン等を含む樹皮が好ましい。
【００１６】
本発明に係わるアカネ科カギカズラ属植物は、アジア、アフリカ、アメリカの熱帯、亜熱帯を中心に３４種類が知られる、木本性のつる植物である。アカネ科カギカズラ属植物としてはカギカズラ（Uncaria rhynchophylla）、トウカギカズラ（Uncaria sinensis）、ガンビールノキ（Uncaria gambir Roxburgh）等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。本発明に係わるアカネ科カギカズラ属植物の種類は、特に限定されるものではないが、ガンビールノキが好ましい。使用部位についても特に限定されるものではないが、アセンヤク（阿仙薬）として知られるガンビールノキ（Uncaria gambir Roxburgh）の葉及び若枝から得られた成分が好ましい。アセンヤクは、従来、収斂性止瀉薬、整腸薬として瀉痢、便血、尿血、血痢など、また口腔清涼剤の原料などにも用いられている生薬で、カテキン、タンニンを豊富含んでいる。
【００１７】
本発明に係わる発酵茶葉は、ツバキ科ツバキ属植物であるチャ（Camellia sinensis (L.) O. Kuntze）を原料に製造される。製造方法等により大きく、不発酵茶（緑茶）、半発酵茶（ウーロン茶、プーアル茶）、発酵茶（紅茶）に分けることができる。本発明で用いる発酵茶としては、いずれも特に限定されるものではないが、ウーロン茶、プーアル茶、紅茶等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。これらの発酵茶のうち、特に好ましいものとしては、紅茶が挙げられる。紅茶には、その発酵過程において、カテキン類が酸化して生成されるテアフラビンが豊富に含まれる。
【００１８】
上記植物及び発酵茶を抽出物として利用する場合、抽出溶媒は特に限定されないが、上記植物及び発酵茶を溶媒、たとえば水、低級アルコール、含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ブタノール等の極性溶媒またはクロロホルム、酢酸エチル、各種エーテル等あるいはこれらの混合物の有機溶媒で抽出して得た抽出物をそのまま、あるいは濃縮して用いるか、抽出物を吸着法、たとえばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したり、ポーラスポリマーのカラムに吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し濃縮した抽出物も使用できる。また、分配法、たとえばブタノールで抽出した抽出物等も使用できる。なお市販品としては、例えば、カバノキ科カバノキ属植物成分としては、丸善製薬社のシラカバ抽出液（ヨーロッパシラカバ樹皮エキス）、やインデナ社のPhytelene of Birch-leaves EN 219（ヨーロッパシラカバ葉エキス）、一丸アルコス社のBitch Extrct（シラカンバ樹皮エキス）等を、アカネ科カギカズラ属植物としては、丸善製薬社のアセンヤク抽出液、Uncaria-Extract（トウカギカズラ）一丸ファルコス社のファルコレックス  アセンヤク、発酵茶葉由来成分としては、丸善製薬社の紅茶抽出液、ウーロン茶抽出液、甜茶抽出液、一丸ファルコス社の紅茶リキッド、池田糖化工業社の紅茶抽出液、紅茶エキスパウダー、ウーロン茶抽出液、ウーロン茶エキスパウダー等があるのでこれを利用してもよく、これらの市販品を前記方法で処理したものを利用することもできる。
【００１９】
上記発酵茶葉には、茶ポリフェノールとして、テアフラビン類が含まれる。具体的には、テアフラビンモノガレートＡ、テアフラビンモノガレートＢ、テアフラビンジガレート、遊離型テアフラビンなどが含まれ、これらを単独もしくは組み合わせて用いることができる。また、上記の茶ポリフェノールは市販品として、商品名：ポリフェノン６０（三井農林株式会社製、茶ポリフェノール含量６０％以上）を利用することができるほか、例えば、特表２００４−５１３１７６号公報に記載の製造方法等により製造することができる。
【００２０】
上記セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤の外用剤への配合量は、用途、剤型、配合目的等によって異なり、特に限定されるものではないが、一般的には、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤の原体として、外用剤中０．００１〜２０．０質量％が好ましく、より好ましくは０．０１〜１０．０質量％である。
【００２１】
本発明の外用剤には上記セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤に対して、更に他の成分と組み合わせることにより、その効果を相乗的に高めることができる。上記セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤と組み合わせて使用される他の成分は、抗酸化剤、細胞賦活剤から選ばれるものであるが、具体的な成分としては、例えば、それぞれ以下に示すものが挙げられる。ここで以下に記載する「誘導体」には形成可能な塩が含まれる。
【００２２】
抗酸化剤としては、ビタミンＥおよびその誘導体（天然ビタミンＥ、ｄｌ−α（β、γ）−トコフェロール、酢酸ｄｌ−α−トコフェリル、ニコチン酸−ｄｌ−α−トコフェリル、リノール酸−ｄｌ−α−トコフェリル、レチノイン酸トコフェリル、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロリル等のトコフェロールおよびその誘導体、トコトリエノール等）、ビタミンＡおよびその誘導体（レチノール、パルミチン酸レチノール、リノール酸レチノール、酢酸レチノール、水添レチノール、レチナールおよびデヒドロレチナール等の誘導体）、カロチノイド（カロチン、リコピン、アスタキサンチン、ルテイン等）、ビタミンＢおよびその誘導体（チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、チアミンリン酸塩、リボフラビン、酢酸リボフラビン、フラビンアデニンジヌクレオチド、塩酸ピリドキシン、ジオクタン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、トリヘキシルデカン酸ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等のニコチン酸類、コリン類等）、ビタミンＣおよびその誘導体（ジパルミチン酸アスコルビルやテトラヘキシルデカ
ン酸アスコルビル等のアスコルビン酸アルキルエステル、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、３−Ｏ−セチルアスコルビン酸等のアスコルビン酸アルキルエーテル等）、ビタミンＤおよびその誘導体（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロキシスタナール等）、ビタミンＫ５、コエンザイムＱ１０、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、ノルジヒドログアヤレチン、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、チオジプロピオン酸ジラウリル、トリルビグアナイド、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム等のエリソルビン酸塩、ハイドロキノンおよびその誘導体、エラグ酸、ＳＯＤ、エルゴチオネイン、グルタチオン、チオタウリン、ヒポタウリン等の還元性基を有するアミノ酸、マンニトールオイゲノール、イソオイゲノール、カテキン、ケルセチン、リグナン、タンニン等のポリフェノール類、ルチンおよびその誘導体、サポニン、イチョウエキス、クスノハコケモモエキス、リンゴエキス、チャエキス、ブドウエキス、チョウジエキス、エイジツエキス、トマトエキス、シソエキス、ニンジンエキス、ハマメリスエキス、メヤシャジツエキス、メリッサエキス、ローズマリーエキス等の植物抽出物、海藻抽出物、あるいは植物油中に含まれる天然型の抗酸化剤又はそれらから誘導される抗酸化剤、例えばフラボノイド類を含む甘草エキス、ゴマ油、ブドウ種子油、棉実油由来のセサミン、エピセサミン等、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００２３】
これらの抗酸化剤のうち、特に好ましいものとしては、ビタミンＥおよびその誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体が挙げられる。
【００２４】
細胞賦活剤としては、前記のビタミンＡおよびその誘導体、前記のカロチノイド、前記のビタミンＢおよびその誘導体、前記のビタミンＣおよびその誘導体、前記のビタミンＥおよびその誘導体、ピロリドンカルボン酸、クエン酸、グリコール酸、酒石酸、乳酸等のα−ヒドロキシ酸、β−乳酸、サリチル酸等のβ−ヒドロキシ酸、α−又はγ−リノレン酸、サイクリックＡＭＰ、トウモロコシ種子エキス、エルゴチオネイン、ヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、イチョウエキス、スギナエキス、ツボクサエキス、ダイズ発酵エキス、トマトエキス、トウキンセンカエキス、ニンジンエキス、ホップエキス、マツエキス、レモンエキス、ローズマリーエキス等の植物抽出物、海藻抽出物、酵母エキス等、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００２５】
これらの細胞賦活剤のうち、特に好ましいものとしては、ビタミンＡおよびその誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体、ビタミンＢおよびその誘導体、クエン酸、リンゴ酸、ピロリドンカルボン酸、酵母エキスが挙げられる。
【００２６】
本発明のセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤と、外用剤への抗酸化剤及び／又は細胞賦活剤の配合比は、その種類により相違するが、一般的には、その配合比が質量基準で１００：１〜１：１００であることが好ましく、１０：１〜１：１０がより好ましい。この範囲であると、より優れたセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害効果が発現し、かつ、優れた肌荒れ予防及び／又は肌荒れ緩和効果、色素沈着予防及び／又は色素沈着緩和効果を発揮することができる。
【００２７】
本発明の外用剤にはＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤とともに、既存のＰＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤、抗炎症剤、肌荒れ予防／改善剤、色素沈着予防／改善剤を配合することができる。これらの成分を併用することは、本効果の相乗効果をもたらし、本効果を損なうものではない。
【００２８】
既存のセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害としては、ｕｃｆ−１０１のようなプロテアーゼ阻害剤や、ＣＲＥＢＬ１（cAMP responsive element binding protein-like １）、ＡＴＦ６（activating transcription factor 6）、ＨＮＦ−４α（hepatocyte nuclear factor 4α）、ＳＨＣ３（src homology 2 domain containing transforming  protein  C3）等が挙げられる。
【００２９】
既存の抗炎症剤としては、ステロイド系抗炎症剤（ヒドロコルチゾンなど)、非ステロイド系抗炎症剤（アスピリンなど）、消炎酵素剤（キモトリプシン）、ε−アミノカプロン酸及びその誘導体、アラントイン、塩化リゾチーム、グアイアズレン、グリチルレチン酸やグリチルリチン酸及びそれらの誘導体、コンドロイチン硫酸及びその誘導体、コンフリー、各種ポリフェノールなど、また、甘草エキス、アルニカエキス、オトギリソウエキス、カモミラエキス、ティーツリーオイル、シコンエキス、シソエキス、シラカバエキス、ソウハクヒエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、ニワトコエキス、モモ葉エキス、ヨモギエキスなどの植物エキス等が挙げられる。
【００３０】
既存の肌荒れ予防／改善剤としては、保湿剤、細胞間脂質及びその類似体、ビタミン類などが挙げられる。保湿剤としては、グリセリン、ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール、トレハロース類、混合異性化糖、プルラン、マルトースなどの糖類、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、エラスチン、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの生態高分子、アミノ酸、乳酸ナトリウム、尿素、ベタイン、カモミラエキスなどの各種植物・海藻エキス等が、細胞間脂質及びその類似体としては、スフィンゴ脂質、セラミド、擬似セラミド、コレステロール及びその誘導体、リン脂質及びそれらの誘導体が、ビタミン類としては、ビタミンＡ群、ビタミンＤ群、ビタミンＥ群、パントテン酸カルシウム、ビオチン、ビタミンＣ群、ニコチン酸アミド、ビタミンＢ６群及びそれらの誘導体が、トラネキサム酸及びその誘導体、カルニチン及びその誘導体などが挙げられる。
【００３１】
既存の色素沈着予防／改善剤としては、前記のビタミンＣ及びその誘導体、アルキルグリセリルエーテル、アルブチン、イオウ、エラグ酸、カモミラエキス、コウジ酸、プラセンタエキス、ルシノール、リノール酸及びリノレン酸およびそれらの誘導体、亜鉛グリシン錯体、ニコチン酸アミド、トラネキサム酸およびその誘導体、ビタミンＥフェルラ酸エステルなどが挙げられる。
【００３２】
本発明の外用剤には、本発明の効果を損なわない範囲で化粧品、医薬部外品等に配合される成分として流動パラフィンなどの炭化水素、植物油脂、ロウ類、合成エステル油、シリコーン系の油相成分、フッ素系の油相成分、高級アルコール類、脂肪酸類、増粘剤、紫外線吸収剤、粉体、顔料、色材、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、多価アルコール、糖、高分子化合物、生理活性成分、経皮吸収促進剤、溶媒、酸化防止剤、香料、防腐剤等を配合することができる。
【００３３】
本発明に係る化粧料の剤型は任意であり、化粧水、ローション、乳液、クリーム、パック、軟膏、分散液、固形物、ムース等の任意の剤型をとることができる。また、用途としては、化粧料の外、皮膚外用剤、医薬用軟膏等に好適に使用できる。
【００３４】
なお、本発明者らはすでに、紫外線照射によるＨｔｒＡ１及びＨｔｒＡ２の炎症性因子に及ぼす作用について、それらの阻害剤であるｕｃｆ−１０１を作成した上で、検討したところ、紫外線によって誘導される炎症性因子群の産生を顕著に抑制することを確認している。つまりＨｔｒＡ１及びＨｔｒＡ２の活性化と表皮組織の炎症惹起の間には関連性があることが示唆されている。（The SID 67th Annual Meeting、poster 032, 2006、The SID 68th Annual Meeting、poster 820, 2007）
従って、本発明に係わるカバノキ科カバノキ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物、発酵茶葉由来成分及び／又はテアフラビン類を有効成分とするセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を利用することで、紫外線誘導インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）及び／又は紫外線誘導プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの炎症性因子産生を抑制することができる。さらに、カバノキ科カバノキ属、アカネ科カギカズラ属に属する植物、発酵茶葉由来成分及び／又はテアフラビン類を有効成分とするセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を含む外用剤は、肌荒れ予防、肌荒れ緩和及び／又は肌荒れ症状改善効果、色素沈着予防、色素沈着緩和及び／又は色素沈着改善効果、しわ形成予防、しわ形成緩和及び／又はしわ改善効果を発揮する。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【００３６】
［実施例１］
ＨｔｒＡ１およびＨｔｒＡ2活性阻害作用を有する植物抽出物のスクリーニング
１．試験の概容
ＨｔｒＡ１1およびＨｔｒＡ１2活性阻害作用を有する植物抽出物をスクリーニングした。
【００３７】
２．実験方法
２−１．蛍光基質（Ｄ−ｃａｓｅｉｎ−ＦＩＴＣ）を用いた活性測定法（一次スクリーニング）
９６ｗｅｌｌプレートに、終濃度７５０ｎｇのＨｔｒＡ１およびＨｔｒＡ２、表１に示す各植物抽出物およびｂｕｆｆｅｒを添加した。氷上にて１０分間インキュベート後、終濃度２．５μｇのＤ−ｃａｓｅｉｎ−ＦＩＴＣを添加し、３７℃にて反応を開始した。反応開始後、５分間隔にて最大３０分後までのＦＩＴＣ蛍光強度変化を蛍光プレートリーダーにて測定した。なお、各植物抽出物のうち、溶液タイプの植物抽出物は、凍結乾燥で得た固形分を用いて評価した。
【００３８】
２−２．電気泳動法を用いた活性測定法（二次スクリーニング）
１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、終濃度５００ｎｇのＨｔｒＡ１及びＨｔｒＡ２、各植物抽出物およびbufferを添加した。氷上にて１０分間インキュベート後、終濃度４μｇのβ−ｃａｓｅｉｎを添加し、３７℃にて反応を開始した。３０分反応後、直ちに氷上にて急冷して反応を停止させた。停止後の反応液に対しＳＤＳサンプルｂｕｆｆｅｒを添加し、１００℃にて５分間ボイルした。反応液全量を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、クマシーブリリアントブルー染色にてβ−ｃａｓｅｉｎの分解程度を分子量比較にて検出した。なお、各植物抽出物のうち、溶液タイプの植物抽出物は、凍結乾燥で得た固形分を用いて評価した。
【００３９】
【表１】
2010143893.tif 000002
【００４０】
３．結果
二次スクリーニングの電気泳動法の結果を図１に示した。ＨｔｒＡ１およびＨｔｒＡ２添加によるβ−ｃａｓｅｉｎの減少およびβ−ｃａｓｅｉｎ分解物の増加が認められたのに対し、紅茶抽出物、アセンヤク抽出物、ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物およびテアフラビン添加によるβ−ｃａｓｅｉｎの分解抑制およびβ−ｃａｓｅｉｎ分解物の生成抑制が認められた。特に、ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物およびテアフラビンではβ−ｃａｓｅｉｎ分解物の生成がほとんど確認されなかったことから、その作用が顕著であることが示された。ウーロン茶エキスについてもわずかながらＨｔｒＡ１およびＨｔｒＡ２添加によるβ−ｃａｓｅｉｎの減少およびβ−ｃａｓｅｉｎ分解物の増加が認められた。
【００４１】
［実施例２］
各植物抽出物の炎症性因子の産生抑制作用
１．試験の概容 
炎症性因子の過剰放出は、シワ形成の要因の一つであることが広く知られている。そこで、ＵＶＢによって産生が増加する代表的な炎症性サイトカインであるＩＬ−１αおよびＰＧＥ２に対する、ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物およびテアフラビンの抑制作用を評価した。
【００４２】
２．実験方法
正常ヒト表皮細胞（クラボウ）はＫＧ２培地（クラボウ）を用いて４８穴マイクロプレートに４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度にて播種した。２４時間培養後、各試験試料を含有するＫＢ２培地（クラボウ）にて２時間培養した。過剰な試験試料をＨａｎｋ‘ｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａ２＋， Ｍｇ２＋無含有；ＨＢＳ（−））にて洗浄した後、再度同ｂｕｆｆｅｒに置換し、東芝ＦＬ−ＳＥランプを光源とするＵＶＢを所定エネルギーにて細胞に照射した。コントロール細胞はアルミ箔にてカバーしＵＶＢを遮蔽した。照射後、再度試験試料を含有するＫＢ２培地に交換し、細胞を２４時間培養した。
【００４３】
培地中に放出されたＩＬ−１αおよびＰＧＥ２は、それぞれHuman IL-1α Quantikine(R) ELISA kit（R&D systems）及びProstaglandine E2 Express EIA kit（Cayman Chemical Company）用いて、添付のプロトコールに準拠して定量を実施した。また、同時に測定したタンパク量によって、ＩＬ−１αおよびＰＧＥ２定量値を除することにより単位タンパク量あたりのＩＬ−１αおよびＰＧＥ２産生量を算出した。
【００４４】
３．結果
結果を表２に示した。紅茶抽出物、アセンヤク抽出物、ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物およびテアフラビン添加による、ＩＬ−１αおよびＰＧＥ２の産生増加抑制が認められた。また、ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物およびテアフラビンによる作用が特に顕著であった。
【００４５】
【表２】
2010143893.tif 000003
【００４６】
［実施例３］
各植物抽出物配合製剤のシワ、荒れ肌改善作用および色素沈着抑制作用
１．試験の概容
特に作用が強かったヨーロッパシラカバ樹皮抽出物およびテアフラビンを配合した製剤のシワ改善作用、荒れ肌改善作用および色素沈着抑制作用を評価した。
【００４７】
２．実験方法
２−１．被験者
各製剤につき、一群健常人男性３０名。
【００４８】
２−２．製剤使用方法および試験期間
各被験者は、プラセボ製剤および各植物抽出物１％を配合した試験製剤を、朝夕１日２回ずつ顔面頬および色素沈着誘導部位に使用した。頬における試験期間は８週間とし、使用前、４週間後および８週間後において各測定を実施した。一方、紫外線による色素沈着誘導部位における試験期間は３週間とし、使用前（色素沈着誘導前）、１週間、２週間および３週間後においてＬ＊値を測定した。
【００４９】
２−３．測定環境
各測定は、室温２１℃±２℃、相対湿度５０〜６０％に保たれた部屋にて実施した。被験者はあらかじめ所定の洗顔料にて洗顔したのちタオルにて水分を払拭し、測定室にて１５分間馴化した後、各測定を実施した。
【００５０】
２−４．レプリカによるシワ解析
レプリカは、ＳＩＬＦＬＯ（White:Davis Healthcare Services社）を用いて右目尻部から採取した。採取したレプリカは所定の方法によって固定平坦化し、斜光投影法によりシワ由来の陰影を抽出した。得られた陰影画像より、画像解析ソフトを用いてシワ面積率を求めた。シワ面積率の変化は０週目を１００%とした相対値で示した。 
【００５１】
２−５．荒れ肌改善作用評価
被験部位の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）はサイクロン水分蒸散計ＡＳ−ＣＴ１（有限会社アサヒバイオメッド）を用いて測定した。ＴＥＷＬの変化は、０週目を１００%とした相対値で示した。
【００５２】
２−６．色素沈着抑制作用評価
上腕内測部に対してソーラーシミュレーター（Multiport Solar UV Simulator Model 601, Solar Light Co., Inc.）を用いて１．５ＭＥＤの紫外線を曝露し、色素沈着を誘導した。色素沈着の色調は測色計（Color Reader CR-13, ミノルタ社）を用いた。色素沈着の程度はＬ＊値を用い、紫外線非照射部位のＬ＊値より紫外線照射部位におけるＬ＊値を引いたΔＬ＊値にて評価した。
【００５３】
３．結果
３−１．シワ改善作用
結果を表３に示した。プラセボ使用群と比較して、シラカバ抽出物およびテアフラビン各１％配合製剤使用群におけるシワ面積率の減少が認められた。
【００５４】
【表３】
2010143893.tif 000004
【００５５】
３−２．荒れ肌改善作用
結果を表４に示した。プラセボ使用群と比較して、シラカバ抽出物およびテアフラビン各１％配合製剤使用群におけるＴＥＷＬの抑制が認められた。
【００５６】
【表４】
2010143893.tif 000005
【００５７】
３−３．色素沈着抑制作用
結果を表５に示した。プラセボ使用群と比較して、シラカバ抽出物およびテアフラビン各１％配合製剤使用群におけるΔL*値の減少が認められた。
【００５８】
【表５】
2010143893.tif 000006
【００５９】
以下に、本発明のセリンプロテアーゼＨｔｒＡ１及び／又はＨｔｒＡ２の活性阻害剤を配合した皮膚外用剤の応用例を示す。配合量は質量％である。実施例４〜１３は、いずれも肌荒れ予防、肌荒れ緩和及び／又は肌荒れ症状改善効果、色素沈着予防、色素沈着緩和及び／又は色素沈着改善効果、しわ形成予防、しわ形成緩和及び／又はしわ改善効果が認められた。
【００６０】
［実施例４］
美容液
質量％
ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物            ０．１
スクワラン                              １．０
べヘニルアルコール                      ４．０
ワセリン                                ３．０
流動パラフィン                        １５．０
モノラウリン酸デカグリセリル            １．０
モノステアリン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン
３．０
キサンタンガム                          ０．１
１，３−ブチレングリコール            １０．０
防腐剤                                  適量
香料                                    適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製法の常法に従い調製した。
【００６１】
［実施例５］
化粧水
質量％
シラカンバ樹皮抽出物                    １．０
アセンヤク抽出物                        １．０
ε−アミノカプロン酸                    ０．１
Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム  
０．１
カモミラエキス                          ０．１
コンドルスクリスプスエキス              ０．１
シソエキス                              ０．１
スクワラン                              ０．２
モノラウリン酸デカグリセリル            ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．２
１，３−ブチレングリコール              ３．０
エチルアルコール                      １０．０
防腐剤                                  適量
香料                                    適量
精製水                                  残部
（調製方法）
全ての成分を５０℃で均一になるまで混合し、調製した。
【００６２】
［実施例６］
クリーム２（エモリエントタイプ）
質量％
紅茶抽出物                              ０．０５
ｕｃｆ−１０１                          ０．０００１
テトラヘキシルデカン酸アスコルビル      １．０
トリヘキシルデカン酸ピリドキシン        ０．５
ｄｌ−α−トコフェロール                ０．２
パルミチン酸レチノール                  ０．１
水添レチノール                          ０．１
スクワラン                            １０．０
ミリスチン酸イソセチル                  ６．０
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル      ３．０
マカデミアナッツ油                      １．０
ジメチルポリシロキサン                  ０．２
セタノール                              ５．０
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル            １．０
テトラオレイン酸ＰＯＥ（４０）ソルビット
０．５
モノステアリン酸グリセリル              １．０
水素添加大豆レシチン                    ０．２
１，３−ブチレングリコール              ５．０
キサンタンガム                          ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．０１
クエン酸                                ０．１
クエン酸ナトリウム                      ０．４
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製造方法の常法に従い調製した。
【００６３】
［実施例７］
美容オイル
（処方）                                  質量％
テアフラビン                            ０．００１
ミリスチン酸イソセチル                １０．０
ホホバ油                                ５．０
ブドウ種子油                            １．０
天然ビタミンＥ                          ０．１
リノール酸レチノール                    ０．１
油溶性甘草エキス                        ０．１
スクワラン                              残部
（調製方法）
全ての成分を５０℃で均一になるまで混合し、調製した。
【００６４】
［実施例８］
スキンローション
（処方）                                  質量％
トリ（カプリル酸・カプリン酸）グリセリル
０．１
ＰＯＰ（４）ＰＯＥ（２０）セチルエーテル
０．６
プロピレングリコール                  １０．０
紅茶抽出物                              ０．５
ウーロン茶抽出物                        ０．５
プーアル茶抽出物                        ０．５
カギカズラ抽出物                        ０．５
グリチルレチン酸ジカリウム              ０．２
ギガルチナステラータエキス              ０．２
ブドウエキス                            ０．００１
エルゴチオネイン                        ０．００１
乳酸、グルコース、クエン酸、リンゴ酸、
チャエキスの混合物                    ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製造方法の常法に従い調製した。
【００６５】
［実施例９］
乳液
（処方）                                  質量％
ｄ−δ−トコフェロール                  ０．１
油溶性トマトエキス（リコピン１％含有）  ０．０１
スクワラン                              ５．０
２−エチルヘキサン酸セチル              ５．０
ジメチルポリシロキサン                  ０．５
パルミチン酸セチル                      ０．５
ベヘニルアルコール                      １．５
ステアリン酸                            ０．５
セラミド２                              ０．１
キミルアルコール                        ０．１
親油型モノステアリン酸グリセリル
１．０
モノステアリン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン
１．０
テトラオレイン酸ＰＯＥ（４０）ソルビタン
１．５
プロピレングリコール                    ７．０
ベツラペンデュラ抽出液                  ５．０
塩酸グルコサミン、海藻エキス、酵母エキス
および尿素の混合物                    ０．３
キサンタンガム                          ０．１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製造方法の常法に従い調製した。
【００６６】
［実施例１０］
クリーム３（油中水型エモリエントタイプ）
（処方）                                  質量％
アセンヤク抽出物                        １．０
ε−アミノカプロン酸セチル              ０．１
亜鉛グリシン錯体                        ０．１
ジメチコンコポリオール                  ０．５
デカメチルシクロペンタシロキサン        ５．０
トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル
１５．０
ミツロウ                                ２．０
ペンタヒドロキシ酸デカグリセリル        ２．０
イソステアリン酸                        １．０
グリセリン                              ４．５
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．０１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
油中水型乳化組成物の乳化法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【００６７】
［実施例１１］
サンスクリーンクリーム
（処方）                                  質量％
ヨーロッパシラカバ葉抽出物              ０．５
ヨーロッパシラカバ樹皮抽出物            ０．５
トウカギカズラ抽出物                    ０．５
流動パラフィン                          ７．０
デカメチルシクロペンタシロキサン        ３．０
セチルアルコール                        ４．０
縮合リシノール酸ヘキサグリセリル        ０．５
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル            １．０
パラメトキシ桂皮酸オクチル              ７．０
酸化チタン                              ３．０
セチル硫酸ナトリウム                    １．０
ステアロイルメチルタウリンナトリウム    ０．３
１，３−ブチレングリコール              ５．０
キサンタンガム                          ０．３
ピロリドンカルボン酸ナトリウム          ０．１
ツボクサエキス                          ０．１
スギナエキス                            ０．１
ローズマリーエキス                      ０．１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
粉体相を油相中に添加した後、油中水型乳化組成物の乳化法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【００６８】
［実施例１２］
外用剤（軟膏製剤）
（処方）                                  質量％
シラカンバ樹皮抽出物                  １０．０
ＰＯＥ（３０）セチルエーテル            ２．０
モノステアリン酸グリセリル            １０．０
流動パラフィン                        １０．０
白色ワセリン                            ５．０
セタノール                              ６．０
プロピレングリコール                  １０．０
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
軟膏組成物の製造方法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【００６９】
［実施例１３］
外用剤（乳剤）
（処方）                                  質量％
ＧＰＩカリウム塩                      １５．０
白色ワセリン                          ４１．０
マイクロクリスタリンワックス            ３．０
ラノリン                              １０．０
モノオレイン酸ソルビタン                ４．７５
モノオレイン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン  ０．２５
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
乳剤組成物の製造方法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】電気泳動法を用いた活性測定法（二次スクリーニング）の結果を示す図である。
【図１】
2010143893.tif 000007