(57)【要約】【課題】スポット単体の位置ばらつきがあるマイクロアレイ基板の測定方法を提供する。【解決手段】スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応して発光する第一の基質を添加するステップと、前記スポットの光を撮影して１次測光画像を生成するステップと、前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成するステップと、前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去するステップと、前記第二の試薬と化学反応して発光する第二の基質を添加するステップと、前記スポットの光を撮影して２次測光画像を生成するステップと、前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定するステップとで構成される。【選択図】図１
2010066146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、
前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応して発光する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、
前記スポットの光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、
前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、
前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、
前記第二の試薬と化学反応して発光する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、
前記スポットの光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、
前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成されるマイクロアレイ測定方法。
【請求項２】
マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、
前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、
前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、
前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、
前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、
前記第二の試薬と化学反応する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、
前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、
前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成されるマイクロアレイ測定方法。
【請求項３】
前記マイクロアレイ基板上には、このマイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出するための基板位置決定用マークが配置されており、
前記１次測光ステップと前記第一の画像解析ステップの間に、前記基板位置決定用マークを用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第一の固定誤り検出ステップと、
前記２次測光ステップと前記第二の画像解析ステップの間に、前記基板位置決定用マークを用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第二の固定誤り検出ステップとを設けた請求項１または２に記載のマイクロアレイ測定方法。
前記
【請求項４】
前記マイクロアレイ基板上には、さらにマイクロアレイ基板の位置ズレを検出するための確認マークが配置されており、
前記第二の固定誤り検出ステップと前記第二の画像解析ステップの間に、前記基板位置決定用マークと前記確認マークを用いて、前記１次測光解析画像と前記２次測光解析画像との間に相対的に生じるズレを補正する画像ズレ補正ステップを設けた請求項３に記載のマイクロアレイ測定方法。
【請求項５】
マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、
前記マイクロアレイ基板上に設けられた基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第一の固定誤り検出ステップと、
前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応して発光する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、
前記スポットの光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、
前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、
前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、
前記基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第二の固定誤り検出ステップと、
前記第二の試薬と化学反応して発光する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、
前記スポットの光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、
前記マイクロアレイ基板上に設けられた確認マーク及び前記基板位置決定用マークを用いて前記１次測光解析画像と前記２次測光画像との間で相対的に生じるズレを補正する画像ズレ補正ステップと、
前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成されるマイクロアレイ測定方法。
【請求項６】
マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、
前記マイクロアレイ基板上に設けられた基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第一の固定誤り検出ステップと、
前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、
前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、
前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、
前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、
前記基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第二の固定誤り検出ステップと、
前記第二の試薬と化学反応する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、
前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、
前記マイクロアレイ基板上に設けられた確認マーク及び前記基板位置決定用マークを用いて前記１次測光解析画像と前記２次測光画像との間で相対的に生じるズレを補正する画像ズレ補正ステップと、
前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成されるマイクロアレイ測定方法。
【請求項７】
前記画像ズレ補正ステップは、
対角に位置する前記確認マークの中心座標同士を直線で結び、
前記直線上の中点位置を算出し、
１次測光解析画像内の前記確認マークの中点位置に対して前記２次測光画像内の前記確認マークの中点位置が一致するように前記２次測光画像を移動させ、
前記中点が一致した位置を基準に、
前記１次測光解析画像内の前記確認マークの中心座標に対して前記２次測光画像内の前記確認マークの中心座標が一致するまで前記２次測光画像を回転移動させることでズレを補正する請求項４から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイ測定方法。
【請求項８】
前記画像ズレ補正ステップは、
前記基板位置決定用マークに隣接する前記確認マークの中心座標を原点座標とし、
前記１次測光解析画像から得られた原点座標に対し、前記２次測光画像から得られた原点座標が一致するように前記２次測光画像を移動させ、
前記原点座標が一致した位置を基準に、前記１次測光解析画像内の原点座標と対角に位置する前記確認マークの中心座標に対して前記２次測光画像内の原点座標と対角に位置する前記確認マークの中心座標位置が一致するまで前記２次測光画像を回転移動させることでズレを補正する請求項４から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スポット単位の位置ばらつきがあるマイクロアレイを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは生体分子の解析に利用されている。その利用は、遺伝子の解析や遺伝子から発現したタンパク質の機能解析など多岐に渡っている。例えば、マイクロアレイを利用した遺伝子解析であれば、個々の細胞、組織あるいは個体での遺伝子の発現の様子を網羅的に解析することが可能である。
【０００３】
マイクロアレイはＤＮＡチップとも呼ばれる。ガラスやシリコン製の１×３インチ大の小基板上に、ナノリットル単位の遺伝子溶液の液滴を高密度に点着させてマイクロメートル単位の微小なスポットを形成することで、ガラスやシリコン製の基板上に遺伝子断片を固定化する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この固定化物を含んだ基板上で、ブロッキング、洗浄、検出反応といった様々な化学反応を行うことで、網羅的な遺伝子解析や発現タンパクの機能解析を行うことが可能となっている。基板上での化学反応は、基板上に反応液を滴下することで行なわれ、検出は、化学反応で発生した発光や化学反応と物理的な力で発生した蛍光をスキャナやＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）カメラで読み取ることで行なわれる。読み取った画像を解析することで目的サンプルの有無や目的サンプル量を発光量から間接的に把握することができる。
【０００５】
ＣＣＤカメラやスキャナで読み取った画像を自動解析するには、基板の位置ずれや、スポット位置のずれを補正する技術が要求される。スポットの位置ずれ補正をするために、基準パターン領域として、試料解析時に、必ず発光するスポットと必ず発光しないスポットを設け、その発光パターンによりスポット位置を決め、補正を行なう方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献２】特開２００３−３０７５１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、マイクロアレイ基板上にスポットを形成する際に、位置決めの精度が十分でなく、スポット単体の位置ばらつきが発生すると、予め定めたスポットの測定範囲と実際のスポット発光領域との間に位置ズレが生じ、正確な発光量の測定が出来ないという課題を有していた。
【０００７】
そこで、本発明は、スポット単体の位置ばらつきによる発光領域の位置ズレが発生しても、正確な発光量の測定を行うことが出来るマイクロアレイ測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そしてこの目的を達成するために、本発明のマイクロアレイ測定方法は、マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応して発光する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、前記スポットの光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、前記第二の試薬と化学反応して発光する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、前記スポットの光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成される事を特徴としたものである。
【０００９】
また本発明のマイクロアレイ測定方法は、マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、前記第二の試薬と化学反応する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成される事を特徴としたものである。
【００１０】
また本発明のマイクロアレイ測定方法は、マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、前記マイクロアレイ基板上に設けられた基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第一の固定誤り検出ステップと、前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応して発光する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、前記スポットの光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、前記基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第二の固定誤り検出ステップと、前記第二の試薬と化学反応して発光する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、前記スポットの光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、前記マイクロアレイ基板上に設けられた確認マーク及び前記基板位置決定用マークを用いて前記１次測光解析画像と前記２次測光画像との間で相対的に生じるズレを補正する画像ズレ補正ステップと、前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成される事を特徴としたものである。
【００１１】
また本発明のマイクロアレイ測定方法は、マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットの発光量を測定するマイクロアレイ測定方法において、前記マイクロアレイ基板上に設けられた基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第一の固定誤り検出ステップと、前記スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応する第一の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第一の基質添加ステップと、前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して１次測光画像を生成する１次測光ステップと、前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成する第一の画像解析ステップと、前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去する検体添加ステップと、前記基板位置決定用マークを透過した光を撮影した画像を用いて前記マイクロアレイ基板の固定位置誤りを検出する第二の固定誤り検出ステップと、前記第二の試薬と化学反応する第二の基質を前記マイクロアレイ基板上に添加する第二の基質添加ステップと、前記スポットに励起光を照射し、前記スポットからの蛍光を撮影して２次測光画像を生成する２次測光ステップと、前記マイクロアレイ基板上に設けられた確認マーク及び前記基板位置決定用マークを用いて前記１次測光解析画像と前記２次測光画像との間で相対的に生じるズレを補正する画像ズレ補正ステップと、前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定する第二の画像解析ステップとで構成される事を特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１２】
以上のように、本発明のマイクロアレイ測定方法によれば、スポットに予め固定された第一の試薬と化学反応して発光する第一の基質を添加するステップと、前記スポットの光を撮影して１次測光画像を生成するステップと、前記１次測光画像から前記スポットの位置を特定した１次測光解析画像を生成するステップと、前記第一の基質を除去した後、前記マイクロアレイ基板上に検体と第二の試薬を添加し結合反応させ、前記スポットに予め固定された抗体と結合しなかった前記検体と前記第二の試薬を除去するステップと、前記第二の試薬と化学反応して発光する第二の基質を添加するステップと、前記スポットの光を撮影して２次測光画像を生成するステップと、前記１次測光解析画像を用いて前記２次測光画像内の前記スポットの位置を特定し、前記スポットの発光量を測定するステップとを行うことにより、スポット単体の位置ばらつきが発生しても、正確な発光量の測定を行なうことが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の検出エリアの位置検出方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
本実施の形態のマイクロアレイ測定方法は、次のような、マイクロアレイ基板上に設けられた複数のスポットにおける、化学反応による発光または蛍光をＣＣＤカメラで撮影し、その発光量から検体の量を測定するものに用いられる。このマイクロアレイ測定方法は、マイクロアレイ基板を固定するステージと、このステージを視野に収めたＣＣＤカメラと、ＣＣＤカメラが撮影した画像を処理する信号処理装置とで構成されるマイクロアレイ測定装置において実現される。
【００１５】
マイクロアレイ基板には、複数のスポットが設けられている。マイクロアレイ基板上の全てのスポットには、第一の基質と化学反応して発光する第一の試薬が均等に固定化されている。加えて、各スポットには、検体と、第二の基質と化学反応して発光する第二の試薬とを固定化するための抗体が固定化されている。ここで、これらの抗体は、複数の検体を測定出来るように、スポットごとに異なる抗体を固定化しても良い。測定の目的に応じて、抗体の種類は自由に変更可能である。このマイクロアレイ基板の作成については、後で詳細に説明する。
【００１６】
ここで、図１を用いて本実施の形態のマイクロアレイ測定方法を説明する。図１は、本実施の形態における、マイクロアレイ測定方法の工程を示すフローチャートである。
【００１７】
まず、ステージに固定されたマイクロアレイ基板に第一の基質を添加する、第一の基質添加ステップを行う（Ｓ１０１）。この第一の基質は、溶液であり、マイクロアレイ基板上の全てのスポットに均等に展開されるように添加される。この第一の基質が展開されると、第一の試薬と化学反応を起こし、各スポットで発光が開始される。
【００１８】
次に、ＣＣＤカメラにてマイクロアレイ基板を撮影する、１次測光ステップを行う（Ｓ１０２）。このＣＣＤカメラは例えばモノクロＣＣＤカメラである。このＣＣＤカメラを所定の時間（例えば１分間）露光し、その間にＣＣＤ素子が受けた光量を積分して各画素の輝度値として出力する。この輝度値を多値で表した画像を１次測光画像とする。
【００１９】
図２（ａ）が、ＣＣＤカメラが出力する１次測光画像である。図２（ａ）において、２０１がスポットである。全てのスポットに均等に第一の試薬を固定化しているため、１次測光画像では、各スポットが均等に発光する。各スポットが発光しているため、スポットに相当するところの輝度値は周囲よりも大きくなる。なお、２０２、２０３は単体で位置ズレが発生したスポットを示している。
【００２０】
次に、この１次測光画像の解析を行い、各スポットの中心座標とスポットの境界を特定する、第一の画像解析ステップを行う（Ｓ１０３）。この結果得られた画像を１次測光解析画像とし、図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）において、２０４が各スポットの中心座標点、２０５が各スポットの境界（スポットサイズ）を表したものである。
【００２１】
次に、検体添加ステップを行う（Ｓ１０４）。このステップでは、まず、マイクロアレイ基板を洗浄して第一の基質を洗い流す。次に各スポットの抗体と反応する検体、及びこの検体と特異吸着する第二の試薬をマイクロアレイ基板上に過剰に添加し、予め各スポットに固定化しておいた抗体とこの検体中の抗原とを抗原抗体反応させて、特異吸着させる。そして抗原抗体反応が完了した後で、マイクロアレイ基板を洗浄して、抗体と反応しきれずに余った抗原と第二の試薬を除去する。
【００２２】
この検体添加ステップは、検体中の成分と固定化物を直接若しくは間接的に反応させる工程、標識物との反応工程や洗浄工程であり、２次測光を生じるための準備工程である。これらの工程は、固定化物が何であるか、検出対象物が何であるか、あるいは、どのような反応方式を用いて光放出をさせるか等の条件で異なってくる。例えば、抗体を固定化する場合でも、既に酵素標識された抗体を固定化するのか、未標識の抗体を固定化するのかで、反応工程が異なるし、抗体の標識物も、蛍光標識、酵素標識やビオチン標識等の標識物の違いでも反応工程は異なる。また、測定方法が、サンドイッチ法なのか、競合法なのかというような違いでも処理が異なる。ここでは、抗体を基板に固定化し、サンドイッチアッセイを行う場合の例を示す。ただし、本反応方式に限定されるものではない。
【００２３】
次に、マイクロアレイ基板に第二の基質を添加する、第二の基質添加ステップを行う（Ｓ１０５）。この時、各スポットに特異吸着した抗原量は、検体によって異なるので、各スポットの発光輝度は違ってくる。なお、ここで添加する第二の基質は、第一の試薬とは化学反応を起こさず、第二の試薬とのみ反応して発光するものである。
【００２４】
次に、ＣＣＤカメラにてマイクロアレイ基板を撮影する、２次測光ステップを行う（Ｓ１０６）。ここでは、１次測光ステップと同様に、所定の時間ＣＣＤカメラを露光し、２次測光画像を生成する。この時、各スポットで発光量が異なり、場合によっては、ほとんど光を発しないスポットも存在する。図２（ｃ）に２次測光画像の模式図を示す。
【００２５】
次に、この２次測光画像の解析を行い、各スポットの発光量を特定する、第二の画像解析ステップを行う（Ｓ１０７）。まず、図２（ｄ）に示すように２次測光画像を、第一の画像解析ステップで得た１次測光解析画像と重ね合わせる。すると、発光量の検出を行うべきスポットの中心座標とスポットの境界が分かる。各スポットにおいて、スポットの境界内の各画素の輝度値を積算して、それを発光量とする。最後に、この発光量を、予め作成しておいた検量線にあてはめ、検体中の成分量を求める。
【００２６】
なお、第一の基質添加ステップと第二の基質添加ステップにおいて、化学反応により蛍光物質を生成する時には、１次測光ステップと２次測光ステップを実行している間、その蛍光物質を励起するための励起光を外部から照射する。
【００２７】
ここで、第一の基質及び第二の基質として利用可能な発光基質を次に示す。ルミノール、イソルミノール、ルシフェリン（ホタルルシフェリン、セレンテラジン、ウミホタルルシフェリン）、ルシゲニン、ロフィン、アクリジニウムエステル、没食子酸、インドール誘導体、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２´−（５´−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ〔３．３．１．１３，７〕ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ２−ｃｈｌｏｒｏ−５−(４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２´−(５´−ｃｈｌｏｒｏ)ｔｒｉｃｙｃｌｏ〔３．３．１．１３，７〕ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３−(２´−Ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ)−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−(３´´−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ)ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（ＡＭＰＰＤ）、ルミジェンＰＰＤ、Ｇａｌａｃｔｏｎ（登録商標）などがある。
【００２８】
また、第一の基質及び第二の基質として利用可能な蛍光基質を次に示す。ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ−４０５、Ａｌｅｘａ−３５０、ＡＭＣＡ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ａｌｅｘａ−４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ−４８８、Ａｌｅｘａ−５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ−５１４、Ａｌｅｘａ−４３０、Ａｌｅｘａ−５１４、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ−５３２、Ａｌｅｘａ−５５５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ−５４６、ＰＥ−Ｒ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ−５６８、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ−５９４、Ａｌｅｘａ−６３３、ＡＰＣ、Ａｌｅｘａ−６４７、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ−６６０、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ−６８０、Ａｌｅｘａ−７００、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ−７５０、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＥｔＢｒ、ＭＤＰＦ、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ、ＳＹＰＲＯ  Ｒｏｓｅ、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ、ＳＹＰＲＯ  Ｔａｎｇｅｒｉｎ、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ４８８、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ３００、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ３６５、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ４８８、ＥＬＦ３９、ＥＬＦ９７、ＤＤＡＯ、Ａｍｐｌｅｘ  Ｇｏｌｄ、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、Ｔｙｒａｍｉｎｅ、ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ   ａｃｉｄ（ＨＰＰＡ）、４−Ｍｅｔｙｌｕｍｂｅｌｌｉｐｈｅｒｙｌ−β―Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、４−Ｍｅｔｙｌｕｍｂｅｌｌｉｐｈｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３−（ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｐｙｒｅｎｅ、ＢＢＴＰ（２´−［２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｙｌ］−６´−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などがある。
【００２９】
なお、添加用の基質２種類と固定化用試薬２種類の選択において、添加された第一の基質及び第二の基質は、固定化された２試薬の内、個々の固定化試薬に対してのみ反応し、相互干渉はしないものを選ぶ必要がある。
【００３０】
ここで、マイクロアレイ基板上に、抗体を固定化してスポットを形成する手順について説明する。図３は、測定用マイクロアレイ基板の作製工程を示した図である。
【００３１】
まず、塗布用の基板３０１を用意する。塗布用の基板３０１としては、ガラス基板やポリスチレンのようなプラスチック基板が利用可能である。また、基板上のアレイ領域３０２に、表面化学処理（シラン化、アミノ化、アルデヒド化、チオール化、エポキシ化、活性エステル化）、金被覆、アルミニウム被覆、ニトロセルロース、フッ化ビニリデン、ポリリシンなどカチオン性ポリマー被覆、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどの親水性ポリマー被覆、光反応性、多孔質化といった処理を施して用いても良い。
【００３２】
次に、発光若しくは蛍光に関与する２試薬を含んだ混合液３０５を調整する。調整した溶液は、穏やかに均一になるまで攪拌した上で塗布を行なう。１次測光に直接関与する試薬３０３及び２次測光に直接関与する試薬として利用できるのは、蛍光タンパク（ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ＰＳ−ＣＦＰ２、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ、ＥｏｓＦＰ、ＰＡ−ＧＦＰ、Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ、ＫＦＰＲｅｄ（活性化後））、ルシフェラーゼ（非分泌型のものとして、ホタル由来、ウミシイタケ由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、イリオモテボタル由来のもの、分泌型のものとして、コペポーダ由来、ウミホタル由来のもの）、アルカリホスファターゼ（ｂｏｖｉｎｅ、ｂｏｖｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ、ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ、ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ、ｒａｂｂｉｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、ｓｈｒｉｍｐ、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ、ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｓｕｓ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属由来）、β―ガラクトシダーゼ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ、ｂｏｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｅｓ、ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、β―グルクロニダーゼ（ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ、ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈｅｌｉｘ  ａｓｐｅｒｓａ、Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ、ｐａｔｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｔａ）、エクオリン、その他の発光や蛍光反応に関与可能なタンパク、蛍光標識したＤＮＡプローブ、発光標識したＤＮＡプローブ、蛍光標識したＲＮＡプローブ、発光標識したＲＮＡプローブが利用できる。２次測光に間接的に関与する試薬としては、抗体、抗原、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、タンパク、ペプチド、有機分子、糖鎖、細胞が利用可能である。
【００３３】
２試薬の内、１試薬は、全てのスポット２０１の塗布状況を特定するための試薬で、１次測光に直接関与する試薬３０３である。もう１試薬は、検体量を測定するための試薬で２次測光に直接若しくは間接的に関与する試薬３０４である。また、１次測光に直接関与する試薬３０３は、１次測光時にどのスポット２０１においても、ほぼ同様の輝度を表示させるために、各スポットにおいて同濃度ずつ塗布されるように調整する。
【００３４】
調整した混合液３０５は、塗布機を用いて基板上に固定化する。塗布方法としては、様々な方法があるが、例えば、混合液を塗布機のピン３０６に溶液を付着させ、付着した混合液３０５を基板表面に押し当てることで混合液３０５を基板のアレイ領域３０２へ塗布を行なう。代表的な塗布方法としては、光リソグラフィ、マイクロスタンプ、メカニカルマイクロスポット、マイクロピペッティング、マイクロディスペンシング、ジェットプリント、エレクトロスプレーデポジション、ナノリソグラフィがある。塗布を行なった試薬は、基板のアレイ領域３０２でマトリクス状に固定化される。固定化されたスポット２０１は、均一に混合した塗布溶液３０５を固定化しているために、２試薬が各スポット中で偏りなく均一に固定化されるので、２試薬それぞれが示す各スポットの発光形状は、同様のものとなる。そのため、１次測光画像の各スポットの解析データを基に２次測光画像の検出エリアを規定することができる。
【００３５】
基板への固定化が完了したら、ブロッキング剤を固定化基板上に添加する。このとき利用可能なブロッキング剤としては、スキムミルク、ＢＳＡ、フィシュゼラチン、レクチン、血清、カゼイン、合成ポリマー、植物成分由来のブロッキング剤などで、これらを組み合わせて利用したり、界面活性剤を混合して利用したりすることができる。ブロッキングを行なうことで、基板上の固定化領域以外で生じる非特異な反応を抑制することができる。
【００３６】
ブロッキングが完了したら、基板上のブロッキング剤を排除する。ブロッキング剤を完全に除去するために、洗浄操作を数回繰り返す。
【００３７】
次に、場合によっては、１次測光に関与するバッファで基板洗浄を１回行なう。この操作を行なうのは、上記洗浄操作と基質を溶解してあるバッファの種類やｐＨが大きく異なる際に行なう。また、この操作は、バッファ交換と言われる操作で、基質を添加した際に、速やかな光放出反応を行なうことが可能となる。このようにして、マイクロアレイ基板が作製される。
【００３８】
以上のように本実施の形態においては、まず、マイクロアレイ基板上の全てのスポットが発光する化学反応を起こさせて、スポットの位置を解析しておき、その後、実際の測定を行うようにしたので、スポット単位で位置ズレが発生していても、測定すべきスポットの範囲を特定することが出来るため、正確に発光量を測定することが可能となる。
【００３９】
なお、第一の画像解析ステップの後で、マイクロアレイ基板に対する、抗体の塗布エラーの検出も可能である。図４は、１次測光画像から判別可能な塗布エラーの例を示した図である。
【００４０】
塗布に成功した場合、１次測光の段階で、エリア４０１内にある全てのスポット２０１が発光する。図４（ａ）のように塗布が成功していれば、全スポット２０１に同濃度の１次測光用の試薬が塗布されていることになるので、どのスポットもほぼ同様の円形で、スポットサイズもほぼ均一なものが得られる。
【００４１】
また、図４（ｂ）は、合否の境界にあたるような塗布の図である。ここには、形状が小さいスポット４０２、位置ズレスポット４０３、楕円化したスポット４０４といった塗布時の形状ばらつきを示した。このようなばらつきを、合格とするか不合格とするかは、予め設定したばらつきの範囲内に収まったスポットかどうかで判断を行なう。範囲の設定内容としては、塗布位置、円の形状、輝度値である。これらの解析パラメータの範囲設定の仕方で、塗布の合否判定を行なうことができる。
【００４２】
図４（ｃ）は、塗布エラーと判断した場合の図である。塗布エラーによるスポット形状としては、形状が小さすぎたスポット４０６、形状が変形しすぎたスポット４０８、形状が大きすぎたスポット４０５、位置がずれすぎたスポット４０７がある。塗布エラーの輝度値としては、形状変化に伴う輝度値の上昇や低下及びソフト上の検知限界を超えた形状変化による識別不能といった問題が発生する。エラースポットの判断基準としては、例えば、スポットサイズの直径が１４〜１６画素に収まり、スポット位置の誤差が１０％以内に収まっていること、というように設定すれば良い。そして、エラースポットと判定されたスポットと、このエラースポットによる影響で正確な発光量の測定が困難であると判断されるスポットは第二の画像解析ステップにおいて、発光量を測定しないようにする。このようにすれば、マイクロアレイ基板におけるスポットの塗布エラーに起因する測定不良を無くすことが可能となる。
【００４３】
（実施の形態２）
本実施の形態においては、マイクロアレイ基板上に、確認マークと基板位置決定用マークとを設け、このマークを用いてマイクロアレイ基板の位置ズレを検出する点が実施の形態１と異なる。
【００４４】
まず、図５を用いて、確認マークと基板位置決定用マークについて説明する。図５は、確認マーク５０１と基板位置決定用マーク５０２の設置位置を示した図である。
【００４５】
確認マーク５０１の設置位置は、図５（ａ）に示したように、アレイ領域３０２の外周部の頂点位置に設ければ良い。確認マーク５０１を各頂点箇所に設置することで、設置数を最小に抑えることができる。また、測定画像中に全ての確認マーク５０１があるようにＣＣＤカメラの視野を調整すれば、１つのスポットも取りこぼし無く、測定出来る。
【００４６】
また、アレイ領域３０２が正方形や長方形のように上下を逆にしたり、左右を反転させたりしても対称な場合は、４つの確認マーク５０１のうちいずれか１つの確認マーク５０１のそばに、基板位置決定用のマーク５０２を設ければ、マイクロアレイ基板の固定向きが間違っていることを判別可能となる。
【００４７】
ここで確認マーク５０１及び基板位置決定用マーク５０２は、第一の基質及び第二の基質と反応することが出来ればよく、それぞれ第一の基質と第二の基質と反応する２種類以上の試薬を混合したものであっても良い。
【００４８】
また、アレイ領域３０２の塗布エリアを広くとるためには、図５（ｂ）に示すように、確認マーク５０１の設置位置をアレイ領域３０２内側の各頂点位置に設ければ良く、その際の基板位置決定用マーク５０２の設置位置は、図５（ａ）と同様に確認マーク５０１に隣接する位置に設ければ良い。
【００４９】
次に、図６を用いて本実施の形態のマイクロアレイ測定方法を説明する。図６は、本実施の形態におけるマイクロアレイ測定方法の工程を示すフローチャートである。図６において、実施の形態１で示した図１と異なるところは、１次測光ステップ（Ｓ１０２）と第一の画像解析ステップ（Ｓ１０３）の間に、第一の固定誤り検出ステップ（Ｓ２０１）を設けた点と、２次測光ステップ（Ｓ１０６）と第二の画像解析ステップ（Ｓ１０７）の間に、第二の固定誤り検出ステップ（Ｓ２０２）と画像ズレ補正ステップ（Ｓ２０３）を設けた点である。その他のステップにおいては、実施の形態１と同じであるので、同じ符号を付して説明を省略する。
【００５０】
まず、第一の固定誤り検出ステップについて説明する。このステップは、マイクロアレイ基板が、上下左右の向きを誤ってステージに固定されているか否かを検出して、向きを誤って固定されていると判定すると、ユーザーにマイクロアレイ基板の固定エラーを通知するものである。
【００５１】
例えば、マイクロアレイ基板上の基板位置決定用マーク５０２が、１次測光画像の左上に存在するように設けられている場合に、１次測光画像内の基板位置決定用マーク５０２が画像の左上以外の位置に検出された場合には、マイクロアレイ基板が向きを誤って固定されていると判定して、ユーザーに通知する。
【００５２】
次に、第二の固定誤り検出ステップについて説明する。このステップは、検体添加ステップ（Ｓ１０４）を、マイクロアレイ基板をステージから取り外して実施した時に必要となる。検体添加ステップを終えて、マイクロアレイ基板を再びステージに固定した際に、固定向きに誤りがあるとユーザーに通知する。具体的方法は第一の固定誤り検出ステップと同じであるので、説明を省略する。
【００５３】
次に、画像ズレ補正ステップについて説明する。このステップでは、確認マーク５０１と基板位置決定用マーク５０２を用いて、１次測光解析画像と２次測光画像の位置ズレを補正する。位置ズレには、上下左右のズレと、回転ズレが考えられるが、上下左右のズレは、１次測光解析画像と２次測光画像のお互いの確認マーク５０１の相対位置を検出して、どちらかの画像をずらすように画像補正を行えば解消出来る為、詳細な説明は省略する。ここでは、回転ズレを補正する２つの形態について、以下に説明する。以下の例では、１次測光画像に対して、２次測光画像が相対的に回転している場合を示している。
【００５４】
１つ目は、中点座標を利用した補正方法である。図７は、中点座標を用いた２次測光画像の基板位置の補正及び検出エリアの決定方法を示した図である。まず、１次測光解析画像７０１及び２次測光画像７０２から確認マーク５０１の中心座標及び基板位置決定用マーク５０２の中心座標を算出する。
【００５５】
次に、基板位置決定用マーク５０２に最も近い確認マーク５０１と対角に位置する確認マーク５０１の中心座標間を直線で結び、直線上の中点座標を算出する。そして、１次測光解析画像中に中点位置７０３ａを記した画像７０３に対し、２次測光画像中に中点位置７０４ａを記した画像７０４を移動させ、中点位置を重ね合わせる。
【００５６】
次に、１次測光解析画像と２次測光画像の中点位置を合致させた画像７０５に対し、中点位置を固定し、この点を中心に、１次測光解析画像の確認マーク５０１の中心座標に対し、２次測光画像の確認マーク５０１の中心座標が合致するように画像を回転移動させることで２次測光画像を補正した２次測光補正画像７０６とする。
【００５７】
そして、第二の画像解析ステップにおいて、位置補正を行なった２次測光補正画像と１次測光解析画像の位置データに基づき２次測光補正画像の検出エリアを規定して、検出エリア内のスポットの測定を行う。
【００５８】
２つ目の補正方法は、原点座標を用いるものである。図８は、原点座標を用いた２次測光画像の基板位置の補正及び検出エリアの決定方法を示した図である。まず、１次測光解析画像８０１及び２次測光画像８０２から確認マーク５０１の中心座標及び基板位置決定用マーク５０２の中心座標を算出する。次に、基板位置決定用マーク５０２に最も近い確認マーク５０１の中心座標を原点座標とする。
【００５９】
次に、１次測光解析画像中に原点位置８０３ａを記した画像８０３に対し、２次測光画像中に原点位置８０４ａを記した画像８０４を移動させ、原点座標位置を重ね合わせる。そして、１次測光解析画像と２次測光画像の原点位置を合致させた画像８０５に対し、原点座標位置を固定し、この点を中心に、１次測光解析画像で取得した確認マーク５０１の中心座標、及び基板位置決定用マーク５０２の中心座標に対し、２次測光画像で取得した確認マーク５０１の中心座標、及び基板位置決定用マーク５０２の中心座標が合致するように画像を回転移動させる。この工程を簡素化するには、原点座標と対角に位置する確認マーク５０１の中心座標通しが一致するまで画像を回転移動させたのでも良い。１次測光解析画像と２次測光画像が完全に重なり合ったところで、基板の位置補正が完了する。
【００６０】
原点位置を基準に基板の位置補正を行なった画像８０６の位置データと１次測光により得られたスポット２０１の位置データに基づき２次測光画像の検出エリアを規定する。
【００６１】
この方法により解析を行なえば、中心座標の一つを原点座標として利用するため、中点座標を用いた解析方法と比べて処理数が簡素化できる。
【００６２】
以上のように本実施の形態においては、マイクロアレイ基板上に設けられたマークを用いてマイクロアレイ基板のステージへの取り付け位置ズレを補正するようにしたので、取り付け位置ズレによる測定不良を防ぐことが可能となる。
【００６３】
なお、本実施の形態における確認マークは、１次及び２次測光時に光を発するスポットを利用した場合であるが、この他にもマイクロアレイ基板自体に透過光を設け、その透過領域を確認マークとして利用することも出来る。この透過領域は本実施の形態に示した確認マーク５０１及び基板位置決定用マーク５０２と同じ形状で、同じ位置に配置する。
【００６４】
図９は、マイクロアレイ基板に光透過領域を設けた場合のマイクロアレイ測定方法の工程を示すフローチャートである。前述の方法と異なるところは、マイクロアレイ基板にＣＣＤカメラの反対側から光を照射し、そのときの透過光を撮影し、マイクロアレイ基板の固定向き誤りを判定する第一の固定誤り検出ステップ（Ｓ３０１）を、第一の基質添加ステップ（Ｓ１０１）の前に行い、同じく透過光を用いてマイクロアレイ基板の固定向き誤りを判定する第二の固定誤り検出ステップ（Ｓ３０２）を、検体添加ステップ（Ｓ１０４）と第二の基質添加ステップ（Ｓ１０５）の間に行うようにした点である。
【００６５】
これらのステップで行うマイクロアレイ基板の向き誤り判定と、画像ズレ補正ステップ（Ｓ３０３）においては、発光するスポットの代わりに透過領域を用いたこと以外の動作は全く同じであるので、詳細な説明を省略する。
【００６６】
なお、本実施の形態においては、ＣＣＤカメラで撮影した画像を補正して位置ズレによる測定不良を無くすようにしたが、マイクロアレイ基板を固定するステージを微調整してＣＣＤカメラに映るアレイ領域の位置ズレを無くすようにしても良い。
【実施例】
【００６７】
１次測光に直接関与する試薬としてＨＲＰを、２次測光に間接的に関与する試薬としてＩｇＥを用いたモデル実験を行った。
【００６８】
基板には、アレイ領域にニトロセルロース処理が行なわれた基板（ＧｅｎＴｅｌ社、ＰＡＴＨ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｌｉｄｅ）を用いた。塗布溶液中には、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ抗体（ヤマサ醤油株式会社）とＨＲＰ (シグマアルドリッチ社)を添加した。ＨＲＰを１次測光用試薬として添加し、ＩｇＥ抗体を２次測光用試薬として添加した。塗布時には、１スポットあたりのＨＲＰ量が１０ｆｍｏｌずつ塗布できるように塗布溶液を調整した。撮影エリア取りこぼし防止用の確認マークの試薬組成もスポットの試薬組成と同様のものとした。また、ＩｇＥ抗体は、各スポットあたり、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１ｆｍｏｌずつ塗布されるようにサンプル調整を行なった。また、コントロールには、ＩｇＥ抗体とＢＳＡを混合したものを固定化したスポットを用意した。ＢＳＡは、ＩｇＥ抗体の低濃度域での構造安定化剤として添加した。調整した混合溶液は、ＭｉｃｒｏＣａｓｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて基板表面へ塗布を行なった。塗布サンプルは、濡らした布を敷いたタッパー中で、２５℃の下、１晩放置し固定化させた。
【００６９】
次に、３％スキムミルクに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものをブロッキング剤としてニトロセルロース基板１０１上に添加した。ブロッキング処理は、振とう機で攪拌しながら、３０分行なった。ブロッキングを行なうことで、固定化領域以外での吸着を抑制することができる。
【００７０】
次に、ブロッキング剤を基板上から除去し、洗浄操作を繰り返し３回行なった後、撮影用のステージに基板を固定した。その後、１次測光用の基質であるルミノール溶液（Ｒｏｃｈｅ社、ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を添加した。ルミノールを添加することで１次発光が発生する。１分間分の発光輝度をＣＣＤカメラで撮影し、１次測光画像とした。
【００７１】
次に、ルミノール溶液を基板上から除去した後、洗浄操作を３回繰り返し、２次抗体として抗ＩｇＥ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社、Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ）を添加した。添加後、２５℃で１時間振とう機で振とうしながら反応させた。２次抗体には、ビオチン化されているものを用いた。
【００７２】
次に、洗浄操作を繰り返し３回行なった後、ルシフェラーゼ（キッコーマン社、Ｉｎｔｅｌｉｔｅ  ＡＢ）を添加した。添加後、２５℃で１時間振とう機上で振とうしながら反応させた。ルシフェラーゼは、ストレプトアビジン化されているものを用いた。
【００７３】
次に、未反応物を取り除くために、洗浄操作を繰り返し３回行なった。その後、２次測光用の基質溶液と同じ組成で基質だけ除いた溶液でバッファ交換を１回行なった。
【００７４】
その後、撮影用のステージに基板を固定した後、２次測光用の基質溶液として、ルシフェリン溶液（キッコーマン社、Ｉｎｔｅｌｉｔｅ  ＡＢ）を添加した。ルシフェリンを添加することで２次発光が発生する。５分間分の発光輝度をＣＣＤカメラで撮影し、２次測光画像とした。
【００７５】
図１０は、上述したＨＲＰとＩｇＥを用いたモデル実験の１次測光画像及び２次測光画像である。図１０（ａ）は、ＨＲＰとＩｇＥをモデル実験に用いた１次測光画像１００１であり、図１０（ｂ）は、ＨＲＰとＩｇＥをモデル実験に用いた２次測光画像１００２である。ここで、サンプル１００３の列がＩｇＥを０．３ｆｍｏｌ、サンプル１００４の列がＩｇＥを０．１ｆｍｏｌ、サンプル１００５の列がＩｇＥを０．０３ｆｍｏｌ、サンプル１００６の列がＩｇＥを０．０１ｆｍｏｌ、サンプル１００７の列がＩｇＥを０．００３ｆｍｏｌ、サンプル１００８の列がＩｇＥを０．００１ｆｍｏｌ塗布したものである。
【００７６】
まず、１次測光画像１００１から、確認マーク１００９、基板位置決定用マーク１０１０及び各スポットの中心座標及びスポットサイズを求めた。次に、基板位置決定用マーク１０１０の隣に位置する確認マーク１００９と対角に位置する確認マーク１０１１を直線で結び中点座標を求めた。
【００７７】
次に、２次測光画像１００２の確認マーク１０１２及び基板位置決定用マーク１０１３の中心座標を求めた。次に、基板位置決定用マーク１０１３の隣に位置する確認マーク１０１２と対角に位置する確認マーク１０１４を直線で結び中点座標を求めた。その後、２次測光画像１００２の中心座標データを１次測光画像１００１の中心座標データに合致するところまで移動させた。次に、中点位置を固定し、中点位置を中心に、確認マーク及び基板位置決定用の確認マークの位置が合致するところまで２次測光画像１００２を回転移動させた。１００１と１００２が完全に合致したところで、１次測光画像１００１のスポットの解析データを基に２次測光画像１００２のスポットの解析位置を決めた。
【００７８】
このようにして得られた解析位置から求めた測定結果（以下、本測定法結果と称す。）を、２次測光画像のみを用いて、各スポット位置を目視で特定してその輝度値を求めた結果（以下、手動法結果と称す。）、および、背景技術に記載した技術において、２次測光画像のみを用いて、各スポットが確認マークを基準として定位置にあるとみなして、この定位置の輝度情報を、各スポットの輝度値として求めた結果（以下、従来法結果と称す。）と比較した。
【００７９】
図１１（ａ）は、上述したＨＲＰとＩｇＥを用いたモデル実験の測定結果を示した図である。この中で、菱形が本測定法結果、四角が手動法結果、三角が従来法結果を示している。横軸は固定化したＩｇＥの濃度、縦軸は各スポットの輝度値を積算した発光量を示している。図１１（ａ）に示したように、本測定法結果は、従来法結果と比べて、手動法結果に近い特性を得ることが出来た。これを回帰法の決定係数Ｒ２で比較すると、本測定法結果はＲ２＝０．９９１５、従来法結果はＲ２＝０．９７８４、手動法結果はＲ２＝０．９９２７であった。このことからも、本発明のマイクロアレイ測定方法が従来法に比較して有用なことが分かる。
【００８０】
さらに、図１１（ｂ）は、上述したＨＲＰの代わりにＡＬＰを用いたモデル実験の測定結果を示した図である。ＩｇＥ抗体とＡＬＰを用いたモデル実験は、上述したものと同じ手順で行い、異なる箇所は、ＨＲＰをＡＬＰに置き換え、１次測光用の基質反応で用いるルミノールをルミジェンＰＰＤ（和光純薬工業株式会社、Ｌｕｍｉ−ＰｈｏｓＰｌｕｓ）に置き換えたことである。図１１（ｂ）において、横軸と縦軸は図１１（ａ）と同じであり、菱形が本測定法結果、四角が手動法結果を示すものである。この時、回帰法の決定係数Ｒ２で確認すると、本測定法結果はＲ２＝０．９７７９、手動法結果はＲ２＝０．９６８８であった。
【００８１】
このことから、ＡＬＰを用いてもＨＲＰと同様の結果が得られることが分かり、ＨＲＰとＡＬＰ以外の酵素であっても、酵素活性を失うことなく基板上に固定化可能な酵素であれば、同様の結果が得られるものと推察される。
【００８２】
さらに図１２は、上述したモデル実験において、ＢＳＡを添加したものと、ＢＳＡを添加せずＨＲＰのみを添加した場合の測定結果を示すものである。横軸と縦軸は図１１（ａ）と同じであり、菱形がＢＳＡを添加したもの、四角がＢＳＡを添加しなかったものである。ここで、四角の測定結果は、図１１（ａ）に示した本測定法結果と同じである。菱形は、目視でスポット位置を確認した手動法結果である。このとき、菱形の決定係数Ｒ２＝０．９８２３であったことから、ＢＳＡの代わりにＨＲＰを用いた場合においても、良好な結果を示すことが証明された。
【００８３】
これにより、従来はＩｇＥの低濃度域では、塗布溶液調整時にサンプルチューブ表面にＩｇＥが吸着されるのを防止するためにＢＳＡが必要であったが、本発明のようにＢＳＡの代わりにＨＲＰを加えることでもＩｇＥの低濃度域での吸着を防止出来ていることが判明した。これはＡＬＰなど疎水基を持つアミノ酸が結合した高分子であれば同様の効果が得られると推察される。
【００８４】
図１３は、上述したモデル実験の画像を示したもので、図１３（ａ）が１次測光画像、図１３（ｂ）が２次測光画像である。ここでスポット１３０１、スポット１３０２、スポット１３０３は、縦方向（図面の上下方向）にずれたスポットを表している。これらのスポットの発光量の相対比を示したものが、図１４である。
【００８５】
図１４は、手動法結果の発光量を１００％の基準として、それに対する本測定法結果の発光量と従来法結果の発光量の比を示している。図１４において、横線棒グラフが本測定法結果、斜線棒グラフが従来法結果を示している。図１４から、本測定法結果は、ずれたスポットに対して、いずれも手動法結果に対する比が±１０％以内の発光量を測定出来ており、ずれたスポットに対して適切な範囲で輝度値を測定していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明にかかるマイクロアレイの測定方法は、マイクロアレイ基板上でスポット単位で位置ズレが発生しても、スポットの位置を特定して測定を行うことが出来るので、一度に多検体を測定する装置や顕微鏡等における測定方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】実施の形態１におけるマイクロアレイ測定方法の工程を示すフローチャート
【図２】スポット位置を特定する画像の例を示す図
【図３】マイクロアレイ基板作成の概要を示す図
【図４】塗布エラー判定の例を示す図
【図５】確認マーク及び基板位置決定マークの配置例を示す図
【図６】実施の形態２におけるマイクロアレイ測定方法の工程を示すフローチャート
【図７】位置ズレを補正する手順を示す図
【図８】位置ズレを補正する別形態の手順を示す図
【図９】実施の形態２におけるマイクロアレイ測定方法の別形態の工程を示すフローチャート
【図１０】モデル実験で得た１次測光及び２次測光画像を示す図
【図１１】モデル実験の測定結果を示す図
【図１２】ＢＳＡの有無を比較した測定結果を示す図
【図１３】モデル実験で得た画像を示す図
【図１４】測定精度の比較を示す図
【符号の説明】
【００８８】
Ｓ１０１  第一の基質添加ステップ
Ｓ１０２  １次測光ステップ
Ｓ１０３  第一の画像解析ステップ
Ｓ１０４  検体添加ステップ
Ｓ１０５  第二の基質添加ステップ
Ｓ１０６  ２次測光ステップ
Ｓ１０７  第二の画像解析ステップ
Ｓ２０１、Ｓ３０１  第一の固定誤り検出ステップ
Ｓ２０２、Ｓ３０２  第二の固定誤り検出ステップ
Ｓ２０３、Ｓ３０３  画像ズレ補正ステップ
２０１  スポット
５０１  確認マーク
５０２  基板位置決定用マーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１０】
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【図１３】
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