(57)【要約】【課題】酵素を用いて２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を立体選択的に製造する。【解決手段】ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いることによる、２−メチル−１，３−プロパンジオールからの（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の立体選択的な製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、２−メチル−１，３−プロパンジオールからの（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法。
【請求項２】
上記ジオールオキシドレダクターゼがラクトアルデヒドレダクターゼであり、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼがラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法。
【請求項３】
上記ラクトアルデヒドレダクターゼが、配列番号２もしくは３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、上記ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載の（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸への酸化反応を触媒するジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼと、それら酵素を用いた（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸は、医薬中間体として有用な化合物であることが知られている。（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸は、１つの不斉炭素をもち、立体異性体を有することから、化学的な純度だけでなく、立体化学的な純度（光学純度）も高い（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸が求められている。
【０００３】
従来、（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法として、イソ酪酸を原料に微生物を用いて生成する方法が知られている。非特許文献１では、（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する酵母としてキャンディダ  ルゴーサ  ＩＦＯ  ０７５０（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ  ＩＦＯ  ０７５０）が見出されたが、その光学純度は９３．３％ｅｅと十分なものではなかった。さらに、非特許文献２では、キャンディダ  ルゴーサ  ＩＦＯ  ０７５０を親株として誘導された変異株ＭＭＥ  １０２７が高い立体選択性を有することが示されたが、その生産速度は１．１ｇ／ｌ／時間と工業生産において十分に高いと言えるものではなかった。
【０００４】
一方、２−メチル−１，３−プロパンジオールを原料に微生物を用いて生成する方法も知られている。非特許文献３では、微生物としてグルコノバクター  ロゼウス  ＩＡＭ  １８４１（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ  ＩＡＭ  １８４１）が見出されたが、その光学純度は８３％ｅｅと高いものではなかった。さらに、非特許文献４では、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アセトバクター）属細菌を用いた方法が開示されており、２時間以内に５ｇ／ｌと２．５ｇ／ｌ／時間以上の高い生産速度が示されているものの、生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の光学純度は９７％ｅｅであり、その立体選択性は未だ満足できるものではないという問題点が残っていた。
【０００５】
また、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する微生物については報告されているものの、その酸化反応を立体選択的に触媒する酵素についてはこれまで知られていなかった。
【０００６】
ジオールから光学活性ヒドロキシカルボン酸への酸化反応を触媒する酵素としてはラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが知られている（特許文献１）。しかしながら、これら酵素が２−メチル−１，３−プロパンジオールから３−ヒドロキシイソ酪酸への酸化反応を触媒するか、仮に触媒したとしても、Ｒ体を立体選択的に合成するか否かは全く不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１０６００５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９８１，Ｖｏｌ．５９，２０３−２０８
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，Ｖｏｌ．６９，７５−７９
【非特許文献３】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８２，Ｖｏｌ．４７，２４００−２４０４
【非特許文献４】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ２００３，Ｖｏｌ．１４，２０４１−２０４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のとおり、微生物を用いて２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を製造する従来法については、その立体選択性は未だ満足できるものではなく、その酸化反応を立体選択的に触媒する酵素についても全く知られていない。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸への酸化反応を触媒する酵素を見出し、該酵素を用いて（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を立体選択的に製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記に鑑み、様々な酸化反応を触媒する酵素を対象に、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸への合成活性を評価した結果、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸への酸化反応を触媒する酵素活性を有することを見出した。そして、それら酵素を用いて（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を立体選択的に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の〔１〕から〔３〕に記載のとおりである。
〔１〕ジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、２−メチル−１，３−プロパンジオールからの（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法。
〔２〕上記ジオールオキシドレダクターゼがラクトアルデヒドレダクターゼであり、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼがラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法。
〔３〕上記ラクトアルデヒドレダクターゼが、配列番号２もしくは３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、上記ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載の（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を立体選択的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各種形質転換体の可溶性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＤＨ５α／ｐＲｅｄの可溶性画分、レーン３はＤＨ５α／ｐＤｅｈの可溶性画分である。
【図２】各種精製酵素液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す。レーン１は組換えラクトアルデヒドレダクターゼ、レーン２は組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、レーン３は分子量マーカーである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明において、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシ
イソ酪酸への酸化反応を触媒するジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、２−メチル−１，３−プロパンジオールを反応基質として３−ヒドロキシ−２−メチルプロパナールを生成し得るジオールオキシドレダクターゼ、および３−ヒドロキシ−２−メチルプロパナールを反応基質として（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を生成し得るアルデヒドデヒドロゲナーゼであれば特に制限はなく、それらのような酵素全てを指す。例えば、ジオールオキシドレダクターゼとしてラクトアルデヒドレダクターゼが挙げられる。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼとしてラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００１５】
この明細書において、（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の合成もしくは製造において「立体選択的」とは、目的物である（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の光学純度が９７％ｅｅ以上であることをいうが、望ましくは９８％ｅｅ以上であり、９９％ｅｅ以上であると最も望ましい。
【００１６】
本発明におけるラクトアルデヒドレダクターゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．７７に分類され、１，２−プロパンジオールから、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でラクトアルデヒドを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。また、ラクトアルデヒドレダクターゼはＬ−１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼと呼ばれることもある。
【００１７】
本発明において使用されるラクトアルデヒドレダクターゼは、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属細菌、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、もしくはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属細菌由来のものが好ましく用いられる。
【００１８】
本発明におけるラクトアルデヒドレダクターゼは、配列番号２もしくは３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、配列番号２もしくは３で示されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。
【００１９】
この明細書において、「複数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜３０個、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜１０個である。
【００２０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０）由来Ｌ−１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＢＡＥ７６８７１）であり、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＣ末端に６個のヒスチジン残基が付加された配列を有する。
【００２１】
本発明におけるラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２２に分類され、ラクトアルデヒドから、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で乳酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指し、且つ国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２１に分類され、グリコールアルデヒドから、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でグリコール酸を生成する反応を触媒する酵素グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼの総称も併せて指すものである。なぜならば大腸菌を用いた先行文献で、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは同一の酵素であることが報告されているからである
。(Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，Ｖｏｌ．２５８，７７８８−７７９２)。
【００２２】
本発明において使用されるラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、もしくはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属細菌由来のものが好ましく用いられる。
【００２３】
本発明におけるラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５もしくは６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、配列番号５もしくは６で示されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。
【００２４】
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０）由来ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＢＡＡ１５０３２）であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＮ末端に６個のヒスチジン残基が付加された配列を有する。
【００２５】
本発明に係るラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、それぞれの酵素を産生する生物から取得することができる。それぞれの酵素を産生する生物として、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０）を例に挙げることができる。
【００２６】
また、ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して、それぞれの酵素を発現させ、単離してもよい。この方法によれば、ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを簡便かつ効率的に取得することができる。さらに、精製をより簡便にするために、それぞれのタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に６から１０個のヒスチジン残基を付加することができる。
【００２７】
形質転換体に使用するラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、ベクターに組込まれた組換えＤＮＡとして用いることができる。
【００２８】
本発明におけるラクトアルデヒドレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。また、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２−メチル−１，３−プロパンジオールから３−ヒドロキシ−２−メチルプロパナールへの酸化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２９】
本発明におけるラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。また、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−２−メチルプロパナールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸への酸化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ、すなわち５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに望ましくは８０％以上、最も望ましくは９０％
以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００３１】
より具体的には、このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いる条件を例示できる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行なうことができ、市販のシステムとしては、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅシステム（アマルシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行なうことができる。試験すべきＤＮＡ又はＲＮＡを転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、全容量の１／２０量のキット添付のブロッキング試薬及び５×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬は例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｏｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドン）であり、これを１／２０に希釈して使用することができる。ハイブリダイゼーションの温度は４０℃以上８０℃以下、より好ましくは５０℃以上７０℃以下の範囲であり、数時間から一昼夜のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、さらに好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡをプローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００３２】
形質転換体に使用する宿主生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよい。宿主生物の例として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではなく、エシェリヒア属細菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属細菌、シュードモナス属細菌などの細菌類、サッカロミセス属、ピキア属、キャンディダ属などの酵母類、アスペルギルス属などの糸状菌類などが使用できる。
【００３３】
宿主生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば宿主細胞が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。このようにして得られた形質転換体は、培養されることにより、多量のラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを安定に生産することができる。
【００３４】
ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを保有する組換えＤＮＡは、形質転換体から取り出すことができ、他の微生物に移入させることも可能である。また、ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを保有する組換えＤＮＡを、ＰＣＲを用いてそれら酵素をコードするＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素等で処理した後、他のベクターＤＮＡ断片と結合させ、宿主生物に移入することも容易に実施できる。
【００３５】
培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養又は流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
【００３６】
培養条件は、培地の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。例えば、好気もしくは微好気条件下でｐＨは６以上８以下、温度は２５℃以上４０℃以下の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養した場合、培養に必要な時間は４８時間以内である。
【００３７】
形質転換体が産生したラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、培養物中の形質転換体を含む培養液をそのまま採取して利用することもできる。また、ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが培養液中に存在する場合は、濾過、 遠心分離などにより、それぞれの酵素を含む溶液と形質転換体とを分離することもできる。ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが形質転換体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過又は遠心分離などの手段により形質転換体を採取して利用することもできる。また、採取した形質転換体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び又は界面活性剤を添加してラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを可溶化し、溶液として分離採取することができる。
【００３８】
このようにして得られたラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム若しくは硫酸ナトリウムなどの塩析処理、又は親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール若しくはアセトンなどによる分別沈澱法により沈澱させることができる。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤若しくはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを得ることができる。また、ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのＮ末端もしくはＣ末端に６から１０個のヒスチジン残基が付加されている場合は、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行うこともできる。
【００３９】
本発明における（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法は、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を合成する工程を含む製造方法である。
【００４０】
ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性の酵素である。（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造において、ラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生する生物を用いる場合は、その生物が産生している酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用することができる。精製したラクトアルデヒドレダクターゼもしくはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる場合は、反応液に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを添加することができる。
【００４１】
反応条件は特別の制限は無いが、ｐＨと温度を適切に制御しながら反応することが好ましい。例えば、ｐＨは７以上１１以下、望ましくは、８以上１０以下とする。また、温度は４℃以上６０℃以下の範囲内とし、反応は振盪、攪拌または静置条件下で行うことができる。
【００４２】
反応液の媒体としては、水、水性媒体、有機溶媒又は水もしくは水性媒体と有機溶媒と
の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよい。
【００４３】
反応液からの（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の分離精製法は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【実施例】
【００４４】
（分析条件）
（Ｒ）−および（Ｓ）−３−ヒドロキシイソ酪酸は高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は次の通りである。
カラム；ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−６１００  （５μｍ）  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（住化分析センター社製）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；２ｍｍｏｌ／ｌ  硫酸銅
検出；ＵＶ２５４ｎｍ
【００４５】
（参考例１）
（Ｒ）−および（Ｓ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の調製
（Ｒ）−および（Ｓ）−３−ヒドロキシイソ酪酸は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，Ｖｏｌ．２６３，３２７−３３１に記載の方法に従い調製した。原料に用いた（Ｒ）−および（Ｓ）−３−ヒドロキシイソ酪酸メチルは、東京化成工業社から購入した。
【００４６】
調製した（Ｒ）−および（Ｓ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を高速液体クロマトグラフィーの標品として用いて、酵素反応により生成した３−ヒドロキシイソ酪酸の光学純度を算出した。
【００４７】
（実施例１）
ラクトアルデヒドレダクターゼ発現プラスミドの構築
Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているラクトアルデヒドレダクターゼ遺伝子（ｆｕｃＯ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＰ００９０４８）の塩基配列を参考に、オリゴヌクレオチドプライマー  ５’−ａｇｔｇａａｔｔｃｇｔａａａｇｇａｔａａａａｃａａｔｇａｔｇｇｃｔａａｃａｇａａｔｇａｔｔｃｔｇａａｃｇ−３’（配列番号７）、および５’−ｇｔｃｇｇａｔｃｃｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｃｃａｇｇｃｇｇｔａｔｇｇｔａａａｇｃｔｃｔａｃ−３’（配列番号８）を合成した。各プライマーを用いてエシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行い、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は、ｆｕｃＯ遺伝子の塩基配列を含み、その５’末端および３’末端にそれぞれ配列番号７および８に記載のオリゴムクレオチドプライマー由来の塩基配列が付加されている。得られたＤＮＡ断片およびプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡績社製）を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（Ａｍ）１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性でかつ白色コロニーとなった形質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。このプラスミドをｐＲｅｄと命名した。
【００４８】
ｐＲｅｄを用いて形質転換した大腸菌を培養することで、ラクトアルデヒドレダクターゼのＣ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基が付加された組換えラクトアルデヒドレダクターゼを生産することができる。
【００４９】
なお、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【００５０】
（実施例２）
ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ発現プラスミドの構築
Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｌｄＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＰ００９０４８）の塩基配列を参考に、オリゴヌクレオチドプライマー  ５’−ｇｇａａｔｔｃａｃａａａａａｇｇａｔａａａａｃａａｔｇｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｔｃａｇｔａｃｃｃｇｔｔｃａａｃａｔｃ−３’（配列番号９）、および５’−ｔｃｔａａｇｃｔｔｔｔａａｇａｃｔｇｔａａａｔａａａｃ−３’（配列番号１０）を合成した。各プライマーを用いてエシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は、ａｌｄＡ遺伝子の塩基配列を含み、その５’末端および３’末端にそれぞれ配列番号９および１０に記載のオリゴムクレオチドプライマー由来の塩基配列が付加されている。得られたＤＮＡ断片およびプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイを用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体を、Ａｍ１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性でかつ白色コロニーとなった形質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。このプラスミドをｐＤｅｈと命名した。
【００５１】
ｐＤｅｈを用いて形質転換した大腸菌を培養することで、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基が付加された組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを生産することができる。
【００５２】
（実施例３）
形質転換体の作製及び発現
ｐＲｅｄおよびｐＤｅｈを用いてエシェリヒア・コリ  ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれＤＨ５α／ｐＲｅｄおよびＤＨ５α／ｐＤｅｈと命名した。
【００５３】
ＤＨ５α／ｐＲｅｄを５００ｍｌの三角フラスコ中のＡｍ１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８０ｍｌに接種し、３０℃にてＯＤ（６６０ｎｍ）が０．５になるまで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド）が１ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、さらに２０時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた菌体を１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。
【００５４】
ＤＨ５α／ｐＤｅｈをバッフル付き５００ｍｌの三角フラスコ中のＡｍ１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８０ｍｌに接種し、３０℃にてＯＤ（６６０ｎｍ）が０．５になるまで振盪培養した後、ＩＰＴＧが１ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、さらに１６時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた菌体を１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。
【００５５】
（実施例４）
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現の確認
実施例３で作製した２種の形質転換体の懸濁液１．０ｍｌをそれぞれバイオラピュター（オリンパス社製）を用いて、氷水中で５分間破砕した。得られた形質転換体の処理物を遠心分離し、得た上清を可溶性画分とした。図１に、それぞれの可溶性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す。レーン１は、分子量マーカーを電気泳動したものである。レーン２および３は、それぞれＤＨ５α／ｐＲｅｄおよびＤＨ５α／ｐＤｅｈの可溶性画分を電気泳動したものである。レーン２では、組換えラクトアルデヒドレダクターゼのバンドが分子量マーカーの３９ｋＤａと５１ｋＤａとの間の位置に
検出された。また、レーン３では、組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのバンドが分子量マーカーの５１ｋＤａの位置付近に検出された。
【００５６】
（実施例５）
組換え酵素の精製
上記の組換えラクトアルデヒドレダクターゼおよび組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、それぞれＣ末端およびＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基が付加されていることから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。
【００５７】
〔１〕組換えラクトアルデヒドレダクターゼの精製
実施例３と同様の方法で得たＤＨ５α／ｐＲｅｄの菌体を１ｍｌの緩衝液１（５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウム、３００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ８．０）で懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器機社製）を用いて０℃で３分３０秒間破砕した。破砕液を遠心分離し、得た０．６ｍｌの上清を緩衝液１で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供し、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に組換えラクトアルデヒドレダクターゼを吸着させた。次に、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムに０．６ｍｌの緩衝液２（５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウム、３００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、３０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ８．０）を注ぎ、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を洗浄した。洗浄操作は４回繰り返した。さらに、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムに０．５ｍｌの緩衝液３（５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウム、３００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、２５０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ８．０）を注ぎ、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、組換えラクトアルデヒドレダクターゼを溶出させた。溶出操作は５回繰り返した。得られた２．５ｍｌの溶出液をＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて脱塩した。脱塩の際の溶出液にはＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．８）を用い、溶出液３．５ｍｌを得た。この溶出液を組換えラクトアルデヒドレダクターゼの精製酵素液とした。
【００５８】
〔２〕組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製
実施例３と同様の方法で得たＤＨ５α／ｐＤｅｈの菌体を１ｍｌの緩衝液４（５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウム、３００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ８．０）で懸濁し、マルチビーズショッカーを用いて０℃で３分３０秒間破砕した。破砕液を遠心分離し、得た０．６ｍｌの上清を緩衝液４で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスピンカラムに供し、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを吸着させた。次に、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムに０．６ｍｌの緩衝液１を注ぎ、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を洗浄した。洗浄操作は４回繰り返した。さらに、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムに０．５ｍｌの緩衝液５（５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウム、３００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、４００ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ８．０）を注ぎ、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼを溶出させた。溶出操作は５回繰り返した。得られた２．５ｍｌの溶出液をＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩した。脱塩の際の溶出液にはＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．８）を用い、溶出液３．５ｍｌを得た。この溶出液を組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製酵素液とした。
【００５９】
図２に、組換えラクトアルデヒドレダクターゼおよび組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製酵素液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す。分析の結果、それぞれの精製酵素液はほぼ単一バンドであった。
【００６０】
（実施例６）
（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法
反応液（１．０ｍｌ）は、３００ｍｍｏｌ／ｌの２−メチル−１，３−プロパンジオール（純正化学社製）、５０ｍｍｏｌ／ｌのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／ｌの酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＳＩＧＭＡ社製）ならびに実施例５と同様の方法で調製した組換えラクトアルデヒドレダクターゼおよび組換えラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製酵素液０．２ｍｌを含み、２５℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を２ｍｏｌ／ｌの塩酸でｐＨ２以下に調整し、１．０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行い、これを減圧蒸留することにより（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を得た。この（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を０．４ｍｌの５０ｍｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、上記（分析条件）で分析した結果、（Ｓ）−３−ヒドロキシイソ酪酸は検出限界以下であり、（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸の光学純度は９９％ｅｅ以上であった。
【００６１】
以上のように、本発明によれば、２−メチル−１，３−プロパンジオールから（Ｒ）−３−ヒドロキシイソ酪酸を立体選択的に製造することができる。
【００６２】
以上、本発明の構成について説明したが、本発明はこれに限られず様々な様態を含む。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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