(57)【要約】      （修正有）【課題】増殖、分化及びアポトーシスの経路に関わる新規タンパク質の提供。【解決手段】トランスフォーミング増殖因子β−９と称され、以後Ｚｔｇｆβ−９と言及する、新規の抗ウイルスポリペプチド、並びに関連組成物。更に、この新規の哺乳類Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに抗体及び抗イディオタイプ抗体を含む組成物、及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドであるアフィニティータグを含むキメラポリペプチド、及び該キメラポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２，３，４，５，９，１２，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１及び２２から成る群から選択される１又は複数のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、アミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記のポリヌクレオチドが、配列番号２，３，４，５，９，１２，１７及び１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離したポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２，３，４，５，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１及び２２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離したポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２，３，４及び５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする、請求項３に記載の単離したポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１及び９から成る群から選択される、請求項１に記載の単離したポリヌクレオチド。
【請求項６】
アミノ酸配列が、配列番号２，３，４，５，９，１２，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１及び２２から成る群から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一である、アミノ酸配列を含んで成る単離したポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２，３，４，５，９，１２，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１及び２２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んで成る、請求項６に記載の単離したポリペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列が、配列番号２，３，４，５，９及び１２から成る群から選択される、請求項６に記載の単離したポリペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列が、配列番号２，３，４及び５から成る群から選択される、請求項６に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２，３，４，５，９，１２，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１及び２２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
請求項１２に記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
最終分化及びアポトーシス性のプログラムされた細胞死に対する細胞増殖の過程の適当な調節は、正常な発生及びホメオスタシスの重要な観点であり（Raff, M.C., Cell, 86 : 173-175 (1996))、そして多くのヒトの病気を変えることが明らかにされてきた。例えば、Sawyers, C.L. et al., Cell, 64 : 337-350 (1991) ; Meyaard, L. et al., Science, 257 : 217-219 (1992) ; Guo, Q. et al., Nature Med., 4 : 957-962 (1998) ; Barinaga, M. Science, 273 : 735-737 (1996) ; Solary, E. et al., Eur. Respir. J., 9 : 1293-1305 (1996) ; Hamet, P. et al., J. Hypertension, 14 : S65-S70, (1996) ; Roy, N. et al. Cell, 80 : 167-178 (1995) ; 及びAmbrosini, G., Nature Med., 8 : 917-921 (1997) を参照のこと。多くの展開が、この平衡の調節の理解に向けられてきた。例えば、シグナリングカスケードは細胞外の刺激物質を介することが解明されており、例えば増殖因子、ペプチドホルモン、及び細胞−細胞の相互作用が、特異的な系統への前記細胞の拘束及びそれらのその結果として起こる増殖的な展開を調節する（Morrison, S.J. et al., Cell, 88 : 287-298 (1997)) 。更に、細胞周期の出口と最終分化とが、ほとんどの細胞型で結びついていることが明らかになった。例えば、Coppola, J.A. et al. Nature, 320 : 760-763 (1986) ; Freytag, S.O., Mol. Cell. Biol. 8 : 1614-1624 (1988) ; Lee, E.Y. et al., Genes Dev., 8 : 2008-2021 (1994) ; Morgenbesser, S.D., et al., Nature, 371 : 72-74 (1994) ; Casaccia-Bonnefil, P. et al., Genes Dev., 11 : 2335-2346 (1996) ; Zacksenhaus, E. et al., Genes Dev., 10 : 3051-3064 (1996) ; 及びZhang, P. et al., Nature, 387 : 151-158 (1997) を参照のこと。アポトーシス（プログラムされた細胞死）も、多くの発生及びホメオスタシス的な過程で重要な役割を果たし（Raff, M.C., Nature, 356 : 397-400 (1992) 、そしてしばしば統合的に最終分化と一緒に調節される（Jacobsen, K.A. et al., Blood, 84 : 2784-2794 (1994) ; Yan, Y. et al., Genes Dev., 11 : 973-983 (1997)）。従って、個々の系統、組織、器官の細胞型が、又は多細胞生物全体のものでも、増殖によって増大した細胞の生成と、最終分化及びアポトーシスから生じる減少した細胞数との間の精巧に調節されたバランスの結果であることは明らかである。このバランスは、複数の調節経路の集合によって共同して調節されていると思われる。その様なネットワークの新規メンバーの同定は、正常な細胞の過程と、ヒトの病状の病因及び処置との両方に重要な洞察を提供することができる。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１７（ＩＬ−１７）は、免疫系の重要な調節因子として含意されてきたサイトカインである（Spriggs, M.K., J. Clinical Immunology, 17 : 366-369 (1997), Broxmeyer, H.E., J. Experimental Medicine, 183 : 2411-2415 (1996), Yao, Z., et al., J. Immunology, 155 : 5483-5486 (1995), Yao, Z., et al., Immunity, 3 : 811-821 (1995)) 。ヒトＩＬ−１７は、活性化したＣＤ４＋記憶Ｔ細胞によってほぼ独占的に関連される（しかし、マウスでは、ＣＤ４−／ＣＤ８−Ｔ細胞もＩＬ−１７を発現する）（Aarvak, T., et al., J. Immunology, 162 : 1246-1251 (1999), Kennedy, J., et al., J. Interferon Cytokine Research, 16 : 611-617 (1996)) 。対照的に、ＩＬ−１７受容体（ＩＬ−１７Ｒ）は、いたるところで発現している様である（Yao, Z., et al., Immunity, 3 : 811-821 (1995)) 。ＩＬ−１７は、様々な異なるストロマ細胞型からのＩＬ−６、ＩＬ−８、単球走化性ペプチド−１及びＧ−ＣＳＦの分泌を誘導するが、リンパ球によるサイトカインの関連に対しては作用しない（Teunissen, M.B.M., J. Investigative Dermatology, 111 : 645-649 (1998), Jovanovic, D.V., et al., J. Immunology, 160 : 3513-3521 (1998), Chabaud, M., et al., J. Immunology, 161 : 409-414 (1998), Cai, X.-Y., et al., Immunology Letters, 62 : 51-58 (1998), Fossiez, F., et al., J. Experimental Medicine, 183 : 2593-2603 (1996)) 。ＩＬ−１７は更に、繊維芽細胞上でのＩＣＡＭ−１接着分子の発現を増強し、そして顆粒の関連を刺激することができる（Schwarzenberger P., et al., J. Immunology, 161 : 6383-9 (1998)) 。合わせて考えると、これらの観察は、ＩＬ−１７がプロ炎症サイトカインとして機能することを示してきた。ＩＬ−１７は更に、樹状細胞の分化、破骨細胞の生成を促進し、ヒトの骨関節炎の軟骨における一酸化窒素の関連を誘導することができ、そして慢性関節性リウマチの患者の滑液に存在する（Antonysamy, M.A., et al., J. Immunology, 162 : 577-584 (1999), Kotake, S., et al., J. Clinical Investigation, 103 : 1345-1352, (1999), Attur, M.G., et al., Arthritis & Rheumatism, 40 : 1050-1053 (1997)) 。可溶性ＩＬ−１７Ｒタンパク質によるＩＬ−１７の妨害は、心臓の同種移植拒絶を抑制することが明らかとなり、これは腎臓の同種移植拒絶を経験しているヒト由来の腎臓の生検材料におけるＩＬ−１７のｍＲＮＡの増大と相関していた（Antonysamy, M.A., et al., J. Immunology, 162 : 577-584 (1999)) 。ＩＬ−１７ｍＲＮＡの発現の増大は、多発性硬化症を有するヒトにも見られる（Matusevicius, D. et al., Multiple Sclerosis, 5 : 101-104 (1999)) 。更に、ＩＬ−１７は、ヌードマウスにおける、ヒトの頸部の腫瘍形成を促進することができる（Tartour, E. et al., Cancer Res., 59 : 3698-36704 (1999)) 。従って、ＩＬ−１７は免疫系及び炎症の過程の調節において重要な役割を果たすようである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、増殖、分化、及びアポトーシスの経路に関わる新規のタンパク質を発見する必要が絶えずある。これらの経路の誘導因子及び阻害因子のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性は、新規の増殖、分化、及びアポトーシスのタンパク質、それらのアゴニスト及びアンタゴニストの巨大な臨床上の潜在能、及びそれらの必要性を例示する。抗ウイルス活性を有する新規因子を発見する必要もある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はトランスフォーミング増殖因子β−９と称され、以後Ｚｔｇｆβ−９と言及する、新規の抗ウイルスポリペプチド、並びに関連組成物及び方法を提供することによりこの必要性を扱う。このポリペプチドは、下文の例１０に開示した様な抗ウイルス活性を有する。それは更に、ニューロンのグリア細胞、リンパ球、造血細胞及びストローマ細胞の増殖、分化及びアポトーシスを調節するのに使用される。
【０００５】
従って、本発明の１つの観点は単離したＺｔｇｆβ−９ポリペプチド及びポリヌクレオチドを提供する。ヒトの配列は配列番号１及び２に定義する。
【０００６】
配列番号１のヌクレオチド配列は、配列番号１及び２に示す様な開始Ｍｅｔを有する約２０２個のアミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。予想されるシグナル配列はアミノ酸残基１５のアラニン（これも含む）まで及んでいるアミノ酸残基１のメチオニンを含んで成る。従って、前記のシグナル配列を除いた成熟配列は、配列番号２のアミノ酸残基１６のアラニンからアミノ酸残基２０２のプロリン（これも含む）まで及ぶ。この成熟配列は、配列番号３にも表す。代わりの態様において、前記のシグナル配列は、アミノ酸残基１６のアラニンまで及んでおり、そしてこれを含んでいる。このことは、配列番号２の、アミノ酸１７のグリシンからアミノ酸残基２０２のプロリン（これも含む）まで及ぶ成熟配列を生成する。この成熟配列は、配列番号４によっても表される。別の代わりの態様において、前記のシグナル配列はアミノ酸残基１７のグリシンまで及んでおり、そしてこれを含んでいる。このことは、配列番号２のアミノ酸残基１８のアラニンからアミノ酸残基２０２のプロリン（これも含む）まで及ぶ成熟配列をもたらす。この成熟配列は更に、配列番号５によって表される。Ｚｔｇｆβ−９の別の変異体は、配列番号１６及び１７に開示する。前記の成熟配列は、アミノ酸残基２３のアラニンから、アミノ酸残基２０９のプロリン（これも含む）まで及ぶ。前記の成熟配列は、配列番号１８によっても表される。
【０００７】
マウスＺｔｇｆβ−９は配列番号８及び９に定義する。シグナル配列は、１位のメチオニンから２２位のアラニンまで及ぶ。従って、成熟配列は配列番号９の２３位のアラニンから２０５位のアルギニンに及ぶ。前記の成熟配列は更に、配列番号１２によって表される。
【０００８】
本発明の追加の態様は、上述したアミノ酸配列を有するＺｔｇｆβ−９のエピトープ関連部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドに関する。本発明のＺｔｇｆβ−９のエピトープ関連部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドは、少なくとも９個、好ましくは少なくとも１５個及び更に好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸を有するその様なポリペプチドの部分を含むが、上述した本発明のポリペプチドの全体のアミノ酸配列を最大の長さとし、そしてこれを含むエピトープ関連ポリペプチドも本発明に含まれる。その様なエピトープ関連ポリペプチドの例は、配列番号１３，１４，１５，１９，２０，２１及び２２である。別のポリペプチド又は担体分に融合しているこれらのポリペプチドも本発明の範囲内にある。Ｚｔｇｆβ−９のエピトープ関連部分をコードする単離した核酸もまた、本発明の範囲内にある。
【０００９】
本発明は更に、１又は複数のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する上述したペプチド又はポリペプチドの単離したペプチド又はポリペプチドを含んで成り、そしてこれは前記ペプチド又はポリペプチドの生物学的活性を維持している。
【００１０】
本発明の更なる観点において、本質的にペプチド結合によって連結した第１部分及び第２部分から成るキメラポリペプチドが提供される。前記キメラポリペプチドの第１部分は、本質的に（ａ）上述したＺｔｇｆβ−９ペプチド、（ｂ）上述したポリペプチドの対立遺伝子変異体から成る。前記キメラポリペプチドの第２部分は、本質的に別のポリペプチド、例えばアフィニティータグから成る。１つの態様において、前記のアフィニティータグは免疫グロブリンＦｃポリペプチドである。本発明は更に、前記のキメラポリペプチドをコードする発現ベクター及び前記のキメラポリペプチドを関連するためにトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明の別の観点は、（ａ）上述したＺｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び（ａ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、から成る群から選択されるポリヌクレオチドを含んで成る、単離した核酸分子を提供する。
【００１２】
本発明の更なる態様は、上文の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも９０％相同、及び更に好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％、又は９９％相同のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で、上文の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含んで成る単離した核酸分子を含む。
【００１３】
本発明の更なる態様は、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドのいずれかに対して少なくとも９０％同一、及び更に好ましくは９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
本発明の別の観点において、（ａ）転写プロモーター；（ｂ）上述したポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、及び（ｃ）転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターが提供され、この中で、前記のプロモーター、ＤＮＡセグメント、及びターミネーターは作用可能に連結している。
【００１５】
本発明の第３の観点において、上文で開示した発現ベクターが導入された、培養した真核細胞が提供され、ここで、前記の細胞は前記のＤＮＡセグメントによってコードされたタンパク質ポリペプチドを発現する。
【００１６】
本発明の別の態様において、上述したＺｔｇｆβ−９ポリペプチドに特異的に結合する単離した抗体が存在する。Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドに結合する抗体の製造方法も本発明の範囲内であり、これはＺｔｇｆβ−９ポリペプチド又はＺｔｇｆβ−９エピトープ関連ポリペプチドを哺乳類に接種し、その結果、前記の哺乳類が前記ポリペプチドに対する抗体を関連することができ、そして前記抗体を単離すること、を含んで成る。
【００１７】
本発明のこれら及び他の観点は、次の詳細な説明によって明らかになるだろう。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本明細書に列記した引用の全ての技術は、引用によってそれらの全てが本明細書に組入れられる。
【００１９】
次の説明において、いくつかの語句は広範囲に使用される。次の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。
【００２０】
本明細書で使用する場合、“核酸”又は“核酸分子”はポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成したフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用によって生成したフラグメントを言及する。核酸分子は、天然のヌクレオチド（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、又は天然のヌクレオチドの類似体（例えば、天然のヌクレオチドのα−光学異性体型）、あるいは両者の組合わせ、の単量体から成っていてもよい。修飾したヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分において交換されていてもよい。糖の修飾は、例えばハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を含み、あるいは糖は、エーテル又はエステルとして機能的になっていてもよい。更に、全体の糖部分は立体的かつ電機的に類似の構造で置換されることがあり、例えばアザ（ａｚａ）糖及び炭素環の糖類似体である。塩基部分の修飾の例は、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、あるいは他の公知のヘテロ環状置換物を含む。核酸単量体はホスホジエステル結合又はその様な結合の類似体によって連結していてもよい。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などを含む。前記の“核酸分子”の語句は、ポリアミド主鎖に結合した天然又は修飾の核酸塩基を含んで成る、いわゆる“ペプチド核酸”も含む。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよい。
【００２１】
“核酸分子の相補体”の語句は、引用のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列及び逆の配向を有する核酸分子を言及する。例えば、５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に相補的である。
【００２２】
“コンティグ”の語句は、別の核酸分子に同一又は相補的な配列の隣接している伸長を持つ核酸分子を表す。コンティグ配列は、それらの全体の内側で又は前記核酸分子の部分的な伸長に沿って、そのいずれかで核酸分子の与えた伸長を“重復”すると言われている。
【００２３】
“縮重ヌクレオチド配列”の語句は、ポリペプチドをコードする引用の核酸分子と比べて、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を表す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同一のアミノ酸残基をコードしている（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣのトリプレットは、それぞれＡｓｐをコードしている）。
【００２４】
“構造遺伝子”の語句は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、そして次に特異的なポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される核酸分子を言及する。
【００２５】
“単離した核酸分子”は、生物のゲノムＤＮＡに組込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された増殖因子をコードするＤＮＡ分子は、単離したＤＮＡ分子である。単離した核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組込まれていない、化学的に合成した核酸分子である。特定の種から単離した核酸分子は、その種由来の染色体の相補的なＤＮＡ分子よりも小さい。
【００２６】
“核酸分子のコンストラクト”は、天然に存在しない配列と組合わせ、そしてそれに並列している核酸のセグメントを含む様に、人の介入によって修飾された、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子である。
【００２７】
“直鎖状ＤＮＡ”は、自由な５’及び３’末端を有する、非環状ＤＮＡ分子を表す。直鎖状ＤＮＡは、閉じた環状のＤＮＡ分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な分断によって調製することができる。
【００２８】
“相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）”は、ｍＲＮＡの鋳型から、逆転写酵素によって形成する一本鎖のＤＮＡ分子である。典型的に、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが、逆転写の開始に利用される。当業者も、その様な一本鎖ＤＮＡ分子及びその相補的なＤＮＡ鎖から成る二本鎖ＤＮＡ分子を言及するために、“ｃＤＮＡ”の語句を使用する。“ｃＤＮＡ”の語句は更に、ＲＮＡの鋳型から合成したｃＤＮＡ分子のクローンを言及する。
【００２９】
“プロモーター”は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’の非コード領域に位置している。転写の開始において機能するプロモーター内の配列の因子は、しばしば共通のヌクレオチド配列によって特徴づけられる。これらのプロモーター因子はＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的因子（ＤＳＥ ; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7 : 551 (1993)) 、サイクリックＡＭＰ応答因子（ＣＲＥ）、血清応答因子（ＳＲＥ；Treisman, Semirars in Cancer Biol. 1 : 47 (1990)) 、糖質コルチコイド応答因子（ＧＲＥ）、並びに他の転写因子の結合部位、例えばＣＲＥ／ＡＴＦ（O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267 : 19938 (1992)) 、ＡＰ２（Ye et al., J. Biol. Chem. 269 : 25728 (1994)) 、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答因子結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Loeken, Gene Expr. 3 : 253 (1993)) 及び八量体因子（一般的な、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) 、及びLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303 : 1 (1994) を参照のこと）を含む。プロモーターが誘導可能なプロモーターならば、転写の速度は誘導体因子に応じて増大する。反対に、転写の速度は、プロモーターが構成性プロモーターであるならば、誘導因子によって調節されない。抑制性プロモーターも知られている。
【００３０】
“コアプロモーター”は、ＴＡＴＡボックスを含むプロモーターの機能及び転写の開始のための必須のヌクレオチド配列を含む。この定義によって、コアプロモーターは、活性を増強するか、又は組織の特異的活性を与えうる特異的な配列無しに、検出可能な活性を持つか、又は持たなくてもよい。
【００３１】
“調節因子”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節因子は、特定の細胞、組織、又は細胞小器官において、独占的に又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。調節因子のこれらの型は、通常“細胞特異的”、“組織特異的”、又は“細胞小器官特異的”な挙動で発現する遺伝子と関係している。例えば、Ｚｔｇｆβ−９調節因子は、脳、脊髄、心臓、骨格筋、胃、膵臓、副腎、唾液腺、肝臓、小腸、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、甲状腺、気管、精巣、卵巣及び胎盤において、選択的に遺伝子の発現を誘導する。
【００３２】
“エンハンサー”は、転写の効率を増大することができる型の調節因子であり、これは転写の開始部位に対するエンハンサーの距離又は配向に関係がない。
【００３３】
“非相同性ＤＮＡ”は、与えた宿主細胞内に天然で存在しないＤＮＡ分子、又はＤＮＡ分子の集団を言及する。特定の宿主細胞に非相同なＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち外因性のＤＮＡ）と組合わされる限り、宿主細胞の種に由来するＤＮＡ（すなわち内因性のＤＮＡ）を含んでいてもよい。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主ＤＮＡセグメントに、作用可能に連結したポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、非相同性ＤＮＡ分子であるとみなされる。反対に、非相同性ＤＮＡ分子は、外因性のプロモーターと作用可能に連結した内因性の遺伝子を含んで成っていてもよい。別の例示として、野生型細胞由来の遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠失している変異体細胞に導入されるならば、非相同性ＤＮＡであるとみなされる。
【００３４】
“ポリペプチド”は、天然又は合成のいずれかによって関連した、ペプチド結合によって連結したアミノ酸の重合体である。約１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドは、通常“ペプチド”と言及される。
【００３５】
“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質は更に、非ペプチド性成分、例えば炭水化物基を含んで成っていてもよい。炭水化物及び他の非ペプチド性置換基は、前記タンパク質が関連する細胞によってタンパク質に加えられ、そしてこれは細胞の型によって変化するだろう。タンパク質は、換言するとそれらのアミノ酸主鎖構造物として本明細書で定義され；置換基、例えば炭水化物基は、一般に具体化されてないが、それにもかかわらず存在することがある。
【００３６】
非宿主ＤＮＡ分子がコードするペプチド又はポリペプチドは、“非相同性”ペプチド又はポリペプチドである。
【００３７】
“組込まれた遺伝的因子”は、その因子が人の手によって細胞に導入された後に、宿主細胞の染色体内に組入れられたＤＮＡのセグメントである。本発明において、組込まれた遺伝的因子は、ほぼ一般的にエレクトロポレーション又は他の技術によって細胞に導入される直鎖状のプラスミドに由来する。組込まれた遺伝的因子は、元の宿主細胞からその子孫へと移る。
【００３８】
“クローニングベクター”は、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージであり、これらは宿主細胞において自律的に複製する能力を有する。クローニングベクターは、典型的に１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでおり、これは決定可能な方法で、前記ベクターの必須の生物学的機能を損うことない核酸分子、並びに前記のクローニングベクターで形質転換した細胞の同定及び選択における使用に適当なマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列、の挿入を認める。マーカー遺伝子は、典型的にテトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００３９】
“発現ベクター”は、宿主細胞で発現する遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に、発現ベクターは転写プロモーター、遺伝子、及び転写ターミネーターを含んで成る。遺伝子の発現は、通常プロモーターの調節のもとに置かれ、そしてその様な遺伝子は前記プロモーターに“作用可能に連結”していると言われる。同様に、調節因子及びコアプロモーターは、前記の調節因子が前記のコアプロモーターの活性を調節するならば、作用可能に連結している。
【００４０】
“組換え宿主”は、非相同性核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。本文脈における組換え宿主の例は、発現ベクターからＺｔｇｆβ−９を関連する細胞である。対照的に、Ｚｔｇｆβ−９はＺｔｇｆβ−９の“天然の供給源”であり、そして発現ベクターを欠く細胞によって関連することもできる。
【００４１】
“組込み型形質転換細胞”は、非相同ＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに組込まれ始めた組換え宿主細胞である。
【００４２】
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子によって発現する雑種タンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスに結合するポリペプチドと融合したＺｔｇｆβ−９ポリペプチドの少なくとも一部を含んで成る。その様な融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、大量のＺｔｇｆβ−９を単離する手段を提供する。
【００４３】
“受容体”の語句は、“リガンド”と命名された生物活性分子に結合する、細胞に会合したタンパク質を表す。この相互作用は、細胞上のリガンドの効果を媒介する。受容体は、膜結合型、細胞質型又は核型；単量体型（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン受容体）又は多量体型（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３、受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体及びＩＬ−６受容体）であってもよい。膜結合型受容体は、典型的にシグナル伝達に関与する細胞外のリガンド結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを含んで成る複数のドメイン構造を特徴とする。ある細胞膜結合型受容体において、細胞外のリガンド結合ドメイン及び細胞内のエフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含んで成る別々のポリペプチドに位置している。
【００４４】
通常、受容体へのリガンドの結合は、細胞内のエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を起こす、受容体の高次構造の変化をもたらし、次にこれは前記細胞の代謝の変化をもたらす。受容体−リガンドの相互作用にしばしば関連している代謝の事象は、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰの関連の増大、細胞のカルシウムの移動、膜脂質の移動、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を含む。
【００４５】
“分泌シグナル配列”の語句は、大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介して前記の大きなポリペプチドを指示するペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を表す。前記の大きなポリペプチドは、通常分泌経路を介する転移の間に開裂して、分泌ペプチドが除去される。
【００４６】
“単離したポリペプチド”は、細胞性成分、例えば炭水化物、脂質、又は天然の前記ポリペプチドと会合した他のタンパク質性の不純物が本質的に混入していないポリペプチドである。典型的に、単離したポリペプチドの調製物は、高度に精製した形態のポリペプチドを含んでおり、すなわち少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、９５％以上純粋、又は９９％以上純粋である。特定のタンパク質調製物が単離したポリペプチドを含むことを示す１つの方法は、前記のタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び前記ゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後の、見かけの一本のバンドによる。しかし、“単離した”の語句は、代わりの物質的な型における同一のポリペプチド、例えば二量体あるいは代わりにグリコシル化しているか又は誘導されている型の存在を排除しない。
【００４７】
“アミノ末端又はＮ末端”及び“カルボキシル末端又はＣ末端”の語句は、本明細書でポリペプチド内の位置を表すために使用される。前記の文を考慮すると、これらの語句は近接しているか又は関連している位置を表すために、特定の配列又はポリペプチドの一部に関して使用する。例えば、ポリペプチド内の対照配列に対してカルボキシル末端に位置しているある配列は、前記の対照配列のカルボキシル末端に近接して位置しているが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置していない。
【００４８】
“発現”の語句は、遺伝子生成物の生合成を言及している。例えば、構造遺伝子の場合、発現は構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写及び１又は複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含む。
【００４９】
“スプライス変異体”の語句は、本明細書で、遺伝子から転写されたＲＮＡの別の型を表すのに使用される。スプライス変異体は、転写されたＲＮＡ分子内で、又はあまり一般的ではない、別々に転写された分子間で、選択的スプライシング部位の使用によって天然に生じ、そして同一の遺伝子から転写された複数のｍＲＮＡをもたらすことがある。スプライス変異体は、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがある。スプライス変異体の語句は、本明細書で、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライス変異体がコードするポリペプチドを表すためにも使用される。
【００５０】
本明細書で使用する場合、“免疫モジュレーター”の語句は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、刺激を助ける分子、造血因子、及びこれらの分子の合成類似体を含む。
【００５１】
“相補体／抗相補体の対”の語句は、適当な条件下で非共有結合した適当な対を形成する同一でない部分を表す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプトアビジン）は相補体／抗相補体の対の基本的なメンバーである。他の例示的な相補体／抗相補体の対は、受容体／リガンドの対、抗体／抗原（あるいはハプテン又はエピトープ）の対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対などを含む。前記の相補体／抗相補体の対の結果として起こる解離が望ましい場合、前記の相補体／抗相補体の対は、好ましくは１０9 Ｍ-1以下の結合親和性を有する。
【００５２】
“抗イディオタイプ抗体”は、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本文脈において、抗イディオタイプ抗体は抗Ｚｔｇｆβ−９抗体の可変領域と結合し、そしてその結果、抗イディオタイプ抗体は、Ｚｔｇｆβ−９のエピトープを擬態する。
【００５３】
“抗体フラグメント”は抗体の一部であり、例えばＦ（ａｂ′）2 、Ｆ（ａｂ）2 、Ｆａｂ′、Ｆａｂなどである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、無傷の抗体によって認識される同一の抗原と結合する。例えば、Ｚｔｇｆβ−９のモノクローナル抗体フラグメントは、Ｚｔｇｆβ−９のエピトープと結合する。
【００５４】
“抗体フラグメント”の語句は、更に、特異的な抗原に結合する合成又は遺伝子操作したポリペプチド、例えば軽鎖の可変領域から成るポリペプチド、重鎖及び軽鎖の可変領域から成る“Ｆｖ”フラグメント、重鎖及び軽鎖の可変領域が、ペプチドリンカー（“ｓｃＦｖタンパク質”）によって連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子、並びに超可変領域を擬態するアミノ酸残基から成る最小の認識単位を含む。
【００５５】
“キメラ抗体”は、げっ歯類の抗体由来の可変ドメイン及び相補性を決定する領域を含み、一方、残りの抗体分子がヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。
【００５６】
“ヒト化抗体”は、モノクローナル抗体のマウスの相補性を決定する領域が、マウスの免疫グロブリンの可変の軽鎖及び重鎖から、ヒトの可変ドメインへと変換された組換えタンパク質である。
【００５７】
本明細書で使用する場合、“治療因子”は、抗体部分に複合して、治療に有用な複合体を生成する分子又は原子である。治療因子の例は、薬剤、毒素、免疫モジュレーター、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤又は染料、及び放射性同位体を含む。
【００５８】
“検出可能な標識”は、抗体部分と複合して、診断に有用な分子を生成することができる分子又は原子である。検出可能な標識の例は、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、又は他のマーカー部分を含む。
【００５９】
“アフィニティータグ”の語句は、本明細書で、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供するか、又は基質への第２ポリペプチドの結合部位を提供するために、第２ポリペプチドに結合するポリペプチドセグメントを表す。原則として、抗体又は他の特異的な結合因子に利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質は、アフィニティータグとして使用できる。アフィニティータグは、ポリヒスチジン群、プロテインＡ（Nilsson et al., EMBO J. 4 : 1075 (1985) ; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198 : 3 (1991)) 、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67 : 31 (1988)) 、Ｇｌｕ−Ｇｌｕアフィニティータグ（Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 7952 (1985)) 、Ｐ物質、ＦＬＡＧペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6 : 1204 (1988)) 、ストレプトアビジン結合ペプチド、あるいは他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを含む。一般的な、Ford et al., Protein Expression and Purification 2 : 95 (1991) を参照のこと。アフィニティータグをコードするＤＮＡは、市販から入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech, Pisataway, NJ) 。
【００６０】
“裸（ｎａｋｅｄ）の抗体”は、抗体フラグメントとは対照的に、治療因子と複合していない、完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル、その両方の抗体、並びにある組換え抗体、例えばキメラ及びヒト化抗体を含む。
【００６１】
本明細書で使用する場合、“抗体成分”の語句は、完全な抗体及び抗体フラグメント、その両方を含む。
【００６２】
“免疫複合体”は、治療因子又は検出可能な標識との抗体成分の複合体である。
【００６３】
本明細書で使用する場合、“抗体融合タンパク質”は、抗体成分及び治療因子を含んで成る組換え分子を言及する。その様な融合タンパク質に適当な治療因子の例は、免疫モジュレーター（“抗体−免疫モジュレーター融合タンパク質”）及び毒素（“抗体−毒素融合タンパク質”）を含む。
【００６４】
“腫瘍と関連する抗原”は、正常な対応細胞によって通常発現していないか、又は低レベルで発現するタンパク質である。腫瘍と関連する抗原の例は、αフェトプロテイン、ガン胎児性抗原、及びＨｅｒ−２／ｎｅｕを含む。腫瘍と関連する抗原の、多くの他の例示は、当業者に知られている。例えば、Urban et al., Ann. Rev. Immunol. 10 : 617 (1992) を参照のこと。
【００６５】
本明細書で使用する場合、“感染因子”は、微生物及び寄生虫の両方を表す。“微生物”は、ウイルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、菌類及び微生物様のものを含む。“寄生虫”は、感染性の、通常徴視的な又は非常に小さい多細胞性の無脊椎動物、あるいはその卵又は幼虫型を表し、これは免疫を媒介する浄化又は溶解的又は食細胞による破壊の影響を受けやすく、例えばマラリア性の寄生虫、スピロヘータなどがある。
【００６６】
“感染因子抗原”は、感染因子と会合する抗原である。
【００６７】
“標的ポリペプチド”又は“標的ペプチド”は、少なくとも１つのエピトープを含んで成り、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞、又は感染因子抗原を有する細胞で発現する、アミノ酸配列である。Ｔ細胞は、主要組織適合複合体分子によって、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに提示されるペプチドエピトープを認識し、そして典型的に標的細胞を溶解するか、又は他の免疫細胞を標的細胞の前記部位に集合させ、それによって標的細胞を殺す。
【００６８】
“抗原ペプチド”は、主要組織適合複合体分子に結合し、Ｔ細胞によって認識されるＭＨＣペプチド複合体を形成せしめ、それによってＴ細胞への提示に応じて細胞障害性リンパ球を誘導するペプチドである。従って、抗原ペプチドは適当な主要組織適合複合体分子への結合、及び細胞障害性Ｔ細胞の応答、例えば細胞溶解あるいは抗原に結合するか又はそれを発現する標的細胞に対する特異的なサイトカインの放出の誘導、をすることができる。抗原ペプチドは、クラスＩ又はクラスIIの主要組織適合複合体分子に関連する、抗原提示細胞又は標的細胞上に結合することができる。
【００６９】
真核生物において、ＲＮＡポリメラーゼIIは構造遺伝子の転写を触媒し、ｍＲＮＡを生成せしめる。核酸分子は、ＲＮＡの転写物が、特異的なｍＲＮＡのそれに相補的である配列を有する様に、ＲＮＡポリメラーゼIIの鋳型を含めて設計することができる。前記のＲＮＡの転写物は“アンチセンスＲＮＡ”と称され、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、“アンチセンス遺伝子”と称される。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合し、ｍＲＮＡの翻訳又はｍＲＮＡの分解の阻害をもたらすことができる。
【００７０】
“Ｚｔｇｆβ−９に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“Ｚｔｇｆβ−９のアンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）Ｚｔｇｆβ−９の一部と安定な三重合体を形成することができるか、又は（ｂ）Ｚｔｇｆβ−９のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重合体を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
“リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。前記の語句は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己開裂ＲＮＡ、及びこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、“リボザイム遺伝子”と称される。
【００７２】
“外部のガイド配列”は、内因性のリボザイム、ＲＮアーゼＰを、細胞内ｍＲＮＡの特定の種に向かわせ、ＲＮアーゼＰによる前記ｍＲＮＡの開裂を生じさせる核酸分子である。外部のガイド配列をコードする核酸分子は、“外部のガイド配列遺伝子”と称される。
【００７３】
“変異体ヒトＺｔｇｆβ-９遺伝子”の語句は、配列番号２を修飾したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。その様な変異体は、Ｚｔｇｆβ-９の天然の多型、及び配列番号２のアミノ酸配列の保存的なアミノ酸置換を含む合成遺伝子を含む。Ｚｔｇｆβ-９遺伝子の追加の変異体型は、本明細書で述べる核酸配列の挿入又は欠失を含む核酸分子である。変異体Ｚｔｇｆβ-９遺伝子は、前記遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその相補体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定することができる。
【００７４】
同様に、“変異体マウスＺｔｇｆβ-９遺伝子”の語句は、配列番号９を修飾したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。変異体マウスＺｔｇｆβ-９遺伝子は、前記遺伝子が配列番号８のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその相補体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定することができる。
【００７５】
あるいは、変異体Ｚｔｇｆβ-９遺伝子は、配列の比較によって同定することができる。２つのアミノ酸配列は、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大限一致する様に並べられた場合に同一であるならば、“１００％のアミノ酸配列の同一性”を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列は、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大限一致する様に並べられた場合に同一であるならば、“１００％のヌクレオチド配列の同一性”を有する。配列の比較は、標準的なソフトウェアプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって製造された、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅに含まれるものを用いて行うことができる。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を、最適な並びを決定することによって比較する他の方法は、当業者に公知である（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology : Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.),“Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,”in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)、並びにBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998）を参照のこと）。配列の同一性を決定する詳しい方法は以下に記載する。
【００７６】
変異体Ｚｔｇｆβ-９遺伝子又は変異体Ｚｔｇｆβ-９ポリペプチドを同定するために使用する特定の方法にかかわらず、変異体遺伝子又は変異体遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その抗ウイルス又は抗増殖活性のいずれか、あるいは抗Ｚｔｇｆβ-９抗体に特異的に結合する能力によって機能的に特徴づけられる。
【００７７】
“対立遺伝子変異体”の語句は、同一の染色体の遺伝子座を占める遺伝子の、２又はそれ以上の別の型のいずれかを表すために本明細書で使用する。対立遺伝子の変異は、突然変異を介して天然に起こり、そして個体群の中の表現型の多型をもたらすことがある。遺伝子の変異はサイレント（コードされたポリペプチドにおける変化が無い）であってもよく、又は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしていてもよい。対立遺伝子変異体の語句は、本明細書で、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を表すためにも使用する。
【００７８】
“オーソログ”の語句は、異なる種由来のポリペプチド又はタンパク質の機能的対応物である、ある種から得られるポリペプチド又はタンパク質を表す。オーソログ間の配列の差異は種形成の結果である。
【００７９】
“パラログ”は、生物によって作られた、異なるが構造的に関連しているタンパク質である。パラログは、遺伝子の複製を介して生じることが信じられている。例えば、α−グロブリン、β−グロブリン、及びミオグロブリンは、互いにパラログである。
【００８０】
標準的な解析方法の不正確性によって、多量体の分子量及び鎖長は近似値であると理解される。その様な値が、“約”Ｘ又は“ほぼ”Ｘとして表される場合、Ｘの述べられている値は、±１０％まで精密であると理解されるだろう。
【００８１】
ヒト又はマウスのＺｔｇｆβ-９遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１又は８に基づいたポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒト又はマウスのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。これらの技術は標準的であり、そしてよく確立されている。例示として、ヒトＺｔｇｆβ-９をコードする核酸分子は、ヒトのｃＤＮＡライブラリーから単離できる。この場合、第一段階は、脳、脊髄、心臓、骨格筋、胃、膵臓、副腎、唾液腺、肝臓、小腸、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、甲状腺、気管、精巣、卵巣又は胎盤組織から、当業者に公知の方法を用いてＲＮＡを単離することによって、ｃＤＮＡライブラリーを調製することだろう。通常、ＲＮＡの単離技術は、細胞を破壊する方法、ＲＮアーゼが行うＲＮＡの分解を阻害する手段、並びにＤＮＡ、タンパク質、及び多糖の混入物からＲＮＡを分離する方法を提供しなければならない。例えば、全ＲＮＡは、液体窒素中で組織を凍結させ、乳鉢及び乳棒で凍結組織を粉砕して細胞を溶解せしめ、フエノール／クロロホルムの溶液で粉砕した組織を抽出してタンパク質を除去せしめ、そして塩化リチウムによる選択的沈澱によって、残存している不純物からＲＮＡを分離することによって単離することができる（例えば、Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edittion, p 4-1〜4-6 (John Wiley & Sons 1995) 〔“Ausubel (1995)”〕；Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, p 33-41 (CRC Press, Inc. 1997)〔“Wu (1997)”〕を参照のこと）。
【００８２】
あるいは、全ＲＮＡは脳又は脊髄組織及び心臓、骨格筋、胃、膵臓、副腎、唾液腺、肝臓、小腸、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、甲状腺、気道、精巣、卵巣又は胎盤から、グアニジンイソチオシアネートで粉砕した組織を抽出し、有機溶媒を抽出し、そして示差遠心分離を用いて混入物からＲＮＡを分離することで単離することができる（例えば、Chirgwin et al., Biochemistry 18 : 52 (1979) ; Ausubel (1995), p 4-1〜4-6 ; Wu (1997) p 33-41を参照のこと）。ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを、全ＲＮＡ調製物から単離しなければならない。ポリ（Ａ）+ ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーの標準的な技術を用いて、全ＲＮＡから単離することができる（例えば、Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69 : 1408 (1972) ; Ausubel (1995) p 4-11〜4-12を参照のこと）。二本鎖ｃＤＮＡ分子は、当業者に公知の技術を用いてポリ（Ａ）+ ＲＮＡから合成できる（例えば、Wu (1997), p 41-46を参照のこと）。更に、商業的に入手可能なキットは、二本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するために使用することができる。例えば、その様なキットはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Gaithersburg, MD），ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Palo Alto, CA），Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Madison, WI）及びＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（La Jolla, CA）から入手可能である。
【００８３】
様々なクローニングベクターが、ｃＤＮＡライブラリーの構築に適している。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、バクテリオファージ由来のベクター、例えばλｇｔ１０ベクターにおいて調製することができる。例えば、Huynh et al.,“Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11，”in DNA Cloring : A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), p 49 (IRL Press, 1985) ; Wu (1997), p 47-52を参照のこと。あるいは、二本鎖ｃＤＮＡ分子は、プラスミドベクター、例えばｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（STRATAGENE ; La Jolla, Ca), ＬＡＭＤＡＧＥＭ−４（Promega Corp.）又は他の商業的に入手可能なベクターに挿入することができる。適当なクローニングベクターも、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Manassas, VA）から得ることができる。クローン化したｃＤＮＡ分子を増幅するために、前記のｃＤＮＡライブラリーは、標準的な技術を用いて、原核細胞の宿主に挿入される。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Gaithersburg, MD）から入手出来る、コンピテントＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞に導入することができる。
【００８４】
ヒトのゲノムライブラリーは、当業者に公知の手段によって調製することができる（例えば、Ausubel (1995), p 5-1〜5-6 ; Wu (1997), p 307-327を参照のこと）。ゲノムＤＮＡは、界面活性剤サルコシルで組織を溶解し、プロテインキナーゼＫで溶解物を分解し、遠心によって前記溶解物から不溶性の残骸を浄化し、イソプロパノールを用いて前記溶解物から核酸を沈澱させ、そして塩化セシウム密度勾配で再懸濁したＤＮＡを精製することによって単離することができる。ゲノムライブラリーの作製に適したＤＮＡフラグメントは、ゲノムＤＮＡの無作為な剪断又は制限エンドヌクレアーゼを用いるゲノムＤＮＡの部分分解によって得ることができる。ゲノムＤＮＡのフラグメントは、従来技術、例えば適当な末端を提供するための制限酵素分解の使用、ＤＮＡ分子の不所望の連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処置の使用、及び適当なリガーゼによるライゲーション、に従い、ベクター、例えばバクテリオファージ又はコスミドベクターに挿入することができる。その様な操作のための技術は、当業界で公知である（例えば、Ausubel (1995), p 5-1〜5-6 ; Wu (1997), p 307-327を参照のこと）。
【００８５】
ヒトＺｔｇｆβ-９遺伝子をコードする核酸分子は、上述した様な、ヒトＺｔｇｆβ−９のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を用いたオリゴヌクレオチドプライマーによる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得ることもできる。ＰＣＲを用いるライブラリーをスクリーニングする一般的な方法は、例えばYu et al.,“Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries,”in Methods in Moleuclar Biology, Vol. 15 : PCR Protocols : Current Methods and Applications, White (ed.), pages 211-215 (Humana Press, Inc. 1993）に提供されている。更に、関連遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いる技術は、例えばPreston,“Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members,”in Methods in Molecular Biology, Vol. 15 : PCR Protocols : Current Methods and Applications, White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993）に記載されている。あるいは、ヒトのゲノムライブラリーは、商業的な供給源、例えばＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Huntsville, AL）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Manassas, VA）から入手出来る。ｃＤＮＡ又はゲノムのクローンを含むライブラリーは、標準的な技術（例えば、Ausubel (1995), p 6-1〜6-11を参照のこと）を用いて、配列番号１に基づく１又は複数のポリヌクレオチドプローブでスクリーニングすることができる。
【００８６】
下文に記載する様に製造した、抗Ｚｔｇｆβ−９抗体は、ｃＤＮＡライブラリーからヒトＺｔｇｆβ−９遺伝子をコードするＤＮＡ配列を単離するために使用することができる。例えば、前記抗体はλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、又は前記抗体はハイブリッドの選択及び翻訳の後の免疫スクリーニングに使用することができる（例えばAusubel (1995), p 6-12〜6-16 ; Margolis et al.,“Screening λ expression libraries with antibody and protein probes,”in DNA Cloning 2 : Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), p 1-14 (Oxford University Press 1995) を参照のこと）。
【００８７】
あるいは、Ｚｔｇｆβ−９遺伝子は相互プライミング  ロング  オリゴヌクレオチド（ｍｕｔｕａｌｌｙ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｌｏｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及び本明細書に記載のヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することで得ることができる（例えば、Ausubel (1995), p 8-8〜8-9を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技術は、少なくとも２キロ塩基の長さのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Adang et al., Plant Molec. Biol. 21 : 1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2 : 266 (1993), Dillon et al.,"Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes,"in Methods in Molecular Biology, Vol. 15 : PCR Protocols : Current Methods and Applications, White (ed.), p 263-268, (Humana Press, Inc. 1993)、及びHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4 : 299 (1995)）。Ｚｔｇｆβ−９  ｃＤＮＡ又はＺｔｇｆβ−９のゲノムフラグメントの配列は、標準的な方法を用いて決定することができる。更に、Ｚｔｇｆβ−９のプロモーター又は調節因子を含むゲノムフラグメントの同定は、よく確立された技術、例えば欠失解析を用いて達成することができる（通常、Ausubel (1995) を参照のこと）。
【００８８】
５’フランキング配列のクローニングも、米国特許第５，６４１，６７０号に開示された方法に従う“遺伝子の活性化”によって、Ｚｔｇｆβ−９タンパク質の製造を容易にする。簡単に述べると、細胞内の内因性Ｚｔｇｆβ−９遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、及び不対のスプライスドナー部位を含んで成るＤＮＡコンストラクトを、Ｚｔｇｆβ−９の遺伝子座に導入することで変化する。前記の標的配列は、前記コンストラクトの、内因性Ｚｔｇｆβ−９の遺伝子座による相同的組換えを許容する、Ｚｔｇｆβ−９の５’非コード配列であり、それによって前記コンストラクト内の前記配列は、内因性のＺｔｇｆβ−９のコード配列と作用可能に連結する様になる。この方法において、内因性のＺｔｇｆβ−９プロモーターは、他の調節配列で置換するか又は補足することができ、その結果、増強した、組織特異的の、又は他の方法で調節した発現が提供される。
【００８９】
更に、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。最近では、選択方法はホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法である。化学的に合成した二本鎖ＤＮＡが、遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成の様な利用に必要ならば、各相補鎖は別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０bp）の製造は技術的に簡単な仕事であり、そして相補鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることで達成することができる。しかし、より長い遺伝子（＞３００bp）の製造のために、特別な戦略に頼らねばならないのは、化学的なＤＮＡの合成の間、各周期のカップリング効率が、滅多に１００％ではないためである。この問題に打ち勝つために、合成遺伝子（二本鎖）は、２０〜１００ヌクレオチドの長さの一本長フラグメントから、モジュール型で組立てられる。前記タンパク質をコードする配列に加えて、合成遺伝子は、クローニングベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位への挿入を容易にする末端配列を設計することができ、そして他の配列は、転写及び翻訳の適当な開始及び終結のためのシグナルを含めて加えられるべきでもある。Glick, Bernard R. and Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994), Itakura, K. et al. Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu. Rev. Biochem. 53 : 323-356 (1984)、及びClimie, S. et al. Chemical synthesis of the thymidylate synthase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 633-637 (1990) を参照のこと。
【００９０】
本発明の好ましい態様において、単離したポリヌクレオチドは、配列番号１のＤＮＡの類似のサイズの領域、又はそれに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするだろう。通常、ストリンジェントな条件は、限定したイオン強度及びpHで、特異的な配列のための熱融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、５０％の標的配列が、完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度である（限定したイオン強度及びpHのもと）。典型的なストリンジェントな条件は、塩濃度がpH７で約０．０２Ｍ又はそれ以下であり、そして温度が少なくとも約６０℃であるものである。既に記載した様に、本発明の単離したポリヌクレオチドはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡ及びＲＮＡの単離方法は当業界で公知である。全ＲＮＡは、グアニジン塩酸抽出、続けて塩化セシウム勾配における遠心による単離を用いて調製することができる〔Chirgwin et al., Biochemistry 18 : 52-94 (1979)〕。ポリ（Ａ）+ ＲＮＡは、Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 : 1408-1412 (1972）の方法を用いて、全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いてポリ（Ａ）+ ＲＮＡから調製される。Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは続いて、例えばハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって同定し、そして単離される。
【００９１】
当業者は、配列番号１及び２に開示した配列が、ヒトの一本鎖の対立遺伝子を表すことを認識するだろう。異なる位置で開裂したリーダー配列を有する、いくつかの天然の成熟Ｎ末端変異体が存在する。これらの配列の対立遺伝子変異体は、標準的な手順に従い、異なる個体由来のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブ化することでクローニングすることができる。本発明は更に、他の種（“種オーソログ”）由来の対応タンパク質及びポリヌクレオチドを提供する。特に注目のものは、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、及び他の霊長類を含む、他の哺乳類の種由来のＺｔｇｆβ−９ポリペプチドである。ヒトＺｔｇｆβ−９タンパク質の種オーソログは、従来のクローニング技術と組合わせて、本発明によって提供される情報及び組成物を用いてクローニングすることができる。例えば、ｃＤＮＡは、前記の遺伝子を発現する組織又は細胞型から得られたｍＲＮＡを用いてクローニングすることができる。ｍＲＮＡの適当な供給源は、本明細書で開示した配列から設計したプローブでノーザンブロットをプローブすることで同定することができる。ライブラリーは、続いてポジティブな組織又は細胞系から調製される。タンパク質をコードするｃＤＮＡは、続いて様々な方法、例えば完全又は部分的なヒトｃＤＮＡあるいは開示した配列に基づいた１又は複数の縮重プローブでプローブすることによって単離される。ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応、又はＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）を用いて、本明細書で開示した配列から設計したプライマーを用いてクローニングすることもできる。追加の方法において、ｃＤＮＡライブラリーは宿主細胞を形質転換するか、又はこれにトランスフェクションするために使用することができ、そして注目のｃＤＮＡの発現は、前記タンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。類似の技術を、ゲノムクローンの単離に利用することもできる。既に使用し、そして要求した様に、“配列番号２で定義される、ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド”の言葉は、配列番号２，３，４及び５のポリペプチドの、全ての対立遺伝子変異体及び種オーソログを含む。
【００９２】
本発明の好ましい態様において、ヒトＺｔｇｆβ−９をコードする単離した核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれに相補的な配列を有する核酸分子に、“ストリンジェントな条件”下でハイブリダイズすることができる。通常、ストリンジェントな条件は、限定したイオン強度及びpHで、特異的な配列のための熱融解点（Ｔｍ）より５℃低く選択される。Ｔｍは、５０％の標的配列が完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度である（限定したイオン強度及びpHのもと）。
【００９３】
例示の様に、変異体Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその相補体）を有する核酸分子と、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１５mMクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（pH７．６）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液：２％（ｗ／ｖ）フィコール４００、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、及び２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／mlの変性し、剪断したサケの精子ＤＮＡを含んで成る溶液中で、４２℃で一晩ハイブリダイズすることができる。当業者は、これらのハイブリダイゼーションの条件の変形を考案することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、より高い温度、例えば約６５℃で、ホルムアミドを含まない溶液中でインキュベートすることができる。更に、あらかじめ混合してあるハイブリダイゼーション溶液は入手可能であり（例えば、ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢハイブリダイゼーション溶液は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）、そしてハイブリダイゼーションは取扱い説明書に従い行うことができる。ハイブリダイゼーションの後、核酸分子を洗浄し、ストリンジェントな条件下、又は高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしなかった核酸分子を除去することができる。典型的なストリンジェントな洗浄条件は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を有する０．５×〜２×ＳＳＣの溶液中で、５５〜６５℃での洗浄を含む。それは、変異体Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はその相補体）と、ストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズする条件であり、ここで、洗浄時のストリンジェント性は、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．５×〜２×ＳＳＣに相当し、それは、５５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．５×ＳＳＣ、又は６５℃で０．１％ＳＤＳを有する２×ＳＳＣを含む。当業者は、例えば洗浄溶液中のＳＳＰＥをＳＳＣに置き換えることで、相当する条件を容易に考察することができる。
【００９４】
典型的な、高度にストリンジェントな洗浄条件は、５０〜６５℃で０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を有する０．１×〜０．２×ＳＳＣの溶液中での洗浄を含む。換言すると、変異体Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はその相補体）と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ここで、洗浄時のストリンジェント性は、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．１×〜０．２ＳＳＣに相当し、これは５０℃で０．１％ＳＤＳを有する０．１×ＳＳＣ、又は６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．２×ＳＳＣを含む。
【００９５】
本発明は更に、配列番号２，３，４，５，９，１２，１７，１８のポリペプチド又はそれらのオーソログに対して、実質的に類似の配列同一性を有する単離したＺｔｇｆβ−９ポリペプチドを提供する。“実質的に類似の配列同一性”の語句は、配列番号２，３，４，５，９，１２，１７，１８に示した配列又はそれらのオーソログに対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％及び９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを表すために本明細書で使用する。
【００９６】
本発明は更に、２つの基準：上述した様な、配列番号２，３，４，５，９，１２，１７又は１８のアミノ酸配列を有するコードされたポリペプチド間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ、を用いて同定することができるＺｔｇｆβ−９の変異体核酸分子を考慮する。その様なＺｔｇｆβ−９変異体は、（１）配列番号１，９又は１６のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はそれらの相補体）と、ストリンジェントな洗浄条件下（ここで、洗浄時のストリンジェント性は、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．５×〜２×ＳＳＣに相当する）でハイブリダイズし、そして（２）配列番号２，３，４，５，９，１２，１７又は１８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子を含む。あるいは、Ｚｔｇｆβ−９変異体は、（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はその相補体）と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし（ここで、洗浄時のストリンジェント性は、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．１×〜０．２×ＳＳＣに相当する）、そして（２）配列番号２，３，４，５，９，１２，１７又は１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％あるいは９５％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子として特徴づけることができる。
【００９７】
本発明は更に、配列番号２に関する、少なくとも１つのハイブリダイゼーション解析及び配列同一性の決定によって特徴づけられる、ヒトＺｔｇｆβ−９変異体核酸分子を考慮する。本発明は更に、配列番号８及び９に関する、少なくとも１つのハイブリダイゼーション解析及び配列の同一性の決定によって同定した、マウスＺｔｇｆβ−９変異体の核酸分子を含む。例えば、上述した試みを用いて、マウスＺｔｇｆβ−９変異体の核酸分子は、少なくとも３つの基準：（１）配列番号８のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はその相補体）との、ストリンジェントな洗浄条件下でのハイブリダイゼーション（ここで、洗浄時のストリンジェント性は、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．５×〜２×ＳＳＣに相当する）、（２）配列番号８のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はその相補体）との、高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション（ここで、洗浄時のストリンジェント性は、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを有する０．１×〜０．２×ＳＳＣに相当する）、及び（３）配列番号１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性があるアミノ酸の同一性（％）、を用いて同定することができる。
【００９８】
配列同一性（％）は、常用の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48 : 603 (1986)、及びHeinkoff and Heinkoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915 (1992）を参照のこと。簡単に述べると、２つのアミノ酸配列は、１０のギャップオープニングペナルティ、１のギャップエクステンションペナルティ、及び表１に示した様な（アミノ酸は、標準的な一文字コードで示す）Heinkoff and Heinkoff (同書）の“ＢＬＯＳＵＭ  ６２”スコアリングマトリックスを用いて、アラインメントスコア（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ）を最適化する様に並べられる。同一性（％）は次に、（〔合計の同一性マッチ数〕／〔長い方の配列の長さ＋２つの配列を並べるために、長い方の配列に導入されるギャップ数〕）（１００）で計算される。
【００９９】
【表１】
2010187691.tif 000002
【０１００】
当業者は、２つのアミノ酸配列を並べて比較するのに利用可能な、多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認識している。Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの、“ＦＡＳＴＡ”類似性検索のアルゴリズムは、本明細書で開示したアミノ酸配列及び予想されるＺｔｇｆβ−９変異体のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを試験するのに適した、タンパク質の配列の比較法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85 : 2444 (1998)、及びPearson, Meth. Enzymol. 183 : 63 (1990）に記載されている。簡単に述べると、ＦＡＳＴＡは、始めに疑問の配列（例えば配列番号２）及び、同一性の最も高い密度（Ｋｔｕｐの変数が１の場合）又は同一性の対（Ｋｔｕｐが２の場合）のいずれかを有する試験配列に共有されている領域を、保存的なアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を考慮せずに同定することで、配列の類似性を特徴づける。同一性の最も高い密度を有する１０個の領域は、次にアミノ酸置換のマトリックスを用いて、全ての対合したアミノ酸の類似性を比較することで再計算され、そして前記領域の末端は、最も高いスコアに寄与する残基のみを含めるために“削除”される。“カットオフ”値（前記配列の長さ及びＫｔｕｐ値に基づいてあらかじめ決定した式によって計算したもの）以上のスコアを有する領域が複数あるならば、前記の削除した最初の領域は、その領域がギャップを有する適当な並びを形成する様に結合することができるかどうかを決定するために試験される。最後に、前記の２つのアミノ酸配列の最も高いスコアを示す領域は、アミノ酸の挿入及び欠失を考慮する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの修飾したもの（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 444 (1970) ; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26 : 787 (1974)）を用いて比較される。ＦＡＳＴＡ解析の例示的なパラメーターは：Ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１、及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、である。これらのパラメーターは、Pearson, Meth. Enzymol. 183 : 63 (1990）の付表において説明されている様な、スコアリングマトリックスファイル（“ＳＭＡＴＲＩＸ”）を修飾することで、ＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【０１０１】
ＦＡＳＴＡは、上述した比率を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するために使用することもできる。ヌクレオチド配列の比較のために、Ｋｔｕｐ値は、上述した他のパラメーターの組合わせによって１〜６に及ぶことがあり、好ましくは３〜６、最も好ましくは３である。
【０１０２】
本発明は、配列番号２，３，４，５，９，１２，１７又は１８のアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。それは、変異体が配列番号２，３，４，５，９又は１２の１又は複数のアミノ酸置換を含む様に得ることができることであり、この中で、アルキルアミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列のアルキルアミノ酸で置換され、芳香族アミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列の芳香族アミノ酸で置換され、硫黄含有アミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列の硫黄含有アミノ酸で置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列のヒドロキシ含有アミノ酸で置換され、酸性アミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列の酸性アミノ酸で置換され、塩基性アミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列の塩基性アミノ酸で置換され、又は二塩基性モノカルボキシルアミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸配列の二塩基性モノカルボキシルアミノ酸で置換される。
【０１０３】
一般的なアミノ酸の中で、例えば“保存的なアミノ酸の置換”は、次の各群の中のアミノ酸の間の置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びスレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、並びに（６）リジン、アルギニン及びヒスチジン。例えば、配列番号２，３，４，５又は１２のいずれかと異なるアミノ酸配列を有する変異体Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドは、スレオニン残基をＳｅｒで置換し、バリン残基をＩＬｅで置換し、アスパラギン酸残基をＧｌｕで置換し、又はバリン残基をＩＬｅで置換することによって得ることができる。更なる変異体は、２又はそれ以上のこれらのアミノ酸置換を有するポリペプチドを製造することで得ることができる。
【０１０４】
ヒト又はマウス、いずれかのＺｔｇｆβ−９の変異体は、配列番号３及び１２のアミノ酸配列を比較し、そして相当するアミノ酸残基においていずれかの変異を認めることで考案することができる。
【０１０５】
前記のＢＬＯＳＵＭ６２の表は、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所的な複数の比較から導いたアミノ酸置換のマトリックスであり、これは５００群以上の関連タンパク質の高度に保存された領域を表している（Heinkoff and Heinkoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89 : 10915 (1992)）。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２の置換の回数は、本発明のアミノ酸配列に導入することができる保存的なアミノ酸の置換を定義するために使用することができる。化学的特性（上文で論じたもの）のみに基づいてアミノ酸の置換を設計することは可能であるが、“保存的なアミノ酸の置換”の言葉は、好ましくは−１以上のＢＬＯＳＵＭ６２の値によって表される置換を言及する。例えば、アミノ酸の置換は、置換が０，１，２、又は３のＢＬＯＳＵＭ６２の値を特徴とするならば保存的である。この系に従って、好ましい保存的なアミノ酸の置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とし、一方、更に好ましい保存的なアミノ酸の置換は、少なくとも２（例えば２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２の値を特徴とする。
【０１０６】
ヒト又はマウスＺｔｇｆβ−９の特定の変異体は、相当するヒト（すなわち配列番号２，３，４，５又は１７）又はマウス（すなわち配列番号９又は１２）のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９９％あるいはそれ以上の配列同一性を持つことを特徴とし、ここで、アミノ酸配列中の変化は、１又は複数の保存的アミノ酸の置換に起因する。
【０１０７】
Ｚｔｇｆβ−９遺伝子の保存的アミノ酸の変化は、ヌクレオチドを配列番号１又は９のいずれか１つに列挙したヌクレオチドで置換することによって導入することができる。その様な“保存的アミノ酸”の変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド部位指定突然変異導入法、リンカースキャニング突然変異導入法、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる突然変異導入法などによって得ることができる（Ausubel (1995), p 8-10〜8-22 ; 及びMcPherson (ed.), Directed Mutagenesis : A Practical Approach (IRL Press 1991)）。抗ウイルス又は抗増殖活性を促進する、その様な変異体の能力は、標準的な方法、例えば本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。あるいは、変異体Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドは、特異的に抗Ｚｔｇｆβ−９抗体に結合する能力によって同定することができる。
【０１０８】
本発明のタンパク質は更に、天然のアミノ酸残基を含んで成っていてもよい。非天然のアミノ酸は、限定しないがトランス−４−ヒドロキシプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシメチルシステイン、ヒドロキシメチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを含む。非天然のアミノ酸残基をタンパク質に組込むために、いくつかの方法が当業界で知られている。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系は、非センスの変異が、化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制される様に適用することができる。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化する方法が、当業界で知られている。非センスの変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、典型的にＥ．コリＳ３０抽出物及び商業的に入手可能な酵素及び他の試薬を含んで成る無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーで精製する。例えば、Robertson et al., J. Am Chem. Soc. 113 : 2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202 : 301 (1991), Chung et al., Science 259 : 806 (1993), and Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90 : 10145 (1993）を参照のこと。
【０１０９】
第２の方法において、翻訳は変異したｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによって、アフリカツメガエルの卵母細胞において行う（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271 : 19991 (1996)）。第３の方法において、Ｅ．コリ細胞は、置換されうる天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下及び所望の非天然のアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。前記の非天然のアミノ酸は、その天然の対応物に代わって、タンパク質内に組込まれる。Koide et al., Biochem. 33 : 7470 (1994) を参照のこと。天然のアミノ酸残基は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的修飾によって、非天然の種に変換されることがある。化学的修飾は、置換の範囲を更に広げるために、部位指定突然変異導入法と組合わせることができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2 : 395 (1993)）。
【０１１０】
限定数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、天然に発生しないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸は、Ｚｔｇｆβ−９のアミノ酸残基で置換されてもよい。
【０１１１】
本発明のポリペプチドの必須アミノ酸は、当業界で知られている方法、例えば部位指定突然変異導入法又はアラニンスキャニング突然変異導入法に従い同定することができる（Cunningham and Wells, Science 244 : 1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88 : 4498 (1991), Coombs and Corey,“Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering”, in Proteins : Analysis and Design, Angeletti (ed.), p259-311 (Academic Press, Inc. 1998)）。後者の技術において、１つのアラニンの変異は、前記分子の各残基で導入され、そして生じた変異体分子は、前記分子の活性に必須であるアミノ酸残基を同定するために下文で開示する様に、生物学的活性を試験される。Hilton et al., J. Biol. Chem. 271 : 4699 (1996) も参照のこと。
【０１１２】
表２
保存的なアミノ酸の置換
塩基性：アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性  ：グルタミン酸
アスパラギン酸
極性  ：グルタミン
アスパラギン
疎水性：ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族：フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型  ：グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
【０１１３】
本発明のポリペプチドの必須アミノ酸は、当業界で知られている方法、例えば部位指定突然変異導入法又はアラニンスキャニング突然変異導入法に従い同定することができる〔Cunningham and Wells, Science 244 : 1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88 : 4498 (1991)〕。後者の技術において、１つのアラニンの変異は、前記分子の各残基で導入され、そして生じた変異体分子は、前記分子の活性に必須であるアミノ酸残基を同定するために下文で開示する様に、生物学的活性（例えば、リガンド結合及びシグナル伝達）を試験される。リガンド−タンパク質の相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学又はフォトアフィニティーラベリングなどの技術によって決定される様な結晶構造の解析によって決定することもできる。例えば、de Vos et al., Science 255 : 306-312 (1992) ; Smith et al., J. Mol. Biol. 224 : 899-904, 1992 ; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309 : 59-64 (1992)を参照のこと。必須アミノ酸の同定は、関連タンパク質との相同性の解析から推論することもできる。
【０１１４】
複数のアミノ酸の置換は、突然変異導入法及びスクリーニングの知られている方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer, Science 241 : 53-57 (1988)又はBowie and Saner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 (1989)に開示されている様なものを用いて作製し、そして試験することができる。簡単に述べると、これらの著者は、ポリペプチドの２又はそれ以上の位置を同時に無作為化し、機能的なポリペプチドを選択し、そして次に変異したポリペプチドの配列を決定し、各位置の許容できる置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用できる他の方法は、ファージディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）（例えばLowman et al., Biochem. 30 : 10832-10837 (1991) ; Lander et al., 米国特許第5,223,409号；Huse, WIPO公開番号WO92/06204）及び領域指定突然変異導入法（Derbyshire et al., Gene 46 : 145 (1986) ; Ner et al., DNA 7 : 127 (1988) ）を含む。
【０１１５】
上文で開示した様な突然変異導入法は、宿主細胞でクローン化され、変異したタンパク質の活性を検出するために、高処理量スクリーニング法と組合わせることができる。この点において好ましいアッセイは、下文に記述されている細胞増殖アッセイ及びバイオセンサーを基にしたリガンド結合アッセイを含む。活性タンパク質又はその一部（例えば、リガンド結合フラグメント）をコードする変異したＤＮＡ分子は宿主細胞から回収し、そして最新機器を用いて素速く配列決定することができる。これらの方法は、注目のポリペプチドの個々のアミノ酸残基の重要性の素速い決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用することもできる。
【０１１６】
上文で論じた方法を用いて、当業者は配列番号２，３，４，５，９，１２，１７又は１８あるいはその対立遺伝子変異体に実質的に同一であり、そして野生型タンパク質の特性を保持する、様々なポリペプチドを製造することができる。本明細書で表し、そして述べた様に、“配列番号２，３，４，５，９，１２，１７又は１８によって限定されるポリペプチド”の言葉は、前記ポリペプチドの全ての対立遺伝子変異体及び種オーソログを含む。
【０１１７】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドのエピトープ関連部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性又は抗原性エピトープである。抗体が結合できるタンパク質の領域は、“抗原性エピトープ”として定義される。例えば、Geysen, H.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998-4002 (1984) を参照のこと。
【０１１８】
抗原性エピトープを有する（すなわち、抗体に結合できるタンパク質分子の領域を含む）ペプチド又はポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を真似ている比較的短い合成ポリペプチドは、部分的に真似したタンパク質と反応する抗血清を簡単に導くことができるということは、当業界で公知である。Sutcliffte, J.G. et al., Science, 219 : 660-666 (1983) を参照のこと。タンパク質反応性血清を導くことができるペプチドは、しばしばタンパク質の一次配列において表され、単純な化学的法則の組合わせで特徴づけることができ、そして無傷のタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）又はアミノ若しくはカルボキシル末端、そのいずれにも限定されない。極度に疎水性のペプチド及び６又はそれ以下の残基のものは一般的に、前記の真似したタンパク質に結合する抗体を誘導する際に効果的でなく、より長い可溶性のペプチド、特にプロリン残基を含むものは、通常効果的である。
【０１１９】
故に、抗原性エピトープを有するペプチド及びポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体を含む抗体を生成するために有用である。本発明の抗原性エピトープ関連ペプチド及びポリペプチドは、少なくとも９個の配列を含み、好ましくは１５〜約３０個のアミノ酸が、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に含まれる。しかし、本発明のアミノ酸配列のより大きな部分を含んで成り、本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列の３０〜５０個のアミノ酸、又はあらゆる長さのものを含むペプチド又はポリペプチドは、前記タンパク質と反応する抗体に誘導するのに有用でもある。好ましくは、前記のエピトープを有するペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒における実質的な可溶性を提供するために選択され（すなわち、前記の配列は比較的親水性の残基を含み、そして疎水性残基は、好ましくは避けられる）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。配列表に示したポリペプチドの全てが、本発明に従い使用されうる抗原性エピトープを含む。
【０１２０】
本発明のポリペプチド、通常ｃＤＮＡ配列は、上述したポリペプチドをコードする。本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、一連のコドンを含んで成り、前記ポリペプチドの各アミノ酸残基は、コドンによってコードされ、そして各コドンは３つのヌクレオチドを含んで成る。アミノ酸残基は、次のそれらの各コドンによってコードされる。
【０１２１】
アラニン（Ａｌａ）は、ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ又はＧＣＴによってコードされ；
システイン（Ｃｙｓ）はＴＧＣ又はＴＧＴによってコードされ；
アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＧＡＣ又はＧＡＴによってコードされ；
グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＧＡＡ又はＧＡＧによってコードされ；
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＴＴＣ又はＴＴＴによってコードされ；
グリシン（Ｇｌｙ）はＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ又はＧＧＴによってコードされ；
ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＣＡＣ又はＣＡＴによってコードされ；
イソロイシン（Ｉｌｅ）はＡＴＡ，ＡＴＣ又はＡＴＴによってコードされ；
リジン（Ｌｙｓ）はＡＡＡ又はＡＡＧによってコードされ；
ロイシン（Ｌｅｕ）はＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＡ，ＣＴＣ，ＣＴＧ又はＣＴＴによってコードされ；
メチオニン（Ｍｅｔ）はＡＴＧによってコードされ；
アスパラギン（Ａｓｎ）はＡＡＣ又はＡＡＴによってコードされ；
プロリン（Ｐｒｏ）はＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ又はＣＣＴによってコードされ；
グルタミン（Ｇｌｎ）はＣＡＡ又はＣＡＧによってコードされ；
アルギニン（Ａｒｇ）はＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ又はＣＧＴによってコードされ；
セリン（Ｓｅｒ）はＡＧＣ，ＡＧＴ，ＴＣＡ，ＴＣＣ，ＴＣＧ又はＴＣＴによってコードされ；
スレオニン（Ｔｈｒ）はＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ又はＡＣＴによってコードされ；
バリン（Ｖａｌ）はＧＴＡ，ＧＴＣ，ＧＴＧ又はＧＴＴによってコードされ；
トリプトファン（Ｔｒｐ）はＴＧＧによってコードされ；そして
チロシン（Ｔｙｒ）はＴＡＣ又はＴＡＴによってコードされる。
【０１２２】
本発明に従い、ｃＤＮＡが上述した様に請求される場合、請求されるものが、センス鎖、アンチセンス鎖両方、並びに自身の各水素結合によって共にアニールしたセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を有する二本鎖のＤＮＡであると理解されることが認識されるだろう。更に、本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）も請求され、そしてこのｍＲＮＡは、上述したｃＤＮＡによってコードされる。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、上文で定義したものと同一のコドンを用いてポリペプチドをコードするが、但し、それぞれのチミンヌクレオチド（Ｔ）は、ウラシルヌクレオチド（Ｕ）で置換される。
【０１２３】
完全長のタンパク質、タンパク質フラグメント（例えば、受容体結合フラグメント）、及び融合ポリペプチドを含む、本発明のタンパク質ポリペプチドは、従来技術に従い、遺伝子操作した宿主細胞で生成することができる。適当な宿主細胞は、外因性のＤＮＡ及び形質転換されるか、又はこれでトランフェクションされ、そして培地で増殖することができる細胞型のものであり、そして細菌、菌細胞、及び培養された高等の真核細胞を含む。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化したＤＮＡ分子を扱い、そして外因性ＤＮＡを様々な宿主細胞に導入するための技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に開示されている。
【０１２４】
通常、Ｚｔｇｆβ−９をコードするＤＮＡ配列は、その発現に必要な他の遺伝的因子に作用可能に連結しており、これは通常、発現ベクター内に、転写プロモーター及びターミネーターを含む。前記ベクターは、普通、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製起点を含むが、当業者は、ある系において、選択マーカーが別々のベクター上で提供されることがあり、そして前記の外因性のＤＮＡの複製が、宿主細胞への組込みによって提供されることがあることを認識するだろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の因子の選択は、当業界の通常の技術レベル内の、日常の設計の問題である。多くのその様な因子は文献に記載されており、そして商業的な業者から入手可能である。
【０１２５】
Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路に進めるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）は発現ベクター内に提供される。前記の分泌シグナル配列は、前記タンパク質のものであってもよく、あるいは別の分泌タンパク質〔例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）〕のリーダー配列に由来するか、又はｄｅ  ｎｏｖｏ合成したものであってもよい。前記の分泌シグナル配列は、正確な読み枠でＺｔｇｆβ−９  ＤＮＡ配列に連結する。分泌シグナル配列は一般に、注目のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置しているが、あるシグナル配列は、注目のＤＮＡ配列のほかの場所に位置していることがある（例えば、Welch et al., 米国特許第5,037,743号；Holland et al., 米国特許第5,143,830号を参照のこと）。
【０１２６】
培養哺乳類細胞は、本発明において好ましい宿主である。外因性ＤＮＡを哺乳類の宿主細胞に導入する方法は、リン酸カルシウムによるトランスフェクション（Wigler et al., Cell 14 : 725 (1978) ; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 : 603 (1981) : Graham and Van der Eb, Virology 52 : 456 (1973))、エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1 :841-845 (1982))、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション（Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)）、及びリポソームによるトランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus 15 : 73 (1993) ; Ciccarone et al., Focus 15 : 80 (1993))を含む。培養哺乳類細胞での組換えポリペプチドの生成は、例えば、Levinson等の、米国特許第４，７１３，３３９号；Hagen 等の、米国特許第４，７８４，９５０号：Palmiter等の、米国特許第４，５７９，８２１号；及びRingold の、米国特許第４，６５６，１３４号に開示されている。適当な培養哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ATCC No. CRL 1650)、ＣＯＳ−７（ATCC No. CRL 1651)、ＢＨＫ（ATCC No. CRL 1632)、ＢＨＫ５７０（ATCC No. CRL 10314）、２９３〔ATCC No. CRL 1573 ; Graham et al., J. Gen. Virol. 36 : 59-72 (1977) 〕及びチャイニーズハムスター卵巣（例えばCHO-K1 ; ATCC No. CCL 61）細胞系を含む。追加の適当な細胞系は当業界で知られており、そして公共の寄託機関、例えばAmerican Type Calture Collection (Rockville, Maryland）から入手可能である。通常、強力な転写プロモーター、例えばＳＶ４０又はサイトメガロウイルス由来のプロモーターが好ましい。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照のこと。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第４，５７９，８２１号及び第４，６０１，９７８号）及びアデノウイルスの主要な後期のプロモーターを含む。
【０１２７】
他の高等真核細胞は宿主細胞としても使用することができ、これは植物細胞、昆虫細胞及びトリの細胞を含む。植物細胞において遺伝子を発現させるためのベクターとしての、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の使用は、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11 : 47 (1987)に概説された。昆虫細胞の形質転換及びそこでの外来ポリペプチドの生成は、Guarino 等の、米国特許第５，１６２，２２２号及びＷＩＰＯ公開番号ＷＯ９４／０６４６３に開示されている。昆虫細胞は、通常、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の、組換えバキュロウイルスに感染することができる。Ｚｔｇｆβ−９をコードするＤＮＡは、ＡｃＮＰＶの多角体遺伝子のコード配列の代わりに、２つのうちの１つの方法によって、バキュロウイルスゲノムに挿入される。はじめのものは、野生型ＡｃＮＰＶと、ＡｃＮＰＶ配列に隣接するＺｔｇｆβ−９のｃＤＮＡを含むトランスファーベクターとの間の、相同的なＤＮＡの組換えの伝統的な方法である。適当な昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞は、野生型ＡｃＮＰＶで感染し、そしてＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモーター、ターミネーター及び隣接配列に作用可能に連結したＺｔｇｆβ−９ポリヌクレオチドを含んで成るトランスファーベクターによってトランスフェクションされる。King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System : A Laboratory Guide, (Chapman & Hall, London) ; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (oxford University Press, New York, New York, 1994) ; and, Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ 1995）を参照のこと。昆虫細胞における天然の組換えは、多角体プロモーターによって進められたＺｔｇｆβ−９を含む組換えバキュロウイルスをもたらすだろう。組換えウイルスの貯蔵物は、当業界で一般に使用される方法によって作製される。
【０１２８】
組換えバキュロウイルスを作製する第２の方法は、Luckow, V. A, et al., J Virol 67 : 4566 (1993)に記載の、トランスポゾンを基にした系を利用する。この系は、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃキット（Life Technologies, Rockville, MD）で販売されている。この系は、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードするＤＮＡを、“バクミド”と称される巨大なプラスミドとしてＥ．コリで維持されるバキュロウイルスゲノムに移動させるための、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃｌ（商標）（Life Technologies ）を利用している。前記のｐＦａｓｔＢａｃｌ（商標）のトランスファーベクターは、注目の遺伝子、この場合はＺｔｇｆβ−９の発現を進めるＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターを利用する。しかし、ｐＦａｓｔＢａｃｌ（商標）はかなりの程度まで修飾することができる。前記のポリヘドリンプロモーターは、除去し、そしてバキュロウイルスの感染の初期に発現し、そして分泌タンパク質を発現するのに有利であることが示された、バキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター（Ｐｃｏｒ，ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られている）で置換することができる。Hill-Perkins, M.S. and Posses, R.D., J Gen Virol 71 : 971 (1990) ; Bonning, B.C. et al., J Gen Virol 75 : 1551 (1994) ; and, Chazenbalk, G.D., and Rapoport, B., J Biol Chem 270 : 1543 (1995)を参照のこと。その様なトランスファーベクターのコンストラクトにおいて、塩基性タンパク質プロモーターの短い又は長いものを使用することができる。更に、トランスファーベクターは、天然のＺｔｇｆβ−９分泌シグナル配列を、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列と交換して構築することができる。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチのメリチン（Invitrogen, Carlsbad, CA）、又はバキュロウイルスｇｐ６７（PharMingen, San Diego, CA)由来の分泌シグナル配列は、天然のＺｔｇｆβ−９分泌シグナル配列と交換するために、コンストラクト内で使用することができる。更に、トランスファーベクターは、発現したＺｔｇｆβ−９ポリペプチドのＣ又はＮ末端で、エピトープタグをコードするＤＮＡ、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕエピトープタグ（Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 7952 (1985)）によるインフレーム融合を含むことがある。当業界で知られている技術を用いて、Ｚｔｇｆβ−９を含むトランスファーベクターは、Ｅ．コリを形質転換し、そして組換えバキュロウイルスの挿入されるｌａｃＺ遺伝子の暗示を含むドクミドでスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドＤＮＡは、一般的な技術を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda)細胞、例えばＳｆ９細胞にトランスフェクションするために使用される。その結果、Ｚｔｇｆβ−９を発現する組換えウイルスが生成する。組換えウイルスの貯蔵物は、当業者で一般的に使用される方法によって作製される。
【０１２９】
前記の組換えウイルスは、宿主細胞、典型的にシロヤナガ（ｆａｌｌ  ａｒｍｙ  ｗｏｒｍ）、スポドプテラ・フルギペルダ由来の細胞系を感染させるために使用される。通常、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology : Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C. (1994）を参照のこと。別の適当な細胞系は、Ｈｉｇｈ  ＦｉｖｅＯ（商標）の細胞系であり、これはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（米国特許第５，３００，４３５号）に由来する。市販の無血清培地は、前記の細胞を生育し、そして維持するために使用される。適当な培地は、Ｓｆ９細胞の場合、Ｓｆ９００II（商標）（Life Technologies）又はＥＳＦ９２１（商標）（Expression Systems) であり；そしてＴ．ニ細胞の場合、ＥｘｃｅｌｌＯ４０５（商標）（JRH Biosciences, Lenexa, KS ）又はＥｘｐｒｅｓｓ  ＦｉｖｅＯ（商標）である。前記の細胞は、約２〜５×１０5 細胞の接種密度から１〜２×１０6 の密度で生育し、このとき、組換えウイルスの保存物は０．１〜１０の感染多重度（ＭＯＩ）で加えられ、更に典型的には３付近である。前記の組換えウイルスに感染した細胞は、典型的に感染後１２〜７２時間で組換えＺｔｇｆβ−９ポリペプチドを関連し、そして様々な効率で、それを培地に分泌する。培養物は、通常、感染後４８時間で採集する。遠心は、培地（上清）から細胞を分離するために使用する。ｚ*** ポリペプチドを含む上清は、通常０．４５μｍの孔の大きさの、微孔質フィルターを介して濾過される。使用する方法は、一般的に入手可能な研究の手引き書（King, L.A. and Possee, R.D., ibid. ; O'Reilly, D.R. et al., ibid. ; Richardson, C.D., ibid）に記載されている。次の、前記の上清からのＺｔｇｆβ−９ポリペプチドの精製は、本明細書に記載の方法を用いて達成することができる。
【０１３０】
薬剤選択は、通常外来ＤＮＡが挿入された培養哺乳類細胞を選択するために使用される。その様な細胞は、一般的に“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そして前記の注目の遺伝子をそれらの子孫に伝えることができる細胞は、“安定なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型の薬剤、例えばＧ−４１８などの存在下で行われる。選択系は、注目の遺伝子の発現レベルを増大させるために使用してもよく、この方法は“増幅”と呼ばれる。増幅は、低濃度の選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に高レベルの、導入した遺伝子の生成物を生成する細胞を選択するために、選択剤の量を増やすことで行われる。好ましい増幅可能な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を与える、ジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数の薬剤耐性、及びピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用することができる。
【０１３１】
他の高等真核細胞も宿主として使用することができ、これは昆虫細胞、植物細胞及びトリの細胞を含む。昆虫細胞の形質転換及びその中での外来ポリペプチドの生成は、Guarino 等の、米国特許第５，１６２，２２２号；Bang等の、米国特許第４，７７５，６２４号；及びＷＩＰＯ公開番号ＷＯ９４／０６４６３に開示されている。植物細胞において遺伝子を発現させるためのベクターとしての、アグロバクテリウム・リゾジェネスの使用は、Shinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11 : 47-58 (1987)に概説された。
【０１３２】
酵母細胞、及び特にサッカロミセス属の細胞を含む菌細胞は、本発明において、例えばタンパク質フラグメント又はポリペプチド融合物を生成するために使用することもできる。外因性ＤＮＡで酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成する方法は、例えばKawasakiの、米国特許第４，５９９，３１１号；Kawasaki等の、米国特許第４，９３１，３７３号；Brake の、米国特許第４，８７０，００８号；Welch 等の、米国特許第５，０３７，７４３号；及びMurray等の、米国特許第４，８４５，０７５号に開示されている。形質転換した細胞は、選択マーカー、一般に薬剤耐性又は特定の栄養素（例えばロイシン）の非存在下で生育する能力によって決定される表現型によって決定される。酵母における使用のための好ましいベクター系は、Kawasaki等の、米国特許第４，９３１，３７３号に開示されているＰＯＴ１ベクター系であり、これは、形質転換した細胞をグルコース含有培地における増殖によって選択することができるようにするものである。酵母における使用に適当なプロモーター及びターミネーターは、グルコース分解酵素遺伝子由来のもの（例えば、Kawasakiの、米国特許第４，５９９，３１１号；Kingsman等の、米国特許第４，６１５，９７４号；及びBitterの、米国特許第４，９７７，０９２号を参照のこと）及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを含む。米国特許第４，９００，４４６号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６号及び第４，６６１，４５４号も参照のこと。ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ギレルモンジイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）及びカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）を含む、他の酵母の形質転換系が当業界で知られている。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 : 3459-3465 (1986）及び、Cregg の、米国特許第４，８８２，２７９号を参照のこと。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞を、McKnight等の、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従い利用することもできる。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換する方法は、Sumino等の、米国特許第５，１６２，２２８号に開示されている。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換する方法は、Lambowitz の、米国特許第４，４８６，５３３号に開示されている。
【０１３３】
細菌エスケリッチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）・コリ、バチルス及び他の属の菌株を含む原核宿主細胞も、本発明における有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、そしてその中でクローン化した外来のＤＮＡ配列を発現する技術は当業界で公知である（例えば、Sambrook等の上記のものを参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてＺｔｇｆβ−９ポリペプチドを発現するとき、前記のポリペプチドは細胞質で、典型的には不溶性顆粒として維持されるか、又は細菌の分泌配列によって周縁質空間に向かうことがある。前者の場合、前記細胞は溶解され、そして顆粒は回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて変性される。前記の変性したポリペプチドは、続いて再生され、そして変性剤を希釈することで、例えば尿素溶液並びに還元及び酸化したグルタチオン混合液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析によって二量体化することができる。後者の場合、前記ポリペプチドは、細胞を破壊して（例えば、超音波又は浸透圧の衝激による）、周縁質空間の成分を放出させ、そして前記タンパク質を回収し、それによって変性及び再生の必要性を回避するこで、周縁質空間から、可溶性及び機能的な型で回収することができる。
【０１３４】
形質転換した又はトランスフェクションした宿主細胞は、選択した宿主細胞の生育に必要な栄養素及び他の成分を含む培養培地中で、常用の方法に従い培養される。限定した培地及び複合培地を含む、様々な適当な培地が当業界で知られており、そして通常、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地は、更に、必要な増殖因子又は血清の様な成分を含むこともある。増殖培地は通常、例えば、発現ベクター上にある選択マーカーによって補足されるか、又は宿主細胞に同時トランスフェクションされる、薬剤耐性又は必須栄養素の欠損によって、外来から加えられたＤＮＡを含む細胞を選択するだろう。
【０１３５】
本発明の１つの観点において、新規タンパク質は培養細胞によって生成し、そして前記細胞又は前記タンパク質は、天然の受容体を含む、前記タンパク質のための１又は複数の受容体、並びに相互作用するタンパク質、例えば二量体の重合相手、天然のリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用される。
【０１３６】
タンパク質の単離：
発現した組換えポリペプチド（又はキメラポリペプチド）は、分画並びに／又は常用の１又は複数の精製方法を用いて精製することができる。硫安沈澱及び酸又はカオトロープ抽出を、試料の分画に使用してもよい。例示的な精製段階は、ハイドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆層高性能液体クロマトグラフィーを含んでいてもよい。適当な陰イオン交換媒体は、誘導デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカなどを含む。ＰＥＩ，ＤＥＡＥ，ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましく、ＤＥＡＥファーストフローセファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ ）が特に好ましい。例示的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチル、又はオクチル基で誘導した媒体、例えばフェニルセファロースＦＦ（Pharmacia ）、トヨパールブチル６５０（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチルセファロース（Pharmacia ）など；又はポリアクリル樹脂、例えばアンバークロムＣＧ７１（Toso Haas)などを含む。適当な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカを基ににした樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋したアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋したポリアクリルアミド樹脂などを含み、これらは、それらが使用されうる条件下で不溶性である。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物部分によるタンパク質の結合をさせる反応基によって修飾することができる。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、並びにカルボジイミドのカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を含む。これら及び他の固体媒体は、当業界で公知でありそして幅広く使用されており、そして商業的な業者から入手可能である。支持媒体に受容体ポリペプチドを結合させる方法は、当業界で公知である。特定の方法の選択は、一般的な設計の問題であり、そして選択した支持体の特性によって部分的に決定される。例えば、Affinity Chromatography : Principles & Methods（Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988）を参照のこと。
【０１３７】
本発明のポリペプチドは、それらの特性の利用によって単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーは、ヒスチジンが豊富なタンパク質を精製するために使用することができる。簡単に述べると、ゲルが、はじめに二価の金属イオンを帯びて、キレートを形成する〔E. Salkowski, Trends in Biochem. 3 : 1-7 (1985）〕。ヒスチジンが豊富なタンパク質は、使用した金属イオンに依存して、異なる親和性を有するこのマトリックスに吸着し、そしてpHを低下させる競合的な溶出、又は強力なキレート剤の使用によって溶出されるだろう。他の精製方法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによる、グリコシル化したタンパク質の精製を含む〔Methods in Enzymol., Vol. 182 : 529-39, “Guide to Protein Puritication”, M. Deutsher, (ed.), (Acad. Press, San Diego, 1990）〕。あるいは、注目のポリペプチドと親和性タグ（例えば、ポリヒスチジン、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）との融合体は、精製を容易にするために構築されることがある。更に、分泌タンパク質の精製を容易にするために、アミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えばポリヒスチジンタグ、Ｐ物質、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド〔Hopp et al., Bio/Technology 6 : 1204-1210 (1988) ; Eastman Kodak Co., New Haven, CT から入手可能〕、Ｇｌｕ−Ｇｌｕアフィニティータグ〔Grussen meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 7952-4 (1985) 〕、あるいは抗体又は他の特異的な結合因子が入手可能である、別のポリペプチド又はタンパク質は、精製において保護するために、Ｚｔｇｆβに融合することができる。
【０１３８】
“トランスジェニックマウス”と称される、Ｚｔｇｆβ−９遺伝子を発現する様に操作されたマウス及び“ノックアウトマウス”と称される、Ｚｔｇｆβ−９遺伝子の完全な不在を示すマウスも生成することができる（Snouwaert et al., Science, 257 : 1083 (1992) ; Lowell, et al., Nature, 366 : 740-742 (1993) ; Capecchi, M. R., Science, 244 : 1288-1292, (1989) ; Palmiter, R.D. et al., Annu. Rev. Genet., 20 : 465-499, (1986)）。例えば、広範にあるいは組織特異的又は組織を限定したプロモーターのもとで、そのいずれかでＺｔｇｆβ−９を過剰発現するトランスジェニックマウスは、過剰発現が表現型をもたらすかどうかを調べるために使用することができる。例えば、野生型Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチド、そのポリペプチドフラグメント又は変異体は、Ｚｔｇｆβ−９の発現が機能的に明らかである組織を同定する、表現型をもたらす正常な細胞の過程を変化させることがあり、そしてＺｔｇｆβ−９タンパク質、遺伝子、そのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的な標的を示すことがある。更に、その様な過剰発現は、ヒトの疾患との類似性を示す表現型を生じることもある。同様に、ノックアウトＺｔｇｆβ−９マウスは、Ｚｔｇｆβ−９がｉｎ  ｖｉｖｏで絶対的に必要とされる場所を決定するために使用することができる。ノックアウトマウスの表現型は、Ｚｔｇｆβ−９アンタゴニストのそのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を予言する。ヒトＺｔｇｆβ−９ｃＤＮＡは、マウスＺｔｇｆβ−９ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを単離するために使用することができ、次にこれらはノックアウト又はトランスジェニックマウスを生成するために使用される。これらのマウスは、Ｚｔｇｆβ−９遺伝子及びそれにコードされるタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏ系で研究するために適用されることがあり、そしてヒトの疾患に相当するｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして使用することができる。更に、Ｚｔｇｆβ−９アンチセンスポリヌクレオチド又はＺｔｇｆβ−９に対するリボザイム又はＺｔｇｆβ−９に対する一本鎖抗体のトランスジェニックマウスの発現は、更にＺｔｇｆβ−９の生物学を結論づけるために使用することができる。
【０１３９】
使用
Ｚｔｇｆβ−９の発現のノーザンブロット解析は、Ｚｔｇｆβ−９が、脳及び脊髄で高度に発現することを明らかにする。従って、Ｚｔｇｆβ−９は、グリア細胞又はニューロンのいずれかと関わる脊髄の維持における役割を果たすと思われる。このことは、Ｚｔｇｆβ−９が、様々な神経変性病、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病及び末梢神経細胞障害、又は多発性硬化症を含む脱髄病を処置するために使用することができることを示す。Ｚｔｇｆβ−９の発現の組織特異性は、Ｚｔｇｆβ−９が脊髄及び脳における増殖及び／又は維持因子であり、これを脊髄、脳又は末梢神経系の損傷の処置に使用できることを示す。Ｚｔｇｆβ−９は、単にウイルス感染を処置するために誰かしらに投与することもできる。
【０１４０】
本発明は、有意な治療的価値を有する試薬も提供する。Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチド（天然又は組換え）、そのフラグメント、それに対する抗体及び抗イディオタイプ抗体は、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドに対する結合親和性を有するとして同定された化合物と一緒に、異常な生理学又は発生に関連する症状の処置に有用であるべきであり、これは異常な増殖、例えばガン性の症状、又は変性的な症状を含む。例えば、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドの異常な発現又は異常なシグナル伝達に関連する疾患又は障害は、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの推定される標的であるべきである。特に、Ｚｔｇｆβ−９は炎症を処置するために使用することができる。炎症は、感染に対する免疫応答、又は自己抗原に対する自己免疫応答の結果である。
【０１４１】
Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドに対する抗体は、精製して、そして次に患者に投与することができる。これらの試薬は、治療的な使用のために、追加の活性又は不活性成分、例えば生理学的に無害な安定化剤及び補形薬と一緒の医薬として許容される担体又は希釈剤と組合わせることができる。これらの組合わせは、滅菌濾過し、そして投与容器中での凍結乾燥による投与形態又は安定化した水性製剤での保存に置くことができる。この発明は更に、抗体、その結合フラグメント又は補体結合ではない型を含む前記抗体の一本鎖抗体の使用を考慮する。
【０１４２】
効果的な治療に必要な試薬の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及び他の投与した薬物を含む、多くの異なる因子に依存するだろう。従って、処置量は、安全性及び効きめを最適化するために滴定されるべきである。典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する投与量は、これらの試薬のｉｎ  ｖｉｖｏ投与に有用な量で、有用な指示を提供することがある。特定の障害の処置のための有効量の動物試験は、ヒトの投与量の更なる予言的な指示を提供するだろう。投与方法は、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、又は経皮投与を含む。医薬として許容される担体は、いくつか例示するために、水、塩溶液又は緩衝液を含むだろう。投与量の範囲は、通常、１日当たり、体重のキログラム当たり、１μｇ〜１０００μｇが予想されるだろう。しかし、投与量は当業界で通常の技術を有する医者によって決定することができる様に、それより高いか又は低くてもよい。薬剤製剤及び投与量の範囲の完全な考察のために、Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1990 ）及びGoodman and Gilman's : The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9th Ed. (Pergamon Press 1996）を参照のこと。
【０１４３】
核酸を基にした治療的処置
哺乳類が変異したＺｔｇｆβ−９遺伝子を持つか又はＺｔｇｆβ−９を欠損しているならば、Ｚｔｇｆβ−９遺伝子を、前記の哺乳の細胞に導入することができる。１つの態様において、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドをコードする遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ウイルスベクターに導入される。その様なベクターは、弱毒化した又は欠陥のＤＮＡウイルス、例えば：限定しないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＳＶ４０などを含む。完全に又はほぼ完全にウイルス遺伝子を欠損している欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞への導入後に感染しない。欠陥ウイルスベクターの使用は、前記ベクターが他の細胞に感染することができることに関係なく、特異的な、局所的な領域における、細胞への投与を与える。特定のベクターの例は、限定しないが、欠陥ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター〔Kaplitt et al., Molec. Cell, Neurosci., 2 : 320-330 (1991)〕、弱毒化したアデノウイルスベクター、例えばStratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90 : 626-630 (1992) に記載のベクター、及び欠陥アデノ随伴ウイルスベクター〔Samulski et al., J. Virol., 61 : 3096-3101 (1987) ; Samulski et al., J. Virol., 63 : 3822-3828 (1989）〕を含む。
【０１４４】
別の態様において、前記遺伝子は、レトロウイルスベクター、例えばAnderson等の、米国特許第５，３９９，３４６号；Mann et al., Cell, 33 : 153 (1983) ; Temin等の、米国特許第４，６５０，７６４号；Temin 等の、米国特許第４，９８０，２８９号；Markowitz et al., J. Virol., 62 : 1120 (1988) ; Temin 等の、米国特許第５，１２４，２６３号；Dougherty 等によって、１９９５年３月１６日に発表された、国際特許公開番号ＷＯ９５／０７３５８；及びBlood, 82 : 845 (1993)、に記載のものに導入することができる。
【０１４５】
あるいは、前記ベクターは、リポソームを用いるｉｎ  ｖｉｖｏでのリポフェクションによって導入することもできる。合成陽イオン性脂質を、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用することができる〔Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 7413-7417 (1987) ; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 8027-8031 (1988)を参照のこと〕。外因性の遺伝子を、特異的な器官にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するためのリポフェクションの使用は、ある実際的な利点を有する。特異的な細胞に対するリポソームの分子標的化は、利益の一面を表す。特定の細胞型への直接的なトランスフェクションが、細胞の異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓、及び脳において特に有利なことは明らかである。脂質は、標的化のための他の分子に化学的にカップリングしてもよい。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体、又は非ペプチド分子は、リポソームに化学的にカップリングすることができる。
【０１４６】
身体から細胞を摘出し、裸のＤＮＡプラスミドとして、又はウイルスベクターによって、前記ベクターを導入し、そして次に形質転換した細胞を身体に再移植することが可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当業界で公知の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用又はＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞に導入することができる〔例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 267 : 963-967 (1992) ; Wu et al., J. Biol. Chem., 263 : 14621-14624 (1988)を参照のこと〕。Ｚｔｇｆβ−９の、ウイルスベクターを介する遺伝子輸送の様な技術は、ヒトの疾患、例えばガン、免疫及び自己免疫疾患、並びに中枢及び末梢神経系の疾患を処置するために使用することができる。
【０１４７】
Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドは、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するために使用することもできる。これらの抗体は、その結果抗イディオタイプ抗体を製造するために使用することができる。本明細書で使用する場合、“抗体”の語句は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）2 及びＦａｂフラグメントなどを含み、これは、遺伝子操作した抗体も含む。抗体は、それらが１０7 ／Ｍ以上又はそれに等しいＫa で、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドに結合し、そしてそれらが実質的に従来技術のポリペプチドに結合しないならば、特異的に結合すると定義される。モノクローナル抗体の親和性は、当業界の通常の技術の１つによって、例えばスキャッチャード解析を用いることで容易に決定することができる。
【０１４８】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造方法は、当業界で公知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, (Second Edition) (Cold Spring Harbor NY, 1989)；及びHurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982）を参照のこと）。ポリクローナル抗体は、様々な温血動物、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、ハムスター、モルモット及びウサギを、Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチド又はそのフラグメントで接種することによって生成することができる。Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばミョウバン（水酸化アルミニウム）又は完全若しくは不完全フロインドアジュバントを介して増大させることもできる。免疫感作に有用なポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えばＺｔｇｆβ−９又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体も含む。前記ポリペプチドの免疫原は、完全長の分子又はその一部であってもよい。前記ポリペプチドの一部が“ハプテン様”ならば、その様な一部は、免疫感作のために高分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はテタヌストキシド）に、有利に結合又は連結していてもよい。当業者に知られている様々なアッセイは、Ｚｔｇｆβ−９に特異的に結合する抗体を検出するために利用することができる。例示的なアッセイは、Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に詳細に記載されている。その様なアッセイの代表的な例は：同時の免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、阻害又は競合アッセイ、及びサンドイッチアッセイを含む。
【０１４９】
本明細書で使用する場合、“抗体”の語句は、ポリクローナル抗体、親和性精製したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、並びに抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）2 及びＦａｂタンパク質分解的フラグメントを含む。遺伝子操作した無傷な抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体など、並びに合成した抗原結合ペプチド及びポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトＣＤＲを、ヒトの骨格及び定常領域に移植するか、全体の非ヒト可変ドメインを組込むことでヒト化することができる（任意に、暴露している残基の置換により、ヒト様の表面でそれらを“覆う”ことによって、“虚飾”の抗体となる）。いくつかの例において、ヒト化した抗体は、適当な結合特性を増強するために、ヒト可変領域の骨格ドメイン内で、非ヒト残基を維持することがある。抗体をヒト化することによって、生物学的な半減期が増大することがあり、そしてヒトへの投与による有害な免疫反応の潜在性が低下する。ヒト抗体は、ヒトの免疫グロブリン部位を含むように操作されたマウスで生成することができる（Vaughan, et al., Nat. Biotech., 16 : 535-539 (1998))。
【０１５０】
本明細書で有用な抗体の生成又は選択のための別の技術は、Ｚｔｇｆβ−９タンパク質又はペプチドへの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリンパ球の暴露、及びファージ又は類似のベクターの抗原提示ライブラリーの選択を含む（例えば、固定化した又は標識したＺｔｇｆβ−９タンパク質又はペプチドの使用を介する）。潜在的なＺｔｇｆβ−９ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージの提示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いくつかの方法、例えば無作為突然変異導入法及び無作為ポリヌクレオチド合成によって得ることができる。これらのランダムペプチド提示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチド、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成的高分子、あるいは有機性又は無機性物質であってもよい、既知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングするために使用することができる。その様なランダムペプチド提示ライブラリーを作製し、そしてスクリーニングするための技術は当業界で公知であり（Lander等の、米国特許第５，２２３，４０９号；Lander等の、米国特許第４，９４６，７７８号；Lander等の、米国特許第５，４０３，４８４号及びLander等の、米国特許第５，５７１，６９８号）、そしてランダムペプチド提示ライブラリー及びその様なライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ）から、商業的に入手可能である。ランダムペプチド提示ライブラリーは、Ｚｔｇｆβ−９に結合するタンパク質を同定するために、本明細書で開示したＺｔｇｆβ−９の配列を用いてスクリーニングすることができる。Ｚｔｇｆβ−９ポリペプチドと相互作用するこれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識するために；親和性精製で相同性ポリペプチドを単離するために使用することができ；それらは、薬剤、毒素、放射性ヌクレオチドなどに直接的又は間接的に複合することができる。これらの結合タンパク質は、分析的な方法で、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用することができる。前記の結合タンパク質は、ポリペプチドの循還レベル決定するため；もととなっている病理学又は疾患のマーカーとしての可溶性ポリペプチドを検出又は定量するための、診断的アッセイに使用することができる。これらの結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＺｔｇｆβ−９の結合及びシグナル伝達を防ぐための、Ｚｔｇｆβ−９の“アンタゴニスト”として働くこともできる。
【０１５１】
抗体は、遺伝子治療によって生成させることもできる。動物は、Ｚｔｇｆβ−９又はその免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを投与され、その結果、前記動物の細胞は核酸でトランスフェクションされ、そして順番に免疫原性の応答を導くタンパク質を発現する。前記の動物によって生成する抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の型で単離される。Ｚｔｇｆβ−９に対する抗体は、前記タンパク質を発現する細胞を標識するために、親和性精製のために、診断的なアッセイにおいて可溶性タンパク質ポリペプチドの循還レベルを決定するためにそして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのリガンド結合及びシグナル伝達を防ぐためのアンタゴニストとして使用することができる。
【０１５２】
放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳類の染色体の高い解像度の、隣接したマップのために開発した体細胞の遺伝的技術である〔Cox et al., Science 250 : 245-250 (1990)〕。遺伝子配列の部分的又は完全な知識は、染色体の放射線ハイブリッドマッピングパネルとの使用に適したＰＣＲプライマーの設計をすることができる。ヒトゲノム全体を覆う市販の放射線ハイブリッドマッピングパネル、例えばスタンフォードＧ３ＲＨパネル及びＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ＲＨパネル（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL ）が入手可能である。これらのパネルは、素速い、ＰＣＲに基づいた、染色体の局在、そして遺伝子、配列標識部位（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｔｅ）（ＳＴＳ）、並びに注目の領域内の、他の非多型性及び多型性マーカーの順序決定を可能にする。このことは、注目の新規に発見した遺伝子と、既にマッピングされたマーカーとの間の、直接的な比率の物理的距離の確立を含む。遺伝子の位置の正確な知識は、１）配列が、存在しているコンティグの一部であるかどうかを決定し、そして様々な型、例えばゲノムＹＡＣ−、ＢＡＣ−又はファージゲノムのクローンあるいはｃＤＮＡクローンでの、追加の周りの遺伝的配列を得て、２）同一の染色体領域に対して連鎖を示す、遺伝しない疾患の可能性のある候補遺伝子を提供し、そして３）モデル生物、例えば特定の遺伝子がどの様な機能を有するかを決定することを助けるのに有用なマウスと相互参照することを含む、いくつかの方法において有用であることがある。
【０１５３】
本発明は更に、診断的な適用における使用を見出す試薬を提供する。例えば、前記のＺｔｇｆβ−９遺伝子は、染色体１３ｑ１１．２−ｑ１１にマッピングされた。Ｚｔｇｆβ−９の核酸プローブは、第１３染色体の異常を調べるために使用することができる。例えば、Ｚｔｇｆβ−９のＤＮＡ又はＲＮＡあるいはその一部を含んで成るプローブは、Ｚｔｇｆβ−９がヒト染色体１３ｑ１１．２−ｑ１１上に存在するか又は変異が起きたかを決定するために使用することができる。Ｚｔｇｆβ−９遺伝子の遺伝子座の、検出可能な染色体異常は、限定しないが、異数性、遺伝子のコピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化及び再編成を含む。その様な異常は、分子遺伝学的な技術、例えば制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ショートタンデムリピート（Short tandem repeat (STR))解析を利用するＰＣＲ技術、及び当業界で知られている他の遺伝子連鎖解析を利用することによって、本発明のポリペプチドを用いて検出することができる。ヒトＺｔｇｆβ−９は１３ｑ１１．２−ｑ１１領域にマッピングされている。マウスＺｔｇｆβ−９は、それぞれ２２．０と１９．５センチモルガンに位置するマウスの第１４染色体骨格マーカーｄ１４ｍｉｔ６４及びｄｍｉｔ８２にマッピングされている。前記の１９．５cm領域は、ギャップ結合遺伝子ｇｊａ３及びｇｊｂ２を含む、ヒトの遺伝子座と相同性があるようである。Mignon, C. et al., Cytogenet. Cell Genet. 72 : 185-186 (1996）を参照のこと。
【０１５４】
本発明は、次の限定しない例によって更に例示される。
【０１５５】
例１
Ｚｔｇｆβ−９のクローニング
ヒトＺｔｇｆβ−９は、配列番号６及び７を用いるＰＣＲスクリーニングによって整列した下垂体ｃＤＮＡプラスミドライブラリーから単離した。サーマルサイクラーの条件は、以下の通りとした：９４℃、３分間（１周期）、９４℃、３秒間（３５周期）、６２℃、２０秒間、７２℃、３０秒間、７２℃、５分間（１周期）、そして４℃で保持した。反応は、ポジティブなプールを同定するためにゲル電気泳動し、そしてこの方法において、前記ライブラリーはポジティブなクローンのプールに減らされた。これらを、Ｅ．コリＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションし、そしてコロニーハイブリダイゼーションのために蒔いた。コロニーは、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎフィルター（Amersham）に移され、そしてポジティブなコロニーが探索された。ポジティブなクローンは、完全長のＺｔｇｆβ−９のために配列決定した。
【０１５６】
前記のヒトＺｔｇｆβ−９ｃＤＮＡ（配列番号１及び１６）の配列解析及び概念翻訳は、長さが２０２アミノ酸残基の生成物を予想する。このタンパク質は、ＩＬ−１７ファミリーの２つのメンバーＺｃｙｔｏ７（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０８２１２）、及びＩＬ−１７と相同性がある。Ｚｔｇｆβ−９は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアを用いるＣｌｕｓｔａｌ法で決定した場合に、Ｚｃｙｔｏ７と２７．８％のアミノ酸同一性及びＩＬ−１７と２０．６％の同一性を共有する。Higgins and Sharp, CABIOS 5 : 151 (1989)を参照のこと。特に、Ｚｔｇｆβ−９は、Ｚｃｙｔｏ７及びＩＬ−１７と、４つの保存されたシステイン（配列番号２のアミノ酸残基１１４，１１９，１６７，１６９）を共有する。これらのシステインは、ＴＧＦ−βタンパク質に見られるものに関するシステインの結び目様タンパク質の折りたたみを形成するのに関与していることが予想される。
【０１５７】
例２
Ｚｔｇｆβ−９のノーザンブロット解析
組織分布の解析は、２つの成人及び胎児のヒトの脳のブロット、Clontech社（Palo Alto, CA)のヒトの複数の組織及びマスタードットブロットを用いる、ノーザンブロット技術によって行った。プローブは、ｃＤＮＡプールの配列番号６及び７を用いたＰＣＲによって得た。サーマルサイクラーの条件は以下の通りとした：９４℃、３分間（周期）、９４℃、１０秒間（３５周期）、６６℃、２０秒間、７２℃、３０秒間、７２℃、５分間（１周期）、そして４℃で保持した。反応混合物は、調製済みのアガロースゲルで電気泳動され、そして１６２bpのフラグメントを、市販のゲル精製試薬及びプロトコール（ＱＩＡＥＸ  IIゲル抽出キット；Qiagen, Inc., Santa Clarita, CA)を用いてゲル精製した。精製したＤＮＡは市販のキット（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム；Amersham Corp., Arlington Heights, IL）を用いて、32Ｐで放射性標識した。前記のプローブは、ＮＵＣＴＲＡＰプッシュカラム（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）を用いて精製した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ（Clontech, Palo Alto, CA)溶液は、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーション溶液は、８mlのＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ、８０μｌの剪断したサケの精子ＤＮＡ（１０mg／ml，５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，  ＣＯ）、４８μｌのヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ（１mg／ml，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）及び１８μｌの放射性標識したプローブから成る。次に、５０℃で行ったハイブリダイゼーション及びブロットは、室温の２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、その後、６０℃の２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、更に６０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。前記ブロットは一晩暴露し、そして展開した。主要な転写のシグナルは、脳及び脊髄のＭＴＮブロット上で観察された。
【０１５８】
マスタードットブロットのシグナルは、全ての脳組織（成人及び胎児）、脊髄、心臓、骨格筋、胃、膵臓、副腎、唾液腺、肝臓、小腸、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、甲状腺、気管、精巣、卵巣及び胎盤で強力であった。
【０１５９】
例３
マウスＺｔｇｆβ−９のクローニング
完全長の配列を、整列したマウスの精巣ｃＤＮＡ／プラスミドライブラリーから得た。前記ライブラリーを、配列番号１０及び１１のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによってスクリーニングした。前記ライブラリーは、２５０個のクローンのポジティブなプールに減らされた。Ｅ．コリＤＨ１０Ｂ細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を、エレクトロポレーションによって、このプールで形質転換した。形質転換した培養物を滴定し、そして〜２０細胞／穴で９６穴プレートに配置した。前記細胞を、３７℃で一晩、ＬＢａｍｐ中で生育した。前記細胞のアリコートを沈澱させ、そしてポジティブなプールを同定するためにＰＣＲを使用した。ポジティブなプール由来の残りの細胞を蒔き、そしてコロニーを、ポジティブなクローンを同定するためのＰＣＲによってスクリーニングした。前記のクローンを配列決定し、そしてそれらは予想される完全長のマウスＺｔｇｆβ−９の配列を含んでいた。マウスのＺｔｇｆβ−９の配列は、配列番号８及び９に定義する。
【０１６０】
例４
マウスＺｔｇｆβ−９のノーザンブロット解析
ノーザンブロット解析は、マウスＭＴＮ及びマスタードットブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びマウスの胚のブロットで行った。完全長のマウスＺｔｇｆβ−９のｃＤＮＡクローン（クローニングの項を参照のこと）を、標準的なプロトコールに従い、ＡｐａＩ及びＥｃｏＲＩで制限分解した。反応物をゲル電気泳動し、そして〜６８６bpのフラグメントは、ＱｉａｅｘIIゲル精製キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いてゲル精製した。前記のｃＤＮＡを、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅII標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＰ３２標識し、そして前述した試薬及びプロトコールを用いてカラム精製した。ハイブリダイゼーション、洗浄、及び検出は、例２に記載の条件下で行った。バンドは、心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣で観察された。前記のマスタードットブロットは、甲状腺で強力なシグナルを持ち、多くの他の組織においてそれより薄いシグナルだった。マウスの胚のブロットに対するハイブリダイゼーションは、Ｚｔｇｆβ−９が試験した全ての時期（７，１１，１５、及び１７日目の胚）で発現したことを示した。
【０１６１】
定量的ＰＣＲによって、マウスＺｔｇｆβ−９は、ＨＣＬ視床下部細胞系において高度に発現し、そしてＧＴ１−１及びＧＴ１−７視床下部細胞系及び末分化のＰ１９奇形がん腫細胞系では低レベルであった。定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、マウスＺｔｇｆβ−９が、海馬の小脳及び嗅覚皮質のニューロンで検出され、プルキンエ細胞及び他の神経群は、脳の切片において重度に標識された、脈絡叢の内皮は、更に重度にポジティブであった。脊髄において、標識は、灰色質に限定され、そして感覚及び運動神経を代表する後角及び前角神経に均一にみられることが明らかとなった。強力な発現は、後根神経節でも観察された。
【０１６２】
例５
抗体の生成
配列番号１３，１４及び１５のポリペプチドを合成し、そしてウサギに注射し、そして次に、ポリクローナル抗血清を、同族の抗原を用いるカラムクロマトグラフィーによって親和性精製した。更に、マルトース結合タンパク質のＣ末端に融合した完全長のヒトとマウスの、Ｚｔｇｆβ−９融合タンパク質を、Ｅ．コリで発現させ、そしてアミロース樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質をウサギに注射し、そして次に、ポリクローナル抗血清を、同族の免疫原を用いるカラムクロマトグラフィーによって親和性精製した。
【０１６３】
例６
免疫細胞化学
例５の手順に従い生成した、ヒトＺｔｇｆβ−９に対する、親和性精製したポリクローナル抗体を、標準的なＣＯＳ細胞及びＺｔｇｆβ−９の哺乳類細胞発現コンストラクトでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上で確認した。抗Ｚｔｇｆβ−９抗体で行った免疫細胞化学は、サルの脳及び脊髄におけるＺｔｇｆβ−９の発現を示した。前記の免疫細胞化学の染色は細胞質内であり、そして多くの巨大なニューロン及びプルキンエ細胞で観察された。ヒトの十二指腸に散在する上皮細胞も、ポジティブな染色を示した。
【０１６４】
例７
哺乳類細胞のタンパク質生成
Ｃ末端に、Ｇｌｕ−Ｇｌｕアフィニティータグ〔Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 7952-4 (1985)〕を持つヒトＺｔｇｆβ−９タンパク質、及び持たないものを、共にＢＨＫ細胞で発現させ、ここでは、Ｚｔｇｆβ−９の発現が、ＣＭＶ最初期プロモーター、マウスの免疫グロブリンの重鎖の位置の可変領域由来の共通イントロン、コード配列の挿入のための複数の制限部位、終止コドン及びヒトの成長ホルモンのターミネーターによって進められる、発現ベクターを用いる。前記プラスミドは更に、Ｅ．コリの複製起点、複製のＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び起点を有する哺乳類の選択マーカー発現単位、ＤＨＦＲ遺伝子並びにオープンリーディングフレームの５’末端のＳＶ４０ターミネーター及びＫｏｚａｃ配列を有する。
【０１６５】
安定な細胞のトランスフェクタントの選択の後、プールから回収した培地を、Ｚｔｇｆβ−９抗体又は抗ＥＥエピトープタグ抗体を用いて、還元及び非還元条件下で、ウエスタンブロットによる解析を行った。ヒトＺｔｇｆβ−９は、還元条件下で、２９KDa に移動することが明らかになった。前記タンパク質の完全にプロセシングされた型の予想される分子量が２０．３１KDa であるので、このことは、前記タンパク質が２つの潜在的なグリコシル化部位の１又は両方でグリコシル化されていることを示している。非還元条件下で、Ｚｔｇｆβ−９タンパク質は４９KDa の位置に移動した。これらの結果は、ヒトＺｔｇｆβ−９が、ジスルフィド架橋したホモ二量体を形成することができることを示している。しかし、Ｃ末端にＥＥタグを有するヒトＺｔｇｆβ−９及びタグのないヒトＺｃｙｔｏ７の同時発現、続く抗ＥＥタグ抗体を用いる親和性精製が、両方のタンパク質の同時精製をもたらし、このことはＺｔｇｆβ−９のホモ二量体に加えて、Ｚｔｇｆβ−９及びＺｃｙｔｏ７も二量体化することができることを示した。Ｚｔｇｆβ−９とＺｃｙｔｏ７との相互作用は、前記タンパク質間の、鎖間のジスルフィド結合に起因するものではないようである。ＢＨＫ細胞で発現した、Ｃ末端にＥＥタグを持つヒトＺｔｇｆβ−９は、更に抗ＥＥ親和性精製され、そしてそのＮ末端の配列が決定された。シグナル開裂部位は、アミノ酸Ａ２３まで進行して起こったことが見出された。
【０１６６】
例８
トランスジェニックマウス
完全長のマウスＺｔｇｆβ−９をコードするオープンリーディングフレームを、最適化した開始コドンを導入するようにＰＣＲによって増幅し、そしてＺｔｇｆβ−９の発現がメタロチオネインＩプロモーターによって調節される、トランスジェニックベクターに導入した。導入遺伝子の挿入物は、ＮｏｔＩ分解及びアガロースゲル精製によってプラスミド主鎖から分離し、そしてＢ６Ｃ３Ｆ１Ｔａｃマウスの交配由来の受精した卵子を、マイクロインジェクションし、そして偽妊娠の雌に移植した。創始者は、ゲノムのカルボキシル末端のＤＮＡ上のＰＣＲによって同定した（ＤＮＡｅａｓｙ  ９６  キット；Ｑｉａｇｅｎ）。トランスジェニック系は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｔａｃマウスと創始者を繁殖させることで開始した。この研究で使用した動物のプロトコールは、ZymoGenetics Institutional Animal Care及びUse Committee によって改良された。４９の子孫の出産から、８％のみが、トランスジェニックであることがわかり（前記の同一のプロモーターによって進んだ、様々な他のｃＤＮＡで観察された平均２０％と比較した結果）、このことはマウスＺｔｇｆβ−９の高い発現が、胎児期に死に至らせることを示している。これと一致して、同定した４匹の創始者の全てが、肝臓でＺｔｇｆβ−９ｍＲＮＡをわずかに低レベル発現した。５匹目の創始者は出産時に死亡し、そして興味深いことに、この動物は肝臓でＺｔｇｆβ−９ｍＲＮＡを非常に高レベルで発現した（８５００コピー／細胞）。この動物の組織病理学的な解析は、胸腺の深刻なアポトーシス及び褐色脂肪の完全な脈管遮断を同定した。発現している雄は、野生型の雌と繁殖させた。ある創始者は、生殖系列の伝達が可能であったが、この創始の全てのトランスジェニックな子孫が、出産時に死亡するか、又は離乳後すぐに萎縮してそして死亡するかのいずれかであった。これらの動物の解析は、深刻な胸腺のアポトーシス、褐色脂肪の脈管遮断、肝炎、及び少ないリンパ球の末梢血球数を含む、様々な表現型を同定した。これらの結果は、Ｚｔｇｆβ−９、そのアゴニスト及びアンタゴニスト、並びにＺｔｇｆβ−９に対する抗体が、免疫細胞、脂肪生成、及び肝細胞の調節に有用であることを示している。
【０１６７】
例９
染色体位置
ヒトＺｔｇｆβ−９は、２つの放射線ハイブリッドパネル上で、染色体１３ｑ１１．２にマッピングがされた。マウスのＺｔｇｆβ−９遺伝子は、それぞれ２２．０及び１９．５センチモルガンに位置する、第１４染色体の骨格マーカーｄ１４ｍｉｔ６４及びｄｍｉｔ８２に連結している。
【０１６８】
例１０
Ｚｔｇｆβ−９によるアデノウイルスの増殖阻害
ヒト及びマウスのＺｔｇｆβ−９のコード領域は、アデノウイルスシャトルベクター内にクローン化され、そして組換えられて、組換えアデノウイルスゲノムを生成した。２９３Ａ細胞へのＺｔｇｆβ−９アデノウイルスゲノムのトランスフェクションは、非常に小さいウイルスのプラークをもたらした（トランスフェクション当たり１又は２個のプラークと少ない）。これらのプラークは、サイズが大きくならなかった。通常、プラークはウイルスの複製時に、１〜２日の周期にわたりサイズが大きく広がる。前記の小さいプラークを採集し、そして我々は２９３Ａ細胞を感染させて、前記のウイルスを広げることに挑戦した。感染した単層は、再び非常に少ないプラークを示し、そして前記のプラークはサイズも小さかった。これらのプラークは時間が達ってもサイズが広がらなかった。前記のウイルスを増幅させる試みを２〜３回繰り返した後、最終的に、我々は素速く増殖するウイルス群を得た。この増幅から生じるウイルスは、更にＺｔｇｆβ−９の配列を含んでいる。しかし、これらのウイルスによる細胞の感染は、タンパク質の関連をもたらさなかった。マウス及びヒト、両方のＺｔｇｆβ−９を含むウイルスの最初の挙動は、我々が見つけた他のいずれのｃＤＮＡのものとも異なっている。明らかに、ウイルスの複製は阻害された。
【配列表】
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