(57)【要約】【課題】  医薬品や健康食品などに有用なＬ−カルノシンを簡便に、しかも高効率、高収率、高純度で製造する方法を提供する。【解決手段】  Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液から水を濃縮することにより、Ｌ−カルノシンンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液とした後、得られたスラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度で０．１時間以上１０時間以下熟成し、次いで、該スラリー溶液とアルコールとを混合した後、Ｌ−カルノシンの結晶を取り出すことを特徴とするＬ−カルノシンの精製方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液から水を濃縮することにより、Ｌ−カルノシンンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液とした後、得られたスラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度で０．１時間以上１０時間以下熟成し、次いで、該スラリー溶液とアルコールとを混合した後、Ｌ−カルノシンの結晶を取り出すことを特徴とするＬ−カルノシンの精製方法。
【請求項２】
スラリー溶液とアルコールとを混合した後、得られたスラリー混合溶液を５０℃以上７０℃以下の温度で０．１時間以上５時間以下熟成し、次いで、Ｌ−カルノシンの結晶を取り出すことを特徴とする請求項１に記載のＬ−カルノシンの精製方法。
【請求項３】
スラリー溶液が、前記水溶液の温度を３０℃以上８０℃以下にして水を濃縮して得られたものである請求項１または２に記載のＬ−カルノシンの精製方法。
【請求項４】
前記水溶液に溶解したＬ−カルノシンが、フタロイル−β−アラニンの酸クロライドと、トリメチルシリル基で保護したL−ヒスチジンとを反応させて得られたフタロイル−L−カルノシンをヒドラジンにより脱保護して得られたものである請求項１〜３の何れかに記載のＬ−カルノシンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−カルノシンの水溶液を水とアルコールにより精製する新規な精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルノシンは、β−アラニンとＬ−ヒスチジンから合成されるジペプチドであり、組織修復促進作用、免疫調整作用、抗炎症作用を有していることから、医薬品や健康食品などの需要が高まっている。また、容易に金属とキレート結合をつくることから、亜鉛と錯形成したポラプレジンクなどの抗潰瘍薬、味覚障害治療薬へ応用されている。これら医薬品に使用されるＬ−カルノシンは高純度のものでなければならず、一般的には９９．５％以上の純度が要求される。
【０００３】
前記の通り、Ｌ−カルノシンは、通常、β−アラニン又はその誘導体と、Ｌ−ヒスチジン又はその誘導体とを原料として合成されるが、この反応により得られる粗Ｌ−カルノシンは、水とアルコールの混合溶媒により再結晶する方法が知られている（例えば、非特許文献１、２、及び３）。
【０００４】
しかしながら、Ｌ−カルノシンを合成した際に含まれる不純物は、極性などがＬ−カルノシンと非常に近いため、精製が困難であった。例えば、前記非特許文献３に記載の方法では、９９．９％と非常に純度の高いＬ−カルノシンが得られるが、収率６５％程度と低収率であった。
【０００５】
本発明者は、上記の低収率の点を改善するため、粗Ｌ−カルノシンの水溶液とアルコールとの混合溶液に、種結晶を加えて特定の温度で熟成（ｒｉｐｅｎｉｎｇ）させ、さらにアルコールを加えることにより、高純度のＬ−カルノシンを製造する方法を提案した（特許文献１参照）。この方法によれば、高収率で高純度のＬ−カルノシンを製造することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３１３２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ケミカル  アンド  ファーマシューティカル  ブレティン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）  ３８  （１１）  ｐ３１４０−３１４６  （１９９０）
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  オーガニック  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  ４８  ｐ３９３−３９５  （１９８３）
【非特許文献３】ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイアティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）（７５）  ｐ２５１１−２５１２  （１９５３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、アルコール、及び種結晶を加えてＬ−カルノシンの結晶を析出させているため、使用する全溶媒量が多くなること、および使用する溶媒量が多いため、特定の温度で熟成する際のエネルギーコストが高くなるといった点で改善の余地があった。そのため、工業的な生産を考慮すると、上記方法よりも更に効率よく、高収率で高純度のＬ−カルノシンを製造する方法の開発が望まれていた。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、比較的少ない溶媒の使用量であっても、高収率で高純度のＬ−カルノシンとすることができる精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。その結果、Ｌ−カルノシンが溶解している水溶液から直接、Ｌ−カルノシンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液を調製し、得られたスラリー溶液を熟成処理した後、アルコールを混合してＬ−カルノシンの結晶を分取することにより、使用する溶媒の量を低減することができ、効率よく、高収率で高純度のＬ−カルノシンを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液から水を濃縮することにより、Ｌ−カルノシンンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液とした後、得られたスラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度で０．１時間以上１０時間以下熟成し、次いで、該スラリー溶液とアルコールとを混合した後、Ｌ−カルノシンの結晶を取り出すことを特徴とするＬ−カルノシンの精製方法である。
【００１２】
本発明において、より高純度のＬ−カルノシンを得るためには、熟成処理後のスラリー溶液とアルコールとを混合した後、得られたスラリー混合溶液を５０℃以上７０℃以下の温度で０．１時間以上５時間以下熟成することが好ましい。また、より短時間で高純度のＬ−カルノシンを高収率で得るためには、３０℃以上８０℃以下の温度で前記水溶液を濃縮してスラリー溶液を調整することが好ましい。
【００１３】
さらに、本発明において、精製の対象となるＬ−カルノシンは、フタロイル−β−アラニンの酸クロライドと、トリメチルシリル基で保護したL−ヒスチジンとを反応させて得られたフタロイル−L−カルノシンをヒドラジンにより脱保護して得られたものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、使用する溶媒量を低減しても、高収率で高純度のＬ−カルノシンを得ることができる。そのため、特に大量のＬ−カルノシンを精製する場合において、容量を小さくすることができるため、工業的なＬ−カルノシンの精製に特に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液から水を濃縮してＬ−カルノシンンの結晶を析出させて、Ｌ−カルノシンのスラリー溶液（スラリー調製工程）とした後、得られたスラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度で０．１時間以上１０時間以下熟成（第一熟成工程）し、次いで、該スラリー溶液とアルコールとを混合した後、Ｌ−カルノシンの結晶を取り出すことにより、Ｌ−カルノシンを精製（精製工程）する方法である。以下、順を追って説明する。先ず、精製の対象となるＬ−カルノシンについて説明する。
【００１６】
（精製の対象となるＬ−カルノシン（粗Ｌ−カルノシン））
本発明において、精製の対象となるＬ−カルノシン（以下、粗Ｌ−カルノシンとする場合もある）は、特に制限されるものではなく、公知の方法、例えば、β−アラニン又はその誘導体と、Ｌ−ヒスチジン又はその誘導体とを原料として合成する方法により製造できる。中でも、フタロイル−β−アラニンの酸クロライドと、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンによりトリメチルシリル基で保護したＬ−ヒスチジンとを反応させ、フタロイル−Ｌ−カルノシンを得、これをヒドラジンで還元、脱保護して得られる粗Ｌ−カルノシンが好適に使用できる。このような方法で得られる粗Ｌ−カルノシンは、ヒスチジンからの収率が９０％と非常に高く、本発明の方法で精製する前の純度を９７．０％以上と高くすることができる（なお、本発明において、Ｌ−カルノシンの純度は、高速液クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定したピーク面積を基準とした純度である。）。この方法は、Ｄｏｋｌａｄｉ  ｎａ  Ｂｕｌｇａｒｓｋａｔａ  Ａｋａｄｅｍｉｙａ  ｎａ  Ｎａｕｋｉｔｅ  ４４  （８）  ｐ５３−５６  （１９９１）に記載されている。この方法の概要を以下に説明する。
【００１７】
粗Ｌ−カルノシンの原料となるフタロイル−β−アラニンは、公知の方法で製造することができ、試薬、又は工業用原料を使用することができる。また、フタロイル−β−アラニンの酸クロライドは、該フタロイル−β−アラニンと二塩化オキサリル、又は塩化チオニルとを反応させることにより製造できる。この反応は、芳香族炭化水素溶媒、またはハロゲン化脂肪族炭化水素溶媒中、還流温度下、フタロイル−β−アラニンと、フタロイル−β−アラニンに対して１〜３０当量の二塩化オキサリル、又は塩化チオニルを混合することにより実施できる。また、該反応は、無溶媒下、２０〜１００℃の温度で実施することもできる。反応後は、必要に応じて使用した溶媒、二塩化オキサリル、又は塩化チオニルを除去してやればよい。こうすることにより、フタロイル−β−アラニンの酸クロライドを製造することができる。
【００１８】
また、トリメチルシリル基で保護したＬ−ヒスチジンは、以下の方法で合成できる。具体的には、硫酸触媒下、Ｌ−ヒスチジンと、該Ｌ−ヒスチジンに対して３〜３０当量の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとを還流温度で反応させ、ｐＨ調整をした後、芳香族炭化水素溶媒を加え、溶媒を留去し、ハロゲン化脂肪族炭化水素溶媒で再結晶することにより、トリメチルシリル基で保護したＬ−ヒスチジンを合成することができる。
【００１９】
次に、粗Ｌ−カルノシンは、上記方法により得られたフタロイル−β−アラニンの酸クロライドとトリメチルシリル基で保護したＬ−ヒスチジンとを反応させた後、得られたフタロイル−Ｌ−カルノシンをヒドラジンで脱保護することにより合成できる。具体的には、先ず、フタロイル−β−アラニンの酸クロライドとトリメチルシリル基で保護したＬ−ヒスチジンとをハロゲン化脂肪族炭化水素溶媒中で反応させてフタロイル−Ｌ−カルノシン塩酸塩とする。次に、アルコール中、該フタロイル−Ｌ−カルノシン塩酸塩をアルカリ、例えば、水酸化リチウム１水和物などで中和して、フタロイル−Ｌ−カルノシンとする。さらに、得られたフタロイル−Ｌ−カルノシンを、水中、ヒドラジン（ヒドラジンの水和物であってもよい）で脱保護し、酢酸を混合することにより、反応液中にＬ−カルノシンを合成することができる。
【００２０】
本発明においては、上記反応液をそのまま、下記に詳述する「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」として使用することもできるが、より高純度のＬ−カルノシンとするためには、該反応液中から脱離した保護基由来の不純物（フタルヒドラジド）をなるべく低減しておくことが好ましい。フタルヒドラジドを低減するには、該反応溶液を冷却すると、先ずフタルヒドラジドが固体として析出するため、この析出したフタルヒドラジドを濾別してやればよい。該固体を濾別して得られた反応液は、そのまま「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」として使用することもできるし、該反応液に、さらに水を混合してＬ−カルノシンの濃度を調節して、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」することもできる。このように反応液から粗Ｌ−カルノシンを単離しない場合には、上記「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」が精製の対象となる。
【００２１】
また、当然のことながら、フタルヒドラジドを低減した反応液を濃縮、冷却、または該反応液とアルコールとを混合することにより、粗Ｌ−カルノシンの結晶を析出させて、一旦、粗Ｌ−カルノシンを単離してもよい。この単離した粗Ｌ−カルノシンは、再度、水と混合することにより、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」とすることができる。中でも、最終的に得られるＬ−カルノシンの純度をより高めるには、該反応液とアルコール（例えば、下記に詳述する炭素数１〜４のアルコール）とを混合して粗Ｌ−カルノシンの結晶を析出させて、一旦、粗Ｌ−カルノシンを単離した後、単離した粗Ｌ−カルノシンを水と混合して、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」とすることが好ましい。
【００２２】
なお、フタルヒドラジンを低減した反応液から得られる粗Ｌ−カルノシンは、通常、９５〜９８％程度の純度を有する。
【００２３】
本発明においては、上記方法により得られた「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」から水を濃縮することにより、Ｌ−カルノシンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液（スラリー調製工程）とすればよい。ただし、より純度の高いＬ−カルノシンとするために、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」を活性炭で精製処理することもできる。なお、本発明によれば、活性炭による精製処理を行わなくとも、十分に純度の高いＬ−カルノシンを製造できるが、該活性炭による精製処理を行う場合には、特開２００７−３１３２８号公報（特許文献１）の方法に準じて行えばよい。
【００２４】
次に、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」から水を濃縮することにより、Ｌ−カルノシンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液とするスラリー調製工程について説明する。
【００２５】
（スラリー調製工程）
本発明においては、上記「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」から水を濃縮することにより、Ｌ−カルノシンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液とすることが重要である。Ｌ−カルノシンの水溶液としない場合、例えば、単離した粗Ｌ−カルノシンと混合する水の量が少なく、水溶液とはならずにスラリー溶液とする場合、下記に詳述する熟成処理、及びアルコールとの混合を行ったとしても、純度の高いＬ−カルノシンを得ることができない。
【００２６】
また、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」から水を濃縮することなく、単に冷却することにより、Ｌ−カルノシンのスラリー溶液とした場合には、最終的に得られるＬ−カルノシンの収率が低下してしまうため好ましくない。
【００２７】
本発明において、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」から水を濃縮する方法は、特に制限されるものではないが、精製時間の短縮、分解物の低減等を考慮すると、該水溶液の温度を３０℃以上８０℃以下として水を濃縮することが好ましく、さらに４０℃以上７０以下として水を濃縮することが好ましい。また、この際、減圧濃縮することが好ましい。該温度範囲で水の濃縮を行うことにより、下記に詳述する熟成処理も同時に行われるものと考えられ、より一層、精製時間を短縮することができる。
【００２８】
本発明において、「Ｌ−カルノシンが溶解した水溶液」から水を濃縮して得られるＬ−カルノシンのスラリー溶液は、下記に詳述する熟成処理において、Ｌ−カルノシンが水に完全に溶解しない状態の濃度とすればよい。Ｌ−カルノシンの結晶が析出しているかどうかは、目視により確認できる。中でも、得られるＬ−カルノシンを高純度化し、収率を高めるには、粗Ｌ−カルノシン１ｇに対して、水の量が１．５０ｍｌ以上２．００ｍｌ以下となる濃度のスラリー溶液とすることが好ましい。
【００２９】
次に、本発明においては、このような方法で得られたスラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度で０．１時間以上１０時間以下熟成する第一熟成工程を行う。この第一熟成工程について説明する。
【００３０】
（第一熟成工程）
本発明においては、上記方法で得られたＬ−カルノシンのスラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度で０．１時間以上１０時間以下熟成する（第一熟成工程）ことが重要である。この熟成とは、０．１時間以上１０時間以下の間、該スラリー溶液を３０℃以上８０℃以下の温度範囲で保持してやればよい。この第一熟成工程を実施することにより、高純度のＬ−カルノシンを得ることができる。
【００３１】
本発明において、第一熟成工程を実施する間、スラリー溶液は、静置しておくこともできるし、攪拌しておくこともできる。中でも、より純度を高めるには、第一熟成工程の間は、スラリー溶液を攪拌しておくことが好ましい。
【００３２】
第一熟成工程において、スラリー溶液の温度（熟成温度）は、３０℃以上８０℃以下でなければならない。３０℃未満の場合には、純度の高いＬ−カルノシンが得られないため好ましくない。一方、８０℃を超える場合には、Ｌ−カルノシンの分解が生じるおそれがあるため好ましくない。より高収率で高純度のＬ−カルノシンを得るためには、該温度は、４０℃以上７０℃以下であることが好ましい。なお、熟成温度は、上記温度範囲を満足すれば特に制限されるものではなく、一定の温度であってもよいし、上記温度範囲内で変化させてもよい。
【００３３】
また、第一熟成工程において、熟成の時間は、０．１時間以上１０時間以下である。工業的な生産、および純度の高いＬ−カルノシンを得るためには、該熟成の時間は、０．５時間以上５時間以下であることがより好ましい。
【００３４】
次に、本発明においては、このような第一熟成工程を行ったスラリー溶液とアルコールとを混合し、析出したＬ−カルノシンの結晶を取り出す精製工程を行う。この精製工程について説明する。
【００３５】
（精製工程）
本発明においては、高純度のＬ−カルノシンを取り出すため、上記第一熟成工程で処理したスラリー溶液とアルコールとを混合し、さらにＬ−カルノシンの結晶を析出させる。
【００３６】
上記アルコールは、高純度のＬ−カルノシンが得られるという理由から、炭素数１〜４のアルコールであることが好ましく、これらアルコールは、試薬或いは工業原料が何ら制限なく使用できる。具体的なアルコールを例示すると、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールが挙げられる。特に、高純度のＬ−カルノシンを得るためには、メタノールを使用することが好ましい。
【００３７】
本発明において、混合するアルコールの量は、十分にＬ−カルノシンの結晶が析出する量であれば特に制限されるものではないが、高純度のＬ−カルノシンを高収率で得るためには、スラリーに含まれる水とアルコールの体積比率（水：アルコール）を１：０．２〜５とすることが好ましく、さらに１：０．２５〜４とすることが好ましく、特に１：０．３３〜０．５０とすることが好ましい。
【００３８】
また、アルコールを加えた後のスラリー溶液（スラリー混合溶液）の濃度は、使用するアルコールの種類、使用量、含まれる水の量によって適宜決定すればよい。ただし、Ｌ−カルノシンの濃度が低すぎると収率が低下する傾向にあり、一バッチあたりの収量が小さくなり経済的でない。一方、Ｌ−カルノシンの濃度が高すぎると、不純物を十分に低減できない傾向にあり、また結晶の取出しが困難になる場合がある。そのため、粗Ｌ−カルノシン１ｇに対して、水、及びアルコールの混合溶液の量を１．８０ｍｌ以上１２．００ｍｌ以下とすることが好ましく、さらに１．８８ｍｌ以上１０．００ｍｌ以下とすることが好ましく、特に２．００ｍｌ以上３．００ｍｌ以下とすることが好ましい。
【００３９】
本発明において、スラリー溶液とアルコールとを混合する方法は、特に制限されるものではないが、高純度のＬ−カルノシンを得るためには、以下の方法により混合することが好ましい。つまり、多量のアルコールとスラリー溶液を混合したり、アルコール中にスラリー溶液を添加して混合すると、混合直後に、Ｌ−カルノシンの結晶が析出するおそれがあり、純度の高いＬ−カルノシンを得られない場合がある。そのため、スラリー溶液とアルコールとを混合するには、攪拌中のスラリー溶液にアルコールを添加することが好ましい。特に、攪拌中のスラリー溶液にアルコールを滴下して混合することが好ましい。
【００４０】
スラリー溶液にアルコールを滴下する際のスラリー溶液の温度は、特に制限されるものではないが、あまり低いと結晶化が促進され、アルコール滴下時に結晶化が起こり、純度の低いＬ−カルノシンが得られる傾向にある。また、あまり高い温度であるとＬ−カルノシンの分解物が生じる恐れがある。そのため、該スラリー溶液の温度は、３０℃以上８０℃以下であることが好ましく、さらに４０℃以上７０℃以下であることが好ましい。
【００４１】
また、アルコールを滴下する速度は、スラリー溶液の濃度、温度、使用するアルコールの種類、量、温度によって適宜決定すればよく、滴下時のスラリー溶液の温度が上記範囲を満足するように調整することが好ましい。ただし、急激に滴下するとＬ−カルノシンの純度が低下する傾向にあり、あまり遅すぎると生産性が低下する。そのため、特に制限されるものではないが、アルコールを滴下する速度は、１．０ｍｌ／分以上７．０ｍｌ／分以下とすることが好ましい。この範囲の滴下速度であれば、アルコールを連続して滴下してもよいし、断続的に滴下してもよい。より純度の高いＬ−カルノシンを得るためには、上記滴下速度の範囲で均一な量のアルコールを連続して滴下することが好ましい。
【００４２】
本発明においては、上記の通り、第一熟成工程で得られたスラリー溶液とアルコールとを混合した後、析出した結晶を取り出すことにより、純度の高いＬ−カルノシンを得ることができる。ただし、より高純度のＬ−カルノシンを得るためには、アルコールを混合した後、Ｌ−カルノシンのスラリー溶液（スラリー混合溶液）を５０℃以上７０℃以下の温度で０．１時間以上５時間以下熟成する（第二熟成工程）ことが好ましい。次に、この第二熟成工程について説明する。
【００４３】
（第二熟成工程）
本発明においては、上記方法により得られたスラリー混合溶液を５０℃以上７０℃以下の温度で０．１時間以上５時間以下熟成することが好ましい。なお、この熟成は、第一熟成工程と同じく、０．１時間以上５時間以下の間、該スラリー混合溶液を５０℃以上７０℃以下の温度範囲で保持してやればよい。この保持の間、スラリー混合溶液は、静置しておいてもよいし、攪拌しておいてもよい。純度の高いＬ−カルノシンとする場合には、攪拌しておくことが好ましい。
【００４４】
本発明によれば、溶媒の使用量を低減しても、純度の高いＬ−カルノシンを製造することができる。特に、上記第二熟成工程を行うことにより、より高純度のＬ−カルノシンとすることができる。そのため、第二熟成工程において、よりその効果を発揮するためには、スラリー混合溶液の温度（熟成温度）は、５５℃以上６５℃以下の温度範囲とすることがより好ましく、熟成の時間は、さらに０．２時間以上４時間以下とすることが好ましく、特に０．５時間以上３時間以下とすることが好ましい。なお、この第二熟成工程においても、熟成温度は、上記温度範囲であれば特に制限されるものではなく、一定の温度であってもよいし、該温度範囲内で変化させてもよい。
【００４５】
本発明においては、上記スラリー混合溶液、または必要に応じて第二熟成工程を行ったスラリー混合溶液から析出したＬ−カルノシンを取り出すことにより、高純度のＬ−カルノシンを得ることができる。中でも、より高純度のＬ−カルノシンをより高収率で得るためには、該スラリー混合溶液を冷却した後、Ｌ−カルノシンを取り出すことが好ましい。アルコールの滴下終了後、または第二熟成工程終了後、スラリー混合溶液を冷却する速度は、０．０１℃／分以上５℃／分以下とすることが好ましく、さらに０．０５℃／分以上２℃／分以下とすることが好ましい。また、冷却による最終到達温度は、高すぎると収率が低下する傾向にあり、低すぎると不純物が増加する傾向にあるため、−１０℃以上３０℃未満とすることが好ましく、さらに０℃以上２５℃以下とすることが好ましい。また、最終到達温度で１時間以上２時間以下熟成する（第三熟成工程）ことにより、収率をより向上できる。なお、この熟成も、該スラリー混合溶液を１時間以上２時間以下の間、上記最終到達温度範囲で保持してやればよい。保持する間も、該スラリー混合溶液を静置しておいてもよいし、攪拌しておいてもよい。
【００４６】
上記のような方法により得られたスラリー混合溶液からＬ−カルノシンを取り出す方法は、特に制限されるものではなく、公知の方法で結晶を取り出してやればよい。具体的には、精製されたＬ−カルノシンは、ろ過や遠心分離などにより固液分離され、自然乾燥、送風乾燥、真空乾燥などにより乾燥することにより単離できる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等制限されることはない。
【００４８】
製造例１
攪拌羽、温度計、ガス吸収装置を備えた１Ｌ四つ口フラスコにフタロイル−β−アラニン１０７ｇ（０．４８８ｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１０ｍｌ存在下、二塩化オキサリル６００ｍｌを加え、室温で２時間攪拌後、二塩化オキサリルを真空留去し、黄色結晶を得た（１）。
【００４９】
別の１Ｌ四つ口フラスコにＬ−ヒスチジン６２．０８ｇ（０．４０ｍｏｌ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン２５６ｍｌ（１．２ｍｏｌ）、濃硫酸０．１ｍｌ加え、還流下３０分間攪拌した。冷却後、キシレン１５０ｍｌ加え、７５℃で溶媒留去し、残渣をクロロホルム８０ｍｌで再結晶した（２）。
【００５０】
（１）をクロロホルム４００ｍｌに溶解し、（２）に滴下し、室温で８時間攪拌した。攪拌後エタノール４００ｍｌ加え３０分攪拌後、結晶をろ過し１５４ｇのフタロイル−Ｌ−カルノシン塩酸塩を得た。
【００５１】
１Ｌ四つ口フラスコにメタノール８００ｍｌ、水酸化リチウム１水和物１７．１ｇとフタロイル−Ｌ−カルノシン塩酸塩１５４ｇを加え、室温で３０分間攪拌し、還流下１５分間攪拌した。冷後、結晶をろ過し、乾燥した結果、フタロイル−Ｌ−カルノシン１３８ｇ得た。
【００５２】
１Ｌ四つ口フラスコにフタロイル−Ｌ−カルノシン１３８ｇ、ヒドラジン水和物２３ｍｌ（０．４６ｍｏｌ）、水４６０ｍｌ投入し、還流下１時間攪拌した。その後、酢酸３１ｍｌを滴下し１０分間攪拌して冷却した。冷却時に析出した固体をろ過で除去し、ｐＨを調整後、エタノールにより再沈殿することにより粗Ｌ−カルノシンを得た。得られた粗Ｌ−カルノシンをろ過して単離し、この粗Ｌ−カルノシンに水を加えて黄色味を帯びた粗Ｌ−カルノシン水溶液（Ｌ−カルノシン８１．２ｇ／水４０６ｇ）とした。粗Ｌ−カルノシンのＨＰＬＣ純度は９７．９％であった。
【００５３】
実施例１
攪拌羽と温度計を備えた５００ｍｌ四つ口フラスコに製造例１と同様の方法で得た粗Ｌ−カルノシン水溶液（水の量  ４２５ｍｌ、粗Ｌ−カルノシンの濃度０．３０６ｇ／ｍｌ、粗Ｌ−カルノシン仕込み量１３０ｇ、粗Ｌ−カルノシンのＨＰＬＣ純度９７．９％）を加え、６０℃に昇温した。
【００５４】
（スラリー調製工程）
その後、該水溶液の温度を５０〜６５℃として減圧濃縮することにより、水を１８５ｍｌ留去し、Ｌ−カルノシンのスラリー溶液とした。（粗Ｌ−カルノシン１ｇに対して、水の量を１．８５ｍｌとした。）
（第一熟成工程）
その後、スラリー溶液の温度を６０℃とし、1時間熟成した。この熟成の間、スラリー溶液を攪拌した。
【００５５】
（精製工程）
第一熟成工程で熟成した６０℃の温度のスラリー溶液を攪拌しながら、該スラリー溶液中に、温度が５５℃を下回らないようにメタノール１００ｍｌを３０分で滴下した。その後、昇温し、得られたスラリー混合溶液を６０℃で1時間熟成した（第二熟成工程）。この第二熟成工程の間、スラリー混合溶液を攪拌した。次いで、スラリー混合溶液を０．４℃／分のスピードで２０℃まで冷却し、２０℃で１時間熟成した（この間もスラリー混合溶液を攪拌した。）。その後、ろ過し、真空乾燥を行った結果、１１５．７ｇ(精製収率８９．０％）、ＨＰＬＣ純度９９．８４％の白色のＬ−カルノシンが得られた。
【００５６】
この実施例１においては、精製したＬ−カルノシン１ｇ当たり、スラリー混合溶液に使用した混合溶液量（水とメタノールの合計量）は、２．９ｍｌであり、下記に詳述する参考例１の約１／７の量であった。なお、スラリー溶液とする前に使用した水の量で換算しても、精製したＬ−カルノシン１ｇ当たり、使用した水とメタノールの合計量は、４．５ｍｌであった。
【００５７】
実施例２
実施例１と同じ粗Ｌ−カルノシン水溶液を使用し、メタノールの代わりにエタノールを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、１２０ｇ（精製収率９２．３％）、ＨＰＬＣ純度９９．８０％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００５８】
実施例３
実施例１と同じ粗Ｌ−カルノシン水溶液使用し、メタノールの代わりにイソプロパノールを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、１２０．２ｇ（精製収率９２．５％）、ＨＰＬＣ純度９９．８０％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００５９】
実施例４
実施例１と同じ粗Ｌ−カルノシン水溶液を使用し、スラリー調整工程の濃縮温度、第一熟成温度、メタノールを滴下する際のスラリー溶液の温度をいずれも７５℃とし、第二熟成温度を６８℃にした以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果、１１５．０ｇ(精製収率８８．５％）、ＨＰＬＣ純度９９．８０％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００６０】
実施例５
実施例１と同じ粗Ｌ−カルノシン水溶液を使用し、スラリー調整工程の濃縮温度、第一熟成温度、アルコール滴下温度を３５℃、第二熟成温度を５３℃にした以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果、１１５．１ｇ(精製収率８８．５％）、ＨＰＬＣ純度９９．７９％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００６１】
実施例６
実施例１と同じＬ−カルノシン水溶液を使用し、第二熟成工程を行わなかった以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、１０４．７ｇ（精製収率８０．５％）、ＨＰＬＣ純度９９．６０％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００６２】
比較例１
実施例１と同じ粗Ｌ−カルノシン水溶液を使用し、スラリー調整工程において水を濃縮することなく、該水溶液を５℃まで冷却し、Ｌ−カルノシンの結晶を析出させてＬ−カルノシンのスラリー溶液を得た。次いで、第一熟成工程を行わず、スラリー溶液の温度を５℃に保ちながら、１００ｍｌのメタノールを３０分で滴下した。その後、第二熟成工程を行わず、得られたスラリー混合溶液から実施例１と同様の方法でＬ−カルノシンを取り出した。その結果、８２．２ｇ（精製収率６３．２％）、ＨＰＬＣ純度９９．７８％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００６３】
比較例２
（スラリー調整工程）
製造例１と同様の方法で得た粗Ｌ−カルノシン水溶液を濃縮乾固し、粗Ｌ−カルノシン１５０ｇ（水分量１４．５％、粗Ｌ−カルノシン１３１ｇ、ＨＰＬＣ純度９７．９％）を得た。この粗Ｌ−カルノシンに水２４０ｍｌを加えて、粗Ｌ−カルノシンの全量を溶解させることなく、Ｌ−カルノシンのスラリー溶液とした。
【００６４】
（第一熟成工程）
得られたスラリー溶液を６０℃で1時間撹拌した。
【００６５】
（精製工程）
次いで、攪拌中の該スラリー溶液中に、メタノール１００ｍｌを３０分で滴下した。その後、得られたスラリー混合溶液を攪拌しながら６０℃で1時間熟成した（第二熟成工程）。さらに、スラリー混合溶液を０．４℃／分のスピードで２０℃まで冷却し、２０℃で１時間熟成した（この間、スラリー混合溶液を攪拌した）。その後、析出した結晶をろ過し、真空乾燥を行った結果、得られたＬ−カルノシンは１１７．５ｇ（精製収率８９．７％）、ＨＰＬＣ純度９９．３１％であり、あまり純度の高いものではなかった。
【００６６】
比較例３
実施例１と同じ粗Ｌ−カルノシン水溶液を使用し、精製工程でメタノールを添加しなかった以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、５７．５ｇ（精製収率４４．２％）、ＨＰＬＣ純度９９．８５％の白色Ｌ−カルノシンが得られたが、収率が極端に低かった。
【００６７】
参考例１        
攪拌羽と温度計を備えた１Ｌ四つ口フラスコに製造例１で得たＬ−カルノシン水溶液を、５℃に冷却後、日本エンバイロケミカル社製活性炭白鷺Ａを８．１ｇ加え、２時間攪拌した。攪拌後活性炭をろ過し、活性炭を２０ｍｌの水で洗浄し、無色澄明水溶液を得た。ＨＰＬＣ純度は９９．０％であった。
【００６８】
攪拌羽と温度計を備えた２Ｌ四つ口フラスコに活性炭処理後のＬ−カルノシン水溶液５０５ｇを加え、５０℃に昇温し、メタノール７３０ｍｌを３０分間で滴下し、種結晶を１．４ｇ添加し、５０℃で２時間熟成した。結晶が充分成長している事を確認し、新たにメタノール４０６ｍｌを３０分で滴下し、０．４℃／分のスピードで５℃まで冷却し、５℃で１時間熟成した。その後、ろ過し、真空乾燥を行った結果、７３．６ｇ（精製収率９０．７％）、ＨＰＬＣ純度９９．８７％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。精製収率、純度は共に高いものが得られた。
【００６９】
この参考例１においては、精製したＬ−カルノシン１ｇ当たり、使用した水、およびメタノールの合計量は、２１．２ｍｌであった。