(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＬＡ−ＤＲ抗原のサブタイプのひとつであるＤＲ１４に含まれる新規アリルを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ１アリル、または特定の塩基配列もしくはその相補配列を有するＨＬＡ−ＤＲＢ１アリル。本発明による新規アリルについて、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の遺伝子型を解析したところ、既知のアリルと全く異なる陽性反応が示された。【選択図】図１
2010162020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列をコードしてなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列またはその相補配列からなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子でコードされたペプチドを有する、タンパク質。
【請求項４】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen、以下「ＨＬＡ」と略すことがある）の新規アリル（allele）に関する。
【関連技術】
【０００２】
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease)）が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡ型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがあるが、コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２および３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のサブタイプのひとつであるＤＲ１４に含まれる遺伝子型は２００８年１０月の時点で、９２種類が報告されているが、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【０００７】
特許第２５６０１６０号（特許文献１）には、ＤＲＢ１＊１４０１およびＤＲＢ１＊１４０２のような既知のアリルに加えて、新規なアリルとしてＤＲＢ１＊１４０５が開示されている。しかしながら、ここには、ＤＲＢ１＊１４０４やそれに近似する配列は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２５６０１６０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies [online]、[平成２０年１０月１０日検索]、インターネット <URL: http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/>.
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−ＤＲＢ１の遺伝子型を解析したところ、既知のアリルと全く異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のサブタイプのひとつであるＤＲ１４に含まれる新規アリルおよびそれに基づくタイピング方法を提供することにある。
【００１２】
本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ１新規アリルを提供するものであり、また本発明は、配列番号２記載の塩基配列またはその相補配列を有するＨＬＡ−ＤＲＢ１新規アリルを提供するものである。
【００１３】
すなわち、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号２の塩基配列またはその相補配列からなるものである。
【００１４】
また本発明によるタンパク質は、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子でコードされたペプチドを有するものである。
【００１５】
さらに本発明のＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング方法は、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明によれば、従来に比べて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のさらに詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性のより厳密な判定が可能となるのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいてより詳細なデータを得ることが可能となる。したがって本発明は、臓器移植時の適合性判定や、各種疾患に対する感受性判定に極めて有用であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】既知のアリル（ＤＲＢ１＊１４０３）とＨＬＡ新規アリル（ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ（すなわち、ＤＲＢ１＊１４８５））との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（ＤＲＢ１＊１４０３）とＨＬＡ新規アリル（ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ（すなわち、ＤＲＢ１＊１４８５））とのアミノ酸配列の比較。
【図３】既知のアリル（ＤＲＢ１＊１４０３、ＤＲＢ１＊１４０５等）とＨＬＡ新規アリル（ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ（すなわち、ＤＲＢ１＊１４８５））とのアミノ酸配列の比較。
【発明の具体的説明および実施例】
【００１８】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１新規アリルの特定とその用途
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１新規アリル（ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子）は、下記のような実験手順に従って得られたものである。
【００１９】
ＤＮＡタイピング法の1つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Luminex社のｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬株式会社製）を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出したＤＮＡ検体で既知の遺伝子型の反応性が示されなかった。
【００２０】
ＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬株式会社製）で得られた増幅産物を用いて、ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987）により、エクソン２の配列を確認した。シークエンス反応は、BigDye Terminator V1.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、Applied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）によりシークエンスデータの取得を行った。エクソン2のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、ＤＲＢ１＊１５０１の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。
よって、この検体がＤＲＢ１＊１５０１と未知のアリルとのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【００２１】
そこでこれら配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２領域をグループ特異的プライマーセット（Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002）により増幅し、アリルを単離した。ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のイントロン１とイントロン２に設定したＤＲ１５グループ特異的プライマーセット（Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002）、およびＤＲ１４グループ特異的プライマーセット（Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002）を用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、得られた増幅産物を３％アガロースゲル電気泳動により分離し、５００ｂｐ付近の断片を取り出して精製を行った。
【００２２】
それぞれのグループ特異的増幅で得られた増幅産物を、BigDye Terminator V1.1 Cycle Sequencing KitおよびApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザを使用し、ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987）により両端のイントロン領域を含むエクソン２領域の配列を確認した。
【００２３】
その結果、ＤＲ１５グループ特異的プライマーセットで得られた増幅物の配列は、ＤＲＢ１＊１５０１と完全に一致し、また、ＤＲ１４グループ特異的プライマーセットで得られた増幅産物の配列は、ＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬で得られた増幅産物を用いたダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列と一致した。
【００２４】
新規配列を有する遺伝子の塩基配列を既知の配列と比較し、分析を行った結果、図１のようにＤＲＢ１＊１４０３のエクソン２内に３箇所の変異を確認した。具体的には、塩基配列の第１５６〜１５８の塩基に変異が見られた。これらの変異は図２に示す５２番目のアミノ酸がアスパラギン酸からセリンへと置き換わる非同義置換であった。また、５２番目のアミノ酸はＨＬＡ−ＤＲ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置していた。
【００２５】
このことから、このアミノ酸はＨＬＡ−ＤＲ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられた。なお、この点は、例えば、文献 Pedro A. Reche & Ellis L. Reinherz, J. Mol. Biol. (2003) 331, pp. 623-641においてこの点が記載されており、具体的には、該文献中に、ＨＬＡ−ＤＲＢ配列が黒三角による位置を特定しつつしめされており（文献の図４）、この場所がＨＬＡ分子の抗原ペプチドとの結合特性や特異性に関係することが明記されている。
したがって、ＤＲＢ１＊１４０３と本発明の変異をもつ遺伝子型（ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があり、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものであることが明らかとなった。
【００２６】
以上のようにして、本発明による新規アリル（ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ）を特定した。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「ＤＲＢ１＊１４８５」とされ、ＷＨＯにおいて正式に登録されている。このため本明細書においては、新規アリルを、「ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ」または「ＤＲＢ１＊１４８５」のいずれかで表示する。
【００２７】
本発明による新規アリルＤＲＢ１＊１４０３Ｖについて、これと配列が近似すると予想されるＤＲＢ１＊１４０５等との間でアミノ酸配列を比較したところ（図３）、ＤＲＢ１＊１４０５との間では、配列中６個所のアミノ酸が相違していることを確認している。具体的には、ＤＲＢ１＊１４０５における変異として特徴的である１１番目のアミノ酸については、本発明によるアリルＤＲＢ１＊１４０３Ｖでは変異が見られない一方で、本発明によるＤＲＢ１＊１４０３Ｖにおいて特徴的な５２番目のアミノ酸の変異については、ＤＲＢ１＊１４０５では変異は見られない。上記のようにこの５２番目のアミノ酸の変異は、抗原ペプチドとの結合に重要であることから、この点で、ＤＲＢ１＊１４０３ＶとＤＲＢ１＊１４０５とは大きく異なっていると言える。
【００２８】
よって、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子は、前記したように、配列番号１のアミノ酸配列をコードしてなるものである。好ましくは、本発明による本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子は、配列番号２の塩基配列またはその相補配列からなるものである。ここで相補配列は慣用の方法により得ることができる。
【００２９】
タイピング方法
上記のように新規アリルの存在とその変異部位が明らかになったため、それら情報に基づいて、そのようなアリルを検出することができるＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピング用ＤＮＡプローブを設計し、得ることができる。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列とその変異部位（５２番目のアミノ酸（配列番号１および図２））に関する情報や、配列番号２のエキソン２の塩基配列と変異部位（１５６〜１５８番目の塩基）に関する情報、さらには必要により公知のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原の情報に従って、当業者であれば慣用の方法に従って、本発明によるプローブを容易に設計し、得ることができる。例えば、配列番号２の塩基配列のＤＮＡ断片にはハイブリダイズするが、ＤＲＢ１＊１４０３のＤＮＡ断片にはハイブリダイズしないものを選択することでも目的のプローブが得ることができる。ここでプローブの設計、合成等の手法については、例えば、"Molecular Cloning"，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(New York)等を参考にすることができる。
【００３０】
従って、本発明においては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列の一部であって、配列番号１の５２番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列の部分領域をコードしてなる塩基配列に相補的な配列を有する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピング用ＤＮＡプローブが提供されうる。
また本発明の別の態様によれば、配列番号２の塩基配列の一部であって、配列番号２の１５６〜１５８番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピング用ＤＮＡプローブが提供されうる。
【００３１】
本発明において得られたプローブは必要に応じて、慣用の標識物質（例えば、放射性同位体、蛍光色素、発色色素、発酵色素等）により、慣用の方法に従って標識されていてもよい。
【００３２】
本発明の別の態様によれば、本発明において得られたプローブを含むタイピング用試薬が提供される。該試薬には、ＨＬＡ−ＤＲの他の型を検出可能なプローブや、検体中のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子を増幅可能なプライマー等を含むものであることができる。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、前記したように、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。
【００３４】
ここで、「得られる配列変異情報」とは、図１および２にも示されているように既知のアリル（ＤＲＢ１＊１４０３）と本件新規アリル（ＤＲＢ１＊１４０３Ｖ）とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。具体的には、例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、ＤＲＢ１＊１４０３のアミノ酸配列上、５２番目のアミノ酸がアスパラギン酸からセリンへと置き換わっている場合であり、塩基配列であれば、１５６〜１５８番目の塩基のＤＲＢ１＊１４０３の場合に対する変異である。
【００３５】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング法には、例えば、被験者のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子が新規アリルを有するか否かを検出する工程が含まれる。このとき検出は、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ(制限酵素断片長多型)法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ(単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、ＡＳＯ(allele specific oligonucleotid)ハイブリダイゼーション法、リバースＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（Luminex社）、ＰＣＲ−ＭＰＨ法（Polymerase Chain Reaction-based Microtiter Plate Hybridization）（湧永製薬株式会社）、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＲＣＡ(rolling cycle amplification)法、ＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等、慣用の方法を利用して、タイピングを実施することができる。この場合、必要により、ＰＣＲ法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅させた後、上述の方法を適宜適用してもよい。
【００３６】
タイピング法の具体例を挙げると、被験者のゲノムＤＮＡから調製した核酸試料を、本発明によるプローブとを反応させた後、特異的なハイブリッド形成を検出することによって、被験者のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子が新規アリルを有するか否かを検出することができる。このとき、使用される核酸試料は、典型的には、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から抽出したゲノムＤＮＡから慣用の方法に従って調製し得ることができる。また、ここでＨＬＡタイピング法には、上記のＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法などが適宜利用することができる。例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ法では、ＰＣＲで増幅させた核酸試料を膜やマイクロプレートなどの支持体に結合させた後、この支持体を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識化プローブと反応させる。非特異的結合成分を洗浄除去した後、標識量を指標として支持体に結合したプローブを検出することができる。Ｌｕｍｉｎｅｘ法ではＰＣＲの増幅産物と、蛍光ビーズに固相化したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを蛍光により検出することができる。
〔配列表〕
SEQUENCE LISTING
<110>  Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
<120>  New HLA-DRB1 genes and their use
<130>  181434SQ
<160>  2     
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  96
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(96)
<223>  DRB1*1485
<400>  1
Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr 
1               5                   10                  15      
Glu Arg Val Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Phe His Asn Gln Glu Glu Asn 
20                  25                  30          
Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu 
35                  40                  45              
Gly Arg Pro Ser Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 
50                  55                  60                  
Asp Arg Arg Ala Leu Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val 
65                  70                  75                  80  
Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Gly Glu Arg Gly Ala Gly Arg 
85                  90                  95      
<210>  2
<211>  270
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(270)
<223>  DRB1*1485
<400>  2
cacgtttctt ggagtactct acgtctgagt gtcatttctt caatgggacg gagcgggtgc     60
ggttcctgga gagatacttc cataaccagg aggagaacgt gcgcttcgac agcgacgtgg    120
gggagtaccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga    180
aggacctcct ggaagacagg cgggccctgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg    240
ttggtgagag cttcacagtg cagcggcgag                                     270
【図１】
2010162020.tif 000003
【図２】
2010162020.tif 000004
【図３】
2010162020.tif 000005