(57)【要約】      （修正有）【課題】甘味度の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの含有率が高いモナティンを効率よく生成できるＤ−アミノトランスフェラーゼを提供する。【解決手段】特定の配列で示される野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列のうち、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位（２４３位、２４４位）の少なくとも一箇所のアミノ酸残基を置換した変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ；ならびに特定の配列で示される野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよび上記変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いたモナティンの製造方法からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）、（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項２】
前記（ａ）、（ｂ）の置換は、下記（ａ’）、（ｂ’）の置換であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
（ａ’）２４３位のセリン残基のリシン残基、またはアスパラギン残基への置換
（ｂ’）２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のタンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式（１）
【化１】
2010042014.tif 000022
（一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。）
で示されるケト酸から、下記一般式（２）
【化２】
2010042014.tif 000023
（一般式（２）におけるＲは、一般式（１）におけるＲと同義である。）
で示される（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体（塩の形態を含む）を生成することを特徴とする光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記Ｒは、フェニル基またはインドリル基であることを特徴とする請求項３記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記アミノ供与体は、アミノ酸であることを特徴とする請求項３または請求項４記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
反応系にＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素、又は、当該酵素活性を有する微生物を含有することを特徴とする、請求項５記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）、（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞を培地中で培養し、培地および／または細胞中にＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性グルタミン酸誘導体の製法に利用できるＤ−アミノトランスフェラーゼに関し、詳しくは、野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼをアミノ酸置換することにより、モナティン前駆体から（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるよう改変した変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに関する。また、本発明は、当該変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いて、モナティン及びその類縁体等のグルタミン酸誘導体の（２Ｒ、４Ｒ）体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記構造式（３）で示される４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール）（以下、「モナティン」と称する。）は、植物シュレロチトン  イリシホリアス（Ｓｃｈｌｅｒｏｃｈｉｔｏｍ  ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）の根に含有され、甘味強度が著しく高いことから、特に低カロリー甘味料として期待される化合物である（特許文献１参照）。
【０００３】
【化１】
2010042014.tif 000002
【０００４】
上記モナティンは２つの不斉（２位、４位）が存在し、天然型の立体異性体は、（２Ｓ，４Ｓ）体と報告されていた。その他の立体異性体の存在についても、合成的に調製され３種の立体異性体の存在が確認され、何れもショ糖の数十倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている（表１）。
【０００５】
【表１】
2010042014.tif 000003
【０００６】
表１に示すように、天然型の（２Ｓ，４Ｓ）−モナティンのみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味強度を有しているが、特に（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンは甘味度がショ糖の２７００倍と著しく高く、甘味剤或いは甘味剤成分（甘味料）として最も期待される。従って、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの含有率の高いモナティンを効率的に生成する方法の開発が望まれる。
【０００７】
モナティンの製造方法については、過去に５例の報告が為されている。詳細は下記の先行技術文献である特許文献１〜３および非特許文献１〜５のうち、特許文献２および非特許文献１〜４に記載の通りである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６４−２５７５７号公報
【特許文献２】米国特許第５９９４５５９号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開  ０７３６６０４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００１年、４２巻、３９号、６７９３〜６７９６頁
【非特許文献２】オーガニック  レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０００年、２巻、１９号、２９６７〜２９７０頁
【非特許文献３】シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、１９９４年、２４巻、２２号、３１９７〜３２１１頁
【非特許文献４】シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、１９９３年、２３巻、１８号、２５１１〜２５２６頁
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１９９８年、１８０巻、１６号、４３１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記文献には（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの立体選択的な製造方法については全く触れられておらず、また、何れの方法も多段階の工程を必要とすることから、工業的な実施が難しいのが現実である。
【００１１】
かかるなか、本発明者らにより、酵素反応を利用して、下記式（４）に示すように４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＩＨＯＧ）からモナティンを製造する新たな方法が提案された。
【００１２】
【化２】
2010042014.tif 000004
【００１３】
この方法は、モナティン前駆体（ＩＨＯＧ）の２位のアミノ化反応を触媒する酵素を利用して、ＩＨＯＧからモナティンを製造するという新規な方法である。ＩＨＯＧのアミノ化反応を触媒する酵素のひとつとしてアミノトランスフェラーゼが例示できるが、ここでＤ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は２Ｒ−モナティンを選択的に生成させることができ、Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は２Ｓ−モナティンを選択的に生成できる。すなわち、反応を触媒する酵素として、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを選択することにより、Ｄ−アミノ酸供与体のアミノ基をＩＨＯＧの２位に転移して、高甘味度異性体である２Ｒ体を選択的に生成せしめることができる。
【００１４】
ＩＨＯＧを基質として２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼとしては、本発明者らの研究によりＢａｃｉｌｌｕｓ属又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属にその存在が確認されている。しかし、これらの微生物の産生するＤ−アミノトランスフェラーゼを用いても、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの含有率が高いモナティンを効率よく生成することは困難であった。
【００１５】
（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できない理由のひとつとして、これらの微生物の産生するＤ−アミノトランスフェラーゼが、ＩＨＯＧの４位の不斉を認識できないことが要因であると考えられる。すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属のＤ−アミノトランスフェラーゼを、ＩＨＯＧの４位のラセミ混合物（以下、４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧと略す場合がある）に作用させた場合、４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧのいずれにも作用して（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンおよび（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンをほぼ等量の割合で生成してしまう。このため、これらの微生物の産生するＤ−アミノトランスフェラーゼを用いても４位に光学活性を有するモナティンを製造することはできなかった。
【００１６】
また、もうひとつの理由として、モナティンの原料であるＩＨＯＧがｐＨに対して不安定な化合物であることが考えられる。本発明者らは、ＩＨＯＧアミノ化反応液中でのＩＨＯＧの安定性を試験するために、ＩＨＯＧアミノ化反応溶液の菌体無添加区でのＩＨＯＧの経時変化を測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、３００ｍＭ  ４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧ、６００ｍＭ  ＤＬ−Ａｌａ、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸からなる反応液１ｍｌを含む試験管を、３７℃で４０時間振とうし、反応を実施した。その結果、４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧの残存率は１６時間後に８１％、２４時間後に７０％、４０時間後には５７％にそれぞれ減少しており、ＩＨＯＧが経時的に分解していることが明らかとなった。これは反応液中でＩＨＯＧから３−インドールピルビン酸とピルビン酸に分解する分解反応や、ＩＨＯＧの環化反応が生じて、モナティンに変換される前にＩＨＯＧが消費されることが原因ではないかと推察される。すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属のＤ−アミノトランスフェラーゼによるアミノ化反応速度が必ずしも十分でないため、ＩＨＯＧの一部が、アミノ化される前に分解反応や環化反応によってアミノ化不能の状態となり、このことが（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できない理由のひとつとして考えられる。
【００１７】
従って、モナティンのなかでも最も甘味度の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に製造する方法の開発が求められている。
【００１８】
本発明が解決しようとする課題は、モナティン及びその類縁体等のグルタミン酸誘導体の（２Ｒ，４Ｒ）−体を効率的に製造できるＤ−アミノトランスフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＤ−アミノトランスフェラーゼおよび  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列において、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位を見出し、この特定部位のアミノ酸残基を置換することにより、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるＤ−アミノトランスフェラーゼが得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに到った。
【００２０】
また、本発明者らは、上記（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位から、モナティン前駆体（ＩＨＯＧ）に対して４Ｒ体選択的に作用する部位、および、Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ基転移活性の向上に関与する部位をそれぞれ特定した。
【００２１】
すなわち、本発明のＤ−アミノトランスフェラーゼは、野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの一部のアミノ酸残基を置換することにより、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるよう改変した変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに関する。
【００２２】
野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、ＩＨＯＧの４位の不斉に対して光学選択性を有しないため、４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧのいずれにも作用して（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンおよび（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンをほぼ等量の割合で生成させる。しかし、本発明によれば、野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの特定のアミノ酸残基を置換することにより野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの基質特異性を変化させて４Ｒ−ＩＨＯＧに選択的に作用するよう改変を加え、４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを選択的に生成させることにより、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成せしめることができる。
【００２３】
また、野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼはそのＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が必ずしも十分でないため、ＩＨＯＧの一部が、アミノ化される前に分解反応や環化反応によってアミノ化不能の状態となってしまい、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量低下の原因となっていたが、本発明では、野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの特定のアミノ酸残基を置換してＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を向上させることができる。これにより、ＩＨＯＧの分解反応や環化反応の反応速度に対するアミノ化反応速度の比が向上するため、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成せしめることができる。
【００２４】
また、もう一つの本発明であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＤ−アミノトランスフェラーゼは、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する野生型のＤ−アミノトランスフェラーゼである。これまで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列に関する報告は無く、本発明者らによりはじめて単離精製されそのアミノ配列及び塩基配列が明らかにされたものである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＤ−アミノトランスフェラーゼは、２Ｒ−モナティンの製造に好適に使用できる。
【００２５】
即ち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔２〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するとともに、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有し、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から生成する（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンの生成量が向上することを特徴とするタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１００位、１８０〜１８３位、２４３位、２４４位から選ばれる少なくとも一箇所にアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１００位、１８０〜１８３位、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔３〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）１８１位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）１８２位のアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｃ）１８３位のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｄ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｅ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１８１〜１８３位、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔４〕  前記（ａ）〜（ｅ）の置換は、下記（ａ’）〜（ｅ’）の置換であることを特徴とする、〔３〕記載のタンパク質。
（ａ’）１８１位のセリン残基のアスパラギン酸残基への置換
（ｂ’）１８２位のアラニン残基のリシン残基、またはセリン残基への置換
（ｃ’）１８３位のアスパラギン残基のセリン残基への置換
（ｄ’）２４３位のセリン残基のグルタミン酸残基、ロイシン残基、リシン残基、アスパラギン残基、またはグルタミン残基への置換
（ｅ’）２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
〔５〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するとともに、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有し、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から２Ｒ−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が高いことを特徴とするタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）１００位のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）１８１位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｃ）１８２位のアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１００位、１８１位および１８２位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔６〕  前記（ａ）〜（ｃ）の置換は、下記（ａ’）〜（ｃ’）の置換であることを特徴とする、〔５〕記載のタンパク質。
（ａ’）１００位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換
（ｂ’）１８１位のセリン残基のアラニン残基への置換
（ｃ’）１８２位のアラニン残基のセリン残基への置換
〔７〕  配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかから選ばれる置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｉ）２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
（ｉｉ）２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
（ｉｉｉ）１８０位のセリン残基のアラニン残基への置換および２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
（ｉｖ）１８０位のセリン残基のアラニン残基への置換および２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
（ｖ）２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換および２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
（ｖｉ）１００位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
（ｖｉｉ）１８２位のアラニン残基のセリン残基への置換および２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
〔８〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）、（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔９〕  前記（ａ）、（ｂ）の置換は、下記（ａ’）、（ｂ’）の置換であることを特徴とする、〔８〕記載のタンパク質。
（ａ’）２４３位のセリン残基のリシン残基、またはアスパラギン残基への置換
（ｂ’）２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
〔１０〕  〔２〕〜〔９〕のいずれか１項に記載のタンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式（１）
【００２６】
【化３】
2010042014.tif 000005
【００２７】
（一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。）
で示されるケト酸から、下記一般式（２）
【００２８】
【化４】
2010042014.tif 000006
【００２９】
（一般式（２）におけるＲは、一般式（１）におけるＲと同義である。）
で示される（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体（塩の形態を含む）を生成することを特徴とする光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１１〕  前記Ｒは、フェニル基またはインドリル基であることを特徴とする〔１０〕記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１２〕  前記アミノ供与体は、アミノ酸であることを特徴とする〔１０〕または〔１１〕記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１３〕  反応系にＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素、又は、当該酵素活性を有する微生物を含有することを特徴とする、〔１２〕記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１４〕  下記（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有し、かつ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列
（Ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
〔１５〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔１６〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するとともに、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有し、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が高いタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１００位、１８０〜１８３位、２４３位、２４４位から選ばれる少なくとも一箇所にアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１００位、１８０〜１８３位、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔１７〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）、（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔１８〕  〔１４〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
〔１９〕  〔１８〕記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
〔２０〕  〔１９〕記載の細胞を培地中で培養し、培地および／または細胞中にＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明者らは、ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒するＢａｃｉｌｌｕｓ属由来のＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表配列番号２）を決定し、研究を重ねた結果、配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、１００位、１８０〜１８３位、２４３位および２４４位が、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位であることを見出した。
【００３１】
また、さらに研究を重ねた結果、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位のうち、１８１〜１８３位の領域と２４３〜２４４位がＩＨＯＧの４位の立体認識に関与しうる部位であり、また、１００位、１８１位および１８２位がＤ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与しうる部位であることを明らかにした。さらに、１８０位は、４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸残基の置換と組み合わせることにより、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の低下を抑制できる部位であること明らかにした。
【００３２】
以下、本発明について、
〔Ａ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
〔Ｉ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
（ｉ）変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
（ｉｉ）変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
〔ＩＩ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの製造方法
（ｉ）野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の取得
（ｉｉ）変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の調製
（ｉｉｉ）変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ産生菌の作製・培養
〔Ｂ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いた（２Ｒ，４Ｒ）−グルタミン酸誘導体の製造方法
〔Ｉ〕Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
〔ＩＩ〕基質ケト酸
〔ＩＩＩ〕アミノ供与体
〔ＩＶ〕反応条件
の順に詳細に説明する。
【００３３】
〔Ａ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、下記式（５）に示すＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒するＢａｃｉｌｌｕｓ属由来のＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸残基の一部を置換したＤ−アミノトランスフェラーゼである。本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるよう野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの一部のアミノ酸残基を置換した点に特徴を有する。
【００３４】
【化５】
2010042014.tif 000007
【００３５】
本願明細書において、「Ｄ−アミノトランスフェラーゼ」とは、Ｄ−アミノ酸供与体のアミノ基をＩＨＯＧに転移することによって２Ｒ−モナティンを生成する酵素を意味する。
【００３６】
本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成せしめるため改変を加えたものであり、(1)ＩＨＯＧに対し４Ｒ体選択的に作用するよう改変を加えたものと、(2)Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性が向上するよう改変を加えたものに大別できる。勿論、ＩＨＯＧに対し４Ｒ体選択的に作用し、且つ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性が向上するよう改変を加えたもの本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに属する。
【００３７】
ここで、(1)の「４Ｒ体選択的に作用する」とは、基質として４Ｒ、Ｓ−ＩＨＯＧを用いてモナティンを生成させた場合、生成モナティンの総量に対し５３％超の割合で４Ｒ−モナティンを生成させることを意味し、「４Ｒ体選択性」とは、４Ｒ体選択的に作用する性質を意味する。ここで、生成モナティンの総量に占める４Ｒ−モナティンの割合は、５５％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。
【００３８】
また、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、モナティン前駆体（ＩＨＯＧ）に対して４Ｒ体選択性を有するのみならず、下記一般式（１）に示すケト酸に対しても同様に４Ｒ体選択性を有する場合がある。
【００３９】
【化６】
2010042014.tif 000008
【００４０】
（一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。）
【００４１】
本来、野生型のＤ−アミノトランスフェラーゼは、モナティン前駆体であるＩＨＯＧの光学異性を区別できず、４Ｓ体、４Ｒ体のいずれにも作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンおよび（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンをほぼ等量の割合で生成させるが、(1)の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、野生型のＤ−アミノトランスフェラーゼの一部のアミノ酸残基を置換させることにより基質特異性を変化させてＩＨＯＧに対して４Ｒ体選択的に作用するよう改変を加えたものであり、ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを選択的に生成することを可能としたものである。
【００４２】
また、(2)の「Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性が向上する」とは、野生型のＤ−アミノトランスフェラーゼと比較してＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が向上すること、ひいては、ＩＨＯＧから生成する２Ｒ−モナティンの生成量を増加させることを意味する。具体的には、配列番号２の場合について例示するとＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと比較して、４Ｒ、Ｓ−ＩＨＯＧから生成する２Ｒ−モナティンの生成量が増加していれば当該要件を満たすが、好ましくは、同一の反応条件下で反応させた場合、配列番号２に示すＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼの１．１倍、より好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、特に好ましくは２倍以上の２Ｒ−モナティンを生成することが好ましい。
【００４３】
一般の酵素反応では、酵素活性が向上しても反応速度が向上するだけで生成物の生成量自体は変わらない。しかし、上述のように、モナティンの原料であるＩＨＯＧは不安定な化合物であり、反応液中でＩＨＯＧから３−インドールピルビン酸とピルビン酸に分解する分解反応や、ＩＨＯＧの環化反応が起こっていると考えられるが、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を向上させることにより、ＩＨＯＧの分解反応や環化反応の反応速度に対するアミノ化反応速度の比が向上し、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成せしめることができる。ここで、Ｄ−アミノトランスフェラーゼによるアミノ化反応速度を簡便に測定する方法として、Ｄ−Ａｌａとα−ケトグルタル酸を基質としたアミノ基転移活性を、反応進行に伴い生成するピルビン酸をｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを用いて酵素的に定量することにより測定する方法を例示することができる。
【００４４】
〔Ｉ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼのもととなる野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼとしては、ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒するＢａｃｉｌｌｕｓ属由来のＤ−アミノトランスフェラーゼを使用できる。このようなＤ−アミノトランスフェラーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼや、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼを例示できる。
【００４５】
以下、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼについて、変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼにわけてそのアミノ酸配列について説明する。
【００４６】
（Ｉ−１）  変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
野生型のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓＡＪ１６１７由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００４７】
(1)４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸置換
配列表配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１８１〜１８３位の領域と２４３〜２４４位の領域がＩＨＯＧの４位の立体認識に関与しうる部位である。
【００４８】
すなわち、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１８１〜１８３位、２４３〜２４４位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、ＩＨＯＧに対して４Ｒ体選択的に作用するようにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼを改変することができる。４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸置換は、１箇所でもよいし、２箇所以上行ってもよい。
【００４９】
１８１位のセリン残基をアミノ酸置換する場合は、アスパラギン酸残基へ置換することが好ましい。また、１８２位のアラニン残基をアミノ酸置換する場合は、リシン残基、またはセリン残基へ置換することが好ましい。また、１８３位のアスパラギン残基をアミノ酸置換する場合は、セリン残基へ置換することが好ましい。また、２４３位のセリン残基をアミノ酸置換する場合は、グルタミン酸残基、ロイシン残基、リシン残基、アスパラギン残基、またはグルタミン残基へ置換することが好ましく、特にアスパラギン残基への置換することが好ましい。また、２４４位のセリン残基をアミノ酸置換する場合は、リシン残基へ置換することが好ましい。
【００５０】
上記４Ｒ体選択性にかかわる部位のうち、特に、２４３位、２４４位へのアミノ酸置換は、４Ｒ体選択性を効果的に向上できる場合が多いので好ましい。また、２４３位と２４４位の両方のアミノ酸残基をアミノ酸置換すると、４Ｒ体選択性をより一層向上できるのでさらに好ましい。
【００５１】
上述のように、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８１〜１８３位、２４３〜２４４位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、ＩＨＯＧに対する４Ｒ体選択性を付与することができる。しかし、４Ｒ体選択性にかかわる部位以外の部位、すなわち、１８１〜１８３位、２４３位、２４４位以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、ＩＨＯＧに対し４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する場合は、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに該当する。
【００５２】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性、および、ＩＨＯＧに対する４Ｒ体選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、とりわけ好ましくは１〜１０個である。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００５３】
(2)Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位への置換
配列表配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１００位、１８１位および１８２位がＤ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位である。
【００５４】
すなわち、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１００位、１８１位および１８２位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性が向上するようにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼを改変することができる。Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位へのアミノ酸置換は、１箇所でもよいし、２箇所以上行ってもよい。
【００５５】
１００位のアスパラギン残基をアミノ酸置換する場合は、アラニン残基へ置換することが好ましい。１８１位のセリン残基をアミノ酸置換する場合は、アラニン残基へ置換することが好ましい。また、１８２位のアラニン残基をアミノ酸置換する場合は、セリン残基へ置換することが好ましい。
【００５６】
上記Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位のうち、特に、２箇所以上を組み合わせて置換すると、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性をより一層向上できるのでさらに好ましい。
【００５７】
上述のように、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１００位、１８１位および１８２位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を向上させることができる。しかし、当然ながら、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位以外の部位、すなわち、１００位、１８１位および１８２位以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、配列番号２に示すＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと比較して、ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が高い場合は、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに該当する。
【００５８】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性、および、ＩＨＯＧに対する４Ｒ体選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、とりわけ好ましくは１〜１０個である。ただし、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１００％超、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１５０％以上、特に好ましくは２００％以上のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００５９】
(3)（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるＤ−アミノトランスフェラーゼ
本発明においては、上記(1)で説明した４Ｒ体選択性にかかわる部位、(2)で説明したＤ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位の少なくとも一方の部位のアミノ酸残基を置換することによって、ＩＨＯＧから生成する（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量が向上するＤ−アミノトランスフェラーゼを調整することが好ましい。
【００６０】
「ＩＨＯＧから生成する（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量が向上する」とは、野生型のＤ−アミノトランスフェラーゼと比較して、ＩＨＯＧから生成する（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量が向上することを意味する。具体的には、配列番号２の場合について例示すると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと比較して、同一条件下で反応させた場合、４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧから生成する（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量が増加していれば、当該要件を満たすが、好ましくは、配列番号２に示すＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼの１．１倍、より好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、特に好ましくは２倍以上の（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量向上がみられることが好ましい。
【００６１】
ここで、Ｄ−アミノトランスフェラーゼによるアミノ化反応速度を簡便に測定する方法として、Ｄ−Ａｌａとα−ケトグルタル酸を基質としたアミノ基転移活性を、反応進行に伴い生成するピルビン酸をｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを用いて酵素的に定量することにより、測定することができる。
【００６２】
（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるＤ−アミノトランスフェラーゼを作製するため、上記(1)で説明した４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸置換と、上記(2)で説明したＤ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位へのアミノ酸置換とを組み合わせて行うことが好ましい。
【００６３】
上記(1)で説明した４Ｒ体選択性にかかわる部位、および(2)で説明したＤ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位の一方のみにアミノ酸置換を導入すると、酵素としてのバランスが低下する場合がある。すなわち、４Ｒ体選択性にかかわる部位のみにアミノ酸置換を導入すると、４Ｒ体選択性は向上するものの、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性が低下（生成する２Ｒ−モナティンの収率が低下）したり、これとは逆に、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位だけにアミノ酸置換を導入すると、４Ｒ体選択性が低下することがある。しかし、これらの置換部位を適宜組み合わせることにより、４Ｒ体選択性およびＤ−アミノトランスフェラーゼ活性の全体的なバランスの高いＤ−アミノトランスフェラーゼを作製することができる。
【００６４】
具体的には、１００位または１８２位への置換と、２４３位への置換を組み合わせることが好ましい。これにより、４Ｒ体選択性およびＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が高い変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを作製できる。
【００６５】
また、４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸残基の置換と併せて１８０位を置換すると、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性の低下を抑制できる場合があるので好ましい。この場合、１８０位のセリン残基をアラニン残基へ置換することが好ましい。１８０位への変異の導入は、４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸置換と組み合わせることにより、生成モナティンの収率を向上できる場合がある。特に、２４３位および／または２４４位のアミノ酸置換と１８０位のアミノ酸置換を組み合わせることが好ましい。
【００６６】
上述のように、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１００位、１８０〜１８３位、２４３位および２４４位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成可能な変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを作製することができる。しかし、当然ながら、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成可能な変異に関与する部位以外の部位、すなわち、１００位、１８０〜１８３位、２４３位および２４４位以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、配列番号２に示すＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと比較して、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が高い場合は、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに該当する。
【００６７】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性、および、ＩＨＯＧに対する４Ｒ体選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、とりわけ好ましくは１〜１０個である。ただし、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が１００％超、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１５０％以上、特に好ましくは２００％以上であることが望ましい。
【００６８】
（Ｉ−２）  変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
野生型のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＡＴＣＣ１０２０８由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子については、特許文献２、及び、非特許文献５に報告がある。前述のように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＡＴＣＣ１０２０８由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと共通する２４３位、２４４位に４Ｒ体選択性にかかわる部位を有すると予測されている。
【００６９】
すなわち、配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して、２４３位、２４４位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、ＩＨＯＧに対して４Ｒ体選択的に作用するようにＤ−アミノトランスフェラーゼを改変することができる。４Ｒ体選択性にかかわる部位へのアミノ酸置換は、１箇所でもよいし、２箇所行ってもよい。
【００７０】
２４３位のセリン残基をアミノ酸置換する場合は、リシン残基、またはアスパラギン残基へ置換することが好ましい。また、２４４位のセリン残基をアミノ酸置換する場合は、リシン残基へ置換することが好ましい。
【００７１】
上述のように、本発明の変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、２４３位、２４４位のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、ＩＨＯＧに対する４Ｒ体選択性を付与したものである。しかし、当然ながら、これらの変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼの４Ｒ体選択性にかかわる部位（２４３位、２４４位等）以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、ＩＨＯＧに対し４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する場合は、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに該当する。
【００７２】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性、および、ＩＨＯＧに対する４Ｒ体選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、とりわけ好ましくは１〜１０個である。ただし、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００７３】
以上、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼについて、変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼと変異型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼに分けて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。すなわち、ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒する他のＢａｃｉｌｌｕｓ属に由来するＤ−アミノトランスフェラーゼであっても、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓやＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓで説明した（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位（１００位、１８０〜１８３位、２４３〜２４４位）に相当する部位をアミノ酸置換することにより、ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するように改変された場合は、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼに該当する。
【００７４】
〔ＩＩ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの製造方法
本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒する野生型のＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子に、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位のアミノ酸残基がアミノ酸置換されるような変異を導入した変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を作製し、同変異型遺伝子を適当な宿主を用いて発現させることによって製造することができる。
【００７５】
また、変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを産生する変異株から取得した変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を適当な宿主を用いて発現させることによっても、製造することができる。
【００７６】
（ＩＩ−１）野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の取得
ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片は、当該酵素活性を有する微生物等の細胞からクローニングすることができる。
【００７７】
ＩＨＯＧから２Ｒ−モナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する細菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が挙げられる。より具体的には以下のような菌株を挙げることができる。
バチルス  マセランス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７；
バチルス  スフェリカス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８；
バチルス  プルビファシエンス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ１３２７；
バチルス  レンタス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＡＪ１２６９９；
バチルス  レンタス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＡＴＣＣ  １０８４０
【００７８】
尚、バチルス  マセランス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７については下記の通り寄託されている。
（ｉ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、
（ｉｉ）寄託日：平成１３年１２月１３日
（ｉｉｉ）寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４３（平成１３年１２月１３日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５３より平成１４年１１月２２日に国際寄託へ移管）
【００７９】
このうち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  が好ましく、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８が好ましい。
【００８０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを配列表の配列番号１に示す。また、バチルス  スフェリカス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを配列表の配列番号３に示す。
【００８１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において９１％、塩基配列において８３．６％の相同性を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＹＭ−１株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において６６％の相同性を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１０７１６株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において４２％の相同性を有する（ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．６」（ＧＥＮＥＴＹＸ社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である）。
【００８２】
なお、配列表配列番号１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼＤＮＡは、本発明者らによりはじめて塩基配列が明らかにされたものであり、本発明に属する。また、当然ながら、配列表配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明に属する。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８５％超、好ましくは９０％超、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件（ここでいう相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい）、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００８３】
また、配列表の配列番号２に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号２は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号６３０〜１４８１の塩基配列がコードするＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、本発明者らによりはじめて明らかにされたものであり、やはり本発明に属する。また当然ながら、配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する場合は、本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼに該当する。ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。ここで、「Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性」とは、Ｄ−アミノ酸供与体のアミノ基をＩＨＯＧに転移することによって２Ｒ−モナティンを生成する活性を意味する。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００８４】
次に、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ産生菌から野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
【００８５】
はじめに、精製されたＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列を決定する。この際、エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃａｎｄ．、１９５０年、  ４、２２７頁）を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。
【００８６】
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００８７】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はテトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８１年、２２、１８５９頁に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ全長を、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、本発明のＤ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはＤ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ全長をＤ−アミノトランスフェラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００８８】
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，トレンズ  ジェネティックス  ５（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５），１９８９年、１８５頁等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ、１９８９年等に記載されている。
【００８９】
単離されたＤ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、ア  プラクティカル  ガイド  トゥ  モレキュラー  クローニング（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８５年に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００９０】
（ＩＩ−２）変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の調製
上記のＤ−アミノトランスフェラーゼ産生菌から得られる野生型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、モナティン前駆体であるＩＨＯＧの光学異性を区別できず、４Ｓ体、４Ｒ体のいずれのＩＨＯＧにも作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンおよび（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンをほぼ等量の割合で生成させてしまい、また、ＩＨＯＧの分解反応、環化反応の反応速度に対してアミノ化反応速度が必ずしも十分でないので、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するために関与する部位に人為的に変異を起こさせ、ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するように改変する。
【００９１】
ＤＮＡの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，イン  ＰＣＲ  テクノロジー（ｉｎ  ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６１、Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．Ｅｄｓ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ、１９８９年、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９８７年、１５４、３８２頁）、ファージを用いる方法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１９８７年、１５４、３５０頁、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９８７年、１５４，３６７頁）などがある。
【００９２】
ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するように改変されたＤ−アミノトランスフェラーゼＤＮＡの具体例としては、下記のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを例示できる。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１００位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換を有するアミノ酸配列
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８１位のセリン残基のアスパラギン酸残基への置換を有するアミノ酸配列
（３）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８２位のアラニン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（４）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８２位のアラニン残基のセリン残基への置換を有するアミノ酸配列
（５）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８３位のアスパラギン残基のセリン残基への置換を有するアミノ酸配列
（６）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のグルタミン酸残基への置換を有するアミノ酸配列
（７）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のロイシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（８）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（９）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１０）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のグルタミン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１１）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４４位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８０位のセリン残基のアラニン残基への置換および２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１３）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８０位のセリン残基のアラニン残基への置換および２４４位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１４）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換および２４４位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１５）１００位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および１８１位のセリン残基のアラニン残基への置換
（１６）１００位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および１８２位のアラニン残基のセリン残基への置換
（１７）１８１位のセリン残基のアラニン残基への置換および１８２位のアラニン残基のセリン残基への置換
（１８）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１００位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
（１９）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８２位のアラニン残基のセリン残基への置換および２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
（２０）配列番号４に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
（２１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、２４３位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
（２２）配列番号４に示すアミノ酸配列において、２４４位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
【００９３】
上記（１）〜（２２）のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、ＤＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
【００９４】
また、これらの変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの４Ｒ体選択性にかかわる部位以外の部位、すなわち、（１）〜（２２）において置換した部位以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成できるＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡも例示できる。ここで、「１若しくは数個」の定義は、〔Ｉ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列の項で説明した場合と同じである。
【００９５】
また、当然ながら、（１）〜（２２）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡも例示できる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８５％超、好ましくは９０％超、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件（ここでいう相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい）、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００９６】
従って、これらの変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードするように、上記の部位特異的変異法により、野生型遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行えばよい。
【００９７】
（ＩＩ−３）変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ産生菌の作製・培養
上記のようにして得られる変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させることにより、変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを発現した組換え菌を得ることができる。
【００９８】
尚、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子としては、（ｉｉ）変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の調製の項で説明した遺伝子が挙げられる。
【００９９】
組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。このうち、組換えＤＮＡ操作について知見のある微生物としてはＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等が挙げられる。一般には、腸内細菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、腸内細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが用いられる。
【０１００】
これら微生物へは、目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を塔載したプラスミド、ファージ等のベクターを用いて導入してもよいし、相同組換えによって該細胞の染色体上に目的遺伝子を組み込んでもよい。好ましくは、いわゆるマルチコピー型のプラスミドベクターが挙げられ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉへのベクターとしてはＣｏｌ  Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、或いはその誘導体が挙げられる。これらベクターには目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を発現させるプロモーターとして、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）等のように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【０１０１】
なお、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、上述のようにＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を直接変異させることによって得られる変異型遺伝子を発現させることによって得られるが、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを産生する微生物（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属）を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤により処理し、ＩＨＯＧから（２Ｒ、４Ｒ）体を効率的に生成するように改変された変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを産生するようになった変異株を培養することによっても得ることができる。
【０１０２】
次に、本発明における微生物の培養方法について説明する。ここでの用語「微生物」とは、本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを発現した遺伝子組換え細胞の培養、変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを産生するようになった変異株の培養の両方を意味する。また、ここで説明する培養条件は、微生物に変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを産生させこれを取得するための培養と、微生物を培養して変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを産生させながら同時にグルタミン酸誘導体を生成する反応を行う場合の培養の両方に適用できる。
【０１０３】
本発明における微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。また、微生物の種類或いは培養条件によっては、培地中に０．１〜１．０ｇ／ｄｌ程度のアミノ酸等のアミノ化合物を添加することによって、アミノ基転移反応活性を促進することもできる。
【０１０４】
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、ｌａｃプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度０．１〜５ｇ／ｄｌ望ましくは０．５ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌ適宜添加することもできる。
【０１０５】
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは３〜１０、更に好ましくは４〜８の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間程度である。
【０１０６】
〔Ｂ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いた（２Ｒ，４Ｒ）−グルタミン酸誘導体の製造方法
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法は、ＩＨＯＧに作用して（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式（１）
【０１０７】
【化７】
2010042014.tif 000009
【０１０８】
（一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。）
で示されるケト酸から、下記一般式（２）
【０１０９】
【化８】
2010042014.tif 000010
【０１１０】
（一般式（２）におけるＲは、一般式（１）におけるＲと同義である。）
で示されるグルタミン酸誘導体（塩の形態を含む）の（２Ｒ、４Ｒ）体を生成することを特徴とする。
【０１１１】
〔Ｉ〕Ｄ−アミノトランスフェラーゼ
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法において、「ＩＨＯＧに作用して（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」としては、〔Ａ〕変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼの項で説明した本発明の変異型Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いる。
【０１１２】
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法においては、当該Ｄ−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応を進行させるため、基質としてＳＲ体のケト酸を用いた場合、効率よく（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体を生成させることができる。
【０１１３】
ここで、「Ｄ−アミノトランスフェラーゼの存在下で」とは、一般式（１）で示されるケト酸から一般式（２）のグルタミン酸誘導体を生成できる状態で、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを反応系に存在させることを意味する。即ち、一般式（１）で示されるケト酸を一般式（２）のグルタミン酸誘導体に変換できる限りはいかなる形態でＤ−アミノトランスフェラーゼを反応系に存在させてもよく、例えば、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物（組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞、変異株）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
【０１１４】
例えば、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、グルタミン酸誘導体を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からＤ−アミノトランスフェラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。
【０１１５】
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
【０１１６】
〔ＩＩ〕基質ケト酸
本発明においては、基質として一般式（１）のケト酸を用いる。
【０１１７】
【化９】
2010042014.tif 000011
【０１１８】
ここでＲは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。
【０１１９】
中でも、当該式中、Ｒは、フェニル基またはインドリル基であることが好ましい。Ｒがインドリル基の場合、一般式（２）のグルタミン酸誘導体として、（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンが生成される。Ｒがフェニル基の場合、一般式（２）のグルタミン酸誘導体として、一般式（２）のグルタミン酸誘導体としてモナティンの類縁体である４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（ＰＨＧ）の（２Ｒ、４Ｒ）体が得られる。
【０１２０】
前記一般式（１）で示されるケト酸の合成方法としては、特に限定はなく、化学反応系および酵素系のどちらを用いてもよい。以下、化学反応系および酵素系に分けて一般式（１）のケト酸の合成方法を説明するが、一般式（１）のケト酸の合成方法は当然これらの方法に限定されるものではない。
【０１２１】
（ＩＩ−１）  化学反応系
化学反応系を利用して一般式（１）の基質ケト酸を合成する場合は、以下に示す方法や後述の参考例を利用して容易に実施することができる。
【０１２２】
例えば、下記一般式（６）で示される置換ピルビン酸とオキサロ酢酸あるいはピルビン酸を、交差アルドール反応及び脱炭酸反応に付して、一般式（１）で示されるケト酸を製造することができる。前記アルドール反応に付して得られる化合物が、反応系内で形成され重要な中間体となるが、敢えてこの化合物を単離することなく次の工程である脱炭酸反応に進むことができる。
【０１２３】
【化１０】
2010042014.tif 000012
【０１２４】
例えば、Ｒがインドリル基である場合、即ち置換ピルビン酸としてインドール−３−ピルビン酸を用いた場合には、モナティン製造の重要中間体であるＩＨＯＧ（又はその塩）を製造することができる。また、例えばＲがフェニル基である場合、即ち置換ピルビン酸としてフェニルピルビン酸を用いた場合には、モナティンの類縁体である４−フェニルメチル−４−ヒドロキシグルタミン酸（以下、ＰＨＧ）に対応する中間体ケト酸である４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＰＨＯＧ）（又はその塩）を製造することができる。
【０１２５】
当該アルドール反応の条件には特に困難は無く、無機塩基又は有機塩基存在下において適当な溶媒中にて置換ピルビン酸及びオキサロ酢酸あるいはピルビン酸を作用させるだけで容易に進行する。
【０１２６】
用いる溶媒の種類としては、反応に不活性なものであれば特に制限は無い。
【０１２７】
当業者であれば、本発明の実施を妨げない範囲で反応温度、塩基の使用量、反応時間、出発物質の添加方法を適宜選択することができる。
【０１２８】
溶媒として好ましくは、水、メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等を挙げることができる。
【０１２９】
使用する場合の塩基として好ましくは、無機塩基、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム等のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属に対応する水酸化物、若しくは炭酸化物や、有機塩基、例えばトリエチルアミン等を挙げることができる。
【０１３０】
反応温度としては、好ましくは−２０〜１００℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度を採用することができる。
【０１３１】
なお、置換ピルビン酸とオキサロ酢酸を基質として用いて得られたアルドール反応縮合物を脱炭酸させる反応においては、自発的な脱炭酸反応によっても達成されるが、反応液に酸又は金属イオン又はその両方を添加することで脱炭酸反応をより効果的に行うことができる。その場合に使用する酸としては、塩酸、硫酸、燐酸、酢酸、パラトルエンスルホン酸、イオン交換樹脂等の固体酸等を、金属イオンとしては、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオン等の遷移金属イオン等を、それぞれ挙げることができる。反応温度として好ましくは−１０〜１００℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度を選択することができる。
【０１３２】
（ＩＩ−２）  酵素系
酵素系を利用して一般式（１）の基質ケト酸を製造する場合は、上記一般式（６）で示される置換ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から一般式（１）で示されるケト酸を生成する反応を触媒する酵素（アルドラーゼ）を用いることにより、特に困難なく、一般式（１）で示されるケト酸を生成できる。
【０１３３】
上記反応を触媒するアルドラーゼの取得源となる微生物としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物を例示できる。
【０１３４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のうち、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であれば、いかなるものも本発明に使用可能であるが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ  ＡＪ１５８２、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ２９１７、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ  ＡＪ２７９７、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ  ＡＪ２４６８がより好ましい。このうち、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１が好ましい。これらの微生物の寄託先を下記に示す。
【０１３５】
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４６（平成１４年６月１０日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８１より平成１４年１１月２２日に国際寄託へ移管）
（ｉｉ）受託日    ２００２年６月１０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ  ＡＪ１５８２株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４７（平成１４年６月１０日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８２より平成１４年１１月２２日に国際寄託へ移管）
（ｉｉ）受託日    ２００２年６月１０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（３）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．  ＡＪ２９１７株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４５（平成１４年６月１０日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８０より平成１４年１１月２２日に国際寄託へ移管）
（ｉｉ）受託日    ２００２年６月１０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（４）Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ  ＡＪ２４６８株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２
（ｉｉ）受託日    １９８５年９月３０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（５）Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ  ＡＪ２７９７株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２５０（昭和６０年９月３０日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−８４６２より平成１４年１１月２７日に国際寄託へ移管）
（ｉｉ）受託日    １９８５年９月３０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【０１３６】
アルドラーゼを取得するには、上記アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させてもよいし、組み換えＤＮＡ技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させてもよい。
【０１３７】
アルドラーゼの存在下、反応を進行させるには、アルドラーゼ、一般式（６）で示される置換ピルビン酸、および、オキサロ酢酸またはピルビン酸のうち少なくとも一種を含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ６〜１２に保ちつつ、３０分〜５日静置、振とう、または攪拌すればよい。
【０１３８】
当該反応液にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などの２価のカチオンを添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはＭｇ２＋を用いることがある。
【０１３９】
これら２価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＳＯ４等を用いることがある。これら２価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で添加することができる。
【０１４０】
反応を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙げれば、１００ｍＭ  バッファー、５０ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭ  ピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に、酵素源としてアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３３℃で４時間振とう反応させることにより、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）が得られる。
【０１４１】
生成した一般式（１）のケト酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
【０１４２】
〔ＩＩＩ〕アミノ供与体
本発明においては、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いるため、アミノ供与体としてＤ−アミノ酸を用いる。ここでいうアミノ供与体には、天然及び非天然Ｄ−アミノ酸等のアミノ化合物が含まれる。即ち、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−チロシン、Ｄ−バリン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−セリン、Ｄ−システイン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン等がアミノ酸の例として挙げられる。反応に添加するアミノ供与体は１種類でもよいし、複数の供与体の混合物でもよい。また、安価なＤＬ−アミノ酸を用いることもできる。
【０１４３】
また、Ｌ−アミノ酸またはＤＬ−アミノ酸を反応液中に添加し、該アミノ酸をラセミ化する反応を触媒する酵素を共存させることにより、Ｄ−アミノ酸供与体として供与体を供給することもできる。このようなラセミ化酵素としてはアラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼ、フェニルアラニンラセマーゼ等を好ましい例として挙げることができる。この場合、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、或いは前記Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物をグルタミン酸誘導体の生成中に反応溶液に添加することができる。
【０１４４】
〔ＩＶ〕反応条件
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、および、アミノ供与体の存在下で、一般式（１）の基質ケト酸から、（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体を効率的に生成するものである。
【０１４５】
前述のように、Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、酵素活性を発揮する限りいかなる形態で反応系に添加してもよく、例えば、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いてグルタミン酸誘導体を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質ケト酸およびアミノ供与体を添加して反応液としてもよいし、溶媒中に培養液より分離された菌体や精製酵素、基質ケト酸、アミノ供与体を添加して反応液としてもよい。
【０１４６】
Ｄ−アミノトランスフェラーゼ源として、微生物菌体を用いる場合、すなわち培養液や洗浄菌体を用いる場合は、基質ケト酸の菌体内への透過性を高めるために、トライトン  Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）やトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。また、反応促進物質として、ピリドキサール−５−リン酸等の補酵素類を上記培地に添加してもよい。上記培地成分として用いる具体的物質として、例えば、炭素源としては、利用する微生物が利用可能であれば制限は無く、例えばグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセロール、酢酸等、又はこれらの混合物を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばフマル酸  ０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス  １ｇ／ｄｌ、ペプトン  １ｇ／ｄｌ、硫安  ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ、及びＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）を含む培地等が挙げられる。
【０１４７】
また、酵素を生産させるための培養とグルタミン酸誘導体製造工程を分割して順次行わせる場合は、グルタミン酸誘導体製造工程では必ずしも好気的雰囲気下で反応を行う必要はなく、むしろ嫌気的雰囲気下で、更には窒素ガス置換、アルゴンガス置換、亜硫酸ソーダ添加等によって反応液中の溶存酸素を除いた系で反応を行わせることも可能である。
【０１４８】
反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは１０〜５０℃で行われるが、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲で行われる。反応溶液のｐＨ値については、通常、２〜１２、好ましくは６〜１１、より好ましくは７〜９の範囲で調節される。ｐＨが高いと、モナティンの原料となるＩＨＯＧが自発的に３−インドールピルビン酸とピルビン酸に分解され易く、また、ｐＨが低いと、ＩＨＯＧが環化し易くアミノ化できなくなるので好ましくない。モナティンの原料となるＩＨＯＧの分解反応および環化反応を効果的に抑制するためには、反応溶液をｐＨ８〜８．５の範囲に保つことが好ましいことがある。反応時間については、通常１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、更に好ましくは１〜２４時間程度が選択される。
【０１４９】
尚、反応液中のグルタミン酸誘導体又は基質ケト酸を定量する場合、周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはＭｅｒｃｋ社製「Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０Ｆ２５４」等を利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−８０Ａ」やダイセル化学工業（株）製「ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）」等の光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。このようにして、反応液中に蓄積されたグルタミン酸誘導体は、常法により反応液中より採取して用いることができる。反応液中からの採取は、このような場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
【０１５０】
尚、目的とするグルタミン酸誘導体は遊離体の形で取得することができるが、必要により塩の形態で取得することもできる。塩の形態としては、塩基との塩を挙げることができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機塩基、アンモニア、各種アミン等の有機塩基を挙げることができる。
【実施例】
【０１５１】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【０１５２】
本実施例において、モナティン及び４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（以下、「ＰＨＧ」と略記する。）の定量は、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−８０Ａ」（５μｍ，６Ｘ１５０ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：１２％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１５３】
本分析条件により、（２Ｓ，４Ｓ）−モナティン及び（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンは１２．１分に、（２Ｓ，４Ｒ）−モナティン及び（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンは９．７分に、（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧ及び（２Ｒ，４Ｒ）−ＰＨＧは７．２分に、（２Ｓ，４Ｒ）−ＰＨＧ及び（２Ｒ，４Ｓ）−ＰＨＧは６．０分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１５４】
また、必要に応じて、ダイセル化学工業製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）」（４．６Ｘ１５０ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。分析条件は以下に示す通りである。
【０１５５】
（モナティンの場合）
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／１０％（ｖ／ｖ）メタノール
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１５６】
本条件によりモナティン光学異性体は（２Ｒ，４Ｓ）、（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｓ，４Ｒ）、及び（２Ｓ，４Ｓ）の順に４２分、５７分、６４分、及び１２５分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１５７】
（ＰＨＧの場合）
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１５８】
本条件によりＰＨＧの光学異性体は（２Ｒ，４Ｓ）、（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｓ，４Ｒ）、及び（２Ｓ，４Ｓ）の順に２０分、２８分、３１分、及び４６分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１５９】
実施例１  ＰＨＯＧアミノ化活性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性菌株のスクリーニング
ブイヨン平板培地（栄研化学）に試験する微生物菌株を接種し、３０℃で２４時間培養した。ここから菌体をかきとり、これを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１００ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸、１００ｍＭ  Ｄ−アラニン、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに約５重量％湿菌体となるように接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。反応終了後に、生成したＰＨＧを定量した。その結果、表２に示す微生物においてＰＨＯＧからの２Ｒ−ＰＨＧ生成活性が見出され、ＰＨＯＧから（２Ｒ，４Ｓ）−ＰＨＧ及び（２Ｒ，４Ｒ）−ＰＨＧを生成せしめることができた。
【０１６０】
【表２】
2010042014.tif 000013
【０１６１】
実施例２  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来ｄａｔ遺伝子（以下、ｂｍｄａｔ）のクローニングと発現プラスミドの採取
（１）染色体ＤＮＡの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１６２】
（２）遺伝子ライブラリからのｂｍｄａｔ遺伝子の単離
まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株の染色体ＤＮＡ３０μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１Ｕ添加し、３７℃にて３時間反応させて部分消化した。次にこのＤＮＡからアガロースゲル電気泳動にて３〜６ｋｂｐの断片を回収した。これをプラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断物（ＢＡＰ処理済み・宝酒造製）１μｇにライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリン  ０．１ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天２％、ｐＨ７．０）にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリン  ０．１ｍｇ／ｍｌとイソブチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭ含むＬＢ液体培地１ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養した。培養液２００〜４００μｌを遠心分離により集菌・洗浄し菌体を得た。得られた菌体を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液２００μｌに接種し、３０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清５μｌを２００μｌのピルビン酸定量反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６Ｕ／ｍｌ  Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（オリエンタル酵母製））を含む９６ウェルプレートに加え、３０℃で１０分間反応させた後に３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて測定した。同様の反応を終濃度０．２ｍＭ〜１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（以下、ＤＡＴ）活性を検出した。
【０１６３】
上記のＤＡＴ活性クローンのスクリーニングにより、ＤＡＴ活性を示すクローンを採取した。この形質転換体よりＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製し、ｐＵＣＢＭＤＡＴと命名した。プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴをＥｃｏＲＩ処理してアガロースゲル電気泳動に供したところ、挿入断片の長さは約３．３ｋｂｐと見積もられた。
【０１６４】
（３）挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表１に示す配列のうち、６３０番から１４８１番に対応する約８５０ｂｐからなるＯＲＦを見出した。本ＯＲＦについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において９１％の相同性を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＹＭ−１株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において６６％の相同性を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１０７１６株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において４２％の相同性を示した。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「ｇｅｎｅｔｙｘ  ６」（ＧＥＮＥＴＹＸ社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。この結果より、本ＯＲＦはＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子をコードしていることが明らかとなった。
【０１６５】
実施例３  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（以下、ＢＭＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンへの変換およびＰＨＯＧからの２Ｒ−ＰＨＧへの変換
（１）ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
ｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン、０．１ｍＭ  イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む３ｍｌのＬＢ培地（バクトトリプトン  １ｇ／ｄｌ、酵母エキス  ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）に接種し、３７℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【０１６６】
（２）ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いた洗浄菌体反応
上記（１）で調製した菌体を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＩＨＯＧ、２００ｍＭ  Ｄ−アラニン、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに、湿菌体重量で２％となるように懸濁した後に、３３℃で１６時間振とう反応した。反応終了後に生成した２Ｒ−モナチンを定量した。その結果、１６．４ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンと１７．０ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンが生成した。
【０１６７】
また、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、２００ｍＭ  Ｄ−アラニン、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液を用いて同様の反応を実施し、生成した２Ｒ−ＰＨＧを定量した。その結果、１７．１ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−ＰＨＧと１９．２ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−ＰＨＧが生成した。
【０１６８】
実施例４  変異型ＢＭＤＡＴの作製
（１）変異型プラスミドの作製
部位特異的変異（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）による変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドの作製には、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用した。まず、目的とする塩基置換を導入し、かつ２本鎖ＤＮＡのそれぞれ鎖に相補的になるように設計した合成オリゴＤＮＡプライマーをそれぞれ（２本１組）合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表３に示す。
【０１６９】
変異型酵素の名称についてであるが、「野生型酵素でのアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えばＳ２４３Ｎ変異型酵素は野生型酵素の２４３番目のＳｅｒ（Ｓ）残基をＡｓｎ（Ｎ）残基に置換した変異型酵素であることを意味する。
【０１７０】
【表３】
2010042014.tif 000014
【０１７１】
該キットの方法に従い、実施例２にて採取した野生型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドｐＵＣＢＭＡＤＴを鋳型として変異型プラスミドを作製した。例えば、ｐＳ２４３Ｎの作製にあたっては、ｐＵＣＢＭＤＡＴを鋳型としてプライマーＳ２４３Ｎ−Ｓ，Ｓ２４３Ｎ−ＡＳを用いて、以下の条件で変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドを増幅した。
９５℃  ３０秒
５５℃  １分
６８℃  ８分          ×１８サイクル
【０１７２】
メチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素ＤｐｎＩ処理によって鋳型ｐＵＣＢＭＤＡＴを切断した後に、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収して塩基配列を決定し、目的とする塩基置換が導入されていることを確認した。
【０１７３】
２重変異型酵素発現プラスミドの作製は、一方の変異型発現プラスミドを鋳型として、上記と同様に作製した。具体的には、ｐＳ２４３Ｎ／Ｓ１８０ＡはｐＳ２４３Ｎを鋳型としてプライマーＳ１８０Ａ−Ｓ，Ｓ１８０Ａ−ＡＳを用いて作製した。ｐＳ２４４Ｋ／Ｓ１８０ＡはｐＳ２４４Ｋを鋳型としてプライマーＳ１８０Ａ−Ｓ，Ｓ１８０Ａ−ＡＳを用いて作製した。ｐＳ２４３Ｎ／Ｓ２４４ＫはｐＳ２４４Ｋを鋳型としてプライマーＳ２４３ＮＳ２４４Ｋ−Ｓ、Ｓ２４３ＮＳ２４４Ｋ−ＡＳを用いて作製した。
【０１７４】
（２）変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製
各種変異型ＢＭＤＡＴ遺伝子塔載プラスミドあるいはｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン、０．１ｍＭ  イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む３ｍｌのＬＢ培地（バクトトリプトン  １ｇ／ｄｌ、酵母エキス  ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）に接種し、３７℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。各種変異型ＢＭＤＡＴの発現の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行った。培養液２５０μｌより遠心分離により集菌して得られる菌体を５００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁して１０分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離（１０，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）により得られる上清５〜１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、野生型およびすべての変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミド導入株にて約３２ｋＤａ付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型ＢＭＤＡＴの発現を確認した。
【０１７５】
実施例５  変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンへの変換およびＰＨＯＧからの２Ｒ−ＰＨＧへの変換
実施例４にて調製した各種変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いて４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンの生産と４Ｒ，Ｓ−ＰＨＯＧからの２Ｒ−ＰＨＧの生産を実施した。４００μｌ培養液より遠心分離にて調整した菌体を以下の組成の反応液にそれぞれ懸濁した。
【０１７６】
ＩＨＯＧ反応溶液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧ、２００ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１ｍＭピリドキサール−５’−リン酸、０．５％（ｖ／ｖ）トルエン
【０１７７】
ＰＨＯＧ反応溶液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ４Ｒ，Ｓ−ＰＨＯＧ、２００ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１ｍＭピリドキサール−５’−リン酸、０．５％（ｖ／ｖ）トルエン
【０１７８】
反応液を３０℃で１６時間インキュベートした後に、生成した２Ｒ−モナティンおよび２Ｒ−ＰＨＧ量を定量した。結果を表４に示す。
【０１７９】
【表４】
2010042014.tif 000015
【０１８０】
その結果、Ｓ１８１、Ａ１８２、Ｎ１８３、Ｓ２４３、Ｓ２４４に変異を導入した変異型ＢＭＤＡＴにおいて４Ｒ体選択性が向上することが明らかとなった。ここでいう４Ｒ体選択性とは、生成した２Ｒ−ＰＨＧあるいは２Ｒ−モナティンのうち（２Ｒ，４Ｒ）体が占める割合のことである。特にＳ２４３Ｎにおいて１２．９ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと１．０ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し、４Ｒ体選択性が９３％に向上した。またＳ２４４Ｋにおいて１２．０ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと５．５ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し、４Ｒ体選択性が６９％に向上した。
【０１８１】
これらの変異型ＤＡＴにさらにＳ１８０Ａの変異を導入した２重変異型酵素を作製したところ、Ｓ２４３Ｎ／Ｓ１８０Ａにおいて１７．５ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと１．９ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し（４Ｒ体選択性９０％）、Ｓ２４３Ｎと比較して、４Ｒ体選択性はわずかに低下したものの、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量が増加した。またＳ２４４Ｋ／Ｓ１８０Ａにおいて１５．０ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと６．６ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し（４Ｒ体選択性７９％）、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量がＳ２４４Ｋと比較して増加した。即ち、４Ｒ体選択性の向上した変異型ＢＭＤＡＴにさらにＳ１８０Ａの変異を導入することにより、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの生成量が増加することが明らかとなった。
【０１８２】
またＳ２４３Ｎ／Ｓ２４４Ｋの２重変異型酵素を作製したところ、１１．０ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと０．２ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し、４Ｒ体選択性が９８％にまで向上した。
【０１８３】
実施例６  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−トランスアミナーゼ（以下、ＢＳＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製と洗浄菌体反応による２Ｒ−モナティンの製造
（１）発現プラスミドの構築
バチルス  スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来Ｄ−トランスアミナーゼ遺伝子（以下「ｂｓｄａｔ」と略記する。）をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にｂｓｄａｔ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＢＳＤＡＴを以下のようにして構築した。先ず、バチルス  スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１０２０８株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表５に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより当該遺伝子を増幅した。これにより、欧州公開特許ＥＰ０７３６６０４本文中、配列番号２記載のｄａｔ塩基配列において、８番目から１２７５番目までに相当するＤＮＡ断片が増幅される。この断片をＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、発現プラスミドｐＵＣＢＳＤＡＴを構築した。
【０１８４】
【表５】
2010042014.tif 000016
【０１８５】
（２）ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
ｐＵＣＢＳＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地（バクトトリプトン  １ｇ／ｄｌ、酵母エキス  ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に４時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【０１８６】
（３）ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いた洗浄菌体反応
上記（２）で調製した菌体を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＩＨＯＧ、２００ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに、湿菌体重量で５％となるように懸濁した後に、１０ｍｌ容試験管に移し、３０℃で１８時間振とう反応した。反応終了後に生成した２Ｒ−モナティンを定量した。その結果ＩＨＯＧから１３．８ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンおよび１２．７ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンを生成せしめることができた。
【０１８７】
実施例７  変異型ＢＳＤＡＴの作製
（１）変異型プラスミドの作製
部位特異的変異  （Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）による変異型ＢＳＤＡＴ発現プラスミドの作製には、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用した。まず、目的とする塩基置換を導入し、かつ２本鎖ＤＮＡのそれぞれ鎖に相補的になるように設計した合成オリゴＤＮＡプライマーをそれぞれ（２本１組）合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表６に示す。変異型酵素の名称についてであるが、「野生型酵素でのアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えばＳ２４３Ｎ変異型酵素は野生型酵素の２４３番目のＳｅｒ（Ｓ）残基をＡｓｎ（Ｎ）残基に置換した変異型酵素であることを意味する。
【０１８８】
【表６】
2010042014.tif 000017
【０１８９】
該キットの方法に従い、実施例６にて採取した野生型ＢＳＤＡＴ発現プラスミドｐＵＣＢＳＡＤＴを鋳型として変異型プラスミドを作製した。例えば、ｐＢＳ−Ｓ２４３Ｎの作製にあたっては、ｐＵＣＢＳＤＡＴを鋳型としてプライマーＢＳ−Ｓ２４３Ｎ−Ｓ，ＢＳ−  Ｓ２４３Ｎ−ＡＳを用いて、以下の条件で変異型ＢＳＤＡＴ発現プラスミドを増幅した。
９５℃  ３０秒
５５℃  １分
６８℃  ８分          ×１８サイクル
【０１９０】
メチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素ＤｐｎＩ処理によって鋳型ｐＵＣＢＳＤＡＴを切断した後に、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収して塩基配列を決定し、目的とする塩基置換が導入されていることを確認した。
【０１９１】
（２）変異型ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製
各種変異型ＢＳＤＡＴ遺伝子塔載プラスミドあるいはｐＵＣＢＳＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン、０．１ｍＭ  イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む３ｍｌのＬＢ培地（バクトトリプトン  １ｇ／ｄｌ、酵母エキス  ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）に接種し、３７℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。各種変異型ＢＳＤＡＴの発現の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行った。培養液２５０μｌより遠心分離により集菌して得られる菌体を５００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁して１０分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離（１０，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）により得られる上清５〜１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、野生型およびすべての変異型ＢＳＤＡＴ発現プラスミド導入株にて約３２ｋＤａ付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型ＢＳＤＡＴの発現を確認した。
【０１９２】
実施例８  変異型ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンへの変換
実施例７にて調製した各種変異型ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いて４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンの生産を実施した。４００μＬ培養液より遠心分離にて調整した菌体を以下の組成の反応液にそれぞれ懸濁した。
ＩＨＯＧ反応溶液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ４Ｒ、Ｓ−ＩＨＯＧ，２００ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１ｍＭピリドキサール−５’−リン酸、０．５％（ｖ／ｖ）トルエン
【０１９３】
反応液を３０℃で１６時間インキュベートした後に、生成した２Ｒ−モナティン量を定量した。結果を表７に示す。
【０１９４】
【表７】
2010042014.tif 000018
【０１９５】
その結果、Ｓ２４３，Ｓ２４４に変異を導入した変異型ＢＳＤＡＴにおいて４Ｒ体選択性が向上することが明らかとなった。ここでいう４Ｒ体選択性とは、生成した２Ｒ−モナティンのうち（２Ｒ，４Ｒ）体が占める割合のことである。特にＳ２４３Ｎにおいて９．９ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと１．０ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し、４Ｒ体選択性が９２％に向上した。またＳ２４４Ｋにおいて１２．７ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンと６．１ｍＭの（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンが生成し、４Ｒ体選択性が６８％に向上した。
【０１９６】
この結果から、ＢＭＤＡＴと相同性を有するＤＡＴ（一例を挙げるとＢＳＤＡＴ）についても、ＢＭＤＡＴへ変異を導入することによってモナティンの４Ｒ体選択性を付与することができる部位（一例を挙げるとＳ２４３、Ｓ２４４）に相当する部位へ変異を導入することにより、モナティンの４Ｒ体選択性を付与せしめることが可能であることが示された。
【０１９７】
実施例９  変異型ＢＭＤＡＴの作製
実施例４と同様の方法で、変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドを作製し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表８に示す。
【０１９８】
【表８】
2010042014.tif 000019
【０１９９】
実施例１０  変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンへの変換およびＰＨＯＧからの２Ｒ−ＰＨＧへの変換
実施例９にて調製した各種変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いて４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧからの２Ｒ−モナティンの生産と、４Ｒ，Ｓ−ＰＨＯＧからの２Ｒ−ＰＨＧの生産を実施した。４００μｌ培養液より遠心分離にて調製した菌体を以下の組成の反応液にそれぞれ懸濁した。
【０２００】
ＩＨＯＧ反応溶液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧ、４００ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、０．５％（ｖ／ｖ）トルエン
【０２０１】
ＰＨＯＧ反応溶液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ４Ｒ，Ｓ−ＰＨＯＧ、４００ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、０．５％（ｖ／ｖ）トルエン
【０２０２】
反応液を３０℃で１６時間インキュベートした後に、生成した２Ｒ−モナティンおよび２Ｒ−ＰＨＧを定量した。結果を表９に示す。
【０２０３】
その結果、Ａ１８２Ｓ、Ｓ２４３Ｎ／Ｎ１００Ａ、Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ、Ｎ１００Ａ／Ｓ１８１Ａ、Ｎ１００Ａ／Ａ１８２Ｓの各変異型ＢＭＤＡＴにおいて、野生型酵素と比較して、２Ｒ，４Ｒ−モナティン生成量が増加することが明らかとなった。特にＳ２４３Ｎ／Ｎ１００Ａ、Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ変異型ＢＭＤＡＴにおいては、８０％以上の４Ｒ−選択性を維持したまま、２Ｒ，４Ｒ−モナティン生成量が増加することが明らかとなった。
【０２０４】
【表９】
2010042014.tif 000020
【０２０５】
実施例１１  変異型ＢＭＤＡＴのアミノ化反応速度の測定
各種変異型ＢＭＤＡＴ遺伝子搭載プラスミドあるいはｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む３ｍｌのカザミノ酸培地（０．５ｇ／ｄｌ  硫酸アンモニウム、０．１４ｇ／ｄｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２３ｇ／ｄｌ  クエン酸・２Ｎａ・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｄｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ｄｌ  ＦｅＳＯ４、２ｍｇ／ｄｌ  ＭｎＳＯ４、２ｍｇ／ｄｌ  塩酸ピリドキシン、０．１ｍｇ／ｄｌ  ｔｈｉａｍｉｎｅ、１ｇ／ｄｌ  カザミノ酸、０．３ｇ／ｄｌ  グリセロール、ｐＨ７．５）に接種し、３７℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌより集菌、洗浄し、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、４℃にて３０分間超音波破砕した。超音波破砕液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清を酵素源とした。Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性（以下、ＤＡＴ活性）の測定は、Ｄ−Ａｌａをアミノドナーとしたα−ケトグルタル酸へのアミノ基転移活性を、反応の進行に従ってＤ−Ａｌａより生成するピルビン酸を酵素的に定量することにより行った。結果を表１０に示す。
【０２０６】
反応条件：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、５Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、１０ｍＭ  Ｄ−Ａｌａ、１０ｍＭ  α−ケトグルタル酸、３０℃、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定
【０２０７】
その結果、Ｎ１００Ａ、Ｓ１８１Ａ、Ａ１８２Ｓ、Ｎ１００Ａ／Ｓ１８１Ａ、Ｎ１００Ａ／Ａ１８２Ｓ、Ｓ１８１Ａ／Ａ１８２Ｓ、Ｓ２４３Ｎ／Ｎ１００Ａ、Ｎ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ各変異型ＢＭＤＡＴにおいて、野生型酵素と比較してＤＡＴ活性が増加していることが明らかとなった。
【０２０８】
【表１０】
2010042014.tif 000021
【０２０９】
実施例１２  Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ変異型ＢＭＤＡＴを用いた４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧの２Ｒ−モナティンへの変換
（１）菌体の調製
ｐＳ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地（バクトペプトン  １ｇ／ｄｌ、酵母エキス  ０．５ｇ／ｄｌ、ＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）に接種し、３７℃、１６時間シード培養した。この培養液２．５ｍｌを、０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むカザミノ酸培地（０．５ｇ／ｄｌ  硫酸アンモニウム、０．１４ｇ／ｄｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２３ｇ／ｄｌ  クエン酸・２Ｎａ・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｄｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ｄｌ  ＦｅＳＯ４、２ｍｇ／ｄｌ  ＭｎＳＯ４、２ｍｇ／ｄｌ  塩酸ピリドキシン、０．１ｍｇ／ｄｌ  ｔｈｉａｍｉｎｅ、１ｇ／ｄｌ  カザミノ酸、０．３ｇ／ｄｌ  グリセロール、ｐＨ７．５）５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコに添加し、３７℃、１８時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【０２１０】
（２）ＩＨＯＧアミノ化反応
上記（１）にて、２４０ｍｌ培養液より集菌・洗浄して調製した菌体を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、２４４ｍＭ  ４Ｒ，Ｓ−ＩＨＯＧ、６００ｍＭ  ＤＬ−Ａｌａ、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸からなる反応液１２０ｍｌに懸濁し、３７℃で２４時間攪拌し、反応を実施した。反応中のｐＨの低下を防ぐため、１Ｎ  ＫＯＨにてｐＨをｐＨ８．４±０．１に制御した。その結果、２４時間で７９．２ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−ＩＨＯＧが反応液中に蓄積した（対４Ｒ−ＩＨＯＧモル収率６５％）。得られた反応液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を取得した。
【０２１１】
（３）酵素反応液からの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの採取
酵素反応液１２１．８４ｇ（（２Ｒ，４Ｒ）−モナティン  ２．７２ｗｔ％）を合成吸着剤（三菱化学製ＤＩＡＩＯＮ−ＳＰ２０７）が６００ｍｌ充填された樹脂塔（直径４ｃｍ）に通し、流速７．５／分で純水を３時間通液し、更に流速７．５／分で１５％２−プロパノール水溶液を３時間通液し、２．６〜３．５〔溶出液量／樹脂用量（Ｌ／Ｌ−Ｒ）〕を収集することにより、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンをほぼ定量的に分取した。
【０２１２】
得られた処理液を１３．３ｇまで濃縮し、２−プロパノール６４ｍｌを添加して１０℃で１６ｈｒ撹拌した。結晶をろ過した後、得られた湿結晶３．０ｇを水１０ｍｌに溶解し、２−プロパノール３０ｍｌを３５℃で添加し、更に３５℃で２−プロパノール３０ｍｌを２時間かけて滴下した。溶液を室温に冷却し、結晶をろ過した後、減圧乾燥にて（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンのカリウム塩２．５９ｇを得た（ａｒｅａ純度９７．４％）。
【０２１３】
＜参考例１＞  ＩＨＯＧの合成
水酸化カリウム１８．９１ｇ（２８６．５ｍｍｏｌ、含量８５重量％）を溶解した水６４．４５ｍｌに、インドール−３−ピルビン酸７．５０ｇ（３５．８ｍｍｏｌ、含量９７．０重量％）とオキサロ酸１４．１８ｇ（１０７．４ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた。この混合溶液を３５℃にて２４時間攪拌した。
【０２１４】
更に、３Ｎ−塩酸４０．０ｍｌを加えて中和（ｐＨ＝７．０）し、１５３．５ｇの反応中和液を得た。この反応中和液には、ＩＨＯＧが５．５５ｇ含まれており、収率５３．３％（対インドール−３−ピルビン酸）であった。
【０２１５】
この反応中和液に水を加え、１６８ｍｌとし、合成吸着剤（三菱化学製ＤＩＡＩＯＮ−ＳＰ２０７）８４０ｍｌにて充填された樹脂塔（直径４．８ｃｍ）に通液した。更に、流速２３．５ｍｌ毎分にて純水を通液し、１．７３〜２．５５（Ｌ／Ｌ−Ｒ）を収集することにより、高純度のＩＨＯＧを３．０４ｇ含む水溶液を、収率５４．７％（樹脂への投入量に対して）にて得た。
【０２１６】
（ＮＭＲ測定）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），３．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），７．０６−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３５．４３，４７．９１，７７．２８，１０９．４９，１１２．０５，１１９．４４，１１９．６７，１２１．９１，１２５．４２，１２８．４１，１３６．２１，１６９．７８，１８１．４３，２０３．５８
【０２１７】
＜参考例２＞  ＰＨＯＧの合成
水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した水２５ｍｌに対し、フェニルピルビン酸５．０ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）、オキサロ酢酸１２．１ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２．２に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、ＰＨＯＧ２．８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）を結晶として得た。
【０２１８】
（ＮＭＲ測定）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：２．４８（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．６０（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．８５−３．３０（ｍ，３．６４Ｈ），７．１７−７．３６（ｍ，５Ｈ）
【０２１９】
（分子量測定）
ＥＳＩ−ＭＳ  計算値  Ｃ１２Ｈ１２Ｏ６＝２５２．２３，分析値２５１．２２（ＭＨ−）
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明により、甘味料等として期待できるモナティンのなかでも最も甘味度の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを酵素反応を利用して効率良く製造することができるので、本発明は工業上、特に食品の分野において極めて有用である。
【配列表】
2010042014000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月2日(2009.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）、（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項２】
前記（ａ）、（ｂ）の置換は、下記（ａ’）、（ｂ’）の置換であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
（ａ’）２４３位のセリン残基のリシン残基、またはアスパラギン残基への置換
（ｂ’）２４４位のセリン残基のリシン残基への置換
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のタンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式（１）
【化１】
2010042014.tif 000024
（一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。）
で示されるケト酸から、下記一般式（２）
【化２】
2010042014.tif 000025
（一般式（２）におけるＲは、一般式（１）におけるＲと同義である。）
で示される（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体（塩の形態を含む）を生成することを特徴とする光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
下記タンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式（１）
【化３】
2010042014.tif 000026
〔一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。〕
で示されるケト酸から、下記一般式（２）
【化４】
2010042014.tif 000027
〔一般式（２）におけるＲは、一般式（１）におけるＲと同義である。〕
で示される（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体（塩の形態を含む）を生成することを特徴とする光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法であって、
タンパク質が、下記（Ａ）あるいは（Ｂ）のアミノ酸配列：
（Ａ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列；あるいは
（Ｂ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列；
を有し、かつ、アミノ供与体の存在下で、前記一般式（１）で示されるケト酸から、前記一般式（２）で示される（２Ｒ、４Ｒ）体のグルタミン酸誘導体を生成する活性を有するタンパク質である、光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記Ｒは、フェニル基またはインドリル基であることを特徴とする請求項３または請求項４記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記アミノ供与体は、アミノ酸であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
反応系にＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素、又は、当該酵素活性を有する微生物を含有することを特徴とする、請求項６記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項８】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に対し、４Ｒ体選択的に作用して、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを生成するＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）、（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）２４３位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）２４４位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、２４３位、２４４位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の細胞を培地中で培養し、培地および／または細胞中にＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
タンパク質のスクリーニング方法であって、
下記（１）〜（３）の工程：
（１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を導入したタンパク質を作製する工程； 
（２）前記（１）で作製されたタンパク質について、所定の活性の有無を確認する工程；ならびに
（３）前記（２）の結果に基づき、前記（１）で作製されたタンパク質のなかから、前記所定の活性を有するタンパク質を選択する工程；
を含み、
前記所定の活性が、アミノ供与体の存在下で、
下記一般式（１）：
【化５】
2010042014.tif 000028
〔一般式（１）中、Ｒは、芳香環または複素環であり、当該芳香環または複素環は、さらにハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。〕
で示されるケト酸から、
下記一般式（２）：
【化６】
2010042014.tif 000029
〔一般式（２）におけるＲは、一般式（１）におけるＲと同義である。〕で表されるケト酸を生成する活性である、スクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のスクリーニング方法を行なう工程を含む、前記所定の活性を有するタンパク質の製造方法。