(57)【要約】【課題】コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子励起の蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察する。【解決手段】標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路１３，１４と、２つの光路１３，１４を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波装置９と、合波されたパルスレーザ光を標本Ａに照射する集光レンズ１０５と、２つの光路１３，１４を導光される各パルスレーザ光のチャープレートを検出する周波数特性検出装置１０と、検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能な周波数分散量調節装置６とを備えるレーザ顕微鏡装置１を採用する。【選択図】図１
2010066239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、
該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波されたパルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、
前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光のチャープレートを検出する周波数特性検出手段と、
該周波数特性検出手段により検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能な周波数分散量調節手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記周波数分散量調節手段が、標本面上におけるパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能である請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記周波数特性検出手段が、さらに、前記二つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を検出し、
該周波数特性検出手段により検出された周波数差を所定の周波数差に調節するための周波数差調節手段を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
フェムト秒パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光を少なくとも前記２つの光路に分岐する分波手段と、
該分波手段により分岐された前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数をその周波数帯域を変更または拡大するように変換する周波数変換手段とを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数特性を表示する表示手段を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記周波数特性検出手段が、検出された前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数特性値、あるいは周波数特性を演算にて求めるための中間値を記憶する記憶手段を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項７】
前記周波数特性検出手段が、前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光のスペクトログラムを検出する検出手段を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項８】
前記周波数特性検出手段が、前記２つの光路を導光される該パルスレーザ光の相互相関信号を検出する検出手段を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項９】
前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１から請求項８のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
【０００３】
従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。
【０００４】
また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の従来例のように、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い（または、パルス幅が比較的広い）ピコ秒パルスレーザ光を用いるのが良い。なぜならば、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうことで、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率的に利用できなくなってしまう。
【０００７】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光のチャープレートを検出する周波数特性検出手段と、該周波数特性検出手段により検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能な周波数分散量調節手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【００１０】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、２つの光路を導光される各パルスレーザ光が合波手段により合波され、照射手段により標本に照射される。この際、２つの光路を導光される各パルスレーザ光のチャープレートが周波数特性検出手段により検出される。そして、周波数特性検出手段により検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートが周波数分散量調節手段により調節される。これにより、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を常に一定に保つように調節することが可能となる。
【００１１】
このように２つのパルスレーザ光の周波数差を時間軸上で一定に保った状態で、標本面上に集光することにより、フェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数帯域を有するパルスレーザ光であっても、２つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために用いることができる。
【００１２】
また、フェムト秒レーザ光のような周波数帯域が比較的広いパルスレーザ光を利用した場合には、いずれか一方のパルスレーザ光を標本に集光することにより、多光子励起光効果を発生させることができる。
以上のように、本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光を効率的に発生させ、鮮明なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像および多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
【００１３】
上記発明において、前記周波数分散量調節手段が、標本面上におけるパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能であることとしてもよい。
このようにすることで、周波数分散量調節手段により、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節し、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づけることができる。これにより、多光子励起光効果を効率的に発生させて、より鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。
【００１４】
上記発明において、前記周波数特性検出手段が、さらに、前記二つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を検出し、該周波数検出手段により検出された周波数差を所定の周波数差に調節するための周波数差調節手段を備えることとしてもよい。
周波数差調節手段は、一方のパルスレーザ光に対して、他方のパルスレーザ光の時間的な重なりを調節することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を２つのパルスレーザ光の周波数帯域内において任意に調節することが可能である。これにより、時間軸上で一定に保った２つのパルスレーザ光の周波数差を確認し、所定の周波数差と一致させることが可能となり、所望のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を、より正確に得ることが可能となる。
【００１５】
上記発明において、フェムト秒パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光を少なくとも前記２つの光路に分岐する分波手段と、該分波手段により分岐された前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数をその周波数帯域を変更または拡大するように変換する変換する周波数変換手段とを備えることとしてもよい。
【００１６】
このようにすることで、単一のレーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光を分波手段により２つの光路に分岐し、周波数変換手段により、２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数を変換することができる。これにより、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることのできる２つのパルスレーザ光を得ることができ、これらパルスレーザ光のレーザ光源を共通化して装置構成を簡略化することができる。
【００１７】
上記発明において、前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数特性を表示する表示手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、表示手段に各パルスレーザ光の周波数特性を表示させつつ、周波数分散量調節手段によりパルスレーザ光のチャープレートを調節、確認することができる。これにより、容易かつ確実に、２つのパルスレーザ光の周波数差を常に一定に保つように調節することが可能となる。
【００１８】
上記発明において、前記周波数特性検出手段が、検出された前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数特性値、あるいは周波数特性を演算にて求めるための中間値を記憶する記憶手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、周波数特性を求めるのに必要な種々の演算が容易に実現できるようになるほか、周波数特性値を種々装置へ出力したり、後工程で確認したりすることも容易となる。
【００１９】
上記発明において、周波数特性検出手段が、前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光のスペクトログラムを検出する検出手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、検出すべき周波数特性の演算が比較的容易に実現できるようになるほか、表示手段にて該周波数特性を確認する際に、その確認も容易になる。
【００２０】
上記発明において、前記周波数特性検出手段が、前記２つの光路を導光される該パルスレーザ光の相互相関信号を検出する検出手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、より簡便な構成で、安価に周波数特性を検出することができるようになる。
【００２１】
上記発明において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節することが可能となる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図１から図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。
【００２４】
レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐する分波装置５（分波手段）と、分波装置５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路１３，１４と、２つの光路１３，１４を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波する合波装置（合波手段）９とを備えている。
【００２５】
第１の光路１３には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散量調節装置（周波数分散量調節手段）６が設けられている。
周波数分散量調節装置６は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路１３上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散量調節装置６を通過するパルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節することでそのパルスレーザ光のチャープレートが調節できるようになっている（例えば、特許文献２参照）。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対（図示略）を用いてもよい。
【００２６】
また、周波数分散量調節装置６は、周波数分散量調節装置６を通過したパルスレーザ光Ｌ１’が、標本Ａにおいて略フーリエ限界パルスに近づくような分散量およびチャープレートを設定することができるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのフェムト秒パルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。
なお、周波数分散量調節装置６は、後述する周波数特性検出装置（周波数特性検出手段）１０により検出された各パルスレーザ光のチャープレートに基づいて制御される。
【００２７】
第２の光路１４には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）７と、フォトニッククリスタルファイバ７通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を調節する周波数差調節装置（周波数差調節手段）８が設けられている。
【００２８】
フォトニッククリスタルファイバ７は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更または拡大してパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路１３，１４を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の観測すべき分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００２９】
周波数差調節装置（周波数差調節手段）８は、例えば、ミラー及びリフレクタにより構成される（図示略）。より具体的には、光路１４上に配されるミラーによりパルスレーザ光Ｌ２’の光路１４を略９０°折り返し、この折り返したＬ２’の光路上に配されるリフレクタで略１８０°さらに折り返して戻し、さらにもう１枚の光路１４上に配されるミラーにより元の光路１４に戻すように配置されている。光路１４上に配されるミラーとリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を変化させることができる。これにより、パルスレーザ光Ｌ２’が標本Ａに到達する際のタイミングを調節することができる。
【００３０】
合波装置（合波手段）９は、光路１４を通過してきたパルスレーザ光Ｌ２’から所望の周波数帯域の成分を切り出すフィルタ（図示略）と、該フィルタを通過したパルスレーザ光Ｌ２’と光路１３を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’とを合波して、ほぼそれらが同軸に導波するようにしたパルスレーザ光Ｌ３を生成する合波部（図示略）とを備えている。すなわち、このパルスレーザ光Ｌ３は、パルスレーザ光Ｌ１’と該フィルタを通過したパルスレーザ光Ｌ２’成分を両方含んだ光波である。合波装置９のフィルタにパルスレーザ光Ｌ２’を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるに際して不要な周波数成分を除去することができる。
【００３１】
顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１０１およびレンズ群１０２と、スキャナ１０１により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ（照射手段）１０５と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１０５によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１０４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１０７と、集光レンズ１０７により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１０８とを備えている。
【００３２】
図中、符号１０３はダイクロイックミラー、符号１０６は顕微鏡ステージである。なお、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１０７により集光され第２の検出器１０８で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は集光レンズ１０５により集光され第１の検出器１０４で検出されてもよい。
【００３３】
また、レーザ光源装置２は、顕微鏡へ導光されたパルスレーザ光Ｌ３に含まれるパルスレーザ光Ｌ１’及びＬ２’の周波数特性を検出するための周波数特性検出装置１０と、集光レンズ１０５と標本Ａ間に設定されるパルスレーザ光標本点１９上に設置され、パルスレーザ光Ｌ３を周波数特性検出装置１０へ導光するためのパルスレーザ光導光部１８とを備えている。このパルスレーザ光導光部１８は、図示しない折り返しミラーやプリズム等で、パルスレーザ光Ｌ３の光軸を、周波数特性検出装置１０の方向に変更して、光路１５のパルスレーザ光Ｌ４として空間的に入射させることができる。その際にはレンズ等を使っても良い。また、ファイバを使って導光するようにすることもできる。レンズやプリズム、ファイバ光学系を使用する場合には、それらにより付与されるチャープ量を予め評価し、後述する極短パルス光測定部２０１による計測値を補正する必要がある。
【００３４】
周波数特性検出装置１０は、図２に示されるように極短パルス光測定部２０１とチャープ評価部２０２から構成される。極短パルス光測定部２０１は、図３に示されるような、パルスレーザ光Ｌ１’、Ｌ２’に含まれる周波数と時間成分の分布であるスペクトログラムＳ１＝Ｓ１（ｖ１，Ｔ１）、Ｓ２＝Ｓ２（ｖ２，Ｔ２）を測定し、そこからチャープレートＣ１（Ｃ１＝Δｖ１／ΔＴ１）、Ｃ２（Ｃ２＝Δｖ２／ΔＴ２）を、各パルスの周波数幅Δｖとパルスの時間幅ΔＴを用いて算出する手段である。該手段の一つとして、ＦＲＯＧ（Frequency-Resolved Optical Grating）検出装置を用いることができる（例えば、非特許文献１参照）。
なお、前述の極短パルス光測定部２０１は、ＦＲＯＧ以外にＧＲＥＮＯＵＩＬＬＥ、ＳＰＩＤＥＲ(Spectral phase Interferometry for direct Electric field Reconstruction)，Ｓｏｎｏｇｒａｍであってもよい（例えば非特許文献２〜４参照）。
【非特許文献１】Journal of optical society America B 11, 2206-2215 (1994)“Frequency-Resolved Optical Gating With the Use of Second-Harmonic Generation”
【非特許文献２】Optics Express 11, 68-78 (2003)“Measuring spatial chirp in ultrashort pulses using single-shot Frequency-Resolved Optical Gating,”
【非特許文献３】Optics Letters 23, 792-5 (1998)“Spectral phase interferometry for direct electric-field reconstruction of ultrashort optical pulses”
【非特許文献４】IEEE PHOTONICS TECHNOLOGY LETTERS, VOL. 13, NO. 5“Optical Sampling System at 1.55 _m for the Measurement of Pulse Waveform and Phase Employing Sonogram Characterization”
【００３５】
図２に示すように、チャープ評価部２０２は、次の（１），（２），（３）の機能を備える。すなわち、（１）極短パルス光測定部２０１によって測定される、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のパルスレーザ光標本点１９におけるスペクトログラムＳ１，Ｓ２、チャープレートＣ１，Ｃ２、およびパルスの周波数幅Δｖとパルスの時間幅ΔＴ等の周波数特性データを記憶する機能、および（２）チャープレートＣ１，Ｃ２から、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートの差ΔＣ（ΔＣ＝Ｃ１−Ｃ２）を演算し、かつスペクトログラムデータに基づいてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ωを演算しそれぞれ記憶する機能、および（３）表示画面を有し、各パルスレーザ光のスペクトログラムＳ１，Ｓ２とチャープレートの差ΔＣ、および周波数差Ωを図や数値などで画面上に表示する機能を備える。チャープ評価部２０２は、レーザ顕微鏡装置を制御するコンピュータや画像やデータ表示用の表示装置で、これらの機能を達成することができる。
【００３６】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、分波装置５により２つの光路１３，１４に分岐される。
【００３７】
第１の光路１３に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１が、第１の光路１３上に配置されている周波数分散量調節装置６を通過させられることによって発生するパルスレーザ光Ｌ１’には、初期の周波数分散量が与えられる。一方、第２の光路１４に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、フォトニッククリスタルファイバ７を通過させられることにより、第１の光路１３のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ７を通過することにより所定の周波数分散量が与えられる。さらにこれらパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’には、合波装置９から標本Ａ面上までの光学系を通過することによりこれら光学系全系の周波数分散量が加えられる。
【００３８】
このように周波数分散量が与えられたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を、集光レンズ１０５と標本Ａ間に位置するパルスレーザ光標本点１９から、パルスレーザ光導光部１８によって周波数特性検出装置１０へと入射させ、極短パルスレーザ光測定部２０１によって周波数特性を測定する。チャープ評価部２０２は、これらの測定データに基づき、標本Ａ面上におけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のスペクトログラムＳ１，Ｓ２と、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレート差ΔＣと、周波数差Ωを演算、記憶、表示する。
【００３９】
この際、図４（ａ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートが相違する場合には、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ωは時間軸上の各時刻において異なり、一定に保たれない。この状態においては、標本Ａ中の分子の特定の振動モードに対応する周波数差と異なる周波数差のパルス成分はノイズとなるため、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の振動モードのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率よく利用することができない。
【００４０】
そこで、周波数特性検出装置１０において検出されたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートが標本Ａにおいて略同等となるように周波数分散量調節装置６を作動させて、図４（ａ）の矢印Ｐ１に示されるようにチャープレートを変化させる。なお、この際、周波数分散量調節装置６の操作は、周波数特性検出装置１０からの制御信号１１にて行う。すなわち、チャープ評価部２０２にて表示されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のスペクトログラムとチャープレート差ΔＣの値を目視で確認しながらユーザが手動で行ってもよいし、チャープ評価装置２０２にて計算されるチャープレート差ΔＣの目標値を設定しておいて自動的に制御信号を出すようにしてもよい。これらの機能によって、顕微鏡操作者は、標本Ａ面上におけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のスペクトログラムＳ１，Ｓ２、チャープレートの差ΔＣ、周波数差Ωなどの周波数特性を、視覚的に捉えたり、数値情報として確認・認識できるようになる。
【００４１】
また、２つのパルスレーザ光Ｌ１‘，Ｌ２’の周波数差Ωを時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のパルスのタイミングによっては、図４（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ω’に一致しない場合がある。この場合には周波数差調節装置８により、第２の光路１４を通過するパルスレーザ光Ｌ２’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図４（ｂ）に矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差を、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ω’に一致させることができる。なお、この際の周波数差調節装置８の操作は、周波数特性検出装置１０からの制御信号１２にて行う。すなわち、チャープ評価部２０２にて表示される周波数差Ωの値を目視で確認しながらユーザが手動で行ってもよいし、チャープ評価装置２０２にて計算される周波数差Ωの許容範囲を決めておき、所定の振動周波数とその範囲に入るように自動的に制御信号を出すようにしてもよい。
【００４２】
以上のように周波数分散量調節装置６および／または周波数調節装置８を作動させることで、合波装置９に到達する２つの光路１３，１４のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートＣと周波数差Ωが調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は、合波装置９によって合波され、同軸上のパルスレーザ光Ｌ３となる。
【００４３】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１０１によって２次元的に走査された後、レンズ群１０２と集光レンズ１０５を介して標本Ａに集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の所定の分子の振動周波数に合わせたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率よく発生させることができる。
【００４４】
標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１０５とは反対側に配置された集光レンズ１０７によって集光され、第２の光検出器１０８により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａでの集光位置の座標と、第２の光検出器１０８により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００４５】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、２つの光路１３，１４を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の標本Ａの位置におけるチャープレートが周波数特性検出装置１０により検出される。そして、周波数特性検出装置１０により検出されたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートが略同等となるように、第１の光路１３を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を周波数分散量調節装置６により調節することで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差を標本Ａ中の分子の所定の振動周波数に一致させることが可能となる。このようにすることで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。
【００４６】
また、周波数調節装置８により、２つの光路１３，１４を通過して合波装置９に入射されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’が標本Ａに到達するタイミングを調節することで、標本Ａにおいて２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ωを、標本Ａ中の分子の所望の振動周波数に一致させることができる。これにより、効率的かつ正確にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ωを任意に調節することができるため、標本Ａ中の別の分子の振動周波数に一致させることもスキャンしてその分布を観測することも可能となる。
【００４７】
また、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性を測定する場合、集光レンズ１０５直後の標本点１９以外に、２０や２１など集光レンズ１０５より手前（光源）側の光路上の点を標本点としてパルス光の周波数特性を測定してもよい。標本点１９の位置であれば、その周波数特性は、ほぼ標本Ａの位置での周波数特性に一致するが、この位置の場合には、以下の方法により、標本Ａにおける周波数特性を算出する必要がある。すなわち、集光レンズ１０５の手前で周波数特性を測定することにより取得される、ΔｖＡ，ΔＴＡ，ＣＡと、これと同一の標本点において、集光レンズ１０５の後の略標本位置Ａに挿入したミラー（図示略）からの反射光の周波数特性を測定することにより取得される、ΔｖＢ，ΔＴＢ，ＣＢを用いると、標本Ａ面でのチャープレートは次式で計算される。
【００４８】
【数１】
2010066239.tif 000003
【００４９】
なお、この場合、該標本点には、図示しないミラーとビームスプリッタを切り替えて配置できるようにし、始めにミラーで集光レンズ１０５の手前でパルスレーザ光Ｌ３の光軸を周波数特性検出装置１０の方向に変更して空間的に入射させ測定し、続いてビームスプリッタに切り替えて、上述の挿入したミラーで集光レンズ１０５を往復して戻ってきたパルスレーザ光Ｌ３の光軸を周波数特性検出装置１０の方向に変更して空間的に入射させ測定すればよい。
【００５０】
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ７を使用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、周波数調節手段として、ミラー（リフレクタ）を有する周波数調節装置８を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
【００５１】
また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１０５により集光され、ダイクロイックミラー１０３によって分岐されて第１の光検出器１０４により検出されてもよい。
【００５２】
次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、多光子励起型の蛍光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
この場合には、周波数特性検出装置１０により測定された標本Ａにおけるパルスレーザ光Ｌ１’のチャープレートが大きくなるように周波数分散量調節装置６を作動させる。具体的には、図５に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を設定する。すなわち、図５（ａ）のＰ３の方向に分散量調節装置６を作動させ、図５（ｂ）のようにチャープレートを増大させる。このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１’を集光レンズ１０５により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
【００５３】
標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１０５によって集光された後、ダイクロイックミラー１０３によって分岐されて第１の光検出器１０４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１’の標本Ａでの集光位置の座標と、第１の光検出器１０４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１０７によって集光され、第２の光検出器１０８により検出されてもよい。
【００５４】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、周波数特性検出装置１０によりパルスレーザ光Ｌ１’の標本Ａにおけるチャープレートを検出し、周波数分散装置６によりパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を調節することで、パルスレーザ光Ｌ１’が標本Ａにおいて略フーリエ限界パルスとなるようにすることができる。これにより、多光子励起光効果を効率的に発生させて、鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。
【００５５】
なお、多光子蛍光観察時における周波数分散量調節装置６の操作は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時と同様に、ユーザによる手動としてもよいし、自動としても良い。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１０７によって集光され、第２の光検出器１０８により検出されてもよい。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ（第二高調波）光、ＴＨＧ（第３高調波）光観察などの観察も行うことができる。
【００５６】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
【００５７】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図６、図７、図８を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１が第１の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光の周波数特性を顕微鏡本体５３内の標本点において検出するのではなく、レーザ光源装置５２内の光路１３及び１４から引き出して検出し、その結果から標本Ａでのパルスレーザ光の周波数特性を演算により見積もる機能を持つ点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置５１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる上述の点について主に説明する。
【００５８】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１は、図６に示されるように、レーザ光源装置５２と、レーザ光源装置５２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体５３とを備えている。
【００５９】
レーザ光源装置５２は、図６に示されるように、光路１３上のパルスレーザ光Ｌ１’及び光路１４上のパルスレーザ光Ｌ２’上の合波装置（合波手段）９より手前の位置に、パルスレーザ光導光手段としてのビームスプリッタ２２と２３をそれぞれ備えている。これらにより、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の一部が折り返され、光路１６、１７を通るパルスレーザ光Ｌ６，Ｌ７となる。この光路１６、１７には、合波装置９と略同一の光学要素で構成される合波装置２４が更に配置される。この合波装置２４により、光路１６、１７を通るパルスレーザ光Ｌ６，Ｌ７は、ほぼそれらの光軸が同軸に導波するパルスレーザ光Ｌ８（光路２５）となる。このパルスレーザ光Ｌ８は、この光路２５上に配置された周波数特性検出装置（周波数特性検出手段）５０により周波数特性が測定される。なおレーザ光源装置５２のその他の部分の構成は、第１の実施形態と同様である。
【００６０】
なお顕微鏡本体５３は、図６に示されるように、上記に伴い、第１の実施形態では顕微鏡本体内にあった標本点（符号１９，２０，２１）が顕微鏡本体外に出ており、これに付随した変更はあるが、その他の構成は第１の実施形態と同様である。
【００６１】
周波数特性検出装置５０は、図７に示されるように、極短パルス光測定部２０１とチャープ量評価部５０２から構成される。極短パルス光測定部２０１としては、例えばＦＲＯＧ検出装置等、第１の実施形態と同様の装置で構成される。一方チャープ量評価部５０２は、第１の実施形態とは異なり、計測したパルスレーザ光Ｌ８（光路２５）に含まれるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性から、標本Ａ上におけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性を演算により見積もる機能を加えて備えており、具体的にはレーザ顕微鏡装置を制御するコンピュータ中にソフトウエアとして実現されている。
【００６２】
周波数特性検出装置５０の該機能につき、図７を用いてさらに詳しく説明する。入力されたパルスレーザ光Ｌ８（光路２５）は、極短パルス光測定部２０１において、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’それぞれの周波数特性として、チャープレートＣ、パルス時間幅ΔＴ(ΔＴ１,ΔＴ２)パルス周波数幅Δｖ（Δｖ１, Δｖ２）、パルス中心周波数ｖ０（中心波長λ０）、スペクトログラムＳが計測される。なお、この計測された周波数特性は、合波装置２４を配したことにより、ほぼ光路１３、１４上の合波装置９の位置でのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性に等しい（図８（ａ）参照）。
【００６３】
チャープ量評価部５０２は、極短パルス光測定部２０１において計測された、Ｌ１’，Ｌ２’のパルスレーザ光の周波数特性値（Ｃ、ΔＴ、Δｖ、ｖ０（λ０）、Ｓ）を記憶し、標本Ａにおけるチャープレート値とチャープレート差ΔＣを以下の演算過程によって計算し、記憶する機能を持つ。
【００６４】
［チャープレートの演算過程］
極短パルス光測定部２０１において測定された、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’それぞれのチャープレート値Ｃおよびパルスの時間幅ΔＴの情報から、以下の計算式により標本Ａにおけるパルスレーザ光の周波数幅Δｖｃａｌｃおよびパルス時間幅ΔＴｃａｌｃが計算され、チャープレートＣｃａｌｃが求まる。（例えば、非特許文献５参照）
【非特許文献５】電気情報通信学会編、「超高速光技術」、第４章
【００６５】
【数２】
2010066239.tif 000004
ｉはパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に対応する添字を表す（ｉ＝１またはｉ＝２）。
【００６６】
【数３】
2010066239.tif 000005
【００６７】
Ｌは合波装置９から標本Ａまでの光学系に存在する各光学素子の物質長、ｎは各光学素子の屈折率、λ０（ｉ）はパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の中心波長、ｃは光速である。なお、計算に必要なＬやｎの波長依存データは、テーブルとして記憶されており、観察時に対物を変更したり、波長を変更したりしても、上述の演算過程が実行できるようになっている。
チャープレート差ΔＣは上記で求めたＬ１’のチャープレートとＬ２’のチャープレートの差より求めることができる。
【００６８】
さらにチャープ量評価部５０２は、標本Ａ上にパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’が到達する時間差ΔＴｄｅｌａｙを以下の演算過程により計算し、これより周波数差Ωを概算し、またこれらを記憶する演算機能を備える。これによって、求められたΔＴｄｅｌａｙ及び周波数差Ωも記憶される。
［到達時間差ΔＴｄｅｌａｙの演算過程］
【００６９】
【数４】
2010066239.tif 000006
ｉはパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に対応する添字を表す（ｉ＝１またはｉ＝２）。
【００７０】
ここで、DＴ’１，DＴ’２は：パルスレーザ光が合波装置９から標本Ａに到達するまでの時間、DＴ１２は極短パルス光測定部２０１で測定されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間差である。
Ｌは合波装置９から標本Ａまでの光学系に存在する各光学素子の物質長、ｎは各光学素子の屈折率、λ０（ｉ）はパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の中心波長、ｃは光速である。
【００７１】
以上の演算により算出された、標本Ａにおけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性を模式的に示すと図８（ｂ）のようになる。なお、図８（ｂ）は、スペクトルグラムの略中心値を直線にて模式化して示してある。パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差については、このスペクトルグラムＳ１及びＳ２の時間軸上の重なり部分の周波数差を求め、その平均値として概算するようになっている。
【００７２】
さらにチャープ量評価部５０２は、標本Ａにおけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性を図や数値表示できるようになっている。より具体的には、図７及び図８（ｂ）に示すように、Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレート差ΔＣ、タイミング差ΔＴｄｅｌａｙ、周波数差Ω及び、前述のスペクトルグラムの模式図を示すようになっている。
【００７３】
次に、この周波数特性検出装置５０の作用について説明する。前述の第１の実施形態でも示したように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートが標本Ａにおいて略同等となるように周波数分散量調節装置６を作動させて、図８（ｂ）の矢印Ｐ４に示されるようにチャープレートを変化させる。なお、この際、周波数分散量調節装置６の操作は、周波数特性検出装置５０からの制御信号１１にて行う。すなわち、チャープ評価部５０２にて表示されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の模式的なスペクトログラムやチャープレート差ΔＣｃａｌｃの値を目視で確認しながらユーザが手動で行ってもよいし、チャープ評価装置５０２にて計算されるチャープレート差の目標値を設定しておいて自動的に制御信号を出すようにしてもよい。
【００７４】
また、２つのパルスレーザ光Ｌ１‘，Ｌ２’の周波数差を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のパルスのタイミングによっては、図８（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差が観測すべき標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に一致しない場合がある（図中で示したΩ“）。この場合には周波数差調節装置８により、第２の光路１４を通過するパルスレーザ光Ｌ１’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図８（ｂ）に矢印Ｐ５で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ωを、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に一致させることができる。なお、この際の周波数差調節装置８の操作は、周波数特性検出装置５０からの制御信号１２にて行う。すなわち、チャープ評価部５０２にて表示されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の到達時間差ΔＴｄｅｌａｙや周波数差Ωの値を目視で確認しながらユーザが手動で行ってもよいし、チャープ評価装置５０２にて計算される周波数差Ωの許容範囲を決めておき、所定の振動周波数とその範囲に入るように自動的に制御信号を出すようにしてもよい。
【００７５】
これらの機能によって、顕微鏡操作者は、標本Ａにおけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のスペクトログラムＳ１，Ｓ２、チャープレートの差ΔＣｃａｌｃ、周波数差Ωなどの周波数特性を、視覚的に捉えたり、数値情報として確認・認識できるようになる。
【００７６】
このように、顕微鏡装置５３内にパルスレーザ光Ｌ３の周波数特性を測定するための標本点を設けられない場合でも、パルスレーザ光Ｌ３が集光された標本Ａの各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数を選択し、該振動周波数からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させることができる。
【００７７】
また、周波数特性検出装置５０により、パルスレーザ光Ｌ１’の標本Ａでの周波数特性を求め、これによりチャープレートＣ１を大きくするように周波数分散量調節装置６を作動させることで、第１の光路１３を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を調節し、標本Ａにおいて略フーリエ限界パルスとすることができる。これにより、多光子励起光効果を効率的に発生させて、鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。
【００７８】
なお、多光子蛍光観察時における周波数分散量調節装置６の操作は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時と同様に、ユーザによる手動としてもよいし、自動としても良い。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ（第二高調波）光、ＴＨＧ（第３高調波）光観察などの観察も行うことができる。
【００７９】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
【００８０】
なお、本実施形態において、光路１３上のパルスレーザ光Ｌ１′及び光路１４上のパルスレーザ光Ｌ２’上の合波装置（合波手段）９より手前の位置に、パルスレーザ光導光手段としてのビームスプリッタ２２と２３をそれぞれ備え、さらに合波装置９と略同一の光学要素で構成される合波装置２４を配して、光路２５上の合波であるパルスレーザ光Ｌ８を作り、これを周波数特性検出装置５０に導波させ周波数特性を測定するようにしたが、合波装置９で合波したパルスレーザ光Ｌ３を直接分波してこれを周波数特性検出装置５０に導波させ周波数特性を測定するようにしても、同様の作用と効果を得ることができる。
【００８１】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図９〜図１３を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置６１が第１、第２の実施形態と異なる点は、標本Ａでのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数特性の検出を、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の相互相関信号を計測することによって可能にする点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置６１について、第１、第２の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００８２】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置６１は、図９に示されるように、レーザ光源装置６２と、レーザ光源装置６２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体６３とを備えている。
【００８３】
図９に示すように、レーザ光源装置６２内の分波装置（分波手段）６５では、レーザ光源４から出射されたフェムト秒パルスレーザ光を３分岐し、そのうち２つを光路１３および１４へ導光し、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２とし、残りの１つのフェムト秒パルスレーザ光を光路２６へ導光し、パルスレーザ光Ｌ９とする。このパルスレーザ光Ｌ９は、標本Ａにおけるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の相互相関波形計測用の参照パルスとして用いる。
【００８４】
周波数特性検出装置６０は、図１０に示すように、相互相関計６０１およびチャープ量評価装置６０２から構成される。パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は集光レンズ１０５を透過後、パルスレーザ光標本点１９から、第１の実施形態と同様のパルスレーザ光導光部１８によって周波数特性検出装置６０へ導光される。周波数特性検出装置６０へ導光されたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は、該装置に備えられた、相互相関計６０１へ入射させられる。また、参照パルスであるパルスレーザ光Ｌ９（以降、参照パルス光Ｌ９と呼ぶ）も相互相関計６０１へ導光させられる。
【００８５】
相互相関計６０１は図１１に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に対する、参照パルス光Ｌ９の遅延時間を調節するための参照パルスタイミング調節装置６０３と、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の相互相関波形ｆ＝ｆ（ｔ）を検出するための二光子吸収光検出装置６０４を備える。参照パルスタイミング調節装置６０３は、周波数分散量調節装置６と同様なミラー及びリフレクタにより構成され、光路長を調整することで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に対する参照パルスレーザ光Ｌ９の遅延時間を変更可能となっている。二光子吸収光検出器６０４は、パルスレーザ光Ｌ１’およびＬ２’に対する二光子吸収波長帯に感度を有する光電変換素子であり、例えばＧａＡｓＰやＧａＰフォトダイオードを使用できる（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献３】特開２００８−２０２４７号公報  なお相互相関波形の検出には、前記の二光子吸収光検出器以外に第二高調波発生等の非線形光学結晶を使用してもよい。
【００８６】
チャープ量評価装置６０２は、相互相関計６０１で計測される相互相関信号ｆ＝ｆ（ｔ）の記憶、表示機能を備える。さらにチャープ量評価装置６０２は、相互相関信号ｆ（ｔ）のフーリエ変換波形Ｆ（ｖ）を計算し、かつ、フーリエスペクトルＦ（ｖ）におけるバンド周波数を算出する演算機能及びその記憶、表示機能を備える。これらの機能は、他の実施例同様に、顕微鏡装置を制御するコンピュータやグラフィカルユーザインタフェースや画像表示用の表示装置でこれらの機能を実現する。
【００８７】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置６１の作用について周波数特性検出装置６０の機能を中心に以下に説明する。
図９に示すように、レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、分波装置６５により３つの光路１３，１４および２６に分岐される。光路１３及び１４上のフェムト秒パルスパルスレーザー光Ｌ１、Ｌ２が、レーザ光源装置６２を通過し、顕微鏡本体６３を通過し、さらに周波数特性検出装置６０にパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’として導光されるまでの構成及び作用は第１の実施形態と同様である。
【００８８】
図１１に示すように、周波数特性検出装置６０中の相互相関計６０１において、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’及び参照パルスレーザ光Ｌ９を二光子吸収検出器６０４にミラーやビームスプリッタ等で折り返して入力する。この時、参照パルスタイミング調節装置６０３により、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に対する参照パルスレーザ光Ｌ９のパルスの遅延時間τを掃引することにより、図１２（ｂ）及び図１３（ｂ）に示すようなパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’についての相互相関信号ｆ（ｔ）を取得できる。相互相関信号ｆ（ｔ）において観測されるビート信号は、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の合成波Ｌ３における、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の差周波成分の周波数ビートを反映する。図１２（ｃ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートが等しくない場合には、該ビート信号は多数の異なる周波数成分を含み、相互相関波形ｆ（ｔ）のフーリエスペクトルＦ（ｖ）に明瞭なピークは観測されない（図１２（ａ）参照）。一方、図１３（ｃ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートが略等しい場合には、該ビート信号には略単一の周波数成分しか含まれないので、相互相関波形ｆ（ｔ）のフーリエスペクトルＦ（ｖ）において、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ωの位置に、単一ピークが観測される。（図１３（ａ）参照。）このように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の相互相関信号のフーリエスペクトル情報から、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’における周波数線形チャープのチャープレートの一致と周波数差を検出することが可能である。
【００８９】
チャープ量評価装置６０２に表示される、相互相関波形のフーリエ変換スペクトルＦ（ｖ）および相互相関波形ｆ（ｔ）を参照しながら、ユーザが手動で周波数分散量調節装置６を操作し、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートを略等しくすることが可能である。あるいは、チャープ量評価装置６０２にフーリエスペクトルのバンド幅を計算する機能を備えさせ、該バンド幅の許容幅を設定した上で、該許容幅内にフーリエスペクトルのバンド幅が収まるように周波数分散量調節装置６を自動制御することによっても、チャープレートを略等しくすることが可能である。なお、この際、周波数分散量調節装置６の操作は、周波数特性検出装置６０からの制御信号１１にて行う。
【００９０】
さらに、パルスレーザ光のチャープレートを略等しく設定した後に、フーリエ変換スペクトルＦ（ｖ）を参照しながら、ユーザが手動で周波数差調節装置８を操作することにより、周波数差Ωを所望の周波数差に設定することが可能である。あるいは、チャープ量評価装置６０２に所望の周波数差の許容値を決めておき、所定の周波数範囲に入るように周波数差調節装置８を自動制御することによっても、周波数差Ωを所望の周波数差に設定することが可能である。なお、この際の周波数差調節装置８の操作は、周波数特性検出装置６０からの制御信号１２にて行う。
【００９１】
この方法によれば、ＦＲＯＧのように比較的大型でコストが高く、かつ周波数特性の解析に時間を要する極短パルスレーザ計測手段を使用せずに、低コストかつ簡便にパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートの調節、および周波数差Ωを調節でき、パルスレーザ光Ｌ３が集光された標本Ａの各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数を選択し、該振動周波数からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させることができる。
【００９２】
また、図示しないシャッタ等で光路１４からのレーザパルスＬ２’を遮断し、パルスレーザ光Ｌ１’及び略フーリエ限界パルスの参照パルス光Ｌ９のみを周波数特性検出装置６０に入力させ、これらの相互相関波形を検出すれば、これは標本Ａの位置でのパルスレーザ光Ｌ１’の周波数特性を示すことになる。この相互相関波形の相互相関幅を狭くなるように周波数分散量調節装置６を作動させることで、第１の光路１３を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を調節し、標本Ａの測定点上において略フーリエ限界パルスとすることができる。これにより、多光子励起光効果を効率的に発生させて、鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。
【００９３】
なお、多光子蛍光観察時における周波数分散量調節装置６の操作は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時と同様に、ユーザによる手動としてもよいし、自動としても良い。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ（第二高調波）光、ＴＨＧ（第３高調波）光観察などの観察も行うことができる。
【００９４】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置６１によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく、より簡便かつ安価に行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を簡便且つ安価に効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
【００９５】
なお、本実施形態の周波数特性検出装置６０に第１の実施形態及び第２の実施形態と同一の極短パルスレーザ光測定部２０１をさらに備え、図示しないビームスプリッタ等によって光路１５を分波し、相互相関計２０３および極短パルスレーザ光測定部２０１の両方へパルスレーザ光Ｌ４（パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’）を入射させるようにしてもよい。この場合、低コストかつ簡便な上記方法と、より精度の高い方法を状況に合わせて選択できるようになる。
【００９６】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、周波数分散量調節装置６として、プリズム対とミラーとを備えて、周波数分散量を連続的に変更可能なものを例示したが、これに代えて、回折格子対、誘電体多層膜鏡等でもよい。また、ガラスや色素溶液等周波数分散量が固定のもの、それらを複数用意し、段階的に切り替える方式のものや、第１の光路１３上に挿脱されてパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量を切り替える方式のものを採用してもよい。
【００９７】
また、周波数分散量調節装置６は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調節できる。また、周波数分散量調節装置６は、所望の周波数分散量を得るように調製された光ファイバであってもよいし、ファイバーブラッググレーティング等でもよい。
【００９８】
また、周波数分散量調節装置６は、第２の光路１４に設けられていてもよいし、両光路１３，１４にそれぞれ設けられていてもよい。特に、周波数分散装置を両光路１３，１４に設けることで、両光路１３，１４を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のチャープレートＣ１，Ｃ２を小さくしてＣＡＲＳスペクトルのスペクトル分解能を向上させることができる。また、周波数量分散調節装置６がレーザ光源４と分波装置５との間に設けられていても、第２の光路１４において所定の周波数分散量を与えることで、マルチモーダルな観察が可能となる。
【００９９】
また、周波数分散量調節装置６で、パルスレーザ光Ｌ１’及びＬ２’のチャープレートを略一致させずに少し異ならせ、パルスレーザ光Ｌ１’とＬ２’の周波数差に一定量の幅を与えてもよい。その場合ＣＡＲＳ光の発生効率は低下するが、標本周囲の環境変化によってスペクトル形状が変化する場合においてもＣＡＲＳイメージを取得することが可能であり、異なる分子のＣＡＲＳイメージを同時に観測したりすることも可能となる。
【０１００】
また、周波数変換装置７には、フォトニッククリスタルファイバを用いたが、これらは特定の周波数範囲をカバーする複数のフォトニッククリスタルファイバで構成してもよい。その場合、これら複数のフォトニッククリスタルファイバを機械的に選択交換しても良いし、それらを直列に並べても良い。また、入射したフェムト秒パルスレーザ光を広い周波数スペクトル帯域に変換する機能を持つものであれば、フォトニッククリスタルファイバ以外の非線形光学材料や素子を用いてももちろんよい。
【０１０１】
また、少なくとも一方の光路１３，１４に、減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路１３，１４を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の光量バランスを図ることができる。
また、各光路にファイバを設けて各パルスレーザ光を導光することとしてもよい。但し、この場合にはファイバにより与えられる周波数分散量を予め測定し、周波数特性検出装置１０、５０、６０で実測または算出される周波数分散量を補正する必要がある。
【０１０２】
また、第１の光路１３を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を、標本Ａにおいて略フーリエ限界パルスに近づくように設定して行われる多光子励起の蛍光観察の際には、第２の光路１４をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第２の光路１４への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Ａに与えるダメージを低減することができる。
【０１０３】
また本発明の各実施形態では、一つのフェムト秒レーザから出射されるフェムト秒パルスレーザ光を合波装置により分岐するようにしたが、１台のレーザから複数の周波数のフェムト秒パルスレーザ光が出射されるレーザを用いるようにしてもよい。また、周波数の異なるフェムト秒パルスレーザ光が出射される複数のレーザーを同期させた上で用いても良い。その場合には分波装置を省略することができる。
【０１０４】
また本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものであるが、その応用分野は、細胞や組織等の生体試料あるいは生体以外の有機・無機等の試料を顕微観察する通常の顕微鏡装置に限定されず、人体や動物等生体をｉｎ−ｖｉｖｏ観察するあるいは構造物を非破壊で観察するための内視鏡的顕微観察装置にも適用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る周波数特性検出装置の作用効果を説明するためのフローチャート図である。
【図３】図１の標本Ａにおけるパルスレーザ光の周波数の時間分布の一例を示すグラフであり、（ａ）パルスレーザ光Ｌ１’（ｂ）パルスレーザ光Ｌ２’をそれぞれ示している。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレート及び周波数差を調節する機能を説明するための図である。
【図５】図１のレーザ顕微鏡装置の多光子励起蛍光観察時におけるチャープレートを調節する機能を説明するための図である。
【図６】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る周波数特性検出装置の作用効果を説明するためのフローチャート図である。
【図８】本発明の第２の実施形態に係る２つの光路を導光されるパルスレーザ光の、標本Ａでのチャープレート及び周波数差を調節する機能を説明するための図である。
【図９】本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図１０】本発明の第３の実施形態に係る周波数特性検出装置の作用効果を説明するためのフローチャート図である。
【図１１】本発明の第３の実施形態に係る相互相関計の装置図である。
【図１２】本発明の第３の実施形態に係る周波数特性検出装置の作用効果を説明するための図である。
【図１３】本発明の第３の実施形態に係る周波数特性検出装置の作用効果を説明するための図である。
【符号の説明】
【０１０６】
Ａ  標本
Ｌ１，Ｌ２  フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ６，Ｌ７，Ｌ８，Ｌ９  パルスレーザ光
Ω，Ω’  周波数（差）
１，５１，６１  レーザ顕微鏡装置
２，５２，６２  レーザ光源装置
３，５３，６３  顕微鏡本体
４  レーザ光源
５  分波装置（分波手段）
６  周波数分散量調節装置（周波数分散量調節手段）
７  フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
８  周波数差調節装置（周波数差調節手段）
９  合波装置（合波手段）
１０，５０，６０  周波数特性検出装置（周波数特性検出手段）
１３，１４，１５  光路
１０４，１０８  光検出器
１０５  集光レンズ（照射手段）
１０７  集光レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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