(57)【要約】【課題】 生産性の高い新規な１，５−ペンタンジアミンの製造方法を提供する。【解決手段】１，５−ペンタンジアミンを生産する能力を有する大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）を培養することによる１，５−ペンタンジアミンの製造方法であって、前記細菌がＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIを発現し、かつリジンデカルボキシラーゼの発現が増強されていることを特徴とする１，５−ペンタンジアミンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，５−ペンタンジアミンを生産する能力を有する大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）を培養することによる１，５−ペンタンジアミンの製造方法であって、前記細菌がＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIを発現し、かつリジンデカルボキシラーゼの発現が増強されていることを特徴とする１，５−ペンタンジアミンの製造方法。
【請求項２】
前記Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIが、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来のアスパルトキナーゼIIIの変異体であることを特徴とする、請求項１に記載の１，５−ペンタンジアミンの製造方法。
【請求項３】
前記Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ−末端から３５４番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換する変異、３５４番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の３８１番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換しかつ３８１番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の３２１番目のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換する変異および該アミノ酸配列の４２１番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異からなる群から選択される変異を有することを特徴とする請求項１または２に記載の１，５−ペンタンジアミンの製造方法。
【請求項４】
前記リジンデカルボキシラーゼが、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の１，５−ペンタンジアミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法による１，５−ペンタンジアミンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−ペンタンジアミンは医薬中間体などの合成原料や高分子原材料として期待され、需要が高まりつつある。発酵法による１，５−ペンタンアミンの製造方法として、これまでにリジンデカルボキシラーゼの発現を増強したエシェリヒア属細菌（特許文献１）またはコリネ型細菌（特許文献２）を用いた製造技術が開示されている。
【０００３】
コリネ型細菌の生育上限温度はエシェリヒア属よりも１０度程度低く、また生育速度も遅いとされる。従って、コリネ型細菌を発酵法の宿主として１，５−ペンタンジアミン生産に利用する場合には、培養温度を下げて培養する必要があると考えられる。すなわち、発酵に用いられている通常の微生物は、発酵中に自らが発生する発酵熱により培地の温度が上昇し、発酵に必要な酵素が失活したり生産菌が死滅したりするために、発酵中に培地を冷却することが必要となっている。従って、発酵におけるコストとしては、培養中に発生する発酵熱の冷却エネルギーが余分にかかってしまう。
【０００４】
一方、１，５−ペンタンジアミンの前駆体であるＬ−リジンを工業規模で発酵生産しているエシェリヒア属細菌（特に大腸菌）は分子生物学的に解析が進んでおり、培養温度も３７℃前後とコリネ型細菌と比較して高く、生育速度も速いことから、効率のよい１，５−ペンタンジアミン製造が可能になることが期待される。しかしながら、エシェリヒア属細菌はアスパラギン酸をβ−ホスホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であるアスパルトキナーゼ（以下、「ＡＫ」と略すことがある）のうち、ＡＫIIIがＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られている。
【０００５】
大腸菌のＡＫは３種あり（ＡＫＩ、ＡＫII、ＡＫIII）、うちＡＫＩとＡＫIIはホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素である。複合酵素の内のひとつはｔｈｒＡ遺伝子にコードされるＡＫＩ−ＨＤＩであり、もう一方はｍｅｔＬＭ遺伝子にコードされるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫIはスレオニンとイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる阻害を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受けるとされている。これらに対し、ＡＫIIIのみは単機能酵素であり、ｌｙｓＣと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られている。ＡＫIIIがＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けると、ＡＫIIIの酵素活性がＬ−リジンによって抑制され、その結果、生産物であるＬ−リジン並びにその代謝産物である１，５−ペンタンジアミンの生産量も抑制される。
【０００６】
そこで、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＡＫIIIの変異酵素を取得することができれば、エシェリヒア属細菌（特に大腸菌）を用いて効率のよい１，５−ペンタンジアミンの発酵生産を行うことが期待できるが、ＡＫIIIの変異酵素についての報告はあるものの（特許文献３および４）、同変異酵素が１，５−ペンタンジアミンの生産性を改善した例は知られていない。
【特許文献１】特開２００２―２２３７７０号公報
【特許文献２】特開２００８−１０４４５３号公報
【特許文献３】特開平１１−１９２０８８号公報
【特許文献４】特開平１１−２８５３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その課題は、簡便かつ効率的な１，５−ペンタンジアミンの製造方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIを発現し、かつリジンデカルボキシラーゼ（ｃａｄＡ）の発現が増強された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養することにより、高い対糖収率で１，５−ペンタンジアミンを製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、１，５−ペンタンジアミンを生産する能力を有する大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）を培養することによる１，５−ペンタンジアミンの製造法であって、前記細菌がＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIを発現し、かつリジンデカルボキシラーゼの発現が増強されていることを特徴とする１，５−ペンタンジアミンの製造方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明の好ましい態様によれば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIが、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来のアスパルトキナーゼIIIの変異体であることを特徴とする１，５−ペンタンジアミンの製造方法である。
【００１１】
また、本発明の好ましい態様によれば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ−末端から３５４番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換する変異、３５４番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の３８１番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異および該アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換しかつ３８１番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の３２１番目のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の４２１番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異、からなる群から選択される変異を有することを特徴とする１，５−ペンタンジアミンの製造方法である。
【００１２】
さらに、本発明は、リジンデカルボキシラーゼが、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来であることを特徴とする１，５−ペンタンジアミンの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、既存の方法に比較してより生産性の高い１，５−ペンタンジアミンの製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、１，５−ペンタンジアミンを生産する能力を有する大腸菌（以下、１，５−ペンタンジアミン生産菌ともいう）にＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIII（以下、変異型ＡＫIIIともいう）を発現させることを特徴とする。
【００１５】
１，５−ペンタンジアミン生産菌に変異型ＡＫIIIを発現させる方法としては、変異型ＡＫIIIをコードする遺伝子（以下、変異型ＬｙｓＣともいう）を１，５−ペンタンジアミン生産菌に導入する方法が好ましく適用される。
【００１６】
変異型ＬｙｓＣを供与する生物としては、特に限定はないが、エシェリヒア属に属する微生物であることが好ましく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることがより好ましい。具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt F.C. et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1）にあげられる大腸菌が利用でき、たとえば、大腸菌のＪＭ１０９株やＭＣ１０６１株等があげられる。ここで、大腸菌の野生型ＬｙｓＣの遺伝子配列は配列番号１、大腸菌の野生型ＡＫIIIのアミノ酸配列は配列番号２で表され、変異型は該野生型の塩基配列もしくはアミノ酸配列が欠失、置換または付加したものである。
【００１７】
大腸菌由来の変異型ＬｙｓＣを取得する方法としては、特開平１１−２８５３８１に開示される方法により取得することができる。変異型ＡＫIIIの具体例としては、特開平１１−２８５３８１に開示される配列番号２のアミノ酸配列中、Ｎ−末端から（１）３２３番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異、（２）３２３番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換しかつ４０８番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異、（３）３４番目のアルギニン残基がシステイン残基に置換しかつ３２３番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異、（４）３２５番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基に置換する変異、（６）３１８番目のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換する変異、（７）３１８番目のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換しかつ３４９番目のバリン残基がメチオニン残基に置換する変異、（８）３４５番目のセリン残基がロイシン残基に置換する変異、（９）３４７番目のバリン残基がメチオニン残基に置換する変異、（１０）３５２番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換する変異、（１１）３５２番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換しかつ３６９番目のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換する変異、（１２）１６４番目のグルタミン酸残基がリジン残基に置換する変異または（１３）４１７番目のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換しかつ４１９番目のシステイン残基がチロシン残基に置換する変異、菊地慶実著「大腸菌における新規リジンデカルボキシラーゼの発見及びその分子生物学的解析」（東北大学学位論文、１９９９年）に開示される（１４）２５０番目のグルタミン酸残基がリジン残基に置換する変異または（１５）３４４番目のスレオニン残基がメチオニン残基に置換する変異、（１６）３５４番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換する変異、あるいは本明細書の実施例にある（１７）３５４番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換する変異、（１８）３８１番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、（１９）３５４番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換しかつ３８１番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、（２０）３２１番目のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換する変異または（２１）４２１番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異が挙げられるが、これらの中でも（１６）〜（２１）に挙げられる変異型ＡＫIIIが１，５−ペンタンジアミン生産菌における１，５−ペンタンジアミンの生産効率に向上する変異として好ましく用いられる。
【００１８】
これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、本発明の変異型ＡＫIIIをコードする核酸である。なお、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変異型ＬｙｓＣに含まれる。こうして得られた該変異型ＬｙｓＣを、組換えＤＮＡとして大腸菌（宿主）に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫIIIを保有する大腸菌を取得できる。
【００１９】
変異型ＬｙｓＣを組換えＤＮＡとして大腸菌に導入する方法としては、該遺伝子断片を取り出し、他のベクターに挿入する方法が挙げられる。本発明において用いることのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。その際、変異型ＬｙｓＣの発現を効率的に実施するために、変異型ＬｙｓＣの上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、野生型ＬｙｓＣに含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。
【００２０】
また、上記のように、変異型ＬｙｓＣを自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、変異型ＬｙｓＣをトランスダクション、トランスポゾン（Berg D.E. and Berg C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, ColdSpring Harbor Lab. (1972)）を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００２１】
次に、本発明で用いられるリジンデカルボキシラーゼについて説明する。リジンデカルボキシラーゼとは、アミノ酸の一種であるリジンから二酸化炭素を除去することにより１，５−ペンタンジアミンを生成し得る酵素である、このような活性を有していれば起源は問わないが、好ましくは微生物由来のものが使用できる。
【００２２】
このような微生物由来のリジンデカルボキシラーゼとしては、バシラス・ハロドゥランス（Bacillus halodurans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli） 、セレノモナス・ルミナンチウム（Selenomonas tuminantium）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・ピロサス（Sterptomyces pilosus）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens） 、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum） 、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium） 、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ナイセリア・メニンギチデス（Neisseria meningitidis） 、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum） またはピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）等由来が挙げられるが、好ましくは大腸菌由来のものである。
【００２３】
大腸菌由来のリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子（以下、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子ともいう）として、ｃａｄＡまたはｌｄｃＣが好ましく、このうちｃａｄＡがより好適に用いられる。すなわち、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有する変異型ＬｙｓＣを保持する大腸菌のリジンデカルボキシラーゼをコードするｃａｄＡまたはｌｄｃＣ遺伝子のコピー数を高め、または細菌細胞内のｃａｄＡまたはｌｄｃＣ遺伝子の発現が増強されるようにｃａｄＡまたはｌｄｃＣ遺伝子のプロモーターを改変することにより、リジンデカルボキシラーゼの活性が増強され、１，５−ペンタンジアミン生産性を一層向上させることができる。
【００２４】
リジンデカルボキシラーゼ遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。例えばＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いて、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子であるｃａｄＡまたはｌｄｃＣ遺伝子をクローニングすることができる。この際使用する染色体ＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ由来であればどの菌株由来でもよい。特に好ましくは、配列番号３に示したｃａｄＡ遺伝子または配列番号４に示したｌｄｃＣ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２５】
リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を保持するベクターＤＮＡは、通常大腸菌で利用するベクターＤＮＡにリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を導入することにより得ることができる。上記ベクターＤＮＡの好適な例として、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂ等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２６】
ベクターＤＮＡが導入された大腸菌は、選択マーカー（ 例えばアンピシリン）で選択される。リジンデカルボキシラーゼ（ｃａｄＡまたはｌｄｃＣ）遺伝子発現を増強させる方法としては、遺伝子コピー数の増加が含まれるため、大腸菌で機能し得るベクター中にリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を導入すると、遺伝子のコピー数が増加する。好ましくはマルチコピーベクターが使用され、マルチコピーベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂなどが挙げられる。また、遺伝子発現の増強は、例えば、相同組換えなどの方法により、遺伝子の複数コピーを細菌染色体中に導入することにより達成され得る。
【００２７】
リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現増強は、本来の天然プロモーターの代わりに、より強力なプロモーターの制御下に、本発明のＤＮＡを配置することによっても達成され得る。好ましくは、上記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子が、該遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されることによって達成され得る。用語「本来のプロモーター」は、野生型生物に存在するＤＮＡ領域であって、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に位置し、同遺伝子の発現を促進する領域を意味する。プロモーターの強度の評価法は、例えば、Deuschle U., Kammerer W., Gents R., Bujard H.（エシェリヒア・コリにおけるプロモーター：ｉｎ ｖｉｖｏ強度の階層は代替的構造を示す。 EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）により記載されている。
【００２８】
翻訳の向上は、本来のシャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列（ＳＤ配列）の代わりに、より効果的なＳＤ配列を本発明のＤＮＡ中に導入することにより達成され得る。ＳＤ配列は、リボソームの１６ＳＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流領域である（Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1974, 71, 4, 1342-6）。用語「本来のＳＤ配列」とは、野生型に存在するＳＤ配列を意味する。効果的なＳＤ配列としては、Ｔ７ファージ由来φ１０遺伝子のＳＤ配列が挙げられる（Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。
【００２９】
上記のようにして得られるＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫIIIを保持し、かつリジンデカルボキシラーゼの発現が増強された大腸菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中に１，５−ペンタンジアミンを生産蓄積させ、該培養物から１，５−ペンタンジアミンを採取することにより、１，５−ペンタンジアミンを効率よく製造することができる。
【００３０】
本発明は、上記形質転換大腸菌を培養することを含む１，５−ペンタンジアミンの製造方法に関するものである。本発明における培養方法について説明する。
【００３１】
培養には、バッチ培養、流加培養（フェドバッチ培養）、連続培養のいずれも採用することができる。これら本発明における大腸菌の培養には、分離膜を用いることも可能である。
【００３２】
培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地が使用可能であり、１，５−ペンタンジアミンが産生される限り特に制限はない。
【００３３】
炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．１％〜４．０％、有機微量成分としてはピリドキサルリン酸やビオチンなどの被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、それぞれ適当量含有する培地が用いられる。
【００３４】
その他、培地にはリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応じて添加されうる。さらにチアミン、ナイアシンなどの要求ビタミン、又はこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
【００３５】
次に、培養条件について説明する。培養は通常、好気的条件下で行うが、１，５−ペンタンジアミンの生成に応じて嫌気的条件下で行うことも可能である。
【００３６】
この１，５−ペンタンジアミン発酵における培養ｐＨ調整には水酸化ナトリウムまたはアンモニアおよび塩酸またはジカルボン酸を使用することが好ましい。これら中和剤を用い培養ｐＨを５〜８に、特に好ましくはｐＨ ６．５〜７．５に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
【００３７】
培養温度は一般に２５℃〜４５℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃が用いられる。また、培養時間に特に制限はなく、一般に４〜１２０時間振とうまたは撹拌培養することで好ましい結果が得られる。
【００３８】
培養液中に生成した１，５−ペンタンジアミンは、そのまま単離精製することなく利用することもできるし、菌体を遠心分離などで除去した後、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方法を組み合わせて分離・精製することもできる。例えば、特開２００４−２２２５６９号公報に示される晶析を用いた精製法を用いることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の１，５−ペンタンジアミンの製造方法をさらに詳細に説明するために、実施例を挙げて説明する。本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４０】
下記実施例においては、リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有する変異型ＬｙｓＣの例として大腸菌由来の遺伝子、発現が増強されたリジンデカルボシキラーゼ遺伝子の例として、大腸菌由来のｇａｐＡ遺伝子プロモーターと連結した大腸菌由来のｃａｄＡ遺伝子（配列番号３）を用いた。
【００４１】
（実施例１）変異型ＬｙｓＣ遺伝子の取得
＜１＞野生型ｌｙｓＣのクローニング
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＡＫIIIをコードする遺伝子（ｌｙｓＣ）の塩基配列は既に報告されており（Cassan M., Parsot C., Cohen G.N. and Patte J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は１３４７塩基対よりなり、４４９アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ−リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を除くために、ＳＤ配列とＯＲＦのみを含む領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
【００４２】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２  Ｗ３１１０株の全ゲノムＤＮＡを斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619(1963)）により調製し、配列番号５及び６に示す配列を有する２種のプライマーを用いてエルリッチらの方法（ＰＣＲ Technology, Stocktonpress (1989)）に従ってＰＣＲ反応を行い、ｌｙｓＣの増幅を行った。得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化した後、低コピーベクターｐＭＷ１１９（宝酒造株式会社）のＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＳＹ１を得た。
【００４３】
ＡＫI、ＡＫIIおよびＡＫIIIの完全欠損株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｇｉｆ１０６Ｍ１株（thrA1101、ilvA296、metL1000、lysC1001、arg-1000）をｐＳＹ１で形質転換したところ、Ｇｉｆ１０６Ｍ１のホモセリンおよびジアミノピメリン酸の要求性が相補されたので、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片は、活性のある野生型ＡＫIIIをコードする遺伝子であるｌｙｓＣを含有すると確認した。また、ＡＫI、ＡＫIIおよびＡＫIII完全欠損株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｉｆ１０６Ｍ１株にｐＳＹ１を導入して得られる形質転換株をＧｉｆ１０６Ｍ１／ｐＳＹ１株と命名し、最少培地Ｍ９に５０ｍＭのＬ−リジンを加えた培地で培養した結果、Ｇｉｆ１０６Ｍ１／ｐＳＹ１株は野生型のｌｙｓＣを含有するプラスミドを保持し、同プラスミド上のｌｙｓＣにコードされる野生型ＡＫIIIが唯一のＡＫであるため、野生型ＡＫIIIがＬ−リジンにより阻害され、Ｇｉｆ１０６Ｍ１／ｐＳＹ１株はＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン及びジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成ができなくなり生育が抑えられた。
【００４４】
＜２＞変異型ｌｙｓＣの取得
Ｌ−リジンによる阻害の解除されたＡＫIIIをコードする変異型ｌｙｓＣを含有するプラスミド保持株は、著量のＬ−リジンが添加された最少培地Ｍ９上での生育が可能になると予想し、生育がＬ−リジンに耐性となっている株を選択することによって、変異型ｌｙｓＣを含有するプラスミド保持株を選択することにした。まず、変異型ｌｙｓＣを効率よく取得するために、＜１＞で作製したｐＳＹ１上のｌｙｓＣに変異処理を行なうことにした。
【００４５】
（１−２−１）変異型ｌｙｓＣを含有するプラスミド保持株の選択条件の検討
Ｇｉｆ１０６Ｍ１／ｐＳＹ１株をそれぞれ種々の濃度のＬ−リジンを含有するＭ９寒天平板培地上で培養を行なった。そしてＬ−リジンによる生育阻止濃度を調べ、変異型ｌｙｓＣを含有するプラスミド保持株の選択条件の検討を行なった。各種濃度でＬ−リジンを含むＭ９培地での形質転換体の生育を表１に示す。なお、表中の＋は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育したことを示し、−は生育しなかったことを示す。
【００４６】
【表１】
2010098998.tif 000002
【００４７】
変異導入実験にはｐＳＹ１を用い、最少培地Ｍ９にＬ−リジン５０ｍＭを添加したものを、変異型ｌｙｓＣを含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、実施例１においてこの培地を選択培地という。
【００４８】
（１−２−２）ヒドロキシルアミンによるｐＳＹ１のインビトロ変異処理
ｐＳＹ１プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法を用いた。
【００４９】
（ヒドロキシルアミンによるインビトロ変異処理）
２μｇのｐＳＹ１を０．４Ｍ ヒドロキシルアミン中（５００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０） ２０μｌ、４Ｍ ヒドロキシルアミン塩酸塩  ２０μｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）２０μｌ、水を加えて計１００μｌとする）で、６０℃及び６２．５℃の条件下で、３０分処理した。処理後のＤＮＡをGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製)で精製後、高効率コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１０Ｇｏｌｄ（Ｔａｋａｒａ社製）に導入し、完全培地（Ｌbroth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 1.5％寒天）に撒きコロニーを形成させた。プレート上に出現したコロニーをすべて掻き集め、QIAprep Spin Miniprep Kit （キアゲン社）によりプラスミド抽出し、ＡＫI、ＡＫIIおよびＡＫIII完全欠損株であるＧｉｆ１０６Ｍ１株に導入し、これを（１−２−１）で設定した選択培地に撒き、生育可能な株を選択し候補株とした。
【００５０】
上記で得られた候補株合計１６株を再度選択培地にスポットし、Ｌ−リジン耐性が認められた１６株を得た。これら１６株がどれだけリジン耐性を有するかを調べるために、Ｌ−リジン存在下での液体培養によって増殖を調べた。１００または２００ｍＭのＬ−リジンを含むＭ９培地において、培養時間４８時間、温度３７℃の条件下、攪拌１８０ｒｐｍで上記１６株の試験管培養を行い、菌体濁度を測定した結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2010098998.tif 000003
【００５２】
２００ｍＭのリジン濃度でも耐性のあったＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．１１株の５株の有する変異型ｌｙｓＣをそれぞれｌｙｓＣＭ１、ｌｙｓＣＭ４、ｌｙｓＣＭ６、ｌｙｓＣＭ１０、ｌｙｓＣＭ１１と命名した。
【００５３】
（１−２−３）ポイントミューテーションによるｐＳＹ１の１アミノ酸置換
ｐＳＹ１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８に示す合成ＤＮＡプライマーと、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社のGeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis Systemを用いて、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＡＫIII遺伝子に、Ｎ−末端から３５２番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異を導入した。この変異を有するアミノ酸配列を有する遺伝子は、上記に示したとおりリジンによるフィードバック阻害が解除されることが既に分かっており、これをｌｙｓＣＭＰと命名した。そして、ｐＳＹ１と同様に、図１に示すようにｌｙｓＣＭＰをｐＭＷ１１９のＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ部位に挿入したプラスミドｐＳＹＭＰを得た。
【００５４】
（１−２−４）野生型ｌｙｓＣおよび変異型ｌｙｓＣの塩基配列の決定
常法に従い、今回取得したｌｙｓＣＭ１、ｌｙｓＣＭ４、ｌｙｓＣＭ６、ｌｙｓＣＭ１０、ｌｙｓＣＭ１１、ｌｙｓＣＭＰそれぞれについて塩基配列を決定し、野生型ｌｙｓＣとの変異点を明らかにした。結果を表３に示す。（１−２−２）で取得した変異型ｌｙｓＣの塩基配列の変異の種類は５種類であった。ｌｙｓＣＭ６に関しては、野生型ｌｙｓＣ遺伝子と塩基配列は同一であり、変異は確認されなかった。（１−２−３）で合成したｌｙｓＣＭＰにおいては、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ−末端から３５２番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異を確認した。
【００５５】
【表３】
2010098998.tif 000004
【００５６】
＜３＞変異型ｌｙｓＣの単離及び変異型ｌｙｓＣ遺伝子産物の検討
上記変異型ｌｙｓＣであることが確認できたｌｙｓＣＭ１、ｌｙｓＣＭ４、ｌｙｓＣＭ１０、ｌｙｓＣＭ１１をｐＳＹ１同様ｐＭＷ１１９に挿入したプラスミドを得、それぞれ図１に示した通り、ｐＳＹＭ１、ｐＳＹＭ４、ｐＳＹＭ１０、ｐＳＹＭ１１と命名した。そして、ＡＫI、ＡＫIIおよびＡＫIII完全欠損株Ｇｉｆ１０６Ｍ１をｐＳＹ１、ｐＳＹＭ１、ｐＳＹＭ４、ｐＳＹＭ１０、ｐＳＹＭ１１またはｐＳＹＭＰで形質転換し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＡＫIIIの酵素活性を測定した。
【００５７】
無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにして調製した。形質転換株をトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌからなる培地で培養し、ＯＤ６００が約０．５になったところで集菌した。菌体を菌体破砕液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ βメルカプトエタノール、１０ｍＭ イミダゾール）にて懸濁後、超音波処理で菌体を破砕した。遠心分離後、可溶性画分をＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅカラム（キアゲン社）に通し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ βメルカプトエタノール、２０ｍＭ イミダゾール）にてカラムを洗浄した。次いで、溶出用緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ βメルカプトエタノール、２５０ｍＭ イミダゾール）をカラムに通し、その上清を粗酵素液とした。
【００５８】
ＡＫIII活性の測定はブラックの方法（Methods in Enzymology, Vol. 5, p820-827, Academic Press Inc., New   York (1962)）に従った。すなわち、最終液量１ｍＬ中に１００ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 硫酸マグネシウム、６００ｍＭ ヒドロキシルアミン・塩酸塩、６００ｍＭ 硫酸アンモニウム、５０ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸及び前記粗酵素液を加え、３０℃、１５分間反応させた後、１０％ 塩化鉄（ＩＩ）６水和物−３．３％トリクロロ酢酸−０．７Ｎ塩酸液１．５ｍＬを加え、遠心分離で沈殿物を除去した液を、５４０ｎｍの吸光度を測定した。活性は１分間に生成するヒドロキサム酸の量で表示（１μｍｏｌ／ｍｉｎ）した。
【００５９】
ＡＫIIIの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に１００ｍＭの濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害の具合を調べた。なお、表４中、阻害解除度（％）は、Ｌ−リジン非存在下での酵素活性に対する１００ｍＭ Ｌ−リジン存在下での酵素活性で表示した。結果を表４に示した。
【００６０】
この結果が示すように、野生型ＡＫIIIはＬ−リジンによる阻害を強く受け、１００ｍＭ Ｌ−リジン存在下になると、１００％酵素活性が阻害された。それに対し、今回得られた変異型ＡＫIIIはいずれも１００ｍＭ Ｌ−リジン存在下での阻害はほとんどみられなかった。また総蛋白当りの比活性は、いずれもほとんどが野生型と同等もしくはそれ以上のものであり、変異導入による活性低下の問題はほとんどなかった。特に、ｌｙｓＣＭ１１は、比活性、阻害解除度共にもっとも向上していた。なお、表４中、阻害解除度（％）とは、反応液中Ｌ−リジン非存在下でのＡＫ活性に対する１００ｍＭ Ｌ−リジンの存在下でのＡＫ活性である。
【００６１】
【表４】
2010098998.tif 000005
【００６２】
（実施例２）変異型ＬｙｓＣを用いた１，５−ペンタンジアミンの発酵生産
実施例１において取得したＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有する変異型ＬｙｓＣを用いて、１，５−ペンタンジアミン生産を行った。
【００６３】
変異型ＬｙｓＣを有するｐＳＹＭ１、ｐＳＹＭ４、ｐＳＹＭ１０、ｐＳＹＭ１１またはｐＳＹＭＰを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株に導入し、１，５−ペンタンジアミン発酵試験を行った。培養は、以下の１，５−ペンタンジアミン生産培地を用い、培養温度３７℃、攪拌８００〜１０００ｒｐｍの条件下で１２時間行った。ＨＰＬＣの分析条件は以下に示す。培養結果を表５に示す。
【００６４】
この結果が示すように、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害解除型遺伝子保持株を用いた試験では、いずれにおいても１，５−ペンタンジアミンが生産された。特に、Ｗ３１１０／ｐＳＹＭ１１を用いた時に、もっとも１，５−ペンタンジアミンを生産することがわかった。
【００６５】
（１，５−ペンタンジアミン生産培地）
Ａ：（ＮＨ４）２ＳＯ４        １６ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４            １ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    １ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．０１ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ    ０．０１ｇ／Ｌ
Yeast Extract (Difco)  ２ｇ／Ｌ
ＫＯＨでｐＨ６．５に調整し、１２１℃で２０分オートクレーブ
Ｂ：２５％グルコース（１１５℃で１０分オートクレーブ）
Ａ：Ｂを４：１で混合し、抗生物質（アンピシリン  ５０μｇ／ｍｌ）を加える。
【００６６】
（１，５−ペンタンジアミン濃度のＨＰＬＣによる分析方法）
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００６７】
【表５】
2010098998.tif 000006
【００６８】
（実施例３）リジンデカルボキシラーゼ遺伝子発現増強株の作製
染色体中に存在するリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現量を増強させるために、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを大腸菌のｇａｐＡ遺伝子（グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）プロモーターと置換した株の作製を試みた。プロモーターの置換は、ＦＬＰレコンビナーゼを用いた相同組換えによる遺伝子破壊方法を改変して行った。以下に、作製方法を示す。
【００６９】
＜１＞ｇａｐＡ遺伝子プロモーターのクローニング
大腸菌Ｗ３１１０株を培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（ＭＯ ＢＩＯ社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。
【００７０】
上記のようにして得られたゲノムＤＮＡを鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号７（ＫＳ０２９）、配列番号８（ＫＳ０３０））をプライマーセットとして、ＰＣＲによりｇａｐＡ遺伝子プロモーター（ｇａｐＡ遺伝子の上流５００ｂｐ、以下ｇａｐＡプロモーターと略す。）の増幅を行った。ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号７（ＫＳ０２９）、８（ＫＳ０３０））には、５末端側及び3末端側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列が付加されるようにして作製した。
【００７１】
各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｇａｐＡプロモーターが挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００７２】
＜２＞リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
次に、＜１＞で得られた大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号９（ＣａｄＡＦ２）、配列番号１０（ＣａｄＡＲ２））をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、リジンデカルボキシラーゼをコードしているｃａｄＡ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応は、伸張反応のみ２分に変えた以外は＜１＞と同様な条件で行った。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号９（ＣａｄＡＦ２）、配列番号１０（ＣａｄＡＲ２））には、５末端側にＨｉｎｄＩＩＩ、３末端側にＸｂａＩ認識配列が付加されるようにして作製した。得られたＤＮＡ断片を＜１＞と同様な方法でｐＵＣ１１８ベクターにライゲーションし、ｃａｄＡ遺伝子が挿入されているｐＵＣ１１８ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断して、ｃａｄＡ遺伝子が挿入されているプラスミドを確認した。
【００７３】
次に、このｃａｄＡ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、得られたｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断部位にライゲーションし、得られたプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断することにより、ｃａｄＡ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。得られたプラスミドをｐＨＳ７とした。
【００７４】
＜３＞クロラムフェニコール耐性遺伝子のクローニング
次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）およびその上下流にＦＬＰ認識サイト（ＦＲＴ）を有するベクターｐＫＤ３を鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１１、配列番号１２）をプライマーセットとして、ＰＣＲによりｃａｔ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応は、伸張反応のみ１分に変えた以外は＜１＞と同様な条件で行った。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号１１、配列番号１２）には、５末端側にＢａｍＨＩ、３末端側にＳａｃＩ認識配列が付加されるようにして作製した。得られたＤＮＡ断片を＜１＞と同様な方法でｐＵＣ１１８ベクターにライゲーションし、ｃａｔ遺伝子が挿入されているｐＵＣ１１８ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断して、ｃａｔ遺伝子が挿入されているプラスミドを確認した。
【００７５】
＜４＞ｃａｔ遺伝子およびｇａｐＡプロモーターのｐＨＳ７への挿入
次に、ｃａｔ遺伝子が挿入されているｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を上記ｐＨＳ７のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ切断部位に導入したプラスミドを作製した。得られたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断して、ｃａｔ遺伝子が挿入されていることを確認した。このようにして得られたプラスミドをｐＫＳ５とした。
【００７６】
＜５＞ｇａｐＡプロモーター−ｃａｄＡ遺伝子カセットの染色体への導入
次に、ｇａｐＡプロモーターが挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、得られたDNA断片を上記ｐＫＳ５のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に導入したプラスミドを作製した。このプラスミドＤＮＡを鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１３（Ｍ１３  ＲＶ）、配列番号８（ＫＳ０３０））をプライマーセットとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＰｒｅｍｉｘＴａｑ  ＥｘＴａｑバージョン  Ｖｅｒ（タカラバイオ社製）を用いた。このＰＣＲにより、約５００ｂｐの増幅断片が得られるプラスミドを目的のプラスミドとして選抜した。このようにして得られたプラスミドをｐＫＳ８とした。
【００７７】
＜４＞のようにして得られたｐＫＳ８を鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１４（ＫＳ０３２）、配列番号１５（ＫＳ０３３））をプライマーセットとして、ＰＣＲによりｇａｐＡプロモーター、ｃａｄＡ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ増幅反応にはKOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。プラスミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、６５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：３分３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。得られた約３．５ｋｂの増幅断片を定法に従って電気泳動後のアガロースゲルから抽出し、５００ｎｇ／μｌとなるように調整した。
【００７８】
Ｗ３１１０株にＦＬＰレコンビナーゼを有するプラスミドｐＫＤ４６を導入した株（Ｗ３１１０／ｐＫＤ４６と表記する。）を５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、一晩３０℃で培養した（前培養）。得られた前培養液を５ｍｌのＳＯＢ培地（１ｍＭアラビノース含有）に１％植菌し、ＯＤ６００が０．６になるまで３０℃で培養した（本培養）。本培養液を遠心して集菌した後、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄し、最終的に５０μｌの１０％グリセロールに菌体を懸濁した。この菌体懸濁液に上記のように精製したＰＣＲ増幅断片を２μｌ添加し、３０分氷冷した。この懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット（０．２ｃｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω）。電気パルスを与えた後、キュベットに１ｍｌのＳＯＣ培地を投入し菌体懸濁液を回収して、３７℃で２．５時間培養した。培養液を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００７９】
得られたコロニーがアンピシリンを添加したＬＢ培地で生育しないことを確認した後、目的とするｃａｄＡ遺伝子のプロモーターがｇａｐＡプロモーターと置換されている株であることを、抽出したゲノムを鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１６（ＫＳ００７）、配列番号１７（ＫＳ００８））をプライマーとしたＰＣＲにより行った。目的とする相同組換え株では約３．８ｋｂの増幅断片が得られるのに対し、目的の位置に相同組換えで挿入されていない株では約２．３ｋｂの増幅断片が得られる。その結果、約３．８ｋｂの増幅断片が確認できた。このｃａｄＡ遺伝子のプロモーターがｇａｐＡプロモーターと置換されている株をＷ３１１０（ｇａｐＡ−ｃａｄＡ）株とした。
【００８０】
（実施例４）リジンデカルボキシラーゼ遺伝子発現増強株を用いた１，５−ペンタンジアミンの発酵生産
大腸菌で１，５−ペンタンジアミンを大量生産させるためには、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を増強した宿主を用いることが好ましい。そこで、変異型ｌｙｓＣが大腸菌で１，５−ペンタンジアミンを大量する際に及ぼす影響を評価するに当たり、実施例３で作製したＷ３１１０（ｇａｐ−ｃａｄＡ）株を使用した。
【００８１】
Ｗ３１１０（ｇａｐＡ−ｃａｄＡ）株をｐＳＹＭ１、ｐＳＹＭ４、ｐＳＹＭ１０またはｐＳＹＭ１１で形質転換し、得られた形質転換体について実施例２と同様にして１，５−ペンタンジアミン生産性を調べた。結果を表６に示す。
【００８２】
この結果が示すように、いずれの株を用いても１，５−ペンタンジアミンが生産されたが、特に、Ｗ３１１０（ｇａｐ−ｃａｄＡ）／ｐＳＹＭ１株、Ｗ３１１０（ｇａｐ−ｃａｄＡ）／ｐＳＹＭ４株、Ｗ３１１０（ｇａｐ−ｃａｄＡ）／ｐＳＹＭ１０株、Ｗ３１１０（ｇａｐ−ｃａｄＡ）／ｐＳＹＭ１１株は１．０ｇ／Ｌ以上の１，５−ペンタンジアミンを生産し、その中でもＷ３１１０（ｇａｐ−ｃａｄＡ）／ｐＳＹＭ１１を用いた時に、もっとも１，５−ペンタンジアミンを生産することがわかった。
【００８３】
【表６】
2010098998.tif 000007
【００８４】
（比較例１）野生型ｌｙｓＣを導入した株による１，５−ペンタンジアミンの発酵生産
Ｗ３１１０株をｐＳＹ１で形質転換し、得られた形質転換体について実施例２と同様にして、１，５−ペンタンジアミン生産性を調べた。結果を表７に示す。
【００８５】
【表７】
2010098998.tif 000008
【００８６】
（比較例２）野生型ｌｙｓＣを導入したリジンデカルボキシラーゼ遺伝子発現増強株による１，５−ペンタンジアミンの発酵生産
実施例２で得られたＷ３１１０（ｇａｐＡ−ｃａｄＡ）株をｐＳＹ１で形質転換し、得られた形質転換体について実施例２と同様に１，５−ペンタンジアミン生産性を調べた。結果を表８に示す。
【００８７】
【表８】
2010098998.tif 000009
【００８８】
これらを比較した結果、本発明によって開示されたリジンによるフィードバック阻害が解除された変異型ｌｙｓＣをリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を増強した宿主株に導入することによって、１，５−ペンタンジアミンの生産効率が向上することが明らかとなり、特にｌｙｓＣＭ１、ｌｙｓＣＭ４、ｌｙｓＣＭ１０またはｌｙｓＣＭ１１をリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を増強した宿主株に導入することによって、特に１，５−ペンタンジアミンの生産効率が向上することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】野生型ｌｙｓＣ並びにｌｙｓＣＭ１、ｌｙｓＣＭ４、ｌｙｓＣＭ１０、ｌｙｓＣＭ１１をそれぞれ含有するプラスミドであるｐＳＹ１、ｐＳＹＭ１、ｐＳＹＭ４、ｐＳＹＭ１０、ｐＳＹＭ１１の構造を示す図である。
【図１】
2010098998.tif 000010
【配列表】
2010098998000001.app