(57)【要約】【課題】生体試料中、特に血液や尿中の分析対象成分を測定する電位差計測装置において、電位差計測を精度良く行い、検体試料中の測定対象物の濃度を正しく定量できるようにする。【解決手段】測定法として電位差計測法を用いて、検体試料と反応試薬溶液の反応容器への導入順序に応じて、検体試料の導入直後又は導入後の一定時間後、又は反応溶液の攪拌開始直後又は攪拌開始後の一定時間後と同期して測定を行い、得られた電位差から検体試料中の測定対象物の濃度を求める。【選択図】図１
2010117183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を含有する測定溶液を測定容器に分注する手段と、
前記測定対象物と選択的に反応する酵素又は試薬を含む反応溶液を前記測定容器に分注する手段と、
前記測定容器中の溶液と接触する測定電極と、
前記測定容器中の溶液と接触する参照電極と、
前記測定電極の界面電位を測定する手段とを備え、
前記測定対象物と、前記酵素又は前記試薬との反応開始直後又は反応開始後の一定時間後と同期して前記測定電極の界面電位の測定を開始する信号を制御する制御装置とを有することを特徴する電位差計測装置。
【請求項２】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定容器の内側形状が円筒形であることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項３】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定容器がフローセルであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項４】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記反応容器が測定電極上に形成されたことを特徴とする電位差計測装置。
【請求項５】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定電極が前記測定容器に接して設置されていることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項６】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定電極に酸化還元物質が固定化されたことを特徴とする電位差計測装置。
【請求項７】
請求項６記載の電位差計測装置において、前記酸化還元物質がチオール基を有することを特徴とする電位差計測装置。
【請求項８】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定容器への前記測定溶液又は前記反応溶液の分注開始と同期して測定を開始することを特徴とする電位差計測装置。
【請求項９】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定容器中の分注された測定溶液と反応溶液を混合する攪拌手段を有することを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１０】
請求項９記載の電位差計測装置において、前記攪拌手段が回転あるいは上下運動を行う攪拌素子であることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１１】
請求項９記載の電位差計測装置において、前記攪拌素子が前記測定電極に隣接して配置されていることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１２】
請求項９記載の電位差計測装置において、前記測定溶液又は前記反応溶液の分注と同期して前記攪拌素子が動作を開始することを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１３】
請求項１記載の電位差計測装置において、前記測定電極が電界効果トランジスタと、前記電界効果トランジスタのゲートと配線で接続された電極であることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１４】
請求項１３記載の電位差計測装置において、前記電極の材料が貴金属であることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１５】
請求項１３記載の電位差計測装置において、前記参照電極は前記電界効果トランジスタと同一基板上に形成されていることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１６】
請求項１３記載の電位差計測装置において、前記測定容器が遮光部材で覆われていることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１７】
請求項１３記載の電位差計測装置において、前記電極と前記参照電極との間に電圧を印加する電源を備えたことを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１８】
請求項１７記載の電位差計測装置において、前記電源で１ｋＨｚ以上の周波数の交流電圧を印加することを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１９】
測定対象物を含有する測定溶液を測定容器に分注する工程と、
前記測定対象物と選択的に反応する酵素又は試薬を含む反応溶液を前記測定容器に分注する工程と、
前記測定容器中の分注された測定溶液と反応溶液を混合する工程と、
前記測定容器中に配置された測定電極の界面電位を測定する工程を有し、
前記測定容器中の分注された測定溶液と反応溶液の混合と同期して前記測定電極の界面電位の測定を開始することを特徴とする電位差測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中、特に血液や尿中の分析対象成分を測定する電位差計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野における血液、尿等の生体試料の定性・定量分析は、検体試料と試薬を反応させた反応液の吸光度変化を測定する比色法が主に用いられており、この方式を自動化した生化学自動分析装置で行われている。生化学自動分析装置としては、フロータイプからディスクリートタイプまで様々な機種が開発されている。現在では、検体試料と試薬溶液の反応容器への分注、検体試料と試薬溶液の攪拌、反応溶液の吸光度変化測定等の全ての操作を自動化したディスクリートタイプが主流である（例えば、特許第2525063号、WO2002/059624）。これらの装置は、比色法を測定原理とするため、大型で高価な光学系が必要であった。比色法で用いられる試薬は、検体試料中の測定対象物と特異的に反応する酵素や化学物質が単独であるいは複数組み合わせて使用されている。例えば、血糖値の測定では、測定対象物質であるグルコースを基質とするヘキソキナーゼを用いて、ATP存在下でグルコースにリン酸を付加し、生成したグルコース−６−リン酸をNADP存在下でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによる脱水素反応の際に生じるNADPHの吸光度の増加により目的のグルコース濃度を得ている。
【０００３】
吸光光度法を用いた呈色法で測定対象物の濃度を求める方法としては、通常、エンドポイント法が用いられている。エンドポイント法は、反応開始前の測定値と反応終了後の測定値から測定対象物の濃度を求める方法である。反応開始前の測定値は、検体試料中の測定対象物と反応する試薬成分を除いた試薬(例えば緩衝液)と検体試料との混合溶液を測定した値であり、反応終了後の測定値は、その混合溶液に測定対象物との反応を生じさせる成分を含有する試薬を添加して反応終了後に測定した値である。
【０００４】
一方、光学系を必要としない測定法としては、検体試料の濃度を電気化学的に測定する方法がある。本方式は測定原理が電気化学的測定法であり、大型で複雑な装置が不要であり、装置システムが小型になる利点を有している。電気化学的測定法には、酸化還元反応に伴い作用電極に流れる電流値を測定する電流計測法と、化学反応に伴い変化する測定電極の界面電位を測定する電位差計測法がある。電気化学的測定で用いられる試薬は、比色法で用いられる試薬と同様に測定対象物と特異的に反応する酵素や化学物質が単独であるいは複数組み合わせて使用されている。
【０００５】
例えば、電流方式を用いた血糖値の測定では、測定対象物質であるグルコースを基質とするグルコースオキシダーゼで酸素あるいはメディエータ存在下でグルコースを酸化することにより、グルコノラクトンと過酸化水素水が生成する。生成した過酸化水素水を電極に流れる電流で測定することにより、測定対象物質であるグルコース濃度を測定する(Pure & Appl. Chem., Vol.68, (1996) pp.1837-1841)。本方式では、酵素を含む反応試薬が予め測定電極上に保持されており、サンプル注入口から導入された検体試料は流路を通り、測定電極表面に達して、所定の酵素反応が開始する構成になっている。電位差計測方式では、グルコースオキダーゼによる酸化反応を酸化還元反応のメディエータであるフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムの酸化還元電位の変化として測定して、測定対象物質であるグルコース濃度を測定する(特許第3387926号、特開2008-128803号公報)。電位差計測方式でも、通常、酵素を含む反応試薬が予め測定電極上に保持されており、導入された検体試料が測定電極表面に達成して、所定の酵素反応が開始する構成になっている(特許第3387926号)。また、測定容器を用いる場合には、酵素等の試薬を含む反応溶液が予め保持された測定容器中に検体試料を注入後の一定時間後の電位差、又は検体試料を注入前もしくは注入直後の電位差と一定時間後の電位差との変化量を用いて測定対象物の濃度を求めていた(特開2008-128803号公報)。
【０００６】
【特許文献１】特許第2525063号
【特許文献２】WO2002/05962
【特許文献３】特開2005-345173号公報
【特許文献４】特許第3387926号
【特許文献５】特開2008-128803号公報
【非特許文献１】Pure & Appl. Chem., Vol.68, (1996) pp.1837-1841
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した測定容器を用いた電位差計測法では、実際の装置に実装する際の酵素等の試薬を含む反応試薬溶液と検体試料の容量に関する考慮がなされておらず、検体試料を注入前もしくは注入直後の電位差と一定時間後の電位差との変化量を用いて測定対象物の濃度を求める方法では、電位差測定ができなかったり、測定値にバラツキが生じる問題があった。例えば、容積が小さい検体試料（通常は数μL）を先に導入し、その後に容積の大きな反応試薬溶液（通常は数十μL〜数百μL）を導入する場合には、検体試料導入時では測定電極が溶液に浸漬しておらず（すなわち、回路を形成していない）、電位差測定を開始することは不可能である。この場合には、反応試薬溶液を導入することより、測定電極が溶液に浸漬され、電位差測定が始めて可能になる。一方、容積の大きな反応試薬溶液を先に導入する場合には、電位差測定は可能であるが、容積の大きな反応試薬溶液に容積が小さい検体試料を注入するため、検体試料と反応試薬溶液の混合が不十分で反応がうまく進まない問題があった。この場合は、所定の時間内に反応が終了しないため、測定値にバラツキが生じる問題があった。また、電位差計測方式では、通常、測定電極として金や白金等の貴金属が用いられるが、これらの電極は未修飾状態では溶液中であまり安定ではないため、電位差がドリフトして測定誤差を生じやすい問題があった。その対策として、電気化学活性物質で電極表面を修飾する方法はある程度有効であるが、高精度分析の場合には電位差のわずかなドリフトが問題になることがある。そのため、電位差計測を精度良く行うのに適した装置構成及び測定手順が求められていた。
【０００８】
本発明の目的は、検体試料と反応試薬溶液を含む２液以上の溶液を用いた電位差計測法において、電位差計測を精度良く行い、検体試料中の測定対象物の濃度を正しく定量できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明では検体試料と反応試薬溶液を含む２液以上の溶液を用いた電位差計測法において、反応開始直後又は反応開始後の一定時間後に電位差を行うために、検体試料と反応試薬溶液の反応容器への導入順序に応じて、検体試料の導入直後又は導入後の一定時間後、又は反応溶液の攪拌開始直後又は攪拌開始後の一定時間後と同期して測定を行い、得られた反応開始直後の電位差と反応がほぼ終了した一定時間後の電位差の変化量から、検体試料中の測定対象物の濃度を求める測定手順を採用した。
【００１０】
例えば、容積が小さい検体試料（通常は数μL）を先に導入し、その後に容積の大きな反応試薬溶液（通常は数十μL〜数百μL）を導入する場合には、反応試薬溶液により検体試料は反応試薬溶液中にすばやく混合されて反応が進むため、反応試薬溶液を測定溶液に分注直後又は分注後一定時間後から測定電極の界面電位の測定を開始する。その際、反応試薬溶液を測定容器に分注する手段と、測定電極と参照電極の測定溶液中への浸漬と同期して測定電極の界面電位の測定を開始する信号を制御する制御装置とを有する装置構成になっている。さらに、検体試料と反応試薬溶液の混合の効率が悪い場合には、攪拌手段を付加させることが望ましい。
【００１１】
また、容積の大きな反応試薬溶液を先に導入し、次に容積の小さい検体試料を注入する場合には、検体試料と反応試薬溶液の混合が不十分で反応がうまく進まないため、検体試料分注後一定時間放置するか、あるいは攪拌機構を具備する必要がある。測定電極の界面電位測定は、検体試料分注後一定時間後、あるいは反応溶液の攪拌開始直後又は攪拌開始後一定時間後から開始する。検体試料分注後一定時間放置する場合には、検体試料分注後一定時間後に測定電極の界面電位の測定を開始する信号を制御する制御装置を有する装置構成になっている。また、攪拌手段を有する場合には、反応溶液の攪拌開始直後又は攪拌開始後一定時間後に測定電極の界面電位の測定を開始する信号を制御する制御装置を有する装置構成になっている。
【００１２】
本発明に使用する測定容器の内側形状は、検体試料と反応試薬溶液の攪拌・混合が効率良く行える円筒形が望ましい。電極の材料には、金、銀等の貴金属を用いることができる。また、未処理の電極表面は電位が不安定なため、フェロセン、ピリジン、ピリミジン等の酸化還元物質を有する分子を電極表面に固定することが望ましい。上記酸化還元物質を有する分子の電極表面への固定化は、電極表面に自己組織化膜を形成する絶縁性分子（例えば、アルカンチオール）をリンカーとする酸化還元物資誘導体を用いればよい。さらに、電位差測定装置として、電極と同一基板上に形成された絶縁ゲート電界効果トランジスタを用いる。その際、参照電極に１ＫＨｚ以上の交流電圧を重畳して測定を行うのが望ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、検体試料と反応試薬溶液を含む２液以上の溶液を用いた電位差計測法において、検体試料と反応試薬溶液の反応容器への導入順序に応じて、検体試料の導入直後又は導入後の一定時間後、又は反応溶液の攪拌開始直後又は攪拌開始後の一定時間後に測定を開始することにより、反応開始直後又は反応開始後の一定時間後と同期して測定を行うことができ、得られた反応開始直後の電位差と反応がほぼ終了した一定時間後の電位差の変化量から検体試料中の測定対象物の濃度を求めることができるため、ドリフトの影響の少ない高精度の電位差計測法を実現し、検体試料中の測定対象物の濃度を正しく定量できるようになる。その際、分注した検体試料と試薬溶液の混合には攪拌素子を用いるのが一般的であるが、本発明の電位差計測法では攪拌素子が電位測定に影響を及ぼさないため、反応開始からのデータが取得でき、精度良く電位差測定ができる。尚、吸光度測定の場合には、攪拌素子が反応容器中の光路上にあり、攪拌混合中は測定光の反射・散乱のため吸光度測定ができない。また、電極表面にフェロセン、ピリジン、ピリミジン等の酸化還元物質を有する分子を固定化することにより、反応溶液中の酸化還元反応の電位を精度良く測定することができる。さらに、電位差測定装置として、電極と同一基板上に形成された絶縁ゲート電界効果トランジスタを用いることで、リーク電流を低減することができ、電極表面の界面電位を安定に測定することができる。その際、参照電極に１ＫＨｚ以上の交流電圧を重畳することで、金電極表面の界面電位を安定化でき、測定精度が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明による電位差計測装置の一例を示すブロック図である。本実施例の測定装置は、電位差測定用電極１０１、参照電極１０２、測定容器１０３、制御装置１０４、データ処理装置１０５、検体試料を測定容器１０３に分注する検体試料用分注器１０６、試薬溶液を測定容器１０３に分注する試薬溶液分注器１０７、分注された検体試料と試薬溶液を攪拌する攪拌素子１０８を有する。制御装置１０４は、電位差測定用電極１０１の電位測定と、電位差測定用電極１０１、参照電極１０２、検体試料用分注器１０６、試薬溶液分注器１０７、攪拌素子１０８の移動及び動作開始の制御を行う。データ処理装置１０５は、電位差測定用電極１０１で取得した信号をデータ処理して検体試料中の測定対象物の濃度を計算する。
【００１５】
電位差測定用電極１０１には、金等の貴金属やカーボンからなる電極を用いることができる。また、生体成分測定時の夾雑物の影響低減のために、電極表面に酸化還元物質を固定化して使用しても良い。酸化還元物質としては、フェロセン、ピリジン、ピリミジン等を使用すれば良い。参照電極１０２は、測定容器１０３中の溶液に接触した電位差測定用電極１０１の表面で起こる平衡反応あるいは化学反応に基づく電位変化を安定に測定するために、基準となる電位を与える。通常は参照電極としては、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極、あるいは甘こう（カロメル）電極が用いられるが、測定する試料溶液の組成が一定の場合には、疑似電極として銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。
【００１６】
測定容器１０３は、角セルのような角を有する容器では分注された検体試料と試薬溶液の攪拌混合がやり難いので、曲面を有する容器、例えば円筒形の容器が望ましい。検体試料用分注器１０６及び試薬溶液分注器１０７は、シリンジポンプ又はペリスタポンプ（チューブポンプ）を使用することができる。攪拌素子１０８は、先端のへらが回転するものを用いることができるが、磁力の力で回転するスターラーを用いても良い。
【００１７】
図２は、本発明による電位差計測装置を用いた測定動作の一例を示す図である。測定手順は以下の通りである。最初、図２(a)に示すように、測定容器２０１に検体試料用分注器２０２を用いて検体試料２０３を分注する。次に、図２(b)に示すように、電位差測定用電極２０４、参照電極２０５及び攪拌素子２０６を測定容器２０１に設置する。この状態では、分注された検体試料２０３と参照電極２０５及び攪拌素子２０６は接していない。次に、測定容器２０１中に試薬溶液分注器２０９を用いて試薬溶液を分注する。試薬溶液の分注と同期して攪拌素子２０６による攪拌混合と電位差測定用電極２０４の電位測定を開始する（図２(c)）。
【００１８】
図３は本発明による他の攪拌手段の一例を示す図であり、(a)は側面図を、(b)鳥瞰図を示す図である。攪拌素子台３０１に設置された攪拌素子３０２には攪拌用へら３０３が取り付けてあり、攪拌素子台３０１を図中の矢印に示すように回転又は上下運動を行うことにより、反応容器３０４内の溶液を攪拌・混合する。その際、電位差測定用電極３０５及び参照電極３０６は攪拌素子台３０１の中央の穴に挿入しており、攪拌素子３０２に接することがないので、電位測定に支障はない。
【００１９】
図４は本発明による他の攪拌手段の一例を示す図であり、(a)は側面図を、(b)は鳥瞰図を示す図である。攪拌素子４０１の先端に攪拌用へら４０２が取り付けてあり、攪拌素子４０１を回転させることにより、測定容器４０３中の溶液が攪拌・混合する。その際、電位差測定用電極４０４及び参照電極４０５は攪拌素子４０１に触れないように配置してあり、電位測定に支障はない。
【００２０】
図５は、本発明の電位差計測装置に使用する測定電極の構造例を示す図である。本実施例では、電極材料として金を使用して、酸化還元物質としてフェロセン誘導体を金電極表面に固定してある。金電極５０１へのフェロセン誘導体５０２の固定化は、末端にチオール基を有するアルカンチオール５０３を介して、金とチオールの結合により固定化した。金電極表面へのフェロセン誘導体の固定化は、以下の手順で行った。最初、固定化に使用する金電極を１Ｎ硝酸、純水、エタノールの順番で洗浄し、金電極表面を窒素パージした。次に、フェロセン誘導体溶液（１１−フェロセニル―１−ウンデカンチオール、濃度；０．５ｍＭ、溶媒；エタノール）に１時間浸漬した。固定化終了後、エタノール及び純水で洗浄し、使用するまでバッファー溶液中で保存した。
【００２１】
図６は、本発明による電位差計測装置の他の実施例を示すブロック図である。本実施例の測定装置は、電位差測定用電極６０１、参照電極６０２、測定容器６０３、制御装置６０４、データ処理装置６０５、検体試料を測定容器６０３に分注する検体試料用分注器６０６、試薬溶液を測定容器６０３に分注する試薬溶液分注器６０７、分注された検体試料と試薬溶液を攪拌する攪拌素子６０８を有する。制御装置６０４は、電位差測定用電極６０１の電位測定と、電位差測定用電極６０１、参照電極６０２、検体試料用分注器６０６、試薬溶液分注器６０７、攪拌素子６０８の動作開始の制御を行う。データ処理装置６０５は、電位差測定用電極６０１で取得した信号をデータ処理して検体試料中の測定対象物の濃度を計算する。
【００２２】
電位差測定用電極６０１は、測定容器６０３の底に接して設置してある。また、電位差測定用電極６０１は、材料として金を使用して、金表面にはアルカンチオールを介してフェロセン誘導体６０９が固定してある。本実施例では、酸化還元物質としては、フェロセン誘導体を使用したが、ピリジン、ピリミジン等を使用しても良い。参照電極６０２は、測定容器６０３中の溶液に接触した電位差測定用電極６０１の表面で起こる平衡反応あるいは化学反応に基づく電位変化を安定に測定するために、基準となる電位を与える。通常は参照電極としては、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極、あるいは甘こう（カロメル）電極が用いられるが、測定する試料溶液の組成が一定の場合には、疑似電極として銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。
【００２３】
測定容器６０３は、角セルのような角を有する容器では分注された検体試料と試薬溶液の攪拌混合がやり難いので、曲面を有する容器、例えば円筒形の容器が望ましい。検体試料用分注器６０６及び試薬溶液分注器６０７は、シリンジポンプ又はペリスタポンプ（チューブポンプ）を使用することができる。攪拌素子６０８は、先端のへらが回転するものを用いた。
【００２４】
図７は、ＦＥＴセンサを用いた本発明の電位差計測装置の一例を示すブロック図である。本実施例の測定装置は、電位差測定用ＦＥＴセンサ７０１、参照電極７０２、測定容器７０３、制御装置７０４、データ処理装置７０５、検体試料を測定容器７０３に分注する検体試料用分注器７０６、試薬溶液を測定容器７０３に分注する試薬溶液分注器７０７、分注された検体試料と試薬溶液を攪拌する攪拌素子７０８、及び参照電極に電圧を印加する電源７０９を有する。制御装置７０４は、電位差測定用ＦＥＴセンサ７０１のソース７１０とドレイン７１１の間の電流変化の測定と、電位差測定用ＦＥＴセンサ７０１、参照電極７０２、検体試料用分注器７０６、試薬溶液分注器７０７、攪拌素子７０８、電源７０９の動作開始の制御を行う。データ処理装置７０５は、電位差測定用ＦＥＴセンサ７０１で取得した信号をデータ処理して検体試料中の測定対象物の濃度を計算する。電位差測定用ＦＥＴセンサ７０１は、測定容器７０３の底に接して設置してある。また、ＦＥＴセンサ７０１のセンシング部には、金電極７１２を使用して、金表面にはアルカンチオールを介してフェロセン誘導体７１３が固定してある。本実施例では、酸化還元物質としては、フェロセン誘導体を使用したが、ピリジン、ピリミジン等を使用しても良い。ＦＥＴセンサ７０１を測定電極として使用する場合には、電源７０９を用いてＦＥＴセンサ７０１と参照電極７０２の間に電圧を印加する必要があるが、金電極表面への外部変動による影響を低減するために、好ましくは交流成分を印加することが望ましい。その際、直流成分に１ＫＨｚ以上の交流電圧を重畳することで、金電極の表面電位の安定化が期待できる。また、ＦＥＴセンサは光に応答するため、測定容器は不透明の材質のものを用いるか、あるいは測定容器そのものを遮光すると良い。
【００２５】
参照電極７０２は、測定容器７０３中の溶液に接触したＦＥＴセンサ７０１のセンシング部の表面で起こる平衡反応あるいは化学反応に基づく電位変化を安定に測定するために、基準となる電位を与える。通常は参照電極としては、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極、あるいは甘こう（カロメル）電極が用いられるが、測定する試料溶液の組成が一定の場合には、疑似電極として銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。
【００２６】
測定容器７０３は、角セルのような角を有する容器では分注された検体試料と試薬溶液の攪拌混合がやり難いので、曲面を有する容器、例えば円筒形の容器が望ましい。検体試料用分注器７０６及び試薬溶液分注器７０７は、シリンジポンプ又はペリスタポンプ（チューブポンプ）を使用することができる。攪拌素子７０８は、先端のへらが回転するものを用いた。
【００２７】
図８は、ＦＥＴセンサを用いた本発明の電位差計測装置に使用する分析素子の構造の一例を示す図である。図８(a)、(b)は、各々断面構造及び平面構造を表わしている。絶縁ゲート電界効果トランジスタ８０１は、シリコン基板の表面にソース８０２、ドレイン８０３、及びゲート絶縁物８０４を形成し、金電極８０５を設けてある。金電極８０５と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート８０６を導電性配線８０７で接続してある。好ましくは、絶縁ゲート電界効果トランジスタは、シリコン酸化物を絶縁膜として用いる金属酸化物半導体（Metal-oxide semiconductor）電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であるが、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）を用いても問題はない。本構造を採用することにより、金電極８０５上にアルカンチオオールを介して容易に酸化還元物質を固定化することができる。
【００２８】
本実施例で使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタは、ＳｉＯ2（厚さ；１７．５ｎｍ）を用いた絶縁層を有するデプレション型ＦＥＴであり、金電極を４００μｍ×４００μｍの大きさで作製してある。通常の測定は、水溶液を使用するため、本素子は溶液中で動作しなければならない。溶液中で測定する場合には、電気化学反応を起こし難い−０．５〜０．５Ｖの電極電位範囲で動作することが必要である。そのため、本実施例ではデプレション型ｎチャネルＦＥＴの作製条件、すなわち閾値電圧（Ｖｔ）調整用イオン打ち込み条件を調整し、ＦＥＴの閾値電圧を−０．５Ｖ付近に設定してある。なお、金電極に代えて、銀等の他の貴金属からなる電極を用いてもよい。
【００２９】
図９は、本発明による電位差計測装置の他の実施例を示すブロック図である。本実施例では、検体試料と試薬溶液との攪拌混合と電位差測定を別の場所で行う構成になっている。最初、図９(a)に示すように、測定容器台９０１上の測定容器９０２中の測定溶液を分注器９０３で一定量分取する。分注器９０３はステージ９０４で検出部９０５の測定チップ９０６上に移動して、測定用溶液を滴下し、電位差測定を開始する（図９(b)）。
【００３０】
その際の検体試料と試薬溶液との攪拌混合の手順を図１０を用いて説明する。最初、図１０(a)に示すように、測定容器１００１に検体試料用分注器１００２を用いて検体試料１００３を分注する。次に、図１０(b)に示すように攪拌素子１００４を測定容器１００１に設置する。次に、測定容器１００１中に試薬溶液分注器１００５を用いて試薬溶液を分注する。試薬溶液の分注と同期して攪拌素子１００４による攪拌混合を一定時間（例えば、１〜２秒）行った後、直ちに反応溶液の一部を分取して測定チップに添加して電位測定を開始する。
【００３１】
本発明で使用する測定チップの構造を図１１を用いて説明する。図１１(a)、(b)は、各々断面構造及び平面構造を表わしている。測定チップは、シリコン基板１１０１上に、金電極１１０２、参照電極１１０３、端子用パッド１１０４、１１０５、金電極１１０２と端子用パッド１１０４を接続させる導電性配線１１０６、参照電極１１０３と端子用パッド１１０５を接続させる導電性配線１１０７を形成してある。金電極１１０２、参照電極１１０３と端子用パッド１１０４、１１０５以外の部分は高耐熱ポリイミドで被覆してある。金電極１１０２には、アルカンチオールを介してフェロセン誘導体を固定して測定電極とした。本実施例では、フェロセン誘導体として、１１−フェロセニル−１−ウンデカンイオールを使用したが、他の電気化学活性物質としてピリジン、ピリミジン等を使用してもよい。参照電極１１０３は、金電極の表面に銀塩化銀を形成して擬似参照電極としている。参照電極１１０３を作製した後、測定セル用部材１１０８を貼り付けて、測定セル１１０９を形成する。本実施例では、測定セル用部材は、円形の貫通穴を形成したポリジメチルシロキサン製のシートを用いたが、シリコンゴム等の柔軟性のある材質を用いればよい。また、円形の貫通穴の代わりに四角の貫通穴を用いても良い。本実施例では、金電極の大きさは１ｍｍ×１ｍｍ、厚さ１００ｎｍで形成したが、電位差計測法では、測定感度が電極の表面積に依存しないため、測定溶液の体積に応じて金電極の面積を変更しても問題ない。また、金電極の厚さは、５０ｎｍ以上であればピンホール等ができることはない。
【００３２】
図１２は、本発明による電位差計測装置の他の実施例を示すブロック図である。本実施例では、検体試料と試薬溶液との攪拌混合と電位差測定を別の場所で行う構成になっている。最初、測定容器台１２０１上の測定容器１２０２中の測定溶液を分注器１２０３で一定量分注する。分注器１２０３はステージ１２０４で測定溶液導入部１２０５上に移動して、測定溶液導入部１２０５に測定用溶液を注入する。測定溶液導入部１２０５に導入された測定溶液は、導入管１２０６を通りフローセル部１２０７に導入・保持される。測定溶液のフローセル部１２０７への導入・保持と同期して、電位測定装置１２０８により電位差測定が開始される。電位差測定の際には、溶液の流れは停止しており、測定用溶液はフローセル中に保持されて流れによる電位の乱れ等の影響はない。尚、本実施例では測定溶液の導入前のフロー停止時の電位差をブランクとした。取得した信号は、データ処理装置１２０９でデータ処理して検体試料中の測定対象物の濃度を計算する。測定溶液のフローセル部１２０７への導入・保持及び電位差測定後の測定溶液の廃液槽１２１０への送液等の一連の動作は、送液部１２１１で制御する。送液部１２１１は、シリンジポンプ又はペリスタポンプ（チューブポンプ）を使用することができる。尚、本発明で使用した検体試料と試薬溶液との攪拌混合の手順は、図１０に示した手順で行った。
【００３３】
本発明で使用するフローセルの構造を図１３を用いて説明する。図１３は、フローセルの断面構造を表わしている。フローセルは、フローセル部材１３０１に溶液導入用配管１３０２、溶液廃液用配管１３０３、及び参照電極１３０４が接続されている構造になっている。本実施例では、フローセル部材１３０１として、ポリジメチルシロキサン製のシートを用いたが、シリコンゴム等の柔軟性のある材質を用いればよい。フローセル部材１３０１の流路内面には、測定電極１３０５が取り付けてあり、フローセル部材１３０１の流路１３０６に接している。測定電極１３０５の信号は配線１３０７により外部に取り出せるようになっている。参照電極１３０４は、フローセル部材１３０１に形成された微細流路１３０８を介して、フローセル部材１３０１内の流路１３０６に接するように取り付けてある。参照電極１３０４は配線１３０９により外部と電気的に接続できるようになっている。本実施例では、測定電極１３０５には、１１−フェロセニル−１−ウンデカンイオールを固定化した金電極を用いた。尚、１１−フェロセニル−１−ウンデカンイオールに代わりに、他のアルカンチオールの炭素鎖の数が違うフェロセン誘導体、ピリジン、ピリミジン等を使用してもよい。参照電極１３０４は、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極を用いたが、甘こう（カロメル）電極や銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。
【００３４】
本発明の電位差計測装置を用いてグルコースを測定した結果を図１４に示す。ここでは、図１に示す装置構成で測定を行った。本実施例で行った測定動作のフローを図１５に示す。本実施例では、測定容器への検体試料の分注、測定容器への試薬溶液分注後、電位差測定用電極、参照電極、及び攪拌素子を同時に測定容器内に挿入し、一定時間後、攪拌素子の動作開始と同期して電位差測定を開始した。本実施例では、電位差測定用電極、参照電極、及び攪拌素子を同時に測定容器内に挿入後の一定時間を１秒とし、測定時間を３分としたが、他の測定対象の場合には、使用する酵素の反応時間や試薬の特性等を考慮して、電位差測定用電極、参照電極、及び攪拌素子を同時に測定容器内に挿入後の一定時間及び測定時間を変更すれば良い。図１４に示すように、反応開始から約１５０秒後に一定の電位差を示していることが分かる。本実施例の測定条件下で予め作成した検量線を図１６に示す。検量線は、既知のグルコース濃度の２つの試料（濃度、７０ｍｇ／ｄｌと１５０ｍｇ／ｄｌ）を用いて作成した。図１６中の点線が検量線、●が測定値を示しており、グルコース濃度として１１５ｍｇ/ｄLを得た。
【００３５】
本実験で用いた測定条件は以下の通りである。
試薬量：３０μＬ
試薬組成：１００ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．０
３７．５ｍＭ フェリシアン化カリウム
１．２５ｍｇ／ｍＬ グルコース脱水素酵素
２％ Triton X-100
サンプル量：７．５μＬ
サンプル：管理血清（オートノルム）
【００３６】
本発明では、グルコース測定について説明したが、測定対象に応じて表１に例示した酵素を用いることができる。
【００３７】
【表１】
2010117183.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明による電位差計測装置の一例を示すブロック図。
【図２】本発明による電位差計測装置を用いた測定動作の一例を示す図。
【図３】本発明による他の攪拌手段の一例を示す図であり、(a)は側面図、(b)鳥瞰図。
【図４】本発明による他の攪拌手段の一例を示す図であり、(a)は側面図、(b)鳥瞰図。
【図５】本発明の電位差計測装置に使用する測定電極の構造例を示す図。
【図６】本発明による電位差計測装置の他の実施例を示すブロック図。
【図７】ＦＥＴセンサを用いた本発明の電位差計測装置の一例を示すブロック図。
【図８】ＦＥＴセンサを用いた本発明の電位差計測装置に使用する分析素子の構造の一例を示す図であり、(a)は断面構造、(b)は平面構造。
【図９】本発明による電位差計測装置の他の実施例を示すブロック図であり、(a)は測定溶液の分注、(b) 測定溶液の測定チップへの添加。
【図１０】本発明による検体試料と試薬溶液との攪拌混合の手順を示す図。
【図１１】本発明の電位差計測装置に使用する測定チップの構造の一例を示す図であり、(a)は断面構造、(b)は平面構造。
【図１２】本発明による電位差計測装置の他の実施例を示すブロック図。
【図１３】本発明の電位差計測装置に使用するフローセルの構造の一例を示す図。
【図１４】本発明の他の実施例である電位差計測装置を用いてグルコースを測定した結果を示す図。
【図１５】本発明の他の実施例である電位差計測装置を用いたグルコース濃度測定動作フローを示す図。
【図１６】本発明の他の実施例である電位差計測装置を用いた取得したグルコース濃度に対する検量線を示す図。
【符号の説明】
【００３９】
１０１，２０４，３０５，４０４，６０１…電位差測定用電極、１０２，２０５，３０６，４０５，６０２，７０２，１１０３，１３０４…参照電極、１０３，２０１，３０４，４０３，６０３，７０３，９０２，１００１，１２０２…測定容器、１０４，６０４，７０４…制御装置、１０５，６０５，７０５，１２０９…データ処理装置、２０３，１００３…検体試料、１０６，２０２，６０６，７０６，１００２…検体試料用分注器、１０７，２０９，６０７，７０７，１００５…試薬溶液分注器、１０８，２０６，３０２，４０１，６０８，７０８，１００４…攪拌素子、２０３…検体試料、２０５…試薬溶液、３０１…攪拌素子台、３０３，４０２…攪拌用へら、５０１，７１２，８０５，１１０２…金電極、５０２，６０９，７１３…フェロセン誘導体、５０３…アルカンチオール、７０１…電位差測定用ＦＥＴセンサ、７０９…電源、７１０，８０２…ソース、７１１，８０３…ドレイン、８０１…絶縁ゲート電界効果トランジスタ、８０４…ゲート絶縁物、８０６…絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート、８０７，１１０６，１１０７…導電性配線、９０１，１２０１…測定容器台、９０３，１２０３…分注器、９０４，１２０４…ステージ、９０５…検出部、９０６…測定チップ、１１０１…シリコン基板、１１０４，１１０５…端子用パッド、１１０８…測定セル用部材、１１０９…測定セル、１２０５…測定溶液導入部、１２０６…導入管、１２０７…フローセル部、１２０８…電位測定装置、１２１０…廃液槽、１２１１…送液部、１３０１…フローセル部材、１３０２…溶液導入用配管、１３０３…溶液廃液用配管、１３０５…測定電極、１３０６…流路、１３０７，１３０９…配線、１３０８…微細流路、
【図１】
2010117183.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2010117183.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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