(57)【要約】【課題】本発明の課題は、新たな肝炎治療剤又は肝炎予防剤を提供することである。【解決手段】本発明により、フロロタンニンを含有する肝炎予防剤又は肝炎治療剤が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フロロタンニンを含有する肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
【請求項２】
前記フロロタンニンが褐藻から抽出されるフロロタンニンである、請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
【請求項３】
前記フロロタンニンがカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）から抽出されるフロロタンニンである、請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
【請求項４】
前記肝炎がアルコール性肝炎である、請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
【請求項５】
前記肝炎が肝線維化による肝硬変又は肝癌である、請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
【請求項６】
請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含有する医薬。
【請求項７】
請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含有する食品又は飲料。
【請求項８】
請求項１に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含有するアルコール飲料。
【請求項９】
フロロタンニンを投与する肝炎の予防又は治療方法。
【請求項１０】
前記フロロタンニンが褐藻から抽出されるフロロタンニンである、請求項９に記載の肝炎の予防又は治療方法。
【請求項１１】
前記フロロタンニンがカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）から抽出されるフロロタンニンである、請求項９に記載の肝炎の予防又は治療方法。
【請求項１２】
前記肝炎がアルコール性肝炎である、請求項９に記載の肝炎の予防又は治療方法。
【請求項１３】
前記肝炎が肝線維化による肝硬変又は肝癌である、請求項９に記載の肝炎の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな肝炎予防剤又は肝炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、肝硬変の成因は、肝炎ウイルスの持続感染によるものが主体であると考えられていた。
近年、日本人のアルコール摂取量や飲酒人口は増加傾向にある。飲酒習慣の広がりとともにアルコール性肝疾患が急増しており、大きな社会問題となっている。
アルコール性肝炎は、過度の飲酒行為によって肝細胞の変性や壊死を引き起こす病変であり、飲酒を続けることによってアルコール性肝硬変、肝癌へと進展していくことが知られている。
【０００３】
フロロタンニンには、抗酸化作用、血管拡張作用、抗炎症作用や心疾患の予防効果を有することが知られている（例えば、特許文献１及び特許文献２を参照。）。
また、フロロタンニンにより、正常肝臓細胞において脂肪の蓄積が減少することが開示されている（非特許文献１）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３２８０１０号公報
【特許文献２】特開２００２−２１２０９５公報
【非特許文献１】Ｅｍｉｌ  Ｃｈｉ、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆｅｅｄｉｎｇ  ＳＥＡＮＯＬ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｉｎｋ  “Ｘ２”  Ｉｎ  ａ  Ｆａｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｔｕｄｙ、［平成１６年１１月３０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.jprenew.com/documents/app_B/SEANOL_UW_FAT_MOUSE_STUDY.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、新たな肝炎治療剤又は肝炎予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、フロロタンニンが肝炎の治療及び予防に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の肝炎治療剤又は肝炎予防剤及び肝炎を治療又は予防する方法を提供する。
［１］
フロロタンニンを含有する肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
［２］
前記フロロタンニンが褐藻から抽出されるフロロタンニンである、前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
［３］
前記フロロタンニンがカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）から抽出されるフロロタンニンである、前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
［４］
前記肝炎がアルコール性肝炎である、前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
［５］
前記肝炎が肝線維化による肝硬変又は肝癌である、前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤。
［６］
前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含有する医薬。
［７］
前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含有する食品又は飲料。
［８］
前記［１］に記載の肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含有するアルコール飲料。
［９］
フロロタンニンを投与する肝炎の予防又は治療方法。
［１０］
前記フロロタンニンが褐藻から抽出されるフロロタンニンである、前記［９］に記載の肝炎の予防又は治療方法。
［１１］
前記フロロタンニンがカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）から抽出されるフロロタンニンである、前記［９］に記載の肝炎の予防又は治療方法。
［１２］
前記肝炎がアルコール性肝炎である、前記［９］に記載の肝炎の予防又は治療方法。
［１３］
前記肝炎が肝線維化による肝硬変又は肝癌である、前記［９］に記載の肝炎の予防又は治療方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【０００９】
本発明は、フロロタンニンを含有する肝炎治療剤又は肝炎予防剤に関する。
【００１０】
本発明において、フロロタンニンとして、例えば、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコール、８，８’−バイエコール等が挙げられる。
本発明において、上記フロロタンニンを１種で用いることもでき、２種以上の混合物を用いることもできる。
【００１１】
本発明において、フロロタンニンとして、褐藻から抽出されるフロロタンニンが挙げられる。
褐藻として、例えば、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ）、マコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｓｔｌｏｎｉｆｅｒ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、モズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ  ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）、オキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ)、チガイソ（Ａｌａｒｉａ  ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、アカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｈｏｒｎｅｒｉ）、ホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）等が挙げられる。
本発明において、フロロタンニンとして、例えば、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）から抽出されるフロロタンニンが挙げられる。
【００１２】
フロロタンニンを褐藻から抽出する方法として、従来公知の方法であれば特に限定されるものではないが、抽出溶媒としてアルコール溶液を用いて抽出する方法を挙げることができる。
フロロタンニンを褐藻から抽出する方法として、例えば、褐藻を２５〜１００％のアルコール溶液を用いて、常温〜９０℃で抽出する方法を挙げることができる。
アルコールとして、炭素数１〜４のアルコールを用いることができる。炭素数１〜４のアルコールとして、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等を挙げることができる。
アルコール溶液として、アルコール水溶液が挙げられる。
【００１３】
フロロタンニンを褐藻から抽出する方法として、何ら限定されるものではないが、以下の方法が挙げられる。
褐藻を水で洗浄して乾燥させて、粉砕することにより、褐藻粉末を得る。褐藻粉末を、アルコール溶液に混合し、室温〜９０℃で０．１〜４時間撹拌してフロロタンニンを抽出する。得られた抽出溶液をろ過し、ろ液を真空濃縮することにより、褐藻粗抽出物を得ることができる。得られた褐藻粗抽出物を再び破砕することにより、褐藻粗抽出物の粉末を得る。褐藻粗抽出物の粉末を、９５％以上のアルコール溶液に混合し、室温〜９０℃で０．１〜４時間撹拌してフロロタンニンを抽出する。得られた抽出溶液をろ過し、ろ液を真空濃縮することにより高純度の褐藻抽出物を得ることができる。
アルコール水溶液による抽出工程を複数回行うことにより、より純度の高いフロロタンニンを含有する褐藻抽出物を得ることができる。
【００１４】
本発明において、フロロタンニンとして、上記抽出方法により得られる褐藻粗抽出物を用いることができ、また、上記抽出方法により得られる高純度の褐藻抽出物を用いることもできる。
本発明において、褐藻抽出物中に固形分としてフロロタンニンが９０〜９９質量％含まれる褐藻抽出物を得ることができる。
本発明において、フロロタンニンを含有する褐藻抽出物を用いることができる。
【００１５】
本発明のフロロタンニンは、肝炎の予防剤又は治療剤として用いられる。
【００１６】
本発明において、肝炎として、ウイルス性肝炎とアルコール性肝炎等が挙げられる。肝炎は、病態の進行により肝線維化を引き起こし肝硬変、肝癌へと進行する。
肝線維化は、肝類洞壁細胞の１つである肝星細胞の活性化により起こる。肝星細胞が様々な病的刺激により活性化すると、筋繊維芽細胞様に分化してコラーゲンなどの細胞外マトリックスを多量に産生して肝線維化が進行する。
本発明のフロロタンニンを含有する肝炎の予防剤又は治療剤は、肝線維化を予防又は治療することができるので、肝硬変及び／又は肝癌への進行を予防又は治療することができる。
【００１７】
本発明において、医薬品や健康食品には、本発明のフロロタンニンを有効成分として１〜１０ｍｇ／日／ｋｇの投与量で使用することができる。
本発明において、上記投与量のフロロタンニンを単回投与することができ、また、上記投与量を複数回投与することもできる。
【００１８】
本発明において、医薬品として、公知の他の肝疾患治療剤、肝臓保護剤と組み合わせて投与することができる。
また、医薬品として、抗肥満剤、抗高脂血症剤、抗糖尿病剤、抗高血圧剤等の公知の他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。
【００１９】
本発明において医薬品として用いる場合には、有効成分であるフロロタンニン以外に、公知の添加剤を用いることができる。添加剤として、例えば、崩壊剤、希釈剤、滑剤、着色剤、矯味剤、懸濁剤、界面活性剤、分散剤、結合剤、コーティング剤等を挙げることができる。
【００２０】
医薬品の投与剤形として、例えば、経口、経皮、注射剤等の公知の剤形を用いることができ特に限定されるものではない。投与剤形として、例えば、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、徐放剤、液剤、軟膏剤、点眼剤、クリーム剤、貼付剤等が挙げられる。
【００２１】
本発明において、医薬品として、肝炎を罹患しているヒト（患者）に投与することにより、肝炎を治療することができる。また、肝硬変又は肝癌を罹患しているヒトに投与することにより、肝硬変又は肝癌を治療することができる。
本発明において、医薬品又は健康食品として、ヒトに投与することにより、肝炎を予防することができる。また、医薬品又は健康食品として、肝硬変又は肝癌への進行を予防することもできる。
本発明において、医薬品として、肝炎を罹患しているヒトに投与することにより、肝線維化による肝硬変及び肝癌への進行を予防することができる。
【００２２】
本発明において、食品又は飲料品として、例えば、健康食品、特定保健用食品、栄養補助食品、保健機能食品、機能性食品等を挙げることができる。食品又は飲料品として、肝炎予防及び改善、アルコール性肝炎予防及び改善、肝機能改善、肝硬変の予防及び改善等の表示を付した食品又は飲料品とすることができる。
【００２３】
本発明において、食品又は飲料品には、公知の添加剤を配合することができる。
添加剤として、例えば、酸化防止剤、香料、有機酸類、無機酸類、有機酸塩類、無機酸塩類、保存料、調味料、甘味料、酸味料、エキス、香辛料、ビタミン類、着色料、乳化剤、増粘剤、保湿剤、防腐剤、ｐＨ調節剤、安定化剤等を挙げることができる。
【００２４】
本発明において、食品又は飲料品の形態として、例えば、液状、ペースト状、固形状等の形態が挙げられる。食品又は飲料品として、具体的には、アルコール飲料、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、乳飲料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、畜肉製品、魚肉製品、珍味類、缶・ビン詰類、即席飲食物、内服液、肝油ドロップ、口中清涼剤、ゼリー等が挙げられる。
【００２５】
本発明において、本発明の肝炎予防剤又は肝炎治療剤の摂取方法として、アルコール飲料を摂取する際に、本発明のフロロタンニンを含有する肝炎予防剤又は肝炎治療剤を同時に摂取する方法が挙げられる。また、フロロタンニンを含有する肝炎予防剤又は肝炎治療剤を含むアルコール飲料を摂取することにより、アルコール飲料と同時にフロロタンニンを含有する肝炎予防剤又は肝炎治療剤を摂取することができる。
【００２６】
本発明の食品又は飲料品中のフロロタンニンの含有量としては特に限定されるものではない。
一日当りの摂取量が６０〜５００ｍｇとなるように、カプセル、錠剤、クッキーバーなどに期待する肝炎予防の効果に応じて食品又は飲料品中のフロロタンニンの含有量を増減することができる。
液状形態の食品又は飲料品である場合には、食品又は飲料品中の含有量は、口中の刺激性の発生を抑制する観点から、また、フレーバー、特に海藻臭の抑制の観点から１００ｍｇ／２００ｍＬ以下である。
【実施例】
【００２７】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施例に用いられる評価方法及び測定方法は以下のとおりである。
【００２８】
［製造例１］（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ抽出物の調製方法）
カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ）０．２ｋｇを水道水で洗浄して乾燥させた。ミキサー（ＭＦＣ  ＳＩ  ｍｉｌｌ，Ｊａｎｋｅ  ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ  Ｉｋａ−Ｗｒｅｃｋ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて粉砕することにより、カジメの乾燥粉末を得た。乾燥粉末０．１ｋｇを、３０％エタノール水溶液０．８Ｌに混合し、８０℃で２時間撹拌して、フロロタンニンの抽出を行った。得られた抽出溶液をろ過した。ろ液を、エバポレーターを用いて真空濃縮することにより、カジメ粗抽出物０．０５ｋｇを得た。得られたカジメ粗抽出物を、ミキサーを用いて再び破砕して篩いを通すことにより８０ｍｅｓｈのカジメ粗抽出物の粉末を得た。
カジメ粗抽出物の粉末０．１ｋｇを、９５％アルコール水溶液０．８Ｌに混合し、８０℃で２時間撹拌して、フロロタンニンの抽出を行った。得られた抽出溶液をろ過した。ろ液を、エバポレーターを用いて真空濃縮することによりフロロタンニンを９５質量％で含有するカジメ抽出物（ＥＣＥ）０．００５ｋｇを得た。
【００２９】
［実施例１］（ｉｎ  ｖｉｔｒｏアルコール性肝炎モデルの作製）
ペントバルビタールナトリウムで麻酔した１０週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ＳＬＣ）からＭｏｌｄｅｕｓらのコラゲナーゼ灌流法により肝細胞を単離した。単離された肝細胞のトリパンブルー染色により、単離された肝細胞のうち９０％以上の肝細胞が生存していることを確認した。
単離した肝細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地２ｍＬ中に２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で３５ｍｍプラスチック皿に播種し、３７℃にて５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター内で、一晩培養した。培地を新しいＦＢＳフリーのＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地に交換したのちに以下の測定に供した。
【００３０】
（肝細胞の生存率の測定）
赤色色素Ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄが生細胞の小胞体に取り込まれ蓄積される性質を利用したＮｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ法によりエタノール負荷試験における肝細胞の生存率を測定した。
培養した肝細胞を２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ含む培地に、製造例１で得たフロロタンニン（ＥＣＥ）と１００ｍＭのエタノールを同時に添加し、サンプリング時までそれぞれ０−２４時間培養した。
培養終了後、培地を除去し、０．４％Ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ保存液をリン酸バッファー（ＰＢＳ）で８０倍に希釈した０．００５％Ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ色素液１ｍｌを添加した。インキュベータ内で肝細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２時間静置した。
Ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ色素液を除去し、次いで、２．５分以内に１％ホルムアルデヒド−１％塩化カルシウム水溶液で１回洗浄した。
１％酢酸−５０％エタノール水溶液１ｍＬを添加して、室温で３０分間放置した。
上清を１％酢酸−５０％エタノール水溶液にて３倍希釈し、分光光度計（Ｖ−５３０  ＪＡＳＣＯ）で５４０ｎｍの吸光度を測定した。測定は、５回行い平均値を求めた。一元配置分散分析により水準間の差を認めた後、Ｔｕｒｋｅｙ法を用いて多重比較検定をした。
エタノール及びフロロタンニンを加えないで行ったコントロールを１００として、肝細胞の生存率を測定した。測定結果を図１に示す。
比較例として、緑茶ポリフェノール（ＧＴＥ、カテキン、ＳＩＧＭＡ社製）を用いて同様に肝細胞の生存率を測定した。
【００３１】
［実施例２］（マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）産生量の測定）
高度不飽和脂肪酸の過酸化物の二次的生成物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）をＴＢＡＲＳ法により測定した。
実施例１の方法により得られた肝細胞を、ＦＢＳフリーのＨａｎｋｓ培地中に２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように加え、１２．５μｇ／ｍｌとなるように製造例１で得たフロロタンニン（ＥＣＥ）を添加し、１００ｍＭとなるようにＥｔＯＨを添加して、サンプリング時までそれぞれ０−２４時間培養した。
培養終了後、培地および１，１，３，３−テトラメトキシプロパン標準溶液５００μＬをねじ口試験管に採取した。ＴＢＡ試薬１ｍＬ、５０ｍＭ  ＢＨＴ  １５μＬを加えてボルテックスで混合した。熱湯中で１５分間加熱し、次いで、氷冷した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行って、上清１５０μＬを９６穴プレートに入れた。マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ）にて励起波長（４８５ｎｍ）、蛍光波長（５３５ｎｍ）で蛍光度を測定した。測定は、５回行い平均値を求めた。一元配置分散分析により水準間の差を認めた後、Ｔｕｒｋｅｙ法を用いて多重比較検定をした。測定結果を図２に示す。
【００３２】
［実施例３］（細胞内還元型グルタチオン（ＧＳＨ）量の測定）
ＧＳＨはＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド）と反応し、ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ誘導体となるため、ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ誘導体をＨＰＣＬにて分離し、蛍光光度計にて励起波長（２３０ｎｍ）、蛍光波長（４４５ｎｍ）で測定し、ＧＳＨを定量した。
培養した肝細胞を２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ含む、実施例１の方法により得られた培地に、製造例１で得たフロロタンニン（ＥＣＥ）１２．５μｇ／ｍＬと１００ｍＬのエタノールを同時に添加し、サンプリング時までそれぞれ０−２４時間培養した。
培養終了後、２５ｍＭトリス塩酸溶液で細胞をかきとり、超音波処理によって細胞膜を破壊したのち遠心分離する。その上清とＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド）を反応させたのちＨＰＬＣにて測定する。
シリカゲルベース逆相カラム(マイテイシル、関東化学製、１５ｃｍ、径４．６ｍｍ)を用い、移動相Ａ（３０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ６．０）と移動相Ｂ（メタノール：アセトニトリル＝９２．３：７．７％)によるグラジエントをかけて溶出し分離してＧＳＨの定量を行った。測定結果を図３に示す。
【００３３】
［実施例４］（抗タイプIコラーゲン抗体を用いた免疫組織化学的解析の測定）
１３−１４週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ＳＬＣ）の肝臓をプロナーゼ（Ｍｅｒｃｋ製）およびコラゲナーゼ液（和光純薬製）で灌流した後、Ｎｙｃｏｎｄｅｎｚ溶液を用いた密度勾配遠心法によって肝星細胞を得た。肝星細胞は細胞数を５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１．５ｍＬに浮遊させ、直径３５ｍｍのプラスチックシャーレ上で２日間培養した後、ＦＢＳフリーのＤＭＥＭ培地に交換し、２４時間培養することによって細胞周期を合わせた。次に、本培養として１００ｍＭエタノール水溶液を添加して、サンプリング時までそれぞれ０−２４時間培養した。製造例１で得たフロロタンニン（ＥＣＥ）の添加実験では、フロロタンニン（１２．５μｇ／ｍＬ）をエタノール（１００ｍＭ）と同時に添加し、サンプリング時までそれぞれ０−２４時間培養した。
培養後、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて４℃、終夜で固定した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ＸのＰＢＳ溶液で５分間×３回洗浄を行った。３％過酸化水素水を用いて内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを５分間行い、一次抗体（抗ラットＩ型コラーゲン抗体  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製）で６０分間反応させた。ＰＢＳを用いて５分間×３回洗浄を行った。二次抗体（ビオチン化ヤギ抗ラット免疫グロブリン抗体、ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ製）で３０分間反応させた。ＰＢＳを用いて５分間×３回洗浄を行った。酵素溶液（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ複合体溶液）で３０分間反応させた。ＰＢＳを用いて５分間×３回洗浄を行った。ペルオキシダーゼ発色反応によりＤＡＢ溶液を用いて５分間反応させた。ＰＢＳを用いて５分間×３回洗浄を行った。水溶性封入剤（Ａｑｕａｔｅｘ、Ｍｅｒｃｋ製）で封入し、標本を作製した。
倒立顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）に接続しているＣＣＤデジタルカメラ（ＦＵＪＩＸ  ＨＣ−２５００）からＰＣソフト（ＦＵＪＩＸ  Ｐｈｏｔｏｇｒａｂ−２５００  ｆｏｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）を用いて画像を取り込んだ。測定結果を図４−６に示す。
【００３４】
［実施例５］
製造例１で得られたカジメ粗抽出物を用いて１０ｍｇ／ｍｌになるように純水に溶解させ、その後８０℃３０分熱処理を行って完全に水に溶解させた。
カジメ粗抽出物の１０ｍｇ／ｍＬ水溶液を純水で２０倍希釈し、次いで、希釈した溶液をＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地２ｍｌに添加して抽出物の最終濃度が２．５μｇ／ｍｌとなるように調製した。
実施例１の方法にしたがって、肝細胞の生存率を測定した。比較例として、アラメ、ヒジキ、コンブについても製造例１と同様に抽出行って、各粗抽出物を作製した。得られた粗抽出物について、カジメ粗抽出物同様に、肝細胞の生存率を測定した。
回復率を、以下の計算式に基づいて求めた。
回復率＝［（抽出物とエタノールを添加した際の細胞生存率）−（エタノール単独を添加した際の細胞生存率）］／［（コントロールの細胞生存率）−（エタノール単独を添加した際の細胞生存率）］×１００
測定結果を表１及び図７に示す。
【００３５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例１のアルコール性肝炎モデルにおける肝細胞の生存率を平均値±標準偏差により示す。図１中、縦軸はコントロール群を１００としたときの肝細胞の生存率を示す。各グラフは、左から順に、コントロール群、エタノール添加（１００ｍＭ）群、各濃度におけるＧＴＥ及びエタノール（１００ｍＭ）添加群、及び１２．５μｇ／ｍＬのフロロタンニン（ＥＣＥ）及びエタノール（１００ｍＭ）添加群を示す。ａ〜ｅは、有意差の記号を示し、共通のアルファベットを共有しないグラフは、異なっていることを示す（ｐ＜０．０５）。
【図２】実施例２のアルコール性肝炎モデルにおける経時的な培地中のＭＤＡ濃度を平均値±標準偏差により示す。図２中、縦軸は、培地中のＭＤＡ濃度を示し、横軸は、時間経過を示す。◇は、コントロール群のＭＤＡ濃度を、□は、エタノール添加（１００ｍＭ）群のＭＤＡ濃度を、△は、１２．５μｇ／ｍＬのフロロタンニン（ＥＣＥ）及びエタノール添加（１００ｍＭ）群のＭＤＡ濃度を示す。＊＊は、コントロール群と有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図３】実施例３のアルコール性肝炎モデルにおける細胞内還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度を平均値±標準偏差により示す。図３中、縦軸は、ＧＳＨ濃度を示し、横軸は、時間経過を示す。◇は、コントロール群のＧＳＨ濃度を、□は、エタノール添加（１００ｍＭ）群のＧＳＨ濃度を、△は、１２．５μｇ／ｍＬのフロロタンニン（ＥＣＥ）及びエタノール添加（１００ｍＭ）群のＧＳＨ濃度を示す。＊＊は、コントロール群と有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図４】実施例４のコントロール群の抗タイプＩコラーゲン抗体を用いた免疫組織化学的解析による画像を示す。細胞質が黒く染色されているほどコラーゲン合成能が亢進されていることを示す。
【図５】実施例４のエタノール添加群の抗タイプＩコラーゲン抗体を用いた免疫組織化学的解析による画像を示す。
【図６】実施例４のフロロタンニン（ＥＣＥ）及びエタノール添加群の抗タイプＩコラーゲン抗体を用いた免疫組織化学的解析による画像を示す。本発明のフロロタンニン（ＥＣＥ）が、エタノールによる肝星細胞のコラーゲン合成能の亢進を有意に抑制していることを示す。
【図７】実施例５のアルコール性肝炎モデルにおける海藻抽出物の回復率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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