(57)【要約】【課題】特定部位におけるＤＮＡ塩基組成を決定するための感度のよい、均一で柔軟性のある方法を提供する。【解決手段】ミクロスフェア上に固定されるように設計されたプライマーが、調査中のＤＮＡストランドにアニールされ、蛍光デオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長されるか、または蛍光リポーターオリゴヌクレオチドへＤＮＡリガーゼによりライゲーションされる。固定されたプライマーに連結された、デオキシヌクレオチドか、またはリポーターオリゴヌクレオチドが、フローサイトメトリ−により測定され、それにより、ＤＮＡストランド上のヌクレオチド多型が同定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）同定されるべき塩基に直に隣接するＤＮＡストランドへのオリゴヌクレオチドのアニーリング工程；
（ｂ）酵素の存在下で、アニールしたＤＮＡストランドとオリゴヌクレオチドを４種の異なるジデオキシヌクレオチドと共にインキュベートする工程であって、ジデオキシヌクレオチドの１種が蛍光リポーター分子を有し、それにより、オリゴヌクレオチドが一塩基単位だけ伸長する工程；
（ｃ）伸長したオリゴヌクレオチドをミクロスフェア上に固定する工程；および
（ｄ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程
の順序からなる、ＤＮＡストランド上の塩基を同定するための方法。
【請求項２】
蛍光リポーター分子が蛍光ジデオキシヌクレオチドを含み、および酵素がＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドがビオチン化され、およびミクロスフェアがアビジンまたはストレプトアビジンで被覆されている請求項１記載の方法。
【請求項４】
ミクロスフェアがビオチン化され、およびオリゴヌクレオチドがアビジンまたはストレプトアビジンに結合されている請求項１記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドがミクロスフェアに共有結合されている請求項１記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが、ミクロスフェア上に固定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項１記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、捕捉プローブにハイブリダイズされる配列タグを含み、配列タグおよび捕捉プローブはイソ−Ｃおよび５−メチル−イソ−Ｇからなる群より選択された少なくとも１つの非天然型塩基を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡストランド上の部位における塩基を同定するための方法であって、
（ａ）リガーゼの存在下で、オリゴヌクレオチド１を塩基に直に隣接するＤＮＡストランドにアニールし、オリゴヌクレオチド２をオリゴヌクレオチド１に隣接したＤＮＡストランドにアニールする工程であり、オリゴヌクレオチド２は蛍光リポーター分子および同定されようとしている塩基に相補的である応答塩基の両方を含み、該リガーゼの存在下でオリゴヌクレオチド２がオリゴヌクレオチド１に結合し、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを形成する工程；
（ｂ）ＤＮＡストランドを溶解し、ミクロスフェア上へライゲーションされたオリゴヌクレオチドを固定する工程；および
（ｃ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程
の順序からなる方法。
【請求項９】
ＤＮＡストランド上の部位における塩基を同定するための方法であって、
（ａ）リガーゼの存在下で、オリゴヌクレオチド１を塩基に直に隣接するＤＮＡストランドにアニールし、オリゴヌクレオチド２をオリゴヌクレオチド１に隣接したＤＮＡストランドにアニールする工程であり、オリゴヌクレオチド２は蛍光リポーター分子および同定されようとしている塩基に相補的である応答塩基の両方を含み、該リガーゼの存在下でオリゴヌクレオチド２がオリゴヌクレオチド１に結合し、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを形成する工程；
（ｂ）ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを増幅する工程；
（ｃ）ミクロスフェア上へライゲーションされたオリゴヌクレオチドを捕捉する工程；および
（ｄ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程
の順序からなる方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド１がビオチン化され、およびミクロスフェアがアビジンまたはストレプトアビジンで被覆されている請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
ミクロスフェアがビオチン化され、およびオリゴヌクレオチド１がアビジンまたはストレプトアビジンに結合されている請求項８または９記載の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチド１がミクロスフェアに共有結合されている請求項８または９記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチド１が、ミクロスフェア上に固定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項８または９記載の方法。
【請求項１４】
配列タグが相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされ、配列タグおよび捕捉プローブはイソ−Ｃおよび５−メチル−イソ−Ｇからなる群より選択された非天然型塩基を含む請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、１９９７年１０月２８日に出願された仮特許出願Ｎｏ．６０／０６３，６８５の優先権を主張する。
【０００２】
［技術の分野］
本発明は、概して、ＤＮＡヌクレオチド塩基組成の決定のためのフローサイトメトリーの用途、より詳しくは、ヌクレオチド多型、挿入および欠失を含む、１ヌクレオチド多型の塩基を同定するためのフローサイトメトリーの用途に関する。本発明は、米国エネルギー省によりカリフォルニア大学の評議員（Regent）に与えられた契約Ｎｏ．Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６において政府の支持によりなされた。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムのＤＮＡ塩基配列の決定は、次世紀における生物医学的科学に大きな衝撃を与えるであろう。最初の完全なヒトＤＮＡの完成は、病気関連遺伝子の遺伝子マッピングから病気感受性（disease susceptibility）および薬剤反応（drug response）についての診断試験（diagnostic tests）までの適用範囲を向上させるであろう。１ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）として知られる特定の変異ＤＮＡ部位における塩基組成の決定は、とくに重要である。配列決定法の最近の世代は、大規模ＳＮＰ分析の要求を満たすには遅すぎ費用がかかりすぎる。すなわち、ＳＮＰｓの遺伝子配列を分析するための、より早くより効率的な方法が必要である。
【０００４】
ＳＮＰｓは、マッピング、病気遺伝子同定および診断検定（diagnostic assay）において多くの用途を有する。これらの適用のすべてが、ＳＮＰ部位における塩基組成の決定を含む。従来の配列決定はこの情報を提供することができるが、多くの個体において多くの部位をスクリーニングするには非実用的である。効率を増すために、複数の別の方法が開発されている。
【０００５】
１部位における塩基組成を決定するために２つの技術、ミニ配列決定（たとえば、「ミニ配列決定：ＤＮＡ分析に対する特異的手段（Tool）およびオリゴヌクレオチドアレイにおける診断法（“Minisequencing：A Specific Tool For DNA Analysis And Diagnostics On Oligonucleotide Arrays”）」、トミ・パスティネン（Tomi Pastinen）ら、Genome Research ７巻、６０６頁（１９９７年）を参照）およびオリゴライゲーション（ligation）（たとえば、「二色のエリザ（ELISA）に基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定によるダイアレル（diallelic）配列異体（variation）の単式の適切な（Single-Well）遺伝子型決定（“Single-Well Genotyping Of Diallelic Sequence Variations By A Two-Color ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay”）」、ビンセント・オー・トベ（Vincent O.Tobe）ら、Nuclear Acids Res. ２４巻、３７２８頁（１９９６年）を参照）が開発されている。ミニ配列決定において、プライマーは、サンプル鋳型における特定の部位に応答するように設計され、ポリメラーゼが、標識化ジデオキシヌクレオチドでプライマーを伸長するために用いられる。オリゴライゲーションにおいては、同様のプライマーが設計され、目的の部位において可変（variable）である下流オリゴを共有結合させるためにリガーゼが用いられる。各場合において、プライマーへの標識の共有結合により明かにされる塩基を同定するために、正しく塩基が組み合わされた基質に対する酵素の選択性が用いられる。大部分の適用において、これらの検定は、マイクロプレート、磁気ビーズ、および最近では顕微鏡スライド上にマイクロアレイされた（microarrayed）オリゴヌクレオチドを含む、固体基質上に固定されたプライマーを用いて行なわれる。検出法は、蛍光検出による直接標識化、またはビオチンおよび標識化ストレプトアビジンを用いる蛍光、化学発光もしくは吸光検出による間接標識化を含む。
【０００６】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（microarray）または「ＤＮＡチップ」は、大規模平行分析への可能性により大きな注目をうみだしている。わずか数分で小さなサンプルの数万の塩基を配列決定するという見込みは刺激的である。現在では、この技術は、実質的なハードウエアおよび消費費用により、入手可能なほんの一握りの遺伝子を配列決定するためにアレイする際の利用性に制限されている。さらに、ハイブリダイゼーションによる配列決定の一般的方法はとくに確固たるものでなく、ハイブリダイゼーション条件のかなりの配列依存最適化が要求される。それにもかかわらず、「アレイ」技術の平行関係（parallelism）はかなり有力であり、複数配列決定（multiplexed sequence determination）は、新しいフローサイトメトリー法の重要な要素である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、塩基組成を識別するための酵素の特異性が蛍光ミクロスフェアアレイの平行分析と組み合わされる、ミクロスフェアおよびフローサイトメトリーを用いるＤＮＡのストランドの特定の部位における塩基組成を決定するための方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、一部は以下の説明に述べられ、一部は以下の実験において当業者に明らかとなり、または本発明の実施によりわかる。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲にとくに指摘されている手段および組み合わせを用いて実現および達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記および他の目的をなし遂げるために、ならびに本明細書において具体化され広く記載されている本発明の目的にしたがって、ＤＮＡストランド上の特定の部位における塩基組成を決定するための方法は、固定化または捕捉タグである蛍光で標識化されたジデオキシヌクレオチドを運ぶオリゴヌクレオチドプライマーを調製する工程、蛍光ジデオキシヌクレオチドとともにＤＮＡポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する工程、タグを付けられたプライマーをミクロスフェアに特異的に結合する工程、およびフローサイトメトリーによりミクロスフェア蛍光を測定する工程を含む。
【００１０】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡサンプル上のつぎのヌクレオチド塩基に応答するために、目的の部位に直に隣接する調査中のＤＮＡサンプルにアニーリングするように設計される。
【００１１】
プライマーが、（ａ）ミクロスフェアへの共有結合に好適なアミノまたは他の官能基、（ｂ）ミクロスフェア上に固定されているアビジンまたはストレプトアビジンへの結合に好適なビオチン基、または（ｃ）ミクロスフェア表面上に固定されているオリゴヌクレオチド捕捉プローブに相補的なオリゴヌクレオチドタグのうちの１つを５′末端上に有することも好ましい。
【００１２】
本発明の目的に基づくもう１つの側面においては、本明細書中のＤＮＡストランド上の特定の部位における塩基組成を決定するための方法は、固定化または捕捉タグである蛍光で標識化されたジデオキシヌクレオチドを運ぶオリゴヌクレオチドプライマーを調製する工程、蛍光リポーターオリゴヌクレオチドを調製する工程、蛍光リポーターオリゴヌクレオチドにオリゴヌクレオチドプライマーを酵素的にライゲーションする工程、タグを付けられたプライマーをミクロスフェアに特異的に結合する工程、およびフローサイトメトリーによりミクロスフェア蛍光を測定する工程を含む。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の利益および利点は、特定部位におけるＤＮＡ塩基組成を決定するための感度のよい、均一で柔軟性のある方法を含む。
【００１４】
明細書に組み込まれ一部をなす添付の図面は、本発明の１つの実施の態様を示し、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１ａは、ミクロスフェア上に固定されているプライマーが、少なくとも１つが蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下で、調査中のＤＮＡ配列とのハイブリダイズのために用いられ、それによりプライマーは１塩基だけ伸長される、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。一方、図１ｂは、その結果、フローサイトメトリーを用いて検出されることができる末端に結合した１つの蛍光ジデオキシヌクレオチドを有しているプライマー、およびＤＮＡ上のＳＮＰに相補的な塩基を表わしている略図である。
【図２】図２ａは、ミクロスフェア上に予め固定されているプライマーの代わりに、可溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェア（apture microspheres）が用いられている以外は、本明細書の図１ａおよび１ｂに記載されたものと同様のフローサイトメトリー用のミクロスフェアをに基づくミニ配列決定の略図である。図２ｂは、調査されるＤＮＡストランドへのビオチン化プライマーのハイブリダイゼーション、および溶液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの結果としての蛍光Ａジデオキシヌクレオチド（ＳＮＰはＴ塩基と仮定）によるこのプライマーの伸長を示している。図２ｃは、ハイブリダイズされたＤＮＡストランドの溶解後における、伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミクロスフェア上への捕捉、およびそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分析を示す。
【図３】図３ａは、ＤＮＡストランド上に４つのＳＮＰｓが存在すると仮定されている以外は、本明細書の図２ａおよび２ｂに記載されるミニ配列決定と同様の方法で、可溶性の配列タグをつけられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミクロスフェアを用いる、多様な（multiplexed）ミクロスフェアに基づくミニ配列決定手順の略図である。一方図３ｂは、フローサイトメトリーを用いて分析されるミクロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。
【図４】図４ａは、ＳＮＰの領域において調査されるＤＮＡストランドにハイブリダイズしているプライマーにライゲーションする（ligating）ための蛍光相補的プライマーと、ミクロスフェア上に固定されているプライマーとの、フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定の略図である。一方図４ｂは、ＤＮＡが溶離されたのちに適当な蛍光相補体（complement）がライゲーションされているミクロスフェア結合プライマー、フローサイトメトリーで決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がＤＮＡストランドに結合されているのかを示す略図である。
【図５ａ】図５ａは、相補塩基がＤＮＡストランド上に見られる場合の、非増幅ＤＮＡ上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミクロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光の分析の略図である。
【図５ｂ】図５ｂは、相補塩基がＤＮＡストランド上に見られない場合の、非増幅ＤＮＡ上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミクロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光の分析の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
要するに、本発明は、ＤＮＡストランドの特定部位におけるＤＮＡ塩基組成を決定するための、オリゴヌクレオチドプライマー、蛍光ジデオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ミクロスフェア、およびフローサイトメトリーの用途を含む。タグをつけられたオリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡサンプルとともにインキュベートされ、目的部位に直に隣接してアニールされる。蛍光ジデオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼが添加され、プライマーが１塩基単位だけ伸長され、それにより、ＤＮＡストランド中への１つの蛍光ジデオキシヌクレオチドの酵素的組み込み時に、ＤＮＡストランドはフローサイトメーターにより検出されることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、シーケナーゼ（Sequenase）、サーモシーケナーゼ（Thermosequenase）、または任意の他の従来のもしくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであってよい。
【００１７】
本発明のもう１つの実施の態様は、この決定を行なうためにミクロスフェアおよびフローサイトメトリーとともにオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドリポーターおよびＤＮＡリガーゼを用いる。蛍光リポーターオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼが添加され、プライマーをリポーターにライゲーションする。蛍光リポーターオリゴヌクレオチドは、サンプルＤＮＡの３′を直接、アニールされているオリゴヌクレオチドプライマーに結合させるように設計される。すなわち、サンプルＤＮＡ上の目的の部位に応答するためにリポーターが可変であり、さらにフローサイトメトリーを用いる蛍光指示（signature）により調査されることができる５′末端を除いて、配列リポーターオリゴヌクレオチドは、サンプルＤＮＡストランドの配列に相補的である。ＤＮＡリガーゼは、任意の従来のまたは熱安定性（thermostable）リガーゼであってよい。プライマーの伸長またはライゲーションは、熱安定性（heat-stable）ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを用いる熱循環（thermal cycling）により促進させることができる。
【００１８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、酵素による伸長またはライゲーションの前またはあとにミクロスフェアに結合される。アミノ標識化プライマーは、ＥＤＡＣを用いてカルボキシル化ミクロスフェアに共有結合されることができる。ビオチン化プライマーは、アビジンまたはストレプトアビジン被覆ミクロスフェアに結合されることができる。オリゴヌクレオチド配列タグを運ぶプライマーは、共有結合によりまたはビオチン−アビジン相互作用によりミクロスフェア上に固定されている相補的オリゴヌクレオチド捕捉配列にアニールされることができる。ミクロスフェアは、ポリスチレン、セルロースまたは他の適当な材料からなり得る。寸法の異なる、または異なる量の蛍光染料により染色されたミクロスフェアは、複数配列分析に使用できる。
【００１９】
本発明を一般的に説明したが、以下の実施例は、さらに明確なその詳細を提供する。
【実施例】
【００２０】
実施例１
固定化プライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定
さて、添付の図面に説明するように本発明の好ましい実施の態様を詳細に言及していく。図に戻って、図１ａは、ミクロスフェア上に固定されたプライマーが、少なくともその１つが蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下で、調査中のＤＮＡ配列とのハイブリダイズするために用いられている、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。プライマーは、ポリメラーゼの作用により、１塩基だけ伸長される。図１ｂは、その結果、フローサイトメトリーを用いて検出されることができる末端に結合した１つの蛍光ジデオキシヌクレオチドを有するプライマーの略図であり、およびＤＮＡ上のＳＮＰに相補的な塩基を表わしている。サンプルＤＮＡ鋳型は、まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために小エビ（shrimp）アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。調査中のＤＮＡストランド上の特定の部位に応答するように設計されるミニ配列決定プライマーが、架橋試薬（たとえば、カルボジイミド）を用いてカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア上の５′−アミノ基により固定される。プライマーを運ぶミクロスフェア（５μｌ）を、増幅されたＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム  ライフ  サイエンス（Amersham Life Sciences）製、クリーブランド（Cleaveland）、オハイオ州（OH））、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程は、４つの蛍光ｄｄＮＴＰのおのおのを用いて３回繰り返された。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。各反応混合物の２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭトリス（Tris）−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、信号（signal）対バックグラウンド（background）比１００以上で、オリゴヌクレオチド鋳型上の特定部位について、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
【００２１】
実施例２
ビオチン化（biotinylated）プライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定
図２ａは、ミクロスフェア上に予め固定されているプライマーの代わりに、可溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェアが用いられている以外は、本明細書の図１ａおよび１ｂに記載されたものと同様のフローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。図２ｂは、調査されるＤＮＡストランドへのビオチン化プライマーのハイブリダイゼーション、および溶液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの結果としての、１つの蛍光Ａジデオキシヌクレオチド（ＳＮＰはＴ塩基と仮定）によるこのプライマーの伸長を示している。図２ｃは、ハイブリダイズされたＤＮＡストランドの溶解後の、伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミクロスフェア上の捕捉、およびそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分析を示す。サンプルＤＮＡ鋳型は、ＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために小エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。鋳型ＤＮＡ上の特定部位に応答するように設計され、５′−ビオチン基を運ぶミニ配列決定プライマーが調製される。ビオチン化プライマーを、鋳型ＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム製）、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、異なる蛍光ｄｄＮＴＰを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。ビオチン化プライマーを捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア５μｌを反応混合物に添加する。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のＤＮＡ配列決定技術によって確認されたように、３０個のＰＣＲ増幅サンプルのうち３０個において、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
【００２２】
実施例３
タグを付けられているプライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定
図３ａは、ＤＮＡストランド上に４つのＳＮＰが存在すると仮定されている以外は、本明細書の図２ａおよび２ｂに説明されるミニ配列決定と同様の方法で、可溶性の配列タグを付けられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミクロスフェアを用いる、多様な（multiplexed）ミクロスフェアに基づくミニ配列決定手順の略図である。図３ｂは、フローサイトメトリーを用いて分析されるミクロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。サンプルＤＮＡ鋳型はＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。鋳型ＤＮＡ上の特定部位に応答するように設計され、５′−配列タグを運ぶミニ配列決定プライマーを調製する。捕捉プローブが、プライマーの５′−配列タグに結合するように設計され、ミクロスフェア上に固定される。捕捉タグを運ぶプライマーを、鋳型ＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム製）、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、異なる蛍光ｄｄＮＴＰを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。ビオチン化プライマーを捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア５μｌを反応混合物に添加する。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。
【００２３】
実施例４
固定化プライマーを用いるフローサイトメトリーによるオリゴヌクレオチドライゲーション
図４ａは、プライマーが、ＳＮＰの領域において調査されるＤＮＡストランドにハイブリダイズしているそのプライマーに、ライゲーションするための蛍光相補的プライマーとともに、ミクロスフェア上に固定される、フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定の略図である。図４ｂは、ＤＮＡが溶離されたのちに適当な蛍光相補体がライゲーションされるミクロスフェア結合プライマーの略図であり、フローサイトメトリーで決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がＤＮＡストランドに結合されているのかを示す。サンプルＤＮＡ鋳型は、ＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。鋳型ＤＮＡ上の特定の部位に応答するように設計されたオリゴヌクレオチドライゲーションプライマーが、カルボジイミドを用いてカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア上の５′−アミノ基を介して固定される。目的の部位に直に隣接して結合するように設計されているが、５′−末端が異なる４つの蛍光リポーターオリゴヌクレオチドを調製する。プライマーを運ぶミクロスフェア（５μｌ）を、鋳型ＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡリガーゼ（１単位、サーモリガーゼ（Thermoligase）、エピセンター  テクノロジーズ（Epicentre Technologies）製、マジソン（Madison）、ウィスコンシン州（ＷＩ））、１つの蛍光標識化リポーターオリゴヌクレオチド（５μＭ）、および緩衝液（サーモリガーゼ緩衝液、エピセンター製）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、４つの蛍光リポーターオリゴヌクレオチド（５μＭ）のおのおのを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のＤＮＡ配列決定技術によって確認されたように、３０個のＰＣＲ増幅サンプルのうち３０個において、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
【００２４】
実施例５
非増幅ＤＮＡ上での多様な（multiplexed）オリゴヌクレオチドライゲーション、およびその後のＰＣＲによる増幅
図５ａおよび５ｂは、相補塩基がＤＮＡストランド上に見られる場合および相補塩基がＤＮＡストランド上に見られない場合それぞれについての、非増幅ＤＮＡ上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミクロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光の分析の略図である。
【００２５】
目的の部位に直に隣接する鋳型ＤＮＡの配列に相補的な１つのオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）、およびオリゴヌクレオチド１に直に隣接する鋳型ＤＮＡの配列に相補的であり、目的の部位を含む４つのオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）からなる、１組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。４つのオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）のおのおのは、４つの可能性のある塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのおのおのに対応しており、他のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）に隣接するヌクレオチド塩基が異なる。オリゴヌクレオチド１は、いずれのオリヌクレオチドが目的の部位に相補的な塩基を含むかどうかに依存して、その他のオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）の１つにライゲーションすることを意図されている。さらに、可能性がある対（合計５個のオリゴヌクレオチド）中の２つのオリゴヌクレオチドのおのおのは、ＰＣＲプライミング部位（PCR priming site）からなる「テイル」を形成する付加的なヌクレオチドを含む。この部位は、オリゴヌクレオチド１の場合と、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔの場合で異なり、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔはこの群中において同じプライマー結合部位を有するが、オリゴヌクレオチド１のものとは異なる。４つの平行ライゲーション反応を、オリゴヌクレオチド１、その他のオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）の１つ、およびＤＮＡリガーゼ酵素を用いて行なう。すべてのオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイズすることが予期されるが、完全に一致しているオリゴヌクレオチドだけがオリゴヌクレオチド１にライゲーションされる。得られるライゲーション産物は、オリゴヌクレオチド１中に導入されたテイルに相補的な１つのプライマー（プライマー１）、およびオリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔのテイルと相補的な配列を有する他のプライマー（プライマー２）を用いて、続くＰＣＲ反応のための鋳型として作用する。プライマー１からのＰＣＲ増幅がライゲーションされたフラグメントを超えて伸長したり、プライマー２に相補的な配列をつくることがなければ、オリゴヌクレオチド２に対するプライマー部位がないために、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ技術で増幅されることができない（図５ｂ）。増幅のあいだにＰＣＲフラグメントを標識化するために、ＰＣＲ工程のあいだに用いられる非標識化ｄＮＴＰに加えて、蛍光で標識化されているｄＮＴＰを添加する。あるいはまた、プライマー２を蛍光染料で標識化して、増幅を起こす染料標識化ＰＣＲ増幅産物を生成する。
【００２６】
最後の工程は、１端が可変ヌクレオチドで他端がプライミング部位（priming site）である以外は、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔと同じ配列を有するオリゴヌクレオチドが表面に固定されているミクロスフェアを、ＰＣＲ混合物に添加することを含む。標識化されているＰＣＲ産物が、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド複合体の新しく合成された相補体にアニーリングすることによりＰＣＲ混合物中に存在する場合、このミクロスフェアは、標識化されているＰＣＲ産物を捕捉することを意図されている。つぎに、ハイブリダイズされている断片のために、ビーズ蛍光はフローサイトメトリーにより分析される。多くのセットのプライマーが、溶液中で同時に多くのＳＮＰｓのタイプを決める（type）ことができ、おのおのが多様な（multiplexed）セット中の異なるビーズ上に捕捉されると同時にフローサイトメーター中で読みとられる。
【００２７】
前記の本発明に関する記載は、図面（illustration）および発明の説明のためのものであり、完全なものであると意図するものではなく、または本発明を開示された厳密なものに制限すると意図するものではない。そして、前記教示を考慮して、明かに多くの修飾および変型（variation）が可能である。たとえば、フローサイトメトリーを用いる分析のために、オリゴヌクレオチドプライマーをミクロスフェアに結合させるため、オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフィア上に固定された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされる配列タグを含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよび５−メチル−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む。他の当業者が、種々の態様において、および熟考される特定の用途に適している種々の変更を行なって発明を最も適切に利用できるように、本発明の原理および実際の適用を最も適切に明らかにするために、実施の態様は、選択および説明されたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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