(57)【要約】【課題】  細胞接着面における細胞の接着性を制御するとともに、細胞の観察や計測での悪影響を抑制する手段を提供する。【解決手段】  構造体は、培養液に浸されて使用されるとともに、培養対象の細胞が付着可能な細胞接着面を有する。この細胞接着面は、細胞の接着性を制御するために複数の微細な突起が連続的に形成された凹凸部を有するとともに、凹凸部が光透過性を有する非晶質フッ素樹脂で形成されている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液に浸されて使用されるとともに、培養対象の細胞が付着可能な細胞接着面を有する構造体であって、
前記細胞接着面は、前記細胞の接着性を制御するために複数の微細な突起が連続的に形成された凹凸部を有するとともに、前記凹凸部が光透過性を有する非晶質フッ素樹脂で形成されていることを特徴とする構造体。
【請求項２】
前記構造体は、底面部に前記細胞接着面を含む培養容器であることを特徴とする請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記構造体は、一方の面に前記細胞接着面が形成された平面状の部材であることを特徴とする請求項１に記載の構造体。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の構造体の細胞接着面に対して照明光を照射し、
前記照明光が照射された前記細胞接着面上の細胞の画像を取得することを特徴とする細胞測定方法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の構造体と、
前記構造体の細胞接着面に対して照明光を照射する照明部と、
前記照明光が照射された前記細胞接着面上の細胞の画像を取得する画像取得部と、
を備えることを特徴とする細胞測定装置。
【請求項６】
培養液中に浸された培養対象の細胞を収容する培養容器であって、
前記培養容器の底面には相対的に前記細胞の接着性の高い第１領域と、前記第１領域に対して前記細胞の接着性の低い第２領域とが形成され、
前記細胞の接着性を制御するために複数の微細な突起が連続的に形成された凹凸部を有するとともに、光透過性を有する非晶質フッ素樹脂で前記凹凸部が形成された構造体を、前記第２領域に備えることを特徴とする培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養で用いられる構造体とその周辺技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、細胞の培養を行うときに、培養容器等の細胞接着面に微細加工を施して細胞との接着性を調整することで、例えば、三次元的な細胞組織（スフェロイドなど）や、細胞アレイや、神経細胞を用いた細胞回路などを形成することが検討されている。一例として、特許文献１には、微小なハニカム構造を有するフィルムを基材としてスフェロイドを培養する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−３３５９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、上述の従来技術では、細胞接着面上の細胞を観察するときに、培養液の屈折率と培養容器等の屈折率との違いから細胞接着面の微細加工によって観察光に屈折が生じ、細胞の観察や計測の妨げとなる点で改善の余地があった。
【０００４】
そこで、本発明は、細胞接着面における細胞の接着性を制御するとともに、細胞の観察や計測での悪影響を抑制する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一の態様の構造体は、培養液に浸されて使用されるとともに、培養対象の細胞が付着可能な細胞接着面を有する。この細胞接着面は、細胞の接着性を制御するために複数の微細な突起が連続的に形成された凹凸部を有するとともに、凹凸部が光透過性を有する非晶質フッ素樹脂で形成されている。
【０００６】
上述した一の態様の構造体は、底面部に細胞接着面を含む培養容器であってもよく、あるいは一方の面に細胞接着面が形成された平面状の部材であってもよい。なお、上述した一の態様の構造体に関して、照明光が照射された細胞接着面上の細胞の画像を取得する細胞測定方法または細胞測定装置の構成も、本発明の具体的態様として有効である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明では、細胞の接着性を制御するための凹凸部が光透過性を有する非晶質フッ素樹脂で形成され、細胞の観察や計測のときに凹凸部での光の屈折が大幅に抑制される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜一の実施形態の説明＞
図１は、一の実施形態での培養容器の構成例を示す図である。一の実施形態では、例えばスフェロイドなどの三次元的な細胞組織の培養に適した培養容器の例である。
【０００９】
培養容器１０の全体形状は、上面が開口された円筒形状となっている。この培養容器１０は、例えば透明なガラスやプラスチックなどの材料で形成される。そして、培養容器１０には、液体培地１２とともに培養対象の細胞１３（一例として幹細胞や株化細胞など）が収容される。
【００１０】
培養容器１０の底面部１０ａの中央部分は、光透過性を有する非晶質フッ素樹脂でコートされている。そして、この非晶質フッ素樹脂の層の上面には、細胞１３が付着可能な細胞接着面１１が形成されている。ここで、非晶質フッ素樹脂は、可視光線の透過率が９５％を超えるとともに、水の屈折率（１．３３）と非常に近似した屈折率（１．３４）であるという光学特性を有している。なお、一の実施形態では、非晶質フッ素樹脂として旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）を用いている。
【００１１】
また、細胞接着面１１には、細胞１３の接着性を制御するための凹凸部が形成されている。図２、図３は、細胞接着面１１の凹凸部の構成の一例を示す図である。一の実施形態での細胞接着面１１には、針状の微細な突起１４が一定のパターンで連続的に形成されており、各々の突起１４とその隙間とが凹凸部をなしている。
【００１２】
また、細胞接着面１１の凹凸部のピッチは、培養対象の細胞１３のサイズよりも十分に小さく設定される。例えば、細胞１３のサイズが１００μｍ程度の場合には、凹凸部のピッチは０．１μｍから１０μｍ程度に設定される（なお、図面では細胞１３および突起１４のサイズをディフォルメして示している）。
【００１３】
また、細胞接着面１１の凹凸部は、例えば、培養容器１０に非晶質フッ素樹脂を塗布してから、ホットエンボス加工で型の形状を転写して形成することができる。また、プラズマエッチングにより、非晶質フッ素樹脂の層に凹凸部を形成してもよい。あるいは、射出成形やホットエンボス加工によって、上記の細胞接着面１１を片面に有する非晶質フッ素樹脂の平面状のシート１５を形成し、この非晶質フッ素樹脂のシート１５を培養容器１０の底面１０ａに固着してもよい（図４参照）。
【００１４】
なお、図２、図３に示した細胞接着面１１の凹凸部のパターンや形状はあくまで一例であり、その構成は適宜変更することが可能である。例えば、細胞接着面１１の突起１４が隔壁状に連続するとともに、隔壁で仕切られた凹部がハニカム状、格子状などのパターンで配列されるようにしてもよい。また、細胞接着面１１の突起１４のテーパーの大きさを適宜調整してもよい（これらの場合の図示はいずれも省略する）。
【００１５】
一の実施形態では、細胞接着面１１に凹凸部を形成することで、培養容器１０の表面が平坦な場合と比べて細胞が付着しにくくなる。その結果、培養する細胞１３が細胞接着面１１の上方に凝集し易くなることから、スフェロイドなどの三次元的な細胞組織の培養が容易となる。
【００１６】
また、細胞接着面１１の凹凸部（１４）は非晶質フッ素樹脂で形成されているため、液体培地１２と凹凸部（１４）との界面では光の屈折率がほぼ同一となる。したがって、細胞１３を光学観察するときには、細胞接着面１１の凹凸部での光の屈折が著しく少なくなることから、細胞接着面１１の凹凸部はほとんど視認できなくなる。そのため、細胞１３の観察や計測のときには、培養容器１０の凹凸部が細胞の背景に写り込まなくなり、培養対象の細胞１３の状態をより的確に把握することが可能となる。
【００１７】
＜一の実施形態の変形例＞
図５、図６は、培養容器１０における細胞接着面１１の構成の別例を示す図である。この図５、図６の例は、細胞アレイの形成に適した細胞接着面１１の例である。
【００１８】
図５、図６の例では、培養容器１０の細胞接着面１１は、上述の例と同様に非晶質フッ素樹脂の層の上に形成されるとともに、各々で細胞の付着性が異なる第１領域２１と第２領域２２とが形成されている。細胞接着面１１の第１領域２１はその表面が平坦に形成されており、相対的に細胞１３の付着性が高く設定されている。図５では、簡単のため、第１領域が４×４の配列をなしている例を図示する。また、各々の第１領域２１には、表面処理を施すことで細胞１３の付着性を一層向上させてもよい。例えば、第１領域２１に電荷を持った高分子被膜（例えばポリリジンのコーティングなど）を形成し、第１領域２１における蛋白質の吸着を高めることで細胞１３の付着性を向上させてもよい。あるいは、第１領域２１にプラズマ照射を行って、親水性を付与することで細胞１３の付着性を向上させてもよい。
【００１９】
一方、細胞接着面１１の第２領域２２には上述の凹凸部（１４）が形成されており、第１領域２１よりも細胞１３の付着性が低くなるように設定されている（図６参照）。図５、図６の例での第２領域２２は第１領域２１を取り囲むように形成されている。この図５、図６の例では、アレイ状に配置された各々の第１領域２１に細胞１３が付着し易くなるため、培養容器１０内に細胞アレイを形成することが容易となる。
【００２０】
図７は、培養容器１０における細胞接着面１１の構成のさらなる別例を示す図である。この図７の例は、上述の図５、図６の変形例であって、細胞回路の形成に適した細胞接着面１１の例である。
【００２１】
図７の例では、培養容器１０の細胞接着面１１は、上述の例と同様に非晶質フッ素樹脂の層の上に形成されるとともに、細胞接着面１１の第１領域は、所望の回路パターンをなすように形成されている。そして、第１領域の各ノード２１ａ（端点や交点の部分）に神経細胞などを播種すると、神経細胞の軸索や樹状突起は各ノードを繋ぐ通路２１ｂに沿って延びやすくなる。そのため、図７の例では、接着性の制御によって各ノード２１ａの神経細胞の接続を調整でき、培養容器１０内に所望のパターンの細胞回路を形成することが容易となる。例えば、神経細胞と心筋拍動細胞とを通路２１ｂで接続されたノード２１ａ上にそれぞれ播種すれば、神経細胞と心筋拍動細胞とを含む細胞回路を形成できる。
【００２２】
また、上述の図５から図７の例では、いずれも第２領域２２の凹凸部が非晶質フッ素樹脂で形成されているため、図１から図４に示す一の実施形態の例と同様に、培養容器１０の凹凸部が細胞の背景に写り込まなくなり、培養対象の細胞１３の状態をより的確に把握できる。
【００２３】
＜他の実施形態の説明＞
図８は、他の実施形態での顕微鏡の構成例を示す図である。この他の実施形態は、上述した各種の培養容器１０で培養される細胞を顕微鏡で観察する例である。顕微鏡４０は、光源４１と、照明光学系４２と、共焦点光学系４３と、撮像装置４４と、ステージ４５と、ステージ駆動部４６と、シフト機構４７と、コントローラ４８と、操作部４９と、表示部５０とを備えている。なお、図８では、顕微鏡と外部装置（コンピュータなど）との接続の有無については図示していないが、外部装置と接続可能な顕微鏡であってもよい。
【００２４】
光源４１は、例えばレーザー光を照射するレーザー光源で構成される。照明光学系４２は、例えばコンデンサレンズからなる。光源４１および照明光学系４２は、共焦点光学系４３の側方に位置し、後述するビームスプリッタ５７から側方に延びる光軸Ｌ１上に配置される。
【００２５】
共焦点光学系４３は、被検物となる培養容器１０から上方に延びる光軸Ｌ２上に、培養容器１０側から、対物レンズ系５５、ピンホールディスク５６、ビームスプリッタ５７、リレーレンズ系５８の順で配置される。
【００２６】
対物レンズ系５５は、ピンホールディスク５６の共焦点ピンホールを通過した光を、ステージ４５に載置された培養容器１０に共焦点ピンホールの像（点像）として集光照射する。培養容器１０に集光照射された共焦点ピンホールの像は、培養容器１０の底面部または細胞の表面で反射される。そして、対物レンズ系５５は、上記の反射光を再び集光することで、ピンホールディスク５６の下面に培養容器１０の底面部または細胞の表面の像を生成する。
【００２７】
ピンホールディスク５６は、光を透過する共焦点ピンホール（図示省略）が多数螺旋状に配列された薄い円盤からなる。ピンホールディスク５６は、ビームスプリッタ５７で反射された光を遮るように、共焦点光学系４３の光軸Ｌ２に対して直交して配置されている。ピンホールディスク５６は、モータ６０により所定の回転速度で回転され、共焦点ピンホールを透過した光のみが、対物レンズ系５５に向けて照射される。
【００２８】
ビームスプリッタ５７は、照明光学系４２からの照明光のうち、特定の偏光成分の光を透過させるとともに、残りの偏光成分を反射する。このビームスプリッタ５７で反射された偏光成分の光は、ピンホールディスク５６の上面に照射される。また、ビームスプリッタ５７は、ピンホールディスク５６の共焦点ピンホールを通過した反射光を透過させて、リレーレンズ系５８に照射する。なお、図８の例では、ビームスプリッタ５７を配置しているが、ビームスプリッタ５７の代わりにハーフミラーを配置することも可能である。リレーレンズ系５８は、ビームスプリッタ５７を透過した反射光を集光し、撮像装置４４の撮像面に共焦点ピンホールの像を結像させる。
【００２９】
撮像装置４４は、リレーレンズ系５８の像面位置に設けられる。撮像装置４４は、例えばＣＣＤやＣＭＯＳなどの二次元の撮像素子から構成される。ステージ４５は、培養容器１０を所定位置に保持した状態で、共焦点光学系４３の焦点近傍位置に配置される。
【００３０】
ステージ駆動部４６は、光軸Ｌ２方向にステージ４５を移動させるとともに、光軸Ｌ２と直交する面上でステージ４５を移動させる。シフト機構４７は、対物レンズ系５５を光軸Ｌ２方向に移動させる。コントローラ４８は、顕微鏡４０の各部を制御する。操作部４９は、顕微鏡４０における観察条件の入力操作等のときに操作される。表示部５０は、例えばＬＣＤからなり、撮像装置４４によって撮像される画像や、観察条件の設定などを行う際の画像を表示する。
【００３１】
顕微鏡４０において、光源４１からの照明光のうちで所定の偏光成分の光は、ビームスプリッタ５７で反射された後に、所定の速度で高速回転しているピンホールディスク５６上に照射される。これにより、ピンホールディスク５６に形成された共焦点ピンホールを通過した光のみがスポット光として培養容器１０をスキャンすることとなる。
【００３２】
そして、共焦点ピンホールを通過した培養容器１０の反射像（共焦点像）を撮像装置４４で撮像することで、培養容器１０の各部の高さ情報を含んだ共焦点画像を得ることができる。すなわち、共焦点光学系４３では、培養容器１０が対物レンズ系５５の焦点面の高さ位置にあるときに、反射光がピンホールディスク５６のピンホール形成面に結像し、反射光のほぼ全量が透過光となって共焦点ピンホールを通過する。一方、共焦点光学系４３において、培養容器１０が対物レンズ系５５の焦点面の高さ位置からわずかでも外れると、反射光はピンホール形成面に結像せず、その一部しか共焦点ピンホールを通過することができない。このため、培養容器１０および共焦点光学系４３の少なくとも一方を光軸Ｌ２方向に変位させることで、培養容器１０の表面に対する焦点面の高さを相対変位させるとともに、ピンホールディスク５６を介して撮像装置４４で検出された反射光の強度が最大となる高さ位置を求めることで、被検物各部の光軸方向の位置を高精度に検出できる。
【００３３】
この他の実施形態の顕微鏡４０では、上述した培養容器１０の構成により、細胞接着面における凹凸部が細胞の背景に写り込まないので、観察時または測定時において培養対象の細胞の状態をより的確に把握できる。
【００３４】
＜実施形態の補足事項＞
（１）上記の実施形態において、培養容器１０全体を非晶質フッ素樹脂で形成し、培養容器１０の底面に細胞接着面の凹凸部を直接形成するようにしてもよい。
【００３５】
（２）また、本発明の構造体は培養容器に用いるものに限定されず、例えば、マイクロ総合分析システム（Micro Total Analysis Systems：μＴＡＳ）のマイクロ流路内で細胞を培養する場合などにも応用することが可能である。
【００３６】
（３）図８では、共焦点光学系を有する顕微鏡の構成例を説明したが、例えば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡などの他の顕微鏡を用いて観察を行うものでもよい。これらの他の顕微鏡の場合も上述の他の実施形態とほぼ同様の効果を得ることができる。なお、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡の構成はいずれも周知であるため、その詳細な説明は省略する。
【００３７】
以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図する。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】一の実施形態での培養容器の構成例を示す図
【図２】細胞接着面の凹凸部の構成の一例を示す平面図
【図３】細胞接着面の凹凸部の構成の一例を示す縦断面図
【図４】平面状のシートを用いて細胞接着面を形成する例を示す図
【図５】培養容器における細胞接着面の構成の別例を示す平面図
【図６】培養容器における細胞接着面の構成の別例を示す縦断面図
【図７】培養容器における細胞接着面の構成の別例を示す平面図
【図８】他の実施形態での顕微鏡の構成例を示す図
【符号の説明】
【００３９】
１０…培養容器、１１…細胞接着面、１２…液体培地、１３…細胞、１４…突起、１５…シート、４０…顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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