(57)【要約】      （修正有）【課題】脳梗塞の遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供する。【解決手段】６３４１人の日本人集団に関し、約５２万個の遺伝子多型から、ゲノム全領域関連解析（GWAS）を行って見出された、脳梗塞に関するLLGL2のrs1671021多型、CELSR1のrs9615362多型、RUVBL2のrs753307多型を決定することによる、脳梗塞の遺伝的リスクの検出方法。これらの多型を含む連鎖不平衡ブロックの塩基配列の中、３個のタグSNPと１個の非同義SNPが脳梗塞に関連し、特にCELSR1のrs6007897（A→G,Thr2268Ala）及びCELSR1のrs4044210（A→G,Ile2107Val）については、アミノ酸置換を伴う重要なSNPであった。【選択図】図３
2010166844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs9615362、RUVBL2のrs753307、CELSR1のrs6007897、CELSR1のrs4044210、RUVBL2のrs1062708のうちの少なくとも１個または２個以上のSNPを決定することを特徴とする脳梗塞の遺伝的リスクの検出方法。
【請求項２】
LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs6007897、CELSR1のrs4044210、RUVBL2のrs1062708のうちの少なくとも１個または２個以上のSNPを決定することを特徴とする請求項１に記載の脳梗塞の遺伝的リスクの検出方法。
【請求項３】
CELSR1のrs6007897またはCELSR1のrs4044210のいずれか一方のSNPを決定することを特徴とする請求項１または２に記載の脳梗塞の遺伝的リスクの検出方法。
【請求項４】
CELSR1の４個のSNP（rs9615362、rs4044210、rs6007897、rs6008788）について、いずれか１個所のSNPの塩基に基づき、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)またはA−G−G−Gのいずれかを決定することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の脳梗塞の遺伝的リスクの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞の遺伝的リスクを検出するための方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は多因子疾患であり、個人の遺伝因子と様々な環境要因との相互作用によって発症すると考えられている。脳卒中は、発症頻度が高く、重篤な疾患である。２００４年のアメリカ心臓学会の統計によれば、７８万人が新規または再発性の脳卒中に罹患し、１５万人が死亡している。米国での脳卒中の患者数は、約５８０万人である。脳卒中のうち、８７％が脳梗塞、１０％が脳出血、残りの３％がくも膜下出血である（非特許文献１）。厚生労働省の統計によれば、２００５年の日本における脳卒中の患者数は、約１４０万人（このうち、６１％が脳梗塞、２５％が脳出血、１１％がくも膜下出血、その他３％である）であり、１３万３千人が死亡している。近年の脳卒中の急性期に対する治療の発達にもかかわらず、脳卒中は、西洋及び日本において、重度障害を起こす最大の原因であり、心臓病とガンに次いで第３位の死因となっている（非特許文献２）。脳卒中のリスクを予測するためのバイオマーカを特定することは、将来の発症を回避するための危険予測および治療のために重要である。
遺伝疫学的研究によって、脳卒中のリスクファクターとして幾つかの遺伝子多型が報告されている（非特許文献３−６）が、脳卒中の遺伝因子については、ほとんどが未知のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、脳梗塞に関連する遺伝的多型を同定し、脳梗塞の発症予測を行うための精度の高い資料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、６３４１名の日本人集団において、約５２万個の遺伝子多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）について、脳梗塞に関するゲノム全領域での関連解析（GWAS）を行ったところ、LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs9615362、及びRUVBL2のrs753307の３個のSNPが脳梗塞に有意に関連した。
これらのSNPを含むエクソンとエクソン・イントロン境界の連鎖不平衡ブロックを検討したところ、４個のSNP、すなわち、３個のタグSNP（CELSR1のrs6007897、LLGL2のrs1671021、RUVBL2のrs1062708）と１個の非同義SNP（CELSR1のrs4044210）が脳梗塞に有意に関連した。CELSR1のrs6007897のバリアント型Ｇ（Ala）アレルとrs4044210のＧ（Val）アレルは脳梗塞の危険因子であり、LLGL2のrs1671021のバリアント型Ｃ（Leu）アレルとRUVBL2のrs1062708のＴアレルは防御因子であった。CELSR1のrs6007897とrs4044210は連鎖不平衡であり、これらを含むCELSR1の４個のSNPのハプロタイプ頻度は、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)が0.8457であり、A−G−G−Gが0.1543であった。このうち、前者は脳梗塞の防御因子であり、後者は脳梗塞の危険因子であった。
【０００５】
こうして、本願発明に係る脳梗塞の遺伝的リスクを検出する方法は、LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs9615362、RUVBL2のrs753307、CELSR1のrs6007897、CELSR1のrs4044210、RUVBL2のrs1062708のうちの少なくとも１個または２個以上のSNPを決定することを特徴とする。
上記方法において、LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs6007897、CELSR1のrs4044210、RUVBL2のrs1062708のうちの少なくとも１個または２個以上のSNPを決定することが好ましい。このとき、CELSR1のrs6007897とrs4044210とは連鎖不平衡なので、いずれか一方を用いることが好ましい。さらに、このときCELSR1の４個のSNP（rs9615362、rs4044210、rs6007897、rs6008788）は連鎖不平衡であり、ハプロタイプ頻度が明らかとなったので、これら４個のSNPのうちのいずれか１個所のSNPの塩基に基づき、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)、またはA−G−G−Gのいずれかを決定することが好ましい。
【０００６】
一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、脳梗塞との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および脳梗塞との関連が裏付けられるわけではない。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、脳梗塞について、遺伝的リスクを予測するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、脳梗塞に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・寝たきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【０００９】
＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、３つの独立した母集団からなる６３４１名（９９２名の脳梗塞患者、５３４９名の対照者）であった。母集団Ａは、２６６名（１３１名の脳梗塞患者と１３５名の対照者）からなり、研究参加施設（岐阜県総合医療センター、岐阜県立多治見病院）に、２００２年１０月から２００４年３月までに、様々な症状の治療のため又は毎年の健康診断のために来院した者であった。母集団Ｂは、４２２５名（７９０名の脳梗塞患者、３４３５名の対照者）からなり、研究参加施設（岐阜県総合医療センター、岐阜県立多治見病院、横浜総合病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院、弘前脳卒中センター、東京都老人医療センター）に、２００２年１０月から２００８年３月までに、様々な症状の治療のため又は毎年の健康診断のために来院した者であった。母集団Ｃは、１８５０名の地域社会に暮らす一般住民（７１名の脳梗塞既往暦者と１７７９名の対照者）であり、群馬県と東京都における老化・老年病の疫学研究に参加した高齢者であった。脳梗塞の有無については、新規かつ突然の脳の局所的な神経学的異常が確認され、２４時間以上に渡って神経症状が継続した者であって、頭部のＣＴまたはＭＲＩによる診断（或いはその両者による診断）によって確定した。脳梗塞のタイプは、脳血管障害の分類III（非特許文献７）に従って決定した。心原性脳塞栓性、ラクナ梗塞のみ、一過性脳虚血発作、出血性脳血管障害または脳出血、脳血管奇形、モヤモヤ病、脳静脈洞血栓症、脳腫瘍、及び外傷性脳血管障害の患者は、今回の研究対象から除外した。心臓弁膜症の有無に拘わらず、心房細動を持つ患者についても同様に研究対象から除外した。
【００１０】
コントロール群は、様々な一般的疾患の治療のために外来患者として訪れた者、または前向きコホート研究に参加した地域の一般住民であった。対象者には、従来の脳梗塞の危険因子であるもの、つまり高血圧（収縮期血圧が140mmHg以上若しくは拡張期血圧が90mmHg以上または両条件を満たす者、または降圧薬を服用している者）、糖尿病（空腹時血糖値が6.93mmol/L以上若しくはヘモグロビンA1c（HbA1c）が6.5%以上、または抗糖尿病薬を服用している者）、または高コレステロール血症（血清総コレステロール値が5.72mmol/L以上、または脂質降下薬を服用している者）を有している者が含まれていた。対象者は、脳梗塞・脳出血・その他の脳疾患、冠動脈疾患・末梢動脈閉塞疾患・その他のアテローム硬化性疾患、その他の血栓性、塞栓性または出血性疾患の既往歴はなかった。
研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、東京都老人総合研究、理化学研究所および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１１】
ゲノムワイド関連解析（GWAS）
脳梗塞のGWASは、母集団Ａについて、StyIとNspIチップから構成され、ゲノム全領域に分布する約５２万個のSNPsを含むジーンチップ・ヒューマン・マッピング・500Kアレイセット（Affymetrix）を用いて行った。解析可能であったデータ割合（コール・レート）が９３％以下であったチップのデータについては、解析に用いなかった。本研究におけるコール・レートの平均値は、９８％であった。各SNPのアレル頻度と脳梗塞との関連をカイ二乗検定にて評価し、Ｐ値が1.0 × 10−20よりも小さな８９４個のSNPを抽出した。これらのSNPについて、ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）を検索し、遺伝子注釈（gene annotation）が付された４９９個のSNPを決定した。次いで、各ハプロブロックのハプロタイプと脳梗塞との関連を調べ、Ｐ値が1.0 × 10−20よりも小さな４５５個のハプロブロックを選択した。これらのハプロブロックについて、ｄｂＳＮＰデータベースを検索し、遺伝子注釈が付された２３８個のハプロブロックを得た。さらに４９９個のSNPのうち、これらのハプロブロックに含まれる１９４個のSNPを選択した。対照群について、これらのSNPの遺伝子型分布が、ハーディ・ワインバーグ平衡から逸脱していないことを確認した。最後に、ＳＮＰチップのハイブリダイゼーション・シグナルの分布が、正規分布から有意に（P ＜ 0.001）逸脱している９４個のSNPについては解析から外し、残った１００個のSNPについて脳梗塞との関連の再現性について別の集団で検討した。
【００１２】
遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット（ゲノミックス社製）によって分離した。多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、表１に示した。表には左から順に、遺伝子（Gene）、一塩基多型(SNP(dbSNP)）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）を示した。また、アニーリング温度は６０℃、サイクル数は５０回とした。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献８）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、脳梗塞との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献８に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
【００１５】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
１．増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ−１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ−１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５°Cで１０分間処理の後、９４°Cで２０秒間の変性、６０°Cで３０秒間のアニーリング、及び７２°Cで３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００１６】
２．ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５°Cで２分間の変性、及び５２°Cで３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００１７】
３．ストレプトアビジン−フィコエリスリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２°Cで１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００１８】
４．測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）−（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００１９】
統計解析
臨床データは、脳梗塞患者群とコントロール群との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的（カテゴリー）データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。遺伝子多型（SNPs）の対立遺伝子頻度は、脳梗塞患者群とコントロール群との間で、カイ二乗検定によって比較した。
【００２０】
脳梗塞と関連する多型を交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。交絡因子については、年齢（age）・性別(sex：女性＝０、男性＝１)・肥満指数(body mass index：BMI)・喫煙状態(smoking status：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)・代謝変数（高血圧（hypertension）・糖尿病（diabetes mellitus）・または高コレステロール血症（hypercholesterolemia）の病歴なし＝０、それらの病歴あり＝１）および各SNPの遺伝子型を独立変数とし、脳梗塞を従属変数とした。各遺伝子型は、優性遺伝モデル（野生型ホモ接合体＝０，ヘテロ接合体とバリアント型ホモ接合体の結合群＝１）及び劣性遺伝モデル（野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の結合群＝０，バリアント型ホモ接合体＝１）、並びにＰ値、オッズ比、及び９５％信頼区間を計算した。以下の記載において、特に示さない限り、危険率５％未満（Ｐ＜０.０５）を統計的に有意であると見なした。統計解析は、ＪＭＰゲノミクス・バージョン３.２ソフトウエア（ＳＡＳインスティテュート社製）及びＳＮＰＡｌｙｚｅバージョン６ソフトウエア（ダイナコム社製）によって実行した。
【００２１】
＜試験結果＞
６３４１名の研究対象者に関するデータを表２に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristic）、母集団Ａ（Subject panel A）について脳梗塞患者群（Ischemic stroke）とコントロール群（Controls）、母集団Ｂ（Subject panel B）について脳梗塞患者群（Ischemic stroke）とコントロール群（Controls）、母集団Ｃ（Subject panel C）について脳梗塞患者群（Ischemic stroke）とコントロール群（Controls）を示している。また特徴欄は、上より順に、症例数（No. of subjects）、年齢（Age(years)）、性別（男性／女性）（Sex(male /female)）、肥満指数（BMI）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、高血圧罹患率（Hypertension）、糖尿病罹患率（Diabetes mellitus）、高コレステロール血症罹患率（Hypercholesterolemia）を示している。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
母集団Ａでは、脳梗塞群の方が対照群に比べ、男性の割合、高血圧罹患率、及び高コレステロール血症罹患率が高い一方、年齢は低かった。母集団Ｂでは、脳梗塞群の方が対照群に比べ、年齢、男性の割合、喫煙率、高血圧罹患率、及び糖尿病罹患率は高い一方、肥満指数は小さかった。母集団Ｃでは、脳梗塞群の方が対照群に比べ、高血圧罹患率が高かった。
母集団ＡについてＳＮＰチップを用いてＧＷＡＳの解析から選択された１００個のSNPと、脳梗塞との関連について、母集団Ｂ中の４１３１名（脳梗塞患者７０５名、対照者３４２６名）においてカイ二乗検定で解析した。結果を表３〜表６に示した。表は、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、一塩基多型（SNP）、多型データベース登録番号（dbSNP）、遺伝子型の確率（P(genotype)）、アレルの確率（P(allele)）を示している。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
【表４】
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【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】
対象集団において、３個のSNP、すなわちLLGL2のrs1671021（遺伝子型分布及びアレル頻度について、それぞれP = 0.0196及び0.0052）、CELSR1のrs9615362（遺伝子型分布及びアレル頻度について、それぞれP = 0.0058及び0.0060）、及びRUVBL2のrs753307（遺伝子型分布及びアレル頻度について、それぞれP = 0.0277 and 0.0239）が、遺伝子型分布及びアレル頻度の両者について、有意に（P ＜ 0.05）脳梗塞と関連した。次いで我々は、脳梗塞患者群から選んだ９６例のＤＮＡサンプルについて、図３−図５（Supplementary Figure 1A-1C）に示すSNPを含む連鎖不平衡（linkage disequilibrium (LD)）ブロックのエクソンとエクソン・イントロン境界について検討した（標準連鎖不平衡係数（ｒ２）を０.３以上とした）。連鎖不平衡ブロックについてのデータは、国際HapMap計画データベース（http://www.hapmap.org/index.html.ja）から入手した。
【００２９】
rs1671021多型（T→C, Phe479Leu）は、LLGL2のエクソン12に位置している。この多型を含む連鎖不平衡ブロックに関するデータが無いため、我々はLLGL2のエクソン12と、このエクソンとイントロンの境界部分について塩基配列の決定を行った（図３（Supplementary Figure 1A）。エクソン12についてはrs1671021以外の多型は認められなかったが、イントロン13にrs2305526（A→T）多型とC→T多型（dbSNPにはrs番号が検索されなかった）が検出された。これら３個の多型は、連鎖不平衡にあった（rs1671021対rs2305526は、r2 =0.1624、P = 3.28 × 10−8であり、rs1671021対C→T多型は、r2 = 0.1739、P = 9.01 × 10−9であり、rs2305526対C→T多型は、r2 = 0.026、P = 0.0272であった）。ハプロタイプ頻度は、T (rs1671021)−A (rs2305526)−C (C→T)が0.4143、T−T−Cが0.3357、C−A−Cが0.1957、C−A−Tが0.0543であった。エクソン12のrs1671021 (T→C, Phe479Leu)と、エクソン13のrs2305526 (A→T)は、いずれもタグSNPであった。
【００３０】
rs9615362 (A→C)多型は、CELSR1のイントロン10に位置している。この多型を含む連鎖不平衡ブロックはエクソン１０−２０を含んでいるので、我々はCELSR1について、これらのエクソンと該当するエクソン・イントロン境界領域の塩基配列を決定した（図４（Supplementary Figure 1B）。rs9615362に加えて、エクソン17のrs4044210（A→G, Ile2107Val）多型、エクソン20のrs6007897（A→G, Thr2268Ala）、及びイントロン19のrs6008788（A→G）を検出した。これら４個の多型は、連鎖不平衡にあった（rs9615362対rs4044210は、r2 = 0.9221、P = 2.05 × 10−40であり、rs9615362対rs6007897は、r2 = 0.8712、P = 2.11 × 10−36であり、rs9615362対rs6008788は、r2 = 0.9582、P = 1.18 × 10−40であり、rs4044210対rs6007897は、r2 = 0.9568、P = 9.25 × 10−40であり、rs4044210対rs6008788は、r2 = 0.9582、P = 1.18 × 10−40であり、rs6007897対rs6008788は、r2 = 0.9111、P = 3.79 × 10−37であった）。ハプロタイプ頻度は、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)が0.8457であり、A−G−G−Gが0.1543であった。エクソン20のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)と、エクソン19のrs6008788 (A→G)は、タグSNPであった。
【００３１】
rs753307 (C→T)多型は、RUVBL2のイントロン13に位置している。この多型を含む連鎖不平衡ブロックはRUVBL2のエクソン７−１５とLHBのエクソン3を含んでいるので、我々はこれらのエクソンと該当するエクソン・イントロン境界領域の塩基配列を決定した（図５（Supplementary Figure 1C）。rs753307に加えて、RUVBL2のエクソン8のrs1062708(C→T, Leu205Leu)とイントロン8のrs2287760 (C→G)を検出した。これら３個の多型は、連鎖不平衡にあった（rs753307対rs1062708はr2 = 0.2789、P = 1.13 × 10−12であり、rs753307対rs2287760はr2 = 0.1078、P = 4.99 × 10−6であり、rs1062708対rs2287760はr2 = 0.0977、P = 2.57 × 10−5であった）。ハプロタイプ頻度は、T (rs753307)−T (rs1062708)−G (rs2287760)が0.472、C−C−Cが0.1323、T−C−Gが0.1284、C−C−Gが0.0957、T−T−Cが0.0805、C−T−Gが0.0805、T−C−Cが0.0106、C−T−Cが1.31 × 10−10であった。イントロン8のrs1062708 (C→T, Leu205Leu)多型とrs2287760 (C→G)多型は、いずれもタグSNPであった。
【００３２】
次に、集団Ｂと集団Ｃにおいて、脳梗塞とエクソン中の３個のタグSNP（LLGL2のrs1671021 (T→C, Phe479Leu)、CELSR1のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)、及びRUVBL2のrs1062708 (C→T, Leu205Leu)多型）と、非同義SNP（CELSR1のrs4044210 (A→G, Ile2107Val)）との関連を検討した。カイ二乗検定によって、集団Ｂでは遺伝子型分布とアレル頻度の両者で、CELSR1のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)とCELSR1のrs4044210 (A→G, Ile2107Val)とLLGL2のrs1671021 (T→C, Phe479Leu)とが有意に（P ＜ 0.05）脳梗塞に関連した（表７）。カイ二乗検定によって、集団Ｃでは遺伝子型分布とアレル頻度の両者で、CELSR1のrs6007897とrs4044210が脳梗塞に有意に（P ＜ 0.05）関連した（表８）。
【００３３】
【表７】
2010166844.tif 000009
【００３４】
【表８】
2010166844.tif 000010
【００３５】
これら３個のタグSNPと１個の非同義置換多型と脳梗塞の関連について、集団Ａ−集団Ｃを組み合わせた全集団において検討した。カイ二乗検定により遺伝子型分布とアレル頻度を評価したところ、これら４個の多型は脳梗塞と有意に（P ＜ 0.05）関連した（表９）。
【００３６】
【表９】
2010166844.tif 000011
【００３７】
年齢、性別、BMI、喫煙率、高血圧罹患率、糖尿病罹患率、及び高コレステロール血症罹患率を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、CRLSR1のrs6007897とrs4044210、LLGL2（優性モデル）のrs1671021、及びRUVBL2（劣性モデル）のrs1062708が有意に（P ＜ 0.05）脳梗塞と関連した。CELSR1のrs6007897のバリアント型Ｇ（Ala）アレルとrs4044210のＧ（Val）アレルは脳梗塞の危険因子であり、LLGL2のrs1671021のバリアント型Ｃ（Leu）アレルとRUVBL2のrs1062708のＴアレルは防御因子であった。これら４個の多型の遺伝子型分布は、脳梗塞患者群及び対照者群のいずれについても、ハーディ・ワインバーグ平衡にあった。
CELSR1のrs6007897とrs4044210は連鎖不平衡にあるため、これらの多型についてハプロタイプ解析を行った。この解析により、メジャーなハプロタイプは、A (rs6007897)−A (rs4044210)であり、これは脳梗塞の防御因子であった。一方、マイナーなハプロタイプは、G−Gであり、これは危険因子であった（表１０）。
【００３８】
【表１０】
2010166844.tif 000012
【００３９】
最後に、これら３個のタグSNPと１個の非同義置換多型が、高血圧、２型糖尿病、高コレステロール血症、及び肥満に関連するか否かを検討した（表１１）。日本人と他のアジア人集団では、BMIが25 kg/m2以上を肥満と定義している（非特許文献９）ので、これに従って「肥満」を定義した。カイ二乗検定によって、全例において各疾患群と対照群との間で、これら４個の多型について遺伝子型分布及びアレル頻度を比較したところ、CELSR1のrs6007897とrs4044210、及びRUVBL2のrs1062708が、２型糖尿病に有意に（P ＜ 0.05）関連した。
【００４０】
【表１１】
2010166844.tif 000013
【００４１】
＜考察＞
脳梗塞の主たる原因はアテローム血栓症であり、これに治療可能な危険因子として高血圧、糖尿病、及び高コレステロール血症が含まれる（非特許文献１０）。これら従来の危険因子に加えて、脳梗塞の発症には遺伝因子が重要である（非特許文献１１）。遺伝因子に基づいて脳梗塞の危険を予測することができれば、治療によって改善できる危険因子をどの程度まで積極的に治療するかどうかを決定するために有効となる。本研究によって、日本人集団においては、CELSR1のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)とrs4044210 (A→G, Ile2107Val)が、脳梗塞の発症に有意に関連し、バリアント型Ｇ(Ala)アレルとＧ（Val）アレルが危険因子であることが明らかとなった。
【００４２】
CELSR1（７回膜貫通型カドヘリン（cadherin, epidermal growth factor (EGF) laminin A G-type repeats (LAG) seven-pass G-type receptor 1））は、カドヘリンタンパク質のフラミンゴ・サブファミリーに属している。フラミンゴ・サブファミリーは、カテニンとの相互作用を有しない特殊なカドヘリンから構成される。フラミンゴ・カドヘリンは、原形質膜に局在しており、細胞外ドメインには、９個のカドヘリンドメイン、７個のＥＧＦ様繰り返し、及び２個のＬＡＧ繰り返しを含んでいる。また、このサブファミリーに特異的な性質として、７回膜貫通ドメインを有している。これらのタンパク質は、カドヘリンドメインが同種結合作用を示し、ＥＧＦ様ドメインが細胞接着と受容体・リガンド相互作用を示すことにより、接触を介した情報伝達を行うリセプターとしての機能を持つと考えられている（Entrez Gene, NCBI：非特許文献１２−１４）。
【００４３】
in situ ハイブリダイゼーション及び逆転写酵素ＰＣＲ解析によれば、１１.５日目のマウス胚では、神経管、脳、肺上皮及び発生期の眼瞼においてCelsr1が発現していることが示されている。成熟マウスでは、Celsr1の発現は、脊髄、眼、及び脳に認められ、主に側脳室・第３脳室・及び第４脳室の上衣細胞に検出された（非特許文献１２）。Celsr1は、発生学的に調節された神経特異的遺伝子であり、初期胚形成に役割を有する（Entrez Gene, NCBI：非特許文献１２）。CELSR1のエクソン１７のrs4044210 (A→G, Ile2107Val)多型は、ホルモン受容体ドメインをコードする遺伝子領域に位置している。細胞外ドメインは、４個の遺伝的に保護されたシステイン残基を含んでおり、これらがジスルフィド結合を形成するらしい。このドメインは多くのホルモン受容体に存在することから、リガンド結合ドメインとして機能しているらしい（Entrez Gene, NCBI）。rs6007897とrs4044210の両多型がタンパク質の構造及び機能に対して与える影響については、明らかではない。CELSR1の遺伝子多型がヒトの疾患と関連したという報告は無い。
【００４４】
今回の研究によれば、日本人集団においてLLGL2（lethal giant larvae homolog 2 gene）は脳梗塞に関連する候補遺伝子の一つであるが、集団Ｃにおいては、rs1671021(T→C, Phe479Leu)多型と脳梗塞との関連は認められなかった。この遺伝子は、ショウジョウバエの致死的巨大幼虫タンパク質（lethal (2) giant larvae protein）に類似するタンパク質をコードしている。このタンパク質は、非対称的な細胞分裂、上皮細胞極性の形成、及び細胞遊走に関係している（非特許文献１５，１６）。細胞の運命決定を行わせるショウジョウバエタンパク質の能力は、特殊なタンパク質キナーゼＣによって調節されている（非特許文献１６）。ヒトLLGL2タンパク質は、特殊なタンパク質キナーゼＣを含む複合体タンパク質と相互作用し、有糸分裂細胞の皮質に局在している（非特許文献１６）。LLGL2転写物の選択的スプライシングによって、タンパク質アイソフォームをコードする複数のｍＲＮＡ変異体が形成される（Entrez Gene, NCBI：非特許文献１５，１６）。このタンパク質の構造及び機能に対して、rs1671021がどのように影響するのかについては、不明である。LLGL2の遺伝子多型についてもヒトの疾患と関連したという報告は無い。
【００４５】
＜結論＞
脳梗塞に関連するとして特定された多型がタンパク質の構造や機能に対して如何なる影響を与えるかについては不明であるが、我々の研究の結果、日本人集団において脳梗塞に関連する遺伝子としてCELSR1が特定された。この遺伝子型を検討することによって、日本人集団における脳梗塞の遺伝的リスクを評価するための有用な情報が得られる。この結果に基づき、遺伝子多型を調べることにより、脳梗塞の危険性を知ることができる。
このように本実施形態によれば、脳梗塞について、遺伝的リスクを予測するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、脳梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４６】
【非特許文献１】Rosamond W, Flegal K, Furie K, Go A, Greenlund K, Haase N, Hailpern SM, Ho M, Howard V, Kissela B, Kittner S, Lloyd-Jones D, McDermott M, Meigs J, Moy C, Nichol G, O’Donnell C, Roger V, Sorlie P, Steinberger J, Thom T, Wilson M, Hong Y; American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics−2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2008;117:e25−e146.
【非特許文献２】Warlow C, Sudlow C, Dennis M, Wardlaw J, Sandercock P. Stroke. Lancet. 2003;362:1211−1224.
【非特許文献３】Gretarsdottir S, Thorleifsson G, Reynisdottir ST, Manolescu A, Jonsdottir S, Jonsdottir T, Gudmundsdottir T, Bjarnadottir SM, Einarsson OB, Gudjonsdottir HM, Hawkins M, Gudmundsson G, Gudmundsdottir H, Andrason H, Gudmundsdottir AS, Sigurdardottir M, Chou TT, Nahmias J, Goss S, Sveinbjornsdottir S, Valdimarsson EM, Jakobsson F, Agnarsson U, Gudnason V, Thorgeirsson G, Fingerle J, Gurney M, Gudbjartsson D, Frigge ML, Kong A, Stefansson K, Gulcher JR. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers riskof ischemic stroke. Nat Genet. 2003;35:131−138.
【非特許文献４】Helgadottir A, Manolescu A, Thorleifsson G, Gretarsdottir S, Jonsdottir H, Thorsteinsdottir U, Samani NJ, Gudmundsson G, Grant SF, Thorgeirsson G, Sveinbjornsdottir S, Valdimarsson EM, Matthiasson SE, Johannsson H, Gudmundsdottir O, Gurney ME, Sainz J, Thorhallsdottir M, Andresdottir M, Frigge ML, Topol EJ, Kong A, Gudnason V, Hakonarson H, Gulcher JR, Stefansson K. The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke. Nat Genet. 2004;36:233−239.
【非特許文献５】Yamada Y, Metoki N, Yoshida H, Satoh K, Ichihara S, Kato K, Kameyama T, Yokoi K, Matsuo H, Segawa T, Watanabe S, Nozawa Y. Genetic risk for ischemic and hemorrhagic stroke. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26:1920−1925.
【非特許文献６】Yamada Y, Metoki N, Yoshida H, Satoh K, Kato K, Hibino T, Yokoi K, Watanabe S, Ichihara S, Aoyagi Y, Yasunaga A, Park H, Tanaka M, Nozawa Y. Genetic factors for ischemic and hemorrhagic stroke in Japanese individuals. Stroke. 2008;39:2211−2218.
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【非特許文献１０】Goldstein LB, Adams R, Becker K, Furberg CD, Gorelick PB, Hademenos G, Hill M, Howard G, Howard VJ, Jacobs B, Levine SR, Mosca L, Sacco RL, Sherman DG, Wolf PA, del Zoppo GJ. Primary prevention of ischemic stroke: a statement for healthcare professionals from the Stroke Council of the American Heart Association. Stroke. 2001;32:280−299.
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【非特許文献１５】Musch A, Cohen D, Yeaman C, Nelson WJ, Rodriguez-Boulan E, Brennwald PJ. Mammalian homolog of Drosophila tumor suppressor lethal (2) giant larvae interacts with basolateral exocytic machinery in Madin-Darby canine kidney cells. Mol Biol Cell. 2002;13:158−168.
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図３】rs1671021多型を含むLLGL2の連鎖不平衡ブロックを示す図である。
【図４】rs9615362多型を含むCELSR1の連鎖不平衡ブロックを示す図である。
【図５】rs753307多型を含むRUVBL2の連鎖不平衡ブロックを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月23日(2009.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010166844000001.app