(57)【要約】【課題】新規なプロトカテク酸の製造方法を提供する。【解決手段】プロトカテク酸生産能を有し、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物を用いてプロトカテク酸前駆物質からプロトカテク酸を生成し、蓄積させ、これを採取することを特徴とするプロトカテク酸の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトカテク酸生産能を有し、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物を用いてプロトカテク酸前駆物質からプロトカテク酸を生成し、蓄積させ、これを採取することを特徴とするプロトカテク酸の製造法。
【請求項２】
プロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物が、プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の変異によりプロトカテク酸５位酸化酵素活性の低下または欠損した微生物であることを特徴とする、請求項１に記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項３】
変異が、プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域内の１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異であることを特徴とする、請求項２に記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項４】
プロトカテク酸５位酸化酵素が、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造方法。
（Ａ）配列番号２、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（Ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
【請求項５】
前記微生物がさらに下記の性質を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造方法。
プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびプロトカテク酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子について、該遺伝子の翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、プロトカテク酸の代謝活性が低下または欠損している。
【請求項６】
前記プロトカテク酸前駆物質がテレフタル酸であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、プロトカテク酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造方法。
【請求項７】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することを特徴とする、請求項６に記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項８】
前記プロトカテク酸前駆物質がフタル酸であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、プロトカテク酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造方法。
【請求項９】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することを特徴とする、請求項８に記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項１０】
前記プロトカテク酸前駆物質がイソフタル酸であり、該微生物をイソフタル酸を含有する
培地中でイソフタル酸と反応させることにより、プロトカテク酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造方法。
【請求項１１】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することを特徴とする、請求項１０に記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項１２】
前記微生物が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られる微生物であることを特徴とする、請求項６または７記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項１３】
前記微生物が、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタル酸３，４−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、ジヒドロゲナーゼ、フタル酸４，５−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、３，４−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素およびフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られる微生物であることを特徴とする、請求項８または９記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項１４】
前記微生物が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られる微生物であることを特徴とする、請求項１０または１１記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項１５】
前記微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬、農薬、香料等の原料として有用なプロトカテク酸を微生物を用いて工業的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトカテク酸は、医薬、農薬、香料等の原料になるほか、新しいプラスチックの原料として期待されている２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を微生物を用いて製造するときの原料として利用できる〔特許文献１〕。
【０００３】
プロトカテク酸の製造方法としては、有機合成法および微生物や酵素を用いる方法が知られている。近年環境保全の観点から、バイオマスから得られるグルコース、およびバイオマス資源から得られるリグニン分解物のバリニン酸などの芳香族化合物を原料として有用化学品を常温・常圧で進行する経済的技術を用いて生産することが求められている。また芳香族化合物であるフタル酸類（フタル酸、テレフタル酸およびイソフタル酸）は安価な原料である上、テレフタル酸はペットボトルからも再生でき、安価な原料となることから、テレフタル酸やバリニン酸などの芳香族化合物を原料としてプロトカテク酸を製造することは重要な研究開発課題である。
発酵法によるプロトカテク酸の製造法に関しては、ブレビバクテリウム属に属する細菌を用いて酢酸を炭素源として生産する方法が報告されている〔特許文献２〕。また遺伝子組換法を用いて、３−ジヒドロシキミ酸からプロトカテク酸を生成する３−ジヒドロシキミ酸脱水酵素を大腸菌またはクレブシエラ（Klebsiella）属細菌に導入して、炭素源であるグルコースから生産する方法が開示されている〔特許文献３〕。これらの方法では、投入した炭素源に対するプロトカテク酸のモル収率が低いために、プロトカテク酸の工業的生産に利用されていない。
微生物変換法または酵素法によるプロトカテク酸の製造法に関しては、微生物シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KS-0180を用いて、パラクレゾールをプロトカテク酸に変換する方法〔特許文献４〕とＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を用いてパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を製造する方法〔特許文献５〕が報告されているが、いずれの方法もプロトカテク酸の生産量は低く、工業化に至っていない。またコマモナス スピーシーズ（Comamonas sp.）及びスフィンゴモナス パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）を用いて、テレフタル酸からプロトカテク酸を経由して２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生産する方法〔特許文献６〕が開示されているが、生成したプロトカテク酸が２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換してしまうために、プロトカテク酸が蓄積しないことが問題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２７８５４９号公報
【特許文献２】特開昭５０−８９５９２号公報
【特許文献３】米国特許第５２７２０７３号明細書
【特許文献４】特開平５−２４４９４１号公報
【特許文献５】特開平７−７５５８９号公報
【特許文献６】特開２００７−１０４９４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ohlendorf D.H., Lipscomb J.D., と Weber P.C. Nature 336, 403-405 (1988).
【非特許文献２】Noda Y., Nishikawa S., Shiozuka K., Kadokura H., Nakajima H., Yoda K., Katayama Y., Morohoshi N., Haraguchi T., と Yamasaki M.. J Bacteriol 172, 2704-2709 (1990)
【非特許文献３】Grant D.J., と Patel J.C.. Antonie Van Leeuwenhoek 35, 325-343(1969)
【非特許文献４】Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、微生物を用いてプロトカテク酸を効率よく製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは微生物を用いてプロトカテク酸を生産・蓄積させるためには、プロトカテク酸を代謝する酵素の活性が低下または欠損している微生物を用いることが望ましいと考えた。
これまでに野生型形質として報告されているプロトカテク酸を代謝する酵素としては、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子〔非特許文献１〕、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子〔非特許文献２〕およびプロトカテク酸脱炭酸酵素遺伝子〔非特許文献３〕が知られている。
一方、上述のように、ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を用いてパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生産することができるが、野生型のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素がプロトカテク酸の５位を酸化する酵素（以下、プロトカテク酸５位酸化酵素と略す）の活性を有することは報告されておらず、シュードモナス・エルギノーサＰＡＯ株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の３８５位のチロシンをフェニールアラニンに変換した変異酵素（以下、ＰＡＯ変異酵素と略す）がプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有することが報告されているにすぎない〔非特許文献４〕。
【０００８】
本発明者らは、プロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する新たな酵素の探索を行ったところ、偶然にもシュードモナス・エルギノーサＰＡＯ株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号２）と相同性を有するアミノ酸配列（配列番号１６）を有するシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素が強いプロトカテク酸５位酸化活性を有することを見出した。さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列と高い相同性を有する、配列番号６、１０、１４、１８、２０、２２、２４、２６または２８で表されるアミノ酸配列を有する野生型蛋白質が強いプロトカテク酸５位酸化活性を有することを見出した。したがって、これら野生型蛋白質を保有する微生物を用いてプロトカテク酸を生産しようとした場合、プロテカテク酸の５位が酸化されて没食子酸に変換されてしまうために、プロトカテク酸の蓄積量が減少してしまうという問題点が浮び上がった。
【０００９】
そこで、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440株が保有する、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子に欠失変異を導入してプロトカテク酸５位酸化活性を欠損された微生物を創製し、当該微生物を用いてプロトカテク酸の生産を試みたところ、当該遺伝子に欠失変異を導入しない場合と比較してプロトカテク酸の生産量を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）に関する。
【００１１】
（１）プロトカテク酸生産能を有し、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物を用いてプロトカテク酸前駆物質からプロトカテク酸を生成し、蓄積させ、これを採取することを特徴とするプロトカテク酸の製造法。
【００１２】
（２）プロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物が、プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の変異によりプロトカテク酸５位酸化酵素活性の低下または欠損した微生物であることを特徴とする、前記（１）に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００１３】
（３）変異が、プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域内の１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異であることを特徴とする、前記（２）に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００１４】
（４）プロトカテク酸５位酸化酵素が、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質であることを特徴とする、前記（１）から（３）のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
（Ａ）配列番号２、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（Ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
【００１５】
（５）前記微生物がさらに下記の性質を有することを特徴とする、前記（１）から（４）のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびプロトカテク酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子について、該遺伝子の翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、プロトカテク酸の代謝活性が低下または欠損している。
【００１６】
（６）前記プロトカテク酸前駆物質がテレフタル酸であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、プロトカテク酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、前記（１）から（５）のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００１７】
（７）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することを特徴とする、前記（６）に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００１８】
（８）前記プロトカテク酸前駆物質がフタル酸であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、プロトカテク酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、前記（１）から（５）のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００１９】
（９）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することを特徴とする、前記（８）に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２０】
（１０）前記プロトカテク酸前駆物質がイソフタル酸であり、該微生物をイソフタル酸を
含有する培地中でイソフタル酸と反応させることにより、プロトカテク酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、前記（１）から（５）のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２１】
（１１）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することを特徴とする、前記（１０）に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２２】
（１２）前記微生物が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られる微生物であることを特徴とする、前記（６）または（７）記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２３】
（１３）前記微生物が、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタル酸３，４−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、ジヒドロゲナーゼ、フタル酸４，５−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、３，４−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素およびフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られる微生物であることを特徴とする、前記（８）または（９）記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２４】
（１４）前記微生物が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られる微生物であることを特徴とする、前記（１０）または（１１）記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２５】
（１５）前記微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物であることを特徴とする、前記（１）から（１４）のいずれか１項に記載のプロトカテク酸の製造法。
【００２６】
（１６）前記（１）から（１５）のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、プロトカテク酸５位酸化酵素の活性を低下または欠損させた微生物を用いてプロトカテク酸を効率よく製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２９】
本発明に用いられる微生物としては、プロトカテク酸を生産する能力を有する微生物であって、該微生物のプロトカテク酸５位酸化酵素活性が、該微生物の野生株のプロトカテク酸５位酸化酵素活性と比べて低下または欠損した微生物であればいずれも用いることができる。該微生物のプロトカテク酸５位酸化酵素活性は、該微生物の野生株のプロトカテク酸５位酸化酵素活性と比べて低下していればよいが、低いほど好ましく、実質的に欠損または完全に欠損していることがさらに好ましい。なお、本発明における野生株とは、本発
明の微生物と分類学上同じ種に属する微生物であって、かつ自然界で最も高頻度に出現する表現型を有する微生物をいう。プロトカテク酸５位酸化酵素活性の低下または欠損は、プロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する微生物（以下、必要に応じて親株と略す）をもとに、プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に変異を導入することにより達成できる。
【００３０】
プロトカテク酸の代謝反応としては、本発明で開示するプロトカテク酸の５位酸化以外に、プロトカテク酸の３，４−環開裂、プロトカテク酸の４，５−環開裂およびプロトカテク酸の脱炭酸が知られている。したがって、本発明の微生物が、プロトカテク酸の環開裂反応や脱炭酸反応に関わるプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびプロトカテク酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子のいずれかを保有している場合、１つ以上の遺伝子について、該遺伝子の翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に変異を導入することにより、プロトカテク酸の代謝活性を低下または欠損させた微生物を用いることがさらに好ましい。
【００３１】
本発明の微生物のプロトカテク酸生産能は、野生株が元来保有していた形質を利用してもよいし、あるいは組換えＤＮＡ手法などにより親株に付与してもよい。なお、組換えＤＮＡ手法などによりプロトカテク酸生産能を付与する場合には、プロトカテク酸５位酸化酵素活性を低下または欠損させるための変異導入とプロトカテク酸生産能の付与は、どちらを先に行ってもよい。
【００３２】
本発明では、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素および該アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質、例えば配列番号６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質がプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有することを開示する。したがって、本発明で言及するプロトカテク酸５位酸化酵素として具体的には、これらの蛋白質があげられる。また、本発明で言及するプロトカテク酸５位酸化酵素として、配列番号２、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることもできる。さらに、該蛋白質として、配列番号２、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかのアミノ酸配列と７５％以上の相同性、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることができる。
【００３３】
本発明の微生物の親株としては、具体的には、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子を保有する微生物があげられる。例えば、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物などの微生物株から上記の特性を有するものを天然から単離することにより得られる。または、このような特性を有する微生物をアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、必要に応じてＡＴＣＣと略記する）、独立行政法人製品基盤技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、必要に応じてＮＢＲＣと略記する）、または独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンターなどから入手することができる。
【００３４】
より具体的には、アシネトバクター（Acinetobacter）属の微生物としては、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ADP1等をあげるこ
とができる。
ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属の微生物としては、例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）USDA110等をあげることができる。
コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の微生物としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032等をあげることができる。
シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物としては、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440等をあげることができる。ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の微生物としては、例えばロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）CGA009等をあげることができる。
シノリゾビウム（Sinorhizobium）属の微生物としては、例えばシノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）1021等をあげることができる。
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属の微生物としては、例えばブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）BL2等をあげることができる。
ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属の微生物としては、例えばノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444等をあげることができる。
ラルストニア（Ralstonia）属の微生物としては、例えばラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）CH34等をあげることができる。
ただし、本発明に使用できる菌株は本菌株に限定されるものではなく、その目的を達成できる菌株であればすべて使用できる。
【００３５】
本発明の微生物は、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ手法等による遺伝子置換法、細胞融合法または形質導入法などの変異導入法を用いて、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする翻訳領域（配列番号５、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７）またはその転写・翻訳調節領域内の１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより得られる。
また、本発明の微生物が、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびプロトカテク酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子のいずれかを保有している場合、１つ以上の遺伝子について、該遺伝子の翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、プロトカテク酸の代謝活性を低下または欠損させることがさらに好ましい。
【００３６】
通常の変異処理法を用いて、上述のプロトカテク酸５位酸化酵素、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼまたはプロトカテク酸脱炭酸酵素の活性を低下または欠損させる場合には、ＤＮＡをインビトロで変異処理する方法としては、ヒドロキシルアミン等を用いて変異を誘起する方法が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
【００３７】
組換えＤＮＡ手法等による遺伝子置換法を用いて、上述のプロトカテク酸５位酸化酵素、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子またはプロトカテク酸脱炭酸酵素遺伝子に変異を導入する場合には、該酵素をコードする翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入した改変型遺伝子を作製した後、改変型遺伝子を含むＤＮＡで上述の微生物を形質転換し、改変型遺伝子と染色体上の遺伝子の間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上に該変異を導入することによって本発明の微生物を得ることができる。
【００３８】
改変型遺伝子は、制限酵素処理による欠失や他のＤＮＡの挿入、部位特異的変異導入法、上述の化学変異処理剤によるＤＮＡの処理、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（以下、ＰＣＲ法と略す）、変異を有する合成ＤＮＡと置換する方法などにより作製することができる。
【００３９】
上記の改変型遺伝子は、通常大腸菌K-12株内で複製するプラスミドベクターに組み込むことにより組換えＤＮＡを作製した後、該組換えＤＮＡを大腸菌K-12株内で増幅した後に、本発明の微生物の中に導入しする。プラスミドベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００４０】
該組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972) 〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、接合伝達法〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)〕、細胞融合法〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)〕等をあげることができる。該組換えＤＮＡの本発明の微生物への形質転換に用いるマーカーとしては、該微生物内で形質が発現するマーカーであればいずれも用いることができるが、カナマイシン耐性遺伝子を用いることが好ましい。該組換えＤＮＡの形質転換により、該組換えＤＮＡ上の改変型遺伝子が染色体上の非改変型遺伝子部位に組み込まれた菌株が出現するが、これらの菌株では、通常染色体上にもともと存在する非改変型遺伝子の配列との組換えを起こし、非改変型遺伝子と該組換えＤＮＡ由来の改変型遺伝子が組換えＤＮＡの他の部分を挟んだ状態で染色体に挿入されている。次いで、非改変型遺伝子と改変型遺伝子の間の相同組換えによって、染色体ＤＮＡ上に非改変型遺伝子のみが残った菌株を選別するには、たとえば本発明の微生物で致死的に機能するレバンシュ−クラ−ゼをコードするsacB遺伝子を相同組換えのマーカーとして用いていることができる〔Ried, J. L., Collmer, A., Gene 57, 239-246. (1987)〕。すなわち該組換えＤＮＡを作製する際に、sacB遺伝子を運ぶプラスミドベクターを用いると、sacB遺伝子が非改変型遺伝子と該組換えＤＮＡ由来の改変型遺伝子が組換えＤＮＡの他の部分を挟んだ状態で染色体に挿入される。この状態の形質転換株は、ショ糖の存在下で培養すると、ショ糖から生成したレバンが致死的に働くために生育できない。一方、相同組換えにより染色体ＤＮＡ上に非改変型遺伝子のみが残った菌株ではsacB遺伝子が抜け落ちているために、ショ糖を含む寒天プレ−ト上で生育するために、本菌株を選別することができる。
【００４１】
微生物は、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸、キナ酸、パラヒドロキシ安息香酸、安息香酸、バニリン酸、バニリン、アントラセン、フェナンスレンまたはトルエンを前駆物質としてプロトカテク酸を生成することが知られている。したがって、本発明の微生物のプロトカテク酸生産能は、これら前駆物質のいずれか１つ以上からプロトカテク酸を生産する能力、すなわちこれら前駆物質のいずれか１つ以上からプロトカテク酸を生産するのに必要な遺伝子群を有することを意味する。好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イ
ソフタル酸またはバニリン酸からプロトカテク酸を生産する能力を有する微生物を用いることができる。より好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸からプロトカテク酸を生産する能力を有するシュードモナス（Pseudomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、バチルス属（Bacillus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphigobium）属またはバークホルデリア（Burkholderia）属の細菌をあげることができる。
【００４２】
本発明で用いられるテレフタル酸の代謝能（テレフタルからプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、テレフタル酸からプロトカテク酸への代謝に関わるテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、およびテレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば、順に、NC_008269における塩基番号171236〜172501、またはNC_008270における塩基番号194261〜195526、及びNC_00869における塩基番号172498〜172968、またはNC_008270における塩基番号193794〜194264、NC_00869における塩基番号173978〜174988、またはNC_008270における塩基番号191774〜192784、NC_00869における塩基番号172965〜173981、またはNC_008270における塩基番号192781〜193797、NC_00869における塩基番号175046〜176425、またはNC_008270における塩基番号190337〜191716が挙げられる。
本発明で用いられるフタル酸の代謝能（フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタル酸３，４−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、ジヒドロゲナーゼ、フタル酸４，５−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、３，４−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素およびフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば、アルスロバクター・キーセリ（Arthrobactor keyseri） 12B株由来の遺伝子である、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子phtAaと遺伝子phtAb、フタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼをコードする遺伝子phtAd、フタル酸３，４−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼをコードする遺伝子phtB、３，４−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子phtCが挙げることができる。またバルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）DBO1株由来の遺伝子としては、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子ophA2、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼをコードする遺伝子ophA1、フタル酸４，５−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ophB、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子ophCが挙げられる。フタル酸トランスポーターをコードする遺伝子としては、バルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ATCC 17616株由来の遺伝子ophDが挙げられる。
また本発明で用いられるイソフタル酸の代謝能（イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）YZW-D株由来の遺伝子である、イソフタル酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子iphA2、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼiphA1、イソフタル酸ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼiphB、およびイソフタル酸パーミアーゼiphCが挙げられる。
また本発明で用いられるバニリン酸の代謝能（バニリン酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、バニリン酸モノオキシゲナーゼまたはバニリン酸Ｏ−脱メチル
化酵素の蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば、順に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032株由来のバニリン酸モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子vanA と遺伝子vanB、おおよびスフィンゴモナス・パウチモビリス（Sphingomonas pautimobilis） SYK-6株由来のバニリン酸Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子ligMが挙げられる。
【００４３】
本発明で用いられる微生物は、上記の原料からプロトカテク酸を生産するのに必要な遺伝子群をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物であってもよい。本発明に使用できるプロトカテク酸を生産する形質転換体は、例えば該ＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従って、上記の微生物から該蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングし、ベクターＤＮＡと連結することで組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。
【００４４】
以上のようにして得られる本発明の微生物を、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍのテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質を含有する培地で培養し、培養物中にプロトカテク酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、プロトカテク酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４５】
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。プロトカテク酸を生産するための原料として、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質を添加する。
【００４６】
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【００４７】
本発明の微生物を培養した後、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸もしくはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質を含む水性媒体中に、該微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を加えることにより、該媒体中にプロトカテク酸を生成、蓄積させ、該媒体からプロトカテク酸を採取することもできる。
【００４８】
該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を含有する抽出物、該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られるプロトカテク酸生産に関わる蛋白質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明のプロトカテク酸の製造に使用することができる。
【００４９】
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。
【００５０】
反応に用いる水性媒体は、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質を含有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２．０％（ｗ／ｖ）添加することもできる。
【００５１】
水性媒体中の反応原料となるテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質の濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍ程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま又はそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質と水の存在下、反応させるが、反応液中のテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはバニリン酸などのプロトカテク酸前駆物質を含む溶液を流す方法も利用できる。反応は、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、ｐＨ５〜９、好ましくはｐ６〜８で行う。
【００５２】
なお、上記水性媒体には、反応時に酸化剤を添加すると、プロトカテク酸の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、プロトカテク酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常０．００１〜０．０５％（Ｗ/Ｖ)、好ましくは０．００５〜０．０２％である。
【００５３】
培養終了後の培養液または反応液中からのプロトカテク酸は、酢酸エチル等の有機溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによってプロトカテク酸を採取することができる。
【００５４】
以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１．プロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する野生型水酸化酵素を下記のようにして同定した。
１．シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列と相同性を有する蛋白質のデータベース検索
シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は、パラヒドロキシ安息香酸を酸化してプロトカテク酸を生成する活性を保有するが、プロトカテク酸５位酸化活性を生成する活性は全く保有していないことが知られている〔Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)〕。当該水酸化酵素と相同性を有するが、その相同性の値が大きくない蛋白質の中に、シュード
モナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とは異なる活性、すなわちプロトカテク酸５位酸化活性を保有する蛋白質があるか調べてみることにした。具体的には、当該水酸化酵素７５％以下の相同性を有する蛋白質をナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（GenBank；以下、ＧＢと略記する）データベースから、配列番号２に示すシュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列とするＢＬＡＳＴ相同性解析法を用いて検索を行った。その結果、表１に示す１２種類の蛋白質が得られた。それぞれの蛋白質の略号とシュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素との相同性％を表１に示した。
【表１】
2010207094.tif 000002
【００５６】
２．染色体ＤＮＡの単離精製
表１記載の１２種類の蛋白質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするために、各菌株の染色体ＤＮＡを下記のようにして調製または入手した。
【００５７】
菌株アシネトバクター・カルコアセティカスADP1（ＡＴＣＣ番号：33305）はＡＴＣＣから入手し、また菌株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032（ＮＢＲＣ番号：12168）はＮＢＲＣから入手した。これらの菌株は各機関から入手した情報に従って培養した。菌株ブラディリゾビウム・ジャポニカムUSDA110および菌株シノリゾビウム・メリロティ1021は財団法人かずさＤＮＡ研究所の柴田大輔博士より分与を受け、同博士から教授された方法に従って培養した。これら培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット（キアゲン社製（DNeasy tissue kit；Qiagen）を用いて単離精製した。菌株カウロバクター・クレセントスCB15の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：19089D）、菌株シュードモナス・プチダKT2440の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：47054D）、菌株ロドシュード
モナス・パルストリスCGA009の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：BAA-98D）、菌株ブレビバクテリウム・リネンズBL2の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：9175D）、菌株ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランスDSM 12444の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：700278Ｄ）、および菌株ラルストニア・メタリデュランスCH34の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：43123Ｄ）はＡＴＣＣから入手した。
【００５８】
３．ＰＣＲプライマーの設計と調製
表２に示す１２種類の遺伝子について、ＮＣＢＩのGenBankデータベースより塩基配列データ（配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７）をインターネット経由で取得した。各塩基配列データのＧＢアクセッション番号は表２に示した。これらの塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするためのＰＣＲプライマーを設計し、合成した。各ＰＣＲプライマーの塩基配列は表２に示した。
【００５９】
４．ＰＣＲ法による各酵素をコードするＤＮＡの増幅
ロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したエキスパンド・ハイ・フィデリティ・ＰＣＲシステム（Expand High Fidelity PCR System）およびロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したジー・シー・リッチ・ＰＣＲシステム（GC Rich PCR System）を用いて、上記２で得た染色体ＤＮＡを鋳型にし、表２記載のＤＮＡプライマーを用いて、添付の説明書に従って表２に示した遺伝子のＤＮＡを増幅させた。なお、ジー・シー・リッチ・ＰＣＲシステムを用いたＰＣＲ反応はデメチルスルホオキシドと7-deasa-dGTPの存在下で実施した。
【表２】
2010207094.tif 000003
【００６０】
５．遺伝子のクローニング
上記４で得られたHFM5遺伝子のＤＮＡ、HFM77遺伝子のＤＮＡ、HFM86遺伝子のＤＮＡ、HFM122遺伝子のＤＮＡ、HFM145遺伝子のＤＮＡ、HFM305遺伝子のＤＮＡ、HFM339遺伝子のＤＮＡ、HFM388遺伝子のＤＮＡ、HFM544遺伝子のＤＮＡ、HFM545遺伝子のＤＮＡ、HFM689遺伝子のＤＮＡおよびHFM737遺伝子のＤＮＡをそれぞれクローンテック社から購入したＢＤ・イン−フュージョン・ＰＣＲ・クローニング・キット（BD In-Fusion PCR Cloning Kit）を用いて、大腸菌T7プロモーターを利用した大腸菌用発現ベクターであるプラスミドpROX1（ロシュ・アプライド・サイエンス社から入手した；塩基配列は配列番号５３に示した）の制限酵素部位Nco Iと制限酵素部位Sma I の間にクローニングし、それぞれの遺伝子を発現するプラスミドpROX_HFM5、pROX_HFM77、pROX_HFM86、pROX_HFM122、pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM339、pROX_HFM388、pROX_HFM544、pROX_HFM545、pROX_HFM689およびpROX_HFM737を得た。なお、これら発現プラスミドは、各野生型酵素のＣ末端にGly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号８８）の１０アミノ酸のペプチドが付加された酵素蛋白質が発現する構造を有する。
【００６１】
これらプラスミドに組み込まれたＤＮＡの塩基配列は、財団法人かずさＤＮＡ研究所の柴田大輔博士に依頼して、ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination法）〔Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, p.5463, (1977)〕により決定され、それぞれのプラスミドが目的の遺伝子を含むことを確認した。
【００６２】
６．形質転換株の造成と培養
上記５で述べたプラスミドpROX_HFM5、pROX_HFM77、pROX_HFM86、pROX_HFM122、pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM339、pROX_HFM388、pROX_HFM544、pROX_HFM545、pROX_HFM689およびpROX_HFM737をそれぞれ大腸菌K-12 BL21(DE3)株にカルシウムイオンを用いる形質転換法を用いて導入することにより、形質転換株BL21/ pROX_HFM5、BL21/ pROX_HFM77、BL21/ pROX_HFM86、BL21/ pROX_HFM122、BL21/ pROX_HFM145、BL21/ pROX_HFM305、BL21/pROX_HFM339、BL21/ pROX_HFM388、BL21/ pROX_HFM544、BL21/pROX_HFM545、BL21/ pROX_HFM689、およびBL21/ pROX_HFM737を造成した。なお、BL21(DE3)株は、大学共同利用機関法人情報・システム研究機構・国立遺伝学研究所・ナショナルバイオリソースプロジェクトより菌株番号ME9026として入手した。
【００６３】
７．上記形質転換株を用いたプロトカテク酸５位酸化酵素反応
上記１２種類の形質転換体を５ｍｌのＬＢ培地（10 g/l トリプトン（Difco社製）、5 g/l 乾燥酵母エキス（Difco社製）、10 g/l 塩化ナトリウム）で一晩培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度１００ｐｐｍになるように加えた。新しいＬＢ培地に１／１００容量接種し、25℃で培養し対数増殖期にＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside）を終濃度１ｍＭになるように添加し、３時間タンパク質生産誘導を行った。タンパク質生産誘導後、大腸菌を遠心によって集菌した。上清を捨て、500μlのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール）に懸濁した。大腸菌懸濁液を超音波破砕機によって、細胞破砕を行った。大腸菌懸濁液は遠心分離（４℃、１０分、２００００×g）を行い、上清と沈殿物に分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液のタンパク質濃度をブラッドフォード法に基づいたバイオラッド（Bio-Rad）プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて計測し、１ｍｇ/ｍｌになるようにＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した。
【００６４】
プロトカテク酸５位酸化酵素反応は０．５ｍＭの基質（プロトカテク酸）、０．０１ｍＭ
ＦＡＤ、０．０１ｍＭ  ＦＭＮ、２．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、２５ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液中で１００μlの反応系で行った。プロトカテク酸を基質にした場合、粗酵素６８μgを反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は３０℃で反応を行い０時間および１時間後に１ｍｌの酢酸エチルにて反応を停止した。さらに１５０μlのＨＥＰＥＳ緩衝液と２Ｎ ＨＣｌ  １．５μlを加えて、５分間激しく混和し、遠心分離（室温、５分、２００００×g）を行った。二層に分離した反応液・酢酸エチル混和物の上層（酢酸エチル層）を８００μl回収し、新しい１．５mlチューブに移した。
【００６５】
真空遠心乾燥機で乾燥後、１０μl アセトニトリルを加え、５分間激しく混和し、さらに１９０μlの水で希釈し、孔径０．２μｍのフィルター（Millex-LG）で濾過し、バイアル瓶に注入した。バイアル瓶はＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）にセットし、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による解析を行った。プロトカテク酸の５位の酸化により生成する没食子酸はＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて検出した。標品の没食子酸と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの質量値を合わせて生産された没食子酸を同定した。
【００６６】
１２種類のHFM酵素群のうち、１０種類（HFM5、HFM86、HFM145、HFM305、HFM339、HFM388、HFM544、HFM545、HFM689およびHFM737）はプロトカテク酸を基質にした場合、プロトカテク酸の５位を酸化して没食子酸を合成した。それぞれの粗酵素タンパク質１ｍｇ当たりの１時間当たりの没食子酸合成はHFM5（151μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM86（30μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM145（249μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM305（359μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM339（20μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM388（11μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM544（35μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM545（8μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）、HFM689（350μM/時間/mg 粗酵素タンパ
ク質）およびHFM737（41μM/時間/mg 粗酵素タンパク質）であった。HFM 145、HFM 305及びHFM689で特にプロトカテク酸５位酸化酵素活性が強かった。
【００６７】
実施例２．単離した水酸化酵素の活性とＰＡＯ変異酵素（配列番号４）の活性を以下のようにして比較した。
１．ポリシストロン型発現プラスミドの構築
上記HFM145酵素遺伝子、HFM305酵素遺伝子及びHFM689酵素遺伝子を大腸菌 JM109株、大腸菌 JM109(DE3)株や大腸菌 BL21(DE3)株で各遺伝子の転写・翻訳効率に依存しない効率よい発現を行うために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。より具体的にはＴ７プロモーター配列と疑似遺伝子及び目的遺伝子をHindIII部位とSphI部位を介してpUC19プラスミドＤＮＡ内に挿入するために、配列番号５４〜５７で表される４本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpUC19（タカラバイオ社製）のHindIII部位とSphI部位の間に挿入し、発現ベクターpUTCH19を構築した。
【００６８】
２．ＰＡＯ変異酵素の造成とベクターへの組み込み
シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子塩基配列データ（NC_002516）をＮＣＢＩのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするための配列番号５８で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号５９で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。シュードモナス・アルギノサPAO株の染色体DNA（ＡＴＣＣ番号：47085D-5）をＡＴＣＣから入手し、これを鋳型として、２種のPCRプライマーとPrimeSTAR DNAポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲによりパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子のＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素蛋白質HFM300をコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_HFM300を造成した。pT7Blue_HFM300から制限酵素HindIIIと制限酵素 XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300を造成した。
【００６９】
３．酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および．酵素蛋白質HFM689を発現するプラスミドの構築
実施例１の結果から、酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689を発現する形質転換株の培養抽出液を用いたときに、高いプロトカテク酸５位酸化酵素活性が観察された。そこで、酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689を効率よく発現するプラスミドの構築を行った。上記プラスミドpROX_HFM145、pROX_HFM305およびpROX_HFM689から生産される酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689は、いずれもＣ末端に10アミノ酸のペプチド（Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号８８））が付加されている。これらペプチドを除去した酵素蛋白質を発現するプラスミドを構築するために、まず表３に示すＰＣＲプライマーを設計し、合成した。
【表３】
2010207094.tif 000004
【００７０】
pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM689のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上表のPCRプライマーとPrimeSTAR DNAポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲにより目的ＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_HFM145、プラスミドpT7Blue_HFM305、プラスミドpT7Blue_HFM689を造成した。これらプラスミドから制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIまたはKpnIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM145、pUTCH_HFM305、pUTCH_HFM689を造成した。
【００７１】
５．蛋白質HFM300、HFM300Y385F、HFM145、HFM305およびHFM689の大腸菌による生産
プラスミドpUTCH_HFM300、pUTCH_HFM300Y385F、pUTCH_HFM145、pUTCH_HFM305およびpUTCH_HFM689をそれぞれ大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385F、JM109/pUTCH_HFM145、JM109/pUTCH_HFM305およびJM109/pUTCH_HFM689を造成した。これら形質転換体を、lacプロモーター誘導発現用培地であるオーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ（Overnight Express Instant TB；Novagen社製；以下、ＯＥＩ−ＴＢ培地と略す）を用いて、３７℃で１４時間培養した。集菌後、ＨＥＰＥＳ−グリシン緩衝液 ０．５ｍｌに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法により計測し、１ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００７２】
６．プロトカテク酸５位酸化酵素活性の測定
上記５で調製した粗酵素液のプロトカテク酸５位酸化酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸（基質）５００μＭ、ＦＡＤ １０μＭ、ＦＭＮ １０μＭ、ＮＡＤＨ ２．５ｍＭ、ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ、粗酵素液６８μｇを含む１００μｌの反応液で３０℃で１時間行った。反応後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385F、JM109/pUTCH_HFM145、JM109/pUTCH_HFM305およびJM109/pUTCH_HFM689において、それぞれ１ｍｇ蛋白質あたり、133μM、133μM、172μM、1456μM、500μMの没食子酸が検出された。この活性測定結果より、各プロトカテク酸５位酸化酵素の活性比は下表のとおりである。
【表４】
2010207094.tif 000005
【００７３】
発現ベクターpUTCH19においては、該ベクターに組み込まれた遺伝子は同じ発現効率で蛋白質が生産されるように設計されているが、そのことを確認するために、上記粗酵素液内のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質の量を下記のようにして測定した。上記で１ｍｇ／ｍｌに調製した粗酵素タンパク質液１０μL(１０μg)にβ−メルカプトエタノール(９９．５％を０．２５μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１．２５μｌ、染色液１．２５μｌ加えて、５分間煮沸処理を行った。冷却した泳動用サンプルをポリアクリルアミドゲル（ATTO e-PAGEL E-T1020L）のウェルにアプライし、２０ｍＡで８０分間泳動した。ゲルをクマシブリリアントブルー溶液（ATTO EzStainAqua）を用いてタンパク質染色を行った。蒸留水で十分に脱色し、スキャナーを用いて画像を電子的に取り込んだ。ベクターコントロールと比較して、新しく発現したタンパク質の中にHFM酵素タンパク質のアミノ酸配列から予想される分子量（約４４ｋＤ）のシグナルが見られた。電子的に取り込んだ画像を画像処理ソフトウェアNIH ImageJ（http://www.bioarts.co.jp/~ijjp/ij/）で解析したところ、各HFM酵素タンパク質の発現量はサンプル間で違いは観察されなかった。
【００７４】
以上の結果より、HFM300蛋白質、HFM145蛋白質、HFM305蛋白質およびHFM689蛋白質がシュードモナス・エルギノーサＰＡＯ株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の３８５位のチロシンをフェニールアラニンに変換したＰＡＯ変異酵素と同等のプロトカテク酸５位酸化酵素活性あるいはより高いプロトカテク酸５位酸化酵素活性を保有していることがわかった。
【００７５】
実施例３．プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子を破壊した菌株をシュードモナス・プチダKT2440株をもとに以下のようにして作製した。
【００７６】
１．レバンシュクラーゼ遺伝子のクローニング
相同組換えにより生成した目的遺伝子の欠損株を選別するため、宿主細胞に対して致死的に機能するレバンシュ−クラ−ゼをコードするバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）168株のsacB遺伝子を相同組換えのマーカーとして用いることにした。バチルス・サブチリス168株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Japan collection of microorganisms；以下、ＪＣＭと略す）よりIAM12118株として入手した。またバチルス・サブチリス168株のゲノム配列情報（NC_000964）をＮＣＢＩよりインターネット経由で取得した。バチルス・サブチリス168株の染色体DNAをGenomic DNA Extraction Kit（Bioscience社製）を用いて精製した。以下、特記しない限り、染色体DNAの精製法はこの方法を用いた。この染色体DNA（100ng）を鋳型に用い、配列番号68で表される配列を有するDNAプライマーと配列番号69で表される配列を有するDNAプライマーのプライマーセットとし、PrimeSTAR
DNAポリメラーゼを用いてPCR反応を行うことにより、sacB遺伝子を含む増幅DNA断片を得た。続いて、Taq DNA ポリメラーゼを用いて増幅DNA断片の3'末端へＡ残基を付加した。増幅DNA断片をゲル電気泳動後に回収、精製した後、pT7Blue-T ベクター（ノバジェン社製）に組み込むことにより、sacB遺伝子を保持するプラスミドpTBSACB1を構築した。
【００７７】
２．遺伝子破壊用発現ベクターの構築
上記で取得したsacB遺伝子を保持するpTBSACB1よりsacB遺伝子をHindIII-KpnI断片1.0kbとKpnI-XbaI断片0.4kbの2つに分けて、実施例２で造成したpUTCH19のHindIII部位とXbaI部位の間に挿入し、sacB遺伝子発現プラスミドpUTCBSACB1を構築した。pUTCBSACB1からsacB遺伝子発現領域（ApaLI断片約2.5kb）をシュードモナス・プチダKT2440株中で機能するカナマイシン耐性遺伝子を保持する大腸菌用クローニングベクターpHSG298（タカラバイオ社製）のApaLI部位に挿入し、遺伝子破壊用ベクターpHBSAC298を構築した。
次に、pHBSAC298をもとにした遺伝子破壊用プラスミドを導入する菌株によってはpHBSAC298中のlacプロモーターからではsacB遺伝子の発現量が少なく、致死的にならない場合が考えられたため、pHSG298（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを利用することにした。pHSG298の配列情報を基に配列番号70〜77で表される８本の
合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpT7Blue-T ベクター（ノバジェン社製）に組み込むことにより、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を保持するプラスミドpTRKD1を構築した。pTBSACB1よりsacB遺伝子をHindIII-KpnI断片1.0kbとKpnI-XbaI断片0.4kbの2つに分け、pTRKD1よりカナマイシン耐性遺伝子プロモーター領域をHindIII-SphI断片0.2 kbとともにpHSG298（タカラバイオ社製）のSphI-XbaI部位に挿入して、遺伝子破壊用ベクターpHKPsacB1を構築した。
【００７８】
３．プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
シュードモナス・プチダKT2440株が保有するプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼは、αサブユニットとβサブユニットの２つのサブユニットからなり、それぞれの蛋白質はpcaH遺伝子（シュードモナス・プチダKT2440株のゲノム配列情報NC_002947における塩基番号5281003〜5281608）とpcaG遺伝子（NC_002947における塩基番号5281619〜5282338）によりコードされている。なお、シュードモナス・プチダKT2440株のゲノム配列情報（NC_002947）をＮＣＢＩよりインターネット経由で取得した。これら２つのサブユニットの発現を欠損させるために、シュードモナス・プチダKT2440株の染色体DNAの一部、すなわちNC_002947における塩基番号5281003〜5282340の1.34 kbの領域を以下の手順で欠失させた。
【００７９】
まずシュードモナス・プチダKT2440株のpcaH・pcaG遺伝子の５’フランキング領域の塩基配列（1130bp；NC_002947における塩基番号5282341〜5283470）と３’フランキング領域の塩基配列（1060bp；NC_002947における塩基番号5279941〜5281000）をシュードモナス・プチダのゲノム配列情報（NC_002947）より取得した。これら塩基配列をもとに該５’フランキング領域を増幅するための２種類のDNAプライマー（配列番号78と配列番号79）を合成した。これら２種類のDNAプライマーとシュードモナス・プチダKT2440株の精製染色体DNA（100ng）を鋳型として、PrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いて該５’フランキング領域を増幅した。Taq DNAポリメラーゼによって増幅DNA断片の３'末端にＡ残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、該５’フランキング領域を保持するプラスミドであるpTC2179uR1を構築した。同様に、該３’フランキング領域を増幅するための２種類のDNAプライマー（配列番号80と配列番号81）を合成し、これらDNAプライマーとシュードモナス・プチダKT2440株の染色体DNA（100ng）を鋳型として、PrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いて該３’フランキング領域を増幅した。Taq DNA ポリメラーゼによって増幅DNA断片の３'末端にＡ残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、該３’フランキング領域を保持するプラスミドであるpTC2178dR1を構築した。続いて、pTC2179uR1から上記５’フランキング領域を含む約1.0kbのBglII-SacI断片を調製し、またpTC2178dR1から上記３’フランキング領域を含む約1.2kbのBglII-PstI断片を調製した後、これら２つの断片を遺伝子破壊用ベクターpHBSAC298のPstI-SacI部位に挿入し、遺伝子破壊用プラスミドpHBD2179-8を構築した。
【００８０】
４．プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
シュードモナス・プチダKT2440株を5mlのＬＢ培地を用いて37℃でＯＤ600が1.0に達するまで培養した。なお、以下の操作は低温及び氷冷した溶液を用いて行った。次に遠心分離により集菌した菌体を2mlの0.3Mショ糖溶液に懸濁し、同様の遠心分離により集菌する操作を２回繰り返すことで菌体を洗浄した後、0.6 mlの0.5Mショ糖溶液に懸濁した。この細胞懸濁液150μlを1 mmのキュベット（BioRad社製）に入れ、さらに約1μgの遺伝子破壊用プラスミドpHBD2179-8を混合した後、エレクトロポレーション法によりシュードモナス・プチダKT2440株の形質転換を行った。なお、エレクトロポレーションは1.2 kV、25μF、400 Ωの条件で行った。エレクトロポレーション処理を加えた細胞懸濁液に1mlのＳＯＣ培地（20g/lトリプトン、5g/l乾燥酵母エキス、0.5 g/l塩化ナトリウム、20mMグルコース、10mM塩化マグネシウム、10mM硫酸マグネシウム）を加え、37℃で９時間培養した。遠
心分離により集菌した菌液を50μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（2%寒天を含むＬＢ培地）の上に塗布した後、37℃で培養することによりカナマイシン耐性であるSCHG株を取得した。このSCHG株の菌体を少量だけ爪楊枝の先で拾い、PCR反応液に懸濁した後、pcaH・pcaG遺伝子領域を増幅させるための２種類のDNAプライマー（配列番号78および配列番号81）とTaq DNA ポリメラーゼを用いてPCR反応を行ったところ、約3.5kbと約2.2kbの２種類の増幅DNA断片が得られた。pcaH・pcaG遺伝子の５’フランキング領域（1.13kb）、翻訳領域（1.34kb）および３’フランキング領域（1.06kb）を含むDNA断片の大きさが約3.5kbであり、またpcaH・pcaG遺伝子の翻訳領域を欠損したDNA断片の大きさが約2.2kbであることから、SCHG株では予想通り遺伝子破壊用プラスミドpHBD2179-8がpcaH・pcaG遺伝子の領域に挿入されていることが示された。さらに、上述のsacB遺伝子を増幅させるための２種類のDNAプライマー（配列番号68および配列番号69）とTaq DNA ポリメラーゼを用いてPCR反応を行ったところ、1.4 kbの増幅DNA断片が得られたことから、SCHG株では遺伝子破壊用プラスミドpHBD2179-8がpcaH・pcaG遺伝子の領域に挿入されていることを確認できた。
【００８１】
続いて、SCHG株をもとにpcaH・pcaG遺伝子欠損株を取得するため、SCHG株を1 mlのＬＢ培地で37℃で一晩培養した。この培養液の一部を10％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に塗布し、37℃で培養した後、ショ糖耐性であるDHG株を取得した。このDHG株の菌体を少量だけ爪楊枝の先で拾い、PCR反応液に懸濁した後、配列番号78で表される塩基配列を有するDNAプライマーと配列番号81で表される塩基配列を有するDNAプライマーを用いてTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応を行ったところ、約2.2 kbの増幅DNA断片が得られた。pcaH・pcaG遺伝子の翻訳領域が欠失した場合、PCR反応により増幅されるDNA断片の大きさが2.19 kbであることから、DHG株は予想通りpcaH・pcaG遺伝子欠損株であることが示された。さらに、DHG株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号68で表される塩基配列を有するDNAプライマーと配列番号69で表される塩基配列を有するDNAプライマーを用いたPCR反応を行ったところ、増幅DNA断片が得られなかったことから、DHG株はsac遺伝子を欠損していることが確認できた。
【００８２】
実施例４．プロトカテク酸５位酸化酵素活性を欠損したシュードモナス・プチダKT2440株をDHG株をもとに以下のようにして作製した。
【００８３】
１．プロトカテク酸５位酸化活性をコードする遺伝子を破壊するためのプラスミドの構築
実施例２に示したように、シュードモナス・プチダKT2440株はパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子（HFM305遺伝子）に由来するプロトカテク酸５位酸化活性を保有している。そこで、実施例３で取得したプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子を欠損しているDHG株をもとに、以下の手順でHFM305遺伝子の破壊株を取得した。
まずシュードモナス・プチダKT2440株のHFM305遺伝子（シュードモナス・プチダKT2440株のゲノム配列情報NC_002947における塩基番号4009429〜4010616）の５’フランキング領域の配列（1044塩基； NC_002947における塩基番号4010625〜4011668）と３’フランキング領域（1061塩基；NC_002947における塩基番号4008368〜4009428）をシュードモナス・プチダのゲノム配列情報（NC_002947）より取得した。これら塩基配列をもとに該５’フランキング領域を増幅するための２種類のDNAプライマー（配列番号82と配列番号83）を合成した。これらDNAプライマーとDHG株の染色体DNA（100 ng）を鋳型として、PrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いて該５’フランキング領域を増幅した。同様に、該３’フランキング領域を増幅するための２種類のDNAプライマー（配列番号84と配列番号85）を合成した。これらDNAプライマーとDHG株の染色体DNA（100 ng）を鋳型として、PrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いて該３’フランキング領域を増幅した。該５’フランキング領域の増幅PCR断片を制限酵素BglIIとPstIで消化することによって得られた約1.04kbのBglII-PstI断片と該３’フランキング領域の増幅PCR断片を制限酵素SphIとBamHIで消化することによって得られた約1.06kbのSphI-BamHI断片を、pHKPsacB1ベクター（実施例３を参照）のマ
ルチクローニングサイト上のSphI-PstI間に挿入することにより、HFM305遺伝子破壊用プラスミドpHKPsacB1_△HFM305を得た。
【００８４】
２．HFM305遺伝子破壊株の作製
DHG株を5mlのＬＢ液体培地を用いて37℃でＯＤ600が1.0に達するまで培養した。次に遠心分離により集菌した菌体を2mlの0.3Mショ糖溶液に懸濁し、同様の遠心分離により集菌する操作を２回繰り返すことで菌体を洗浄した後、0.6mlの0.5Mショ糖溶液に懸濁した。この細胞懸濁液150μlを1 mmのキュベット（BioRad社製）に入れ、さらに約1μgの遺伝子破壊用プラスミドpHKPsacB1_△HFM305を混合した後、エレクトロポレーション法によりDHG株の形質転換を行った。エレクトロポレーション処理を加えた懸濁液に1mlのＳＯＣ培地を加え、37℃で9時間培養した。なおエレクトロポレーションは2.5 kV、25μF、200 Ωの条件で行った。遠心分離により集菌した菌液を50μg / mlのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地の上に塗布した後、37℃で培養することによりカナマイシン耐性であるSCHG305株を取得した。このSCHG305株の菌体を少量だけ爪楊枝の先で拾い、PCR反応液に懸濁した後、HFM305遺伝子領域を増幅させるための２種類のDNAプライマー（配列番号82および配列番号85）とTaq DNAポリメラーゼを用いてPCR反応を行ったところ、約3.3 kbと約2.1 kbの２種類の増幅DNA断片が得られた。HFM305遺伝子の５’フランキング領域（1.06kb）、翻訳領域（1.2kb）および３’フランキング領域（1.04kb）を含むDNA断片の大きさが約3.3kbであり、またpcaH・pcaG遺伝子の翻訳領域を欠損したDNA断片の大きさが約2.1kbであることから、SCHG305株では予想通り遺伝子破壊用プラスミドpHKPsacB1_△HFM305がHFM305遺伝子の領域に挿入されていることが示された。さらに、上述のsacB遺伝子を増幅させるための２種類のDNAプライマー（配列番号68および配列番号69）とTaq DNAポリメラーゼを用いてPCR反応を行ったところ、1.4kbの増幅DNA断片が得られたことから、SCHG305株では遺伝子破壊用プラスミドpHKPsacB1_△HFM305がHFM305遺伝子の領域に挿入されていることを確認できた。
【００８５】
続いて、SCHG305株をもとにHFM305遺伝子欠損株を取得するため、SCHG305株を1 mlのＬＢ培地で37℃で一晩培養した。この培養液の一部を10％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に塗布し、37℃で培養した後、ショ糖耐性であるDHG305株を取得した。このDHG305株の菌体を少量だけ爪楊枝の先で拾い、PCR反応液に懸濁した後、HFM305遺伝子の５'フランキング領域をPCRにより増幅させるときに用いた配列番号82で表される塩基配列を有するDNAプライマーとHFM305遺伝子の３'フランキング領域をPCRにより増幅させるときに用いた配列番号85で表される塩基配列を有するDNAプライマーを用いて、Taq DNAポリメラーゼによるPCR反応を行ったところ、約2.1kbの増幅DNA断片が得られた。遺伝子の翻訳領域が欠失した場合、PCR反応により増幅されるDNA断片の大きさが2.1 kbであることから、DHG305株は予想通りHFM305遺伝子が欠損していることが示された。さらに、DHG305株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号68で表される塩基配列を有するDNAプライマーと配列番号69で表される塩基配列を有するDNAプライマーを用いたPCR反応を行ったところ、増幅DNA断片が得られなかったことから、DHG305株はsac遺伝子を欠損していることが確認できた。
【００８６】
実施例５．シュードモナス・プチダKT2440株、DHG株およびDHG305株のプロトカテク酸生産能を以下のようにして比較した。
【００８７】
１．大腸菌−シュードモナス用シャトル・ベクターの構築
シュードモナス・プチダKT2440株やその遺伝子欠損株（以下、シュードモナス属株と略す）に外来遺伝子などをプラスミド状態で保持させるために用いる大腸菌−シュードモナス用シャトル・ベクターを、大腸菌用ベクターであるpHSG298（タカラバイオ社製）に、シュードモナス属株でプラスミドを複製させるための複製領域として、グラム陰性細菌の広宿主域プラスミドRSF1010の複製領域を挿入することにより作製した。すなわち、広宿主域プラスミドRSF1010（長岡技術科学大学の福田雅夫博士より入手した）のPstI断片約7.9
kbをpHSG298のPstI部位に挿入し、pHSFP1を構築した。このpHSFP1を制限酵素PstIとPvuIIによって消化した後、Blunting Highキット（東洋紡社製）を用いて、PstI末端を平滑末端に変えた。pHSFP1由来の約5.8kbのPstI（平滑末端）−PvuII断片を精製した後、pHSG298のStuI部位に挿入し、大腸菌−シュードモナス用シャトル・ベクターpHSF298を構築した。
【００８８】
２．テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡクローニング
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）RHA1株のテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子の塩基配列データ（NC_008269における塩基番号171236〜172501、またはNC_008270における塩基番号194261〜195526、及びNC_00869における塩基番号172498〜172968、またはNC_008270における塩基番号193794〜194264、NC_00869における塩基番号173978〜174988、またはNC_008270における塩基番号191774〜192784、NC_00869における塩基番号172965〜173981、またはNC_008270における塩基番号192781〜193797）をＮＣＢＩのＧＢデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするための配列番号86で表されるフォワードPCRプライマーおよび配列番号87で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。ロドコッカス属RHA1株の染色体DNAを鋳型として、２種のPCRプライマーとPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲによりテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼによる３'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸１，２−ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_TPACB1を造成した。pT7Blue_TPACB1から制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_TPACB1を造成した。
【００８９】
なお、ロドコッカス属RHA1株は長岡科学技術大学の福田雅夫博士より分与を受け、同博士から教授された方法に従って培養した。培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット（キアゲン社製（DNeasy tissue kit；Qiagen）を用いて単離精製した。
【００９０】
３．テレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡクローニング
菌体内へのテレフタル酸の取り込みを促進させる効果が予測されるテレフタル酸トランスポーターtpaK遺伝子（NC_00869における塩基番号175046〜176425、またはNC_008270における塩基番号190337〜191716）を、本来ロドコッカス属RHA1株が有するテレフタル酸変換酵素遺伝子群の遺伝子構造（tpaAaAbCBKで配置されている）を利用して発現させるため、tpaB遺伝子の一部領域を含む領域の増幅を行った。ロドコッカス属RHA1株の染色体DNA（100ng）を鋳型として、配列番号６０で表される配列を有するDNAプライマーと配列番号６１で表される配列を有するDNAプライマーを用いて、tpaB遺伝子の一部領域とtpaK遺伝子の全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。Taq DNA ポリメラーゼによって増幅DNA断片の３'末端にＡ残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、tpaB遺伝子の一部領域とtpaK遺伝子の全領域をを保持するプラスミドpTRTPAK2を構築した。このpTRTPAK2よりtpaB遺伝子の一部領域とtpaK遺伝子を含むSphI-XbaI断片1.6 kbを、上述のpUTCH_TPACB1のSphI部位とXbaI部位の間に挿入し、ロドコッカス属RHA1株由来のテレフタル酸変換酵素遺伝子群（tpaAaAbCBK）を発現するプラスミドpUTCTPACBK1を構築した。
【００９１】
４．シュードモナス・プチダKT2440株、DHG株およびDHG305株へのテレフタル酸利用能の付与
実施例３で造成したDHG株、実施例４で造成したDHG305株およびシュードモナス・プチダKT2440株に対して、以下のようにしてテレフタル酸からのプロトカテク酸の生産能を付与した。
【００９２】
上で造成したテレフタル酸変換酵素遺伝子群（tpaAaAbCBK）を運ぶプラスミドpUTCTPACBK1をSpeIで消化した後、制限酵素XbaIで消化した大腸菌−シュードモナス用シャトル・ベクターpHSF298に導入することによりプラスミドpHTPACBKを構築した。pHTPACBKのテレフタル酸代謝酵素群は大腸菌lacプロモーター下流に支配されており、シュードモナス・プチダ KT2440株、DHG株およびDHG305株においては構成的に発現する。
【００９３】
シュードモナス・プチダKT2440株、DHG株およびDHG305株をそれぞれ5mlのＬＢ培地で18時間培養した後、集菌し、0.3Mショ糖溶液で２回洗浄した後、450μlの0.5Mショ糖と150μlの80％グリセロールの混合液に懸濁した。この細胞懸濁液150μlを1mmのキュベットに入れ、さらに約1μgのpHTPACBKを混合した後、エレクトロポレーション法によりDHG株の形質転換を行った。エレクトロポレーション処理を加えた懸濁液に1mlのＳＯＣ培地を加え、37℃で2時間培養した。遠心分離により集菌した菌液を50μg / mlのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地の上に塗布した後、37℃で18時間培養することによりアンピシリン耐性およびカナマイシン耐性である菌株を取得した。シュードモナス・プチダKT2440株、DHG株およびDHG305株をもとにアンピシリン耐性およびカナマイシン耐性として取得した菌株をそれぞれKT2440-pHTPACBK株、DHG-pHTPACBK株、DHG305-pHTPACBK株と名付けた。KT2440-pHTPACBK株、DHG-pHTPACBK株、DHG305-pHTPACBK株をそれぞれ5mlの微量元素を含むＭ９―グルコース培地で培養した。同培地100ｍｌを含む500 ml三角フラスコにすべて植菌し、３０℃、150rpmで振盪培養を行った。４日間培養後にテレフタル酸を5mMになるように添加した後、さらに４日間培養を続けた。KT2440-pHTPACBK株、DHG-pHTPACBK株、DHG305-pHTPACBK株について、それぞれの三角フラスコから5μlの培養液を採取し、10倍希釈した後、250μlの酢酸エチル、5μlの2N HClを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を200μlとり、新しい1.5mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、190μlの水で希釈し、孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）を用いてプロトカテク酸の量を測定した。その結果、KT2440-pHTPACBK株、DHG-pHTPACBK株およびDHG305-pHTPACBK株のプロトカテク酸の生産量はそれぞれ0.0mM、2.9mM、3.6mMであった。この結果よりHFM305遺伝子の破壊によりプロトカテク酸の生産性が大きく向上することがわかった。
【配列表】
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