(57)【要約】【課題】従来困難であった炎症性腸疾患の根治を可能にすることが期待される炎症性腸疾患の治療剤及びそれに用いられるポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】炎症性腸疾患の治療剤は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列、或いはＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含み、場合によっては５’末端側及び３’末端側のいずれか一方又は双方にｐｏｌｙ（Ａ）配列、ｐｏｌｙ（Ｃ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ）配列、及びｐｏｌｙ（ｄＴ）配列のいずれかを有するポリヌクレオチドと、シゾフィラン等のβ−１，３−グルカンとの複合体を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、β−１，３−グルカンとの複合体を含むことを特徴とする炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項１記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含むことを特徴とする請求項１及び２のいずれか１項記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項３記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１で表される下記の塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の炎症性腸疾患の治療剤。
5’-tggtgttcacgatgaacataggcatg-3’  ［配列番号１］
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項７】
前記β−１，３−グルカンがシゾフィランであることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、５’末端側及び３’末端側のいずれか一方又は双方にｐｏｌｙ（Ａ）配列、ｐｏｌｙ（Ｃ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ）配列、及びｐｏｌｙ（ｄＴ）配列のいずれかを有することを特徴とする請求項７記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項９】
抗原提示細胞を標的とすることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の炎症性腸疾患の治療剤。
【請求項１０】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列と、β−１，３−グルカンと相互作用し複合体を形成することが可能な塩基配列とを有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含むことを特徴とする請求項１０及び１１のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項１２記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
塩基配列が、配列番号１で表される下記の塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項１０から１３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
5’-tggtgttcacgatgaacataggcatg-3’  ［配列番号１］
【請求項１５】
ＤＮＡであることを特徴とする請求項１０から１４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記β−１，３−グルカンと相互作用し複合体を形成することが可能な塩基配列として、５’末端側及び３’末端側のいずれか一方又は双方にｐｏｌｙ（Ａ）配列、ｐｏｌｙ（Ｃ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ）配列、及びｐｏｌｙ（ｄＴ）配列のいずれかを有することを特徴とする請求項１０から１５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の治療剤及びそれに用いられるポリヌクレオチドに関し、更に詳細には従来困難であった炎症性腸疾患の根治を可能にすることが期待される新規な炎症性腸疾患の治療剤及びそれに用いられるポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）に大別される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、特に若年成人に好発し罹患数は増加傾向にある。ＩＢＤの原因は不明であり、情緒障害、繊維不足、下剤乱用及び食物不耐性等が、その発症に関係があるとされている病因因子のうちの一部であるが、いずれについても十分に実証はなされていない。これまでに検討されてきた治療方法としては、５−アミノサリチル酸製剤などを用いた対処療法（例えば、特許文献１参照）や、プレドニソロンを中心とするステロイド薬投与が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。また、海外では、心理療法、食事療法、鎮痙薬、抗コリン作用薬、抗うつ薬、膨張性薬剤、様々な受容体拮抗薬及び精神安定剤等による治療が試みられてきたが、いずれも十分な効果を上げるには至っていない（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，５１９，０１４号明細書
【特許文献２】特開２００７−５２００４９５号公報（明細書段落［０００７］）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】厚生労働省「難治性炎症性腸管障害に関する調査研究」班、平成１３ 年度研究報告書、ｐ．５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの薬物療法はいずれも対症療法であり、ＩＢＤの根治を目的とするものではない。また、薬剤抵抗性症例では外科的手術に至るものもあるが完治することは少なく、したがって当該疾病の根治方法の確立が急務である。更に、ＩＢＤは厚生労働省指定の難病に指定されており、国家的見地からもＩＢＤに対する根本的治療法の確立が求められている。
【０００６】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、活性化リンパ球より放出されるサイトカインの一種であり、炎症や異物の侵入が発生した部位にマクロファージを集め、活性化させる作用を有している。ＭＩＦは異物の侵入等からの生体の保護に重要な役割を果たしているが、その過剰発現は種々の炎症性疾患の原因となることが知られている。そのため、ＭＩＦの制御が諸疾患の症状緩和に有益であると考えられる。
【０００７】
本発明者らは、抗ＭＩＦ抗体が、マウス敗血症モデル等における症状の緩和や、催炎症性サイトカインの産生の抑制に非常に有効であることを示してきた。したがって、抗ＭＩＦ抗体は、炎症性疾患の一種であるＩＢＤの治療にも有効であることが期待される。しかしながら、臨床的には抗体療法は抗体の生産が技術的・経済的な障害となっている。ｓｉＲＮＡやアンチセンスＤＮＡ等の核酸医薬が抗体に変わる特異的ＭＩＦ抑制法と考えられるが、従来のＤＤＳでは実用性に問題があった。
【０００８】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、従来困難であった炎症性腸疾患の根治を可能にすることが期待される炎症性腸疾患の治療剤及びそれに用いられるポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、β−１，３−グルカンとの複合体を含むことを特徴とする炎症性腸疾患の治療剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
なお、本発明において「マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列」とは、ＭＩＦをコードするｍＲＮＡ配列を表す。また、「ポリヌクレオチド」とは、２以上の任意の数のヌクレオチドが縮合した化合物を意味し、いわゆる「オリゴヌクレオチド」も、本発明における「ポリヌクレオチド」に含まれる。
【００１０】
ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含むポリヌクレオチドは、抗原提示細胞等の免疫細胞中でＭＩＦをコードするｍＲＮＡ配列（センス配列）とハイブリダイズし、その発現を阻害することができる。そのため、腸管を含む体内におけるＭＩＦの過剰発現を抑制し、ＩＢＤの発症及び増悪を妨げることができる。また、ポリヌクレオチドの産生は抗体よりも技術的にも経済的にも臨床応用に好適である。このようなポリヌクレオチドを核酸塩基との水素結合により、３重らせん構造を有する複合体を形成し、生体に対し無害であることが知られているβ−１，３−グルカンと複合化することにより、生体内での核酸加水分解酵素によるポリヌクレオチドを抑制し、ウィルスベクター等の従来の核酸ＤＤＳよりも安全かつ確実に標的細胞にデリバリーすることができる。更に、抗原提示細胞の細胞膜上に存在するＤｅｃｔｉｎ−１という膜タンパクがβ−グルカンに対する認識能を有しているため、本態様に係る炎症性腸疾患の治療剤は、標識化等の処理を行うことなく、標的細胞である抗原提示細胞等に対し、ＭＩＦをコードするｍＲＮＡ配列（センス配列）とハイブリダイズし、その発現を阻害することができる塩基配列を含むポリヌクレオチドをデリバリーすることができる。
【００１１】
本発明の第２の態様は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列と、β−１，３−グルカンと相互作用し複合体を形成することが可能な塩基配列とを有することを特徴とするポリヌクレオチドを提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１２】
本態様に係るポリヌクレオチドは、ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列と、β−１，３−グルカンと相互作用し複合体を形成することが可能な塩基配列とを有しているため、抗原提示細胞等の標的細胞内でＭＩＦの発現を抑制できると共に、ポリヌクレオチドを標的細胞にデリバリーするための担体であるβ−１，３−グルカンと安定な複合体を形成することができる。そのため、本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤の調製に好適に用いることができる。
【００１３】
本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤及び第２の態様に係るポリヌクレオチドにおいて、前記ポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含んでいることが好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含んでいると、ＭＩＦのセンス配列に対するハイブリダイズ能が向上し、ＭＩＦの発現をより確実に抑制できる。
【００１４】
本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤及び第２の態様に係るポリヌクレオチドにおいて、ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含んでいてもよく、この場合において、前記ポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を含むことが好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列とハイブリダイズすることにより、ＭＩＦの発現を更により確実に抑制でき、ＩＢＤの発症抑制効果をより高めることができる。ポリヌクレオチドが、ＭＩＦのセンス配列中の、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を含んでいると、ＭＩＦの発現抑制効果を更に向上させることができる。
【００１５】
本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤において、前記ポリヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１で表される下記の塩基配列を含んでいてもよい。
5’-tggtgttcacgatgaacataggcatg-3’  ［配列番号１］
配列番号１で表される塩基配列は、ヒトを始めとする多くのほ乳類に共通するＭＩＦをコードするｍＲＮＡの開始コドン近傍の塩基配列に相補的な配列である。そのため、多くのほ乳類において、炎症性腸疾患の治療剤として好適に用いることができる。
【００１６】
本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤及び第２の態様に係るポリヌクレオチドにおいて、前記アンチセンスポリヌクレオチドがＤＮＡであることが好ましい。
ＤＮＡはＲＮＡに比べて安定性が高いため、炎症性腸疾患の治療剤の血液中での半減期を増大させ、より確実に標的細胞である抗原提示細胞にデリバリーできる。
【００１７】
本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤において、前記β−１，３−グルカンがシゾフィランであることが好ましい。
シゾフィランは核酸と安定な複合体を形成することが知られている、また、注射剤として長年の臨床応用実績があり、高い安全性を有することが実証されている。そのため、安全性が高く、標的細胞へのデリバリー効率の高い炎症性腸疾患の治療剤を得ることができる。
【００１８】
また、β−１，３−グルカンがシゾフィランである本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤及び第２の態様に係るポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドが、５’末端側及び３’末端側のいずれか一方又は双方にｐｏｌｙ（Ａ）配列、ｐｏｌｙ（Ｃ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ）配列、及びｐｏｌｙ（ｄＴ）配列のいずれかを有することが更に好ましい。
これらの塩基配列は、シゾフィランに対して高い複合体形成能を有しているため、安定な複合体を形成することができる。また、β−１，３−グルカンを始めとするβ−グルカンは、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球等の自然免疫を担う細胞に発現している膜タンパク質であるｄｅｃｔｉｎ−１により認識される。このため、本発明に係る炎症性腸疾患の治療剤は、特に化学修飾等の標識化を行うことなくこれらの細胞を標的とすることができる。特に抗原提示細胞によるＭＩＦの産生は、ＩＢＤの発症の起因の１つと考えられることから、抗原提示細胞を標的とし、ＭＩＦの発現を阻害することにより、ＩＢＤの発症及び増悪を効果的に防止することができる。
【００１９】
本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤において、抗原提示細胞を標的とすることが好ましい。抗原提示細胞は、ＭＩＦの過剰発現に起因するＩＢＤの発症の起点となる細胞であるため、それを標的とすることにより、効果的にＩＢＤの治療及び予防を行うことができる。
【００２０】
また、本発明の他の態様は、本発明の第２の態様に係るポリヌクレオチドとβ−１，３−グルカンとを用いて炎症性腸疾患の治療剤を製造する方法、ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列と、β−１，３−グルカンと相互作用し複合体を形成することが可能な塩基配列を含むポリヌクレオチドを抗原提示細胞等にデリバリーする方法、及び本発明の第１の態様に係る炎症性腸疾患の治療剤を投与することにより、炎症性腸疾患を治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によると、従来の抗体医薬や核酸ＤＤＳよりも安全性及び経済性に優れ、炎症発生の起因となる抗原提示細胞等におけるＭＩＦの過剰発現を抑制することにより、従来困難であった炎症性腸疾患の根治を可能にすることが期待される炎症性腸疾患の治療剤及びそれに用いられるポリヌクレオチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例２における各群のマウスの体重変化を示すグラフである。
【図２】実施例２における各群のマウスの大腸の長さを比較したグラフである。
【図３】実施例２における各群のマウスのサイトカインの発現量を比較したグラフである。
【図４】実施例２における各群のマウスの血中ＭＩＦ濃度を比較したグラフである。
【図５】実施例３における各群のＲＡＷ２６４．７細胞におけるＭＩＦの放出量を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の一実施の形態に係る炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療剤（以下、「ＩＢＤ治療剤」と略称することがある。）は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、β−１，３−グルカンとの複合体を含んでいる。
【００２４】
ＩＢＤ治療剤の製造に用いられるポリヌクレオチドとしては、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のセンス配列の少なくとも一部を有する核酸（ｍＲＮＡ）とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を有する任意のものが用いられる。好ましいポリヌクレオチドは、ＭＩＦのセンス配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を含む、いわゆるアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドである。アンチセンスポリヌクレオチドとは、標的ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有する鎖長の短い一本鎖の核酸分子である。アンチセンスポリヌクレオチドの塩基数は、９〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２８塩基である。ヒトの場合、塩基数が１７以上であれば、得られるポリヌクレオチドの総数（４１７＝１．７×１０１０）がヒトの遺伝子総数（６×１０９）を上回るため、特定遺伝子のみの発現の阻害が統計的には可能になる。
【００２５】
アンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくは開始コドンを標的とするよう設計される。すなわち、アンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくは開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列を含み、より好ましくは、開始コドンを起点とする９〜５０塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を含んでいる。ＭＩＦのセンス配列は、ＩＢＤの治療対象となる動物の種類により異なるが、センス配列又はＭＩＦのアミノ酸配列が既知の場合には、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＰＤＢ、ＤＤＢＪ等のデータベースから得られた配列データを元に、任意の公知の方法を用いてアンチセンスポリヌクレオチドを設計することができる。また、ＭＩＦのセンス配列及びアミノ酸配列がいずれも未知である動物の場合には、任意の公知の方法により単離したＭＩＦのアミノ酸配列又はＭＩＦをコードするｍＲＮＡの塩基配列を任意の公知の方法により決定し、それらに基づいてポリヌクレオチドを設計することができる。
【００２６】
上述のような塩基配列を含むポリヌクレオチドは、種々の機構によりＭＩＦの発現を阻害すると考えられる。考えられる発現阻害機構としては、（１）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖を特異的に加水分解するリボヌクレアーゼＨによるｍＲＮＡ／ポリヌクレオチド複合体の分解、（２）リボソーム複合体による翻訳の阻害、及び（３）ポリヌクレオチドがイントロンとエキソンの境界部を標的とする場合には、ｍＲＮＡのスプライシングの阻害等が挙げられる。
【００２７】
ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれであってもよいが、抗原提示細胞等の標的細胞へのデリバリー効率を向上させるためには、安定性が高く血中半減期のより長いＤＮＡがより好ましい。
【００２８】
好ましいポリヌクレオチドの具体例として、配列番号１で表される下記のポリヌクレオチドと、３’末端側に３０個のｐｏｌｙ（ｄＡ）配列を含み、下記の配列番号２で表されるポリヌクレオチドが挙げられる。
5’-tggtgttcacgatgaacataggcatg-3’  ［配列番号１］
5’-tggtgttcacgatgaacataggcatgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’  ［配列番号２］
【００２９】
配列番号１で表される塩基配列は２６塩基からなり、ヒトやマウス等の多くのほ乳類におけるＭＩＦのセンス配列中の開始コドンを含む８つのアミノ酸配列ＭＰＭＦＩＶＮＴをコードする塩基配列に相補的な２４の塩基配列を含んでいる（下記表１を参照）。
【００３０】
【表１】
2010207109.tif 000002
【００３１】
β−１，３−グルカンとの複合体形成能を向上させるために、ポリヌクレオチドは、５’末端側及び３’末端側のいずれか一方又は双方に、β−１，３−グルカンとの複合体形成能が高いｐｏｌｙ（Ａ）配列、ｐｏｌｙ（Ｃ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ）配列、及びｐｏｌｙ（ｄＴ）配列のいずれかの繰り返し配列を有していることが好ましい。好ましい繰り返し配列を構成する塩基及びヌクレオチドの種類並びに塩基数は、センス配列の少なくとも一部を有する核酸（ｍＲＮＡ）とハイブリダイズし、ＭＩＦの発現を阻害することが可能な塩基配列又はアンチセンス配列（以下、総称して「ＭＩＦの発現阻害に関与する塩基配列」と呼ぶ場合がある。）の長さ、用いられるβ−１，３−グルカンの種類及び分子量等に応じて適宜決定される。例えば、β−１，３−グルカンとしてシゾフィランが用いられる場合には、繰り返し配列としてｐｏｌｙ（Ａ）配列又はｐｏｌｙ（ｄＡ）配列を有していることが好ましく、繰り返し配列の長さは、ＭＩＦの発現阻害に関与する塩基配列の長さ以上であることが好ましく、例えば、１０〜６０塩基長である。
【００３２】
上記のような塩基配列を有するポリヌクレオチドは、化学合成法、遺伝子工学的手法等の任意の公知の方法を用いて合成することができる。
【００３３】
上記のようなポリヌクレオチドをβ−１，３−グルカンと相互作用させ、複合体を形成させる。β−１，３−グルカンと複合体を形成させることにより、ポリヌクレオチドを加水分解から保護し、血液及び体液中における半減期を大幅に（例えば１０倍程度）に増大させることができる。そのため、ポリヌクレオチドを標的細胞により確実にデリバリーすることが可能になる。
【００３４】
主鎖がβ−１，３−グルカン及びβ−１，３−キシランからなる多糖は、ｐｏｌｙ（Ｃ）等の核酸と近似するヘリックスパラメータを有しており（例えば、高橋、小畠、鈴木、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｐｈｙｓ．Ｊｐｎ．２７巻、７６７ページ、及び「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ」、Ｓｈａｒｗｏｏｄ ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、１９９８年を参照）、核酸塩基と水素結合可能な水酸基を有しているため、核酸と相互作用し、三重らせん構造を有する安定な複合体を形成することが知られている。β−１，３−グルカンの具体例としては、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン等が挙げられる。これらは、主鎖がβ−結合（β−Ｄ−結合）により結合したグルカンで、側鎖の頻度が異なる天然の多糖である。これらのβ−１，３−グルカンは、化学修飾等の処理を行うことなくそのまま用いてもよいが、通常の過ヨウ素酸化法を用いてその側鎖を適当に間引くことにより、その溶解性を制御することもできる。
【００３５】
β−１，３−グルカンの分子量は、炎症性腸疾患の治療剤の調製に用いられるポリヌクレオチドの塩基長、繰り返し配列の塩基長等に応じて適宜調節される。しかし、分子量が小さいと、いわゆるクラスター効果（高分子系の協同現象）が発現し難くなり好ましくない。通常は、核酸と複合体を形成しうるβ−１，３−グルカンの重量平均分子量としては、核酸塩基の種類や高次構造によって異なるが、好ましくは２０００以上、さらに好ましくは４０００以上、より好ましくは６０００以上である。また、ポリヌクレオチド上の核酸塩基と水素結合を形成する水酸基の数は、通常は、５個以上、好ましくは、８個以上、さらに好ましくは、１０個以上必要である。
なお、β−１，３−グルカンの重量平均分子量は、光散乱法、沈降速度法（超遠心法）等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。
【００３６】
β−１，３−グルカンは、一般に菌類や真性細菌によって産生されるため、これらの微生物を培養後、菌体をホモゲナイズし、細胞溶出分や不溶性残渣等の不純物から超遠心法等の方法により単離することにより得ることができる。一般に、このようにして得られるβ−１，３−グルカンは高分子量（重量平均分子量が数十万程度）で三重らせん構造を取る。必要に応じて低分子化して用いてもよい。低分子化は、β−１，３−グルカンの種類や所望の分子量に応じて、酵素分解、酸加水分解等から適宜適当な方法及び条件を選択して行う。例えば、シゾフィランの場合には、８０％ＤＭＳＯ−硫酸による加水分解等により、種々の分子量を有する一本鎖シゾフィランを得ることができる。
【００３７】
シゾフィラン等のβ−１，３−グルカンは、通常、水中で三重らせん構造を呈している。したがって、ポリヌクレオチドと複合体を形成するためには、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）のような溶媒に溶解して分子間水素結合及び疎水性相互作用による会合状態を解いて一本鎖にする。これにポリヌクレオチドを含有する水溶液（又はアルコール等の極性溶媒の溶液）を添加してゆくと、溶媒の極性の増大に伴い、疎水性相互作用によりポリヌクレオチドとβ−１，３−グルカンとが会合し、ポリヌクレオチドの分子鎖を取り込みながら分子内および分子間でポリヌクレオチドと多糖との会合体が形成される。その結果、１分子のポリヌクレオチドと２分子のβ−１，３−グルカン分子とからなる三重らせん構造を有する複合体が形成される。複合体の形成は、例えば、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを測定することにより、コンホメーション変化を調べることによって確認することができる。得られる複合体は、一般に水溶性であり、温度変化やｐＨの変化によって解離及び再結合する。更に、複合体は核酸分解酵素に対する耐性を有し、ポリヌクレオチドが破壊されることもない。
【００３８】
上に述べたような、ポリヌクレオチドとβ−１，３−グルカン分子との複合体を含む炎症性腸疾患の治療剤の製剤には、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤及び添加物）及び製剤方法を用いることができる。例えば、炎症性腸疾患の治療剤は、錠剤、座剤、カプセル剤、シロップ剤、ナノゲル等のマイクロカプセル剤、滅菌液剤、懸濁液剤等の形態を取ることができる。
【００３９】
得られる炎症性腸疾患の治療剤は、安全で毒性を有しない。そのため、ヒト又は温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口及び非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、皮下及び筋中注射、腹腔内投与、直腸投与、内視鏡等による腸内投与等が挙げられる。
【００４０】
活性成分であるポリヌクレオチドとβ−１，３−グルカン分子との複合体の用量は、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の重篤度、投与方法等に応じて異なる。体重６０ｋｇの成人を例に取ると、経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇである。他の動物に投与する場合には、上記用量を単位体重当たりの用量に換算後、投与対象となる動物の体重を乗じて得られた用量を用いる。
【実施例】
【００４１】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：ポリヌクレオチドとシゾフィランとの複合体の調製
（１）三重らせんシゾフィランの調製
文献（Ａ．Ｃ．Ｓ．３８（１），２５３（１９９７）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９，１２１−１３５（１９８１））記載の定法にしたがい、三重らせんシゾフィランを調製した。すなわち、最少培地を用いて、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ．Ｆｒｉｅｓ（ＡＴＣＣ ４４２００）を７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量４５万の三重らせんシゾフィランを得た。これをＤＭＳＯに溶解（１％）させて三重らせんを解き、１本鎖にした。これを限外ろ過にて溶液を水に置換した。凍結乾燥後、８０％ＤＭＳＯ−硫酸中１００℃で加水分解し、限外ろ過により溶媒を水に置換した。このようにして、重量平均分子量約１００００の１本鎖シゾフィランを得た。
【００４２】
（２）ポリヌクレオチドの調製
下記の表２に示す３種類の塩基配列を有するポリヌクレオチドを、Ｎａｐａｊｅｎｏｍｉｃｓ社（北九州市若松区）より購入した。いずれのポリヌクレオチドも、３’−末端側にシゾフィランに対し高い結合能を有する３０個のｄＡからなるｐｏｌｙ（ｄＡ）配列（表２中では「ｄＡ３０」と表記している。）を有している。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
「ＡＳＭＩＦ＋ｄＡ３０」（配列番号２）は、表１における「アンチセンス配列」（配列番号１）を含む。「ＳＥＭＩＦ＋ｄＡ３０」（配列番号３）は、表１における「センス配列」を含む。「ＳＣＭＩＦ＋ｄＡ３０」（配列番号４）は、配列番号１で表される塩基配列のスクランブル配列を含む。
【００４５】
シゾフィランの濃度を０．５ｇ／ｄＬに調整し、この溶液１００μＬ、１０００μＬの純水（ｐＨ＝６．５）と、０．１ｇ／ｄＬのポリヌクレオチド溶液１００μＬを混合し、複合体の水溶液を調製した。得られた溶液は透明で均一であった。以下、上記の３種類の塩基配列（配列番号２〜４）を有するポリヌクレオチドを用いて調製した複合体を、それぞれ、「ＡＳＭＩＦ複合体」、「ＳＥＭＩＦ複合体」、及び「ＳＣＭＩＦ複合体」と略称する。
【００４６】
実施例２：腸炎マウスモデルにおける投与実験
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２％デキストラン硫酸（ＤＳＳ）を５日間飲水させ、腸炎マウスモデルを作製した。その後、モデルを４群に分け、ＤＳＳの投与開始から０日目、３日目、７日目、及び１０日目に、それぞれの群に対し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、シゾフィラン（ＳＰＧ）、ＳＣＭＩＦ複合体、及びＡＳＭＩＦ複合体を腹腔内投与（０．２ｍｇ／ｋｇ）した。以下、それぞれの群を、「ＰＢＳ投与群」、「ＳＰＧ投与群」、「ＳＣＭＩＦ投与群」、及び「ＡＳＭＩＦ投与群」と呼ぶ。
【００４７】
ＤＳＳの投与開始から１４日間、各群のマウスについて毎日体重測定を行った。ＤＳＳの投与開始から１４日目に、各群のマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、大腸を摘出後その全長を測定し、組織学的観察を行った。また、腸間膜リンパ節及び大腸より単核球を採取し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激後、ＥＬＩＳＡ法（タンパク質抽出物）及びリアルタイムＰＣＲ法（ＲＮＡ抽出物）を用いてＭＩＦの発現量を測定した。また、血清中のＭＩＦ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４８】
（１）体重変化
各群のマウスの体重変化を図１に示す。腸炎の増悪に伴い、各群ともＤＳＳの投与開始から０〜７日目にかけて体重の減少が観測された。７日経過後（ＤＳＳの投与終了から２日経過後）は、各群とも、腸炎の治癒に伴い体重は増加したが、特にＡＳＭＩＦ投与群においては、他群に比べて有意な（Ｐ＜０．０５）体重増加が認められた。このような、同じ塩基長を有するポリヌクレオチドを含む複合体を投与したにも関わらず、ＡＳＭＩＦ複合体投与時にのみ顕著な体重増加が認められたという結果は、ＡＳＭＩＦ複合体を投与しＭＩＦの発現を抑制することにより、ＤＳＳ刺激により発症したＩＢＤが有意に改善されることを示している。
【００４９】
（２）大腸の長さ
各群のマウスの大腸の長さの比較を図２に示す。ＩＢＤの発症により大腸の長さが短くなることが知られており、大腸の長さはＩＢＤの重篤度の指標として用いることができる。図２より、ＡＳＭＩＦ投与群のみ大腸の長さ（Ｃｏｌｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）が有意に（Ｐ＜０．０５）長いことがわかる。この結果も、ＡＳＭＩＦ複合体を投与しＭＩＦの発現を抑制することにより、ＤＳＳ刺激により発症したＩＢＤが有意に改善されることを示している。
また、結果は示さないが、組織学的観察の結果からも、ＰＢＳ投与群、ＳＰＧ投与群及びＳＣＭＩＦ投与群においては、腸管表面の組織の損傷が認められたのに対し、ＡＳＭＩＦ投与群においては、組織が回復しているのが観測された。
【００５０】
（３）ＭＩＦの発現量
各群のマウスのサイトカインの発現量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）及び血中ＭＩＦ濃度の比較を、それぞれ図３及び図４に示す。いずれの結果からも、ＡＳＭＩＦ投与群のみＭＩＦの発現量が有意に低く、他の３群については有意差が認められなかった。また、図３の結果から、ＭＩＦのみならず、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の発現量についても同様の結果が認められた。以上の結果から、ＡＳＭＩＦ複合体によるＭＩＦの発現抑制効果とＩＢＤの症状の改善効果との間に相関が存在することが示唆された。
【００５１】
実施例３：ＲＡＷ２６４．７細胞からのＭＩＦの放出量に及ぼすＡＳＭＩＦ複合体の効果
マウス由来のマクロファージ様細胞であり、ＬＰＳ刺激によりＴＮＦα及びＭＩＦを産生及び放出する事が知られているＲＡＷ２７６．４細胞を、２０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で１２ウェルプレートに播種し、２４時間の前培養を行った。次にＳＰＧ、ＳＣＭＩＦ複合体、ＳＥＭＩＦ複合体及びＡＳＭＩＦ複合体を添加し、２４時間培養を行った。更に、ＰＢＳ（−）Ｂｕｆｆｅｒ（含０．２５％ＢＳＡ）に溶解したＬＰＳ（Ｌ６５２９、ＳＩＧＭＡ社製）を調製し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬになるように各ウェルに添加し１時間培養した。この培養上清を用い、ＭＩＦの放出量を測定した。培養は、１００単位のペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄ５７９６
ＳＩＧＭＡ）に１０％ＦＢＳを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で行った。ＭＩＦの放出量の測定には、ＩＤＬＩＳＡ Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ ＭＩＦ測定キット（Ｓａｐｐｏｒｏ．ＩＤＬ．社製）を使用した。
【００５２】
図５に示すように、無添加の細胞（図５中「ｎｏｎ」）においてＭＩＦの放出量が２．０ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍＬの添加によりＭＩＦの放出量が約６．５ｎｇ／ｍＬに増大した。この結果は、ＬＰＳの刺激によるＭＩＦの産生及び放出を示しており、細胞のレスポンスが正常に作用していることを示している。また、ＡＳＭＩＦ複合体（図５中「ＡＳ」）、ＳＥＭＩＦ複合体（図５中「ＳＥ」）、及びＳＣＭＩＦ複合体（図５中「ＳＣ」）のいずれも、ＬＰＳ単独投与時及びＳＰＧ投与時よりもＭＩＦの放出抑制効果を示したが、特に、ＡＳＭＩＦ複合体は、濃度依存的にＭＩＦの放出を抑制することがわかる。ＡＳＭＩＦ複合体によるＭＩＦの放出抑制効果は、他の複合体よりも顕著であり、添加濃度が５００ｎＭの場合、２．０ｎｇ／ｍＬ程度（ＡＳＭＩＦ複合体不添加時の１／３以下）までＭＩＦの放出を抑制していることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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