(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の標的遺伝子を発現させる１のベクター、および１のベクターで複数の標的遺伝子を発現させる方法を提供すること。【解決手段】１のベクター上に、プロモーター領域、標的遺伝子領域及びポリＡ付加領域を有する発現単位を２以上含む発現ベクターであって、該発現単位の少なくとも２以上が同一方向に転写されるように同一鎖上に配置された発現ベクター、該発現ベクターを導入した細胞、及び該発現ベクター導入細胞の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター領域、標的遺伝子領域及びポリＡ付加領域を有する発現単位を２以上含む発現ベクターであって、該発現単位の少なくとも２以上が同一方向に転写されるように同一鎖上に配置された発現ベクター。
【請求項２】
プロモーター領域が、１分子のポリメラーゼによって制御を受ける配列である請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
プロモーター領域が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから選択される１のポリメラーゼによって制御を受ける配列である請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
発現単位を３以上含む請求項１から３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の発現ベクターであって、複数の標的遺伝子の発現が可能である発現ベクター。
【請求項６】
転写干渉抑制作用を備えることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入されたことを特徴とする細胞。
【請求項８】
細胞が、真核細胞である請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
細胞が多分化能を有することを特徴とする請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか１項に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む形質転換細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれか１項に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む多分化能を有する細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の標的遺伝子を一つのベクターで発現させるための発現ベクター、当該発現ベクターが導入された細胞、当該発現ベクターによって複数の標的遺伝子を発現させる方法、及び当該発現ベクターの導入により複数の遺伝子発現に基づく細胞の形質転換を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の分化転換においては、多数のネットワーク構成遺伝子が相互に機能し働いていると考えられ、該ネットワーク構成遺伝子をセットで導入する方法が求められてきた。例えばｉＰＳ細胞の作製においては、複数の特定転写因子（例えばＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣ，ＫＬＦ４等）をセットで機能させることが必要であることが報告されている（非特許文献1）。
【０００３】
複数の遺伝子を発現させることが求められる例においては、複数の標的遺伝子を各々個別の発現ベクターに組込み、これら発現ベクターを細胞群に共導入させ発現させる方法、又は、一つの発現ベクターに複数の標的遺伝子を組込み、該発現ベクターを細胞群に導入させ発現させる方法が用いられてきた。例えば八幡らは１分子ベクター上に複数の転写単位を乗せた方法を使用しており（非特許文献２）、また上記ｉＰＳ細胞の樹立においては、一般に因子毎にレトロウイルスベクターを作成し共導入して発現させている（非特許文献１）。
【０００４】
しかし、多種類の発現単位を別々の発現ベクターに組込み細胞群へ共導入する方法においては、処理細胞すべてに全種類の遺伝子が導入されるとは限らず、共導入後、所望の遺伝子が全て導入された細胞を選択する必要があった。このため、選択により遺伝子導入細胞が少数になること、及び、各因子の発現量のばらつきが大きく、効果の解析が困難である等の問題があった。
【０００５】
また、一つの発現ベクターに複数の標的遺伝子を組込んだ後、細胞群に導入させ発現させる方法においては、同一ベクターの同一方向に２以上の発現単位を搭載すると転写干渉と呼ばれる現象が起き、下流側の発現効率が極端に落ちるという問題があった（非特許文献３）。転写干渉は、１の転写工程が、直接、隣接した第２の転写工程を抑制する作用のことをいい、その現象がおこるメカニズムには、プロモーター競合、シィッテングダック干渉、閉鎖、衝突、妨害の５種類があると報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
これを解決する１つの手段として、発現単位を一つのベクターの同一鎖上に逆方向に連結させることによって転写干渉を回避する方法が知られている。しかし、この方法は、３以上の発現単位を発現させたい場合に転写干渉を回避することが困難であるという問題があった。
【０００７】
また、上述の八幡らの場合、ｃｈｉｃｋｅｎ  ＨＳインスレーターを挿入することにより転写干渉を緩和させているが、多数の転写単位を連結するに当たっては、ベクターの構築において同一プロモーター及びインスレーターから成る数百ベース以上の繰り返し配列を構築することになり、大腸菌内で組み換え／欠失を起こす頻度が高くなる（すなわちベクター構築が困難であること）という問題があった。
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  Ｔａｎａｂｅ  Ｋ，  Ｏｈｎｕｋｉ  Ｍ，  Ｎａｒｉｔａ  Ｍ，  Ｉｃｈｉｓａｋａ  Ｔ，  Ｔｏｍｏｄａ  Ｋ，  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ（２００７）１３１，８６１−８７２
【非特許文献２】Ｋａｚｕｈｉｄｅ  Ｙａｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７）３７４，５８０−５９０
【非特許文献３】Ｓｈｅａｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３９−３４５  Ｖｏｌ．２１  Ｎｏ．６  Ｊｕｎｅ  ２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、複数の標的遺伝子を１つのベクターで発現させることができる発現ベクター、及び、当該発現ベクターが導入された細胞を提供することである。特には、当該ベクターであって、構築が容易なベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは以上の点に鑑み検討を行った結果、１分子のポリメラーゼによる転写系の制御を利用することにより、１つのベクターの同方向に複数の発現単位を連結した場合であっても、複数の遺伝子を発現させることが可能であることを見出した。また、当該ベクターが、発現単位を連結後、ベクターに導入することで容易に構築できることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
１．プロモーター領域、標的遺伝子領域及びポリＡ付加領域を有する発現単位を２以上含む発現ベクターであって、該発現単位の少なくとも２以上が同一方向に転写されるように同一鎖上に配置された発現ベクター。
２．プロモーター領域が、１分子のポリメラーゼによって制御を受ける配列である前記１に記載の発現ベクター。
３．プロモーター領域が、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３のＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼから選択される１のポリメラーゼによって制御を受ける配列である前記１に記載の発現ベクター。
４．発現単位を３以上含む前記１から３のいずれか１に記載の発現ベクター。
５．前記１から４のいずれか１に記載の発現ベクターであって、複数の標的遺伝子の発現が可能である発現ベクター。
６．転写干渉を抑制することにより複数の標的遺伝子の発現が可能である前記１から５のいずれか１に記載の発現ベクター。
７．前記１から６のいずれか１に記載の発現ベクターが導入されたことを特徴とする細胞。
８．細胞が、真核細胞である前記７に記載の細胞。
９．細胞が多分化能を有することを特徴とする前記８に記載の細胞。
１０．前記１から６のいずれか１に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む形質転換細胞の製造方法。
１１．前記１から６のいずれか１に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む多分化能を有する細胞の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のベクターは、同一ベクターの同一鎖上に、同方向に転写ユニットを連結しても、転写干渉を抑制することができ、複数の標的遺伝子を発現させることができる。特には、本発明は、１分子のポリメラーゼによる単純な転写系の制御を利用することにより、同一ベクターの同一鎖上に、同方向に転写ユニットを連結しても、転写干渉を抑制することができ、複数の標的遺伝子を発現させることができる。また、本発明の転写干渉が抑制された発現ベクターは、容易に構築することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の一形態について説明するが、本発明はこれに限られるものではない。また、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００１４】
本明細書においてプロモーター領域とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合することによって標的遺伝子を発現することが可能な転写開始に関与するＤＮＡ上の特定領域の塩基配列のことであり、このような機能を有する塩基配列であれば特に限定されるものでなく、公知のプロモーター領域を用いることができる。本明細書で使用するプロモーター領域として、好ましくは、１分子からなるポリメラーゼにより制御を受けるプロモーター領域であり、より好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及び、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによって制御を受けることが知られている、Ｔ７ファージＤＮＡのプロモーター領域、Ｔ３ファージＤＮＡのプロモーター領域、及び、ＳＰ６ファージＤＮＡのプロモーター領域である。
【００１５】
本明細書中においてＴ７ファージＤＮＡのプロモーター領域は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写できる配列であれば特に限定されないが、例えば、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１）からなるＤＮＡ塩基配列を備える領域、又は、当該配列に１若しくは数個（好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ塩基配列であって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより制御を受けることが可能な塩基配列を包含する。例えば、Ｔ７ファージＤＮＡのプロモーター領域は、５’末端が１〜数個欠失している配列を備える領域であってもよい。
また、バクテリオファージＴ３由来のプロモーター領域とは、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写できる配列であれば特に限定されないが、例えば、ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号２）からなるＤＮＡ塩基配列を備える領域、又は、当該配列に１若しくは数個（好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ塩基配列であって、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼに制御を受けることが可能な塩基配列を備える領域を包含する。
更に、バクテリオファージＳＰ６由来のプロモーター領域は、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写できる配列であれば特に限定されないが、例えば、ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号３）からなるＤＮＡ塩基配列を備える領域、又は当該配列に１若しくは数個（好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ塩基配列であって、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼに制御を受けることが可能な塩基配列を包含する。例えば、バクテリオファージＳＰ６由来のプロモーター領域は、５’末端が１〜数個欠失している配列を備える領域であってもよい。
【００１６】
本発明に係るベクターに組込む標的遺伝子は、所望の遺伝子を選択することができ、本方法において発現可能な遺伝子であれば特に限定されない。例えば、本発明に係るベクターに組込む標的遺伝子の大きさは、１０〜１０，０００ｂｐとすることができる。
【００１７】
該標的遺伝子は、当業者に公知の技術を組み合わせて作製することができる。例えば、標的遺伝子を構成する構成要素の各遺伝子配列を化学的合成法、又はクローニング法によって個々に調整し、これら構成要素をリガーゼを用いて順次連結し、又は、ＰＣＲ増幅法を組み合わせることにより目的の遺伝子を作製することができる。
【００１８】
本発明に係るポリＡとは、ｍＲＮＡの３’末端に付加した２〜２００塩基のアデニン（Ａ）ヌクレオチドのことをいう。本願におけるポリＡは、好ましくは１０から１００塩基のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをいい、より好ましくは１５から６０塩基のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをいう。
【００１９】
本明細書において発現単位は、プロモーター領域、標的遺伝子領域、及び、ポリＡ付加領域を含む。また本発明における発現単位は、その他の配列、例えば、Ｋｏｚａｋ配列、ＵＴＲ領域、ＳＴＮＶ領域、ＴＥＶ領域、ｏｂｅｌｉｎ領域、Ｔ７ターミネーター領域、その他エンハンサー領域、又は、分離精製用タグ等を含むものであってもよい。
【００２０】
発現単位は、上述の方法により作製された標的遺伝子にプロモーター領域及びポリＡ領域を付加することにより作製することもできるし、核酸の化学合成法（ＤＣＣ法、りん酸トリエステル法、ホスファイト法、アミダイト法等）、又は、発現単位を構成する構成要素の各遺伝子配列を化学的合成法、又はクローニング法によって個々に調整し、これら構成要素をリガーゼを用いて順次連結し若しくはＰＣＲ増幅法を組み合わせることにより作製することもできる。
【００２１】
本発明は、前記プロモーター配列、前記標的遺伝子配列、及び、前記ポリＡを含む発現単位を複数有するベクターを提供するものである。本発明のベクターに含まれる発現単位の数は、２以上であれば特に限定されないが、例えば、２〜１００，０００個、２〜５０，０００個、２〜１０，０００個、２〜１，０００個、２〜２００個、２〜１００個、２〜５０個、又は、３〜１００，０００個、３〜５０，０００個、３〜１０，０００個、３〜１，０００個、３〜２００個、３〜１００個、３〜５０個とすることができる。例えば、ベクターとしてＢＡＣを使用した場合、本発明のベクターに含まれる発現単位の数は、２〜１，０００個、３〜２００個、２〜１００個とすることができる。また、例えば、ベクターとして染色体を使用した場合、本発明のベクターに含まれる発現単位の数は、３〜１０，０００個、３〜１，０００個、３〜１００個とすることができる。
【００２２】
本発明の発現単位を組み込むベクターは、当該技術において公知のものを用いることができ、例えば、本発明の上記発現単位を組み込むことができる適当な挿入部位すなわち制限酵素部位を有していること、該標的遺伝子を宿主細胞内で発現可能であること、及び／又は、該宿主細胞内で自律的に複製可能であること等の性質を有しているベクターを使用することができる。本発明のベクターは、複製開始点、ターミネーター配列、リボソーム結合配列等を適宜含むことができ、加えて、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子等の選択マーカーを含んでもよい。本発明のベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＢＡＣ、及び、染色体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。より具体的には、本発明のベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＷ７等のプラスミドを使用することができる。
【００２３】
本発明の発現ベクターは、細胞に所望の生理的な変化を起こすのに十分な量の標的遺伝子産物を発現するベクターであれば特に限定されない。例えば、本発明のベクターは、蛍光を確認することが可能な量の蛍光蛋白質を発現するベクター、又は、細胞に薬剤耐性能を与える量の薬剤耐性遺伝子産物を発現するベクターであってもよい。
【００２４】
本発明の発現ベクターは、公知の技術方法を用いて作製することができる。例えば、所望の標的遺伝子を有し適宜制限酵素切断部位を両端に配した発現単位をそれぞれ個々に作製した後、当該発現単位を結合して発現単位の結合物を作製し、その後、当該発現単位結合物の両端に配置した制限酵素切断部位で切断した断片を、適切な制限酵素により切断したベクターにリガーゼを用いて結合することにより、ベクターに導入することができる。また、発現単位の連結部と異なる制限酵素切断部位を発現単位結合物の両端に使用することにより、発現単位の結合物の作製と同時にベクターへの導入を行うこともできる。
【００２５】
発現単位の結合物の作成は、当業者周知の方法を適宜組み合わせて行うことができるが、例えば、適宜制限酵素切断部位を両端に有する発現単位を順に一つずつＴ４リガーゼで結合させていく（発現単位Ａ及び発現単位Ｂを結合した後、結合物ＡＢに発現単位Ｃを結合させる、以下、これの繰り返しにより発現単位を結合させていく）方法、発現単位の各連結部分に異なる制限酵素を使用することにより一度のライゲーションで連結させる方法、又は、各発現単位を一度に連結させた後、目的の順番で連結している結合物だけを選択して回収する方法等により行うことができる。
【００２６】
また、本発明の発現ベクターは、例えば、所望の標的遺伝子を有し適宜制限酵素切断部位を両端に配した発現単位をそれぞれ個々に作製した後、発現単位を組み込むベクターに、１個ずつ発現単位を組み込んでいくことにより作製することができる。各発現単位の両端に配置する制限酵素切断部位は、同一であってもよいし異なってもよいが、単離精製プロセスを経ないで作製する場合には異なる制限酵素切断部位を使用することが好ましい。
【００２７】
更に、本発明の発現ベクターは、例えば、既に所望の数のプロモーター領域とポリＡ領域及び該プロモーター領域とポリＡ領域の間に制限酵素切断部位を配置した発現ベクターに、所望の標的遺伝子を組み込むことにより作製することもできる。当該発現ベクター上の制限酵素切断部位は、同一であってもよいし異なってもよいが、異なる制限酵素切断部位を使用することが好ましい。
【００２８】
本発明のベクターを導入する細胞は、本発明のベクターにより複数の遺伝子を発現させることができる細胞であれば特に限定されず、真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよい。例えば、大腸菌等の細菌細胞、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞を使用することができ、好ましくは、動物細胞である。本発明で使用することができる動物細胞の種類は特に限定されないが、例えば、マウス等のげっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、又は、サル若しくはヒト等の霊長類に由来する細胞を使用することができる。細胞の種類としては、例えば、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン等の神経組織由来細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、各種臓器細胞、筋肉細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、線維芽細胞、樹立されている各種の細胞株、間葉系細胞、又は、幹細胞（ＥＳ細胞等）を使用することができる。
【００２９】
本発明の発現ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の通常の遺伝子導入法により行うことができる。例えば、コンピテントセルの使用、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ウイルスによる感染等を挙げることができる。
【００３０】
本発明の形質転換細胞は、上述の方法により上記ベクターを細胞に導入することにより得ることができる。本発明の形質転換細胞としては、例えば、上記ベクターの導入によって蛍光発生能、薬剤耐性能、多分化能を獲得した細胞等、遺伝的性質が変化した細胞であり、例えば、ｉＰＳ細胞等の多分化能を有する細胞である。本発明における形質転換細胞は、導入された当該ベクターのうち、当該発現単位がゲノムＤＮＡに組み込まれ、当該ベクターは分解された細胞であってもよい。また、本明細書における形質転換細胞は、本発明のベクターの導入により所望の形質を獲得した細胞であれば特に限定されず、従って、本発明のベクターを保持した状態であってもよいし、本発明が導入されたことにより、所望の形質を獲得した後に、ベクターが脱落したのもであってもよい。
【００３１】
本明細書における多分化能を有する細胞は、特定の転写因子（例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ等）をコードするＤＮＡを有する上記ベクターを細胞に導入することにより得ることができる（ＷＯ／２００７／０６９６６６：Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ２，Ｊｕｎｅ  ２００８：１０５−１１５：Ｓｃｉｎｅｎｃｅ  ２１  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００７：１９１７−１９２０：Ｎａｔｕｒｅ４５１，１４１−１４６，１０  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８）。このような多分化能を有する細胞は、一度多分化能を獲得した後は、外来遺伝子由来転写因子の働きがない状態でも多分化能を維持できることが知られている。よって、本明細書における多分化能を有する細胞は、本発明のベクターを保持した状態であってもよいし、本発明のベクターが導入されたことにより、多分化能を獲得した後に、ベクターが脱落したのもであってもよい。
【００３２】
本発明において標的遺伝子の発現方法は、上記の方法で発現ベクターを導入した細胞を発現可能な条件下適切な培地にて培養し、標的遺伝子を発現させる方法であれば特に限定されないが、発現を積極的に誘導する薬剤等を添加してもよい。
【００３３】
本願で使用する発現の確認は、標的遺伝子の発現が確認される方法であれば、特に限定されないが、例えば、発現タンパク質を単離・精製後、分子量の測定を行うことによって導入された遺伝子の翻訳産物であることを確認することができる。発現タンパク質の単離・精製は、例えば発現タンパク質の性質（親和性、分子量、イオンに対する選択性等）を利用して行うこともでき、また、タグ等を付加した標的遺伝子の発現については、タグに親和性のある素材を利用し単離・精製することができる。更に、標的遺伝子の発現の確認として、標的タンパク質に対する抗体を利用して検出するウエスタンブロッティング法や活性測定（蛍光強度測定、標識された基質の分解能測定、薬剤耐性能等）等を挙げることができる。
【００３４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これら実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
ＢＺｎＴＲ１細胞株の作製
（１）ＥＳ細胞の培養
フィーダーフリー株ＥＢ５（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手  Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２８：３１−４０，２０００）及びＥＢ３（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手  Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ９：４７１−４７７，２００４）を用いて、ゼラチンコート培養皿上にて以下の条件で培養した。
培地（Ｇｌａｓｇｏｗ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ：ＧＭＥＭ）
１０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ
１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ
１０−４Ｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１×  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１０００  Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ
培養条件
ゼラチンコートディッシュ上におよそ６，３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３日培養後に同密度に継代し維持した。
また、ｎＴＲの安定発現株の製造方法については、ｎＴＲと薬剤選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、安定形質転換細胞を選抜して行った。
【００３６】
（２）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰの構築
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、大腸菌株ＢＬ２１からプライマー５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号４）と５’−ＴＴＴＴＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＡＡＧＴＣＣＧＡ−３’（配列番号５）を用いてハイフィデリティＰＣＲ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｐｌｕｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、９８℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分を２０サイクル）で増幅した（配列番号６）。ＳＶ４０ラージＴ抗原由来核移行配列ＭＰＫＫＫＲＫＶＡ（配列番号７）をコードする５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＣＣ−３’（配列番号８）の直下にインフレームでＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を配置した。こうして作製した核移行シグナル付きＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（以下ｎＴＲと略す）をｐＣＡＧ−ＩＰ（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手）に組み込んでｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰを構築した。ＩＰはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−ｐｕｒｏ（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を指す。
構築したプラスミドの概略図を図１に示す。
【００３７】
（３）ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰをＥＢ３細胞株へ導入
マウスＥＳ細胞株ＥＢ３に、ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰを導入した。この細胞株をＢＺｎＴＲ１とした。
ｎＴＲの安定発現株の作製は、ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰを５０マイクログラム、ＳｃａＩにて直鎖上にしたのち、エレクトロポレーション法（８００Ｖ、３μＦ）にて１×１０７個の細胞へ導入し、３．１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で１０センチディッシュ５枚に播種、２日後にＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  （１．５μｇ／ｍｌ）を添加、薬剤を入れ続けて培養し１０日後に出現したコロニーを４８ウェルプレートへ継代し、３日後に２４ウェルプレートへとさらに継代、このときに増殖の速いクローンすなわち薬剤耐性遺伝子を細胞集団中で均一に発現するクローンを選択した。
【実施例２】
【００３８】
発現単位にＩＲＥＳを含む発現ベクター
（１）ｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔの構築
ｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔは、ｐＢＲ３２２プラスミドにＴ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣ−３’：配列番号９）＋ＩＲＥＳ＋ＥＧＦＰ＋Ｔ７ターミネーターをこの順に組み込んだ。具体的には、制限酵素サイトＢａｍＨＩとＴ７プロモーター遺伝子配列を含むプライマー５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧ−３’  （配列番号１０）と、制限酵素サイトＮｃｏＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴ−３’  （配列番号１１）を用いてｐＣＡＧ−ＩＰ（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＩＲＥS（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）の遺伝子配列（配列番号１２）を増幅させた。次に制限酵素サイトＮｃｏＩを含むプライマー５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１３）と、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１４）を用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＥＧＦＰの遺伝子配列（配列番号１５）を増幅させた。同様に、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを含むプライマー５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡ−３’（配列番号１６）と、制限酵素サイトＳａｌＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡ−３’（配列番号１７）を用いてｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＴ７ターミネーターの遺伝子配列（配列番号１８）を増幅させた。最後に上記３つの断片と、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理したｐＢＲ３２２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し組換えを行った。ＴｔはＴ７ターミネーターを表す。
構築したプラスミドの概略図を図２に示す。
【００３９】
（２）細胞への導入
実施例１で作製したＢＺｎＴＲ１細胞株を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の密度で播種し、実施例１と同様の培養条件で一晩培養した。１μｇのｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰと１μｇのｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクション法にて試薬添付のプロトコールに従ってトランスフェクションを行った。
【００４０】
（３）ＥＧＦＰ遺伝子の発現確認
本実施例において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、構成的プロモーターＣＡＧにより常時発現した。すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターに結合し、ＥＧＦＰ遺伝子を含むｍＲＮＡが転写され、ｍＲＮＡの翻訳量が一定以上に到達すると、ＥＧＦＰの蛍光として確認できた。
上記細胞を一日培養した後、ＥＧＦＰの一過性発現を蛍光顕微鏡観察によって観測した。顕微鏡ＩＸ７１型（オリンパス社製）を用い、蛍光ミラーユニットのＧＦＰはＵ−ＭＧＦＰＨＱ（オリンパス社製）、ＤｓＲｅｄはＵ−ＭＲＦＰＨＱ（オリンパス社製）を使用した。
【００４１】
（４）結果
図３は、発現ベクターｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、ＥＧＦＰ遺伝子発現の結果を示す図である。図中、Ｔ７−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰでＥＧＦＰの発現を検出できた（図３右下の写真）。図３では、ｎＴＲを発現する細胞でのみ蛍光がみられることから、ｐＢＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰＴｔに内在するプロモーター活性によるＥＧＦＰの発現ではなく、Ｔ７系による転写であることがわかる。
このことから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって発現が制御される転写系はＥＳ細胞において機能することが示された。
【実施例３】
【００４２】
発現単位にＩＲＥＳ以外の他の構成領域を含む発現ベクター
（１）ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドの構築
構築した以下のプラスミドの概略図を図４に示す。
（１−１）ポリＡにおけるＡの数の検討
ｐＢＲ３２２プラスミドに、Ｔ７プロモーターの下流にＥＧＦＰ配列、ポリＡ配列（Ａの数が０個、１５個及び３０個）、及び、クラスIIＴ７ターミネーター配列（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：８８０２−１８８１１，１９９８）を組み込んだベクター、即ち、Ｔ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターを有するベクターを構築した。ここでポリＡとしては以下の配列を付加した。
Ａ０：５’  −ＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号１９）
Ａ１５：５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号２０）
Ａ３０：５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号２１）
また、Ｋｏｚａｋ配列（５’−ＡＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２２））は、Ｔ７プロモーター直下に配置した。
ベクター構築において、具体的には制限酵素サイトＳａｌＩ、Ｔ７プロモーター遺伝子配列及びＫｏｚａｋ配列を含むプライマー５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号２３）、各ポリＡの配列とＴ７ターミネータークラスIIの配列および制限酵素サイトＢａｍＨＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２４）、５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２５）、又は、５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２６）をそれぞれを用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＥＧＦＰの遺伝子配列（配列番号１５）を増幅させた。この断片と、予め制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで処理したｐＢＲ３２２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し組換えを行った。
【００４３】
（１−２）５’側翻訳効率向上配列としてＩＲＥＳ（約５００ｂｐ）を配置した発現ベクター
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドについて、Ｔ７プロモーターとＩＲＥＳの後に開始コドンＡＴＧから始まるコード領域を配置し、Ｔ７プロモーター−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を有するベクターを作製した。具体的なベクターの構築方法は、５’側プライマーとして５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧ−３’（配列番号２７）、３’側プライマーとして５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２８）を用いてｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔを鋳型として（１−１）と同条件で増幅し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理した後ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入した。ＩＲＥＳの配列は配列番号１２を使用した。
【００４４】
（１−３）５’側翻訳効率向上配列としてＳＴＮＶ配列、ＴＥＶ配列、又は、Ｏｂｅｌｉｎ配列を配置した発現ベクター
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドについて、Ｔ７プロモーターと以下の配列の後に開始コドンＡＴＧから始まるコード領域を配置し、Ｔ７プロモーター  −ＳＴＮＶ、ＴＥＶ、Ｏｂｅｌｉｎ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を有するベクターを構築した。具体的なベクターの構築方法は、５’側プライマーとして翻訳効率向上配列を含む５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号２９）、３’側プライマーとして５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号３０）を使用した以外は（１−１）と同様の方法を用いて行った。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として（１−１）と同条件で増幅し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理した後ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入した。
ＳＴＮＶ配列、ＴＥＶ配列、又は、Ｏｂｅｌｉｎ配列は、以下の配列を使用した。
ＳＴＮＶ：５’−ＡＧＴＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号３１）（Ｔｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：９５０４−９５１０，１９９３）
ＴＥＶ：５’  −ＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号３２）（Ｎｉｅｐｅｌ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｅ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：９０８０−９０８８，１９９９）
Ｏｂｅｌｉｎ：５’−ＡＣＧＡＴＣＧＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＴＧＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡ−３’（配列番号３３）（Ｓｈａｌｏｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８８：７３０−９，２００４）
【００４５】
（１−４）５’ＵＴＲ最小配列を配置した発現ベクター
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドについて、Ｔ７プロモーターとＵＴＲ最小配列の後に開始コドンＡＴＧから始まるコード領域を配置し、Ｔ７プロモーター−ＵＴＲ−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を有するベクターを構築した（ｐＰｙＴ７−ＵＴＲ−ＥＧＦＰ−Ａ３０ｔ）。具体的なベクターの構築方法は、５’側プライマーとして５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３４）、３’側プライマーとして５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号３５）を使用した以外は（１−１）と同様の方法を用いて行った。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として（１−１）と同条件で増幅し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理した後ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入した。ＵＴＲ最小配列：５’−ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３６）
【００４６】
（２）細胞への導入、ＥＧＦＰ遺伝子の発現、発現確認については、実施例２と同様の方法で行った。
【００４７】
（３）結果
発現ベクターｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、ＥＧＦＰ遺伝子発現をＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）解析した結果を図５に示す。解析方法は、前方散乱光（ＦＳ：大きさ）、側方散乱光（ＳＳ：内部構造）の２パラメーターでメジャーな集団を用い（全体の４５％前後）、ＧＦＰ蛍光を４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励起、検出を行った。ＥｍｐｔｙでＧＦＰ陽性集団が０．２％存在するが、ＢＺｎＴＲ１はＧＦＰを微弱に発現しており、その蛍光漏れ込みであると推測される。
【００４８】
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔにおいて、ＥＧＦＰの３’側Ａが３０個、１５個、０個の発現ベクターにおいては、３０個が一番良い翻訳効率だった（図５はＡ０及びＡ３０の例を示した）。また、５’側翻訳効率向上配列としてＩＲＥＳ（約５００ｂｐ）を用いると翻訳効率が顕著に向上することが確認できた。更に、ＳＴＮＶ配列、ＴＥＶ配列、及びＯｂｅｌｉｎ配列を用いても、発現を確認することができた。（ＳＴＮＶのみ示した）。更にまた、真核生物プロモーターからの転写産物において翻訳可能な５’ＵＴＲ最小配列を挿入すると蛍光がみられなくなったことから、Ｔ７系では翻訳効率を上昇させる働きは非常に小さいと考えられた。
【実施例４】
【００４９】
（１）ｐＲＧとｐＲＧｉｎｖの構築（２種の発現単位を有する発現ベクター）
ｐＲＧ及びｐＲＧｉｎｖは、ＧＦＰとＤｓＲｅｄの２種類の遺伝子を使用して、それぞれ、Ｔ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−Ａ３０−Ｔ７  ターミネーターとＴ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＤｓＲｅｄ−Ａ３０−Ｔ７  ターミネーターからなる発現単位を作製し、順向きあるいは逆向きに上述の方法と同様に構築した。
ベクター構築において、具体的には５’側プライマー５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号３７）と３’側プライマー５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号３８）、鋳型としてｐＣＡＧ−ＤｓＲｅｄ−ＩＰを用いて実施例３の（１−１）と同条件でＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＤｓＲｅｄ−Ａ３０−Ｔ７  ターミネーター断片として増幅し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した後平滑化し、実施例３の（１−１）作製したプラスミドｐＰｙＴ７ＥＧＦＰＡ３０ｔの平滑化したＳａｌＩサイトに挿入した。
構築したプラスミドの概略図を図６に示す。
（２）細胞への導入、ＥＧＦＰ遺伝子の発現、発現確認については、実施例２と同様の方法で行った。
また、発現確認においては、薬剤耐性能を有する遺伝子の発現を確認するため、薬剤添加を行った。薬剤耐性株の選択のためには、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ（Ｎａｃａｌａｉ社）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ）をＮｅｏｍｙｃｉｎを用いた。一過性発現であるため、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎを３００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌで条件検討を行い、一日で生存する細胞（薬剤耐性遺伝子が発現された細胞）と死滅する細胞との見分けがつく程度の薬剤濃度を決定した。
（３）結果
発現ベクターｐＲＧ及びｐＲＧｉｎｖを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、標的遺伝子発現の結果を図７に示す。順向き逆向きいずれにおいても視認できる程度の発現が確認された。
【実施例５】
【００５０】
（１）ｐＧＲＮＨの構築（４種の発現単位を有する発現ベクター）
４種の標的遺伝子を発現させるため、ＥＧＦＰ，ＤｅＲｅｄ，Ｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子），Ｈｐｈ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）について、それぞれＴ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ｃＤＮＡ（ＥＧＦＰ，ＤｅＲｅｄ，Ｎｅｏ，Ｈｐｈ）−Ａ３０−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を作製し、同一ベクターの同一鎖上に配置させ発現ベクターを構築した。
構築したプラスミドの概略図を図８に示す。
発現ベクターｐＧＲＮＨは、ＥＧＦＰ、ＤｅＲｅｄ、Ｎｅｏ、ＨｐｈのそれぞれをＰＣＲでＴ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ｃＤＮＡ−Ａ３０−Ｔ７  ターミネーターの順に配置したものを１つの発現単位として構築し、これら４つを連結しｐＢＲ３２２プラスミドに挿入した。ＥＧＦＰの配列は配列番号１５、ＤｓＲｅｄの配列は配列番号３９、Ｎｅｏの配列は配列番号４０、Ｈｐｈの配列は配列番号４１の配列を使用した。
具体的には、制限酵素ＳｆｉＩサイトを５’末端に配したプライマー（Ｔ７プロモーターあるいはＴ７ターミネーターを直下に配する）を用いて増幅し（テンプレートは市販のベクターを使用した）、ＳｆｉＩで切断後、電気泳動を行って目的遺伝子を回収した。回収した目的遺伝子量は、電気泳動を行い、そのエチジウムブロマイドによる蛍光強度から濃度を算出することにより確認した。モル比にして１：１：１：１となるように、ＥＧＦＰ，ＤｅＲｅｄ，Ｎｅｏ，及びＨｐｈの４断片を混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩連結反応を行った。ここで、ＳｆｉＩサイトの切断配列は任意の３塩基ＮＮＮであり、隣接させたい断片のＳｆｉＩサイトのＮＮＮと相補的なＮＮＮとすれば設計通りの断片同士が結合することとなり、４断片を設計通り配置することができる。
本実施例では、４断片について以下のプライマーで増幅することにより、各ＳｆｉＩサイトを作製した。
ＥＧＦＰ
ＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４２）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４３）
ＤｓＲｅｄ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４４）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４５）
Ｎｅｏ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４６）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４７）
Ｈｐｈ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４８）
ＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４９）
上記４つの増幅断片をＳｆｉＩで消化し、ゲル回収の後ライゲーションすると４断片が設計通りの順番で結合したものができた。
また、ＧＦＰとＨｐｈの片側については、プルーフリーディング活性のあるＰｆｘで増幅し、平滑末端とした。この末端にアダプター（５’−ＴＣＡＴＡＣＣＧＣＧＡＣＡＣＴ−３’（配列番号５０）と５’−ＡＧＴＧＴＣＧＣＧＧＴＡＴ−３’（配列番号５１）をアニーリング）を連結し、電気泳動後ゲル回収を行った。これをｐＢＲ３２２にクローニングした。
【００５１】
（２）細胞への導入、ＥＧＦＰ遺伝子の発現については、実施例２と同様の方法で行った。発現確認については、実施例４と同様の方法で行った。
【００５２】
（３）結果
発現ベクターｐＧＲＮＨを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、標的遺伝子発現の結果を図９に示す。ＧＦＰ，ＤｓＲｅｄ，Ｎｅｏ，Ｈｐｈを同一ベクターにクローニングしたｐＧＲＮＨを用いて、これをＢＺｎＴＲ１へ導入した結果、一日後に蛍光が確認できた（図９上）。また、薬剤耐性能試験の結果、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  が１，５００（μｇ／ｍｌ）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎが３００（μｇ／ｍｌ）で一日後に薬剤感受性細胞が死滅することがわかった。ｐＧＲＮＨを導入したＢＺｎＴＲ１について、この濃度で薬剤添加後一日において、両薬剤に耐性を示すことがわかった（図９下）。
【００５３】
本実施例においては、直列の４種遺伝子を発現させることが可能であることが示された。このことから原理的には所望の数の遺伝子を同時に発現させることができることが示された。つまり、これまではｉ）転写干渉ｉｉ）長鎖反復配列によるプラスミド構築の困難さの、いずれかの支障により多因子同時発現は不可能であった。本発明により２及び４個の発現単位で転写干渉を受けず（複数個つなげても転写干渉はないと推測できる）、且つ反復配列が５０ベース以下に抑制できた（経験上、反復配列として懸念される長さではない）ことから、複数個の発現単位からの発現を阻害する原因を全て取り除けたといえる。
【００５４】
本実施例の結果から、２以上の発現単位を同一ベクター上に搭載すると発現効率が極端に落ちる転写干渉現象の原因は、転写が多数の基本転写因子の協調的機能によるものであることにあると考えられた。すなわち多数の基本転写因子の協調的機能による転写の場合、その多数の構成因子のうちどの一つが機能阻害を受けても転写できなくなると考えられた。つまり、同様の働きをするタンパク質が競合的に働くことにより、転写機能の阻害の影響を受けやすくなっていると考えられる。例えば、１０因子からなる転写系を考えると、それぞれの因子が競合的阻害をうける確率が０．２であるとして、そのどれもが阻害を受けない（転写される）確率は０．８の１０乗、すなわち０．１１程度になる。一方、１因子からなる転写系だと、たとえ競合阻害を受ける確率が０．３だったとしても、転写される確率は０．７となる。従って、極めて単純なポリメラーゼとプロモーターから成る転写系、具体的には１分子のポリメラーゼにより制御を受ける転写系を用いることで、転写干渉を回避できることが示された。
【００５５】
以上のことから、本願発明に使用されるＲＮＡポリメラーゼは、一種類の分子で各プロモーターからの転写が可能である転写系であれば転写干渉を起こさないことが示された。一般に、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６のポリメラーゼは、それぞれ特異的なプロモーター領域に結合し、１分子のポリメラーゼによって転写調節を担うものと考えられている（Ｊｏｎaｔｈaｎ  Ｆｉｎｎ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎaｌ  ｅｘｐｒｅｓｓ  aｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０４−２７６９ｆｊｅ  Ｊaｎ．  ２６，２００５）。ここではＴ７系を用いたが、同じく一分子のＲＮＡポリメラーゼで転写できるＴ３系やＳＰ６系（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９：６０８−１０，  ２００５）でも同様の効果が得られると考えられる。
【００５６】
また、本願の実施例ではＥＳ細胞を使用したが、ＥＳ細胞は、外来のプロモーターを抑制する強い活性をもち、限られたハウスキーピング遺伝子プロモーターが使用できるのみであること、高速で増殖するため翻訳産物が拡散するのが速く、転写翻訳の効果を得られにくいこと、高速増殖と多能性に起因する高い毒性（あるいは分化誘導刺激）感受性により、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ分子が毒性（あるいはクロマチン状態や細胞の性質になんらかの影響）を示せばたちまち細胞は死滅（あるいは分化）することが知られている。従って、本発明のベクター又は方法は、これらの厳しい条件を有するＥＳ細胞において転写翻訳が可能な系であることから、他の全ての細胞においても使用できるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の発現ベクターを用いれば、１種のベクターを細胞に導入させることによって、複数の標的遺伝子を効率よく発現させることが求められる形質転換（例えばｉＰＳ細胞樹立）に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰの構成図である。
【図２】ｐＢＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔｔの構成図である。
【図３】ｐＢＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔｔを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、ＥＧＦＰ遺伝子発現の確認の結果を示す図である。図中、ｎＴＲはｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰの安定発現株、Ｔ７−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰはｐＢＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔｔの一過性トランスフェクション、Ｐｈは位相差、ＧＦＰはＧＦＰフィルターを示す。
【図４】発現ベクターｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔの構成図である。（１−１）はＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦP−ｐｏｌｙＡ−Ｔ７ターミネーターを、（１−２）はＴ７プロモーター  −ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７  ターミネーターを、（１−３）はＴ７プロモーター−ＳＴＮＶ、ＴＥＶ、Ｏｂｅｌｉｎ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７  ターミネーターを、（１−４）はＴ７プロモーター−ＵＴＲ−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７  ターミネーターをｐＢＲ３２２ベクターに組み込んだベクターである。
【図５】発現ベクターｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、ＥＧＦＰ遺伝子発現の確認をＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍaｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）解析によって行った図である。図中、ＥｍｐｔｙはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩ、Ｔ７−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰはｐＰｙＴ７ＩＲＥＳＥＧＦＰＡ３０ｔ、  Ｔ７−ＥＧＦＰ−Ａ０はｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ、Ｔ７−ＥＧＦＰ−Ａ３０は  ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰＡ３０ｔ、Ｔ７−ＳＴＮＶ−ＥＧＦＰ−Ａ３０は  ｐＰｙＴ７ＳＴＮＶ−ＥＧＦＰ−Ａ３０ｔを示す。
【図６】ｐＲＧとｐＲＧｉｎｖの構成図である。
【図７】発現ベクターｐＲＧ及びｐＲＧｉｎｖを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、標的遺伝子発現の確認の結果を示す図である。
【図８】ｐＧＲＮＨの構成図である。
【図９】ｐＧＲＮＨを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、標的遺伝子発現の確認の結果を示す図である。図中、矢印は生存細胞を表す。スケールは２００μｍである。
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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