(57)【要約】【課題】そのリガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害し、ミエリンによって媒介される成長円錐の崩壊と、神経突起成長の阻害を弱める分子を提供すること。【解決手段】免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、その抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸が開示される。このようなＮｏｇｏ受容体抗体、その抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸を含む組成物、ならびに、このようなＮｏｇｏ受容体抗体、その抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸を作成し、使用するための方法もまた、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経生物学および分子生物学に関する。さらに具体的には、本発明は、免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、その抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸に関する。本発明はさらに、このようなＮｏｇｏ受容体抗体、その抗原結合断片、免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、可溶性Ｎｏｇｏ受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸を含む組成物、さらには、このようなＮｏｇｏ受容体抗体、その抗原結合断片、免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、可溶性Ｎｏｇｏ受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸を作成し、使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ニューロンの軸索および樹状突起は、ニューロンからの長い細胞の伸張である。伸張途中の軸索または神経突起の先端部には、成長円錐として知られている特殊な領域が含まれている。成長円錐は、局所環境を感知し、ニューロンの標的細胞に向かっての軸索の成長を導く。成長円錐は、いくつかの環境による合図、例えば、表面接着、成長因子、神経伝達物質、および電場に反応する。円錐での成長の誘導には、種々のクラスの接着分子、細胞内シグナル、さらには、成長円錐を刺激し阻害する因子が関与している。成長途中にある神経突起の成長円錐は種々の速度で前進するが、通常は、１日あたり１から２ミリメートルの速度で前進する。
【０００３】
成長円錐は手の形状であり、広がった扁平な伸張（微小突起または糸状仮足）を有しており、これは胚の中の表面に対して別々に接着する。糸状仮足は、絶えず活動しており、一部の糸状仮足は、成長円錐の内部へと引っ込み、一方、他の糸状仮足は、基体を通り抜けて伸張し続ける。種々の糸状仮足の間での伸張により、葉状仮足が形成される。
【０００４】
成長円錐は、その葉状仮足と糸状仮足を用いて、その前方と両側の領域を探索する。伸張によって、成長に好ましくない表面と接触すると、それは引っ込む。伸張によって、好ましい成長表面に接触すると、それは伸張し続け、その方向に成長円錐を導く。成長円錐は基体の表面レパートリーにおける小さなバリエーションによって導かれ得る。成長円錐が適切な標的細胞に到達すると、シナプス結合が作成される。
【０００５】
神経細胞の機能は、その当面の環境におけるニューロンと他の細胞との間での接触によって大きく影響される（Ｕ．Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９８８，６８，ｐ．８１９）。これらの細胞としては、特定の神経膠細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）の乏突起膠細胞、および末梢神経系（ＰＮＳ）のシュワン細胞（これは、神経軸索をミエリン鞘で覆う（多層膜の絶縁構造））（Ｇ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ，Ｅｄ．［Ｓｉｎａｕｅｒ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，１９９２］，ｐ．２８１）が挙げられる。
【０００６】
ＣＮＳニューロンは、損傷後に再生する能力を有しているが、この能力は、ミエリンの中に存在する阻害タンパク質の存在が原因であり、そして、それらの局所環境に通常見られる他のタイプの分子もおそらく原因で、再生が阻害される（Ｂｒｉｔｔｉｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００１，３０，ｐｐ．１１−１４；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，ｐｐ．２７９２−２８０３；Ｇｒｉｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，ｐｐ．３１４４−３１６０）。
【０００７】
乏突起膠細胞上に見られるいくつかのミエリン阻害タンパク質、例えば、ＮｏｇｏＡ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９；Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ，ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９４，１３，８０５−８１１；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９４，１３，７５７−７６７）、および乏突起膠細胞糖タンパク質（ＯＭ−ｇｐ、Ｍｉｋｏｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８，１０６，１２７３−１２７９）の特性が明らかにされている。これらのタンパク質は、それぞれ、ニューロンのＮｏｇｏ受容体−１のリガンドであることが別々に示されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１７，９４１−９４４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，１１９０−９３；Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９；Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００２，３５，２８３−９０）。
【０００８】
Ｎｏｇｏ受容体−１は８個のロイシンを多く含む繰り返しを含む、ＧＰＩ結合膜タンパク質である（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４０９，３４１−３４６）。阻害タンパク質（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐ）と相互作用すると、Ｎｏｇｏ受容体−１複合体は、成長円錐の崩壊および神経突起成長の阻害を導くシグナルを変換する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのリガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害し、ミエリンによって媒介される成長円錐の崩壊と、神経突起成長の阻害を弱める分子が、緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドおよびそれを含む融合タンパク質、ならびに、Ｎｏｇｏ受容体−１の特異的な免疫原性領域に対する抗体およびその抗原性断片に関する。本発明はまた、本発明の抗体に結合する免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドにも関する。本発明はまた、Ｎｏｇｏ受容体−１に結合するモノクローナル抗体によって結合されるＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドにも関する。このようなポリペプチドは、特に、免疫原として、または、本発明の抗体に対して同様の特異性を有している抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用することができる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにペプチドを作成する方法に関する。本発明の抗体、可溶性受容体、および受容体融合タンパク質は、Ｎｏｇｏ受容体−１をアンタゴナイズするかまたはブロックし、そしてそのリガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害すること、ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害すること、およびニューロンにおける神経突起成長または萌芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）の阻害を減少させることについて有用である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＡＡＡＦＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２６）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）；ＬＤＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号２９）；ＬＤＬＡＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３０）；ＬＤＬＡＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３１）；ＬＤＡＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３２）；ＬＤＡＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３３）；ＬＤＬＳＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３４）；ＬＤＬＳＳＤＥＡＥＬＲ（配列番号３５）；ＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）；ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）；ＡＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４１）；ＬＡＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４２）；ＬＤＬＳＤＮＡＡＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４３）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴ（配列番号４４）；およびＬＤＬＳＤＮＡＱＬＡＶＶＤＰＴＴ（配列番号４５）からなる群より選択される、ポリペプチド。
（項目２）
項目１に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
（項目３）
発現制御配列に動作可能に連結された、項目２に記載の核酸。
（項目４）
項目２または３に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目５）
項目２または３に記載の核酸を含むか、あるいは、項目４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目６）
項目１に記載のポリペプチドを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）項目５に記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）該宿主細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する工程
を含む、方法。
（項目７）
抗体を産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）項目１に記載のポリペプチドまたは項目５に記載の宿主細胞で、宿主を免疫化する工程；および
（ｂ）該抗体を回収する工程
を含む、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法によって産生された抗体、または、該抗体の抗原結合断片。
（項目９）
項目１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＨＢ  ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）によって産生されるモノクローナル抗体ではない、抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
項目８または９に記載の抗体または抗原結合断片であって、該抗体は、
（ａ）ニューロンの成長円錐の崩壊を阻害する；
（ｂ）ニューロンにおける神経突起成長および萌芽の阻害を減少させる；ならびに
（ｃ）リガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する、
抗体または抗原結合断片。
（項目１１）
前記神経突起成長および萌芽が軸索成長である、項目１０に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１２）
前記ニューロンが中枢神経系ニューロンである、項目１０に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１３）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目８または９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１４）
前記抗体がマウス抗体である、項目８または９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１５）
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体からなる群より選択される、項目８または９に記載の抗体。
（項目１６）
リガンドへのＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する方法であって、Ｎｏｇｏ受容体−１を項目１０に記載の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
（項目１７）
前記リガンドが、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害するための方法であって、該ニューロンを項目１０に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
（項目１９）
ニューロンにおける神経突起成長および萌芽の阻害を減少させるための方法であって、該ニューロンを項目１０に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
（項目２０）
前記神経突起成長または萌芽が軸索成長である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ニューロンが中枢神経ニューロンである、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２２）
薬学的に許容される担体と、項目８または９に記載の抗体または抗原結合断片とを含む、組成物。
（項目２３）
１つ以上のさらなる治療剤をさらに含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法であって、該ニューロンを、有効量の項目８または９に記載の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
（項目２５）
前記ニューロンがインビトロにある、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ニューロンが哺乳動物中にある、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記哺乳動物が、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、脳卒中、外傷性脳損傷、または脊髄損傷の兆候または症状を呈する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
哺乳動物において死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法であって、
（ａ）項目８または９に記載の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片を発現する培養された宿主細胞を提供する工程；および
（ｂ）該ニューロンの部位またはその付近において、哺乳動物中に宿主細胞を導入する工程
を含む、方法。
（項目２９）
哺乳動物中にある死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する遺伝子治療方法であって、項目８または９に記載の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを、該ニューロンの部位またはその付近に投与する工程を含み、該抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体または抗原結合断片は、該哺乳動物中のヌクレオチド配列から、該ニューロンの生存を促進するために十分な量で発現される、方法。
【００１１】
いくつかの実施形態においては、本発明により、ＡＡＡＦＴＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２６）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）；ＬＤＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号２９）；ＬＤＬＡＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３０）；ＬＤＬＡＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３１）；ＬＤＡＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３２）；ＬＤＡＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３３）；ＬＤＬＳＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３４）；ＬＤＬＳＳＤＥＡＥＬＲ（配列番号３５）；ＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）；ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）；ＡＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４１）；ＬＡＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４２）；ＬＤＬＳＤＮＡＡＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４３）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴ（配列番号４４）；およびＬＤＬＳＤＮＡＱＬＡＶＶＤＰＴＴ（配列番号４５）からなる群より選択されるポリペプチドが提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のポリペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態においては、核酸は、発現制御配列に動作可能であるように連結される。いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明の核酸を含むベクターが提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明の核酸を含むか、または本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養すること、および宿主細胞または培養培地からポリペプチドを回収することを含む、本発明のポリペプチドを産生する方法が提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、本発明により、宿主を、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸を含むかまたは本発明のベクターを含む宿主細胞で免疫化し、抗体を回収する工程を含む、抗体を産生する方法が提供される。本発明により、また、この方法によって産生される抗体、またはその抗原結合断片も提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。ここでは、抗体はハイブリドーマ細胞株ＨＢ  ７Ｅ１１によって産生されるモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）ではない。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態においては、抗体または抗原結合断片は、（ａ）ニューロンの成長円錐の崩壊を阻害する；（ｂ）ニューロンにおける神経突起成長および萌芽の阻害を減少させる；ならびに（ｃ）リガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する。いくつかの実施形態においては、神経突起成長および萌芽は、軸索成長である。いくつかの実施形態においては、ニューロンは中枢神経系のニューロンである。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体はマウス抗体である。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体からなる群より選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、本発明により、リガンドへのＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する方法が提供される。この方法には、Ｎｏｇｏ受容体−１を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、リガンドは、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態においては、本発明により、ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害するための方法が提供される。この方法には、ニューロンを、本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態においては、本発明により、ニューロンにおける神経突起成長および萌芽の阻害を減少させるための方法が提供される。この方法には、ニューロンを、本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、神経突起成長または萌芽は、軸索成長である。いくつかの実施形態においては、ニューロンは中枢神経系のニューロンである。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、本発明により、薬学的に許容される担体と、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、組成物にはさらに、１つ以上のさらなる治療薬が含まれる。
【００２２】
いくつかの実施形態においては、本発明により、死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法が提供される。この方法には、ニューロンを、有効量の本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、ニューロンは生体外にある。いくつかの実施形態においては、ニューロンは哺乳動物中に存在する。いくつかの実施形態においては、哺乳動物は、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、またはアルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、脳卒中、外傷性脳損傷、または脊髄損傷の兆候または症状を呈する。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、本発明により、哺乳動物において死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法が提供される。この方法には、（ａ）本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片を発現する培養された宿主細胞を提供すること；および（ｂ）ニューロンの部位またはその付近に哺乳動物中に宿主細胞を導入することが含まれる。
いくつかの実施形態においては、本発明により、哺乳動物中にある死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する遺伝子治療方法が提供される。この方法には、本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを、ニューロンの部位またはその付近に投与することが含まれる。ここでは、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体または抗原結合断片は、哺乳動物中のヌクレオチド配列から、ニューロンの生存を促進するために十分な量で発現される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、Ｎｏｇｏ受容体−１の構造の模式図である。ヒトｓＮｏｇｏＲ３１０には、残基２６〜３１０が含まれており、ｓＮｏｇｏＲ３４４には残基２６〜３４４が含まれている。ラットｓＮｏｇｏＲ３１０には残基２７〜３１０が含まれており、ｓＮｏｇｏＲ３４４には残基２７〜３４４が含まれている。
【図２】図２は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｔｉ（登録商標）ソフトウェアを使用したＮｏｇｏ受容体−１タンパク質についての抗原性プロットを示す。ラットＰ−６１７は配列番号１０であり、ラットＰ−６１８は配列番号１１である。ヒトＰ−６１７は、配列番号４７であり、ヒトＰ−６１８は、配列番号４８である。
【図３】図３Ａは、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体７Ｅ１１の結合活性を示すグラフである。このグラフは、Ｎｏｇｏ受容体−１に対するＮｏｇｏ６６の結合に対する７Ｅ１１の濃度の効果を示す。図３Ｂは、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体１Ｈ２の結合活性を示す。グラフは、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ（本明細書中と、米国特許出願番号６０／４０２，８６６においては、Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ３４４またはＩｇ−ｓＮｏｇｏＲ３４４とも呼ばれる）に対するＮｏｇｏ６６の結合に対する１Ｈ２の濃度の効果を示す。Ｆｃ−ＭＡＧはｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃへの結合についてＮｏｇｏ６６と競合しなかった。
【図４】図４は、抗Ｎｏｇｏ−Ｒ−１抗体１Ｈ２、３Ｇ５、および２Ｆ７についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。固定された抗原の存在下でのＯＤ４５０に対する抗体の効果が決定された。固定された抗原はｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ（本明細書中と、米国特許出願番号６０／４０２，８６６においては、Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ３１０またはＩｇ−ｓＮｏｇｏＲ３１０とも呼ばれる）、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ、ｐ−６１７、ｐ−６１８、ｐ−４、ｐ−５、オボアルブミンおよびＢＳＡである。
【図５】図５は、種々の量のミエリンの存在下でのラットＤＲＧ神経突起成長に対する、モノクローナル抗体７Ｅ１１の効果を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、以下の競合因子の存在下での１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６および１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０に対するｓＮｏｇｏＲ３１０の結合の効果を示すグラフである：Ｎｏｇｏ６６、Ｎｏｇｏ４０、および抗Ｎｏｇｏ受容体−１モノクローナル抗体上清。図６Ｂは、ｓＮｏｇｏＲ３１０に対する１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６の結合活性を示す。
【図７】図７は、ｓＮｏｇｏＲ３１０への１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０の結合に対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を示すグラフである。
【図８】図８は、１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０に対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの結合活性を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ミエリンの存在下、またはミエリンが存在しない条件下での、神経突起成長／細胞に対するｓＮｏｇｏＲ３１０の効果のグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ミエリンの存在下、またはミエリンが存在しない条件下での、神経突起成長に対するｓＮｏｇｏＲ３１０の効果のグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、漸増量のミエリンの存在下、またはミエリンが存在しない条件下での、Ｐ４ラットＤＲＧ神経突起成長に対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ、２０ｎｇのミエリン、およびミエリン＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの処置後の、神経突起の数／細胞を示す。
【図１１】図１１は、漸増量のミエリンの存在下での、ＤＲＧ神経突起成長／細胞に対するモノクローナル抗体５Ｂ１０の効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ラットの脊髄離断モデルにおける損傷の誘導後３０日までのＢＢＢスコアに対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を示すグラフである。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、株０８または株０１によるＷＴまたはトランスジェニックマウスにおける背部片側切断後の時間の関数として、運動機能ＢＢＢスコアを報告する。図１３Ｃは、ＷＴおよびトランスジェニックマウスについて、損傷後の時間の関数として、最大の耐え得る斜平面角を示す。図１３Ｄは、損傷後の時間の関数として、斜めの格子をよじ登る間の後肢のミスを示す。全てのグラフにおいて、それぞれのグループにおいて７〜９匹のマウスによる平均±ｓ．ｅ．ｍ．が報告される。トランスジェニックのグループによる値は、ＷＴのマウスの値とは統計学的に異なる（二重のアスタリスク、Ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定）。
【図１４】図１４Ａは、ビヒクルで処置した動物またはｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置した動物における背部片側切断後の時間の関数として、運動機能ＢＢＢスコアを示す。図１４Ｂは、損傷後の時間の関数として、格子を歩行する間の後肢のミスを示す。図１４Ｃは、足跡の分析を示し、これにより、損傷を受けさせていないラット、または損傷を受けさせたｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃラットよりも、対照マウスにおいて、ストライドがより短く、ストライド幅がより大きいことが明らかである。全てのグラフにおいて、それぞれのグループにおいて７〜９匹のラットによる平均±ｓ．ｅ．ｍ．が報告される。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃグループの値は、対照とは統計学的に異なる（図１４Ａ〜Ｂ）。対照の値は、図１４Ｃにおいては、ＳＣＩなしのラット、またはＳＣＩ＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃラットとは統計学的に異なる（アスタリスク、Ｐ＜０．０５；二重のアスタリスク、ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
（定義および一般的な技術）
他の場所で定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合は、本出願が含む定義が支配する。また、他の方法で状況によって必要とされない限りは、単数形の用語に複数形が含まれ、複数形の用語に単数形が含まれる。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、全ての目的についてそれらの全体が参考として援用される。
【００２６】
本明細書中に記載されるものと同様であるかまたはそれらと同等である方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲全体を通じて、語「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、記載される整数、または整数のグループの包含を暗に意味するが、任意の他の整数または整数のグループを排除するようには理解されない。
【００２８】
本発明をさらに定義するために、以下の用語と定義が本明細書において提供される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、「抗体」は、完全な免疫グロブリン、またはその抗原結合断片を意味する。本発明の抗体は、任意のイソ型またはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、Ｅ、およびＡ）、あるいは、任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）であり得、そしてカッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有し得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、「Ｆｃ」は、パパインでの消化によって得ることができる抗体の重鎖定常領域の部分を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、「ＮｏｇｏＲ融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合させられた可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１部分を含むタンパク質を意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、「ヒト化抗体」は、ヒト以外の配列の少なくとも一部がヒト配列で置き換えられている抗体を意味する。ヒト化抗体を作成するための方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同５，８７７，２９３号に見ることができる。
【００３３】
本明細書中で使用される場合は、「キメラ抗体」は、第１の抗体に由来する１つ以上の領域と、少なくとも１つの他の抗体に由来する１つ以上の領域を含む抗体を意味する。第１の抗体とさらなる抗体は、同じ種に由来するものであっても、異なる種に由来するものであってもよい。
【００３４】
本明細書中、および米国特許出願番号第６０／４０２，８６６において使用される場合は、「Ｎｏｇｏ受容体」、「ＮｏｇｏＲ」、「ＮｏｇｏＲ−１」、「ＮｇＲ」、および「ＮｇＲ−１」はそれぞれ、Ｎｏｇｏ受容体−１を意味する。
【００３５】
（Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド）
１つの態様においては、本発明は、免疫原性であるＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに関する。本発明のいくつかの実施形態においては、免疫原性ポリペプチドは、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（ラット）（配列番号１）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＳＶＤＰＡＴ（ヒト）（配列番号２）；ＡＶＡＳＧＰＦＲＰＦＱＴＮＱＬＴＤＥＥＬＬＧＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡ（ラット）（配列番号３）；ＡＶＡＴＧＰＹＨＰＩＷＴＧＲＡＴＤＥＥＰＬＧＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡ（ヒト）（配列番号４）；およびＣＲＬＧＱＡＧＳＧＡ（マウス）（配列番号５）からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的には構成される。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、本発明は、Ｎｏｇｏ受容体−１に結合するモノクローナル抗体によって結合されるＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、７Ｅ１１モノクローナル抗体によって認識される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）；ＬＤＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号２９）；ＬＤＬＡＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３０）；ＬＤＬＡＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３１）；ＬＤＡＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３２）；ＬＤＡＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３３）；ＬＤＬＳＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３４）；ＬＤＬＳＳＤＥＡＥＬＲ（配列番号３５）；ＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）；ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）；ＡＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４１）；ＬＡＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４２）；ＬＤＬＳＤＮＡＡＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４３）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴ（配列番号４４）；およびＬＤＬＳＤＮＡＱＬＡＶＶＤＰＴＴ（配列番号４５）からなる群より選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、本発明は、配列番号１〜５、２６〜２７、２９〜３７、および４１〜４５のポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明のいくつかの実施形態においては、核酸分子は、発現制御配列（例えば、ｐＣＤＮＡ（Ｉ））に連結される。
【００３８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターにも関する。本発明のいくつかの実施形態においては、ベクターはクローニングベクターである。本発明のいくつかの実施形態においては、ベクターは発現ベクターである。本発明のいくつかの実施形態においては、ベクターには、少なくとも１つの選択マーカーが含まれる。
【００３９】
本発明はまた、上記の核酸またはベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００４０】
本発明はまた、宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の免疫原性ポリペプチドを産生する方法にも関する。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は原核生物である。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は真核生物である。いくつかの実施形態においては宿主細胞は酵母である。
【００４１】
（抗体）
本発明はさらに、本発明のＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。いくつかの実施形態においては、抗体または抗原結合断片は、配列番号１〜５、２６〜２７、２９〜３７、および４１〜４５からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的には構成されるポリペプチドに結合する。本発明の抗体または抗原結合断片は、生体内または生体外で産生することができる。抗体または抗原結合断片の産生については以下で議論される。
【００４２】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、リガンド（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、ＯＭ−ｇｐ）に対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害し、神経突起成長および萌芽、具体的には、軸索成長のミエリンによって媒介される阻害を減少させ、ミエリンによって媒介される成長円錐の崩壊を弱める。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片は、マウスのものである。いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１はラット由来のものである。他の実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１はヒトのものである。いくつかの実施形態においては、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片は組み換えのもの、遺伝子操作されたもの、ヒト化されたもの、および／またはキメラである。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、抗体は、モノクローナル７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）；モノクローナル１Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８４）；モノクローナル２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８５）；モノクローナル３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８６）；およびモノクローナル５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８８）からなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体４６である。
【００４５】
例示的な抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片を含む断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ポリペプチドに特異的抗原結合性（例えば、免疫接着体）を付与するために十分である免疫グロブリンの部分を少なくとも含むダイアボディーおよびポリペプチドである。
【００４６】
本明細書中で使用される場合は、ＦｄはＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなる断片を意味し、Ｆｖは、抗体の単一のアームのＶＬドメインとＶＨドメインからなる断片を意味し、そしてｄＡｂは、ＶＨドメインからなる断片を意味する（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）。本明細書中で使用される場合は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域とＶＨ領域が、それらが１本のタンパク質鎖として作成されることを可能にする合成のリンカーを介して、一価の分子を形成するように対を形成している抗体を意味する（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３、１９８８）。本明細書中で使用される場合は、ダイアボディーは、ＶＨとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖の上で発現されるが、同じ鎖の上にある２つのドメインの間で対を形成することを可能にするためには短すぎるリンカーを使用しており、それによって、これらのドメインが別の鎖の相補ドメインと対を形成するようにさせて、２つの抗原結合部位を作成する、二重特異的抗体を意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８，１９９３、およびＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照のこと）。本明細書中で使用される場合は、目的の抗原に特異的に結合する免疫接着体は、１つ以上のＣＤＲが、共有結合によって、または非共有結合によってのいずれかで組み込まれ得る分子を意味する。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のＮｏｇｏ受容体−１抗体のサブユニットポリペプチドが提供される。ここでは、サブユニットポリペプチドは、（ａ）重鎖またはその可変領域；および（ｂ）軽鎖またはその可変領域からなる群より選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のＮｏｇｏ受容体−１抗体のサブユニットポリペプチドの、重鎖またはその可変領域、あるいは、軽鎖またはその可変領域をコードする核酸が提供される。
【００４９】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のＮｏｇｏ受容体−１抗体の超可変領域（ＣＤＲ）、またはＣＤＲをコードする核酸が提供される。
【００５０】
（免疫化）
本発明の抗体は、適切な宿主（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類を含む脊椎動物、ならびに、鳥類、爬虫類、および魚類の卵の中）の免疫化によって作成することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、宿主は、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドで免疫される。他の実施形態においては、宿主は、完全な、または破壊された細胞の細胞膜と会合させられたＮｏｇｏ受容体−１で免疫化され、本発明の抗体が、本発明のＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに対する結合によって同定される。
【００５２】
いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１抗原は、免疫応答を刺激するために、アジュバントとともに投与される。アジュバントは、多くの場合、抗原に対する免疫応答を誘発するために、抗原に加えて投与されることが必要とされる。これらのアジュバントは、通常、非特異的炎症を促進し、免疫化の部位への単核の食細胞の動員を伴う、不溶性または非分解性の物質である。アジュバントの例としては、フロイトのアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチダーゼ）、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
抗体を作成するための方法の概要については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０，ｐｐ．６５７−８０．，およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）を参照のこと。本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドとの免疫反応性の決定は、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって行うことができ、例えば、免疫ブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡが含まれる。
【００５４】
（抗体の産生および抗体を産生する細胞株）
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）前出に記載されているような標準的な手順によって行うことができる。
【００５５】
簡単に説明すると、適切な時点で、動物が屠殺され、リンパ節および／または脾臓Ｂ細胞が、当該分野で周知であるいくつかの技術のうちのいずれか１つによって不死化させられる。このような技術としては、例えばＥＢＶでの形質転換、または不死化細胞株、例えば、骨髄腫細胞との融合が挙げられるが、これらに限定されない。その後、細胞は、クローンに分けられ、それぞれのクローンの上清が、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに特異的な抗体の産生について試験される。ハイブリドーマの選択、クローニング、および拡大の方法は当該分野で周知である。同様に、免疫グロブリン遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を同定するための方法は当該分野で公知である。
【００５６】
本発明の抗体を産生するための他の適切な技術には、リンパ球のＮｏｇｏ受容体−１への、もしくは本発明の免疫原性ポリペプチドへの生体外での暴露、あるいは、ファージもしくは同様のベクター中の抗体のライブラリーの選択が含まれる。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，ｐｐ．１２７５−８１（１９８９）を参照のこと。本発明において有用である抗体は、修飾して使用することができ、また、修飾することなく使用することもできる。
【００５７】
抗原（この場合は、本発明のＮｏｇｏ受容体−１または免疫原性ポリペプチド）および抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質に共有結合または非共有結合のいずれかによって連結させることによって標識することができる。種々の標識および結合技術が当該分野で知られており、これらを本発明の実施において使用することができる。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害因子、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。このような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組み換え免疫グロブリンを産生することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態においては、抗体は、複数の結合特異性を有する。例えば、二官能性抗体は、当業者に公知である多数の技術のうちのいずれか１つによって調製される。このような技術としては、ハイブリッドハイブリドーマの産生、ジスルフィド交換、化学的架橋、２つのモノクローナル抗体の間へのペプチドリンカーの付加、特定の細胞株への免疫グロブリン重鎖および軽鎖の２つのセットの導入などが挙げられる（さらに詳細な議論については下記を参照のこと）。
【００５９】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体である場合もあり、例えば、不死化ヒト細胞によって産生されるもの、「ヒト」抗体を産生することができるＳＣＩＤ−ｈｕマウスまたは他のヒト以外の動物によって産生されるものであり得る。
【００６０】
（ファージディスプレイライブラリー）
本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体は、組み換えの組み合わせ抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例示的な組み合わせライブラリーは、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに対する結合のためのものであり、例えば、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドで免疫化した動物に由来するｍＲＮＡから調製されたＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーを調製しスクリーニングするための方法論は当該分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーを作成するための方法および材料は市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２；およびＭｏｒｐｈｏＳｙｓによる他のもの）。抗体ディスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングすることにおいて使用することができる方法および試薬は、他にも存在する（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２を参照のこと）。
【００６１】
組み換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーから本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体をスクリーニングし単離した後、選択された抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収することができ、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。所望される場合は、核酸はさらに、本発明の他の抗体形態を生じるように、以下に記載されるように操作され得る。組み合わせライブラリーのスクリーニングによって単離した抗体を発現させるためには、抗体重鎖および軽鎖、またはその可変領域をコードするＤＮＡが、組み換え発現ベクター中にクローニングされ、そして上記のように、哺乳動物宿主細胞に導入される。
【００６２】
（クラススイッチ）
本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体は任意のイソ型であり得る。任意の所望されるイソ型の抗体は、クラススイッチによって産生することができる。クラススイッチのためには、ＣＬまたはＣＨをコードするヌクレオチド配列のいずれをも含まない、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸が、当該分野で周知の方法を使用して単離される。ＶＬまたはＶＨをコードする核酸は、その後、免疫グロブリン分子の所望されるクラスに由来するＣＬまたはＣＨをコードするヌクレオチド配列に対して動作可能であるように連結させられる。これは、上記のようなＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸を使用して行うことができる。例えば、もともとＩｇＭであった本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体は、ＩｇＧへとクラススイッチさせることができる。さらに、クラススイッチを、１つのＩｇＧサブクラスから別のサブクラスへ、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へと変換させるために使用することもできる。
【００６３】
（変異させられた抗体）
他の実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合断片は、重鎖および／または軽鎖の種々のドメインにおいて変異させることができ、それによって、抗体の結合特性を変化させることができる。例えば、変異は、１つ以上のＣＤＲ領域中に作成することができ、これによって、Ｎｏｇｏ受容体−１についての抗体のＫｄを増大または低下させることができ、Ｋｏｆｆを増大または低下させることができ、あるいは、抗体の結合特異性を変化させることができる。部位特異的変異誘発における技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（前出）を参照のこと。好ましい実施形態においては、変異は、本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の可変領域中の生殖系と比較して異なっていることが知られているアミノ酸残基に作成される。いくつかの実施形態においては、変異は、本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の可変領域中の生殖系と比較して異なっていることが知られている１つ以上のアミノ酸残基に作成される。別の実施形態においては、抗体の重鎖または軽鎖可変領域をコードする核酸が、１つ以上のフレームワーク領域の中で変異させられる。変異は、半減期が長くなるように、フレームワーク領域または定常ドメインに作成される場合もある。フレームワーク領域または定常ドメイン中の変異はまた、抗体の免疫原性を変化させるように作成される場合もあり、これによって、別の分子に対する共有結合または非共有結合のための部位が提供されるか、あるいは、補体結合のような特性が変化する。変異は、１つの変異抗体中のフレームワーク領域、定常ドメイン、および可変領域のそれぞれに作成することができる。あるいは、変異は、１つの変異抗体中の１つのフレームワーク領域の中だけに、複数の可変領域の中だけに、または定常ドメインの中だけに作成される場合もある。
【００６４】
（融合抗体および免疫接着体）
別の実施形態においては、別のポリペプチドに連結させられた本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の全てまたは一部を含む、融合抗体または免疫接着体が作成される場合もある。いくつかの実施形態においては、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の可変領域だけが、ポリペプチドに連結させられる。他の実施形態においては、本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体のＶＨドメインが、第１のポリペプチドに連結させられ、一方では、ＶＨドメインとＶＬドメインとが抗体結合部位を形成するように互いに相互作用できるような様式で、抗体のＶＬドメインが、第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドに対して連結させられる。他の実施形態においては、ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとが互いに相互作用できるように、リンカーによってＶＬドメインから間隔を空けられる（下記の単鎖抗体の項を参照のこと）。ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、その後、目的のポリペプチドに連結させられる。融合抗体は、Ｎｏｇｏ受容体−１リガンドを発現する細胞または組織に対してポリペプチドを向けるために有用である。目的のポリペプチドは、治療薬、例えば、毒素である場合も、また、診断薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのような、容易に視覚化させることができる酵素である場合もある。さらに、「融合抗体」は、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されるように作成され得る。これは、１本のポリペプチド鎖の上に二価または多価の抗体を作成することが望まれる場合、あるいは、二重特異的抗体を作成することが望まれる場合に、有用である。
【００６５】
（単鎖抗体）
本発明には、本発明のＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ＳｃＦｖを産生するためには、ＶＨ−、およびＶＬ−をコードするＤＮＡが、可撓性リンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号１０）をコードするＤＮＡに対して動作可能であるように連結させられる。その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、可撓性リンカーによって連結させられたＶＬおよびＶＨ領域を有している連続する１本鎖のタンパク質として発現させられ得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４を参照のこと）。単鎖抗体は、ＶＨとＶＬが１つだけ使用される場合には一価であり、また、ＶＨとＶＬが２つ使用される場合には二価であり、また、２つ以上のＶＨとＶＬが使用される場合には多価である場合もある。
【００６６】
（キメラ抗体）
本発明にはさらに、二重特異的抗体またはその抗原結合断片が含まれる。これらにおいては、１つの特異性は本発明のＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに対する特異性である。１つの実施形態においては、１つの結合ドメインを通じて本発明のＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに特異的に結合し、第２の結合ドメインを通じて第２の分子に特異的に結合するキメラ抗体が作成され得る。キメラ抗体は、組み換え分子生物学の技術によって産生することができ、また、両方を物理的に結合させることもできる。さらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、ミエリンによって媒介される成長円錐の崩壊、ならびに神経突起成長および萌芽の阻害を弱めることに関係している別の分子にも特異的に結合する、１つ以上のＶＨおよびＶＬを含む単鎖抗体を作成することができる。このような二重特異的抗体は、周知の技術、例えば、Ｆａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）およびＷｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ（前出）を使用して、そして、（ｉｉｉ）と組み合わせて作成することができる（例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと。
【００６７】
いくつかの実施形態においては、キメラ抗体は、本発明の抗体に由来する１つ以上の可変領域を使用して調製される。別の実施形態においては、キメラ抗体は、上記の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ領域を使用して調製される。
【００６８】
（誘導された抗体および標識された抗体）
本発明の抗体または抗原結合断片は、別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）になるように誘導することができ、また、別の分子に連結させることもできる。一般的には、抗体または抗原結合断片は、本発明のポリペプチドに対する結合が、誘導または標識によって悪影響を受けないように誘導される。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、１つ以上の他の分子構成要素、例えば、別の抗体（例えば、二重特異的抗体またはダイアボディー）、検出試薬、細胞傷害性因子、薬剤、および／あるいは別の分子との抗体もしくは抗原結合断片の会合を媒介することができるタンパク質またはペプチド（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）に対して、機能するように連結させられ得る（化学結合、遺伝子融合、非共有結合などによる）。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、誘導された抗体は、２つ以上の抗体（同じタイプの抗体、またはたとえば二重特異的抗体を作成するための異なるタイプの抗体）を架橋することによって産生される。適切な架橋基としては、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって間隔を隔てられた２つの異なる反応基を有しているヘテロ二官能性の架橋基、またはホモ二官能性の架橋基（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態においては、誘導された抗体は標識された抗体である。例えば、それらを用いて本発明の抗体または抗体部分を誘導することができる検出試薬は、蛍光化合物（フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルフォニルクロライド、フィコエリスリン、ランタニドリンなどを含む）である。抗体はまた、検出に有用である酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどを用いて標識することができる。検出可能な酵素で標識される実施形態においては、抗体は、検出可能な反応産物を生じるために酵素を使用する別の試薬を添加することによって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、過酸化水素およびジアミノベンジジンを用いる。抗体はまた、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定によって検出される場合もある。抗体はまた、二次的なレポーター（例えば、ロイシンジッパー対合配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープで標識される場合もある。
【００７１】
抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原断片もまた、放射標識されたアミノ酸で標識され得る。放射標識は、診断目的と治療目的の両方に使用され得る。放射標識された抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体は、診断的に、例えば、被験体においてＮｏｇｏ受容体−１レベルを決定するために使用することができる。さらに、放射標識された抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体は、脊髄損傷を処置するために治療的に使用される場合もある。ポリペプチドの標識の例としては、以下の放射性同位元素または放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
【００７２】
抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルまたはエチル基、あるいは炭水化物基のような化学基で誘導することができる場合もある。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、血清半減期を長くするため、または組織結合を増大させるために、有用であり得る。
【００７３】
（抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の特徴づけ）
（抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体のクラスおよびサブクラス）
抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体のクラスおよびサブクラスは、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的には、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的である抗体を使用して決定することができる。このような抗体は市販によって入手することができる。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、さらに他の技術によっても決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全てまたは一部を配列決定し、免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列に対してそれらのアミノ酸配列を比較し、そして抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定することもできる。
【００７４】
（Ｎｏｇｏ受容体−１に対する抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の結合親和性）
本発明のＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに対する本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の結合親和性および解離速度は、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、結合親和性は、競合ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、またはＫｉｎＥｘＡ技術によって測定することができる。解離速度も、また、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ技術によって測定することができる。結合親和性と解離速度は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、表面プラスモン共鳴によって測定される。
【００７５】
７Ｅ１１および１Ｈ２のＫｄは、それぞれ、１×１０−７Ｍおよび２×１０−８Ｍであることが決定された。
【００７６】
（抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体によるＮｏｇｏ受容体−１活性の阻害）
いくつかの実施形態においては、本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片は、リガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する。このような阻害のＩＣ５０は、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または機能的拮抗によって、測定することができる。いくつかの実施形態においては、ＩＣ５０は、０．１から５００ｎＭの間である。いくつかの実施形態においては、ＩＣ５０は１０から４００ｎＭの間である。さらに他の実施形態においては、抗体またはその一部は、６０ｎＭから４００ｎＭの間のＩＣ５０を有する。７Ｅ１１および１Ｈ２のＩＣ５０は、結合アッセイにおいて、それぞれ、４００ｎＭおよび６０ｎＭであることが決定された。下の表３を参照のこと。
【００７７】
つまり、当業者であれば、本発明の教示が提供されると、本発明の抗体の生物学的特性を変化させるために、あるいは、それを特定の用途により適するように任意の他の方法においてこれを変化させ得るために使用することができる、種々の方法を利用することができる。本発明の抗体の生物学的特性を変化させるための方法には、安定性または半減期、免疫原性、毒性、親和性、あるいは、所定の抗体分子の量を増大または減少させる方法が含まれる。
【００７８】
本発明の抗体を含む組成物、およびその使用が以下に記載される。
【００７９】
（可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド）
（タンパク質）
全長のＮｏｇｏ受容体−１は、シグナル配列、Ｎ末端領域（ＮＴ）、８個のロイシンを多く含む反復（ＬＲＲ）、ＬＲＲＣＴ領域（８個のロイシンを多く含む反復のＣ末端のロイシンを多く含む反復ドメイン）、Ｃ末端領域（ＣＴ）、およびＧＰＩアンカーから構成されている（図１を参照のこと）。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態では、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドが提供される。本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドには、ＮＴドメイン；８個のＬＲＲ、およびＬＲＲＣＴドメインが含まれており、シグナル配列と機能的なＧＰＩアンカーは含まれていない（すなわち、ＧＰＩアンカーは含まれないか、細胞膜に対して効率的に会合する能力を欠いているＧＰＩアンカーが含まれる）。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドには、異種ＬＲＲが含まれる。いくつかの実施形態においては、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドには、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の異種ＬＲＲが含まれる。異種ＬＲＲは、Ｎｏｇｏ受容体−１以外のタンパク質から得られるＬＲＲを意味する。異種ＬＲＲを得ることができる例示的なタンパク質は、トル様（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体（ＴＬＲ１．２）；Ｔ細胞活性化ロイシン反復を多く含むタンパク質；デセオリン；ＯＭ−ｇｐ；インシュリン様成長因子結合タンパク質酸性不安定サブユニットｓｌｉｔおよびｒｏｂｏ；ならびにトル様受容体４である。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、本発明により、３１９アミノ酸の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド（可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１  ３４４、ｓＮｏｇｏＲ１−３４４、またはｓＮｏｇｏＲ３４４）（配列番号６および８の残基２６〜３４４、または配列番号８の残基２７〜３４４）が提供される。いくつかの実施形態においては、本発明により、２８５アミノ酸の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド（可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１  ３１０、ｓＮｏｇｏＲ１−３１０、またはｓＮｏｇｏＲ３１０）（配列番号７および９の残基２６〜３１０、または配列番号９の残基２７〜３１０）が提供される。図１を参照のこと。
【００８３】
（表１  ヒトおよびラットのＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドの配列）
【００８４】
【表１】
2010207239.tif 000002
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、Ｎｏｇｏ受容体−１に対するリガンドの結合を阻害し、Ｎｏｇｏ受容体−１リガンドのアンタゴニストとしての役割を果たすように使用される。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、ニューロンにおいて神経突起成長および萌芽、例えば、軸索成長の阻害を減少させるために、そしてニューロンにおけるミエリンによって媒介される成長円錐の崩壊を阻害するために、使用される。いくつかの実施形態においては、ニューロンはＣＮＳニューロンである。
【００８５】
ｓＮｏｇｏＲ３１０およびｓＮｏｇｏＲ３４４は、驚くべきことに、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐのＮｏｇｏ受容体−１に対する結合をブロックする。
【００８６】
いくつかの実施形態においては、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、異種ポリペプチドをさらに含む融合タンパク質の構成要素である。いくつかの実施形態においては、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン定常ドメインである。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖定常ドメインである。いくつかの実施形態においては、異種ポリペプチドはＦｃ断片である。いくつかの実施形態においては、Ｆｃは、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドのＣ末端に連結させられる。いくつかの実施形態においては、融合Ｎｏｇｏ受容体−１タンパク質は二量体である。
【００８７】
（本発明の核酸分子）
本発明により、配列番号１〜９、２６〜２７、２９〜３７、および４１〜４５のいずれか１つのポリペプチドを含む、本発明のポリペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態においては、核酸は、配列番号６および８に示されるＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２６〜３４４、または配列番号８に示されるＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２７〜３４４からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態においては、核酸分子は、配列番号７および９に示されるＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２６〜３１０、または配列番号９に示されるＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２７〜３１０からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。本明細書中で使用される場合は、「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンス分子、さらに、自然界の供給源に由来するかまたは合成されたかにはかかわらず、別の骨格をベースとするかまたは別の塩基を含む核酸を意味する。いくつかの実施形態においては、核酸にはさらに、転写プロモーターおよび状況に応じたシグナル配列を含む。これらのそれぞれは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能であるように連結される。
【００８８】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質をコードする核酸が提供される。本発明のＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質には、配列番号６および８に示されるＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２６〜３４４、または配列番号８のアミノ酸残基２７〜３４４、および配列番号７および９に示されるＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２６〜３１０、または配列番号９のアミノ酸残基２７〜３１０からなる群より選択されるポリペプチドを含む融合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態においては、核酸は、配列番号２６〜２７、２９〜３７、および４１〜４５からなる群より選択されるポリペプチドを含むＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質をコードする核酸にはさらに、転写プロモーターおよび状況に応じたシグナル配列が含まれる。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列はさらに、免疫グロブリン定常領域をコードする。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は重鎖定常領域である。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列はさらに、ヒンジ領域に連結させられた免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする。いくつかの実施形態においては、核酸はさらにＦｃをコードする。いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質にはＦｃ断片が含まれる。
【００８９】
本発明のコード核酸はさらに、診断目的およびプローブとしての目的のための検出可能な標識を含むように修飾される場合もある。種々のこのような標識は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されるコード分子とともに容易に使用することができる。適切な標識としては、ビオチン、放射標識核種などが挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、標識されたコード核酸分子を得るために、当該分野で公知の標識のうちの任意のものを使用することができる。
【００９０】
（組成物）
いくつかの実施形態においては、本発明により、配列番号１〜５、２６〜２７、２９〜３７、および４１〜４５からなる群より選択されるポリペプチドを含む組成物が提供される。
【００９１】
いくつかの実施形態においては、本発明により、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片、あるいは可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、または本発明の融合タンパク質を含む組成物が提供される。
【００９２】
いくつかの実施形態においては、本発明には、作用部位への投与のために薬学的に使用することができる調製物へと活性のある化合物を加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む、適切な薬学的に許容される担体が含まれる場合もある。非経口投与に適している処方物としては、水溶性の形態、例えば、水溶性の塩である活性のある化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油状の注射懸濁液としての活性のある化合物の懸濁液が投与される場合もある。適切な親油性溶媒またはビヒクルとして、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成の脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性の注射用懸濁液には、懸濁液の粘度を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトール、およびデキストランが含まれる場合もある。状況に応じて、懸濁液には、安定剤も含まれる場合がある。リポソームを、本発明の分子を細胞への送達のためにカプセル化するために使用することもできる。例示的な「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤など、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、さらにはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態においては、組成物には、等張化剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが含まれる。いくつかの実施形態においては、組成物には、湿潤剤のような薬学的に許容される物質、または少量の、湿潤剤、乳化剤、保存剤、または緩衝液のような補助物質が含まれる。補助物質は、本発明の抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体、または融合タンパク質の保存期間または有効性を増強させる。
【００９３】
本発明の組成物は種々の形態で存在することができ、例えば、液体、半固体、および固体である投与形態、たとえは、液体の溶液（例えば、注射することができる、および注入することができる溶液）、分散液、または懸濁液が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与の態様、および治療用途に応じて変化する。１つの実施形態においては、組成物は、注射することができるか、または注入することができる溶液の形態であり、例えば、他の抗体でのヒトの受動免疫法に使用されるものと同様の組成物である。
【００９４】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬剤濃度に適している他の秩序構造として、処方することができる。滅菌の注射することができる溶液は、上記に列挙した成分の１つまたはそれらの組み合わせとともに、適切な溶媒の中に必要とされる量の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体を配合し、必要である場合には、その後に濾過滅菌することによって、調製することができる。一般的には、分散液は、塩基性の分散媒体と、上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌のビヒクルの中に活性のある化合物を配合することによって調製される。滅菌の注射することができる溶液の調製のための滅菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性のある成分と任意のさらなる所望される成分の粉末が、それらの予め滅菌濾過された溶液から得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子の大きさを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射することができる組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、活性のある化合物は、迅速な放出から化合物を保護する担体を用いて調製することができ、例えば、移植物、経皮パッチ、およびマイクロカプセルに入れられた送達システムを含む徐放処方物である。生分解性の生体適合性高分子、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような処方物の調製のための多くの方法については特許がとられており、当業者に一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【００９６】
補助的な活性のある化合物をもまた、組成物中に配合することもできる。いくつかの実施形態においては、本発明のＮｏｇｏ受容体−１抗体もしくはその抗原結合断片、または可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドまたは融合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療薬と一緒に処方され、そして／または一緒に投与される。
【００９７】
本発明の薬学的組成物には、「治療有効量」または「予防上有効である量」の、本発明の抗体、抗原結合断片、ポリペプチド（単数または複数）、または融合タンパク質が含まれる場合もある。「治療有効量」は、所望される治療結果に到達するために必要な、有効量、投与量、および期間をいう。Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくはその抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、またはＮｏｇｏ受容体融合タンパク質の治療有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重のような要因によって変化する場合がある。治療有効量はまた、抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、またはＮｏｇｏ受容体融合タンパク質の任意の毒性作用または有害な作用よりも、治療上の利点がある効果が上回るような量である。「予防上有効である量」は、所望される予防的な結果に到達するために必要な、有効量、投与量、またはそのために必要な期間をいう。通常は、予防のための用量は、疾患の前、または疾患の初期段階に被験体において使用されるので、予防上有効である量は、治療有効量よりも少ない。
【００９８】
投与レジュメは、最適な所望される反応（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調整することができる。例えば、１回のボーラスが投与される場合があり、数回に分けられた用量が時間をかけて投与される場合もあり、また、治療状況の緊急性によって望まれる場合には、用量が比例的に減少させられる場合も、増大させられる場合もある。投与を容易にするための単位投与量形態に非経口組成物を処方することが特に有効であり、そして、投与量単位が均質であることは、本明細書中で使用される場合には、処置される哺乳動物被験体について単一の投与量として適している物理的に分かれている単位をいう。個々の単位には、必要とされる薬学的担体と組み合わせて、所望される治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性のある化合物が含まれる。本発明の単位投与量形態についての詳細は、（ａ）抗体、抗原結合断片、および可溶性受容体−１ポリペプチド、またはＮｏｇｏ受容体融合タンパク質の特有の特性、ならびに到達させられる特定の治療または予防効果、さらには（ｂ）個体の過敏症の処置については、そのような抗体、抗原結合断片、および可溶性受容体−１ポリペプチド、またはＮｏｇｏ受容体融合タンパク質を混合することに関する当該分野に特有の限界に影響されるか、またはそれらに直接依存する。いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片についての治療有効量の範囲は、０．１〜４ｍｇ／ｋｇ／日である。いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片についての治療有効量の範囲は、０．２〜４ｍｇ／ｋｇ／日である。いくつかの実施形態においては、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体またはその抗原結合断片についての治療有効量の範囲は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００９９】
（抗体、抗原結合断片、可溶性受容体、および融合タンパク質の使用）
いくつかの実施形態においては、本発明により、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、そのような抗体の抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドを含む融合タンパク質を、それを必要としている哺乳動物に投与することによって、Ｎｏｇｏ受容体−１活性を阻害するための方法が提供される。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、本発明により、リガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する方法が提供される。この方法には、Ｎｏｇｏ受容体−１を、本発明の抗体または抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、リガンドは、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、本発明により、ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害するための方法が提供される。この方法には、ニューロンを、本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明により、ニューロンにおいて神経突起成長または萌芽の阻害を減少させるための方法が提供される。この方法には、ニューロンを、本発明の抗体または抗原結合断片と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、ニューロンは、ＣＮＳニューロンである。これらの方法のいくつかにおいては、神経突起成長または萌芽は、軸索成長である。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、本発明により、哺乳動物において死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法が提供される。この方法には、（ａ）（ｉ）抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくはその抗原結合断片、または（ｉｉ）可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドを発現する、培養された宿主細胞を提供すること；および、（ｂ）哺乳動物中に、ニューロンの部位またはその付近に、宿主細胞を導入することが含まれる。Ａｌｍｕｄｅｎａ  Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏ，Ｍ  Ｉｓａｂｅｌ  Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｆ  Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｉｔｏ  ａｎｄ  Ｊｅｓｕｓ  Ａｖｉｌａ（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｒａｌｅｇｉｃ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ａｘｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｓｐｉｎａｌ
ｃｏｒｄｓ  ｂｙ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２５，４２５−４３５。
【０１０３】
いくつかの実施形態においては、本発明により、哺乳動物中にある死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する遺伝子治療方法が提供される。この方法には、（ａ）抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくはその抗原結合断片、または（ｂ）可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを、ニューロンの部位またはその付近に投与することが含まれる。ここでは、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、抗原結合断片、または可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、哺乳動物中のヌクレオチド配列から、ニューロンの生存を促進するために十分な量で発現される。これらの実施形態に有用であるウイルスベクターおよび方法は、例えば、Ｎｏeｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕ
ｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１３，１４８３−９３（２００２）に記載されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態においては、本発明により、リガンドに対するＮｏｇｏ受容体−１の結合を阻害する方法が提供される。この方法には、リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質と接触させる工程が含まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態においては、本発明により、Ｎｏｇｏ受容体−１リガンドの活性を調節する方法が提供される。この方法には、Ｎｏｇｏ受容体−１リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質と接触させる工程が含まれる。
【０１０６】
いくつかの実施形態においては、本発明により、ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害するための方法が提供される。この方法には、Ｎｏｇｏ受容体−１リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明により、ニューロンにおいて神経突起成長または萌芽の阻害を減少させるための方法が提供される。この方法には、Ｎｏｇｏ受容体−１リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏ受容体−１融合タンパク質と接触させる工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、ニューロンはＣＮＳニューロンである。いくつかの実施形態においては、リガンドは、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ，ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、神経突起成長および萌芽は、軸索成長である。
【０１０７】
本明細書中に記載される任意のタイプの抗体または受容体を、治療的に使用することができる。いくつかの実施形態においては、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態においては、哺乳動物はヒト患者である。いくつかの実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、獣医学的な目的のために、またはヒトの疾患についての動物モデルとして、抗体が交差反応するＮｏｇｏ受容体−１を発現するヒト以外の哺乳動物（例えば、霊長類、カニクイザル、またはアカゲザル）に投与される。このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効力を評価するために有用であり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態においては、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくはその抗原結合断片、または可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、または融合タンパク質の投与は、損傷部位からの軸索成長を促進するように、脊髄損傷を処置するために使用される。
【０１０９】
本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくは抗原結合断片、または可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドもしくは融合タンパク質は、単独で提供することもでき、また、特定の病理学的プロセスを調節する他の物質と組み合わせて、または順次組み合わせて提供することもできる。例えば、抗炎症薬が、ニューロンのさらなる損傷をブロックするため、および軸索の再生の阻害のための手段として、脳梗塞の後に同時に投与される場合がある。本明細書中で使用される場合は、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１、およびＮｏｇｏ受容体融合タンパク質は、２つが同時に、連続して、または別々に投与される場合に、１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせて投与されると言われる。
【０１１０】
本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入、または口腔経路によって投与することができる。例えば、薬剤は、微量注入によって損傷部位に局所投与される場合がある。典型的な部位としては、怪我によって生じた脊髄の損傷した領域が挙げられるが、これに限定されない。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、同時に行われている（行われている場合には）処置の種類、処置の頻度、所望される効果の性質に応じて変化する。
【０１１１】
本発明の化合物は、通常は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスのような哺乳動物に生体内で、あるいは生体外で利用することができる。
【０１１２】
（本発明のベクター）
いくつかの実施形態においては、本発明により、コード配列を含む組み換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）が提供される。本明細書中で使用される場合は、ｒＤＮＡ分子は、分子操作が行われたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作成するための方法は当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。いくつかのｒＤＮＡ分子においては、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列およびベクター配列に動作可能であるように連結される。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、本発明により、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが提供される。本発明の核酸が動作可能であるように連結されるベクターおよび発現制御配列の選択は、当該分野で周知であるように、所望される機能的特性（例えば、タンパク質の発現および形質転換される宿主細胞）に直接依存する。本発明のベクターは、少なくとも、複製、または宿主染色体への組み込みを指示することができ、ｒＤＮＡ分子中に含まれる構造遺伝子を発現できることが好ましい。
【０１１４】
動作可能であるように連結されたタンパク質をコードする配列の発現を調節するために使用される発現制御エレメントは当該分野で公知である。発現制御エレメントとしては、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞の培地中の栄養素に反応する誘導性プロモーターは、容易に制御することができるので好ましい。
【０１１５】
１つの実施形態においては、コード核酸分子を含むベクターには、原核生物のレプリコンが含まれる。すなわち、ＤＮＡ配列は、形質転換される原核生物宿主細胞、例えば、細菌宿主中で自律複製を指示し、染色体外で組み換えＤＮＡ分子を維持する能力を有する。そのようなレプリコンは当該分野で周知である。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターにはまた、薬剤耐性のような、その発現により検出可能な、または選択可能なマーカーを付与する遺伝子が含まれる場合もある。細菌の薬剤耐性遺伝子の典型は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。
【０１１６】
原核生物のレプリコンを含むベクターには、さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞中のコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指示することができる原核生物またはバクテリオファージのプロモーターが含まれ得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、転写を生じさせることができるＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、通常、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含むプラスミドベクターとして提供される。このようなベクタープラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬ、およびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主を、本発明のタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を発現させるために使用することができる。
【０１１７】
真核生物細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成させるために使用することができる。真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、いくつかの市販の供給業者から入手することができる。通常は、このようなベクターは、所望されるＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ（登録商標）３１２５５）、および他の真核生物発現ベクターである。
【０１１８】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核生物発現ベクターには、さらに、真核生物細胞中で有効である選択マーカー、好ましくは、薬剤耐性選択マーカーを含めることができる。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現によりネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）。あるいは、選択マーカーは、別のプラスミド上に存在させることができ、２つのベクターを宿主細胞の同時トランスフェクションによって導入し、トランスフェクタントを、選択マーカーについて適切な薬剤の中で培養することによって選択することができる。
【０１１９】
本発明の抗体または抗体部分を発現させるためには、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に動作可能であるように連結されるように、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードするＤＮＡが発現ベクター中に挿入される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶに由来するエピソームなどが挙げられる。抗体遺伝子は、ベクター中の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図される機能を果たすように、ベクター中に連結される。発現ベクターと発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子と、抗体の重鎖遺伝子が、別々のベクターに挿入され得る。いくつかの実施形態においては、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片とベクター上の相補的な制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合は、平滑末端の連結）によって、発現ベクター中に挿入される。
【０１２０】
便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、上記のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し、発現することができるように操作された適切な制限部位を有しているベクターである。このようなベクター中では、スプライシングは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライシングドナー部位と、ヒトＣ領域の前にあるスプライシングアクセプター部位との間で、また、ヒトＣＨエキソンの中に存在するスプライシング領域でも生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流に存在するもともとの染色体部位で生じる。組み換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングすることもできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドである場合も、また異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）である場合もある。
【０１２１】
本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中でのそれらの発現を制御する調節配列を有する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因によって変化する場合があることは、当業者によって理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞での発現に好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質の発現を指示するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび強力哺乳動物プロモーター（例えば、本来の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる詳細については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０１２２】
異種遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）、および選択マーカー遺伝子のような、さらなる配列を有する場合がある。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６５５号、および同第５，１７９，０１７号を参照のこと、全て、Ａｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，による）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子によって、薬剤、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートに対する耐性が、ベクターが導入される宿主細胞に付与される。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（例えば、ｄｈｆｒ−宿主細胞におけるメトトレキセート選択／増幅の使用について）、およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択について）が挙げられる。
【０１２３】
（本発明のタンパク質を組み換えにより産生する宿主細胞および方法）
本発明の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体、免疫原性ペプチド、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な宿主細胞の形質転換のために使用することができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によって行うことができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当該分野で周知である。これには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化、および核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子を、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入することができる場合もある。
【０１２４】
適切な細胞宿主の本発明のｒＤＮＡ分子での形質転換は、周知の方法によって行われる。これらは、通常、使用されるベクターおよび使用される宿主システムのタイプに応じて異なる。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０−２１１４を参照のこと）。脊椎動物細胞のｒＤＮＡを含むベクターでの形質転換に関しては、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質、または塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，１３７３−１３７６を参照のこと）。
【０１２５】
うまく形質転換された細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択マーカーについての選択を含む、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入によって得られる細胞は、単一コロニーを生じるようにクローニングされ得る。これらのコロニーに由来する細胞を、回収し、溶解させ、そしてそれらのＤＮＡ内容物を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３−５１７によって記載されているような方法を使用してｒＤＮＡの存在について試験することができ、また、細胞によって産生されるタンパク質が、免疫学的方法によってアッセイされる場合もある。
【０１２６】
発現のための宿主として利用することができる哺乳動物細胞株は当該分野で周知であり、これには、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））から入手することができる多くの不死化細胞株が含まれる。これらとしては、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ
Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多数の他の細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有しているかを決定することによって選択される。使用することができる他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞である。本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくは抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合は、これらは、宿主細胞中で抗体、ポリペプチド、および融合ポリペプチドを発現させるために、あるいは、さらに好ましくは、本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくは抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質を宿主細胞が増殖させられる培養培地中に分泌させるために十分な時間の間、宿主細胞を培養することによって産生される。本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくは抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【０１２７】
さらに、本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏ受容体−１抗体もしくは抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質（あるいはそれらに由来する他の部分）の、産生細胞株からの発現は、多数の公知の技術を使用して増強させることができる。例えば、グルタミン合成酵素の遺伝子発現システム（ＧＳシステム）が、特定の条件下で発現を増強させるための一般的なアプローチである。ＧＳシステムは、欧州特許第０，２１６，８４６号、同第０，２５６，０５５号、および同第０，３２３，９９７号、ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４と組み合わせて、完全にまたは一部議論されている。
【０１２８】
（宿主細胞）
本発明により、さらに、本発明のＮｏｇｏ受容体−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および／または可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、原核生物である場合も、また真核生物である場合もある。細胞株が細胞培養方法と適合しており、発現ベクターの増幅、および遺伝子産物の発現と適合している限りは、本発明のタンパク質の発現に有用である真核生物細胞は限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル、またはヒト細胞株に由来するもののような脊椎動物細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。有用な真核生物宿主細胞の例として、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣ（登録商標）から入手することができるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手することができるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚性細胞ＮＩＨ−３Ｔ３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、同様の真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
【０１２９】
（ｒＤＮＡ分子を使用する組み換えタンパク質の産生）
本発明により、さらに、本発明のＮｏｇｏ受容体−１抗体もしくは抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド、および／または可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質を、本明細書中に記載される核酸分子を使用して産生するための方法が提供される。一般的な用語においては、組み換え形態のタンパク質の産生には、通常、以下の工程が含まれる：
最初に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。コード配列にイントロンが間に挟まっていない場合は、これはいずれの宿主での発現にも適している。
【０１３０】
その後、核酸分子は、状況に応じて、上記のような適切な制御配列と動作可能であるように連結中に配置させられて、タンパク質のオープンリーディングフレームを含む発現ユニットが形成される。発現ユニットは、適切な宿主を形質転換するために使用され、形質転換された宿主が組み換えタンパク質が産生される条件下で培養される。状況に応じて、組み換えタンパク質は、培地から、または細胞から単離される。タンパク質の回収および精製は、何らかの不純物が寛容であり得るいくつかの場合においては必要ない場合もある。
【０１３１】
上記の工程のそれぞれは、種々の方法で行うことができる。例えば、所望されるコード配列が、ゲノム断片から得られ、適切な宿主の中で直接使用される場合もある。種々の宿主において動作可能である発現ベクターの構築は、適切なレプリコン、および制御配列を使用して、上記のように行われる。制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現させるために使用される宿主細胞のタイプに応じて変化し、上記で詳細に議論されている。適切な制限部位を、もともと利用できない場合は、摘出可能な遺伝子がこれらのベクターの中に挿入されることを可能にするために、コード配列の末端に付加することができる。当業者であれば、当該分野で公知の任意の宿主／発現システムを、組み換えタンパク質を産生させるように本発明の核酸分子とともに使用するために容易に適応させることができる。
【０１３２】
本発明がより理解されるように、以下の実施例が示される。これらの実施例は、説明の目的のためのものにすぎず、いかなる様式においても本発明の範囲を限定するとは解釈されない。
【実施例】
【０１３３】
（実施例１）
（マウスモノクローナル抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の産生）
本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに特異的に結合する抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体を、以下の方法および手順を使用して作成した。
【０１３４】
（免疫化）
２つの免疫化アプローチを使用した：
（１．免疫原としてのＮｏｇｏ受容体−１（ＮｏｇｏＲ−１）を含むＣＯＳ−７細胞または細胞膜）
ラットＮｏｇｏ受容体−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ｎｏ．ＡＦ４６２３９０）を、ＣＭＶプロモーターと薬剤選択のためのゲネチシン耐性遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターｐＥＡＧ１２５６（Ｂｉｏｇｅｎ（登録商標））にサブクローニングした。組み換えプラスミドを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用してＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントをゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、２ｍｇ／ｍＬ）を使用して選択し、クローニングし、そしてＮｏｇｏ受容体−１タンパク質の表面での発現についてＦＡＣＳによって確認した。ＣＯＳ−７膜を、記載されている手順にしたがってこれらの細胞から調製し（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７５：１１５５−１１６１（２０００））、２回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬ（タンパク質濃度）で１０％のグリセロール中で−７０℃で保存した。
【０１３５】
８週齢の雌ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、５０μｇのラットＮｏｇｏ受容体−１−ＣＯＳ−７膜、または表面上にＮｏｇｏ受容体−１を発現するＣＯＳ−７細胞全体のいずれか、および５０μｌのＲＩＢＩ  ＭＰＬ−ＴＤＭ−ＣＷＳアジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む乳濁物のいずれかで、２週間ごとに１回、腹腔内に免疫した（Ｌｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。免疫化したマウスから血清を、最初の免疫化の前、２回目の免疫化の７日後、および３回目の免疫化の７日後、および３回目の免疫化の３８日後に採取し、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体力価を、以下に記載するようにＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１３６】
（２．免疫原としての特異的Ｎｏｇｏ受容体−１ペプチド）
ラットＮｏｇｏ受容体−１遺伝子配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉ（登録商標）ソフトウェアを使用して抗原性分析した（図２）。分析において同定した抗原性ペプチドを、標準的なグルタルアルデヒド手順を使用してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。
【０１３７】
８週齢の雌ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、５０μｇのＫＬＨ結合ペプチドと５０μｌの完全なフロイトのアジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む乳濁物で、２週間ごとに１回、腹腔内に免疫した。免疫化したマウスから血清を、最初の免疫化の前、２回目の免疫化の１週間後、３回目の免疫化の１週間後に採取し、抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体力価を測定した。追加免疫の用量を、３回目の免疫化の後に投与した。この追加免疫用量での免疫化の３日後に、融合実験を開始した。
【０１３８】
（ハイブリドーマの産生およびスクリーニング）
抗原性Ｎｏｇｏ受容体−１ペプチドで免疫化したマウスに由来する血清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、一方、Ｎｏｇｏ受容体−１を発現するＣＯＳ−７細胞で免疫化したマウスに由来する血清は、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。Ｎｏｇｏ受容体−１−ＣＯＳ−７細胞に特異的に結合した抗体についてポジティブであるマウスをフローサイトメトリーによって同定し、屠殺した。脾細胞をマウスから単離し、記載されている（Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ように、ＦＬ６５３骨髄腫（Ｉｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫のＡＰＲＴ誘導株、１０％のＦＢＳ、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、４ｍＭのＬ−グルタミン、および２０ｍｇ／ｍＬの８−アザグアニンを含むＤＭＥＭ中で維持した）に融合させた。融合させた細胞を、２４ウェルまたは４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）にプレートし、アデニン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養培地を供給した。ＡＡＴ耐性培養物を、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって、Ｎｏｇｏ受容体−１−ＣＯＳ−７細胞、またはＮｏｇｏ受容体−１抗原性ペプチドのいずれかに対する結合について、下記のようにスクリーニングした。ポジティブであるウェルの細胞を、限界希釈によってさらにサブクローニングした。
【０１３９】
Ｎｏｇｏ受容体−１抗原性ペプチドに対する抗体の結合についてスクリーニングするために、免疫原として使用したペプチドをＢＳＡに結合させた。５０μＬの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）中の０．５μｇの結合ペプチドを、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））のそれぞれのウェルに添加した。その後、プレートを、３７℃で１時間、または４℃で１６時間インキュベートし、非特異的結合部位を、０．１％のＢＳＡ、０．１％のオボアルブミン、０．１％のブロット（ｂｌｏｔｔｏ）、および０．００１％のアジドを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を使用してブロックした。ハイブリドーマ上清を添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）の５０μｌの１：１０，０００希釈液をそれぞれのウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。３回の洗浄の後、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させ、２Ｍの硫酸で停止させた。色の強さを、分光光度計において４５０ｎｍでモニターした。
【０１４０】
抗体を、全長のＮｏｇｏ受容体−１に対する結合について以下のようにスクリーニングした。ＣＯＳ−７細胞を、０．１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ
ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で製造供給元によって記載されているように標識した。等量のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）で標識した対照細胞を、抗Ｎｏｇｏ受容体−１試験血清とのインキュベーションの前に、洗浄したＮｏｇｏ受容体−１−ＣＯＳ−７細胞と混合した。５０μＬの細胞混合物を、９６ウェルＶ底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８７７、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）のそれぞれのウェルに分配し、１００μＬのハイブリドーマ上清または対照抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体を添加した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、５０μＬの、ＰＢＳ中のＲ−フィコエリスリン結合親和性純粋Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ坑マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともにインキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％のＦＢＳを含む２００μＬのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＡＣＳ分析を行った。あるいは、Ｎｏｇｏ受容体−１−ＣＯＳ−７細胞をハイブリドーマ上清と混合し、その後、Ｒ−フィコエリスリン結合ヤギ坑マウス二次抗体で処理し、標準的なＦＡＣＳ分析に直接供した。
【０１４１】
本発明者らは、種々の免疫原を使用して２５個の抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体を作成した。本発明者らは、免疫原としてラットＮｏｇｏ受容体−１の残基１１０〜１２５に対応するペプチド配列を使用して２つの抗体７Ｅ１１および５Ｂ１０を作成した。本発明者らは、免疫原として全長のラットＮｏｇｏ受容体−１でトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞から調製した膜を使用して、３つの抗体１Ｈ２、３Ｇ５、および２Ｆ７を作成した。本発明者らは、免疫原としてｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃを使用して１３個の抗体（１Ｄ９．３、１Ｅ４．７、１Ｂ４．３、２Ｃ４．３、１Ｆ１０．３、２Ｈ１．４、１Ｈ３．３、１Ｇ４．１、１Ｅ４．１、２Ｇ７．１、２Ｃ４．１、２Ｆ１１．１、および１Ｈ４．１）を作成し、免疫原としてラットＮｏｇｏ受容体−１の残基４２３−４３４に対応するペプチド配列を使用して７個の抗体（２Ｅ８．１、２Ｇ１１．２、および１Ｂ５．１）を作成した。
【０１４２】
（モノクローナル抗体７Ｅ１１および５Ｂ１０の配列分析）
本発明者らは、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを使用して全ＲＮＡを抽出し、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。本発明者らは、プライマー５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１２）および５’−ＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ−３’（配列番号２５）を使用してＰＣＲによって、軽鎖配列を増幅した。本発明者らは、プライマー５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１３）および５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＫＣＣＣＣＷＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＫＧＧＡ−３’（配列番号１４）を使用してＰＣＲによって重鎖配列を増幅した。これらのプライマーには、以下のような縮重ヌクレオチドが含まれている：ＳはＧまたはＣを示し；ＭはＡまたはＣを示し；ＲはＧまたはＡを示し；ＷはＡまたはＴを示し；ＫはＧまたはＴを示し；そしてＹはＴまたはＣを示す。本発明者らは、ＰＣＲ断片を配列決定ベクターにクローニングし、配列決定ベクターに特異的なプライマーを使用して、ジデオキシ鎖終結によってＣＤＲのＤＮＡ配列を決定した。本発明者らは、ＤＮＡ配列を概念的に翻訳し、モノクローナル抗体７Ｅ１１および５Ｂ１０の重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域の部分的なアミノ酸配列を表２に示す。ｍＡｂの重鎖および軽鎖に由来する３個のＣＤＲには、表２の中で下線を付けて示す。７Ｅ１１および５Ｂ１０の軽鎖は、９４％のアミノ酸配列同一性を有しており、重鎖は９１％のアミノ酸配列同一性を有している。ｍＡｂ  ７Ｅ１１、５Ｂ１０、と１Ｈ２は、ＩｇＧ１イソ型であり、ｍＡｂ  ３Ｇ５と２Ｆ７は、ＩｇＧ２ａイソ型である。これらの５個のｍＡｂのそれぞれは、κイソ型の軽鎖を有している。本発明者らは、このアプローチによって他のモノクローナル抗体の配列を分析する。
【０１４３】
（表２  ｍＡｂ  ７Ｅ１１と５Ｂ１０のアミノ酸配列）
【０１４４】
【表２】
2010207239.tif 000003
（モノクローナル抗体７Ｅ１１のエピトープマッピング）
Ｍａｂ  ７Ｅ１１は、ラットＮｇＲ１およびヒトＮｇＲ１の両方に結合する。７Ｅ１１の結合に関与しているエピトープを決定するために、本発明者らは、ラットＮｇＲ１の断片と合成ペプチドを作成し、７Ｅ１１への結合についてそれらを試験した。
【０１４５】
全８個のＬＲＲドメインと、Ｎ末端およびＣ末端キャップとを含むラットＮｇＲ１の組み換え断片（ｓＮｇＲ３１０）を、酸または臭化シアン（ＣＮＢｒ）のいずれかで処理し、ゲル電気泳動によって断片を分離した。未処理のｓＮｇＲ３１０は、４２ｋＤａの見かけの分子量で移動した。ｓＮｇＲ３１０の酸処理により、１５ｋＤａ（ａａ２７〜ａａ１２２）と３０ｋＤａ（ａａ１２３〜ａａ３１０）の２つの主要な切断産物が生じた。ＣＮＢｒ処理によって、３つの断片が生じ、これらは、３３／３５ｋＤａの二重線（ａａ２７〜２２９）（これは、異種のグリコシル化を受けた断片をおそらく示している）、１０ｋＤａの産物（ａａ２４１〜ａａ３１０）、および１１アミノ酸の断片（ａａ２３０〜ａａ２４０）（これは、ゲル上には留まらない）である。ゲルのウェスタンブロットを７Ｅ１１でプローブし、これによって、これが完全なラットＮｇＲ１（ａａ２７〜ａａ３１０）、１５ｋＤａの酸による断片（ａａ２７〜ａａ１２２）、および３５ｋＤａのＣＮＢｒによる断片（ａａ２７〜ａａ２２９）に結合することが明らかになった。７Ｅ１１は、３０ｋＤａの酸による断片（ａａ１２３〜ａａ３１０）、または１０ｋＤａのＣＮＢｒによる断片（ａａ２４１〜ａａ３１０）には結合しなかった。１５ｋＤａの酸による断片と３５ｋＤａのＣＮＢｒによる断片のいずれにも、配列ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号１）が含まれていた。これは、ＮｇＲ１上にある１つのエプトープに対する７Ｅ１１の結合と一致した。
【０１４６】
７Ｅ１１結合部位を、さらに、ｓＮｇＲ３１０のトリプシンペプチド消化物を試験することによって分析した。ＨＰＬＣ分析はいくつかの断片を示し、これによって、いくつかのトリプシン反応性であるリジンおよびアルギニン残基がＮｇＲ１配列中に存在することが示された。７Ｅ１１は、トリプシン消化ペプチドの１つだけに結合し、このことは、７Ｅ１１がＮｇＲ１上の１つのエピトープだけに結合することについてのさらなる証拠を提供する。その後の質量スペクトル分析（ＭＳ）および配列分析によって、結合されるペプチドがＡＡＡＦＴＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２６）であることが明らかになった。
【０１４７】
ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴペプチド（配列番号１）について、さらなるマッピング分析を行った。ペプチドをトリプシンで消化した。これによって２つの主要な断片ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）およびＶＶＤＰＴＴ（配列番号２８）が生じた。それらに結合する７Ｅ１１の能力を試験した。ＭＳ分析によって、抗体が、ペプチドＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）に結合し、したがって、このペプチドに７Ｅ１１についての結合エピトープが含まれていることが明らかになった。このペプチド断片の中での詳細なＭＳ分析によって、これもまた７Ｅ１１に結合する、Ａｓｎ１１５およびＧｌｎ１１７の脱アミノ化、１１２または１１３でのアラニンの付加、または１１４でのセリンの付加を有しているペプチドを含む、いくつかのスクランブルペプチドが同定された（表３）。これらのデータは、このペプチド断片中に存在しているいくつかのアミノ酸残基には、７Ｅ１１への結合に重要ではないものがある可能性を示している。
【０１４８】
（表３  ７Ｅ１１によって結合される変異体ペプチド）
【０１４９】
【表３】
2010207239.tif 000004
ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴペプチド（配列番号１）を、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎでも消化し、７Ｅ１１の結合を試験した。エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎは、このペプチドを３つのペプチド断片、Ｌ、ＤＬＳ、およびＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）に切断した。これらの産物のうち、７Ｅ１１はＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴペプチド（配列番号３６）に結合した。まとめると、トリプシンとＡｓｐ−Ｎでの切断のデータによって、さらに、７Ｅ１１の結合エピトープは、それらの間で共有されている配列ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）に限定された。
【０１５０】
７Ｅ１１はラットＮｇＲ１およびヒトＮｇＲ１に結合するが、マウスＮｇＲ１、ヒトＮｇＲ２、またはマウスＮｇＲ３には結合しないという観察に基づいて、種々の種に由来するＮｇＲ１、ＮｇＲ２、およびＮｇＲ３のアミノ酸配列を、７Ｅ１１の結合エピトープ中の重要な残基を推定するために分析した。配列アラインメントにより、ラットＮｇＲ１のアミノ酸１１０〜１２５と、ヒトＮｇＲ１の対応する配列が同一であり、マウスＮｇＲ１配列は１１９位の１つのアミノ酸だけが異なることが明らかになった（ラットＮｇＲ１およびヒトＮｇＲ１においてはＡｒｇ１１９、マウスＮｇＲ１においてはＨｉｓ１１９、表４）。
【０１５１】
（表４  種々の種に由来するＮｇＲの配列アラインメント）
【０１５２】
【表４】
2010207239.tif 000005
ＮｇＲ１上のＡｒｇ１１９は、７Ｅ１１との結合に関与している。なぜなら、これは、ラットＮｇＲ１とヒトＮｇＲ１にはしっかりと結合するが、マウスＮｇＲ１にはほとんど結合しないからである。同様に、７Ｅ１１はＮｇＲ３には十分には結合しないので、Ａｌａ１１６はエピトープには含まれる。なぜなら、ＤＮＡＱＬＲ配列（配列番号３７）の中において、ＮｇＲ３は、対応する配列においてアルギニンだけがＮｇＲ１とは異なるからである。ＤＮＡＱＬＲ配列（配列番号３７）のうち、ＮｇＲ２の６個の残基のうちの４個は、ラットＮｇＲ１と同じである。Ａｌａ１１６とＧｌｎ１１７が、アルギニンおよびヒスチジンでそれぞれ置き換えられている。これにより、Ａｌａ１１６が、７Ｅ１１との結合に寄与している重要なアミノ酸残基ではあるが、Ｇｌｎ１１７の関与を必ずしも妨げるわけではないことが確認される。
【０１５３】
これらの接点を確認するために、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ配列（配列番号２７）の中に点変異を含むいくつかのペプチドを作成し、７Ｅ１１との結合について試験した。ペプチドを、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））上に固定し、７Ｅ１１の段階希釈物を載せた。得られたＥＣ５０値を表５に示す。７Ｅ１１は、変異体Ｌｅｕ１１０ＡｌａおよびＡｓｐ１１１Ａｌａに結合し、もとのペプチドと同様のＥＣ５０値を有していた。Ｇｌｎ１１７Ａｌａを試験すると、ＥＣ５０値は３０倍に増大し、Ａｒｇ１１９Ｈｉｓを試験すると、ＥＣ５０値は２５倍に増大していた。もっとも顕著なＥＣ５０値の変化は、Ａｒｇ１１９をアラニンに変異させた場合に観察された。
【０１５４】
（表５  種々のＥＣ５０値を伴った変異体ペプチドに対する７Ｅ１１の結合）
【０１５５】
【表５】
2010207239.tif 000006
７Ｅ１１結合エピトープの位置を、また、ｓＮｇＲ３１０についての最近明らかにされた結晶構造において決定した。予想したように、７Ｅ１１エピトープが分子の表面に露出している構造が示された。残基Ａｒｇ１１９、Ｇｌｎ１１７、Ａｌａ１１６、およびＡｓｐ１１４は、構造から突き出しており、一方、Ｌｅｕ１１８とＡｓｎ１１５は内部に存在している。エピトープは、構造の凹面にある酸性パッチの先端と、一方の側面に面している塩基性表面にある。
【０１５６】
（モノクローナル抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体による可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１へのリガンド結合の阻害）
上記のように産生した抗Ｎｏｇｏ受容体−１モノクローナル抗体を、これらがＮｏｇｏ受容体−１に対するリガンドの結合を阻害するかどうかを決定するために試験した。
【０１５７】
０．５μｇの、下記のように産生したラットＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸残基２６〜３４４と、ラットＩｇＧ１分子のヒンジ領域およびＦｃ領域とを含む可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質（ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ）を、２５０μｇのプロテインＡ、またはコムギ胚芽アグルチニン結合ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に、２５℃で２時間かけて固定した。５０μＬのＨＥＰＥＳ緩衝化インキュベーション培地（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のオボアルブミン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、およびプロテアーゼ阻害因子）中の、Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ−１に結合させたＳＰＡビーズ、抗Ｎｏｇｏ受容体−１  ｍＡｂ、および１μＬの１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６（Ａｍｅｒｓｈａｍ，２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｎＭ）を、それぞれの試料ウェルに添加した。１６時間後、放射活性を、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、４連の試料において測定した。ＩＣ５０値を、曲線適合分析によって計算した（図３）（ＰＲＩＳＭ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＮＪ）。いくつかの実験においては、本発明者らは、ＡＰ−リガンド結合体（例えば、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６）を使用し、アルカリホスファターゼ活性をモニターすることによって結合を検出した。本発明者らは、Ｎｏｇｏ受容体−１に対するリガンドＭＡＧ−ＦｃおよびＡＰ−ＯＭ−ｇｐの結合をブロックするｍＡｂの能力もまたアッセイした。
【０１５８】
モノクローナル抗体７Ｅ１１、５Ｂ１０、１Ｈ２、３Ｇ５、および２Ｆ７は全て、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐのｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対する結合を阻害した。７Ｅ１１および１Ｈ２についてのＮｏｇｏ６６に対する計算したＩＣ５０は、それぞれ、４００ｎＭおよび６０ｎＭであった。Ｎｏｇｏ受容体−１に対する３つのリガンドの結合のｍＡｂによって媒介される阻害をモニターするＥＬＩＳＡによるデータを、表６にまとめる。
【０１５９】
（表６  ｍＡｂはＮｏｇｏ受容体−１に対する、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ、およびＯＭ−ｇｐの結合を阻害する）
【０１６０】
【表６】
2010207239.tif 000007
置き換えの割合（％）を３０ｎＭの抗体について示し、そして特定のｍＡｂについてのＥＣ５０を記載した曲線適合分析によって決定した。“−”は、検出できる程度の活性がないことを示し、“ＮＤ”は決定しなかったことを示す。
【０１６１】
（実施例２）
（Ｆａｂ−ファージ抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体の産生）
本発明の免疫原性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドに特異的に結合する抗Ｎｏｇｏ受容体−１Ｆａｂファージ抗体をもまた、以下のように、Ｆａｂ−ファージライブラリーをスクリーニングすることによって作成した。
【０１６２】
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  Ｆａｂ−ファージライブラリーＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤを、組み換えラット可溶性ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質、およびラットＮｏｇｏ受容体−１を発現するＣＯＳ７細胞に対してスクリーニングした。Ｎｏｇｏ受容体−１に特異的に結合するＦａｂ−ファージを精製し、特徴を決定した。１４Ｄ５の重鎖は、ＶＨ２遺伝子に由来するものであり、軽鎖はＶＫ１遺伝子に由来するモノであった。これらのＦａｂ−ファージ１４Ｄ５の１つについて重鎖および軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を、表７に示す。
【０１６３】
（表７  １４Ｄ５のＣＤＲのアミノ酸配列）
【０１６４】
【表７】
2010207239.tif 000008
１４Ｄ５は、一価および二価のいずれの形態でもラットＮｏｇｏ受容体−１に結合する。さらに、１４Ｄ５は、マウスＮｏｇｏ受容体−１およびヒトＮｏｇｏ受容体−１、ならびにヒトＮｏｇｏ受容体−２に結合するが、マウスＮｏｇｏ受容体−３には結合しない。
【０１６５】
（実施例３）
（抗Ｎｏｇｏ受容体−１モノクローナル抗体によるＮｏｇｏ受容体−１の免疫沈降）
免疫沈降を行うために、１００μＬの溶解させた細胞、または５０μＬのＰｉＰＬＣで処理した細胞を、４００または４５０μＬの抽出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）、またはＲＩＰＡ緩衝液と、それぞれ、３０μＬのプロテインＡまたはＧ、および１〜２μｇの抗体の存在下で、混合した。混合物を、４℃で１６時間、震盪装置の中でインキュベートした。
【０１６６】
試料を、穏やかに攪拌してプロテインＡまたはＧが結合したビーズをペレットとした。ビーズを１ｍＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標））で３回洗浄した。最後の洗浄は、１０％のもとの洗浄緩衝液を使用して行った。
【０１６７】
ビーズを、１０％のβ−メルカプトエタノールを含む１００μＬの２×ＳＤＳ中に再度懸濁した。試料を室温でインキュベートし、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲル上で泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって決定すると、モノクローナル抗体３Ｇ５および２Ｆ７がＮｏｇｏ受容体−１を免疫沈降させた。
【０１６８】
（実施例４）
（ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の決定）
実施例１および２で産生したモノクローナル抗体およびＦａｂ−ファージ抗体の特異性を決定するために、本発明者らは、Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドのパネルを使用してＥＬＩＳＡを行った。パネルは、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ（ラットＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸２６〜３１０とラットＦｃ断片を含む融合タンパク質）、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ（上記を参照のこと）、ポリペプチドｐ−６１７（配列番号１）、ポリペプチドｐ−６１８（ａ１９〜ラットＮｏｇｏ受容体−１のＬＲＲ７領域に由来するアミノ酸ポリペプチド；図２；配列１１）、ならびに、ポリペプチドｐ−４およびｐ−５（それぞれ、Ｎｏｇｏ受容体−１のＬＲＲ５およびＬＲＲＣＴ領域に由来するポリペプチド）から構成された。オボアルブミンおよびＢＳＡを対照として使用した。図４に示すように、ｍＡｂ  １Ｈ２、３Ｇ５、および２Ｆ７は全て、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに特異的に結合した。同様の実験においては、これらの抗体は、ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸３１０〜３４４からなるポリペプチド（配列番号３）にも特異的に結合し、ｍＡｂ  ７Ｅ１１および５Ｂ１０はポリペプチドｐ−６１７（配列番号１）に特異的に結合した。
【０１６９】
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの免疫化による１０個の抗体（１Ｄ９．３、１Ｅ４．７、１Ｂ４．３、２Ｃ４．３、１Ｆ１０．３、２Ｈ１．４、１Ｈ３．３、１Ｇ４．１、１Ｅ４．１、および２Ｇ７．１）は、結合について互いに置換することができ、このことは、これらが、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ上の同様であるかまたは重複しているエピトープを認識することを示している。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの免疫化による他の３個の抗体（２Ｃ４．１、２Ｆ１１．１、および１Ｈ４．１）は、アミノ酸残基２６〜３１０に存在する異なるエピトープを認識する。
【０１７０】
本発明者らは、また、Ｆａｂ−ファージ１４Ｄ５を使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、ＡＰ−ＯＭ−ｇｐ、およびＭＡＧ−Ｆｃリガンドを、固定したｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに結合させた場合には、１μＭの１４Ｄ５はＮｏｇｏおよびＭＡＧの結合を完全に阻害した。１０μＭの１４Ｄ５が、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対するＯＭ−ｇｐの結合を完全に阻害するためには必要であった。
【０１７１】
（実施例５）
（神経突起成長についてのアッセイ）
ニューロンに対するＣＮＳミエリンの阻害作用を弱める、上記で産生したモノクローナル抗体およびＦａｂ−ファージ抗体の能力を試験するために、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウェル）を、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ（登録商標）））でコーティングした。ＣＮＳミエリンまたはＰＢＳを、３μＬの液滴としてスポットした。蛍光ミクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を、ミエリン／ＰＢＳに添加して、後で液滴が同定できるようにした（Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，２０００）。その後、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドをリンスし、１０μｇ／ｍＬのラミニン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））でコーティングした。Ｐ３−４
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの子供から後根神経節（ＤＲＧ）を取り出し、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ１型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で解離させ、炎磨きパスツールピペット（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｐｉｐｅｔｔｅ）で粉末状にし、ニューロン細胞を多く含むように予めプレーティングし、最後に予めコーティングしたＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド上に２３，０００細胞／ウェルでプレートした。培養培地は、５％の熱不活化ドナーウマ血清、５％の熱不活化ウシ胎児血清、および５０ｎｇ／ｍＬのｍＮＧＦを含むＦ１２とし、３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。１５μｇ／ｍＬのｍＡｂ  ７Ｅ１１を、プレーティングの直後に添加した。
【０１７２】
スライドを、２０％のスクロースを含む４％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定し、１：５００希釈した、ニューロンマーカーである抗β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＴＵＪ１）について染色した。二次抗体である抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：３００希釈し、スライドを、Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（登録商標）（Ｂｉoｍｅｄｉａ（登録商標））を用いてカ
バースライドをかけた。ＯｐｅｎＬａｂ（登録商標）ソフトウェアを用いて５倍のデジタル画像を獲得し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェアを使用して、神経突起成長の定量のために分析した。
【０１７３】
ＭＡｂ  ７Ｅ１１は、神経突起成長のミエリンによって媒介される阻害からＤＲＧニューロンを保護した（図５）。同様の結果が、ｍＡｂ  １Ｈ２、および３Ｇ５を用いても観察された。
【０１７４】
ラットＰ７  ＤＲＧニューロンを、ＣＮＳミエリン基質上で培養した場合の神経突起成長の保護アッセイにおいては、二価の１４Ｄ５もまた、神経突起成長を効率よく促進した。
【０１７５】
（実施例６）
（Ｎｏｇｏ受容体−１でトランスフェクトした細胞についての７Ｅ１１を用いた免疫組織化学）
実施例１に記載したように産生した抗Ｎｏｇｏ受容体−１  ｍＡｂの結合特性をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ラットＮｏｇｏ受容体−１またはヒトＮｏｇｏ受容体−１を発現する、固定されたおよび生存しているＣＯＳ−７または２９３細胞の両方に対する結合を比較した。
【０１７６】
（固定された細胞）
Ｎｏｇｏ受容体−１でトランスフェクトした細胞と、トランスフェクトしていない細胞を、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド中にプレートし、ＰＢＳ中の、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、１０％の正常なヤギの血清、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１時間ブロックした。Ｍａｂ  ７Ｅ１１を、ブロッキング溶液中で１５μｇ／ｍＬ、および１．５μｇ／ｍＬで添加し、室温で２時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ（登録商標）結合二次抗体抗マウス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ブロッキング溶液中で１：３００希釈で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩを全ての核種を標識するために二次抗体に対して５μｇ／ｍＬで添加した。
【０１７７】
（生存している細胞）
トランスフェクトした細胞と、トランスフェクトしていない細胞を、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド中にプレートし、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のドナーウマ血清を含む）で、４℃で３０分間ブロックし、ＦＡＣＳ緩衝液中の１５μｇ／ｍＬ、および１．５μｇ／ｍＬの７Ｅ１１とともに、４℃で１時間インキュベートし、リンスし、二次抗体抗マウス−Ａｌｅｘａ（登録商標）（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：３００希釈）とともに４℃で３０分間インキュベートした。
【０１７８】
免疫組織化学染色実験は、全てのｍＡｂがラットのＮｏｇｏ受容体−１を発現する細胞に結合したことを示した。ｍＡｂ  ７Ｅ１１、２Ｇ７．１、および２Ｃ４．１は、ヒトＮｏｇｏ受容体−１を発現する、固定した細胞および生存している細胞の両方に結合した。
【０１７９】
（実施例７）
（脊髄挫傷のマウスモデル）
生体内でのニューロンに対する実施例１で産生した抗Ｎｏｇｏ受容体−１  ｍＡｂの効果を試験するために、本発明者らは、マウスの脊髄挫傷モデルを使用する。
【０１８０】
雌のマウス（１８〜２２ｇ）を、鎮痛薬および抗生物質で予防的に処置する。マウスに麻酔をかけ定位固定装置に置き、立体顕微鏡下にて脊柱固定を行う。脊髄への外傷を、落錘方法の修正版によって行う（Ｍ．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃａｓｐａｓｅ−１  ａｎｄ  −３  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．３３３−３４２，２０００）。
【０１８１】
簡単に説明すると、Ｔ９およびＴ１０椎弓切除術を行い、脊柱を、一対のマウス用の横方向のクランプを使用して安定させ、Ｔ９−Ｔ１０横方向の処理を双方からサポートする。直径１．４ｍｍ、重さ２ｇのステンレス鋼製の衝突棒（ｉｍｐａｃｔ  ｒｏｄ）を、硬膜の上２．５ｃｍに上げ、Ｔ１０レベルで脊髄に落とす。外科手術の間、マウスは３７℃の加温毛布の上に維持し、１ｍＬの暖めた滅菌の生理食塩水を、脱水を避けるために外科手術後、それぞれのマウスに皮下投与する。膀胱を、反射的な膀胱の制御が回復するまで、１日に１回、手で絞る。
【０１８２】
全ての動物に、外科手術後８〜１２時間おきに術後鎮痛剤を投与し、その後７日間にわたって抗生物質での処置を１日に２回行う。動物は、研究期間を通じて食物および水を自由に摂取できるようにする。抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体を、以下のラットの脊髄離断モデルにおいて記載するように、２８日間にわたり、髄腔内注射によって損傷部位に投与する。
【０１８３】
（実施例８）
（可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質の特徴づけ）
可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド（ｓＮｏｇｏＲ−１）および融合タンパク質（Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ−１）を特徴付けるために、本発明者らは以下の実験を行った。
【０１８４】
３μｇの可溶性Ｎｏｇｏ受容体（ｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦｃおよびｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ）を、２５０μｇのＷＧＡ−ＳＰＡビーズ上に固定し、１００μＬの最終容量の結合緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＣａ、２ｍＭのＭｇ、０．１％のＢＳＡ、０．１％のオボアルブミンおよびプロテアーゼ阻害因子）中の０．５μＬの放射活性リガンド（最終濃度０．５ｎＭ）を投与した。リガンドには、１０μＭのＮｏｇｏ６６、１０μＭの１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０（ＮｏｇｏＡのアミノ酸１〜４０）、および１０μＬの抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体上清を、それぞれのリガンドのセットについて含めた。Ｎｏｇｏ４０上の３個のチロシンを別々にヨウ素化し、Ｎｏｇｏ４０−Ａ、−Ｂ、および−Ｃと、それぞれ命名した。三連の平均値を、較正した％結合放射活性として示す（図６、７、および８）。エラーバーはＳＥＭを示す。阻害因子が存在しない条件下で結合した放射活性を１００％とし、１０μＭのＮｏｇｏ４０の存在下での最も低い結合放射活性を、データを較正するための０％とした。
【０１８５】
（実施例９）
（可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質に対するリガンドの結合の阻害）
実施例８の結合アッセイと同様の結合アッセイを、実施例１で産生した２つのｍＡｂの、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対する１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６の結合を阻害する能力を試験するために使用した。Ｍａｂ  ２Ｆ７および３Ｇ５は、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対する１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６の結合を阻害した。
【０１８６】
（実施例１０）
（神経突起成長アッセイ）
Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウェル）を、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ（登録商標）））でコーティングした。ＣＮＳミエリンのみ、あるいは、ｓＮｏｇｏＲ３１０、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ融合タンパク質、ｍＡＢ  ５Ｂ１０、または対照としてのＰＢＳと混合したＣＮＳミエリンを、３μＬの液滴として別々にスポットした。蛍光ミクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を、ミエリン／ＰＢＳに添加して、後で液滴が同定できるようにした（Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，２０００）。その後、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドをリンスし、１０μｇ／ｍＬのラミニン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））でコーティングした。
【０１８７】
Ｐ３−４  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの子供から後根神経節（ＤＲＧ）を取り出し、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ１型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で解離させ、炎磨きパスツールピペット（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｐｉｐｅｔｔｅ）で粉末状にし、ニューロン細胞を多く含むように予めプレーティングし、最後に予めコーティングしたＬａｂ−Ｔｅｋ培養スライド上に２３，０００細胞／ウェルでプレートした。培養培地は、５％の熱不活化ドナーウマ血清、５％の熱不活化ウシ胎児血清、および５０ｎｇ／ｍＬのｍＮＧＦを含むＦ１２とし、３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。
【０１８８】
スライドを、２０％のスクロースを含む４％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定し、１：５００希釈した、ニューロンマーカーである抗β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＴＵＪ１）について染色した。二次抗体である抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：３００希釈し、スライドを、Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（登録商標）（Ｂｉoｍｅｄａ（登録商標））を用いてカバ
ースライドをかけた。ＯｐｅｎＬａｂ（登録商標）ソフトウェアを用いて５倍のデジタル画像を獲得し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェアを使用して、神経突起成長の量について分析した。
【０１８９】
ｓＮｏｇｏＲ３１０、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ、およびｍＡｂ  ５Ｂ１０は全て、神経突起の成長のミエリンによって媒介される阻害からＤＲＧニューロンを保護した（図９〜１１）。ｓＮｏｇｏＲ３１０を、ニワトリのニューロンを使用する同様のアッセイにおいて使用し、保護することを見出した。
【０１９０】
本発明者らは、また、ラミニンの存在下で増殖させた細胞と、ラミニンが存在しない条件下で増殖させた細胞を用いて実験を行うことにより、可溶性Ｎｏｇｏ受容体の神経保護効果を試験した。ラミニンを含まない培地中でのニューロン細胞の成長は乏しく、ニューロンのストレス条件のモデルとなる。
【０１９１】
ＤＲＧを、ラットの子供から生後６〜７日で切り出し（Ｐ６〜７）、単細胞になるように解離させ、上記のようにポリ−Ｄ−リジンを予めコーティングした９６ウェルプレート上にプレーティングした。いくつかのウェルには、２μｇ／ｍＬのラミニンを２〜３時間かけて添加し、細胞をプレーティングする前にリンスした。１８〜２０時間のインキュベーションの後、プレートを、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、１：５００希釈した、ウサギ抗β−ＩＩＩ−チューブリン抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ（登録商標））および１：１００希釈した抗ＨｕＣ／Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、１：２００希釈で添加した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＩＩ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標））を使用して、５倍のデジタル画像を獲得し、Ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用することによって、ウェルあたりの平均の神経突起成長／ニューロンとして神経突起成長を定量した。１種類の条件について３つのウェルからの９個の５倍の画像を分析した。
【０１９２】
いくつかの実験においては、ＰＣ１２細胞のサブクローン（Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標））を使用した（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標））。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を、２００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを用いて７日間の間予め分化させ、分離させ、ポリ−Ｄ−リジンをあらかじめコーティングした９６ウェルプレート上に再度プレーティングした。いくつかのウェルには、５μｇ／ｍＬのラミニンを２〜３時間かけて添加し、細胞をプレーティングする前にリンスした。２日間のインキュベーションの後、プレートを、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、１：５００希釈した、ウサギ抗β−ＩＩＩ−チューブリン抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ（登録商標））およびＨｏｅｃｈｓｔ（核染色）で染色した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＩＩを使用して、ＤＲＧ細胞中のものとして神経突起成長を定量した。
【０１９３】
ｓＮｏｇｏＲ３４４−ＦｃまたはラットＩｇＧを、プレーティング時に、Ｐ６−７  ＤＲＧニューロンおよび分化させたＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞に、溶液中で添加した。
【０１９４】
Ｐ６  ＤＲＧニューロンをラミニンが存在しない条件下で増殖させた場合のｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの神経保護作用を、１μＭおよび１０μＭで観察した。神経突起成長の定量は、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの添加に伴う用量依存性の増加を示した。ラミニン基質上でのＤＲＧニューロンの成長に対する同じ濃度のｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの添加は、何ら特異な効果を生じなかった。このことは、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃはストレスを受けた細胞に対してのみ活性があることを示している。ラミニンが存在しない条件下での同じ濃度のｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの神経保護効果を、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を用いて観察した。
【０１９５】
（実施例１１）
（Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ−１融合タンパク質の産生および精製）
ラットＮｏｇｏ受容体−１のアミノ酸１〜３１０をコードするｃＤＮＡ構築物を、哺乳動物発現ベクター中に含まれるラットＩｇＧ１  Ｆｃに融合させ、このベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ＤＧ４４）細胞にエレクトロポレーションした。細胞を、１０％の透析したウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、および抗生抗かび剤を補充したα−ＭＥＭ中で維持した。トランスフェクションの２日後、馴化培地を回収し、還元条件下でのウェスタンブロットによって分析した。約６０ｋＤａのタンパク質のバンドを、ポリクローナルウサギ抗Ｎｏｇｏ受容体−１抗体を使用して検出した。細胞を増殖させ、Ｒ−ＰＥ結合ヤギ坑ラットＩｇＧ抗体を使用して分類した。２回目の分類の後、細胞を、９６ウェルプレートに１細胞／ウェルの密度でプレーティングした。個々のウェルから分泌された可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１タンパク質のレベルを試験し、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して比較した。ＥＬＩＳＡプレートを、ヤギ坑ラットＩｇＧ  Ｆｃκ特異的抗体を用いてコーティングした。馴化培地をアプライした。結合した可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１タンパク質を、ＨＲＰ結合ロバ抗ラットＩｇＧ  Ｆａｂ、Ｆｃ特異的抗体によって検出した。クローン４Ｃ１２は最も高い分泌レベルを有していた。４Ｃ１２を、スピナーフラスコの中のＣＨＯ−Ｍ７培地中で拡大、増殖させた。分泌レベルは、３７℃で約１０ｍｇ／Ｌであった。
【０１９６】
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を、大スケールで培養した。１．７Ｌの濃縮した馴化培地を、１０Ｌのバイオリアクターを運用することによって得た。１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）の１／１０用量を添加することによって、ｐＨを上昇させた。固形の塩化ナトリウムおよびグリシンをそれぞれ、３．０Ｍおよび１．５Ｍになるように添加した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍの塩化ナトリウム、１．５Ｍのグリシン（ｐＨ８．９）で平衡化させた６０ｍＬのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを準備した。濃縮した馴化培地をカラムに、蠕動ポンプを使用して１．５ｍＬ／分でアプライした。カラムを、３００ｍＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍの塩化ナトリウム、１．５Ｍのグリシン（ｐＨ８．９）で洗浄し、その後、１２０ｍＬの５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ８．９）で洗浄した。タンパク質を、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ２．８）を用いて溶出させた。１０ｍＬの画分を、１．０ｍＬの１．０ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）を含むチューブに回収した。タンパク質画分をプールし、３×２Ｌの５ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
【０１９７】
（実施例１２）
（脊髄離断アッセイ）
生体内で機能回復を促進するそれらの能力を試験するために、ｓＮｏｇｏＲ−１融合タンパク質を、ラットの脊髄離断アッセイにおいて試験した。
【０１９８】
Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプに、使用する日に新しく作成した試験溶液（ＰＢＳ中のｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ）を充填した。充填濃度は、５μＭおよび５０μＭになるように計算した。ポンプを、動物への埋め込みの前に、３７℃で＞４０時間になるように準備した。雌のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットに、術前鎮痛剤と鎮静剤を投与し、イソフルラン（Ｏ２中３％）を使用して麻酔した。
【０１９９】
ラットを、定位フレームに入れ、運動皮質を露出させ、左右双方から菅追跡剤（ｔｒａｃｔ  ｔｒａｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）ＢＤＡ（１０，０００ＭＷ）を注入した。その後、ラットに、Ｔ５−Ｔ６で脊髄の背部片側切断を行い、その後、試験化合物を投与するための髄腔内カテーテルとポンプシステムを挿入した（１つのグループあたりｎ＝１１）。
【０２００】
ラットを回復させ、ラットは外科手術後２８日まで生存していた。ＢＢＢシステムを用いた行動採点法により、研究の生存期間が終わる直前である損傷の誘導後２８日までを記録した。潅流および固定後、脊髄を採取し、凍結防止し、切片とし、染色し、軸索のカウントを行った。
【０２０１】
Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動機能評価尺度（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １３，３４３−３５９）、傾斜板試験、および傾斜格子歩行試験（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，２００３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３，２３，４２１９−２７）を、損傷の後、ラットとマウスにおいてモニターした。傾斜板試験のために、本発明者らは、５０ｃｍ×６０ｃｍの板がマウスが滑り落ちることなく５秒間傾いていられる最大角を測定した。傾斜格子歩行のために、マウスに、４５度の傾斜のワイヤー格子をよじ登るようにトレーニングした（２．５４ｃｍ四方の３５ｃｍの長さ）。格子面よりも下に後肢が落ちた回数を、下から上までの各歩行について記録した。ラットの行動試験については、ＢＢＢ運動機能尺度、格子歩行分析および足跡の分析を行った。格子歩行のために、ラットに、ワイヤー格子上を歩くようにトレーニングし（２．５４ｃｍ四方の７０ｃｍの長さ）、格子面よりも下に後肢が落ちた回数を数えた。足跡の分析のために、ラットの後肢の歩行パターンを、９０ｃｍの通路を途切れることなく動く間に、インクで記録し、それぞれの側のストライドの長さおよびストライドの幅を計算した（Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８８３，１６５−１７７）。これらの行動試験の全てを、少なくとも２匹の個体によって行った。外科手術、行動試験、および組織学的分析の間中、研究は、ミニポンプの中の化合物の実体について盲検とした。
【０２０２】
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃは機能の回復を促進した（図１２）。
【０２０３】
（実施例１３）
（ラットの脊髄挫傷アッセイ）
生体内でのニューロンに対する可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドおよび融合タンパク質の作用を、ラットの脊髄挫傷アッセイにおいて試験する。
【０２０４】
雌のフードをかぶせたＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（１７０〜１９０ｇ）を、鎮痛剤と抗生物質で予防的に処置する。外科手術の１０分前に、動物を２．５ｍｇ／ｋｇのミダゾラムを用いてｉ．ｐ．で鎮静し、Ｏ２中の２〜３％のイソフルランで麻酔する。その後、ラットの毛を剃り、アルコールとベタジンで拭き、眼に眼用滑剤を点眼する。次に、中線切開を行い、Ｔ７からＴ１２脊椎を露出させる。
【０２０５】
背部椎弓切除術を、Ｔ９  １／２とＴ１０で行い、脊髄を露出させる。ラットを衝撃部材の上に載せる。Ｔ７およびＴ８セグメントを最初にクランプし、その後、Ｔ１１およびＴ１２セグメントを尾側のクランプに取り付ける。やわらかい物質をラットの胸部の下に入れる。衝撃部材の棒をゼロ位置にセットし、電気設置クリップを傷の端に取り付ける。その後、衝撃部材の棒を２５．０ｍｍまで上げ、露出させた脊髄の真上の位置になるように適切に調節する。次に、衝撃部材の棒を、露出させた脊髄に当たるように放し、衝撃部材の棒をすぐに拾い上げる。
【０２０６】
その後、ラットを取り外し、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）を傷の上に置く。傷を覆う筋肉を縫合し、切開部を外科用ホッチキスで留める。動物を、麻酔から回復するまでインキュベーターに入れる。ラットには、必要に応じて、抗生物質、鎮痛剤、および生理食塩水を投与する。膀胱を、機能が回復するまで毎朝晩に絞る。
【０２０７】
可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１融合タンパク質（例えば、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ）を、上記のラットの脊髄離断モデルにおいて記載したように、髄腔内投与する。ＢＢＢ採点法を、外科手術の１日後、その後４週間から６週間まで毎週行う。
【０２０８】
（実施例１４）
（トランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の発現）
本発明者らは、生体内で発現させた場合のその効果を試験するために、可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作成した。
【０２０９】
本発明者らは、マウスｓＮｏｇｏＲ３１０  ｃＤＮＡ（Ｎｏｇｏ受容体−１のアミノ酸１〜３１０に対応する）を、Ｃ−３１２３ベクターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。このベクターの中では、ｓＮｏｇｏＲ３１０の発現はグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ｇｆａｐ）遺伝子調節エレメントの制御下にある。グリア細胞繊維性酸性タンパク質遺伝子調節エレメントは、損傷の部位の反応性星状細胞からの分泌の増強を伴う、高レベルの発現を可能にする。本発明者らは、得られたベクターをＡａｔＩＩとＳｆｉＩで連続して消化し、ｇｆａｐ：：ｓＮｏｇｏＲ３１０構築物を３．４ｋｂの断片上に単離した。本発明者らは、この断片を胚にマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを作成した。本発明者らは、ＰＣＲによって、トランス遺伝子が組み込まれていることを確認し、５つの創始株を同定した。本発明者らは、最も高い発現レベルを有している２つの創始株のヘテロ接合型雄を、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。本発明者らは、ヘテロ接合型トランスジェニックマウスにおいてＧＦＡＰ陽性細胞がｓＮｏｇｏＲ３１０を発現し、分泌していることを、Ｎｏｇｏ受容体−１に対して惹起させた抗体を使用したウェスタンブロット分析によって確認した。
【０２１０】
本発明者らは、プロテアーゼ阻害因子（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中で皮質および脊髄をホモジナイズし、ホモジネートを４０，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した。本発明者らは、抗体特異性を高めるために上清を４％のパラホルムアルデヒドで２０分間処理し、免疫ブロッティングの前に透析した。本発明者らは、ＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ中の１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）中での超音波処理によって微粒子画分をホモジナイズし、得られたホモジネートを遠心分離し、この上清（界面活性剤可溶性微粒子画分）を上記のように処理した。本発明者らは、２０μｇの脳または脊髄タンパク質を、１：２０００希釈のＮｏｇｏ受容体−１に対して惹起させられたウサギ抗血清を使用する免疫ブロットによって分析した。本発明者らは、ＡＰ結合抗ウサギＩｇＧおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰ  ＡＰ基質とのインキュベーションによって、免疫反応性を視覚化した。
【０２１１】
本発明者らは、２つのトランスジェニック株Ｔｇ０８およびＴｇ０１に由来する皮質および脊髄の界面活性物質を含まない可溶性抽出物中に、分泌された３７ｋＤａのｓＮｏｇｏＲ３１０を検出した。しかし、３７ｋＤａまたは８１ｋＤａのいずれの可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１タンパク質は、同腹子の野生型（ＷＴ）マウス中に存在するとしても、ごくわずかであった。微粒子画分の試験により、ＷＴおよびトランスジェニックマウスの両方に相当のレベルの内因性Ｎｏｇｏ受容体−１が存在することが明らかになった。
【０２１２】
（実施例１５）
（損傷の後のトランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の発現）
本発明者らは、背部の全片側切断（ｏｖｅｒ−ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ）損傷を行うことにより、トランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の発現に対するＣＮＳ損傷の影響を試験した。本発明者らは、実施例１４に記載したようにヘテロ接合型の雄をＣ５７／ＢＬ６雌と交配させることによって、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスと、トランスジェニックではない対照動物を得た。
【０２１３】
本発明者らは、成体である雌のヘテロ接合型トランスジェニックマウスまたは同腹子であるＷＴマウス（１０〜１６週齢）に深く麻酔をかけ、完全な椎弓切除術を行って、Ｔ６およびＴ７のレベルで脊髄の背部を完全に露出させた。本発明者らは、３０ゲージ針と一対のマイクロシザーズでＴ６に背部全片側切断（ｏｖｅｒ−ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ）を行い、背部と背側部の皮質脊髄路（ＣＳＴ）を完全に切断した。本発明者らは、記号のついた針を脊髄の背部を数回貫通させて、病変が確実に１．０ｍｍの深さになるようにした。本発明者らは、椎弓切除術を行った筋肉層を縫合し、外科用ホッチキスで背面で皮膚を閉じた。皮質脊髄路を追跡するために、本発明者らは、脊髄損傷の１４日後に、頭蓋骨内において右側に大脳皮質を覆うバーホール（ｂｕｒｒ  ｈｏｌｅ）を作成した。本発明者らは、トレーサーＢＤＡ（ＭＷ  １０，０００、ＰＢＳ中で１０％）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、皮質表面から０．７ｍｍの深さで４つの注射部位に注入した。損傷の４週間後、マウスにＰＢＳを噴門から潅流させ、その後、４％のパラホルムアルデヒドを潅流させた。ｓＮｏｇｏＲ３１０の発現実験に使用したマウスには、トレーサーの注射を全く行わなかった。
【０２１４】
ウェスタンブロット分析に使用したマウスについては、Ｔ３とＬ３の間のレベルで脊髄を採取し、損傷の１４日後の潅流は行わなかった。Ｎｏｇｏ受容体−１免疫組織化学的染色に使用したマウスには、片側切断の１０日後に４％のパラホルムアルデヒドを潅流させ、損傷をうけた脊髄を切片を作成するために取り出した。トランスジェニックマウスとＷＴマウスの損傷した脳におけるｓＮｏｇｏＲ３１０の発現を試験するために、皮質の刺し傷を、定位固定装置に取り付けた１１番手術用メスを用いて作成した（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）。ブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）の０．５ｍｍ後方、中線から１．５ｍｍ側方、３．５ｍｍの深さに、４ｍｍの傍矢状の切開を行った。
【０２１５】
本発明者らは、トランスジェニックマウスにおいては、損傷の１０日後に、脊髄の可溶性抽出物中においてｓＮｏｇｏＲ３１０のレベルの増大を観察したが、ＷＴマウスにおいては見られなかった。このことは、病変の周辺でのＧＦＡＰの損傷後のアップレギュレーションと一致する。この原因が、Ｎｏｇｏ−Ａの代償性アップレギュレーションではないことを確認するために、本発明者らはその発現を試験し、ＷＴマウスとトランスジェニックマウスの両方に由来する、完全な、または損傷を受けた皮質および脊髄のいずれにおいても同様であったことを見出した。
【０２１６】
本発明者らは、病変の領域を含む損傷を受けた脳および脊髄の、Ｎｏｇｏ受容体−１およびＧＦＡＰに対する抗体での免疫染色によって、損傷を受けたＣＮＳ中でのｓＮｏｇｏＲ３１０の細胞性発現を試験した。反応性の星状細胞神経膠の一般的な形態は、ＷＴマウスとトランスジェニックマウスの間では差はなかったが、細胞内空間および細胞外空間の両方において、Ｎｏｇｏ受容体−１について染色された密度は、ＷＴマウスよりも、ｇｆａｐ：：ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスにおいて顕著に高い。このことは、トランスジェニックマウスの病変の周辺での高いｓＮｏｇｏＲ３１０の発現を示している。Ｎｏｇｏ受容体−１タンパク質は、トランスジェニックマウスだけにおいて、星状細胞マーカーであるＧＦＡＰと一緒に存在している。トランスジェニックの試料においては、大幅に強い拡散した非細胞性染色もまた存在し、これは、細胞外空間にあるｓＮｏｇｏＲ３１０と一致する。神経細胞体Ｎｏｇｏ受容体−１染色は、ＷＴマウスとトランスジェニックマウスの両方において検出される。
【０２１７】
（実施例１６）
（分泌されたｓＮｏｇｏＲ３１０はトランスジェニックマウスにおいてＣＳＴの萌芽を誘導する）
本発明者らは、トランスジェニックマウスにおける病変の周辺でのｓＮｏｇｏＲ３１０の発現の増大が損傷を受けた軸索の再生を生じるかどうかを試験した。
【０２１８】
本発明者らは、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３，４２１９−２７に記載されているように、順行性トレーサーであるビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）を右運動皮質に注入することによって、下行皮質脊髄路（ＣＳＴ）の完全性を調べた。同腹子のＷＴマウスにおいては、突出した背部ＣＳＴ（ｄＣＳＴ）は、病変に対して吻側にしっかりとまとまっており、いくつかの背側部のＣＳＴ線維は同側上に見ることができる。少数のＢＤＡ標識された短い付随する萌芽が、灰白質、具体的には、前索に突き出しているが、萌芽は、トレーサーの注入に対して対側性の脊髄の側に、大部分が確認できる。しかし、損傷を受けたｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスに由来する背部片側切断に対して吻側の切片は、極めて異なるＢＤＡ標識パターンを示す。高密度のＢＤＡ標識されたＣＳＴ線維が、株Ｔｇ０８または株Ｔｇ０１に由来する全てのトランスジェニックマウスにおいて突出したｄＣＳＴの外側に観察される。異所性の線維は、灰白質の領域を貫通して伸び、いくつかの線維は外側白質および背側部の白質にまで達する。いくつかの線維（横断切片あたり４〜１２個の萌芽）が、脊髄の反対側（トレーサーの注入部位に対して同側）に見られる。付随する萌芽のマイクロデンシトメトリーによる測定は、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスにおいて萌芽の密度がおよそ１０倍増大したことを示す。病変に対して１から４ｍｍ吻側の傍矢状の縦断面の試験により、ｄＣＳＴ線維がｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスにおいては腹部の灰白質の領域に入るような多数の分岐する萌芽を延ばし、これが同腹子であるＷＴ動物とは対照的であることが明らかになる。一般的には、トランスジェニックマウスの病変に対して吻側の萌芽のパターンおよび広がりは、Ｎｏｇｏ受容体−１アンタゴニストペプチドＮＥＰ１−４０で全身的に処置したマウスにおいて観察されるものと似ている（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，２００３）。
【０２１９】
これらの結果は、分泌されたｓＮｏｇｏＲ３１０がトランスジェニックマウスにおいてＣＳＴ萌芽を誘導することを示している。
【０２２０】
（実施例１７）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスにおいては、ＣＳＴ軸索の再生により病変部位を回避して脊髄の先端へとバイパスする）
本発明者らは、トランスジェニックマウスから、病変部位に対して吻側４ｍｍから尾側４ｍｍの脊髄（合計８ｍｍ長）を単離した。これを、グルタルアルデヒド重合アルブミンマトリックスに包埋し、ビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）（３０μｍの厚み）の上で傍矢状に切断した。本発明者らは、損傷部位に対して吻側５〜７ｍｍ、尾側５〜７ｍｍの脊髄から、横断切片（５０μｍ）を回収した。ラットにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの注射実験のために、病変部位から、吻側１０ｍｍから尾側１０ｍｍまでまたがる脊髄を、バイブレーションミクロトーム上で傍矢状（５０μｍ）に切断した。横断切片を、損傷部位に対して吻側１１〜１６ｍｍから尾側１１〜１６ｍｍの脊髄から回収した。本発明者らは、これらの切片を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートし、ニッケル増強ジアミノベンジジンＨＲＰ反応によってＢＤＡトレーサーを視覚化した（Ｇｒａｎｄｐｒｅ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１７，５４７−５５１）。本発明者らは、間接的な免疫蛍光によって、セロトニン免疫組織化学（抗−５−ＨＴ抗体）のためにいくつかの切片を処理した。病変の領域を視覚化するために、本発明者らは、いくつかの切片を、ＧＦＡＰに対する抗体（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で二重染色した。本発明者らは、封入剤で切片を封入し、脱水し、保護した。
【０２２１】
本発明者らは、損傷後にトランスジェニックマウスにおいて発現されたｓＮｏｇｏＲ３１０によって誘導された線維  （実施例１６）が、病変の領域を抜けて尾側の脊髄に達し、機能回復をもたらすかどうかを試験した。
【０２２２】
カメラルシーダディスプレイに取り込んだ損傷部位の全域を越える連続する傍矢状切片は、病変から数ミリメートルの再生しつつあるＣＳＴ線維の全体的な分布パターンを示す。ＷＴマウスに由来する切片は、損傷部位を越えて伸びるＣＳＴ繊維は示さない。ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスに由来する同様の切片は、離断領域を超える多数のＣＳＴ線維と、先端部の灰白質および白質の領域に伸びる突起を、高度に分岐したパターンで示す。片側切断に対してすぐ吻側には、高密度のＢＤＡ標識されたＣＳＴ萌芽が、突出したｄＣＳＴ突起から病変の領域の方向に存在するが、ほとんどのＣＳＴ萌芽は、傷跡の形成および組織の空孔が顕著である離段領域を超えることはできなかった。少しではあるが極めて顕著な、再生しつつある軸索の画分が、腹部および腹側部の灰白質および白質の残っている組織の細胞間橋を通って病変部位を回避する。さらに、ごく少数のＣＳＴ線維は、離断領域自体を通過して、病変の背部および背側部の脊髄を通って先端領域へと伸びるようである。病変の近傍では、再生しつつある線維の進路は通常、蛇行性であり、吻側のＣＳＴ中の正常なまっすぐの線維とは極めて異なる。側枝および樹枝状の線維は、脊髄の先端部の灰白質領域において最も頻繁に見られる。再構築により、それぞれのトランスジェニックマウスにおいて病変に対して尾側１〜４ｍｍのいずれかのレベルで、吻−尾軸において、５〜１５本のＢＤＡ標識された再生しつつある線維の追跡が明らかになる。背部片側切断に対して５〜７ｍｍ尾側の横断面については、ＢＤＡ標識されたＣＳＴ軸索が、それぞれのトランスジェニックマウスにおいて灰白質と白質の両方の領域において見られる。トランスジェニックマウスについての繊維の数は、矢状断面の最も近いレベルとほぼ同数のＢＤＡ標識されたＣＳＴ線維を示す。
【０２２３】
ＣＳＴ線維に加えて、他の下行路、例えば、縫線核脊髄線維もまた、マウスの運動機能に関与している。このマウスの背部全片側切断（ｏｖｅｒ−ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ）モデルにおいては、離断によりセロトニン作動性線維の大部分が損傷を受け、前角においてはこれらの線維の密度がおよそ８０％減少した。尾側の脊髄の前角におけるセロトニン線維の全長の分析は、トランスジェニックマウスにおいてはＷＴグループよりもはるかに多い数のこれらの線維を示し、このことは、トランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の成長促進作用が、１つの軸索の下行路には限定されないことを示している。
【０２２４】
（実施例１８）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０のトランスジェニックでの発現は運動機能の回復を改善する）
ＣＳＴ軸策の追跡およびセロトニン作動性線維の分析は、トランスジェニックマウスにおいて星状細胞から分泌されたｓＮｏｇｏＲ３１０が、脊髄の損傷をうけた下行軸索の広範囲の解剖学的再生を刺激することを示している。本発明者らは、これらの再生した線維が機能の回復に利点をもたらすかどうかを決定するために、実施例１２に記載したいくつかの行動試験を行った。
【０２２５】
ＢＢＢ試験によって評価した場合には、ＷＴマウスは、４週間の生存期間の間に運動機能を一部回復する。損傷後４週間では、ほとんどのＷＴマウスが、しっかりと体重を支えながら、しっかりと足底で踏みしめることによって特徴付けられるレベルに回復したが、これらは、時折、前肢−後肢の同調を生じるだけで、主に、最初に表面に接触させた足の位置で旋回する。対照的に、株Ｔｇ０８およびＴｇ０１の両方に由来するｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスのＢＢＢスコアは、７〜２８日の観察期間を通じて、対照のグループよりも有意に高い（図１３Ａおよび１３Ｂ）。損傷の２８日後には、ほとんどのトランスジェニックマウスが一貫して前肢−後肢の同調を示し、主に、足の位置は体に対して並行である。
【０２２６】
本発明者らは、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスの能力をさらに特徴付けるために、２つのさらなる行動試験を使用した。最初に、本発明者らは、５秒以内にマウスがその格子を落ちることなく傾けられた板につかまっていられる最大角を測定した。背部片側切断による損傷の前には、トランスジェニックマウスおよびＷＴマウスの両方が、５５度に傾けられた板の上でその姿勢を維持できる。損傷の７〜２８日後に、維持できる角度は、全てのマウスにおいて低くなるが、トランスジェニックマウスが維持できる角度は、対照のグループよりも有意に大きい（図１３Ｃ）。別の行動試験においては、マウスに、垂直に対して４５度の角度に置いた格子に上らせ、格子面から後肢が脱落した回数を数えた（Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。損傷前のトレーニングの間のこの試験においては、マウスはミスすることはなかった。損傷後２〜６週間の期間の間には、ＷＴマウスは多数回の足を踏み外すミスをし、最少程度の改善しか見られない。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスは、この期間の間に、格子をよじ登ることにおいて進行性の改善を示し、ほとんどの改善は損傷後１〜３週間の間に生じる（図１３Ｄ）。したがって、星状細胞からｓＮｏｇｏＲ３１０を分泌するトランスジェニックマウスは、胸部脊髄の片側切断の後、ＣＳＴの再生、縫線核脊髄萌芽、および運動機能の改善を示す。
【０２２７】
（実施例１９）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質の髄腔内投与によりＣＳＴの萌芽が誘導される）
脊髄の外傷後の可溶性Ｎｏｇｏ受容体−１の成長促進の利点についての第２の試験として、本発明者らは、精製したタンパク質を髄腔内投与した。
【０２２８】
本発明者らは、安定性を増大させ精製を促進するために、ラットのＮｏｇｏ受容体−１のリガンド結合ドメイン（２７〜３１０）をラットＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合させた。本発明者らは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からタンパク質を精製した。このタンパク質は、マウスｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｍｙｃ  Ｈｉｓについて以前に示されたとおり（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２，８８７６−８８８３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１１９０−１１９３）、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧ、およびミエリンの作用を生体外でブロックする。本発明者らは、胸中部の背部片側切断損傷を行ったラットに、浸透圧ミニポンプによりｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質を髄腔内投与した。損傷後の４週間の生存期間の間に、１．２ｍｇのｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質を、それぞれのラットに局所投与した。ビヒクル（１．２ｍｇのラットＩｇＧ）での処置を受けたラットにおいては、片側切断部位に対して吻側の切片は、しっかりとまとまった突出した背部ＣＳＴを示し、病変部位の上部にはごく少数の異所性ＢＤＡ標識ＣＳＴ線維を示す。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質を投与した損傷を受けたラットに由来する、病変に対して吻側の切片は、極めて異なる標識パターンを示す。ＢＤＡ標識されたＣＳＴからの多数の異所性線維の萌芽が、横断切片および傍矢状切片から観察される。いくつかの場合には、突起が、中線付近のｄＣＳＴ領域から脊髄の境界線に向かってのび、背側部ＣＳＴと混ざりあっている。芽がでかかった軸索は灰白質を通り、白質よりもさらに伸びている。ｄＣＳＴに隣接する異所性の芽がでかかった線維の測定（横断切片において≧１００μｍ、矢状断片においては≧２００μｍ）により、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットにおけるさらなる増大が明らかになる。
【０２２９】
（実施例２０）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットにおいて、ＣＳＴ軸索は脊髄の先端へと再生する）
本発明者らは、雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９０〜２５０ｇ）に深く麻酔をかけ、Ｔ６〜７の脊髄レベルで椎弓切除術を行い、脊髄を露出させた。本発明者らは、脊髄の背部の半分を、３０ゲージ針と一対のマイクロシザーズで切断し、ＣＳＧＴ経路の背部を完全に切断し、１１番手術用メスの鋭い部分を脊髄の背部の半分を横断させることにより、病変の深さ（１．８ｍｍ）を確保した（Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１７，５４７−５５１）。ＰＢＳ中の１．２ｍｇのラットＩｇＧ、またはＰＢＳ中の１．２ｍｇのｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ融合タンパク質を充填した浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）、２ＭＬ４、２ｍＬの容量、２．５μＬ／ｈ、２８日間の投与）を、動物の背中の皮膚の下の筋肉に埋め、縫合した。ミニポンプの出口に接続したカテーテルを、硬膜の中の小さな穴を通じてＴ７〜８のレベルで脊髄の髄腔内空間に挿入した。
【０２３０】
Ｎｏｇｏ受容体−１アンタゴニストタンパク質の注入により、ラットの片側切断に対して吻側で広範囲の萌芽を誘導したが、より重要な問題は、芽を出しつつあるＣＳＴ線維が脊髄の先端に突き出すかどうか、そして運動機能の回復に関係しているかどうかである。ビヒクルで処置したラットに由来する病変部位を横切る縦断面は、病変のレベルより下では、検出できる程度のＢＤＡ標識された腹部ＣＳＴ線維は示さないか、またはごく少数のＢＤＡ標識された腹部ＣＳＴ線維しか示さない（ＧｒａｎｄＰｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，３５１３−３５１８）。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットに由来する同様の切片は、多くのＢＤＡ標識線維が離断部位をバイパスし、主に腹部および腹側両面脊髄の組織の細胞間橋を通って尾側の脊髄に向かって突出することを示す。星状細胞マーカーＧＦＡＰについての免疫染色は、離断の程度が脊髄中心菅の領域よりも深くまで到達していることを示す。突出した背部ＣＳＴ中の吻側の線維の直線的なプロフィールとは異なり、再生したＣＳＴ線維は、通常、脊髄先端、特に、灰白質の領域においては、高度に分岐している軌跡を残す。これらの線維は、脊髄の多くの領域で検出されるが、これらは、脊髄の中心部分、および脊髄の背部の半分から脊髄の隅々にわたって容易に見ることができる。矢状断面によるＣＳＴ線維の数は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットのそれぞれに由来する病変に対して１〜２ｍｍ尾側ではおよそ２０個のＢＤＡ標識された軸索を、病変に対して７〜８ｍｍ遠位では１５個の追跡された軸索を示す。
【０２３１】
一般的には、これらの線維の分岐パターンは、ＮＥＰ  １−４０ペプチドで局所的に処置された動物から観察されるパターンと類似しているが、それぞれの萌芽にさらに付随する分岐が、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質で処置した切片から見られる。脊髄の先端からの萌芽の測定は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットにおいてそれぞれの萌芽に付随する全ての長さが、ＮＥＰ  １−４０で処置した動物よりも２倍長いことを示す。Ｎｏｇｏ受容体−１アンタゴニストで処置したグループの両方における脊髄に対して１〜１０ｍｍ尾側の萌芽の数（長さに関して≧２００μｍ）は、対照のグループよりもおよそ２０〜４０倍多い。萌芽も、ＮＥＰ  １−４０で局所的に処置したラットよりもｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットにおいて多く見られるが（２５個の萌芽／ラットに対しておよそ５０個の萌芽／ラット）、この差は、統計学的に有意ではない（ｐ＝０．１７１３、ｔ検定）。
【０２３２】
再生しつつあるＣＳＴ軸索を、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置を受けさせたラットにおいて、片側切断に対して１１〜１５ｍｍ尾側の脊髄の横断切片において観察する。これらの線維は、脊髄の灰白質と白質の両方において検出される。灰白質で検出された繊維は、多くの場合には、白質の領域で見られるものよりも多くの分岐の付随を示す。対照的に、ビヒクルで処置したグループに由来する横断切片においては、腹部の白質の領域において、ごくたまにＢＤＡ標識が見られ、これは、損傷を受けていない腹部のＣＳＴ軸索と一致する。脊髄の先端のこのレベルでは、Ｎｏｇｏ受容体−１アンタゴニスト（ｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦｃおよびＮＥＰ  １−４０）で処置されたグループの両方に由来するＢＤＡ標識されたＣＳＴ線維の平均の数は、ビヒクルで処置されたラットよりもおよそ２０倍多い。まとめると、いずれのＮｏｇｏ受容体アンタゴニスト（ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質およびＮＥＰ  １−４０ペプチド）も、脊髄の先端において劇的なＣＳＴ軸索の再生を生じるが、前者によって誘導される萌芽は、より高度に分岐したパターンを示す。
【０２３３】
（実施例２１）
（局所ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃは、損傷を受けたラットの脊髄において赤核脊髄およびセロトニン作動性軸索の萌芽を誘導する）
片側切断の１４日後、バーホールを、ＣＳＴ線維の軌跡をたどるために、下肢の感覚運動皮質に重なる頭蓋骨のそれぞれの側に空けた。順行性のニューロンのトレーサーであるＢＤＡ（ＰＢＳ中に１０％、３．５μＬ／皮質）を、それぞれの側の硬膜から１．５ｍｍの深さの７個の注射部位に注射した（Ｇｒａｎｄｐｒｅ，２００２）。ラットにおいて赤核脊髄路の軌跡をたどるために、トレーサーＢＤＡ（１μＬ：ＭＷ  １０，０００；ＰＢＳ中１０％）を、左側の赤核（ブレグマの前方５．８ｍｍ、０．７ｍｍ側方、頭蓋骨表面に対して７．０ｍｍ腹部側）に注射した。ＢＤＡの注射の２週間後、これらの動物にＢＰＳを潅流させ、その後、４％のパラホルムアルデヒドを潅流させ、組織を組織学のために採取した。
【０２３４】
損傷を受けた赤核脊髄路（ＲＳＴ）繊維の修復は、脊髄損傷後の機能の改善に関与している（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９，４３７０−４３８７）。ＣＮＳニューロンにおけるＮｏｇｏ受容体−１の広範囲の分布（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２，５５０５−５５１５）は、Ｎｏｇｏ受容体−１のそのアンタゴニストでの阻害により、損傷後のＲＳＴ軸索の再成長を生じさせることができることを可能にする。損傷を受けたＲＳＴに対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの作用を試験するために、この経路の完全性を、左の赤核にＢＤＡを注射することによって軌跡をたどった。脊髄のレベルでは、ＲＳＴ線維は通常は、脊髄の背側部の白質の領域に局在しており、これを、この研究の背部片側切断によって離断する。対照ラットに由来する病変から１１〜１５ｍｍ吻側の横断切片においては、少数の短いＢＤＡ標識線維が、突出したＲＳＴと背部の角状灰白質の間に見られた。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置した同じレベルの切片は、メインのＲＳＴと背部の角状灰白質との間に多くの連結している線維を示す。ＳＣＩに対して１１〜１５ｍｍ遠位の横断切片については、ビヒクルで処置されたラットにおいてはＢＤＡ標識されたＲＳＴ線維は見られなかった。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの処置を受けた同じレベルの切片は、トレーサーの注射部位に対して対側にある灰白質および白質の両方において多くのＢＤＡ標識されたＲＳＴ線維を示す。分岐パターンを伴ういくつかの萌芽が、ＢＤＡ注射部位に対して同側の灰白質に見られる。
【０２３５】
赤核脊髄線維もまた、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置された脊髄損傷を受けたラットにおいて試験した。免疫染色は、病変に対して１１〜１５ｍｍ吻側のセロトニン作動性線維の密度を示し、これは、ビヒクルで処置されたグループとｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置されたグループの間で類似している。病変の１１〜１５ｍｍ下の切片においては、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置されたラットにおけるセロトン線維は、対照のグループの線維の２倍多く存在する。これらの結果は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質によるＮｏｇｏ受容体−１の阻害に対する反応性が、ＣＳＴ線維に限定されておらず、他の下方路、例えば、赤核脊髄およびセロトニン作動性軸索もまた、Ｎｏｇｏ受容体−１アンタゴニズムに反応することを示している。
【０２３６】
（実施例２２）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの局所処置によりラットにおける機能回復が改善する）
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質の髄腔内投与により、外傷性脊髄損傷後にいくつかの下方路において軸索の再生が刺激される。本発明者らは、このタンパク質により、損傷を受けた脊髄における機能回復もまた改善されるかどうかを試験した。
【０２３７】
片側切断の２週間後に、ビヒクルで処置したラットの運動機能ＢＢＢスコアは、１２の安定なレベルに達する（図１４Ａ）。外傷の４週間後、対照のほとんど（７匹のちの６匹）は、頻度が一定である体重を支える足底での踏み、および頻度が一定である前肢−後肢の同調を有しているが、これらは、主に、最初に表面に接触させた足の位置で旋回する。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質での処置を受けさせたラットにおいては、運動機能スコアは、外傷後２〜４週間の間改善し続ける。損傷の４週間後、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置された９匹の動物全てが、一貫した前肢−後肢の同調、および、最初に試験表面と接触させた足の位置と並行な足の位置を有していた。
【０２３８】
格子の歩行は、脊髄損傷後の下行する細かい運動機能の制御の欠損を評価するために使用されている（Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この能力には、前肢−後肢の同調、ならびに、腹側両面、皮質脊髄、および赤核脊髄線維によって媒介される随意運動の制御が必要である。損傷の前のトレーニングの間は、全てのラットが格子の棒の上に彼らの後肢を正確に置く。損傷後２〜４週間は、対照のラットは、１回のセッションについて８〜９回のミスをし、時間とともに最少程度の改善しか見られない。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットは、格子歩行について進行性の改善を示し、有意に少ないミスしかしない（平均で４〜７回／セッション）。改善のほとんどは、損傷後２〜３週間で生じる。対照のグループにおける後肢の足跡の分析は、損傷を受けていないラットまたはｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの処置を受けた損傷を受けたラットと比較して、片側切断後４週間で、ストライドの長さが顕著に小さく、立脚の幅が大きかったことを示す（図１４Ｃ）。したがって、これらの複数の行動試験は、Ｎｏｇｏ受容体−１機能の、アンタゴニストタンパク質の局所注射での遮断により、損傷後の運動機能の回復に改善が生じたことを示す。
【０２３９】
（生物学的寄託物）
ハイブリドーマＨＢ  ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）、ＨＢ  １Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８４）、ＨＢ  ３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８６）、ＨＢ  ５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８８）、およびＨＢ  ２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８５）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ（登録商標）」、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ
２０１１０−２２０９，ＵＳＡに、２００２年８月９日に寄託した。
【０２４０】
当業者に明らかであるように、多数の変更および修飾を、本発明の精神を逸脱することなく本発明の好ましい実施形態に対して行うことができる。全てのこのようなバリエーションは、本発明の範囲に含まれるように意図される。
【図１】
2010207239.tif 000009
【図２】
2010207239.tif 000010
【図３】
2010207239.tif 000011
【図４】
2010207239.tif 000012
【図５】
2010207239.tif 000013
【図６】
2010207239.tif 000014
【図７】
2010207239.tif 000015
【図８】
2010207239.tif 000016
【図９Ａ】
2010207239.tif 000017
【図９Ｂ】
2010207239.tif 000018
【図１０Ａ】
2010207239.tif 000019
【図１０Ｂ】
2010207239.tif 000020
【図１１】
2010207239.tif 000021
【図１２】
2010207239.tif 000022
【図１３】
2010207239.tif 000023
【図１４】
2010207239.tif 000024