(57)【要約】      （修正有）【課題】特に治療的適用において使用するために大規模な量の活性な（感染性の）アデノウィルスおよびＡＡＶの精製の提供。【解決手段】クロマトグラフィ材料との接触から生ずるウィルスに対する、特にウィルスの表面成分に対する何らかの損傷が最小にされるかまたは排除されるような様式で、そのようなウィルスを適当なクロマトグラフィ材料と接触させるための改良された方法。その結果は、治療的適用、例えば遺伝子導入／治療処置において使用するために適当な活性な（感染性の）ウィルスの商業的水準の量を迅速に且つ有効に精製するその能力である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アデノウイルス感染細胞を溶解して活性なアデノウイルスを含む全細胞溶解産物を生成し、
（ｂ）該溶解産物を少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスに適用し、そして
（ｃ）全細胞溶解物のアデノウイルス活性の６０〜１００％を有するアデノウイルス粒子の組成物を回収すること
を含むアデノウイルスの精製方法であって、
該クロマトグラフィーマトリックスが、アニオン交換材料、カチオン交換材料、疎水性相互作用材料、ヒドロキシアパタイト材料、ヘパリン材料、及びゲル濾過材料からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）に先立って、全細胞溶解物をヌクレアーゼとインキュベートすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）に先立って、全細胞溶解物を清澄化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）に先立って、溶解物を清澄化することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）に先立って、全細胞溶解物を限外濾過に付すことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）に先立って、溶解物を限外濾過に付すことを更に含む、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼはベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ：商標）である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）は洗浄剤と加圧溶解の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）は洗浄剤溶解を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄剤はトゥイーン−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）は加圧溶解を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
加圧溶解はミクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を利用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）アデノウイルス感染細胞を溶解して活性なアデノウイルスを含む全細胞溶解産物を生成し（但し該溶解には繰り返しの凍結−解凍は含まれないものとする）、
（ｂ）該溶解産物を少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスに適用し、そして
（ｃ）全細胞溶解物のアデノウイルス活性の６０〜１００％を有するアデノウイルス粒子の組成物を回収すること
を含むアデノウイルスの精製方法であって、
該クロマトグラフィーマトリックスが、アニオン交換材料、カチオン交換材料、疎水性相互作用材料、ヒドロキシアパタイト材料、ヘパリン材料、及びゲル濾過材料からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項１４】
（ａ）アデノウイルス感染細胞を溶解して活性なアデノウイルスを含む全細胞溶解産物を生成し、
（ｂ）該溶解産物を少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスに適用し、そして
（ｃ）全細胞溶解物のアデノウイルス活性の６０〜１００％を有するアデノウイルス粒子の組成物を回収する（但し、少なくとも約１ｍｇの活性アデノウイルス粒子は回収される）こと
を含むアデノウイルスの精製方法であって、
該クロマトグラフィーマトリックスが、アニオン交換材料、カチオン交換材料、疎水性相互作用材料、ヒドロキシアパタイト材料、ヘパリン材料、及びゲル濾過材料からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）は、まず、溶解物をヘパリンクロマトグラフィーマトリックスに適用し、第２に該ヘパリンクロマトグラフィーマトリックスから回収された溶解物をＤＥＡＥクロマトグラフィーマトリックスに適用し、第３に該ＤＥＡＥクロマトグラフィーマトリックスから回収された溶解物をゲル濾過マトリックスに適用することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項の方法により得られるアデノウイルス粒子の組成物。
【請求項１７】
一連の少なくとも２つのカラム分離を含む方法であって、
各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、
各分離が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とアデノウイルスたんぱく質とを含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつ
ＡＡＶが、該アデノウイルスたんぱく質から、該一連のカラム分離により分離されて感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。
【請求項１８】
一連の少なくとも２つのカラム分離を含む方法であって、
各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、
各分離が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とヘルパーウイルスとを含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつ
ＡＡＶが、該ヘルパーウイルスから、該一連のカラム分離により分離されて感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。
【請求項１９】
一連の少なくとも２つのカラム分離を含む方法であって、
各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、
各分離が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつ
ＡＡＶが、該細胞溶解産物から、該一連のカラム分離により分離されて、感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、前記一連のカラム分離が、下記：
１）前記組成物をヒドロキシアパタイト樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にＡＡＶ含有溶離液を該樹脂から回収すること、
２）該ＡＡＶ含有溶離液をイオン交換性基を有するマクロ細孔樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料に適用させ、次に該ＡＡＶ含有溶離液を該樹脂から回収すること、及び
３）該ＡＡＶ含有溶離液を、硫酸化樹脂又はヘパリン化重合体樹脂のいずれかから構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料に適用させ、次に該ＡＡＶ含有溶離液を該樹脂から回収すること、
を含み、
ＡＡＶが、該組成物から該一連のカラム分離により分離されて、感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は１９９５年８月３０日に出願された米国法定特許出願シリアル第６０／００２，９６７号（このテキストを参照することにより本明細書に組み入れる）の部分継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、特に治療的適用における使用のための、活性な（感染性の）アデノウィルスおよびＡＡＶの大規模な量の精製に関する。特に、本発明は適当なクロマトグラフ材料との接触から生ずる、ウィルスに対する、特にその表面成分に対する何らかの損傷を最小にするかあるいは排除するような様式で、そのようなウィルスを適当なクロマトグラフ材料と接触させるための改良された方法を提供する。その結果は、治療的適用、例えば遺伝子導入／治療処置において使用するために適当な活性な（感染性の）ウィルスの商業的水準量を迅速に且つ効率的に精製するその能力である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
病気の分子治療は治療上の利益を与えるために関連者の細胞への核酸の投与をしばしば包含する。最も普通には、ウィルスの自然のままの感染性の利点を取り入れそして細胞への異種核酸を移送する（遺伝子導入）それらの能力を取り入れる組み換え体ウィルスが技術的に検討される。そのような組み換え体ウィルスベクターの普及した使用は、そのようなウィルスのデザインおよび生産のための戦略により左右される。
【０００４】
遺伝子治療のためにウィルスベクターを使用する大抵の試みは、主に細胞ゲノム中に組み込むレトロウィルスベクターの能力の故に、レトロウィルスベクターに依存していた。しかしながら、分裂する細胞のみに対するそれらの向性、細胞ゲノム中への組み込みの際の挿入突然変異誘発の可能性、時間経過にわたっての導入遺伝子の減少した発現、血清補体による急速な不活性化そして複製−応答能ある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）レトロウィルスの生成の可能性を包含する、レトロウィルスベクターの欠点が次第に明らかになって来ている（Ｊｏｌｌｙ，ＤによるＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４（１９９４）：Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．によるＢｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：２２２−２２５（１９９５））。
【０００５】
アデノウィルスは古典的遺伝学および分子生物学における研究により十分に特徴づけられた、約３６ｋｂのゲノムを有する核ＤＮＡウィルスである（１９９０年ニューヨークのＲａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ発行、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．等監修のＶｉｒｏｌｏｇｙ第２版におけるＨｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．による“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”）。アデノウィルスをベースとするベクターは、とりわけ、分裂性細胞および非分裂性細胞の両方に対する向性、最小の病原性、ベクター株の製造のために高い力価に複製する能力および大きな挿入物を運ぶためのその能力を包含する、細胞への治療的導入遺伝子の送り込みのための幾つかの特有な利点を提供する（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．によるＣｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６（１９９２）；Ｊｏｌｌｙ，ＤによるＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４（１９９４））。
【０００６】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は感染細胞のゲノム中に組み込むことが出来る一本鎖非病原性ＤＮＡウィルスである。ウィルス活性周期のこの特徴は、遺伝子治療のための関連者（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に遺伝子を送り込むための（組み換え体アデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）を生成する）遺伝子治療媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）としてＡＡＶの使用に注意を集中させた。細胞ゲノム中に治療遺伝子を挿入するＡＡＶの能力は関連者（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の遺伝子の持続した発現を容易にしそして遺伝子治療ベクターの繰り返しての投与の必要性を減少させる。
【０００７】
アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の精製のための現在の方法は、治療的用途のためのウィルス株の大規模な生産を容易に可能にすることが出来ない、密度勾配遠心分離の使用を包含する。ＡＡＶベクターの普及した使用をさらに制限するのは、ＡＡＶベクター株の増殖のために必要とされる汚染性アデノウィルスを除去する一方で、高い力価のＡＡＶを生ずる何らかの適当な精製方法が一般に欠如していることである。
【０００８】
イオン交換、親和クロマトグラフィおよびゲル濾過は、たんぱく質精製において広く使用されているカラムクロマトグラフィ手段である。しかしながら、最近まで、これらの方法はアデノウィルスの精製には適用不能であった。そのような技術は、ウィルスに対して損傷を生じ、それにより標的細胞に結合し且つ感染させるそれらの能力を減少させた。１９９５年８月３０日に出願された法定米国特許出願シリアル第６０／００２，９６７号は本明細書において一層十分に記載されるようなクロマトグラフィ分画化（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）技術を使用する感染性アデノウィルスを精製するためのパラメーターを記載している。最近の研究は組み換え体アデノウィルスの精製においてカラムクロマトグラフィが使用されることが出来ることを示した（Ｈｕｙｇｈｅ等によるＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１４０３−１４１６（１９９５））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
平均直径がアデノウィルスの直径（直径＝繊維を除いて約８０ｎｍそして繊維分子を有して約１４０ｎｍ）とおおよそ同じである細孔を中に有するビーズからなる、いわゆる“マクロ細孔”樹脂のような他のシステムを用いるカラムクロマトグラフィは、感染性のアデノウィルスの回収を生じなかった。これについての最も確実と思われる理由は、そのような樹脂中をアデノウィルスが通過すると、ウィルスがビーズ中の細孔と緊密に接触することによりウィルスの表面から繊維を切り落とすからである。とりわけ、アデノウィルスの繊維分子は標的細胞に結合しかつ感染するそのウィルスの能力に包含されるされるべきと信じられる。したがって、そのような先行技術のカラム法による繊維分子（ならびに他の表面分子）の損傷または損失は不活性（非感染性）ウィルスの回収を結果として生ずることになる。
【００１０】
当業界において周知であるように、ＡＡＶの増殖はアデノウィルスのようなヘルパーウィルスの使用を必要とする。ヘルパーウィルスについての要件はＡＡＶの精製を複雑にする。ＡＡＶ精製に対する現在の方法は、凍結−解凍の繰り返しのサイクルを用いて、ＡＡＶ感染細胞を溶解（ｌｙｓｉｎｇ）し、次に細胞汚染物質の存在しないそしてＡＡＶ増殖のために必要とされる（アデノウィルスのような）ヘルパーウィルスが実質的に存在しない感染性ＡＡＶを得るために密度勾配遠心分離を使用して細胞溶解産物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を分画化することを包含する（Ｆｌｏｔｔｅ等によるＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２９−３７（１９９５）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ等によるＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１５３１−１５４１（１９９５）；Ｆｉｓｈｅｒ等によるＪ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０−５３２（１９９６））。標準の精製技術は、活性な（感染性の）ウィルスの非常に低い収率（０．３〜５％）を一般に生ずる。さらに、ヘルパーウィルスの必要性の故に、ヘルパー（例えばアデノウィルス）の全く存在しないＡＡＶを得ることは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、特に治療用途のための、感染性アデノウィルスおよびＡＡＶの商業的に有用な量の精製のための方法に向けられている。
【００１２】
本発明は、感染性ウィルスを精製する先行技術の方法に伴う問題を避けそして宿主への治療導入遺伝子の遺伝子導入において有用である感染性アデノウィルスの大規模な分離を提供するクロマトグラフィ分画化技術に依存している。したがって、本発明は、ウィルス、特に感染性のために必要とされると信じられるその表面成分が、下記のような接触により損傷されないような様式でそしてそのような条件下に、治療的に有用なウィルスを、クロマトグラフィ分画化技術において使用されるのに適当な材料と接触させるための改良された方法を提供する。
【００１３】
特に、アデノウィルス精製に関して、本発明はこれらの改良された方法論において包含される幾つかのデザイン考慮を含む。これらのデザイン考慮はそれらが同様な目的、即ち精製において使用される種々のクロマトグラフィ材料との接触によるウィルスに対する損傷を最小にするかまたは排除すること、を達成する点において関連している。特にそれらの方法は生物学的分子の分配において包含されるそのような材料中の開口または細孔の作用を避けるように意図される。
【００１４】
本発明の一つの面において、“回分式（ｂａｔｃｈ）”タイプの技術が使用されることが出来る。この面において、ウィルスは、“流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）”処置に付されるよりもむしろ適当なクロマトグラフィ材料と混合される。この方法を用いて、ウィルス粒子はビーズ中の細孔に入りそして損傷を受ける傾向が少なくなる。
【００１５】
本発明の第２の面は、支持体材料の細孔の寸法が、クロマトグラフィ分画化中（例えばカラムまたは膜において）ウィルスが細孔に入ることが出来ないほどに小さいクロマトグラフィ材料を用いることを包含する。そのようなクロマトグラフィ材料の細孔寸法における減少は、例えば支持体マトリックスの増大させた架橋により達成させることが出来る。細孔寸法における減少は、ウィルスが損傷される可能性があるビーズ中の開口にウィルスが入るのを防止する。
【００１６】
別法として、マトリックス材料中の細孔にウィルスが近づくのを防止する構造体、例えば、“触手（ｔｅｎｔａｃｌｅｓ）”を含有するクロマトグラフィ材料が使用される。また、これはウィルス粒子に対する損傷を防止するかまたは最小にするのに役に立つ。
【００１７】
本発明の第３の面において、クロマトグラフィ材料のマトリックスは寸法において非常に大きい開口または細孔、即ちアデノウィルス粒子の直径よりかなり大きい直径を有する細孔を含有するクロマトグラフィ材料が用いられる。かくして、ウィルスは損傷されることなしにそのようなクロマトグラフィ材料中の細孔を通過して分配されることが出来る。
【００１８】
これらのデザイン考慮に基づいて、本発明の精製方法は生物学的物質を分画化するのに有用であると知られている広い種々の市販のクロマトグラフィ材料の使用を可能にする。そのような材料の有用な支持体マトリックスは、とりわけ、セルロースのような重合体物質またはシリカゲルタイプの樹脂または膜あるいは架橋多糖類（例えばアガロース）または他の樹脂を包含する。また、クロマトグラフィ材料は生物学的分子を分離するのに有用である、マトリックス材料に結合された種々の官能基または活性基をさらに含むことが出来る。
【００１９】
そのようなものとして、本発明の方法はまた、ウィルスが種々の非共有メカニズムを介して相互作用しそして後でそこから実質的に除去されることが出来る、支持体材料に結合された親和性基の使用を利用する。本発明において提供される好ましい方法はクロマトグラフィ分画化技術において有用なイオン交換（特に陰イオン交換）タイプの相互作用を利用する。他の特定の親和性基は、とりわけ、支持体マトリックスに結合されたヘパリンおよびウィルス−特異性抗体の使用を包含することが出来る。本技術を介してのウィルス精製において親和性基の選択における考慮の中で、ウィルスが選ばれた親和性基と相互作用する結合力および感染性に包含されるウィルス表面分子を損傷することなしのその除去の容易さである。
【００２０】
活性（感染性）ウィルスの高い収率で比較的に高い分子量のウィルス種（例えば、アデノウィルスおよびＡＡＶ）の商業的規模の生産はこれらの方法を用いて達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ａｃｔｉ−ＭｏｄＲカートリッジ樹脂の概要図である。
【図２】図２は、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲ樹脂からのアデノウィルスの溶離プロフィルを示すクロマトグラムである。アデノウィルスについての溶離ピークは標識されている。
【図３】図３は、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００樹脂からのアデノウィルスの溶離プロフィルを示すクロマトグラムである。アデノウィルスについての溶離ピークは標識されている。
【図４】図４は、ＣｓＣｌ勾配精製されたウィルス（レーン（Ｌａｎｅ）Ｂ）と比較してのＤＥＡＥおよびゲル濾過クロマトグラフィにより精製されたアデノウィルス（レーンＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図５】図５は、ＣｓＣｌ勾配精製されたウィルス（レーンＡ）と比較してのヘパリン、ＤＥＡＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘＲクロマトグラフィにより精製されたアデノウィルス（レーンＢ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図６】図６は、ＣｓＣｌ勾配精製されたウィルスＡと比較してのヘパリン、ＤＥＡＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘＲクロマトグラフィにより精製されたアデノウィルスＢの濃度計による濃度測定分析を示す。
【図７】図７は、（Ａ）ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００樹脂および（Ｂ）ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲ樹脂からのＡＡＶの溶離プロフィルを示すクロマトグラムである。
【図８】図８は、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲおよびＤＥＡＥクロマトグラフィにより精製されたＡＡＶの２つの分画（レーンＡおよびＢ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】図９ＡはＡＡＶ／アデノウィルス−含有２９３細胞溶解産物のセラミックヒドロキシアパタイトグロマトグラフィである。ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方についての溶離ピークは標識されている。  図９ＢはヒドロキシアパタイトＡＡＶ含有溶離液のＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲクロマトグラフィを示す。ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方についての溶離ピークは標識されている。  図９ＣはＡＡＶ−含有ＤＥＡＥ溶離液のＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートクロマトグラフィを示す。樹脂から溶離されたＡＡＶピークは標識されている。
【図１０】図１０は、種々のカラム、即ちレーン１：ヒドロキシアパタイト装入；レーン２：ヒドロキシアパタィト溶離液；レーン３：ＤＥＡＥ溶離液；レーン４：ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート溶離液；そしてレーン５：ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート溶離液（１００μｌ）、から回収したＡＡＶ含有分画のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（ｋＤにおける）対照たんぱく質標準は左のカラムにおいて示される。
【図１１】図１１は、セラミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥおよびＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートクロマトグラフィにより精製されたＡＡＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１２】図１２は、ＣｓＣｌ勾配精製されたＡＡＶ（レーン２〜４）と比較してのセラミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥおよびＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートクロマトグラフィにより精製されたＡＡＶ（レーン１）のクーマシー染色たんぱく質ゲルを示す。
【図１３】図１３は、Ｒｅｐ対照と比較しての、抗Ｒｅｐ抗体を用いる、セラミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥおよびＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートクロマトグラフィにより精製されたＡＡＶ（レーンＡＡＶ）の免疫ブロットを示す。
【図１４】図１４は、ｐＴＲｌａｃＺの概要図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、特に遺伝子治療を包含する、遺伝子導入のような、治療適用において使用するための活性な（感染性の）アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の精製のための大きな規模に適合することが出来るクロマトグラフィ分画化方法に向けられている。本発明のクロマトグラフィ方法は、ウィルス精製の密度勾配超遠心分離の現在の、大規模にすることが出来ない（ｎｏｎ−ｓｃａｌｅａｂｌｅ）方法に代わって使用されそして工業的規模で活性な（感染性の）ウィルスの生産を可能にすることが意図される。該２種のウィルスの精製のためのデザイン戦略は相互に関連している。上に記載したように、ＡＡＶの増殖は、最も普通にはアデノウィルスによって提供されるヘルパーウィルス成分の存在を必要とする。ＡＡＶの精製はアデノウィルスの汚染の故に問題があった。
【００２３】
本発明のクロマトグラフィ分画化技術は、もっぱら遠心分離に基づく先行技術のウィルス精製方法以上の幾つかの利点を提供し；本方法は迅速であり；実験計画は効率がよく、単一操作でミリグラム量のウィルスの分離を可能にし；ウィルスの完全性が危うくされず；そして高収量の感染性ウィルスが得られる。
【００２４】
（アデノウィルスの精製）
上に記載したように、たんぱく質または他のウィルスの精製において日常的に使用されているような慣用のクロマトグラフィ方法および材料をアデノウィルスの精製に適合させようとする先行技術の試みは成功しなかった。そのような方法を適用するにあたって、損傷からアデノウィルスを保護するためにそして特に感染性のために必要なそのマクロ分子成分に対して保護するために十分な注意が払われなかったと信じられる。理論に関して制限されることなしに、“繊維”として知られているたんぱく質種を最も特定的に含む、特有のアデノウィルスたんぱく質は、感染中に標的細胞へのアデノウィルスの結合において包含される。そのようなたんぱく質の多くのコピーが各々のアデノウィルス上に見い出されることが出来るけれども、ウィルス感染性は大抵の細胞タイプに対して相対的に低くそしてしたがって、例えば繊維分子または他のウィルスマクロ分子の小さい部分でさえ、それに対しての損傷は、首尾のよい感染の確立を実質的に防ぐ可能性がある。それ故に、高い感染性を維持することは、遺伝子治療のためのような治療的用途のために意図されるアデノウィルスベクターの商業的規模の生産に関してかなり重要なことである。
【００２５】
したがって、アデノウィルス粒子の脆い性質を適当に考慮に入れるために広い種々のクロマトグラフィ方法が提供される。現在開示されるように、マトリックスまたは支持体材料、およびそれに通常カップリング結合される活性（結合性）基を包含する広い種々の慣用のクロマトグラフィ材料は本発明の実施において有用である。
【００２６】
本明細書に記載される方法は、アデノウィルスの成分に対しての損傷なしに水性媒体中の高い濃度で精製されたアデノウィルス粒子の取り出しを可能にする。同様に、本方法はミリグラム量のウィルスの製造に適している。
【００２７】
アデノウィルスはウィルス感染細胞、例えば２９３細胞から単離される。細胞は収量を最適化するために高い感染の多重度（ＭＯＩ）で感染されることが出来る。感染された細胞からウィルスを回収するために適当な任意の方法が利用されることが出来る。感染された細胞からのウィルスの回収のための好ましい技術は凍結−解凍およびミクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）の使用を包含する。しかしながら、大規模に出来る方法でウィルスを精製するために、繰り返しての凍結−解凍を行うことなしにウィルス感染細胞を溶解する（ｌｙｓｅ）方法を使用することそして遠心分離なしで細胞溶解産物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）から細胞破片を除去することが好ましい。活性ウィルスの放出のためのウィルス感染された２９３細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）のための最適の条件は、加圧セル、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ加圧セル（マサチューセッツ州ニュートンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ製）を用いて達成されることが出来る。例えば高分離能接線流動システム（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含む、Ｍｉｎｉｔａｎシステム（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いての溶解産物の限外濾過は、クロマトグラフィ分画化技術の前にウィルス分画をさらに濃縮するために用いられることが出来る。
【００２８】
そのようにして得られたアデノウィルス含有溶解産物は、次に本発明のクロマトグラフィ分画化技術に付されることが出来る。アデノウィルス精製に関して本発明はこれらの改良された方法論に含まれる幾つかのデザイン考慮を包含する。これらのデザイン考慮は、それらが同様な目的、即ち精製において使用される種種のクロマトグラフィ材料との接触によるウィルスに対する損傷を最小にするかまたは排除することを達成する点で関連している。特に、その方法は生物学的分子の分配に包含されるそのような材料における開口または細孔の作用を不要にすることが意図される。
【００２９】
本発明の一面において、“回分式”タイプの技術が使用されることが出来る。この面において、ウィルスは“流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）”方式に付されるよりもむしろ適当なクロマトグラフィ材料と混合される。この方法を用いて、ウィルス粒子は、それらが損傷される可能性があるビーズ中の細孔に入る見込みが少ない。
【００３０】
本発明の第２の面は、クロマトグラフィ分画化中（例えばカラムまたは膜において）ウィルスが細孔に入ることが出来ないように、支持体材料の細孔寸法がウィルス粒子の寸法より小さいクロマトグラフィ材料を用いることを包含する。そのようなクロマトグラフィ材料の細孔寸法における減少は、例えば支持体マトリックスの増大させた架橋により達成させることが出来る。細孔の寸法におけるその減少は、ウィルスが損傷される可能性があるビーズ中の開口にウィルスが入ることを防止する。
【００３１】
別法として、マトリックス材料中の細孔にウィルスが近づくのを防止する構造物、例えば“触手（ｔｅｎｔａｃｌｅｓ）”を含有するクロマトグラフィ材料が使用されることが出来る。また、これはウィルス粒子に対する損傷を防止するかまたは最小にするのに役に立つ。
【００３２】
本発明の第３の面において、材料のマトリックスが寸法において非常に大きい開口または細孔、即ちアデノウィルス粒子の直径よりかなり大きい直径を有する細孔を含有するクロマトグラフィ材料が使用されることが出来る。したがって、ウィルスは損傷されることなしに、そのようなクロマトグラフィ材料中の細孔を通過して分配されることが出来る。
【００３３】
これらのデザイン考慮に基づいて、本発明の精製方法は生物学的物質を分画化するのに有用であると知られている広い種々の市販のクロマトグラフィ材料の使用を可能にする。そのような材料の有用な支持体マトリックスは、とりわけセルロースのような重合体物質あるいはシリカゲルタイプの樹脂または膜あるいは架橋された多糖類（例えばアガロース）または他の樹脂を包含することが出来る。また、クロマトグラフィ材料は生物学的分子を分離するのに有用である、マトリックスに結合された種々の官能基または活性基をさらに含むことが出来る。
【００３４】
そのようなものとして、本発明の方法はまた、ウィルスが種々の非共有メカニズムを介して相互作用しそして後でそこから除去されることが出来る、支持体マトリックスに結合された親和性基の使用を利用する。本発明において提供される好ましい方法は、クロマトグラフィ分画化技術において有用なイオン交換（特に、陰イオン交換）タイプの相互作用を利用する。他の特定の親和性基は、とりわけ支持体マトリックスに結合されたヘパリンおよびウィルス−特異性抗体の使用を包含することが出来る。本技術を介してのウィルス精製おいての親和性基の選択における考慮の中で、ウィルスが選ばれた親和性基と相互作用する結合力そして感染性に包含されるウィルス表面分子を損傷することなしのその除去の容易さである。
【００３５】
次のタイプのクロマトグラフィ材料は上に論じられた回分方式タイプのクロマトグラフィ方法のために適している。
【００３６】
本開示の教示はまた、回分式形においてだけならば、他の市販のクロマトグラフィ材料の使用を可能にする。本発明の好ましい態様ではないけれども、そのようなクロマトグラフィ材料と接触することによりアデノウィルスが損傷される可能性があるといったん分かれば、精製方法はウィルスに対する損傷を最小にするように再計画されることが出来る。多くの重合体材料がすべての接触しているアデノウィルスを損傷する可能性がある細孔を含有する程度まで、そのような損傷は、例えばカラム圧力を最小にし、それによりマトリックスの細孔中にアデノウィルスが入るのを制限することにより制限されることが出来る。その最も簡単な例において、精製工程は単に回分形式で行われる。本発明のこの面に従って有用な重合体材料はＰｈａｒｍａｃｉａの製品ヘパリン  セファロース  ハイ  パーフォマンス；カリフォルニア州リッチモンド、ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイト；およびＡｍｉｃｏｎからのセルファイン（ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）サルフェートを包含する。
【００３７】
クロマトグラフィ材料は、そのすべての細孔空間とのアデノウィルスの相互作用が最小となるように十分なマトリックス架橋を有し、またアデノウィルスに対する親和性を有する（例えばイオン交換基またはヘパリンを包含する）多くの結合基が存在する重合体からなる。本発明の実施において有用な代表的ヘパリン化重合体はＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ＰｌｕｓＲ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ製）、６％架橋化ヘパリンアガロースのような約６％またはそれ以上の架橋を有するものを包含する。そのようなアガロースマトリックスは、ＨｅｐａｒｉｎＡｇａｒｏｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）のような４％架橋化生成物の排除限界よりずっと低いと予想される約六百万ダルトンの排除限界を有する。１つの実験において、感染性形でのアデノウィルスの回収は４％生成物よりもむしろ６％生成物が用いられた場合に実質的に改良された。本発明の実施において有用であるヘパリン基を含有する追加の重合体は（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の）Ｈｅｐａｒｉｎ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲＣＬ６Ｂを包含する。
【００３８】
いったん注意深くコントロールされた架橋の利点が理解されたならば、当業者は、アデノウィルスが、それとの接触により損傷されないように任意数の認識されたマトリックス材料および結合用基から構成される任意の数の重合体材料と置き換えることが出来ることは明らかである。
【００３９】
提供された第２のデザイン考慮に関して代表的なクロマトグラフィ材料はアデノウィルスと有効に相互作用するがしかし、ウィルスそして特にその繊維たんぱく質を損傷する可能性がある（約０．１ミクロンのような）そのすべての細孔スペースへのウィルスの接近を最小にするデザインを有する官能基を含有する。
【００４０】
同様に、種々の長さの重合化鎖が結合されておりそしてさらに官能基が結合されていてもよい芯領域を含有するいわゆる触手化重合体（ｔｅｎｔａｃｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）がある：例えばロードアイランド州ウェークフィールドのＥ．Ｍｅｒｃｋから市販のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｔｅｎｔａｃｌｅ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ。これらのクロマトグラフィ材料はＤＥＡＥ、第四級アミノエチル、第四級アンモニウム、ＤＭＡＥ、ＴＭＡＥ、等あるいは例えばＳＯ３  −  またはカルボキシルのようなイオン交換性基で終わっている、アクリルアミド誘導体の重合化鎖がグラフトされている、オリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリスロールジメタクリレート（ｐｅｎｔａ−ｅｒｙｔｈｒｏｌｄ−ｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）から共重合された不溶性マトリックスを有するものとして記載されている。同様な“触手化（ｔｅｎｔａｃｌｅｄ）”材料を使用することは本発明の実施内である。
【００４１】
第３のデザインに関して好ましいクロマトグラフィ材料は少なくとも約０．１μｍ（アデノウィルスの寸法）、しかし好ましくは少なくとも約１μｍの細孔を有するマトリックスを含む。
【００４２】
そのような材料は標的プロトマーに対して高い基質特異性により、非特異性たんぱく質の無視できる結合、および最も大きな既知の球状ウィルスの精製のために十分である細孔寸法（〜１．２μｍ）により特徴づけられるセルロース膜またはシリカ膜カートリッジであることが出来る。低い結合性のセルロースまたはシリカ膜フィルターのスタックからなる、カートリッジデザインは高い流速に適しており、一方ではカートリッジの大きな細孔寸法はカラム中に詰められたビーズゲル樹脂を伴った拡散を排除する。
【００４３】
例えば、ＡＣＴＩ−ＭＯＤＲ（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）カートリッジは、微細孔シリカ／ＰＶＣのシートからなる。これらのシリカシートは多数の均一な細孔と共に大きな表面積を有する（図１パネルＡ参照）。細孔は、異なる活性側鎖、例えばＤＥＡＥまたはヘパリン構造単位が結合されていてもよいシリカと列をなしている。クロマトグラフィ中、ＡＣＴＩ−ＭＯＤＲの高度に多孔質のシリカ／ＰＶＣシート中を通過する（または同様に有効なＭｅｍＳｅｐＲ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）カートリッジ中の開口を通過する）ウィルスの運動は、活性化シリカ表面とのウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎｓ）の直接接触を可能にする（図１パネルＢ）。そのような接触は適当な分離を可能にする一方で、同時に従来のビーズ化ゲルタイプの樹脂を用いて起こる、カプセル化されたウィルス粒子それ自体の寸法とおおよそ同じであるか又はそれよりやや小さい樹脂のビーズ中の細孔とのウィルス粒子の有害な相互作用を避けることを可能にする。そのような有害な相互作用は、例えば繊維たんぱく質を包含するウィルス粒子表面成分に対して損傷して、それにより首尾よく標的細胞を感染するウィルス粒子の能力を減少させることを包含するであろう。
【００４４】
本発明の実施において有用である追加の重合体製品はウィルス粒子を損傷しないのに十分に大きい細孔を含有する重合体製品でありそして、とりわけ、ＣｙｃｌｏＳｅｐＲモジュール（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．製）のようなスパイラル  プレパレーチブ  クロマトグラフィ  モジュールを包含する。該ＣｙｃｌｏＳｅｐＴＭスパイラル精製カラムは、種々のスペース化形態に有効である一体的リブデザインと共に、微細孔プラスチックシート（ＭＰＳＲ）からなるマトリックスを有する。そのマトリックスはらせん状に巻かれていてそしてシリカで被覆されている。得られた親水性表面はヘパリンのような種々の親和性リガンドまたはＤＥＡＥおよびカルボキシメチルのようなイオン交換クロマトグラフィにおいて使用される親和性リガンドを用いて誘導化されることが出来る。
【００４５】
陰イオン交換クロマトグラフィはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡＥ（第四級アミノエチル）およびＱ（第四級アンモニウム）を包含するが、しかしそれらに限定されない、陰イオン交換技術についての当業界で知られている種々の官能性部分を用いて行われることが出来る。これらの官能性部分は本明細書に記載されたセルロースおよびシリカ樹脂を包含する、本発明において有用な任意の適当な樹脂に結合されることが出来る。例えば、ＤＥＡＥは、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）のようなカラムにおけるセルロース樹脂、ＳａｒｔｂｉｎｄＴＭ膜吸収剤（ニュージャージー州、エッジウッドのＳａｒｔｏｒｉｕｓ製）およびＡＣＴＩ−ＭＯＤＲ（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）のようなシリカ樹脂を包含する種々の樹脂に結合されることが出来る。
【００４６】
ＳＰ  ＭｅｍＳｅｐＲ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、ＣＭ  ＭｅｍＳｅｐＲ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＲＳＯ３  −  （ニュージャージー州ギブスタゥンのＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＳＲ（ニューヨーク州メルビルのＢｉｏＲａｄ製）のようなカラムならびにヘパリンをベースとする樹脂の使用を包含するがしかしそれらに限定されない陽イオン交換クロマトグラフィがまた、アデノウィルスの精製のために使用されることが出来る。Ｈｅｐａｒｉｎ  ＡＣＴＩ−ＭＯＤＲカートリッジ（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）およびＰＯＲＯＳＲＰｅｒｆｕｓｉｏｎクロマトグラフィ媒体（ベーリンガー  マンハイム製）は本発明のこの態様の追加の例を表す。
【００４７】
アデノウィルスを精製するために使用されることが出来る他の親和性リガンドは、本明細書において提供されるような適当な樹脂に結合された抗アデノウィルス抗体ならびに当業者に既知の他のものを包含する。
【００４８】
好ましくはアデノウィルスの精製は以下の工程を包含する：Ｔｗｅｅｎ−８０のような洗浄剤の存在下に、アデノウィルスで感染された２９３細胞の加圧溶解（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｙｓｉｓ）および溶解産物（ｌｙｓａｔｅ）中のウィルスの回収；３μｍガラス繊維フィルターおよび０．８μｍ酢酸セルロースフィルター中を通過させることによる溶解産物の清澄化；アデノウィルスが流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画において回収されるＡＣＴＩ−ＭＯＤＲシリカカートリッジを用いるヘパリンクロマトグラフィ；およびＭｅｍＳｅｐＲカートリッジを用いるＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィ。結合されたアデノウィルスは適当な緩衝液中５００〜７００ｍＭのＮａＣｌを用いてＤＥＡＥ−樹脂からの溶離され；次に、ＤＥＡＥ溶離液のゲル濾過（サイズエクスクルージョン）クロマトグラフィに付し、そこでアデノウィルスはカラム溶離液の空隙容量（ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）で回収される。
【００４９】
精製するために、例えばＳｕｐｅｒｄｅｘＲ（ニュージャージー州ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ製）のような樹脂を用いるゲル濾過クロマトグラフィはすべての汚染処理から離れた活性アデノウィルスを回収するために用いられることが出来る。そのような樹脂は、樹脂のビーズから完全に排出されそしてカラムの空隙容量で溶離するアデノウィルスを生ずる非常に小さな細孔寸法（排除限界二百万ダルトン）を有する。その分配は、たんぱく質脱塩カラムに対して同様な様式で機能を果たす。
【００５０】
アデノウィルス精製は例えばウェスターンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いてウィルスたんぱく質についてアッセイすることにより調べられることが出来る。アデノウィルスＤＮＡの確認（同定）は、例えばスロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ）分析、サゥザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析またはウィルスＤＮＡの制限酵素分析を用いて、ウィルス回収の指標として用いられることが出来る。精製はアッセイされたサンプル中のウィルスたんぱく質または核酸の優勢性により証拠づけされる。
【００５１】
アデノウィルス粒子の確認（同定）はまた、例えば精製分画の２６０ｎｍでの分光測光法的吸光度を用いてあるいは例えば電子顕微鏡によるウィルス粒子の観察を用いて、ウィルス精製をアッセイするために用いられることが出来る。
【００５２】
感染性アデノウィルスの回収は、適当な宿主細胞系（例えば２９３細胞）をクロマトグラフィに付されたサンプルで感染させることにより調べられることが出来る。感染性のアデノウィルスはプラークアッセイにより確認（同定）され且つ力価測定されることが出来る。別法として、感染された細胞は、豊富なアデノウィルスヘキソンたんぱく質に対して染色されることが出来る。そのような染色は感染後７日に細胞をアセトン−メタノールで固定しそして多クローン性ＦＩＴＣ−標識化抗−ヘキソン抗体（カリフォルニア州ＴｅｍｅｃｕｌａのＣｈｅｍｉｃｏｎ製）で染色することにより行われることが出来る。精製された分画の活性度は、クロマトグラフィをかけるまえとそしてそれをかけた後とでの感染性を比較することにより調べられることが出来る。
【００５３】
本発明の方法において他のカラムの使用はアデノウィルスの精製に向けられた本発明の範囲内である。
【００５４】
上に論じられたように、ＡＡＶの増殖は、ＡＡＶ製剤と共に精製されてそしてＡＡＶ製剤を汚染する可能性がある、ヘルパーアデノウィルスを必要とするのでＡＡＶ精製は、ＡＡＶの精製において（例えばクロマトグラフィ材料の細孔との接触により）アデノウィルスを損傷するクロマトグラフィ材料の利点を取り入れる。したがって、ＡＡＶの精製はアデノウィルス精製にとって好ましくないクロマトグラフィ材料を使用する。例えばそのような材料は細孔の大きさがアデノウィルスのおおよその大きさである、上に論じられたいわゆる“マクロ細孔”樹脂を包含する。一般に、精製中アデノウィルスを損傷してそれを不活性に導く細孔寸法を有するマトリックスを選ぶことが有利である。
【００５５】
本発明はまた、カラムクロマトグラフィを用いて、細胞溶解産物中のアデノウィルスおよび細胞たんぱく質からＡＡＶの分離のための方法に関する。密度勾配超遠心分離の現在の大規模に出来ない方法以上のカラムクロマトグラフィの利点は多量のＡＡＶが生成されることが出来ることである。ＡＡＶの精製のためにカラムクロマトグラフィを用いる他の利点は、それがＡＡＶの生成においてヘルパーウィルスとして慣用的に用いられる汚染性アデノウィルスを有効に除去することである。
【００５６】
（ＡＡＶの精製）
ＡＡＶ−感染細胞の初期の溶解は、感染性ウィルス粒子を放出するために、細胞を物理的に処理するよりもむしろ化学的にまたは酵素的に処理する方法を介して行われることが出来る。そのような方法は、宿主細胞、非カプセル化または不完全なアデノウィルスＤＮＡを酵素的に分解させるために（ベンゾナーゼＲ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅＲ）：ＤＮＡｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼの略）のような）ヌクレアーゼの使用を包含する。トリプシンのようなたんぱく質分解酵素は宿主細胞、アデノウィルスまたは遊離のＡＡＶたんぱく質を酵素的に分解するために使用されることが出来る。当業界に知られている洗浄剤、界面活性剤及び他の化学剤はまた、単独で又は酵素処理と組み合わせて使用されることが出来る。
【００５７】
ＡＡＶ−感染細胞は、強化ポンプ送り込みシステムが短時間断続される一定圧力の加圧様式を造るために促進吸引ストロークおよび長期スロー圧力ストロークを使用するミクロ流動化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）加圧セルのような加圧セルに適用することによりさらに溶解されることが出来る。この圧力は、次にＡＡＶの最大活性を穏やかに維持しながらＡＡＶ活性細胞を溶解するために使用される。そのような加圧技術の使用の追加の利点は、そのような方法が微粒子担体上での細胞の増殖を包含する、細胞培養の条件の規模を上昇させるために適用されることが出来ることである。別法として、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）加圧セル（イリノイ州ＤｅｅｒｆｉｅｌｄのＢａｘｔｅｒ製）、Ｍａｎｔｏｎ  Ｇｏｕｌｉｎ均質化器（ホモジェナイザー）（イリノイ州ＤｅｅｒｆｉｅｌｄのＢａｘｔｅｒ製）またはＤｙｎｏｍｉｌｌが使用されることが出来る。得られた溶解産物は次にガラス繊維フィルターまたは酢酸セルロースフィルターに通過させて濾過することにより清澄化されることが出来る。代わりのものは、ＭｉｌｌｅｘＲＤｕｒａｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）フィルターおよびＧｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＴｕｆｆｒｙｎＲフィルター（ミシガン州アンアーバーのＧｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を包含する。使用されることが出来るフィルターの寸法は、０．８μｍおよび０．４５μｍを含む。もし真空濾過が使用されないならば、ガラスウールがまた、溶解産物を清澄化するために使用されることが出来る。
【００５８】
ＡＡＶの大規模な精製のための、感染細胞溶解産物を分画化するための適当なカラムクロマトグラフィ方法は、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ−Ｓ（Ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｈｉ  Ｆｌｏｗ）（カリフォルニア州カールズバッドのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ製）、Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ−Ｓ（ネブラスカ州リンカーンのＩｓｃｏ製）、ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート（マサチューセッツ州ビバリーのＡｍｉｃｏｎ製）のようなサルフェート化樹脂の使用を包含する。そのようなサルフェート化樹脂は、約４００〜５００ｍＭ、好ましくは約４７５ｍＭのＮａＣｌを含有する溶離緩衝液を用いてＡＡＶから汚染性アデノウィルスを除去することが出来る。
【００５９】
ＡＡＶ精製において使用されるＤＥＡＥ含有樹脂はＰｕｒｅｓｙｎ  ＤＥＡＥ（ペンシルベニア州マルバーンのＰｕｒｅｓｙｎ製）、ＥＭ  Ｍｅｒｃｋ  Ｔｅｎｔａｃｌｅ  ＤＥＡＥ（ニュージャージー州ホワィトハウスステーションのＭｅｒｋ製）、Ｓｔｅｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＤＥＡＥ（カリフォルニア州カールズバッドのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ製）、マクロ細孔ＤＥＡＥ樹脂（ニューヨーク州メルビルのＢｉｏｒａｄ製）、ＤＥＡＥ  ＡＣＴＩ−ＭＯＤＲ（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）、ＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐＲ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を包含するがしかしそれらに限定されなく、それらのすべては汚染性アデノウィルスを除去することが出来る。
【００６０】
Ｅｍ  Ｍｅｒｃｋ  Ｔｅｎｔａｃｌｅ  ＤＥＡＥは長さで約１５〜５０単位のアクリルアミド誘導体の重合化鎖がグラフトされているオリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリトロイドから共重合されたマトリックスからなるイオン交換媒体である。Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＤＥＡＥは、ＤＥＡＥ反応性基が結合されている６％架橋アガロースからなる。マクロ細孔ＤＥＡＥ樹脂は、ＤＥＡＥ反応性基が親水性支持体に結合されている、８０〜１００ｎｍの細孔寸法を有する剛性親水性支持体である。ＤＥＡＥ  Ａｃｔｉ−ＭｏｄＲカートリッジは、微細孔シリカ／ＰＶＣのシートからなる。これらのシリカシートは大きな均一な細孔と共に大きな表面積を有する。細孔は、ＤＥＡＥのような活性な側鎖が結合されることが出来るシリカと列をなしている。このタイプのマクロ細孔構造物は、幅で約１２，０００Å、即ち１．２μｍの細孔を有している。ＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐＲ樹脂において、ＤＥＡＥ基は重合体マトリックスセルロースに共有的に結合されている。そのような樹脂からのＡＡＶの回収のための適当な溶離緩衝液はｐＨ７．５の燐酸塩緩衝液中に２００ｍＭのＮａＣｌを含む。
【００６１】
ＡＡＶの精製はまたＢｉｏｒａｄ（ニューヨーク州メルビル）販売のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂を包含するヒドロキシアパタイト樹脂を使用する。そのようなヒドロキシアパタイト樹脂からのＡＡＶの回収は１００〜１３５ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．４、１０〜４００ｍＭの燐酸塩勾配）を用いての溶離を使用する。そのカラムは、３０ｍＭの燐酸塩でまず洗浄されそして約１３５ｍＭの燐酸塩でＡＡＶは溶離する）を用いての溶離を使用する。
【００６２】
本発明の特定の面において、セルロースまたはシリカ膜樹脂上でのクロマトグラフィはＡＡＶの有効な大規模の精製のためにマクロ細孔樹脂の使用と組み合わせて使用される。マクロ細孔樹脂の例はＢｉｏＲａｄマクロ細孔シリーズ（ニューヨーク州メルビル）またはＤＥＡＥ−Ｔｈｒｕｐｕｔ（６％架橋アガロース）（カリフォルニア州カールズバッドのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ製）を包含する。シリカまたはセルロース膜樹脂は、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＴＭ１０１０ＨＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、ＡＣＴＩ−ＭＯＤＲカートリッジまたはＣｙｃｌｏＳｅｐＴＭ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）らせん精製カラムを包含する。マクロ細孔樹脂に関しての以前の研究は、ビーズでの８０ｎＭ細孔寸法が１４０ｎｍの直径を有するアデノウィルスを排除するかまたは損傷するので、アデノウィルスの精製のためにこれらが非常に有用であるとは示さなかった。しかしながら、この寸法制限は、これらの樹脂がウィルス粒子の異なる寸法に基づいてＡＡＶ製剤から汚染性アデノウィルスを除くことが出来るので、ＡＡＶ精製のためには有利である。樹脂の細孔寸法の識別に基づいてアデノウィルスからＡＡＶを分離するために、マクロ細孔樹脂の能力についてマクロ細孔樹脂を選択することは当業者の技術の十分な範囲内にある。
【００６３】
本発明の特定の態様において、洗浄剤の存在下にＡＡＶ感染細胞の加圧溶解は細胞溶解産物を生成し、これは濾過により清澄化される。次にその溶解産物は、細胞たんぱく質および汚染性アデノウィルスからＡＡＶを分離するために一連のカラムに適用される。好ましい一連のカラム分離はセラミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥイオン交換、ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートおよび亜鉛キレートクロマトグラフィの使用を包含する。ＡＡＶは、次のとおりのカラムから回収されることが出来る：（ｐＨ６．４の１００〜１３５ｍＭの燐酸塩で）ヒドロキシアパタイト；（ｐＨ７．５の燐酸塩緩衝液中の２００ｍＭの塩で）ＤＥＡＥイオン交換；（ｐＨ７．５の燐酸塩緩衝化食塩水中の４２５ｍＭの塩で）ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート；そして亜鉛キレートカラム（ｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ緩衝液）からの流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）において。
【００６４】
ＡＡＶの精製のための特に好ましい態様は、以下の工程を包含する：
Ｔｗｅｅｎ−８０およびトリプシンの存在下に、アデノウィルスでまた感染されているＡＡＶ感染２９３細胞の加圧溶解および溶解産物中のウィルスの回収；０．４５μｍまたは０．８μｍの酢酸セルロースフィルターを通過させての濾過を介して溶解産物の清澄化；セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、そこで、結合されたＡＡＶはｐＨ６．４の１００〜１３５ｍＭの燐酸塩中の樹脂から溶離される；ＭｅｍＳｅｐＲカートリッジを用いるＣＨＡ溶離液のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ、そこで、結合されたＡＡＶは２００ｍＭの塩（ｐＨ７．５の燐酸塩緩衝液）中の樹脂から溶離される；ＤＥＡＥ溶離液のＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートクロマトグラフィ、そこで、結合されたＡＡＶは４２５ｍＭの塩（燐酸塩緩衝化食塩水、ｐＨ７．５）中の樹脂から溶離される；そして場合により亜鉛キレートクロマトグラフィ、そこでＡＡＶは流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画（Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５）において回収される。
【００６５】
ＡＡＶはまた、低分子量汚染物質からＡＡＶを分離しそしてＡＡＶが空隙容量（ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）で回収される、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００樹脂（ニューヨーク州ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ製）を用いてアデノウィルスから分離されることが出来る。
【００６６】
ここに記載された方法は、遠心分離ペレット化を行うことなしに、水性媒体中で高い濃度で精製されたＡＡＶ粒子の回収を可能にする。同様に、その方法は密度勾配遠心分離の使用なしでのミリグラム量のウィルスの生成に適している。
【００６７】
他のカラムの使用はＡＡＶの大規模な精製においてカラムクロマトグラフィを使用することに向けられている本発明の範囲内である。
【００６８】
精製の実験計画の完全性を査定するために、当業者はＡＡＶウィルスが回収されるかどうかそして細胞たんぱく質および（アデノウィルスのような）汚染性ヘルパーウィルスが除去されたかどうかを調べるために任意の数の査定を使用することが出来る。ＡＡＶ回収および精製は種々のクロマトグラフィ工程からの回収された分画におけるＡＡＶ  ＤＮＡおよびＡＡＶたんぱく質の水準または感染性ウィルスの力価からの水準を調べることにより監視されることが出来る。
【００６９】
ＡＡＶ  ＤＮＡの水準はＡＡＶ−特異性プローブを用いて固定化ＤＮＡを検出するスロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ）装置を用いて調べられることが出来る。ウィルス粒子の数は、既知の粒子数のサンプルから生成された標準曲線の使用により調べられることが出来る。組み換え体ＡＡＶがβ−ガラクトシダーゼのような標識遺伝子を含有する場合、回収されたウィルスの量は標識遺伝子生成物（例えば、Ｘ−ｇａｌ）についての適当な査定によりあるいは遺伝子のＤＮＡコピーを検出するアッセイ（例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応の略））により調べられることが出来る。
【００７０】
別法として、ウィルスの存在は回収された分画に含有されるＡＡＶたんぱく質の水準から調べられることが出来る。ウィルスたんぱく質はウェスターンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈降反応、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルあるいは当業者に知られているたんぱく質特徴づけおよび定量化のための任意の他の方法によりアッセイされることが出来る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルがクーマシーで染色される場合、他の非−ＡＡＶたんぱく質の存在が、ＡＡＶ分画の濃度の指標として調べられることが出来る。
【００７１】
単離されたウィルス分画の純度は、分画中のたんぱく質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、次にクーマシー染色そして濃度計を使っての濃度測定により調べされる。ＡＡＶウィルスのたんぱく質に関して、ＶＰ３は、通常、ウィルスたんぱく質の約８０％を表し、一方ではＶＰ１とＶＰ２とは一緒にして合計ウィルスたんぱく質の約２０％を表す。純度はアッセイされたサンプル中の異種のたんぱく質の不存在により査定される。
【００７２】
本発明の精製方法は天然に存在するウィルスまたは組み換え体ウィルスに適用されることが出来る。
【００７３】
本発明の実施は、当業界の範囲にある分子生物学、たんぱく質分析および微生物学の慣用の技術を使用する。そのような技術は、例えばニューヨークのＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５年）発行Ａｕｓｂｅｌ等の監修のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（この内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に十分に説明されている。
【００７４】
本発明は以下の実施例に関して例示される。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：２９３細胞からのアデノウィルスの抽出）
（Ａ．細胞からのアデノウィルスの抽出）
ヒトの胎児細胞系（２９３）がアデノウィルスを増殖するために用いられた。細胞単層が広範な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すまでウィルス感染細胞をインキュベートした。通常の感染時間は４８〜６０時間であった。燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中に細胞を収穫しそして１０００ｘｇでの遠心分離により収集した。さらに使用するために細胞ペレットを−８０℃で凍結させるかまたは０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０、１０％グリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ２および５０μｍのＺｎＣｌ２を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。再懸濁の後に１０００ｐｓｉでミクロ流動化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ製のＭｏｄｅｌ  ＨＣ５０００）を用いて細胞を溶解しそして室温で１時間ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（２５００単位ｂｅｎｚｏｎａｓｅＲ／１０８細胞）を用いて溶解産物をインキュベートした。細胞破片を除くために、溶解産物は、それを（真空でなしに）ガラスウール中に通過させることによりあるいは３．０μｍガラス繊維フィルター（カリフォルニア州Ｓｉｅｒｒａ  Ｃｏｕｒｔ−ＤｕｂｌｉｎのＭｉｒｃｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製＃Ｃ３００Ａ０９０Ｃ）中を通過させる真空濾過により清澄化された。次にこれは０．８μｍ酢酸セルロースフィルター（カリフォルニア州ＳｉｅｒｒａＣｏｕｒｔ−ＤｕｂｌｉｎのＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製＃ＣＤ８０Ａ０９０Ｃ）を用いて濾過された。清澄化の後に、溶解産物は直接にクロマトグラフィにかけられるか、あるいはクロマトグラフィにかける前に、Ｍｉｎｉｔａｎ限外濾過システム（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製＃ＸＸ４２ＭＴ０６０）を用いて追加の濾過工程に付された。
【００７６】
（Ｂ．限外濾過）
（上記のとおりにして造られた）アデノウィルスで感染された２９３細胞からの溶解産物は以下の緩衝液（燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０、１０％グリセロール、５０μＭのＺｎＣｌ２）中で３００ｍｌ／分から４００ｍｌ／分までの変化させる流速でＭｉｎｉｔａｎ限外濾過システム（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製＃ＸＸ４２ＭＴ０６０）中に通過された。限外濾過の後に感染性単位の回収を測定するために、再調整物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）はウィルス力価アッセイを用いてアデノウィルス感染性について検定し、一方では、再調整物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中のたんぱく質の回収がＢＣＡアッセイ（イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．の＃２３２２０）を用いて測定された。
【００７７】
（結果）
表１はアデノウィルス感染された細胞についての溶解の方法としてミクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）加圧溶解および凍結−解凍の両方を用いての活性アデノウィルスの回収間の比較を提供する。ミクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）および洗浄剤含有緩衝液を用いて、凍結−解凍による溶解と比較して加圧溶解で活性ウィルスの９６％回収があった。したがって、ミクロ流動化器は多量の細胞を一回で処理させることを可能にする利点を有する、別の有効な溶解法を提供する。また、ミクロ流動化基が微粒子担体に結合された細胞を有効に溶解することが出来るので、微粒子担体上で細胞を増殖することを包含する細胞培養条件の規模を上昇させるための方法が可能である。細胞の溶解は、宿主細胞、カプセル化されていないかまたは不完全なアデノウィルスの核酸を分解するヌクレアーゼであるＢｅｎｚｏｎａｓｅＲの存在下に起こった。
【００７８】
細胞の溶解の後に、得られた溶解産物は、ガラスウール中を通過させる濾過により、あるいは３．０μｍガラス繊維フィルター（カリフォルニア州Ｓｉｅｒｒａ  Ｃｏｕｒｔ−ＤｕｂｌｉｎのＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製＃３００Ａ０９０Ｃ）中に通過させての真空濾過を用いることにより清澄化されて、細胞破片を除去した。次に、０．８μｍ酢酸セルロースフィルター（ＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いての追加の濾過工程が行われた。典型的には８４％の活性アデノウィルスが最終の清澄化溶解産物において回収される一方で、ほんの４３％だけの合計細胞溶解産物たんぱく質が回収された。
【００７９】
次に、カラムクロマトグラフィにかける前に、清澄化された細胞溶解産物をさらに精製するために限外濾過が用いられた。アデノウィルスの分子寸法は１５０ｘ１０６ダルトンであり、一方では大半の宿主細胞汚染性たんぱく質の分子寸法はより低いと予想される。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｉｎｉｔａｎＲ限外濾過システム（３００ｋＤａの分子量カット膜）が使用された。表２は感染性アデノウィルス単位の最大回収が、膜中を通過する流速が２００ｍｌ／分でありそして緩衝液がグリセロール及びトリプシンを含有したときに達成されたことを示す。これらの条件下、１００％のアデノウィルス活性度が達成された一方で、５５％の宿主細胞たんぱく質が除去された。（微粒子担体上で増殖されそして）アデノウィルスで感染された２９３細胞の攪拌培養がこれらの研究で用いられた。それ故に、有効な細胞溶解および微粒子担体上で増殖された２９３細胞からの活性アデノウィルスの放出はＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒＲ加圧セルを用いて可能である。
【００８０】
【表１】
2010207244.tif 000002
【００８１】
【表２】
2010207244.tif 000003
【００８２】
（実施例２：アデノウィルスのクロマトグラフィ精製）
カラム樹脂がＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣを用いてそれらの分離特性について試験された。
【００８３】
（方法）
（１．ＤＥＡＥクロマトグラフィ）
（Ａ．アデノウィルス）
１０％グリセロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び５０μＭのＺｎＣｌ２を含有する燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５））を用いてＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐＲ１０１０ＨＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）カラム（５ｍｌ）を平衡化させた。例１において造られたとおりのアデノウィルスで感染された２９３細胞からの清澄化された溶解産物は、（ＰＢＳ、１０％グリセロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＺｎＣｌ２中の）予め平衡化されたカラムに５ｍｌ／分の流速で適用された。そのカラムを、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのＫＣｌで洗浄しそして１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０および５０μＭのＺｎＣｌ２中のＫＣｌとＮａＣｌとの線形勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を５ｍｌ／分の流速で樹脂に適用した。結合されたたんぱく質を樹脂から溶離しそして５ｍｌの分画で集めた。各々の分画を（下に記載されたとおりにして）（ａ）アデノウィルスＤＮＡおよび（ｂ）アデノウィルスたんぱく質、について監視した。アデノウィルスのＤＮＡおよびたんぱく質の両方について陽性であった分画を、ウィルス力価アッセイを用いて活性についてさらにアッセイした。
【００８４】
（Ｂ．ＡＡＶ）
アデノ随伴ウィルスＡＡＶで感染された２９３細胞からの細胞溶解産物はまた、上記のとおりにしてＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐＲクロマトグラフィを用いてクロマトグラフィにかけられた。しかしながら、細胞を溶解しそしてカラムを平衡化するために用いられた緩衝液は５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％のＮＰ−４０を含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）であった。結合されたたんぱく質はアデノウィルス精製のために上に記載されたとおりの塩勾配を用いて樹脂から溶離された。樹脂から集められた分画は、スロットブロットアッセイ（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）を用いてＡＡＶ  ＤＮＡについてアッセイされそしてＡＡＶの３種のキャプシドたんぱく質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対しての抗体（マサチューセッツ州ベルモントのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓのカタログ０３−６５１５８）を用いて免疫ブロットによりＡＡＶたんぱく質についてアッセイされた。
【００８５】
（２．ゲル濾過クロマトグラフィ）
（Ａ．アデノウィルス）
次に、ＰＢＳ、１０％グリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＺｎＣｌ２および０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を用いて平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００ＨＲ２６／６０カラム（Ｐｈａｍａｃｉａ製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィが行われた。アデノウィルスのたんぱく質およびＤＮＡの両方の存在を示した、ＤＥＡＥ樹脂から溶離された分画は貯留され（ｐｏｏｌｅｄ）そしてかき混ぜセル（Ａｍｉｃｏｎ製）を用いて、１５ｍｌの容量に濃縮された。１ｍｌ／分の流速でサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘＲ樹脂に適用しそして溶離中に１．５ｍｌ分画を集めた。下に記載されたとおりにして分画をアデノウィルスのＤＮＡおよびたんぱく質についてアッセイした。
【００８６】
（Ｂ．ＡＡＶ）
（下に記載された）塩化セシウム法により精製されたアデノウィルスは最終塩化セシウムは最終塩化セシウム密度勾配遠心分離の後に、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ樹脂に直接適用された。これは、通常透析により除去された、サンプル中の塩化セシウムの濃度を減少させるためであった。
【００８７】
幾つかの実験において、ＤＥＡＥカラム上でクロマトグラフィにかける前に、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００ＨＲ２６／６０を用いてＡＡＶの全細胞溶解産物のゲル濾過クロマトグラフィが行われた。
【００８８】
本発明のこの面に従って有用な追加の重合体材料は、Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（ＩＳＣＯ製）のような、架橋されたセルロース重合体を包含する。
【００８９】
（結果）
図２はアデノウィルスを含有する２９３細胞溶解産物のクロマトグラフィの後に、ＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐＲ樹脂からのアデノウィルスの典型的な溶離プロフィルを示す。すべてのアデノウィルスは該ＤＥＡＥ樹脂に結合しそして（傾斜線により表される）樹脂に適用された塩勾配を用いて溶離された。溶離プロフィル上に示されるように、アデノウィルスは５００〜７００ｍＭのＮａＣｌ間で樹脂から溶離した。このピークは初期全細胞溶解産物中の１０％未満の合計たんぱく質を含有した一方で、典型的には６０〜１００％のアデノウィルス活性が回収された。この溶離された分画の追加の精製は、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００樹脂を用いてゲル濾過クロマトグラフィにより達成された。最も高い力価を有した、ＤＥＡＥカラムからの分画が貯留され、Ａｍｉｃｏｎかき混ぜセルを用いて濃縮されそしてＳｕｐｅｒｄｅｘＲ樹脂に適用された。アデノウィルスは、樹脂の空隙容量（ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）で溶離した（図３）。この分画において約５０〜７０％のアデノウィルス活性が回収された。カラムから溶離されたすべての分画についてのたんぱく質評価（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）は、ゲル濾過工程が約７０％の汚染性たんぱく質を除去したことを示した。図４は先行技術の塩化セシウム法により精製されたアデノウィルスと比較された、ＤＥＡＥおよびゲル濾過カラムクロマトグラフィの組み合わせにより精製されたアデノウィルスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。カラムクロマトグラフィにより精製されたアデノウィルスにおいて存在するいくらかの追加のたんぱく質バンドがあった。アデノウィルスの追加の精製を達成させるために、他の樹脂が、これらの汚染性たんぱく質を除去するそれらの能力について評価された。
【００９０】
（実施例３：疎水性クロマトグラフィ）
（方法）
４種のことなるタイプの疎水性樹脂が、例２のアデノウィルス製剤からの汚染物質を除くそれらの能力について試験された：ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏｐｒｅｐＲカラム（ブチルおよびメチル）およびＴｏｓｏｈａｕｓＲ６５０Ｍ（６５μｍ）（フェニルおよびエーテル）。２ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中の各々の疎水性樹脂にアデノウィルスを適用した。０．１５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。
【００９１】
（結果）
流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶離された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらの樹脂を用いて、他の細胞成分からのアデノウィルスの分離が殆どなかったことを示した。
【００９２】
（実施例４：陽イオン交換樹脂）
（方法）
ＣＭおよびＳＰ  ＭｅｍＳｅｐＲカートリッジ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＲＳＯ３（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製の触手イオン交換樹脂）およびＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏｐｒｅｐ  ＳＲは、２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、別々に平衡化された。０．２５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する同じ緩衝液中の樹脂の各々にアデノウィルスで感染された２９３細胞からの細胞溶解産物を適用した。それらのカラムを１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１００ｍＭのＫＣｌで洗浄しそして１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０及び５０μＭのＺｎＣｌ２中のＫＣｌとＮａＣｌの線形勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を用いて、結合されたたんぱく質を該樹脂から溶離した。Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＳＲクロマトグラフィの結果を表５に示す。
【００９３】
（実施例５：ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂）
（方法）
ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂（マサチューセッツ州ビバリ−のＡｍｉｃｏｎ製）を用いてのすべての実験のために、アデノウィルスで感染された２９３細胞からの細胞溶解産物は、また１０％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０、２ｍＭのＭｇＣｌ２および５０μＭのＺｎＣｌ２を含有する２５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の溶液中の該樹脂に適用された。１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０および５０μＭのＺｎＣｌ２中のＮａＣｌとＫＣｌの線形塩勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶離された分画の両方はアデノウィルスＤＮＡについてアッセイされそして下に記載されたとおりにして抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットされた。
【００９４】
（結果）
たいていは有意義な精製を提供してきた樹脂、ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートは、しかしながら、殆どのアデノウィルスが、活性形で存在する精製された生成物には導かなかった。ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートは、繰り返しグルコース下位単位の第６炭素でエステル化されたスルホネート基を有するセルロースマトリックスからなる（Ｐ．Ｆ．Ｏ’Ｎｅｉｌ等によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１９９３）ｐｐ１７３〜１７８）。この樹脂へのたんぱく質の結合はその多糖類部分を介して生ずると考えられる。アデノウィルスは表面糖たんぱく質を有しない、膜で包まれていないウィルスなので、それはこの樹脂に結合する筈がなく、一方では殆どの細胞の糖たんぱく質は汚染物質として存在するであろうと考えられた。
【００９５】
表３はＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート上でのクロマトグラフィにかけた後のアデノウィルスの活性の回収についての結果を示す。アデノウィルスのたんぱく質およびＤＮＡは予期されたように、流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）容量で回収されたがしかしこの分画において約１０％未満のアデノウィルス活性が回収された。ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート上のクロマトグラフィにかけている間のウィルスの不活性化は、約８０ｎｍの平均直径を有する、樹脂のビーズの細孔を包含する有害な相互作用／分配の結果であった可能性がある。
【００９６】
（実施例６：ヘパリン樹脂）
（方法）
以下のヘパリン樹脂の各々がアデノウィルスを精製するそれらの能力について評価された：Ｈｅｐａｒｉｎ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ（４％架橋、Ｓｉｇｍａ製）、ＨｉＴｒａｐＲＨｅｐａｒｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ＰｌｕｓＲ（６％架橋、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ製）、Ｈｅｐａｒｉｎ  ＡＣＴＩ−ＭＯＤＲカートリッジＲ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．製）。
【００９７】
ヘパリン樹脂を用いてのすべての実験のためにアデノウィルスで感染された２９３細胞からの細胞溶解産物は、また１０％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０、２ｍＭのＭｇＣｌ２および５０μＭのＺｎＣｌ２を含有する、２５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の溶液中の樹脂に適用された。結合されたたんぱく質は、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０および５０μＭのＺｎＣｌ２中のＮａＣｌとＫＣｌの線形塩勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を用いて樹脂から溶離された。流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶離された分画の両方は、アデノウィルスのＤＮＡについてアッセイされそして下に記載されたとおりにして抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットされた。
【００９８】
（結果）
ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートの落胆する性能についての原因をさらに理解するためにヘパリン化重合体（樹脂）の性能がまた調べられた。ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートと同様に、ヘパリンはスルホン化多糖類でありそして共通している或る結合特性を有すると予想される。しかしながら、ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートとは異なって、それは種々の細孔寸法の種々の異なるビーズ化された樹脂に架橋された１種またはそれ以上の形で市販されている。表３は種々のヘパリン−結合樹脂のスクリーニングの結果を示す。試験された樹脂のすべてはウィルスサンプルを汚染した細胞たんぱく質（ＢＣＡにより測定されたものとして）の＞４０％を結合したが、しかし活性ウィルスの１００％回収を提供した唯一の樹脂は６％架橋されたアガロースであるＳｔｅｒｏｇｅｎｅＲヘパリンアガロースである。一般的に言えば、約６百万ダルトンの排除限界を有する６％アガロースマトリックスは、例えば４％架橋および約２千万ダルトンの排除限界を有するアガロースゲルよりも小さな細孔を有するであろう。その平均細孔寸法の故に、該６％架橋アガロースはクロマトグラフィ中にアデノウィルスを完全に排除した可能性がある。結果として、活性アデノウィルスは流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画において回収された。
【００９９】
【表３】
2010207244.tif 000004
【０１００】
アデノウィルスで感染された２９３細胞からの溶解産物は、上に記載されたとおりのヘパリンＡＣＴＩ−ＭＯＤＲデスクを用いてクロマトグラフィにかけられた。アデノウィルスは流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画において回収されそしてＤＥＡＥイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィの組み合わせを用いてさらに精製された。ＧＦカラムからのアデノウィルス分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、（カラムクロマトグラフィにより精製された）アデノウィルスの純度が、ＣｓＣｌ遠心分離により精製された対照アデノウィルスと同程度に純粋であったことを示した（図５）。図６は図５において分析された分画の濃度計による濃度測定分析を示す。
【０１０１】
（実施例７：ＢｉｏＲａｄセラミックヒドロキシアパタイト（８０μｍ細孔寸法））
２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２および１０％のグリセロールを含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いてＢｉｏＲａｄヒドロキシアパタイトカラムを平衡化した。アデノウィルスまたはＡＡＶを同じ緩衝液中の樹脂に適用した。すべてｐＨ７．５で、燐酸ナトリウムの１０ｍＭから３００ｍＭに増加させている線形塩勾配を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。
【０１０２】
（実施例８：分配用（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）重合体）
一連の分配用重合体（樹脂）が活性なアデノウィルスを精製するその能力についてスクリーニングされた（表４）。試験された重合体の大半は有意義な精製を提供したが、しかしほんの僅かのものだけが活性形で精製されたアデノウィルスの回収に導いたことが見い出された。一般に、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｅｍＳｅｐＲカートリッジまたはＡＣＴＩ−ＭＯＤＲカートリッジ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のような、膜−ベースカートリッジ重合体（樹脂）は活性なウィルスの良好な回収を与えた。これらの製品の優れた性能はこれらのカートリッジにおける膜マトリックスの開いているマクロ細孔構造に起因している可能性があると信じられる（これらの好ましい例において、ＤＥＡＥ基は、ＭｅｍＳｅｐＲの場合において重合体マトリックスセルロースに共有的に結合されており、あるいはＡＣＴＩ−ＭＯＤＲの場合においてシリケートに共有結合されている）。（幅において約１２，０００Å、即ち、１．２μｍの開口（細孔）を有する）このタイプのマクロ細孔構造は、（繊維を含む）約１４０ｎｍの直径を有するアデノウィルス粒子の迅速な通過を可能にする。
【０１０３】
表５はアデノウィルス精製のための種々のクロマトグラフィ方法の概要表である。
【０１０４】
【表４】
2010207244.tif 000005
【０１０５】
【表５】
2010207244.tif 000006
【０１０６】
（実施例９：アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の精製）
遺伝子治療におけるベクターとしてＡＡＶを用いて伴う主な問題の一つは、十分な量のウィルスの生成である。現在、ＡＡＶは、一般に活性なウィルスの非常に低い収率（０．３〜５％）を生ずる、密度勾配超遠心分離技術により精製されている。しかしながら密度勾配超遠心分離は、２９３細胞においてＡＡＶを増殖するのにヘルパーウィルスとして使用されるアデノウィルスから、ＡＡＶを分離するのに非常に有効である。本発明はＡＡＶの収率を増大させるために、感染細胞からのＡＡＶの抽出のための改良された方法をカラムクロマトグラフィ工程と組み合わせることを提供する。
【０１０７】
感染された２９３細胞からのＡＡＶの改良された抽出は洗浄剤（Ｔｗｅｅｎ−８０）の存在下の細胞の加圧溶解により達成された。例１において上に提供されたとおりの溶解産物の清澄化の後に、ＡＡＶはゲル濾過クロマトグラフィにより他の細胞のたんぱく質から分離された。図７ａはＡＡＶ感染された２９３細胞溶解産物をクロマトグラフィにかけた後の、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）からの溶離プロフィルを示す。空隙容量ピークは、この分画のスロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ）分析および免疫ブロットにより検出されたものとして、大部分のＡＡＶを含有する。
【０１０８】
このピークの追加の精製は、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲカートリッジを用いてイオン交換クロマトグラフィにより達成された。ＤＥＡＥカラムはアデノウィルスからＡＡＶを分離するのに非常に有効であった。使用された条件（２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５））下、ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方は、ＤＥＡＥ−樹脂に結合した。線形塩（ＫＣｌおよびＮａＣｌ）勾配が樹脂に適用されたとき、ＡＡＶは２００ｍＭの塩で溶離し（図７、パネルＢ）、一方ではアデノウィルスは樹脂にかなりしっかりと結合したままの状態であってそして後に５００〜７００ｍＭのＮａＣｌでの勾配で溶離された（図７、パネルＢ）。それ故に、ＡＡＶおよびアデノウィルスはＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィを用いてお互いから有効に分離されることが出来る。ＡＡＶを含有する２つのＤＥＡＥ分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は図８において示される。ＤＥＡＥ分画＃７におけるＡＡＶの活性度は６．５  ｘ  １０７ｉ．ｕ．／ｍｌ又は３．８  ｘ  １０８ｉ．ｕ．の合計であった。ＤＥＡＥ貯留分画におけるＡＡＶの活性度は１．３８  ｘ  １０７ｉ．ｕ．／ｍｌまたは２．７６  ｘ  １０８ｉ．ｕ．の合計であった。総合して、これらの分画はＤＥＡＥ樹脂に適用されたＡＡＶ感染性単位のおおよそ１００の回収を提供する。
【０１０９】
（実施例１０：２９３細胞からのＡＡＶの抽出）
ヒトの胎児細胞系（２９３）はまた、ＡＡＶを増殖するために用いられた。ウィルス感染された細胞は、細胞単層が広範な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すまでインキュベートされた。細胞を収穫しそして１０００  ｘ  ｇでの遠心分離により集めた。細胞ペレットはさらに使用するために−８０℃で凍結されるかあるいは１０ｍＭのＮａＰｉ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ６．４）中に再懸濁された。
【０１１０】
再懸濁の後に、細胞を室温で１時間ｂｅｎｚｏｎａｓｅＲで処理し、次に１％Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下にトリプシン処理を行った。次に、１０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（マサチューセッツ州ニュートンのＭｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ製）を用いて細胞を溶解した。得られた溶解産物は、クロマトグラフィにかける前に、３．０μｍガラスフィルター中を通しての真空濾過により清澄化されて細胞破片を除き、次に０．８μｍの酢酸セルロースフィルター（Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて濾過工程を行うかあるいは０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘＲＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）フィルターユニット中を通過させて濾過された。
【０１１１】
（実施例１１：ＡＡＶのクロマトグラフィ精製）
ＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣを用いて、有効なＡＡＶ精製特性について種々のクロマトグラフィ樹脂が試験された。以下のシリーズのクロマトグラフィ工程は特に有用であることが分かった。
【０１１２】
ａ）ＢｉｏＲａｄセラミックヒドロキシアパタイト（８０μｍ細孔寸法）
（アデノウィルスの存在下に）ＡＡＶで感染された２９３細胞からの細胞溶解産物（例１０）は、１０ｍＭのＮａＣｌおよび１０％のグリセロールを含有する１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．４）で予め平衡化されたＢｉｏＲａｄヒドロキシアパタイトカラム上でクロマトグラフィにかけられた。ＡＡＶを同じ緩衝液中の該樹脂に適用した。ｐＨ６．４で１０ｍＭから４００ｍＭまでの増大させている燐酸ナトリウムの勾配を用いて樹脂から結合たんぱく質を溶離した。樹脂から集められた分画はスロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ）アッセイを用いてＡＡＶ  ＤＮＡについてアッセイされそしてＡＡＶの３種のキャプシドたんぱく質のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対する抗体（マサチューセッツ州ベルモントのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓからのカタログ０３−６５１５８）を用いて免疫ブロットによりＡＡＶたんぱく質についてアッセイされた。樹脂から溶離された分画はまた、抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットによりアデノウィルス汚染性たんぱく質について分析された。
【０１１３】
図９Ａは、ＡＡＶおよびアデノウィルスを含有する２９３細胞溶解産物をクロマトグラフィにかけた後の、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＡ）の典型的な溶離プロフィルを示す。ＡＡＶおよびアデノウィルスのすべてはＣＨＡ樹脂に結合しそして燐酸塩勾配を樹脂に適用したときに溶離された。ＡＡＶは溶離プロフィルについて示されるように、１２５ｍＭの燐酸塩で樹脂から溶離した。このピークは、初期全細胞溶解産物中の２０％未満の合計たんぱく質を含有する一方で、典型的に８０％のＡＡＶ活性が回収された。溶離されたＡＡＶピークはまた、免疫ブロットによりおよび力価分析により測定されたとき、若干の汚染性アデノウィルスたんぱく質を含有した（表５）。
【０１１４】
ｂ）ＤＥＡＥクロマトグラフィ（陰イオン交換）
アデノウィルスからＡＡＶを分離するために、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィが使用された。ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲ１０１０ＨＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）カラム（５ｍｌ）は、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールを含有する１０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化された。（上記）ヒドロキシアパタイトカラムから溶離されたＡＡＶ含有分画は貯留されそしてＤＥＡＥ樹脂の平衡化のために用いられたと同じ緩衝液中に透析された。１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）および１０％のグリセロール中のＫＣｌおよびＮａＣｌの線形塩勾配（５０ｍＭ〜２Ｍ）が５ｍｌ／分の流速で樹脂に適用された。結合されたたんぱく質は、樹脂から溶離されそして２．５ｍｌ分画に集められた。ＡＡＶは２００ｍＭの塩で溶離した一方で、アデノウィルスは５００〜７００ｍＭ塩で溶離した。各分画は、ａ）ＡＡＶたんぱく質（クーマシーブルー染色および免疫ブロット）；ｂ）ＡＡＶ  ＤＮＡ；ｃ）汚染性アデノウィルスたんぱく質およびｄ）感染性、について監視された。
【０１１５】
使用された条件（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５））下に、ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方は、ＤＥＡＥ−樹脂に結合した。線形塩勾配が樹脂に適用されたとき、ＡＡＶは２００ｍＭ塩で溶離した（図９Ｂ）一方で、アデノウィルスは樹脂にいっそうしっかりと結合した状態のままでありそして後に、５００〜７００ｍＭのＮａＣｌでの塩勾配で溶離された（図９Ｂ）。それ故に、ＡＡＶとアデノウィルスとは陰イオン交換（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィを用いて有効に分離されることが出来る。ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐＲからのＡＡＶの活性の回収は７５％であった（表５）。ＤＥＡＥ樹脂からの貯留されたＡＡＶ含有分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１０、レーン３）は、いぜんとして若干の汚染性たんぱく質の存在があったことを示したので、この分画はＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂を用いてさらに精製された。レーン１〜４は、等しいパーセンテージの各々の分画（０．５％）を表しそして精製を通じてのＡＡＶたんぱく質の回収を示す。レーン５は最終ＡＡＶ含有分画の大きなパーセンテージを表しそしてＡＡＶたんぱく質のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の一層強い着色を提供する。ＡＡＶのＤＮＡおよびたんぱく質の両方について陽性であった分画を貯留しそしてＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂を用いてさらにクロマトグラフィにかけた（下記）。
【０１１６】
ｃ）ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂（Ａｍｉｃｏｎ製）
１０％グリセロールを含有するＰＢＳを用いてＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂を平衡化した。ＡＡＶのたんぱく質およびＤＮＡを含有するＤＥＡＥ樹脂から溶離された分画を貯留しそして１ｍｌ／分の流速で樹脂に適用した。樹脂を２５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄しそしてＰＢＳ／グリセロール中の０．２５〜１ＭのＮａＣｌの線形塩勾配を適用した。この塩勾配を用いて樹脂から溶離された物質および流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画の両方は、ａ）ＡＡＶたんぱく質（免疫ブロット）；ｂ）ＡＡＶ感染性（力価分析）；ｃ）アデノウィルスたんぱく質（免疫ブロット）；およびｄ）アデノウィルス感染性（力価分析）について分析された。使用された緩衝液条件下、ＡＡＶは樹脂に結合しそして４７５ｍＭの塩で溶離された（図９Ｃ）。アデノウィルスのたんぱく質およびＤＮＡは流通分画において回収された。
【０１１７】
表５は幾つかの精製操作からのＡＡＶ活性の回収を示す。図１０は各カラムからの精製のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。上に記載された３種のカラム精製処理は４８％のＡＡＶ収率および＞９０％純粋の純度を提供した（図１１）。図１２は、ＣｓＣｌ勾配法を用いて精製されたＡＡＶと本発明のカラム精製処理を用いて精製されたＡＡＶとを比較する、クーマシー染色ゲルである。このゲルは両方の方法を用いて精製されたＡＡＶが比較し得る純度のものであることを示す。また、上記方法により精製されたＡＡＶはＲｅｐたんぱく質が存在しないことが示された（図１３）。図１３は、既知のＲｅｐ標準と一緒に、カラム精製されたＡＡＶの（抗Ｒｅｐ抗体を用いる）免疫ブロットを示す。ＡＡＶ活性の約７１％がＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート溶離液において回収される一方で、１％未満のアデノウィルス活性が同じ分画で回収される。
【０１１８】
したがって、ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートは２つの主要な用途を有し、即ち、ａ）それはＡＡＶ製剤中の汚染性アデノウィルスの水準を減少させる、そしてｂ）それはＡＡＶ含有分画を濃縮する。しかしながらＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェートクロマトグラフィにかけた後に、汚染性アデノウィルスの水準が減少される事実にもかかわらず、いぜんとして若干の低水準のアデノウィルス活性（６．７３  ｘ  １０３ＩＵ／ｍｌ）が残っている。
【０１１９】
ｄ）亜鉛キレートクロマトグラフィ
汚染性アデノウィルスのすべてを完全に除去するために、亜鉛キレートクロマトグラフィを用いる追加のクロマトグラフィ工程が使用された。金属とのウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎｓ）の相互作用はウィルスおよびバクテリアファージの研究から推論された。本発明者の実験室からの以前の研究はアデノウィルスが亜鉛金属親和性カラムに吸着することが出来ることを示した。
【０１２０】
ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂から回収された精製ＡＡＶの最終の分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、次に抗アデノウィルス抗体を用いる免疫ブロットにより分析された。これは最終ＡＡＶ含有分画中のアデノウィルスの汚染の水準を調べるためであった。免疫ブロットは、検出出来るアデノウィルスたんぱく質が存在しなかったことを示した一方で、力価分析はアデノウィルス活性が全体活性のほんの１％を表したにすぎなかったけれども、この分画における若干のアデノウィルス活性があったことを示した（表６）。
【０１２１】
その固定化された亜鉛カラムは、１容量の１００ｍＭのＥＤＴＡおよび１容量の０．２ｍＭのＮａＯＨで順次カラムを洗浄することにより金属装入のために造られた。そのマトリックスは、氷酢酸で酸性化された水中の１００ｍＭのＺｎＣｌ２で洗浄することにより亜鉛が装入された。次にそのカラムは、水で洗浄されそして４５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２および０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）で平衡化された。ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂から溶離されたＡＡＶ含有分画を亜鉛キレート樹脂に適用した。装入の後に、４５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）から、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓまでの、１０カラム容量線形勾配を用いて、カラムを洗浄した。溶離は、１０カラム容量にわたって、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ２中の線形（０〜５００ｍＭ）グリシン勾配を用いて行われた。
【０１２２】
ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＲサルフェート樹脂から溶離されたＡＡＶ含有分画は４５０ｍＭのＮａＣｌ中の亜鉛キレート樹脂に適用された。流通分画が集められそして結合されたたんぱく質はグリシン勾配を用いて溶離された。流通分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＡＡＶのすべてが流通で回収されたことを示した一方で、抗アデノウィルス抗体を用いての免疫ブロットは、アデノウィルスが亜鉛キレート樹脂に結合しそしてグリシンの増大させる勾配の存在下に溶離されたことを示した。亜鉛キレートクロマトグラフィを用いる初期の実験は、それがＡＡＶとアデノウィルスの分離のために有用な樹脂であり得ることを示した。
【０１２３】
その精製方法は３０％〜４０％の全体的収率と共に７０％より大きい純度があったＡＡＶを生成した。
【０１２４】
【表６−１】
2010207244.tif 000007
【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【０１２５】
（実施例１２：ウィルスの密度勾配精製）
標準の組み換え体アデノウィルスまたはＡＡＶウィルスは、３工程遠心分離方法により造られた。感染された細胞は、ｂｅｎｚｏｎａｓｅＲの存在下に凍結−解凍の３サイクルにより溶解された。溶解産物は４℃で３５００ｒｐｍで１５分間、卓上遠心分離機において遠心分離された。ペレットは捨てられそして上澄液は、１．２７ｇ／ｃｍ３のＣｓＣｌおよび１．４ｇ／ｃｍ３のＣｓＣｌ不連続ステップ勾配上に層状に置かれそして１．５時間２６，０００ｒｐｍで遠心分離された。ウィルスバンドを集め、１．３４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌと混合しそして６０，０００ｒｐｍで少なくとも２時間遠心分離した。この第１平衡勾配からのウィルスバンドを集め、１．３４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌと混合しそして一夜３０，０００ｒｐｍで再遠心分離した。この工程からの最終のウィルスのプールは１％のスクロースを補充した燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対して広範に透析された。別法として、上に記載されたようなＳｕｐｅｒｄｅｘＲ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）上でのゲル濾過によりＣｓＣｌを除去した。
【０１２６】
（実施例１３：アガロースゲルを用いてのアデノウィルスＤＮＡの検出）
カラム分画を、先ず１５分間０．１％のＳＤＳで処理し、次に室温で１時間プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ製）で消化した。消化が完了した後に、フェノール：ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコールの１容量で２回抽出し、次に−２０℃で２０分間氷冷９５％エタノールの２容量で沈殿させた。沈殿物を４℃で２０分間１３，０００  ｘ  ｇでペレット化した。サンプルをＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。アデノウィルスＤＮＡの制限酵素消化を行いそして４時間、１２０Ｖでまたは一夜３５Ｖで０．８％アガロースゲル上の診断アデノウィルス断片についてその消化物を分析した。
【０１２７】
（実施例１４：ＡＡＶ  ＤＮＡの検出のためのカラム分画のスロットブロット分析）
カラム分画を、スロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ）分析によりＡＡＶ  ＤＮＡについてアッセイした（ＡＡＶ  ＤＮＡは、またリポーター遺伝子としてｌａｃＺを含有する、マィアミのフロリダ大学のＤｒ．Ｎ．Ｍｕｚｙｃｚｉａにより提供されたベクター構成体中に存在した：図１４参照）。サンプルはアデノウィルスを不活性化するために２０分間５６℃でインキュベートし、次に１５分間３７℃でＤＮａｓｅＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩの略）で処理して非ウィルス粒子ＤＮＡを分解させた。次にＤＮａｓｅＩは１０分間６８℃での熱処理により不活性化された。サンプルのたんぱく質分解酵素Ｋ処理の後に、フェノール／クロロホルムを用いてＤＮＡを抽出しそして３ＭのＮａＯＡｃで沈殿させた。ＤＮＡをＧｅｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ膜に適用しそして予備ハィブリッド形成およびハィブリッド工程形成の後に、Ｐ３２ランダム標識ＣＭＶ  β−ｇａｌＰｖｕ  II  断片を用いて膜をプローブした。サンプル中のＡＡＶの粒子の数は、ｐＴＲｌａｃＺ  ＤＮＡ標準曲線を用いて計算された。
【０１２８】
（実施例１５：ウィルスたんぱく質検出）
４〜２０％勾配または１０〜２０％勾配（Ｄａｉｉｃｈｉ製）ゲルのいずれかを用いて一次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クーマシーブルーを用いてゲル中のたんぱく質を検出した。免疫ブロットのために、ＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ製）はメタノールで再湿潤されそして１０％メタノールを含有する１０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１１）中に浸された。ゲルは１０分間この転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）緩衝液中で平衡化されそして次にＮｏｖｅｘ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ中で１時間３０Ｖでブロットされた。転移の後に、膜が１時間ＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中の１％乾燥ミルクでブロックされた。ブロックの後に、膜は、抗アデノウィルス抗体（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ製）でプローブされるかまたは２時間０．１％のＢＳＡを含有する、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）および０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０（ＴＢＳＴ）中の抗−ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３（ＡＡＶ）抗体でプローブされた。膜は、２０分間、ホースラデイシュペルオキシダーゼ（またの名は、わさびだいこんペルオキシダーゼ）標識化抗マウスＩｇＧでインキュベートされそして免疫反応性バンドは、ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ベーリングマンハイム製）を用いて化学発光により可視化された。
【図１】
2010207244.tif 000011
【図２】
2010207244.tif 000012
【図３】
2010207244.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
2010207244.tif 000016
【図７】
2010207244.tif 000017
【図８】
2010207244.tif 000018
【図９】
2010207244.tif 000019
【図１０】
2010207244.tif 000020
【図１１】
2010207244.tif 000021
【図１２】
2010207244.tif 000022
【図１３】
2010207244.tif 000023
【図１４】
2010207244.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月26日(2010.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）とアデノウィルスたんぱく質とを含有する細胞溶解産物組成物からＡＡＶを感染性ウィルスとして精製及び回収する方法であって、一連の少なくとも２つのカラム分離を含み、
各分離が、イオン交換樹脂及びサルフェート化樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、かつ
各分離が、
該細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させてＡＡＶを該クロマトグラフィーマトリックス材料に吸着させるステップ、
該クロマトグラフィーマトリックス材料を洗浄液で洗浄してアデノウィルスたんぱく質を除去するステップ、次に
該クロマトグラフィーマトリックス材料を溶離液で溶離してＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から収集するステップ
を含む、
上記方法。
【請求項２】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）とヘルパーウィルスとを含有する細胞溶解産物組成物からＡＡＶを感染性ウィルスとして精製及び回収する方法であって、一連の少なくとも２つのカラム分離を含み、
各分離が、イオン交換樹脂及びサルフェート化樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、かつ
各分離が、
該細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させてＡＡＶを該クロマトグラフィーマトリックス材料に吸着させるステップ、
該クロマトグラフィーマトリックス材料を洗浄液で洗浄してヘルパーウィルスを除去するステップ、次に
該クロマトグラフィーマトリックス材料を溶離液で溶離してＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から収集するステップ
を含む、
上記方法。
【請求項３】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）を含有する細胞溶解産物組成物からＡＡＶを感染性ウィルスとして精製及び回収する方法であって、一連の少なくとも２つのカラム分離を含み、
各分離が、イオン交換樹脂及びサルフェート化樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、かつ
各分離が、
該細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させてＡＡＶを該クロマトグラフィーマトリックス材料に吸着させるステップ、
該クロマトグラフィーマトリックス材料を洗浄液で洗浄して細胞溶解産物成分を除去するステップ、次に
該クロマトグラフィーマトリックス材料を溶離液で溶離してＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から収集するステップ
を含む、
上記方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記一連のカラム分離が、下記：
１）前記組成物をヒドロキシアパタイト樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にＡＡＶ含有溶離液を該樹脂から回収すること、
２）該ＡＡＶ含有溶離液をイオン交換性基を有するマクロ細孔樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料に適用させ、次に該ＡＡＶ含有溶離液を該樹脂から回収すること、及び
３）該ＡＡＶ含有溶離液を、サルフェート化樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料に適用させ、次に該ＡＡＶ含有溶離液を該樹脂から収集すること、
を含む、
上記方法。
【請求項５】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）及びアデノウィルスの両方を含有する組成物からＡＡＶを精製する方法であって、アデノウィルスを不活性化して除去するステップを含み、該ステップは、
該組成物を、１４０ｎｍであるアデノウィルスの大きさを有する細孔を有するクロマトグラフィーマトリックス材料と混合して、アデノウィルスを不活性化し、ＡＡＶを含有する組成物を回収することであって、該クロマトグラフィーマトリックス材料は、下記：
ａ．マクロ細孔ＤＥＡＥ樹脂及びＢｉｏＲａｄマクロ細孔シリーズ（ＢｉｏＲａｄ）から選択されるマクロ細孔樹脂；
ｂ．ヘパリンアガロース（４％架橋）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から選択されるヘパリン化重合体；
ｃ．Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ−Ｓ（Ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｈｉ  Ｆｌｏｗ）（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ）、Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ−Ｓ（Ｉｓｃｏ）、及びセルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）（登録商標）サルフェートから選択されるサルフェート化樹脂；
ｄ．ＢｉｏＲａｄからのセラミックヒドロキシアパタイト樹脂から選択されるヒドロキシアパタイト樹脂
からなる群から選択され、該クロマトグラフィーマトリックス材料は、外表面及び細孔の内表面に存在すること；及び
一連のカラム分離を、セラミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥイオン交換、セルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）（登録商標）サルフェート、及び、任意で亜鉛キレートクロマトグラフィを使用して行うこと、
を含み、かつ
各分離が、
ＡＡＶを含有する組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させてＡＡＶを該クロマトグラフィーマトリックス材料に吸着させるステップ、
該クロマトグラフィーマトリックス材料を洗浄液で洗浄してアデノウィルスを除去するステップ、次に
該クロマトグラフィーマトリックス材料を溶離液で溶離してＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から収集するステップ
を含む、
上記方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィーマトリックス材料が、セルロース又はシリカ膜樹脂をマクロ細孔樹脂と結合して含む、請求項５に記載の方法。