(57)【要約】【課題】水に対する溶解性を高めた可溶化蜂の子処理物、並びに可溶化蜂の子処理物を含有する医薬品、化粧品又は飲食品を提供する。【解決手段】本発明の可溶化蜂の子処理物は、蜂の子を、プロテアーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することにより得られることを特徴とする。プロテアーゼ処理に用いるプロテアーゼとしては、例えば、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ、バチルス・リケニフォルミス由来のアルカリ性プロテアーゼが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することにより得られることを特徴とする可溶化蜂の子処理物。
【請求項２】
蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することにより得られることを特徴とする可溶化蜂の子処理物。
【請求項３】
前記プロテアーゼ処理は、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ及びバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリ性プロテアーゼから選ばれる少なくとも一種を用いて処理されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の可溶化蜂の子処理物。
【請求項４】
前記可溶化蜂の子処理物は、アレルギー性が低減されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶化蜂の子処理物。
【請求項５】
蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することを特徴とする可溶化蜂の子処理物の製造方法。
【請求項６】
蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することを特徴とする可溶化蜂の子処理物の製造方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼ処理は、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ及びバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリ性プロテアーゼから選ばれる少なくとも一種を用いて処理されることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の可溶化蜂の子処理物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする医薬品、化粧品又は飲食品。
【請求項９】
前記飲食品は、アレルギー低減飲食品であることを特徴とする請求項８に記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分をプロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる可溶化蜂の子処理物、その製造方法、並びに可溶化蜂の子処理物を含有する医薬品、化粧品又は飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蜂の子は、ミツバチ、スズメバチ、クマバチ、アシナガバチ等の蜂の幼虫や蛹であり、一部の地域においては食用として用いられている。また、蜂の子はタンパク質、脂肪及び炭水化物等の栄養素をバランスよく豊富に含有するとともに、血流改善作用や滋養強壮作用等、種々の生理作用を有していることが知られ、漢方薬や健康食品の素材としても扱われている。例えば、特許文献１には、女王蜂の幼虫を粉末状に加工して得られる蜂の子粉末が開示されている。特許文献１の蜂の子粉末は、女王蜂の幼虫を熱処理した後に水分含量が１０％以下となるまで乾燥させ、得られた乾燥幼虫を粉末化することにより調製される。
【特許文献１】特開２００１−２０４４２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１の蜂の子粉末は、そのまま水に溶解させた場合、容易に溶解しないという問題があった。そのため、例えば飲料品として適用する場合に、蜂の子粉末を高濃度で配合させることができず、水溶液、例えば飲料品への適用が非常に困難であった。この発明は、こうした従来の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、水に対する溶解性を高めた可溶化蜂の子処理物、その製造方法、並びに可溶化蜂の子処理物を含有する医薬品、化粧品又は飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の可溶化蜂の子処理物は、蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することにより得られることを特徴とする。
【０００５】
請求項２に記載の可溶化蜂の子処理物は、蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することにより得られることを特徴とする。
【０００６】
請求項３に記載の可溶化蜂の子処理物は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記プロテアーゼ処理は、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ及びバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリ性プロテアーゼから選ばれる少なくとも一種を用いて処理されることを特徴とする。
【０００７】
請求項４に記載の可溶化蜂の子処理物は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発明において、前記可溶化蜂の子処理物は、アレルギー性が低減されていることを特徴とする。
請求項５に記載の可溶化蜂の子処理物の製造方法は、蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することを特徴とする。
【０００８】
請求項６に記載の可溶化蜂の子処理物の製造方法は、蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分を、プロテアーゼ処理、セルラー
ゼ処理及び酸性化処理を組み合わせて処理することを特徴とする。
【０００９】
請求項７に記載の可溶化蜂の子処理物の製造方法は、請求項５又は請求項６に記載の発明において、前記プロテアーゼ処理は、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ及びバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリ性プロテアーゼから選ばれる少なくとも一種を用いて処理されることを特徴とする。
【００１０】
請求項８に記載の医薬品、化粧品又は飲食品は、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の蜂の子処理物を含有することを特徴とする。
請求項９に記載の飲食品は、請求項８に記載の発明において、アレルギー低減飲食品であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、水に対する溶解性を高めた可溶化蜂の子処理物、その製造方法、並びに可溶化蜂の子処理物を含有する医薬品、化粧品又は飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の可溶化蜂の子処理物を具体化した実施形態を説明する。なお、以下では、可溶化蜂の子処理物を単に蜂の子処理物として記載する。
本実施形態において使用される蜂の子としては、蜂の幼虫及び蜂の蛹から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。これら蜂の幼虫及び蛹は、雌雄のいずれであってもよく、また、ミツバチ、スズメバチ、クマバチ、アシナガバチ等いずれの蜂の幼虫及び蛹であってもよい。さらに、本実施形態で使用される蜂の子の産地は、中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、南アメリカ諸国のいずれでもよい。
【００１３】
本実施形態の蜂の子処理物は、蜂の子（蜂の子を粉末状に加工した蜂の子粉末、生の蜂の子を含む）、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出処理して得られる不溶性成分（すなわち、主成分が水である抽出溶媒に対する不溶性の画分（抽出残渣））が原料として使用される。蜂の子を粉末化する方法としては、従来用いられているいずれの方法を採用してもよく、例えば、特許文献１に開示される方法が挙げられる。また、生の蜂の子を原料として使用する場合には、すり潰す等してペースト状に前処理しておくことが好ましい。また、蜂の子の主成分が水である抽出溶媒に対する不溶性の画分を得る場合において、溶媒の温度は特に限定されない。なお、抽出操作は、所定温度下で攪拌しながら数時間程度行えばよい。そして、溶媒溶解成分を抽出した後、濾過及び遠心分離などの公知の固液分離方法を適用することにより、蜂の子から主成分が水である溶媒に対する不溶性の画分を得ることができる。
【００１４】
ここで、主成分が水である抽出溶媒とは、溶媒中の存在割合（容量％）が最も高い成分が水である溶媒を意味している。そして、溶媒中における水の含有量は、５０容量％以上であることが好ましい。また、水以外の成分として、例えばエタノール等の親水性有機溶媒を少量含有していてもよい。
【００１５】
本実施形態の蜂の子処理物の製造工程は、まず、蜂の子粉末、生の蜂の子、又は蜂の子を主成分が水である抽出溶媒により抽出して得られる不溶性成分（以下、これらを総じて蜂の子原料という。）について、プロテアーゼ処理し、第１中間処理物を得る工程が行われる。次に、上記第１中間処理物について、好ましくはセルラーゼ処理し、第２中間処理物を得る工程が行われる。最後に、上記第１中間処理物又は上記第２中間処理物について、酸性化処理することにより、蜂の子処理物が得られる。プロテアーゼ処理は、プロテアーゼを用いて蜂の子原料に含有されるタンパク質のペプチド結合を加水分解して低分子化する処理である。プロテアーゼには、ペプチドの末端から加水分解するエキソ型プロテアーゼとペプチドの途中位置から分解するエンド型プロテアーゼとが存在するが、いずれの
プロテアーゼも使用することができる。また、プロテアーゼには、至適ｐＨを酸性付近（例えば、ｐＨ６．０未満）、中性付近（例えば、ｐＨ５．０〜９．０）、アルカリ性付近（例えば、ｐＨ８．０以上）に有する酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼがそれぞれ存在するが、いずれのプロテアーゼも使用することができる。さらに、プロテアーゼは、微生物由来、動物由来、植物由来等、様々なものに由来するプロテアーゼが存在するが、いずれのものに由来するプロテアーゼも使用することができる。これらのプロテアーゼの中でも、水に対する溶解性の向上の観点から微生物由来のプロテアーゼが好ましく用いられる。
【００１６】
酸性プロテアーゼとして、具体的には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger
）由来の酸性プロテアーゼを挙げることができる。市販品としては、スミチームＡＰ（新日本化学工業社製）を使用することができる。スミチームＡＰを用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは３５〜５０℃、より好ましくは４０〜５０℃、さらに好ましくは４５〜５０℃の条件で行なわれる。
【００１７】
中性プロテアーゼとして、具体的には、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis
）由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）
由来の中性プロテアーゼ、及びパパイヤ由来のプロテアーゼを挙げることができる。バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（アマノエンザイム社製）を使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇは、ｐＨ５．０〜７．０の領域で有効に作用し、その至適ｐＨは、ｐＨ７．０である。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇを用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは４０〜６０℃、より好ましくは４５〜５５℃、さらに好ましくは５０〜５５℃の条件で行なわれる。
【００１８】
また、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、ウマミザイムＧ（アマノエンザイム社製）及びスミチームＦＰ（新日本化学工業社製）を使用することができる。ウマミザイムＧは、中性付近で有効に作用し、その至適ｐＨは、ｐＨ８．０である。ウマミザイムＧを用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは３５〜５５℃、より好ましくは４０〜５５℃、さらに好ましくは４５〜５５℃の条件で行なわれる。スミチームＦＰを用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは３０〜５０℃、より好ましくは３５〜５０℃、さらに好ましくは４０〜５０℃の条件で行なわれる。
【００１９】
また、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のプロテアーゼとして、市販品としては、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（アマノエンザイム社製）を使用することができる。プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇは、中性から弱アルカリ性の領域で有効に作用し、その至適ｐＨは、ｐＨ８．０である。プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇを用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは５０〜７５℃、より好ましくは６０〜７５℃、さらに好ましくは６５〜７０℃の条件で行なわれる。また、パパイヤ由来のプロテアーゼとして、市販品としては、パパインＷ−４０（アマノエンザイム社製）を使用することができる。パパインＷ−４０を用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは４５〜６０℃、さらに好ましくは４５〜５５℃の条件で行なわれる。
【００２０】
アルカリ性プロテアーゼとして、具体的には、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus
licheniformis）由来のアルカリ性プロテアーゼを挙げることができる。市販品としては、プロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆ（大和化成社製）を使用することができる。プロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆは、アルカリ性付近で有効に作用し、その至適ｐＨは、ｐＨ１０．０〜１１．０である。プロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆを用いたプロテアーゼ処理は、好ましくは４０〜６０℃、より好ましくは５０〜６０℃、さらに好ましくは５５〜６０℃の条件で行なわれる。
【００２１】
これらのプロテアーゼ中で、水に対する溶解性の向上の観点からプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ウマミザイムＧ、及びプロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆが好ましく用いられる。
各種プロテアーゼを用いたプロテアーゼ処理は、蜂の子原料、プロテアーゼ及び水（又は緩衝液）を含む反応液を、各種プロテアーゼに応じた反応条件下でインキュベートすることにより実施される。プロテアーゼ処理の処理時間は、反応温度、酵素の力価等により適宜設定されるが、好ましくは２〜５時間、より好ましくは３〜４時間である。処理時間が２時間未満の場合、プロテアーゼによるタンパク質分解が十分に進行しないおそれがある。逆に、処理時間が５時間を越える場合、プロテアーゼ処理（蜂の子処理物の製造）に要する時間が著しく浪費されるため不経済である。処理ｐＨは好ましくは各酵素の至適ｐＨ付近で行なわれる。なお、このプロテアーゼ処理は、インキュベート後の反応液を直ちに８５〜１００℃で５〜６０分間加熱してプロテアーゼを失活させることが望ましい。
【００２２】
前記反応液には、蜂の子原料に起因する粘度上昇を抑えてプロテアーゼ処理を迅速に進行させるための溶媒として、水（又は緩衝液）が含有されている。反応液は、蜂の子原料の重量に対して２〜１５倍量、好ましくは２〜１４倍量、より好ましくは３〜１０倍量の水（又は緩衝液）が含有されていることが望ましい。蜂の子原料の重量に対して２倍量未満の溶媒が加えられる場合、蜂の子原料に起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができないため、プロテアーゼ処理を迅速に進行させることが困難になる。逆に、蜂の子原料の重量に対して１０倍量を超える溶媒が加えられる場合、続く各処理を経て得られる蜂の子処理物を粉末化する際に、多くの時間を要するという不都合が発生する。
【００２３】
引き続いて、プロテアーゼ処理により得られた第１中間処理物に対するセルラーゼ処理が行なわれる。セルラーゼ処理は、セルラーゼを用いて蜂の子原料に含有されるセルロース等のβ−１,４−グリカンのグリコシド結合を加水分解して低分子化する処理である。
【００２４】
セルラーゼには、β−１,４−グリカンの末端から加水分解するエキソ型セルラーゼとβ
−１,４−グリカンの途中位置から分解するエンド型セルラーゼとが存在するが、いずれ
のセルラーゼも使用することができる。また、セルラーゼには、至適ｐＨを酸性付近（例えば、ｐＨ６．０未満）、中性付近（例えば、ｐＨ５．０〜９．０）、アルカリ性付近（例えば、ｐＨ８．０以上）に有する酸性セルラーゼ、中性セルラーゼ、アルカリ性セルラーゼがそれぞれ存在するが、いずれのセルラーゼも使用することができる。
【００２５】
セルラーゼとして具体的には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来の
酸性セルラーゼを挙げることができる。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
由来の酸性セルラーゼとして、市販品としては、セルラーゼＡ「アマノ」３（アマノエンザイム社製）を使用することができる。セルラーゼＡ「アマノ」３は、酸性付近で有効に作用し、その至適ｐＨは、ｐＨ４．５である。セルラーゼＡ「アマノ」３を用いたセルラーゼ処理は、好ましくは４０〜６０℃、より好ましくは４０〜５５℃、さらに好ましくは５０〜５５℃の条件で行なわれる。
【００２６】
セルラーゼを用いたセルラーゼ処理は、前記プロテアーゼ処理後の反応液にセルラーゼを添加し、セルラーゼに応じた反応条件下でインキュベートすることにより実施される。セルラーゼ処理の処理時間は、反応温度、酵素の力価等により適宜設定されるが、好ましくは０．１〜６時間、より好ましくは０．５〜２時間である。処理時間が０．１時間未満の場合、セルラーゼによるβ−１,４−グリカンの分解が十分に進行しないおそれがある。逆に、処理時間が６時間を越える場合、セルラーゼ処理（蜂の子処理物の製造）に要する時間が著しく浪費されるため不経済である。なお、このセルラーゼ処理は、インキュベート後の反応液を直ちに８５〜１００℃で５〜６０分間加熱してセルラーゼを失活させることが望ましい。
【００２７】
引き続いて、セルラーゼ処理により得られた第２中間処理物に対する酸性化処理が行なわれる。酸性化処理は、セルラーゼ処理後の反応液を酸性化することにより、蜂の子原料に含まれるキトサンやセルロース等の糖質及び不溶性の脂質を分解して低分子化する処理である。具体的には、セルラーゼ処理後の反応液に酸性の物質を添加してｐＨが安定するまで攪拌する。この酸性の物質としては、例えは、クエン酸、塩酸が挙げられる。また、酸性化処理時のｐＨは、好ましくはｐＨ２．０〜４．０、より好ましくはｐＨ３．０〜３．５である。酸性化処理の時間としては、ｐＨ、反応温度等により適宜設定されるが、好ましくは０．１〜２時間、より好ましくは０．２〜０．５時間である。
【００２８】
続いて、酸性化処理後の反応液を、濾紙や珪藻土等を用いて濾過処理することにより、可溶性成分が溶解する溶液と不溶性成分とを分離する。そして、濾過処理により得られた溶液に含有される溶質を、凍結乾燥等の手段を用いて乾燥・粉末化することにより本実施形態の蜂の子処理物が得られる。
【００２９】
本実施形態の蜂の子処理物は、高い抗酸化作用、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性作用、皮膚繊維芽細胞増殖促進作用、疲労回復作用、及び血流改善作用を有する。したがって、それらの作用効果を得ることを目的とした抗酸化剤、ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤、皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、疲労回復剤、及び血流改善剤として適用することができる。
【００３０】
具体的な配合形態として、抗酸化剤は、好ましくは飲食品、化粧品及び医薬品等として適用することができる。ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、好ましくは血圧が高めの方の飲食品及び医薬品等として適用することができる。皮膚繊維芽細胞増殖促進剤は、好ましくは化粧品等として適用することができる。疲労回復剤は、好ましくは栄養補助食品等の飲食品及び医薬品等として適用することができる。血流改善剤は、好ましくは冷え性や耳鳴り等、血行不良に起因する症状のある方の飲食品及び医薬品等として適用することができる。
【００３１】
また、本実施形態の蜂の子処理物は、蜂の子原料と比較してそのアレルギー性が低減されている。したがって、本実施形態の蜂の子処理物は、好ましくはアレルギー患者等のアレルギー症状を有する方の飲食品（アレルギー低減飲食品）として適用することができる。
【００３２】
本実施形態の蜂の子処理物を化粧品に適用する場合、化粧品基材に配合することにより製造することができる。化粧品の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状等のいずれであってもよい。化粧品基剤は、一般に化粧品に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。
【００３３】
本実施形態の蜂の子処理物を飲食品に適用する場合、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状等のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。
【００３４】
本実施形態の蜂の子処理物を医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。本実施形態の蜂の子処理物は経口摂取により投与されることが望ましい。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。
【００３５】
次に本実施形態における作用効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態では、蜂の子処理物を得るための工程にプロテアーゼ処理及び酸性化処理が含まれている。これにより、蜂の子原料から水に対する溶解性を高めた蜂の子処理
物を高収率で得ることができる。さらに、本実施形態では、上記処理に加えて、蜂の子処理物を得るための工程にセルラーゼ処理が含まれている。これにより、蜂の子処理物の収率をより高めることができる。また、セルラーゼ処理を行なうことにより、反応液の消泡性及び濾過性が向上する。
【００３６】
（２）本実施形態において、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる蜂の子処理物は、高い抗酸化作用を有している。したがって、抗酸化剤として、抗酸化作用を目的とした化粧品、飲食品及び医薬品等に好ましく適用することができる。
【００３７】
（３）本実施形態において、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる蜂の子処理物は、高いＡＣＥ阻害活性作用を有している。したがって、ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤として、血圧効果作用を目的とした飲食品及び医薬品等に好ましく適用することができる。
【００３８】
（４）本実施形態において、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる蜂の子処理物は、高い皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用を有している。したがって、皮膚繊維芽細胞増殖促進剤として、ヒト皮膚繊維芽細胞増殖促進作用の発揮を目的とする飲食品及び医薬品等に好ましく適用することができる。
【００３９】
（５）本実施形態において、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる蜂の子処理物は、高い抗疲労作用を有している。したがって、疲労回復剤として、疲労回復作用を目的とした飲食品及び医薬品等に好ましく適用することができる。
【００４０】
（６）本実施形態において、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる蜂の子処理物は、高い血流改善作用を有している。したがって、血流改善剤として、血流改善作用を目的とした飲食品及び医薬品等に好ましく適用することができる。
【００４１】
（７）本実施形態において、プロテアーゼ処理に用いるプロテアーゼは、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ及びバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリ性プロテアーゼのうちのいずれかが好ましく適用される。この場合、抗酸化作用及び血流改善作用をより高めることができる。
【００４２】
（８）本実施形態において、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理及び酸性化処理することにより得られる蜂の子処理物は、蜂の子原料と比較してそのアレルギー性が低減されている。したがって、アレルギー低減飲食品に好ましく適用することができる。
【００４３】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  本実施形態では、蜂の子原料に対して、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理の３工程処理を行なうことにより蜂の子処理物を得ていたが、セルラーゼ処理を行なうことなく、プロテアーゼ処理及び酸性化処理の２工程処理のみにより蜂の子処理物を得るようにしてもよい。このようにした場合も、蜂の子原料から水に対する溶解性を高めた蜂の子処理物を高収率で得ることができる。
【００４４】
・  本実施形態では、蜂の子原料に対して、順にプロテアーゼ処理、セルラーゼ処理、酸性化処理を行なっていたが、これら各処理の順番はとくに限定されるものではなく、どのような順番で行なわれてもよい。また、プロテアーゼ処理とセルラーゼ処理とを同時に行なってもよい。
【００４５】
・  本実施形態では、濾過処理により得られた溶液中に含まれる溶質を乾燥・粉末化させていたが、濾過処理により得られた溶液をそのまま飲食品、医薬品及び化粧品等に適用してもよい。なお、本発明の蜂の子処理物は、粉末状の形態に限られるものではなく、液
状、ペースト状等、いずれの形態に加工させたものであってもよい。
【００４６】
・  本実施形態における蜂の子処理物は、ヒトが摂取する飲食品及び医薬品等に対して適用することができるのみならず、家畜の飼料、サプリメント、栄養食品、医薬品等として配合してもよい。
【００４７】
・  アレルギー低減飲食品として適用する場合、蜂の子処理物は、珪藻土濾過処理がなされていることが好ましい。この場合、蜂の処理物のアレルギー性をより効果的に低減することができる。
【００４８】
・  蜂の子処理物のアレルギー性をより効果的に低減することができるため、好ましくは微生物由来のプロテアーゼ、より好ましくはバチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼが用いられる。
【実施例】
【００４９】
以下に、試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（蜂の子処理物の調製）
表１の実施例１〜６に示されるように、中国産の雄蜂の蛹から得られた蜂の子粉末を原料として用い、プロテアーゼ処理及び酸性化処理を行なった。まず、この蜂の子粉末２．５ｇを２０質量％となるように水に懸濁させ、蜂の子原料水溶液（１２５ｍｌ）を調製した。次に、蜂の子原料水溶液に各実施例に対応するプロテアーゼを２５ｍｇ（蜂の子粉末に対して１質量％）添加し、５０℃にて４時間プロテアーゼ処理を行なった。ここでは、プロテアーゼとして、スミチームＡＰ（新日本化学工業社製）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（アマノエンザイム社製）、ウマミザイムＧ（アマノエンザイム社製）、スミチームＦＰ（新日本化学工業社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（アマノエンザイム社製）、プロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆ（アマノエンザイム社製）の６種類を使用した。また、プロテアーゼ処理時における反応液のｐＨは、プロテアーゼがスミチームＡＰの場合は３．０、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ウマミザイムＧ、スミチームＦＰ、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇの場合は７．０、プロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆの場合は１０．０とした。
【００５０】
続いて、プロテアーゼ処理後の各反応液に対して、ｐＨが３．５になるまで塩酸を添加した。その後、反応液のｐＨを維持しつつ、室温にて０．２時間インキュベートすることにより酸性化処理を行なった。そして、酸性化処理後の反応液を珪藻土により濾過処理し、得られた溶液中に含まれる溶質を凍結乾燥して粉末状の蜂の子処理物をそれぞれ調製し、その収量及び回収率を測定した。
【００５１】
また、この他に、実施例７及び８として、蜂の子原料水溶液を蜂の子原料をプロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化の３工程処理した蜂の子処理物についても別途調製した。その際、プロテアーゼとして、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ又はパパインＷ−４０（アマノエンザイム社製）を用いるとともに、セルラーゼとしてセルラーゼＡ「アマノ」３（アマノエンザイム社製）を用いた。まず、プロテアーゼ処理を上記方法と同様の方法にて行なった。なお、プロテアーゼとしてパパインＷ−４０を用いた場合には、プロテアーゼ処理時における反応液のｐＨを７．０とした。その後、プロテアーゼ処理後の反応液に対して、セルラーゼＡ「アマノ」３を２５ｍｇ（蜂の子粉末に対しての１質量％）添加し、５５℃にて１時間セルラーゼ処理を行なった。また、セルラーゼ処理時における反応液のｐＨは４．５とした。
【００５２】
続いて、セルラーゼＡ「アマノ」３処理後の反応液に対して、酸性化処理を上記方法と同様の方法にて行なった。そして、酸性化処理後の反応液を珪藻土により濾過処理し、得られた溶液中に含まれる溶質を凍結乾燥して粉末状の蜂の子処理物を調製し、その収量及び回収率を測定した。
【００５３】
また、比較例１は、蜂の子粉末２．５ｇを２０質量％となるように水に懸濁させて調製した蜂の子水溶液（１２５ｍｌ）を使用した。比較例２は、上記蜂の子水溶液（１２５ｍｌ）に対して上記実施例と同様の方法により酸性化処理を行なったものを使用した。比較例３は、上記蜂の子水溶液に対して、実施例７及び８と同様の方法によりセルラーゼ処理及び酸性化処理を行なったものを使用した。比較例３では、まず、セルラーゼＡ「アマノ
」Ｇを用いてセルラーゼ処理を行ない、次に酸性化処理を行なった。そして、比較例１〜３についても各実施例と同様に濾過処理及び凍結乾燥して粉末状の蜂の子処理物をそれぞれ調製し、その収量及び回収率を測定した。その結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2010030975.tif 000002
表１に示されるように、プロテアーゼ処理及び酸性化処理の２工程処理した実施例１〜６は、未処理の比較例１と比較して高い回収率を示し、水に対する溶解性が向上していることが確認された。とくに、プロテアーゼとして、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ウマミザイムＧ、及びプロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆをそれぞれ使用した実施例２、３及び６は、３０％以上の高い回収率を示した。中でもプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇを使用した実施例２は、約４０％という非常に高い回収率を示した。同様に、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理の３工程処理した実施例７及び８も、未処理の比較例１と比較して高い回収率を示し、水に対する溶解性が向上していることが確認された。とくに、微生物由来のプロテアーゼを使用することが有効であることが確認された。
【００５５】
また、セルラーゼＡ「アマノ」３処理及び酸性化処理の２工程処理した比較例３は、酸性処理のみを行なった比較例２と比較して、その回収率がほとんど変化しないことが確認された。これに対して、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ処理、セルラーゼＡ「アマノ」３処理及び酸性化処理の３工程処理した実施例７は、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ処理及び酸性化処理の２工程処理した実施例２と比較して、その回収率が向上することが確認された。この結果から、プロテアーゼ処理とセルラーゼ処理とを組み合わせて用いることが回収率の向上、すなわち水に対する溶解性の向上に効果的であることが示された。また、セルラーゼ処理を行なった場合には、回収率とは別に、反応液の消泡性及び濾過性が向上することも確認された（データ不添付）。
【００５６】
次に、実施例７の蜂の子処理物（凍結乾燥粉末）を試験試料として用い、蜂の子処理物の各種生理活性について評価した。以下では、実施例７について単に実施例と表記している。また、原料として用いた蜂の子粉末を比較例として用いている。
【００５７】
（試験例１、抗酸化活性としてのラジカル補足能試験）
実施例の抗酸化作用をラジカル補足能試験により評価した。本試験は、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨ(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)が抗酸化物質に
より還元されて退色することを利用するものである。実施例及び比較例をそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水中に溶解させて各試料溶液を調製した。各試料溶液１００μｌに、１７０μＭのＤＰＰＨエタノール溶液１．９ｍｌを加えて混合し、ＤＰＰＨエタノール試料溶液とし、１５分間反応させた。その後、分光光度計（島津製作所製ＵＶ-１２
００）を用いて、各ＤＰＰＨエタノール試料溶液の光の波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、試料溶液に代えて蒸留水をＤＰＰＨエタノール溶液に混合したものをコ
ントロールとして、同様に５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。ＤＰＰＨラジカル捕捉率は以下の式より求めた。その結果を表２に示す。
【００５８】
ＤＰＰＨラジカル捕捉率（％）＝｛（Ａｃ−Ａｓ）／Ａｃ｝×１００
Ａｃ：コントロールの５１７ｎｍにおける吸光度
Ａｓ：（ＤＰＰＨエタノール試料溶液の５１７ｎｍにおける吸光度）−（試料溶液の５１７ｎｍにおける吸光度）
【００５９】
【表２】
2010030975.tif 000003
表２に示されるように、実施例及び比較例ともにＤＰＰＨラジカル補足作用を示すものの、とくに実施例は比較例と比べて高いＤＰＰＨラジカル補足作用を示した。この結果から、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を行なうことにより、ＤＰＰＨラジカル補足作用、すなわち抗酸化作用が向上することが確認された。
【００６０】
フリーラジカルは悪性腫瘍、心疾患、脳血管疾患等の種々の疾患の原因因子と考えられている。そのため、フリーラジカルを除去する作用を有する実施例は、それらの疾患の予防及び治療のための有効な成分になり得る。したがって、フリーラジカル除去能の発揮を目的とする健康食品、化粧品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。
【００６１】
（試験例２、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性試験）
実施例のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害作用を評価した。ＡＣＥは血圧上昇因子アンジオテンシンＩＩの生成に関わる酵素であり、この酵素の働きを抑えることは、血圧の降下にもつながることが確認されている。実施例及び比較例をそれぞれ０．０８ｍｇ／ｍｌ，０．４ｍｇ／ｍｌ，２ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水中に溶解させて試料溶液を調整した。
【００６２】
ＡＣＥ阻害活性の測定は、受田らの方法に準じて行った。まず、各試料溶液５０μｌ及び５．８３ｍＭ ＡＣＥ基質溶液（Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・Ｈ２Ｏ，１Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ８．３ ５０ｍＭ ホウ酸緩衝液に溶解）１５０μｌを混合し、３７℃にて５分間プレインキュベートした。続いて、各試料に１２０ｍＵ／ｍｌのウサギ肺由来アンジオテンシン変換酵素をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした後、１Ｎ塩酸を２５０μl添加して反応を停止させた。そして、各試料中に生成された馬尿酸
を酢酸エチルで抽出し、濃縮乾固したものを蒸留水２．５ｍｌに再溶解して、その２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６３】
なお、試料溶液に代えて蒸留水を混合したものを用意し、これをコントロールとするとともに、各試料及びコントロールのそれぞれに対して、インキュベート前に予め１Ｎ塩酸２５０μｌを加えたものを用意し、これを各ブランクとした。そして、コントロール及び各ブランクについても、インキュベート後に、同様の抽出処理、濃縮乾固処理及び再溶解処理を行ない、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。そして、各濃度の試料溶液におけるＡＣＥ阻害率を以下の式より求めた。
【００６４】
ＡＣＥ阻害率（％）＝［｛（Ｅｃ−Ｅｃｂ）−（Ｅｓ−Ｅｓｂ）｝／（Ｅｃ−Ｅｃｂ）］×１００
Ｅｃ：コントロールの２２８ｎｍにおける吸光度
Ｅｃｂ：コントロールのブランクの２２８ｎｍにおける吸光度
Ｅｓ：各試料の２２８ｎｍにおける吸光度
Ｅｓｂ：各試料のブランクの２２８ｎｍにおける吸光度
そして、求められた各濃度におけるＡＣＥ阻害率に基づいて、ＡＣＥ阻害活性を５０％阻害する濃度（ｍｇ／ｍｌ）をＡＣＥ阻害活性ＩＣ５０値として算出した。その結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
2010030975.tif 000004
表３に示されるように、比較例ではＡＣＥ阻害活性については殆ど認められないのに対し、実施例では高いＡＣＥ阻害活性が認められた。この結果から、ＡＣＥ阻害活性は、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を行なうことにより初めて発現することが示された。よって、ＡＣＥ阻害活性を有する実施例は、血圧降下作用の発揮を目的とする飲食品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。
【００６６】
（試験例３、皮膚繊維芽細胞増殖試験）
実施例のヒト皮膚繊維芽細胞増殖作用について評価した。実施例を６μｇ／ｍｌ，３０μｇ／ｍｌ，１５０μｇ／ｍｌとなるように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中に溶解させて試料培地を調整した。また、実施例を含まない１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用意し、これをコントロールとした。
【００６７】
まず、ヒト皮膚繊維芽細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて培養後、０．８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ウェルに１ｍｌずつ播種した。翌日、培地を試料培地に交換し、４８時間培養した後に、血球計算板にて細胞数の測定を行なった。その結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
2010030975.tif 000005
表４に示すように、実施例を３０μｇ／ｍｌ及び１５０μｇ／ｍｌの濃度で含有する試料培地においては、コントロールに対して有意な細胞数の増加が認められた。この結果から、実施例は、ヒト皮膚繊維芽細胞を増殖させる作用を有することが示された。よって、実施例は、ヒト皮膚繊維芽細胞増殖作用の発揮を目的とする飲食品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。
【００６９】
（試験例４、疲労回復試験）
実施例の疲労回復作用をマウス強制水泳試験により評価した。マウスを水中に入れると、最初の１分間程度は四肢と尾を使って泳ぎ、脱出を試みる。しかし、その後は疲労によりマウスが水泳を止め、水面に浮くだけの時間が生じる。本試験では、これを不動時間として計測する。なお、本試験では実施例及び比較例の他に、陽性対照としてＬ−カルノシ
ンについても、その評価を行なった。
【００７０】
試験動物としてｄｄＹ系雄性マウス（５週齢）を使用し、各試料を蒸留水に溶解させたものを４日間経口投与した。各試料は、実施例及び比較例については、１日当たり５００ｍｇ／ｋｇ（体重）となるように投与し、Ｌ−カルノシンについては、１日当たり５０ｍｇ／ｋｇ（体重）となるように投与した。また、蒸留水のみを投与したものを用意し、これをコントロールとした。そして、５日目に強制水泳試験を実施した。強制水泳については、まず、５分間の予備強制水泳を試行し、その直後に各試料を前日までと同量経口投与した。その経口投与６０分経過後に再強制水泳を５分間試行し、５分間の再強制水泳中に、マウスが水中で動かない時間を累計して、これを不動時間とした。その結果を表５に表す。
【００７１】
【表５】
2010030975.tif 000006
表５に示されるように、実施例及び比較例ともに、コントロールと比較して有意な浮動時間の短縮が認められた。よって、実施例は、肉体疲労の改善作用の発揮を目的とする飲食品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。
【００７２】
（試験例５、血流試験）
実施例の血流改善作用について評価した。本試験では、実施例及び比較例の他に陽性対照としてＬ−アルギニンについても、その評価を行なった。ラットに対して、２ｇ／ｋｇ（体重）となるように実施例、比較例及びＬ−アルギニンを経口投与し、６０分経過後に麻酔注射を行なうとともに、ラットの尾部付け根にける血流量の測定を開始した。血流量の測定は６０分間行ない、その平均血流量を算出した。その結果を表６に示す。なお、実施例、比較例及びＬ−アルギニンを投与していないラットについても同様の操作を行い、これをコントロールとした。
【００７３】
【表６】
2010030975.tif 000007
表６に示されるように、実施例及び比較例ともに有意な血流量の増加作用を示した。とくに、実施例は比較例と比べても高い血流量の増加作用を示した。この結果から、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を行なうことにより、血流量増加作用がさらに向上することが確認された。よって、実施例は、血流量改善作用の発揮を目的とする飲食品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。
【００７４】
（試験例６、アレルギー性に関する試験）
実施例のアレルギー性の有無について評価した。本試験では、実施例及び比較例に含まれる甲殻類アレルギー物質（甲殻類アレルギー性タンパク質）をＥＬＩＳＡ法により測定した。甲殻類アレルギー物質の測定は、ＦＡテスト  ＥＩＡ−甲殻類「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）を用いて行なった。実施例及び比較例をそれぞれ２．５ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水中に溶解させて試料溶液を調整し、各試料溶液中に含まれる甲殻類アレルギー物質含量を測定した。なお、各試料溶液について甲殻類アレルギー物質含量の測定を３度行い、甲殻類アレルギー物質含量の平均値が２０ｐｐｍ以上である場合にアレルギー性有り（陽性）、１．０ｐｐｍ以上２０ｐｐｍ未満である場合にアレルギー性の疑い有り（疑陽性）、１．０ｐｐｍ未満である場合にアレルギー性無し（陰性）と判定した。その結果を表７に示す。
【００７５】
【表７】
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表７に示されるように、比較例は甲殻類アレルギー性物質含量が多く、甲殻類アレルギーについて陽性を示した。これに対して、実施例は甲殻類アレルギー性物質含量が低減されており、甲殻類アレルギーについて陰性を示した。この結果から、プロテアーゼ処理、セルラーゼ処理及び酸性化処理を行なうことにより、甲殻類アレルギー性物質含量が低下し、アレルギー性が低減されることが確認された。よって、実施例はアレルギー低減飲食品として好適に適用することができる。
【００７６】
次に、上記実施形態から把握できる技術的思想について記載する。
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする冷え性改善剤。
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする耳鳴り改善剤。
【００７７】
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする血圧降下剤。
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする皮膚繊維芽細胞増殖促進剤。
【００７８】
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする抗疲労剤。
○  前記可溶化蜂の子処理物を含有することを特徴とする血流改善剤。