(57)【要約】【課題】骨形成促進作用、さらには骨吸収抑制作用に優れ、かつ安全性の高い新規な成分を用いて、骨粗鬆症の治療又は予防に有効な医薬組成物を提供する。【解決手段】ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツの水溶性画分を、骨粗鬆症の治療又は予防のための医薬組成物に配合する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツの水溶性画分を有効成分として含有する、ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２／骨形成因子−２）産生促進剤。
【請求項２】
さらにＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ／破骨細胞分化抑制因子）産生促進剤である、請求項１に記載のＢＭＰ−２産生促進剤。
【請求項３】
前記非結球性メキャベツの水溶性画分が、前記非結球性メキャベツの水抽出物である、請求項１又は２に記載のＢＭＰ−２産生促進剤。
【請求項４】
前記非結球性メキャベツの水溶性画分が、前記非結球性メキャベツの水抽出物を、さらに水と有機溶媒により分配して得た水層画分である、請求項１又は２に記載のＢＭＰ−２産生促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載のＢＭＰ−２産生促進剤を含有する、骨粗鬆症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項６】
前記非結球性メキャベツの水溶性画分が、３０倍濃縮水抽出物の量に換算して、１日当たり、０．００１ｍＬ／ｋｇ体重〜１００ｍＬ／ｋｇ体重の量で投与される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツの水抽出物を、水と有機溶媒により分配する工程、及び分配により得られた水層画分を有効成分として配合する工程を含む、ＢＭＰ−２産生促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＭＰ−２産生促進剤、並びに骨粗鬆症の予防又は治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症とは、骨が脆くなり、骨折しやすくなる病態である。骨粗鬆症による骨折は、特に高齢の女性に多く見られ、ＱＯＬ(ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ)の低下及び「寝たきり」の主要な原因の１つとなっている。骨粗鬆症は、主に加齢とともに骨吸収と骨形成のバランスが崩れ、相対的に骨吸収が優位になったために骨量の減少が起こり、さらに骨の微細構造の変化により骨の強度が低下することで発症する。
日本における骨粗鬆症の患者数は、現在１０００万人前後と推定されている。さらに総人口に占める高齢化率は、２００５年の報告では１９．５％であり、年々増加していることから、患者数は、今後も増加すると考えられ、その予防と治療は、大きな課題である。
骨粗鬆症の予防においては、最大骨量をできるだけ高め、それを長く維持し、閉経後および老年期に生じる骨量の減少を少しでも抑制することが重要である。そのため、食事や製剤からのカルシウムやビタミンＤ、ビタミンＫの摂取が推奨されているが、それだけで骨量の減少を抑制することは困難である。
骨粗鬆症の治療においては、破骨細胞による骨吸収を抑制し、一方において骨芽細胞による骨形成を促進して、全体的な骨量を増やすことが重要である。
【０００３】
現在市販されている骨粗鬆症の治療薬としては、ビスフォスフォネート製剤、エストロゲン製剤、カルシトニン製剤などがあるが、これらの治療剤は骨吸収抑制剤であり、骨量の減少防止、維持には有効であるが、失われた骨量を顕著に回復することはできない。
さらに、ビスフォスフォネート製剤は、発熱や食道潰瘍、低カルシウム血症、稀ではあるが顎骨壊死という副作用がある。エストロゲン製剤には、乳癌、子宮癌や心筋梗塞、脳卒中のリスクが高まるという副作用がある。また、カルシトニン製剤は、連続して使っていると効果の減弱が生じる事があるため長期の治療には適しておらず、吐き気やのぼせ、鼻の炎症、稀にショック症状が起きるという副作用がある。
骨量を回復するためには、骨吸収抑制に加えて骨形成を積極的に亢進させて骨量と骨構造を回復し、骨の力学的強度を回復することが可能な治療剤が望まれている。骨形成を亢進する効果が見込まれる薬剤としては、高脂血症治療剤として使用されているスタチン類が挙げられる。スタチン類は、骨芽細胞における骨形成タンパク質であるＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２／骨形成因子−２）の産生を増加させることにより、骨形成を促進することが細胞実験及び卵巣を摘出したラットにおいて明らかにされている（非特許文献１）。しかしながら、スタチン類は横紋筋融解、胃腸障害、肝機能障害、発疹、不眠等の副作用がある。
【０００４】
一方、食品由来の成分としては、ケルセチンまたはケルセチン誘導体に、ＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ／破骨細胞分化抑制因子）産生促進作用があることが報告されている。また、ケルセチンを含む、タマネギ、ほうれん草、ケール、又はパセリの抽出物、若しくはソバ、トマト、グリーンアスパラ、あずき、ジャガイモ、イチジク、アンズ及びレモンの抽出物の加水分解物をＯＰＧ産生促進剤の有効成分として用いることが提案されている（特許文献１）。しかしながら、これらの成分については、ＯＰＧ産生促進作用しか報告されていない。
また、セリ科植物由来処理物、ユリ科植物由来処理物、キク科植物由来処理物から選択される植物由来処理物を有効成分として含有することを特徴とする骨形成促進または骨形成タンパク質産生増強を要する疾患の治療剤又は予防剤が提案されている（特許文献２）
。しかしながら、これらの成分については、骨形成促進作用しか報告されていない。また、ゲラニオール及び／又はペリリルアルコールを有効成分として含有する骨粗鬆症予防剤が提案されている（特許文献３）。これらの成分には骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用が報告されている。しかしながら、これらは香気成分であり、食品原料からの収量が少なく、且つ香味の点で有効量の摂取がしにくい。
【０００５】
【非特許文献１】Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen D, Rossini G, Boyce B, Zhao M, Gutierrez G.：Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science. Dec 3;286(5446):1825-6.（1999）
【特許文献１】特開2007-137775号公報
【特許文献２】国際公開第2004/030683号パンフレット
【特許文献３】特開2007-001894号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、骨形成促進作用に優れ、かつ安全性の高い新規な成分を提供することを課題とする。本発明は、さらに、骨形成促進作用及び骨吸収抑制作用の両者を兼ね備えた新規な成分を提供することを課題とする。そして、このような新規の成分を用いて、骨粗鬆症の治療又は予防に有効な医薬組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、このような新規の成分を容易に製造する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、骨形成促進作用に優れ、かつ安全性の高い新規な成分を探し求め、その効果について研究を重ねた結果、ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツの水溶性画分に、ＢＭＰ−２産生促進作用があることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツの水溶性画分を有効成分として含有する、ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２／骨形成因子−２）産生促進剤。
（２）さらにＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ／破骨細胞分化抑制因子）産生促進剤である、（１）に記載のＢＭＰ−２産生促進剤。
（３）前記非結球性メキャベツの水溶性画分が、前記非結球性メキャベツの水抽出物である、（１）又は（２）に記載のＢＭＰ−２産生促進剤。
（４）前記非結球性メキャベツの水溶性画分が、前記非結球性メキャベツの水抽出物を、さらに水と有機溶媒により分配して得た水層画分である、（１）又は（２）に記載のＢＭＰ−２産生促進剤。
（５）（１）〜（４）の何れかに記載のＢＭＰ−２産生促進剤を含有する、骨粗鬆症の予防又は治療のための医薬組成物。
（６）前記非結球性メキャベツの水溶性画分が、３０倍濃縮水抽出物の量に換算して、１日当たり０．００１ｍＬ／ｋｇ体重〜１００ｍＬ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１ｍＬ／ｋｇ体重〜１０ｍＬ/ｋｇ体重の量で投与される、（５）に記載の医薬組成物。
（７）ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツの水抽出物を、水と有機溶媒により分配する工程、及び分配により得られた水層画分を有効成分として配合する工程を含む、ＢＭＰ−２産生促進剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤を投与又は摂取することにより、ＢＭＰ−２の産生が促進され、骨形成が促進される。さらに、本発明のＢＭＰ−２産生促進剤を投与又は摂取することにより、ＯＰＧの産生も促進され、骨吸収が抑制される。本発明のＢＭＰ−２産生促進剤は、ＢＭＰ−２の産生を促進する効果とＯＰＧの産生を促進する効果の両者を併せ持ち、安全性も高いため、骨粗鬆症の治療又は予防のための医薬組成物の成分として好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤は、ケール（Brassica oleracea var. acephala）とメキャベツ（Brassica oleracea var. gemmifera）を交配して得られる非結球性メキャベツ（以下、単に「非結球性メキャベツ」ともいう。）の水溶性画分を有効成分として含有することを特徴とする。
非結球性メキャベツは、ケールとは異なり、葉柄と茎の間に腋芽葉を有し、さらにメキャベツとも異なり、腋芽葉が結球しないという特徴を有する。
非結球性メキャベツには市販品があり、これを使用することができる。市販品としては、例えば、株式会社増田採種場製の商品名「プチヴェール」（登録商標）が挙げられる。
【００１１】
非結球性メキャベツの水溶性画分を得るための抽出に用いる溶媒としては、水が好ましい。
抽出のための非結球性メキャベツの部位は特に制限されないが、葉が好ましい。通常は、葉を生のまま、又は乾燥させて、裁断又は粉砕した後、溶媒を添加し抽出を行う。溶媒の添加量は、特に制限されないが、通常、非結球性メキャベツの乾燥物１ｇに対し、溶媒１ｍＬ〜１００ｍＬである。抽出に用いる溶媒の温度は特に制限されないが、好ましくは１０〜３０℃である。また、抽出時間も溶媒の温度により調節すればよいが、１０〜３０℃で抽出する場合には、好ましくは１０〜１５分である。
このようにして得られた抽出物は、好ましくは、常法により濃縮し、さらに好ましくは凍結乾燥する。
【００１２】
得られた抽出物は、本発明のＢＭＰ−２産生促進剤の有効成分として用いることができる。好ましくは、該抽出物を精製した後、ＢＭＰ−２産生促進剤の有効成分として用いる。例えば、上記のようにして得られた抽出物を、親水性溶媒と、酢酸エチル、エチルエーテル、クロロホルムなどの疎水性溶媒により分配し、親水性溶媒画分を分離する。
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤の有効成分である非結球性メキャベツの水溶性画分は、非結球性メキャベツの水抽出物、又は該水抽出物を、水と、酢酸エチルなどの疎水性溶媒により分配して得られる水層画分が好ましい。
【００１３】
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤は、好ましくは、さらにＯＰＧ産生促進剤でもある。
【００１４】
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤は、非結球性メキャベツの水溶性画分の他に、他の任意成分を含有していてもよい。このような任意成分は、ＢＭＰ−２産生促進作用やＯＰＧ産生促進作用などが期待され、かつ安全性が確認されているものを特に制限なく用いることができる。また、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、保存剤、矯味矯臭剤、希釈剤等を加えてもよい。
【００１５】
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤に任意成分を配合する場合の非結球性メキャベツの水溶性画分の含有量は、ＢＭＰ−２の産生促進に有効な量の非結球性メキャベツの水溶性画分が含まれる限り特に制限されず、剤形、使用形態、使用対象、使用方法などにより適宜調節することができる。
【００１６】
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤は、そのままで、又は通常医薬組成物に用いられる成分
と組み合わせて製剤化することにより、骨形成の促進を必要とする疾患の治療又は予防のための医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」ともいう。）とすることができる。骨形成の促進を必要とする疾患としては、骨粗鬆症、骨折、骨形成不全症、骨軟化症、骨ペーチェット病、慢性関節リウマチ等が挙げられる。
本発明のＢＭＰ−２産生促進剤は、ＢＭＰ−２の産生を促進する効果およびＯＰＧの産生を促進する効果の両者を併せ持つため、特に、骨粗鬆症の治療又は予防のための医薬組成物の有効成分として好適である。
【００１７】
本発明の医薬組成物に用いることができる任意成分は、安全性が確認されているものである限り特に制限されない。
本発明の医薬組成物の剤形は、特に制限されないが、一般に製剤上許容される１または２種類以上の担体、賦形剤、統合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服剤形とすることが好ましい。このような製剤化は、医薬の製造に用いられる常法に従って行うことができる。
【００１８】
また、本発明の医薬組成物におけるＢＭＰ−２産生促進剤の含有量は、有効量の非結球性メキャベツの水溶性画分を継続的に投与するのに好適な範囲であれば特に制限されない。すなわち、投与する対象の症状、年齢、性別、食生活などの生活習慣に応じて適当な投与量を選択し、医薬組成物を製造することができる。通常は、成人１人、１日当たり、３０倍濃縮水抽出物の量に換算して、０．００１ｍＬ／ｋｇ体重〜１００ｍＬ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１ｍＬ／ｋｇ体重〜１０ｍＬ／ｋｇ体重の量の非結球性メキャベツの水溶性画分を投与するのに適した範囲となるように、医薬組成物の本発明のＢＭＰ−２産生促進剤の含有量を調節する。本発明において、「３０倍濃縮水抽出物」とは、後述する実施例の１の方法により得られた水抽出物を意味し、「３０倍濃縮水抽出物に換算して・・・の量」とは、後述する実施例の１の方法により得られた水抽出物における水溶性画分の量に相当する量を意味する。
また、本発明の医薬組成物は、内服することにより投与することが好ましい。投与量は有効量の非結球性メキャベツの水溶性画分を投与できればよく、上記と同様に投与する対象に応じて適宜調節することができる。通常は、成人１人、１日当たり、３０倍濃縮水抽出物の量に換算して、０．００１ｍＬ／ｋｇ体重〜１００ｍＬ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１ｍＬ／ｋｇ体重〜１０ｍＬ／ｋｇ体重の量の非結球性メキャベツの水溶性画分を投与することが好ましい。また、投与方法は特に制限されるものではないが、３ヶ月以上の期間にわたって継続的に投与することが好ましい。
【実施例】
【００１９】
１．非結球性メキャベツの水溶性画分の調製
商品名「プチヴェール」（登録商標）（株式会社増田採種場製）の旬を迎える冬期に収穫した外葉を使用し、凍結乾燥後、粉末化した。プチヴェール凍結乾燥粉末６．２５ｇに１００ｍＬの蒸留水を加え、１０分間振とう機（株式会社イワキ）にて振とうし、１４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離（日立工機株式会社）して上清を回収した。
残渣に同様の操作を２回行い、集まった上清、計３００ｍＬをロータリーエバポレーター（旭硝子株式会社）にて１０ｍＬまで濃縮したものを水抽出物とした（ｐＨ５．７）。
水抽出物１０ｍＬに蒸留水３０ｍＬを加え、０．５Ｍ塩酸を用いてｐＨ３．０に調整後、１００ｍＬの酢酸エチルで４回抽出を行なった。集まった上清（計４００ｍＬ）を濃縮乾固し、１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させたものを溶媒層画分とした。
また、酢酸エチル抽出後の下層４０ｍＬは０．５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨ５．７に調整後、１０ｍＬに減圧濃縮した。これを水層画分とした。
水抽出物、溶媒層画分、水層画分の各画分は、それぞれ０．２２μｍのフィルターでろ過し、滅菌したものを試験に供した。
【００２０】
２．骨芽細胞関連因子のｍＲＮＡ発現促進作用の試験
各画分について、ヒト株化骨芽細胞ＭＧ−６３を用い、プチヴェールの水溶性画分の骨芽細胞関連因子のｍＲＮＡ発現を促進する作用を調べた。骨芽細胞関連因子としては、骨形成に関わるＢＭＰ−２と骨吸収に関わるＯＰＧを対象とした。ＭＧ−６３細胞は、１０％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地 (Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、 Ｇｉｂｃｏ社)を用いて、３７℃、 ５容量％二酸化炭素存在下で培養した。６０ｍｍディッシュに所定量のＭＧ−６３細胞を各群３枚ずつ播き、ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（６０％程度）状態まで培養後、無血清ＭＥＭ培地に交換し２４時間培養した。
その後、各画分、さらにコントロールとして滅菌水（ｐＨ５．７）、及びＤＭＳＯを、それぞれ培地に対して１容量％添加した無血清ＭＥＭ培地に交換し、４８時間培養後、細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いて ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ０．５ μｇを鋳型とし、市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたＰＣＲでｃＤＮＡを作成した。
ＰＣＲ反応は、作成したｃＤＮＡ溶液２０μＬのうち２μＬを鋳型とし、ＢＭＰ−２プライマー（配列番号１及び２）、ＯＰＧプライマー（配列番号３及び４）、及び内部標準物質ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ）プライマー（配列番号５及び６）を、それぞれＳｅｎｓｅプライマー、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマーともに１０μＭとなるように添加して、９４℃ ２分、９４℃ １分、５８℃ １分、 ７２℃ １分のサイクルをＢＭＰ−２では２５サイクル、ＯＰＧでは１９サイクル、ＧＡＰＤＨでは１５サイクル 行った。
ＰＣＲ産物を５％ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌで泳動し、Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ (Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社)で染色後、ルミノイメージアナライザーＬＡＳ−３０００（富士フィルム株式会社）で測定した。
【００２１】
３．統計処理
統計解析ソフトＳＰＳＳ１３．０Ｊ（エス・ピー・エス・エス株式会社）を使用し、平均値の差の検定には一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、多重比較検討Ｄｕｎｎｅｔｔ法を用いてｐ＜０．０５で有意差と判定した。
【００２２】
４．結果
ＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現に対する効果を図１に、ＯＰＧのｍＲＮＡ発現に対する効果を図２に示した。
ＢＭＰ−２及びＯＰＧのｍＲＮＡ発現量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対する相対値で示した。また、水抽出物及び水層画分添加時のｍＲＮＡ発現量は、滅菌水（ｐＨ５．７）添加時のｍＲＮＡ発現量に対する割合で示し、溶媒層画分添加時のｍＲＮＡ発現量は、ＤＭＳＯ添加時のｍＲＮＡ発現量に対する割合で示した。
【００２３】
水抽出物及び水層画分は、ＢＭＰ−２及びＯＰＧのｍＲＮＡ発現量を上昇させた。
しかし、溶媒層画分はＢＭＰ−２及びＯＰＧのｍＲＮＡ発現量のいずれも上昇させなかった。
以上より、ＢＭＰ−２産生促進及びＯＰＧ産生促進に有効な成分は、非結球性メキャベツの水溶性画分であることがわかった。また、非結球性メキャベツの水抽出物、及び該水抽出物から酢酸エチルにより疎水性の成分を除いた水層画分は、ＢＭＰ−２の産生量を上昇させ、骨形成を促進し、且つＯＰＧの産生量を上昇させ、破骨細胞の分化を抑制して骨吸収を抑制することが示唆された。
なお、非結球性メキャベツに含まれるケルセチン等のフラボノイド類の含量は把握していないが、これらの物質は、溶媒層画分に含まれると推定される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】各画分がＭＧ−６３のＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの発現量に与える影響を示す図である。
【図２】各画分がＭＧ−６３のＯＰＧ ｍＲＮＡの発現量に与える影響を示す図である。
【図１】
2010030905.tif 000003
【図２】
2010030905.tif 000004
【配列表】
2010030905000001.app