(57)【要約】【課題】KLF15 の下流において、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する作用を有する因子を特定し、それによる抗肥満薬と、その肥満薬をスクリーニングする方法、並びに、それに関する遺伝子を欠損させた非ヒト動物と、その脂肪組織または脂肪細胞、更に、肥満または栄養障害の体質の評価方法、栄養障害改善薬を提供すること。【解決手段】アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制するか、または、その活性を阻害する薬剤を含有し、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備える抗肥満薬。【選択図】図７
2010126504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制するか、または、その活性を阻害する薬剤を含有し、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備える
ことを特徴とする抗肥満薬。
【請求項２】
低炭水化物食による食事療法との併用療法に使用される
請求項１に記載の抗肥満薬。
【請求項３】
抗肥満薬をスクリーニングする方法であって、
被験物質が、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、
アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を有する
ことを特徴とする抗肥満薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
被験物質を非ヒト動物に投与する工程と、
被験物質を投与した非ヒト動物における肥満度を測定する工程と、
その肥満度を減少させる被験物質を有効物質として選択する工程とを含む
請求項３に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
被験物質を投与する非ヒト動物に、低炭水化物食を負荷する工程を含む
請求項３または４に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験物質を投与した非ヒト動物における酸素消費量を測定する工程と、
その酸素消費量を増加させる被験物質を有効物質として選択する工程とを含む
請求項３ないし５に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の遺伝子を欠損させた
ことを特徴とする非ヒト動物。
【請求項８】
抗肥満または低インスリンまたは低レプチンの状態である
請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の非ヒト動物に由来する
ことを特徴とする脂肪組織または脂肪細胞。
【請求項１０】
アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現または活性に関連するアセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）遺伝子またはその調整遺伝子を解析することにより、
肥満または肥満に起因する状態または疾患、または、栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患になり得る体質であるかを評価する
ことを特徴とする肥満または栄養障害の体質の評価方法。
【請求項１１】
アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を増強するか、または、その活性を亢進する薬剤を含有し、
アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）に関連する機能不良を起因とする栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患の改善、または、絶食時の栄養改善を、予防または治療する作用を備える
ことを特徴とする栄養障害改善薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備える抗肥満薬と、その肥満薬をスクリーニングする方法、それに関する遺伝子を欠損させた非ヒト動物と、その脂肪組織または脂肪細胞、更に、肥満または栄養障害の体質の評価方法、栄養障害改善薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の変容に伴い、肥満と生活習慣病が年々増加し、死亡原因として心臓病や脳卒中が高い割合を占めている。
例えば、糖尿病患者の体重を５−１０％減少させ血糖コントロールを是正すると、合併症の発症リスクが減少し、高血圧や高脂血症などの心血管疾患が減ることが知られている。また高齢糖尿病患者の体重を１kg減少させると、２−３ヶ月の延命につながることも報告されている。このように、肥満治療は生活の質的向上に限らず、患者の寿命に密接なことが明らかになっている。
肥満治療の基本は運動療法と食事療法により生活習慣を改善することであるが、これを実行するのは容易ではない。そこで、運動療法や食事療法を代替または補助できる薬品が求められている。
【０００３】
一般に哺乳類は、長期間の飢餓状態でも生存できるように複雑な代謝システムを進化させている。摂食条件下では、哺乳類はグルコースを主な代謝燃料として利用する。絶食時や、低炭水化物食摂取時や糖尿病などのケトン体生成条件下では、脂肪酸及びケトン体が主なエネルギー源として利用される。
ケトン体は、一部は骨格筋及び心臓でも使用されるが大部分は脳で使用され、ミトコンドリア内での脂肪酸のβ酸化により生成されるアセチルCoA から肝臓で産出される。酢酸は、ケトン体生成条件下において肝臓で合成され、代替燃料として利用されるという報告がある。例えば、絶食ラットの肝臓における酢酸濃度は極めて高く、また、ラット単離肝臓灌流法による試験及び単離肝細胞を用いた試験から、肝臓による遊離酢酸の生成が報告されている。酢酸は、ラット肝ペルオキシソームにおける脂肪酸酸化の最終生成物であるアセチルCoA 加水分解酵素の加水分解により産生される。しかし、骨格筋などの末梢組織、心臓、褐色脂肪組織（BAT）または脳で、酢酸が、グルコースや脂肪酸やケトン体に代わる代替燃料として実際に利用されているかはわかっていなかった。
【０００４】
アセチルCoA 合成酵素（AceCS）は、酢酸とCoA を結合させてアセチルCoA を生成する。哺乳類には、酵素的特性が類似している２つのAceCSが存在する。一方はAceCS1と呼ばれる細胞質内酵素であり、もう一方のAceCS2はミトコンドリア基質の酵素である。AceCS1とAceCS2はそれぞれ、サーチュインファミリーの脱アセチル化酵素に属するSIRT1とSIRT3により転写後に調節される。SIRT1及びSIRT3はいずれもカロリー制限中にアップレギュレートされ、カロリー制限による延命促進作用に介在すると考えられている。
【０００５】
AceCS1は、脂肪酸及びコレステロールを合成するためのアセチルCoA を供給する。AceCS1は肝臓において高レベルで発現され、その転写はコレステロール及び脂肪酸の代謝に関与する複数の遺伝子を活性化させるbasic helix-loop-helix leucine zipper（bHLH-Zip）転写因子、ステロール調節エレメント結合タンパク質（SREBP）によって調節される。
一方、AceCS2は、ATP及びCO2 を産生するトリカルボン酸（TCA ）回路による酸化のためのアセチルCoA を生成する。AceCS2はBAT、心臓及び骨格筋において高レベルで発現される。ケトン体生成条件下ではBAT、心臓及び骨格筋におけるAceCS2のmRNAレベルは大幅に増加するが、肝臓にはわずかに検出可能な量のmRNAしか存在しない。
骨格筋における空腹誘導性のAceCS2転写活性化は、主にKrueppel-likeファミリーの転写因子に属するKrueppel-like factor(KLF15）により制御されるが、KLF15は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）やケトン体生成条件下で必要なアミノ酸分解酵素など、糖新生等に関与する多くの遺伝子を調節するものである。
【０００６】
特許文献１には、KLF15 が、前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化誘導によって細胞内の脂肪蓄積を促進する因子であり得ることが開示されている。
特許文献２には、脂肪細胞特異的にKLF15 を発現するトランスジェニック動物が対照動物より痩せ、耐糖能に優れ、肥満の程度に関わらず血中アディポネクチンが低下することが開示され、脂肪細胞におけるKLF15 が、個体の糖・脂質代謝能を改善し得る因子として作用することが示唆されている。
また、特許文献３には、アセチルCoA カルボキシラーゼ阻害作用を有する化合物と、特定の構造を有したアシルスルホンアミド誘導体を抗肥満または抗脂肪肝の予防及び治療薬として用いることが開示されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１７１３１６
【特許文献２】特開２００７−２７４９３２
【特許文献３】特開２００５−１９４１９１
【０００８】
しかしながら従来技術では、KLF15 の下流において、細胞のエネルギー産生に必須な遺伝子は同定されていず、特に酢酸がケトン体生成条件下で燃料として利用されるかどうかは検討されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、KLF15の下流において、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する作用を有する因子を特定し、それによる抗肥満薬と、その肥満薬をスクリーニングする方法、それに関する遺伝子を欠損させた非ヒト動物と、その脂肪組織または脂肪細胞、更に、肥満または栄養障害の体質の評価方法、栄養障害改善薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、AceCS2による酢酸の活性化が、空腹時の熱産生において特異的かつ固有の役割を果たし、AceCS2-/-マウスでは、低炭水化物飼料摂取時に酸素消費量が増加し、体重増加が抑制されることを見いだした。この知見に基づき本発明に至った。
すなわち、本発明の抗肥満薬は、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制するか、または、その活性を阻害する薬剤を含有し、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備えることを特徴とする。
【００１１】
ここで、低炭水化物食による食事療法との併用療法に使用して、効果の向上に寄与させてもよい。
【００１２】
本発明の抗肥満薬のスクリーニング方法は、被験物質が、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を有することを特徴とする。
【００１３】
ここで、被験物質を非ヒト動物に投与する工程と、被験物質を投与した非ヒト動物における肥満度を測定する工程と、その肥満度を減少させる被験物質を有効物質として選択する工程とを含めてもよい。
【００１４】
また、被験物質を投与する非ヒト動物に、低炭水化物食を負荷する工程を含めてもよい。
【００１５】
また、被験物質を投与した非ヒト動物における酸素消費量を測定する工程と、その酸素消費量を増加させる被験物質を有効物質として選択する工程とを含めてもよい。
【００１６】
本発明の非ヒト動物は、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の遺伝子を欠損させたことを特徴とする。
【００１７】
ここで、抗肥満または低インスリンまたは低レプチンの状態にして、モデル動物として寄与させてもよい。
【００１８】
本発明の脂肪組織または脂肪細胞は、その非ヒト動物に由来することを特徴とする。
【００１９】
本発明の肥満または栄養障害の体質の評価方法は、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現または活性に関連するアセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）遺伝子またはその調整遺伝子を解析することにより、肥満または肥満に起因する状態または疾患、または、栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患になり得る体質であるかを評価することを特徴とする。
【００２０】
本発明の栄養障害改善薬は、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）の発現を増強するか、または、その活性を亢進する薬剤を含有し、アセチルCoA 合成酵素2 型（AceCS2）に関連する機能不良を起因とする栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患の改善、または、絶食時の栄養改善を、予防または治療する作用を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明による抗肥満薬は、酢酸の活性化に必要なAceCS2の発現を特異的に抑制するか、または、その活性を特異的に阻害する薬剤を含有するので、好ましくない他の作用を起こすことなく、個体における熱産生を誘導し、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療することができる。
それにより、糖尿病や、高脂血症、高血圧症、高インスリン血症、動脈硬化症、高脂血症、高血圧症、多嚢胞性卵巣症候群などの予防や治療に有用である。
【００２２】
本発明によるスクリーニング方法は、抗肥満薬の開発に有用である。
本発明による非ヒト動物は、抗肥満や、低インスリン、低レプチンなどの状態のモデル動物として有用である。
本発明による脂肪組織または脂肪細胞は、モデル組織や細胞として有用である。
【００２３】
本発明による肥満または栄養障害の体質の評価方法は、AceCS2遺伝子またはその調整遺伝子を解析することに基づくので、肥満または肥満に起因する状態または疾患、または、栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患になり得る体質であるかの評価に有用でもある。
本発明による栄養障害改善薬は、AceCS2の発現を特異的に増強するか、または、その活性を特異的に亢進する薬剤を含有するので、好ましくない他の作用を起こすことなく、AceCS2に関連する機能不良を起因とする栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患の改善や、絶食時の栄養改善を、予防または治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
酢酸がケトン体生成条件下において燃料として利用されるか否かを検討するため、次のようにAceCS2遺伝子欠損マウスを作製した。
図１に示すように、マウスAceCS2遺伝子のエクソン1を分裂させる挿入型ベクターを構築した。図では、該当する制限酵素認識部位のみが表示されている。サザンブロット分析用のプローブ（棒線）と遺伝子型特定用のPCR プライマー（矢印）の位置が示されている。
具体的には、Sv129 マウス由来のゲノムDNA断片を用いて標的プラスミドを構築した。２つのloxP部位で挟まれたLac Z/ネオマイシン耐性遺伝子カセットを、ES細胞（Sv129 系由来）のAceCS2遺伝子座に導入した。標準的な遺伝子標的法により、電気穿孔法、抽出及びスクリーニングを実施した。ネオマイシン耐性ES細胞クローンからゲノムDNA を単離し、KpnIで消化した後、相同的組換え及びfloxed（loxP配列で挟まれた）対立遺伝子の存在を検出するプローブを用いたハイブリダイゼーションに供した。
【００２５】
次いで図２に示すように、AceCS2遺伝子に挿入型ベクターが入った２系列のマウスを、図１に示したプローブを用いてサザンブロット法により同定した。図では、EC細胞クローン由来のKpnI消化DNA のサザンブロット分析が示されている。
具体的には、桑実胚凝集法により雄性キメラマウスを作製し、雌性C57BL/6Jマウスと交配させ、相同的組換えをサザンブロット法により確認した。KpnIによる消化の結果、野生型DNA に6.5 kbの断片が、相同組換え体に10.5kbの断片が生じた。
【００２６】
次いで図３に示すように、遺伝子型をPCR法により特定した。エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルは、AceCS2+/+、AceCS2 +/-、AceCS2-/-マウスの遺伝子型特定のためのPCR 産物を示す。
具体的には、マウスの遺伝子型特定をテールDNAのPCR法により行った。変異対立遺伝子は、AceCS2遺伝子と3’からLac Z/ネオマイシン対立遺伝子カセットまでの配列との間にある512 bpのPCR産物を増幅する一対のオリゴヌクレオチド（5’-GGCGCACAACAAAACCTAGT-3’及び5’-GACAGTATCGGCCTCAGGAA-3’）を用いて検出した。野生型対立遺伝子は、エクソン1の全長にわたる355 bpのPCR産物を増幅する一対のオリゴヌクレオチド（5’-GGCGCACAACAAAACCTAGT-3’及び5’-GGGGTTCGTGCCTGGTTG-3’）を用いるPCR法により検出した。
【００２７】
次いで図４（ア）（イ）にそれぞれ示すように、RNA転写物及びタンパク質の欠失をリアルタイムPCR法（QRT-PCR）及びイムノブロット法により確認した。
図４（ア）は、AceCS2転写物の定量的逆転写PCR（QRT-PCR）分析結果を示す。具体的には、AceCS2+/+、AceCS2 +/-、AceCS2-/-マウスの心臓由来の全RNAをQRT-PCRに供した。β-アクチンを不変対照として使用した。値は、任意で1と定義したAceCS2+/+マウスのmRNA量との相対値である。図中*はAceCS2+/+との比較においてp＜0.05、**はAceCS2 +/-との比較においてp＜0.01、***はAceCS2+/+との比較においてp＜0.001（+/+：n＝9、+/-：n＝17、-/-：n＝7）を表す。
【００２８】
図４（イ）は、アフィニティ精製抗ウサギポリクローナルAceCS2抗体を用いたAceCS2+/+マウス及びAceCS2-/-マウス心臓タンパク質の免疫ブロット分析結果を示す。各レーンに SDS溶解緩衝液中の心臓由来全細胞溶解物20μgを入れ、GAPDHはポリクローナル抗GAPDH抗体を負荷対照として検出された。
【００２９】
なお、ウサギポリクローナル抗マウスAceCS2抗体（IgGA001）を生成するためには、マウスAceCS2のC末端に対応する12残基のペプチド（CQKYEEQRAATN）を合成し（Sigma Genesis, Japan）、キーホールリンペットヘモシアニンと結合させた後、ニュージーランド白色ウサギに投与した。IgG画分はproteinA-Sepharose（GE Healthcare Bioscience）でアフィニティークロマトグラフィーにより調製した。免疫ブロット分析には、心臓由来の全細胞溶解物を分取したもの（20μg）を１０％ゲルでSDS-PAGEに供した後、抗AceCS2抗体の1：1000希釈による分析を行った。
【００３０】
野生型（AceCS2+/+）、ヘテロ接合型（AceCS2+/-）、ホモ接合型（AceCS2-/-）のマウスが出生した割合は、単純なメンデル比による予測のとおりであった。雌雄いずれのAceCS2-/-マウスも生殖機能は正常で、外観も標準的であった。骨、脳、胃、心臓、腸、腎臓、肝臓、膵臓、白色脂肪組織、BAT、骨格筋など成熟雄性マウスの多数の組織から採取した切片を光学顕微鏡で検査した結果、組織学的異常は認められなかった。
【００３１】
出生時には、AceCS2-/-マウスの体重及び体長に同腹子との差も認められなかった。離乳時（4 週齢）までに、雌雄いずれのAceCS2-/-マウスでも有意な発育遅延が明らかになった。離乳後は、通常飼料を摂取したAceCS2-/-マウスの体重及び体長がAceCS2+/+マウスに追いつき始め、20週齢までにAceCS2-/-マウスの体重が同腹子と同等になった。4 週齢のAceCS2-/-マウスの摂餌量はAceCS2+/+マウスに比べてわずかに少なかったが、20週齢までに同腹子と同等になった。離乳前及び26週齢のAceCS2+/+及びAceCS2-/-マウスの血漿パラメータによると、2 〜4 週齢時及び26週齢時のいずれにおいても、グルコース、ケトン体、非エステル化脂肪酸（NEFA）及びインスリン濃度にAceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウス間の差は認められなかった。AceCS2-/-マウス（4週齢）の成長ホルモン及びインスリン様成長因子1（IGF-1）の血漿濃度もAceCS2+/+マウスと同等であった。2週齢のAceCS2-/-マウスの血漿レプチン濃度は同週齢の野生型同腹子より低かった。血漿酢酸濃度はAceCS2+/+マウスに比べてAceCS2-/-マウスにおいて顕著に上昇していた。
【００３２】
実際に空腹時に酢酸が燃料として利用されるか否かを検討するため、全身酢酸酸化試験を実施した。
48時間の絶食後、マウスに［14C ］酢酸を投与した。腹腔内（i.p.）注入から20、40及び60分後に、12週齢の雄性マウスが［1-14C］酢酸または［1-14C ］β-ヒドロキシ酪酸を酸化して14CO2 を産生する能力を検査した。
図５（ア）は、酢酸からの14CO2産生率を示すグラフである。*はAceCS2+/+との比較においてp ＜0.001を表す。図示のように、AceCS2-/-マウスにおいて酢酸酸化速度が急激に低下した。
【００３３】
図５（イ）は、60分経過後に総血漿［1-14C］酢酸濃度を測定した結果を示すグラフである。AceCS2-/-マウスの血漿［14C］酢酸濃度は高いままであったが、AceCS2+/+マウスの血漿［14C ］酢酸濃度は非常に低かった。
【００３４】
AceCS2-/-マウスにおいて、血漿酢酸濃度が高いことが酢酸酸化速度に影響する可能性があるため、AceCS2-/-マウスで認められる同程度の濃度（約2 mM）の非標識酢酸を含めた場合の［14C ］酢酸の酸化も検討した。
図６（ア）は、非標識酢酸を含めた場合の酢酸からの14CO2 産生率示すグラフである。非標識酢酸（0.6 g/kg）は［1-14C］と共に注入し、40分後に酢酸産生率を測定した。非標識酢酸（0.6 mg/kg ）の投与により、血漿中の酢酸が急速に増加した。その後、投与から40分後には2 mMまで減少した。本条件下でも、図示のように、測定された酢酸酸化速度はAceCS2-/-マウスにおいて有意に低かった。
【００３５】
図６（イ）は、β-ヒドロキシ酪酸からの14CO2産生率（AceCS2+/+：n＝6、AceCS2-/-：n＝6）を示すグラフである。図示のように、ケトン体の酸化は遺伝子型にかかわらず同程度であり、AceCS2-/-マウスにおけるケトン体の利用は正常であることが示唆された。
【００３６】
図７は、エネルギー代謝におけるAceCS2のモデルを示す説明図である。
本発明者は非特許文献１で、AceCS2導入細胞では［14C ］酢酸がCO2 に取り込まれることを開示している。これと上述のデータから、マウスではCO2 及びATP を生成するための酢酸酸化にAceCS2が必要であることがわかる。また非特許文献２〜４では、遍在性のペルオキシソーム酵素である肝アセチルCoA 加水分解酵素により大量の酢酸が肝臓で生成されること、並びにこの酢酸は後に肝外組織による利用が可能であることが開示されている。
これらに基づき、図示のように、48時間の絶食や低炭水化物／高脂肪食といった低血糖条件下において酢酸が肝臓で脂肪酸から生成され、血中に放出されるというモデルが提唱できる。この酢酸が骨格筋やBAT などの肝外組織で使用されるためはAceCS2が必要であり、酢酸はこれらの組織で再活性化されてミトコンドリア内のTCA 回路に再度取り込まれ、ATP 及び熱が産生される。
【００３７】
【非特許文献１】Fujino, T., Kondo, J., Ishikawa, M., Morikawa,K., and Yamamoto, T.T. (2001). Acetyl-CoA synthetase 2, a mitochondrial matrixenzyme involved in the oxidation of acetate. J Biol Chem 276, 11420-11426.
【非特許文献２】Leighton, F., Bergseth, S., Rortveit, T.,Christiansen, E.N., and Bremer, J. (1989). Free acetate production by rathepatocytes during peroxisomal fatty acid and dicarboxylic acid oxidation. JBiol Chem 264, 10347-10350.
【非特許文献３】Murthy, V.K., and Steiner, G. (1973). Hepaticacetate levels in relation to altered lipid metabolism. Metabolism 22, 81-84.
【非特許文献４】Seufert, C.D., Graf, M., Janson, G., Kuhn, A.,and Soling, H.D. (1974). Formation of free acetate by isolated perfused liversfrom normal, starved and diabetic rats. Biochem Biophys Res Commun 57, 901-909.
【００３８】
酢酸酸化の生理学的役割を更に評価するため、AceCS2-/-マウスにげっ歯類用標準飼料を自由摂取させるか、48時間絶食させた。
図８は、通常飼料を摂取した雄性マウス（12週齢）の深部体温を48時間の絶食後に測定した（AceCS2+/+：n＝8、AceCS2-/-：n＝7）結果を示すグラフである。*はAceCS2+/+との比較においてp ＜0.05を表す。図示のように、通常の摂食状態では、AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの間で深部体温に有意差は認められなかった。48時間の絶食後では、AceCS2+/+マウスは深部体温を維持することができたが、AceCS2-/-マウスでは深部体温が有意に低下した。これらのデータから、空腹時の熱産生の結果として、正常体温の維持にはAceCS2による酢酸の活性化が重要であることが実証された。
【００３９】
非特許文献５では、マウスではBAT 及び骨格筋が主な発熱組織であり、ここで交感神経系の刺激を受けた脂肪酸酸化によりミトコンドリア内に存在する脱共役タンパク質（UCP ）を介して熱が産生されることが開示されている。本発明者の実験によると、空腹時には、AceCS2+/+マウスと同性及び同週齢のAceCS2-/-マウスの間でBAT及び骨格筋のミトコンドリアの数及び形態に差は認められなかった。
非特許文献５及び６では、UCP などの酸化タンパク質は熱産生に重要であると考えられている。本発明者の実験によると、AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの間でBAT 中のUCP1ないし骨格筋中のUCP2及びUCP3のｍRNA レベルに有意差はなかった。他の発熱分子であるPGC1α及びPPARδのｍRNA レベルにも差はなかった。
【００４０】
【非特許文献５】Spiegelman, B.M., and Flier, J.S. (2001).Obesity and the regulation of energy balance. Cell 104, 531-543.
【非特許文献６】Matthias, A., Ohlson, K.B., Fredriksson, J.M.,Jacobsson, A., Nedergaard, J., and Cannon, B. (2000). Thermogenic responses inbrown fat cells are fully UCP1-dependent. UCP2 or UCP3 do not substitute forUCP1 in adrenergically or fatty scid-induced thermogenesis. J Biol Chem 275, 25073-25081.
【００４１】
基質補充（substrate supply）を評価するため、様々な血漿中代謝産物濃度を測定した。AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの間で血漿グルコース濃度にもNEFAないしケトン体濃度にも有意な変化は認められなかった。また、二重エネルギーX 線吸収測定法（DEXA）により測定した脂肪率（％ Fat mass）にも、摂食条件下のAceCS2-/-マウスとAceCS2+/+マウスの間に有意差は認められなかった。
【００４２】
しかし、図９（ア）に示すように、摂食及び絶食条件のいずれにおいてもAceCS2-/-マウスの血漿酢酸濃度はAceCS2+/+マウスの5 〜10倍であった。図９（ア）は、摂餌状態または48時間の絶食状態の雄性マウス（12週齢）の血漿酢酸濃度（摂餌状態AceCS2+/+：n＝4 、絶食状態AceCS2+/+：n＝4 、摂餌状態AceCS2-/-： n＝4 、絶食状態AceCS2-/-：n＝4 ）を示す。これらのデータから、AceCS2-/-マウスでは酢酸利用が損なわれていて、肝外組織での酢酸利用の欠損が空腹誘導性低体温の原因であることが示唆される。
【００４３】
図９（イ）は、48時間絶食した雄性AceCS2+/+マウス及び AceCS2-/-マウス（12週齢）の腓腹筋におけるアセチルCoA 濃度を測定した（AceCS2+/+：n＝7、AceCS2-/-：n＝8）結果を示すグラフである。絶食条件下のAceCS2-/-マウスではアセチルCoA 濃度が75％低下していた。
【００４４】
図１０（ア）は、12週齢時に雄性AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの腓腹筋のATP 及びAMP 含有量を測定した（AceCS2+/+：n＝7、AceCS2-/-：n＝8）結果を示すグラフである。**はAceCS2+/+との比較においてp ＜0.01を表す。AceCS2-/-マウスではATP 含有量が有意に低下していることがわかる。
【００４５】
図１０（イ）（ウ）は、48時間絶食したAceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウス（12週齢）の腓腹筋及びBAT におけるNAD+ 及びNADH濃度とNAD+ /NADH比（AceCS2+/+：n＝4 、AceCS2-/-：n＝4 ）を示すグラフである。絶食条件下のAceCS2-/-マウスの骨格筋におけるATP濃度も、AceCS2+/+マウスに比べて有意に低下していた。これらのデータから、AceCS2は、48時間の絶食中にＡＴＰを産生するためのアセチルCoA の供給において、極めて重要な役割を果たすことがわかる。
【００４６】
図１１（ア）（イ）（ウ）は、間接的な熱量測定により絶食下の雄性マウス（12週齢）における酸素消費量（VO2）、VO2の平均、RQ（呼吸商）を算出した（AceCS2+/+：n＝6 、AceCS2-/-：n＝5 ）結果を示すグラフであり、図１１（エ）は、明期及び暗期においてビーム遮断により雄性マウス（14週齢）の総自発運動量を測定した（AceCS2+/+：n＝12、AceCS2-/-：n＝12）結果を示すグラフである。
酸素消費量は36時間の絶食後に有意に増加したが、自発運動は低下しなかった。
【００４７】
図１２（ア）は、飼料及び飲料水を自由摂取とした雄性マウス（12週齢）を低温（4 ℃）に供した場合において、深部体温を5時間にわたり測定した（AceCS2+/+：n＝10、AceCS2-/-：n＝11）結果を示すグラフである。図示のように、摂食条件下でこれらのAceCS2-/-マウスを低温（4 ℃）に曝露しても、体温が更に低下することはなかった。なお、非特許文献７には、AceCS2-/-マウスにおける低体温は、低温に反応して生じる適応性低体温とは異なることが開示されている。
【００４８】
【非特許文献７】Lowell, B.B., andSpiegelman, B.M. (2000). Towards a molecular understanding of adaptivethermogenesis. Nature 404, 652-660.
【００４９】
図１２（イ）は、24時間絶食し飲料水は自由摂取とした雄性マウス（12週齢）を低温（4 ℃）に供した場合において、深部体温を5時間にわたり測定した（AceCS2+/+：n＝7 、AceCS2-/-：n＝8）結果を示すグラフである。図示のように、24時間の絶食条件下では、48時間の絶食とは異なり、いずれのマウスでも2 〜3 ℃低下したが、AceCS2-/-マウスはAceCS2+/+マウスと同程度の深部体温を維持した。
これらのマウスを低温に曝露すると、深部体温は更に低下した。5時間の低温曝露後に、AceCS2-/-マウスとAceCS2+/+マウスの間に有意差は認められなかった。
これらのデータから、低温に反応して生じる適応性熱産生は、AceCS2-/-マウスにおいて損なわれていなかったことがわかり、AceCS2-/-マウスでも交感神経系は深部体温を適正に維持することができることが示唆された。
【００５０】
図１３（ア）（イ）は、それぞれAceCS2+/+、AceCS2-/-において、摂餌条件下及び48時間の絶食条件下において雄性マウス（12週齢、遺伝子ごとにn ＝9）を、疲労が限界に達するまで走行させるプロトコルによる電動トレッドミル運動負荷に供した（AceCS2+/+：n＝9 、AceCS2-/-：n＝9）結果を示すグラフである。*は摂餌条件との比較においてp＜0.05を表す。
図示のように、48時間絶食したAceCS2-/-マウスでは、走行運動耐容能が顕著に低下したが、AceCs2+/+マウスの走行能は摂食条件下と絶食条件下の間で変化しなかった。このことから、酢酸は空腹時の運動及び熱産生に必要な重要な燃料であることが示唆される。
【００５１】
AceCS2-/-マウスでは血漿酢酸濃度が非常に高いので、このようなマウスはアシドーシスになる可能性があり、もしならないのであれば呼吸を亢進させてCO2 を吐き出し酸血症にならないようにしていると考えられる。そこで、動脈血ガス、pH、重炭酸塩濃度を測定した。
図１４は、AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの血液ガス分析結果を示す表である。雄性マウス（12週齢、遺伝子型ごとにn ＝6 ）に通常飼料を給与した場合を示し、* はAceCS2+/+との比較においてp＜0.05を表す。
図示のように、AceCS2-/-マウスにおいて動脈二酸化炭素分圧（PaCO2）値が有意に低下していて（p＜0.05、n＝5-6）、AceCS2-/-マウスは呼吸を亢進させてCO2 を吐き出していることが示唆された。PaCO2 、標準重炭酸イオン濃度（［HCO3 ］）及びpHに有意な差は認められなかった。
これらのデータから、AceCS2-/-マウスは呼吸を亢進させて酢酸蓄積により生じ得るアシドーシスを補正することがわかる。このAceCS2-/-マウスの呼吸亢進は、AceCS2+/+マウスに比べてエネルギー消費量が増加した一因とも考えられる。
【００５２】
絶食条件と同様に、グルコースまたは炭水化物の摂取量が低い条件下でも、酢酸利用は重要であると考えられる。
これを検討するため、4 週齢のAceCS2-/-マウス及びAceCS2+/+マウスに低炭水化物／高脂肪飼料（LC/HF；エネルギーから炭水化物0.4 ％、脂質90.5％、タンパク質9.1 ％）を摂取させた。
図１５は、離乳時のマウスにおける血漿酢酸濃度を示すグラフである。雄性マウス（4 週齢、遺伝子型ごとにn ＝5 ）に母乳を給与した場合を示す。AceCS2+/+ との比較において、**はp＜0.01を表す。
図示のように、離乳時（4 週齢）のAceCS2-/-マウスの血漿酢酸濃度は顕著に高かった。また、AceCS2-/-マウスの平均体重は同腹子より40％低かったが、血漿中のケトン体、NEFA、グルコース及びインスリン濃度はAceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの間で同等であった。
【００５３】
図１６（ア）は、離乳時のマウスにおける深部直腸体温を示すグラフである。雄性マウス（4 週齢、AceCS2+/+：n ＝８、AceCS2-/-：n ＝７）にLC/HF 飼料を給与した場合を示す。AceCS2+/+ との比較において、***はp＜0.001を表す。
図示のように、LC/HF 飼料下においてAceCS2-/-マウスは低体温を示した。体温はLC/HF 飼料摂取2日目に最も低下したが（30.1±1.4 ℃）、AceCS2+/+マウスはLC/HF 飼料下でも37 ℃の体温を維持した。
【００５４】
図１６（イ）は、離乳時のマウスにおける体重を示すグラフである。雄性マウス（4 週齢、AceCS2+/+：n＝８、AceCS2-/-：n ＝７）にLC/HF飼料を給与した場合を示す。AceCS2ima +/+ との比較において、***はp＜0.001 を表す。
図示のように、AceCS2-/-マウスでは体重が低下したが、AceCS2+/+マウスの体重は安定していた。
【００５５】
図１６（ウ）は、離乳時のマウスにおける血糖値を示すグラフである。雄性マウス（4 週齢、AceCS2+/+：n ＝8、AceCS2-/-：n ＝7 ）にLC/HF 飼料を給与した場合を示す。AceCS2+/+ との比較において*、はp＜0.05、***はp＜0.001 を表す。
図示のように、AceCS2-/-マウスでは、この期間にわたって持続性の低血糖（56±5 mg/dL ）が認められたのに対し、AceCS2+/+マウスでは離乳時に血漿グルコース濃度の一過性の減少が認められたものの、すぐに正常値に回復した（137 ±7 mg/dL ）。AceCS2+/+マウスで認められた一過性の低血糖は、おそらく強制離乳のストレスが原因で生じる離乳日の摂餌抑制によるものと考えられる。
【００５６】
図１７（ア）（イ）は、離乳時のマウスにおける血漿NEFA濃度及びケトン体濃度を示すグラフである。雄性マウス（4 週齢、AceCS2+/+：n ＝８、AceCS2-/-：n＝7 ）にLC/HF飼料を給与した場合を示す。AceCS2+/+ との比較において、*はp＜0.05を表す。
図示のように、一部の例外を除きAceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの間に有意差は認められなかった。
また、糖新生に関与する酵素のmRNA数は、AceCS2-/-マウスではAceCS2+/+マウスほど減少しなかった。更に、AceCS2-/-マウスにピルビン酸を投与すると低血糖が回復したことから、糖新生経路は正常であることがわかった。
【００５７】
図１８は、離乳時のマウスにおける生存率を示すグラフである。雄性マウス（4週齢、AceCS2+/+：n ＝22、AceCS2-/-：n ＝18）に母乳を給与した場合を示す。AceCS2+/+ との比較において、**はlong-rank検定によりp＜0.001を表す。
図示のように、LC/HF 飼料摂取開始から5 日後にAceCS2-/-マウスが死亡し始め、21日後までに50％のAceCS2-/-マウスが死亡した。一方、AceCS2+/+マウスに死亡は認められなかった。しかし、LC/HF飼料摂取開始から21日目以降に、生存AceCS2-/-マウスの体温及び血漿グルコース濃度が徐々に回復し、更なる死亡は認めなかった。
【００５８】
なお、死亡したAceCS2-/-マウスと、離乳後4日間のLC/HF飼料摂取期間を生存したAceCS2-/-マウスの間で、体重、体温、血漿パラメータ（グルコース、NEFA及びケトン体）に有意差はなかった。したがって、死因は単なる栄養不良ではなかった。また、高炭水化物／高脂肪（HC/HF ）飼料（カロリーから脂質58％、タンパク質15％、炭水化物27％）の影響も検討したが、HC/HF 飼料下では、AceCS2-/-マウス及びAceCS2+/+のいずれも死亡が認められなかった。
これらのデータから、低炭水化物食や絶食時などの低グルコース利用条件下で正常な熱産生及び燃料使用を維持するためには、AceCS2が介在する酢酸酸化が不可欠であることがわかった。
【００５９】
図１９は、4 週齢からLC/HF 飼料を給与された雄性マウスの体重変化（AceCS2+/+：n ＝15、AceCS2-/-：n ＝12）を示すグラフである。AceCS2+/+との比較において、*はp＜0.05、**はp＜0.01、***はp＜0.001 を表す。
図示のように、生存AceCS2-/-マウスにLC/HF飼料を給与し続けた結果、AceCS2+/+マウスでは効率的に体重が増加したが、AceCS2-/-マウスは体重増加が抑制された。
なお、AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの間で摂餌量は変化しなかった。
【００６０】
図２０は、LC/HF 飼料を給与されたAceCS2+/+及びAceCS2-/-雄性マウス（26週齢）の様々な組織の重量（AceCS2+/+：n ＝5 、AceCS2-/-：n ＝5 ）を示すグラフである。AceCS2+/+との比較において、***はp＜0.001 を表す。
図示のように、肝臓、腎臓、BAT、心臓の重量に、AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスとの間で顕著な差は認められなかったが、AceCS2-/-マウスの脂肪体はAceCS2+/+マウスより有意に低かった。
【００６１】
図２１は、LC/HF 飼料を摂取したAceCS2-/-マウスとAceCS2+/+マウスの代謝パラメータを示す表である。雄性マウス（24週齢、遺伝子型ごとにn ＝7 〜9 ）にLC/HF 飼料を給与し、血液試料の分析は分離した血漿について行った。AceCS2+/+との比較において、*はp＜0.05、**はp＜0.01を表す。
図示のように、血漿グルコース濃度は変化しなかったが、血漿インスリン濃度はAceCS2+/+マウスに比べてAceCS2-/-マウスで有意に低下した。AceCS2-/-マウスでは血漿レプチン濃度は4 分の1であったが、血漿酢酸濃度は7倍であった。
【００６２】
AceCS2-/-マウスにおける体重増加抑制の根底にある機序を検討するため、摂餌量とエネルギー消費量を検査した。
図２２（ア）（イ）は、間接的な熱量測定によりLC/HF 飼料を給与された雄性マウス（26週齢）における酸素消費量（VO2 ）及びVO2 の平均を算出した（AceCS2+/+：n＝8、AceCS2-/-：n＝7）結果を示すグラフである。
図示のように、AceCS2-/-マウスでは、昼夜を通じてAceCS2+/+マウスより酸素消費率が一貫して高く、したがって代謝率も高かった。異種間物差法及び性別について補正後、AceCS2-/-対立遺伝子の影響は極めて有意であった（p＜0.01、n＝7 、多変量ANOVA ）。また、呼吸商はAceCS2+/+マウス及びAceCS2-/-マウスのいずれにおいても0.71であった。
これらのデータから、AceCS2-/-マウスの体重増加に対する抵抗性は、少なくとも部分的にエネルギー消費量増加によるものと考えられる。
【００６３】
AceCS2-/-マウスにおいて脂肪酸合成が変化している可能性を検討するため、マロニルCoA 濃度及びアセチルCoA カルボキシラーゼ（ACC）活性を測定した。AceCS2-/-マウスとAceCS2+/+マウスの間で骨格筋及びBAT中のマロニルCoA 濃度及びACC活性に有意差はなかった。肝臓では、AceCS2-/-マウスにおいてマロニルCoA 濃度が20％低下したが、AceCS2は肝臓で発現されないことから、これは血漿インスリン濃度低下の副次的作用である可能性がある。これらのデータから、脂肪酸の合成及び分解はAceCS2遺伝子の欠損によって損なわれないことが示唆された。
【００６４】
LC/HF 飼料摂取中のAceCS2-/-マウスの体重増加抑制は、単に離乳直後の低炭水化物飼料摂取により誘発された発育不全の表現型（体重増加抑制、低体温、低血糖及び低生存率）に起因した可能性もある。そのため、離乳後にまず通常飼料を6週間給与し（10週齢まで）、その後LC/HF飼料に切り替えた。この方法では、離乳直後にLC/HF飼料を給与した場合と対照的に、いずれのAceCS2-/-マウスも死亡しなかった。
図２３は、雄性マウスを4週齢時に離乳し、通常飼料を6週間（10週齢まで）給与した後、LC/HF飼料に切り替えた（AceCS2+/+：n ＝8 、AceCS2-/-：n ＝8 ）場合の体重変化を示すグラフである。AceCS2+/+との比較において、*はp＜0.05、**はp ＜0.01、***はp ＜0.001を表し、NCは標準試料を表す。
図示のように、LC/HF 飼料への切替え後に、AceCS2-/-マウスはAceCS2+/+マウスに比べて体重増加が抑制された。体重増加抑制は、低炭水化物飼料下でのみ認められ、高脂肪／高炭水化物飼料を給与した場合には、体重増加から保護されなかった。
これより、成熟AceCS2-/-マウスでは高脂肪摂取、低炭水化物摂取及びケトン体生成条件下において脂肪過多が抑制されるのが明らかとなった。
【００６５】
以上から、酢酸も熱産生において、脂肪酸及びケトン体とは重複しない特異的な機能を有する燃料として利用されることが実証された。AceCS2が介在する酢酸代謝は、空腹や糖尿病などのケトン体生成条件下での生存及びエネルギー産生に不可欠である。
これらの知見を基に、本発明者は、AceCS2の発現を抑制するか、または、その活性を阻害する薬剤を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する抗肥満薬として提供する。特に、低炭水化物食による食事療法との併用療法に使用すると効果が増すものである。
本発明による抗肥満薬は、脂肪過多等の肥満を改善し得るので医薬として有用である。
【００６６】
AceCS2のオルソログは特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サルなどの哺乳動物等の非ヒト動物に由来するものを対象とし得る。
また、対象とするAceCS2は、酢酸代謝能を有する限り、そのコードするアミノ酸配列に１以上の変異を有していてもよい。
【００６７】
本発明による抗肥満薬は、医薬上許容される担体を適宜含有してもよい。
そのような担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、アップルジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられる。
【００６８】
抗肥満薬の経口投与に好適な形態としては、水や生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含むカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、散剤、顆粒剤等などが挙げられる。
【００６９】
静脈内注射や、皮下注射、筋肉注射、局所注入など、非経口投与に好適な形態としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等を含めてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等を含めてもよい。
このような製剤は、アンプルやバイアルのように、単位投与量または複数回投与量ずつ容器に封入してもよい。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存してもよい。
【００７０】
抗肥満薬の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式、疾患の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢などによって異なるが、成体１日当たり約０．００１ｍｇ〜約５．０ｇ／ｋｇが目安となる。
【００７１】
抗肥満薬のスクリーニングには、被験物質が、AceCS2の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、AceCS2の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程とを有する。
【００７２】
評価する工程では、スクリーニング方法に供される被験物質に、任意の公知化合物や新規化合物が使用でき、例えば、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど）、糖質（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖など）、脂質（飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖、環を含む脂肪酸など）、アミノ酸、蛋白質（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００７３】
被験物質によるAceCS2の発現を抑制するか活性を阻害する作用を評価可能であれば任意の方法が可能であり、例えば、非ヒト動物、あるいはAceCS2の発現抑制か活性阻害を測定可能な細胞を用いて行ってもよい。
【００７４】
非ヒト動物を用いて行う場合、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物などが挙げられる。肥満または肥満に起因する状態または疾患を示すモデル動物を用いてもよい。
肥満または肥満に起因する状態または疾患を示すモデル動物としては、例えば、肥満状態または疾患のモデル動物（ob/obマウス、Ayマウス、Zucker-fattyラット、Otsuka long-evans fatty (OLETF )ラット、グルタミン酸などの薬物投与による過食誘発マウス及びラットなど）や、肥満に起因する状態または疾患のモデル動物として、高脂肪食負荷されたモデル動物や耐糖能異常に起因する疾患のモデル動物（db/dbマウス、KKAyマウス、Wistar-fattyラット、Goto-Kakizaki (GK)ラット、Otsuka long-evans fatty(OLETF)ラット、秋田マウス、ストレプトゾトシンなどの薬物投与による膵破壊マウス及びラットなど）、低アディポネクチン血症のモデル動物（アディポネクチン欠損マウス、ob/obマウス、A-ZIP脂肪萎縮症マウスなど）、高インスリン血症のモデル動物（IRS1欠損マウスなど）、動脈硬化症のモデル動物（apoE欠損マウス、LDL受容体欠損マウス、WHHLウサギなど）、高血圧症のモデル動物（11βHSD導入マウス、SHRラット、SHRSPラットなど）が挙げられる。
【００７５】
非ヒト動物が用いられる場合、被験物質の非ヒト動物への投与には従来公知の方法が利用できる。例えば、経口投与、非経口投与（静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、局所注入など）が挙げられる。投与量、投与間隔、投与期間等は、用いる被験物質や動物の種類等に応じて適宜設定される。
【００７６】
非ヒト動物における肥満度を測定するには、体重や、体脂肪率、基礎代謝などを指標として利用できる。
特に、被験物質を投与する非ヒト動物に低炭水化物食を負荷し、酸素消費量を測定する方法が有効である。
【００７７】
また、被験物質を投与した動物におけるAceCS2の発現量を測定することによって、被験物質がAceCS2の発現を抑制する効果があるかを評価してもよい。
発現量の測定は、例えば、非ヒト動物から脂肪組織等の生体試料を採取し、その試料中の転写産物等を測定することにより行ってもよい。
【００７８】
非ヒト動物の組織や細胞、例えば、脂肪組織または脂肪細胞を用いて、スクリーニングを行ってもよい。
AceCS2の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、脂肪細胞等のAceCS2発現細胞であり、AceCS2の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、AceCS2遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞である。
【００７９】
AceCS2遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、AceCS2遺伝子の転写調節領域、その領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。
AceCS2遺伝子の転写調節領域は、AceCS2の発現を制御し得る領域であれば任意であり、例えば、AceCS2遺伝子の転写調節領域の塩基配列において１以上の塩基が、欠失、置換、付加された塩基配列からなり、転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。
【００８０】
本発明では、AceCS2の遺伝子を欠損させた非ヒト動物、並びに、それに由来する組織または細胞も提供する。
その非ヒト動物は、抗肥満または低インスリンまたは低レプチンの状態のモデル動物であり得て、野生型に比べて有意な差異が認められるものである。
それに由来する組織または細胞は、本発明によるスクリーニング、肥満の改善が所望される疾患または状態のマーカー遺伝子のスクリーニング、脂肪細胞マーカー遺伝子のスクリーニング、肥満の改善が所望される疾患または状態の病態メカニズムの解析などに有用である。これらは、例えば、マイクロアレイやプロテインチップ等を用い、本発明による非ヒト動物における発現プロファイルを測定し、対照動物の発現プロファイルと比較する発現プロファイル解析により可能である。
【００８１】
上述はAceCS2に関して、抗肥満の観点から触れたが、逆に、痩せに関する観点からの活用も、上述と同様に可能である。
すなわち、AceCS2の発現を特異的に増強するか、または、その活性を特異的に亢進する薬剤を含有すれば、好ましくない他の作用を起こすことなく、AceCS2に関連する機能不良を起因とする栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患の改善、または、絶食時の栄養改善を、予防または治療する作用を備える栄養障害改善薬として提供可能である。
【００８２】
また、AceCS2に関して、抗肥満と痩せに関する体質の評価方法も、上述と同様に可能である。
すなわち、AceCS2の発現または活性に関連するAceCS2遺伝子またはその調整遺伝子を解析することによって、肥満または肥満に起因する状態または疾患、または、栄養障害または栄養障害に起因する状態または疾患になり得る体質であるかを評価することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明による抗肥満薬は、好ましくない他の作用を起こすことなく、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療することができるので、社会問題化しつつある肥満対策に有用である。また本発明は同様に、栄養障害の改善薬の提供や、肥満に関する病態メカニズムの解析等にも役立ち、産業上利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】マウスAceCS2遺伝子のエクソン1を分裂させる挿入型ベクターを示す説明図
【図２】サザンブロット分析結果を示す写真
【図３】PCR法分析結果を示す写真
【図４】（ア）リアルタイムPCR法（QRT-PCR）分析結果を示すグラフ、（イ）イムノブロット法分析結果を示す写真
【図５】（ア）酢酸からの14CO2 産生率を示すグラフ、（イ）60分経過後における総血漿［1-14C］酢酸濃度を示すグラフ
【図６】（ア）非標識酢酸を含めた場合における酢酸からの14CO2 産産生率示すグラフ、（イ）β-ヒドロキシ酪酸からの14CO2 産生率を示すグラフ
【図７】エネルギー代謝におけるAceCS2のモデルを示す説明図
【図８】通常飼料を摂取したマウスの48時間の絶食後における深部体温を示すグラフ
【図９】（ア）摂餌状態または48時間の絶食状態のマウスの血漿酢酸濃度を示すグラフ、（イ）48時間絶食したマウスの腓腹筋におけるアセチルCoA 濃度を示すグラフ
【図１０】（ア）12週齢時のマウスの腓腹筋のATP及びAMP含有量をを示すグラフ、（イ）48時間絶食したマウスの腓腹筋におけるNAD+及びNADH濃度とNAD+/NADH比を示すグラフ、（ウ）48時間絶食したマウスのBATにおけるNAD+及びNADH濃度とNAD+/NADH比を示すグラフ
【図１１】（ア）絶食下のマウスにおける酸素消費量（VO2）を示すグラフ、（イ）絶食下のマウスにおける酸素消費量（VO2 ）の平均を示すグラフ、（ウ）絶食下のマウスにおけるRQ（呼吸商）を示すグラフ、（エ）明期及び暗期におけるマウスの総自発運動量を示すグラフ
【図１２】（ア）自由摂取としたマウスを低温に供した場合における深部体温を示すグラフ、（イ）絶食下のマウスを低温に供した場合における深部体温を示すグラフ、
【図１３】（ア）AceCS2+/+マウスにおける運動負荷結果を示すグラフ、（イ）AceCS2-/-マウスにおける運動負荷結果を示すグラフ
【図１４】AceCS2+/+マウスとAceCS2-/-マウスの血液ガス分析結果を示す表
【図１５】離乳時のマウスにおける血漿酢酸濃度を示すグラフ
【図１６】（ア）離乳時のマウスにおける深部直腸体温を示すグラフ、（イ）離乳時のマウスにおける体重を示すグラフ、（ウ）離乳時のマウスにおける血糖値を示すグラフ
【図１７】（ア）離乳時のマウスにおける血漿NEFA濃度を示すグラフ、（イ）離乳時のマウスにおけるケトン体濃度を示すグラフ
【図１８】離乳時のマウスにおける生存率を示すグラフ
【図１９】LC/HF 飼料を給与された雄性マウスの体重変化を示すグラフ
【図２０】LC/HF 飼料を給与されたAceCS2+/+及びAceCS2-/-マウスの様々な組織の重量を示すグラフ
【図２１】LC/HF 飼料を摂取したAceCS2-/-マウスとAceCS2+/+マウスの代謝パラメータを示す表
【図２２】（ア）LC/HF 飼料を給与されたマウスにおける酸素消費量（VO2）を示すグラフ、（イ）LC/HF 飼料を給与されたマウスにおける酸素消費量（VO2 ）の平均を示すグラフ
【図２３】LC/HF 飼料に切り替えたマウスの体重変化を示すグラフ
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２】
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【図３】
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