(57)【要約】【課題】  遺伝子工学的手法を用いた高等生物由来のタンパク質の製造において、活性型タンパク質を大量に生産するための制御因子、及び前記因子を用いた製造方法を提供すること。【解決の手段】  バチルス属細菌由来中性プロテアーゼ遺伝子の一部を含むシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列、及び前記配列を含む発現プラスミドを宿主に形質転換して得られる組み換え微生物を用いてタンパク質製造を行なうことで前記課題を解決した。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＡＡＡＧＧＡＧＧＡからなる配列を含む、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列。
【請求項２】
請求項１に記載のシャイン・ダルガノ配列を含む発現プラスミドを宿主に形質転換することで得られた、遺伝子組み換え体。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子組み換え体を用いた、タンパク質の製造方法。
【請求項４】
タンパク質が抗体または抗体の断片である、請求項３に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を大量に発現させるのに有用なシャイン・ダルガノ配列、及びそれを用いた遺伝子工学的にタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日までに産業上有用な物質を効率よく多量に生産するために多様な微生物を利用する技術が開発されている。特に大腸菌を用いた系は強力なプロモーター系、正確な制御系、多様な宿主系が開発されており、微生物由来の遺伝子以外にも植物、動物といった高等生物の遺伝子を発現制御することも可能となっている。しかしながら大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有しているため、一般的に分泌されるタンパク質は内膜との間に存在するペリプラズム層に蓄積し、培養液中に放出されない。そのため、物理的又は化学的に菌体を破砕して、目的のタンパク質を抽出する必要があるが、前記抽出操作の際、目的のタンパク質が機械的または酵素的な破壊を受けることで活性を失う問題があった。
【０００３】
近年、ペリプラズム層を介して可溶性で活性型のタンパク質を大腸菌の菌体外へ分泌生産する技術が開発された（特許文献１）。しかしながら、生産するタンパク質の量が少なく工業生産に適用するには経済性に問題があった。
【０００４】
また、大腸菌では高等生物由来のタンパク質の発現の際、多くの場合活性を持たない不溶物として得られる問題があり、さらにリフォーディングとよばれる操作で活性を持つ構造のタンパク質に再構築する必要があった。そのため、工業生産への適用はさらに困難であった。
【０００５】
近年、他の微生物内での分泌発現によって活性型で異種タンパク質を得る技術が開発されている。このような発現系の一つとして、タンパク質分泌能が高いバチルス属細菌を宿主として用いる方法が報告されている（非特許文献１）。バチルス属細菌の細胞内でのタンパク質発現量を調節する重要な制御因子としてプロモーター、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列、シグナルペプチド、及びターミネーターと呼ばれる塩基配列が知られている。
【０００６】
プロモーターはｍＲＮＡ合成の開始に関与する特定の短い塩基配列のことであり、細菌の場合は転写開始点から約１０塩基上流（−１０領域）と約３５塩基上流（−３５領域）に見られる二つの短い配列から構成されている。
【０００７】
ＳＤ配列は原核生物のｍＲＮＡにおいて開始コドンの上流に見られる配列で、リボソームの結合部位となる部分であり、リボソームにおけるタンパク質の合成開始に関与するといわれている。
【０００８】
シグナルペプチドは細胞質内でタンパク質の局在化や膜輸送を指示するペプチドであり、Ｎ末端付近の正電荷を持つアミノ酸が局在した領域、及び疎水性のコア領域及びシグナルペプチダーゼに認識切断される領域からなる、２０から５０アミノ酸残基のペプチドである。当該ペプチドは、バチルス属細菌がタンパク質を細胞外分泌生産する際に中心的な役割を果たすものと考えられている。
【０００９】
ターミネーターは構造遺伝子の最後に接続した塩基配列であり、ｍＲＮＡ合成の終了に関与する配列と考えられている。
【００１０】
前記制御因子の一例として、バチルス属菌中性プロテアーゼ由来のプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチド及びターミネーター配列が非特許文献２、及び特許文献２から５に開示されており、バチルス属細菌で抗体を発現させうるプロモーター及び分泌シグナル配列が特許文献６に開示されている。
【００１１】
前記文献で開示の制御因子は、いずれも強力な発現因子として報告されているが、目的とするタンパク質によっては必ずしも良好に作用せず、特に高等生物由来のタンパク質について活性型が分泌されにくいという問題があった。例えばプロテアーゼのようなバチルス属細菌で一般的に高発現するタンパク質のＳＤ配列やシグナルペプチドが必ずしもすべてのタンパク質に強力には働かず、宿主の種類および発現しようとするタンパク質ごとにプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチド及びターミネーターとの間に相性があり、最適なものを選定することが必要である。近年、様々な高等生物由来の活性型タンパク質の工業生産に対する要求が高まり、これに適する新規な制御因子の提供が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平８−３２２５８６号公報
【特許文献２】特開平２−２６５４９１号公報
【特許文献３】特開平２−２６５４９２号公報
【特許文献４】特開平２−２６８６８７号公報
【特許文献５】特開平２−２６８６８８号公報
【特許文献６】特開平７−０７５５８１号公報
【特許文献７】特開平５−１８４３６３号公報
【特許文献８】特開平１０−３０９１９８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｓｃｈｕｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６２、１３７（２００７）
【非特許文献２】Ｋｕｂｏ  ａｎｄ  Ｉｍａｎａｋａ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３４、１８８３（１９８８）
【非特許文献３】Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、５５７（１９８３）
【非特許文献４】Ｄｅｂｎａｕ  ａｎｄ  Ａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、５６，２０９（１９７１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、遺伝子工学的手法を用いた高等生物由来のタンパク質の製造において、活性型タンパク質を大量に生産するための制御因子、及び前記因子を用いたタンパク質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明者らは、前記課題に対し、バチルス属細菌由来中性プロテアーゼの遺伝子を詳細に検討した結果、先行文献中には特別な機能を持たない配列として公開された配列の一部がシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列として強力な機能を有していることを見出し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
第一の発明は、少なくともＡＡＡＧＧＡＧＧＡからなる配列を含む、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列である。
【００１７】
第二の発明は、第一の発明に記載のシャイン・ダルガノ配列を含む発現プラスミドを宿主に形質転換することで得られた、遺伝子組み換え体である。
【００１８】
第三の発明は、第二の発明に記載の遺伝子組み換え体を用いた、タンパク質の製造方法である。
【００１９】
第四の発明は、タンパク質が抗体または抗体の断片である、第三の発明に記載のタンパク質の製造方法である。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列は少なくともＡＡＡＧＧＡＧＧＡを含んでいればよく、一例として配列番号２９で示す配列をあげることができる。なお、本発明のＳＤ配列をコードするＤＮＡを得る方法としては、既存のプラスミドであるｐＵＢＴＺ２（バチルス・ステアロサーモフィルス由来の中性プロテアーゼ遺伝子をクローニングした大腸菌及び枯草菌間のシャトルベクター、特許文献７）よりＰＣＲ反応で当該ＤＮＡ断片を増幅して得る方法、及び化学合成によって直接前記ＤＮＡを得る方法が例示できる。
【００２２】
本発明の宿主はバチルス属細菌であれば特に限定がないが、この中でも特にタンパク質分泌能が高く、かつ病原性がない枯草菌（バチルス・ズブチリス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
【００２３】
本発明で用いる発現プラスミドにおいて、プロモーターはバチルス属細菌内で機能するものであればよく、一例として、特許文献４で開示の、−３５領域がＴＴＴＴＣＣ、−１０領域がＴＡＴＴＧＴからそれぞれなるプロモーターがあげられる。また、プロモーター、及びその間に介在するＤＮＡを得るには、公知の化学合成によって直接前記ＤＮＡを得る方法、天然由来のＤＮＡから制限酵素で切り出して得る方法、既存のＤＮＡからＰＣＲ反応により核酸増幅して得る方法等により得られる。
【００２４】
本発明で用いる発現プラスミドにおいて、分泌発現に用いるシグナルペプチドはバチルス属細菌内で機能するものであればよく、一例として、特許文献３の請求項４で開示の、ＭＫＲＫＭＫＬＲＳＦＧＶＡＡＧＬＡ（配列番号３０）で示される耐熱性中性プロテアーゼのシグナルペプチド、及び非特許文献２で開示のＭＫＲＫＭＫＭＫＬＡＳＦＧＬＡＡＧＬＡＡＱＶＦＬＰＹＮＡＬＡ（配列番号３１）からなるペプチドがあげられる。前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡを得る方法としては、既存の遺伝子からＰＣＲ反応により前記ＤＮＡを核酸増幅して得る方法、また化学合成法によって直接前記ＤＮＡを得る方法を例示できる。
【００２５】
本発明において分泌発現を目的とするタンパク質に特に限定はないが、アミラーゼ、プロテアーゼ、抗体といった天然においても細胞外に分泌生産されるタンパク質が好ましい。また前記タンパク質をコードする遺伝子を得る方法にも特に限定はなく、抗体を目的タンパク質とした場合の一例として、特許文献８に開示の抗エストラジオール抗体遺伝子取得法があげられる。また、特許文献８に開示の、クローニング済みの遺伝子をプラスミドから切り出す方法や、前記遺伝子断片をＰＣＲ反応等の方法により増幅させる方法も用いることもできる。
【００２６】
本発明で用いる発現プラスミドにおける、もう一つの構成要素であるタンパク質発現の構造遺伝子群の終点に位置するターミネーターもバチルス属細菌内で機能するものであればよく、一例として、特許文献５の請求項３で開示の、ＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧ（配列番号３２）を含む配列があげられる。
【００２７】
本発明のタンパク質製造は、任意のプロモーターの下流に本発明のＳＤ配列を配置し、その下流に任意のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して、所望のタンパク質をコードする遺伝子を持つＤＮＡ配列を配置し、さらにその下流に任意のターミネーターを配置した発現プラスミドを作成し、前記プラスミドをバチルス属細菌に導入することでタンパク質製造を行なう。即ち、一般的には、５’末端側から、プロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチド、目的タンパク質遺伝子、ターミネーターの順に配置し、発現プラスミドを作成する。
【００２８】
発現培養に用いる条件は、バチルス属細菌の培養で通常設定する条件の中から適宜選択すればよい。培養温度は２０から４０℃が好ましく、特に２５から３０℃が好ましい。培養時のｐＨは６から８が好ましい。培養に用いる培地としてはバチルス属細菌が増殖し、かつ目的のタンパク質が分泌発現可能な培地を適宜選択すればよい。培養時間は、目的のタンパク質が分泌発現するのに適する時間であれば任意に設定できるが、通常は数時間から１００時間の間に設定される。
【００２９】
発現したタンパク質を定量する方法としては一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した後に色素や免疫学的方法で染色して比色定量する方法、及びＥＬＩＳＡ法を例示でき、また酵素等を発現する場合には前記酵素の活性を測定する方法なども用いることができる。特に、抗体やレセプターなどを製造する場合はＥＬＩＳＡ法による活性定量法が簡便であるため好ましい。
【００３０】
ＥＬＩＳＡ法におけるタンパク質の組み合わせは目的のタンパク質が定量できる方法であれば特に限定されないが、一例として、目的抗体に対する抗原、目的抗体、酵素標識抗目的抗体、の順に重ねたサンドイッチ法をあげることができる。ここで酵素標識抗目的抗体の一例として、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素で標識された抗目的抗体をあげることができる。
【００３１】
また、ＥＬＩＳＡの検出法についても特に限定されないが、標識に用いた酵素の特異的発色試薬、蛍光試薬又は化学発光試薬が市販されており、それらを標識に用いた酵素に応じて適宜選択し使用することができる。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合は発色基質をペルオキシダーゼと過酸化水素で酸化反応させて比色定量する方法があり、例えばＴＭＢ  ２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（商品名、フナコシ社製）といった市販の試薬で発色させた後、マイクロタイタープレートリーダＭＰＲ４ｉ（商品名、東ソー社製）といった市販の測定装置で比色定量することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、バチルス属細菌由来中性プロテアーゼ遺伝子中、先行文献中には特別な機能を持たない配列として公開された配列の一部をシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列として使用することで、バチルス属細菌に所望の高等生物由来タンパク質を分泌生産することが可能なタンパク質の製造方法を提供している。本発明により得られた、タンパク質は、菌体外に活性型の状態で分泌される。これにより、タンパク質抽出のための菌体破砕工程や、変性剤によるタンパク質の活性型への再構築が不要となり、効率よく所望のタンパク質を得ることができる。また、非特許文献２で開示のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列と比較し、プロモーター部とシグナル配列部が短いＤＮＡ配列であっても分泌生産が可能となったことから、ベクターの安定化と高発現性が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】プラスミドｐＵＣＨＳ１Ｌ作成の工程図。図中、ＶＨ＋ＣＨは抗体のＨ鎖のＶＨ領域及びＣＨ１領域の遺伝子断片、ｓｔｏｐはストップコドン、ＶＬ＋ＣＬは抗体Ｌ鎖のＶＬ領域及びＣＬ領域の遺伝子断片、Ｐｒは耐熱性中性プロテアーゼ由来のプロモーター領域、ＳＤは本発明のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列（配列番号２９）、ＳＰは耐熱性中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチド領域、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子領域であることを示し、ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩは対応する制限酵素の切断サイトを示す。
【図２】プラスミドｐＵＣＳＨＳ１Ｌ作成の工程図。図中の略号は図１に準ずる。
【図３】プラスミドｐＵＢＣＨ１ＬΔｔ作成の工程図。図中の略号のうち、Ｋｍｒはカナマイシン耐性遺伝子領域であることを示し、その他は図１に準ずる。
【図４】プラスミドｐＵＢＣＨ１Ｌ作成の工程図。図中の略号のうち、Ｋｍｒはカナマイシン耐性遺伝子領域、ＴＴは耐熱性中性プロテアーゼ由来のターミネーター配列であることをそれぞれ示し、その他は図１に準ずる。
【図５】プラスミドｐＵＢＣＨ２Ｌの概略図。図中の略号は図４に準ずる。
【図６】プラスミドｐＵＢＣＨ３Ｌの概略図。図中の略号のうち、Ｓｕｐは１３塩基の付加配列（配列番号３３）であることを示す。その他は図４に準ずる。
【図７】プラスミドｐＵＢＣＨ２Ｌで形質転換した枯草菌ＤＢ１１７株（黒丸）、ＤＢ１０４株（白丸）、及びＭＴ２株（白三角）を２５℃、３０℃、又は３７℃で２４時間培養したのちの、培養上清中の抗体力価を測定した結果を示す。図中の各シンボルは各条件で２４点の同一の実験を行なった際の平均値を示す。また、破線は標準偏差を示す。
【図８】プラスミドｐＵＢＣＨ１Ｌ、ｐＵＢＣＨ２Ｌ、又はｐＵＢＣＨ３Ｌで形質転換した枯草菌ＤＢ１１７株を３０℃で２４時間培養後の、培養上清中の抗体力価を測定した結果を示す。図中の棒は各形質転換体を２４回培養した結果の平均値を示す。また、棒に示した縦線は標準偏差を示す。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  発現ベクターｐＵＢＣＨ１Ｌの作成
（１）インサート配列（プロモーターからシグナル配列を含む塩基配列）の合成
（１−１）配列番号１から１２（配列番号１は配列番号１３の１から４０番目の塩基に、配列番号２は配列番号１３の３５から７９番目の塩基の相補鎖に、配列番号３は配列番号１３の７３から１１５番目の塩基に、配列番号４は配列番号１３の１０８から１５２番目の塩基の相補鎖に、配列番号５は配列番号１３の１４４から１８８番目の塩基に、配列番号６は配列番号１３の１７９から２２３番目の塩基の相補鎖に、配列番号７は配列番号１３の２１７から２６１番目の塩基に、配列番号８は配列番号１３の２５４から２９８番目の塩基の相補鎖に、配列番号９は配列番号１３の２９１から３３５番目の塩基に、配列番号１０は配列番号１３の３２７から３７１番目の塩基の相補鎖に、配列番号１１は配列番号１３の３６６から４１０番目の塩基に、配列番号１２は配列番号１３の４００から４３５番目の塩基の相補鎖に、それぞれ相当）に示すオリゴヌクレオチドを混合し、タカラバイオ社製ＤＮＡポリメラーゼ（商品名、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて１回目のＰＣＲを行ないＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は９４℃で５分加熱した後、９４℃での加熱（３０秒）、５７℃でのアニーリング（３０秒）及び７２度での伸張反応（４５秒）のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃で７分加温することにより行なった。
（１−２）１回目のＰＣＲ反応後の反応液をキアゲン社製ＰＣＲ精製キットで精製して５０μＬのＤＮＡ溶液を得た。
（１−３）（１−２）で得られたＤＮＡ溶液のうちの１μＬを鋳型とし、配列番号１及び１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして２回目のＰＣＲ反応を、１回目と同じ条件で行なった。
（１−４）２回目のＰＣＲ反応後の反応液を、アガロースゲル電気泳動より約４００ｂｐのＤＮＡ断片を切出し、キアゲン社製ゲル抽出キットにより精製して配列番号１３に示すインサート配列（５’末端付近にＥｃｏＲＩサイトとＳａｃＩサイトを含み、中央部に中性プロテアーゼプロモーター配列、本発明のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列（配列番号２９、３２５から３３９番目の塩基）、および中性プロテアーゼシグナル配列（配列番号３１のペプチドをコードする塩基配列、３４０から４２９番目の塩基）を含み、３’末端付近にＮｈｅＩサイトを含む）を得た。
（１−５）２回目のＰＣＲ反応用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１４及び１５（配列番号１４は配列番号１６の１から３４番目の塩基に、配列番号１５は配列番号１６の３９６から４３３番目の塩基の相補鎖に、それぞれ相当）を用いた他は（１−３）から（１−４）と同様な操作を行ない、配列番号１６に示すインサート配列（５’末端付近にＫｐｎＩサイトを含み、中央部に中性プロテアーゼプロモーター配列、本発明のＳＤ配列（配列番号２９、３１９から３３３番目の塩基）、及び中性プロテアーゼシグナル配列（配列番号３１のペプチドをコードする塩基配列、３３４から４２３番目の塩基）を含み、３’末端付近にＰｓｔＩサイトを含む）を得た。
【００３６】
（２）インサート配列（ＳＤ配列からシグナル配列を含む塩基配列）の合成
（２−１）１回目のＰＣＲ反応用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１０、１１、１５、１７（配列番号１７は配列番号１８の１から３２番目の塩基に相当）、２回目のＰＣＲ反応用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１５及び１７を用いた他は、（１−１）から（１−４）と同様な操作を行ない、配列番号１８に示すインサート配列（５’末端付近にＫｐｎＩサイトを含み、中央部に本発明のＳＤ配列（配列番号２９、１３から２７番目の塩基）と中性プロテアーゼシグナル配列（配列番号３１のペプチドをコードする塩基配列、２８から１１７番目の塩基）を含み、３’末端付近にＰｓｔＩサイトを含む）を得た。
（２−２）２回目のＰＣＲ反応用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１５及び１９（配列番号１９は配列番号２０の１から３６番目の塩基に相当）を用いた他は、（２−１）と同様の操作を行ない、配列番号２０に示すインサート配列（５’末端付近にＫｐｎＩサイトと１３塩基の付加配列（配列番号３３、１３から２５番目の塩基）を含み、中央部に本発明のＳＤ配列（配列番号２９、２６から４０番目の塩基）と中性プロテアーゼシグナル配列（配列番号３１のペプチドをコードする塩基配列、４１から１３０番目の塩基）を含み、３’末端付近にＰｓｔＩサイトを含む）を得た。
【００３７】
（３）抗体Ｈ鎖遺伝子断片（ＶＨからＣＨ１領域）の増幅
特許文献８で開示の方法で調製された抗エストラジオール抗体発現プラスミドを鋳型とし、配列番号２１及び２２に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ反応により抗体Ｈ鎖遺伝子断片（ＶＨからＣＨ１領域）を増幅した。ＰＣＲ反応は９４℃で５分加熱した後、９４℃での加熱（３０秒）、５７℃でのアニーリング（３０秒）及び７２度での伸張反応（４５秒）のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃で７分加温することにより行なった。増幅した遺伝子はキアゲン社製ＰＣＲ精製キットで精製した。
【００３８】
（４）抗体Ｌ鎖遺伝子断片（ＶＬからＣＬ領域）の増幅
プライマーとして配列番号２３及び２４に示されるオリゴヌクレオチドを用いた他は、（３）と同様にＰＣＲ反応を行ない、抗体Ｌ鎖遺伝子（ＶＬからＣＬ領域）の増幅断片を得た。
【００３９】
（５）ターミネーターの増幅
鋳型として特許文献７で開示のプラスミドｐＵＢＴＺ２を、プライマーとして配列番号２５及び２６に示されるオリゴヌクレオチドを用いた他は、（３）と同様にＰＣＲ反応を行ない、中性プロテアーゼターミネーターの増幅断片（配列番号３４、２３から５３番目の塩基は配列番号３２と同じ）を得た。
【００４０】
（６）発現ベクターの構築
（６−１）（３）で調製した抗体Ｈ鎖遺伝子断片（ＶＨからＣＨ１領域）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで、（４）で調製したＬ鎖抗体遺伝子断片（ＶＬからＣＬ領域）を制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｐｈＩで、（１−５）で調製した配列番号１６に示したインサート配列をＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで、それぞれ切断した後、それぞれキアゲン社ＰＣＲ精製キットで精製した。
（６−２）プラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ製）をＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、さらにアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した後、アガロースゲル（ゲル濃度１％）電気泳動を行ない、約３ｋｂの断片をキアゲン社製ゲル抽出キットを用いて切出し精製した。
（６−３）（６−２）の断片に、（６−１）で調製した制限酵素処理済の抗体Ｈ鎖遺伝子断片、配列番号１６に示すインサート配列及び抗体Ｌ鎖遺伝子断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、プラスミドｐＵＣＨＳ１Ｌ（図１）を合成した。
（６−４）プラスミドｐＵＣＨＳ１Ｌ（図１）をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩで切断し、さらにアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した後、アガロースゲル（ゲル濃度１％）電気泳動を行ない、約４．８ｋｂの断片をキアゲン社製ゲル抽出キットを用いて切出し精製した。
（６−５）（６−４）で得られた断片に、予めＥｃｏＲＩとＮｈｅＩで切断してキアゲン社ＰＣＲ精製キットで精製した配列番号１３に示すインサート配列をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、プラスミドｐＵＣＳＨＳ１Ｌ（図２）を合成した。
（６−６）プラスミドｐＵＣＳＨＳ１Ｌ（図２）を制限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル（ゲル濃度１％）電気泳動を行ない、約２ｋｂの断片をキアゲン社製ゲル抽出キットを用いて切出し精製し、５’末端側から、中性プロテアーゼプロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、中性プロテアーゼシグナル配列、抗体Ｈ鎖遺伝子断片（ＶＨからＣＨ１領域）、中性プロテアーゼプロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、中性プロテアーゼシグナル配列、Ｌ鎖抗体遺伝子断片（ＶＬからＣＬ領域）より構成されるＤＮＡ断片を得た。
（６−７）特許文献７で開示のｐＵＢＴＺ２を、ＳｎａＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アルカリフォスファターゼによる脱リン酸化処理後、１％アガロースゲル電気泳動からの切出しにより約５ｋｂｐの断片を調製した。
（６−８）（６−７）で得られた断片に、予めＴ４ＤＮＡキナーゼ処理によりリン酸化した２つのオリゴＤＮＡ（配列番号２７及び２８）をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させプラスミドｐＵＢＣ１（図３）を合成した。
（６−９）プラスミドｐＵＢＣ１（図３）を制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、さらにアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した後、アガロースゲル（ゲル濃度１％）電気泳動を行ない、約５ｋｂの断片をキアゲン社製ゲル抽出キットを用いて切出し精製した。
（６−１０）（６−９）で得られた断片と、（６−６）で調製した、５’末端側から、プロモーター中性プロテアーゼプロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、中性プロテアーゼシグナル配列、抗体Ｈ鎖遺伝子断片（ＶＨからＣＨ１領域）、中性プロテアーゼプロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、中性プロテアーゼシグナル配列、Ｌ鎖抗体遺伝子断片（ＶＬからＣＬ領域）より構成されるＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、プラスミドｐＵＢＨ１ＬΔｔ（図３）を合成した。
（６−１１）プラスミドｐＵＢＨ１ＬΔｔ（図３）を、制限酵素ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した後、アガロースゲル（ゲル濃度１％）電気泳動を行ない、約７ｋｂの断片をキアゲン社製ゲル抽出キットを用いて切出し精製した。この断片に（５）で合成したターミネーター断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、プラスミドｐＵＢＣＨ１Ｌ（図４）を合成した。
【００４１】
実施例２  発現ベクターｐＵＢＣＨ２Ｌの作成
配列番号１６のインサート配列の代わりに（２−１）で調製した配列番号１８を用いた他は、実施例１の（６）と同様の操作を行ない、プラスミドｐＵＢＣＨ２Ｌ（図５）を合成した。当該プラスミドと実施例１で調製したプラスミドｐＵＢＣＨ１Ｌの相違は、前者の抗体Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子をつなぐ断片が、終止コドン、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、及び中性プロテアーゼシグナル配列により構成されるのに対し、後者では終止コドン、中性プロテアーゼプロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、及び中性プロテアーゼシグナル配列により構成される点が異なる。
【００４２】
実施例３  発現ベクターｐＵＢＣＨ３Ｌの作成
配列番号１６のインサート配列の代わりに（２−２）で調製した配列番号２０を用いた他は、実施例１の（６）と同様の操作を行ない、プラスミドｐＵＢＣＨ３Ｌ（図６）を合成した。当該プラスミドと実施例１で調製したプラスミドｐＵＢＣＨ１Ｌの相違は、前者の抗体Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子をつなぐ断片が、終止コドン、１３塩基の付加配列（ＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＴ、配列番号３３）、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、及び中性プロテアーゼシグナル配列により構成されるのに対し、後者では終止コドン、中性プロテアーゼプロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）、及び中性プロテアーゼシグナル配列により構成される点が異なる（図６）。
【００４３】
実施例４  枯草菌への形質転換
（１）大腸菌ＪＭ１０３株のコンピテントセルをＨａｎａｈａｎの方法（非特許文献３）に従って作成し、発現ベクターｐＵＢＣＨ１Ｌ、ｐＵＢＣＨ２Ｌ又はｐＵＢＣＨ３Ｌで形質転換した。これらの形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養した。この培養液からキアゲン社プラスミド抽出キットを用いて各プラスミドの水溶液３０μＬを調製した。
（２）枯草菌ＭＴ２株、ＤＢ１０４株又はＤＢ１１７株のコンピテントセルを公知の方法（非特許文献４）に従って調製した。前記細胞懸濁液１００μＬに、（１）で調製した各プラスミド水溶液５μＬを加えて、３７℃で１時間、穏やかに振とうした後、ＬＢ培地９００μＬを加えて３７℃で１．５時間、激しく振とうして培養した。（３）（２）の培養液より遠心分離で菌体を回収し、１００μＬの生理食塩水に再懸濁し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ平板培地に１０μＬまたは９０μＬを塗布して３７℃で一晩静置培養した。生育したカナマイシン耐性のコロニーより目的のプラスミドを持つものを選別し、目的の形質転換体枯草菌菌株を調製した。
【００４４】
実施例５  抗体遺伝子の発現に対する菌株と温度の影響
（１）実施例４で調製した形質転換体のうち、プラスミドｐＵＢＣＨ２Ｌで形質転換した枯草菌ＭＴ２、ＤＢ１０４及びＤＢ１１７株を２ＰＹ培地（ポリペプトン  ４０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、グルコース  ２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１ｇ／Ｌ）０．７５ｍＬを入れた９６穴深穴プレート（ＢＭ６０３０Ｓ深穴プレート角型Ｖ底、ビーエム機器社製）に植菌し、温度２５℃、３０℃又は３７℃にて、バイオシェーカーＭＢＲ−０２２ＵＰ（商品名、タイテック社製）を用いて１２００ｒｐｍの振とう速度で２４時間培養した。
【００４５】
（２）（１）の培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清液中の抗体力価を以下の方法によりＥＬＩＳＡ法で測定した。
（２−１）予めエストラジオール標識牛血清アルブミンを結合させた後にパーフェクトブロック（商品名、ピアス社製）でブロッキングしておいた９６穴プレートに、培養上清１００μＬを入れて３７℃で１時間抗原抗体反応を行なった後、溶液を除去した。
（２−２）西洋ワサビペルオキシダーゼ修飾抗マウス抗体抗体溶液を添加して３７℃で１時間抗原抗体反応を行なった後、再度溶液を除去した。
（２−３）西洋ワサビペルオキシダーゼの発色試薬（ＴＭＢ  ２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（商品名）、フナコシ社製）５０μＬを添加して適当な色調になるまで発色を行ない、５０μＬの１０％リン酸水溶液で反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクとして培養上清の代わりに２ＰＹ培地を用いて同様の反応を行なって４５０ｎｍの吸光度を測定し、検体の４５０ｎｍの吸光度からブランクの吸光度を引くことにより抗体力価とした。
【００４６】
ＥＬＩＳＡの結果を図７に示す。いずれの菌株も３７℃で培養した場合には培養上清中に抗体力価は確認できなかったものの、２５℃又は３０℃で培養した場合には明らかな抗体力価が確認できており、本発明のＳＤ配列を含んだ発現プラスミドを枯草菌に形質転換することにより、抗原への結合活性を保持した抗体が得られることが示された。なお、ＤＢ１０４株及びＤＢ１１７株では３０℃での抗体生産が最も多かったが、ＭＴ２株における３０℃での生産性は他の菌株より低かった。
【００４７】
実施例６  プラスミド構成の違いにおける抗体遺伝子の発現の影響
（１）発現プラスミドｐＵＢＣＨ１Ｌ、ｐＵＢＣＨ２Ｌ又はｐＵＢＣＨ３Ｌで形質転換した枯草菌ＤＢ１１７株を、培養温度が３０℃で実施例５と同様に培養し、遠心分離して培養上清を得た。
【００４８】
（２）培養上清中の抗体力価を実施例５と同様に測定した。
【００４９】
結果を図８に示す。使用した発現プラスミドは抗体Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を連結した配列において、ｐＵＢＣＨ１Ｌでは中性プロテアーゼ由来プロモーター、本発明のＳＤ配列（配列番号２９）および中性プロテアーゼ由来シグナル配列を含み、ｐＵＢＣＨ２Ｌでは本発明のＳＤ配列（配列番号２９）および中性プロテアーゼ由来シグナル配列のみを含み、またｐＵＢＣＨ３Ｌでは１３塩基の付加配列（配列番号３３）と本発明のＳＤ配列（配列番号２９）および中性プロテアーゼ由来シグナル配列を含む点で異なるが、これらの相違による抗体生産性への影響は認められなかった。図８には抗エストラジオール抗体産生ハイブリドーマ（特許文献８）の培養上清より調製した標準抗体（約１０μｇ／ｍＬ）の測定結果も示した。発色量の比較から前記３つの組換え枯草菌による抗体生産量は約１０μｇ／ｍＬと推定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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