(57)【要約】【課題】細胞を、その特性を損なうことなく、かつ細胞同士が重なり合うことなく分散した状態で３次元培養できる細胞培養用基材を提供する。【解決手段】平均繊維径が０．０５〜５μｍである高分子化合物より形成された繊維構造体の繊維表面上に、疎水性材料結合部位および細胞接着部位を有するキメラタンパク質が固定化された細胞培養用基材、かかる基材に幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体、ならびに該基材を含む細胞培養増殖装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均繊維径が０．０５〜５μｍである高分子化合物より形成された繊維構造体の繊維表面上に、疎水性材料結合部位および細胞接着部位を有するキメラタンパク質が固定化された細胞培養用基材。
【請求項２】
疎水性材料結合部位が免疫グロブリンの定常部の少なくとも一部のアミノ酸配列を含み、細胞接着部位がカドヘリンスーパーファミリーの細胞外ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
高分子化合物が生分解性の脂肪族ポリエステルである、請求項１または２に記載の細胞培養用基材。
【請求項４】
高分子化合物が熱可塑性樹脂である、請求項１または２に記載の細胞培養用基材。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養用基材に幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体。
【請求項６】
幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、間様系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、がん幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選ばれる一種以上の細胞である、請求項５に記載の幹細胞培養複合体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養用基材を含む細胞培養増殖装置。
【請求項８】
培養増殖可能な細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、間様系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、がん幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選ばれる一種以上の細胞である、請求項７に記載の細胞培養増殖装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の培養や増殖に適したキメラタンパク質固定化細胞培養用基材、それに幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体、および該基材を含む細胞培養増殖装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療において、細胞は重要な鍵要因のひとつであり、品質の安定した大量の細胞を確保することが大きな課題の一つである。特に、未分化な幹細胞や前駆細胞を大量かつ安定的に培養できるシステムの実現、実用化は強く望まれるものである。胚性幹細胞培養において、マウス胚性幹細胞はコンパクトに凝集して盛り上がった形状のコロニーを形成するのに対し、ヒト胚性細胞は扁平なコロニーを形成する。マウス胚性幹細胞は白血病阻害因子（ＬＩＦ）を培地に添加することにより安定に未分化状態を維持でき、ヒト胚性幹細胞培養においては塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の添加が有効である。しかし、マウスおよびヒト胚性幹細胞ともコロニーを形成することからコロニー中に含まれる最大の細胞数は限定されるため、再生医療で必要な細胞数を確保するためには大面積の培養基材が必要となったり、医療で用いる場合、コロニーを形成した細胞群を単分散させたりする必要がある。また、胚性幹細胞の培養にはフィーダー細胞が必要な場合もあるが、胚性幹細胞を医療に用いる場合には異種細胞の混入よる汚染も危惧される（非特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献１においては、胚性幹細胞培養の際、用いるフィーダー細胞の細胞膜上にノッチリガンドタンパク質を強制発現させ、培養効率を上昇させることが開示されている。しかしながら、依然フィーダー細胞を用いること、フィーダー細胞に、更に変異を加えていることなど、医療用途での使用を目的とする胚性幹細胞の培養方法としては課題が多い。
【０００４】
非特許文献２には合成樹脂で成型された培養基上へのサイトカインなどの生理活性因子の光固定化方法が開示されている。このアジドフェニル基を介した光固定化法は、光リソグラフィーを用いたマイクロパターニングへの応用展開の可能性があるものの、ＵＶ照射や発生するラジカルによる生理活性因子の活性喪失や、反応福次産物の影響に十分配慮する必要がある。また、活性が発揮できる立体配向性を制御しながら生理活性因子を培養基表面上に固定することは事実上困難であり、低効率な固定化法である。
【０００５】
特許文献２には、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインに直接つながれた可溶性タンパク質を含む融合タンパク質について記載されている。また、特許文献３には、基材の表面に、目的とする細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質が結合されている医療用支持体、血管再生用支持体、神経再生用支持体が開示されている。しかしながら、いずれの文献にも本発明の細胞培養基材についての開示はない。
【０００６】
ところで、カドヘリンは脊椎動物の組織でカルシウムイオン依存の細胞間接着に関与する主要な細胞接着分子であり、さまざまな臓器、組織よりその発現が確認されていて、それら一群はカドヘリンスーパーファミリーとよばれている。カドヘリンが存在しない、またはカドヘリンが機能しないようなカルシウムイオン非存在条件においては細胞同士の接着は阻害され、細胞は分散状態となる。また、カドヘリンは発生の過程においても重要な働きをもつことが見出されている。
一方、免疫グロブリンの重鎖を構成する定常領域は細胞膜を貫通できるなど疎水性が高い。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３４号公報
【特許文献２】特表２００３−５０８０２３号公報
【特許文献３】特開２００５−１６８７６０号公報
【非特許文献１】実験医学、２６、６４３−６４８、２００８
【非特許文献２】表面科学、２５、１６−２２、２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、細胞を、その特性を損なうことなく、かつ細胞同士が重なり合うことなく分散した状態で３次元培養できる細胞培養用基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は平均繊維径が０．０５〜５μｍである高分子化合物より形成された繊維構造体の繊維表面上に、疎水性材料結合部位および細胞接着部位を有するキメラタンパク質が固定化された細胞培養用基材である。
また、本発明はかかる細胞培養用基材に幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体である。
さらに、本発明は前記細胞培養用基材を含む細胞培養増殖装置である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞培養用基材によれば、例えば幹細胞を、その特性を損なうことなく、かつ細胞同士が重なり合うことなく分散した状態で３次元培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞培養用基材は、高分子化合物からなり０．０５〜５μｍの平均繊維径をもつ繊維構造体を基本骨格とする。５μｍより繊維径が太いと、細胞培養皿底面と比較した単位表面積の拡大効果に乏しく、０．０５μｍより繊維径が細いと、細胞が繊維上に定着することを困難にする。好ましい当該繊維構造体の平均繊維径は０．１〜５μｍであり、さらに好ましくは０．５〜５μｍである。
【００１２】
本発明で用いる繊維構造体は、単数または複数の繊維が積層され、必要に応じて繊維間が固定されて形成された２次元または３次元の構造体である。繊維構造体の形状は正方形、円形、球形、ブロック体、綿状であってもよく、その形状は問わない。
【００１３】
本発明で用いる繊維構造体は、高分子化合物であるかぎり、いずれの材料も用いることができるが、生分解性の脂肪族ポリエステルや熱可塑性樹脂が好ましい。また、製造のしやすさの観点からは揮発性溶媒に溶解可能な高分子化合物が好ましい。揮発性溶媒に溶解可能な生分解性高分子としては、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリメリレンカーボネート、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン、ポリフェニレンスルフィド、ポリスルホン、ポリエーテルサルフォン、非晶ポリアリレート、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、およびこれらの共重合体などが挙げられる。
【００１４】
これらのなかでも、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、およびポリエチレンサクシネート、ならびにこれらの共重合体などの脂肪族ポリエステルやポリスチレン、ポリプロピレンが挙げられ、さらに好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリスチレン、ポリプロピレンが挙げられる。なかでもポリスチレン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体が好ましい。
【００１５】
本発明で用いる繊維構造体においては、その目的を損なわない範囲で他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
【００１６】
次に、本発明で用いる繊維構造体の製造方法について説明する。当該繊維構造体を構成する繊維の紡糸方法は、公知のいずれの方法も用いることができるが、好ましくは静電紡糸法である。静電紡糸法には、用いる高分子化合物を溶媒に溶解させる工程がある。この溶液中の溶媒に対する高分子化合物の濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。高分子化合物の濃度が１重量％より小さいと繊維構造体を形成することが困難となり、好ましくない。また、３０重量％より大きいと、得られる繊維構造体の繊維径が大きくなり好ましくない。より好ましい溶液中の溶媒に対する生分解性高分子の濃度は２〜２０重量％である。
【００１７】
また、高分子化合物の溶媒は一種を単独で用いてもよく、複数の溶媒を組み合わせてもよい。かかる溶媒としては、高分子化合物を溶解可能で、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、アセトン、クロロホルム、エタノール、２−プロパノール、メタノール、トルエン、テトラヒドロフラン、水、ベンゼン、ベンジルアルコール、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、フェノール、ピリジン、トリクロロエタン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、これらの溶媒の混合溶媒が挙げられる。これらのなかでも、取扱い性や物性などから、ジクロロメタン、エタノール、ジメチルスルホキシドが好ましい。
【００１８】
次に、溶液に高電圧を印加させる工程と、溶液を噴出させる工程と、噴出された溶液から溶媒を蒸発させて繊維構造体を形成させる工程について説明する。
【００１９】
前記静電紡糸法においては、高分子化合物を溶解した溶液を噴出させて繊維構造体を形成させるために、溶液に高電圧を印加させる必要がある。電圧を印加させる方法については、高分子化合物を溶解した溶液を噴出させて繊維構造体が形成されるものであれば特に限定されないが、溶液に電極を挿入して電圧を印加させる方法や、溶液噴出ノズルに対して電圧を印加させる方法などがある。また、溶液に印加させる電極とは別に補助電極を設けることも可能である。
【００２０】
印加電圧の値は、前記繊維構造体が形成されれば特に限定されないが、通常は５〜５０ｋＶの範囲である。印加電圧が５ｋＶより小さい場合は、溶液が噴出されずに繊維構造体が形成されないため好ましくなく、印加電圧が５０ｋＶより大きい場合は、電極からアース電極に向かって放電が起きるため好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｋＶの範囲である。所望の電位は、公知の任意の適切な方法でつくればよい。
【００２１】
本発明で用いる繊維構造体は、高分子化合物を溶解した溶液を噴出させた直後に高分子化合物を溶解させた溶媒が揮発して形成される。通常の紡糸は大気下、室温で行われるが、揮発が不十分である場合には陰圧下で行うことや、高温の雰囲気下で行うことも可能である。また、紡糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は０〜５０℃の範囲である。
【００２２】
本発明で用いる繊維構造体は、公知のあらゆる滅菌方法で滅菌処理することができる。好ましく用いられる滅菌方法は、電子線照射やエチレンオキシドによるガス滅菌である。
【００２３】
本発明で用いるキメラタンパク質の製造には、当業者が用いうることいかなる遺伝子工学的手法を用いてもよい。そのなかでも好ましくは大腸菌発現系、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、および無細胞発現系であり、さらに好ましくは動物細胞発現系である。
【００２４】
本発明で用いるキメラタンパク質に含まれる免疫グロブリンの定常領域は、例えばＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＧ  ＣＨのようなドメインと、その変異型含んでいる。また、別のクラスの免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）に含まれる定常ドメインや、その変異型も含まれる。このなかでも好ましくはヒンジ領域とＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むものであり、さらに好ましくはヒンジ領域とＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ  Ｆｃフラグメントである。
【００２５】
本発明で用いるキメラタンパク質に含まれる細胞接着部位は、カドヘリンスーパーファミリーに属するすべての細胞外ドメインを含んでおり、このうち好ましくは古典的カドヘリンの細胞外ドメインであり、さらに好ましくはＥ−カドヘリンの細胞外ドメイン、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン、およびＶＥ−カドヘリンの細胞外ドメインである。
【００２６】
次に、繊維構造体上へのキメラタンパク質の固定化方法について説明するが、本発明の細胞培養用基材は特にこの固定化方法によるものに限定されない。好ましくは、１〜１００μｇ/ｍＬの濃度に調整したキメラタンパク質溶液中に繊維構造体を２〜４８時間、２〜３７℃の条件で浸漬後、リン酸緩衝液にて洗浄することにより繊維構造体上へキメラタンパク質を固定化できる。このうち好ましくは１〜２０μｇ/ｍＬのキメラタンパク質溶液中に繊維構造体を４℃、１２時間、または２５℃、４時間、または３７℃、２時間浸漬し、リン酸緩衝液にて洗浄するする方法である。さらに好ましくは５〜１５μｇ/ｍＬのキメラタンパク質溶液中に繊維構造体を４℃、１２時間浸漬し、リン酸緩衝液にて洗浄する方法である。
【００２７】
本発明の細胞培養用基材に播種して培養する細胞は、採取する組織、部位、種類により、特に限定されるものではない。好ましくは幹細胞や組織前駆細胞などの未成熟細胞であり、例えば胚性幹細胞、体性幹細胞、間様系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、がん幹細胞、人工多能性幹細胞、造血前駆細胞、血管内皮前駆細胞、骨髄前駆細胞、角膜前駆細胞、神経前駆細胞、赤血球前駆細胞、象牙芽前駆細胞、骨芽前駆細胞、破骨前駆細胞、前駆脂肪細胞である。さらに好ましくは胚性幹細胞、体性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞である。
【００２８】
本発明の細胞培養用基材を用いて細胞培養を実施するには、当該繊維構造体中に１×１０２〜１０８細胞／ｃｍ３の密度で細胞を播種することで達成される。好ましくは１×１０３〜１０７細胞／ｃｍ３の細胞密度での播種であり、さらに好ましくは１×１０４〜１０６細胞／ｃｍ３の密度での播種である。培養方法は当業者が用いる如何なる方法を採用してもよい。好ましくは細胞培養皿、細胞培養フラスコ、柱状体に細胞を含んだ細胞培養用基材を浸漬することにより実施される。培養に際して用いられる培養液は、播種する細胞を培養するのに適したものであればその種類を問わない。
本発明の細胞培養用基材に上述したような幹細胞を播種して培養することにより、本発明の幹細胞培養複合体を得ることができる。
【００２９】
また、本発明の細胞培養用基材に、上述したような幹細胞を播種して培養するのに適した環境を提供する器具や機構の一つ以上を組み合わせることで、本発明の細胞培養増殖装置とすることができる。かかる器具や機構としては、例えば培養容器、攪拌装置、培養液循環装置、温度調整装置、湿度調整装置、二酸化炭素や酸素などのガス供給装置、ガス組成調整装置、培地のｐＨ調整装置、各種センサなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の細胞培養用基材の製造過程においては、基本骨格である繊維構造体と生物機能を有するタンパク質を共有結合で固定化するような化学処理を施しておらず、活性が発揮できる立体配向性を制御しながら簡便に固定化する方法で作製されているので、生物機能を有するタンパク質の生物活性を損なうことがない。
【００３１】
また、驚くべきことに繊維構造体上にキメラタンパク質を固定する際、細胞培養皿底面と比較して単位表面積が約５０〜５０００倍に上昇するにもかかわらず、細胞培養皿を固定する際と同等のキメラタンパク質溶液濃度にて固定化することができた。
【００３２】
さらに、当該培養基中で培養される幹細胞は集合して凝集塊を形成することがなく、分散した状態を維持できる。また、当該繊維の繊維径は微細であるため、単位重量当たりの比表面積が大きく、幹細胞の３次元培養を可能にする。
本発明の細胞培養用基材を用いて幹細胞を培養している際、その培養液中に適当な生物機能因子を添加することにより幹細胞を所望の組織へと分化することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３４】
［実施例１］キメラタンパク質Ｎ−Ｃａｄ−Ｆｃの製造
（Ｎ−Ｃａｄ−Ｆｃ発現ベクターの作製）
Ｎ−カドヘリンを発現する成熟マウスの脳よりＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いてｍＲＮＡを調製し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（インビトロジェン社）を用いてマウス脳のｃＤＮＡライブラリーを作製した。得られたｃＤＮＡライブラリーをもとに、配列番号１および配列番号２で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＮ−カドヘリン配列を増幅した。次にこの配列を鋳型として配列番号３および配列番号４で表されるプライマーを用いたＰＣＲ法により、Ｎ−カドヘリン細胞外ドメインのｃＤＮＡを増幅した。このＤＮＡ配列にはＮ−カドヘリンをコードするＤＮＡ配列と、それをベクターに連結するための配列がＰＣＲの過程で付加されている。また、ＩｇＧのＦｃドメインの配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとの親和性を向上させるために変異導入されたもの（特開２００４−３２１１００号参照）を用いた。これらの遺伝子をｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インビトロジェン社）のＭＣＳに挿入することにより、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン配列とＦｃ配列が連結された発現ベクターＮ−ｃａｄ−ｆｃｐＲｃ／ＣＭＶベクター（図１）を得た。
【００３５】
（Ｎ−Ｃａｄ−Ｆｃ安定発現細胞株の作製）
上記の方法により得られたプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−Ｋ１にリポフェクタミン試薬（インビトロジェン社）を用いて遺伝子導入し、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む培養液を用いて限外希釈法により安定発現細胞株をクローニングした。
【００３６】
（Ｎ−Ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製）
クローニングした細胞を、血清を含まないＣＨＯ−ＳＦＭ培地に馴化させ、大量培養した。培養上清を回収して１０〜２０倍に濃縮後、ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を用いてＮ−Ｃａｄ−Ｆｃを精製した。精製したＮ−Ｃａｄ−Ｆｃについてはリン酸緩衝液を用いて４℃で透析後、以下に示す方法でタンパク質濃度および純度を測定して以降の実験に使用した。
【００３７】
（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる確認）
サンプルを等量の２×サンプルバッファー（１００ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ６．８、 ４％ ＳＤＳ、１．２％ ２−メルカプトエタノール、２０％ グリセロール）と混合し、９５℃で５分間加熱してタンパク質を変性させた後、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離した。電気泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜にセミドライ法により２０Ｖの定電圧で９０分間転写した。このＰＶＤＦ膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ（ナカライテスク社）を用いて室温で３０分間ブロッキング処理を行った。Ｆｃ部位を確認するためにパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１／１０，０００希釈液を室温で９０分間反応させた。検出にはＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて発光させ、Ｘ線フィルムに露光した。
【００３８】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を図２に示す。ｐｒｅは濃縮した精製前のサンプル、ｔｈｒｏｕｇｈはカラムに吸着しなかった画分、ｅｌｕｔｅは溶出画分である。サンプル中に含まれるＮ−Ｃａｄ−Ｆｃの大部分がカラムに吸着し、溶出画分１に溶出されていることが分かる。
【００３９】
（Ｎ−Ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質量の決定）
精製したＮ−Ｃａｄ−Ｆｃ溶液の全タンパク質濃度をＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて測定した。タンパク質濃度は約２００μｇ／ｍＬであった。次にサンプルを１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Ｃｏｐｐｅｒ  Ｓｔａｉｎ  ＆  Ｄｅｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて泳動後のゲルを染色した。染色後の泳動像について画像解析ソフトＩｍａｇｅ−Ｊを用いてＮ−Ｃａｄ−Ｆｃの純度を解析した結果、純度は約７０％であった。
【００４０】
［実施例２］ＰＬＬＡファイバーシートの作製
Ｌ−ポリ乳酸（ＰＬＬＡ、多木化学株式会社）８重量部、ジクロロメタン−エタノール（７：２、和光純薬工業株式会社、特級）９２重量部を室温（２５℃）で混合し、溶液を調製した。図３に示す装置を用いて紡糸を行い、繊維構造体を得た。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズル１からコレクター４までの距離は２０ｃｍであった。得られた繊維構造体の平均径は３．４μｍであった。
【００４１】
［実施例３］Ｎ−Ｃａｄ−Ｆｃ固定化ＰＬＬＡファイバー上でのＰ１９細胞の培養
実施例２で作製したＰＬＬＡファイバーシートを実施例１で調製したＮ−Ｃａｄ−Ｆｃ溶液（１０μｇ／ｍＬ）に４℃で一晩浸すことにより、ファイバー表面にＮ−Ｃａｄ−Ｆｃを固定化した。当該シートをリン酸緩衝液で洗浄後、Ｎ−カドヘリンを発現するマウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９を１．３×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、４日間培養を続けた。
【００４２】
図４Ｄに示されるように、４日後の位相差顕微鏡観察にてＰ１９細胞がＰＬＬＡ繊維に配向しながら接着、増殖している様子が観察された。これは、繊維上に固定化されたＮ−カドヘリンとＰ１９細胞表面のＮ−カドヘリンとが接着することにより、繊維と細胞との親和性が向上した結果であると考えられる。
以上により、本発明の細胞培養用基材によれば、細胞を、その特性を損なうことなく、かつ細胞同士が重なり合うことなく分散した状態で３次元培養できることが示された。
【００４３】
［比較例１］ＰＬＬＡファイバー上でのＰ１９細胞培養
実施例２で作製したＰＬＬＡファイバーシートをリン酸緩衝液で洗浄後、マウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９を１．３×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、４日間培養を続けた。
図４Ａに示されるように、４日後の位相差顕微鏡観察にて多数のＰ１９細胞がコロニー状に凝集塊を形成している様子が観察された。
【００４４】
［比較例２］ゼラチン固定化ＰＬＬＡファイバー上でのＰ１９細胞培養
実施例２で作製したＰＬＬＡファイバーシートを０．１％ ゼラチン溶液に４℃で一晩浸すことにより、ファイバー表面にゼラチンを固定化した。当該シートをリン酸緩衝液で洗浄後、マウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９を１．３×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、４日間培養を続けた。
図４Ｂに示されるように、４日後の位相差顕微鏡観察像にて多数の細胞がコロニー状に凝集塊を形成している様子が観察された。
【００４５】
［実施例４］Ｅ−Ｃａｄ−Ｆｃ固定化ＰＬＬＡファイバー上でのＰ１９細胞培養
実施例２で作製したＰＬＬＡファイバーシートをＥ−Ｃａｄ−Ｆｃ溶液（１０μｇ／ｍＬ）に４℃で一晩浸すことにより、ファイバー表面にＥ−Ｃａｄ−Ｆｃを固定化した。当該シートをリン酸緩衝液で洗浄後、マウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９を１．３×１０４／ｃｍ２の密度で播種し、４日間培養を続けた。
図４Ｃに示に示されるように４日後の位相差顕微鏡観察像にて細胞がＰＬＬＡ繊維に僅かに配向しながら接着している様子が観察された。これはＥ−カドヘリンとＮ−カドヘリンとの間の立体相同性に起因する結果と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の細胞培養用基材によれば、例えば幹細胞をその特性を損なうことなく、かつ細胞同士が重なり合うことなく分散した状態で３次元培養をすることができる。よって、細胞治療用の所望の幹細胞を大量に増殖、取得するためのバイオリアクターとして利用することができる。また、当該構造体を生体内へ埋植した場合は、再生医療用の材料として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明で用いるキメラタンパク質のベクター設計図である。
【図２】本発明で用いるキメラタンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ分析図である。
【図３】本発明の細胞培養用基材を製造するための装置の一例を模式的に示した図である。
【図４】本発明の細胞培養用基材中での細胞培養像である。
【符号の説明】
【００４８】
１    溶液噴出ノズル
２    溶液
３    溶液保持槽
４    電極
５    高電圧発生機
Ａ    未処理
Ｂ    ゼラチン
Ｃ    Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ
Ｄ    Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ
【図３】
2010063411.tif 000002
【図１】
2010063411.tif 000003
【図２】
2010063411.tif 000004
【図４】
2010063411.tif 000005
【配列表】
2010063411000001.app