(57)【要約】【課題】高血糖状態における生理機能の適正化を図ることが容易な最終糖化産物生成抑制剤を提供する。【解決手段】最終糖化産物生成抑制剤は、丹参の水抽出物、芍薬の水抽出物、香附子の水抽出物又は冠元顆粒を有効成分として含有する。この最終糖化産物生成抑制剤は、高血糖状態において促進される最終糖化産物（ＡＧＥｓ）の生成、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の変性、活性酸素（Ｏ２−）の生成及び過酸化脂質の増加を抑制するとともに、同状態において活性化されるポリオール経路を抑制する。その結果、高血糖状態における生理機能の適正化を図るとともに、糖尿病合併症の発症及び進展を抑える。冠元顆粒は、丹参、香附子、木香、紅花、芍薬及びセンキュウの各構成生薬を所定の配合割合（例えば重量比で４：１：１：２：２：２）で調合したものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
丹参の水抽出物、芍薬の水抽出物、香附子の水抽出物、又は丹参、香附子、木香、紅花、芍薬、センキュウを構成生薬とする冠元顆粒を有効成分として含有する最終糖化産物生成抑制剤。
【請求項２】
糖尿病合併症の発症及び進展を抑える作用を有することを特徴とする請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品や食品等の用途に利用される最終糖化産物生成抑制剤に関する。より詳しくは、冠元顆粒又はその構成生薬を有効成分とする最終糖化産物生成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、国民病とも言われるほどにその患者数が多いうえ、いわゆる糖尿病予備軍と疑われる人の数も多く、その数はさらに上昇している。しかし、糖尿病では、その初期において自覚症状が少ないという問題があるうえ、適切な予防措置を行わなければ合併症の発症及び進展が大きな問題となるケースも多い。このため、現在、糖尿病合併症の成因の解明や治療法の確立が急務となっている。
【０００３】
一方、従来より、冠元顆粒の薬理作用としては、血圧上昇抑制作用、脳血流量改善作用（脳卒中発症予防作用）、血液改善作用（抗トロンビン作用）等の血流改善作用が知られている。また、特許文献１には、老化促進モデルマウスの学習・記憶障害改善作用に基づいた抗痴呆剤が開示されている。その他、冠元顆粒には、月経困難症の改善作用、慢性肝炎の改善作用、難治性貧血の改善作用等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−５６６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、冠元顆粒が持つ新規な薬理作用を解明したことによりなされたものである。その目的とするところは、高血糖状態における生理機能の適正化を図ることが容易な最終糖化産物生成抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤の発明は、丹参の水抽出物、芍薬の水抽出物、香附子の水抽出物、又は丹参、香附子、木香、紅花、芍薬、センキュウを構成生薬とする冠元顆粒を有効成分として含有することを要旨とする。
【０００７】
この最終糖化産物生成抑制剤は、有効成分として丹参の水抽出物、芍薬の水抽出物、香附子の水抽出物、又は丹参、香附子、木香、紅花、芍薬、センキュウを構成生薬とする冠元顆粒を含有しているため、該有効成分の薬理作用により高血糖状態における生理機能の適正化が容易に図られる。即ち、前記有効成分としての冠元顆粒は、高血糖状態における血中総蛋白濃度及び血中アルブミン濃度の低下を抑えるとともに血糖値を低下傾向にする作用を有しており、糖尿病及び糖尿病前状態の人の高血糖状態における生理機能の適正化が図られる。なお、前記糖尿病としては１型糖尿病及び２型糖尿病の両方に効果がある。また、前記冠元顆粒が及ぼす薬理作用は、当該冠元顆粒の構成生薬である丹参、芍薬及び香附子が主に担っている。
【０００８】
さらに、前記有効成分は、高い抗酸化活性を有しているため、高血糖状態において生成される活性酸素を消去して蛋白質や脂質の過酸化による変性を抑える。このため、前記有効成分は、血中及び細胞内において糖尿病合併症に関与する蛋白糖化反応を介した最終糖化産物の生成やスーパーオキシドジスムターゼ等の活性酸素を消去する酵素の変性を抑制
する。その結果、血中及び細胞内の活性酸素量が低下し、当該活性酸素によって引き起こされる糖尿病合併症の発症及び進展が抑えられる。
【０００９】
またこのとき、前記有効成分は、細胞内のグルコース濃度の上昇に伴って活性化されるポリオール経路を抑制し、当該ポリオール経路を介してソルビトールが細胞内に蓄積されるのを抑える。細胞内へのソルビトールの蓄積は、浸透圧調節の異常をきたし、血管障害や神経障害等の糖尿病合併症の引き金となるが、前記有効成分は、細胞内へのソルビトールの蓄積を抑えることによって、細胞内の浸透圧調節を正常化させて生理機能の適正化を図るべく作用し、糖尿病合併症の発症及び進展を抑制する。
【００１０】
また、最終糖化産物生成抑制剤は、高血糖状態において発生しやすくなる蛋白質や脂質の過酸化による変性等の酸化ストレス傷害を抑える作用に優れているため、糖尿病及び糖尿病前状態の人の生理機能の適正化を図る効果に優れている。なお、前記高血糖状態とは、血糖値が医学的な正常範囲よりも高い状態を意味し、通常は空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬよりも高い状態を指す。
【００１１】
請求項２に記載の最終糖化産物生成抑制剤の発明は、請求項１に記載の発明において、糖尿病合併症の発症及び進展を抑える作用を有することを要旨とする。
この構成によれば、最終糖化産物生成抑制剤は、糖尿病及び糖尿病前状態の人の生理機能の適正化を図る効果に優れているため、それらの人々が糖尿病合併症を併発したり、悪化させたりするのを容易に抑えることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高血糖状態における生理機能の適正化を図ることが容易な最終糖化産物生成抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施形態の糖尿病合併症の発症及び進展メカニズムを模式的に示す。
【図２】（ａ）〜（ｃ）はいずれも、実施例１の評価項目２における血清成分の測定結果を示すグラフ。
【図３】（ａ）は実施例１の評価項目３における糖化蛋白量の測定結果を示すグラフ、（ｂ）は実施例１の評価項目４における過酸化脂質量の測定結果を示すグラフ、（ｃ）は実施例１の評価項目５におけるスーパーオキシドラジカル量の測定結果を示すグラフ。
【図４】（ａ）は実施例１の評価項目６における腎組織中のＳＯＤ活性の測定結果を示すグラフ、（ｂ）は実施例１の評価項目７における腎組織中のソルビトール含量の測定結果を示すグラフ。
【図５】（ａ）〜（ｇ）はいずれも、実施例２における抗酸化活性の測定結果を示すグラフ。
【図６】（ａ）〜（ｇ）はいずれも、実施例２におけるＡＧＥｓ生成抑制活性の測定結果を示すグラフ。
【図７】（ａ）〜（ｇ）はいずれも、実施例２における蛋白質の酸化抑制活性の測定結果を示すグラフ。
【図８】実施形態の高血糖状態における細胞内の生体反応を模式的に示す。
【図９】実施例３の細胞生存率の測定結果を示すグラフ。
【図１０】（ａ）は実施例３におけるＮＯ濃度の測定結果を示すグラフ、（ｂ）は実施例３におけるスーパーオキシド濃度の測定結果を示すグラフ。
【図１１】（ａ）は実施例３におけるパーオキシナイトライト濃度の測定結果を示すグラフ、（ｂ）は実施例３における細胞内酸化ストレスの測定結果を示すグラフ。
【図１２】実施例３におけるＮＦ−κＢに対する冠元顆粒の影響を表す蛍光顕微鏡写真。
【図１３】実施例３におけるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のウェスタンブロッティング解析結果を示す染色像。
【図１４】実施例４における血糖値の測定結果を示すグラフ。
【図１５】（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、実施例４における血糖値、糖化蛋白量及び過酸化脂質量の測定結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の糖尿病改善剤（糖尿病改善薬）は、有効成分として冠元顆粒を含有している。この糖尿病改善剤は、有効成分としての冠元顆粒が高血糖状態における生理機能の適正化を図る薬理作用を有しているため、糖尿病患者における合併症の発症及び進展の抑制を図るようになっている。さらに、この糖尿病改善剤は、糖尿病と疑われる人（いわゆる糖尿病予備軍の人）の健康状態の改善を図ることもできるようになっている。前記有効成分が及ぼす薬理作用は、冠元顆粒の構成生薬である丹参、芍薬及び香附子が主に担っており、丹参及び芍薬が重要であり、丹参が特に重要である。
【００１５】
なお、前記高血糖状態とは、血糖値が医学的な正常範囲（例えば７５ｇ経口糖負荷試験にて診断される）よりも高い状態を意味し、通常は空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬよりも高い状態を指す。また、前記糖尿病患者としては１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、若年発症型糖尿病）、又は２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、成人発症型糖尿病）と診断された患者を指す。前記糖尿病と疑われる人としては、糖尿病と診断されていない人であって空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬよりも高くなる傾向のある人、又は糖尿病前状態（耐糖能異常（impaired glucose tolerance））と診断された人を指す。
【００１６】
糖尿病は、膵のインスリン産生細胞（β細胞）におけるインスリン分泌不全又は標的細胞でのインスリン作用不全の結果生じる疾患であり、糖、蛋白質、脂質等の代謝異常を引き起こす。この糖尿病は、高血糖、糖尿、体蛋白質の崩壊、ケトン血症、アシドーシス等の症状を呈し、それらの症状が遷延すると網膜、腎糸球体、中枢神経系を中心とする血管障害等の合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー等）を併発するという特徴を有する。
【００１７】
冠元顆粒は、丹参（タンジン）、香附子（コウブシ）、木香（モッコウ）、紅花（コウカ）、芍薬（シャクヤク）及びセンキュウの６種類の構成生薬を所定の配合割合で調合した漢方薬（漢方方剤）である。この冠元顆粒は、１９６０年代に中国で脳・心血管疾患に対する治療薬の研究から誕生し、１９６９年には９種類の生薬からなる冠心一号方、続いて１９７８年には５種類の生薬（丹参、芍薬、センキュウ、紅花、降香）からなる冠心二号方が誕生し、さらに降香を木香、香附子に置き換えた冠元顆粒が１９９０年に日本で医薬品として承認された。
【００１８】
冠元顆粒に含まれる各構成生薬の配合割合は、丹参２．６〜６．８重量部、香附子０．６〜１．７重量部、木香０．６〜１．７重量部、紅花１．１〜３．４重量部、芍薬１．１〜３．４重量部、センキュウ１．１〜３．４重量部が好ましく、丹参、香附子、木香、紅花、芍薬及びセンキュウが重量比で４：１：１：２：２：２であるのが最も好ましい。この冠元顆粒は、中年以降又は高血圧傾向のあるものの頭痛、頭重、肩こり、めまい、動悸等の諸症状を改善する効能・効果を有している。
【００１９】
丹参はシソ科（Labiatae）の多年草タンジン（Salvia miltiorrhiza Bunge）の根からなる。香附子はカヤツリグサ科（Cyperaceae）の多年草ハマスゲ（Cyperus rotundus Linne）の根茎からなる。木香はキク科（Compositae）の多年草サウスレアラパア（Aucklandia lappa Decne (Saussurea lappa Clarke)）の根からなる。紅花はキク科（Compositae
）の１〜２年草木ベニバナ（Carthamus tinctorius Linne）の管状花からなる。芍薬はボタン科（Paeoniaceae）の多年草シャクヤク（Paeonia lactiflora Pallas）の根からなる。センキュウはセリ科（Umbelliferae）の多年草センキュウ（Cnidium officinale Makino）の根茎からなる。
【００２０】
この冠元顆粒は、前記構成生薬を所定の配合割合で混合し、この混合物全重量の５〜３０倍量、好ましくは１０〜２０倍量の水にて熱水抽出した後、抽出された熱水抽出液（冠元顆粒エキス）を濃縮及び乾燥することにより製造される顆粒状品である。前記濃縮及び乾燥は常用手段、例えば減圧蒸発濃縮法、スプレードライ法、凍結乾燥法等により行われる。この冠元顆粒の製造方法によれば、例えば、丹参４．５ｇ、香附子１．１２５ｇ、木香１．１２５ｇ、紅花２．２５ｇ、芍薬２．２５ｇ及びセンキュウ２．２５ｇ（合計１３．５ｇ）から、固形分４．５ｇの冠元顆粒が得られる。
【００２１】
こうして得られた冠元顆粒（固形物）は、そのまま散剤、粉剤等の形態で糖尿病改善剤として使用してもよく、或いは適当な賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等の添加剤とともに顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等の形態で糖尿病改善剤として使用してもよい。また、前記乾燥前の熱水抽出液又はその濃縮液を基にドリンク剤等の形態で糖尿病改善剤として使用することもできる。この糖尿病改善剤は、有効成分としての冠元顆粒を成人１日当たり好ましくは１〜２０ｇ、特に好ましくは４．５ｇ程度の摂取量を服用するとよく、好ましくは前記摂取量を１日複数回（３回程度）に分けて食間又は空腹時に服用するとよい。冠元顆粒を有効成分として含有する糖尿病改善剤の用途としては、漢方薬等の医薬品、又は健康食品や一般食品等の食品が挙げられる。この糖尿病改善剤は、血糖値が高めの人に摂取させることにより、それらの人々の生理機能の適正化を図ることができるようになっている。
【００２２】
次に、糖尿病合併症の発症及び進展メカニズムについて図１を参照しながら説明する。なお、図１に図示される下向き太矢印は、冠元顆粒によって引き起こされる作用を示し、例えば高血糖状態で活性化されるポリオール経路に対し、冠元顆粒が該経路の活性化を抑える作用を示すことを表している。また、前記下向き太矢印の太さは、前記冠元顆粒の作用の強さを表現している。
【００２３】
図１に模式的に示すように、高血糖状態の生体内では、血中及び細胞内における高い糖濃度によって非酵素的な蛋白糖化反応（メイラード反応、グリケーション）が進行しやすくなる。この蛋白糖化反応は、蛋白質のアミノ基と還元糖のアルデヒド基とが反応してシッフ塩基やアマドリ転位生成物のような蛋白糖化反応の前期生成物を生成した後、該前期生成物が脱水、酸化、縮合等の二次的な反応を経て、蛋白糖化反応の後期生成物である最終糖化産物（ＡＧＥｓ；advanced glycation endproducts）を生成させる。このＡＧＥｓは、糖尿病合併症に深く関与しているため、糖尿病合併症を直接引き起こし得る作用を有している。
【００２４】
また、前記蛋白糖化反応は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）やカタラーゼのような活性酸素の消去を行う酵素（蛋白質）をターゲットに進行すると、それらの酵素を変性させて酵素活性を低下させ、血中及び細胞内の活性酸素量を増大させる作用も有している。このＳＯＤの変性、前記ＡＧＥｓの生成、及び前記蛋白糖化反応は、いずれも血中及び細胞内の活性酸素（フリーラジカル）の生成を促進させる作用を有しており、当該活性酸素の生成を介して直接的又は間接的に糖尿病合併症の発症及び進展を引き起こす。前記間接的に糖尿病合併症が引き起こされる場合には、活性酸素が脂質を酸化して過酸化脂質を生成させ、当該過酸化脂質が糖尿病合併症の発症及び進展に関与する。
【００２５】
また、同図に示すように、高血糖状態の細胞内では、グルコース濃度の上昇に伴って、
アルドース還元酵素の活性が高められてポリオール経路が活性化するようになっている。このポリオール経路は、前記アルドース還元酵素によってグルコースをソルビトールへと変換（還元）する経路であり、細胞内へのソルビトールの蓄積を促進させる。この細胞内へのソルビトールの蓄積は、浸透圧調節のために細胞外液が細胞内に多量に浸入するという現象を引き起こす。その結果、蛋白質の変性や失活を引き起こしたり細胞内を酸欠状態にしたりして細胞機能の低下や細胞死を引き起こし、糖尿病合併症の発症及び進展に深く関与している。またこのとき、前記ソルビトールの蓄積は、活性酸素や過酸化脂質の生成促進を介して糖尿病合併症の発症及び進展を引き起こす作用も有している。
【００２６】
上述したような糖尿病合併症の発症及び進展メカニズムは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を正常な実験動物に経口投与することにより作出した試験研究用のモデル動物を用いて研究され得る。前記モデル動物は、糖尿病（１型及び２型糖尿病）に罹患したのと同様な症状が現れるため、インビボ（in vivo）の試験研究に用いられる。また、自然発症糖尿病ラットのような２型糖尿病のモデル動物を用いて、インビボの試験研究を行うこともできる。また、細胞培養において培養液中のグルコース濃度を高めることによって、高血糖状態を模したインビトロ（in vitro）の試験研究もできるようになっている。
【００２７】
このとき、前記蛋白糖化反応の進行度は、例えば、ＡＧＥｓ生成へと至る該蛋白糖化反応の中間生成物である糖化蛋白量を測定すること（図３（ａ）、図１５（ｂ）参照）、或いはＡＧＥｓの生成量を直接測定すること（図６参照）により定量可能である。前記活性酸素の生成度合いは、例えば、活性酸素量（スーパーオキシドラジカル量）、過酸化脂質量、ＳＯＤ活性を測定することにより定量可能である（図３（ｂ）、（ｃ）、図４（ａ）、図１５（ｃ）参照）。前記ポリオール経路の活性化度は、細胞内のソルビトール含量を測定することにより定量可能である（図４（ｂ）参照）。
【００２８】
そして、図１の下向き太矢印で示すように、冠元顆粒は、高血糖状態に起因する糖尿病合併症の発症及び進展へと向かう上記流れの中で、ＡＧＥｓの生成抑制、ＳＯＤ変性の抑制、活性酸素の生成抑制、ポリオール経路の活性化の抑制及び過酸化脂質の増加抑制を引き起こし、糖尿病合併症の発症及び進展を抑える効果を発揮する。また、冠元顆粒は、高血糖状態における血中総蛋白濃度及び血中アルブミン濃度の低下を抑える作用を有するとともに血糖値を低下傾向にする作用を有しており、高血糖状態における生理機能の適正化を図るようになっている（図２（ａ）〜（ｃ）、図１４参照）。
【００２９】
一方、図８に模式的に示すように、全ての細胞内には、普遍的に核内転写因子ＮＦ−κＢ（Nuclear factor-kappa B）が存在し、免疫グロブリン遺伝子、或いはサイトカイン遺伝子やその受容体遺伝子等の炎症関連遺伝子の転写調節領域に結合してこれらの遺伝子の転写を活性化している。このＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（Inhibitor-kappa B）による調節を受けて活性化され、前記遺伝子の転写を促進するようになっている。
【００３０】
さて、高血糖状態に曝された細胞内では、Ｉ−κＢと複合体を形成して不活化状態で存在するＮＦ−κＢが、Ｉ−κＢから解離して活性化されるとともに核内に移行し、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）遺伝子やシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）遺伝子等の炎症関連酵素遺伝子の転写を促進させる。さらに、同細胞内では、上述したように活性酸素（Ｏ２−，Ｈ２Ｏ２，・ＯＨ等）が生成されやすくなっている。
【００３１】
前記ｉＮＯＳは、マクロファージや血管平滑筋等に存在しており、炎症反応が起こると活性化される。このｉＮＯＳは、前記細胞質内で発現して一酸化窒素（ＮＯ）を生成させる反応を触媒し、その反応によって生成されたＮＯに前記活性酸素（スーパーオキシド）が反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）を生成させる。このパーオキシナイトライトは、ＮＯよりも強力な活性酸素であり、脂質や蛋白質の過酸化を引き起こす。また
、前記ＣＯＸ−２は、炎症に関わるプロスタグランジンの生成に関与しており、糖尿病合併症を始めとする多くの慢性疾患の病因となり得る。
【００３２】
これに対し、冠元顆粒は、上述したように細胞内における活性酸素の生成を抑制する（図１０（ｂ）、図１１（ｂ）参照）とともに、細胞質内で前記ＮＦ−κＢとＩ−κＢとの解離を抑えてＮＦ−κＢの核内移行及び活性化を抑制する（図１２参照）作用を有している。その結果、非特異的な炎症反応等の好ましくない生体反応を抑えて生理機能の適正化が図られるとともに、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の発現を抑制し（図１３参照）、高血糖状態におけるＮＯ及びパーオキシナイトライトの生成を抑える（図１０（ａ）、図１１（ａ）参照）。また、この冠元顆粒は、高血糖状態において増加する細胞死を抑える作用も有している（図９参照）。
【００３３】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態の糖尿病改善剤は、冠元顆粒を有効成分として含有している。この糖尿病改善剤は、有効成分としての冠元顆粒が、高血糖状態における血中総蛋白濃度や血中アルブミン濃度の低下を抑える作用を有するとともに血糖値を低下傾向にする作用を有しているため、糖尿病及び糖尿病前状態の人の生理機能の適正化を図ることができる。さらに、この糖尿病改善剤は、前記有効成分が高血糖状態において生成されやすくなる活性酸素を消去して蛋白質や脂質の過酸化による変性を抑えることから、活性酸素によって引き起こされる糖尿病合併症の発症及び進展を抑える効果に優れている。また、この糖尿病改善剤は、前記有効成分が細胞内グルコース濃度の上昇に伴って活性化されるポリオール経路の進行を抑制し、血管障害や神経障害等の糖尿病合併症の引き金となる細胞内へのソルビトールの蓄積を抑えるとともに、細胞内の浸透圧調節を正常化させて生理機能の適正化を図るべく作用する。よって、この糖尿病改善剤は、糖尿病及び糖尿病前状態の人の生理機能の適正化を図ることができるとともに、糖尿病合併症の発症及び進展を抑えることができる。
【００３４】
・  糖尿病改善剤は、天然の植物を原料とするとともに既に広く使用されている漢方薬を基礎としていることから、副作用の心配がないうえ、その他の薬効（頭痛、頭重、肩こり、めまい、動悸等の諸症状を改善する効能・効果）を有している点にも優れている。
【実施例１】
【００３５】
＜糖尿病モデルラットに対する冠元顆粒の効果＞
（冠元顆粒の調製）
本実験に用いた冠元顆粒の構成生薬及びその含有量は、２．２５ｇの芍薬（Paeoniae Radix）、２．２５ｇのセンキュウ（Cnidii Rhizoma）、２．２５ｇの紅花（Carthami Flos）、１．１２５ｇの香附子（Cyperi Rhizoma）、１．１２５ｇの木香（Aucklandiae Radix）及び４．５ｇの丹参（Salviae Miltiorrhizae Radix）からなる。これらの構成生薬を調合したものに２０倍量の水を加えて１００℃、１時間熱水抽出した。次いで、ろ過後に減圧濃縮して溶媒を留去したところ、収率４４％の冠元顆粒（冠元顆粒エキス）が得られた。
【００３６】
（糖尿病モデルラットの作製と評価）
８週齢のウイスター系雄性ラット（体重180-220g）にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）５０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内投与することにより糖尿病モデルラットを作製した。ＳＴＺ投与から１０日後に採血し、一群につき１１匹ずつ４群（コントロール群及び第１群〜第３群）にグループ分けをした。なお、各群に属するラットはそれぞれ血糖値と体重が概ね揃うようにグループ分けされた。次いで、第１群、第２群及び第３群の糖尿病モデルラットに対し、冠元顆粒をそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ体重、１００ｍｇ／ｋｇ体重及び２００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量となるように胃ゾンデで２０日間、連日経口投与した。なおこのとき
、前記冠元顆粒は蒸留水に溶解した状態で経口投与された。一方、コントロール群（Control Rat；図２〜４ではＣと略記）には蒸留水のみを与えた。連日経口投与終了後、血液及び腎臓を採取、最終投与後尿を採取するとともに、下記評価項目１〜７を測定した。また、前記ＳＴＺを投与していない正常ラット（Normal Rat；図２〜４ではＮと略記）についても比較のため同評価項目を測定した。
【００３７】
評価項目１；ラットの形態学的及び生理学的測定
連日経口投与前後のラットの体重を求め、連日経口投与後のラットの体重の増加量を算出した。連日経口投与後の腎臓重量（ウェット状態）を測定した。さらに、前記最終投与後に採取した尿量の平均値を求めた。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2010180250.tif 000003
表１より、２０日間の連日経口投与期間中の体重増加は、糖尿病モデルラットで有意に低下していたが、冠元顆粒投与群（第１群〜第３群）では上昇傾向であった。一方、腎臓重量は糖尿病モデルラットで有意に上昇していたが、冠元顆粒投与群では濃度依存的に低下傾向であった。尿量は糖尿病モデルラットで有意に上昇していたが、冠元顆粒投与群ではさらに有意な上昇を示していた。
【００３９】
評価項目２；血清成分の測定
採取した血液から血清を分離した後、該血清中の血糖値、総蛋白濃度、アルブミン濃度、尿素窒素量及びクレアチニンレベルを測定した。これら血清成分の測定は、いずれも市販キットであるグルコースＣII−テストワコー、Ａ／Ｇ Ｂ−テストワコー（和光純薬工業製）、ＢＵＮカイノス及びＣＲＥ−ＥＮカイノス（カイノス製）を用いた比色法にて測定した。結果を図２（ａ）〜（ｃ）及び表２に示す。
【００４０】
【表２】
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表２より、腎機能の指標である血清尿素窒素量及びクレアチニンレベルを測定した結
果、血清尿素窒素量は糖尿病によって有意に上昇し、冠元顆粒投与群では低下傾向にあった。しかしながら、クレアチニンレベルは糖尿病モデルラットでも変化は認められず、また冠元顆粒投与群においても変化していなかった。一方、図２（ａ）より、血糖値は糖尿病モデルラットで有意に上昇し、冠元顆粒投与群では低下傾向にあった。図２（ｂ）、（ｃ）より、血清中の総蛋白濃度及びアルブミン濃度は、いずれも糖尿病モデルラットで有意に低下していたが、冠元顆粒投与群では濃度依存的に有意に上昇していた。
【００４１】
評価項目３；糖化蛋白量の測定
採取した血液から血清を分離した後、該血清を蒸留水で１０倍希釈し、その１ｍＬに０．７５ｍＬのシュウ酸（oxalic acid）を加え、１００℃で２７０分間加熱後、４０％トリクロロ酢酸を加えて混和後、３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後の上清１ｍＬに０．２５ｍＬのチオバルビツール酸を加え、３７℃で３０分間反応後、４４３ｎｍにおける吸光度を測定し、糖化蛋白量に換算した。結果を図３（ａ）に示す。図３（ａ）より、血清中の糖化蛋白量は糖尿病モデルラットで有意に上昇し、冠元顆粒投与群では濃度依存的に低下するとともに高濃度では有意な低下が認められた。
【００４２】
評価項目４；過酸化脂質量の測定
血清１５０ｍＬ、０．０５Ｎ塩酸１．５ｍＬ、０．６７％チオバルビツール酸０．５ｍＬを９５℃で３０分間反応させることにより、過酸化脂質量の指標としてのマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）構造を有するチオバルビツール酸反応物（ＴＢＡ−ＲＳ）を生成させた。反応停止後に１５％メタノール含有ブタノールを２ｍＬ加え、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、５３５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＭＤＡ量に換算した。結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）より、血清中の過酸化脂質量は糖尿病モデルラットで有意に上昇し、冠元顆粒投与群では濃度依存的に低下するとともに高濃度では有意な低下が認められた。
【００４３】
評価項目５；スーパーオキシドラジカル量の測定
反応液（0.125μＭethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (ＥＤＴＡ)、62
μＭ nitro blue tetrazolium (ＮＢＴ)、98μＭ nicotinamide adenine dinucleotide reduced form (ＮＡＤＨ) をpH7.4の50ｍＭリン酸緩衝液に溶かしたもの）２００μＬに、血清２５μＬと、３３μＭフェナジンメトサルフェート（phenazine methosulfate；ＰＭＳ）含有５０μＭリン酸緩衝液２５μＬとを加え、５分間インキュベーション後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図３（ｃ）に示す。図３（ｃ）より、血清中のスーパーオキシドラジカル量は糖尿病モデルラットで有意に上昇し、冠元顆粒投与群では濃度依存的に低下するとともに高濃度では有意な低下が認められた。
【００４４】
評価項目６；腎組織中のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性の測定
腎臓の１０％ホモジネートをそれぞれ１０倍、１００倍及び１０００倍に希釈し、それぞれに緩衝液（65mM KH2PO4、35mM 四ホウ酸Na、0.5mM EDTA・2Na）０．２ｍＬ、０．５ｍＭキサンチン溶液０．２ｍＬ、１０ｍＭヒドロキシルアミン０．１ｍＬを加え、さらに０．２ｍｇ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ０．２ｍＬを加えて３０分間反応させた。次に、発色液（N-1-naphthylethylenediamine, sulfanilic acid, acetic acid）を加え、室温で３０分間反応後、５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＳＯＤ活性に換算した。結果を図４（ａ）に示す。図４（ａ）より、腎組織中のＳＯＤ活性は糖尿病モデルラットのコントロール群で有意に低下した。また、冠元顆粒投与群では、前記コントロール群と比べてＳＯＤ活性が上昇するとともに、高濃度（第３群）では有意な上昇を示していた。
【００４５】
評価項目７；腎組織中のソルビトール含量の測定
腎臓の７％ホモジネート１ｍＬに０．４５７Ｍ水酸化ナトリウム（NaOH）０．５ｍＬと０．２９３Ｍ硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）０．５ｍＬとを加え、３，０００ｒｐｍで１５分間
遠心分離した。上清０．０５ｍＬに、０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液を０．２５ｍＬ、０．１ＭのＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．０５ｍＬ、２５０ｍｇ／ｄＬのＮＡＤ（nicotinamide adenine dinucleotide）を０．５ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬのソルビトールデヒドロゲナーゼ（sorbitoldehydrogenase）を０．０２５ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させた。その後、蛍光強度（励起波長 365nm、蛍光波長 450nm）を測定し、ソルビトール含量に換算した。結果を図４（ｂ）に示す。図４（ｂ）より、腎組織中のソルビトール含量は糖尿病モデルラットで有意に上昇し、冠元顆粒投与群（第２群、第３群）では有意に低下した。
【００４６】
以下に、上記評価項目１〜７の評価結果より導出される考察を記載する。
本実施例においてＳＴＺにて誘導された糖尿病モデルラットは、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方に対するモデル動物として汎用されている。このため、本実施例にて得られた結果は、１型及び２型糖尿病の両方に当てはめて考えることができる。
【００４７】
糖尿病合併症の成因の一つとして、非酵素的な蛋白糖化反応（メイラード反応）の後期生成物であるＡＧＥｓが注目されている。ＡＧＥｓは、蛋白質のアミノ基と還元糖のアルデヒド基とが反応して、シッフ塩基、アマドリ転位生成物のような前期生成物を経由して、脱水、酸化、縮合等の反応を経て得られる後期反応生成物であり、糖尿病合併症、動脈硬化、老化等に深く関与している。そして、このＡＧＥｓを生成する過程で活性酸素が産生される。今回、ＡＧＥｓ生成の指標としてその中間生成物である糖化蛋白量を、ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラットを用いて測定したが、糖化蛋白の生成は冠元顆粒によって抑制された。しかしながら、高血糖に対する改善作用（血糖値の低下作用）が統計学的有意には見られなかったことから、冠元顆粒はＡＧＥｓの生成過程に作用して蛋白糖化反応の低下をもたらしているものと考えられる。
【００４８】
一方、冠元顆粒によってＳＯＤ活性の上昇とスーパーオキシドラジカルの生成低下とが認められたことから、前記蛋白糖化反応の低下がＳＯＤ活性−スーパーオキシドラジカル系、又は直接活性酸素・フリーラジカル生成に好影響をもたらしたものと考えられる。また、脂質の過酸化は、脂質ラジカルの連鎖反応によって引き起こされる。その脂質過酸化の指標であるＴＢＡ−ＲＳの生成が冠元顆粒投与群で抑制されたことから、冠元顆粒が脂質ラジカルの連鎖反応に対して好影響を及ぼしていることが示唆される。
【００４９】
高血糖によってポリオール経路を介したアルドース還元酵素の活性化が引き起こされ、その結果ソルビトールが細胞内に蓄積されやすくなる。このソルビトールの蓄積は、細胞外液を細胞内に浸入させて浸透圧調節を行うべく作用するが、そのために細胞内の蛋白質等が変性したり、酸欠状態となったり、細胞が死滅したりしやすくなる。このことから、細胞内へのソルビトールの蓄積は、糖尿病症状の悪化と合併症の誘発及び進展の一因となるが、冠元顆粒が腎臓中のソルビトール蓄積を抑制したことは、アルドース還元酵素に対する抑制的作用を示唆している。
【００５０】
冠元顆粒の構成生薬の１つである丹参は、腎機能改善作用を有することを本発明者らが報告している。そこで、本実験では、腎機能パラメーターである血清尿素窒素量、クレアチニンレベル及び尿量を測定した。しかしながら、本実験に用いた糖尿病モデルラットでは、正常ラットと比較して尿素窒素量が有意に上昇していたが、クレアチニンレベルについてはほとんど変わらなかった。また、前記糖尿病モデルラットの尿量は正常ラットと比べて著しく有意に増加していた。これに対し、冠元顆粒投与群では血清尿素窒素及びクレアチニンの血中レベルに有意な変化を認めなかったが、尿量についてはさらに有意に増加していた。しかし、腎重量には何ら影響を及ぼしていないことから、尿量が増加した原因として冠元顆粒の血流改善による利尿作用によるものと推測される。
【００５１】
一方、血清中の蛋白質、中でも特に含量が多いアルブミンは肝臓で生合成されるが、糖尿病モデルラットではそのアルブミン濃度が著しく有意に低下していた。これに対し、冠元顆粒投与群では、投与量に依存してアルブミン濃度が有意に増加しているため、肝機能の改善と糖尿病による低栄養状態の改善とがなされているものと推測される。なお、この推測を裏付けるデータとして、糖尿病で減少した体重の改善傾向が認められている。
【００５２】
従って、冠元顆粒は、高血糖状態によって引き起こされる蛋白糖化反応やポリオール経路の活性化を抑制していたが、これらの抑制作用は冠元顆粒の抗酸化作用に寄与しているものと考えられる。一方、この冠元顆粒は、血糖値への有意な改善作用は認められなかったが、前記高血糖状態によって引き起こされる様々な反応や経路を抑制していることから、高血糖が引き金となって起こる糖尿病合併症の発症及び進展を抑制する作用を有していることが強く示唆される。
【実施例２】
【００５３】
＜インビトロ実験＞
冠元顆粒、丹参、芍薬、センキュウ、紅花、木香、香附子のそれぞれについて、抗酸化活性（ＤＰＰＨラジカル消去活性）、ＡＧＥｓ生成抑制活性、及びＡＡＰＨ（2,2’-azobis(2-amidinopropane)-dihydrochloride）による蛋白質の酸化抑制活性をインビトロで測定した。
【００５４】
（抗酸化活性の測定）
ＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去活性の測定は、波多野らの方法（Hatano, T., Edamatsu. R., Hiramatsu, M. , Mori, A., Fujita, Y. Yasuhara,T:' Yoshida, T. and Okuda, T. : Effects of the interaction of taninnins with co-existing substances. VI. Effects of tannins and related polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Chem. Pharm. Bull. 37, 2016-2021 (1989).）に従って測定した（５４０ｎｍの吸光度）。このとき、試料としての冠元顆粒、丹参、芍薬、センキュウ、紅花、木香又は香附子を、それぞれ図５（ａ）〜（ｇ）のグラフの横軸に示される濃度となるように添加した。試料を添加していないときの吸光度と、試料を各種濃度で添加したときの吸光度とによりラジカル消去活性を求めた。結果を図５（ａ）〜（ｇ）のグラフに示すとともに、図５（ａ）〜（ｇ）のグラフより導出されるラジカル消去活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を同図内に括弧書きにて示す。
【００５５】
図５（ａ）〜（ｇ）より、丹参、芍薬、紅花及び香附子に高い抗酸化活性があり、これらの活性、特に丹参の抗酸化活性が冠元顆粒の抗酸化作用に寄与していると考えられる。従って、冠元顆粒が糖尿病状態における酸化ストレス傷害を抑える作用に優れている一因として、丹参を中心とする高い抗酸化活性が関与しているものと考えられる。
【００５６】
（ＡＧＥｓ生成抑制活性の測定）
１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２５ｍＭグルコース及び２５ｍＭフルクトースを添加した高血糖状態の血清を模したリンゲル液に、試料としての冠元顆粒、丹参、芍薬、センキュウ、紅花、木香又は香附子を、それぞれ図６（ａ）〜（ｇ）のグラフの横軸に示される濃度となるように添加し、３７℃で２週間インキュベートした。そして、このリンゲル液中に生成されたＡＧＥｓ量をVinsonとHowardの方法（Vinson,J.A.,Howard III,T.B. Inhibition of protein glycation and advanced glycation end products by ascorbic acid and other vitamins and nutrients. J.Nutr:Biochem.7:659-663(1996)）に従って測定した。そして、試料を添加していないときのＡＧＥｓ生成量と、試料を各種濃度で添加したときのＡＧＥｓ生成量とによりＡＧＥｓ生成阻害率を求めた。結果を図６（ａ）〜（ｇ）のグラフに示すとともに、図６（ａ）〜（ｇ）のグラフより導出さ
れるＡＧＥｓ生成活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を同図内に括弧書きにて示す。
【００５７】
図６（ａ）〜（ｇ）より、丹参及び芍薬に高いＡＧＥｓ生成阻害活性があり、これらの活性、特に丹参のＡＧＥｓ生成阻害活性が冠元顆粒のＡＧＥｓ生成阻害作用に寄与していると考えられる。また、香附子にも丹参及び芍薬と比べると若干弱いがＡＧＥｓ生成阻害活性があった。従って、血糖値が高い血中においても冠元顆粒がＡＧＥｓの生成を阻害している可能性が高く、糖尿病合併症の抑制に優れた効果を発揮し得ることが強く示唆される。また、この効果は、丹参又は芍薬でも発揮され得ることが示唆される。
【００５８】
（蛋白質の酸化抑制活性の測定）
糖尿病状態では、ＡＡＰＨが蛋白質の酸化変性を促進させる作用を有し、この作用が合併症の発症及び進展に大きく関わっている。そこで、蛋白質として蛍光性のあるアロフィコシアニン（allophycocyanin）を用い、ＡＡＰＨによるアロフィコシアニンの分解（変性）促進作用を冠元顆粒又はその構成生薬が抑えられるか否かについて検討した。なお、前記ＡＡＰＨによるアロフィコシアニンの分解量は、Courderot-Masuyerらの方法（Courderot-Masuyer,C.,Dalloz,F.,Maupoil,V.Rochette,L.Antioxidant properties of aminoguanidine. Fundam.Clin.Pharmacol.13:535-540(1999)）に従って測定した。
【００５９】
即ち、３７．５ｎＭのアロフィコシアニン及び３ｍＭのＡＡＰＨを添加したリン酸緩衝液に、試料としての冠元顆粒、丹参、芍薬、センキュウ、紅花、木香又は香附子を５μｇ／ｍＬ添加した。試料添加後から０分、５分、１０分、２０分及び３０分後に前記リンゲル液を少量ずつ採取し、励起波長５９８ｎｍ、蛍光波長６５１ｎｍでそれぞれ蛍光強度を測定した。なお、コントロールとしては前記試料を添加していないものを用いた。結果を図７（ａ）〜（ｇ）のグラフに示すとともに、図７（ａ）〜（ｇ）のグラフより導出されるアロフィコシアニンの分解を５０％阻害する時間（ｔ１／２）を同図内に括弧書きにて示す。
【００６０】
図７（ａ）〜（ｇ）より、丹参及び芍薬にアロフィコシアニンの酸化抑制活性が高く、特に丹参による高い酸化抑制活性が冠元顆粒の酸化抑制作用に寄与していると考えられる。従って、冠元顆粒、丹参及び芍薬は、糖尿病状態における蛋白質の酸化変性を抑えて糖尿病合併症の抑制に優れた効果を発揮することが示唆される。
【実施例３】
【００６１】
＜高濃度グルコース誘導細胞毒性に対する冠元顆粒の効果＞
本実施例では、高血糖状態における酸化ストレスに及ぼす冠元顆粒の影響を、細胞レベルで検討した。
【００６２】
（細胞生存率と形態学的検討）
ブタ腎上皮細胞ＬＬＣ−ＰＫ１（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）が２×１０４細胞／ｍＬの濃度で懸濁された細胞懸濁液（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液）２００μＬを９６穴プレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養液中に５ｍＭグルコースを添加し、さらに２４時間培養した。次いで、５ｍＭ又は３０ｍＭグルコースと、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの冠元顆粒とを添加して２４時間培養した。そして、細胞生存率をＭＴＴ法（Mosmann,T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival :application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65,55-63,1983.）に従って測定した（５４０ｎｍの吸光度）。結果を図９に示す。また、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の形態学的検討は、該細胞が２×１０４細胞／ｍＬの濃度で懸濁された細胞懸濁液を６穴プレートに２ｍＬ播種し、上記と同様の方法で培養し、顕微鏡下で撮影した。
【００６３】
図９より、高濃度グルコース処理による細胞毒性は、冠元顆粒処理によって濃度依存的に減少した。即ち、細胞生存率は、３０ｍＭグルコース処理によって３０％程度減少したが、冠元顆粒処理群では５ｍＭグルコース処理と同程度にまで回復していた。この効果は顕微鏡撮影による形態学的変化にも影響を及ぼしていた。なお、データは示さないが、前記ＭＴＴ法の代わりにトリパンブルー法で同様の試験を行ったところ、得られた結果はほぼ同様であった。以上より、冠元顆粒は、高濃度のグルコースによって誘導される細胞毒性を軽減する効果に優れている。
【００６４】
（一酸化窒素（ＮＯ）濃度の測定）
活性酸素の１種であるＮＯの測定は、グリース法に基づいた亜硝酸塩（nitrite）の定量法を利用して行った。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞が２×１０４細胞／ｍＬの濃度で懸濁された細胞懸濁液２００μＬを９６穴プレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養液中に５ｍＭグルコース（Ｇｌｃ）を添加し、さらに２４時間培養した。次いで、５ｍＭ又は３０ｍＭグルコースと、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの冠元顆粒とを添加して２４時間培養した（以下、このときの培養液を培養液Ａと記載する）。１００μＬの培養液Ａにグリース試薬（0.1％N-(-1-naphtyl) ethylendiamine, 1％ sulfanilamide, 2.5％ Ｈ３ＰＯ４）を加え、室温で５分間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＮＯ濃度に換算した。結果を図１０（ａ）に示す。
【００６５】
（スーパーオキシド（Ｏ２−）濃度の測定）
反応液（0.125ｍＭ ＥＤＴＡ, 62μＭ ＮＢＴ, 98μＭ ＮＡＤＨ含有５０ｍＭリン酸緩衝液）に、前記培養液Ａと３３μＭのＰＭＳとを加え、５分間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１０（ｂ）に示す。
【００６６】
酸化ストレスによって上皮細胞の機能障害が起こることが知られているが、本実験では、高血糖によって酸化ストレス状態が誘導された細胞に対する冠元顆粒の影響を調べるため、ＮＯ濃度及びスーパーオキシド濃度を測定した。図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、高濃度グルコースによってスーパーオキシド濃度及びＮＯ濃度が上昇した。特に、スーパーオキシド濃度は、３０ｍＭグルコース処理によって、５ｍＭグルコース処理群より２０％程度上昇していた。一方、ＮＯ濃度は、３０ｍＭグルコース処理によって、５ｍＭグルコース処理群より１５０％も上昇していた。これに対し、５０μｇ／ｍＬの冠元顆粒を投与した群では、スーパーオキシド濃度及びＮＯ濃度は、それぞれ３０ｍＭグルコース処理のみの場合より３４％及び４４％低下していた。
【００６７】
（パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）濃度の測定）
ジヒドロローダミン１２３（dihydrorhodamine 123）は、パーオキシナイトライトによる酸化反応によって濃度依存的にローダミン１２３（rhodamine 123）を生成させる。前記培養液Ａに、６．２５μＭのジヒドロローダミン１２３を含有する緩衝液（pH 7.4, 125μＭ diethylenetriamine-N,N,N',N",N"- pentaacetic acid）を加え、３７℃で５分間インキュベーションした。パーオキシナイトライト濃度は、ローダミン１２３の吸収波長である５００ｎｍにおける吸光度を測定した後に濃度換算した。結果を図１１（ａ）に示す。
【００６８】
パーオキシナイトライトは、スーパーオキシドとＮＯとが反応して生成される強力な酸化物であるが、腎臓では腎虚血−再灌流の生理に関与していることが報告されている。図１１（ａ）に示すように、３０ｍＭグルコース処理によって、５ｍＭグルコース処理群と比較してパーオキシナイトライト濃度は８０％程度上昇していた。これに対し、冠元顆粒は、高濃度グルコースによって上昇したパーオキシナイトライト濃度を濃度依存的に低下
させた。
【００６９】
（細胞内酸化ストレスの測定）
WangとJosephの方法（Wang,H. and Joseph,J.A.: Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. Free Radic. Biol. Med. 27,612-616,1999.）に従って細胞内の活性酸素量を定量することにより、細胞内における酸化ストレス状態を測定した。前記活性酸素量の定量は、安定な酸化変化を測定する方法であり、非蛍光物質であるＤＣＦＨ−ＤＡ（2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate）が活性酸素存在下で強い蛍光を示す蛍光物質ＤＣＦ（2’,7’-Dichlorofluorescein）に変換されるという原理に基づく。
【００７０】
即ち、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞が２×１０４細胞／ｍＬの濃度で懸濁された細胞懸濁液２００μＬを９６穴プレートに播種し、５ｍＭグルコース含有培養液で２４時間予備培養した。次いで、５ｍＭ又は３０ｍＭグルコースと、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの冠元顆粒とを添加して２４時間培養後、リン酸緩衝液で洗浄し、１００μＭのＤＣＦＨ−ＤＡを１００μＬ加えて１５分間培養した。その後、９６穴プレート内から培養液を取り除いてＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液を加え、１時間培養した。この９６穴プレートについて、マイクロプレートリーダー（Tecan；励起波長:485nm、蛍光波長:535nm）にて蛍光物質ＤＣＦの蛍光強度を測定した。結果を図１１（ｂ）に示す。
【００７１】
図１１（ｂ）に示す結果は、５ｍＭグルコース及び０μｇ／ｍＬの冠元顆粒を含有する培養液で培養した細胞をコントロールとし、当該コントロールの蛍光強度を１００％としたときの相対値で表されている。図１１（ｂ）より、細胞内活性酸素量をＤＣＦＨ−ＤＡアッセイにて測定した結果、３０ｍＭグルコース処理細胞における細胞内活性酸素量は、５ｍＭグルコース処理細胞と比較して約２倍に増加していたが、冠元顆粒処理細胞では濃度依存的に低下していた。
【００７２】
（核内転写因子ＮＦ−κＢに対する冠元顆粒の影響）
図８に模式的に示すように、高血糖状態に曝された細胞質内では、上述したように活性酸素（Ｏ２−，Ｈ２Ｏ２，・ＯＨ等）が生成されやすくなっている。また、高血糖状態に曝された細胞内では、細胞質内でＩ−κＢと結合して不活化状態で存在するＮＦ−κＢが、Ｉ−κＢから解離して活性化されるとともに核内に移行し、ｉＮＯＳ遺伝子やＣＯＸ−２遺伝子等の炎症関連酵素遺伝子の転写を促進させる。ｉＮＯＳは、マクロファージや血管平滑筋等に存在し、炎症反応等により活性化される。このｉＮＯＳは、前記細胞質内で発現してＮＯを生成させる反応を触媒し、その反応によって生成されたＮＯに前記活性酸素（スーパーオキシド）が反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）を生成させる。パーオキシナイトライトはＮＯよりも高い活性を有する活性酸素であり、脂質や蛋白質の過酸化を引き起こす。また、前記ＣＯＸ−２は、炎症に関わるプロスタグランジンの生成に関与しており、多くの慢性疾患の病因となり得る。
【００７３】
本実験では、高血糖状態に曝したＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＮＦ−κＢの局在を調べた。即ち、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞が懸濁された細胞懸濁液を６穴プレートに播種し、５ｍＭグルコース含有培養液で２４時間予備培養した。次いで、５ｍＭ又は３０ｍＭグルコースと、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの冠元顆粒とを添加して２４時間培養した。
【００７４】
これらＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養細胞を３．７％パラホルムアルデヒドで３０分間、４℃で固定後、洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を３０分間、４℃で浸透させた。次いで、前記細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、２％ＢＳＡで１時間ブロッキング後、anti-ＮＦ−κＢ抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.から購入）を加えて２時間、４℃で処
理した。次に、anti-ＮＦ−κＢ抗体を結合させた細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、ＦＩＴＣ（Fluoresceinisothiocyanate）−共役 anti-rabbit ＩｇＧを加えて１時間、４℃でインキュベーションし洗浄した。最後に、これらの細胞に対し、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-phenylindole）を加えて５分間室温で染色後、リン酸緩衝液で２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１２に示す。
【００７５】
ＮＦ−κＢは、炎症関連酵素の発現を調節し、サイトカイン（cytokines）、ケモカイン（chemokines）、免疫受容体（immunoreceptors）等の免疫応答の中心的メディエーターの活性に関与している。図１２に示すように、ＮＦ−κＢは５ｍＭグルコース処理細胞では細胞質にとどまっていたが、３０ｍＭグルコースで処理細胞では核内に移行していた。しかしながら、冠元顆粒処理した細胞では、５ｍＭグルコースで処理細胞とほとんど変わらず、細胞質にとどまっていた。
【００７６】
（ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のウェスタンブロッティング解析）
本実験では、高血糖状態に曝したＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の発現をウェスタンブロッティングにより調べた。即ち、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞が懸濁された細胞懸濁液を１０ｍＬカルチャーディッシュに播種し、５ｍＭグルコース含有培養液で２４時間予備培養した。次いで、５ｍＭ又は３０ｍＭグルコースと、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの冠元顆粒とを添加して２４時間培養した。
【００７７】
これらＬＬＣ−ＰＫ１細胞を１０ｍＬカルチャーディッシュの底面から剥離して回収した後、抽出緩衝液（25ｍＭ Tris-HCl (pH 7.5), 250ｍＭ NaCl, 5ｍＭ ＥＤＴＡ, 1％ nonidet P-40, 1ｍＭphenylmethylsulfonyl fluoride (ＰＭＳＦ), 1ｍＭ ＤＴＴ, 50μＬプロテアーゼインヒビターカクテル）を加え、細胞内の蛋白質を抽出した。抽出された蛋白質の量は、Bio-Rad protein assay kit（バイオラッド社製）で測定した。ウェスタンブロッティングは、３０μｇの蛋白質が含まれるように電気泳動用緩衝液に溶解させ、常法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜にトランスファーし、当該ニトロセルロース膜について免疫ブロット解析（immunoblot analysis）を行った。
【００７８】
この免疫ブロット解析では、anti-ＮＯＳ２（ｉＮＯＳ）モノクローナル抗体、anti-ＣＯＸ−２モノクローナル抗体、蛋白質発現量の標準マーカーとしてのanti-ＣＯＸ−１モノクローナル抗体、及びペルオキシダーゼ標識化２次抗体（peroxidase-labeled secondary antibody）を用いた。これらの抗体は、いずれもSanta Cruz Biotechnology Inc.から購入した。なお、前記免疫ブロット解析は、ニトロセルロース膜をＥＣＬ（enhanced chemiluminescence）法にて撮影することにより実施した。結果を図１３に示す。
【００７９】
ＮＯＳによるＮＯ産生は、マクロファージ、肝細胞、好中球、上皮細胞等の種々の細胞で見られることが知られている。図１３より、高濃度グルコース処理によってｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２が多量に発現していた。ｉＮＯＳは、３０ｍＭグルコース処理群で過剰発現していたが、冠元顆粒処理により濃度依存的に発現量が低下していた。一方、ＮＯとプロスタグランジンは、いずれも多くの慢性疾患の病因であることが知られているが、プロスタグランジンの合成過程を触媒するＣＯＸはアラキドン酸をプロスタグランジンに変換する酵素である。ＣＯＸ−２は炎症に関わるプロスタグランジンの生成に関与しており、ＣＯＸ−１はほとんど全ての臓器に恒常的に発現している蛋白質であって、本実験では蛋白質発現量の標準マーカーとして用いた。本実験において、ＣＯＸ−２が高濃度グルコース処理によって過剰発現していたが、冠元顆粒はＣＯＸ−２の発現量を濃度依存的に低下させた。
【００８０】
上述したように、腎上皮細胞に対して高濃度グルコースによる酸化ストレスを与えたところ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２及び活性酸素の産生が高められた。これに対し、冠元顆粒は
、図８に示される高血糖状態の細胞において、細胞内の転写因子ＮＦ−κＢの核内への移行（活性化）を抑制するとともに活性酸素の生成を直接抑制した。さらに、冠元顆粒は、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２及び様々な種類の活性酸素の産生を抑制し、糖尿病合併症の発症及び進展を抑える効果があることが示された。即ち、本実験により、新しい視点からの冠元顆粒の作用が明らかになった。
【実施例４】
【００８１】
＜自然発症糖尿病ラットに対する冠元顆粒の効果＞
大塚製薬（株）より供与された自然発症糖尿病ラット（Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty Rat；ＯＬＥＴＦラット）を用いて、２型糖尿病に対する冠元顆粒の効果を検討した。なお、ＯＬＥＴＦラットは、肥満を伴うインスリン非依存性糖尿病を呈し、本邦の糖尿病患者の９０％以上を占める２型糖尿病のモデル動物である。また、腎症、神経障害等の合併症を引き起こすことも知られている。
【００８２】
まず、ＯＬＥＴＦ雄性ラットを２２週齢まで飼育し、いずれも高血糖状態であったことを確認した後、ＯＬＥＴＦ対照群、第１群及び第２群の３つの群にグループ分けをした。なお、各群に属するラットはそれぞれ血糖値と体重が概ね揃うようにグループ分けされた。次いで、第１群及び第２群のラットには、蒸留水に溶かした冠元顆粒をそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、及び１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量となるように胃ゾンデで１５週間、連日経口投与した。一方、ＯＬＥＴＦ対照群には蒸留水のみを同様に投与した。
【００８３】
その後、投与３週間毎に各ラットの尾静脈より採血を行い、それぞれ血糖値を測定した。結果を図１４に示す。さらに、投与１５週後に各ラットの腹部下大動脈より採血を行い、血糖値、糖化蛋白量及び過酸化脂質量をそれぞれ測定した。これらの結果を図１５（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示す。なお、糖尿病を発症せず、かつＯＬＥＴＦラットと遺伝的に近縁のＬＥＴＯ（Long-Evans Tokushima Otsuka）ラットを正常対照群（ＬＥＴＯ対照群）として用い、前記ＯＬＥＴＦ対照群と同様に調べた。
【００８４】
その結果、図１４より、ＯＬＥＴＦ対照群の血糖値は、ＬＥＴＯ対照群より高く、投与後１２週目（３４週齢）まではおよそ８０％高い値を示していたが、ＯＬＥＴＦラットに冠元顆粒を投与した第１群及び第２群では、いずれも血糖値が投与量依存的に低下していた。ところが、図１４及び図１５（ａ）に示すように、投与後１５週目では、ＯＬＥＴＦ対照群及びＬＥＴＯ対照群いずれも著しく血糖値が上昇し、ＯＬＥＴＦ対照群と冠元顆粒投与群との間に有意な差は認められなくなった。
【００８５】
一方、図１５（ｂ）に示すように、投与後１５週目（３７週齢）のラット血清中の糖化蛋白量（ｎmol／ｍｇprotein）は、ＬＥＴＯ対照群の１６．５に対して、ＯＬＥＴＦ対照群では１８．９にまで有意に上昇していた。これに対し、冠元顆粒を投与した第１群及び第２群では、それぞれ１７．６及び１７．８の値を示し、ＯＬＥＴＦ対照群に対して有意に低下していた。また、図１５（ｃ）に示すように、血清中の過酸化脂質量（ｎmol／ｍＬ）は、ＯＬＥＴＦ対照群では５．６５であり、ＬＥＴＯ対照群の３．１５に対して有意に増加していたが、冠元顆粒を投与した第１群及び第２群では、それぞれ３．６４及び３．７９の値を示し、いずれもＯＬＥＴＦ対照群に対して有意に低下していた。以上の結果から、冠元顆粒は、酸化ストレス状態を是正することにより、糖化蛋白質及び過酸化脂質の生成を有意に抑え、２型糖尿病状態の改善に寄与することが示唆された。
【００８６】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  実施形態の糖尿病改善剤は冠元顆粒を有効成分として含有するものであったが、前記有効成分として丹参、芍薬及び香附子から選ばれる少なくとも１種の生薬の水抽出物（熱水抽出物）を含有するものであってもよい。このとき、糖尿病改善剤の有効成分は、丹
参、芍薬及び香附子から選ばれる少なくとも１種を、その全重量の５〜３０倍量、好ましくは１０〜２０倍量の水にて熱水抽出した後、抽出された熱水抽出液を濃縮及び乾燥することにより製造される。このように構成した場合でも、上記実施形態の糖尿病改善剤の場合と同様に、高血糖状態における生理機能の適正化を図ることが容易である。
【００８７】
・  糖尿病改善剤は、ヒト以外にも、ウマ、ウシ、ブタのような家畜（非ヒト哺乳動物）、ニワトリ等の家禽、或いは犬や猫等のペットに投与してもよい。
・  前記有効成分（冠元顆粒、丹参の水抽出物、芍薬の水抽出物又は香附子の水抽出物）を、パン、ケーキ、スナック菓子等の嗜好品、牛乳やヨーグルト等の乳製品、清涼飲料等の飲料品に含有させてもよい。
【００８８】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  高血糖状態における血中総蛋白濃度の低下を抑える作用を有することを特徴とする請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤。高血糖状態における血中アルブミン濃度の低下を抑える作用を有することを特徴とする請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤。高血糖状態における蛋白糖化反応を抑える作用を有することを特徴とする請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤。高血糖状態におけるポリオール経路の活性化を抑える作用を有することを特徴とする請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１２】
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【図１３】
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