(57)【要約】【課題】疾患から動物を保護するために広範な範囲の所望の免疫応答を惹起し得る有効なワクチンを提供すること。【解決手段】本発明は、ＨＢｓＡｇ抗原を含むウイルス抗原のような特異的抗原に対する特異的細胞性および体液性免疫応答を惹起するために動物を免疫化するための方法および試薬に関する。本発明は、新鮮または凍結乾燥リポソーム中に特異的に調製された免疫原、この免疫原の投与の適正な経路、この免疫原の適正な用量、および１つの投与経路におけるＤＮＡプライミング、これに続く異なる経路におけるリポソーム媒介タンパク質抗原追加免疫を含む異種免疫化の特定の組み合わせを用いる方法を提供し、細胞媒介免疫応答、サイトカイン分泌、体液性免疫、免疫保護およびＴｈ１、Ｔｈ２、または混合もしくはバランスのとれたＴｈ応答であるＴヘルパー応答の選択的偏り（ｓｋｅｗｉｎｇ）を増大することに関する免疫応答を仕立てる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００４年１月７日に出願された米国仮出願番号第６０／５３４，９２３号の利益を主張し、その明細書は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（政府資金調達）
本明細書に記載される本発明は、全部または一部が、疾病対策予防センターからの助成Ｒ３１／ＣＣＲ９２２４１３−０１；Ｒ３１／ＣＣＲ９２４３７８−０１によって支援された。合衆国政府は、本発明に特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
種々の病原体（例えば、感染性微生物）に対する有効な予防的および治療的ワクチンの開発は、世界的に疾病対策のための重要な目的である。多くの場合、最も有効なワクチンは、鼻通路、肺、生殖道および消化管を含む、微生物の最も一般的な侵入口、身体の粘膜表面を標的にする。
【０００４】
特定の病原体に対する保護免疫は、体液性応答、細胞性応答および粘膜応答によって達成される。体液性応答または抗体応答は、病原体中和で重要であり、そしていくつかの感染性疾患では非常に有効であり得る。抗体は、血液中を循環し、そして全体の体液性免疫応答の尺度を提供する。細胞媒介免疫、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、多くの細胞内病原体および癌に対する保護免疫のために必要である。鼻通路、肺、生殖道および消化管の粘膜表面における局所免疫はまた、これらの部位を通って身体に接近する病原体に対する有効な免疫応答にとって重要である。有効な粘膜免疫応答の顕著な特徴は、粘膜表面における分泌性ＩｇＡ抗体の局所的産生である。ＩｇＡもまた、血液中を循環し、そしてそこでのそのレベルは、全体の粘膜免疫応答に対する判断基準を提供する。粘膜ＩｇＧもまた、特定の病原体を中和することで重要である。繰り返し免疫化は、増大した免疫応答を生じ得、そして増加した保護を与える。免疫化をプライミングすることは、免疫の基礎レベルを確立し、そしてＴおよびＢ細胞記憶の発生に至り得る。後の時間における追加免疫は、これらの記憶細胞を動員し得、そしてより高く、かつより特異的な免疫応答に至る。
【０００５】
大部分の免疫応答は、Ｔリンパ球によって調節され、これは、この応答を開始し、そしてその性質を形作る。免疫応答が成熟するとき、ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）免疫応答またはＴヘルパー２型（Ｔｈ２）免疫応答に向かって分極するようになり得る。Ｔｈ１およびＴｈ２型応答の顕著な特徴は、存在するサイトカインの優勢パターンである。Ｔｈ１応答は、高レベルのＩＦＮ−γおよび低レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０によって特徴付けられ、その一方、Ｔｈ２応答は、低レベルのＩＦＮ−γおよび高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０によって特徴付けられる。これらのサイトカインは、Ｔ細胞の機能的能力を決定することで重要な役割を演じる。Ｔｈ２型応答は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体の好ましい産生に至り、ＣＴＬの生成はほとんどないか、またはない。Ｔｈ１型の応答は、ＩｇＧ２ａサブクラスの抗体の好ましい産生、およびウイルスまたはその他の生物で感染された細胞を有効に死滅させ得るＣＴＬの誘導に至る。
【０００６】
以下の表Ａは、Ｔｈ１およびＴｈ２分極した免疫応答の免疫学的特徴を要約する。Ｔｈ１分極応答は、代表的には、ウイルスまたは細菌での感染の間に生成される。対照的に、Ｔｈ２分極応答は、しばしば、寄生虫感染で、アレルギー応答で、およびヒトで用いられている従来のミョウバンを基礎にした筋肉内に送達されるタンパク質ワクチンによって観察される。遺伝学はまた、生成された免疫応答の型を決定し得る。例えば、Ｔｈ１応答は、マウスのＣ５７ＢＬ／６株で優勢であり、その一方、Ｔｈ２応答は、マウスのＢａｌｂ／ｃ株で優勢である。免疫応答はまた、Ｔｈ１およびＴｈ２構成要素の両方からなり得、免疫応答の体液性アームおよび細胞媒介性アームの両方による保護を与える。サイトカイン産生細胞の頻度の直接決定は、ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素連結免疫吸収ＳＰＯＴアッセイ）の使用によるか、または細胞内サイトカイン産生を示す免疫蛍光染色によって達成される。血清ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比もまた、Ｔヘルパー型（表Ａ）を決定するための広く受容され、そして従われる規準である。平衡化Ｔｈ１およびＴｈ２応答のためのＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比は、０．５〜２．０であり得る。
【０００７】
【表１】
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本明細書で用いられるとき、「Ｔヘルパー１型応答」および「Ｔｈ１応答」は交換可能に用いられ、１つ以上、通常すべての上記の表Ａの中央カラムに列挙された特徴を含む宿主動物応答の範囲をいう。これらの特徴は、０．５を超えないＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比；Ｔヘルパー１細胞による増加したＩＦＮ−γ（およびその他のＴｈ１サイトカイン）分泌およびＴヘルパー２細胞による減少したＩＬ−１０およびＩＬ−４（およびその他のＴｈ２サイトカイン）分泌；および高ＣＴＬ活性を含む。
【０００８】
同様に、本明細書で用いられるとき、「Ｔヘルパー２型応答」および「Ｔｈ２応答」は交換可能に用いられ、１つ以上、通常すべての上記の表Ａの右カラムに列挙された特徴を含む宿主動物応答の範囲をいう。これらの特徴は、２．０以上のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比；Ｔヘルパー１細胞による減少したＩＦＮ−γ（およびその他のＴｈ１サイトカイン）分泌およびＴヘルパー２細胞による増加したＩＬ−１０およびＩＬ−４（およびその他のＴｈ２サイトカイン）分泌；およびＣＴＬ活性が低いまたはないことを含む。
【０００９】
ワクチンは、送達される薬剤および投与の経路に依存して、種々の形態をとる。ワクチン送達システムは、しばしば、ワクチンを身体の特定領域に投与するように設計され得る。胃腸管では、このワクチンが、局所的効果を奏するか、または血流中に追加するか、または局所的環境中のリンパ系組織と相互作用する機会をもつより前に、分解または消失しないことが重要である。鼻咽頭管では、このワクチンが、吸収細胞に近接して残ることが重要であり；抗原が、鼻管を通って洗浄されるか、または飲み込まれる前に、これら抗原がリンパ系細胞と接触して残ることもまた重要である。さらに、抗原、ビヒクル、および免疫刺激剤が、単一の複合体中で同時送達されることが重要である。
【００１０】
伝統的には、免疫化は、不活性化全生物もしくは細胞、微生物もしくは細胞の抽出物、またはタンパク質もしくはペプチド抗原のような単離された成分を投与することにより達成されている。免疫化は、弱毒化生存生物の経口、鼻腔内（ＩＮ）、または筋肉内（ＩＭ）投与によって達成されている。代表的には、ヒトおよび動物は、筋肉内または経皮的経路を経由して保存剤、アジュバト、およびその他の賦形剤の存在下でこのような組成物を注射され、共通使用における通常の小児科ワクチンまたは成人ワクチンで保護免疫を惹起する。非経口免疫化は、稀に、抗体産生、特に、侵入する微生物に対する第１の防御障壁として重要な免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を生じる有効な粘膜免疫応答を惹起し得る。
【００１１】
現在、生存弱毒化ウイルスまたは細菌のみが、経口的および／または鼻腔内に投与されるとき、ヒトまたは動物中に保護免疫応答を誘導し得る。現在まで、経口、鼻腔内また膣内経路によって投与され得るワクチンはほとんど開発されておらず、そしてこれらのワクチンは、いつも、経口ポリオワクチン、および共通で用いられる経口サルモネラ腸チフスワクチンのような生存生物である。例えば、冷適応によって調製された生存弱毒化インフルエンザウイルス（ＦｌｕＭｉｓｔＴＭ）は、鼻腔内投与によってインフルエンザに対してヒトをワンチン化するために用いられ得る。遺伝子変異の自然の素因ならびに効目および安全性問題に起因して、免疫寛容患者に付与されると、生存ウイルスをベクターとするか、またはそれに基づくワクチンの使用にともなう潜在的リスクについての問題がある。
【００１２】
代表的には、一般使用におけるワクチンは、細胞抽出物から調製されるか、または組換え産生方法によって産生され；これらのワクチンは、通常、タンパク質、微生物トキソイド、不活性化全ウイルス、または微生物起源の多糖類からなる。これらのタイプの材料は、通常、注射によって投与されるとき、疾患保護免疫応答の誘導で有効である。しかし、たとえ、ヒトおよび大部分の動物の消化管および鼻咽頭管に、非宿主抗原に対する免疫応答を誘導し得る細胞および組織が豊富に与えられたとしても、このような材料は、経口または鼻腔内投与により投与されるとき、免疫原性に乏しいか、または非免疫原性である。経口的または鼻腔内で投与されるワクチンの主な失敗の原因の１つは、抗原が、通過の間に吸収性に乏しく、かつ不安定であるからである。経口的に投与されるタンパク質およびペプチドは、いつも、プロテアーゼおよびその他加水分解酵素の作用、ならびに胃酸によりＧＩ管で分解される。従って、細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）免疫原からなるワクチンは、経口経路または鼻腔内経路によって投与されるとき有効でない。従って、経口投与または鼻腔内投与後に、有効な免疫応答を誘導し得る、抗原保護ビヒクルおよび有効なアジュバントとして繰り返し用いられ得る組成物は、動物およびヒトをワクチン化するためにより有用かつ便利な手段を提供し得る。
【００１３】
粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）は、胃腸管（内臓関連リンパ組織、ＧＡＬＴ）、乳腺、生殖管および呼吸管（気管支、および鼻関連リンパ組織、ＢＡＬＴおよびＮＡＬＴ）からなるネットワークシステムである。共通の粘膜免疫システムの特有の特徴の１つは、１つの粘膜部位における免疫学的誘導が、しばしば、遠位粘膜部位で免疫応答を生じることである。これは、高内皮細静脈を経由するリンパ球の移動に起因する。しかし、異なる粘膜表面へのワクチンの投与に際して別個の差異が観察されており、そして応答の区画化が生じ得る。さらに、いくつかの粘膜部位は、遠位部位で良好な応答を誘導し、そしてすべての遠位部位が等しく応答するわけではない。
【００１４】
鼻腔内免疫化は、種々の病原体、可溶性タンパク質およびマイクロパーティクルで送達される抗原に対する粘膜免疫を刺激するための有効な経路である。鼻腔内免疫化は、局所的、および遠位粘膜免疫応答の両方を誘導するさらなる利点を有する。例えば、鼻腔内ワクチン化は、直接免疫化が、しばしば、上皮細胞代謝回転およびホルモン影響によって妨害される尿生殖器管における免疫を惹起し得る（非特許文献１）。鼻腔内免疫化は、ＮＡＬＴによるか、または深部肺免疫化による、強力な抗原特異的免疫応答を誘導し得る。上部呼吸管のための主要な粘膜誘導部位であるＮＡＬＴは、鼻腔内免疫化抗原に対し、局所におよび遠位に粘膜免疫を発生するために重要である。ウイルスペプチドに対する粘膜ＩｇＡおよびＩｇＧ応答、ならびに高められたＣＴＬ応答が、ＮＡＬＴの刺激後に観察されている。肺は、局所的にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよび細胞媒介性応答を産生し得る免疫応答性器官である（非特許文献２）（非特許文献３）。肺における保護免疫応答は、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザワクチンを用いたワクチン化の後に証明されており、一方、肺免疫化およびチャレンジ（抗原投与）の後の長期間の抗体産生は肺関連組織と関連している（非特許文献４）。
【００１５】
粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）は、胃腸管（内臓関連リンパ組織、ＧＡＬＴ）、乳腺、生殖管および呼吸管（気管支、および鼻関連リンパ組織、ＢＡＬＴおよびＮＡＬＴ）からなるネットワークシステムである。共通の粘膜免疫システムの特有の特徴の１つは、１つの粘膜部位における免疫学的誘導が、しばしば、遠位粘膜部位で免疫応答を生じることである。これは、高内皮細静脈を経由するリンパ球の移動に起因する。しかし、異なる粘膜表面へのワクチンの投与に際して別個の差異が観察されており、そして応答の区画化が生じ得る。さらに、いくつかの粘膜部位は、遠位部位で良好な応答を誘導し、そしてすべての遠位部位が等しく応答するわけではない。
【００１６】
鼻腔内免疫化は、種々の病原体、可溶性タンパク質およびマイクロパーティクルで送達される抗原に対する粘膜免疫を刺激するための有効な経路である。鼻腔内免疫化は、局所的、および遠位粘膜免疫応答の両方を誘導するさらなる利点を有する。例えば、鼻腔内ワクチン化は、直接免疫化が、しばしば、上皮細胞代謝回転およびホルモン影響によって妨害される尿生殖器管における免疫を惹起し得る（非特許文献１）。鼻腔内免疫化は、ＮＡＬＴによるか、または深部肺免疫化による、強力な抗原特異的免疫応答を誘導し得る。上部呼吸管のための主要な粘膜誘導部位であるＮＡＬＴは、鼻腔内免疫化抗原に対し、局所におよび遠位に粘膜免疫を発生するために重要である。ウイルスペプチドに対する粘膜ＩｇＡおよびＩｇＧ応答、ならびに高められたＣＴＬ応答が、ＮＡＬＴの刺激後に観察されている。肺は、局所的にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよび細胞媒介性応答を産生し得る免疫応答性器官である（非特許文献２）（非特許文献３）。肺における保護免疫応答は、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザワクチンを用いたワクチン化の後に証明されており、一方、肺免疫化およびチャレンジ（抗原投与）の後の長期間の抗体産生は肺関連組織と関連している（非特許文献４）。最適上部呼吸管免疫は、組み合わせた上部および下部呼吸管接種によって誘導される（非特許文献５）。
【００１７】
ＤＮＡ免疫化は、感染疾患に対する保護的免疫を生成するためのアプローチである（非特許文献６）。タンパク質またはペプチドを基礎にしたサブユニットワクチンとは異なり、ＤＮＡ免疫化は、宿主細胞による異種タンパク質の発現を通じて保護免疫を提供し、それ故、ウイルスまたは細胞内病原体での感染の間に生じる様式とより類似の様式で免疫系に対する抗原の提示を可能にする（非特許文献７；非特許文献８）。この技法により、相当の影響力が生成されているけれども、成功した免疫の大部分は、ウイルス疾患について、ＤＮＡ免疫化によって一致して誘導されている（非特許文献９）。非ウイルス病原体では結果はより変動し、これらは、この病原体の性質における差異選択された免疫抗原における差異、および免疫化の経路における差異を反映し得る（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＤＮＡワクチン化のさらなる開発は、基礎となる免疫学的機構を解明すること、およびワクチン開発の現存する戦略が失敗したその他の感染疾患へのその適用を広げることに依存する。
ＤＮＡワクチンは、いくつかの最近の臨床試験に従って、ヒトにおいて良好に寛容性を示したが、より良好な免疫効力を達成する差し迫った必要性がある。それ故、多くの第２世代ＤＮＡワクチンが、種々のシステムおよびデバイスを用いて開発中である。さらに、混合様式ワクチン化、またはプライム−ブーストと呼ばれる免疫化の新たなアプローチが評価されている。それは、１つの型のワクチンを用いる初期ワクチン化、次いで、異なる型のワクチンを用いる追加免疫（ブースト）を含む。例えば、有望な前臨床結果は、最初にＤＮＡで免疫化すること、次いで、この抗原をコードするワクシニアまたはアデノウイルスベクターで、またはこのＤＮＡワクチンにコードされるこの抗原の組換えタンパク質で追加免疫することによって得られている。しかし、追加免疫として用いられるワクシニアおよびアデノウイルスについて問題がある。ウイルスベクターに対する既存の抗体は、免疫応答をブロックし得るので、これらの組換えウイルスは、通常、繰り返して用いられることはできず、そして免疫寛容患者にはまた、特に安全性の問題がある。さらに、非経口免疫化経路によってブースターとして用いられる純粋タンパク質は、一般に、粘膜免疫応答を誘導すること、または細胞媒介免疫応答を増大することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｃｓｅｎｃｓｉｔｓら、１９９９、ＪＩ．１３８２〜１３８９
【非特許文献２】Ｌｉｕ  Ｍら、１９８２．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１２９（６）：２６５３〜２６６１
【非特許文献３】Ｂｉｃｅ  ＤＥら、１９８０．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３（４）：４３８〜４５
【非特許文献４】Ｂｉｃｅ  ＤＥら、１９９３．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８（６）：６６２〜６６７
【非特許文献５】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＡＨ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１４０４〜１５
【非特許文献６】Ｌｉｕら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２、１９９５
【非特許文献７】ＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｉｅｇ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１６５、１９９５
【非特許文献８】ＭｃＤｏｎｎｅｌおよびＡｓｋａｒｉ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：４２、１９９６
【非特許文献９】Ｍａｎｉｃｋａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２５９、１９９５
【非特許文献１０】Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９８６６、１９９４
【非特許文献１１】Ｂａｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：６３２、１９９５
【非特許文献１２】ＸｕおよびＬｉｅｗ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５３４、１９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
保護粘膜免疫応答は、バイオテロリズムで用いられ得る多くの天然に存在する感染性生物および微生物によって引き起こされる疾患を制御することで重要である。ＣＴＬを含む細胞媒介免疫応答はまた、全身的および粘膜部位の両方で細胞内病原体を制御することで重要である。ミョウバンをアジュバントとして用いる、筋肉内に送達される伝統的なタンパク質ワクチンは、主にＩｇＧ１抗体応答をともなうが、しかし、ＣＴＬ応答または粘膜部位における局所免疫を刺激しない、代表的なＴｈ２応答を生成する。従って、疾患から動物を保護するために広範な範囲の所望の免疫応答を惹起し得る有効なワクチンに対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明の１つの局面は、動物において所望の免疫応答を惹起することを提供し、方法であって、該動物に、抗原をコードする核酸配列を含むプライミング調製物、およびこの抗原およびリポソームを含む追加免疫調製物（抗原−リポソーム調製物）を投与する工程を包含し（異種免疫化）、それによって該動物において所望の免疫応答を惹起する。
【００２１】
１つの実施形態では、上記所望の免疫応答は、病原体に対し、そして上記抗原は病原体特異的抗原である。
【００２２】
１つの実施形態では、上記プライミング調製物は：皮下、筋肉内、皮内および経粘膜から選択される経路によって投与され、そして上記追加免疫調製物は：皮下、筋肉内、皮内および経粘膜から選択される経路によって投与される。
【００２３】
１つの実施形態では、上記異種免疫化のためのプライミング調製物は、上記動物に筋肉内で投与され、そしてここで、上記追加免疫調製物は、上記動物に鼻腔内に投与される。
【００２４】
１つの実施形態では、上記追加免疫調製物は、リポソーム中にカプセル化された病原体特異的タンパク質抗原を含む。
【００２５】
１つの実施形態では、上記追加免疫調製物中のリポソームは、約０．５〜５μｍの平均サイズである。
【００２６】
１つの実施形態では、上記プライミング調製物および上記追加免疫調製物の各々は、動物に単独で投与されるとき、所望のレベルの免疫応答を達成するには不十分である。
【００２７】
１つの実施形態では、上記免疫応答は、上記病原体に対する免疫を与える。
【００２８】
１つの実施形態では、上記プライミングは、約３〜６週間だけ分離された１つまたは２つの投与を含み、そしてここで、上記追加免疫調製物は、最後のプライミングの後、約３〜１０週間で投与される。
【００２９】
１つの実施形態では、上記プライミングは、約３日だけ分離された１つまたは２つの投与を含み、そしてここで、上記追加免疫調製物は、最後のプライミングの後、約３週間で投与される。
【００３０】
１つの実施形態では、上記抗原−リポソーム調製物中のリポソームは、約０．５〜５μｍの平均サイズである。
【００３１】
１つの実施形態では、上記追加免疫の用量は、上記動物の鼻腔内にＩｇＡ応答を誘導するように投与される。
【００３２】
１つの実施形態では、上記ＩｇＡ応答は、全身および粘膜応答を含む。
【００３３】
本発明の別の局面は、動物において、Ｔｈ２応答に偏向する傾向の免疫応答を惹起するための方法を提供する。この方法は、プライミング調製物および追加免疫調製物を投与する工程を包含し、その各々は、同じ抗原およびリポソームを含む（同種免疫）。
【００３４】
１つの実施形態では、上記宿主動物は、ヒトまたは家畜動物（ウシ、ブタ、ウマ、またはヒツジなど）、ペット（イヌまたはネコなど）、または小実験動物（マウス、またはラットなど）のような哺乳類動物である。
【００３５】
１つの実施形態では、上記病原体は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のようなウイルスである。
【００３６】
１つの実施形態では、上記病原体は、クラミジアの株の１つである。
【００３７】
１つの実施形態では、上記病原体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのような細菌株である。
【００３８】
１つの実施形態では、上記病原体特異的抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＰＡ抗原のような保護抗原（ＰＡ）である。
【００３９】
１つの実施形態では、リポソーム中に包括される免疫原は、Ｔ細胞を活性化、または全ウイルス粒子を不活性化するペプチドである。
【００４０】
１つの実施形態では、上記病原体特異的抗原は、ＨＢｓＡｇのようなウイルス表面抗原である。
【００４１】
１つの実施形態では、上記病原体特異的抗原は、ペプチドである。
【００４２】
１つの実施形態では、上記病原体特異的抗原は、不活性化ウイルスまたは細菌の種類である。
【００４３】
１つの実施形態では、上記病原体特異的抗原（ペプチド、タンパク質または不活性化ウイルス）は、リポソーム中にカプセル化されている。
【００４４】
１つの実施形態では、上記病原体特異的抗原（ペプチド、タンパク質または不活性化ウイルス）は、空のリポソームと混合される。
【００４５】
１つの実施形態では、上記抗原−リポソーム調製物は、新鮮に調製される。
【００４６】
１つの実施形態では、上記抗原−リポソーム調製物は、使用前に凍結乾燥される。
【００４７】
１つの実施形態では、上記方法は、同じ上記抗原−リポソーム調製物の１つ以上の追加免疫調製物を投与する工程をさらに包含し、ここで、各投与は、約２〜１６週間、好ましくは約３〜６週間だけ分離されている。
【００４８】
１つの実施形態では、すべての調製物は、同じ量の上記病原体特異的抗原を有する。
【００４９】
１つの実施形態では、異なる量のプライミングおよび追加免疫が、同じ経路を経由して上記動物に投与される。
【００５０】
１つの実施形態では、異なる量のプライミングおよび追加免疫が、異なる経路を経由して上記動物に投与される。
【００５１】
１つの実施形態では、上記追加免疫調製物および初期プライミングは、上記動物に同じ経路を経由して投与される。
【００５２】
１つの実施形態では、上記追加免疫調製物および初期プライミングは、上記動物に別個の経路を経由して投与される。
【００５３】
１つの実施形態では、上記方法は、上記病原体特異的抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答を測定する工程をさらに包含する。
【００５４】
１つの実施形態では、上記体液性免疫応答は、血清中または粘膜表面における総抗原特異的抗体（Ｉｇ）力価；血清中または粘膜表面における抗ＨＢｓＡｇ特異的抗体；抗原特異的抗体アイソタイプおよび／またはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａを含むサブタイプの力価；ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの比を含む。
【００５５】
１つの実施形態では、上記細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の出現；増大したＣＴＬ殺傷活性；ＩＦＮ−γを含むＴｈ１応答に特徴的なサイトカインの分泌；ＩＬ−１０およびＩＬ−４を含むＴｈ２応答に特徴的なサイトカインの分泌；およびＴヘルパー細胞プロフィールの分極化（例えば、Ｔｈ１対Ｔｈ２応答）を含む。
【００５６】
１つの実施形態では、上記体液性および／または細胞性応答は、最後の追加免疫後、約２、４、６または８週間で上記宿主動物から得たサンプルから一般に測定される。しかし、応答は、最後の追加免疫後、数ヶ月について測定され得る。
【００５７】
１つの実施形態では、上記免疫応答は、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＴ細胞応答を含む。
【００５８】
１つの実施形態では、上記ＩｇＡ応答は、全身的および／または粘膜ＩｇＡ応答を含む。
【００５９】
１つの実施形態では、上記ＩｇＧ応答は、全身的および／または粘膜ＩｇＧ応答を含む。
【００６０】
本発明は、さらに、２つの免疫化成分を含む免疫原組成物を提供し、ここで、第１の免疫化成分は、抗原をコードする核酸を含み、そして第２の免疫化成分は、抗原およびリポソームを含む。１つの実施形態では、所望の免疫応答は病原体に対してであり、そして抗原は病原体特異的抗原である。
【００６１】
上記のすべての実施形態は、当初記載されているか否かにかかわらず、本発明の同じまたは異なる局面の下、適切であるときはいつも任意のその他の実施形態と自由に組み合わされ得ることが企図される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
動物において所望の免疫応答を惹起する方法であって、該動物に：
ａ）抗原をコードする核酸を含むプライミング調製物；および
ｂ）該抗原およびリポソームを含む追加免疫調製物、を投与する工程を包含し、それによって該動物において所望の免疫応答を惹起する、方法。
（項目２）
前記所望の免疫応答が病原体に対し、そして前記抗原が病原体特異的抗原である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プライミング調製物が：皮下、筋肉内、皮内および経粘膜から選択される経路によって投与され、そして前記追加免疫調製物が：皮下、筋肉内、皮内および経粘膜から選択される経路によって投与される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記追加免疫調製物が、前記動物の鼻腔内に投与される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記追加免疫調製物が、リポソーム中にカプセル化された病原体特異的タンパク質抗原を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記追加免疫調製物中のリポソームが、約０．５〜５μｍの平均サイズである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記免疫応答が、前記病原体に対する免疫を与える、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記病原体が、ウイルスである、項目２〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ウイルスがＨＢＶであり、そして前記病原体特異的抗原がＨＢｓＡｇである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記動物が、ヒトである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
宿主動物において、Ｔｈ１応答に偏向する傾向の所望の免疫応答を惹起する方法であって：
ａ）該動物の筋肉内に、抗原をコードする核酸を含むプライミング調製物を投与する工程；および
ｂ）引き続き、該動物に、前記抗原およびリポソームを含む追加免疫調製物投与する工程を包含し、それによって、該動物においてＴｈ１応答に偏向する傾向の所望の免疫応答を惹起する、方法。
（項目１２）
前記Ｔｈ１応答に偏向する傾向の所望の免疫応答が、病原体に対し、そして前記抗原が、病原体特異的抗原である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記追加免疫調製物が、前記動物の鼻腔内に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記追加免疫調製物が、リポソーム中にカプセル化された病原体特異的タンパク質抗原を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記追加免疫調製物中のリポソームが、約０．５〜５μｍの平均サイズである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記免疫応答が、前記病原体に対する免疫を与える、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記病原体が、ウイルスである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ウイルスがＨＢＶであり、そして前記病原体特異的抗原がＨＢｓＡｇである、項目１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記動物が、ヒトである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
宿主動物において免疫応答を惹起するためのキットであって：
ａ）抗原をコードする核酸を含む第１の免疫化成分；
ｂ）該抗原およびリポソームを含む第２の免疫化成分；および
ｃ）該動物に該第１の免疫化成分を投与し、次いで該第２の免疫化成分を投与し、該動物に免疫応答を惹起するための指示書、を備える、キット。
（項目２１）
前記所望の免疫応答が、病原体に対し、そして前記抗原が、病原体特異的抗原である、項目２０に記載のキット。
（項目２２）
前記第１の免疫化成分の投与が：皮下、筋肉内、皮内および経粘膜から選択される任意の経路により得、そして前記第２の免疫化成分の投与が：皮下、筋肉内、皮内および経粘膜から選択される任意の経路により得る、項目２１に記載のキット。
（項目２３）
前記第２の免疫化成分が、動物の鼻腔内に投与される、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
前記第２の免疫化成分が、リポソーム中にカプセル化された病原体特異的タンパク質抗原を含む、項目２３に記載のキット。
（項目２５）
前記追加免疫調製物中のリポソームが、約０．５〜５μｍの平均サイズである、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
前記病原体が、ウイルスである、項目２０〜２５のいずれか１項に記載のキット。
（項目２７）
前記ウイルスがＨＢＶであり、そして前記病原体特異的抗原がＨＢｓＡｇである、項目２６に記載のキット。
（項目２８）
前記動物が、ヒトである、項目２７に記載のキット。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、直径が平均４μｍのサイズのリポソームのサイズ分布プロフィールを示す。ｘ軸は、サイズをμｍで、そしてｙ軸は、粒子数を示す。
【図２】図２は、実験内の、個々のＣＤ１マウス（上部パネル）およびＢａｌｂ／ｃマウス（下部パネル）間で観察される血清ＨＢｓＡｇ特異的Ｉｇ力価における変動の程度を表す。１つ（黒塗り円）または２つ（黒塗り三角）の、ＨＢｓＡｇ−リポソーム  ＩＮ、ＨＢｓＡｇ−リポソーム  ＩＭ、またはＨＢｓＡｇ  ＩＭに対するＧＳＫ市販ワクチンでの同種免疫化を受けたマウスからの応答が示される。終点力価は、２×無刺激マウスについて観察された血清力価値より大きい血清力価として規定される。水平線は、平均応答を示す（ｎ＝５マウス／群）。
【図３】図３は、ＨＢｓＡｇ−リポソームでの鼻腔内免疫化後、ＣＤ１マウスにおけるＨＢｓＡｇ特異的血清Ｉｇレベルの動力学を示す。このデータは、一次免疫化後（黒塗りシンボル）および追加免疫後２週間（交差ハッチ＋をともなう黒塗りシンボル）の種々の時間での血清サンプルの系列希釈後のＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＥＬＩＳＡにおける４５０ｎｍにおけるＯＤとして示される。値は、血清プール（ｎ＝５マウス／群）からの平均である。ＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチンに対する応答が比較のために示される。
【図４】図４は、０週（黒塗りシンボル）または０週および６週（交差ハッチ＋をともなう黒塗りシンボル）に鼻腔内に免疫化されたＣＤ１マウスにおけるＨＢｓＡｇ−リポソーム用量応答を示す。ＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチンに対する応答が比較のために示される。ＨＢｓＡｇ特異的血清Ｉｇレベルは、最初の免疫化後８週でとられた血清サンプルプールについて測定された（ｎ＝５マウス／群）。
【図５】図５は、ＨＢｓＡｇ−リポソーム（１５μｇ／用量）を投与されたＣＤ１マウスにおける総ＨＢｓＡｇ−特異的血清抗体に対する追加免疫の投与および送達の経路の影響を示す。黒塗りのシンボルは、単一のプライミング免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。交差ハッチ（＋）をもつシンボルは、同種の一次および二次ブースト免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。ＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチン対する応答を比較のために示す。
【図６】図６は、ＨＢｓＡｇ−リポソーム（１５μｇ／用量）を投与されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける総ＨＢｓＡｇ−特異的血清抗体に対する追加免疫の投与および送達の経路の影響を示す。黒塗りのシンボルは、単一のプライミング免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。交差ハッチ（＋）をもつシンボルは、同じ同種の一次および二次ブースト免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。ＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチン対する応答を比較のために示す。
【図７】図７は、鼻腔内に新鮮（矩形）または凍結乾燥（三角）いずれかのＨＢｓＡｇ−リポソームで免疫化されたか、または市販のＧＳＫワクチン（丸）で筋肉内に免疫化されたＣＤ１マウスにおけるＨＢｓＡｇ−特異的血清Ｉｇ応答の比較を示す。黒塗りシンボルは、単一のプライミング免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。交差ハッチ（＋）をもつ黒塗りシンボルは、同種の一次および二次ブースト免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。総ＨＢｓＡｇ−特異的血清抗体応答は、一次免疫化後８週の血清で測定された。
【図８】図８は、筋肉内に新鮮（矩形）または凍結乾燥（三角）いずれかのＨＢｓＡｇ−リポソームで免疫化されたか、または市販のＧＳＫワクチン（丸）で筋肉内に免疫化されたＣＤ１マウスにおけるＨＢｓＡｇ−特異的血清Ｉｇ応答の比較を示す。黒塗りシンボルは、単一のプライミング免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。交差ハッチ（＋）をもつシンボルは、同種の一次および二次ブースト免疫化を受けたマウスにおける応答を示す（ｎ＝５）。総ＨＢｓＡｇ−特異的血清抗体応答は、一次免疫化後８週の血清で測定された。
【図９】図９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける血清ＨＢｓＡｇ−特異的ＩｇＧ応答に対するリポソームサイズの影響を示す（一次免疫化後６週、および追加免疫後２週）。ＨＢｓＡＧを含むリポソーム（１５μｍ）は、４μｍ、１μｍおよび０．２μｍのサイズとされ、そして単一サイズとして、または３つすべてのサイズの等量混合物としてＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に投与された（ｎ＝５）。ＨＢｓＡｇ−特異的ＩｇＧに対する定量的ＥＬＩＳＡを、プールされた血清サンプルにおける血清ＩｇＧレベルを決定するために用いた（群あたりｎ＝５マウス）。混合群の垂直の棒は、抗体応答が付加的である場合の推定値を示す。
【図１０】図１０は、異なるプロトコールで免疫化されたＣＤ１マウスの血清中のＨＢｓＡｇ−特異的抗体のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を示す。グレーの棒は、０週に１つの免疫化を受けたマウスからのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比である。黒の棒は、０週および６週に２つの同種の免疫化を受けたマウスからのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比である。定量的ＨＢｓＡｇ−特異的ＥＬＩＳＡアッセイを、一次免疫化後８週に血清プール（群あたり４〜５の個々のマウスからの等量の血清）からの血清中のＨＢｓＡｇ−特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルを決定するために用いた。各パネル中の０．５および２．０における２つの垂直線は、抗体応答の３つの異なるパターンの境界を定める。０．５以下の比は、Ｔｈ１分極応答を示す。２．０以上の比は、Ｔｈ２分極応答を示す。０．５〜２．０の比は、混合、または平衡応答を示す。
【図１１】図１１は、異なるプロトコールで免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの血清中のＨＢｓＡｇ−特異的抗体のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を示す。グレーの棒は、０週に１つの免疫化を受けたマウスからのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比である。黒の棒は、０週および６週に２つの同種の免疫化を受けたマウスからのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比である。定量的ＨＢｓＡｇ−特異的ＥＬＩＳＡアッセイを、一次免疫化後８週に血清プール（処置群あたり４〜５の個々のマウスからの等量の血清）からの血清中のＨＢｓＡｇ−特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルを決定するために用いた。各パネル中の０．５および２．０における２つの垂直線は、抗体応答の３つの異なるパターンの境界を定める。０．５以下の比は、Ｔｈ１分極応答を示す。２．０以上の比は、Ｔｈ２分極応答を示す。０．５〜２．０の比は、混合、または平衡応答を示す。
【図１２】図１２は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡは、ＣＤ１（矩形）およびＢａｌｂ／ｃマウス（三角）マウスにおける抗体応答に対する弱い免疫原であることを示す。ＣＤ１マウスにおける（交差ハッチ＋をもつ黒塗り丸）、およびＢａｌｂ／ｃマウスにおける（交差ハッチ＋をもつ白抜き丸）ＧＳＫワクチンに対する応答が比較のために示される。黒塗りシンボルは、単一のプライミング免疫化を受けたマウスにおける応答（ｎ＝５）を示す。交差ハッチ（＋）を備えるシンボルは、同種の一次および二次ブースト免疫化を受けたマウスにおける応答（ｎ＝５）を示す。総ＨＢｓＡｇ−特異的血清抗体応答は、一次免疫化後８週の血清中で測定された。マウスは、１００μｇのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡまは３μｇのミョウバンを基礎にするタンパク質ＨＢｓＡｇワクチン（ＧＳＫ）ＩＭのいずれかを受けた。
【図１３】図１３は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡでのＢａｌｂ／ｃマウスのＩＭ免疫化が、末梢Ｔ細胞区画（脾臓細胞）をＴｈ１に偏るサイトカインプロフィールに分極することを示す。左パネルは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイからの結果を示し、そして右パネルは、ＩＬ−１０ＥＬＩＳＰＯＴアッセイからの結果を示す。このグラフは、両アッセイにおけるサイトカイン産生にＴ細胞を活性化することにおけるＨＢｓＡｇ  ＣＴＬペプチドとＨＢｓＡｇタンパク質との間の比較を示す。関係のないペプチドおよびタンパク質をまた、特異性コントロールとして含めた。Ｔ細胞分裂促進因子コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対するポリクローナル抗体応答が、ＩＬ−１０に対する最大応答のために示されている。ＩＦＮ−γアッセイにおけるＣｏｎＡ刺激についての結果は示されない。なぜなら、スポットが多過ぎて、正確に定量できなかったからである。ペプチドおよびタンパク質の両方は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫化マウスにおけるＩＦＮ−γ産生を刺激し得るが、いずれも有意なＩＬ−１０産生を生成せず、ＤＮＡ免疫化マウスにおける強力なＴｈ１サイトカイン傾向を直接示す。非免疫化マウスは、ＨＢｓＡｇペプチドまたはタンパク質での刺激に対し、いずれのサイトカインに対しても検出可能な数のスポットを生成しなかった（データは示さず）。
【図１４】図１４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける異種免疫化の影響を示す：ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫化マウスは、低用量のＨＢｓＡｇ−リポソームＩＮでの追加免疫後、高レベルのＨＢｓＡｇ−特異的血清Ｉｇを生成する。マウスは、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで筋肉内に免疫化し（０週および６週に１００μｇ）、そして低用量のＨＢｓＡｇ−リポソーム（１２週に３μｇ／用量、ｎ＝８マウス／群）で追加免疫した。黒塗りシンボルは、ＩＮ追加免疫の前のＨＢｓＡｇ−特異的血清Ｉｇ抗体応答を示す。交差ハッチを有する黒塗りシンボルは、ＩＮ追加免疫後４週のＨＢｓＡｇ−特異的総血清Ｉｇ応答を示す。
【図１５】図１５は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける異種免疫化の影響を示す：ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫化マウスは、低用量のＨＢｓＡｇ−リポソームＩＮでの追加免疫後、高レベルのＨＢｓＡｇ−特異的血清および膣ＩｇＡを生成する。マウスは、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで筋肉内に免疫化し（０週および６週に１００μｇ）、そして低用量のＨＢｓＡｇ−リポソーム（１２週に３μｇ／用量）で追加免疫した。黒塗りシンボルは、ＩＮ追加免疫直前のＨＢｓＡｇ−特異的血清ＩｇＡ抗体応答を示す。交差ハッチを有する黒塗りシンボルは、ＩＮ追加免疫後４〜５週のＨＢｓＡｇ−特異的ＩｇＡ応答を示す。ポジティブコントロールとして、血清ＩｇＡ応答が、０週および６週に１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソームで同種免疫化し、そして２週間後に試験したマウスについて示される（交差ハッチ＋をもつ丸）。すべての群は、８匹のマウス含んだ。
【図１６】図１６は、粘膜ＩｇＧがまた、異種免疫化プロトコールで免疫化されたマウウ中で生成されることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡでの２つのＩＭプライミング免疫化（各々１００μｇ）、次いで、ＨＢｓＡｇ−リポソーム（１５μｇ）、空のリポソーム、または処置せずに残す（群あたりｎ＝５）のいずれかでのＩＮ免疫化を受けた。最終の免疫化後４週間に、マウスを屠殺し、そして肺および膣の洗浄液を測定した。ＨＢｓＡｇ−特異的ＩｇＧ力価を、抗原特異的サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いてサンプルプールについて得た。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇ−リポソームＩＮの組み合わせを受けたマウスのみが、未処置マウスで観察されたバックグラウンドレベルを超える抗原特異的粘膜ＩｇＧ応答を生成した。
【図１７】図１７は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡでのプライミングＩＭ（０週および６週に１００μｇ）、およびＨＢｓＡｇ−リポソームでの追加免疫（６週に３μｇ）からなる異種免疫化プロトコール後の、個々のＢａｌｂ／ｃマウスの血清中のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を示す。血清サンプルを、上記追加免疫後４週で採取した。すべてのマウスは、Ｔｈ１に偏った免疫応答を示した（ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比＜０．５）。これらの結果は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫化のみの後に見られるＴｈ１−傾向の応答が、ＨＢｓＡｇ−リポソームの送達後でさえ保存され、これが、Ｂｌａｂ／ｃマウスにおけるＴｈ２傾向応答を促進することを示す（図１１と比較のこと）。
【図１８】図１８は、同種免疫化プロトコール（左パネル）または異種免疫化プロトコール（右パネル）によって免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＨＢｓＡｇ−特異的血清ＩｇＧ結合活性（アビディティー）指数を示す。マウスは、０週および４週に免疫化され（同種免疫化）、または０週および４週にプライムされ、そして８週に追加免疫した（異種免疫化）。抗体結合活性は、最後の免疫化後２週で得た血清について測定された。点線は、この定量的アッセイで可能である最大結合活性を示す。この異種免疫化プロトコールは、最高の結合活性のＨＢｓＡｇ−特異的血清ＩｇＧ抗体を生成する。同じ実験からのＡｇ−リポソームＩＮが、比較のために右パネルに示される。
【図１９】図１９は、インビボＣＴＬ殺傷アッセイからの代表的結果を示す。左パネル：無刺激Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞。右パネル：異種免疫化レジメン（２×ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ  ＩＭ＋１×ＨＢｓＡｇ−リポソームＩＮ）を受けたＢａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞。すべてのマウスは、ＣＦＳＥｌｏｗ非パルス化同種遺伝子脾臓細胞およびＣＦＳＥｈｉｇｈＨＢｓＡｇペプチドバルス化同種遺伝子脾臓細胞の混合物を受けた。２０時間後、レシピエント脾臓を回収し、そしてフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ蛍光（ｘ軸）について分析した。領域１は、非蛍光性（レシピエント）脾臓細胞についてゲート化される。領域２は、ＣＦＳＥｌｏｗ（非パルス化ドナー）細胞についてゲート化される。領域３は、ＣＦＳＥｈｉｇｈ（ＨＢｓＡｇ−ペプチドパルス化ドナー）細胞についてゲート化される。２００，０００の生存細胞を分析した。右パネルにおけるＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞（Ｒ３）の消失は、免疫化マウスにおけるＣＴＬによる注入された標的細胞のＨＢｓＡｇペプチド特異的殺傷を示す。
【図２０】図２０は、異種免疫化レジメンを受けたマウスの肺からのＨＢｓＡｇ−ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＨＢｓＡｇ）のクリアランスを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、４週の間隔で、示されたように免疫化された（処置群：群あたりｎ＝５マウス）。マウスは、１００μｇのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ  ＩＭおよび１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソーム  ＩＮの用量を受けた。マウスを、追加免疫後１４日に、鼻腔内に５０μｌ容量で送達された２×１０５ＰＦＵのＶＶ−ＨＢｓＡｇで感染した。マウスは、ウイルスチャレンジ後５日目に屠殺し、そしてウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞を用いて肺ホモジネートについて決定した。示された値は、１群あたり４匹のマウスの平均±ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．概説）
本発明は、少なくとも一部は、異種免疫化プロトコールを、リポソームと混合された抗原または免疫原と組み合わせると、豊富な免疫応答を惹起するという驚くべき発見に基づく。本出願人らは、抗原または免疫原に対する所望の免疫応答を惹起するために新規な方法を考案した。２つの例は、本発明の方法が、動物において惹起し得る頑強な免疫応答を強調する。第１に、本発明の方法は、生存ウイルスのような生存する病原体によるチャレンジから動物を保護する免疫応答を惹起するために用いられ得る。第２に、本発明の方法を用いるワクチン化は、現在利用可能なワクチンに非応答性である個体に免疫を与える。さらに、本明細書で提供される新規な方法は、リポソーム以外の任意のアジュバントの必要性なくして所望の免疫応答を達成し、それ故、多くのアジュバント、特にコレラトキシン（ＣＴ）およびＥ．ｃｏｌｉ熱分解性エントロトキシン（ＬＴ）のような細菌トキシンにともなうリスクおよび合併症を避ける。用いられる特定の免疫化プロトコールに依存して、本明細書に記載される方法は、以下の組み合わせを含む広範な範囲の免疫応答を誘導し得る：頑強な抗体応答、ＣＴＬ生成のようなＴ細胞応答、ならびにＴｈ１型サイトカイン産生および粘膜部位における局所免疫。
【００６４】
従って、本発明は、動物において所望の免疫応答を惹起するための方法を提供し、抗原をコードする核酸、およびこの抗原およびリポソームを含む追加免疫調製物を含み、この動物において所望の免疫応答を惹起する。この方法は、病原体に対して宿主動物における免疫応答を惹起するために特に有用である。このような文脈では、プライミング調製物は、病原体特異的抗原をコードする核酸を含み、追加免疫調製物はこの病原体特異的抗原およびリポソームを含む。特定の実施形態では、この病原体はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。本発明の異種免疫化レジメンは、異なる形態のＨＢｓＡｇワクチン（例えば、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ  ＩＭおよびＨＢｓＡｇ−リポソーム  ＩＮまたはＩＭ）でのプライミングおよび追加免疫を含み、これは、より頑健な全身免疫応答、そしてまた粘膜部位における局所免疫の誘導を生じる。１つの実施形態では、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンでの筋肉内プライミング、およびＨＢｓＡｇ−リポソームでの鼻腔内追加免疫は、可能な相乗的抗体応答を誘導し、ＣＴＬおよびＴｈ１型サイトカインプロフィールを活性化し、そして粘膜部位で分泌性ＩｇＡおよびＩｇＧの産生を惹起した。別の実施形態では、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンでの筋肉内プライミングおよびＨＢｓＡｇ−リポソームでの鼻腔内追加免疫は、ＨＢｓＡｇ（ＶＶ−ＨＢｓＡｇ）を発現する組換えワクシニアウイルスでの鼻腔内抗原投与の後、実質的な抗原特異的肺ＣＴＬおよび完全なウイルスクリアランスを生成した。鼻腔内経路による追加免疫の送達は、局所免疫の生成のための重要な決定因子として確立された。
【００６５】
本発明はまた、宿主動物において免疫応答を惹起するためのキットを提供する。コノキットは、抗原をコードする核酸を含む第１の免疫化成分、この抗原およびリポソームを含む第２の免疫化成分、および上記動物に上記第１の免疫化成分を投与し、次いで上記第２の免疫化成分を投与し、この動物に免疫応答を惹起するための使用者のための指示書を備える。
【００６６】
本発明はさらに、免疫応答を、Ｔｈ１応答に偏向する傾向にある所望の免疫応答が、宿主動物中で惹起され得るように調整する方法を提供する。この方法は、動物に、抗原をコードする核酸配列を含むプライミング調製物を筋肉内に投与する工程；および、引き続き、この動物に、この抗原およびリポソームを含む追加免疫調製物を投与する工程を包含する。「偏向する傾向にある」は、観察される免疫応答が、免疫化前に比較してＴｈ１またはＴｈ２応答に近づくような状況をいう。特定の実施形態では、免疫化は、Ｔｈ２応答をＴｈ１応答に完全にスイッチする。その他の実施形態では、免疫化は、Ｔｈ２応答をＴｈ１応答に完全にスイッチしなくても良いが、それに代わって、混合された応答、またはより弱いＴｈ２応答を生じる。
【００６７】
本発明はさらに、微生物にとって最も一般的な侵入口である身体の粘膜表面を特異的に標的するために有効なワクチンおよびワクチン化プロトコールを開発する方法を提供する。本発明は、規定された組成／サイズでリポソーム中にこれらをカプセル化することによって、そしてそれらを粘膜表面に直接送達することによってより効率的にワクチンが作製され得ることを提供する。リポソームカプセル化ワクチンを適切なアジュバントおよび免疫化レジメンと組み合わせることにより、免疫応答は、より有効および特異的ワクチンを提供するように仕立てられる。特定の実施形態では、理想的なワクチンは、平衡化した免疫応答、または、粘膜部位での、頑強な抗体応答、ＣＴＬ生成およびＴｈ１型サイトカイン産生、ならびに局所免疫を含む局所免疫をまた誘導するＴヘルパー１（Ｔｈ１）に偏る免疫応答を生成し得る。その他の実施形態では、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）に偏る免疫応答を生成する免疫応答を仕立てることが可能であり得、これは、移植片宿主における拒絶において、そして特定の寄生虫感染に対して保護することで有益であり得る。
【００６８】
本発明は、最も頑強な抗体応答を生成するために（ＨＢｓＡｇのような）種々の抗原のリポソーム中へのカプセル化のための最適条件（例えば、ＨＢｓＡｇの用量、リポソームサイズ、リポソーム：タンパク質比、および新鮮リポソーム対凍結乾燥リポソーム、および再構築リポソーム）を決定するための方法を提供する。血清抗体応答は、送達の鼻腔内（ＩＮ）および筋肉内（ＩＭ）経路によってリポソーム中にカプセル化されたこのような抗原（ＨＢｓＡｇ−リポソーム）を受けたマウス中で比較された。本発明はまた、同じ形態の抗原（同種免疫）の１つの投与（プライム）または２つの投与（プライムおよびブースト）後の血清抗体応答の影響を開示する。リポソームは、鼻腔内または筋肉内経路を経由するＨＢｓＡｇに対する免疫を誘導するための非常に有効なアジュバントおよび送達ビヒクルであることが見出された。１つの実施形態では、試験抗原ＨＢｓＡｇは、ヒトで現在用いられている市販され利用可能なＨＢｓＡｇワクチン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）で処理されたマウスで観察されたレベルを達成したか、または超えた。鼻腔通路の粘膜表面への抗原の標的化送達はまた、サンプルとしたすべての粘膜表面で粘膜分泌物中の分泌性ＩｇＡの局所産生を刺激した。
【００６９】
従って、本発明は、異なるタイプの免疫応答（抗体産生、Ｔ細胞サイトカインプロフィール、ＣＴＬによる細胞性免疫、および粘膜表面における局所免疫）を促進するいくつかのワクチン送達プロトコールを提供する。これらの送達プラットホームの合理的な組み合わせは、特定の状況下、例えば、Ｔｈ１もしくはＴｈ２型免疫応答、または混合／より平衡化された応答を嗜好するために、特定の病原体に対する最良の保護を提供するよう仕立てられるワクチンの開発を可能にする。
【００７０】
１つの局面では、本発明は、ウイルス抗原のような特定の抗原に対して、動物、特に哺乳動物において免疫応答を効率的に惹起するための方法および試薬を提供する。本発明の１つの顕著な特徴は、鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）で宿主動物に送達されるリポソームにカプセル化されたタンパク質抗原の使用に関する。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明は、規定された組成およびサイズのリポソーム中に抗原をカプセル化することにより、そして得られる抗原−リポソーム調製物を粘膜免疫系に直接送達することによってより効率的なワクチンを生成するための方法および試薬を提供する。その他の実施形態では、本発明の特定のプラットホーム送達技術の適用は、このようなリポソームカプセル化ワクチンの適切なアジュバントおよび免疫化レジメンとの合理的な組み合わせを提供し、より有効および特異的な（細胞媒介および体液免疫応答を増大し、Ｔｈ２および混合／平衡Ｔｈ１／Ｔｈ２をＴｈ１応答に仕立て、ＩＦＮ−γ分泌を増加し、高レベルの粘膜ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＣＴＬを誘導する）ワクチンを提供するような免疫応答を仕立てる。
【００７２】
（ＩＩ．免疫プロトコル）
本発明の方法およびキットの１つの構成要素は、「プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）」免疫の使用であり、これは、１種以上の抗原のその後の投与に備えて、その同じ抗原を動物（特に、ヒト患者）に初期投与することを包含する。具体的には、用語「プライミング」とは、本明細書で使用される場合、望ましい抗原に対する免疫応答を誘導する抗原を用いる最初の免疫をいい、同じかまたは異なる、ワクチン送達系の状況で投与される場合に、その望ましい抗原でその後に再度免疫される際に、その同じ抗原に対するより高いレベルの免疫応答を再現する。
【００７３】
本発明の方法およびキットの別の構成要素は、「追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」、すなわち「ブースト（ｂｏｏｓｔ）」の使用であり、これは、プライミング免疫において情報記憶された（ｃｏｄｅ）されたものと同じ抗原を送達する、組成物の投与を意味する。ブーストは、ときおり、二次免疫応答（ａｎａｍｎｅｓｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（すなわち、以前にプライミングした動物での免疫応答）といわれる。各ブーストについて、同じかまたは異なる量を利用して、複数回のブーストが投与され得る。プライミングとは異なる抗原送達系を利用する追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）は、「異種ブースト（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｏｓｔ）」といわれ得るのに対して、プライミングと同じ抗原送達系を利用する追加免疫は、「同種ブースト（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｏｓｔ）」といわれ得る。
【００７４】
上記の一連の投与の代替として、プライミング調製物および追加免疫調製物が、同時に（すなわち、実質的に同時に）投与されうる。本発明の方法は、この方法が動物において惹起し得る免疫応答に関して、プライミング免疫と追加免疫との間で強力な相乗効果をもたらす。結果として、本発明の方法は、プライミング調製物および追加免疫調整物の各々が、単独で動物に投与される場合に、望ましいレベルの免疫応答を達成するに不十分である場合、望ましいレベルの免疫応答を惹起することを可能にする。特定の具体的実施形態において、鼻内ブーストでの異種免疫は、粘膜ＣＴＬ（ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋  表現型およびインビボＣＴＬ死滅）を生じ、生の病原体によるチャレンジ（例えば、例示的な実施例において出願人らによって示されるような、生ＨＢＶによるチャレンジ）に対する完全な防御を提供する。
【００７５】
宿主動物における免疫応答の効果は、種々のアッセイ（体液性免疫応答および細胞性免疫応答が挙げられ得る）によって評価され得る。体液性免疫応答としては、血清または粘膜表面における総抗原特異的抗体（Ｉｇ）力価；血清または粘膜表面におけるＨＢｓＡｇ特異的抗体の力価；特異的抗体アイソタイプおよび／またはサブタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａが挙げられる）の力価；ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの比率が挙げられる。細胞性免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の表現型および活性を含み；細胞性免疫応答はまた、Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカイン（ＩＦＮ−γが挙げられる）の分泌、およびＴｈ２応答に特徴的なサイトカイン（ＩＬ−１０およびＩＬ−４が挙げられる）の分泌を含む。そのサイトカインは、サイトカインＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって直接検出され（すなわち、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）、そしてＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比（例えば、Ｔｈ１  対  Ｔｈ２  応答）から推測される。
【００７６】
プライミング調製物および追加免疫調製物の各々は、以下の経路のうちのいずれか１つによって投与されうる：皮下、筋肉内、皮内、および粘膜。そのプライミング調製物および追加免疫調製物は、同じ経路によって投与されてもよいし、異なる経路によって投与されてもよい。特定の好ましい実施形態において、そのプライミング調製物は、筋肉内に投与され、追加免疫調製物は、筋肉内または鼻内のいずれかに投与され、強力な全身免疫応答を生じるのみならず、粘膜部位における局所免疫の誘導も生じる。１つの特定の実施形態において、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンでの筋肉内でのプライミングおよびＨＢｓＡｇ−リポソームでの鼻内での追加免疫は、強力な相乗的抗体応答、活性化されたＣＴＬおよびＴｈ１型サイトカインプロフィール、および粘膜部位での保存された分泌型ＩｇＡ生成を誘導した。鼻内経路によるブーストの送達は、局所免疫の生成のための重要な決定因子として確立された。
【００７７】
プライミング投与と追加免疫投与との間で、異なる間隔が使用されてもよい。ブースト投与は、以前の投与（初回ブーストまたは前のブースト）から、２〜８週間、好ましくは、４〜６週間時間を隔てて行われ得る。代表的には、初回投与から４〜６週間後に１回ブーストを投与することで十分である。本発明は、プライミング調製物または追加免疫調製物のいずれか、またはこれら両方が、動物に１回以上投与されうることを企図する。
【００７８】
ブースト投与および初回投与は、同量または異なる量の抗原−リポソーム調製物を利用してもよいし、ブースト投与および初回投与は、同じ経路または異なる経路で投与されてもよい。その初回投与およびブースト投与は、異なる計画に従って送達される異なる量のＤＮＡ抗原、および送達される異なる量の抗原−リポソーム調製物を利用してもよい。
【００７９】
（ＩＩＩ．抗原）
本明細書で使用される場合、用語「抗原」または「免疫原」とは、交換可能に使用され、関心のある動物内で免疫応答を誘導し得る、全てのペプチド配列またはタンパク質配列を包含すると解釈される。この用語「抗原」または「免疫原」は、既知の抗原または野生型抗原のペプチドアナログまたはタンパク質アナログを包含し、これらのアナログは、野生型抗原よりも可溶性でありかつ安定性であり得、そして抗原が、より免疫学的に活性であるかまたは特定の細胞型における発現のためにより最適である（すなわち、ヒト化コドンの利用）ようにする、特定の変異または改変も含みうる。抗原はまた、特定のアミノ酸置換が、天然に存在する抗原に対して行われたペプチドであり得る。この置換は、天然に存在する抗原のタンパク質構造、もしくはその一部（既知の防御性エピトープ（すなわち、ＣＴＬエピトープ）、または既知のエピトープ（１つの病原体に限定されていても、されていなくてもよい）の合成由来のつらなり（ｓｔｒｉｎｇ）（多価ワクチン）を含む）を変化させる。
【００８０】
望ましい抗原のアミノ酸配列と相同な配列を有するさらなるペプチドまたはタンパク質はまた、その相同な抗原が、それぞれの病原体に対する免疫応答を誘導する場合に、有用である。望ましい抗原コード配列に相同な遺伝子は、これらの遺伝子が、望ましい抗原の生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするのであれば、本発明に包含されると解釈されるべきである。
【００８１】
本明細書に記載される抗原のアナログは、保存的アミノ酸、配列差異によって、または配列に影響を及ぼさない改変を介して、あるいはその両方によって天然に存在するタンパク質またはペプチドとは異なり得る。例えば、保存的アミノ酸変化が行われ得、これは、タンパク質またはペプチドの一次配列を変化させるが、通常はその機能を変化させない。改変（通常は一次配列を変化させない）としては、ポリペプチドのインビボまたはインビトロでの化学的誘導体化（例えば、アセチル化、またはカルボキシル化）が挙げられる。また、抗原として含まれるのは、グリコシル化（例えば、その合成およびプロセシングの間にポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって行われるもの、またはさらなるプロセシング工程において行われるもの；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば、哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによって、改変されるタンパク質である。また本発明に従って抗原として含まれるのは、リン酸化されたアミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン）を有する配列である。また、抗原として含まれるのは、タンパク質分解に対するそれらの耐性を改善するかまたは可溶性特性を最適化する、通常の分子生物学的技術を利用して改変されたポリペプチドである。このようなポリペプチドのアナログとしては、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸）を含むものが挙げられる。本発明の抗原は、本明細書に列挙される具体的な例示的プロセスのいずれかの生成物に限定されない。
【００８２】
抗原は、全長の抗原、その免疫原性フラグメント、またはその抗原由来のエピトープであり得る。特定の実施形態において、その追加免疫調製物中の病原体特異的抗原は、弱毒化病原体または死滅病原体の形態であり得る。有効な抗原はまた、これらの病原体の表面抗原を含む。
【００８３】
用語「エピトープ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約３〜５個のアミノ酸、好ましくは、約５〜１０個または１５個のアミノ酸、およびわずか約１０００個のアミノ酸（またはその間の任意の整数）の配列であって、それ自体またはより大きな配列の一部として、このような配列に応答して生成される抗体に結合するか、または細胞性免疫応答を刺激する配列を規定するものをいう。用語「エピトープ」は、天然の配列と同一の配列、ならびに天然の配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般には、本質的に保存的）を包含する。本発明において使用される抗原は、単一のエピトープ（例えば、単一のＣＴＬエピトープ）のみを含んでいてもよい。
【００８４】
プライミング調製物中の核酸によってコードされる抗原および追加免疫調製物中の抗原は、好ましくは、重複するエピトープを有する。特定の実施形態において、その２つの抗原は、互いに同一であり得る。あるいは、その２つの抗原は、重複するが異なるエピトープセットを有しうる。例示によれば、ＨＢＶのワクチン接種プロトコルにおいて、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡは、プライミング調製物において使用され得、追加免疫調製物は、不活性化ＨＢＶであり得る。別の例示によれば、そのプライミング調製物は、ＨＢｓＡｇにおいて見出される単一エピトープをコードするミニ遺伝子であり得、その追加免疫調製物は、ＨＢｓＡｇ抗原を含み得、その逆もまた同様である。
【００８５】
以下は、本発明において使用されうる抗原の例示である。
【００８６】
抗原は、以下に由来し得る：ＨＩＶ−１（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥまたはｇＤまたはこれらの誘導体）、あるいはＨＳＶ１またはＨＳＶ２、サイトメガロウイルスに由来する最初期タンパク質（例えば、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６）、特にヒトサイトメガロウイルスに由来するもの（例えば、ｇＢもしくはその誘導体）、エプスタインバーウイルス（例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３）、あるいは肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原もしくはｐｏｌ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原およびＥ型肝炎ウイルス抗原、もしくは他のウイルス病原体（例えば、パラミクソウイルス）：ＲＳウイルス（例えば、Ｆタンパク質およびＧタンパク質またはこれらの誘導体）、またはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス由来の抗原（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、ｅｇＬＩ、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞（例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＭタンパク質、あるいはこれらの組み合わせ）、または細菌病原体（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが挙げられる）に由来する抗原（例えば、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ））；Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来してもよいし（例えば、Ｍタンパク質またはそのフラグメント、Ｃ５Ａプロテアーゼ）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ（Ｍ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても知られる）が挙げられる）（例えば、高分子量のアドヘシンおよびインバシン（ｉｎｖａｓｉｎ）および低分子量のアドヘシンおよびインバシン）；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素またはこれらの誘導体、繊維状血球凝集素、アデニレートシクラーゼ、線毛）、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａが挙げられる）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＥＳＡＴ６、Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ａ、−Ｂまたは−Ｃ、ＭＰＴ  ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ  １９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ  ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａが挙げられる）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ（腸管毒性Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、コロニー形成因子、熱不安定毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、シガ毒素様毒素またはその誘導体）が挙げられる）；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）が挙げられる）；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉが挙げられる）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられる）；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（例えば、毒素、アドヘシンおよびインバシン）およびＣ．ｃｏｌｉが挙げられる）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓが挙げられる）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが挙げられる）；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空砲形成毒素（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ）が挙げられる）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられる）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが挙げられる）；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍが挙げられる）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（例えば、ボツリヌス毒素及びその誘導体）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（例えば、クロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびこれらの誘導体）が挙げられる）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）が挙げられる）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）が挙げられる）；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉが挙げられる）；Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．（Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球性エールリヒア症の因子が挙げられる）；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉが挙げられる）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉが挙げられる；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓが挙げられる）；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ（例えば、稀な外膜タンパク質）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄ��ｓｅｎｔｅｒｉａｅが挙げられる）；あるいは抗原は、以下のような寄生生物に由来しうる：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが挙げられる）；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）が挙げられる）；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａが挙げられる）；Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉが挙げられる）；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．（Ｔ．ｃｒｕｚｉが挙げられる）；Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａが挙げられる）；Ｌｅｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．（Ｌ．ｍａｊｏｒが挙げられる）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．（Ｐ．  ｃａｒｉｎｉｉが挙げられる）；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓが挙げられる）；Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ．（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉが挙げられる）。あるいは抗原は、以下の酵母に由来してもよい：Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる）；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓが挙げられる）。
【００８７】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに関する他の好ましい特定の抗原は、例えば、以下である：
【００８８】
【化１】
2010180253.tif 000003
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのタンパク質はまた、融合タンパク質およびその改変体を含み、ここで少なくとも２つ、好ましくは３つのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓポリペプチドが、より大きなタンパク質に融合される。好ましい融合物としては、以下が挙げられる：
【００８９】
【化２】
2010180253.tif 000004
Ｃｈｌａｍｙｄｉａについての最も好ましい抗原としては、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（ＷＯ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ  ３６６４１２）および推定膜タンパク質（Ｐｍｐ）が挙げられる。ワクチン処方物の他のＣｈｌａｍｙｄｉａ抗原は、ＷＯ９９／２８４７５に記載される群から選択されうる。
【００９０】
好ましい細菌ワクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質）およびタンパク質結合ニューモリジン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９８９，６７，１００７；Ｒｕｂｉｎｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５，３３７−３４２）ならびにその変異無毒化誘導体（ＷＯ９０／０６９５１；ＷＯ９９／０３８８４）が挙げられる）由来の抗原を含む。他の好ましい細菌ワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（例えば、ＰＲＰおよびその結合体）、非典型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ）が挙げられる）に由来する抗原、フィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（ＵＳ５，８４３，４６４）または複数コピー改変体、あるいはこれらの融合タンパク質が挙げられる。
【００９１】
本発明において使用されうる抗原は、マラリアを引き起こす寄生生物に由来する抗原をさらに含みうる。例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに由来する好ましい抗原としては、ＲＴＳ、ＳおよびＴＲＡＰが挙げられる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４アミノ酸を介して連結されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳ）のＣ末端部分の実質的に全てを含むハイブリッドタンパク質である。その完全構造は、英国特許出願第９１２４３９０．７の優先権を主張する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１（番号ＷＯ９３／１０１５２の下で公開）に開示される。酵母において発現される場合に、ＲＴＳは、リポタンパク質粒子として生成され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と一緒に発現される場合には、ＲＴＳ、Ｓとして既知の混合粒子を生じる。ＴＲＡＰ抗原は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５（ＷＯ９０／０１４９６の下で公開）において記載される。本発明の好ましい実施形態は、マラリアワクチンであり、ここでこの抗原性調製物は、ＲＴＳ、ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含む。おそらく多段階のマラリアワクチンの成分でありそうな他のプラスモディウムの抗原は、Ｐ．ｆａｃｉｐａｒｕｍ  ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰｌ、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．におけるこれらのアナログである。
【００９２】
本発明のワクチンは、アレルギーまたは感染性疾患に加えて慢性障害の予防または治療のためにも使用されうる。このような慢性障害は、喘息、アテローム硬化症およびアルツハイマー病および他の自己免疫障害の様な疾患である。避妊薬としての使用のためのワクチンもまた、考えられ得る。
【００９３】
アルツハイマー神経変性疾患に罹患しやすいまたはこの疾患に罹患している患者の予防および治療に関連した抗原は、特に、Ｎ末端の３９〜４３アミノ酸フラグメント（ＡＢ  アミロイド前駆タンパク質およびより小さなフラグメント）である。この抗原は、国際特許出願番号番号ＷＯ９９／２７９４４（Ａｔｈｅｎａ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に開示される。
【００９４】
自己免疫障害のためのワクチンまたは避妊用ワクチンとして含まれうる潜在的な自己抗原としては、以下が挙げられる：サイトカイン、ホルモン、増殖因子または細胞外タンパク質、より好ましくは、４−ヘリカル（ｈｅｌｉｃａｌ）サイトカイン、最も好ましくは、ＩＬ１３である。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９，ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦおよびＯＳＭが挙げられる。４−ヘリカルサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＧＭＣＳＦおよびＭＣＳＦが挙げられる。ホルモンとしては、ｉｎｃｌｕｄｅ、例えば、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、ＶＧＦ、グレリン、ａｇｏｕｔｉ、ａｇｏｕｔｉ関連タンパク質および神経ペプチドＹが挙げられる。増殖因子としては、例えば、ＶＥＧＦが挙げられる。
【００９５】
（ＩＶ．プライミング調製物および追加免疫調製物）
プライミング調製物において使用される核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡが挙げられる）であり得る。好ましくは、そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列であり、最も好ましくは、ｃＤＮＡ配列である。哺乳動物内での抗原性ペプチドの発現を得るために、その抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクター系中に与えられることが必要である。「適切なベクター」とは、本明細書で使用される場合、その抗原性ペプチドが、免疫応答を誘起するに十分な量で哺乳動物内で発現されることを可能にする任意のベクターを意味する。
【００９６】
例えば、その選択されるベクターは、プラスミド、ファージミドまたはウイルスベクターであり得る。そのベクターは、その抗原性ペプチドの発現を得るために正しい順序で配置された、プロモーターおよびポリアデニル化／転写終結配列を含み得る。これらの成分および必要に応じて他の成分（例えば、エンハンサー、制限酵素部位および選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子））を含むベクターの構築は、当業者に周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，１−３巻き，第２版，１９８９に詳細に説明されている。
【００９７】
抗原性ペプチドをコードする核酸を有するベクターは、種々の様式で投与され得る。そのベクターを、適切な媒体（例えば、緩衝化生理食塩水溶液（例えば、ＰＢＳ））に懸濁し、次いで、筋肉内、皮下、皮内または粘膜に注射することで、裸の形態（すなわち、リポソーム処方物とも、ウイルスベクターとも、トランスフェクション促進タンパク質とも会合していない裸のヌクレオチド配列）で投与することが可能である。ベクターを、鼻経路または肺経路を介する投与のために、例えば、リポソームにまたはポリラクチドコ−グリコリド（ＰＬＧ）粒子内に（２５）包むことがさらに可能である。
【００９８】
本発明の一実施形態によれば、ベクターの皮内投与、好ましくは、遺伝子銃（特にパーティクルボンバードメント）投与技術の使用を介した投与についても可能である。このような技術は、金ビーズの上にベクターをコーティングし、次いでこれを、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４４：３７−４２（１９９６）に記載されるように表皮に高圧で投与することを包含し得る。
【００９９】
組換えウイルスベクターはまた、ＤＮＡ抗原を送達するために使用され得る。このアプローチの利点としては、複数の細胞型におけるＤＮＡコードタンパク質の豊富な発現、ＣＴＬ応答の大きな増強およびウイルスが複数の遺伝子をコードする能力が挙げられる。ワクシニアウイルス（改変ウイルスＡｎｋａｒａを含む）およびアデノウイルス（非複製性）は、ワクチン開発に利用されている、２つの普及しているウイルスである（Ｉｍ  ａｎｄ  Ｈａｎｋｅ，Ｅｘｐｅｒｔ，Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３：Ｓ８９−Ｓ９７（２００４）；Ｂａｓａｋら，Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１８２−１９６（２００４））。
【０１００】
ＤＮＡワクチンの最近の改変は、単一のＣＴＬエピトープをコードするミニ遺伝子の開発、ＭＨＣ経路によるエピトープのより効率的な提示を可能にする遺伝子にコードされる標的化シグナルの使用およびＭＨＣクラスＩＩ経路を標的とする分泌タンパク質の生成が挙げられる（Ｄｏｒｉａ−ＲｏｓｅおよびＨａｉｇｗｏｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１：２０７−２１６（２００３）；Ｌｅｉｆｅｒｔら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：４０−５３（２００４））。
【０１０１】
プライミング調製物および追加免疫調製物は、予防的または治療的に有効であるような量で投与される。その正確な量は、免疫される動物の種および体重、投与経路、プライミング調製物および追加免疫調製物の効力および用量、処置または防御される疾患状態の性質、免疫応答を生じる被験体の免疫系の能力ならびに望ましい防御効力または治療効力の程度に依存して、かなり変動し得る。これらの変数に基づいて、医師または獣医師は、適切な投薬レベルを容易に決定し得る。
【０１０２】
本発明の方法およびキットはまた、当該分野で公知の１種以上のアジュバントを追加して、実施されることが企図される。アジュバントは、免疫細胞の活性を調節することによって、抗原に対する特異的免疫応答を増大する物質または手順である。例示的なアジュバントとしては、塩ベースのアジュバント（例えば、ミョウバン塩）、リポ多糖および細菌毒素のような細菌由来アジュバント、抗原の緩慢な放出を可能にするアジュバントエマルジョン、同時刺激分子に対するアゴニスト抗体、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、および組換え／合成アジュバントが挙げられる。ミョウバンは、タンパク質ワクチンに対する免疫応答を刺激するために使用される最も一般的な塩ベースのアジュバントであり、米国でヒトでの使用について認可されている唯一のアジュバントである（Ａｌｖｉｎｇ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（３）：Ｓ５６−Ｓ６４（２００２）；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（３）：Ｓ７−１２（２００２））。しかし、ミョウバンは、Ｔｈ２に偏った応答に都合がよく、細胞媒介性免疫を刺激しない。粘膜免疫は、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）およびＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ））の使用を介して誘導され、が、これらのアジュバントの安全性には、疑問が残る（Ａｌｖｉｎｇ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（３）：Ｓ５６−Ｓ６４（２００２）；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（３）：Ｓ７−１２（２００２））。より新しい、安全なアジュバントの開発は、最近では、特定の免疫応答経路を刺激することに焦点を当てている。サイトカイン（例えば、インターフェロン−γおよび顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））の同時投与は、細胞性免疫応答を刺激することにおいて有望であることが示された（（ＰｅｔｒｏｖｓｋｙおよびＡｇｕｉｌａｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：４８８−４９６（２００４）において概説されている）。高レベルのサイトカインは、毒性を引き起こし得るが、投薬レジメンは、注意深く調節されなければならない。サイトカインの投与は、サイトカインおよび抗原をコードする遺伝子両方が、同じベクターによって同時に発現され得るＤＮＡワクチン接種について特に有望である。探査されるさらなるアジュバントとしては、ｔｏｌｌシグナル伝達経路を標的とするものが挙げられる。細菌ＤＮＡにおいて一般に見出されるＣｐＧ  ＤＮＡモチーフは、細胞性免疫応答の強力なアクチベーターであり、より新たな世代のＤＮＡベースのワクチンは、しばしば、複数のＣｐＧモチーフをコードする（（ＰｅｔｒｏｖｓｋｙおよびＡｇｕｉｌａｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：４８８−４９６（２００４）において概説される）。
【０１０３】
（Ｖ．病原体）
用語「病原体」とは、本明細書で使用される場合、宿主細胞において感染を引き起こし、、任意のウイルス、細菌および寄生生物をいう。
【０１０４】
本発明は、広い範囲の病原体に対して宿主動物を効率的に免疫するために使用され得る。本明細書の教示に鑑みれば、当業者は、本発明の方法および組成物が、広い範囲のウイルス（例えば、レトロイドウイルス（ｒｅｔｒｏｉｄ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルスおよびエンベロープウイルスに適用可能であることを理解する。一実施形態において、本発明は、レトロイドウイルスに適用可能である。別の実施形態において、本発明は、レトロウイルス（レトロウイルス科）にさらに適用可能である。なお別の実施形態において、本発明は、レンチウイルス（霊長類レンチウイルス群が挙げられる）に適用可能である。さらなる実施形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、およびヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）に適用可能である。
【０１０５】
限定されることは意図しないが、関連するレトロウイルスとしては、以下が挙げられる：カワカマスにおいてリンパ肉腫を引き起こすＣ型レトロウイルス、ミンクに感染するＣ型レトロウイルス、ヒツジに感染するヤギレンチウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｎｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＥＩＡＶ））、ブタに感染するＣ型レトロウイルス、トリ白血症肉腫ウイルス（ＡＬＳＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコエイズウイルス、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、サル白血病ウイルス（ＳＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＴ細胞白血病ＩＩ型ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）およびヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）。
【０１０６】
本発明の方法および組成物は、ＲＮＡウイルス（ｓｓＲＮＡ（−）鎖ウイルスおよびｓｓＲＮＡ（＋）鎖ウイルスが挙げられる）にさらに適用可能である。このｓｓＲＮＡ（＋）鎖ウイルスとしては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明は、モノネガウイルス目（フィロウイルスが挙げられる）に適用可能である。フィロウイルスは、エボラウイルスおよびマルブルグウイルスをさらに含む。他のＲＮＡウイルスとしては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）、カリシウイルス（ノーウォーク様ウイルスが挙げられる）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルスが挙げられる）、トガウイルス（アルファウイルス、セムリキ森林ウイルスが挙げられる）、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルスおよび風疹ウイルス、オルソミクソウイルス（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型のインフルエンザウイルス）、ロタウイルス、ブンヤウイルス（リフトバレー熱ウイルスおよびハンタウイルスが挙げられる）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルスおよびマルブルグウイルス）、およびパラミクソウイルス（流行性耳下腺炎ウイルスおよび麻疹ウイルスが挙げられる）が挙げられる。本発明の方法で処置され、他のウイルスとしては、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ２）、炭疽菌、ＲＳウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳについての病原体）および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）が挙げられる。処置され、さらなる病原体としては、クラミジアおよびマラリアを引き起こす寄生生物（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅが挙げられる）が挙げられる。
【０１０７】
本発明に従う方法およびキットは、全ての動物（例えば、家畜、実験動物、農耕用動物（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、捕獲された野生動物および最も好ましくは、ヒトが挙げられる）の予防手順または処置手順に関連して使用され得る。
【０１０８】
本発明の方法およびキットは、治療的ワクチン接種に有用である。この治療的ワクチン接種の目的は、ウイルスに既に感染した細胞を根絶するために、感染した個体における免疫応答を標的とすることである。強い免疫応答を刺激することなく慢性感染を確立するウイルスは、新規な治療的ワクチン接種ストラテジーの作製を必要とする（（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：４５０−４６２（２００４）に概説される）。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、ヘルペスウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が、長期間の感染を確立する多くのウイルスである。ウイルスのための治療的ワクチンの開発は、感染細胞を認識かつ破壊するために、ＣＴＬの活性化に焦点を当てた。出願人は、本発明の方法が、細胞性免疫応答を増強する際に有効であり、そのことによって、治療的ワクチン接種を提供するために適切にされることを示した。この方法の有効性は、サイトカインアジュバントおよびＣｐＧモチーフ（これは、抗癌ワクチンの開発において特に有望であることが示された（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：６８２７−６８３０（２００４））を含めることによってさらに増強され得る。
【０１０９】
本発明のワクチンは、疾患（例えば、慢性状態）の免疫治療的処置に特に適しているが、持続性の感染の治療のためにも適している。従って、本発明のワクチンは、感染性疾患（例えば、結核（ＴＢ）、ＨＩＶ感染（例えば、ＡＩＤＳ）およびＨＢＶ感染）の免疫療法に特に適している。
【０１１０】
（ＶＩ．リポソーム調製物）
本発明はまた、粘膜部位を介したワクチン適用のためのリポソームベースの抗原送達プラットフォーム技術を提供する。本発明は、よりバランスのとれたＴｈ応答、または混合されたＴｈ応答を達成するために、リポソーム封入技術、粘膜部位への特異的送達、ならびにアジュバントおよび異種免疫プロトコルの使用を組み合わせる。
【０１１１】
リポソームは、ワクチンのための送達プラットフォームとしてのいくつかの潜在的利点を有する。リポソーム内での抗原の封入は、これらの抗原を隔離し、従って、リポソームは、抗原の持続放出を行い得る抗原デポーとして作用する。さらにリポソームは生体適合性でかつ生分解性であり、毒性および免疫原性が低い。適切なサイズ（例えば、０．２μｍより大きく５μｍまで）にされた場合、リポソームは、抗原提示細胞によって身体中に選択的に取り込まれ、体液性抗体およびＣＴＬ応答の両方を誘導する可能性を有する。リポソームは、抗原キャリア／ビヒクルとして作用し、かつ毒性も免疫原性もなく繰り返し投与され得るアジュバントである。
【０１１２】
リポソームは、通常は形状が球状の、生物起源または合成起源のリン脂質から構成される膜二重層からなる構造体である。リン脂質または脂質が水と接触したとき、リポソームは自然に形成される。リポソームの構造は、熱、超音波エネルギー、凍結−融解サイクル、または剪断力の形態でのエネルギーの投入を含め、実験室においてこれらを形成する方法によって操作され得る。リポソームは生物学的膜の特徴を有するので、リポソームは、種々の生物学的および治療的に適切な複合分子（タンパク質を含む）を含むように、実験室において操作され得る。リポソームのリン脂質二重層は、内部水性コア中に封入された物質を外側から分離して保護する。水溶性物質および水不溶性物質は両方とも、それぞれ、同じリポソームの異なる区画（水性コアおよび二重層膜）に封入され得る。これらの物質の化学的および物理的な相互作用は、除去され得る。なぜなら、これらの物質は、これらの異なる区画に存在するからである。
【０１１３】
本発明の方法およびキットとともに用いられるリポソームは、当該分野で公知の任意の方法を用いて調製され得る。これらのリポソームは、約０．５〜５ミクロンの平均直径を有し得るが、０．２〜８ミクロンのリポソームもまた有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の方法およびキットにおいて用いられ得るリポソームは、１以上の特化された脂質（リポソームに取り込まれた場合に、このような特化された脂質を欠くリポソームと比較して長期化された循環寿命をもたらす）を含むリポソームである、「長期循環性リポソーム」（「立体的に安定化されたリポソーム」としても公知）である。当該分野で公知の長期循環性リポソームの例としては、（Ａ）リポソームが１以上の糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含むリポソーム、または（Ｂ）リポソームが、１以上の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）で誘導体化された１以上の脂質を含むリポソームが挙げられる。何らかの理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含む長期循環性リポソームについては、これらのリポソームの長期化した循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少から得られる（Ａｌｌｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０１１４】
Ａ．糖脂質含有リポソーム：１以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当該分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，６９４９）によって説明された。米国特許第４，８３７，０２８号および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ８８／０４９２４（両方とも、Ａｌｌｅｎらに対するもの）は、（１）スフィンゴミエリンを含むリポソームおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂらに対するもの）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／１３４９９（Ｌｉｍらに対するもの）において開示される。
【０１１５】
Ｂ．親水性ポリマーで誘導体化されたリポソーム：１以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびそれらの調製方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８４，１６７，７９）は、ポリマーグリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが、有意に長期化された血中半減期をもたらすことに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって改変された合成リン脂質およびこのようなリン脂質を含むリポソームは、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載される。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の有意な増加を有することを実証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）へのＰＥＧの化学的結合から形成される、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）に拡大した。
【０１１６】
ＰＥＧ部分がその外部表面に共有結合したリポソームは、欧州特許第０  ４４５  １３１号Ｂ１および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０４３８４（Ｆｉｓｈｅｒに対するもの）に記載される。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モルパーセント（ｍｏｌ％）含むリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ  ０  ４９６  ８１３号Ｂ１）によって記載される。多数の他の脂質−ポリマー結合体を含むリポソームは、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（両方とも、Ｍａｒｔｉｎらに対するもの）、ならびに公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示される。ＰＥＧで改変されたセラミド脂質を含むリポソームは、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、官能性部分でその表面がさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載する。
【０１１７】
Ｃ．ＤＭＰＧ含有リポソーム：ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含む種々のリポソームが記載されている。しかし、一般的に、このようなリポソームは、約１０％以上のｍｏｌ％のＤＭＰＧを含む（例えば、Ａｋｈｔａｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９，５５５１）；Ｙａｃｈｉら（Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓ．，１９９６，１７，６９９）；およびＦａｒｍｅｒら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１９８７，１４９，１８４）を参照のこと）。３ｍｏｌ％のＤＭＰＧを有するリポソームが記載されているが、このようなリポソームは、本発明のリポソーム組成物中に見出されない成分（特に、ホスファチジルコリン誘導体）を含んでいた。このようなホスファチジルコリン誘導体成分としては、例えば、１０ｍｏｌ％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（Ｂｒｏｄｔら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９８９，２８，５４）または７ｍｏｌ％ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒら，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．，１９８５，２６，７４３；Ｗａｓａｎら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９３，３７，２４６；およびＬｉら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓ．，１９９５，７，６１１）が挙げられる。
【０１１８】
リポソーム調製物は、新たに調製されるかまたは長期保存のために凍結乾燥されるかのいずれかであり得る。両方の調製物は、匹敵する有効性で用いられ得る。本発明の方法において用いられるリポソームは、全く同じ（例えば、同じ組成または同じサイズ）であってもよく、または１種類より多くの種類のリポソームを含んでもよい。
【０１１９】
特定の実施形態では、市販のリポソームが用いられ得る。例えば、リポソームは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）（脂質ベースのリポソーム処方物の開発に特化した契約研究機関）によって契約の下、作製され得る。特定の他の実施形態では、種々のサイズのリポソームは、下記の方法論を用いて調製され得る。得られるリポソームは、特定の調製プロトコルに依存して、代表的に、マイクロフルイダイザーを通して調製物を通すことにより、４μｍ、１μｍ、または０．２μｍにサイズ合わせされる。手短には、リポソームを、以下の脂質濃度で調製した：ホスファチジルコリン／コレステロール／ジセチルホスフェートが７／３／０．５モル％。抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）は、免疫応答を試験するために、いくつかの濃度で多層リポソームに取り込まれる。平均６０％のＨＢｓＡｇが、以下の実施例においてリポソームに取り込まれた。リポソームのサイズをまた、Ｎ４  ＭＣ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて測定した。４μｍのサイズのリポソームの代表的プロファイルを図１に示す。１つの実施形態では、リポソーム：タンパク質比は、１５μｇのＨＢｓＡｇを封入するために通常用いられる含有量の１／２および１／３に減少した。特定の実施形態では、抗原調製物は、保存のために凍結乾燥され得、次いで使用前に再構成され得る。サイズおよびζ電位（ゼータ、電荷の尺度）の両方が使用前に測定され得る。ζ電位は、Ｚｅｔａ−Ｐｕｌｓ  ζ電位分析器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて決定された。脂質：抗原タンパク質比は、特定の抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）に対する免疫応答におけるこの比の重要性を決定するために、いくつかの調製物において変動され得る。
【０１２０】
（Ａ．２〜４μｍのサイズ範囲を有するリポソームについての基本的方法）
本発明のリポソームを、以下の脂質濃度で調製した：ホスファチジルコリン／コレステロール／ジセチルホスフェートが７／３／０．５モル％。ジセチルホスフェートを、クロロホルム＋５％エタノールに溶解し、超音波処理し、次いでホスファチジルコリンおよびコレステロールを添加した。脂質をＬａｂｃｏｎｃｏロータリーエバポレーターにおいて１時間乾燥し、そして痕跡量のクロロホルムを、Ｆｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを一晩用いた凍結乾燥によって除去した。脂質薄膜を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＨＢＳ）中の１２５〜３００μｇ／ｍｌの濃度の抗原（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ））とともに水和し、そして０．２μｍナイロンフィルターで濾過した。この混合物を徹底的にボルテックスし、そして１時間沈降させ、次いで再度ボルテックスして、多層小胞の形成を確実にした。次いで、得られたリポソームを３サイクルの凍結−融解に供した（１サイクル＝１時間の凍結および室温での１時間の融解）。リポソームのサイズを、Ｎ４  ＭＤ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて測定した。ζ電位を、Ｚｅｔａ−Ｐｕｌｓ  ζ電位分析器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１．０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で測定した。
【０１２１】
（Ｂ．１．０μｍのサイズのリポソーム）
本発明のリポソームを、以下の脂質濃度で調製した：ホスファチジルコリン／コレステロール／ジセチルホスフェートが７／３／０．５モル％。ジセチルホスフェートを、クロロホルム＋５％エタノール中に溶解し、超音波処理し、次いでホスファチジルコリンおよびコレステロールを添加した。脂質をＬａｂｃｏｎｃｏロータリーエバポレーターにおいて１時間乾燥し、そして痕跡量のクロロホルムを、Ｆｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを一晩用いた凍結乾燥によって除去した。脂質薄膜を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中の１２５〜３００μｇ／ｍｌの濃度の抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）とともに水和し、そして０．２μナイロンフィルターで濾過した。この混合物を徹底的にボルテックスし、そして１時間沈降させ、次いで再度ボルテックスして、多層小胞の形成を確実にした。次いで、このリポソームを３サイクルの凍結−融解に供した（１サイクル＝１時間の凍結および室温での１時間の融解）。第３サイクルの後、リポソームを水浴中で５０℃まで温め、そして携帯型Ａｖａｎｔｉ−マイクロエクストルーダを用いて、１．０μｍの孔サイズを有するポリカーボネートフィルターを通して押出した。リポソームのサイズを、上記の通りに測定した。
【０１２２】
（Ｃ．０．２μｍのサイズを有するリポソーム）
本発明のリポソームを、以下の脂質濃度で調製した：ホスファチジルコリン／コレステロール／リン酸ジセチル  ７／３／０．５モル％。リン酸ジセチルを、クロロホルム＋５％のエタノール中に溶解させ、超音波処理し、次いで、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを添加した。脂質をＬａｂｃｏｎｃｏロータリーエバポレーターで１時間乾燥させ、クロロホルムの痕跡をＦｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５凍結乾燥システムを用いて一晩凍結乾燥することによって除去した。脂質フィルムを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中の１２５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌの濃度で抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）を用いて水和し、０．２μｍのナイロンフィルターで濾過した。その混合物を徹底的にボルテックスし、１時間静置し、次いで、再度ボルテックスして多重膜の小胞の形成を確実にした。次いで、そのリポソームを３サイクルの凍結−解凍（１サイクル＝１時間凍結させ、室温で１時間解凍する)に供した。３回目のサイクルの後、リポソームを水浴中で５０度に温め、手持ち式のＡｖａｎｔｉ押出し成形機を用いて最初に１．０μｍの孔径、次いで０．４μｍの孔径、最後に０．２μｍの孔径を有するポリカーボネートフィルターを通して押し出した。次いで、リポソームのサイズを上記のように測定した。
【０１２３】
（Ｄ．凍結乾燥リポソームの調製）
本発明のリポソームを以下の脂質濃度で調製した：ホスファチジルコリン／コレステロール／リン酸ジセチル  ７／３／０．５モル％。リン酸ジセチルを、クロロホルム＋５％のエタノール中に溶解させ、超音波処理し、次いで、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを添加した。脂質をＬａｂｃｏｎｃｏロータリーエバポレーターで１時間乾燥させ、クロロホルムの痕跡をＦｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５凍結乾燥システムを用いて一晩凍結乾燥することによって除去した。脂質フィルムを、１００ｍｇ／ｍｌのマルトースを含むＨＢＳ中の１２５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌの濃度で抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）を用いて水和し、０．２μｍのナイロンフィルターで濾過した。その混合物を徹底的にボルテックスし、１時間静置し、次いで、再度ボルテックスして多重膜の小胞の形成を確実にした。次いで、そのリポソームを３サイクルの凍結−解凍（１サイクル＝１時間凍結させ、室温で１時間解凍する)に供した。リポソームのサイズを測定し、リポソームをＦｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５凍結乾燥システムを用いて一晩凍結乾燥した。凍結乾燥リポソームを、必要な抗原濃度に達するように、対応する量の水とともにボルテックスすることによって再構成した。
【０１２４】
（ＶＩＩ．アッセイ）
以下のアッセイは、本発明の特定の工程を行うために必要とされ得る。通常、当業者が認識するように、異なるが機能的に等価な多くのアッセイが、同一の目的を達成するために使用され得る。従って、具体的に記載されるアッセイのいずれも、明確に記載されない限り限定するものではない。
【０１２５】
（Ａ．酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
免疫したマウスの収集したサンプルにおける抗ＨＢｓＡｇ特異的抗体応答（例えば、Ｉｇ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を、ＥＬＩＳＡによって試験した。３層の（抗原−試験サンプルまたはＩｇ標準物質−ＨＲＰ結合検出抗体）ＥＬＩＳＡを、Ｉｇ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を試験するために設計した。１０μｇ／ｍｌの純粋なＨＢｓＡｇ（５０μｌ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。血清または分泌サンプルの連続希釈物を、遮断工程の後に添加した。ヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を検出抗体として使用して、サンプル中の抗ＨＢｓＡｇ特異的Ｉｇ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをそれぞれ試験した。連続希釈したＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ標準物質を使用して、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体ＥＬＩＳＡについての標準曲線を作成した。５層捕捉ＥＬＩＳＡを用いて、マウスＩｇＡおよびマウスＩｇＧについて粘膜サンプルを試験した。４ｍｇ／ｍｌのラット抗マウスＩｇＡ捕捉抗体（５０μｌ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングして、血清および粘膜（糞便、膣、肺洗浄物および唾液）部位からＩｇＡ抗体を捕捉した。２μｇ／ｍｌの精製ＨＢｓＡｇ（１００μｌ）を添加して、抗ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＡ抗体に結合させる。ヤギ抗ＨＢｓＡｇを使用して、上記工程において捕捉されたＨＢｓＡｇに特異的に結合させる。ロバ抗ヤギＩｇＡ−ＨＲＰが、基質−ＴＭＢからの発色前の最終的な検出抗体であった。粘膜ＩｇＧの検出のために、ラット抗マウスＩｇＧ抗体を捕捉抗体として使用し、その後、ＨＢｓＡｇ、ヤギ抗ＨＢｓＡｇおよびロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰを、ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡで使用したのと同じ濃度で使用した。
【０１２６】
（Ｂ．ＩｇＧ抗体アビディティの測定）
ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ抗体のアビディティを、定量的ＥＬＩＳＡアビディティアッセイを用いて評価する。アッセイを、抗原−抗体相互作用を妨げるためにカオトロピック試薬の尿素を追加して、ＩｇＧ抗体についての最適条件を用いて実施する。一貫した正確な結果を保証するために、試験したサンプル希釈物中のＩｇＧの相対量は、１００ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌであり、これは、標準曲線の直線で定量的な部分の範囲内である。希釈したサンプルを、最初にＨＢｓＡｇをコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で室温にて１時間インキュベートして、抗原−抗体結合を生じさせる。ウェルを洗浄し、続いて標準的なＥＬＩＳＡ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）またはＥＬＩＳＡ緩衝液中の種々の濃度の尿素とともに室温で１５分間インキュベートする。さらに洗浄した後、ＥＬＩＳＡを従来のとおりに行う。アビディティ指標（ＡＩ）を、以下の式に従って計算する：尿素の非存在下でのＩｇＧ（ｎｇ／ｍｌ）／尿素の存在下でのＩｇＧ（ｎｇ／ｍｌ）。
【０１２７】
（Ｃ．ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫ＳＰＯＴ）アッセイによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０分泌細胞の検出）
免疫したマウスおよび無刺激マウス由来の脾臓または末梢血液細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０分泌細胞の測定のために、インビトロで培養した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、市販の抗体ペアおよび試薬（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ならびにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＩＰマルチウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｈｏｐｋｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を用いて確立した。インビトロ培養物を、１ｍｌあたり１０μｇ／２．５×１０６細胞の濃度にてＨＢｓＡｇペプチドで２０〜２２時間刺激した。ペプチドを含まない培養物をネガティブコントロールとして使用し、抗ＣＤ３またはＣｏｎ  Ａで刺激した培養物をポジティブコントロールとして使用した。この研究からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０  ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）によって、スポットの頻度およびスポットサイズの両方について、この目的のために設計されたデジタルプレートリーダーおよびソフトウェアを用いて定量的に分析した。
【０１２８】
（Ｄ．インビボＣＴＬ細胞毒性アッセイ）
インビボＣＴＬアッセイは、免疫した動物におけるＣＴＬ活性を測定することについて最近文献に記載されている（参考文献：Ｅｓｔｃｏｕｒｔ，Ｍ．Ｊ．ら、２００２、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（１）：３１−３７;Ｂａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２７−３１;Ｋｕｍａｒａｇｕｒｕ，Ｕ．ら、２００４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：３３７１９−３７２４）。このインビボアッセイは、２ラウンドのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンＩＭ、その後、本発明のリポソーム調製物（例えば、ＨＢｓＡｇ−リポソーム）ＩＮを与えたマウスを使用する。抗体応答の測定のためにサンプル収集を完了した後（ＩＮブーストの６週間もしくはそれ以上の期間後）、マウスにＤＮＡブーストを与え、記憶Ｔ細胞を活性化エフェクター細胞に動員する。７日〜１２日後、動員したエフェクター細胞の活性を、これらの細胞がマウスに静脈内養子移入されるＨＢｓＡｇペプチドでパルスした標的を特異的に殺傷する能力を決定することによって定量する。マウスに、生体内色素であるＣＦＳＥ（ＦＩＴＣチャネルにおける蛍光放射）で差次的に標識される無刺激マウス由来の２つの細胞集団（ペプチドでパルスされないＣＦＳＥｌｏｗ細胞、およびＨＢｓＡｇ由来のＬ（ｄ）−限定的免疫優性ペプチド（ＨＢｓＡｇの２８〜３９）でパルスされるＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞）を与える。非パルスＣＦＳＥｌｏｗ集団と比較したペプチドパルスＣＦＳＥｈｉｇｈ集団の消失が、以下に示される式によるペプチド特異的殺傷の指標である。無刺激レシピエントのコホートにおけるこれら２つの集団のパーセンテージが、細胞移入についての内部標準として役立つ。このアッセイの概要を以下に示す。
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
標的細胞調製：
無刺激脾細胞：ＣＦＳＥｌｏｗで標識する。ペプチドでパルスしない。フローサイトメトリーによって標識を確認する。
無刺激脾細胞：ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識する。ペプチドでパルスしない。フローサイトメトリーによって標識を確認する。
同数のＣＦＳＥｌｏｗ細胞とＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞とを混合する（各々、１〜１．５×１０７細胞）。
【０１２９】
インビボＣＴＬアッセイ：
免疫したマウスおよび無刺激マウスの両方のコホートに細胞を静脈内移入する。
２０〜２４時間後、脾臓を採取し、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために処理する。
【０１３０】
割合＝ＣＦＳＥｌｏｗ細胞  ：  ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞のパーセンテージ
特異的溶解％＝１−（無刺激マウスにおける割合／免疫したマウスにおける割合）×100
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
【０１３１】
（Ｅ．ＨＢｓＡｇを発現する組換え生ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＨＢｓＡｇ）による鼻腔内チャレンジ後の保護粘膜免疫の測定）
Ｂ型肝炎ウイルスは、高度に種特異的であり、ヒトおよびいくつかの非ヒト霊長類のみに感染する。この問題を回避するために、ＨＢｓＡｇを発現する組換えウイルスを、マウスにおける生ウイルスチャレンジのために使用して、ＨＢＶワクチン接種プロトコルの保護効力を試験した。本発明者らは、ベクターＨＢｓＡｇ抗原を発現する遺伝子操作した弱毒化ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＨＢｓＡｇ）（これは、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ博士、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ（Ｓｍｉｔｈ，ＭａｃｋｅｔｔおよびＭｏｓｓ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：４９０−４９５）により快く提供された）を使用してマウスをチャレンジした。ウイルスチャレンジのために病原抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用することの可能性および有用性は、Ｃ型肝炎およびＨＩＶを含む数種のウイスル疾患モデルにおいて、マウスで最近実証されている（Ｐａｎｃｈｏｌｉ，Ｐ．ら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１）：３８２−９０；Ｍａｒａｔａ，Ｋ．ら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（１１）；Ｂｅｌｙａｋｏｖ，ＩＭら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（４）：１７０９−１４）。
【０１３２】
無刺激マウスまたは免疫したマウスを、５０μｌの容量中の２×１０５ＰＦＵのウイルスで鼻腔内感染させた。マウスを５日後に屠殺し、ウイスル力価を肺ホモジネート中で決定した。肺洗浄物および脾細胞もまた、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋表現型によって規定されるＣＴＬの存在について評価した。
【０１３３】
（Ｆ．生ＶＶ−ＨＢｓＡｇを用いる鼻腔内チャレンジ後のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋表現型によるＣＴＬの検出）
ＣＴＬは、十分に認識され標準化されたプロトコル（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡによって提供される試薬およびキットを参照のこと）に従って、表面ＣＤ８＋細胞内ＩＦＮγ＋表現型によって規定され得る。これらの試薬を使用して、表現型によって規定されるＣＴＬの頻度を、フローサイトメトリー分析によって決定した。この目的のために、肺および脾臓から回収した単核細胞をＨＢｓＡｇ  ＣＴＬペプチド（ＨＢｓＡｇの２８〜３９）を用いてインビトロでゴルジインヒビターの存在下で５時間活性化し、蓄積した細胞内サイトカインの分泌を防いだ。次いで、製造業者の指針に従って、細胞をＣＤ８について表面染色し、透過化処理し、そして細胞内ＩＦＮγを染色した。
【実施例】
【０１３４】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書および図面全体を通して引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許出願の内容は、本明細書によって参考として援用される。
【０１３５】
以下の実施例において、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を、本願リポソームベースワクチンのための例示的抗原として選択した。Ｂ型肝炎感染は、深刻な健康上のリスクであり、そして世界中の主要死亡原因のうちの１つである。ＨＢｓＡｇに対する抗体応答は、５％〜１０％のヒトにおいて生存ウイルスによる感染に対する保護を付与することが公知である。ＨＢｓＡｇは、充分に特徴付けられた抗原である。この抗原は、多数のＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープを含む。これらのエピトープによって、この抗原は、マウスにおける免疫応答を実証するための適切なモデル抗原となる。さらに、組換えＢ型肝炎ウイルスタンパク質および遺伝子発現構築物もまた、市販されている。これによって、高価な試薬を開発する必要性が排除される。しかし、本発明は、このＨＢｓＡｇワクチンに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、広範囲の病原体（種々のウイルスおよび細菌を含む）における広範な使用を有する。
【０１３６】
（実施例１：抗体応答に対するプライムおよびブースト免疫プロトコルの効果）
宿主動物（例えば、ＣＤ１マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウス）を免疫するために、本願ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物を使用する一次免疫を、０週目にその動物に投与した。６週目に、ＨＢｓＡｇ−リポソーム二次ブースト免疫を、投与した。
【０１３７】
ワクチン送達プラットフォームを最適にするために、本発明者らは、実施例１〜５において概説されるような、種々の免疫ストラテジーを使用していくつかの実験を実施した。この一連の実験において、リポソームを、４μｍの大きさにした。この大きさは、タンパク質抗原に対する免疫応答を刺激する際に有効であると報告されている。最初の実験は、以下のパラメーターを試験した：２回の免疫（０週目および６週目のプライムおよびブースト）に対する１回の免疫（０週目のプライム）の影響（実施例１）；抗体応答の速度論（実施例２）；ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物の用量（実施例３：３μｇ／マウスまたは１５μｇ／マウス）；投与経路（実施例４：鼻内経路または筋肉内経路）；ならびにワクチンの物理的形態（実施例５：新鮮なワクチンまたは凍結乾燥ワクチン）。サンプルを、体液性免疫応答および粘膜免疫応答の分析のために、示された時点に収集した。
【０１３８】
ネガティブコントロールは、未刺激マウス、リポソーム単独、およびＨＢｓＡｇタンパク質単独を包含した。動物にはまた、ポジティブコントロールとして、３μｇ  ＧＳＫワクチン（ＧＳＫ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得たＥｎｇｅｒｉｘＴＭ−Ｂ、すなわち「ＧＳＫ  ＨＢｓＡｇ」）を筋肉内免疫した。非近交系の遺伝的に不均質なＣＤ１マウス（Ｎ＝２２５、５匹／群）および近交系Ｔｈ２プローン（ｐｒｏｎｅ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｎ＝５０、５匹／群）の両方に、比較目的のために免疫した。ＣＤ１マウスは、非近交系株であり（すなわち、遺伝的に不均質である）、従って、ヒトにおいて見出される多岐にわたる遺伝学を表わす。
【０１３９】
例えば、一連の実験において、１０匹のマウスに対して、０週目に、プライム抗原によって免疫した。６週目に、ブースト投与を、その１０匹のマウス中５匹に投与した。サンプルを、ＥＬＩＳＡアッセイによる抗体決定のために、２週目、４週目、６週目、８週目、および１２週目に、（例えば、血液、糞便、膣洗浄物から）収集した。
【０１４０】
下記の実施例は、これらの研究から得た代表的データを示し、これらは、本願ＨＢｓＡｇ−リポソームによるワクチン接種のための最適条件を実証する。上記の種々のワクチンに対する体液性免疫応答を、本発明者らが開発したＥＬＩＳＡアッセイ（上記）を使用してＨＢｓＡｇ特異的全血清抗体応答を決定することによって、測定した。プライミング後の２週間目、４週間目、６週間目、８週間目、および１２週間目に採取したサンプルを分析したが、一次免疫後８週間目の応答のみが、ほとんどの実施例について示される。
【０１４１】
ほとんどのグラフは、ポジティブコントロールとしての市販のＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチンに対する応答を含み、本発明者らが試験ワクチンについて達成することを望む基準として役立つ。どの未刺激マウスにおいても、ＨＢｓＡｇ特異的応答は、全く検出されなかった（データは、示さない）。黒塗りの記号は、１回の免疫を受けたマウスからの応答を同定し、一方、黒塗りの網目記号（＋）は、プライミングおよびブースター免疫の両方を受けたマウスからの応答を示す。結果は、ＨＢｓＡｇ特異的全血清抗体についてのＥＬＩＳＡアッセイにおける４５０ｎｍでの光学密度（ｙ軸）に対する、試験したサンプルの希釈度（ｘ軸）として示される。任意単位として表わされるこのＥＬＩＳＡの結果は、４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）にて読取った。
【０１４２】
明確にするために、本明細書中に示されるデータのほとんどは、１つの実験について５匹〜１０匹のマウスからプールしたサンプル（マウス群から得た等量の個々のサンプル）からの平均である。図２は、ある１つの実験における個々のＣＤ１マウスとＢａｌｂ／ｃマウスとの間で観察される変動の程度を示す。
【０１４３】
図２〜図８において、３μｇ用量のＨＢｓＡｇ−リポソームを鼻内送達すること（図４）以外は、試験したすべての条件について、ブースター免疫は、ＨＢｓＡｇ−リポソームに対するＨＢｓＡｇ特異的血清抗体応答およびＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチンコントロールに対するＨＢｓＡｇ特異的血清抗体応答の両方を、実質的に増強したことが、示される。従って、リポソームは、このＨＢｓＡｇ抗原のための非常に有効なアジュバントおよび送達ビヒクルであり、抗体応答は、同じ二次ブースター免疫の後に実質的に増加される。
【０１４４】
（実施例２：リポソーム中に封入されたＨＢｓＡｇ（ＨＢｓＡｇ−リポソーム）で鼻内（ＩＮ）免疫した後のＣＤ１マウスにおける抗体応答の速度論）
図３は、１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソームでＣＤ１マウスを鼻内免疫した後の、ＨＢｓＡｇ特異的抗体の血清力価を示す。ＨＢｓＡｇ特異的抗体の力価の有意なブーストが、同じＡｇ調製物の二次ブースト投与を使用した場合、観察された。しかし、ブースト投与をしない場合、力価は、一次免疫後約４週間目にそのピークに到達し、８週を通して同様のレベルのままであった。さらに、１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソームは、３μｇ投与量の市販のＧＳＫワクチンと少なくとも同程度に有効である。
【０１４５】
（実施例３：ＨＢｓＡｇ−リポソームに対する用量応答）
ＣＤ１マウスを、上記リポソーム調製物中に封入した３μｇまたは１５μｇのいずれかのＨＢｓＡｇで免疫し、二次ブースト投与を行ったか、または二次ブースト投与は行わなかった。図４は、１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソームは、市販のＧＳＫワクチン（３μｇ）と少なくとも同程度に有効であったことを示す。しかし、同じリポソーム調製物中にある３μｇのＨＢｓＡｇは、それよりもかなり有効ではなく、二次ブースト投与は、力価の有意な増加をもたらさないようであった。
【０１４６】
（実施例４：ＨＢｓＡｇ−リポソームの投与経路）
投与経路の効果を試験するために、ＣＤ１マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウスを、上記と同じＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物を用いて、鼻内（ＩＮ）投与または筋肉内（ＩＭ）投与を介して免疫した。抗体力価を、（一次）免疫の８週間後に測定した。ＣＤ１およびＢａｌｂ／ｃの両方において、１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソームのＩＮ投与およびＩＭ投与の両方（二次ブーストを伴うか、または二次ブーストを伴わない）は、３μｇの上記ＧＳＫワクチンと少なくとも同程度に有効であった（図５および図６）。
【０１４７】
（実施例５：抗体応答に対する新鮮なＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物または凍結乾燥ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物の効果）
上記ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物が、新鮮な形態または凍結乾燥形態として使用されなければならないか否かを試験するために、ＣＤ１マウスを、新鮮なリポソーム調製物または凍結乾燥リポソーム調製物のいずれかで、鼻内投与経路または筋肉内投与経路のいずれかによって免疫した。すべての血清Ｉｇ力価は、一次免疫の８週間後に測定した。
【０１４８】
ＨＢｓＡｇ−リポソームの鼻内投与は、上記リポソーム調製物が新鮮である場合には、３μｇのＧＳＫワクチンコントロールと少なくとも同程度に有効であった（図７）。同等レベルの力価が、ＧＳＫワクチンと、新鮮なＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物（ブースト有またはブースト無しのいずれか）との間で観察された。凍結乾燥ＨＢｓＡｇ−リポソームは、この実験において、新鮮な調製物よりもわずかに有効ではなかった。しかし、別の実験においては、凍結乾燥ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物は、新鮮な対応物よりもわずかに良好であった（データは示さない）。
【０１４９】
同様の結果が、ＩＭ投与によって得られた（図８）。新鮮なＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物および凍結乾燥ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物の両方が、互いと比較して、そしてＧＳＫポジティブコントロールと比較して、同様の最終力価を有した。
【０１５０】
これらの結果は、凍結乾燥ＨＢｓＡｇ−リポソームの再構成調製物が、ＩＮ経路またはＩＭ経路によって送達される場合に、新鮮な調製物とほぼ同程度に有効であったことを示す。凍結乾燥調製物の効力は、将来のワクチン処方物の分配および保存を簡単にする。
【０１５１】
（実施例６：ＨＢｓＡｇ−リポソームに対する抗体応答に対するリポソームサイズの効果）
リポソームサイズの効果を、サイズが４μｍ、１μｍおよび０．２μｍであるリポソーム中にＨＢｓＡｇ（１５μｇ／マウス）を封入することによって評価した。定量的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、単一サイズのリポソームによる鼻内免疫後または３種すべてのサイズの等量混合物による鼻内免疫後に、ＨＢｓＡｇ特異的血清ＩｇＧレベルを測定した。種々のサイズのリポソームの混合物は、単一サイズのリポソームよりも免疫原性であり得ることが可能である。ＨＢｓＡｇの全量および脂質の全量は、４つの群において同じであった。
【０１５２】
図９は、１μｍサイズのリポソームおよび４μｍサイズのリポソームが最も有効であった一方で、もっと小さい０．２μｍリポソームは、ＨＢｓＡｇ特異的血清ＩｇＧを生成するためにそれらよりも有効ではなかったことを、示す。３種すべてのサイズの等量混合物は、付加的応答を生じたが、相乗的応答は生じなかった。合わされたリポソームの３種のサイズの効果が付加的である場合の推定応答が、垂直な筋として図９において示される。
【０１５３】
（実施例７：ＨＢｓＡｇ−リポソームに対する抗体応答に対するリポソーム：タンパク質比の効果）
本発明者らは、ＨＢｓＡｇ特異的血清ＩｇＧ抗体を生成する際のリポソーム：タンパク質比の重要性を決定した。この決定は、マウスを、本発明者らの標準的リポソーム含量またはそのリポソーム濃度の１／２および１／３のＨＢｓＡｇ−リポソーム（１５μｇ／マウス、０週目にプライムし、６週目にブーストした）で鼻内免疫することによった。そのリポソーム：ＨＢｓＡｇ比を１／２および１／３に減少させると、血清ＩｇＧ応答が、不釣合いなことに、本発明者らの標準リポソーム調製物から得た応答のそれぞれ３５％および２％まで減少した（ｎ＝８匹の動物／群；血清ＩｇＧを、ブーストの２週間後に各群から得た血清プールに関して測定した）。従って、上記ＨＢｓＡｇを封入するために使用したリポソームの量は、高レベルのＨＢｓＡｇ特異的血清抗体応答を生成するために有意な効果を有する。
【０１５４】
（実施例８：同種免疫プロトコル後の偏向したＴｈ応答の特徴づけ）
サイトカインは、免疫系（例えば、細胞媒介性免疫およびアレルギー型応答）における生物学的効果のほとんどの原因となる、ホルモン性メッセンジャーである。このサイトカインは、多数であるが、サイトカインは、機能的に２つの群（炎症促進性であるサイトカイン、および本質的に抗炎症性であるがアレルギー応答を促進するサイトカイン）に分割され得る。
【０１５５】
Ｔリンパ球は、主要なサイトカイン源である。これらの細胞は、その細胞表面上に抗原特異的レセプターを保有して、異種病原体の認識が可能である。これらの細胞はまた、自己免疫疾患エピソードの間に正常組織を認識し得る。２種類の主要なＴリンパ球サブセットが存在し、これらは、ＣＤ４およびＣＤ８として公知である細胞表面分子の存在によって区別される。ＣＤ４を発現するＴリンパ球はまた、ヘルパーＴ細胞としても公知である。これらは、最も大量のサイトカイン産生体であると考えられる。このサブセットは、Ｔｈ１およびＴｈ２へとさらに細分され得る。これらの細胞が産生するサイトカインは、Ｔｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインとして公知である。
【０１５６】
Ｔｈ１型サイトカインは、細胞内寄生生物を死滅することおよび自己免疫応答を永続することを担う、炎症促進性応答を生じる傾向がある。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、主要なＴｈ１サイトカインである。ＣＴＬ活性はまた、Ｔｈ１型免疫応答において高い。対照的に、Ｔｈ２型サイトカインは、インターロイキン４、インターロイキン５、およびインターロイキン１３（これらは、アトピーにおけるＩｇＥ応答および好酸球性応答の促進に関連する）ならびにインターロイキン１０（ＩＬ−１０）（これは、より多くの抗炎症応答を有する）を包含する。Ｔｈ２応答は、Ｂ細胞から免疫グロブリン分泌細胞への成熟に補助を提供し、それによって、体液性防御機構を主に活性化する。ＣＴＬ活性は、一般的には、Ｔｈ２型免疫応答において低い。過度な場合、Ｔｈ２応答はまた、Ｔｈ１媒介性殺菌作用を相殺する。
【０１５７】
一般的に、最適なシナリオは、ヒトが、免疫チャレンジに適合した、充分にバランスのとれたＴｈ１応答およびＴｈ２応答を生じることであるようである。しかし、実際には、Ｔｈ１およびＴｈ２のサブセット産生の概念の中核は、これらの応答が偏向する傾向である。従って、Ｔｈ１サイトカイン産生プロフィールまたはＴｈ２サイトカイン産生プロフィールは、一方のＴｈサブセットを優先的に増幅することおよび対立する応答をダウンレギュレートすることによって、免疫応答の間にしばしば優勢である。この偏向した応答は、多くの病原性生物に対する宿主防御のために重要であるようである。細胞内病原体（例えば、ウイルス）に対する耐性は、しばしば、主にＴｈ１応答を必要とし、一方、Ｔｈ２応答は、代表的には、細胞外寄生生物と対抗するために必要である。従って、感染性因子に応答して宿主により産生されたＴ細胞由来サイトカインは、多くの感染性疾患モデルにおいて感染の結果を決定する。
【０１５８】
炎症促進性Ｔｈ１応答が、細胞内感染を制御するために通常は必要とされるが、その応答のバランスをとる必要もまた存在する（Ｔａｙｌｏｒ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８（１）：１３５〜４８，１９９８）。細胞内感染を制御下に維持するために充分に強力な１型応答を生じるとともに、その防御応答が宿主に対して損傷を引き起こすのを防ぐためのちょうど充分な２型応答または免疫抑制応答を同時に生じることが、重要である。利用可能なデータは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０が、Ｔｈ２応答を抑えるように協働することを示唆する。従って、感染後の首尾よい結果のためには、感染型に対して適切な、Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答の正確な決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）が必要である。これは、量に関してだけではなく、これらの応答がどこで、いつ、どの程度長く生じるかにも関する。
【０１５９】
いくつかの要因が、Ｔ細胞応答を主にＴｈ１表現型または主にＴｈ２表現型へと進めるために提唱されており、その要因としては、抗原の特性、抗原の用量、暴露部位および宿主において進行中の免疫応答が挙げられる。抗原に対するＴヘルパー細胞応答は、偏向しているとしてか、または混合型であるとして、特徴付けられ得る。偏向したＴｈ細胞応答は、Ｔｈ１サイトカインプロフィールまたはＴｈ２サイトカインプロフィールに向っての抗原特異的Ｔｈ細胞集団の歪みから生じる。この偏向したＴｈ細胞応答は、それぞれ、抗原特異的ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比  ＜０．５および＞２．０によって反映される。混合型Ｔｈ応答は、両方のＴ細胞集団を含み得、これは、０．５と２．０との間の抗原特異的ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比によって反映される。下記の表Ｂを参照のこと。
【０１６０】
（表Ｂ：偏向したＴｈ１応答および偏向したＴｈ２応答の特徴）
【０１６１】
【表２】
2010180253.tif 000005
ＨＢｓＡｇ−ワクチン処方物に対する免疫応答の性質を、一次免疫の後８週目に、ＣＤ１マウスの血清およびＢａｌｂ／ｃマウスの血清においてＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を決定することによって評価した。本発明者らは、ＨＢｓＡｇに特異的なＩｇＧ１抗体およびＨＢｓＡｇに特異的なＩｇＧ２ａ抗体を測定するための定量的ＥＬＩＳＡアッセイを設計した。図１０および図１１は、市販のＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチン、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチン、およびＨＢｓＡｇ−リポソームワクチンを鼻内送達もしくは筋肉内送達することにより免疫された、ＣＤ１マウス（図１０）およびＢａｌｂ／ｃマウス（図１１）の血清におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を示す。各パネルにおける０．５および２．０の位置にある２本の垂直線は、左から右に向う領域において、抗体応答の３つの異なるパターン（Ｔｈ１型抗体応答、混合型もしくは中性抗体応答、またはＴｈ２型抗体応答）を区別する。
【０１６２】
公開された結果と一致して、市販のＨＢｓＡｇワクチンは、非近交系ＣＤ１系統マウスおよび近交系Ｂａｌｂ／ｃ系統マウスの両方において、Ｔｈ２型免疫応答を優先的に生じた。予期されたように、上記ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンは、両方の系統においてＴｈ１型免疫応答を生じた。ＨＢｓＡｇ−リポソームの鼻内投与は、ＣＤ１マウスにおいて混合型応答を生じ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＴｈ２偏向型応答を生じた。対照的に、ＨＢｓＡｇ−リポソームの筋肉内投与は、両方の系統のマウスにおいて、中性免疫応答を生じた。
【０１６３】
ＧＳＫワクチンは、筋肉内送達のために設計されたミョウバンベースのヒト処方物（ＧＳＫ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得たＥｎｇｅｒｉｘＴＭ−Ｂ（ａｄｗサブタイプ））であった。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンは、プラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）であった。これは、商業的供給源（Ａｌｄｅｖｒｏｎ，Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）から購入した。このプラスミドは、極初期ＣＭＶプロモーターの制御下にて小Ｂ型肝炎表面抗原を発現する（参考文献：Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｍ．Ｌ．ＭｉｃｈｅｌおよびＲ．Ｇ．Ｗｈａｌｅｎ，ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２；１８４７〜１８５１，１９９３）。
【０１６４】
（実施例９：ＨＢｓＡｇ−リポソームの鼻内送達後の独特なＩｇＡ応答）
１９６０年代後期において始まって、粘膜免疫は、この免疫がヒトにおける呼吸ウイルスに対する防御と相関することが示されたときに、呼吸ウイルスに対する重要な防御であると認識された。ほぼ同時期に、ＩｇＡクラスの抗体は、気道および他の粘膜表面において特に優勢であること、および粘膜免疫の媒介因子であることが、見出された。他の研究は、局所ワクチン接種を介して感染に対する防御を発生させる際に、粘膜免疫が理想的には刺激され得ることをその後に確認した。
【０１６５】
ＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体の両方とも、極めて系統特異的であるようである。呼吸ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）によって自然感染した場合、体液性免疫応答および全身性細胞免疫応答の両方が生じる。その血清中の抗ウイルス抗体レベルもまた、防御に相関する。
【０１６６】
本発明の一局面は、粘膜部位に対してリポソーム中にあるＨＢｓＡｇを直接送達することによって、粘膜免疫応答を惹起するための方法を提供する。ＩｇＡ特異的サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイを、血清中のＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＡおよび粘膜部位からのＨＢｓＡｇを測定するように設計した。上記で考察した実験群すべてに由来する血清、糞便、および膣洗浄物、ならびにいくつかの唾液サンプルを、ＩｇＡについて試験した。終点力価を、試験サンプルの連続希釈によって各サンプルプール（１プール当たりＮ＝４〜５匹のマウス）について確立した。終点力価を、系統が一致する未刺激非免疫マウス由来のサンプルにおいて同じサンプル希釈度にて観察された値の２倍よりも大きい値である、ＩｇＡ
ＥＬＩＳＡアッセイにおける４５０ｎｍでのＯＤとして規定した。
【０１６７】
検出可能なＩｇＡ応答を示した唯一のサンプルは、鼻内経路によってＨＢｓＡｇ−リポソームワクチンを与えられたマウスに由来した。表Ｃは、ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡにおいて正のスコアであったサンプルからの結果を要約する。ＩｇＡ応答が、この血清と、１回だけ投与した後の粘膜部位に由来するほとんどのサンプルとで、検出された。二次免疫でブーストすると、ほとんどのサンプルにおいてＩｇＡレベルがさらに増加した。さらに、鼻内経路による局所免疫は、サンプリングされたすべての遠隔粘膜部位（糞便ペレット、膣洗浄物、および唾液（限定されたサンプル数が理由で唾液についてのデータは示されない）を含む）において、分泌ＩｇＡ応答を生じた。これらの結果は、１つの経路（鼻内経路）によるＨＢｓＡｇ−リポソームでの免疫が、サンプルリングされた粘膜部位すべてにおいて、ＨＢｓＡｇ特異的粘膜ＩｇＡ免疫を生じたことを示す。このＨＢｓＡｇ−リポソームワクチンは、ＨＢｓＡｇタンパク質単独またはリポソーム単独とは対照的に、血清免疫Ｉｇ力価をブーストし、そしてまた鼻内投与された場合には、血清ＩｇＡ応答および分泌ＩｇＡ応答の両方を誘導する。
【０１６８】
他のすべての免疫原は、いかなる検出可能なＩｇＡ応答を生じることもできない（結果は、示さない）。
【０１６９】
（表Ｃ．ＨＢｓＡｇ−リポソームで免疫したマウスにおけるＩｇＡ応答の要約）
【０１７０】
【表３−１】
2010180253.tif 000006
血清サンプル、糞便サンプル、および膣洗浄物サンプルを、１群当たり５匹の個別マウスから収集した。サンプルを個別に処理し、サンプルプールを、１匹のマウスについて等体積のサンプルを使用して作製した。終点力価を、各サンプルについて決定し、そして未刺激非免疫ＣＤ１マウスまたは未刺激非免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスについて観察されるものと２倍よりも大きな血清力価として規定した。相対力価の決定のために使用した力価値の範囲を、下記に示す。
§測定せず。
サンプルを入手不能。
【０１７１】
【表３−２】
2010180253.tif 000007
（実施例１０：ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫単独に対する抗体応答は、弱い）
ＤＮＡワクチン免疫は、宿主（ヒトを含む）において防御免疫応答を生じると最近記載された。米国特許第６，６３２，６６３号およびＷＯ  ０３／０７５９５５  Ａ１（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１７２】
免疫原としてのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡの有効性を試験するために、ＣＤ１マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウスに、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで筋肉内免疫し、二次ブーストを行ったか、または二次ブーストは行わなかった。全ＨＢｓＡｇ特異的血清Ｉｇを、上記のような免疫の８週間後に測定した。ＧＳＫ  ＨＢｓＡｇワクチンを、ポジティブコントロールとして使用した。
【０１７３】
図１２は、アジュバントを伴うＨＢｓＡｇタンパク質ワクチンとは対照的に、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡによる筋肉内免疫が、ＣＤ１系統マウスおよびＢａｌｂ／ｃ系統マウスの両方において、ＨＢｓＡｇに対する弱い抗体応答を生じたことを示す。惹起された免疫応答は、ブーストしていないコントロールのＧＳＫワクチンと比較して、ブーストした場合でさえ、せいぜい弱い〜中程度である。
【０１７４】
（実施例１１：同種ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫は、強力なＣＴＬ活性およびＴｈ１偏向サイトカインプロフィールを生じる）
ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫は、弱い抗体応答誘導因子である（実施例１０）が、Ｔ細胞応答の非常に強い誘導因子である。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで筋肉内免疫（０週間目および６週間目に１００μｇ、記憶ＣＴＬを動員するために１１週間目にブースター投与）した後、平均８７％±８％のＨＢｓＡｇ特異的死滅が、インビボＣＴＬアッセイを使用して読出し情報として観察された（ｎ＝４匹のマウス）。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫はまた、ＨＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞によるサイトカイン応答を、１型サイトカインプロフィールに向って強く偏向させた。図１３は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫したマウスに由来する脾細胞による、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイからの結果を示す。ＨＢｓＡｇタンパク質（Ｔ細胞エピトープを含む）およびＨＢｓＡｇ由来の免疫優性ＣＴＬペプチド（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．ら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５８４２）の両方ともが、高頻度でＩＦＮ−γ分泌細胞を生じたが、非常に少数のＩＬ−１０分泌細胞しか生じなかった。従って、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡによる同種免疫は、代表的な強く偏向したＴｈ１型プロフィールを生じる。このことは、２種の異なるマウス系統において観察されたＴｈ１型ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比と一致する（図１０および図１１）。
【０１７５】
（実施例１２：全身抗体応答および粘膜抗体応答に対する、プライミング投与としてのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡとブースター投与としてのＨＢｓＡｇ−リポソームでの異種免疫の効果）
ＨＢｓＡｇ−リポソームによる筋肉内ＤＮＡ免疫は、全抗体の生成に対する弱い刺激であった（実施例１１）が、これは、Ｔｈ１偏向型細胞媒介性免疫応答を刺激する際に非常に有効であった（実施例１１）。記憶Ｔ細胞応答および記憶Ｂ細胞応答を生じる際にＤＮＡ免疫が有効であったか否かを決定するために、本発明者らは、異種免疫プロトコルを開発した。このプロトコルにおいて、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫を、プライミング投与として使用し、ＨＢｓＡｇ−リポソームを、ブースター投与として使用する。ＤＮＡが、Ｔ細胞記憶応答およびＢ細胞記憶応答を生成する際に有効である場合には、これらの応答は、種々の形態の上記抗源（ＨＢｓＡｇ−リポソーム）でブーストした後に示され得る。従って、本発明は、異種免疫実験設計を提供する。このプロトコルの変化形は、慣用的に過ぎず、充分に本発明の範囲内にある（上記プロトコルに関する並べ替えについて、実施例１６を参照のこと）。
【０１７６】
代表的プロトコルにおいて、まず、マウスを、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンで筋肉内免疫してプライミングし、その後、低用量のＨＢｓＡｇ−リポソームで鼻内チャレンジした。特定の実施形態において、この低用量は、単独で投与した場合には、それ自体では、有意な免疫応答を惹起するのに不十分である。完全規模の免疫応答を惹起するために十分な用量と比較した場合に、この低用量は、高々、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ以下である。
【０１７７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０週間目に１００μｇのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡにより筋肉内免疫し、６週間目に再度ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡによって筋肉内免疫した。１６週間目に、ＨＢｓＡｇ−リポソームでのブーストを、３μｇという減少した用量にて粘膜内投与した。血清サンプルを、このブーストの２週間後、４週間後、および６週間後に取得した。ポジティブコントロールとして、ＣＤ１マウスを、１５μｇのＨＢｓＡｇ−リポソームで鼻内免疫し、二次ブーストを行った。ポジティブコントロールの血清を、一次免疫の８週間後に取得した。ネガティブコントロールとして、未刺激ＣＤ１マウス由来の血清を、８週間目に取得した。
【０１７８】
図１４は、この異種免疫プロトコルからの結果を示す。２回のＩＭ（筋肉内）ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫または１回のＩＮ（鼻内）ＨＢｓＡｇ−リポソーム（低用量）免疫単独は、弱い血清抗体応答を誘導した。しかし、このＤＮＡ免疫レジメンにＨＢｓＡｇ−リポソーム（３μｇ）ＩＮ（鼻内）による二次低用量ブーストを付加すると、２回のＩＮ（鼻内）ＨＢｓＡｇ−リポソーム（高用量）後のマウスにおいて観察されるよりもさらに高いレベルまで、全ＨＢｓＡｇ特異的抗体応答を顕著に増加した。
【０１７９】
定量的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、この実験からの血清におけるＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧのｍｇ量を決定した。２回のＤＮＡ免疫後のＩｇＧレベルは、平均して４３．２μｇ／ｍｌであり、ＨＢｓＡｇ−リポソームによるブースト後には２４８μｇ／ｍｌにまで増加した。上記リポソーム調製物を単独で投与すると、０．６μｇ／ｍｌの血清ＩｇＧしか生じなかった。
【０１８０】
著しいことに、ＤＮＡ免疫はまた、粘膜ＩｇＡ応答についての免疫系をプライミングする。この免疫系は、低用量ＨＢｓＡｇ−リポソームブーストの鼻内送達後にも動員される。図１５は、この異種免疫レジメンのＤＮＡ成分およびリポソーム成分単独では、検出可能なＩｇＡ応答を刺激しないことを示す。しかし、実質的なＩｇＡ応答が、この異種ＤＮＡプライミングおよびＨＢｓＡｇ−リポソームブーストのプロトコルを使用して、血清中および膣中にて誘導された。分泌ＩｇＡもまた、このプロトコルを使用して糞便サンプルにおいて誘導された（データは、示さない）。図１５はまた、より高用量のＨＢｓＡｇ−リポソーム単独（１５μｇ  ＨＢｓＡｇ）によるプライミングおよびブーストの後の、代表的な血清ＩｇＡ応答を示す。この応答は、強いＩｇＡ応答についての基準である。ＨＢｓＡｇ−リポソームによるブーストは、血清ＩｇＡ応答または粘膜ＩｇＡ応答を生じるためには、鼻内経路によって送達されなければならない。このブーストがＩＮ（鼻内）投与ではなくＩＭ（筋肉内）投与された場合、低レベルの分泌ＩｇＡしか生じないが、循環血清ＩｇＧ応答は、強い（データは、示さない）。
【０１８１】
ＨＢｓＡｇに特異的なＩｇＧ抗体もまた、上記異種免疫プロトコルを投与したマウス由来の肺洗浄物および膣洗浄物において検出された（図１６）。未処理マウスも、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡをＩＭ（筋肉内）投与された後に空リポソームをＩＮ（鼻内）投与されたマウスも、肺洗浄物または膣洗浄物において、バックグラウンド値を超える検出可能なＩｇＧレベルを生じなかった。しかし、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ  ＩＭ（筋肉内）とＨＢｓＡｇ−リポソームＩＮ（鼻内）との組み合わせで免疫したマウスは、肺部位および膣部位の両方において、容易に検出可能な粘膜ＩｇＧを生じた。このことは、関連がある。なぜなら、粘膜ＩｇＧはまた、特定の病原体（例えば、ＨＳＶ−２およびインフルエンザ）に対して防御する際に防御的役割を果たすことが示されているからである（ＨＳＶ−２について、Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｌ．ら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：８１０９〜８１１５；Ｔａｍｕｒａ，Ｓ．およびＴ．Ｋｕｒａｔａ，２００４，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５７（６）：２３６〜４７；Ｒｅｎｅｇａｒ，Ｋ．Ｂ．ら、２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（３）：１９７８〜８６）。
【０１８２】
本出願人らは、上記異種免疫プロトコル後のＴ細胞応答の偏向に対する、ＨＢｓＡｇ−リポソームを用いたＩＮ（鼻内）ブーストの効果を評価するために、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を決定した。図１７は、ＨＢｓＡｇ−リポソームブーストの後の個々のマウス血清における、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比を示す。著しいことには、上記ＤＮＡ免疫プロトコルにこのブーストを追加しても、免疫応答をＴｈ２型プロフィールに向けて移動させなかった。二次ＤＮＡ免疫の４週間後の抗体応答は、Ｔｈ１型偏向（ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比＝０．４７）を示した。Ｔｈ１偏向型応答が、ＨＢｓＡｇ−リポソームによる鼻内ブーストの後に、依然として存在した（ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比＝０．５０）。この実験は、ＤＮＡ免疫が、ＨＢｓＡｇ−リポソームを鼻内送達した場合に有効に動員される、Ｔｈ１型記憶の強力かつ安定な基礎を確立することを示す。
【０１８３】
本願異種免疫プロトコルは、中性Ｔｈ応答または１型偏向Ｔｈ応答ならびに細胞媒介性免疫を促進し、一方で、（上記ブースト用量の抗原−リポソーム調製物が鼻内投与された場合には）粘膜ＩｇＡ応答および粘膜ＩｇＧ応答を必要に応じて誘導する。細胞内病原体からの防御免疫のためには、細胞媒介性免疫応答を、特に、増強されたＴｈ１サイトカイン分泌のためおよびＣＴＬ生成のために開始することが、しばしば望ましい。このことは、特定の実施形態にとっては特に有用である。この特定の実施形態においては、抗原および／または免疫プロトコルが、Ｔｈ２応答でも混合型応答でもなく、Ｔｈ１応答を生じることが望ましいものであり得る。なぜなら、Ｔｈ２応答は、特に小児においては、アレルギー反応に類似する特定の望ましくない副作用に関連し得るからである。
【０１８４】
他の実施形態（初回投与が、鼻内投与される本願ＨＢｓＡｇ−リポソーム調製物であり、ブースト投与が、筋肉内投与されるＨＢｓＡｇ−ＤＮＡである）において、宿主動物において生じる中程度の免疫応答は、Ｔｈ１型応答ではなく、混合型である傾向がある。このことは、本願異種免疫の順序は、Ｔｈ１応答を達成するために重要であるという論点を示す。
【０１８５】
（実施例１３：ＨＢｓＡｇに対する血清ＩｇＧ抗体のアビディティに対する、プライミング投与としてのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡとブースターとしてのＨＢｓＡｇ−リポソームとの異種免疫の効果）
抗体アビディティ（すなわち、抗原−抗体結合の全体的強さ）は、病原体の制御において重要な役割を果たし得、アビディティが高い抗体は、アビディティが低い抗体よりも一般的に有効である。上記ＨＢｓＡｇ抗原についてのＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ血清抗体の結合強度を決定するために、定量的ＩｇＧアビディティアッセイを、抗原−抗体複合体を破壊するためにカオトロピック試薬である尿素を使用して開発した。アビディティが高い抗体ほど、その抗体に結合した上記抗原を解離させるためには、より高濃度の尿素を必要とする。図１８は、同種免疫レジメンにより免疫したマウスにおけるＩｇＧアビディティの代表的結果（左パネル）および異種免疫レジメンにより免疫したマウスにおけるＩｇＧアビディティの代表的結果（右パネル）を示す。結果は、アビディティ指数として示される。このアビディティ指数は、（尿素非存在下での遊離ＩｇＧのμｇ）／（尿素存在下での遊離ＩｇＧのμｇ）である。このアッセイにおいて得られ得る最大比は、１．０である。この最大比は、各グラフの上部に点線として示される。
【０１８６】
ＨＢｓＡｇ−リポソームによる同種免疫は、ヒトにおいて使用される現行のＧＳＫ  ＨＢｓＡｇミョウバンベースワクチンを用いて得られるアビディティと密接に対応するアビディティを生じる。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡによる免疫もまた、良好なアビディティ応答を生じる。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡとその後のＨＢｓＡｇ−リポソームとによる異種免疫は、この抗体アビディティをなおさらに増加させ、上記の市販のヒトワクチンの参照応答を上回る。上記ＨＢｓＡｇ−リポソームブーストを鼻内送達すると、アビディティが最高の抗体を生じる。しかし、ＩＭ（筋肉内）送達もまた、非常に有効である。アビディティが高い抗体ほど、抗原中和において有効であると推定される。このことは、上記の市販のＧＳＫワクチン（ＩＭ（筋肉内））またはＨＢｓＡｇ−リポソーム（ＩＮ（鼻内）もしくはＩＭ（筋肉内））を使用する同種免疫レジメンに対する、上記異種免疫プロトコルの優位性を示す。
【０１８７】
（実施例１４：プライミング投与としてのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡとブースターとしてのＨＢｓＡｇ−リポソームとによる異種免疫は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＢｓＡｇに対する非応答性を克服する）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、上記ＨＢｓＡｇタンパク質に対して非応答性である（参考文献：Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（１０）：５９２９〜３４）。上記のＨＢｓＡｇについての市販のＧＳＫワクチンを受けるヒトの約５％〜約１０％も、同様である。異種免疫が非応答性マウスにおける免疫応答を誘導し得るか否かを決定するために、以下の実験を実施した（表Ｄ）。１つの群（Ａ群）のＣ６７ＢＬ／６マウスを、ＨＢｓＡｇ−リポソームを２回鼻内送達して免疫した。予期したとおり、これらのマウスは、検出可能なレベルの抗ＨＢｓＡｇ血清ＩｇＧを生じなかった。その後、これらのマウスと、第二群の未刺激マウス（Ｂ群）とを、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡを２回筋肉内送達して免疫した。ＤＮＡワクチン接種に応答した両方の群のマウスにおける血清ＩｇＧレベルは、同等であった（Ａ群およびＢ群について、それぞれ１２．８μｇ／ｍｌおよび８．０μｇ／ｍｌ）。その後、各群を、ＨＢｓＡｇ−リポソームでさらにブーストし、その後、最終血清ＩｇＧレベルを測定した。驚くべきことに、両方の群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、等しく高レベルの抗ＨＢｓＡｇ血清ＩｇＧを示した（Ａ群、２３８μｇ／ｍｌ；Ｂ群、３１０μｇ／ｍｌ）。この実験からの結果は、３つの事項を示す。１）異種免疫は、非応答性マウス系統において高い抗体応答を刺激し得る。２）免疫の順序が、血清ＩｇＧ応答の誘導のために重要である。３）相乗作用的抗体応答が、異種免疫応答後に観察される。
【０１８８】
（表Ｄ．ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ免疫とその後のＨＢｓＡｇ−リポソームのＩＮ（鼻内）免疫とが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＢｓＡｇに対する非応答性を克服する）
【０１８９】
【表４】
2010180253.tif 000008
（実施例１５：異種免疫は、インビボＣＴＬ活性およびＴｈ１偏向型サイトカイン分泌を生じる）
多くの細胞内病原体からの防御免疫には、しばしば、ＩＦＮ−γ高産生性であるＴｈ１偏向型免疫応答と、病原体に感染した細胞を死滅させ得る細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成とが、必要である。本発明者らのワクチン送達プロトコルにより生成される細胞媒介性免疫応答を評価するために、本出願人らは、ＣＴＬ応答を測定するためのインビボアッセイと、ＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞およびＨＢｓＡｇ特異的ＩＬ−１０分泌細胞（それぞれ、Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答）の頻度を数えるためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイとを確立した。
【０１９０】
インビボＣＴＬアッセイは、文献において最近報告されている。従来のインビトロＣＴＬアッセイとは異なり、このインビボＣＴＬアッセイは、ＣＴＬがインビボ状況で標的を死滅させる能力の真の尺度を提供する。本出願人らは、２回のＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ  ＩＭ（筋肉内）を投与された後に低用量ＩＮ（鼻内）ＨＢｓＡｇ−リポソームブーストを投与されたマウスにおいて、インビボＣＴＬ活性を測定した。そのサンプルの収集を抗体応答測定のために（ＩＮ（鼻内）ブーストの６週間以上後に）完了した後、マウスに、ＤＮＡブーストを与えて、活性化エフェクター細胞中へと記憶Ｔ細胞を動員した。７日間後、動員されたＣＴＬエフェクター細胞の活性を、ＨＢｓＡｇペプチドでパルスされた色素標識標的をその細胞が特異的に死滅させる能力を決定することによって定量した。この標的は、「方法」において概説されるように、マウス中に静脈内に養子移入された。非パルス色素標識ＣＦＳＥｌｏｗ集団に対するペプチドパルスした色素標識ＣＦＳＥｈｉｇｈ集団の消滅が、ペプチド特異的死滅の尺度である。未刺激レシピエントコホートにおけるこれら２つの集団の割合は、細胞移植についての内部コントロールとして役立った。そのレシピエントの脾臓におけるＣＦＳＥｌｏｗドナー細胞およびＣＦＳＥｈｉｇｈドナー細胞の割合を、フローサイトメトリー分析によって決定した。
【０１９１】
代表的なフローサイトメトリー分析が、ある１つのアッセイについて図１９において示される。その左パネルは、ＣＦＳＥ標識標的細胞を注射した２２時間後の未刺激マウスの脾臓から回収された、ＣＦＳＥｌｏｗ（グラフ上のＲ２）ドナー細胞集団およびＣＦＳＥｈｉｇｈ（グラフ上のＲ３）ドナー細胞集団を示す。ＣＦＳＥ蛍光が、ｘ軸上のＦＩＴＣチャネルまたはＦＬ１チャネルにおいて示される。ＦＬ１蛍光が、この分析から自己蛍光細胞を排除するためにのみ、無関係のＦＬ２蛍光に対して示される。その右パネルは、上記異種免疫プロトコルを受けたマウスからの同じ分析を示す。そのＲ３領域からのＣＦＳＥｈｉｇｈ（特定ペプチドによりパルスした）集団の消滅は、ＣＴＬによる特異的死滅を示す。
【０１９２】
高レベルのＨＢｓＡｇペプチド特異的ＣＴＬ死滅活性が、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで筋肉内プライミングされＨＢｓＡｇ−リポソームで鼻内ブーストしたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、観察された。インビボＣＴＬ活性は、４匹のマウスからなる集団において、平均して７８％（６５％特異的死滅〜９１％特異的死滅の範囲）であった。
【０１９３】
異種免疫レジメンを受けたマウス由来の脾細胞をまた、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＩＦＮ−γ分泌細胞およびＩＬ−４分泌細胞の測定のためにインビトロで培養した。このＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、市販の抗体対および試薬（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＩＰマルチウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｈｏｐｋｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）とを使用して確立した。インビトロ培養物を、１ｍｌにつき２．５×１０６細胞につき１０μｇの濃度のＨＢｓＡｇペプチドで２０時間〜２２時間刺激した。ペプチドを含まない培養物を、ネガティブコントロールとして使用した。抗ＣＤ３で刺激した培養物またはＣｏｎ  Ａで刺激した培養物を、ポジティブコントロールとして使用した。スポットを、ＣＴＬ  Ｉｎｃ．によって定量分析した。
【０１９４】
本出願人らは、上記異種免疫プロトコルで免疫したマウスにおいて、高頻度のＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞を観察したが、非常に低頻度のＨＢｓＡｇ特異的ＩＬ−１０分泌細胞しか観察しなかった（データは示さない）。これらの結果は、上記異種免疫プロトコルがＴｈ１型サイトカイン偏向型免疫応答を生じるという、血清ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の分析から誘導された本発明者らの結論を直接確認する。
【０１９５】
（実施例１６：上記異種免疫プロトコルのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ成分およびＨＢｓＡｇ−リポソーム成分についての送達プロトコルにおける変動）
さらなる研究によって、上記異種免疫プロトコルの２つのパラメーター（ＤＮＡプライミングおよび抗原−リポソームブースト）が、ＣＴＬ応答および／または抗体応答について良好な免疫原性を依然として保持しながら変化され得る程度を、決定した。表Ｅは、ＤＮＡプライミング投与が用量および送達速度に関して変化した、マウスにおけるインビボＣＴＬ死滅活性および血清ＩｇＧ応答の結果を示す。示される第一のプロトコル（Ａ）は、０週間目および３週間目のＤＮＡ送達（合計用量２００μｇ）と、６週間目のＨＢｓＡｇ−リポソームブーストとからなる。このプロトコルは、前の実施例において示されたように、ほぼ最大の特異的ＣＴＬ死滅活性および高レベルのＨＢｓＡｇ特異的血清ＩｇＧを生じる。合計２００μｇである２回の投与から合計１００μｇである１回の投与へとそのＤＮＡを減少させる（Ｂ）と、同レベルのＣＴＬ応答および抗体応答を生じる。その１回の（１×）ＤＮＡプライミング用量を、３日間のタイムスパン内で送達される２つの部分に分割することと、そのリポソームブースト投与を３週間短縮することとからなる、さらなる改変（Ｃ）によって、高いＣＴＬ死滅活性および抗体応答が維持された。減少したＤＮＡプライミング用量（Ｄ）において、ＣＴＬレベルおよび抗体レベルの両方が減少し始める徴候が存在する。１００分の１のＤＮＡ（Ｅ）において、ＣＴＬ活性は、依然として、最大値の約２／３であり、一方、抗体レベルは、ほぼ検出不能である。従って、そのＤＮＡブースター免疫の用量およびタイミングの両方におけるかなりの変動が、高いＣＴＬレベルおよび抗体レベルという望ましい結果を依然として維持しながらも、可能である。
【０１９６】
（表Ｅ．Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるインビボＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ死滅活性および血清ＩｇＧを生じることにおける、種々のＤＮＡプライミングレジメンの効果）
【０１９７】
【表５】
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表Ｅに対する説明文。５匹のマウスからなる群を、示されるように免疫した。血清プールを、ＨＢｓＡｇ特異的血清ＩｇＧ決定のために、最後の免疫の２週間後に収集した。インビボＣＴＬアッセイを、ＤＮＡプライミングの差を明らかにするのを助けるための刺激として、１回（１×）ＤＮＡ（１００μｇ）  ＩＭ（筋肉内）ブースト投与の７日間後に、個々のマウスに対して実施した。上記処理群の下の括弧内の数字は、マウス１匹について投与された全ＤＮＡ用量を示す。
【０１９８】
調べた第二の変数は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡでプライミングしたマウスに鼻内送達したＨＢｓＡｇ−リポソームの体積であった。これは、ＨＢｓＡｇと空リポソームとを一緒に混合すること、１５μｇ／投与で送達したタンパク質とリポソーム含量との全量を一定に維持することによって、達成した。このプロトコルは、可能であった。なぜなら、ＨＢｓＡｇとリポソームとの混合物は、ＨＢｓＡｇをリポソーム中に封入した場合に観察される応答の約７０％である応答を生じることが示されたからであった。血清抗ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧレベルは、５０μｌ、４０μｌ、または３０μｌという接種体積を点滴した後に同様の狭い範囲内にあることが、見出された。
【０１９９】
（表Ｆ．上記異種免疫プロトコルを使用する抗体応答に対するＨＢｓＡｇ−リポソーム体積の効果）
【０２００】
【表６】
2010180253.tif 000010
Ｎ＝８匹のマウス／群。
【０２０１】
（実施例１７：異種免疫（ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡプライミングおよびＨＢｓＡｇ−リポソームブースト）は、粘膜ＣＴＬを生じ、そして生存ウイルス（ＶＶ−ＨＢｓＡｇ）チャレンジに対する完全防御を提供する）
上記異種免疫レジメンが、そのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋表現型により規定される局所粘膜ＣＴＬまたは全身ＣＴＬを生じたか否かを決定するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、２回のＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ  ＩＭ（筋肉内）とその後の１回のＨＢｓＡｇ−リポソームＩＮ（鼻内）とによって、免疫した。２回のＨＢｓＡｇ−ＤＮＡでの免疫後に１回の空リポソームで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスと、非免疫マウスとが、コントロールとして役立った。これらのマウスに、上記リポソーム免疫の１４日間後に、上記ＨＢｓＡｇを発現する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ−ＨＢｓＡｇ）で鼻内チャレンジした。ウイルスチャレンジの５日間後に、肺（局所粘膜区画）単核球および脾臓（全身区画）単核球を、単離し、そしてＣＴＬの存在について試験した。抗原特異的ＣＴＬを、フローサイトメトリー分析により決定されるそのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋表現型によって同定した。表Ｇは、その肺または脾臓のいずれかにおいて、未刺激マウスはほとんどＣＴＬを生じなかったことを示す。かなりの数のＣＴＬが、ＤＮＡおよび空リポソームで免疫したマウスの肺において生じた。かなり少ない数のＣＴＬがまた、その脾臓において生じた。しかし、ＤＮＡとＨＢｓＡｇ−リポソームとの組み合わせで免疫したマウスは、その肺において局所的にＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬの広範囲の増殖を生じ、脾臓区画においてかなりの数のＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬを生じた。これらのデータは、この異種免疫プロトコルの両方の要素が、ウイルスによるチャレンジの後に、肺粘膜において多数の抗原特異的局所ＣＴＬを生じることを示す。著しいことには、抗原特異的ＣＴＬはまた、その脾臓区画においても検出される。このことは、抗原特異的ＣＴＬの全身応答を示す。
【０２０２】
（表Ｇ．異種免疫後のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋ＣＴＬの生成）
【０２０３】
【表７】
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§  Ｂａｌｂ／ｃマウスを、４週間間隔にて、示されるように免疫した（処理群；ｎ＝５匹／群）。マウスを、１００μｇのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで筋肉内免疫（４頭筋１つにつき５０μｌ）し、５０μｌの空リポソームまたはＨＢｓＡｇ−リポソームのいずれかで鼻内免疫した。マウスに、最後の免疫の１４日間後に、２×１０５ＰＦＵのＶＶ−ＨＢｓＡｇを合計５０μｌにて鼻内注射した。
ζ  免疫蛍光分析を、ウイルスチャレンジの５日間後に、肺単核球（ｎ＝１／群）および脾細胞（ｎ＝５／群）に対して実施した。細胞を、１０６細胞について１０μｍのＨＢｓＡｇ  ＣＴＬペプチドを用いて、インビトロにて５時間刺激した。その後、細胞を、表面のＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γについて染色した。
【０２０４】
図２０は、３つのマウスコホート（未処理マウス；ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡと空リポソームとをＩＮ（鼻内）投与されたマウス；ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡとＨＢｓＡｇ−リポソームとをＩＮ（鼻内）投与されたマウス）に対して鼻内送達されたＶＶ−ＨＢｓＡｇチャレンジからの結果を示す。肺１つ当たりのＬｏｇ  ＰＦＵ（ウイルスプラーク形成単位）を、ＶＶ−ＨＢｓＡｇによるチャレンジの５日間後に測定した。未処理未刺激マウスは、肺において高いウイルス力価を有し、肺１つ当たり平均３．７２  ｌｏｇ  ＰＦＵ（１１，０３８  ＰＦＵ）である。ＤＮＡと空リポソームとを投与されたマウスは、未処理マウスよりも２ｌｏｇ少ない、肺１つ当たりのＰＦＵを有した（１．８６  ｌｏｇ  ＰＦＵまたは１５６  ＰＦＵ）。ＤＮＡとＨＢｓＡｇ−リポソームとを投与されたマウスは、肺において検出可能なＰＦＵのウイルスを有さなかった。このことは、粘膜チャレンジ部位からのそのウイルスの完全な排除を示す。この構築物中のＨＢｓＡｇタンパク質は、細胞内でのみ発現されるので、このウイルスの排除は、おそらく、肺区画におけるＣＴＬの活性に起因する。
【０２０５】
（ＩＸ．要約）
表Ｈは、特定のＨＢｓＡｇワクチン送達プラットフォームを用いて生じた免疫応答の特徴を要約する。１１種の別個の免疫プロトコル（同種免疫プロトコルおよび異種免疫プロトコル）を開発した。これらのプロトコルに対する免疫応答を特徴付けた。免疫スケジュールおよびワクチン成分は、示される通りである。すべての抗体応答は、最後のブースター免疫の２週間後に測定した。プロトコル８およびプロトコル９は、上記異種免疫プラットフォームの短縮バージョンであることが、留意されるべきである。ＨＢｓＡｇをモデル抗原として使用して、本出願人らは、免疫応答が、特定の結果（すなわち、抗体応答レベル、Ｔヘルパーサイトカインプロフィール（Ｔｈ１対Ｔｈ２）、分泌ＩｇＡ粘膜免疫の発生、および細胞溶解性Ｔ細胞の惹起）に向かって方向付けら得ることを示した。これらの研究は、特定の環境下で特定の病原体に対する防御免疫を生じてＴｈ１型免疫応答もしくはＴｈ２型免疫応答または混合型応答／よりバランスのとれた（ｍｏｒｅ  ｂａｌａｎｃｅｄ）応答を支持するように免疫応答を調節するために使用され得る、合理的基礎を提供する。
【０２０６】
【表８】
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要約すると、上記結果は、特定の用量のＨＢｓＡｇは、特定の組成およびサイズ（平均４μｍサイズ）のリポソーム中に封入された場合に、血清抗体産生のための強力なワクチンであることを示す。強力な応答が、そのワクチンが鼻内投与または筋肉内投与された場合に観察される。対照的に、筋肉内注射されたＨＢｓＡｇ−ＤＮＡは、ＨＢｓＡｇ特異的血清抗体を誘導する際にそれほど有効ではない。本出願人らは、そのマウスが、すべての処方物中にある上記鼻内ワクチンを困難の証拠も死亡の証拠を伴わずに許容することは、観察しなかった。
【０２０７】
ＨＢｓＡｇ−リポソームによる鼻内免疫のみが、全身性ＩｇＡ応答および粘膜ＩｇＡ応答を生じ、一方、他のすべての免疫レジメンは、ＩｇＡ応答を生じなかった。最後に、ＩＭ（筋肉内投与）によるＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンとＩＮ（鼻内投与）によるＨＢｓＡｇ−リポソームとの異種免疫レジメンは、理想的なワクチン送達プラットフォームである。これは、この異種免疫レジメンが、相乗作用的血清抗体応答、強力な粘膜ＩｇＡ応答おおび血清ＩｇＡ応答を生じ、そして抗原特異的Ｔ細胞応答およびＩＦＮ−γ分泌を、ＤＮＡワクチンプライミングにより確立されたＴｈ１型応答を変化させることなく増強する可能性があるという点で、理想的である。
【０２０８】
ＨＢｓＡｇ−リポソームの生体分布は、直接的には測定しなかった。しかし、ワクチン処方物が粘膜表面における局所免疫を刺激する能力を、決定し、その結果を上記に示した。
【０２０９】
一般的には、本明細書中で使用される命名法および本発明において利用される実験手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、および組換えＤＮＡ技術を包含する。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号において示される方法論；同第４，６８３，２０２号において示される方法論；同第４，８０１，５３１号において示される方法論；同第５，１９２，６５９号において示される方法論；および同第５，２７２，０５７号において示される方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻，Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと。利用可能な免疫アッセイが、特許文献および科学文献において広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号；および同第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ���ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）、ならびに「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１巻〜第３１７巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（これらはすべて、本明細書中に完全に示されたがのごとく、参考として援用される）を参照のこと。他の一般的参考文献は、この文書全体を通じて提供されている。それらの参考文献中の手順は、当該分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。それらの参考文献中に含まれる情報はすべて、本明細書中に参考として援用される。
【０２１０】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載される発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、または慣用的に過ぎない実験しか使用せずに確認し得る。そのような等価物は、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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