(57)【要約】【課題】生体組織を分解して得られた細胞懸濁液から採取する生体組織由来細胞から効率的に脂肪を除去する脂肪除去方法および生体組織処理方法を提供する。【解決手段】生体組織１を分解して得られた細胞懸濁液３を収容する濃縮容器６の内壁６ａに界面活性剤７を含む界面活性溶液８を接触させる容器処理ステップＳ２１と、濃縮容器６内で細胞懸濁液３を攪拌するエマルション形成ステップＳ２２と、該エマルション形成ステップＳ２２において形成されたエマルションを除去するエマルション除去ステップＳ２３とを備える脂肪除去方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織を分解して得られた細胞懸濁液を収容する濃縮容器の内壁に界面活性剤を含む界面活性溶液を接触させる容器処理ステップと、
前記濃縮容器内で前記細胞懸濁液を攪拌するエマルション形成ステップと、
該エマルション形成ステップにおいて形成されたエマルションを除去するエマルション除去ステップとを備える脂肪除去方法。
【請求項２】
前記界面活性溶液が、洗浄液である請求項１に記載の脂肪除去方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、ＭＰＣまたはプルロニックＦ６８またはパーフルオロカーボンエマルションである請求項１または請求項２に記載の脂肪除去方法。
【請求項４】
前記エマルション形成ステップが、５〜４００ｒｐｍで前記細胞懸濁液を攪拌する請求項１から請求項３のいずれかに記載の脂肪除去方法。
【請求項５】
生体組織を消化酵素溶液で分解し細胞懸濁液を得る組織分解ステップと、
前記細胞懸濁液から脂肪分を除去する脂肪除去ステップと、
該脂肪除去ステップで得られた生体組織由来細胞を洗浄し濃縮する細胞洗浄ステップとを備え、
前記脂肪除去ステップが、
前記細胞懸濁液を収容する濃縮容器の内壁に界面活性剤を含む界面活性溶液を接触させる容器処理ステップと、
前記濃縮容器内で前記細胞懸濁液を攪拌するエマルション形成ステップと、
該エマルション形成ステップにおいて形成されたエマルションを除去するエマルション除去ステップとを備える生体組織処理方法。
【請求項６】
前記容器処理ステップの後に、該容器処理ステップにおいて内壁に界面活性溶液を接触させた濃縮容器内において前記組織分解ステップを行う請求項５に記載の生体組織処理方法。
【請求項７】
前記界面活性溶液が、洗浄液である請求項５または請求項６に記載の生体組織処理方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、ＭＰＣまたはプルロニックＦ６８またはパーフルオロカーボンエマルションである請求項５から請求項７のいずれかに記載の生体組織処理方法。
【請求項９】
前記エマルション形成ステップが、５〜４００ｒｐｍで前記細胞懸濁液を攪拌する請求項５から請求項８のいずれかに記載の生体組織処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪除去方法および生体組織処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織由来の細胞を得るには、生体組織を消化酵素液で分解して、生体組織から分離した細胞を含む細胞懸濁液とし、細胞懸濁液を洗浄、濃縮して所望の細胞の細胞濃縮液を生成する（例えば、特許文献１参照。）。生体組織から分離した細胞を再生医療などに用いる場合、最終生成物である細胞濃縮液に組織由来の脂肪が残留すると治療効果に影響を及ぼす可能性があるため、脂肪を含まない高純度な細胞濃縮液が求められる。
【０００３】
一方、昆虫細胞をバイオリアクター内で昆虫細胞を攪拌する際に界面活性剤であるプルロニックＦ６８を添加すると、プルロニックＦ６８の保護効果により昆虫細胞は損傷を受けることなく正常に成長できるということが報告されている（非特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０５／０１２４８０号パンフレット
【非特許文献１】David W. Murhammer & Charles F. Goochee,“Scaleup of Insect Cell Cultures: Protective Effects of Pluronic F-68”,Bio/Technology, 6, 1998, p.1411-p.1418
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、細胞懸濁液に含まれる脂肪が容器の内壁に吸着しやすく、遠心分離後に細胞濃縮液を回収する際に内壁に吸着した脂肪も同時に回収してしまい、脂肪を含まない高純度の細胞液を得るのは困難である。
容器の内壁へ脂肪が吸着するのを防ぐために、内壁の表面に微細な凹凸構造を施すまたは表面をテフロンなどでコートする表面処理も考えられるが、コストの高騰や滅菌処理に弱いという問題があり実用的でない。現段階では、効率よく脂肪を除去するために上清に浮く脂肪を取り除く以外の工夫はなく、脂肪除去に時間と労力がかかるという不都合がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織を分解して得られた細胞懸濁液から採取する生体組織由来細胞から効率的に脂肪を除去する脂肪除去方法および生体組織処理方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織を分解して得られた細胞懸濁液を収容する濃縮容器の内壁に界面活性剤を含む界面活性溶液を接触させる容器処理ステップと、前記濃縮容器内で前記細胞懸濁液を攪拌するエマルション形成ステップと、該エマルション形成ステップにおいて形成されるエマルションを除去するエマルション除去ステップとを備える脂肪除去方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、濃縮容器に細胞懸濁液を収容する前に予め容器処理ステップにおいて、濃縮容器の内壁に界面活性剤を含む界面活性溶液を接触させ、内壁を界面活性溶液で濡らしておく。疎水性の濃縮容器内面は、界面活性剤が疎水性側を濃縮容器の内壁側へ、親水性側を濃縮容器の半径方向内方へ向けて並んだ界面活性剤層で覆われ親水性となる。また、界面活性溶液の水滴が内壁に付着した状態ができる。この後に濃縮容器内に細胞懸濁液を収容し、エマルション形成ステップにより細胞懸濁液を攪拌すると、水滴に含まれる界面活性剤により、細胞懸濁液に含まれる脂肪分はミセルを形成し、このミセルが細胞懸濁液内に分散してエマルションを形成する。また、細胞懸濁液内に含まれる脂肪分は疎水性を有するため、親水性の濃縮容器内壁へ吸着しない。
【０００９】
したがって、エマルション除去ステップにおいて細胞懸濁液からエマルション形成した溶液を除去すると、同時にミセル状の脂肪分も除去される。この場合に、エマルション形成した溶液は濃縮容器内壁に吸着し難いので、濃縮容器内壁に脂肪分が吸着して残留することなく、効率的に脂肪分を濃縮容器内から除去することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記界面活性溶液が、洗浄液であってもよい。
このようにすることで、界面活性剤を含む洗浄液で濃縮容器内部をすすぐと、濃縮容器内壁が界面活性剤の層で覆われ、濡れた状態をつくることができ、簡易な方法で容器処理ステップを行うことができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記界面活性剤が、２−メタクロイルオキシホスホリルコリン（ＭＰＣ、日本油脂社製）またはプルロニックＦ６８（ＡＤＥＫＡ社製）またはパーフルオロカーボンエマルションであることが好ましい。
ＭＰＣまたはプルロニックＦ６８またはパーフルオロカーボンエマルションは、生体安全性が確かめられているため、最終生成物に残留しても問題にならない。また、プルロニックＦ６８は攪拌による細胞への損傷を軽減する効果があることがわかっている。
【００１２】
また、上記発明においては、前記エマルション形成ステップが、５〜４００ｒｐｍで前記細胞懸濁液を攪拌することが望ましい。
５〜４００ｒｐｍで細胞懸濁液を攪拌することで、気泡の発生を抑えながら効率よくエマルションを形成させ、また、細胞の損傷を軽減することができる。
【００１３】
また、本発明は、生体組織を消化酵素溶液で分解し細胞懸濁液を得る組織分解ステップと、前記細胞懸濁液から脂肪分を除去する脂肪除去ステップと、該脂肪除去ステップで得られた生体組織由来細胞を洗浄し濃縮する細胞洗浄ステップとを備え、前記脂肪除去ステップが、前記細胞懸濁液を収容する濃縮容器の内壁に界面活性剤を含む界面活性溶液を接触させる容器処理ステップと、前記濃縮容器内で前記細胞懸濁液を攪拌するエマルション形成ステップと、該エマルション形成ステップにおいて形成されたエマルションを除去するエマルション除去ステップとを備える生体組織処理方法を提供する。
【００１４】
本発明によれば、組織分解ステップにおいて生体組織を消化酵素を含む消化酵素溶液内で攪拌して生体組織を分解すると、生体組織から生体組織由来細胞が分離し細胞懸濁液を得る。細胞懸濁液内には生体組織由来の脂肪分が含まれるため、脂肪除去ステップにおいて細胞懸濁液から脂肪分を除去し、脂肪分をほとんど含まない生体組織由来細胞の細胞濃縮液を得る。そして、細胞洗浄ステップにおいて、脂肪除去ステップで得られた細胞濃縮液を洗浄液内で攪拌した後遠心分離で生体組織由来細胞の沈殿と不純物が混入した上清に分離し、上清を除去することで、最終生成物である洗浄された生体組織由来細胞の細胞濃縮液を得ることができる。
【００１５】
この場合に、脂肪除去ステップにおいて、組織分解ステップで得られる細胞懸濁液を濃縮容器に収容する前に、予め容器処理ステップを行い濃縮容器の内壁を界面活性剤を含む界面活性液に接触させておく。これにより、エマルション形成ステップにおいて細胞懸濁液を攪拌したときに脂肪分がミセルを形成し、このミセルが細胞懸濁液内に分散してエマルションを形成するので、エマルション除去ステップにおいて溶液と同時に脂肪分も除去できる。また、その際に濃縮容器内壁に脂肪分が吸着して残留することがないので、効率的に脂肪分を除去することができる。
【００１６】
続く細胞洗浄ステップにおいても、細胞濃縮液内に残留した脂肪分は残留した界面活性剤によりミセル状になって洗浄液内に分散するので、洗浄液と同時に残留した脂肪分も除去できる。また、容器処理ステップにおいて界面活性剤層に覆われた濃縮容器の内壁は親水性が保たれるので、洗浄液を除去する際に脂肪分が内壁に吸着することを防ぐことができる。その結果、洗浄液を排出し濃縮容器内に残った生体組織由来細胞の細胞濃縮液を回収する際に同時に脂肪を回収してしまうという不都合がなく、最終生成物として純度の高い生体組織由来細胞を得ることができる。
【００１７】
上記発明においては、前記容器処理ステップの後に、該容器処理ステップにおいて内壁に界面活性溶液を接触させた濃縮容器内において、組織分解ステップを行ってもよい。
このようにすることで、内壁表面が界面活性剤層に覆われ親水性になり、界面活性溶液の水滴が付着した状態の濃縮容器内で組織分解ステップを行うと、生体組織を分解しながら、生体組織から分離した脂肪をミセル状にして消化解酵素液内へ分散させエマルションを形成させることができる。
【００１８】
すなわち、組織分解ステップとエマルション形成ステップを同時に行うことができるので作業の効率が上がる。また、組織分解ステップとエマルション形成ステップでそれぞれ行っていた攪拌を１回に減らすことができるので、攪拌による細胞への損傷を軽減することができる。
【００１９】
また、上記発明においては、前記界面活性溶液が、洗浄液であってもよい。
また、上記発明においては、前記界面活性剤が、ＭＰＣまたはプルロニックＦ６８またはパーフルオロカーボンエマルションであることが好ましい。
また、上記発明においては、前記エマルション形成ステップが、５〜４００ｒｐｍで細胞懸濁液を攪拌することが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、生体組織を分解して得られた細胞懸濁液から採取する生体組織由来細胞から効率的に脂肪を除去することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の一実施形態に係る脂肪除去方法および生体組織処理方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織の処理方法は、図１に示されるように、生体組織１を消化酵素溶液２で分解して細胞懸濁液３を得る組織分解ステップＳ１と、組織分解ステップＳ１で得た細胞懸濁液３から生体組織１由来の脂肪分４を除去する脂肪除去ステップＳ２と、脂肪分４を除去した生体組織由来細胞５を洗浄し濃縮する細胞洗浄ステップＳ３とを備えている。
本実施形態に係る脂肪除去方法は、上記脂肪除去ステップＳ２である。
【００２２】
脂肪分解ステップＳ１は、生体組織１を消化酵素溶液２内で攪拌することにより行われる。消化酵素により生体組織１が分解されると生体組織１から生体組織由来細胞５が分離し、消化酵素溶液２内に生体組織由来細胞５が浮遊する細胞懸濁液３が得られる。
【００２３】
脂肪除去ステップＳ２は、濃縮容器６の内壁６ａを界面活性剤７を含む界面活性溶液８に接触させる容器処理ステップＳ２１と、界面活性溶液８に接触させた濃縮容器６内で細胞懸濁液３を攪拌しエマルションを形成させるエマルション形成ステップＳ２２と、エマルション形成ステップＳ２２で形成したエマルションを除去するエマルション除去ステップＳ２３とを備えている。
【００２４】
容器処理ステップＳ２１は、例えば、洗浄液９である乳酸リンゲル液（以下ＬＲ液）に１％の界面活性剤７であるプルロニックＦ６８を添加した１％プルロニックＦ６８／ＬＲ液（界面活性溶液８）で濃縮容器６内部をすすぐことにより行われる。これにより、疎水性の濃縮容器６の内壁６ａは、プルロニックＦ６８が疎水性側を濃縮容器６の内壁６ａ側へ、親水性側を濃縮容器６の半径方向内方へ向けて並んだプルロニックＦ６８の層に覆われ親水性になる。
【００２５】
また、内壁６ａは、１％プルロニックＦ６８／ＬＲ液の水滴が付着した状態になる。エマルション形成ステップＳ２２は、このような濃縮容器６に組織分解ステップＳ１で得た細胞懸濁液３を収容し５〜４００ｒｐｍで攪拌することにより行われる。細胞懸濁液３に含まれる生体組織１由来の脂肪分４が濃縮容器６の内壁６ａに付着したプルロニックＦ６８によりミセル状になり細胞懸濁液３内へ分散されエマルションを形成する。
【００２６】
続いて、エマルション除去ステップＳ２３により濃縮容器６を遠心分離し、生体組織由来細胞５を含む沈殿とエマルションを形成した上清とに分離する。そして上清を除去すると、同時に上清内にミセル状で分散する脂肪分４も除去され、沈殿した脂肪分４をほとんど含まない生体組織由来細胞５の細胞濃縮液が濃縮容器６内に残る。
【００２７】
細胞洗浄ステップＳ３は、エマルション除去ステップＳ２３で得られた細胞濃縮液が残った濃縮容器６に洗浄液９、例えば、ＬＲ液を注入して攪拌し、遠心分離により生体組織由来細胞５の沈殿とＬＲ液の上清に分離し上清を除去することにより行われる。細胞濃縮液に残留する脂肪分４は、細胞濃縮液に残留したプルロニックＦ６８によりミセルを形成してＬＲ液内に分散され、ＬＲ液とともに排出されるようになっている。
【００２８】
脂肪分４以外の残留する不純物も攪拌によりＬＲ液内に分散されＬＲ液とともに排出される。この細胞洗浄ステップＳ３を１回以上繰り返すことで、細胞濃縮液に残留する不純物を除去し、最終生成物である生体組織由来細胞５の細胞濃縮液を得る。
【００２９】
この場合に、容器処理ステップＳ２１においてプルロニックＦ６８の層に覆われた濃縮容器６の内壁６ａは親水性を保っているので、ＬＲ液を排出する際に細胞濃縮液に残留した脂肪分４が内壁６ａに吸着しないようになっている。その結果、ＬＲ液で洗浄した最終生成物である生体組織由来細胞５の細胞濃縮液を濃縮容器６から回収する際に、濃縮容器６の内壁６ａに吸着した脂肪分４を同時に回収してしまうという不都合を回避でき、脂肪分４を含まない純度の高い生体組織由来細胞５の細胞濃縮液を得ることができるという利点がある。
【００３０】
このように、本実施形態に係る脂肪除去方法および生体組織処理方法によれば、濃縮容器６の内部をプルロニックＦ６８／ＬＲ液で洗浄するだけで、濃縮容器６内に収容する細胞懸濁液３内に生体組織１由来の脂肪分４を分散しエマルションを形成させるとともに脂肪分４の濃縮容器６の内壁６ａへの吸着を防ぐことができる。その結果、効率的に生体組織由来細胞５から脂肪分４を除去し、生体組織１の処理にかかる時間と労力と軽減することができる。
【００３１】
なお、本実施形態においては、前記容器処理ステップＳ２１の後に、該容器処理ステップＳ２１において濃縮容器６の内壁６ａに界面活性溶液８を接触させた濃縮容器６内において前記組織分解ステップＳ１を行ってもよい。
【００３２】
容器処理ステップＳ２１において濃縮容器６の内壁６ａがプルロニックＦ６８層に覆われ親水性になり、プルロニックＦ６８／ＬＲ液の水滴が付着した状態を作った濃縮容器６内に生体組織１と消化酵素溶液２を収容し、攪拌して生体組織１を分解する。このようにすることで、生体組織１を分解する工程と、生体組織１に含まれる脂肪分４がミセル状になって消化酵素溶液２内へ分散しエマルションを形成する工程を同時に行うことができ、作業の効率を上げることができる。また、攪拌の工程を減らすことができるので生体組織由来細胞５の損傷を軽減できる。
【００３３】
また、本実施形態においては、界面活性剤７としてプルロニックＦ６８を用いることとしたが、これに代えて、ＭＰＣまたはパーフルオロカーボンエマルションを用いてもよい。
プルロニックＦ６８またはＭＰＣまたはパーフルオロカーボンエマルションは生体安全性が確かめられており、最終生成物に残留しても生体への安全性に問題がない。
【００３４】
また、本実施形態においては、エマルション形成ステップＳ２２において細胞懸濁液３を５〜４００ｒｐｍで攪拌することとしたが、３０〜１００ｒｐｍで攪拌することが望ましい。このようにすることで、効率よくエマルションを形成させながら細胞懸濁液３内の生体組織由来細胞５への損傷を軽減することができる。
【００３５】
また、本実施形態においては、エマルション除去ステップＳ２３において前記濃縮容器６を遠心分離することにより生体組織由来細胞５の沈殿とエマルションの上清に分離し上清を除去することしたが、これに代えて、フィルターにより濃縮容器６内からエマルションを除去してもよい。
【００３６】
また、本実施形態においては、容器処理ステップＳ２１において１％プルロニックＦ６８／ＬＲ溶液を注入することとしたが、これに代えて、プルロニックＦ６８とＬＲ液を独立に注入して濃縮容器６内で１％プルロニックＦ６８／ＬＲ液を調製してもよい
【００３７】
また、本実施形態においては、プルロニックＦ６８により生体組織１由来の脂肪分４がミセル状になりエマルションを形成すれば、該エマルションを分離しなくてもよい。
エマルションを栄養として動脈投入し利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の一実施形態に係る脂肪除去方法および生体組織処理方法の手順を示す概念図である。
【符号の説明】
【００３９】
１  生体組織
２  消化酵素溶液
３  細胞懸濁液
４  脂肪分
５  生体組織由来細胞
６  濃縮容器
６ａ  内壁
７  界面活性剤
８  界面活性溶液
９  洗浄液
Ｓ１  組織分解ステップ
Ｓ２  脂肪除去ステップ
Ｓ２１  容器処理ステップ
Ｓ２２  エマルション形成ステップ
Ｓ２３  エマルション除去ステップ
Ｓ３  細胞洗浄ステップ
【図１】
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