(57)【要約】【課題】エンドセリン発現抑制剤を評価又は選択する方法の提供。【解決手段】以下の工程（１）〜（５）：（１）被検物質を表皮細胞と接触させる工程、（２）当該表皮細胞を５〜150μＭの過酸化水素に曝露させる工程、（３）当該表皮細胞におけるエンドセリン発現量を測定する工程、（４）上記（３）で算出されたエンドセリン発現量を、被検物質と接触させた表皮細胞を過酸化水素に曝露させない対照群におけるエンドセリン発現量と比較する工程、（５）上記（４）の結果に基づいて、エンドセリン発現量を減少させる被検物質をエンドセリン発現抑制剤として評価又は選択する工程、を含むエンドセリン発現抑制剤の評価又は選択方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（５）：
（１）被検物質を表皮細胞と接触させる工程、
（２）当該表皮細胞を５〜150μＭの過酸化水素に曝露させる工程、
（３）当該表皮細胞におけるエンドセリン発現量を測定する工程、
（４）上記（３）で算出されたエンドセリン発現量を、被検物質と接触させた表皮細胞を過酸化水素に曝露させない対照群におけるエンドセリン発現量と比較する工程、
（５）上記（４）の結果に基づいて、エンドセリン発現量を減少させる被検物質をエンドセリン発現抑制剤として評価又は選択する工程、
を含むエンドセリン発現抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
被検物質が植物抽出物である請求項１記載の評価又は選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、エンドセリン発現抑制剤を評価又は選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリンは、アミノ酸残基21個からなるペプチドであり、直接・間接的に血管性及び非血管性の平滑筋を持続的に収縮させる生理活性物質である。エンドセリンの作用増大は、末梢、腎臓及び脳の血管における持続的な血管収縮などの原因となるため、高血圧症、心筋梗塞、脳卒中、急性腎不全、レイノー症候群、アテローム硬化症、喘息、前立腺癌などの種々の疾病を引き起こすと考えられている。エンドセリンには構造の類似したファミリーペプチドとして、３種のエンドセリン（エンドセリン−１、エンドセリン−２、エンドセリン−３）がヒトを含む動物で存在していることが知られ、これらのペプチドはいずれも血管収縮作用及び昇圧作用を有することが知られている。
【０００３】
近年、エンドセリンの個体形成における役割も明らかにされ、またグリア細胞や腎メサンギウム細胞、メラノサイトなど様々な細胞におけるエンドセリンの役割も解明されつつある。例えば、肌に紫外線を浴びると表皮角化細胞でエンドセリン−１が過剰に産生され、メラノサイトの増殖・活性化を引き起こし、メラニンを過剰に産生することが報告されている（非特許文献１−３）。また、エンドセリン−１は小腸でのグルコース輸送を阻害することが報告されている（非特許文献４）。さらに、エンドセリン−１ＫＯマウスで痛覚の閾値が低下することから、エンドセリン−１は痛覚調節に関わっていると考えられている（非特許文献５）。
従って、様々な細胞におけるエンドセリンの発現を抑制できれば、前記のような種々の疾病の予防・治療だけでなく、シミやソバカスの予防・改善、或いは小腸でのグルコース輸送の改善、痛覚の低下改善などに有用であると考えられるが、これまでエンドセリン発現抑制作用を有する物質を簡便にスクリーニングする系は見出されていない。
【０００４】
一方、過酸化水素の皮膚構成細胞に対する効果を検討したものとして非特許文献６が知られ、ここでは表皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞を300μＭ過酸化水素の存在下培養することにより該細胞において種々のサイトカインの発現が促進することが報告されている。しかしながら、300μＭもの過酸化水素へ表皮細胞を曝露したのでは細胞障害性が大きいため、該細胞における種々のサイトカインの発現変動を正確に把握することはできない。
また、これまで過酸化水素が表皮細胞におけるエンドセリン発現に与える影響については全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Photochem Photobiol.，63，1-10 (1996）
【非特許文献２】J Biol Chem.，267，24675-24680 (1992)
【非特許文献３】J Invest Dermatol.，105，32-37 (1995)
【非特許文献４】Journal of Physiology, 499.2, 391-402 (1997)
【非特許文献５】Neuroscience, 130, 349-358 (2005)
【非特許文献６】J Dermatol Sci., 26, 85-93 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エンドセリン発現抑制剤を評価又は選択する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、過酸化水素による表皮角化細胞のエンドセリン産生への影響について検討したところ、過酸化水素によりエンドセリン−１遺伝子の発現が上昇することを見出した。そして、過酸化水素負荷条件下の細胞におけるエンドセリン−１遺伝子の発現抑制作用を指標とすれば、エンドセリン発現を抑制する物質を簡便に評価又は選択できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の工程（１）〜（５）：
（１）被検物質を表皮細胞と接触させる工程、
（２）当該表皮細胞を５〜150μＭの過酸化水素に曝露させる工程、
（３）当該表皮細胞におけるエンドセリン発現量を測定する工程、
（４）上記（３）で算出されたエンドセリン発現量を、被検物質と接触させた表皮細胞を過酸化水素に曝露させない対照群におけるエンドセリン発現量と比較する工程、
（５）上記（４）の結果に基づいて、エンドセリン発現量を減少させる被検物質をエンドセリン発現抑制剤として評価又は選択する工程、
を含むエンドセリン発現抑制剤の評価又は選択方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、表皮細胞におけるエンドセリンの発現を抑制する物質を簡便に評価又は選択することができる。従って、本発明は、エンドセリンの生理作用に起因する各種疾患の予防及び／又は治療剤、光老化抑制剤、腸管でのグルコール輸送改善剤、痛覚低下改善剤などの簡易なスクリーニング法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】過酸化水素による表皮細胞のエンドセリン−１遺伝子発現量を示す図である。
【図２】培養再開１２時間後のアトロバスタチンのエンドセリン発現抑制効果を示す図である。
【図３】ローズマリーエキスのエンドセリン発現抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
エンドセリン−１は、紫外線照射によりヒト表皮細胞において過剰産生することが知られている（非特許文献１−３）。一方、後記実施例に示すとおり、過酸化水素によってヒト表皮細胞におけるエンドセリン−１遺伝子の発現が上昇することが判明した（実施例１）。従って、過酸化水素による曝露は紫外線照射と同等の効果をヒト表皮細胞に及ぼすと考えられる。また、実際に、エンドセリン発現抑制作用を有するものとして報告されているアトロバスタチン（J Atheroscler Thromb, 2002; 9: 178-183）によって過酸化水素に曝露させたヒト表皮細胞におけるエンドセリン−１遺伝子の発現が抑制されたことから（図２）、当該エンドセリン−１遺伝子の発現抑制作用を指標に、エンドセリン発現抑制剤を評価又は選択できると考えられる。
【００１２】
本発明において用いられる表皮細胞は、市販品として入手可能であるが、ヒト皮膚よりパンチバイオプシー等により採取してもよい。採取部位は特に制限されず、ヒトの顔面部、上腕内側部、上腕外側部、大腿内側部、大腿外側部、腹部、背部などの皮膚が挙げられる。
【００１３】
表皮細胞と被検物質との接触は、例えば被検物質を所定の濃度になるように予め培養液中に添加した後、表皮細胞を培養液に載置すること、或いは、表皮細胞が載置された培養液に、被検物質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。
ここで、表皮細胞の播種時の細胞濃度は、0.5×103〜1.0×105個/cm2とするのが好ましく、特に1.0×103〜3.5×104個/cm2とするのが好ましい。また、被検物質の添加濃度は、0.00001〜10質量％（固形残分）とするのが好ましく、特に0.0001〜３質量％（固形残分）とするのが好ましい。
【００１４】
被検物質としては、エンドセリン発現抑制剤として使用することを所望する物質であれば特に制限されず、例えば動植物抽出物、化合物、化学物質などを用いることができる。
【００１５】
表皮細胞を培養する培地は、当該細胞を培養できる常用の培地を用いることができ、例えば表皮角化細胞増殖用培地（Ｍｅｄｉａ−ＫＧ２）などが挙げられる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、増殖因子、抗菌剤、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。
【００１６】
表皮細胞を過酸化水素に曝露させるには、細胞と被検物質とを接触させた後、例えば室温（25℃）〜37℃で通常３〜48時間程度、好ましくは６〜24時間程度培養した後に行うのが好ましい。
過酸化水素への曝露は、例えば過酸化水素を含有する緩衝液中で細胞を培養することにより行うことができる。緩衝液としては、例えばPBS、ハンクス緩衝液、アール緩衝液、リンゲル緩衝液などが挙げられる。また、緩衝液中の過酸化水素の濃度は５〜150μＭに設定するのが、細胞障害を低減する点から好ましく、特に20〜100μＭとすることが好ましい。
緩衝液中での培養は、室温（25℃）〜37℃で通常15分〜５時間程度、好ましくは0.5〜２時間程度行うのが好ましい。
【００１７】
本発明においては、過酸化水素に曝露後、更に上記と同様の培地で室温（25℃）〜37℃で通常３〜72時間程度、好ましくは６〜24時間程度培養する。
【００１８】
エンドセリンの発現量の測定は、エンドセリン遺伝子発現をmRNAレベルで検出する場合は、例えば細胞からtotal RNAを抽出して、リアルタイムRT-PCR法、RNA分解酵素プロテクションアッセイ法、或いはノーザンブロット解析法などを利用して、エンドセリン遺伝子から転写されたmRNAを検出定量すればよい。
また、エンドセリンの発現をタンパク質レベルで検出する場合には、通常の免疫測定法により測定することができ、例えばRIA法、EIA法、ELISA、バイオアッセイ法、ウェスタンブロットなどにより行うことができるが、ELISAが安価・簡便で望ましい。
【００１９】
エンドセリン発現抑制剤の評価は、被検物質と接触させた表皮細胞を過酸化水素に曝露させない対照群のエンドセリン発現量と比較し、その発現量が減少した場合、被検物質にはエンドセリン発現抑制効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
ここで、エンドセリン発現抑制剤としては、エンドセリンの生理作用に起因する各種疾患、例えば高血圧症、心筋梗塞、脳卒中、急性腎不全、レイノー症候群、アテローム硬化症、喘息、前立腺癌などの予防及び／又は治療；シミやソバカスなどの光老化症状の予防及び／又は改善；腸管でのグルコール輸送の改善、痛覚低下の改善、のための医薬品、化粧品又は食品となる得るものである。なお、ここでいう「シミ」は、メラニンの生成により皮膚に過剰に色素が沈着した状態（hyperpigmentation）の広義を意味するが、「シミ」には、例えば老人性色素班、炎症後の色素沈着、そばかす等の色素沈着による皮膚の黒色化（pigment spot）が包含される。
【実施例】
【００２０】
実施例１  過酸化水素が表皮細胞のエンドセリン-１遺伝子発現に与える影響
【００２１】
１）方法
表皮角化細胞増殖用培地EpiLifeTM中にヒト表皮細胞（NHEK (F)  新生児包皮由来，クラボウ社）を2500個／cm2ずつ播種し、37℃にて細胞密度がサブコンフルエントになるまで培養した。PBS（−）にて洗浄後、５〜100μM H2O2を含む2.0ml PBS（−）を添加し、37℃にて１時間培養した。無処理コントロールは、PBS（−）で洗浄後、2.0ml PBS（−）を添加し、37℃にて１時間培養した。アトロバスタチンを添加する実験では、細胞密度がサブコンフルエントに達した後、アトロバスタチンを最終濃度6.6μMとなるように添加した表皮角化細胞増殖用培地EpiLifeTM中で24時間培養後、PBS（−）にて洗浄し、100μM H2O2を含む2.0ml PBS（−）を添加し、37℃にて１時間培養した。
【００２２】
表皮角化細胞増殖用培地EpiLifeTMで洗浄した後、新たに増殖用培地を2.0ml添加して培養を再開し、６，12，24時間後にそれぞれISOGEN（和光純薬工業（株））を用いて細胞の総RNAを回収し、これを鋳型としてスーパースクリプトIIIファーストストランド合成ス
ーパーミックス（Invitrogen社）を用いてcDNAを作成した。このcDNAを用いてTaqMan（登録商標） Gene Expression Assays をプライマーおよびプローブとしてエンドセリン-１遺伝子発現量をリアルタイムRT-PCRにより測定した（使用機器：ABI PRISM（登録商標） 7000 シークエンスディテクションシステム）。
【００２３】
各試料における遺伝子発現量は標準cDNAに対する相対値として表し、更に、内部標準遺伝子としてRPLP0遺伝子の相対発現量を測定し、これにより標準化した。なお、エンドセリン-１およびRPLP0遺伝子発現量の検討に用いたTaqMan（登録商標） Gene Expression AssaysのIDはそれぞれHs00174961_m1，Hs99999902_m1である。
有意差の検定は、ｔ-検定により行い、有意水準は５％とした。多重検定を行う際には，特に記載のない場合はボンフェローニ補正により有意水準を算出し、これを用いて判定した。
【００２４】
２）結果
図１から明らかなように、過酸化水素によってヒト表皮細胞におけるエンドセリン−１遺伝子の発現が上昇した。一方、当該遺伝子発現の上昇は、アトロバスタチンによって有意に抑制された（図２）。なお、いずれも無処理コントロールのエンドセリン−１遺伝子発現量を100とした場合の相対比（％）として求めた。
以上より、この系におけるエンドセリン−１遺伝子の発現抑制作用を指標に、エンドセリン発現抑制剤をスクリーニングすることが可能と考えられる。
【００２５】
実施例２  過酸化水素による表皮細胞のエンドセリン-１遺伝子発現促進
１）方法
［細胞培養］
培養ヒト表皮細胞（NHEK (F)  新生児包皮由来，クラボウ社）を表皮角化細胞増殖用培地EpiLifeTMに増殖添加剤（インスリン 0.5ml，hEGF 0.5ml，ハイドロコーチゾン 0.5ｍｌ，抗菌剤 0.5ml，BPE 2ml）を添加したもの（以下、増殖用培地）で培養した。継代には、0.025％トリプシン／0.01％EDTAを用いた。
【００２６】
［過酸化水素処理］
培地を除き、PBS（−）で２回洗浄した後100μM H2O2を含むPBS（−）を2.0ml添加して37℃にて１時間培養した。無処理コントロールは、過酸化水素処理と同様にPBS（−）で洗浄後PBS（−）2.0mlを添加して37℃にて１時間培養した。
【００２７】
２）スクリーニング
６wellプレートに表皮細胞を2500個／cm2ずつ播種し、2.0mlの増殖用培地中で培養した。細胞密度がサブコンフルエントに達したことを確認した後、サンプルを添加した培地に交換した。サンプル添加培地はファルコレックスローズマリー  Ｅ（一丸ファルコス株式会社製  抽出溶媒50％エタノール水溶液）を最終濃度0.00075％残渣となるように増殖用培地に添加して作成した。
サンプル添加培地で24時間培養後、上記の過酸化水素処理を行い、その後増殖用培地で洗浄した後、新たに増殖用培地を2.0ml添加して12時間培養した。サンプルの細胞毒性は細胞の形態を観察し、異常の有無で判定した。なお、溶媒コントロールとしてサンプルの代わりに50％エタノール水溶液を用いた。
培養再開後、６時間および12時間後にそれぞれISOGEN（和光純薬工業（株））を用いて細胞の総RNAを回収し、これを鋳型としてスーパースクリプトIIIファーストストランド合成スーパーミックス（Invitrogen社）を用いてcDNAを作成した。このcDNAを用いて実施例１と同様にTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays をプライマーおよびプローブとしてエンドセリン-１遺伝子発現量をリアルタイムRT-PCRにより比較検討した。
【００２８】
３）結果
ローズマリーエキス添加時のエンドセリン−１遺伝子発現量及び50％エタノール水溶液（溶媒コントロール）添加時のエンドセリン−１遺伝子発現量を図３に示す。いずれも無処理コントロール（対照群）のエンドセリン−１遺伝子発現量を100とした場合の相対比（％）として求めた。
今回用いたサンプル（ローズマリーエキス）は過酸化水素による表皮角化細胞からのエンドセリン−１産生を40％以上抑制した(図３)。従って、ローズマリーエキスはエンドセリン発現抑制効果があると評価できる。
【図１】
2010207125.tif 000002
【図２】
2010207125.tif 000003
【図３】
2010207125.tif 000004