(57)【要約】【課題】アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルを増加させてアナライトを高感度に検出できるアナライト分析方法を提供する。【解決手段】アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、からなる、アナライト分析方法。【選択図】図１
2010117140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、
前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、
前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、
からなる、アナライト分析方法。
【請求項２】
前記ビオチンビス体は、２つのビオチンをリンカーにより架橋させた構造である請求項１に記載のアナライト分析方法。
【請求項３】
前記リンカーの長さは、０．１４ｎｍから６ｎｍである請求項２に記載のアナライト分析方法。
【請求項４】
前記リンカーは、アルキル、アルコール、カルボン酸、スルホン酸、エステル、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、糖、リン酸、アミノ酸、メタクリル酸、アミド、イミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エチレン、カーボネート、ビニル、ヒドラゾン、環式化合物、ヘテロ環式化合物またはこれらの組み合わせからなる請求項２に記載のアナライト分析方法。
【請求項５】
前記アビジンは、卵白アビジン、ストレプトアビジン、リコンビナントアビジンである、請求項１に記載のアナライト分析方法。
【請求項６】
前記アナライトは、抗原、抗体、核酸のいずれかでありリガンドと特異的に結合する物質である請求項１に記載のアナライト分析方法。
【請求項７】
前記リガンドは、抗原、抗体、核酸のいずれかであり前記アナライトと特異的に結合する物質である請求項６に記載のアナライト分析方法。
【請求項８】
前記標識物質は、電気化学発光性あるいは化学発光性のいずれかを性質を有する請求項１に記載のアナライト分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定のアナライトを、高感度に検出するためのアナライト分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素免疫測定法は、酵素を標識した抗体をアナライトと抗原抗体反応させ、アナライトの濃度に応じて、酵素から生成されるシグナルを検出する高感度免疫測定法である。この方法は、酵素が有する触媒活性の高さから容易に高いシグナルを得ることができるため、アナライトを高感度に測定できる。
【０００３】
一般的に、酵素免疫測定法は、固相に固定化された固相固定化抗体に対し、アナライトを含む試料を加え、抗原抗体反応させる。次に、酵素標識抗体とアナライトとを抗原抗体反応により、固相固定化抗体・アナライト・酵素標識抗体との複合体を形成させる。この複合体に対し、酵素基質溶液を加えて、酵素反応を行わせることにより、発色・発光等のシグナルを生成させる。このシグナルを検出することで、目的とするアナライトの存在量を知る方法である。
【０００４】
しかしながら、上記方法は、酵素のような巨大分子の標識物質を抗体に直接結合させているため、抗原抗体反応の際に立体障害となり反応が阻害される。そのため、抗体にビオチン、酵素にアビジンを修飾し、抗原抗体反応後に、アビジン−ビオチン反応によって酵素を結合させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
これは、固相に接続された固相固定化抗体に対し、アナライトを含む試料を加え、抗原抗体反応させる。次に、ビオチン標識抗体とアナライトとを抗原抗体反応させ、更に、アビジン標識酵素を加えることにより、固相固定化抗体・アナライト・ビオチン標識抗体・アビジン標識酵素とで複合体を形成させる。この複合体に対し、酵素基質溶液を加えて、酵素反応を行わせることにより、発色・発光等のシグナルを生成させる。このシグナルを検出することで、目的とするアナライトの存在量を検出する。
【０００６】
しかしながら、上記の方法では、安定した酵素が必要となる。そのため、近年では、イソルミノールやアクリジニウムエステル等の化学発光物質を標識した化学発光免疫分析法や、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体のような電気化学発光物質を抗体に標識した電気化学発光免疫分析法が広く用いられている。
【０００７】
化学発光免疫分析方法や電気化学発光免疫分析方法は、優れた方法であるが、抗体への標識率が低いと、得られる発光量が微弱なので、複雑な光学系を有した装置が必要となる。そのため、高分子化合物にビオチン及び発光物質を修飾した、ビオチン標識−発光性高分子化合物を使用する（例えば、特許文献２参照。）。
【０００８】
この方法は、上述した酵素を用いた免疫測定法と同様に、固相に固定化された固相固定化抗体に対し、アナライトを含む試料を加え、抗原抗体反応させる。次に、ビオチン標識抗体とアナライトとを抗原抗体反応により、固相固定化抗体・アナライト・ビオチン標識抗体との複合体を形成させる。その後、アビジン及び前記ビオチン標識−発光性高分子化合物を添加させて、固相固定化抗体・アナライト・ビオチン標識抗体・アビジン・ビオチン標識−発光性高分子化合物との複合体を形成させる。この複合体から発する発光量を検出することで、目的とするアナライトの存在量を知る方法である。
【０００９】
このビオチン標識−発光性高分子化合物は、高分子化合物に発光物質を複数個結合させているだけでなく、アビジンとビオチン標識−発光性高分子化合物との結合により、連鎖的にまた多岐にアビジン・ビオチン標識−発光性高分子化合物の複合体を形成させている。そのため、発光シグナルが増加されるので、簡易な装置を用いても感度良く分析が出来る。
【特許文献１】特開昭５８−３０６６７号公報
【特許文献２】国際公開第２００３／０３１９７４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、前記従来の構成では、ルミノールを３００個結合させたビオチン標識−発光性高分子化合物を用いて免疫測定を行うと、ルミノール単体を標識させた場合に比べて発光シグナルは４倍程度の増加に留まる。これは、ビオチン標識−発光性高分子化合物がアビジン−ビオチン結合の際に、立体障害が生じるためである。すなわち、前記従来の構成では、アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルが増加しないという課題を有していた。
【００１１】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルを増加させてアナライトを高感度に検出できるアナライト分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記従来の課題を解決するために、本発明のアナライト分析方法は、アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、からなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のアナライト分析方法によれば、低分子であるビオチンビス体が、標識物質修飾アビジン間のリンカーとして作用するため、アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルを増加させてアナライトを高感度に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明のアナライト分析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１５】
（実施の形態１）
図１は、本手法におけるアナライト分析方法を示した図である。この図とともに詳細に説明する。本実施例では、抗原をアナライトとして説明するが、抗体もしくは核酸をアナライトとしても良い。
【００１６】
（結合体形成ステップ）
図１ａは、固相上に固定した固相固定化抗体、抗原、ビオチン修飾抗体が結合した形態を示す図である。１は固相として用いた磁気ビーズであり、２は固相固定化抗体である。３は抗原であり、４のビオチン修飾リガンドと結合している。５はビオチン修飾リガンドに修飾されているビオチンである。本発明では、図１ａに示す形態を結合体と称する。この結合体は、公知の抗原抗体反応を使えば、容易に形成することが出来る。
【００１７】
本実施例では、固相に磁気ビーズを用いたが、これ以外のビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリエチレンビーズなどを用いても良い。また、  本発明で用いる固相はビーズに限定されるものではなく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体で作製されたプレートでも良い。なお、以上の物質は電気化学発光を行う場合、電極として利用する利点がある。
【００１８】
次に、固相に固相固定化抗体を固定させる。一般的な手法としては、物理的に吸着させる手法が挙げられる。また、抗体のシステイン残基やアミノ基、カルボキシル基を用いて、これらと結合できる官能基を化学処理した固相と共有結合させる手法も挙げられる。これらの手法は公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００１９】
本発明で用いるリガンドは、抗原、抗体、核酸のいずれかから選択される。本実施例では、アナライトに抗原を用いたため、リガンドには抗体を用いた。
【００２０】
本発明で用いるビオチン修飾リガンドの修飾は、共有結合により行う。共有結合には、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、マレイミド−チオール結合がある。抗体の場合、アミノ残基とビオチンに含まれるカルボン酸との間でアミド結合させるが、チオールやマレイミドを修飾させたビオチンが市販されているので、これを用いてシステイン残基などに修飾させても良い。
【００２１】
なお、リガンドが核酸の場合は、５´末端若しくは３´末端にビオチンと共有結合できる官能基を修飾した核酸を合成する手法が一般的である。また、グアニンやウラシルなどの基質にビオチンを修飾させ、核酸増幅やニックトランスレーションなどによりビオチンを導入させる手法もある。
【００２２】
（複合体形成ステップ）
次に、以上に説明した図１ａの結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体を添加して、複合体を形成する方法を説明する。
【００２３】
図１ｂは、標識物質修飾アビジンを示す図である。６は標識物質であり、７のアビジンに修飾されている。アビジン７への標識物質６の修飾は、共有結合により行えば良い。共有結合の例としては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、マレイミド−チオール結合が挙げられる。
【００２４】
標識物質６は、電気化学発光性、化学発光性を有する物質であれば特に限定されず、電気化学発光であれば、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエン、トリスビピリジンルテニウム錯体、トリスビピリジンオスミウム錯体などを挙げることができ、化学発光では、イソルミノール、ルシゲニン、ロフィン、アクリジニウムエステル、ジフェノイルペルオキシド、イミダゾピラジノン系化合物が利用できる。
【００２５】
この標識物質をアビジン７に修飾させる。アビジンには、卵白アビジン、ストレプトアビジン、リコンビナントアビジンがある。修飾方法は、上述した共有結合により行う。
【００２６】
図１ｃは、ビオチンビス体９を示す図である。ビオチンビス体９とは、ビオチン５を２つ有する化合物であり、リンカー８を介してビオチン５を共有結合させた化合物である。リンカー８の種類は、アルキル、アルコール、カルボン酸、スルホン酸、エステル、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、糖、リン酸、アミノ酸、メタクリル酸、アミド、イミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エチレン、カーボネート、ビニル、ヒドラゾン、環式化合物、ヘテロ環式化合物またはこれらの組み合わせからなる。
【００２７】
リンカーの剛直性は、本発明においては大変重要である。剛直性が低いと、リンカーが屈曲し、アビジン−ビオチン結合の反応効率を低下させてしまう。そのため、エチレンなどの不飽和炭化水素やシクロアルカンなどの環式化合物を持たせると良い。
【００２８】
また、リンカー長さも本発明においては重要である。リンカー長さは、０．１４ｎｍから６ｎｍが望ましい。これは、アビジンのビオチン結合部位が、アビジン分子表面から約０．９ｎｍの深さにあるためである。ビオチン部位のＣ４の位置にある側鎖の鎖長は約０．４３ｎｍであり、そのままビス体を形成させても約０．８６ｎｍ程度である。そのため、ビオチン間の距離が０．１４ｎｍ以下だと、ビオチンの一方はアビジンと反応出来るが、もう一方のビオチンは、前記アビジンに埋もれてしまう。また、埋もれなかった場合でも、アビジン間の立体障害により、アビジン−ビオチン結合が阻害されてしまう。一方、６ｎｍ以上では、リンカー自体が立体障害の要因となるため、６ｎｍ以下に設計する。さらに水溶液への溶解度を上げるため、アルコールやカルボン酸などの親水基を修飾させると良い。
【００２９】
図１ａで作製した結合体に、上述した標識物質修飾アビジン及びビオチンビス体を添加することで、図１ｄに示す結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体が形成される。これは、図１ｃで示したビオチンビス体９が標識物質修飾アビジン間のリンカーとして機能するので、連鎖的に標識物質修飾アビジンの複合体が形成される。形成後、緩衝液で未反応のビオチンビス体及び、標識物質結合アビジンを除去する。
【００３０】
（分析ステップ）
図１ｅは、図１ｄで形成した複合体を電極１０に配置した図である。このように電極に複合体を配置した後、還元剤を含む電解液を添加して電圧を印加する。この工程で生成した発光を光電子増倍管やＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）で計測する。
【００３１】
電極１０は、導電物質であれば特に限定されない。例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体等が利用できる。
【００３２】
上述の検出ステップは、電気化学発光する標識物質を用いた場合で説明したが、標識物質が化学発光の場合では、電極１０を設ける必要は無い。
【００３３】
以上のことから、目的の抗原が存在する場合は、固相上に、結合体・標識物質結合アビジン複合体が形成される。標識物質結合アビジンは、ビオチンビス体を介して連鎖的に複合体を形成しているので、標識物質結合アビジン同士が立体障害を起こすことがなく、アナライトを高感度に検出することができる。
【００３４】
以下に、本発明のアナライト分析方法を用いたＴＮＦ−αの測定手順を詳細に説明する。ここで用いる固相固定化抗体及び、ビオチン修飾抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤｕＯＳＥＴ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍのｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａキットを使用した。
【００３５】
（１）抗体（ＴＮＦ−α抗体）固定化磁気ビーズの調製
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の直径１．５μｍのシリカコーティング磁気ビーズ（１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを採取し、磁石で磁気ビーズを引き寄せて、上澄みを廃棄した。その後、ｐＨ７．４に調整した１０ｍＭのリン酸緩衝液１ｍＬ添加し、攪拌させて、再度磁気ビーズを引き寄せて上澄みを廃棄した（以降、緩衝液添加から上澄みの廃棄までの工程を洗浄操作と略す）。
【００３６】
この磁気ビーズに、１０ｍＭのリン酸緩衝液３００μＬと、上述したキットに含まれる固相固定化抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を２００μＬ添加した。そして、さらにウシ血清アルブミン（以降、ＢＳＡと略す）を１％含んだ１０ｍＭのリン酸緩衝液を１００μＬ添加した後、３７℃で１８時間穏やかに攪拌させることにより、磁気ビーズに固相固定化抗体を結合させた。
【００３７】
次に、洗浄操作を行った後、磁気ビーズのコーティング剤としてＢＳＡを３％含んだ１０ｍＭのリン酸緩衝液を１ｍＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。このようにして、ＴＮＦ−α抗体固定化磁気ビーズを得た。
【００３８】
（２）抗原（ＴＮＦ−α）と磁気ビーズ固定化抗体の結合
まず、サンプルであるＴＮＦ−αを１％ＢＳＡ含有１０ｍＭリン酸緩衝液で１００ｐｇ／ｍＬに濃度調整した。次に、（１）で調製したＴＮＦ−α抗体固定化磁気ビーズを２５μＬ採取し、磁石で磁気ビーズを引き寄せて、上澄みを廃棄した。その後、上述したＴＮＦ−αを５００μＬ添加して、３０℃で１時間反応させた。
【００３９】
（３）ＴＮＦ−αとビオチン修飾抗体の反応
キットのビオチン修飾抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１０μＬ採取し、１％ＢＳＡ含有１０ｍＭリン酸緩衝液４４０μＬで希釈した。（２）の反応後、０．１％ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）ｉｓｏｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ（以降、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と略す）含有１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄操作を３回行い、未反応物などを除去した。この磁気ビーズに、前記ビオチン修飾抗体４５０μＬを添加し、３０℃で１時間反応させることにより、ＴＮＦ−αとの抗原抗体反応を行った。
【００４０】
（４）ルテニウム錯体修飾アビジンの合成
標識物質には、電気化学発光物質である、ルテニウム錯体を使用し、以下のようにしてアビジンへ修飾した。
【００４１】
（４−１）ルテニウム錯体の合成
まず、テトラヒドロフラン（以降、ＴＨＦと略す）６０．０ｍLに溶解させた４，４´−ジメチル−２，２´ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、氷冷しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、氷冷しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た（収率４７．２％）。
【００４２】
次に窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及び脱水したジメチルホルムアミド（以降、ＤＭＦと略す）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬ及び蒸留水２００ｍＬで洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６１．５％）。
【００４３】
三塩化ルテニウム（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２´−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をＤＭＦ（８０．０ｍL）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、１８時間４℃に冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに１６時間４℃で静置した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た(収率６８．２％)。
【００４４】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｃ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率８１．６％）。
【００４５】
さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを
１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍ
ｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去
した。
【００４６】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を４℃で１６時間静置し、析出した不純物を自然ろ過で除去した。
【００４７】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、蒸留水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、目的物である標識物質（化１）を得た(収率７１．４％)。
【００４８】
表１は、前述のようにして得たルテニウム錯体（化１）の１Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００４９】
【化１】
2010117140.tif 000003
【００５０】
【表１】
2010117140.tif 000004
【００５１】
（４−２）ルテニウム錯体修飾アビジンの合成
ストレプトアビジン１．０ｍｇをｐＨ７．４に調整した１０ｍＭのリン酸緩衝液１ｍＬに溶解させた。これに、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドを１．０ｍｇ（８．６９μｍｏｌ）、１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを１４．０ｍｇ（７３．０μｍｏｌ）添加して、３０℃で１時間反応させた。その後、ルテニウム錯体１．３ｍｇ（１．５２μｍｏｌ）とトリエチルアミン０．４μＬ（２．８６μｍｏｌ）を１ｍＬの１０ｍＭのリン酸緩衝液で溶解させた溶液を添加し、さらに３０℃で１８時間反応させた。
【００５２】
この反応液を透析膜に注入し、１０ｍＭのリン酸緩衝液で２日間透析を行い、未反応のルテニウム錯体などを除去することで、ルテニウム錯体修飾アビジンを得た。
【００５３】
（５）ビオチンビス体の合成
ビオチンビス体（化２）は以下のようにして合成した。まず、ビオチン５０ｍｇ（２０５μｍｏｌ）をＤＭＦ１５ｍＬに溶解させ、これにジシクロヘキシルカルボジイミド（以降、ＤＣＣと略す）を１７２ｍｇ（８３４μｍｏｌ）添加し、２５℃で２時間反応させた。
【００５４】
１，４−シクロヘキサンビス（メチルアミン）１２．８ｍｇ（９０μｍｏｌ）とトリエチルアミン２８．７μＬ（２０５μｍｏｌ）とをＤＭＦ１ｍＬに溶解させた溶液を、前記ビオチン溶液に滴下して、さらに１８時間２５℃で攪拌させた。
【００５５】
反応後、エバポレーターによりＤＭＦを留去した後、酢酸エチルを添加して、目的物を溶解させ、残渣をろ過で除去した。再度エバポレーターにより酢酸エチルを留去し、ジエチルエーテルとメタノールの混合溶媒を添加して、残留したＤＣＣ等を除去することにより、ビオチンビス体を得た。
【００５６】
このビオチンビス体は、１Ｈ−ＮＭＲで構造を確認したところ、１〜３ｐｐｍにかけてシグナルが重複していたため、ビオチン単体との識別が出来なかった。そこで、薄層クロマトグラフィーにて確認した。固定相をシリカ、移動相をメタノール：クロロホルム＝１：３の体積比で混合させた溶液で展開させたところ、ビオチンのＲｆ値は０．２８であったのに対し、生成物は０．６８であった。なお、他の原料も確認したが、これとは違う位置であったため、目的物のビオチンビス体が合成できたと判断した。
【００５７】
【化２】
2010117140.tif 000005
【００５８】
（６）ビオチン修飾抗体とルテニウム錯体修飾アビジンとの結合
（３）でビオチン修飾抗体を結合させた磁気ビーズは、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有１０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗浄操作を行った。この磁気ビーズに、（４）で合成したルテニウム錯体修飾アビジンを５μＬ採取し、１％ＢＳＡ含有１０ｍＭリン酸緩衝液４４０μＬで希釈した溶液を添加した。
【００５９】
３０℃で３０分間攪拌させた後、再度０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有１０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗浄操作を行った。さらに１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄し、上澄みを完全に除去した後、同緩衝液で２０μＬに置換した。
【００６０】
（７）ビオチンビス体・ルテニウム錯体修飾アビジンの複合体形成
（５）で合成したビオチンビス体をジメチルスルホキシドに溶解させて、１０ｍＭに濃度調整し、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液を添加して、１万倍希釈した。このビオチンビス体溶液４５０μＬを（６）の磁気ビーズ液に添加し、１０分攪拌させた後、ルテニウム錯体修飾アビジン１０μＬを１％ＢＳＡ含有１０ｍＭリン酸緩衝液４４０μＬで希釈した溶液を添加した。
【００６１】
３０℃で３０分間反応させた後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有１０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗浄操作を行った。さらに１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄し、上澄みを完全に除去した後、同緩衝液で２０μＬに置換した。
【００６２】
（８）磁気ビーズの電極固定
電極には、金電極を使用した。この金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。６０℃に加熱したホットプレート上に電極を置き、上述で得られた磁気ビーズ液を２．５μＬ滴下して乾燥固定した。これを、実施例とした。
【００６３】
なお、従来例として、工程１、２、３、４、６により得られた、ビオチン−ルテニウム錯体修飾アビジン結合サンプルを作製し、同様の工程で電極上に磁気ビーズを乾燥固定させた。また、さらに、コントロールとして、ＴＮＦ−αを添加することなく、各工程を行った磁気ビーズも電極に乾燥固定させた。
【００６４】
（９）電気化学発光測定
０．１Ｍのリン酸緩衝液及び、０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液をそれぞれの電極に８０μＬ滴下し、電極に電圧を印加することにより発生した電気化学発光の発光量を測定した。電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、４秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【００６５】
図２は、実施例、従来例及びコントロールにおけるＴＮＦ−αの電気化学発光量の測定結果である。従来例の最大発光量は３６６カウントだが、実施例の最大発光量は６４８２カウントと従来例の１８倍の値を示している。なお、コントロールとしてＴＮＦ−αを含まないサンプルを測定したときの最大発光量は１２４カウントであったことから、実施例は、アナライトに対して特異的に発光していることが分かる。以上の結果から、実施例は、ビオチンビス体により、ルテニウム錯体修飾アビジンが連鎖的に複合体を形成したと考えられる。このように、本発明の手法を用いれば、高感度に目的のアナライトを検出できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明にかかるアナライト分析方法は、ビオチンビス体を用いて、標識物質修飾アビジンの複合体を効率よく形成させる。そのため、試料中に存在する特定のアナライトを高感度に検出することができ、免疫診断、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途等に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の実施の形態におけるアナライト分析方法を示す図
【図２】本発明の実施の形態におけるＴＮＦ−α測定結果を示す図
【符号の説明】
【００６８】
１  固相（磁気ビーズ）
２  リガンド（抗体）
３  アナライト（抗原）
４  ビオチン修飾リガンド（抗体）
５  ビオチン
６  標識物質
７  アビジン
８  リンカー
９  ビオチンビス体
１０  電極
【図１】
2010117140.tif 000006
【図２】
2010117140.tif 000007