(57)【要約】【課題】  限定されるものではないが、イマチニブまたは（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）などのＴＫＩをはじめとする薬物で処置された患者における浮腫の副作用の発生の見込みを予測する方法を提供すること。【解決手段】  限定されるものではないが、イマチニブまたは（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）などのＴＫＩをはじめとする薬物で処置された患者における浮腫の副作用の発生の見込みを予測する方法を見いだした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、
ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち複数に関して、生体サンプルにおけるＲＮＡ発現レベルを判定すること；
ｂ）患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示されている平均非浮腫発現プロフィールとを比較すること；
ｃ）（ｂ）における比較から得られた２つの遺伝子発現プロフィール間の類似性を判定すること；
ｄ）（ｃ）において判定された類似性の程度の手段により、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みを判定する
ことを含む方法。
【請求項２】
（ｃ）において判定される前記類似性が前記の２つの遺伝子発現プロフィールを比較することにより得られる数学的相関係数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）において判定される前記相関係数がピアソンの相関係数（ＰＣＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）が、ＰＣＣが０.３７未満であれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症しないよりも発症する見込みが高いと判定し、ＰＣＣが０.３７以上であれば、患者が浮腫を発症するよりも発症しない見込みが高いと判定することにより判定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを、１５％の浮腫症例だけしか浮腫を持たないとして誤分類されないような高感度で予測する方法であって、
ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち複数に関して、生体サンプル中のＲＮＡ発現レベルを判定すること；
ｂ）患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示されている平均非浮腫発現プロフィールとを比較すること；
ｃ）（ｂ）における比較から得られた２つの遺伝子発現プロフィールの間のＰＣＣを判定すること；
ｄ）ＰＣＣが陰性でかつ負または０.７８未満であれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症しないよりも発症する見込みが高いと判定すること；および
ｅ）陰性のＰＣＣが０.７８以上であれば、患者が浮腫を発症するよりも発症しない見込みが高いと判定する
ことを含む方法。
【請求項６】
生体サンプルが血液サンプルを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
表２の１３のプレディクター遺伝子の全てが用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
薬物がチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＴＫＩがイマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、
ａ）患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、転写開始部位から−５１１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１４２３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の同一性を判定すること；および
ｂ）この部位のヌクレオチド対が双方ともＧＣであれば、患者が浮腫を発症する見込みがあると判定し、この部位のヌクレオチド対の少なくとも一方がＡＴであれば、患者が浮腫を発症する見込みがないと判定すること
を含む方法。
【請求項１１】
薬物がＴＫＩである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＫＩがイマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、
ａ）患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、転写開始部位から−３１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の同一性を判定すること；および
ｂ）この部位のヌクレオチド対が双方ともＡＴであれば、患者が浮腫を発症する見込みがあると判定し、この部位のヌクレオチド対の少なくとも一方がＧＣであれば、患者が浮腫を発症する見込みがないと判定すること
を含む方法。
【請求項１４】
薬物がＴＫＩである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＫＩがイマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、
ａ）生体サンプルにおいてＩＬ−１β遺伝子の転写レベルを判定すること；および
ｂ）そのレベルが閾値レベルを超えていれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがあると判定する
ことを含む方法。
【請求項１７】
薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、
ａ）生体サンプルにおいてＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルを判定すること；および
ｂ）そのレベルが閾値レベルを超えていれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがあると判定する
ことを含む方法。
【請求項１８】
薬物がＴＫＩである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＴＫＩがイマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、
ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のタンパク質産物のうち２以上に関して、生体サンプルにおけるタンパク質発現パターンを判定すること；
ｂ）このタンパク質発現パターンと表３に示されている浮腫および非浮腫発現プロフィールに関して予想されるパターンとを比較すること；
ｃ）そのパターンが、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがない非浮腫パターンと類似性が高いかどうかを判定すること；および
ｄ）そのパターンが、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがある浮腫パターンと類似性が高いかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項２１】
表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち複数のタンパク質発現を判定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の全てのタンパク質発現を判定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
薬物がＴＫＩである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＫＩがイマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者を薬物で処置する方法であって、
ａ）請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法の使用により、意図した薬物に曝された際に特定の患者が浮腫を発症する見込みを判定すること；および
ｂ）（ａ）における判定の結果に基づく安全かつ適当な方法で、その患者に対して意図した薬物療法を改良すること
を含む方法。
【請求項２６】
薬物試験のために臨床試験を計画する方法であって、
ａ）前記発現プロファイリング法またはジェノタイピング法のいずれかを用いることにより、試験薬に曝された際に特定の患者が浮腫を発症する見込みを判定すること；および
ｂ）（ａ）における判定の結果に基づき、臨床試験においてその患者を適当な分類に割り付けること
を含む方法。
【請求項２７】
浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有する、ＩＬ−１β遺伝子由来のアンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子の治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法。
【請求項２８】
浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害／活性化するアンタゴニストの治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記アンタゴニストが前記タンパク質に特異的な抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体が有毒試薬と共役されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を低下／増強させる能力を有するリボザイムをコードするヌクレオチド配列の治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法。
【請求項３３】
浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を低下させる能力を有する、ＩＬ−１β遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法。
【請求項３４】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上に対応するタンパク質発現パターンを判定するための手段を含むキット。
【請求項３５】
前記手段が１３のプレディクター遺伝子のうち複数に対応するタンパク質発現パターンを判定することができる、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記手段が１３のプレディクター遺伝子の全てに対応するタンパク質発現パターンを判定することができる、請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項３７】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、ＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルを判定するための手段を含むキット。
【請求項３８】
前記タンパク質発現を判定するための手段が抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記タンパク質発現が標識抗体を用いたウエスタンブロッティングにより判定される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
患者の生体サンプルを得るための手段をさらに含む、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
タンパク質を検出するための手段および患者の生体サンプルを収容するのに好適な容器をさらに含む、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
キット結果の使用および解釈に関する説明書をさらに含む、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、
（ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上に対応するタンパク質発現パターンを判定するための手段；
（ｂ）前記手段、および前記タンパク質を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記手段が前記タンパク質と複合体を形成することができる容器；
（ｃ）（ｂ）の複合体を検出するための手段；および所望により、
（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書
を含むキット。
【請求項４４】
表２に示されている１３のプレディクター遺伝子に関するタンパク質発現パターンを判定するためのキットであって、
ａ）タンパク質発現パターンの判定に必要な全ての試薬を含む容器；および
ｂ）どのようにしてこの分析を実施および解釈するかを記載した表示
を含むキット。
【請求項４５】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、
（ａ）ＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルを判定するための手段；
（ｂ）前記手段、およびタンパク質を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記手段が前記タンパク質と複合体を形成することができる容器；
（ｃ）（ｂ）の複合体を検出するための手段；および所望により、
（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書
を含むキット。
【請求項４６】
前記判定ステップ（ａ）が請求項３７〜４２、または４５のいずれか一項に記載のキットの使用をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記判定ステップ（ａ）が請求項３４〜３６、または３８〜４４のいずれか一項に記載のキットの使用
をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上の転写レベルを判定するための手段を含むキット。
【請求項４９】
前記手段が１３のプレディクター遺伝子のうち複数の転写レベルを判定することができる、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記手段が１３のプレディクター遺伝子の全ての転写レベルを判定することができる、請求項４８または４９に記載のキット。
【請求項５１】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、ＩＬ−１β遺伝子の転写レベルを判定する手段を含むキット。
【請求項５２】
転写レベルを判定するための前記手段が前記遺伝子の転写産物と結合することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが前記遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと結合することができる、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記転写レベルがノーザンブロット分析、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、およびマイクロアレイの群から選択される技術により判定される、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
患者の生体サンプルを得るための手段をさらに含む、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
転写レベルを測定するための手段および患者の生体サンプルを収容するのに好適な容器をさらに含む、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
キット結果の使用および解釈に関する説明書をさらに含む、請求項４８〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、
（ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上の転写産物と結合することができるいくつかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび転写産物を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが前記転写産物と結合することができる容器；
（ｃ）（ｂ）の結合を検出するための手段；および所望により、
（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書
を含むキット。
【請求項５９】
表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の発現パターンを判定するためのキットであって、
ａ）必要な遺伝子チップを、その展開に必要な試薬とともに含む容器；および
ｂ）得られる遺伝子発現パターンの作成、読み取りおよび解釈に関する説明書
を含むキット。
【請求項６０】
薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを推定するためのキットであって、
（ａ）ＩＬ−１β遺伝子の転写産物と結合することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および転写産物を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが前記転写産物と結合することができる容器；
（ｃ）（ｂ）の結合を検出するための手段；および所望により、
（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書
を含むキット。
【請求項６１】
判定ステップ（ａ）が請求項４８〜５０、または５２〜５９のいずれか一項に記載のキットの使用をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
判定ステップ（ａ）が請求項５１〜５７、または６０のいずれか一項に記載のキットの使用をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項６３】
患者のＩＬ−１β遺伝子における多型パターンを同定するためのキットであって、配列Ｘ０４５００の１４２３番のＩＬ−１β遺伝子における遺伝的多型パターンを判定するための手段を含むキット。
【請求項６４】
患者のＩＬ−１β遺伝子における多型パターンを同定するためのキットであって、配列Ｘ０４５００の１９０３番のＩＬ−１β遺伝子における遺伝的多型パターンを判定するための手段を含むキット。
【請求項６５】
患者の生体サンプルを得るための手段をさらに含む、請求項６３または６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記手段がＤＮＡサンプル回収手段をさらに含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
特定の多型部位における遺伝的多型パターンを判定するための前記手段が少なくとも１種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６８】
特定の多型部位の１つにおける遺伝的多型パターンを判定するための前記手段が２種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６９】
特定の多型部位の１つにおける遺伝的多型パターンを判定するための前記手段が、少なくとも１種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも１種の遺伝子特異的ジェノタイピングプライマー組成物を含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
前記遺伝子特異的ジェノタイピングプライマー組成物が少なくとも２セットの対立遺伝子特異的プライマー対を含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記２種の対立遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドが個別の容器にパッケージングされている、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、ＩＬ−１β遺伝子の、転写開始部位から−５１１の位置（配列Ｘ０４５００の１４２３番）にあるヌクレオチド対の同一性を判定するためのキットであって、
ａ）患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、ＩＬ−１β遺伝子の、転写開始部位から−５１１の位置（配列Ｘ０４５００の１４２３番）にあるヌクレオチド対の性質を検出するのに特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；および
ｂ）前記ヌクレオチド対の性質に基づきこれらの結果を解釈するための説明書
を含むキット。
【請求項７３】
転写開始部位から−３１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の同一性を判定するためのキットであって、
ａ）転写開始部位から−３１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の性質を検出するのに特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；および
ｂ）前記ヌクレオチド対の性質に基づきこれらの結果を解釈するための説明書
を含むキット。
【請求項７４】
判定ステップ（ａ）が請求項６３、または６５〜７２のいずれか一項に記載のキットの使用をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
判定ステップ（ａ）が請求項６４〜７１、または７３のいずれか一項に記載のキットの使用をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、限定されるものではないが、チロシンキナーゼ阻害（ＴＫＩ）薬をはじめとする薬物で処置された患者における浮腫の発生の見込みを予測する方法に関する。特に、本発明は、イマチニブ、特にそのメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）；また、ＳＴＩ５７１としても知られる、Novartis Pharmaceuticals， East Hanover， NJ， USA）をはじめとする薬物で処置された患者における副作用としての浮腫の発生を予測するための、数形態のゲノム分析の使用に関する。この種のゲノム分析としては、遺伝子発現プロファイリングおよび単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
浮腫は細胞外体液容積の管外または間質成分の増加として定義される。浮腫は様々な形態で現れ、例えば液体は腹腔または胸腔に蓄積することもあるし、あるいは、全身浮腫の場合のように全身性であることもある。浮腫の場所および分布はその病因論とメカニズムによって決定される。浮腫は多くの場合、顔面腫脹（眼窩周囲の領域に見られる場合が最も多い）により、また、圧力をかけた後の皮膚の陥凹の持続によって認識される。
【０００３】
一般に、血漿容積および間質容積は体内の全水分量の三分の一を保持する「細胞外空間」を含む。この２成分の細胞外コンパートメント間の液体の配置を調節する力は「スターリング力」と呼ばれている。通常、血管系内の静水圧と間質液のコロイド浸透圧は血管から管外空間への液体の移動を促進する傾向がある。これに対し、血漿タンパク質により与えられるコロイド浸透圧と、組織張力と呼ばれる間質液内の静水圧は、血管コンパートメントへの液体の移動を促進する。これらの力の結果として、液体が絶えず交換され、溶質が拡散する。浮腫は毛細管の圧力および透過性の増殖など、これらの力の何らかの障害の結果起こり得る。
【０００４】
本明細書で特に着目するのは、薬物の治療的投与の副作用として生じる種々の形態浮腫である。これらの薬物が患者に浮腫を作るメカニズムは全般的に知られてない。かろうじて目に付く眼窩周囲浮腫など、大部分の薬剤に対する応答において生じる浮腫は極めて軽いものであるが、薬物が肺浮腫や脳浮腫などの生命を脅かす形態の浮腫を生じることもある。
【０００５】
イマチニブは数種の癌の発達に原因的な、または極めて重要な役割を果たすいくつかのタンパク質のチロシンキナーゼ活性の阻害剤であるが、いくつかのケースではその使用は浮腫の発症を引き起こすことがある。Druker et al．， Nature Med．， Vol．2， pp．561-566 （1996）参照。
【０００６】
白血病の背景
種々の形態の白血病が、類似の病理学を基礎に有する種々の関連疾患を含む。この基礎的病理学は正常な造血の脱調節である。このプロセスは厳格に調節された増殖と成熟末梢血細胞となる多能性造血幹細胞の分化を必要とする。全ての種の白血病で、悪性事象は造血の進行のどこかで起こり、種々のメカニズムにより正常に分化ができず、調節されない様式で増殖が続く後代が生じてしまう。白血病は急性型と慢性型、そして、影響を受ける細胞系統に応じて骨髄型とリンパ型に分けられる。
【０００７】
慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia， CML）は慢性骨髄性白血病（chronic myeloid leukemia）、慢性骨髄性白血病（chronic myelocytic leukemia）または慢性顆粒球性白血病とも呼ばれる。ＣＭＬは、顆粒球、特に好中球系、特には単球系の過剰発現を特徴とし、著しい巨脾症をもたらし、白血球総数が極めて多くなる疾病である。好塩基球増加症および血小板増加症が一般的である。９５％を超える症例で骨髄細胞に、特徴的な細胞遺伝学的異常であるフィラデルフィア（Ｐｈ’）染色体が存在する。この変化した染色体の存在は、この種の白血病の分子的病因論を理解する鍵でもあり、患者の臨床的改善を評価するための主要な使用でもある。Sawyer， N．Engl．J．Med．， Vol．340， pp．1330-1340 （1999）参照。
【０００８】
ＣＭＬの最も顕著な病理学的特徴は、典型的なＣＭＬを有する９０％を超える患者の骨髄細胞にＰｈ’染色体が存在することである。Ｐｈ’染色体は、第９染色体と第２２染色体の長腕材料のバランスのとれた転座によって生じる。第９染色体から得られるものより、第２２染色体から失われる染色体材料のほうが多いので、Ｐｈ’染色体はその通常のＤＮＡ成分の約６０％しか含まない短い第２２染色体である。第９染色体の長腕のｑ３４バンドに起こるこの破断は、細胞癌遺伝子Ｃ−ＡＢＬを、破断点クラスター領域（ＢＣＲ）と呼ばれる第２２染色体上の位置へ転座させる。このＢＣＲにおける破断点は患者によって異なるが、一人の患者では全ての細胞で同じである。Ｃ−ＡＢＬは、マウスにおいて白血病を引き起こすアベルソンウイルスＶ−ＡＢＬのホモログである。これら２つの遺伝子配列の並置は、分子量２１０，０００ｋｄ（Ｐ２１０）の新たなタンパク質をコードする新たなハイブリッド遺伝子（ＢＣＲ／ＡＢＬ）を生じる。このＰ２１０タンパク質、すなわちチロシンキナーゼはＣＭＬ細胞の制御されない増殖の引き金をひく上で役割を果たし得る。Ｐｈ’染色体は赤血球、骨髄細胞、単球および巨核球で、また、あまり多くはないがＢリンパ球で、まれにＴリンパ球で生じるが、骨髄繊維芽細胞では生じない。
【０００９】
これまでＣＭＬの予後は、Ｐｈ陽性（Ｐｈ＋）ＣＭＬの平均生存が３〜４年と悪い。インターフェロンによる処置および過激な化学療法または同種異系骨髄移植これをいくらか改善してきたが、ＣＭＬ患者の処置における最大の改善はイマチニブの導入であった。Druker et al．， N．Engl．J．Med．， Vol．344， pp．1031-1037 （2001）;およびDruker et al．， N．Engl．J．Med．， Vol．344， pp．1038-1056 （2001）参照、また、Cecil Textbook of Medicine， 21st Edition， Goldman and Bennett， Eds．， W．B．Saunders， Chapter 176 （2000）も参照。
【００１０】
ＣＭＬでは、第９および第２２染色体が末端切断され、ＣＭＬ細胞を特徴づける＋（９；２２）相互転座を形成し、誘導体２２ｑ−染色体、すなわちＰｈ’染色体上のＢＣＲ−ＡＢＬと、染色体９ｑ＋上のＡＢＬ−ＢＣＲの２つの融合遺伝子が形成される。ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子はチロシンキナーゼ活性が脱調節された２１０ｋｄタンパク質をコードする。このタンパク質がＣＭＬにおいて病因的役割を果たす。Daley et al．， Science， Vol． 247， pp．824-830 （1990）参照。イマチニブはこのタンパク質および他のチロシンキナーゼの活性を特異的に阻害する。イマチニブはＣＭＬを有する患者の処置、およびＰｈ’染色体を有するＣＭＬまたはＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）の急性転化における患者の処置に著しい有効性を示している。Druker （2001）， 前掲参照。
【００１１】
さらに、イマチニブの、増殖因子受容体末端である別のチロシンキナーゼ、すなわちc-Kitを阻害する能力は、イマチニブを全く無関連の形態の癌、胃腸間質腫瘍の有効な処置とする。Brief Report， Joensuu et al．， N． Engl．J．Med．， Vol．344， No．14， pp．1052-1056 （2001）参照。
【００１２】
イマチニブは制御されないチロシンキナーゼ活性を特徴とする種々の疾患を有する患者において極めて有効であることが示されている。これにはＰｈ＋白血病が含まれる。ＣＭＬに対するイマチニブの効果に関する１つの研究では、３００ｍｇ以上で処置された５４名の患者のうち、５３名が完全な血液学的応答を示し、２９名で細胞性応答が生じ（大きな応答、すなわち、分裂中期の０〜３５％の細胞がＰｈ’染色体陽性を示す１７名（この用量を受容した５４名の患者の３１％）を含む）、これらの患者のうち７名は完全な細胞遺伝学的緩解を示した。Druker et al．（2001）， 前掲参照。
【００１３】
イマチニブはＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼの特異的阻害剤として開発され、ＣＭＬ患者の処置に極めて有効であることが実証されている。通常、十分許容されていることながら、浮腫はイマチニブ処置の最もよく受ける副作用の１つとして挙げられてきた。Kantarjian et al．， N．Engl．J．Med．， Vol．346， pp．645-652 （2002）; Druker et al．（2001）， 前掲; Cohen et al．， Clin．Cancer Res．， Vol．8， pp． 935-942 （2002）; and Ebnoether et al．， Lancet， Vol．359， pp．1751-1752 （2002）参照。
【００１４】
慢性期のＣＭＬを有する患者の臨床試験の報告は、イマチニブ処置に付随する最も多い有害事象の１つとして浮腫／体液貯留を示しており、３９〜６０％の患者（あらゆるグレード）に見られる。Kantarjian et al．（2002）， 前掲; Druker et al．（2001）， 前掲; およびCohen et al．（2002）， 前掲参照。これらの症例の大部分は軽度か中度ものであったが、主に表在的であり、例えば、眼窩周囲浮腫および下肢の末梢浮腫であった。しかし、１〜２％の患者では、肺浮腫、胸腔および心臓周囲滲出をはじめとするより重篤な形態の体液貯留が見られた。Cohen et al．（2002）， 前掲参照。さらに、イマチニブで処置されたＣＭＬ患者における２例の脳浮腫（一方は致命的）が最近報告されている。Ebnoether et al．（2002）， 前掲参照。
【００１５】
報告されている浮腫症例の大部分は軽度から中度のものであり、主として眼窩周囲浮腫および下肢の末梢浮腫からなる。Cohen et al．（2002）， 前掲参照。上述のように、最近報告されたイマチニブで処置されたＣＭＬ患者の２例の脳浮腫をはじめ、より重篤な形態の浮腫もまれに見られている。Ebnoether et al．（2002）， 前掲参照。このようにより重篤な浮腫症例の可能性があることから、ＴＫＩで処置する必要のある患者が開発される処置の副作用として浮腫を発症する見込みを予測する方法が極めて重要なものとなる。本発明の前には、この重要な薬物種のこの潜在的に重篤な副作用を推定する方法は存在しなかった。
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
本発明は、限定されるものではないが、イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）をはじめとするＴＫＩ薬での処置に対する副作用として、投与された患者が浮腫を発症する見込みを予測することのできるいくつかの方法およびキットを提供することにより上述の問題を解決するものである。これらの方法およびキットは遺伝子発現プロファイリングおよびいくつかの遺伝子におけるＳＮＰの分析に頼るものである。
【００１７】
よって、本発明の一態様は、限定されるものではないが、ＴＫＩ薬をはじめとする薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、ａ）表２に示されている１３のリポーター／プレディクター遺伝子のうち複数に関して、生体サンプルにおけるＲＮＡ発現レベルを判定すること；ｂ）患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示されている平均非浮腫発現プロフィールとを比較すること；ｃ）（ｂ）における比較から得られた２つの遺伝子発現プロフィール間の類似性を判定すること；およびｄ）（ｃ）において判定された類似性の程度の手段により、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みを判定することを含む方法である。より好ましい実施形態では、本方法は、前記（ｃ）において判定された類似性が前記２つの遺伝子発現プロフィールを比較することにより得られる数学的相関係数である上記方法の使用を伴う。本発明の最も好ましい実施形態では、（ｃ）で判定される前記相関係数はピアソンの相関係数（ＰＣＣ）である。
【００１８】
他の好ましい実施形態では、本発明は、限定されるものではないが、ＴＫＩ薬をはじめとする薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、ａ）表２に示されている１３のリポーター／プレディクター遺伝子のうち複数に関して、生体サンプル中のＲＮＡ発現レベルを判定すること；ｂ）患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示されている平均非浮腫発現プロフィールとを比較すること；ｃ）（ｂ）における比較から得られた２つの遺伝子発現プロフィールの間のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を判定すること；ｄ）ＰＣＣが０．３７未満であれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症しないよりも発症する見込みが高いと判定すること；およびｅ）ＰＣＣが０．３７以上であれば、患者が浮腫を発症するよりも発症しない見込みが高いと判定することを含む方法を提供する。
【００１９】
もう１つの実施形態では、限定されるものではないが、ＴＫＩ薬をはじめとする薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを、１５％の浮腫症例だけしか浮腫を持たないとして誤分類されないような高感度で予測する必要がある場合、本発明は、ａ）表２に示されている１３のリポーター／プレディクター遺伝子のうち複数に関して、生体サンプル中のＲＮＡ発現レベルを判定すること；ｂ）患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示されている平均非浮腫発現プロフィールとを比較すること；ｃ）（ｂ）における比較から得られた２つの遺伝子発現プロフィールの間のＰＣＣを判定すること；ｄ）ＰＣＣが負または０．７８未満であれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症しないよりも発症する見込みが高いと判定すること；およびｅ）負のＰＣＣが０．７８以上であれば、患者が浮腫を発症するよりも発症しない見込みが高いと判定することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、生体サンプルは血液または組織サンプルを含む。好適な血液または組織サンプルとしては、全血、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検が挙げられる。
【００２１】
他の実施形態によれば、本発明は１３のリポーター／プレディクター遺伝子のうち７または８、より好ましくは９または１０、最も好ましくは１１または１２のＲＮＡ発現レベルが判定される方法を提供する。本発明の他の実施形態は、表２の１３のリポーター／プレディクター遺伝子全てのＲＮＡレベルが判定される方法を提供する。
【００２２】
もう１つの態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＴＫＩ薬をはじめとする薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、ａ）患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、転写開始部位から−５１１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１４２３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の同一性を判定すること；およびｂ）この部位のヌクレオチド対の双方がＧＣであれば、患者が浮腫を発症する見込みがあると判定すること；およびｃ）この部位のヌクレオチド対の少なくとも一方対がＡＴであれば、患者が浮腫を発症する見込みがないと判定することを含む方法を提供する。
【００２３】
もう１つの態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＴＫＩ薬をはじめとする薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、ａ）患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、転写開始部位から−３１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の同一性を判定すること；およびｂ）この部位のヌクレオチド対が双方ともＡＴであれば、患者が浮腫を発症する見込みがあると判定し、この部位のヌクレオチド対の少なくとも一方がＧＣであれば、患者が浮腫を発症する見込みがないと判定することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明の他の態様は、薬物で処置された際にどの女性患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、ａ）生体サンプルにおいてＩＬ−１β遺伝子の転写レベルおよび／またはＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルを判定すること；およびｂ）そのレベルが閾値レベルを超えていれば、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがあると判定することを含む方法を提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、薬物がＴＫＩイマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）である上記方法を提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法であって、ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のタンパク質産物のうち２以上に関して、生体サンプルにおけるタンパク質発現パターンを判定すること；ｂ）このタンパク質発現パターンと表３に示されている浮腫および非浮腫発現プロフィールに関して予想されるパターンとを比較すること；ｃ）そのパターンが、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがない非浮腫パターンと類似性が高いかどうかを判定すること；およびｄ）そのパターンが、薬物で処置された際に患者が浮腫を発症する見込みがある浮腫パターンと類似性が高いかどうかを判定することを含む方法を提供する。この方法において、薬物は限定されるものではないが、イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）をはじめとするいずれのＴＫＩであってもよい。
【００２７】
本発明に従う方法の他の好ましい実施形態では、患者から採取した血液を含む。あるいは、転写レベルまたはタンパク質発現レベルは、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検をはじめ、患者から得られる血清または組織サンプルなどの他の生体サンプルで判定される。
【００２８】
本発明の他の実施形態は、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち複数のタンパク質発現が判定される方法を提供する。好ましくは、１３のプレディクター遺伝子のうち７または８、より好ましくは９または１０、最も好ましくは１１または１２のタンパク質発現が判定される。別の最も好ましい実施形態では、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の全てのタンパク質発現が判定される方法が提供される。
【００２９】
他の好ましい態様では、本発明は、薬物試験のために臨床試験を計画する方法であって、ａ）上記の発現プロファイリング法またはジェノタイピング法のいずれかを用いることにより、試験薬に曝された際に特定の患者が浮腫を発症する見込みを判定すること；およびｂ）（ａ）における判定の結果に基づき、臨床試験においてその患者を適当な分類に割り付けることを含む方法を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、患者を薬物で処置する方法であって、ａ）上記の発現プロファイリング法またはジェノタイピング法のいずれかを用いることにより、意図した薬物に曝された際に特定の患者が浮腫を発症する見込みを判定すること；およびｂ）（ａ）における判定の結果に基づく安全かつ適当な方法で、その患者に対して意図した薬物療法を改良することを含む方法。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有する、ＩＬ−１β遺伝子由来のアンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子の治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
他のいくつかの実施形態では、本発明は、浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害／活性化するアンタゴニストの治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法を提供する。本方法の使用に際しては、このアンタゴニストは、限定されるものではないが、モノクローナル抗体および／または有毒試薬と共役されたモノクローナル抗体をはじめ、そのタンパク質の特異的ないずれの抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントであってもよい。
【００３３】
他のいくつかの実施形態では、本発明は、浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変化させる能力を有するリボザイムをコードするヌクレオチド配列の治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態では、浮腫を有する、または有するリスクのある被験者を処置する方法であって、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変化させる能力を有する、ＩＬ−１β遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療上有効な量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
最も好ましい実施形態では、本発明は、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳が低下される上記方法を提供する。他の最も好ましい実施形態では、このＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳は増強される。
【００３６】
本発明の別の態様は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上に対応するタンパク質発現パターンを判定するための手段を含むキットを提供する。本発明の好ましい一実施形態によれば、この手段は表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち複数に対応するタンパク質発現パターンを判定することができる。好ましくは、１３のプレディクター遺伝子のうち７または８、より好ましくは９または１０、最も好ましくは１１または１２のタンパク質発現が判定される。別の最も好ましい実施形態では、その手段が表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の全てのタンパク質発現を判定することができるキットが提供される。
【００３７】
本発明の別の態様は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、ＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルを判定するための手段を含むキットを提供する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、このタンパク質発現パターンを判定するための手段は抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントを含む。タンパク質発現を判定するための好適な手段としては、標識抗体を用いたウエスタンブロッティングが挙げられる。
【００３９】
本発明の最も好ましい実施形態は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、（ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上に対応するタンパク質発現パターンを判定するための手段；（ｂ）前記手段、および前記タンパク質を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記手段が前記タンパク質と複合体を形成することができる容器；（ｃ）（ｂ）の複合体を検出するための手段；および所望により、（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書を含むキットを提供する。
【００４０】
他の実施形態では、本発明は、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子に関するタンパク質発現パターンを判定するためのキットであって、ａ）タンパク質発現パターンの判定に必要な全ての試薬を含む、または収容する容器；およびｂ）どのようにしてこの分析を実施および解釈するかを記載した表示を含むキットを提供する。
【００４１】
本発明のもう１つの態様は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、（ａ）ＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルを判定するための手段；（ｂ）前記手段、およびタンパク質を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記手段が前記タンパク質と複合体を形成することができる容器；（ｃ）（ｂ）の複合体を検出するための手段；および所望により、（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書を含むキットを提供する。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、このＩＬ−１β遺伝子により発現されるタンパク質のレベルは血液中または血清中で判定される。
【００４３】
本発明のもう１つの態様は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上の転写レベルを判定するための手段を含むキットを提供する。本発明の好ましい一実施形態によれば、この手段は１３のプレディクター遺伝子のうち複数の転写レベルを判定することができる。好ましくは１３のプレディクター遺伝子のうち７または８、より好ましくは９または１０、最も好ましくは１１または１２の転写レベルが判定される。もう１つの最も好ましい実施形態では、その手段が表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の全てのレベルを判定することができるキットが提供される。
【００４４】
本発明のもう１つの態様は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、ＩＬ−１β遺伝子の転写レベルを判定する手段を含むキットを提供する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、転写レベルを判定するための前記手段は、上記のように前記遺伝子の転写産物と結合することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、最も好ましくは、プレディクター遺伝子またはＩＬ−１β遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと結合することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。転写レベルを判定するための好適な手段としては、ノーザンブロット分析、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、およびマイクロアレイが挙げられる。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記のキットは患者の生体サンプルを得るための手段をさらに含む。好ましくは、患者から採取される生体サンプルは血液または組織サンプルを含む。好適な血液または組織サンプルとしては、全血、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検が挙げられる。好ましい一実施形態では、キットは、タンパク質を検出するための手段または転写レベルを測定するための手段および患者の生体サンプルを収容するのに好適な容器をさらに含み、さらに所望によりキット結果の使用および解釈に関する説明書を含む。
【００４７】
本発明のもう１つの最も好ましい実施形態は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、（ａ）表２に示されている１３のプレディクター遺伝子のうち２以上の転写産物と結合することができるいくつかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび転写産物を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが前記転写産物と結合することができる容器；（ｃ）（ｂ）の結合を検出するための手段；および所望により、（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書を含むキットを提供する。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の発現パターンを判定するためのキットであって、ａ）必要な遺伝子チップを、その展開に必要な試薬とともに含む容器；およびｂ）得られる遺伝子発現パターンの作成、読み取りおよび解釈に関する説明書を含むキットを提供する。
【００４９】
本発明のもう１つの実施形態は、薬物で処置された際にどの患者が浮腫を発症する見込みが高いかを予測するためのキットであって、（ａ）ＩＬ−１β遺伝子の転写産物と結合することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および転写産物を含む患者の生体サンプルを収容するのに好適であり、その中で前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが前記転写産物と結合することができる容器；（ｃ）（ｂ）の結合を検出するための手段；および所望により、（ｄ）キット結果の使用および解釈に関する説明書を含むキットを提供する。
【００５０】
好ましくは、本発明の上記の態様実施形態に従う薬物は、限定されるものではないが、イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）をはじめとするいずれのＴＫＩであってもよい。
【００５１】
さらに、本発明は、患者のＩＬ−１β遺伝子における多型パターンを同定するためのキットを提供し、該キットは配列Ｘ０４５００の１４２３番および／または配列Ｘ０４５００の１９０３番のＩＬ−１β遺伝子における遺伝的多型パターンを判定するための手段を含む。このキットはさらに全血、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検などの血液または組織サンプルを得るための手段を含んでもよい。好ましくはこのような手段はＤＮＡサンプル回収手段を含む。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、特定の多型部位における遺伝的多型パターンを判定するための手段は、少なくとも１種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む。最も好ましくは、このキットは２種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む。あるいは、このキットは４種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む。いっそうより好ましい実施形態では、このキットは、少なくとも１種の遺伝子特異的ジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１種の遺伝子特異的ジェノタイピングプライマー組成物を含む。好ましくは、このような遺伝子特異的ジェノタイピングプライマー組成物は少なくとも２セットの対立遺伝子特異的プライマー対を含み、これらは所望により個別の容器にパッケージングされていてもよい。
【００５３】
さらに、本発明は、患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、ＩＬ−１β遺伝子の、転写開始部位から−５１１の位置（配列Ｘ０４５００の１４２３番）にあるクレオチド対の同一性を判定するためのキットであって、ａ）患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、ＩＬ−１β遺伝子の、転写開始部位から−５１１の位置（配列Ｘ０４５００の１４２３番）にあるヌクレオチド対の性質を検出するのに特異的な少なくとも１種の試薬を含む、または収容する容器；およびｂ）前記ヌクレオチド対の性質に基づきこれらの結果を解釈するための説明書を含むキットを提供する。
【００５４】
さらに、本発明は、転写開始部位から−３１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるクレオチド対の同一性を判定するためのキットであって、ａ）転写開始部位から−３１塩基対上流の位置（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるクレオチド対の性質を検出するのに特異的な少なくとも１種の試薬を含む、または収容する容器；およびｂ）前記ヌクレオチド対の性質に基づきこれらの結果を解釈するための説明書
を含むキットを提供する。
【００５５】
さらに、本発明の他の実施形態は、上記のキットのいずれか１つが、限定されるものではないが、イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）をはじめとするＴＫＩなどの薬物で処置された際にどの患者が（どの女性患者が、を含む）浮腫を発症する見込みが高いかを予測する方法をはじめとして本明細書により提供される方法の判定ステップ（ａ）で用いられることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】８８サンプルの「プレディクター」セットについて、浮腫を予測するために使用される１３の遺伝子のクラスター分析。影付けの程度は発現の相対レベルを表し、最も濃い影は低い発現を示し、中間的な影は高い発現を示す。サンプルは遺伝子発現の、平均非浮腫発現プロフィールとの相関に従って並べてあり、遺伝子のクラスタリングはＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）のピアソン類似法を用いて行った。各サンプルのＰＣＣを中央のパネルに、最も高い相関を一番上にしてプロットした。右のパネルは実際の浮腫の状態を表し、塗りつぶし（ダーク）は浮腫を示し、白は浮腫を持たない患者を示す。ラインは最適精度の閾値（０．３７；実線）および最適感度（０．７８；破線）を示す。
【図２】浮腫プレディクター遺伝子をバリデートするために使用される１７サンプルの「テスト」セットのクラスター分析。影付けの程度は発現の相対レベルを表し、最も濃い影は低い発現を示し、中間的な影は高い発現を示す。サンプルは遺伝子発現の、平均非浮腫発現プロフィールとの相関（８８サンプルの「プレディクター」セットに関して計算）に従って並べてあり、遺伝子のクラスタリングはＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録総評）のピアソン類似法を用いて行った。各サンプルのＰＣＣを中央のパネルに、最も高い相関を一番上にしてプロットした。右のパネルは実際の浮腫の状態を表し、塗りつぶし（ダーク）は浮腫を示し、白は浮腫を持たない患者を示す。波線は、８８サンプルの「プレディクター」セットを用いて判定した際の最適感度の閾値（０．７８）を示す。
【図３】ＩＬ−１β遺伝子型と浮腫および血管浮腫との関連。ＣＣ遺伝子型は、多型部位−５１１（配列Ｘ０４５００遺伝子の１４２３番）におけるＩＬ−１β遺伝子の両コピー上にＧＣ塩基対が存在することを示す。非ＣＣ遺伝子型は、ＩＬ−１β遺伝子の多型部位−５１１（配列Ｘ０４５００遺伝子の１４２３番）におけるコピーの一方または双方にＡＴ塩基対が存在することを示し、すなわち、これは転写開始部位から−５１１塩基対上流にあるＣ→Ｔ塩基転移を示す。
【図４】−５１１  ＩＬ−１β多型と性別により階層化される浮腫との関連。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の開示
本発明は、限定されるものではないが、数種のタンパク質のチロシンキナーゼ活性の阻害剤、すなわち、チロシンキナーゼ阻害（ＴＫＩ）薬である薬物をはじめとする薬物で処置された患者における浮腫の副作用の発生の見込みを予測するいくつかの異なる方法を提供し、この薬物としては限定されるものではないが、イマチニブ、メシル酸イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）（ＳＴＩ５７１， Novartis Pharmaceuticals， East Hanover， NJ， USAとしても知られる）が挙げられる。
【００５８】
一実施形態では、ＴＫＩなどの薬物で処置する必要のある患者は、表２に示されている１３の遺伝子のうち複数を含むＲＮＡ発現プロフィールの判定のために採血されている。あるいは、このＲＮＡ発現レベルは、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検をはじめとする他の組織サンプルで判定してもよい。一実施形態では、この遺伝子群に関して測定されたＲＮＡ発現レベルを、表３に示されているような同じ１３のプレディクター遺伝子に関する平均浮腫発現レベルまたは平均非浮腫発現レベルと比較し、その類似性の程度を判定する。
【００５９】
好ましい一実施形態では、１３のプレディクター遺伝子のこの群に関して測定された患者のＲＮＡ発現レベルを、表３に示されているような同じ遺伝子に関する平均非浮腫発現レベルと比較し、その類似性の程度を判定する。
【００６０】
この類似性の程度は、その値が２つの数値群、すなわち、１３のプレディクター遺伝子のうち複数に関して患者の血液から測定されたｍＲＮＡ発現値と、表３に示されている平均非浮腫発現値または平均浮腫発現値の間の類似性の既知の関数となるようなある結果をもたらす任意の数学的手法により判定することができる。
【００６１】
好ましい一実施形態では、限定されるものではないが、この類似性の程度は患者で測定されたＲＮＡ発現レベルと、表３に示されている、１３の遺伝子のうち複数の平均非浮腫ＲＮＡ発現レベルとの間のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）をはじめとする数学的相関係数を求めることにより判定される。
【００６２】
最も好ましい一実施形態では、この相関係数はピアソンの相関係数（ＰＣＣ）であり、１３のプレディクター遺伝子の全てを用いて最も精度の高い比較が行われる。次に、このようにして求められたＰＣＣの値、または他のいずれかの相関係数もしくは類似性指数を用い、限定されるものではないが、イマチニブまたはメシル酸イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）をはじめとするＴＫＩ薬をはじめとする浮腫を作る薬物で患者を処置した場合に浮腫の発生する見込みを予測することができる。
【００６３】
好ましい一実施形態では、次に、患者で測定されたＲＮＡ発現プロフィールと平均浮腫または平均非浮腫発現プロフィール（表３から）との間の類似性の程度を用いて、ＴＫＩ薬で処置した場合にその患者は浮腫を発症する見込みがあるかないかを予測することができる。例えば、これを簡単に説明するため、表２に示されている１３の遺伝子の全てまたは大部分に関して、患者で測定されたＲＮＡ発現プロフィールが、浮腫を発症しなかった被験者の平均発現プロフィール（平均非浮腫発現プロフィール）と類似性が高ければ、ＴＫＩ薬で処置された際にこの患者が浮腫を発症する見込みは小さい。表３に示されている１３の遺伝子の全てまたは大部分に関して患者で測定されたＲＮＡ発現プロフィールがＴＫＩ薬で処置された際にいずれかの種類の浮腫を発症した被験者の平均発現プロフィール（平均浮腫発現プロフィール）と類似性が高ければ、ＴＫＩなどの薬物で処置された際にその患者が浮腫を発症する見込みが高い。
【００６４】
好ましい一実施形態では、類似性の程度は、表２の１３の遺伝子に関して測定された患者の遺伝子発現プロフィールと非浮腫患者からの平均発現プロフィール（表３）との間のＰＣＣの算出により求められる。
【００６５】
ＰＣＣの値は、その患者が、比較対象となる表３の発現プロフィールと同じ浮腫の副作用を患うか、または非浮腫かの確率に直接関連する。つまり、患者のＰＣＣが平均非浮腫発現プロフィールに比べて高いほど患者がＴＫＩ薬に応答して浮腫を発症しない見込みが高くなる。他方、患者のＰＣＣが平均浮腫発現プロフィールに比べて高いほど、ＴＫＩなどの薬物で処置された際に患者誘導体が浮腫を発症する見込みが高くなる。
【００６６】
このように、ある場合に、ＰＣＣの値を用いれば、その結果の、つまり患者が、限定されるものではないが、イマチニブまたはＧＬＥＥＶＥＣ（商標）／ＧＬＩＶＥＣ（登録商標）をはじめとするＴＫＩなどの薬物で処置された場合に浮腫を発症するか否かの確率を求めることができる。当業者ならば、各患者の臨床状態がカットオフとして用いる、または特定の患者に関して臨床的判断を下す助けとするＰＣＣを指し示すことが分かるであろう。例えば、一実施形態では、浮腫を発症する、または発症しない患者群の数を最適精度で判定することが望まれる。これは偽陽性（浮腫として誤分類される非浮腫）を最少にすることと同時に偽陰性（非浮腫として誤分類される浮腫）を最少にするという双方を意味する。
【００６７】
この精度はＰＣＣを０．３７に設定することによって得られる。この閾値を用いるには、平均非浮腫発現プロフィールと比べた場合の遺伝子発現プロフィールが０．３７以上のＰＣＣとなる患者を非浮腫群として分類し、一方、発現プロフィールが０．３７未満となった患者を浮腫群として分類する。
【００６８】
さらに好ましい一実施形態では、このＰＣＣは任意の感度をもたらすように、すなわち、偽陰性（非浮腫として誤分類される浮腫）の数をできる限り最少とするように設定することができる。このような最適感度設定は、浮腫の発生が患者にとって重篤または生命を脅かすような事象となる状態において指示されよう。この実施形態では、ＰＣＣを０．７８に設定することにより閾値が決定される。この場合、患者は、発現プロフィールが０．７８未満のＰＣＣで、平均非浮腫プロフィールと負の相関がある場合、浮腫を発症する見込みが７．２０倍（９５％信頼区間（ＣＩ）：２．４２−２１．４４）である。この例に示されるように、当業者ならば、感度を最大にするか、または特異性を最大にするか、またはいずれかの所望の比率の偽陽性または偽陰性をもたらす、類似性の程度または限定されるものではないがＰＣＣをはじめとする相関係数を選択することができる。当業者ならば、患者に対して最大の利益と安全性を与えるため、その臨床状態に対するＰＣＣの選択を容易に調節することができる。
【００６９】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＴＫＩなどの薬物で処置された際にどの患者が浮腫を被る見込みがあるかを予測する他の方法を提供する。これらの方法は患者の血液を採取し、ＩＬ−１β遺伝子におけるある特定の多型の有無を判定することを伴う。あるいは、患者から他の組織サンプルを得、それを用いてＩＬ−１β遺伝子多型の有無を判定してもよい。このような組織サンプルとしては、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検が挙げられる。
【００７０】
具体的には、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１多型に関してＣＣ遺伝子型を有する女性患者は、非ＣＣ遺伝子型を有する女性よりも、ＴＫＩ薬で処置された際に浮腫を被る見込みが１３．０倍高い（９５％ＣＩ：２．０７−８１．４８）。この多型は男性患者では予測値とはならない。
【００７１】
従って、ＴＫＩなどの薬物を受容しようとしている女性患者から採血し、患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、ＩＬ−１β遺伝子の多型部位−５１１Ｃ→Ｔ（配列Ｘ０４５００の１４２３番）におけるヌクレオチド対の同一性を判定する。両ヌクレオチドともＧＣであることが分かれば、その女性はＴＫＩ薬で処置された際に浮腫を発症すると予測される。両対がＡＴであるか、または一方がＡＴであってもう一方がＧＣであれば、ＴＫＩ処置は浮腫の副作用を生じない。
【００７２】
本発明のもう１つの実施形態では、ＴＫＩなどの薬物を受容しようとしている女性患者から採血し、患者に存在する２コピーのＩＬ−１β遺伝子に関して、転写開始部位から−３１塩基対上流（配列Ｘ０４５００の１９０３番）にある多型部位におけるヌクレオチド対の同一性を判定し、この部位の両ヌクレオチド対がＡＴであれば、その患者は薬物処置で浮腫を発症する見込みがあると判定し、また、この部位の少なくとも一方のヌクレオチド対がＧＣであれば、その患者は薬物処置で浮腫を発症する見込みがないと判定する。
【００７３】
なおさらなる一実施形態では、本発明は、患者のＩＬ−１β遺伝子において着目する多型部位（−５１１部位および−３１部位の双方）におけるヌクレオチド対を判定するためのキットであって、ａ）ＩＬ−１β遺伝子の多型部位におけるクレオチド対の性質を検出するのに特異的な少なくとも１種の試薬を含む、または収容する容器；およびｂ）前記ヌクレオチド対の性質に基づきこれらの結果を解釈するための説明書を含むキットを提供する。
【００７４】
さらなる一実施形態では、本発明は、表２に示されている１３のプレディクター遺伝子の発現パターンを判定するためのキットであって、ａ）必要な遺伝子チップを、その展開に必要な試薬とともに含む容器；およびｂ）得られる遺伝子発現パターンの作成、読み取りおよび解釈に関する説明書を含むキットを提供する。
【実施例】
【００７５】
実施例１
方法
ＲＮＡ発現プロフィール相関法
臨床サンプルは、多国籍第３相臨床試験（インターフェロン−αとイマチニブに関するIRIS: International Randomized Study）に登録し、新たに慢性期Ｐｈ＋  ＣＭＬ（ＣＭＬ−ＣＰ）と診断された患者から得た。ＲＮＡ抽出用の血液を米国の複数のセンターから２００名を超える患者から採取した。これらの患者は各々、地域倫理委員会が承認した薬理遺伝学インフォームド・コンセントフォームの書面にサインをしている。イマチニブ処置アームに対して無作為化した患者から、薬物処置前のベースラインとして全部で１１５サンプルを採取した。これらのうち１０サンプルは、患者が初期に試験から離脱したため、または処理されたＲＮＡの量が非常に少なかったために分析から除外した。残りの１０５サンプルのうち８８サンプルを、患者がイマチニブ処置後に浮腫を発症するかどうかを予測できる遺伝子を同定するための「プレディクター」セットとして用い、１７サンプルを、プレディクター遺伝子をバリデートするための「テスト」セットとして用いた。
【００７６】
有害事象に関する臨床データ最低６ヶ月イマチニブ処置後に評価した。国際医学用語集（the Medical Dictionary for Regulatory Activities Terminology， MedDRA）の高位語（High Level Term， HLT）を用いて分類した場合に少なくとも１種の浮腫の発生（グレードを問わない）があった場合に浮腫を有するものと識別した。この薬理ゲノミクス研究で評価した患者のうち、４３％（１０５名のうち、４５名）が、イマチニブで処置した後に少なくとも１種の浮腫症例があったと分類され（浮腫群）、これらの場合の大部分は眼窩周囲浮腫（３１％）と末梢浮腫（１９％）であった。グレード３の眼窩周囲浮腫が１件あったことを除き（これは試験投薬によるものではなかった）、この研究で評価された患者の浮腫症例は全て軽度から中度であった。浮腫症例の分類は次の通りであった：８８サンプルの「プレディクター」セットは３７が浮腫、５１が非浮腫であり；１７サンプルの「テスト」セットは８が浮腫、９が非浮腫であった。
【００７７】
ＲＮＡ発現プロファイリング
ＲＮＡ発現データは、１２，０００を超える既知のヒト遺伝子と発現配列タグ（ＥＳＴ）を表す高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（HG U95Av2， Affymetrix， Santa Clara， CA， USA）を用いて各血液サンプルから作成した。サンプル調製およびマイクロアレイのプロセシングはAffymetrix（Santa Clara， CA， USA）のプロトコールを用いて行った。要するに、ＴＲＩ試薬（商標）ＢＤ（Sigma， St．Louis， MO， USA）を用いて冷凍全血から全ＲＮＡを抽出した後、RNeasy Mini Spin Columns（Qiagen， Valencia， CA， USA）で精製した。５〜８μｇの精製全ＲＮＡから出発し、Superscript Choice System（Invitrogen Life Technologies， Carlsbad， CA， USA）を用い、全長ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡを、ＢＩＯＡＲＲＡＹ（登録商標）High Yield RNA Transcript Labeling Kit（ENZO Diagnostics， Farmingdale， NY， USA）を用いてin vivoで転写し、ビオチン標識ｃＲＮＡを生成した。このｃＲＮＡを断片化し、４５℃で１６時間マイクロアレイとハイブリダイズさせた。
【００７８】
アレイを洗浄し、標準Affymetrixプロトコールに従い、Affymetrix流体ステーションを用いて染色した。Affymetrix GENEARRAY（登録商標）スキャナーを用いてアレイをスキャンし、Affymetrix GENECHIP（登録商標）Laboratory Information Management System （LIMS）によりデータ（．DATファイル）をキャプチャーした。このＬＩＭＳデータベースを、全てのプローブセル（．CELファイル）平均強度がインターナル側オラクルデータベースにダウンロードできるネットワークファイリングシステムを介してインターナル側ユニックスSun Solarisサーバーに接続した。各マイクロアレイの蛍光強度を、１５０の値に対してグローバルスケーリングによりノーマライズし、複数のアレイ間での直接比較を可能にした。
【００７９】
各アレイの品質は、バックグラウンド、遺伝子存在のパーセンテージ、スケーリング倍率、「ハウスキーピング」遺伝子β−アクチンとＧＡＰＤＨの３’／５’比などの因子を数値化することにより評価した。この研究で分析したサンプルに関するこれら品質管理パラメーターは広範囲であり、多くのサンプルが最適品質には満たないものと考えられた。例えば、１０５サンプルの遺伝子存在の平均パーセンテージは５〜３８％の範囲にわたり、平均値はわずか１４％であった。これは他の臨床試験に登録された非ＣＭＬ患者から得られた全血から得られたものの約半分である。この矛盾はおそらくサンプルの採取と取り扱いに伴う問題、特に本研究の血液サンプルはＲＮＡ安定化因子を含まないＥＤＴＡ管に採取されたことによるものであると思われるが、白血病患者からの血液における、全体としての遺伝子発現の基本的な違いを反映しているのかもしれない。本実施例の目的では、浮腫と非浮腫群の間、または「プレディクター」と「テスト」セットの間のサンプル品質に統計学的に有意な違いはなかったことに着目することが重要である（データは示されていない）。
【００８０】
データ分析
８８サンプルの「プレディクター」セットで出発し、マイクロアレイデータをGENESPRING（登録商標）バージョン４．１．５ソフトウエア（Silicon Genetics， San Carlos， CA， USA）に送り込んだ。生の発現値を、少なくとも１０％のサンプル（８８のうち９）がバックグラウンドよりも１００以上高い平均強度値を持つようにフィルタリングした。浮腫群と非浮腫群とを最もよく識別した遺伝子のリストを特定するため、GENESPRING（登録商標）エクセルおよびＳＡＳバージョン８．２（The SAS Institute， Cary， NC， USA）を用いてさらなるフィルタリングステップを行った。８８全ての遺伝子がノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡにより、ｐ＜０．０５で２群間の差が少なくとも１．７倍という基準を満たした。最後に、これらの遺伝子のうち４つのものは発現レベルおよび性別の間の関連を見出した後に排除した（非浮腫群のみに対し、男性対女性のＡＮＯＶＡを用いた）。これは本研究の患者について浮腫の発症と性別との間に有意な関連があったという発明者らの知見に対応して行ったものであり、イマチニブ処置後、女性は男性に比べ約３倍浮腫を発症する見込みが高かった（ｐ＝０．０２２、フィッシャーの正確確率検定）。
【００８１】
この８４の可能性のあるプレディクター遺伝子のリストから、「リーブワンアウト(（leave-one-out)）」法を用いて、最終予後セットとして用いるための最適遺伝子数を求めた。van’t Veer，et al．， Nature， Vol．415， pp．530-536 （2002）参照。遺伝子は発現値と予後カテゴリー（０＝非浮腫；1＝浮腫）との相関（ＰＣＣの絶対値）により順に並べた。５つの最も相関の高い遺伝子で出発し、１サンプルを分析から除外し、残り８７のサンプルから各群（浮腫および非浮腫）の平均遺伝子発現プロフィールを算出した。除外したサンプルの予測結果は、除外したサンプルの発現プロフィールのＰＣＣと、８７のサンプルを用いて算出した平均浮腫および非浮腫プロフィールとを比較することにより判定した。この分析を残りのサンプルを用い、８８全てのサンプルが除外されるまで繰り返した。正確な予測と誤った予測の例の数を、偽陰性（非浮腫として誤分類される浮腫）と偽陽性（浮腫として誤分類される非浮腫）の数を算出することにより求めた。リストの上のものからさらなるプレディクター遺伝子を加えた後、８４全ての遺伝子が用いられるまで、この「リーブワンアウト」法全体を繰り返した。最少の偽陰性および偽陽性をもたらす遺伝子数を最適なプレディクター遺伝子セットとして選択した（ｎ＝１３）。
【００８２】
次のステップは、この最適化された遺伝子セットを用い、浮腫または非浮腫の正確な予測に用いるための適当な閾値を算出することであった。経験的に、双方からの結果を比較した後に、個々のサンプルを浮腫プロフィールに対立するものとしての非浮腫プロフィールと比較することにした。ＰＣＣを用い、８８サンプルの各々に関してプレディクター遺伝子の発現パターンを平均非浮腫プロフィール（８８名の患者のうち非浮腫患者５１名全てを用いて算出した）と相関させた。患者サンプルを最高から最低まで相関によりランク付けし、その閾値相関が引き出された関数として誤り率を求めた。「最適精度」の閾値は偽陽性と偽陰性双方が最少となった点において求めた。しかし、偽陰性（非浮腫として誤分類される浮腫患者）の数を最少とするために、１５％（３７のうち５）の浮腫症例だけしか誤分類されないような「最適感度」において第２の閾値を求めた。これらの閾値を利用し、ｐ値カットオフを０．０５としたフィッシャーの正確確率検定によって求めた統計学的有意性でＳＡＳを用いてオッズ比（ＯＲ）を算出した。
【００８３】
最終のステップは、１７の患者サンプルの「テスト」セットを用いて浮腫状態を予測するために選択されたプレディクター遺伝子の有効性をバリデートすることであった。８８サンプルの「プレディクター」セットからの平均非浮腫発現プロフィールに対してこれら１７サンプルの各々についてプレディクター遺伝子のＰＣＣを算出し、「最適感度」における閾値を浮腫予測のカットオフとして選択した。よって、１７のテストサンプルの１つについて算出したものが閾値以上であった場合は、その患者は浮腫無しとして分類され、相関が閾値未満であった場合は、その患者は浮腫有りと予測された。ＳＡＳを用いて浮腫ありおよび浮腫無しと正しく予測された患者および誤って予測された患者の数に基づき、ＯＲおよびフィッシャーの正確確率検定を行った。
【００８４】
結果
浮腫状態を予測するのに用いる１３の遺伝子の選択は方法の節に記載されているように８８サンプル（浮腫３７、非浮腫５１）の「プレディクター」セットを用いて行った。表２はこれらの遺伝子のリストを、それらのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセット名称、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号、染色体上の位置、機能に関する簡単な説明、ならびに浮腫および非浮腫サンプル間で何倍の差があるかを添えて示している。これら１３の遺伝子のうち、３つはシグナル伝達に関するものであり（ＰＴＰＮ１２、Ｐ２Ｙ１０およびＡＲＨＧＤＩＢ）、２つは細胞周期レギュレーターであり（ＣＤＫＮ１ＢおよびＣＵＬ１）、２つは免疫応答に関するものであり（ＦＣＥＲ１ＧおよびＭＣＰ）、２つはＲＮＡプロセシングに関するものであり（ＳＦＲＳ２ＩＰおよびＳＴＡＵ）、１つは転写因子であり（ＨＩＶＥＰ２）、１つは代謝に関するものであり（ＰＧＣ）、２つは現在のところ機能が未知のものである（ＣＬ２４７１１およびＦＬＪ０００３６）。これら遺伝子のほとんどのものの発現は浮腫群では非浮腫に比べて有意に高いが、２つの遺伝子（ＰＧＣ、Ｐ２Ｙ１０）は浮腫集団で発現が低い。
【００８５】
方法の節で述べられているように、閾値の値は、まず、平均非浮腫発現プロフィールとの相関に従ってプレディクターセット内でサンプルを順に並べることにより求めた。図１はこれら１３の遺伝子のクラスター分析の結果を、ＰＣＣにより、非浮腫プロフィールと最高の相関を有するサンプルが一番上に来、非浮腫状態との相関が最少のものが一番下に来るようにサンプルを並べて示している。最初の出発点として、偽陽性（浮腫として誤分類される非浮腫）および偽陰性（非浮腫として誤分類される浮腫）の双方の数が最少となる最適精度点で閾値を求めた。これはＰＣＣ値０．３７で見られた（図１、実線）。この閾値を用いると、ＰＣＣが０．３７以上（平均非浮腫発現プロフィールを用いたＰＣＣに基づく）の個体は非浮腫群に分類され、一方、ＰＣＣが０．３７未満の個体は浮腫群に分類される。表４に示されているように観測頻度を決定し、ＯＲを算出した。この場合のＯＲは、発現プロフィールが平均非浮腫プロフィールと負の相関があれば（ＰＣＣ＜０．３７）、患者の浮腫を発症する見込みは６．８倍（９５％ＣＩ：２．６−１７．４）高かったことを示している。観測値と期待値の間の差は、ｐ値６．２５×１０−５としたフィッシャーの正確確率検定によれば有意性が高かった（表４）。
【００８６】
これらの所見が統計学的に有意であれば、浮腫患者の３２％（３７名のうち１２名）が実際には非浮腫（偽陰性）として分類されたことに着目することが重要である。まれにではあるが、浮腫は生命を脅かす有害事象である可能性もあることから、この場合、それらの患者が浮腫の発症の適切な監視や浮腫の発症を防ぐ助けとなる処置を受けられるように、偽陰性の数を最少にすることが臨床上最も適切であろう。これがＰＣＣ０．７８で第２の閾値を選択することの根拠であった。この値を、浮腫症例の１５％（３７名のうち５名）だけしか誤分類されないような感度になるよう最適化した。この基準を用いた度数分析の結果は表４に示されている。ここでも、観測値と期待値の間の差は、ｐ値１．３７×１０−４で、統計学的に有意性が高かった。この場合のＯＲは、発現プロフィールが平均非浮腫プロフィールと負の相関があれば（ＰＣＣ＜０．７８）、患者の浮腫を発症する見込みは７．２倍（９５％ＣＩ：２．４−２１．４）高かったことを示している。
【００８７】
浮腫状態を予測するための１３のプレディクター遺伝子の有効性のバリデーションを、プレディクター遺伝子を決定するための分析に含めなかった患者の１７サンプルの「テスト」セットを用いて行った。これらの患者（８名が浮腫、９名が非浮腫）は患者の「プレディクター」セットと同じ臨床試験からのものであった。プレディクターセットとテストセットの間で、実験パラメーターには有意な差はなかった（データは示されていない）。１３のプレディクター遺伝子を用いたテストセットのクラスター分析の結果は図２に示されている。最適感度閾値として０．７８を用いると、８名の浮腫患者全員、ならびに９名の非浮腫患者のうち７名が正確に分類でき、全体の精度が８８％となった。表４において度数分析で示されているように、これらの結果はｐ値０．００２３で統計学的に有意である（フィッシャーの正確確率検定）。しかし、ＯＲ５１．０というのはおそらくサンプルサイズが小さかったことにより膨らんだものである。
【００８８】
この薬理ゲノム分析の目的は、イマチニブ誘発性浮腫に対する感受性を予測するために使用でき、また、おそらくは浮腫の病態生理学に何らかの知見を与え得るゲノムマーカーを同定することであった。イマニチブ処置アームに関して無作為化した患者からの全部で１０５のベースライン血液サンプルをこれらの分析に用いた。これらのサンプルのうち、８８名の患者のサブセット（３７名が浮腫、５１名が非浮腫）をプレディクター遺伝子のリストを決定するため「プレディクター」セットとして用い、残りの１７名の患者（８名が浮腫、９名が非浮腫）をこれらのプレディクター遺伝子をバリデートするため「テスト」セットとして用いた。
【００８９】
van’t Veer et al．（2002）前掲によって記載されている分析戦略を用いると、浮腫を予測するために最適な１３の遺伝子からなるセットが定義でき、偽陰性の数を最少とするための閾値ＰＣＣの値０．７８が選択された。サンプルのプレディクターセットに関しては、これにより浮腫患者の同定について８６％の成功率（３７のうち３２）が得られ、ＯＲ７．２、ｐ＝１．３７×１０−４であった（表４）。この結果を１７名の患者からなるテストセットでバリデートしたところ、８名の浮腫患者全員が正しく同定され、全体の予測精度は８８％となった。また、これらの結果は、ｐ値０．００２３で統計学的に有意であったが、有意にもかかわらずにＯＲが５１．０というのは、サンプルサイズが小さかったことにより膨らんだものと思われる。これらの予備的な所見をさらに実質的にバリデートするためには、十分な統計力を与えるのに十分な患者サンプルを用いて、少なくとも１回の独立した臨床試験でこれらの結果の適用を行わなければならない。
【００９０】
表２に示されているように、これら１３のプレディクター遺伝子には幅広い機能が存在する。これらの遺伝子のうち２つは現在のところ機能が未知のものであり（ＣＬ２４７１１およびＦＬＪ０００３６）、残りの１１の遺伝子は、細胞周期の調節（ＣＤＫＮ１ＢおよびＣＵＬ１）、シグナル伝達（ＰＴＰＮ１２、Ｐ２Ｙ１０およびＡＲＨＧＤＩＢ）、ＲＮＡプロセシング（ＳＦＲＳ２ＩＰおよびＳＴＡＵ）、免疫応答（ＭＣＰおよびＦＣＥＲ１Ｇ）、転写物因子（ＨＩＶＥＰ２）および代謝（ＰＧＣ）を含む機能を有する。これらの遺伝子の示差的発現はイマチニブ誘発性浮腫に関して予測性がある。
【表１】
2010166915.tif 000002
HLT = MedDRA高位語
PT = MedDRA基本語
NEC = 分類不能
NOS = 特定不能
【表２】
2010166915.tif 000003
注：遺伝子は８８の患者サンプル（３７が浮腫、５１が非浮腫）の「プレディクター」セットを用いた８４の可能性ある候補遺伝子の「リーブワンアウト」分析から判定した。遺伝子は浮腫の状態との絶対相関により最高から最低へ順に並べた。
倍率＝差の倍率（浮腫対非浮腫群）
【表３】
2010166915.tif 000004
【表４】
2010166915.tif 000005
*１３のプレディクター遺伝子に対する平均非浮腫発現プロフィールと比較した。
ｐ値はフィッシャーの正確確率検定を用いて算出した。
プレディクターセット＝プレディクター遺伝子リストの決定のために用いた８８の患者サンプル
テストセット＝プレディクター遺伝子をバリデートするために用いた１７の患者サンプル
【００９１】
実施例２
ＩＬ−１β遺伝子の多型
第３相臨床試験において浮腫の有害な症状と関連する遺伝因子を同定するため薬理遺伝学的分析を行った。６ヶ月の暫定的分析で、２６の遺伝子から７０のＳＮＰを検討し、イマチニブ処置個体における眼窩周囲浮腫および顔面浮腫と、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１  Ｔ→Ｃ多型との間の有意な関連を観測した（ｐ＝０．０１６、ＯＲ：３．０６、９５％ＣＩ：１．２９−７．２７）。同じ分析を性別により階層化して行った。女性における眼窩周囲浮腫および顔面浮腫とＩＬ−１β多型との間には有意な関連が見られた（ｐ＝０．０００５５７４）。−５１１多型に関してＣＣ遺伝子型を有する女性は、非ＣＣ遺伝子型を有し、イマニチブで処置された女性よりも浮腫を被る見込みが１３．０倍高い（９５％ＣＩ：２．０７−８１．４８）（１２ヶ月で固定したデータ）。男性では関連は見られなかった。従って、−５１１  ＩＬ−１β多型と浮腫との関連は女性に特異的なものであると思われ、イマチニブで処置された場合になぜ女性が男性の３倍浮腫を被る見込みが高いかを説明できる。この研究の結果は、ＩＬ−１βプロモーターにおける−５１１多型がイマチニブで処置された女性における眼窩周囲浮腫および顔面浮腫の予測マーカーとして使用できることを示唆する。
【００９２】
臨床試験において有害事象としての浮腫の予測マーカーを同定するための薬理遺伝学的分析を行った。これは、新たに診断され、これまでにＰｈ＋  ＣＭＬ−ＣＰ処置を受けていない患者におけるイマチニブ対、Ａｒａ−Ｃｎと組み合わせたＩＦＮ−αの第３相試験であった。イマチニブまたはＩＦＮ−αで処置された１５１名の患者の遺伝子型を分析した。全部で米国患者の５７．７２％がこの薬理遺伝学的分析への参加に同意した。
【００９３】
「Ｇｌｅｅｖｅｃで処置した患者における浮腫および体液貯留に関する病因論および提案される研究戦略に関する要旨集」は、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）イマチニブ臨床試験で特定の患者群における高頻度の浮腫の傾向を要約したものである。これらの群には高齢患者（６５歳以上）、曲線下面積（ＡＵＣ）値の高い患者、および進行した段階のＣＭＬを有する患者が含まれる。この同じレポートで、年齢（６５歳を超える）、心血管疾患の病歴、女性、進行段階のＣＭＬおよび安定状態においてイマチニブの平均濃度の値が２倍である患者という５つのカテゴリーがグレード３〜４の浮腫と有意に関連することが報告されている。
【００９４】
このように、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーターにおける−５１１多型と眼窩周囲浮腫および顔面浮腫の間の有意な関連が特定された。浮腫に関する要旨集で概略が示された浮腫と人口統計学的因子との関連により、この関連に関するイマニチブ試験集団内の人口統計学的因子を検討した。これらの分析は性別により階層化され、イマチニブで処置された女性における−５１１  ＩＬ−１β遺伝子型と眼窩周囲浮腫および顔面浮腫との間の有意な関連を見出した（ｐ＝０．０００５５７４）。男性において関連はなかったことから、この関連は性別特異的なものであると思われる。予測マーカーとしてのＩＬ−１βの同定はＣＭＬによる女性患者の処置および重篤な浮腫の予防において医師の助けとなり得る。
【００９５】
候補遺伝子のアプローチを用い、浮腫の予測マーカーとして使用できる遺伝的多型が同定されたが、これは浮腫形成の作用機序を示唆するものであり得る。ＳＮＰは２つの異なる方法により開発された。Third Wave Technologies， Inc．はＳＮＰの１つのコレクションを開発したが、他のセットはデータベースマイニングアプローチを用いて自家開発されたものである。ＯＭＩＭ、ｔｈｅ  ＳＮＰ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｌｏｃｕｓ  ＬｉｎｋおよびｄｂＳＮＰなどの公的データベースが使用された。候補遺伝子は、浮腫、ＤＮＡ修復、疾病の病因または薬物の作用機序におけるそれらの関連を含んだ根拠に基づき選択された。Third Wave Technologies， Inc．はジェノタイピング用のＳＮＰアッセイを開発した。
【００９６】
ジェノタイピング
試験の１日目の処置投与の前に、米国のみに登録された患者から２０ｍＬの血液を得た。血液サンプルは地域倫理委員会によって承認されたプロトコールに従ってインフォームド・コンセントを得た後に採取した。ＤＮＡはＰＵＲＥＧＥＮＥ（商標）ＤＮＡ単離キット（Ｄ−５０Ｋ）（Gentra， Minneapolis， MN）を製造業者の奨励に従って用いて抽出した。遺伝子型データおよび表現型データを全部で１５１名の患者について評価した。ジェノタイピングは、６０ｎｇのゲノムＤＮＡについて、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Third Wave Technologies， Inc．）を製造業者の奨励に従って用いて行った。Lyamichev et al．， Nat Biotechnol．， Vol．17， pp．292-296 （1999）参照。
【００９７】
浮腫と有意に関連していたＳＮＰを本研究室でもう一度ジェノタイピングし、それらの遺伝子型を確認した。さらなる品質管理チェックを行い、遺伝子型をハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）に関して試験した。このＨＷＥ則は、無作為に交配する大きな集団において対立遺伝子頻度が世代間で変化しないことをさす。ＨＷＥの偏差は次の２つの可能性のうちの１つを示す：
１）ジェノタイピングエラー；または
２）この多型と検討する集団の間の関連。
【００９８】
２つめの場合、疾病の病因論に何らかの関わりを持つと期待される以上に特定の多型が優勢であることが分かるであろう。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の研究では、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）は、ＡＰＯＥε４が患者をＡＤの発症に傾かせることからＨＷＥにはないと考えられる。全ての統計は統計プログラムＳＡＳバージョン８．２で行った。
【００９９】
遺伝子発現プロファイリング
ＴＲＩ試薬（商標）ＢＤを用いる全血の遺伝子発現プロファイリングのために血液サンプルを処理した。４７０の血液サンプルからＲＮＡを抽出し、−８０℃で保存した。この研究では、遺伝子型情報もある患者から９６の発現プロフィールを調べた。
【０１００】
統計学的方法
ジェノタイピングされた集団の典型的な性質
全臨床試験集団のうちジェノタイピングされた集団がいかに典型的なものかを決定するため、この２つの集団間の人口統計学と浮腫の発症を比較した。なお、ジェノタイピングされた集団は米国患者のみからなっていたので、さらなる集団としてこの試験における全米国患者を調べた。年齢はノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて比較し、他は全て統計プログラムＳＡＳバージョン８．２にてフィッシャーの正確確率検定を用いて分析した。
【０１０１】
遺伝子型と浮腫状態との関連
フィッシャーの正確確率検定を用いて各患者の遺伝子型と浮腫状態の臨床表現型とを比較した。浮腫状態は最低１２ヶ月の処置後にデータをコンパイルした臨床データベースから判定した。イマチニブで処置された患者の浮腫のメカニズムは知られていない。また、より重篤な体液貯留事象がより一般的な眼窩周囲浮腫および末梢浮腫事象と同じ病態生理学を有するのかどうかは分かっていない。研究した患者では、１名の患者がグレード３の重篤な眼窩周囲浮腫事象を被った。大多数は軽度の事象を１つ被っただけか、または体液貯留を全く示さなかった。結局のところ、出された浮腫の病態生理学に関する仮説は本発明者らの統計学的関連分析で実行できた程度に少なかった。遺伝子型と浮腫の間の関連について３つの分析を行った。１つ目は、浮腫を持たない他の全ての被験者と比べていずれかの形態の浮腫を有する患者（分析した例の５５％）からなった。２つ目および３つ目の分析は浮腫の発症率が最も高いサブグループを用いて行った。例えば、第１群（眼窩周囲浮腫および顔面浮腫）は浮腫有りと分類され、他の全ての患者は浮腫無しと分類された。同様に、３つ目の分析では、第２群の個体（末梢浮腫、浮腫ＮＯＳおよび圧痕浮腫）を浮腫有りとして、他の全てを浮腫無しとしてコードした。
【０１０２】
イマチニブとＩＦＮ−αで同様の結果が見られるとは期待されなかったことから、各遺伝子型／表現型の相関を処置によって階層化し、主にイマチニブの結果に着目した。最終の分析に用いた患者の数は９１名のイマチニブ処置患者であった。全ての統計は統計プログラムＳＡＳバージョン８．２で行った。
【０１０３】
ロジスティック回帰
ロジスティック回帰を用いて、どの変数が眼窩周囲浮腫および顔面浮腫に関して予測性があるかを決定した。眼窩周囲／顔面浮腫は種々のモデルにおいて用いられる従属変数であった。遺伝子型と人口統計的因子のいずれの交絡作用も考慮できるようにこれらのモデルを用いた。ロジスティック回帰を構築し、−５１１  ＩＬ−１β遺伝子型と浮腫の間で見られた独自の関連をモデル化した。モデルは全て、イマチニブで処置した男性および女性の両者からなった（ｎ＝９１）。最初のロジスティック回帰分析では、年齢、性別、人種、および−５１１  ＩＬ−１β遺伝子型をクラスとしてフルモデルに加えた。これまでに見られた性別と遺伝子型の間の相互作用の可能性を調べるため、２元共変量相互作用を可能とするさらなる変数を作成した。さらなる分析は、最初のモデルで用いたクラスとともに、遺伝子型と性別と人種の間、および遺伝子型と性別と年齢の間の３元相互作用を可能とするさらなる２つの変数からなった。黒色人種、東洋人およびその他の個体の罹患率は低いことから、人種群は白色人種とその他という２つのカテゴリーに変換し、上記のように３回目のロジスティック回帰を完了させた。このロジスティック回帰は、遺伝子型／表現型の有意な相関をさらに特徴づけるための予備的分析として完了させた。
【０１０４】
多型は本明細書で報告した９１名のイマチニブ患者に、さらに１８名のＩＦＮ−α処置患者を加えて分析し、ＨＷＥであることが判明した。−５１１  ＩＬ−１β多型はこの遺伝子のプロモーター領域にあり、転写開始部位から−５１１塩基対上流においてＣ／Ｔ塩基転移を示す。El-Omar et al．， Nature， Vol．404， pp．389-402 （2000）参照。−５１１  ＩＬ−１β多型と、同じ遺伝子の−３１変異体とのほぼ完全な連鎖不平衡（ＬＤ）により、−３１  ＩＬ−１β多型をジェノタイピングしたところ、これと、イマチニブで処置された女性における浮腫との間の相関も見られた（ｐ＝０．００５４）。
【０１０５】
下記表５はＩＬ−１β遺伝子型の、イマチニブで処置された女性における浮腫と非浮腫を示している。この表はイマチニブで処置された女性における浮腫と関連している２つのＩＬ−１β多型に関する遺伝子型の分布を示している。女性は有害事象として浮腫を被っているかどうかによって特徴づけられている。浮腫を被った−５１１遺伝子座にＣＣ遺伝子型、かつ、−３１遺伝子座にＴＴを有する女性は、この遺伝子座に代わりの遺伝子型を有する女性よりも有意に多い（それぞれｐ＝０．００４１およびｐ＝０．００５４）。
【表５】
2010166915.tif 000006
【０１０６】
−５１１および−３１  ＩＬ−１βＳＮＰのＬＤ
ＬＤの程度を算出するために用いられる統計量Ｄ’をコンピューター計算し、−５１１と−３１  ＩＬ−１βプロモーター多型間のほぼ完全なＬＤのリポートを確認した。Ｄ’は比較される２つの多型の頻度にかかわらず、同じ範囲の値を有する。ＥＨ連鎖有用性プログラムを用いて、これら２つのマーカー間のＬＤを試験し、見積もった。無作為に集めた集団中の個体数に一致するようにとったサンプルデータに基づき、ＥＨプログラムは各マーカーに関する対立遺伝子頻度を見積もる。Xie et al．， Am．J．Hum．Genet．， Vol．53， p．1107 （abstract） （1993）; and Terwilliger et al．， John's Hopkins University Press， Baltimore （1994）参照。
【０１０７】
ＥＨプログラムによってコンピューター計算された０．９７８の｜Ｄ’｜を有するＣＭＬ患者のこの集団において、−５１１  ＩＬ−１β多型と−３１  ＩＬ−１β多型はほぼ完全なＬＤ状態にある。Xie et al．， 前掲参照。｜Ｄ’｜値が１というのは完全なＬＤを示し、｜Ｄ’｜値が０というのはＬＤ状態でないことを示す。Reich et al．， Nature， Vol．411， pp．199-204 （2001）参照。よって、あるＩＬ−１β多型で見られる統計学的に有意な関連は全て、別のＩＬ−１β多型でも統計学的に有意となる。ＩＬ−１β（−５１１）Ｃ→Ｔ多型はＴ→Ｃ塩基転移を生じる位置（−３１）に位置するＩＬ−１βプロモーター内の別の多型と強いＬＤ状態（９９．５％）にある。El-Omar et al．（2000）， 前掲参照。よって、ＩＬ−１βプロモーターの位置（−５１１）にＴを有する患者は位置（−３１）にＣを有すると予測される。これらの所見を、これら２つの臨床試験で試験した患者で確認した。野生型ＩＬ−１β遺伝子では、−３１の位置にはＴが見られる。このＴは、ＩＬ−１βの転写の開始に重要な役割を果たすＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡＡＡＡ）の一部であることから、ＩＬ−１βの発現に極めて重要である。一般に、ＴＡＴＡボックス配列は転写が正しい位置で始まることを保証するよう、転写装置を遺伝子内の正しい位置に補充および配置することに関与する。位置（−３１）におけるＴ→Ｃ多型はこの重要なＴＡＴＡボックス配列を妨げ（ＴＡＴＡＡＡＡ→ＣＡＴＡＡＡＡ）、従って、これは不活性となり、ＩＬ−１β遺伝子の転写の効率的な開始を妨げる。この変化したＩＬ−１βＴＡＴＡボックス配列には転写装置は結合しないことが示されている。El-Omar （2002）， 前掲参照。逆に、−５１１におけるＣ多型は−３１におけるＴと相関している。従って、このプロモーターに完全なＴＡＴＡボックスを有する女性は薬物誘発性浮腫の高いリスクがあり得る。よって、ＩＬ−１βプロモーター内の多型（Ｔ→Ｃ塩基転移を生じる位置（−３１）に存在）またはＩＬ−１βプロモーターの−５１１に存在する多型（Ｃ→Ｔ）のいずれかとＬＤ状態にある他のいずれの多型の存在も薬物処置による浮腫の発症の見込みに対して予測効果を有する。（−３１）多型とＬＤ状態にある他の多型の同定のための手段は当業者に周知である。現在知られているか、あるいは将来発見されるこのような多型はいずれも、薬物で処置された際の患者における浮腫形成の見込みを予測するため、またはこのような場合に処置の選択肢を決定する助けとするために、本発明の方法で使用することができる。
【０１０８】
人口統計学的変数、遺伝子型変数および表現型変数の間の相関分析
多様な人種群に由来する個体の遺伝子構成は幅広く異なる。この分散を評価するため、各多型を人種により分析した。また、人種間で浮腫の発生に違いがあるかどうかも調べた。試験データパネルでは、人種は白色人種、黒色人種、東洋人およびその他に分類した。非白色人種の数は少なかった。分析力を高めるため、白色人種および非白色人種として再コードした人種でも分析を行った。この分析部分集団におけるＰ値をフィッシャーの正確確率検定を用いて算出した。全ての統計は統計プログラムＳＡＳバージョン８．２にて行った。
【０１０９】
人種に加え、性別および／または年齢が浮腫に関連するかどうか、また、これらの変数が−５１１  ＩＬ−１βＳＮＰとの関連とは独立であるかどうかも検討した。性別および年齢は、発明者らの以前の試験でそれらが血管浮腫に関連していることが示唆されたので検討した。性別および年齢は研究データセットから特定した。浮腫表現型と関連のＳＮＰの間の関連研究は全て性別によって階層化した。年齢と全クラスの浮腫の間の１元配置ＡＮＯＶＡを行った。ロジスティック回帰を用いて、どの変数が眼窩周囲浮腫および顔面浮腫に関して予測性があるかを決定した。眼窩周囲／顔面浮腫は種々のモデルにおいて用いられる従属変数であった。遺伝子型と人口統計的因子のいずれの交絡作用も考慮できるようにこれらのモデルを用いた。ロジスティック回帰を構築し、−５１１  ＩＬ−１β遺伝子型と浮腫の間で見られた独自の関連をモデル化した。
【０１１０】
モデルは全て、イマチニブで処置した男性および女性の両者からなった（ｎ＝９１）。最初のロジスティック回帰分析では、年齢、性別、人種、および−５１１  ＩＬ−１β遺伝子型をクラスとしてフルモデルに加えた。これまでに見られた性別と遺伝子型の間の相互作用の可能性を調べるため、２元共変量相互作用を可能とするさらなる変数を作成した。さらなる分析は、最初のモデルで用いたクラスとともに、遺伝子型と性別と人種の間、および遺伝子型と性別と年齢の間の３元相互作用を可能とするさらなる２つの変数からなった。黒色人種、東洋人およびその他の個体の罹患率は低いことから、人種群は白色人種とその他という２つのカテゴリーに変換し、上記のように３回目のロジスティック回帰を完了させた。このロジスティック回帰は、遺伝子型／表現型の有意な相関をさらに特徴づけるための予備的分析として完了させた。
【０１１１】
浮腫群において特定の遺伝子型（例えば、ＣＣと非ＣＣ）を有するオッズを、非浮腫群における同じ遺伝子型を有するオッズで割ることにより、ＯＲと９５％ＣＩを算出した。
【０１１２】
複数試験の補正
浮腫の予測マーカーを同定するために用いられるアプローチの性質上、複数の試験に関して補正を行わなければならない。行った試験が多いほど、ｐ＜０．０５の確率で関連を発見する機会が増える。ボンフェローニ補正因子を用いて複数の試験を補正するには、所望のｐ値を行った試験の数で割る。得られた値は「有意」とみなされる値である。従って、この分析で試験した７０の多型については、ｐ値０．０００７が有意とみなすに必要である。これは極めて小さな数であり、この慎重なカットオフでは、有用な可能性のある予測マーカーを見逃がしてしまうかもしれない。
【０１１３】
複数の試験を補正するもう１つの方法はブーツトラップ法（bootstrapping）である。この方法は有意性試験を計算するためにシミュレーションを適用するコンピューター集約的な統計分析である。乱数生成器を用いてデータセットを再抽出する。ブーツトラップ法は発明者らの有意性結果の安定性を調べるために行った。ブーツストラップは浮腫表現型と６８の多型からなり、女性だけを用いて１０，０００反復で行った。全ての統計は統計プログラムＳＡＳバージョン８．２で行った。
【０１１４】
ジェノタイピングされた集団の典型的な性質
本研究において薬理遺伝学的研究に用いられた患者のサブセットが試験集団の典型的なものであるかどうかを調べるため、浮腫に関連するいくつかの人口統計を検討した。ジェノタイピングされた集団は米国からの患者のみからなった。よって、このジェノタイピングされた集団を臨床試験の全米患者集団とも比較した。この研究のジェノタイピングされた集団は米国からの試験集団と、性別、人種、年齢および浮腫の発生に関しては類似している。それらは人種に関してのみ異なる。米国集団は４．７８％に対して１１．９２％と黒色人種が多く、９０．０６％に対して８０．１３％と白色人種が少なく、３．５０％に対して６．６２％と他のカテゴリーの個体がやや多い。
【０１１５】
遺伝子型と浮腫状態との相関の結果
２６の遺伝子における７０の遺伝的多型の分析は、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１多型が、イマチニブで処置された女性における眼窩周囲浮腫および顔面浮腫と有意な関連があると同定した（ｐ＝０．０００５６）。ＣＣ遺伝子型の女性は、非ＣＣ遺伝子型の個体より、眼窩周囲浮腫および顔面浮腫を発症する見込みが１３．０倍高い（９５％ＣＩ：２．０７−８１．４８）（図３および図４も参照）。このＩＬ−１β多型はそのプロモーター領域にあり、転写開始部位から−５１１塩基対上流の位置においてＣ→Ｔの塩基転移を示す。
【０１１６】
人口統計学的変数、遺伝子型変数および表現型変数の間の相関
性別および年齢はイマチニブ処置個体の血管浮腫と有意に関連していることが分かった（ｐ＜０．０５）。驚くべきことに、性別は全ての患者においてＩＬ−１β多型と関連している（ｐ＝０．０１０６）、図４。ＣＣ遺伝子型の女性は非ＣＣ遺伝子型の女性よりも血管浮腫を発症する見込みが高い。ＩＬ−１β遺伝子は常染色体上にあることから性別および遺伝的多型との相関は予期されない。この性別と−５１１多型との関連がこの研究試験集団に特異なものか、他の対照集団でも見られるのかを理解する１つの試みにおいて、さらに３種類の無関連の臨床試験を検討した。全ての組み合わせ試験でも、この３種類の対照試験のいずれでも、性別と−５１１  ＩＬ−１βＳＮＰの間に有意な関連は見られなかった。−５１１  ＩＬ−１β多型の遺伝子型分布はイマチニブと他の全てのものとの間で有意な違いはなかった。しかし、分析を性別によって階層化した場合、他の全ての女性と比べて、研究試験からの女性における遺伝子型分布は有意な違いがあった。−５１１  ＩＬ−１β多型に関するＴＴ遺伝子型を有する女性白血病患者はいないものと思われる。イマチニブで処置された女性におけるＣＣ：ＣＴ：ＴＴ遺伝子型の分布は、男性がそれぞれ２３：２５：１９であるのに対し、１６：１９：１である。他の全ての試験と比べた研究から男性の分布には有意な差はなかった。
【０１１７】
この遺伝子型の分布はこの多型に関して、４つの人種間で有意な差がある。観測されたＩＬ−１βと血管浮腫との間の関連が人種特異的なものであったかどうかを調べるため、人種により分析を階層化した。イマチニブで処置された男性および女性において、黒色人種における−５１１  ＩＬ−１βＣＣ：ＣＴ：ＴＴ分布は１：６：４であり、白色人種では２９：３１：１３、東洋人では０：２：０、その他のでは３：０：２であり、全ての群を合わせると３３：３９：１９である。このデータを性別と人種により階層化すると、白色人種は研究した女性の７７％となる。白色人種においては、−５１１  ＩＬ−１β多型のＣＣ遺伝子型はイマチニブで処置された場合、女性を浮腫に罹りやすくするという明らかな傾向がある。さらなる研究で、−５１１  ＩＬ−１β多型と浮腫との関連が人種特異的であるかどうかを決定するためには、異なる人種的バックグラウンドからの適当数の個体を含めなければならない。特徴づけられた、この４つの異なる人種間で見られたＩＬ−１β多型の対立遺伝子分布における違いは、人種間での浮腫の罹患率の違いをもたらす可能性がある。
【０１１８】
年齢も血管浮腫と関連があった（ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０３９３）。しかし、ＩＬ−１β多型との関連はなく、このことはそれが血管浮腫の発症における独立変数であることを示唆している。
【０１１９】
複数試験の補正
ボンフェローニ補正
分析されたＳＮＰの数および多くの試験が偽陽性の誤り率を含み得るという事実のため、複数試験の補正を行った。イマチニブで処置された女性における浮腫とＩＬ−１β変異体との関連に関するこの所見は、以下で計算されるような０．０００７のｐ値を推定するボンフェローニ補正法を用いると、有意であるとは言えない。
【数１】
2010166915.tif 000007
−５１１および−３１多型で観測されるｐ値は０．０００７カットオフよりも大きかった。
【０１２０】
ブーツストラップ法
ブーツストラップ分析では、イマチニブで処置された女性における浮腫と−５１１  ＩＬ−１β多型との間の関連に関する補正ｐ値は０．０５８となった。
【０１２１】
イマチニブ誘発性浮腫に対する感受性を予測に使用でき、浮腫の病態生理学の理解を理想的に助け得る遺伝子マーカーを同定するために薬理遺伝学的分析を行った。候補遺伝子における遺伝子型と研究試験からの患者における浮腫の存在との間の関連を探し出すための統計学的試験を行った。−５１１  ＩＬ−１β多型とイマチニブで処置された女性のみの眼窩周囲浮腫および顔面浮腫との間に関連が発見された。イマチニブで処置され、ＩＬ−１β−５１１遺伝子座にＣＣ遺伝子型を有する女性患者は、イマチニブで処置され、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型を有する女性よりも血管浮腫を被る見込みが１３倍高い（９５％ＣＩ：２．０７−８１．４８）。従って、イマチニブで処置された女性に見られる症例の６７％（１５名のうち１０名）を占めるＩＬ−１β遺伝子における眼窩周囲浮腫および顔面浮腫に関する、代用マーカー（surrogate marker）が同定された。血管浮腫と関連した遺伝子型はＩＬ−１β遺伝子の高い発現レベルに関連している可能性がある。このような代用マーカーは臨床において血管浮腫に対する患者の感受性を予測するために容易に適用でき、より密な監視、または予防的療法が可能となる。この試験は遺伝学的であってもよいし、あるいは、可能性としては血清中のＩＬ−１βタンパク質レベルの測定値であってもよい。
【０１２２】
本明細書において「浮腫」とは、限定されるものではないが、血管浮腫（眼窩周囲浮腫および顔面浮腫を含む）、浮腫ＮＥＣ（末梢浮腫、浮腫ＮＯＳおよび圧痕浮腫を含む）および肺浮腫（肺の鬱血を含む）および脳浮腫をはじめとする、臨床上有意ないずれのタイプまたは種類の浮腫の発生に関してもさす。
【０１２３】
本明細書において「非浮腫」とは、臨床上有意ないずれのタイプまたは種類の浮腫も存在しないことを意味する。
【０１２４】
通常のマイクロアレイ技術
何千もの個々の遺伝子のサインを同時に評価するマイクロアレイ技術は臨床腫瘍学の場で急速に受け入れられつつある。この技術は種々のクラスの癌を識別できる遺伝因子、臨床応答の生物マーカー、ならびに急性リンパ芽球性白血病の場合にイマチニブ処置に対する耐性の発達を予測できる遺伝子を同定するために用いられている。この研究の目的は、この遺伝子発現プロファイリング戦略を用いて、イマチニブで処置されたＣＭＬ患者における浮腫の予測遺伝子発現プロフィールを同定することであった。
【０１２５】
測定方法
本発明の実験方法は細胞成分の測定に依存する。測定する細胞成分は細胞の生物学的状態のいずれの態様に由来するものであってもよい。それらは転写の状態に由来するものであってもよく、その場合にはＲＮＡの存在量が測定され、あるいは翻訳の状態に由来するものであってもよく、その場合にはタンパク質の存在量が測定され、活性状況に由来するものであってもよく、その場合にはタンパク質活性が測定される。また、細胞の特徴は混合型の態様に由来するものであってもよく、例えば、１以上のタンパク質の活性が、他の細胞成分のＲＮＡの存在量（遺伝子発現）とともに測定される。この節では、薬物または経路応答において細胞成分を測定するための例示的な方法を記載する。本発明はこのような測定の他の方法にも適用できる。
【０１２６】
好ましくは、本発明では、他の細胞成分の転写の状態が測定される。転写の状態は、次のサブセクションで記載される核酸または核酸模倣プローブのアレイに対するハイブリダイゼーションの技術により、あるいはそれに続くサブセクションに記載されている他の遺伝子発現技術により測定することができる。しかし、測定されるその結果は、ｍＲＮＡの存在量および／または比率（通常、ＲＮＡ分解率に差がない場合はＤＮＡ発現比を反映する）を表す値を含むデータである。
【０１２７】
本発明の別の種々の実施形態では、翻訳の状態、活性の状態または混合型の態様など、転写の状態以外の生物学的状態の態様を測定することができる。
【０１２８】
表２に開示されている遺伝子の１つによりコードされるタンパク質またはタンパク質結合相手と相互作用できる化合物を同定して、そのタンパク質またはその結合相手の活性を変化させるために細胞フリーアッセイを用いることもできる。細胞フリーアッセイは、コードされるタンパク質と、標的ペプチドなどのその結合相手との間の相互作用を調節する化合物を同定するためにも使用できる。
【０１２９】
分子間の相互作用はまた、最適な現象において表面プラズモン共鳴を検出するリアルタイム・バイオモレキュラー・インターアクション・アナリシス（ＢＩＡ）ファルマシア・バイオセンサー（ＡＢ）を用いることでも評価することができる。検出は生物特異的な界面における質量高分子の質量濃度における変化に依存し、分子の標識の必要はない。有用な一実施形態では、試験化合物のライブラリーをセンサー界面、例えばマイクロフローセルの壁面に固定化することができる。次に、タンパク質、その機能的断片またはタンパク質結合相手を含有する溶液をこのセンサー表面に継続的に循環させる。シグナル記録で示される共鳴角における変化は相互作用の存在を示す。この技術はＰｈａｒｍａｃｉａにより「ＢＩＡテクノロジーハンドブック」にさらに詳細に記載されている。
【０１３０】
細胞フリーアッセイのもう１つの実施形態は、
ａ）少なくとも１つの遺伝子によりコードされるタンパク質、そのタンパク質結合相手および試験化合物を合わせて反応混合物を形成すること；および
ｂ）試験化合物の存在下および不在下でタンパク質とタンパク質結合相手の相互作用を検出すること
を含む。
【０１３１】
試験化合物の存在下でのタンパク質と結合相手の相互作用が、試験化合物の不在下での相互作用に比べて著しい変化（増強または阻害）があれば、試験化合物に対するそのタンパク質の活性の有効なアゴニスト（ミメティックまたは増強剤）またはアンタゴニスト（阻害剤）を示す。このアッセイの成分は同時に合わせることもできるし、あるいはタンパク質を一定の時間、試験化合物と接触させ、その後、その反応混合物に結合相手を添加することもできる。化合物の有効性は種々の濃度の化合物を用いて用量応答曲線を作成することにより評価することができる。対照アッセイはまた、試験化合物の不在下でタンパク質とその結合相手との間の複合体の形成を定量することにより行うことができる。
【０１３２】
タンパク質とその結合相手との間の複合体の形成は、放射性標識、蛍光標識または酵素標識タンパク質などの検出可能なように標識されたタンパク質またはその結合相手を用い、免疫アッセイにより、またはクロマトグラフィー検出により検出することができる。
【０１３３】
好ましい実施形態では、このタンパク質またはその結合相手は、タンパク質とその結合相手の複合化されていない形態からの複合体の分離およびアッセイの自動化を容易にするために固定化することができる。タンパク質とその結合相手との複合体形成は例えばマイクロタイタープレート、マイクロ遠沈管および試験管など、いずれのタイプの容器でも行える。特に好ましい実施形態では、タンパク質を別のタンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合させて、例えばグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical， St．Louis， MO）に吸着させることができる融合タンパク質を形成し、次にこれを例えば３５Ｓで標識した標識タンパク質相手および試験化合物と合わせ、複合体の形成に十分な条件下でインキュベートすることができる。次に、これらのビーズを洗浄して結合していない標識を除去し、マトリックスを固定化し、放射性標識を測定する。
【０１３４】
タンパク質をマトリックスに固定化するためのもう１つの方法は、ビオチンとストレプトアビジンの使用を伴う。例えば、タンパク質を周知の技術を用い、ビオチンＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドを用いてビオチニル化し、ストレプトアビジンをコートしたプレートのウェルに固定化することができる。
【０１３５】
また、細胞フリーアッセイを用いて、少なくとも１つの遺伝子によりコードされるタンパク質と相互作用することができ、その遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を調節する薬剤を同定するためにも使用できる。一実施形態では、このタンパク質を試験化合物とともにインキュベートし、そのタンパク質の触媒活性を測定する。もう１つの実施形態では、このタンパク質の標的分子に対する結合親和性を当技術分野で公知の方法により測定することができる。
【０１３６】
本明細書において「アンチセンス」とは、開示されている遺伝子の少なくとも１つのＲＮＡ発現産物の一部に相補的なヌクレオチド配列をさす。「相補的」ヌクレオチド配列とは、標準的なワトソン−クリックの相補性の法則に従って塩基対を形成し得るヌクレオチド配列をさす。すなわち、プリンはピリミジンと塩基対を形成し、ＤＮＡの場合にはグアニン：シトシンおよびアデニン：チミン、あるいはＲＮＡの場合にはアデニン：ウラシルの組み合わせを形成する。その他のあまり一般的ではない塩基、例えば、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他をハイブリダイズ配列に含めてもよく、対合は妨害されない。
【０１３７】
全ての実施形態において、細胞成分の測定は測定が行われる場合に相対的に独立な様式で行われるべきである。
【０１３８】
転写の状態の測定
好ましくは、転写の状態の測定は、核酸をオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせることにより行われ、これはこのサブセクションに記載されている。転写の状態を測定する他の特定の方法はこのサブセクションの後半に記載されている。
【０１３９】
通常の転写物アレイ
好ましい一実施形態では、本発明は「オリゴヌクレオチドアレイ」（ 本明細書では「マイクロアレイ」とも呼ばれる）を用いる。マイクロアレイは細胞における転写の状態を分析するため、特に癌細胞の転写の状態を測定するために使用できる。
【０１４０】
一実施形態では、転写物アレイは、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能なように標識された標識ポリヌクレオチド（例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成した蛍光標識ｃＤＮＡまたは標識ｃＲＮＡ）をマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより作製される。マイクロアレイは細胞または生物のゲノムの多くの遺伝子、好ましくは大部分またはほとんど全ての遺伝子の産物に対する結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位を並べた表面である。マイクロアレイはいくつかの方法で作製することができ、そのいくつかを以下に記載する。しかし、作製されたマイクロアレイはある特徴を共有する。これらのアレイは再現性があり、あるアレイの複数のコピーが生産でき、互いに容易に比較することができる。好ましくは、マイクロアレイは小さく、通常５ｃｍ２より小さく、それらは結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定な材料から製造される。マイクロアレイ中のある結合部位またはユニークな結合部位のセットは細胞内の単一の遺伝子の産物と特異的に結合する。特定のｍＲＮＡにつき１を超える物理的「結合部位」（以下、部位）が存在し得るが、以下の考察を明瞭にするため、単一の部位があると仮定する。特定の実施形態では、各位置に既知配列の核酸が付加された位置的にアドレス可能なアレイが用いられる。
【０１４１】
細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを作製し、好適なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイとハイブリダイズさせる場合、いずれかの特定の遺伝子に対応するアレイの部位に対するハイブリダイゼーションのレベルはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡの、細胞内の存在率を反映している。例えば、全細胞ｍＲＮＡと相補的であり、検出可能なように標識された（例えば蛍光団で）ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせる場合、その細胞内で転写されない、ある遺伝子に対応する（すなわち、その遺伝子の産物と特異的に結合することができる）アレイ上の部位のシグナルは小さいか、またはシグナルがない（例えば蛍光シグナル）、コードされているｍＲＮＡが優勢である遺伝子は相対的に強いシグナルを有する。
【０１４２】
マイクロアレイの作製
マイクロアレイは当技術分野で公知であり、遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチドおよびその断片）と、配列において対応するプローブが、既知の位置で特異的にハイブリダイズまたは結合できる表面からなる。一実施形態では、マイクロアレイは、各位置がある遺伝子によりコードされる産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）の独立した結合部位を表し、その生物のゲノム中の大部分またはほとんど全ての産物に対する結合部位が存在するアレイ（すなわち、マトリックス）である。好ましい一実施形態では、この部位は特定の同族ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡが特異的にハイブリダイズできる核酸または核酸類似体である。この結合部位の核酸または類似体は例えば合成オリゴマー、全長ｃＤＮＡ、全長より短いｃＤＮＡ、または遺伝子断片であってよい。
【０１４３】
好ましい一実施形態では、このマイクロアレイは標的生物のゲノムの全てまたはほとんど全ての遺伝子の産物に対する結合部位を含むが、このような包括性は必ずしも必要ではない。このマイクロアレイは標的生物の遺伝子の一部分のみの結合部位を含んでもよい。しかし、一般に、このマイクロアレイはゲノム中の遺伝子の少なくとも約５０％、多くの場合には少なくとも約７５％、より多くの場合には少なくとも約８５％、よりいっそう多くの場合には約９０％を超える、最も多くの場合には少なくとも約９９％に対応する結合部位を有する。好ましくは、このマイクロアレイは対象とする生物ネットワークモデルを試験および確認するために適切な遺伝子に対する結合部位を有する。「遺伝子」は、生物内で（例えば、単細胞の場合）、または多細胞生物ではいくつかの細胞で、それからｍＲＮＡが転写される好ましくは少なくとも５０、７５または９９のアミノ酸からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と特定される。ゲノム中の遺伝子の数はその生物によって発現されるｍＲＮＡの数から、またはそのゲノムの十分同定されている部分から推定することにより見積もることができる。対象とする生物のゲノムが配列決定されている場合は、ＯＲＦの数を求めることができ、ｍＲＮＡコード領域はＤＮＡ配列解析により同定することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ゲノムは完全に配列決定されており、９９アミノ酸よりも長い約６，２７５のＯＲＦを有することが報告されている。これらのＯＲＦの分析から、タンパク質産物を特定すると思われる５，８８５のＯＲＦがあることが示されている。出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる、Goffeau et al．， ‘Life with 6000 Genes’， Science， Vol．274， pp． 546-567 （1996）参照。これに対し、ヒトゲノムは約２５，０００〜３５，０００の遺伝子を含むと見積もられている。
【０１４４】
マイクロアレイ用の核酸の調製
上述のように、特定の同族ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイズする「結合部位」は通常、その結合部位に結合されている核酸または核酸類似体である。一実施形態では、このマイクロアレイの結合部位はある生物のゲノム中の各遺伝子の少なくとも一部に対応するＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡは、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる）またはクローニングされた配列からの遺伝子セグメントのＰＣＲ増幅により得ることができるか、あるいはこれらの配列はフォトリソグラフィー技術の使用によりチップの表面に新たに合成してもよい（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘはこのような異なる技術を用いてチップ上で直接それらのオリゴを合成する）。ＰＣＲプライマーとしては、それらの遺伝子またはｃＤＮＡの既知配列に基づき、ユニークな断片（すなわち、そのマイクロアレイ上の他のいずれの断片とも１０塩基を超える連続する同じ配列を共有することのない断片）の増幅をもたらすものを選択する。必要な特異性と最適な増幅特性を有するプライマーのデザインにはコンピュータープログラムが有用である。例えば、Oligo， pl version 5．0， Nat．Biosci参照。極めて長い遺伝子に対応する結合部位の場合、オリゴ−ｄＴプライミングｃＤＮＡプローブがマイクロアレイにハイブリダイズされる際に全長よりも短いプローブでも十分結合するように、その遺伝子の３’末端付近のセグメントを増幅することが望ましい場合がある。一般には、マイクロアレイ上の遺伝子断片は約２０ｂｐ〜約２０００ｂｐの間、より一般には約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐの間、通常は約３００ｂｐ〜約８００ｂｐの間の長さである。ＰＣＲ法は周知のものであり、例えば、出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる、Innis et al．， Eds．， PCR Protocols:  A Guide to Methods and Applications， Academic Press Inc．， San Diego， CA （1990）参照。核酸の単離および増幅にはコンピューター制御のロボットシステムが有用であるのは明らかである。
【０１４５】
マイクロアレイ用の核酸を作製するための別の手段として、例えばＮ−ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学を用いる、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成によるものがある。Froehler et al．， Nucl．Acid Res．， Vol．14， pp．5399-5407 （1986）;およびMcBride et al．， Tetrahedron Lett．， Vol．24， pp．245-248 （1983）参照。合成配列は約１５塩基〜約５００塩基、より一般には約２０塩基〜約５０塩基の長さである。いくつかの実施形態では、合成核酸は非天然塩基、例えばイノシンを含む。上述のように、核酸類似体をハイブリダイゼーションの結合部位として用いてもよい。好適な核酸類似体の一例としてペプチド核酸がある。例えば、Egholm et al．，‘PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson-Crick Hydrogen-Bonding Rules’， Nature， Vol．365， pp． 566-568 （1993）;および米国特許第５，５３９，０８３号参照。
【０１４６】
もう１つの実施形態では、結合（ハイブリダイゼーション）部位は遺伝子のプラスミドまたはファージクローン、ｃＤＮＡ（例えば、ＥＳＴ）、またはそれらに由来する挿入配列から製造される。Nguyen et al．， ‘Differential Gene Expression in the Murine Thymus Assayed by Quantitative Hybridization of Arrayed cDNA Clones’， Genomics， Vol．29， pp．207-209 （1995）参照。さらに別の実施形態では、結合部位のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０１４７】
核酸の固相表面への結合
核酸または類似体は固相支持体へ結合させるが、これはガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたはその他の材料から製造することができる。核酸を表面に結合させる好ましい方法としては、Schena et al．， ‘Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray’， Science， Vol．270， pp． 467-470 （1995）に概略が記載されているようにガラスプレート上にプリントすることによるものがある。この方法はｃＤＮＡのマイクロアレイの作製に特に有用である。また、DeRisi et al．， ‘Use of a cDNA Microarray to Analyze Gene Expression Patterns in Human Cancer’， Nature Gen．， Vol．14， pp．457-460 （1996）; Shalon et al．， ‘A DNA Microarray System for Analyzing Complex DNA Samples Using Two-Color Fluorescent Probe Hybridization’， Genome Res．， Vol．6， pp．639-645 （1996）;およびSchena et al．， ‘Parallel Human Genome Analysis; Microarray-Based Expression of 1000 Genes’， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．93， pp．10539-11286 （1995）参照。上述の製品は各々、出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる。
【０１４８】
マイクロアレイを作製するもう１つの好ましい方法として、高密度オリゴヌクレオチドアレイを作製することによるものがある。In situ合成のためのフォトリソグラフィー技術を用いて、表面の所定の位置に所定の配列に相補的な何千というオリゴヌクレオチドを含むアレイを作製する技術（Fodor et al．， ‘Light-Directed Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis’， Science， Vol．251， pp．767-773 （1991）; Pease et al．， ‘Light-Directed Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA Analysis’， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．91， pp．5022-5026 （1994）; Lockhart et al．， ‘Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays’， Nature Biotech．， Vol． 14， p．1675 （1996）;および米国特許第５，５７８，８３２号；同第５，５５６，７５２号；および同第５，５１０，２７０号参照（各々、出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる））;または所定のオリゴヌクレオチドの迅速合成および定着のための他の方法（Blanchard et al．， ‘High-Density Oligonucleotide Arrays’， Biosensors Bioelectron．， Vol．11， pp．687-690 （1996）参照）は公知である。これらの方法を用いる場合、誘導体化されたスライドガラスなどの表面に既知配列のオリゴヌクレオチド（例えば、２５マー）が直接合成される。通常、製造されたアレイは冗長であり、１つのＲＮＡにつき数個のオリゴヌクレオチド分子がある。オリゴヌクレオチドプローブは選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを検出するために選択することができる。
【０１４９】
マイクロアレイを作製するためのその他の方法（例えば、マスキングによるもの、Maskos et al．， Nuc．Acids Res．， Vol．20， pp．1679-1684 （1992）参照）も使用できる。基本的に、例えばナイロンハイブリダイゼーションメンブラン上のドットブロット（出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる、Sambrook et al．， ‘Molecular Cloning--A Laboratory Manual’， 2nd Edition， Vols．1-3， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY （1989）参照）など、いずれの種類のアレイでも使用できるが、当業者が認識しているように、極めて小さいアレイのほうが、ハイブリダイゼーション量が少ないので好ましい。
【０１５０】
標識プローブの作製
全ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法は周知であり、一般に、Sambrook et al．， 前掲に記載されている。一実施形態では、ＲＮＡは本発明で対象とする種々のタイプの細胞から、チオシアン化グアニジウム、その後のＣｓＣｌ遠心分離を用いて抽出する。Chirgwin et al．， Biochemistry， Vol．18， pp．5294-5299 （1979）参照。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロースを用いて選択により選択される。Sambrook et al．， 前掲参照。対象となる細胞としては、野生型細胞、薬剤に曝された野生型細胞、修飾／摂動された細胞成分を有する細胞、および薬剤に曝され、修飾／摂動された細胞成分を有する細胞が挙げられる。
【０１５１】
標識ｃＤＮＡはｍＲＮＡから、あるいはまた、オリゴｄＴプライミングまたはランダムプライミング逆転写により直接ＲＮＡから調製され、双方とも当技術分野では周知のものである。例えば、Klug et al．， Methods Enzymol．， Vol．152， pp．316-325 （1987）参照。逆転写は検出可能な標識に共役されたｄＮＴＰ、最も好ましくは、蛍光標識ｄＮＴＰの存在下で行えばよい。あるいは、単離されたｍＲＮＡを、標識ｄＮＴＰの存在下で二本鎖ｃＤＮＡのin vitro転写により合成される標識アンチセンスＲＮＡへと変換することもできる。出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる、Lockhart et al．， ‘Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays’， Nature Biotech．， Vol．14， p．1675 （1996）参照。別の実施形態では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを検出可能な標識の不在下で合成することができ、その後、例えばビオチニル化したｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組み込むか、または同様のいくつかの手段（例えば、ビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡにリン架橋するなど）によって標識した後、標識ストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリン共役ストレプトアビジン）またはその同等物を添加してもよい。
【０１５２】
蛍光標識プローブを用いる場合、フルオレセイン、リッサミン（lissamine）、フィコエリトリン、ローダミン（Perkin Elmer Cetus）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Amersham）およびその他をはじめ、多くの好適な蛍光団が知られている。例えば、Kricka， Nonisotopic DNA Probe Techniques， Academic Press， San Diego， CA （1992）参照。容易に識別できるように、発光スペクトルの異なる蛍光団対が選択されることが分かるであろう。
【０１５３】
もう１つの実施形態では、蛍光標識以外の標識が用いられる。例えば、放射活性標識または 発光スペクトルの異なる放射活性標識対が使用できる。Zhao et al．， ‘High Density cDNA Filter Analysis:  A Novel Approach for Large-Scale， Quantitative Analysis of Gene Epression’， Gene， Vol．156， p．207 （1995）;および and Pietu et al．， ‘Novel Gene Transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array’， Genome Res．， Vol．6， p．492 （1996）参照。 しかし、放射活性粒子の散在性と、その結果として広い空間の結合部位が必要なことから、放射性同位元素の使用はあまり好ましい実施形態とは言えない。
【０１５４】
一実施形態では、標識ｃＤＮＡは、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ、ならびに０．１ｍＭ  ｄＴＴＰ、ならびに蛍光デオキシリボヌクレオチド（例えば、０．１ｍＭローダミン１１０ＵＴＰ （Perken Elmer Cetus）または０．１ｍＭ  Ｃｙ３  ｄＵＴＰ（Amersham））を含有する混合物を逆転写酵素（例えば、（商標）ＩＩ，  ＬＴＩ  Ｉｎｃ．）とともに４２℃で６０分間をインキュベートすることにより合成される。
【０１５５】
マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」、すなわち、プローブが相補的な核酸配列を有する配列アレイ部位とハイブリダイズする、二重らせんを形成する、または結合するが、非相補的核酸配列を有する部位とはハイブリダイズしないように選択される。本明細書において、あるポリヌクレオチド配列は別のものと、短い方のポリヌクレオチドが２５塩基以下であれば、標準的な塩基対形成法則を用いて誤対合がないか、または短い方のポリヌクレオチドが２５塩基よりも長ければ、誤対合は５％だけという場合に、相補的であるとみなされる。ポリヌクレオチドは完全に相補的である（誤対合がない）のが好ましい。特異的なハイブリダイゼーション条件は、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを行うことにより、特異的ハイブリダイゼーションを生じるということは容易に証明することができる。例えば、Shalon et al．， 前掲;およびChee et al．， 前掲参照。
【０１５６】
最適なハイブリダイゼーション条件は、標的プローブと固定化されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、オリゴマーと、２００塩基を超えるポリヌクレオチド）およびタイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＰＮＡ）によって異なる。核酸の特異的（すなわち、ストリンジェント）ハイブリダイゼーション条件のための一般的なパラメーターは、出典明示によりあらゆる目的でその全開示内が本明細書の一部とされる、Sambrook et al．， 前掲;およびAusubel et al．， Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley-Interscience， NY （1987）に記載されている。Schena et al．のｃＤＮＡマイクロアレイを用いる場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は５×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中、６５℃で４時間のハイブリダイゼーション、その後、２５℃で低ストリンジェンシー洗浄バッファー（１×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ）中、２５℃で高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．１×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ）中で１０分の洗浄というものである。Shena et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．93， p．10614 （1996）参照。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えばTijessen， Hybridization with Nucleic Acid Probes， Elsevier Science， Publishers B．V．and Kricka （1993）;および‘Nonisotopic DNA Probe Techniques’， Academic Press， San Diego， CA （1992）により提供される。
【０１５７】
シグナルの検出とデータ解析
蛍光標識プローブを用いる場合、転写物アレイの各部位における蛍光放出を好ましくは共焦レーザー顕微鏡を走査することにより検出できる。一実施形態では、適当な励起直線を用い、用いる２つの蛍光団の各々に関して別々にスキャンを行う、あるいは、用いる蛍光団に特異的な波長で検体照射を可能とするレーザーを使用することができ、この蛍光団からの発光を分析することができる。好ましい一実施形態では、これらのアレイを、コンピューター制御Ｘ−Ｙステージと顕微鏡対物レンズを備えた共焦蛍光スキャナーでスキャンする。蛍光団の一連の励起をマルチライン混合ガスレーザーで行い、発光を波長により分光し、光電子増倍管で検出する。蛍光レーザースキャニング装置はSchena et al．， Genome Res．， Vol．6， pp．639-645 （1996）およびそこに挙げられている他の参照文献に記載されている。あるいは、Ferguson et al．， Nature Biotechnol．， Vol．14， pp．1681-1684 （1996）に記載されている光ファイバー束を用いて、多数の部位のｍＲＮＡの存在量レベルを同時に監視してもよい。
【０１５８】
シグナルを記録し、好ましい一実施形態では、コンピューターにより、例えば、１２ビットアナログ／デジタルボードを用いて解析する。一実施形態では、スキャンした画像をグラフィックプログラム（例えば、Hijaak Graphics Suite）を用いてデスペックル（despeckled）した後、各部位における各波長における平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを作成するイメージグリッディングプログラムを用いて解析する。
【０１５９】
Agilent Technologies GENEARRAY（商標）スキャナーはベンチトップ型の４８８ｎＭアルゴン−イオンレーザに基づく分析装置である。このレーザーは４ミクロン未満のスポットサイズに焦点を合わせることができる。この精度により、２０ミクロンといった小さなプローブ細胞を含むプローブアレイのスキャンが可能となる。このレーザー光をプローブアレイに集め、蛍光標識ヌクレオチドを励起させる。次に、これを、そのアッセイに用いる色素に対して選択されたフィルターを用いてスキャンする。プローブアレイを移動させることで直行座標におけるスキャンを行う。レーザー照射光はハイブリダイズサンプルに組み込まれている色素分子によって吸収され、それらに蛍光を生じさせる。この蛍光をレンズによって平行化にし、波長分光のためにフィルターに通す。次に、この光を２つ目のレンズにより深度識別のための開口部に集め、その後、高感度光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出する。ＰＭＴの出力電流をアナログ／デジタル変換器により電圧読み取り値に変換し、処理されたデータを、その時スキャンしているサンプル点の蛍光強度レベルまたは画素（ピクセル）としてコンピューターに再び送る。スキャンの進行とともに、コンピューターはデータを画像として表示する。さらに、サンプルの発現プロフィールを表す全てのサンプルの蛍光強度レベルをコンピューターで読み取り可能な形式で記録する。
【０１６０】
必要に応じて、そのチャネルと２つのフルオルの間の「クロストーク」（または重複）に関する、経験的に決定される補正を行ってもよい。転写物アレイ上の任意の特定のハイブリダイゼーション部位について、この２つの蛍光団の発光の比率を算出すればよい。この比率は同族遺伝子の絶対発現レベルには依存しないが、その発現が薬物投与、遺伝子欠損、または他のいずれかの試験事象により有意に調節される遺伝子に有用であり得る。
【０１６１】
好ましくは、正または負として摂動を同定する他、その摂動の大きさを決定するのが有利である。これは当業者に容易に明らかになる方法により行うことができる。
【０１６２】
転写状態を測定する他の方法
細胞の転写の状態は、当技術分野で公知の他の遺伝子発現技術によって測定してもよい。このような技術のいくつかは、二重制限酵素消化とフェージングプライマーを組み合わせた方法（例えば、Zabeau et al．により１９９２年９月２４日に出願された欧州特許出願０ ５３４８５８  Ａ１参照）、または所定のｍＲＮＡ末端に最も近い部位を有する制限断片を選択する方法（例えば、Prashar et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．93， pp．659-663 （1996）参照）など、電気泳動分析のための、複雑性が限られた制限断片のプールを生産する。他の方法では、複数のｃＤＮＡの各々において各ｃＤＮＡを同定するのに十分な塩基（例えば、２０〜５０塩基）を配列決定すること、または所定のｍＲＮＡ末端（例えば、Velculescu， Science， Vol．270， pp．484-487 （1995）参照）、経路パターンに関連する既知の位置に生成された短いタグ（例えば、９〜１０塩基）を配列決定することなどにより、ｃＤＮＡプールを統計学的にサンプリングする。
【０１６３】
他の態様の測定
本発明の種々の実施形態では、薬物応答および経路応答を得るために、翻訳の状態、活性の状態または混合型態様など、転写状態以外の生体状態の態様も測定できる。これらの実施形態の詳細は本節に記載されている。
【０１６４】
翻訳状態の測定
遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は、検出可能なように標識されているか、またはその後標識可能なプローブにより検出することができる。通常、プローブは発現タンパク質を認識する抗体である。
【０１６５】
本明細書において、「抗体」とは、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体およびその抗体フラグメントとタンパク質の結合に十分な生物学的に機能的な抗体フラグメントが含まれる。
【０１６６】
開示されている遺伝子の１つによりコードされるタンパク質に対する抗体の生産のためには、ポリペプチドまたはその一部を注射することにより種々の宿主動物を免疫化すればよい。このような宿主動物としては、限定されるものではないが、いくつか挙げれば、ウサギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主種に応じて、限定されるものではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバント；水酸化アルミニウムなどの無機ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性剤；ならびにＢＣＧおよびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントをはじめとする種々のアジュバントを用い、免疫応答を増強させてもよい。
【０１６７】
ポリクローナル抗体は、目的遺伝子産物などの抗原、またはその抗原機能的な誘導体で免疫化した動物の血清に由来する異質な抗体分子集団である。ポリクローナル抗体の生産のためには、上記に記載されているものなどの宿主動物を、コードされるタンパク質またはその一部をこれもまた上記に記載されているようなアジュバントを補って注射することにより免疫化できる。
【０１６８】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は特定の抗原に対する均質な抗体集団であり、連続的な細胞培養系による抗体分子の生産をもたらすいずれの技術によって得てもよい。これらのものとしては、限定されるものではないが、Kohler et al．， Nature， Vol．256， pp．495-497 （1975）;および米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術；Kosbor et al．， Immunol．Today， Vol．4， p．72 （1983）; Cole et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．80， pp．2026-2030 （1983）のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；およびCole et al．， Monoclonal Antibodies and Cancer Ther．， Alan R．Liss， Inc．， pp．77-96 （1985）のＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が挙げられる。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤをはじめとするいずれかの免疫グロブリンクラスおよびそのいずれかのサブクラスであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養可能である。in vivoで高力価のｍＡｂが生産できることから、これが現在のところの好ましい生産方法となっている。
【０１６９】
さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Morrison et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．81， pp．6851-6855 （1984）; Neuberger et al．， Nature， Vol．312， pp．604-608 （1984）;およびTakeda et al．， Nature， Vol．314， pp．452-454 （1985）参照）を使用することができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来の可変または超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０１７０】
あるいは、単鎖抗体の生産に関して記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird， Science， Vol．242， pp．423-426 （1988）; Huston et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．85， pp．5879-5883 （1988）;およびWard et al．， Nature， Vol．334， pp． 544-546 （1989）参照）を、示唆発現される遺伝子単鎖抗体を産生するために採用することができる。単鎖抗体はＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸橋を介して連結することにより形成され、その結果、単鎖ポリペプチドが生じる。
【０１７１】
より好ましくは、「ヒト化抗体」の生産に有用な技術を、タンパク質、その断片または誘導体に対する抗体を産生するために採用することができる。このような技術は米国特許第５，９３２，４４８号；同第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，７７０，４２９号に開示されている。
【０１７２】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作出できる。例えば、このようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により生産できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより作製できるＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とするため、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Huse et al．， Science， Vol． 246， pp．1275-1281 （1989）参照）。
【０１７３】
次に、既知のタンパク質がそのサンプル内でどの程度発現されるかを、上記の抗体を用いる免疫アッセイ法により決定する。このような免疫アッセイ法としては、限定されるものではないが、ドットブロッティング、ウエスタンブロッティング、競合および非競合タンパク質結合アッセイ、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化セルソルター（ＦＡＣＳ）ならびによく用いられ、科学文献や特許文献に広く記載されている他のものが挙げられ、多くは商業的に使用される。
【０１７４】
検出を容易にするためには、サンドイッチＥＬＩＳＡが特に好ましく、いくつか変法が存在し、それらは全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的な前者のアッセイでは、非標識抗体を固相支持体に固定化し、供試サンプルを、好適なインキュベーション時間の後に結合した分子と、抗体−抗原の二元複合体を形成させるに十分な時間接触させる。この時点で、次に、検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識された第２の抗体を加え、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体の形成に十分な時間インキュベートする。反応していない物質を洗い流し、シグナルの観察によって抗原の存在を判定するか、あるいは既知量の抗原を含む対照サンプルと比較することにより定量してもよい。前者のアッセイのバリエーションとしては、結合させた抗体にサンプルおよび抗体の双方を同時に加える同時アッセイ、または標識した抗体と供試サンプルをまず合わせてインキュベートし、表面に結合させた非標識抗体に加える逆アッセイがある。これらの技術は当業者に周知であり、細かいバリエーションの可能性は容易に明らかとなるであろう。本明細書において「サンドイッチアッセイ」とは、基本的な二元配置技術に対する全てのバリエーションを含むものとする。本発明の免疫アッセイにとって制限因子となるのは、標識される抗体が対象とする遺伝子によって発現されるタンパク質に特異的な抗体でなればならないということだけである。
【０１７５】
この種のアッセイで最もよく用いられるリポーター分子は酵素、蛍光団または放射核含有分子のいずれかである。酵素免疫アッセイの場合、通常はグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩の手段により、酵素を第二の抗体と共役させる。しかしながら、容易に分かるであろうが、多様な種々の連結技術が存在し、これらは当業者に周知のものである。一般に用いられる酵素としては、とりわけホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。特定の酵素とともに用いる基質は通常、対応する酵素によって加水分解された際に検出可能な変色を呈するように選択される。例えば、p-ニトロフェニルホスフェートはアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとともに用いるのに好適であり、過ヨウ素酸塩コンジュゲートの場合には一般に１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが用いられる。また、上記に示した発色基質の代わりに蛍光産物を生じる蛍光性基質を用いることもできる。次に、適当な基質を含む溶液をこの三元複合体に加える。基質が第二の抗体に連結された酵素と反応し、定性的な可視シグナルを生じ、これをさらに通常は分光光度法により定量することができ、血清サンプル中に存在するタンパク質の量を評価することができる。
【０１７６】
あるいは、フルオレセインやローダミンのような蛍光化合物を、それらの結合能力を変化させることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長の光を照射することにより活性化させると、この蛍光団で標識された抗体は光エネルギーを吸収して分子を励起状態にし、その後、特徴的なより長い波長の光を放出する。この放出は光学顕微鏡で可視的に検出できる特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術はいずれも当技術分野で十分確立されており、本方法にとって特に好ましい。しかし、放射性同位元素、化学発光または生物発光分子などの他のリポーター分子も使用できる。必要とされる用途に合わせて手順をどのように変更すればよいかは、当業者であれば、容易に明らかとなる。
【０１７７】
また、翻訳状態の測定はいくつかのさらなる方法に従って行ってもよい。例えば、タンパク質の全ゲノムモニタリング（すなわち「プロテオーム」、Goffeau et al．， 前掲参照）は、結合部位がその細胞ゲノムによってコードされる複数のタンパク質種に特異的な、好ましくはモノクローナル抗体を固定化したものを含むマイクロアレイを構築することにより行うことができる。コードされるタンパク質の実質的画分に対する、または少なくとも、対象とする生物ネットワークモデルを試験または確認するために適切なタンパク質に対する抗体が存在することが好ましい。モノクローナル抗体を作製する方法は周知のものである。例えば、出典明示によりあらゆる目的でその全開示内容が本明細書の一部とされる、Harlow et al．， Antibodies:  A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor， NY （1988）参照。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は細胞のゲノム配列に基づいてデザインされた合成ペプチド断片に対して惹起される。このような抗体アレイでは、細胞由来のタンパク質をアレイに接触させ、それらの結合を当技術分野で公知のアッセイを用いてアッセイする。
【０１７８】
あるいは、タンパク質は二次元ゲル電気泳動システムにより分離することもできる。二次元ゲル電気泳動は当技術分野で周知のものであり、一般には一次元等電点電気泳動とその後の二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を伴う。例えば、Hames et al．， Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach， IRL Press， NY （1990）; Shevchenko et al．， Proc．Natl Acad．Sci．USA， Vol．93， pp． 1440-1445 （1996）; Sagliocco et al．， Yeast， Vol．12， pp．1519-1533 （1996）;およびLander， Science， Vol．274， pp．536-539 （1996）参照。得られた電気泳動図は、質量分析技術、ウエスタンブロッティング、およびポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いる免疫ブロット分析、ならびに内部およびＮ末端マイクロシーケンシングをはじめ、多くの技術により分析することができる。これらの技術を用いれば、薬物に曝された細胞（例えば、酵母）における場合、または例えば特定の遺伝子の欠失もしくは過剰発現により修飾された細胞における場合をはじめ、ある生理条件下で産生される全てのタンパク質の実質的な機能を同定することができる。
【０１７９】
生物学的状態の他の態様に基づく実施形態
その時存在する、現在のところｍＲＮＡの存在量以外の細胞成分をモニタリングすることはｍＲＮＡをモニタリングする際には出くわさない、ある技術的問題が見られるが、本発明の方法を用いれば、細胞機能の特徴に関連するタンパク質の活性が測定できることは当業者に明らかであり、本発明の実施形態はこのような測定に基づき得る。活性の測定は、特徴づけられている特定の活性に対して適当ないずれの機能的、生化学的または物理的手段によって行ってもよい。活性が化学変換を伴う場合、細胞のタンパク質を天然基質と接触させ、変換率を測定することができる。活性が多量体ユニットの会合、例えば活性化ＤＮＡ結合複合体とＤＮＡとの会合を伴う場合、会合したタンパク質の量、または転写されたｍＲＮＡの量など、会合の二次的結果を測定することができる。また、例えば細胞周期も制御の場合など、機能的活性が分かっている場合に限り、その機能の遂行を観測することもできる。しかしながら、分かった、また、測定されたタンパク質活性の変化は、本発明の上記の方法によって分析された応答データとなる。
【０１８０】
別の非限定的な実施形態では、応答データは細胞の生物学的状態の混合態様からなってもよい。応答データは、例えば、あるｍＲＮＡの存在量の変化、あるタンパク質の存在量の変化、およびあるタンパク質活性の変化から構築することができる。
【０１８１】
応答の予測のためのＳＮＰの使用
ＳＮＰ
ヒトゲノムにおける配列バリエーションは主としてＳＮＰからなり、残りの配列バリエーションとしては短いタンデムリピート（マイクロサテライトを含む）、長いタンデムリピート（ミニサテライト）ならびにその他の挿入および欠失がある。ＳＮＰはヒト集団において２つの択一的塩基が相当な頻度（＞１％など）で存在する場所である。ＳＰＮは多型の存在によるという点で「対立遺伝子的」であると言え、ある種のいくつかのメンバーはオリジナルの「対立遺伝子」のような非変異配列を有し、一方、その他のメンバーは変異した配列、すなわち変異型または突然変異対立遺伝子を有し得る。最も単純な場合では、ただ１つの変異した配列が存在し、その多型は二対立遺伝子的であると言われる。択一的突然変異が生じると、三対立遺伝子的多型などが生じ得る。ＳＮＰはゲノム中に拡散し、遺伝子の機能を変化させるＳＮＰは表現型のバリエーションに直接寄与するものとなり得る。それらの罹患率および拡散性により、ＳＮＰはヒト病態に関与する遺伝子を限局化する重要な手段となる可能性がある。例えば、パイロット研究を開示しており、２．３メガ塩基のＤＮＡ領域に２，２２７個のＳＮＰがマッピングされている、Wang et al．， Science， Vol．280， pp．1077-1082 （1998）参照。
【０１８２】
ＳＮＰと特定の表現型との関連は、ＳＮＰがその表現型の原因であるということを示すものではなく、あるいはＳＮＰがその表現型の原因であるという必要もない。むしろ、このような関連は、そのＳＮＰは表現型の決定因子が存在するゲノム上の位置付近に位置し、従って、これらの決定因子との、ひいては着目する表現型との関連が見出される可能性が高いということだけを示すと考えられる。よって、ＳＮＰは「真の」機能的変異体とはＬＤの関係にあり得る。対立遺伝子的関連としても知られるＬＤは、ゲノムの２つの異なる場所にある対立遺伝子が期待されたものよりも高い関連である場合に存在する。従って、ＳＮＰは、特定の表現型を生じる突然変異とのその近接性のために価値を有するマーカーとして役立ち得る。疾病と関連したＳＮＰはまた、それらが位置する遺伝子の機能に直接的な作用を持ち得る。配列変異体はアミノ酸変化を生じるか、またはエキソン−イントロンスプライシングを変更し、それにより関連タンパク質を直接修飾し得るか、あるいは、調節領域に存在して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現サイクルまたは安定性を変化させ得る。Nowotnym， Curr．Opin．Neurobiol．， Vol．11， pp．637-641 （2001）参照。
【０１８３】
一般的なゲノム変異体が疾病の感受性に果たす役割の最もよい例が、ＡＰＯＥ  ε４対立遺伝子がＡＤに果たす役割である。このε４対立遺伝子はＡＤの存在と、また、疾病発症の初期年齢と高い関連がある。それは研究された多くの集団で見られた強い関連である。St．George-Hyslop et al．， Biol．Psychiatry， Vol．47， pp．183-199 （2000）参照。多型バリエーションは卒中および心血管疾患にも（Wu et al．， Am．J．Cardiol．， Vol．87， pp．1361-1366 （2001）参照）；また、多発性硬化症にも関連づけられている（Oksenberg et al．， J．Neuroimmuol．， Vol．113， pp．171-184 （2001）参照）。
【０１８４】
多くの一般疾患を発症するリスク、および薬物に対する個々の応答とこれらの症状の処置に用いられる薬物の代謝がその基礎にあるゲノムバリエーションに、いずれか１つの変異体の効果は小さいながら、実質的に影響を受けるということがますます明確になりつつある。
【０１８５】
よって、ＳＮＰと臨床表現型との間の関連は、１）そのＳＮＰがその表現型の機能的一因であること、または２）その表現型を生じるゲノム上のＳＮＰの位置の近くに他の突然変異が存在することを示唆する。２つ目の可能性は遺伝の生物学に基づいている。大きなＤＮＡ片が遺伝し、互いに近接したマーカーは多くの世代について無関連の個体では組み換えられていない可能性があり、すなわち、これらのマーカーはＬＤの状態にある。
【０１８６】
よって、遺伝的連鎖マーカーとしての多型の使用は、特定の形質を担う遺伝子を限局化、同定および特性決定する上で臨床上有用である。特に、このようなマッピング技術は、種々の処置に対する応答をはじめ、種々の疾病または疾患に関連する形質を担う遺伝子の同定を考慮している。
【０１８７】
ＳＮＰの同定および特性決定
一本鎖コンホメーション多型分析、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によるヘテロ二重らせん分析、直接ＤＮＡ配列決定およびコンピューター法をはじめ、多くの異なる技術を用いてＳＮＰを同定および特性決定することができる。Shi， Clin．Chem．， Vol．47， pp．164-172 （2001）参照。公的データベースにおける豊富な配列情報のおかげで、コンピューターツールを用い、ある遺伝子（ｃＤＮＡまたはゲノム配列のいずれか）に関して独立に提案された配列をアライニングすることによりin silicoでＳＮＰを同定することができる。実験的に、またin silico法により得られたＳＮＰを比較したところ、SNPFinder（http://Ipgws．nci．nih．gov:82/perl/SNP/SNP_cgi．pl）に見出せる候補ＳＮＰの５５％がまた実験的にも発見されたことが示された。Cox et al．， Hum．Mutal．， Vol．17， pp．141-150 （2001）参照。しかしながら、これらのin silico法は真のＳＮＰの２７％が発見できたに過ぎなかった。
【０１８８】
最も一般的なＳＮＰ分類法は現在のところ、ハイブリダイゼーション、プライマー伸張および切断法を含む。これらの方法の各々は適当な検出系と連動しなければならない。検出技術としては蛍光分極（Chan et al．， Genome Res．， Vol．9， pp．492-499 （1999）参照）、ピロリン酸放出の蛍光測定検出（ピロシーケンシング）（Ahmadiian et al．， Anal．Biochem．， Vol．280， pp．103-110 （2000）参照）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく切断アッセイ、ＤＨＰＬＣ、および質量分析が挙げられる。Shi， Clin．Chem．， Vol．47， pp．164-172 （2001）;および米国特許第６，３００，０７６  Ｂ１号参照。ＳＮＰを検出および特性決定するその他の方法としては、米国特許第６，２９７，０１８  Ｂ１号および同第６，３００，０６３  Ｂ１号に記載されているものがある。上記参照文献の開示は出典明示によりその全開示内が本明細書の一部とされる。
【０１８９】
特に好ましい一実施形態では、多型の検出はいわゆるＩＮＶＡＤＥＲ（商標）技術（Third Wave Technologies Inc．から入手可能）の手段により行うことができる。このアッセイでは、上流にある特定の「インベーダー」オリゴヌクレオチドと下流にある部分的に重複したプローブが一緒に相補的ＤＮＡ鋳型と結合した際に特定の構造を形成する。この構造はＣｌｅａｖａｓｅ酵素により特定の部位において認識および切断され、その結果、プローブオリゴヌクレオチドの５’フラップが放出される。次にこの断片は、反応混合物中に含まれている合成二次標的および二次的蛍光標識シグナルプローブに対して、「インベーダー」オリゴヌクレオチドとして働く。この結果、Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素によりこの二次的シグナルプローブの特異的切断が起こる。蛍光共鳴エネルギー移動可能な色素分子で標識された、この二次的プローブが切断されると、蛍光シグナルが生じる。Ｃｌｅａｖａｓｅは重複するＤＮＡ配列またはフラップによって形成される構造に対してストリンジェントな要求を持ち、従って、下流のＤＮＡ鎖上の切断部位のすぐ上流にある単一の塩基対の誤対合を特異的に検出に用いることができる。Ryan et al．， Molecular  Diagnosis， Vol．4， No 2， pp．135-144 （1999）;およびLyamichev et al．， Nat．Biotechnol．， Vol．17， pp．292-296 （1999）参照、また、米国特許第５，８４６，７１７号および同第６，００１，５６７号も参照（なお、これらの開示は出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とする）。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、組成物は、２以上の多型部位にあるヌクレオチドの同一性を同時にプロービングするための２以上の示差的に標識されたジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含む。また、プライマー組成物は、多型部位を含有する２以上の領域の同時のターゲッティングおよび増幅を可能とするため、２セット以上の対立遺伝子特異的プライマー対を含んでもよいと考えられる。
【０１９１】
本発明のＩＬ−１βジェノタイピングオリゴヌクレオチドはまた、マイクロチップ、ビーズまたはスライドガラスなどの固相表面に固定化してもよいし、あるいはその固相表面で合成してもよい（例えば、ＷＯ９８／２００２０およびＷＯ９８／２００１９参照）。このような固定化ジェノタイピングオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、プローブハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ伸張アッセイをはじめとする種々の多型検出アッセイで用いてよい。本発明の固定化ＩＬ−１βジェノタイピングオリゴヌクレオチドは、複数の遺伝子の多型に関してＤＮＡサンプルを同時に迅速にスクリーニングするようデザインされたオリゴヌクレオチドの整列アレイを含み得る。
【０１９２】
本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、特定のＳＮＰのただ１つのヌクレオチドに相補的な３’末端ヌクレオチド、または好ましくは、３’末端から２番目のヌクレオチドを有し、それにより、そのヌクレオチドを含有する対立遺伝子が存在する場合にのみポリメラーゼ媒介伸張のプライマーとして働く。コード鎖または非コード鎖のいずれかにハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが本発明により意図される。ＩＬ−１β遺伝子多型を検出するためのＡＳＯプライマーは当業者に公知の技術を用いて開発できる。
【０１９３】
本発明の他のジェノタイピングオリゴヌクレオチドは本明細書で同定された新規多型部位の１つの１〜数個ヌクレオチドだけ下流に位置する標的領域とハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の新規多型１つを検出するためのポリメラーゼ媒介プライマー伸張法に有用であり、従って、このようなジェノタイピングオリゴヌクレオチドは本明細書では「プライマー伸張オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。好ましい一実施形態では、プライマー伸張オリゴヌクレオチドの３’末端はその多型部位のすぐ隣に位置するヌクレオチドと相補的なデオキシヌクレオチドである。
【０１９４】
もう１つの実施形態では、本発明は個別の容器にパッケージングされた少なくとも２つのジェノタイピングオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。このキットはまた、個別の容器にパッケージングされたハイブリダイゼーションバッファー（ここで、これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして使用される）などの他の成分を含んでもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドが標的領域の増幅のために使用される場合、このキットは個別の容器にパッケージングされたポリメラーゼ、およびＰＣＲなど、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸張のために最適化された反応バッファーを含み得る。上記のオリゴヌクレオチド組成物およびキットは個体においてＩＬ−１β遺伝子をジェノタイピングおよび／またはハプロタイピングするための方法に有用である。
【０１９５】
ジェノタイピング法の一実施形態は、個体から、その個体に存在している２コピーのＩＬ−１β遺伝子またはその断片を含む核酸混合物を単離すること、およびその２コピーの多型部位の１以上におけるヌクレオチド対の同一性を判定し、その個体にＩＬ−１β遺伝子型を割り付けることを含む。当業者ならば容易に理解できるように、個体におけるこの２「コピー」の遺伝子は同じ対立遺伝子であってもよいし、異なる対立遺伝子であってもよい。特に好ましい一実施形態では、このジェノタイピング法は各多型部位のヌクレオチド対の同一性を判定することを含む。
【０１９６】
一般には、核酸混合物またはタンパク質は血液サンプルまたは組織サンプルなど、個体から採取した生体サンプルから単離される。好適な組織サンプルとしては、全血、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬側塗抹、皮膚、ならびに筋肉または神経組織および毛髪などの特定器官の組織の生検が挙げられる。核酸混合物はゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡからなってもよく、後者２つの場合では、生体サンプルはＩＬ−１β遺伝子が発現される器官から得なければならない。さらに、当業者ならば、イントロン、５’および３’非転写領域またはプロモーター領域に位置する多型を検出するためにはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物は使用されないことが分かるであろう。ＩＬ−１β遺伝子断片が単離される場合には、それはジェノタイピングされる多型部位を含んでいなければならない。
【０１９７】
ハプロタイピング法の一実施形態は、個体から、その個体に存在する２コピーのうち一方のＩＬ−１β遺伝子またはその断片を含む核酸分子を単離すること、およびそのコピーの１以上の多型部位におけるヌクレオチドの同一性を判定し、その個体にＩＬ−１βハプロタイプを割り付けることを含む。この核酸は、限定されるものではないが、ＩＬ−１βイソ遺伝子を調製するための上記方法の１つ（ターゲティングin vivoクローニングが好ましいアプローチである）をはじめ、２コピーのＩＬ−１β遺伝子または断片を分離することができるいずれの方法を用いて単離してもよい。
【０１９８】
当業者ならば容易に分かるように、個々のクローンはいずれも個体に存在している２コピーのうち一方のＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプ情報をもたらすに過ぎない。個体のもう一方のコピーについてもハプロタイプ情報が望まれる場合には、さらなるＩＬ−１βクローンを調べる必要がある。一般には、ある個体の両コピーのＩＬ−１β遺伝子を９０％を超える確率でハプロタイピングするには少なくとも５つのクローンを調べなければならない。特に好ましい一実施形態では、各多型部位におけるヌクレオチドが同定される。
【０１９９】
好ましい一実施形態では、ある個体に関するＩＬ−１βハプロタイプ対が、その個体に存在している各コピーのＩＬ−１β遺伝子の１以上の多型部位における位相ヌクレオチド配列を同定することにより判定される。特に好ましい一実施形態では、このハプロタイピング法はＩＬ−１β遺伝子の各コピーの各多型部位における位相ヌクレオチド配列を同定することを含む。両コピーの遺伝子をハプロタイピングする場合は、その同定ステップは個別の容器に入れられた遺伝子の各コピーで行うのが好ましい。しかしながら、これら２コピーが異なるタグで標識されているか、またはそうでなければ個別に識別可能か同定可能であれば、同じ容器でこの方法を行うことができるということも考えられる。例えば、この遺伝子の第１および第２のコピーがそれぞれ異なる第１および第２の蛍光色素で標識され、かつ、多型部位をアッセイするために対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドがさらに第３の異なる蛍光色素で標識されるならば、第１の色素と第３の色素の組み合わせが検出されると第１の遺伝子コピーの多型が同定され、一方、第２の色素と第３の色素の組み合わせが検出されると第２の遺伝子コピーの多型が同定される。
【０２００】
ジェノタイピング法およびハプロタイピング法の双方では、多型部位のヌクレオチド（またはヌクレオチド対）の同一性を、一方または両方のコピーのＩＬ−１β遺伝子またはその断片から直接多型部位を含む標的領域を増幅することにより判定でき、その増幅領域の配列は常法により判定される。当業者ならば、多型部位において同系接合性である個体ではその部位において同じヌクレオチドが２回検出され、一方、その部位において異系接合性である個体であれば、２つの異なるヌクレオチドが検出されることが容易に分かるであろう。この多型はポジティブ型として知られるように直接同定してもよいし、あるいは、ネガティブ型同定と呼ばれる推論によって同定してもよい。例えば、参照集団においてＳＮＰがグアニンとシトシンであることが分かっている場合、部位は、その部位において同系接合性である全ての個体ではグアニンまたはシトシンのいずれかであること、あるいはその部位において異系接合性である個体ならばグアニンとシトシンの両者であることがポジティブに判定できる。あるいは、その部位は、グアニンではない（従ってシトシン／シトシン）またはシトシンではない（従ってグアニン／グアニン）ものとネガティブに判定できる。
【０２０１】
さらに、本明細書に記載の新規多型部位のいずれかに存在する対立遺伝子の同一性は、対象とする多型部位と連鎖不平衡にある、本明細書に開示されていない多型部位をジェノタイピングすることにより間接的に判定することができる。ある部位における特定の変異体の存在が第２の部位における別の変異体の予測性を高める場合、その２つの部位は連鎖不平衡状態にあると言われる。Stevens， Mol．Diag．， Vol．4， pp．309-317 （1999）参照。これまでに開示されている多型部位と連鎖不平衡にある多型部位はその遺伝子の領域内に位置するか、または本明細書では検討されてない他のゲノム内に位置する可能性がある。本明細書に記載の新規多型部位と連鎖不平衡にある多型部位のジェノタイピングは、限定されるものではないが、多型部位の対立遺伝子の同一性を検出するための上述の方法のいずれかにより行えばよい。
【０２０２】
標的領域は、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，９６５，１８８号参照）、リガーゼ連鎖反応（Barany et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．88， pp．189-193 （1991）;およびＷＯ９０／０１０６９参照）、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイをはじめとするいずれのオリゴヌクレオチド指定増幅法を用いて増幅してもよい。Landegren et al．， Science， Vol．241， pp．1077-1080 （1988）参照。このような方法でプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドはその多型部位を含む、またはその多型部位に隣接する核酸の領域と特異的にハイブリダイズしなければならない。一般には、これらのオリゴヌクレオチドは１０〜３５の間のヌクレオチド長、好ましくは１５〜３０の間のヌクレオチド長である。最も好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドは２０〜２５ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは当業者が通常考慮および実践する多くの因子によって異なる。
【０２０３】
標的領域を増幅するためには、転写に基づく増幅型（米国特許第５，１３０，２３８号および同第５，１６９，７６６号；ＥＰ３２９，８２２；およびＷＯ８９／０６７００参照）および等温法をはじめとする他の公知の核酸増幅手順を用いてよい。Walker et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．89， pp．392-396 （1992）参照。
【０２０４】
標的領域における多型はまた、当技術分野で公知のハイブリダイゼーションに基づくいくつかの方法の１つを用いて増幅の前または後にアッセイしてもよい。一般には、このような方法を行う上で、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが用いられる。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは示差的に標識されたプローブ対として使用でき、その対の一方のメンバーは標的配列の１つに完全な適合を示し、他方のメンバーは異なる変異体に完全な適合を示す。いくつかの実施形態では、１を超える多型部位が対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセットまたはオリゴヌクレオチド対を用いて一度に検出され得る。好ましくは、このセットのメンバーは、検出される多型部位の各々とハイブリダイズする場合、互いの融点は５℃以内、より好ましくは、２℃以内である。
【０２０５】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは両存在とも液相で行ってもよく、またはこのようなハイブリダイゼーションはオリゴヌクレオチドか標的ポリヌクレオチドのいずれかが固相支持体に共有結合または非共有結合されている場合に行える。結合は例えば抗体−抗原相互作用、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン、塩橋、疎水性相互作用、化学結合、ＵＶ架橋焼付などにより媒介することができる。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは固相支持体上で直接合成してもよいし、あるいは合成した後に固相支持体に結合させてもよい。本発明の検出方法に用いるのに好適な固相支持体としては、ケイ素、ガラス、プラスチック、ペーパーなどからなる支持体が挙げられ、これは例えばウェル（９６ウェルプレートなど）、スライド、シート、メンブラン、ファイバー、チップ、ディッシュおよびビーズに形成すればよい。この固相支持体は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドまたは標的核酸の固定化を助けるために処理、コーティングまたは誘導体化してもよい。
【０２０６】
ある個体のＩＬ−１β遺伝子の遺伝子型またはハプロタイプは、遺伝子の一方または両方のコピーを含む核酸サンプルを、ＷＯ９５／１１９９５に記載されているもののような核酸アレイまたはサブアレイにハイブリダイズさせることにより判定してもよい。これらのアレイは遺伝子型またはハプロタイプに含まれる多型の各々を表す対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのバッテリーを含む。
【０２０７】
多型が何であるかはまた、限定されるものではないが、リボプローブを用いるＲＮアーゼ保護法（Winter et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．82， p．7575 （1985）;およびMeyers et al．， Science， Vol．230， p．1242 （1985）参照）および大腸菌ｍｕｔＳタンパク質など、ヌクレオチドの誤対合を認識するタンパク質（Modrich， Ann．Rev．Genet．， Vol．25， pp．229-253 （1991）参照）をはじめとする誤対合検出技術を用いて判定してもよい。あるいは、変異体対立遺伝子は一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（Orita et al．， Genomics， Vol．5， pp．874-879 （1989）;およびHumphries et al．， Molecular Diagnosis of Genetic Diseases， Elles， Ed．， pp．321-340 （1996）参照））、または変性勾配ゲル電気泳動（Wartell et at．， Nucl．Acids Res．， Vol．18， pp．2699-2706 （1990）;およびSheffield et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．86， pp．232-236 （1989）参照）により同定することができる。
【０２０８】
多型を同定するには、ポリメラーゼ媒介プライマー伸張法を用いてもよい。このような方法のいくつかは特許および科学文献に記載されており、「Genetic Bit Analysis」法（ＷＯ９２／１５７１２）およびリガーゼ／ポリメラーゼ媒介Genetic Bit Analysis（米国特許第５，６７９，５２４号参照）が挙げられる。関連の方法がＷＯ９１／０２０８７、ＷＯ９０／０９４５５、ＷＯ９５／１７６７６、米国特許第５，３０２，５０９号および同第５，９４５，２８３号に記載されている。伸張された、多型を含むプライマーは質量分析に検出すればよい。米国特許第５，６０５，７９８号参照。別のプライマー伸張法として、対立遺伝子特異的ＰＣＲがある。Ruafio et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．17， p． 8392 （1989）; Ruafio et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．19， pp．6877-6882 （1991）; ＷＯ９３／２２４５６;およびTurki et al．， J．Clin．Invest．， Vol．95， pp．1635-1641 （1995）参照。さらに、対立遺伝子特異的プライマーを用いてその核酸の複数の領域を同時に増幅することにより、複数の多型部位を検討することもできる。Wallace et al．（ＷＯ８９／１０４１４）参照。
【０２０９】
好ましい実施形態では、各民族地理学的群に関するハプロタイプ頻度データを調べ、それがＨＷＥと一致するかどうかを判定する。ＨＷＥ（Hartl et al．， Principles of Population Genomics， Sinauer Associates， 3rd Edition， Sunderland， MA （1997）参照）は、ハプロタイプ対Ｈ１／Ｈ２の発見頻度が、Ｈ１≠Ｈ２であるときはＰＨ−Ｗ（Ｈ１／Ｈ２）＝２ｐ（Ｈ１）ｐ（Ｈ２）に等しく、Ｈ１＝Ｈ２のときにはＰＨ−Ｗ（Ｈ１／Ｈ２）＝ｐ（Ｈ１）ｐ（Ｈ２）に等しいと仮定する。観測されるハプロタイプ頻度と期待されるハプロタイプ頻度の間の統計学的に有意な差はその集団群内の著しい同系交配、その遺伝子に対する強い選択圧、サンプリングの偏りおよび／またはジェノタイピングプロセスの誤差をはじめとする１以上の因子によるものであり得る。民族地理学的群でＨＷＥからの大きな偏差が見られる場合、その偏差がサンプリングの偏りによるものかどうかを知るためにその群の個体数を増やすことができる。もし、サンプルサイズを大きくしても観測されるハプロタイプ対頻度と期待されるハプロタイプ頻度対の間の差が小さくならなければ、例えばＣＬＡＳＰＥＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）技術（米国特許第５，８６６，４０４号）、ＳＭＤまたは対立遺伝子特異的広領域ＰＣＲ（Michalotos-Beloin et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．24， pp．4841-4843 （1996）参照）などの直接的なハプロタイピング法を用いて個体をハプロタイピングすることを考えたいであろう。
【０２１０】
ＩＬ−１βハプロタイプ対を予測するための本方法の一実施形態では、割り付けステップは以下の分析を行うことを含む。まず、可能性のある各ハプロタイプ対を、参照集団のハプロタイプ対と比較する。一般に、参照集団のハプロタイプ対の１つが可能性のあるハプロタイプ対と適合し、その対が個体に割り付けられる。場合によっては、参照ハプロタイプ対に表されているただ１つのハプロタイプが、ある個体の可能性のあるハプロタイプ対と一致することがあり、このような場合、その個体はこの既知のハプロタイプと、可能性のあるハプロタイプ対から既知のハプロタイプを差し引くことによって得られる新規ハプロタイプを含むハプロタイプに割り付けられる。まれな場合、参照集団に可能性のあるハプロタイプ対と一致するハプロタイプがないか、あるいはまた、複数の参照ハプロタイプ対が可能性のあるハプロタイプ対と一致する。このような場合、例えば、ＣＬＡＳＰＥＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）技術（米国特許第５，８６６，４０４号）、ＳＭＤまたは対立遺伝子特異的広領域ＰＣＲ（Michalotos-Beloin et al．， 前掲参照）などの直接分子を用いて個体をハプロタイピングするのが好ましい。
【０２１１】
ｍＲＮＡの存在量または活性を修飾する方法
本発明の種々の実施形態は、発現されるｍＲＮＡの存在量または活性の変更または修飾が臨床上有益な効果をもたらす。ＲＮＡの存在量および活性を修飾する方法は現在のところ、リボザイム、アンチセンス種、二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーの４つのクラスに属する。Good et al．， Gene Ther．， Vol．4， pp． 45-54 （1997）参照。制御可能なこれらのものの適用または細胞曝露は、ｍＲＮＡの存在量および活性（その、活性な、または検出可能な遺伝子発現産物、すなわち、タンパク質への翻訳を含む）をはじめとするＲＮＡ存在量の制御可能な摂動を可能とする。
【０２１２】
リボザイム
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様の様式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分子である。リボザイムはＲＮＡ切断反応を触媒することができる。Cech， Science， Vol．236， pp．1532-1539 （1987）; ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９０／１１３６４（1990）; and Sarver et al．， Science， Vol．247， pp． 1222-1225 （1990）参照。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を修飾することにより、リボザイムを分子内の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを切断するように合成することができる。例えば、Cech， Amer．Med．Assn．， Vol．260， pp．3030 （1988）参照。よって、特定の配列を含むｍＲＮＡだけが切断され、不活性化される。
【０２１３】
２つの基本的なタイプのリボザイムとして、例えばRossie et al．， Pharmacol．Ther．， Vol．50， pp．245-254 （1991）に記載されているような「ハンマーヘッド」型と、例えばHampel et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．18， pp．299-304 （1999）および米国特許第５，２５４，６７８号に記載されているような「ヘアピン」リボザイムがある。ヘアピンおよびハンマーヘッドＲＮＡリボザイムは特定の標的ｍＲＮＡを特異的に切断するようにデザインすることができる。リボザイム活性を有する短いＲＮＡ分子をデザインするための規則が確立されており、それらは他のＲＮＡ分子を特異性の高い方法で切断することができ、事実上全ての種のＲＮＡをターゲッティングできる。Haseloff et al．， Nature， Vol．334， pp．585-591 （1988）; Koizumi et al．， FEBS Lett．， Vol．228， pp．228-230 （1988）;およびKoizumi et al．， FEBS Lett．， Vol．239， pp．285-288 （1988）参照。
【０２１４】
リボザイム法は細胞を曝露し、細胞内などでこのような小さなＲＮＡリボザイム分子の発現を誘導することを含む。Grassi et al．， Ann．Med．， Vol．28， pp．499-510 （1996）; Gibson， Cancer and Metastasis Rev．， Vol．15， pp．287-299 （1996）参照。開示されている少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡへターゲッティングされたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現を利用して、その遺伝子によりコードされているタンパク質を阻害することができる。
【０２１５】
リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で直接細胞に送達することもできるし、あるいは、目的のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入することもできる。リボザイムは通常、ｍＲＮＡを切断して、それにより細胞内のｍＲＮＡの存在量を修飾する上で触媒上有効となるよう十分な数で発現させることができる。Cotten et al．，‘Ribozyme Mediated Destruction of ＲＮＡ In Vivo’， EMBO J．， Vol．8， pp．3861-3866（1989）参照。特に、これまでの規則に従ってデザインし、例えば標準的なホスホルアミダイト化学により合成されたリボザイムコードＤＮＡ配列はアンチコドンステムの制限酵素部位と、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のループに連結することができ、次にこれを当業者に通常の方法により目的の細胞へ形質転換し、そこで発現させることができる。好ましくは誘導プロモーター（例えば、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント）もまたこの構築物に導入すれば、リボザイム発現を選択的に制御することができる。飽和的に使用するためには、高く、かつ、構成的な活性のプロモーターを使用することができる。ｔＤＮＡ遺伝子（すなわち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子）は、それらのサイズが小さく、転写率が高く、また、異なる種類の組織で偏在発現することから本適用に有用である。
【０２１６】
従って、リボザイムは通常、事実上ｍＲＮＡ配列を切断するようにもデザインすることができ、細胞をこのようなリボザイム配列をコードするＤＮＡで形質転換することができ、これにより、制御可能で触媒的に有効な量のリボザイムが発現される。よって、細胞内のいずれのＲＮＡ種の存在量でも修飾または摂動させることができる。
【０２１７】
リボザイム配列は本質的にアンチセンスヌクレオチドに関して記載されたものと同様の方法で修飾することができ、例えば、リボザイム配列は修飾された塩基部分を含み得る。
【０２１８】
アンチセンス分子
もう１つの実施形態では、標的ＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）種の活性、特にその翻訳率はアンチセンス核酸の制御可能な適用によって制御可能なように阻害することができる。高レベルで適用すれば飽和型の阻害が得られる。本明細書において「アンチセンス核酸」とは、コード領域および／または非コード領域に双方的ないくつかの配列のために、標的ＲＮＡの配列特異的な（例えば、非ポリＡ）一部、例えばその翻訳開始領域とハイブリダイズすることができる核酸をさす。本発明のアンチセンス核酸は二本鎖または一本鎖ＲＮＡもしくはＲＮＡまたはその修飾物もしくは誘導体であるオリゴヌクレオチドであってよく、これらは制御可能な方法で直接細胞に投与することができるか、または標的ＲＮＡの翻訳を摂動するに十分な制御可能な量で外因的に導入された配列を転写させることにより細胞内で生産することができる。
【０２１９】
好ましくは、アンチセンス核酸は少なくとも６個のヌクレオチドからなり、好ましくは、オリゴヌクレオチド（６個のオリゴヌクレオチド〜約２００個のオリゴヌクレオチド）である。特定の態様では、このオリゴヌクレオチドは少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチドまたは少なくとも２００個のヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾型であり、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このオリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で修飾することができる。このオリゴヌクレオチドはペプチド、または細胞膜を通過する輸送を助ける薬剤（例えば、Letsinger et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．86， pp．6553-6556 （1989）; Lemaitre et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．84， pp．648-652 （1987）;およびＰＣＴ国際公開公報ＷＯ８８／０９８１０（１９８８）参照）、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Krol et al．， Biotechnol．Tech．， Vol．6， pp． 958-976 （1988）参照）またはインターカレート剤（例えば、Zon， Pharmacol．Res．， Vol．5， pp．539-549 （1988）参照）など、他の付加基を含んでもよい。
【０２２０】
本発明の好ましい一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは一本鎖ＤＮＡとして提供される。このオリゴヌクレオチド通常当技術分野で公知の構成要素で、その構造のいずれの位置で修飾してもよい。
【０２２１】
典型的なアンチセンスアプローチとしては、コードされる遺伝子のｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の調製を含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドはコードされる遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし、翻訳を妨げる。アンチセンスヌクレオチド配列の、目的の遺伝子とハイブリダイズする能力はそのアンチセンスヌクレオチド配列の相補性の程度と長さによって異なる。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、それが含み得るＲＮＡとの塩基の誤対合が増えて、なお、安定な二重らせんまたは三重らせんを形成する。当業者ならば、ハイブリダイズした複合体の融点を求めるための常法を用いることで、誤対合の許容度を決定することができる。
【０２２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくはそのｍＲＮＡの５’末端、例えば、ｍＲＮＡの開始部位、すなわちＡＵＧに相補的な領域に及ぶ（該領域を含む）非翻訳配列と相補的となるようにデザインする。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列も、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有効であることが示されている。例えば、Wagner， Nature， Vol．372， p． 333 （1994）参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡコード領域に相補的となるようにデザインすることもできるが、このようなオリゴヌクレオチドはあまり有効な翻訳阻害剤ではない。
【０２２３】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾塩基部分を含み、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンからなる群から選択される。
【０２２４】
もう１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースからなる群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含む。
【０２２５】
なおもう１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール、またはその類似体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０２２６】
なおもう１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは２−ａ−アノマーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のＢユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に走っている相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する。Gautier et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．15， pp．6625-6641 （1987）参照。
【０２２７】
このオリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などと共役させてもよい。
【０２２８】
本発明のアンチセンス核酸は標的ＲＮＡ種の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は好ましいが、必ずしも必要ではない。本明細書に言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成し得るに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重らせんＲＮＡのうちの一本の鎖を試験してもよく、あるいは、三重らせんの形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズ能はアンチセンス核酸の相補性の程度と長さの双方によって異なる。一般に、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、それが含み得る標的ＲＮＡとの塩基の誤対合が増えて、なお、安定な二重らせん（または場合によっては三重らせん）を形成する。当業者ならば、ハイブリダイズした複合体の融点を求めるための常法を用いることで、誤対合の許容度を確認することができる。標的ＲＮＡの翻訳の阻害に有効なアンチセンス核酸の量は標準的なアッセイ技術により決定することができる。
【０２２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知の標準法、例えば、Biosearch， Applied Biosystemsなどから市販されているものなどの自動ＤＮＡシンセサイザーを用いることで合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはStein et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．16， p．3209 （1988）の方法により合成することができ、メチルホスホネート オリゴヌクレオチドはＣＰＧ（controlled pore glass）高分子支持体（Sarin et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．85， pp．7448-7451 （1988）参照）などの使用により調製することができる。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al．， Nucl．Acids Res．， Vol．15， pp．6131-6148 （1987）参照）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al．， FEBS Lett．， Vol．215， pp．327-330 （1987）参照）である。
【０２３０】
合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、次に、制御された、または飽和型の様式で細胞に投与することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれらが細胞に取り込まれるように制御されたレベルで細胞の増殖環境中に置くことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みは当技術分野で周知の方法を用いることで補助することができる。
【０２３１】
宿主細胞へ導入する場合、アンチセンスヌクレオチド配列はその遺伝子に対応する細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、その結果、例えば細胞内で転写および／または翻訳を阻害することにより、コードされているタンパク質の発現を阻害する。
【０２３２】
アンチセンスヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子は、例えば、細胞内で転写された際にコードされているその遺伝子のｍＲＮＡの少なくともユニークな部分に相補的なＲＮＡを産生する発現ベクターとして送達することができる。あるいは、アンチセンスヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子は、ex vivoで調製され、細胞に導入された際に、その遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることによりコードされているタンパク質の発現の阻害をもたらすオリゴヌクレオチドプローブである。
【０２３３】
好ましくは、このオリゴヌクレオチドは人工ヌクレオチド間結合を含み、これによりそのアンチセンス分子はエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ耐性となり、従って、細胞内で安定となる。アンチセンスヌクレオチド配列として用いられる修飾核酸分子の例としては、ＤＮＡのホスホルアミダート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート類似体がある。例えば、 米国特許第５，１７６，９９６号；同第５，２６４，５６４号；および同第５，２５６，７７５号参照。アンチセンス療法において有用なオリゴマーを調製する一般的なアプローチ。例えば、 Van der Krol．， Biotechnol．Tech．， Vol．6， pp．958-976 （1988）;およびStein et al．， Cancer Res．， Vol．48， pp．2659-2668 （1988）参照。
【０２３４】
細胞内発現されるアンチセンス分子
上述のように、アンチセンスヌクレオチドは種々の技術により、ＩＬ１β遺伝子をin vivo発現する細胞に送達することができる。しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに十分な細胞内濃度を得るのが難しい場合もある。よって、もう１つの実施形態では、アンチセンスヌクレオチド配列を含む核酸をプロモーター、すなわち、発現構築物を形成するために特定の遺伝子の転写を開始するのに必要なＤＮＡ配列の転写制御下に置く。本発明のアンチセンス核酸は外因性の配列からの転写により細胞内で制御可能に発現される。発現が高レベルで制御されれば、飽和型の摂動または修飾が得られる。例えば、ベクターはin vivo導入可能であり、その結果、ベクターは細胞に取り込まれ、その細胞内でベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。このようなベクターはアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、転写されて目的のアンチセンスＲＮＡを産生する限り、エピソームとして留まることもできるし、あるいは染色体に組み込むこともできる。このようなベクターは当技術分野で標準的な組み換えＤＮＡ技術の方法により構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、または哺乳類細胞での複製および発現に用いられる当技術分野で公知の他のものであってもよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、対象となる細胞において当技術分野で公知のいずれのプロモーターによるものであってもよい。このようなプロモーターは誘導型であっても構成型であってもよい。最も好ましくは、プロモーターは制御可能で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの制御された発現を達成するために外因性部分の投与により誘導可能なものである。このような制御可能なプロモーターとしては、Ｔｅｔプロモーターがある。哺乳類細胞用として使用可能な他のプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon， Nature， Vol．290， pp．304-310 （1981）参照）、ラウス肉腫ウイルスの長い３’末端リピートに含まれているプロモーター（Yamamoto et al．， Cell， Vol．22， pp．787-797 （1980）参照）、ヘルペスチミジンキナーゼ プロモーター（Wagner et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．78， pp．1441-1445 （1981）参照）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al．， Nature， Vol．296， pp．39-42 （1982）参照）が挙げられる。
【０２３５】
このように、アンチセンス核酸は事実上いずれのｍＲＮＡ配列をターゲテッィングするようにも通常デザインでき、通常、細胞をこのようなアンチセンス配列をコードする核酸で形質転換するか、細胞を曝すかでき、その結果、有効かつ制御可能な、または飽和量のアンチセンス核酸が発現される。よって、細胞内での事実上いずれの種のＲＮＡの翻訳も修飾または摂動することができる。
【０２３６】
二本鎖ＲＮＡ
また、開示されている遺伝子のうち少なくとも１つに対応する二本鎖ＲＮＡ、すなわち、センス−アンチセンスＲＮＡを利用して、開示されている遺伝子のうち少なくとも１つの発現を妨げることもできる。二本鎖ＲＮＡによる内因性遺伝子の機能および発現の妨害はＣ．エレガンス（C．elegans）などの種々の生物で示されている。例えば、Fire et al．， Nature， Vol．391， pp．806-811 （1998）参照。
【０２３７】
ＲＮＡアプタマー
最後に、さらなる実施形態では、ＲＮＡアプタマーを細胞に導入または細胞で発現させることができる。ＲＮＡアプタマーは、翻訳を特異的に阻害することができるＴａｔおよびＲｅｖ  ＲＮＡ（Good et al．， Gene Ther．， Vol．4， pp．45-54 （1997）参照）などのタンパク質の特異的ＲＮＡリガンドである。
【０２３８】
発現タンパク質の存在量または活性の修飾方法
タンパク質の存在量を修飾する方法、とりわけ、タンパク質分解速度を変更するもの、および抗体（天然標的タンパク質種の活性の存在量に影響を及ぼすタンパク質と結合する）が挙げられる。タンパク質活性を直接修飾する方法としては、とりわけ、抗体、ドミナントネガティブ突然変異、特定の薬物または化学部分の使用が挙げられる。
【０２３９】
タンパク質種の分解速度が上昇（または低下）すると、その種の存在量が低下（または増加）する。本発明では、高温および／または当技術分野で公知の特定の薬物への曝露に応じて標的タンパク質の分解速度を高める方法を使用できる。例えば、このような方法１つでは、熱誘導性または薬物誘導性Ｎ末端デグロン（degron）を用いるが、これは高温（例えば３７℃）で急速なタンパク質分解を促進する分解シグナルを露出し、低温（例えば２３℃）では隠されて急速分解を妨げるＮ末端タンパク質断片である。Dohmen et al．， Science， Vol．263， pp． 1273-1276 （1994）参照。このようなデグロンの例としては、Ｎ末端のＶａｌがＡｒｇで置換され、６６番のＰｒｏがＬｅｕで置換されているマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ変異体、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓがある。この方法によれば、例えば標的タンパク質Ｐの遺伝子は当技術分野で公知の標準的な遺伝子ターゲッティング法（Lodish et al．， Molecular Biology of the Cell， W．H．Freeman and Co．， NY （1995）、特に第８節参照）により、融合タンパク質Ｕｂ−Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓ−Ｐ（「Ｕｂ」はユビキチンを表す）をコードする遺伝子で置換されている。このＮ末端ユビキチンは翻訳された後に急速に切断されてＮ末端デグロンを露出する。低温では、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓの内部にあるリジンは露出されておらず、融合タンパク質のユビキチン化は起こらず、分解は遅く、活性のある標的タンパク質レベルは高くなる。高温（メトトレキサート不在）では、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓの内部にあるリジンは露出され、融合タンパク質のユビキチン化が起こり、分解は急速で、活性のある標的タンパク質レベルは低くなる。
【０２４０】
また、この技術では、熱による分解の活性化はメトトレキサート曝露により制御可能に遮断されるので、分解速度の制御可能な修飾が可能となる。この方法は、薬物および温度変化などの他の誘導因子に応答性のある他のＮ末端デグロンにも採用できる。また、当業者ならば、もう１つのドミナントネガティブ戦略として、標的タンパク質と結合し、それを阻害する抗体の発現が利用できることが分かるであろう。
【０２４１】
小分子薬物またはリガンドによる、発現されるタンパク質活性の修飾
さらに、ある特定の標的タンパク質の活性は外因性の薬物またはリガンドに曝すことにより、制御された、または飽和型の様式で修飾または摂動することができる。本発明の方法はしばしば癌を処置するための種々の薬物の有用性を試験または確認するために適用されることから、薬物曝露は細胞成分、ｍＲＮＡおよび発現タンパク質の双方を修飾／摂動する重要な方法である。好ましい一実施形態では、インプットした細胞成分を薬物曝露または遺伝子操作（遺伝子欠失またはノックアウトなど）のいずれかにより摂動させ、系の応答を、以下に記載する遺伝子転写物アレイへのハイブリダイゼーションなどの遺伝子発現技術により測定する。
【０２４２】
ある好ましい場合では、細胞内でただ１つの標的タンパク質とのみ相互作用し、そのただ１つの標的タンパク質のみの活性を変更し、その活性を増強するか、または低下させることが知られている薬物である。細胞を量を変えた薬物に段階的に曝すことにより、インプットとして標的タンパク質を含むネットワークモデルの摂動が起こる。飽和型の曝露は飽和型の修飾／摂動を生じる。例えば、シクロスポリンＡはシクロフィリンとの複合体を介して作用するカルシニュリンタンパク質の極めて特異的なレギュレーターである。従って、シクロスポリンＡの一連の滴定を用いて、カルシニュリンタンパク質の、所望のいずれの阻害量でも作り出すことができる。あるいは、シクロスポリンＡへの飽和型の曝露により、カルシニュリンタンパク質は最大に阻害される。
【０２４３】
抗体およびアンタゴニストによるタンパク質活性の修飾
「アンタゴニスト」とは、遺伝子によりコードされているタンパク質と結合した際にその活性を阻害する分子をさす。アンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、炭水化物および小分子が挙げられる。
【０２４４】
特に有用な実施形態では、アンタゴニストは少なくとも１つの遺伝子により発現される細胞表面タンパク質に特異的な抗体である。治療薬として有用な抗体は上記のような抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントを包含する。抗体は単独で治療のエフェクターとして働き得るし、あるいは、他の細胞を動員して、実際に細胞の死滅を果たし得る。抗体はまた、化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒、百日咳毒などの試薬と共役させ、標的薬剤として働かせてもよい。あるいは、このエフェクターは、腫瘍標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０２４５】
治療に使用できる抗体−治療薬コンジュゲートの例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
１）１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ’、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅなどの放射性核種と結合された抗体。例えば、Goldenberg et al．， Cancer Res．， Vol．41， pp．4354-4360 （1981）; Carrasquillo et al．， Cancer Treat．Rep．， Vol．68， pp．317-328 （1984）; Zalcberg et al．; J．Natl．Cancer Inst．， Vol．72， pp． 697-704 （1984）; Jones et al．， Int．J．Cancer， Vol．35， pp．715-720 （1985）; Lange et al．， Surgery， Vol． 98， pp．143-150 （1985）; Kaltovich et al．， J．Nucl．Med．， Vol．27， pp．897 （1986）;またはder et al．， Int．J．Radiother．Oncol．Biol．Phys．， Vol．8， pp．259-261 （1982）; Courtenay-Luck et al．， Lancet， Vol．1， pp．1441-1443 （1984）;およびEttinger et al．， Cancer Treat．Rep．， Vol．66， pp．289-297 （1982）参照；
２）メトトレキサート、アドリアマイシンおよびリンホカイン（インターフェロンなど）などの薬物または生物応答改変剤と結合された抗体。例えば、Chabner et al．， ‘Principles and Practice of Oncology’， Cancer， Vol．1， pp．290-328 （1985）; Oldham et al．， ‘Principles and Practice of Oncology’， Cancer， Vol．2， pp．2223-2245 （1985）; Deguchi et al．， Cancer Res．， Vol．46， pp．43751-43755 （1986）; Deguchi et al．， Fed．Proc．， Vol．44， p．1684 （1985）; Embleton et al．， Br．J．Cancer， Vol．49， pp．559-565 （1984）; and Pimm et al．， Cancer Immunol．Immunother．， Vol．12， pp．125-134 （1982）参照；
３）毒素と結合された抗体。例えば、Uhr et al．， Monoclonal Antibodies and Cancer， Academic Press， Inc．， pp．85-98 （1983）; Vitetta et al．， Biotechnol．Bio．Frontiers， pp．73-85 （1984）;およびVitetta et al．， Science， Vol．219， pp．644-650 （1983）参照；
４）ヘテロ機能性抗体、例えば、複合体が癌腫とエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞などのキラー細胞）の双方と結合するように別の抗体と結合または組み合わせた抗体。例えば、Perez et al．， J．Exper．Med．， Vol．163， pp．166-178 （1986）;およびLau et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．82， pp．8648-8652 （1985）参照；および
５）天然、すなわち、非共役または非複合抗体。例えば、Herlyn et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．79， pp．4761-4765 （1982）; Schulz et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．80， pp．5407-5411 （1983）; Capone et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．80， pp．7328-7332 （1983）; Sears et al．， Cancer Res．， Vol．45， pp．5910-5913 （1985）; Nepom et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．81， pp．2864-2867 （1984）; Koprowski et al．， Proc．Nat．Acad．Sci．USA， Vol．81， pp．216-219 （1984）;およびHoughton et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．82， pp．1242-1246 （1985）参照。
【０２４６】
上記のように抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントと治療薬とを結合させる方法は当技術分野で周知のものであり、例えば、上記の参照文献に示されている方法に記載されている。
【０２４７】
治療薬としてのアンタゴニストの使用
なおもう１つの実施形態では、浮腫を処置する治療薬としての有用なアンタゴニストは開示されている遺伝子の１つによりコードされるタンパク質の阻害剤であり得る。
【０２４８】
標的タンパク質の活性はまた、（中和）抗体により低下させることができる。このような抗体に制御して、または飽和的に曝すことにより、タンパク質の存在量／活性は制御された、または飽和型の様式で修飾または摂動することができる。例えば、タンパク質表面上の好適なエピトープに対する抗体は、活性型を非凝集性野生型に比べて活性の小さい、または最小限の活性の複合体へと凝集することにより、野生型活性型の標的タンパク質の存在量を低下させ、そしてそれにより間接的に活性を低下させ得る。あるいは、抗体は、例えば活性部位と直接相互作用することによって、または活性部位への基質の接近を遮断することによって、タンパク質活性を直接低下させることもできる。逆に、ある特定の場合では、（活性化）抗体はまた、タンパク質およびそれらの活性部位と相互作用し、結果としての活性を増強させ得る。いずれの場合でも、（記載される種々のタイプの）抗体は（記載の方法により）特定のタンパク質種に対して惹起させ、それらの効果をスクリーニングすることができる。これらの抗体の効果をアッセイし、標的タンパク質種の濃度および／または活性を上昇または低下させる好適な抗体を選択することができる。このようなアッセイとしては、抗体を細胞へ導入すること（下記参照）、および当技術分野で公知の標準的手段（免疫アッセイなど）により、野生型量の濃度または標的タンパク質の活性をアッセイすることを含む。野生型の正味の活性は既知の標的タンパク質活性に適当なアッセイ手段によりアッセイすることができる。
【０２４９】
抗体の細胞への導入
抗体は、例えば抗体の細胞へのマイクロインジェクション（Morgan et al．， Immunol．Today， Vol．9， pp．84-86 （1988）参照）または目的抗体をコードするハイブリドーマｍＲＮＡの細胞への形質転換（Burke et al．， Cell， Vol．36， pp．847-858 （1984）参照）をはじめとする多くの様式で細胞へ導入することができる。さらなる技術では、組換え抗体を、標的タンパク質と結合し、同時に標的タンパク質活性を遮断するよう操作し、幅広い非リンパ様細胞種で異所発現させることができる。Biocca et al．， Trends Cell Biol．， Vol．5， pp．248-252 （1995）参照。この抗体の発現は好ましくは、Ｔｅｔプロモーターなどの制御可能なプロモーター、または構成的な活性なプロモーター（飽和型の摂動を得るため）の制御下にある。最初のステップは標的タンパク質に対して適当な特異性を有する特定のモノクローナル抗体を選択することである（下記参照）。次に、選択された抗体の可変領域をコードする配列を、例えば完全抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ペプチドリンカーにより結合されたＶＨおよびＶＬ領域）（「ＳｃＦｖ」フラグメント）、ダイアボディー（特異性の異なる２つの会合したＳｃＦｖフラグメント）などをはじめとする操作された種々の抗体形式にクローニングすることができる。Hayden et al．， Curr．Opin．Immunol．， Vol．9， pp．210-212 （1997）参照。細胞内で発現された種々の形式の抗体は、それらを種々の既知の細胞内リーダー配列との融合物として発現させることにより、細胞コンパートメント （例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなど）にターゲッティングすることができる。Bradbury et al．， Antibody Engineering， Vol．2， pp．295-361 （1995）参照。特に、ＳｃＦｖ形式は細胞質のターゲッティングに特に好適であることが明らかである。
【０２５０】
有用な抗体の種類
抗体タイプとしては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の生産には、当技術分野で公知の種々の手順を用い得る。抗体の生産のために、種々の宿主動物を標的タンパク質の注射により免疫化することができ、このような宿主動物としては、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられる。宿主種に応じ、免疫応答を増強するために種々のアジュバントを使用することができ、これらには限定されるものではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバント；水酸化アルミニウムなどの無機ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、ジニトロフェノールなどの界面活性剤；ならびにカルメット・ゲラン菌（Bacillus Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【０２５１】
モノクローナル抗体
標的タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するためには、連続的な細胞培養系により抗体分子の生産をもたらすいずれの技術を用いてもよい。このような技術としては、限定されるものではないが、Kohler et al．， Nature， Vol．256， pp．495-497 （1975）が最初に開発したハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al．， Immunol．Today， Vol．4， p．72 （1983）参照）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al．， Monoclonal Antibodies Cancer Ther．， pp．77-96 （1985）参照）が挙げられる。本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は最近の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）を用いた無菌動物で生産することができる。本発明によれば、ヒト抗体が使用でき、これらはヒトハイブリドーマにより（Cote et al．， Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．80， pp．2026-2030 （1983）参照）、またはin vitroにてヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することにより（Cole et al．， （1985）， 前掲参照）得ることができる。実際、本発明によれば、標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子に由来する遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともにスプライシングすることにより、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Morrison et al．（1984）， 前掲; Neuberger et al．（1984）， 前掲; Takeda et al．（1985）， 前掲参照）を使用でき、このような抗体も本発明の範囲内にある。
【０２５２】
さらに、モノクローナル抗体が有利である場合、それらはファージディスプレー技術を用いて、大きな抗体ライブラリーから択一的に選択することができる。Marks et al．， J．Biol．Chem．， Vol．267， pp．16007-16010 （1992）参照。これらの技術を用い、最大１０１２の異なる抗体のライブラリーをｆｄ繊維状ファージの表面で発現させ、モノクローナル抗体の選択に利用可能な抗体の「シングルポット（single pot）」in vitro免疫系が作出されている。Griffiths et al．， EMBO J．， Vol．13， pp．3245-3260 （1994）参照。このようなライブラリーからの抗体の選択は、ファージと固定化標的タンパク質とを接触させ、標的に結合したファージを選択およびクローニングし、その抗体可変領域をコードする配列を目的の抗体形式を発現する適当なベクターにサブクローニングすることを含む、当技術分野で公知の技術により行うことができる。
【０２５３】
本発明によれば、単鎖抗体の生産に関して記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、標的タンパク質に特異的な単鎖抗体を生産するために採用することができる。本発明のさらなる実施形態では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記載されている技術（Huse et al．（1989）， 前掲参照）を用いれば、標的タンパク質に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定することができる。
【０２５４】
標的タンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントは当技術分野で公知の技術により作製することができる。例えば、このようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより作製できるＦａｂ’フラグメント；抗体分子をペプシンおよび還元剤およびＦｖフラグメントで処理することにより作製できるＦａｂフラグメントが挙げられる。
【０２５５】
抗体の生産において、目的抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡにより達成することができる。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するためには、標的タンパク質と結合する抗体に関して、作製したハイブリドーマまたはファージディスプレー抗体ライブラリーをアッセイすればよい。
【０２５６】
タンパク質活性を修飾するその他の技術
ドミナントネガティブ突然変異は、細胞内で発現された際に標的タンパク質種の活性を妨げる内因性遺伝子の突然変異または変異型外因性遺伝子である。標的タンパク質の構造および活性に応じ、その標的の活性を妨げるドミナントネガティブ突然変異を構築するのに適当な戦略の選択の指針となる一般規則がある。Hershkowitz， Nature， Vol．329， pp．219-222 （1987）参照。活性型の単量体形態である場合、 不活性型の過剰発現が、標的タンパク質の正味の活性を有意に低下させるに十分な、天然基質またはリガンドに関する競合が起こり得る。このような過剰発現は、例えば活性増強のプロモーター、好ましくは制御可能な、または誘導型のプロモーター、あるいはまた、構成的に発現するプロモーターと変異型遺伝子とを会合させることにより達成することができる。あるいは、活性部位の残渣を変化させて、標的リガンド内で事実上不可逆的な会合を起こすことができる。このようなことは、特定のチロシンキナーゼで、活性部位のセリン残基を注意深く置き換えることにより達成できる。Perlmutter et al．， Curr．Opin．Immunol．， Vol． 8， pp．285-290 （1996）参照。
【０２５７】
活性型の多量体形態である場合、いくつかの戦略がドミナントネガティブ変異体の選択の指針となり得る。多量体の活性は、多重会合ドミナントと結合して多量体の形成を妨げる外因性タンパク質をコードする遺伝子の発現によって、制御された、または飽和型の様式で低下させることができる。あるいは、特定のタイプの不活性タンパク質ユニットの、制御可能な、または飽和型の過剰発現を不活性な多量体における野生型活性ユニットと連携させ、それにより多量体活性を低下させることができる。Nocka et al．， EMBO J．， Vol．9， pp．1805-1813 （1990）参照。例えば、二量体ＤＮＡ結合タンパク質の場合、このＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ結合ユニット、または活性化ユニットから欠失された活性化ドメインから検出することができる。また、この場合、ＤＮＡ結合ドメインユニットを、そのドメインをその活性化ユニットと会合させることなく発現させることができる。これにより、ＤＮＡ結合部位は、発現の活性化の見込みがなくとも連携される。特定のタイプのユニットが通常活動中にコンホメーション変化を受ける場合には、ある固定されたユニットの発現が結果として得られる複合体を不活性化することができる。さらなる例としては、細胞の運動性、細胞分裂プロセス、細胞の構築などの細胞機構に関与するタンパク質は通常、数タイプの多くのサブユニットの会合からなっている。これらの構造は構造欠陥を有する数種の単量体ユニットが含まれることによる妨害に感受性が高い場合が多い。このような変異型単量体は関連のタンパク質活性を妨げ、制御された、または飽和型の様式で細胞内において発現させることができる。
【０２５８】
ドミナントネガティブ突然変異の他、温度感受性（または他の外因性因子）のある変異型標的タンパク質を、当技術分野で公知の突然変異誘発およびスクリーニング手順により発見することができる。
【０２５９】
処置様式
アンチセンスヌクレオチドにより処置する場合は、その方法は、ＩＬ−１β遺伝子由来のアンチセンスヌクレオチド（ここで、このアンチセンスヌクレオチドはＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有する）の配列を含む単離された核酸分子の治療上有効な量を投与することを含む。「単離された」核酸分子とは、その核酸分子がその本来の環境、例えば、天然に存在するものである場合は天然環境から取り出されていることを意味する。例えば、天然の核酸分子は単離されていないが、天然系において共存する数種類または全ての物質から分離されている同じ核酸分子は、その後に天然系に再導入されるとしても、単離されている。このような核酸分子がベクターの一部または組成物の一部であってもよく、これらはこのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではないという点でやはり単離されている。
【０２６０】
リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡ分子による処置に関しては、その方法は、リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列（ここで、このリボザイム／二本鎖ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列はＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有する）の治療上有効な量を投与することを含む。
【０２６１】
アンタゴニストにより処置する場合は、その方法は、被験者にＩＬ−１β遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害または活性化するアンタゴニストの治療上有効な量を投与することを含む。
【０２６２】
アンチセンスヌクレオチド；リボザイム、二本鎖ＲＮＡまたはアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子の「治療上有効な量」とは、これらの治療薬の１つの、浮腫を処置するのに十分な量をさす。治療上有効な量の決定は十分当業者の能力の範囲内である。いずれの治療用物質についても、治療上有効な用量はまず、例えば、細胞培養アッセイかまたは動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタ）において評価することができる。また、動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次に、このような情報を用いてヒトへの投与に有用な用量および投与経路を決定することができる。
【０２６３】
治療効果および毒性は細胞培養系または実験動物において標準的な薬学手順、例えば、その集団の５０％に治療上有効な用量（ＥＤ５０）およびその集団の５０％に致死的な用量（ＬＤ５０）によって求めることができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示すアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡおよびアンタゴニストが好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはヒト用の用量範囲の処方に用いられる。このような組成物中に含まれる用量は毒性がほとんど、またはまったくなく、ＥＤ５０値を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。用量は用いる投与形、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で可変である。
【０２６４】
正確な用量は処置を要する被験体に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、十分なレベルの有効部分が提供されるよう、または望ましい作用を維持するように調節する。考慮すればよい因子としては、病態の重篤度、被験体の全身の健康状態、被験体の齢、体重および性、食事、投与時間および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する許容度／応答が挙げられる。
【０２６５】
通常の用量は、投与経路にもよるが、０．１〜１００，０００ｍｇ、総用量約１ｇまでで可変である。特定の投与および送達方法に関する指針は文献に示されており、当業者であれば一般に利用できる。当業者ならば、ヌクレオチドについてはアンタゴニストとは異なる処方を用いるであろう。
【０２６６】
治療用途では、アンチセンスヌクレオチド；リボザイム、二本鎖ＲＮＡ（リポソームに封入されたものであっても、ウイルスベクターに包含されたものであってもよい）および抗体をコードするヌクレオチド配列が、好ましくは、治療薬を１種以上の医薬上許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物として投与される。この組成物は単独で投与してもよいし、または少なくとも１種の他の薬剤、例えば、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水をはじめとする任意の滅菌生体適合性医薬担体にて投与し得る安定化合物と組み合わせて投与してもよい。この組成物は患者に単独で投与してもよいし、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与してもよい。
【０２６７】
医薬組成物は、限定されるものではないが、経口的、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、延髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所的、舌下または直腸手段をはじめとする多くの経路によって投与し得る。これらの医薬組成物は、有効成分とともに、活性化合物の、医薬的に使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤および／または補助剤を含む好適な医薬上許容される担体を含んでもよい。製剤および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、Remingtonの‘Pharmaceutical Sciences’，Maack Publishing Co．， Easton， PAの最新版に見出せる。
【０２６８】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の医薬上許容される担体を経口投与に好適な用量にて使用して製剤化することができる。このような担体によって、医薬組成物を、患者による摂取を目的とした、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。
【０２６９】
経口用医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、所望により、得られた混合物を粉砕し、錠剤または糖衣錠核を得ることが望まれる場合は、好適な補助剤を添加した後に顆粒混合物を加工することによって得ることができる。好適な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質増量剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールをはじめとする糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアガムおよびトラガカントガムをはじめとするガム類；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。必要に応じて、崩壊剤または可溶化剤、例えば、架橋性ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を添加してもよい。
【０２７０】
糖衣錠核を、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい、濃縮糖溶液などの好適なコーティング剤と併用してもよい。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち、用量を明らかにするために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を添加してもよい。
【０２７１】
経口使用可能な医薬製剤としては、ゼラチン製の押し込み型カプセル剤、ならびに、ゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどのコーティング剤からなる密閉型軟カプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、有効成分を、ラクトースまたはデンプンなどの増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、所望により、安定剤と混合して含めることができる。軟カプセル剤の場合、活性化合物を安定剤を含むまたは含まない好適な液体、例えば、脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁させればよい。
【０２７２】
非経口投与に好適な医薬製剤を、水溶液、好ましくは、生理的に適合するバッファー、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理的緩衝生理食塩水中の水溶液に製剤化してもよい。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液を好適な油性注射懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが挙げられる。送達に非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを使用してもよい。所望により、その懸濁液に、好適な安定剤または化合物の溶解度を高めて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含めてよい。
【０２７３】
局所または鼻内投与では、製剤に特定のバリアーを通過させるのに適した浸透剤を使用する。このような浸透剤は、通常、当技術分野で公知である。
【０２７４】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の方法により、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、水簸、乳化、カプセル化、包摂または凍結乾燥工程により製造し得る。
【０２７５】
医薬組成物を塩として提供してもよく、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする多くの酸を用いて形成することができる。塩は対応する遊離塩基形態で存在するよりも水性または他のプロトン性溶媒への溶解度が増加する傾向がある。別の場合では、好ましい製剤が、以下のもの：１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１〜２％スクロースおよび２〜７％マンニトールのいずれかまたは全てをｐＨ範囲４．５〜５．５にて含んでよく、使用前にバッファーと合わせられる凍結乾燥粉末であってもよい。
【０２７６】
医薬組成物を調製した後、それらを好適な容器に入れ、適応症状の治療に関して表示してもよい。アンチセンスヌクレオチドまたはアンタゴニストの投与では、このような表示には、用量、投与頻度および投与方法が記述される。当業者ならば、アンチセンスヌクレオチドについてはアンタゴニスト、例えば、抗体または阻害剤とは異なる処方を用いるであろう。タンパク質の経口投与に好適な医薬製剤は、米国特許第５，００８，１１４号；同第５，５０５，９６２号；同第５，６４１，５１５号；同第５，６８１，８１１号；同第５，７００，４８６号；同第５，７６６，６３３号；同第５，７９２，４５１号；同第５，８５３，７４８号；同第５，９７２，３８７号；同第５，９７６，５６９号および同第６，０５１，５６１号に記載されている。
【０２７７】
もう１つの態様では、被験者における浮腫を処置する方法であって、上記のような治療薬、例えば、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡおよびアンタゴニスト（抗体など）を利用する方法が提供される。アンチセンスヌクレオチドを利用した浮腫の処置に関しては、その方法は、被験者にＩＬ−１β遺伝子由来のアンチセンスヌクレオチド（ここで、このアンチセンスヌクレオチドは少なくとも１つの遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有する）の配列を含む単離された核酸分子の治療上有効な量を投与することを含む。
【０２７８】
リボザイムを利用した浮腫の処置に関しては、このような方法は、被験者に、リボザイムをコードする、ＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有するヌクレオチド配列の治療上有効な量を投与することを含む。
【０２７９】
二本鎖ＲＮＡを利用した浮腫の処置に関しては、その方法は、被験者に、ＩＬ−１β遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ここで、この二本鎖ＲＮＡはＩＬ−１β遺伝子の転写／翻訳を変更する能力を有する）の治療上有効な量を投与することを含む。
【０２８０】
アンタゴニストを利用した浮腫の処置に関しては、その方法は、被験者に、ＩＬ−１β遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害または活性化をもたらすアンタゴニストの治療上有効な量を投与することを含む。
【０２８１】
浮腫の処置に関して、アンチセンスヌクレオチド；リボザイム、二本鎖ＲＮＡまたはアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子の「治療上有効な量」とは、これらの治療薬のうち１つの、浮腫の程度を軽減するのに十分な量をさし、上記のように決定することができる。
【０２８２】
コンピューターの実行
好ましい一実施形態では、これまでの方法の演算処理ステップが１つのコンピューターシステムで、または１以上のネットワークコンピューターシステムで実行され、生物系のモデルを構成および試験するための高性能かつ便宜な設備を提供する。コンピューターシステムは、内部コンポーネントを含み、かつ、外部コンポーネントに接続されている単一ハードウェアプラットフォームであってよい。このコンピューターシステムの内部コンポーネントは、メインメモリと相互接続されたプロセッサエレメントを含む。例えば、コンピューターシステムがクロック速度２００Ｍｈｚ以上であり、メインメモリ３２ＭＢ以上のインテル社ペンティアム系プロセッサーであってよい。
【０２８３】
外部コンポーネントは、大容量データ記憶装置を含む。この大容量記憶装置は、１以上のハードディスクであってもよい（一般に、プロセッサーおよびメモリとともにパッケージされている）。一般に、このようなハードディスクは、少なくとも１ＧＢの記憶容量を有するものである。他の外部コンポーネントとしてはユーザインターフェースデバイスを含み、これはモニターおよびキーボード、付属品としてのポインティングデバイス（「マウス」などであり得る）、または他のグラフィックインプットデバイスであってよい。一般に、このコンピューターシステムは、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステム、またはインターネットなどの広域通信ネットワークにも接続されている。このネットワーク接続により、このコンピューターシステムは他のコンピューターシステムとデータおよび処理タスクを共有可能となる。
【０２８４】
このシステムの動作中に数個のソフトウェアコンポーネント（当技術分野で標準的なものおよび本発明に特殊なもの）がメモリにロードされる。これらのソフトウェアコンポーネントによってコンピューターシステムは本発明の方法に従って総合的に機能する。これらのソフトウェアコンポーネントは、通常、大容量記憶装置に保存されている。あるいは、ソフトウェアコンポーネントはフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどの取り外し可能な媒体（示されていない）に保存されていてもよい。このソフトウェアコンポーネントは、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互接続の管理を担うオペレーティングシステムである。このオペレーティングシステムは、例えば、マイクロソフト社ウィンドウズ系（例えば、ウィンドウズ９５、ウィンドウズ９８もしくはウィンドウズＮＴ）、またはユニックスオペレーティングシステム（例えば、サンソラリス）であってよい。ソフトウエアは、共通言語と本発明に特殊な方法を実行するプログラムをアシストするためにこのシステムに便宜に存在する機能を含む。本発明の解析方法のプログラミングに使用可能な言語としては、Ｃ、Ｃ＋＋または、あまり好ましくはないが、ＪＡＶＡが挙げられる。本発明の方法は、数学ソフトウェアパッケージでプログラミングすることが最も好ましく、これにより、用いるアルゴリズムを含む、方程式および高位仕様の処理の記号入力が可能になることから、ユーザーが個々の方程式またはアルゴリズムを手続きプログラミングする必要性がなくなる。このようなパッケージとしては、例えば、マスワークス社（Natick， MA）のマットラボ（MATLAB）（商標）、ウルフラムリサーチ社（Champaign， IL）のマセマチカ（MATHEMATICA）（商標）およびマスソフト社（Cambridge， MA）のマスキャド（MATHCAD）（商標）が挙げられる。
【０２８５】
好ましい実施形態では、この解析ソフトウェアコンポーネントは実際には相互作用する個別ソフトウェアコンポーネントを含んでなる。解析ソフトウエアは、システムの動作に必要な全てのデータが収められているデータベースである。このようなデータとしては、通常、必ずしも限定されるものではないが、過去の試験の結果、ゲノムデータ、試験手順およびコスト、ならびに他の情報が挙げられ、これらについては当業者ならば明らかであろう。解析ソフトウエアは、本発明の解析方法を実行する１以上のプログラムを含むデータ整理および演算処理用コンポーネントを含む。解析ソフトウエアはまた、コンピューターシステムのユーザーに試験ネットワークモデル、所望により、試験データの制御および入力を提供するユーザーインターフェースも含む。このユーザーインターフェースは、仮説をシステムに指定するためのドラッグ・アンド・ドロップインターフェースを含んでもよい。また、このユーザーインターフェースは、試験データを大容量記憶装置コンポーネント（例えば、ハードドライブ）から、取り外し可能な媒体（例えば、フロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ）から、またはネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワークまたはインターネットなどの広域通信ネットワーク）に及ぶ本システムと交信している異なるコンピューターシステムからロードするための手段を含んでもよい。
【０２８６】
本発明の解析方法を実行する別のコンピューターシステムおよび方法は当業者に明らかであり、それらは添付の特許請求の範囲内に包含されるものとする。特に、添付の特許請求の範囲は、当業者ならば容易に理解できる本発明の方法を実行する別のプログラム構造を含むものとする。
【０２８７】
用語解説
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０２８８】
参照文献
限定されるものではないが、刊行物、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ番号およびタンパク質受託番号をはじめ、本明細書に挙げられている全ての刊行物および参照文献は、各々個々の刊行物または参照文献が完全に示されている場合に出典明示により本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示されているかのように、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる。また、本願が優先権を主張する特許出願はいずれも、刊行物および参照文献に関して上記したように、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる。
【０２８９】
本発明は本願に記載される特定の実施形態の文言に限定されるものではなく、それらは本発明の個々の態様の一例に過ぎない。当業者には明らかなように、本発明では多くの改変およびバリエーションがその精神および範囲を外れることなく行える。当業者には以上の記載および添付図面から、本明細書に列挙されているものの他、本発明の範囲内にある機能的に同等な方法および装置が明らかであろう。このような改変およびバリエーションも添付の特許請求の範囲内にあるものとする。本発明は添付の特許請求の範囲の文言、ならびにこのような特許請求の範囲に与えられているのと同等の全範囲にのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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