(57)【要約】      （修正有）【課題】精製Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼポリペプチドおよびその断片およびそれらの使用を提供する。【解決手段】精製Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼポリペプチドおよびその断片、すなわち、哺乳類血管内皮増殖因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ−３）細胞外ドメイン（ＥＣ）の一部分を含んでなる精製ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリペプチドに特異的に結合するプローブ、およびそれらの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類血管内皮増殖因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ−３）細胞外ドメイン（ＥＣ）の一部分を含んでなる精製ポリペプチドであって、
前記一部分が少なくとも１個のＶＥＧＦＲ−３リガンドに結合し且つ前記一部分がＶＥＧＦＲ−３−ＥＣの少なくとも第一、第二および第三の免疫グロブリン様ドメインを含んでなり、
該ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３免疫グロブリンドメインIV - VIIを欠損しており、かつ
該ポリペプチドがあらゆる膜貫通ドメインを欠損した可溶性ポリペプチドである
ことを特徴とする、精製ポリペプチド。
【請求項２】
前記一部分が、ＶＥＧＦＲ−３−ＥＣの第一、第二および第三の免疫グロブリンドメインから本質的になる、請求項１に記載の精製ポリペプチド。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ−３がヒトＶＥＧＦＲ−３である、請求項１または２に記載の精製ポリペプチド。
【請求項４】
ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３の免疫グロブリン様ドメインをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製ポリペプチド。
【請求項５】
ＶＥＧＦＲ−３が配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製ポリペプチド。
【請求項６】
ＶＥＧＦＲ−３をコードするヒト遺伝子の補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがＶＥＧＦＲ−１をコードするヒト遺伝子の補体にハイブリダイズすることができないハイブリダイゼーション条件下において、ＶＥＧＦＲ−３が、前記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含んでなり、前記ハイブリダイゼーション条件が
(a)  ５０%ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．１%ＳＤＳ、および０．１mg/mlの超音波処理したサケ精子DNAを含んでなるハイブリダイゼーション溶液、
(b)  ４２℃の温度で１８〜２４時間のハイブリダイゼーション、および
(c)  ハイブリダイゼーションに続く６５℃の洗浄温度での１×ＳＳＣおよび０．１%ＳＤＳを含んでなる洗浄溶液を用いる洗浄
を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製ポリペプチド。
【請求項７】
免疫グロブリンＦｃペプチドに融合した、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項８】
該ポリペプチドに付着した細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質。
【請求項９】
細胞傷害性薬剤が、植物毒素、細菌毒素、真菌毒素、放射性同位元素、代謝阻害剤、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、およびＤＮＡ挿入剤からなる群より選択される、請求項８に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質と、薬学上許容可能なキャリヤーとを含んでなる、組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする配列に操作結合している発現制御配列をさらに含んでなる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドに操作結合している発現調節配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項１４】
発現制御配列が哺乳類細胞における発現を促進するプロモーターを含んでなる、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターである、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターと、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる、組成物。
【請求項１７】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションした細胞。
【請求項１８】
腫瘍性疾患の診断に用いる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項１９】
腫瘍性疾患の治療に用いる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項２０】
腫瘍性疾患が血管またはリンパ管の新血管新生を特徴とする腫瘍であり、新血管新生がＶＥＧＦＲ−３を発現する内皮細胞を含んでなる、請求項１８または１９に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項２１】
腫瘍性疾患が乳癌である、請求項１８または１９に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項２２】
腫瘍転移の診断に用いる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項２３】
腫瘍転移の予防に用いる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項２４】
腫瘍性疾患の診断に用いる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物。
【請求項２５】
腫瘍性疾患の治療に用いる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物
【請求項２６】
腫瘍性疾患が血管またはリンパ管の新血管新生を特徴とする腫瘍であり、新血管新生がＶＥＧＦＲ−３を発現する内皮細胞を含んでなる、請求項２４または２５に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物。
【請求項２７】
腫瘍性疾患が乳癌である、請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物。
【請求項２８】
腫瘍転移の診断に用いる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物。
【請求項２９】
腫瘍転移の予防に用いる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物。
【請求項３０】
哺乳類血管内皮増殖因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ−３）細胞外ドメイン（ＥＣ）の一部分を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを、癌の哺乳類患者に投与することを含んでなる、癌の増殖または転移による展開を抑制する方法であって、
前記一部分が、少なくとも１個のＶＥＧＦＲ−３リガンドに結合し且つ前記一部分がＶＥＧＦＲ−３−ＥＣの少なくとも１個の免疫グロブリン様ドメインを含んでなり、
コードされた前記ポリペプチドが、あらゆる膜貫通ドメインを欠損している可溶性ポリペプチドであり、
投与を、前記ポリヌクレオチドの摂取およびこのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの哺乳類患者の細胞による発現が可能な条件下で行い、ポリヌクレオチドを哺乳類患者の癌の増殖または転移による展開を抑制するのに有効な量で投与する
ことを特徴とする、方法。
【請求項３１】
投与が、ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを投与することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
投与が、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または細胞を投与することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物をリボソームにカプセル化する、請求項３０〜３２に記載の方法。
【請求項３４】
ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類患者がＶＥＧＦＲ−３を発現する内皮細胞の増殖を特徴とする癌と診断されており、投与が前記患者の血管形成およびリンパ管形成の少なくとも一方を抑制する、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
癌が血管またはリンパ管の新血管新生を特徴とする腫瘍を含んでなり、新血管新生がＶＥＧＦＲ−３を発現する内皮細胞を含んでなり、投与により前記患者の血管形成およびリンパ管形成の少なくとも一方を抑制する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
癌細胞が、ＶＥＧＦＲ−３、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄからなる群より選択される少なくとも１個のポリペプチドを発現する、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
患者がヒトである、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
癌が乳癌である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
患者に第二の癌治療薬を投与する段階をさらに含んでなる、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
第二の癌治療薬が、化学療法薬、放射性薬剤、癌治療薬およびリンパ管形成阻害薬をコードする核酸、または血管新生阻害薬を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
癌が操作可能な腫瘍を含んでなり、かつ、投与段階を腫瘍切除の前、中または後に行う、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
患者が、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭および首、食道、骨髄、および血液からなる群より選択される、組織、器官または細胞の癌を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳類患者の癌の転移による展開を抑制する方法であって、
癌の疑いのある哺乳類患者に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質または組成物を癌の転移による展開を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、方法。
【請求項４５】
哺乳類患者の癌の増殖を抑制する方法であって、
癌の疑いのある哺乳類患者に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質または組成物を癌の増殖を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、方法。
【請求項４６】
癌の増殖または転移を抑制するための医薬の製造における、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、ベクター、または組成物の使用。
【請求項４７】
哺乳類ＶＥＧＦＲ−３−ＥＣドメインの一部分を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、癌細胞の増殖または転移を抑制するための医薬の製造における使用であって、
前記一部分が少なくとも１個のＶＥＧＦＲ−３リガンドに結合し且つ前記一部分がＶＥＧＦＲ−３−ＥＣの少なくとも１個の免疫グロブリン様ドメインを含んでなり、コードされたポリペプチドがあらゆる膜貫通ドメインを欠損している可溶性ポリペプチドである、使用。
【請求項４８】
前記ポリヌクレオチドをリポソームにカプセル化する、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドがベクター中にある、請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよびヘルペスウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含んでなる、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
医薬が、前記患者の血管形成およびリンパ管形成の少なくとも一方を抑制する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５２】
癌が血管またはリンパ管の新血管新生を特徴とする腫瘍を含んでなり、新血管新生がＶＥＧＦＲ−３を発現する内皮細胞を含んでなり、且つ前記医薬が患者の血管形成およびリンパ管形成の少なくとも一方を抑制する、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
癌細胞が、ＶＥＧＦＲ−３、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄからなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
癌が乳癌である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５５】
医薬が第二の癌治療薬をさらに含んでなる、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５６】
第二の癌治療薬が、化学療法薬、癌治療薬およびリンパ管形成阻害薬をコードする核酸、または血管新生阻害薬を含んでなる、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
癌が操作可能な腫瘍であり、且つ、投与段階を腫瘍切除の前、中または後に行う、請求項４７に記載の使用。
【請求項５８】
医薬が、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、乳房,子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭および首、食道、骨髄、および血液からなる群より選択される、組織、器官、または細胞の癌の患者の治療のためのものである、請求項４７に記載の使用。
【請求項５９】
哺乳類患者の癌の転移による展開を抑制するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物の使用。
【請求項６０】
哺乳類患者の癌の増殖を抑制または減少させるための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、融合タンパク質、または組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願は、１９９８年１０月９日出願の米国特許出願番号第０９／１６９,０７９号明細書、および１９９７年７月２８日出願の米国特許出願番号第０８／９０１,７１０号明細書であって、現在の米国特許第６,１０７,０４６号明細書、１９９４年１１月１４日出願の米国特許出願番号第０８／３４０,０１１号明細書であって、現在の米国特許第５,７７６,７５５号明細書、１９９４年６月９日出願の米国特許出願番号第０８／２５７,７５４号明細書であって、現在は放棄したものに基づいて優先権を主張している二番目の出願であり、最後の２つの出願はまた１９９２年１０月９日出願の米国特許出願番号第０７／９５９,９５１号明細書であって、現在は放棄したものの一部継続出願である。これらの出願は総て、その内容がその開示の一部として本明細書に引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的には受容体用遺伝子、特に受容体用遺伝子チロシンキナーゼ、組換えＤＮＡベクターへのそれらの挿入、および微生物の宿主株および宿主真核細胞での生成タンパク質の産生に関する。更に具体的には、本発明は、受容体型チロシンキナーゼであるＦｌｔ４、Ｆｌｔ４をコードするヌクレオチド配列、Ｆｌｔ４をコードするＤＮＡの生成方法およびそれらの遺伝子産物、これらの受容体をコードする核酸を特異的に認識する（にハイブリダイズする）核酸プローブ、これらの受容体を特異的に認識する抗体、および例えば、動物およびヒトの組織のリンパ管および高内皮性小静脈（ＨＥＶ）を同定し病的条件においてＦｌｔ４発現細胞の増殖を増加させまたは防止するためのこれらのプローブおよび抗体および他のＦｌｔ４結合化合物の使用方法に関する。
【０００３】
背景技術
分化細胞や組織の発生、維持および修復に関与する細胞挙動は、大部分は増殖因子や類似リガンドおよびそれらの受容体によって伝達される細胞間シグナルによって制御される。受容体は応答細胞の細胞表面にあり、それらは増殖因子として知られるペプチドまたはポリペプチド、並びに他のホルモン様リガンドに結合する。この相互作用により応答細胞で速やかな生化学的変化並びに細胞の遺伝子発現の長期再調整が生じる。様々な細胞表面と会合した幾つかの受容体は、特異的増殖因子を結合することができる。
【０００４】
チロシンリン酸化は、血漿膜を通るシグナル伝達の重要な様式に一つである。幾つかのチロシンキナーゼ遺伝子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−Ａおよび−Ｂ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のような、ポリペプチド増殖因子およびホルモンの膜貫通受容体をコードする[Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (I 990)]。 幾つかの造血性増殖因子の受容体は、チロシンキナーゼであり、これらにはコロニー刺激因子１受容体であるｃ−ｆｍｓ[Sherr et al., Cell, 41: 665-676 (1985)]および原始的な造血増殖因子受容体であるｃ−ｋｉｔ[Huang et al., Cell, 63: 225-33 (1990)]が挙げられる。
【０００５】
これらの受容体は、その特異性および親和性が異なっている。一般的には、受容体型チロシンキナーゼは、糖タンパク質であり、（一または複数の）特異的増殖因子を結合することができる細胞外ドメイン、通常はこのタンパク質のα−らせん部分である膜貫通ドメイン、傍膜ドメイン（ここでは、受容体がタンパク質リン酸化などによって制御されることがある）、チロシンキナーゼドメイン（受容体の酵素成分）、および、多くの受容体でチロシンキナーゼの敷津の認識および結合に関与しているカルボキシ末端尾からなっている。
【０００６】
幾つかの受容体型チロシンキナーゼでは、選択的スプライシングおよび選択的ポリアデニル化により同一遺伝子から幾つかの別個のポリペプチドを産生することができる。これらは、上記した様々なドメインを含んでいることもまたは含まないこともある。結果として、ある細胞外ドメインは細胞によって分泌される異なるタンパク質として発現されることがあり、またある種の形態の受容体はチロシンキナーゼドメインを欠き、膜貫通ドメインと短いカルボキシ末端尾を介して血漿膜に挿入された細胞外ドメインのみを含むことがある。
【０００７】
血管系、胚血管新生および血管新生、血液凝固、傷治癒および再生の生理学、並びに幾つかの疾患は、血管を裏打ちする血管内皮を伴う。血管樹の発生は血管新生によって起こり、またある理論によれば、リンパ系の形成は血管からの出芽による動脈および静脈の発生の少し後に開始する。Sabin, F.R., Am. J Anat., 9:43 (1909)、およびvan der Putte, S.C.J, Adv. Anar. Embryol. Cell Biol., 51:3 (1975)を参照されたい。
【０００８】
胎児期の後、新血管新生(neovascularization)に関連した血管新生の際を除き、内皮細胞は極めてゆっくりと増殖する。血管新生を刺激する増殖因子は、特異的内皮細胞表面受容体型チロシンキナーゼによってその効果を発揮する。
【０００９】
受容体型チロシンキナーゼのリガンドの中では、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がヒナ鳥漿尿膜において僅かではあるが血管形成性であることが示されている。トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）は、幾つかの腫瘍細胞型およびマクロファージによって分泌される血管新生因子である。ｃ−ｍｅｔ原癌遺伝子によってコードされる受容体のリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）も血管形成性が強く、培養内皮細胞でＴＧＦαに類似の応答を誘発する。
【００１０】
内皮細胞増殖、分化、並びにある種の分化した機能の刺激に主として関与している可能性がある内皮細胞特異的増殖因子および受容体が存在することを、証拠は示している。最も詳細に研究されている増殖因子は、ＰＤＧＦファミリーの一つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。血管内皮増殖因子は、内皮細胞に対する分裂促進活性および血管透過性を誘発する能力によって見出されたジスルフィド結合した２３kDaサブユニットの二量体性糖タンパク質である（従って、別名を血管透過因子という）。ＶＥＧＦの他の報告されている効果としては、細胞内Ｃａ２＋の可動性、プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１合成の誘発、内皮細胞におけるヘキソース輸送の刺激およびイン・ビトロでの単球移動の促進が挙げられる。異なるｍＲＮＡスプライシング変異体によってコードされる４種類のＶＥＧＦアイソフォームは、同様に内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激することができると思われる。ＶＥＧＦの１２１および１６５アミノ酸アイソフォームは可溶性形態で分泌され、一方、１８９および２０６アミノ酸残基のアイソフォームは細胞表面に会合したままであり、ヘパリンに強力な親和性を有する。可溶性の非ヘパリン結合およびヘパリン結合形態も関連胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ；それぞれ１３１および１５２アミノ酸）について記載されており、胎盤、栄養芽層腫瘍、および培養ヒト内皮細胞で発現する。
【００１１】
ＶＥＧＦ発現のパターンは、それが正常な血管系および腫瘍血管新生の発生および維持に関与している。ネズミの発生の際には、交尾後７．５日の全内胚葉はＶＥＧＦを発現し、心室神経外胚葉は毛細血管の内方増殖段階でＶＥＧＦを産生する。ウズラ発生の２日目には、卵黄嚢並びに全胚の血管形成部分にＶＥＧＦの発現が見られる。更に、成熟マウスの有窓上皮細胞に隣接する上皮細胞は永続的ＶＥＧＦ発現を示し、特異的内皮表現型および機能の維持に役割を果たしていることを示唆している。
【００１２】
ＶＥＧＦの２種類の高アフィニティー受容体である、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１）およびＶＥＧＦＲ−２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ−１（キナーゼインサートドメイン含有受容体／胎児肝臓キナーゼ−１）が特性決定されている。これらの受容体はＰＤＧＦ−受容体ファミリーに分類されている。しかしながら、ＶＥＧＦ受容体は、その細胞外ドメインに７個の免疫グロブリン様ループ（他の種類のＰＤＧＦファミリーでは５個であるのとは異なる）および１個の長めのキナーゼインサートを有する。ＶＥＧＦ受容体の発現は主として血管内皮細胞で起こるが、幾らかは単球や黒色腫細胞系上に存在することもある。内皮細胞のみがＶＥＧＦに応じて増殖することが報告されており、異なる起源由来の内皮細胞は異なる応答を示す。例えば、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２を介して伝達されるシグナルは、細胞型特異的であると思われる。
【００１３】
ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦ１６５に高アフィニティーで結合する（Ｋｄはそれぞれ約２０pMおよび２００pM）。Ｆｌｋ−１受容体はＶＥＧＦに応じて自己リン酸化を行うことも示されているが、Ｆｌｔ１のリン酸化はほとんど検出されなかった。ＶＥＧＦＲ−２によって伝達されるシグナルは、この受容体を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の形態学、アクチン再編成および膜ラッフリングに顕著な変化を生じる。これらの細胞では、ＶＥＧＦＲ−２もリガンドによって誘発される走化性および有糸分裂促進性(mitogenicity)を伝達するが、ＶＥＧＦＲ−１でトランスフェクションした細胞はＶＥＧＦに対するマイトジェン応答を欠いていた。対照的に、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１を発現するラット洞様毛細血管内皮細胞に強力な増殖刺激効果を有した。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２と共沈するリンタンパク質は別個のものであり、異なるシグナル形成分子が受容体特異的細胞内配列と相互作用することを示唆している。
【００１４】
イン・シテューハイブリダイゼーションの研究では、マウスＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡ発現は、卵黄嚢および胚内中胚葉（交尾後（ｐ．ｃ．）７．５日の胚と推定され、これから内皮が誘導され、後で推定血管芽細胞、心内膜、および大および小血管内皮（交尾後１２．５日）が誘導される）で見られた。胎児および初期出生後脳の血管芽および分岐血管の増殖する内皮細胞にはＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡが豊富であること、および、成熟脳での発現が減少することは、ＶＥＧＦＲ−２が脈管形成および血管新生の主要な調節因子であることを示唆している。ＶＥＧＦＲ−１発現も、同様にマウス胚の初期血管発生および皮膚創傷治癒における新血管新生と関連していた。しかしながら、高レベルのＶＥＧＦＲ−１発現が成熟器官で検出されており、これは、ＶＥＧＦＲ−１が細胞増殖には関係しない成熟血管の静止内皮において機能を有することを示唆している。ＶＥＧＦＲ−２の鳥類の同族体は、原腸形成の開始から中胚葉で観察されたが、ＶＥＧＦＲ−１同族体は内皮マーカーを共発現する細胞で最初に見出された。イン・ビトロでのウズラ原外胚葉培養物では、これらの細胞の脈管形成分化に必要なＦＧＦ−２がＶＥＧＦＲ−２発現をアップレギュレーションした。いずれのＶＥＧＦ受容体の発現も、発生において後で一層制限されるようになることが分かった。ヒト胎児組織では、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２はオーバーラップしているが若干異なる発現パターンを示した。これらのデーターは、ＶＥＧＦとその受容体がパラクリン的に作用して、内皮細胞の分化および組織の新血管新生を調節することを示唆している。
【００１５】
ＶＥＧＦは、最近内皮細胞増殖および血管新生の低酸素症によって誘発される刺激因子であることが示されており、特異的モノクローナル抗体を用いるＶＥＧＦ活性の阻害が実験的腫瘍の増殖およびそれらの血管密度を減少させることが示されている[Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997); Shibuya et al., Adv. Cancer Res., 67: 281-316 (1995); Kim et al., Nature, 362. 841-844 (1993)]。
【００１６】
固形腫瘍の大きさが数ｍｍ３を越えて増殖することは血管供給に依存しており、血管新生を抗癌療法の魅力的なターゲットとしている。有望な結果は、内在性血管新生阻害因子、またはプラスミノーゲンの断片であるアンジオスタチン、およびコラーゲン１８の断片であるエンドスタチンなどの「スタチン」で報告されている[O'Reilly et al., Cell, 79: 315-328 (1994); O'Reilly et al., Cell, 88: 277-85 (1997)]。いずれの因子も通常は原発性腫瘍によって産生され、転移休眠を保持している。いずれかのスタチンの全身投与は、動物モデルでの原発性腫瘍の休眠を誘発し、持続させることも示されている。受容体およびスタチンによるシグナル形成、並びにそれらを活性化するプロテアーゼは、明らかにされないままである。癌および他の病理学的疾患状態の治療における血管新生を制御する追加の治療分子が求められている。
【００１７】
原発性乳癌は幾つかの血管新生ポリペプチドを発現し、その中でＶＥＧＦが最も多量に存在することが示されている［例えば、Relf et al., Cancer Res., 57: 963-969 (1997)を参照されたい］。腫瘍細胞は、侵襲性および非侵襲性のいずれの腺管（イン・シテュー）乳癌においても高レベルのＶＥＧＦｍＲＮＡを含んでいた[Brown et al., Hum. Pathol., 26: 86-91 (1995)]。イン・シテュー癌に隣接する内皮細胞は、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡを発現した。ＶＥＧＦおよびその受容体は悪性乳房腫瘍の血管新生進行の一因となる可能性があるが、幾つかの独立した研究では、腫瘍血管密度と疾患の予知の間に相関が見られているからである[Weidner et al., J. Natl. Cancer Inst., 84. 1875-1887 (1992)]。診断およびスクリーニングを改良し、治療介入のターゲットとして役立てるために、乳癌および乳癌関連の血管新生の追加のマーカーが求められている。
【００１８】
リンパ系の主要な機能は、組織からの液体戻り(fluid return)を供給し、多くの血管外物質を血液に逆輸送することである。更に、成熟過程中には、リンパ球が血液から出てゆき、リンパ様器官や他の組織中を移行し、リンパ管に入り、胸管を通って血液に戻る。特殊化した小静脈である高内皮性小静脈（ＨＥＶ）は再度リンパ球に結合し、それらの組織中への管外遊出を生じる。リンパ管、および特にリンパ節は、このようにして免疫学、および様々な腫瘍の転移の発生に重要な役割を演じている。
【００１９】
２０世紀初頭以来、リンパ系の胚性起源に関する３つの異なる理論が紹介されてきた。しかしながら、リンパ管は、それらに利用可能な既知の特異的マーカーがないため同定が困難であった。
【００２０】
リンパ管は、通常はリンパ管造影法によって研究されている。リンパ管造影法では、Ｘ線コントラスト媒質をリンパ管に直接注入する。コントラスト媒質は、リンパ系の遠心性排液管(efferent drainage vessels)に沿って分布する。コントラスト媒質はリンパ節に集まり、そこに半年までも留まるので、その間にＸ線分析によってリンパ節の大きさおよび構造を追跡することができる。この診断法は、リンパ節に転移した癌患者やリンパ腫のようなリンパ腫瘍で特に重要である。しかしながら、リンパ組織の画像化のための改良した材料および方法が、当該技術分野で求められている。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、 ヒト白血病細胞由来の未知チロシンキナーゼ相同ＰＣＲ−ｃＤＮＡ断片として同定された、染色体５上にある新規受容体型チロシンキナーゼの遺伝子に関する[Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]。この遺伝子およびそのコードタンパク質は、Ｆｌｔ４と呼ばれる。この略号は、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ４(fms-like tyrosine kinase 4)という用語に由来するものである。
【００２２】
Ｆｌｔ４は、構造がＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２遺伝子の産物に緊密な関連を有する受容体型チロシンキナーゼである。この類似性およびこれら３種類の受容体のリガンド間で続いて見出された類似性により、Ｆｌｔ４受容体はＶＥＧＦＲ−３とも呼ばれている。Ｆｌｔ４およびＶＥＧＦＲ−３という名称は、本明細書では互換的に用いられる。これら３種類の受容体が類似しているにも拘わらず、Ｆｌｔ４の成熟形態は細胞外ドメインでタンパク質分解的に開裂して１２５／１２０kDおよび７５kDの２種類のジスルフィド結合したポリペプチドとなる点がＶＥＧＦＲと異なっている。Ｆｌｔ４遺伝子は、４．５および５．８kbのｍＲＮＡをコードし、それらは選択的３′エキソンを表し且つそれぞれ１９０kDおよび１９５kDのポリペプチドをコードする。
【００２３】
相違することのもう一つの証拠は、ＶＥＧＦはＦｌｔ４に特異結合せず且つその自己リン酸化を誘発しないことである。
【００２４】
Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ１、およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体ｍＲＮＡシグナルの比較ではオーバーラップを示したが、検討を行った組織では異なる発現パターンを示した。Kaipainen, et al., J. Exp. Med., 178:2077 (1993)。Ｆｌｔ４遺伝子発現は、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の発現より限定されていると思われる。Ｆｌｔ４の発現は頭部間葉の血管芽細胞、主静脈、および胚体外では交尾８．５日後のマウス胚の尿膜でのイン・シテューハイブリダイゼーションによって最初に検出可能になる。交尾１２．５日後の胚では、Ｆｌｔ４シグナルは発生中の静脈および推定リンパ管内皮で観察されるが、動脈内皮では陰性であると思われる。発生の後期段階中に、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは発生中リンパ管に限定されるようになる。リンパ管内皮および幾つかの高内皮性小静脈のみが成人組織でＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現し、発現増加が転移性リンパ節(metastatic lymph nodes)リンパ洞およびリンパ管腫で見られる。これらの結果は、リンパ管の静脈起源の理論を支持している。
【００２５】
ヒト赤白血病細胞系からクローニングしたＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼｃＤＮＡのタンパク質産物は、Ｎ−グリコシル化されており、その細胞外ドメインに７個の免疫グロブリン様ループを含んでいる。Ｆｌｔ４の細胞質チロシンキナーゼドメインはアミノ酸レベルでＦｌｔ１およびＫＤＲの相当するドメインと約８０％同一であり、血小板由来増殖因子、コロニー刺激因子−１、幹細胞因子の受容体、およびＦｌｔ３受容体と約６０％同一である。Pajusola et al., Cancer Res., 52:5738 (1992)を参照されたい。
【００２６】
本発明は、Ｆｌｔ４タンパク質およびそのペプチド断片の産生および他の起源由来の関連遺伝子の回収に用いられるＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼをコードする単離したポリヌクレオチド（例えば、定義した構造のＤＮＡまたはＲＮＡセグメント）を提供する。
【００２７】
本発明は、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼをコードする外来セグメントを含む組換えＤＮＡベクター、または微生物または真核細胞に挿入することができ且つコードタンパク質を発現することができる関連タンパク質を提供する。
【００２８】
本発明は、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼおよび多くの種由来の同様な機能を有するタンパク質の有用量を産生することができる真核細胞を提供する。
【００２９】
本発明は、実験室で合成的にまたは微生物によって得ることができるペプチドであって、天然のＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼタンパク質の活性によく似ているペプチドを提供する。もう一つの態様では、本発明は、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼタンパク質の活性を阻害するペプチドに関する。
【００３０】
特に好ましいものは、(a) Ｆｌｔ４−短形態であって、そのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列が配列番号１および２に示されるもの、および(b) 様々なヌクレオチドおよびそのカルボキシル末端に相当するアミノ酸残基を有する第二の形態、すなわち、Ｆｌｔ４−長形態であって、そのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列が配列番号３および４に示されるものからなる群から選択されるペプチドである。Ｆｌｔ４長形態は、長さが１３６３アミノ酸残基である。
【００３１】
ＤＮＡおよびＲＮＡ分子、組換えＤＮＡベクター、および改質微生物または真核細胞であって、上記タンパク質またはペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでなるものも、本発明の一部である。特に、下記の２種類のＤＮＡ配列、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、または相当するＲＮＡ配列の全部または一部を含んでなる配列が特に好ましい：(a) Ｆｌｔ４−短形態［配列番号２］をコードする配列番号１のようなＤＮＡ配列、および(b) 配列番号1のヌクレオチド３９１３〜４４１６が変化したＦｌｔ４をコードする、Ｆｌｔ４長形態［配列番号４］をコードする配列番号３のようなＤＮＡ配列。
【００３２】
大きい方の配列のセグメントを含むＤＮＡおよびＲＮＡ分子も、遺伝子工学の手法による上記ペプチドの産生およびオリゴヌクレオチドプローブの産生に関する本発明の好ましい態様の実施に用いられる。
【００３３】
Ｆｌｔ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は本発明で同定されるので、Ｆｌｔ４タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または市販装置を用いる合成化学によって製造することができ、その後遺伝子を組換えＤＮＡ技術の既知の手法を用いて多数の利用可能なＤＮＡベクターのいずれかに挿入することができる。更に、本明細書に開示されるペプチドのいずれかの直接合成を容易に利用可能にする自動化装置を用いることもできる。
【００３４】
本発明は、Ｆｌｔ４ペプチドおよび他の構造体、リンパ管内皮細胞の特異的マーカーとしてのＦｌｔ４の使用に関する。
【００３５】
具体的態様では、本発明は、Ｆｌｔ４を認識する核酸プローブおよび抗体、特にモノクローナル抗体およびこれらの抗体を含む組成物に関する。
【００３６】
また、具体的態様では、本発明は、組織試料および生体におけるリンパ管を観察する方法に関する。更に、本発明の目的は、リンパ管組織、特にリンパ管の状態（炎症、感染、外傷、増殖など）を記載する臨床的検出法を提供すること、および生体におけるリンパ管、従ってリンパ管血管新生の検出法を提供することである。
【００３７】
本発明のもう一つの目的は、Ｆｌｔ４受容体タンパク質またはその様々なエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することである。本発明の目的は、これらのモノクローナル抗体を組織、特にリンパ管組織のＦｌｔ４受容体を検出し、その量を測定するための診断目的に使用することである。抗Ｆｌｔ４抗体に関しては、「Ｆｌｔ４を特異的に認識する」、「Ｆｌｔ４に特異的に結合する」、「Ｆｌｔ４に特異的な」などの用語は、抗体がＶＥＧＦＲ−２/Ｋｄｒ/Ｆｌｋ−１およびＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１など他の内皮細胞表面受容体より優先的にＦｌｔ４に結合する（と免疫反応する）ことを意味する。従って、抗Ｆｌｔ４抗体またはＦｌｔ４「に特異的な」他のＦｌｔ４結合化合物は、本明細書に記載の本発明の方法（例えば、医療画像化、検出、スクリーニング、または標的設定療法）に準じて組織または生物試料中のＦｌｔ４の同定および／または標識に有用であり、それらは他の抗原のエピトープを全く結合することができないか、または実際的にはごく僅かなそれらのＦｌｔ４結合アフィニティーより十分に低いアフィニティーでしか他の抗原を結合できないからである。
【００３８】
本発明のもう一つの態様は、細胞試料でのＦｌｔ４受容体の存在を決定する方法であって、(a) 細胞試料を抗体、特に本発明のモノクローナル抗体に暴露し、(b) 上記モノクローナル抗体のＦｌｔ４受容体への結合を検出する段階を含んでなる方法に関する。下記の詳細な説明から明らかになるように、組織試料でのＦｌｔ４受容体の存在、量、密度、および位置に関する情報は、疾患状態の種類および重篤度に関して診断および予後関連性を有し、且つ治療上の関連性を有し、抗Ｆｌｔ４に基づく治療法を、腫瘍、または腫瘍を取り囲み、腫瘍の役に立ちまたは腫瘍を供給する血液またはリンパ管および組織でのＦｌｔ４発現を特徴とする疾患の患者だけに特異的に調整することが望ましい。従って、Ｆｌｔ４受容体の存在のスクリーニングは、治療法の第一段階、および／または治療経過中の観察段階を構成することができる。
【００３９】
本発明は、リンパ血管新生、および炎症性、感染性および免疫学的疾患におけるＦｌｔ４の機能の調節（例えば、拮抗または増大）方法にも関する。例えば、一態様では、このような方法は、特にＦｌｔ４機能が、転移性癌、リンパ腫、炎症（慢性または急性）、感染症および免疫疾患のような疾患に関連している場合には、このような反応に関与するＦｌｔ４内皮細胞部位を遮断するのに十分な量のＦｌｔ４結合化合物を供給することによってＦｌｔ４が介在したリンパ血管新生を阻害することを含んでなる。多くの腫瘍はリンパ管を介して転移するので、Ｆｌｔ４リガンドおよびＦｌｔ４間の相互作用の遮断に関する療法が抗癌治療法の一部としての腫瘍転移の抑制に対する広汎な用途を有することが期待されている。
【００４０】
本発明は、特異的Ｆｌｔ４刺激リガンドおよびモノクローナル抗体、およびリンパ管内皮を刺激するためのそれらの使用、および断片およびペプチド並びにＦｌｔ４機能を阻害するためのリガンドに関する研究、所望な場合には、Ｆｌｔ４機能を伴う様々な疾患状態におけるような研究から誘導した抗体にも関する。
【００４１】
本発明は、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼのリガンドの細胞系供給源を提供する。これらの細胞からコンディショニング培地を用いて、Ｆｌｔ４リガンドを当該技術分野で標準的な方法を用いることによって精製し、クローニングすることができる。このコンディショニング培地または精製したリガンドを用いて、Ｆｌｔ４リガンドのアッセイ系、および二量体化インヒビター並びにＦｌｔ４シグナル伝達のインヒビターが得られ、これによりこれらのインヒビターを同定および調製することができる。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、ＰＣ−３細胞系由来のコンディショニング培地はタンパク質またはその断片を含んでなり、Ｆｌｔ４受容体を刺激し、ある種の内皮細胞の増殖および分化並びに分化機能を調節することができる。Ｆｌｔ４リガンドまたはそのペプチドまたは誘導体は、内皮細胞の増殖、分化およびそれらの分化機能の調節、およびこのリガンドのアゴニストおよびアンタゴニストの生成に有用である。特に、Ｆｌｔ４リガンドは、リンパ管内皮の調節に有用である。しかしながら、Ｆｌｔ４リガンドは、精製したりまたは組換え供給源から産生されると、関連したＫＤＲ/Ｆｌｋ−１受容体を刺激することもある。
【００４３】
Ｆｌｔ４刺激リガンドを同定することによって、このリガンドのインヒビターまたはＦｌｔ４機能のインヒビターを直接分析することができる。このようなインヒビターはＦｌｔ４リガンドを含むコンディショニング培地に単に加えられるだけであり、それらが自己リン酸化を阻害するときには、それらはＦｌｔ４シグナル形成インヒビターとして作用する。例えば、組換えまたは合成ペプチド（Ｆｌｔ４細胞外ドメインの断片を含むが、これに限定されない）をＦｌｔ４−リガンド相互作用またはＦｌｔ４二量体化の阻害について分析することができる。このようなＦｌｔ４の推定インヒビターおよび更にＦｌｔ４受容体−リガンド相互作用を遮断するＦｌｔ４リガンド、ペプチドまたは他の化合物に対する抗体、並びにＦｌｔ４リガンドをコードするｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、内皮細胞の調節および内皮細胞機能に関連した疾患の治療に有用である。
【００４４】
ＶＥＧＦ−Ｃと呼ばれるＦｌｔ４リガンドの詳細な特性決定は、１９９８年２月２日に出願され、国際公開ＷＯ９８／３３９１７号として公表されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号明細書、１９９６年８月１日に出願され、国際公開ＷＯ９７／０５２５０号として公表されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号明細書、および優先権についてそれらに依存した米国特許出願優先権書類に提供されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。推定アミノ酸配列 forプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃは、本明細書では配列番号２１に記載されている。
【００４５】
ＶＥＧＦ−Ｄと呼ばれる第二のＦｌｔ４リガンドの詳細な説明は、Achen, et al., Proc. Nat'l Acad Sci. U S.A., 95(2): 548-553 (1998)、およびGenbank受託番号第ＡＪ０００１８５号で提供され、これら両者の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列は、本明細書では配列番号２２に記載されている。
【００４６】
本発明は、細胞中でのＦｌｔ４チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現を特徴とする疾患に罹っている哺乳類生物の治療方法であって、哺乳類生物に組成物を投与する段階を含んでなり、この組成物が生物の細胞で発現したＦｌｔ４へのＦｌｔ４リガンドタンパク質の結合を阻害することによってＦｌｔ４機能を阻害するのに有効な化合物を含んでなる、方法にも関する。疾患は、望ましくないリンパ血管新生を特徴とする疾患のような既に上記した疾患であることがある。更に、Ｆｌｔ４発現は、少なくともある種の乳癌、あるいは他の癌に関連した血管系(blood vessel血管系)にも（すなわち、相当する正常（健康）な組織の血管系での発現のほとんど検出されないまたは検出不能なレベルを大幅に上回るレベルで）存在することが見出されている。従って、好ましい態様では、細胞は内皮細胞（リンパ管または血管）を含んでなる。もう一つの態様では、細胞はＦｌｔ４を発現するある種のリンパ腫のような腫瘍性細胞を含んでなる。ヒトの治療を、特に考察する。
【００４７】
「Ｆｌｔ４リガンドタンパク質の、生物の細胞で発現したＦｌｔ４への結合を阻害するのに有効な化合物」とは、ＰC-３コンディショニング培地から単離可能な血管内皮増殖因子Ｃとして本明細書に記載されているＦｌｔ４リガンドの結合を阻害する任意の化合物を意味する。このような化合物は、血管内皮増殖因子ＤのＦｌｔ４への結合の阻害にも有効である。典型的な化合物としては、下記のポリペプチドが挙げられる：(a) 抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；(b) 可溶性Ｆｌｔ４断片（例えば、細胞外ドメイン断片）を含んでなるポリペプチドであって、この断片断片とポリペプチドはＦｌｔ４リガンドに結合することができる；(c) 脊椎動物の血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチドであって、ポリペプチドと断片または類似体は本来の宿主細胞（すなわち、細胞表面で本来のＦｌｔ４タンパク質を発現する生物の細胞）に結合するが、活性化することはできないもの；および(d) 脊椎動物の血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチドであって、ポリペプチドと断片または類似体が本来の宿主細胞で発現したＦｌｔ４に結合するが、活性化することはできないもの。例えば、ＶＥＧＦ−Ｃおよび組換え発現したＦｌｔ４を用いる標準的イン・ビトロスクリーニング分析法によって同定可能な小分子も考慮される。抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチドが、極めて好ましい。このようなポリペプチドとしては、例えば、Ｆｌｔ４に特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体；そのような抗体の断片；キメラ型およびヒト化抗体；Ｆｌｔ４に特異的に結合し且つ別の抗原にも特異的に結合する二重特異性抗体などが挙げられる。循環型Ｆｌｔ４リガンドに結合することによってこのリガンドのＦｌｔ４への結合を阻害する化合物の使用も考えられる。このような化合物としては、抗ＶＥＧＦ−Ｃまたは抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体、またはそれらの抗原結合断片を含んでなるポリペプチドが挙げられる。関連態様では、本発明は、下流の細胞内Ｆｌｔ４シグナル形成を妨害することによってＦｌｔ４機能を阻害する治療方法を考察する。
【００４８】
好ましい態様では、化合物は、本明細書の他の箇所で記載される検出可能な標識または細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる。典型的な細胞傷害性薬剤としては、植物毒素（例えば、リシン、サポリン）、細菌または真菌毒素、放射性同位元素（例えば、２１１−アスタチン、２１２−ビスマス、９０−イットリウム、１３１−ヨウ素、９９ｍ−テクニチウムおよび本明細書記載の他の元素）、抗代謝物薬剤（例えば、メトトレキセート、５−フルオロデオキシウリジン）、アルキル化剤（例えば、クロラムブシル）、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンカアルカロイド）、およびＤＮＡ挿入剤（例えば、アドリアマイシン）が挙げられる。他の典型的な薬剤としては、細胞に適用したときにＤＮＡの損傷を誘発する化合物治療薬が挙げられる。このような薬剤および因子としては、γ線照射、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、電子線照射などのＤＮＡ損傷を誘発する放射線および波動が挙げられる。「化学療法剤」としても記載されている様々な化合物は、ＤＮＡ損傷を誘発する機能を有し、これらはいずれも本明細書に開示される組合せ治療法で使用することを目的とするものである。使用が考えられる化学療法剤としては、例えば、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、および過酸化水素が挙げられる。本発明は、放射線をベースとしたものかまたは実際の化合物のいずれか１種類以上のＤＮＡ損傷剤の組合せの使用、例えば、Ｘ線とシスプラチンの使用、またはシスプラチンとエトポシドの使用も包含する。更に他の薬剤は、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られる）、ＶＰ−１６（エトポシドとしても知られる）および類似のダウノルビシン（ＤＮＡに挿入し、ＤＮＡ指定ＲＮＡポリメラーゼを遮断し、ＤＮＡ合成を阻害する）；マイトマイシン（ムタマイシンおよび／またはマイトマイシン−Ｃとしても知られる）；アクチノマイシンＤ；ビンクリスチンおよびシクロホスファミド；ブレオマイシン；ＶＰ１６（エトポシド）；腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］；タキソール；メルファラン；シクロホスファミド、クロラムブシルである。本発明のペプチドの投与は、数分間〜数週間の間隔で他の薬剤の投与の前または後に行ってもよい。他の薬剤および発現構造体を別個に投与する態様では、通常はそれぞれの投与時間の間にかなりの時間が経ってしまわないようにして、薬剤とペプチド基剤の治療薬が有利に組み合わせた効果を発揮することができるようにする。このような場合には、両モダリティーを互いに約１２〜２４時間以内に投与し、更に好ましくは互いに約６〜１２時間以内に投与することが考えられ、遅延時間は約１２〜１６時間であるのが最も好ましい。しかしながら、場合によっては、治療期間を延長し、それぞれの投与の間に数日間（２，３，４，５，６または７日）〜数週間（１，２，３，４，５，６，７または８週）の間を空けるのが望ましいことがある。一方または両方の薬剤を反復投与することが、具体的に考えられる。
【００４９】
同様に、投与を改良するには、組成物は、好ましくは、薬学上許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤー媒体をさらに含んでなる。
【００５０】
本明細書で詳細に説明されるように、Ｆｌｔ４発現は、主として健常成人のリンパ管内皮に限定されるが、少なくともある種の腫瘍を取り囲む血管系で同定されている。従って、本発明は、血管内皮細胞でのＦｌｔ４チロシンキナーゼ (Ｆｌｔ４）の発現を特徴とする腫瘍性疾患に罹っている哺乳類生物の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳類生物に、組成物であって、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質の生物の血管内皮細胞で発現したＦｌｔ４への結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、これによって血管内皮細胞のＦｌｔ４が介在した増殖を阻害する段階を含んでなる方法も包含する。癌（例えば、乳癌）、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫、および肉腫から選択される腫瘍性疾患の治療を、特に考察する。しかしながら、本明細書に詳細に記載のスクリーニング手法により、血管内皮細胞でのＦｌｔ４発現を特徴とする他の腫瘍であって、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ４治療法が可能な候補である腫瘍が同定されることが容易に明らかになるであろう。血管内皮細胞におけるＦｌｔ４の発現を特徴とする乳癌の治療を、特に考察する。血管内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼの発現を特徴とする腫瘍性疾患とは、本明細書に例示されているように、Ｆｌｔ４が健常組織の血管で普通に見られる検出不能かまたはほとんど検出できないレベルよりずっと高レベルで血管系において同定可能な疾患を意味する。
【００５１】
化合物の治療上有効量は、当該技術分野で認められている用量増加および用量−応答分析法を用いて経験的に決定される。腫瘍の治療について治療上有効とは、癌治療を受けている患者に対する許容できないレベルの副作用なしに腫瘍増殖を減少させるのに有効な量、または腫瘍増殖を停止するのに有効な量、または腫瘍を完全に収縮または除去するのに有効な量を意味する。化合物が抗体または他のポリペプチドを含んでなる場合には、体重１kg当たり０．１〜１００mgの抗体、更に好ましくは１〜１０mg/kgが特に考えられる。典型的には長い循環半減期を示すヒト化抗体については、毎日〜１月おきの間隔での、更に好ましくは毎週、または１週おき、または３週毎の投与が特に考えられる。治療の進行、患者の副作用、および循環抗体レベルを観察することにより、最適投与法についての追加の指針が提供される。他の抗体をベースとした癌治療の公表されたおよび進行中の臨床試験からのデーター（例えば、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦ受容体）も、有用な投与法指針を提供する。
【００５２】
本明細書に記載の治療方法について、好ましい化合物としては、抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド、および可溶性Ｆｌｔ４細胞外ドメイン断片を含んでなるポリペプチドが挙げられる。ヒトおよびヒト化抗Ｆｌｔ４抗体が、極めて好ましい。極めて好ましいＦｌｔ４細胞外ドメイン断片は、Ｆｌｔ４細胞外ドメインのリガンド結合部分を含んでなる。例えば、Ｆｌｔ４細胞外ドメインの最初の３種類の免疫グロブリン様ドメインを含んでなる可溶性断片が、極めて好ましい。Ｆｌｔ４リガンドのみを結合するまたは他のペプチド（例えば、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の免疫グロブリン様ドメイン）に融合している小さい方の断片も、考えられる。同様に、溶解度および／または安定性、血清半減期、または治療効力を向上するための他の特性を改良する改質、が考えられる。例えば、溶解度および血清半減期を向上するためのＦｌｔ４細胞外ドメインと免疫グロブリンＦｃペプチド（特に、ＩｇＧ１Ｆｃアイソタイプ）とに融合を含んでなるポリペプチドが考えられる［Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548-553 (1998)を参照されたい］。
【００５３】
本発明の治療方法の予想される利点は、Ｆｌｔ４が通常は健常組織の血管系では有意なレベルでは発現しないという事実にある。極めて好ましい態様では、治療化合物は二重特異性抗体またはその断片であって、抗体または断片がＦｌｔ４を特異的に結合し且つ血管内皮マーカー抗原を特異的に結合することを特徴とするものを含んでなる。「血管内皮マーカー抗原」とは、増殖する血管内皮細胞上で発現し、好ましくは、リンパ管内皮細胞上では発現しない任意の細胞表面抗原を意味する。典型的な血管内皮マーカーとしては、ＰＡＬ−Ｅ［deWaal, et al., Am. J. Pathol., 150:1951-1957 (1994)］、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２[Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18:4-25 (1997)]、Ｔｉｅ[Partanen et al., Mol. Cell. Biol., 12: 1698-1707 (1992)]、エンドグリン［米国特許第５,７７６,４２７号明細書、この内容は、その開示の一部として本明細書に引用される］、およびフォンビルブラント因子が挙げられる。このような二重特異性抗体は、Ｆｌｔ４および血管内皮マーカーを両方とも発現する腫瘍関連血管系に優先的に位置することが予想される。極めて好ましい態様では、化合物は、腫瘍細胞を殺しおよび／または腫瘍細胞への血管系供給を停止する目的で、二重特異性抗体に接合した抗腫瘍性または細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる。典型的な薬剤としては、上記のもの、およびスタチン、サイトカイン、ケモカインなど宿主での腫瘍に対する免疫応答を刺激するための治療タンパク質が挙げられる。
【００５４】
もう一つの態様では、化合物はＦｌｔ４／Ｆ１ｔ４リガンド複合体（例えば、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ結合したＦｌｔ４から構成される複合体）から構成されるエピトープ（または複数のエピトープ）を認識する抗体（または二重特異性抗体）を含んでなる。
【００５５】
血管新生因子を阻害する可能性を有する広範囲薬剤と接合しまたは同時投与することも考えられる。このような薬剤としては、例えば、ヘパリンに結合する血管新生因子を阻害することがあるヘパリン結合薬（例えば、ペントサンおよびスラミン類似体）、およびフルナジリン類似体のような内皮細胞増殖および移動を遮断する化学薬剤が挙げられる。現在研究されている他の薬剤としては、Marimastat（British Biotech, Annapolis MD；非小細胞肺、小細胞肺および乳癌について指示される）；AG3340 (Agouron, LaJolla, CA；神経膠芽細胞腫多型用）；COL-3 (Collagenex, Newtown PA；脳腫瘍用）；Neovastat (Aeterna, Quebec, Canada；腎臓および非小細胞肺癌用）；BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb, Wallingford CT；転移性非小細胞肺癌)；Thalidomide (Celgen； 黒色腫、頭および首癌、卵巣、転移性前立腺、およびカポジ肉腫；再発性または転移性結直腸癌（アジュバントを有する）；婦人科肉腫、肝臓癌；多発性骨髄腫；ＣＬＬ、再発性または進行性脳癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺、非転移性前立腺、難治性多発性骨髄腫、および直腸癌）；Squalamine (Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting, PA；非小細胞癌および卵巣癌）；Endostatin (EntreMEd, Rockville, MD；固形腫瘍用）；SU5416 (Sugen, San Francisco, CA；再発性頭および首、高次固形腫瘍、IIIＢまたはIV期乳癌；再発性または進行性脳（小児科）；卵巣、ＡＭＬ；神経膠腫、進行悪性腫瘍、進行結直腸、フォンヒッペル−リンドウ病、進行柔組織；前立腺癌、結直腸癌、転移性黒色腫、多発性骨髄腫、悪性中皮腫、転移性直腸、進行または再発性頭および首、転移性結直腸癌）； SU6668 (Sugen San Francisco, CA;進行腫瘍）；インターフェロン−α；抗−ＶＥＧＦ抗体(NAtional Cancer Institute, Bethesda MD; Genentech San Franscisco, 
CA；難治性固形腫瘍；転移性直腸細胞癌、未治療の進行結直腸）；EMD121974 (Merck KCgaA, Darrnstadt, Germany；ＨＩＶ関連カポジ肉腫、進行性または再発性未分化神経膠腫）；インターロイキン１２(Genetics Institute, Cambridge, MA；カポジ肉腫）およびIM862 (Cytran, Kirkland, WA；卵巣癌、結腸および直腸起源の未治療の転移性癌およびカポジ肉腫）が挙げられる。
【００５６】
抗Ｆｌｔ４化合物により腫瘍血管に標的設定し、次に腫瘍増殖部位で局所的に（例えば、放射線照射によって）活性化するプロドラッグへの抗Ｆｌｔ４化合物の接合も考えられる。このようなプロドラッグの使用は、Ｆｌｔ４を発現する健常リンパ管に対する薬剤の副作用を最小限に止めるという利点を有することが予想される。
【００５７】
同様に、本発明は、血管内皮細胞でのＦｌｔ４チロシンキナーゼ (Ｆｌｔ４)の発現を特徴とする腫瘍性疾患に罹っている哺乳類生物の治療の方法であって、血管内皮細胞でのＦｌｔ４チロシンキナーゼ (Ｆｌｔ４)の発現を特徴とする腫瘍性疾患に罹っている哺乳類生物を同定し、このような治療を必要としている哺乳類生物に、組成物であって、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質の生物の血管内皮細胞で発現したＦｌｔ４への結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、これによって血管内皮細胞のＦｌｔ４が介在した増殖を阻害する段階を含んでなる方法も包含する。
【００５８】
本発明は、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼタンパク質 (Ｆｌｔ４)の存在について生物試料をスクリーニングする方法であって、(a) Ｆｌｔ４を含むと思われる生物試料をＦｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物に、化合物が生物試料中のＦｌｔ４に結合する条件下で接触させ、(b) 試料中のＦｌｔ４に結合しないＦｌｔ４結合化合物を除く条件下で生物試料を洗浄し、(c) 洗浄段階の後に試料中のＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼに結合したＦｌｔ４結合化合物を検出することによってＦｌｔ４の存在について試料をスクリーニングする段階を含んでなる方法も提供する。好ましくは、化合物は、(a) 抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド、および(b) Ｆｌｔ４リガンド、またはＦｌｔ４結合断片またはその類似体を含んでなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる。Ｆｌｔ４を特異的に結合し、検出可能な標識を含んでなる抗体が、極めて好ましい。
【００５９】
本発明は、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼタンパク質（Ｆｌｔ４）を発現する細胞を含むと思われる脊椎動物組織を画像化する方法であって、(a) 脊椎動物組織をＦｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物と接触させ、(b) 組織に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出することによって組織を画像化する段階を含んでなる方法にも関する。好ましくは、組織はヒト組織であり、この方法は、接触段階の後で画像化段階の前に、組織中でＦｌｔ４に結合しないＦｌｔ４化合物を組織から除去する条件下で組織を洗浄する段階をさらに含んでなる。
【００６０】
関連態様では、本発明は、脊椎動物の生体由来の組織中の腫瘍を画像化する方法であって、(a) 腫瘍を含むと思われる脊椎動物組織をＦｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物と接触させ、(b) 上記組織中の細胞に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出し、(c) Ｆｌｔ４結合化合物が結合した血管内皮細胞を同定することによって固形腫瘍を画像化し、Ｆｌｔ４を発現する血管が組織における腫瘍の存在および位置と相関している段階を含んでなる方法を提供する。好ましい態様では、この方法は、組織を、リンパ管内皮には実質的に存在しない血管内皮マーカー（例えば、ＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２）に特異的に結合する第二の化合物（例えば、抗体）と接触させ、組織中の細胞に結合した第二の化合物を検出する段階を含んでなり、画像化段階がＦｌｔ４結合化合物および第二の化合物の両方で標識された血管を同定し、Ｆｌｔ４結合化合物および第二の化合物の両方で標識した血管が組織中の腫瘍の存在および位置と相関している。第二の化合物を使用することにより、実施者はＦｌｔ４を発現する血管と表面でＦｌｔ４を発現する正常なリンパ管とを一層速やかに識別することができることが理解されるであろう。
【００６１】
本発明はまた、腫瘍性疾患状態のスクリーニングの方法であって、(a) 腫瘍性疾患状態を有することが疑われる哺乳類生物由来の組織を、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼを特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなる組成物と接触させ、(b) 哺乳類生物の細胞に結合した抗体または抗体断片を検出し、(c) 哺乳類生物の細胞に結合した抗体の量または分布から腫瘍性疾患についてスクリーニングを行う段階を含んでなる方法にも関する。本明細書に記載されているように、Ｆｌｔ４（通常は、血管系では、検出不能であるかまたはほとんど検出できない）が少なくとも幾つかの腫瘍の血管系では強力に着色される。従って、一態様では、スクリーニング段階において、血管内皮細胞に結合した抗体または抗体断片の検出を腫瘍性疾患の存在と相関させる。この方法では、「検出」は、本明細書に記載されているように、相当する正常（健常）組織で見られるほとんど検出することができないかまたは検出不能なレベルより有意に高いレベルでの検出を意味する。このような特異な表現は、健常生物由来の組織で行ったコントロールと比較することによって確認することができる。腫瘍についての哺乳類組織のスクリーニングが、特に考えられる。上記のように、このような方法の実施は、上記哺乳類に血管内皮マーカー特異的に結合する第二の化合物を投与することによって更に促進することができ、検出段階は、新血管新生内皮細胞に結合した上記第一および上記第二の化合物の検出を含んでなる。
【００６２】
前述から、本発明の方法で用いられる様々な化合物も本発明の態様と解釈されることを理解されるであろう。このような化合物としては、例えば、上記の抗Ｆｌｔ４抗体および二重特異性抗体が挙げられる。同様に、本明細書に記載の治療、診断、もしくは画像化目的の医薬を製造するための（単独でまたは組み合わせて）、本明細書に記載した任意の化合物の使用も、本発明の態様と解釈される。この医薬は、薬学上許容可能な希釈剤、アジュバント、キャリヤーなどをさらに含んでなることができる。
【００６３】
同様に、本発明は、本発明の方法を実施する上で使用しやすいやり方で包装した本発明の化合物または組成物を含んでなるキットを包含する。最も単純な態様では、このようなキットは封印したボトルまたは容器などの容器に入れた本発明の化合物または組成物であって、本発明の方法を実施する上で化合物または組成物の用法を記載したラベルを容器に貼り付けまたは包装に含めたものを包含する。好ましくは、化合物または組成物は、単位投薬量形態に包装される。もう一つの態様では、本発明のキットは、血管内皮細胞表面で発現するがリンパ管内皮には実質的に存在しないマーカー（抗原）に結合する第二の化合物と一緒に包装したＦｌｔ４結合化合物を包含する。
【００６４】
更に、本発明の多くの態様は、画像化または治療の目的でのペプチドまたはポリペプチドの使用に関して、および／または細胞表面上のＦｌｔ４タンパク質発現を抗体を用いる検出、スクリーニング、画像化などのターゲットとしての使用に関して記載してきた。リガンド結合可溶性Ｆｌｔ４断片を含んでなるポリペプチドのようなタンパク質治療薬の送出は、遺伝子治療材料および方法を用いて行うこともできる。例えば、目的とする治療ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる裸のＤＮＡ構造体または遺伝子治療発現ベクター構造体が、治療を必要とする哺乳類患者に送られる。好ましくは、この構造体は、治療ペプチドをコードする配列に操作可能に結合したプロモーターまたは他の発現制御配列を含んでなり、イン・ビボでの治療ペプチドの発現を促進する。一態様では、核酸はリポソームにカプセル化されている。もう一つの態様では、核酸、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスのようなウイルスベクターであるか、または哺乳類の遺伝子治療法に開発された他のベクターである。典型的な治療方法は、遺伝子治療構造体を含んでなる医薬組成物を患者に投与する段階、または細胞をエクス・ビボで形質転換またはトランスフェクションし、形質転換細胞を患者に導入する段階を包含する。同様に、細胞または組織によるＦｌｔ４発現の検出は、ノーザンハイブリダイゼーションまたはイン・シテューハイブリダイゼーション分析法でＦｌｔ４ｍＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いて、または定量的ＰＣＲまたは試料中のＦｌｔ４ｍＲＮＡを測定するための他の手法を行うことによって行うことができる。
【００６５】
本発明の他の特徴およびバリエーションは、詳細な説明を含む本出願明細書の全体から当業者に明らかになるであろうし、これら総ての特徴は、本発明の側面と解釈される。同様に、本明細書に記載した本発明の特徴は、これもまた本発明の側面と解釈される他の態様に再度組み合わせることができ、特徴の組合せが本発明の側面または態様として具体的に上記されているかどうかには関係しない。また、本発明にとって重要である本明細書に記載されている制限はそれ自体としてのみ考察されるべきであり、本明細書で重要であると記載されていない制限を欠いている本発明のバリエーションは、本発明の側面と解釈される。
【００６６】
上記に加え、本発明は、追加の側面として、上記に具体的に記載したよりもいずれにせよ狭い範囲で本発明の総ての態様を包含する。本発明者（ら）は添付した特許請求の範囲の全範囲を発明したのであるが、特許請求の範囲はその範囲内に第三者の従来技術の成果を包含しようとするものではない。従って、特許請求の範囲内の法律上の従来技術が特許庁または第三者または個人によって出願人に指摘される場合には、本出願人（ら）は、適切な特許法の下で補正する権利を行使して、このような特許請求の範囲の主題を再定義し、これらの特許請求の範囲から法律上従来技術または法律上従来技術の明らかなバリエーションを具体的に除外する権利を留保する。このような補正された特許請求の範囲によって定義される本発明のバリエーションは、本発明の側面と解釈される。
【発明の具体的な説明】
【００６７】
Ｆｌｔ４と呼ばれる新規受容体型チロシンキナーゼのクローニング、配列決定および発現を、下記に説明する。Ｆｌｔ４遺伝子は多くの増殖因子や増殖因子受容体がある染色体領域５ｑ３５に位置している。Ｆｌｔ４の細胞外ドメインは、１２個の潜在的グリコシル化部位を含む７個の免疫グロブリン様ループからなっている。構造上の類似性に基づいて、Ｆｌｔ４および以前に知られていたＦｌｔ１およびＫＤＲ／ＦＬＫ１受容体はクラスIIIチロシンキナーゼのサブファミリーを構成することができる。Ｆｌｔ４遺伝子は５．８kbおよび４．５kbのｍＲＮＡとして発現し、これらは３′配列が異なり且つＨＥＬおよびＤＡＭＩ白血病細胞で特異的に発現することが見出された。
【００６８】
ウイルムス(Wilm's)腫瘍細胞系、網膜芽細胞腫細胞系、および未分化奇形癌細胞系はＦｌｔ４を発現したが、分化奇形癌細胞はネガティブであった。ほとんどの胎児組織もＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現し、脾臓、脳中間領域および肺は最高レベルの発現を示した。成人組織では、その最高発現レベルは、胎盤、肺、腎臓、心臓および肝臓で見られ、この順で発現が減少した。イン・シテューハイブリダイゼーションでは、Ｆｌｔ４オートラジオグラフィー粒子が胎児肺の内皮細胞に蒸着した。胎児組織でのＦｌｔ４の免疫組織学的染色により、内皮細胞の染色が確かめられた。Ｆｌｔ４の発現パターンは、Ｆｌｔ１およびＫＤＲと比較して、１８週齢のヒト胎児の組織では大きく異なっている。Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178:2077 (1993)を参照されたい。
【００６９】
Ｆｌｔ４ｃＤＮＡを含む発現ベクターは、例４および１１に記載の通り、ＣＯＳおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞で産生され、発現した。
【００７０】
本発明のＦｌｔ４ＤＮＡおよびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドの精製、および様々な器官の内皮細胞の増殖および分化の調節に用いることができる。それらは、ある種の疾患の診断／治療に重要であることも証明することができる。
【００７１】
以下の説明において、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術で用いられる多くの用語が頻繁に用いられる。これらの用語に与えられる範囲を包含する明細書および特許請求の範囲を明確且つ一貫して理解するために、下記の定義が提供される。
【００７２】
遺伝子：  ＲＮＡポリメラーゼの鋳型を含むＤＮＡ配列。遺伝子から転写されたＲＮＡは、タンパク質をコードすることもまたはしないこともある。タンパク質をコードするＲＮＡメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれ、真核生物ではＲＮＡポリメラーゼIIによって転写される。しかしながら、これは、ＲＮＡポリメラーゼII鋳型を含む遺伝子であって、特異的ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有するが通常は翻訳されないＲＮＡ配列が転写されるものを構築することも知られている。このような遺伝子構造体は、本明細書では「アンチセンスＲＮＡ遺伝子」と呼ばれ、このようなＲＮＡ転写体は「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ配列に翻訳停止コドンが存在するため、通常は翻訳可能でない。
【００７３】
「相補的ＤＮＡ」または「cＤＮＡ」遺伝子は、介在配列（イントロン）を欠くｍＲＮＡの逆転写によって合成された組換え遺伝子を包含する。
【００７４】
クローニングビヒクル：  宿主細胞で自律複製することができるプラスミドまたはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であり、これらのＤＮＡ配列をビヒクルの本質的生物学的機能を喪失することなく確定的に切断することができ且つＤＮＡをスプライシングしてその複製およびクローニングを生じさせることができる１個または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とするもの。クローニングビヒクルは、クローニングビヒクルを用いて形質転換した細胞の同定で使用するのが適当なマーカーをさらに含むことがある。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。「ベクター」という用語は、「クローニングビヒクル」に用いられることがある。
【００７５】
発現ベクター：  クローニングベクターに類似したビヒクルまたはベクターであり、クローニングした遺伝子を、宿主中に形質転換した後に発現することができるもの。クローニングした遺伝子は、通常はプロモーター配列のようなある種の調節配列の制御下にある（すなわち、この配列操作可能に結合している）。発現調節配列は、ベクターが原核生物または真核生物宿主で操作可能に結合した遺伝子を発現するようにデザインされているかどうか、および更にエンハンサー要素、終結配列、組織特異性要素、および／または翻訳開始および終結部位のような転写要素をさらに含むかどうかによって変化する。
【００７６】
本発明は、組換えＦｌｔ４タンパク質（短および長形態）の両発現、およびこれらのタンパク質の機能誘導体に関する。
【００７７】
機能誘導体：  Ｆｌｔ４タンパク質の「機能誘導体」は、非組換えＦｌｔ４タンパク質の生物活性に本質的に類似した生物活性（機能的または構造的）を有するタンパク質である。Ｆｌｔ４タンパク質の機能誘導体は、特異的機能の実行のためのこのような修飾の必要性によって、共役結合した炭水化物のような翻訳後修飾を含むこともまたは含まないこともある。「機能誘導体」という用語は、分子の「断片」、「変異体」、「類似体」および「化学的誘導体」を包含すると解釈される。
【００７８】
本明細書で用いられるように、ある分子は、通常はこの分子の一部ではない追加的化学的残基をこの分子が含むときには、別の分子の「化学的誘導体」であるといわれる。このような残基は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを向上させることができる。これらの残基は、この分子の毒性を選択的に減少させ、且つこの分子の望ましくない副作用などを除去または減衰させることができる。このような効果を伝達することができる残基は、Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)に開示されている。このような残基を分子にカップリングする手続きは、当該技術分野で周知である。
【００７９】
断片：  Ｆｌｔ４タンパク質のような分子の「断片」は、ペプチドコア、またはペプチドコアの変異体のような分子の任意の部分を表すことを意味する。
【００８０】
変異体：  Ｆｌｔ４タンパク質のような分子の「変異体」は、構造および生物活性が分子全体またはその断片に実質的に類似している分子を表すこと意味する。従って、２分子が同様な活性を有する場合には、分子の一方の組成、または二次、三次または四次構造が他方で見られるものと同一ではなく、またはアミノ酸の配列が同一ではない場合であっても、この用語が本明細書で用いられるように、それらは変異体と考えられる。
【００８１】
類似体：  Ｆｌｔ４タンパク質または遺伝子配列の「類似体」は、本発明のＦｌｔ４タンパク質または遺伝子配列に機能が実質的に類似しているタンパク質または遺伝子配列を表すことを意味する。
【００８２】
好ましい態様の説明
本発明は、本発明者らが「Ｆｌｔ４」と呼ぶチロシンキナーゼの受容体、Ｆｌｔ４をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど）、Ｆｌｔ４遺伝子配列からのＦｌｔ４ペプチドまたはＦｌｔ４タンパク質の産生およびその産物、組換えＦｌｔ４発現ベクター、Ｆｌｔ４類似体および誘導体、およびＦｌｔ４および関連タンパク質の診断および／または治療での使用、Ｆｌｔ４リガンド、Ｆｌｔ４アンタゴニスト、および抗Ｆｌｔ４抗体に関する。
【００８３】
組換えＦｌｔ４の産生
生物活性Ｆｌｔ４は、Ｆｌｔ４コード配列またはその機能的に同等なものを適当な宿主細胞でクローニングおよび発現することによって産生することができる。
【００８４】
組換えＤＮＡ技術を用いるＦｌｔ４の産生は、説明のために、(1) 所望なＦｌｔ４のコード配列（遺伝子）を単離または生成させ、(2) 所望なＦｌｔ４の合成を指令することができる発現ベクターを構築し、(3) Ｆｌｔ４遺伝子を複製および発現することができる適当な宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換し、および／または遺伝子産物をプロセッシングして所望なＦｌｔ４を産生し、(4) 所望なＦｌｔ４産物を同定する、段階的工程に分割することができる。
【００８５】
Ｆｌｔ４遺伝子の単離または生成
Ｆｌｔ４のヌクレオチドコード配列またはその機能的に同等なものを用いて、所望なＦｌｔ４産物の発現を指令する組換え発現ベクターを構築することができる。本発明の方法の実施では、そこに記載されているヌクレオチド配列、またはその断片または機能的に同等なものを用いて適当な宿主細胞で組換えＦｌｔ４産物の発現を指令する組換え分子を生成することができる。Ｆｌｔ４コードヌクレオチド配列は、Ｆｌｔ４様活性を生成するおよび／またはＦｌｔ４コードｍＲＮＡを発現する様々な細胞供給源から得ることができる。本発明者らは、ヒト胎盤、白血病細胞、および幾つかの腫瘍細胞系などＦｌｔ４の多数の適当なヒト細胞供給源を同定した。
【００８６】
Ｆｌｔ４コード配列は、これらの細胞供給源から単離し、精製したＲＮＡからｃＤＮＡクローニングによって、またはゲノムクローニングによって得ることができる。Ｆｌｔ４配列は、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ材料から当該技術分野で周知の手法を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。クローンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、当該技術分野で周知の手法を用いて調製することができ、特定のＦｌｔ４ＤＮＡについてＦｌｔ４遺伝子の任意の部分に実質的に相補的なヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることができる。完全長のクローン、すなわち、所望なＦｌｔ４の全コード領域を含むものを選択して、発現ベクターを構築することができる。あるいは、Ｆｌｔ４ コードＤＮＡを全部または一部を当該技術分野で標準的な手法を用いる化学合成によって合成することができる。ヌクレオチドコード配列が本来的に縮重しているため、実質的に同一または機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明の方法の実施に用いることができる。このようなＦｌｔ４ヌクレオチド配列の変更としては、同一または機能的に同等な遺伝子産物をコードする配列を生じる異なるヌクレオチドの欠失、付加または置換が挙げられる。遺伝子産物は、サイレント変化を生じることによって生物活性生成物を生成する配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができる。このようなアミノ酸置換は、関与した残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、帯電していない極性の頭基または同様な親水性値を有する無極性の頭基を有するアミノ酸としては、下記のものが挙げられる：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシン。
【００８７】
Ｆｌｔ４発現ベクターの構築
この知見を用いて、Ｆｌｔ４受容体型チロシンキナーゼを合理的な量で提供することができる様々な組換えＤＮＡベクターが提供される。本明細書で同定された重要な構造的特徴を有する合成タンパク質並びに他の供給源由来の同じファミリーのタンパク質をコードする関連構造の他の組換えＤＮＡベクターを、組換えＤＮＡ技術の標準的手法を用いてＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼｃＤＮＡから産生することができる。このＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼ  発現する組換え体は、この手法の一例として産生されている（例３および４を参照されたい）。新たに見出された配列および構造の知見を用いて、真核細胞のトランスフェクションによって、生物学的目的でＦｌｔ４受容体型チロシンキナーゼおよびその様々なドメインを調製することができる。
【００８８】
Ｆｌｔ４遺伝子産物を発現するトランスフェクタントまたは形質転換体の同定
組換えコード配列を含み、生物活性な成熟した産物を発現する宿主細胞は、(a)ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡのハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、(c) 受容体細胞でのＦｌｔ４ｍＲＮＡ転写体の発現によって測定される転写レベルの評価、および(d) イムノアッセイおよび最後にはその生物活性によって測定される成熟遺伝子産物の検出の少なくとも４種類の一般的方法によって同定することができる。
【００８９】
第一の方法では、発現ベクターに挿入されるＦｌｔ４コード配列の存在を、Ｆｌｔ４コード配列に相同性のヌクレオチド配列を含んでなるプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。
【００９０】
第二の方法では、組換え発現ベクター／宿主系は、ある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス封入体(occlusion body)形成など）の存在または非存在に基づいて同定し、選択することができる。例えば、Ｆｌｔ４コード配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入すると、そのコード配列を有する組換え体をマーカー遺伝子機能がないことによって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子は、Ｆｌｔ４コード配列の発現を制御するのに用いる同じまたは異なるプロモーターの制御下で、Ｆｌｔ４配列とタンデムに配置することができる。マーカーが誘発または選択に応答して発現することは、Ｆｌｔ４コード配列の発現を示唆している。
【００９１】
第三の方法では、Ｆｌｔ４コード領域についての転写活性は、ハイブリダイゼーション分析法によって評価することができる。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは、Ｆｌｔ４コード配列に相同性のプローブまたはその特定部分を用いるノーザンブロット法によって単離して分析することができる。あるいは、宿主細胞の総核酸を抽出して分析し、それらのプローブにハイブリダイゼーションすることができる。
【００９２】
第四の方法では、Ｆｌｔ４の発現は、例えば、ウェスタンブロット分析法、放射線免疫沈澱法、固相酵素免疫検定法などの免疫検定法によって免疫学的に分析することができる。しかしながら、発現系の成功の最終的な試験には、生物活性を有するＦｌｔ４遺伝子産物の検出を必要とする。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場合には、培養したトランスフェクタント宿主細胞から得られる無細胞培地をＦｌｔ４活性について分析することができる。遺伝子産物が分泌されない場合には、細胞溶解生成物を上記の活性について分析することができる。いずれの場合にも、Ｆｌｔ４へのリガンド結合または他のＦｌｔ４の生物活性を測定する分析法を用いることができる。
【００９３】
Ｆｌｔ４誘導体、類似体、およびペプチド
Ｆｌｔ４に関する誘導体、類似体およびペプチドの産生および使用も考えられ、これらは本発明の範囲内にある。このような誘導体、類似体、またはペプチドは、特定の用途によっては本来のＦｌｔ４と比較して増加または減少した生物活性を有することがある。本発明のＦｌｔ４に関連した誘導体、類似体、およびペプチドは、当該技術分野で知られている様々な手段によって産生させることができる。遺伝子およびタンパク質レベルでの手続きおよび操作は、本発明の範囲内にある。当該技術分野で標準的なペプチド合成を用いて、Ｆｌｔ４ペプチドを得ることができる。タンパク質レベルでは、多数の化学修飾を用いて、エンドペプチダーゼ（例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）またはエキソペプチダーゼ、アセチル化、ホルミル化、酸化などによる特異的な化学的開裂を包含するが、これらに限定されない当該技術分野で知られている手法によってＦｌｔ４様誘導体、類似体、またはペプチドを産生することができる。
【００９４】
好ましい誘導体、類似体、およびペプチドは、Ｆｌｔ４リガンド結合活性を保持しているものである。Ｆｌｔ４リガンドと結合するがこれに応答してシグナルを導入しない誘導体、類似体、およびペプチドは、Ｆｌｔ４インヒビターとして有用である。リガンドと結合しこれに応答して、例えば、細胞内Ｆｌｔ４自己リン酸化を介してシグナルを導入する誘導体、類似体、およびペプチドは、本来のＦｌｔ４と同様に有用である。上記の結合および／または自己リン酸化分析法に使用する好ましいＦｌｔ４リガンドは、本明細書記載のＰＣ−３コンディショニング培地から単離可能な約２３kdのポリペプチドを含んでなるリガンドである。血管内皮増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）と呼ばれるこのリガンドは、１９９６年８月１日に出願され、国際公開ＷＯ ９７／０５２５０号として公表されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号明細書、および優先権についてこれらに基づく米国特許出願優先権書類で詳細に特性決定されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００９５】
抗Ｆｌｔ４抗体
また、Ｆｌｔ４または関連タンパク質を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生も本発明の範囲内にある。
【００９６】
当該技術分野で知られている様々な手順を用いて、Ｆｌｔ４のエピトープに対するポリクローナル抗体の産生に用いることができる。抗体の産生のために、様々な宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを包含するがこれらに限定されない）を、Ｆｌｔ４または合成Ｆｌｔ４ペプチドを投与することによって免役することができる。宿主の種によっては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルション、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanins）、ジニトロフェノールのような界面活性物質、およびＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumのような潜在的有用性を有するヒトアジュバントを包含するがこれらに限定されない様々なアジュバントを用いて免疫応答を増加させることができる。
【００９７】
Ｆｌｔ４のエピトープに対するモノクローナル抗体は、培養における連続細胞系による抗体分子の産生を準備する任意の手法を用いることによって調製することができる。これらには、最初はKoehler et al., Nature, 256: 495-497 (1975)によって記載されたハイブリドーマ法、および更に最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法[Kosbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)]およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｌｔ４に対する抗体は、細菌中でクローニングした免疫グロブリンｃＤＮＡから産生することもできる。組換えファージ抗体系を用いて、細菌培養物中で抗体を速やかに産生させて選択し、それらの構造を遺伝子操作することができることがある。
【００９８】
この分子のイディオタイプを含む抗体断片は、既知の手法によって生成することができる。例えば、上記断片としては、抗体分子のペプシン消化によって生成させることができるＦ(ａｂ′)２断片、Ｆ(ａｂ′)２断片のジスルフィドブリッジを還元することによって生成させることができるＦａｂ′断片、および抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成させることができる２個のＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
Ｆｌｔ４に対する抗体を、Ｆｌｔ４ポリペプチドのアフィニティー精製、およびＦｌｔ４生合成、代謝および機能の解明における成熟Ｆｌｔ４およびＦｌｔ４前駆体およびサブコンポーネント形態の定性的および定量的検出に用いることができる。Ｆｌｔ４チロシンキナーゼ活性の検出を、上記検定法におけるＦｌｔ４特異シグナルを生成させ増幅する酵素的手段として用いることができる。Ｆｌｔ４に対する抗体は、診断および治療薬として用いることもできる。
【０１００】
Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ４コード核酸分子、および抗Ｆｌｔ４抗体の使用
本発明者らは、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ４類似体および誘導体、Ｆｌｔ４コード核酸分子、アンチセンス核酸分子、および抗Ｆｌｔ４抗体の診断および／または治療での使用など、本発明の組成物の多種多様な使用を考えている。
【０１０１】
Ｆｌｔ４コード核酸分子またはその断片は、ｍＲＮＡsコードＦｌｔ４を検出し定量するためのプローブとして用いることができる。既知遺伝子配列の全部または一部を含んでなる配列を検出するための核酸プローブを用いる検定法は、当該技術分野で周知である。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡレベルは、腫瘍形成の出現および／または存在、並びに他のヒト疾患の開始および／または進行を示唆することができる。従って、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡを検出して定量することができる検定法であれば、重要な診断手段を提供することができる。
【０１０２】
アンチセンスＦｌｔ４ＲＮＡ分子は、治療目的がＦｌｔ４の存在を除去しまたはそのレベルをダウンレギュレーションしようとする望みを伴うＦｌｔ４コードｍＲＮＡの翻訳を阻害する上で治療上有用である。Ｆｌｔ４アンチセンスＲＮＡは、例えば、Ｆｌｔ４が例えばその過剰発現による起因薬として関与する疾患の治療におけるＦｌｔ４拮抗薬として用いることができる。
【０１０３】
更に、Ｆｌｔ４アンチセンスＲＮＡは、Ｆｌｔ４作用機序の解明に有用である。Ｆｌｔ４コード核酸分子は、本出願明細書で別個に検討される組換えＦｌｔ４タンパク質および関連分子の産生に用いることができる。
【０１０４】
抗Ｆｌｔ４抗体を用いて、様々な状況におけるＦｌｔ４を診断して定量することができる。例えば、Ｆｌｔ４の様々なドメインに対する抗体を、Ｆｌｔ４のイムノアッセイまたはＦｌｔ４の免疫組織化学的評価の基礎として用いることができる。Ｆｌｔ４のチロシンキナーゼ活性は、これらの検定法においてＦｌｔ４シグナルの生成の酵素増幅反応として用いることができる。抗Ｆｌｔ４抗体は、細胞表面上のＦｌｔ４の量の検討に用いることもできる。
【０１０５】
Ｆｌｔ４リガンドアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することによって、Ｆｌｔ４活性を調節することができるようになる抗体を産生することができる。また、合成的手段またはランダムオリゴヌクレオチドから組換え手段によってランダムペプチドを産生することができ、Ｆｌｔ４受容体に特異的結合を示すものをＦｌｔ４細胞外ドメインを用いて選択することができる。このようなペプチドセグメントは、当該技術分野で標準的な方法を用いてＦｌｔ４の細胞外ドメインを用いるファージディスプレーライブラリーから選択することもできる。このようなペプチドは、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有することができる。Ｆｌｔ４抗体は、Ｆｌｔ４発現細胞および組織または腫瘍のイン・ビボ画像化の目的で様々な化合物に接合した後、重要な診断手段も提供することができる。
【０１０６】
Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体は、適当な超磁性、常磁性、電子稠密、音波発生または放射性薬剤に共役的または非共役的にカップリングして、ターゲッティングした画像化剤を生成することができる。タンパク質分解または化学的処理によって生成した抗体断片、またはモノクローナル抗体のエピトープ結合ドメインを用いることによって生成した分子を、完全な抗体の代わりに用いることができる。次に、この画像化剤を、診断目的で人体のＸ線、磁気共鳴、超音波検査またはシンチグラフィーによる画像化のコントラスト試薬として用いる。
【０１０７】
Ｆｌｔ４の分子生物学
配列番号１および３に記載のＦｌｔ４ｃＤＮＡクローンの完全配列は４１９５または４７９５ヌクレオチドに及び、選択的スプライシングによっては１２９８または１３６３アミノ酸のオープンリーディングフレームを含む。ヌクレオチドおよび推定Ｆｌｔ４アミノ酸配列（短形態）を、配列番号１および２に示す。図２は、Ｆｌｔ４アミノ酸配列とＦｌｔ１チロシンキナーゼアミノ酸配列との比較を表している。Shibuya et al., Oncogene, 5: 519-524 (1990)を参照されたい。
【０１０８】
大部分が疎水性アミノ酸の推定シグナルペプチド配列は、イニシエーターメチオニンの後に続く。相当するＡＴＧを取り巻く配列は、コンセンサス翻訳開始配列と一致する[Kozak, Nucl. Acids Res., 15: 8125-8135 (1987)]。両Ｆｌｔ４ポリペプチドの予測細胞外部分は長さが７７５アミノ酸であり、アスパラギン結合したグリコシル化の１２個の潜在的部位を含む（ＮＸＳ／Ｔ）。これは、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーの部分に記載されているスペーシングのパターンを示す幾つかのアミノ酸残基も含む[Williams et al., Annu. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988)]。これは１２個のシステイン残基を有し、これは７個の免疫グロブリン様ドメインに配置することができる。図２に示すように、７個の免疫グロブリン様ドメインは、下記のように定義される：Ｉｇ−Ｉ（配列番号１，１５８〜３６４位；配列番号２，アミノ酸４７〜１１５）；Ｉｇ−II（配列番号１，４７９〜６４９位；配列番号２，アミノ酸 １５４〜２１０）；Ｉｇ−III（配列番号１，７６１〜９６１位；配列番号２，アミノ酸２４８〜３１４）；Ｉｇ−IV（配列番号１，１０７０〜１２２８；配列番号２，アミノ酸３５１〜４０３）；Ｉｇ−Ｖ（配列番号１，１３４０〜１６３３位；配列番号２，アミノ酸４４１〜５３８）；Ｉｇ−VI（配列番号１，１７３９〜１９９０；配列番号２，アミノ酸５７４〜６５７）；およびＩｇ−VII（配列番号１，２１０２〜２２７５；配列番号２，アミノ酸６９５〜７５２）。予測されるＩｇ様ドメインIVは、システイン残基を欠いている。図２も、Ｆｌｔ１の細胞外ドメイン（配列番号５）を示しており、これはＦｌｔ４の最も近縁のヒト同族体である。この図から、システイン残基の配列とＩｇ様領域の極めて類似した組成がわかる。
【０１０９】
Ｆｌｔ４の細胞質ドメインを、２３個の疎水性アミノ酸残基の推定膜貫通領域によって細胞外部分から分離する。この配列を、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間の接合を示唆している塩基性領域によって細胞質側にフランキングする。チロシンキナーゼ相同ドメインは残基８４３から始まり、ＡＴＰ結合ポケットとＹ１０６８におけるｃ−ｓｒｃのＹ４１６に相同性の推定的自己リン酸化部位を包含する（図２）。Ｆｌｔ４のチロシンキナーゼ触媒ドメインは、ほとんどが親水性でありＦｌｔ１に相同性を示さない６５アミノ酸配列（ａａ９４４〜１００８）によって２つのサブドメインに分割される。Ｆｌｔ１とは異なり、Ｆｌｔ４はそのキナーゼインサートにチロシン残基を含まない。
【０１１０】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡの第二の種は、一層長い形態のＦｌｔ４タンパク質の選択的３′末端を有する。
【０１１１】
図３Ａ〜Ｃには、選択的スプライシングによるＦｌｔ４ｍＲＮＡの短および長形態が示されている。図３Ａは、 クローンＪ．１．１およびＩ．１．１のｃＤＮＡインサートの３′末端の図解構造を示す。クローンＪ．１．１のＴＡＧ停止コドン並びにポリアデニル化部位（ポリＡ）が示唆されている。クローンＩ．１．１は、陰を付けた部分（それぞれ、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡの長および短形態）がクローンＪ．１．１と異なっている。ＴＡＡおよびポリＡは、クローンＩ．１．１の停止コドンとポリアデニル化部位を示している。更に、ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩの制限エンドヌクレアーゼ開裂部位が示されている。下には、ｃＲＮＡ保護分析に用いるクローンＩ．１．１の２５６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩインサートが示されている。最も濃い陰を付けた部分は、イン・ビトロでのアンチセンス鎖の転写の線形化センスＲＮＡ鋳型におけるポリリンカー由来の配列を示している。ＲＮアーゼ保護分析後の保護された断片の図解構造も示されている。図３Ｂおよび３Ｃは、２５６bp３５Ｓで標識したアンチセンスＲＮＡプローブ、および指示した細胞系由来のポリアデニル化ＲＮＡによって保護したときのＦｌｔ４ＲＮＡの長および短形態を表す２１１および１２４bpの消化断片のオートラジオグラムを示す（Ｔｅｒａ−２は、本明細書ではレチン酸（ＲＡ）で１０日間処理したまたは処理することなく分析した奇形癌細胞系である）。（ネガティブ）コントロールレーンは、転移ＲＮＡで保護した結果を示す。Ｔｅｒａ−２細胞の分化中のＦｌｔ４ｍＲＮＡのダウンレギュレーションに注目されたい。クローン１３のＴｅｒａ−２細胞は、Dr. C.F. Graham (Department of Zoology, University of Oxford, UK)によって提供された。継代数が１８〜４０の細胞を、この検討で用いた。細胞を、１０％子牛胎児血清と抗生物質を補足したイーグル最小必須培地に保持した。分化を誘発するため、細胞をゼラチンをコーティングした組織培養級皿で１．５×１０３個の細胞／ｃｍ２の密度で培養した。翌日、２×１０−６ＭのＲＡを培地に加えた。細胞を、ＲＡの存在下にて１０日間培養した。
【０１１２】
図３Ａ〜Ｃに示した結果は、選択的スプライシングによって生成したこれら２種類のＦｌｔ４（短および長）形態のカルボキシ末端の生成を説明している。
【０１１３】
その推定アミノ酸配列によれば、Ｆｌｔ４はクラスIIIのＲＴＫに属する。更に具体的には、Ｆｌｔ４は、ＲＴＫのサブファミリーに属し、これはその細胞外部分に７個のＩｇ−ループを含んでおり、従って、これは５個のＩｇ−ループを含むクラスIIIＲＴＫの他のものと異なっている。Ｆｌｔ４は、ＦＬＴファミリーのプロトタイプ受容体であるＦｌｔ１であって、ヒトゲノムＤＮＡライブラリー由来のｖ−ｒｏｓ関連ＤＮＡとしてクローニングしたもの[Shibuya et al., Oncogene, 5: 519-524 (1990)]、およびマウスＦＬＫ１受容体であって、マウス肝臓の造血幹細胞エンリッチト画分からクローニングしたもの[Matthews et al., Cell, 65: 1143-1152 (1991); Matthews et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991)]と極めて近接した相同性である。Ｆｌｔ４の細胞外ドメインは、ヒトＦｌｔ１およびマウスＦＬＫ１とそれぞれ３３％および３７％のアミノ酸配列同一性を示す。Ｆｌｔ１とＦＬＫ１は、Ｆｌｔ４と同様に、肺、心臓、および腎臓のような様々な正常組織で広汎に発現する。更に、最近同定されたヒト内皮細胞受容体型チロシンキナーゼＫＤＲ[Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)]は、Ｆｌｔ４やＦｌｔ１ファミリーのものとかなりの相同性を示す。利用可能な配列データーから、ＫＤＲはチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインＦｌｔ４と８１％同一であることを計算することができる。更に、ＫＤＲの細胞外ドメインも７Ｉｇ−ループ構造を有し、そのＴＫ１およびＴＫ２ドメインはマウスＦＬＫ１受容体の相当するドメインと９５％および９７％の同一性を有する。これは、ＫＤＲがマウスＦＬＫ1のヒト同族体であることを示唆している。
【０１１４】
Ｆｌｔ４ＴＫドメインはＦｌｔ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲのＴＫドメインと約８０％同一性を有するが、ＲＴＫクラスIIIの他の受容体のＴＫドメインとは約６０％の同一性しか持たない。これらの他の受容体も細胞外領域に５個のＩｇ様ドメインしか持たないので、クラスIIIＲＴＫ内の別個のＦＬＴサブファミリーにおいてＦｌｔ４、Ｆｌｔ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲを分類することができる。
【０１１５】
ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｆｍｓおよびｃ−ｋｉｔのキナーゼインサート中の配列Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｙ−Ｍ／Ｖ−Ｐ／Ｄ／Ｅ−Ｍ[Cantley, et al., Cell, 64: 281-302 (1991)]（配列番号６）に配置されたチロシン残基は自己リン酸化部位であり、リン酸化すると、ホスファチジルイノシトール３′−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）のＳＨ２ドメインに結合する[Reedijk et al., EMBO J, 11: 1365-1372 (1992)]。興味深いことには、これらのクラスIIIＲＴＫとは異なり、ＦＬＴサブファミリーまたはＦｌｔ３／ＦＬＫ２受容体は上記のコンセンサスモティーフを含まない。
【０１１６】
８個のヒトクラスIIIＲＴＫ遺伝子は、３種類の異なる染色体に集まっている。染色体４は、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ−αおよびＫＤＲ遺伝子を含む[Yarden et al., EMBO J, 6: 3341-3351 (1987); Stemnan et al., Genes, Chromosomes, Cancer, 1: 155-158 (1989); Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)]。Ｆｌｔ１とＦｌｔ３遺伝子は、染色体１３ｑ１２に位置しているが[Satoh et al., Jpn. J Cancer Res., 78: 772-775 (1987); Rosnet et al., Genomics, 9: 380-385 (1991)]、Ｆｌｔ４は染色体５バンドｑ３５にあり[Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]、ｆｍｓおよびＰＤＧＦＲ−β遺伝子に近い[Warrington et al., Genomics, 11: 701-708 (1991)。染色体５の長アームは、白血病細胞で見られるトランスロケーションに関与している。染色体５の長アームの部分の欠失は、難治性貧血や大赤血球症の患者の骨髄細胞で見られた[Van Den Berghe et al., Nature, 251: 437-439 (1974)]。異常５ｑ染色体は、過剰な芽細胞を有する難治性貧血[Swolin et al., Blood, 58: 986-993 (1981)]、原因不明骨髄様化生[Whang-Peng et al., Leuk. Res., 2: 41-48 (1978)]、慢性骨髄性白血病[Tomiyasu et al., Cancer Genet. Cytogenet., 2: 309-315 (1980)]、真性赤血球増加症[Van Den Berghe et al., Cancer Genet. Cytogenet., 1: 157-162 (1979)]、および本態性血小板血症[Nowell et al., Cancer, 42: 2254-2260 (1978)]のような数種類の他の骨髄増殖性疾患で見られる。
【０１１７】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現に関して見出されたことは、そのタンパク質生成物がある種の白血病細胞に特徴的であることを示唆している。巨核芽球性と内皮細胞とに分配された幾つかの分化抗原が存在することが示されており、一例は血小板糖タンパク質IIIaである[Ylaenne et al., Blood, 72: 1478-1486 (1988); Kieffer et al., Blood, 72: 1209-1215 (1988); Berridge et al., Blood, 66: 76-85 (1985)]。更に、Ｆｌｔ４は、胎児期中の肺や腎臓などのある種の内皮細胞によって発現する。
【０１１８】
発生中のＦｌｔ４の役割を更に理解するため、マウスＦｌｔ４の部分ｃＤＮＡをクローニングした。イン・シテューハイブリダイゼーションでこれらのプローブを用いて、マウス発生中のＦｌｔ４ｍＲＮＡ発現を分析した。Ｆｌｔ４はリンパ系の脈管形成および血管新生中に発現することが確定された。Ｆｌｔ４は正常および病理学的条件での成人組織のリンパ管内皮細胞並びにある種の高内皮性小静脈（ＨＥＶ）で見出されたので、これらの知見の関連性を正常および病理学的成人組織でも確認した。
【０１１９】
マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片のクローニングでは、その推定アミノ酸配列は相当するヒト配列とほぼ同一であることを示した（検討を行った両セグメントでのアミノ酸同一性は約９６％）。マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡの同一性についてのもう一つの証拠は、ノーザンブロット法によるハイブリダイゼーション検討から得られ、両種からのプローブはマウス組織由来の典型的な５．８kbのｍＲＮＡシグナルを生じた。成熟マウスの様々な組織から単離したＲＮＡの分析では、肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓でＦｌｔ４発現を示したが、脳および精巣ではハイブリダイゼーションを全くまたはほとんど示さなかった。このパターンは、Galland et al., Oncogene, 8: 1233 (1993)によって初期に報告されたパターンと類似している。ＲＮアーゼ保護の結果は、８．５日ｐ．ｃ．胚から出発するマウスの発生の際にはＦｌｔ４遺伝子が必要であり、相対的発現レベルは極めて安定であることを示唆していた。
【０１２０】
イン・シテューハイブリダイゼーションには、細胞外ドメインの配列をコードするマウスＦｌｔ４ｃＤＮＡの２個の断片を選択した。これにより、ハイブリダイゼーションパターンを、関連したＦＬＫ−１およびＦｌｔ１受容体パターンであって細胞外領域ではＦｌｔ４と極めて低い程度の配列同一性しか示さないものから明確に区別できた。Millauer et al., Cell, 72: 835 (1993); Yamaguchi et al., Development, 118:489 (1993); Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8915 (1993); Finnerty et al., Oncogene, 8: 2293 (1993)を参照されたい。
【０１２１】
Ｆｌｔ４は、ＦＬＫ−１、Ｆｌｔ１、ＴｉｅおよびＴｅｋ内皮受容体型チロシンキナーゼ遺伝子と同様に、交尾後（ｐ．ｃ．）７．５日の胚では発現しなかった。８．５日ｐ．ｃ．の胚では、最も強いＦｌｔ４シグナルが尿膜、頭部間葉のエナメル芽細胞、背大動脈および主静脈に集中していた。弱いシグナルが、心内膜に見られた。対照的に、卵黄嚢の血管芽細胞はＦＬＫ−１、およびＦｌｔ１、ＴｉｅおよびＴｅｋと異なり陰性であった。Korhonen et al., Oncogene, 8: 395 (1993);およびPeters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8915 (1993)を参照されたい。静脈系に対するＦｌｔ４発現の制限は１１．５日後のマウス胚由来の試料で更に一層明らかであり、ＴｉｅｍＲＮＡは動脈でも発現した。１２日ｐ．ｃ．の胚では、Ｆｌｔ４シグナルが発生する静脈および推定リンパ管内皮を修飾したが、内皮Ｔｉｅ受容体型チロシンキナーゼに対するものとは異なり、動脈内皮陰性であった。発生の後期段階中に、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは発生リンパ管を表す血液細胞を欠いた脈管叢に限定された。リンパ管内皮と幾つかの高内皮性小静脈が、成人組織でＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現した。リンパ洞および高内皮性小静脈、転移性リンパ節、およびリンパ管腫では、発現が増加した。
【０１２２】
マウス胚由来のデーターの解釈が困難なため、ヒト内皮を検討したが、これはリンパ系がヒトではずっと詳細に定義されているからである。また、様々な内皮から確立した細胞も、細胞培養で検討し、Ｆｌｔ４発現の特異性がイン・ビトロ条件で持続されるかどうかを見ることができた。内皮細胞系は、イン・ビトロ培養によって分化特性を喪失することが知られている。従って、それらがＦｌｔ４ｍＲＮＡに対して陰性であることは予想外ではなかった。培養した大動脈内皮細胞も、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡを欠いていた。しかしながら、微小血管系や大腿および臍帯静脈から増殖したヒト内皮細胞からは、シグナルが得られた。従って、Ｆｌｔ４発現の特異性の少なくとも幾らかは、細胞培養において保持された。
【０１２３】
成人組織のイン・シテューハイブリダイゼーション分析により、Ｆｌｔ４が発生マウス胚に見られるリンパ系に限定されることを確かめた。Ｆｌｔ４発現はリンパ管内皮とヒトリンパ節の洞で見られた。興味深いことには、リンパ節への白血球の輸送に機能を有することが示されている立方骨内皮を有するリンパ節ＨＥＶの幾つかは、Ｆｌｔ４陽性であった。更に、平行ハイブリダイゼーション分析は、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡレベルが正常なリンパ節と比較して転移性でのこれらの構造では増大することが示された。Ｆｌｔ４は結合組織ストロマから構成される良性腫瘍であるリンパ管腫や増殖する内皮ライニングしたリンパ管チャンネルでも極めて顕著であった。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡはこれらの腫瘍のリンパ管内皮に限定され、それらの動脈、静脈および毛細血管では見られなかった。ヒト肺では、リンパ管構造は唯一の同定されたＦｌｔ４陽性管であった。
【０１２４】
上記の結果は、Ｆｌｔ４が成人組織におけるリンパ管および幾つかの高内皮性小静脈の新規マーカーであることを示している。これらの結果は、リンパ管の静脈起源についての仮説も支持している。増殖因子受容体としてのＦｌｔ４は、これらの血管の分化および機能に関与することがある。Ｆｌｔ４リガンド、ＶＥＧＦ−Ｃを介するＦｌｔ４によって伝達される生物学的作用の詳細な特性決定は、１９９６年８月１日に出願され、国際公開ＷＯ９７／０５２５０号として公表されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号明細書に提供されている。
【０１２５】
本発明に係るＦｌｔ４結合化合物と組み合わせたこれらの結果により、特に可視化することができる放射性、電子稠密または他のレポーター物質にカップリングした本発明の抗体を用いることによってリンパ管内皮を選択的に標識することができる。リンパ系にＦｌｔ４受容体インターナリゼーション誘発モノクローナル抗体またはリガンドを含む物質を投与することによって、予め定められた分子をリンパ管内皮に輸送することができることがある。また、本発明に係るＦｌｔ４結合化合物を用いて、高内皮性小静脈、特にＦｌｔ４受容体のレベルを増加して発現する活性化ＨＥＶを検出することが可能なことがある。本発明者らの知見によれば、上記のような特異的マーカーは現在のところはリンパ管内皮には利用可能ではないのである。
【０１２６】
遺伝子に基づく治療法
本発明は、遺伝子治療法も考えている。特に、癌細胞の血管系または癌細胞自身を、治療成果をもたらすやり方で細胞の血管系に例えば、本発明の可溶性ＶＥＧＦＲ−３断片のような治療ペプチドを提供することができる発現構造体と接触させることができる。このような治療成果は、例えば、腫瘍の血管系におけるＶＥＧＦＲ−３の阻害、新脈環形成の阻害、リンパ管形成の阻害、腫瘍増殖のアブレーション(abalattion)、退行または他の阻害、腫瘍の血管またはリンパ管系または実際に腫瘍細胞自身のアポトーシスの誘発であることがある。
【０１２７】
これらの態様に対して、典型的な発現構造体は、ウイルス、またはウイルスゲノム由来の工学処理した構造体を含んでなる。発現構造体は、一般に発現しようとする遺伝子をコードする核酸と、投与する細胞で遺伝子の発現を行う追加の調節領域をさらに含んでなる。上記の調節領域としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。
【０１２８】
ＤＮＡは、様々なウイルスベクターを用いて細胞に導入することができることが現在広く認められている。このような態様では、目的とする遺伝子を含むウイルスベクターを含んでなる発現構造体は、アデノウイルス（例えば、米国特許第５,８２４,５４４号明細書；米国特許第５,７０７,６１８号明細書；米国特許第５,６９３,５０９号明細書；米国特許第５,６７０,４８８号明細書；米国特許第５,５８５,３６２号明細書を参照されたい。上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）、レトロウイルス（例えば、米国特許第５,８８８,５０２号明細書；米国特許第５,８３０,７２５号明細書；米国特許第５,７７０,４１４号明細書；米国特許第５,６８６,２７８号明細書；米国特許第４,８６１,７１９号明細書を参照されたい。上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第５,４７４,９３５号明細書；米国特許第５,１３９,９４１号明細書；米国特許第５,６２２,８５６号明細書；米国特許第５,６５８,７７６号明細書；米国特許第５,７７３,２８９号明細書；米国特許第５,７８９,３９０号明細書；米国特許第５,８３４,４４１号明細書；米国特許第５,８６３,５４１号明細書；米国特許第５,８５１,５２１号明細書；米国特許第５,２５２,４７９号明細書を参照されたい。上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）、アデノウイルス−アデノ随伴ウイルスハイブリッド（例えば、米国特許第５,８５６,１５２号明細書を参照されたい。上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）、またはワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルス（例えば、米国特許第５,８７９,９３４号明細書；米国特許第５,８４９,５７１号明細書；米国特許第５,８３０,７２７号明細書；米国特許第５,６６１,０３３号明細書；米国特許第５,３２８,６８８号明細書を参照されたい。上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）ベクターであることがある。
【０１２９】
他の態様では、非ウイルスデリバリーが考えられる。これらには、リン酸カルシウム沈澱(Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990)、ＤＥＡＥ−デキストラン(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985)、エレクトロポレーション(Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984)、直接マイクロインジェクション(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985)、ＤＮＡ負荷リポソーム(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Felgner, Sci Am. 276(6):102-6, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7(15):1791-3, 1996)、細胞超音波処理(Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-84679 1987)、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572, 1990)、および受容体が介在したトランスフェクション (Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987; Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993)が挙げられる。
【０１３０】
本発明の具体的態様では、発現構造体（または実際に、上記したペプチド）をリボソームに閉じ込めることができる。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒質とを特徴とする小胞性構造体である。多重膜リボソームは、水性媒質によって隔離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁するときに自発的に形成される。脂質成分は閉構造を形成する前に自己再配列を行い、水と溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ghosh and Bachhawat, 「肝臓疾患、特異受容体とリガンドを用いるターゲット設定した診断と治療(Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands)」, Wu G, Wu C 監修, New York: Marcel Dekker, pp. 87-104, 1991)。ＤＮＡのカチオン性リボソームへの付加により、リボソームから光学的に複屈折性の液体−結晶性の凝縮小球へのトポロジー遷移が生じる(Radler et al., Science, 275(5301):810-4, 1997)。これらのＤＮＡ−液体複合体は、遺伝子治療やデリバリーに用いられる潜在的非ウイルスベクターである。
【０１３１】
リポソームが介在した核酸デリバリーとイン・ビトロでの外来ＤＮＡの発現は、極めて好結果で行われてきた。本発明では、「リポフェクション」技術を伴う様々な商業的方法も考えられる。本発明のある種の態様では、リポソームは血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成することができる。これは、細胞膜との融合を助長して、リポソームにカプセル化されたＤＮＡの細胞へのエントリーを促進することが示されている (Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989)。他の態様では、リポソームは核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と共同して複合体形成し、または用いることができる(Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991)。更にもう一つの態様では、リポソームはＨＶＪおよびＨＭＧ−ｌのいずれとも共同して複合体形成しまたは用いることができる。この場合には、上記発現構造体をイン・ビトロおよびイン・ビボでの核酸の導入および発現に好結果で用いることができ、次いでそれらは本発明に応用可能である。
【０１３２】
治療遺伝子をコードする核酸を細胞中に送達するのに用いることができる他のベクターデリバリー系としては、受容体が介在したデリバリービヒクルが挙げられる。これらは、ほとんど総ての真核細胞での受容体が介在したエンドサイトーシスによる高分子の選択的摂取を利用している。様々な受容体は細胞型特異的に分布するので、デリバリーは極めて特異的となり得る（Wu and Wu, 1993, 上記引用）。
【０１３３】
受容体が介在した遺伝子ターゲッティングビヒクルは、一般に２種類の成分である細胞受容体特異的リガンドとＤＮＡ結合剤とからなる。幾つかのリガンドが、受容体が介在した遺伝子導入に用いられてきた。最も詳細に特性決定されたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（Wu and Wu, 1987, 上記引用）およびトランスフェリン(Wagner et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 87(9):3410-3414, 1990)である。最近、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子デリバリービヒクルとして用いられ(Ferkol et al., FASEB J., 7:1081-1091, 1993; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:4086-4090, 1994)、上皮増殖因子（ＥＧＦ）も遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するのに用いられてきた(Myers, ＥＰＯ ０２７３０８５号明細書）。
【０１３４】
他の態様では、デリバリービヒクルは、リガンドとリポソームを含んでなることができる。例えば、Nicolau et al.(Methods Enzymol., 149:157-176, 1987)は、リポソームに組込まれたラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド(asialganglioside)を用いて、肝細胞によるインスリンの摂取の増加を観察した。従って、治療遺伝子をコードする核酸を、リポソームを含むまたは含まない任意の数の受容体−リガンド系によって特定の細胞型に送達することもできる。
【０１３５】
本発明のもう一つの態様では、発現構造体が単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなることがある。構造体の導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記方法のいずれかによって行うことができる。これは、特にイン・ビトロでの導入に応用可能であるが、イン・ビボでの使用にも同様に応用することができる。Dubensky et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533, 1984)は、ポリオーマウイルスＤＮＡをＣａＰＯ４沈澱生成物の形態で成熟および新生マウスの肝臓および脾臓へ投与して、活性ウイルス複製および急性感染症を説明することに成功した。Benvenisty and Neshif (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555, 1986)も、ＣａＰＯ４沈澱したプラスミドの腹腔内投与によりトランスフェクションした遺伝子が発現することを示した。
【０１３６】
裸のＤＮＡ発現構造体を細胞に導入するための本発明のもう一つの態様は、粒子衝撃を伴うことができる。この方法は、ＤＮＡをコーティングしたマイクロプロジェクタイルを高速に加速して、細胞膜を貫通して細胞を殺さずに細胞に入り込むことができる能力によっている(Klein et al., Nature, 327:70-73, 1987)。小粒子を加速するための幾つかの装置が開発されている。一つの上記装置は、電流を発生させた後、起動力を供給するための高電圧放電に依存している(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572, 1990)。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【０１３７】
当業者は、イン・ビボおよびエクス・ビボの状況への遺伝子デリバリーの応用の仕方を周知している。ウイルスベクターについては、一般にウイルスベクターストックが調製される。ウイルスの種類および達成可能な力価によって、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１または１×１０１２個の感染性粒子が患者に送達される。同様な数字を、相対的摂取効率を比較することによってリポソームまたは他の非ウイルス処方物について推定することができる。薬学上許容可能な組成物としての処方物については、下記に記載する。
【０１３８】
様々な腫瘍型に対しては、様々な経路が考えられる。経路についての下記の節には、可能な経路の詳細なリストが示されている。実際的に任意の腫瘍に対しては、全身デリバリーが考えられる。これは、微視的または転移性癌を攻撃する上で特に重要であることが分かるであろう。孤立した腫瘍マスを同定することができる場合には、様々な直接的、局所的および領域的方法を採用することができる。例えば、腫瘍を発現ベクターまたはタンパク質と共に直接投与することができる。腫瘍床を、切除の前、中または後に治療することができる。切除の後には、一般にベクターを手術の後に本来の場所に置かれたカテーテルによって送達する。腫瘍血管系を利用して、支持静脈または動脈を注入することによってベクターを腫瘍に導入することができる。更に末端の血液供給経路を利用することもできる。
【０１３９】
別態様では、エクス・ビボ遺伝子治療が考えられる。エクス・ビボ態様では、患者由来の細胞を採取して、少なくとも幾らかの期間、体外に保持する。この期間中に、一つの療法を送達し、その後に細胞を患者に再導入するのであり、好ましくは、試料中のいずれの腫瘍細胞も殺されてしまっている。
【実施例】
【０１４０】
下記の例は単に本発明を例示するためのものであり、その範囲を制限するためのものではない。
【０１４１】
例１
Ｆｌｔ４をコードするｃＤＮＡクローンの単離および特性決定
材料および方法
バクテリオファージλｇｔｌＩ［Dr. Mortimer Poncz、Childrens Hospital of Philadelphia,PAの厚意により寄贈された；Poncz et al., Blood, 69: 219-223 (1987)］のオリゴ−ｄＴ感作ヒトＨＥＬ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、同一ライブラリーからＰＣＲ増幅したｃＤＮＡ断片でスクリーニングした[Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]。陽性プラークを文献記載の方法で同定し、精製した［Sambrook et al.,「分子クローニング−実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)」，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)］。バクテリオファージλのｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩ断片として単離し、GEM3Zf(+)プラスミド(Promega)にサブクローニングした。完全なＦｌｔ４タンパク質コード領域を単離した。ＨＥＬライブラリーから単離した３種類のオーバーラップクローン（図１に例示）を、得られた配列に準じてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるジデオキシチェインターミネーター法を用いて配列決定した。ｃＤＮＡの総ての部分を、両方の鎖について配列決定した。配列分析は、ＧＣＧパッケージプログラムを用いて行った［Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12: 387-395 (1984)およびthe Prosite program for Apple MacIntosh］。
【０１４２】
図１Ａは、分析を行ったＦｌｔ４ｃＤＮＡクローンの概略構造を示している。矢印は、図１Ｂに示したノーザンブロットをプローブするのに用いたサブクローニングした制限断片（そのサイズはkbで示す）Ｅ＝ＥｃｏＲＩ部位、Ｓ＝ＳｐｈＩ部位。図１Ｂは、図１Ａに示したプローブを用いるＤＡＭＩおよびＨＥＬ白血病細胞ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析を示している。
【０１４３】
結果
ＰＣＲクローニング法によりＨＥＬ細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した２１０bpの長さのＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片を分子プローブとして用い、オリゴｄＴ−感作ヒト赤白血病細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【０１４４】
クローンのヌクレオチド配列分析は、１２９８アミノ酸（ａａ）残基のオープンリーディングフレームを明らかにした（配列番号２，図２）。図に印を付けた翻訳イニシエーターメチオニン典型的なコンセンサス配列によって囲まれ[Kozak, Nucleic Acids Res., 12: 857-872 (1984)]、小胞体へのトランスロケーションのシグナル配列に特徴的な疎水性アミノ酸配列が続いている。
【０１４５】
Ｆｌｔ４の細胞外ドメインは、７個の免疫グロブリン様ループに整列させることができる（図２）。この図は、Ｆｌｔ４とＦｌｔ１との比較を示しており、これらは極めて類似した構造を含んでいる。Ｆｌｔ１のアミノ酸配列を、配列番号５として示す。
【０１４６】
アミノ酸残基７７５〜７９８は、配列の疎水性伸長部を形成しており、これは受容体の膜貫通ドメインとして機能すると思われ、ポリペプチドの細胞質と推定される側の幾つかの塩基性残基が続く。傍膜ドメインは、ａａ８４２でのチロシンキナーゼ配列相同性の開始前には４４残基である。６５ａａのキナーゼインサート配列の相同性の中断により、この相同性は最初に受容体のカルボキシル末端尾における１１７５ａａで失われる。アミノ酸配列データーベース（Swissprot and NBRF）での関連チロシンキナーゼドメインの探索により、それぞれ触媒的チロシンキナーゼ領域において約８０および６０％の相同性を有するＦｌｔ１およびＰＤＧＦＲＢチロシンキナーゼが同定されている。
【０１４７】
例２
抗Ｆｌｔ４抗血清の調製
Ｆｌｔ４短形態の予想Ｃ末端をコードする６５７塩基対のＥｃｏＲＩ断片を、ｐＧＥＸ−１λＴ細菌発現ベクター(Pharmacia)でのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼコード領域を用いてインフレームでクローニングし、E. coli.でＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合タンパク質を産生した。生成融合タンパク質は細菌で産生し、製造業者の指示に従ってグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーによって部分的に精製した。このタンパク質をウサギの免疫化に用いて、Ｆｌｔ４に対するポリクローナル抗体を産生した。三回目のブースター免疫化の後に抗血清を用いた。
【０１４８】
例３
ＣＯＳ細胞でのＦｌｔ４の発現
材料および方法
完全長Ｆｌｔ４タンパク質コード配列（３種類のクローン組み合わせた、図１）ＳＶポリ哺乳類発現ベクター[Stacey et al., Nucleic Acids Res., 18: 2829 (1990)]構造体ＳＶ１４−２のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。発現ベクター（ＳＶ−ＦＬＴ４短およびＳＶ−ＦＬＴ４長、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡのそれぞれの形態を含む）を、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法によってＣＯＳ細胞に導入した[McCutchan et al., J Natl. Cancer Inst., 41: 351-357 (1968)]。トランスフェクションの２日後に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、免疫沈澱緩衝液（１０mM ＴｒｉｓpH７．５，５０mM ＮａＣｌ，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．５％ Nonidet P40，０．１％ＳＤＳ，０．１ ＴＩＵ/mlアプロチニン）に削り落とした。溶解生成物を超音波処理し、１０,０００× gで１５分間遠心分離し、氷上で抗血清３mlと共に一晩インキュベーションした。プロテインＡセファロース(Pharmacia)を加え、インキュベーションを回転しながら３０分間継続した。沈殿を免疫沈澱緩衝液で４回、ＰＢＳで１回、水で１回洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１４９】
結果
Ｆｌｔ４ｃＤＮＡ配列の構造を予測したものを、完全長Ｆｌｔ４短および長タンパク質コード領域をｐＳＶポリ発現ベクターのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、これらの発現ベクターをＣＯＳ細胞にトランスフェクションすることによって試験した。これら２種類の構造体によって産生したタンパク質は、そのＣ末端が異なり、長い方の形態は追加の６５アミノ酸を含んでいる。トランスフェクションの２日後に、細胞を溶解し、予測したＦｌｔ４タンパク質（すなわち、Ｆｌｔ４の短および長形態の両方に共通する部分）の短形態の４０カルボキシル末端アミノ酸残基を含むＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合タンパク質に対して生じた抗体を用いて免疫沈澱を行った。免疫沈澱したポリペプチドは、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。免疫前血清は特異的バンドを全く示さなかったが、Ｆｌｔ４特異抗体は約１７０および１９０KDの２つのバンドを認識する。これらの２つのバンドは、Ｆｌｔ４タンパク質の特異的にグリコシル化した形態を表すことがある。
【０１５０】
例４
ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＦｌｔ４の発現
材料および方法
完全長Ｆｌｔ４ｃＤＮＡ（短形態）を、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復プロモーターを含むＬＴＲポリベクター（Makela, et aL, Gene, 118:293-294 (1992)を参照されたい、ＡＴＣＣ受託番号７７１０９およびGeneBank受託番号Ｘ６０２８０を有するプラスミドベクターｐＬＴＲポリを開示している）にサブクローニングした。このＬＴＲ−ＦＬＴ４発現ベクターをｐＳＶ２ネオマーカープラスミドと共に用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を共トランスフェクションし、Ｇ４１８耐性クローンをＦｌｔ４発現について分析した。
【０１５１】
ウェスタン免疫ブロット分析のために、１枚のコンフルエントな大きなプレート上の細胞２．５％ ＳＤＳ，１２５mM Ｔｒｉｓ，pH ６．５で溶解した。細胞溶解生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に電気泳動的転写を行った。この膜を、Ｆｌｔ４カルボキシ末端ペプチドに対して生じた抗血清と共にインキュベーションし、結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したブタ抗ウサギ抗血清(Dako)およびＥＣＬ試薬(Amersham)を用いて可視化した。代謝標識のため、培養物を１００μCi/ml ３５Ｓ−メチオニンで１時間標識した。標識後に、細胞を２回洗浄し、その増殖培地で１または２時間インキュベーションし、溶解し、抗Ｆｌｔ４抗体で免疫沈澱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートフルオログラフィーによって分析した。
【０１５２】
結果
１７０および１９０KDポリペプチドは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションしたＦｌｔ４短形態で検出できたが、ｐＳＶ２ネオのみでトランスフェクションした細胞では検出できなかった。これら２つのバンドに加えて、約１２０Ｋｄの主要バンドがＦｌｔ４産生クローンで観察された。代謝標識およびパルス−チェイス実験では、このタンパク質が短形態Ｆｌｔ４ポリペプチドの翻訳後工程の結果として生じることを示していた。
【０１５３】
例５
Ｆｌｔ４座の染色体マッピング
クラスIII受容体遺伝子のある程度のクラスタリングが観察されているため、Ｆｌｔ４の染色体上の位置を決定することは非常に興味深いことである。例えば、齧歯類−ヒト細胞ハイブリッドを分析したところ、Ｆｌｔ４がヒト染色体５へ結合していることが示された。
【０１５４】
領域５q３３−＞５ｑｔｅｒでのＦｌｔ４遺伝子の位置は、部分染色体５を有するハイブリッドを用いて決定した。これらのハイブリッドを、Ｆｌｔ４座の存在についてフィルターハイブリダイゼーションによって試験した。Ｆｌｔ４陽性ハイブリッドには共通しており且つＦｌｔ４陰性ハイブリッドにはない染色体５の領域は、５ｑ３３．１−ｑｔｅｒであった。従って、このハイブリッドにおけるヒト染色体５ｑ３３−ｑｔｅｒの存在は、Ｆｌｔ４配列の存在と相関している。領域マッピングの結果は、これらの座がＦｌｔ４に対して陰性であるハイブリッドＧＢ１３に総て存在するので、Ｆｌｔ４座ＣＳＦＩＲ／血小板由来増殖因子受容体−β（ＰＤＧＦＲＢ）座並びにβ−アドレナリン作動性受容体（ＡＤＲＢＲ）座に対してテロメア性であることを示していた。
【０１５５】
例６
腫瘍細胞系および内皮細胞におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現
この検討で用いた白血病細胞系（Ｋ５６２）は、幾つかの以前に公表された文献に報告されており[Lozzio et al., Blood, 45: 321-334 (1975)]、ＨＬ−６０[Collins et al., Nature, 270: 347-349 (1977)]、ＨＥＬ[Martin et al., Science, 216: 1233-1235 (1982)]、ＤＡＭＩ[Greenberg et al., Blood, 72: 1968-1977 (1988)]、ＭＯＬＴ−４[Minowada et al., J. Natl. Cancer Inst., 49: 891-895 (1972)]、Jurkat [Schwenk et al., Blut, 31: 299-306 (1975)]、Ｕ９３７[Sundstroem et al., Int. J. Cancer, 17: 565-577 (1976)]、ＫＧ−１[Koeffler et al., Science, 200: 1153-1154 (1978)]、ＪＯＫ−１[Andersson et al., 1982, R. F. Revoltella監修，「癌細胞における分化機能の発現(Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells)」，239-245, Raven Press, New York]、およびＭＬ−２[Gahmberg et al., 1985, L. C. Andersson, et al.監修，「正常および悪性分化の際の遺伝子発現(Gene Expression During Normal and Malignant Differentiation)」，107-123, Academic Press, London]である。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した下記の腫瘍細胞系も分析を行った：ＪＥＧ−３，絨毛癌；Ａ２０４，肉腫；ＳＫ−ＮＥＰ−１，腎芽細胞腫；ＢＴ−４７４，乳癌；Ｙ７９，網膜芽細胞腫。白血病細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を含むＲＰＭＩで増殖させた。Ｄａｍｉ細胞は、１０％ウマ血清を含むイソコフ改良ＤＭＥＭで培養した。第一経路のヒト臍帯静脈内皮細胞をＡ５４９肺癌細胞と融合することによって得た恒久的内皮ハイブリッド細胞系（ＥＡｈｙ９２６）[Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50: 3734-3737 (1983)]を、１０％ＦＣＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地で培養した。
【０１５６】
ポリ(Ａ)＋ＲＮＡを、文献記載の方法で細胞系から抽出した［Sambrook et al.，上記参照］。ポリ(Ａ)＋ＲＮＡ試料５μｇを、ホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで電気泳動し、標準的条件を用いてブロットした［Sambrook et al.，上記参照］。Ｆｌｔ４ｃＤＮＡクローンのインサートをランダムプライミング法によって標識し、ブロットにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×デンハート(Denhard's)溶液（１００×デンハート溶液は、それぞれフィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミン２％含む）、５×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，２００mM ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ，２００mMＥＤＴＡ，pH７．０），０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム），および超音波処理したサケ精子ＤＮＡ０．１mg/mlで４２℃で１８〜２４時間行った。フィルターを１×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣ１，１５mM クエン酸ナトリウム，pH７．０），０．１％ ＳＤＳで６５℃で洗浄し、Kodak社製ＸＡＲ−５フィルムに露光した。
【０１５７】
ノーザンブロット分析は、８種類の白血病細胞系（ＨＥＬ，Ｋ５６２，ＤＡＭＩ，Ｕ９３７，ＭＯＬＴ４，ＨＬ６０，Jurkat，およびＫＧ−１）と内皮ハイブリッド細胞系（ＥＡｈｙ９２６）から抽出したポリ(Ａ)＋ＲＮＡを用いて行った。ＧＡＰＤＨプローブを用いるハイブリダイゼーションを、分析に対するＲＮＡの同等量の荷重に対する内部コントロールとして用いた。ＨＥＬ赤白血病細胞とＤＡＭＩ巨核芽球性白血病細胞だけが、５．８kbおよび４．５kbＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現させた。Ｋ５６２赤白血病，JurkatおよびＭＯＬＴ−４Ｔ−細胞白血病、並びにＨＬ−６０前骨髄球性白血病、Ｕ９３７単球性白血病、およびＫＧ−１骨髄性白血病細胞は、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡに対して陰性であった。
【０１５８】
ノーザンブロット分析は、５種類の腫瘍細胞系（ＪＥＧ−３、Ａ−２０４、ＳＫ−ＮＥＰ−１、ＢＴ−４７４、およびＹ７９）および上記白血病細胞系の２種類（ＪＯＫ−１、ＭＯＬＴ４）から抽出したポリ(Ａ)＋ＲＮＡを用いて行った。標識したＳ２．５ｃＤＮＡクローン（図１参照）を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。β−アクチンプローブを用いるハイブリダイゼーションを、分析に対するＲＮＡの同等量の荷重に対する内部コントロールとして用いた。ＳＫ−ＮＥＰ−１腎芽細胞腫およびＹ７９網膜芽細胞腫細胞のみが、Ｆｌｔ４転写体を含むことが観察された。
【０１５９】
Ｔｅｒａ−２奇形癌細胞を、ニューロン分化を誘発する目的でビヒクル（−）またはレチン酸（＋）で１０日間処理した後に分析した[Thompson et al., J. Cell Sci., 72: 37-64 (1984)]。この細胞から単離したポリ(Ａ)＋ＲＮＡのノーザンブロット分析では、未分化細胞はＦｌｔ４に対して５．８kbおよび４．７kbのｍＲＮＡを発現したが、１０にちかんの分化の後には、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡはノーザンブロット分析およびハイブリダイゼーションでは検出されなかったことを見出した。これらの結果は、これらの細胞の分化の際にＦｌｔ４がダウンレギュレーションされることを示唆している。
【０１６０】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現を、未分化およびＴＰＡ−分化ＨＥＬ細胞でも分析した。ＨＥＬおよびＤＡＭＩ細胞系はいずれも二重赤血球／巨核芽球表現型を有し、腫瘍プロモーターである１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）で処理することによって巨核芽球性マーカーの発現を更に誘発することができる。Ｆｌｔ４発現がこれらの細胞においてそれらの分化の際に刺激されるかどうかを分析した。ＨＥＬ細胞を、ＴＰＡまたはそれを溶解するのに用いたＤＭＳＯで２日間処理した後に分析した。Ｆｌｔ４シグナルを除去した後、フィルターをＲｂ−１およびβ−アクチンｃＤＮＡでプローブし、レーンの同等荷重を確かめた。オートラジオグラフィーによるデンシトメトリー走査分析およびＧＡＰＤＨ遺伝子の構成的発現に対する規格化に基づいて、細胞が巨核芽球性分化を行うときに、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡレベルはＴＰＡで誘導されたＨＥＬ細胞で約３．４倍に増加することが決定された。
【０１６１】
例７
胎児肺におけるＦｌｔ４の発現
イン・シテューハイブリダイゼーション：１５週齢ヒト胎児由来の胚組織を、トゥルク大学中央病院およびトゥルク大学（フィンランド）の合同倫理委員会の許可を得て入手した。試料を１０％ホルマリンに４℃で１８時間固定し、脱水し、ワックスに埋設し、６μｍの切片に切断した。２０６および１５７塩基のＲＮＡプローブ（アンチセンスおよびセンス）を、ＳＰ−６およびＴ７ポリメラーゼおよび［３５Ｓ］−ＵＴＰを用いて線形化したプラスミドＤＮＡ生成させた。切片のイン・シテューハイブリダイゼーションは、Wilkinson et al., Development, 99:493-500 (1987)；Wilkinson,. Cell, 50:79-88 (1987)に記載の方法に準じて、下記の変更を行って行った：1) パラフィンワックスに埋設する前にトルエンの代わりにキシレンを用い、2) ６μm切片を切断し、２％  ３−アミノプロピル−トリエトキシシラン(Sigma)で前処理したガラススライドの表面のジエチルピロカーボネート処理水の層上に置き、3) プローブのアルカリ加水分解を省略し、4) ハイブリダイゼーション混合物は６０％脱イオンホルムアミドを含み、5) 高緊縮洗浄は５０mM ＤＴＴと１×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃で８０分間行い、6) 切片をＮＴＢ−２エマルション(Kodak)で被覆し、４℃で保管した。１４日間の露出時間の後、スライドをKodak Ｄ−１９現像液で２．５分間現像し、Unifix (Kodak)で５分間定着した。切片をヘマトキシリン水溶液で染色した。
【０１６２】
アンチセンスプローブを用いるハイブリダイゼーションの検討では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡが主として１５週齢胎児の肺のある種の内皮細胞で観察された。センス鎖プローブおよびＲＮアーゼＡ処理した切片を用いるコントロールハイブリダイゼーションでは、上記バックグラウンドを上回るシグナルを生じなかった。
【０１６３】
イムノペルオキシダーゼ染色には、抗Ｆｌｔ４抗体の１：１００希釈液、ペルオキシダーゼ接合ブタ抗ウサギ抗体、および当該技術分野で標準的な方法を用いた。予備免疫血清または免疫原でブロックした血清を用いるコントロール染色では、シグナルを生じなかった。１７週齢のヒト胎児由来の肺組織を分析し、結果はｍＲＮＡのイン・シテューハイブリダイゼーション実験の結果と一致し、肺のある種の大きな血管の内皮細胞は、ウサギ抗Ｆｌｔ４抗血清で陽性に染色された。
【０１６４】
例８
ヒト以外の哺乳動物種におけるＦｌｔ４遺伝子の同定
図４に、異なる種由来のＤＮＡにおけるＦｌｔ４配列の存在を検討する実験の結果を示す。進化においてＦｌｔ４遺伝子がどの程度良好に保存されているかを明らかにするために、２．５kbｃＤＮＡ断片（図１参照）を様々な動物および酵母から精製したゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、ＥｃｏＲＩで消化した。ハイブリダイゼーション溶液は、５０％ ホルムアミド、５×デンハート溶液、（１００× デンハート溶液は、フィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミンがそれぞれ２％である）、５×食塩水−リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ（３M ＮａＣｌ，２００mM ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ，２０mM ＥＤＴＡ，pH７．０）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、および０．１mg/mlの超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含んでなるものであった。ハイブリダイゼーションを、４２℃で２４時間行った。フィルターを６５℃で１×標準食塩クエン酸（１５０mM ＮａＣｌ，１５mM クエン酸ナトリウム，pH ７．０）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで洗浄し、Kodak ＸＡＲ−５フィルムに露出した。特異的バンドがサル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、およびヒナ鳥ＤＮＡで見られたが、酵母ＤＮＡではシグナルは得られなかった。Ｆｌｔ４ｃＤＮＡを、ウズラから単離した。Eichmann et al., Gene, 174(l): 3-8 （１９９６年９月２６日）およびGenbank受託番号Ｘ８３２８７を参照されたい。
【０１６５】
例９
成人組織でのＦｌｔ４遺伝子発現
成人組織でのＦｌｔ４ｍＲＮＡ発現を、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓組織由来のポリ(Ａ)＋ＲＮＡ(Multiple Tissue Northern Blot, Clontech Inc.)２μｇ を用いて、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによって分析した。構成的に発現した遺伝子に対するプローブを用いるコントロールハイブリダイゼーションは、レーンの同等な荷重を示した。
【０１６６】
様々なヒト組織からのポリ(Ａ)＋ＲＮＡとＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションでは、胎盤、肺、心臓および腎臓において移動度が５．８および４．５kbのｍＲＮＡバンド、および６．２kbの弱く標識されたバンドを示した。微かなｍＲＮＡバンドが肝臓および骨格筋で見られたが、膵臓および脳はＦｌｔ４ＲＮＡほとんど含まないと思われた。
【０１６７】
例１０
ヒト胎児組織でのＦｌｔ４発現
ヒト胎児組織でのＦｌｔ４ｍＲＮＡ発現を検討するため、下記の１６〜１９週齢のヒト胎児由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロットを１．９kbのＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片とハイブリダイズし（図１参照）、生成するオートラジオグラフをデンシトメーターで走査した。結果を、相当する臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色ゲルのＵＶ画像から推計したＲＮＡの量に対して規格化した。下記の符号は、増加順でのｍＲＮＡレベルを表す：−，＋，＋＋，＋＋＋。
【０１６８】
【表１】
2010088433.tif 000002
【０１６９】
ヒト胎児組織では、胸腺および小腸以外のいずれもＦｌｔ４転写体を含んでいることが示された。最高発現レベルは、肺および脾臓で見られた。
【０１７０】
例１１
Ｆｌｔ４発現ベクター
完全長Ｆｌｔ４ｃＤＮＡ（短形態）は、a) ［プライマーオリゴヌクレオチド5'-ACATGCATGC CACCATGCAG CGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3' （配列番号７）（フォワード）、および5'-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3'（リバース）を用いてＳ２．５kbクローン（図１参照）から増幅した］ＳｐｈＩで開裂したＦｌｔ４ＰＣＲ断片（配列番号８）の、２個のＳｐｈＩ部位を用いてｐＳＰ７３ベクター(Promega)にサブクローニングしたＳ２．５kb断片の５′末端への連結、b) ０．６kbＥｃｏＲＩ断片（図１参照）からオリゴヌクレオチドプライマー 5'-CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3'（配列番号９）（フォワード）および5'-CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTT CTT-3'（配列番号１０）（リバース）を用いて増幅した最後の１３８bpを含むＰＣＲ断片のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いる構造体a)の３′末端への連結、c) 構造体b)のＥｃｏＲＩ部位での１．２kbのＥｃｏＲＩ断片の連結、d) 生成する完全長ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩで開裂したＳＶ−ポリ発現ベクターへの連結によって産生した[Stacey et al., Nucl. Acids Res., 18: 2829 (1990)]。
【０１７１】
例１２
Ｆｌｔ４リガンドの同定
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の非存在下にてＦ１２培地で７日間培養したＰＣ−３前立腺癌細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３５）由来のコンディショニング培地を１６０００× gで２０分間遠心分離することによって透明にし、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を誘発する能力についてスクリーニングした。
【０１７２】
Ｆｌｔ４を組換え発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（例１３参照）を直径が５cmの細胞培養皿に再播種し、１０％ウシ胎児血清と抗生物質を含むダルベッコの改良最小必須培地（ＤＭＥＭ）でコンフルエンシーまで増殖した。コンフルエント細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＤＭＥＭ／０．２％ウシ血清アルブミン中で一晩飢餓状態に置いた。刺激のため、飢餓培地をコンディショニング培地１mlに代え、細胞を３７℃で５分間インキュベーションした。
【０１７３】
ＰＣ−３コンディショニング培地で刺激した後、細胞を含む培養プレートを氷上に置き、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．４、１００mM ＮａＶＯ４を含む１５０mM ＮａＣｌで２回洗浄した。洗浄溶液を皿から除き、細胞をアプロチニン、１mM ＰＭＳＦおよび１mM ＮａＶＯ４を含むＲＩＰＡ緩衝液［１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５、５０mM ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ Nonidet P40、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］で溶解し、溶解生成物を１０秒間２回超音波処理を行った。次に、溶解生成物を１６,０００× gで３０分間遠心分離し、上清を新たな試験管に移して、免疫沈澱に用いた。
【０１７４】
Ｆｌｔ４Ｃ末端（上記）に対するポリクローナル抗体を用いて、免疫沈澱を行った。細胞溶解生成物の上清を、ウサギポリクローナル抗Ｆｌｔ４抗血清２〜４μlを加えた氷上で２時間インキュベーションした。プロテインＡ−セファロース(Pharmacia)をＰＢＳに溶解した５０％（容積／容積）溶液約３０μlを加え、インキュベーションを＋４℃で回転しながら４５分間継続した。免疫沈殿物をＲＩＰＡ緩衝液で３回およびＰＢＳで１回洗浄した。次に、免疫沈殿物を、７．５％ゲル中でＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、ニトロセルロースにブロットした。これらのウェスタンブロットをモノクローナル抗ホスホチロシン（抗−Ｐ−Ｔｙｒ）抗体（PT-66 Sigma, cat. P-3300の１：２０００倍希釈物）と共にインキュベーションした後、ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗体（１：１０００倍希釈物、Dako, cat. P 161）で化学発光検出システム(Amersham)を用いて検出した。場合によっては、ブロットを１００mM２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH６．７中で時折攪拌しながら５０℃で３０分間ストリッピングして前のシグナルを除き、抗Ｆｌｔ４抗体（１：１０００倍希釈物）で再染色した後、ペルオキシダーゼ接合ブタ抗ウサギ抗体（１：１０００倍希釈物， Dako, P217）で染色した。Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化の陽性コントロールとしては、チロシルホスファターゼインヒビター過バナジン酸ナトリウム（ＰｅｒＶＯ４）１００mMで２０分間処理したＦｌｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞からの抗Ｆｌｔ４免疫沈殿物を用いた。過バナジン酸ナトリウムによる細胞の処理は、オルトバナジン酸ナトリウム１００mM（最終濃度）と過酸化水素２mM（最終濃度）を細胞培地に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベーションすることによって行った。この手続きによって、バナジン酸塩の過酸化形態を生じたが（バナジルヒドロペルオキシド）、これは生細胞でのタンパク質チロシンホスファターゼの極めて強力なインヒビターである。
【０１７５】
ＰＣ−３細胞コンディショニング培地は、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化して加工処理した成熟形態と同時移行する１２０kDポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激した。同時移行は、ブロットを抗Ｆｌｔ４抗体で再染色した後に確かめた。
【０１７６】
１２０kDポリペプチドがコンディショニング培地の非特異成分ではないことを明らかにするため、コンディショニング培地１５mlをニトロセルロース上にブロットしたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットを抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体で染色した。数個のポリペプチドを検出したが、それらはいずれもＦｌｔ４と共に同時移行したものではなく、１２０kDバンドは実際に刺激した細胞から免疫沈澱したチロシン−リン酸化タンパク質であることを示していた。ヘパリンセファロースCL-6B (Pharmacia)で室温にて２時間前処理したＰＣ−３コンディショニング培地による刺激の分析（レーン３）は、Ｆｌｔ４リガンドがヘパリンに結合しないことを示している。
【０１７７】
未コンディショニング培地は、Ｆｌｔ４自己リン酸化を誘導しなかった。また、非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＦＧＦＲ−４でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のいずれも、ＰＣ−３細胞からのコンディショニング培地で刺激したときに、１２０kDポリペプチドのチロシンリン酸化を示さなかった。ＰＣ−３コンディショニング培地をCentricon-10濃縮装置(Amicon)を用いて４倍に濃縮すると、刺激活性はかなり増加した。また、１０,０００未満の分子量（＜１０,０００）のタンパク質を含む濃縮後に得られた流動は、Ｆｌｔ４のリン酸化を刺激しなかった。ＰＣ−３細胞の濃縮コンディショニング培地を製造業者の指示に従ってＣＮＢｒ活性化セファロース（１mg/ml）にカップリングしたＦｌｔ４細胞外ドメイン（Ｆｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ、下記参照）５０mlで前処理したところ、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化は完全になくなった。コンディショニング培地を同様にセファロースＣＬ−４１３で前処理したところ、その刺激活性には影響が見られなかった。
【０１７８】
これらのデーターは、ＰＣ−３細胞がＦｌｔ４の可溶性リガンドを産生することを示している。上記実験は、リガンドが組換えＦｌｔ４ＥＣドメインに結合することを示している。従って、このリガンドは、アフィニティークロマトグラフィーにおける組換えＦｌｔ４ＥＣドメインを用いて精製することができる。精製タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）上にブロットしたＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行い、そのアミノ末端配列を当該技術分野で標準的な方法によって決定することができる。あるいは、精製したリガンドをペプチドに消化して、それらのアミノ末端配列を決定することができる。精製したタンパク質から得たペプチド配列を用いて、これらの配列をコードするオリゴヌクレオチドの混合物を合成する。上記オリゴヌクレオチドおよびそれらの相補的ＤＮＡ鎖相対物は、ＰＣ−３細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーによって放射性標識して、そのスクリーニングに用いて、リガンドをコードするｃＤＮＡを得ることができるのであり、いずれも当該技術分野で標準的な方法によるものである(Wen et al., Cell 69: 559-572 (1992))。あるいは、上記オリゴヌクレオチドおよびそれらの相対物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして用いて、鋳型としてＰＣ−３細胞ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いてリガンドをコードする配列を増幅することができる。このようなｃＤＮＡの合成およびＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の方法は、当該技術分野で標準的なものである(Innis et al., 1990,「ＰＣＲプロトコール(PCR protocols)」, Academic Press; McPherson, M.J. et al., 1991,「ＰＣＲ，実際の方法(PCR, a practical approach)」, IRL Press; Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 8913-8917 (1990))。更にもう一つの代替法は、真核生物発現ベクターにクローニングしたｃＤＮＡを用いて（例えば、Invitrogen Librarianクローニングキットおよび提供されるベクター、例えばｐｃＤＮＡ IまたはｐｃＤＮＡIIIを用いて）、当該技術分野で標準的な方法によってＦｌｔ４−アルカリホスファターゼ(Cheng and Flanagan, Cell, 79: 157-168, (1994))、Ｆｌｔ４−免疫グロブリン（Ｆｌｔ４−Ｉｇ）(Lyman et al., Cell, 75:, 1157-1167 (1993))、または同様なアフィニティー試薬で例えば、ＣＯＳ細胞にトランスフェクションした上記ライブラリーをスクリーニングすることによるＰＣ−３細胞からＦｌｔ４リガンドをクローニングすることである。
【０１７９】
例１３
細胞系およびトランスフェクション
ＮＩＨ３Ｔ３細胞および２９３−ＥＢＮＡ細胞(Invitrogen)を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。安定発現のため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡがＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬(Boehringer-Mannheim)を用いるリポフェクション法によってモロニーマウス(Moloney murine)白血病ウイルスＬＴＲプロモーターの制御下で発現するｐＳＶ−ｎｅｏベクター（上記の例４参照）と共にＬＴＲ−ＦＬＴ４1ベクターを用いてトランスフェクションした。ＣＯＳ- I細胞を、ＤＥＡＥデキストラン法によってトランスフェクションした(McClutchan and Pagano, J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-35 (1968))。トランスフェクションした細胞を、５００mg/mlネオマイシン中で選定した。
【０１８０】
例１４
Ｆｌｔ４融合タンパク質の構築および発現
ｐＶＴＢａｃ−ＦＬＴ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ融合構造体
ｃＤＮＡ コードＦｌｔ４の末端を、下記のように修飾した：細胞外ドメイン（ＥＣ）をコードするＦｌｔ４ｃＤＮＡ配列の３′末端を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム(Qiagen, Hilden, Germany)に続いて停止コドンに結合するための６個のヒスチジン残基をコードするオリゴヌクレオチド
5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号１３，ＳａｌＩ部位に下線を付し、配列番号１のヌクレオチド２１８４〜２２０４に相当する配列を含む）、および
5'CGCGGATCCCTAGTGATGGTG
ATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3'（配列番号１４，ＢａｍＨＩ部位に下線を付し、配列番号１のヌクレオチド２３４１〜２３２４に相補的な配列を含む）を用いて増幅した。増幅断片ＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４１ベクター（例４参照）に連結し、Ｆｌｔ４膜貫通および細胞質ドメインをコードする配列を含む特異的ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片に取って代わった。
【０１８１】
領域をコードするＦｌｔ４シグナル配列のないＦｌｔ４ｃＤＮＡの５′末端を、オリゴヌクレオチド
5'-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3'（配列番号１１、ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ部位に下線を付し、配列番号1のヌクレオチド８６〜１０３に相当する配列を含む）および5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3'（配列番号１２、配列番号１のヌクレオチド７００〜６８１に相補的な配列を含む）を用いるＰＣＲによって増幅した。この増幅断片（配列番号１のヌクレオチド８６〜７００を含む）をＨｉｎｄIIIとＳｐｈＩ（配列番号１のヌクレオチド５８８〜５９３に相当するＳｐｈＩ部位、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡの増幅領域内にある）で消化した。
【０１８２】
生成するＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ断片を用いて、直ぐ上に記載した修飾したＬＴＲ−ＦＬＴ４1ベクターのＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ断片に取って代えた（ＨｉｎｄIII部位はＦｌｔ４インサートとベクターのｐＬＴＲポリ部分の５′接合部にあり、ＳｐｈＩ部位はＦｌｔ４ｃＤＮＡにあり、配列番号１のヌクレオチド５８８〜５９３に相当する）。次に、生成するＦｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓインサートＢａｍＨＩ断片としてｐＶＴＢａｃプラスミドのＢａｍＨＩ部位に連結した(Tessier et al., Gene 98: 177-183 (1991))。構造体を、リポフェクションによってバキュロウイルスゲノムＤＮＡと共にＳＦ−９細胞にトランスフェクションした。組換えウイルスを生じ、High-Five細胞(Invitrogen)の感染に用いた。
【０１８３】
Ｆｌｔ４−ＡＰ融合構造体
Ｆｌｔ４ＥＣドメインをコードする配列の３′末端を、オリゴヌクレオチド 5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号１５）および5'-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3'（配列番号１６）を用いて増幅し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４1ベクターに連結し、膜貫通および細胞質ドメインをコードする配列に取って代えた。次に、生成するインサートをＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片としてアルカリホスファターゼコード領域とインフレームのプラスミドＡＰｔａｇ−１のＨｉｎｄIII−ＢｇｌII部位に連結した(Flanagan and Leder, 1990, Cell 63, 185-194)。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬(Boehringer)を用いるリポフェクションによってこのＦｌｔ４−ＡＰ構造体およびｐＳＶ２ｎｅｏ(Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982))と同時トランスフェクションし、トランスフェクション細胞を５００mg/mlネオマイシンの存在下にて選定した。培地に生成した組換えタンパク質を、熱量測定反応によって検出し、アルカリホスファターゼ活性について染色した(Cheng and Flanagan, Cell 79: 157-168 (1994))。
【０１８４】
Ｆｌｔ４−Ｉｇ構造体
Ｆｌｔ４−免疫グロブリンキメラをコードする組換えＤＮＡは、下記のようにして構築した。シグナル配列をコードするＦｌｔ４ヌクレオチドを包含するＦｌｔ４をコードするｃＤＮＡの５′末端を、プライマー5'-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3'（配列番号１７）および5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3'（配列番号１８）を用いて増幅し、ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４1ベクターに連結した。Ｆｌｔ４ＥＣコード配列の３′末端を、オリゴヌクレオチド5'-CTGGAGTC.GACTTGGCGGACT-3'（配列番号１９）および 5'-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG-3'（配列番号２０）を用いて増幅し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４1ベクターに連結し、膜貫通および細胞質ドメインをコードする配列に取って代わった。スプライス供与体部位を含むこのＦｌｔ４ＥＣインサートを、最初にヒト免疫グロブリン重鎖ヒンジをコードするエキソンおよび定常領域エキソンに連結した(Karjalainen, K., TIBTECH, 9: 109-113 (1991))。Ｆｌｔ４−Ｉｇキメラを含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩインサートを当該技術分野で標準的な方法（クレノウ(Klenow)）によって平滑にし、ｐＲＥＰ７(Invitrogen)の平滑化ＨｉｎｄIII部位に連結した。この構造体をリン酸カルシウム沈澱法によって２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションし、コンディショニング培地を用いてプロテインＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによってＦｌｔ４−Ｉｇタンパク質を単離した。
【０１８５】
例１５〜１７
Ｆｌｔ４リガンドの精製および配列決定
血清枯渇条件下でＰＣ−３細胞によって産生した細胞培養物上清をCentriprepフィルターカートリッジを用いて３０〜５０倍に濃縮し、固定化Ｆｌｔ４細胞外ドメインのカラムに装填した。２種類のアフィニティーマトリックスを、選択的構造体および方法を用いて調製する。最初の場合に、Ｆｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ融合タンパク質をＣＮＢｒで活性化したセファロース4B (Pharmacia)に架橋させ、第二の場合には、Ｆｌｔ４−Ｉｇ融合タンパク質をジメチルピメリデートを用いてプロテインＡセファロースにカップリングさせる(Schneider et aL, 1982, J. Biol. Chem. 257: 10766-10769)。アフィニティーカラムから溶出した材料を、イオン交換および逆相高圧クロマトグラフィー、およびＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動を用いて更に精製を行う。クロマトグラフィー画分を、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を刺激する能力について試験する。精製した生物活性リガンドタンパク質を微小配列決定し、縮重オリゴヌクレオチドを、例えばＰＣ−３細胞から単離したポリ(Ａ)＋ＲＮＡから生じたｃＤＮＡライブラリーから、リガンドコードｃＤＮＡを単離しクローニングする目的で、得られたアミノ酸配列に基づいて作製する。
【０１８６】
血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）と呼ばれるＦｌｔ４リガンド並びにＶＥＧＦ−Ｃをコードする本来のヒト、ヒト以外の哺乳類およびトリのポリヌクレオチド配列、およびＶＥＧＦ−Ｃ変異体および類似体の詳細な特性決定は、１９９８年２月２日に出願された（１９９８年８月６日に国際公開ＷＯ９８／３３９１７号として公表された）国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号明細書；Joukov et al., J Biol. Chem., 273(12): 6599-6602 (1998)；Joukov et aL, EMBO J, 16(13): 3898-3911 (1997)；および１９９６年８月１日に出願された（国際公開ＷＯ９７／０５２５０号として公表された）国際特許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号明細書に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。上記文献に詳細に記載されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｃは、最初は４１９アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドとしてヒト細胞で産生される。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸配列は配列番号２１に記載されており、ヒトＶＥＧＦ−ＣをコードするｃＤＮＡは、ブダペスト条約の規定に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (USA)）に寄託されている（寄託日１９９５年７月２４日、およびＡＴＣＣ受託番号９７２３１）。他の種からのＶＥＧＦ−Ｃ配列も記載されている。例えば、Genbank受託番号ＭＭＵ７３６２０(Mus musculus)、およびＣＹ１５８３７(Coturnix coturnix)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０１８７】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを多段階で加工して、約２１〜２３kDの成熟して極めて活性の高いＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを産生させる（還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価）。このような加工としては、シグナルペプチドの開裂（配列番号２１、残基１〜３１）、カルボキシル末端ペプチド（配列番号２１のアミノ酸２２８〜４１９にほぼ相当し、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）配列を暗示させる間隔を置いたシステイン残基のパターンを有する[Dignam et al., Gene, 88:133-40 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211:331-49 (1990)]）の開裂による約２９kDの部分加工形態の生成、およびアミノ末端ペプチド（配列番号２１のアミノ酸３２〜１０３にほぼ相当する）の開裂による約２１〜２３kDの完全に加工した成熟形態の生成が挙げられる。実験的証拠は、ＶＥＧＦ−Ｃの部分加工形態（例えば、２９kD形態）はＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）受容体に結合することができるが、ＶＥＧＦＲ−２への高アフィニティー結合は完全に加工した形態のＶＥＧＦ−Ｃでしか起こらないことを示している。ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、天然では非ジスルフィド結合二量体として会合していると思われる。
【０１８８】
更に、配列番号２のアミノ酸１０３〜２２７が総てＶＥＧＦ−Ｃの機能の維持に決定的なものとは限らないことも明らかにされている。配列番号２のアミノ酸１１３〜２１３からなる（且つ残基１０３〜１１２および２１４〜２２７を欠く）ポリペプチドはＶＥＧＦ−Ｃ受容体に結合して刺激する能力を保持しており、約残基１３１から約残基２１１までに及ぶポリペプチドがＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持すると予想される。１５６位のシステイン残基は、ＶＥＧＦＲ−２結合能にとって重要であることが示されている。しかしながら、ＶＥＧＦ−ＣΔＣ１５６ポリペプチド（すなわち、欠失または置換によりこのシステインを欠いている類似体）は、ＶＥＧＦＲ−３の有力なアクチベーターのままである。配列番号２の１６５位のシステインはいずれの受容体の結合にも重要であるが、８３または１３７位のシステインを欠いている類似体は、これらの受容体と結合するための本来のＶＥＧＦ−Ｃと競合して、これらの受容体を刺激する。
【０１８９】
ヒトＶＥＧＦ−Ｃと他の種からのＶＥＧＦ−Ｃとの配列（任意の一般に許容された配列アルゴリズムを用いて行った）は、ＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を破壊することなく修飾（例えば、挿入、置換、および／または欠失）を導入することができる追加の残基を示唆している。２種以上の配列したＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドが異なるアミノ酸、特に化学的特性が異なる側鎖を有する異なるアミノ酸を有する任意の位置は、機能が同時に除去されることのない修飾を受けやすい適当な位置である。ヒト、ネズミ、およびウズラＶＥＧＦ−Ｃの典型的な配列は、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号明細書の図５に記載されている。
【０１９０】
上記考察に加えて、特に上記置換の数が小さい場合にＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持するポリペプチドを生じると思われる野生型ＶＥＧＦ−Ｃ配列に無数の保存的アミノ酸置換を行うことができることが理解されるであろう。「保存的アミノ酸置換」とは、同様な化学的特性の側鎖を有するアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。保存的置換を行うための同様なアミノ酸としては、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リシン、ヒスチジン）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性の脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、小さな側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）、または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を破壊することなく１または数個の内部アミノ酸を付加または欠失することも考えられる。
【０１９１】
上記から、多くのＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドや変異体が高アフィニティーでＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）と結合し、従ってＦｌｔ４結合化合物を用いる組織試料の画像化またはスクリーニングを伴う本発明の局面においてＦｌｔ４結合化合物として有用であることが理解されるであろう。特に興味深いものは、ＶＥＧＦＲ−２結合アフィニティーを減少させまたは除去する変更を含み、生成するポリペプチドがＶＥＧＦＲに対する結合特異性が増加する形態のＶＥＧＦ−Ｃである。上記のように、このような変更としては、Ｃｙｓ１５６の欠失または置換であって、ＶＥＧＦＲ−３結合アフィニティーを実質的に除去するもの、または（ＶＥＧＦＲ−２アフィニティーは完全に加工されたＶＥＧＦ−Ｃで最高であるので）天然のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質分解性加工部位を破壊するアミノ酸配列の変更が挙げられる。更に、Ｆｌｔ４結合アフィニティーを保持するがＦｌｔ４自己リン酸化を活性化することはできないように修飾されたＶＥＧＦ−Ｃ分子は、本明細書に記載の処理法において有用なＦｌｔ４アンタゴニストである。上記の教示から、本明細書に記載のＦｌｔ４リガンドを、ヒトＦｌｔ４対立遺伝子変異体の同一性を確かめ、本明細書で教示されたＦｌｔ４配列に相同性を有する非ヒト遺伝子配列（例えば、例８および図４を参照されたい）が実際にＦｌｔ４に対する非ヒト相対物であることを確かめるための追加指標としてアッセイに用いることができる。プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃの推定アミノ酸配列は、本明細書で配列番号２１に記載されている。
【０１９２】
血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）と呼ばれる第二のＦｌｔ４リガンド、並びにＶＥＧＦ−Ｄ、およびＶＥＧＦ−Ｄ変異体および類似体をコードするヒトポリヌクレオチド配列の詳細な説明は、１９９７年８月２１に出願され１９９８年２月２６日に国際公開ＷＯ９８／０７８３２号として公表された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６号明細書、およびAchen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA., 95(2): 548-553 (1998)に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。それらの文献に詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｄは、最初は３５４アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドとしてヒト細胞に産生される。このプレプロ−ＶＥＧＦ−ＤのｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、本明細書の配列番号２２に記載されている。他の種からのＶＥＧＦ−Ｄ配列も報告されている。例えば、Genbank受託番号Ｄ８９６２８(Mus musculus)およびＡＦ０１４８２７(Rattus norvegicus)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０１９３】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは２１アミノ酸の推定シグナルペプチドを有し、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃの加工と同様な方法で明らかにタンパク質分解的に加工される。配列番号２２の「組換え的に成熟した」ＶＥＧＦ−Ｄを欠いている残基１〜９２および２０２〜３５４は、受容体ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ−３を活性化する能力を保持しており、非共有的に結合した二量体として会合していると思われる。ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの本発明におけるＦｌｔ４結合化合物としての有用性は、ＶＥＧＦ−Ｃについて上記したものと同様である。同様に、（ＶＥＧＦ相同性ドメインの８個の保存システインの第二のものＣｙｓ１３６を除去しまたはタンパク質分解性加工部位を除去するための）ＶＥＧＦ−Ｄに対する類似の変更により、ＶＥＧＦＲ−２結合アフィニティーが減少または除去され、従ってＦｌｔ４特異性が増加したポリペプチドを生じることが予想される。Ｆｌｔ４結合アフィニティーを保持するがＦｌｔ４自己リン酸化を活性化することができないように修飾されたＶＥＧＦ−Ｄ分子は、本明細書に記載の処理の方法において有用なＦｌｔ４アンタゴニストである。
【０１９４】
例１８
マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡプローブのクローニング
１２９ＳＶマウス(Stratagene)由来のλＦＩＸ（商標）II遺伝子ライブラリーからの約１０６個のプラークを、細胞外ドメインをカバーする上記のＳ２．５ヒトＦｌｔ４受容体ｃＤＮＡ断片でスクリーニングした。Pajusola et al., Cancer Res., 52:5738 (1992)も参照されたい。２．５kbのＢａｍＨＩ断片を陽性プラークからサブクローニングし、両端から配列決定した。このサブクローンから、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてpBluescript KSIl+/-ベクター(Stratagene)中にマウスＦｌｔ４ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１７４５〜２０４９をカバーするエキソン断片を増幅してクローニングした。Finnerty et al., Oncogene, 8:2293 (1993)を参照されたい。
【０１９５】
ヌクレオチド１〜１９２をカバーする第二の断片も、同様にクローニングした。
【０１９６】
例１９
マウス組織中のＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析
総ＲＮＡを、Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162:156 (1987)に準じて、発生胚（交尾後８〜１８日および１日齢のマウス）から単離した。交尾から８日後の胚の試料は、胎盤も包含した。
【０１９７】
ＲＮアーゼ保護分析のために、ＲＮＡプローブを、アンチセンス配向について［３２Ｐ］−ＵＴＰおよびＴ７ポリメラーゼを用いて例１８に準じて得た線形化したネズミＦｌｔ４プラスミドから生成させた。用いたβ−アクチンプローブは、公表されたマウスβ−アクチン配列のヌクレオチド１１８８〜１２７９に相当する。Tokunaga, et al., Nucleic. Acid. Res., 14:2829 (1986)を参照されたい。６％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル中で精製した後、標識した転写体を総ＲＮＡ３０μｇに５２℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイズしていないＲＮＡを、ＲＮアーゼＡ（１０U/ml）およびＴ１（１mg/ml）を用いて３７℃、pH７．５で１時間消化した。ＲＮアーゼをプロテイナーゼＫで３７℃で１５分間消化することによって不活性化し、試料６％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで分析した。
【０１９８】
この実験で分析したＦｌｔ４の発現パターンは、極めて弱いｍＲＮＡシグナルが肺、肝臓、心臓、腎臓、骨格筋および脾臓で得られたが、精巣および脳では明らかに特異的シグナルは見られないことを示していた。マウス発生の様々な相で集めた一連のＲＮＡをＲＮアーゼ保護検定法によって分析したところ、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは、交尾から８日後から新生マウスまでの胚形成中に発現し、シグナル強度に大きな変動は見られないことを示した。
【０１９９】
例２０
マウス胚におけるＦｌｔ４についてのイン・シテューハイブリダイゼーション
Ｆｌｔ４転写体を細胞と組織に一層良好に割りふるため、交尾から７．５および８．５日後のマウス胚の切片を、標識したＦｌｔ４ＲＮＡとハイブリダイズした。マウス胚はＣＢＡおよびＮＭＲＩマウスの交尾により誘導した。妊娠マウスを頸部脱臼によって屠殺し、胚を直ちに冷凍するかまたはリン酸緩衝食塩水を介して４％パラホルムアルデヒド中に移した。胚と単離したマウス器官を４℃で１８時間固定し、脱水し、パラフィンに埋設し、６μｍの切片に切断した。
【０２００】
１９２および３０５ヌクレオチドのＲＮＡプローブ (アンチセンスおよびセンス）（例１８参照）を、［３５Ｓ］−ＵＴＰを用いて線形化プラスミドから生成させた。切片のイン・シテューハイブリダイゼーションは、Wilkinson et al., Development, 99:493 (1987)、およびWilkinson et al., Cell, 50:79 (1987)（上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）に準じて、下記の修飾を行った： 1) パラフィンに埋設する前にトルエンの代わりに、キシレンを用い、2) ６μｍ切片を切断し、２％３−トリエトキシシリルプロピルアミンで前処理したスライドガラスの表面上のジエチルピロカーボネート処理水の層上に置き、3) プローブのアルカリ加水分解を省略し、4) 高緊縮洗浄は３０mM ＤＴＴおよび１×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃で８０分間行った。溶液をＮＴＢ−２エマルション(Kodak)でカバーし、４℃で保管した。スライドを１４日間暴露し、現像して、ヘマトキシリンで染色した。センス鎖とＲＮアーゼＡ処理した切片を用いるコントロールハイブリダイゼーションは、バックグラウンド上に特異的シグナルを生じなかった。
【０２０１】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現は７．５日ｐ．ｃ．のマウス胚では検出されなかったが、発生８．５日目の発生途上の大動脈では明るいシグナルが検出された。対照的に、発生途上の卵黄嚢はＦｌｔ４陰性であった。胚外組織では、Ｆｌｔ４が尿膜で顕著に発現したが、発生途上の卵黄嚢の血島は陰性であった。一方、頭部間葉の血管芽細胞は著しくＦｌｔ４陽性であった。発生途上の胎盤では、Ｆｌｔ４シグナルが最初に末梢洞様毛細血管静脈で見られた。９．５日ｐ．ｃ．胎盤では、静脈裂孔の内皮およびライヘルト膜に部分的に融合した巨細胞はＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現した。
【０２０２】
従って、Ｆｌｔ４発現は初期の内皮細胞前駆体である血管芽細胞では極めて顕著であったが、これは８．５日ｐ．ｃ．胚のある種の血管に限定されていると思われた。Ｔｉｅ受容体は発生途上のマウス胚の総ての内皮細胞で発現することが知られており、従って、これらの細胞に対するマーカーを提供する。Korhonen, et al. Oncogene, 8:395 (1993)、およびKorhonen et al., Blood, 80. 2548-2555 (1992)を参照されたい。特に、Ｔｉｅプローブとは対照的に、Ｆｌｔ４プローブは、１１．５日ｐ．ｃ．胚の動脈内皮、例えば、発生途上の背側大動脈または頸動脈の内皮、と極めて弱くハイブリダイズした。代わりに、Ｆｌｔ４シグナルは、発生途上の静脈ではずっと顕著であった。例えば、Ｆｌｔ４シグナルは発生途上の後腎を取り囲む静脈で検出され、Ｔｉｅプローブは主として後腎内の毛細血管を認識した。
【０２０３】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは、１２．５日ｐ．ｃ．マウス胚の幾つかの領域に分布されることが観察され、腋窩領域の膨張血管で特に顕著であった。同様なＦｌｔ４陽性血管構造は、頸静脈部分の正中切断で見られた（データーは示さず）。Ｆｌｔ４発現血管の叢様パターンは、眼窩周囲領域と周りの発生途上の椎骨で現れた。また、発生途上の皮膚の直ぐ下では、Ｆｌｔ４陽性血管網状組織が明らかであった。発生途上の脳など幾つかの領域から一層弱い毛細血管シグナルが得られた。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡも、頸部領域、発生途上の鼻および発生途上の舌の基部、並びに尾領域における小血管で検出することができた。更に、肝臓は、スポット様パターンでのＦｌｔ４ｍＲＮＡに強い陽性を示した。
【０２０４】
更に発生中に、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは、胚のある種の血管に一層限定されると思われた。１４．５日ｐ．ｃ．胚は、この限定された発現パターンを正確に示している。このような胚からの正中切断では、最も顕著なＦｌｔ４シグナルが発生途上の脊柱の前側部分に沿って観察された。このシグナルは、発生のこの時期に形成される最大のリンパ管である胸管の内皮細胞に由来すると考えられた。対照的に、背側大動脈および下大静脈は陰性であった。腸間膜領域の膨張血管も、Ｆｌｔ４に強い陽性を示した。更に、１２．５日ｐ．ｃ．胚と同様に、眼窩周囲、下顎、並びに頸部領域の解剖学的境界に沿った血管網状組織は、Ｆｌｔ４陽性の内皮を含んでいた。同様な構造は、心臓周囲空間および皮下組織中に存在した。特に、Ｆｌｔ４陰性血管とは対照的に、総てのＦｌｔ４陽性血管はそれらの管腔に血液細胞を欠いていた。これらの発現パターンは、Ｆｌｔ４が発生のこの時期にリンパ管の内皮に閉じ込められることを示唆している。本発明者らがＦｌｔ４発現を観察したもう一つの部位は、発生途上の骨髄のシヌソイドであった。
【０２０５】
Ｆｌｔ４プローブとハイブリダイズした１６．５日ｐ．ｃ．胚の上部胸郭の横断面も分析した。ヘマトキシリン−エオシン染色を行い、この領域の様々な種類の血管を可視化した。これらには、頸動脈および腕頭動脈(brachiochepalic arteries)、大静脈および胸管が挙げられ、これはサイズが小さく、周りの筋および結合組織を欠いている。一層高倍率では、胸管並びに附近の小血管の内皮細胞がＦｌｔ４プローブとハイブリダイズすることが観察された。
【０２０６】
例２１
培養内皮細胞でのＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析
例２０に記載のイン・シテューハイブリダイゼーションの結果は、Ｆｌｔ４が静脈内皮細胞と、後でリンパ管および幾つかの静脈内皮細胞で発現するが、動脈内皮では発現しないことを示していた。このような調節がイン・ビトロで保持されるかどうかを決定するために、ノーザンブロット法およびハイブリダイゼーション分析を用いて培養内皮細胞を検討した。
【０２０７】
ヒト大動脈、大腿静脈、臍帯静脈、および包皮微細血管からの内皮細胞を単離し、培養して、当該技術分野で以前に記載されている方法で特性決定した。Van Hinsberg et al., Arteriosclerosis, 7:389 (1987)、およびVan Hinsberg, et al., Thromb. Haemostas, 57:148 (1987)を参照されたい。それらを５〜８回継代した後（分離比１：３）コンフルエント密度で用いて、ポリアデニル化ＲＮＡを単離した。
【０２０８】
内皮細胞系ＥＡｈｙ９２６(Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80:3734-3737 (1983))、ＢＣＥ(Folkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76: 5217-5221 (1979))およびＬＥII(Schreiber et al., Proc. Natl. Acad Sci., 82: 6138 (1985)) は、Ｆｌｔ４を発現しなかった。しかしながら、培養ヒト微小血管、静脈および臍帯静脈内皮細胞はＦｌｔ４に特異的な５．８および４．５kbのｍＲＮＡに対して陽性であったが、大動脈内皮細胞は陰性であった。対照的に、別腫の内皮受容体型チロシンキナーゼ遺伝子ｔｉｅは、検討した総ての内皮細胞型で４．４kbｍＲＮＡとして発現した。
【０２０９】
例２２
成人組織のＦｌｔ４ｍＲＮＡ
例２０で得られた結果は、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡが主として発生中のリンパ管の内皮に閉じ込められることを示していた。ヒトでのこの知見が潜在的に重要であるため、ヒトＦｌｔ４プローブを用いて成人組織でのＦｌｔ４発現も検討した。用いたヒトＦｌｔ４プローブは、ｃＤＮＡの塩基対１〜５９５をカバーするＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片であった（配列番号１）。Pajusola et al., Cancer Res., 52:5738 (1992)も参照されたい。フォンビルブラント因子プローブは、塩基対１〜２３３４をカバーするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片であった。Bonthron, et al., Nucleic Acids Res., 141:7125 (1986)。
【０２１０】
本発明者らは、組織病理学的診断用に取り寄せた固定材料を日常的に使用した。正常な肺組織は、類表皮癌に冒された左下肺葉の切除物から得た。腸間膜および腸間膜リンパ節は、結腸腺癌の患者から得た。唾液腺に隣接する正常なリンパ節は、その大きさが異常なため摘出した。２名の患者からの扁桃、および２個の虫垂は、診断上変化は見られなかった。２種類のリンパ管筋腫および３種類の嚢胞性リンパ管腫を検討したところ、同様な結果を得た。
【０２１１】
組織病理学的診断用に１０％ホルマリンで固定した日常的な試料であるヒト組織については、通常のイン・シテュープロトコールでは調度バックグラウンドが得られたが、プロテイナーゼＫの代わりにマイクロ波処理を行うことによって、特異的ハイブリダイゼーションを行うことができた。Shi, et al., J. Biol. Chem., 266:5774 (1991); Catoretti, et al., J. of Pathol., 168:357 (1992)。
【０２１２】
腸間膜、肺および虫垂リンパ管内皮ではＦｌｔ４シグナルを生じたが、静脈、動脈、および毛細血管では陰性であった。Ｆｌｔ４がＨＥＶで発現するかどうかを検討するため、扁桃を検討した。実際に、扁桃では、Ｆｌｔ４に特異的なオートラジオグラフィー粒子が幾つかのＨＥＶで検出された。
【０２１３】
例２３
正常および転移性リンパ節、およびリンパ管腫におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析
ヒト腸間膜リンパ節の一部（例２２参照）を、Ｆｌｔ４発現について分析した。Ｆｌｔ４発現が、リンパ洞、および求心性および遠心性リンパ管で観察された。同じパターンが、腺癌転移物を含むリンパ節で観察された。正常および転移性リンパ節における幾つかのＨＥＶも陽性であった。嚢胞性リンパ管腫におけるＦｌｔ４発現は、総ての血管におけるフォンビルブラント因子についてのイン・シテューシグナルとの比較から明らかなように、リンパ管内皮に特異的であった。
【０２１４】
これらの結果と一致して、Ｆｌｔ４についての免疫染色は、リンパ管内皮と考えられるものの増殖を特徴とする珍しい疾患である皮膚リンパ管腫疾患(cutaneous lymphangiomatosis)の内皮で強い陽性を示した。Lymboussaki et al., Am. J. Pathol., 153(2): 395-403 (August, 1998)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０２１５】
更に、Ｆｌｔ４についての免疫染色により、カポジ肉腫皮膚小結節状病変組織試料内の紡錘細胞を同定した。Jussila et al., Cancer Res., 58:1599-1604 (April, 1998)を参照されたい。Ｆｌｔ４の見かけのリンパ管特異性を考慮して、これらの結果は、カポジ肉腫のある種の細胞がリンパ管内皮起源であることの示唆と一致していると考えることができる。例えば、Beckstead et al, Am J. Pathol., 119: 294-300 (1985)、およびDictor et aL, Am J. Pathol., 130: 411-417 (1988)を参照されたい。
【０２１６】
例２４
胎児内皮細胞におけるＦｌｔ４の局在化
例２に記載されているように、端渓対の４０カルボキシ末端アミノ酸をコードするＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片を、６５７bpのＥｃｏＲＩ断片としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼコード領域とインフレームでｐＧＥＸ−１λＴ細菌発現ベクター(Pharmacia)にクローニングした。生成するＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合タンパク質がE. coli.で産生し、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製タンパク質を凍結乾燥し、ＰＢＳに溶解し、フロイントアジュバントと混合し、ウサギの免疫化に用いた。抗血清は、３回目の追加免疫の後に用いた。
【０２１７】
１７および２０週齢のヒト胎児からの組織を、プロスタグランジンで誘発した合法的妊娠中絶から得た。この研究は、ヘルシンキ大学中央病院の倫理委員会によって承認された。在胎齢を胎児の足の大きさから推定した。胎児組織Tissue-Tek (Miles)に埋設し、直ちに冷凍して、−７０℃で保管した。
【０２１８】
抗Ｆｌｔ４抗血清をＧＳＴ−セファロースカラムに交差吸収させて抗ＧＳＴ−抗体を除いた後、ＧＳＴ−Ｆｌｔ４アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。幾つかの組織の６μmの厚みのクリオスタット切片をアセトンで固定し、０．３％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で３０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。洗浄後、切片を５％の正常なブタ血清と共にインキュベーションした。次に、切片をＦｌｔ４に対する抗体と共にインキュベーションし、洗浄した。結合抗体をペルオキシダーゼ接合ブタ抗ウサギＩｇＧで検出した後、０．２％３,３−ジアミノベンジジン(Amersham)を基質として用いてペルオキシダーゼ活性について染色した。切片を、マイヤー(Meyer's)ヘマトキシリン中で対比染色した。
【０２１９】
ヒト胎児腸間膜の抗Ｆｌｔ４イムノペルオキシダーゼ染色は幾つかの血管内皮中にＦｌｔ４タンパク質を示したが、抗原ブロック抗Ｆｌｔ４抗体とプレイミューン血清(preimmune sera)によるコントロール染色は陰性であった。比較のため、切片を、血管内皮細胞に特異的なVIII因子関連抗原に対する抗血清で染色した。Ｆｌｔ４に対するイムノペルオキシダーゼ染色を赤血球を含まない血管内皮細胞に関して観察したが、血管は陰性であった。赤血球を含まない血管はリンパ管内皮細胞と思われ、このような血管は腸間膜で特に頻繁に見られる。VIII因子関連抗原に対する抗体は、総ての血管の内皮細胞を染色した。
【０２２０】
例２５
Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体の産生
融合Ｉ：
組換えＦｌｔ４細胞外ドメインタンパク質は、Ｆｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ−ｐＶＴＢａｃプラスミド構造体（例１４）をハイ−ファイブ(High-Five)細胞で発現させることによって産生した。Ｆｌｔ４細胞外ドメイン (Ｆｌｔ４ＥＣ）は、組換えＦｌｔ４細胞外ドメインのＣＯＯＨ末端でコードした６ｘＨｉｓタグの結合および溶出のためのＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて製造業者(Qiagen)の指示に従って感染したハイ−ファイブ細胞の培地から精製した。
【０２２１】
４月齢のBalb/c雄マウスに、精製した組換え生成Ｆｌｔ４細胞外ドメインタンパク質（１５０μｇ／マウス）をフロイント完全アジュバントに乳化したものを腹腔内投与することによって免役した。１５０μｇの追加免疫投与は３〜４週間の間隔を置いて行い、最後の追加免疫（１０μｇＦｌｔ４ＥＣ／ＰＢＳ、腹腔内投与）は更に３週間の間隔を置いて投与した。最後に追加免疫投与を行ってから４日後に、マウスを屠殺して、マウス脾臓リンパ球様細胞をＳＰ２／０プラスマ細胞腫細胞とそれぞれ２：１の比率で融合した。
【０２２２】
融合細胞を、２０％子牛胎児血清とＨＡＴ補給物（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン；GIBCO, 043-01060H; ５０倍希釈）を含む Ex-Cell 320培地(SERALAB)中９６穴培養プレート(NUNC)で集めた。細胞を＋３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で培養した。１０日後、ＨＡＴ補給培地を、ＨＴ補給細胞培養培地（GIBCO; 043-01065H, ５０倍希釈）に代えた。ＨＴ培地は、アミノプテリンを欠いていること以外はＨＡＴ培地と同じである。
【０２２３】
３週間で、特異抗体産生を、下記の例６に記載の抗原特異的なイムノフルオロメトリックアッセイ（ImmunoFluoroMetric Assay, ＩＦＭＡ）によって決定した。マスタークローンを、Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 5 7:865-868 (1984)に記載の限定希釈法によってクローニングした。陽性クローンを２４穴組織培養プレート(NUNC)上に広げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。陽性クローンを蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によって試験した。
【０２２４】
安定なクローンは、クラスＩｇＡに属すると思われるＩｇを産生した１種類を除き、ＩｇＧ１のクラスに属する免疫グロブリンを分泌した。モノクローナル抗体のサブクラスは、ＩＦＭＡでのビオチン接合体(SEROTEC)としてマウスサブクラスに対するラットモノクローナル抗体を用いて決定した。
【０２２５】
Balb/cマウスを用いて、腹水流体中でモノクローナル抗体を産生した。上記のハイブリドーマを、動物をプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン９８％, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinbeim, Cat.No. T 2,280-2）で前処理した後、マウス腹腔内に投与した。プリスタン０．５mlは、ハイブリドーマ細胞の約２週間前に投与した（i．v．）。投与した細胞の量は、約７．５〜９x１０６／マウスであった。ハイブリドーマの投与から１０〜１４日後に、腹水を集めた。
【０２２６】
融合II：
２月齢のBalb/cマウス（雌）を、組換え生成Ｆｌｔ４細胞外ドメインタンパク質（２０μｇ／マウス）ををフロイント完全アジュバントに乳化したものを腹腔内投与して免役した。２０μｇの追加免疫投与は３〜４週間の間隔を置いて行い、最後の追加免疫（１０μｇＦｌｔ４／ＰＢＳ、静脈内投与）は更に３週間の間隔を置いて投与した。最後に追加免疫投与を行ってから４日後に、マウスを屠殺して、マウス脾臓リンパ球様細胞をＳＰ２／０プラスマ細胞腫細胞とそれぞれ２：１の比率で融合した。
【０２２７】
融合細胞を、２０％子牛胎児血清とＨＡＴ補給物（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン，GIBCO BRL 21060-017; ５０倍希釈）を含むOptiMEM 1培地（Glutamaxを含む，1,51985-026, Gibco BRL）中９６穴培養プレート(FALCON)で集めた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で培養した。１０日後、ＨＡＴ補給培地を、ＨＴ補給細胞培養培地（GIBCO BRL; 41065-012, ５０倍希釈）に代えた。
【０２２８】
３週間で、特異抗体産生を、下記の例６に記載の抗原特異的なイムノフルオロメトリックアッセイ（ImmunoFluoroMetric Assay, ＩＦＭＡ）によって決定した。マスタークローンを、Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 5 7:865-868 (1984)に記載の限定希釈法によってクローニングした。陽性クローンを２４穴組織培養プレート(FALCON)上に広げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。陽性クローンをＦＡＣＳによって試験した。
【０２２９】
クローン２Ｅ１１および６Ｂ２は、クラスＩｇＡに属すると思われる免疫グロブリンを分泌し、クローン２Ｂ１２はサブクラスＩｇＭに属するＩｇを産生した。マウスサブクラスＩｇG１はＩＦＭＡでのビオチン接合体(SEROTEC)としてマウスサブクラス重鎖に対するラットモノクローナル抗体を用いて決定し、マウスサブクラスＩｇＭは、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit) (Dipstick Format) (19663 -012, Life Technologies Inc.)を用いて決定した。
【０２３０】
例２６
Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体の特異性
精製した組換えＦｌｔ４細胞外ドメイン−６ｘＨｉｓ融合産物（例１４および２５で産生）を、下記の修正を加えたMukkala et al., Anal.Biochem, 176(2). 325 (1989)に記載の方法に準じてユーロピウムで標識した： ２５０倍モル過剰量のイソチオシアネートＤＴＴＡ−Ｅｕ（Ｎ１キレート, WALLAC, Finland）をＦｌｔ４溶液（０．５mg/ml、ＰＢＳ中）に加え、０．５M炭酸ナトリウム緩衝液, pH９．８加えてpHを約９に調整した。標識は、＋４℃で一晩行った。未結合標識を、ＰＤ−１０(PHARMACIA, Sweden)を溶離剤としてのＴＳＡ緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, pH７．８、０．１５M ＮａＣｌを含む）と共に用いて除去した。
【０２３１】
精製後、１mg/mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標識したＦｌｔ４に加え、標識を＋４℃で保管した。Ｆｌｔ４分子当たり取り込まれたユーロピウムイオンの平均数は、既知ＥｕＣｌ３標準品(Hemmila et al., Anal. Biochem., 137:335-343 (1984))と比較して蛍光を測定することによって決定したところ、１．９であった。
【０２３２】
例２５で産生した抗体を、ウサギ抗マウスＩｇ(Z 259, DAKOPATTS)でコーティングしたマイクロタイトレーションストリップウェル（NUNC, ポリソルブ(polysorb)）を用いるサンドイッチ型免疫蛍光測定検定法でスクリーニングを行った。前コーティングしたウェルを、DELFIA洗浄溶液を含むPlatewash 1296-024 (WALLAC)によって１回洗浄した。DELFIAアッセイ緩衝液を、細胞培養上清および予備スクリーニングアッセイにおいて陽性コントロールとして用いる脾臓摘出マウスの血清の希釈緩衝液として用いた（１：１０００〜１：１００,０００の希釈倍率）。
【０２３３】
＋４℃で一晩（あるいは、室温で２時間）のインキュベーションは、Plateshake振盪装置(1296-001, WALLAC)で５分間振盪した後、上記の洗浄溶液で４回洗浄することによって開始した。
【０２３４】
ユーロピウム標識Ｆｌｔ４を、アッセイ緩衝液１００μlに１：５００の希釈倍率で加えた。Plateshake振盪装置で５分間振盪し、室温で１時間インキュベーションした後、ストリップを上記のようにして洗浄した。
【０２３５】
免疫促進溶液(DELFIA)を、２００μl／ウェルで加えた。次に、プレートをPlateshake振盪装置上で５分間振盪し、蛍光強度をARCUS-1230 (WALLAC)によって１０〜１５分間測定した（Loevgren et al.: Collins W.P.（監修）「選択的イムノアッセイ(Alternative Immunoassays)」, John Wiley & Sons Ltd. (1985), pp. 203-216）。DELFIAの結果は、試験した総てのモノクローナル抗体がＦｌｔ４ＥＣ抗原を結合することを示している。Ｆｌｔ４と反応性のモノクローナル抗体（およびこの抗体を産生するハイブリドーマ）を選択して、更にスクリーニングを行った。
【０２３６】
生成するモノクローナル抗体を、ＬＴＲ−ＦＬＴ４1構造体とネオマイシン耐性のトランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の二重抗体免疫蛍光染色に用いた。細胞をＥＤＴＡを用いて培養プレートから分離し、染色して、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。ＦＡＣＳ分析の結果を、指示したモノクローナル抗体で陽性染色の細胞の百分率として示す（下表２を参照）。
【０２３７】
【表２】
2010088433.tif 000003
【０２３８】
ＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌ−トランスフェクション細胞でのＦＡＣＳの結果は、抗体がＦｌｔ４発現細胞を効果的に認識することを示している。これらの同じ抗体は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のバックグラウンド染色しか生じない。従って、これらの抗体は、細胞表面上でＦｌｔ４チロシンキナーゼを特異的に認識する
【０２３９】
抗Ｆｌｔ４ハイブリドーマ９Ｄ９Ｆ９と呼ばれるクローンは、ＩＲＮＡによって免疫グロブリンのクラスＩｇＧ１のものであると決定されたモノクローナル抗体を安定に分泌することが分かった。ハイブリドーマ９Ｄ９Ｆ９は、１９９５年３月２３日にthe German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of human and Animal Cell Cultures and Viruses（Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig, Germany）に寄託され、受託番号ＡＣＣ２２１０を与えられた。
【０２４０】
融合II抗体
上記のユーロピウム標識したＦｌｔ４細胞外ドメインタンパク質を、例２５に記載の融合II抗体のスクリーニングにも用いた。抗体は、ウサギ抗マウスＩｇ(Z 259, DAKO)でコーティングしたマイクロタイトレーションウェル(Nunc, Polysorb)を用いるＦｌｔ４に特異的な IＦＭＡを用いてスクリーニングした。予備コーティングしたウェルを、DELFIA Plate洗浄を用いることによって洗浄溶液(Wallac)で１回洗浄した。
【０２４１】
The DELFIAアッセイ緩衝液を、細胞培養上清（予備スクリーニングで１：２に希釈）および陽性コントロールとして用いた脾臓摘出マウスの血清（希釈度１：１０００〜１：１００,０００）の希釈緩衝液として用いた。標準品として、精製した抗Ｆｌｔ４ ９Ｄ９Ｆ９（マウスサブクラスＩｇＧ１）を１．０ng/ml〜２５０ng/mlの濃度で用いた。試料をPlateshake振盪装置上室温で５分間振盪した後、＋４℃で約１８時間インキュベーションした。フレームを最初に４回洗浄した後、Ｅｕを標識したＦｌｔ４（１：２０００，１００μlアッセイ緩衝液中）を加え、最後にフレームを室温で１時間インキュベーションした。上記のように洗浄した後、免疫促進溶液（２００μl／ウェル，Wallac）を加え、フレームをPlateshake振盪装置上で５分間振盪した。蛍光強度を、ARCUS-1230 (Wallac)によって測定した。Ｆｌｔ４と反応性のモノクローナル抗体を選択して、上記のようにＦｌｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる二重抗体免疫蛍光染色検定法で更にスクリーニングを行った。
【０２４２】
Ｆｌｔ４に対して生成する融合IIモノクローナル抗体と相当するＦＡＣＳ分析の結果（指示したモノクローナル抗体で陽性染色の細胞の百分率として表した）を、表３にまとめる。
【０２４３】
抗Ｆｌｔ４抗体の定量の標準曲線を、アフィニティー精製した抗Ｆｌｔ４ ９Ｄ９Ｆ９を用いて作製した。直線範囲は、１．０ng/ml〜２５０ng/mlに達した。
【０２４４】
表面上に完全長Ｆｌｔ４を発現するｐＬＴＲＦＬＴ４ｌ構造体と同時トランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞溶解物を６．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動し、タンパク質をニトロセルロースニトレート膜（０．４５μm, SCHLEICHER & SCHUELL）に導入し、モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ細胞培養上清（１：１０, ４％メタノール，０．０４％ＳＤＳを含む５０mM ＴＲＩＳ−４０mMグリシン緩衝液）で免疫ブロットした。モノクローナル抗体の特異性を、ＨＲＰ接合ウサギ抗マウスＩｇ（P 161, DAKO, １５０mM食塩水、５％粉乳を含む２０mM ＴＲＩＳ緩衝液, pH７．５で１：１０００に希釈）とＥＣＬ  (Enhanced chemiluminescence, AMERSHAM)とのインキュベーションを用いて検出した。
【０２４５】
【表３】
2010088433.tif 000004
【０２４６】
例２７
細胞溶解物中にあり且つヒト組織のリンパ管内皮細胞で発現したＦｌｔ４を同定するための抗Ｆｌｔ４抗体の使用
上記の例で記載したハイブリドーマ９Ｄ９によって産生したモノクローナル抗体を、ＨＥＬ細胞の溶解生成物の免疫沈澱およびウェスタンブロット分析に用いた。例６で記載したように、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現は、以前にＨＥＬ細胞で観察されていた。約２ｘ１０７個の培養ＨＥＬ細胞を例１１で記載したＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、（例１１でポリクローナル抗体について記載したように）９Ｄ９抗体約２μｇで免疫沈澱を行った。ウェスタンブロット分析のため、免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％ゲル）で電気泳動し、ニトロセルロース膜に電気泳動的転写を行った。Ｆｌｔ４ポリペプチドに相当する１７５kDと１２５kDのポリペプチドバンドを、９Ｄ９抗体の１μg/ml希釈物を用いて免疫沈殿物のウェスタンブロット分析で検出した。
【０２４７】
ヒト皮膚組織の免疫染色は、９Ｄ９モノクローナル抗体とアルカリホスファターゼＡＢＣ−ＡＰキット(Dako)を用いて行った。簡単に説明すれば、成人皮膚の６μm試料を含むスライドを室温（ＲＴ）で３０分間乾燥し、冷アセトンで１０分間固定した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５分間１回洗浄した。次に、試料を２％ウマ血清と共にＲＴで３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。
【０２４８】
免疫染色のため、試料を９Ｄ９一次抗体と共にＲＴで１時間インキュベーションし、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。洗浄後、試料をビオチン化ウサギ抗マウス二次抗体と共にＲＴで３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで５分間３回再度洗浄した。
【０２４９】
結合抗体は、試料をＡＢＣ−ＡＰ複合体とＲＴで３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＡＰ−基質(Sigma Fast Red TR/Naphtol AS-MX (Cat. No. F-4648))と共にＲＴで１５分間インキュベーションし、水ですすぐことによって検出された。次に、試料をマイヤーヘマトキシリンで３０秒間対比染色し、水ですすいだ。アクアマウント(Aquamount)とカバーグラスを付けて、試料を顕微鏡下で分析した。９Ｄ９抗体染色がこれらのヒト皮膚切片のリンパ管内皮細胞で観察された。追加の分析は、リンパ管内皮に対する見かけの特異性を確かめるのに役立った。Lymboussaki et al., Am. J. Pathol., 153(2):395-403 (August, 1998)、およびJussila et al., Cancer Res., 58:1599-1604 (April, 1998)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０２５０】
これらの結果により、リンパ管内皮に対する有用なマーカーとしてのＦｌｔ４の有用性、および組織試料でこれらの細胞で発現したＦｌｔ４を同定し、可視化するための抗Ｆｌｔ４抗体の有用性も確認される。
【０２５１】
例２８
乳癌血管新生におけるＶＥＧＦ−Ｃ/ＶＥＧＦＲ−３シグナル形成経路のアップレギュレーション
上記の例では、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）が正常組織でのリンパ管内皮の特異的抗原マーカーとして有用であることを示している。以下の手続きは、更に、ＶＥＧＦＲ−３が（例えば、診断およびスクリーニングの）抗原マーカーとしておよび悪性乳房腫瘍における治療ターゲットとして有用であることを示す。極めて多数のＶＥＧＦＲ−３ 陽性の血管が、組織学的に正常な乳房組織と比較して侵襲性乳癌で見出された（Ｐ＜０．０００１）。
【０２５２】
材料および方法
新たに凍結した乳房組織試料は、ヘルシンキ大学の病理学科のファイルから取り出した。試料は、腺管癌（ｎ＝６）、小葉癌（ｎ＝６）、腺管内癌（ｎ＝８）、繊維腺腫（ｎ＝４）、および組織学的に正常な乳房組織（ｎ＝１２）からなっていた。総ての試料は、摘出術後直ちに液体窒素で凍結し、−７０℃で保管した。
【０２５３】
ヒトＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を、本質的に上記例、例えば、例２５に記載の方法で産生した。ＶＥＧＦＲ−３細胞外タンパク質ドメイン（ＶＥＧＦＲ−３ＥＣ）は、培地から精製した昆虫細胞中で組換えバキュロウイルスによって発現した。次に、ＶＥＧＦＲ−３ＥＣに対するマウスモノクローナル抗体を標準的方法を用いて産生し、免疫グロブリン画分は、ハイブリドーマ腹水流体またはTecnomouse（商標）培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０２５４】
組織試料の５μmクリオスタット切片を風乾して、冷アセトンで１０分間固定した。切片をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再水和し、５％正常なウマ血清中で室温にて３０分間インキュベーションした。次に、切片を湿った雰囲気中室温にて１．０μg/mlの濃度のＭａｂｓ９Ｄ９Ｆ９（例２６）と共に２時間インキュベーションした。ＶＥＧＦＲ−３ＥＣの別個のエピトープに対する他の抗ＶＥＧＦＲ−３Ｍａｂも検討し、クローン２Ｅ１１Ｄ１１（例２６）および７Ｂ８Ｆ９（本質的に例２６に記載の方法で作製）をそれぞれ９．５および８．５μg/mlの濃度で用いた。続いて、ビオチン化抗マウス血清中で３０分間インキュベーションした後、Vectastain Elite Mouse IgG ABCキット(Vector laboratories, Burlingame, USA)の試薬を用いて６０分間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ活性は、３−アミノエチルカルバゾール(AEC, Sigma, St. Louis, USA)１０分間で発現した。最後に、切片をヘマトキシリンで２０秒間染色した。陰性コントロールは、一次抗体を省略して、または同じアイソタイプと関連のない一次抗体を用いて行った。精製したバキュロウイルス免疫原を用いて、もう一つの陰性コントロールとしての９Ｄ９抗体の結合をブロックした。これらの実験において、抗体を、ＰＢＳ中で１０倍モル過剰量のＶＥＧＦＲ−３ＥＣタンパク質と共に一晩インキュベーションした。４０００rpm，＋４℃で４分間遠心分離した後、上清を慎重に集めた後、一次抗体として用いた。抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で染色したものに隣接する５μmクリオスタット切片を、血管内皮マーカーＰＡＬ−Ｅ（０．１５μg/ml, Monosan, Uden, the Netherlands)、ラミニン（クローンＬＡＭ−８９の上清の１：４０００倍希釈物, Sigma, St Louis, MO）、コラーゲンXVIII（１．９μg/ml）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ, ０．５μg/ml,クローン１Ａ４, Sigma）、ＶＥＧＦＲ−１（クローン１９の上清の１：２００倍希釈物）、またはＶＥＧＦＲ−２（１：１００倍希釈物）について免疫染色した。
【０２５５】
総ての試料の病理学的検討は、染色処置の後に行った。血管密度は、Gasparini and Harrisが推奨する指針に従って、ＰＡＬ−Ｅ[de Waal et al., Am. J. Pathol., 150: 1951-1957 (1997)]について染色したスライドから得た[Gasparini G, and Harris A, J Clin. Oncol., 13: 765-782 (1995)]。ＶＥＧＦＲ−３陽性の血管密度を、同じ方法で検討した。スライドを最初に低倍率で走査し、次に腫瘍内血管密度を、最高血管密度（「血管ホットスポット」）を有する部分または最高のＶＥＧＦＲ−３陽性血管密度を有する部分での４００ｘの倍率の高出力場（ｈｐｆ）当たりの染色血管の数を係数することによって評価した。最低でも５つの場をスライド当たりに係数し、その後、３個の最高計測値を平均した。
【０２５６】
二重染色を行い、２種類の腺管内癌のリンパ管と血管の免疫組織化学的染色を識別した。アセトン固定した５μmのクリオスタット切片を抗ＰＡＬ−Ｅ抗体と１時間、ビオチン化ウマ抗マウス抗体（Vectastain Elite mouse IgG ABCキット, Vector laboratories, Burlingame, USA）と３０分間、ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ（Vectastain,１：１００）と４５分間インキュベーションし、最後にＡＥＣと１０分間発現させた。第二段階については、切片を抗ＶＥＧＦＲ−３抗体と１時間（０．１４μg/ml）、続いてビオチン化抗マウス抗体と３０分間（クローンの上清の１：２００倍希釈物）、ＡＢＣ−ペルオキシダーゼと３０分間（１：１００）、０．０１％ペルオキシドを含むビオチン化チラミン溶液（１：２．０００）と５分間、ＡＢＣ−アルカリホスファターゼ（１：１００）と２０分間インキュベーションし、ＩＳＨシグナル増加について文献に以前に記載されている手続きに従って、Fast Blue (Sigma, St. Louis, USA)で２０分間発現させた[Kerstens et al., J Histochem. Cytochem., 43: 347-352 (1995)]。二重染色切片に隣接するクリオスタット切片（５μm）も、上記の方法でＶＥＧＦＲ−３抗体のみで免疫染色した。
【０２５７】
ポリクローナル抗体は、文献に記載の通り、成熟して分泌されるヒト血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）（ＶＥＧＦ−Ｃプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの残基１０４〜１２０）のＮ−末端のアミノ酸残基２〜１８に相当する合成ペプチドに対してウサギで産生された［Joukov et al., EMBO J, 16: 3 898-3911 (1997)、この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される］。抗血清は、エポキシ活性化セファロース−６Ｂカラムに結合した免疫原性ポリペプチドを用いてアフィニティー精製し、ＶＥＧＦ−Ｃまたはコントロールβ−ガラクトシダーゼを発現するアデノウイルスベクターに感染した細胞を用いてＶＥＧＦ−Ｃの特異的染色について試験した。
【０２５８】
８種類の腺管内癌とＶＥＧＦＲ−３について分析した総ての侵襲性癌を選定して、ＶＥＧＦ−Ｃの発現について更に分析した。抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で染色した切片に隣接する５μmのクリオスタット切片を風乾し、冷アセトンで１０分間固定した。切片をＰＢＳで再水和し、５％正常ヤギ血清中で３０分間、次いでＰＢＳで１：２００に希釈したヒトＶＥＧＦ−Ｃに対するウサギポリクローナル抗体で湿った雰囲気中室温で２時間インキュベーションした。続いて、ビオチン化抗ウサギ血清中で３０分間インキュベーションした後、the Vectastain Elite Rabbit IgG ABCキット(Vector laboratories, Burlingame, USA)の試薬を用いて６０分間インキュベーションした。切片を、更に上記の通りに加工した。陰性コントロールとしては、精製免疫原を用いてＶＥＧＦ−Ｃ抗体の結合をブロックした。これらの実験では、ＶＥＧＦ−Ｃ抗体をＰＢＳ中で１０倍モル過剰量のＶＥＧＦ−Ｃタンパク質と共に一晩インキュベーションした。４０００rpm、＋４℃で４分間遠心分離した後、上清を慎重に集めて免疫染色に用いた。
【０２５９】
ヒトXVIII型コラーゲンに対するモノクローナル抗体は、DiaBor Ltd. (Oulu, Finland)によりマウスのヒトXVIII型コラーゲンのＮ−末端ＮＣ１ドメインの共通領域に相当する組換えポリペプチドＱＨ４８．１８[Saarela et al., Matrix Biology, 16: 319-28 (1998)]による免疫化によって生じた。クローンをポリペプチドＱＨ４８．１８を用いるＥＬＩＳＡ検定法とウェスタン分析によってスクリーニングし、また凍結したヒト組織切片の免疫蛍光染色によってもスクリーニングした。ハイブリドーマクローンをスクリーニングすることによって、３種類のモノクローナル抗体を生じ、これは上記した３種類総ての検定法（ＥＬＩＳＡ、ウェスタン分析、免疫蛍光染色）で陽性であった。最強シグナルを生じた抗体の一つであるＤＢ１４４−Ｎ２を、次の実験に用いた。これは、ポリクローナル抗−ａｌｌ ｈｕ(XVIII)と同一の染色パターン（例えば、成人皮膚および腎臓試料）を生じた。
【０２６０】
結果
Ａ）  組織学的に正常な乳房組織および良性繊維腺腫のＶＥＧＦＲ−３
正常な乳房組織におけるＶＥＧＦＲ−３の免疫組織化学的染色では、管間ストロマの毛細血管の染色は極めて弱かった。これらの血管は特異的パターンを全く形成せず、ストロマ中に散在した。正常な乳房組織試料中のＶＥＧＦＲ−３陽性の血管の密度は６〜１７/ｈｐｆの範囲であり、メジアンは９（ｎ＝１２）であった。これらの血管のほとんどは血管内皮マーカーＰＡＬ−Ｅおよび基底板成分である,コラーゲンXVIIIについて強力に染色されることから、ＶＥＧＦＲ−３は正常な乳房組織の血管で弱く発現することを示唆していた。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−３について明確に染色されるストロマ中の幾つかの薄い血管はＰＡＬ−Ｅについては陰性であり、コラーゲンXVIII型についてはごく弱い陽性であり、それらがリンパ管であることを示唆していた。ＶＥＧＦＲ−３陽性の血管も良性繊維腺腫で一様に見出されており、それらの密度（メジアン８血管／ｈｐｆ；範囲３〜１９；ｎ＝４）は組織学的に正常な乳房組織の密度と異ならなかった（メジアン８対９；Ｐ＞０．１，マン−ホイットニー検定(Mann-Whitney test)）。
【０２６１】
Ｂ)  腺管内癌におけるＶＥＧＦＲ−３陽性の血管
腺管内癌では、強力に染色されたＶＥＧＦＲ−３陽性の血管の特徴的パターンが観察された。これらの血管は、罹患した管の周りにアーチ様構造を形成した（図５Ａ）。この「ネックレス」パターンは、血管内皮マーカーＰＡＬ−Ｅ（図５Ｂ）についての隣接切片の染色でも観察され、ＶＥＧＦＲ−３発現は毛細血管内皮で増加することを示唆していた。血管とリンパ管を更に明確に識別し、管壁における平滑筋細胞と血管周囲細胞の存在について検索するため、平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ）と基底板成分のラミニンおよびXVIII型コラーゲンを用いて更に染色を行った。この染色によれば、腺管内癌に近接した小血管はＶＥＧＦＲ−３と基底板タンパク質を同時に発現したが、ＳＭＡについては一層弱く染色し、それらは管壁では血管周囲細胞／平滑筋細胞によって不完全にカバーされていることを示唆した（図５Ｃ〜５Ｆの黒矢印）。対照的に、管内病変から幾らか距離のある大きめの血管は一般にＶＥＧＦＲ−３に対して陰性であるが、ラミニン、コラーゲンXVIIIおよびＳＭＡに対しては陽性であった（紅矢印）。ＶＥＧＦＲ−３に対しては陽性であるが、基底板タンパク質ラミニンおよびXVIII型コラーゲンに対してはごく弱くしか染色されず、ＳＭＡに対しては全く染色されない管が見出された（緑色矢印）。これらはリンパ管を表していると考えられた。
【０２６２】
Ｃ）  血管とリンパ管の示差二重染色
２種類の腺管内癌を、リンパ管を血管から明確に識別するための免疫組織化学的二重染色法の目的で選定した［de Waal et al., Am. J. Pathol., 150: 1951-1957 (1997)を参照されたい］。この方法を用いると、ＶＥＧＦＲ−３陽性血管は青色に染色され、ＰＡＬ−Ｅ陽性血管と基底板は褐色に染色された。いずれの試験試料も、同様な染色パターンを示し、腫瘍が満ちた管をライニングしている脈管は大部分はＰＡＬＥ陽性であったが（図５Ｇおよび５Ｈにおける鏃）、管間ストロマ中で短い距離離れているリンパ管と思われるＶＥＧＦＲ−３陽性脈管はＰＡＬＥ陰性であった（図５Ｇおよび５Ｈにおける黒矢印）。起こり得る二重染色人工産物による誤解を排除するため、隣接の５μm切片を抗ＶＥＧＦＲ−３のみで染色した。この染色により、ＰＡＬ−Ｅ陽性血管の幾つかはＶＥＧＦＲ−３に対しても陽性であることが確かめられた。
【０２６３】
Ｄ）  腺管内癌細胞中のＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２、および隣接脈管におけるその受容体
ヒトＶＥＧＦ−Ｃに対するポリクローナルアフィニティー精製した抗体を用いて、８種類の腺管内癌試料を染色した。総ての試験試料は少なくとも幾らかのＶＥＧＦ−Ｃを含んでいたが、染色の強度と発現パターンにはかなりの不均一性が見られた。幾つかの場合には、癌細胞のほとんどはＶＥＧＦ−Ｃに陽性であったが、他の場合には、幾つかの癌細胞が染色シグナルを生じるに過ぎなかった。対照的に、弱いシグナルが罹患していない正常な管上皮でも得られたが、患部管の周りの正常な組織では染色はほとんどまたは全く見られなかった。抗原遮断実験では、ＶＥＧＦ−Ｃに対する染色が特異的であることを示していた。他のＶＥＧＦ−Ｃ受容体、ＶＥＧＦＲ−２、並びに他のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１）は、いずれも腺管内癌細胞に隣接する同じ「ネックレス」管で発現した。
【０２６４】
Ｅ）  侵襲性乳癌におけるＶＥＧＦＲ−３陽性血管およびＶＥＧＦ−Ｃ
強く染色したＶＥＧＦＲ−３陽性血管は、検討を行った総ての侵襲性腺管癌と小葉癌にも見られた。ＶＥＧＦＲ−３陽性血管は特異的分布パターンを全く形成するとは思われず、これらの血管のほとんどはＰＡＬ−Ｅ抗原に対しても免疫反応性であった。腫瘍内ＶＥＧＦＲ−３陽性血管密度（メジアン２１、範囲９〜５６血管／ｈｐｆ、ｎ＝１２）は、侵襲性乳癌では正常な乳房組織と比較して有意に増加した（メジアン２１対９；Ｐ＜０．０００１、マン−ホイットニー検定）。時折、癌細胞のＶＥＧＦＲ−３陽性リンパ管への侵襲を観察することができた。
【０２６５】
ＶＥＧＦ−Ｃに対する免疫染色は、検討を行った侵襲性癌で大きく変動した（ｎ＝１２）。幾つかの癌細胞はＶＥＧＦ−Ｃについては強い陽性を示したが、他のものでは着色は極めて弱いかまたは場合によっては、全く染色が見られなかった。腺管内癌の場合と同様に、これらの切片の結合組織にはほとんどまたは全く染色が見られなかった。
【０２６６】
上記データーは、ほとんどの成人組織では主にリンパ管内皮マーカーであると思われていたＶＥＧＦＲ−３が正常な乳房組織の毛細血管内皮でも極めて弱く発現することを示している。更に具体的には、腺管内癌では、強く染色したＶＥＧＦＲ−３ 陽性血管の「ネックレス」パターンが腫瘍が満ちた管をライニングしていることが認められた。これらの血管のほとんどは血管内皮マーカーＰＡＬ−Ｅと基底板成分であるラミニンおよびコラーゲンXVIIIを発現したが、ＳＭＡに対する抗体を用いる染色によって示されるように、腫瘍細胞から更に離れた位置の血管より血管周囲細胞／平滑筋細胞が明らかに少なかった。これらの特徴は、「ネックレス」血管が血管新生を受けていたことを示唆している。罹患した管から離れた距離にある第二の群の血管はＶＥＧＦＲ−３について陽性であったが、基底板成分については極めて弱い陽性であり、ＰＡＬ−Ｅについては陰性であり、これらがリンパ管であることを示唆していた。これらの管は、ＳＭＡ陽性の血管周囲細胞成分も欠いていた。また、侵襲性乳癌では、見られた血管パターンは腫瘍細胞の周囲の結合組織ストロマでは一層ランダムに構成されていたが、ＶＥＧＦＲ−３はＰＡＬ−Ｅ陽性の血管でアップレギュレーションした。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−３発現が、腫瘍増殖に関連した血管新生の際に乳癌でアップレギュレーションすることを示している。イン・シテューでの癌で見出されたＶＥＧＦＲ−３陽性の血管の数が非常に増加していることは、癌細胞が様々な因子を産生し、これが癌細胞直近の血管の増殖を活性化するという仮説と矛盾しない。
【０２６７】
ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ−２と高親和性で結合し、腺管内癌および侵襲性癌細胞はＶＥＧＦ−Ｃタンパク質について陽性に染色することが多かったので、この増殖因子は癌のＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２陽性血管についての増殖因子候補である。これらのデーターは、３５種類の未選定の悪性侵襲性腫瘍（乳癌、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫など）のほぼ半数がノーザンブロット分析においてＶＥＧＦ−ＣｍＲＮＡを含むというもう一つの研究と一致している［Salven et al., Am. J Pathol., 153(l): 103-108 (July, 1998)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される］。まとめれば、本明細書に記載のデーターは、乳癌あるいは他の非リンパ性癌のＶＥＧＦＲ−３および／または ＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−Ｃを介した刺激を遮断する薬剤による治療について示唆している。考えられる遮断薬としては、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−１に結合する二重特異性抗体、循環型ＶＥＧＦ−Ｃに結合するＶＥＧＦＲ−３可溶性細胞外ドメイン断片、ＶＥＧＦＲ−３および／またはＶＥＧＦＲ−２に結合し且つこれらの受容体の活性化を阻害するＶＥＧＦ−Ｃ断片および類似体、ＶＥＧＦＲ−３および／またはＶＥＧＦＲ−２に結合し且つ適当な治療薬に接合するＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、断片および類似体、ＶＥＧＦＲ−３チロシンキナーゼインヒビター、これらの受容体に結合して阻害する小分子が挙げられる。更に、ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２のいずれとも結合するので、抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体および抑制性ＶＥＧＦ−Ｄ断片および類似体は適当な遮断薬である。ヒトまたはヒト化抗体およびそれらの断片が、抗体薬剤がヒト治療の目的で選択される限りにおいて、好ましい。更に、本発明の追加側面として、上記薬剤のいずれかを用いて、例えば、悪性腫瘍および悪性腫瘍の広がりの診断およびスクリーニングの目的で、イン・ビトロまたはイン・ビボで哺乳類組織を評価することが考えられる。
【０２６８】
上記薬剤のいずれについても、薬剤は、放射性同位元素（例えば、１４Ｃ、１３３Ｉおよび１２５Ｉ）、発色団（例えば、フルオレセイン、フィコビリタンパク質、テトラエチルローダミン、蛍光によって検出するための蛍光性または着色生成物を生成する酵素、吸光度、可視カラー、または凝集であって、電子顕微鏡法によって検出するための電子稠密生成物を生成するもの、またはフェリチン、ペルオキシダーゼまたは金ビーズのような電子稠密分子など、これらに限定されない検出可能なラベルを付けることにより診断およびスクリーニングの目的で更に改良することができることが考えられる。同様に、これらの薬剤は、抗腫瘍特性を有する分子、例えば、植物、動物、微生物または真菌起源の毒素；放射性同位元素；薬物；酵素；および／またはサイトカインおよび他の治療タンパク質を付着（例えば、接合）またはこれと同時投与することによる治療目的のために更に改良することができる（例えば、Pietersz & McKenzie, 「癌治療のための抗体接合体(Antibody Conjugates for the treatment of Cancer)」, Immunological Reviews, 129:57-80 (1992)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。
【０２６９】
例２９
治療薬としてヒトに投与するための抗Ｆｌｔ４抗体
Ａ）  抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体のヒト化
本明細書、例えば、例２８に記載のＦｌｔ４の生物学は、Ｆｌｔ４受容体のリガンドが介在したシグナル形成を遮断するＦｌｔ４インヒビター（拮抗薬）用の治療上の使用を示している。Ｆｌｔ４中和抗体は、Ｆｌｔ４アンタゴニストとして有用な一種の治療薬を含んでなる。従って、モノクローナル抗体を「ヒト化」してその血清半減期を改良し、ヒト宿主での免疫原性を少なくする（すなわち、ヒト抗体の非ヒト抗Ｆｌｔ４抗体に対する応答を防止する）ことによって、ヒトでの抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体の治療薬としての有用性を改良するためのプロトコールが続くことになる。
ヒト化の原理は文献に記載されており、抗体タンパク質のモジュール配置によって助長される。結合補体の可能性を最小限にするには、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。
【０２７０】
例えば、ヒト化のレベルは、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体のような目的とする非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインをヒト抗体分子の定常ドメインと共に含んでなるキメラ抗体を生成させることによって達成される（例えば、Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1989)を参照されたい）。Ｆｌｔ４中和抗Ｆｌｔ４抗体の可変ドメインは、Ｂ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡからまたは目的とするハイブリドーマから単離したｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡからクローニングされる。Ｖ領域遺伝子断片をヒト抗体定常ドメインをコードするエキソンに連結し、生成する構造体を適当な哺乳類宿主細胞（例えば、骨髄腫またはＣＨＯ細胞）で発現させる。
【０２７１】
更に高レベルのヒト化を達成するには、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の抗原結合補体性決定領域（「ＣＤＲ」）をコードする可変領域遺伝子断片の部分のみをヒト抗体配列にクローニングする［例えば、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36 (1988);およびTempest et al., Bio/Technology, 9:266-71 (1991)を参照されたい］。必要ならば、ＣＤＲ３領域の周囲のヒト抗体のβ−シート骨格も変更して、最初のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造を一層緊密に反映するようにする（Kettleborough et al., Protein Engin., 4:773-783 (1991);およびFoote et al., J. Mol. Biol., 224:487-499 (1992)を参照されたい）。
【０２７２】
代替法では、目的とする非ヒトモノクローナル抗体の表面を、非ヒト抗体の選択した表面残基を変更することによって、例えば、部位指定突然変異誘発によって、内部の総てを保持して非ヒト抗体の残基を接触させることによって、ヒト化する。Padlan, Molecular Immunol., 28(415):489-98 (1991)を参照されたい。
【０２７３】
Ｆｌｔ４中和抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体およびそれらを産生するハイブリドーマ、例えば９Ｄ９Ｆ９を用いる上記の方法を用いて、Ｆｌｔ４発現が有害な状態を治療しまたは緩解する治療薬として有用なヒト化Ｆｌｔ４中和抗体を生成させる。
【０２７４】
Ｂ）  ファージディスプレーからのヒトＦｌｔ４中和抗体
ヒトＦｌｔ４中和抗体は、Aujame et al., Human Antibodies, 8(4):155-168 (1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15:62-70 (1997);およびRader et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:503-508 (1997)に記載されているようなファージディスプレー技術によって生成し、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。例えば、Ｆａｂ断片の形態の抗体可変領域または結合した一本鎖Ｆｖ断片を、糸状ファージ微量コートタンパク質pIIIのアミノ末端に融合させる。融合タンパク質の発現および成熟ファージコートへのその組込みにより、表面に抗体を示し且つ抗体をコードする遺伝子材料を含むファージ粒子を生じる。上記構造体を含んでなるファージライブラリーを最近で発現させ、標識したまたは固定したＦｌｔ４を抗原−プローブとして用いてライブラリーをＦｌｔ４に特異的なファージ−抗体について選別（スクリーニング）する。
【０２７５】
Ｃ）  トランスジェニックマウスからのヒトＦｌｔ４中和抗体
ヒトＦｌｔ４中和抗体を、本質的にBruggemann and Neuberger, Immunol. Today, 1 7(8):391-97 (1996)、およびBruggemann and Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 8:455-58 (1997)に記載の方法でトランスジェニックマウスで生成させる。生殖細胞配置にヒトＶ−遺伝子セグメントを有し且つそのリンパ球様組織でトランスジーンを発現するトランスジェニックマウスを、通常の免疫化プロトコールを用いてＦｌｔ４組成物で免役する。通常のプロトコールを用いて免役したマウスからのＢ細胞を用いてハイブリドーマを生成し、スクリーニングを行って、抗Ｆｌｔ４ヒト抗体（例えば、上記のような）を分泌するハイブリドーマを同定する。
【０２７６】
Ｄ）  二重特異性抗体
Ｆｌｔ４に特異的に結合し且つ病理学および／または治療に関連した他の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を、文献に記載されている標準的手続きを用いて生成し、単離し、試験する。例えば、Pluckthun & Pack, Immunolechnology, 3:83-105 (1997); Carter et al., J. Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); Renner & Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, No. 145, pp. 179-209; Pfreundschuhの米国特許第５,６４３,７５９号明細書; Segal et al., J. Hematotherapy, 4: 377-382 (1995); Segal et al. Imniunobiology, 185: 390-402 (1992);およびBolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother., 34: 1-8 (1991)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０２７７】
例３０
癌の治療を目的とする抗Ｆｌｔ４療法の効力を示すための動物モデル
癌治療について任意の容認された動物が、癌治療についての抗Ｆｌｔ４療法の効力を明らかにする上で有用であると考えられる。標準的な用量−応答の研究結果を用いる乳癌治療の効力を明らかにするための典型的なモデルとしては、Tekmal and Durgam, Cancer Lett., 118(l): 21-28 (1997); Moshakis et al., Br. J. Cancer, 43: 575-580 (1981);およびWilliams et al., J. Nat. Cancer Inst., 66: 147-155 (1981)に記載のモデルが挙げられる。ネズミモデルの他に、イヌおよびブタモデルが考えられるが、これは少なくともある種の抗ヒトＦｌｔ４抗体（例えば、９Ｄ９抗体）がイヌおよびブタ由来のＦｌｔ４も認識するからである。腫瘍の大きさと副作用を、コントロールと比較した治療効力を説明する目的で観察する。
【０２７８】
例３１
可溶性ＦＬＴ４はＶＥＧＦ−Ｃが介在する腫瘍増殖と転移を阻害する
腫瘍形成におけるＶＥＧＦ−Ｃのイン・ビボでの役割を更に説明するために、組換えＶＥＧＦ−Ｃを過剰発現するＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞をＳＣＩＤマウスに正常位移植した。ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現は腫瘍増殖を増加したが、ＶＥＧＦ−Ａ過剰発現とは異なり、腫瘍血管新生にはほとんど影響を与えなかった。一方、ＶＥＧＦ−Ｃは腫瘍関連リンパ管の増殖を著しく促進し、腫瘍周縁部では一般に腫瘍細胞が浸潤した。ＶＥＧＦ−Ｃのこれらの効果は、可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質によって阻害された。これらのデーターは、ＶＥＧＦ−Ｃがリンパ管を介して腫瘍増殖および／または転移をアップレギュレーションすることができ、しかもこれらの効果をＶＥＧＦ−Ｃとその（複数の）受容体の間の相互作用を遮断することによって阻害することができることを示している。特に、可溶性ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ４は、この相互作用を遮断するのに用いることができる。
【０２７９】
材料および方法
Ａ）  プラスミド発現ベクターの調製
ヒトＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ１６５をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＢＳ７プラスミドに導入した(Peterson and Legerski, Gene, 107: 279-84, 1991)。 同じベクターを用いて、可溶性受容体キメラＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇであって、ヒト免疫グロブリンγ鎖のＦｃドメインに融合したＶＥＧＦＲ−３の最初の３個の免疫グロブリン相同性ドメインを含むものおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇであって、同様な構造体のＶＥＧＦＲ−１の最初の５個のＩｇ相同性ドメインを含むものを発現した(Achen, et al., Proc Nad Acad Sci USA, 95: 548-53, 1998)。
【０２８０】
Ｂ）  トランスフェクション細胞の産生と分析
ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞系のＭＣＦ−７S１サブクローンにエレクトロポレーションによってプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、安定な細胞プールを選択して、以前に報告されている方法で培養した(Egeblad and Jaattela, Int J Cancer, 86: 617-25, 2000)。細胞を、１００μCi/ml［３５Ｓ］−メチオニンおよび［３５Ｓ］−システイン(Redivue Pro-Mix, Amersharn Pharmacia Biotech)を補足したメチオニンとシステインを含まないＭＥＭ(Gibco)で代謝標識した。標識した増殖因子を、ＶＥＧＦ−Ｃ(Joukov, et al., EMBO J, 16: 3898-911, 1997)またはＶＥＧＦ(MAB293, R & D Systems)に対する抗体を用いてコンディショニング培地から免疫沈澱した。免疫複合体およびＶＥＧＦR−Ｉｇ融合タンパク質をプロテインＡセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて沈澱し、０．５％ＢＳＡ，０．０２％ Tween 20／ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄して、還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析を行った。
【０２８１】
Ｃ）  細胞増殖および腫瘍形成検定法
細胞（２００００／ウェル）を２４ウェルで４種類培養し、１、４、６および８日後に複製プレート上でトリプシン処理し、血球計を用いて計数した。新鮮な培地を、４および６日後に供給した。腫瘍形成検定法のため、サブコンフルエント培養物をトリプシン処理によって回収し、２回洗浄して、ＰＢＳ中１０７個の細胞を、０．７２mgの１７β−エストラジオール(Innovative Research of America)を含む皮下６０日徐放ペレットを有する卵巣摘出ＳＣＩＤマウスの第二の（腋窩）乳腺の脂肪パッドに摂取した。卵巣摘出とペレットの移植は、腫瘍細胞の接種４〜８日前に行った。腫瘍の長さと幅を１週間に２回機械的に測定し、腫瘍が半楕円体であり、深さが幅と同じであると仮定して、腫瘍容積を長さ×幅×深さ×０．５として計算した(Benz et al., Breast Cancer Res Treat, 24: 85-95, 1993)。
【０２８２】
Ｄ）  血管の組織学および定量
腫瘍を摘出して、４％パラホルムアルデヒド（pH７．０）で２４時間固定し、パラフィンに埋設した。切片（7μm）を、公表されたプロトコール(Partanen et al., Cancer, 86: 2406-12, 1999)に準じて、ＰＥＣＡＭ−１(Pharmingen)、ＶＥＧＦＲ−３(Kubo et al., Blood, 96: 546-553, 2000)またはＰＣＮＡ(Zymed Laboratories)に対するモノクローナル抗体、またはＬＹＶＥ−１(Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789-801, 1999)、ＶＥＧＦ−Ｃ(Joukov et al., EMBO J, 16: 3898-911, 1997)またはラミニンに対するポリクローナル抗体で免疫染色した。ＰＥＣＡＭ−１陽性の血管の平均数を、切片中の最高血管密度（管ホットスポット）を３箇所の面積から決定した（６０×倍率）。総ての組織学的分析は、盲検腫瘍試料を用いて行った。
【０２８３】
Ｅ）  可溶性ＶＥＧＦＲ−３のアデノウイルス発現およびエバンスブルードレインニング検定法
ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＡｄＢｇｌIIプラスミドにサブクローニングし、アデノウイルスを以前に報告されている方法で産生した(Laitinen et al., Hum Gene Ther., 9: 1481-6, 1998)。ＶＥＧＦＲ−３−ＩｇまたはＬａｃＺコントロール(Laitinen et al., Hum Gene Ther., 9: 1481-6, 1998)アデノウイルス１０９pfu／マウスを、腫瘍細胞の接種３時間前にＳＣＩＤマウスに静脈内投与した。３週間後、それぞれの群からの４尾のマウスを麻酔して、腹部皮膚を開いて３％エバンスブルー色素(Sigma)／ＰＢＳ数μlを腫瘍に投与した。腫瘍からの色素の排液は、肉眼で行った。
【０２８４】
結果
Ａ）  ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−３−Ｉｇの発現はイン・ビトロでのＭＣＦ−７細胞増殖に影響を与えない
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、上記のように完全長ヒトＶＥＧＦ−Ｃまたは可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質（ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ）をコードする発現プラスミドでトランスフェクションし、安定な細胞プールを選択した。比較のため、ヒトＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦＲ−１ −Ｉｇを同じ細胞で発現させた。免疫沈澱を用いて、タンパク質を効率的に産生して分泌させる目的でこれらの細胞のコンディショニング培地を分析した。ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦまたは代謝標識したＭＣＦ−７細胞由来の可溶性受容体タンパク質の免疫沈澱物を、還元条件下でＰＡＧＥで分析した。
【０２８５】
この検討により、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ、可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質または可溶性ＶＥＧＦＲ−１融合タンパク質の過剰発現はイン・ビトロでのＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖に影響しないことが明らかなった。細胞を２４穴プレートに播種してその増殖血球計を用いて測定したところ、トランスフェクション細胞の増殖速度は影響されないことが明らかになった。
【０２８６】
Ｂ）  ＶＥＧＦ−Ｃは腫瘍血管新生に影響することなく腫瘍増殖を増加させる
ＶＥＧＦ−Ｃのイン・ビボ効果を決定するため、ＭＣＦ−７細胞プールを、徐放エストロゲンペレットを有する卵巣摘出ＳＣＩＤマウスの乳房の脂肪パッドに移植し、ＭＣＦ−７腫瘍の増殖を支持するのに要する一定レベルのホルモンを供給した。
【０２８７】
ＶＥＧＦ−Ｃの過剰発現は、腫瘍増殖を有意に増加した（ＶＥＧＦ−Ｃ：５４５mm3±１１０mm3、コントロール：２６８ｍｍ３±６９ｍｍ３、１３日目、ｎ＝８，ｐ＜０．０００１，ステューデントｔ検定法）。しかしながら、腫瘍増殖に対するＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現の効果はＶＥＧＦ−Ａより遙かに小さかった（ＶＥＧＦ−Ａ：１１３６ｍｍ３±３３９ｍｍ３、コントロール：１８９ｍｍ３±５７ｍｍ３、１５日間、ｎ＝６，ｐ＜０．０００１，ステューデントｔ検定法）。増加した腫瘍増殖を、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦを過剰発現するＭＣＦ−７細胞と可溶性ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦＲ−１融合タンパク質を発現する細胞とをそれぞれ混合することによって中和した。更に、ＶＥＧＦ−Ｃを過剰発現する腫瘍の増殖増加は、静脈内投与した組換えアデノウイルスにより肝臓で発現した循環型可溶性ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによっても阻害された。
【０２８８】
腫瘍血管新生に対するＶＥＧＦ−Ｃの効果を検討するため、腫瘍の切片を主として血管でおよびリンパ管ではごく弱く発現した内皮抗原ＰＥＣＡＭ−１について染色した。腫瘍におけるＰＥＣＡＭ−１陽性の血管を定量したところ、ＶＥＧＦ−Ｃの過剰発現は腫瘍血管の密度にほとんど影響しないことが明らかになった（ＶＥＧＦ−Ｃ腫瘍についての微視的視野，ｎ＝１８，４０．２±１２．２血管、およびコントロール腫瘍，ｎ＝２３，３６．６±１１．６、３回の異なる実験の平均値）。対照的に、ＶＥＧＦ−Ａの過剰発現は、血管密度を約２倍に増加した。
【０２８９】
Ｃ）  ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現は腫瘍細胞のリンパ管形成およびリンパ管内増殖と関連している
腫瘍関連リンパ管に対するＶＥＧＦ−Ｃの効果を、リンパ管特異的マーカーＬＹＶＥ−ｌについて免疫染色によって分析した(Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789-801, 1999.)。このマーカーは、ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍の周縁部では極めてリンパ管過形成性であることが明らかになった。増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）がＬＹＶＥ−１陽性内皮細胞の多くで検出され、これらのリンパ管が活発に増殖していることを示した。これらの管がリンパ管と同一であることは、ＶＥＧＦＲ−３について染色されおよび基底板成分ラミニンについては染色されないことによって確認された。薄いリンパ管は、ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍の幾つかの内部にも見られた。
【０２９０】
腫瘍周縁部のリンパ管は、一般にＶＥＧＦ−Ｃ陽性の腫瘍細胞によって浸潤されていた。著しく対照的に、ＶＥＧＦ過剰発現およびコントロール腫瘍は、リンパ管を全くまたはほとんど持たない。
【０２９１】
Ｄ）  ＶＥＧＦ−Ｃによって誘発されるリンパ管形成は循環型可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質によって阻害される
ヒト乳癌では、センティネル・ノード(centinel node)法を用いて、リンパ排液および転移の広がりを追跡する（総説については、Parker et al., Radiol Clin North Am, 38: 809-23, 2000を参照されたい）。ＭＣＦ−７腫瘍のリンパ排液を追跡するため、エバンスブルー色素をＶＥＧＦＲ−３−ＩｇまたはコントロールアデノウイルスＶＥＧＦ−Ｃに感染したマウスの過剰発現またはコントロール腫瘍に投与した。コントロール実験では、培養ヒト胎児腎臓細胞にＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇアデノウイルスが感染することにより、多量の可溶性ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ融合タンパク質が分泌され、マウスの静脈内感染により血清中のＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ融合タンパク質のレベルが全身的に高くなった。エバンスブルー色素を腫瘍に投与したところ、リンパ管は染色されたが血管は染色されず、ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍の周囲に広がったリンパ管の数がコントロール腫瘍と比較して増加することが明らかになった。広がったリンパ管のほとんどは、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇアデノウイルスを投与したマウスのＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍では見られなかった。
【０２９２】
上記データーは、ＭＣＦ−７乳房腫瘍でのＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現が腫瘍関連リンパ管の増殖を強力且つ特異的に誘導するが、腫瘍血管新生には大きな効果はないことを立証している。更に、ＶＥＧＦ−Ｃにより増加した腫瘍増殖と腫瘍関連リンパ管形成は、可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質、すなわちＶＥＧＦＲを発現する内皮細胞のＶＥＧＦ−Ｃによる刺激を遮断する目的で選択された薬剤によって阻害されることが立証された。
【０２９３】
特異的マーカーを欠いているため、これまでは、腫瘍が積極的にリンパ管形成を誘導することができるか、または既に存在しているリンパ管を過剰増殖によって包含して、腫瘍内部の高間質流体圧力によりそれらを圧縮することができるかを決定することが困難であった。様々な実験モデルからのデーターは、後者が起こることを最近示唆している(Leu et al., Cancer Res, 60: 4324-7, 2000; Stohrer et al., Cancer Res, 60: 4251-5, 2000)。ここで、ＶＥＧＦ−Ｃの過剰発現により、実験的腫瘍に関連したリンパ管の増殖を誘導することができることが示されている。ＶＥＧＦ−Ｃによって誘導された腫瘍周縁部のリンパ管は極めて過形成性であり、ほとんどが腫瘍細胞で満たされており、一方、腫瘍内部のリンパ管は平板化して内腔が見られなかった。正常な成人組織のリンパ管内皮細胞とは異なり、ＭＣＦ−７腫瘍に関連したリンパ管内皮細胞は活発に増殖していた。従って、腫瘍周縁および内部のリンパ管は、以前から存在するリンパ管の内皮細胞の増殖によって生成したと思われる。
【０２９４】
リンパ管を介する癌の局所リンパ節への展開は、長い間臨床的使用における重要な予知指示薬であった。この例で示されるように、ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍に関連した拡大したリンパ管内部での腫瘍細胞の増殖は、腫瘍周縁のリンパ管侵襲に極めて類似しており、ヒト乳癌でのリンパ節への転移による展開と生存率の低さと相関している(Lauria et al., Cancer, 76: 1772-8, 1995)。従って、本明細書に記載のデーターは、ＶＥＧＦ−Ｃの発現がリンパ系を介する腫瘍転移を促進することの証拠を提供している。従って、例２８および他のデーターは、ＶＥＧＦＲ−３が多くの種類の固形腫瘍の血管でアップレギュレーションされるのに対して(Valtola et al., Am J Pathol, 154: 13 81-90, 1999; Partanen et al., Cancer, 86: 2406-12, 1999; Kubo et al., Blood, 96: 546-553, 2000)、この例では、ＶＥＧＦ−Ｃの過剰発現の効果が主としてリンパ管形成性である腫瘍モデルを示している。
【０２９５】
ＶＥＧＦ−Ｃの腫瘍増殖に対する効果は、ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍の増殖を阻害するＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質の能力によって示されるように、単に細胞プール間の変動によるものではなかった。エバンスブルー色素を腫瘍に投与することによって、多数の大きな排液リンパ管(large draining lymphatic vessels)がＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍と関連していることが明らかになった。更に多数の機能的リンパ管があれば、リンパ管排液が一層良好になり、従って間質圧力が低下してＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現腫瘍の血液灌流を増加させることができる。特定の腫瘍についてのＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ−ＶＥＧＦＲ−３が介在した腫瘍進行が血管新生リンパ管形成(angiogenesis lymphangiogenesis)または両方を介して進行するかどうかとは関係なく、本発明の治療方法はこれらの工程を阻害するものである。
【０２９６】
結論として、上記の結果は、腫瘍細胞によって産生されたＶＥＧＦ−Ｃは、腫瘍周囲のリンパ管の増殖を誘発し、癌のリンパ管内への展開を促進することができることを示している。これらのデーターは、例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−３タンパク質を用いる遺伝子治療による腫瘍関連リンパ管形成の阻害が、腫瘍転移を阻害する重要な方法であることを示唆している。
【０２９７】
例３２
可溶性ＶＥＧＦＲ−３／ＦＬＴ４を発現するマウスでのリンパ管形成の阻害
前例は、ＶＥＧＦ−Ｃがイン・ビボでの腫瘍増殖を増加させ、この腫瘍の腫瘍増殖の促進がリンパ管と関連していることを明らかにした。ＶＥＧＦ−Ｃのこれらの効果は、可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質によって阻害された。本例では、可溶性ＶＥＧＦＲ−３がＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−Ｄシグナル形成のインヒビターであり、トランスジェニックマウスの皮膚で発現すると、これがリンパ管形成を阻害して既に形成されているリンパ管の退行を誘発するが、血管系は損なわれないままであることのもう一つの証拠を提供する。
【０２９８】
更に具体的には、本例では、免疫グロブリン（Ｉｇ）γ鎖（ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ）のＦｃドメインに接合したＶＥＧＦＲ−３の細胞外部分のリガンド結合部分からなるキメラタンパク質がＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄの活性を中和し、ケラチン−１４（Ｋ１４）プロモーター下でマウス表皮に発現するとき皮膚リンパ管系の形成を阻害することを示す。血管網状組織はこれらのマウスでは正常なままであったので、阻害はリンパ管に特異的であると思われる。胚発生中のＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによって誘発されたリンパ管の退行は、この受容体による連続的シグナル形成がリンパ管系の維持に本質的であることを示している。
【０２９９】
材料および方法
Ａ）  ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質の産生
上記の例３１およびJoukov et al., (EMBO J. 16:3898 -3911, 1997)に記載のヒトＶＥＧＦ−Ｃの成熟形態。ＶＥＧＦ−Ｄは、R&D Systems (Minneapolis, Minnesota)から得た。ヒトＩｇＧ1Ｆｃドメインに融合したヒトＶＥＧＦＲのリガンド結合ドメインからなるＶＥＧＦＲ−１−ＩｇおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇタンパク質は、Drosophila S2細胞(Invitrogen, Carlsbad, Califorriia)で産生した。
【０３００】
Ｂ）  ＶＥＧＦＲ−３バイオアッセイ
ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲキメラを発現するＢａ／Ｆ３細胞(Achen, Eur. J Biochem. 267, 2505-2515, 2000)を９６穴マイクロタイタープレートに１５,０００細胞／ウェルでＶＥＧＦ−Ｃを１００ng/mlおよび指定濃度のＶＥＧＦＲ−１９タンパク質を補足して３個ずつ播種した。４８時間後に、細胞の生存度を、ＭＴＴ（３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(Sigma)、０．５mg/ml）を加えた後、更に２時間培養し、等量の細胞リーシス溶液（１０％ＳＤＳ，１０mM ＨＣｌ）を加え、３７℃で一晩インキュベーションすることによって測定した。吸光度は、５４０nmで測定した。
【０３０１】
Ｃ）  トランスジェニックマウスの生成
ヒトＶＥＧＦＲ−３Ｉｇ−相同性ドメイン１−３をコードする配列を、ＰＣＲを用いて増幅した。この目的に用いたプライマーは、下記の通りであった：
5'-TACAAAGCTTTTCGCCACCATGCAG-3' （配列番号２３）、および
5'-TACAGGATCCTCATGCACAATGACCTC-3' （配列番号２４）。
【０３０２】
ＰＣＲ産物を、ヒトＩｇＧ1Ｆｃ尾を有するインフレームのplg-plusベクター(Ingenius, R&D Systems)にクローニングした。ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ構造体を、次にヒトケラチン−１４プロモーター発現ベクターに導入した。発現カセット断片を、ＦＶＢ／ＮＩＨとＤＢＡｘＢａ１ｂＣのハイブリッド株の受精マウスの卵母細胞に投与して、７系列のＫ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスを作製した。トランスジーン発現を分析して、表現型を下記のようにトランスジーンを発現する３つの始祖系総てから確かめた。
【０３０３】
Ｄ）  トランスジーン発現の分析
ノーザンブロット分析のため、皮膚から抽出した総ＲＮＡ１０μｇを１％アガロースに加えたものに電気泳動を行い、ナイロンフィルター(Nytran)に移し、相当する［３２Ｐ］を標識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィー露出した。ウェスタンブロット分析のため、皮膚生験試料を、１mM ＰＭＳＦ、１mM/mlアプロチニン、１mM Ｎａ３ＶＯ４および１０μg/mlロイペプチンを補足したリーシス緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ，pH７．６，１mMＥＤＴＡ，５０mM ＮａＣｌ，５０mM ＮａＦ，１％ Triton-X100）中でホモジナイズした。Ｉｇ−融合タンパク質を総タンパク質１mgから沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、ヒトＩｇＧ(DAKO, Carpinteria, California)に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ウサギ抗体と増感した化学発光検出装置を用いて検出した。
【０３０４】
Ｅ）  免疫組織化学およびＴＵＮＥＬ染色
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した組織からのパラフィン切片（５μｍ）を、マウスＶＥＧＦＲ−３(Kubo et al., Blood 96:546-553, 2000)またはＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１(PharMingen, San Diego, California)に対するラットモノクローナル抗体、マウスＬＹＶＥ−１(Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789-801, 1999)に対するウサギポリクローナル抗体、またはヒトＩｇＧＦｃドメイン(Zymed, San Diego. California)に対するビオチン化マウスモノクローナル抗体を用いて染色した。ＴＵＮＥＬ染色のために、ＤＮＡ断片化の検出をイン・シテューでのCell Death Detection キット(fluorescein; Roche, Indianapolis, IN)を用いて行った。
【０３０５】
Ｆ）  血管とリンパ管の可視化
血管の可視化（Thurston et al. Science 286, 2511-2514 (1999)）のために、１mg/mlビオチン化Lycopersicon esculentumレクチン(Sigma)１００μｇを大腿静脈から投与（IＶ）し、２分間循環させた。１％ＰＦＡ／０．５％グルタルアルデヒドをＰＢＳに加えたものを灌流することによって固定した後、結合したレクチンをＡＢＣ−３,３’−ジアミノベンジジンペルオキシダーゼ反応によって可視化した。ＶＥＧＦＲ−３ ＋／ＬａｃＺマウスでは、リンパ管を次にβ−ガラクトシダーゼ基質Ｘ−Ｇａｌ(Sigma, St. Louis, MO)で染色した。機能的リンパ管の可視化のために、エバンスブルー色素(５mg/ml; Sigma, St. Louis, MO)を後肢の掌に投与するかまたはＴＲＩＴＣ−デキストラン（Sigma, ８mg/ml）を耳または尾に投与して、リンパ管をそれぞれ光学または蛍光顕微鏡法によって分析した。
【０３０６】
Ｇ）  血清中のＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇタンパク質の検出
ＥＬＩＳＡプレート(Nunc Maxisorp, Copenhagen, Denmark)に、ヒトＩｇＧ（Zymed, ２μg/ml、ＰＢＳ中）またはヒトＶＥＧＦＲ−３（クローン７Ｂ８，４μg/ml）に対するマウス抗体をコーティングした。マウス血清をインキュベーション緩衝液（５mg/ml ＢＳＡ，０．０５％ Tween 20、ＰＢＳ中）で希釈して、室温で２時間結合させた。次に、プレートをインキュベーション緩衝液で３回洗浄した後、マウス抗ヒトＩｇＧ1（Zymed，１：５００）を１時間付加した。次いで、アルカリホスファターゼと接合したストレプトアビジン（Zymed，１：５０００）をウェル中で３０分間インキュベーションした後、基質（１mg/ml ｐ−ニトロフェニルホスフェート／０．１M ジエタノールアミン，pH１０．３）を加え、吸光度を４０５nmで測定した。
【０３０７】
Ｈ）  磁気共鳴画像化
ＭＲＩデーターは、９．４Ｔ垂直磁石(Oxford Instruments, Oxford, UK)に連結したs.m.i.s.コンソール(Surrey Medical Imaging Systems, Guildford, UK)を用いて得た。シングルループ表面コイル（直径３５mm）を、シグナル伝達および検出に用いた。Ｔ２重み付け（ＴＲ ２０００ms, ＴＥ ４０ms, ４走査回数／線）多重スライススピン−エコー配列をＦＯＶ ２５．６ｍｍ２（マトリックスサイズ： ２５６ｘ１２８）および横方向のスライス厚み１．３mmで、Ｔ２重み付け（ＴＲ ２０００ms, ＴＥ ４０ms, ４走査回数／線）多重スライススピン−エコー配列を用いた。中心が１．２ppmの飽和パルスを用いて、Ｔ２画像の脂肪シグナルを減少させた。拡散重み付けＭＲＩを、スピン−エコー配列（ＴＲ ２０００ms，ＴＥ ４０ms）でのスライス軸に沿って単極拡散グラディエント（ｂ値＝約８００s/ｍｍ２)を用いて得て、水の見かけの拡散係数（ＡＤＣ）を、ｂ値の関数としてのＭＲＩデーターを単一指数(single exponential)に納めることによって計算した。
【０３０８】
結果
Ａ）  可溶性ＶＥＧＦＲ−３はイン・ビトロでのＶＥＧＦ−Ｃによるシグナル形成を阻害する
ＶＥＧＦＲ−３によるＶＥＧＦ−Ｃシグナル形成を阻害するため、ＶＥＧＦＲ−３の最初の３個のＩｇ−相同性ドメインとＩｇＧＦｃドメインからなる融合タンパク質を用いた。ＶＥＧＦＲ−３−ＩｇはＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄを完全長細胞外ドメインと同じ効率で結合し、ＶＥＧＦ−Ｃによって誘発されるＶＥＧＦＲ−３リン酸化とそれに続くｐ４２／ｐ４４マイトジェンで活性化したタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のＶＥＧＦＲ−３発現内皮細胞での活性化を阻害した。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｃに結合しない同様なＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇ融合タンパク質は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫの活性化に影響しなかった。
【０３０９】
ＶＥＧＦ−Ｃシグナル形成に対する可溶性ＶＥＧＦＲ−３の効果を、ＩＬ−３の非存在下でＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞にＶＥＧＦ−Ｃ依存性生存および増殖シグナルを伝達することができるキメラＶＥＧＦＲ−３／エリトロポエチン（Ｅｐｏ）受容体を用いてバイオアッセイでも測定した(Achen et al., Eur. J. Biochem., 267:2505-2515, 2000)。この細胞検定法では、ＶＥＧＦ−Ｃ依存性細胞の生存は０．５：１のモル比（ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ：ＶＥＧＦ−Ｃ）で完全に阻害されたが、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇでは効果が見られなかった。 同様に、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇも、ＶＥＧＦ−Ｄによって誘発されるＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ細胞の生存をなくした。対照的に、１０倍モル過剰量のＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇであっても、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−２の親和性が低いためＶＥＧＦ−Ｃ依存性生育力は部分的にしか破壊されなかった。
【０３１０】
Ｂ）  可溶性ＶＥＧＦＲ−３はイン・ビボでのリンパ管の形成を阻害する
ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇのイン・ビボでの阻害効果を測定するため、融合タンパク質を、トランスジーン発現を皮膚の基底表皮細胞に指定するＫ１４プロモーターの制御下で発現させた。ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ発現は、皮膚ＲＮＡのノーザンブロット分析および皮膚からのタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析によってマウスで検出された。これらのマウスは健常で繁殖力があると思われ、通常の寿命を持っていた。皮膚を組織学的に検討したところ、真皮および皮下層の肥厚が明らかになった。抗体染色により、基底ケラチノサイトでのＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ発現が確かめられた。皮膚切片をリンパ管内皮のマーカー、ＶＥＧＦＲ−３(Jussila el al., Cancer Res. 58:1599-1604, 1998; Kubo et al., Blood, 96 546-553, 2000)およびＬＹＶＥ−１(Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789-801, 1999)について染色したところ、コントロールマウスのリンパ管は染色されたが、トランスジェニックマウスではリンパ管は認められなかった。対照的に、血管は、トランスジェニックおよび野生型皮膚のいずれにおいても全内皮マーカーＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１について染色された。
【０３１１】
Ｃ）  可溶性ＶＥＧＦＲ−３はリンパ管形成を抑制するが血管新生を抑制しない
リンパ管を一層良好に可視化するため、Ｋ１４−ＶＥＧＦＲ−３−ＩｇマウスをＦｌｔ４座でβ−ｇａｌを発現するヘテロ接合体ＶＥＧＦＲ−３＋／ＬａｃＺマウスと交雑させた(Dumont et al., Science 282, 946-949, 1998)。耳の皮膚のホールマウント組織調製物を基質Ｘ−ｇａｌを用いて染色したところ、リンパ管は検出されなかったが、コントロールマウスでは青色に染色するリンパ管が可視化された。ビオチン標識レクチンを用いる血管灌流染色では(Thurston et al., Science 286, 2511-2514, 1999)、血管はＫ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスでは正常であると思われた。
【０３１２】
リンパ管の非存在は、皮膚に投与されたエバンスブルー色素またはＴＲＩＴＣ−デキストランの運命を観察する機能的検定法を用いて確認した。色素は、野生型マウスの後肢掌に投与された後、座骨静脈の周囲のリンパ管に速やかに集まったが、トランスジェニックマウスでの管には色素が見られず、集合リンパ管は存在しないかまたは未発達であった。コントロールマウスのリンパ管も、耳または尾に皮内投与したＴＲＩＴＣ−デキストランについての蛍光顕微鏡法を用いて可視かしたが、トランスジェニックマウスではこのような管は見られなかった。
【０３１３】
Ｄ）  循環可溶性ＶＥＧＦＲ−３は内部臓器におけるリンパ管組織の一時的喪失と関連している
２週齢までは、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ／ＶＥＧＦＲ−３＋／ＬａｃＺマウスでは、横隔膜、心臓、肺、盲腸、膵臓、腸間膜および食道のような臓器では、コントロールＶＥＧＦＲ−３＋／ＬａｃＺ同腹子マウスと比較して、リンパ管はあったとしても少数で薄く未発達のものでしかなかった。Ｘ−ｇａｌ染色によって得られたこのような知見は、ＶＥＧＦＲ−３およびＬＹＶＥ−１についての免疫染色によって確かめられた。更に、心臓心膜にリンパ管がないことは、少なくとも幾つかの種類のマウスでの心臓周囲流体の蓄積と関連していた。３週齢時には、リンパ管の再増殖は明らかであった。成熟したトランスジェニックマウスでは、心臓と横隔膜のような幾つかの臓器だけに異常パターン化し且つ不完全発現したリンパ管が見られた。
【０３１４】
内部臓器で見られた効果は、可溶性ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇタンパク質が血流中を循環していることを示している。実際に、融合タンパク質が、トランスジェニックマウスの血清で特異的固相酵素免疫検定法を用いて検出され、そのレベルは１００〜２００ng/mlの範囲であり、若いマウスで最高になった。本発明者らのイン・ビトロ実験に基づけば、上記濃度は約２０〜４０ng/mlのＶＥＧＦ−Ｃを中和するものであった。ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇタンパク質は、静脈内投与した組換えＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇは少なくとも９時間は血清中にあったので、血流中で比較的安定であった。
【０３１５】
Ｅ）  トランスジェニック表現型はヒトリンパ水腫の特徴を有する
Ｋ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスは、その足の腫脹によって野生型同腹子と区別され、この腫脹は誕生時に既に見られていた。老齢マウスでは、皮膚の肥厚、皮膚繊維症および皮下脂肪の沈着増加が見られた。磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）では、トランスジェニックマウスの足皮膚と皮下組織において流体蓄積増加を示すＴ２−高緊張領域が明らかにされているが、同様の領域は同腹子コントロールでは見られなかった。これらの高緊張部分についての見かけの拡散係数（ＡＤＣ）は１．９９［０．６０］×１０−３mm２/sであり、ＡＤＣが１．３２［０．２１］×１０−３mm２/sである正常組織についてより高く、脂肪についての値より大きさが約１〜２の次数大きかった(Thurston, et al. Science 286, 2511-2514 (1999)。更に、リンパ節の大きさと外観は、特に下大静脈の周囲の大きな大動脈傍リンパ節で変動した。しかしながら、腸間膜リンパ節とパイエル斑がＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスで見られた。
【０３１６】
Ｆ）  内皮細胞アポトーシスによる発現リンパ管の退行
胚生成中に、Ｋ１４によって引き起こされるトランスジーン発現の著しい増加がＥ１４．５で起こり、Ｅ１６．５までに発現全胚皮膚を包含する(Byrne, et al., Development 120, 2369-2383, 1994)。ＶＥＧＦＲ−３＋／ＬａｃＺバックグラウンドでＸ−Ｇａｌ染色によって分析したところ、皮膚のリンパ管網状組織は、Ｅ１５のトランスジェニックおよび野生型胚の間では識別できなかった。Ｅ１５．５〜１６．５では、トランスジェニック胚のリンパ管は幾つかの部分で退行した。Ｅ１７．５では、リンパ管は未だ連続的網状組織を形成したが、コントロール胚より薄かった。Ｅ１８．５では、全皮膚リンパ管網状組織はトランスジェニック胚では破壊され、出生後は、皮膚にはリンパ管が全くないかまたは数個の単なる破壊されたリンパ管のみが見られ、主として大きな皮膚血管を伴っていた。従って、リンパ管は最初は胚発生中に皮膚に形成するが、トランスジーンの発現が現れると退行する。しかしながら、皮膚血管系の形成は、Ｔｉｅ−プロモーター−ＬａｃＺバックグラウンドにおけるＸ−Ｇａｌ染色によって示されるように、Ｋｌ４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ胚では阻害されなかった(Korhonen et al. Blood 86, 18228-1835 (1995)。
【０３１７】
ＴＵＮＥＬ染色を用いて、内皮細胞のアポトーシスを検出し、これはＰＥＣＡＭ−１について同時染色することによって同定された。アポトーシス内皮細胞は、トランスジェニック胚の真皮で最初にＥ１７．５およびＥ１８．５に見られた。内皮細胞アポトーシスは、野生型胚では見られなかった。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、ほとんどトランスジェニック皮膚のＶＥＧＦＲ−３陽性の内皮だけで検出され、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ性アポトーシスはリンパ管内皮にターゲッティングされていることを示していた。
【０３１８】
本例は、可溶性ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質がリンパ管形成を阻害し、存在する胚リンパ管をイン・ビボで退行させることを示している。従って、連続的ＶＥＧＦＲ−３シグナル形成が胚発生およびリンパ管系の維持に本質的である。
【０３１９】
Ｋ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスの皮膚にリンパ管が存在しないことは、リンパ系の機能不全によって引き起こされ、重篤度が増すと四肢の腫脹を特徴とする疾患であるヒトリンパ水腫におけるように真皮、特に皮下脂肪層の肥厚と関連していた（Witte et al., リンパ管形成：機構、意義および臨床的関係(Lymphangiogenesis: Mechanisms, significance and clinical implications)  「新脈管形成の調節(Regulation of Angiogenesis)」（Goldberg, I.D. & Rosen, E.M.監修） 65-112 (Birkhaeuser Verlag, Basel, Switzerland) 1997; Mortimer, Cancer 83, 2798-2802 (1998)）。遺伝病である原発性リンパ水腫では、皮相または皮下リンパ管は通常は形成不全または無形成性であり、それらはリンパ管流体を静脈循環に輸送することができない。非遺伝性の二次的または後天性リンパ水腫は、リンパ管が手術、放射線、感染症または外傷によって損傷したときに発生する。リンパ水腫では、タンパク質に富む流体が間質空間に蓄積し、組織繊維症および脂肪変性、傷治癒の干渉を生じ、感染症に係りやすくなる。Ｋ１４ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスでは、真皮での高分子輸送が欠けており、特に老齢マウスでは皮膚繊維症の兆候が見られる。更に、トランスジェニックマウスでの足の腫脹、および皮膚および皮下組織での流体の蓄積増加は、ヒトリンパ水腫の症状と類似していた。従って、Ｋ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスの皮膚表現型は、幾つかの特徴をヒトリンパ水腫と共有している。幾つかのリンパ水腫ファミリーの検討では、ヘテロ接合性の不活性化ミスセンス突然変異がＦｌｔ４のチロシンキナーゼコード領域で検出されている(Karkkainen et al., Nature Genet., 25:153-159, 2000; Irrthurn et al., Am. J. Hum. Gen. 67:259-301 2001)。少なくとも幾人かのリンパ水腫患者は、ＶＥＧＦＲ−３シグナル形成が不完全であることによるリンパ管機能不全である。この観察と同時に、この例の結果は、可溶性ＶＥＧ
ＦＲ−３タンパク質によるＶＥＧＦＲ−３シグナル形成の破壊により、リンパ管網状組織を完全に破壊し、リンパ水腫様表現型を生じることができることを示している。更に、リンパ水腫の幾つかの症例におけるように、ある局所リンパ節の大きさと外観は可変であり、リンパ流と機能的リンパ管系は正常なリンパ節の形成に本質的であることを示唆している。
【０３２０】
ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇも、既に形成したリンパ管の退行を誘発した。従って、発生中に、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３への結合を阻害すると、リンパ管内皮細胞のアポトーシスとリンパ管網状組織の破壊を生じ、これは、リンパ管内皮細胞の生存には連続的ＶＥＧＦＲ−３シグナル形成が必要であることを示している。細胞培養では、ＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞の生存と関連した生化学的シグナル形成カスケードを活性化する。皮膚でＶＥＧＦ−Ｃ(Jeltsch et al., Science, 276:1423-1425, 1997)またはＶＥＧＦ−Ｄを過剰発現するトランスジェニックマウスが過形成性皮膚リンパ管系を発生しても、Ｋ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスと交雑させると、その皮膚リンパ管も退行する。いずれのＶＥＧＦＲ−３リガンドも皮膚で発現するので、Ｋ１４−ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスで観察された表現型はＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄの両方の同時阻害によるものと思われる。
【０３２１】
ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄは、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれでも血管内皮細胞について分裂促進性であるが(Joukov et al. EMBO J. 16, 3898-3911, 1997; Achen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 95, 548-553, 1998; Cao et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 95, 14389-14392 1998; Witzenbichler et al., Am. J. Pathol. 153, 381-394, 1998; Marconcini et al., Proc. Nall. Acad Sci. USA 96, 9671- 1999)、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇは血管に影響するとは思われなかった。Ｋ１４−プロモーター発現の開始が遅いことから、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇタンパク質のリンパ管特異性を説明することができる。Ｋ１４−プロモーター活性は、約Ｅ１４．５〜１６．５までは見られない(Byme et al., Development 120:2369-2383, 1994)。内因性ＶＥＧＦＲ−３の発現は発生途上の血管で最初にＥ８．５で検出されるが、Ｅ１４〜１６．５までに、これは健常血管内皮では大幅にダウンレギュレーションされた(Dumont et al., Science 282, 946-949 1998; Kaipainen, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 3566-3570, 1995)。従って、ＶＥＧＦＲ−３が最早通常は健常組織の血管内皮に存在しない発生期中には、ＶＥＧＦＲ−３シグナル形成は他の受容体よりも皮膚における血管新生に一層僅かな役割しか果たさない。
【０３２２】
若いＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇマウスでは、幾つかの内部臓器はほぼ完全にリンパ管を欠いているが、リンパ管は成熟マウスでは、幾つかの臓器では異常パターンではあるが、再増殖した。従って、リンパ管系の増殖および維持は、成熟臓器で再活性化することができる。例えば、成熟している結合組織マトリックスからのＶＥＧＦＲ−３阻害または独立シグナルのレベル減少により、リンパ管形成が再活性化されたが、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄレベルの増加が確実であることを示唆する証拠は得られていない。 しかしながら、アデノウイルスベクターを介してＶＥＧＦ−Ｃを間質流体で通常見られる量を上回る量で投与することによって、成熟組織におけるリンパ管を増殖させることができる。ＶＥＧＦＲ−２を最早結合しない改質ＶＥＧＦ−Ｃの遺伝子治療での使用（米国特許第６,１３０,０７１号明細書；Joukev et al., J. Biol. Chem., 273:6599-6602）によって、血管内皮に対するその潜在的効果を防止することができる。
【０３２３】
従って、可溶性ＶＥＧＦＲ−３は、イン・ビボでのリンパ管形成の強力且つ特異的なインヒビターである。可溶性ＶＥＧＦＲ−３は、明細書の他の場所に記載したように、Ｆｌｔ４の細胞外断片を含んでなることができる。上記のように、好ましい可溶性ＶＥＧＦＲ−３は、ＶＥＧＦＲ−３の最初の３個のドメインを含んでなるものであるが、可溶性ＶＥＧＦＲ−３は、図２に示されているＶＥＧＦＲ−３の野生型配列を多少含んでなるＶＥＧＦＲ−３の断片であることができることを理解すべきである。例えば、可溶性ペプチドは、ＩｇIV、ＩｇＶ、ＩｇVI、ＩｇVIIの１種類以上を含んでなることもできる。あるいは、可溶性ＶＥＧＦＲ−３は、ＩｇＩのみをＩｇII、ＩｇIII、ＩｇIV、ＩｇＶ、ＩｇVIおよびＩｇVIIからなる群から選択されるドメインの１個以上と任意の組合せで含んでなることができる可能性がある。
【０３２４】
更に、本例では、ヒトリンパ水腫の特徴を有するマウスモデルも確立する。リンパ水腫は常に皮膚を必要とするので、このマウスモデルはこの疾患の理解と特徴付け、およびヒト患者に応用することができる新たな治療法の試験に有用である。
【０３２５】
本発明の概要または詳細な説明に引用されている特許明細書や定期刊行物など総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０３２６】
本発明をその特異的態様に関して記載してきたが、更に改質することができ、また本出願明細書は、本発明の原理に従い且つ本発明が関係する技術分野で既知または通常の実施の範囲内に収まり且つこれまでに記載されたおよび特許請求の範囲に記載の本質的特徴に応用することができる本発明の開示内容からの離反を包含する本発明の任意の変更、使用、または翻案をカバーしようとするものであることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
【図１Ａ】Ｆｌｔ４ｃＤＮＡクローンの構造の略図。
【図１Ｂ】ノーザンハイブリダイゼーションゲルの写真による再生。
【図２Ａ】Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図およびＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列の比較。
【図２Ｂ】Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図およびＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列の比較。
【図２Ｃ】Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図およびＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列の比較。
【図２Ｄ】Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図およびＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列の比較。
【図２Ｅ】Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図およびＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列の比較。
【図２Ｆ】Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図およびＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列の比較。
【図３Ａ】クローンＪ．１．１およびＩ．１．１のｃＤＮＡインサートの３′末端の略図。
【図３Ｂ】アンチセンスＲＮＡプローブ、およびＦｌｔ４ＲＮＡの長および短形態でのハイブリダイゼーションのオートラジオグラムの写真による再生。
【図３Ｃ】アンチセンスＲＮＡプローブ、およびＦｌｔ４ＲＮＡの長および短形態でのハイブリダイゼーションのオートラジオグラムの写真による再生。
【図４】様々な腫からのＤＮＡ試料におけるＦｌｔ４配列のハイブリダイゼーション分析を示すゲルの写真による再生。
【図５Ａ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｂ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｃ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｄ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｅ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｆ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｇ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図５Ｈ】腺管内癌における管を発現するＶＥＧＦRを免疫組織化学的に描写したもの。隣接切片（図５Ａ，Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３とＰＡＬ−Ｅは、癌細胞で満たされた導管の周りに同様なパターンの「ネックレス」管（鏃）を装飾している。もう一つの組の隣接切片を、ＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンXVIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）についての染色と比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）についての二重染色、およびＶＥＧＦＲ−３のみについて染色した隣接切片（図５Ｈ）との比較。罹患した導管に隣接する管は二重陽性（鏃）であるが、ＶＥＧＦＲ−３ 陽性管は管間ストロマ（矢印）での罹患導管から短い距離離れて存在する。基底板は、二重染色処置においてＰＡＬ−Ｅに陽性である点に留意されたい。倍率：図５Ａ，Ｂ ４００倍。図５Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ ３２０倍。図５Ｅ，Ｆ ４８０倍。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010088433.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2010088433.tif 000010
【図２Ｅ】
2010088433.tif 000011
【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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