(57)【要約】【課題】分生胞子の増殖にかかわる因子について種々検討し、この分生胞子増殖因子を利用して、従来のＰＤＢと比較して分生胞子の形成量を向上させるための技術を提供することを目的とする。【解決手段】分子量が２０ＭＤａ以上のデンプンを含む分生胞子増殖因子、該分生胞子増殖因子を含む培地並びに該分生胞子増殖因子の製造方法により解決する。本発明によれば、２０ＭＤａ以上の分子量のデンプンを使用することにより、グルコースの添加量を増加することなく、糸状菌の分生胞子形成数及び乾燥菌体重量を、従来のＰＤＢ培地よりも有意に増加させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が２０ＭＤａ以上のデンプンを含む分生胞子増殖因子。
【請求項２】
前記デンプンが、ジャガイモ、サツマイモ、コメ、トウモロコシからなる群から選択された少なくとも１種以上の原料を由来とするものである、請求項１に記載の分生胞子増殖因子。
【請求項３】
前記分生胞子が、フザリウム（Fusarium）属の分生胞子である、請求項１又は２に記載の分生胞子増殖因子。
【請求項４】
前記分生胞子が、フザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の分生胞子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分生胞子増殖因子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の分生胞子増殖因子を含む培地。
【請求項６】
さらに、マグネシウム又はその塩を含む、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
デンプン含有物に水を添加して混合し、デンプンを水中に溶出させる工程と、
デンプン含有物と水との混合物をろ過してろ液を得る工程と、
ろ液にトルエンを添加して混合し、分離した沈殿物、水層、トルエン層のうち沈殿物を分取する工程と、
を有する、分生胞子増殖因子の製造方法。
【請求項８】
前記デンプンが、ジャガイモ、サツマイモ、コメ、トウモロコシからなる群から選択された少なくとも１種以上の原料を由来とするものである、請求項７に記載の分生胞子増殖因子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌類の分生胞子形成能に優れた分生胞子増殖因子、該分生胞子増殖因子を含む培地及び該分生胞子増殖因子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分生胞子はバド・セル（bud-cell）、ミクロコニディア（microconidia）、小型分生子とも呼ばれ、菌糸から分岐した胞子のうや胞子柄から形成された無性胞子の一種である。
【０００３】
一般にカビなどの糸状菌はその名の通り１０〜３０μｍの細長い糸状の細胞が多数に枝分かれした形状を有しているが、分生胞子は卵〜長円形の形状を有する単細胞である。糸状菌の分生胞子は単細胞として存在するため、菌糸と比較して実験操作における利便性が高い。そのため、植物の病理試験の指標などに利用されている。
【０００４】
分生胞子を糸状菌培地から製造する方法としては、例えば、特開２００３−２７４９３１号公報に、ペプトン、酵母エキスおよびグルコースを含有する培地を用いて、非病原性フザリウム属に属する微生物の分生胞子を短時間で大量に培養する培養方法および培養培地が開示されている（特許文献１）。
【０００５】
特開２００２−２３３３５８号公報には、糸状菌を液体培地を収容した容器中で静置培養して、液体表面に分生子を生成させたのち、その培養生成物を乾燥し、この間に菌糸体を容器壁面に吸着させ除去することにより、菌糸片や培地由来の固形分が混入せず、かつ粒径のそろった高純度分生子を簡便に得ることができる糸状菌の分生子の製造方法が開示されている（特許文献２）。
【０００６】
また、特開２００６−１４１３９２号公報には、培養開始時の培養物の水分比率が５０重量％〜７０重量％の範囲内となるように微生物を接種し、少なくとも微生物の分生子が形成されるまでの期間内において培養物の含水率を３５重量％〜７５重量％の範囲内で維持する条件下で培養することにより、子実体及び／又は分生子柄束の形成を抑えながら、分生子の形成を主として向上させることができる、ペーシロマイセス属の微生物の分生子の製造方法が開示されている（特許文献３）。
【特許文献１】特開２００３−２７４９３１号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３５８号公報
【特許文献３】特開２００６−１４１３９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
分生胞子を形成するための培地のひとつに、ポテトデキストロース培地（以下「ＰＤＢ培地」ということがある。）がある。ＰＤＢ培地は汎用性が高い培地であるため、粉末を純水で溶解して調製する市販品も広く利用されている（市販ＰＤＢ培地）。
【０００８】
市販ＰＤＢ培地は糸状菌などの真菌類の培地として広く利用されているが、分生子形成能が十分ではなく、乾燥菌体重量も少ないという問題があった。そのため、市販ＰＤＢ培地よりも効率よく糸状菌の分生胞子を形成できる培地の開発が望まれていた。
【０００９】
そこで本発明は、分生胞子の増殖にかかわる因子について種々検討し、この分生胞子増殖因子を利用して、従来のＰＤＢ培地と比較して分生胞子の形成量を向上させるための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者はＰＤＢ培地に使用されるデンプンに着目して種々検討を行ったところ、分子量の大きいデンプンを用いた場合に分生胞子の形成が向上するとの知見を得た。
【００１１】
本発明はかかる知見に基づくものであり、分子量が２０ＭＤａ以上のデンプンを含む分生胞子増殖因子を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、前記分生胞子増殖因子を含む培地を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、デンプン含有物に水を添加して混合し、デンプンを水中に溶出させる工程と、デンプン含有物と水との混合物をろ過してろ液を得る工程と、ろ液にトルエンを添加して混合し、分離した沈殿物、水層、トルエン層のうち沈殿物を分取する工程と、を有する、分生胞子増殖因子の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の分生胞子増殖因子、該分生胞子増殖因子を含む培地及び該分生胞子増殖因子の製造方法によれば、２０ＭＤａ以上の分子量のデンプンを使用することにより、グルコースの添加量を増加することなく、糸状菌の分生胞子形成数及び乾燥菌体重量を、従来のＰＤＢ培地よりも有意に増加させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の好ましい実施形態について説明する。本発明の分生胞子増殖因子は、その分子量が２０ＭＤａ以上のデンプンを含むものである。
【００１６】
２０ＭＤａ以上のデンプンを用いることにより、分子量を調整しないデンプンを使用した場合と比較して、糸状菌の分生胞子形成能及び乾燥菌体重量を向上させることができる。一方、２０ＭＤａ未満のデンプンを使用する場合は、分子量未調整のデンプンを主成分とする従来の培地と分生胞子形成能に関して大きな差異は認められない。
【００１７】
前記デンプンは、その由来は特に限定されないが、入手の容易さやコスト等の面を考慮すれば、ジャガイモ、サツマイモ、コメ、トウモロコシからなる群から選択された少なくとも１種以上の原料を由来とすることが好ましく、特にジャガイモ由来のデンプンであることがより好ましい。
【００１８】
前記分生胞子は、フザリウム（Fusarium）属の分生胞子であることが好ましい。フザリウム（Fusarium）属のカビは、畑などでレタス、イチゴ、ホウレンソウ、トマトなど、多数の農作物に寄生する植物病原菌として知られている。また、この菌の感染した農作物を食べることによって中毒を引き起こすため、研究対象として重要な糸状菌である。
【００１９】
フザリウム（Fusarium）属の具体例としては、例えば、フザリウム  オキシスポラム（Fusarium  oxysporum）、フザリウム  バーチシリオイデス（Fusarium  verticillioides）、フザリウム  グラミネアラム（Fusarium  graminearum）、フザリウム  スポロトリキオイデス（Fusarium  sporotrichioides）、フザリウム  アクミナタム（Fusarium  acuminatum）、フザリウム  アベナシューム（Fusarium  avenaceum）、フザリウム  セミテクタム（Fusarium  semitectum）、フザリウム  カルモラム（Fusarium  culmorum）、フザリウム  ソラニ（Fusarium  solani）、フザリウム  トリシンツム（Fusarium  tricinctum）、フザリウム  ニバーレ（Fusarium  nivale）、フザリウム  プラリフェラタム（Fusarium  proliferatum）、フザリウム  ポアエ（Fusarium  poae）、フザリウム  ボセウム（Fusarium  voseum）、フザリウム  モニリフォルメ（Fusarium  moniliforme）、フザリウム  ロゼウム（Fusarium  roseum）等を挙げることができる。
【００２０】
次に、本実施形態の分生胞子増殖因子の製造方法について、図を参照しつつ説明する。図１は本実施形態の分生胞子増殖因子の製造方法の概略を示す図である。
【００２１】
本実施形態の分生胞子増殖因子の製造は、まず、デンプン含有物１０に水１２を添加して撹拌混合し、デンプンを水中に溶出させる（Ｓ１）。デンプン含有物１０の種類は特に限定されないが、入手の容易さやコスト等の面を考慮すれば、ジャガイモ、コメ、サツマイモ、トウモロコシからなる群から選択された少なくとも１種以上であることが好ましく、特にジャガイモであることがより好ましい。ジャガイモを用いる場合、皮は剥いても剥かなくてもよい。
【００２２】
次に、デンプン含有物１０と水１２との混合物をろ過することにより（Ｓ２）、ろ液１４を得る。ろ過は、ふるい（２５０μｍ）等により行うことができる。
【００２３】
次に、ろ液１４にトルエン１６を添加して混合することにより、タンパク質及び脂質を分離する（Ｓ３）。具体的には、ろ液１４にトルエンを添加して混合することにより、沈殿物１８と水層１９とトルエン層２０に分離する。ここで、分離した沈殿物１８、水層１９、トルエン層２０のうち、沈殿物１８を分取し、水層１９とトルエン層２０は除去する。トルエン層２０にはタンパク質画分及び脂質画分が含まれるため、これによりデンプン抽出液に含まれていたタンパク質及び脂質が除去される。
【００２４】
その後、沈殿物１８を３０〜４５℃で、１８時間程度乾燥することにより（Ｓ４）、所望の大分子量デンプン２４、即ち分生胞子増殖因子が得られる。大分子量デンプン（分生胞子増殖因子）は、その分子量が少なくとも２０ＭＤａ以上である。
【００２５】
本実施形態の分生胞子増殖因子は、糸状菌培地の添加物として使用することができる。本実施形態の分生胞子増殖因子を含む培地は、糸状菌の分生胞子形成能が向上し、効率よく分生胞子を製造することができる。
【００２６】
分生胞子増殖因子を培地に添加する場合、その添加量は、培地の全量に対し０．５〜２．０重量％であることが好ましく、０．７〜１．５重量％であることがより好ましい。添加量が多いほど分生胞子の数が増加する傾向があるが、液体培地の場合、２．０重量％を超える量を添加すると、培地成分が沈澱したり、液体培地の粘度が増加してゲル状になる。
【００２７】
前記培地は、上述した分生胞子増殖因子のほか、さらに、マグネシウム又はその塩を含むことが好ましい。マグネシウム又はその塩が含まれることにより、糸状菌の分生胞子形成数をより増加させることができる。その原理は明らかではない部分もあるが、培地中でマグネシウムがイオン化し、糸状菌に摂取されることにより分生胞子の形成を促すものと思われる。なお、マグネシウム又はその塩の添加量は、０．５ｍＭ程度であることが好ましい。
【００２８】
その他、培地成分として使用することができるものとして、炭素源、ビタミン・ミネラル類などを挙げることができる。
【００２９】
ビタミン・ミネラル類としては、上述したマグネシウム又はその塩のほか、例えば、カルシウム、カリウム、ナトリウム又はそれらの塩などを挙げることができる。ビタミン・ミネラル類の添加量は培養する糸状菌の種類に応じて適宜設定することができる。
【実施例】
【００３０】
１．分生胞子増殖因子の製造
皮を剥いたジャガイモ２００ｇを１ｃｍ角に切断したものに純水２００ｍｌを添加し、ホモジナイザーを用いて３分間混合することにより、デンプンを水中に溶出させた。次に、混合溶液を２５０μｍのふるいを用いてろ過し、ろ液を得た。そのろ液にトルエン１００ｍｌを添加し、２００ｒｐｍ、３０分間の条件で振盪抽出を行った。混合液を２時間静置して沈殿層と水層とトルエン層に分離させ、沈殿層を分取してタンパク質と脂質分画を含む水層とトルエン層を除去した。
【００３１】
沈殿物を採取し、水分を除去した。沈殿物はその後乾燥器を用いて４０℃で１８時間乾燥処理を行い、約５０ｇの大分子量デンプン、即ち分生胞子増殖因子を得た。
【００３２】
図２は大分子量デンプン（分生胞子増殖因子）につきゲル濾過を実施した際のクロマトグラムである。カラムはφ１６ｍｍ×７６０ｍｍ  Sepharose CL-2B（ＧＥヘルスケア社製）を使用し、移動相は１０ｍＭ  ＮａＯＨを使用した。なお、比較例として、市販のＰＤＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製Potato Dextrose Broth）のクロマトグラムを併記した。
【００３３】
図２に示すように、分生胞子増殖因子は市販ＰＤＢ培地とは全く異なるピークを示すことが判明した。分子量既知のデキストランを使用して分生胞子増殖因子の推定分子量を求めたところ、ゲル濾過の担体の排除限界以上であったことから、分生胞子増殖因子の分子量は２０ＭＤａ以上であることが明らかになった。
【００３４】
２．培地の調製
市販のＰＤＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製Potato Dextrose Broth）に、前記１で得られた分生胞子形成因子を下記の表に示す割合で添加し、さらに純水を添加して撹拌し、オートクレーブで滅菌処理を実施することにより、糸状菌用の液体培地を調製した。但し、培地６は培地に沈殿が生じたため、後述する培養試験には使用しなかった。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
３．培養試験
（１）フザリウム  オキシスポラム  フォルマ  スペシャリス  ラクチュケ（Fusarium
oxysporum f. sp. lactucae）を供試菌株として、培地１〜５を使用して分生胞子（bud-cell）の形成を試みた。前培養として、市販ＰＤＢ７０ｍｌを含む３００ｍｌ容羽付三角フラスコで２５℃、２日間、１４０ｒｐｍ振とう培養した。また、本培養として、培地７０ｍｌを含む３００ｍｌ容羽付三角フラスコで２５℃、４日間、１４０ｒｐｍ振とう培養した。。
【００３７】
結果を図３及び図４に示す。図３は培養４日目の分生胞子（bud-cell）の数を測定した結果を示し、図４はそのときの乾燥菌体重量を測定した結果を示す。図３及び図４に示すように、分生胞子増殖因子を添加した培地で培養した場合は、分生胞子増殖因子を添加しない培地で培養した場合と比較して、フザリウム  オキシスポラム  フォルマ  スペシャリス  ラクチュケ（Fusarium oxysporum f. sp. lactucae）の分生胞子（bud-cell）数及び乾燥菌体重量が共に増加することが判明した。
【００３８】
但し、培地中のグルコース濃度を０から２％まで段階的に設定した培地では、糖濃度依存的に乾燥菌体重量が増加するが、分生胞子（bud-cell）数には影響しなかった。
【００３９】
以上の結果から、糸状菌の液体培養中の分生胞子（bud-cell）の形成要因として、分子量が２０ＭＤａ以上のデンプンが大きく影響していることが明らかとなった。
【００４０】
（２）宿主特性の異なるフザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を供試菌株として、分生胞子（bud-cell）の形成を試みた。培地は、市販のＰＤＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製Potato  Dextrose  Broth）２．４重量％に、前記１で得られた分生胞子形成因子２．５重量％を添加し、さらに純水を添加して全量が１００重量％となるように調製した培地を用いた。
【００４１】
結果を図５及び図６に示す。図５は培養４日目の分生胞子（bud-cell）の数を測定した結果を示し、図６はそのときの乾燥菌体重量を測定した結果である。図５及び図６に示すように、トマト根腐萎凋病を発病させるフザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を除き、分生胞子増殖因子を添加した培地で培養したすべての菌株で分生胞子（bud-cell）形成数及び乾燥菌体重量が市販ＰＤＢ培地よりも多くなることが判明した。
【００４２】
（３）デンプン原料の検討
デンプン原料として、サツマイモデンプン、トウモロコシデンプン、コメデンプンを使用した以外は、前記１と同様の要領で分生胞子増殖因子を製造した。そして、市販のＰＤＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製Potato Dextrose Broth）２．４重量％に、得られた分生胞子形成因子（分子量２０ＭＤａ以上）２．５重量％を添加し、さらに純水を添加して全量が１００重量％となるように調製した培地を用いて、フザリウム  オキシスポラム  フォルマ  スペシャリス  ラクチュケ（Fusarium oxysporum f. sp. lactucae）の分生胞子形成数を測定した。
【００４３】
結果を図７及び図８に示す。図７は培養４日目の分生胞子（bud-cell）の数を測定した結果を示し、図８はそのときの乾燥菌体重量を測定した結果である。図７及び図８に示すように、サツマイモデンプン、トウモロコシデンプン、コメデンプンにそれぞれ由来する分生胞子増殖因子のいずれも、フザリウム  オキシスポラム  フォルマ  スペシャリス  ラクチュケ（Fusarium oxysporum f. sp. lactucae）の分生胞子の形成数を増加させる効果を有することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本実施形態の分生胞子増殖因子の製造方法の概略を示す図である。
【図２】ゲル濾過を実施した際のクロマトグラムである。
【図３】フザリウム  オキシスポラム  フォルマ  スペシャリス  ラクチュケの培養４日目の分生胞子（bud-cell）の数を測定した結果を示す図である。
【図４】フザリウム  オキシスポラム  フォルマ  スペシャリス  ラクチュケの培養４日目の分生胞子（bud-cell）の乾燥菌体重量を測定した結果を示す。
【図５】宿主特異性が異なるフザリウム  オキシスポラムの培養４日目の分生胞子（bud-cell）の数を測定した結果を示す図である。
【図６】宿主特異性が異なるフザリウム  オキシスポラム培養４日目の分生胞子（bud-cell）の乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。
【図７】異なるデンプン原料から製造した分生胞子増殖因子を添加した培地での培養４日目の分生胞子（bud-cell）の数を測定した結果を示す図である。
【図８】異なるデンプン原料から製造した分生胞子増殖因子を添加した培地での培養４日目の分生胞子（bud-cell）の乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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