(57)【要約】      （修正有）【課題】生体外での部位特異的組換を用いた組換ウイルスの準備方法の提供。【解決手段】環状ウイルスゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、部位特異的組換部位によって隣接される線状ウイルスゲノムＤＮＡを形成し、生体外において、部位特異的組換部位によって隣接される所望のゲノム材料を用いて部位特異的組換を行う方法。部位特異的組換した混合物を、所望の組換ウイルスゲノムＤＮＡの選出といった更なる工程なくして、宿主に適用することができるので、同時に多数の組換ウイルスをより迅速に得ることが出来る。【選択図】図１
2010207231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のゲノム材料を含む発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法であって、
１）制限酵素を用いて環状のウイルスゲノムＤＮＡの１つ以上の部位を消化し、部位特異的組換用の酵素が認識する２つの部位特異的組換部位に挟まれた、線状のウイルスゲノムＤＮＡを準備する工程と、
２）前記線状のウイルスゲノムＤＮＡを挟んでいる２つの部位特異的組換部位と反応する、前記部位特異的組換用の酵素が認識する２つの部位特異的組換部位に挟まれた、所望のゲノム材料を含む遺伝子カセットを準備する工程と、
３）前記の１）において準備した線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片と、２）において準備した遺伝子カセットとを、前記部位特異的組換用の酵素の存在下において生体外で反応させる工程とを含み、
前記の線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片及び前記の遺伝子カセットは発現されないものであり、
前記の３）の工程において、所望のゲノム材料を含む発現可能な組換ウイルスベクターが構築され、所望のゲノム材料を含まないウイルスゲノムＤＮＡは発現が防止されたものであり、
前記ウイルスがバキュロウイルスである、ことを特徴とする発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法。
【請求項２】
前記の１）における制限酵素は、ＣＣＴＮＡＧＧの塩基配列を認識することを特徴とする請求項１に記載の発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法。
【請求項３】
所望のゲノム材料を含む組換ウイルスのスクリーニング方法であって、
１）制限酵素を用いて環状のウイルスゲノムＤＮＡの１つ以上の部位を消化し、部位特異的組換用の酵素が認識する２つの部位特異的組換部位に挟まれた、線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片を準備する工程と、
２）前記線状のウイルスゲノムＤＮＡを挟んでいる２つの部位特異的組換部位と反応する、前記部位特異的組換用の酵素が認識する２つの部位特異的組換部位に挟まれた、所望のゲノム材料を含んだ遺伝子カセットを準備する工程と、
３）所望のゲノム材料を含む発現用環状組換ウイルスベクターを含む反応混合物を生成するために、前記の１）において準備した線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片と、２）において準備した遺伝子カセットとを、前記部位特異的組換用の酵素の存在下において生体外で反応させる工程と、
４）マルチウエルプレート内の宿主に、３）における前記反応混合物を導入する工程と、
５）宿主内における発現を識別する工程とを含み、
前記の線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片及び前記の遺伝子カセットは発現されないものであり、
前記の３）の工程において、所望のゲノム材料を含む発現可能な組換ウイルスベクターが構築され、所望のゲノム材料を含まないウイルスゲノムＤＮＡは発現が防止されたものであり、
前記ウイルスがバキュロウイルスである、ことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法であって、
１）制限酵素を用いて環状のウイルスゲノムＤＮＡの１つ以上の部位を消化し、部位特異的組換用の酵素が認識する２つの部位特異的組換部位に挟まれた、線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片を準備する工程と、
２）前記線状のウイルスゲノムＤＮＡを挟んでいる２つの部位特異的組換部位と反応する、前記部位特異的組換用の酵素が認識する２つの部位特異的組換部位に挟まれた、所望のゲノム材料を含む遺伝子カセットを準備する工程と、
３）所望のゲノム材料を含む発現用環状組換ウイルスベクターを含む反応混合物を生成するために、１）において準備した線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片と、２）において準備した遺伝子カセットとを、前記部位特異的組換用の酵素の存在下において生体外で反応させる工程と、
４）宿主に、３）における前記反応混合物を感染させる工程と、
５）４）における感染された宿主から組換ウイルスを発現させる工程とを有し、
前記の線状のウイルスゲノムＤＮＡ断片及び前記の遺伝子カセットは発現されないものであり、
前記の３）の工程において、所望のゲノム材料を含む発現可能な組換ウイルスベクターが構築され、所望のゲノム材料を含まないウイルスベクターは発現が防止されたものであり、
前記ウイルスがバキュロウイルスである、ことを特徴とする組換ウイルスの準備方法。
【請求項５】
前記の１）におけるウイルスゲノムＤＮＡ断片は、細菌型の複製開始点と抗生物質耐性ＤＮＡとを含んでいることを特徴とする請求項４に記載の環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法。
【請求項６】
前記の４）における工程は、マルチウエルプレート内で行われることを特徴とする請求項４又は５に記載の環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法。
【請求項７】
前記の１）における制限酵素は、ＣＣＴＮＡＧＧの塩基配列を認識することを特徴とする請求項４から６の何れか一項に記載の環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、組換ウイルスの生産方法、及び組換ウイルスベクターの生産方法に関し、さらに、前記生産方法およびその生産方法によって生産される組換ウイルスにおけるＤＮＡ構成に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
組換ウイルスベクターとは、遺伝学的に作りだされたベクターであり、ワクチンの生成、遺伝子の機能解析、遺伝子群の解析、または遺伝子ドメインの解析等に使用され、さらに蛋白質の生成及び、遺伝子療法等にも使用される。ウイルスベクターに組み込まれるゲノム材料として、遺伝子、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ペプチドあるいは蛋白質をコードしたＤＮＡ配列、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低干渉性ＲＮＡ）、ＤＮＡ用のｓｉＲＮＡ、プロモーター、エンハンサー等がある。ベクターの生成に使用されるウイルスとしては、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、シンドビド（sindbid）ウイルス、バクシニア（vacxnia）ウイルス等がある。
【０００３】
レトロウイルスは、遺伝子療法において最もよく使用されるウイルスの一つとして知られている[Clive Patience et al. J Virol, 72:2671-2676, 1998, Marshall, Science, 269: 1050-1055,1995]。レトロウイルスゲノムは、２つの末端反復配列（LRTs）と、キャプシド配列と、３つのコーディング領域（gag、pol、env）とを有しており、その生成（準備）方法と、生体外及び生体内における用途は、ＷＯ９９０８６９２Ａ１と、ＥＰ４５３２４２とに開示されている。しかしながら、レトロウイルスには、臨床応用において、以下のような問題点がある。すなわち、複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）（Sharon K. Powell et al. J.Virol., 73:8813-8816, 1999）を形成してしまう。また、遺伝子発現レベルが比較的低く、体内において徐々に減少してしまう。また、低力価であるといった問題がある。また、非分裂細胞に遺伝子を導入することができないという問題もある（Jaffe, E.M. Cancer Res., 53:2221-2226, 1993; Bender, M.A. et al. J. Virol., 61:1639-1646, 1987）。
【０００４】
アデノウイルスは、線状のゲノム（約３６ｋｂ）を有し、左反転末端領域（the left inverse terminal region）（ＩＴＲ）（１０３ｂｐ）付近に複製開始点とキャプシドシグナルとを有する（Shenk, Adenoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM Howley PM, ed. Virology. Philadelphia: Raven publishers, 1996: 2111-2148）。通常、アデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムから、ウイルスの複製に不可欠なＥ１部位を切除することによって作られる。Ｅ１部位の代わりに外来のゲノム材料を有するアデノウイルスベクターは、Ｅ１蛋白質を供給するパッケージング細胞に導入され、パッケージング細胞でのみ、ウイルスの複製が行われる。代表的なパッケージング細胞としては、HEK293細胞、911細胞及び、PER.C6細胞などが挙げられる（Hitt MM et al., Advances in Pharmacology, vol. 40, 137-206 （1997）, Wang Y. and Huang S., Drug）。アデノウイルスベクターは、その安全性、多様な細胞とのアフィニティー性、分裂細胞への感染率、及び、高い力価（１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）と言った点等において有利であることから、異種遺伝子を発現するベクターの作製のために使用されている。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（約４７００ｂｐ）は、各末端に複製開始点としてのＩＴＲｓ（約１４５ｂｐ）を有しており、多様な宿主細胞のゲノムＤＮＡに安全かつ特異的に組み込まれる。
【０００６】
組換ウイルスをベクターとして使用するために、感染先の細胞内で組換ウイルス自体の複製が行われないようにしなければならない。このことから、通常、組換ウイルスの作製には、ウイルス複製に不可欠なゲノム領域の幾つかが切除された欠陥ウイルスが使用される。レトロウイルスでは、例えばgag、pol及び／又はenv遺伝子が、所望のゲノム材料に置き換えられる（Bender et al., J. Virol. 61 （1987） 1639）。アデノウイルスにおいては、ウイルスベクター作製のために、Ｅ１、Ｅ２及び／又は、Ｅ４部位が切除されている（Levrero et al., Gene 101 （1991） 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 （1986） 161, Van der Vliet et al.,（1975））。一方、ＩＴＲやキャプシド配列等の、複製に不可欠な領域でのみ構成される仮性ウイルス（pseudo-virus）ベクターもまた、組換ウイルスを得るために使用されている（WO95/02697参照）。
【０００７】
また、環状ゲノムＤＮＡを有することで知られているバキュロウイルスも、ウイルスベクターの作製に使用されている。バキュロウイルス科（のウイルス）は、昆虫及び甲殻類などの無脊髄動物に感染する。AcNPVは、最も広く使用されているバキュロウイルスの一つで、二本鎖の環状ゲノムＤＮＡ（約１３４ｋｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ:ＮＣ001623）を有している。Smith et alは、β−インターフェロン遺伝子を挿入することによって組換バキュロウイルスを開発し、この組換バキュロウイルスを使った、昆虫細胞からのβ−インターフェロン蛋白質の取得に成功している（Smith GE., Mol. Cell. Biol., V3, p2156-2165, 1983）。以来、バキュロウイルス系を使って多数の遺伝子の発現と、生産とが行われてきた。前記方法では、以下の（１）及び（２）に示すような特徴を有している。すなわち、（１）ポリヘドリンプロモーターを使い、所望の組換バキュロウイルスを効率的に生成することができ、（２）細菌内培養において活性を示さない遺伝子を発現させるために使用することができる、と言った特徴を有している。これは、昆虫の細胞内で、翻訳後修飾が行われるためである。しかしながら、バキュロウイルスのゲノムサイズが原因となり、従来の制限酵素反応及びライゲーション反応法では、ゲノム操作が難しいということが生る。そのため、一般的に昆虫細胞内では、相同的組換が用いられてきた。相同的組換を行うために、所望の遺伝子と、及び相同的組換に必要な核酸配列とを含む担体ベクターが作製される。この担体ベクターと、ウイルスゲノムＤＮＡとを昆虫細胞に感染させて組換を促進する。しかしながら、組換ウイルスの生産効率は０．１〜２％と比較的低いため、所望の組換ウイルスを得るためには、バキュロウイルスプラークのスクリーニングが繰り返し行われる必要がある。よって、この方法も非効率的な方法と考えられている。
【０００８】
そこで、組換ウイルスの生産効率を上げた、改善方法がKitts PA et al.により開示されている（Nucleic Acids Res., Oct 1990; 18: 5667 - 5672. Kitts PA et al）。この技術では、バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを制限酵素を用いて線状に形成した。この方法では、Bsu36I部位認識核酸配列を導入するために、Bsu36I認識塩基配列（ＣＣＴＮＡＧＧ）又はLacZ遺伝子を含むリンカーが、野生型オートグラファカリフォルニアニュークレア多角体病ウイルス（AcNPV）ゲノムのポリヘドリン配列に挿入される。次いで、相同的組換を促進するために、ウイルスＤＮＡはBsu36I制限酵素で消化され、所望のゲノム材料を含む担体ベクターと共に昆虫細胞に導入される。所望の組換ウイルスの生産効率は２６％〜４４％である。この方法によれば、組換対象外の消化された線状ＤＮＡ部分は、ウイルスベクターの生産から選択的に除外される。これにより、比較的高い効率で、所望の蛋白質を発現する所望の組換ウイルスが生成される。しかしながら、前記方法には、以下の（１）および（２）の問題ある。すなわち、（１）Bsu36I認識部位を１００％消化することができない、（２）消化されたＤＮＡ部位同士が連結酵素（リガーゼ）によって昆虫細胞内で融合しているので、所望のウイルスベクターを選抜する工程が必要になると言った問題点がある。
【０００９】
別の方法として、Peakman TC et al.によって開示された、生体外でのcre/loxP機構の部位特異的組換えを用いた方法がある（Peakman TC et al., Nucleic Acids Research, Vol 20, Issue 3 495-500）。つまり、loxP部位を含むバキュロウイルスを生成し、cre組換酵素の存在下で、前記バキュロウイルスと、loxP部位によって隣接されたゲノム材料を有するトランスファーベクター（transfer vectors）とを反応させることにより、バキュロウイルスに対し、所望のゲノム材料を用いた体外での部位特異的組換を行った。前記方法により、組換ウイルスの生産に費やされる時間が短縮することができる。しかしながら、所望の組換ウイルスの生産効率が０．２％〜４９％とまだ低く、このため組換ウイルス生成のための高生産性機構として利用するには適していない。
【００１０】
さらに、細胞内において部位特異的組換えによってバキュロウイルスに所望のゲノムカセットを挿入する方法がLuckow VA et alによって報告されている（Luckow VA et al., Virol., Aug 1993; 67: 4566 - 4579）。Luckowの方法によれば、まず、バクテリア内で複製を行うプラスミド複製開始点と、カナマイシン耐性遺伝子と、attTn7組換配列とを、バキュロウイルスゲノムに挿入することにより、シャトルベクター（約１３０ｋｂ）を生成する。前記シャトルベクターは、「Bacmid」と名付けられ、このBacmidとヘルパープラスミドを用いて、大腸菌E coliを形質転換させることにより、DH10Bacを生成する。その後、DH10Bacを、所望の遺伝子とポリヘドリンプロモーターとを有するプラスミドを用いて形質転換させ、大腸菌E coli内で組換Bacmidを生成する。このようにして生成された組換Bacmidは単離されて、組換ウイルスを得るために昆虫細胞に導入される。前記方法によれば、トランスポゾンの部位特異的組換によって、比較的高い効率でバキュロウイルスを生成することができる。しかしながら、前記方法は、複雑な工程（手順）を要する。例えば、所望のゲノム材料をTn7Bacmid担体ベクターにクローニングする工程、Tn7バキュロウイルス組換のためにDH10Bacを形質転換させる工程、所望のゲノム材料を含むBacmidを持つバクテリアを選び、単離する工程、単離したバクテリアのBacmidＤＮＡ（約１３０ｋｂ）を精製する工程、組換ウイルスを生産するために、再度、該ＤＮＡを昆虫細胞に導入する工程などが挙げられる。
【００１１】
したがって、前記先行技術のどの方法も、組換ウイルスの生成に費やされる比較的長い時間（約３〜６週間）及び、低い生産効率の問題を克服するのに適した方法を開示していない。それゆえ、改善された方法の開発が渇望されている。
【００１２】
そこで、我々は、所望のゲノム材料を有する組換ウイルスを、より速く、より効率的に生産するための研究を重ね、部位特異的組換を用いて生体外で組換ウイルスベクターを準備することによって、また、その組換ウイルスベクターに、組換ウイルスを生成させるようにすることによって、本発明を完成させた。本発明によって、生体外で得られたウイルスベクターは、選出といった更なる工程を経ずに、直接動物細胞に適用できることから、本発明は、全工程を著しく簡素化することができる。さらに、１００％の生産効率で所望の組換ウイルスを提供することが出来る。したがって、本発明では、ウイルスのより高い力価を得ることが出来る。
【００１３】
〔発明の詳細な説明〕
本発明をより詳細に説明するために、参照の刊行物は本願の一部として含むものである。
【００１４】
本発明を理解するうえで、ここに使用される全ての技術用語及び、科学用語は、ここで定義されているものを除いて、当業者によって共通に解釈される意味をなすものとする。また、ここにおいて定義されてない技術も、当業者に熟知されているものとする。
【００１５】
特定の緩衝剤（液）、培養培地、試薬、細胞、培養物、条件等あるいは、これらに準ずるものは、ここに挙げたものに限定されるものでなく、当業者が、審議されている特定の文脈に関わると判断し得る材料あるいは、該当すると判断し得る全ての材料を含むものとする。例えば、ここに挙げる方法、材料あるいは組成物の掲げる目的を達成することができるならば、緩衝機構又は培地が異なる公知の方法を用いて、代替することは、往々にして可能である。
【００１６】
本発明の目的は、より迅速に、より効率的に組換ウイルスを生成する方法を提供することにある。
【００１７】
前記目的を達成するために、本発明において、生体外での部位特異的組換によって生成された組換ウイルスベクターを採用している。
【００１８】
本発明によれば、ウイルスゲノムＤＮＡは、生体外において部位特異的組換に導入される前に、制限酵素によって線状にされる。部位特異的組換の対象でない線状ウイルスゲノムＤＮＡは、自ら複製を行うことが出来ないので、発現したウイルスの殆どは、環状ウイルスゲノムＤＮＡからのものであるとすることができる。よって、本発明によれば、所望の組換ウイルスを選出・分離の工程を経ずに、高い効率で、組換ウイルスを得ることができる。従って、本発明の方法は、例えばポリオーマウイルスや、パピローマウイルスや、Ｂ型肝炎ウイルス等の環状ゲノムＤＮＡを有するウイルスに適用することができる。
【００１９】
部位特異的組換は、多様な生物において自然に起こる事象である。この部位特異的組換用の酵素は、ＤＮＡ配列を部分的に認識して、他の対応するＤＮＡ配列と置き換えるために、エンドヌクレアーゼ活性だけでなく、リガーゼ活性も有している（Yang W. and Mizuuchi K.、 Structure、 1997、 Vol. 5、 1401-1406（9））。バクテリオλ（ラムダ）ファージ由来のInt/att機構や、Ｐ１バクテリオファージ由来のCre/loxP機構や、酵母菌由来のFLP-FRT機構は、非常に発展した部位特異的組換機構である。
【００２０】
部位特異的組換システムは、１）組換ウイルスにクローニングされた所望のゲノム材料の発現制御、２）ヘルパーウイルス依存性ウイルスの作製の際のヘルパーウイルスの切り取り、３）パッケージング細胞における相同的組換の効率向上、あるいは、４）担体ベクターと、組換ウイルス生成用のパッケージング細胞内のウイルスゲノムとの間の部位特異的組換の促進、に用いられる（Philip NG et al.、 Biotechniques、 vol. 29. 524-528 （2000）、 Philip NG et al.、 Human Gene therapy、 vol. 10.、 2667-2672 （1999）、 Hardy S et al.、 Journal of Viology、 vol. 71.、1842-1849 （1997）、 Parks RJ et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci USA、 vol 93.、 13565-13570 （1996））。しかしながら、このような従来技術に開示される部位特異的組換の応用は、単に間接的な用途であり、生体外ではなく、生体内又は細胞株内での補充用途に過ぎない。
【００２１】
さらに、環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルス生成における部位特異的組換の応用として、１）バクテリア内でのTn7組換による組換バキュロウイルスの作製、２）生体外におけるcre/loxP機構を用いた組換バキュロウイルスの作製、が報告されている。
【００２２】
しかしながら、組換ウイルスベクターを得るために、生体外での部位特異的組換を応用して、ウイルスゲノムＤＮＡへ所望のゲノム材料を特異的に挿入するといったことはなかった。特に、所望のゲノム材料を含まないウイルスゲノムＤＮＡの発現を防止するための応用がなかった。従って本発明は、生体外で組換ウイルスベクターを生成するにあたり、部位特異的組換を使用したことに特徴がある。本発明には、従来技術と比べて、予期されなかった以下の利点を有していた。１）生体外において部位特異的組換を用いることによって組換ウイルスベクターをより容易に、より迅速に生成することが可能である。２）ウイルスゲノムＤＮＡを線状に形成することから、所望のゲノム材料が合わさることによる環状は形成されず、発現されないので、中間宿主から所望の組換ウイルスを選び出すといった更なる工程を必要としなくなる。３）ウイルスゲノム由来のＤＮＡを含まない発現カセットを含むトランスファーベクターを用いることによって、異なる種類のウイルスから同じ種類のゲノム材料を生成したり、ウイルス型マルチウエル（例えば、９６ウエルあるいは、３８４ウエル）と類似するものから異なるゲノム材料を生成したりすることが可能である。
【００２３】
さらに、本発明によれば、パッケージング細胞内での相同的組換はもはや必要なくなり、また相同的組換を誘発するための特別な細胞株も必要としない。本発明の方法（BacHTS機構）の工程と、従来技術の方法（BacPAK6機構及び、BacToBac機構）の工程とを比較した結果を表１及び表２に示す。以下の結果から明白であるように、本発明の方法では、従来技術に比べてより迅速に所望の組換ウイルスを生成することが可能である。
【００２４】
【表１】
2010207231.tif 000003
【００２５】
【表２】
2010207231.tif 000004
【００２６】
さらに、本発明によれば、所望のゲノム材料を発現するプロモーターと、融合蛋白質生成用の融合機構及びポリアデニル配列とが、親ウイルスゲノムから与えられるので、共通の担体ベクターにクローニングされた遺伝子カセットが、多様な種類のウイルスの作製のために用いられる。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、環状ゲノムＤＮＡを有するバキュロウイルスを採用しており、バクテリオファージλ（Genebank: NC 001416）由来のInt/att機構を部位特異的組換機構に採用している。Int/att機構では、ウイルスゲノムＤＮＡ断片内のattR部位特異的組換部位が、λインテグラーゼ組換酵素と、コファクター（a co-factor）としてのＩＨＦと、Xisとの存在下において、担体ベクター由来の所望のゲノム材料を有する対応するattL部位特異的組換部位と反応して、attB部位及びattP部位を含むベクターＤＮＡ断片となる（see Hartley JL. Genome Research、 2000、 Vol. 10、 1788-1795）。その他にも、例えば、バクテリオファージＰ１由来のCre/loxP機構や、酵母２μ環状プラスミド由来のFLP-FRT機構といった多様な生物由来の組換機構を採用することができる。
【００２８】
混合物が直接、所望の組換ウイルスを発現すると見込まれる好適な宿主に導入するときは、attB1−「所望のゲノム材料」−attB2を含む環状ウイルスゲノムＤＮＡのみが複製を行い、ウイルス粒子を形成することができる。互いに反応することのない線状ウイルスＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ、並びに、attP部位を有する環状ウイルスＤＮＡは、複製を行うことができず、またウイルス粒子を形成することもできない。遺伝子カセットと、vBacHTSバキュロウイルスＤＮＡとの間での、生体外での部位特異的組換を図１に示す。
【００２９】
他の実施例において、vBacHTSウイルスＤＮＡは、部位特異的組換配列とBsu36I認識塩基配列とを含むように構成されており、制限酵素Bsu36Iによって処理され、２つの部位特異的部位に挟まれた線状ウイルスＤＮＡとなる。部位特異的組換によって生成された環状ＤＮＡが、効率的にウイルス粒子を形成するのに対して、前記の線状vBacHTSＤＮＡは、vBacHTSウイルスＤＮＡが、互いに異なる核酸配列を有する、２つのBsu36I認識配列において消化されるので、ウイルス粒子を形成することができない。
【００３０】
さらに他の実施形態では、部位特異的組換によって組み込まれた所望のゲノム材料を有するウイルスＤＮＡを含む反応混合物が、Sf21昆虫細胞に導入され、ウイルスパッケージング（viral packaging）が検知される。従って、本発明によれば、好適なゲノムＤＮＡを選択し増幅するための大腸菌E coli又は、酵母菌等の中間宿主を用いることなく、組換ウイルスを得ることが可能である。これにより、組換ウイルスは、宿主からの所望の遺伝子の発現に適用可能である。ＧＦＰ蛋白質及びＧＵＳ蛋白質の活性測定によって、本発明の方法が従来技術に比べてより効率的であることが示されている。従って本発明は、ゲノムプロジェクト[Wang Y. and Huang S.、 Drug Discovery Today、vol. 5、 10-16 （2000）]が完了して以来、大幅な需要の高まりを見せている遺伝子機能の研究において、非常に有用なツールとなり得るものである。
【００３１】
本発明では、発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法であって、１）少なくとも２つの部位特異的組換部位と、少なくとも１つの制限酵素認識部位とを有するウイルスゲノムＤＮＡを準備する工程と、２）少なくとも２つの部位特異的部位に隣接した、所望のゲノム材料を含む遺伝子カセットを準備する工程と、３）前記の１）において準備したＤＮＡ断片と、２）において準備した遺伝子カセットとを、生体外で反応させる工程とを含む発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法（１）が提供される。
【００３２】
本発明では、上記構築方法（１）において、制限酵素を用いて前記ウイルスゲノムＤＮＡの１つ以上の部位を消化し、線状のウイルスゲノムＤＮＡを生成する発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法（２）が提供される。
【００３３】
本発明では、上記構築方法（２）において、前記制限酵素は、ＣＣＴＮＡＧＧの塩基配列を認識する発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法（３）が提供される。
【００３４】
本発明では、上記構築方法（１）において、前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、あるいはＨＢＶである発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法（４）が提供される。
【００３５】
本発明では、上記構築方法（１）〜（４）のいずれかによって生成された、組換ウイルスベクターが提供される。
【００３６】
本発明では、所望のゲノム材料を含む組換ウイルスのスクリーニング方法であって、１）少なくとも２つの部位特異的組換部位と、少なくとも一つの制限酵素認識部位とを含むウイルスゲノムＤＮＡ断片を準備する工程と、２）少なくとも２つの部位特異的部位に隣接する所望のゲノム材料を含んだ遺伝子カセットを準備する工程と、３）発現用環状変換ウイルスベクターを含む反応混合物を生成するために、前記の１）において準備したＤＮＡ断片と、２）において準備した遺伝子カセットとを生体外で反応させる工程と、４）マルチウエルプレート内の宿主に、３）における前記反応混合物を導入する工程と、５）宿主内における発現を識別する工程とを含むスクリーニング方法（１）が提供される。
【００３７】
本発明では、上記スクリーニング方法（１）において、前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ＨＢＶの何れかであることを特徴とする所望のゲノム材料を含む組換ウイルスのスクリーニング方法。
【００３８】
本発明では、環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法であって、１）少なくとも２つの部位特異的組換部位と、少なくとも１つの制限酵素認識部位とを含むウイルスゲノムＤＮＡ断片を準備する工程と、２）少なくとも２つの部位特異的部位によって隣接された所望のゲノム材料を含む遺伝子カセットを準備する工程と、３）発現用環状組換ウイルスベクターを含む反応混合物を生成するために、１）において準備したＤＮＡ断片と、２）において準備した遺伝子カセットとを生体外で反応させる工程と、４）マルチウエルプレート内の宿主に、３）における前記反応混合物を導入する工程とを有する組換ウイルスの準備方法（１）が提供される。
【００３９】
本発明では、上記準備方法（１）において、前記ウイルスゲノムＤＮＡ断片は、動物細胞に対して非感染性であるか、複製かつウイルス粒子形成が不可能であるとともに、細菌型の複製開始点と抗生物質耐性ＤＮＡとを含んでいる環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法（２）が提供される。
【００４０】
本発明では、上記準備方法（１）において、宿主への前記反応混合物の導入は、マルチウエルプレート内で行われる環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法（３）が提供される。
【００４１】
本発明では、上記準備方法（１）において、制限酵素を用いて前記ウイルスゲノムＤＮＡの１つ以上の部位を消化し、線状のウイルスゲノムＤＮＡを生成することを特徴とする環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法（４）が提供される。
【００４２】
本発明では、上記準備方法（１）において、前記制限酵素は、ＣＣＴＮＡＧＧの塩基配列を認識することを特徴とする環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法（５）が提供される。
【００４３】
本発明では、上記準備方法（１）において、前記ウイルスは、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ＨＢＶの何れかであることを特徴とする環状ゲノムＤＮＡを有する組換ウイルスの準備方法（６）が提供される。
【００４４】
本発明では、上記準備方法（１）〜（６）いずれかによって準備された組換ウイルスが提供される。
【００４５】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、BacHTS機構を用いた遺伝子スクリーニング工程を示す図である。
図２は、BacHTSプラスミド（pBacHTS）の切断地図である。
図３は、BacHTS2プラスミド（pBacHTS2）の切断地図を示す。
図４は、BacPAK8-attR1プラスミド（pBacPAK8-attR1）の切断地図である。
図５は、BacPAK8-attR1R2プラスミド（pBacPAK8-attR1R2）の切断地図である。
図６は、BacHTS-GFPプラスミド（pBacHTS-GFP）の切断地図である。
図７は、BacHTS-Flagプラスミド（pBacHTS-Flag）の切断地図である。
図８は、BacHTS-Hisプラスミド（pBacHTS-His）の切断地図である。
図９は、BacHTS-HisGstプラスミド（pBacHTS-HisGst）の切断地図である。
図１０は、BacHTS-Gstプラスミド（pBacHTS-Gst）の切断地図である。
図１１は、BacHTS2-EGFPプラスミド（pBacHTS2-EGFP）の切断地図である。
図１２は、Entr-EGFPプラスミド（pEntr-EGFP）の切断地図である。
図１３は、vBacHTSウイルスの準備工程を示す図である。
図１４は、bBacHTS2クローンの準備工程を示す図である。
図１５は、バキュロウイルスポリヘドリンの遺伝子座の地図を示す図である。
図１６は、vBacHTSウイルスＤＮＡ及びbBacHTS2ウイルスＤＮＡのアガロースゲル電気泳動解析を説明する図である。
図１７は、vBacHTS及び遺伝子カセットを用いて、所望の組換えウイルスを準備する過程を説明する図である。
図１８は、vBacHTS機構における、ＧＦＰバキュロウイルスとＧＵＳ組換ウイルスとの活性測定結果を示す図である。
図１９は、vBacHTS機構における、ＧＦＰバキュロウイルスとＧＵＳ組換ウイルスとに対するプラーク測定を示す図である。
図２０は、bBacHTS２機構における、ＧＦＰバキュロウイルスとＧＵＳ組換ウイルスとの活性測定結果を示す図である。
図２１は、bBacHTS２システム内の、ＧＵＳバキュロウイルスとＧＵＳ組換えウイルスとの活性度測定結果を示す図である。
図２２は、マルチウエルプレート内のＧＦＰの画像及び、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
図２３は、マルチウエルプレートにおける、ＧＵＳ組換ウイルスのX-Glucを用いた酵素活性を示す図である。
図２４は、生体外における部位特異的組換の結果を示す図である。
図２５は、組換えＤＮＡを細胞に導入して、４日目Sf21細胞内のGFP-LacZ融合蛋白質の発現を表す図である。
図２６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＧＦＰ抗体を用いた、GFP-LacZ融合蛋白質発現のウエスタンブロット結果を示す図である。
図２７は、X-Gal基質を用いた、組換えウイルス（GFP-LacZ）におけるLacZ酵素活性を表す図である。
図２８は、マルチウエルプレートからの、GFP-YPKバキュロウイルスに感染したSf21細胞のイメージを示す図である。
図２９は、プロテインキナーゼ（Ｒｂ、ヒストンＨ１、ＭＢＰ）のスクリーニング結果を示す図である。
図３０は、Ｒｂ（網膜芽細胞腫）蛋白質のリン酸化反応を示す図である。
図３１は、#2-A9プロテインキナーゼによる、Ｒｂ蛋白質のリン酸化反応を示す図である。
【００４６】
本発明の最良の実施形態について以下の実施例に記載する。本発明の特許請求の範囲内にある他の実施形態は、本明細書あるいはここに開示される発明の実施を検討することにより、当業者にとって明白になるであろう。本明細書及び実施例は、実施例とともに請求項に記載される本発明の範囲及び精神に基づいて、典型例として解釈されたものであり、ここに記載する実施例は、あくまでも本発明を様々な角度から例示したものであり、決して本発明の範囲を制限するものではない。実施例において、ゲノムＤＮＡ分離、ＰＣＲ、及び配列を決定する工程等に採用した従来技術の詳細にわたる説明はなされていない。これらの従来技術は、当業者が熟知するものであり、多数の刊行物に記載されているものである。ここで参照した刊行物は、本発明の基礎として含めるものである。
【００４７】
〔実施例〕
〔実施例１：pBacHTSの作製〕
pBacHTSウイルスベクターを作製した。作製にあたり、まず、pBacPAK8（Clontech製、Genebank：U2446）のシャトルベクターのBamHI/EcoRI部位（Clontech社のGenebank：U2446）において、増幅したattR1部位と、pBacPAK8のBsu36I認識塩基配列とをクローニングして、Life Technologies（LTI）社のDH5aを形質転換させ、アンピシリンを含む寒天培地において、培養しスクリーニングすることによって、pBacPAK8-R1（図４参照）を作製した。同様に、pBacPAK8-R1のEcoRI/PacI部位配列にて、ＰＣＲで増幅されたattR2部位と、Bsu36I認識部位配列とをクローニングすることによってpBacPAK8-R1Ｒ２を生成した（図５参照）。pBacHTSを得るために、pEntr4プラスミド（Invitrogen社）のEcoR1消化断片由来のccdB遺伝子を含むＤＮＡ断片（４２７ｂｐ）をpBacPAK8-R1Ｒ２に挿入し、得られたプラスミドをDB3.1 cell（LTI社）に導入された。pBacHTSは、attR1部位とattR2部位との間に、二つの異なるBsu36I認識配列を有していた（図２）。attR1部位及びattR2部位には、λバクテリオファージ、Xis、IHF-a及び、IHF-b由来のインテグラーゼ存在下で、attL1及びattL2部位それぞれと反応する部位特異的リコンビナーゼ標的配列を含む。
【００４８】
〔実施例２：pBacHTS-6His、pBacHTS-Gst、pBacHTS-HisGst、pBacHTS-GFP及び、pBacHTS-Flagの作製〕
各種の融合蛋白質を発現する組換バキュロウイルスを作製するために、融合タグをポリヘドリンプロモーターの下流（in the back of polyhedrin promoter）に挿入した。pBacHTS-Gstは、ＧＳＴ融合蛋白質の発現ベクターを生成するために構築された。そのため、pGEX-2T（Ｇｅｎｂａｎｋ:Ｕ13850）を、Bg1IIを含むプライマー及び、BamH1 linkerを含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、BglII及びBamHIで処理して、pBacHTS／BamHI制限部位に挿入した。加えて、６個のHisリンカーをpBacHTSのBamHI部位に挿入することによってHisタグ融合蛋白質を発現するベクターを生成pBacHTS-Hisが構築された。さらにＰＣＲ増幅され、BglIIとBamHIとで処理されたＧＳＴ遺伝子をpBacHTS-HisのBamHI部位に挿入することによってpBacHTS-HisGSが構築された。一方、ＧＦＰ遺伝子をBamHIリンカーを含むプライマー及び、KpnIリンカーを含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、BamHI/KpnIを用いて消化した。その後、消化された遺伝子をpBacHTSのBamHI/KpnI制限部位に挿入し、pBacHTS-GFPを生成した。さらに、pBacHTSのBamHI/KpnI部位において、Flagタグを発現するリンカーを挿入することによって、pBacHTS-Flagを生成した（図７参照）。
【００４９】
〔実施例３：vBacHTSウイルス、vBacHTS-Hisウイルス、vBacHTS-HisGstウイルス、vBacHTS-Gstウイルス及び、vBacHTS-GFPウイルスのＤＮＡの作製〕
pBacHTSプラスミドによってポリヘドリン座位が取り除かれたバキュロウイルスは、相同的組換を用いて準備された。つまり、pBacHTSプラスミド、Bsu36I消化BacPAK6ウイルスＤＮＡ（Clontech製、#6144-1）及び、リポフェクチン（LTI製）の混合物をSf21昆虫細胞にトランスフェクト（形質移入）し、細胞内での相同的組換を促した。ＰＣＲの対象となる組換えウイルスを、二度繰り返されるプラーク測定を通して単離した。精製されたウイルスクローンをvBacHTSウイルス（配列番号１：ポリヘドリン座位の配列）と呼ぶ（図１５参照）。図１３に示されるように、pBacHTS-His（図８参照）、pBacHTS-HisGst（図９参照）、pBacHTS-GST（図１０参照）、pBacHTS-GFP（図６参照）をそれぞれ、BacPAK6ウイルスと共に導入し、vBacHTS-His（配列番号２：ポリヘドリン座位の配列）、vBacHTS-HisGst（配列番号３：ポリヘドリン座位の配列）、vBacHTS-Gst（配列番号４：ポリヘドリン座位の配列）及び、vBacHTS-GFP（配列番号５：ポリヘドリン座位の配列）を作製した（図１５参照）。得られたウイルスは、前記ポリヘドリン座位の配列以外において、野生型ＡｃＮＰＶ（ＧｅｎＢａｎｋ:ＮＣ001623）と同じである。ウイルスプラークは寒天培地から選択した。
【００５０】
〔実施例４：vBacHTS、vBacHTS-His、vBacHTS-HisGst、vBacHTS-GFP及び、vBacHTSのウイルスＤＮＡの精製〕
vBacHTSウイルスＤＮＡを単離するために、Sf21細胞を、細胞培養皿（直径１００ｍｍ）に蒔くことにより、３日後にウイルス力価が１．２×１０８ｐｆｕ／ｍｌのウイルス培養培地を作成した。そして、Sf21細胞１．２５×１０７を、再度細胞培養皿（直径１５０ｍｍ）に蒔き、２０倍の量のウイルス（ＭＯＩ＝２０）に感染させた。４８時間培養した後、一皿当たり、２５ｍｌの細胞培養培地を得た。６皿（直径１５０ｍｍ）から得た、計１５０ｍｌの細胞培養培地を、２０，０００回転／分（ｒｐｍ）で９０分間遠心分離させることによって、ウイルス粒子を沈殿させ、この沈殿したウイルス粒子をHanil, Supra22kを用いて回収した。回収したウイルス粒子を２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に懸濁させ、ショ糖濃度勾配超遠心機（Beckman SW41 rotor）を用いて、３０，０００回転／分で処理し、５０％〜４０％ショ糖溶液の層からウイルス粒子を精製した。精製されたウイルスを再度１８，０００回転／分で９０分間、遠心分離した。その後、再度ウイルス粒子の沈殿物を２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのTris-HCl、ｐＨ＝８．０、１ｍＭのEDTA）に懸濁させ、０．５％のＳＤＳ、１％のβ−メルカプトエタノール、０．２ｍｇのプロテイナーゼＫを加え、４２℃で２時間放置し、ウイルス包膜を分離した。同量のフェノール／クロロホルム溶液を用いてウイルスライセート（lysate）を二度抽出し、抽出物にエタノールを加えることにより、沈殿物である純粋なウイルスＤＮＡを得た。そして、５０単位（ユニット）の制限酵素Bsu36I（New England Bio labs 社  NEB#524）を、精製されたＤＮＡ（１０μｇ）に加えた混合物を、以下の研究に使用する前に２時間、３７℃で放置した（図１６参照）。
【００５１】
〔実施例５：遺伝子カセットの作製〕
ＧＦＰのＰＣＲ生成物をattL1とattL2部位との間に挿入しpEntr-GFP遺伝子カセットを作製した。LTI社のpEntr-Gus遺伝子カセットを使用した。
【００５２】
〔実施例６：ＧＦＰ遺伝子又はＧＵＳ遺伝子を有する、所望の組換ウイルスの作製〕
ＧＦＰ及び、Ｇｕｓを発現する組換えウイルスを、本研究では作製した。pEntr-GFP遺伝子カセット（１００ｎｇ）又は、pEntr-Gus遺伝子カセット（１００ｎｇ）を試験管に移し、４μＬのインテグラーゼ、Xis、IHF-a及び、IHF-bを含むインテグラーゼ混合物の存在下で、１００ｎｇのBsu36I処理済vBacHTSウイルスＤＮＡと２５℃、２時間反応させた。そして、Sf21細胞に、前記の反応混合物をリポフェクチン（LTI製）と共に感染させることによって、組換えウイルスを作製した。二日後、ＧＦＰ遺伝子カセットを有する昆虫細胞に、緑色蛍光が観測された。また、四日後、ほぼ全ての細胞が緑色蛍光を表した。また、感染した感染細胞内に、蛍光及びウイルス感染の症状が観測された。
【００５３】
一方、pEntr-Gus遺伝子カセットを含む混合物をSf21細胞に導入し、四日後に、さらにX-Glucを加えた。２時間反応させた後、Sf21細胞は青くなり、ＧＵＳの発現を示した（図１８参照）。前記の組換えウイルスの生産性を測定するために、四日目のウイルス培養物を拡散し、昆虫細胞に導入した。次いで、１％低融点アガロースを含む培養地を感染細胞に加えて四日後、プラークが検知された。結果、殆どのプラークが青色蛍光を表した（図１９参照）。
【００５４】
〔実施例７：組換ウイルス生産効率の測定〕
本研究では、ＧＦＰを発現する組換ウイルスを作製した。作製にあたり、pEntr-GFP遺伝子カセット１００ｎｇを、４μＬのインテグラーゼ混合物の存在下で反応させた。前記１００ｎｇのpEntr-GFP遺伝子カセットには、ＧＦＰ遺伝子及び、２００ｎｇのBsu36I処理されたvBacHTS、vBacHTS-His又は、vBacHTS-HisGstのウイルスＤＮＡが含まれており、前記４μＬのインテグラーゼ混合物には、インテグラーゼ、Xis（エグシオネーゼ）（exisionase）、IHF-a及び、IHF-bが含まれている。反応は、２５℃で６時間行われた。このようにして、得られた混合物を、組換バキュロウイルスを作製するために、リポフェクチン（LTI製）と共に、Sf21細胞に導入した。２７℃で４８時間培養した後、蛍光顕微鏡下でＧＦＰの発現が確認された。バキュロウイルスが複製された細胞が蛍光を示したことから、緑色蛍光を示した細胞を数えることによって組換ウイルスの発現効率を測定した。一方、Bsu36I及び５００ｎｇのpBacPAK-GFPで処理したBacPAK6ウイルスＤＮＡ（Clontech製）をSf21細胞に導入し、Sf21細胞内でのＧＦＰの発現を観察した。
【００５５】
【表３】
2010207231.tif 000005
【００５６】
結果、本発明のウイルス発現効率は、従来技術と比べて、はるかに高かった（表３参照）。
【００５７】
〔実施例８：組換ウイルス発現効率の測定〕
Ｇｕｓを発現する組換えウイルスを作製し、Ｇｕｓ遺伝子を発現しているプラークの数を数えた。そのために、まず、１００ｎｇのpEntr-Gus遺伝子カセットを４μＬのインテグラーゼ混合物存在下で反応させた。前記１００ｎｇのpEntr-Gus遺伝子カセットには、Ｇｕｓ遺伝子の他に、Bsu36Iにより処理されたvBacHTS、vBacHTS-His又は、vBacHTS-HisGstのウイルスＤＮＡをそれぞれ２００ｎｇずつ有しており、前記４μＬのインテグラーゼ混合物には、インテグラーゼ、エグシオネーゼ、IHF-a及び、IHF-bが含まれている。反応は、２５℃で６時間行われた。このようにして、作られた混合物をリポフェクチン（LTI社）と共にSf21細胞へ導入し、組換バキュロウイルスを生成した。ウイルス培養培地に対し、プラーク測定を行った。一方、組換えウイルスの生産性を測定するために、四日目のウイルス培養培地を拡散し昆虫細胞に導入した。続いて、前記昆虫細胞に、１％低融点アガロースを含む培地を加えた後、四日間培養した。１００μＬの０．３３％中性赤色水溶液及び、２５μＬのX-Gluc（ＤＭＳＯ １ｍｌに対し２０ｍｇ）を加えた後、染色処理を施して四日後に、Ｇｕｓ遺伝子を発現しているプラークの数を数えた（表４参照）。
【００５８】
【表４】
2010207231.tif 000006
【００５９】
結果、X-Glucで処理すると殆どのプラークが青色を表し、従来技術に比べてかなり高いＧＵＳウイルスの生成効率を示した。
【００６０】
〔実施例９：マルチウエルプレート内における、組換えウイルスの高生産的作製〕
マルチウエルプレートから所望の組換ウイルスを同時に生成するために、vBacHTSウイルスＤＮＡをBsu36I制限酵素で処理した。本研究では、組換バキュロウイルスの作製と、遺伝子発現を確認するためにＧＦＰ遺伝子カセットを採用した。前記ＧＦＰ遺伝子カセットを同時に９６ディープウエルプレート（96-deep well plate）内で培養し、自動装置で精製した。組換反応、昆虫細胞の培養及び、ウイルス感染を８チャンネル・ピペットを用いて行う間、その全工程はマルチウエルプレート内で行われた。２μＬのリコンビナーゼ及び４μＬの緩衝液の存在下で、約５０ｎｇの遺伝子カセットと、２００ｎｇのvBacHTSバキュロウイルスＤＮＡとを２５℃で１２時間反応させた。計２０μＬの反応混合物をこの反応に使用した。遺伝子カセットの挿入を検知するために、プライマーを用いて、ポリヘドリン座位増幅のためのＰＣＲ増幅を行った。
Baculo-Forwardプライマー：  5-actgttttcgtaacagttttg-3（配列番号６）
Baculo-Reverseプライマー：  5-acaacgcacagaatctagc-3（配列番号７）。
【００６１】
結果、極めて高い効率で組換ウイルスＤＮＡが作製された。一方、５μＬの組換反応混合物と、５μＬの１０％リポフェクチン希釈溶液（10% lipofectin dilates）とを混合することによってリポゾームが作製された。次に、このリポゾームは、９６ウエルプレート（ＳＰＬ）内の５０，０００のSf21細胞に導入された後、細胞を４日間培養した。１０μＬのウイルスを再度感染させた培養三日目のSf21細胞５０，０００個が蛋白質発現を示した。ＧＦＰウイルスに関しては、蛍光顕微鏡下で、緑色蛍光の発現が確認された。また、ＧＦＰウイルス感染による症状の発症も確認された。それぞれのウエルからＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて細胞を単離し、ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットでＧＦＰ発現を測定した。ＧＦＰ蛋白質に関しては、計測値が蛍光顕微鏡下で見られたパターンと類似していた（図２２参照）。
【００６２】
〔実施例１０：ＧＦＰ組換バキュロウイルスを用いた９６ウエルプレート内のLacZ遺伝子突然変異体の高生産及び酵素活性スクリーニング〕
マルチウエルプレートから同時に所望の組換バキュロウイルス（約１〜３．２ｋｂ）を作製するために、vBacHTS-GFPウイルスＤＮＡをBsu36I制限酵素で処理した。本研究では、pEntr-LacZdelの遺伝子カセットを採用した。pEntr-LacZdelの遺伝子カセットは、９６ウエルプレート内において、大腸菌E coli（約３．２ｋｂ）由来のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を、ＰＣＲクローニングすることによって作製された。なお、このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、３’-末端において切除されている。具体的には、LacZの遺伝子をＰＣＲクローニングすることによってpEntr-LacZを生成し、その後、ExoIII/S1ディリーションキット（ExoIII/S1 deletion kit）（#K0421）（Fermentas製）を用いて、pEntr-LacZを処理することによってpEntr-LacZdelを作製した。この全工程は、組換反応、昆虫細胞の培養及び、ウイルス感染を、８チャンネルピペットを用いて行うのと同時に、マルチウエルプレート内で行われた。２μＬの組換物及び４μＬの緩衝液の存在下で、５０ｎｇの遺伝子カセット及び２００ｎｇのvBacHTSバキュロウイルスＤＮＡを２５℃で１２時間反応させた。計２０μＬの反応混合物がこの反応に使用された。遺伝子カセットの挿入を検知するために、一対のプライマー（actgttttcgtaacagttttg 及び acaacgcacagaatctagc）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ポリヘドリン座位を増幅した。結果、極めて高い効率で組換ウイルスが作製された（図２５参照）。一方、５μＬの組換反応混合物と、５μＬの１０％リポフェクチン希釈液とを混合しリポゾームを作製した。このリポゾームは、９６ウエルプレート（ＳＰＬ）内のSf21細胞５０，０００個に導入され、細胞を４日間培養された（図２６参照）。ＧＦＰ融合蛋白質の発現を測定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及び、ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った（図２６参照）。
【００６３】
遺伝子活性をスクリーニングするために、β−ガラクトシダーゼの展開液として、X-Gal（ＤＭＳＯ １ｍＬに対し２５ｍｇ）１．５μＬを、最初の感染から三日間培養したウイルスを含むそれぞれのウエルに加えた。１２時間反応を行った後、２個のウエルにおいて、β−ガラクトシダーゼ活性を有するウイルスを検知した（図２７参照）。
【００６４】
〔実施例１１：９６ウエルプレート内での組換バキュロウイルスを用いた非相同性遺伝子の高発現、及び酵素活性のスクリーニング〕
本研究では、１２４個のプロテインキナーゼ遺伝子を有するS. cerevisieを採用した。S. cerevisieゲノムから１１２個の遺伝子カセットを得るために、遺伝子特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅と、クローニングとを行った。前記遺伝子カセットの組換と、vBacHTS-GFPベクターＤＮＡとにより組換バキュロウイルスを生成した。それぞれの組換ウイルスが、融合した蛋白質に応じて、特有の蛍光を表した（図２８参照）。また、ヒトｃＤＮＡを３２個有する組換バキュロウイルスも同様に作製された。
【００６５】
まず、細胞を前記のウイルスに感染させ、三日間培養した。細胞を溶解させるために、緩衝液を使って細胞ライセートを生成した。ヒストンＨ１基質、ＭＢＰ（ミエリン塩基性蛋白質）基質及び、Ｒｂ基質に対してプロテインキナーゼ活性を示すウイルスをスクリーニングした。１０μＭのＡＴＰと、０．２μＣｉのＰ３２−δ−標識ＡＴＰ（ガンマ、Ｐ３２ ＡＴＰ）と、２μＬのリン酸塩バッファー［２００ｍＭのＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＧＴＡ及び、１０ｍＭのＤＴＴ］の存在下で、２μｇの蛋白質基質（ヒストンＨ１、ＭＢＰ及びＲｂ）を１０μＬの細胞抽出物と３０℃で１０分間反応させた。１２０μＬの１％リン酸溶液を加えて反応を止めた後、反応混合物をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ製、#MAIP-N45）に導入した。その後、洗浄剤［１０ｍＭのＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌ］で、前記ＰＶＤＦ膜を４回洗い、乾燥させ、その後室温でホスホスクリーン（phosphoscreen）に露出し、ホスホイメージャー（ＭＤ社又はＦｕｊｉ社製）を使って、シグナルを検知した。結果、いくらかのウイルスでプロテインキナーゼ活性の増加が観察された（図２９参照）。続いて、蛋白質のリン酸化反応の特異性を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動解析を行った。このとき、細胞抽出物の濃度を変えると同時に、細胞抽出物に含まれるプロテインキナーゼ濃度に対するＲｂ蛋白質リン酸化レベルを測定した。結果、プレート#2-D３蛋白質及び、プレート#2-A9蛋白質を発現するバキュロウイルスの細胞抽出物においてのみ、濃度に合わせるようにＲｂ蛋白質リン酸化が増加した（図３０参照）。一方、プレート#2-D1蛋白質及び、プレート#2-D２蛋白質は、非常に弱いリン酸化活性を見せた。プレート#2-D1蛋白質及び、プレート#2-D2蛋白質からの陽性信号は、Ｒｂ蛋白質リン酸化反応よりも自動リン酸化活性によるものだと言うことが確認された。プレート#2-D3蛋白質及び、プレート#2-A9蛋白質によるＲｂ蛋白質リン酸化は、前記Ｒｂ蛋白質のリン酸化が基質と酵素との濃度に依存すると言う典型的な蛋白質リン酸化パターンを示した（図３１参照）。したがって、本発明によれば、本発明の高生産性機構から得たバキュロウイルスライブラリーから、新種の有用な蛋白質を見つけ出すことが出来る。
【００６６】
〔実施例１２：pBacHTS２及び、pBacHTS２-GFPの作製〕
複製が可能であり、かつ、生体外での組換反応に適用可能なvBacHTS２ウイルス（配列番号８：ポリヘドリン座位配列）を生成するために、pBacHTS２のバキュロウイルス導入ベクターが作製された。得られたvBacHTS２ウイルスの配列は、前記ポリヘドリン座位配列以外において、野生型ＡｃＮＰＶ（ＧｅｎＢａｎｋ:ＮＣ001623）のものと同じであった。前記pBacHTS２は、attR1部位とattR2部位との間にあるBsu36I制限酵素認識部位に、ＢＡＣベクター由来の複製開始点及びＣｍＲ（クロラムフェニコール耐性遺伝子）を有していた。したがって、前記pBacHTS２は、バクテリア内での複製が可能なＢＡＣベクターの一種であった。ＢＡＣベクター由来の複製開始点とＣｍＲとを、所望の遺伝子カセットに置き換えることで、vBacHTSウイルスが生体外において生成される。
【００６７】
pBacHTS２を作製するために、まず、ＢＡＣ（細菌性人工染色体）ベクター複製開始点及びＣｍＲを有する６．５ｋｂのＤＮＡ断片を作製した。pBACe3.6（Ｇｅｎｂａｎｋ:Ｕ80929）を鋳型として使用した。そして、１０ｐｍｏｌｅのBsu36I認識配列を有する一対の配列、２００μＭのdNTPs、及び、２．５ＵのＰｆｕターボポリメラーゼ（ストラタジーン製）を用いて、ＰＣＲサイクラー（アプライドバイオシステム製、Gene Amp PCR System 2700）で、ＰＣＲ増幅を行った。計５０μＬの反応混合物を使用した。ＰＣＲを２０サイクル（９５℃でのＤＮＡ変性を３０秒間、６０℃でのＤＮＡ伸長を３０秒間、７２℃でのＤＮＡ増幅を７分間）行った。６．５ｋｂのＤＮＡ断片及び、vBacHTSベクターのＰＣＲ生成物をBsu36Iで消化し、Ｔ４リガーゼの存在下、１６℃で一晩反応させた。反応後の混合物を使い、大腸菌E coli（DH5a）を形質転換し、その後、pBacHTS２を作成するために、クロラムフェニコール（Ｃｍ）及びアンピシリン（Ａｍｐ）（選出用）培養培地を用いて培養した。同様に、Bsu36I処理済ＰＣＲ生成物である６．５ｋｂのＤＮＡ断片を、pBacHTS-GFPベクターのBsu36I部位に挿入することにより、pBacHTS２-GFPベクターを得た。
【００６８】
〔実施例１３：部位特異的組換部位を有するウイルスの作製〕
細菌内で複製される相同的組換を用いて、バキュロウイルスは準備された。つまり、この相同的組換体は、pBacHTS2プラスミドと、Bsu36I消化BacPAK6ＤＮＡと、リポフェクチン（LTI製）との混合物を導入することによって、Sf21細胞内で誘発された。感染細胞を、２７℃で４日間培養し、１００ｍｍ皿内において５×１０６のSf21細胞に導入した。これにより、ウイルスの高い力価を得た。２ｍｌの５０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）６０００を細胞培養培地に加えた後の遠心分離によって、ウイルス粒子の沈殿物を生成した。次いで、プロテイナーゼＫを、４２℃の混合物に加え、２時間放置することによって、ウイルスエンベロープを取り除いた。同量のフェノール／クロロホルムを用いて、ウイルスライセートを二度抽出し、エタノールを加えた。これにより、沈殿・精製されたvBacHTS２ウイルスＤＮＡを得た。その後、DH10B細胞株（LTI製）を、マイクロパルサー（MicroPulser）（Bio-Rad社）を用いて、前記の精製されたＤＮＡで形質転換し、次に、Ｃｍ含有の培養培地で培養することによって、バクテリアコロニーを形成させた。そして、１Ｌの２×ＹＴ培地（１Ｌにつき、１０ｇの酵母エキス粉末、１６ｇのトリプトン、５ｇのNaCl）でバクテリアを培養し、その後、ＤＮＡを精製してbBacHTS２と命名した（図１６）。したがって、この方法によれば、ウイルスＤＮＡを昆虫細胞で培養することなく、バクテリア培養培地から得ることができるので、所要時間とコストの大幅な削減が可能になる。精製された１０μｇのＤＮＡを、５０単位（ユニット）のBsu36Iを用いて、３７℃で５時間消化した後、８０℃で２０分間加熱してBsu36I酵素を不活性化した。同様に、vBacHTS2-GFP（配列番号９：ポリヘドリン座位配列）を相同的組換によってpBacHTS2-GFPベクターから準備し、エレクトロポレーションによってDH10Bに導入した。ＤＮＡは精製され、bBacHTS2-GFPと命名された（図１６参照）。vBacHTS2-GFPウイルスの配列は、前記ポリヘドリン座位配列以外において、野生型ＡｃＮＰＶ（ＧｅｎＢａｎｋ:ＮＣ001623）のものと同じであった。
【００６９】
〔実施例１４：バクテリアから生成されたvBacHTS2ＤＮＡ及びvBacHTS2-GFPＤＮＡを用いた、所望の組換ウイルスの作製準備〕
１μＬのインテグラーゼ混合物の存在下において、５０ｎｇのpEntr-GFP及びpEntr-Gus遺伝子カセットを、２００ｎｇのBsu36I処理済vBacHTS２ウイルスＤＮＡと、２５℃で１２時間、生体外で反応させた。pEntr-GFP遺伝子カセットの代わりにpEntr-Gus遺伝子カセットを使い、同様の反応を行った。前述の実施例と同様のＰＣＲ反応を行った。テンプレートとしての反応混合物、及び、ウイルスポリヘドリン座位を増幅する一対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、組換反応があったかどうかを確認した。１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、Bioneerプレミックスキット（Bioneer premix kit）のチューブ一本とを用いて、計２０サイクルのＰＣＲを行った。各サイクルのＰＣＲは、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分間行った。ＰＣＲ反応を完了した後、１％アガロースゲルで、ＰＣＲ生成物を電気泳動し、組換作業の効率（efficient performance）を確認した。遺伝子カセット反応混合物を、５μＬのリポフェクチン（ＬＴＩ）と共に、Sf21細胞へと導入し、バキュロウイルスを得た。ＧＦＰ遺伝子カセット反応混合物を導入してから二日後に、昆虫細胞内で、緑色蛍光が観察された。さらに、導入後四日目に殆どの細胞が、緑色蛍光を表した（図２５）。緑色蛍光及び感染症状を確認するために、Sf21細胞を、再度ウイルス培養培地を感染させた。同様に、pEntr-Gus遺伝子カセットを、Bsu36I処理済vBacHTS2ＤＮＡと２５℃で１２時間反応させた。その後、得られた反応混合物をSf21細胞に導入し、２７℃で４日間培養した。培養した細胞に、６μＬのX-Gluc（DMSO １ｍｌに対し２０ｍｇ）を加えると、培養培地全体で強い青色を表し、Ｇｕｓ遺伝子の発現だけでなく、Ｇｕｓ遺伝子を有する組換えウイルスが効率的に生成されたことも示した。
【００７０】
〔産業上の利用の可能性〕
前記のように、本発明によれば、より速く、より簡単に組換ウイルスを生成することが出来る。また、高い効率で高力価ウイルスを得ることが出来る。本発明では、部位特異的組換を生体外で行うので、ウイルスゲノムのどの目的部位にも正確に所望の遺伝子を挿入することが可能であり、また膨大な量のウイルスを同時に生成することが可能である。したがって、本発明を高生産性機構に適用し、遺伝子機能研究に用いる数百あるいは数千のウイルスを同時に生成したり、いくつかの組換ウイルスを生成することが可能である。さらに本発明により、組換バキュロウイルスライブラリーを構築し、前記バキュロウイルスライブラリーを、所望のゲノム材料のスクリーニングに利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】BacHTS機構を用いた遺伝子スクリーニング工程を示す図である。
【図２】BacHTSプラスミド（pBacHTS）の切断地図である。
【図３】BacHTS2プラスミド（pBacHTS2）の切断地図を示す。
【図４】BacPAK8-attR1プラスミド（pBacPAK8-attR1）の切断地図である。
【図５】BacPAK8-attR1R2プラスミド（pBacPAK8-attR1R2）の切断地図である。
【図６】BacHTS-GFPプラスミド（pBacHTS-GFP）の切断地図である。
【図７】BacHTS-Flagプラスミド（pBacHTS-Flag）の切断地図である。
【図８】BacHTS-Hisプラスミド（pBacHTS-His）の切断地図である。
【図９】BacHTS-HisGstプラスミド（pBacHTS-HisGst）の切断地図である。
【図１０】BacHTS-Gstプラスミド（pBacHTS-Gst）の切断地図である。
【図１１】BacHTS2-EGFPプラスミド（pBacHTS2-EGFP）の切断地図である。
【図１２】Entr-EGFPプラスミド（pEntr-EGFP）の切断地図である。
【図１３】vBacHTSウイルスの準備工程を示す図である。
【図１４】bBacHTS2クローンの準備工程を示す図である。
【図１５】バキュロウイルスポリヘドリンの遺伝子座の地図を示す図である。
【図１６】vBacHTSウイルスＤＮＡ及びbBacHTS2ウイルスＤＮＡのアガロースゲル電気泳動解析を説明する図である。
【図１７】vBacHTS及び遺伝子カセットを用いて、所望の組換えウイルスを準備する過程を説明する図である。
【図１８】vBacHTS機構における、ＧＦＰバキュロウイルスとＧＵＳ組換ウイルスとの活性測定結果を示す図である。
【図１９】vBacHTS機構における、ＧＦＰバキュロウイルスとＧＵＳ組換ウイルスとに対するプラーク測定を示す図である。
【図２０】bBacHTS２機構における、ＧＦＰバキュロウイルスとＧＵＳ組換ウイルスとの活性測定結果を示す図である。
【図２１】bBacHTS２システム内の、ＧＵＳバキュロウイルスとＧＵＳ組換えウイルスとの活性度測定結果を示す図である。
【図２２】マルチウエルプレート内のＧＦＰの画像及び、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図２３】マルチウエルプレートにおける、ＧＵＳ組換ウイルスのX-Glucを用いた酵素活性を示す図である。
【図２４】生体外における部位特異的組換の結果を示す図である。
【図２５】組換えＤＮＡを細胞に導入して、４日目Sf21細胞内のGFP-LacZ融合蛋白質の発現を表す図である。
【図２６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＧＦＰ抗体を用いた、GFP-LacZ融合蛋白質発現のウエスタンブロット結果を示す図である。
【図２７】X-Gal基質を用いた、組換えウイルス（GFP-LacZ）におけるLacZ酵素活性を表す図である。
【図２８】マルチウエルプレートからの、GFP-YPKバキュロウイルスに感染したSf21細胞のイメージを示す図である。
【図２９】プロテインキナーゼ（Ｒｂ、ヒストンＨ１、ＭＢＰ）のスクリーニング結果を示す図である。
【図３０】Ｒｂ（網膜芽細胞腫）蛋白質のリン酸化反応を示す図である。
【図３１】#2-A9プロテインキナーゼによる、Ｒｂ蛋白質のリン酸化反応を示す図である。
【図１】
2010207231.tif 000007
【図２】
2010207231.tif 000008
【図３】
2010207231.tif 000009
【図４】
2010207231.tif 000010
【図５】
2010207231.tif 000011
【図６】
2010207231.tif 000012
【図７】
2010207231.tif 000013
【図８】
2010207231.tif 000014
【図９】
2010207231.tif 000015
【図１０】
2010207231.tif 000016
【図１１】
2010207231.tif 000017
【図１２】
2010207231.tif 000018
【図１３】
2010207231.tif 000019
【図１４】
2010207231.tif 000020
【図１５】
2010207231.tif 000021
【図１７】
2010207231.tif 000022
【図１６】
2010207231.tif 000023
【図１８】
2010207231.tif 000024
【図１９】
2010207231.tif 000025
【図２０】
2010207231.tif 000026
【図２１】
2010207231.tif 000027
【図２２】
2010207231.tif 000028
【図２３】
2010207231.tif 000029
【図２４】
2010207231.tif 000030
【図２５】
2010207231.tif 000031
【図２６】
2010207231.tif 000032
【図２７】
2010207231.tif 000033
【図２８】
2010207231.tif 000034
【図２９】
2010207231.tif 000035
【図３０】
2010207231.tif 000036
【図３１】
2010207231.tif 000037
【配列表】
2010207231000001.app