(57)【要約】【課題】多孔質基材上に均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含むスフェロイド複合体を提供する。【解決手段】細胞接着性の多孔質基材と、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上と、前記基板上の疎水性領域に形成されたスフェロイドと、を含むスフェロイド複合体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板と、
前記基板上の疎水性領域に形成されたスフェロイドと、
を含むスフェロイド複合体。
【請求項２】
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する、請求項１に記載のスフェロイド複合体。
【請求項３】
前記多孔質基材は、生分解性化合物および細胞外マトリクスの少なくとも一方を含む請求項１または請求項２に記載のスフェロイド複合体。
【請求項４】
前記多孔質基材は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、レクチン由来の接着タンパク質、ポリリジン、および接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種を含む請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のスフェロイド複合体。
【請求項５】
前記疎水性領域は前記多孔質基材上にアレイ状に形成されている請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のスフェロイド複合体。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のスフェロイド複合体の２以上が積層された多層型スフェロイド複合体。
【請求項７】
細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種することと、
播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを前記基板上の疎水性領域に形成させることと、
を含むスフェロイド複合体の製造方法。
【請求項８】
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する、請求項７に記載のスフェロイド複合体の製造方法。
【請求項９】
前記多孔質基材は、生分解性化合物および細胞外マトリクスの少なくとも一方を含む請求項７または請求項８に記載のスフェロイド複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記多孔質基材は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、レクチン由来の接着タンパク質、ポリリジン、および接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種を含む請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載のスフェロイド複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記多孔質基材は、温度応答的に性状が変化する温度応答性層上に配置されている請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載のスフェロイド複合体の製造方法。
【請求項１２】
前記疎水性領域は前記多孔質基材上にアレイ状に形成されている請求項７〜請求項１１のいずれか１項に記載のスフェロイド複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイド複合体およびその製造方法、ならびに多層型スフェロイド複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の細胞培養では、二次元的な平面培養であるため、多くの細胞が立体的に凝集している生体器官とは、組織形態だけでなく機能の発現においても大きな差異が存在する。このような理由から、近年、ヒトを含めた動物の組織細胞を三次元的に培養し、培養細胞によって生体の器官様構造体を再構築しようとする試みが検討されはじめている。そのための三次元細胞培養方法として、細胞をコラーゲンゲル内に包埋して三次元的に培養する方法やスフェロイド形成法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、通液性を有する糸を用いた通液性細胞培養担体が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平７−７９７７２号公報
【特許文献２】特開平７-２９８８７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の三次元細胞培養法であるコラーゲンゲル培養法や、特許文献１に記載のスフェロイド形成法の場合には、培養細胞の三次元構造体が大きくなるにつれて、内側の細胞に栄養分を供給することが困難になるという問題があった。また、同時にそれらの細胞の分泌する細胞代謝物（有益な生理活性物質と有害となる老廃物）を外側へ放出することができなくなることがあり、このため、従来方法で構築した細胞の三次元構造体の場合には、培養時間が長くなるに従って、内側の細胞が壊死してしまう場合があった。
また、上記特許文献２に記載の培養担体では、担体全体に細胞が接着して細胞の足場となるため、細胞の三次元凝集体を空間的に凝集してしまい、長期間にわたって細胞機能を高い状態のまま維持培養することが難しいという問題があった。
本発明は、多孔質基材上に均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含むスフェロイド複合体およびその効率的な製造方法、ならびに該スフェロイド複合体が積層された多層型スフェロイド複合体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様は、細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板と、前記基板上の疎水性領域に形成されたスフェロイドと、を含むスフェロイド複合体である。
【０００５】
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有することが好ましい。
また前記多孔質基材は、細生分解性化合物および細胞外マトリクスの少なくとも一方を含むことが好ましく、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、レクチン由来の接着タンパク質、ポリリジン、および接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種を含むことがより好ましい。
さらに前記疎水性領域は前記多孔質基材上にアレイ状に形成されていることもまた好ましい。
【０００６】
また本発明の第２の態様は前記スフェロイド複合体の２以上が積層された多層型スフェロイド複合体である。
【０００７】
本発明の第３の態様は、細胞接着性の多孔質基材と、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、細胞を播種することと、播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを前記基板上の疎水性領域に形成させることと、を含むスフェロイド複合体の製造方法である。
【０００８】
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有することが好ましい。
また前記多孔質基材は、細生分解性化合物および細胞外マトリクスの少なくとも一方を含むことが好ましく、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、レクチン由来の接着タンパク質、ポリリジン、および接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種を含むことがより好ましい。
また前記多孔質基材は、温度応答的に性状が変化する温度応答性層上に配置されていることが好ましい。
さらに前記疎水性領域は前記多孔質基材上にアレイ状に形成されていることもまた好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多孔質基材上に均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含むスフェロイド複合体およびその効率的な製造方法、ならびに該スフェロイド複合体が積層された多層型スフェロイド複合体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のスフェロイド複合体は、細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板と、前記基板上の疎水性領域に形成されたスフェロイドとを含むものである。
かかるスフェロイド複合体においては、多孔質基材上に均一な大きさのスフェロイドが形成されるため、スフェロイドの維持性がより良好になる。
【００１１】
本発明のスフェロイド複合体は、後述するスフェロイド複合体の製造方法で製造されることが好ましい。これにより、スフェロイドの大きさをより効率的に均一化することができ、より良好な維持性を有するスフェロイド複合体となる。
本発明のスフェロイド複合体の詳細については、スフェロイド複合体の製造方法と併せて後述する。
【００１２】
本発明の多層型スフェロイド複合体は、前記スフェロイド複合体の２以上が、積層されて形成されたものである。これにより均一な大きさを有する複数のスフェロイドが３次元的に配置された多層型スフェロイド複合体を得ることができる。
【００１３】
積層の方法としては、特に制限はなく通常の方法を適宜用いることができる。また、積層するスフェロイド複合体の数についても特に制限はなく、目的に応じて積層数を適宜選択することができる。
【００１４】
このようにして得られた多層型スフェロイド複合体は、均一な大きさのスフェロイドが３次元的に配置されているので、例えば、移植片として用いた場合に組織様の挙動をとりやすい。
【００１５】
本発明のスフェロイド複合体の製造方法は、細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種することと、播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを形成させることと、を含む。
かかる基板を用いることで、均一な大きさを有する複数のスフェロイドを多孔質基材上の疎水性領域に効率的に形成することができ、基板と基板上のスフェロイドとを含むスフェロイド複合体を効率よく製造することができる。
【００１６】
また本発明の製造方法で製造されるスフェロイド複合体は、多孔質基材上にスフェロイドが形成されているため、多孔質基材を通じてスフェロイドの維持に必要な物質を供給し、また不要な物質を除去することができ、スフェロイドの維持性がより良好になる。
更に前記スフェロイド複合体を複数積層して多層型スフェロイド複合体を形成した場合でも、個々のスフェロイドをより良好な状態で維持することが可能となる。
【００１７】
また、上記のような特徴を有する多層型細スフェロイド複合体を用いて細胞を培養することで、細胞は効率よく三次元構築体を形成して培養され、その内部構成細胞への新鮮な培養液の供給と細胞代謝物（有益な生理活性物質や、老廃物）の除去をも可能とすることができる。さらに説明すると、上記のとおり、本発明における基材は通液性を有するため、特に基材（細胞接着ドメイン層）を介して基材上およびその周囲の培養細胞に培養液を供給することができる。このため、長期間の培養により細胞数が増加した場合にも、内側の細胞が壊死するのを防ぐことができるとともに、内側の細胞のみならず、全構成細胞から、経時的に細胞代謝物（有益な生理活性物質あるいは有害な老廃物）を循環培養液中に回収することができる。つまり、本発明における基材は、生体組織における毛細血管と同様の機能を有していることになる。
このような基板と基板上に形成された培養細胞に由来する多細胞性擬集塊（スフェロイド）とからなるスフェロイド複合体は、形態的にも、機能発現の点からも生体器官のすぐれたモデルとなり、人工臓器の開発や新薬の薬効または毒性の評価系の開発、個人レベルでの抗癌剤の選択と癌の転移能評価等において経時的代謝物を回収測定できることも加え極めて有用な材料となる。
さらに、このようなスフェロイド複合体は、熱傷や褥瘡などの創傷治療用の移植体として応用も可能と考えられる。
【００１８】
本発明のスフェロイド複合体は、上記の細胞の三次元培養を効率よく行うため、培養装置として構成することもできる。その構成は、本発明のスフェロイド複合体を使用するのであれば、特に限定はない。例えば、スフェロイド複合体への培養液の通液供給を制御する手段を備えた培養装置として、構成してもよい。このような培養装置の構成としては、例えば、支持体に立設支持された、もしくは、支持体を用いずに培養容器に取付けたピペット状体もしくはスポイト状体を使用して培養液の通液供給を制御することや、この培養液の供給手段にポンプを備えてもよい。
【００１９】
さらにまた、本発明におけるスフェロイド複合体は、たとえば、栄養血管を周囲に誘導する場とすることもできる。生体の組織もしくは器官は、血管による栄養送達等が重要である。したがって、たとえば、生理活性因子や塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）等の血管新生因子（増殖因子）を兼備し、血管誘導をサポートするように、ナノストラクチャおよびマイクロストラクチャを制御した足場材料を組み合わせて、空間配置された細胞凝集塊内部への血管侵入を促すように作用させることで、血管形成を誘導することもできる。
そうすることで、さらに生体に近い環境とすることができて、より効率よく細胞を自己組織形成させることができる。
【００２０】
前記基板において、前記親水性領域は、後述する感光性組成物が硬化した架橋体が形成された領域であり、また前記疎水性領域は、前記親水性領域以外の領域であって多孔質基材が露出した領域である。
本発明における基板は、複数の前記親水性領域と複数の疎水性領域とが区画化されて形成された基板であることが好ましい。また前記親水性領域および疎水性領域の数、大きさおよびその形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。尚、本発明における基板およびその作製方法の詳細については後述する。
【００２１】
本発明においては、均一な大きさのスフェロイドを形成する観点から、前記複数の疎水性領域が均一な大きさおよび形状を有していることが好ましく、前記複数の疎水性領域がアレイ状に形成されていることがより好ましい。
また、大量の均質なスフェロイドを効率的に形成する観点から、前記疎水性領域を例えば円状に形成した場合の大きさとして、直径が５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜３００μｍであることがより好ましい。
【００２２】
本発明のスフェロイド複合体の作製方法は、前記基板上に、細胞を播種することと、播種された細胞を培養して、培養された細胞由来のスフェロイドを基板上の疎水性領域に形成させることを含む。
前記基板上に細胞を播種し、培養することで、前記基板上の疎水性領域に培養された細胞由来のスフェロイドを形成することができる。すなわち、前記基板上の疎水性領域にのみ細胞が配置され、親水性領域には細胞が接着しないことにより、疎水性領域の数、大きさ、およびその形状に応じたスフェロイドを形成することができる。
【００２３】
本発明において前記基板上に播種する細胞としては、接着性細胞であれば、種および由来組織は特に限定されない。例えば、生体より採取した直後の細胞および癌化した樹立細胞系等を挙げることができ、好ましくは特定の臓器の機能発現および病態に関連する細胞である。より具体的には、薬物代謝に関連する肝実質細胞、血糖値制御に関連する膵臓β細胞、骨再生に関連する骨芽細胞、軟骨細胞、神経伝達にかかわる神経幹細胞、発毛に関連する毛母細胞、がん細胞、繊維芽細胞、および様々な細胞へ分化誘導できる胚性幹細胞、及び間葉系幹細胞等を挙げることができる。またこれら細胞と相互作用する非実質細胞も用いることができる。
【００２４】
各種細胞の培養には、通常使用される培地を使用することができる。培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地であればよく、例えば、イスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地等の血清を含まない各種の基礎培養液（標準培養液）を挙げることができる。
この培地には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常５容量％〜１０容量％とすることができる。また、適宜、各種ビタミンやストレプトマイシン等の抗生物質（ＡＢ）を添加したものであってもよい。
【００２５】
各種細胞の培養条件は、細胞に応じて適宜選択することができる。例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養条件を適用することができる。
また各種細胞由来のスフェロイドの形成においては、通常の培養条件で２時間〜２日程度培養を行うことでスフェロイドを形成することができる。
【００２６】
前記基板上に、各種細胞を播種する方法に特に制限はなく通常の方法を適宜用いることができる。また播種する胚性幹細胞の密度については、スフェロイドが形成可能であれば特に制限はなく、基板の大きさ、疎水性領域の数及び大きさ等に応じて適宜選択することができる。例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることができ、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。
【００２７】
本発明において前記基板上で細胞を培養する期間としては、細胞が基板上の疎水性領域にスフェロイドを形成可能な期間以上であれば特に制限はない。スフェロイドの形成に要する期間としては、通常の培養条件であれば例えば、数十分〜４８時間である。
【００２８】
本発明において各種細胞由来のスフェロイドの形成は、形態観察に基づいて判断することができる。すなわち、播種された細胞は、培養期間の経過に伴って、疎水性領域上に集合し、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成する。
【００２９】
本発明のスフェロイド複合体の製造方法によれば、均一な大きさで且つ大量のスフェロイドが基板上に形成されたスフェロイド複合体を得ることができる。均一な大きさで形成されたスフェロイドは、その性質もほぼ均質なものであるため、種々の挙動において同様の傾向を示すことができる。
【００３０】
本発明における基板上には、必要に応じて前記疎水性領域に予めフィーダー細胞を配置することができる。すなわち本発明においては、本発明の基板上の疎水性領域にフィーダー細胞層を形成し、形成されたフィーダー細胞層上で、各種細胞を培養することができる。
予めフィーダー細胞層を形成することで、各種細胞由来のスフェロイド形成がより効率的に進行し、スフェロイドの安定性が向上する。前記フィーダー細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、血管内皮細胞（例えば、大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞」）、繊維芽細胞等を挙げることができる。
【００３１】
本発明のスフェロイド複合体の製造方法においては、基板の作製効率および取り扱い性の観点から、細胞接着性の多孔質基材が仮支持体上に形成されていることが好ましい。
【００３２】
すなわち本発明のスフェロイド複合体の製造方法は、仮支持体上に配置された細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種することと、播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイド前記基板上の疎水性領域に形成させて、仮支持体上にスフェロイド複合体を形成することと、前記スフェロイド複合体と前記仮支持体とを分離することと、を含むことが好ましい。
【００３３】
本発明において前記スフェロイド複合体と前記仮支持体とを分離する方法としては特に制限なく通常の方法を用いることができる。例えば、多孔質基材として生分解性の多孔質基材を用いることで、数日間培養することで生分解性の多孔質基材の一部が分解し、スフェロイド複合体と仮支持体とを分離することができる。また、培養条件を弱酸性もしくは弱アルカリ性とすることで生分解性の多孔質基材の一部が分解し、スフェロイド複合体と仮支持体とを分離することができる。
【００３４】
前記仮支持体の材質としては、例えば、ガラス、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン、ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等を挙げることができる。本発明においては、多孔質基材の接着性の観点から、ガラス又は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガラスであることがより好ましい。
【００３５】
また本発明において前記多孔質基材は、温度応答的に性状が変化する温度応答性層上に配置されていることが好ましく、さらに前記温度応答性層は仮支持体上に配置されていることがより好ましい。
温度応答性層上に細胞接着性の多孔質基材が配置されることにより、多孔質基材を温度応答性層上から、より容易に分離することができる。
【００３６】
前記温度応答性層は、下限臨界溶解温度以上で疎水性を示し、下限臨界溶解温度以下で親水性を示す温度応答性ポリマーを含んで構成することができる。本発明においては、細胞培養温度下（通常、３７℃）では疎水性を示し、スフェロイド複合体を仮支持体から分離する温度条件下では親水性を示す温度応答性ポリマーであることが好ましい。
前記下限臨界溶解温度は、特に限定されないが、多孔質基材の仮支持体からの分離の観点から、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。
【００３７】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは、培養細胞への障害性の観点から、下限臨界溶解温度が０〜８０℃であることが好ましく、０〜５０℃であることがより好ましい。
前記温度応答性ポリマーの具体例としては、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
【００３８】
また前記温度応答性層は、その他のポリマーを含んでいてもよい。具体的には例えば、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。
【００３９】
これらの温度応答性ポリマーは、例えばモノマーの単独重合体の下限臨界溶解温度が０〜８０℃を有するようなモノマーの単独または共重合により調製される。モノマーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ−(またはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられる。
また、培養する細胞の種類によって下限臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、温度応答性層と仮支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、温度応答性層の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してもよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である
【００４０】
本発明において仮支持体上に温度応答性層を配置する方法としては特に制限はない。例えば、仮支持体としてガラスを用いる場合、ガラス基材をシランカップリング剤で表面処理した後、ガラス基材上に温度応答性ポリマーを構成するモノマーを含む感光性組成物層を形成し、光照射等によってモノマーを重合することで、ガラス基材上に温度応答性ポリマーを含む温度応答性層を形成することができる。
前記シランカップリング剤で表面処理する方法としては、例えば、ＤＡＴＥＳ（(N,N’-diethylamino)dithiocarbamoylpropyl(triethoxy)silane）を用いて、表面処理する方法等を挙げることができる。
また、モノマーの重合方法としては、通常のラジカル重合であっても、ＲＡＦＴ重合（Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization）等であってもよい。
【００４１】
また本発明においては、前記温度応答性層を設けた基材を、さらに前述した細胞接着性タンパク質で表面処理してもよい。これによって、より効率的にスフェロイドを形成することができる。
【００４２】
本発明における基板は、細胞接着性の多孔質基材、ならびに、前記多孔質基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体の少なくとも１種を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む。
【００４３】
前記多孔質基材は、細胞接着性を有し、細胞の維持に必要な物質の透過性を有していれば特に制限なく公知の材料を用いることができる。また、多孔質基材はゲル状、ファイバー状、不織布等の如何なる形状、形態からなるものであってもよい。
例えば、ゲル状の物質からなる多孔質基材を作製する方法としては、細胞接着性の高分子化合物を溶液状態として、仮支持体上に、塗布、浸漬、またはスピンコートなど、通常用いられる液膜形成方法を用いて作製することができる。また仮支持体上で、重合性の生分解性モノマーを重合する方法で作製することもできる。
【００４４】
またファイバー状の物質からなる多孔質基材を製造する方法としては、例えば、エレクトロスピニング（ＥＬＳＰ）法を挙げることができる。ＥＬＳＰ法とは、容易にサブミクロンスケールの直径を有するファイバーを作製することを可能とする技術である。具体的には、細胞接着性の高分子化合物（例えば、ポリグリコール酸）の溶液に高電圧を印加することによって、アルミホイルなどの導電性材料上に高分子化合物溶液をスプレーして高分子化合物からなるファイバーを形成させるものである。このときファイバーの直径は、印加電圧、高分子化合物溶液の濃度、スプレーの飛散距離等を調整することで、適宜変更することができる。また、導電性材料上に連続的にファイバーを形成することで、立体的な網目をもつ３次元構造の薄膜を形成することもできる。更にこの方法によれば、ファイバーからなる薄膜の膜厚を厚くすることも可能であり、サブミクロンの網目をもつ不織布を作製することもできる。こうして作成した不織布を仮支持体（例えば、ガラス、樹脂など）上に保持または固定することができる。
【００４５】
さらに本発明においては前記多孔質基材が、織成体から形成されていてもよい。本発明において前記「ファイバー」は、一本からなる糸状のものや、これらを束ねた糸状のもの等を含んでいるが、本発明における織成体は、これら糸状のものを織り合わせたものである。ここで、前記織成体が、メッシュ体またはナノファイバーからなることを特徴とすることで、さらに効率よく細胞を三次元的に培養することができる。
また、これらの糸状のファイバーは、たとえば、数１０〜数１００μｍ径程度のもの、あるいはそれ以外のものの適宜な組み合わせにより構成することができる。糸状のファイバーや織成体については、複数種のもの、糸の径、織成体の開口メッシュの大きさ等の物理的形状や性質の異なる複数のものを適宜に用いることができる。いずれのものにおいても、三次元培養のための空間形状が形成できるようにすることが好ましい。したがって、メッシュ体の場合には、この形状があらかじめ保持されていることになる。また、例えば、メッシュ体については、そのメッシュ開口を、１０〜１０００μｍ程度にしたもの等が良好に使用されることになる。
【００４６】
本発明において多孔質基材を構成する細胞接着性の化合物としては、ゲル状またはファイバー状に形成可能で、細胞が接着できて足場とすることができるものであれば特に限定されない。
中でも前記多孔質基材は、スフェロイド複合体の生体適合性の観点から、生分解性化合物および細胞外マトリックスの少なくとも一方を含むことが好ましく、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、レクチン由来の接着タンパク質、ポリリジン、および接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましい。
【００４７】
本発明において前記多孔質基材の厚さとしては特に制限はないが、例えば、０．５μｍ〜５０００μｍとすることができ、生分解性と生体適合性の観点から、１μｍ〜５００μｍであることが好ましい。
本発明における前記多孔質基材は、スフェロイドの形成性と基板の取り扱い性の観点から、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、レクチン由来の接着タンパク質、ポリリジン、および接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種からなり、仮支持体上に膜厚１μｍ〜５００μｍで、ゲル状に形成されたものであることが好ましい。
【００４８】
前記多孔質基材上に配置された複数の親水性領域は、後述する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を硬化させて形成された領域であり、また、疎水性領域は多孔質基材が露出した領域である。
【００４９】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有することを特徴とする。
かかる構成の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性の架橋体を形成することができる。かかる親水性の架橋体は、細胞非接着性の経時安定性が良好であり、例えば、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて多孔質基材上に親水性領域と疎水性領域とが高精度に形成された基板は、該基板上で細胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特異的に細胞が接着するため、高精度に区画化された細胞集合体を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が良好であり、長期に渡って区画化された細胞凝集塊（スフェロイド）を維持することができる。
【００５０】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体において、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の含有数は３以上である。前記ポリアルキレングリコール基の含有数が２以下では、これによって形成された親水性領域の細胞非接着性の経時安定性が不十分であり、区画化された細胞集合体を長期間維持することができない。
また前記ポリアルキレングリコール基の含有数は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、４以上１６以下であることが更に好ましい。
【００５１】
本発明における前記ポリアルキレングリコール基は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
【００５２】
前記重合性置換基は、重合性の官能基そのものであっても、重合性の官能基と連結基とを含んで構成された置換基であってもよい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アジド基であることがより好ましい。
【００５３】
また前記重合性置換基における連結基としては重合性の官能基とポリアルキレングリコール基とを連結可能な基であれば特に制限はなく、例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及び水素原子から選ばれる少なくとも１種を含んで構成することができる。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
【００５４】
末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を構成するポリアルキレングリコール基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体に親水性を付与可能なポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。例えば、炭素数２〜４のアルキレングリコール構造単位（例えば、エチレンオキシ、ｎ−プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ等）を含むポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができる。
【００５５】
前記ポリアルキレングリコール基におけるアルキレングリコール構造単位は、１種のアルキレングリコール構造単位からなるものであっても、２種以上アルキレングリコール構造単位の組合せからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコール基が２種以上のアルキレングリコール構造単位の組合せからなる場合、ブロックポリマーであってもランダムポリマーであってもよい。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
【００５６】
本発明における、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基は、少なくとも３つの前記ポリアルキレングリコール基における重合性置換基が結合していない方の末端と結合し、前記ポリアルキレングリコール基を互いに連結可能なものであれば特に制限はない。結合様式としては共有結合、配位結合、イオン結合のいずれであってもよい。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
【００５７】
前記糖類としては、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、グルコース等を挙げることができる。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ペンタエリスリトール、キシリトール、ソルビトール等を挙げることができる。更に、多価カルボン酸としては、プロパントリカルボン酸、クエン酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げることができる。また、前記金属原子としては、金、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げることができる。
【００５８】
本発明においては、親水性と経時安定性の観点から、多価アルコールに由来する連結基であることが好ましく、グリセリンに由来する連結基又はペンタエリスリトールに由来する連結基がより好ましく、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、及びポリペンタエリスリトールから選ばれる化合物に由来する連結基であることが特に好ましい。
【００５９】
本発明における末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の観点から、下記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。
【００６０】
【化１】
2010063375.tif 000002
【００６１】
一般式（１）中、ｍは２〜４の整数を表すが、２又は３であることが好ましく、２であることがより好ましい。またｎは５〜１０００の整数を表すが、１０〜５００であることが好ましく、１０〜３００であることがより好ましい。
【００６２】
一般式（１）中、Ｘ１は重合性置換基を表す。本発明において前記重合性置換基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋硬化性の観点から、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される重合性置換基であることが好ましい。
【００６３】
【化２】
2010063375.tif 000003
【００６４】
一般式（３）中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表す。前記２価の連結基としてはエチレン性不飽和基とポリアルキレングリコール基とを連結可能であれば特に制限はない。例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び水素原子の少なくとも１種を含んで構成される２価の連結基を挙げることができ、カルボニル基、エステル基、アミド基、フェニレン基、炭素数２〜４のアルキレン基、から選ばれる２価の連結基又はこれらの組合せからなる２価の連結基であることが好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
【００６５】
また、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。炭素数１〜３のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。本発明においては、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋反応性の観点から、Ｒ３は水素原子又はメチル基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
【００６６】
一般式（４）におけるＬ４は２価の連結基を表すが、その定義及びその好ましい範囲は前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
【００６７】
また本発明においては、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される置換基であることが好ましい。これにより、重合性置換基の反応開始がより長波長の光照射によって可能となる。
【００６８】
【化３】
2010063375.tif 000004
【００６９】
一般式（５）中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表す。Ｌ５で表される２価の連結基は、前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また、ｉは１又は２を表す。
【００７０】
一般式（５）中、Ｒ５は置換基を表すが、一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であれば特に制限はない。中でも一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を長波長側にシフト可能な置換基であることが好ましい。具体的には例えば、ニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適に挙げることができる。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
【００７１】
また、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性と架橋反応性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【００７２】
【化４】
2010063375.tif 000005
【００７３】
一般式（２）中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表す。ｐが１のときＬ２は単結合であることが好ましく、ｐが２のときＬ２はメチレン基であることが好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは１〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
【００７４】
一般式（２）中、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す。中でも架橋反応性の観点から、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であることが好ましく、前記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることがより好ましい。
【００７５】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、経時安定性とスフェロイド形成性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表されるものであって、前記重合性置換基が前記一般式（３）、一般式（４）及び一般式（５）の少なくとも１種で表されるものであることが好ましい。
【００７６】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、下記具体例中のポリアルキレングリコールの重合度（ｎ）は分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量から算出される平均重合度を意味する。また、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
【００７７】
【化５】
2010063375.tif 000006
【００７８】
【化６】
2010063375.tif 000007
【００７９】
【化７】
2010063375.tif 000008
【００８０】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、３以上のポリエチレングリコール基を有する化合物（以下、「マルチアームＰＥＧ」ということがある。例えば、日油（株）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等）の末端水酸基に対して、重合性置換基を、通常用いられる方法を用いてエステル結合、エーテル結合等で結合することによって合成することができる。例えば、エステル結合の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で行うことができる。
【００８１】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、後述の感光性組成物の成分とすることができる。また、架橋反応により親水性の架橋体を形成することができる。
【００８２】
本発明における感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の少なくとも１種を含有することを特徴とする。かかる感光性組成物を用いることで、例えば、基材上に高精度に区画化された親水性領域と疎水性領域とを形成することができる。
前記感光性組成物においては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を１種単独で含有することもできるし、２種以上を含有することもできる。
また前記感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体に加えて、光重合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を含んで構成することができる。
【００８３】
前記光重合開始剤としては、光照射によって重合反応を開始可能なものであれば特に制限はないが、生細胞に対する障害性が低いものであることが好ましい。具体的には、例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  １８４（いずれもチバ・スペシャリティー・ケミカルズ社製）等を挙げることができ、細胞毒性と水溶性の点からＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９が好ましい。
【００８４】
前記溶剤としては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を溶解可能であれば特に制限はない。ここでいう溶解可能とは前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を質量基準で０．１％以上溶解できることをいう。
前記溶剤として具体的には、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、クロロホルム等の有機溶媒、及び水を好ましく用いることができる。また、溶剤は１種単独でも２種以上を混合して用いてもよい。
【００８５】
前記感光性組成物における前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の含有率としては、例えば０．１〜５０質量％とすることができ、０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００８６】
本発明における架橋体は、前記感光性組成物を架橋硬化させて形成されたものである。前記架橋硬化は光照射による重合反応に起因するものであれば特に制限はなく、感光性組成物に応じて適宜架橋硬化条件を選択することができる。
【００８７】
本発明における基板を作製する方法は、例えば、多孔質基材上に前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を付与して感光性組成物層を形成する工程と、前記感光性組成物層を、露光処理する硬化工程とを含むことができる。これにより、多孔質基材上に、前記架橋体が形成された基板を作製することができる。
前記基板を作製する方法は、必要に応じて、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程、乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことができる。
【００８８】
本発明において、多孔質基材上に感光性組成物層を形成する工程には、特に制限なく通常の薄膜形成方法を適用することができ、例えば、塗布法、ディップコート法、スピンコート法等を好適に適用することができる。
多孔質基材上に形成された感光性組成物層の層厚としては、特に制限はなく基板の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｍ〜１０００μｍとすることができる。なかでも、スフェロイドの形成性の観点から、１０ｎｍ〜１０００ｎｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
【００８９】
前記多孔質基材上に感光性組成物層を形成する工程は、必要に応じて、感光性組成物中の溶剤を除去する工程を含むことができる。前記溶剤を除去する工程としては、前記溶剤に応じて適宜その条件を選択することができ、常温乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい。例えば、３０〜１５０℃で１分〜１０時間とすることができ、好ましくは３５〜１２０℃で３分〜１時間である。
【００９０】
前記硬化工程における露光処理は、前記感光性組成物層を全面露光する工程であっても、所望のパターン様に部分露光する工程であってもよい。本発明においては、所望のパターン様に部分露光する工程であることが好ましく、前記部分露光する工程後に更に現像工程を含むことがより好ましい。これにより、前記架橋体からなる親水性領域と架橋体が形成されていない疎水性領域とが、パターン様に多孔質基材上に形成された基板を作製することができる。
【００９１】
前記所望のパターン様に部分露光する工程は、所望のパターン様に光透過性を有するマスク（フォトマスク）を介して、部分露光する工程であることが好ましい。また、前記マスクを感光性組成物層に密着させて部分露光を行うことにより、より高精度でパターン様に露光することができる。
【００９２】
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であれば特に制限はない。光源として例えば、Ｘ線、電子線、エキシマレーザー、キセノンランプ、メタルハライドランプ、低圧水銀ランプ及び高圧水銀ランプ等を挙げることができる。中でも低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量についても特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、２８０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、０．１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２とすることができ、１〜２００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜２０ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。
【００９３】
前記現像工程は、前記感光性組成物層における未露光領域を多孔質基材上から除去できる方法であれば特に制限はなく、例えば、溶剤を用いた洗浄、及び溶剤への浸漬等を挙げることができ、本発明においては、溶剤として水を用いる洗浄及び水への浸漬であることが好ましい。
【００９４】
本発明における基板は、例えば、架橋体からなる親水性領域と、多孔質基材が露出した疎水性領域とが区画化（パターニング）されて基材上に形成された基板として作製することにより、スフェロイド培養基板としてより好適に用いることができる。すなわち、前記疎水性領域にのみ細胞が配置され、前記親水性領域には細胞が接着しないことにより、所望のパターン様にスフェロイドを配置可能とすることができる。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００９６】
まず、本発明に用いられる分岐ポリアルキレングリコール誘導体、および該ポリアルキレングリコールを含む感光性組成物を用いて作製された基板について具体的に説明する。
（参考例１）
〜分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の合成〜
４−アジド−安息香酸１２ｇ（９３．６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの塩化チオニルに溶解し、１．５時間、加熱還流した。反応混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加えて再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し、白色固体として目的物の４−アジド−安息香酸クロリド９．３ｇ（５１．２ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.11-8.15 (2H, ｍ), 7.11-7.16 (2H, m).
【００９７】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた４−アジド−安息香酸クロリド３６３ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【００９８】
マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表１に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、参考例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表１に示した。
【００９９】
【表１】
2010063375.tif 000009
【０１００】
（参考例２）
５−アミノ−サリチル酸１５．３ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−サリチル酸を白色固体として１２．０ｇ（６７．０ｍｍｏｌ、収率＝６７％）得た。
1H-NMR(DMSO-d6) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz).
【０１０１】
得られた５−アジド−サリチル酸５ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）を塩化チオニル５０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).
【０１０２】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−サリチル酸クロリド３５８ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）１．７７ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１０３】
（参考例３）
参考例２において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＢ２０Ｋ）１．７２ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１０４】
（参考例４）
５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１８．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−２−ニトロ安息香酸を白色固体として１９．２ｇ（９２．４ｍｍｏｌ、収率＝９２％）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2H, m).
【０１０５】
得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸１．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).
【０１０６】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸クロリド４１７ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）１．８１（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).  
【０１０７】
（参考例５）
参考例４において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は参考例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＣ２０Ｋ）１．７１ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１０８】
（参考例６）
アクリロイルクロリド１８１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のベンゼン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のベンゼン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１０９】
（参考例７）
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１０】
（実施例１）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）の０．１％水溶液に、仮支持体である白切スライドガラス（松浪硝子工業（株）製、丸型２１ｍｍφ）を２時間浸漬後、乾燥して、スライドガラス上にＰＬＬからなる薄膜を形成した。ついでこれをゼラチンの０．１５％水溶液に２時間浸漬後、乾燥して、スライドガラス上にＰＬＬとゼラチンからなる多孔質基材を形成した。
【０１１１】
参考例１で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）をトルエンに溶解し、感光性組成物Ａとして４ＰＡ２０Ｋのトルエン溶液（１％）を調製した。
多孔質基材として、上記で得られた仮支持体上に設けられたＰＬＬとゼラチンからなる薄膜を用い。薄膜上に、感光性組成物Ａを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径２００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有し、仮支持体上に形成された基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１１２】
仮支持体上に形成された基板を、滅菌処理し、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む。以下使用した培地は全て同様に血清を含んでいる）を添加し、ウシ関節軟骨細胞（コンドロサイトＰ−３）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさを有する軟骨細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
スフェロイドが形成された基板を、数日間（１日〜２１日間）培養することで仮支持体から分離して、スフェロイド複合体を得た。
【０１１３】
また、４ＰＡ２０Ｋの代わりに参考例２〜５で調製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて調製した感光性組成物を用いた場合、参考例６〜７で調製したポリアルキレングリコール誘導体を用い、さらに光重合開始剤であるＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９の濃度が０．０５％となるように調製した感光性組成物を用いた場合のいずれにおいても、均一な大きさを有する軟骨細胞の細胞塊（スフェロイド）が形成されたスフェロイド複合体が得られた。
【０１１４】
（実施例２）
実施例１において、仮支持体上に形成された多孔質基材として、ＰＬＬとゼラチンからなる薄膜の代わりに、ポリ乳酸（ＰＬＡ、Ｍｎ：２０Ｋ）のトルエン溶液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を、スライドガラス上に２００μｌ滴下後、スピンコート法（２０００ｒｐｍ×３０秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させて形成したＰＬＡの薄膜を用いた以外は実施例１と同様にして、スフェロイド複合体を得た。
【０１１５】
（実施例３）
実施例２において。ＰＬＡの代わりにポリカプロラクトン（ＰＣＬ、Ｍｎ：４２．５Ｋ、Ｍｗ：６５Ｋ）を用いた以外は実施例２と同様にして、スフェロイド複合体を得た。
【０１１６】
（実施例４）
実施例２において、仮支持体上に形成された多孔質基材として、ＰＬＡからなる薄膜の代わりに、スライドガラス上にＰＬＡの薄膜を形成した後、ＰＬＬの０．１％水溶液に２時間浸漬後、乾燥して形成した、ＰＬＡ薄膜上にＰＬＬがコートされた薄膜を用いた以外は、実施例２と同様にして、スフェロイド複合体を得た。
【０１１７】
（実施例５）
実施例４において、ＰＬＡの代わりにＰＣＬを用いた以外は、実施例４と同様にして、スフェロイド複合体を得た。
【０１１８】
（実施例６）
実施例４において、ＰＬＬの０．１％水溶液の代わりにゼラチンの０．１５％水溶液を用いた以外は、実施例４と同様にして、スフェロイド複合体を得た。
【０１１９】
（実施例７）
実施例５において、ＰＬＬの０．１％水溶液の代わりにゼラチンの０．１５％水溶液を用いた以外は、実施例５と同様にして、スフェロイド複合体を得た。
【０１２０】
（実施例８）
白切スライドガラス（松浪硝子工業（株）製、丸型２１ｍｍφ）をオゾン洗浄（１５分×２回）した。これをカップリング剤ＤＡＴＥＳ（(N,N’-diethylamino)dithiocarbamoylpropyl(triethoxy)silane）１ｍｌ、クロロホルム８ｍｌ、メタノール１ｍｌ、濃塩酸８５μｌの混合溶液に３０分浸した。その後、７０℃で３０分乾燥させ、クロロホルム、メタノール、ミリＱ水で順次で洗浄後、デシケーターで減圧乾燥した。
これを無垢テフロン（登録商標）容器にいれ、１時間アルゴンガスでバブリングした４ｍｏｌ／ｌのＩＰＡＡｍ(イソプロピルアクリルアミド)のＴＨＦ溶液で満たした。空気が入らないように石英ガラスを被せて２５ｍＷ/ｃｍ２で１０分間、ＵＶ照射した。その後、メタノール、ミリＱ水で順次洗浄し、乾燥させて、温度応答性層を有する仮支持体を得た。
【０１２１】
上記で得られた温度応答性層を有する仮支持体を用い、濃度が１０ｍｇ／ｍｌであるＰＬＡ（ポリ乳酸、Ｍｎ：２０Ｋ）のトルエン溶液を、仮支持体の温度応答性層上に２００μｌ滴下し、スピンコート法（２０００ｒｐｍ×３０秒）により薄膜を形成し、乾燥させた。
次いで、フィブロネクチンの１．５μｌ／ｍｌに３７℃で２時間浸漬した。
以上により、仮支持体上に配置された温度応答性層上に、ＰＬＡとフィブロネクチンからなる多孔質基材を形成した。
【０１２２】
実施例１において、ＰＬＬとゼラチンからなる多孔質基材が形成されたスライドガラスの代わりに、上記で得られた温度応答性層上にＰＬＡとフィブロネクチンからなる多孔質基材が形成されたスライドガラスを用いた以外は、実施例１と同様にして、仮支持体上に複数の親水性領域および疎水性領域が形成された基板を作製した。
このようにして作製した基板を用いた以外は、実施例１と同様にして細胞を培養して仮支持体上にスフェロイド複合体を形成した。
次いで、仮支持体上に形成された複合体を仮支持体ごと２５℃の温度条件下におくことで、仮支持体からスフェロイド複合体を分離することができた。
【０１２３】
（実施例９）
実施例８において、ＰＬＡの代わりにＰＣＬ（ポリカプロラクトン、Ｍｎ：４２．５Ｋ、Ｍｗ：６５Ｋ）を用いた以外は実施例８と同様にしてスフェロイド複合体を作製した。
【０１２４】
（実施例１０）
実施例１と同様にして作製した基板を滅菌処理し、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ。このＢＡＥＣがパターン状に培養された基板に培地としてWILLIAMS’ MEDIUM E（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ラット初代肝細胞を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内にパターン化されたＢＡＥＣ上に均一な大きさを有する肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
スフェロイドが形成された基板を、数日間（１日〜２１日間）培養することで仮支持体から分離して、スフェロイド複合体を得た。
また、実施例１で作製した基板の代わりに、実施例２〜９と同様にして作製した基板を用いて、上記と同様にしてスフェロイド複合体をそれぞれ得た。
【０１２５】
（実施例１１）
実施例１と同様にして作製した基板を滅菌処理し、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む。以下使用した培地は全て同様に血清を含んでいる）を用い、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ。このＮＩＨ−３Ｔ３がパターン状に培養された基板に培地としてWILLIAMS’ MEDIUM E（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ラット初代肝細胞を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内にパターン化されたＮＩＨ−３Ｔ３上に均一な大きさを有する肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
スフェロイドが形成された基板を、数日間（１日〜２１日間）培養することで仮支持体から分離して、スフェロイド複合体を得た。
また、実施例１で作製した基板の代わりに、実施例２〜９と同様にして作製した基板を用いて、上記と同様にしてスフェロイド複合体をそれぞれ得た。
【０１２６】
実施例１〜実施例１１で得られたスフェロイド複合体は、いずれも多孔質基材上に、均一な大きさを有する複数のスフェロイドが形成されたものであった。
また、得られたスフェロイド複合体について、下記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド複合体中のスフェロイドが均一な大きさを維持したまま生存していることが確認された。
【０１２７】
（ＭＴＴ染色）
ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide、和光純薬製）の０．５ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｍｅｍα：ＧＩＢＣＯ社製）を調製した。
１２ウェルプレートの底面にセットしたスフェロイド含有ハイドロゲルに上記ＭＴＴ溶液２ｍｌを加えて、３時間インキュベートした。
【０１２８】
（実施例１１）
〜多層型スフェロイド複合体の作製〜
実施例１で得られたスフェロイド複合体を、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＤＭＥＭを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１日間継続した。その後、仮支持体を剥離した側同士が接触するように２層を積層して多層型スフェロイド複合体を作製した。得られた多層型スフェロイド複合体について、さらに１０日培養を継続した。
また、仮支持体を剥離した側とその反対側とが接触するように５層を積層して多層型スフェロイド複合体を作製した。得られた多層型スフェロイド複合体について、さらに１０日培養を継続した。
いずれの多層型スフェロイド複合体においても、ＭＴＴ染色によりスフェロイドが生存していることが確認された。
【０１２９】
以上から、本発明のスフェロイド複合体の製造方法によれば、多孔質基材上に均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含むスフェロイド複合体を効率的に形成することができたことが分かる。