(57)【要約】【課題】微量な反応液で、標的核酸の定量を効率よく行うことが可能な、生体試料定量用チップ及び生体試料定量方法を得る。【解決手段】マイクロリアクターアレイ１０は、既知量の標的核酸が含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための反応容器群Ａと、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための反応容器群Ｂと、検体と、既知量の内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための反応容器群Ｃ，Ｄを備え、反応容器１０４は、核酸増幅反応によって増幅された核酸の一部に結合する蛍光プローブが塗布されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる標的核酸の定量を行うための生体試料定量用チップであって、
既知量の前記標的核酸が含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための第１の反応容器群と、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための第２の反応容器群と、
前記検体と、既知量の前記内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための第３の反応容器群と、を備え、
前記第１〜第３の反応容器群は、前記核酸増幅反応によって増幅された核酸の一部に結合する蛍光プローブが塗布された複数の反応容器を備えていることを特徴とする生体試料定量用チップ。
【請求項２】
前記第１〜第３の反応容器群は、それぞれ異なる標的核酸を増幅するためのプライマーが塗布された複数の反応容器を備えていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料定量用チップ。
【請求項３】
前記第１〜第３の反応容器群は、
各々の前記反応容器に接続された反応液導入用流路と、
前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、
前記反応液導入用流路に接続された廃液収容部と、を備えていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体試料定量用チップ。
【請求項４】
前記第１の反応容器群は、一定量の前記標的核酸が塗布された複数の反応容器を備え、
前記第２及び第３の反応容器群は、一定量の前記内部標準核酸が塗布された複数の反応容器を備えていることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料定量用チップ。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料定量用チップを備えた生体試料定量用キットであって、
前記第１の反応容器群に導入するための、既知量の前記標的核酸が含まれる核酸増幅反応液と、
前記第２の反応容器群に導入するための、前記内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液と、
前記第３の反応容器群に前記検体と併せて導入するための、既知量の前記内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液と、を含むことを特徴とする生体試料定量用キット。
【請求項６】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行うための生体試料定量方法であって、
前記第１の反応容器群に既知量の前記標的核酸が含まれる核酸増幅反応液を、前記第２の反応容器群に前記内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液を、前記第３の反応容器群に前記検体と既知量の前記内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液を、それぞれ導入する第１の工程と、
核酸増幅反応を行う第２の工程と、
各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する第３の工程と、
前記第１の反応容器群と前記第２の反応容器群において測定された前記蛍光強度に基づいて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定する第４の工程と、を含むことを特徴とする生体試料定量方法。
【請求項７】
請求項４に記載の生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行うための生体試料定量方法であって、
前記第１の反応容器群及び前記第２の反応容器群に前記核酸増幅反応液を、前記第３の反応容器群に前記検体と前記核酸増幅反応液を導入する第１の工程と、
核酸増幅反応を行う第２の工程と、
各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する第３の工程と、
前記第１の反応容器群と前記第２の反応容器群において測定された前記蛍光強度に基づいて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定する第４の工程と、を含むことを特徴とする生体試料定量方法。
【請求項８】
前記第４の工程では、
前記核酸増幅反応の前後で測定された２つの蛍光強度の値を用いて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定することを特徴とする請求項６または請求項７に記載の生体試料定量方法。
【請求項９】
前記第４の工程では、
前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第１の状態、及び前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第２の状態で測定された２つの蛍光強度の値を用いて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定することを特徴とする請求項６または請求項７に記載の生体試料定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の定量などを行うための生体試料定量用チップ、生体試料定量用キット、及び生体試料定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System(マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。
【０００３】
試料として用いるＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がよく知られている。ＰＣＲ法は、ターゲットのＤＮＡと試薬を混合したものをチューブに入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、ポリメラーゼという酵素の作用により温度サイクル１回あたり、約２倍にターゲットＤＮＡだけを増幅することができる。
【０００４】
近年、特殊な蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲという方法が実用化され、増幅反応を行いながらＤＮＡの定量ができるようになった。リアルタイムＰＣＲは、測定の感度、信頼性が高いことから、研究用、臨床検査用に広く使われている。
【０００５】
特許文献１〜３には、サンプル中に含まれる標的核酸の定量方法に関する技術が記載されている。リアルタイムＰＣＲ法でＤＮＡの定量を行う場合、絶対定量法か相対定量法が用いられるが、臨床検査では主に絶対定量法が用いられる。絶対定量法では既知のコピー数の標的核酸を含んだ標準サンプルを用いて検量線を作成し、測定対象サンプルに含まれる標的拡散のコピー数（絶対量）を測定する。検量線を作成するためには、標準サンプルの希釈系列を作製し、少なくとも５点の測定データを取得して検量線をひく必要がある。この検量線の作成が作業を煩雑にし、検査コストが高くなる原因になっている。また、リアルタイムＰＣＲ法では、検体中に増幅反応を阻害する物質が存在する場合、測定結果が検量線からずれるため、信頼性が低くなる場合がある。
【０００６】
また、ＰＣＲに必要な反応液の量は数十μｌが標準的であり、さらに１つの反応系では基本的に１つの遺伝子の測定しかできないという問題があった。蛍光プローブを複数入れてその色で区別することにより４種類程度の遺伝子を同時に測定する方法もあるが、それ以上の遺伝子を同時に測定するためには反応系の数を増やすしかなかった。検体から抽出されるＤＮＡの量は一般に少量であり、また試薬も高価なため同時に多数の反応系を測定することは困難であった。反応容器を小型化する方法も提案されているが、検体液の分注精度の低下や、１つの反応容器中に含まれる標的核酸の量が少なくなるといった理由により、定量ばらつきが大きくなるという問題があった。
【特許文献１】特許第２８７８４５３号公報
【特許文献２】特許第３３３１１７８号公報
【特許文献３】ＷＯ２００５／０５９５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、微量な反応液で、標的核酸の定量を効率よく行うことが可能な、生体試料定量用チップ、生体試料定量用キット、及び生体試料定量方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る生体試料定量用チップは、検体に含まれる標的核酸の定量を行うための生体試料定量用チップであって、既知量の前記標的核酸が含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための第１の反応容器群と、前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための第２の反応容器群と、前記検体と、既知量の前記内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液を導入して核酸増幅反応を行うための第３の反応容器群と、を備え、前記第１〜第３の反応容器群は、前記核酸増幅反応によって増幅された核酸の一部に結合する蛍光プローブが塗布された複数の反応容器を備えている。
【０００９】
本発明に係る生体試料定量用チップを用いれば、第１の反応容器群には標的標準核酸、第２の反応容器群には内部標準核酸、第３の反応容器群には検体と内部標準核酸を導入して核酸増幅反応を行い、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することにより、第１及び第２の反応容器群における蛍光強度の変化から検体中の標的核酸量と蛍光変化量との関係（検量線）を得ることができる。よって、標的核酸の定量を高精度に効率よく行うことが可能である。
【００１０】
また、前記第１〜第３の反応容器群は、それぞれ異なる標的核酸を増幅するためのプライマーが塗布された複数の反応容器を備えていることが望ましい。
これにより、同時に多数種類の標的核酸の増幅及び定量を行うことができる。
【００１１】
また、前記第１〜第３の反応容器群は、各々の前記反応容器に接続された反応液導入用流路と、前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、前記反応液導入用流路に接続された廃液収容部と、を備えていることが望ましい。
【００１２】
本発明によれば、遠心力を利用して、反応容器内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理及び定量が可能となる。
【００１３】
また、前記第１の反応容器群は、一定量の前記標的核酸が塗布された複数の反応容器を備え、前記第２及び第３の反応容器群は、一定量の前記内部標準核酸が塗布された複数の反応容器を備えているようにしてもよい。
このように、各々の反応容器に必要な標的核酸及び内部標準核酸を予め塗布しておくことにより、使用時には核酸増幅反応液と検体液をそれぞれ導入するだけでよく作業が簡易になるので、導入する溶液の間違いなどが発生しにくい。
【００１４】
本発明に係る生体試料定量用キットは、本発明に係る生体試料定量用チップを備えた生体試料定量用キットであって、前記第１の反応容器群に導入するための、既知量の前記標的核酸が含まれる核酸増幅反応液と、前記第２の反応容器群に導入するための、前記内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液と、前記第３の反応容器群に前記検体と併せて導入するための、既知量の前記内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液と、を含むものである。
本発明によれば、使用時にはキットに含まれる反応液をそれぞれ対応する反応容器群に導入すればよいので、容易に増幅反応及び定量を行うことができる。
【００１５】
本発明に係る生体試料定量方法は、本発明に係る生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行うための生体試料定量方法であって、前記第１の反応容器群に既知量の前記標的核酸が含まれる核酸増幅反応液を、前記第２の反応容器群に前記内部標準核酸が既知の量含まれる核酸増幅反応液を、前記第３の反応容器群に前記検体と既知量の前記内部標準核酸が含まれる核酸増幅反応液を、それぞれ導入する第１の工程と、核酸増幅反応を行う第２の工程と、各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する第３の工程と、前記第１の反応容器群と前記第２の反応容器群において測定された前記蛍光強度に基づいて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定する第４の工程と、を含むものである。
【００１６】
また、前記第１の反応容器群が、一定量の前記標的核酸が塗布された複数の反応容器を備え、前記第２及び第３の反応容器群が、一定量の前記内部標準核酸が塗布された複数の反応容器を備えている場合には、
前記第１の反応容器群及び前記第２の反応容器群に前記核酸増幅反応液を、前記第３の反応容器群に前記検体と前記核酸増幅反応液を導入する第１の工程と、核酸増幅反応を行う第２の工程と、各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する第３の工程と、前記第１の反応容器群と前記第２の反応容器群において測定された前記蛍光強度に基づいて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定する第４の工程と、を含むものである。
【００１７】
本発明によれば、第１の反応容器群には標的標準核酸、第２の反応容器群には内部標準核酸、第３の反応容器群には検体と内部標準核酸を導入して核酸増幅反応を行い、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することにより、第１及び第２の反応容器群における蛍光強度の変化から検体中の標的核酸量と蛍光変化量との関係（検量線）を得ることができる。よって、標的核酸の定量を高精度に効率よく行うことが可能である。
【００１８】
また、前記第４の工程では、前記核酸増幅反応の前後で測定された２つの蛍光強度の値を用いて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定することが望ましい。
また、前記第４の工程では、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第１の状態、及び前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第２の状態で測定された２つの蛍光強度の値を用いて、前記検体に含まれる前記標的核酸の量を推定するようにしてもよい。
これにより、検量線の精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイ（生体試料定量用チップ）１０の概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。図に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１，１０２，１０３、反応容器１０４、反応液導入用流路１０５、廃液収容部１０６、反応液収容部１０７、反応液導入用流路１０５と廃液収容部１０６を接続する流路１０８、反応液供給口１０９を備えている。
【００２０】
図１（Ｂ）に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１，１０２，１０３を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１には、複数の反応容器１０４、反応液導入用流路１０５、反応液収容部１０７、反応液供給口１０９が形成されている。透明基板１０２には、廃液収容部１０６、流路１０８が形成されている。透明基板１０１，１０２，１０３は例えば樹脂基板とすることができ、各部は例えば射出成型により形成することができる。
【００２１】
マイクロリアクターアレイ１０には反応容器群Ａ〜Ｄが設けられている。反応容器群Ａ〜Ｄは、各々が複数の反応容器１０４、各々の反応容器１０４に接続された反応液導入用流路１０５、反応液導入用流路１０５に接続された反応液収容部１０７、及び反応液導入用流路１０５に接続された廃液収容部１０６を備えている。
【００２２】
後述するように、反応容器群Ａ（第１の反応容器群）は、標的核酸が既知の濃度で含まれる標的標準核酸溶液を導入して核酸増幅反応を行うための反応容器群である。反応容器群Ｂ（第２の反応容器群）は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な内部標準核酸が既知の濃度で含まれる内部標準核酸溶液を導入して核酸増幅反応を行うための反応容器群である。反応容器群Ｃ及び反応容器群Ｄ（第３の反応容器群）は、検体液と内部標準核酸溶液を導入して核酸増幅反応を行うための反応容器群である。
【００２３】
反応容器１０４は、例えば直径５００μｍの円形状で、深さ１００μｍに形成されている。反応液導入用流路１０５は、反応液の流れる方向に垂直な断面が、幅２００μｍ、深さ１００μｍに形成されている。隣り合う反応容器１０４間の距離は、反応容器１０４間での反応液の混合を防止できるように十分に確保されている。なお、反応容器１０４、及び反応液導入用流路１０５は、気泡の吸着を防止するため内壁面が親液性となるように表面処理を施しておくことが望ましい。また、反応容器１０４、及び反応液導入用流路１０５の内壁面にはタンパク質などの生体分子の非特異吸着を抑制する表面処理が施されていることが望ましい。
【００２４】
また、各々の反応容器１０４には蛍光プローブが塗布されている。蛍光プローブは、ＰＣＲ反応によって増幅された標的核酸の一部に結合し、内部標準核酸と標的核酸を識別して蛍光変化を示すものであればよく、Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｈｙｂ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）などを利用することができる。
【００２５】
廃液収容部１０６は、反応液導入用流路１０５と流路１０８を介して接続されている。廃液収容部１０６には、後述するように、反応液導入用流路１０５に充填された反応液が排出されるため、反応液導入用流路１０５の容積よりも大きな容積を有していればよい。流路１０８は透明基板１０２を垂直に貫通するように設けられている。
【００２６】
また、透明基板１０１，１０２，１０３の互いに接触する面が撥液性を有するように表面処理を施したり、接触面にシール性を持たせたりすることにより、反応容器１０４から反応液が漏れ、基板表面を伝わって別の反応容器１０４に入ることを防ぐことができる。具体的には接触面をシリコーンゴムやフッ素樹脂でコートするなどの方法が考えられる。
【００２７】
次に、マイクロリアクターアレイ１０に反応液を充填する方法を説明する。まず、反応容器群Ａ〜Ｄの各反応液収容部１０７に、反応液供給口１０９からピペット等を用いて反応液を供給する。
【００２８】
反応容器群Ａの反応液収容部１０７に供給する反応液には、標的核酸が既知の濃度で含まれる標的標準核酸溶液と、核酸増幅反応液が含まれる。核酸増幅反応液には、反応に適した濃度のポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が含まれる。
【００２９】
反応容器群Ｂの反応液収容部１０７に供給する反応液には、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な内部標準核酸が既知の濃度で含まれる内部標準核酸溶液と、核酸増幅反応液が含まれる。
【００３０】
また、反応容器群Ｃ，Ｄの反応液収容部１０７に供給する反応液には、検体液と内部標準核酸溶液、核酸増幅反応液が含まれる。検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡなどを用いることができる。反応容器群Ｃ及び反応容器群Ｄに供給する反応液には、それぞれ異なる検体が含まれる。
【００３１】
また、プライマーは核酸増幅反応液に含まれていてもよいし、各反応容器１０４内に、予め塗付され乾燥状態で収容されていてもよい。また、反応容器群Ａ〜Ｄを構成する各々の反応容器１０４には、それぞれ異なるプライマーを塗付しておいてもよい。これにより、同時に多数種類の標的核酸のＰＣＲが行えるようになっている。ただし、反応容器群Ａ〜Ｄ間で対応する反応容器１０４には同一のプライマーを塗布する。
【００３２】
次に、マイクロリアクターアレイ１０を図２Ａ，図２Ｂに示すような遠心装置５０を用いて回転させる。図２Ａは遠心装置５０を横から見た図、図２Ｂは遠心装置５０を上から見た図である。
図２Ａ，図２Ｂに示すように、遠心装置５０は、マイクロリアクターアレイ１０を装着可能なホルダ（被回転部）５１，５１ａ、回転モータ（回転手段）５２を備える。ホルダ５１，５１ａは、回転軸Ｏからマイクロリアクターアレイ１０に向かう方向に対して角度θ傾斜している。このため、ホルダ５１，５１ａに装着されたマイクロリアクターアレイ１０も回転軸Ｏからマイクロリアクターアレイ１０に向かう方向に対して角度θ傾斜する。ここではθ＝４５°である。なお、θは、０°＜θ＜９０°の範囲であればよい。
【００３３】
図３は、遠心装置５０のホルダ５１に装着したマイクロリアクターアレイ１０を上から見た図、図４は、ホルダ５１に装着したマイクロリアクターアレイ１０の横断面図であり、図４（Ａ）〜図４（Ｃ）は、それぞれ図３（Ａ）〜図３（Ｃ）のＤ−Ｄ断面に相当する。
【００３４】
まず、図３（Ａ）及び図４（Ａ）に示すように、回転軸Ｏから見て透明基板１０１が外側になるようにマイクロリアクターアレイ１０をホルダ５１に装着し回転する。これにより、反応液収容部１０７から反応容器１０４へ向かう方向に遠心力がかかり、反応液収容部１０７内の反応液が反応液導入用流路１０５を充填しながら進んで反応容器１０４を充填する。反応液よりも比重の軽い空気は反応液導入用流路１０５内へ押し出され、反応液と入れ替わることにより、反応容器１０４が反応液で満たされる。
【００３５】
この時、反応液は廃液収容部１０６へは送出されない。これは、図４（Ａ）に示すように、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向が遠心力の方向（図中矢印Ｆ）に対して１３５度の角度をなしているため、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう方向の遠心力成分が０以下となるからである。
【００３６】
なお、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向と遠心力の方向のなす角度が９０度以上１８０度以下であれば、反応液は廃液収容部１０６へ送出されない。
【００３７】
以上のように、反応液が廃液収容部１０６の方へ流れていかないため、すべての反応容器１０４に効率よく反応液を充填することができ、回転後は図３（Ｂ）及び図４（Ｂ）に示すように、すべての反応容器１０４と反応液導入用流路１０５に反応液が充填された状態となる。
【００３８】
次に、遠心装置５０の回転を一端停止し、今度は図３（Ｃ）及び図４（Ｃ）に示すように、回転軸Ｏから見て透明基板１０３が外側になるようにマイクロリアクターアレイ１０をホルダ５１ａに装着し回転する。これにより、今度は反応液導入用流路１０５内の反応液が廃液収容部１０６に送出される。これは、図４（Ｃ）に示すように、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向が、遠心力の方向（図中矢印Ｆ）に対して４５度の角度をなしているため、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう方向の遠心力成分が０以上となるからである。なお、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向と遠心力の方向のなす角度が０度以上かつ９０度より小さければ、反応液は廃液収容部１０６へ送出される。なお、反応液導入用流路１０５内の反応液は廃液収容部１０６へ送出されるが、反応容器１０４内の反応液は反応容器１０４内に留まる。
【００３９】
このように、反応液導入用流路１０５内の反応液を廃液収容部１０６に送出することにより、各反応容器１０４を分離することができる。
【００４０】
なお、図３（Ｃ）及び図４（Ｃ）に示す状態で回転する際、予め反応液供給口１０９から、ピペット等を用いて反応液収容部１０７にミネラルオイルを供給しておくようにしてもよい。この状態でマイクロリアクターアレイ１０を回転させると、反応液導入用流路１０５にミネラルオイルが充填される。この時、反応液の比重がミネラルオイルよりも重いので、反応容器１０４内の反応液はミネラルオイルと入れ替わらない。これにより、個々の反応容器１０４を分離して、反応容器１０４間でのコンタミネーションを防止することができる。また、反応処理中に、反応容器１０４内が乾燥することを防止することもできる。なお、ミネラルオイルの代わりに反応液よりも比重が軽く、反応液と混和せず反応液よりも蒸発しにくい液体を用いても良い。また、一旦、図３（Ｃ）及び図４（Ｃ）に示す状態で回転を行って反応液導入用流路１０５内の反応液を廃液収容部１０６に送出した後で、反応液収容部１０７にミネラルオイルを供給し、再度遠心装置５０を回転させてもよい。
【００４１】
以上のような手順でマイクロリアクターアレイ１０に反応液を供給したら、次にＰＣＲ処理（生体試料反応処理）を行う。具体的には、マイクロリアクターアレイ１０の開口部をシールした後、マイクロリアクターアレイ１０をサーマルサイクラーに設置してＰＣＲ処理を行う。一般的には、まず、９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約５５℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを繰り返す。
【００４２】
ＰＣＲ処理の後、蛍光顕微鏡を用いて個々の反応容器１０４内の蛍光強度を測定し、検体中に含まれる標的核酸の量を定量する。
【００４３】
以下に、蛍光プローブとしてＱ−Ｐｒｏｂｅを用いた場合を例にとり、検体中の標的核酸の定量方法について説明する。Ｑ-Ｐｒｏｂｅは、結合した核酸に含まれるグアニンと相互作用して著しく蛍光が消光するのが特徴である。標的核酸と内部標準核酸の両方にＱ-Ｐｒｏｂｅが結合できるようにし、さらに、Ｑ-Ｐｒｏｂｅがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことにより、既知の内部標準核酸の量に対する標的核酸の相対量を推定することができる。
【００４４】
図５に、標的核酸と内部標準核酸の配列例を示す。下線を引いた部分にＱ-Ｐｒｏｂｅが結合する。図に示すように、蛍光プローブの結合部分の直後が、標的核酸は「ＴＴＴＴ」、内部標準核酸は「ＧＧＧＴ」となっている。従って、Ｑ-Ｐｒｏｂｅは内部標準核酸と結合した際に、結合部分のグアニン（Ｇ）と反応するため、蛍光が消光する。
【００４５】
次に、測定した蛍光強度から標的核酸の定量を行う方法について説明する。
反応容器群Ａのように標的標準核酸のみを含む場合、ＰＣＲによる増幅産物は標的標準核酸の増幅産物のみである。この場合の蛍光変化量をＦｔとする。反応容器群Ｂのように内部標準核酸のみを含む場合、増幅産物は内部標準核酸の増幅産物のみである。この場合の蛍光変化量をＦｃとする。反応容器群Ｃ，Ｄのように内部標準核酸と標的核酸の両方を含む場合、両方の増幅産物ができるため、この場合の蛍光変化量Ｆは、以下の式１で表せる。
Ｆ＝ＦｔＸ／（Ｘ＋Ｃ）＋ＦｃＣ／（Ｘ＋Ｃ）
＝〔Ｃ（Ｆｃ−Ｆｔ）／（Ｘ＋Ｃ）〕＋Ｆｔ  …（１）
ここで、Ｃは反応容器群Ｃ，Ｄにおける、内部標準核酸の量（反応容器内のコピー数）、Ｘは反応容器群Ｃ，Ｄにおける、標的核酸の量（反応容器内のコピー数）である。
【００４６】
蛍光変化量Ｆには、個々の反応容器が発する蛍光輝度そのものを用いてもよいが、増幅前の蛍光輝度と増幅後の蛍光輝度の比、あるいは、増幅後に、増幅産物および蛍光プローブが解離する温度まで加熱した状態の蛍光輝度と、増幅産物と蛍光プローブが結合している温度での蛍光輝度との比を用いても良い。これにより、検量線の精度を向上させることができる。
【００４７】
上記の式１に、反応容器群Ａと反応容器群Ｂの蛍光輝度から求めたＦｔとＦｃを代入することにより、検体中に含まれる標的核酸の量Ｘを求めることができる。
【００４８】
（実施例）
マイクロリアクターアレイ１０の反応容器１０４には、予め図６に示す配列を有するプライマー及びＱ-ｐｒｏｂｅが塗布され、真空乾燥されている。Ｑ-ｐｒｏｂｅは図７に示す配列を有し、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）にて蛍光標識されている。
【００４９】
反応容器群Ａの反応容器１０４には標的標準核酸溶液が、反応容器群Ｂの反応容器１０４には内部標準核酸溶液が、反応容器群Ｃ〜Ｇ（Ｅ〜Ｇは別のマイクロリアクターアレイ１０に設けられている。）の反応容器１０４には、それぞれ異なる希釈率の検体液と一定量の内部標準核酸溶液が供給される。表１に、反応容器群Ａ〜Ｇの各反応容器１０４内における標的核酸及び内部標準核酸の量を示す。
【００５０】
【表１】
2010088317.tif 000003
上記の核酸溶液と共に、ライトサイクラー４８０ジェノタイピングマスター、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（以上、ロシュ  ダイアグノスティクス社）を含むＰＣＲ反応液（核酸増幅反応液）を反応容器１０４に充填し、サーマルサイクラーでＰＣＲを行った。蛍光測定は、室温にて増幅の前後に測定し、さらに、増幅後は６０℃と９５℃で測定を行った。なお、６０℃では増幅産物と蛍光プローブが結合しており、９５℃では増幅産物および蛍光プローブが解離する。
【００５１】
（実験結果）
増幅後の６０℃及び９５℃における蛍光強度値の比を蛍光変化量としたとき、式１のパラメータは以下にようになった。
Ｆｔ＝１．２８
Ｆｃ＝０．８２
ここで、Ｃは反応容器群Ｃ〜Ｇにおける内部標準核酸の量（１０００コピー）である。これらの値を式１に代入すると、
Ｆ＝１．２８−４６０／（Ｘ＋１０００）  …（２）
となる。
図８に、式２に基づいて作成した、検体中の標的核酸量Ｘと蛍光変化量Ｆとの関係（検量線）及び、実測値（図中■）を示す。
【００５２】
また、室温における増幅前後の蛍光強度値の比を蛍光変化量としたとき、式１のパラメータは以下にようになった。
Ｆｔ＝１．２５
Ｆｃ＝０．９４
ここで、Ｃは反応容器群Ｃ〜Ｇにおける内部標準核酸の量（１０００コピー）である。これらの値を式１に代入すると、
Ｆ＝１．２５−３１０／（Ｘ＋１０００）  …（３）
となる。
図９に、式３に基づいて作成した、検体中の標的核酸量Ｘと蛍光変化量Ｆとの関係（検量線）及び、実測値（図中◆）を示す。
【００５３】
図８、９から明らかなように、標的核酸／内部標準核酸の構成比と、Ｑ-Ｐｒｏｂｅの蛍光変化量との間には高い相関がある。したがって、式２，３により求めた検量線を用いて検体中の標的核酸の定量を行うことが可能であることが示唆された。
【００５４】
なお、ここでは、１種類の標的核酸についての定量結果を示したが、上述したように各反応容器群の反応容器には、それぞれ異なる標的核酸を増幅・定量するための試薬（プライマー、蛍光プローブ）を導入することができるので、上記のような検量線を同時に多数作成し、それぞれの標的核酸の定量を行うことができる。
【００５５】
また、本実施例では、内部標準核酸の量を反応容器あたり１０００コピーとしたが、定量する標的核酸の量に応じて変更することができる。すなわち、検体中の標的核酸の量が内部標準核酸の量と著しく異なる場合は、希釈により検体の濃度を適切に調整するか、あるいは、内部標準核酸の量を適切に設定することにより定量精度を上げることができる。また、内部標準核酸の量を段階的に変えた反応容器群を追加してもよい。
【００５６】
以上のように本実施形態によれば、反応容器群Ａの反応容器１０４には標的標準核酸溶液、反応容器群Ｂの反応容器１０４には内部標準核酸溶液、反応容器群Ｃ、Ｄの反応容器１０４には、それぞれ異なる希釈率の検体液と一定量の内部標準核酸溶液を充填してＰＣＲ反応を行い、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することにより、反応容器群Ａ、Ｂにおける蛍光強度の変化から検体中の標的核酸量Ｘと蛍光変化量Ｆとの関係（検量線）を得ることができる。よって、標的核酸の定量を高精度に効率よく行うことが可能である。
【００５７】
また、遠心力を利用して、反応容器１０４内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理及び定量が可能となる。
【００５８】
また、本実施形態では、検量線作成のために、標的標準核酸溶液を用いるグループ（反応容器群Ａ）と内部標準核酸溶液を用いるグループ（反応容器群Ｂ）をそれぞれ１つずつ設けたが、検量線の精度を高めるために、これらのグループを希釈率の異なる複数の反応容器群から構成してもよい。
【００５９】
また、本実施形態では、反応容器１０４に反応液を充填するのに遠心力を利用しているが、遠心力の代わりに、毛管力やポンプによる圧力等を用いて充填するようにしてもよい。
【００６０】
（生体試料定量用キット）
本発明に係る生体試料定量用キットは、実施の形態１によるマイクロリアクターアレイ１０と、反応容器群Ａに供給するための標的標準核酸溶液と核酸増幅反応液を含む溶液と、反応容器群Ｂに供給するための内部標準核酸溶液と核酸増幅反応液を含む溶液と、反応容器群Ｃ，Ｄに供給するための内部標準核酸溶液と核酸増幅反応液を含む溶液を有する。使用時には、反応容器群Ａ，Ｂにはそれぞれキットに備えられた溶液を供給し、反応容器群Ｃ，Ｄにはキットに備えられた溶液に、必要に応じて希釈した検体液を加えて供給する。
【００６１】
このように、使用時にはキットに含まれる反応液をそれぞれ対応する反応容器群に導入すればよいので、容易に増幅反応及び定量を行うことができる。
【００６２】
実施の形態２．
実施の形態２では、反応容器群Ａの反応容器１０４に、予め一定量の標的核酸が塗布されている。同様に、反応容器群Ｂの反応容器１０４には、予め一定量の内部標準核酸が塗布されており、反応容器群Ｃ，Ｄの反応容器１０４には、予め一定量の内部標準核酸が塗布されている。
【００６３】
実施の形態２では、反応容器群Ａ及び反応容器群Ｂには、核酸増幅反応液のみを供給すればよい。また、反応容器群Ｃ，Ｄには、検体液と核酸増幅反応液を供給すればよい。
【００６４】
このように、実施の形態２によれば、各々の反応容器１０４に必要な標的核酸及び内部標準核酸を予め塗布しておくことにより、使用時には核酸増幅反応液と検体をそれぞれ導入するだけでよく作業が簡易になるので、導入する溶液の間違いなどが発生しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイの概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図。
【図２Ａ】図２Ａは、遠心装置を横から見た図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、遠心装置を上から見た図である。
【図３】遠心装置のホルダに装着したマイクロリアクターアレイを上から見た図。
【図４】遠心装置のホルダに装着したマイクロリアクターアレイの横断面図。
【図５】標的核酸と内部標準核酸の配列例を示す図。
【図６】プライマーの配列例を示す図。
【図７】Ｑ-ｐｒｏｂｅの配列を示す図。
【図８】検体中の標的核酸量Ｘと蛍光変化量Ｆとの関係（検量線）及び、実測値を示す図。
【図９】検体中の標的核酸量Ｘと蛍光変化量Ｆとの関係（検量線）及び、実測値を示す図。
【符号の説明】
【００６６】
１０  マイクロリアクターアレイ、１０１，１０２，１０３  透明基板、１０４  反応容器、１０５  反応液導入用流路、１０６  廃液収容部、１０７  反応液収容部、１０８  流路、１０９  反応液供給口、５０  遠心装置、５１，５１ａ  ホルダ、５２  回転モータ
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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