(57)【要約】【課題】多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる微細粒子のスクリーニング装置を提供する。【解決手段】計測部１４は、計測用チップ９０の微細粒子Ｍに光Ｌを照射して微細粒子Ｍから蛍光を発生させ、移動部１６は、計測用チップ９０と回収プレート８０とを載せて、計測部１４に対して第１方向（Ｘ方向）と第１方向と直交する第２方向（Ｙ方向）に移動して位置決めでき、回収部１３は、第１方向と第２方向に対して直交する垂直方向（Ｚ方向）に移動して位置決め可能な吸引・吐出キャピラリ１４０を有しており、吸引・吐出キャピラリ１４０により蛍光を発する微細粒子Ｍ１を含めた全数の微細粒子Ｍを選択的に吸引して回収プレート８０の所定の位置に排出して回収する。【選択図】図１３
2010085343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング装置であって、
装置の土台となるベースと、
光を透過する材料で形成され、前記微細粒子を含む懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、
オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および／またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、
前記光情報を解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、
前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第１方向と少なくとも前記第１方向と直交する第２方向に移動可能な移動部と、
前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、
を備え、
前記ウェルの位置情報と前記微細粒子の光情報とを照合し、
前記計測部は、合焦した状態で計測を行なうとともに、前記吸引・吐出キャピラリと前記計測用チップとの位置関係をモニタリングすることにより判断することを特徴とする微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２】
前記計測部は、光源と、前記光情報を検出するための光検出部を有しており、前記光源と前記光検出部は前記計測用チップを含む平面に対してある一方に配置され、前記吸引・吐出キャピラリは前記計測用チップを含む平面に対して他方に配置されることを特徴とする請求項１に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３】
前記移動部は、
第１テーブルと、
前記第１テーブルに搭載されて前記第１テーブルに対して前記第１方向に移動して位置決め可能な第２テーブルと、
前記第２テーブルに搭載されて前記第２テーブルに対して前記第２方向に移動して位置決め可能な搭載用テーブルと、を備え、
前記計測用チップと前記回収プレートは、前記搭載用テーブルの搭載面上に並べて配置されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４】
前記計測部は、少なくとも、
光源と、
前記光源より照射される光のうち、所望の励起波長帯域のみを選択するための光学フィルタと、前記計測用チップからの光情報の所望の波長帯域のみを選択するための光学フィルタと、励起光と光情報との波長帯域の差によって光路を切り替えるためのダイクロイックミラーから構成される少なくとも１つのフィルタユニットと、
前記励起波長の光を前記計測用チップに導くとともに前記計測用チップからの光情報を集光するための対物レンズと、
前記対物レンズを光軸方向に可動させることによるオートフォーカス機能を持つフォーカスユニットと、
計測対象からの光情報を検出するための光検出部と、
から構成される請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５】
前記計測部は、ハーフミラーを有し、前記ハーフミラーと前記フィルタユニットと切り替えることで前記光源からの光の一部を前記計測用チップ上面に照射すると同時に、前記計測用チップ上面からの反射光の一部を光検出部に導くことによって前記計測用チップ上面および前記上面に形成された前記ウェルの形状および位置情報を計測することを特徴とする請求項４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項６】
前記計測部は、前記光源とは別に計測用チップの上方に前記計測用チップ上面と垂直な軸に対して対称な２つ以上の方向より光を照射する光源を有し、計測チップからの透過光によって計測チップ上面およびこの面に形成されたウェル等の形状および位置情報を計測することを特徴とする請求項１に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項７】
前記計測部は、計測データのコントラスト値を指標としたオートフォーカス機能を有し、
計測時に透過光もしくは反射光によるオートフォーカスによって前記計測用チップ上面への合焦を維持するともに、反射光によって前記吸引・吐出キャピラリ先端のオートフォーカスを行なうことで前記吸引・吐出キャピラリ先端の計測視野内の位置、および計測チップ面との距離を計測することを特徴とする請求項４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項８】
前記計測用チップ上に形成された前記ウェルが凹形状であり、前記回収プレートには回収した前記微細粒子を収容するための複数のウェルを有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項９】
前記計測用チップ上面に、前記ウェルの深さよりも浅い複数の凹部が形成されていることを特徴とする請求項８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１０】
前記計測用チップは、前記移動部に対して、固定具を用いて固定されていることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１つの項に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１１】
前記固定具であって、少なくとも前記計測用チップの前記ウェルの形成されている側の面と接する面（以下、基準面）は、前記計測用チップよりも剛性の高い材質で形成されており、
前記計測用チップの前記ウェルの形成されている面を前記固定具の基準面に当接させ、前記ウェルの形成されている側と反対の面から弾性を有する部材によって押し付けることにより、前記計測用チップ自体の反りを矯正するとともに、前記固定具に対する位置決めを行ない、更に前記計測用チップ上面より滴下する懸濁液がもれないようにシール機能を有することを特徴とする請求項１０に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１２】
前記光情報が蛍光であって、反射光もしくは透過光による形状情報計測による前記計測用チップの前記ウェル位置情報と、前記励起光による光情報計測による前記微細粒子からの蛍光情報の両方を用いて計測・解析を行い、前記励起光を照射することによる蛍光計測を実施した後に、同一視野における透過光計測を実施することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１３】
前記光情報が蛍光であって、更に前記励起光を前記計測用のチップ上の複数の前記ウェルを含む領域に照射することによって、１視野で複数の前記ウェルを含む領域内に存在する前記微細粒子を計測する時に、実質的に自家蛍光の均質な部材に励起光を照射した際に前記光検出部によって検出される輝度分布をもちいて微細粒子からの蛍光計測値の補正を行なう際に、前記の輝度分布の複数ピクセルの平均化処理、もしくは周波数フィルタによって画素ノイズの除去を行うことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１４】
前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、微細粒子の懸濁に用いる液体のみを注入した状態で輝度分布を取得することを特徴とする請求項１３に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１５】
前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、前記ウェルの形成されていない部分の輝度分布を取得することを特徴とする請求項１３に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１６】
前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、実際の計測結果から前記ウェル以外の部分の輝度分布を抽出し、このデータを補完することによって計測視野全面の輝度分布を取得することを特徴とする請求項１３に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１７】
前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、前記微細粒子を含んだ計測情報から、データ処理によって計測視野全面の輝度分布に対する微細粒子の影響を低減させた結果を用いることを特徴とする請求項１３に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１８】
前記吸引・吐出キャピラリを、前記計測用チップに対して垂直方向に移動するとともに、前記計測チップが配された前記移動部を移動させることによって、回収対象の前記微細粒子が収納されたウェルに前記吸引・吐出キャピラリを接近させ、シリンジ方式によって其のウェル内に収納されている前記微細粒子を吸引し、前記回収プレートの所定の前記ウェル内に吐出することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項１９】
前記キャピラリ先端の内径は、前記ウェルの直径の２倍以下とし、前記計測用チップの上面への接近距離は、ウェルピッチ以下とすることを特徴とする請求項１８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２０】
前記計測用チップ面からの高さが既知であるようなキャピラリ高さ合わせ用基準面にフォーカスをあわせ、そのフォーカスした位置に対物レンズを保持したまま、前記キャピラリ先端にフォーカスが合う位置まで回収部により前記キャピラリを移動させることで前記計測用チップの上面との距離を確定し、このときの前記回収部の位置座標からの相対移動によって前記キャピラリ先端を前記計測用チップ面から所望の距離にまで接近させることを特徴とする請求項１８または請求項１９に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２１】
前記固定具に、前記計測用チップの前記ウェル面側が当接される前記基準面からの距離が既知である前記キャピラリ高さ合わせ用基準面が設けられていることを特徴とする請求項１１に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２２】
計測視野内での前記キャピラリ先端位置を記録し、前記移動部によって回収対象の前記ウェル側をこの前記キャピラリ先端位置に合わせることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２３】
前記キャピラリ先端に予め液体を充填しておくことを特徴とする請求項１８〜請求項２２のいずれか１つの項に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２４】
前記吸引・吐出キャピラリによる吸引量を制御する場合に、吸引速度を一定、もしくは引き始めの吸引速度を基準として、吸引途中で段階的もしくは連続的に速度を低下させることを特徴とする請求項１８〜請求項２３のいずれか１つの項に記載の微細粒子のスクリーニング装置
【請求項２５】
前記微細粒子は、生体の細胞であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２６】
前記吸引・吐出キャピラリは、前記計測用チップに対して接近もしくは離れる速度が制御されることを特徴とする請求項２４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２７】
前記吸引・吐出キャピラリは、前記計測用チップの前記ウェルではない場所に下降させてから前記計測用チップに対して水平移動させて対象とする前記ウェルの真上に位置させることを特徴とする請求項２４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２８】
前記吸引・吐出キャピラリが前記計測用チップの前記ウェルから前記微細粒子を吸引する動作前後の前記ウェル周囲を画像にして、前記解析部は、動作前後の前記ウェル周囲の画像を比較することにより、前記吸引・吐出キャピラリが前記ウェルから前記微細粒子が吸引されたかどうかを判断することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項２９】
前記吸引・吐出キャピラリの先端部の画像によって、前記前記吸引・吐出キャピラリの先端部における前記微細粒子の詰まりを推定することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３０】
前記回収プレートの底面側から画像を得て、前記回収プレートの前記ウェル内に前記微細粒子が回収されているかどうかを確認することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３１】
前記計測用チップの複数の前記ウェルから吸引した前記微細粒子は、前記回収プレートの１つの前記ウェルに収納されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３２】
前記吸引・吐出キャピラリの先端部が、前記計測用チップに対して吸引位置まで接近する際に、予備的な吸引動作を行い続けることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３３】
微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、
装置の土台となるベースと、
光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、
オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および／またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、
前記光情報を照合・解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、
前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第１方向と少なくとも前記第１方向と直交する第２方向に移動可能な移動部と、
前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記計測用チップと前記回収プレート間で移動可能であり、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、
を用い、
前記吸引・吐出キャピラリと前記計測用チップとの位置関係をモニタリングにより判断することを特徴とする微細粒子のスクリーニング方法。
【請求項３４】
前記計測部は、移動可能な反射板を有し、前記反射板が前記計測用チップと前記回収部の間に移動して前記光源からの光を反射し、反射した光が前記計測用チップを透過する光情報を前記光検出部で検出することで、前記微細粒子および前記計測用チップの上面およびウェルの形状および位置情報を計測することを特徴とする請求項１または請求項２または請求項４または請求項５に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３５】
前記反射板が、鏡面であることを特徴とする請求項３４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３６】
前記反射板が、ダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項３４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３７】
前記反射板と前記計測用チップの間には、拡散板が配置されていることを特徴とする請求項３４に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項３８】
前記計測部は、光源と、前記光情報を検出するための光検出部を有しており、前記光源と前記光検出部は前記計測用チップを含む平面に対してある一方に配置され、前記吸引・吐出キャピラリは前記計測用チップを含む平面に対して他方に配置されることを特徴とする請求項３３に記載の微細粒子のスクリーニング方法。
【請求項３９】
前記計測部は、移動可能な反射板を有し、前記反射板が前記計測用チップと前記回収部の間に移動して前記光源からの光を反射し、反射した光が前記計測用チップを透過する光情報を前記光検出部で検出することで、前記微細粒子および前記計測用チップの上面およびウェルの形状および位置情報を計測することを特徴とする請求項３８に記載の微細粒子のスクリーニング方法。
【請求項４０】
前記固定具の突き当て部に当接させることで前記計測用チップの上下面に平行な方向に
位置決めするために、前記計測用チップの側面に設けられた突起と、
前記計測用チップに形成されて前記計測用チップを前記固定具に対してセットする際の
向きを明示する表示部と、を有することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１つの項に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４１】
前記突起は、前記計測用チップの側面から突出して形成されていることを特徴とする請求項４０に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４２】
前記計測用チップは、前記ウェルの形成されているエリアが１０ｍｍ四方以上の広さであり、前記ウェルの周囲の一部もしくは全部の領域が前記固定具で固定され、前記ウェルの形成されていない下面側より適切な大きさの力を加えることで、前記ウェルの形成されているエリアの任意の２ｍｍ四方の平面度を１０μｍ以下とすることを特徴とする請求項４０または請求項４１に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４３】
前記計測用チップの前記ウェルが形成されている計測エリアに含まれる任意の２ｍｍ四方の領域内の厚みの変動Δｔが、１０／（１−１／ｎ）［μｍ］以下（ｎは計測用チップの材率の屈折率）であることを特徴とする請求項４２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４４】
前記計測用チップの前記ウェルが形成されている計測エリアに含まれる任意の２ｍｍ四方の領域内の前記上面と前記下面の成す傾斜角度φの変動が、（５×１０―６）／｛ｔ（１−１／ｎ）｝［ｒａｄ］以下である（ｔは前記計測用チップの平均厚み［ｍｍ］，ｎは前記計測用チップの材質の屈折率）ことを特徴とする請求項４３に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４５】
微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、計測用チップは、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の少なくとも１個が格納され得る大きさを持つウェルが複数設けられており、前記計測用チップは固定具に対して固定され、計測部が、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に光を照射することによって、前記微細粒子の光信号を取得する場合に、
前記計測用チップの突起を、前記固定具の突き当て部に当接させることで位置決めする際に、前記固定具に対してセットする向きを明示する表示部に基づいて前記固定具に対してセットすることを特徴とする微細粒子のスクリーニング方法。
【請求項４６】
前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る１つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４７】
計測対象である前記ウェル内の前記微細粒子の輝度分布が表示され、表示された輝度分布から輝度領域を指定することを特徴とする請求項４６に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４８】
前記ウェル内の前記微細粒子を複数回計測して、各計測の解析結果および複数回計測の解析結果から演算された演算結果に基づいて、前記回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする請求項４６または請求項４７に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項４９】
複数回計測された結果から演算された前記演算結果は、同一箇所の計測結果の差分か、もしくは同一箇所の計測結果の比率であることを特徴とする請求項４８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５０】
前記各計測結果、および前記複数回の計測結果から演算された前記演算結果のそれぞれより選択した前記回収対象候補から、論理和、論理積、もしくはその組み合わせにより成る論理式を用いて前記回収対象候補の前記ウェルを決定できることを特徴とする請求項４８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５１】
前記複数回計測の各結果および前記複数回計測結果から演算された前記演算結果が表示され、各々の前記演算結果から輝度領域の選択が行われることを特徴とする請求項５０に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５２】
前記サンプルである前記微細粒子の発する蛍光輝度の経時変化によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測の間に時間間隔が設けられることを特徴とする請求項４８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５３】
前記サンプルである前記微細粒子の発する蛍光輝度の特定試薬との反応性によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測間に試薬が供給されることを特徴とする請求項４８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５４】
前記複数回計測の合間に照射光もしくは蛍光の光路にて透過または反射させるためのフィルタを自動的に切り替える機能を持つことを特徴とする請求項４８に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５５】
前記回収対象候補である前記ウェルの前記微細粒子の上限個数を指定し、輝度領域の指定による前記回収対象候補の前記ウェルのうち、前記上限個数だけが回収されることを特徴とする請求項４６〜請求項４８のいずれか１つの項に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【請求項５６】
微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、
装置の土台となるベースと、
光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、
オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および／またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、
前記光情報を照合・解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、
前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第１方向と少なくとも前記第１方向と直交する第２方向に移動可能な移動部と、
前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記計測用チップと前記回収プレート間で移動可能であり、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を用い、
前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る１つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルを選択することを特徴とする微細粒子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細粒子のスクリーニング装置に関し、特に微細粒子（例えば細胞など）に対して光を当てて微細粒子から発する蛍光を標識として標的とする微細粒子を探索して、その探索した微細粒子を選択的に吸引して回収するための微細粒子のスクリーニング装置および微細粒子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的対象物である細胞を探索して回収する探索回収装置としては、次のようなものがある。試料台の上には、細胞を載せた試料板を載せるようになっており、照明と対物レンズがこの試料板を挟んで対向する位置に配置されている。細胞を吸引するためのノズルは、細胞に対して斜め下方向に向けて配置されていて、吸引できるようになっている。試料台はＸＹステージにより移動可能である。探索回収装置では、試料台には１つの試料板を載せて照明を当てることで細胞の蛍光を観察して、ノズルを用いて蛍光を発する細胞を回収する。この探索回収装置では、スライドグラス上に塗布した細胞を顕微鏡により探索し、形状・色・サイズ等から回収対象を選定し、その部分に剥離液を滴下した後に剥離液ごと回収するものである（例えば、特許文献１参照）。また、粒子サンプルを蛍光情報によって分種する技術としては、セルソーターが広く用いられている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００５−２０７９８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１に開示された探索回収装置では、スライドグラス上に塗布した細胞を顕微鏡により探索し、形状・色・サイズ等から回収対象を選定し、その部分に剥離液を滴下した後に剥離液ごと回収するものである。
【０００４】
しかしながら、この方法では、回収対象の細胞の複数が近くに存在する場合、個々の細胞を選択的に回収することが困難である。これを防ぐためには、サンプル自体の濃度を下げる方法が考えられるが、スループットの低下をまねくという問題が発生してしまう。また、特にドライアップに耐えられず、懸濁液として扱う必要のあるサンプルを選択的に回収することが困難であるために、対象とできる細胞が限定されるという問題がある。更に、細胞等の微細粒子を用いたスクリーニング系では蛍光や化学発光等の情報の取得が広く望まれている。
試料を載せる部材は照明と対物レンズを含む光学系に対して精度良く位置決めすることで、位置決め作業性を向上して焦点外れや認識位置のズレを防止することが望まれている。
【０００５】
例えばカメラ等で計測を行う場合、高スループットのためには１度に計測できるエリアを広くする必要がある。この領域を視野内に正確に位置決めするとともに、全面で観察焦点を合わせた状態で計測するためには、部材自体の精度と、セットする際の位置決め精度の両立が必要である。
全ての計測対象である細胞のような微細粒子を計測して全体の輝度分布状況を確認した上で回収対象とする微細粒子を選択することで、異物によるノイズなどが確実に除去された微細粒子の回収が望まれている。
【０００６】
そこで、本発明は上記課題を解消するために、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる微細粒子のスクリーニング装置および微細粒子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明は、精度良く位置決めすることで、位置決め作業性を向上して焦点外れや認識位置のズレを防止して、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる微細粒子のスクリーニング装置および微細粒子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明は、全ての計測対象である細胞のような微細粒子を計測して全体の分布状況を確認した上で回収対象とする微細粒子を選択して、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる微細粒子のスクリーニング装置および微細粒子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解消するために、本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング装置であって、装置の土台となるベースと、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子を含む懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および／またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、前記光情報を解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第１方向と少なくとも前記第１方向と直交する第２方向に移動可能な移動部と、前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を備え、前記ウェルの位置情報と前記微細粒子の光情報とを照合し、前記計測部は、合焦した状態で計測を行なうとともに、前記吸引・吐出キャピラリと前記計測用チップとの位置関係をモニタリングすることにより判断することを特徴とする。
【０００９】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測部は、光源と、前記光情報を検出するための光検出部を有しており、前記光源と前記光検出部は前記計測用チップを含む平面に対してある一方に配置され、前記吸引・吐出キャピラリは前記計測用チップを含む平面に対して他方に配置されることを特徴とする。
【００１０】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記移動部が、第１テーブルと、前記第１テーブルに搭載されて前記第１テーブルに対して前記第１方向に移動して位置決め可能な第２テーブルと、前記第２テーブルに搭載されて前記第２テーブルに対して前記第２方向に移動して位置決め可能な搭載用テーブルと、を備え、前記計測用チップと前記回収プレートは、前記搭載用テーブルの搭載面上に並べて配置されていることを特徴とする。
【００１１】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測部が、少なくとも、光源と、前記光源より照射される光のうち、所望の励起波長のみを選択するための光学フィルタと、前記計測用チップからの光情報の所望の波長領域のみを選択するための光学フィルタと、励起光と光情報との波長差によって光路を切り替えるためのダイクロイックミラーから構成される少なくとも１つのフィルタユニットと、前記励起波長の光を前記計測用チップに導くとともに前記計測用チップの光情報を収集するための対物レンズと、前記対物レンズを光軸方向に可動させることによるオートフォーカス機能を持つフォーカスユニットと、計測対象からの光情報を検出するための光検出部と、から構成される。
【００１２】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測部が、ハーフミラーを有し、前記ハーフミラーと前記フィルタユニットと切り替えることで前記光源からの光の一部を前記計測用チップ上面に照射すると同時に、前記計測用チップ上面からの反射光の一部を光検出部に導くことによって前記計測用チップ上面および前記上面に形成された前記ウェルの形状および位置情報を計測することを特徴とする。
【００１３】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測部が、前記光源とは別に計測用チップの上方に前記計測用チップ上面と垂直な軸に対して対称な２つ以上の方向より光を照射する光源を有し、計測チップからの透過光によって計測チップ上面およびこの面に形成されたウェル等の形状および位置情報を計測することを特徴とする。
【００１４】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測部が、計測データのコントラスト値を指標としたオートフォーカス機能を有し、計測時に透過光もしくは反射光によるオートフォーカスによって前記計測用チップ上面への合焦を維持するともに、反射光によって前記吸引・吐出キャピラリ先端のオートフォーカスを行なうことで前記吸引・吐出キャピラリ先端の計測視野内の位置、および計測チップ面との距離を計測することを特徴とする。
【００１５】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップ上に形成された前記ウェルが凹形状であり、前記回収プレートには回収した前記微細粒子を収容するための複数のウェルを有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップ上面に、前記ウェルの深さよりも浅い複数の凹部が形成されていることを特徴とする。
【００１７】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップが、前記移動部に対して、固定具を用いて固定されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記固定具が、少なくとも前記計測用チップの前記ウェルの形成されている側の面と接する面（以下、基準面）は、前記計測用チップよりも剛性の高い材質で形成されており、前記計測用チップの前記ウェルの形成されている面を前記固定具の基準面に当接させ、前記ウェルの形成されている側と反対の面から弾性を有する部材によって押し付けることにより、前記計測用チップ自体の反りを矯正するとともに、前記固定具に対する位置決めを行ない、更に前記計測用チップ上面より滴下する懸濁液がもれないようにシール機能を有することを特徴とする。
【００１９】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記光情報が蛍光であって、反射光もしくは透過光による形状情報計測による前記計測用チップの前記ウェル位置情報と、前記励起光による光情報計測による前記微細粒子からの蛍光情報の両方を用いて計測・解析を行い、前記励起光を照射することによる蛍光計測を実施した後に、同一視野における透過光計測を実施することを特徴とする。
【００２０】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記光情報が蛍光であって、更に前記励起光を前記計測用のチップ上の複数の前記ウェルを含む領域に照射することによって、１視野で複数の前記ウェルを含む領域内に存在する前記微細粒子を計測する時に、実質的に自家蛍光の均質な部材に励起光を照射した際に前記光検出部によって検出される輝度分布をもちいて微細粒子からの蛍光計測値の補正を行なう際に、前記の輝度分布の複数ピクセルの平均化処理、もしくは周波数フィルタによって画素ノイズの除去を行うことを特徴とする。
【００２１】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、微細粒子の懸濁に用いる液体のみを注入した状態で輝度分布を取得することを特徴とする。
【００２２】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、前記ウェルの形成されていない部分の輝度分布を取得することを特徴とする。
【００２３】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、実際の計測結果から前記ウェル以外の部分の輝度分布を抽出し、このデータを補完することによって計測視野全面の輝度分布をリアルタイムに取得することを特徴とする。
【００２４】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記自家蛍光の均質な部材として前記計測用チップを用い、前記微細粒子を含んだ計測情報から、データ処理によって計測視野全面の輝度分布に対する微細粒子の影響を低減させた結果を用いることを特徴とする。
【００２５】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリを、前記計測用チップに対して垂直方向に移動するとともに、前記計測チップが配された前記移動部を移動させることによって、回収対象の前記微細粒子が収納されたウェルに前記吸引・吐出キャピラリを接近させ、シリンジ方式によって其のウェル内に収納されている前記微細粒子を吸引し、前記回収プレートの所定の前記ウェル内に吐出することを特徴とする。
【００２６】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記キャピラリ先端の内径が、前記ウェルの直径の２倍以下とし、前記計測用チップの上面への接近距離は、ウェルピッチ以下とすることを特徴とする。
【００２７】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップ面からの高さが既知であるようなキャピラリ高さ合わせ用基準面にフォーカスをあわせ、そのフォーカスした位置に対物レンズを保持したまま、前記キャピラリ先端にフォーカスが合う位置まで回収部により前記キャピラリを移動させることで前記計測用チップの上面との距離を確定し、このときの前記回収部の位置座標からの相対移動によって前記キャピラリ先端を前記計測用チップ面から所望の距離にまで接近させることを特徴とする。
【００２８】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記固定具に、前記計測用チップの前記ウェル面側が当接される前記基準面からの距離が既知である前記キャピラリ高さ合わせ用基準面が設けられていることを特徴とする。
【００２９】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは計測視野内での前記キャピラリ先端位置を記録し、前記移動部によって回収対象の前記ウェル側をこの前記キャピラリ先端位置に合わせることを特徴とする。
【００３０】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記キャピラリ先端に予め液体を充填しておくことを特徴とする。
【００３１】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリによる吸引量を制御する場合に、吸引速度を一定、もしくは引き始めの吸引速度を基準として、吸引途中で段階的もしくは連続的に速度を低下させることを特徴とする。
【００３２】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記微細粒子が、生体の細胞であることを特徴とする。
【００３３】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリが、前記計測用チップに対して接近もしくは離れる速度が制御されることを特徴とする。
【００３４】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリが、前記計測用チップの前記ウェルではない場所に下降させてから前記計測用チップに対して水平移動させて対象とする前記ウェルの真上に位置させることを特徴とする。
【００３５】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリが前記計測用チップの前記ウェルから前記微細粒子を吸引する動作前後の前記ウェル周囲を画像にして、前記解析部は、動作前後の前記ウェル周囲の画像を比較することにより、前記吸引・吐出キャピラリが前記ウェルから前記微細粒子が吸引されたかどうかを判断することを特徴とする。
【００３６】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリの先端部の画像によって、前記前記吸引・吐出キャピラリの先端部における前記微細粒子の詰まりを推定することを特徴とする。
【００３７】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記回収プレートの底面側から画像を得て、前記回収プレートの前記ウェル内に前記微細粒子が回収されているかどうかを確認することを特徴とする。
【００３８】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップの複数の前記ウェルから吸引した前記微細粒子が、前記回収プレートの１つの前記ウェルに収納される機能を有することを特徴とする。
【００３９】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記吸引・吐出キャピラリの先端部が、前記計測用チップに対して吸引位置まで接近する際に、予備的な吸引動作を行い続けることを特徴とする。
【００４０】
本発明の微細粒子のスクリーニング方法は、微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、装置の土台となるベースと、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および／またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、前記光情報を照合・解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第１方向と少なくとも前記第１方向と直交する第２方向に移動可能な移動部と、前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記計測用チップと前記回収プレート間で移動可能であり、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を用い、前記吸引・吐出キャピラリと前記計測用チップとの位置関係をモニタリングにより判断することを特徴とする。
【００４１】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測部は、移動可能な反射板を有し、前記反射板が前記計測用チップと前記回収部の間に移動して前記光源からの光を反射し、反射した光が前記計測用チップを透過する光情報を前記光検出部で検出することで、前記微細粒子および前記計測用チップの上面およびウェルの形状および位置情報を計測することを特徴とする。
【００４２】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記反射板が、鏡面であることを特徴とする。
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記反射板が、ダイクロイックミラーであることを特徴とする。
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記反射板と前記計測用チップの間には、拡散板が配置されていることを特徴とする請求項３５に記載の微細粒子のスクリーニング装置。
【００４３】
本発明の微細粒子のスクリーニング方法は、好ましくは前記計測部は、光源と、前記光情報を検出するための光検出部を有しており、前記光源と前記光検出部は前記計測用チップを含む平面に対してある一方に配置され、前記吸引・吐出キャピラリは前記計測用チップを含む平面に対して他方に配置されることを特徴とする。
【００４４】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、前記固定具の突き当て部に当接させることで前記計測用チップの上下面に平行な方向に位置決めするために、前記計測用チップの側面に設けられた突起と、前記計測用チップに形成されて前記計測用チップを前記固定具に対してセットする際の向きを明示する表示部と、を有することを特徴とする。  本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記突起が、前記計測用チップの側面から突出して形成されていることを特徴とする。
【００４５】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップが、前記ウェルの形成されているエリアが１０ｍｍ四方以上の広さであり、前記ウェルの周囲の一部もしくは全部の領域が前記固定具で固定され、前記ウェルの形成されていない下面側より適切な大きさの力を加えることで、前記ウェルの形成されているエリアの任意の２ｍｍ四方の平面度を１０μｍ以下とすることを特徴とする。
【００４６】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップの前記ウェルが形成されている計測エリアに含まれる任意の２ｍｍ四方の領域内の厚みの変動Δｔが、１０／（１−１／ｎ）［μｍ］以下（ｎは計測用チップの材率の屈折率）であることを特徴とする。
【００４７】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記計測用チップの前記ウェルが形成されている計測エリアに含まれる任意の２ｍｍ四方の領域内の前記上面と前記下面の成す傾斜角度φの変動が、（５×１０―６）／｛ｔ（１−１／ｎ）｝［ｒａｄ］以下である（ｔは前記計測用チップの平均厚み［ｍｍ］，ｎは前記計測用チップの材質の屈折率）ことを特徴とする。
【００４８】
本発明の微細粒子のスクリーニング方法は、微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、計測用チップは、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の少なくとも１個が格納され得る大きさを持つウェルが複数設けられており、前記計測用チップは固定具に対して固定され、計測部が、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に光を照射することによって、前記微細粒子の光信号を取得する場合に、前記計測用チップの突起を、前記固定具の突き当て部に当接させることで位置決めする際に、前記固定具に対してセットする向きを明示する表示部に基づいて前記固定具に対してセットすることを特徴とする。
【００４９】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る１つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする。  本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは計測対象である前記ウェル内の前記微細粒子の輝度分布が表示され、表示された輝度分布から輝度領域を指定することを  特徴とする。
【００５０】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記ウェル内の前記微細粒子を複数回計測して、各計測の解析結果および複数回計測の解析結果から演算された演算結果に基づいて、前記回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする。
【００５１】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記複数回計測結果から演算された前記演算結果は、同一箇所の計測結果の差分であるか、同一箇所の計測結果の比率であることを特徴とする。
【００５２】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記各計測結果、および前記複数回の計測結果から演算された前記演算結果のそれぞれより選択した前記回収対象候補から、論理和、論理積、もしくはその組み合わせにより成る論理式を用いて前記回収対象候補の前記ウェルを決定できることを特徴とする。
【００５３】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記複数回計測の各結果および前記複数回計測結果から演算された前記演算結果をグラフ表示して、各々の前記グラフ上で測定者によって輝度領域の選択が行われることを特徴とする。
【００５４】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記サンプルである前記微細粒子の発する蛍光輝度の経時変化によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測の間に時間間隔が設けられることを特徴とする。
【００５５】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記サンプルである前記微細粒子の発する蛍光輝度の特定試薬との反応性によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測間に試薬が供給されることを特徴とする。
【００５６】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記サンプルである前記微細粒子の発する複数種類の蛍光情報によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測の合間に照射光もしくは蛍光の光路にて透過または反射させるためのフィルタの少なくとも１枚を自動的に切り替える機能を持つことを特徴とする。
【００５７】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記回収対象候補である前記ウェルの前記微細粒子の上限個数を指定し、輝度領域の指定による前記回収対象候補の前記ウェルのうち、前記上限個数だけが回収されることを特徴とする。
【００５８】
本発明の微細粒子のスクリーニング方法は、微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、装置の土台となるベースと、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および／またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、前記光情報を照合・解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第１方向と少なくとも前記第１方向と直交する第２方向に移動可能な移動部と、前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記計測用チップと前記回収プレート間で移動可能であり、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を用い、前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る１つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルを選択することを特徴とする。
【発明の効果】
【００５９】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置とスクリーニング方法によれば、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。
【００６０】
本発明によれば、計測部と回収部を同時に配置できる構成とすることで、微細粒子の蛍光や散乱光、透過光などの高輝度な光情報を得て、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。
本発明によれば、精度良く位置決めすることで、位置決め作業性を向上して焦点外れや認識位置のズレを防止して、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。
【００６１】
本発明によれば、全ての計測対象である細胞のような微細粒子を計測して全体の分布状況を確認した上で回収対象とする微細粒子を選択して、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
以下、図面を参照して、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。  
図１は、本発明の微細粒子のスクリーニング装置の好ましい実施形態を示す正面図である。図２は、図１の微細粒子のスクリーニング装置の好ましい実施形態を示す斜視図である。
【００６３】
図１と図２に示す微細粒子のスクリーニング装置１は、計測用チップ９０内の複数の微細粒子（例えば生体の細胞など）に対して光を当てることで微細粒子から発する蛍光を標識として、標的とする微細粒子を探索して、回収条件を満たした微細粒子の入っているウェルにある全ての微細粒子を標的対象物として選択的に吸引して、回収プレート８０に回収するための装置である。
【００６４】
図１に示す微細粒子のスクリーニング装置１は、ベース１１と、支持部１２と、回収部１３と、計測部１４と、画像解析部１５と、移動部１６と、を備え、図２に示すように、各部がカバー１９により覆われている。カバー１９は、外部からの光や異物の進入を防いでいる。なお、ベース１１は、スクリーニング装置１の各要素を保持するための本体フレームである。
【００６５】
図１に示すように、図１の紙面垂直方向がＸ方向（第１方向）であり、左右方向がＹ方向（第２方向）である。Ｚ方向は、Ｘ方向とＹ方向に対して垂直な方向である。
【００６６】
ベース１１は、回収部１３と、計測部１４と、移動部１６を保持しており、ベース１１はプレート部材２０，２１，２２を有している。これらのプレート部材２０，２１は、複数の垂直部材２３により平行に固定されており、プレート部材２０，２２は、複数の部材２４により平行に固定されている。この部材２４は、高さの調整をするとともに、振動を遮断する材質により構成されている。
【００６７】
最も上に位置するプレート部材２１の上には、支持部１２と支持台３０が固定されている。支持部１２は、プレート部材２１の上においてＺ方向に沿って垂直に立てて配置されている。支持台３０は、脚部３０Ｒと支持板３０Ｐを有している。プレート部材２０，２１，２２と支持板３０Ｐは、Z方向に沿って相互に間隔をおいて配置されている。
【００６８】
次に、図１と図３を参照して、移動部１６の構造例について説明する。
図３は、移動部１６とその移動部１６の上に搭載されている搭載用テーブル４と回収プレート８０と計測用チップ９０を示している。
【００６９】
図３と図１に示すこの移動部１６は、図１に示すベース１１の支持台３０に固定されている。移動部１６は、移動対象物である搭載用テーブル４０を搭載しており、この搭載用テーブル４０をＸ方向とＹ方向に沿ってそれぞれ移動して位置決めすることができる。
【００７０】
図３に示すように、移動部１６は、第１テーブル５１と第２テーブル５２を有している。第１テーブル５１は、図１の支持台３０に固定されており、第２テーブル５２をＸ方向に沿って移動して位置決め可能に搭載している。第２テーブル５２は、搭載用テーブル４をＹ方向に沿って移動して位置決め可能に搭載している。
【００７１】
図３に示すように、第１テーブル５１の上面には、ガイドレール５３，５３と第１モータ５５が設けられている。第２テーブル５２の下面には、断面Ｕ字型の部材５４，５４とナット５７が設けられている。ガイドレール５３，５３がそれぞれに部材５４，５４にかみ合っている。第１モータ５５の送りねじ５６は、ナット５７にかみ合っている。これにより、制御部１００が指令して第１モータ５５を作動して送りねじ５６を回転することで、第２テーブル５２はＸ方向に沿って移動して位置決め可能である。
【００７２】
図３に示すように、第２テーブル５２の上面には、ガイドレール６３，６３と第２モータ６５が設けられている。搭載用テーブル４０の下面には、断面Ｕ字型の部材６４，６４とナット６７が設けられている。ガイドレール６３，６３がそれぞれに部材６４，６４にかみ合っている。第２モータ６５の送りねじ６６は、ナット６７にかみ合っている。これにより、制御部１００が指令して第２モータ６５を作動して送りねじ６６を回転することで、搭載用テーブル４０はＹ方向に沿って移動して位置決め可能である。
【００７３】
図３に示すように、第１テーブル５１は第１開口部５９を有しており、第２テーブル５２は第２開口部６９を有しており、さらに搭載用テーブル４０は第３開口部７９を有している。これらの第１開口部５９と第２開口部６９と第３開口部７９は、第２テーブル５２がＸ方向に移動し、搭載用テーブル４０がＹ方向に移動しても常に重なるような大きさを有しており、計測部１４の対物レンズ１１０側からの光（照射光）Ｌを、搭載用テーブル４０の上の計測用チップ９０の微細粒子に対して導くための開口部である。
【００７４】
これにより、第２テーブル５２がＸ方向に移動し搭載用テーブル４０がＹ方向に移動しても、対物レンズ１１０側からの光Ｌは、第１開口部５９と第２開口部６９と第３開口部７９を通過して、搭載用テーブル４０上の計測用チップ９０の微細粒子に対して照射され、微細粒子から蛍光を発生させることができる。
【００７５】
なお、図３に示す移動部１６の搭載用テーブル４０は、モータと送りネジを用いてＸ、Ｙ方向に移動可能であるが、これに限らずリニアモータなどを用いても良い。
【００７６】
図４は、搭載用テーブル４０と回収プレート８０と計測用チップ９０を示している。図４に示すよう、搭載用テーブル４０は、例えば長方形状の板状部材であり、この搭載用テーブル４０の搭載面７０の上には回収プレート８０と計測用チップ９０が着脱可能にＹ方向に沿って並べて搭載できる。
【００７７】
回収プレート８０は、板状の部材であり、回収プレート８０には多数のウェル８１がＸ方向とＹ方向に沿って等間隔をおいてマトリックス状に配列されている。これらのウェル８１は、生物の細胞のような微細粒子が吸引・吐出キャピラリ１４０から順次排出されてくるときに、順次排出されてくる微細粒子が別々に回収して格納することができる微細粒子回収格納部である。ウェル８１は、例えば断面でみて、ほぼＵ字型の凹部あるいはカップ型の凹部である。
【００７８】
図４に示す計測用チップ９０は、固定具１２０により固定されており、この固定具１２０は、搭載用テーブル４０の所定の位置に位置決めして固定されている。
【００７９】
図５は、計測用チップ９０とこの計測用チップ９０の固定具１２０の形状例を示す断面図である。
【００８０】
この固定具１２０は、計測用チップ９０を搭載用テーブル４０の搭載面７０に対して一定の高さの基準面ＣＬの位置で固定して保持するためのものである。図５の例では、固定部材１２０は、第１ケース部１２１と第２ケース部１２２と弾性部材１２３を有している。弾性部材１２３は例えば長方形のリングであり、弾性部材１２３は第２ケース部１２２の内側のフラット面１２６に固定されている。
【００８１】
計測用チップ９０は、第１ケース部１２１と第２ケース部１２２の間に配置されており、計測用チップ９０が弾性部材１２３によりＺ１方向に押し上げられることで、計測用チップ９０の上面９０Ｓは、第１ケース部１２１のフラットな内面１２４に対して突き当てられている。
【００８２】
これにより、計測用チップ９０の上面９０Ｓは常に位置精度の出た基準面１２４に押し付けられて、計測用チップ９０の上面９０Ｓは基準面ＣＬに位置決めすることができるので、例えば計測用チップ９０の厚みのバラツキや反りがあったとしても、厚みのバラツキの影響や反りの影響を低減することができる。
【００８３】
従って、計測用チップ９０の上面９０Ｓと、計測部１４の対物レンズ１１０および回収プレート８０とのＺ方向に関する距離を正確に管理できる。言い換えれば、図７に示す計測用チップ９０のウェル２００内の微細粒子Ｍの位置と、計測部１４の対物レンズ１１０および回収プレート８０との距離を正確に管理できる。
【００８４】
第１ケース部１２１は第２ケース部１２２に対して例えばヒンジ機構部を用いて開閉することができ、これにより、固定具１２０内の計測用チップ９０を取り出して、新たな計測用チップ９０と交換することができる。
【００８５】
次に、図３、図５および図７を参照して計測用チップ９０について説明する。
計測用チップ９０の形状例は、図７（Ａ）に例示しており、計測用チップ９０は透光性を有する材料、例えばガラスやプラスチックにより作られている。
【００８６】
図３と図５に示す計測用チップ９０は、光を透過する材料で形成され、例えば長方形の板状部材であり、複数の微細粒子をそれぞれ格納するために複数のウェル２００がＸ方向とＹ方向に沿って等間隔をおいてマトリックス状に配列されている。図５に示すように、各ウェル２００は、微細粒子の懸濁液５００を分注もしくは一括注入することで、微細粒子Ｍの少なくとも１個が格納され得る大きさを持つ。
【００８７】
計測用チップ９０の上面９０Ｓには、ウェル２００の深さよりも浅い複数の凹部が形成されていることが望ましい。この浅い複数の凹部は、計測用チップ９０のＺ方向に関する位置を、計測部１４がオートフォーカスするための基準に用いられる。すなわち、計測用チップ９０の上面のウェル以外の部分にオートフォーカス用のマーキングとしての凹部が形成されるが、画像処理によるコントラスト解析の際にその凹部の深さはなるべく急峻で浅い方が好ましく、例えば３μｍ以下が好ましい。凹部は、計測用チップ９０の上面の決まった位置に形成してもよいし、ランダムに形成してもよいが、凹部の形成位置は、計測対象の吸着性などを考慮して決定すべきである。
【００８８】
図１と図５に示すように計測用チップ９０は、移動部１６に対して、固定具１２０を用いて固定されている。この固定具１２０は、少なくとも計測用チップのウェル２００の形成されている側の面と接する面（以下、基準面）１２４が、計測用チップ９０よりも剛性の高い材質で形成されている。計測用チップ９０は、ウェル２００が形成されている上面９０Ｓを固定具１２０の基準面ＣＬに当接させ、ウェル２００の形成されている側と反対の面から弾性を有する弾性部材１２３によって押し付ける。また、シール部材２２２が固定具１２０の基準面ＣＬと計測用チップ９０の上面９０Ｓの間をシールしている。この固定構造により、計測用チップ９０自体の反りを矯正するとともに、固定具９０に対する位置決めを行ない、更に計測用チップ９０上面９０Ｓより滴下する懸濁液５００がもれないように確実にシールすることができる。
【００８９】
図７（Ａ）に例示するように、各ウェル２００は、生物細胞のような微細粒子Ｍを格納するための微細粒子回収格納部であり、例えば断面形状は、ほぼＵ字型の凹部あるいはカップ型の凹部である。各ウェル２００には、複数の微細粒子Ｍが格納されるようになっており、計測用チップ９０の上面９０Ｓには懸濁液５００の膜が形成されている。各ウェル２００の直径Ｄは例えば１０μｍであり、各ウェル２００はＸ方向とＹ方向に例えばそれぞれ５００個配列されている。
【００９０】
次に、図１と図６を参照して、回収部１３の構造例を説明する。
図１に示す回収部１３は、ベース１１に配置され、Ｘ方向とＹ方向に対して直交するＺ方向に移動して位置決め可能な吸引・吐出キャピラリ１４０を有しており、吸引・吐出キャピラリ１４０により、図５に例示する輝度条件を満たした微細粒子Ｍ１が収納されているウェル２００内の微細粒子全数を吸入して回収プレート８０の所定の位置に吐出して回収する。
【００９１】
回収部１３は、Ｘ方向とＹ方向に対して直交するＺ方向に移動して位置決め可能な吸引・吐出キャピラリ１４０を有しており、この吸引・吐出キャピラリ１４０により前記輝度条件を満たした微細粒子Ｍ１が収納されているウェル内の微細粒子全数Ｍを吸入して回収プレート８０の所定の位置に吐出して回収するためのものである。
【００９２】
図６に示すように、回収部１３は、操作部１３０と基部１３１を有しており、基部１３１は支持部１２に固定されている。操作部１３０は、吸引ポンプ１３３と、吸引・吐出キャピラリ１４０を備えている。吸引・吐出キャピラリ１４０はＺ２方向（下方向）に沿って先細り状の中空部材であり、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は、図１と図５に示すように、計測用チップ９０のウェル２００に接近されるようになっており、吸引・吐出キャピラリ１４０の後端部１４３は吸引ポンプ１３３に接続されている。
【００９３】
図６に示すように、モータ２５１の送りねじ２５２が操作部１３０のナット２５３にかみ合っており、制御部１００がモータ２５１を作動させて送りねじ２５２を回転することで、ナット２５３とともに操作部１３０をＺ方向（Ｚ１方向とＺ２方向）に沿って上下移動して位置決めすることができる。
【００９４】
これにより、図６の回収部１３はＺステージと呼ぶことができ、図３の移動部１６はＸ・Ｙステージとも呼ぶことができる。
【００９５】
次に、図１を参照して、計測部１４および解析部１５を説明する。
図１に示す計測部１４は、計測用チップ９０の複数のウェル２００が含まれる領域に対して光Ｌを照射することで、その領域内の微細粒子Ｍから蛍光を発生させて、その蛍光を受光する。受光した微細粒子Ｍからの蛍光は、画像解析部１５により画像解析する。画像解析部１５は、各ウェル２００内の複数の微細粒子Ｍの内の、少なくとも最大輝度の蛍光を発する微細粒子Ｍ１の蛍光強度を算出する。
【００９６】
これにより、Ｘ方向とＹ方向で構成される平面内において、回収条件を満たした最大輝度の蛍光を発する微細粒子Ｍ１が収納されているウェル２００の位置を制御部１００が認識する。制御部１００は、図３に示す第１モータ５５と第２モータ６５に対して制御駆動信号を与えることで、移動部１６上の計測用チップ９０のウェル２００を、吸引・吐出キャピラリ１４０の真下に位置させることができる。つまり、吸引・吐出キャピラリ１４０は、ウェル単位でそのウェル内の微細粒子を吸引することができるようになっている。吸引・吐出キャピラリ１４０は、回収条件を満たした微細粒子の入っているウェルにある全ての微細粒子を吸引する。吸引・吐出キャピラリ１４０は、複数のウェルの内の選択されたウェル、すなわち回収条件を満たした微細粒子の入っているウェル内から全ての微細粒子を吸引することができる。
【００９７】
図１に示す計測部１４は、計測用チップ９０および計測用チップ９０に収容された微細粒子Ｍに少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することによって、透過光もしくは反射光による形状および位置情報、および蛍光・化学発光等の輝度情報を個々の微細粒子の平均サイズより細かい分解能で取得するとともに、計測チップ自体の形状や、計測用チップ９０上に配置されたウェル２００の位置や大きさ等の情報を取得する。
【００９８】
図１に示す画像解析部１５は、計測された形状情報および光情報を解析することで、少なくとも各ウェル２００内に、測定者によって設定できる輝度条件を満たす微細粒子Ｍ１が１個以上存在することを確認するためのデータを取得する。そして、微細粒子のスクリーニング装置１は、透過光もしくは反射光によるウェル２００の位置認識情報と蛍光・化学発光の光情報とを合わせ照合することにより微細粒子からの光情報を特定し、さらに計測部１４はオートフォーカス機能を有し、合焦した状態で計測を行なうとともに、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２と計測用チップ９０上面との位置関係を、両者に対するオートフォーカスの実施により判断することができる。
【００９９】
図１に示すように、計測部１４は、対物レンズ１１０を有しており、対物レンズ１１０は計測用チップ９０に対して光を導く。対物レンズ１１０は、計測用チップ９０と移動部１６の下方に配置されており、吸引・吐出キャピラリ１４０は、計測用チップ９０と移動部１６の上方に配置されている。これにより、計測用チップ９０とその移動部１６は、対物レンズ１１０と吸引・吐出キャピラリ１４０の間に配置させることができる。
【０１００】
図１の計測部１４では、励起光源２６０は、例えばレーザ光源や水銀ランプを採用できる。シャッターユニット２６１は、励起光源２６０と蛍光フィルタユニット２６２の間に配置されており、シャッターユニット２６１は計測用チップ９０の微細粒子Ｍに対して光Ｌを照射しない場合には、励起光源２６０の発生する光Ｌが蛍光フィルタユニット２６２の手前で遮断することができる。
【０１０１】
図１に示す計測部１４についてさらに説明する。
図１に示すように、計測部１４は、少なくとも、光源としての励起光源２６０と、光源より照射される光のうち所望の励起波長帯域のみを選択するための光学フィルタ（励起フィルタ）７２０と、計測用チップ９０からの光情報の所望の波長帯域のみを選択するための光学フィルタ（蛍光フィルタ）７２１と、励起光と光情報との波長帯域の差によって光路を切り替えるためのダイクロイックミラー７５１から構成される少なくとも１つの蛍光フィルタユニット２６２と、励起光源から出射された光を計測用チップ９０に導くとともに計測用チップ９０から得られる光情報を収集するための対物レンズ１１０と、対物レンズ１１０を光軸方向に可動させるオートフォーカス機能を持つフォーカスユニット２６５と、計測対象からの光情報を検出するための光検出部としての受光部２６６と、から構成される。図１に示すように、蛍光フィルタユニット２６２と受光部２６６は、蛍光落射ユニット７５０に固定されている。  
【０１０２】
さらに、計測部１４はハーフミラー（図示せず）を有しており、ハーフミラーと蛍光フィルタユニット２６２とを切り替えることで、光源２６０からの光の一部を観察対象に照射すると同時に、観察対象からの反射光の一部を光検出部である受光部２６６に導くことによって、計測用チップ９０の上面９０Ｓおよびこの上面９０Ｓに形成されたウェル２００の形状および位置情報を計測することができる。なお、ハーフミラーとは、一般的に入射された光を５０％強度ずつ分光する機能を有する光部品であるが、この実施形態では、分光の光強度を必ずしも５０％にする必要はない。ただし、受光部２６６に入射される光強度は、大きい方ほど測定精度が向上するため、受光部２６６に分光される光強度が大きい分岐ミラーを使用する方が好ましい。
【０１０３】
蛍光フィルタユニット２６２では、光源２６０からの光が光学フィルタ７２０（励起フィルタ）によって励起光の波長成分のみが透過され、ダイクロイックミラー７５１で反射（透過）されて対物レンズ１１０に入射され、計測用チップ９０に照射される。計測用チップ９０から反射光として戻ってくる光は、再びダイクロイックミラー７５１で反射（透過）するため、光源２６０側に戻って行き、受光部２６６側には向かわない。
【０１０４】
一方、蛍光については励起光よりも波長が長いためダイクロイックミラー７５１を透過（反射）し、さらに光学フィルタ７２１（蛍光フィルタ）によって検出したい波長帯域のみが、検出部（CCDカメラなど）である受光部２６６に伝播される。すなわち、蛍光フィ
ルタユニット２６２を用いる場合、基本的に反射光は検出部まで伝播されず、検出することが困難である。なお、反射光によって計測チップ表面、ウェル、および回収部先端の形状や位置を計測する場合は、蛍光フィルタユニット２６２の代わりにハーフミラーのみを用いることとする。このようにハーフミラーを用いる場合には、ダイクロイックミラー７５１の場所にハーフミラーを置き、他２つの光学フィルタ７２０，７２１は基本的に必要ないが、蛍光フィルタユニットにおける励起フィルタに対応する位置のフィルタとして計測対象の蛍光を退色させにくい波長を選択透過するフィルタを用いるのが更に好ましい。
【０１０５】
また、光量を調節するためにＮＤフィルタを用いたり、微細粒子にダメージを与えないように紫外光カットフィルタを用いたりしてもよい。
このようにハーフミラーを用いた、反射光による位置情報の計測には、蛍光計測と共通の光源を用いることができるという利点がある。このことは計測機能と回収機能を持つスクリーニング装置に限らず、計測のみの装置であっても共通の利点である。
【０１０６】
図１に示す計測部１４の複数の対物レンズ１１０，２６４は、例えばレボルバー式で回転することで、必要な倍率の対物レンズを計測用チップ９０の下方位置に位置決めすることができる。フォーカスユニット２６５は、例えば制御部１００からの指令によりモータ２６５Ｍを作動することで、計測用チップ９０の下方位置に配置された例えば対物レンズ１１０をＺ方向に沿って移動して位置決めすることで、計測用チップ９０の微細粒子Ｍに対する対物レンズ１１０のフォーカス調整を行うことができる。
【０１０７】
図２８は、計測部１４の詳細説明図である。
図２８に示す微細粒子のスクリーニング装置１Ｂでは、光の反射板１１００が、回収部１３と計測用チップ９０の間に配置される。
【０１０８】
ここで、微細粒子のスクリーニング装置１Ｂは、計測用チップ９０と、計測用チップ９０を移動するための移動部１６と、対物レンズ１１０と、回収部１３の操作部１３０と、励起光源２６０と、蛍光フィルタユニット２６２と、ＣＣＤカメラのような受光部２６６と、反射板１１００と、反射板移動装置１１１０と、制御部１００を有している。
また、励起光源２６０と、受光部（光検出部の一例）２６６とは、計測用チップ９０と反射板１１００に対して同じ側、すなわち計測用チップ９０の下側に配置されている。
反射板１１００は、回収部１３の操作部１３０の吸引・吐出キャピラリ１４０と、計測用チップ９０の間に配置されている。この反射板１１００は、反射して透過光情報が得られればどのようなものでも良く、たとえば鏡面あるいはダイクロイックミラーを使用することができる。
【０１０９】
さらに、反射板１１００は、反射板移動装置１１１０に連結されており、反射板移動装置１１１０は、制御部１１０の指令により、反射板１１００をＹ方向に移動可能である。Ｙ方向の移動は図２８のような直線方向だけではなく、回転方向への移動でもよい。これにより、反射板１１００は、回収部１３の操作部１３０の吸引・吐出キャピラリ１４０と、計測用チップ９０の間に配置でき、逆に操作部１３０の吸引・吐出キャピラリ１４０と、計測用チップ９０の間から退出させることができる。
【０１１０】
反射板１１００は、操作部１３０の吸引・吐出キャピラリ１４０と、計測用チップ９０の間に移動して位置決めした状態では、励起光源２６０の光は、励起用フィルタ２７０を通過して、ダイクロイックミラー（またはハーフミラー）７５１で反射して対物レンズ１１０と移動部１６の開口部と計測用チップ９０を透過して、反射板１１００に達する。
そして、反射板１１００に達した光は、反射板１１００により反射されて、先の透過とは逆方向に計測用チップ９０を透過する。この透過光情報は、計測用チップ９０とダイクロイックミラー（またはハーフミラー）７５１と吸収用フィルタ７２１を通過して受光部２６６で検出することができる。画像解析部１５は、この透過光情報により、図２９に示すような計測用チップ９０ウェル２００内の微細粒子Ｍ、計測用チップ９０の上面９０Ｓおよびウェル２００の形状および位置情報を計測するようになっている。
【０１１１】
これにより、反射板１１００で計測用チップ９０の透過光を受光部２６６において取得できる。反射板を用いないで図３１に示す光源２５０が、計測用チップ９０の上面９０Ｓと垂直な軸に対して対称な２つ以上の方向より光を照射して、計測用チップ９０からの透過光によって計測用チップ９０の上面９０Ｓおよびこの上面９０Ｓに形成されたウェル２００等の形状および位置情報を計測する場合に比べて、例えば約２倍の高コントラストの画像が取得できる。このように、１つの励起光源２６０を用いることで、計測用チップ９０は、蛍光と、透過光の取得が可能である。しかも、励起光源２６０の光が計測用チップ９０を一度透過するために、計測用チップ９０の透過光情報から紫外光をカットするため、蛍光が退色しにくく、また微細粒子にダメージを与えない。
【０１１２】
図３０（Ａ）は、反射板１１００と計測用チップ９０の間には何も配置されていない例を示しており、図３０（Ｂ）は、反射板１１００と計測用チップ９０の間に、さらに拡散板１２００が配置されている例を示している。
【０１１３】
このように、図３０（Ａ）に示す例では、反射板１１００のからの反射光が計測用チップ９０の中心部分に偏るのに対して、図３０（Ｂ）の例では、拡散板１２００が配置されていることにより、反射板１１００のからの反射光が計測用チップ９０に対して均一な光として計測用チップ９０に透過させることができるので、偏りのない透過光情報を得ることができる。
【０１１４】
計測部１４は、計測データのコントラスト値を指標としたオートフォーカス機能を有し、計測時に透過光もしくは反射光によるオートフォーカスによって計測用チップ９０の上面９０Ｓへの合焦を維持するともに、反射光によって吸引・吐出キャピラリ１４０先端部１４２のオートフォーカスを行なうことで、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の計測視野内の位置、および計測チップ面との距離を計測することができる。
【０１１５】
微細粒子のスクリーニング装置１は、光情報が蛍光であって、反射光もしくは透過光による形状情報計測による計測用チップ９０のウェル２００の位置情報と、励起光による光情報計測による微細粒子からの蛍光情報の両方を用いて計測・解析を行い、励起光を照射することによる蛍光計測を実施した後に、同一視野における透過光計測を実施する。すなわち、微細粒子のスクリーニング装置１では、蛍光計測データのうち、形状情報によって特定されるウェル２００の位置の部分のみの解析を行なう。その際、形状情報の計測を先に行なうと、計測対象である微細粒子の蛍光が退色してしまい、正確な情報の取得ができなくなるために、蛍光輝度を反射光もしくは透過光による形状情報計測よりも先に計測することが有効である。
【０１１６】
更に励起光を計測用チップ９０上の複数のウェル２００を含む領域に照射することによって、１視野で複数のウェル２００を含む領域内に存在する微細粒子を計測する。この時に、実質的に自家蛍光の均質な部材に励起光を照射した際に光検出部である受光部２６６によって検出される輝度分布を用いて微細粒子からの蛍光計測値の補正を行なう時には、前記輝度分布の複数ピクセルの平均化処理、もしくは周波数フィルタによって画素ノイズの除去を行う。
【０１１７】
補正データの取得方法としては、例えば自家蛍光の均質な部材として計測用チップ９０を用いて、微細粒子の懸濁に用いる液体のみを注入した状態で励起光強度分布を取得する方法や、実際の計測結果からウェル２００以外の部分の輝度分布を抽出し、このデータを補完することによって計測視野全面の輝度分布を取得する方法、更にはチップ面の中で前記ウェルの形成されていない部分の輝度情報を取得する方法などがある。更には微細粒子を含んだ計測情報から、データ処理によって計測視野全面の輝度分布に対する微細粒子の影響を低減させた結果を用いることもできる。
【０１１８】
自家蛍光の均質な部材としては、計測用チップを用いてウェルの形成されていない部分の輝度分布を取得するものである。
【０１１９】
補正の対象となるのは、計測視野内に照射される励起光の強度分布（不均一性）だけではなく、レンズやフィルタ等の各光学系の透過効率等による検出効率の不均一性もある。これらの不均一性は、励起光自体の径方向分布、および励起光及び蛍光を導くレンズ等の光学部品の径方向分布への依存性が高いため、取得した輝度分布を処理することで輝度の高周波成分を除去することが好ましい。仮に元画像が微細粒子を含む計測情報から得られたものであっても、処理の過程において微細粒子の輝度の影響を実質的に取り除くことができるため、必要精度によっては予め補正用情報を取得しておくのではなく、計測と同時に補正することが可能である。処理方法としては、平均化、周波数解析、クラスター解析等を用いたデータ処理等を用いることが考えられる。これらの複数の手法は、求められる補正精度によって選択すべきである。
【０１２０】
図１において、シャッターユニット２６１のシャッターを開けると、励起光源２６０の光は、蛍光フィルタユニット２６２の蛍光フィルタ７２０で励起波長帯域のみ透過し、ダイクロイックミラー７５１で反射され、対物レンズ１１０を透過して、計測用チップ９０に照射される。これにより、計測用チップ９０内の微細粒子Ｍが例えば蛍光を発生すると、その蛍光はダイクロイックミラー７５１を透過し、蛍光フィルタ７２１で任意の波長帯域のみ透過して受光部２６６により受光されて、光信号―電気信号変換されて画像解析部１５によりその蛍光が画像解析される。
【０１２１】
次に、図１に示す微細粒子のスクリーニング装置１を用いて、計測用チップ９０のウェル内における蛍光を発する微細粒子を含む全数の微細粒子を、他のウェル内の微細粒子からは選択して吸引して回収プレート８０に回収するスクリーニング方法の一例について、図７〜図９を参照しながら説明する。
【０１２２】
図７（Ａ）は、計測用チップ９０の一部分を示す断面図であり、計測用チップ９０のウェル２００内にはまだ微細粒子は入っていない。図７（Ｂ）は、計測用チップ９０の各ウェル２００内に複数の微細粒子Ｍが配置された状態を示している。
【０１２３】
図８（Ａ）は、ウェル２００内の複数の微細粒子Ｍに光（照射光、励起光）Ｌが照射されて複数の微細粒子Ｍが蛍光を発するが、特に最大輝度の蛍光を発する微細粒子Ｍ１が蛍光を発している例を示す。図８（Ｂ）は、吸引・吐出キャピラリ１４０が各ウェル２００に対して順番に近づいて、最大輝度の蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含む全数の微細粒子Ｍを吸引して回収する様子を示す。
【０１２４】
図９は、最大輝度の蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含む全ての微細粒子を計測用プレート９０のウェル２００から吸引して、回収プレート８０のウェル８１に対して回収する例を示す。
【０１２５】
図１に示すように、搭載用テーブル４０の搭載面７０には、回収テーブル８０と計測用チップ９０の固定具１２０がそれぞれ所定の位置に配置されている。固定具１２０は、対物レンズ１１の上方位置に配置されている。吸引・吐出キャピラリ１４０は、計測用チップ９０の上に位置されている。
【０１２６】
励起光源２６０の光は、上述したように対物レンズ１１まで伝播され、光Ｌとして計測用チップ９０に照射される。これにより、図８（Ａ）に示す計測用チップ９０内の複数の微細粒子Ｍが蛍光を発生するが、これらの複数の微細粒子Ｍの蛍光は、上述したように、ダイクロイックミラー７５１を通過して光学フィルタ（蛍光フィルタ）７２１によって検出したい波長帯域のみ透過されて受光部２６６により受光されて、光信号―電気信号変換されて画像解析部１５によりその蛍光が画像解析される。
【０１２７】
画像解析部１５では、各ウェル２００内の複数の微細粒子Ｍの内の、少なくとも最大輝度の微細粒子Ｍ１の蛍光強度を解析する。この解析結果を基に、輝度条件を満たす微細粒子を、その微細粒子が収納されたウェル２００から回収することになる。
【０１２８】
画像解析部１５の結果から、制御部１００では、最大輝度の微細粒子Ｍ１の収納されているウェルの位置情報を基にして、図３に示す制御部１００が指令して第１モータ５５を作動することで、第２テーブル５２をＸ方向に沿って移動して位置決めし、第２モータ６５を作動することで、搭載用テーブル４０をＹ方向に沿って移動可能および位置決めする。そして、図６に示す制御部１００が指令してモータ２５１を作動することで、吸引・吐出キャピラリ１４０がＺ２方向に下降する。
【０１２９】
これにより、吸引・吐出キャピラリ１４０は、その先端部１４２を、図８（Ｂ）に示すように、計測用プレート９０の各ウェル２００に近づけて、任意の１つのウェルに位置決めすることができる。
【０１３０】
その後、図９に示すように、制御部１００が指令して吸引ポンプ１３３を作動することで、吸引・吐出キャピラリ１４０が、最大輝度の蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含めた全数の微細粒子Ｍを有するウェル２００から、微細粒子Ｍ１を含めた全数の微細粒子Ｍを他のウェル２００の微細粒子とは区別して選択的に吸引する。
【０１３１】
さらに、図６に示す制御部１００が指令してモータ２５１を作動することで、吸引・吐出キャピラリ１４０がＺ１方向に上昇する。図３に示す制御部１００が指令して第１モータ５５を作動することで、第２テーブル５２をＸ方向に沿って移動して位置決めし、第２モータ６５を作動することで、搭載用テーブル４０をＹ方向に沿って移動して位置決めすることで、吸引・吐出キャピラリ１４０が、回収プレート８０の任意のウェル８１上に相対的に移動して位置決めされる。そして、図６に示す制御部１００が指令してモータ２５１を作動することで、吸引・吐出キャピラリ１４０がＺ２方向に下降すると、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が回収プレート８０のあらかじめ定められた位置のウェル８１に近づく。
【０１３２】
このウェル８１には予め培養液などの液体ＬＤが入れられており、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２がこの液体ＬＤの中に入るようになっている。
【０１３３】
吸引ポンプ１３３を逆に作動することで、吸引・吐出キャピラリ１４０がその微細粒子Ｍ１を含めた全数の微細粒子Ｍを回収プレート８０のあらかじめ定められた位置のウェル８１の液中に排出できる。これによって、最大輝度の蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含めた全数の微細粒子Ｍは回収プレート８０のウェル８１内に回収することができる。
【０１３４】
上述した最大輝度の蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含む全数の微細粒子の吸引および回収動作は、計測用チップ９０の、回収条件を満たした微細粒子が収納されている各ウェル２００について順番に行う。
【０１３５】
このようにして、各ウェル２００内の蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含む全数の微細粒子は、移動部１６による計測用チップ９０のＸ方向とＹ方向の移動操作と、回収部１３による吸引・吐出キャピラリ１４０のＺ方向の上下移動操作により、確実かつ効率よく、回収プレート８０のあらかじめ定められた位置のウェル８１から回収することができる。この結果、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。
【０１３６】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置１では、吸引・吐出キャピラリ１４０は、計測用チップ９０に対して垂直方向（Ｚ方向）に移動して計測用チップ９０の各ウェル２００に対して接近する。これにより、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は、各ウェル２００に対して確実に近づいて、標的とする微細粒子Ｍ１を含む全数の微細粒子をウェル２００内から、他のウェル内の微細粒子とは区別して吸引して回収できる。
【０１３７】
図１０は、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の高さ合わせ用基準面の例を示している。この高さ合わせ用基準面８９０は、固定具１２１に設定されており、計測用チップ９０面からの高さが既知である。この高さ合わせ用基準面８９０は、固定具１２１の内面１２４に一致している。図１に示す対物レンズ１１０はこの高さ合わせ用基準面８９０にフォーカスをあわせ、その位置に対物レンズ１１０を保持したまま、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２にフォーカスが合う位置まで回収部１３を移動させる。これにより、計測用チップ９０の上面９０Ｓとの距離を確定し、このときの回収部１３の位置座標からの相対移動によって、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は計測用チップ９０の上面９０Ｓから所望の距離ＶだけＺ２方向に沿って位置８９１まで下降して上面９０Ｓに接近させる。これにより、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は、高さ合わせ用基準面８９０を利用してＺ方向に沿って確実に位置合わせすることができる。
【０１３８】
図１１は、吸引・吐出キャピラリ１４０によりシリンジ方式によって微細粒子を回収した際の回収成功率を示す。回収成功率の定義は、回収目的のウェル内のすべての微細粒子が吸引・吐出キャピラリ１４０により回収され、隣接するウェルからは１つの微細粒子も回収されない確率を言う。
【０１３９】
試行回数は各条件で１０回とし、吸引はストローク制御によるものである。吸引量は各条件で回収率が最大になる条件とした。吸引速度は一定とした。吸引対象は、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline、リン酸緩衝生理食塩水）中の固定化酵母細胞を使用した。ウ
ェル径は約１０μｍであり、ウェルピッチは約３０μｍである。計測用チップへの吸引・吐出キャピラリ１４０の接近距離（間隔）を、１０，２０，３０，４０μｍの４条件とし、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の内径を、１０，２０，３０，４０μｍの４条件とした。
【０１４０】
図１１を参照すると、計測用チップへの接近距離（μｍ）が小さいほど回収成功率が高く、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の内径（μｍ）が小さいほど回収成功率が高かった。
【０１４１】
すなわち、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の内径は、ウェルの直径の２倍以下であることが好ましく、計測用チップへの接近距離は、ウェルピッチ以下であることが好ましい。このようにすることで、吸引・吐出キャピラリ１４０は、シリンジ方式によって対象となるウェルから微細粒子をより確実に回収できる。
【０１４２】
計測視野内での吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２を記録し、移動部１６によって計測用チップ９０の回収対象のウェル側をこのキャピラリ先端位置に合わせるようにすることで、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の中心とウェルの中心を合わせる。これにより、より確実にウェル内の全数の微細粒子を回収することができる。
【０１４３】
吸引・吐出キャピラリ１４０により微細粒子を吸引する際に、吸引量を制御する場合、吸引速度を一定、もしくは引き始めの吸引速度を基準として、吸引途中で段階的にもしくは連続的に速度を低下させる。すなわち、微細粒子の種類によっては、微細粒子がウェル壁面に吸着している場合があり、この吸着力に勝るだけの吸引力が必要になるが、一度吸着が剥がれれば、それ以後はそれほどの吸引力は必要なくなる。逆に、その後は隣接するウェルからの誤吸引を防止するために、吸引力を減じる必要がある。このように、吸引する際に、吸引力を制御することで、微細粒子をウェル内から確実に吸引することができる。
【０１４４】
なお、図９に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２内には、液体の一例である懸濁液５００を予め充填することができる。このように先端部１４２に液体を予め入れておかないと、回収部１３の気密性が完全でない限り、毛細管現象によって、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２から液体が流入してくる。液体の流入のスピードは回収部１３の気密性の度合いに依存するが、最終的な流入量は、吸引・吐出キャピラリ１４０と液体の物性と吸引・吐出キャピラリ１４０の径にのみ依存し、流入した液体の重さとつりあいの位置まで入ってくる。このため、液体と一緒に不要な微細粒子も流入してしまう。入れておく液体は、実際に計測微粒子を懸濁するのに用いるものが好ましいが、この限りではない。
【０１４５】
充填量としては、溶液の物性（粘度・密度）、吸引・吐出キャピラリ１４０と溶液との親和性、及びキャピラリの内径によって決まる、毛細管現象によるつりあい位置のレベルが望ましいが、充填量に誤差がある場合でも流入のスピードを下げることができ、吸引・吐出動作の精度を上げることができる。
【０１４６】
図１２は、微細粒子Ｍ１が対象のウェル２００から吹き出されてしまう現象の例を示している。これは、キャピラリ内にある液体が、慣性力によってキャピラリ先端から下方に流出するために発生する現象である。図１２において、隣接するウェル２００は、粒子格納ピッチＰＴ毎に配列されている。吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の内径ＳＴが、微細粒子の平均直径の１．５倍以上であり、粒子格納ピッチＰＴ以下である。吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２とチップ９０との距離ＳＬが、粒子格納ピッチＰＴ以下に設定されている
【０１４７】
図１２（Ｂ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０が対象ウェル２００に対して接近した場合、微細粒子Ｍ１が対象ウェル２００から吹き出されてしまうおそれがある。このような微細粒子Ｍ１が対象ウェル２００から吹き出されてしまう現象は、吸引・吐出キャピラリ１４０が接近して停止する際の減速が急激である場合、吸引・吐出キャピラリ１４０内の液３３０の量が多い場合、そして吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２のテーパー部分が長い場合に発生しやすい。
【０１４８】
そこで、図１３に示すような微細粒子Ｍ１の回収動作を行うことにより、微細粒子Ｍ１が対象ウェル２００から吹き出されてしまうのを防止する。
図１３（Ａ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が懸濁液５００に着水する前に、吸引・吐出キャピラリ１４０は空吸引して、吸引・吐出キャピラリ１４０はＺ２方向に沿って対象ウェル２００に高速接近する。図１３（Ｂ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が懸濁液５００に着水した後、速度を緩めることで、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は、高速接近段階では多段階に接近速度を下げて対象ウェル２００に低速接近させる。このように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は高速接近から低速接近させる少なくとも２段階以上の速度で接近させる。なお、高速接近の速度は特に限定されない。
【０１４９】
その後、図１３（Ｃ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は、例えば１ｍｍ／ｓ以下の低速で接近するとともに吸引・吐出キャピラリ１４０内は予備吸引する。これにより、微細粒子Ｍ１が対象ウェル２００から吹き出されてしまうことが無くなる。
【０１５０】
なお、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が、チップ９０の上面（目的位置）から０．２ｍｍ以下に接近してから停止するまでの平均接近速度は、０．５ｍｍ／ｓ以下であることがより好ましい。吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が、チップ９０の上面（目的位置）から０．１ｍｍ以下に接近している際の下降減速度、及び上昇加速度の大きさは、２０μｍ／ｓ２以下であることが望ましい。少なくとも吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が、最終停止する前の減速時には、前記の予備吸引動作を継続する。
【０１５１】
なお、上述したように、吸引・吐出キャピラリ１４０は、その先端部１４２とチップ９０との間で、接近もしくは離れる速度を制御することが可能であるが、この速度は、段階的に可変もしくは連続的に可変的な制御をすることが可能である。
【０１５２】
図１３（Ａ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が懸濁液５００に着水する前に、吸引・吐出キャピラリ１４０は空中で空吸引を実施するが、この空吸引により、（液中での吸引量合計＜吐出量合計）となるようにすることが好ましい。これは回収動作が繰り返されるうちに、キャピラリ内の液面が上昇し、これによって前記の微細粒子が対象ウェルから噴出される現象が発生しやすくなることの防止、またその程度が激しくなることを防止するためである。
【０１５３】
吸引・吐出キャピラリ１４０の上下動作における各停止位置、速度、および加減速度と、吸引・吐出キャピラリ１４０の吸引ポンプの吸引および吐出の量、速度、前記キャピラリの上下動作とのタイミング等の動作を吸引・吐出パラメータとして微細粒子の回収動作中に測定者によって変更できる機能をもつことが好ましい。自動調整ができることは更に好ましい。
【０１５４】
その後、図１３（Ｄ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は、対象のウェル２００内から微細粒子Ｍ１が吸引される。図１３（Ｅ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２は回収プレート８０のウェル８１に位置決めされて、指定回数の吐出しと、吸引動作を繰り返して微細粒子Ｍ１をウェル８１内に吐き出す。このように指定回数の吐出しと吸引動作を繰り返すことにより、先端部１４２内に微細粒子Ｍ１が残留するのを防止できる。このような一連の動作を繰り返すことにより、微細粒子Ｍ１が対象ウェル２００から吹き出されてしまうのを防ぎながら、対象粒子を繰り返して確実に回収することができる。
【０１５５】
また、微細粒子Ｍ１を対象ウェル２００から吹き出すのを防止する別の手法としては、図１４（Ａ）に示すように、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２はＺ２方向に沿って、隣接する対象ウェル２００，２００との間の突出部２０９に向けて接近して、その後吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２はＹ１方向に沿って水平に移動することで、目的としている対象ウェル２００に対して位置決めする。このように吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２をウェルでない場所に下降させてから水平移動させて対象ウェルの真上に位置決めすることにより、微細粒子Ｍ１が対象ウェル２００から吹き出されてしまうのを防ぐことができる。
【０１５６】
さらに、微細粒子Ｍ１を対象ウェル２００から吹き出すのを防止する別の手法としては、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の形状を設定することである。図１５（Ａ）と図１５（Ｂ）は、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の形状例を示しており、図１５（Ａ）の先端部１４２の形状では、先端１４２Ｓから内径ＳＴが０．７ｍｍに達するまでの軸方向の長さＤＰが４ｍｍであり、図１５（Ｂ）の先端部１４２の形状では、軸方向の長さＤＰが５．０ｍｍである。例えば先端１４２Ｓからの長さＤＰが５ｍｍ以下であり、特に好ましくは４ｍｍ〜５．０ｍｍであれば、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が対象ウェルに高速で接近しても微細粒子が噴き出されてしまうことが少なくなる。これは、キャピラリ内の液に作用する慣性力に対する流体抵抗が大きくなるためである。図１６は、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の形状と対象ウェルから微細粒子が噴き出される程度の関係例を示しており、実際に傾きの大きい曲線ＣＭ１が、傾きの小さい曲線ＣＭ２に比べて微細粒子の噴き出し量を減らすことができた。
【０１５７】
また、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端面の軸方向に対する垂直度は、２０μｍ以下であることが望ましい。吸引・吐出キャピラリ１４０の外径は、内径に対して１０μｍ以上大きく、６０μｍ以下であることが好ましい。
【０１５８】
これは、キャピラリ先端面を観察しやすい形状（垂直で、さらに断面積が確保された形状）とすることで、ＡＦ（オートフォーカス）精度を向上させることにより、位置決め精度が向上し、最終的に回収成功率を向上させるためである。なお、吸引・吐出キャピラリ１４０の外径を６０μｍ以下とした理由は、キャピラリ先端面の一部が隣のウェルに位置してしまう恐れがあるからである。
【０１５９】
さらに、微細粒子Ｍ１の回収率を向上するためには、図１７に示すように、複数の対象ウェル２００に対して、それぞれ吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２を対応させて、各吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が対象ウェル２００内の微細粒子を吸引して、回収プレートの１つのウェル内に収納することもできる。このようにすることにより、例えば同程度の輝度の細胞は、回収プレートの同じウェルにまとめた方がその後の扱い等が便利になる場合が考えられる。
【０１６０】
次に、図１８を参照して、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２が微細粒子を吸引（ピックアップ）できたかどうかの成否を確認する動作例について説明する。
【０１６１】
図１８（Ａ）は、対象ウェル２００内に微細粒子Ｍが残っている例を示しており、図１８（Ｂ）は、対象ウェル２００内に微細粒子Ｍが残っていない例を示している。図１８（Ａ）では、受光部２６６は対物レンズ１１０を介して対象ウェル２００内に微細粒子Ｍが残っている状態を受光している。また、図１８（Ｂ）では、受光部２６６は対物レンズ１１０を介して対象ウェル２００内に微細粒子Ｍが残っていない状態を受光している。このようにして、解析部は、微細粒子をピックアップ動作する前後にウェルの周囲を撮影して、その比較によって微細粒子がピックアップの成否を判断でき、対象ウェル２００内に微細粒子Ｍが吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２により確実に吸引されたかどうかを光学的に確認することができる。
【０１６２】
もし、微細粒子のピックアップが失敗したと判断された場合、同一ウェルからのピックアップを所定回数繰り返すことで、回収率を向上させることができる。解析部は、ピックアップの成否の履歴により、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の詰まりの推定を行うことが可能となる。
【０１６３】
また、同様にして、受光部２６６は対物レンズ１１０を介して吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２内の状態を受光することにより、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２内の詰まり状態を検出することができる。  
図１９（Ａ）と図１に示すように、複数の光源２５０は、計測用チップ９０の上面９０Ｓと垂直な軸に対して対称な２つ以上の方向より光を照射して計測用チップ９０に光を透過させて対物レンズ１１０を介して受光部２６６に受光させるようになっている透過光源である。
【０１６４】
図１９（Ｂ）に示すのはチップ９０のウェル２００に対して対物レンズ１１０のピントが合っている場合と合っていない場合を示している。ウェル２００に対して対物レンズ１１０のピントが合っている場合には、一重のリング状の像２００Ｊが受光されるが、ウェル２００に対して対物レンズ１１０のピントが合っていない場合には、離れた二重のリング状の像２００Ｋが受光される。光源２５０の垂直線に対する設定角度θが予め判っている場合に、解析部は、画像処理により、離れた二重のリング状の像２００Ｋの分離距離ＶＮから対物レンズ１１０の合焦までの距離を計算することができる。この方法によってオートフォーカスの所要時間を大幅に短縮することができる。
【０１６５】
図２０は、計測用チップ９０におけるウェル２００の配列例を示している。計測用チップ９０におけるウェル２００は、図１の受光部２６６と対物レンズ１１０の光学系の観察視野に対応する領域９１９毎に区切られていて、各領域９１９は間隔ＭＢをおいて、マトリックス状に配列されている。各領域９１９内には、複数のウェル２００がマトリックス状に配列されている。隣接する領域９１９，９１９の間隔ＭＢは、同一領域９１９内のウェルの配列ピッチよりも大きくなっている。これによって、各領域９１９の位置は、各領域９１９の４隅のウェルの少なくとも１つの位置ＣＶによって認識して、その領域９１９を光学系の視野中心に移動させることができる。
【０１６６】
ウェル内の微細粒子の残留の様子が光学系の画像によりリアルタイムでモニタして確認でき、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２内の詰まりを光学系の画像によりリアルタイムでモニタして確認できるので、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の速度、停止位置、吸引速度、減速度合いなどのパラメータを更新することができる。
解析部は、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２を撮影して、画像によって吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部１４２の詰まりを推定することができる。回収プレート８０の底面側からの撮影画像によって、回収された微細粒子の収納の確認を行うこともできる。
【０１６７】
本発明の実施形態では、吸引・吐出キャピラリは、高速⇒低速の少なくとも２段階以上の速度で計測用チップに対して接近されるので、ウェル内から微細粒子が出てしまうことを防止して微細粒子の回収率を向上できる。また、吸引・吐出キャピラリは、計測用チップのウェルではない場所に下降させてから計測用チップに対して水平移動させて対象とするウェルの真上に位置させることにより、ウェル内から微細粒子の流出が更に防止され、微細粒子の回収率を更に向上させることができる。
【０１６８】
吸引・吐出キャピラリが計測用チップのウェルから微細粒子を吸引する動作前後のウェル周囲を画像にして、解析部は、動作前後のウェル周囲の画像を比較することにより、吸引・吐出キャピラリがウェルから微細粒子が吸引されたかどうかを判断する。これにより、微細粒子の回収率を向上できる。
【０１６９】
吸引・吐出キャピラリの先端部の画像によって、吸引・吐出キャピラリの先端部における微細粒子の詰まりを推定する。これにより、回収動作をスムーズに行える。
回収プレートの底面側から画像を得て、回収プレートのウェル内に微細粒子が回収されているかどうかを確認する。これにより、回収プレートのウェル内に微細粒子が回収されているかを画像で確認できる。
【０１７０】
吸引・吐出キャピラリの先端部は、計測用チップのウェルに対して低速で接近するとともに吸引・吐出キャピラリ内は予備吸引される。これにより、ウェル内から微細粒子が出てしまうことを防止して微細粒子の回収率を向上できる。
【０１７１】
図２１は、計測用チップ９０の好ましい形状例を示している。
図２１に示す計測用チップ９０は、既に説明したように長方形の平板であり、ウェル領域２００Ｒを有しているが、例えば樹脂成型品である。計測用チップ９０の１つの長辺部分７１０には、例えば位置決め用の２つの突起７２０が突出して形成されているとともに、１つの短辺部分７１１には、例えば位置決め用の１つの突起７２１が突出して形成されている。突起７２０，７２１は例えば長方形状を有しており、突起７２０は突き当て面７２０Ｂを有し、突起７２１は突き当て面７２１Ｂを有している。すなわち、計測用チップ９０の２つの側面からそれぞれ突起７２０，７２１が突出して形成されている。
突起７２０の突き当て面７２０Ｂは、固定具１２０の内側の位置決め部１２０Ｆに対して突き当て、突起７２１の突き当て面７２１Ｂは、固定具１２０の内側の位置決め部１２０Ｇに対して突き当てる。
【０１７２】
これにより、計測用チップ９０は、固定具１２０の内側の位置決め部１２０Ｆ、１２０Ｇに対して突き当て方向ＧＨに沿って突き当てることで位置決めが確実に行えるので、位置決めが再現性良く行え、位置決め作業性が向上する。これに対して、突起を用いない場合は、固定具への突き当てによる位置決めのためには計測用チップ９０の該当する側面の全面を当接させることになるが、側面全面で精度を確保することは非常に困難である。
【０１７３】
また、計測用チップ９０の上面９０Ｓ側には、計測用チップ９０の表示部７５０が形成されている。この表示部５０は、例えば矢印形状であり突き当て方向ＧＨに向いている。表示部５０は、計測用チップ９０の上面９０Ｓまたは下面や外周部に設けても良く、計測用チップ９０をセットする際の向き（表裏及び方向）を明示するパターンもしくは切り欠きなどのマークである。
【０１７４】
次に、図２２は、計測用チップ９０が固定具１２０に固定された場合において、計測用チップ９０の反りを解消することを示しいている。
図２２（Ａ）は本発明の実施形態であり、図２２（Ｂ）は比較例である。
図２２（Ａ）では、対物レンズ１１０と受光部２６６及び固定具１２０を示している。計測用チップ９０の上下面は、例えば成型における離型後の材質の温度変化による反りなどに代表されるような、形状として低次の局面を形成している例である。
【０１７５】
この計測用チップ９０の上面９０Ｓが固定具１２０の内面１２４に対して当てられ、そして計測用チップ９０の下面９０Ｄ側から力ＦＣを加えることによって、計測用チップ９０の反りが矯正される。すなわち、ウェルが形成されている上面９０Ｓ側の計測エリアを含む領域は、その反対面である下面９０Ｄより力を加えることによって固定具１２０のフラットな剛性平面である内面１２４に押し付けて計測用チップ９０の反りを矯正する。フラットな剛性平面である内面１２４に対する計測エリアの任意の２ｍｍ四方の領域の平行度が、１０μｍ以下となる（ウェル自体の傾斜のような微小な起伏や突起を除く）。これにより、光学系に対するウェルの位置精度が向上し、観察視野内の全域で合焦を確保することができる。
【０１７６】
これに対して、図２２（Ｂ）に示す比較例では、計測用チップ９０Ｎの上面９０ＳＮと下面９０ＤＮにはそれぞれ小さな凹凸が存在しており、たとえ計測用チップ９０Ｎの上面９０ＳＮが固定具１２０の内面１２４に対して当てられ、そして計測用チップ９０Ｎの下面９０ＤＮ側から力ＦＣを加えても測用チップ９０の反りを矯正することができず、一回の観察視野（例えば２ｍｍ四方）内の全域で合焦を確保することができない。
次に図２３は、計測チップ９０の厚み変動によって発生する観察焦点のズレについて示している。
【０１７７】
図２３（Ａ）から図２３（Ｃ）では、計測チップの上面（ウェルが形成された面）と光学系との距離自体はすべて同じであるがチップの厚みの違いによって焦点位置が異なることを示している。すなわち、図２３（Ｂ）では、光学系９７６の焦点ＭＰが上面９０Ｓに正確に位置しているのに対して、図２３（Ａ）では、焦点ＭＰが上面９０Ｓの上側に、図２３（Ｃ）では下側に位置しており、どちらも計測対象位置から焦点がずれてしまっている。このズレ量が被写界深度以上になると、正常な計測が不可能となる。２ｍｍ四方程度の観察視野を確保するための一般的な計測光学系の場合、焦点ズレは範囲は１０μｍ以内に抑える必要があり、許容される厚み変動量は以下のように計算される。
【０１７８】
図２３において、ｔは計測用チップ９０の厚み［ｍｍ］であり、Δｔは計測用チップ９０の厚み変動［ｍｍ］であり、Ｌ０とＬは、対物レンズ１１０のレンズ１１０Ｂの焦点距離［ｍｍ］であり、ΔＬは焦点ズレ［μｍ］である。
ここで、焦点距離Ｌは、式１の関係を有する。
Ｌ＝Ｌ０＋ｔ×（１−１／ｎ）・・・・・式１
式１から、
ΔＬ＝Δｔ×（１−１／ｎ）・・・・・・式２
が得られる。
焦点ズレ±５μｍ以内（一視野内の焦点ズレ幅が１０μｍ以内）にするためには、
Δｔ≦１０／（１−１／ｎ）・・・・・・式３
となる。
【０１７９】
計測用チップ９０がポリスチレン（屈折率ｎ＝１．５９）製である場合には、焦点ズレΔＬを±５μｍ以内とするためには、Δｔは±１３．５μｍ以内であり、厚みの変動Δｔが２７μｍ以内である。
【０１８０】
これにより、計測用チップ９０の厚みにこの範囲内の変動があっても、任意の２ｍｍ四方の領域内の焦点ズレを±５μｍ以内に抑えることができるため自動計測時の焦点外れや、認識位置のズレを防止できる。   
【０１８１】
図２４は、計測用チップ９０の上面９０Ｓと下面９０Ｄの平行ズレによる観察位置の誤差について示している。本微細粒子のスクリーニング装置では、観察画像によってウェルや吸引・吐出キャピラリの位置を把握や補正を行うため、画像による位置認識精度としては±５μｍが必要であるため、観察画像のゆがみをこのレベル以下に抑える必要がある。
【０１８２】
図２４（Ａ）では、上面９０Ｓと下面９０Ｄが平行であり、図２４（Ｂ）では、上面９０Ｓと下面９０Ｄが平行ではない例を示している。観察対象ＭＪは、ウェルまたは吸引・吐出キャピラリの先端部などである。計測用チップ９０の少なくともウェルが形成されている上面９０Ｓでは、光学系の計測エリアに含まれる任意の２ｍｍ四方の領域内の位置認識精度が±５μｍ以内にするためには、上面９０Ｓと下面９０Ｄの成す傾斜角度（平行からのズレ）φの変動が、（５×１０―６）／｛ｔ（１−１／ｎ）｝［ｒａｄ］以下である（ｔは前記計測用チップの平均厚み［ｍｍ］，ｎは前記計測用チップの材質の屈折率）ことが必要であることを示している。
【０１８３】
Δは観察対象ＭＪの観察位置のズレを示し、ｔは計測用チップ９０の平均厚み、ｎは計測用チップ９０の材質の屈折率、φは下面９０Ｄの傾斜角度を示している。
観察対象ＭＪの観察位置のズレΔは、式４で示すことができる。
Δ＝ｔ・ｔａｎ［φ―ｓｉｎ−１｛（ｓｉｎφ）／ｎ｝］≒ｔ・φ・（１−１／ｎ）・・・・・・・・・・・・・・・式４
Δ≦５μｍにするためには、
φ≦（５×１０―６）／｛ｔ（１−１／ｎ）｝［ｒａｄ］・・・式５
となる。
【０１８４】
これにより、少なくとも一回の観察視野（例えば２ｍｍ四方）内の全域で位置の認識精度を±５μｍ以内にすることができ、一回の観察視野（例えば２ｍｍ四方）内の全域での観察対象の位置認識精度が向上する。
【０１８５】
図２５は、位置の認識精度を±５μｍ以内を満たすための傾斜角度φと観察位置のズレΔの関係例を示しており、チップの厚みｔは１ｍｍであり、屈折率ｎはポリスチレンに相当する１．５９の場合である。観察位置のズレΔ（μｍ）が５μｍ以内であるためには、傾斜角度の変動は、０．８度以下であることを示している。
【０１８６】
本発明の実施形態では、計測用チップ９０は、ウェルが形成されているエリアが１０ｍｍ四方以上の広さをもっており、その周囲の計測に供しない領域の適切な一部もしくは全部が、固定具１２０に設けられている。固定具１２０の一つの平面に含まれた実質的に剛体とみなすことのできる基準面（内面１２４に相当）に押し付ける方向に、計測用チップ９０のウェルの形成されていない下面側より適切な大きさの力ＦＣを加えることで、ウェルが形成されている全領域に含まれる任意の２ｍｍ四方の領域の、基準面（内面１２４に相当）に対する平面度を１０μｍ以下とできる。このため、精度良く位置決めすることで、位置決め作業性を向上して焦点外れや認識位置のズレを防止することができる。
図２６は、微細粒子の光信号を１回計測した場合のグラフ例を示す図である。図２６に示す例では、縦軸には微細粒子の蛍光の輝度を検出した度数を示し、横軸には計測値（輝度）を示している。
【０１８７】
図１の画像解析部１５は、図２６に示す１つのグラフ８６０の計測結果において計測曲線ＭＫ１を表示しており、この計測曲線ＭＫ１に対しては、任意に輝度領域ＴＲ１と輝度領域ＴＲ２を指定することができる。輝度領域ＴＲ１は下限８７１と上限８７２によりなる領域であり、輝度領域ＴＲ２は下限８７３と上限８７４によりなる領域である。これらの輝度領域ＴＲ１と輝度領域ＴＲ２は、それぞれ微細粒子の回収対象ＦＨ１と回収対象ＦＨ２となる。
【０１８８】
このように図１の画像解析部１５は、微細粒子の光情報の解析の結果から、グラフ８６０を提供し、これに対して測定者が解析輝度の下限と上限からなる１つ以上の輝度領域を設定することによって、回収対象候補のウェルを指定することができる。すなわち図２６のグラフ８６０は、計測対象の輝度分布をグラフ表示しており、このグラフ８６０を用いて容易に回収対象とする微細粒子の輝度領域を指定することができる。
図２７は、微細粒子の光信号を複数回計測した場合のグラフ例を示す図である。図２７に示す例では、縦軸には微細粒子の蛍光の輝度を検出した度数を示し、横軸には計測値（輝度）を示している。
【０１８９】
図２７に示す例では、図１の画像解析部１５は、３つのグラフ８８１，８８２，８８３を提供する。グラフ８８１は計測結果（１）を示し、グラフ８８２は計測結果（２）を示し、さらにグラフ８８３は計測結果（１）、（２）の演算結果（３）を示している。
図２７の例では、同一のサンプル（微細粒子）を複数回（この例では２回）計測して、各計測の解析結果（１）、（２）、および複数回計測の解析結果から演算された演算結果（３）に基づいて、回収対象を選択することができる。
【０１９０】
図２７（Ａ）に示す計測結果（１）は、図２６に示す計測結果と同じものである。図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）では、計測曲線ＭＫ２に対して輝度領域ＴＲ３が設定されている。輝度領域ＴＲ３は、下限８８８と上限８８９によりなる領域である。図２７（Ｃ）に示す演算結果（３）は、図２７（Ａ）に示す計測結果（１）と図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）の演算結果（差分）を示しており、計測曲線ＭＫ３に対して輝度領域ＴＲ４が設定されている。輝度領域ＴＲ４は、下限８９８と上限８９９によりなる領域である。すなわち、複数回の計測結果から演算された結果は、同一箇所（同一ウェル）の計測結果の差分である。図２７（Ａ）に示す計測結果（１）、図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）、そして図２７（Ｃ）に示す演算結果（３）は、１つ以上の論理和あるいは論理積を用いて任意に組み合わせて、ウェル内の微細粒子の回収対象を選択して決定することができる。図２７（Ａ）に示す計測結果（１）、図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）は、同じサンプルにおいて計測する条件が異なっている、例えば経過時間や、特定の試薬を滴下する前か後か、等の条件が異なっている場合の計測例である。例えば図１３（Ａ）に示す計測結果（１）、図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）、そして図２７（Ｃ）に示す演算結果（３）のそれぞれにて設定される輝度領域の全てを満たす条件のウェル内の微細粒子を回収対象とすることができる。
【０１９１】
上述した例では、図２７（Ｃ）に示す演算結果（３）は、図２７（Ａ）に示す計測結果（１）と図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）の演算結果（差分）を示している。しかし、他の実施形態としては、複数回の計測結果から演算された演算結果は、同一箇所の計測結果の比率であっても良い。
【０１９２】
例えば、図２７（Ａ）に示す計測結果（１）を得てから、所定時間経過した後の測定結果として図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）を得る際に、微細粒子の発する蛍光輝度の経時変化によるスクリーニングを実施するために、複数回の計測間に、所定の時間間隔を設けることができる。
【０１９３】
例えば、図２７（Ａ）に示す計測結果（１）を得て、図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）を得る際に、微細粒子の発する蛍光輝度の特定試薬との反応性によるスクリーニングを実施するために、これらの計測間に、手動もしくは自動で所定の試薬を供給できる。
例えば、図２７（Ａ）に示す計測結果（１）を得て、図２７（Ｂ）に示す計測結果（２）を得る際これらの複数回の計測の間に、照射光もしくは蛍光の光路にて透過または反射させるためのフィルタの少なくとも１つを自動的に切り替えることにより、複数種の蛍光を計測することによるスクリーニングを実施できる。
【０１９４】
図１に示す回収部１３は、回収対象候補のウェル内の微細粒子の上限個数を指定して、輝度領域の指定による回収対象候補のウェルのうち、この上限個数だけを実際に回収する機能を有している。これは、例えばウェル数が数１０万個以上という大規模スクリーニングを効率的に実施するために特に有効な機能である。
【０１９５】
フローサイトメータ（セルソータ）に代表されるように、始めに回収条件輝度を与えておく場合には、予め同様のサンプルによって輝度の確認を行い、条件を決めておく必要がある。このようにすると、手間がかかり、更に確認用サンプルと本番計測用サンプルで退色や異物など、品質が異なる場合は所望のサンプルを回収できない可能性がある。
【０１９６】
しかし、本発明の実施形態では、回収対象となるサンプルが含まれる母集団自体の計測結果の分布を見た上で直接選択できるため、サンプルそれ自体の品質（例えば退色状況や劣化状況、異物などの混入状況など）に応じて、回収対象の選定が可能となる。
【０１９７】
本発明の実施形態では、計測結果を示すグラフにおいて輝度値自体よりも輝度分布が重要であり、すべてのウェル内の微細粒子の蛍光輝度の計測をして、度数のピーク輝度等、全体の輝度分布状況を確認した上で、その分布そのものから回収対象ウェルを選択することで、ノイズ部分などが確実に除去された回収条件を指定することができる。
【０１９８】
上述したように、図１の画像解析部１５は、輝度分布を複数回計測することにより、例えば計測時間差や、試薬滴下後の計測タイミングなどを正確にコントロールするか、もしくはその履歴を正確に記録することができる。複数回計測する場合には、図１３に示すような３回の計測に限らず、２回あるいは４回以上であっても良い。
【０１９９】
次に、図３１を参照して、本発明の別の実施形態を説明する。
図３１に示す微細粒子のスクリーニング装置１Ｃが図２８に示す微細粒子のスクリーニング装置１Ｂと異なるのは、光源２６０とは別に計測用チップ９０の上方に複数の光源２５０を備えることである。光源２５０は、計測用チップ９０の上面９０Ｓと垂直な軸に対して対称な２つ以上の方向より光を照射する。計測用チップ９０からの透過光によって計測用チップ９０の上面９０Ｓおよびこの上面９０Ｓに形成されたウェル２００等の形状および位置情報を計測することができる。この計測においても蛍光フィルタは不要であるが、ダイクロイックミラーと蛍光フィルタを通っても十分な光量が残るように光源波長と光量を選択することで、光路に蛍光フィルタユニットを配置したまま、これを除去したり切り替えたりしなくても観察が可能という利点がある。
光源２５０は回収部を避けて配置することができるため、透過光源を配置しながらも回収を配置することができる。
【０２００】
ところで、本発明は、上記実施形態に限定されず種々の変形例を採用できる。
例えば、本発明の実施形態では、標的とする微細粒子として生体の細胞を例に挙げているが、これに限らず他の種類の微細粒子であっても良い。
【０２０１】
また、図３に示すように、搭載用プレート４０の上には、１枚の回収プレート８０が配置されているが、複数枚の回収プレートを並べて配置しても良い。
【０２０２】
移動部１６の直線移動用の駆動系として、回転型の電動モータと送りねじとガイドレールを用いているが、回転型の電動モータに代えてリニアモータなどを用いることができる。
【０２０３】
回収プレート８０のウェル８１の断面形状と計測用チップ９０のウェル２００の断面形状は、図示例に限らず他の形状、例えば半球形状を採用することもできる。
【０２０４】
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、遺伝子、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖類の生体高分子に関する検査、解析、分析が要求される分野、例えば工学分野、食品、農産、水産加工等の農学全般、薬学分野、衛生、保健、免疫、疫病、遺伝等の医学分野、化学もしくは生物学等の理学分野等、あらゆる分野に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】本発明の微細粒子のスクリーニング装置の好ましい実施形態を示す正面図である。
【図２】図１の微細粒子のスクリーニング装置を示す斜視図である。
【図３】移動部とその移動部の上に搭載されている搭載用テーブルと回収プレートと計測用チップを示す斜視図である。
【図４】搭載用テーブルと回収プレートと計測用チップを示す図である。
【図５】計測用チップとこの計測用チップの保持部材の形状例を示す図である。
【図６】回収部の構造例を示す斜視図である。
【図７】図７（Ａ）は、計測用チップの一部分を示す断面図であり、計測用チップのウェル内にはまだ微細粒子は入っていない図である。図７（Ｂ）は、計測用チップのウェル内に微細粒子Ｍが挿入された状態を示している図である。
【図８】図８（Ａ）は、ウェル内の微細粒子Ｍに光Ｌが照射されて一部の微細粒子Ｍが蛍光を発している例を示す図である。図８（Ｂ）は、吸引・吐出キャピラリが選択されたウェルに近づいて全ての微細粒子を吸引して回収する様子を示す図である。
【図９】図９は、蛍光を発している微細粒子Ｍ１を含む全数の微細粒子を計測用プレートのウェルから吸引して、回収プレートのウェルに対して回収する例を示す図である。
【図１０】キャピラリ高さ合わせ用基準面の例を示す図である。
【図１１】キャピラリにより微細粒子を回収した際の回収成功率を示す。
【図１２】微細粒子が対象ウェルから吹き出されてしまう現象の例を示す図である。
【図１３】微細粒子の回収動作を示す図である。
【図１４】微細粒子を対象ウェルから吹き出すのを防止する別の手法を示す図である。
【図１５】微細粒子を対象ウェルから吹き出すのを防止する別の手法を示す図である。
【図１６】吸引・吐出キャピラリの先端部の形状と対象ウェルから微細粒子が噴き出される関係を示す図である。
【図１７】微細粒子の回収率を向上させる例を図である。
【図１８】吸引・吐出キャピラリの先端部が微細粒子を吸引できたかどうかの成否を確認する動作を示す図である。
【図１９】複数の光源を使用している場合のメリットを示す図である。
【図２０】計測用チップにおけるウェルの配列例を示す図である。
【図２１】計測用チップの好ましい形状例を示す図である。
【図２２】計測用チップが固定具に固定された場合において、計測用チップの反りを解消することを示す図である。
【図２３】計測用チップの厚みの変動による焦点ズレについて示す図である。
【図２４】計測用チップの上面と下面の平行ズレによる観察位置の誤差について図である。
【図２５】位置の認識精度を±５μｍ以内を満たすための傾斜角度φと観察位置のズレΔの関係例を示す図である。
【図２６】サンプルを１回計測した場合のグラフ例を示す図である。
【図２７】同一サンプルを複数回計測した場合のグラフ例を示す図である。
【図２８】計測部の詳細説明図である。
【図２９】図２８の実施形態で透過光を通す計測用チップの例を示す図である。
【図３０】反射板と計測用チップの間に拡散板が配置されている例を示す図である。
【図３１】本発明のさらに別の実施形態を示す図である。
【符号の説明】
【０２０６】
１      微細粒子のスクリーニング装置
１１    ベース
１２    支持部
１３    回収部  １４    計測部
１５    画像解析部
１６    移動部
１９    カバー
３０    支持台
４０    搭載用テーブル
５１    第１テーブル
５２    第２テーブル
５５    第１モータ
５６    送りねじ
５７    ナット
６５    第２モータ
６６    送りねじ
６７    ナット
７０    搭載面
８０    回収プレート
８１    回収プレートのウェル
９０    計測用チップ
１００  制御部
１１０  対物レンズ
１２０  計測チップの固定具
１３０  操作部
１３３  吸引ポンプ
１４０  吸引・吐出キャピラリ
１４２  吸引・吐出キャピラリの先端部
２００  計測用チップのウェル  ２５１  モータ
２５２  送りねじ
２５３  ナット
２６０  励起光源
２６１  シャッターユニット
２６２  蛍光フィルタユニット
２６４  対物レンズ
５００  懸濁液
ＬＤ    液体
Ｌ      光（励起光、照射光）
Ｘ      第１方向
Ｙ      第２方向
Ｚ      第３方向（垂直方向）
ＣＬ    計測チップの上面の基準面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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