(57)【要約】      （修正有）【課題】テロメスタチン類似の構造を有し、テロメラーゼ阻害活性を有する、新規化合物を提供する。【解決手段】７つのオキサゾールからなる大環状構造を有し、且つ、例えば、−（ＣＨ２）４−ＮＨ２で表されるようなアミノ基のある側鎖を有する化合物。当該化合物は、公知であるテロメスタチンのテロメラーゼ阻害活性よりも数倍程度も強いテロメラーゼ阻害活性を有し、テロメラーゼを発現している腫瘍細胞に特異的に作用し、腫瘍の増殖を抑制する活性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）で示される化合物。
【化１】
2010030999.tif 000039
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【請求項２】
Ｘが、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、又は、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘが、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−又は−ＣＨ（ＮＨ２）−であることを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物において、Ｘが−ＣＨ２−であり、Ｒ１が炭素数１〜７の直鎖状のアルキレン基であって、次の一般式（２）で示される化合物。
【化２】
2010030999.tif 000040
（式中、ｎは２〜８の整数を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【請求項５】
ｎが４であることを特徴とする、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、それぞれ独立に、水素原子又はアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜７のアルキル基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のいずれも、水素原子であることを特徴とする、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物において、Ｘが−ＣＨ２−であり、Ｒ１が炭素数３のアルキレン基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、次の構造式（３）で示される化合物。
【化３】
2010030999.tif 000041
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物の塩。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物又はその塩を含んでなる、テロメラーゼ阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、抗腫瘍剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、以下の（Ｆ）〜（Ｈ）の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（Ｆ）ジクロロメタン中、下記の一般式（８）に示される化合物とメタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）とを反応させ、さらにジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）を加えることにより、分子内脱水して下記の一般式（９）に示される化合物を得る工程；
【化４】
2010030999.tif 000042
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
（Ｇ）非プロトン性極性溶媒中において、次の一般式（９）に示される化合物に、Ｎ−ブロムスクシンイミド（ＮＢＳ）と炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３）を作用させて、次の一般式（１０）に示される化合物を得る工程；
【化５】
2010030999.tif 000043
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
（Ｈ）次の一般式（１０）に示される化合物が有する保護基Ｙ及びＲ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´に含まれる保護基を脱離させて、次の一般式（１）に示される化合物を得る工程。
【化６】
2010030999.tif 000044
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【請求項１３】
保護基Ｙが、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）であり、酸性溶媒中で、保護基Ｙ（Ｂｏｃ基）を脱離させることを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜８いずれかに記載の化合物と、当該化合物におけるアミノ基に反応しうる蛍光化合物とを反応させたG-quadruplex構造を可視化するプローブ。
【請求項１５】
上記蛍光化合物は、一般式（１６）に示される化合物であって、一般式（１７）で示される化合物である請求項１４記載のプローブ。
【化７】
2010030999.tif 000045
【化８】
2010030999.tif 000046
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｑは、蛍光色素を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ１０は単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基を側鎖に有する大環状ヘプタオキサゾール構造を有する新規化合物に関する。また、本発明は該化合物を含むテロメラーゼ阻害剤及び抗腫瘍剤並びに該化合物の製造方法に関する。さらに、本発明は、DNAの高次構造であるG-quadruplex構造の存在を蛍光により簡便に検出するツールを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
テロメアとは、真核生物の染色体の末端に存在する構造である。ヒトの場合、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎという６塩基の繰り返し配列でおよそ１万塩基対ほど存在しており、３´末端においてはおよそ１００塩基ほど突出（オーバーハング）して一本鎖となっている。
テロメアのオーバーハングした一本鎖においては、カリウムやナトリウムイオンのような一価のカチオンが高濃度に存在する条件下において、G-quadruplexと呼ばれる、特有のらせん状の高次構造を形成している。このG-quadruplex構造は、テロメアだけではなく、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｍｙｃ及びｂｃｌ−２のような遺伝子プロモーター領域にも存在し、固有の構造を有することが、最近明らかとなった。例えば、テロメアのG-quadruplexは逆平行な構造を有するのに対し、ｃ−ｍｙｃとｃ−ｋｉｔのプロモーター領域は順平行な構造を有しており、ｂｃｌ−２のプロモーター領域は、順平行と逆平行の様式が混在した構造を有している。
【０００３】
これらのG-quadruplex構造は、重要な生物学的メカニズムに関与している。例えば、G-quadruplexの形成は、テロメアを大幅に短縮させ、続いて、テロメアの末端に結合しているＴＲＦ２及び／又はＰｏｔ１が解離することにより、がん細胞のアポトーシスを引き起こすものである。また、ｃ−ｋｉｔとｃ−ｍｙｃの転写活性が、プロモーター領域でのG-quadruplex構造の形成により抑制されることが、インビトロの実験で示されている。従って、強力で特異的にG-quadruplexに結合する物質は、生物学的ツールとなるだけでなく、抗がん剤の候補となりうるため、強力なG-quadruplexの結合剤の開発を目的とした研究が盛んに行われている。
【０００４】
テロメスタチンは、５つのオキサゾールと２つのメチルオキサゾールと一つのチアゾールを有する大環状構造を有し、ＴＲＡＰ（telomeric repeat amplification protocol）アッセイを用いたスクリーニングにより放線菌（Streptomyces anulatus 3533-SV4）から単離された天然有機化合物である（特許文献１及び非特許文献１）。テロメスタチンは、ＩＣ５０が５ｎＭという非常に高いテロメアーゼ阻害活性を示し、その構造式は次のとおりである。
【０００５】
【化１】
2010030999.tif 000002
【０００６】
テロメスタチンのオキサゾール及びチアゾールからなる大環状構造は、テロメアと相互作用し、G-quadruplex構造を強力に安定化させることが報告されている（非特許文献２）。それゆえ、テロメスタチンは、標準的なG-quadruplex結合剤として、様々な機能の研究に広く用いられている。また、テロメスタチンを抗腫瘍剤とする研究も行われている（非特許文献３）。しかしながら、テロメスタチンは、天然の有機化合物であり大量に得ることができないため、合成方法に関する研究が行われてきた（特許文献２及び非特許文献４）
また、テロメスタチンの誘導体・類縁体の合成及び活性評価に関する研究も数多く行われている（特許文献３及び４並びに非特許文献５〜１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ ００／２４７４７号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ ０２／４８１５３号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−３１６００８号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ ２００７／１２７１７３号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Shin-ya, K.ら他７名、２００１年発行、Journal of the American Chemical Society、vol.123、pp.1262-1263
【非特許文献２】Kim, M. Y.ら他４名、２００２年発行、Journal of the American Chemical Society、vol.124、pp.2098-2099
【非特許文献３】Tauchi, T.ら他６名、２００６年発行、Oncogene、vol.25、pp.5719-5725
【非特許文献４】Doi, K.ら他３名、２００６年発行、Organic Letters、vol.8、Issue 18、pp.4165-4167
【非特許文献５】石塚大倫ら他５名、２００８年３月１２日発行、「テロメスタチンをリードとした大環状ヘプタオキサゾール（７ＯＴＤ）誘導体の合成と活性評価」、日本化学会講演予稿集、Vol.88、No.2、pp.1049
【非特許文献６】寺正行ら他３名、２００８年３月１２日発行、「テロメスタチンをリードとした大環状ヘキサオキサゾール（６ＯＴＤ）誘導体の合成とG-quadruplex安定化の評価」、日本化学会講演予稿集、Vol.88、No.2、pp.1048
【非特許文献７】石塚大倫ら他４名、２００７年１２月１日発行、「テロメスタチンをリードとしたG-q ligandの合成研究と活性評価」、有機合成化学協会関東支部シンポジウム、Vol.54、pp.56
【非特許文献８】石塚大倫ら他３名、２００７年３月１２日発行、日本化学会講演予稿集、Vol.87、No.2、pp.1190
【非特許文献９】Suzanne G. Rzuczekら他３名、２００８年発行、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、vol.18、pp.913-917
【非特許文献１０】Gurpreet Singh Minhasら他４名、２００６年発行、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、vol.16、pp.3891-3895
【非特許文献１１】Masayuki Teraら他６名、２００６年発行、Heterocycles、vol.69、pp.505-514
【非特許文献１２】Nobuaki Endohら他４名、２００３年発行、Heterocycles、vol.60、pp.1567-1572
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来の状況に鑑み、テロメラーゼ阻害活性の高いテロメスタチン類縁体を提供するとともに、当該テロメスタチン類縁体の合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究した結果、オキサゾールを６つではなく７つ有する大環状構造として平面性を高め、さらに、アミノ基を有する側鎖を設けることにより、テロメラーゼ阻害活性の高いテロメスタチン類縁体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明に係る新規化合物は、下記の（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の化合物を含むものである。
【００１２】
（Ｉ）次の一般式（１）で示される化合物。
【００１３】
【化２】
2010030999.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【００１５】
（ＩＩ）Ｘが、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−又は−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−であることを特徴とする、上記（Ｉ）に記載の化合物。
【００１６】
（ＩＩＩ）Ｘが、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−又は−ＣＨ（ＮＨ２）−であることを特徴とする、上記（ＩＩ）に記載の化合物。
【００１７】
（ＩＶ）上記（ＩＩＩ）に記載の化合物において、Ｘが−ＣＨ２−であり、Ｒ１が炭素数１〜７の直鎖状のアルキレン基であって、次の一般式（２）で示される化合物。
【００１８】
【化３】
2010030999.tif 000004
【００１９】
（式中、ｎは２〜８の整数を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【００２０】
（Ｖ）ｎが４であることを特徴とする、上記（ＩＶ）に記載の化合物。
【００２１】
（ＶＩ）Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、それぞれ独立に、水素原子又はアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜７のアルキル基であることを特徴とする、上記（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の化合物。
【００２２】
（ＶＩＩ）Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のいずれも、水素原子であることを特徴とする、上記（Ｖ）に記載の化合物。
【００２３】
（ＶＩＩＩ）上記（Ｉ）に記載の化合物において、Ｘが−ＣＨ２−であり、Ｒ１が炭素数３のアルキレン基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、次の構造式（３）で示される化合物。
【００２４】
【化４】
2010030999.tif 000005
【００２５】
また、上述した本発明に係る新規化合物は、塩として提供することもできる。さらに、上述した本発明に係る新規化合物又はその塩は、例えばテロメラーゼ阻害剤としての用途を有する。さらに、上述した本発明に係る新規化合物又はその塩は、テロメーゼ阻害作用に基づく疾患の治療剤としての用途を有する。テロメーゼ阻害作用に基づく疾患としては、例えば癌を挙げることができる。すなわち、本発明に係る新規化合物又はその塩は、抗腫瘍剤としての用途を有する。
【００２６】
一方、本発明は、上述した本発明に係る新規化合物の製造方法（ＩＸ）〜（Ｘ）提供する。
【００２７】
（ＩＸ）上記（Ｉ）に記載の化合物を製造する方法であって、以下の（Ｆ）〜（Ｈ）の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（Ｆ）ジクロロメタン中、下記の一般式（８）に示される化合物とメタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）とを反応させ、さらにジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）を加えることにより、分子内脱水して下記の一般式（９）に示される化合物を得る工程；
【００２８】
【化５】
2010030999.tif 000006
【００２９】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−又は−ＣＨ（ＮＨ２）−を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
（Ｇ）非プロトン性極性溶媒中において、次の一般式（９）に示される化合物に、Ｎ−ブロムスクシンイミド（ＮＢＳ）と炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３）を作用させて、次の一般式（１０）に示される化合物を得る工程；
【００３０】
【化６】
2010030999.tif 000007
【００３１】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−又は−ＣＨ（ＮＨ２）−を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
（Ｈ）次の一般式（１０）に示される化合物が有する保護基Ｙ及びＲ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´に含まれる保護基を脱離させて、次の一般式（１）に示される化合物を得る工程。
【００３２】
【化７】
2010030999.tif 000008
【００３３】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−又は−ＣＨ（ＮＨ２）−を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【００３４】
（Ｘ）保護基Ｙが、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）であり、酸性溶媒中で、保護基Ｙ（Ｂｏｃ基）を脱離させることを特徴とする、上記（ＩＸ）に記載の製造方法。
【００３５】
さらに、本発明は、本発明に係る新規化合物を利用することで、G-quadruplex構造を可視化するプローブ（ＸＩ）及びその製造方法（ＸＩＩ）提供することができる。
【００３６】
（ＸＩ）上記（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）いずれかに記載の化合物と、当該化合物におけるアミノ基に反応しうる蛍光化合物とを反応させたG-quadruplex構造を可視化するプローブ。
【００３７】
一例として具体的に本発明に係るプローブとしては、上記蛍光化合物として一般式（１６）に示される化合物を使用し、一般式（１７）で示される化合物を挙げることができる。
【００３８】
【化８】
2010030999.tif 000009
【００３９】
【化９】
2010030999.tif 000010
【００４０】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｑは、蛍光色素を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ１０は単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。）
【００４１】
（ＸＩＩ）上記（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）いずれかに記載の化合物と、当該化合物におけるアミノ基に反応しうる蛍光化合物とを反応させるG-quadruplex構造を可視化するプローブの製造方法。
【００４２】
一例として具体的に本発明に係る製造方法は、上記（Ｉ）に記載の化合物（１）と、次の一般式（１６）に示される蛍光化合物とを下記式のように反応させるものを挙げることができる。
【００４３】
【化１０】
2010030999.tif 000011
【００４４】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｑは、蛍光色素を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ１０は単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。）
【発明の効果】
【００４５】
本発明に係る化合物は、平面性の高い７つのオキサゾールを有する大環状構造を有し、また、アミノ基を有する側鎖を持つため、高いテロメラーゼ阻害活性を有している。
【００４６】
また、本発明に係る化合物の製造方法は、６つのオキサゾールを有する化合物の一部を閉環することにより、７つのオキサゾールを有する大環状構造にするという、非常に難しい反応を可能にし、テロメラーゼ活性の高い本発明に係る化合物を製造できるものである。
【００４７】
さらに、本発明のプローブは、G-quadruplex構造に結合する活性を有し、また、蛍光により検出することができるため、生体細胞若しくは生体組織又は核酸中におけるG-quadruplex構造の存在を簡便に検出するツールとして利用することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明のG-quadruplex構造を可視化するプローブの機能性評価を行った結果を示す図である。図中、「＋」は、DNAに対して化合物を１等量添加していることを示し、「＋＋」は、DNAに対して化合物を10等量添加していることを示す。また、「L1BOD-7OTD」は、BODIPYの蛍光波長で励起したときのゲルの発光を撮影した写真であり、「Stains-all」は、BODIPYの蛍光波長で励起したときのゲルの発光を撮影した写真であり、「Merged」は、これらの二つを重ねた写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。尚、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-166494号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【００５０】
１．本発明の化合物
１−１．本発明の化合物の構造
本発明の化合物は、下記の一般式（１）に示される化合物である。尚、本発明の一般式及び構造式においては、光学異性体が存在する場合には、その全ての光学異性体を含むものである。
【００５１】
【化１１】
2010030999.tif 000012
【００５２】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、又は、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【００５３】
１−２．本発明の化合物の特徴構造及びそれによる効果
本発明の化合物は、７つのオキサゾールからなる大環状構造を有するため、６つのオキサゾールを有する化合物と比べて平面性が高まっている。本発明の化合物のテロメラーゼ阻害活性が高い理由は明らかではないが、この高い平面性によりG-quadruplexと強力に相互作用していることが考えられる。
また、本発明の化合物は、−Ｒ１−Ｘ−ＮＨ２からなる側鎖を有している。本発明の化合物のテロメラーゼ阻害活性が高い理由は明らかではないが、この側鎖のアミノ基が、G-quadruplexを形成するヌクレオチドのリン酸と相互作用することが考えられる。
【００５４】
尚、アミノ基のある側鎖を有するが、大環状構造を構成するオキサゾールが６つである化合物（比較例１）と、アミノ基のある側鎖を有し７つのオキサゾールを有する本発明の化合物について、テロメラーゼ阻害活性を比較したところ、本発明の化合物のほうが高いテロメラーゼ阻害活性を呈した（比較例１及び表１参照）。
また、７つのオキサゾールを有するが、アミノ基のある側鎖を有しない化合物（比較例２）と、アミノ基のある側鎖を有し７つのオキサゾールを有する本発明の化合物について、テロメラーゼ阻害活性を比較したところ、本発明の化合物のほうが高いテロメラーゼ阻害活性を呈した（比較例２及び表１参照）。
【００５５】
また、本発明の化合物は、テロメラーゼを発現している腫瘍細胞に特異的に作用し、腫瘍の増殖を抑制する活性を呈した（実施例３参照）。
【００５６】
１−３．本発明の化合物の側鎖の構造
本発明の一般式（１）で示される化合物は、−Ｒ１−Ｘ−ＮＨ２からなる側鎖を有しているが、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基のいずれかである。
尚、上記の２価の基を構造式で表すと、以下のとおりである。
【００５７】
【化１２】
2010030999.tif 000013
【００５８】
Ｘが−ＣＨ２−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、シクロヘキサジエニレン基又は３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基の場合には、側鎖はアミノ基を１つ有する側鎖となる。また、Ｘが−ＮＨＣ（ＮＨ）−又は−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−の場合には、側鎖はグアニジノ基を有する側鎖となる。尚、グアニジノ基とは、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ３で示される置換基である。そして、Ｘが−ＣＨ（ＮＨ２）−の場合には、側鎖はアミノ基を２つ有する側鎖となる。
Ｘは、−ＣＨ２−又は−ＮＨＣ（ＮＨ）−とすることが好ましく、特に、−ＣＨ２−とすることが好ましい。
【００５９】
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
ここで、単結合とは、何も基がないことを意味し、例えば、Ｒ１が単結合でＸが−ＣＨ２−の場合には、側鎖はアミノメチル基となる。
炭素数１〜１２のアルキレン基は、直鎖状のもののみならず、分岐鎖を有するアルキレン基も含まれる。炭素数１〜１２のアルキレン基としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、テトラメチレン、２−メチルテトラメチレン、２、３−ジメチルテトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、ウンデカメチレン、ドデカメチレン基が挙げられる。
【００６０】
炭素数１〜１２のアルケニレン基も、直鎖状のもののみならず、分岐鎖を有するアルケニレン基も含まれる。また、二重結合が２つ以上であってもよい。炭素数１〜１２のアルケニレン基としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ビニレン、プロペニレン、１−メチル−１−プロペニレン、２−メチル−１−プロペニレン、３−メチル−１−プロペニレン、２，３−ジメチル−１−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、１，３−ブタジエニレン、２−ペンテニレン、２，３−ペンタジエニレン、２−ヘキセニレン、１，３，５−ヘキサトリニレン、３−ヘプテニレン、４−オクテニレン、４−ノネニレン、５−デセニレン、６−ウンデセニレン、６−ドデセニレン基等が挙げられる。
【００６１】
炭素数１〜１２のアルキニレン基も同様に、直鎖状のもののみならず、分岐鎖を有するアルキニレン基も含まれる。また、三重結合が２つ以上あってもよい。炭素数１〜１２のアルキニレン基としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、エチニレン、プロピニレン、３−メチル−１−プロピニレン、ブチニレン、１、３−ブタジイニレン、２−ペンチニレン、２−ペンチニレン、２，４−ペンタジイニレン、２−ヘキシニレン、１，３，５−ヘキサトリイニレン、３−ヘプチニレン、４−オクチニレン、４−ノニニレン、５−デシニレン、６−ウンデシニレン、６−ドデシニレン基等が挙げられる。
【００６２】
Ｒ１は、炭素数１〜１２のアルキレン基とすることが好ましく、より好ましくは、炭素数１〜７の直鎖状のアルキレン基とすることが好ましい。
そして、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１が炭素数１〜７の直鎖状のアルキレン基である場合には、本発明の化合物は、次の一般式（２）で示される。
【００６３】
【化１３】
2010030999.tif 000014
【００６４】
（式中、ｎは２〜８の整数を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【００６５】
上記一般式（２）において、ｎは２〜８の整数であり、側鎖は炭素数２〜８のアミノアルキル基となる。
より好ましくは、ｎを３〜５の整数とし、側鎖を炭素数３〜５のアミノアルキル基とするのがよい。最も好ましくは、ｎを４とし、側鎖をアミノブチル基とするのがよい。
【００６６】
１−４．本発明の化合物の大環状構造における周縁部
本発明の化合物の大環状構造における周縁部、すわなち、本発明の一般式（１）又は（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
【００６７】
ここで、アミノ基とは−ＮＨ２であり、グアニジノ基とは−ＮＨＣ（ＮＨ）−ＮＨ２である。
また、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基には、直鎖状のもののみならず、分岐鎖を有するアルキレン基も含まれ、また、アミノ基及び／又はグアニジノ基を合計で２つ以上有していてもよい。
アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、３−アミノプロピル基、２−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノ−３−グアニジノプロピル基、ブチル基、４−アミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２−グアニジノ−４−アミノブチル基、４−アミノ−３−（２−アミノエチル）ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、５−アミノペンチル基、５−グアニジノペンチル基、ヘキシル基、６−アミノヘキシル基、オクチル基、ノニル基、ドデシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
【００６８】
アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基とは、単環式又は縮合環式のアリール基により置換された総炭素数７〜１２のアルキル基であり、アミノ基若しくはグアニジノ基を１つのみならず、２つ以上有していてもよい。また、アミノ基又はグアニジノ基を有していないアラルキル基でもよいことは、もちろんのことである。
アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基としては、これらに限定されるわけではないが、ベンジル基、４−アミノベンジル基、３−グアニジノ−４−アミノベンジル基、フェネチル基、４−アミノフェネチル基、フェニルプロピル基、３，４−ジアミノフェネチル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、ナフチルメチル基、ナフチルエチル基等が挙げられる。
【００６９】
アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基には、アミノ基及び／又はグアニジノ基を合計で２つ以上有しているフェニル基も含まれ、これらに限定されるわけではないが、例えば、フェニル基、４−アミノフェニル基、４−グアニジノフェニル基、３−グアニジノ−４−アミノフェニル基等が挙げられる。
【００７０】
炭素数２〜６の複素環基としては、これらに限定されるわけではないが、チエニル基、フリル基、ピラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、イソチアゾリル基、イソオキサゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等が挙げられる。
また、ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。
【００７１】
本発明の好ましい一つの実施態様として、本発明の一般式（１）又は（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、それぞれ独立に、水素原子又はアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜７のアルキル基とすることができる。
ここで、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜７のアルキル基は、直鎖状のもののみならず、分岐鎖を有するアルキレン基も含まれ、また、アミノ基及び／又はグアニジノ基を合計で２つ以上有していてもよい。
アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜７のアルキル基としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、３−アミノプロピル基、２−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノ−３−グアニジノプロピル基、ブチル基、４−アミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２−グアニジノ−４−アミノブチル基、４−アミノ−３−（２−アミノエチル）ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、５−アミノペンチル基、ヘキシル基、６−アミノヘキシル基、６−グアニジノヘキシル基、ヘプチル基、７−アミノヘプチル基等が挙げられる。
【００７２】
本発明の好ましい一つの実施態様として、本発明の一般式（１）又は（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、それぞれ独立に、水素原子又はアミノ基を末端に有する炭素数１〜７の直鎖状のアルキル基とすることができる。
アミノ基を末端に有する炭素数１〜７の直鎖状のアルキル基としては、アミノメチル基、２−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基、５−アミノペンチル基、６−アミノヘキシル基、７−アミノヘプチル基が挙げられる。
【００７３】
本発明の好ましい一つの実施態様として、本発明の一般式（１）又は（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７を、水素原子とし、Ｒ３及びＲ６の少なくとも一方を、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜７のアルキル基とすることができる。
本発明の好ましい一つの実施態様として、一般式（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７を、水素原子とし、Ｒ３及びＲ６の両方を、末端にアミノ基を有する炭素数１〜７の直鎖状のアルキル基とすることができる。
この場合、本発明の化合物は、次の一般式（１２）で示される。
【００７４】
【化１４】
2010030999.tif 000015
【００７５】
（式中、ｎは２〜８の整数を表し、ｍは１〜７の整数を表し、ｌは１〜７の整数を表す。）
【００７６】
本発明の好ましい一つの実施態様として、本発明の一般式（１）又は（２）で示される化合物において、Ｒ２及びＲ３をメチル基とし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を水素原子とすることにより、天然のテロメスタチンと同様に、２つのメチルオキサゾールと５つのオキサゾールからなる大環状構造の化合物とすることができる。
【００７７】
本発明の好ましい一つの実施態様として、本発明の一般式（１）又は（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を水素原子とすることができる。
【００７８】
１−５．構造式（３）で示される化合物
本発明の好ましい一つの実施態様として、一般式（２）で示される化合物において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を水素原子とし、ｎを４とすることができる。
この場合には、本発明の化合物は、次の構造式（３）で示される。
【００７９】
【化１５】
2010030999.tif 000016
【００８０】
上記の構造式（３）に示される化合物は、下記の実施例２に記載の方法によりテロメラーゼ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０が０．８ｎＭという極めて高いテロメラーゼ阻害活性を持つものであり、天然有機化合物であるテロメスタチンのテロメラーゼ阻害活性（ＩＣ５０＝約５ｎＭ）よりも数倍程度もの強い活性を奏するものである。
【００８１】
２．本発明の化合物を含む塩、テロメラーゼ阻害剤及び抗腫瘍剤
本発明の化合物は、塩とすることができる。例えば、本発明の化合物に酸を付加することにより塩とすることができる。酸としてはこれらに限定されるわけではないが、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００８２】
本発明の化合物は、強いテロメラーゼ阻害活性を有するため、テロメラーゼ阻害剤とすることができる。本発明のテロメラーゼ阻害剤は、例えば、本発明の化合物を安定に保存することができるジメチルスルホキシド、メタノール、水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の溶媒に希釈することにより製造することができる。
本発明のテロメラーゼ阻害剤は、ガンのメカニズムや、動物や植物の発生のメカニズムの研究等、テロメラーゼの酵素活性を抑制する実験系に幅広く利用することができる。
【００８３】
一方、本発明の化合物は、強いテロメラーゼ阻害活性を有するため、テロメラーゼの活性亢進に起因する疾患の治療剤及び/又は予防剤として使用することができる。
【００８４】
テロメラーゼの活性亢進に起因する疾患としては癌を挙げることができる。
なお、公知のテロメーゼ阻害剤であるテロメスタチンは、抗腫瘍活性を有することが知られている（非特許文献３: Tauchi, T.ら他６名、２００６年発行、Oncogene、vol.25、pp.5719-5725）。したがって、本発明の化合物を有効成分として含む抗腫瘍剤は、テロメスタチンと同様にテロメラーゼ阻害活性を有する抗腫瘍剤の有効成分とすることができる。
なお、後述する実施例に示すように、本発明の化合物は、テロメスタチンと比較して著しく優れたテロメラーゼ阻害作用を有するため、本発明に係る抗腫瘍剤は、より優れた抗腫瘍活性を示す蓋然性が高く、癌治療や癌予防に優れた効果を期待することができる。また、後述する実施例に示すように、本発明に係る抗腫瘍剤は、テロメラーゼを高度に発現している腫瘍細胞に特異的に作用するため、正常細胞には作用せず副作用の少ない抗腫瘍剤を開発することを可能にするものである。
【００８５】
ここで、腫瘍とは、生体が有する制御機構に反して細胞が過剰に増殖する組織塊を意味する。本発明において、癌とは、腫瘍を伴う疾患であれば特に限定されず、例えば、胃癌、白血病、大腸癌、肺癌、肝臓癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨肉腫、悪性リンパ種、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。
本発明の抗腫瘍剤は、目的に応じて各種の薬学的投与形態にすることができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、乳剤等にすることにより、経口剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、注射剤、エアゾール剤とすることができる。
【００８６】
３．本発明の化合物の製造方法
３−１．本発明の化合物の合成スキーム
本発明の化合物は、例えば、反応（Ｃ−１）〜（Ｈ）からなる、次の本発明の合成スキームに従って合成することができる。
【００８７】
【化１６】
2010030999.tif 000017
【００８８】
（反応式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｚは、Ｙとは異なるアミノ基の保護基を表す。
Ｗはヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
上記スキームにおけるＸは、この明細書で上述したものと同じものを表す。
【００８９】
上記スキームにおけるＹは、アミノ基の保護基を表す。Ｙとしては、例えば、これらに限定されるわけではないが、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｙとしては、これらの中でも特に、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を用いることが好ましい。
【００９０】
上記スキームにおけるＺは、アミノ基の保護基を表す。ただし、ＺはＹとは異なる保護基とする。反応（Ｃ−２）において、一方の保護基のみを脱離させるためである。
Ｚとしては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｚとしては、これらの中でも特に、ベンジルオキシカルボニル基を用いることが好ましい。
【００９１】
上記スキームにおけるＷは、ヒドロキシル基の保護基を表す。Ｗとしては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、アセチル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
Ｗとしては、これらの中でも特に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を用いることが好ましい。
【００９２】
上記スキームにおけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、この明細書で前に説明したものと同じものを表す。
上記スキームにおけるＲ８及びＲ９は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基を表す。
上記スキームにおけるＲ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の有するアミノ基が保護基Ｙ若しくは他の保護基で保護されているものを表す。すなわち、Ｒｘ（Ｘ＝１〜７）がアミノ基又はグアニジノ基を有するときに、そのアミノ基又はグアニジノ基が有するアミノ基を保護基Ｙ若しくは他の保護基で保護したものが、Ｒｘ´（Ｘ＝１〜７）となる。
【００９３】
３−２．直鎖状ヘキサオキサゾールの合成
本発明の合成スキームでは、反応（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）により、直鎖状ヘキサオキサゾールを合成する。
まず、本発明の合成スキームにおける反応（Ｃ−１）は、以下の反応を行うものである。
【００９４】
【化１７】
2010030999.tif 000018
【００９５】
（反応式中、Ｚはアミノ基の保護基を表す。
Ｗはヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ８は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、Ｙ（アミノ基の保護基）若しくは他の保護基で保護されたアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【００９６】
上記の反応（Ｃ−１）は、Ｚを脱保護する反応であり、Ｚの種類により反応条件が異なる。
例えば、Ｚがベンジルオキシカルボニル基の場合には、プロトン性極性有機溶媒中で、パラジウム触媒の存在下に、ベンジルオキシカルボニル基を脱保護することができる。
ここで、プロトン性極性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、メタノール・ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）混合溶媒、エタノール・ＴＨＦ混合溶媒等を用いることができる。
パラジウム触媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、パラジウム／炭素、水酸化パラジウム／炭素等を用いることができる。
【００９７】
また、Ｚが９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基の場合には、二級アミンによって脱保護することができる。
Ｚが２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基の場合には、亜鉛粉末−酢酸などを作用させることで脱保護することができる。
Ｚがアリルオキシカルボニル基の場合には、パラジウム触媒の存在下、アミンを加えることにより脱保護することができる。
【００９８】
次に、本発明の合成スキームにおける反応（Ｃ−２）は、以下の反応を行うものである。
【００９９】
【化１８】
2010030999.tif 000019
【０１００】
（反応式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｚは、Ｙとは異なるアミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ９は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１０１】
上記の反応（Ｃ−２）は、アルコキシカルボニル基ＣＯＯＲ９をカルボニル基ＣＯＯＨとする反応であり、含水極性溶媒中において、強塩基性無機塩と反応させることにより行われる。
ここで、含水極性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ＴＨＦと水の混合溶媒、メタノールと水の混合溶媒等を用いることができる。
また、強塩基性無機塩としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができる。
【０１０２】
直鎖状ヘキサオキサゾールを合成する最後の工程である反応（Ｃ−３）は、以下の反応を行うものである。
【０１０３】
【化１９】
2010030999.tif 000020
【０１０４】
（反応式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｚは、Ｙとは異なるアミノ基の保護基を表す。
Ｗはヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ８は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１０５】
上記の反応（Ｃ−３）は、一般式（４´）に示される化合物のアミノ基と、一般式（５´）に示される化合物のカルボキシル基とを、縮合させる反応である。
この反応は、溶媒中において、縮合剤である４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホルニウム（ＤＭＴ−ＭＭ）又はその塩を加えることにより行うことができる。ここで、溶媒としては、特に限定されないが、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等、あるいは、これらの混合溶媒を用いることができる。
あるいは、非プロトン性極性溶媒中において、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）を加えることにより、縮合させることができる。
ここで、非プロトン性極性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等を用いることができる。
【０１０６】
３−３．直鎖状ヘキサオキサゾールの大環状化
次に、反応（Ｄ−１）〜（Ｄ−３）により、直鎖状ヘキサオキサゾールの大環状化を行う。
ここで、反応（Ｄ−１）、（Ｄ−２）及び（Ｄ−３）を行う順序だが、（Ｄ−１）を最初に行ってもよく、（Ｄ−２）を最初に行ってもよい。また、反応（Ｄ−１）及び（Ｄ−２）を同時に行っても良い。
すなわち、（Ｄ−１）が、化合物の末端の−ＮＨＺ基の保護基Ｚを脱保護する反応であり、（Ｄ−２）が、化合物の末端のアルコキシカルボニル基ＣＯＯＲ９をカルボニル基ＣＯＯＨとする反応であり、（Ｄ−３）が、（Ｄ−１）により生じたアミノ基と（Ｄ−２）により生じたカルボキシル基を縮合させる反応であるため、（Ｄ−１）と（Ｄ−２）の反応はいずれを先に行ってもよいことになる。
【０１０７】
本発明の合成スキームにおける反応（Ｄ−１）は、以下の反応を行うものである。
【０１０８】
【化２０】
2010030999.tif 000021
【０１０９】
（反応式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｚは、Ｙとは異なるアミノ基の保護基を表す。
Ｗはヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ８は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１１０】
上記反応式において、一般式（６´−１−１）で示される化合物は、末端にＣＯ２Ｒ８基とＮＨＺ基を有する化合物であり、一般式（６´−１−２）で示される化合物は、末端にＣＯＯＨ基とＮＨＺ基を有する化合物である。
また、一般式（６´−２−１）で示される化合物は、末端にＣＯ２Ｒ８基とアミノ基を有する化合物であり、一般式（６´−２−２）で示される化合物は、末端にカルボキシル基とアミノ基を有する化合物である。
【０１１１】
上記の反応（Ｄ−１）は、Ｚを脱保護する反応であり、Ｚの種類により反応条件が異なる。
例えば、Ｚがベンジルオキシカルボニル基の場合には、プロトン性極性有機溶媒中で、パラジウム触媒の存在下に、ベンジルオキシカルボニル基を脱保護することができる。
ここで、プロトン性極性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、メタノール・ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）混合溶媒、エタノール・ＴＨＦ混合溶媒等を用いることができる。
パラジウム触媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、パラジウム／炭素、水酸化パラジウム／炭素等を用いることができる。
【０１１２】
また、Ｚが９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基の場合には、二級アミンによって脱保護することができる。
Ｚが２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基の場合には、亜鉛粉末−酢酸などを作用させることで脱保護することができる。
Ｚがアリルオキシカルボニル基の場合には、パラジウム触媒の存在下、アミンを加えることにより脱保護することができる。
【０１１３】
本発明の合成スキームにおける反応（Ｄ−２）は、以下の反応を行うものである。
【０１１４】
【化２１】
2010030999.tif 000022
【０１１５】
（反応式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｚは、Ｙとは異なるアミノ基の保護基を表す。
Ｗはヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ８は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１１６】
上記反応式において、一般式（６´−１−１）で示される化合物は、末端にＣＯ２Ｒ８基とＮＨＺ基を有する化合物であり、一般式（６´−１−２）で示される化合物は、末端にＣＯＯＨ基とＮＨＺ基を有する化合物である。
また、一般式（６´−２−１）で示される化合物は、末端にＣＯ２Ｒ８基とアミノ基を有する化合物であり、一般式（６´−２−２）で示される化合物は、末端にカルボキシル基とアミノ基を有する化合物である。
【０１１７】
上記の反応（Ｄ−２）は、アルコキシカルボニル基ＣＯＯＲ９をカルボニル基ＣＯＯＨとする反応であり、含水極性溶媒中において、強塩基性無機塩と反応させることにより行われる。
ここで、含水極性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ＴＨＦと水の混合溶媒、メタノールと水の混合溶媒等を用いることができる。
また、強塩基性無機塩としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができる。
【０１１８】
本発明の合成スキームにおける反応（Ｄ−３）は、以下の反応を行うものである。
【０１１９】
【化２２】
2010030999.tif 000023
【０１２０】
（反応式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｗはヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１２１】
上記の反応（Ｄ−３）は、一般式（６´−２−２）で示される化合物の末端のアミノ基とカルボキシル基を縮合させる反応であり、非プロトン性溶媒中において、リン化合物の存在下に、反応させることができる。
ここで、非プロトン性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等や、これらの混合溶媒を用いることができる。
また、リン化合物としては、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、ビス−（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物（ＢＯＰＣｌ）、ビス−（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸（ＢＯＰ）等を用いることができる。
【０１２２】
３−４．大環状ヘキサオキサゾールの一部環化による大環状ヘプタオキサゾールの合成
次に、反応（Ｅ）〜（Ｇ）により、大環状ヘキサオキサゾールの一部を環化することによって、大環状ヘプタオキサゾールを合成する。
まず、本発明の合成スキームにおける反応（Ｅ）は、以下の反応を行うものである。
【０１２３】
【化２３】
2010030999.tif 000024
【０１２４】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１２５】
上記の反応（Ｅ）は、一般式（７）に示される化合物が有するヒドロキシル基の保護基Ｗを脱離させる反応であり、Ｗの種類により反応条件が異なる。
例えば、Ｗがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基の場合には、非プロトン性溶媒中において、フッ化水素を加えることにより、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を脱離させることができる。
また、Ｗがｐ−メトキシベンジル基の場合には、パラジウムを触媒とした水素添加反応、バーチ還元などで脱離できる。
Ｗがｔｅｒｔ−ブチル基の場合には、トリフルオロ酢酸や、塩酸-酢酸エチル溶液などの強酸性条件下脱保護することができる。
Ｗがアセチル基の場合には、メタノール中炭酸カリウムによって脱保護することができる。
【０１２６】
Ｗがベンゾイル基の場合には、強塩基条件または強いヒドリド還元条件で脱保護することができる。
Ｗがトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基又はｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基の場合には、酸性条件またはフッ化物イオンを作用させることで脱保護できる
【０１２７】
本発明の合成スキームにおける反応（Ｆ）は、以下の反応を行うものである。
【０１２８】
【化２４】
2010030999.tif 000025
【０１２９】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜６のアシル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１３０】
上記の反応（Ｆ）は、ジクロロメタン中、上記一般式（８）に示される化合物と、メタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）とを反応させ、さらにジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）を加えることにより、分子内脱水することにより、上記一般式（９）に示される化合物を得ることができる。
【０１３１】
本発明の合成スキームにおける反応（Ｇ）は、以下の反応を行うものである。
【０１３２】
【化２５】
2010030999.tif 000026
【０１３３】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜６のアシル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１３４】
上記の反応（Ｇ）は、非プロトン性極性溶媒中において、Ｎ−ブロムスクシンイミド（ＮＢＳ）と炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３）を作用させることにより行うことができる。
ここで、非プロトン性極性溶媒としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を用いることができる。
【０１３５】
尚、上記の反応（Ｇ）は、以下の中間体（１１）を経る反応であると考えられる。
【０１３６】
【化２６】
2010030999.tif 000027
【０１３７】
最後に、アミノ基の保護基Ｙ及びＲ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´に含まれる保護基を脱離させることにより、本発明の化合物が得られる。すなわち、最後の工程である反応（Ｈ）は、以下の反応を行うものである。
【０１３８】
【化２７】
2010030999.tif 000028
【０１３９】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１４０】
上記の反応（Ｈ）は、保護基Ｙ及びＲ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´に含まれる保護基を脱離させる反応であり、保護基Ｙの種類により反応条件が異なる。
例えば、Ｙがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基の場合には、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム等に、塩酸、酢酸等の酸を加えた酸性溶媒中において、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を脱離することができる。
Ｙが９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基の場合には、二級アミンによって脱保護することができる。
Ｙが２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基の場合には、亜鉛粉末−酢酸などを作用させることで脱保護することができる。
Ｙがアリルオキシカルボニル基の場合には、パラジウム触媒の存在下、アミンを加えることにより脱保護することができる。
【０１４１】
なお、Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´における保護基が、アミノ基に対する保護基Ｙと同じ官能基である場合、上記の反応（Ｈ）は単一の反応により処理を終えることができる。一方、アミノ基に対する保護基Ｙ、Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´における保護基が、２種類以上の官能基である場合には、上記の反応（Ｈ）は、使用した保護基の種類に応じて複数の反応により処理を終えることができる。
【０１４２】
３−５．トリオキサゾールの合成方法
上記の本発明の合成スキームにおいて、一般式（４）及び（５）に示される化合物は、特許文献２（WO 02/48153）、非特許文献９（Suzanne G. Rzuczek et al.、2008、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、vol.18、pp.913-917）、非特許文献１０（Gurpreet Singh Minhas et al.、2006、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、vol.16、pp.3891-3895）、非特許文献１１（Masayuki Tera et al.、2006、Heterocycles、vol.69、pp.505-514）、非特許文献１２（Nobuaki Endoh et al,、2003、Heterocycles、vol.60、pp.1567-1572）、Sang-Ku Yoo et al.、1992、Tetrahedron letters、vol.33、No.16、pp.2159-2162等の公知の方法により、あるいはこれらの改良方法により合成することができる。
【０１４３】
例えば、一般式（４）に示される化合物は、アミノ酸の誘導体を原料に、次のスキームに従って合成することができる。
【０１４４】
【化２８】
2010030999.tif 000029
【０１４５】
(上記式中、Ｚはアミノ基の保護基を表す。
Ｗは、ヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ８は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、Ｙ（Ｚと異なるアミノ基の保護基）で保護されたアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１４６】
上記反応（Ａ−１）は、アミノ酸とアミノ酸の誘導体間にペプチド結合を形成してジペプチドを得る反応であり、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣｌ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を反応試薬とすることができる。
上記反応（Ａ−２）は、反応（Ａ−１）により得られたジペプチドを閉環してオキサゾール環を形成する反応である。この反応は、例えば、３フッ化ジエチルアミノイオウ（ＤＡＳＴ）を試薬として用いる反応に次いで、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）及びブロモトリクロロメタン（ＢｒＣＣｌ３）を試薬として用いる反応の２ステップで行うことができる。
上記反応（Ａ−３）は、反応（Ａ−２）で得られた化合物のメチル基を脱離させる反応である。この反応は、例えば、テトラヒドロフランと水の混合溶媒中、水酸化リチウムを加えることにより行うことができる。
このようにして、一般式（１２）に示される化合物を得ることができる。
【０１４７】
上記反応（Ａ−４）は、２種類のアミノ酸誘導体間にペプチド結合を形成してジペプチドを得る反応であり、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣｌ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を反応試薬とすることができる。
上記反応（Ａ−５）は、反応（Ａ−４）により得られたジペプチドを閉環してオキサゾール環を形成する反応である。この反応は、例えば、３フッ化ジエチルアミノイオウ（ＤＡＳＴ）を試薬として用いる反応に次いで、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）及びブロモトリクロロメタン（ＢｒＣＣｌ３）を試薬として用いる反応の２ステップで行うことができる。
上記反応（Ａ−６）は、アミノ基の保護基Ｚを脱保護する反応であり、本明細書において既に述べた方法により行うことができる。
このようにして一般式（１３）に示される化合物を得ることができる。
【０１４８】
上記反応（Ａ−７）は、一般式（１２）に示される化合物と一般式（１３）に示される化合物の間にペプチド結合を形成して、テトラペプチド得る反応であり、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を試薬として反応させることができる。
上記反応（Ａ−８）は、反応（Ａ−７）により得られたテトラペプチドを閉環してオキサゾール環を形成する反応である。この反応は、例えば、３フッ化ジエチルアミノイオウ（ＤＡＳＴ）を試薬として用いる反応に次いで、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）及びブロモトリクロロメタン（ＢｒＣＣｌ３）を試薬として用いる反応の２ステップで行うことができる。
このようにして、一般式（４）で示される化合物を得ることができる。
【０１４９】
また、一般式（５）に示される化合物は、アミノ酸誘導体を原料に、次のスキームに従って合成することができる。
【０１５０】
【化２９】
2010030999.tif 000030
【０１５１】
（上記式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｙは、アミノ基の保護基を表す。
ＺはＹとは異なるアミノ基の保護基を表す。
Ｗは、ヒドロキシ基の保護基を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ９は、メチル基又はエチル基を表す。
Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´は、それぞれ独立に、水素原子、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、保護基を有するアミノ基、保護基を有するグアニジノ基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、保護基を有するアミノ基若しくは保護基を有するグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。）
【０１５２】
上記反応（Ｂ−１）は、２種類のアミノ酸誘導体間にペプチド結合を形成してジペプチドを得る反応であり、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣｌ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を反応試薬とすることができる。
上記反応（Ｂ−２）は、反応（Ｂ−１）により得られたジペプチドを閉環してオキサゾール環を形成する反応である。この反応は、例えば、３フッ化ジエチルアミノイオウ（ＤＡＳＴ）を試薬として用いる反応に次いで、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）及びブロモトリクロロメタン（ＢｒＣＣｌ３）を試薬として用いる反応の２ステップで行うことができる。
上記反応（Ｂ−３）は、反応（Ｂ−２）で得られた化合物のメチル基を脱離させる反応である。この反応は、例えば、テトラヒドロフランと水の混合溶媒中、水酸化リチウムを加えることにより行うことができる。
このようにして、一般式（１４）に示される化合物を得ることができる。
【０１５３】
上記反応（Ｂ−４）は、２種類のアミノ酸誘導体間にペプチド結合を形成してジペプチドを得る反応であり、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣｌ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を反応試薬とすることができる。
上記反応（Ｂ−５）は、反応（Ｂ−４）により得られたジペプチドを閉環してオキサゾール環を形成する反応である。この反応は、例えば、３フッ化ジエチルアミノイオウ（ＤＡＳＴ）を試薬として用いる反応に次いで、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）及びブロモトリクロロメタン（ＢｒＣＣｌ３）を試薬として用いる反応の２ステップで行うことができる。
上記反応（Ｂ−６）は、アミノ基の保護基Ｚを脱保護する反応であり、本明細書において既に述べた方法により行うことができる。
このようにして一般式（１５）に示される化合物を得ることができる。
【０１５４】
上記反応（Ｂ−７）は、一般式（１４）に示される化合物と一般式（１５）に示される化合物の間にペプチド結合を形成して、テトラペプチド得る反応であり、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を試薬として反応させることができる。
上記反応（Ｂ−８）は、反応（Ｂ−７）により得られたテトラペプチドを閉環してオキサゾール環を形成する反応である。この反応は、例えば、３フッ化ジエチルアミノイオウ（ＤＡＳＴ）を試薬として用いる反応に次いで、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）及びブロモトリクロロメタン（ＢｒＣＣｌ３）を試薬として用いる反応の２ステップで行うことができる。
このようにして、一般式（５）で示される化合物を得ることができる。
【０１５５】
３−６．原料とするアミノ酸誘導体
本発明の化合物を製造するための原料、すなわち、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体としては、公知のアミノ酸を原料として得られた誘導体を用いることができ、また、新たに合成した新規なアミノ酸を原料として得られた誘導体を用いることもできる。
【０１５６】
ここで、公知のアミノ酸としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、オルニチン、２，５−ジアミノペンタン酸、リシン、２，６−ジアミノカプロン酸、アルギニン、２−アミノ−５−グアニジノペンタン酸、ホモアルギニン（Ｎ６−（アミノイミノメチル）−Ｌ−リシン）、２，７−ジアミノ−７−イミノヘプタン酸、アルビジイン（３−（アミノカルボニルアミノ）−Ｌ−アラニン）、シトルリン、ホモシトルリン（Ｎ６−（アミノカルボニル）−Ｌ−リシン）、アスパラギン、２−アミノ−３−カルバモイルプロパン酸、グルタミン、２−アミノ−４−カルバモイル酪酸、ギガルチニン（Ｎ５−［［（アミノイミノメチル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−オルニチン）、アミノクレマイシン（２−アミノ−４−（４−アミノ−２，５−シクロヘキサジエニル）酪酸）、テトラヒドロラチリン（α，２−ジアミノ−１，４，５，６−テトラヒドロ−４−ピリミジンプロパン酸）、セリン、トレオニン、アロトレオニン、β−ヒドロキシノルバリン（３−ヒドロキシ−Ｌ−ノルバリン）、２−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシロイシン、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、３−ヒドロキシオルニチン、３−ヒドロキシリシン、３−フェニルセリン、２−アミノ−３―ヒドロキシ−３−フェニルプロパン酸、３−（２−チエニル）セリン、α−アミノ−β−ヒドロキシ−２−チオフェンプロピオン酸、α−アミノ−β−ヒドロキシ−２−フランプロピオン酸等を用いることができる。
【０１５７】
アミノ酸の誘導体は、例えば、上記公知のアミノ酸をアルキルエステルとすることにより、又は、保護基を付加することにより得ることができる。ここでアルキルエステルとは、メチルエステル又はエチルエステルである。アルキルエステルは、例えば、アミノ酸とアルコールを反応させることによって得ることもできるが、他の方法により得た誘導体であってもよい。また、保護基とは、前述したＹ、Ｚ又はＷと同じ保護基を用いることができ、また、これ以外の保護基を用いることもできる。
【０１５８】
ここで、アミノ基の保護基であるｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基又はベンジルオキシカルボニル基等でアミノ酸を保護する場合には、例えば、これらに限定されるわけではないが、塩基の存在下に、ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基又はクロロギ酸ベンジルを反応させることにより、保護することができる。
また、ヒドロキシル基の保護基であるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｐ−メトキシベンジル基等でヒドロキシル基を保護する場合には、例えば、これらに限定されるわけではないが、塩基の存在下に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド又はｐ−メトキシベンジルクロリドを反応させることにより、保護することができる。
【０１５９】
本発明の化合物は、原料であるアミノ酸を適宜選択することにより、所望の構造を有する化合物を得ることができる。例えば、一般式（１）におけるＸが−ＣＨ２−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、オルニチン、２，５−ジアミノペンタン酸、リシン又は２，６−ジアミノカプロン酸等の誘導体（保護基を付加したもの）を用いればよい。
また、一般式（１）におけるＸが−ＮＨＣ（ＮＨ）−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、アルギニン、２−アミノ−５−グアニジノペンタン酸、ホモアルギニン（Ｎ６−（アミノイミノメチル）−Ｌ−リシン）等の誘導体を用いればよい。
次に、一般式（１）におけるＸが−ＣＨ（ＮＨ２）−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、２，５，５−トリアミノペンタン酸等の誘導体を用いればよい。
【０１６０】
一般式（１）におけるＸが−Ｃ（ＮＨ）−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、２，７−ジアミノ−７−イミノヘプタン酸の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＸが−ＮＨＣＯ−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、アルビジイン（３−（アミノカルボニルアミノ）−Ｌ−アラニン）、シトルリン又はホモシトルリン（Ｎ６−（アミノカルボニル）−Ｌ−リシン）の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＸが−ＣＯ−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、アスパラギン、２−アミノ−３−カルバモイルプロパン酸、グルタミン又は２−アミノ−４−カルバモイル酪酸の誘導体を用いればよい。
【０１６１】
一般式（１）におけるＸが−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、ギガルチニン（Ｎ５−［［（アミノイミノメチル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−オルニチン）等の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＸがシクロヘキサジエニレン基である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、アミノクレマイシン（２−アミノ−４−（４−アミノ−２，５−シクロヘキサジエニル）酪酸等の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＸが３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基である化合物を製造するためには、上記反応式（Ｂ−１）で用いるアミノ酸として、これらに限定されるわけではないが、例えば、テトラヒドロラチリン（α，２−ジアミノ−１，４，５，６−テトラヒドロ−４−ピリミジンプロパン酸）等の誘導体を用いればよい。
【０１６２】
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、原料であるアミノ酸を適宜選択することにより、所望の構造にすることができる。
例えば、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、水素原子とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、セリンの誘導体（アルキルエステル又は保護基を付加したもの）を用いればよい。
また、一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、トレオニン、アロトレオニン、β−ヒドロキシノルバリン（３−ヒドロキシ−Ｌ−ノルバリン）、２−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシロイシン、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、３−ヒドロキシオルニチン又は３−ヒドロキシリシン等の誘導体を用いればよい。
【０１６３】
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、アミノ基とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、例えば、２，３−ジアミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸等の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、グアニジノ基とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、例えば、２−アミノ−３−グアニジノ−３−ヒドロキシプロピオン酸等の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−ベンジルプロパン酸等の誘導体を用いればよい。
【０１６４】
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、３−フェニルセリン又は２−アミノ−３―ヒドロキシ−３−フェニルプロパン酸等の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、炭素数２〜６の複素環基とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、３−（２−チエニル）セリン、α−アミノ−β−ヒドロキシ−２−チオフェンプロピオン酸、α−アミノ−β−ヒドロキシ−２−フランプロピオン酸等の誘導体を用いればよい。
一般式（１）におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７を、ハロゲン原子とするためには、上記反応（Ａ−１）、（Ａ−４）、（Ｂ−１）及び（Ｂ−４）で用いるアミノ酸誘導体として、これらに限定されるわけではないが、例えば、２−アミノ−３−クロロ−３−ヒドロキシプロピオン酸等の誘導体を用いればよい。
【０１６５】
３−７．置換基の変換
本発明の化合物は、上記のように原料として用いるアミノ酸を適宜選択することにより、所望の構造のものを得ることができる。しかし、一度合成した化合物の置換基を別の置換基に変換することによっても、所望の構造の化合物を得ることが可能である。
例えば、本発明の化合物の側鎖がアミノアルキル基である場合に、次の反応で示されるように、ウレイドアルキル基に変換することができる。
【０１６６】
【化３０】
2010030999.tif 000031
【０１６７】
上記反応は、アミノアルキル基を有する大環状ヘプタオキサゾールをトリエチルアミン中で、塩化水銀及び１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチル−２−チオプソイドウレア（1,3-Bis(tert-butoxycarbonyl)-2-methyl-2-thiopseudorea）を加え、次にトリフルオロ酢酸を加えた溶媒中で反応させることにより、ウレイドアルキル基を有する大環状ヘプタオキサゾールを製造することができる。
【０１６８】
３−８．中間化合物
以上で説明したように、本発明の化合物を合成するスキームにおいては、一般式（４）及び一般式（５）を出発化合物とし、一般式（６）〜（１０）を中間化合物として最終的に一般式（１）の化合物を合成する。ここで、一般式（６）〜（１０）を中間化合物は、全て一般式（１）の化合物を合成するための化合物として有用である。特に、一般式（１０）に示される化合物は、アミノ基に対する保護基Ｙ、Ｒ２´、Ｒ３´、Ｒ４´、Ｒ５´、Ｒ６´及びＲ７´に含まれる保護基を有している以外は、一般式（１）と同じ化学構造を有している。したがって、一般式（１０）に示される化合物は、本発明の化合物を製造する上で特に有用な化合物である。
【０１６９】
４．G-quadruplex構造を可視化する低分子プローブ
本発明の化合物は、G-quadruplex構造に強く結合する活性を奏するものである。従って、本発明の化合物と蛍光化合物を連結すれば、G-quadruplex構造の存在を可視化する低分子のプローブとすることができる。ここで、蛍光化合物としては、本発明の化合物における側鎖のアミノ基と反応しうる蛍光化合物を用いることにより、本発明の化合物と連結することができる。
【０１７０】
ここで、アミノ基と反応し得る蛍光化合物としては、蛍光色素分子に、アミノ基と反応する官能基を付加した化合物を用いることができる。ここで、蛍光色素分子としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ＢＯＤＩＰＹ（商標名、モレキュラー・プローブ社）、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名、モレキュラー・プローブ社）及びＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標、モレキュラー・プローブ社）等を用いることができる。そして、これらの蛍光色素分子に、必要に応じてリンカーを介して、スクシンイミジルエステル（スクシンイミジルオキシカルボニル基）、酸ハロゲン化物（ハロゲンオキシカルボニル基）、イソチオシアネート基、カルボキシル基等のアミノ基と反応し得る官能基を付加することにより、目的の蛍光化合物を得ることができる。
尚、このようなアミノ基と反応し得る官能基の付加された蛍光色素分子は、市販のものを用いてもよく、例えば、ＦＩＴＣ（株式会社同仁化学）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ ＳＥ（モレキュラー・プローブ社）、５（６）−ＴＡＭＲＡ−Ｘ ＳＥ（ＡＮＡ ＳＰＥＣ社）等を利用することができる。
【０１７１】
一例として、蛍光化合物として、スクシンイミジルエステル（スクシンイミジルオキシカルボニル基）を付加した蛍光色素分子を用いた場合には、下記反応式のように、一般式（１）で示される化合物と、一般式（１６）で示されるスクシンイミジルエステルを付加した蛍光色素分子とを反応させることによって、本発明のプローブを得ることができる。
【０１７２】
【化３１】
2010030999.tif 000032
【０１７３】
（式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（ＮＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ２）−、−Ｃ（ＮＨ）−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣ（ＮＨ）−、シクロヘキサジエニレン基、及び、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２，６−イル基を表す。
Ｑは、蛍光色素を表す。
Ｒ１は、単結合、炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数１〜１２のアルケニレン基又は炭素数１〜１２のアルキニレン基を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、アミノ基、グアニジノ基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよい炭素数７〜１２のアラルキル基、アミノ基若しくはグアニジノ基を有していてもよいフェニル基、炭素数２〜６の複素環基又はハロゲン原子を表す。
Ｒ１０は、炭素数１〜１２のアルキレン基を表す。）
【０１７４】
上記反応は、塩基性溶媒中で行うことができるが、特に、トリエチルアミン中で行うことが好ましい。また、反応温度は通常、２０〜８０℃程度である。
一般式（１６）において、Ｑは蛍光色素を表すが、蛍光色素としては特に限定されず、例えば、ＢＯＤＩＰＹ（商標名、モレキュラー・プローブ社）、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名、モレキュラー・プローブ社）及びＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標、モレキュラー・プローブ社）等を用いることができる。
また、一般式（１６）において、Ｒ１０は、炭素数１〜１２のアルキレン基を表すが、直鎖状のもののみならず、分岐鎖を有するアルキレン基も含むものである。
【０１７５】
本発明のプローブは、G-quadruplex構造に強く結合するため、蛍光化合物に由来する蛍光を検出することで、G-quadruplex構造を測定することができる。例えば、測定対象の核酸と本発明のプローブとを接触（例えば、溶液中にて混合する）させた後、未反応のプローブを除去した後に核酸における蛍光化合物に由来する蛍光を検出することで、当該核酸にG-quadruplex構造が含まれているか否かを判断することができる。また、この場合、蛍光強度に基づいて測定対象の核酸に含まれるG-quadruplex構造の存在を定量的に判定することができる。
また、本発明のプローブは、単離した生体細胞や生体組織に取り込ませ、蛍光化合物に由来する蛍光を検出することで、当該生体細胞や生体組織におけるG-quadruplex構造の存在位置を測定することができる。この場合においても、蛍光強度に基づいて測定対象の生体細胞や生体組織に含まれるG-quadruplex構造の存在位置とともに存在量を定量的に判定することができる。
【実施例】
【０１７６】
次に、実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１７７】
（実施例１：  本発明の化合物の合成）
７つのオキサゾールからなる大環状構造を有し、側鎖としてアミノブチル基を有するＬ１Ｈ１−７ＯＴＤを、次のスキーム１に従って合成した。
【０１７８】
【化３２】
2010030999.tif 000033
【０１７９】
（１）反応ａ
トリオキサゾール４を、水素をエアレーションしたテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とメタノールの混合溶媒に溶解し、水酸化パラジウム／炭素の存在下に、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）を脱離した。
（２）反応ｂ
トリオキサゾール５を、ＴＨＦと水の混合溶媒に溶かし、一水和水酸化リチウムを加えることにより、カルボン酸を生成させた。
（３）反応ｃ
トリオキサゾール４から合成したアミンと、トリアゾール５から合成したカルボン酸とを、ＴＨＦと水の混合溶媒に溶かし、Ｎ−メチルモルホリン４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホルニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）とＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を加えることにより、アミンとカルボン酸を縮合させた。トリオキサゾール４及びトリオキサゾール５から９１％の収率で直鎖状のヘキサオキサゾール６を得た。
（４）ヘキサオキサゾールの大環状化
反応ａと同じ条件で、ヘキサオキサゾール６のＣｂｚ基を脱離させ、反応ｂと同じ条件で、ヘキサオキサゾール６のメチルエステルを脱保護した。その後、生じたアミノ酸を
、ジイソプロピルエチルアミン（ＥｔｉＰｒ２Ｎ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）を加えたＮ‘Ｎ−ジメチルホルムアミドとジクロロメタンの混合溶媒中に、３ｍＭとなるよう高希釈して環化し、ヘキサオキサゾール６から５７％の収率で大環状ビスアミドを得た。
【０１８０】
（５）反応ｅ
ビスアミド７をＴＨＦ溶媒に溶かし、ＨＦ・ピリジンにより、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基を脱保護し、アルコール８を得た。
（６）反応ｆ
アルコール８をジクロロメタンに溶かし、メタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）とトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を加えて、メシレーションによりオレフィン９に変換し、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）で処理した。
【０１８１】
（７）反応ｇ
アセトニトリル溶媒中において、オレフィン９をＮ−ブロムスクシンイミド（ＮＢＳ）と反応させ、生じた臭化物をトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）で処理し、さらに炭酸セシウムにより環化して、ヘプタオキサゾール１１を生じさせた。
（８）反応h
最後に、ヘプタオキサゾール１１をクロロホルムに溶解し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を脱保護し、オレフィン９から３０％の収率でＬ１Ｈ１−７ＯＴＤを得た。
【０１８２】
（９）ＮＭＲスペクトルの測定
上記スキームにより合成されたＬ１Ｈ１−７ＯＴＤについて、重水素置換溶媒中において核磁気共鳴装置で測定を行い、ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果は以下のとおりである。
1H NMR (400 MHz, ref 2.5 ppm for DMSO d-6)
δ8.97 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.83 (s, 2H), 8.71 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.06 (br, 2H), 7.62 (br, 1H), 5.33 (br, 1H), 2.06 (m, 1H), 1.70 (br, 3H), 1.24 (br, 1H), 0.908 (br, 1H).
13C NMR (100 MHz, ref 49.0 ppm for DMSO d-6)
δ172.6, 168.1, 165.2, 164.7, 164.6, 163.7, 152.3, 152.1, 150.4, 150.3, 150.1, 149.9, 149.4, 149.2, 148.6, 148.5, 148.2, 148.0, 145.2, 139.0, 138.3, 138.2, 138.1, 137.4, 57.27, 57.10, 43.46, 41.96, 36.00, 28.98.
（１０）質量分析
上記スキームにより合成されたＬ１Ｈ１−７ＯＴＤについて、ＥＳＩ−ＭＳ装置にて測定を行い、分子量を測定したところ、分子量は598.1467であった。また、得られた分子量値から元素組成を推定したところＣ２７Ｈ１９Ｎ９Ｏ８Ｎａであった。これらの結果から目的の化合物が合成できたことを確認した。
（１１）旋光度の測定
上記スキームにより合成されたＬ１Ｈ１−７ＯＴＤを、クロロホルムとメタノールの混合溶媒に溶解し、旋光光度計を用いて測定を行った。得られた値は、[α]Ｄ＝77.1であり、光学純度の高い化合物が得られたことを確認した。
【０１８３】
（実施例２：  テロメラーゼ阻害活性の測定）
合成された本発明の化合物Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤついて、ＴＲＡＰアッセイを用いてテロメアーゼ阻害活性を試験した。ＴＲＡＰアッセイは、G-quadruplex結合剤のテロメアーゼ阻害活性を簡便に評価するために広く用いられている。このアッセイにより、ＩＣ５０が０．８ｎＭという、極めて強力なテロメラーゼ阻害活性が示された。この化合物は、現在までに報告されている中で最も強力なテロメラーゼ阻害剤である。
ＴＲＡＰアッセイは、Tabata, Y. et al., J.Antibiot., 1999, vol.52, pp.412に記載されたプロトコールに従い、ヒトＢリンパ腫Namalwa細胞の細胞溶解物から粗精製されたテロメラーゼに対する阻害活性を測定した。
【０１８４】
（実施例３：  Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤのテロメアとの相互作用の測定）
telo24とその変異配列であるtelo24-mutを用いたＰＣＲストップアッセイにより、テロメアのＤＮＡ配列と本発明の化合物Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤとの選択的な相互作用を試験した。ＰＣＲのプロトコールに従い、telo24とtelo24-mutの鎖伸張反応に対するＬ１Ｈ１−７ＯＴＤの阻害活性を評価した。この試験により、Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤは、telo24のＰＣＲを、ＩＣ５０が０．６７±０．０１μＭの値で強く阻害した。一方、telo24-mutに対するＬ１Ｈ１−７ＯＴＤの阻害活性は弱く、そのＩＣ５０値は５．２±０．８μＭであった。これらの結果から、Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤは、telo24の変異配列よりも７．７倍以上も強くtelo24と選択的に相互作用することが示された。
【０１８５】
（比較例１：  大環状構造中のオキサゾールが６つの化合物）
（１）Ｌ２Ｈ２−６ＯＴＤの合成
比較例として、アミノ基又はグアニジノ基を持つ側鎖を有するが、大環状構造を構成するオキサゾールが６つである化合物（Ｌ２Ｈ２−６ＯＴＤ）を以下のスキームにより合成した。
【０１８６】
【化３３】
2010030999.tif 000034
【０１８７】
（１−１）反応ａ
トリオキサゾール３を、ＴＨＦと水の混合溶媒に溶解し、水酸化リチウムを加えることによりカルボン酸を生成させた。
（１−２）反応ｂ
トリオキサゾール３を、水素をエアレーションしたテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とメタノールの混合溶媒に溶解し、水酸化パラジウム／炭素の存在下に、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を脱保護して、アミンを生成させた。
（１−３）反応ｃ
反応ａにより生成させたカルボン酸４と、反応ｂにより生成させたアミン５とを、Ｎ−メチルモルホリン４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホルニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）とＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を加えることにより縮合させ、直鎖状のヘキサオキサゾール６を得た。
（１−４）反応ｄ
ヘキサオキサゾール６を、ＴＨＦと水の混合溶媒に溶解し、水酸化リチウムを加えることにより末端のメトキシカルボニル基をカルボキシル基とした。
（１−５）反応ｅ
ヘキサオキサゾール６を、ＴＨＦとメタノールの混合溶媒中で、水酸化パラジウム／炭素の存在下に、末端のベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を脱保護して末端をアミノ基とした。
【０１８８】
（１−６）反応ｆ
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとジクロロメタンの混合溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン（ＥｔｉＰｒ２Ｎ）と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）とビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロリド（ＢＯＰＣｌ）を加え、反応ｄにより生じたヘキサゾール６のカルボキシル基と、反応ｅにより生じたヘキサオキサゾール６のアミノ基を縮合して、大環状ヘキサオキサゾールを生成させた。
（１−７）反応ｇ
ジクロロメタン中、トリフルオロ酢酸を加えて酸性とすることにより、大環状ヘキサオキサゾールの２つの側鎖Ｒの保護基であるｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を脱保護し、ジアミノブチル大環状ヘキサオキサゾール２ｂを得た。
（１−８）反応ｈ及びｉ
トリエチルアミン、塩化水銀及び１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチル−２−チオシュードウレア（1,3-Bis(tert-butoxycarbonyl)-2-methyl-2-thiopseudorea）を加え、次にトリフルオロ酢酸を加えたジクロロメタン中で、ジアミノブチル大環状ヘキサオキサゾール２ｂのアミノ基をグアニジノ基に変換し、ジグアニジノブチル大環状ヘキサオキサゾール２ｃを得た。
（１−９）反応ｉ
ジクロロメタン溶媒中で、無水酢酸と反応させることにより、ジグアニジノブチル大環状ヘキサオキサゾール２ｃの側鎖のグアニジノ基にアセチルアミンとした。
【０１８９】
（２）テロメラーゼ阻害活性の測定
上記のスキームにより合成したＬ２Ｈ２−６ＯＴＤのテロメラーゼ阻害活性を、実施例２に記載のＴＲＡＰアッセイにより測定した。
その結果、Ｌ２Ｈ２−６ＯＴＤのテロメラーゼ阻害活性は、側鎖の末端がアミノ基である大環状ヘキサオキサゾール（２ｂ）についてはＩＣ５０が２０ｎＭであり、側鎖の末端がグアニジノ基である大環状ヘキサオキサゾール（２ｃ）についてはＩＣ５０が２０ｎＭであった。これは、実施例１で合成した本発明に化合物のテロメラーゼ阻害活性（ＩＣ５０＝０．８ｎＭ）よりもかなり低いものであった。
【０１９０】
（比較例２：  アミノ基のある側鎖を有しない化合物）
（１）Ｓ１Ｔ１−７ＯＴＤの合成
次の比較例として、７つのオキサゾールからなる大環状構造を有するが、アミノ基のある側鎖を有しない次の化合物（Ｓ１Ｔ１−７ＯＴＤ）を、非特許文献５（石塚大倫ら他５名、２００８年３月１２日発行、日本化学会講演予稿集、Vol.88、No.2、pp.1049）に記載のスキームにより合成した。
【０１９１】
【化３４】
2010030999.tif 000035
【０１９２】
（２）テロメラーゼ阻害活性の測定
上記のスキームにより合成したＳ１Ｔ１−７ＯＴＤのテロメラーゼ阻害活性を、実施例２に記載のＴＲＡＰアッセイにより測定した。
その結果、Ｓ１Ｔ１−７ＯＴＤのテロメラーゼ阻害活性は、ＩＣ５０＝１０ｎＭであった。これは、実施例１で合成した本発明に化合物のテロメラーゼ阻害活性（ＩＣ５０＝０．８ｎＭ）よりもかなり低いものであった。
本発明の化合物及び比較例で合成した化合物並びにテロメスタチンのテロメラーゼ阻害活性を測定した結果を次の表に示す。
【０１９３】
【表１】
2010030999.tif 000036
【０１９４】
（実施例３：  抗腫瘍活性の測定）
抗腫瘍活性の測定には、テロメラーゼを過剰に発現しているガン細胞であるHeLa細胞（子宮頸癌の細胞株）と、テロメラーゼを発現していないガン細胞であるSaos-2細胞（骨肉芽腫の細胞株）を用いた。また、抗腫瘍剤としては、実施例１で合成した本発明の化合物Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤを用い、比較として代表的な抗腫瘍剤であるドキソルビシン（doxorubicin）を用いた。ドキソルビシンは、DNAの塩基対間に挿入されてDNA増幅を阻害することにより腫瘍の増殖を抑制する抗腫瘍剤であり、テロメラーゼを阻害することにより腫瘍の増殖を抑制するものではない。
２つのガン細胞の培養には、10%のウシ胎児血清、50μg/mlのストレプトマイシン及び5U/mlペニシリンを含む改良したダルベッコイーグル培地（Dulbecco's Eagle's medium）を用いた。１つのウェルあたり2×10３個のガン細胞を、96穴のウェルプレートに播種し、いろいろな濃度の抗腫瘍剤（Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤ及びドキソルビシン）で６日間処理した。ガン細胞の生存能力を、MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロミド）アッセイで測定した。６日間の培養で、ガン細胞の生存率が50％となる抗腫瘍剤の濃度をIC５０とした。
【０１９５】
その結果、Ｌ１Ｈ１−７ＯＴＤは、テロメラーゼを過剰に発現しているガン細胞であるHeLa細胞に対してIC５０が2.2±0.5μMの細胞毒性を示したが、テロメラーゼを発現していないガン細胞であるSaos-2細胞に対しては細胞毒性を示さなかった。一方、テロメラーゼに依存せず抗腫瘍活性を示すドキソルビシンは、HeLa細胞に対してIC５０が0.03±0.001μMの細胞毒性を示し、Saos-2細胞に対してIC５０が0.07±0.005μMの細胞毒性を示した。
これらの結果から、本発明の化合物は、テロメラーゼを過剰に発現しているガン細胞に特異的に作用して抗腫瘍活性を奏するものであり、テロメラーゼを発現していない細胞には作用しないことが明らかとなった。
【０１９６】
（実施例４：  ウレイドブチル基を有する大環状ヘプタオキサゾールの合成）
実施例１で合成したＬ１Ｈ１−７ＯＴＤを、トリエチルアミン中で、塩化水銀及び１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチル−２−チオシュードウレア（1,3-Bis(tert-butoxycarbonyl)-2-methyl-2-thiopseudorea）を加え、次にトリフルオロ酢酸を加えた溶媒中で反応させることにより、アミノブチル基をウレイドブチル基に変換した。反応式を次に示す。
【０１９７】
【化３５】
2010030999.tif 000037
【０１９８】
（実施例５：  G-quadruplex構造を可視化する低分子プローブの合成）
実施例１で合成したＬ１Ｈ１−７ＯＴＤを、トリエチルアミン中で、蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹと連結したプロピオン酸スクシンイミドと反応させた。反応は、６０℃で行い、８０％の収率で生成物（L1BOD-7OTD）が得られた。反応式を次に示す。
【０１９９】
【化３６】
2010030999.tif 000038
【０２００】
（実施例６：  プローブの機能評価）
G-quadruplex構造を形成する一本鎖DNAであるtelo24（5-TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTAGGG-3：配列番号１）と、G-quadruplex構造を形成しない一本鎖DNAであるtelo24-mut（5- TTA GAG TTA GAG TTA GAG TTA GGG-3：配列番号２）を調整した。次に、これらと実施例１で合成したL1H1-7OTD及び実施例５で合成したプローブとを、図１中の表に示される８通りの組み合わせで混合し、12%のポリアクリルアミドゲルの８つのレーンで、TBEバッファーを用いて電気泳動を行った。図１中、「＋」は、DNAに対して化合物を１等量添加していることを示し、「＋＋」は、DNAに対して化合物を10等量添加していることを示す。泳動後の一本鎖DNAをStains-all（シグマ−アルドリッチ社製）で染色し、Stains-allの蛍光波長と、BODIPYの蛍光波長とで検出を行った。図１中、「L1BOD-7OTD」は、BODIPYの蛍光波長で励起したときのゲルの発光を撮影した写真であり、「Stains-all」は、BODIPYの蛍光波長で励起したときのゲルの発光を撮影した写真であり、「Merged」は、これらの二つを重ねたものである。これらの結果から、本発明のプローブは、G-quadruplex構造を形成するtelo24のみを検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２０１】
本発明の化合物は、高いテロメラーゼ阻害活性を有するため、癌のメカニズムや動植物の発生メカニズムの研究に用いる生化学的試薬として有用であり、また、副作用の少ない抗腫瘍剤としても有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２０２】
SEQUENCE LISTING
<110>  National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
<120>  A telomerase inhibitor
<130>  090077
<150>  JP 2008-166494
<151>  2008-06-25
<160>  2     
<170>  PatentIn version 3.4
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Synthetic DNA
<400>  1
ttagggttag ggttagggtt aggg                                            24
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Synthetic DNA
<400>  2
ttagagttag agttagagtt aggg                                            24
【図１】
2010030999.tif 000047