(57)【要約】      （修正有）【課題】５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド（アカデシン）のリボシドの新規な治療上の使用の提供。【解決手段】アカデシン（ＡＩＣＡリボシドまたはＡＩＣＡＲとしても知られている）は、リンパ球におけるアポトーシスを阻害しないが、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患の患者からのＢ細胞のアポトーシスを誘発する。Ｔ細胞は影響を受けない。結果として、アカデシンおよびその生体前駆体（例えば、その一、二および三−５’−リン酸塩）は、ヒトのリンパ増殖性疾患に用いることができる治療薬に転換される。Ｔ細胞がほとんど影響を受けないという意外な特徴は、有害な二次的効果（免疫抑制）が僅かであることを意味しており、クラドリビン、フルダラビンおよび当該技術分野で知られている他のヌクレオシドを上回るアカデシンによって提供される治療上の利点を表している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのＢ細胞リンパ増殖性疾患の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な溶媒和物または付加塩の使用：
【化１】
2010180230.tif 000004
（上記式中、
−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５は、−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯ−Ｒ’および−ＣＯ−ＯＲ’からなる群から独立して選択され、但し、−Ｒ’は１２個までの炭素原子を有するヒドロカルビルであって、脂肪族（アルキル、アルケニル、およびアルキニル基並びに飽和および不飽和結合を混合して有する基を含む）、脂環式、アリールまたはそれらの組合せであることができ、−Ｒ’は直鎖、分岐鎖、環、またはそれらの組合せから選択される基であることができ、−Ｒ’は１以上のハロゲン原子および／または１以上の（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル基によって置換された１以上の水素原子を有することができ、−Ｒ’は１以上のＮＨ、Ｏおよび／またはＳ基によって置換された１以上のＣＨ２基を有することができ、かつ−Ｒ’は１以上のＮ原子によって置換された１以上のＣＨ基を有することができる）。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物において、−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５が−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、および−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２からなる群から独立して選択される基である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンおよびアカデシン５’−一リン酸塩からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がＢ細胞慢性リンパ性白血病である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が脾辺縁層リンパ腫である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がマントル細胞リンパ腫である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が濾胞性リンパ腫である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がリンパプラズマ細胞性リンパ腫(lymphoplasmacytic lymphoma)である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がワルデンストレーム(Waldenstrom)症候群である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
Ｂ細胞リンパ増殖性疾患のヒト患者の治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容可能な溶媒和物または付加塩の治療上有効量を、薬学上許容可能な希釈剤またはキャリヤーの適当量と共に投与することを含んでなる、方法：
【化２】
2010180230.tif 000005
（上記式中、
−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５は、−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯ−Ｒ’および−ＣＯ−ＯＲ’からなる群から独立して選択され、但し、−Ｒ’は１２個までの炭素原子を有するヒドロカルビルであって、脂肪族（アルキル、アルケニル、およびアルキニル基並びに飽和および不飽和結合の混合して有する基を含む）、脂環式、アリールまたはそれらの組合せであることができ、−Ｒ’は直鎖、分岐鎖、環、またはそれらの組合せから選択される基であることができ、−Ｒ’は１以上のハロゲン原子および／または１以上の（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル基によって置換された１以上の水素原子を有することができ、−Ｒ’は１以上のＮＨ、Ｏおよび／またはＳ基によって置換された１以上のＣＨ２基を有することができ、かつ−Ｒ’は１以上のＮ原子によって置換された１以上のＣＨ基を有することができる）。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物において、−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５が−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、および−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２からなる群から独立して選択される基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンおよびアカデシン５’−一リン酸塩からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がＢ細胞慢性リンパ性白血病である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が脾辺縁層リンパ腫である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がマントル細胞リンパ腫である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が濾胞性リンパ腫である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がリンパプラズマ細胞性リンパ腫(lymphoplasmacytic lymphoma)である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がワルデンストレーム症候群である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトのＢ細胞リンパ増殖性疾患の治療用医薬の製造に用いられる、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な溶媒和物または付加塩：
【化３】
2010180230.tif 000006
（上記式中、
−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５は、−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯ−Ｒ’および−ＣＯ−ＯＲ’からなる群から独立して選択され、但し、−Ｒ’は１２個までの炭素原子を有するヒドロカルビルであって、脂肪族（アルキル、アルケニル、およびアルキニル基並びに飽和および不飽和結合を混合して有する基を含む）、脂環式、アリールまたはそれらの組合せであることができ、−Ｒ’は直鎖、分岐鎖、環、またはそれらの組合せから選択される基であることができ、−Ｒ’は１以上のハロゲン原子および／または１以上の（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル基によって置換された１以上の水素原子を有することができ、−Ｒ’は１以上のＮＨ、Ｏおよび／またはＳ基によって置換された１以上のＣＨ２基を有することができ、かつ−Ｒ’は１以上のＮ原子によって置換された１以上のＣＨ基を有することができる）。
【請求項２２】
式（Ｉ）の化合物において、−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５が−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、および−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２からなる群から独立して選択される基である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンおよびアカデシン５’−一リン酸塩からなる群から選択されるものである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がＢ細胞慢性リンパ性白血病である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が脾辺縁層リンパ腫である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がマントル細胞リンパ腫である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が濾胞性リンパ腫である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がリンパプラズマ細胞性リンパ腫である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患がワルデンストレーム症候群である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ヒトにおけるある種の白血病およびリンパ腫の治療を目的とするアカデシンまたはアカデシン前駆体の使用に関する。
【０００２】
背景技術
白血病は、循環器、骨髄または他の組織における白血球（leukocite）の数の大幅な増加を特徴とする増血組織の癌である。多数の様々な白血病は、疾病の経過、および関与している白血球の支配的な型により分類される。白血病は急性または慢性として、および骨髄性（骨髄由来）またはリンパ性（リンパ球が関与する）として定義される。これらの特徴を用いて、白血病のほとんど総ての症例は、４種類、すなわち急性骨髄性、急性リンパ性、慢性骨髄性および慢性リンパ性白血病の一つとして表される。リンパ球の２つの主要な型は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、またはＢ細胞およびＴ細胞である。
【０００３】
Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、長寿命のＢリンパ球の蓄積を特徴とする。循環細胞のほとんどは非分割性(non-dividing)であると思われ、Ｂ細胞のクローン過剰は、主として細胞サイクル制御の変化によるよりも計画された細胞死を妨げるという欠陥によって引き起こされる。グルココルチコイド、および臨床的に用いられるヌクレオシド類似体であるクラドリビン（２−クロロ−２’−デオキシアデノシン）およびフルダラビン（９−β−Ｄ−アラビノ−２−フルオロアデニン、５’−一リン酸塩の形態で用いられる）などの他の化学療法薬は、Ｂ−ＣＬＬリンパ球においてアポトーシス（計画された細胞死とも呼ばれる）を誘発し、アポトーシスはそれらの治療作用のメカニズムであることを示唆している。従って、フルダラビンおよび他のヌクレオシドは、単独または他の薬剤との組合せのいずれでもＢ−ＣＬＬの治療に極めて有効である。しかしながら、これらのヌクレオシドはＴ細胞のアポトーシスを誘発する。この誘発は、免疫抑制を誘発することから重要な有害副作用である。
【０００４】
Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、通常はＢ細胞性リンパ増殖性疾患、すなわちＢ細胞数または機能の異常増加に関係した疾患および／または疾病と呼ばれる、一層広いグループの病気の特定の症例である。Ｂ−ＣＬＬの他に、このグループの病気としては、特に脾辺縁層リンパ腫（ＳＭＺＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、リンパプラズマ細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、およびワルデンストレーム(Waldenstrom)症候群（ＷＳ）が挙げられる。上記したことは、Ｂ細胞性リンパ増殖性疾患、特にＢ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の治療には新たな治療薬が求められていることを示している。
【０００５】
アカデシンは、５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボキサミド、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシド、ＡＩＣＡリボシド、およびＡＩＣＡＲとも呼ばれ、ＣＡＳ  ＲＮ  ２６２７−６９−２であり、かつ下式にて示される天然物である：
【化１】
2010180230.tif 000002
（上記式中には、ヒドロキシル基の位置番号が示されている）
【０００６】
アカデシン５’−一リン酸塩は、ＡＩＣＡリボチドおよびＺＭＰとも呼ばれ、ＣＡＳ  ＲＮ  ３０３１−９４−５を有し、これはアカデシンの天然に存在する活性代謝物である。冠状動脈バイパス移植手術を受けている患者の臨床研究では、手術前および手術中にアカデシンを投与することによって早期の心臓死や心筋梗塞を減少させることができることが明らかにされている（例えば、D.T. Mangano, Journal American Medical Association 1997, vol. 277, pp. 325-332を参照されたい）。フェーズＩＩＩ試験がアカデシンを用いてで行われており、経口および静脈内投与時にそれが安全であることが示されている。血流の減少による組織損傷を防止し（米国特許第4,912,092号明細書、米国特許第5,817,640号明細書参照）、神経変性疾患を治療し（米国特許第5,187,162号明細書参照）、中枢神経系の損傷を防止し（米国特許第5,236,908号明細書）、肥満を治療し（WO 0193873 A1号明細書参照）、２型糖尿病を治療し（WO 0197816 A1号明細書参照）、かつインスリン耐性に関連した疾患を治療する（WO 0209726 A1号明細書参照）ためのアカデシンの使用に関する特許付与された特許明細書および公開された特許出願明細書がある。調味材料（米国特許第3,355,301号明細書参照）、抗コレステロール血症／抗高脂血症薬（WO 9303734 A1号明細書参照）、抗肥満薬（WO 0193874 A1号明細書参照）、および抗糖尿病薬（WO 0197816 A1号明細書参照）としてのアカデシン５’−一リン酸塩の使用に関する特許付与された特許明細書および公開された特許出願明細書がある。しかしながら、白血病およびリンパ腫の治療を目的とするアカデシン、アカデシン５’−一リン酸塩、またはそれらのプロドラッグの使用に関しては、当該技術分野では報告も示唆もされていない。
【０００７】
アカデシンは幾つかの細胞のアポトーシス阻害薬であることは知られている。例えば、アカデシンがグルココルチコイドによって誘発される静止胸腺細胞のアポトーシスを阻害すること、アカデシンがフルクトース２，６−二リン酸塩を過剰産生する繊維芽細胞における血清遮断によって引き起こされるアポトーシスを阻害すること、およびアカデシンが一次星状細胞におけるセラミドによって誘発されるアポトーシスを阻害することが知られている。従って、アカデシンはリンパ球のアポトーシスに何らかの効果を有するならば、アカデシンはその阻害薬となることが期待される。
【発明の概要】
【０００８】
意外なことには、本発明者らは、アカデシンが幾つかのＢ細胞リンパ増殖性疾患の患者から得た試料のＢ細胞においてアポトーシスを誘発するが、Ｔ細胞は実質的に影響を受けないことを見出した。これらの予想外の結果から、アカデシンおよびその生体前駆体が、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患、すなわちＢ細胞の数または機能の異常増加に関係した疾患および／または疾病、特にはＢ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、脾辺縁層リンパ腫（ＳＭＺＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、リンパプラズマ細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、およびワルデンストレーム症候群（ＷＳ）などの治療薬として有用であると判断される。
【０００９】
アカデシンのＢおよびＴリンパ球に対する特異な効果は、アカデシンを抗白血病薬として用いるときには免疫抑制の副作用は小さいことを意味するため、本発明の重要な利点である。特に、これは、フルダラビンまたは当該技術分野で知られている他のヌクレオシドの使用と比較して治療上有利である。
【００１０】
本発明のもう一つの重要な利点は、アカデシンの選択性およびアポトーシスを誘発するのに必要な濃度である。本発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞系）、ＪＶＭ−２、ＭＣＦ−７（乳癌細胞系）、２９３、Ｈｅｌａ（子宮頸癌細胞系）およびＨＵＨ７（肝臓癌細胞系）など様々な細胞系におけるアカデシンの効果を検討し、これら総ての細胞系はＢ−ＣＬＬ細胞系よりもアカデシンに対する感受性が低いことを見出した。このことは、他の細胞系を損傷することによって生じる副作用の可能性は、アカデシンを治療薬として用いるときには小さいことを意味する。さらに、アカデシンは、静脈内投与する場合には健常者には十分に耐えられるものであり、Ｂ−ＣＬＬ患者由来の細胞においてアポトーシスを生じる範囲の血漿濃度（２００μＭ）を達成するものである。
【００１１】
アカデシンの潜在的治療能力（例えば、その消化管吸収）を向上させる目的で、幾つかのアカデシンの生体前駆体であって、体内に導入されると代謝されてアカデシンまたはその活性形態になるものが開示されている（米国特許第5,817,640号明細書、欧州特許第427,799 B1号明細書、およびそれらの引用文献参照）。アカデシンの生体前駆体とは、本明細書では式（Ｉ）の化合物を意味する：
【化２】
2010180230.tif 000003
（上記式中、
−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５は、−Ｈ（アカデシン自体は、−Ｒ２、＝−Ｒ３＝−Ｒ５＝−Ｈの選択に対応するものである）、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯ−Ｒ’および−ＣＯ−ＯＲ’からなる群から独立して選択され、但し、−Ｒ’は１２個までの炭素原子を有するヒドロカルビルであって、脂肪族（アルキル、アルケニル、およびアルキニル基並びに飽和および不飽和結合の混合して有する複数の基を含む）、脂環式（炭素環式）、アリール（芳香族）またはそれらの組合せであることができ、−Ｒ’は直鎖、分岐鎖、環、またはそれらの組合せから選択される基であることができ、−Ｒ’は１以上のハロゲン原子および／または１以上の（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル基によって置換された１以上の水素原子を有することができ、−Ｒ’は１以上のＮＨ、Ｏおよび／またはＳ基によって置換された１以上のＣＨ２基を有することができ、かつ−Ｒ’は１以上のＮ原子によって置換された１以上のＣＨ基を有することができる）。
これに関して、ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩの原子を意味する。
【００１２】
本発明は、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患のヒト患者の治療方法であって、上記にて定義した式（Ｉ）のアカデシンまたはアカデシンの生体前駆体、またはその薬学上許容可能な溶媒和物または付加塩の治療上有効量を、薬学上許容可能な希釈剤またはキャリヤーと共に投与することを含んでなる方法に関する。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、経口または非経口的に（さらに好ましくは、静脈内に）投与される。この方法の特定の態様によれば、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患はＢ−ＣＬＬ、ＳＭＺＬ、ＭＣＬ、ＦＬ、ＬＰＬ、ＷＳ、および明確な診断のないＢ細胞リンパ増殖性疾患である。
【００１３】
本発明の一つの態様は、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患のヒト患者の治療用の医薬の製造のための、アカデシンまたはアカデシンの生体前駆体である上記にて定義した式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容可能な溶媒和物または付加塩の使用に関する。具体的態様によれば、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患は、Ｂ−ＣＬＬ、ＳＭＺＬ、ＭＣＬ、ＦＬ、ＬＰＬ、ＷＳ、およびそれぞれ明確な診断のないＢ細胞リンパ増殖性疾患である。好ましい態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、および−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２からなる群から独立して選択される−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５を有するものである。さらに好ましい態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、アカデシンおよびアカデシン５’−一リン酸塩からなる群から選択される。さらに一層好ましい態様によれば、式（Ｉ）の化合物はアカデシンである。
【００１４】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含んでなる(comprise)」という用語およびこの用語の「含んでなる(comprising)」のような語尾変化は、他の技術的特徴、添加剤、成分または工程を除外しようとするものではない。優先権を主張する出願明細書の内容、並びに優先権出願明細書および本出願明細書の要約の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。下記の具体的説明および図面は、例示の目的で提供されるものであり、本発明を制限しようとするものではない。
【発明の具体的説明】
【００１５】
患者および細胞単離
４６名のＢ−ＣＬＬ患者、７名のＳＭＺＬ患者、２名の明確な診断のないＢ細胞リンパ増殖性疾患の患者、および４名の健常提供者について検討を行った。総ての患者は、標準的臨床および実験室基準に基づいて診断した。総ての患者から、書面によるインフォームド・コンセントを得た。末梢血試料からの単核細胞はＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ（Seromed、ベルリン、ドイツ）グラディエント上での遠心分離によって単離し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下にて液体窒素中で低温保存した。
【００１６】
細胞培養
リンパ球は、２〜５×１０６個／ｍＬの濃度で、１０％熱不活性化したウシ胎児血清（Gibco-BRL、ペーズリー、英国）、１％グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（Biological Industries、ベイト・ヘメク、イスラエル）中で５％二酸化炭素を含む加湿雰囲気中、３７℃にて融解の直後に培養した。
【００１７】
フローサイトメトリーによるアポトーシスの分析
アポトーシスは、アネキシンＶ結合によって測定した。ホスファチジルセリンを、以前に報告されている方法に従い、表面アネキシンＶ染色によって定量した（B. Bellosillo et al., Blood 1998, vol. 92, pp. 1406-1414参照）。試料のＴ細胞におけるアポトーシスを分析するため、５００，０００個の細胞を指示した因子を用いて２４時間インキュベーションした。次に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で洗浄し、アネキシン結合緩衝液５０μＬ中でＡＰＣ接合抗ＣＤ３およびＰＥ接合抗ＣＤ１９と共に暗所で１０分間インキュベーションした。次に、細胞をアネキシン結合緩衝液で２５０μＬの容量まで希釈し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ  ０．５μＬを用いて暗所にて１５分間インキュベーションした。アネキシン結合緩衝液２５０μＬおよびＰＩ  ５μＬを、サイトメトリー分析の直前に加えた。データーを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【００１８】
アカデシンは、Ｂ−ＣＬＬ、ＳＭＺＬおよび明確な診断のないリンパ増殖性疾患の患者の細胞にアポトーシスを誘発する
Ｂ−ＣＬＬ細胞の生育力に対する、５０μＭ〜１ｍＭの範囲における数種類の用量のアカデシンの効果を検討した。意外なことには、アカデシンは、図１に示されるように、用量依存的にアポトーシスを誘発した。５名の患者の細胞を、指示した様々な用量のアカデシンと共に２４時間インキュベーションした。ＥＣ５０は、Ｂ−ＣＬＬ細胞については３８０±６０μＭ（ｎ＝５）であった。
【００１９】
４６名の患者の細胞を、０．５ｍＭアカデシンと共に（＋）またはなしで（−）、２４時間インキュベーションした。生育力（Ｖ）をホスファチジルセリン暴露およびＰＩ摂取の分析によって測定し、これを非アポトーシス細胞の割合として表した。総ての患者はアカデシンに感受性であり、生育力は６７±１１％から２６±１４％（ｎ＝４６）まで減少した。図２は、２０名の患者からの結果を示すものである。
【００２０】
７名のＳＭＺＬ患者および２名の明確な診断のないリンパ増殖性疾患患者からの細胞を、０．５ｍＭおよび１．０ｍＭアカデシンと共に（Ａ）またはなしで（ＣＴ）２４時間インキュベーションした（図５および６参照）。生育力（Ｖ）をホスファチジルセリン暴露およびＰＩ摂取の分析によって測定し、これを非アポトーシス細胞の割合として表した。
【００２１】
アカデシンのＢおよびＴ細胞に対する特異的効果
Ｂ−ＣＬＬ患者におけるアポトーシスの誘発がＢ細胞に選択的であるかどうかを分析するため、アポトーシスＴ細胞を数種類の用量のアカデシンを用いて２４時間処理した４種類のＢ−ＣＬＬ血液試料にて計数した（ＣＤ３陽性細胞）。生育力（Ｖ）を非アポトーシスＣＤ３＋／ＣＤ１９− Ｔ細胞（白抜き記号）またはＣＤ３−／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞（黒塗り記号）として測定し、これを非治療細胞の生育力の割合として表した。Ｂ−ＣＬＬ患者のＴ細胞は、１ｍＭまでの用量においてアカデシンによって誘発されるアポトーシスに耐性であった。さらに高濃度のアカデシン（２−４ｍＭ）は、Ｔ細胞の生育力に若干ではあるが影響を与えた。
【００２２】
図４は、Ｂ−ＣＬＬ患者および健常提供者（Ｎ）由来のＢおよびＴ細胞におけるアポトーシスの誘発の比較を示す。１８名の患者および４名の健常提供者の細胞を、０．５ｍＭのアカデシンと共に２４時間インキュベーションした。生育力は、平均値±標準偏差として表される。生育力は、Ｂ細胞において著しく減少したが、Ｔ細胞では減少しなかった。これらの結果は、アカデシンによって誘発されるアポトーシスに対してＢ細胞がＴ細胞よりも一層感受性が高いことを示している。
【００２３】
図５および図６は、ＳＭＺＬおよび明確な診断のないリンパ増殖性疾患の患者由来のＢおよびＴ細胞におけるアカデシンによって誘発されるアポトーシスの比較を示す。生育力は、Ｂ細胞において著しく減少したが、Ｔ細胞では減少しなかった。これらの結果は、アカデシンによって誘発されるアポトーシスに対してＢ細胞がＴ細胞よりも一層感受性が高いことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】様々な用量のアカデシンとの２４時間インキュベーションに対する５名の患者のＢ−ＣＬＬ細胞の生育力を百分率にて示すことによって、Ｂ−ＣＬＬ患者の細胞に対するアカデシンの細胞毒性効果を表す。
【図２】２０名の患者のＢ−ＣＬＬ細胞の生育力百分率における、０．５ｍＭアカデシンと共に（＋）またはなしでの（−）２４時間インキュベーションの効果を示すことにより、Ｂ−ＣＬＬ患者の細胞に対するアカデシンの細胞毒性効果を表す。
【図３】２名のＢ−ＣＬＬ患者のＢ細胞（黒塗り丸および菱形）およびＴ細胞（白抜き丸および菱形）に対するアカデシンの特異的細胞毒性効果を表す。
【図４】１８名のＢ−ＣＬＬ患者と４名の健常提供者（Ｎ）のＢおよびＴ細胞を０．５ｍＭアカデシンと共に２４時間インキュベーションした後の、アポトーシスの誘発の比較。
【図５】ＳＭＺＬ患者の７試料の結果を表す。細胞を、アカデシンと共に（Ａ＝アカデシン）またはなしで（ＣＴ＝コントロール）２４時間処理した。生育力（Ｖ，％）をフローサイトメトリー（アネキシンＶ結合）によって分析した。
【図６】明確な診断のないＢ細胞リンパ増殖性疾患の患者の２試料の結果を表す。細胞を、アカデシンと共に（Ａ＝アカデシン）またはなしで（ＣＴ＝コントロール）２４時間処理した。生育力（Ｖ、％）をフローサイトメトリー（アネキシンＶ結合）によって分析した。
【図１】
2010180230.tif 000007
【図２】
2010180230.tif 000008
【図３】
2010180230.tif 000009
【図４】
2010180230.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月6日(2010.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な溶媒和物または付加塩を含んでなる、ヒトのＢ細胞リンパ増殖性疾患の治療用医薬組成物：
【化１】
2010180230.tif 000013
（上記式中、
−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５は、−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯ−Ｒ’および−ＣＯ−ＯＲ’からなる群から独立して選択され、但し、
−Ｒ’は１２個までの炭素原子を有するヒドロカルビル基であり、ここで、
−Ｒ’は、脂肪族（アルキル、アルケニル、およびアルキニル基並びに飽和および不飽和結合を混合して有する基を含む）、脂環式、アリールまたはそれらの組合せであることができ、
−Ｒ’は直鎖、分岐鎖、環、またはそれらの組合せから選択される基であることができ、
−Ｒ’は１以上のハロゲン原子および／または１以上の（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル基によって置き換えられた１以上の水素原子を有することができ、
−Ｒ’は１以上のＮＨ、Ｏおよび／またはＳ基によって置き換えられた１以上のＣＨ２基を有することができ、かつ
−Ｒ’は１以上のＮ原子によって置き換えられた１以上のＣＨ基を有することができる）。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物において、−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ５が−Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、および−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２からなる群から独立して選択される基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンおよびアカデシン５’−一リン酸塩からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物がアカデシンである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｂ細胞リンパ増殖性疾患が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、脾辺縁層リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、リンパプラズマ細胞性リンパ腫(lymphoplasmacyticlymphoma)、およびワルデンストレーム(Waldenstrom)症候群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。