(57)【要約】      （修正有）【課題】可変遺伝子間配列を使用するジシストロン性メッセージを提供する。【解決手段】上流側シストロンが、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖のどちらかをコードするＤＮＡを含み、下流側シストロンが、それぞれ対応する軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡを含む、特定の抗原結合特異性を有する抗体分子を産生するためのジシストロン性メッセージであって、２つのシストロンが最適化された遺伝子間配列によって連結されているジシストロン性メッセージからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流側シストロンが、抗体の重鎖をコードするＤＮＡを含み、下流側シストロンが、それに対応する軽鎖をコードするＤＮＡを含む、特定の抗原結合特異性を有する抗体分子を産生するためのジシストロン性配列からなる核酸であって、
２つのシストロンが、配列番号４によって表わされる遺伝子間配列１（ＩＧＳ１）、配列番号７によって表わされる遺伝子間配列２（ＩＧＳ２）、配列番号１０によって表わされる遺伝子間配列３（ＩＧＳ３）、又は配列番号１３によって表わされる遺伝子間配列４（ＩＧＳ４）によって連結されており、産生抗体が抗ＴＮＦα抗体でもなく、抗ＫＤＲ抗体でもないことを特徴とする、核酸。
【請求項２】
請求項１に記載のジシストロン性配列を含む、発現ベクター。
【請求項３】
前記発現ベクターが、配列番号３のヌクレオチド配列を有するベクターである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の発現ベクターで形質転換した、ホスト細胞。
【請求項５】
前記ホスト細胞が大腸菌である、請求項４に記載のホスト細胞。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のホスト細胞を培養することを含む、抗体分子の産生方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって産生される抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖が、２つのシストロンが最適化された遺伝子間配列によって連結されているジシストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）メッセージ中に存在するＤＮＡによってコードされる抗体の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、特定の抗原を認識する能力によって、医学及び生物工学において非常に有用で効果的なツールとなっている。選択されたある種の細胞上の抗原に特異的な抗体は、これらの抗体を、選択した細胞に向けるために使用されてきた。いくつかのケースでは、細胞上のレセプターに抗体が結合すると、細胞の機能に影響を及ぼすことがわかっている。また、治療剤及び診断剤は、選択した細胞に、これらの薬剤を特異的に送り込むために、これらに抗体を結合させることが行なわれている。この技術は、特に癌細胞のターゲティングに使用されている。また、抗体は、ウイルス又は細菌に感染した細胞上の抗原を標的とするため、ＴＮＦαなどの他の分子を標的とするため、又は分析用に使用されている。生物工学では、抗体は、精製及び触媒反応において、プローブなどの使用に多く利用されている。
【０００３】
すべての完全な抗体分子は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖から構成される。各鎖は、可変ドメインと定常ドメインを含んでいる。軽鎖は、２つのドメイン、つまり、ＶＬ及びＣＬを含み、重鎖は、少なくとも５つのドメイン、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、場合によっては、更にＣＨ４を含んでいる。４つの鎖は、いつでもおおよそ同じ様式で組織されている。すなわち、２つの重鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合で互いに連結され、各重鎖はまた、軽鎖のうちの１本とジスルフィド結合で連結され、２つの軽鎖はそれぞれ別の重鎖に連結する。
【０００４】
抗体分子全体は、ほぼＹ字型で、基本的に２つの主機能部から構成される。第１の機能部は、特異的抗原を認識する役割を担い、Ｙの腕の上部を形成する。各部の抗原結合領域は、１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインを含む。各可変ドメインは、３つの超可変領域を含み、他方の鎖の３つの超可変領域と互いに抗原結合部位を形成する。これら超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３）として知られる。これらＣＤＲはループを形成し、フレームワーク領域上に保持されている。ＶＨ及びＶＬを含む領域は、抗体ごとに可変であるため、「Ｖ」領域として知られる。
【０００５】
第２の機能部は、抗体に認識された抗原を処理する他の細胞のエフェクター機能を誘発ーする役割を担い、Ｙの腕の下部とステムから形成される。この領域は、比較的定常であるため、定常「Ｃ」領域として知られる。この領域は、ＣＬドメインと重鎖のＣドメインすべてを含む。
【０００６】
軽鎖には、κ及びλの２種類があり、重鎖には、α、δ、γ、ε及びμの５種類がある。抗体のクラスは、重鎖の型によって決定され、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭである。
【０００７】
酵素切断によってその定常領域の一部が除去された抗体断片も、医学及び生物工学で使用される。これらには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片が含まれる。
【０００８】
抗体を産生する脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させて、ハイブリドーマを得ることによって、大量のモノクローナル抗体（特別な抗体特異性を有する）を直接に産生することが知られている（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．「所期の特異性を有する融合細胞分泌抗体の連続培養」（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５−４９７（１９７５））。しかし、このような抗体は、ヒトにおいて免疫原性でないため、ヒトの治療に使用することは適切ではない。多くのモノクローナル抗体は、非ヒト細胞で産生される。
【０００９】
複数の抗体の有用な特性を組み合わせることを可能にして、１つの新しい抗体を作る組み換えＤＮＡ技術が開発されている。１つの抗体の完全な可変領域を含む抗体結合部位を、別の抗体の定常領域に連結させてキメラ抗体を産生することが、欧州特許第０１２０６９４号（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、欧州特許第０１２５０２３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ）、欧州特許第０１７１４９６号（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）、欧州特許第０１７３４９４号（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）及び特許国際公開第８６／０１５３３号（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。
【００１０】
たとえば、特許国際公開第８６／０１５３３号は、ネズミ可変領域をヒトの定常領域と結合させたキメラ抗体の調製を記載している。しかし、キメラ非ヒト／ヒト抗体には非ヒトドナー由来の残基をかなり比率で含むので、特に長期間が投与すると、抗体が潜在的に有害な免疫応答を誘発する可能性がある（Ｂｅｇｅｎｔら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６２，４８７（１９９０））。
【００１１】
抗体の「ヒト化」とは、非ヒト／ヒトキメラ抗体を、ヒト免疫系に対してヒト抗体により似たものにする技術で、上記に記載した望ましくない免疫反応を解消するために開発された。欧州特許第０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）は、完全なネズミの可変領域を使用する代わりに、ネズミのモノクローナル抗体のＣＤＲをヒト抗体の可変ドメインのフレームワーク領域上に移植する方法について記載している。したがって、ネズミ由来であるのは、抗原結合ドメイン自体を形成するＣＤＲのみで、その他の残基がヒト由来である。
【００１２】
Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（「治療用ヒト抗体の再形成」”Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｉｔｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３−３２４、１９８８）は、可変ドメインにある他のヒト残基を非ヒトドナーの等価物に変換して、抗体結合活性を改善することが有益であることを見出した。このような残基は、ヒト重鎖のポジション２７に見つかった。ヒトのセリンから対応するラットの残基（フェニールアラニン）に変換すると、抗体結合能力の改善がもたらされた。このような残基が別にポジション３０で見出された。しかし、上記に記載されたポシション２７の変更に加えて、重鎖のポジション３０にヒトのセリンからラットのチロシンへの変更を含む構築物は、セリンからフェニールアラニンへの変更をポジション２７のみに有するヒト化された抗体に比べて、優位に結合活性を変更しなかった。
【００１３】
重鎖残基２７及び３０は、ＣＤＲ１近隣の構造ループ内にある。Ｑｕｅｅｎら（特許国際公開９０／０７８６１）は、ＣＤＲと相互作用する他の残基もまた、抗体結合親和性を決定する際に重要であると推測した。このことを念頭において、Ｑｕｅｅｎらは、ヒト化抗体を設計する際、どの残基がドナーに由来し、どれがアクセプタに由来すべきかを決定するための４つの判定基準を提案した。より決定的な分析で、Ａｄａｉｒら（特許国際公開９１／０９９６７）が、ヒト化抗体の設計を可能にする残基番号の優先度を開示した。
【００１４】
Ｖａｕｇｈａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５−５３９，１９９８）を含めてＣＤＲを移植された抗体について論じた数多くの論文が公表されている。
【００１５】
定常領域が、治療剤又は診断剤として作用可能なエフェクター又はレポーター分子と融合した抗体複合体も記載されている（特許国際公開第９５／０１１５５号、米国特許第３９２７１９３号、第４３３１６４７号、第４３４８３７６号、第４３６１５４４号、第４６８４５７号、第４４４４７４４号、第４４６０４５９号及び第４４６０５６１号並びに以下の総説：Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５２、１６５７（１９９１）；Ｋｏｐｐｅｌ，Ｇ．Ａ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１、１３（１９９０）；Ｏｅｌｔｍａｎｎ，Ｔ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｅ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、５、２３３４（１９９１）；及びｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｈ．Ｅ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｒｉｔａｉｎ、Ｍａｙ  １９８６、４３０−４３９）。
【００１６】
適切なホスト細胞を、１つは求める抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列を含み、１つはその抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含む２つの発現ベクターでトランスフェクトして、正常、キメラ又はヒト化された抗体を産生することが知られている（特許国際公開第９１／０９９６７号）。また、適切なホスト細胞を、求める抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列とその抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列との両方を含む発現ベクターでトランスフェクトすることも知られている。後者の例では、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列はどちらも、それ自体の個々のプロモータの制御下（特許国際公開第９１／０９９６７号）にあるか、ジシストロン性メッセージ中（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．、Ｐａｕｌ  Ｃｈａｎｇ，Ｃ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．及びＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：「活性キメラ抗体断片の分泌」（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０４１−１０４３（１９８８））に存在する。
【００１７】
ジシストロン性メッセージは、多くのヒトの癌の表面上に発現しているガングリオシド抗原に対するキメラマウスＬ６Ｆａｂ抗体を産生するためにＢｅｔｔｅｒらによって使用された。このケースでは、一部を切り詰めた重鎖（Ｆｄ）とκ軽鎖とが、確実に、物理的に近接して翻訳され、それらが正しく組み合わさり、分泌されることを企図して、ジシストロン性メッセージが選択された。ジシストロン性メッセージは、細菌中で機能できるのみであり、哺乳類及び細菌中においては、「１遺伝子１プロモータ」という概念が機能する。ジシストロン性メッセージでは、プロモータは第１のシストロンにのみ連結している。第２のシストロンは、ポリメラーゼによって第２のシストロンまで「読み通され」て転写され、２つのシストロンが単一のＲＮＡ分子で表されることになる。２つのコードＤＮＡシストロンは、「遺伝子間配列」又は「ＩＧＳ」として知られる、ある長さのＤＮＡによって分離される。このＩＧＳ領域は、ＤＮＡから転写されるＲＮＡ分子中にも存在する。
【００１８】
転写開始速度を最適化することが、大腸菌で分泌される異種タンパクを高度に発現させるためには必要不可欠であることが、しばらく前から認識されている（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．及びＹａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、６２９−６３４（１９９６））。しかし、Ｆａｂが異なると、フレームワークとＣＤＲ配列が異なり、それによって大腸菌ペリプラズム内での折りたたまれ易さ（又は速度）の差を含めて異なる特性が分子に付与される。（Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ８、８１−８９（１９９５））。たとえば、大腸菌のペリプラズム内で容易かつ迅速に折りたたまれて生来のコンフォーメーションをとるＦａｂ’は、高度の「耐容性をもつ」と思われ、迅速な翻訳に適応し、高度な蓄積を達成することができる。折りたたみがより不十分なＦａｂ’は、迅速に翻訳された場合、ホスト細菌による耐容性が不十分になると思われ、ホストの折りたたみ／分泌機構を飽和させ、ホスト細胞の生理に有害な影響を与える可能性がある。
【００１９】
したがって、ホスト細胞発現ベクターシステムを使用して抗体を産生する場合、特定の抗体における高レベル発現は耐容性があるが、抗体が異なると、高レベルの発現は、おそらく分泌又は折りたたみの効率が異なるという理由で、細胞に対して毒性となる可能性がある。
【００２０】
個々の抗体の発現レベルは、重鎖及び軽鎖の存在する量によって決まる。最大量の産生を得るためには、重鎖と軽鎖の比を、たとえば、両方の量が等しくするなどバランスさせなければならない。しかし、重鎖と軽鎖のどちらか一方の量が少ないと、その量が産生される抗体の量を制限することになる。過剰の重鎖蓄積は耐容性が特に不十分となる可能性がある。
【００２１】
ジシストロン性メッセージによってコードされる抗体の場合、上流側シストロンは、特定の抗原特異性を有する抗体の重鎖と軽鎖のどちらか一方をコードするＤＮＡを含むことができる。その場合、下流側シストロンは、それぞれ、上流側シストロンの重鎖又は軽鎖のパートナーをコードする。特定の抗体を所望の発現レベルで産生させるには、ジシストロン性メッセージの下流側シストロンでコードＤＮＡに対応する抗体鎖の発現レベルを調節できれば有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】欧州特許第０１２０６９４号
【特許文献２】欧州特許第０１２５０２３号
【特許文献３】欧州特許第０１７１４９６号
【特許文献４】欧州特許第０１７３４９４号
【特許文献５】国際公開第８６／０１５３３号パンフレット
【特許文献６】欧州特許第０２３９４００号
【特許文献７】国際公開９０／０７８６１号パンフレット
【特許文献８】国際公開９１／０９９６７号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９５／０１１５５号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第３９２７１９３号
【特許文献１１】米国特許第４３３１６４７号
【特許文献１２】米国特許第４３４８３７６号
【特許文献１３】米国特許第４３６１５４４号
【特許文献１４】米国特許第４６８４５７号
【特許文献１５】米国特許第４４４４７４４号
【特許文献１６】米国特許第４４６０４５９号
【特許文献１７】米国特許第４４６０５６１号
【特許文献１８】国際公開第９１／０９９６７号パンフレット
【特許文献１９】国際公開第９１／０９９６７号パンフレット
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５−４９７（１９７５）
【非特許文献２】Ｂｅｇｅｎｔら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６２，４８７（１９９０））
【非特許文献３】Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら  ”Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｉｔｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３−３２４、１９８８）
【非特許文献４】Ｖａｕｇｈａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５−５３９，１９９８）
【非特許文献５】Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５２、１６５７（１９９１）
【非特許文献６】Ｋｏｐｐｅｌ，Ｇ．Ａ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１、１３（１９９０）
【非特許文献７】Ｏｅｌｔｍａｎｎ，Ｔ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｅ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、５、２３３４（１９９１）
【非特許文献８】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｈ．Ｅ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｒｉｔａｉｎ、Ｍａｙ  １９８６、４３０−４３９
【非特許文献９】Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．、Ｐａｕｌ  Ｃｈａｎｇ，Ｃ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．及びＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０４１−１０４３（１９８８）
【非特許文献１０】Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．及びＹａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、６２９−６３４（１９９６）
【非特許文献１１】Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ８、８１−８９（１９９５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
第１の態様において、本発明は、上流側シストロンが、抗体の重鎖と軽鎖のどちらかをコードするＤＮＡを含み、下流側シストロンが、それぞれ対応する軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡを含む、特定の抗原結合特異性を有する抗体分子を産生するためのジシストロン性メッセージであって、２つのシストロンが、最適化された遺伝子間配列（ＩＧＳ）によって連結されており、産生される抗体が、抗ＴＮＦα抗体（たとえば、特許国際出願ＧＢＯ１／０２４７７参照）でもなく、抗ヒトキナーゼ挿入ドメインを含むレセプタ（抗ＫＤＲ）抗体（たとえば、特許国際出願ＧＢ０２／００４６１９参照）でもないことを特徴とする、ジシストロン性メッセージを提供する。
【００２５】
好ましくは、上流側シストロンは、抗体の軽鎖をコードし、下流側シストロンは対応するその重鎖をコードする。
【００２６】
特定の抗体について所望の発現レベルを達成するために、ＩＧＳは、ジシストロン性メッセージにおける下流側シストロンに対応する抗体鎖の発現レベルが調節されるように最適化されている。
【００２７】
本明細書では、ＩＧＳの長さを、上流側シストロンの終結コドンと下流側シストロン（両端を含まない）の開始コドンとの間のヌクレオチドの数であると定義する。ＩＧＳの長さは、下流側シストロンに対応するＲＮＡ部分の翻訳速度の決定に関係する。たとえば、遺伝子間配列が短いと、重鎖と軽鎖の間の翻訳のカップリングが非常に緊密になり、上流側シストロンによってコードされる抗体鎖の合成が終了した後、下流側シストロンによってコードされる抗体鎖の合成が開始される前に、翻訳を行うリボソームが、ｍＲＮＡから十分に解離しなくなる可能性がある（Ａｄｈｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  ｖａｎ  Ｄｕｉｎ、Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１３、８１１−８１８（１９９０）；Ａｎｄｒｅ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．、４６８、７３−７８（２０００））。このような過程は、翻訳の再開始と呼ばれ、上流の遺伝子の終結コドンと下流遺伝子の開始コドンが非常に接近している場合にのみ生じる。速度論的に考察すると、このような過程により、翻訳において、ＩＧＳで別のリボソームがｍＲＮＡ分子と結合する必要がなくなるので、下流側シストロンによってコードされるポリペプチドの発現が増加することになる。
【００２８】
２つの遺伝子間が離れすぎていると、上流側シストロンの合成が終了した後にリボソームが解離するので、下流側シストロンの翻訳を開始するには新しいリボソームが必要となる。そのため、通常、翻訳開始効率が低下することになる。
【００２９】
ＩＧＳにはシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）リボソーム結合部位（１６ＳｒＲＮＡと相補的である）が存在しているので、リボソームがＩＧＳ配列に結合し、下流側シストロンを翻訳することができる。翻訳の再開始が可能になるのに十分なほどシストロン間の距離が短い場合、上流側シストロン内にＳＤ部位が存在すると、下流側シストロンの翻訳開始効率が上がることを示唆する証拠がいくつかある（Ｓｐａｎｊａａｒｄ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  ｖａｎ  Ｄｕｉｎ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７、５５０１−５５０７（１９８９））。
【００３０】
ＳＤ部位、及びＳＤ部位の端とＡＵＧ開始コドンの間のヌクレオチド配列には、翻訳開始の強さに影響を与えるいくつかの特徴がある（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、６０、５１２−５３８（１９９６）に総説される）。下流側シストロンの、ＳＤ部位とＡＵＧ開始コドンの間の距離は、そのような特徴の１つであり、ＳＤ部位自体の「効力（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」もその特徴の１つである。ＳＤ部位に結合する１６ＳｒＲＮＡ配列と１００％相補的なＳＤ部位は、通常、１６ＳｒＲＮＡ配列と部分的にしか相補的でないＳＤ部位の場合よりも、発現は大きくなる。
【００３１】
ＳＤ配列と開始コドン間領域の配列は、下流側シストロンの翻訳速度を決定する別の重要な要素である。距離及び配列は、開始コドンの周りでｍＲＮＡのとり得る２次構造に影響する（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、６０、５１２−５３８（１９９６）参照）。開始コドンは、「ループ」中に存在するはずで、「ステム」内には閉じ込められていないが、ＳＤ配列はその逆である。したがって、ＩＧＳの配列と長さを変更することによって、翻訳カップリングの程度及び／又は翻訳開始の強さを変更することができ、それによって、下流側シストロンの翻訳のレベル、及びそれをコードする抗体鎖のその後の蓄積速度を変更することができる。
【００３２】
本発明のジシストロン性メッセージのＩＧＳは、２つのシストロンの最適な翻訳カップリングが実現されるように、長さ、配列及び２次構造が変更されている。
【００３３】
本発明に使用される最適なＩＧＳ配列は、以下の方法を使用して実験的に決定することができる。この方法は、抗体分子をテスト用に挿入することが可能な一連のＩＧＳ変異体を含む一連の適切な発現ベクターを構築することを含む。各抗体の各ＩＧＳ配列の実験を、発現ベクターで適切なホストを形質転換して、抗体の発現及び収率を分析することによって行うことができる。本発明に記載された、長さと配列の異なる１組のＩＧＳ配列を使用して、かかるベクターを構築することができ、その中から特定の抗体分子の最適なＩＧＳ配列を選択することができる。この配列には、ＩＧＳ配列１から４が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ベクターｐＴＴＱ９を示す図である。
【図２】ＯｍｐＡポリリンカー領域の配列を示す図である。
【図３】ベクターｐＡＣＹＣ１８４を示す図である。
【図４】ベクターｐＴＴＯ−１を示す図である。
【図５】ベクターｐＴＴＯ−１の完全なＤＮＡ配列を示す図である。
【図６】ベクターｐＴＴＯ−２を示す図である。
【図７】ベクターｐＤＮＡｂＥｎｇＧ１を示す図である。
【図８】ベクターｐＴＴＯ（ＴＮＦα）を示す図である。
【図９】大腸菌Ｆａｂ’発現用の、４つの異なる遺伝子間配列をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す図である。
【図１０】振盪フラスコ分析の結果として、ＩＧＳ変異体ｐＴＴＯ（ＴＮＦαＩＧＳ−１、ｐＴＴＯ（ＴＮＦαＩＧＳ−２）、ｐＴＴＯ（ＴＮＦαＩＧＳ−３）及びｐＴＴＯ（ＴＮＦαＩＧＳ−４）のペリプラズムＦａｂ’の蓄積を示す図である。
【図１１】Ｆａｂ’ｇ１６３の４つのＩＧＳ変異体を生成するために使用する４通りの連結を示す図である。
【図１２】振盪フラスコ分析の結果として、ＩＧＳ変異体ｐＴＴＯ（ｇ１６３  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯ（ｇｌ６３  ＩＧＳ−２）、ｐＴＴＯ（ｇｌ６３  ＩＧＳ−３）及びｐＴＴＯ（ｇ１６３  ＩＧＳ−４）の可溶性Ｆａｂ’の蓄積を示す図である。
【図１３】ベクターｐＴＴＯＤ（ｇ１６３  ＩＧＳ−３）の制限マップを示す図である。
【図１４】振盪フラスコ分析の結果として、ＩＧＳ変異体ｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−２）及びｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−３）の可溶性Ｆａｂ’の蓄積を示す図である。
【図１５】発酵槽比較分析の結果として、ＩＧＳ変異体、ｐＴＴＯＤ（ｇｌ６５  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯＤ（ｇｌ６５  ＩＧＳ−２）、ｐＴＴＯＤ（ｇｌ６５  ＩＧＳ−３）及びｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−４）の可溶性Ｆａｂ’蓄積を示す図である。
【図１６】発酵槽比較分析の結果として、ＩＧＳ変異体ｐＴＴＯＤ（ｇＡ３３  ＩＧＳ−２）及びｐＴＴＯＤ（ｇＡ３３  ＩＧＳ−３）の可溶性Ｆａｂ’蓄積を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
好ましい一実施形態では、下流側シストロンによってコードされる抗体鎖が最高に発現されるように、ＩＧＳが最適化されている。これにより、下流側シストロンによってコードされる抗体鎖の量には制限がなく、特定の抗体の最高レベルの発現がもたらされる。
【００３６】
別の実施形態では、下流側シストロンの翻訳の翻訳開始速度ができるだけ速くなるように、ＩＧＳが最適化される。
【００３７】
別の実施形態では、下流側シストロンの翻訳の翻訳開始速度が、達成可能なもっとも大きな速度にならないように、ＩＧＳが最適化される。
【００３８】
別の実施形態では、下流側シストロンの翻訳の翻訳開始速度が低い速度となるように、ＩＧＳが最適化される。
【００３９】
本発明のジシストロン性メッセージは、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードしている。抗体は、抗体全体でもＦａｂ又はＦａｂ’断片など特定の断片でもよい。抗体はまた、キメラ又はヒト化された抗体であってもよい。
【００４０】
本発明のジシストロン性メッセージは、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡもしくはいかなる組合せを含んでいてもよい。
【００４１】
特定の抗体のコードＤＮＡ配列は、当分野の技術者に周知の方法で得られる。たとえば、抗体重鎖及び軽鎖の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列は、所望により、決定されているＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成できる。
【００４２】
本発明のジシストロン性メッセージでは、ＩＧＳによって連結される、特異的抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ配列を調製するために、分子生物学の標準技法が使用できる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技法を使用して、完全又は部分的に合成できる。部位特異的突然変異及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が、適宜に使用できる。
【００４３】
本発明のジシストロン性メッセージは、抗体鎖の１つをコードするＤＮＡ配列と融合させたエフェクター又はレポーター蛋白をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。
【００４４】
本発明のジシストロン性メッセージには、抗体鎖の１つをコードするＤＮＡ配列と融合されたペプチド結合鎖をコードするＤＮＡ配列も含むことができ、それによって、その後にエフェクター又はレポーター蛋白もしくは分子をジシストロン性メッセージから発現される抗体に付加することが可能になる。
【００４５】
本発明のジシストロン性メッセージには、抗体鎖を、ペリプラズム又は細胞外部を標的として送ることができるように、抗体鎖の１つ又は両方をコードするＤＮＡ配列の上流に融合された分泌シグナル配列を含んでいてもよい。
【００４６】
好ましくは、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡペプチド配列である。
【００４７】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるジシストロン性メッセージを含む発現ベクターを提供する。
【００４８】
好ましくは、発現ベクターのフレームワークをなすのは、ｐＴＴＯである。ｐＴＴＯ発現ベクターは、大腸菌中で組み換えタンパクが可溶性でペリプラズムに蓄積するように設計されている。このベクターは、以下の主な特徴を有する。
【００４９】
（ｉ）テトラサイクリン耐性マーカー：耐性遺伝子の産物によって不活性化されない抗生物質、したがってプラスミドを含む細胞の選択が維持される；
（ｉｉ）低コピー数：ｃｏｌＥ１由来のレプリコンを含むプラスミドと整合性があるプラスミドｐ１５Ａ由来の複製起点；
（ｉｉｉ）クローン遺伝子の転写のための強力で誘導性のｔａｃプロモータ；
（ｉｖ）ｌａｃＩｑ遺伝子：ＩＰＴＧ／アロラクトースで誘導されるまでｔａｃプロモータを抑制状態に維持するＬａｃリプレッサー蛋白の構成的発現をもたらす；
（ｖ）ＯｍｐＡシグナル配列：クローン化された遺伝子のペリプラズムでの分泌をもたらす；
（ｖｉ）短いＬａｃＺペプチドに対してＯｍｐＡシグナル配列を翻訳カップリングして、効率的な転写開始をもたらす。
【００５０】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１態様によるジシストロン性メッセージを含むクローニングベクターを提供する。
【００５１】
発現及びクローニングベクターを構築する一般的方法、トランスフェクション法、及び培養法は、当分野の技術者に周知の方法である。
【００５２】
第４の態様において、本発明はまた、特定の抗体分子をコードするＤＮＡの発現をもたらすのに適した条件下で、本発明の発現ベクターで形質転換された細菌ホスト細胞を培養し、その抗体分子を単離することを含む特定の抗体分子を産生する方法であって、抗体の発現レベルが最適化されている方法を提供する。
【００５３】
適切な細菌ホスト細胞であれば何なる細胞であっても、本発明によるジシストロン性メッセージによってコードされる特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖を発現させるのに使用することができる。しかし、好ましくは、大腸菌のホスト細胞を使用する。他の微生物系を使用してもよい。
【００５４】
抗体分子は、細胞から分泌されることができ、また、適切なシグナル配列によってペリプラズムを標的とすることができる。あるいは、抗体分子は、細胞の細胞質内に蓄積されることもできる。産生された抗体及び使用された方法に応じて、抗体分子が再び折りたたまれることを可能として、機能的なコンフォーメーションを形成することが望ましい。抗体分子を再び折りたたませることを可能とする手順は、当分野の技術者に周知である。
【００５５】
本発明によるジシストロン性メッセージによって産生される抗体分子は、特定の抗体が製薬上許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と共に含まれる治療用又は診断用組成物を作製するために使用することができる。
【００５６】
抗体分子は、治療用組成物又は診断用組成物中で唯一の有効成分であっても、たとえば、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ又は抗ＬＰＳ抗体などの他の抗体成分、あるいはキサンチンなどの非抗体成分を含む１つ又は複数の成分が一緒であってもよい。
【００５７】
本発明によって産生された特定の抗体分子は、その抗体分子を使用する治療法に従って任意の適切な形態及び量で投与することができる。
【００５８】
適切な投与形態には、非経口的投与に適する形態、たとえば注射又は点滴、たとえばボーラス注射又は連続点滴が挙げられる。産物を注射又は点滴投与する場合、油性又は水溶性媒体中で、懸濁液、溶液又は乳濁剤の形をとってもよいし、懸濁剤、保存剤、安定剤、及び／又は分散剤などの製剤用添加剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含んでいてもよい。
【００５９】
あるいは、抗体分子は、使用する前に適当な滅菌液で溶解して使用されるような乾燥形態であってもよい。
【００６０】
抗体分子が経口投与に適している場合、たとえば、抗体断片の場合、配合物は、有効成分の他に経口投与組成物の配合に使用される適切な添加剤を含んでいてもよい。
【００６１】
治療用及び診断用組成物は、単位剤形であってもよく、その場合、各単位投与量は、有効量の特定の抗体分子を含む。また投与量は、年齢及び患者の状態によって選択される。
【００６２】
抗体分子の半減期が短い場合（たとえば、２から１０時間）、１日に１回又は複数回の投与が必要となる。一方、抗体分子の半減期が長い場合（たとえば、２から１５日）、１日に１回、１週間に１回の投与、又は１カ月又は２カ月ごとに１回の投与しか必要でないこともある。
【００６３】
本発明を、さらに、添付の図面を参照して以下の実施例で単に例として説明する。
【実施例】
【００６４】
抗ＴＮＦα抗体をコードするジシストロン性メッセージ
本発明のジシストロン性メッセージを使用して、抗ＴＮＦαＦａｂ’抗体断片の高レベル発現を達成した。上流側シストロンは、抗体の軽鎖をコードし、下流側シストロンは、抗体の重鎖をコードしていた。ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を、軽鎖及び重鎖の各々をコードするＤＮＡの５’末端に融合させて、ペリプラズムに対する効率的な分泌を可能にした。
【００６５】
重鎖の発現のレベルを変えるため、種々のＩＧＳの範囲をコードする一連のオリゴヌクレオチドカセットをジシストロン性メッセージに使用した。異なるカセットを使用して、重鎖の翻訳開始速度を変更した結果、翻訳された重鎖産物の蓄積が、ある範囲の速度で生じた。
【００６６】
最適配列を実験的に決定することが可能になるように一連の４つのＩＧＳを設計した。最高量の可溶性Ｆａｂ’の蓄積を生じるＩＧＳ変異体を、振盪させたフラスコを誘導装置として、又は発酵槽発現を決定手段として使用して、実験的に選択した。驚くべきことに、異なるＦａｂ’に対して異なるＩＧＳが選択された。これは、それぞれ新しいＦａｂ’断片を発現させるには、実験的な選定が必要であることを示唆する。
【００６７】
（実験）
材料と方法
一般的微生物学及びＤＮＡ操作技法
形質転換及び慣用培養物増殖用に、大腸菌株ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｅ  Ｓｃｈｅｌｐ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、発現の研究には、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ＃  ２７３２５）を使用した。ＤＮＡ制限酵素及び修飾酵素は、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｌｅｗｅｓ、Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ））及びニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｈｉｔｃｈｅｒ、Ｈｅｒｔｓ、ＵＫ））から入手した。プラスミドの調製は、プラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｒａｗｌｅｙ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を使用して行った。ＤＮＡ断片の精製は、キアゲン社のスピンカラムを使用して行った。ＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＣｌｅａｎプロトコル（ＢＩＯ  １０１）を使用してアガロースから精製した。オリゴヌクレオチドは、Ｏｓｗｅｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅから供給され、４０ｎＭのスケールで合成した。ＰＣＲは、推奨のように、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のＡｍｐｌｉｔａｑを使用して行った。ＤＮＡシークエンス反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＤｙｅＤｅｏｘｙチェーンターミネーターキットを使用して行い、ＡＢＩ３７３Ａ  自動シークエンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で実施した。データをプログラム：オートアセンブラー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
【００６８】
振盪フラスコによる誘導
大腸菌Ｗ３１１０培養物を、テトラサイクリン（７．５μｇ／ｍｌ）を補給した液体ブロス中で生育させた。誘導するために、一晩培養した新鮮な培養物（３０℃で生育させた）を、２Ｌのバッフル付きフラスコ中、液体ブロス２００ｍｌで、ＯＤ６００＝０．１まで希釈し、オービタルインキュベータ中３０℃で増殖させた。ＯＤ６００＝０．５で、ＩＰＴＧを２００μＭまで加えた。サンプル（ＯＤ用に正規化）を間隔をおいて採取した。
【００６９】
ペリプラズム抽出
培養物サンプルを氷上で（５分）冷却し、次いで細胞を遠心分離によって採集した。抽出緩衝液で懸濁した（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）後に、サンプルを一晩３０℃でインキュベートし、遠心分離で清澄させた。
【００７０】
アッセンブリーアッセイ
Ｆａｂ’の濃度をＥＬＩＳＡで求めた。プレートを４℃一晩、抗ヒトＦｄ６０４５（コーティング緩衝液、生理的食塩水中２μｇ／ｍｌ、ウエルあたり１００μ１）（欧州特許第４９１０３１号参照）でコートした。洗浄後、ウエルあたり１００μｌのサンプルを充填し、精製されたＡ５Ｂ７γ−１  Ｆａｂ’（欧州特許第４９１０３１号参照）を、初期濃度２μｇ／ｍｌで標準として使用した。サンプルをプレートの端から端までサンプルコンジュゲート緩衝液（リットル当たり：トリス  アミノメタン６．０５ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇ、ツイーン２０を０．１ｍｌ、カゼイン（０．２％）を１ｍｌ）で２倍に連続希釈し、プレートを１時間室温で攪拌しながらインキュベートした。プレートを洗浄、乾燥し、次いで、抗ヒトＣκ（ＧＤ１２）ペルオキシダーゼ１００μｌ（サンプルコンジュゲート緩衝液中で希釈したもの）を加えた。インキュベーションを室温で１時間、攪拌しながら行った。プレートを洗浄、乾燥し、次いで基質溶液１００μｌ（１０ｍｌ酢酸ナトリウム／クエン酸溶液（０．１Ｍ、ｐＨ６）、過酸化水素水溶液１００μｌ、テトラメチルベンジジン溶液（ジメチルスルホキシド中１０ｍｇ／ｍｌ）を１００μ１）を加えた。基質添加の４から６分後に、６３０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００７１】
発酵
大腸菌Ｗ３１１０培養物を、振盪フラスコで、テトラサイクリン（７．５μｌ／ｍｌ）を補給した液体ブロス中で、３０℃で、ＯＤ６００＝１．０になるまで生育させ、この培養物１００ｍｌを使用して、１．５Ｌのバッチ供給式培養発酵槽に入れたＳＭ６培地（＋グリセロール）（欧州特許第６５１８０３号）１Ｌに播種した。ｐＨを５０％アンモニウムと５％硫酸とで７．０に調節した。溶存酸素濃度を可変式攪拌で３０％に維持した。テトラサイクリンは、発酵培地に含まれていなかった。初期のグリセロール濃度は３％ｗ／ｖであり、発酵中、培養物がＯＤ６００≒６０に達した後、グリセロールが利用可能でなくなるような場合がもう一回あった時には、さらにグリセロールを供給した。培養物を３０℃で、ＯＤ６００＝５５まで生育させ、５０％ラクトースを１２０ｍｌ添加した：利用可能なグルコースが利用された後、ラクトースが誘導される。２０時間後、さらにラクトース６０ｍｌを一度に添加し、誘導後、２５から３０時間発酵をモニターし、サンプル（ＯＤ用に正規化されたもの）を間隔を置いて採取した。
【００７２】
（結果）
プラスミドｐＴＴＯ−１及びｐＴＴＯ−２の構築
プラスミドｐＴＴＱ９をアマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から入手した。これを図１に示す。アリコット（２μｇ）を制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、消化物を１％アガロースゲルにかけ、大きなＤＮＡ断片（４５２０ｂｐ）を精製した。２つのオリゴヌクレオチドを合成し、これを互いにアニールしたところ、図２に示すＯｍｐＡポリリンカー領域をコードしていた。この配列は、ｐＴＴＱ９の制限酵素消化によって得られたＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ末端と適合する付着端を有する。このオリゴヌクレオチドの「カセット」をｐＴＴＱ９ベクター中に挿入した。これによって、ＳａｌＩ部位は再生されないが、ＥｃｏＲＩ部位は保持される。このカセットは、大腸菌外膜タンパクＯｍｐ−Ａのシグナル配列の最初の１３アミノ酸をコードし、その前にＯｍｐＡ遺伝子のシャインダルガノリボソーム結合部位がある。これに加えて、酵素ＸｂａＩ、ＭｕｎＩ、ＳｔｙＩ及びＳｐｌＩの制限部位が存在する。ＭｕｎＩ及びＳｔｙＩ部位は、ＯｍｐＡシグナル配列のコード領域内にあり、遺伝子の挿入用の５’クローニング部位として意図される。このカセットを構成する２つのオリゴヌクレオチドを、５ｐモル／μｌの濃度で混合し、湯浴で９５℃まで３分かけて加熱し、室温までゆっくり冷却することによって、互いにアニールさせた。次に、アニールした配列を、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＴＱ９に連結した。得られたプラスミド中間産物は、ｐＴＱＯｍｐと呼ばれ、ＤＮＡシーケンスで検証した。
【００７３】
中間産物のアリコットを、次に、ＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ（２３５０ｂｐ精製断片）並びにＥｃｏＲＩ及びＸｍｎＩ（３５０ｂｐ精製断片）で切断した。２３５０ｂｐ断片は、翻訳終結領域及びｌａｃＩｑ遺伝子をコードし、また３５０ｂｐ断片はｔａｃプロモータ、ＯｍｐＡシグナル配列、及びマルチクローニング部位をコードしている。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、図３）を、ＳｔｙＩで消化し、大豆ヌクレアーゼで処理して、平滑末端を生成し、次にＰｖｕＩＩで消化した（２３４８ｂｐ精製断片−この断片はテトラサイクリン耐性マーカー及びｐ１５Ａ複製起点をコードする）。この断片をアルカリホスファターゼで処理して、（自己連結を防止するために）５’末端のリン酸を除去し、他の精製断片と連結した。得られたプラスミドをｐＴＴＯ−１と名付けた。これを図４のマップに示す。図５はｐＴＴＯ−１の完全なＤＮＡ配列を示す。プラスミドｐＨＣ１３２由来のＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片であるヒトＩｇ軽鎖κ定常ドメインを挿入すると、ｐＴＴＯ−２が得られた（図６）。
【００７４】
Ｆａｂ’可変領域のｐＴＴＯ−２への挿入
Ｆａｂ’ＴＮＦα可変領域遺伝子は、国際出願ＧＢＯｌ／０２４７７号の配列番号８由来の配列を含む抗体全体を哺乳類細胞発現用ベクターからＰＣＲ増幅することによって生成した。ＯｍｐＡシグナル配列をコードし、ｐＴＴＯ−２中にフレームを合わせて挿入するためのＭｕｎＩ制限酵素部位を含むＤＮＡを、各遺伝子の５’末端に付加し、その生来のＩｇリーダーと置き換えた。
【００７５】
次に、精製されたＶＬ遺伝子（ＭｕｎＩ／ＳｐｌＩ）を、ｐＴＴＯ−２のＭｕｎＩ／ＳｐｌＩ部位に挿入して、軽鎖中間産物ｐＴＴＯ（ＴＮＦαＬ）を得た。
【００７６】
重鎖ＶＨ遺伝子を、中間ベクターｐＤＮＡｂＥｎｇ−Ｇ１（図７）によって、ＭｕｎＩ部位とＡｐａＩ部位の間に挿入し、ｐＤＮＡｂＥｎｇ（ＴＮＦαＨ）を得た。重鎖遺伝子を、ＥｃｏＲＩ断片として、このプラスミドからｐＴＴＯ（ＴＮＦαＬ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、大腸菌発現プラスミドｐＴＴＯ（ＴＮＦα）（図８）を得た。
【００７７】
ｐＴＴＯ（ＴＮＦα）のＩＧＳ変異体の構築
一連の４つの遺伝子間配列（ＩＧＳ）変異体を、ＴＮＦαＦａｂ’用の最適ＩＧＳの実験的決定が可能になるように設計した（図９）。ＩＧＳ１及びＩＧＳ２は、非常に短い遺伝子間配列（それぞれ、−１及び＋１）を有し、緊密に繋がって翻訳されることが予想され、それらのＳＤ配列（下線）がわずかに異なっている。これらの２つの配列が、高度の翻訳開始レベルをもたらす可能性が高い。ＩＧＳ３及びＩＧＳ４は、終結コドンと開始コドンの距離（＋１３）が長く、配列の構成が異なる。ＩＧＳ３のＳＤ配列は、ＩＧＳ１、２又は４のＳＤ配列より働きが強い。全配列を２次構造について（ｍ／ｆｏｌｄプログラム（Ｊａｅｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３：２８１−３０６（１９９０）；ｐａｒｔ  ｏｆ  ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用して）調べ、できるだけ「最適化」した。しかし、２つの鎖が翻訳上緊密にカップリングしているので、リボソームが解離しない。これは、ｍＲＮＡが「裸」でない可能性があり、２次構造の形成を妨げることを意味する。
【００７８】
ＩＧＳ変異体は、ｐＴＴＯ（ＴＮＦα）のＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化によって調製したベクター中に２つの断片を連結することによって構築した。ｐＤＮＡｂＥｎｇ（ＴＮＦα）のＭｕｎＩ−ＮｏｔＩ消化によって調製した挿入断片を精製し、各ＩＧＳカセット（ＳａｃＩ−ＭｕｎＩ）と一緒にベクター中に連結し、４つの発現プラスミドｐＴＴＯ（ＴＮＦα  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯ（ＴＮＦα  ＩＧＳ−２）、ｐＴＴＯ（ＴＮＦα  ＩＧＳ−３）及びｐＴＴＯ（ＴＮＦα  ＩＧＳ−４）を得た。
【００７９】
ＴＮＦαＩＧＳ変異体の振盪フラスコ発現分析
４つのＩＧＳ変異体ベクター及び元の発現ベクターＰＴＴＯ（ＴＮＦα）をそれぞれ使用して、大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した。次に形質転換された大腸菌を、Ｆａｂ’の発現について、上記に記載したように振盪フラスコで分析した。典型的実験結果を図１０に示す。
【００８０】
異なる遺伝子間配列は、異なる発現プロフィルをもたらした。ＩＧＳ１及びＩＧＳ２は、ペリプラズムＦａｂ’を迅速に蓄積し、誘導から１時間後がピークであり、その後、回復レベルが落ち込んだ。ＩＧＳ１については、ピークが大きくなるほど急激な落ち込みとなった。こうした結果は、これら構築物では翻訳カップリングが緊密であることから予想されるように、合成のレベルが高いことと整合していた。ＩＧＳ１は、明らかに、ＩＧＳ２よりも高いレベルの重鎖発現をもたらした。この場合、１時間後のピークの後に、ペリプラズム発現レベルが落ちるので、高レベルの発現に対する耐容性が不十分と思われる。これは、ＩＧＳ１培養物の増殖プロフィル（図示せず）で観察され、誘導から１時間後にピークに達した後落ち込み、細胞死及び溶菌が示唆された。
【００８１】
ＩＧＳ３はＦａｂ’をよりゆっくりと蓄積し、誘導２時間後に、高いピーク値（３２５ｎｇ／ｍｌ／ＯＤ）を有するピークを示した後、レベルが落ち込んだ。この培養物の増殖は、誘導の３時間後まで続き、より高い生物体量に達した（図示せず）。これは、重鎖の合成レベルがより低いことと整合する。
【００８２】
ＩＧＳ４は、物質をやはりよりゆっくりした速度で蓄積し、他の３つの構築物の示す高い生産性のピークに達することはなかった。
【００８３】
ＩＧＳ変異体は全て、オリジナルのｐＴＴＯ（ＴＮＦα）ベクターより著しい成績を収めた。異なるＩＧＳ配列は、異なる翻訳開始速度をもたらすという仮説が、これらの実験結果から裏付けられた。ＴＮＦαＦａｂ’については、高い重鎖の翻訳開始速度に対する耐容性が不十分であり、したがって最適ではないと思われる。ＩＧＳ３によってもたらされるようなより遅い速度では、より良好な増殖特性がもたらされ、その結果、時間がたつに連れ、より良い収率で蓄積される。
【００８４】
発酵槽（図示せず）での生産性を比較した後、ＩＧＳ３構築物が最高の収量であったのでこれを選択した。
【００８５】
異なるＦａｂ’抗体をコードするジシストロン性メッセージ：ｇ１６３Ｆａｂ’ＩＧＳ変異体の作成
上記に記載の１組のｐＴＴＯ／ＩＧＳベクターを使用して、もう１つのＦａｂ’の発現分析を行った。最初に、ヒト化Ｆａｂ’ｇ１６３を使用した。４通りの連結の仕方を使用して、Ｆａｂ’ｇ１６３の４つのＩＧＳ変異体（図１１）を生成した。ｇ１６３のＶＨ遺伝子（哺乳類発現ベクターｐγ−４からＰＣＲによって得た）のＭｕｎＩ−ＡｐａＩ断片をプラスミドｐＤＮＡｂＥｎｇＧＩに挿入して、重鎖の中間産物を生成した。この中間産物をＰｖｕＩＩとＮｏｔＩで切断し、ｇ１６３ＶＨ＋ＣＨ１断片を生成した。プラスミドｐＴＴＯ（ＴＮＦα）をＭｕｎＩとＮｏｔＩで切断し、大きな断片を精製してベクター断片を得た。ＰＣＲによって、哺乳類発現ベクターｐＭＲ１０．１（ｇｌ６３）からＭｕｎＩ−ＳｐｌＩ  ＶＬ断片を生成した。最後に、上記の４ｐＴＴＯ（ＴＮＦα）ＩＧＳ変異体のＳｐｌＩ−ＰｖｕＩＩ消化によって、Ｃκ−ＩＧＳ断片を生成した。次に、別々の４通りの連結を行い、構築物ｐＴＴＯ（ｇｌ６３  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯ（ｇ１６３  ＩＧＳ−２）、ｐＴＴＯ（ｇ１６３  ＩＧＳ−３）、及びｐＴＴＯ（ｇｌ６３  ＩＧＳ−４）を生成した。これら構築物の振盪フラスコ分析の結果を図１２に示す。
【００８６】
ＩＧＳ−１及び−２が迅速なＦａｂ’蓄積をもたらし、誘導の１時間後にピークとなり、その後急激に低下するという点で、この発現プロフィルは、Ｆａｂ’ＴＮＦαで見られる発現プロフィルと非常に類似していた。ＩＧＳ−３は、より遅い蓄積開始速度をもたらし、より遅い時間（誘導開始２から３時間後）にピークに達し、その後より遅い速度で低下する。ＩＧＳ−４構築物は、誘導の経過時間を通してゆっくり立ち上がり、この場合もやはり他の構築物の示す高い収率に達することはなかった。ＩＧＳ−１及び−２では、やはり誘導のわずか１時間後（図示せず）に、生物体量がピークに達することが発現プロフィル及び増殖プロフィルで示されるため、ＩＧＳ−３を選択し、発酵槽で高い収率（図示せず）まで発現させた。
【００８７】
プラスミドｐＴＴＯＤの構築
Ｆａｂ’のコード戦略を簡略化するために、プラスミドｐＴＴＯ−１からＰｖｕＩＩ（３部位）、ＥｃｏＲＶ（２部位）及びＡｐａＩ（１部位）に対するフレームワークの制限部位を取り除くことによって、プラスミドｐＴＴＯＤを得た。これらに変更を加える際、ｌａｃＩｑ遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子の蛋白コード配列を変えずに、遺伝情報を発現しない「サイレント」な変化をＤＮＡレベルで加えた。ＰＣＲ戦略を使用して、「サイレント」変化（これらの制限部位を除去した）を有するプライマーを設計し、これを使用して親プラスミド（ｐＴＴＯ−１）の一部分を増幅した。フランキング制限部位（未変更）を使用して、親プラスミド中の配列をこれらの修飾配列で置き換えた。プラスミドｐＴＴＯＤをこの多段階方法で作成した。ベクターｐＴＴＯ内の既存のｇ１６３Ｆａｂ’遺伝子を、遺伝子に隣接するユニークなＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位を使用してｐＴＴＯＤ中にトランスファーし、ｐＴＴＯＤ（ｇ１６３）ＩＧＳ変異体１から４を作成した。ｐＴＴＯＤ（ｇ１６３ＩＧＳ−３）の制限マップを図１３に示す。
【００８８】
ＩＧＳ変異体としての他のＦａｂ’の発現
ＴＮＦα及びｇ１６３の他に、さらにいくつかのＦａｂ’が、２個以上のＩＧＳ変異体として発現した。それには、ｇ１６５及びｇＡ３３と名付けられたＦａｂ’が含まれる。図１４は、振盪フラスコで比較されたｐＴＴＯＤ（ｇｌ６５）ＩＧＳ−１から−３を示す。ＴＮＦα及びｇ１６３とは対照的に、ＩＧＳ−２及びＩＧＳ−１は、ＩＧＳ−３より成績がよい。このＦａｂ’の発現は、たとえ迅速な速度でも、ホスト細胞による十分な耐容性があるようである。ＩＧＳ−２を発現する培養物は、誘導期間中（図示せず）ずっと増殖し続けた。図１５は、このＦａｂ’を有するＩＧＳ−１から４の発酵槽での比較を示し、これは、基本的に振盪フラスコで行われた観測を再現している。ＩＧＳ−２は、収率が最高の変異体であることが確認された。発酵槽中で、Ｆａｂ’ｇＡ３３、ｐＴＴＯＤ（ｇＡ３３）ＩＧＳ−２及び−３を比較すると、両者は同様の収率を示した（図１６）。したがって、最適の収率を得るためには、Ｆａｂ’が異なれば異なるＩＧＳ配列が必要となる。
【００８９】
振盪フラスコ対発酵槽分析
振盪フラスコでは、プロモータの脱抑制を、発現の迅速な誘導をもたらすＩＰＴＧによって行った。発酵槽における誘導方式は異なり、ラクトース（細菌によってアロラクトースに変換される）を使用して、より穏やかにプロモータのスイッチを入れる。こうした誘導の速度論が異なるにもかかわらず、振盪フラスコでは、発酵槽中で構築物がどのような対比を示すかの示唆を与えることが明らかになった（図１４及び１５参照）。
【００９０】
最適な収率を得るためには、Ｆａｂ’が異なれば異なるＩＧＳが必要になるという原理がはっきり証明されている。本明細書に記載した本システムの新規性は、高レベルのＦａｂ’の発現を達成する手段として、ジシストロン性メッセージの第２遺伝子の翻訳開始速度を最適にするために、ＩＧＳカセットを使用することにある。上記に記載したシステムでは、軽鎖の発現は変わらないままであり、重鎖の翻訳開始速度のみが最適化される。この戦略がなぜ成功したかについて、２つの可能な説があげられる。
【００９１】
（ｉ）もし十分な軽鎖が合成されて、重鎖が過剰になることを防ぐとしても、軽鎖の発現がＦａｂ’の全蓄積レベルに影響を与えることはほとんどない。過剰の軽鎖は通常何の問題もなく許容される。可溶性発現の効率を規定するのは重鎖の翻訳レベルである；あるいは
【００９２】
（ｉｉ）重鎖の最適化は、実際、軽鎖発現速度が一定になるように調節され、したがって、２つの鎖のレベルのバランスがとられる。可溶性発現の効率を規定するのは、重鎖の折りたたみ／分泌速度それ自体ではなく、２つの異種鎖の発現のバランスである。
【００９３】
上記に記載された実施例は単なる模範例にすぎず、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【図１】
2010207241.tif 000002
【図２】
2010207241.tif 000003
【図３】
2010207241.tif 000004
【図４】
2010207241.tif 000005
【図５−１】
2010207241.tif 000006
【図５−２】
2010207241.tif 000007
【図５−３】
2010207241.tif 000008
【図５−４】
2010207241.tif 000009
【図６】
2010207241.tif 000010
【図７】
2010207241.tif 000011
【図８】
2010207241.tif 000012
【図９】
2010207241.tif 000013
【図１０】
2010207241.tif 000014
【図１１】
2010207241.tif 000015
【図１２】
2010207241.tif 000016
【図１３】
2010207241.tif 000017
【図１４】
2010207241.tif 000018
【図１５】
2010207241.tif 000019
【図１６】
2010207241.tif 000020
【配列表】
2010207241000001.app