(57)【要約】【課題】本発明の課題は、新規な抗体のスクリーニング方法、それにより得られる抗体およびその抗体を有効成分とする医薬組成物を提供することにある。【解決手段】本発明によれば、末梢循環のB細胞を消失させずに、比較的低用量で、B細胞の機能を制御し、自己免疫疾患等を予防治療できる可能性のある新規な抗体のスクリーニング方法、それにより得られる抗体およびその抗体を有効成分とする医薬組成物が提供可能である。これは、B細胞特異的表面抗原に対する抗体であり、かつB細胞によるInterleukine-6産生を調節し、および/または、B細胞によるInterleukine-10産生を調節する作用を有する抗体をスクリーニングすることにより達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
B細胞特異的表面抗原に対する抗体のスクリーニング方法であり、i) B細胞特異的表面抗原に対する抗体をB細胞に添加する工程、ii) 次にB細胞によるInterleukine-6産生が変化したことを確認する工程、および/または、B細胞によるInterleukine-10産生が変化したことを確認する工程を有する、抗体のスクリーニング方法。
【請求項２】
B細胞特異的表面抗原が、CD22α、CD22β、CD19、CD20、CD79αおよびCD79βから選ばれるいずれか一つあるいは複数である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
B細胞特異的表面抗原が、CD22αおよび/またはCD22βである、請求項1または2記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
B細胞が、株化B細胞、げっ歯類末梢血由来細胞、げっ歯類リンパ節由来細胞、ヒト末梢血由来細胞、ヒトリンパ節由来細胞およびヒト扁桃腺由来細胞から選ばれる、請求項１から３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
B細胞によるInterleukine-6産生が、B細胞の活性化による誘導および/または増強である、請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
B細胞の活性化が、抗IgM抗体、抗IgM抗体ビーズ、抗IgG抗体、抗IgG抗体ビーズ、抗Ig抗体、抗Ig抗体ビーズ、Staphylococcus aureus CowanＩ株の菌体成分 、Lipopolysaccharide 、Pokeweed mitogen 、Epstein-Barr virus 、CpG oligodeoxynucleotidesおよびToll like receptor ligandから選ばれるいずれか一つあるいは複数による活性化である、請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ii)の工程が、B細胞によるInterleukine-6産生が抑制されるものであり、および/または、B細胞によるInterleukine-10産生が増強されるものである、請求項１から６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
B細胞によるInterleukine-6産生の抑制が、Interleukine-6を産生するB細胞のみを消失させ、および/または、Interleukine-6を産生するB細胞のみにInterleukine-6産生抑制を生じさせることである、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
Interleukine-6産生の変化が、5％以上100％以下抑制されたことである、請求項1から8のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
Interleukine-6産生の変化が、25％以上100％以下抑制されたことである、請求項1から8のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
Interleukine-6産生の変化が、40％以上100％以下抑制されたことである、請求項1から8のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
Interleukine-10産生の変化が、150％以上増強されたことである、請求項1から11のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項1記載の方法で得られた抗体を遺伝子組換えの手法により製造する、抗体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から13のいずれかに記載の方法により得られる抗体。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項14記載の抗体。
【請求項１６】
抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項14または15記載の抗体。
【請求項１７】
請求項14から16のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１８】
Interleukine-6および/またはInterleukine-10が関与する疾患並びにBリンパ腫から選ばれる疾患の治療および/または予防に用いられる請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
自己免疫疾患またはキャッスルマン病の予防および/または治療に用いられる請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
慢性関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスの予防および/または治療に用いられる請求項17に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、B細胞特異的表面抗原に対する抗体で、かつB細胞によるInterleukine（以下、「IL」と称することもある）-6産生を調節し、および/または、B細胞によるIL-10産生を調節する作用を有する抗体のスクリーニング方法およびそれにより得られる抗体、並びにその抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｂ細胞を標的とした抗体医薬が、非ホジキンリンパ腫及び関連するＢ細胞リンパ腫等の癌の治療に有効であることが認知されてきた。その中にはB細胞特異的表面抗原CD20またはCD22をターゲットとした抗CD20抗体又は抗CD22抗体があり、これらの抗体によりＢ細胞を選択的に枯渇させる方法が有効であることが報告されている。例えば、リツキサン(Rituxan)（登録商標）はＢ細胞の表面分子であるCD20抗原に特異的なキメラ・モノクローナル抗体であり（非特許文献1）、Ｂ細胞を選択的に長期間消失させる（非特許文献2）。既に、本抗体は非ホジキンリンパ腫の治療に用いられている（非特許文献3）。
【０００３】
最近、自己免疫疾患に対しても、これらの癌治療用のＢ細胞を標的とした抗体医薬が有効であることを示した臨床試験の結果が報告された。例えば、難治性の慢性関節リウマチ患者を対象とする臨床試験で、リツキサンとメトトレキサート併用群はメトトレキサート単独投与群を大きく上回る改善効果を示し、その効果は持続することが報告されている（非特許文献4）。一方抗CD22抗体製剤に関しては、エプラツズマブ（Epratuzumab）が原発性シェーグレン症候群に対して有効性を示す臨床試験の結果が報告されている（非特許文献5）。これらは、病因B細胞の消失により、そのIL-6産生が遮断されるため、自己免疫反応が沈静化することによる効果と考えられる。しかし、エプラツズマブの自己免疫反応鎮静化のメカニズムに関してはB細胞に抑制性シグナルを供与する可能性、即ちCD22のリン酸化誘導活性も検討されたが（非特許文献6）、作用メカニズムは未だ不明である。また、新規な抗CD22モノクローナル抗体による自己免疫疾患治療方法が報告されている（特許文献1および2）。
【０００４】
上記のように臨床試験の結果が示されてはいるが、これらの抗体医薬は、末梢を循環しているＢ細胞を長期にわたり消失させる。その結果、「生体防御機能の一翼を担っているＢ細胞」および「Interleukine-10等の産生により自己免疫を治癒の方向へ制御するＢ細胞」（非特許文献7および8）が供に長期間欠如することになり、感染症や癌などのリスクが高くなると同時に自然治癒力も低下する。
【０００５】
さらに、これら抗体医薬は非常に高価な治療法となるため、その薬剤費は使用の障害となる。例えば、リツキサンは慢性関節リウマチ患者を対象とする臨床試験では、1gを2回投与するという高投与量が使用されている（非特許文献4）。また、エプラツズマブも原発性シェーグレン症候群を対象とした臨床試験で、360 mg/m2を隔週で4回投与しており（非特許文献5）、同様に高投与量であり、患者の経済的負担となる。
【０００６】
以上を考慮すると、末梢循環のB細胞を完全に消失させずに、比較的低用量で病因Ｂ細胞の機能を制御することにより効果を発揮するＢ細胞を標的とした抗体医薬は理想的である。これは特に、病因B細胞のIL-6産生能を低下させ、および/または自然治癒に重要なIL-10産生を行うB細胞を誘導または維持させる抗体医薬によって達成されると考えられる。そのメカニズムとしては、異常な活性化状態にある当該病因B細胞においてB細胞の膜上に存在する抑制性受容体（CD22, Fc gamma RIIB(CD32), CD72, and paired immunoglobulin-like receptor (PIR)-B等）を介した抑制性シグナル（非特許文献9）を供与することによりB細胞を正常状態へ誘導することによると予想される。
【０００７】
しかし上述したように、B細胞特異的表面抗原と結合することにより、非選択的にB細胞を消失させるあるいは機能低下させる抗体はこれまでに報告されているが、自己免疫疾患の治療においてIL-6および/またはIL-10の産生量の調節を指標とした抗B細胞表面抗原抗体を用いること、IL-6および/またはIL-10の産生量の調節を指標として効果的な抗体をスクリーニングする方法については一切報告されていない。また、異常な活性化状態の病因B細胞に対して抑制性シグナルを供与することにより、自己免疫疾患を治療するアゴニスト抗体に関する報告も一切無く、抑制性シグナル伝達経路のある段階を指標にしたスクリーニングする方法についての報告もない。
【特許文献１】特表2005-526044号公報
【特許文献２】特表2005-526501号公報
【非特許文献１】Blood 83, 435-445 (1994)
【非特許文献２】Arthritis Rheum 54, 613-620 (2006)
【非特許文献３】Curr Opin Oncol 10, 548-551 (1998)
【非特許文献４】N Engl J Med 350, 2572-2581 (2004)
【非特許文献５】2005年米国リウマチ学会（演題番号 681, 学会抄録：S277頁）
【非特許文献６】Clin Cancer Res 9, 3982s-3990s, (2003)
【非特許文献７】J Exp Med 184, 2271-2278 (1996)
【非特許文献８】Nat Immunol 3, 944-950 (2002)
【非特許文献９】Current Opinion in Immunology 17, 290-297 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、B細胞特異的表面抗原に対する抗体であり、かつ、B細胞によるIL-6産生を調節し、および/または、B細胞によるIL-10産生を調節する作用を有する抗体のスクリーニング方法を提供すること、その抗体を提供すること、並びに、これにより得られた抗体を有効成分とする医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは自己免疫疾患等に有効であるB細胞を標的とした抗体を探索すべく研究を行った結果、IL-6産生調節作用および/またはIL-10産生調節作用を有する抗体が、末梢循環のＢ細胞を消失させずに、比較的低用量で、B細胞の機能を制御し、自己免疫疾患やB細胞リンパ腫の予防治療に有用であることを見出した。
【００１０】
即ち本発明の要旨は、以下の通りである。
(1)B細胞特異的表面抗原に対する抗体のスクリーニング方法であり、i) B細胞特異的表面抗原に対する抗体をB細胞に添加する工程、ii) 次にB細胞によるInterleukine-6産生が変化したことを確認する工程、および/または、B細胞によるInterleukine-10産生が変化したことを確認する工程を有する、抗体のスクリーニング方法。
(2)B細胞特異的表面抗原が、CD22α、CD22β、CD19、CD20、CD79αおよびCD79βから選ばれるいずれか一つあるいは複数である、(1)記載のスクリーニング方法。
(3)B細胞特異的表面抗原が、CD22αおよび/またはCD22βである、(1)または(2)記載のスクリーニング方法。
(4)B細胞が、株化B細胞、げっ歯類末梢血由来細胞、げっ歯類リンパ節由来細胞、ヒト末梢血由来細胞、ヒトリンパ節由来細胞およびヒト扁桃腺由来細胞から選ばれる、(1)から(3)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(5)B細胞によるInterleukine-6産生が、B細胞の活性化による誘導および/または増強である、(1)から(4)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(6)B細胞の活性化が、抗IgM抗体、抗IgM抗体ビーズ、抗IgG抗体、抗IgG抗体ビーズ、抗Ig抗体、抗Ig抗体ビーズ、Staphylococcus aureus CowanＩ株の菌体成分 、Lipopolysaccharide 、Pokeweed mitogen 、Epstein-Barr virus 、CpG oligodeoxynucleotidesおよびToll like receptor ligandから選ばれるいずれか一つあるいは複数による活性化である、(5)記載のスクリーニング方法。
(7)ii)の工程が、B細胞によるInterleukine-6産生が抑制されるものであり、および/または、B細胞によるInterleukine-10産生が増強されるものである、(1)から(6)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(8)B細胞によるInterleukine-6産生の抑制が、Interleukine-6を産生するB細胞のみを消失させ、および/または、Interleukine-6を産生するB細胞のみにInterleukine-6産生抑制を生じさせることである、(7)記載のスクリーニング方法。
(9)Interleukine-6産生の変化が、5％以上100％以下抑制されたことである、(1)から(8)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(10)Interleukine-6産生の変化が、25％以上100％以下抑制されたことである、(1)から(8)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(11)Interleukine-6産生の変化が、40％以上100％以下抑制されたことを確認することである、(1)から(8)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(12)Interleukine-10産生の変化が、150％以上増強されたことである、(1)から(11)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(13)(1)記載の方法で得られた抗体を遺伝子組換えの手法により製造する、抗体の製造方法。
(14)(1)から(13)のいずれかに記載の方法により得られる抗体。
(15)抗体がモノクローナル抗体である、(14)記載の抗体。
(16)抗体がヒトモノクローナル抗体である、(14)または(15)記載の抗体。
(17)(14)から(16)のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
(18)Interleukine-6および/またはInterleukine-10が関与する疾患並びにBリンパ腫から選ばれる疾患の治療および/または予防に用いられる(17)に記載の医薬組成物。
(19)自己免疫疾患またはキャッスルマン病の予防および/または治療に用いられる(17)に記載の医薬組成物。
(20)慢性関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスの予防および/または治療に用いられる(17)に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、末梢循環のB細胞を消失させずに、比較的低用量で、B細胞の機能を制御し、自己免疫疾患等を予防治療できる可能性のある新規な抗体のスクリーニング方法、それにより得られる抗体およびその抗体を有効成分とする医薬組成物が提供可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の一つの態様としては、B細胞特異的表面抗原に対する抗体のスクリーニング方法であり、かつ、B細胞によるIL-6産生を調節する目的を有し、および/または、B細胞によるIL-10産生を調節する作用を有する抗体のスクリーニング方法が挙げられる。
【００１４】
（１）抗体の取得
本発明で用いられるB細胞特異的表面抗原に対する抗体としては、B細胞特異的表面抗原に対する抗体として公知のものであれば使用することができる。好ましくは抗CD22α抗体、抗CD22β抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD79α抗体あるいは抗CD79β抗体が挙げられ、最も好ましいのは抗CD22α抗体あるいは抗CD22β抗体である。なお本発明においては、特に言及しない限り、抗CD22抗体とは抗CD22α抗体および抗CD22β抗体を意味し、CD22とはCD22αおよびCD22βを意味する。
【００１５】
B細胞特異的表面抗原に対する抗体は、市販品あるいは公知の手法により調製することができる。例えば、自己免疫疾患患者陽性血漿のみを集めて高力価製剤を調製する方法、B細胞特異的表面抗原蛋白質あるいはB細胞特異的表面抗原発現細胞で免疫した動物から抗血清を得る方法（Current Protocols In Immunology, Unit 2.4, （1991））、細胞融合法により得られた抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を培養してモノクローナル抗体を調製する方法（Current Protocols In Immunology, Unit 2.6-2.7, （1991））、ベクター免疫により抗体を調製する方法（Neurobiol Dis 14, 365-379(2003)）、遺伝子工学的手法により組換え抗体を調製する方法（Mol. Cells 20, 17-29 (2005)、J Immunother 29, 1-9 (2006)）などが例示される。
【００１６】
ここでB細胞特異的抗原蛋白質の入手方法は、例えば市販品を用いること、遺伝子組換え産物を用いることなどが挙げられる。B細胞特異的抗原発現細胞としては、本来B細胞特異的抗原を発現しているものや、細胞にB細胞特異的抗原発現プラスミドを導入することによりB細胞特異的抗原発現量を高めたものなどを用いることができる。
【００１７】
また、B細胞特異的抗原発現プラスミドは、適当な細胞から調製したcDNAやゲノムDNA、cDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリーなどからクローニングしたB細胞特異的抗原 cDNA、あるいは文献やデータベースなどの既知の配列情報から化学合成したDNAなどを材料に得られたB細胞特異的抗原cDNAを、適当な発現ベクターに挿入することにより構築することができる。その際B細胞特異的抗原cDNAは完全長のものでも、塩基を欠失したcDNA断片でも、あるいはマウスとヒトなどのキメラcDNAでもよい。
【００１８】
本発明の抗体はB細胞特異的抗原と結合する限り特に制限はなく、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体等を適宜用いることができるが、ヒトに対する異種抗原性を低下させるためにキメラ型抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などが好ましい。また、本発明の抗体はB細胞特異的抗原に対する結合能を有していれば全長抗体あるいは抗体断片のどちらでもよい。抗体断片の具体例としてFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFvなどを挙げることができる。また、本発明の抗体はポリエチレングリコール、放射性物質、トキシン等の各種分子と公知の方法に従って結合されたコンジュゲート抗体でもよい。
【００１９】
（２）B細胞の種類
本発明で用いられるB細胞は、株化B細胞でも初代培養B細胞でもよい。株化B細胞としては、IL-6産生能および/またはIL-10産生能を有する公知の細胞株であればよく、好ましくはRamos（ATCC NO. CRL-1596）、Ramos.2G6.4C10（ATCC NO. CRL-1923）、RPMI1788(ATCC NO. CCL-156) 、Raji（ATCC NO. CCL-86）が用いられる。初代培養B細胞としては、げっ歯類末梢血由来、げっ歯類リンパ節由来、ヒト末梢血由来、ヒトリンパ節あるいはヒト扁桃腺由来のB細胞が用いられる。最も好ましいのは、ヒト末梢血由来B細胞である。なお、IL-6あるいはIL-10産生細胞であるか否かは、後述の実施例で示すとおりEnzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）法などにより調べられる。
【００２０】
（３）IL-6
本発明におけるIL-6とは、慢性関節リウマチ（RA）等の自己免疫疾患、多発性骨髄腫で異常発現しており、これら病態における原因物質の一つである（Eur J Immunol 18, 1797-1801 (1988)）。
【００２１】
IL-6産生量の測定方法としては、後述の実施例で示すようなELISAを用いた方法がある。その他、Flow Cytometerを用いたCytometric Bead Array Kit（BD Pharmingen）による方法、マウスB細胞ハイブリドーマ株、B9細胞を用いたBioassayによる方法（Current Protocols In Immunology, Unit 6.6.1-6.6.4, (1991)）などによりIL-6産生量を測定することができる。
【００２２】
（４）IL-10
本発明におけるIL-10とは、Th1細胞からのサイトカイン産生を抑制する因子として同定されたもので（J Exp Med 170, 2081-2095 (1989)）、多発性硬化症（MS）やRA等の自己免疫疾患に対して予防治療効果があることが知られている物質のことである（Eur J Immunol 23, 1745-1751 (1993)、J Immunol 164, 1576-1581 (2000)）。
【００２３】
IL-10の測定方法としては、上記IL-6の産生方法と同様にFlow Cytometerを用いたCytometric Bead Array Kit（BD Pharmingen）による方法で実施できる。
【００２４】
（５）IL-6産生の変化
本発明において、IL-6の産生の変化とは、IL-6の産生抑制およびIL-6の産生誘導および/または増強のいずれも含まれる。IL-6の産生とは、B細胞の活性化による誘導・増強を特に意味し、それは抗IgM抗体、抗IgM抗体ビーズ、抗IgG抗体、抗IgG抗体ビーズ、抗Ig抗体、抗Ig抗体ビーズ、Staphylococcus aureus CowanＩ株の菌体成分 (SAC)、Lipopolysaccharide (LPS)、Pokeweed mitogen (PWM)、Epstein-Barr virus (EBV)等のウイルス、Ion channels activator (A23187 ionophore, Ionomycin等)、Protein kinase C activator (Phorbol esters等) 、B細胞表面分子に対する抗体（抗CD20抗体、抗CD４0抗体等）、B細胞表面分子に対するリガンド（CD４0L等）を発現した細胞、CpG oligodeoxynucleotides、Toll like receptor ligand、各種リンフォカイン（IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, TGF-β,等）、8-Mercaptoguanosine (8-MG)、Dextran Sulfate、 Poly (IC)、Indolactamなどによってなされうる。これらはいずれも市販品を用いることができる。
【００２５】
好ましくは、B細胞の活性化が、抗IgM抗体、抗IgM抗体ビーズ、抗IgG抗体、抗IgG抗体ビーズ、抗Ig抗体、抗Ig抗体ビーズ、 SAC、LPS、PWM、EBV等のウイルス、Ion channels activator (A23187 ionophore, Ionomycin等)、Protein kinase C activator (Phorbol esters等) 、CpG oligodeoxynucleotidesおよび/またはToll like receptor ligand等によってなされうることを意味する。
【００２６】
最も好ましくは、B細胞の活性化が、抗IgM抗体、抗IgM抗体ビーズ、抗IgG抗体、抗IgG抗体ビーズ、抗Ig抗体、抗Ig抗体ビーズ、SAC、LPS、PWM、EBV等のウイルス、CpG oligodeoxynucleotidesおよびまたはToll like receptor ligand等によってなされうることを意味する。
【００２７】
抗IgM抗体としてはヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、ブタ、サル、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットの抗ヒトIgMポリクローナル抗体が用いられ、あるいはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはサルの抗ヒトIgMモノクローナル抗体が用いられる。抗IgM抗体として最も好ましくは、マウス抗ヒトIgM F(ab’)2が用いられる。CpG oligodeoxynucleotidesは細菌由来のDNAに高頻度に認められる配列であり、Toll Like Receptor 9を介したB cell receptorからの刺激を増幅することにより（J Exp Med 195, 1507-1512 (2002)）、IL-6産生を誘導および/または増強するものである。
【００２８】
B細胞を活性化する方法は、上記刺激剤の濃度や細胞数に応じて適した手段が選択されるが、例えば刺激剤を含んだ溶液をB細胞培養液中へ添加する方法等で行うことができる。
【００２９】
本発明においては、B細胞特異的表面抗原に対する抗体により、B細胞によるIL-6産生が抑制されることが好ましく、特に、IL-6を産生するB細胞のみにIL-6産生抑制が生じること、またはIL-6を産生するB細胞のみを消失させることによりIL-6産生が抑制されることが好ましい。IL-6産生の抑制は、B細胞からのIL-6分泌量を抑制することによって実現される。これには、IL-6遺伝子の転写活性抑制、IL-6蛋白質合成量抑制、IL-6蛋白質の細胞からの分泌抑制などがある。IL-6を産生するB細胞のみを消失させることについては、IL-6を産生するB細胞がネクローシスあるいはアポトーシスにより消失することなどによって実現される。
【００３０】
ネクローシスとは、外因性（抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）、補体、毒素、無酸素状態など）により起こる壊死のことで、細胞の膨化、自己融解により膜の変化が最初に見られる。
【００３１】
アポトーシスとは、もともと遺伝子に書き込まれている自己破壊プログラムにより誘導される細胞死の形態のことで、核DNAの分解、核の変性と凝縮、細胞の残骸の貪食などが特長である。
【００３２】
ネクローシスあるいはアポトーシスは、Annexin V, Biotin Apoptosis Detection Kit（R&D Systems，Inc.）等を用いて、アポトーシスの初期過程で見られるphosphatidyl serineの細胞膜内での分布の変化を蛍光またはビオチン標識した Annexin Vでアポトーシスを起こした細胞を染色後、ネクローシスを起こした細胞を赤色蛍光に染色するDNA蛍光染色剤Propidium Iodideで染色し、それぞれの細胞をFlow Cytometerで解析することにより検出することができる。
【００３３】
本発明においては、B細胞特異的表面抗原に対する抗体をB細胞に添加する前のIL-6産生量が、当該抗体を添加した後に5％以上100％以下阻害されることが望ましい。これはすなわち、当該抗体を添加前のB細胞によるIL-6産生量を100％とした場合に、その生産量が当該抗体添加後には95％から0％まで減少することを意味する。望ましくは、当該抗体をB細胞に添加する前のIL-6産生量が、当該抗体を添加した後に25％以上100％以下阻害されることが望ましい。これはすなわち、当該抗体を添加前のB細胞によるIL-6産生量を100％とした場合に、その生産量が当該抗体添加後には75％から0％まで減少することを意味する。さらに望ましくは、当該抗体をB細胞に添加する前のIL-6産生量が、当該抗体を添加した後に40％以上100％以下阻害されることが望ましい。これはすなわち、当該抗体を添加前のB細胞によるIL-6産生量を100％とした場合に、その生産量が当該抗体添加後には60％から0％まで減少することを意味する。
【００３４】
（６）IL-10産生の変化
本発明において、IL-10の産生の変化とは、IL-10の産生抑制およびIL-10の産生誘導および/または増強のいずれも含まれる。
【００３５】
本発明においては、B細胞特異的表面抗原に対する抗体により、B細胞によるIL-10産生が誘導および/または増強することが好ましい。IL-10産生の誘導および/または増強は、B細胞からのIL-10分泌量を誘導および/または増強することによって実現される。これには、IL-10遺伝子の転写活性誘導および/または増強、IL-10蛋白質合成量誘導および/または増強、IL-10蛋白質の細胞からの分泌増強などがある。
【００３６】
本発明においては、B細胞特異的表面抗原に対する抗体をB細胞に添加する前のIL-10産生量が、当該抗体を添加した後に1.5倍以上増強されることが望ましい。IL-10産生量の増強は多ければ多いほどよく、例えば当該抗体添加前のB細胞によるIL-10産生量の2倍、10倍、50倍、あるいは100倍増強するものであっても良い。
【００３７】
なお、「B細胞によるIL-6産生が変化したことを確認する工程、および/または、B細胞によるIL-10産生が変化したことを確認する工程を有する」とは、B細胞によるIL-6産生が変化したことを確認する工程、B細胞によるIL-10産生が変化したことを確認する工程、若しくは、B細胞によるIL-6産生が変化したことを確認する工程かつIL-10産生が変化したことを確認する工程も有することを意味する。好ましくは、B細胞によるIL-6産生を抑制することを確認する工程、B細胞によるIL-10産生を誘導および/または増強することを確認する工程を有すること、若しくはB細胞によるIL-6産生を抑制し、かつ、IL-10産生を誘導および/または増強することを確認する工程を有することを意味する。最も好ましくは、B細胞によるIL-6産生を抑制し、かつ、IL-10産生を誘導および/または増強することを確認する工程を有することを意味する。
【００３８】
（７）確認方法
IL-6産生あるいはIL-10産生が変化したことを確認するためには、それぞれの遺伝子の転写活性の変化を確認する方法、それぞれの蛋白質合成量の変化を確認する方法、それぞれの蛋白質が細胞から分泌された量の変化を確認する方法などが挙げられる。
【００３９】
転写活性の変化を確認する方法としては、例えば、常法に従ったレポータージーンアッセイによる確認方法が挙げられる。具体的には、IL-6遺伝子あるいはIL-10遺伝子のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼなどの適切なレポーター因子を接続したベクターを作成し、それをB細胞に導入してルシフェラーゼ活性を測定する方法である。
【００４０】
蛋白質合成量の変化を確認する方法としては、B細胞をホモジナイズし、その中に含まれるIL-6あるいはIL-10の量をEnzyme linked immunosorbent assay (ELISA)により測定する方法である。
【００４１】
蛋白質が細胞から分泌された量の変化を確認する方法としては、B細胞の培養上清を採取し、その中に含まれるIL-6あるいはIL-10の量をELISAにより測定する方法である。ELISAにより測定する具体的な方法としては、例えば実施例10に示すような方法がある。
【００４２】
（８）スクリーニング方法
本発明において目的の抗体をスクリーニングする方法は、例えば、下記のように実現される。即ち、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）に各種のヒトB細胞特異的抗体を加え、更に適当量のanti-human IgM F(ab’)2を添加し、CO2インキュベーターで37℃、48時間培養を行い、その上清中のIL-6産生量とIL-10産生量を測定する。
【００４３】
このようにしてIL-6濃度および/またはIL-10濃度を測定した結果、IL-6産生が調節されている、および/またはIL-10産生が調節されている場合には、本発明の抗体であると判定する。
【００４４】
本発明によるスクリーニングにより選抜された抗体は、IL-6および/またはIL-10が関与する疾患並びにB細胞リンパ腫から選ばれる疾患の治療および/または予防作用を有し、自己免疫疾患あるいはB細胞リンパ腫等の予防および/または治療に有効である。なお、自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ（RA）、多発性硬化症（MS）、全身性エリテマトーデス（SLE）等が挙げられる。
【００４５】
（９）抗体の製造方法
本発明においては、一旦抗体がスクリーニングによって選択された後は、その抗体は通常の方法によって製造することが可能である。すなわち、その抗体を産生するハイブリドーマの培養による抗体の産生、遺伝子工学的手法により組換え抗体を産生する等の方法である。具体的には、組換えベクターに、本発明のスクリーニング方法によって選択された抗体の塩基配列を有するcDNAの全部または一部を挿入し、その組換えベクターを導入した形質転換体を作成して、目的の抗体を産生させる方法である。
【００４６】
本発明において抗体の製造に使用される組換えベクターとは、大腸菌のような原核細胞において発現可能なベクター（例えばpBR322、pUC119またはこれらの派生物）であっても良いが、真核生物において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能はベクターとしては、例えば実施例記載のようなプラスミドベクター、あるいはpcDNA3.1(Invitrogen社)、pDON-AI DNA（宝バイオ社）などが挙げられる。
【００４７】
本発明において抗体の製造に使用される形質転換体としては、大腸菌のような原核細胞であってもよいが、真核細胞が好ましく、哺乳動物由来の細胞がより好ましい。哺乳動物由来の細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）などが挙げられる。
【００４８】
（１０）抗体の種類
本発明においてスクリーニングにより選抜され、製造された抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも含まれる。好ましくはモノクローナル抗体であり、さらに好ましくはヒトモノクローナル抗体である。
【００４９】
（１１）医薬組成物
本発明に係る方法によって得られる抗体を予防および/または治療剤として用いる場合には、公知の方法に従って製剤化し、投与する医薬組成物とすることができる。例えば、そのまま液剤としてまたは適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳類に対して経口的または非経口的に投与することができる。本発明に係る方法によって得られる抗体のヒトに対する投与量は、0.01mg/kg〜50mg/kgが挙げられる。
【００５０】
なお、投与量は年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与期間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者に治療を行っている際の病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、IL-6および/またはIL-10が関与する疾患並びにB細胞リンパ腫から選ばれる疾患に有効な抗体を効果的に選択するスクリーニング方法を提供することができる。またその方法によって選択された抗体を用いて、有効なIL-6および/またはIL-10が関与する疾患並びにB細胞リンパ腫から選ばれる疾患の治療および/または予防薬を提供することができる。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、その要旨を超えない限り以下に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１：組換えマウスCD22高発現細胞の作製
マウスCD22発現細胞を遺伝子工学的手法で以下のように調製した。まず、マウスB リンパ腫細胞株WEHI231細胞（ATCC NO. CRL-1702）からQuick Prep Micro mRNA Purification Kit（アマーシャムファルマシアバイオテク製）を用いてmRNAを抽出した。RNA PCR Kit(AMV) Ver.2.1（タカラバイオ製）を用い、キットに付属のRandom 9 mersを用いてRT-PCRを行った。その後、マウスCD22配列特異的プライマー（配列表の配列番号1および2）とPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ製）を用いてPCR反応を行い、増幅された約2.8kbの断片を分離後、DNAシークエンサー（アマシャムファルマシア社）を用いて蛍光標識プライマーによるダイデオキシ法で塩基配列を決定した（配列表の配列番号3および4）。この断片をマウスCD22 cDNAとしてTOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン製）のpCR2.1-TOPOにクローニングし、pNT48と命名した。さらに当該マウスCD22 cDNA断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、pCD22/mouseを構築した。Lipofectamine2000（インビトロジェン製）を用いてpCD22/mouseをチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1細胞にトランスフェクションし、形質転換体を取得した。マウスCD22高発現細胞をCell ELISA法により選択し（Current Protocols In Immunology Unit 2.1）、限外希釈によりリクローニングを行い、最も安定に高発現する株をrCD22-CHO#34と命名した。
【００５４】
実施例2：抗マウスCD22抗体の作製
初回免疫は、組換えマウスCD22高発現細胞（rCD22-CHO#34）とアジュバント ( FCA ) を1：1で混合した懸濁液を調製し、アルメニアハムスターの皮下に1×107 cells/匹になるように投与した。2回目以降は抗原を生理食塩水で希釈して、数回免疫した。抗体価測定後、抗体価の上昇した個体に対してrCD22-CHO#34の腹腔内投与によりブースターを行った。アルメニアハムスター脾細胞を採取してマウスミエローマ細胞株P3U1細胞とポリエチレングリコール（PEG）法（Kohler G, Milstein C.   Nature 256: 495-497, 1975）にて細胞融合させた。融合後HAT選択を行った細胞の培養上清を用いてスクリーニングを行い、抗マウスCD22モノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を選択した（Current Protocols In Immunology Unit 2.5）。最終的に、マウスCD22と特異的に反応する７種類（サブクローンとして18株）の抗マウスCD22モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。当該ハイブリドーマを培養して得られた培養上清から通常の精製手法により各種抗マウスCD22モノクローナル抗体を調製した。
【００５５】
実施例3：組換えヒトCD22高発現細胞の作製
ヒトCD22発現細胞を遺伝子工学的手法で以下のように作製した。まず、市販ヒトリンパ腫細胞由来cDNAライブラリー（インビトロジェン製）からヒトCD22配列特異的プライマー（配列表の配列番号5および6）とPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ製）を用いてPCR反応を行い、増幅された約2.6kbの断片を分離後、DNAシークエンサー（アマシャムファルマシア社またはアプライドバイオシステム社）を用いて蛍光標識プライマーによるダイデオキシ法またはダイターミネーター法で塩基配列を決定し、既知のヒトCD22配列であることを確認した（配列表の配列番号7および8）。この断片をヒトCD22としてZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン製）のpCR-BluntII-TOPOにクローニングし、pNT62と命名した。さらに当該ヒトCD22 cDNAを動物細胞発現ベクターpcDNA3.1Zeo(+)（インビトロジェン製）に挿入し、pTM025を構築した。Lipofectamine2000（インビトロジェン製）を用いてpTM025をマウスミエローマ細胞株NS0細胞にトランスフェクションし、10%FBSと250μg/mLゼオシンを含有したDMEM培地を選択培地として形質転換体を取得した。実施例1と同様にしてヒトCD22高発現細胞を選択し、限外希釈によりリクローニングを行い、最も安定に高発現する株をG11-14と命名した。このクローンが発現するヒトCD22は、完全ヒト型である（図1(1)）。
【００５６】
次に、マウスCD22のドメイン1および2（J Immunol. 149: 2641-2649, 1992）とヒトCD22のドメイン3から7（J Exp Med. 173:137-146, 1991）を結合した第１のマウス・ヒト-ハイブリッドCD22発現細胞を以下のように作製した。配列表の配列番号9に示したプライマーと5’側にリン酸基を付けた配列表の配列番号10に示したプライマーを用いてマウスCD22をもつプラスミドpNT48を鋳型としてPCR反応を行い、マウスCD22のドメイン1および2を含むDNA断片を取得し、HindIIIで消化した。また、配列表の配列番号11と配列表の配列番号12に示したプライマーを用いてpTM025を鋳型としてPCR反応を行い、ヒトCD22のドメイン3から7を含むDNA断片を取得し、PstIで消化した。これら2つの断片とpcDNA3.1Zeo(+)（インビトロジェン製）をHindIIIとPstIで消化して得られたベクター断片とを組み合わせて、マウスCD22のドメイン1および2とヒトCD22のドメイン3から7を結合した第１のマウス・ヒト-ハイブリッドCD22発現プラスミドpTM029を構築した。次にLipofectamine2000（インビトロジェン製）を用いてpTM029をマウスミエローマ細胞株NS0細胞にトランスフェクションして形質転換体を取得した。目的の第１のマウス・ヒト-ハイブリッドCD22高発現細胞を実施例１と同様にして選択し、限外希釈によりリクローニングを行い、最も安定に高発現する株を2株得てそれぞれ34-1/30およびB4-152と命名した。このクローン発現するCD22は、マウス型のドメイン1および2とヒト型のドメイン3から7のハイブリッド型である（図1(2)）。
【００５７】
さらに、マウスCD22のドメイン1および2とヒトCD22のドメイン5から7を結合した第２のマウス・ヒト-ハイブリッドCD22発現細胞を以下のように作製した。配列表の配列番号9に示したプライマーと5’側にリン酸基を付けた配列表の配列番号10に示したプライマーを用いてPCR反応を行い、マウスCD22のドメイン1および2を含むDNA断片を取得し、HindIIIで消化した。また、配列表の配列番号13と配列表の配列番号14に示したプライマーを用いてPCR反応を行い、ヒトCD22のドメイン5から7を含むDNA断片を取得し、PstIで消化した。これらの断片とpcDNA3.1Zeo(+)（インビトロジェン製）をHindIIIとPstIで消化して得られたベクター断片とを組み合わせて、マウスCD22のドメイン1および2とヒトCD22のドメイン5から7を結合した第2のマウス・ヒト-ハイブリッドCD22発現プラスミドpTM027を構築した。次にLipofectamine2000（インビトロジェン製）を用いてpTM027をマウスミエローマ細胞株NS0細胞にトランスフェクションして形質転換体を取得した。目的の第２のマウス・ヒト-ハイブリッドCD22高発現細胞を実施例１と同様にして選択し、限外希釈によりリクローニングを行い、最も安定に高発現する株をB9-4と命名した。このクローン発現するCD22は、マウス型のドメイン1および2とヒト型のドメイン5から7のハイブリッド型である（図1(3)）。
【００５８】
実施例4：抗ヒトCD22抗体の作製
組換えヒトCD22高発現細胞G11-14は生理的食塩水で1×107 cells/100μLに懸濁し、FcgRIIb欠損 BALB/cマウス（5週齢、雌）（Nature. 379:346-349 1996）の皮下に4回免疫した。また組換えヒトCD22高発現細胞34-1/30およびB9-4は、マイトマイシンC処理（150μg/mL, 37℃で60分間）後に生食で1×107 cells/100μLに懸濁し、FcgRIIb欠損 BALB/cマウス（5週齢、雌）の皮下にそれぞれ11回あるいは15回免疫した。免疫されたマウスについて抗体価測定後、抗体価の上昇した個体に対し、ヒトCD22高発現細胞（G11-14、34-1/30、B9-4）をそれぞれ腹腔内投与によりブースターを行った。マウス脾細胞を採取してマウスミエローマ細胞株X63・Ag8細胞またはP3U1細胞とPEG法（Nature 256: 495-497, 1975）にて細胞融合させた。実施例2と同様に融合後HAT選択を行った細胞の培養上清を用いてスクリーニングを行い、抗ヒトCD22または抗ヒト−マウスハイブリッド型モノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を選択した。以降これらをまとめて「抗ヒトCD22モノクローナル抗体」という。最終的に、ヒトCD22と特異的に反応する126種類の抗ヒトCD22モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。当該ハイブリドーマを培養して得られた培養上清から通常の精製手法（Current Protocols In Immunology Unit 2.6-2.7）により各種抗ヒトCD22モノクローナル抗体を調製した。
【００５９】
実施例5：マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの局所リンパ節細胞を用いたIL-6産生抑制活性およびIL-10産生誘導活性を指標とした抗マウスCD22抗体のスクリーニング系
(1) マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの構築
多発性硬化症（MS）の疾患モデルとして、マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルが使用されているので、報告に従って本モデルを作製し実験に供した（Nature 317: 355-358, 1985）。すなわち、PL/J X SJL/J F1マウス（The Jackson Laboratory、10週齢、雌）に、マウスのミエリン塩基性蛋白質（MBP）の1番目から11番目までのアミノ酸から成るMBP Ac1-11ペプタイド（ペプチド研究所）とAdjuvant complete H37RA（Difco）の懸濁液を皮下に１回免疫し、day0とday2にpertussis toxin(200ng)（List Pharmaceuticals）を静注してEAEを誘発した。
【００６０】
(2) 投与方法
当該EAEモデル動物に抗マウスCD22抗体A、BまたはCを、投与量0.2〜200μg/headで免疫日から１日１回、５日間、尾静脈より投与した（N=4）。上記抗体は生理的食塩水で希釈して使用した。
【００６１】
(3) 細胞調製方法
IL-6の測定：免疫開始10日目に各群の局所リンパ節を採取し、細胞懸濁液を調整した（N=4）。各群のリンパ節細胞(5×106cells/mL)に抗原 (MBP Ac1-11、30 μg/mL)を添加し、刺激開始48時間後の培養上清中のIL-6をELISA法（Mouse IL-6 BD OptEIA ELISA set, BD）により測定した。
【００６２】
IL-10の測定：免疫開始10日目に各群の局所リンパ節を採取し、細胞懸濁液を調整した（N=4）。各群のリンパ節細胞(5×106cells/mL)に、Anti-Mu (10μg/mL) + Anti-CD40 (1μg/mL)を添加し、選択的にB細胞を刺激した。刺激開始48時間後の培養上清中のIL-10をELISA法（Mouse IL-10 BD OptEIA ELISA set, BD）により測定した。
【００６３】
(4) 結果
抗原刺激により局所リンパ節細胞から産生されるIL-6産生は、抗マウスCD22抗体A、BまたはCにより用量依存性に強力に抑制された（図2）。一方、局所リンパ節細胞からのIL-10産生は、抗マウスCD22抗体Bにより用量依存性に数倍増強された（図3(2)）。以上より、本スクリーニング系を用いることにより、IL-6産生抑制活性を示す抗マウスCD22抗体、IL-10産生誘導活性を示す抗マウスCD22抗体が選別できることが判明した。
【００６４】
実施例6：マウスEAEモデルに対する抗マウスCD22抗体の効果
実施例5に示したIL-6産生抑制能を有する抗マウスCD22抗体Aおよび、IL-6産生抑制能とIL-10産生誘導能の両方を有する抗マウスCD22抗体BのそれぞれをEAEモデルマウスに投与し、その治療効果を生存率を指標として検討した。
【００６５】
(1) マウスEAEモデルの構築
実施例5と同様にしてEAE発症マウスを構築した。
【００６６】
(2) 投与方法
当該EAEモデル動物に、実施例5に示した抗マウスCD22抗体AあるいはBを、投与量2〜200μg/headで免疫日から1日1回、5日間、尾静脈より投与した（N=10）。上記抗体は生理的食塩水で希釈して使用した。
【００６７】
(3) 結果
結果を図4に示す。同程度に強力なIL-6産生抑制作用を発揮する両抗マウスCD22抗体AおよびBとも、EAEに対して同程度の効果を発揮した。抗マウスCD22抗体投与によるEAEに対する効果の持続性はコントロール群に対して有意であった。IL-6産生抑制作用とIL-10産生誘導作用の両機能を有する抗マウスCD22抗体B（図4(2)）は、IL-6産生抑制作用のみを有する抗マウスCD22抗体A(図4(1))に比べ、より低用量からEAEに対して有意な効果を発揮することが示された。
【００６８】
実施例7：マウスEAEモデルにおける抗マウスCD22抗体のリンパ球サブセットに及ぼす影響
抗マウスCD22抗体がB細胞を消失して効果を発揮しているか否か検討する目的で、抗CD22抗体のリンパ球サブセットに及ぼす影響を調べた。
【００６９】
(1) マウスEAEモデルの構築
実施例5と同様にしてEAE発症マウスを構築した。
【００７０】
(2) 投与方法
当該EAEモデル動物に、実施例5で示したIL-6産生抑制作用を有する抗マウスCD22抗体Cを、投与量200μg/headで1日1回、5日間尾静脈より投与した（N=4）。上記抗体は生理的食塩水に希釈して使用した。
【００７１】
(3) フローサイトメトリー解析
免疫10日目に各群の局所リンパ節細胞の懸濁液を調製し、B細胞マーカー検出用としてphycoerythrin (PE) 標識ラット抗マウスB220モノクローナル抗体（BD Pharmingen）を、T細胞マーカー検出用としてfluorescein-isothiocyanate （FITC）標識ラット抗マウスCD3モノクローナル抗体（BD Pharmingen）を使用し、30分間、4℃で染色した。洗浄後、各群のリンパ球サブセットについてFACS Calibur (Becton Dickinson)を使用して解析した。 
【００７２】
なお、フローサイトメトリー解析への死細胞の影響を除くために、propidium iodide (2 mg/ml; Sigma) で死細胞を染色し、propidium iodide陽性細胞を除外して解析した。
【００７３】
(4) 結果
フローサイトメトリー解析の結果を表１に示す。本発明でスクリーニングされたCD22抗体はB細胞の生存に大きな影響を及ぼさないことが判明した。従って、生体防御に重要なB細胞を消失させず、重篤な感染症は誘発しないと期待される。
【００７４】
表1
【００７５】
【表１】
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【００７６】
実施例8：自然発症マウス全身性エリテマトーデス（SLE）モデルに対する抗マウスCD22抗体の効果
実施例5に示したIL-6産生抑制能を有する抗マウスCD22抗体CをSLEモデルマウスに投与し、その治療効果を尿潜血スコアを指標として検討した。
【００７７】
(1) 自然発症型マウスSLEモデル
SLE様の病態を自然に発症するNZW X BXSB F1マウス（日本エスエルシー）を用いた。既に病態が進行し始めている8週齢まで飼育し、実験に供した。このSLE様病態は、ヒトSLEと同様に病的なB1細胞に起因しているといわれる（Autoimmunity 15, 99-105 (1993)）。
【００７８】
(2) 尿潜血（occult blood）スコア
2週毎に新鮮尿を採取し、エームス尿検査試験紙(ヘマコンビスティクス, Bayer)を用いて潜血を検査し尿潜血（occult blood）スコアを求めた。
【００７９】
(3) 投与方法
当該SLEモデル動物に、実施例5で示したIL-6産生抑制作用を有する抗マウスCD22抗体Cを、投与量200μg/headで8週齢時に1日1回、5日間だけ尾静脈より投与した（N=10）。上記抗体は生理的食塩水に希釈して使用した。
【００８０】
(4) 結果
抗マウスCD22抗体投与後のSLE様病態の進行度を図5に示す。抗マウスCD22抗体投与群は早期より発症するループス腎炎の進行をコントロール群に対して有意に抑制した。この抑制効果は、投与終了後3ヶ月以上持続した。
【００８１】
実施例9：マウスII型コラーゲン誘発関節炎（CIA）モデルに対する抗マウスCD22抗体の効果
実施例5に示した、IL-6産生抑制能およびIL-10産生誘導能を有する抗マウスCD22抗体BをCIAモデルマウスに投与し、その治療効果を関節炎スコアを指標として検討した。
【００８２】
(1) マウスII型コラーゲン誘発関節炎（CIA）モデルの構築
慢性関節リウマチ（RA）の動物モデルであるCIAモデルの確立は、ヒト慢性関節リウマチと同様にB細胞の過剰な活性化と自己抗体産生が見られるFcgRIIb欠損マウスを用いて行った（J Exp Med. 146:857-868（1977））。具体的には、FcgRIIb欠損 C57BL/6マウス（10週齢、雌）にウシII型コラーゲン（コラーゲン技術研修会）とAdjuvant complete H37RA（Difco）の懸濁液を皮下に１回免疫し、CIAを誘発した。
【００８３】
(2) 関節炎スコア
下記の判定基準に基づき、四肢毎に重症度を判定し0〜4点のスコアをつけた。各マウスの関節炎スコアは、四肢のスコアの合計 (最大：16点)とした（Int Arch Allergy Appl Immunol. 35:456-467 (1969)）。
【００８４】
判定基準： 0点：症状なし、1点：四肢の指など小関節が1本のみ腫脹発赤、2点：小関節2本以上、あるいは手首や足首など比較的大きな関節が腫脹発赤、3点：1本の手や足全体が発赤腫脹、4点：さらに1本の手や足の全体的な腫脹が最大限に到達
（3）抗体投与方法
CIAモデル動物に、実施例5で示した抗マウスCD22抗体Bあるいは抗マウスIL-6Receptor(IL-6R)抗体（Clone D7715A7，BD Pharmingen）を、投与量200μg/headで免疫日（day0）から1日1回、5日間、腹腔内投与した（N=10）。上記抗体は生理的食塩水に希釈して使用した。
【００８５】
（4）結果
抗マウスCD22抗体投与後の関節炎の進行度を図6に示す。抗マウスCD22抗体Bはコントロール群に対して顕著に関節炎の進行を強く抑制した。この抑制効果は、観察期間であった投与終了後2ヵ月間持続した。
【００８６】
本発明により得られた抗マウスCD22抗体Bは、実施例5の結果からIL-6産生を強く抑制すると判明していたので、IL-6シグナルを阻害する抗IL-6R抗体と効力を比較した。その結果、抗CD22抗体Bは抗IL-6R抗体に比して有意に持続性効果を示した。
【００８７】
実施例10：ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を用いた抗ヒトCD22抗体のスクリーニング系
（1）採血方法
採血時の抗凝固薬として、ヘパリンナトリウム（三菱ウェルファーマ；最終濃度50単位）またはEDTA（GIBCO；最終濃度5 mM）を用いて健常人ボランティアより採取した。
【００８８】
（2）末梢血単核細胞（PBMC）の分取
Lymphoprep（AXIS-SHIELD社）を用いて、常法に従い健常人ボランティアより採取した血液からPBMCを単離した（Scand. J. Clin Lab. Invest, 21, Suppl. 97.）。得られたPBMCは培地で所定の細胞濃度に調整した。
【００８９】
（3）培養方法
PBMCを105/well で丸底の96 well plateに播き、各種抗ヒトCD22抗体を加え数時間培養後、更に10 mg/mLの濃度でanti-human IgM F(ab’)2を添加し、細胞を刺激した。CO2インキュベーターで37℃、48時間培養後、その培養上清を遠心分離して回収した。
【００９０】
（4）IL-6産生量とIL-10産生量の測定方法
培養上清を適当に希釈し、IL-6産生量とIL-10産生量をそれぞれ対応するELISAキット（Human IL-6 BD OptEIA ELISA set 、Human IL-10 BD OptEIA ELISA set、BD Biosciences）で測定した。
【００９１】
（5）抗ヒトCD22抗体のスクリーニング方法
実施例4にて得られた抗ヒトCD22抗体について、IL-6産生抑制活性およびIL-10産生誘導活性を評価した。すなわち、PBMCに各種抗ヒトCD22抗体を加え、約6時間培養後更に10 mg/mLの濃度でanti-human IgM F(ab’)2を添加し、CO2インキュベーターで37℃、48時間培養を行った。その上清中のIL-6産生量とIL-10産生量を測定した。
【００９２】
（6）結果
図7に示すとおり、対照に比して50％以上のIL-6産生抑制活性を示す抗ヒトCD22抗体を選別できた。また、図8に示すとおり、対照に比して200％以上のIL-10産生誘導活性を示す抗ヒトCD22抗体が選別された。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施例3で得られた3種の組換えヒトCD22発現細胞CD22分子部分の模式図を示す。(1)は組換えCD22発現細胞株G11-14、(2)は組換えCD22発現細胞株B9-4、(3)は組換えCD22発現細胞株34-1/30およびB4-152の模式図を示す。
【図２】実施例5の、抗マウスCD22抗体のIL-6産生抑制活性測定結果を示した図である。
【図３】実施例5の、抗マウスCD22抗体のIL-10産生誘導活性測定結果を示した図である。
【図４】実施例6のマウスEAEモデルに対する抗マウスCD22抗体投与の効果を、生存率を指標にして示した図である。(1)は抗CD22抗体Aを投与した場合の生存率を、(2)は抗CD22抗体Bを投与した場合の生存率を表す。
【図５】実施例8の自然発症マウス全身性エリテマトーデス（SLE）モデルに対する抗マウスCD22抗体投与の効果を、尿潜血（occult blood）を指標にして示した図である。
【図６】実施例9のマウスII型コラーゲン誘発関節炎（CIA）モデルに対する抗マウスCD22抗体投与の効果を、関節炎スコアを指標にして示した図である。
【図７】実施例10の抗ヒトCD22抗体のIL-6産生抑制活性測定結果を示した図である。カラム「0」はPBMCの無刺激時のIL-6産生量を示す。カラム「anti-IgM」は、anti-human IgM F(ab’)2を添加しPBMCを刺激した時のIL-6産生量を示す。カラム「対照」は、anti-human IgM F(ab’)2刺激下にて対照抗体を添加した時のIL-6産生量を示す。カラム「1〜26」はanti-human IgM F(ab’)2刺激下にて各種抗ヒトCD22抗体（NO.1〜26）を添加した時のIL-6産生量を示す。
【図８】実施例10の抗ヒトCD22抗体のIL-10産生誘導活性結果を示した図である。カラム「0」はPBMCの無刺激時のIL-10産生量を示す。カラム「anti-IgM」は、anti-human IgM F(ab’)2を添加しPBMCを刺激した時のIL-10産生量を示す。カラム「対照」は、anti-human IgM F(ab’)2刺激下にて対照抗体を添加した時のIL-10産生量を示す。カラム「1〜26」はanti-human IgM F(ab’)2刺激下にて各種抗ヒトCD22抗体（NO.1〜26）を添加した時のIL-10産生量を示す。
【００９４】
SEQUENCE LISTING
<110>  Mitsubishi Pharma Corporation
<120>  Methods for antibody screening
<130>  2007P00042
<160>  14    
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Inventor: Okamoto, Tadao; Miura, Masami
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer based on murine CD22
<400>  1
gggaattcgc cacaccaccc ccaaccgtgg                                      30
<210>  2
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer based on murine CD22
<400>  2
tttctagatc aagaacctga aacagcagct                                      30
<210>  3
<211>  2607
<212>  DNA
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(2607)
<223>  cDNA based on murine CD22
<400>  3
atg cgc gtc cat tac ctg tgg ctc ctc ttg atc cta gga cat gtg gct       48
Met Arg Val His Tyr Leu Trp Leu Leu Leu Ile Leu Gly His Val Ala         
1               5                   10                  15              
tcg gct cgg tac agc tca gca aat gat tgg acc gtt gac cat ccc caa       96
Ser Ala Arg Tyr Ser Ser Ala Asn Asp Trp Thr Val Asp His Pro Gln         
20                  25                  30                  
acc ctc ttt gcc tgg gag gga gcc tgc atc agg att cct tgc aag tac      144
Thr Leu Phe Ala Trp Glu Gly Ala Cys Ile Arg Ile Pro Cys Lys Tyr         
35                  40                  45                      
aaa act cca cta ccc aag gca cgt ctg gac aac atc ctc ctt ttt cag      192
Lys Thr Pro Leu Pro Lys Ala Arg Leu Asp Asn Ile Leu Leu Phe Gln         
50                  55                  60                          
aac tat gag ttt gac aag gcc acc aag aaa ttc aca gga act gtc ctg      240
Asn Tyr Glu Phe Asp Lys Ala Thr Lys Lys Phe Thr Gly Thr Val Leu         
65                  70                  75                  80          
tac aac gcc aca aag act gag aag gac cca gag tct gag ctg tac ctt      288
Tyr Asn Ala Thr Lys Thr Glu Lys Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Leu         
85                  90                  95              
tct aag caa ggg aga gta aca ttt ctg ggg aac aga ata gac aat tgt      336
Ser Lys Gln Gly Arg Val Thr Phe Leu Gly Asn Arg Ile Asp Asn Cys         
100                 105                 110                 
acc ctg aaa atc cac ccg ata cgt gcc aat gac agt ggg aat ctg ggg      384
Thr Leu Lys Ile His Pro Ile Arg Ala Asn Asp Ser Gly Asn Leu Gly         
115                 120                 125                     
ttg agg atg acc gca ggg act gaa cga tgg atg gag ccc att cac ctc      432
Leu Arg Met Thr Ala Gly Thr Glu Arg Trp Met Glu Pro Ile His Leu         
130                 135                 140                         
aat gtc tcg gag aaa ccg ttc caa cct tac atc cag atg cca tca gaa      480
Asn Val Ser Glu Lys Pro Phe Gln Pro Tyr Ile Gln Met Pro Ser Glu         
145                 150                 155                 160         
atc cgg gaa tcc caa agt gtc act ctg acc tgt gga ctg aat ttc tcc      528
Ile Arg Glu Ser Gln Ser Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Asn Phe Ser         
165                 170                 175             
tgc ttt ggg tat gac atc ctc ttg aag tgg ttc cta gaa gat tct gag      576
Cys Phe Gly Tyr Asp Ile Leu Leu Lys Trp Phe Leu Glu Asp Ser Glu         
180                 185                 190                 
atc acc tcc atc acc tct tct gtc acc tcc atc acc tct tct gtc acc      624
Ile Thr Ser Ile Thr Ser Ser Val Thr Ser Ile Thr Ser Ser Val Thr         
195                 200                 205                     
tcc tcc att aag aat gtc tat aca gag agc aag ctc acc ttc caa cca      672
Ser Ser Ile Lys Asn Val Tyr Thr Glu Ser Lys Leu Thr Phe Gln Pro         
210                 215                 220                         
aag tgg acg gac cac gga aag agt gtg aag tgc caa gtc cag cac tcc      720
Lys Trp Thr Asp His Gly Lys Ser Val Lys Cys Gln Val Gln His Ser         
225                 230                 235                 240         
tcc aaa gtg ctc tca gag tgc act gtg cat ctg gat gtt aag tat acc      768
Ser Lys Val Leu Ser Glu Cys Thr Val His Leu Asp Val Lys Tyr Thr         
245                 250                 255             
ccg aag ctg gag atc aag gtc aat ccc aca gag gtg gaa aag aac aat      816
Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Asn Pro Thr Glu Val Glu Lys Asn Asn         
260                 265                 270                 
tct gtg acc atg aca tgc cgg gtt aac agc agc aac ccg aaa ctc agg      864
Ser Val Thr Met Thr Cys Arg Val Asn Ser Ser Asn Pro Lys Leu Arg         
275                 280                 285                     
acc gtg gcg gtg tct tgg ttc aag gat ggg cgc ccc cta gag gat cag      912
Thr Val Ala Val Ser Trp Phe Lys Asp Gly Arg Pro Leu Glu Asp Gln         
290                 295                 300                         
gaa ctg gaa cag gaa caa cag atg tcc aag cta att ctg cat tca gtg      960
Glu Leu Glu Gln Glu Gln Gln Met Ser Lys Leu Ile Leu His Ser Val         
305                 310                 315                 320         
acc aag gac atg aga ggg aaa tac cgg tgc cag gct tcc aac gac ata     1008
Thr Lys Asp Met Arg Gly Lys Tyr Arg Cys Gln Ala Ser Asn Asp Ile         
325                 330                 335             
ggc cca gga gag tcg gaa gaa gtg gaa ctc acg gtg cac tat gct cca     1056
Gly Pro Gly Glu Ser Glu Glu Val Glu Leu Thr Val His Tyr Ala Pro         
340                 345                 350                 
gaa ccc tcc agg gtt cac atc tac cct tcc ccc gct gaa gag gga cag     1104
Glu Pro Ser Arg Val His Ile Tyr Pro Ser Pro Ala Glu Glu Gly Gln         
355                 360                 365                     
tca gta gag ctg att tgt gag tca ctg gcc agt cca agt gca aca aac     1152
Ser Val Glu Leu Ile Cys Glu Ser Leu Ala Ser Pro Ser Ala Thr Asn         
370                 375                 380                         
tac acc tgg tat cac aac agg aaa cct ata cct gga gac acc caa gag     1200
Tyr Thr Trp Tyr His Asn Arg Lys Pro Ile Pro Gly Asp Thr Gln Glu         
385                 390                 395                 400         
aag ctc cgc atc cct aaa gtc tcc ccg tgg cat gct ggg aat tac tct     1248
Lys Leu Arg Ile Pro Lys Val Ser Pro Trp His Ala Gly Asn Tyr Ser         
405                 410                 415             
tgc ttg gca gag aac cgt ctg ggt cat gga aag ata gac cag gaa gct     1296
Cys Leu Ala Glu Asn Arg Leu Gly His Gly Lys Ile Asp Gln Glu Ala         
420                 425                 430                 
aag ctg gat gtc cat tat gct ccc aag gcg gtg acc aca gtg att cag     1344
Lys Leu Asp Val His Tyr Ala Pro Lys Ala Val Thr Thr Val Ile Gln         
435                 440                 445                     
agc ttc aca cca atc ctg gaa gga gac agt gtg acc ctg gtc tgt agg     1392
Ser Phe Thr Pro Ile Leu Glu Gly Asp Ser Val Thr Leu Val Cys Arg         
450                 455                 460                         
tac aac tcc agc aat cca gac gtc acc tcc tac aga tgg aac cct caa     1440
Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Asp Val Thr Ser Tyr Arg Trp Asn Pro Gln         
465                 470                 475                 480         
ggt tct ggg agt gtg ctc aaa ccc gga gtg ctg agg att cag aaa gtg     1488
Gly Ser Gly Ser Val Leu Lys Pro Gly Val Leu Arg Ile Gln Lys Val         
485                 490                 495             
aca tgg gat tcc atg cct gtc agc tgt gct gcc tgc aac cac aag tgt     1536
Thr Trp Asp Ser Met Pro Val Ser Cys Ala Ala Cys Asn His Lys Cys         
500                 505                 510                 
tcg tgg gcc ctc cct gtc atc ctg aat gtc cac tac gcc ccc aga gac     1584
Ser Trp Ala Leu Pro Val Ile Leu Asn Val His Tyr Ala Pro Arg Asp         
515                 520                 525                     
gtg aag gta ctg aag gta agc ccc gca tca gag atc cgc gct ggg cag     1632
Val Lys Val Leu Lys Val Ser Pro Ala Ser Glu Ile Arg Ala Gly Gln         
530                 535                 540                         
cgt gtc ctc ctc caa tgc gac ttc gca gag agc aac ccg gca gag gtc     1680
Arg Val Leu Leu Gln Cys Asp Phe Ala Glu Ser Asn Pro Ala Glu Val         
545                 550                 555                 560         
cgc ttc ttc tgg aag aag aat ggg agt ctc gtg cag gaa ggg agg tac     1728
Arg Phe Phe Trp Lys Lys Asn Gly Ser Leu Val Gln Glu Gly Arg Tyr         
565                 570                 575             
ctg agc ttc ggc tcc gtc tcc cca gaa gat tct gga aat tat aac tgc     1776
Leu Ser Phe Gly Ser Val Ser Pro Glu Asp Ser Gly Asn Tyr Asn Cys         
580                 585                 590                 
atg gtc aac aac tcc atc gga gag acc ttg tca cag gcc tgg aac ctc     1824
Met Val Asn Asn Ser Ile Gly Glu Thr Leu Ser Gln Ala Trp Asn Leu         
595                 600                 605                     
caa gtg ctg tat gct cct cgg agg cta cgt gtg tcc atc agc cct ggg     1872
Gln Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Ile Ser Pro Gly         
610                 615                 620                         
gac cat gtg atg gag ggg aag aag gcc acc ttg tcc tgt gag agt gat     1920
Asp His Val Met Glu Gly Lys Lys Ala Thr Leu Ser Cys Glu Ser Asp         
625                 630                 635                 640         
gcc aat ccg ccc atc tca cag tac acc tgg ttt gac tcc agt ggc caa     1968
Ala Asn Pro Pro Ile Ser Gln Tyr Thr Trp Phe Asp Ser Ser Gly Gln         
645                 650                 655             
gac ctc cac tcc tca ggc cag aaa ctg aga ctg gaa ccc ctg gag gtc     2016
Asp Leu His Ser Ser Gly Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Leu Glu Val         
660                 665                 670                 
caa cac acg ggt tcc tac cgc tgc aaa ggg acc aat ggg ata ggc aca     2064
Gln His Thr Gly Ser Tyr Arg Cys Lys Gly Thr Asn Gly Ile Gly Thr         
675                 680                 685                     
gga gag tca cca ccc agc acc ctc act gtc tac tac agt cca gag acc     2112
Gly Glu Ser Pro Pro Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr         
690                 695                 700                         
atc ggc aag cgg gtc gcc ttg gga cta ggc ttc tgc ctg act atc ttc     2160
Ile Gly Lys Arg Val Ala Leu Gly Leu Gly Phe Cys Leu Thr Ile Phe         
705                 710                 715                 720         
atc ctg gcc atc tgg ggg atg aaa atc cag aaa aaa tgg aag caa aac     2208
Ile Leu Ala Ile Trp Gly Met Lys Ile Gln Lys Lys Trp Lys Gln Asn         
725                 730                 735             
cgc agc cag cag ggg ctt cag gaa aat tcc agt ggc cag agc ttt ttt     2256
Arg Ser Gln Gln Gly Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe         
740                 745                 750                 
gtg agg aac aaa aag gct agg agg acc cct ctc tca gaa ggc ccc caa     2304
Val Arg Asn Lys Lys Ala Arg Arg Thr Pro Leu Ser Glu Gly Pro Gln         
755                 760                 765                     
tcc cag gga tgc tac aat ccg gca atg gat gac act gtt agt tat gcc     2352
Ser Gln Gly Cys Tyr Asn Pro Ala Met Asp Asp Thr Val Ser Tyr Ala         
770                 775                 780                         
atc ttg cgc ttt cca gag agt gac acg cac aat gct gga gat gca ggg     2400
Ile Leu Arg Phe Pro Glu Ser Asp Thr His Asn Ala Gly Asp Ala Gly         
785                 790                 795                 800         
acc cca gca aca cag gct cct cct cca aac aac agc gac acg gtc act     2448
Thr Pro Ala Thr Gln Ala Pro Pro Pro Asn Asn Ser Asp Thr Val Thr         
805                 810                 815             
tac tcg gtg ata cag aag cgg cct atg ggg gat tat gag aat gtg aat     2496
Tyr Ser Val Ile Gln Lys Arg Pro Met Gly Asp Tyr Glu Asn Val Asn         
820                 825                 830                 
ccg agc tgc ccg gag gat gag agc atc cat tac tca gag ctg gtt cag     2544
Pro Ser Cys Pro Glu Asp Glu Ser Ile His Tyr Ser Glu Leu Val Gln         
835                 840                 845                     
ttt ggg gct ggt aag cgg ccc cag gca aag gaa gac gta gac tat gtg     2592
Phe Gly Ala Gly Lys Arg Pro Gln Ala Lys Glu Asp Val Asp Tyr Val         
850                 855                 860                         
acc ctc aag cac tga                                                 2607
Thr Leu Lys His                                                         
865                                                                     
<210>  4
<211>  868
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<223>  Amino-acid sequence of murine CD22
<400>  4
Met Arg Val His Tyr Leu Trp Leu Leu Leu Ile Leu Gly His Val Ala 
1               5                   10                  15      
Ser Ala Arg Tyr Ser Ser Ala Asn Asp Trp Thr Val Asp His Pro Gln 
20                  25                  30          
Thr Leu Phe Ala Trp Glu Gly Ala Cys Ile Arg Ile Pro Cys Lys Tyr 
35                  40                  45              
Lys Thr Pro Leu Pro Lys Ala Arg Leu Asp Asn Ile Leu Leu Phe Gln 
50                  55                  60                  
Asn Tyr Glu Phe Asp Lys Ala Thr Lys Lys Phe Thr Gly Thr Val Leu 
65                  70                  75                  80  
Tyr Asn Ala Thr Lys Thr Glu Lys Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Leu 
85                  90                  95      
Ser Lys Gln Gly Arg Val Thr Phe Leu Gly Asn Arg Ile Asp Asn Cys 
100                 105                 110         
Thr Leu Lys Ile His Pro Ile Arg Ala Asn Asp Ser Gly Asn Leu Gly 
115                 120                 125             
Leu Arg Met Thr Ala Gly Thr Glu Arg Trp Met Glu Pro Ile His Leu 
130                 135                 140                 
Asn Val Ser Glu Lys Pro Phe Gln Pro Tyr Ile Gln Met Pro Ser Glu 
145                 150                 155                 160 
Ile Arg Glu Ser Gln Ser Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Asn Phe Ser 
165                 170                 175     
Cys Phe Gly Tyr Asp Ile Leu Leu Lys Trp Phe Leu Glu Asp Ser Glu 
180                 185                 190         
Ile Thr Ser Ile Thr Ser Ser Val Thr Ser Ile Thr Ser Ser Val Thr 
195                 200                 205             
Ser Ser Ile Lys Asn Val Tyr Thr Glu Ser Lys Leu Thr Phe Gln Pro 
210                 215                 220                 
Lys Trp Thr Asp His Gly Lys Ser Val Lys Cys Gln Val Gln His Ser 
225                 230                 235                 240 
Ser Lys Val Leu Ser Glu Cys Thr Val His Leu Asp Val Lys Tyr Thr 
245                 250                 255     
Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Asn Pro Thr Glu Val Glu Lys Asn Asn 
260                 265                 270         
Ser Val Thr Met Thr Cys Arg Val Asn Ser Ser Asn Pro Lys Leu Arg 
275                 280                 285             
Thr Val Ala Val Ser Trp Phe Lys Asp Gly Arg Pro Leu Glu Asp Gln 
290                 295                 300                 
Glu Leu Glu Gln Glu Gln Gln Met Ser Lys Leu Ile Leu His Ser Val 
305                 310                 315                 320 
Thr Lys Asp Met Arg Gly Lys Tyr Arg Cys Gln Ala Ser Asn Asp Ile 
325                 330                 335     
Gly Pro Gly Glu Ser Glu Glu Val Glu Leu Thr Val His Tyr Ala Pro 
340                 345                 350         
Glu Pro Ser Arg Val His Ile Tyr Pro Ser Pro Ala Glu Glu Gly Gln 
355                 360                 365             
Ser Val Glu Leu Ile Cys Glu Ser Leu Ala Ser Pro Ser Ala Thr Asn 
370                 375                 380                 
Tyr Thr Trp Tyr His Asn Arg Lys Pro Ile Pro Gly Asp Thr Gln Glu 
385                 390                 395                 400 
Lys Leu Arg Ile Pro Lys Val Ser Pro Trp His Ala Gly Asn Tyr Ser 
405                 410                 415     
Cys Leu Ala Glu Asn Arg Leu Gly His Gly Lys Ile Asp Gln Glu Ala 
420                 425                 430         
Lys Leu Asp Val His Tyr Ala Pro Lys Ala Val Thr Thr Val Ile Gln 
435                 440                 445             
Ser Phe Thr Pro Ile Leu Glu Gly Asp Ser Val Thr Leu Val Cys Arg 
450                 455                 460                 
Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Asp Val Thr Ser Tyr Arg Trp Asn Pro Gln 
465                 470                 475                 480 
Gly Ser Gly Ser Val Leu Lys Pro Gly Val Leu Arg Ile Gln Lys Val 
485                 490                 495     
Thr Trp Asp Ser Met Pro Val Ser Cys Ala Ala Cys Asn His Lys Cys 
500                 505                 510         
Ser Trp Ala Leu Pro Val Ile Leu Asn Val His Tyr Ala Pro Arg Asp 
515                 520                 525             
Val Lys Val Leu Lys Val Ser Pro Ala Ser Glu Ile Arg Ala Gly Gln 
530                 535                 540                 
Arg Val Leu Leu Gln Cys Asp Phe Ala Glu Ser Asn Pro Ala Glu Val 
545                 550                 555                 560 
Arg Phe Phe Trp Lys Lys Asn Gly Ser Leu Val Gln Glu Gly Arg Tyr 
565                 570                 575     
Leu Ser Phe Gly Ser Val Ser Pro Glu Asp Ser Gly Asn Tyr Asn Cys 
580                 585                 590         
Met Val Asn Asn Ser Ile Gly Glu Thr Leu Ser Gln Ala Trp Asn Leu 
595                 600                 605             
Gln Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Ile Ser Pro Gly 
610                 615                 620                 
Asp His Val Met Glu Gly Lys Lys Ala Thr Leu Ser Cys Glu Ser Asp 
625                 630                 635                 640 
Ala Asn Pro Pro Ile Ser Gln Tyr Thr Trp Phe Asp Ser Ser Gly Gln 
645                 650                 655     
Asp Leu His Ser Ser Gly Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Leu Glu Val 
660                 665                 670         
Gln His Thr Gly Ser Tyr Arg Cys Lys Gly Thr Asn Gly Ile Gly Thr 
675                 680                 685             
Gly Glu Ser Pro Pro Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr 
690                 695                 700                 
Ile Gly Lys Arg Val Ala Leu Gly Leu Gly Phe Cys Leu Thr Ile Phe 
705                 710                 715                 720 
Ile Leu Ala Ile Trp Gly Met Lys Ile Gln Lys Lys Trp Lys Gln Asn 
725                 730                 735     
Arg Ser Gln Gln Gly Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe 
740                 745                 750         
Val Arg Asn Lys Lys Ala Arg Arg Thr Pro Leu Ser Glu Gly Pro Gln 
755                 760                 765             
Ser Gln Gly Cys Tyr Asn Pro Ala Met Asp Asp Thr Val Ser Tyr Ala 
770                 775                 780                 
Ile Leu Arg Phe Pro Glu Ser Asp Thr His Asn Ala Gly Asp Ala Gly 
785                 790                 795                 800 
Thr Pro Ala Thr Gln Ala Pro Pro Pro Asn Asn Ser Asp Thr Val Thr 
805                 810                 815     
Tyr Ser Val Ile Gln Lys Arg Pro Met Gly Asp Tyr Glu Asn Val Asn 
820                 825                 830         
Pro Ser Cys Pro Glu Asp Glu Ser Ile His Tyr Ser Glu Leu Val Gln 
835                 840                 845             
Phe Gly Ala Gly Lys Arg Pro Gln Ala Lys Glu Asp Val Asp Tyr Val 
850                 855                 860                 
Thr Leu Lys His 
865             
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer based on human CD22
<400>  5
gcttgcaccc agacacgaca                                                 20
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer besed on human CD22
<400>  6
cctctgctgc agcccatcca                                                 20
<210>  7
<211>  2544
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(2544)
<223>  cDNA besed on human CD22
<400>  7
atg cat ctc ctc ggc ccc tgg ctc ctg ctc ctg gtt cta gaa tac ttg       48
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu         
1               5                   10                  15              
gct ttc tct gac tca agt aaa tgg gtt ttt gag cac cct gaa acc ctc       96
Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu         
20                  25                  30                  
tac gcc tgg gag ggg gcc tgc gtc tgg atc ccc tgc acc tac aga gcc      144
Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala         
35                  40                  45                      
cta gat ggt gac ctg gaa agc ttc atc ctg ttc cac aat cct gag tat      192
Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr         
50                  55                  60                          
aac aag aac acc tcg aag ttt gat ggg aca aga ctc tat gaa agc aca      240
Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr         
65                  70                  75                  80          
aag gat ggg aag gtt cct tct gag cag aaa agg gtg caa ttc ctg gga      288
Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly         
85                  90                  95              
gac aag aat aag aac tgc aca ctg agt atc cac ccg gtg cac ctc aat      336
Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn         
100                 105                 110                 
gac agt ggt cag ctg ggg ctg agg atg gag tcc aag act gag aaa tgg      384
Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp         
115                 120                 125                     
atg gaa cga ata cac ctc aat gtc tct gaa agg cct ttt cca cct cat      432
Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His         
130                 135                 140                         
atc cag ctc cct cca gaa att caa gag tcc cag gaa gtc act ctg acc      480
Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr         
145                 150                 155                 160         
tgc ttg ctg aat ttc tcc tgc tat ggg tat ccg atc caa ttg cag tgg      528
Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp         
165                 170                 175             
ctc cta gag ggg gtt cca atg agg cag gct gct gtc acc tcg acc tcc      576
Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser         
180                 185                 190                 
ttg acc atc aag tct gtc ttc acc cgg agc gag ctc aag ttc tcc cca      624
Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro         
195                 200                 205                     
cag tgg agt cac cat ggg aag att gtg acc tgc cag ctt cag gat gca      672
Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala         
210                 215                 220                         
gat ggg aag ttc ctc tcc aat gac acg gtg cag ctg aac gtg aag cac      720
Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His         
225                 230                 235                 240         
acc ccg aag ttg gag atc aag gtc act ccc agt gat gcc ata gtg agg      768
Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg         
245                 250                 255             
gag ggg gac tct gtg acc atg acc tgc gag gtc agc agc agc aac ccg      816
Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro         
260                 265                 270                 
gag tac acg acg gta tcc tgg ctc aag gat ggg acc tcg ctg aag aag      864
Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys         
275                 280                 285                     
cag aat aca ttc acg cta aac ctg cgc gaa gtg acc aag gac cag agt      912
Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser         
290                 295                 300                         
ggg aag tac tgc tgt cag gtc tcc aat gac gtg ggc ccg gga agg tcg      960
Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser         
305                 310                 315                 320         
gaa gaa gtg ttc ctg caa gtg cag tat gcc ccg gaa cct tcc acg gtt     1008
Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val         
325                 330                 335             
cag atc ctc cac tca ccg gct gtg gag gga agt caa gtc gag ttt ctt     1056
Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu         
340                 345                 350                 
tgc atg tca ctg gcc aat cct ctt cca aca aat tac acg tgg tac cac     1104
Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His         
355                 360                 365                     
aat ggg aaa gaa atg cag gga agg aca gag gag aaa gtc cac atc cca     1152
Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro         
370                 375                 380                         
aag atc ctc ccc tgg cac gct ggg act tat tcc tgt gtg gca gaa aac     1200
Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn         
385                 390                 395                 400         
att ctt ggt act gga cag agg ggc ccg gga gct gag ctg gat gtc cag     1248
Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln         
405                 410                 415             
tat cct ccc aag aag gtg acc aca gtg att caa aac ccc atg ccg att     1296
Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile         
420                 425                 430                 
cga gaa gga gac aca gtg acc ctt tcc tgt aac tac aat tcc agt aac     1344
Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn         
435                 440                 445                     
ccc agt gtt acc cgg tat gaa tgg aaa ccc cat ggc gcc tgg gag gag     1392
Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu         
450                 455                 460                         
cca tcg ctt ggg gtg ctg aag atc caa aac gtt ggc tgg gac aac aca     1440
Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr         
465                 470                 475                 480         
acc atc gcc tgc gca cgt tgt aat agt tgg tgc tcg tgg gcc tcc cct     1488
Thr Ile Ala Cys Ala Arg Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro         
485                 490                 495             
gtc gcc ctg aat gtc cag tat gcc ccc cga gac gtg agg gtc cgg aaa     1536
Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys         
500                 505                 510                 
atc aag ccc ctt tcc gag att cac tct gga aac tcg gtc agc ctc caa     1584
Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln         
515                 520                 525                     
tgt gac ttc tca agc agc cac ccc aaa gaa gtc cag ttc ttc tgg gag     1632
Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu         
530                 535                 540                         
aaa aat ggc agg ctt ctg ggg aaa gaa agc cag ctg aat ttt gac tcc     1680
Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser         
545                 550                 555                 560         
atc tcc cca gaa gat gct ggg agt tac agc tgc tgg gtg aac aac tcc     1728
Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser         
565                 570                 575             
ata gga cag aca gcg tcc aag gcc tgg aca ctt gaa gtg ctg tat gca     1776
Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala         
580                 585                 590                 
ccc agg agg ctg cgt gtg tcc atg agc ccg ggg gac caa gtg atg gag     1824
Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu         
595                 600                 605                     
ggg aag agt gca acc ctg acc tgt gag agc gac gcc aac cct ccc gtc     1872
Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val         
610                 615                 620                         
tcc cac tac acc tgg ttt gac tgg aat aac caa agc ctc ccc tac cac     1920
Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His         
625                 630                 635                 640         
agc cag aag ctg aga ttg gag ccg gtg aag gtc cag cac tcg ggt gcc     1968
Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala         
645                 650                 655             
tac tgg tgc cag ggg acc aac agt gtg ggc aag ggc cgt tcg cct ctc     2016
Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu         
660                 665                 670                 
agc acc ctt act gtc tac tat agc ccg gag acc atc ggc agg cga gtg     2064
Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val         
675                 680                 685                     
gct gtg gga ctc ggg tcc tgc ctc gcc atc ctc atc ctg gca atc tgt     2112
Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys         
690                 695                 700                         
ggg ctc aag ctc cag cga cgt tgg aag agg aca cag agc cag cag ggg     2160
Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly         
705                 710                 715                 720         
ctt cag gag aat tcc agc ggc cag agc ttc ttt gtg agg aat aaa aag     2208
Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys         
725                 730                 735             
gtt aga agg gcc ccc ctc tct gaa gac ccc cac tcc ctg gga tgc tac     2256
Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Asp Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr         
740                 745                 750                 
aat cca atg atg gaa gat ggc att agc tac acc acc ctg cgc ttt ccc     2304
Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro         
755                 760                 765                     
gag atg aac ata cca cga act gga gat gca gag tcc tca gag atg cag     2352
Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln         
770                 775                 780                         
aga cct ccc cgg acc tgc gat gac acg gtc act tat tca gca ttg cac     2400
Arg Pro Pro Arg Thr Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His         
785                 790                 795                 800         
aag cgc caa gtg ggc gac tat gag aac gtc att cca gat ttt cca gaa     2448
Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu         
805                 810                 815             
gat gag ggg att cat tac tca gag ctg atc cag ttt ggg gtc ggg gag     2496
Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu         
820                 825                 830                 
cgg cct cag gca caa gaa aat gtg gac tat gtg atc ctc aaa cat tga     2544
Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His             
835                 840                 845                     
<210>  8
<211>  847
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<223>  Amino-acid sequence of human CD22
<400>  8
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu 
1               5                   10                  15      
Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu 
20                  25                  30          
Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala 
35                  40                  45              
Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr 
50                  55                  60                  
Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr 
65                  70                  75                  80  
Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly 
85                  90                  95      
Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn 
100                 105                 110         
Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp 
115                 120                 125             
Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His 
130                 135                 140                 
Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr 
145                 150                 155                 160 
Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp 
165                 170                 175     
Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser 
180                 185                 190         
Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro 
195                 200                 205             
Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala 
210                 215                 220                 
Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His 
225                 230                 235                 240 
Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg 
245                 250                 255     
Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro 
260                 265                 270         
Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys 
275                 280                 285             
Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser 
290                 295                 300                 
Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser 
305                 310                 315                 320 
Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val 
325                 330                 335     
Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu 
340                 345                 350         
Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His 
355                 360                 365             
Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro 
370                 375                 380                 
Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn 
385                 390                 395                 400 
Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln 
405                 410                 415     
Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile 
420                 425                 430         
Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn 
435                 440                 445             
Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu 
450                 455                 460                 
Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr 
465                 470                 475                 480 
Thr Ile Ala Cys Ala Arg Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro 
485                 490                 495     
Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys 
500                 505                 510         
Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln 
515                 520                 525             
Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu 
530                 535                 540                 
Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser 
545                 550                 555                 560 
Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser 
565                 570                 575     
Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala 
580                 585                 590         
Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu 
595                 600                 605             
Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val 
610                 615                 620                 
Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His 
625                 630                 635                 640 
Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala 
645                 650                 655     
Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu 
660                 665                 670         
Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val 
675                 680                 685             
Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys 
690                 695                 700                 
Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly 
705                 710                 715                 720 
Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys 
725                 730                 735     
Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Asp Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr 
740                 745                 750         
Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro 
755                 760                 765             
Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln 
770                 775                 780                 
Arg Pro Pro Arg Thr Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His 
785                 790                 795                 800 
Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu 
805                 810                 815     
Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu 
820                 825                 830         
Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His 
835                 840                 845         
<210>  9
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer besed on murine CD22
<400>  9
ccaagcttgc caccatgcgc gtccat                                          26
<210>  10
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer besed on murine CD22
<400>  10
atacttaaca tccagatgca                                                 20
<210>  11
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer besed on human CD22
<400>  11
accccgaagt tggagatcaa ggtc                                            24
<210>  12
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer besed on human CD22
<400>  12
cttttctgct cagaaggaac                                                 20
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<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
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<223>  Primer besed on human CD22
<400>  13
cctcccaaga aggtgaccac                                                 20
<210>  14
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer besed on human CD22
<400>  14
gcctgcaggt gtcaatgttt gaggat                                          26
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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