(57)【要約】      （修正有）【課題】低下したアクチンに対する結合親和性を有するヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸配列変異体を提供する。【解決手段】アクチン−耐性変異体をコードし、それにより臨床用途に十分な量のこれらの変異体の生産を可能とする核酸配列。また、医薬組成物およびヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体の治療的使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示した天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、以下の位置:Ｇ４９Ｒ、Ｄ５３Ｃ、Ａ１１４Ｇ、Ａ１１４Ｈ、及びＳ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔのうちの１つ以上で他のアミノ酸への少なくとも一つのアミノ酸置換を有するヒトＤＮアーゼＩの変異体であって、前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するが前記少なくとも一つのアミノ酸置換を有さない変異体よりも、増大したＤＮＡ−加水分解活性を有する変異体。
【請求項２】
配列番号１に示した天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも９５%の同一性を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
配列番号１に示した天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも９８%の同一性を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
請求項１記載のヒトＤＮアーゼＩの変異体をコードする単離された核酸。
【請求項５】
請求項１に記載のヒトＤＮアーゼＩの変異体および任意に医薬上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項６】
該組成物が液状形態である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
該組成物が粉末形態である請求項５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）、ポリデオキシリボ核酸を加水分解できるホスホジエステラーゼに関する研究から得られた結果に関する。本発明は、一般に、ヒトＤＮアーゼＩの修飾された（変異体）形態および組換えＤＮＡ法によるそれらの調製、それらの利用性がそれにより臨床的に開発できる医薬組成物、およびこれらのＤＮアーゼＩ変異体およびその組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮアーゼＩはポリデオキシリボ核酸を加水分解できるホスホジエステラーゼである。ＤＮアーゼＩは多くの種から様々の程度に精製されてきた。
【０００３】
ウシＤＮアーゼＩは生化学的に広範囲に研究されてきた。例えば、Moore，The Enzyme（Boyer，P.D.編），281-296頁，Academic Press，New York (1981)参照。ウシＤＮアーゼＩについての完全なアミノ酸配列は公知であり（Liaoら，J．Biol．Chem.，248:1489-1495(1973);Oefnerら，J．Mol．Biol．192:605-632(1986 )；Lahmら，J．Mol．Biol．Biol．221:645-667(1991)、ウシＤＮアーゼＩをコードするＤＮＡはクローン化され発現されている(Worrallら，J．Biol．Chem．265 :21889-21895(1990))。ウシＤＮアーゼＩの構造はＸ−線結晶学によって決定されている。Suckら，EMBO J．3:2423-2430(1984); Suckら，Nature 321:670-625( 1986); Oefnerら，J．Mol．Biol．192:605-632(1986))。
【０００４】
ヒトＤＮアーゼＩをコードするＤＮＡは単離され、配列決定され、そのＤＮＡは組換え宿主細胞で発現されており、それにより、商業的に有用な量にてのヒトＤＮアーゼＩの生産を可能する。Shakら，Proc．Nat．Acad．Sci．87:9188-9192 (1990)。
【０００５】
ＤＮアーゼＩは多数の公知の用途を有し、治療目的で使用されてきた。その主な治療用途は、肺炎および嚢胞性線維症（ＣＦ）のごとき病気において肺分泌（粘液）の粘弾性を低下させ、それにより気道の清掃を助力することであった。例えば、Lourencoら，Arch．Intern.，Med．142:2299-2308(1982); Shakら，Proc．nat．Acad．Sci．87:9188-9192（1990）；Hubbardら，New Engl．J．Med.326 :812-815(1992); Fuchsら，New Engl．J.Med．321: 637-642(1994); Brysonら， Drugs 48:894-906(1994)。また、粘液は慢性気管支炎、喘息性気管支炎、気管支拡張症、気腫、急性および慢性静脈洞炎、および通常の風邪の罹患率に寄与する。
【０００６】
かかる病気を有する個人の肺分泌は複雑な物質であり、それは粘液糖蛋白質、ムコ多糖、プロテアーゼ、アクチンおよびＤＮＡを含む。肺物質における物質のいくつかは、微生物（例えば、シュードモナス(Pseudomonas)、ニューモコッカス(Pneumocossus)、またはスタフィロコッカス(Staphylococcus)菌の株）または他の刺激剤（例えば、タバコの喫煙、花粉）の存在に応答して肺組織に浸潤する白血球（好中球）から放出される。かかる微生物また刺激剤と反応する間に、白血球は変性し、それらの内容物を放出し、それは肺分泌の粘弾性に寄与する。
【０００７】
肺分泌の粘弾性を低下させるＤＮアーゼＩの能力は、好中球によって放出された大量のＤＮＡのその酵素分解に帰せられてきた。Shakら，Proc．Nat．Acad．Sci．87:9188-9192(1990)); Aitkenら，J．Am．Med．Assoc.267:1947-1951(1992) )。
【０００８】
より最近では、アクチンの離解を含めたＤＮアーゼＩの粘液溶解効果につき種々のメカニズムが提案されている。Vasconcellosら，Science 263:969-971(1994 ))。アクチンは、真核細胞における最も豊富な蛋白質の１つであり（例えば、アクチンは全白血球蛋白質の約１０％よりなる）、広範に研究されてきた。Kabsch ら，Ann．Rev．Biophys．Biomol．Struct.21:49-76(1992); Sheterlineら，Proc．Profile 1:1-121(1994)。アクチンは２つの形態、モノマー形態（Ｇ−アクチン）、およびＧ−アクチンモノマーから組み立てられるフィラメント形態（Ｆ−アクチン）で存在する。アクチンのポリマーフィラメントは高度に粘弾性であって、肺分泌の粘度にかなり寄与する。Mornetら，Proc．Nat．Acad．Sci．81:368 0-3684(1984); Newmanら，Biochemistry 24:1538-1544(1985); Janmeyら，Biochemistry 27:8218-8226(1988); Vasconcellosら，Science 263:969-971(1994)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Moore，The Enzyme（Boyer，P.D.編），281-296頁，Academic Press，New York (1981)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＤＮアーゼＩはアクチンに結合し(Lazaridesら，Proc．Nat．Acad．Sci．71:4 742-4746(1974); Kabschら，Nature 347:37-44(1990))、アクチンフィラメントを脱重合させること（ならびにＧ−アクチンのフィラメントへの重合を阻害すること）が知られている(Mannherzら，FEBS Lett．60:34-38(1975); Hitchcockら，Cell 7:531-542(1976); Pinderら，Biochemistry 21:4886-4890(1982); Weber ら，Biochemistry 33:4780-4786(1994))ので、痰および他の肺分泌に対するＤＮアーゼＩの粘液分解効果は、ＤＮＡ加水分解よりもむしろアクチン離解（脱重合）によることが提案されている。Vasconcellosら，Science 263: 969-971(1994 )。この見解に合致して、アクチンの存在下では、ＤＮアーゼＩのＤＮＡ−加水分解活性は阻害されることが知られている。Lazaridesら，Proc．Nat．Acad．Sci．71:4742-4746(1974); Mannherzら，Eur．J．Biochem．104:367-379(1980)。また、この見解と一致して、アクチン切断蛋白質（例えば、グルソリン）が嚢胞性線維症痰の粘弾性を低下させるのに効果的であることが報告されている。Vasconcellosら，Science 263:969-971 1994); Stosselら，PCT出願公開WO 94/22465 （１９９４年１０月１３日公開）。
【００１１】
本発明は、部分的には、ＤＮアーゼＩの粘液分解活性の生化学的基礎を測定する本発明者らによる研究に基づいている。この研究は、種々のヒトＤＮアーゼＩ変異体の設計および合成、ならびにＤＮＡを加水分解し、アクチンに結合し、イン・ビトロで痰の粘弾性を低下させるそれらの能力を評価するこれらの変異体のアッセイを含むものであった。本発明者らはヒトＤＮアーゼＩ変異体のいくつかのクラスを創製した。１のクラスの変異体（アクチン−耐性変異体）はアクチンに結合する能力が低下したが、依然として粘液分解活性を有し、ある場合には、天然ヒトＤＮアーゼＩと比較して低下した粘液分解活性を有した。これらのアクチン−耐性変異体は天然ヒトＤＮアーゼＩとほぼ同一のＤＮＡ−加水分解活性を有するが、かかる活性はアクチンによる阻害に対して感受性が低かった。第２のクラスの変異体は天然ヒトＤＮアーゼＩで見い出されているものと同様の親和性でもってアクチンに結合するが、天然ヒトＤＮアーゼＩと比較して低下した粘液分解活性および低下したＤＮＡ−加水分解活性を有した。
【００１２】
これらの結果は、肺分泌の粘弾性を低下させることにおけるヒトＤＮアーゼＩの治療効果が、フィラメント状アクチンを脱重合させるその能力よりもむしろその接触ＤＮＡ−加水分解活性によるものであることを示す。従って、天然ヒトＤＮアーゼＩよりも低い親和性をもってアクチンに結合するが依然としてＤＮＡ−加水分解活性を保有するヒトＤＮアーゼＩの変異体は、特に、比較的大量のアクチンよりなる肺分泌を有する患者の治療において有用な治療剤であるはずである。かかる変異体はアクチンに対して低下した親和性を有するので、それらのＤＮＡ加水分解活性はアクチンの存在下でより阻害されず、従って、これらの変異体は天然ヒトＤＮアーゼＩと比較して、アクチンの存在下でより大きい粘液分解活性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ−加水分解活性を保有するが天然ヒトＤＮアーゼＩよりも低い親和性でもってアクチンに結合するヒトＤＮアーゼＩ変異体を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、ヒトＤＮアーゼＩのかかるアクチン−耐性変異体をコードする核酸、かかる核酸よりなる組換えベクター、それらの核酸またはベクターで形質転換された組換え宿主細胞、および組換えＤＮＡ技術によってヒトＤＮＡ変異体を産生する方法を提供することにある。
【００１５】
また、本発明は、所望により医薬上許容される賦形剤と共に、ヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体よりなる医薬組成物に指向される。
【００１６】
また、本発明は、治療上有効量のＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体を患者に投与することよりなる、患者においてＤＮＡ含有物質の粘弾性または粘性コンシステンシーを低下させる方法に指向される。
【００１７】
本発明は、特に、治療上有効量のＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体を患者に投与することよりなる、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、肺炎、気管支拡張症、気腫、喘息、または全身性エリテマトーデスのごとき病気を有する患者を治療する方法に指向される。
【００１８】
また、本発明は、存在するアクチンの量を測定し、患者がアクチン−耐性ＤＮアーゼＩ変異体での治療に適する候補であるか否かを決定するための、患者からの粘性物質（痰）のイン・ビトロ診断アッセイにおけるヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体の使用に指向される。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的は、明細書を全体として考慮すると、当業者に明らかであろう。
【００２０】
【表１Ａ】
2010088452.tif 000002
【００２１】
【表１Ｂ】
2010088452.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒト成熟ＤＮアーゼＩのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を上記表１及び図１に示す。数字は該配列内のアミノ酸残基の順次の位置を示す。  図２−図６は以下の変異体についてのデータを示す：
【図２Ａ】天然ヒトＤＮアーゼＩおよび変異体の相対的比活性を示す。誤差棒は標準偏差（ｎ−重率）。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRヒトＤＮアーゼＩ(Genentech，Inc.，South San Francisco,カリフォルニア州，米国)の相対的比活性は１．０と定義される。天然ヒトＤＮアーゼＩの相対的比活性は、ＤＮＡ−加水分解活性を低下されたヒトＤＮアーゼＩの脱アミド化形態のＰｕｌｍｏｚｙｍｅRの発生によるＰｕｌｍｏｚｙｍｅRのそれよりも大きい(Frenzら，1993年12月23日に公開されたPCT特許出願WO93/25670)。
【図２Ｂ】天然ヒトＤＮアーゼＩおよび変異体の相対的比活性を示す。誤差棒は標準偏差（ｎ−重率）。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRヒトＤＮアーゼＩ(Genentech，Inc.，South San Francisco,カリフォルニア州，米国)の相対的比活性は１．０と定義される。天然ヒトＤＮアーゼＩの相対的比活性は、ＤＮＡ−加水分解活性を低下されたヒトＤＮアーゼＩの脱アミド化形態のＰｕｌｍｏｚｙｍｅRの発生によるＰｕｌｍｏｚｙｍｅRのそれよりも大きい(Frenzら，1993年12月23日に公開されたPCT特許出願WO93/25670)。
【図２Ｃ】天然ヒトＤＮアーゼＩおよび変異体の相対的比活性を示す。誤差棒は標準偏差（ｎ−重率）。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRヒトＤＮアーゼＩ(Genentech，Inc.，South San Francisco,カリフォルニア州，米国)の相対的比活性は１．０と定義される。天然ヒトＤＮアーゼＩの相対的比活性は、ＤＮＡ−加水分解活性を低下されたヒトＤＮアーゼＩの脱アミド化形態のＰｕｌｍｏｚｙｍｅRの発生によるＰｕｌｍｏｚｙｍｅRのそれよりも大きい(Frenzら，1993年12月23日に公開されたPCT特許出願WO93/25670)。
【図２Ｄ】天然ヒトＤＮアーゼＩおよび変異体の相対的比活性を示す。誤差棒は標準偏差（ｎ−重率）。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRヒトＤＮアーゼＩ(Genentech，Inc.，South San Francisco,カリフォルニア州，米国)の相対的比活性は１．０と定義される。天然ヒトＤＮアーゼＩの相対的比活性は、ＤＮＡ−加水分解活性を低下されたヒトＤＮアーゼＩの脱アミド化形態のＰｕｌｍｏｚｙｍｅRの発生によるＰｕｌｍｏｚｙｍｅRのそれよりも大きい(Frenzら，1993年12月23日に公開されたPCT特許出願WO93/25670)。
【図３】光吸収増加アッセイで測定したごとく、アクチンの存在下におけるヒトＤＮアーゼＩ活性のＤＮＡ−加水分解活性およびヒトＤＮアーゼＩの単一残基変異体を示す。「パーセント活性」は実施例３に記載したごとくに計算したＤＮアーゼＩ（天然または変異体）のパーセントＤＮＡ−加水分解活性であり；アクチンの不存在下におけるＤＮアーゼＩのＤＮＡ−加水分解活性が１００パーセント活性であると定義される。誤差棒は標準偏差を表す。
【図４】光吸収増加アッセイまたはメチルグリーンアッセイで測定した、アクチン存在下における天然ヒトＤＮアーゼＩおよびヒトＤＮアーゼの複数残基変異体のＤＮＡ−加水分解活性を示す。「パーセント活性」は実施例３に記載したごとくに計算したＤＮアーゼＩ（天然または変異体）のパーセントＤＮＡ−加水分解活性であり；アクチンの不存在下におけるＤＮアーゼＩのＤＮＡ−加水分解活性が１００パーセント活性と定義される。誤差棒は標準偏差を表す。
【図５Ａ】（実施例３に記載した）アクチン結合ＥＬＩＳＡアッセイで測定したアクチンに対するヒトＤＮアーゼＩ変異体の相対的結合親和性を示す。ＥＣ50値は該アッセイにおいて最大信号の半分を与えるのに必要なＤＮアーゼＩ（天然または変異体）の濃度である。誤差棒は標準偏差を表す。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRおよび天然ヒトＤＮアーゼＩに対するＥＣ50値は、各々、６７±２３ｐＭ（ｎ＝３１）および８７±１４ｐＭ（ｎ＝３２）である。図に示される相対的結合親和性は、天然ヒトＤＮアーゼＩにつき測定されたＥＣ50値で除したヒトＤＮアーゼＩ変異体につき測定されたＥＣ50値である。アッセイで測定できたものよりもＥＣ50値がより大きい変異体は、ある値よりも大きい（例えば、＞１０、＞１００、＞３００、＞２０００、＞２００００、＞３５０００）比（ＥＣ50（ＤＮアーゼＩ変異体）／ＥＣ50（天然ＤＮアーゼＩ）を有するものとして示される。
【図５Ｂ】（実施例３に記載した）アクチン結合ＥＬＩＳＡアッセイで測定したアクチンに対するヒトＤＮアーゼＩ変異体の相対的結合親和性を示す。ＥＣ50値は該アッセイにおいて最大信号の半分を与えるのに必要なＤＮアーゼＩ（天然または変異体）の濃度である。誤差棒は標準偏差を表す。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRおよび天然ヒトＤＮアーゼＩに対するＥＣ50値は、各々、６７±２３ｐＭ（ｎ＝３１）および８７±１４ｐＭ（ｎ＝３２）である。図に示される相対的結合親和性は、天然ヒトＤＮアーゼＩにつき測定されたＥＣ50値で除したヒトＤＮアーゼＩ変異体につき測定されたＥＣ50値である。アッセイで測定できたものよりもＥＣ50値がより大きい変異体は、ある値よりも大きい（例えば、＞１０、＞１００、＞３００、＞２０００、＞２００００、＞３５０００）比（ＥＣ50（ＤＮアーゼＩ変異体）／ＥＣ50（天然ＤＮアーゼＩ）を有するものとして示される。
【図５Ｃ】（実施例３に記載した）アクチン結合ＥＬＩＳＡアッセイで測定したアクチンに対するヒトＤＮアーゼＩ変異体の相対的結合親和性を示す。ＥＣ50値は該アッセイにおいて最大信号の半分を与えるのに必要なＤＮアーゼＩ（天然または変異体）の濃度である。誤差棒は標準偏差を表す。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRおよび天然ヒトＤＮアーゼＩに対するＥＣ50値は、各々、６７±２３ｐＭ（ｎ＝３１）および８７±１４ｐＭ（ｎ＝３２）である。図に示される相対的結合親和性は、天然ヒトＤＮアーゼＩにつき測定されたＥＣ50値で除したヒトＤＮアーゼＩ変異体につき測定されたＥＣ50値である。アッセイで測定できたものよりもＥＣ50値がより大きい変異体は、ある値よりも大きい（例えば、＞１０、＞１００、＞３００、＞２０００、＞２００００、＞３５０００）比（ＥＣ50（ＤＮアーゼＩ変異体）／ＥＣ50（天然ＤＮアーゼＩ）を有するものとして示される。
【図５Ｄ】（実施例３に記載した）アクチン結合ＥＬＩＳＡアッセイで測定したアクチンに対するヒトＤＮアーゼＩ変異体の相対的結合親和性を示す。ＥＣ50値は該アッセイにおいて最大信号の半分を与えるのに必要なＤＮアーゼＩ（天然または変異体）の濃度である。誤差棒は標準偏差を表す。ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRおよび天然ヒトＤＮアーゼＩに対するＥＣ50値は、各々、６７±２３ｐＭ（ｎ＝３１）および８７±１４ｐＭ（ｎ＝３２）である。図に示される相対的結合親和性は、天然ヒトＤＮアーゼＩにつき測定されたＥＣ50値で除したヒトＤＮアーゼＩ変異体につき測定されたＥＣ50値である。アッセイで測定できたものよりもＥＣ50値がより大きい変異体は、ある値よりも大きい（例えば、＞１０、＞１００、＞３００、＞２０００、＞２００００、＞３５０００）比（ＥＣ50（ＤＮアーゼＩ変異体）／ＥＣ50（天然ＤＮアーゼＩ）を有するものとして示される。
【図６】圧縮アッセイによって測定した、嚢胞性線維症患者からの痰試料における天然ヒトＤＮアーゼＩおよびヒトＤＮアーゼＩの変異体の粘液溶解活性を示す。誤差棒は平均値の標準偏差を表す。
【図７】実施例３に記載したアクチン結合ＥＬＩＳＡアッセイの模式的表示を示す。
【００２３】
Ｉ．定義
本明細書で用いるごとく、「ヒトＤＮアーゼＩ」、「天然ヒトＤＮアーゼＩ」、および「野生型ＤＮアーゼＩ」なる用語は図１に記載したヒト成熟ＤＮアーゼＩのアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
【００２４】
ヒトＤＮアーゼＩの「変異体」または「アミノ酸配列変異体」は天然ヒトＤＮアーゼＩのそれとは異なるアミノ酸配列よりなるポリペプチドである。一般に、変異体は天然ヒトＤＮアーゼＩと少なくとも８０％の配列同一性（相同性）、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を保有する。パーセンテージ配列同一性は、例えば、最大相同性が供されるように配列を並べた後に、 Fitchら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 80:1382-1386(1983)によってNeedlemanら，J．Mol．Biol．48:443-453(1970)によって記載されたアルゴリズムのバージョン)決定されている。
【００２５】
「ヒトＤＮアーゼＩ−耐性変異体」、「アクチン−耐性変異体」、および「ヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体」なる語は、（１）ＤＮＡ−加水分解活性および（２）アクチンに対する低下した結合親和性を有する天然ヒトＤＮアーゼＩの変異体をいう。
【００２６】
「ＤＮＡ−加水分解活性」とは、基質ＤＮＡを加水分解（切断）して５’−リン酸化オリゴヌクレオチド末端生成物の生成における天然ヒトＤＮアーゼＩまたはヒトＤＮアーゼＩの変異体の酵素活性をいう。ＤＮＡ−加水分解活性は分析用ポリアクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動、光吸収増加アッセイ(Kunitz，J．Gen．Physiol.,33:349-362(1950); Kunitz，J．Gen．Physiol．33:363-377(1950))、またはメチルグリーンアッセイ(Kurnick，Arch．Biochem．29:41-53(1950); Sinicropiら，Anal．Biochem．222;351-35 (1994))を含めた当該分野で公知のいくつかの異なる方法にうちいずれかによって容易に測定される。
【００２７】
アクチンに対する天然ヒトＤＮアーゼＩまたはヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体の「結合親和性」とは、アクチンに非共有結合により結合するＤＮアーゼＩの能力をいう。結合親和性は、例えば、Mannherzら，Eur．J．Biochem．104:367-379(1980)に記載されているごとき、当該分野で公知の種々の方法うちいずれかによって測定できる。別法として、異なるＤＮアーゼ（例えば、天然ヒトＤＮアーゼＩおよびその変異体）の相対的結合親和性は、（実施例３に記載された）ＥＬＩＳＡアッセイにおいて固定化アクチンへのＤＮアーゼの結合を測定することによって、あるいは（やはり実施例３に記載した）アクチンの存在下または不存在下におけるＤＮアーゼのＤＮＡ−加水分解活性を比較することによって決定される。実施例に記載した方法は、特に、アクチンに対する低下した結合親和性を有する変異体を迅速に同定するためにヒトＤＮアーゼＩの変異体をスクリーニングするのに便宜である。
【００２８】
「アクチンに対する低下した結合親和性」を有するヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体は、匹敵する条件下で測定して、天然ヒトＤＮアーゼＩがアクチンに結合する親和性よりも比較的低いアクチンに対する結合親和性を有するものである。もし実施例３に記載されたアクチン結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてアクチンに対するヒトＤＮアーゼＩ（天然または変異体）の結合親和性を測定するならば、「アクチンに対する低下した結合親和性」を有するアクチン−耐性変異体は天然ヒトＤＮアーゼＩのそれよりも大きいＥＣ50値を有するものである。そのアッセイにおいて、アクチン−耐性変異体は、典型的には、天然ヒトＤＮアーゼのそれよりも５−倍ないし１００−倍大きいＥＣ50値を有する；しかし、特に、天然ヒトＤＮアーゼＩアミノ酸配列の複数アミノ酸残基を改変することによって（図５Ａ、５Ｄ参照）、天然ヒトＤＮアーゼＩのそれよりも５００−倍を越えて大きいＥＣ50値を有するアクチン−耐性変異体も容易に産生される。
【００２９】
「粘液溶解活性」とは、例えば、天然ヒトＤＮアーゼＩまたはヒトＤＮアーゼＩの変異体で物質を処理した際に観察される、痰または他の生物学的物質の粘弾性（粘度）の低下をいう。粘液溶解活性は、痰圧縮アッセイ(1994年5月11日に公開されたPCT特許出願WO94/10567)、トーション振子を用いるアッセイ（Janmey． J．Biochem．Biophys．Methods 22:41-53(1991)、または他のレオロジー的方法を含めた当該分野で知られたいくつかの異なる方法のいずれかによって容易に測定される。
【００３０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、一般に、例えば、米国特許第４,６８３,１９５号に記載されているごとき所望の配列のイン・ビトロでの増幅方法をいう。一般に、ＰＣＲ方法は、鋳型核酸に優先的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを用いるプライマー伸長合成の反復サイクルを含む。
【００３１】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は本明細書では相互交換的に使用され、かかる用語は細胞の増殖または培養から得られた子孫を含むと理解されるべきである。「形質転換」および「トランスフェクション」はＤＮＡを細胞に導入するプロセスをいい、相互交換的に使用される。
【００３２】
「作動可能に連結した」とは、配列の通常の機能を行うことができるような相互の配置にて、酵素連結または他の方法によって２以上のＤＮＡ配列を共有結合連結することをいう。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されればポリペブチドのＤＮＡに作動可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーはもしそれが配列の転写に影響するならば暗号配列に作動可能に連結し；あるいはリボソーム結合部位はもしそれが転写を容易とするように位置しているならば暗号配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接しかつリーディング相にあることをいう。連結は、通常の制限部位における連結によって達成される。かかる部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、標準的に組換えＤＮＡ法と組み合わせて用いる。
【００３３】
ここにアミノ酸は以下のごとく３文字または一文字表示によって確認される。
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸     Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン 
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン         Ｌｅｕ Ｌ ロイシン 
Ｓｅｒ Ｓ セリン             Ｔｙｒ Ｙ チロシン 
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸       Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン 
Ｐｒｏ Ｐ プロリン           Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン 
Ｇｌｙ Ｇ グリシン           Ｌｙｓ Ｋ リシン 
Ａｌａ Ａ アラニン           Ａｒｇ Ｒ アルギニン 
Ｃｙｓ Ｃ システイン         Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン 
Ｖａｌ Ｖ バリン             Ｇｌｎ Ｑ グルタミン 
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン         Ａｓｎ Ｎ アスパラギン 
【００３４】
ＩＩ．アクチン−耐性変異体の選択
本発明はヒトＤＮアーゼＩのアミン酸配列変異体の構造、アクチン結合特性、ＤＮＡ−加水分解活性、および粘液溶解活性の研究に基づいている。本発明のアクチン−耐性変異体はＤＮＡ−加水分解活性を有するが、天然ヒトＤＮアーゼＩよりも低い親和性でもってアクチンに結合する。アクチン結合の低下は、好ましくは、例えば、天然ヒトＤＮアーゼＩのＧｌｕ１３、Ｈｉｓ４４、Ｌｅｕ４５、Ｖａｌ４８、Ｇｌｙ４９、Ｌｅｕ５２、Ａｓｐ５３、Ａｓｎ５６、Ａｓｐ５８、Ｈｉｓ６４、Ｔｙｒ６５、Ｖａｌ６６、Ｖａｌ６７、Ｓｅｒ６８、Ｇｌｕ６９、Ｐｒｏ７０、Ｓｅｒ９４、Ｔｙｒ９６およびＡｌａ１１４残基（３文字アミノ酸表示に続く数字は、図１の配列内のアミノ酸残基の特異的位置を示す）を含めた、アクチンの結合に影響するらしい天然ヒトＤＮアーゼＩ内のアミノ酸残基においておよび／またはその周辺に突然変異を作成することによって達成される。
【００３５】
ヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体を作成できる種々の方法がある。本発明の１の具体例において、アクチン−耐性変異体は、アクチン結合に影響する天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸残基においてまたはそれに隣接して（すなわち、その約５アミノ酸残基内に）単一または複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を導入することによって調製される。かかる突然変異のいくつかの例示的例は以下のものである：Ｄ５３Ｒ，Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｅ６９Ｒ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ（図２−６参照）。
【００３６】
本発明のもう１つの具体例において、アクチン−耐性変異体は、アクチン結合に影響する天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸残基においてまたはそれに隣接して（すなわち、その約５アミノ酸残基内に）新しい糖鎖付加部位を生じさせる突然変異を導入することによって調製される。例えば、部位特異的突然変異を用いて、炭水化物部位のアスパラギン側鎖への酵素付着のための認識配列である、１つのトリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここに、Ｘはプロリンを除くいずれかのアミノ酸）を導入する。Creghton,Proteins,76-78頁(W．H．Freeman，1984)。得られたＮ−グリコシル化変異体ＤＮアーゼＩおよびアクチンの炭水化物部位の間に起こる立体障害は、天然ヒトＤＮアーゼＩと比較して、アクチン結合およびＤＮアーゼＩＤＮＡ−加水分解活性の結果としての阻害を低下させまたは妨げる。新しいグリコシル化部位を導入するためのかかる突然変異のいくつかの例示的例は以下の通りである：Ｈ４４Ｎ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｓ、Ｖ６６Ｎ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔ。
【００３７】
所望により、新しいグリコシル化部位を生じさせるためのかかる突然変異と組み合わせて、アクチン−耐性変異体で望まれるグリコシル化の程度に応じて、天然ヒトＤＮアーゼＩアミノ酸配列内の１８および／または１０６位において天然に起こるグリコシル化部位を欠失させることもできる。
【００３８】
本発明のさらなる具体例において、部位特異的突然変異誘発を用いて、生物学的にまたは化学的に（後記参照）翻訳後修飾に適したアクチン結合に関与する天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸残基においてまたは隣接して（すなわち、その約５アミノ酸残基内に）導入する。Meansら，「蛋白質の化学修飾（Holden-Day，1971）；Glazerら，「蛋白質の化学修飾：選択された方法および分析手法（Elsevier,1975）；Creighton，Proteins，70-87(W.H.Freeman，1984); Lundblad，「蛋白質修飾のための化学試薬」(CRC Press，1991)。かかる翻訳後修飾はＤＮアーゼＩに立体障害または改変された静電気的特性を導入することができ、これは天然ヒトＤＮアーゼＩと比較して、アクチン結合およびＤＮＡ−加水分解活性の結果としての阻害を低下させまたは妨げる。例えば、システイン残基をアクチン結合に関与する天然ヒトＤＮアーゼＩの残基においてまたはそれに隣接して導入することができる。システイン残基の遊離チオールはもう１つのかかるＤＮアーゼＩ変異体とで分子間ジスルフィド結合を形成してＤＮアーゼＩダイマーを形成でき、あるいは、例えばチオール−特異的アルキル化剤で修飾することができる。かかる突然変異のいくつかの例示的例は以下の通りである：Ｈ４４Ｃ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｎ５６Ｃ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ。
【００３９】
便宜のために、天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸配列における置換、挿入および／または欠失は、通常、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、天然ヒトＤＮアーゼＩをコードするＤＮＡに対応するヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって作成される。次いで、突然変異ＤＮＡの発現の結果、所望の（非天然）アミノ酸配列を有する変異体ヒトＤＮアーゼＩが得られる。
【００４０】
Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989))に開示されているごとき当該分野で公知のいずれの技術を用いて部位特異的突然変異誘発を行うこともできるが、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発が本発明のヒトＤＮアーゼＩ変異体を調製するための好ましい方法である。当該分野でよく知られているこの方法(Zollerら，Meth．Enz．100:4668-500(1983); Zollerら，Meth．Enz．154:329-350(1987); Carter，Meth，Enz．154:382-403(1987); Kunkelら，Meth．Enzymol．154 :367-382(1987); Horwitzら，Meth，Enz．185:599-611(1990))は置換変異体を作成するのに特に適しているが、便宜に欠失および挿入変異体を調製するのに使用することもできる。
【００４１】
部位特異的突然変異誘発は、典型的には、一本鎖および二本鎖形態双方で存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発で有用な典型的ベクターは一本鎖ファージの複製起点を含有するＭ１３ファージおよびプラスミドベクターを含む(Messingら，Meth．Enzymol．101:20-78(1983); Veriaら，Meth． Enzymol．153:3-11(1987); Shortら，Nuc．Acids．Res．16:7583-7600(1988))。適当な宿主細胞におけるこれらのベクターの複製の結果、部位特異的突然変異誘発で使用できる一本鎖ＤＮＡが合成される。
【００４２】
略言すれば、天然ヒトＤＮアーゼＩ（またはその変異体）をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を行うにおいて、ＤＮＡの一本鎖に所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをまずハイブリダイズさせることによってＤＮＡを改変する。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、およびＤＮＡの一本鎖を鋳型として用い、全第２鎖を合成する。かくして、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドが得られた二本鎖ＤＮＡ中に取り込まれる。
【００４３】
ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、天然に生じるＤＮＡの精製により、あるいはイン・ビトロ合成によるなどしていずれかの適当な方法によって調製できる。例えば、オリゴヌクレオチドは、Narangら，Meth，Enzymol．68:90-98(1979); Brownら，Meth．enzymol．68:109-151(1979); Caruthersら，Meth．Enzymol．154：287-313(1985)によって記載されているごとき、有機化学における種々の技術を用いて容易に合成される。適当なハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーに対する一般的なアプローチはよく知られている。Kellerら，DNA Probes，11-18頁(stockton Press，1989)。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーは１０−２５またはそれ以上のヌクレオチドを含有し、所望の突然変異をコードする配列のいずれか側に少なくとも５のヌクレオチドを含んで、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に対して所望の位置に優先的にハイブリダイズすることを確実とする。
【００４４】
勿論、部位特異的突然変異誘発を用いて多数の置換、挿入または欠失突然変異を出発ＤＮＡに導入することができる。突然変異させるべき部位が相互に近くに位置すれば、突然変異は所望の突然変異の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを用いて同時に導入することができる。しかしながら、もし突然変異されるべき部位が相互にいくらか距離があれば（約１０ヌクレオチドを越えて離れていれば）、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生じさせるのはより困難である。代わりに、２つの別の方法のうち１つを使用することができる。
【００４５】
第１の方法において、各所望の突然変異に対して別のオリゴヌクレオチドを生成させる。次いで、オリゴヌクレオチドを同時に一本鎖鋳型ＤＮＡにアニールさせ、鋳型から合成されたＤＮＡの第２鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードするであろう。
【００４６】
別の方法は、所望の変異体を生成させるために２以上のラウンドの突然変異誘発を含む。第１のラウンドは単一の突然変異を導入するものとして記載される。第２のラウンドの突然変異誘発は第１のラウンドで生成した突然変異ＤＮＡを鋳型として利用する。かくして、この鋳型は１以上の突然変異を全てに含有する。次いで、さらなる所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせ、ＤＮＡの得られた鎖は今や第１および第２ラウンドの突然変異誘発双方からの突然変異をコードする。この得られたＤＮＡは第３ラウンドの突然変異誘発で使用される。
【００４７】
また、ＰＣＲ突然変異誘発（Higuchi，PCR Protocols,177-183頁(Academic Press，1990)；Valletteら，Nuc．Acids Res．17: 723-733(1989)はヒトＤＮアーゼＩの変異体を作成するのに適する。略言すれば、少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおける出発物質として使用する場合、鋳型ＤＮＡにおける対応する領域から配列がわずかに異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型と異なる位置のみにおける鋳型配列とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片を得る。突然変異のプラスミドＤＮＡへの導入には、例えば、プライマーの１つの配列は所望の突然変異を含み、突然変異の位置のプラスミドＤＮＡの１の鎖にハイブリダイズするように設計され；他のプライマーの配列はプラスミドＤＮＡの反対側鎖内のヌクレオチド配列と同一でなければならないが、この配列はプラスミトＤＮＡに沿ってどこに位置させることもできる。しかしながら、第２のプライマーの配列は、結局はプライマーと境界を接するＤＮＡの全増幅領域が容易に配列決定できるように、第１のもののそれから２００ヌクレオチド内に位置させるのが好ましい。丁度記載したもののようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅の結果、プライマーによって特定される突然変異の位置において異なるＤＮＡ断片の集団が得られ、恐らくは他の位置において、鋳型のコピは幾分エラーを生じやすい。Wagnerら，PCR Topics，69-71頁(Springer-Verlag，1991)。
【００４８】
もし生成物増幅ＤＮＡに対する鋳型の比が極端に低ければ、生成物ＤＮＡ断片の大部分は所望の突然変異を取り込む。この生成物ＤＮＡを用いて、標準的な組換えＤＮＡ法を用い、ＰＣＲ鋳型として働くプラスミド中の対応する領域を置き換える。別々の位置における突然変異は、突然変異体第２プライマーを用いるか、あるいは異なる突然変異体プライマーで第２ＰＣＲを行い、２つの得られたＰＣＲ断片を同時に３（またはそれ以上）部分連結でプラスミド断片に連結することによって同時に導入できる。
【００４９】
変異体、カセット突然変異誘発を調製するためのもう１つの方法は、Wellsら，Gene 34:315-323(1985)によって記載されている技術に基づく。出発物質は突然変異させるべきＤＮＡ配列よりなるプラスミド（または他のベクター）である。突然変異させるべき出発ＤＮＡにおけるコドンを同定する。同定された突然変異部位の各側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。もしかかる制限部位が存在しなければ、前記したオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発法を用いてそれらをＤＮＡの適当な位置に導入してそれらを生成させることができる。プラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断してそれを線状化する。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが所望の突然変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを標準的な手法を用いて合成し、ここに、オリゴヌクレオチドの２つの鎖は別々に合成し、次いで、標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットは、それをプラスミドに直接連結できるように線状化プラスミドの末端に適合する５’および３’末端を有するように設計する。得られたプラスミドは突然変異したＤＮＡ配列を含有する。
【００５０】
ＤＮＡにおける突然変異の存在は、制限マッピングおよび／またはＤＮＡ配列決定を含めた当該分野でよく知られた方法によって測定される。ＤＮＡ配列決定についての好ましい方法はSangerら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 72:3918-3921 (1979)のジデオキシ鎖停止法である。
【００５１】
ヒトＤＮアーゼＩ変異体をコードするＤＮＡを、さらなるクローニングまたは発現のための複製可能なベクターに挿入する。「ベクター」は宿主細胞内で複製でき、それ自体適合する宿主細胞と組み合わせて２つの機能を行うのに有用であるベクターおよびその他のＤＮＡである（ベクター−宿主系）。１の機能はヒトＤＮアーゼＩ変異体をコードする核酸のクローニングを容易とする、すなわち、利用できる量の核酸を生成させるものである。他の機能はヒトＤＮアーゼＩ変異体の発現を指示するものである。これらの機能の１つまたは双方は、クローニングまたは発現に用いる特定の宿主細胞においてベクターによってなされる。ベクターはそれらが行う機能に応じて異なる要素を含有する ヒトＤＮアーゼＩ変異体を生成させるには、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した前記した変異体をコードするＤＮＡおよびリボソーム結合部位よりなる。次いで、変異体を組換え細胞培養中で直接に、あるいは異種ペプチド、好ましくは異種ポリペプチドおよびヒトＤＮアーゼＩ変異体との間の連結において特異的切断部位を有する単一配列または他のポリペプチドとの融合として発現させる。
【００５２】
原核生物(例えば、イー・コリ(E．coli)および他の細菌)は本発明の最初のクローニング工程で好ましい宿主細胞である。それらは、大量のＤＮＡの迅速な産生、部位特異的突然変異誘発で用いる一本鎖ＤＮＡ鋳型の産生、および生じた変異体のＤＮＡ配列決定で特に有用である。また、原核生物宿主細胞をヒトＤＮアーゼＩ変異体をコードするＤＮＡの発現で使用することもできる。原核生物細胞で産生されるポリペプチドは典型的にはグリコシル化されていない。
【００５３】
加えて、本発明のヒトＤＮアーゼＩ変異体は、真核生物微生物（他えば、酵母）または動物または他の多細胞生物に由来する細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、および他の哺乳動物細胞）を含めた真核生物宿主細胞で、あるいは生きた動物（例えば、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ）で発現させることができる。
【００５４】
クローニングおよび発現方法は当該分野でよく知られている。本発明のヒトＤＮアーゼＩ変異体を産生するのに用いるので有用な原核生物および真核生物宿主細胞、ならびに発現ベクターは、例えば、Shak，PCT特許出願WO90/07572(1990年 7月12日公開)に開示されているものである。
【００５５】
原核生物細胞または実質的な細胞壁構築を含有する細胞を宿主として用い、ＤＮＡでの細胞のトランスフェクションの好ましい方法はCohenら，Proc．Natl．Acad．Sci．69:2110-2114(1972)によって記載されているカルシウム処理法または Chungら，Nuc．Acids．Res．16:3580(1988)のポリエチレングリコール法である。酵母を宿主として用いるのならば、トランスフェクションは一般にHinnen，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75:1929-1933(1978)によって教示されているごとくポリエチレングリコールを用いて達成される。哺乳動物細胞を宿主細胞として用いるならば、トランスフェクションは一般にリン酸カルシウム沈殿法によって行う。Grahamら，Virology，52:546(1978)，Gormanら，DNA and Protein Eng．tech．2:3-10(1990)。核注入、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合のごとき、ＤＮＡを原核生物細胞および真核生物細胞にＤＮＡを導入する他の公知の方法も本発明で用いるのに適する。
【００５６】
本発明で特に有用なのは、ヒトＤＮアーゼＩ変異体をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞において一過性発現を供する発現ベクターである。一般に、一過性発現は、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積し、発現ベクターによってコードされる高レベルの所望のポリペプチドのを合成するように、宿主細胞で効果的に複製できる発現ベクターの使用を含む。適当な発現ベクターおよび宿所細胞よりなる一過性発現系は、クローン化ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの便宜な陽性同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性につきかかるポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能とする。Wongら，Science 228:810-815(1985); Leeら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 82:4360-4364(1985); Yangら，Cell 47:3-10(1986)。かくして、一過性発現系は、天然ヒトＤＮアーゼＩよりも低い親和性をもってアクチンに結合する変異体を同定するためのアッセイならびにＤＮＡ−加水分解活性を持つ変異体を測定するためのアッセイと組み合わせて、天然ヒトＤＮアーゼＩのアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡを発現させるのに便利に使用される。
【００５７】
ヒトＤＮアーゼＩ変異体は、好ましくは、それが発現される宿主細胞から分泌させ、その場合、変異体は宿主細胞が増殖する培養培地から回収される。その場合、無血清培地で細胞を増殖させるのが望ましいであろう。というのは、血清蛋白質および他の血清成分の培地中での不存在は、変異体の精製を容易とするからである。もしそれが分泌されないならば、ヒトＤＮアーゼＩ変異体は宿主細胞の溶解物から回収する。変異体がヒト起源のもの以外の宿主細胞で発現される場合、該変異体はヒト起源の蛋白質は完全に含まない。とにかく、ヒトＤＮアーゼＩ変異体の実質的に均質な調製物を得るためには、組換え細胞蛋白質から変異体を精製する必要がある。治療的使用では、精製された変異体は、好ましくは、９９％より大きい純度であろう（すなわち、いずれの他の蛋白質も精製された組成物中、１％未満の全蛋白質よりなるであろう）。
【００５８】
一般に、ヒトＤＮアーゼＩ変異体の精製は、それが会合するかも知れない汚染物と比較して、変異体の異なる物理化学的特性を利用することによって達成される。例えば、第１工程として、培養培地または宿主細胞溶解物を遠心して、粒状細胞夾雑物を除去する。しかる後、例えば、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、ゲル濾過（分子排除クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー（例えば、Sepharoseにカップリングさせた抗−ヒトＤＮアーゼＩ抗体を使用）、テンタクル(tentacle)カチオン交換クロマトグラフィー(Frenzら，PCT特許出願WO93/25670、1993年12月23日)、逆相ＨＰＬＣおよび／またはゲル電気泳動によって、ヒトＤＮアーゼＩ変異体を汚染可溶性蛋白質およびポリペプチドから精製する。
【００５９】
勿論、当業者ならば、天然ヒトＤＮアーゼＩで用いる精製法はヒトＤＮアーゼＩ変異体を精製するのに有用であって、天然および変異体蛋白質の間の構造的および他の差異を説明するためにはいくからの修飾が必要である。例えば、いくつかの宿主細胞（特に細菌宿主細胞）では、ヒトＤＮアーゼＩ変異体は最初に不溶性で会合した形態（当該分野では「屈折体」または「封入体」という）で発現させることができ、この場合、この精製の間にヒトＤＮアーゼＩ変異体を可溶化させ、復元させる必要があろう。組換え蛋白質屈折体を可溶化させ復元する方法は当該分野で公知である(例えば、Builderら，米国特許第4,511,502号参照)。
【００６０】
本発明のもう１つの具体例において、ヒトＤＮアーゼＩ変異体は直接天然または変異体ヒトＤＮアーゼＩ蛋白質において共有結合修飾をなすことによって調製される。かかる修飾を施してアクチン結合または蛋白質のもう１つの特性（例えば、安定性、生物学的半減期、免疫原性）に影響を与え、これは前記したアミノ酸配列置換、挿入および欠失の代わりにまたはそれに加えてなすことができる。
【００６１】
共有結合修飾は天然または変異体ヒトＤＮアーゼＩの標的化アミノ酸残基を、選択されたアミノ酸側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって導入できる。適当な誘導体化剤および方法は当該分野でよく知られている。
【００６２】
例えば、システイニル残基は最も普通にはクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのごときα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。また、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化する。
【００６３】
ヒスチジル残基はｐＨ５.５−７.０でのジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化する。何故ならば、この剤はヒスチジル側鎖に比較的特異的だからである。パラーブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は好ましくはｐＨ６.０にて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行う。
【００６４】
リシニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの剤での誘導体化はリシニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬はメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼ−触媒のグリオキシレートとの反応のごときイミドエステルを含む。アルギニル残基は１または数種の通常の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため該反応をアルカリ性条件下で行う必要がある。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニンのイプシロンアミノ基と反応させることもできる。
【００６５】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのごときカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００６６】
グリコシドの蛋白質のアミノ残基への共有結合カップリングを用いて、特にアクチン結合に関与する残基においてまたはそれに隣接して、炭水化物置換基の数またはプロフィールを修飾しまたは増加させることができる。使用するカップリング様式に応じて、糖を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのそれらのごとき遊離スルノヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのそれらのごとき遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのそれらのごとき芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。適当な方法は、例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）、およびAplinら，CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306頁(1981)に記載されている。
【００６７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒト血清アルブミンのごとき剤のヒトＤＮアーゼＩ変異体への共有結合は、他の蛋白質で観察されているごとく、変異体の免疫原性および／または毒性を減じ、および／またはその半減期を延長する。Abuchowskiら，J．Biol．Chem．252:3582-3586(1977);Poznanskyら，FEBS Letters 239:18-22(1988); Goodsonら，Biotechnology 8:343-346(1990); Katre，J．Immunol．144:209-213(1990);Harris，Polyethylene Glycol Chemistry(Plenum Press，1992)。加えて、アクチン結合に影響するアミノ酸残基におけるまたはそれに隣接して（すなわち、その約５個のアミノ酸残基内においての）これらの剤による天然ヒトＤＮアーゼＩまたはその変異体の修飾の結果、アクチン−耐性変異体を得ることができる。
【００６８】
さらなる具体例において、ヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体は、ＤＮアーゼＩ変異体の脱アミドを低下させまたは妨げるために、天然ヒトＤＮアーゼＩアミノ酸配列の７４位で起こるＡｓｎ残基における突然変異（例えば、Ｎ７４Ｄ、Ｎ７４ＫまたはＮ７４Ｓ突然変異）を含むことができる。Frenzら，PCT特許出願WO93/25670(1993年12月23日公開)。もう１つの例として、ヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体は、痰および他の生物学的物質に存在し得るプロテアーゼ（例えば、好中球エステラーゼ）による分解に対する変異体の感受性を低下させるアミノ酸配列突然変異または他の共有結合修飾を含むことができる。
【００６９】
前記したごときヒトＤＮアーゼＩ変異体のＤＮＡ−加水分解活性およびアクチン−結合親和性は、当該分野で公知であるおよび本明細書に記載したアッセイおよび方法を用いて容易に決定される。（前記定義の）ＤＮＡ−加水分解活性および低下したアクチンに対する結合親和性を有するいずれのかかる変異体も本発明の範囲内にあるアクチン−耐性変異体である。
【００７０】
本発明のヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体は痰、粘液、または他の分泌のごときＤＮＡ−含有物質の粘弾性を低下させるために用いられる。かかる変異体は、異常粘性または濃厚分泌を有する肺病ならびに感染性肺炎、気管支炎または気管気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、喘息、結核および真菌類感染を含めた急性もしくは慢性の肺病を持つ患者の治療で特に有用である。かかる治療では、アクチン−耐性変異体の溶液または微粉砕乾燥調製物を、例えば、エアロゾル処理によって患者の気道（例えば、気管支）または肺に常法により注入する。
【００７１】
また、アクチン−耐性変異体は蓄膿症、髄膜炎、膿瘍、腹膜炎、静脈洞炎、耳炎、歯周炎、心膜炎、膵臓炎、胆石症、心内膜炎および敗血症性関節炎のごとき疾患における膿瘍または重症の狭域感染の付加的治療ならびに皮膚および／または粘膜、外科的負傷、潰瘍性病巣および火傷の感染病巣のごとき種々の炎症および感染病巣の局所治療でも有用である。アクチン−耐性変異体はかかる感染の治療の治療で用いられる抗体の効率を改良できる（例えば、ゲンタマイシン活性は無傷ＤＮＡに対する可逆的結合によって顕著に低下する）。
【００７２】
また、天然ヒトＤＮアーゼＩおよびそのアクチン−耐性変異体は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、種々の自己抗体の産生によって特徴付けられる生命を脅かす自己免疫疾患の治療でも有用であり得る。ＤＮＡは免疫合併症の主要な抗原成分である。この場合には、ヒトＤＮアーゼＩ（天然または変異体）は、例えば、罹病患者への静脈内、皮下、鞘内、または筋肉内投与によって全身投与できる。
【００７３】
また、天然ヒトＤＮアーゼＩおよびそのアクタン−耐性変異体は、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、喘息、肺炎または他の肺病を有する患者、またはその呼吸が通気器または他の機械的デバイスによって助力される患者、または呼吸器系感染の発生の危険がある他の患者、例えば手術後患者で起こり得るごとき、呼吸器系感染の新しい発生および／または悪化を防止するのにも有用であり得る。
【００７４】
アクチン−耐性変異体は公知の方法に従って処方して治療上有用な組成物を調製することができる。好ましい治療組成物は緩衝化または非緩衝化水溶液中のアクチン−耐性変異体の溶液、好ましくはｐＨ７の１.０ｍＭ塩化カルシウムを含有する１５０ｍＭ塩化ナトリウムのごとき等張塩溶液である。これらの溶液は罹患患者の気道または肺に直接投与するのに有用なジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた商業的に入手可能な噴霧器で用いるのに特に適合する。
【００７５】
もう１つの具体例において、治療組成物は、実質的には同時係属米国特許出願第０８／２０６,０２０号（１９９４年３月４日出願）に記載されているアクチン−耐性変異体の溶液のスプレイ−乾燥によって好ましくは調製されたアクチン−耐性変異体の乾燥粉末よりなる。
【００７６】
さらなる具体例において、治療組成物はヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体を活性に産生する細胞よりなる。かかる細胞は患者の組織に直接導入することができるか、あるいは多孔性膜内にカプセル化でき、次いで、これを患者に移植することができ、いずれの場合においても、増大した濃度のＤＮＡ−加水分解活性が必要な患者の体内の領域へのアクチン−耐性変異体の送達を提供する。例えば、ヒトＤＮアーゼＩのアクチン−耐性変異体をコードするＤＮＡで患者自身の細胞がイン・ビボまたはエクス・ビボにて形質転換され得、従って、患者内で直接ＤＮアーゼＩを産生させるのに使用される。
【００７７】
治療上有効量のアクチン−耐性ヒトＤＮアーゼＩ変異体は、例えば、処理すべき物質中のＤＮＡおよびアクチンの量、治療対象、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。従って、治療者が用量を力価測定し、最適治療効果を得るのに必要な投与経路を修飾することが必要であろう。天然ヒトＤＮアーゼＩに対するアクチンの存在下におけるアクチンに対するその低下した結合親和性およびその結果増大したＤＮＡ−加水分解活性に鑑みると、治療効果を達成するのに要するアクチン−耐性変異体の量は、同一条件下で同一効果を達成するのに必要な天然ヒトＤＮアーゼＩの量よりも低いであろう。一般に、アクチン耐性変異体の治療上有効量は、本明細書に記載した医薬組成物内にて投与される、患者の体重１ｋｇ当たり約０.１μｇないし約５ｍｇの変異体の投与量であろう。
【００７８】
アクチン−耐性ＤＮアーゼＩ変異体は、所望により、抗生物質、気管支拡張剤、抗炎症剤、粘液溶解剤（例えば、ｎ−アセチル−システイン）、アクチン結合またはアクチン切断蛋白質（例えば、ゲルソリン；Matsudariaら，Cell 54:139-140(1988); Stosselら，PCT特許出願WO94/22465(1994年10月13日公開)、プロテアーゼ阻害剤、または遺伝子治療製品(例えば、嚢胞性線維症経膜コンダクタンス調節剤（ＣＦＴＲ）遺伝子、Riordanら、Science 245:1066-1073(1989))のごとき、前記リストの疾患を治療するのに用いる１以上の他の薬理剤と組み合わせるかまたはそれと共に投与することもできる。
【００７９】
以下の実施例は例示のためのみに供し、断じて本発明を限定する意図のものではない。本明細書で引用した全ての特許および文献は明示的に本明細書の一部とみなす。
【実施例】
【００８０】
実施例１  ヒトＤＮアーゼＩの突然変異誘発 
Chungら(Nuc．Acids Res．16:3580(1988)の方法を用いて、イー・コリ(E．coli)株ＣＪ２３６（BioRad Laboratories，リッチモンド，カリフォルニア州米国）をプラスミドｐＲＫ．ＤＮアーゼ３.で形質転換した。本発明を作成するのに用いたプラスミドｐＲＫ．ＤＮアーゼ３.は、ヒトＤＮアーゼＩをコードする核酸配列が図１に示したものである以外はＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０７５７２（１９９０年７月１２日公開）に記載された通りである。形質転換細胞を５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に置き、３７℃で一晩増殖させた。５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｌ ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Stratagene，La Jolla，カリフォルニア州米国）を含有する２ＹＴブロス（５ｍｌ）を寒天プレートからの個々のコロニーで接種し、撹拌しつつ３７℃で一晩増殖させた。一本鎖ＤＮＡをこの培養から単離し、引き続いての突然変異誘発用の鋳型として用いた。
【００８１】
部位特異的突然変異誘発はKunkelら(Meth．Enzymol．154:367-382(1987)の方法に従って合成オリゴヌクレオチドを用いて達成された。突然変異原オリゴヌクレオチドは誤対合コドンの５’側の９または１２の正確な塩基対合および誤対合コドンの３’側の９つの正確な塩基対合を有する２１−量体または２４−量体であった。突然変異誘発に続き、個々のクローンからの一本鎖ＤＮＡをジデオキシ配列決定(Sangerら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 74:5463-5467(1977))に付した。次いで、変異体ヌクレオチド配列を有するＤＮＡを前記したごとくにイー・コリ株ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’(Stratagene)に形質転換した。平板培養および前記単一コロニー単離の後、個々のコロニーを用いて５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する０.５リットルＬＢブロスを接種した。撹拌しつつの３７℃における一晩の増殖に続き、細胞を遠心によって収穫し、Ｑｉａｇｅｎチップ−５００カラム(Qiagen Inc.，Chatsworth，カリフォルニア州米国)を用いて変異体ＤＮＡ（発現ベクター中）を精製した。
【００８２】
図２−６は作成された異なるヒトＤＮアーゼＩ変異体を示す。図においておよび明細書を通じて、ＤＮアーゼＩに存在するアミノ酸置換突然変異の表示は最初のアルファベット文字、数および第２のアルファベット文字により省略する。最初のアルファベット文字は天然（野生型）ヒト成熟ＤＮアーゼＩにおけるアミノ酸残基の１文字省略であり、数字は天然ヒト成熟ＤＮアーゼＩにおけるその残基の位置を示し（図１に示すナンバリング）、および第２のアルファベット文字は変異体ＤＮアーゼＩにおけるその位置におけるアミノ酸残基の１文字省略である。例えば、Ｄ５３Ｒ突然変異を有するＤＮアーゼＩ変異体において、天然ヒト成熟ＤＮアーゼＩにおける５３位のアスパラギン酸（Ｄ）残基はアスパラギン（Ｒ）残基によって置き換えられている。単一変異体における複数突然変異は同様に表示され、変異体に存在する異なる突然変異の各々をコロン（：）で離す。例えば、表示Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａは変異体がＤ５３Ｒ突然変異およびＹ６５Ａ突然変異を有することを示す。
【００８３】
実施例２  ヒトＤＮアーゼ変異体の発現
ヒト胚性腎臓２９３細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ １５７３，American Type Culture Collection，Rockville，メリーランド州米国)を、１５０ｍｍプラスチック製ペトリ皿を含有する血清中で増殖させた。リン酸カルシウム法（Gormanら，DNA and Protein Eng．Tech．2:3-10(1990)）を用い、対数相細胞を２２.５μｇの精製変異体ＤＮＡ（前記のごとく調製）および１７μｇアデノウイルスＤＮＡで一過的に共トランスフェクトした。トランスフェクション１６時間後に、細胞を１５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、培地を無血清培地に変えた。１回目は無血清培地変更から２４時間または７２時間後に、最後は９６時間後に細胞培養培地の２回の収穫を各プレートから採った。ＤＮアーゼＩ変異体を含有する合計ほぼ５０ｍｌの細胞培養上清をこのようにして得た。各プレートから収集した培養上清のプールを、Centriprep１０濃縮器で５ないし５０倍濃縮し、濃縮物をアッセイして、ＤＮアーゼＩ変異体の種々の生化学的および生物学的活性を測定した。
【００８４】
２９３細胞をプラスミドｐＲＫ．ＤＮアーゼ.３.で一過的にトランスフェクトした以外は前記したのと同一の手法によって、天然ヒトＤＮアーゼを含有する濃縮物を調製した。
【００８５】
実施例３  ヒトＤＮアーゼＩ変異体の生化学的および生物学的活性
Ｉ．相対的特異的活性
ＤＮアーゼＩ変異体の相対的特異的活性は２つの異なるアッセイにおいて変異体の活性を天然ヒトＤＮアーゼＩのそれと比較することによって評価した。特に、変異体の相対的特異的活性はメチルグリーン活性で測定した変異体の濃度(μg/mlで表す)(Sinicropiら，Anal．Biochem．222:351--358(1994); Kurmick，Arch． Biochem．29:41-53(1950))をＤＮアーゼＩ ＥＬＩＳＡアッセイ（後記）で測定した変異体（μｇ／ｍｌ）の濃度で割ったものと定義される。メチルグリーン活性アッセイおよびＤＮアーゼＩ ＥＬＩＳＡアッセイ双方において、ＰｕｌｍｏｚｙｍｅRヒトＤＮアーゼＩを用いて標準曲線を決定した。天然ヒトＤＮアーゼＩおよび変異体の相対的特異的活性を図２Ａ−Ｄに示す。
【００８６】
メチルグリーン活性アッセイ（Sinicropiら，Anal．Biochem．222:351-358(1994); Kurnick，Arch．B1ochem.29:41-53(1950))はメチルグリーン色素を利用し、これはＤＮＡにおいてほぼ１０塩基毎にインターカレートし、その結果緑色の基質が得られる。ＤＮＡがＤＮアーゼＩによって切断されるので、メチルグリーン色素は放出され、無色形態まで酸化される。かくして、緑色の喪失はアッセイ試料に添加されたＤＮアーゼＩの量に比例する。次いで、アッセイで存在するＤＮアーゼＩの量は既知量のＤＮアーゼＩをアッセイすることによって調製された標準曲線との比較によって定量される。
【００８７】
ＤＮアーゼＩ ＥＬＩＳＡアッセイはマイクロタイタープレートをヤギ抗−ＤＮアーゼＩポリクローナル抗体で被覆し、アッセイすべき試料を添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたウサギ抗−ＤＮアーゼＩポリクローナル抗体とのいずれの得られた結合ＤＮアーゼＩも検出することを含む。ＨＲＰ基質および色発色剤を添加すると、色発生は試料に存在するＤＮアーゼＩの量に比例する。次いで、既知量のＤＮアーゼＩをアッセイすることによって調製された標準曲線との比較によって、アッセイに存在するＤＮアーゼＩの量を定量する。
【００８８】
両アッセイにおいて、試料の複数希釈をアッセイし、標準曲線の中央範囲に入る値を平均し、標準偏差を計算した。
【００８９】
また、ＤＮアーゼＩ ＥＬＩＳＡによって測定したＤＮアーゼＩ濃度を用いて、ＤＮアーゼＩ変異体を特徴付けた他のアッセイ（例えば、後記するアクチンによる阻害のアッセイ）においてＤＮアーゼＩ濃度を標準化した。
【００９０】
ＩＩ．ＤＮアーゼＩ加水分解活性のアクチン阻害
Ｇ−アクチン(Kabshら，Ann．Rev．Biophys．Biomol．Struct．21: 49-76(1992)))は、アクチン（商業的に入手した(Sigma，セントルイス，ミズリー州米国）あるいはPardeeら，Meth．enzymol．85:164-181(1982)の方法によって調製)の１ｍｇ／ｍｌ溶液を４℃にて５ｍＭ ＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２、０.２ｍＭ ＣａＣｌ2、０.５ｍＭ ＡＴＰ、０.５ｍＭ β−メルカプトエタノールに対して一晩透析することによって調製した。１３,０００×ｇにおける５分間の遠心の後、２９０ｎｍにおける吸光度を測定することによってＧ−アクチンの量を定量し；１ｍｇ／ｍｌ溶液は０.６６ＯＤの吸光度を有する。完全ではないが実質的に（＞５０％阻害）に天然ヒトＤＮアーゼＩのＤＮＡ−加水分解活性を阻害するのに要するＧ−アクチン調製の量を各アッセイで用いた同一条件下での予備実験で測定した。
【００９１】
アクチン阻害に対する感度は、２つの異なるアッセイ、前記したメチルグリーンアッセイおよびＤＮＡの変性および脱重合に際しての２６０ｎｍにおける吸光度の増加に基づく光吸収増加アッセイ(Kunitz，J．Gen．Physiol．33:349-362(1950); Kunitz，J．Gen．Physiol．33:363-377(1950))いずれかににおいて、アクチンの存在下および不存在下で変異体のＤＮＡ−加水分解活性を測定することによって評価した。これらのアッセイにおいて選択されたパーセント阻害を図３および４に示す。
【００９２】
光吸収増加アッセイにおいて、合計アッセイ容量１.０ｍｌ中の４０μｇＤＮＡを含有するキュベットに添加する前に、濃縮された培養上清（前記したように調製、ＤＮアーゼＩ変異体を含有）を、緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５ ＣａＣｌ2、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１％ＢＳＡ）中の２−ないし３−倍モル過剰のアクチンと共にまたはそれを添加せずに室温にて１時間インキュベートした。アッセイにおけるＤＮアーゼＩ変異体の最終濃度はＤＮアーゼＩ ＥＬＩＳＡによって測定して、ほぼ２６ｎＭであった。アクチンの存在下および不存在下におけるＤＮアーゼＩ変異体によるＤＮＡ加水分解の速度を測定した。図３および４に示すパーセント活性は、アクチンの不存在下におけるＤＮＡ−加水分解活性に対するアクチンの存在下におけるヒトＤＮアーゼＩ（天然または変異体）のＤＮＡ加水分解活性の比を決定し、１００を乗じることによって計算した。
【００９３】
メチルグリーンアッセイにおいて、（前記したごとく調製し、ＤＮアーゼＩ変異体を含有する）濃縮された培養上清を緩衝液Ｂ(２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.５、４ｍＭ ＣａＣｌ2、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１％ＢＳＡ、０.０１％チメロソール、および０.０５％Tween 20)中の１０００−倍モル過剰のアクチンと共にまたはそれを添加せずに３７℃で１６時間インキュベートした。各場合における活性酵素の濃度は、PulmozymeRの標準曲線との比較によって評価した。変異体の「パーセント活性」残存とは、アクチンの不存在下における活性に対するアクチンの存在下における活性の比を１００倍したものをいう。
【００９４】
図３および４に示されるように、天然ヒトＤＮアーゼのＤＮＡ−加水分解活性はアクチンの存在下で実質的に低下する。比較することにより、天然ヒトＤＮアーゼの種々の単一および複数残基変異体は、天然ヒトＤＮアーゼよりもアクチンの存在下におけるより高いＤＮＡ−加水分解活性を有することによって示されるごとく、アクチンの阻害に対して比較的耐性である。
【００９５】
ＩＩＩ．アクチン結合ＥＬＩＳＡ 
マイクロタイターをベースとするアッセイを開発して、アクチンを固定化する天然ヒトＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩ変異体の結合を測定した。まず、Maxi Sorpプレート(Nunc.，Inc.，Naperville，イリノイ州，米国)のウェルを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.２中１０ μｇ／ｍｌの濃度にて、ヒトＧＣグロブリン(Calbiochem.，La Jolla，カリフォルニア州，米国)、アクチン結合蛋白質(Goldschmidt-Clermontら，Biochem．J． 228:471-477(1985)，McLeodら，J．Biol．Chem．264:1260-1267(1989)、Houmeidaら，Eur．J．Biochem．203:499-503(1992))ウェル当たり１００μｌで４℃にて１６−２４時間被覆した。ＧＣグロブリンを捨てた後、ウェル当たり２００μｌの緩衝液Ｃ（緩衝液Ｃは０.５ｍＭアデノシン三リン酸を添加した前記緩衝液Ｂに同じ；緩衝液Ｃは特に断りのない限りすべての引き続いての工程でアッセイ希釈剤として使用した）を添加し、室温で１−２時間振盪器上でプレートをインキュベートすることによって過剰の反応性部位をブロックした。続いて行った各インキュベーション工程はMini Orbital Shaker(Bello Biotechnology，Vineland，ニュージャージー州,米国)上にて室温で１時間行い；各工程の間に、プレートを空にし、Microwasher IIプレート洗浄器(Skatron A/S，Norway)にて、０.０５％Tween 20を含有するリン酸緩衝液生理食塩水で６回洗浄した。次に、前記したごとくに調製したＧ−アクチンを緩衝液Ｃ中、５０μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μｌを各ウェルに添加した；プレートをインキュベートし、洗浄し、PulmozymeRの種々の希釈および天然ヒトＤＮアーゼＩまたはその変異体を含有する細胞培養培地をウェルに添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した。最後に、抗−ヒトＤＮアーゼＩウサギポリクローナル抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（オリジナルのストック濃度は４６５μｇ／ｍｌであった）の１／２５,０００希釈の１００μｌを各ウェルに添加した。インキュベーションおよび洗浄の後、ウェル当たり１００μｌの色発色試薬（Sigma Fast 製造業者の推奨に従って可溶化させた。フェニレンジアミンおよび尿素／Ｈ2Ｏ2錠剤）の添加によって色発色を開始させ、ウェル当たり１００μｌの４.５Ｎ Ｈ2ＳＯ4 の添加によって停止させた。４９２ｎｍにおける吸光度を記録し、元来ウェルに添加したＤＮアーゼＩの濃度に対してプロットした。天然ヒトＤＮアーゼＩおよびアクチンに結合した変異体につきＳ字状曲線が得られた；これらの曲線は、非線形回帰分析（Marquardt，J．Soc．Indust．Appl．Math．11:431-441(1963)）によって４つのパラメーターの方程式に適合し；アッセイにおいて半最大シグナルを与えるのに必要な各ＤＮアーゼＩ（天然または変異体）の濃度は曲線から計算し、これをＥＣ50値という。天然ヒトＤＮアーゼＩおよび変異体の分子量は３７，０００ダルトンであると見積もられた。
【００９６】
各ヒトＤＮアーゼＩ変異体の相対的結合親和性は、変異体のＥＣ50値をＥＬＩＳＡアッセイで測定した天然ヒトＤＮアーゼＩのＥＣ50値で割ることによって計算し、結果を図５Ａ−Ｄに示す。例として、もしヒトＤＮアーゼＩ変異体の相対的結合アッセイは５であると計算されれば、この値は変異体についてのＥＣ50値が天然ヒトＤＮアーゼのＥＣ50値よりも５倍大きい、あるいは換言すれば、変異体はこのＥＬＩＳＡアッセイにおいてアクチンに対して天然ヒトＤＮアーゼＩの親和性よりも５−倍小さいことを示す。
【００９７】
ＩＶ．痰圧縮アッセイ 
痰圧縮アッセイ（PCT出願WO94/10567、１９９４年５月１１日公開）を用いて、天然ヒトＤＮアーゼＩおよび異なるＤＮアーゼＩ変異体と共に行ったインキュベーションの前後に、嚢胞性線維症患者からの痰（「ＣＦ痰」）の相対的粘弾性を測定した。ＣＦ痰をＤＮアーゼＩ試料と混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、半固体溶液を毛細管に負荷し、次いで、これを１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心した。速心に続き、ペレットの高さを測定し、溶液＋ペレットの高さと比較した。次いで、これらの測定を用いて痰のパーセント圧縮を計算し、これは痰の粘弾性と相関する。
【００９８】
天然ヒトＤＮアーゼＩおよびヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体でのＣＦ痰の処理に際して測定されたパーセント圧縮を図６に示す。これらの結果はヒトＤＮアーゼＩアクチン−耐性変異体が、圧縮アッセイによって測定して、ＣＦ痰の粘弾性の低下において天然ヒトＤＮアーゼＩよりも効果的であることを示す。
［配列表］
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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