(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子治療に有効な組換えウイルスベクターシステムを提供する。【解決手段】ＢＩＶＵ５要素に連結した第一ＢＩＶＲ領域、パッケージング配列、プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子、及び、第二ＢＩＶＲ領域に連結したＢＩＶＵ３要素を含むＲＮＡベクターを含むビリオン。主要スプライスドナー部位が不活性化又は消滅しているビリオン。更にｃＰＰＴを含み、ｃＰＰＴがＢＩＶｃＰＰＴであり、ポリプリン区域を含むビリオン。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＩＶ  Ｕ５要素に連結した第一ＢＩＶ  Ｒ領域、パッケージング配列、プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子、及び、第二ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ３要素を含むＲＮＡベクターを含むビリオン。
【請求項２】
主要スプライスドナー部位が不活性化又は消滅している、請求項１記載のビリオン。
【請求項３】
更にｃＰＰＴを含む、請求項１記載のビリオン。
【請求項４】
ｃＰＰＴがＢＩＶｃＰＰＴである、請求項３記載のビリオン。
【請求項５】
更に３‘ポリプリン区域を含む、請求項１記載のビリオン。
【請求項６】
更にＲＮＡ輸送要素を含む、請求項１記載のビリオン。
【請求項７】
ＲＮＡ輸送要素がレンチウイルスｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）である、請求項６記載のビリオン。
【請求項８】
レンチウイルスＲＲＥがＢＩＶＲＲＥである、請求項７記載のビリオン。
【請求項９】
ＲＮＡ輸送要素が構成的輸送要素（ＣＴＥ）である、請求項６記載のビリオン。
【請求項１０】
ＣＴＥがマッソンファイザー（Mason-Pfizer）サルウイルスＣＴＥである、請求項９記載のビリオン。
【請求項１１】
ベクターが更にスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）を含む、請求項１記載のビリオン。
【請求項１２】
ＳＡＲがヒトインターフェロンβのスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）を含む、請求項１１記載のビリオン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、以下の米国仮出願の利益を主張するものである：１９９９年１２月１日付け出願され、２０００年１１月１６日付けで米国仮出願への変更を申請された、米国仮出願第09/464,460 「ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）に基づくベクター」、及び（２）２０００年１１月１７日付けで出願された米国仮出願第60/249,492 「ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）に基づくベクター」。これら２つの仮出願の開示の全内容は本明細書中に引用され取り込まれる。
本発明は、一般的には、組換えウイルスのベクターとしての使用、及び、より具体的には、所望のタンパク質を標的細胞内で発現させることが出来る、組換えウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）由来のベクター構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えウイルスベクターを、例えば、遺伝子治療等の様々な用途に使用する場合には、ウイルスが標的細胞内で複製できないようにしてウイルス又は細胞の制御不可能な増殖を避ける必要がある。安全性に加えて、組換えウイルスベクターシステムは効率的でかつ正確である必要がある。
【０００３】
レトロウイルスは真核細胞内への遺伝子移入を媒介するベクターとして使用されている。レトロウイルスにはレンチウイルス、泡沫ウイウス、及びオンコウイルスのサブファミリーが含まれる。これらのウイルスは複製して一般的にプロウイルスと呼ばれるＤＮＡ中間体を介して宿主細胞ゲノム内へ組み込まれる。
【０００４】
ウイルスベクターは一般的に、ウイルス遺伝子の主要な部分を欠失させて目的遺伝子と置換することによって構築される。最も頻繁には、目的遺伝子は長い末端反復（ＬＴＲ）内のウイルス調節配列の制御下で転写される。或いは、目的遺伝子はそれ自身の内部プロモーターの制御下で転写される。ベクターから欠失された遺伝子は一般的には一つ又はそれ以上のパッケージングセルラインにおけるヘルパー又はパッケージング構築物により提供される (Bender at al., J. Virol. 61:1639-1649 (1987) 及び Miller et al., Biotechniques, 7:890-990 (1989))。ヘルパー構築物の相補的な部分が二つの別個な構築物に分割されているMarkowitz et al., J. Virol. 62:1120-1124 も参照されたし。パッケージングセルラインはレトロウイルスベクターでトランスフェクションされて、ウイルス粒子内に包まれたベクターＲＮＡを生産する。これらの放出されたウイルス粒子は複製不能であり、目的とする異種遺伝子を有するレトロウイルスベクターを標的細胞に運搬するために使用することが出来る。
【０００５】
組換えウイルスベクターシステムの安全性、効率、及び正確さを増大させるために、様々な改良された組換えシステムが構築されてきた。個のような改良の一つの型は、３‘ＬＴＲを欠失させてより安全なパッケージングセルラインを作ることである。その他の改良としては、一つのウイルスｅｎｖ遺伝子を別のウイルスのｅｎｖ遺伝子と置換することにより宿主範囲を増大させて、偽型ヘルパーウイルスを生じる融合プロデューサーラインを創出することである。より具体的には、関連しないウイルスであるＶＳＶ及びＨＳＶで偽型化することにより、宿主細胞範囲が拡大したＨＩＶが作られた (Zhu et al., J. AIDS, 3:215-219 (1990) 及び Naldini et al., Science, 272:263-267 (1996))。更に、ベクター内の最小ウイルスコード領域を使用して改良がなされた。更に、現在使用されているパッケージングセルラインの殆どは別個のプラスミドでトランスフェクションされ、各々は必要なコード領域の一つを含み、その結果、複製可能なウイルスが作られるまでには多数の組換え事象が必要となる。
【０００６】
オンコウイルス由来のベクターとは対照的に、レンチウイルスは非分裂状態の細胞に感染することが出来る。この性質はインビボ遺伝子治療に特に有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的にはＢＩＶはヒト細胞には感染しないので、本発明のベクターにおいてＢＩＶゲノムバックボーンを使用することによって、従来のパッケージングセルラインの困難さを解消し、改良されたベクター構築物のためのその他の関連する利点を更に提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様として、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子のセグメント、及び、ビリオン内にウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＲＮＡをパッケージするためのＢＩＶパッケージング配列を含むＢＩＶゲノムに由来するＤＮＡセグメント；該ＤＮＡセグメントに機能的に連結したプロモーター；及び、該プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子（該導入遺伝子はｅｎｖ遺伝子のセグメント内に挿入されている）を含む、ＢＩＶ結合ベクター構築物、が提供される。好適具体例では、内部ｅｎｖ遺伝子の一部が欠失し、導入遺伝子が該欠失により生じたギャップに挿入されている。別の具体例では、ＤＮＡセグメントはｖｉｆ，ｖｐｗ，ｖｐｙ，ｒｅｖ及びｔａｔ遺伝子の中の一つ又はそれ以上、特に、ｔａｔ及びｒｅｖを含むことが出来る。
【０００９】
本発明は更に、ＢＩＶゲノムに由来するＤＮＡセグメント；ビリオン内にＲＮＡをパッケージするためのパッケージング配列；該ＤＮＡセグメントに機能的に連結した第一プロモーター；及び、第二プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子を含む、ＢＩＶベクター構築物を提供する。一具体例において、パッケージング配列がＢＩＶパッケージング配列であり、第一プロモーターがＬＴＲプロモーター又はＣＭＶプロモーターである。更に別の具体例では、ＤＮＡセグメントが更にｇａｇ遺伝子の一部を含む。別の具体例では、ベクターがｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含む。
【００１０】
更に本発明は、少なくともＢＩＶのｇａｇ又はｐｏｌ遺伝子を含むＢＩＶ  ＤＮＡ配列断片、及び該ＢＩＶ  ＤＮＡ配列断片に機能的に連結したプロモーターを含む、ＢＩＶパッケージング構築物を提供する。好適には、該ＢＩＶ  ＤＮＡ断片の下流に位置するポリアデニル化配列を含む。更に具体例において、パッケージング構築物は内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を含み、好ましくは、異種イントロンを含む。
【００１１】
本発明は更に、（１）ＢＩＶゲノムに由来するＤＮＡセグメント、ビリオン内にＲＮＡをパッケージするために必要なパッケージング配列、該ＤＮＡセグメントに機能的に連結したプロモーター、及び、第二プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子、を含むＢＩＶベクター構築物；（２）少なくともＢＩＶのｇａｇ又はｐｏｌ遺伝子を含むＢＩＶ  ＤＮＡ配列断片、該ＢＩＶ  ＤＮＡ断片に機能的に連結したプロモーター、及び、該ＢＩＶ  ＤＮＡ断片の下流に位置するポリアデニル化配列、を含むＢＩＶパッケージングベクター構築物；並びに、（３）ウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、から成る３ベクターシステムを提供する。一具体例においては、発現ベクター構築物が水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇエンベロープ糖タンパク質発現ベクターである。第二具体例では、ＢＩＶベクター構築物のＤＮＡセグメントはＢＩＶのｇａｇ遺伝子に一部を含有する。更に別の具体例では、ＢＩＶベクター構築物は、ｇａｇ，ｖｉｆ，ｖｐｗ，ｖｐｙ，ｔａｔ，ｒｅｖ及びｅｎｖから成る群から選択される一つ又はそれ以上のＢＩＶ遺伝子を含む。
【００１２】
更に本発明は、上記の３ベクターシステムで真核宿主細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトされた宿主細胞を培養し；製造されるビリオンを回収し、及び、回収されたビリオンを哺乳動物細胞に投与して哺乳動物細胞に感染させ、それによって目的遺伝子を移入させることから成る、目的遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法に係る。一具体例では、哺乳動物細胞がインビトロにおかれ、別の具体例では、哺乳動物細胞がインビボにおかれる。
【００１３】
更に、本発明は、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びビリオン内にＢＩＶ  ＲＮＡをパッケージするためのＢＩＶパッケージング配列を含むＢＩＶゲノムに由来するＤＮＡセグメント、該ＤＮＡセグメントに機能的に連結したプロモーター、並びに、該プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子を含む第一ベクター構築物；並びに、ウイルス表面タンパク質発現ベクターから成る２ベクターシステムに係る。好適には、このようなベクターは水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇエンベロープ糖タンパク質発現ベクターである。
【００１４】
更に、本発明は、上記の２ベクターシステムで真核宿主細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトされた宿主細胞を培養して製造されるビリオンを回収し、及び、ビリオンを哺乳動物細胞に投与して哺乳動物細胞に感染させ、それによって目的遺伝子を移入させることから成る、目的遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法に係る。
更に本発明の特に好適な具体例として、ＢＩＶ由来最小ベクターシステムが提供される。このシステムは、最小ベクター構築物、最小パッケージング構築物、及び最小ウイルス表面タンパク質発現構築物からなる。最小ベクター構築物は、第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したプロモーター；該第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ５要素；パッケージング配列；導入遺伝子；及び、第二ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ３要素を含む。パッケージング構築物は、ＢＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌコード配列に機能的に連結したプロモーター及びｇａｇ／ｐｏｌコード配列の３‘末端におけるポリアデニル化シグナルを含む。ウイルス表面タンパク質発現構築物は、ウイルスエンベロープコード配列に機能的に連結したプロモーター及び該コード配列の３‘末端におけるポリアデニル化シグナルを含む。
【００１５】
本発明の具体例は更にパッケージング細胞を含む。パッケージング細胞は、最小パッケージング構築物及び最小ウイルス表面タンパク質発現構築物を含む。
【００１６】
最小ベクター構築物が追加されることによって、プロデューサー細胞が生じる。該プロデューサー細胞はベクターを含むビリオンを生産する。細胞にこのビリオンを感染させることによって、導入遺伝子が該細胞に移入される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】野生型ＢＩＶプロウイルスプラスミド（ｐＢＩＶ）クローン１２７の模式図を示す。
【図２】ＢＩＶパーッケージング構築物：野生型ＢＩＶ，ＣＭＶ誘導ＢＩＶ，及び３つのパーッケージング構築物（ＢＨ１−３）について、それらのｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が表わされている。アクセサリ遺伝子は示されていない。更に、ウイルス主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ）、小キメライントロン（ｉｎ）、ＨＩＶｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソームエントリー部位に連結したプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）、及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ）を示す。
【図３】ＢＩＶベクター及び形質導入効率。全てのベクターは、ＴＡＴＡボックスの直後に開始するＢＩＶ５‘ＬＴＲに連結し、ＴＡＴＡボックス内で終了するＣＭＶ前初期プロモーターを含む。ＢＩＶ配列はｇａｇ開始コドンで終了するか（ＢＣＣＧ及びＢＣＰＧ）、又はｇａｇコード領域内の約５１０ｂｐで終了する（その他の全て）。全てのベクターは、異種である内部プロモーター：ＣＭＶ，ＰＧＫ又はＭＮＤに連結したｅＧＦＰｃＤＮＡを含有する。幾つかのベクターは、ＢＩＶ５’セグメント及び内部プロモーターの間に一つ又はそれ以上の挿入部を有し、これらの挿入部は可能性のあるＢＩＶ中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、ｇａｇ遺伝子の５’セグメント、βインターフェロンスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）、及び推定ＢＩＶｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含む。ｅＧＦＰｃＤＮＡの下流には、ＢＩＶ３‘ＬＴＲ及び約１３０ｂｐ（ＢＣＣＧ及びＢＣＰＧ）、約１．２ｋｂ（ＢＣ２ＣＧ，ＢＣ２ＰＧ，及びＢＣ２ＭＧ）、又は８０ｂｐ（その他の全て）の隣接ｅｎｖ配列が位置する。２つのベクター（ＢＣ４ＭＧ及びＢＣ４ＭＧｐｐｔ）は修飾３’ＬＴＲを含み、その中には３‘ＬＴＲＵ３領域の殆どがＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルエンハンサー要素（ＳＩＮＳＶ）と置換されている。転写開始部位及び方向は矢印で示されている。下部には、一連の実験で使用された２つのＨＩＶ−１対照ベクターが表わされている。右欄には、パッケージング構築物ＢＨ２又はＶＳＶ−Ｇを用いた一連の実験における感染３日後の２９３Ｔ細胞への形質導入効率が記載されている。実験番号３−５からの感染はスピノキュレーションの間のｐＨ上昇を遅らせるために追加緩衝液の存在下で実施された。その結果、形質導入効率が上昇した。
【図４】パッケージング構築物、ベクターバックボーン、及びＶＳＶ−Ｇ発現構築物からなるＢＩＶ由来の遺伝子移入システムの模式図を示す。ＣＭＶ：ＣＭＶ前初期プロモーター；ｃＰＰＴ：中央ポリプリン区域（ｔａｃｔ）；ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答要素（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）；ＭＮＤ：ＭＮＤＬＴＲ；ＳＩＮ：自己不活性化；ＳＶ４０ＵＳＥ：ＳＶ４０上流ポリアデニル化エンハンス要素。
【図５】ＢＩＶ由来最小ベクターシステム。図は、最小ベクター構築物、最小パッケージング構築物、及び最小ウイルス表面タンパク質発現構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特記のない限り、本発明の実施に際して、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学、ウイルス学、及びその他の当該技術分野における公知の技術を使用するものである。これらの技術は公知文献に開示されているが、特に、例えば、Sambrook, Fritsch, Mmaniatis, eds., “MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL”, 2nd edition (1989); Celis, J.E. “Cell Biology, A  Laoratory Handbook”, Academic Press, Inc. (1994); 及び Bahnson et al., J. of Virol. Methods, 54:131-143 (1995)を参照されたし。
【００１９】
様々な刊行物、特許及び公開特許明細書が引用される。これらの開示内容は、本発明が関連する技術分野の技術水準をより完全に記載する為に、引用されることで本明細書の開示内容に取り込まれるものである。
【００２０】
特記のない限り、本明細書中の各用語は単数形及び複数形を意味する。例えば、「ビリオン粒子」はビリオン粒子の複数形を含む。本発明のポリヌクレオチド又は核酸はＲＮＡ又ＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡを含む。
【００２１】
ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）はレトロウイルスのサブファミリーであるレンチウイルスに分類される (Gonda et al., Nature, 330:388-391 (1987))。レンチウイルスは外来性、非発ガン性のレトロウイルスであり、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶｓ）、ヒツジのビスナ及び進行性肺炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が含まれる。ＢＩＶはＨＩＶ，ＳＩＶ及びＥＩＡＶを免疫学的交叉反応性を有している。これらのウイルスは典型的には、8，000〜10，000のヌクレオチドをゲノムに有しており、ｇａｇ，ｐｏｌ、ｅｎｖ及び長い末端反復（ＬＴＲ）配列が含まれる。
【００２２】
ｇａｇ遺伝子はレトロウイルスゲノムにおける５‘−主要な遺伝子であり、ウイルス粒子を形成する構造タンパク質をコードする。これはポリタンパク質前駆体に翻訳されて、更に、切断されて３つから５つの構造タンパク質を生じる。
【００２３】
ｐｏｌ遺伝子は、ポリタンパク質切断、逆転写及び染色体へのプロウイルスの組み込みに必要な酵素がコードされている。
【００２４】
ｅｎｖ遺伝子はエンベロープタンパク質をコードする。本明細書中で、「ｅｎｖ遺伝子」は天然ｅｎｖ遺伝子のみならず、該ｅｎｖ遺伝子への修飾、例えば、レトロウイルスの標的特異性を変えるような修飾、又は偽型レトロウイルスを生じるようなｅｎｖ遺伝子も含むものである。ＰＣＴ公開WO92/14829 （公開1992年9月3日、名称：変更された宿主範囲を有するウイルス粒子）を参照のこと。
【００２５】
レトロウイルスは、ウイルスRNAのビリオン内へのパッケージング、標的細胞への感染、ビリオン内に含まれるRNAの逆転写酵素によりRNAゲノムのDNAコピーが生産されることによるDNAプロウイルスの形成、DNAの細胞核への輸送、プロウイルスDNAの標的細胞ゲノムへの組み込み、５‘LTR配列内のプロモーターに誘導されるウイルスDNAからｍRNAへの転写、ｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質の翻訳、ウイルス粒子の形成及び変異、並びに細胞から単一膜で覆われたビリオンの放出から成る、複製サイクルの特徴を共有する。LTRには、逆転写、組み込み、転写、及びポリアデニル化に重要なｃｉｓ−活性化配列が含まれている (Coffin J., J. Gen. Virology 42:1-26 (1979)) 。
【００２６】
レンチウイルスのゲノムは複雑である。それらには、上記のレトロウイスル遺伝子であるｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて「中央領域」を含む多くの非構造／調節遺伝子を有している (Braun et al., J. Virol. 61:4046-4054 (1987)及びChakrabarti et al., 328:543-547 (1987))。
【００２７】
様々な種から単離されたゲノムに見出される非構造／調節遺伝子の成分はお互いに異なる。特に、ｅｎｖ配列において異なっている。BIVの基本的なゲノム組織はGarvey et al., Virology, 175:391-409 (1990) 及び 米国特許第5,380,830 に開示されており、それらの全ての内容は本明細書に引用される。更に、BIVゲノムDNAをBIV感染細胞から得る方法も開示されている。ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は異なるフレームにあり、オーバーラップしている（重なっている）。ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子は同じ読み取り枠（フレーム）にあり、中央領域により分離されている。中央領域に５つの開かれた読み取り枠（ORFｓ）がある。これらの中の３つはHIV及び他のレンチウイルスのｖｉｆ，ｔａｔ，及びｒｅｖに対するエクソンに構造的に類似している。他の２つのORFｓは、中央領域において、HIV-1及び／又はHIV-2のORFｓをコードするｖｐｒ，ｖｐｘ及びｖｐｕと類似の位置にある。他のレンチウイルスのゲノムにおいてｅｎｖの後 ( post-env) に位置するｎｅｆORFはBIVでは欠けているようである (Garvey et al., 1990 上記)。
【００２８】
エクソンは遺伝子のセグメントである。それはタンパク質の特定の部分をコードする。遺伝子とは、ポリペプチド鎖の生産に関与する核酸セグメントであり、DNAのコード領域セグメントの前後の領域も含む。
【００２９】
ｔａｔ遺伝子は２つのコードエクソンから成る。最初のエクソンは中央領域に含まれ、二番目はｅｎｖコード配列の３‘末端に含まれるが、ｅｎｖ及びｒｅｖとは異なる読み取り枠内にある。
【００３０】
ｒｅｖ遺伝子も２つのコードエクソンから成る。最初のエクソンは中央領域の３‘末端の近傍に位置しｅｎｖの５’末端と一部重複する。二番目のエクソンはｅｎｖコード配列の３‘末端に異なる読み取り枠で含まれる。ｒｅｖ遺伝子産物は、ｇａｇ−ｐｏｌ翻訳及びスプライシングなしでの細胞質へのビリオンパッケージングに用いられる完全長RNAを含む、イントロン含有ウイルスｍRNAを輸送する。
【００３１】
本発明に係る、BIVコード配列及びベクター構築物の調製に使用するに適したレトロウイルスゲノムを含むプラスミドは本明細書の開示、又は、例えば、ＡＴＣＣ受託番号６８０９２及びＡＴＣＣ受託番号６８０９３並びにＧＥＮＢＡＮＫのような寄託及びデータベースに基づき容易に得ることが出来る。様々なＢＩＶクローンがGarvey et al., （上記）及び米国特許第5,380,830 に記載されている。特に、それぞれＡＴＣＣ受託番号６８０９２及びＡＴＣＣ受託番号６８０９３を有する、ＢＩＶ１２７及び１０６を参照されたし。
【００３２】
ＢＩＶゲノムのヌクレオチド配列には、天然の変異が個々のＢＩＶウイルスの間に存在し得ることを理解されたい。これらの変異により、該遺伝子の機能が失われない限り、一つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、浸入又は付加することがある。このような変異体をコードするＤＮＡ配列は標準的なクローニング手段又はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第4,683,195及び米国特許第4,683,202）によって作成することが出来る。
【００３３】
本発明は、ＢＩＶの任意の株又はクローンから得られるＢＩＶゲノム由来の核酸セグメントを提供する。一具体例では、本発明のＢＩＶ構築物は、一つまたはそれ以上の機能的ＢＩＶ遺伝子を発現するためのＢＩＶゲノムのヌクレオチドに対応する充分な数のヌクレオチドを含むものである。
【００３４】
「ＢＩＶ結合ベクター構築物」とは、ヌクレオチド配列の発現を指示できるアセンブリであり、ＢＩＶの転写を開始させることの出来るプロモーター配列領域を有する５‘ＬＴＲ領域；該プロモーターに機能的に連結したＢＩＶのｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子；ｅｎｖコード領域のセグメント；パッケージング配列；及び、ｅｎｖコード領域のセグメント内に挿入されており該プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子、を含む。好適には、導入遺伝子は、ＢＩＶのｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子に機能的に連結したプロモーターと同一又は異なる第二プロモーターに機能的に連結する。
【００３５】
ＢＩＶクローン１２７に見出されるＢＩＶｅｎｖ遺伝子は約２７１１個のヌクレオチド長でありおよそヌクレオチド５４１５から開始する。好適具体例において、導入遺伝子はｅｎｖ遺伝子の内部(interior) 領域内に挿入される。例えば、導入遺伝子はｅｎｖコード領域の内のｔａｔ及びｒｅｖコード領域エクソン１セグメントの後でかつｔａｔ及びｒｅｖコード領域エクソン２セグメントの前に挿入される。好適には、導入遺伝子は、ＢＩＶポリヌクレオチド６２７５に対応するｅｎｖコードセグメントのヌクレオチド８６０の後ろに挿入される。別の具体例では、ｅｎｖコード領域のセグメントが欠失している。好適には、ｅｎｖ遺伝子の内部領域から欠失セグメントを得て、導入遺伝子はその欠失により生じる隙間（ギャッ）に挿入される。欠失したｅｎｖコード領域のセグメントは２０ヌクレオチドから１５００ヌクレオチドの長さである。ｅｎｖ遺伝子のセグメントの欠失方法は当業者に周知である。
【００３６】
「ＢＩＶベクター構築物」とは、ヌクレオチド配列の発現を指示できるアセンブリである。該ベクター構築物は、ＢＩＶの転写を開始することの出来る５‘配列（プロモーター領域を含む）；ＢＩＶゲノムに由来するＤＮＡセグメント；ＢＩＶ又は他のレンチウイルス又はレトロウイルス由来のパッケージング配列；及び、第二プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子を含むものである。従って、本発明の一態様においては、ＢＩＶゲノムに由来するＤＮＡセグメント；ビリオン内にＲＮＡをパッケージするためのパッケージング配列；該ＤＮＡセグメントに機能的に連結した第一プロモーター；及び第二プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子を含む、ＢＩＶベクター構築物が提供される。好適具体例においては、ＢＩＶベクター構築物のパッケージング配列はＢＩＶパッケージング配列である。
【００３７】
ＢＩＶのｇａｇ遺伝子の一部分はＤＮＡセグメント内に含有されていても良い。ＢＩＶのｇａｇ遺伝子は約１４３１個のヌクレオチドである。好適には、ｇａｇ遺伝子の当該部分は約２００個以下のヌクレオチドを含むものである。ＤＮＡセグメントは更に、ｖｉｆ，ｖｐｗ，ｖｐｙ，ｔａｔ，ｒｅｖ及びｅｎｖから成る群から選択されるＢＩＶ遺伝子を含むことが出来る。
【００３８】
別の好適具体例では、導入遺伝子が、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、又はＭＮＤプロモーターに機能的に連結している。ＢＩＶベクター構築物は更に一つ又はそれ以上のｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、好ましくはヒト起源であるヒトインターフェロンβのスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）、及び／又は中央ポリプリン区域を含み、それらは好ましくは、ＢＩＶ５‘セグメント及び内部（第二）プロモーターの間に位置する。即ち、一好適具体例では、第二プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子は推定ＢＩＶ  ＲＲＥの下流に位置する。
【００３９】
更に別の好適具体例では、本発明のＢＩＶベクター構築物は自己不活性化（ＳＩＮ）ベクター(self-inactivating vector)である。特に、ＢＩＶベクター構築物の３‘ＬＴＲのＵ３領域の一部分が欠失するか又は異種配列と置換されていても良い。好ましくは、３‘ＬＴＲのＵ３領域の一部分はＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルエンハンサー要素と置換されている。
【００４０】
特に好適な具体例では、ＢＩＶベクター構築物は自己不活性化ベクターであり、更に、ＭＮＤプロモーターに機能的に連結した導入遺伝子を含み、ＭＮＤプロモーターの上流にＲＲＥ及び中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）を含むものである。
【００４１】
「ＢＩＶパッケージング構築物」は時にはヘルパー構築物と呼ばれ、ヌクレオチド配列の発現を指示できるアセンブリである。ここでヌクレオチド配列は、少なくともＢＩＶのｇａｇ又はｐｏｌ遺伝子；該ヌクレオチド配列に機能的に連結したプロモーター；及び、ｇａｇ又はｐｏｌ遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列の下流に位置するポリアデニル化配列、を含む。好ましくは、ポリアデニル化配列はサイミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のものである。
【００４２】
上記のＢＩＶベクター構築物、ＢＩＶ結合ベクター構築物、及びＢＩＶパッケージング構築物は、前述の具体的な遺伝子に加えて、その他のＢＩＶ遺伝子を含むことが出来る。このようなその他の遺伝子として、ｐｏｌ，ｖｉｆ，ｖｐｗ，ｖｐｙ，ｔａｔ，ｒｅｖ及びｅｎｖ遺伝子を上げることが出来る。特に、ＢＩＶ構築物は機能的ＢＩＶｒｅｖ遺伝子に対応するヌクレオチドを含むものである。しかしながら、ＢＩＶ構築物は異なるレンチウイルスに由来するｒｅｖ遺伝子、特にＨＩＶｒｅｖ遺伝子を含むことも出来る。本発明のＢＩＶ構築物は更に核輸送要素、好ましくはｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を、好ましくは、導入遺伝子の下流に含むことが出来る。好ましくは、ＢＩＶ構築物は更に、機能的ｔａｔ遺伝子に対応する充分な数のヌクレオチドをふくむことが出来る。更にＢＩＶゲノムの３‘ＬＴＲも以下に記載するように含むことが出来る。
【００４３】
別の態様として、本発明は、好ましくは樹立セルラインを上記のＢＩＶ結合ベクター構築物又はＢＩＶパッケージング構築物で形質転換することから成る、ＢＩＶパッケージングセルラインの製造方法に関する。遺伝子治療への応用においては、一過性トランスフェクションによっては容易に調製することができない大量の上清を製造する必要がある。従って、標的細胞に目的とする遺伝子を移入するためにプロデューサーセルラインを使用することが出来る。「プロデューサーセルライン」とは、組換えＢＩＶ粒子を生産することが出来るセルラインを意味する。プロデューサーセルラインには上記のＢＩＶ構築物が組み込まれて含有されるものである。例えば、本発明のＢＩＶ構築物のような多くのＢＩＶベクターが組換えＢＩＶ粒子に含まれる。組換えウイルスベクター粒子を製造することが出来るレトロウイルスパッケージング細胞を同定するための様々な方法が当業者には周知である。これらの方法にはＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットが含まれる。
【００４４】
パッケージングセルラインの非限定的な例として、ＰＡ１２，ＰＡ３１７，ＦＬＹＡ１３，ＰＥ５０１，ＰＧ１３，ＣＲＩＰ，ＲＤ１１４，ＧＰ７Ｃ−ｔＴＡ−Ｇ１０，ＰＰＡ−６及びＰＴ６７(Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895 (1986); Miller et al., Biotechniques 7:980(1989); Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460 (1988); Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392 (1993);及びRigg et al., Virol. 218:290 (1996))を挙げることが出来る。
【００４５】
更に本発明の特に好適な具体例として、最小ベクター構築物が提供される。このベクター構築物は、第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したプロモーター；該第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ５要素；パッケージング配列；導入遺伝子；及び、第二ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ３要素、を含むベクター構築物であり、該プロモーターはベクター構築物のＲＮＡ転写を開始するものである。好適には、パッケージング配列はＢＩＶパッケージング配列である。或いは、パッケージング配列は別のレンチウイルス又はレトロウイルス由来であり得る。更に、パッケージング配列における如何なる開始コドンも欠失又は変異により消滅していることが好ましい。又、主要スプライスドナー部位が不活性化又は消滅していることが好ましい。これらのパッケージング配列及びスプライスドナー部位に対する変更は標準的手段により行なうことが出来る。
【００４６】
最小ベクターの特に好適態様においては、Ｕ３要素における一つ又はそれ以上のヌクレオチド配列が、あらゆる下流遺伝子のＵ３媒介転写を減少又は消滅させるために変異又は欠失している。これによって自己不活性化ベクターが提供される。このような状況下では導入遺伝子は内部プロモーターに機能的に連結している。更に、Ｕ３要素が更にポリアデニル化を増大させる配列を含むことが好ましい。好適例はＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素である(Sehet et al., Mol. Cell Biol., 12:5386-5393 (1992))。
【００４７】
最少ベクターは更なる要素を含むことが出来る。このような要素の一つはｃＰＰＴである。好適には、ｃＰＰＴはＢＩＶｃＰＰＴである。該ベクターは更に３‘ポリプリン区域を含む、これは３’Ｕ３要素の直ぐ上流（即ち、５‘）に位置する。
【００４８】
更に、ベクターはＲＮＡ輸送要素を含む。このような輸送要素はレンチウイルスｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）であり得る。好適には、レンチウイルスＲＲＥがＢＩＶ  ＲＲＥである。或いは又、ＲＮＡ輸送要素は構成的輸送要素（ＣＴＥ）である。より好ましくはＣＴＥがマッソンファイザー（Mason-Pfizer）サルウイルスＣＴＥである。別の好適例ＣＴＥはニワトリ白血病ウイルスＣＴＥである。
【００４９】
別の好適具体例として、本発明は最少パッケージング構築物を提供する。該構築物は、ＢＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌコード配列に機能的に連結したプロモーター；及び、ｇａｇ／ｐｏｌコード配列の３‘末端におけるポリアデニル化シグナルを含む。好適には、該パッケージング構築物は更に異種イントロンをｇａｇ／ｐｏｌコード配列の上流（即ち、５’）に含む。更に、パッケージング構築物はＲＮＡ輸送要素を含む。このような輸送要素はレンチウイルスｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、好適には、ＢＩＶ  ＲＲＥであり得る。或いは又、上記のように構成的輸送要素（ＣＴＥ）である。パッケージング構築物にはＲｅｖコード配列が含まれていても良い。
【００５０】
異種イントロンが該構築物、特に、パッケージング構築物に含まれていても良い。異種イントロンは公知であり、その非限定例としてはヒトベータグロブリン遺伝子イントロンがある。本発明の構築物中で使用されるイントロンはＳＶ４０ウイルス及びヒトインシュリン遺伝子から得ることが出来る。好適には、イントロンはｇａｇ及びｐｏｌヌクレオチド配列の上流に位置する。
【００５１】
更なる具体例においては、本発明の構築物には、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）が含まれ、これは第二遺伝子、好ましくは異種遺伝子の翻訳を可能にする。異種遺伝子はマーカー遺伝子、又は以下に詳細に述べるような目的とするタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【００５２】
ＢＩＶ遺伝子又は導入遺伝子の発現に必要なものは、コードする核酸配列に機能的に連結した適当なプロモーターである。「機能的に連結する（した）」とは、成分がその通常の又は期待される機能を発揮するように構成されている要素の配置（アレンジメント）をいう。プロモーター又は他の調節要素はコード配列とつながっている必要はない。機能的な関係が維持される限り、プロモーター又は他の調節要素とコード領域との間に介在残基が存在していても良い。
【００５３】
上記のような構築物に関して、プロモーターの選択は当業者にとって周知の範囲であり、本発明の構築物で形質転換した宿主細胞又は標的細胞内での遺伝子転写を指示できるものであれば、プロモーターは原核細胞、真核細胞又はウイルスプロモーターのいずれでもかまわない。更に、プロモーターは組織特異的プロモーター、誘導プロモーター、合成プロモーター、又は融合（ハイブリッド）プロモーターであり得る。本発明の構築物には一つ以上のプロモーターを置くことも可能である。好適には、ＢＩＶ遺伝子は機能的に一つのプロモーターに連結し、導入遺伝子は第二プロモーターに機能的に連結している。本発明構築物に有用なプロモーターの非限定的例としては、ファージラムダ（ＰＬ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルスプロモーター、テトラマイシン調節トランスアクチベーター応答プロモーター（ｔｅｔ）システム、MoMLV  ＬＴＲ又はＨＩＶ  ＬＴＲのような長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）のＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子調節配列、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パブロウイルスプロモーター、PGKプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０のような熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、免役ブロブリンプロモーター、MMTVプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、及びノプリン合成プロモーターを挙げることが出来る。数々のプロモーターがStratagene (La Jolla, CA) のような市販業者から販売されている。
【００５４】
好適プロモーターには、ＨＩＶ又はＢＩＶの５‘ＬＴＲプロモーターのようなＬＴＲが含まれる。更に、好適プロモーターとしてＣＭＶプロモーター及びＰＧＫプロモーターを挙げることが出来る。特に、ＭＮＤプロモーターが好ましい。本発明の構築物にはその他の調節配列、例えば、エンハンサー及びスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）も含まれていても良い。特に好適なものは、ヒトインターフェロンβに由来するスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）である。特定のエンハンサーは当業者が容易に同定することが出来る。
【００５５】
「パッケージング配列」とは、レトロウイルスＲＮＡをビリオン内にパッケージングするのに必要な配列と定義される。パッケージング配列は一般的には、５‘主要スプライスドナー及びｇａｇ遺伝子開始コドンの間の領域に位置する。ＢＩＶ由来のパッケージング配列が好ましいが、本発明のベクターには他のレトロウイルス、特にレンチウイルス、更にはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２又はＳＩＶ由来のパッケージング配列が含まれていても良い。パッケージング配列は１０００程度の長いヌクレオチド又は５０程度の短いヌクレオチドが含まれ得る。パッケージング配列領域の大きさは当業者が決めることが出来る。
【００５６】
すでに記載したように、本発明の一つ又はそれ以上の構築物は更に、コード領域の３‘に位置するポリアデニル化シグナル（ポリＡ）含むことが出来る。ポリＡのテールは細胞質内での安定性を促進するに十分な任意の大きさであり得る。ポリＡはＢＩＶ，ＨＩＶ及びＳＩＶのようなレンチウイルスから得ることが出来る。しかしながら、ポリＡはＳＶ４０ポリＡのようなその他のウイルスからも得ることが出来る。
【００５７】
プロモーター領域に加えて、逆転写、組み込み、転写及びポリアデニル化に重要なｃｉｓ作用（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）要素がレトロウイルの長い末端反復（ＬＴＲ）に含まれ、及び一つ又はそれ以上のこれらの要素が本発明の構築物に含まれていても良い。好適には、構築物はＢＩＶ  ＬＴＲのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを５‘末端に含み、機能的ＬＴＲを生じる。構築物には更に３’ＬＴＲ領域が含まれ得る。ＢＩＶ１２７のプロウイルスＬＴＲは５８９ポリヌクレオチドである。ＬＴＲはＵ３、Ｒ及びＵ５要素から構成されている（米国特許第5,380,830）。
【００５８】
本発明は更に、ＢＩＶベクター構築物、ＢＩＶ結合ベクター構築物、及びＢＩＶパッケージング構築物を含む、２ベクターシステム及び３ベクターシステムに係る。３ベクターシステムの一具体例では、上記のようなＢＩＶベクター構築物及びＢＩＶパッケージングベクター構築物、並びに第三構築物を含む。第三構築物は異なるウイルスからのウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター構築物である。ウイルス表面タンパク質は任意の他のウイルスエンベロープタンパク質であり得、例えば、水泡性口内炎エンベロープウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ＭｏＭＬＶｅｎｖタンパク質、又は、ギボンサル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ラブドウイルス（Ｒａｂｉｅｓ，Ｍｏｋｏｌａ，Ｌｙｓｓａ）、アルファウイルス（ロスリバーウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓ）、パラミボウイルス（センダイ）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、レトロウイルス（ＭＬＶ，１０Ａ１、Ｘｅｎｏ）、アレナウイルス（ＬＣＭＶ）、及びパラインフルエンザウイルスに由来するエンベロープがある。好適な表面タンパク質はＶＳＶ−Ｇである。１９９８年１０月６日発行の米国特許第5,817,491号を参照のこと、尚、その全内容は本明細書に含まれるものとする。
【００５９】
２ベクターシステムは、上記のようなＢＩＶ結合ベクター構築物及び表面タンパク質発現ベクターを含む。表面タンパク質ベクター構築物の好適例は水泡性口内炎エンベロープウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）発現ベクターである。
【００６０】
ＶＳＶ−Ｇ偽型ＢＩＶウイルス調製物の力価（タイター）はウイルスの遠心により増加させることが出来る。未濃縮のＶＳＶ−Ｇ偽型ＢＩＶウイルス調製物は、ヒト腎臓上皮セルライン２９３Ｔにおける約５ｘ１０５感染単位（ＩＵ）／ｍｌの力価を有する。ウイルス濃縮によって、力価を顕著に上昇させることが出来る。
【００６１】
一般的に、本発明ベクターの力価は、第一に、ウイルス含有培地を遠心してウイルス粒子を回収し、第二に、上清を除去し、第三に、ウイルス粒子を少容量の新たな培地に懸濁することによって増大させることが出来る。例えば、回収したウイルスを遠心前の元の容量の１０分の１の容量の液体に懸濁することによって１０倍にまで濃縮し、形質導入効率を３−１０倍にすることが出来る。当業者には容易に理解されるように、更にウイルスの濃度を濃縮することによって形質導入効率をより増大させることが可能である。
【００６２】
本発明基づきに単独又は組み合わせて使用されるＢＩＶに基づく構築物は、実質上、あらゆる種類のセルライン又は宿主細胞の形質転換に使用することが出来る。真核宿主細胞が好ましい。形質転換はトランスフェクション又は形質導入（トランスダクション）であり得る。トランスフェクションは標的又は宿主細胞を単離ＤＮＡゲノムで形質転換するものである。Kriegler, M., Gne Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freman & Company NY (1990) を参照のこと。形質導入はプロデューサー細胞と細胞の直接共培養 (Bregi et al., Blood 80:1418-1422 (1992)、又はウイルス上清単独又は適当な増殖因子との培養(Xu et al., Exp. Hemat., 22:223-230 (1994)) を含む。例えば、CalPhos kit(Clontech Inc. Palo Alto) 及びProfection kit(Promega, Madison WI)のような市販のキットも参照されたし。スピノキュレーション法については、Kotani et al., Human Gene Ther. 5:19-28 (1994) 及びForstell et al., J. Virol. Methods 60:171-178 (1996)を参照されたい。
【００６３】
セルラインを本発明の構築物でトランスフェクション又は形質導入したら、遺伝子が発現され、新たなビリオンが細胞によって製造される。その結果、ビリオンを回収し、標的細胞を感染し、ベクター内の目的とする遺伝子（群）を標的細胞に移入するのに使用される。
【００６４】
好ましくは、上記細胞は哺乳動物細胞、最も好ましくは霊長類細胞、特にヒト細胞である。その例として、ヒト胚性腎臓細胞（２９３T）、ＥＲＥｐウサギ細胞、Ｃｆ２Ｔｈ（ATCC No．CRL 1430），ＣＨＯ，ＳＷ４８０，ＣＶ−１，ヒトＴ細胞セルラインＣＥＭ−ＳＳ、ジャーカット、ＭＤＣＫ及びＤ１７イヌセルライン、ＨＴ１０９０、ＬＩＮＡ、ＷＥＳ及びマウスセルラインＮＩＨ３Ｔ３を挙げることが出来る。セルライン又は細胞培養物はインビトロで増殖又は維持された真核細胞を意味する。細胞の子孫はその親細胞と完全に一致はしていない（形態学的、遺伝子型、表現型の点）ことを理解されたい。
【００６５】
本発明の特に好適な例では、最小ベクター及びパッケージング構築物がパッケージング細胞及びプロデューサー細胞を作成するために使用される。パッケージング細胞には本発明のパッケージング構築物及び最小ウイルス表面タンパク質発現構築物が含まれる。最小ウイルス表面タンパク質発現構築物はウイルスエンベロープコード配列に機能的に連結したプロモーター及び該コード配列の３‘にポリアデニル化シグナルを含む。構築物は更に、該プロモーターとコード配列との間に異種イントロンを含むことが出来る。ウイルスエンベロープはこれまでに記載した任意のものであり、好適にはＶＳＶ−Ｇウイルスエンベロープである。
【００６６】
パッケージング細胞に最小ベクター構築物をトランスフェクションすることによってプロデューサー細胞が作成される。プロデューサー細胞は、(i) ＢＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌコード配列；(ii)ウイルスエンベロープコード配列；並びに、(iii) 第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したプロモーター、第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ５要素、パッケージング配列、導入遺伝子、及び、第二ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したＢＩＶ  Ｕ３要素を含むベクター構築物を含む。プロデューサー細胞を培養すると、本発明の最小ベクターを含むビリオンが産生される。この最小ベクターは最小ベクター構築物のＲＮＡ版であり、第一ＢＩＶ  Ｒ領域に連結したプロモーターを含有していない。好ましくは、本明細書中で記載したように、ＲＮＡベクーには更に、導入遺伝子に機能的に連結した内部プロモーターが含まれる。より好ましくは、このようなベクターはＳＩＮベクターである。ビリオンは所望の標的細胞に感染し、標的細胞に導入遺伝子を移入するのに使用される。
【００６７】
本発明のベクターによって、セルライン、ヒト及び非ヒトが起源の初代細胞を含む数多くの標的細胞に感染させることに成功した。これら細胞の例として、イヌ骨肉腫セルラインＤ−１７，ラット平滑筋セルラインＡ−１０、マウス神経細胞ＭＮ９Ｄ，ヒト内皮セルラインＨＵＶＥＣ，ラット初代内皮細胞、ヒト初代リンパ球及びヒト初代造血幹細胞を挙げることが出来る。その内の最後の２つの細胞型は殆どが非分裂細胞から構成される。従って、本発明のベクターは、非分裂性の初代ヒト細胞に感染させるのに特に有用に使用することが出来る。細胞の増殖がなくなる程度のガンマ照射の後にＨＵＶＥＣセルラインに感染させることが出来る。このようなガンマ照射の後の結果はガンマ照射の前と類似している。
【００６８】
好適な標的又は宿主細胞は哺乳動物細胞、特に、霊長類、最も好適にはヒト細胞である。好適なヒト細胞には造血細胞がある。造血細胞には、造血幹細胞、赤血球、好中球、血小板、肥満細胞、好酸球、好塩球、並びに、Ｂ及びＴリンパ球が含まれる。造血幹細胞及びＴ細胞は特に好ましい。
【００６９】
トランスフェクション又は形質導入の前に、造血細胞を単離及び選択することが出来る。単離及び選択の方法は当業者に周知である（米国特許第5,061,620; 米国特許第5,677,136、及び 米国特許第5,750,397）。例えば、成人の骨髄（ＡＢＭ）又は可動化血液（ＭＰＢ）から取得したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞が使用される。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞はヒト造血幹細胞が濃縮されておりＡＢＭ及びＡＰＢからフローサイトメトリーによって単離することが出来る（米国特許第5,061,620）。
【００７０】
本発明は更に、上記の２又は３ベクターシステムで真核宿主細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトされた宿主細胞を培養し、製造されるビリオンを回収し、及び、ビリオンを哺乳動物細胞に投与して哺乳動物細胞に感染させ、それによって目的遺伝子を移入させることから成る、目的遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法に係る。既に記載したように、宿主細胞をトランスフェクションする方法は公知であり、更に、Graham 及びvan der Eb, Virology 52:456-467, 1973 を参照することが出来る。
【００７１】
トランスフェクション又は形質導入された細胞を培養する方法は当業者に周知であり、Freshney, R.I. “Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques”, Wiley-Liss Inc. (1994) を参照されたし。様々な培地が市販されている。その非限定的な例としては、ＤＭＥＭ，ＩＭＤＭ，Ｘ−ｖｉｖｏ１５及びＲＰＭＩ−１６４０を挙げることができる。各組成には様々な栄養素及び増殖因子を添加することが出来る。ＣＤ３４＋造血幹細胞又はその前駆細胞を培養するには、サイトカインを培地と組み合わせることが好ましい。このようなサイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ−６，ＴＰＯ，ＳＣＦ，ＩＬ−３及びＬＩＦを挙げることが出来る。細胞への投与方法は周知であり、例えば、遺伝子治療のためにヒト患者に投与することも含まれる。
【００７２】
トランスフェクションされた細胞からビリオンを回収する方法は、例えば、Rigg et al.,218:290-295 に記載されている。本発明のＢＩＶに基づく構築物を含むビリオンは、インビボ又はインビトロで哺乳動物細胞に投与される。更に、ビリオンには本明細書に記載したような異種治療遺伝子が含まれていることが好ましい。本発明によりＢＩＶに基づく構築物を用いて製造されるビリオンは組換え粒子又はビリオンである。「組換え粒子又はビリオン」とは、本発明のＢＩＶに基づくベクターＲＮＡを含むウイルス粒子をいう。或る場合には、ＢＩＶベクター構築物はＢＩＶ以外のウイルス、例えば、その他のレトロウイルス特に他のレンチウイルスに由来する粒子内に含有されている。
【００７３】
本明細書中において、一般的に導入遺伝子と称される目的とする遺伝子は異種（heterologous）遺伝子、例えば、マーカー遺伝子である。マーカー遺伝子の選択は当業者の裁量の範囲内であり、その非限定的例としては、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼをコードする(Neor) 遺伝子のような薬剤耐性マーカー、アシクロビル又はガンシクロビルのような薬剤に対して細胞を感受性にするＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、低親和性神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、増強された (enhanced) 緑蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、細菌ｈｉｓＤ遺伝子、マイスＣＤ２４（ＨＳＡ）、マウスＣＤ８ａ（ｌｙｔ）、プロマイシン、フレオマイシン又はベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）対する耐性を付与する細菌遺伝子、及びグルタミン合成（ＧＳ）遺伝子を挙げることが出来る。好適一具体例でのマーカー遺伝子はｅＧＦＰである。マーカー遺伝子はマーカー遺伝子を含有する標的細胞の同定を可能にする別のプロモーターの調節下にあることが好ましい。
【００７４】
一般的に導入遺伝子と称される広範囲なヌクレオチド配列が、マーカー遺伝子に加えて、又はその代わりに、ＢＩＶに基づく本発明の構築物に含有される。好適には、該ヌクレオチド配列は生存ウイルス粒子の産生を可能にするような大きさであるべきである。これら導入遺伝子の非制限的なリストには、タンパク質、抗原、及びリボザイムをコードする配列、並びにアンチセンス配列が含まれる。
【００７５】
タンパク質は治療タンパク質又は構造タンパク質である。更に、タンパク質は完全なタンパク質であるか又はその機能的活性な断片であり得る。タンパク質としては、例えば、細胞分化を制御するタンパク質、又は患者の内因性遺伝子の欠陥によって生じる疾患を補償又は補うことの出来る治療遺伝子である。治療遺伝子は、感染性物質の生産又は機能に拮抗 (anntagonize) 又は中和したり、病理過程に拮抗したり、宿主の遺伝的メークアップを改善したり、又は、生着を容易にするものが含まれる。
【００７６】
治療遺伝子又は遺伝子配列の具体的な例として、以下の治療に有効な遺伝子又は遺伝子配列を挙げることが出来る：アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ）、鎌状細胞貧血、リコンビナーゼ欠損症、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損症，アンチセンス又はトランスドミナントＲＥＶ遺伝子のようなＨＩＶ、又は単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）。更に、異種遺伝子には、酵母遺伝子のような非ヒトの治療遺伝子であっても良い(Seo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:9167 (1998))。
【００７７】
導入遺伝子のヌクレオチド配列は当業界で公知であり、又は、ＧｅｎＢａｎｋのような様々な配列データベース、又はAdvanced Biotechnologies （ＭＤ）のような市販のソースから入手可能である。更に、例えば、ＰＣＲのような当該技術分野で周知の方法を用いて、該配列を含むか又は発現する細胞から異種配列をコードするｃＤＮＡ配列を得ることが出来る。
【００７８】
更に、目的とする遺伝子は、ＴＮＦ−αのような腫瘍壊死因子遺伝子；インターフェロン−α、−β及び−γのようなインターフェロンをコードする遺伝子；ＩＬ−１，ＩＬ−１β及びＩＬ−２〜ＩＬ−１４、特にＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６及びＩＬ−１０のようなインターロイキンをコードする遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦ；アデノシンデアミナーゼ又はＡＤＡをコードする遺伝子；リンパ球に対する増殖因子であるリンホカインのような細胞増殖因子をコードする遺伝子；可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、Ｔ細胞受容体、ＬＤＬ受容体をコードする遺伝子；ＡｐｏＥ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡｌ及びその他のコステロール輸送及び代謝に関与する遺伝子；α−１アンチトリプシン遺伝子；オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子；ＣＦＴＲ遺伝子；インシュリン遺伝子；ＮＤｌ−１遺伝子；ネガティブ選択マーカー、又は、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及び水痘・帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のようなウイルスチミジンキナーゼ遺伝子である「自殺」遺伝子；並びに、抗体の抗原結合ドメインに対するＦｃ受容体をコードするＤＮＡ配列、並びに、ウイルス複製を阻害するアンチセンス配列から選択することが出来る。
【００７９】
ヒト患者の場合には、治療遺伝子は一般的にはヒト由来のものであるが、患者において悪性の免疫応答を生じないときには、高い相同性及びヒトにおける生物学的に同一又は均等な機能を発揮する近接種の遺伝子も使用することが出来る。核酸配列又は治療遺伝子の治療上活性な量は、投与時及び所望の効果を達成するに必要な期間に有効な量である。このような量は、例えば、性別、年齢、対象者に体重、及びその他の様々な因子に応じて変動するものである。
【００８０】
標的細胞内の導入遺伝子の発現をアッセイするための方法は当業者に公知である。これらの方法には、フローサイトメトリーセレクション、ウェスタンブロットによるタンパク質検出、ＰＣＲの使用（米国特許第4,683,195及び米国特許第 4,683,202 ）、ノーザン又はサザーンブロットによるヌクレオチドセレクション、及び酵素免疫アッセイを上げることが出来る。Sambrook J, Fritsch, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989 を参照のこと。
【実施例】
【００８１】
実施例１：材料及び方法
実施例１．１プラスミドの構築
（ｉ）ｇａｇ及びｅｎｖ配列の量（ＢＣ  ｖｓ．ＢＣ２prefix）；（ｉｉ）ｅＧＦＰ発現を指示する内部プロモーター：ＣＭＶ（ＣＧsuffix）ｖｓ．ＰＧＫ（ホスフォグリセレートキナーゼプロモーター（１）；ＰＧsuffix）ｖｓ．ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター（Robbins, P.B., X.J. Yu, D.M. Skelton, K.A. Pepper, R.M. Wasserman, L.Zhu, 及びD.B.Kohn, 1997, J. Virol. 71:9466-9474）； ＭＧsuffix）；（ｉｉｉ）ｅＧＦＰのベクター内での位置（推定ＢＩＶＰＲＥの上流又は下流；ＢＣ２ｖｓ．ＢＣ３prefix）；及び（ｉｖ）推定ＢＩＶパッケージングシグナルの下流に挿入される付加セグメント（ｇａｇ，ｐｐｔ，ｓａｒsuffixes）において異なるベクターが作成される。更に、２つのベクターは修飾３‘ＬＴＲを含み、その中ではＵ３（ＴＡＴＡボックスを含む）の大きな部分が後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素を含むＳＶ４０ウイルスセグメントと置換されている（USE; Schek, N., C. Cooke, 及びJ.C. Alwine, 1992 Mol. Cell Biol. 12:5386-5393; ＢＣ３ vs. ＢＣ４ prefix）。
【００８２】
全ての制限エンドヌクレアーゼはRoche Molecular Biochemicals (Indianapolis,IN) から購入した。ＢＩＶプロウイルスクローン１２７を含むプラスミドｐＢＩＶ（Garvey, K.J., M.S Oberste, J.E.Elser, M.J. Braun 及びM.A. Gonda 1990 Vilogy, 175:391-409）はＮＩＨから入手した。
【００８３】
プラスミドｐＣｌはPromega (Madison, WI) から購入した。プラスミドｐＣｌＧＬは水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）ｃＤＮＡ(Burns, J.C., T.Friedmann, W.Driever, M.Burrascano, 及びJ.K.Yee, 1993, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:8033-8037, Yee, J.K., A.Miyanohara, P.Laporte, K.Bouic, J.C.Burns, 及びT. Friedmann, 1994 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:9564-9568) をｐＣｌポリリンカー内で、ヒトサイトメガロイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター及びキメライントロンの下流であってＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルの上流に含有する。
【００８４】
ＨＩＶ−１ｒｅｖｃＤＮＡをＣＭＶプロモーターの調節下で含むプラスミドｐＣｒｅｖは以前に記載されている(Malim, M.H., J.Hauber, R.Fenrick, 及びB.R.Cullen, 1988 Nature 335:181-183)。
【００８５】
プラスミドｐＢＨ１は以下の２つのｐＢＩＶセグメントをｐＣｌポリリンカー内に標準的手法を用いて連続的に挿入することで得られる：ｇａｇ，ｐｏｌ，ｖｉｆ，ｖｐｗ，及びｖｐｙ遺伝子、並びに、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子の第一コードエクソンを含む５．５ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片；推定ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）及びｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子の第二コードエクソンを含む１．３ｋｂのＤｒａＩＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片。
【００８６】
プラスミドｐＢＨ２及びプラスミドｐＢＨ３は、キメライントロンは削除し、更に、ｐＢＨ２の５‘ＢＩＶ断片は主要スプライスドナー部位を含むリーダーの３’７０ｂｐを更に含む以外は、上記を同様に構築された。
【００８７】
プラスミドｐＢＨ１及びプラスミドｐＢＨ３は更に、（１）ＲＲＥを含む約５００ｂｐのＨＩＶ−１断片、（２）脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）(Jang, S.K., M.V.Davies, R.J. Kaufman,及び E. Wimmer 1989 J.Virol. 63:1651-1660)、及び（３）プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ(Vara, J.A., A. Portela, J. Ortin,及び A. Jimenez 1986 Nuc. Acids. Res. 14:4617-4624)が挿入されることによって修飾されている。
【００８８】
プラスミドｐＢＢは一般的に、プラスミドｐＢＩＶをＢｆｒＩ及びＢｇｌＩＩで消化してコード領域の殆どを除去した後に、そのギャップにオリゴヌクレオドＢＢ５（５‘−ＴＴＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ−３’）及びＢＢ３（５‘−ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣ−３’）をアニーリングすることによって作成された短いポリリンカーを挿入することで作成される。
【００８９】
パッケージング構築物ＢＨ２及びＨＩＶ−１パッケージング構築物（ＨＩＶ−１パッケージング構築物はＣＭＶプロモーターで始まり、その次に、異種イントロン、ＨＩＶ主要スプライスドナー、ｖｐｕ，ｅｎｖ及びｎｅｆ以外の全ＨＩＶコード領域、及びＨＩＶ−１ＲＲＥ、最後にＳＶ４０ポリアデニル化部位が続く。Douglas, J., W. Y. Lin, M. Panis, 及びG. Veres, Human Gene Therapy, “Effect HIV-based vector transduction of unstimulated human CD34+ cells in the SCID-hu Thy/Liv model of human T cell lymphopoiesis” を参照のこと）は、以下に示すようなｇａｇ終止コドンの直上流の２つのヘマグルチニン（ＨＡ）オリゴヌクレオチドの挿入、及び、殆どのｐｏｌコード領域の欠失により、それぞれ修飾されている。第一に、各パッケージング構築物のｇａｇ終止コドンを含む小断片（ＢＩＶの２９０ｂｐのＡｐａＩ−Ａｃｃｌ断片、ＨＩＶ−１の３６０ｂｐのＡｐａＩ−ＢｓｔＸＩ断片）をＡｐａＩ／ＥｃｏＲＶ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋(Stratagene, La Jolla CA) に連結する。次に、各サブクローンを以下のＨＡタグを含むプライマーを使用するＰＣＲ増幅にかける：ＨＩＶ−１に対して、ＨＨＡＳ５‘−ＴＡＴＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧ−３’及びＨＨＡＡ５‘−ＡＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧ−３’；ＢＩＶに対して、ＢＨＡＳ５‘−ＴＡＴＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＡＡＡＧ−３’及びＢＨＡＡ５‘−ＡＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＴＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＣ−３’。各ＰＣＲ産物をサークルにふし、修飾ｇａｇ断片をＡｐａＩ／ＳｍａＩで切り出し、ｇａｇにおけるＡｐａＩ部位及びｐｏｌの３‘末端（ＨＩＶ−１のＡｓｐ７１８、ＢＩＶのＮｓｉＩ）の間が欠けた親パッケージング構築物に連結する。
【００９０】
以下に示すように、ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーターを用いてプラスミドｐＢＩＶ及びｐＢＢＢにおける５‘ＬＴＲ内のＢＩＶプロモーターを置換した。第一に、ＴＡＴＡボックスの上流のＣＭＶ領域を以下のプイマーを用いてＰＣＲ増幅する：ＣＢ５（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧ−３‘）及びＣＭＶＢＩＶ３（５’−ＡＧＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＡＣＡ−３‘）。一方、ＴＡＴＡボックス下流のＢＩＶ領域を以下のプイマーを用いてＰＣＲ増幅する：ＣＭＶＢＩＶ５（５’−ＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＴ−３‘）及びＢｇａｇ３（５’−ＧＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴ−３‘）。第二に、これらの増幅産物を混合し、プライマーＣＢ５及びＢｇａｇ３を用いて増幅する。最終産物をＸｍａＣＩで消化し、ＮｒｕＩ及びＸｍａＣＩで既に消化されたプラスミドｐＢＩＶ及びｐＢＢＢに連結して、ｐＢＩＶＣ及びｐＢＢＢＣを作成する。
【００９１】
プラスミドｐＢＩＶＣを次いでＳｍａＩ及びＡｆｌＩＩＩで消化してコード領域の殆どを除去し、エンハンスされた緑蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｃＤＮＡ（Promega, Madison WI） に連結されたＣＭＶプロモーター又はマウスホスフォグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Adra, C.N., P.H. Boer, 及びM.W. McBurney, 1987 Gene, 60:65-74）のいずれかを有するＤＮＡセグメントにブラントエンド（平滑末端）連結し、それぞれ、プラスミドｐＢＣＣＧ（「ｐＢＩＶＣ−ＳＡＣＧ」とも称される）及びｐＢＣＰＧ（「ｐＢＩＶＣ−ＳＡＰＧ」とも称される）を作成する。
【００９２】
同様に、プラスミドｐＢＩＶＣはＢｆｒＩ及びＢｇｌＩＩで消化してコード領域のより小さいセグメントを除去し、ＣＭＶ−ｅＧＦＰ及びＰＧＫ−ｅＧＦＰカセット、並びに、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＮＤ）プロモーター（Robbins, P.B., X.J. Yu, D.M. Skelton, K.A.Pepper, R.M.Wasserman, L.Zhu, 及びD.B. Kohn, 1997, J. Virol. 71:9466-9474） に連結したｅＧＦＰを有するＤＮＡセグメントにブラントエンド（平滑末端）で連結し、それぞれ、プラスミドｐＢＣ２ＣＧ（「ｐＢＩＶＣ−ＢＢＣＧ」とも称される）、プラスミドｐＢＣ２ＰＧ（「ｐＢＩＶＣ−ＢＢＰＧ」とも称される）及びｐＢＣ２ＭＧを作成する。
【００９３】
プラスミドｐＢＢＢＣをＭｕｎＩ及びＨｐａＩで消化して推定ＲＲＥ及び３‘ＬＴＲの間のＢＩＶ配列を除去し、ＭＮＤ−ｅＧＦＰ及びＰＧＫ−ｅＧＦＰカセットに連結し、それぞれ、プラスミドｐＢＣ３ＭＧ及びｐＢＣ３ＰＧを作成する。ＣＭＶ−ｅＧＦＰカセットも同様にプラスミドｐＢＩＶのＢｓｔＥＩＩ部位に挿入してｐＢＣＧを作成する。
【００９４】
プラスミドｐＢＣ３ＭＧをＢｆｒＩ及びＢｇｌＩＩで消化して短いポリリンカーを除去し、次いで、（１）ｐＢＩＶｐｏｌ遺伝子の〜５００ｂｐＢｇｌＩＩ断片（推定中央ポリプリン区域を含有）に連結してプラスミドｐＢＣ３ＭＧｐｐｔを作成するか；（２）ｐＢＩＶの〜１ｋｂＢｆｒＩ断片（ＢＩＶｇａｇ遺伝子の５‘末端を含有）に連結してプラスミドｐＢＣ３ＭＧｇａｇを作成するか；又は、（３）ヒトインターフェロン−βスカフォールド付着領域（ＳＡＲ：Agarwal, M., T.W. Austin, F.Morel, J. Chen, E. Bohnlein, 及びI. Plavec, 1998 72:3720-3728）を含む〜８００ｂｐ断片に連結してプラスミドｐＢＣ３ＭＧｓａｒを作成する。
【００９５】
プラスミドｐＢＣ３ＭＧｇａｇをＢｆｒＩで直鎖化し、ＳＡＲ及びｃＰＰＴ断片に連結して、それぞれ、プラスミドｐＢＣ３ＭＧｇａｇＳＡＲ及びｐＢＣ３ＭＧｇａｇｐｐｔを作成する。
【００９６】
プラスミドｐＢＣ３ＭＧｐｐｔをＢｆｒＩで直鎖化し、ＳＡＲ断片に連結して、プラスミドｐＢＣ３ＭＧｐｐｔｓａｒを作成する。
【００９７】
プラスミドｐＢＣ３ＭＰ及びｐＢＣ３ＭＰｓａｒは、それぞれ、プラスミドｐＢＣ３ＭＧ及びｐＢＣ３ＭＧｓａｒから、ｅＧＦＰｃＤＮＡをプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（Vara, J.A. Portela, J. Ortin, 及びA. Jimenez, 1986, Nuc. Acid Res. 14:4617-4624）で置換することによって作成される。
【００９８】
３‘ＬＴＲがＵ３領域における大きな欠失及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素（ＵＳＥ：Schek, N.C. Cooke, 及びJ.C. Alwine, 1992, Mol. Cell Biol., 12:5386-5393）の挿入を含む、プラスミドｐＢＣ４ＭＧ及びｐＢＣ４ＭＧｐｐｔを、それぞれ、プラスミドｐＢＣ３ＭＧ及びｐＢＧ３ＭＧｐｐｔから 以下のように作成する。第一に、ＬＴＲ及びＳＶ４０領域の５’部分を以下のプライマーを使用するＰＣＲ増幅にかける：ＧＦＰ５（５‘−ＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧ−３’）及びＢＳＩＮＳＶ３（５‘−ＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＣＧＧＧＧ−３’）。一方で、３‘部分を以下のプライマーを使用するＰＣＲ増幅にかける：ＢＳＩＮＳＶ５（５’−ＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＡＧ−３‘）及びＢＩＶ３（５’−ＴＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＴＧＧ−３‘）。第二に、２つの増幅産物を混合し、プライマーＧＦＰ５およびＢＩＶ３を用いて増幅する。最終産物をＳｓｐＢＩ及びＳｐｈＩで消化し、予めＳｓｐＢＩ及びＳｐｈＩで消化したプラスミドｐＢＣ３ＭＧ及びｐＢＣ３ＭＧｐｐｔに連結する。得られたプラスミドｐＢＣ４ＭＧ及びｐＢＣ４ＭＧｐｐｔはＵ３領域の３３２ｂｐに代わって４０ｂｐのＳＶ４０ＵＳＥを含有する。
【００９９】
ＢＩＶ遺伝子移入システムの相対的評価のためにＨＩＶ−１及びＭＬＶ遺伝子移入システムが用いられる。このようなシステムの構築及び上記の目的での使用には当業者に公知の標準的な技術が含まれる。
【０１００】
実施例１．２：不死化細胞
細胞は以下のソースから入手する。２９３Ｔ細胞はGary Nolan (Stanford University, Palo Alto, CA)から入手した。ＣＥＭＳＳ細胞はＡＩＤＳ試薬プログラム(Rockville MD) から入手した。Ａ−１０及びＤ−１７細胞はアメリカン・ティッシュ・タイプ・コレクション（ＡＴＣＣ、Manassas VA）から入手した。ＭＮ９Ｄ細胞(Choi, H.K., L.A. Won, P.J. Kontur, D. N. Hammond A.P. Fox, B.H. Wainer, P.C. Hoffmann, 及びA. Heller 1991, Brain Res. 552:67-76) はRainer  Ortmann (Novartis, Basel, Switzerland) から入手した。胚性ウサギ上皮（EREｐ）細胞(Oberste, M.S., J.C. Williamson, J.D. Greenwood, K. Nagashima, T.D. Copeland, 及びM.A. Gonda 1993, J. Virol. 67:6935-6405) は国立衛生研究所（NIH, Rockville MD）から入手した。
【０１０１】
HUVEC（２０）細胞及び初代ラット大動脈（平滑筋）細胞はClonetics（SanDiegoCA）から入手した。HUVEC細胞は０．１％ヒト上皮増殖因子（ｈEGF）、２％ウシ胎児血清（FCS）、０．４％ウシ脳抽出物ｗ／ヘパリン、０．１％GA-1000（ゲンタマイシン、アンフォテリシンB）、及び０．１％ハイドロコルチゾンを含むFGMビュレットキットとともにEBM基礎培地中で培養する。
【０１０２】
ラット大動脈細胞は０．１％ｈEGF、５％FCS、０．４％ウシ脳抽出物ｗ／ヘパリン、０．１％GA-1000、及び０．１％ハイドロコルチゾンを含むEGM-MVビュレットキットとともにEBM基礎培地中で維持し、プリマリア（Primaria）組織培養フラスコ（BectonDickinsonBioscences，SanJose CA）内で培養する。
【０１０３】
ＣＥＭＳＳ細胞は、１０％ＦＣＳ添加のＲＰＭＩ−１６４０培地で培養する。その他の全てのセルラインは１０％ＦＣＳ添加のダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養する。１．２５ｘ１０５個のＨＵＶＥＣ細胞を５ｍｌ培地に懸濁し、１３７Ｃｓ源放射装置から８０００ｒａｄで照射し、６ウェルディッシュに移動させ、２日間インキュベートして細胞サイクルのＧ２／Ｍフェーズに同調させる。
【０１０４】
実施例１．３：ウイルス生産
４−１０ｘ１０６個の２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュに蒔き一晩の後、翌日にリン酸カルシウム法（Clontech, Palo Alto CA）により２０−３０μｇプラスミドＤＮＡでトランスフェクトする。典型的には、ベクター２０μｇ、パッケージング構築物１０μｇ、及びＶＳＶ−Ｇプラスミド３μｇを使用する。ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質が必要とされる場合には、４μｇのプラスミドｐＣｒｅｖを追加する。２４−７２時間後、細胞又はウイルス含有培地を回収し、様々な方法で分析する（以下を参照）。トランスフェクション効率を評価するには、細胞の一部を、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton dickinson Biosciences, San Jose CA）を用いるフローサイトメトリーによるｅＧＦＰ発現に関して分析する。培地中に放出されたウイルス量を測定するには、培地から低速遠心によって細胞残渣（デブリス）を除去し、１０μｌを溶解し、市販のキット（Roche Molecular Biochemicals , Indianapolis IN) を用いてＲＴ活性を分析する。
【０１０５】
実施例１．４：ＲＮＡレベルの分析：ノーザンブロット
トランスフェクトした細胞を溶解し、市販のキット（Qiagen, Valencia CA） を用いて細胞質ＲＮＡを調製する。更に、ウイルス含有培地を回収し、低速遠心によって細胞残渣（デブリス）を除去し、次に、高速遠心（50,000 x g、90分間、４℃）でウイルス粒子を回収する。ウイルスペレットを溶解し、市販のキット（Qiagen, Valencia CA） を用いてウイルスＲＮＡを調製する。細胞質ＲＮＡの固定量（１０μｇ）又はウイルスＲＮＡ（ＲＮＡ調製物の三分の一、定量せず）を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロンフィルター(Bio-Rad, Hercules, CA) に移す。このフィルターを市販キット（Ambion, Austin TX）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰによりランダムに標識化（random-primed） されたＤＮＡ断片（４０ｘ１０６ｃｐｍ）に暴露し、次いで、洗浄し、結合したプローブをホスフォイメージャー（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）で分析する。プローブはＢＩＶｇａｇ断片、ＨＩＶ−１ｇａｇ断片（〜１ｋｂ大きさ）、〜３３０ｂｐのＢＩＶＵ３断片、及び〜８００ｂｐのｅＧＦＰ断片が含まれている。
【０１０６】
実施例１．５：タンパク質レベルの分析：ウェスタンブロット
１％ＮＰ−４０，１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ及びPefablocプロテアーゼインヒビター（Roche Molecular Biosciences, Indianapolis IN）を含む緩衝液中で、トランスフェクトした細胞を氷上で１時間溶解する。溶解物を遠心（8,000ｘｇ、２０分間、４℃）して沈殿したタンパク質及び他の残渣を除去する。又は、ウイルス含有培地を回収し、短い遠心にかけて細胞残渣を除去し、次いで、高速遠心（50,000ｘｇ、９０分間、４℃）にかけてウイルス粒子を回収する。ウイルスペレットを直接SDS−PAGE試料緩衝液（Novex, San Diego, CA）内で溶解する。細胞又はウイルス残渣の固定量をアクリルアミドゲル電気泳動にかけてニトロセルロースフィルターに移す。該フィルターをBIVＧａｇタンパク質に対して特異的なウサギ血清（NIHから入手）、次いで、西洋ワサビペーオキシダーゼ（HRP）共役ヤギ抗ウサギIｇ抗体（Zymed, South San Francisco CA）、次いで、HRP基質OPD（Sigma, St. Louis MO）に暴露する。予め染色された分子量標準（Bio-Rad, Hercules CA） をBIVGagバンドのおおよその分子量を測定するのに使用する。HIVウェスタンブロットの場合には、OPD反応前に、フィルターはビオチニル化抗HIVＧａｇ抗体（Beckman Coulter,Fullteron CA）、次いで、ステプタビジン共役HRP（Beckman Coulter,Fullteron CA）に暴露する。HAウェスタンブロットの場合には、OPD反応前に、フィルターはビオチニル化抗HA抗体（Roche Molecular Biosciences, Indianapolis IN）、次いで、ステプタビジン共役HRP（Beckman Coulter,Fullteron CA）に暴露する。VSV-Gウェスタンブロットの場合には、OPD反応前に、フィルターはマウス抗VSV-Gモノクローナル抗体（Sigma, St. Louis MO）及びHRP共役ヤギ抗マウスIg抗体（Zymed, South San Francisco CA）に暴露する。
【０１０７】
実施例１．６：形質導入の分析
細胞を形質導入するために、ウイルス含有培地を短時間の遠心にかけ、細胞残渣を除去し、１ｍｌをポリプロピレンチューブ内の新鮮な細胞（５ｘ１０５CEMSS細胞）又は６ウェル（前日に蒔いたウェル当たり３−６ｘ１０５付着細胞）に添加する。硫酸プロタミン（Sigma, St. Louis MO）を最終濃度８μｇ／ｍｌとなるようにウェルに添加し、チューブ又はディッシュを3000ｐｒｍ、２−3時間、３２−３７℃で遠心（スピノキュレーション）にかける。後の実験では、チューブ又はディッシュには１０ｍMのHEPES緩衝液をスピノキュレーションの前に添加し、細胞を遠心中に培地のｐHが上昇するのを防ぐ。スピノキュレーションの後に、チューブ又はディッシュを異なる方法で処理する。上清をチューブから吸引し、CEMSS細胞を新鮮な培地に懸濁し６ウェルディッシュに移す。対照的に、スピノキュレーションしたディッシュはインキュベーターに戻して30−60分間放置し、その後、培地を除去し、新鮮な培地をウェルに添加する。スピノキュレーションの２−３日後に、細胞の一部をプレートから取り出し、FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) 用いるフローサイトメトリーによりｅＧＦＰ発現を分析する。ベクターｐBC3MP及びｐBC3MPｓａｒを含むウイルス調製物の場合には、２９３T細胞は連続希釈したウイルス含有培地と共にスピノキュレーションにかけ、スピノキュレーションの２４時間後に５μｇ／ｍｌプロマイシン含有の新鮮な培地を細胞に添加し、７−１０日後に、コロニーを直接目視により計測する。
【０１０８】
実施例１．７：初代T細胞の感染
成人末梢全血からフィコール密度勾配遠心によりヒト末梢血単核球（PBMC）を単離し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすぎ、１０％FCS添加RPMI-1640培地に懸濁する。培地にIL2（Peprotech, Rocky Hill NJ）を最終濃度が２００U／ｍｌとなるように添加してPBMCの一部を活性化し、該細胞を以下のように予めコートした１２ウェルディッシュ中（ウェル当たり３ｘ１０６個の細胞）で３日間培養する。即ち、ディッシュを１ｕｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＦｃ(Pierce, Rockford IL) と共に３時間インキュベートし、PBSですすぎ、１ｕｇ／ｍｌの抗CD3(OKT3)及び１０ｎｇ／ｍｌの抗CD２８（BD Pharmingen, San Diego CA）モノクローナル抗体混合物と共に１時間インキュベートし、培地ですすぐ。５ｘ１０５個の活性化又は刺激されていないPBMCをポリプロピレンチューブ中でCEMSS細胞と同様にウイルス上清と共にスピノキュレーションする（上記）。スピノキュレーションの後に、細胞をすすぎ、IL2含有培地に懸濁し、抗CD3及び抗CD２８モノクローナル抗体で予めコートした２４ウェルディッシュ内で培養する。４日及び２週間後に、細胞の一部を取り出し、FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) 用いるフローサイトメトリーによりｅＧＦＰ発現を分析する。T細胞は光散乱特性、並びに、APC共役抗CD４モノクローナル抗体及びPerCP共役抗CD8モノクローナル抗体(Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) を用いるCD4及びCD8の発現により同定する。
【０１０９】
実施例１．８：ヒト造血幹細胞（HSCｓ）の感染
ヒトＣＤ３４＋細胞を、Isolex 300SA (Baxter, IL) を用いて正常ドナーのG-CSF可動化末梢全血から単離する。この細胞（８０−９０％純度のＣＤ３４＋）を分取（１ｘ１０７）し、４５％イスコフ変性イーグル培地（IMDM）,４５％FCS及び１０％DMSOから成る培地中で凍結する。形質導入に先立ち、まず、２％FCS,１％HEPES、及び１０Ｕ／ｍｌヘパリン含有緩衝液中で凍結細胞を融解する。融解後に、細胞（５ｘ１０５）をサイトカイニンなしでウイルス上清と共にスピノキュレーション（上記）するか、又は、サイトカイニン含有培地（X-vivo１５培地(BioWhittaker, Walkersville MD)、トロンボポイエチン（ｔｐｏ）様（50ng/ml; Novartis, Basel Switzerland）、ｆｌｔ３リガンド（100ng/ml; Systemix, Palo Alto CA））、及びｃ−ｋｉｔリガンド（100ng/ml; Systemix, Palo Alto CA））中で４８時間培養し、その後、ウイルス上清と共にスピノキュレーションする。感染後に、細胞をサイトカイニン含有培地中で培養する。3日間又は２週間後に、細胞の一部をAPC共役抗CD３４抗体FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA)で染色し、FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) 用いるフローサイトメトリーによりＣＤ３４＋細胞におけるｅＧＦＰ発現を分析する。
【０１１０】
実施例２：ヒト細胞のBIVによる形質導入
野生型BIVゲノムに増強された（enhanced）緑蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）マーカー遺伝子を挿入することで修飾し、構築物BCGを作成する（詳細については実施例１のプラスミド構築を参照）。ｅＧＦＰ遺伝子はウイルスエンベロープ遺伝子内の内部位置に挿入されているので、ウイルスｒｅｖ又はｔａｔ発現、若しくはｒｅｖ応答要素（RRE）機能には影響を与えない。ヒト腎臓腫瘍セルラインである２９３Tを構築物BCG及び水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）をコードするプラスミドでコトランスフェクションする。２日後に、ウイルス含有培地を回収し、新鮮な２９３T細胞に接触させる。更に、野生型BIV複製を支持する胚性ウサギ内皮セルラインEREｐ（Oberste, M.S., J.C. Williamson, J.D. Greenwood, K. Nagashima, T.D. Copeland 及びM.A. Gonda, 1993 J. Viorl. 67:6395-6405)を培地に添加する。３日後に、この細胞に関してフローサイトメトリーによりｅＧＦＰ発現を分析する。２９３T細胞のサブセット（約５％）はｅＧＦＰを発現し、BIVがヒト細胞に形質導入するに必要な全ての機能（逆転写及び組み込み）を備えていることが示された。同様な形質導入効率がEREｐセルラインについても認められる。
【０１１１】
実施例３：BIVパッケージング構築物ａ
ウイルス遺伝子を含むパッケージング構築物は実施例１に記載のように作成し（図２）、ｇａｇｍＲＮＡ発現及び一過性発現システムにおけるウイルス生産（表１）につきアッセイする。
【０１１２】
【表１】
2010166919.tif 000003
【０１１３】
ａそれぞれ示された構築物でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からウイルス含有培地を回収してＲＴアッセイにより分析する。７つのトランスフェクションを行った。各値は培地１ｍｌ当たりのＲＴタンパク質（ｐｇ）で示す。
【０１１４】
構築物の一つであるＢＩＶＣは、５‘ＬＴＲＵ３領域がヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターと正確に置換されていることを除いて、野生型ＢＩＶと同一である。２つのセグメントの結合個所は同一のＴＡＴＡボックスに位置し、ウイルスＲＮＡが標的細胞への感染のための適当な５’末端を有する可能性を最大化するようになっている。その他の３つのＢＩＶパッケージング構築物はｇａｇ遺伝子近傍のＢＩＶリーダーに連結されたＣＭＶプロモーターを有し、５ＬＴＲ及びプライマー結合部位を欠き、更にＢＨ１及びＢＨ３の場合には主要スプライスドナーも欠く。構築物ＢＨ１はＣＭＶとＢＩＶのセグメントの間に挿入された小さなキメライントロンを有している。構築物ＢＨ２は、ｐｏｌ遺伝子の下流に、ｅｎｖ内部の欠失（約１ｋｂ）（ｔａｔ及びｒｅｖ発現又はＲＲＥ機能に影響はないと予想される）を除いて全てのウイルスコード配列を有している。一方で、ＢＨ１及びＢＨ３は、ｐｏｌ遺伝子の約２５０ｂｐ下流で停止するＢＩＶ配列を含む。ＢＨ１及びＢＨ３はｒｅｖ遺伝子及びＲＲＥを欠いているので、ＨＩＶ−１ＲＲＥがＢＩＶ配列の下流に挿入され、構築物が構成されるときにＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質がイントランスで提供される。更に、これら２つの構築物は、パッケージング構築物を安定的に生産するセルラインを選択するために、脳心筋炎ウイルス(ECMV; Jang, S.K., M.V. avies, R.J. Kaufman, 及びE.wimmer, J. Virol. 63:1651-1660) 由来の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）と組み合わされたプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ(Vara, J.A., A. Portela, J. Ortin, 及びA. Jimenez, 1986 Nuc. Acids Res., 14:4617-4624) を含む。
【０１１５】
トランスフェクトされた細胞の細胞質ＲＮＡのノーザンブロット分析により、野生型ＢＩＶ（２４９ｃｐｍ）及びＢＣＧ構築物（１１３ｃｐｍ）に比べて、ＢＩＶＣ構築物はｇａｇｍＲＮＡをより高い安定したレベル（８１６ｃｐｍ）生産することが示された。これはＣＭＶプロモーターが２９３Ｔ細胞中のＢＩＶＬＴＲに比べてより活性が強いことを示唆するものである。パッケージング構築物ＢＨ１（７０ｃｐｍ）及びＢＨ３（３９ｃｐｍ）は低レベルのｇａｇｍＲＮＡ発現を示した。しかしながら、ＢＨ２（８６１ｃｐｍ）はＢＩＶＣ構築物に匹敵する高レベルの発現を示した。比較のためＣＭＶ誘導ＨＩＶ−１誘導パッケージング構築物はより高いレベル（１１２０ｃｐｍ）のｇａｇｍＲＮＡ発現を示した。
【０１１６】
感染細胞から回収したウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ（表１）及びウェスタンブロット分析により、ＢＩＶＣが野生型ＢＩＶ，ＢＨ１及びＢＨ３に比べてより多量のウイルス粒子を生産することが示された。しかしながら、ＢＨ２又はＨＩＶ−１パッケージング構築物と比べるとかなり少量であった。ＢＩＶＣウイルスが低量であったのは、細胞変性効果及び小さいシンシチウム（syncytia）が観察されたことから、高いレベルの野生型ＢＩＶエンベロープタンパク質をＢＩＶＣが生産したことから生じた感染細胞における毒性が原因であるかもしれない。ウェスタンブロット分析により、ＢＩＶＣ及びＢＨ２の両ウイルス調製物ともに成熟していた、即ち、Ｇａｇタンパク質が殆ど完全に切断されていたことが示された。
【０１１７】
ＲＴアッセイにより、ＢＨ２が産生したウイルス量はＨＩＶ−１パッケージング構築物が産生した量に類似していた。このウイルス量が類似していることを確認するために、ｇａｇ終止コドンの直上流に２つの構成的ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを挿入することでこれら２つのパッケージング構築物を修飾する。更に、ｐｏｌ遺伝子の殆どを欠失させてＧａｇポリタンパク質の切断を阻害したＨＡ−タグ構築物を、親構築物と平行して２９３Ｔ細胞に導入する。２日後に修飾ウイルスを回収し、Ｇａｇタンパク質に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットアッセイにより親ウイルスと比較する。いずれの修飾構築物も親構築物と同様のウイルス量を産生した。次に、修飾ウイルスをＲＴアッセイによって親構築物に標準化し（ノーマライズ）（ＨＩＶ−１については６４９ｐｇ、ＢＨ２については２０５ｐｇ）、ウェスタンブロットアッセイによりＨＡ−タグＢＩＶＧａｇポリタンパク質について分析した。ＨＡ−タグＨＩＶ−１Ｇａｇポリタンパク質量及びＨＡ−タグＢＩＶＧａｇポリタンパク質量は類似しており、ＲＴアッセイに対応している。ＢＨ２パッケージング構築物はＨＩＶ−１パッケージング構築物にほぼ匹敵するウイルスレベルを産生する。
【０１１８】
ＶＳＶ−Ｇ取り込み（incorporation）効率を評価する目的でもＢＨ２及びＨＩＶ−１ウイルス調製物についてウェスタンブロットアッセイを行う。各パッケージング構築物及びＶＳＶ−Ｇでトランウフェクトした２９３Ｔ細胞からウイルスを回収し、ＲＴアッセイによって標準化し、ＶＳＶ−Ｇに特異的なモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットアッセイにかける。ＢＨ二及びＨＩＶ−１試料で検出されたＶＳＶ−Ｇ量は類似しており、ＢＩＶはＨＩＶ−１と同程度に効率的にＶＳＶ−Ｇを取り込むことがしめされた。
【０１１９】
実施例４：ＢＩＶベクター
実施例１に詳細に記載されているように、ｅＧＦＰマーカー遺伝子及び標的細胞への移入にシスで必要な全てのウイルス要素を含むＢＩＶ由来ベクターを作成した。
第一に、ｇａｇ配列以外の全てを含む完全なリーダー及び最小ｅｎｖ配列（即ち、ＲＲＥなし）を含有する２つのベクター（ＢＣＣＧ及びＢＣＰＧ）を、約５００ｂｐのｇａｇ配列及び１．２ｋｂのｅｎｖ配列を含むアナログベクター（ＢＣ２ＣＧ及びＢＣ２ＰＧ）と比較する。他のレトロウイルスを用いた以前の研究によってパッケージング要素を含むか又はより上流のパッケージング要素を安定化させるかによって、ｇａｇ遺伝子の５‘がウイルス粒子内へのベクターＲＮＡの包み込み（encapsidation）を増加することが示されているので（Bender, M.A., T. D.Paler, R.E. Gelinas, 及びA.D. Miller 1987, J.Virol. 61:1639-1646, Buchschacher, G.L., 及びA.T. Panganiban, 1992, J. Virol. 66:2731-2739;Parolin, C.P., T. Dorfman, G. Palu, H. Gottlinger, 及びJ. Sodroski, 1994 J. Virol.68:3888-3895）、後者のベクターを作成した。更に、ＨＩＶ−１の研究によって、ｇａｇ遺伝子は核からのＲＮＡ輸送を阻害する配列を含み、ＲＲＥはこの阻害をｒｅｖタンパク質存在下で除去することが示されている（Malim, M.H., J. Hauber, S.Y. Le, J.V. Maizel,及び B.R. Cullen 1989 Nature 338:254-257;Schwartz, S., B. K. Felber, 及びG.N. Pavlakis 1992 J. Virol. 66:150-159）。ＰＧＫ内部プロモーターを有する２つのベクターの２９３Ｔ細胞への形質導入を、ＶＳＶ−Ｇで偽性化されたＢＨ２パッケージング構築物を用いて分析する。ＢＣ２ＰＧは細胞の５％に形質導入し、ＢＣＰＧはいずれの細胞に形質導入しない（第３図、実験＃１）。４つの全てのベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞及び回収したＢＨ２ビリオンにおける細胞質ＲＮＡ発現をノーザンブロット分析で評価する。各ベクターはトランスフェクトした細胞質内での高レベルな完全長ＲＮＡを生産するが、ＢＣ２ＣＧ及びＢＣ２ＰＧの完全長ＲＮＡのみがＢＨ２ビリオンに効率的に包み込まれる。従って、ＢＩＶｇａｇ遺伝子の５’末端はウイルスＲＮＡの包み込みに直接的又は間接的に要求される配列を含むことが多い。面白いことに、このような配列がＢＣＰＧ及びＢＣＣＧの完全長ＲＮＡ上にない場合、内部開始ｍＲＮＡが取り込まれる。これは、他のパッケージング要素がＢＩＶゲノムの３‘部分に存在することを示している (Berkowita R.D. J. Fisher, 及びS.P. Goff, 1996 Current Topics in Microbiology and Immunology 214:177-218) 。
【０１２０】
次に、ＰＧＫプロモーターをＭＮＤプロモーターと２つの点で比較する。即ち、推定ＢＩＶＲＲＥの上流（ＢＣ２ＰＧ及びＢＣ２ＭＧ）又は下流（ＢＣ３ＰＧ及びＢＣ３ＭＧ）におけるプロモーター−ｅＧＦＰカセットがある点である。２９３Ｔ細胞において、後者産物は前者より僅かに高い形質導入効率（ＰＧＫベクターに対して１４％対６％、ＭＮＤベクターに対して３５％対２９％）を生じ、両方の構築物において、ＭＮＤプロモーターはＰＧＫプロモーターよりも良い結果を示した（図３、実験＃２）。しかしながら、全てのベクターはアナログＰＧＫ−ｅＧＦＰベクターを含むＨＩＶ−１ウイルス（７５％形質導入）よりもかなり少ない細胞しか形質導入しない。
【０１２１】
最適なベクターであるＢＣ３ＭＧを生産して、遠心によって濃縮される能力、リンパ系セルラインを形質導入する能力、及び感染後の２週間に亘るｅＧＦＰ発現頻度の変化について分析する。ビリオンの一部を遠心により回収し、元の容積の１００分の１以下の容量に懸濁し、次いで、１０倍又は１００倍に希釈する。１ｘウイルスは低い形質導入効率しか示さないが、Ｔリンパ系セルラインであるＣＥＭＳＳは２９３Ｔ細胞（５％）よりもより効率的（１２％）に形質導入される。更に、１０ｘウイルスは２９３Ｔ細胞を１０倍高いパーセンテージで形質導入し、ＣＥＭ細胞は４．５倍高いパーセンテージで形質導入した。更に、ｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは２９３Ｔ細胞において２週間にわたり約５分の一に減少したが、ＣＥＭＳＳラインにおいてはより少ない程度まで減少した。その後の新しくて濃縮しないウイルス調製物を使用して感染させたところ、ｅＧＦＰ＋２９３Ｔ細胞のパーセンテージの時間経過による減少は最初のｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージと逆の相関があることが示された。例えば、感染の２日後に７３％ｅＧＦＰ＋である２９３Ｔ細胞は感染の２週間後に４３％ｅＧＦＰ＋となり、４週間後には２８％ｅＧＦＰ＋である。
【０１２２】
ＢＣ２ベクターと比較してＢＣ３が示したより高い形質導入効率は、パッケージングシグナルの位置が非ウイルス配列、即ち、内部プロモーターから遠く離れているために、パッケージングシグナルの安定性が増大したことが原因と考えられる（Kaye, J.F., J.H. Richardson, 及びA.M. Lever 1995 J. Virol. 69:6588-6592）。従って、ＨＩＶ−１の中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）に類似した方法で機能するポリプリン区域（Charneau, P., M. Alizon, 及びF. Clavel 1992, J. Virol. 66:2814-2820, Charneau, P., Misambeau, R. G, P., S. Paulous, H, Buc. 及びF. Clavel 1994 . Mol. Biol. 241:651-662） を含む、ｐｏｌ遺伝子の約５００ｂｐのセグメントを含む追加のウイルスセグメントがベクターＢＣ３ＭＧのｇａｇ領域の直ぐ下流に挿入される。更に、ｇａｇ遺伝子の３‘部分（約１ｋｂ）が挿入される。このベクター（ＢＣ３ＭＧｇａｇ）はキャプシド領域における約２００ｂｐを除いた全てのｇａｇ遺伝子を含む。２つの新たなベクターをＢＨ２及びＶＳＶ−Ｇと共に用いて、親ベクターＢＣ３ＭＧの形質導入効率（５５％）よりも僅かに高い効率（７０％及び７３％）で２９３Ｔ細胞を形質導入することが見出された（図３、実験＃３）。比較のために、ＭＮＤ−ｅＧＦＰベクターを含むＨＩＶ−１ウイルスは細胞の１００％を形質導入する。
【０１２３】
組み込まれたプロウイルスＤＮＡからのベクター発現を可能にすることが示されているβ−インターフェロンスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）（Agarwal, M., T.W. Austin, F.Morel, J. Chen, E. Bohnlein, 及びI. Plavec 1998 J. Virol., 72:3720-3728）もパッケージングシグナルの直ぐ下流に挿入される。このベクター、ＢＣ３ＭＧｓａｒはＢＣ３ＭＧｐｐｔに比べて僅かに高い頻度で２９３Ｔ細胞を形質転換する（７１％対６０％、図３、実験＃４）。更に、ＳＡＲセグメント、３‘ｇａｇセグメント及びｃＰＰＴを２つ一組に含有するベクターを作成した。しかしながら、これらのいずれのベクターも各セグメントを単独で含有するベクターと比較してより高い形質導入頻度を有するものではなかった（図３、実験＃４）。
【０１２４】
ＢＣ３ＭＧベクター及びＢＣ３ＭＧｐｐｔベクターは次いでそれらのＳＩＮ対応物である、ＢＣ４ＭＧ及びＢＣ４ＭＧｐｐｔと比較した。これらのＳＩＮベクターは３‘ＬＴＲのＵ３領域の内部３２２ｂｐが欠失し、５’末端に５５ｂｐ及び３‘末端に７ｂｐが保持されている。その結果、ＴＡＴＡボックス及びプロモーター要素の殆どが除去されている。この領域が欠失したベクターは標的細胞に組み込まれたベクターが転写を指示することができないので、５’ＬＴＲ「自己不活性化（self-inactivating）」、又はＳＩＮと呼ばれる（Miyoshi, H., U. Blomer, M. Takahashi, F.H. Gage, 及びI. M. Verma, 1998, J. Virol. 72:8150-8157, Zufferey, R., T. Dull, R. J. Mandel, A. Bukovsky, D.Quiroz, L. Naldini, 及びD. Trono, 1998 J. Virol. 72:9873-9880）。この効果はベクターの安全性を向上させるばかりではなく、５‘ＬＴＲからの転写がベクター内部プロモーターからの転写と干渉するような場合には、ＳＩＮ欠失は形質導入細胞における導入遺伝子の発現を増加させることにもなるであろう。組み込まれたＨＩＶ−１プロウイルスから読み過ごし（read-through）が起こることが以前に報告されており(Dron, M., L. Hameau, L. Benboudjema, J. Guymarho, C. Cajean-Feroldi, C. Rizza Pgodard, C. Jasmin, M.G. Tovey, 及びM.C. Lang, 1999 Arch. Virol 144:19-28) 、ＨＩＶ−１転写物は常に３’ＬＴＲで終止するとは限らないことが示唆されている。この現象がＢＩＶベクターでも起こり、遺伝子移入システムの力価を減少させる可能性はあるので(Carswell, S., 及びJ.C. Alwine 1989, Mol Cel Biol. 9:4248-4258）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素（ＵＳＥ；：Schek, N., C. Cooke, 及びJ.C. Alwine 1992 Mol. Cell Biol. 12:386-5393）をＳＩＮ欠失により生じたギャプに挿入する。２つの新たなベクターであるＢＣ４ＭＧ及びＢＣ４ＭＧｐｐｔのパッケージング構築物ＢＨ２及びＶＳＶ−Ｇとの形質導入効率を分析する。その結果、ＢＣ４ＭＧは２９３Ｔ細胞の６８％を形質導入し、ＢＣ４ＭＧｐｐｔは２９３Ｔ細胞の９０％を形質導入した（図３、実験＃５）。しかしながら、親である非ＳＩＮベクターも同様の形質導入効率（それぞれ６８％及び８４％）を示し、ＳＩＮ欠失とＳＶ４０ＵＳＥ挿入はＢＩＶ遺伝子移入システムの力価を実質的に増加するものではない。
【０１２５】
BIVウイルスの力価を正確に測定するために、ｅＧＦＰｃDNAをベクターBC3MG及びBC3MGｐｐｔから除去し、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（Vara, J.A. Portela, J. Ortin, 及びA.Jimenez 1986, Nuc. Acids Res. 14:4617-4624）と置換し、ベクターＢＣ３ＭＰ及びＢＣ３ＭＰｐｐｔを作成する。同じことをＭＮＤ−ｅＧＦＰカセット含有ＨＩＶ−１ベクターに対しても行なう。これら３つのベクターを２９３Ｔ細胞内で調製し、連続希釈を新鮮な２９３Ｔ細胞に暴露する。２日後に、細胞をプロマイシンで処理して非形質転換細胞を死滅させる。１週間培養したのち、ディッシュ内で増殖したコロニー数を計数し、元のウイルスの力価を計算するのに使用する。ＨＩＶウイルス力価は１ｍｌ当たり１．２ｘ１０７細胞、ＢＣ３ＭＰウイルスの力価は１ｍｌ当たり３ｘ１０５細胞、ＢＣ３ＭＰｐｐｔウイルスの力価は１ｍｌ当たり４．５ｘ１０５細胞であり、ＨＩＶウイルス力価の約３０分の１であった。
【０１２６】
実施例５：他のセルライン及び非分裂細胞への形質導入
パッケージング構築物ＢＨ２、ベクターＢＣ３ＭＧ及びＶＳＶ−Ｇを用いて２９３Ｔ細胞内で調製した、濃縮ＢＩＶウイルスを用いて以下の一連の細胞を形質導入した：イヌ骨肉種ラインであるＤ−１７；ラット平滑筋セルラインであるＡ−１０；ヒト内皮セルラインであるＨＵＶＥＣ；及び、マウス神経セルラインであるＭＮ９Ｄ。これらの各セルラインにおいて、感染２週間後でもＢＩＶウイルスは細胞のかなりのパーセンテージ（６３−８８％）を形質導入した。更に、初代ラット内皮細胞をＢＩＶウイルスで形質導入したが、不死化ラインのような効率ではなかった。（２２％）。
【０１２７】
ＢＩＶウイルスが非分裂細胞を形質導入する能力を評価するために、濃縮ＢＩＶウイルス（ｘ１０）を放射線照射ＨＵＶＥＣ細胞及び休止（resting）ヒト末梢血リンパ球の形質導入について評価した。ＨＵＶＥＣラインはＢＩＶウイルスに暴露する２日前に放射線照射され、細胞周期のＧ２／Ｍ相に同調させた。予想されたように、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）調製物は未処理細胞を容易に形質導入したが、放射線照射細胞にはそうではなかった。対照的に、ＢＩＶ及びＨＩＶ−１ウイルスのいずれも未処理細胞及び放射線照射細胞の双方に対して同様の効率で形質導入することができ、各レンチウイルスは非分裂細胞を効率的に形質導入することができることを示している。
【０１２８】
非刺激ヒトＰＢＬにおいて、感染４日後にアッセイしたときに、ＢＩＶにより形質導入された細胞の殆どはｅＧＦＰを非常に低いレベルでしか発現しなかったが、ＢＩＶウイルスは1ＨＩＶ−１と同様の形質導入効率を示した。しかしながら、感染２週間後に、これら薄い（ｄｉｍ）細胞は集団からなくなった。その結果、形質導入された細胞のパーセンテージは低い（１０ｘウイルスに対して１％、４０ｘウイルスに対して６％）。しかしながら、予め活性化した (pre-activated)（即ち、増殖）ＰＢＬにおいても、１０ｘウイルスにより形質導入された細胞はわずか５％であるように、ウイルスは低い形質導入効率しか示さなかった。対照的に１０ｘＨＩＶ−１ウイルスは、予め活性化した細胞の８１％、非刺激細胞の４４％を形質導入し、一方、１０ｘＭＬＶウイルスは予め活性化した細胞の４３％を形質導入したが、非刺激細胞の１％しか形質導入しなかった。
【０１２９】
最後に、濃縮したBIVウイルスを用いて、その殆どが静止状態（quiscent）にある非刺激可動化末梢CD34＋造血幹細胞（HSCｓ）（Knaan-Shanzer, F., D. Valerio, 及びV.W. van Beusechem 1996. Hum Gene Ther. 3:323-333 Uchida, N., D. He, A.Friera, M. Reitsma, D. Sasaki, B. Chen 及びA. Tsukamoto 1997 Blood 89:465-472）を形質導入する。１０ｘBIV調製物は感染３日後に１９％のHSCを形質導入し、４０ｘBIV調製物は３１％のHSCを形質導入した。興味深いことには、１０ｘBIVウイルスで形質導入された殆ど全ての細胞は高いレベルのｅＧＦＰを発現し、これらの細胞は１１日後に細胞を分析したときにも消滅していない。４０ｘBIVウイルスで形質導入された細胞は２つのｅＧＦＰ＋集団をしめす。その一つ（細胞の１８％）は非常に低いレベルのｅＧＦＰを発現し、もう一方（細胞の１３％）は高いレベルのｅＧＦＰを発現する。両方の集団ともに次の１１日間に亘り、頻度が６分の１に減少した。
【０１３０】
実施例６．１：略号
HIV：ヒト免疫不全ウイルス
BIV：ウシ免疫不全ウイルス
VSV-G：水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質G
MLV：マウス白血病ウイルス
AAV：アデノ随伴ウイルス
IU：感染ユニット（単位）
HSｋMC：ヒト初代骨格筋細胞
【０１３１】
実施例６．２：導入
ヒト遺伝子治療用の治療遺伝子を輸送するために、様々なウイルスベクターが開発されてきた。マウス白血病ウイルス（MLV）、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくベクターはこのような目的の為に広く使用されている。しかしながら、これらの全てのベクターシステムは利点と同時に欠点も有している。MLV由来ベクターはヒト遺伝子治療に対して安全性が証明されているが、しばしばインビボにおける治療標的となる非分裂細胞に形質導入する能力がないことが欠点である。ヒトアデノウイルス由来ベクターは様々な非分裂標的細胞に効率的に形質導入することができるしかしながら、強力な宿主免役反応及び一過性遺伝子発現のために、最も一般的に使用されるアデノウイルスベクターを利用することが制限される。AAVウイルス由来ベクターはそのコード能力が低いために、このベクターの有用性は低い。
【０１３２】
最近になって、レンチウイルス由来のベクターシステムの遺伝子輸送システムとして可能性が広範囲にわたって研究されてきた。レンチウイルスベクターは分裂細胞及び非分裂細胞の両方に効率的に形質導入することが出来、それらの染色体に安定的に組み込まれ、その結果、長期に亘って遺伝子を発現することが出来る。更にこのベクターは異種ウイルスエンベロープを有する偽型（pseudotype）に対する安定性に因る広範囲な指向性を提供する。加えて、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子のみが標的細胞内で発現されるために、宿主免役反応問題に対する懸念を起こす可能性がない。インビトロにおいて、ヒト免役不全ウイルス（HIV）由来のVSV-G偽型レンチウイルスベクターが、例えば、ミクロファージ、神経細胞、肝細胞、光受容体細胞、及び造血幹細胞のような様々な非分裂細胞を形質導入することが示された。インビボにおいて、レンチウイルスベクターはラット神経細胞を形質導入し、長期間に亘り導入遺伝子が発現することが示された。
【０１３３】
HIV由来のレンチウイルスベクターに関連する安全性に対する心配を解消するために、我々はウシ免疫不全ウイルス（Bovine Immunodeficiency Virus: BIV）由来のレンチウイルスベクターシステムを開発した。BIVはヒト病原体ではなく、自然宿主であるウシにおいて明らかな病気を引き起こすものではない。ここで、１）BIVに基づく（由来）レンチウイルスベクターがHIV由来システムに匹敵する１．２ｘ１０６i.u./mlの力価を有していること、２）BIVに基づくベクターは１回の超遠心ステップによって１５０倍以上に濃縮することが可能であること、３）BIVに基づくベクターは分裂細胞及び非分裂ヒト初代骨格筋細胞の双方に効率的に形質導入することができる、ことを示す。
【０１３４】
実施例６．３：方法
細胞。ヒト初代骨格筋細胞（ｈSkMC）はクローンティクス(Clonetics, Walkersville, MD) から購入し、製造者の指示に従って維持及び培養した。ヒト胚性腎臓２９３T細胞は, 10%ウシ胎児血清（FBS: Hyclone Labs, Logan, UT）含有ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM:BioWhittaker,Walksville,MD）（完全DMEM培地）で培養した。
【０１３５】
BIV由来の遺伝子移入システム。BIV由来の遺伝子移入システムは３つのプラスミド構築物を含む。ヘルパー機能を提供するBIVパッケージング構築物；ｅＧＦＰのようなマーカー遺伝子、又はプロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性遺伝子をコードするBIVレンチウイルスベクターバックボーン；及び、VSV-G発現遺伝子をコードする発現構築物。BIVレンチウイルスベクターバックボーン及びVSV-G発現発現構築物は基本的に既に記載したものと同じである。しかしながら、BIVパッケージング構築物BH２は修飾された。具体的には、主要スプライスドナー部位（MSD）からBIVｇａｇ開始コドンまでの１５ｂｐの推定パッケージング配列を欠失させて、BH２ΔΨを作成した。推定パッケージング配列を欠失させる為に、MSDからｇａｇ開始コドンまでの領域を２つのプライマーPackageDel５（５‘−CGACCCGGGCGGCCGCTTCG-3’）及びPackageDel３（５‘−CTACTCACCTGTCCGGAGTC-3’）を用いるPCR増幅にかける。増幅したＰＣＲ産物ＳｍａＩで消化し、予めＳｍａＩで消化したＢＨ２プラスミドに連結してBH２ΔΨを作成する。
【０１３６】
レンチウイルスベクターの調製。レンチウイルスベクターを調製するために、１０ｃｍディッシュ内の８５％集密度（confluent）の２９３Ｔ細胞に、リン酸カルシウムトランスフェクション法にて１５μｇパッケージングプラスミド（BH２ΔΨ）、１５μｇベクタープラスミド（ＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰ又はＢＩＶＭＮＤＰｕｒｏ）、４．５μｇＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド（ｐＣＭＶ．ＶＳＶ−Ｇ）をトランスフェクトした。ベクター上清の一部を採取し、使用するまで−８０℃で保存する。ＢＩＶレンチウイルスベクターを濃縮するために、回収したベクター上清を４℃、１００，０００ｘｇの超遠心に９０分間かける。ベクターのペレットを少量のＤＭＥＭ培地に再懸濁し、使用するまでその一部を−８０℃で保存する。
【０１３７】
形質導入。８μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Sigma, St. Louis, MO）存在下で標的細胞をレンチウイルスベクターで４時間かけて形質導入した。細胞を培地で２回洗浄し、更に連続して４８時間培養した。形質導入された細胞のｅＧＦＰ発現をＦＡＣＳｃａｎで分析する。
【０１３８】
ＢＩＶレンチウイルスベクターのタイトレーション（力価測定）。ＢＩＶレンチウイルスベクターの力価を測定するために、１日目に、５ｘ１０４個の203Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。２日目に、プロマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルスベクター（完全ＤＭＥＭ培地２ｍｌを添加した非濃縮５μｌ）を用いて８μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン存在下で細胞を形質導入する。３日目に、形質導入された細胞をトリプシン処理し、各ウェルから形質導入された細胞の５％を、５μｇ／ｍｌのプロマイシン（Sigma, St. Louis, MO）存在下の完全ＤＭＥＭ培地を含む６ｃｍディッシュに蒔いた。３日後に、培地をプロマイシンを含む新鮮な培地と交換した。形質導入後７日目に、細胞培養培地を吸引し、プロマイシン耐性クローンをクマシーブルーで染色して計数した。
【０１３９】
逆転写酵素アッセイ。ＢＩＶのＲＴはＨＩＶのＲＴと交叉反応することを利用して、ＢＩＶのＲＴをＲｏｃｈｅから購入したＨＩＶのＲＴのアッセイキットを使用して定量した。
【０１４０】
ＢｒｄＵ取り込み。細胞が形質導入されるときに、活性化されて分裂しているかどうかを測定するために、製造業者の指示に従って、細胞をＢｒｄＵ（ＢｒｄＵラベリングキット、Phamingen, San Diego, CA）でラベル化した。
【０１４１】
実施例６．４：結果
ＢＩＶ由来遺伝子移入システム。ＢＩＶ由来遺伝子移入システムはＢＩＶパッケージング構築物、ＢＩＶベクター構築物、及びＶＳＶ−Ｇ発現構築物から構成されている（図４）。ＢＩＶレンチウイルスベクターを作成するために、これら３つの構築物を２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、上記のように、感染後４８時間にウイルスベクター上清を回収した。
【０１４２】
ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターの力価。ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターの凡その力価を測定するために、プラスミドBH２ΔΨ（１５μｇ）、ＢＩＶＭＮＤＰｕｒｏ（ＭＮＤＬＴＲプロモーターに調節されるプロマイシン耐性遺伝子を含むＢＩＶレンチウイルスベクターの（バックボーン）（１５μｇ）、及びｐＣＭＶ．ＶＳＶ−Ｇ（４．５μｇ）を、上記のように２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトした。対照として、ＢＩＶＭＮＤＰｕｒｏをＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰ（ＢＩＶＭＮＤＰｕｒｏ中のプロマイシン耐性遺伝子がｅＧＦＰコード遺伝子と置換されている）と置換した。プロマイシン耐性遺伝子又はｅＧＦＰ遺伝子をコードするＢＩＶレンチウイルスベクターを使用して２９３Ｔ細胞を形質導入した。プロマイシン選択後に、プロマイシン耐性クローンを計数した。ベクターにより１ｍｌ当たり約１．２ｘ１０６プロマシン耐性クローンが得られ、ＢＩＶレンチウイルスベクターは約１．２ｘ１０６ｉ．ｕ．/mlの力価を有していることが示唆された。プロマイシン耐性クローンはＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰで形質導入した細胞においては見出されなかったので、これらのクローンはＢＩＶＭＮＤＰｕｒｏに特異的なものである。
【０１４３】
ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターの濃縮。ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターの高い力価を得るために、ベクター上清を超遠心にかける。濃縮前後のベクターＲＴ活性を測定し比較した。表２に示されるように、３つの独立したベクター調製物から明らかなように、ＲＴ活性１５０倍以上に増加した。
【０１４４】
【表２】
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【０１４５】
表２．ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターの濃縮。３つの独立したＢＩＶ由来レンチウイルスベクター調製物を超遠心にかける。逆転写酵素（ＲＴ）活性を濃縮前後で測定する。超遠心の１回目の後に、２つの異なるベクターによる３つの独立した調製物の全てについてＲＴ活性は１５０倍以上に増加した。
【０１４６】
ＢＩＶレンチウイルスベクターによる分裂ヒト初代骨格筋細胞の形質導入。１ｘ１０５個のヒト骨格筋細胞を６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。翌日、上記のように、細胞をＢｒｄＵでラベル化するか、又は硫酸プロタミン存在下でＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰ（各ウェル当たり１２０ｎｇＲＴ当量）で３時間形質導入した。形質導入の１６時間後のＢｒｄＵ取り込み、又は、形質導入の４８時間後のｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで測定した。ｈＳｋＳＭＣはＢＩＶ由来レンチウイルスベクターＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰにより効率的に形質導入された。５６％以上の細胞がｅＧＦＰ発現に関して陽性であり、相対平均ｅＧＦＰ強度は２３００以上であった。これはＢＩＶ由来レンチウイルスベクターがヒト初代骨格筋細胞を効率的に形質導入できることを示している。細胞によるＢｒｄＵ取り込みに示されるように、これらの細胞は形質導入されるときに活発に分裂している。
【０１４７】
ＢＩＶレンチウイルスベクターによる非分裂ヒト初代骨格筋細胞の形質導入。細胞周期（サイクル）を停止させるために、ｈＳｋＳＭＣをガンマラジエーターにより３５００ｒａｄｓで放射照射した。照射された２ｘ１０５個のヒト骨格筋細胞を６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。翌日、上記のように、細胞をＢｒｄＵでラベル化するか、又は硫酸プロタミン存在下でＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰ（各ウェル当たり１２０ｎｇＲＴ当量）で３時間形質導入した。形質導入の１６時間後のＢｒｄＵ取り込み、又は、形質導入の４８時間後のｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで測定した。非分裂ｈＳｋＳＭＣはＢＩＶ由来レンチウイルスベクターＢＩＶＭＮＤｅＧＦＰにより効率的に形質導入された。５9％以上の細胞がｅＧＦＰ発現に関して陽性であり、相対平均ｅＧＦＰ強度は１５００以上であった。これはＢＩＶ由来レンチウイルスベクターが非分裂ヒト初代骨格筋細胞を効率的に形質導入できることを示している。細胞によるＢｒｄＵ取り込みに示されるように、これらの細胞は形質導入されるときに非分裂状態であることが確認されている。
【０１４８】
実施例６．５：議論
レンチウイルス由来ベクターはヒト遺伝子治療用の有力な遺伝子移入技術として現れてきた。レンチウイルスベクターは分裂及び非分裂細胞の双方に対してインビボ及びインビトロで効率的に形質導入することが出来、長期間に亘って導入遺伝子を発現する。治療効果を達成するために一生にわたる長期の遺伝子発現が要求されるような利用例においては、長期間に亘る治療遺伝子の発現が必要とされる。これらの例としては、神経性疾患、代謝疾患、及び眼疾患を挙げることが出来る。これら疾患の多くのものには効果的な治療法がない。
【０１４９】
様々なレンチウイルス由来遺伝子移入システムが発表されてきたが、最も効率的なシステムはＨＩＶ由来のものである。ウイルスベクターを用いる遺伝子治療においては安全性は最も重要である。ＨＩＶ由来のレンチウイルスベクターに関する安全性への懸念を解消すべく、我々は、ＢＩＶ由来の遺伝子移入システムを開発した。我々が認識する限り、ＢＩＶはヒト病原体ではなく、その自然宿主においても顕著な疾患は引き起こさない。
【０１５０】
ＢＩＶはこれまでにあまり研究されてこなかった。例えば、パッケージングシグナルは同定されていなかった。その結果、従来の幾つかの構築物においては、パッケージング及びベクター転写物の両方がベクター粒子内に取り込まれ、ＢＩＶレンチウイルスベクターの力価を低下させていた。本発明の例では、ＭＳＤからｇａｇ開始コドンまでの推定パッケージング配列領域を欠失させた。我々は、この配列がＢＩＶパッケージングシグナルの一部であることを見出した（データしめさず）。我々は、更に、ＭＳＤの上流配列及びｇａｇの最初の２００ｂｐがＢＩＶ転写物を効率的にパッケージングするための追加要素を含んでいることを見出した。
【０１５１】
我々は、プロマイシン耐性選択マーカーをコードするベクターを用いて、我々の開発したＢＩＶレンチウイルスベクターの凡その力価を測定した。ＢＩＶベクターは約１．２ｘ１０６ｉ．ｕ．/mlの力価を達成し、これはＨＩＶ由来レンチウイルスベクターに匹敵するものである。更に、ＶＳＶ−Ｇ偽型ＢＩＶレンチウイルスベクターが１回の超遠心操作によって高力価に濃縮されることを確認した。
【０１５２】
我々は、ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターが本当に細胞染色体内に組み込まれ、その結果、サザーンブロット及びＢＩＶ形質導入ヒト細胞の連続継代によって示されるように、長期間に亘って遺伝子発現が維持されることを確認した。
【０１５３】
骨格筋細胞は、薬剤を筋肉内投与することが容易であるために、ヒト遺伝子治療、特に、分泌性治療タンパク質の理想的な標的である。本研究において、分裂及び非分裂の双方のヒト初代骨格筋細胞を形質導入した。非濃縮ＢＩＶ由来レンチウイルスベクターはこれらの細胞を効率的に形質導入することを見出した。
【０１５４】
実施例６．６：要約
レンチウイルス由来遺伝子移入システムはインビボ及びインビトロにおいて様々な非分裂標的細胞を効率的に形質導入することができるので、有力な遺伝子移入技術である。細胞染色体内への取り込みによって導入遺伝子が長期間発現される。更に、レンチウイルスベクター媒介遺伝子発現はウイルスタンパク質の新生（de novo）合成を必要をしないために、宿主免疫システムにより標的細胞が除去される可能性を減少させる。しかしながら、これまでに最も有力な結果が得られていたレンチウイルスシステムはＨＩＶに由来するものであった。ＨＩＶはＡＩＤＳの原因因子である。幾つかの動物レンチウイルスに由来する遺伝子移入システムが開発されて来た。これらのシステムはＨＩＶ由来ベクターの代わりとなるものであるが、これら動物レンチウイルスベクター由来の力価及び形質導入効率はＨＩＶ由来ベクターと比較して低いものであった。本発明の実施例においては、改良されたＢＩＶ由来のレンチウイルスベクターシステムが１．２ｘ１０６ｉ．ｕ．/mlの力価（非濃縮）を達成し、、更に１５０倍以上に濃縮出来ることを記載されている。ＢＩＶ由来のレンチウイルスベクターシステムは効率的に分裂及び非分裂ヒト骨格筋細胞に形質導入する。我々のデータによれば、ＢＩＶ由来のレンチウイルスベクターはヒト遺伝子治療用の優れた遺伝子移入システムを提供するものである。
【０１５５】
実施例７：ＢＩＶ由来最小レンチウイルスベクターシステムの作成
ＢＩＶ由来最小ベクター（「ＢＣ４ＭＧ．ｍｉｎ」と命名）は、修飾ＢＩＶ５‘ＬＴＲ、変異主要スプライスドナー部位、パッケージング配列、最小ｇａｇ配列、ｃＰＰＴ、内部プロモーターに機能的に連結された導入遺伝子、ＣＴＥ（マッソンーファイザーサルウイルス由来の構成的輸送要素システム）、３’ＰＰＴ、及び、修飾３‘ＬＴＲを含む。図５参照のこと。具体的には、ＴＡＴＡボックス内で終了するＣＭＶ−前初期プロモーターが、ＴＡＴＡボックスの直後から開始するＢＩＶ５’ＬＴＲに連結している。ＢＩＶ配列はｇａｇコード領域内の２００ｂｐで終了している。全てのベクターは、異種である内部プロモーターに連結したレポーター遺伝子又はその他の導入遺伝子ｃＤＮＡを含む。導入遺伝子ｃＤＮＡの下流にＢＩＶ３‘ＬＴＲ、及び３’ＰＰＴを含む８０ｂｐの隣接ｅｎｖ配列が存在する。推定ｃＰＰＴは内部プロモーターの上流に挿入され、導入遺伝子の下流にＣＴＥの一つ又は複数のコピーが挿入される。実施例１のように、３‘ＬＴＲはＵ３領域の大きな欠失及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素を含む。
【０１５６】
最小ＢＩＶ由来ベクターは、ＢＣ４ＭＧｐｐｔに基づき、以下の修飾：（ｉ）ｇ２００ｂｐまでのｇａｇ配列の更なる欠失；（ｉｉ）ｇａｇ開始コドンＡＴＧの変異；（ｉｉｉ）主要スプライスドアー部位（ＭＳＤ）の変異；及び（ｉｖ）推定ＢＩＶｒｅｓ−レスポンス（応答）要素（ＲＲＥ）がＣＴＥと置換されること。
【０１５７】
プラスミド増幅を容易にするために、ＢＣ４ＭＧｐｐｔをＢｓａｐＭＩで消化し、得られる全プラスミド配列を含む４７４３ｂｐ断片を予めＨｉｎｃＩＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内でクローニングし、ＢＳ４ＭＧｐｐｔを作成する。
【０１５８】
更にｇａｇ配列に欠失を作るために、ＢＳ４ＭＧｐｐｔをＥｃｏＮＩ及びＢｑｌＩＩで消化し、得られた７２８７ｂｐ断片を自己連結してプラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔΔｇａｇを作成した。得られたベクターは僅か２００ｂｐのＢＩＶｇａｇ配列しか有していないものである。
【０１５９】
主要スプライスドナー部位を変異させるために、プラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔΔｇａｇの
ＣＭＶプロモーター領域の上流からＭＳＤ領域まで以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＭＳＤ５（５‘−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＧ−３’）及びＭＳＤ３（５‘−ＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧ−３’）。増幅産物をＳｐｅＩ及びＳｍａｌＩで消化し、予めＢＳ４ＭＧｐｐｔ．ΔｇａｇをＳｐｅＩ及びＳｍａｌＩで消化して得られた６３７３ｂｐ断片に内に連結して、プラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔΔＭＳＤを作成する。
【０１６０】
ｇａｇ開始コドン内に変異を起こさせるために、プラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔΔＭＳＤのＣＭＶプロモーター領域の上流からｇａｇ領域まで以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ｇａｇ５（５‘−ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣ−３’）及びｇａｇ３（５‘−ＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＣ−３’）。増幅産物をＳｐｅＩ及びＳｍａｌＩで消化し、予めＢＳ４ＭＧｐｐｔ．ΔｇａｇをＳｐｅＩ及びＳｍａｌＩで消化して得られた６３７３ｂｐ断片に内に連結して、プラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔΔｇａｇＡＴＧを作成する。
【０１６１】
推定ＢＩＶｒｅｖ−応答要素（ＢＩＶＲＲＥ）をＣＴＥと置換するために、ＣＴＥ配列をプラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔΔｇａｇＡＴＧのＳｓｐＢＩ部位に挿入し、次に、ＢＩＶＲＲＥを完全に除去する。ＣＴＥを挿入するために、マッソンーファイザー（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルスＣＴＥ（ＭＰＭＶ  ＣＴＥ）を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＣＴＥ５‘（５’−ＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧ−３‘）及びＣＴＥ３’（５‘−ＣＣＴＴＴＴＧＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＣ−３’）。増幅産物をＳｓｐＢＩで消化し、予めＳｓｐＢＩで消化したＢＳ４ＭＧｐｐｔΔｇａｇＡＴＧに連結して、プラスミドＢＳ４ＭＧｐｐｔＣＴＥΔｇａｇＡＴＧを作成する。ＢＩＶＲＲＥを除去するために、まず、ＢＩＶＲＲＥの上流を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＲＲＥ１（５‘−ＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧ−３’）及びＲＲＥ２（５‘−ＴＡＡＧＴＧＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴ−３’）、一方、ＢＩＶＲＲＥの下流を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＲＲＥ３（５‘−ＡＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣ−３’）及びＲＲＥ４（５‘−ＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧ−３’）。次に、得られた２つの増幅産物を混合し、プライマーＲＲＥ１及びＲＲＥ４を用いるＰＣＲにかける。最終産物をＫａｓＩ及びＢｂｖＣＩで消化し、予めＫａｓＩ及びＢｂｖＣＩで消化したＢＳ４ＭＧｐｐｔＣＴＥΔｇａｇＡＴＧに連結して、ＢＩＶ由来最小ベクター構築物である、ＢＳ４ＭＧ．ｍｉｎを得る。
【０１６２】
実施例７．２：最小パッケージング構築物
最小パッケージング構築物は、ＣＴＥの一つ又は複数のコピーに連結したＢＩＶｇａｇ及びｐｏｌコード配列を含む。図５を参照のこと。
【０１６３】
最小パッケージング構築物を作成するために、まず、ＣＴＥを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＣＴＥ１（５‘−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＡＧ−３’）及びＣＴＥ２（５‘−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＣＴＣＧＧＡＧＧＣ−３’）。増幅産物をＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化し、予めＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化したｐＣｌプラスミドと連結してｐＣｌ．ＣＴＥを作成した。次に、ＢＩＶのｇａｇ及びｐｏｌコード配列を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＧＡＧ５（５‘−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＡＡ−３’）及びＰＯＬ３（５‘−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＴ−３’）。増幅産物をＸｈｏＩで消化し、予めＸｈｏＩで消化したｐＣｌ．ＣＴＥプラスミドと連結してＢＩＶ由来最小パッケージング構築物、ＢＩＶＧＰＣＴＥを作成した。
【０１６４】
実施例７．３：ベクター構築物の発現
ＢＩＶ由来最小レンチウイルスベクターシステムは更に第三構築物、即ち、異なるウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター構築物を含む。このウイルス表面タンパク質は水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）及びその他のものを含む、任意のウイルスエンベロープタンパク質であり得る。図５参照。
【０１６５】
様々な刊行物、特許及び公開特許明細書、寄託番号、並びにデータベース寄託番号の開示内容は、本発明が関連する技術分野の技術水準をより完全に記載する為に、それらが引用されることで本明細書の開示内容に取り込まれるものである。
【０１６６】
以上これまで一般的に記載された本発明は、以下の実施例に則してより容易に理解されるように説明される。これらの実施例は本発明の或る具体例を記載する目的のみで含まれるものであって、本発明をいかなる意味でも限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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