(57)【要約】      （修正有）【課題】主根の伸長を抑制することなく、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法を提供する。【解決手段】変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１ｍM未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養して、該条件下で培養した野生型のイネより側根が長い及び／又は側根の数が多いイネを得ることを含む、側根が発達したイネを製造する方法を提供することにより解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１ｍM未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養して、該条件下で培養した野生型のイネより側根が長い及び／又は側根の数が多いイネを得ることを含む、側根が発達したイネを製造する方法。
【請求項２】
変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１ｍM未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養することを含む、イネの側根を発達させる方法。
【請求項３】
前記変異があるＥＬ５が、ＥＬ５のドメインＩＶに変異があるＥＬ５である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ドメインＩＶに変異があるＥＬ５が、ドメインＩＶのアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異があるＥＬ５である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ドメインＩＶに変異があるＥＬ５が、ＥＬ５のアミノ酸配列における、第１６２位のバリン、第１３８位のロイシン、第１６５位のトリプトファン、及び第１５３位のシステインからなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基が野生型とは異なるアミノ酸残基へ置換されたＥＬ５である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ドメインＩＶに変異があるＥＬ５が、ＥＬ５のアミノ酸配列における第１６２位のバリンがアラニンへ置換されたＥＬ５である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換イネが、変異があるＥＬ５をコードする遺伝子をＥＬ５遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター、及びトウモロコシ由来ユビキチンプロモーターからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロモーターの制御下に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記硝酸塩が、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム及び亜硝酸ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の硝酸塩である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選ばれる少なくとも１種のアンモニウム塩である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養が、５〜１０日間実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低窒素条件下で培養することにより、野生型のイネと比して、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
窒素は植物の生長を支える重要な栄養素の一つである。窒素には植物の発育を促進する働きがある。例えば、過去４０年間で世界の作物生産量を２倍にするため、それまでの７倍の窒素肥料が使用された。しかし、植物の生長を促すために窒素を大量に消費することには、種々の問題がある。
【０００３】
大量に土壌に投入された窒素は、地下水などを経由して湖沼や海洋に流れ、プランクトンの異常発生などの環境汚染を引き起こす。さらに大量の窒素の土壌への投入は、家畜障害をもたらし得る。例えば、大量に窒素を吸収した土壌で育てた草を摂取した牛などの家畜は、胃の中でＮ−ニトロソ化合物を生成し、癌を発症する可能性が高くなる他、乳中の硝酸態窒素量が増加するため、高窒素下で生育した乳牛の乳を飲んだ乳幼児はヘモグロビン血症を引き起こす可能性が高くなる。さらに、近年では、原料となる化石燃料の値上り等から窒素肥料が高騰し、大量の窒素肥料の使用を必要とする農法は農家の収益を低下させる。
【０００４】
上記窒素の大量消費に関する問題を解決する試みとして、現在は、窒素利用効率を高めることにより、低窒素条件下で、バイオマスを含む植物の収量を向上させることが研究されている。植物の窒素利用効率を高めるためには、植物の窒素の吸収能及び同化能の向上が求められる。このうち、窒素の吸収能を高めるためのアプローチとして、窒素吸収の場である根の形（root architecture）を改良する試みがある。
【０００５】
植物の根は大きく主根と側根に分けられる。一般に、イネを含む植物では、窒素源が少なすぎると側根が形成されず、主根のみが伸長するが、窒素があると、窒素を効率よく吸収するために主根から側根が分化し伸長する。これまでに本発明者らは、細胞膜局在性のＲＩＮＧ−Ｈ２型ユビキチンリガーゼであるＥＬ５のアミノ酸配列の一部に変異を入れた変異ＥＬ５を発現するイネを、２０．６ｍＭの硫酸アンモニウム、１８．８ｍＭの硝酸カリウム及び３．０ｍＭの塩化カルシウムを含むＭＳ培地で培養すると根が褐変化して伸びないが（非特許文献１）、次いで水道水か純水で４日間栽培することにより主根を発根させる方法を報告した（非特許文献２）。さらに、シロイヌナズナをオーキシンの存在下で培養することにより、シロイヌナズナの側根を伸長させ得るとの報告がある（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H. Koiwai, A. Tagiri, S. Katoh, E. Katoh, H. Ichikawa, E. Minami, and Y. Nishizawa, (2007), The Plant J. 51, 92-104.
【非特許文献２】小岩井花恵、中島恵美、岸本久太郎、加藤悦子、南栄一、西澤洋子（2008）第49回日本植物生理学会年会講演要旨p.172
【非特許文献３】Yoko Okushima, Hidehiro Fukaki, Makoto Onoda, Athanasios Theologis, and Masao Tasaka, (2007), Plant Cell 19: 118-130.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
側根が長く伸びた植物は、根全体の表面積が大きく、窒素の吸収能が高いことが予想され、低窒素条件下でも生育が阻害されないことが期待される。また、植物に与える窒素肥料の使用量を低減することにより、環境や家畜に対して負荷が少なく、かつ低コストである農業が可能となる。そこで、低窒素条件下で栽培し得る、側根数が多く、長い植物を製造する方法が求められている。
【０００８】
しかし、従来知られている技術のうち非特許文献２に記載の方法は、イネの主根を形成させる方法であり、イネの側根を形成させる方法ではない。また、非特許文献３に記載されているように、シロイヌナズナの側根はオーキシンによって伸長し得る。しかし、イネの側根がオーキシンによって伸長することについてはこれまでに知られておらず、例えイネの側根がオーキシンによって伸長するとしても、オーキシンは主根の伸長を抑制することから、オーキシンによってイネの根全体の表面積を増加させることができないと予測される。
【０００９】
したがって、土壌中の窒素を効率よく吸収させるために、主根の伸長を抑制することなく、野生型のイネと比べて、側根が長い又は側根の数が多いイネ、すなわち側根が発達したイネを製造する方法はこれまでに知られていない。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、主根の伸長をほとんど抑制することなく、野生型のイネと比べて、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、ＥＬ５のドメインＩＶのアミノ酸配列における、第１６２位のバリンがアラニンへ置換されたＶ１６２Ａ変異ＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１mＭ未満の硝酸カリウム又は１０ｍＭ未満の硫酸アンモニウムを含む培地を用いて培養することにより、野生型のイネより側根の数が多いイネを得ることに成功した。この低窒素条件下で培養することにより側根が発達したイネが得られるとの現象は、土壌中の窒素源が少ないと、側根の伸長がはじまる部分である側根原基の分化及び伸長がほとんど起こらないが、窒素源が増えると側根形成が促進されるというこれまでの知見に相反する現象であり、本発明者らにとっては驚くべき現象であった。また、主根の伸長と側根の発達は別機構で制御されていることが知られている。非特許文献３に記載されている通り、オーキシン処理により、側根は発達するが、主根の伸長は抑制される。また、窒素源が豊富な環境下でイネを栽培すると、上記の通り、側根は発達するが、主根の伸長は抑制される。しかし、上記現象は、主根の伸長機構に影響を与えることなく、側根の発達を促進するものであった。すなわち、上記現象は、主根の伸長を抑制せずに、側根の発達を促進することができる現象であった。
【００１２】
さらに本発明者らは、変異ＥＬ５の発現を、野生型のＥＬ５の発現を制御するＥＬ５遺伝子プロモーターで制御することにより、上記と異なる態様の変異ＥＬ５（例えば、Ｗ１６５Ａ変異ＥＬ５など）を発現する形質転換イネが、低窒素条件下で側根を発達させ得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【００１３】
したがって、本発明によれば、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１ｍM未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養して、該条件下で培養した野生型のイネより側根が長い及び／又は側根の数が多いイネを得ることを含む、側根が発達したイネを製造する方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１ｍM未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養することを含む、イネの側根を発達させる方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、前記変異があるＥＬ５が、ＥＬ５のドメインＩＶに変異があるＥＬ５である。
【００１６】
好ましくは、前記ドメインＩＶに変異があるＥＬ５が、ドメインＩＶのアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異があるＥＬ５である。
【００１７】
好ましくは、前記ドメインＩＶに変異があるＥＬ５が、ＥＬ５のアミノ酸配列における、第１６２位のバリン、第１３８位のロイシン、第１６５位のトリプトファン、及び第１５３位のシステインからなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基が野生型とは異なるアミノ酸残基へ置換されたＥＬ５である。
【００１８】
好ましくは、前記ドメインＩＶに変異があるＥＬ５が、ＥＬ５のアミノ酸配列における第１６２位のバリンがアラニンへ置換されたＥＬ５である。
【００１９】
好ましくは、前記形質転換イネが、変異があるＥＬ５をコードする遺伝子をＥＬ５遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター、及びトウモロコシ由来ユビキチンプロモーターからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロモーターの制御下に含む。
【００２０】
好ましくは、前記硝酸塩が、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム及び亜硝酸ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の硝酸塩である。
【００２１】
好ましくは、前記アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選ばれる少なくとも１種のアンモニウム塩である。
【００２２】
好ましくは、前記培養が、５〜１０日間実施される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、低窒素条件下で、野生型のイネより側根が長い及び／又は側根の数が多いイネを得ることができる。通常、窒素濃度を上げれば、側根を発達させることができるが、主根の伸長は抑制される。しかし、本発明はこの逆の現象を利用するものであり、窒素濃度を下げることにより、主根の伸長をほとんど抑制することなく、側根を発達させることができる。このような低窒素条件下でのイネの栽培によって、野生型のイネの栽培と比べて、環境や家畜への影響を低減し、かつ経済性に有利な農業の実現が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】各種EL5遺伝子にコードされるタンパク質の模式図とユビキチンリガーゼ活性を示した図である。記号は、それぞれＩ：膜貫通領域、ＩＩ：塩基性アミノ酸領域、ＩＩＩ：保存領域、ＩＶ：ＲＩＮＧ−Ｈ２ドメイン、ＩＶ’：アミノ酸変異導入ＲＩＮＧ−Ｈ２ドメイン、Ｖ：Ｃ末端領域を示す。
【図２】窒素非含有水耕液栽培１０日目に形成された冠根の平均長(A)、冠根単位長さ当たりの側根形成数（B）、及び栽培６日目の写真（C）を示した図である。記号は、それぞれNT: 非形質転換（野生型）のイネ（品種：日本晴）、EL5V162A；EL5V162A発現イネを示す。
【図３】野生型のイネ及びＥＬ５Ｖ１６２Ａを発現する形質転換イネの水耕栽培１０日後の側根形成度、および、それらの代表的な根の写真を示した図である。
【図４】変異ＥＬ５遺伝子を含むベクターであるpENTR-EL5V162A及びpENTR-EL5W165Aの模式図である。
【図５】変異ＥＬ５遺伝子を含むバイナリーベクターであるpBI333-EN4-EL5V162A 及びpBI333-EN4-EL5W165Aの模式図である。
【図６】変異ＥＬ５遺伝子を含むバイナリーベクターを作製するために用いたバイナリーベクターであるpBI333-EN4-RCG3の模式図である。
【図７】ＥＬ５プロモーターをクローン化したクローニングベクターの模式図である。
【図８】ＥＬ５プロモーターを有する変異ＥＬ５遺伝子を含むバイナリーベクターであるpBI333-PEL5-EL5W165Aの模式図である。
【図９】pBI333-PEL5-EL5W165Aで形質転換したイネと野生型のイネの発根テスト１０日後の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明の詳細について説明する。
本発明は、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法に関する。本発明の側根が発達したイネを製造する方法は、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養して、該条件下で培養した野生型のイネより側根が長い又は側根の数が多いイネを得ることを含む。以下に、本発明の側根が発達したイネを製造する方法について順を追って説明する。
【００２６】
１．変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネ
ＥＬ５は、ＧｅｎＢａｎｋなどにおいてアクセッション番号：ＡＢ０４５１２０として登録されている、細胞膜局在性のユビキチンリガーゼ(以下、E3ともいう)の一種である。ＥＬ５をコードする遺伝子（以下、ＥＬ５遺伝子ともいう）は、イネの内在性の遺伝子であり、ＧｅｎＢａｎｋなどにおいて上記アクセッション番号として登録されている。
【００２７】
図１に示す通り、野生型のＥＬ５は、５つのドメイン（Ｉ：第３６位〜第６４位：膜貫通領域、ＩＩ：第６５位〜第９７位：塩基性アミノ酸領域、ＩＩＩ：第９８位〜第１２８位：保存領域、ＩＶ：第１２９位〜第１８１位：ＲＩＮＧ−Ｈ２ドメイン、Ｖ：第１８２位〜第３２５位：Ｃ末端領域）を有する。変異があるＥＬ５（以下、変異ＥＬ５ともいう）は、上記ドメイン１〜５のいずれか１種又は２種以上のドメインにおける１個又は２個以上のアミノ酸残基に変異があるものを意味するが、変異の数や態様については、特に制限はない。
【００２８】
変異ＥＬ５の具体例として、図１に、ドメインＩＶに変異があるＥＬ５の模式図を示す。図１において、ＥＬ５Ｃ１５３Ａ、ＥＬ５Ｖ１６２Ａ及びＥＬ５Ｗ１６５Ａは、ドメインＩＶに存在するＥＬ５の第１５３位のシステイン、第１６２位のバリン及び第１６５位のトリプトファンがそれぞれアラニンへ置換された変異ＥＬ５である。
【００２９】
ＥＬ５のインビトロ（in vitro）でのE3活性は、ドメインＩＶであるRING-H2ドメインとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用の程度で決まり、Katohら（JBC, 280, 41015, 2005）によって報告されている。すなわち、図１に示す通り、ＥＬ５Ｃ１５３ＡとＥＬ５Ｗ１６５ＡはＥ３活性が実質的に消失しており、ＥＬ５Ｖ１６２ＡはＥ３活性が野生型に対して低下している。ＥＬ５L１３８ＡのE３活性はＥＬ５Ｖ１６２Ａよりもさらに低下している。本発明の範囲に影響を及ぼさない程度の推測として、側根が発達したイネを得るためには、Ｅ３活性が実質的に消失している変異ＥＬ５を発現するイネを得るよりも、ＥＬ５Ｖ１６２ＡやＥＬ５L １３８Ａなど、Ｅ３活性を低下させた変異ＥＬ５を発現するイネを得る方が好ましい場合もある。Ｅ３活性は、以下の方法で定性的に測定することができる。
【００３０】
EL5のインビトロE3活性は、Matsudaらの方法（J. Cell Sci., 114, 1949, 2001）を基にした、Takaiら（Plant Journal 30, 447, 2002）の方法や、Katohら（JBC,280, 41015, 2005）の方法で測定することができる。すなわち、EL5の第９６位のグリシンから第１８１位のバリンまでのRING-H2ドメインを含む領域をマルトース結合タンパク質（MBP）のC末端に融合させた組換えタンパク質（MBP-EL5）を大腸菌を使って調製する。このMBP-EL5にユビキチン、ユビキチン結合酵素、ユビキチン活性化酵素、ATPなどを混ぜ、３０℃か３５℃で１〜２時間インキュベートする。反応物を抗MBP抗体や抗ユビキチン抗体を用いて、通常のウェスタン分析を行うと、用いたEL5のRING-H2ドメインにユビキチン連結酵素活性（ユビキチンリガーゼ活性又はE3活性ともいう）に応じて、MBPのリジン残基にユビキチンが連結されたために分子量が増加したことによる、電気泳動で高分子側にシフトしたバンドが検出される。Ｅ３活性がなければ、バンドのシフトは認められず、E3活性が低下していれば、シフトしたバンドの濃さが元のMBP-EL5を反応させたときよりも薄くなる。
【００３１】
変異ＥＬ５を発現する形質転換イネは特に制限されなく、変異ＥＬ５遺伝子を発現可能な状態で導入されたイネ、内在性のＥＬ５遺伝子に変異が生じたイネ、又はこれらの両方の特徴を有するイネのいずれでもよい。なお、本明細書において、変異ＥＬ５を発現する形質転換イネに対して、変異ＥＬ５を発現しないイネを、野生型のイネという。
【００３２】
イネに変異ＥＬ５遺伝子を発現可能な状態で導入する方法としては、これまでに知られているイネに外来遺伝子を発現可能な状態で導入する方法を限定せずに用いることができる。このような方法として、例えば、イネ内で機能するプロモーターとターミネーターとの間に変異ＥＬ５遺伝子を連結させたベクターを用意し、次いでこのベクターをイネに導入する方法を挙げることができる。なお、本明細書における分子生物学的な手法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３３】
上記方法において、プロモーターとしては、例えば、イネ内で機能するプロモーターであるＥＬ５遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）プロモーター、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターなどを用いることができる。ターミネーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどを挙げることができる。また、後述するように、プロモーターと変異ＥＬ５遺伝子との間にエンハンサーが含まれていてもよい。
【００３４】
イネの内在性のＥＬ５遺伝子に変異を導入する方法についても特に制限はなく、これまでに知られているイネ内の遺伝子に変異を導入する方法、例えば、イネ内の遺伝子の変異を誘発する薬剤を添加する方法やＵＶや放射能などを照射する方法などを限定せずに用いることができる。
【００３５】
２．変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを製造する方法
変異ＥＬ５を発現する形質転換イネを製造する方法の具体例として、後述する実施例に記載の方法について説明する。
【００３６】
（１）変異ＥＬ５遺伝子を得る方法
まず、変異ＥＬ５遺伝子又は変異ＥＬ５を含むベクターを得る。アクセッション番号：AB045120に記載の塩基配列の情報を基づいて常法に従って作成したＥＬ５遺伝子のｃＤＮＡを含むベクターを用意する。このベクターを鋳型として、所望の部位に変異を導入することができるプライマーセットと市販のキット（例えば、Quickchange site-directed mutagenesis kit、Stratagene社）を用いたＰＣＲにより、部位特異的突然変異が生じたＥＬ５遺伝子を含むベクターを得ることができる。変異ＥＬ５を含むベクターの具体例を図４に示す。得られたベクターについて、EL5遺伝子をシークエンシングし、所望の部位に変異が導入されていること、及びそれ以外の塩基配列には変異が入っていないことを確認することが望ましい。
【００３７】
（２）変異ＥＬ５遺伝子が挿入されたバイナリーベクターの作製
変異ＥＬ５遺伝子が得られれば、これまでに知られている種々の方法、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法などを利用して、変異があるＥＬ５遺伝子をイネ内に導入し、次いでイネ内でＥＬ５を発現させることできる。例えば、変異があるＥＬ５遺伝子をバイナリーベクター内のＴ−ＤＮＡ領域に挿入し、次いでこのＴ−ＤＮＡ領域をアグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌を介してイネ内に導入すれば、イネ内で変異ＥＬ５を発現させることができる。
【００３８】
具体的には、上記（１）で得られたベクターから切り出した変異があるＥＬ５遺伝子を含む断片を、バイナリーベクターにおけるＴ−ＤＮＡ領域内にある、イネ内で機能するプロモーターとターミネーターの間にある外来遺伝子導入部位に挿入する。バイナリーベクターは、上記構成をとるＴ−ＤＮＡ領域があれば特に制限されないが、例えば、ｐＢ１１２１（Clontech社）などの市販のバイナリーベクター以外にも、市販品に種々の改変を施したバイナリーベクターを用いることができる。
【００３９】
Ｔ−ＤＮＡ領域は、この領域が導入されたイネを効率的に選択するために、選択マーカーが発現可能な選択マーカー遺伝子カセットを含むことが好ましく、又は選択マーカー遺伝子カセットを含むＤＮＡと共にイネ内に導入されることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質ハイグロマイシン耐性をもたらすハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン耐性をもたらすネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
市販品を改変したバイナリーベクターとしては、例えば、市販のバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域内に、上記の選択マーカー遺伝子カセットの他に、エンハンサーなどの変異ＥＬ５の発現を促進する領域を１個又は複数個を入れたものなどを使用することができる。
【００４１】
例えば、図６に示すpBI333-EN4-RCG3は、市販のpB1121のＴ−ＤＮＡ領域内に、選抜マーカーカセットとしてＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター：：ハイグロマイシンリン酸転移酵素（ＨＰＴ）：：ＣａＭＶターミネーターを有し、さらに外来遺伝子発現領域にあるプロモーターを、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を４反復させた人工プロモーターであるＥＮ４へ変えたものである。pBI333-EN4-RCG3の詳細については、本発明者らの文献（Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999）を参照できる。
【００４２】
（３）アグロバクテリウムへの遺伝子導入法
変異があるＥＬ５遺伝子を挿入したＴ−ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターをアグロバクテリウム属細菌へ導入する方法は、これまでに知られている細菌にベクターを導入して細菌を形質転換させる方法を制限なく用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオン法、トリペアレント法などを用いることができるが、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。具体的には、Nagelらの文献（Nagel et al., Microbiol. Lett., 67, 325, 1990）に記載の方法に従ったエレクトロポレーション法を用いれば、上記（２）で作製したバイナリーベクターをアグロバクテリウム属細菌へ導入することができる。バイナリーベクターをアグロバクテリウム属細菌へ導入した後は、バイナリーベクター内の選択マーカーを用いて、形質転換アグロバクテリウムを選択することができる。
【００４３】
（４）イネへの遺伝子導入法
イネに、上記形質転換アグロバクテリウムを接触させることにより、変異ＥＬ５を発現し得る形質転換イネを得ることができる。イネとは、通常、イネ科イネ属の植物をいい、学名ではOryza sativaとよばれる。イネには数種類の根があり、例えば、種子根、冠根、側根、根毛などに分けられる。一般的には、種子根は、種子中の胚に既に形成されている幼根が発達したものをいい、植物によっては主根とも呼ばれ、イネには１本だけあるものとして知られており；冠根は、シュート基部から発生する根をいい、節根や不定根としても知られており；側根は、種子根や冠根の内鞘細胞層から発生する根をいい、支根とも呼ばれており；根毛は、種子根、冠根、側根から生える一つの細胞が細長く成長した毛状の根をいう。
【００４４】
形質転換イネを得る方法は、通常知られているアグロバクテリウム属細菌を植物に接触させる方法を制限なく用いることができ、例えば、Toki S (Plant Mol. Biol. Rep. 1997)やToki S (Plant J. 2006)などの文献に記載の方法に従って実施することができるが、これらに限定されるものではない。形質転換アグロバクテリウムをイネに感染させる方法の具体例は、以下の通りであるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
脱籾した完熟種子を所定濃度のエタノール、次亜塩素酸ナトリウム、滅菌水などで洗浄する。滅菌した種子をオーキシンを含む培地（例えば、N6D培地）に置き、種子の前培養を実施する。上記（３）で得た形質転換アグロバクテリウムを、感染に適した条件で、前培養後の種子に感染させる。感染後、メロペンなどの除菌剤用いて、種子からアグロバクテリウムを除菌し、次いで上記選択マーカーを利用して、形質転換細胞を選択する。
【００４６】
選択された形質転換細胞は、適切な植物調節物質を含む再分化培地（例えば、サイトカイニンを含むＭＳ培地）に移され、適切な期間、保温され得る。イネを再生するためには、再分化した形質転換体を、発根培地（例えば、植物調節物質を含まないＭＳ培地）に移す。形質転換体をイネへ再生させる方法としては、例えば、カルスからイネを再生させる方法（Toki, et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006）、エレクトロポレーション法を用いた場合は、プロトプラストからイネを再生させる方法（Toki, et al., Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1992）などを用いることができる。ゲノム中に変異ＥＬ５遺伝子が導入された形質転換体が得られれば、これを基にして、イネ培養組織やイネのシュートなどを量産することも可能である。根の発育が確認された後、形質転換イネは、鉢上げされ得る。これらの方法については、特許第３１４１０８４号公報の段落００２８〜００３０を参照することができる。ただし、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネはＭＳ培地において根をほとんど形成しないため、鉢上げするためには水道水などで培養して発根させた後に鉢上げする。
【００４７】
３．変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネの培養方法
側根が発達したイネを得ることを目的とした、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネの培養方法は、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて、野生型のイネの生育に適した条件下で変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを培養する限りにおいて特に制限はない。
【００４８】
培養に供する形質転換イネは、冠根が発達し得る程度の大きさを有するイネであればよく、例えば、２ｃｍ以上の苗条（シュート）が好ましく、３ｃｍ〜１０ｃｍのシュートがより好ましく、３ｃｍ〜５ｃｍのシュートがさらに好ましい。
【００４９】
形質転換イネの培養に供される培地は、窒素源として１ｍＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む。硝酸塩としては、１ｍＭ未満、好ましくは０．１ｍＭ以下、より好ましくは０．０５ｍＭ以下、さらに好ましくは０．０１ｍＭ以下の濃度で培地に含まれる限りにおいて特に制限はなく、例えば、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム及び亜硝酸ナトリウムなどを単独又は組み合わせて用いることができるが、好ましくは硝酸カリウムである。同様に、アンモニウム塩についても培地に含まれる濃度が１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは２ｍＭ以下、さらに好ましくは０．２ｍＭ以下であれば特に制限はなく、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムなどを単独又は組み合わせて用いることができるが、好ましくは硫酸アンモニウムである。培地に含まれる硝酸塩及びアンモニア塩の濃度範囲は、それぞれ１ｍＭ未満及び１０ｍＭ未満であれば特に制限はなく、例えば、０ｍＭの濃度、すなわち窒素源を含まない培地とすることもできる。
【００５０】
窒素源以外の培地の組成は、通常知られているイネに適した培地組成を含む培地を制限なく用いることができ、例えば、ＭＳ培地（Murashige−Skoog培地）やＢ５培地（O.L.Gamborg et al, (1968), Experimental Cell Research, 50, 151-158を参照）などの組成を改変して用いることができる。例えば、冠根の生育に増して側根を発達させるためには、カルシウム塩の量を減らすことが好ましく、培地中のカルシウム塩の濃度を１００μＭ以下とすることがより好ましい。
【００５１】
培地の形態は特に制限はなく、例えば、液体、半固体又は固体の培地とすることができる。より具体的には、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を土壌に加えたものを、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地として使用することができる。
【００５２】
形質転換イネを培養する際の温度、期間、照射量その他の条件は、ＥＬ５遺伝子に変異がない野生型のイネの生育に適した条件、例えば、５〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃；数日〜数十日間、好ましくは５〜１０日間；無照射又は数キロルックス〜数十キロルックス、好ましくは２〜５キロルックスの白色光を照射して培養することができる。
【００５３】
４．側根が発達したイネ
本発明の製造方法で得られる側根が発達したイネは、野生型のイネより、側根が長い及び／又は側根の数が多いイネである。比較の対象となる野生型のイネは、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネの培養条件と同じ条件で培養したものである。変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネ及び野生型のイネの培養の時期は、同時でもいいし、それぞれ異なるタイミングでもよい。野生型のイネより側根が長い及び／又は側根の数が多いか否かは、目視又は顕微鏡やデジタルマイクロスコープなどの機器を用いて、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて、野生型のイネの生育に適した条件下で変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを培養して得られたイネ（以下、本発明の方法によって得られたイネともいう）と、同条件下で培養した野生型のイネ（以下、対照イネともいう）の側根の長さ若しくは側根の数又はその両方を測定することにより確認することができる。
【００５４】
例えば、対照イネと比較して、所定の長さ、例えば、冠根から出根し、１ｃｍの冠根当たり０．５ｍｍ以上の長さの側根の数が多いことを確認することによって、側根が発達したイネであることが確認できる。本発明の方法によって得られる側根が発達したイネは、体長が１０〜１５ｃｍである場合に、１ｃｍの冠根当たり０．５ｍｍ以上の長さの側根の数が、通常、対照イネと比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、又は４倍以上である。
【００５５】
本発明の方法によって得られた側根が発達したイネは、例えば、窒素源として１ｍＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む土壌を培地とした場合には、植え替えなどせずに、そのまま又は窒素源を加えて引き続き培養することができる。また、例えば、窒素源として１ｍＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含むＭＳ培地などを用いて培養した場合には、側根が発達したイネは、イネ栽培用土壌に植え替えることが好ましい。この場合は、側根が発達したイネは、野生型のイネの栽培条件と比べて、窒素源を低下させた条件下で栽培することが期待できる。
【００５６】
５．イネの側根を発達させる方法
上記の通り、変異があるＥＬ５を発現する形質転換イネを、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて、野生型のイネの生育に適した条件下で培養すれば、該形質転換イネの側根を野生型イネの側根よりも発達させることができる。本発明には、窒素源として１mＭ未満の硝酸塩又は１０ｍＭ未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養することを含む、イネの側根を発達させる方法も含まれる。
【００５７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００５８】
１．改変EL5遺伝子の作製
EL5タンパク質の162番目のバリン残基をアラニンに置換したEL5V162Aをコードする変異EL5遺伝子クローンを得るために、EL5遺伝子のcDNA（アクセッション番号：AB045120のうち、アミノ酸コード領域のcDNA）がクローン化されているpENTRベクター（Invitrogen社）を鋳型とし、Quickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene)を用いて、kitに付属のプロトコールに従ってPCRを行った。オリゴDNAプライマーとして、EL5V162A作製用には、5'-CCACGCCGAGTGCGCGGACATGTGGCTCG-3'（配列表の配列番号１）と5'-CGAGCCACATGTCCGCGCACTCGGCGTGG-3'（配列表の配列番号２）を用い、さらにEL5W165A作製用には、5'- CGTCGACATGGCGCTCGGCTCCCACTCC-3'（配列表の配列番号３）と5'- GGAGTGGGAGCCGAGCGCCATGTCGACG-3'（配列表の配列番号４）を用いた。各プライマーの下線部は、変異を導入した塩基を示す。得られたプラスミドのEL5遺伝子の部分をシークエンシングし、目的の部位に変異が導入されていること、および、それ以外の塩基配列には変異が入っていないことを確認し、pENTR-EL5V162AおよびpENTR-EL5W165A（図４を参照）を得た。
【００５９】
２．植物導入用ベクターの構築
上記の通りに得られた変異EL5遺伝子をイネで発現させるために、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を４反復させた人工プロモーターＥＮ４（独立行政法人農業生物資源研究所  廣近洋彦博士より譲渡）の下流に連結させたバイナリーベクターpBI333-EN4-EL5V162AおよびpBI333-EN4-EL5W165A（図５を参照）を構築した。具体的には以下のように実施した。
【００６０】
ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−RCG3（Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999に記載の方法に従って調製したもの、図６を参照）は、バイナリーベクターｐＢＩ１２１（Clontech社、アクセッション番号：AF485783）のＴ−ＤＮＡ領域内に、選抜マーカーカセットとして、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター：：ハイグロマイシンリン酸転移酵素（ＨＰＴ）：：ＣａＭＶターミネーターを持つ他に、上記ＥＮ４と、その下流に、RCG3（イネキチナーゼ遺伝子Ｃｈｔ−３;アクセッション番号：D16223）とノパリン合成酵素のターミネーター（ＮＯＳ３’）を持つ。このｐＢＩ３３３−ＥＮ４−RCG3をＳａｃＩで開環後、T4  DNAポリメラーゼで平滑末端化し、続いてXbaIで切断することによってRCG3を除き、そこに先にクローン化したpENTR-EL5V162AまたはpENTR-EL5W165A由来のXbaI-EcoRV断片を連結し、pBI333-EN4-EL5V162AおよびpBI333-EN4-EL5W165Aを完成させた。
【００６１】
EL5自身のプロモーターを使ってEL5W165Aを発現させるために、次の方法でEL5プロモーター（PEL5）をクローン化した。すなわち、イネ（品種:日本晴）のDNAを鋳型にして、5'-GCGGGCCCGCAAATAGGGTCTCTCGTTAGC-3'（配列表の配列番号５）と5'-CCTCTAGATGCATATGTGACCGCGCGCACT-3'（配列表の配列番号６）を用いてPCRし、続いてApaIとXbaIで切断後、pBlueScript SK（Stratagene社）のApaIとXbaI間に連結し、SK-PEL5を得た（図７を参照）。次に、SK-PEL5のPEL5を含むApaIからXbaIまでの断片を、先に作製したpBI333-EN4-EL5W165AをApaIとXbaIで切断して、EN4プロモーターを除いた断片と連結し、pBI333-PEL5-EL5W165Aを完成させた（図８を参照）。
【００６２】
３．形質転換イネの作製
（１）アグロバクテリウムへの遺伝子導入法
Nagelらの方法（Microbiol. Lett., 67, 325, 1990を参照）にしたがってpBI333-EN4-EL5V162Aあるいは、pBI333-PEL5-EL5W165Aを、エレクトロポーレーション法によりAgrobacterium tumefacience（ＥＨＡ１０５株）に導入した。その後、５０μg/mLのカナマイシン及び５０μg/mLのハイグロマイシンを含むＬＢ培地上で２８℃で２日間培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得た。
【００６３】
（２）イネへの遺伝子導入
イネの形質転換は、超迅速形質転換法（特許第３１４１０８４号公報、又は、Toki et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006を参照）に従って実施した。ただし、アグロバクテリウムの除菌にはメロペン（大日本住友製薬）を用いた。具体的には以下のようにして実施した。
【００６４】
上記（１）で調製した形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液と、超迅速形質転換法にしたがって前培養したイネ（Oryza sativa 品種：日本晴）の種子を、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０g/L  スクロース、１０g/L  グルコース、０．３g/L  カザミノ酸、２mg/L  ２，４−Ｄ、１０mg/L  アセトシリンゴン、４g/L  ゲルライト、pH５．２）上で、暗黒下で３日間、２８℃で共存培養した。その後、２５mg/Lのメロペンを含有する滅菌水を用いて種子からアグロバクテリウムを洗浄後、種子を１２．５mg/Lのメロペン及び選抜マーカーとして５０mg/Lのハイグロマイシン、さらに４g/L  ゲルライトを加えたＮ６培地（選抜培地）に置床して、２８℃、暗所で約１０日間培養し、ハイグロマイシン耐性細胞を増殖し、カルスを得た。
【００６５】
選抜されたハイグロマイシン耐性カルスを再分化培地（６．２５mg/L  メロぺン及び５０mg/L  ハイグロマイシンを補充したＭＳ培地：３０g/L  スクロース、３０g/L  ソルビトール、２g/L  カザミノ酸、２mg/L  カイネチン、０．００２mg/L  ＮＡＡ、４g/L  ゲルライト、pH５．８）に移植して、再分化するまで、２８℃、明所で培養を続けた。
【００６６】
再分化個体を、ホルモンフリー培地（６．２５mg/L  メロぺン及び２５mg/L  ハイグロマイシンを補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）に置床した。約１０日後、新しいホルモンフリー培地に1シュート毎に移植し、さらに約１週間後、形質転換植物が大きくなったところで無菌培養を終え、pBI333-PEL5-EL5W165A導入イネは３日間の馴化処理後、また、pBI333-EN4-EL5V162A導入イネは１０日間の水道水での発根処理を経て、「呉羽粒状培土−Ｄ」（商品名；呉羽化学）を詰めたポットに移植し、温室内で生育させ、次世代の自殖種子（Ｒ１世代）を得た。
【００６７】
４．無窒素条件下での発根テスト（結果は図２を参照）
EL5V162A遺伝子を発現するイネは、上記のホルモンフリー培地では発根が著しく阻害されるが、ホルモンフリー培地で培養を続けることによって、シュートを分げつさせ、増やすことが可能である。
【００６８】
ホルモンフリー培地上で継代し、継代後３〜４週の３〜５ｃｍ長になったEL5V162A遺伝子導入イネ（EL5V162Aイネ）のシュートを用いた。対照として、非形質転換イネ（品種：日本晴）の籾を取り除き、50%次亜塩素酸で30分滅菌後、滅菌水で３〜５回洗浄した後、4倍希釈のMS寒天培地で7日間発芽させ、胚乳及び根を切除したイネを用いた。それぞれをマヨネーズ瓶に入れた100mlの水耕液（70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucrose）に、プラスチック製の筏を使って1瓶あたり12シュートずつ植え、約3キロルックスの白色光照射下で無菌的に10日間培養した後（２８℃）、発根した冠根の長さ、及び冠根の単位長さあたりの側根数を測定した。
【００６９】
その結果、冠根表面から出根した全ての側根数は、対照イネでは3.95±0.33本/cmであったのに対して、EL5V162Aイネでは16.35±1.11本/cmと約4倍の側根数の増加が見られた。冠根長は対照イネで1.94±0.73cm、EL5V162Aイネで2.23±1.11cmと有意差はなかった。
【００７０】
５．各種窒素濃度下における発根テスト（結果は図３を参照）
ホルモンフリー培地上で継代し、継代後３〜４週の３〜５ｃｍ長になったEL5V162A遺伝子導入イネ（EL5V162Aイネ）のシュートを用いた。対照として、非形質転換イネ（品種：日本晴）の籾を取り除き、50%次亜塩素酸で30分滅菌後、滅菌水で３〜５回洗浄した後、4倍希釈のMS寒天培地で7日間発芽させ、胚乳及び根を切除したイネを用いた。それぞれをマヨネーズ瓶に入れた100mlの水耕液（70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucrose, 10 mM MES (pH5.8)および各種濃度の窒素源を添加したもの）に、プラスチック製の筏を使って1瓶当たり12シュートずつ植え、約3キロルックスの白色光照射下で無菌的に１０日間、２８℃で培養し、根元１ｃｍおよび根端１ｃｍにおける約０．５ｍｍ以上の側根数を、対照イネと比較することにより側根形成度を記述した。各試験区の窒素源は以下の濃度で加えた。
硫酸アンモニウム（最終濃度；0.2mM、2mM、5mM、10mM）
硝酸カリウム（最終濃度；0.01mM、0.05mM、0.1mM、1mM、10mM）
【００７１】
水耕液調製法は以下の通りである。終濃度70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucroseになるように調製した溶液をオートクレーブ後、ファイルター滅菌した1M MES（pH5.8）を1/100容添加した。これを窒素無添加水耕液とし、さらに、オートクレーブした硫酸アンモニウムあるいは硝酸カリウム溶液を上記の終濃度になるように添加した。
【００７２】
その結果、各窒素濃度試験区の対照イネに対して、EL5V162Aイネは、１ｍM以下の硝酸カリウム又は５ｍＭ以下の硫酸アンモニウムの存在下では、多くの側根を形成した。
【００７３】
６．EL5W165A導入イネの発根テスト（結果は図９を参照）
隔離温室で栽培したpBI333-PEL5-EL5W165Aで形質転換したイネの自殖次世代種子の玄米を50%次亜塩素酸で30分滅菌し、滅菌水で３〜５回洗浄した後、１５ｍｇ／Lのハイグロマイシンを含む、終濃度70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 10 mM MES (pH5.8)、１．５％寒天培地に置床し、明下、２８度で１０日間培養した。対照として、非形質転換イネ（品種：日本晴）の玄米を、50%次亜塩素酸で30分滅菌し、滅菌水で３〜５回洗浄した後、終濃度70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 10 mM MES (pH5.8)、１．５％寒天培地に置床し、明下、２８℃で１０日間培養した。
【００７４】
ハイグロマイシン耐性のpBI333-PEL5-EL5W165A導入イネ、および対照イネの胚乳と根を切除後、それぞれをマヨネーズ瓶に入れた100mlの水耕液（70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucrose, 10 mM MES (pH5.8)）に、プラスチック製の筏を使って1瓶当たり12シュートずつ植え、約3キロルックスの白色光照射下で無菌的に10日間、２８℃で培養し、側根形成を観察した。その結果、対照イネに対して、PEL5-EL5W165Aイネは、より多くの側根を形成した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の側根が発達したイネを製造する方法やイネの側根を発達させる方法は、例えば、農業及びイネの根を利用したバイオマス生産分野において利用できる。本発明によれば、土壌中の窒素量を減らして側根が発達したイネを製造し、かつこのイネを引き続き低窒素条件下で生育させることが期待されるために、窒素肥料の使用を抑えた低コスト・低環境負荷の農業が可能になると期待できる。また、従来技術と異なり、本発明により製造されたイネは、発根剤処理が不要なために、イネの根を培養して物質を生産させる際のコスト削減効果が見込める。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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