(57)【要約】【課題】Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物を作製するための発現ベクター、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物及びその作製方法を提供する。【解決手段】発現ベクターは、ＣＡＧプロモーターに比べてＬａｐｔｍ５遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができるプロモーターと、Ｌａｐｔｍ５遺伝子とを含発現ベクターの提供を可能とした。また該ベクターを用いることにより、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物の作製方法の提供を可能とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＧプロモーターに比べてＬａｐｔｍ５（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５）遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができるプロモーターと、Ｌａｐｔｍ５遺伝子とを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
ＡＧプロモーターを含む発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有している請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
ＡＧプロモーターを含む図１に記載の発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有している請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ＡＧプロモーターを含む配列表配列番号４に記載の塩基配列からなる発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有している請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項５】
ＡＧプロモーターが、ＣＡＧプロモーターより、ＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒが除去された構成を有している請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項６】
Ｌａｐｔｍ５遺伝子が配列表配列番号３に記載の遺伝子である請求項１〜５のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項７】
ｄｏｎｏｒ胚内にＬａｐｔｍ５遺伝子を導入するための発現ベクターである請求項１〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
ドライマウス（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ）型のトランスジェニック生物を作製するための発現ベクターである請求項１〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜８の発現ベクターを用いることを特徴とするトランスジェニック生物の作製方法。
【請求項１０】
Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジェニック生物。
【請求項１１】
請求項９に記載のトランスジェニック生物の作製方法によって作製されたＬａｐｔｍ５遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジェニック生物。
【請求項１２】
導入されたＬａｐｔｍ５遺伝子が配列表配列番号３に記載の遺伝子である請求項１０又は１１に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３】
トランスジェニック生物が、ドライマウス（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ）型のトランスジェニック生物である請求項１０〜１２のいずれかに記載のトランスジェニック生物。
【請求項１４】
トランスジェニック生物が、マウスである請求項１０〜１３のいずれかに記載のトランスジェニック生物。
【請求項１５】
発現ベクターであって、少なくともＡＧプロモーターを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１６】
図１に記載の発現ベクターである請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
配列表配列番号４に記載の塩基配列からなる請求項１５又は１６に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスジェニック生物を作製するための発現ベクター、及びトランスジェニック生物及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群（シェーグレン症候群）は、外分泌腺に異常を来たす自己免疫疾患である。この疾患に随伴して唾液腺炎や涙腺炎が発症し、口唇唾液腺や涙腺の分泌機能が侵されることによって、口腔や眼球の乾燥症（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ、ＤＲＹ  ＥＹＥ）を呈することが知られている。
Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群の病因には、遺伝的素因、免疫異常、未知の環境要因等の複数の要素が関与しており、その実態は未解明である。そのため、ＭＲＬ／ｌｐｒ系マウス、ＮＯＤ（ｎｏｎｏｂａｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ）系マウスなどのモデルマウスを用いて、病因の探求や治療に有効な成分のスクリーニング等が行われている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
本発明者らは、これらのＳｊｏｇｒｅｎ症候群のモデルマウスにおける、ＤＮＡマイクロアレイ法を用いた研究結果（例えば、非特許文献１、２参照）に基づいて、有意な発現を認めた遺伝子の比較を行った。その結果、高発現を認めたＬａｐｔｍ５（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５）遺伝子に注目した。
【０００４】
Ｌａｐｔｍ５遺伝子は、Ｃｌａｓｔ６（ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−６）遺伝子とも呼ばれる。ＣＤ４０によって発現が制御される遺伝子であり、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄等の免疫系組織、Ｂ細胞等の免疫細胞で発現していることが知られている（非特許文献３参照）。
Ｌａｐｔｍ５遺伝子は、Ｂリンパ腫に関与する可能性があることが示唆されているが、この遺伝子と免疫不全疾患との関係については未知である。そのため、この遺伝子の機能解析を目的として、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を欠損させたノックアウトマウスが作製されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００５】
本発明者らはＬａｐｔｍ５遺伝子を発現させることで、トランスジェニック生物の作製に試みた。このトランスジェニック生物の作製には、ＣＭＶ  ＩＥ  ｅｎｈａｎｃｅｒを含むＣＡＧプロモーターを組み込んだ発現ベクターを用いたが、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された仔の出産は認められなかった。この結果は胎児致死によると推定されたことから、Ｌａｐｔｍ５遺伝子は生命維持に強く関係する遺伝子と推測された。
Ｌａｐｔｍ５遺伝子の機能解析、さらにはこの遺伝子とＳｊｏｇｒｅｎ症候群、Ｄｒｙ  ｍｏｕｔｈやＤｒｙ  ｅｙｅとの関連を調べるために、新たなトランスジェニック生物の提供が望まれている。
〔先行文献〕
【特許文献１】特開平１１−３０２１９２号公報
【特許文献２】特開平１０−１９４９８９号公報
【特許文献３】特開２００６−１４１３２１号公報
【非特許文献１】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．  ２００２；  ８１：  １７１−１７６
【非特許文献２】Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．  ２００４；  ３２：  ２８４−２９１
【非特許文献３】Ｉｎｔ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．  ２００３；  ２２：  ３０１−３０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物を作製するための発現ベクターを提供することにある。
また、本発明の課題は、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物及びその作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を特定のプロモーターと組み合わせた発現ベクターを構築し、この発現ベクターを用いてトランスジェニック生物を作製したところ、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されているにもかかわらず、トランスジェニック生物を作製することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＣＡＧプロモーターに比べてＬａｐｔｍ５遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができるプロモーターと、Ｌａｐｔｍ５遺伝子とを含むことを特徴とする発現ベクターである。
【０００９】
本発明では、発現ベクターが、ＡＧプロモーターを含む発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有していることが好適である。また、ＡＧプロモーターを含む図１に記載の発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有していることが好適である。さらに、ＡＧプロモーターを含む配列表配列番号４に記載の塩基配列からなる発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有していることが好適である。
前記ＡＧプロモーターとしては、ＣＡＧプロモーターより、ＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒが除去された構成を有しているものを好適に用いることができる。前記Ｌａｐｔｍ５遺伝子としては、配列表配列番号３に記載の遺伝子であることが好適である。
【００１０】
本発明の発現ベクターは、ｄｏｎｏｒ胚内にＬａｐｔｍ５遺伝子を導入するための発現ベクターとして好適に用いることができる。また、発現ベクターは、ドライマウス（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ）型のトランスジェニック生物を作製するための発現ベクターとして好適に用いることができる。
【００１１】
また、本発明は、前記の発現ベクターを用いることを特徴とするトランスジェニック生物の作製方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジェニック生物を提供する。本発明のトランスジェニック生物は、前記のトランスジェニック生物の作製方法によって作製することができる。本発明のトランスジェニック生物では、導入されたＬａｐｔｍ５遺伝子が、配列表配列番号３に記載の遺伝子であることが好適である。本発明のトランスジェニック生物は、ドライマウス（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ）型のトランスジェニック生物であってもよく、生物がマウスであってもよい。
【００１３】
なお、本発明には、少なくともＡＧプロモーターを含むことを特徴とする発現ベクターも含まれ、該発現ベクターとしては、図１に記載の発現ベクターが好適である。さらに配列表配列番号４に記載の塩基配列からなる発現ベクターであることが好適である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の発現ベクターを用いることにより、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物を作製することができる。これによって、唾液分泌が低下しているドライマウス（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ）型のトランスジェニック生物が得られる。このドライマウス型のトランスジェニック生物は、実験モデル動物等に利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の「発現ベクター」は、ＣＡＧプロモーターに比べてＬａｐｔｍ５遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができるプロモーターとＬａｐｔｍ５遺伝子とを含んでいればよい。
本発明の「ＣＡＧプロモーター」とは、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒとＣｈｉｃｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒをつなげた構造と、兎のβ−グロビン遺伝子のｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌサイトを有するプロモーターである。
参考文献１に記載されている発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（図２）は、このＣＡＧプロモーターを有することにより、導入したい遺伝子をほぼ全身性に過剰発現させることができる。
参考文献１：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｇｅｎｅ．  １９９１  Ｄｅｃ  １５；１０８（２）：１９３−９．
【００１６】
本発明の「ＣＡＧプロモーターに比べてＬａｐｔｍ５遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができるプロモーター」は、ＣＡＧプロモーターに比べてＬａｐｔｍ５遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができるプロモーターであればいずれのものも用いることができる。
例えばＣＡＧプロモーターより、ＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒが除去された構成を有しているＡＧプロモーターを用いることが好適である。なお、本発明のＡＧプロモーターには、Ｃｈｉｃｋｅｎ  β−Ａｃｔｉｎ遺伝子とＲａｂｂｉｔ  β−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子とが融合されたプロモーターと同様の構成を有するものも含まれる。
【００１７】
本発明のＡＧプロモーターは、ＣＡＧプロモーターに対して、１／５００以上〜１／５０以下程度の発現強度で、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を発現させることができる。すなわち、ＡＧプロモーターは、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を適度に発現させることができる。そのため、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物は、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されているにもかかわらず、致死に至らないため好適である。
【００１８】
すなわち、本発明の発現ベクターは、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が、ＡＧプロモーターと組み合わせられているものであることが好適であり、例えば、ＡＧプロモーターを含む発現ベクターに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された構成を有していても良い。
ＡＧプロモーターを含む発現ベクターとしては、例えば、ＡＧプロモーターを含む図１に記載の発現ベクター（以下、発現ベクターｐＡＧＧＳとする）や、配列表配列番号４に記載の塩基配列からなる発現ベクターなどが挙げられる。
【００１９】
発現ベクターｐＡＧＧＳは、発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（図２、配列表配列番号５）から、制限酵素処理等によって、ＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを除去することによって得られた発現ベクターのことをいう。
発現ベクターｐＡＧＧＳは、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＳａｌＩ（１）−ＳｎａＢＩ（３５７）部位を制限酵素処理し、発現強度を調節するためにＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ又はＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを含む領域（配列表配列番号６）を除去した後、この両端をＴ４ポリメラーゼで平滑化した後、ＤＮＡリガーゼによって再環化させて構築したものである。ＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを除去することによって導入した遺伝子の発現強度を１／５００以上〜１／５０以下に低減させることができると考えられる。
【００２０】
Ｌａｐｔｍ５遺伝子とはＣＤ４０によって発現が制御される遺伝子であり、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄等の免疫系組織、Ｂ細胞等の免疫細胞で発現していることが知られている。Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群のモデルマウスにおいて有意な発現が認めた遺伝子である。
本発明のＬａｐｔｍ５遺伝子は、公知のＬａｐｔｍ５遺伝子であれば、いずれの生物由来のＬａｐｔｍ５遺伝子であっても良い。Ｌａｐｔｍ５遺伝子としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、オランウータン、チンパンジーなどの各種生物由来のＬａｐｔｍ５遺伝子などが挙げられる。具体的には、Ｌａｐｔｍ５遺伝子としては、例えば、マウス由来のＬａｐｔｍ５遺伝子（ＮＭ＿０１０６８６）（塩基配列：配列表配列番号１、アミノ酸配列：配列表配列番号２）などが挙げられる。
また、Ｌａｐｔｍ５遺伝子としては、例えば、配列表配列番号３に記載の遺伝子であっても良い。
【００２１】
本発明の発現ベクターは、例えば、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を、ＡＧプロモーターを含む発現ベクターに導入することにより作製することができる。ＡＧプロモーターを含む発現ベクターとしては、発現ベクターｐＡＧＧＳや、配列表配列番号４に記載の塩基配列からなる発現ベクターを好適に用いることができる。
【００２２】
発現ベクターｐＡＧＧＳに、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を導入する方法としては、特に制限されないが、例えば、制限酵素処理して直鎖状にした発現ベクターｐＡＧＧＳに、制限酵素処理によって平滑化したＬａｐｔｍ５遺伝子（配列表配列番号１）を含む塩基配列を連結すること等が挙げられる。例えば、Ｍｏｕｓｅ  ｌａｐｔｍ５（ＮＭ＿０１０６８６）遺伝子（配列表配列番号１）をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶで制限処理して取り出した後、両端をＥｃｏＲＩで平滑化したもの（配列表配列番号３、図３）を、構築した発現ベクターｐＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ（１３６１）−ＥｃｏＲＩ（１３７３）部位（図４）に導入すること等もあげられる。
【００２３】
本発明の発現ベクターは、ｄｏｎｏｒ胚内にＬａｐｔｍ５遺伝子を導入するための発現ベクターとして好適に用いることができる。具体的には、発現ベクターは、例えば、ドライマウス（ＤＲＹ  ＭＯＵＴＨ）型やドライアイ（ＤＲＹ  ＥＹＥ）型のトランスジェニック生物を作製するための発現ベクターとして用いることができ、特に、ドライマウス型のトランスジェニック生物を作製するための発現ベクターとして好適に用いることができる。
【００２４】
本発明の発現ベクターは、前述のように、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を含んでいるが、Ｌａｐｔｍ５遺伝子の発現強度が適度に調整されているため、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物を有効に作製することが可能である。なお、本発明の発現ベクターを用いると、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入されたトランスジェニック生物を、致死率が１０％以下（好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下、特に好ましくは１％以下）で作製することができる。
【００２５】
本発明のトランスジェニック生物は、非ヒトトランスジェニック生物であることが重要である。本発明では、トランスジェニック生物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、オランウータン、チンパンジーなどが挙げられる。トランスジェニック生物としては、げっ歯類、非げっ歯類（霊長類など）のいずれであってもよい。また、トランスジェニック生物としては、実験動物、ペット、家畜などのいずれであってもよい。本発明では、トランスジェニック生物としては、特にマウスが好適である。
【００２６】
本発明のトランスジェニック生物は、ドライマウス型（口渇型、口腔乾燥型、口内乾燥型）のトランスジェニック生物、ドライアイ型（眼渇型、眼乾燥型）のトランスジェニック生物である。このようなドライマウス型やドライアイ型のトランスジェニック生物は、口唇唾液腺や涙腺等の分泌線の分泌機能が低下しており、本発明の発現ベクターが用いられていない生物又はＬａｐｔｍ５遺伝子が外部から導入されていない生物（コントロール；Ｗｄ）よりも、口腔や眼球等の乾燥性が高くなっている。すなわち、ドライマウス型のトランスジェニック生物は、コントロール（Ｗｄ）よりも、唾液分泌量が低下している。また、ドライアイ型のトランスジェニック生物は、コントロール（Ｗｄ）よりも、涙分泌量が低下している。本発明では、ドライマウス型やドライアイ型のトランスジェニック生物における唾液や涙の低下量としては、例えば、コントロールに対して５重量％以上（好ましくは１０重量％以上）であり、特に２０重量％以上（中でも２５重量％以上）であることが好適である。従って、ドライマウス型やドライアイ型のトランスジェニック生物における唾液や涙の量は、コントロールに対して９５重量％以下（好ましくは９０重量％以下）であり、特に８０重量％以下（中でも７５重量％以下）であることが好適である。
【００２７】
なお、本発明では、トランスジェニック生物は、生後直後より、唾液や涙の分泌量が顕著に低下している形態を有していてもよく、ある程度の年齢（週齢）になってから、唾液や涙の分泌量が低下する形態を有していてもよい。例えば、トランスジェニックマウスの場合、４０週齢以降で、唾液分泌量が低下し始める特性を有していてもよい。このように、本発明では、トランスジェニック生物の口腔や眼球の乾燥性は、ある程度の年齢（週齢）になってから顕著に発現が見られる場合があってもよい。トランスジェニック生物の口腔や眼球の乾燥性が顕著に発現していると観測される年齢（週齢）としては、特に制限されず、トランスジェニック生物の種類、発現ベクターの使用量、Ｌａｐｔｍ５遺伝子の導入量などにより異なっていても良い。例えば、トランスジェニック生物がマウスの場合、トランスジェニックマウスの口腔や眼球の乾燥性が顕著に発現していると観測される年齢（週齢）としては、０〜１００週齢（好ましくは１０〜９０週齢、さらに好ましくは２０〜８０週齢、特に好ましくは３０〜７０週齢）であってもよい。
【００２８】
唾液分泌量の測定方法としては、特に制限されず、公知の方法から適宜選択することができる。例えば、マウスに２分間綿棒を噛ませ重量測定することで、唾液量の測定を行うサクソンテスト変法などが挙げられる。
唾液分泌量の測定方法として、例えば次の１〜７の工程による測定方法が挙げられる。
１．脱脂綿にジエチルエーテルを含ませ、ガラス瓶に入れる。
２．その中にマウスを入れ軽く麻酔をかける（マウスがふらふらするまで）。
３．麻酔後、電子天秤でマウスの重量を測定する。
４．メンティップ（日本綿棒製）でマウスの口の中を拭う（マウスが綿棒を噛みだすまで）。
５．チャック付きの小袋に小分けしておいたメンティップ（重量を事前に測定しておく）をマウスの口に入れて、２分間、咀嚼させる。その際、咀嚼回数をカウントする。
６．電子天秤で重量を測り、測定前の重量との差を唾液分泌量とする。
７．マウスの体重で唾液分泌量を補正する。
【００２９】
本発明では、トランスジェニック生物は、本発明の発現ベクターを用いることにより作製することができる。トランスジェニック生物の作製に際して、本発明の発現ベクターの利用方法は、特に制限されず、公知の発現ベクターの利用方法の中から適宜選択することができる。すなわち、本発明では、前記発現ベクター（ＡＧプロモーターとＬａｐｔｍ５遺伝子とを含む発現ベクター）を用いて、公知のトランスジェニック生物の作製方法を利用して、トランスジェニック生物を作製することができる。このように、本発明では、トランスジェニック生物の作製に際しては、従来のトランスジェニック生物の作製方法を利用することができ、従来の設備を利用することができる。
【００３０】
具体的には、例えば、本発明の発現ベクターをマイクロインジェクションによって、ｄｏｎｏｒ胚に顕微注入し、偽妊娠ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ動物に移殖して、自然分娩させることにより、本発明のトランスジェニック生物を作製することができる。
【００３１】
発現ベクターをｄｏｎｏｒ胚に導入する方法としては、特に制限されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法／リポソーム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。なお、発現ベクターは、そのままの状態又は形態のもの（未処理のもの）をｄｏｎｏｒ胚に導入することも可能であり、制限酵素等で処理をして直鎖状にしたものをｄｏｎｏｒ胚に導入することも可能である。
【００３２】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
＜発現ベクターの構築＞
１．ｐＣＡＧＧＳ（大阪大学医学部より譲渡）のＳａｌＩ（１）−ＳｎａＢＩ（３５７）部位を制限酵素処理し、発現強度を調節するためにＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを除去した。この両端をＴ４ポリメラーゼ酵素で平滑化した後、ＤＮＡリガーゼ酵素で再環化させて、発現ベクターｐＡＧＧＳを構築した。発現ベクターｐＡＧＧＳの塩基配列を配列表配列番号４に、発現ベクターｐＣＡＧＧＳの塩基配列を配列表配列番号５に示した。また、発現ベクターｐＣＡＧＧＳより除去したＣＭＶ−ＩＥ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを配列表配列番号６に示した。
【００３４】
２．Ｍｏｕｓｅ  ｌａｐｔｍ５（ＮＭ＿０１０６８６）遺伝子（配列番号１）をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶで制限処理して取り出した後、両端をＥｃｏＲＩで平滑化したもの（配列番号３、図３）を、前記１で構築した発現ベクターｐＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ（１３６１）−ＥｃｏＲＩ（１３７３）部位（図４）に導入した。
これらの発現ベクターの作製は委託（オリエンタル酵母工業株式会社）にて行った。
【実施例２】
【００３５】
＜トランスジェニック生物の作製方法＞
トランスジェニック生物は、Ｇｏｒｄｏｎ（１９８０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：７３８０−７３８４）らの改良法を用いて、次の１〜３の工程によって作製した。
【００３６】
１．マイクロインジェクションによって、ｄｏｎｏｒ胚（由来：Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＣｒｌｊ、ｓｔａｇｅ：前核期胚）の雄性前核へ実施例１にて作製した発現ベクターｐＡＧＧＳを顕微注入した（顕微注入胚数：３００個／コンストラクト）。発現ベクターｐＡＧＧＳは、ＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩで切断し、発現カセット部位を取り出して直鎖状にしたものを導入した。
【００３７】
２．顕微注入胚をプラグ確認日の偽妊娠ｒｅｃｉｐｉｅｎｔマウス（系統：Ｃｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ））卵管内へ移殖した後、当該マウスを隔離飼育用ビニールアイソレータ内へ導入し、自然分娩させた。出産予定日の午後までに出産が認められない場合は、子宮切断術による新生仔の摘出を実施した。分娩予定日又は子宮切断術予定日は顕微注入・胚移植日より１９日目であった。得られた新生仔を予め別のアイソレータに準備した里親（ＳＰＦ）に付けて哺育させた。
【００３８】
３．当該新生仔のｔａｉｌを離乳時（４週齢）に採材し遺伝子解析に供した。また、微生物学的検査を１）離乳時に仮腹又は里親を用いて、２）遺伝子解析結果判明時にトランスジェニック（−）産仔を用いて実施した。
１）遺伝子解析
ａ．断尾
ＳＰＦ飼育室へ導入後（離乳・ＳＰＦ確認後）、得られた産仔の断尾を実施した。断尾は予め乾熱滅菌した専用ハサミで尾を先端より約１５ｍｍの位置で切断することで行った。得られた尾は、滅菌済エッペンドルフチューブに入れ、解析時まで−８０℃で保管した。
ｂ．遺伝子解析
遺伝子解析は委託（オリエンタル酵母株式会社）にｔａｉｌを送付して行った。
２）微生物学的検査について（ＳＰＦ確認）
委託（株式会社メルシャン  クリンテック）にて、下記の項目について微生物学的検査を行った。
項目：Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ，Ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｉｌｉｆｏｒｍｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｒｏｄｅｎｔｉｕｍ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋｕｔｓｃｈｅｒｉ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ，Ｇｉａｒｄｉａ  ｍｕｒｉｓ／Ｓｐｉｒｏｎｕｃｌｅｕｓ  ｍｕｒｉｓ，Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｅｓ，Ｓｙｐｈａｃｉａ  ｓｐｐ．，Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ
【００３９】
遺伝子解析の結果を図５に示した。得られた７匹の産仔は、いずれも１００，２００，３００，４００，５００，６５０，８５０ｂｐ，１ｋｂ，１．６５ｋｂｐの９本のバンドと２ｋｂから１２ｋｂまでの１ｋｂごとのバンドを示したことから、トランスジェニック（＋）産仔であることが確認された。これらのトランスジェニック（＋）産仔をＳＰＦ施設にて飼育した。
【００４０】
［比較例］
図２に示したｐＣＡＧＧＳ（大阪大学医学部、宮崎純一教授より譲渡）のＥｃｏＲＩ（１７２４）−ＥｃｏＲＩ（１７３６）部位に、前記実施例１において平滑化したＭｏｕｓｅ  ｌａｐｔｍ５（ＮＭ＿０１０６８６）遺伝子（配列番号３）を導入した。
ｐＣＡＧＧＳは、ＡＧプロモーターと比較して、増幅遺伝子が１００倍の発現強度をもつＣＡＧプロモーターを含んでいる。このＣＡＧプロモーターとｌａｐｔｍ５遺伝子とを含む発現ベクターを用いて、実施例２と同様の方法でトランスジェニック生物の作製を行った。しかし、このＣＡＧプロモーターとｌａｐｔｍ５遺伝子とを含む発現ベクターを用いた場合には、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が導入された仔の出産は認められなかった。
コントロールとしてＬａｐｔｍ５遺伝子を含まないｐＣＡＧＧＳを導入したｄｏｎｏｒ胚では出産があったことから、この結果はインジェクション操作ミスではなく、胎児致死を起こしたことによると推定された。この結果より、Ｌａｐｔｍ５遺伝子は高発現させ過ぎると胎児死を起こしてしまい、生命維持に強く関係する遺伝子であると考えられた。
【実施例３】
【００４１】
＜トランスジェニック生物の機能解析＞
実施例２にて得られたトランスジェニック（＋）産仔同士を掛け合わせ、継代繁殖を行った。これによって得られたマウス（Ｆ１）を用いて、トランスジェニックマスの機能解析を行った。
【００４２】
１．サクソンテスト変法
マウスに２分間綿棒を噛ませ重量測定することで、唾液量の測定を行った。その結果、図６及び表１に示すように、トランスジェニックマウス（Ｔｇ）はコントロール（Ｗｄ）と比較して、４０週齢以降で唾液分泌量が低下した。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
２．唾液腺組織像の比較
トランスジェニックマウス（Ｔｇ）の雌雄及びコントロール（Ｗｄ）の雌における４３週齢の唾液組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、浸潤細胞のフォーカススコアを行った。その結果、図７に示すように、唾液腺組織像において、トランスジェニックマウスとコントロール（Ｗｄ）間で炎症細胞浸潤に差を認めなかった。
【００４５】
前記１．２．の結果より、Ｌａｐｔｍ５遺伝子が唾液分泌の低下に関与をしていることが確認され、本発明のマウスはＤｒｙ  ｍｏｕｔｈ  ｍｉｃｅ  ｍｏｄｅｌとして利用し得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の発現ベクター及びトランスジェニック生物の作製方法によって、Ｌａｐｔｍ５遺伝子を発現するトランスジェニック生物を作製することができる。さらに本発明によって得られる唾液分泌が低下しているマウスは、Ｄｒｙ  ｍｏｕｔｈ  ｍｉｃｅ  ｍｏｄｅｌとして研究機関や医療機関等において実験モデル動物として利用できる。Ｄｒｙ  ｍｏｕｔｈの症状は、単にＳｊｏｇｒｅｎ症候群だけでなく、甲状腺疾患、老人性口腔乾燥症、薬剤の副作用等として現れることから、実験モデル動物としての価値は高い。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ｐＡＧＧＳを示した図である。
【図２】ｐＣＡＧＧＳを示した図である。
【図３】ｐＡＧＧＳに導入したＬａｐｔｍ５配列を示した図である（実施例１）。
【図４】Ｌａｐｔｍ５配列を導入した部位を示した図である（実施例１）。
【図５】トランスジェニック生物の遺伝子解析の結果を示した図である（実施例２）。
【図６】トランスジェニック生物の唾液分泌量を示した図である（実施例３）。
【図７】Ａ．トランスジェニックマウス（Ｔｇ）の雌、Ｂ．トランスジェニックマウス（Ｔｇ）の雄、Ｃ．コントロール（Ｗｄ）の雌についての唾液腺組織における浸潤細胞のフォーカススコアの結果を示した図である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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