(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍の治療のための細胞治療方法の提供。【解決手段】ヒトＨＬＡクラスＩおよび規定された補助分子でトランスフェクトされた人工産物の抗原提示細胞（ＡＡＰＣ；キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））を、正常ドナーおよび癌患者双方からのＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するのに使用する。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の表面上に高密度まで発現されたクラスＩ分子は空であり、特異的ペプチドを内因性に発現する腫瘍細胞を認識するポリクローナル応答の生成をもたらす複数のペプチドの効率的な添加を見込む。生成される応答は、ペプチドエピトープが規定される免疫原である場合に、確固、抗原特異的かつ再現可能である。本人工産物抗原発現系は、集団のかなり大多数の大部分の癌を治療するよう適合させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは癌と関連する１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり）；
ｂ．前記癌を伴う被験体からＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で６ないし７日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合すること；
ｆ．前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を、５，０００ラドのγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し１０のＣＤ８＋細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を６ないし７日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてＣＤ８+懸濁物
をアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【請求項２】
各ペプチドが長さ８ないし１０アミノ酸である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは黒色腫と関連する１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、各ペプチドは長さ８ないし１０アミノ酸であり）；
ｂ．前記黒色腫を伴う被験体からＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で６ないし７日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、２０μｇ／ｍｌの、前記ｎｎＡＰＣが提示することができる各ペプチドと混合すること；
ｆ．前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を５，０００ラドのγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を６ないし７日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．ＣＤ８+懸濁物を、適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【請求項４】
ヒトクラスＩ  ＨＬＡ分子、結合分子および共刺激分子を発現する核酸でトランスフェ
クトされたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞由来の天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）であって、前記核酸によりコードされる１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であるｎｎＡＰＣ。
【請求項５】
前記ｎｎＡＰＣが、１０までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能である、請求項４記載の天然に存在しない抗原提示細胞ｎｎＡＰＣ。
【請求項６】
前記ｎｎＡＰＣが、以下の１０種のペプチド分子、チロシナーゼ369-377、チロシナーゼ207-216、ｇｐ１００209-217、ｇｐ１００154-162、ＭＡＲＴ−１27-35、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ789-797、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ369-377、Ｃ−レクチン8-16、Ｐｅｃ６０20-29およびＰｅｃ６０25-33を同時に提示する、請求項５記載の天然に存在しない抗原提示細胞ｎｎＡＰＣ。
【請求項７】
段階、
ａ．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）卵から昆虫細胞系を調製すること；
ｂ．前記昆虫細胞を、昆虫細胞を成長させるのに適する培地、好ましくはシュナイダー［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］TMドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地中で成長させること；
ｃ．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターからｐＲｍＨａ−３プラスミドを作成すること（前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドは、メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル化シグナルを担持するアルコール脱水素酵素遺伝子を包含し）；
ｄ．前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドに、ヒトクラスＩ  ＨＬＡ  Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、β−２ミクログロブリンおよびＬＦＡ−３の相補ＤＮＡを挿入すること（Ａ２．１はいずれかのヒトクラスＩ  ＤＮＡ配列で置換することができ）；
ｅ．前記昆虫細胞を、ｐｈｓｈｎｅｏプラスミド、および相補ＤＮＡを含有する前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドでトランスフェクトすること；
ｆ．前記昆虫細胞をＣｕＳＯ4と接触させて前記昆虫細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の発現を誘導することによりｎｎＡＰＣを創製すること
よりなる、１５までのペプチド分子を同時に提示することが可能な天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）の製造方法。
【請求項８】
前記ｎｎＡＰＣが１０までのペプチドを提示することが可能である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記昆虫細胞系が、細胞を１２日間成長させること、所望の細胞を同定することが可能であるペプチドをもつ前記所望の細胞を選択すること、ならびに前記所望の細胞をＯＫＴ３およびＩＬ−２で拡張することにより調製される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記所望の細胞を同定することが可能な前記ペプチドが四量体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＧＣは、癌と関連する１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、前記ペプチド分子はそれぞれが長さ６ないし１２アミノ酸であり）；
ｂ．前記癌を伴う被験体もしくは適するドナーからＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．馴化成長培地（ＣＧＭ）もしくはＩＬ−２、ＩＬ−７よりなる群から選択されるサイトカインを含有する培地に前記ＣＤ８+細胞を添加すること（前記サイトカインは個別にもしくは組合せで使用することができ）；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球もしくはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、１ないし５０μｇ／ｍｌの、前記ｎｎＡＰＣが同時に提示することができる前記ペプチドの１種と混合すること；
ｆ．前記末梢血単球懸濁物を、所望の末梢血単球を除く懸濁物中の全部の成分を無効にするのに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記各ペプチドを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し１０のＣＤ８+細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組み合わせること；および
ｊ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法であって、
段階（ａ）の前記ペプチド分子が、配列番号１から４２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される、上記方法。
【請求項１２】
段階（ａ）の前記ペプチド分子が、配列番号１から４２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
段階（ａ）の前記ペプチド分子が、配列番号１から４２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
癌は、治療の領域でなされたかなりの進歩にもかかわらず大きな健康の問題であり続けている。化学療法、放射線治療、外科的介入および三者の組合せという標準的治療レジメンは、永続する治癒を生じさせることにしばしば失敗する。多くの場合、治療を受けた癌患者は、しばしば、いくらかの期間の後に疾患状態に戻り、病状をさらに悪化させることは、患者に対するこれらの治療レジメンの苛烈さである。
【０００２】
癌治療の発展を複雑にする別の要因は、癌が単一の生物学的作用物質もしくは因子によってではなく、しかしむしろ作用物質および要因の組合せにより引き起こされることが見出されたことである。単一の原因物質もしくは事象が治療の焦点である大部分の医学的治療と異なり、癌治療は複数の生物学的因子を取り扱うことを必要とする。
【背景技術】
【０００３】
近年、研究は患者自身の免疫系を利用する癌治療を開発することに向けられている。１つのこうしたアプローチは養子免疫療法である。養子免疫療法は、腫瘍もしくは癌細胞を治療する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成させるために患者自身の細胞を使用することを要する。しかしながら、この技術は、ヒト患者についての実現可能な臨床的治療レジメンとして十分に証明されないままである。ＣＴＬを免疫化するための適正なエピトープを同定するという問題を別として、従来技術は、複数の抗原に十分に標的を定めて癌を効果的に治療するためのＡＰＣへの十分な数の異なるエピトープの提示方法を提供しない。本発明は、まだ対処されていない必要性を満足し、ならびに他の利益を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、１０までもしくはそれ以上の異なるペプチドを同時に提示することが可能な天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）、ｎｎＡＣＰの製造方法、癌の治療のための前記ｎｎＡＣＰの使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】発明にかかる、抗原提示細胞もしくは標的細胞（この場合は腫瘍細胞）との細胞傷害性Ｔリンパ球としてもまた知られるＣＤ８+細胞の間の相互作用のグラフィック描写である。
【図２（Ａ−Ｂ）】発明にかかる、リンパ球に媒介される細胞増加症の機構の２図のグラフィック描写である。
【図３】発明にかかる、ヒト空クラスＩ分子を発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上に複数のペプチドを添加するのに使用することができるペプチド結合体を同定するための競争アッセイで数種の異なるペプチドを試験した実験の結果を示す。
【図４（Ａ）】発明にかかる、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に単一のエピトープとして添加された場合のＣＴＬを生じさせる能力について３種の黒色腫ペプチドを試験した実験の結果を示す。単一ドナーにおいて、単独ないし３種の異なるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）調製物を添加された場合のペプチドのそれぞれに対して、ＣＴＬ活性が導き出された。応答の特異性を、高親和性結合体、対照ＨＢｃペプチドと比較した。
【図４（Ｂ）】発明にかかる、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に単一のエピトープとして添加された場合のＣＴＬを生じさせる能力について３種の黒色腫ペプチドを試験した実験の結果を示す。単一ドナーにおいて、単独ないし３種の異なるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）調製物を添加された場合のペプチドのそれぞれに対して、ＣＴＬ活性が導き出された。応答の特異性を、高親和性結合体、対照ＨＢｃペプチドと比較した。
【図４（Ｃ）】発明にかかる、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に単一のエピトープとして添加された場合のＣＴＬを生じさせる能力について３種の黒色腫ペプチドを試験した実験の結果を示す。単一ドナーにおいて、単独ないし３種の異なるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）調製物を添加された場合のペプチドのそれぞれに対して、ＣＴＬ活性が導き出された。応答の特異性を、高親和性結合体、対照ＨＢｃペプチドと比較した。
【図５（Ａ）】発明にかかる、４種までの異なるペプチドを単一のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に添加した実験の一連の結果を示す。表されたペプチドのそれぞれにおけるＣＴＬ活性が３週間の刺激プロトコル後にみられ、そしてこの図でグラフに描かれている。
【図５（Ｂ）】発明にかかる、４種までの異なるペプチドを単一のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に添加した実験の一連の結果を示す。表されたペプチドのそれぞれにおけるＣＴＬ活性が３週間の刺激プロトコル後にみられ、そしてこの図でグラフに描かれている。
【図５（Ｃ）】発明にかかる、４種までの異なるペプチドを単一のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に添加した実験の一連の結果を示す。表されたペプチドのそれぞれにおけるＣＴＬ活性が３週間の刺激プロトコル後にみられ、そしてこの図でグラフに描かれている。
【図６（Ａ）】発明にかかる、３種の異なる一次インビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。
【図６（Ｂ）】発明にかかる、３種の異なる一次インビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。
【図６（Ｃ）】発明にかかる、３種の異なる一次インビトロ刺激プロトコル後のＣＴＬ活性を示す。
【図７（Ａ−Ｂ）】発明にかかる、標準的刺激プロトコル後の単一ペプチドエピトープに対するＣＴＬ応答を導き出す、樹状細胞に対するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の能力を比較する。
【図８】発明にかかる、成熟もしくは未熟いずれかの表現型を表す樹状細胞が、細胞に適用するのに規定されたペプチドを使用した場合に特異的ＣＴＬ応答の導出においてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞ほど効率的でなかったことを示す。
【図９（Ａ）】発明にかかる、４種のペプチドを提示する３種の異なるインビトロ刺激プロトコルに対して単一ドナーにより生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図９（Ｂ）】発明にかかる、４種のペプチドを提示する３種の異なるインビトロ刺激プロトコルに対して単一ドナーにより生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図９（Ｃ）】発明にかかる、４種のペプチドを提示する３種の異なるインビトロ刺激プロトコルに対して単一ドナーにより生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図１０】発明にかかる、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に組合せで添加された１０種のペプチドに対し生成されたＣＴＬ活性を示す。
【図１１】発明にかかる、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ分子でトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上でのＨＥＲ−２ペプチド（８２６、８３５、８６１および８６３）のペプチド結合能力を示す。
【図１２】発明にかかる、ＭＡＲＴ−１特異的エフェクター細胞に対する抗ペプチドおよび抗腫瘍応答を立証する。Ｔ２細胞にはＭＡＲＴ−１ペプチドもしくは陰性対照（ＨＢｃ）を添加した。Ｍａｌｍｅ３Ｍは黒色腫系統であり、Ｍａｌｍｅ３は非腫瘍細胞系である。
【図１３（Ａ）】発明にかかる、２例の異なるドナーからのＨＥＲ−２特異的ＣＤ８エフェクター細胞の四量体染色を示す。
【図１３（Ｂ）】発明にかかる、２例の異なるドナーからのＨＥＲ−２特異的ＣＤ８エフェクター細胞の四量体染色を示す。
【図１４】発明にかかる、ペプチドの添加されたＴ２細胞で評価されたＨＥＲ−２エフェクター細胞に対する抗ペプチド応答を示す。
【図１５（Ａ−Ｂ）】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の卵巣腫瘍細胞系（ＨＴＢ−７７）の高められた殺傷を立証する。
【図１５（Ｃ−Ｄ）】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の卵巣腫瘍細胞系（ＨＴＢ−７７）の高められた殺傷を立証する。
【図１６】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合の乳癌細胞系（ＨＴＢ−１３３）の高められた殺傷を示す。
【図１７】発明にかかる、腫瘍細胞系ＨＴＢ−７７／Ａ２．１の溶解を立証するのにＩＦＮγ前処理が必要とされることを示す。
【図１８（Ａ−Ｂ）】発明にかかる、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＥＲ−２の表面発現が、２種の細胞系（ＨＴＢ−７７およびＨＴＢ−７７／Ａ２．１）でのＩＦＮγ誘導により影響を及ぼされないことを立証するグラフである。
【図１９】発明にかかる、どのタンパク質のｍＲＮＡレベルがＩＦＮγでの誘導後にＨＴＢ−７７／Ａ２．１細胞中で上昇されるかを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製することであって、前記ｎｎＡＰＣは、癌と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０の異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、各ペプチドはが長さ約６ないし１２アミノ酸、好ましくは長さが約８ないし１０アミノ酸、かつ約１０ｎＭないし１００μＭの濃度範囲にあり；
ｂ．癌を伴う被験体もしくは適するドナーからＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．馴化成長培地（ＣＧＭ）もしくはＩＬ−２、ＩＬ−７のようなサイトカインを含有する培地、好ましくはＩＬ−２、または組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７に前記ＣＤ８+細胞を添加すること；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球、あるいはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約１０ないし５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合すること；
ｆ．前記末梢血単球懸濁物を、約３，０００ないし７，０００ラドの範囲、好ましくは約５，０００ラドの線量のような、懸濁物中のこれらの細胞の増殖を予防するのに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること、あるいは、末梢血リンパ球懸濁物を、限定されるものでないがマイトマイシンＣを挙げることができる細胞増殖抑制剤で処理してもよい；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１０ｎｇ／ｍｌないし１０μｇ／ｍｌの前記各ペプチドを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８+細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．場合によっては、ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を約６ないし７日間刺激すること；
ｋ．場合によっては、ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．場合によっては、ＣＤ８+懸濁物を適するＣＴＬ活性についてアッセイすること、ならびに、場合によって、ＣＴＬの純度、無菌性（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに、
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製することであって、前記ｎｎＡＰＣは癌と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０のペプチドを同時に提示することが可能であり、各ペプチドは長さが８ないし１０アミノ酸であり；
ｂ．癌を伴う被験体からＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で約６ないし７日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合すること；
ｆ．前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を、約５，０００ラドのγ線放射で照射すること；ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を約６ないし７日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてＣＤ８+懸濁物をアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の態様は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製することであって、前記ｎｎＡＰＣは黒色腫と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０のペプチドを同時に提示することが可能であり、各ペプチドは長さが８ないし１０アミノ酸であり；
ｂ．黒色腫を伴う被験体からＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で約６ないし７日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの、前記ｎｎＡＰＣが提示することができる各ペプチドと混合すること；
ｆ．前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を、約５，０００ラドのγ線放射で照射すること；ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を約６ないし７日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．ＣＤ８+懸濁物を、適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、ｎｎＡＰＣが以下のペプチド、チロシナーゼ369-377、チロシナーゼ207-216、ｇｐ１００209-217、ｇｐ１００154-162、ＭＡＲＴ−１27-35、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ789-797、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ369-377、Ｃ−レクチン8-16、Ｐｅｃ６０20-29お
よびＰｅｃ６０25-33を提示する、黒色腫の治療方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、感染したもしくは形質転換された細胞を排除する治療がＣＴＬにより達成されることが立証されている、クラスＩ  ＨＬＡ分子と通常は関連する不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）もしくは不十分な（ｉｎａｄａｑｕａｔｅ）免疫応答をもたらす疾患もしくは疾患状態の治療方法である。
【００１１】
本発明の別の態様は、クラスＩ  ＨＬＡ分子と通常は関連する不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）もしくは不十分な（ｉｎａｄａｑｕａｔｅ）免疫応答をもたらす疾患もしくは疾患状態の治療方法であって、ＣＴＬによる排除を受けやすいことが示されている感染したもしくは形質転換された細胞は：
ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製することであって、前記ｎｎＡＰＣは前記疾患もしくは疾患状態と関連する約１５までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０の異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、各ペプチドは長さが約６ないし１２アミノ酸、好ましくは長さが約８ないし１０アミノ酸、かつ、約１０ｎＭないし１００μＭの濃度範囲にあり；
ｂ．ＣＤ８+細胞を前記被験体もしくは適するドナーから収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を、ＣＧＭもしくはＩＬ−２、ＩＬ−７のようなサイトカインを含有する培地好ましくはＩＬ−２、または組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７に添加すること；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球、あるいはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約１０ないし５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合すること；
ｆ．前記末梢血単球懸濁物を、約３，０００ないし７，０００ラドの範囲、好ましくは約５，０００ラドの線量のような、所望の末梢血単球を除く懸濁物中の全部の成分を無効にする（ｓｔｅｒｉｌｉｚｅ）のに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１０ｎｇ／ｍｌないし１０μｇ／ｍｌの前記各ペプチドを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８+細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．場合によっては、ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を、約６ないし７日間刺激すること；
ｋ．場合によっては、ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．場合によっては、適するＣＴＬ活性についてＣＤ８+懸濁物をアッセイすること、ならびに、場合によってはＣＴＬの純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る方法により治療する。
【００１２】
本発明は、発現のためヒトクラスＩ  ＨＬＡ、結合および共刺激分子をコードするＤＮＡでトランスフェクトされたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞由来の天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）を提供し、ｎｎＡＰＣは１５までの異なるペプチド分子、好ましくは１０のペプチド分子を提示することが可能である。
【００１３】
本発明の別の態様は、被験体の治療を高める多様な所望の機能と関連するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えば、治療されている疾患もしくは疾患状態と関連するペプチドに加えて、ｎｎＡＰＣは、細胞−細胞接着を高めるもしくは付加的な細胞活性化
シグナルを伝達する、リンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｔ細胞共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のような補助分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と関連するペプチドを提示することができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、いくつかの型の癌と関連するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのような乳癌関連ポリペプチドと関連するもしくはそれ由来のペプチドは、ＭＡＲＴ−１もしくはＭＡＧＥのような黒色腫関連ポリペプチドと関連するもしくはそれ由来のペプチドとともに提示されるかもしれない。
【００１５】
本発明の別の態様は、１０までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能な天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）の製造方法を提供し、前記方法は、段階：
ａ．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）卵から昆虫細胞系を調製すること；あるいは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子および共刺激接着分子を発現させるための昆虫細胞系を調製すること；
ｂ．前記昆虫細胞を、昆虫細胞を成長させるのに適する培地、好ましくはシュナイダー［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］TMドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地中で成長させること；
ｃ．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターからｐＲｍＨａ−３プラスミドを作成することであって、前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドは、メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル化シグナルを担持するアルコール脱水素酵素遺伝子を包含し；
ｄ．前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドに、ヒトクラスＩ  ＨＬＡ  Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、β−２ミクログロブリンおよびＬＦＡ−３の相補ＤＮＡを挿入することであって、Ａ２．１はいずれかのヒトクラスＩ  ＤＮＡ配列で置換することができ；
ｅ．前記昆虫細胞を、ｐｈｓｈｎｅｏプラスミド、および相補ＤＮＡを含有する前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドでトランスフェクトすること；ならびに
ｆ．前記昆虫細胞をＣｕＳＯ4と接触させて前記昆虫細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の発現を誘導することによりｎｎＡＰＣを創製すること
よりなる。
【００１６】
本発明の昆虫細胞は、昆虫細胞を成長させるのに適する培地（下で「昆虫成長培地」と称される）中で成長させる。シュナイダー［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］TMドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地、グレース昆虫培地、およびＴＣ−１００昆虫培地のような、昆虫成長培地は、多数の供給元から商業的に入手可能である。あるいは、昆虫成長培地は当業者により調製することができる。典型的には、該培地は、無機塩（例えば、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム）、アミノ酸、多様な炭水化物、ならびに化学種（Ｉｍｏｇｅｎｅ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．（１９６４）１５６（１）：ｐｇ．９１）のような、昆虫細胞の成長を促進かつ持続するのに必要な成分を包含することができる。あるいは、該培地は、ビタミン、ミネラル、および昆虫細胞の成長で補助する他の成分もまた包含することができる。
【００１７】
以下は、本明細で使用される略語および定義の一覧である。
略語
ＡＰＣ          抗原提示細胞
ＣＤ８+         ＣＤ８+  Ｔ細胞
ＣＴＬ          細胞傷害性Ｔリンパ球
Ｅ              エフェクター
Ｆａｓ          ＣＤ９５としてもまた知られる、Ｔ細胞上のエピトープ
ＩＣＡＭ        細胞間接着分子
ＩＬ            インターロイキン
ＬＡＫ          リンホカイン活性化型キラー細胞
ＬＦＡ          リンパ球機能抗原
ＭＨＣ          主要組織適合抗原複合体
ｎｎＡＰＣ      天然に存在しない抗原提示細胞
ＮＰ            核タンパク質
ＰＢＭＣ        末梢血単核細胞
ＰＢＳ          リン酸緩衝生理的食塩水
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＰＭＩ        ロズウェル  パーク  メモリアル  インスティテュート（Ｒｏｓｗｅｌ
ｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
ＲＷＪＰＲＩ    Ｒ．Ｗ．ジョンソン  ファーマシューティカル  リサーチ  インスティ
テュート（Ｔｈｅ  Ｒ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
Ｔ              標的
ＴＣＰ          Ｔ細胞抗原受容体
ＴＩＬ          腫瘍浸潤リンパ球
【００１８】
以下は、多様なペプチドエピトープについて本明細で使用される略語の一覧である。個々のアミノ酸残基は、当業者により容易に既知かつ使用される一文字記号に従って同定される。
【００１９】
【表１】
2010222352.tif 000002
【００２０】
ペプチドエピトープの略語
本明細書で使用されるところの「チロシナーゼ３６９−３７７」もしくは「チロシナーゼ369-377」はアミノ酸配列ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）を指す。この定義内に、配列ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）のアミノ酸残基「Ｎ」を「Ｄ」に改変してＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）のアミノ酸配列をもたらす翻訳後事象から生じる、配列ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）のペプチドもまた包含される（Ｓｋｉｐｐｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：５２７−５３４）。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「チロシナーゼ２０７−２１６」もしくは「チロシナーゼ207-216」という用語はアミノ酸配列ＦＬＰＷＨＲＬＦＬＬ（配列番号３）を指す。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「ｇｐ１００  ２０９−２１７」もしくは「ｇｐ１００209-217」という用語はアミノ酸配列ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）を指す。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「ｇｐ１００  １５４−１６２」もしくは「ｇｐ１００154-162」という用語はアミノ酸配列ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号５）を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「ＭＡＲＴ−１  ２７−３５」もしくは「ＭＡＲＴ−１27-35」という用語はアミノ酸配列ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号６）を指す。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ７８９−７９７」もしくは「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ789-797」という用語はアミノ酸配列ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（配列番号７
）を指す。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ３６９−３７７」もしくは「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ369-377」という用語はアミノ酸配列ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号８
）を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「Ｃ−レクチン  ８−１６」もしくは「Ｃ−レクチン8-16」という用語はアミノ酸配列ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（配列番号９）を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「Ｐｅｃ６０  ２０−２９」もしくは「Ｐｅｃ６０20-29」という用語はアミノ酸配列ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（配列番号１０）を指す。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「Ｐｅｃ６０  ２５−３３」もしくは「Ｐｅｃ６０25-33」という用語はアミノ酸配列ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（配列番号１１）を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「ＣＤ８ペプチド  ５９−７０」もしくは「ＣＤ８ペプチド59-70」という用語は、ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ（配列番号１２）のアミノ酸配列
を指す。
【００３１】
用語および定義
本明細書で使用されるところの「養子免疫療法」という用語は、疾患もしくは疾患状態の治療のためのドナーもしくは自己のＴリンパ球の投与を指し、ここで疾患もしくは疾患状態は、クラスＩ  ＨＬＡ分子と通常は関連する不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）もしくは不十分な（ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ）免疫応答をもたらす。養子免疫療法は、感染したもしくは形質転換された細胞の排除がＣＴＬにより達成されることが立証されているいかなる疾患もしくは疾患状態にも適切な治療である。例えば、疾患もしくは疾患状態は、限定されるものでないが、黒色腫、前立腺、乳房、結腸直腸、胃、咽頚部、膵、子宮頚、卵巣、骨、白血病および肺癌のような癌および／もしくは腫瘍；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス感染症；結核、らいおよびリステリア症のような細菌感染症、ならびにマラリアのような寄生虫感染症を挙げることができる。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「Ｂ７．１」という用語は抗原提示細胞に関連する共刺激分子を指す。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「ＢＣＮＵ」という用語は１，３−ビス（２クロロエチル）−１−ニトロソ尿素としてもまた知られるカルムスチンを指す。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「ＢＳＥ」という用語はウシ海綿状脳症を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「ＣＤ」という用語は、抗原エピトープおよび機能によるグループ分けされる分化抗原クラスターすなわちＴリンパ球（元は）、Ｂリンパ球、単球、マクロファージおよび顆粒球を指す。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「ＤＴＩＣ」という用語は、ダカルバジンすなわち５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドを指す。
【００３７】
本明細書で使用されるところの「エクスビボ」もしくは「エクスビボ療法」という用語は、該改変された細胞により生じられる治療上の利益の長期のもしくは一定の送達により改善することができる病理学的状態を治療するのに該改変された細胞を使用することができるような、生物学的材料（典型的には細胞）を患者もしくは適するドナーのような適する代替供給源から得かつ改変する治療を指す。治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は患者もしくは代替供給源のいずれかから得られた改変された生物学的材料の患者への再導入を包含する。エクスビボ療法の一利益は、治療からの望ましくない傍系の影響に患者を曝露することなく治療の利益を患者に提供する能力である。例えば、サイトカインはしばしば、患者のＣＴＬの拡張を刺激するために癌もしくはウイルス感染症を伴う患者に投与される。しかしながら、サイトカインは患者において流感様の症状の発症をしばしば引き起こす。エクスビボ手順において、サイトカインは患者の身体の外側でＣＴＬの拡張を刺激するのに使用され、そして患者はサイトカインの曝露および結果としての副作用を容赦される。あるいは、適する状況もしくは条件下で、適切な場合かつ被験体が利益を得ることができる場合、被験体を、低レベルの投薬量のγインターフェロン、αインターフェロンおよび／もしくはＩＬ−２で同時に治療することができる。インターフェロンの期待される効果は、おそらく抗原特異的ＣＴＬによる溶解に対し腫瘍細胞を感作することであり、また、ＩＬ−２の効果は、おそらく抗原特異的ＣＴＬの持続性を高めることである。
【００３８】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＰＥＳ」という用語はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’２−エタンスルホン酸緩衝液を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「ＨＬＡ−Ａ２．１」という用語は、およそ４５％の白色人種で見出されるＨＬＡクラスＩ分子を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるところの「ＭＡＲＴ−１」もしくは「Ｔ細胞−１により認識される黒色腫抗原」という用語は黒色腫関連抗原を指す。この抗原のアミノ酸および核酸配列、ならびに多様な特徴は、「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年１１月３０日公布の米国特許第５，９９４，５２３号明細書；「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年２月２３日公布の米国特許第５，８７４，５６０号明細書；ならびに「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９８年１２月１日公布の米国特許第５，８４４，０７５号明細書に開示される。とりわけ、米国特許第５，９９４，５２３号明細書は、それぞれ配列番号１および配列番号２として図１にＭＡＲＴ−１の完全長の核酸およびアミノ酸配列を開示する。前述の図１は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本明細書で使用されるところの「ＭＡＧＥ」は黒色腫関連抗原を指す。この抗原のアミノ酸および核酸配列、ならびに多様な特徴は、「それと関連する複数の抗原についてアッセイすることによる乳癌および黒色腫の決定方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｙ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  Ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ）」と題された２０００年１０月３１日公布の米国特許第６，１４０，０５０号明細書；「ＭＡＧＥ−ＸＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを検出することによる癌のスクリーニング方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏ
ｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  ａ  ＭＡＧＥ−ＸＰ  Ｇｅｎｅ）」と題された１９９８年６月２日公布の米国特許第５，７５９，７８３号明細書；および「合成ペプチドエピトープを使用するヒトにおける抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」と題された１９９７年９月２日公布の米国特許第５，６６２，９０７号明細書に開示される。
【００４２】
本明細書で使用されるところの「ＭＰＣ−１０」という用語は磁性粒子濃縮装置を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「ＮＫ細胞」という用語はナチュラルキラー細胞を指す。
【００４４】
本明細書で使用されるところの「ＯＫＴ３」という用語は、オルソクローン（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ）ＯＫＴ３、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるところの「ＴＡＰ−１，２」という用語は、抗原プロセシング関連輸送タンパク−１，２を指す。
【００４６】
本明細書で使用されるところの「Ｔｈ細胞」という用語はヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋を指す。
【００４７】
本明細書で使用されるところの「チロシナーゼ」という用語は、黒色腫に関連するタンパク質を指す（Ｂｒｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：４８９−４９５；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）５４：３１２４−３１２６）。「Ｐ１５およびチロシナーゼ黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｐ１５  ａｎｄ  Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９８年１２月１日公布の米国特許第５，８４３，６４８号明細書は、図７、図ＡないしＤにチロシナーゼに関連する抗原ペプチドおよび関連するポリ核酸を開示し、前述の図は引用することにより本明細書に組み込まれる。「異常細胞上のヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）分子およびチロシナーゼ由来ペプチドを含有する複合体の検出方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａ２  （ＨＬＡ−Ａ２）  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ａ  Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」と題された１９９６年１月３０日公布の米国特許第５，４８７，９７４号明細書は、実施例９で表３にチロシナーゼおよび黒色腫と関連する付加的なペプチドを開示し、前述は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本明細書で使用されるところの「ｇｐ１００」という用語は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）により認識される黒色腫抗原を指す。ｇｐ１００を認識するＴＩＬはインビボの腫瘍拒絶と関連する（Ｂａｋｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１００５−１００９；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：３９６１−３９６８）。ｇｐ１００に関連する抗原ペプチドは、「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ
Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年１１月３０日公布の米国特許第５，９９４，５２３号明細
書；「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９９年２月２３日公布の米国特許第５，８７４，５６０号明細書；ならびに「黒色腫抗原ならびに診断および治療法におけるそれらの使用（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された１９９８年１２月１日公布の米国特許第５，８４４，０７５号明細書に開示される。とりわけ、米国特許第５，９９４，５２３号明細書は、図４および５にＧＰ１００に関係する核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ開示する。配列番号２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０および４１として同定されるものを包含する該アミノ酸配列由来の抗原ペプチドもまた開示される。前述の図４および５の全部、ならびに配列番号により同定されるペプチドは、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「黒色腫」という用語は、限定されるものでないが黒色腫、転移性黒色腫、メラノサイトもしくはメラノサイト関連神経細胞いずれか由来の黒色腫、黒色肉腫、黒色癌腫、黒色上皮腫、黒色腫インシトゥ表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、侵襲型黒色腫もしくは家族性異型黒子・黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群を指す。哺乳動物におけるこうした黒色腫は、染色体異常、変性性の成長および発生障害、有糸分裂促進剤、紫外線放射（ＵＶ）、ウイルス感染症、遺伝子の不適切な組織発現、遺伝子の発現の変化、ならびに細胞上での提示もしくは発癌物質により引き起こされるかもしれない。前述の黒色腫は、本出願に記述される方法により診断、評価もしくは治療することができる。
【００５０】
本明細書で使用されるところの「Ｃ−レクチン」という用語は、卵巣癌に関連することが見出されている配列のペプチドを指す。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「主要組織適合抗原複合体」もしくは「ＭＨＣ」という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を包含する多様な種で記述される組織適合抗原系を包含することを意味される包括的呼称である。
【００５２】
本明細書で使用されるところの「エピトープ」、「ペプチドエピトープ」、「抗原性ペプチド」および「免疫原性ペプチド」という用語は、哺乳動物において細胞性免疫応答を引き起こすことが可能な抗原由来のペプチドを指す。こうしたペプチドは、該ペプチドで免疫化された動物からの抗体ともまた反応性であるかもしれない。こうしたペプチドは長さが約５ないし２０アミノ酸、好ましくは長さが約８ないし１５アミノ酸、および最も好ましくは長さが約９ないし１０アミノ酸であってよい。
【００５３】
本明細書で使用されるところの「Ｐｅｃ６０」という用語は、卵巣および乳癌に関連することが見出されている配列のペプチドを指す。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「類似物」という用語は、とりわけ１個もしくはそれ以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されかつ本明細書に記述されるところの本発明の機能的局面を表す本明細書に示される、本発明の配列に実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するいかなるポリペプチドも包含する。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１個の非極性（疎水性）残基の代わりに別のものの置換、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間のような１個の極性（親水性）残基の代わりに別のものの置換、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのような１個の塩基性残基の代わりに別のものの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸もしくは別のもののような１個の酸性残基の置換を包含する。
【００５５】
本明細書で使用されるところの「保存的置換」という用語は、誘導体化されない残基の代わりの化学的に誘導体化された残基の使用もまた包含する。
【００５６】
本明細書で使用されるところの「化学的誘導体」という用語は、官能性側基の反応により化学的に誘導体化された１個もしくはそれ以上の残基を有する主題のポリペプチドを指す。こうした誘導体化された分子の例は、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基もしくはホルミル基を形成するように誘導体化された分子を包含する。遊離カルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導体化してよい。遊離ヒドロキシル基はＯ−アシルもしくはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化してよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素はＮ−イン−ベンジルヒスチジン（ｉｍ−ｂｅｎｚｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を形成するように誘導体化してよい。２０種の標準的アミノ酸の１種もしくはそれ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するタンパク質もしくはペプチドもまた化学的誘導体として包含される。例えば：４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに用いてよく；５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに用いてよく；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに用いてよく；ホモセリンをセリンの代わりに用いてよく；そしてオルニチンをリシンの代わりに用いてよい。本発明のタンパク質もしくはポリペプチドは、欠くことのできない活性が維持される限りは、その配列が本発明の対応する核配列にコードされるポリペプチドの配列に関して１個もしくはそれ以上の付加および／もしくは欠失または残基を有するいかなるポリペプチドもまた包含する。
【００５７】
本明細書で使用されるところの「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」という用語は、１種もしくはそれ以上の膜会合型の受容体様癌遺伝子タンパク質を発現もしくは過剰発現する癌遺伝子を指す。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現もしくは過剰発現に関連することが見出された癌は、ある種の乳房、胃、卵巣、結腸および唾液腺の癌などである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子はチロシンタンパク質キナーゼファミリーの癌遺伝子の１メンバーであり、そして上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と高程度の相同性を共有する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは細胞の成長および／もしくは分化で役割を演じることが示されている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、本質的に正常な遺伝子産物の増大されたもしくは無秩序な発現から生じる量的機構により悪性病変を誘導するようである。「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子が関連する悪性病変の診断および治療のためのＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫反応性（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｗｈｉｃｈ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」と題された２０００年６月１３日公布の米国特許第６，０７５，１２２号明細書は、第１２段第３１行ないし第１３段第７行で、ＣＤ８+  Ｔ細胞応答を導き出すペプチド
を開示し、配列番号により同定されるものは引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５８】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５）はＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物である。乳房、卵巣、結腸、肺および前立腺の癌を包含する多様な癌において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が増幅されそしてＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質が過剰発現される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは悪性の形質転換と関連する。それは、非浸潤性管癌の５０％ないし６０％、および全乳癌の２０％ないし４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺で生じる腺癌のかなりの部分で見出される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、悪性の表現型のみならず、しかしまた全部の侵襲性乳癌の１／４で見出される悪性病変の攻撃性とも緊密に関連する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、乳房および卵巣双方の癌における乏しい予後と相関する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、長さがおよそ１２５５アミノ酸（ａａ）である１８５ｋｄの相
対分子量をもつ膜貫通タンパク質である。それは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する４０％の相同性をもつおよそ６４５ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）、高度に疎水性の膜貫通固定ドメイン（ＴＭＤ）、およびＥＧＦＲに対する８０％の相同性をもつおよそ５８０アミノ酸のカルボキシ末端細胞質ドメイン（ＣＤ）を有する。
【００５９】
癌遺伝子に関する進行中の研究は、悪性病変細胞中で効果をもたらしかつ形質転換の原因であるかもしくはそれと関連する最低４０種の癌遺伝子を同定した。癌遺伝子は、（癌遺伝子により発現されるタンパク質のような）それらの遺伝子産物の推定の機能もしくは位置に基づき、多様な群に分類されている。癌遺伝子は正常細胞の生理学のある局面に不可欠であると考えられる。
【００６０】
癌は、治療の領域でなされたかなりの進歩にもかかわらず大きな健康の問題であり続けている。化学療法、放射線治療、外科的介入および三者の組合せという標準的治療レジメンは、永続する治癒を生じさせることにしばしば失敗する。多くの場合、治療を受けた癌患者は、しばしば、いくらかの期間の後に疾患状態に戻り、病状をさらに悪化させることは、患者に対するこれらの治療レジメンの苛烈さである。黒色腫の例において、転移性黒色腫の治癒は慣習的化学療法を使用して達成されていない。３５％ないし５０％の奏効率が、併用化学療法のダートマスレジメン（ＤＴＩＣ、シスプラチン、ＢＣＮＵおよびタモキシフェン）で報告されているが、しかし、生存期間は６ないし１０ヶ月に留まっている。高率の再発が、攻撃的な「高用量強度」化学療法、ならびに自己骨髄移植を伴う造血の多血症について報告されている。にもかかわらず、生存期間の中央値は短かった（およそ４ヶ月）。
【００６１】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらは、多様な癌の治療として活性化されたリンパ球の注入を使用することを試みた。当初、リンホカイン活性化型キラー細胞（ＬＡＫ）、および後にＩＬ−２でエクスビボ活性化された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用したが、しかし、有効性の証拠は不確かである。事実、対照臨床試験は、患者へのＩＬ−２の直接投与を上回るエクスビボ活性化された細胞の使用に対する利点を示すことに失敗した。従って、ＬＡＫおよびＴＩＬ療法の利益は重要でなく、かつ、副作用は、典型的には、多くの試験が早期に中断されたほどひどい。
【００６２】
マウス腫瘍モデルにおける研究は、養子免疫療法すなわち腫瘍抗原（１種もしくは複数）に特異的なＴ細胞のインビボ免疫感作が最小限の毒性を伴い非常に有効であることを立証した。ヒト腫瘍の治療にこの戦略を適用するための大きな障害は、腫瘍細胞を細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性の破壊に対し感受性にする免疫原性抗原の同定である。黒色腫患者からの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離は、ＣＴＬが向けられる腫瘍抗原（エピトープ）のいくつかの同定に至った。これらは、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：４８９−４９５；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）５４：３１２４−３１２６）、ＭＡＲＴ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１８０：３４７−３５２）、ｇｐ  １００（Ｂａｋｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１００５−１００９；およびＫａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：３９６１−３９６８）、ならびにＭＡＧＥ（Ｇａｕｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：９２１−９３０）を包含する。これらのうち、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は黒色腫でほぼ普遍的に発現され、そして従って養子免疫療法についての論理的選択である。
【００６３】
近年、およそ数年の生存の大きな改善が、免疫学的療法を受けている小さな割合の黒色腫患者で示されている。これは、「癌ワクチン」での能動的特異的免疫療法、ならびにＩＬ−２、α−インターフェロンおよびγ−インターフェロンのようなサイトカインのよう
な免疫系の非特異的推進物質（ｂｏｏｓｔｅｒ）の使用を包含する。しかしながら、サイトカインの利益は、悪心および発熱のようなそれらの使用にしばしば付随する副作用により小さくされる。
【００６４】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８+）はウイルス感染症に対する主要防御線である。ＣＤ８+リンパ球はウイルスにより感染した宿主細胞を特異的に認識しかつ殺す。理論的には、癌を包含する他の型の疾患と闘うのに免疫系を利用することが可能であるはずである。しかしながら、わずかなインビトロ／エクスビボ手順が、ＣＴＬを特異的に活性化するのに利用可能である。上に示された重要な黒色腫抗原の同定、および下述されるＣＴＬの特異的インビトロ活性化方法は、今や、転移性黒色腫の養子免疫療法の概念の試験を可能にする。
【００６５】
全てのナイーブなＴ細胞は、免疫応答を導き出すための活性化に２種のシグナルを必要とする。ＣＤ８+リンパ球（ＣＴＬ）について、特異性を分け与える第一のシグナルは、
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在するクラスＩ  ＭＨＣ（ＨＬＡ）複合体に結合された抗原の免疫原性ペプチドフラグメント（エピトープ）のＣＤ８+細胞への提示よりな
る。この複合体は、シグナルを細胞内で伝えるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識される。
【００６６】
Ｔ細胞受容体への結合はＴ細胞の活性化を誘導するのに必要であるがしかし十分でなく、そして通常、細胞増殖もしくはサイトカイン分泌に至ることができない。完全な活性化は第二の共刺激シグナル（１種もしくは複数）を必要とし、これらのシグナルは活性化カスケードをさらに高めるようはたらく。抗原提示細胞上の共刺激分子のなかで、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１のような細胞接着分子（インテグリン）が、Ｔ細胞上のそれぞれＣＤ２８およびＬＦＡ−１に結合することによりこの過程で補助する。ＣＤ８+細胞が、適切な共
刺激分子の相互作用の存在下でクラスＩ  ＭＨＣ分子により結合された免疫原性ペプチド（エピトープ）を担持する抗原提示細胞と相互作用する場合に、ＣＤ８+細胞は完全に活
性化された細胞溶解性Ｔ細胞となる。
【００６７】
リンパ球に媒介される細胞殺傷は、Ｔ細胞活性化について上述された認識過程によって抗原を担持する標的（腫瘍）細胞へのＣＤ８+  ＣＴＬの結合で開始する、一連の生物学
的事象を必要とする。
【００６８】
上述されたところの、ＣＤ８+細胞と抗原提示細胞もしくは標的（腫瘍）細胞との間の
相互作用を図１に描く。該相互作用は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）への、ＡＰＣもしくは標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子と共同しての抗原の結合で開始する。リンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｔ細胞共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のような補助分子が、細胞−細胞接着を高めるか、もしくは付加的な細胞活性化シグナルを伝達する。
【００６９】
細胞−細胞相互作用の後に、ＣＴＬは可溶性細胞溶解メディエーター（Ｔ細胞の細胞質顆粒中に貯蔵されるパーフォリンおよびグランザイム）ならびにＣＴＬ表面分子（Ｆａｓリガンド）の作用により標的細胞を殺す。細胞溶解性の攻撃後に、標的細胞は、壊死（膜の穿孔およびオルガネラ破壊）もしくはアポトーシス（クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化および膜泡形成）により死ぬ。
【００７０】
リンパ球に媒介される細胞溶解の機構を図２にグラフィカルに示す。図２の図Ａにおいて、標的細胞に結合した後に、ＣＴＬ中の細胞質顆粒が、細胞間空隙中へのパーフォリンおよびグランザイムを含有する顆粒の放出のため、標的細胞に迅速に向け直される。これらのタンパク質分解酵素が標的細胞の原形質膜に孔を形成し、ついには細胞壊死に至る。図Ｂにおいて、標的細胞に結合した後に、ＣＴＬ上のＦａｓリガンド発現のレベルが増大
する。Ｆａｓリガンドと、標的細胞上のＦａｓ受容体の相互作用がアポトーシスにつながる。ＣＰＰ３２のようなプロテアーゼ、およびＩＬ−１ｂ変換酵素（ＩＣＥ）に関連する他者がアポトーシスの誘導に関係している。インビトロＣＤ８+活性化に、天然に存在す
る抗原提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、自己腫瘍細胞を使用することが可能である。しかしながら、このアプローチ後の活性化の効率は低い。これは、天然のＡＰＣのクラスＩ分子が、腫瘍エピトープ以外に多くの他の型のペプチドエピトープを含有するためである。ペプチドの大部分は正常の無害の細胞タンパク質由来であり、腫瘍に対して実際に有効であるとみられる活性の天然のＡＰＣの数の希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）をもたらす（Ａｌｌｉｓｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）７：６８２−６８６）。
【００７１】
この問題に対するより直接的かつ効率的な一アプローチは、（癌のような）特定の疾患と闘うことに関連したそれらのエピトープもしくは（黒色腫特異的抗原のような）腫瘍特異的抗原のみでＣＤ８+細胞を特異的に活性化することである。この目的のため、人工産
物の抗原提示細胞を、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）細胞中でＭＨＣ  クラスＩ分子を発現させることにより創製する。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は免疫系を有しないため、クラスＩ分子上にペプチドエピトープを添加することに関与するＴＡＰ−１，２ペプチド輸送タンパクが存在しない。結果として、クラスＩ分子は、空容器（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｓｓｅｌ）としてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞表面上に出現する。これらのトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を、限定されるものでないが黒色腫特異的エピトープを挙げることができる癌もしくは腫瘍特異的エピトープのようなクラスＩ分子に結合する外因性ペプチドとともにインキュベートすることにより、すべてのクラスＩ分子を同一のペプチドで占有することが可能である。これらのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＡＰＣ中に単一ペプチドを含有するクラスＩ分子の高密度発現は、抗原ペプチドに完全に特異的である細胞傷害性ＣＤ８+  Ｔ細胞のイ
ンビトロでの生成を可能にする。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を調製するための方法および手順は、「ヒトクラスＩ  ＭＨＣおよびβ２−ミクログロブリンを発現する昆虫細胞を使用する細胞傷害性Ｔ細胞のインビトロ活性化（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＭＨＣ  ａｎｄ  β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」と題された１９９６年６月２５日公布の米国特許第５，５２９，９２１号明細書、ならびに「ＭＨＣ  クラスＩ抗原およびβ２−ミクログロブリンをコードする遺伝子を発現しかつ空複合体を集成することが可能なショウジョウバエ細胞系、ならびに前記細胞系の作成方法（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｃｅｌｌ
Ｌｉｎｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ａｎｄ  β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｅｍｐｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｓａｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ）」と題された１９９４年５月２４日公布の米国特許第５，３１４，８１３号明細書に教示される。とりわけ、米国特許第５，５２９，９２１号明細書は、第２６段第５６行ないし第２８段第２２行で、前駆細胞の培養物の多様な分離および／もしくは濃縮方法を開示する。
【００７２】
加えて、この特徴は、高用量の多様なサイトカインでの免疫系のインビボ刺激に対する必要性を除外する。それによりサイトカインにより引き起こされる副作用をなしで済ませる治療をもたらす。あるいは、適する状況もしくは条件下で、適切な場合かつ被験体が利益を得ることができる場合、被験体を、低レベルの投薬量のα−インターフェロン、γ−インターフェロンおよび／もしくはＩＬ−２で同時に治療することができる。
【００７３】
サイトカインでのインビボ刺激に対する必要性を除外することは、患者の治療の質の向
上を提供する。患者へのサイトカインの投与を包含する治療レジメンは、しばしば、悪心、嘔吐および発熱のような流感様の症状を発症する患者をもたらす。これらの副反応は一般に生命を脅かさないが、とは言え既に弱らされた状態にある患者で起こるとりわけ重症の反応は、生命を危うくする状況をもたらす可能性がある。別の考慮は、それ以外は有益な治療レジメンの患者の受容性およびコンプライアンスに対してこうした副反応が有する有害な影響である。サイトカインでのインビボ刺激に対する必要性を除去することは、患者の快適さを向上させる治療レジメンをもたらし、また、彼もしくは彼女の患者が従うことがよりありそうである有効な治療方法を臨床家に提供する。
【００７４】
腫瘍の養子免疫療法のための本方法の有用性は、ＡＰＣとしてトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスの２Ｃ系統からのＣＤ８+細胞を使用してマウスで立証されている。
この系において、精製されたＣＤ８+  ２Ｃ細胞は、共刺激分子Ｂ７−１およびＩＣＡＭ
−１もまた担持するＭＨＣクラスＩ（Ｌd）のトランスフェクトされたショウジョウバエ
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるインビトロペプチドに高度に反応性である。プライミングされないＣＤ８＋  Ｔ細胞についての最小要件を規定するためのプローブとしてのトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（Ｃａｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１４７３６−１４７４１）。あるいは、分離されないマウス脾細胞を精製された２Ｃ細胞の代わりに応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として使用する場合は、共刺激分子に対する必要性は当てはまらない。この例において、脾集団中のＣＤ８+細胞は活性化されたＢ細胞から「傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ
）」共刺激を受領する。この知見を利用して、ＭＨＣクラスＩ（Ｌd）のトランスフェク
トされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞が、添加されたリンホカインの非存在下でインビトロで同系のＰ８１５肥満細胞腫の腫瘍特異的ペプチドに応答するように正常ＤＢＡ／２マウス脾細胞を誘導することが可能であることを示すことが可能であった。Ｐ８１５肥満細胞腫を担持するＤＢＡ／２マウスへのこれらのＣＴＬの注入は迅速な腫瘍退縮に至った（Ｓｕｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４：５５５−５６４）。
【００７５】
手順的には、正常ＤＢＡ／２マウス脾細胞を、ＤＢＡ／２由来Ｐ８１５肥満細胞腫細胞系からの腫瘍特異的エピトープＰ１Ａ．３５−４３ペプチドで添加された、ＭＨＣクラスＩ（Ｌd）のトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞と
ともにインビトロで培養した。５日後に培養物から収集されたリンパ球は、インビトロでＰ８１５腫瘍細胞に対する強い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を表したが、しかし、図３、図Ａに示されるとおり、Ｐ１Ａ．３５−４３を発現しないＰ８１５の突然変異体細胞系Ｐ１０２４を溶解することに失敗した。これらのＣＴＬを、３日前にＰ８１５細胞を以前に接種されたＤＢＡ／２マウスに注入した場合、腫瘍は第一週の間に妨害を受けずに成長したが、しかし、その後、図３、図Ｂに示されるとおり、次の週の間に排除された。図３、図Ｂに示されるとおり、ＣＴＬをウイルス核タンパク質ペプチドのような無関係の抗原に対してインビトロで免疫化した場合、特異性は、Ｐ８１５の成長に対するいずれかの影響の非存在により立証された。要約すれば、主要組織適合抗原複合体クラスＩ（Ｌｄ）のトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、添加されたリンホカインの非存在下で、同系のＰ８１５肥満細胞腫の腫瘍特異的ペプチドにインビトロで応答するように正常ＤＢＡ／２マウス脾細胞を誘導した。Ｐ８１５肥満細胞腫を担持するＤＢＡ／２マウスへのこれらのＣＴＬの注入は迅速な腫瘍の退縮に至った（Ｗｏｌｆｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：４８９−４９５）。
【００７６】
インビトロのヒト研究
健康被験体からのヒトＣＴＬをチロシナーゼに対してインビトロで免疫化した。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞のみでの一次刺激後に、チロシナーゼを担持するＪＹ細胞の特異的溶解が、試験された全部のＣＴＬエフェクター対ＪＹ標的の比で明ら
かであった。健康被験体からのチロシナーゼ特異的ＣＴＬを、完全な刺激／再刺激プロトコルを使用して誘導し、そしてＭａｌｍｅ  ３Ｍ黒色腫細胞系を殺すそれらの能力について試験した。１もしくは２の可能な例外を伴い、Ｍａｌｍｅ  ３Ｍに対する特異的ＣＴＬ活性が、全ドナーにおいて変動する程度まで誘導された。大部分については、対照のＭａｌｍｅ  ３腫瘍細胞に対する反応性は最小限であった。黒色腫患者からの細胞もまた、健康志願者由来のものに類似の活性および特異性のＣＴＬを生成させるために、チロシナーゼエピトープに対してインビトロで免疫化した。
【００７７】
インビトロで細胞傷害性Ｔリンパ球を生成させるためのいかなる天然のもしくは人工産物の抗原提示細胞（ＡＰＣ）系の使用も、これらの系が生成することが可能である抗原特異性により制限される。
【００７８】
以下のＡＰＣ系を利用して、単一エピトープに対する抗原特異的ＣＴＬを生成させた。すなわち、１）規定されたペプチドを適用された（ｐｕｌｓｅｄ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）；２）リンパ芽球から得られかつペプチドを適用された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）；３）天然のペプチドが酸ストリッピングされ（ａｃｉｄ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）かつ目的のペプチドが添加されたリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）；４）空のクラスＩ分子を発現するよう工作されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞；ならびにヒトクラスＩおよび共刺激分子でトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｂ．ＬａｔｏｕｃｈｅとＭ．Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０００）１８：４０５−４０９）。
【００７９】
樹状細胞（ＤＣ）は、一次抗原細胞の提示におけるそれらの広範な応用のために、ヒトにおける一次抗原提示細胞系とみなされる。自己もしくは外来タンパク質はＤＣ内でプロセシングされる。結果として生じるペプチドエピトープがＨＬＡ分子により提示され、そしてＤＣの表面に輸送される。しかしながら、ＤＣがインビトロで一貫して生成されることができず、ＣＴＬが４種の異なるペプチドに対し方向を定めたことが見出された。これは、４種のペプチドのそれぞれに対応する活性を有するＣＴＬを提供したとみられる。加えて、ペプチドの適用の時点でのＤＣの表現型（成熟もしくは未熟）は結果に影響しないこともまた見出された。
【００８０】
あるいは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の刺激は、通常、１０までの異なる型のペプチドに対し向けられるＣＴＬをもたらした。これは、１０種のペプチドのそれぞれに対し活性であるＣＴＬを提供する。
【００８１】
ＣＴＬ応答を導き出すショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞およびＤＣの能力を、最初に、単一ペプチドエピトープに対しそれぞれの標準的刺激プロトコルに従って評価した。ＤＣおよびトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を比較するために。未熟ＤＣを、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で自己単球を１週間培養することにより生成させた。成熟ＤＣは、回収の２４時間前の培地へのＴＮＦαの添加により、未熟ＤＣから得た。ＤＣ（未熟および成熟）を回収し、ペプチドを適用し、そしてＣＤ８細胞およびペプチドを適用されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の刺激に使用された手順に従って、精製されたＣＤ８細胞と混合した。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、図７に示されるとおり、チロシナーゼペプチドエピトープ６８９について評価される場合に、ＤＣよりも一般により良好な刺激物質であることが見出された。さらに、未熟もしくは成熟いずれの表現型を表すＤＣ（図８）も、規定されたペプチドを使用してＡＰＣに適用した場合に、特異的ＣＴＬ応答の導出においてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞ほど効率的でなかった。これは、免疫系中でＤＣにより演じられる支配的役割のため、とりわけ驚くべきことである。１ドナーでの比較試験を図９に示されるとおり実施した。特異的殺傷が、刺激物質としてハ
エ細胞を使用する場合に４種の異なるペプチドに対して生成された一方、未熟ＤＣは無意味の特異的殺傷をもたらし、また、成熟ＤＣは刺激に使用された４種のペプチドの１種のみに対する特異的殺傷をもたらした。
【００８２】
細胞傷害性リンパ球の調製
抗ＣＤ８抗体での陽性選択により白血球成分分取（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）サンプルから単離されたＣＤ８+細胞を、ヒトクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２．１）、Ｂ７．１
、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＢ７．２を発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示される４種の異なる黒色腫関連ペプチドに対して刺激する。ＣＤ８+細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下にペプチドエピトープを添加された自己
単球で２回再刺激する。ＣＴＬをＯＫＴ３およびＩＬ−２とともに非特異的に拡張する。ＣＴＬ活性をＭａｌｍｅ  ３Ｍ細胞に対して測定し、また、ＣＤ８+  Ｔ細胞の純度をフ
ローサイトメトリーにより評価する。
【００８３】
製造過程およびプロトコルは、優良実験室規範（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）および優良製造規範（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って行う。「優良実験室規範」および「優良製造規範」は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により設定されている実験室および製造の実務の基準であり、かつ、当業者に容易に知られる。ＣＴＬは、正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、生存率、ＣＴＬ活性、無菌性およびエンドトキシン含量についてモニターする。
【００８４】
乳房および卵巣癌を治療するための本発明の方法における使用に適するペプチドエピトープの一覧を以下の表１に示す。以下の表１に列挙されるものに加えて広範なペプチドエピトープもまた、乳房および卵巣癌を治療するための本発明の方法での使用に適することができるが、但しこうしたペプチドはＴ細胞エピトープであることが、当業者に容易に明らかである。
【００８５】
【表２】
2010222352.tif 000003
【００８６】
【表３】
2010222352.tif 000004
【００８７】
以下の実施例は本発明を具体的に説明する目的上提供されるが、しかし、本発明を該実施例の内容に制限しない。
【実施例】
【００８８】
実施例１
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）抗原提示細胞の製造
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）Ｓ２細胞系を、発表された手順に従ってキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）−Ｒ）卵から調製し、そしてアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託した（ＣＲＬ  １０９７４）。Ｓ２細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充された商業的シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地中で成長させる。
【００８９】
Ｓ２細胞中でＭＨＣクラスＩおよび共刺激タンパク質を発現させるためのｐＲｍＨａ−３プラスミドは、文献に記述されるとおり構築されたｐＲｍＨａ−１発現ベクター由来であった。それは、メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル化シグナルを担持するアルコール脱水素酵素遺伝子を含有する。
【００９０】
トランスフェクションのための相補ＤＮＡを以下のとおり調製した：
ＨＬＡ−Ａ２．１およびβ−２ミクログロブリン：発表された配列由来のプライマーを使用するＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ
Ｂ７．１：発表された配列由来のプライマーを使用するＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲＩＣＡＭ−１：発表された配列由来のプライマーを使用するＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ
Ｂ７．２：発表された配列由来のプライマーを使用するＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ
ＬＦＡ−３：発表された配列由来のプライマーを使用するＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ
【００９１】
相補ＤＮＡは個別にｐＲｍＨａ−３ベクターに挿入した。Ｓ２細胞を、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１プラスミドＤＮＡ、ならびにｐｈｓｈｎｅｏプラスミドの混合物でトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、ジェネチシンを含有するシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）培地中で培養することにより選択した。使用２４時間前に、トランスフェクトされた遺伝子の発現をＣｕＳＯ4の添加により誘導した。発現のレベルは、抗ＨＬＡ−Ａ２．１、抗Ｂ７．１および抗ＩＣＡＭ−１抗体を使用するフローサイトメトリーにより評価した。３０％以上の細胞によるＨＬＡ発現が、ＣＤ８+リンパ球の効率的なインビトロ活性化に必要である。
【００９２】
ヒトＣＤ８+細胞の単離
ＣＤ８+細胞は、ダイナビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ］TM単離手順（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））を使用する陽性選択により白血球成分分取サンプルから単離する。抗ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体（ヒトγグロブリン［ガンマガード（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）(R)］１ｍｌ中５０μｇ）を、１％ヒト血清アルブミン（バクスター−ハイランド（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ））および０．２％クエン酸ナトリウムを補充されたダルベッコのＰＢＳ中の洗浄された細胞に添加する。穏やかな混合を伴う４℃で４５分のインキュベーション後に、ヒツジ抗マウスＩｇＧで被覆されたダイナル（Ｄｙｎａｌ）磁性ビーズ（ダイナビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ］TM）を含有する同一緩衝液中で、１：１のビーズ対細胞の比で洗浄かつ再懸濁する。細胞およびビーズを滅菌管に入れ、そして４℃で４５分間穏やかに混合する。この時間の終了時に、抗体結合された細胞を、製造元の説明書（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））に従ってＭＰＣ−１(R)分離装置を使用して磁気的に除去する。ＣＤ８細胞−ビーズ複合体の解離を、ＣＤ８ペプチド59-70（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ；配列番号１２）の存在下３７℃で４５分間のインキュベーションにより達成する。遊離ビーズを磁気的に除去し、そしてＣＤ８細胞を計数しかつフローサイトメトリーにより分析して純度を評価する。ＣＤ８+細胞の回収は典型的に８０％より大きい。表１は、抗ＣＤ８抗体での陽性選択による正常ヒトＰＢＭＣ調製物からの１４の別個のＣＤ８+調製物の細胞組成を要約する。
【００９３】
【表４】
2010222352.tif 000005
【００９４】
精製されたヒトＣＤ８+細胞のインビトロ免疫感作
一次刺激
トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞を、１０％ウシ胎児血清およびＣｕＳＯ4を補充されたシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）培地（１０6個の細胞／ｍｌ）中、２７℃で２４時間インキュベートする。細胞を回収し、洗浄し、そして１００μｇ／ｍｌのヒトチロシナーゼ366-377を含有する昆虫Ｘ−プレス培地（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｘ−ｐｒｅｓｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（バイオウイタッカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））に再懸濁する。２７℃で３時間のインキュベーション後に、Ｓ２細胞を、１０％自己血清を補充されたＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中１：１０の比でＣＤ８+細胞と混合する。細胞混合物を３７℃で４日間インキュベートし、その間にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞が死に絶える。第５日に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を添加して、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ集団を選択的に拡張する。
【００９５】
再刺激
白血球成分分取の時点で得られた凍結自己ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを融解し、洗浄し、そして１０％自己血清（β２ミクログロブリンの供給源として）および２０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ369-377を含有するＲＰＭＩ培地中１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁する。γ線照射（５，０００ラド）後に細胞を３７℃で２時間インキュベートする。ダルベッコのＰＢＳで洗浄することにより非接着細胞を除去する。１０％自己血清および１０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ369-377を含有するＨｅｐｅｓ緩衝ＲＰＭＩ培地中での９０分間のインキュベーションにより、接着性単球にチロシナーゼエピトープを添加する。上清を除去し、そしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）活性化されたＣＤ８+細胞懸濁物（１０％自己血清を含むＲＰＭＩ培地中３×１０6個の細胞／ｍｌ）を、１の接着性単球に対し１０のＣＤ８+細胞の比で添加する。３７℃で３ないし４日の培養後に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を、培地交換を伴い添加して、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ集団を選択的に拡張する。
【００９６】
非特異的拡張
エフェクター細胞を、自己血清、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ(R)３）、ＩＬ−２およびγ線照射された自己ＰＢＭＣを補充されたＲＰＭＩ培地中でそれらを培養することにより、非特異的に拡張する。
【００９７】
活性および純度のアッセイ
ＣＴＬアッセイ
Ｍａｌｍｅ  ３Ｍ細胞を51Ｃｒ放出アッセイでの標的細胞として使用する。４％ウシ胎
児血清、１％ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．２５％ゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ培地中の５×１０6個のＭａｌｍｅ  ３Ｍ細胞を、０．１ｍＣｉの51Ｃｒで３７℃で１時間標識する。細胞を４回洗浄し、かつ、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））を含むＲＰＭＩ中１０5個の細胞／ｍｌに希釈する。９６穴マイクロタイタープレート中で、１００μｌのエフェクターＣＴＬおよび１００μｌのペプチド添加された51Ｃｒ標識Ｍａｌｍｅ  ３Ｍ標的細胞を、１００：１、２０：１および４：１（エフェクター：標的）の比で組合せる。Ｋ５６２細胞を２０：１（Ｋ５６２：Ｍａｌｍｅ  ３Ｍ）の比で添加して、ナチュラルキラー細胞のバックグラウンド溶解を低下させる。非特異的溶解は非腫瘍性ＨＬＡ−Ａ２．１線維芽細胞系Ｍａｌｍｅ  ３を使用して評価する。51Ｃｒの自発的放出および最大放出を測定するための対照を二重で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）包含する。３７℃で６時間のインキュベーション後に、プレートを遠心分離し、そして上清を計数して51Ｃｒ放出を測定する。
【００９８】
特異的溶解のパーセントは、以下の等式：
【００９９】
【数１】
2010222352.tif 000006
【０１００】
を使用して計算する。
フローサイトメトリー。
【０１０１】
インビトロ活性化の前および後のＣＤ８+細胞を、蛍光モノクローナル抗体およびＦＡ
ＣＳ分析を使用して、細胞表面マーカーの数について分析した。健康なドナーからの細胞を使用する典型的な活性プロトコルからの結果を表２に示す。
【０１０２】
【表５】
2010222352.tif 000007
【０１０３】
活性および純度に加えて、ＣＴＬ調製物を、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすることができる。
【０１０４】
【表６】
2010222352.tif 000008
【０１０５】
【表７】
2010222352.tif 000009
【０１０６】
実施例２
黒色腫に対する細胞傷害性Ｔ細胞注入の試験
試験の目的
本実施例は、以下の因子：
１．インビトロ免疫感作後の再注入された自己ＣＴＬの安全性および忍容性；
２．制限希釈分析での全身循環の要因考慮（ｆａｃｔｏｒｉｎｇ）における注入されたＣＴＬの動力学；
３．ラジオシントグラフィーによるＣＴＬの全身の配置；
４．免疫組織学による生検された結節の細胞組成（ＣＴＬ、ＴＨ、ＮＫ、Ｂ細胞）；なら
びに
５．２ヶ月にわたる測定可能な傷害の退縮および応答の持続期間
に従って評価されるところの黒色腫の治療における細胞傷害性Ｔ細胞注入の有効性を教示する。
【０１０７】
患者集団
治療への適格性は、患者が測定可能もしくは評価可能であった組織学的に報告された切除不可能な悪性黒色腫およびＨＬＡ−Ａ２表現型を有することを必要とした。治療前評価は、ＭＲＩもしくはＣＴスキャンによる脳の放射線学的評価、胸部および腹部のＣＴ走査、ならびに、とりわけ皮膚およびリンパ節の身体検査を包含した。治療された患者の総数は１５（９例の男性および６例の女性）であった。年齢は、５８歳の平均を伴う３３から７５歳までの範囲にわたった。転移性疾患の平均持続期間は１．５年であった。アネルギーの状態が存在したかどうかを決定するための治療前皮膚試験を１５例中１４例の患者で実施し、１４例中５例は評価された普遍的抗原の全７種について陰性と判定された。患者は、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）を用いるＦＡＣＳ分析によりＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプについてスクリーニングした。サブタイプ分類（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）はＰＣＲ分析により実施した。患者の１例を除く全部がＨＬＡ−Ａ*０２０１であり、例外（患者０８）はＨＬＡ−Ａ*０２０５であった。
【０１０８】
エクスビボで生成された自己ＣＴＬでの治療
１５例の患者を本臨床プロトコル下に治療した。全患者は、自己ＣＴＬの少なくとも単回注入を受領した。各患者に投与された周期の数および細胞の用量は表１に要約する。インビトロで生成された細胞の数は、アフェレーシス（ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ）処置から単離されたＰＢＭＣの数、および各ＰＢＭＣ調製物中に存在するＣＤ８+  Ｔ細胞の数のよ
うな患者関連の因子に依存した。インビトロで生成された細胞の全部をドナーに再注入したため、各患者に投与された用量は必然的に変動した。患者間の用量を正規化する試みにおいて、計算された「効力」得点を各用量について記録した。該値は、細胞の総数にペプチド添加された標的細胞で得られた溶解活性を掛けることにより得た。注入されたＴ細胞の用量は、４×１０7個の最小（患者０８）から３．２×１０9個の最大（患者１３）までの範囲にわたった。患者は各周期の終了時の彼らの臨床状態に基づいて第二、第三もしくは第四の治療周期に進入した。アフェレーシスサンプルから得られたＰＢＭＣの数は、とりわけその後の周期の開始が以前のものの終了に近かった場合に、付加的周期を受けている患者でより低い傾向があった。これは、前の周期の間に投与されたＩＦＮα−２ｂによる持続性のリンパ球減少に帰される。単離されたナイーブなＣＤ８+  Ｔ細胞の総数はＰ
ＢＭＣ調製物のそれぞれ中のその割合に依存した。ＣＤ８+  Ｔ細胞のパーセントは患者
間で８％ないし３１％の間で変動した。得られた拡張係数は最終的な細胞数にもまた寄与し、そして０．１から６．０倍の範囲にわたった。エクスビボでＣＴＬを生成させるための手順は本明細および上の実施例１に教示される。
【０１０９】
ＩＦＮα−２ｂに対する応答におけるクラスＩおよび黒色腫関連抗原のアップレギュレーション
インビボで黒色細胞腫を溶解する抗原特異的ＣＴＬの能力を高める試みにおいて、低用量のＩＦＮα−２ｂを、ＣＴＬ注入前連続５日間、および追加の４週間に週３回投与した。サイトカインに対するインビボ応答の一測定方法は、連続的時間点で得られる生検を特異的抗体での陽性染色についての免疫組織化学的分析により評価することである。連続的生検を、クラスＩおよび抗原発現の双方の評価のため、複数の皮膚傷害を伴う１例の患者（患者０４）で得た。生検は、クラスＩおよびＭＡＲＴ−１発現がいずれの治療前も弱く陽性であったことを示した（生検Ａ）。１０ＭＵ／ｍ2の皮下注入の５日後に、これら２種のマーカーの劇的な増大が示された（生検Ｂ）。チロシナーゼおよびｇｐ１００について、免疫組織化学的染色は治療前サンプルでそれぞれ陰性ないし弱く陽性であった（生検
Ａ）。最初の５日のＩＦＮα投与および１３回の追加治療後に、これらの後者の抗原の発現が、染色された組織サンプル中で増大した（生検Ｃ）。
【０１１０】
エクスビボで生成されたＣＴＬの抗原特異性
全患者からの生成されたＣＴＬを、生検材料が系統を樹立するために利用可能であった場合、ペプチド添加されたＴ２標的、ＨＬＡ−Ａ２黒色腫細胞系（Ｍａｌｍｅ３Ｍ）および自己黒色腫系統に対して、遊離日に評価した。細胞の各調製された用量をその細胞溶解活性について評価した。各ペプチド単独で、もしくは全４種のペプチドを同時にのいずれかを提示するペプチド添加されたＴ２細胞を使用して、各患者について生成されるＣＴＬ応答の特異性を決定した。内因性に発現された黒色腫関連抗原を担持する細胞を溶解する能力を、ＨＬＡ−Ａ２を合致された系統もしくは自己腫瘍系統で評価した。細胞溶解活性に加え、抗原特異性を、特異的ペプチド刺激に応答して作成される細胞内γインターフェロン産生の確立された検出方法で評価した。エクスビボプロトコルの終了時に生成されたＣＴＬをこの方法により評価した。ペプチドのそれぞれに特異的な細胞の割合を個別に記録した。患者１３からの各大量の（ｂｕｌｋ）ＣＤ８培養物中の特異的細胞の数を、Ｔ細胞のその集団中で検出されるペプチド特異性のそれぞれを加えることにより計算した。特異的細胞の総数の増加を、各連続する治療周期で検出することができた。
【０１１１】
ＣＴＬ治療後の腫瘍生検に浸潤するＣＤ８およびＣＤ４細胞の検出
治療の前、間および後の全患者からの生検サンプルが理想的であったと思われる。しかしながら、実験条件は制限された数の患者のみからの生検サンプルを見込んだ。腫瘍組織は試験に参入した１５例の患者の５例から得た。２例の患者（患者０８および１３）において、生検サンプルは、Ｔ細胞療法後それぞれ５および６週で入手可能であった。組織サンプルの検査は、浸潤するＣＤ８およびＣＤ４双方の細胞の存在を示した。腫瘍サンプルの１つは、追跡検査の時点（Ｔ細胞の第二の注入後４週間）までに大きさが増大した、頭皮の後頭部領域の皮膚傷害から採取した。該生検は、リンパ球でひどく浸潤された組織の壊死を示した。他の生検は股関節置換手術の間に取り出された大腿骨頭部からであった。患者０８からの皮膚傷害は一般的クラスＩおよび特異的ＨＬＡ−Ａ２マーカー双方について強く陽性（４＋）であった。チロシナーゼおよびｇｐ１００は弱く陽性（それぞれ１＋および２＋）であった一方、ＭＡＲＴ−１はこの同一のサンプルで陰性であった。患者１３からの生検の領域もまた、より不均質な染色；ＨＬＡ−Ａ２．１分子の発現を欠く腫瘍細胞の明確な集団、およびＭＡＡの１種もしくはそれ以上を伴い壊死性であった。しかしながら、無傷の組織領域は強いクラスＩ（４＋）および黒色腫関連抗原の全部を示した。この後者のサンプルにおけるリンパ球浸潤は、腫瘍結節に深く浸潤するよりはむしろそれらを取り巻くようであった。しかしながら、腫瘍に直接関連した最高の割合の細胞はＣＤ８細胞であった。これらの患者の双方からの治療前生検サンプルの欠如は、治療前の組織サンプル中の類似の型の浸潤する細胞の確認を予防した。
【０１１２】
Ｔ細胞療法後のＣＴスキャンは客観的応答を確認する
ＣＴスキャンは治療前スクリーニング基準および治療後追跡検査の一部であった。患者１０は治療前スキャン（９９年６月２３日）の５週間後に８×１０8個のＣＴＬの単回注入を受領した（９９年７月２７日）。注入１ヶ月後に胸部のＣＴスキャンを反復した場合（９９年８月２７日）に、肺傷害の大きさの劇的な減少が示された。同様に、患者１４は、６．６×１０8個の細胞での第一の注入（９９年１０月５日）の３．５週間前に参入過程の一部として胸部ＣＴスキャンを受けた（９９年９月１０日）。１１．５×１０8個の細胞での第二の注入１ヶ月後の追跡ＣＴスキャン（９９年１月７日）は３個の別個の傷害の劇的な縮化を示した。患者１３は前および後ＣＴスキャンで測定されたような客観的応答もまた有した。傍気管腺症は周期Ｉ後に７．８ｃｍ2（試験前）から４．４ｃｍ2となり、そして周期ＩＩ後に消失した。
【０１１３】
アネルギー状態の存在はＣＴＬを生成させるもしくは臨床応答を予防する能力を排除しなかった
本プロトコル下で治療された患者の大部分は以前の医学的介入を受領していた。治療前皮膚試験を実施して、一団の７種の普遍的抗原に対するアネルギー応答が、エクスビボでＣＴＬを生成させるかもしくは報告された臨床応答を予防するかのいずれかの不能と相関するかどうかを決定した。エクスビボでＣＴＬを生成させる能力は、患者の治療前皮膚試験の結果と相関しなかった。患者０３および０４（双方とも混合型応答体（ｍｉｘｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））は、第二の周期の開始前に反復皮膚試験を受け、そしてアネルギーのままであったことは注目されるべきであろう。
【０１１４】
実施例３
乳房および卵巣腫瘍細胞を溶解することが可能なＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬの生成
われわれは、全部の形態の癌にこのアプローチを用いて標的を定めることができるかどうかを決定するために、他の腫瘍型にわれわれのＣＴＬ生成技術を適用することに興味をもった。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、多くのヒトの癌、主として乳房、卵巣および結腸の腺癌において増幅かつ過剰発現されるＥＧＦＲに対する相同性をもつ癌原遺伝子である。それはしばしば攻撃的疾患と関連し、そして乏しい予後の指標である可能性がある。それはこれらの型の癌の可能な標的としていくつかの臨床試験で研究されている。
【０１１５】
１９９０年代早期に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドエピトープが、コンピュータ補助ペプチド結合アルゴリズム、もしくは卵巣癌患者の腹水から単離されたＣＴＬをマッピングすることのいずれかにより同定された（表３）。
【０１１６】
【表８】
2010222352.tif 000010
【０１１７】
ペプチドの全部を合成し、同定番号（ＰＲＩ＃）を与え、そして、黒色腫関連のＴ細胞ペプチドエピトープについてわれわれが使用した同一の方法を利用してエクスビボでＣＴＬを生成させる能力について評価した。ＣＤ８細胞を正常ドナーから単離して、既知のＣＴＬペプチドエピトープを添加されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を用いてエクスビボでＣＴＬを慣例に生成させる能力を決定した。ペプチド８２６、８３５、８６１および８６３はＣＴＬ生成の最高の頻度を有した（表４）。
【０１１８】
【表９】
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【０１１９】
トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は１０種までの異なるペプチドエピトープを提示する独特の能力を有する（図１０）一方、われわれは、これらのペプチドに対するＣＴＬをエクスビボで生成することの頻度により４種のＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチド、８２６、８３５、８６１および８６３を選択した。これら４種の異なるＨＥＲ−２ペプチドは、トランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の表面上に提示されたＨＬＡ−Ａ２．１分子への弱いないし中程度の結合体（ｂｉｎｄｅｒ）を表す。われわれは、黒色腫関連ペプチドでのわれわれの経験が、弱いクラスＩ結合体が実際にそれらが天然のＴ細胞エピトープを表す場合に腫瘍細胞を認識する強力なＣＴＬを一般に生成することを示唆しているため、弱いＡ２結合体を包含する傾向がある。われわれが標的を定める腫瘍関連タンパク質の大多数は自己抗原であり、そしてそれ自体、ウイルスペプチドとともにみられるクラスＩ分子に対する高親和性を有することを期待することができる。低ないし中程度の結合体は、一般に、腫瘍細胞を非常に効率的に溶解するＣＴＬを生成させる。これは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に対する低親和性結合体である（図３）がそれでもなおペプチド添加された標的細胞（Ｔ２）もしくはより重要には黒色腫細胞（Ｍａｌｍｅ３Ｍ）双方を溶解することが可能な強力なＣＴＬを慣例に生成させるエピトープを表す（図１２）ＭＡＲＴ−１ペプチドで立証された。
【０１２０】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕはＥＧＦ−Ｒファミリーの１メンバーでありかつ増殖因子受容体として機能する。ＨＥＲ−２タンパク質はヒトにおいて胎児の発生の間に発現される。成体では、該タンパク質は多くの正常組織の上皮細胞中で弱く検出可能である。正常細胞において、ＨＥＲ−２遺伝子は単一コピーとして存在する。該遺伝子の増幅および／もしくは関連タンパク質の過剰発現が、乳房、卵巣、子宮、胃を包含する多くのヒト癌、および肺の腺癌で同定されている。ＨＥＲ−２とＥＧＦ−Ｒ受容体との間の配列の差異を表５に示す。われわれが評価した４種のＨＥＲ−２ペプチドの３種は、２種のタンパク質の間の３個もしくはそれ以上のアミノ酸変化を有する。単一のアミノ酸変化は２種のタンパク質を区別するのに十分である。
【０１２１】
【表１０】
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【０１２２】
ＣＴＬが４週間のエクスビボ刺激プロトコル後に生成された後、われわれは、免疫化ペプチドを用いて調製されたＨＬＡ−Ａ２．１四量体分子を使用して、ペプチド特異的細胞が存在したかどうかを評価した。図１３に立証されるとおり、ペプチド特異的ＣＴＬを生成させる能力はドナー依存性であった。図Ａ（ドナー２６１）において、該ドナーはペプチド８３５に対する強いＣＴＬ応答を示した（３７．５５％）。図Ｂ（ドナー２６２）において、ペプチド特異的ＣＴＬを８３５および８６１双方の四量体分子で検出することができる（それぞれ３．６％および１５．１％）。これは、該刺激プロトコルの終了時にペプチド特異的ＣＴＬを保証するための複数のペプチドの使用を支持する。本エクスビボプロトコルは、多特異性ＣＴＬを比較的容易に生成させることを可能にする。
【０１２３】
抗ペプチドおよび抗腫瘍応答
完全なエクスビボプロトコルの完了後に、生成されたＣＴＬを抗原特異性について評価した。ＣＴＬを生成させるために、第０日にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に４種のＨＥＲ−２ペプチドの組合せを添加した。４週のエクスビボ刺激プロトコルの終了時に、大量のＣＤ８培養物を抗原特異性について評価した。免疫化ペプチドのそれぞれを添加されたＴ２細胞を標的細胞として使用した。図１４に典型的な応答を描く。大量の培養物は４種のＨＥＲ−２ペプチドのそれぞれに対する特異性を含有する。抗腫瘍応答を卵巣腫瘍細胞系（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−７７）で評価した。標的細胞系がＨＬＡ−Ａ２．１拘束性でない場合、われわれは+／−アッセイ系を有するように細胞系をトランスフェクトした。ＨＬＡ−Ａ２．１をＨＴＢ−７７系統にトランスフェクトした場合、ＣＤ８エフェクター細胞による高められた殺傷が示された（図１５、図ＡないしＤ）。個々のペプチドを代表するＨＥＲ−２特異的エフェクターを評価して、この腫瘍細胞系上でのペプチドエピトープのそれぞれの提示を確認した。
【０１２４】
ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた乳房腺癌細胞系（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−１３１）もまた、ＨＥＲ−２特異的ペプチドエフェクターでの腫瘍溶解を立証する能力について評価された。ペプチド８６１に特異的なＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた場合にこの腫瘍細胞系を溶解することができた（図１６）。
【０１２５】
腫瘍細胞の溶解に必要とされるＩＦＮγ処理
ＨＴＢ−７７／Ａ２．１細胞系は、ペプチド特異的溶解を立証するためにＩＦＮγでの前処理を必要とする。細胞を、51Ｃｒ放出アッセイの開始前２４時間、５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（２５ｎｇ／ｍｌの比活性）で処理した。図１７で、ＩＦＮγの添加は、ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた細胞系の高められた溶解をもたらした。ＨＬＡ−Ａ２．１およびＨＥＲ−２双方の表面発現に対するこの用量のＩＦＮγの影響を決定するために、ＦＡＣＳ分析を実施して、誘導の２４および４８時間後双方のこれらの分子のレベルを測定した。図１８、図ＡおよびＢはＦＡＣＳ分析の結果を描く。図Ａで、ＩＦＮγでの誘導後２４および４８時間に、ＨＴＢ−７７細胞の表面上でのＨＥＲ−２分子の促進は存在しなかった。ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされた細胞では、ＨＥＲ−２もＨＬＡ−Ａ２．１も、類似の処理プロトコル後に表面の発現レベルの増大を立証しなかった。示されたことは、ｍＲＮＡレベルをマイクロアレイＤＮＡチップ分析により評価した場合のＴＡＰ−１の発現、ならびにＨＬＡ−ＤＭおよび−ＤＲ、カテプシンＳおよびＤならびにカスパーゼ５のレベルの増大であった（図１９）。これは、ＩＦＮγの存在下でＨＴＢ−７７／Ａ２．１細胞の促進殺傷が存在する理由を説明するとみられる。この特定の分子のアップレギュレーションは、ＨＥＲ−２分子のより効率的なプロセシングをもたらして目的のペプチドのより良好な提示を可能にするとみられる。
【０１２６】
ペプチド
合成ペプチドはペプチド合成機（ギルソン  カンパニー  インク（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．））を使用して標準的なＦｍｏｃ化学により作成した。全部のペプチドはＣ−８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより＞９５％純度まで精製した。純度および正体は、電子スプレーイオン化を用いる質量分析計を使用して確立した。黒色腫関連ペプチドは：ペプチド８１９はＭＡＲＴ−１特異的であり（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ  配列番号６）、８１７および８５３は双方がｇｐ１００ペプチドであり（それぞれＩＴＤＱＶＰＦＳＶ  配列番号４およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ  配列番号５）、チロシナーゼ特異的ペプチドは６８９および７９２であり、７９２は、ペプチド６８９により表される天然の配列（ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ  配列番号１）の翻訳後修飾されたバージョン（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ  配列番号２）を表したを包含した。ペプチド８２６（ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ  配列番号７）および８３５（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ  配列番号８）は、ｐ１８５タンパク質のそれぞれ細胞内および細胞外ドメインからのＨＥＲ−２／ｎｅｕ配列を表した。Ｐｅｃ６０20（ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ  配列番号１０）Ｐｅｃ６０25（ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ  配列番号１１）は卵巣腫瘍系統で検出される粘液素タンパク質を表す重なり合う配列であった。Ｃ−レクチンもまた卵巣腫瘍細胞系で検出されるタンパク質であり、そしてその配列からのペプチド（Ｃ−レクチン8）はＫＭＡＳＲＳＭＲＬ  配列番号９により表される。
【０１２７】
インビトロ細胞傷害性アッセイ
標準的51Ｃｒ放出アッセイを実施して、Ｔ２細胞に添加された黒色腫関連ペプチドエピトープのＣＴＬエフェクター細胞認識を測定した。収穫物３×１０６個のＴ２細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ（培地）中で成長させた。０．１ｍＣｉの51Ｃｒを添加し、そして水浴中３７℃でインキュベートした。標識された細胞を１０ｍｌの４％洗浄液（ＲＰＭＩ＋４％ＦＢＳ）およびペレットに添加し、追加の２回洗浄し、そして自発的対洗剤に溶解された細胞の放射活性を記録するために０．２×１０６個／ｍＬの最終濃度に培地で再懸濁した。細胞に２０μｇ／ｍＬの適切なペプチド（１種もしくは複数）を３０分間適用した。５０μＬを、１０、２、０．４および０．０８×１０6個／ｍＬのＣＤ８エフェクタ
ー細胞をそれぞれ含有する各９６穴プレートに添加し、これを３７℃で６時間インキュベートし、回転しそして上清について収集した。
【０１２８】
フローサイトメトリーおよび四量体染色
細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3）中４℃で３０分
間のインキュベーション、次いで同一緩衝液での洗浄により、ＦＩＴＣもしくはＰＥ結合モノクローナル抗体で標識した。細胞を、データ獲得およびそれのセルクェスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェアを用いるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））での分析前に０．５％ホルムアルデヒド中で固定した。非特異的染色は、標識精製された一次抗体に対する使用された同一の二次抗体、もしくは一次抗体を直接標識した場合はアイソタイプを合致された対照を用いて測定した。四量体染色は、陰性対照として配列ＳＬＹＶＴＶＡＴＬ  配列番号４３をもつＨＬＡ−Ａ２．１特異的ＨＩＶｇａｇ四量体分子（ベックマン  コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて実施した。ＨＥＲ−２特異的四量体は、配列ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（８２６  配列番号７）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（８３５  配列番号８）もしくはＶＭＡＧＶＧＦＳＰＹＶ（８６１  配列番号１６）ペプチドを用いて作成した。ＰＥ標識四量体ＨＬＡ−Ａ２．１ペプチド複合体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ８ａ（ＢＤ  ファーマジン（ＢＤ  ＰｈａｒＭａｇｉｎ））モノクローナル抗体とともに使用して、エピトープ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、包装挿入物に記述されたとおり染色した。サンプルをベクトン  ディスケンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｓｃｋｅｎｓｏｎ）ＦＡＣＳｃａｎでの二色フローサイトメトリーにより分析し、そしてゲートされた（ｇａｔｅｄ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、四量体ＨＬＡ−Ａ２．１ペプチド複合体での染色について検査した。
【０１２９】
実施例４
本エクスビボ刺激プロトコルを用いる付加的な乳房および卵巣特異的ＣＴＬの生成
われわれは、多様な腫瘍起源の数種の腫瘍抗原の全部の既知のＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドエピトープに対するＣＴＬ応答を生成する能力を立証した。われわれの当初の研究は黒色腫に焦点を当て、ここで、われわれは、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼの黒色腫関連タンパク質に特異的な４種の異なるペプチドエピトープに特異的なＣＴＬで治療された患者における客観的臨床応答を立証することが可能であった［Ｒｉｃｈａｒｄｓら，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，カリフォルニア州サンフランシスコ（２００１年５月）］。
【０１３０】
広範な他の癌に存在する他の腫瘍抗原に対するＣＴＬを生じさせる能力を拡大するため、われわれは、数種の異なる腫瘍型に共通の腫瘍抗原に対する発表されたおよび新規の配列を選択した。これらは、ＡＥＳ、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＦＢＰ、Ｃ−レクチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｐｅｃ６０、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、テロメラーゼおよびＧ２５０を包含する。表７はこれらの抗原、発現の頻度およびそれらを発現する癌を記述する。われわれのエクスビボ刺激プロトコルを用いてのこれらのペプチドへの応答の頻度を表６に列挙する。
【０１３１】
【表１１】
2010222352.tif 000013
【０１３２】
【表１２】
2010222352.tif 000014
【０１３３】
以下に本発明の特徴と態様を列挙する。
【０１３４】
１．  ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＧＣは、癌と関連する約１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、前記ペプチド分子はそれぞれが長さ約６ないし１２アミノ酸であり）；
ｂ．前記癌を伴う被験体もしくは適するドナーからＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激すること；
ｄ．馴化成長培地（ＣＧＭ）もしくはＩＬ−２、ＩＬ−７よりなる群から選択されるサイトカインを含有する培地に前記ＣＤ８+細胞を添加すること（前記サイトカインは個別にもしくは組合せで使用することができ）；
ｅ．前記被験体もしくは適するドナーから収集された懸濁されない末梢血単球もしくはＣＤ−８枯渇末梢血単球を、約１ないし５０μｇ／ｍｌの、前記ｎｎＡＰＣが同時に提示することができる前記ペプチドの１種と混合すること；
ｆ．前記末梢血単球懸濁物を、所望の末梢血単球を除く懸濁物中の全部の成分を無効にするのに必要な十分な線量のγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記各ペプチドを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８+細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組み合わせること；および
ｊ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【０１３５】
２．  前記ｎｎＡＰＣが約１０までのペプチド分子を提示することが可能である、１．記載の方法。
【０１３６】
３．  前記ペプチド分子が長さ約８ないし１０アミノ酸である、１．記載の方法。
【０１３７】
４．  前記ペプチド分子が約１０ｎＭないし１００μＭの濃度範囲にある、１．記載の方法。
【０１３８】
５．  前記サイトカイン成分がＩＬ−２である、１．記載の方法。
【０１３９】
６．  前記サイトカイン成分が、組合せのＩＬ−２およびＩＬ−７である、１．記載の方法。
【０１４０】
７．  γ線放射の線量が約３，０００ないし７，０００ラドである、１．記載の方法。
【０１４１】
８．  γ線放射の線量が約５，０００ラドである、１．記載の方法。
【０１４２】
９．  ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは癌と関連する約１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり）；ｂ．前記癌を伴う被験体からＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で約６ないし７日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合すること；
ｆ．前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を、約５，０００ラドのγ線放射で照射すること；ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で、前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を約６ないし７日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてＣＤ８+懸濁物をアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【０１４３】
１０．  各ペプチドが長さ約８ないし１０アミノ酸である、９．記載の方法。
【０１４４】
１１．  ａ．天然に存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製すること（前記ｎｎＡＰＣは黒色腫と関連する約１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であり、各ペプチドは長さ８ないし１０アミノ酸であり）；
ｂ．前記黒色腫を伴う被験体からＣＤ８+細胞を収集すること；
ｃ．前記ＣＤ８+細胞を前記ｎｎＡＰＣ細胞系で約６ないし７日間刺激すること；
ｄ．前記ＣＤ８+細胞を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｅ．前記被験体から収集された末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの、前記ｎｎＡＰＣが提示することができる各ペプチドと混合すること；
ｆ．前記ＣＤ８枯渇末梢血単球懸濁物を約５，０００ラドのγ線放射で照射すること；
ｇ．接着性末梢血単球を単離すること；
ｈ．前記接着性末梢血単球に、約１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの前記エピトープを添加すること；
ｉ．前記ＣＤ８+細胞を、１の末梢血単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で前記接着性末梢血単球と組み合わせること；
ｊ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記組み合わせられた懸濁物を約６ないし７日間刺激すること；
ｋ．ＣＤ８+細胞および末梢血単球の前記懸濁物を培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激すること；
ｌ．ＣＤ８+懸濁物を、適するＣＴＬ活性、純度、無菌性およびエンドトキシン含量についてアッセイすること；ならびに
ｍ．前記被験体にＣＤ８+懸濁物を接種すること
を含んで成る、前記被験体の治療方法。
【０１４５】
１２．  前記ｎｎＡＰＣが１０のペプチドを提示する、１１．記載の方法。
【０１４６】
１３．  前記ペプチドが、チロシナーゼ369-377、チロシナーゼ207-216、ｇｐ１００209-217、ｇｐ１００154-162、ＭＡＲＴ−１27-35、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ789-797、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ369-377、Ｃ−レクチン8-16、Ｐｅｃ６０20-29およびＰｅｃ６０25-33である、１２．記載の方法。
【０１４７】
１４．  ヒトクラスＩ  ＨＬＡ分子、結合分子および共刺激分子を発現する核酸でトランスフェクトされたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞由来の天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）であって、前記核酸によりコードされる１５までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能であるｎｎＡＰＣ。
【０１４８】
１５．  前記ｎｎＡＰＣが、１０までの異なるペプチド分子を同時に提示することが可能である、１４．記載の天然に存在しない抗原提示細胞ｎｎＡＰＣ。
【０１４９】
１６．  前記ｎｎＡＰＣが、以下の１０種のペプチド分子、チロシナーゼ369-377、チロシナーゼ207-216、ｇｐ１００209-217、ｇｐ１００154-162、ＭＡＲＴ−１27-35、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ789-797、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ369-377、Ｃ−レクチン8-16、Ｐｅｃ６０20-29およびＰｅｃ６０25-33を同時に提示する、１５．記載の天然に存在しない抗原提示細胞
ｎｎＡＰＣ。
【０１５０】
１７．  段階、
ａ．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）卵から昆虫細胞系を調製すること；
ｂ．前記昆虫細胞を、昆虫細胞を成長させるのに適する培地、好ましくはシュナイダー［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］TMドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地中で成長させること；
ｃ．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターからｐＲｍＨａ−３プラスミドを作成すること（前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドは、メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル化シグナルを担持するアルコール脱水素酵素遺伝子を包含し）；
ｄ．前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドに、ヒトクラスＩ  ＨＬＡ  Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、β−２ミクログロブリンおよびＬＦＡ−３の相補ＤＮＡを挿入すること（Ａ２．１はいずれかのヒトクラスＩ  ＤＮＡ配列で置換することができ）；
ｅ．前記昆虫細胞を、ｐｈｓｈｎｅｏプラスミド、および相補ＤＮＡを含有する前記ｐＲｍＨａ−３プラスミドでトランスフェクトすること；
ｆ．前記昆虫細胞をＣｕＳＯ4と接触させて前記昆虫細胞中のトランスフェクトされた遺
伝子の発現を誘導することによりｎｎＡＰＣを創製すること
よりなる、１５までのペプチド分子を同時に提示することが可能な天然に存在しない抗原提示細胞（ｎｎＡＰＣ）の製造方法。
【０１５１】
１８．  前記ｎｎＡＰＣが１０までのペプチドを提示することが可能である、１７．記載の方法。
【０１５２】
１９．  前記昆虫細胞系が、細胞を１２日間成長させること、所望の細胞を同定することが可能であるペプチドをもつ前記所望の細胞を選択すること、ならびに前記所望の細胞をＯＫＴ３およびＩＬ−２で拡張することにより調製される、１７．記載の方法。
【０１５３】
２０．  前記所望の細胞を同定することが可能な前記ペプチドが四量体である、１９．記載の方法。
【０１５４】
２１．  段階（ａ）の前記ペプチド分子が、配列番号１から４２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される、１．記載の方法。
【０１５５】
２２．  段階（ａ）の前記ペプチド分子が、配列番号１から４２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される、９．記載の方法。
【０１５６】
２３．  段階（ａ）の前記ペプチド分子が、配列番号１から４２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される、１７．記載の方法。
【図１】
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【図２（Ａ−Ｂ）】
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【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図４（Ｃ）】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
2010222352.tif 000022
【図５（Ｃ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
2010222352.tif 000025
【図６（Ｃ）】
2010222352.tif 000026
【図７（Ａ−Ｂ）】
2010222352.tif 000027
【図８】
2010222352.tif 000028
【図９（Ａ）】
2010222352.tif 000029
【図９（Ｂ）】
2010222352.tif 000030
【図９（Ｃ）】
2010222352.tif 000031
【図１０】
2010222352.tif 000032
【図１１】
2010222352.tif 000033
【図１２】
2010222352.tif 000034
【図１３（Ａ）】
2010222352.tif 000035
【図１３（Ｂ）】
2010222352.tif 000036
【図１４】
2010222352.tif 000037
【図１５（Ａ−Ｂ）】
2010222352.tif 000038
【図１５（Ｃ−Ｄ）】
2010222352.tif 000039
【図１６】
2010222352.tif 000040
【図１７】
2010222352.tif 000041
【図１８（Ａ−Ｂ）】
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【図１９】
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【配列表】
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