(57)【要約】【課題】Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を効率よく生産することのできる細菌、及び該細菌を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊することにより、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がｓｄｈＡ遺伝子、ｓｄｈＢ遺伝子、ｓｄｈＣ遺伝子及びｓｄｈＤ遺伝子から選択される１又は２以上の遺伝子である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ｓｕｃＡ遺伝子、ｏｄｈＡ遺伝子及びｓｕｃＢ遺伝子から選択される１又は２以上の遺伝子である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌、またはコリネ型細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸がＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン酸を前駆体として生合成されるＬ−アミノ酸である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−グルタミンから選択される請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として、他のＬ−アミノ酸は動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
細菌を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型細菌（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００３】
例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。
【０００４】
近年は、目的物質の発酵生産に組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献８、特許文献９）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献１０）によって、細菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００５】
例えば、Ｌ−グルタミン酸生産では、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献１１参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献１２参照）。
【０００６】
また、微生物のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α-KGDH）を欠損させることにより、著量のＬ−グルタミン酸を生産することが知られている（特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５）。
【０００７】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（SDH）は、コハク酸からフマル酸への反応を触媒する酵素であり、コリネ型細菌では本酵素遺伝子を欠損することにより微量のＬ−グルタミン酸を生成することが報告されている（特許文献１６）。
一方、腸内細菌群に属するエシェリヒア・コリ（Esherichia coli）においてもコハク酸デヒドロゲナーゼ欠損株は知られているが（非特許文献２）、Ｌ−グルタミン酸生産との関連は知られていなかった。
【０００８】
また、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損したエシェリヒア・コリはコハク酸要求性となるが、SDHとの２重欠損とすることでコハク酸要求性が回復することが知られている（非特許文献２）。しかし、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとコハク酸デヒドロゲナーゼの二重欠損がＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸製造へ及ぼす効果は知られていない。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献８】米国特許第５，１６８，０５６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７７６，７３６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９０６，９２５号明細書
【特許文献１１】特公平７−１２１２２８号公報
【特許文献１２】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献１３】欧州特許出願公開771879号公報
【特許文献１４】欧州特許出願公開0952221号公報
【特許文献１５】欧州特許出願公開1078989号公報
【特許文献１６】欧州特許出願公開1106684号公報
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】J Gen Microbiol. 1978 Jul;107(1):1-13
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を効率よく生産することのできる細菌を提供すること、及び該細菌を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように細菌を改変することにより、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊することにより、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した、前記方法。
（３）コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がｓｄｈＡ遺伝子、ｓｄｈＢ遺伝子、ｓｄｈＣ遺伝子及びｓｄｈＤ遺伝子から選択される１又は２以上の遺伝子である前記方法。
（４）α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ｓｕｃＡ遺伝子、ｏｄｈＡ遺伝子、及びｓｕｃＢ遺伝子から選択される１又は２以上の遺伝子である、前記方法。
（５）前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌、またはコリネ型細菌である、前記方法。（６）前記アミノ酸がＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン酸を前駆体として生合成されるＬ−アミノ酸である前記方法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−グルタミンから選択される前記方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法を用いることにより、効率よく、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明に用いる微生物
本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法である。
【００１４】
本発明に用いる微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変することによって得ることができる。また、本発明に用いる微生物は、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を親株とし、Ｌ−アミノ酸生産能を付与又は増強することによって得ることができる。
【００１５】
本発明に用いる微生物は、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種によりＬ−アミノ酸生産能を付与されたものであってもよい。
【００１６】
ここで「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したときに、Ｌ−アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。好ましくは、同条件で培養された野生株又は非改変株よりも、多量のＬ−アミノ酸を生産する能力を有することをいう。
【００１７】
Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン（シスチン）、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ホモセリンが挙げられるが、Ｌ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン酸を前駆体とするＬ−アミノ酸が好ましく、特にＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンが好ましい。
【００１８】
本発明の製造法において使用される微生物としては、細菌、例えばエシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属等の腸内細菌科に属する微生物や、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌が挙げられるが、これらに制限されない。
【００１９】
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていた
が、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００２０】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００２１】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００２２】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC:住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）より分譲を
受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/）。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００２３】
本発明に用いる腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属などに属し、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）。腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
【００２４】
エシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００２５】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361、International Journal of Systematic Bacteriology,Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある。(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345, ）また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology,Jan 1993;43(1).p.162-173 参照）。
【００２６】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００２７】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２８】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２９】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００３０】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００３１】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強
以下、上記のような微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は上記のような微生物のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００３２】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３３】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。またＬ−アミノ酸生産菌は、遺伝子組換えによって、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。
【００３４】
以下、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物について例示する。
【００３５】
育種によってＬ−グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）
などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
【００３６】
これらの遺伝子の発現を増強するための方法としては、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００３７】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載された微生物が例示できる。
【００３８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、アセチルCoA ハイドロラーゼ（WO2006/057450）などが挙げられる。
【００３９】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させることは、後述のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるのと同様の方法によって、行うことができる。
【００４０】
さらにコリネ型細菌においてＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490])を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
【００４１】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させる方法として、Ｄ−キシルロースー５−リン酸フォスフォケトラーゼ（D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase ）及び/又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（fructose-6-phosphate phosphoketolase）をコードする遺伝子（これらを併せてホスホケトラーゼと呼ぶ）を導入する方法が挙げられる。
例えば、ホスホケトラーゼ活性が上昇した微生物としては、以下の微生物が挙げられる（WO2006/016705）。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869ΔsucA(pVK9-xfp)、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869ΔsucA(pVK9-PS2_xpkA)
【００４２】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を
増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。また、L-グルタミン酸生産能は、L-グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅することによっても付与することができる（WO2005/085419）。
【００４３】
また、本発明に用いるＬ−グルタミン酸生産微生物としては、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物を用いることができる。例えば、欧州公開公報1078989号記載の方法により、低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。
【００４４】
本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）及びAJ13601株（FERM BP-7207）（以上、欧州特許出願公開0952221号明細書参照）などが挙げられる。パントエア・アナナティスAJ13356は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16645として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6615が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている（後記実施例参照）。また、後述するAJ13355から誘導された菌株AJ13356、及びAJ13601も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。AJ13601は、１９９９年８月１８日に経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-17156として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM
BP-7207が付与されている。
【００４５】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
【００４６】
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERMBP-2632；特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【００４７】
Ｌ−グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）の破壊、PII制御タンパク質（glnB）の破壊によっても達成できる。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【００４８】
Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する別の方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法（特開昭56-151495）などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492；特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381；特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12212 (FERM P-8123；特開昭61-202694)
【００４９】
Ｌ−プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌やＬ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056), VKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315), および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体やBloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体を保持する菌株などが挙げられる。
【００５０】
また、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、及びアザチジン−２−カルボキシレートに耐性な株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702株のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682およびb2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したエシェリヒア・コリ等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。
コリネ型細菌のＬ−プロリン生産菌としては、ＤＬ−３，４−デヒドロプロリン耐性株（FERM BP-1219.米国特許4224409号公報）、クエン酸合成酵素活性がその親株の１．４倍以上に上昇した株（FERM P-5332、FERM P-5333、FERM P-5342、FERMP-5343  特許1426823号）、酢酸要求性が付与された株（FERM P-5931）が挙げられる。
【００５１】
Ｌ−ロイシン生産能を有する微生物としては、例えば、4-アザロイシンまたは5,5,5-トリフルオロロイシンに耐性を示すエシェリヒア・コリ H-9068株 (ATCC 21530)、H-9070株
（FERM BP-4704）および H-9072株（FERM BP-4706）(米国特許5,744,331), およびＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼを保持するエシェリヒア・コリ（欧州特許1067191)、β-2-チエニルアラニン及びβ-ヒドロキシロイシンに耐性を示すエシェリヒア・コリ AJ11478株（米国特許5,763,231）、エシェリヒア・コリ57株（VKPM B-7386, ロシア特許 No.2140450）などが挙げられる。
【００５２】
コリネ型細菌のＬ−ロイシン生産菌としては、２−チアゾールアラニンかつβ−ハイドロキシロイシン耐性株（特開平8-266295）、バリンアナログ耐性株（特開昭63-248392）、バリン要求性株（特公昭38-4395）、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）耐性株（特公昭51-37347）、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン要求性株（特公昭54-36233）が挙げられる。
【００５３】
Ｌ−システイン生産能を有する微生物としては、フィードバック阻害が解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードするcysE遺伝子アレルで形質転換されたエシェリヒア・コリJM15株（米国特許 6,218,168）、細胞毒性物質を排除するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェリヒア・コリW3110株（米国特許 5,972,663）、システインデスルフヒドラーゼ活性を低下させたエシェリヒア・コリ（特開平11−155571）、cysB遺伝子によってコードされるシステインレグロンの転写活性化因子を増幅したエシェリヒア・コリW3110株（WO01/27307）などが挙げられる。
【００５４】
Ｌ−イソロイシン生産能を有する微生物としては、例えば、6-ジメチルアミノプリン耐性を示すエシェリヒア属細菌の変異株（特開平5-304969）、Ｌ−イソロイシンヒドロキサメート、チアイソロイシン、ＤＬ−エチオニンまたはアルギニンヒドロキサメートに耐性を示す変異株（特開平5-130882）、スレオニンデアミナーゼ遺伝子及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が増幅された組換え株（特開平2-458、特開平2-42988、特開平8-47397）などが挙げられる。
【００５５】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを  強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α−ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−バリン生産能は、例えば、ilvGMEDA オペロンによってコードされるＬ−バリン合成酵素、特にilvG遺伝子によってコードされるアセトヒドロキシレートシンターゼの活性を増加させることによって付与することができる（特公平02-748418)。Ｌ−バリン合成酵素はＬ−バリンによるフィードバック阻害が解除されたものであってもよい。Ｌ−バリン生産能は、アセトラクテートシンターゼIII遺伝子(ilvIH 遺伝子)の発現を低下させることによっても付与することができる。
【００５７】
さらに、細菌にアミノ酸アナログ耐性を付与することによってＬ−バリン生産能を付与することもできる。そのような細菌の例としては、例えば、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニン要求性であり、Ｄ−リボース、プリンヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を示す変異株（FERM P-1841, FERM P-5556; 特開昭53−025034）やポリケチド耐性を示す変異株（FERM P-9325; 特許第01934507号）が挙げられる。
【００５８】
Ｌ−バリン生産菌の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1
988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００５９】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００６０】
コリネ型細菌のＬ−バリン生産菌としては、例えば、Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロン、すなわちilvBNをコードするアセトヒドロキシ酸シンタ−ゼやイソメロリダクターゼ(ilvC)(  国際公開パンフレットWO00-50624号  )が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン及び/又はＬ−イソロイシン及び/又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。
【００６１】
Ｌ−アラニン生産能を有する微生物としては、例えば、H+-ATPase活性が欠損したコリネ型細菌（Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40）やアスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ遺伝子が増幅されたコリネ型細菌（特開平07-163383）などが挙げられる。
【００６２】
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、ＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン）、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【００６３】
またＬ−アルギニン生産能を有する微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００６４】
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するもので
あれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-4409号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等が挙げられる。
【００６５】
また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）；メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等として育種することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
【００６６】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM P-7273）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００６７】
さらにアルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）を使用することが出来る。
【００６８】
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンもＬ−アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによってこれらの生産能を付与することができる。（国際公開2006-35831号パンフレット）
【００６９】
Ｌ−リジン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−リジン生産能を有するＬ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株、具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000−189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にAEC(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性を付与することによって育種されたも
のである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００７０】
コリネ型細菌のＬ−リジン生産菌としては、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）株など：特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公平7-112438号公報参照）；その生育にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照）；AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照）；ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株；オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報）；フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号明細書）などが挙げられる。
【００７１】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産能が付与された微生物を得ることが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、発現調節配列を改変することによって、達成できる。
【００７２】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。
【００７３】
さらに、Ｌ−リジン生産能を有する微生物は、Ｌ−リジン以外の化合物を生成する反応
を触媒する酵素の活性や、Ｌ−リジン生産に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイムがあり、該酵素の活性が低下または欠損した株は、国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００７４】
Ｌ−トリプトファン生産能を有する微生物として好ましいものは、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強された細菌である。アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を細菌に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェリヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミドpGH5（国際公開第94/08031号パンフレット参照）を導入することによって得られる形質転換株が挙げられる。
【００７５】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡを導入することによってもＬ−トリプトファン生産能を付与することができる。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが挙げられる（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００７６】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーをコードするtrpRを欠損させるか、またはtrpRにリプレッサーの活性が低下するような変異を導入することによってＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）。
【００７７】
また、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された細菌も好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、aceオペロンのプロモーターがリプレッサーであるiclRによって抑制を受けないこと、又は抑制が解除されていることが望ましく、このような細菌はiclR遺伝子を破壊することによって、達成することができる。
aceオペロンの発現が強化された細菌は、aceオペロンを含むＤＮＡを強力なプロモーターに連結し、これをプラスミドや相同組換えによって、細菌内に導入することや、トランスポゾンによって上記ＤＮＡを多コピー存在させることによって達成できる。
【００７８】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産能を有する微生物として、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕株、及びトリプトファンオペロンを含むプラスミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕株（いずれも米国特許第 4,371,614号明細書参照）が挙げられる。
【００７９】
Ｌ−トリプトファン生産能を有するコリネ型細菌としてはサルフアグアニジンに耐性株
であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ１２１１８（FERM BP-478  特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開S63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナ−ゼをコ−ドする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。
【００８０】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。
【００８１】
Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する微生物としては、tyrA,tyrRが欠損したエシェリヒア・コリAJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。また、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、yedA増幅株（国際公開第03/044192号パンフレット、米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1）が挙げられる。
【００８２】
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したコリネバクテリウム・グルタミカムBPS-13株 (FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062)及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号  JP 02303495）、チロシン要求性株（JP 05049489）等を使用することができる。
【００８３】
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコ−ドする遺伝子としては、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコ−ドされるアスパルトキナ−ゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナ−ゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンタ−ゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナ−ゼ活性が欠損したTDH６株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００８４】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエ−タ−構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、
培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエ−ション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る。（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００８５】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α−amino−β−hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００８６】
このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００８７】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナ−ゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノ−ルピルビン酸シンタ−ゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００８８】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００８９】
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することも出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-3996 のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００９０】
また、エシェリヒア・コリB-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も好適なＬ−スレオニン生産能が付与された細菌として例示することができる。B-5318株は、1987年11月19日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、ＰRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。
【００９１】
本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【００９２】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（fbp;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００９３】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochrome bo type oxidase）遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【００９４】
本発明に用いる微生物は、上記のようなＬ−アミノ酸生産能を有する微生物であって、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びαケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物である。
【００９５】
＜１−２＞コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の低下
本発明において、「酵素活性が低下する」とは、非改変株、例えば親株又は野生株に比べてコハク酸デヒドロゲナーゼ活性、及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低いことを意味し、酵素活性が完全に消失していることを含む。
【００９６】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（以下、「SDH」と記載することがある）は、EC:1.3.99.1の以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明において、SDH活性とは、この反応を触媒する活性を意味する。
【００９７】
コハク酸 ＋ FAD ⇔ フマル酸 ＋ FADH2
【００９８】
SDHは、微生物種によって、３つまたは４つのサブユニット構造から構成されており、これらのうち少なくとも１種のタンパク質を正常に機能しないように改変することによって達成できる。具体的には、SDHは以下のサブユニット（カッコ内はサブユニットをコー
ドする遺伝子名）から構成されており、種によってはmembrane anchor proteinをsdhC単独で、あるいはsdhCとsdhDでコードしているものがある。
【００９９】
SDHA：flavoprotein subunit (sdhA)
SDHB：Fe-S protein subunit (sdhB)
SDHC：membrane anchor protein (sdhC）
SDHD：membrane anchor protein (sdhD)
【０１００】
また、SDHサブユニット複合体は、SDHとフマル酸レダクターゼ両方の活性を有している場合がある。例えば、コリネ型細菌のSDHサブユニット複合体は、SDHとフマル酸レダクターゼの両方の活性を有している（WO2005/021770）。
【０１０１】
SDH活性の確認は、2,6-dichloroindophenol（DCIP）の還元を指標として測定することで行うことができる。具体的な方法はTatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch Microbiol (2005) 183: 317-324に記載されている。
本発明においては、SDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含むオペロンを総称して「SDHをコードする遺伝子」ということがある。
【０１０２】
腸内細菌のSDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスの遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号１〜６に示す。
【０１０３】
コリネ型細菌のSDHをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのsdhオペロン（Genebank accession No.NCgl0359（sdhC） NCgl0360(sdhA) NCgl0361(sdhB)）、及びブレビバクテリウム・フラバムのsdhオペロン（特開2005-095169号、EP1672077A1）の配列が開示されている。
【０１０４】
コリネ型細菌のSDHをコードする遺伝子として、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号７３〜７６に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ATCC13869の遺伝子の塩基配列及び各サブユニットを配列番号７７〜８０に示す。
【０１０５】
本発明において、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「α-KGDH」ということがある）活性とは、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル−CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、α-KGDH（E1o：α−ketoglutarate dehydrogenase, EC:1.2.4.2）、ジヒドロリポアミドＳ−サクシニルトランスフェラーゼ（E2o：dihydrolipoamide-S-succinyltransferase; EC:2.3.1.61）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をα-KGDH活性という。α-KGDH活性の確認は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。
【０１０６】
E1o: 2-oxoglutarate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine = [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] S-succinyldihydrolipoyllysine + CO2
E2o：CoA + enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine = succinyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH
+ H+
【０１０７】
なお、α-KGDHは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenase）、２-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）とも呼ばれる。
【０１０８】
腸内細菌科、例えばパントエア・アナナティスでは、この３種それぞれの酵素活性を有するサブユニットタンパク質が複合体を形成している。そして、各サブユニットは各々sucA、sucB及びlpdによってコードされ、sucA、sucB遺伝子は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（sdhB）の下流に存在している（米国特許第6,331,419号）。尚、同特許には、これらの遺伝子はエンテロバクター・アグロメランスAJ13355の遺伝子として記載されているが、同菌株は、後にパントエア・アナナティスに再分類されている。
【０１０９】
腸内細菌のα-KGDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスのsucA、sucB及び下流に存在するsucC遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号７〜１１に示す。また、エシェリヒア・コリのα-KGDHをコードするsucA、sucB及びsucC遺伝子は、それぞれGenbank NP_415254, NP_415255に開示されている。
【０１１０】
また、コリネ型細菌では、E1oサブユニットはodhA遺伝子（sucA遺伝子とも呼ばれるGenBank Accession No. NC_003450のNCgl1084として登録されている）によってコードされ、E3サブユニットはlpd遺伝子（GenBank Accession No. Y16642）によってコードされている。一方、E2oサブユニットは、E1oサブユニットとともに２機能性タンパク質としてodhA遺伝子にコードされているか（Usuda et al., Microbiology 1996 142, 3347-3354参照）、あるいはodhA遺伝子とは別のGenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126として登録されている遺伝子によってコードされていると推測されている。従って、本発明においては、odhA遺伝子は、E1oサブユニットをコードする遺伝子であるが、併せてE2oをコードしていてもよい。
【０１１１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのodhA遺伝子の塩基配列及びE1oサブユニットのアミノ酸配列（WO2006/028298）を、配列番号１２、１３に示す。また、上記GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126の塩基配列及び同配列によりコードされるE2oサブユニットのアミノ酸配列を、配列番号１４、１５に示す。また、上記GenBank Accession No.NC_003450のNCgl1084の塩基配列及び同配列によりコードされるE1oサブユニットの配列を配列番号８１、８２に示す。
本発明においては、α−KGDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含む遺伝子クラスターを総称して、「α−KGDHコードする遺伝子」ということがある。
各酵素活性を低下させることは、例えば、以下の方法により行うことができる。
【０１１２】
（１）遺伝子組換えにより、各酵素をコードする遺伝子を破壊する方法
遺伝子組換えにより、SDH又はα-KGDH（以下、単に「酵素」と記載することがある）をコードする遺伝子を改変することにより、親株、あるいは野生株に対して細胞あたりのこれらの遺伝子がコードする酵素タンパク質の分子の数を減少又はさせるか、又は酵素タンパク質分子を全く生成させなくすることができる。また、酵素タンパク質の分子当たりの酵素活性を低下又は喪失させてもよい。酵素タンパク質分子の数は、同酵素をコードする遺伝子の発現量を低下させることにより減少させることができる。遺伝子の発現量の低下には、同遺伝子から転写されるmRNAの転写量の低下、及び同mRNAの翻訳量の低下が含まれる。また、酵素タンパク質分子を全く生成させなくすること、あるいは酵素タンパク質の分子当たりの活性を低下又は喪失させることは、同酵素をコードする遺伝子を破壊することによって達成される。比較対象となる野生株としては、パントエア・アナナティスAJ13355株、クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株、コリネバクテリウム・グルタミカム
ATCC13032、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067等が挙げられる。
【０１１３】
改変するSDHをコードする遺伝子としては、SDHの各サブユニットのいずれをコードする遺伝子の１つ又はそれ以上であってもよく、また、オペロン全体であってもよいが、それぞれのサブユニット（SDHA、SDHB、SDHC、SDHD）をコードする遺伝子に変異を導入してもよい。
【０１１４】
また、改変するα-KGDHをコードする遺伝子としては、α-KGDHの各サブユニットのいずれをコードする遺伝子の１つ又はそれ以上であってもよく、また、遺伝子クラスター全体であってもよいが、E1oサブユニットをコードする遺伝子（sucA又はodhA）、あるいはE2oサブユニットをコードする遺伝子（sucB）が好ましい。
【０１１５】
微生物が属する種又は菌株によって、SDH又はα-KGDHの各サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、それらをコードする遺伝子は配列番号１、７、１２、１４、７３、７７、又は８１の塩基配列のバリアントであってもよい。各遺伝子のバリアントは、配列番号１、７、１２、１４、７３、７７、又は８１の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、各遺伝子のバリアントは、各遺伝子ホモログ、例えば腸内細菌科やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１、７、１２、１４、７３、又は８１の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
【０１１６】
SDHのサブユニットとしては、配列番号２〜４、６、７４〜７６、７８〜８０のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質が、α-KGDHのサブユニットとしては、配列番号８〜１１、１３、１５、及び８１のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、細菌の種や菌株によって使用コドンが異なり、各遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、コードされるタンパク質の機能が変わらない限り、これらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列をコードしている場合がある。ここで、数個とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、各タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【０１１７】
各遺伝子のバリアントは、配列番号１、７、１２、１４、７３、７７、又は８１の塩基配列中の各々のコード領域の塩基配列を有する遺伝子だけでなく、これらの塩基配列又はコード領域の塩基配列に相補的な配列、または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェン
トな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。
【０１１８】
遺伝子の改変は、具体的には、染色体上の遺伝子コード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【０１１９】
また、腸内細菌では、sdhオペロンの上流にsucA、sucB遺伝子が存在し、sdhオペロンの発現量が低下するような変異を導入することにより、sucA、sucB遺伝子の発現量が低下することも考えられ、このような変異も本発明に含まれる。
【０１２０】
本発明において、「遺伝子組換えにより改変された」とは、相同組換えを利用して、染色体上の遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することによって、細胞内の酵素活性を低下させることをいう。本発明においては、遺伝子の不活化は自然突然変異により元に戻らない程度に、遺伝子が改変されていることが好ましい。
しかしながら、本発明においては、SDH活性及びα-KGDH活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
【０１２１】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、産生する酵素タンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【０１２２】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に酵素をコードする遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、酵素タンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−グルタミン酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【０１２３】
染色体上の遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【０１２４】
尚、Redドリブンインテグレーションには、参考例１に示すように、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株、例えばパントエア・アナナティスSC17(0)株を好適に用いることができる。SC17(0)株は、2005年9月21日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【０１２５】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【０１２６】
遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
【０１２７】
（２）栄養要求性を利用したα-KGDH活性低下株の取得
α-KGDH活性が低下した株は、上述の（１）の方法によっても取得できるし、栄養要求性を利用し、以下のような方法でも取得できる。
【０１２８】
例えば、微生物菌体にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる通常の変異処理（例えば、２５０μｇ／ｍｌ、３０℃、２０分）を施した後、固体培地上で培養し、コロニーを形成させる。これよりレプリカ法により、Ｌ−グルタミン酸を単一炭素源及び単一窒素源とする培地で生育できない変異株を分離することによって、α-KGDH活性が低下した株を単離できる。
【０１２９】
α-KGDH活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；米国特許第5,492
,818号参照)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12822（FERM BP−4173；米国特許第5,492,818号参照）
コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12823（FERM BP−4174；米国特許第5,492,818号参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
コリネバクテリウム・グルタミカム OAGN、OA2-2、OAGN2-2（WO2006/028298）
パントエア・アナナティス AJ13601（FERM BP-7207）
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス AJ13355（FERM BP-6614）
【０１３０】
（３）コハク酸要求性を指標としたSDH活性低下株の取得
α-KGDH活性低下株は、succynil-CoAの供給低下により、生育にコハク酸を必要とする。一方、α-KGDHとSDHの２重欠損株ではコハク酸要求性が回復することが知られている（J Gen Microbiol. 1978 Jul;107(1):1-13）。したがって、α-KGDH活性が低下した株から、コハク酸要求性が回復した株を選択することによって、α-KGDH及びSDH活性が低下した株を取得することができる。具体的には、コハク酸を含まない最少培地にα-KGDH活性が低下した株をプレーティングし、コロニーを形成させる。コハク酸を含まない最少培地で生育出来るα-KGDH活性が低下した株では、高頻度でSDHをコードする遺伝子に変異を有している。
【０１３１】
＜３＞本発明のＬ−アミノ酸の製造方法
上記のような微生物を培地中で培養し、該培地中又は菌体内にＬ−アミノ酸を生成、蓄積せしめ、Ｌ−アミノ酸を該培地又は菌体から採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することが出来る。
【０１３２】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【０１３３】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【０１３４】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中又は菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積される。
【０１３５】
また、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である場合、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させ
ながら生成、蓄積させるように培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。尚、酸性条件下での生育の向上、及び、効率的なＬ−グルタミン酸の析出を両立するためには、ｐＨは好ましくは５．０〜４．０、より好ましくは４．５〜４．０、さらに好ましくは４．３〜４．０であることが望ましい。尚、上記ｐＨでの培養は、培養の全期間であってもよく、一部であってもよい。
【０１３６】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。培地中にＬ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析させた後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０１３７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１３８】
〔参考例１〕λ Red遺伝子産物に耐性なパントエア・アナナティス菌株の構築
パントエア・アナナティスにおいてsdhA遺伝子破壊を行うために、「Red-driven integration」あるいは「Red-mediated integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.  97. 6640-6645 (2000)）を高効率で行うための受容菌を構築した。
【０１３９】
まず、λのgam、bet及びexoの各遺伝子（以下、「λ Red遺伝子」）を発現する新規なヘルパープラスミドRSF-Red-TERを構築した（図１）。詳細は、参考例２に記載する。
【０１４０】
このプラスミドは、異なる遺伝子背景を持つ広い範囲の宿主に使用できる。その理由は、１）これは、多くのグラム陰性菌及びグラム陽性菌、並びに植物においてさえも安定に維持され得るRSF1010広宿主域プラスミドのレプリコンを有しており（Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987）、２）λ Red遺伝子、gam、bet及びexo遺伝子は、多くの細菌のRNAポリメラーゼによって認識される、PlacUV5プロモーターの調節化にあり（例えば、Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio,
M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)）、３）自己調節因子PlacUV5-lacI、及びエシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ非依存性転写ターミネーター（TrrnB）は、λ Red遺伝子の基底発現レベルを低くする（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）からである。さらに、RSF-Red-TERプラスミドは、レバンスクラーゼ（levansucrase）遺伝子（sacB）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを回収することができる。
【０１４１】
エシェリヒア・コリでは、RSF-Red-TERプラスミドにより提供される短いフランキング領域と共に、PCRで生成したDNA断片がインテグレートする頻度は、pKD46ヘルパープラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を用いた場合と同程度に高い。しかし、λ Red遺伝子の発現は、パントエア・アナナティスにとって毒性を示す。RSF-Red-TERヘルパープラスミドで形質転換された細胞は、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド、1mM)及び適当な抗生物質（クロラムフェニコール25μg/ml又はカナマイシン40μg/ml）を含むLB培地で非常に低い生育速度を示し、λ Red介在組換え（λ Red-mediated recombination）の効率は、観察されたとしても極端に低い（10-8）。
【０１４２】
λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべての発現に耐性なパントエア・アナナティスの変異株
を選択した。そのために、パントエア・アナナティスSC17株（米国特許第6,596,517号）を、RSF-Red-TERプラスミドでエレクトロポレーションにより導入した。１８時間培養後、約106個の形質転換株が得られ、１０クローンまではコロニーが大きいサイズであり、残りはすべて非常に小さかった。１８時間培養後、大きいコロニーは約2mmであり、小さいコロニーは約0.2mmであった。培養を24時間まで延長しても、小さいコロニーはそれ以上生育しなかったが、大きいコロニーは生育を続けた。λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべて（gam、bet及びexo）の発現に耐性な、大きいコロニーのパントエア・アナナティス変異株の一つを、更なる解析に用いた。
【０１４３】
RSF-Red-TERプラスミドDNAを、大きいコロニーのクローン１つ、及びいくつかの小さいコロニーのクローンから単離し、エシェリヒア・コリMG1655を再形質転換して、Red遺伝子の活性な産物を合成するプラスミドの能力を調べた。得られた形質転換体におけるRed依存的インテグレーションのコントロール実験により、大きいコロニーのクローンから単離されたプラスミドのみが、Red依存的インテグレーションに必要なλ Red遺伝子の発現をもたらすことが示された。選択された大きいコロニーのクローンにおいて、Red媒介インテグレーションが起るかを調べるために、KmRマーカー及びhisD遺伝子に相同な40bpのフランキング領域を含み、パントエア・アナナティスのhisD遺伝子のSmaI認識部位にインテグレートするようにデザインされた、PCRで生成した直鎖状のDNA断片を用いて、エレクトロポレーションを行った。２個の小さいコロニーのクローンをコントロールとして用いた。パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。PCRには、配列番号１７及び１８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、pMW118-(λatt-Kmr-λatt）プラスミドを鋳型として使用した。λ Red遺伝子に耐性ではない２個の小さなコロニーのクローンをコントロールとして使用した。pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築は、参考例３で詳述する。
【０１４４】
RSF-Red-TERプラスミドは、同プラスミド上にあるlacI遺伝子によって、Red遺伝子の発現を誘導することができる。２つの誘導条件について調べた。第１のグループでは、IPTG(1mM)をエレクトロポレーションの１時間前に添加し、第２のグループでは、IPTGはエレクトロポレーション可能な細胞の調製のための培養開始時に添加した。大きいコロニーのクローンからのRSF-Red-TERを保持する細胞の後代の生育速度は、SC17プラスミドを持たない菌株よりも有意に低くはなかった。IPTGの添加により、これらの培養物の生育速度はわずかに低下しただけであった。一方、小さいコロニーのクローンの後代は、IPTG非添加で非常にゆっくり生育し、誘導すると生育は事実上停止した。大きいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクトロポレーションした後、たくさんのKmRクローン（短い誘導時間で１８クローン、誘導時間を延長すると約１００クローン）が生育した。調べた100クローンの全ては、His-表現型を有し、20クローンについてPCRで確認したところ、これらの細胞の染色体の構造が期待どおりであることが確認された。一方、小さいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクトロポレーションしても、インテグレーションされた株は得られなかった。
【０１４５】
得られた大きいコロニーのクローンを、7%スクロースを含むプレートで生育させてプラスミドを脱落させ、RSF-Red-TERで再形質転換した。プラスミドを持たない株をSC17(0)と命名した。同株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【０１４６】
上記再形質転換の後に生育した全てのクローンは、親株クローンSC17(0)と同様に大きなコロニーサイズを有していた。RSF-Red-TERプラスミドで再形質転換したSC17(0)株におけるRed媒介インテグレーションの実験を行った。得られた３つの独立した形質転換株に
ついて、前の実験に用いたのと同じDNA断片を用いて調べた。短い誘導時間（エレクトロポレーション１時間前）を採用した。各々の実験で、１０個を超えるKmRクローンが生育した。試験した全てのクローンは、His-表現型を有していた。こうして、λ Red遺伝子の発現に耐性なSC17(0)と名付けた変異株が選択された。この菌株は、パントエア・アナナティス染色体へのRed依存的インテグレーションのための好適な受容菌として使用できる。
【０１４７】
〔参考例２〕ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図２に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova,
A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代りにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。
【０１４８】
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たRSF-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMWPlaclacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstI、及びSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号２３及び２４のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号２５及び２６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。
【０１４９】
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号２７及び２４のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号２４及び２８のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSFsacBPlacMCSベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。
【０１５０】
〔参考例３〕pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築
pMW118-(lattL-Kmr-lattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175)プラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の４つの断片を連結することによって得た。
【０１５１】
１）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattLに相当する領域から、プライマーP1（配列番号２９）及びP2（配列番号３０）を用いたPCR増幅により得たattL（配列番号３１）を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。
【０１５２】
２）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattRに相当する領域から、プライマーP3（配列番号３２）及びP2（配列番号３３）を用いたPCR増幅により得たattR（配列番号３４）を持つPstI-HindIII断片(182bp)。これらのプライマーは、PstI及びHindIIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
【０１５３】
３）pMW118-ter_rrnBのBglII-HindIII大断片(3916 bp)。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、次の３つのDNA断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性（ApR）の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6（配列番号３５及び３６）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8（配列番号３７及び３８）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。
【０１５４】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及びter_thrL転写ターミネーターを持つpML-Tc-ter_thrLのEcoRI-PstI小断片(1388bp)（配列番号３９)。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは、次の２工程で得た。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no.
5, 3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10（配列番号４０及び４１）を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理した。
【０１５５】
〔実施例１〕パントエア・アナナティスにおけるsdhA遺伝子及びsucA遺伝子の破壊効果
（１）グルタミン酸生産プラスミドRSFPPGの構築
Ｌ−グルタミン酸生合成系遺伝子、prpC遺伝子（国際公開2006/051660号パンフレット）、ppc遺伝子、gdh（欧州出願公開0999282号明細書）遺伝子を増幅したプラスミドRSFPPGを構築した。
【０１５６】
RSFCPG（欧州出願公開1233068号明細書）のgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマー１（配列番号４２）とプライマー２（配列番号４３）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマー３（配列番号４４）とプライマー４（配列番号４５）を用い、E.coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglII、KpnIで処理し、ライゲーション後、E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でクエン酸シンターゼ（CS）欠損株であるE. coli ME8330株を形質転換し、50mg/Lウラシル、5mg/Lチアミン-HClを含有するM9最少培地（グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽出し、これをRSFPPGとした。パントエア・アナナティスSC17sucA株にＬ−グルタミン酸生産プラスミドRSFPPGを導入し、Ｌ−グルタミン酸生産菌SC17sucA/RSFPPG（本菌株を「NA1株」と呼ぶ）を構築した。
【０１５７】
上記SC17sucA株は、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として自然界より単離されたAJ13355株から、粘液質低生産変異株（SC17）を取得し、同株のsucA遺伝子を破壊することによって得られた株である（米国特許第6,596,517号）。SC17sucA株は、プライベートナンバーAJ417が付与され、平成１６年２月２６日に経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。前述のAJ13601は、このSC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhAの各遺伝子、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を導入し、さらに、低pHにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である（米国特許第6,596,517号）。
【０１５８】
（２）sdhA遺伝子破壊株の構築
pMW-attL-Kmr-attRを鋳型として、配列番号４６、４７のプライマーを用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子の両端にそれぞれλphageのattL及びattRの配列、更にその外側にそれぞれsdhA遺伝子の上流50bp、下流50bpずつの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。
【０１５９】
次にSC17(0)をRSF-Red-TERで形質転換し、SC17(0)/RSF-Red-TER株を得た。同株を25mg/Lクロラムフェニコールを含有するL培地（バクトトリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl 5gを純水1Lに含む培地、pH7.0）で終夜培養を行い、この終夜培養液を25mg/L
クロラムフェニコールと1mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイドを含有するL培地100mLに1/100量接種し、3時間34℃で培養を行った。こうして作製した菌体を集菌し、氷冷した10%グリセロールで３回洗菌した後、最終的に0.5mLの10%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとし、上項で調製したPCR断片100ngを、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度18kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたSOC培地（バクトトリプトン20g/L、イーストエキストラクト5g/L、NaCl 0.5g/L、グルコース10g/L）を添加し34℃で2時間振盪培養を行い、L培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（1L当り、グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g）と40mg/Lのカナマイシンを加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりsdhA遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と置換していることを確認した。
【０１６０】
このsdhA遺伝子欠損株より、Edge Biosystems社製 Bacterial Genomic DNA Purification Kitを用いて染色体を抽出した。一方、NAI株を、L培地に前記最少培地成分と12.5mg/Lのテトラサイクリンを添加した寒天培地にて終夜培養した。菌体をエーゼで掻き取り、氷冷しておいた10%グリセロールで3回洗菌し、菌体に10%グリセロールを最終500μLとなるように加えて懸濁したものをコンピテントセルとした。このコンピセントセルに、前述の染色体DNA 600ngを、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて電場強度17.5kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたSOC培地を添加し、34℃で2時間振盪培養を行った後に、L培地に前記最少培地成分と12.5mg/Lのテトラサイクリン、40mg/Lのカナマイシンを添加した寒天培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりsdhA遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と置換していることを確認した。
NA1株は、α-KGDHのE1サブユニットをコードするsucA遺伝子を欠損している。一方、SC17(0)/RSF-Red-TER株のsucA遺伝子には変異は入っていない。sdhA遺伝子とsucA遺伝子は非常に近傍にあり、sdhA遺伝子欠損株の染色体DNAによる形質転換の際に、sdhAの変異とともにある程度の割合で野生型のsucA遺伝子も同時に移行する。従って、取得されたNA1のsdhA欠損株の中には、sucA遺伝子が欠損しているものと、野生型に復帰しているものの２種類が含まれる。そこで、NA1のsucA遺伝子の変異箇所に相当する領域をPCRにより増幅し、制限酵素BglIIにて切断できるかどうかを指標として、sucAが欠損しているか、あるいはsucA遺伝子が野生型に復帰しているかを確認し、sdhA単独欠損株とsucAsdhAの二重欠損株を得た。
【０１６１】
（３）sdhA欠損株、sucAsdhA二重欠損株のＬ−グルタミン酸生産能の評価
次に、上項で取得したsdhA欠損株とsucAsdhA二重欠損株のＬ−グルタミン酸生産能の評価を行うために、これらの菌株を下記に示す組成の培地5mLを注入した試験管に植菌し、18時間培養を行った。sucA単独欠損株であるNA1株は同培地でほとんど生育せず、Ｌ−グルタミン酸蓄積も3.3g/L程度に留まったのに対し、sdhA単独欠損株では13.2g/LのＬ−グルタミン酸蓄積が得られ、sucA単独欠損株を大きく上回る結果となった。一方、sucAsdhA二重欠損株では14.7g/LのＬ−グルタミン酸蓄積が得られ、sucA、sdhAをそれぞれ単独に欠損した場合よりさらに高いＬ−グルタミン酸生産能を有し、生育も大幅に改善することが確認された。
【０１６２】
（Ｌ−グルタミン酸生産評価培地組成）
（A区）
シュークロース          30g/L
MgSO4・7H2O               0.5g/L
（B区）
(NH4)2SO4              20g/L
KH2PO4                  2g/L
FeSO4・7H2O              20mg/L
MnSO4・5H2O              20mg/L
Yeast Extract (Difco)    2g/L
パントテン酸カルシウム  18mg/L
（C区）
炭酸カルシウム   20g/L
A区、B区は115℃ 10分  オートクレーブ殺菌、C区は180℃ 3時間  乾熱滅菌
室温に冷却後３者を混合して使用。
【０１６３】
【表１】
2010041920.tif 000003
【０１６４】
〔実施例２〕コリネ型細菌におけるodhA遺伝子及びsdhA遺伝子の破壊効果
（１）odhA遺伝子破壊株の構築
Brevibacterium flavum ATCC14067株（現在はCorynebacterium glutamicumに分類されている）より、odhA遺伝子を欠損し、かつyggB遺伝子（配列番号５６）の837位のGがAに置換され、gdh遺伝子のプロモーターが改変された株を構築した。なお、本実施例ではB. flavum ATCC14067株を親株として用いたが、C. glutamicum ATCC13032株、B. lactofermentum ATCC13869株を親株として用いても、同様の性質を有する菌株を構築することができる。
【０１６５】
まずodhAを欠損させるためのプラスミドpBS3ΔsucA47を構築した。配列番号４８に示す合成DNAと配列番号４９に示す合成DNAをプライマーとして、B. flavum ATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号５０と配列番号５１の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号５２と配列番号５３の合成DNA（BamHI配列が付加されている）をプライマーとしてPCRを行い、odhA遺伝子のコード領域を欠失した断片を取得した。得られた変異型odhA断片はBamHIで処理してpBS3(国際公開2006/070944号パンフレット)のBamHI部位に挿入し、得られたプラスミドをpBS3ΔsucA47とした。
【０１６６】
電気パルス法にてB. flavum ATCC14067にpBS3ΔsucA47を導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地（グルコース 5g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.4g/l、FeSO4・7H2O 0.01g/l、MnSO4・4-5H2O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整：オートクレーブ120℃20分）上に塗布した。31.5℃にて２日間培養後、生育してきた株をpBS3ΔsucA47が染色体に挿入された株ATCC14067-ｐBS3ΔsucAとした。続いてATCC14067-ｐBS3ΔsucA株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地（スクロース 100g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.4g/l、FeSO4・7H2O 0.01g/l、MnSO4・4-5H2O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整：オートクレーブ120℃20分）上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株を選択し、さらにCM-Dex寒天培地上で純化した。これらの株より染色体ＤＮＡを調製し、配列番号５２と配列番号５３に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、約１．９Kbの増幅断片が確認された株を8L3株とした。
【０１６７】
8L3株の染色体DNAを鋳型として、配列番号５４と配列番号５５の合成DNA（SacI配列が付加されている）をプライマーとしてPCRを行い、得られた増幅断片の配列を決定したところ、配列番号５７の１１１位のアラニンがスレオニンに置換されていることが示された。すなわち8L3はodhA欠損の導入時に、偶発的にこの変異が導入された二重変異株であった。8L3と同じyggB変異を有する株として、ATCC14067yggB8 株が知られている(国際公開2006/070944号パンフレット)。ATCC14067yggB株にpBS3ΔsucA47を導入し、上記工程を経る
ことにより、8L3と同様のyggB変異を有するodhA欠損株を構築することができる。
【０１６８】
次にgdhのプロモーター領域に変異を導入するためのプラスミドpBS4gdh3を構築した。配列番号６０に示す合成DNAと配列番号６１に示す合成DNAをプライマーとして、B. lactofermentum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号６２と配列番号６３の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号６４と配列番号６５の合成DNA（SmaI配列が付加されている）をプライマーとしてPCRを行い、gdh遺伝子のプロモーター領域に変異が導入された断片を取得した。得られた変異型gdh断片はSmaIで処理してpBS4S(国際公開2006/070944号パンフレット)のSmaI部位に挿入し、得られたプラスミドをpBS4gdh3とした。
【０１６９】
電気パルス法にて8L3株にpBS4gdh3を導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地上に塗布した。31.5℃にて３日間培養後、生育してきた株をpBS4gdh3が染色体に挿入された株8L3-pBS4gdh3として単離した。続いて8L3-pBS4gdh3株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株を選択し、さらにCM-Dex寒天培地上で純化した。これらの株より染色体ＤＮＡを調製し、gdhのコード領域上流の配列を決定した。配列番号６６に示す配列を有する株を8L3G株とした。
（２）SDH欠損株の構築
【０１７０】
sdhAを欠損させるためのプラスミドpBS3Δsdh47を構築した。配列番号６７に示す合成DNAと配列番号６８に示す合成DNAをプライマーとして、B. flavum ATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号６９と配列番号７０の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号７１と配列番号７２の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、sdhA遺伝子のコード領域を欠失した断片を取得した。得られた変異型sdhA断片はBamHIで処理してpBS3(国際公開2006/070944号パンフレット)のBamHI部位に挿入し、得られたプラスミドをpBS3ΔsdhA47とした。
【０１７１】
電気パルス法にて8L3G株にpBS3ΔsdhA47を導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地上に塗布した。31.5℃にて２日間培養後、生育してきた株をpBS3ΔsdhA47が染色体に挿入された株8L3G-pBS3ΔsdhAとして単離した。続いて8L3G-pBS3ΔsdhA株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株を選択し、さらにCM-Dex寒天培地上で純化した。これらの株より染色体ＤＮＡを調整し、配列番号７１と配列番号７２に示す合成DNA（BamHI配列が付加されている）をプライマーとしてPCRを行い、約１Kbの増幅断片が確認された株を8L3GΔSDH株とした。
【０１７２】
（６）sdhA欠損株、sucAsdhA二重欠損株のＬ−グルタミン酸生産能の評価
次に、上項で取得した8L3G株と、そのSDH欠損株の8L3GΔSDH株のＬ−グルタミン酸生産能の評価を行うために、これらの菌株を各１枚のCM-Dexプレート培地にて一晩培養したのち、プレートから菌体を全量かきとって下記に示す組成の培地300mLを注入したJarに植菌し、31.5℃で培養した。培養中のpHは、アンモニアガスを用いて7.2にコントロールし、溶存酸素濃度が5%以上に保たれるように通気攪拌を制御した。表２に示すように、sucA単独欠損株である8L3G株より、sucAsdhA二重欠損株である8L3GΔSDHの方がグルタミン酸の生産速度が高く、培養12.5時間目でのＬ−グルタミン酸蓄積は、8L3GΔSDH株の16.5g/Lに対し、8L3GΔSDH株では19g/Lと、sucA単独欠損株である8L3G株を大きく上回る結果となった。これらの結果から、コリネ型細菌においてもsucAとsdhAを同時に欠損することがＬ−グルタミン酸生産において効果的であることが示された。
【０１７３】
（Ｌ−グルタミン酸生産評価培地組成）
グルコース              60g/L
MgSO4・7H2O               0.9g/L
H3PO4                    1.54g/L
KOH                      1.45g/L
FeSO4・7H2O             １0mg/L
大豆加水分解物           1.54g/L(窒素分として)
ビオチン                 3.2mg/L
VB1                      0.67mg/L
DL-メチオニン            0.28g/L
アンモニア水でpH4.0に調整後、120℃で15分滅菌し、培養直前にアンモニアガスでpH7.2に調整して培養を行う。
【０１７４】
【表２】
2010041920.tif 000004
【０１７５】
〔配列表の説明〕
配列番号１：パントエア・アナナティスのsdhオペロンの塩基配列（SDHD、SDHA、SDHBのアミノ酸配列併記）
sdhC：527〜913
sdhD：910〜1254
sdhA：1258〜3021
sdhB：3039〜3752
配列番号２：SDHDのアミノ酸配列
配列番号３：SDHAのアミノ酸配列
配列番号４：SDHBのアミノ酸配列
配列番号５：パントエア・アナナティスのsdhオペロンの塩基配列（SDHCのアミノ酸配列併記）
配列番号６：SDHCのアミノ酸配列
配列番号７：パントエア・アナナティスのα-KGDHサブユニット遺伝子と近傍遺伝子の塩基配列
sdhB：   2〜 121
sucA： 322〜3129
sucB：3145〜4368
sucC：4437〜4556
配列番号８：サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテインのアミノ酸配列（部分）
配列番号９：α-KGDH E1oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号10：α-KGDH E2oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号11：succinyl-CoA シンセターゼβサブユニットの一部
配列番号12：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのodhA遺伝子の塩基配列
配列番号13：odhAがコードするE1oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号14：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのE2oサブユニットをコードする遺伝子（GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126）の塩基配列
配列番号15：NCgl2126がコードするE2oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号16：パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列
配列番号17：Kmr遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号18：Kmr遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号19：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号20：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号21：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号22：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号23：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号24：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号25：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号26：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号27：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号28：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号29：attL増幅用プライマー
配列番号30：attL増幅用プライマー
配列番号31：attLの塩基配列
配列番号32：attR増幅用プライマー
配列番号33：attR増幅用プライマー
配列番号34：attRの塩基配列
配列番号35：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号36：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号37：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号38：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号39：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号40：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号41：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号42：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号43：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号44：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号45：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号46：sdhA破壊のためのDNA断片増幅用プライマー
配列番号47：sdhA破壊のためのDNA断片増幅用プライマー
配列番号48：sucA遺伝子上流断片増幅用プライマー
配列番号49：sucA遺伝子上流断片増幅用プライマー
配列番号50：sucA遺伝子下流断片増幅用プライマー
配列番号51：sucA遺伝子下流断片増幅用プライマー
配列番号52：sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号53：sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号54：yggB遺伝子増幅用プライマー
配列番号55：yggB遺伝子増幅用プライマー
配列番号56：yggB遺伝子の塩基配列
配列番号57：YggBのアミノ酸配列
配列番号58：変異型yggB遺伝子の塩基配列
配列番号59：変異型YggBのアミノ酸配列
配列番号60：gdh遺伝子上流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号61：gdh遺伝子上流増幅用プライマー
配列番号62：gdh遺伝子下流増幅用プライマー
配列番号63：gdh遺伝子下流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号64：gdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号65：gdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号66：変異型gdh遺伝子コード領域上流の塩基配列
配列番号67：sdhA遺伝子上流増幅用プライマー
配列番号68：sdhA遺伝子上流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号69：sdhA遺伝子下流増幅用プライマー
配列番号70：sdhA遺伝子下流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号71：sdhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号72：sdhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号73：C. glutamicum ATCC13032のsdhオペロンの塩基配列（SDHC、SDHA、SDHBのアミノ酸配列併記）
sdhC：449〜1219
sdhA：1239〜3257
sdhB：3260〜4006
配列番号74：SDHCのアミノ酸配列
配列番号75：SDHAのアミノ酸配列
配列番号76：SDABのアミノ酸配列
配列番号77：B. lactofermentum ATCC13869のsdhオペロンの塩基配列（SDHC、SDHA、SDHBのアミノ酸配列併記）
sdhC：449〜1219
sdhA：1239〜3257
sdhB：3260〜4006
配列番号78：SDHCのアミノ酸配列
配列番号79：SDHAのアミノ酸配列
配列番号80：SDHBのアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構造を示す図。
【図２】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築を示す図。
【図１】
2010041920.tif 000005
【図２】
2010041920.tif 000006
【配列表】
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