(57)【要約】【課題】本発明は、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を酸化還元タンパク質が電極と迅速に電子授受できる状態、酸化還元タンパク質がその基質分子と適切に接触可能な状態、及び酸化還元タンパク質の活性が保持された状態で固定化された酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題は、電極上に疎水性分子の薄膜を形成した後、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜試料を接触させることにより、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を疎水性薄膜上に固定化して得られる本発明の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極により解決することができる。この電極はバイオセンサ又はバイオリアクタとして有用である。【選択図】図１
2010085208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、該電極の電極界面に配置された疎水性薄膜と、該疎水性薄膜上に固定された、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜とを備える、酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項２】
予め調製された、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を、前記電極の電極界面に配置された疎水性薄膜に固定化して作製される、請求項１の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項３】
前記疎水性薄膜が、電子導電性を有する分子を含む、請求項１又は２の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項４】
前記疎水性薄膜が、芳香族環を有する分子を含む、請求項１〜３のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項５】
前記芳香族環を有する分子がチオレートである、請求項４の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項６】
前記芳香族環を有する分子が、一般式（１）
【化１】
2010085208.tif 000005
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、独立に、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子及びヘテロ原子含有有機基からなる群から選択される。）
で表される分子である、請求項５の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項７】
前記芳香族環を有する分子が、一般式（２−１）又は（２−２）
【化２】
2010085208.tif 000006
（ｆ、ｇ、ｈ、i、ｊ、ｋ及びｌは、独立に、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子及びヘテロ原子含有有機基からなる群から選択される。）
で表される分子である、請求項５の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項８】
前記チオレートが、ベンゼンチオール、２−ナフタレンチオールまたは１−ナフタレンチオールから誘導されるチオレートである、請求項５の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項９】
前記電極が、酸化還元サイクル処理を施した金属電極である、請求項１〜８のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項１０】
前記酸化還元タンパク質を含有する脂質膜が、該酸化還元タンパク質を発現する細胞由来の脂質膜調製物又は人工合成膜調製物である、請求項１〜９のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項１１】
前記酸化還元タンパク質が、触媒機能を有する酵素、電子伝達機能を有するタンパク質又は分子結合・運搬機能を有するタンパク質である、請求項１〜１０のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項１２】
前記触媒機能を有する酵素がシトクロムＰ４５０である、請求項１１の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極を備えるバイオセンサ又はバイオリアクタ。
【請求項１４】
電極の電極界面に疎水性薄膜を形成する製膜工程と、形成された該疎水性薄膜に、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を含む液を接触させることにより該脂質膜を固定化する固定化工程とを含む、請求項１〜１２のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元タンパク質が電極と電子授受できる状態で固定化された電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には多くの酸化還元タンパク質が存在し電子の伝達や電子移動を介した様々な反応を触媒して生命活動に関与している。例えばシトクロムP450は、細菌から植物、哺乳動物に至るほとんど全ての生物に存在する酸化還元酵素であり、異物（薬物）の代謝、ステロイド、脂質やビタミン等の生合成などの機能を有している。ヒトは薬物代謝に関わる多数のP450分子種を有し、市販薬物の約95％がP450酵素による代謝を受けると考えられている。そのためこれらのP450分子種の薬物代謝活性を計測することは、薬物投与設計（オーダーメイド医療）および新薬開発の現場において非常に重要な技術となってきている。
【０００３】
酸化還元タンパク質は、電子授受により機能を発現するため、電子を供給あるいは受容する相手（レドックスパートナー）が必要となる。例えば、シトクロムP450が基質を代謝するためには、P450の活性中心であるヘム鉄イオンに電子が供給されて酵素が還元型になる必要があり、生体内ではP450還元酵素等を介してNADPHから電子が供給されている。現在のP450アッセイ法では、NADPH、P450還元酵素およびNADPH再生のための酵素反応系を電子供給システムとする煩雑かつ高価な系が用いられている。また活性は代謝物の生成をクロマトグラフィー（HPLC）で分析する手法が用いられているが、試料の前処理や長い分析時間を要するなど問題点が多い。そこでより安価・簡便・迅速な計測法の開発が強く望まれていた。
【０００４】
電気化学法は、電位を制御することにより電極を電子供与体（還元剤）あるいは電子受容体（酸化剤）として作用させ、電極表面近傍の分子と電子授受（分子の酸化あるいは還元）を行わせて、動いた電子の数すなわち反応した物質量を電流として計測する方法である。電極を電子供給源あるいは受容源として酸化還元タンパク質-電極間の直接電子授受を行わせることができれば、還元剤や酸化剤を系に投入することなく、電気化学駆動により酸化還元タンパク質の活性や機能を安価・簡便・迅速に計測できる。バイオリアクタ、バイオ電池への応用も期待できる。しかしながら、酸化還元タンパク質の活性中心（電子授受を行う部位）はタンパク質内部に埋もれていることが多く電極界面とのコミュニケーション（電子カップリング）がとりにくいことや、タンパク質自身が固体電極界面上で変性すること等の問題により、電極との間で直接電子授受を行うのは難しい。そこでこれまでに多くの工夫がなされ種々の酸化還元タンパク質について電極との直接電子授受が報告されている。例えば特許文献１には、電極表面を負電荷を有する高分子膜で被覆し、その後正電荷を持たせたタンパク質分子を固定化し、再び負電荷の高分子膜で被覆するというステップを繰り返した layer-by-layer法によりタンパク質を固定化すると、電極-タンパク質間の電子授受を観測できる例が報告されている。特許文献１以外にも電極と酸化還元タンパク質間の電子授受に関する報告がなされているが、全て単離・精製された酸化還元タンパク質が試料として用いられている。
【０００５】
酸化還元タンパク質、特に膜結合タンパク質を単離・精製することは労力、時間、コストを要するため実用的ではない。また膜結合タンパク質を膜から取り出すと本来の能力が減少することもある。そこで現在では、例えば膜結合タンパク質であるシトクロムP450の活性評価においては精製試料が用いられることはほとんどなく、膜に結合した状態の粗精製試料（ミクロソーム）が医薬品等の研究開発現場において使用されている。
【０００６】
酸化還元タンパク質が膜に結合した状態の粗精製試料を用いて、電極との直接電子授受を実現できれば、従来法よりもずっと安価・簡便に酸化還元タンパク質を電気化学的に計測または利用できるようになり、実用的な観点からも非常に好ましい。これまでに、特許文献1の手法で、シトクロムP450還元酵素を含んだ膜分画試料（ミクロソーム）を用いた固定化および電気化学計測の検討が行われ、電極との直接電子授受が観測されているが、電子授受速度が迅速ではなく電子授受後の酵素反応もスムースに進行しないという問題を有しており（非特許文献1）、新たな手法の開発が強く望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】US 2005/0208542 A1
【非特許文献１】Sultana, N.; Schenkman, J. B.; Rusling, J. F. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 13460-13461.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を酸化還元タンパク質が電極と迅速に電子授受できる状態及び酸化還元タンパク質がその基質分子と適切に接触可能な状態および酸化還元タンパク質の活性が保持された状態で固定化された酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、電極上に疎水性を有する薄膜のコーティング行い、その界面上に酸化還元タンパク質を含有する脂質膜試料を接触させると、酸化還元タンパク質が電極と電子授受できる状態、酸化還元タンパク質がその基質分子と適切に接触可能な状態及び酸化還元タンパク質の活性が保持された状態で脂質膜が電極上に固定化されることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
(1) 電極と、該電極の電極界面に配置された疎水性薄膜と、該疎水性薄膜上に固定された、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜とを備える、酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
(2) 予め調製された、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を、前記電極の電極界面に配置された疎水性薄膜に固定化して作製される、(1)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【００１１】
(3) 前記疎水性薄膜が、電子導電性を有する分子を含む、(1)又は(2)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
(4) 前記疎水性薄膜が、芳香族環を有する分子を含む、(1)〜(3)のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
(5) 前記芳香族環を有する分子がチオレートである、(4)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【００１２】
(6) 前記芳香族環を有する分子が、一般式（１）
【化１】
2010085208.tif 000003
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、独立に、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子及びヘテロ原子含有有機基からなる群から選択される。）
で表される分子である、(5)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【００１３】
(7) 前記芳香族環を有する分子が、一般式（２−１）又は（２−２）
【化２】
2010085208.tif 000004
（ｆ、ｇ、ｈ、i、ｊ、ｋ及びｌは、独立に、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子及びヘテロ原子含有有機基からなる群から選択される。）
で表される分子である、(5)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【００１４】
(8) 前記チオレートが、ベンゼンチオール、２−ナフタレンチオールまたは１−ナフタレンチオールから誘導されるチオレートである、(5)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
(9) 前記電極が、酸化還元サイクル処理を施した金属電極である、(1)〜(8)のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【００１５】
(10) 前記酸化還元タンパク質を含有する脂質膜が、該酸化還元タンパク質を発現する細胞由来の脂質膜調製物又は人工合成膜調製物である、(1)〜(9)のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
(11) 前記酸化還元タンパク質が、触媒機能を有する酵素、電子伝達機能を有するタンパク質又は分子結合・運搬機能を有するタンパク質である、(1)〜(10)のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
(12) 前記触媒機能を有する酵素がシトクロムＰ４５０である、(11)の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極。
【００１６】
(13) (1)〜(12)のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極を備えるバイオセンサ又はバイオリアクタ。
(14) 電極の電極界面に疎水性薄膜を形成する製膜工程と、形成された該疎水性薄膜に、酸化還元タンパク質を含有する脂質膜を含む液を接触させることにより該脂質膜を固定化する固定化工程とを含む、(1)〜(12)のいずれかの酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極を製造する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る脂質膜固定化電極では、脂質膜中の酸化還元タンパク質の活性が保持され、酸化還元タンパク質が電極と電子授受を行うこと及びその基質分子と適切に接触することが可能である。
【００１８】
本発明に係る脂質膜固定化電極の製造手順は簡便である。このため本発明によれば、酸化還元タンパク質の単離・精製を要することなく酸化還元タンパク質の活性や機能を電気化学の手法で安価・簡便・迅速に計測あるいは制御することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
1. 電極
本発明において疎水性薄膜が被覆される電極の材料は、一般的に電気化学計測で使用できる導電性を有する材料であれば特に限定されない。例えば金属、炭素、半導体等導電性を有する単体が例示できる。疎水性薄膜の形成が容易であることから、金属電極、例えば金、銀、銅、白金電極が好ましい。また金属電極のかなでも、酸化還元サイクル処理を施した金属電極を用いることが特に好ましい。酸化還元サイクル処理とは酸化→還元→酸化を繰り返し行う処理であり、この処理により金属電極の表面に凹凸が形成される。この処理を施した金属電極を用いて製造される本発明の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極では、電極−酸化還元酵素間の電子授受の効率が、同処理を施さない金属電極を使用する場合と比較して向上する。
【００２０】
2. 疎水性薄膜
前記電極の電極界面に、疎水性薄膜が構築される。疎水性薄膜とは、水に溶けにくい分子又は水に溶けない分子を主成分として電極界面上に配列させた薄膜である。疎水性薄膜の表面上の水の接触角（測定温度25℃）は60°以上であることが好ましい。薄膜の疎水性が維持される限り、水に溶けにくい分子又は水に溶けない分子に加えて、水溶性の分子が薄膜の構成成分として含まれていても良い。
【００２１】
疎水性薄膜を構成する分子は、電極と容易に反応する官能基を持つことが好ましい。電極として金、銀、銅、白金等の金属電極を用いる場合はチオレート等の、電極を構成する金属と金属−硫黄結合を形成する官能基を有する分子を用いることが好ましい。このような分子は、当該分子の溶液を金属電極と接触させるだけで容易に当該分子の単分子薄膜を金属電極表面上に構築することができる。
【００２２】
疎水性薄膜は、電子導電性を有する分子を含むことが好ましく、電子導電性を有する分子からなることが更に好ましい。電子導電性を有する分子としては、π結合等の電子の通り道に成りうる結合を有する分子が挙げられ、特に芳香族環を有する分子が好ましい。芳香族環としてはベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、テトラセン環、ペンタセン環、アズレン環、フェナントレン環、クリセン環、トリフェニレン環、テトラフェン環、ピレン環、ピセン環、ペンタフェン環、ペリレン環、ヘリセン環、コロネン環、チオフェンが挙げられるがこれらには限定されない。
【００２３】
疎水性薄膜を構成する分子として特に好ましいものは上記一般式(1)、(2-1)又は(2-2)で表される分子である。上記一般式(1)、(2-1)又は(2-2)で表される分子は、基-Ｓ-を介して電極界面に結合されることができる。一般式(1)、(2-1)又は(2-2)中の「アルキル基」とは、好ましくは炭素数1〜8、より好ましくは炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状の低級アルキル基である。一般式(1)、(2-1)又は(2-2)中の「ハロゲン原子」とは塩素、フッ素、臭素又はヨウ素を指す。一般式(1)、(2-1)又は(2-2)中の「ヘテロ原子含有有機基」とは、好ましくは、ヘテロ原子として窒素、酸素、硫黄を含む、総原子数が2〜5個である有機基であり、より好ましくは水酸基、アミド基、チオール基である。疎水性薄膜を構成する分子として最も好ましいものは、一般式(1)、(2-1)又は(2-2)において置換基が全て水素原子である、ベンゼンチオール（チオフェノール）、2-ナフタレンチオール又は1-ナフタレンチオールから誘導されたチオレートである。
【００２４】
チオレートの薄膜を電極上に形成する方法としては、チオール化合物(R-SH)(Rは有機基)を電極界面に接触させてチオレート(R-S-)を誘導する方法や、ジスルフィド化合物(R-S-S-R’)(R及びR’は同一または異なる有機基)を電極界面に接触させてチオレート(R-S-およびR’-S-)を誘導する方法が挙げられる。チオレートは基‐S-を介して電極界面に結合されることができる。
【００２５】
疎水性薄膜は薄いほど好ましい。酸化還元タンパク質が電極と電子授受を行うためには、酸化還元タンパク質の活性中心と電極表面の距離が近いほど有利であり、電子移動速度の常用対数は距離に比例して遅くなるからである。このような薄膜としては上述の分子により形成される単分子膜が挙げられる。薄膜は、3〜50Åの厚さであることが好ましい。
【００２６】
3. 酸化還元タンパク質
「酸化還元タンパク質」とは、活性中心として酸化還元（電子授受）応答を示す部位を有するタンパク質を指す。このような部位としては鉄等の金属イオン、フラビン等の有機分子が挙げられる。
【００２７】
酸化還元タンパク質としては、触媒機能を有する酵素、電子伝達機能を有するタンパク質、分子結合・運搬機能を有するタンパク質等が挙げられる。触媒機能を有する酵素の代表例がシトクロムP450である。このほかに使用できる酸化還元タンパク質としては、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、水素酸化還元酵素、蟻酸脱水素酵素、亜硝酸還元酵素、硝酸還元酵素、一酸化窒素還元酵素、亜酸化窒素還元酵素、フマル酸還元酵素、コハク酸脱水素酵素、ジメチルスルホキシド還元酵素、アルカン酸化酵素、シトクロム酸化酵素、NADH脱水素酵素、シトクロムc、シトクロムb、フラボシトクロムが挙げられる。
【００２８】
4. 酸化還元タンパク質含有脂質膜
本発明の特徴の一つは、脂質膜中に取り込まれた状態の酸化還元タンパク質を電極上に固定化することである。この特徴により、細胞中で生体膜（脂質膜）に存在する酸化還元タンパク質の活性を損なうことなく、電気化学的反応を行うことが可能となる。
【００２９】
酸化還元タンパク質を含有する脂質膜としては、酸化還元タンパク質を発現する細胞由来の脂質膜調製物であってもよく、人工的に作製した脂質膜であってもよい。酸化還元タンパク質を発現する細胞は、天然細胞、培養細胞、遺伝子工学的に目的タンパク質を発現させた細胞のいずれであってもよい。脂質膜の調製は一般的な方法で行うことができる。例えば、細胞を破砕して超遠心によって沈降する画分を細胞膜調製物として使用することができる。
【００３０】
5. 酸化還元タンパク質含有脂質膜の固定化方法
酸化還元タンパク質含有脂質膜は、疎水性薄膜が界面上に形成された電極と、該脂質膜を含む液とを接触させることにより疎水性薄膜上に固定化される。この固定化は、疎水性薄膜と脂質膜の疎水性部分との疎水相互作用により生じるものと考えられる。酸化還元タンパク質含有脂質膜は水などの極性溶媒中では通常は脂質二重層を形成しているが、水などの極性溶媒中で疎水性薄膜と接触させると疎水性部分が疎水性薄膜に向いた単分子層の膜となり、疎水結合を形成するものと考えられる（図１参照）。
【００３１】
6. 構造
本発明の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極の構造を図1に模式的に示す。本発明によれば、酸化還元タンパク質が、電極との電子授受及び周辺溶液中の基質のタンパク質基質結合部位へのアクセスに適切な向きに配向されているものと考えられる。一方、非特許文献１に記載の従来技術では、正電荷を有する高分子膜を電極界面に結合させ、この高分子膜に負電荷を有する脂質膜を静電相互作用により固定化させていたため、酸化還元タンパク質の配向がタンパク質−電極間の電子の授受及び周辺溶液中の基質のタンパク質基質結合部位へのアクセスに適していなかったものと考えられる（図4参照）。
【００３２】
7. 用途
本発明の酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極は、タンパク質分析ツール、酵素の基質特異性触媒反応を利用するバイオセンサ、酵素の物質変換能力を利用するバイオリアクタなどの分野において利用することができる。具体的には、例えば酸化還元タンパク質としてシトクロムP450を用いた場合、医薬品開発現場におけるシトクロムP450による薬物および薬物候補化合物の代謝スクリーニング、薬物-薬物および薬物-食品相互作用分析等の薬物代謝研究、臨床現場での薬物代謝分析などに用いるためのバイオセンサとして利用できると考えられる。また、シトクロムP450は様々な反応を触媒し、生成物として人間に有用な医薬品（化学合成が困難な医薬品）を生産する分子種も知られていることから、有用物質を生産するためのバイオリアクタとしても非常に有効であると考えられる。また例えば酸化還元タンパク質としてフラボシトクロムを用いた場合は、バイオエタノール生産に有用なピルビン酸の高効率な合成のためのバイオリアクタとして利用できると考えられる。
【実施例】
【００３３】
酸化還元タンパク質として、ヒトシトクロムP450を用いた例を以下に示す。
（1）酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極の作製
（a）電極上への疎水性を有する薄膜のコーティング
市販の金ディスク電極（φ=3 mm）をラッピングフィルム（#2000, #4000, #6000）および1μmのダイヤモンドスラリーにて研磨を行い電極表面を清浄にした。続いて、0.1 M HCl中にて酸化還元サイクル処理（0.28V → 1.2V →  0.28V vs. Ag/AgCl；各電圧を30秒保持）を10回繰り返し電極表面積を凹凸化した。
上記電極を 1mMのナフタレンチオールのエタノール溶液に浸漬して、ナフタレンチオール単分子膜界面を得た。この界面上の水滴の接触角は81°であった。
【００３４】
（b）疎水性を有する薄膜をコーティングした電極上への酸化還元タンパク質含有脂質膜の固定化
遺伝子工学的にヒトシトクロムP450を発現させた大腸菌由来の脂質膜試料（市販品: 1 nmol/mL）を２μL採取して4μLの0.1 Mリン酸緩衝溶液（グリセロールを20%含有）で希釈して、(a)で作製した電極上に載せ、室温で３０分ほど静置後、純水および緩衝溶液で洗浄して４℃の緩衝溶液中にて保存した。脂質膜の固定化は反射赤外分光法において、リン脂質由来の吸収により確認した。
【００３５】
（2）酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極の電気化学測定
上記(1)で作製した、ヒトシトクロムP450含有脂質膜固定化電極の電気化学計測をサイクリックボルタンメトリー法により行った。
（a）基質非存在下での応答
脱酸素した緩衝溶液中で測定したシトクロムP450含有脂質膜固定化電極の電気化学応答を図2aに示した。-0.4 V vs. Ag/AgCl付近に酸化（正の電流）および還元（負の電流）ピークを示した。ここに一酸化炭素を添加すると電気化学応答は図2bの様になり、酸化および還元電流ピーク共にポジティブ側の電位に約70mV程シフトした（還元側でシフトしていない成分が観測されているが、共発現させたシトクロムP450還元酵素に由来するものと考えられる）。これは、ヘム鉄イオンを持つタンパク質に特有の応答であり、シトクロムP450と電極間の電子授受が起こっていることが示された。また、酸化ピークと還元ピークの分離幅から見積もった電子移動速度定数は、約500s-1となり従来法（非特許文献１）より二桁も大きな値となり、迅速な電子移動が起こっていることが示された。
【００３６】
（b）基質存在下での応答
基質薬物（テストステロン）および適度な酸素を含む緩衝溶液中で測定したシトクロムP450含有脂質膜固定化電極の電気化学応答を図3に示した。
【００３７】
試験条件は以下の通りである：
0.1M リン酸緩衝溶液中（pH7.4）で、0.1 V/sの掃引速度で測定。
(a) 基質および阻害剤非存在下。
(b) 30 μM テストステロン。
(c) 130 μM テストステロン。
(d) 500 μM ケトコナゾール。
(e) 500 μM ケトコナゾール + 30 μM テストステロン。
(f) 500 μM ケトコナゾール + 130 μM テストステロン。
【００３８】
図3a→b→cとテストステロンの濃度が増えるにつれ（0→30→130μM）、還元電流が増大していることがわかる。この触媒還元電流は、電極からシトクロムP450へ電子が渡り、活性化されたP450が基質薬物を代謝して休止状態へ戻ったところへ再び電極から電子を受け取り活性化されるというサイクル反応が起こっていることを示している。また、シトクロムP450に特異な阻害剤（ここではケトコナゾール）を添加すると、図２d,e,fに示されるように基質薬物添加による触媒還元電流は観測されなかった。このことから、電極を電子源（還元剤）としたシトクロムP450による薬物代謝反応が進行していることが示された。テストステロン濃度と得られた電流値の関係から、簡易的に見積もったKm値が63μMとなり、既存の方法（NADPHを還元剤としてHPLCで分析）で得られている値71μMと良く一致し、基質薬物と電極上に固定化したシトクロムP450酵素とのコンタクトが良好であることも示された。また得られた電流値は反応速度を示しており、シトクロムP450の測定対象薬物に対する代謝能力の指標になる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明における酸化還元タンパク質含有脂質膜固定化電極の構造の模式図である。
【図２】ヒトシトクロムP450含有脂質膜（大腸菌由来）固定化電極の脱酸素緩衝溶液中での電気化学応答（サイクリックボルタグラム）を示した図である。0.1M リン酸緩衝溶液中（pH7.4）で、20 V/sの掃引速度で測定。(a) CO非存在下。(b) CO存在下。
【図３】ヒトシトクロムP450含有脂質膜（大腸菌由来）固定化電極の適度な酸素を含む緩衝溶液中での基質薬物（テストステロン）および阻害剤（ケトコナゾール）添加時の電気化学応答（サイクリックボルタグラム）を示した図である。
【図４】従来技術による酸化還元タンパク質含有脂質膜の電極への固定化方法を模式的に示す。
【図１】
2010085208.tif 000007
【図２】
2010085208.tif 000008
【図３】
2010085208.tif 000009
【図４】
2010085208.tif 000010