(57)【要約】【課題】未分化細胞を効率よく安定に標識する方法が提供される。【解決手段】本発明は、内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を用いることを含む、未分化細胞を標識する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を用いることを含む、未分化細胞を標識する方法。
【請求項２】
前記モータリン結合性物質が、モータリンに対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、全長モータリンを抗原として用いて作製された抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識物質が蛍光物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標識物質が量子ドットである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＡｌｅｘａからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
それぞれが異なる標識物質を含む２種以上の標識複合体で標識する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記未分化細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞、滑膜由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、及びｉＰＳ細胞由来間葉系細胞からなる群より選択される間葉系細胞様細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モータリン結合性物質と前記標識物質とが、アビジン−ビオチン反応を用いて結合している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識複合体を前記未分化細胞と接触させることを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を含む、未分化細胞標識用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モータリン結合物質を用いた未分化細胞の標識方法に関する。本発明は、特に、量子ドットを標識物質として用いる未分化細胞の標識方法に関する。本発明の方法によれば、未分化細胞が安定に標識される。
【背景技術】
【０００２】
モータリンはＨｓｐ７０ファミリータンパク質の一種であり、熱非応答性タンパク質である。このタンパク質は、大腸菌のＤｎａｋや酵母のＳＳＣ１ｐ、ラット細胞で細胞質画分に恒常的に発現しているＨｓｐ７０、Ｈｓｃ７０、ラット細胞で小胞体に存在するＢｉＰなどのＨｓｐファミリータンパク質と非常に高い相同性を有する。まず、マウス由来の正常線維芽細胞の細胞質画分からモータリン１（ｍｏｔ−１）が単離され（非特許文献１）、続いてマウスの不死化細胞ｃＤＮＡの免疫クローニング及び正常細胞からの配列との比較から、モータリン２（ｍｏｔ−２）が単離された（非特許文献２）。モータリン２は、カルボキシル末端の２アミノ酸のみでモータリン１と異なる配列を有する。モータリン１は正常細胞で発現しているが、モータリン２は不死化細胞で発現する。ヌードマウスを用いたアッセイによれば、モータリン１の発現は細胞老化様の表現型を引き起こすのに対し、モータリン２の過剰発現は悪性化を引き起こす（非特許文献３）。ヒトでは、マウスモータリンとアミノ酸レベルで９５％の高い相同性を有し、マウスモータリン２と同様の機能的特徴を有する１遺伝子（ヒトモータリン２）のみしか単離されていない。本明細書中では、特に断らない限り、モータリン２を単に「モータリン」と称する。ヒトモータリン２は、６７９アミノ酸からなる分子量７３，９１３ダルトンのタンパク質であり、その前駆体タンパク質は４６アミノ酸からなるミトコンドリア移行シグナルペプチドを含む。モータリン２はカルシウム依存的な自己リン酸化を経て、細胞内の様々な場所で種々のタンパク質と結合し、ミトコンドリア輸送、細胞内輸送、シャペロニン機能、ストレス応答、腫瘍形成などの多岐にわたる機能に関与すると考えられている。
【０００３】
本発明者らは、モータリンの発現量の増加と発癌との関連を調べる過程で、癌細胞に対して内在化機能を有する抗モータリン抗体を見出し、この抗体並びに当該抗体を用いた癌治療用医薬組成物及び薬剤キャリアなどに関する特許出願を行った（特許文献１及び２）。癌細胞に対する内在化機能を有する抗モータリン抗体は、それ自身が抗体医薬として使用可能であり、さらに、免疫毒などを腫瘍細胞に輸送する薬剤キャリアとして用いることができる。
【０００４】
本発明者らはまた、該抗モータリン抗体を量子ドットとコンジュゲート化させ、癌化細胞株のイメージングに用い得ることを見出した（非特許文献４）。
【０００５】
Ｓｈｉｏｔａらは、抗モータリン抗体を用いた癌細胞のイメージング、及び該抗体を用いた細胞への核酸送達を報告している（非特許文献５）。Ｓｈｉｏｔａらは、抗モータリン抗体の内在化による核酸の送達が、正常細胞では効率的に起こらず、癌細胞特異的に起こったことを報告している。
【０００６】
一方、再生医療の分野では、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び最近開発されたｉＰＳ細胞などによる移植医療の実用化が期待されている。しかしながら、生体外で培養したこれら未分化細胞の安全性には疑問が残るため、安全性の確認のために、生体内に移植した後の移植細胞の挙動のモニタリングの重要性が高まっている。
【０００７】
この目的で、既存の細胞標識方法を用いることが考えられる。そのような方法としては、例えば、未分化細胞に核酸を導入して、該核酸からのレポーター遺伝子の発現に頼る方法がある。また、クロモス・モレキュラー・システムズ社らの方法（特許文献３）では、核酸自体を標識し、標識核酸を細胞に導入することにより、細胞を標識することが提案されている。しかし、レポーター遺伝子の発現、又は導入核酸の標識に頼る既存の方法では、効率よい安定な細胞の可視化が実現されているとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／０２２３４４号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−８９４７１号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００２／０７６５０８号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｄｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８：６６１５−６６２１
【非特許文献２】Ｗａｄｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８：２２２３９−２２２４２
【非特許文献３】Ｗａｄｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３：２９５８６
【非特許文献４】Ｋａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００７，８５（１）：１３３−４０
【非特許文献５】Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２００７，１８（１１）：１１５３−６０
【非特許文献６】Ｏｈｙａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２００９, ２０（３）：２１７−２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したとおり、未分化細胞の効率よい安定な可視化が可能になれば、移植細胞のモニタリングが容易になり、再生医療の発展に寄与することができる。しかしながら、生体内での移植細胞のモニタリングを可能にする程度に、未分化細胞を効率よく安定に標識する方法は、現在のところ報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは、未分化細胞を効率よく安定に標識する方法を開発した。具体的には、本発明は、内在化機能を有するモータリン結合性物質を用いて標識物質を細胞内に導入することにより、未分化細胞の安定な標識化を可能にするという知見に基づいて完成された。
【００１２】
より具体的には、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を用いることを含む、未分化細胞を標識する方法。
〔２〕前記モータリン結合性物質が、モータリンに対する抗体である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記抗体が、全長モータリンを抗原として用いて作製された抗体である、上記〔２〕に記載の方法。
【００１３】
〔４〕前記標識物質が蛍光物質である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５〕前記標識物質が量子ドットである、上記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記標識物質が、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａからなる群より選択される、上記〔４〕に記載の方法。
〔７〕それぞれが異なる標識物質を含む２種以上の標識複合体で標識する、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１４】
〔８〕前記未分化細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞、滑膜由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、ｉＰＳ細胞由来間葉系細胞からなる群より選択される間葉系細胞様細胞である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔９〕前記間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞である、上記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記モータリン結合性物質と前記標識物質とが、アビジン−ビオチン反応を用いて結合している、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１〕前記標識複合体を前記未分化細胞と接触させることを含む、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２〕内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を含む、未分化細胞標識用試薬。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、未分化細胞の効率よい安定な標識化が可能になり、これにより移植細胞のモニタリングを実現することができる。このことは、移植医療の安全性の確認を容易にし、再生医療の発展に大きく寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ＲＭＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図２】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したウサギ間葉系幹細胞（ＲｂＭＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図３】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したサル間葉系幹細胞（ＭｏＭＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図４】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図５】ウサギ間葉系幹細胞内（ＲｂＭＳＣ）でのＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）の存在を表すＺ軸スタックイメージである。
【図６】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ｉ−ＲＭＳＣ）の骨芽細胞への分化（２週間）を示す顕微鏡写真である。
【図７】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ｉ−ＲＭＳＣ）の脂肪細胞への分化（２週間）を示す顕微鏡写真である。
【図８】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したウサギ間葉系幹細胞（ｉ−ＲｂＭＳＣ）の軟骨細胞への分化（４週間）を示す顕微鏡写真である。
【図９】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したサル間葉系幹細胞（ｉ−ＭｏＭＳＣ）の骨芽細胞への分化を示す顕微鏡写真である。
【図１０】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したサル間葉系幹細胞（ｉ−ＭｏＭＳＣ）の脂肪細胞への分化を示す顕微鏡写真である。
【図１１】分化した細胞でのＱＤの追跡を表す表である。
【図１２】骨芽細胞に分化したＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ｉ−ＲＭＳＣ）のアリザリンレッドＯ染色を表す写真である。
【図１３】軟骨細胞に分化したＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したウサギ間葉系幹細胞（ｉ−ＲｂＭＳＣ）のサフラニンＯ染色を表す写真である。
【図１４】脂肪細胞に分化したＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ｉ−ＲＭＳＣ）のオイルレッド染色を表す写真である。
【図１５】軟骨細胞に分化したＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したウサギ間葉系幹細胞（ｉ−ＲｂＭＳＣ）の硫酸化グリコサミノグリカンアッセイの結果を示すグラフである。
【図１６】脂肪細胞に分化したＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ｉ−ＲＭＳＣ）の脂肪アッセイの結果を示すグラフである。
【図１７】ＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識した移植物のｉｎ  ｖｉｖｏでの分化を表す図である。（Ａ）培養骨移植ラットモデル、（Ｂ）培養軟骨凝集物移植ウサギモデル。
【図１８】骨形成分化後にＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したラット間葉系幹細胞（ｉ−ＲＭＳＣ）中のｉＱＤの存在を示す顕微鏡写真である。
【図１９】軟骨形成分化後にＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）で標識したウサギ間葉系幹細胞（ｉ−ＲｂＭＳＣ）中のｉＱＤの存在を示す顕微鏡写真である。
【図２０Ａ】ＱＤ−モータリン抗体複合体との培養後１時間及び６時間における、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞へのＱＤの導入効率を示すＦＡＣＳデータである。
【図２０Ｂ】ＱＤ−モータリン抗体複合体との培養後１２時間及び２４時間における、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞へのＱＤの導入効率を示すＦＡＣＳデータである。
【図２１】ＱＤ−モータリン抗体複合体を用いた細胞の標識と、細胞核染色物質を用いた標識とを組み合わせて多重染色した細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２２】Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５及びＱｄｏｔ（登録商標）７０５とを用いた細胞のマルチカラーラベリングを示す顕微鏡写真である。
【図２３】ＱＤ−モータリン抗体複合体を用いて標識した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単層培養時（Ａ）、３次元培養直前（Ｂ）及び軟骨分化誘導後（Ｃ）の組織におけるＱＤの挙動を示す顕微鏡写真である。
【図２４】ウサギの全層欠損させた関節部にＭＳＣを移植した直後及び移植後４週の関節部を示す肉眼所見写真である。
【図２５】移植後４週における関節部組織のサフラニンＯ染色、Ｉ型コラーゲン免疫染色及びＩＩ型コラーゲン免疫染色を示す顕微鏡写真である。
【図２６】移植後８週における関節部組織のサフラニンＯ染色、Ｉ型コラーゲン免疫染色及びＩＩ型コラーゲン免疫染色を示す顕微鏡写真である。
【図２７】移植後４週における関節部の種々の部位における蛍光−位相差観察像を示す写真である。
【図２８】移植後８週における関節部の種々の部位における蛍光−位相差観察像を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、内在化機能を有するモータリン結合物質を利用して、未分化細胞を標識する方法に関する。本発明によれば、間葉系幹細胞などの未分化細胞の効率よい安定な標識が可能になる。
【００１８】
前述のように、内在化機能を有する抗モータリン抗体を用いた癌細胞の標識化は既に報告されている（Ｋａｕｌら（Ｋａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００７，８５（１）：１３３−４０）及びＳｈｉｏｔａら（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２００７，１８（１１）：１１５３−６０））。モータリンタンパク質が不死化細胞で特異的に細胞表面に発現しているという、モータリンの特徴的な局在パターンを考えれば、このような技術の適用は癌細胞に限られると考えるのが当然である。事実、Ｓｈｉｏｔａらは、抗モータリン抗体を用いる核酸の導入が、正常細胞では効率的に起こらなかったことを報告している（Ｓｈｉｏｔａら，２００７、上掲）。しかしながら、本発明者らは、癌細胞で内在化する抗モータリン抗体が、間葉系幹細胞などの未分化細胞でも同様に内在化を示すことを見出し、本発明を完成させた。この本発明者らの知見は、上述のモータリンの特異的局在パターンからは予想し得ず、驚くべきものである。再生医療での未分化細胞の多大な応用可能性を考えれば、本発明の技術が医療分野においてなし得る功績は大きいと予想される。
【００１９】
本明細書中、「モータリン結合性物質」とは、モータリン（モータリン２）に特異的に結合する能力を有するいずれかの物質を意味する。そのようなものとしては、限定するものではないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））、モータリン結合タンパク質断片などが挙げられる。
【００２０】
好ましいモータリン結合性物質は、モータリンに対する特異的ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体である。特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８などに詳細に記載されている。この場合、抗原としては、全長モータリンタンパク質、又はモータリン部分ペプチドを用いることができる。
【００２１】
本明細書中、「標識物質」とは、顕微鏡などによりその局在を検出可能ないずれかの物質を意味する。そのようなものとしては、限定するものではないが、蛍光物質（量子ドット及びその他の蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａなど））、金コロイド、発光物質などが挙げられる。好ましい標識物質は量子ドット及びその他の蛍光物質である。
【００２２】
好ましい標識物質である量子ドットとして、当技術分野で公知の量子ドットであれば任意のものを用いることができる。例えば、半導体シェル（ＺｎＳ）で被覆された半導体素材（ＣｄＳｅ）のナノクリスタルである、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５及びＱｄｏｔ（登録商標）８００（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを利用することが可能である。
【００２３】
本発明においては、上述した標識物質の１つを単独で使用してもよいし、あるいはそれぞれが異なる標識物質を含む２種以上の標識複合体を用いて、細胞を多重標識（マルチカラーラベリング）することも可能である。
【００２４】
本発明において、モータリン結合性物質と標識物質との結合（コンジュゲート化）は、例えば、ビオチン−アビジン法、既存の化学リンカーを用いる方法、架橋剤（ＥＤＣなど）を用いた架橋反応、イオン結合などにより行われ、好ましくはビオチン−アビジン法により行われる。例えば、抗体と量子ドットとの結合は、Ｑｄｏｔ（登録商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いて製造業者の取扱説明書に従い行うことができる。このようにして、モータリン結合性物質とそれに結合した標識物質とを含む標識複合体を調製することができる。
【００２５】
本明細書中、物質の「内在化機能」とは、物質が細胞表面に接触した際に、その細胞の細胞膜により取り込まれて、細胞内に侵入する機能を意味する。物質の内在化機能は、該物質を細胞に接触させた後に、細胞膜を透過性にし、該物質を特異的に標識する別の物質で該物質の局在を確認することにより試験することができる。例えば、抗体の内在化機能は、抗体を細胞に接触させた後に、固定剤を用いて細胞を固定し、細胞膜を透過性にし、続いて適切な二次抗体を用いて該抗体を標識して、顕微鏡を用いて抗体複合体を検出することにより試験することができる。又は、被験物質を直接標識して、これを細胞と接触させた後に直接検出してもよい。本発明では、好ましくは、モータリン結合性物質は未分化細胞に対する内在化機能を有し、特に好ましくは間葉系幹細胞に対する内在化機能を有し、最も好ましくは骨髄由来間葉系幹細胞に対する内在化機能を有する。
【００２６】
量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ；ＱＤ）は、一般的には３次元すべての方向から移動が制限された電子の状態を指す。主に半導体において、結晶成長や微細加工により、電子の持つド・ブロイ波長（数ｎｍ〜２０ｎｍ）の粒子状構造を作り出すと、電子はその領域内に閉じ込められ、電子の状態密度は離散化される。３次元すべての方向から電子を閉じ込めたものが、量子ドットと呼ばれる。
【００２７】
特に、ＣｄＳｅから作られる量子ドットは、新しい蛍光性材料として期待され、蛍光色素としてバイオ研究に応用されている。バイオ研究などに応用される量子ドットには、水中で使用し易いように、ポリマーコーティングが施される。このようなコーティングされた量子ドットは、二次抗体やストレプトアビジンとコンジュゲート化され、蛍光染色用試薬として使用されている。細胞などの染色に量子ドットを用いる利点は、長時間の励起光照射によっても量子ドットがほとんど退色しないことにある。このことは、特に、１つの細胞について複数の画像スライスを撮影する必要がある共焦点イメージングなどにおいては、非常に有利である。
【００２８】
さらに、粒径によって、様々な励起−発光スペクトルを有する量子ドットを取得可能である。例えば、単一の励起波長（ＵＶ領域）によって異なる波長で発光する量子ドットを作製することが可能であり、そのような量子ドットを組み合わせれば、単一励起波長で複数の発光シグナルを得ることもできる。また、ストークスシフト（励起波長と発光波長の差）が大きい量子ドットも作製されており、これを用いるとバックグラウンドが低く抑えられる。
【００２９】
本明細書中、「未分化細胞」とは、分化能を有する細胞を意味し、具体的には、限定するものではないが、骨髄由来間葉系幹細胞、滑膜由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、ｉＰＳ細胞由来間葉系細胞からなる群より選択される間葉系細胞様細胞である。これらの具体的な細胞の単離は、Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｏｎｅ  １９９２，１３：８１−８８；Ｙｏｏ  ＪＵ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．１９９８，８０：１７４５−１７５７；Ｏｈｙａｂｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｗａｌｌ  ｖｅｓｓｅｌ  （ＲＷＶ）  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００６，９５（５）：１００３−８などに記載されている。
【００３０】
本明細書中、「間葉系細胞様細胞」とは、間葉系組織（骨組織、軟骨組織、脂肪組織など）に存在する体性幹細胞、それらの組織に分化し得る体性幹細胞、その特徴から間葉系組織に分化し得る細胞であると考えられる細胞（間葉系幹細胞）、及び間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞を意味する。具体的には、上記で挙げた細胞である。特に好ましい未分化細胞は、各種の組織由来の間葉系幹細胞であり、最も好ましい未分化細胞は骨髄由来間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞は、間葉系組織を構成する細胞への分化能を有する。すなわち、骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞、腱細胞、脂肪細胞などに分化する能力を有する。そのため、骨、血管、心筋などの再構築をはじめとする再生医療への応用が期待されている。最近では、間葉系幹細胞が、グリア細胞（外胚葉由来）、肝細胞（内胚葉由来）などの中胚葉性でない細胞にまで分化する可能性も示されている。また、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞としては、限定されるものではないが、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞が挙げられる。
【００３１】
本発明においては、未分化細胞と上述の標識複合体とを接触させることによって、標識複合体が未分化細胞内に内在化し、未分化細胞が標識される。そのような接触としては、特に限定されるものではないが、標識複合体を含有する溶液に未分化細胞を浸漬すること、標識複合体を含有する培地中で未分化細胞を培養することが挙げられる。
【００３２】
また、本発明に係る標識複合体による標識を、慣用の細胞標識手法（蛍光、放射線、酵素などを用いる方法）と組み合わせてもよい。例えば、細胞染色に一般的に用いられているヘキスト３３２５８、ＤＩＣなどから選択される１種以上の細胞標識手法と組み合わせることが可能である。
【００３３】
上述のとおり標識された細胞における標識シグナルは、当技術分野で公知の蛍光検出方法及び手段を用いて検出することができる。例えば、蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。使用する励起フィルター及び蛍光フィルター、検出条件などは、使用する標識物質（量子ドットなど）の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
また本発明は、内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を含む、未分化細胞標識用試薬に関する。本発明の標識用試薬において、モータリン結合性物質は抗モータリン抗体であることが好ましい。また、標識物質は、蛍光物質、例えば量子ドット及びその他の蛍光物質、金コロイド、発光物質などであるが、量子ドットであることが好ましい。標識用試薬には、前記標識複合体の他、未分化細胞の標識及び標識の検出を実施するために有用な成分が含まれてもよい。そのような成分としては、例えば、未分化細胞を処理するための試薬、未分化細胞を培養するための培地、他の標識などが挙げられる。本発明の標識用試薬を用いることによって、上述した未分化細胞の標識を容易かつ簡便に行うことができる。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態である、抗モータリン抗体と量子ドットとの組み合わせを用いると、以下の実施例に詳細に述べるとおり、未分化細胞の効率よい安定な標識が可能であった。驚くべきことに、標識化した細胞は、種々の組織型に正常に分化する能力を保持し、生体内に移植すれば、検出可能な標識を維持しながら、生体組織の一部を構成することができた。
【００３６】
したがって、本発明の方法を用いて標識化した細胞は、再生医療における移植に用いることができ、さらに、これらは標識化されているために、生体内での移植細胞の挙動を追跡することを可能にする。
【００３７】
本明細書中で引用する特許文献及び非特許文献は、参照により本明細書中にその全文が組み入れられる。
【００３８】
以下に、本発明を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］
材料と実験操作
１．ＱＤをコンジュゲートしたモータリン抗体の作製
ＱＤ−抗モータリン抗体の作製はＫａｕｌら（Ｋａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００７，８５（１）：１３３−４０）及びＳｈｉｏｔａら（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２００７，１８（１１）：１１５３−６０）に従った。
【００４０】
簡単に説明すると、モノクローナル抗体作製のために、組換え発現させたヒトモータリンタンパク質全長を抗原としてマウスを免疫した。標準的なプロトコールに従いハイブリドーマを作製した（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照されたい）。抗モータリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、１０％低ＩｇＧ  ＦＢＳ及び１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。培養した培地を１２００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。プロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の取扱説明書に従い使用して、抗体を精製した。なお、ここで得られたハイブリドーマ細胞は、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３７−６として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００９年１０月１３日付で寄託され、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８５４が付与されている。
【００４１】
抗モータリン抗体の内在化機能は、量子ドットとコンジュゲート化した抗モータリン抗体を細胞培養培地に添加し、細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより評価した。これにより、内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体クローンを選択した。
【００４２】
モータリン抗体をコンジュゲートするＱＤにはＱｄｏｔ（登録商標）６５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＺｎＳの殻で被覆されたＣｄＳｅナノクリスタル）を用いた。ＱＤと抗体との結合は、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ２２０２１ＭＰ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従い行った。これにより、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）を作製した。
【００４３】
２．ＱＤを用いた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の安定的なｉｎ  ｖｉｔｒｏラベリング
２．１  間葉系幹細胞の作製及びラベリング
各動物種由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、７週齢のＦｉｓｈｅｒ３４４雌ラット、１０日齢の雌日本白色家兎、胎齢１００日の雌カニクイザル、およびヒトの長管骨より骨髄を採取し、各々に適した培養液にて増殖させることにより作製した。ウサギＭＳＣには１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ、その他ＭＳＣには１０％ＦＢＳを含むＡｌｐｈａＭＥＭを用いた。具体的には、適切な針を用いて陰圧又はフラッシュアウトにより各々の動物から骨髄を採取し、培地に懸濁し、細胞培養用プラスチックディッシュ（必要な場合には、細胞接着のためにタンパク質でのコーティングを施してある）上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて３〜４日間インキュベートした。接着した細胞を単離して、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とした。このように作製した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などに分化することが可能であることが示されている（Ｂｉａｎｃｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９８８，６８：４０１−４１１；Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４：１４３−１４７）。
【００４４】
初代培養においてＭＳＣが８０％コンフルエントに達したら、培養液中にＱＤ−抗モータリン抗体（〜０．２−０．４ｍｇ／ｍｌ）を加えて２４時間培養することにより、ＭＳＣにＱＤラベルを施した。
【００４５】
２．２  細胞分化
その後、骨分化誘導培養液：１０％ＦＢＳと骨分化誘導サプリメントを含むＤＭＥＭ、骨分化誘導サプリメント［１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０ｍｇ／ｍｌ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、及び１０−８Ｍ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ］、軟骨分化誘導培養液：軟骨分化誘導サプリメントを含むＤＭＥＭ、軟骨分化誘導サプリメント［５０ｍｇ／ｍｌ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、４０ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、ＩＴＳ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１０−７Ｍ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β］、及び脂肪分化誘導培養液：１０％ＦＢＳと脂肪分化誘導サプリメントを含むＤＭＥＭ、脂肪分化誘導サプリメント［０．５ｍＭ  Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）、１０−５Ｍ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０−６Ｍ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及び２×１０２Ｍ  Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ］の３種類の分化誘導培養液中での、二次元培養、あるいはペレット培養による三次元培養により、骨芽細胞、脂肪細胞、又は軟骨細胞への分化誘導を行った。二次元培養又は三次元培養による細胞の分化は、例えば、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８４：１４３−７；Ｍａｃｋａｙ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  １９９８，４：４１５−２８などに詳細に記載されている。
【００４６】
３．ＱＤを用いた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の安定的なｉｎ  ｖｉｖｏラベリング
生体内でのＱＤラベルされたＭＳＣの分化への影響を確認するために、骨移植モデル及び軟骨移植モデルを利用した。骨移植モデルには、７週齢のＦｉｓｈｅｒ３４４雌ラットを用いた。大腿骨の末端部に立方状欠損２×２×２ｍｍ３を作製し、あらかじめ骨分化を誘導したＱＤ標識ＭＳＣを播種したβ−ＴＣＰをその欠損に移植して、３週間飼育した。また、軟骨移植モデルには１０日齢の雌日本白色家兎を用いた。大腿骨の膝蓋骨に円筒状欠損φ５×４ｍｍを作製した。あらかじめ軟骨分化を誘導したＱＤラベルＭＳＣを、ＲＷＶバイオリアクターで三次元培養により凝集させて２週間培養した。培養組織を欠損部に移植して、４〜８週間飼育した。
【００４７】
４．各種分化誘導後の細胞・組織評価
４．１  組織学的評価（定性評価）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ二次元培養細胞は、１０％中性ホルマリン緩衝液にて３０分４℃で固定し、蒸留水で洗浄した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元培養細胞は、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液にて一晩４℃で固定してパラフィンで包埋したのち、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＲＭ２２５５）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。ｉｎ  ｖｉｖｏ骨移植組織は、４％ＣＭＣを用いて凍結ブロックを作製したのち、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。ｉｎ  ｖｉｖｏ軟骨移植組織は、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液にて１週間、４℃で固定して、ＥＤＴＡにて１ヵ月間４℃で脱灰し、パラフィンで包埋したのち、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＲＭ２２５５）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。骨芽細胞には、二次元培養細胞の場合にはアリザリンレッド染色、移植組織の場合にはヘマトキシリン−エオジン染色、脂肪細胞にはオイルレッドＯ染色、そして軟骨細胞にはサフラニンＯ染色を行った。
【００４８】
４．２  定量評価
軟骨細胞・組織に関しては、ＢｌｙｃｃａｎＴＭ  Ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ｂ１０００）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って硫酸化グリコサミノグリカンを測定した。測定サンプルとしては、細胞をサンプリングして直ちに凍結乾燥を行ったのち、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで６０℃、１６時間抽出した溶液を使用した。脂肪細胞に関しては、オイルレッドＯ染色して十分乾燥したのち、イソプロパノールを加えて色素を溶出した。その溶出液をマイクロプレートリーダー、５４０ｎｍにて測定した。
【００４９】
４．３  蛍光イメージング
カバーバラスに播種されたＱＤラベルした各種細胞は、メタノール：アセトン（１：１，ｖ／ｖ）固定液にて氷上で５分間固定した。ＱＤフィルターセットＸＦ  ３０５−１（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ４２５ＤＦ４５，ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ４７５ＤＣＬＰ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ６５５ＤＦ２０）（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を装備した蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００  Ｍ）で観察を行い、解析ソフトＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．４（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して解析を行った。
【００５０】
結果
上記のとおり、ＭＳＣを単離してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて十分増殖させたのち、ＱＤをラット、ウサギ、サル、およびヒトの各々のＭＳＣに導入すると、使用したＱＤの励起−発光波長に適したフィルターを用いた蛍光顕微鏡観察において、蛍光像が観察された（図１〜４）。これにより、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いて、各種間葉系幹細胞にＱＤが導入されたことが示された。Ｚ軸スタックイメージを観察すると、ＱＤは細胞内部にほぼ均等に導入されていた（図５）。したがって、抗モータリン抗体を用いて、ラットからヒトまで種の壁を越えてＱＤをＭＳＣに効率よく導入することができた。次に、ＱＤラベルされたＭＳＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化誘導培養した後にも、ＱＤの存在が確認された（図６〜１０）。
【００５１】
また、分化誘導したのち、ＱＤラベルされたＭＳＣとラベルしていないＭＳＣを比較して、増殖及び分化に違いが生じているか検討した。この結果を図１１に示す。図１１に示されるように、＊３週間（３Ｗｋ）培養後の分化（骨形成）した細胞でのＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱｄｏｔ）全体は、２週間（２Ｗｋ）のものと比較するとやや少なかった。しかし、個々の細胞中のｉＱｄｏｔの蛍光は同じであった。この結果から、同様の細胞播種密度で分化誘導培養したが、標識・非標識で細胞の増殖に著しい違いは見られなかった。しかし、骨分化誘導３週間後の細胞でのＱＤの存在量が、２週間の細胞と比較すると減少していたために、蛍光強度の低下がみられた（図１１）。
【００５２】
分化への影響は、骨分化においてはバイオミネラリゼーションを確認するためのアリザリンレッド染色（図１２）、軟骨分化においては軟骨基質を染色するサフラニンＯ染色（図１３）、および脂肪分化においては油滴を染色するオイルレッド染色（図１４）により確認した。ＱＤ標識による分化への著しい影響は見られなかった。このことは、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いて標識した未分化細胞を分化させることにより、移植材料を作製することが可能であることを示す。
【００５３】
軟骨分化では、標識・非標識いずれの試料においても、培養時間の経過により硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生量が同様に増加していた（図１５）。脂肪分化においても、染色観察と同様、標識・非標識の違いに有意差は見られなかった（図１６）。
【００５４】
さらに、ＱＤラベルされたＭＳＣを分化誘導して作製した移植材料（骨・軟骨様組織）を移植したのち、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける移植組織内でのＱＤの挙動を確認した。この結果を図１７に示す。図１７は、（Ａ）培養骨移植ラットモデル、（Ｂ）培養軟骨凝集物移植ウサギモデルの結果を示している。いずれの場合にも、組織化学的結果により示されるように正常な骨構造が形成され（Ａ−ａ、Ｂ−ｇ及びＢ−ｊ）、また分化後にも実質的なＱＤ蛍光シグナルが残っていた（Ａ−ｂ、Ａ−ｃ、Ｂ−ｄ、Ｂ−ｈ及びＢ−ｋ）。β−リン酸トリカルシウム（β−ＴＣＰ）ブロック中のラット骨芽細胞（Ａ−ｂ）、及びβ−ＴＣＰブロックに支持された骨芽細胞の移植から形成された骨（Ａ−ｃ）の顕微鏡像、並びに移植軟骨から形成されたウサギ軟骨内組織（２６日：Ｂ−ｇ、Ｂ−ｈ及びＢ−ｉ；８週：Ｂ−ｊ、Ｂ−ｋ及びＢ−ｌ）の低倍率及び高倍率像を示す。移植の２６日後及び８週間後で、サフラニン−Ｏ染色（Ｂ−ｇ及びＢ−ｊ）により確認された再生骨組織において、強いＱＤ蛍光シグナルが観察された（Ｂ−ｄ、Ｂ−ｈ、Ｂ−ｉ、Ｂ−ｋ及びＢ−ｌ）。このように、８週間にわたる長期においても移植組織内にＱＤの存在が確認された（図１７）。このことは、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いて標識した細胞から作製した移植材料を用いると、移植後の長期間にわたって、生体内での移植物の追跡が可能であることを示している。
【００５５】
また、ＭＳＣを単離してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて十分増殖させて骨芽細胞又は軟骨細胞に分化誘導培養した細胞にＱＤラベリングを試みたところ、いずれの細胞にもＱＤの細胞内導入を確認することができた（図１８〜１９）。脂肪細胞に分化誘導した細胞についても同様の結果が得られた（データは示していない）。これにより、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いるＱＤラベリングは、分化誘導後の細胞に対してさえ有効であることが示された。
【００５６】
［実施例２］
実施例１と同様にして、ＱＤをコンジュゲートしたモータリン抗体（ＱＤ−モータリン抗体複合体）を作製し、骨芽細胞様樹立細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社 ＥＣ９９０７２８１０）を標識した。簡単に説明すると、ＱＤ−モータリン抗体複合体を含有する培地（ＭＥＭＡｌｐｈａ・ＧＩＢＣＯ・１２５７１−０７１／１５％ＦＢＳ・ＳＩＧＭＡ・Ｆ２４４２）において、３７℃にて１〜２４時間にわたり骨芽細胞を培養した。続いて、培養後１、６、１２及び２４時間において、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）（ベクトン・ディッキンソン株式会社・ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター）を用いて励起波長最大４８２ｎｍ及び蛍光波長最大６９５ｎｍにて蛍光を検出し、ＱＤの細胞導入効率を検討した。
【００５７】
この結果を図２０Ａ及びＢに示す。この結果から、２４時間後には９６％の細胞にＱＤが導入されていることがわかった。
【００５８】
［実施例３］
実施例２と同様にして、ＱＤ−モータリン抗体複合体を用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を標識した。また同時に、細胞内核染色物質を用いて細胞を染色した。簡単に説明すると、細胞を１０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬株式会社 ０６２−０１６６１）により４℃、２時間固定して、ＰＢＳで洗浄したのち、細胞に十分浸る適当な容量のＰＢＳを加えて、さらにヘキスト３３２５８（和光純薬株式会社 ３４３−０７９６１）及びＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ． Ｈ−１２００）を加えて、室温で１５分間染色した。染色後は蒸留水で洗浄して封入した。
【００５９】
この結果を図２１に示す。この結果から、ＱＤ−モータリン抗体複合体を他の染色物質と組み合わせて用いることにより、細胞を多重染色することができることが示された。また、ＱＤは細胞質内に比較的均質に存在していることがわかった。
【００６０】
［実施例４］
実施例１と同様にして、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ２２０２１ＭＰ）を使用して、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５−モータリン抗体複合体を作製した。また、同じ手法を用いて、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ１０１６１ＭＰ）を使用して、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５−モータリン抗体複合体を作製した。
【００６１】
これらのそれぞれ異なる種類の量子ドットを含む複合体を用いて、実施例２と同様の手順でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を標識した。その後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）（ベクトン・ディッキンソン株式会社・ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター）を用いて、Ｑｄｏｔ(登録商標）６５５については励起波長最大４８２ｎｍ及び蛍光波長最大６９５ｎｍにて蛍光を検出し、またＱｄｏｔ(登録商標）７０５については励起波長最大４８２ｎｍ及び蛍光波長最大８４５ｎｍにて蛍光を検出した。
【００６２】
この結果を図２２に示す。図２２に示されるように、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５及びＱｄｏｔ（登録商標）７０５は細胞質内に別個に観察することができる。これにより、複数種の標識物質を利用することでマルチカラーラベリングが可能であることが実証された。
【００６３】
［実施例５］
本実施例においては、ＱＤ−モータリン抗体複合体で標識したウサギ間葉系幹細胞からの３次元軟骨の作製と、ウサギ膝関節全層欠損モデルへの移植実験を行った。
【００６４】
１２日齢の日本白色家兎（雌）の長管骨から、慣用法を用いて骨髄細胞を採取した。単層培養時に、実施例１で作製した抗モータリン抗体−Ｑｄｏｔ複合体を含む培養液にて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養し、Ｑｄｏｔを細胞内導入した。軟骨分化誘導下に３次元培養を１週間行い、軟骨様組織を構築した。その組織を、１０週齢の雌ウサギの直径５ｍｍ、深さ４ｍｍで全層欠損させた大腿膝関節部に同種移植した。移植後４週及び８週で評価を行った。
【００６５】
図２３に、単層培養時（Ａ）、３次元培養直前（Ｂ）、及び軟骨分化誘導後（Ｃ）の関節組織の写真を示す。これらの組織内のいずれにおいてもＱｄｏｔは細胞内で安定して観察された。また、図２４に、移植前及び移植後４週における関節部分の写真を示す。移植後４週においては、関節欠損部は白色の組織で覆われていた。
【００６６】
移植後４週及び８週において、関節組織部から組織を取り出し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液にて一晩４℃で固定して４％ＣＭＣを用いて凍結ブロックを作製したのち、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。ＰＢＳでＣＭＣを除去したのち、サフラニンＯ染色、コラーゲンＩ、ＩＩ染色を行った。サフラニンＯ染色は、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン染色セット（和光純薬株式会社・２９８−２１７４１）により１０分間、核を染色し、流水で１０分間洗浄し、０．５％塩酸アルコールに浸漬したのち、０．００１％ファストグリーン（ＭＥＲＣＫ・Ｃ．Ｉ．  ４２０５３）で室温、５分染色した。そののち、１％酢酸水溶液で１０〜１５秒洗浄して、０．１％サフラニンＯ（Ｃｈｒｏｍａ・１Ｂ４６３）水溶液で室温、５分染色して、蒸留水で洗浄した。コラーゲンＴｙｐｅＩおよびコラーゲンＴｙｐｅＩＩの免疫染色は０．１％プロテアーゼ（シグマ・Ｐ５３８０）含有ＰＢＳ溶液を室温で５分間反応させ、蒸留水で洗浄し、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（ＤＡＫＯ・Ｓ３０２０）を５分間反応させ、蒸留水で洗浄してＴＢＳＴに５分間浸漬させた。そののち、１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｒｏｃｈｅ・１０９６ １７６）を４℃、１時間反応させて、一次抗体コラーゲンＴｙｐｅＩ（第一ファインケミカル株式会社・Ｆ５６）、コラーゲンＴｙｐｅＩＩ（第一ファインケミカル株式会社・Ｆ５７）、それぞれを４℃で一晩反応させたのち、ＴＢＳＴで洗浄して、二次抗体である抗マウスＩｇＧ（西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ・ＮＡ９３１Ｖ）に１時間、浸漬して蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン（ＤＡＣＯ・Ｓ２０２０）で１分間、室温で染色した。
【００６７】
この組織学的評価の結果を図２５（移植後４週）及び図２６（移植後８週）に示す。移植後４週では、サフラニンＯ染色では関節表面が赤く染色され、細胞密度は高い組織であることが確認できた。また免疫染色において軟骨部ではＩＩ型コラーゲンにより染色された。また、軟骨下骨部ではＩ型コラーゲンにより染色され、リモデリングも良好であることが確認できた。一方、移植後８週においては、サフラニンＯ染色により軟骨部では軟骨基質が確認され、細胞は軟骨組織に特異的な柱状配列であることが確認できた。免疫染色ではＩＩ型コラーゲンは陽性、Ｉ型コラーゲンは陰性で硝子様軟骨組織での修復が確認できた。
【００６８】
また移植後４週及び８週において、関節組織を蛍光顕微鏡で観察した。その蛍光−位相差観察像を、図２７（移植後４週）及び図２８（移植後８週）に示す。移植後４週では、修復組織の骨髄側を中心にＱｄｏｔが観察された。また移植後８週では、移植部全体にＱｄｏｔが観察された。特に軟骨下骨部ではクラスター形成を伴う蛍光が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明により標識された未分化細胞は、分化誘導したのちに移植治療に用いることが可能であるので、本発明は、再生医療において有用性を有する。
【受託番号】
【００７０】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８５４（Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３７−６、２００９年１０月１３日付寄託）
【図１】
2010117350.tif 000002
【図２】
2010117350.tif 000003
【図３】
2010117350.tif 000004
【図４】
2010117350.tif 000005
【図５】
2010117350.tif 000006
【図６】
2010117350.tif 000007
【図７】
2010117350.tif 000008
【図８】
2010117350.tif 000009
【図９】
2010117350.tif 000010
【図１０】
2010117350.tif 000011
【図１１】
2010117350.tif 000012
【図１２】
2010117350.tif 000013
【図１３】
2010117350.tif 000014
【図１４】
2010117350.tif 000015
【図１５】
2010117350.tif 000016
【図１６】
2010117350.tif 000017
【図１７】
2010117350.tif 000018
【図１８】
2010117350.tif 000019
【図１９】
2010117350.tif 000020
【図２０Ａ】
2010117350.tif 000021
【図２０Ｂ】
2010117350.tif 000022
【図２１】
2010117350.tif 000023
【図２２】
2010117350.tif 000024
【図２３】
2010117350.tif 000025
【図２４】
2010117350.tif 000026
【図２５】
2010117350.tif 000027
【図２６】
2010117350.tif 000028
【図２７】
2010117350.tif 000029
【図２８】
2010117350.tif 000030