(57)【要約】【課題】リグナン生合成に関与する新たな遺伝子を提供すること【解決手段】本発明は、リグナンにメチル基を転移する活性（リグナンメチル化活性）を有する酵素、それをコードする遺伝子、この遺伝子を用いてメチル化リグナンを製造する方法などを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(h)からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からリグナンメチル化活性を有するタンパク質を採取する該タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
上記形質転換体が請求項1〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からメチル化リグナンを採取するメチル化リグナンの製造方法。
【請求項１３】
上記形質転換体が請求項1〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグナンメチル化活性（リグナンにメチル基を転移する活性）を有する酵素、それをコードする遺伝子、この遺伝子を用いてメチル化リグナンを製造する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物二次代謝産物の一種であるリグナンは植物界に幅広く分布しており(非特許文献：Umezawa, T.(2003) Phytochem. Rev. 2, 371-390)、それらのうち有用な生物活性を有するものは医薬品や健康食品として利用されている。例えばゴマ科ゴマのフロフラン型リグナンの代表であるセサミンは、抗酸化性、脂質代謝改善や肝機能保護などの機能性が知られており市販されている（非特許文献１： Nakai, M., et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51, 1666-1670； 非特許文献２：Tsuruoka, T. et al. (2005) Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188）。
【０００３】
一方、メギ科ポドフィラム（アメリカハッカクレン）の根に含まれるアリルテトラリンラクトン型の抗腫瘍性リグナンであるポドフィロトキシンは細胞分裂阻害活性を有するため制がん剤および新しい制がん剤の開発に利用されている(非特許文献３：Ayres, D. C. and Loike, J. D. (1990) Lignans: Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K.)。また、多くのリグナンは摂取後体内において女性ホルモン様活性を有するエンテロラクトンに代謝されると考えられている。
このようにリグナン類の有用性が明らかになりつつあるのに対して、その生合成経路における触媒酵素遺伝子についての情報は限られている(非特許文献４：Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2, 257-288)。
【０００４】
リグナン生合成は主に、モクセイ科レンギョウ、メギ化ポドフィラム、およびアマ科アマで研究がされており、モノリグノールの一種であるコニフェリルアルコールの酸化的重合によって与えられるフロフラン型リグナンのピノレジノールから始まる。ゴマにおいて、ピノレジノールはチトクロームP450酵素であるCYP81Q1によってピノレジノールに二つのメチレンジオキシ環が形成されてセサミンに変換され、さらにその代謝物であるセサミノールが配糖体化されることが示されている（非特許文献５：Noguchi, A., et al (2008) Plant J. 54, 415-427）。
【０００５】
ラクトン環を有するリグナン生合成経路では、ピノレジノールはピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素(PLR)によってラリシレジノールを経てセコイソラリシレジノールに代謝される(非特許文献４)。セコイソラリシレジノールはさらにセコイソラリシレジノール脱水素酵素(SIRD)によってマタイレジノールへと変換される。
【０００６】
マタイレジノール以降のラクトン環を有するリグナン代謝経路についてはポドフィロトキシン配糖体に至るまでに複数の酵素反応を経る必要があるが、いくつか酵素活性が報告されているだけで実行酵素の単離に至っていない(非特許文献６： Sakakibara, N., et al (2003) Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485）。
【０００７】
セリ科シャクはその葉や根において、ヤテインやポドフィロトキシンなどのラクトン環を有するリグナンを含有していることが知られている。さらにラベル体投与実験によって、ヤテインはツヤプリカチン、５位メチル化ツヤプリカチン、４,５位メチル化ツヤプリカチンを経て生合成されることが示されている（非特許文献６）。
【０００８】
【非特許文献１】J. Agri. Food Chem. 51, 1666-1670 (2003)
【非特許文献２】Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188 (2005)
【非特許文献３】Lignans: Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K. (1990)
【非特許文献４】Phytochem. Rev. 2, 257-288 (2003)
【非特許文献５】Plant J. 54, 415-427 (2008)
【非特許文献６】Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の下、リグナン生合成に関与する新たな酵素およびそれをコードする遺伝子を同定することが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、下記に示す、リグナンメチル化活性を有する酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター、形質転換体、この形質転換体を用いてメチル化リグナンを製造する方法などを提供する。
【００１１】
（１）以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１２】
（１a）以下の(e)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１３】
（２）以下の(g)〜(h)からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２a）以下に示す上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１４】
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ＤＮＡである、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
（９）上記（７）に記載のベクターが導入された形質転換体。  
【００１５】
（１０）上記（８）又は（９）に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からリグナンメチル化活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
（１１）上記形質転換体が上記（１）〜（５）のいずれか項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである上記（１０）に記載の方法。  
【００１６】
（１２）上記（８）又は（９）に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からメチル化リグナンを採取するメチル化リグナンの製造方法。
（１３）上記形質転換体が上記（１）〜（５）のいずれか項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである上記（１２）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ツヤプリカチンなどのリグナンをメチル化できるので、新たな機能を有するリグナン化合物の探索に有用である。本発明の遺伝子を用いて探索される化合物あるいはそれを中間体として得られる化合物は、医薬の有効成分、機能性食品素材、花弁植物において新しい花色を導く分子となり得る。例えば、後述の実施例において得られたメチルツヤプリカチンは、抗癌剤として知られているポドフィロトキシンの中間体として有用である。したがって、本発明は、医薬品産業、食品産業、農業などにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、それぞれ、5’−メチルツヤプリカチン（上段）、4−メチルツヤプリカチン（中段）、5−メチルツヤプリカチン(下段)の標準サンプルのＧＣ-ＭＳチャートを示す。TICはTotal Ion Chromatogramを意味する。
【図２】図２は、それぞれ、5’−メチルツヤプリカチン（上段）、4−メチルツヤプリカチン（中段）、5-メチルツヤプリカチン(下段)の標準サンプルのＭＳスペクトルを示す。それぞれに共通して見られる532のイオンはＴＭＳ化されたメチル化ツヤプリカチンを示す。
【図３】図３は、酵素反応基質のツヤプリカチン（左式）及び5位メチル化ツヤプリカチン（右式）を示す。図中の数字は、それぞれの化学式が太い折れ線で示す箇所で切断されたときに生じるフラグメントイオンの推定MSスペクトルの値を示す。
【図４】図４は、それぞれ、（Ａ）ツヤプリカチン標準品、（Ｂ）5−メチルツヤプリカチンの標準品、（Ｃ）メチルツヤプリカチンとAsOMT116との反応液、（Ｄ）メチルツヤプリカチンと煮沸したAsOMT116との反応液のＧＣ-ＭＳチャートを示す。TICはTotal Ion Chromatogramを意味する。
【図５】図５は、それぞれ、（Ａ）基質であるメチルツヤプリカチン標準品のＭＳスペクトル、（Ｂ）5−メチルツヤプリカチンの標準品のMSスペクトル、（Ｃ）メチルツヤプリカチンとAsOMT116との反応生成物のMSスペクトル、及び（Ｄ）AsOMT116 が触媒するリグナンメチル化反応の模式図を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号：１：AsOMT116 cDNA配列
配列番号：２：AsOMT116のアミノ酸配列
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書中、「リグナン」は、Ｃ6Ｃ3骨格を有するフェニルプロパノイド化合物２分子が、主としてこれらの８−８’位を介して重合（８，８’−結合）した化合物である。リグナンは、植物における生体防御機構に寄与していると考えられている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖ． ２， ３７１−３９０ （２，００３）参照）。
代表的なリグナンとしては、ゴマに含まれる（+）−セサミン、（+）−セサミノール、（+）−セサモリン、（＋）−ピノレジノール、（+）−ピペリトールおよび（+）−セサモリノール；レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（−）−アルクチゲニンおよび（−）−マタイレジノール；ソシマ（Ｄａｐｈｎｅ  ｔａｎｇｕｔｉｃａ）に含まれる（−）−ピノレジノールおよび（−）−ラリシレジノール；アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に含まれる（＋）−セコイソラリシレジノールなどが挙げられる。これらのリグナンの分子構造は多様である（Ｗｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０， ２７−１１０ （２，００３）等参照）。（+）−ピノレジノールに代表されるゴマリグナン類は最も幅広い植物種で同定されているフロフラン型のリグナン類に分類される。ゴマリグナンの１つであるセサミンは、多彩な生理活性作用を有しており、コレステロール代謝、肝機能および免疫機能の改善に有効である（例えば、ゴマその科学と機能性、並木満夫編：丸善プラネット社（1998）参照）。セサミンをゴマ種子またはゴマの絞り粕から分離精製する方法がすでに実用化されており（例えば、特開２００１−１３９５７９公報、特開平１０−７６７６号公報等）、セサミンを主成分とするアルコール分解促進作用を有する肝機能改善／増強剤が市販されている（商品名：セサミン、発売元：サントリー株式会社）。またセサミン以外の他のリグナン（例えば、セサミノール、セサモリンなど）もまた生理活性作用を有することが報告されている（例えば、日本農芸化学会誌、７６：８０５−８１３（２００２）参照）。このように、リグナン又はその誘導体は、種々の生理活性を有する生理活性物質あるいはその中間体として有用である。  
【００２１】
以下に、本発明のリグナンにメチル基を転移する酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター、形質転換体などを詳細に説明する。
【００２２】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記(a)及び(b)のポリヌクレオチドに限定されるものではなく、これらのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２３】
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２４】
本明細書中、「リグナンメチル化活性」は、リグナンをメチル化する活性、すなわち、リグナンにメチル基を転移する活性を意味する。「リグナンメチル化活性」は、メチル基供与体であるSAMと基質であるリグナンとをリグナンメチル化酵素と反応させ、その反応生成物をHPLCまたはLC-MS分析することで測定又は確認することができる。一般的なメチル化酵素活性測定法は公知文献に記載されている（例えば、Toquin, V., et al. (2003) Plant Mol. Biol. 52, 495-509.,Gang, D. R., et al. (2002) Plant Cell 14, 505-519など参照)。  
【００２５】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２６】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
【００２７】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２８】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。  
【００２９】
２．本発明のタンパク質  本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３０】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；  C群：アスパラギン、グルタミン；  D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；  E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；  F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；  G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３１】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
本発明のタンパク質は、上記したリグナン（特に、ツヤプリカチン）のメチル化反応を触媒することができる。  
【００３２】
３．ベクター及びこれを導入した形質転換体  次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。
【００３３】
本発明のベクターは、通常、（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；（ｉｉ）該プロモーターに結合した、上記（ａ）〜（ｊ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００３４】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
【００３６】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ３３７  １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，  ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，  生化学，  ６４，  ６６０，  １９９２；  Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｇｅｎｅ，  １０１，  １４９，  １９９１）などが利用可能である。
【００３７】
また、本発明は、上記（ａ）〜（i）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。
【００３８】
３．形質転換体
本発明は、上述したリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。本明細書中、用語「形質転換体」は、組織または器官だけでなく、生物個体を含む意味で用いられている。
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。  
【００３９】
本発明の形質転換体または細胞は、これらの形質転換体または細胞が天然に有するリグナンおよび／またはメチル化リグナンの組成が改変されていることを特徴とする。本発明の形質転換体または細胞は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、ゴマ、レンギョウまたはアマであることが特に好ましい。このような形質転換体または細胞は、本発明のメチル化リグナン含有量を制御する方法を用いることによって、リグナンを産生する生物中のメチル化リグナンの含有量を増加または減少させることができる。  
【００４０】
本発明の形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態の植物形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように植物中に導入することによって取得される。  
【００４１】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。  
【００４２】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。  
【００４３】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。  
【００４４】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。  
【００４５】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。  植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。  
【００４６】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。  
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。  
【００４８】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明の形質転換体植物としては、例えば、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ、アマ、シャクおよびミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。
好ましい実施形態において、ゴマを使用して、本発明の形質転換体を作製することができる。ゴマの形質転換体の作製方法としては、例えば、Ｔ．Ａｓａｍｉｚｕ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｓａｍｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＡＴ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｓｅｓａｍｅ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  １６：２２〜２５（２００２）に記載されるような公知の方法が挙げられる。
このようにして得た形質転換ゴマを用いれば、当該ゴマ内でメチル化リグナンを生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでメチル化リグナン（例えば、メチルツヤプリカチン）を生産することができる。
【００４９】
他の好ましい実施形態において、本発明の形質転換体として、タバコを好適に用いることができる。タバコは、ペチュニアなどとともに、形質転換が容易な代表的植物であり、細胞壁を取り除いた細胞の１個（プロトプラスト）から、植物１個体への再生が可能である。この再生された植物１個体は、多細胞に由来する１個体とは異なりキメラ状に陥らないため、形質転換体の作製を効率よく行うことができる。
タバコの形質転換に好ましい方法としては、リーフディスク法が挙げられる。この方法は、操作が容易であり、かつ１枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換体を得ることができる方法である。形質転換の方法はたとえば「新生物化学実験の手引き３  核酸の分離・分析と遺伝子実験法  化学同人  １９９６年」に記載されている。
このようにして得た形質転換タバコを用いれば、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明の形質転換体として、イネを好適に用いることもできる。形質転換イネを用いれば、当該イネ内で低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
【００５０】
本発明の形質転換体は、リグナン（特に、ツヤプリカチン）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチル化リグナンを生産することができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された形質転換体を用いれば、植物などの生物に内在するリグナンをメチル化する反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、メチル化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
本発明の形質転換体を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するタンパク質を低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
一実施形態において、本発明に係る細胞は、種々の細菌宿主であり得る。本実施形態に係る細胞は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように細胞中に導入することによって取得される。  
【００５１】
当業者は、本明細書中の記載に従えば、リグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されれば、細菌から高等植物までの広範な生物にリグナンメチル化能を付与することができるということを容易に理解する。
本発明の細胞は、リグナン（特に、ツヤプリカチン）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチル化リグナンを生産することができる。  
【００５２】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された細胞を用いれば、当該細胞内でリグナンメチル化反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、メチル化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
本発明に係る細胞を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するタンパク質を低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。  
【００５３】
４．本発明のタンパク質の製造方法
本発明は、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる本発明のタンパク質の製造方法を提供する。具体的には、上記形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を分離・精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。  
【００５４】
例えば、本発明のタンパク質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。  
【００５５】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。  
【００５６】
５．メチル化リグナンの製造方法
本発明は、本発明のタンパク質を発現する生物体または細胞を用いてメチル化リグナンを生産する方法を提供する。上記生物体は、天然の未改変生物体であっても組換え発現系を用いた形質転換体であってもよい。本発明のメチル化リグナン製造方法は、リグナン（特に、ツヤプリカチン）を効率よく製造することができる。
一実施形態において、本発明のメチル化リグナン製造方法は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用いてメチル化リグナンを製造する。好ましくは、上記生物体は、上述した形質転換体植物または細菌であり、特に好ましくは、大腸菌、ゴマ、レンギョウまたはアマである。
【００５７】
本発明のメチル化リグナン製造方法は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。本実施形態において、上記生物体は形質転換される前に産生したメチル化リグナンと形質転換後に産生するメチル化リグナンとの間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびメチル化リグナンは、その含有率が増加する。本実施形態に係るメチル化リグナン製造方法は、さらに上記生物体からメチル化リグナンを抽出する工程を含む。  
【００５８】
６．食品および工業製品
本発明は、上述のメチル化リグナン製造方法により得られたメチル化リグナンを用いて製造される食品および工業製品を提供する。本項で記載する食品は、上述した形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根であっても、上述した形質転換植物体から抽出されたメチル化リグナンを用いて製造された食品（例えば、ゴマ、レンギョウまたはアマ、あるいはこれらの加工食品）であってもよい。本発明に係る食品または工業製品は、所望する量のリグナン（特に、ツヤプリカチン）を含有することができる。
例えば、上述のようにメチル化リグナンの含量が増加した本発明の形質転換植物から抽出されたメチル化リグナン抽出液は、メチル化リグナンの含量が高い食品として提供される。また、抽出したメチル化リグナンに限らず、上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等もまた、メチル化リグナンを多く含む食品として提供される。メチル化リグナン組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、または酵母等のあらゆる生物を対象とすることが可能である。
また、リグナンおよびメチル化リグナンの独特な物性に基づいて、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、工業製品（例えば、フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品）の原料に利用され得る。  
【００５９】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
【実施例】
【００６０】
[実施例１]：遺伝子クローニング
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning(Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)に記載の方法に従った。
【００６１】
セリ科シャク（Anthrissus sylvestris）の若い葉と根からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総ＲＮＡを抽出し、引き続き、オリゴテックス−dT mRNA精製キット(TaKaRa Bio)によりPolyA(+)RNAを得た。このポリA(+)RNA 4μgを用いて、ラムダZAPIIdirectional cDNAライブラリー合成キット(Stratagen社)を用いて、同社の推奨する方法によりcDNAライブラリーを作製した。
【００６２】
上記cDNAライブラリーを含むファージ約30万pfuを用いて、表1に記載の４種のOMT遺伝子特異的プライマーセットで増幅される断片を混合したものをスクリーニングプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。プローブはノンラジオアイソトープDIG−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社、）を用いて、製造者が推奨する条件に従いPCRによりラベルした。この際、ＯＭＴプライマーセット1および2に関してはキク科ベニバナのｃＤＮAを鋳型として用いた（Set 1 Forward:配列番号：３；Set 1 Reverse：配列番号：４；Set 2 Forward:配列番号：５；Set 2 Reverse：配列番号：６）。また、ＯＭＴプライマーセット3および4に関してはヤナギ科ポプラのｃＤＮAを鋳型として用いた（Set 3 Forward:配列番号：７；Set 3 Reverse：配列番号：８；Set 4 Forward:配列番号：９；Set 4 Reverse：配列番号：１０）。鋳型ｃＤＮＡを1μl、1x Taq buffer (TakaRa Bio)、 0.2mM dNTPs、表１に示す遺伝子特異的プライマー各0.2 pmol/μl、rTaq polymerase 1.25 Uを含むPCR反応液を使用した。このPCR反応液を、94℃で5分反応させた後、94℃1分、52℃1分、72℃2分の反応を30サイクル行い、最後に72℃で5分間処理した。このPCR産物からMini Quick Spinカラム(Roche)でプライマーおよび未反応のdNTPを除去し、これをプローブとして用いた。
【００６３】
【表１】
2010207169.tif 000002
【００６４】
ライブラリーのスクリーニングならびに陽性クローンの検出はノンラジオアイソトープDIG−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。ハイブリダイゼーション反応を30％ホルムアミドを含む5xSSC中、37℃で一晩行い、メンブレンの洗浄を4x SSC、1%SDSを用いて55℃で20分間行った。約40万プラークをスクリーニングして得た陽性クローンから、DNA Sequencer model 3100 (Applied Biosystems) を用いて合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によってcDNA配列を得た。得られたcDNA配列をBlastxプログラム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によってホモロジー解析することでシャクメチル化酵素様遺伝子(AsOMT)を得た。
【００６５】
配列番号1および2に示されるAsOMTクローン116（以下AsOMT116）はBlastx解析によってRosa chinensisのphloroglucinol O-methyltransferase (アクセッション番号BAD18975)と低い相同性（約51%）を示したが、明確な機能が推定できなかったため、大腸菌で発現させて機能解析を行った。
【００６６】
AsOMT116 cDNA配列（配列番号：1）
ATGTCTAAACAAGATCAAGATGCCACTGAATTCACAAGGGTGCTGCAGGTAAGTGGTGGCATAATTCTTGGAATGGTATTGAAAGCTGCTGTTGAGTTTAATCTTTTCGAGATCATGGCCAATGCTGCTGCTGTTGATGGAGCTTCTCCTTTCGGAGATGATGCTAAGAAGTTGTCTAGTGATGATATTGTAGCTCATCTTCCCACACAAAATCCTGCAGCTACTGCAATGCTGGAGCGAATTCTTCGGTTTCTGTCTGCTCATTCCTTTCTTACCAGGACCGTAGTAGCTGGAGAAGGTGGCCAGGAACAGAGTTTGTATGGTCTAGAAAGTATTTGCAAGAATTACATTCCTGATCAAGATGGTGTTTCATTTGCTCCTTTATTGGTTATGCTTCATGACAAAGTTATCATCGATTCTTTGTTGTGCTTGAAAGATGCACTTCTTGAGGGAGGTATTCCGTTTAACAAGGCTCATGATGGCATGGATGCATTTGAATACCCTGCAATAGACAGCAGATTCAATGACGTTTTCAATCAAGCAATGTACAACCACACCACTTTAATCATGAAGAAGATTCTAGAAGTTTACGCTGGATTCGAAGAACTCACAGAGATTGTAGATGTTGGTGGTGGAACCGGGGCAACACTAGCCAAAATCATGTCCAAATATCCTCATATCAGGGGAATCAACTTCGATTTGCCTCATGTCATCAAGAACGCCCCTCCTTTAGCTGGTGTGGAGCATGTGGGAGGAGATATGTTTGAAAGTGTCCCGAAAGGAGAGGTCATCTTCATGAAGTGGATACTTCATGATTGGAGCGATGGACACTGCTTAAAGCTTTTGCAGAATTGCTGCAACTCCCTTCCAGAATCTGGCAAGGTGATAATTGTAGAATCAATAGTGCCAGAGAATACGAACACAGGTTCTTCATCGGAATTAAGCAATGTCATGAGCAATGATATGGTAATGCTGGCAGTAAATCCGGGAGGAAAGGAGAGGAGTATCAAAGAATTTGAGGCATTGGCAAAAGAATCTGGATTCGCCACCGTAGAACTCATATGCAGCGTCGCTATATATAGTGTTCTAGAATTTCATAAGAAAGTG
【００６７】
AsOMT116 アミノ酸配列（配列番号：2）の一文字表記
MSKQDQDATEFTRVLQVSGGIILGMVLKAAVEFNLFEIMANAAAVDGASPFGDDAKKLSSDDIVAHLPTQNPAATAMLERILRFLSAHSFLTRTVVAGEGGQEQSLYGLESICKNYIPDQDGVSFAPLLVMLHDKVIIDSLLCLKDALLEGGIPFNKAHDGMDAFEYPAIDSRFNDVFNQAMYNHTTLIMKKILEVYAGFEELTEIVDVGGGTGATLAKIMSKYPHIRGINFDLPHVIKNAPPLAGVEHVGGDMFESVPKGEVIFMKWILHDWSDGHCLKLLQNCCNSLPESGKVIIVESIVPENTNTGSSSELSNVMSNDMVMLAVNPGGKERSIKEFEALAKESGFATVELICSVAIYSVLEFHKKV
【００６８】
[実施例２］：発現ベクター構築
AsOMT116の完全長ORFを、下記の制限酵素サイトを付加したプライマー（表２：上段：配列番号：１１；下段：配列番号：１２）を用いてRT-PCR法によって増幅した。
【００６９】
【表２】
2010207169.tif 000003
【００７０】
シャクcDNAは前述のシャク総RNA 1μgを鋳型として逆転写反応することにより得た。cDNA合成はSuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL）を利用し、合成条件は製造業者が推奨する条件に倣った。
【００７１】
PCR反応液(50μl)は、シャクcDNA 1μl、1×ExTaq buffer(TaKaRa Bio)、0.2mM dNTP、プライマー(表3)各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5Uからなる。このPCR反応液を、94℃で3分間反応させた後、94℃で１分間、50℃で1分間、72℃で2分間の反応を30サイクル行った。PCR産物を1％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、AsOMT116の完全長ORFから推定された約1.1ｋｂのサイズの増幅産物が得られたことを確認した。
【００７２】
このPCR産物をpBluescript SK+ベクター（Stratagene）にサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100 (Applied Biosystems) を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって挿入断片内ＰＣＲによる変異がないことを確認した。
【００７３】
プライマーに付加したNheIおよびXhoIの制限酵素部位を利用して約1.1ｋｂのAsOMT116断片を切り出した。この断片を、大腸菌発現ベクターであるpET23a(Novagen社)のNheIおよびXhoIサイトへ連結し、本酵素遺伝子の大腸菌発現ベクターを得た。本ベクターXhoIサイト下流にあるHisタグとAsOMT116遺伝子のオープンリーディングフレームを有する、AsOMT116とHisタグの融合タンパク質が発現するよう設計した。
【００７４】
［実施例３］：酵素機能解析
本酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られたAsOMT116大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を、50 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（10 g/l typtone pepton，5 g/l  yeast extract，1 g/l NaCl）4 mlに接種し、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度（OD600）がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5 mMのIPTGを添加し、18℃で20 hr振盪培養した。
【００７５】
以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（5,000×g，10 min）にて集菌し、Buffer S［20 mM HEPESバッファー（pH 7.5），20 mM イミダゾール、14 mM β-メルカプトエタノール］を細胞１gあたり1 ml添加し、形質転換体を懸濁した。続いてこの懸濁液を超音波破砕して（15 sec×8回）、遠心分離（15,000×g，15 min）した。得られた上清（可溶性画分）を粗酵素液として回収し、酵素解析に用いた。
【００７６】
酵素反応条件は以下の通りである。反応液（0.04 mM Ｓ−アデノシルメチオニン、50 mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)、2mM MgCl2、0.01mM 基質（ツヤプリカチン）、約3mg粗酵素）50μlを調製し、30℃、１時間反応させた。
【００７７】
酵素反応液は酢酸エチル抽出を行い、乾燥後、10μlのＮ，Ｏ−ビス(トリメチルシリル)アセトアミドに溶解させることでトリメチルシリル(TMS)化させ、下記条件でGC-MS分析を行った。
【００７８】
分析機器：島津 GCMS-QP2010 Plus mass spectrometer system 
モード：electron impact
カラム： 10m Shimadzu CPB10-M25
キャリアーガス： ヘリウム
インジェクション温度：250℃
カラム温度：160℃〜250℃、速度20℃/分
【００７９】
標品は前述の先行文献（Sakakibara, N., et al (2003) Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485）で調製したものを使用した。本条件で標準品の5’位メチルツヤプリカチン、5位メチルツヤプリカチンおよび4位メチルツヤプリカチンはそれぞれ保持時間約20.1分、20.3分、および18.3分に溶出された(図１)。5’位メチルツヤプリカチンと5位メチルツヤプリカチンの保持時間は近似しているが、これら両者はMSフラグメントパターンから区別できることを確認した（図２）。たとえば、5位メチルツヤプリカチンで見られる239のフラグメントイオンは5’位メチルツヤプリカチンには認められないが、逆に、5’位メチルツヤプリカチンに見られる297のフラグメントイオンは5位メチルツヤプリカチンには認められない（図２）。すべてのモノメチル化ツヤプリカチンには、水酸基がTMS化された532の親イオンが認められた。上記の5位メチル化ツヤプリカチンで見られる239のフラグメントイオン、およびツヤプリカチンと5’位ツヤプリカチンにおいて見られる297のフラグメントイオンから、それらの構造を推定した（図３）。
【００８０】
上記のGC-MS分析条件で、AsOMT116の酵素反応液をGC-MS分析に供したところ、保持時間約20.3分に新たな生成物が検出された（図４A及びC）。このGC保持時間20.3分のピークは、煮沸処理したAsOMT116では得られなかった（図４D）。したがって、20.3分のピークがAsOMT116の反応生成物であることを確認した。
【００８１】
このGC保持時間20.3分のピーク生成物についての質量分析（MS）の結果から、239のフラグメントイオンなど、5位メチル化ツヤプリカチンと共通する質量分析パターンが検出された（図５B及びC）。したがって、このAsOMT116の酵素反応液中の新たな生成物は5位メチル化ツヤプリカチンであることが判明した（図５）。また、反応基質であるツヤプリカチンにおいて、親イオン590は認められるが、図５B及びCで検出された239のイオンは認められなかった（図５A）。一方、5位メチル化ツヤプリカチン又は反応生物において、239のフラグメントイオンの出現に伴い、反応基質であるツヤプリカチンで検出された297のイオンは消失した（図５B及びC）。すなわち、この239のフラグメントイオンがAsOMT116によってメチル化を受けた部分を含むフラグメントであることが示された。したがって、GC-MS分析によって、5位メチル化ツヤプリカチンがAsOMT116の反応生成物であることを確認した。
【００８２】
以上の結果から、AsOMT116はシャク由来のツヤプリカチンの5位を特異的にメチル化する新規メチル化酵素であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、ツヤプリカチンなどのリグナンをメチル化できるので、新たな機能を有するリグナン化合物の探索に有用である。本発明の遺伝子を用いて探索される化合物あるいはそれを中間体として得られる化合物は、医薬の有効成分、機能性食品素材、花弁植物において新しい花色を導く分子となり得る。例えば、後述の実施例において得られたメチルツヤプリカチンは、抗癌剤として知られているポドフィロトキシンの中間体として有用である。したがって、本発明は、医薬品産業、食品産業、農業などにおいて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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