(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト胎盤から単離され、配列決定分析により特徴付けられる核酸を提供する。【解決手段】精製ポリヌクレオチドであって、ｉ）受け入れ番号ＤＳＭ１３７８３下のＤＳＭＺに集積された、ＰＡＰＰ−Ａ２のコード化配列に相当する、特定の配列を含むポリヌクレオチド；およびｉｉ）特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド；およびｉｉｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）または（ｉｉ）によりエンコードされたポリペプチドのフラグメントをエンコードするポリヌクレオチド；およびそのようなポリヌクレオチドの相補鎖、からなる群から選ばれる、精製ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される単離されたポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する抗体であって、当該フラグメントが、
ｉ）少なくともインシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｉｉ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｉｉｉ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、抗体。
【請求項２】
該抗体が、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
該抗体が、モノクローナルである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
個体から得た生物学的サンプルにおけるＰＡＰＰ−Ａ２の検出法、あるいはＰＡＰＰ−Ａ２レベルの測定法であって、当該方法が、
ｉ）当該個体から生物学的サンプルを提供して、
ｉｉ）
ａ）配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される単離されたポリペプチドであって、当該フラグメントが、
少なくともインシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリペプチド；および／または
ｂ）ＰＡＰＰ−Ａ２発現に由来するｍＲＮＡ形態のポリヌクレオチド、および／または
ｃ）好ましくはＩＧＦＢＰ−５、その誘導体、またはＰＡＰＰ−Ａ２に対する他の任意の好適な基質の開裂を検出することによる、ＰＡＰＰ−Ａ２特異的プロテアーゼ活性、
を検出することによりサンプル中のＰＡＰＰ−Ａ２を検出する、
ことからなるステップを含む、方法。
【請求項５】
該方法が、ステップｉｉ）で検出されたＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２レベルを、
ｉ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２の量および／または濃度；および／または
ｉｉ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡの量および／または濃度；および／または
ｉｉｉ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２特異的なプロテアーゼ活性、
からなる群から選ばれる予め決められた値と比較することからなる更なるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該予め決められた値が、当該個体の正常な生理学的状態を示す、請求項５１に記載の方法。
【請求項７】
該生物学的サンプルが、血液、尿、胸腔内液、口腔洗浄液、組織バイオパシー、および卵胞液からなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
該ＰＡＰＰ−Ａ２レベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２特異的プロテアーゼ活性として測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
該ＰＡＰＰ−Ａ２レベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白の量として測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
該ＰＡＰＰ−Ａ２レベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２のメッセンジャーＲＮＡの量として測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
該ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白量が、免疫化学的分析により測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白量が、少なくとも１つのモノクローナル抗体により検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白が、少なくとも１つ更なる成分、好ましくはポリペプチドを含む複合体において検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
該ＰＡＰＰ−Ａ２が、ＰＡＰＰ−Ａ２単量体として検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
該ＰＡＰＰ−Ａ２が、ＰＡＰＰ−Ａ２二量体として検出される、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の属する分野
本発明は、妊娠関連血漿蛋白−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）と相同性のある新規なポリペプチドに関する。本発明に記載の新規なポリペプチドは、ＰＡＰＰ−Ａ２と示す。本発明は更に、そのようなポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードする核酸配列を含む新規なポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
本発明は更に、本明細書の以下で定義されるような、新規なポリヌクレオチド（そのフラグメントを含む）を用いる方法、および当該ポリヌクレオチドから生成可能な新規なポリペプチドの使用法に関する。
【０００３】
本発明は、組み換えＰＡＰＰ−Ａ２の発現と精製、およびＰＡＰＰ−Ａ２に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成、そしてヒトの組織または体液由来の天然のＰＡＰＰ−Ａ２の精製にも関する。
【０００４】
更なる態様において、本発明は、病理的状態に対するマーカーとして、および妊娠している、ならびに妊娠していない個体のＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性を改変する薬物に対する治療的ターゲットとしてのＰＡＰＰ−Ａ２の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
本発明の背景
妊娠関連血漿蛋白−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）
ＰＡＰＰ−Ａは、１９７４年に初めて妊婦の血清から胎盤起源と考えられる他の蛋白と一緒に単離された（非特許文献１）。血清中濃度は、妊娠の終了時には約５０ｍｇ／リットルに達する（非特許文献２；非特許文献３）。ＰＡＰＰ−Ａは、高分子量のホモ四量体として最初は特徴付けられた（非特許文献４；非特許文献１；非特許文献５）が、今やＰＡＰＰ−Ａは、主として妊婦の血清および血漿に、好酸球主要塩基性蛋白のプロフォーム（ｐｒｏＭＢＰ）との共有結合性のヘテロ四量体の２：２の複合体、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰとして存在することが実証されている（非特許文献６）。妊婦の血清および血漿中において僅か約１％のＰＡＰＰ−Ａが、最近実証されるように（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）ホモ二量体として存在する。ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体の存在は、精製されたＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰの消化から、ジスルフィド結合によって相互に結合されたＰＡＰＰ−ＡおよびｐｒｏＭＢＰペプチドの単離により一部分は明らかとなった（非特許文献６）。
【０００６】
ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体のサブユニットは、ジスルフィド結合の還元および変性により不可逆的に分離可能である（非特許文献６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元すると、ＰＡＰＰ−Ａサブユニットは、見かけの分子量が２００ｋＤａであり（非特許文献７）、その１５４７残基の配列は、クローニングしたｃＤＮＡから分かる（非特許文献８）。ＰＡＰＰ−Ａは、８０残基のｐｒｅ−ｐｒｏ片（非特許文献９）を含む、ｐｒｅ−ｐｒｏ蛋白（ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ）として合成される。ＰＡＰＰ−Ａと広範に相同性のある蛋白は、文献上では報告されていないが、ＰＡＰＰ−Ａは、４８２〜４９２位に伸長した亜鉛結合モチーフ（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ）（非特許文献８に従ってナンバリングしたもの）を含む配列モチーフを含有する。このモチーフおよび構造的に重要なメチオニン残基（ＰＡＰＰ−Ａにおいて５５６位の残基と考えられている）は、厳密には亜鉛ペプチダーゼのスーパーファミリーであるメトジンシン（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ）：ａｓｔａｃｉｎｓ、ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ（またはｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎｓ）、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ、およびｍａｔｒｉｘｉｎｓ（マトリックスメタロプロテアーゼまたはＭＭＰ’ｓ）内に保持されている（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００７】
ＰｒｏＭＢＰサブユニットは、２３ｋＤａの計算されたペプチド質量を有する（非特許文献１２；非特許文献１３）。しかしながらＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ｐｒｏＭＢＰは、おそらくその強力で異常なグリコシル化（非特許文献１４；非特許文献７）のために、クマシー染色したゲルでは見ることのできない５０〜９０ｋＤａのスメア（ｓｍｅａｒ）として移動している（非特許文献６）。ＰＡＰＰ−ＡおよびｐｒｏＭＢＰは双方とも、インサイツハイブリダイゼーションにより示されるように（非特許文献１５）妊娠中に胎盤においてであるが、主に異なる種類の細胞において生成される。ＲＴ−ＰＣＲによる分析により、ＰＡＰＰ−ＡおよびｐｒｏＭＢＰの双方のｍＲＮＡが、胎盤中よりは量は少ないけれども、数種の生殖および非生殖組織中に存在することが明らかになった（非特許文献１６）。
ＰＡＰＰ−Ａの臨床的用途
臨床上、血清ＰＡＰＰ−Ａレベルの低下は、ダウン症妊娠の予測値として徐々に利用されてきており（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）、血清ＰＡＰＰ−Ａレベルは、他の胎児異常においてもまた低下することが示されている（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。
【０００８】
更に、血管形成後の冠動脈の平滑筋細胞においてはＰＡＰＰ−Ａ合成が増大し（Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ、製本中）、それは、現在臨床的価値の可能性があるために評価されている。妊婦血清におけるｐｒｏＭＢＰの測定が診断的価値があることもデータは示している（非特許文献２４）。
ＰＡＰＰ−Ａの蛋白分解活性：ＩＧＦＢＰ−４の開裂
ごく最近になって、ＰＡＰＰ−Ａの推定のメタロプロテアーゼ活性が、実験で確認されている（非特許文献２５）。ＰＡＰＰ−Ａは、ヒト線維芽細胞調整培地（ＨＦＣＭ）から一部分精製され、インシュリン様成長因子結合蛋白（ＩＧＦＢＰ）−４に対する蛋白分解活性を引き起こすことが示されている。ＩＧＦＢＰは、そのうちの６個が示されているが、ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩ活性の重要なモジュレータ−である（非特許文献２６；非特許文献２７）。
【０００９】
ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩは、インビボおよびインビトロの双方において、強力な蛋白同化および細胞分裂作用を有する重要なポリペプチドである。ＩＧＦＢＰ−４に結合したＩＧＦは、そのレセプターとは相互作用できないが、その結合蛋白が開裂すると、生理活性ＩＧＦが遊離される。興味深いことに、ＰＡＰＰ−ＡによるＩＧＦＢＰ−４の開裂は、厳密にはＩＧＦの存在が必要とされる（非特許文献２８；非特許文献２５）。ＰＡＰＰ−Ａ分泌は、骨芽細胞および骨髄間質細胞から（非特許文献２５）、顆粒膜細胞から（非特許文献２９）、および血管平滑筋細胞から（Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）も実証されており、これらはすべて既知のＩＧＦ依存性ＩＧＦＢＰ−４プロテアーゼ活性を有する。
ＩＧＦＢＰ−５
ＩＧＦＢＰ−４と同様、ＩＧＦＢＰ−５開裂は、多数の組織および調整培地において、同定されていないプロテアーゼにより起こると広範に報告されている（非特許文献３０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４，  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １１８，  ２２３−３６
【非特許文献２】Ｆｏｌｋｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １３９，  ９１０−４
【非特許文献３】Ｏｘｖｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，  １３６４５−５１
【非特許文献４】Ｂｉｓｃｈｏｆ，  １９７９，  Ａｒｃｈ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ２２７，  ３１５−２６
【非特許文献５】Ｓｉｎｏｓｉｃｈ，  １９９０，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １１，  ７０−８
【非特許文献６】Ｏｘｖｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８，  １２２４３−６
【非特許文献７】Ｏｘｖｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２０１，  ４１５−２３
【非特許文献８】Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８
【非特許文献９】Ｈａａｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７，  １５９−６３
【非特許文献１０】Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３３１，  １３４−４０
【非特許文献１１】Ｓｔｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４，  ８２３−４０
【非特許文献１２】Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８，  １４９３−８
【非特許文献１３】ＭｃＧｒｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８，  ２２９５−３０８
【非特許文献１４】Ｏｘｖｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  ３３，  ３２９−３６
【非特許文献１５】Ｂｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７１，  ５６０−６
【非特許文献１６】Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６１，  １０８３−９
【非特許文献１７】Ｂｒａｍｂａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｂｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  １００，  ３２４−６
【非特許文献１８】Ｈａｄｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８，  ９５５−６１
【非特許文献１９】Ｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｍｊ  ３０５，  ２８
【非特許文献２０】Ｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４１，  ４６１−７
【非特許文献２１】Ｂｉａｇｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  １８，  ９０７−１３
【非特許文献２２】Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ２０，  ４１１−６
【非特許文献２３】Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ３，  ２２５−３２
【非特許文献２４】Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  １９，  ９０５−１０
【非特許文献２５】Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，  ３１４９−５３
【非特許文献２６】Ｆｏｗｌｋｅｓ，  １９９７，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８，  ２９９−３０６
【非特許文献２７】Ｒａｊａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １８，  ８０１−３１
【非特許文献２８】Ｃｏｎｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１，  １１２９−３７
【非特許文献２９】Ｃｏｎｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８４，  ４７４２−５
【非特許文献３０】Ｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２０，  ７６１−８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の概要
妊娠関連血漿蛋白−Ａ２
本発明に記載の新規な核酸は、ヒト胎盤から単離され、配列決定分析により特徴付けられる。該新規なヌクレオチド配列は、新規なポリペプチド、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする。
【００１２】
ＰＡＰＰ−Ａ２のアミノ酸配列は、２３３残基のｐｒｅ−ｐｒｏ片および１５５８残基の成熟部分から構成される。ＰＡＰＰ−Ａ２の成熟部分は、ＰＡＰＰ−Ａの成熟部分と相同する（およそ４５％の同一性）が、そのｐｒｅｐｒｏ片は、その２つの蛋白間で全く類似性がない。ＰＡＰＰ−Ａと同様、ＰＡＰＰ−Ａ２は、それをメトジンシンスーパーファミリーの推定のメタロプロテアーゼとして分類する保存アミノ酸伸長部を含有する。
【００１３】
ＰＡＰＰ−Ａ２は、哺乳類の発現系において発現し、ＰＡＰＰ−Ａ２が活性酵素であることが実証されている。更に、ＰＡＰＰ−Ａ２が、ＩＧＦＢＰ−５、インシュリン様成長因子結合蛋白５型を開裂することが実証されている。相対的に、ＰＡＰＰ−ＡによるＩＧＦＢＰ−４の開裂は、以前から実証されている。
【００１４】
完全長の形態のＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が、同定され、配列決定され、単離される。該ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡの一部分が、組み換え宿主における発現のために発現ベクター中にクローニングされる。該ｃＤＮＡは、組み換え完全長のＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントを生成するのに有益である。該ｃＤＮＡおよびそれ由来の組み換えＰＡＰＰ−Ａ２蛋白は、抗体生成、診断用キット、実験用試薬、およびアッセイのおいて有益となる。
【００１５】
該ｃＤＮＡおよび組み換えＰＡＰＰ−Ａ２蛋白は、ＰＡＰＰ−Ａ２機能に影響を及ぼす化合物を同定するのにも使用され得る。ＰＡＰＰ−Ａ２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスミメティクスは、臨床上ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白の発現を減少させ、それによりＰＡＰＰ−Ａの効果にアンタゴニストとして作用するために有益となり得る。同様に、ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列は、遺伝子治療に対して、ターゲット細胞中にＰＡＰＰ−Ａ２を導入し、それによりＰＡＰＰ−Ａ２の効果を促進させるために使用可能である。
【００１６】
本発明は更に、細胞中のＩＧＦＢＰ−５蛋白分解活性の減少または削減に対する治療的ターゲットとして使用されるＰＡＰＰ−Ａ２に関する。
【００１７】
診断の目的でのＰＡＰＰ−Ａ２の使用法を提供することが、更なる本発明の目的である。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下に続く図面およびその説明、以下に続く詳細な説明、および請求項から明らかとなるであろう。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、以下の精製ポリヌクレオチドなどが提供される：
（項目１）  精製ポリヌクレオチドであって、
ｉ）受け入れ番号ＤＳＭ１３７８３下のＤＳＭＺに集積された、ＰＡＰＰ−Ａ２のコード化配列に相当する、配列番号１のヌクレオチド１〜５３７６を含むポリヌクレオチド；および
ｉｉ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド；および
ｉｉｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）または（ｉｉ）によりエンコードされたポリペプチドのフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドであって、当該フラグメントが、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）またはその誘導体、あるいは任意の他の基質に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリヌクレオチド；そして
ｉｖ）相補鎖が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のいずれかで定義されるようなポリヌクレオチドと、厳密な条件下でハイブリダイズされるポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドが、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントをエンコードし、当該フラグメントが、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）またはその誘導体、あるいは任意の他の基質に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリヌクレオチド；および
ｖ）（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のいずれかで定義されるようなポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に縮重されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの相補鎖、からなる群から選ばれる、精製ポリヌクレオチド。
【００２０】
（項目２）  項目１に記載で、配列番号１に示されるようなコード化配列を含む、精製ポリヌクレオチド。
【００２１】
（項目３）  項目１に記載で、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする、ポリヌクレオチド。
【００２２】
（項目４）  項目１に記載で、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドであって、当該フラグメントが、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリヌクレオチド。
【００２３】
（項目５）  該ポリペプチドの相補鎖が、項目２〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドと、厳密な条件下でハイブリダイズする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
【００２４】
（項目６）  項目１に記載で、項目３及び４のいずれかに記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に縮重されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【００２５】
（項目７）  該ポリヌクレオチドが、項目２〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドの相補鎖を含む、項目１に記載のポリヌクレオチド。
【００２６】
（項目８）  ３’未翻訳領域、またはそのフラグメント、あるいは配列番号１に相当する、配列番号１の核酸残基５３７７〜８５２７を含む更なるポリヌクレオチドに実施可能に結合した、項目１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【００２７】
（項目９）  項目１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドに実施可能に結合した発現シグナルを含む、発現ベクターの形態の組み換えＤＮＡ分子。
【００２８】
（項目１０）  項目１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は項目９に記載のベクターを用いてトランスフェクト、あるいは形質転換した、宿主生体。
【００２９】
（項目１１）  該生体が、哺乳類の生体である、項目１０に記載の宿主生体。
【００３０】
（項目１２）  配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される単離されたポリペプチドであって、
当該フラグメントが、
ｉ）少なくともインシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｉｉ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｉｉｉ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリペプチド。
【００３１】
（項目１３）  該フラグメントが、任意のプロセシング変異体を含むＰＡＰＰ−Ａ２の成熟部分に相当する、アミノ酸残基２３４〜１７９１を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される、項目１２に記載のポリペプチド。
【００３２】
（項目１４）  該フラグメントが、ＰＡＰＰ−Ａ２のｐｒｅｐｒｏ部分に相当する、アミノ酸残基１〜２３３を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される、項目１２に記載のポリペプチド。
【００３３】
（項目１５）  該フラグメントが、ＰＡＰＰ−Ａ２のｐｒｏ部分に相当する、アミノ酸残基２３〜２３３を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される、項目１２に記載のポリペプチド。
【００３４】
（項目１６）  該フラグメントが、ＰＡＰＰ−Ａ２のシグナルペプチドまたはリーダー配列に相当する、アミノ酸残基１〜２２を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される、項目１２に記載のポリペプチド。
【００３５】
（項目１７）  配列番号２のアミノ酸残基２３４〜１７９１に相当する、ＰＡＰＰ−Ａ２の成熟部分に実施可能に結合した、項目１４〜１６のいずれかに記載のポリペプチド。
【００３６】
（項目１８）  該ポリペプチドが、組み換えポリペプチドである、項目１２〜１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【００３７】
（項目１９）  該ポリペプチドが、ヒト蛋白、または該ポリペプチドに天然に付随する他の蛋白を含まない、項目１２〜１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【００３８】
（項目２０）  ｉ）項目１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／またはｉｉ）項目９に記載のベクター、および／またはｉｉｉ）項目１０および１１のいずれかに記載の宿主生体、および／またはｉｖ）項目１２〜１９のいずれかに記載のポリペプチドを、生理的に許容される担体と組み合わせて含む、組成物。
【００３９】
（項目２１）  ｉ）項目１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／またはｉｉ）項目９に記載のベクター、および／またはｉｉｉ）項目１０および１１のいずれかに記載の宿主生体、および／またはｉｖ）項目１２〜１９のいずれかに記載のポリペプチドを、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【００４０】
（項目２２）  項目１２に記載のポリペプチドに対して特異性を有する抗体の生成法であって、当該方法が、
ｉ）宿主生体を提供し、
ｉｉ）その宿主生体を、項目１０に記載のポリペプチドを用いて免疫し、そして
ｉｉｉ）当該抗体を得る、
ことからなるステップを含む、方法。
【００４１】
（項目２３）  項目１２に記載のポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する、抗体。
【００４２】
（項目２４）  該抗体が、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選ばれる、項目２３に記載の抗体。
【００４３】
（項目２５）  該抗体が、モノクローナルである、項目２４に記載の抗体。
【００４４】
（項目２６）  項目１８に記載のポリペプチドの生成法であって、当該方法が、
ｉ）好適な宿主生体を提供し、
ｉｉ）ステップｉ）で提供された宿主生体を、項目１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または項目９に記載のベクターを用いてトランスフェクトまたは形質転換し、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた宿主生体を該ポリヌクレオチドまたはベクターによりエンコードされたポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして所望により
ｉｖ）宿主生体による組み換え発現の結果生じるポリペプチドを、その宿主生体から単離する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００４５】
（項目２７）  該宿主生体が、哺乳類細胞である、項目２６に記載の方法。
【００４６】
（項目２８）  アンチセンス法を用いて、細胞中のＰＡＰＰ−Ａ２の発現を阻害および／または減少させる方法であって、当該方法が、
ｉ）項目７に記載のポリヌクレオチドを提供し、
ｉｉ）ステップｉ）において提供される当該ポリヌクレオチドを用いて、ＰＡＰＰ−Ａ２を発現可能な細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において得られた細胞を、ＰＡＰＰ−Ａ２の発現に関与する当該細胞において、ステップｉ）で提供されたポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに好適な条件下で培養し、そして
ｉｖ）当該細胞においてＰＡＰＰ−Ａ２の発現を阻害および／または減少させる、
ことからなるステップを含む、方法。
【００４７】
（項目２９）  該アンチセンスポリヌクレオチドおよび該相補的なポリヌクレオチドが、別々のポリヌクレオチド分子から同時発現される、項目２８に記載の方法。
【００４８】
（項目３０）  個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）から得た生物学的サンプルにおけるＰＡＰＰ−Ａ２の検出法、あるいはＰＡＰＰ−Ａ２レベル（ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ＰＡＰＰ−Ａ２）の測定法であって、当該方法が、
ｉ）当該個体から生物学的サンプルを得て、
ｉｉ）そのサンプルにおいて、
ａ）項目１２に記載のポリペプチド；および／または
ｂ）ＰＡＰＰ−Ａ２発現に由来するｍＲＮＡ形態のポリヌクレオチド、および／または
ｃ）好ましくはＩＧＦＢＰ−５、その誘導体の開裂、またはＰＡＰＰ−Ａ２に対する他の任意の好適な基質を検出することによる、ＰＡＰＰ−Ａ２特異的プロテアーゼ活性、
を検出することによりサンプル中のＰＡＰＰ−Ａ２を検出する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００４９】
（項目３１）  該方法が、ステップｉｉ）で検出されたＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２レベルを、
ｉ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２の量および／または濃度；および／または
ｉｉ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡの量および／または濃度；および／または
ｉｉｉ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２特異的なプロテアーゼ活性、
からなる群から選ばれる予め決められた値と比較することからなるステップを更に含む、項目３０に記載の方法。
【００５０】
（項目３２）  該予め決められた値が、当該個体の正常な生理学的（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）状態を示す、項目３１に記載の方法。
【００５１】
（項目３３）  該生物学的サンプルが、血液、尿、胸腔内液、口腔洗浄液、組織バイオパシー、および卵胞液からなる群から選ばれる、項目３０に記載の方法。
【００５２】
（項目３４）  該ＰＡＰＰ−Ａ２レベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２特異的プロテアーゼ活性として測定される、項目３０に記載の方法。
【００５３】
（項目３５）  該ＰＡＰＰ−Ａ２レベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白の量として測定される、項目３０に記載の方法。
【００５４】
（項目３６）  該ＰＡＰＰ−Ａ２レベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２のメッセンジャーＲＮＡの量として測定される、項目３０に記載の方法。
【００５５】
（項目３７）  該ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白量が、免疫化学的分析により測定される、項目３５に記載の方法。
【００５６】
（項目３８）  該ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白量が、少なくとも１つのモノクローナル抗体により検出される、項目３７に記載の方法。
【００５７】
（項目３９）  該ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白が、少なくとも１つ更なる成分を含む複合体、好ましくはポリペプチドにおいて検出される、項目３０に記載の方法。
【００５８】
（項目４０）  該ＰＡＰＰ−Ａ２が、ＰＡＰＰ−Ａ２単量体として検出される、項目３０に記載の方法。
【００５９】
（項目４１）  該ＰＡＰＰ−Ａ２が、ＰＡＰＰ−Ａ２二量体として検出される、項目３０に記載の方法。
【００６０】
（項目４２）  個体における病態の診断法であって、当該方法が、
ｉ）項目３０〜４１のいずれかに記載の方法を実施し、そして
ｉｉ）その病態を診断する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００６１】
（項目４３）  該病態が、胎児異常である、項目４２に記載の方法。
【００６２】
（項目４４）  該胎児異常が、トリソミー２１、トリソミー１８、トリソミー１３、および開放型二分脊椎からなる群から選ばれる、項目４３に記載の方法。
【００６３】
（項目４５）  該胎児異常が、子宮外妊娠、開放型二分脊椎、神経管閉鎖障害、腹部壁欠損、Ｅｄｗａｒｄｓ症候群、Ｐａｔｅａｕｓ症候群、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、モノソミーＸ、またはＫｌｅｉｎ−ｆｅｌｔｅｒ’ｓ症候群である、項目４３に記載の方法。
【００６４】
（項目４６）  該病態が、成長促進状態および成長阻害状態からなる群から選ばれる異常な成長状態である、項目４３に記載の方法。
【００６５】
（項目４７）  該病態が、再狭窄、アテローム性心筋梗塞、創傷治癒、線維症、心筋梗塞、骨粗鬆症、リュウマチ性関節炎、多発性骨髄腫、または癌からなる群から選ばれる、項目４６に記載の方法。
【００６６】
（項目４８）  生物学的サンプルにおける項目１に記載のポリヌクレオチドの発現検出法であって、当該方法が：
ｉ）項目１に記載のポリヌクレオチドを推定で含有する生物学的サンプルを提供し、そして
ｉｉ）その生物学的サンプルを、ｉ）項目１に記載のポリヌクレオチドに相補的な、およびｉｉ）それとハイブリダイズ可能な、鎖を含むポリヌクレオチドと接触させ、そして
ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションが起こさせ、そして
ｉｖ）ステップｉｉｉ）で得られたハイブリダイゼーション複合体を検出する、
ことからなるステップを含み、
該ハイブリダイゼーション複合体の存在が、項目１に記載のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントの生物学的サンプルにおける発現を示している、方法。
【００６７】
（項目４９）  ＰＡＰＰ−Ａ２のプロテアーゼ活性を阻害する薬剤の同定法であって、当該方法が、
ｉ）ａ）項目１２に記載のポリペプチド、およびｂ）当該ポリペプチドに対して予め決められた基質、およびｃ）推定の阻害剤をインキュベートし、そして
ｉｉ）該基質の蛋白分解が阻害されるかどうかを決定する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００６８】
（項目５０）  該基質が、ポリペプチドを含む、項目４９に記載の方法。
【００６９】
（項目５１）  該基質が、内部でクエンチングする蛍光性ペプチドを含む、項目５０に記載の方法。
【００７０】
（項目５２）  該基質が、ＩＧＦＢＰ−５またはそのフラグメントを含むか、あるいはそれから本質的に構成される、項目５０に記載の方法。
【００７１】
（項目５３）  項目４９〜５２のいずれかの方法のいずれかに従って得られる、阻害剤。
【００７２】
（項目５４）  病態の処置を必要とする個体においてその病態を処置するための薬物の製造における、項目５３に記載の阻害剤の使用。
【００７３】
（項目５５）  ＰＡＰＰ−Ａ２のプロテアーゼ活性を促進する薬剤の同定法に関し、当該方法が、
ｉ）ａ）項目１２に記載のポリペプチド、およびｂ）当該ポリペプチドに対して予め決められた基質、およびｃ）推定の促進剤をインキュベートし、そして
ｉｉ）該基質の蛋白分解が促進されるかどうかを決定する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００７４】
（項目５６）  該基質が、ポリペプチドを含む、項目５３に記載の方法。
【００７５】
（項目５７）  該基質が、内部でクエンチングする蛍光性ペプチドを含む、項目５４に記載の方法。
【００７６】
（項目５８）  該基質が、ＩＧＦＢＰ−５またはそのフラグメントを含むか、あるいはそれから本質的に構成される、項目５４に記載の方法。
【００７７】
（項目５９）  項目５４〜５７のいずれかの方法のいずれかに従って得られる、促進剤。
【００７８】
（項目６０）  病態の処置を必要とする個体においてその病態を処置するための薬物の製造における、項目５９に記載の促進剤の使用。
【００７９】
（項目６１）  個体の治療による処置法であって、当該方法が、ｉ）項目２１に記載の医薬組成物、および／またはｉｉ）項目５３に記載の阻害剤、および／または項目５９に記載の促進剤を、当該個体に投与することからなるステップを含む、方法。
【００８０】
（項目６２）  ＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２の他の蛋白との複合体の精製法であって、当該方法が、
ｉ）項目１２に記載のポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供し、そして
ｉｉ）ＰＡＰＰ−Ａ２をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する、ことからなるステップを含む、方法。
【００８１】
（項目６３）  個体における該病態の診断法、または当該病態の素因の診断法であって、当該方法が、
ａ）当該個体からの体液サンプルを提供し；そして
ｂ）当該組体液サンプル中のＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ、およびｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ／Ｃ３ｄｇからなる群から選ばれる複合体のレベルを測定し；そして
ｃ）病態または病態の素因を診断（予め決められた値より上または下の複合体レベルが病態または病態の素因を示す）する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００８２】
（項目６４）  哺乳類の胎児における病態を診断法、または当該病態の素因の診断法であって、当該方法が、
ａ）当該胎児の母親からの体液サンプルを提供し；そして
ｂ）当該体液サンプル中のＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ、およびｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ／Ｃ３ｄｇからなる群から選ばれる複合体のレベルを測定し；そして
ｃ）病態または病態の素因を診断（予め決められた値より上または下の複合体レベルが病態または病態の素因を示す）する、
ことからなるステップを含む、方法。
【００８３】
（項目６５）  該病態が、ダウン症、子癇前症、および不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群からなる群から選ばれる、項目６３および６４のいずれかに記載の方法。
【００８４】
（項目６６）  該複合体が、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰであって、該病態が、ダウン症、および不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群から選ばれる、項目６３および６４のいずれかに記載の方法。
【００８５】
（項目６７）  該複合体が、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧであって、該病態が、ダウン症である、項目６３および６４のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１ａ】ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡの配列図である。
【図１ｂ】ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡの配列図であり、図１ａの続きである。
【図１ｃ】ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡの配列図であり、図１ｂの続きである。
【図２】アミノ酸配列に翻訳されたときのＰＡＰＰ−Ａと、ＰＡＰＰ−Ａの配列伸長部との間の相関関係を示し、またＰＡＰＰ−Ａの中央領域と相同性のあるｃＤＮＡ配列を得る方法を示す図である。
【図３】ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａと整列したｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２のアミノ酸配列を示した図である。
【図４】ＰＡＰＰ−Ａ２をウエスタンブロッティングおよびクマシー染色した図である。
【図５】ＩＧＦＢＰ−１〜６に対するＰＡＰＰ−Ａ２活性を示した図である。
【図６】ＩＧＦＢＰ−５に対するＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性を示した図である。
【図７ａ】ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡコード化領域のｃＤＮＡ配列を示した図である。
【図７ｂ】ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡコード化領域のｃＤＮＡ配列を示した図であり、図７ａの続きである。
【図８】ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体中のＰＡＰＰ−Ａサブユニットのジスルフィド構造、ＰＡＰＰ−Ａの推定のドメイン、およびＰＡＰＰ−Ａの遺伝子構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
定義
本明細書で使用されるように、ＰＡＰＰ−Ａ２とは、本明細書に定義されるような図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）を有する単離されたＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドまたはその変異体をいう。本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２またはその変異体は、組み換えＤＮＡ技術により生成され得るか、あるいは該ＰＡＰＰ−Ａ２が自然発生し得る。
【００８８】
ヌクレオチド配列をエンコードするＰＡＰＰ−Ａ２とは、本明細書に定義されるような図１に示される配列（配列番号１）を有する単離された核酸をいう。
【００８９】
「活性のある」とは、任意の自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２の生物学的および／または免疫学的活性を保持しているＰＡＰＰ−Ａ２の形態をいう。
【００９０】
「自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２」とは、遺伝学的に作られたものではないヒト細胞より生成されたＰＡＰＰ−Ａ２をいい、特にアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化反応、脂質付加反応、アシル化、または他のポリペプチドと共有結合または非共有結合性の複合形態を含むがそれに限定されない、ポリペプチドの翻訳後修正により生ずる様々なＰＡＰＰ−Ａ２が考えられる。
【００９１】
「単離されたポリペプチド」とは、ある蛋白質、あるいはその変異体またはフラグメントであり、蛋白化学の分野においては既知の常法により評価されるように特定の調製物のうち９０％またはそれ以上の蛋白含量からなる。
【００９２】
「誘導体」とは、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性ヌクレオチド、様々な酵素等を用いる）、ペグ化（ポリエチレングリコールを用いる誘導体化）といった化学修飾により、またはオルニチンといったアミノ酸の挿入（または化学合成によるアミノ酸の置換）により自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２から誘導されるポリペプチドをいい、これは通常ヒト蛋白では生じない。
【００９３】
「組み換え変異体」とは、組み換えＤＮＡ技術により作られた、アミノ酸の挿入、欠失、および置換による自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２とは異なる任意のポリペプチドをいう。どのアミノが酸残基が、蛋白分解活性または細胞接着性といった目的の活性を失うことなく、置換されたり、付加されたり、欠失されたりし得るかを決定する際の情報は、例えば構造的に類似の蛋白（例えば、他のメトジンシンファミリープテアーゼ）を用いて、既知のジスルフィド構造からなる局部的に相同する蛋白を用いて、または二次構造の予測により、ＰＡＰＰ−Ａ２の一部分の配列を比較することにより見い出し得る。
【００９４】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、限定ではないが、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との置換、あるいはスレオニンのセリンとの置換といった、すなわち１つのアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置換、すなわち同類アミノ酸置換の結果である。本明細書で使用されるような「置換」なる用語の意味の範囲にある更なる例示および定義は、本明細書の以下の本発明の詳細な説明において提供されている。
【００９５】
アミノ酸「挿入」または「欠失」は、典型的には約１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸といった約１個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、例えば約１個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸といった約１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸の範囲である。可能な変異体は、組み換えＤＮＡ技術を用いて系統的にＰＡＰＰ−Ａ２分子中にアミノ酸の挿入、欠失、または置換し、その結果生成する組み換え変異体を活性についてアッセイすることにより実験的に決定され得る。
【００９６】
所望される場合、「シグナルまたはリーダー配列」は、細胞膜を通るポリペプチド（完全長のＰＡＰＰ−Ａ２、またはそのＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドの一部分）を示し得る。このような配列は、本発明のポリペプチド上に天然に存在し得るか、あるいは組み換えＤＮＡ技術により異種の蛋白源から提供され得る。
【００９７】
ポリペプチド「フラグメント」、「部分」、または「セグメント」とは、様々な実施態様において、少なくとも約５個のアミノ酸、しばしば少なくとも約７個のアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個のアミノ酸、例えば少なくとも約１７個以上のアミノ酸のアミノ酸残基の伸長部である。それは、長さがインタクトなＰＡＰＰ−Ａ２までの更に長い残基の伸長部であってもよい。活性となるために、いかなるＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドまたはＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドフラグメントも、そのままで、あるいはキーホール  リムペット  ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）といったキャリアー蛋白と結合したときに生物学的および／または免疫学的活性を呈するのに十分な長さを有さねばならない。
【００９８】
「オリゴヌクレオチド」またはポリヌクレオチド「フラグメント」、「部分」、もしくは「セグメント」は、ＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドフラグメントの発現に有益な配列をエンコードするＰＡＰＰ−Ａ２の伸長部である。それはまた、典型的にはｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子の関連する部分を増幅したり明らかにするためのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション法において使用可能なヌクレオチド残基の伸長部でもあり得る。特に、オリゴヌクレオチドプローブの一方または両方は、いかなる既知のまたは従来技術の分子とも同一性または相補性のないＰＡＰＰ−Ａ２の一部分と同一または相補的である配列を含むであろう。この目的で、当該オリゴヌクレオチドプローブは、一般的には約１０個のヌクレオチド〜５０個のヌクレオチド、および好ましくは約１５個のヌクレオチド〜約３０個ヌクレオチドを含むであろう。
【００９９】
本明細書において使用されるように「動物」とは、ヒト、家庭用または農耕用（ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ等）または試験用（マウス、ラット、ラビット等）の種を含むと定義され得る。
【０１００】
「組み換え」とはまた、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードし、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されるポリヌクレオチドをいい得る。ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするＤＮＡは、対立遺伝子または組み換え変異体およびその突然変異体をも含み得る。
【０１０１】
「核酸プローブ」は、本発明により提供されるＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡ配列をベースにして調製される。核酸プローブは、約６ｋｂよりも少ないヌクレオチド、通常は約１ｋｂよりも少ないヌクレオチドを有する配列部分を含む。偽陽性部を削除するために適当な試験をした後、これらのプローブをは、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｍＲＮＡが細胞または組織中に、または（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  １，  ２４１−５０）に記載されるような細胞または組織から抽出した類似の染色体ＤＮＡ由来の核酸配列を単離するために存在するかどうかを決定するために使用され得る。プローブは、自然発生的な、まは組み換え１本または２本鎖の核酸から誘導され得るか、あるいは化学的に合成され得る。それらは、ニックトランスレーション法、Ｋｌｅｎｏｗ  フィルイン反応、ＰＣＲ法、または当業者には周知の他の方法により標識され得る。本発明のプローブ、それらの調製および／または標識化は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）；または（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に詳しく示されている。
【０１０２】
別法としては、これらのＰＡＰＰ−Ａ２または類似のポリペプチドをエンコードする組み換え変異体を合成したり、遺伝子コード中の「重複性」を使用することにより選択したりしてもよい。様々な制限部位を提供するサイレント変化といった様々なコドン置換体が、プラスミドまたはウィルス性ベクター中へのクローニング、あるいは特定の原核または真核系統における発現を最適化するために導入されてもよい。制限されないが活性、鎖間のアフィニティー、あるいはポリペプチドの分解または代謝回転率を含む、ポリペプチドの特性を改変するために突然変異が導入されてもよい。一例としては、より小さい分子量の分子を提供するために、停止コドンをヌクレオチド配列中に挿入してＰＡＰＰ−Ａ２のサイズを制限することが挙げられる。
【０１０３】
「発現ベクター」は、遺伝子のクローン化コピーの転写および適当な宿主中におけるｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として本明細書に定義されている。このようなベクターは、バクテリア、酵母、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞といった様々な宿主において、真核生物遺伝子を発現するために使用可能である。
【０１０４】
本明細書で使用されるように、「抗体」なる用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびに抗原またはハプテンに結合可能なＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２といったそれらのフラグメントを含む。それは、従来のマウスモノクローナル抗体ならびにヒト抗体、およびヒト以外の抗体のヒト化形態を含み、そしてそれはまた、ファージ抗体ライブラリーから単離した「抗体」をも含む。
【０１０５】
「リボザイム」とは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒可能な酵素のＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的なターゲットＲＮＡへの配列特異的なハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断型開裂を包含する。本発明の範疇で、ＰＡＰＰ−Ａ２のＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断型開裂を特異的かつ効率的に触媒するハンマーヘッド型リボザイム分子が作られる。いかなる潜在的なＲＮＡターゲット内の特異的なリボザイム開裂部位も、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位に対するターゲット分子をスキャンすることにより最初に同定される。いったん同定されると、開裂部位を含むターゲット遺伝子の領域に相当する１５〜２０個の間のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチド配列を不安定にし得る二次構造といった予測される構造特性について評価され得る。候補ターゲットの適合性もまた、リボヌクレアーゼ蛋白アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのし易さを試験することにより評価され得る。
発明の詳細な説明
ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列の単離
本発明は１つの態様において、妊娠関連血漿蛋白−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）と全体的に相同性のある蛋白をエンコードする新規なｃＤＮＡ配列に関する。この蛋白は、ＰＡＰＰ−Ａ２と示されている。ＰＡＰＰ−Ａ２の完全なヌクレオチド配列は、ヒトの胎盤から単離されたｍＲＮＡから得られる（実施例１）。その完全なヌクレオチド配列（配列番号１）および翻訳されたＰＡＰＰ−Ａ２のアミノ酸配列（配列番号２）の両方が図１に示されている。
【０１０６】
ＰＡＰＰ−Ａ２のＰＡＰＰ−Ａとの相同性は、図３に示すように２つのアミノ酸配列の整列化により明らかになる。ＰＡＰＰ−Ａ２およびＰＡＰＰ−Ａは、およそ４５％のアミノ酸残基を共有する。ＰＡＰＰ−Ａの機能（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，  ３１４９−５３；Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）に重要と考えられる配列モチーフが、ＰＡＰＰ−Ａ２においても見い出されている。原則的には、ＰＡＰＰ−Ａ２は、７３３〜７４３位に伸張された亜鉛結合モチーフ（１文字表記により示されるアミノ酸）を含有する（図２）。このモチーフおよび構造的に重要なメチオニン残基は、厳密的には亜鉛ペプチダーゼのスーパーファミリーである、メトジンシン内に保持されている（Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３３１，  １３４−４０；Ｓｔｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４，  ８２３−４０）。
【０１０７】
ＰＡＰＰ−Ａと同様に、ＰＡＰＰ−Ａ２は、ｐｒｅｐｒｏ蛋白として合成される。ＰｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２は、１７９１個のアミノ酸を有する（図１）。ＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２のｐｒｅｐｒｏ部分間には、相同性はない。更に、該２つの蛋白のｐｒｅｐｒｏ部分は、長さにおいては有意に差はない。ＰＡＰＰ−Ａ２ｐｒｅｐｒｏペプチドは、２３３個の残基を有し（図３）；ＰＡＰＰ−Ａｐｒｅｐｒｏペプチドは、８０個の残基を有する（Ｈａａｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７，  １５９−６３）。
ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列の使用
ＰＡＰＰ−Ａ２（またはそのコンプリメント）をエンコードするヌクレオチド配列は、分子生物学の当業者には既知の技術において非常に多くの用途がある。これらの技術としては、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲに対するオリゴマーの構築における使用、ＰＡＰＰ−Ａ２またはそのフラグメントの組み換え生成における使用、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、それらの化学的類似物（例えばＰＮＡまたはＬＮＡ）等の産生における使用が挙げられる。本明細書において開示されるＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチドの使用は、既知の技術の例示であり、当業者には既知のいかなる技術の使用をも制限する意図はない。更に、本明細書において開示されるヌクレオチド配列は、新しい技術が、例えば、３つの遺伝子コード、特異的塩基対の相互作用が現在既知であるヌクレオチド配列の特性次第であるならば、まだ開発されていない分子生物学的技術において使用され得る。
【０１０８】
該遺伝子コードの縮重の結果、多数のＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列が、幾分任意の既知のおよび自然発生的な遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性を有して生成され得ることが、当業者により理解されるであろう。本発明は、可能なコドン選択に基づいた組み合わせを選択することにより作成され得るヌクレオチド配列の可能なバリエーションのそれぞれまたはすべてを特に考えている。これらの組み合わせは、自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２のヌクレオチド配列に適用されるような標準的な３つの遺伝子コードに従って作られ、特に開示されるように、そのバリエーションのすべてが考えら得る。
【０１０９】
ＰＡＰＰ−Ａ２および／またはその変異体をエンコードするヌクレオチド配列は、好ましくは厳密な条件下で、自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能であるけれども、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列または実質的には異なるコドン使用を有するその誘導体を生成することは有利であり得る。コドンは、特定のコドンが宿主により利用される頻度に従って、特に原核生物または真核生物の発現宿主においてペプチドの発現が起こる速度を上げるよう選択可能である。ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列および／またはその誘導体を、そのエンコードされたアミノ酸配列を変えないで実質的に変える他の理由としては、自然発生的な配列から生成される転写物より長い半減期といった、より所望される特性を有するＲＮＡ転写物の生成が挙げられる。
【０１１０】
ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列は、十分に確立された組み換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）を用いて、様々な他のヌクレオチド配列に結合され得る。ＰＡＰＰ−Ａ２へ結合するのに有益なヌクレオチド配列としては、例えばプラスミド、コスミド、ラムダ・ファージ誘導体、ファージミド等の当業者には周知の各種クローニングベクターが挙げられる。対象のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクター、配列決定ベクター等が挙げられる。一般的には、対象のベクターは、少なくとも１つの生体において複製機能の発生源、すなわち簡単な制限エンドヌクレアーゼ感受性部位、および、宿主細胞に対する選択マーカーを含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明の別の態様は、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする自然発生的なヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能なＰＡＰＰ−Ａ２特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することである。当該プローブはまた、同様のＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする配列の検出に使用され得、好ましくは保存領域または活性部位由来の少なくとも５０％のヌクレオチドを含有するはずである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１のヌクレオチド配列から、またはプロモーター、エンハンサー要素および／またはそれぞれの自然発生的なＰＡＰＰ−Ａ２を含む可能なイントロンを含む、ゲノム配列から誘導され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐまたは３５Ｓといった放射性核種、またはアビジン／ビオチンカップリング系等を介してプローブに結合したアルカリフォスファターゼといった酵素標識を含む、様々なレポーター群により標識され得る。
【０１１２】
米国特許第４，６８３，１９５号および第４，９６５，１８８号に記載されるように、ＰＣＲは、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドの更なる使用を提供する。ＰＣＲにおいて使用される当該プローブは、組み換え起源からなるものであってもよく、化学的に合成されてもよく、あるいはその混合であり、そして診断的用途のための分離したヌクレオチド配列、または非常に関連するゲノム配列の同定のための縮重した可能な配列のプールを含む。
【０１１３】
ＰＡＰＰ−Ａ２  ＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを生成する他の手段としては、ＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２の誘導体をエンコードする核酸配列の、ｍＲＮＡプローブの生成用ベクター中へのクローニングが挙げられる。そのようなベクターは、当該分野では既知であり、市販で利用可能であり、そしてインビトロでＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼおよび適当に放射活性標識したヌクレオチドの付加によりＲＮＡプローブを合成するのに使用され得る。
【０１１４】
ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするＤＮＡ配列またはその一部分を完全に合成化学により生成することが可能であり、その後遺伝子をこの特許の出願時に当分野において既知である試薬、ベクター、および細胞を用いて多くの利用可能なＤＮＡベクターのいずれか中に挿入可能である。更に、ＰＡＰＰ−Ａ２配列またはその任意の部分中に変異を導入するのに、合成化学が利用されてもよい。
【０１１５】
異常レベルのＰＡＰＰ−Ａ２発現に関係する疾患を検出するためのアッセイにおいて、該ヌクレオチド配列が利用可能である。該ヌクレオチド配列は、当該分野において既知の方法により標識され、ハイブリダイズ条件下で、患者からの体液または組織サンプルに添加可能である。インキュベーション期間後、ヌクレオチドが酵素により標識されるのであれば、そのサンプルを、所望により染料（または現像液を必要とする他の標識）を含有する適合流体で洗浄する。その適合流体を洗い流した後、染料を定量し、スタンダードと比較する。別法としては、ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡのレベルは、固定のプローブを用いるマイクロアレイ法により測定可能である。サンプル中における発現は、（半定量的な）ＲＴ−ＰＣＲによっても評価可能である。サンプル中における発現は、別法としてハイブリダイゼーションをベースにした方法によっても評価可能である。例えば、インサイツハイブリダイゼーション法は、ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡを検出するのに使用可能である。この方法は、ｍＲＮＡを合成する細胞を示すという利点を有するが、ＲＴ−ＰＣＲよりも感受性が低い。
【０１１６】
アンチセンスＲＮＡとＤＮＡ分子、およびＰＡＰＰ−Ａ２の翻訳を阻害する機能を有するリボザイムを含むオリゴリボヌクレオチド配列が、本発明の範疇に含まれる。アンチセンス法は、当該分野では既知であり、本明細書において適用され得る。本発明のアンチセンスＲＮＡとＤＮＡ分子、およびリボザイムが両方とも、ＲＮＡ分子の合成のために、当該分野で既知の任意の方法により調製され得る。これらは、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成といった当該分野では周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成する技術を含む。別法としては、ＲＮＡ分子は、当該アンチセンスＲＮＡ分子をエンコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボでの転写により産生され得る。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターといった好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを導入する広範なベクター中に導入され得る。別法としては、使用されるプロモーター次第で、構成的にまたは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株中に安定に導入可能である。
【０１１７】
本発明は、他の種から単離した未知のＰＡＰＰ−Ａ２遺伝子およびそのＰＡＰＰ−Ａ２遺伝子の対立遺伝子に関し、その中にはＰＡＰＰ−Ａ２類似遺伝子または相同遺伝子が存在する。本明細書に示されたヒトＰＡＰＰ−Ａ２クローンの放射活性標識フラグメントを用いて、緩和された厳密条件下においてバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーが、スクリーニングされ得る。別法として、そのヒトＰＡＰＰ−Ａ２配列は、ＰＣＲプローブとして、またはバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用可能な縮重した、または完全に縮重したオリゴヌクレオチドプローブをデザインするために使用可能である。そのＰＣＲ生成物は、サブクローニングされ、増幅された配列がＰＡＰＰ−Ａ２配列を示すことを保証するために配列決定され得る。そのＰＣＲフラグメントは、増幅フラグメントを放射活性標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、完全長のＰＡＰＰ−Ａ２クローンを単離するために使用され得る。別法として、その標識化フラグメントは、ゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。使用され得るクローニング法の概説については、例えば（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）が参照される。
組み換えＰＡＰＰ−Ａ２の発現
生物学的に活性なプロテアーゼを発現するために、その蛋白または機能的等価物に対してコードされるヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたコード化配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に挿入可能である。例えば、組み換え蛋白は、免疫化して実験試薬としておよび診断キットにおいて抗体を得るために使用可能である。
【０１１８】
より具体的には、当業者に周知な方法が、ＰＡＰＰ−Ａ２配列および適当な転写／翻訳の制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するのに利用可能である。これらの方法としては、インビトロでの組み換えＤＮＡ法、合成法、およびインビボでの組み換え／遺伝的組み換えが挙げられる。例えば（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に示される方法を参照。
【０１１９】
更に、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする配列のフラグメントを含む発現ベクターが構築されてもよい。特に、これは、免疫用抗原としてのＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドの一部分の使用に関連し得る。更に、ＰＡＰＰ−Ａ２またはそのフラグメントのコード化配列が、ベクター中に存在するコード化ヌクレオチド配列を有するフレーム中でクローンされ得、その結果、融合蛋白または「タグ化」ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白となる。例えば、当該融合蛋白は、ＰＡＰＰ−Ａ２およびＧＳＴから構成されてもよく、当該タグが、ｃ−ｍｙｃタグ（検出用）および／またはヒスチジンタグ（精製用）であってもよい。
【０１２０】
様々な宿主−発現ベクター系が、ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列またはそのフラグメントを発現するために利用され得る。これらは、ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換したバクテリア；ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列を含有する組み換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母；ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列を含有する組み換えウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）を用いて感染させた昆虫細胞系統；ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列を含有する組み換えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）を用いて感染させた、あるいはＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系統；または安定に増幅された（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）、あるいは２つの小さな染色体（例えば、マウスの細胞株）中で不安定に増幅された、いずれかの多数のＰＡＰＰ−Ａ２  ＤＮＡの複製を含有するように作成された細胞株を含む組み換えウィルス発現ベクター（例えば、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、ヒト腫瘍細胞）を用いて感染させた動物細胞系統といった微生物体を含むがそれに限定されるわけではない。
【０１２１】
これらの系統の発現要素は、強度および特性が様々である。利用される宿主／ベクター系統次第で、構成的および誘導的プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素が、発現ベクターにおいて利用され得る。例えば、バクテリア系統においてクローニングする場合、バクテリオファージ・ラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、  ｐｔｒｐ、  ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等といった誘導プロモーターが使用され得；昆虫細胞系統においてクローニングする場合、バキュロウィルス多角体プロモーターといったプロモーターが使用され得；植物細胞系統においてクローニングする場合、植物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニットに対するプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合蛋白に対するプロモーター）または植物ウィルスから誘導されるプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコート蛋白プロモーター）が使用され得；哺乳類細胞系統においてクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムから誘導され得プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウィルスから誘導されるプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、アデノウィルス後期プロモーター；ワクシンウィルスの７．５Ｋのプロモーター）使用され得；ＰＡＰＰ−Ａ２  ＤＮＡの複数の複製を含有する細胞株を産生する場合、ＳＶ４０、ＢＰＶ、およびＥＢＶベースのベクターが適当な選択マーカーと一緒に使用され得る。
【０１２２】
形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むがそれに限定されない多数の方法のうちの任意の１つを介して、該発現ベクターを宿主細胞中に導入し得る。その発現ベクターを含有する細胞を、それがＰＡＰＰ−Ａ２蛋白を生成するかどうかを決定するためにクローンで増殖し、個々に分析する。ＰＡＰＰ−Ａ２を発現する宿主細胞クローンの同定は、抗ＰＡＰＰ−Ａ２抗体との免疫反応性を含むがそれに限定されない数種の手段、および宿主細胞関連ＰＡＰＰ−Ａ２活性の存在によりなされ得る。
【０１２３】
バクテリア系統において、多数の発現ベクターが、発現されたＰＡＰＰ−Ａ２の予定の使用される使用次第で有利に選択され得る。例えば、大量のＰＡＰＰ−Ａ２生成される予定である場合、容易に精製され得る融合蛋白生成物の高レベルの発現を導くベクターが所望となり得る。そのようなベクターとしては、大腸菌発現ベクター、ｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，  １９８３，  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２，  １７９１−４）が挙げられるがそれに限定されず、当該ベクターにおいてＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列は、ハイブリッドＡＳ−ｌａｃＺ蛋白を生成するよう、ｌａｃＺコード化領域を有するフレーム内のベクター中にリゲートされ得る。ｐＧＥＸベクターはまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として外来のポリペプチドを発現するために使用され得る。一般的に、そのような融合蛋白は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで遊離型のグルタチオンの存在中での溶出により可溶化細胞から容易に精製可能である。目的のクローン化ポリペプチドがＧＳＴ部分から遊離可能となるよう、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むようにｐＧＥＸベクターがデザインされる。酵母において、構成的または誘導的プロモーターを含有する多数のベクターが使用され得る。概説については、（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３，  ５１６−４４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  １９９９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３０６，  １５４−６９）参照。
【０１２４】
植物発現ベクターが使用される場合、ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列の発現は、多数のプロモーターのうちのいずれかにより引き起こされ得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡ  プロモーターといったウィルスプロモーター（Ｇｍｕｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｈｌｉ，  １９８９，  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２０，  ９５−１０１）；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニットといった植物プロモーター（Ｂｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，  ８３８−４３）が使用され得る。
【０１２５】
ＰＡＰＰ−Ａ２を発現するために使用可能な代替の発現系は、昆虫系統である。そのような系においては、バキュロウィルスが、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。その後、ウィルスは、昆虫細胞において成育する。ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列が、ウィルスの非必須領域（例えば、多角体遺伝子）中でクローン化されて、バキュロウィルスプロモーターの制御下に置かれてもよい。次いで、これらの組み換えウィルスは、挿入された遺伝子が発現される昆虫細胞を感染するために使用される。例えば（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，  ２１５６−６５）参照。
【０１２６】
様々な哺乳類の発現ベクターが、哺乳類細胞中で組み換えＰＡＰＰ−Ａ２を発現するために使用され得る。組み換えＰＡＰＰ−Ａ２発現に好適となり得る市販で入手可能な哺乳類の発現ベクターとしては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＴＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｃＤＮＡ３．１およびその誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられるがそれに限定されない。好適となり得、かつ市販で入手可能である哺乳類種由来の細胞株としては、ＣＶ−１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、Ｃ１２７Ｉ、ＢＳ−Ｃ−１、ＭＲＣ−５および２９３が挙げられるがそれに限定されない。更に、哺乳類の宿主細胞においで、多数のウィルスベースの発現系が利用され得る。発現ベクターとしてアデノウィルスが使用される場合においては、ＰＡＰＰ−Ａ２コード化配列が、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３つのリーダー配列にリゲートされ得る。次に、このキメラ遺伝子が、インビトロまたはインビボの組み換えによりアデノウィルスゲノム中に挿入され得る。ウィルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１またはＥ３領域）への挿入により、生育可能で感染宿主中でＰＡＰＰ−Ａ２が発現可能な組み換えウィルスとなるであろう。例えば（Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，  １９８４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８１，  ３６５５−９）参照。別法としては、ワクシニアの７．５Ｋのプロモーターが使用されてもよい。例えば（Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７９，  ７４１５−９）参照。
【０１２７】
長期間にわたる高収率の組み換え蛋白生成のために、安定した発現が好ましい。例えば、ＰＡＰＰ−Ａ２を安定に発現する細胞株が作成されてもよい。複製のウィルス源を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、適当な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択マーカーにより制御されたＰＡＰＰ−Ａ２  ＤＮＡを用いて形質転換可能である。外来ＤＮＡの導入に続いて、作成された細胞が、栄養強化培地において１〜２日間生育され得、その後、選択培地に交換される。組み換えプラスミド中の選択マーカーは、その選択に耐性を与え、そして細胞が安定にそのプラスミドを染色体に組み入れ、増殖して病巣を形成するのを可能にし、次にクローン化され細胞株中に拡大可能となる。
【０１２８】
組み換えＰＡＰＰ−Ａ２の適用のいくつかは、その蛋白を精製されたあるいは一部精製された形態にする必要があり得る。組み換えにより発現したＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドのフラグメントは、液体クロマトグラフィーによって単離可能である。当該分野において周知の様々な蛋白精製法としては、例えば（Ｓｃｏｐｅｓ，  １９８７）に示されている方法が挙げられる。別法としては、組み換えＰＡＰＰ−Ａ２融合蛋白、または「タグ化」ＰＡＰＰ−Ａ２がアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。更に、ＰＡＰＰ−Ａ２対して産生される抗体が、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製のために使用され得る。
【０１２９】
ＰＡＰＰ−Ａ２の組み換え変異体が、部位特異的突然変異誘発により生成され得る。ＰＡＰＰ−Ａ２の適用の中には、こういった変異体が、例えば蛋白安定性の増大、または活性の変化のために好ましくなり得るものもある。
ＰＡＰＰ−Ａ２に対する抗体の生成と使用
組み換え蛋白が抗体を産生するのに使用され得る。ＰＡＰＰ−Ａ２に対する単一特異的抗体が、ＰＡＰＰ−Ａ２に対して反応性のある抗体を含有する哺乳類の抗血清から精製可能であり、あるいは標準的な方法を用いてＰＡＰＰ−Ａ２と反応可能なモノクローナル抗体として調製可能である。
【０１３０】
本明細書において使用されるように単一特異的抗体は、ＰＡＰＰ−Ａ２に対して同種結合特性を有する単一の抗体種または多数の抗体種として定義される。本明細書において使用されるように同種結合とは、上述に示すように、抗体種のＰＡＰＰ−Ａ２と関連する抗原といった特異的な抗原またはエピトープへの結合能をいう。ＰＡＰＰ−Ａ２特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等といった動物を（ラビットまたはマウスが好ましい）、免疫アジュバント有りあるいは無しのいずれかで、適当なＰＡＰＰ−Ａ２の濃度を用いて免疫することにより産生される。例えば、ＰＡＰＰ−Ａ２に対して特異的な抗体は、天然および組み換えＰＡＰＰ−Ａ２の精製用に、実験試薬として、および抗体ベースの診断用キットにおいて使用可能である。
【０１３１】
ＰＡＰＰ−Ａ２と反応可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、常法により、例えば同系交配マウスをＰＡＰＰ−Ａ２で免疫することにより調製可能である。該マウスは、約０．５ｍｌの緩衝液または生理食塩水中において等量の許容可能なアジュバントに組み込まれた約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＰＡＰＰ−Ａ２を用いて免疫される。フロイントの完全アジュバントが好ましい。該マウスは、０日目に初期免疫を受け、約３〜約３０週間休息させる。免疫化マウスは、約０．１〜約１０ｍｇのＰＡＰＰ−Ａ２をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）といった緩衝溶液で静注（ＩＶ）経路により、１度またはそれ以上追加免疫される。抗体陽性のマウス由来のリンパ節は、当該分野において既知の標準的な方法で免疫化マウスから脾臓を除去することにより得られる。ハイブリドーマ細胞は、安定なハイブリドーマが形成される条件下で、脾リンパ節を適当な融合相手と混合することにより生成される。融合されたハイブリドーマ細胞は、当該分野において既知の方法を用いて、ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテインを補充したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）での生育により選択される。約１４、１８、および２１日目で生育陽性のウェルから上清液をを回収し、固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）といったイムノアッセイによる抗体生成に対して、抗原としてＰＡＰＰ−Ａ２を用いてスクリーニングする。ｍＡｂのアイソトープを決定するために、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）沈降アッセイにおいて培養液も試験される。次に抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞がクローン化される。詳細については（Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ，  １９９２）参照。
【０１３２】
インビトロでの抗ＰＡＰＰ−Ａ２の生成は、十分な量の特異的ｍＡｂを得るために約２％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭにおけるハイブリドーマの生育により実施される。該ｍＡｂは、当該分野において既知の方法により精製される。  腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降法、受身凝集反応、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，  １９９５）を含むがそれに限定されない様々な血清学的または免疫学的アッセイにより決定される。
【０１３３】
「モノクローナル抗体」はまた、例えば（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，  ６２４−８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２，  ５８１−９７）に示されている方法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。同定されたファージ抗体は、バクテリアにおける発現により生成可能である。
【０１３４】
上述のような方法は、ＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドフラグメントまたは完全長の発生期のＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドに特異的な単一特異的抗体を生成するのに使用され得る。
【０１３５】
ＰＡＰＰ−Ａ２抗体アフィニティーカラムは、抗体をゲル支持体、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化されているゲル支持体Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に添加して、該抗体をアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成させることにより作成することができる。次いで、該抗体は、スペーサーアームによりアミド結合を介して該ゲルに結合される。残りの活性化エステルが、その後１Ｍ  エタノールアミン  ＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチングされる。そのカラムを、水、次いで０．２３Ｍ  グリシン  ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、いかなる非共役型抗体または外来蛋白をも除去する。次に、そのカラムをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、ＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントを含有する細胞培養上清または細胞抽出物をそのカラムにゆっくりと通過させる。次に、そのカラムを洗浄し、蛋白を溶出する。精製されたＰＡＰＰ−Ａ２蛋白を次に、リン酸緩衝生理食塩水で透析する。
【０１３６】
ヒト血漿または血清、組織抽出物、あるいはトランスフェクトされていない細胞株由来の培地といった起源（ＰＡＰＰ−Ａ２を内生に分泌する）由来の天然のＰＡＰＰ−Ａ２も、抗体アフィニティーカラムを使用することにより精製され得る。
【０１３７】
ＰＡＰＰ−Ａ２に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、体液または組織、および細胞抽出物中のＰＡＰＰ−Ａ２抗原の測定に多数のアッセイが実施され得る。診断の目的で、抗体ベースのキットが使用され得る。該アッセイとしては、沈降法、受身凝集反応、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法が挙げられるがそれに限定されない。
【０１３８】
例えば、そのようなＥＬＩＳＡの１つにおいて、サンプル中に存在する抗原が固定化ポリクローナル抗（ＰＡＰＰ−Ａ２）により獲得される場合、サンドイッチアッセイ法が実施可能である。次に、１つまたはそれ以上のモノクローナルＰＡＰＰ−Ａ２抗体およびペルオキシダーゼ共役抗（マウスＩｇＧ）を使用することにより、検出が実施される。別のアッセイにおいては、サンプル中に存在する抗原が、固定化ポリクローナル抗（ＰＡＰＰ−Ａ２）により獲得され、ビオチン化ポリクローナル抗（ＰＡＰＰ−Ａ２）を用いて検出される。更なる実施例および詳細については、（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，  １９９５）参照。アッセイは、精製されたＰＡＰＰ−Ａ２を用いて、キャリブレートして一連の希釈により標準曲線を構築することができる。精製された形態での溶液中のＰＡＰＰ−Ａ２濃度は、アミノ酸分析（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  １９９３，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  ３０，  ７８９−９４）により正確に測定可能である。
【０１３９】
ＰＡＰＰ−Ａ２の生物学的活性を阻害するために、ポリクローナル抗体が使用され得る。特異的に、ポリクローナルＰＡＰＰ−Ａ抗体によるＰＡＰＰ−ＡのＩＧＦＢＰ−４蛋白分解活性の阻害（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，  ３１４９−５３）と同様に、ＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性を阻害するために、抗（ＰＡＰＰ−Ａ２）が使用され得る。ＰＡＰＰ−Ａ２の活性に対して、特定のモノクローナル抗体がまた、抑制性となり得る。そのようなモノクローナル抗体は、ＰＡＰＰ−Ａ２の活性部位に非常に近接するエピトープを認識する傾向があるが、その阻害活性は、活性部位の近く以外のエピトープへの結合に基づくものであり得る。抑制性のモノクローナル抗体は、ＰＡＰＰ−Ａ２、ＰＡＰＰ−Ａ２から誘導されたペプチドを有するＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントの免疫により得ることができる。
【０１４０】
抑制性（モノクローナル）抗体は、ＰＡＰＰ−Ａ２活性を減少させるのに所望となり得る病状において治療的価値を有し得る。
ＰＡＰＰ−Ａ２の活性
ＰＡＰＰ−Ａと同様、ＰＡＰＰ−Ａ２は、メトジンシンスーパーファミリーの推定のメタロプロテアーゼ（Ｓｔｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４，  ８２３−４０）として分類される保存アミノ酸分岐鎖を含有する。ＰＡＰＰ−Ａ２がインシュリン様成長因子結合蛋白、（ＩＧＦＢＰ）−５の開裂を示すことにより蛋白分解活性を呈する（実施例６．７）ことが、実験で確認されている。
【０１４１】
一般的に、潜在的な蛋白基質に対するＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性が、精製または一部分精製されたＰＡＰＰ−Ａ２を様々な実験条件（例えば、温度、緩衝液組成、イオン強度、およびｐＨ）下でその潜在的な基質とインキュベーションすることにより評価され得る。当該蛋白に対するＰＡＰＰ−Ａ２の酵素活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（明確に形成される蛋白分解性フラグメントの分解または遊離が明らかとなる）、または遊離したペプチドの高速液体クロマトグラフィー検出により評価可能である。そのような方法を用いることにより、ＰＡＰＰ−Ａ２の他の基質ターゲットが同定され得る。例えば活性部位の残基が不活性な酵素を獲得するために置換されている様々なＰＡＰＰ−Ａ２とのインキュベーションが、適切なネガティブコントロールとしての役割を果たす。
【０１４２】
固相支持体に接着したアミノ酸の可能なすべての組み合わせからなるランダムペプチドライブラリーが、ＰＡＰＰ−Ａ２により開裂可能なペプチドを同定するのに使用され得る。そのようなペプチドの同定は、ペプチドライブラリーを組み換え可溶性ＰＡＰＰ−Ａ２を用いてスクリーニングすることにより達成され得る。酵素の発現および精製法が上述で示され、目的の機能的ドメインによって、組み換えの完全長ＰＡＰＰ−Ａ２またはそのフラグメント、類似物、あるいは誘導体が使用され得る。更なる詳細については、（Ｍｅｌｄａｌ，  １９９８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ６５−７４；Ｍｅｌｄａｌ，  １９９８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ５１−７）参照。あるいは、ペプチド基質が、同定されたＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白基質から誘導されてもよい。
【０１４３】
別法としては、ＰＡＰＰ−Ａ２により開裂可能なペプチドを同定するのにペプチドライブラリーのファージディスプレイが使用されてもよい（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，  １１１３−７）。
【０１４４】
ＰＡＰＰ−Ａ２基質としての機能するペプチドは、体液または組織、および細胞抽出物におけるＰＡＰＰ−Ａ２蛋白分解活性の検出用アッセイにおいて機能し得る。蛍光クエンチングに基づいたアッセイにおいて機能するために、基質ペプチドが誘導され得る（Ｍｅｌｄａｌ，  １９９８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ６５−７４）。そのような、または他の方法に基づいたキットが、ＰＡＰＰ−Ａ２活性の測定が関係する病気において診断目的で使用され得る。
ＰＡＰＰ−Ａ２の活性を改変する試薬の同定
ＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性の検出用アッセイは、上述のように、ＰＡＰＰ−Ａ２の活性を改変する分子の同定法を提供する。そのような分子は、例えば、ペプチド、誘導化ペプチド、ヒドロキサム酸誘導化ペプチド、小さな有機分子、または抗体であってもよい。
【０１４５】
ペプチドライブラリーのスクリーニングは、ＰＡＰＰ−Ａ２の生物学的活性を改変および／または阻害するよう作用する試薬を見いだすために使用可能である。酵素の発現および精製法は、上述で示されており、目的の機能的ドメインによって、組み換えの完全長ＰＡＰＰ−Ａ２またはそのフラグメント、類似物、あるいは誘導体を発現するために使用され得る。固相支持体に接着したアミノ酸の可能なすべての組み合わせからなるランダムペプチドライブラリーは、ＰＡＰＰ−Ａ２の活性部位または他の部位に結合することにより、ＰＡＰＰ−Ａ２活性を改変および／または阻害可能なペプチドを同定するため使用され得る。例えば、（Ｍｅｌｄａｌ，  １９９８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ７５−８２）参照。
【０１４６】
同様に、ＰＡＰＰ−Ａ２の活性に影響を及ぼす低分子量の有機分子を同定するために、コンビナトリアルケミストリーが利用されてもよい。
ＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２の複合体の測定
ＰＡＰＰ−Ａは、好酸球主要塩基蛋白（ｐｒｏＭＢＰ）のプロフォームとの２：２のジスルフィド結合複合体、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰとして主に妊婦の血清中に存在する。ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体に加えて、ｐｒｏＭＢＰは、アンジオテンシン（ＡＮＧ）との２：２のジスルフィド結合複合体、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧとして循環中に存在し、この複合体のフラクションは、更に補体成分Ｃ３ｄｇのフラグメントと複合体化（ＰＲＯＭＢＰ／ＡＮＧ／Ｃ３ｄｇ）している（Ｏｘｖｉｇ，  １９９５；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  ２０００）。
【０１４７】
個体の体液中のＰＡＰＰ−Ａおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２および／またはｐｒｏＭＢＰを含む複合体のレベルは、病態の素因を示したり、または病態の存在を示したりし得る。従って、本発明は、１つの実施態様において、個体において病態を診断したり、当該病態の素因を診断したりする方法を教示し、その方法は、
ａ）当該個体から体液サンプルを提供し；そして
ｂ）当該組体液サンプル中のＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ、およびｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ／Ｃ３ｄｇからなる群から選ばれる複合体のレベルを測定し；そして
ｃ）病態または病態の素因を診断（予め決められた値より上または下の複合体レベルが病態または病態の素因を示す）することからなるステップを含む。
【０１４８】
更に、哺乳類の母親の体液中のＰＡＰＰ−Ａおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２および／またはｐｒｏＭＢＰを含む複合体レベルは、当該母親の胎児の病態の素因を示したり、病態の存在を示したりし得る。それゆえ、本発明は、哺乳類の胎児において病態を診断したり、当該病態の素因を診断する方法を提供し、その方法は、
ａ）当該胎児の母親から体液サンプルを提供し；そして
ｂ）当該体液サンプル中のＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ、およびｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ／Ｃ３ｄｇからなる群から選ばれる複合体のレベルを測定し；そして
ｃ）病態または病態の素因を診断（予め決められた値より上または下の複合体レベルが病態または病態の素因を示す）する
ことからなるステップを含む。
【０１４９】
特に、本発明の方法に従って、以下に示す複合体のうちの１つまたはそれ以上のレベルが決定され得る：
ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ
ＰＡＰＰ−Ａ２およびｐｒｏＭＢＰ（ＰＡＰＰ−Ａ２／ｐｒｏＭＢＰ）
ＰＡＰＰ−Ａ２およびＰＡＰＰ−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２）
ｐｒｏＭＢＰを有するＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２（ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ）
ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ
ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧ／Ｃ３ｄｇ
体液サンプル中のＰＡＰＰ−Ａおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２および／またはｐｒｏＭＢＰを含む複合体レベルは、当業者には既知の任意の従来法によって決定され得る。例えば、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰＡＰＰ−Ａ２、ｐｒｏＭＢＰ、ＡＮＧ、またはＣ３ｄｇと特異的に相互作用する免疫特異的な試薬といった、測定するのに所望の複合体の１つまたはそれ以上の成分と特異的に相互作用する免疫特異的な試薬の使用を含む方法により、そのレベルは測定可能である。例えば、免疫特異的な試薬は、複合体の個々の成分に特異的な、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および／またはその抗原結合フラグメントであり得る。
【０１５０】
そのような方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が挙げられるがそれに限定されるわけではなく、当該方法においては、複合体の１成分を特異的に認識する免疫特異的な試薬が捕獲抗体として使用され、その複合体が検出抗体として使用されるならば、別の免疫特異的な試薬が別の成分を特異的に認識する。その検出抗体が、直接的または間接的のいずれかで検出可能であるのが好ましく、例えば検出抗体が検出可能なラベルに直接結合してもよく、あるいは検出抗体が、検出可能なラベルと結合した別の試薬と相互作用可能であってもよい。
【０１５１】
例えば、検出可能なラベルは、蛍光ラベル、色素体、放射活性ラベル、重金属、または酵素であり得る。
【０１５２】
例えば、体液サンプル中のＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体のレベルは、捕獲用のＰＡＰＰ−Ａ特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体および検出用のｐｒｏＭＢＰ特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定され得、あるいは体液サンプル中のｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧのレベルは、捕獲用のｐｒｏＭＢＰ特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体および検出用のＡＮＧ特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定され得る。
【０１５３】
病態（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は、ＰＡＰＰ−Ａおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２および／またはｐｒｏＭＢＰを含む複合体のレベルより診断され得る、あるいはＰＡＰＰ−Ａおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２および／またはｐｒｏＭＢＰを含む複合体のレベルにより素因が診断され得る任意の病態であり得る。例えば、病態は、ダウン症、子癇前症、および不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群からなる群から選ばれ得る。
【０１５４】
体液サンプルは、血清サンプルを含む血液サンプル、尿サンプル、糞サンプル、または羊水サンプルといった任意の有用な体液サンプルであり得る。
【０１５５】
特に、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰレベルは、病態が、ダウン症、および不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群からなる群から選ばれる場合に決定され得る。
【０１５６】
本発明の１つの実施態様において、ダウン症の診断またはダウン症の素因の診断は、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰレベルの決定することを含み、予め決められた値より低いＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰレベルは、ダウン症またはダウン症の素因があることを示している。
【０１５７】
本発明の別に実施態様において、不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群の診断、または不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群の素因の診断は、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰレベルを決定することを含み、予め決められた値より高いＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰレベルは、不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群または不安定狭心症および心筋梗塞を含む急性冠症候群の素因があることを示している。
【０１５８】
更に別の実施態様において、ダウン症の素因を診断する、あるいはダウン症を診断するために、ｐｒｏＭＢＰ／ＡＮＧレベルが決定され得る。上述の診断法はすべて、１つまたはそれ以上の他の診断法と組み合わせて実施されてもよい。更に、本発明に記載の１以上の異なる診断が実施されてもよく、例えば、１以上の複合体レベルを測定する、あるいは異なる個体サンプルにおいて１つの複合体レベルを測定することが可能である。
天然の蛋白分解性フラグメントを産生するためのＰＡＰＰ−Ａ２の使用
ＰＡＰＰ−Ａ２は、ＰＡＰＰ−Ａ２により特異的に開裂される蛋白の天然のフラグメントを産生するために使用され得る。ＩＧＦＢＰ−５の場合のように（実施例６．７および６．９参照）、そういったフラグメントは、インタクトなＩＧＦＢＰ−５とは異なる生物学的効果を有し得る。精製されたＰＡＰＰ−Ａ２で開裂後、標準的なクロマトグラフィーによりフラグメントを精製可能である（実施例６．９参照）。
発現用ＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントのデザイン
成熟ＰＡＰＰ−Ａにおいて見られるシステイン残基がすべて、成熟ＰＡＰＰ−Ａ２においても見られるため（図３参照）、ジスルフィド結合パターンは、共通のシステイン残基のパターンについては、ＰＡＰＰ−Ａ２と同じであると推定することができる。それゆえ、ＰＡＰＰ−Ａサブユニットのジスルフィド構造（図８参照）の知見が、すべてのシステイン残基組み合わせが可能であるＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントを合理的にデザインするために利用可能である。ＰＡＰＰ−Ａ２の推定のドメイン境界は、図８に示されるジスルフィド構造に基づいて決めることができる。それらのドメインは、別々にまたは一緒に発現可能である。ドメインが別のＰＡＰＰ−ＡサブユニットまたはｐｒｏＭＢＰに対して鎖間ジスルフィド結合を形成する（図８参照）ことが既知のシステイン残基を含有する場合に、このシステインが突然変異して、例えばセリンまたはアラニン残基となることが必要となり得る。
【０１５９】
従って、可能な境界領域は、Ｃｙｓ−４０３とＣｙｓ−４９９との間、Ｃｙｓ−８２８とＣｙｓ−８８１との間、Ｃｙｓ−１０４８とＣｙｓ−１１１５との間、Ｃｙｓ−１３９０とＣｙｓ−１３９６との間、Ｃｙｓ−１４５９とＣｙｓ−１４６４との間、Ｃｙｓ−１５２１とＣｙｓ−１５２５との間、Ｃｙｓ−１５９０とＣｙｓ−１５９５との間、Ｃｙｓ−１６４６とＣｙｓ−１６５３との間、およびＣｙｓ−１７２９とＣｙｓ−１７７３との間（ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２ナンバリングは、図１および３と同様）である。
医薬組成物
ＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼとしてのＰＡＰＰ−Ａ２の同定は、治療用ターゲットとしてＰＡＰＰ−Ａ２を用いることにより、インビボにおいて成長および分化に影響を及ぼす方法を提供する。ＰＡＰＰ−Ａ２の阻害は、バイオアベイラブルなＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの量を減少させると考えられている。例えば、ＰＡＰＰ−Ａ２活性の阻害は、再狭窄、アテローム性動脈硬化、および線維症といった疾患に有益となり得る。アクチベーター、またはＰＡＰＰ−Ａ２の活性を上昇させる薬剤は、バイオアベイラブルなＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの量を上昇させると考えられている。
【０１６０】
ＰＡＰＰ−Ａ２活性を変化させる、またはＰＡＰＰ−Ａ２の細胞表面への接着を変化させる薬剤を、医薬組成物中に組み込むことができる。そのような薬剤は、ＰＡＰＰ−Ａ活性を変化させる、あるいはＰＡＰＰ−Ａの細胞表面への接着を変化させる薬剤と一緒に組み込まれてもよい。ＰＡＰＰ−Ａ２特異的な薬剤とＰＡＰＰ−Ａ特異的な薬剤との組み合わせは、ＰＡＰＰ−Ａに対して示される従来の試薬よりも有効となり得る。ＰＡＰＰ−Ａ２特異的試薬とＰＡＰＰ−Ａ特異的試薬との組み合わせを薬学的に有効量でそれらを必要とする個体に投与することからなるステップを含む処置法もまた提供されている。
【０１６１】
一例として、抗ＰＡＰＰ−Ａ２ポリクローナルまたはモノクローナルといった抗体が、薬学的に許容される無毒性の賦形剤または担体との混合により医薬組成物に製剤化することができる。そのような１つまたは複数の組成物は、特に溶液または水性生理緩衝食塩水中に懸濁した形態で経腸投与用に；特に錠剤またはカプセルの形態で経口投与用に；あるいは特に粉末状、点鼻薬、またはエアロゾルの形態で経鼻用に調製されてもよい。他の投与経路用の組成物が、常法を用いて所望されるように調製されてもよい。
【０１６２】
経腸投与用製剤は、一般的な賦形剤（すなわち、薬学的に許容される担体）として、滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリコールといったポリアルキレングリコール、野菜起源の油、水素化ナフタレン等を含有してもよい。特に、生物適合性、生物分解性の乳酸ポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが、インビボで本発明の化合物の放出を制御する賦形剤の例である。他の好適な経腸的送達システムとしては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透ポンプ、埋込み型注入システム、およびリポソームが挙げられる。吸入投与用製剤は、所望であれば、ラクトースといった賦形剤を含有してもよい。吸入製剤は、例えばポリオキシエチル−９−ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸を含有する水性溶液であってもよく、あるいはそれらが点鼻薬の形態での投与用油状溶液であってもよい。所望であれば、該化合物が経鼻的に適用されるゲルとして製剤化可能である。経腸投与用製剤も、舌下投与用にグリココール酸を含んでいてもよい。
医療用具
本発明は、患者の体内配置（例えば移植）用医療用具も特徴としており、それはＰＡＰ
Ｐ−Ａ２プロテアーゼ活性を阻害または活性化する薬剤を含む。好適な薬剤は、本明細書
に記載の方法を用いて容易に同定される。用具は、該薬剤を含んだり、あるいは該試薬を
コートすることが可能である。阻害剤の非制限的な例としては、抗−ＰＡＰＰ−Ａ２ポリ
クローナルまたはモノクローナルといった抗体、あるいは１,１０−フェナントロリンと
いったメタロプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１６３】
ＰＡＰＰ−Ａ２のＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼ活性は、１，１０−フェナントロリンにより強く阻害されるが、マトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ’Ｓ）によっては阻害されない。他の阻害剤としては、ヒドロキサム酸の誘導体といった小分子が挙げられる。抗ＰＡＰＰ−Ａ２ポリクローナルＩｇＧもまた、ＨＦＣＭにおいてＩＧＦ−依存性−またはＩＧＦ−非依存性−ＩＧＦＢＰ−５特異的ＰＡＰＰ−Ａ２プロテアーゼ活性を用量依存的に阻害し得る。
【０１６４】
更に、修飾化ポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、任意のアミノ酸）は、阻害剤として機能することができる。本発明に記載の医療用具をコートしたり埋め込むために、ＰＡＰＰ−Ａ２のＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼ活性の任意の阻害剤を使用可能である。修飾化ポリペプチドとしては、対応する野生型配列と比較して、アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、または挿入、ならびに化学修飾が挙げられる。プロテアーゼ抵抗性ＩＧＦＢＰ−５が、ＰＡＰＰ−Ａ２のＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼ活性の阻害剤そのものではないけれども、それが医療用具をコートしたり埋め込んだりするのに使用される場合、同様の結果が期待される。
【０１６５】
一例として、ＰＡＰＰ−Ａ２阻害剤を用いた医療用具のコーティングまたは埋め込みは、所望によりＰＡＰＰ−Ａ阻害剤と組み合わせて、バルーン血管形成後の再狭窄の進行の阻害を助けたり、動脈硬化性プラークサイズの更なる増大を阻害したりすることが可能である。ステント留置による冠動脈血管形成は、冠動脈アテローム性動脈硬化に対する現在の主要な治療法である。冠動脈疾患の血管形成の重要な目的は、急性および慢性の合併症の両方を回避することである。現代の方法は、当面の問題の削減には非常に成功している。残念なことに、ステントされた患者の２０〜３０％においては、それでもなお再狭窄が起こる。既知の薬理学的治療法（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）で、再狭窄を回避するのに利用可能なものはない。
【０１６６】
特定のメカニズムにより結合されないで、ヒトにおける血管形成に応答した新生内膜肥厚に先立って冠動脈平滑筋細胞によるＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼ発現が増加すると考えられている。
【０１６７】
例えば、ＰＡＰＰ−Ａ２活性の促進は、創傷治癒、骨折、骨粗鬆症、または排卵に有益となり得る。骨粗鬆症または骨量減少の他の症状は、骨形成が増大し、骨再吸収が減少することにより利益を受け得る。ＰＡＰＰ−Ａ２活性を促進させる薬剤としては、例えば修飾化ＩＧＦ、すなわちＩＧＦ類似物が可能である。
【０１６８】
類似物としては、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、ならびに化学修飾を含むＩＧＦポリペプチドが挙げられる。アミノ酸の置換としては、同類および非同類アミノ酸置換が挙げられ得る。同類アミノ酸置換は、あるアミノ酸を同じクラスのアミノ酸と置き換え、一方、非同類アミノ酸置換は、あるアミノ酸を異なるクラスのアミノ酸と置き換える。非同類置換の結果、ポリペプチドの疎水性または残りの側鎖のバルクが変化する。更に、非同類置換は、正電荷を減少させ負電荷を導入するなど、ポリペプチドの電荷を本質的に変化させる。非同類置換の例としては、非極性アミノ酸の塩基性アミノ酸への置き換え、または酸性アミノ酸の極性アミノ酸の置き換えが挙げられる。アミノ酸の挿入、欠失、および置換は、当該分野には既知のランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、または他の組み換え法の使用が可能である。
【０１６９】
例えば、医療用具としては、骨を安定させるために使用される骨プレートまたは骨スクリュー、あるいは体内管腔部の開存性を回復したり維持したりするために典型的には体内で使用されるステントが可能である。例えば、血管は血液の流れを制限する動脈硬化性のプラークにより詰まってくる。典型的にはステントは、体内管腔部内の流動を調節する内部チャンネルを形成する管状構造を有している。ステントの外壁は、体内管腔部の内壁と接合している。病変部内のステントの配置により、体内管腔部の更なる閉塞の回避し、そして継続的な流動を可能にすることを助けることができる。典型的にはステントは、ステントを運ぶカテーテルまたはガイドワイヤーの経皮的挿入により実施される。通常ステントは、膨張可能な構造を有する。所望の部位へ送達する際、ステントはカテーテルに装着されたバルーンにより膨張可能である。別法としては、ステントが、圧縮された状態で鞘または他の制限部内に保持するバイアス構造または弾性構造を有していてもよい。その制限が除かれたときに、ステントは自発的に膨張する。いずれの場合においても、ステント壁は、膨張して体内管腔部の内壁に接合し、そして一般的には所望の位置にステントを固定する。
本発明の記載
第１の態様において、本発明は、
ｉ）受け入れ番号ＤＳＭ１３７８３下のＤＳＭＺに集積された、ＰＡＰＰ−Ａ２のコード化配列に相当する、配列番号１のヌクレオチド１〜５３７６を含むポリヌクレオチド；および
ｉｉ）配列番号２も示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド；および
ｉｉｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）または（ｉｉ）によりエンコードされたポリペプチドのフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドであって、当該フラグメントが、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）またはその誘導体、あるいは任意の他の基質に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリヌクレオチド；そして
ｉｖ）相補鎖が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のいずれかで定義されるようなポリヌクレオチドと、厳密な条件下でハイブリダイズされるポリヌクレオチド
であって、当該ポリヌクレオチドが、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントをエンコードし、当該フラグメントが、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）またはその誘導体、あるいは任意の他の基質に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、ポリヌクレオチド；および
ｖ）（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のいずれかで定義されるようなポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に縮重されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
、およびそのようなポリヌクレオチドの相補鎖、からなる群から選ばれる精製ポリヌクレオチドに関する。
【０１７０】
本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドとは、任意の自然発生的な基本骨格構造を有する任意の自然発生的なポリヌクレオチド、ならびに当該分野においてＬＮＡ（ロック型核酸、ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびＰＮＡ（ペプチド核酸）として既知のヌクレオチドをいう。
【０１７１】
好ましい実施態様において、精製ポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるようなＰＡＰＰ−Ａ２、ヌクレオチド１〜５３７６からなるコード化配列、または配列番号２で示されるようなアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１７２】
別の好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列を含み、当該フラグメントは、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）またはその誘導体、あるいは任意の他の基質に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する。
【０１７３】
相補鎖が本発明に記載のポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。
【０１７４】
本明細書で使用されるような厳密な条件とは、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｅ．  Ｍ．，  １９７５，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８：５０３−５１７により示されるようなサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションに関連して通常適用されるような厳密さをいう。そのような目的のために、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションからなるステップを含むことが日常的に実施されている。このようなステップは、通常、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒにおいてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９により示される（これは、参照して本明細書の一部とする）ように、６ｘＳＳＰＥ、５％  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％  ＳＤＳ、５０％  ホルムアミド、１００ｍｇ／ｍｌ  変性サケ精巣ＤＮＡ（４２℃で１８時間インキュベーション）を含有する溶液を用いて実施され、次に２ｘＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳ（室温および３７℃）で洗浄し、０．１ｘＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳ（６８℃で３０分間インキュベーション）で洗浄する。
【０１７５】
ＤＮＡ配列は、様々な方法で使用される。それらは、ｕＨＡｓｅのホモログ（例えば、ｈｕＨＡｓｅのホモログ）を同定するためのプローブとして使用され得る。哺乳類のホモログは、相互に実質的な配列類似性、すなわち少なくとも７５％、通常少なくとも９０％、より一般的には少なくとも９５％の配列同一性を有する。配列類似性は、保存モチーフ、コード化領域、フランキング領域等といった比較的長い配列のサブセットであり得る標準配列を基準にして計算される。標準配列は、通常、少なくとも約１８ｎｔの長さ、より一般的には少なくとも約３０ｎｔの長さとなり、比較される完全長の配列まで延び得る。配列分析に対するアルゴリズムは、当該分野、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されるＢＬＡＳＴにおいて既知である。
【０１７６】
配列類似性を有する核酸が、厳密性の低い条件下、例えば５０℃および１０倍のＳＳＣ（０．９Ｍ  生理食塩水／０．０９Ｍ  クエン酸ナトリウム）でハイブリダイゼーションにより検出され、５５℃および１倍のＳＳＣで洗浄されるときには結合したままである。配列同一性は、厳密性の高い条件下、例えば５０℃またはそれ以上および０．１倍のＳＳＣ（９ｍＭ  生理食塩水／０．９  Ｍクエン酸ナトリウム）でハイブリダイゼーションにより検出され得る。プローブ、特にＤＮＡ配列の標識化プローブを使用することにより、ホモログまたは関連遺伝子を単離することができる。ホモログ遺伝子の起源は、任意の種、例えば霊長類、特にはヒト；例えばラットおよびマウスといったげっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、オパイン、ウマ、酵母、ショウジョウバエ、シノラブディス（Ｃａｅｎｈｏｒａｂｄｉｔｉｓ）等であり得る。
【０１７７】
更なる実施態様において、配列番号１にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、またはそのフラグメントに縮重されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１７８】
縮重は、本明細書において使用されるように、該縮重したポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドと関係する活性または機能性に鑑みて定義されており、該ポリヌクレオチドは、ｉ）少なくともインシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）特異的なタンパク分解活性を含み、そして／またはｉｉ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体またはその結合フラグメントにより認識され；そして／またはｉｉｉ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する、のいずれかである。
【０１７９】
更なる実施態様において、本発明に記載のポリヌクレオチドの相補鎖を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１８０】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＰＡＰＰ−Ａ２の３’未翻訳領域またはそのフラグメントに相当する核酸残基を含む更なるポリヌクレオチドに実施可能に結合され得る。本明細書で使用されるように、その３’未翻訳領域は、配列番号１の５３７７〜８５２７の核酸残基を含む。
【０１８１】
本明細書に記載のポリヌクレオチドに実施可能に結合された発現シグナルを含む発現ベクターの形態で組み換えＤＮＡ分子もまた提供される。
【０１８２】
更なる態様において、本発明に記載のポリヌクレオチドまたは本発明に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主生体が提供される。その宿主生体は、例えば哺乳類の細胞株といった哺乳類の生体が好ましい。しかしながら、酵母または真菌類（ｆｕｎｇｉ）といった微生物真核生物もまた使用され得、同様にシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）または大腸菌といった微生物原核生物も使用され得る。当業者であれば、特定の細胞における発現に好適なリーダー配列および／またはシグナルペプチドを含む、発現シグナルをいかに選択するかを知っているだろう。当業者であればまた、標準的な分子生物学的方法を使用することにより特定細胞における発現レベルをいかに決定するかを知っているだろう。
【０１８３】
更なる態様において、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらから本質的に構成される単離されたポリペプチドに関し、当該フラグメントは、
ａ）インシュリン様成長因子結合蛋白５型（ＩＧＦＢＰ−５）に特異的な蛋白分解活性を有し；そして／または
ｂ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識可能な抗体、またはその結合フラグメントにより認識され；そして／または
ｃ）当該ポリペプチドに対して親和性を有する細胞表面レセプターに結合するのに、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと競合する。
【０１８４】
本発明の好ましい１つの実施態様において、配列番号２の変異体およびそのフラグメントの変異体もまた提供される。変異体は、予め決められたアミノ酸配列と同一性の程度またはそれらの相同性に基づいて決定され、当該予め決められたアミノ酸配列は、配列番号２であり、またその変異体がフラグメントである場合には、配列番号２のフラグメントである。
【０１８５】
従って、変異体は、予め決定された配列と、少なくとも７５％の配列同一性配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９２％の配列同一性、例えば少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するのが好ましい。
【０１８６】
変異体はまた、本明細書の以下で定義されるような予め決定された数の同類（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換に基づいて決定される。本明細書で定義されるような同類アミノ酸置換は、１つのアミノ酸（予め決定されたアミノ酸群内）の別のアミノ酸（同一群内）との置換に関し、そのアミノ酸は、同様またはほぼ同様の特性を呈する。
【０１８７】
本明細書において適用されるような「同類アミノ酸置換」なる用語の意味の範疇で、本明細書の以下で示すアミノ酸群内で、１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されてもよい：
ｉ）極性の側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓ）
ｉｉ）非極性の側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔ）
ｉｉｉ）脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
ｉｖ）環状の側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
ｖ）芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
ｖｉ）酸性の側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
ｖｉｉ）塩基性の側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
ｖｉｉｉ）アミド側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
ｉｘ）ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘ）硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
ｘｉ）中性で弱い疎水性のアミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘｉｉ）親水性で酸性のアミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、および
ｘｉｉｉ）疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）。
【０１８８】
従って、本発明に記載の変異体またはそのフラグメントは、配列が同一の変異体またはそのフラグメント内、あるいは配列が異なる変異体またはそのフラグメント間に、相互に独立して導入された複数の置換体といった、少なくとも１つの置換体を含んでいてもよい。
【０１８９】
その同一の変異体またはそのフラグメントが、本明細書の上述で定義されるような１つ以上の同類アミノ酸群から１つ以上の同類アミノ酸置換体を含んでいてもよいことが、上述の概要から明らかである。
【０１９０】
アミノ酸の付加または欠失は、２〜１０個のアミノ酸、例えば１０〜２０個のアミノ酸、例えば２０〜３０個のアミノ酸、例えば４０〜５０個のアミノ酸の付加または欠失であり得る。しかしながら、５０個以上のアミノ酸の付加または欠失、例えば１０〜１００個のアミノ酸の付加、例えば１００〜１５０個のアミノ酸の付加、例えば１５０〜２５０個のアミノ酸の付加もまた、本発明の範疇に含まれる。
【０１９１】
いかなる機能的等価物をも含む、本発明に記載のポリペプチドフラグメントは、１つの実施態様において、少なくとも２５０個の未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも２４０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも２２５個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも２００個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１８０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１６０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１５０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１４０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１３０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１２０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１１０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも１００個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも９０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも８５個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも８０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも７５個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも７０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも６５個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも６０個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも５５個未満のアミノ酸残基、例えば少なくとも５０個未満のアミノ酸残基を含み得る。
【０１９２】
本発明において使用されるような「機能的等価性」とは、予め決められた配列のフラグメントに相当する機能性を基準にして確立された１つの好ましい実施態様に従う。より具体的には、機能的等価性とは、ポリペプチドフラグメントのＩＧＦＢＰ−５特異的プロテアーゼ活性を示す、および／またはＰＡＰＰ−Ａ２を認識可能な抗体により認識される、および／またはＰＡＰＰ−Ａ２に対する親和性を有するレセプターへ結合するのにＰＡＰＰ−Ａ２と競合する能力として理解されるべきである。
【０１９３】
ＰＡＰＰ−Ａ２の機能的等価物または変異体は、挿入、欠失、および同類置換を含む置換の数および範囲が増えるにつれて、次第に好ましく予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２配列とは異なるアミノ酸配列を示すと理解される。この相違は、好ましい予め決められた配列とそのフラグメントまたは機能的等価物との間の相同性の減少として測定される。
【０１９４】
配列番号２のすべてのフラグメントまたは機能的等価物は、本明細書において報告されるようなＰＡＰＰ−Ａ２の好ましい予め決められた配列に対してそれらが示す相同性の程度にかかわらず、本発明の範疇に含まれる。この理由は、ＰＡＰＰ−Ａ２の領域の幾つかが、その結果生成するフラグメントの結合活性にいかなる有意な影響をも与えることなく最も容易に変異し易い、あるいは完全に欠失可能であるからである。
【０１９５】
置換により得られる機能的変異体は、天然ＰＡＰＰ−Ａ２活性のある程度の形態または度合を十分に示し得、機能的に類似のアミノ酸側鎖を含む残基が置換されると、相同性は更に低くなる。この点で機能的な類似性とは、疎水性、塩基性、中性または酸性、あるいは立体的なバルクの有無といった側鎖の主要な特性をいう。従って、本発明の１つの実施態様において、同一性の程度は、本発明に記載の好ましい予め決められたフラグメントの変異体または機能的等価物であるフラグメントの原則的な尺度ではない。
【０１９６】
アミノ酸配列間の相同性は、ＢＬＯＳＵＭ３０、ＢＬＯＳＵＭ４０、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ５５、ＢＬＯＳＵＭ６０、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＢＬＯＳＵＭ６５、ＢＬＯＳＵＭ７０、ＢＬＯＳＵＭ７５、ＢＬＯＳＵＭ８０、ＢＬＯＳＵＭ８５、またはＢＬＯＳＵＭ９０といった周知のアルゴリズムを用いて計算され得る。
【０１９７】
配列番号２のフラグメントと少なくともある程度の相同性を共有するフラグメントは、それらが配列番号２の当該フラグメントと、少なくとも約９０％相同する、例えば少なくとも９２％相同する、例えば少なくとも９４％相同する、例えば少なくとも９５％相同する、例えば少なくとも９６％相同する、例えば少なくとも９７％相同する、例えば少なくとも９８％相同するときには、本発明の範疇にあると考えられるべきである。本発明の１つの実施態様に従って、相同性の割合を、同一性の割合という。
【０１９８】
本明細書で使用される意味に従って、機能的等価性を決定するときに考慮に入れられ得る更なる因子は、ｉ）本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントを検出するた抗血清能、ｉｉ）機能的に等価なＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントのバインディングアッセイにおけるＰＡＰＰ−Ａ２との競合能である。既知のアミノ酸配列内の免疫遺伝学的に活性なアミノ酸の配列を決定する１つの方法は、米国特許５，５９５，９１５号においてＧｅｙｓｅｎにより示されており、これは参照して本明細書に組み込まれている。
【０１９９】
ペプチドフラグメントの構造および機能相関を決定するために更に好適に適応される方法は、米国特許第６，０１３，４７８号に示されており、これは参照して本明細書に組み込まれている。また、アミノ酸配列のレセプター部分への結合のアッセイ法は、当業者には既知である。
【０２００】
同類置換は、配列番号２の好ましい予め決められた任意の位置に導入され得、そしてそれは、任意の１以上の位置に非同類置換を導入するのにもまた所望となり得る。
【０２０１】
ＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントの機能的に等価なフラグメントの形成をもたらす非同類置換は、例えば；ｉ）例えば非極性の側鎖（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＭｅｔ）を有する残基が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎといった極性の側鎖を有する残基またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＬｙｓといった帯電したアミノ酸に置換される、あるいは帯電したまたは極性の残基を非極性残基と置換するなど、実質的に極性が異なる；および／またはｉｉ）別の残基によるＰｒｏまたはＧｌｙの置換またはＰｒｏまたはＧｌｙへの変換といった、ポリペプチド基本骨格配向性への効果が実質的に異なる；および／またはｉｉｉ）例えばＧｌｕまたはＡｓｐといった負に帯電した残基のＬｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇといった正に帯電した残基への置換（およびその反対）など、実質的に電荷が異なる；および／またはｉｖ）例えばＨｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒといった嵩高い残基のマイナーな側鎖を有する残基、例えばＡｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒへの置換（およびその反対）など、実質的に立体的なバルクが異なる。
【０２０２】
アミノ酸の置換により得られる変異体は、１つの好ましい実施態様において、疎水性および親水性の値、および電荷、サイズ等を含むアミノ酸側鎖置換体との相対的な類似性に基づいて作成され得る。例えば、様々な前述の特性を考慮にいれるアミノ酸置換は、当業者には周知であり、：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【０２０３】
本明細書に記載の変異体に加えて、立体構造的に類似の変異体は、変異体構造の鍵となる部分を模倣するために形成され得、当該化合物がまた、本発明の変異体と同様に使用されてもよい。これは、当業者には既知のモデリングおよび化学的デザインの技術により達成され得る。そのような立体構造的に類似する構成はすべて、本発明の範疇にあることが理解されよう。
【０２０４】
更なる実施態様において、本発明は、置換されたアミノ酸の値の＋／−２．５以内、例えば＋／−２．３以内、例えば＋／−２．１以内、例えば＋／−２．０以内、例えば＋／−１．８以内、例えば＋／−１．６以内、例えば＋／−１．５以内、例えば＋／−１．４以内、例えば＋／−１．３以内、例えば＋／−１．２以内、例えば＋／−１．１以内、例えば＋／−１．０以内、例えば＋／−０．９以内、例えば＋／−０．８以内、例えば＋／−０．７以内、例えば＋／−０．６以内、例えば＋／−０．５以内、例えば＋／−０．４以内、例えば＋／−０．３以内、例えば＋／−０．２５以内、例えば＋／−０．２以内である親水性または疎水性指標を有する機能的に構成される置換アミノ酸に関する。
【０２０５】
蛋白に相互作用性の生物学的機能を与える際の親水性および疎水性アミノ酸指標の重要性は、当業者には十分に理解されている（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔ−ｔｌｅ，  １９８２およびＨｏｐｐ、国特許第４，５５４，１０１号、それぞれ参照して本明細書に組み込まれる）。
【０２０６】
本明細書で使用されるようなアミノ酸疎水性指標値は以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２）。
【０２０７】
アミノ酸親水性値を以下の通りである：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋−．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋−．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）（米国特許第４，５５４，１０１号）。
【０２０８】
本明細書に記載のペプチジル化合物に加えて、立体構造的に類似の化合物が、ペプチド構造の鍵の部分を模倣するために形成され得、そしてその当該化合物はまた、本発明のペプチドと同様に使用され得る。これは、当業者には既知のモデリングおよび化学的デザインの技術により達成され得る。例えば、テトラペプチド構造を模倣するために、例えばジアルギニンペプチド基本骨格のアミノ末端を修飾するようエステル化およびアルキル化が実施されてもよい。そのような立体構造的に類似の構成はすべて、本発明の範疇にあることが理解されよう。
【０２０９】
Ｎ末端をアルキル化およびＣ末端をエステル化したペプチドもまた、本発明の範疇に包含される。機能的等価物はまた、二量体または無関係な化学的部分を含む、同一または他のＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２分子を用いて形成される、グリコシル化して共有結合性または凝集性の共役体を含む。そのような機能的等価物は、当該分野において既知の方法により、Ｎ末端およびＣ末端のいずれか一方または両方を含むフラグメントにおいて見られる群への機能性の結合により調製される。
【０２１０】
機能的等価物が、それゆえカルボキシル末端の脂肪族またはアシルエステルまたはアミド、アルキルアミン、またはカルボキシル側鎖を含む残基に共役した、例えばアスパラギン酸残基でアルキルアミンに共役したフラグメント；水酸基を含む残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基を含有する残基のＮ−アシル誘導体、例えばｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅまたは免疫原性蛋白を有する共役体を含み得る。アシル基の誘導体は、アルキル部分の群（Ｃ３〜Ｃ１０の直鎖アルキルを含む）から選ばれ、それによりアルカノイル種、および炭素環式またはヘテロ環式化合物を形成し、それによりアロイル種を形成する。反応基は、好ましくは反応側鎖の基を通じて不溶性のマトリクスに架橋結合する蛋白に使用するそれ自身は既知の二官能性化合物である。
【０２１１】
共有結合性または凝集性の機能的等価物およびその誘導体は、イムノアッセイにおける試薬として、またはアフィニティー精製法に有益である。例えば、本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２のフラグメントは、それ自身既知の方法により臭化シアン活性化セファロースに共有結合することにより不可溶化され、抗ＰＡＰＰ−Ａ２抗体または細胞表面レセプターのアッセイまたは精製に使用されるグルタルアルデヒド架橋を用いてまたは用いないでポリオレフィン表面に吸収され得る。フラグメントは、検出可能な基で標識化、例えばクロラミンＴ法による放射性ヨウ素化される、希土類キレートに共有結合される、または例えば診断アッセイに使用する別の蛍光部分と共役され得る。
【０２１２】
ＰＡＰＰ−Ａ２の好ましい予め決められたフラグメントの突然変異誘発は、アミノ酸を、通常、約１〜１０個程度のアミノ酸残基、好ましくは約１〜５個のアミノ酸残基を挿入する、あるいは約１〜１０個の残基、例えば約２〜５個の残基を欠失することにより実施可能である。
【０２１３】
１つの実施態様において、ＰＡＰＰ−Ａ２のフラグメントは、自動合成により合成される。任意の商業的に利用可能な固相法、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法が実施され得、その方法において、アミノ酸が、成長するアミノ酸鎖に順次付加される（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１４６，  １９６３参照）。
【０２１４】
ポリペプチドの自動合成用装置は、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．といった供給業者から市販で入手可能であり、一般的には取扱い説明書に従って操作され得る。固相合成により、本発明に記載の任意のＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントに所望のアミノ酸置換を導入することが可能になる。置換、欠失、相挿入、またはその任意のサブコンビネーションが、組み合わされて機能的等価物の最終配列に到達し得ることが理解されよう。挿入は、例えば疎水性または免疫原性蛋白、または任意のポリペプチドといった担体、または担体と同様の役割をすることが可能な骨格構造を用いたアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合を含むと理解されるはずである。
【０２１５】
本発明によるＰＡＰＰ−Ａ２のフラグメントのホモ二量体およびヘテロ二量体を含む二量体を含むオリゴマーも提供され、本発明の範疇に該当する。ＰＡＰＰ−Ａ２の機能的等価物および変異体が、他のアミノ酸配列を有する、または天然のＰＡＰＰ−Ａ２配列を有するホモ二量体またはヘテロ二量体として生成可能である。ヘテロ二量体としては、いかなる生物活性をも有するまたは示す必要がない免疫反応性ＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントならびにＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントを含有する二量体である。
【０２１６】
本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントは、インビトロおよびインビボの両方で合成され得る。インビトロの合成法は周知であり、ＰＡＰＰ−Ａ２のインビボでの合成法に好適なまたは好適に適応可能な方法は、従来技術でも示されている。インビボで合成される場合、宿主細胞は、ＰＡＰＰ−Ａ２またはそのフラグメントをエンコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて形質転換される。ベクターは、複製可能な核酸構築物として定義されている。ベクターは、ＰＡＰＰ−Ａ２の発現を仲介するために使用される。発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントをエンコードする核酸配列、またはインビボで発現可能な任意の機能的等価物が、好適な宿主においてそのフラグメントまたは等価物の発現に影響を与えることが可能な好適なコントロール配列に実施可能に結合される。そのようなコントロール配列は、当該分野においては周知である。
【０２１７】
多細胞生体由来の細胞培養物は、好ましい宿主細胞である。原則として、脊椎動物培養由来であろうと無脊椎動物培養由来であろうと任意の真核細胞培養物が高等であるほど有効である。例えば有益な宿主細胞株は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３およびＭＤＣＫ細胞株である。好ましい宿主細胞は、内因性のＰＡＰＰ−Ａ２を合成することが知られている真核細胞である。当該宿主細胞の培養物は、フラグメントの起源として単離および使用され得、あるいは成育状態を促進または阻害することを目的とする治療法、あるいはヒトまたは動物の身体に関して実施される診断方法を含む治療的処置法において使用され得る。
【０２１８】
特定の実施態様において、本発明は、本発明に記載のポリペプチドフラグメントに関し、ＰＡＰＰ−Ａ２フラグメントは、その任意のプロセシング変異体を含む、ＰＡＰＰ−Ａ２の成熟部分に相当する２３４〜１７９１のアミノ酸残基を含むかあるいは本質的に構成される。
【０２１９】
プロセシング変異体は、シグナルペプチダーゼおよびフリン（ｆｕｒｉｎ）を含むがそれに限定されない任意のプロテアーゼにより触媒された、別のプロセシング事象、可能なプロセシング事象の結果生成する変異体である。１つの推定される開裂部位は、２３３位の後ろに位置し、本明細書の以降において詳細に示されている。別の推定される開裂部位は、ＲＱＲＲモチーフ（ＰＡＰＰ−Ａ２のアミノ酸配列において１９６〜１９９位）の後ろに位置する。プロセシング変異体は、ＰＡＰＰ−Ａ２がヒトまたは動物の組織、血清または体液において発現されるときにインビボでのプロセシングから生じる変異体を含むと理解されるはずである。
【０２２０】
配列番号２に示される成熟配列（アミノ酸残基２３４〜１７９１）から本質的に構成される成熟ＰＡＰＰ−Ａ２アミノ酸配列は、１つの実施態様において、１〜約１０個のＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸、好ましくは１〜１０個のＮ末端アミノ酸、例えば２〜８個のＮ末端アミノ酸、例えば３〜６個のＮ末端アミノ酸の間が欠損しているこの部分の配列を含むことが理解されるはずである。
【０２２１】
また、本明細書において使用されるように、本質的に構成されるという定義においては、配列番号２に示される成熟配列（アミノ酸残基２３４〜１７９１）がそれに加えて更に１〜約１０個のＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸、好ましくは１〜１０個のＮ末端アミノ酸、例えば２〜８個のＮ末端アミノ酸、例えば３〜６個のＮ末端アミノ酸を有することも含まれる。この本質的に構成されるという定義はまた、他の態様において適用されて、ＰＡＰＰ−Ａ２の特定部分と結合して使用されることに制限されない。この定義は、プロセシングされたＰＡＰＰ−Ａ２がもともと単離されているもの以外の、組織、血清、または体液において別のプロセシングから生じるポリペプチドを含む他のプロセスＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドにも適用されるはずである。
【０２２２】
更に、好ましいフラグメントは、ＰＡＰＰ−Ａ２のｐｒｅｐｒｏ部分に相当するアミノ酸残基１〜２３３、ＰＡＰＰ−Ａ２のｐｒｏ部分に相当するアミノ酸残基２３〜２３３、ＰＡＰＰ−Ａ２のシグナルペプチドまたはリーダー配列に相当するアミノ酸残基１〜２２を含み、あるいはそれらから本質的に構成され、当該配列は、配列番号２のアミノ酸残基２３４〜１７９１に相当するＰＡＰＰ−Ａ２の成熟部分に実施可能に結合される。
【０２２３】
組み換えＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチド、またはそのフラグメントも提供され、当該ポリペプチドにはヒト蛋白、あるいは当該ポリペプチドに天然に付随する他の蛋白がないのが好ましい。
【０２２４】
更なる態様において、ｉ）本発明に記載のポリヌクレオチド、および／またはｉｉ）本発明に記載のベクター、および／またはｉｉｉ）本発明に記載の宿主生体、および／またはｉｖ）本発明に記載のポリペプチドを、生理的に許容される担体と組み合わせて含む組成物が提供される。
【０２２５】
更に別の態様において、ｉ）本発明に記載のポリヌクレオチド、および／またはｉｉ）本発明に記載のベクター、および／またはｉｉｉ）本発明に記載の宿主生体、および／またはｉｖ）本発明に記載のポリペプチドを、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
【０２２６】
本発明は更に、本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異性を有する抗体の生成法に関し、当該方法は、
ｉ）宿主生体を提供し、
ｉｉ）その宿主生体を、請求項１０に記載のポリペプチドを用いて免疫し、そして
ｉｉｉ）当該抗体を得る、
ことからなるステップを含む。
【０２２７】
本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特定の結合親和性を有するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体がまた提供される。該抗体は、モノクローナルであるのが好ましい。
【０２２８】
更なる態様において、本発明に記載のＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドの生成法が提供され、当該方法は、
ｉ）好適な宿主生体、好ましくは哺乳類細胞を提供し、
ｉｉ）ステップｉ）で提供された宿主生体を、本発明に記載のポリヌクレオチド、または本発明に記載のベクターを用いてトランスフェクトまたは形質転換し、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた宿主生体を該ポリヌクレオチドまたはベクターによりエンコードされたポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして所望により
ｉｖ）宿主生体による組み換え発現の結果生じるポリペプチドを、その宿主生体から単離する、
ことからなるステップを含む。
【０２２９】
本発明の更に更なる態様において、アンチセンス法を用いて細胞中のＰＡＰＰ−Ａ２の発現を阻害および／または減少させる方法が提供され、当該方法は、
ｉ）本発明に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを提供し、
ｉｉ）ステップｉ）において提供された当該アンチセンスポリヌクレオチドを用いて、ＰＡＰＰ−Ａ２を発現可能な細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において得られた細胞を、ＰＡＰＰ−Ａ２の発現に関与する当該細胞において、ステップｉ）で提供されたポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに好適な条件下で培養し、そして
ｉｖ）当該細胞においてＰＡＰＰ−Ａ２の発現を阻害および／または減少させる、
ことからなるステップを含む。
【０２３０】
該アンチセンスポリヌクレオチドおよび該相補的なポリヌクレオチドは、別々のポリヌクレオチド分子から同時発現されてもよく、あるいはそれらが、同一の分子から発現されてもよい。ハイブリダイゼーションの別法として、該方法は、逆転写ＰＣＲ法（ｒｔＰＣＴ法）の使用を含み得る。
【０２３１】
本発明の更に別の態様において、個体から得た生物学的サンプルにおけるＰＡＰＰ−Ａ２の検出法、あるいはＰＡＰＰ−Ａ２レベルの測定法が提供され、当該方法は、
ｉ）当該個体から生物学的サンプルを得て、
ｉｉ）そのサンプルにおいて、
ａ）ＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドまたはそのフラグメント、および／または
ｂ）ＰＡＰＰ−Ａ２発現に由来するｍＲＮＡ形態のポリヌクレオチド、および／または
ｃ）ＰＡＰＰ−Ａ２特異的プロテアーゼ活性、好ましくはＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼ活性、またはＩＧＦＢＰ−５の誘導体に対して示される蛋白分解活性を検出することによりサンプル中のＰＡＰＰ−Ａ２を検出する、
ことからなるステップを含む。
【０２３２】
該方法は、ステップｉｉ）で検出されたＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２レベルを、
ａ）ＰＡＰＰ−Ａ２の予め決められた量および／または濃度；および／または
ｂ）ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡの予め決められた量および／または濃度；および／または
ｃ）予め決められたＰＡＰＰ−Ａ２特異的なプロテアーゼ活性、
からなる群から選ばれる予め決められた値と比較することからなるステップを更に含んでいてもよい。
【０２３３】
１つの実施態様においてその予め決められた値は、当該個体の正常な生理学的状態を示している。
【０２３４】
該生物学的サンプルは、血液、尿、胸腔内液、口腔洗浄液、組織バイオパシーおよび卵胞液からなる群から選ばれるのが好ましい。
【０２３５】
ＰＡＰＰ−Ａ２のレベルが、ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白の量として測定される場合、そのＰＡＰＰ−Ａ２蛋白が免疫化学分析により測定されるのが好ましく、当該方法においてはＰＡＰＰ−Ａ２蛋白が、少なくとも１つのモノクローナル抗体により検出される。ＰＡＰＰ−Ａ２蛋白はまた、少なくとも１つの更なる成分、好ましくは例えばｐｒｏ−ＭＢＰ（ｐｒｏ−主要塩基性蛋白）であるがそれに限定されないポリペプチドを含む複合体において検出され得る。ＰＡＰＰ−Ａ２はまた、ＰＡＰＰ−Ａ２単量体としてあるいはＰＡＰＰ−Ａ２二量体として検出され得る。
【０２３６】
本発明の更なる態様は、個体における病態の診断法に関し、当該方法は、  ｉ）ＰＡＰＰ−Ａ２の検出法またはＰＡＰＰ−Ａ２レベルの測定法を実施し、そして
ｉｉ）その病態を診断する
からなるステップを含む。
【０２３７】
該病態は、例えばトリソミー２１、トリソミー１８、トリソミー１３、および開放型二分脊椎からなる群から選ばれる胎児異常であるがそれに限定されない胎児異常が好ましい。
【０２３８】
本発明に従って診断可能な更なる胎児異常は、子宮外妊娠、開放型二分脊椎、神経管閉鎖障害、腹部壁欠損、Ｅｄｗａｒｄｓ症候群、Ｐａｔｅａｕｓ症候群、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、モノソミーＸ、またはＫｌｅｉｎ−ｆｅｌｔｅｒ’ｓ症候群である。
【０２３９】
別の態様において、該病態は、再狭窄、アテローム性心筋梗塞、創傷治癒、線維症、心筋梗塞、骨粗鬆症、リュウマチ性関節炎、多発性骨髄腫、または癌を含むがそれに限定されない成長促進状態および成長阻害状態からなる群から選ばれる異常な成長状態である。
【０２４０】
本発明の更に更なる態様において、生物学的サンプルにおける本発明に記載のポリヌクレオチドの発現検出法が提供され、当該方法は、
ｉ）本発明に記載のポリヌクレオチドを推定で含有する生物学的サンプルを提供し、そして
ｉｉ）その生物学的サンプルを、ｉ）本発明に記載のポリヌクレオチドに相補的な、およびｉｉ）それとハイブリダイズ可能な鎖を含むポリヌクレオチドと接触させ、そして
ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションが起こさせ、そして
ｉｖ）ステップｉｉｉ）で得られたハイブリダイゼーション複合体を検出する、
ことからなるステップを含み、
当該方法において、ハイブリダイゼーション複合体の存在は、本発明に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの生物学的サンプルにおける発現を示している。
【０２４１】
本発明の更に更なる態様において、ＰＡＰＰ−Ａ２のプロテアーゼ活性を阻害する薬剤の同定法が提供され、当該方法は、
ｉ）ａ）本発明に記載のポリペプチドまたはそのフラグメント、およびｂ）当該ポリペプチドまたはフラグメントに対して予め決められた基質、およびｃ）推定の阻害剤をインキュベートし、そして
ｉｉ）該基質の蛋白分解が阻害されるかどうかを決定する、ことからなるステップを含む。
【０２４２】
該基質は、内部でクエンチングする蛍光性ペプチドであり得るポリペプチドを含むのが好ましい。１つの好ましい基質は、ＩＧＦＢＰ−５またはそのフラグメントを含むか、あるいはそれから本質的に構成される。
【０２４３】
本発明はまた、ＰＡＰＰ−Ａ２のプロテアーゼ活性を阻害する薬剤を同定する当該方法に従って得られる阻害剤に関する。
【０２４４】
病態の処置を必要とする個体において、その病態を処置するための薬物の製造における当該提供された阻害剤の使用も提供される。
【０２４５】
更に更なる態様において、本発明は、ＰＡＰＰ−Ａ２のプロテアーゼ活性を促進可能な薬剤の同定法に関し、当該方法は、
ｉ）ａ）本発明に記載のポリペプチドまたはフラグメント、およびｂ）当該ポリペプチドに対して予め決められた基質、およびｃ）推定の促進剤をインキュベートし、そして
ｉｉ）該基質の蛋白分解が促進されるかどうかを決定する、
ことからなるステップを含む。
【０２４６】
該基質は、内部でクエンチングする蛍光性ペプチドであり得るポリペプチドを含むのが好ましい。ＩＧＦＢＰ−５またはそのフラグメントが基質として特に好ましい。
【０２４７】
ＰＡＰＰ−Ａ２のプロテアーゼ活性を促進可能な薬剤を同定する方法に従って得えられる促進剤も提供され、本発明はまた、病態の処置を必要とする個体においてその病態を処置するための薬物の製造における当該促進剤の使用も提供される。
【０２４８】
更に別の態様において、個体の治療による処置法が提供され、当該方法は、ｉ）本発明に記載の医薬組成物、および／またはｉｉ）本発明に記載の阻害剤、および／または本発明に記載の促進剤を当該個体に投与することからなるステップを含む。
【０２４９】
更に更なる態様において、ＰＡＰＰ−Ａ２またはＰＡＰＰ−Ａ２の他の蛋白との複合体の精製法が提供され、当該方法は、
ｉ）本発明に記載のポリペプチド、またはそのフラグメントに対して特異的な結合親和性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供し、そして
ｉｉ）ＰＡＰＰ−Ａ２、またはそのフラグメントをアフィニティークロマトグラフィーにより精製する、
ことからなるステップを含む。
【０２５０】
本発明がその詳細な説明と組み合わせて示されている一方、前述の説明は、添付の請求の範囲により定義される本発明の範囲を説明し、そして制限しないことが意図されていることが理解される。他の態様、利点、および修飾は、以下に示す請求項の範疇である。
図面の簡単な説明
図１は、ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡ配列（５’→３’の方向で）を示す。配列のコード化部分およびその末端のストップコドン（＊）だけが示されて、１〜５３７６がナンバリングされている。ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２の翻訳されたポリペプチド配列も示されている。シグナルペプチド開裂部位は、ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ２．０を用いてｎｔ．６４−６６によりエンコードされたアラニン残基の後となると予測された（（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０，  １−６）、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／にあるＷＷＷ予測サーバー）。ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２のシグナルペプチド（ｎｔ．１−６６、２２残基）が太字で示されている。この図のヌクレオチド配列は、配列番号１のｎｔ．１〜５３７６を示している。この図の蛋白配列が配列番号２として示されている。
【０２５１】
図２は、アミノ酸配列に翻訳されたときのＰＡＰＰ−Ａ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８）と、ＰＡＰＰ−ＡのＮ−末端部（ｈｏｍ−Ｎ、受入れ番号  ＡＬ０３１７３４のコード化部分）およびＣ−末端部（ｈｏｍ−Ｃ、受入れ番号  ＡＬ０３１２９０のコード化部分）と相同性のある２つのゲノムクローン内に含まれる配列伸長部との間の相関関係を示す図式である。この図はまた、ＰＡＰＰ−Ａの中央領域と相同性のあるｃＤＮＡ配列を得る方法をも示している。Ｈｏｍ−Ｎ、ｈｏｍ−Ｃ、および中央領域が一緒になって、新規な蛋白、ＰＡＰＰ−Ａ２の完全な配列をエンコードし、これは、ＰＡＰＰ−Ａのホモログである。該中央領域は、テンプレートとして特異的に初回刺激を受けて（プライマー、Ｒｔ−Ｎ−ｍｉｄ）、逆転写したヒト胎盤ｍＲＮＡ、ＰＣＲ用にプライマー、ＰＲ−ｍｉｄ５およびＰＲ−ｍｉｄ３を用いてＰＣＲにより得られた（表１）。完全長のＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡ構築物を得るために、ゲノムクローンｈｏｍ−Ｎおよびｈｏｍ−Ｃに相当するｃＤＮＡクローンも、テンプレートとして特異的に初回刺激を受けた胎盤ｍＲＮＡ（プライマーは示さず、表１参照）により合成されたｃＤＮＡを用いて得た。これは、明細書中に詳細に示されるように、シグナルペプチド伸長部（ｈｏｍ−Ｎ中）および停止コドン（ｈｏｍ−Ｃの３’末端）の同定が必要とされた。プライマーはすべて、表１に示されている。注：ここで示される配列の相対的な位置は、実施される実験に従うものであるが、図は、縮尺に正確には示されていない。
【０２５２】
図３は、ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２（配列番号２）のアミノ酸配列を、ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａと整列して示している。ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２（ＰＡ２）の推定のアミノ酸配列が、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２，  ４６７３−８０）を用いてｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ（ＰＡ）（（Ｈａａｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７，  １５９−６３）、ＡＡＣ５０５４３）の配列と整列された。ＰＡＰＰ−Ａのｐｒｅｐｒｏ部分が、ＰＡＰＰ−Ａ２に相当する領域と有意な同一性を示さなかったので、そのアラインメントを、ｐｒｏペプチドの長さの違いを強調するために手動で調節した。矢印は、ＰＡＰＰ−Ａについては以前に見い出された成熟蛋白のＮ末端部（Ｇｌｕ−８１）（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８）、そしてＰＡＰＰ−Ａ２については本発明で見出されたＮ末端部（Ｓｅｒ−２３４）を示す。推定のシグナルペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ２．０（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０，  １−６）を用いて強く予測されるが、小文字で示している。ＰＡＰＰ−Ａ２のｐｒｏ部分は、Ｍｅｔ−１６８に相当する候補開始コドンを別に１つ含むが、ＳｉｇｎａｌＰを用いてこの残基の後に続くシグナルペプチドは何も予測されなかった。ＰＡＰＰ−Ａの配列モチーフ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８）もまた、ＰＡＰＰ−Ａ２において見い出され：触媒亜鉛結合モチーフおよび推定のＭｅｔ−ターンの残基は、両方の配列において下線が引いて、太字にしている。Ｌｉｎ−ノッチモチーフ（ＬＮＲ１−３）および短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ−１〜５）は四角で囲んでいる。システイン残基は、影付きになっている、成熟ＰＡＰＰ−Ａのシステインはすべて、ＰＡＰＰ−Ａ２でも見られる。更に、分泌型のＰＡＰＰ−Ａ２は４つのシステイン残基（Ｃｙｓ−３４３、Ｃｙｓ−５３３、Ｃｙｓ−６１８、およびＣｙｓ−１２６８）を有し、ＰＡＰＰ−Ａにはそれに相当するものはない。
【０２５３】
図４は、ウエスタンブロッティングおよびクマシー染色によるＰＡＰＰ−Ａ２を示している。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の培地は、モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃを用いてウエスタンブロットされる。レーン１、空ベクターでトランスフェクトした細胞；レーン２、ｃ−ｍｙｃペプチド（ｐＰＡ２−ｍＨ）を用いてＣ末端をタグ化した野生型ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした細胞、非還元型；レーン３、不活性化Ｅ７３４Ｑ変異体（ｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨ）を有するＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞、非還元型；レーン４、レーン２と同じであるが還元型。可能な自触反応を除去するために、組み換えＰＡＰＰ−Ａ２を、ｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨでトランスフェクトした細胞の血清フリーの培地からニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した（レーン５、還元型）。
【０２５４】
図５は、ＩＧＦＢＰ−１〜６に対するＰＡＰＰ−Ａ２活性を示す。空ベクター（−）またはＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡ（ｐＰＡ２）（＋）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の培地を、６つのＩＧＦＢＰ（ＢＰ１〜ＢＰ６）のそれぞれと一緒にインキュベートし、その活性を放射標識したＩＧＦ−ＩＩを用いてリガンドブロッティングにより評価した。ＩＧＦＢＰ−５の完全の開裂は、ＢＰ５＋レーンにおけるシグナルの不在から明らかである。ＩＧＢＰ−３の部分分解もまた、明らかである。
【０２５５】
図６は、ＩＧＦＢＰ−５に対するＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性を示す。空ベクター（レーン１）、不活性化Ｅ７３４Ｑ変異体を有するＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡ（ｐＰＡ２−ＫＯ）（レーン２）、または野生型ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡ（ｐＰＡ２）（レーン３〜６）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の培地を、Ｃ末端をｃ−ｍｙｃタグ化したｒＩＧＦＢＰ−５と一緒にインキュベートした。蛋白分解活性を、抗ｃ−ｍｙｃを用いてウエスタンブロッティングにより評価した。「ｉ」は、インタクトなｒＩＧＦＢＰ−５を示し；「ｃ」は、検出可能なＣ末端ｃ−ｍｙｃタグ化開裂生成物を示す。阻害剤なしの場合において、野生型ＰＡＰＰ−Ａ２は、すべてのｒＩＧＦＢＰ−５を分解した（レーン３）。ＰＡＰＰ−Ａ２活性は、１０ｍＭ  フェナントロリン（レーン４）および５ｍＭ  ＥＤＴＡ（レーン５）により止められるが、１００ｍＭ  ３，４−ＤＣＩ（レーン６）によっては影響は受けなかった。精製されたｒＩＧＦＢＰ−５のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥが、精製されたＰＡＰＰ−Ａ２による消化前（レーン７）および後（レーン８）で示されている。抗ｃ−ｍｙｃを用いた同じ消化のウエスタンブロットも示されている（レーン９）。配列分析により、Ｓｅｒ−１４２とＬｙｓ−１４３の間の部位でＰＡＰＰ−Ａ２がＩＧＦＢＰ−５を開裂することが明らかになった。
【０２５６】
図７は、ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡコード化領域のｃＤＮＡ配列を示しており３’ＵＴＲの配列が直接続いている。３’ＵＴＲの配列は、実施例６．３で詳細に示されるように得られる。この配列の最初の５３７６個のヌクレオチド（ｎｔ．１〜５３７６）は、図１および配列番号１（ｎｔ．１〜５３７６）で示されるコード化配列を示す。この配列のヌクレオチド５３７７〜８５２７は、配列番号３（ｎｔ．５３７７〜８５２７）で示されるＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相当する。
【０２５７】
図８は、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体（上の棒状の図）中のＰＡＰＰ−Ａサブユニットのジスルフィド構造を示している。ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体をプロテアーゼおよび臭化シアンで分解した後、標準的なＨＰＬＣにより、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体起源のシステイン含有ペプチドを単離した。ペプチドは、アミノ酸分析、Ｎ末端配列分析により、そして質量分析により同定した（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．、未公表）。ジスルフィド結合が、細線で示されている。２つのシステイン残基は、ｐｒｏＭＢＰへの鎖間ジスルフィド架橋を形成し、１つがＰＡＰＰ−Ａへの鎖間架橋を形成してそれにより二量体が生じる（図示の通り）。アスタリスクは、パートナーが見い出されていないシステインを示す。成熟ＰＡＰＰ−Ａにおいて存在するシステイン残基は、成熟ＰＡＰＰ−Ａ２においても存在している（図３参照）。ＰＡＰＰ−Ａ２ジスルフィドペアは同じであると仮定するのが理にかなっている。それゆえ、この情報は、ＰＡＰＰ−Ａ２の単離されたドメイン（フラグメント）の発現に対して境界領域を決定する際、重要である。ＰＡＰＰ−Ａの遺伝子構造も示されている（下の棒状の図）。エクソン／イントロンの境界は、ＰＡＰＰ−Ａ  ｃＤＮＡ（ＡＮ  Ｘ６８２８０）のゲノム配列（ＡＮ  ＡＢ０２０８７８、ＡＬ３５３１４１、およびＡＬ１３７０２４）との比較に基づいている。中央の棒状の図は、上側および下側の棒状の図の情報に基づいたＰＡＰＰ−Ａの推定のドメインを示している。
【実施例】
【０２５８】
実施例
６．１．ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするヌクレオチド配列の同定
本明細書において提供される受入れ番号（ＡＮ）は、Ｇｅｎ−Ｂａｎｋまたは他の生物学的配列データベースで示された配列をいう。ＡＮは、特定のＡＮのもとで示される蛋白またはヌクレオチド配列と置き換え可能である。
【０２５９】
ＰＡＰＰ−Ａと相同性のあるＤＮＡ配列（（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８）、ＡＮ  ＣＡＡ４８３４１）について、公式のヌクレオチドデータベースを調査すると、ポリペプチド配列に翻訳された場合、ＡＮ  ＡＬ０３１７３４およびＡＬ０３１２９０を有する２つのゲノムクローンが明らかとなった。両方とも、ヒト染色体１（１ｑ２４）起源である。調査は、デフォルト設定によるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でｔｂｌａｓｔｎプログラムを用いて、データベースの「ｎｒ」コレクションに対して実施された。この実施例において、ＰＡＰＰ−Ａは、（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８）に示すように、Ｎ末端のＧｌｕを残基１としてナンバリングしている。蓄積された配列記録（ＡＮ  Ｘ６８２８０）において、このＧｌｕは残基５である。
【０２６０】
ＡＬ０３１７３４で報告される配列は、１６８８３５の塩基対を含む。全体配列のうち２つの不連続配列伸長部（ｎｔ．１０３４３２〜１０３５６６、および１４０８４６〜１４１９１９）が一緒に、翻訳されたときにＰＡＰＰ−Ａポリペプチド配列の残基１６〜５９および５９〜４１３と整列される。ＡＬ０３１２９０において報告される配列は、１２１７８０の塩基対を含む。全体配列のうち４つの不連続配列伸長部（ｎｔ．１０２０９〜１０３５８、１１７５２〜１１９０１、２０５３１〜２０４６３、および６０５３６〜６０６５２）が一緒に、翻訳されたときにＰＡＰＰ−Ａポリペプチド配列の残基１３１３〜１３６２、１３７６〜１４２５、１４５７〜１４７９、および１４７０〜１５０６と整列される。両方のゲノム配列のコード化領域間の配列伸長部は、非コード化ゲノムＤＮＡ（イントロン）または整列しないコード化領域を示す。
【０２６１】
これらの所見に基づいて、我々は、ＰＡＰＰ−Ａと相同性のある新規蛋白、ＰＡＰＰ−Ａ２の存在を仮定した。そのあと、それは、ＡＬ０３１７３４およびＡＬ０３１２９０に報告される２つのゲノム配列により部分的に包含されるＰＡＰＰ−Ａ２領域の完全なコード化配列を確立した。我々は、これらの連続的配列、ｈｏｍ−Ｎおよびｈｏｍ−Ｃをそれぞれ示した（図２）。しかしまず第１に、我々は、ＰＡＰＰ−Ａに対してまた相同性を示し、ｈｏｍ−Ｎおよびｈｏｍ−Ｃ（図２）の配列に結合するコード化ｃＤＮＡ配列の存在を確立した。使用される重要なプライマーはすべて表１に示されている。１７９１残基のｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードするｃＤＮＡ配列全体を、図１に示している。標準的なクローニング法が利用されて、すべてのＤＮＡ構築物は、配列決定により分析された。使用される方法は、以下に示される。ＰＡＰＰ−Ａ２という名前は、このＤＮＡ配列によりエンコードされた蛋白に対して使用される。
【０２６２】
Ｈｏｍ−Ｎとｈｏｍ−Ｃとの間の中央領域に相当する連続的なコード化ｃＤＮＡ伸長部のクローニング：該中央領域（図２）を得るために、テンプレートとしてヒト胎盤ｍＲＮＡおよびプライマー、ＡＬ０３１２９０から誘導されるＲＴ−Ｎ−ｍｉｄを用いて、ｃＤＮＡを合成した（表１、図２）。このｃＤＮＡは、仮定のＰＡＰＰ−Ａ２の中央領域に相当するｃＤＮＡを得るために、ＰＣＲにおいてテンプレートとして使用した。ＰＣＲプライマーは、ＰＲ−ｍｉｄ５およびＰＲ−ｍｉｄ３であった（表１、図２）。得られた中央領域のコード化配列は、図３の残基６６５〜１５７２（配列番号１）、全体で９０８個のアミノ酸に相当する。
【０２６３】
【表１】
2010222341.tif 000002
【０２６４】
ＰＡＰＰ−Ａ２のＮ末端部に相当する連続的なコード化ｃＤＮＡ伸長部（ｈｏｍ−Ｎ）のクローニング：５’方向に更に続くゲノム配列ＡＬ０３１７３４のマニュアル調査により、ＰＡＰＰ−Ａ残基１６〜５９に相当する配列伸長部の読み取り枠：Ｎｔ．１０２６４６〜１０３５６６が、メチオニン残基で始まる３０７残基のポリペプチド配列をエンコードすることが明らかになった。この所見に基づいて、中央領域（上述で詳細に示されるような、ＲＴ−Ｎ−ｍｉｄで初回刺激を受けた胎盤ｍＲＮＡ）を得るために使用されるｃＤＮＡを、ｈｏｍ−Ｎの連続的なｃＤＮＡを得るためのＰＣＲにおいてテンプレートとして使用した。ＰＣＲプライマーは：ＰＲ−Ｎ５およびＰＲ−Ｎ３（表１、図２）であった。
【０２６５】
ＰＡＰＰ−Ａ２のＣ末端部に相当する連続的なコード化ｃＤＮＡ伸長部（ｈｏｍ−Ｃ）のクローニング：ＡＬ０３１２９０のゲノム配列に適合するヒトＥＳＴ配列について利用可能なデータベース（デフォルト設定を有するｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でのｂｌａｓｔｎプログラムを用いて）を調査することにより、伸長部ｎｔ．６０５３６〜６０６５２（上述参照）ですでに定義されたＡＬ０３１２９０のコード化領域のいくつかとオーバーラップするＥＳＴ配列が明らかになった。ＡＬ０３１２９０のｎｔ．６２７９０−６２９９５もまた、胎盤起源のヒトＥＳＴ配列、ＡＡ３６８０８１の配列と適合した。ポリペプチド配列に翻訳されたときに、このＥＳＴ配列は、ＰＡＰＰ−ＡのＣ末端部と相同性を示した。更に、停止コドンが、ＰＡＰＰ−Ａのアミノ酸１５３７に相当するコード化配列内に存在した。すなわち、その２つの配列が整列化されるときに、ＰＡＰＰ−Ａ２は、ＰＡＰＰ−ＡよりもＣ末端側には存在しない。このことに基づいて、テンプレートとしてヒト胎盤ｍＲＮＡおよびＡＬ０３１２９０起源のプライマー（表１）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲプライマー、ＰＲ−Ｃ５およびＰＲ−Ｃ３（表１、図２）を用いて、ｈｏｍ−Ｃの連続的ｃＤＮＡを得るためのＰＣＲにおいてテンプレートとして、このｃＤＮＡを使用した。
【０２６６】
すべてのＰＣＲは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施した。３つのオーバーラップするＰＡＰＰ−Ａ２  ｃＤＮＡ（ｈｏｍ−Ｎ、新規な中央領域、およびｈｏｍ−Ｃ）はすべて、ベクターＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローン化した。いくつかのクローンを双方向で配列決定した。その構築物は、それぞれｐ２Ｎ、ｐ２Ｍｉｄ、およびｐ２Ｃという。ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする全体的なヌクレオチド配列は、図１（および配列番号１）に示されている。
６．２．ＰＡＰＰ−Ａ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析
成熟ＰＡＰＰ−Ａの１５４７残基のうち、７０８残基（４５．８％）が、ｐｒｅｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２と同一である。ＰＡＰＰ−Ａのｐｒｅｐｒｏ部分とＰＡＰＰ−Ａ２の残りの（Ｎ末端）との間には、十分な同一性はない（図３）。この実施例において、ＰＡＰＰ−Ａは、（（Ｈａａｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７，  １５９−６３）、ＡＡＣ５０５４３）に従ってナンバリングしている。
【０２６７】
ＰＡＰＰ−Ａにおいて認識される配列モチーフ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８）は、ＰＡＰＰ−Ａ２にも存在する：伸長された亜鉛結合連続配列、３つｌｉｎ−ノッチ反復（ＬＮＲ１〜３）、および５つの短い連続反復（ＳＣＲ１〜５）（図３）。更に、ＰＡＰＰ−Ａの８２個のシステイン残基すべてが、その２つの蛋白の間に保持されて、更に４個のシステインがＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチド配列中に存在する。
６．３．ＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡ起源のヒトＥＳＴ配列の同定
ＡＬ０３１２９０のゲノム配列と適合するＥＳＴ配列のクラスターを、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする配列の末端部からのおよそ１．２ｋｂで始まり、ＡＬ０３１２９０のｎｔ．６４０００〜６６０００周辺で同定した。ＰＡＰＰ−Ａ２のコード化領域およびこのクラスターに結合するｍＲＮＡの存在が、ＡＬ０３１２９０由来のプライマー（５’−ＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴ−３’、ＡＬ０３１２９０のｎｔ．６４９００−６４８７９）およびＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする配列（５’−ＣＣＧＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＣ−３’、ＡＬ０３１２９０のｎｔ．２０４９９−２０５１９、ＡＦ３１１９４０のｎｔ．５１７１−５１９１）、およびテンプレートとしてオリゴ−ｄＴ初回刺激を受けた胎盤ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲにおいて明らかにされた（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６１，  １０８３−９）。予測されるように、結果の生成物のサイズは、２．２ｋｂであり、更に約３ｋｂの３’ＵＴＲを有するＰＡＰＰ−Ａ２  ｍＲＮＡの存在が示される。組織間の分配は、表２に示されている。
【０２６８】
【表２】
2010222341.tif 000003
【０２６９】
６．４．組み換えＰＡＰＰ−Ａ２およびＰＡＰＰ−Ａ２変異体の哺乳類細胞における発現
以下に示すプラスミド構築物が作成された：
ａ）ｐＰＡ２：発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１＋においてアミノ酸１−１７９１をエンコードするｐｒｅ−ｐｒｏ−ＰＡＰＰ−Ａ２のｃＤＮＡ配列
ｂ）ｐＰＡ２−ＫＯ：ｐＰＡ２と同様であるが、ＰＡＰＰ−Ａ２の活性部位のＧｌｕ−７３４がＧｌｎ残基と置換されたもの（Ｅ７３４Ｑ）
ｃ）ｐＰＡ２−ｍＨ：発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａを含有する、アミノ酸１〜１７９１をエンコードするｐｒｅ−ｐｒｏ−ＰＡＰＰ−Ａ２のｃＤＮＡ配列で、後に停止コドンは続くのではなくて、ｃ−ｍｙｃおよびＨｉｓタグが続いているもの
ｄ）ｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨ：ｐＰＡ２−ｍＨと同様であるが、ｐＰＡ２−ＫＯがＥ７３４Ｑ置換されたもの
３つのオーバーラップしているＰＡＰＰ−Ａ２  ｃＤＮＡフラグメント（ｈｏｍ−Ｎ、中央領域、およびｈｏｍ−Ｃ）を、ＰＡＰＰ−Ａ２をエンコードする一本の連続したｃＤＮＡ配列の構築に使用した。そのオーバーラップするフラグメントは、ベクター、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にすべて含まれており、上述に詳細に示すように、ｐ２Ｎ、ｐ２Ｍｉｄ、およびｐ２Ｃという（実施例６．１）。適当な配向のｃＤＮＡ挿入部を有するｐ２Ｎおよびｐ２Ｃのクローンを選んだ。
【０２７０】
ｐＰＡ２の構築：ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐ２Ｃから切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でクローン化してｐ２ＣＢｌｕｅを得た。ＮｏｔＩ−ＳｐｅＩフラグメントをｐ２Ｎから切り取り、ＳｐｅＩ−ＢｃｌＩフラグメントをｐ２Ｍｉｄから切り取った。それら２つのフラグメントを、１つの反応においてｐ２ＣＢｌｕｅのＮｏｔＩ／ＢｃｌＩ部位にリゲートして、ＰＡＰＰ−Ａ２  ｃＤＮＡ全体を含むｐ２ＮＭｉｄＣＢｌｕｅを得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋のＮｏｔＩ−ＡｐａＩフラグメントを切り取って、哺乳類の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｏｔＩ／ＡｐａＩ部位中にリゲートして、このベクターの修飾型である、ｐｃＤＮＡ−ＮＡを得た。その後、完全長のｃＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを用いてｐ２ＮＭｉｄＣＢｌｕｅから切り取り、ｐｃＤＮＡ−ＮＡ中でクローン化してｐＰＡ２を得た。ＳｐｅＩとＢｃｌＩを除いて、使用されるすべての制限部位は、ベクターのマルチクローニング部位中にあり、両方ともｐ２Ｎ、ｐ２Ｍｉｄ、およびｐ２Ｃのコード化ＰＡＰＰ−Ａ２配列伸長部の２つのオーバーラップ領域のそれぞれに位置する（それぞれ、図３のｎｔ．２３６５およびｎｔ．４２０３）。
【０２７１】
ｐＰＡ２−ＫＯの構築：ｐＰＡ２−ＫＯ構築物は、ＰＡＰＰ−Ａ２の活性部位のＧｌｕ−７３４残基がＧｌｎ残基と置換したｐＰＡ２発現構築物の一変異体である。従って、その突然変異体は、Ｅ７３４Ｑである。ｐＰＡ２−ＫＯ構築物は、テンプレートとしてｐＰＡ２を用いて、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｇｅｎｅ  ７７，  ５１−９）を用いた部位特異的突然変異誘発により作成した。簡単にいうと、外側のプライマーが、５’−ＣＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＧ−３’（５’末端プライマー、配列番号１のｎｔ．９７６〜９９５）および５’−ＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣ−３’（３’末端プライマーｎｔ．１０４０〜１０２１、ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋の配列）である。オーバーラップする内部プライマーは、５’−ＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＴＧＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１のｎｔ．２２１０〜２１７８、Ｅ７３４Ｑの結果ｎｔ．２２００はＣではなくてＧである）および５’−ＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１のｎｔ．２１９６〜２２２１、Ｅ７３４Ｑの結果、ｎｔ．２２００はＧではなくてＣである）である。その結果生成する突然変異フラグメントを、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、ｐＰＡ２と交換してｐＰＡ２−ＫＯを産生した。ＰＣＲはすべて、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施し、全ての構築物を配列分析により確認した。
【０２７２】
ｐＰＡ２−ｍＨの構築：２つのプライマー（５’−ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧ−３’、配列番号１のｎｔ．４９０６〜４９２６、および５’−ＧＡＣＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧ−３’、配列番号１のｎｔ．５３７３〜５３５４、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＡＡＧＣＴＴ、およびＰＣＲ生成物の開裂を促進するｎｔ．ＧＡＣＧＴＡの前にある）を、ＰＣＲにおいて、テンプレートとしてｐＰＡ２と一緒に使用して、発現ベクターへのインフレームでリゲーションするためにＨｉｎｄＩＩＩ部位で置換された停止コドンを有するＰＡＰＰ−Ａ２のＣ末端の１５６残基をエンコードするヌクレオチドフラグメントを産生した。簡単にいうと、ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）ＡベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中でクローン化してｐＰＡ２Ｃ−ｍＨを産生した。ＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメント（ＰＡＰＰ−Ａ２のＮ末端部分をエンコードする）、およびＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ＰＡＰＰ−Ａ２の残りの中央部分をエンコードする）をｐＰＡ２から切り取って、１つの反応においてｐＰＡ２Ｃ−ｍＨのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位にリゲートした。その結果生成する構築物、ｐＰＡ２−ｍＨは、ＰＡＰＰ−Ａ２、続いてＫＬＧＰ残基、ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＮＳＡＶＤ残基、および６個のＨ−残基（アミノ酸は、１文字表記されている）をエンコードした。６個のヒスチジン残基の直後に停止コドンが続いている。
【０２７３】
ｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨの構築：残基Ｇｌｕ−７３４をＧｌｎ残基に置換したｐＰＡ２−ｍＨ変異体を構築した：ｐＰＡ２−ＫＯのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントを切り取り、ｐＰＡ２−ｍＨのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ部位と交換してｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨを産生した。
【０２７４】
哺乳類細胞における発現：すべての構築物（ｐＰＡ２、ｐＰＡ２−ＫＯ、ｐＰＡ２−ｍＨ、およびｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨ）ならびに空の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１＋およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ）を、組み換えＰＡＰＰ−Ａ２蛋白の発現のために哺乳類の細胞中に短期間トランスフェクトした。簡単にいうと、ヒトの胎児の腎臓２９３Ｔ細胞（２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏ）（ＤｕＢｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７，  ３７９−８７）を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭ  グルタミン、非必須アミノ酸、およびゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した高濃度のグルコースＤＭＥＭ培地中で維持した。細胞を６ｃｍの培養皿上にプレーティングし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製した１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いたリン酸カルシウム共沈（Ｐｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０，  ８３９２−６）により１８時間後にトランスフェクトした。更に４８時間後、その上清を回収して、血清フリーの培地（２９３ＳＦＭＩＩ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で更に４８時間置き換えた。その血清フリーの培地を回収して、遠心分離により除去した。
【０２７５】
構築物、ｐＰＡ２−ｍＨおよびｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨを用いたトランスフェクションの結果生成する組み換え蛋白のウエスタンブロッティングによる分析は、ＰＡＰＰ−Ａ２が、２２０ｋＤａの蛋白（図２参照）として分泌されることを示した。ジスルフィド結合の還元により、バンド移動には目に見える変化はもたらされなかった。従って、ＰＡＰＰ−Ａとは対照的に、ＰＡＰＰ−Ａ２は、単量体として分泌される。
６．５．タグ化ＰＡＰＰ−Ａ２のアフィニティークロマトグラフィーによる精製
金属キレートアフィニティーカラム（２ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をニッケルイオンで帯電して、ｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨを用いて短期間トランスフェクトした細胞（実施例６．４参照）由来の血清フリー培地をロードした（５０ｍｌ）。１Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳ中での洗浄後、結合蛋白を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの０．５ｍｌのＰＢＳフラクション中で溶出した。ＰＡＰＰ−Ａ２を含有するフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより位置決めした（図４、レーン５）。この蛋白は、空ベクターにより同じ方法で処置したトランスフェクトした細胞（偽のトランスフェクタント、ｍｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）からは見られなかった。
６．６．ＰＡＰＰ−Ａ２のＮ末端配列分析
構築物、ｐＰＡ２−ＫＯ−ｍＨ（実施例６．４および６．５参照）を用いてトランスフェクトした細胞の培地から精製された、Ｃ末端側をタグ化したＰＡＰＰ−Ａ２を還元し、１０〜２０％  ＳＤＳゲル上に流して、更にＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより提供）上にブロッティングした。４つのレーンのバンドを切り取って、オンラインのＨＰＬＣを備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７７Ａシーケンサー（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  １９９５，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２５，  １８７−８）で、Ｎ末端分析を実施した。ＰＡＰＰ−Ａ２ポリペプチドのＳｅｒ−２３４の前で、Ｒ（２３０）ＶＫＫの後の開裂の結果得られたおよそ２０ｐｍｏｌレベルでＮ末端配列：Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ＳＰＰＥＥＳＮ）が見られた。
【０２７６】
これにより、ＰＡＰＰ−Ａ２がＰＡＰＰ−Ａと同様、ｐｒｅｐｒｏ蛋白として合成されるという予測が確認される。Ｐ１位におけるアルギニン残基の不在は、この開裂の原因となるｐｒｏ蛋白プロセシング酵素がフリンではなくて、似た別のｐｒｏ蛋白転換酵素（Ｎａｋａｙａｍａ，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２７，  ６２５−３５）であることを示している。ｐｒｏＰＡＰＰ−Ａ２の開裂は、典型的にフリン開裂を示すＲ（１９６）ＱＲＲ（Ｎａｋａｙａｍａ，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２７，  ６２５−３５）の後と予想されるかもしれない。我々は、開裂がこの部位で起こり、所見のＮ末端部が更なるプロセシングの結果によるものであるということを排除することはできない。
６．７．インシュリン様成長因子結合蛋白（ＩＧＦＢＰ）−５の開裂
ＩＧＦＢＰ−１（ＨｅｐＧ２調整培地由来）、ｒＩＧＦＢＰ−２（ＧｒｏＰｅｐ）、ｒＩＧＦＢＰ−３（Ｐｏｗｅｌｌ博士より贈与）、ｒＩＧＦＢＰ−４（Ａｕｓｔｒａｌ）、ｒＩＧＦＢＰ−５（Ａｎｄｒｅｓｓ博士より贈与）、およびｒＩＧＦＢＰ−６（Ａｕｓｔｒａｌ）に対する活性をアッセイするために、放射標識したＩＧＦ−ＩＩ（Ｂａｃｈｅｍ）を用いたリガンドブロッティング（Ｃｏｎｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１，  １１２９−３７）を利用した。６つの結合蛋白のうち、ＩＧＦＢＰ−５は、完全な開裂を示した（図５）。ＩＧＦＢＰ−３は、一部分分解した（図５）。この開裂は、ＩＧＦの存在とは無関係であった。実験は、ｐＰＡ２または空ベクターを用いてトランスフェクトした細胞由来の培地を用いて実施した。
【０２７７】
更なる分析に対して、組み換えＩＧＦＢＰ−５が哺乳類の細胞中で生成された。簡単にいうと、ヒト胎盤オリゴ−ｄＴで初回刺激したｃＤＮＡ（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６１，  １０８３−９）を、テンプレートとして用いて、ヒトＩＧＦＢＰ−５（受け入れ番号  Ｍ６５０６２）をエンコードするｃＤＮＡを増幅した。ＸｈｏＩ部位（５’−ＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＧＴ−３’）およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（５’−ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧ−３’）を含有する特異的なプライマーを使用し、その結果のＰＣＲ生成物を消化して、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中でクローン化した。完全長のｐｒｏＩＧＦＢＰ−５をエンコードした構築物の直後に、残基ＫＬＧＰ、ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＮＳＡＶＤ残基、および６個のＨ−残基（アミノ酸は、一文字表記されている）が続く。その構築物を、配列分析により確認した。トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。組み換えＩＧＦＢＰ−５の細胞培養および発現は、上述の実施例６．４．に示される通りに実施した。
【０２７８】
ウエスタンブロッティングにより開裂分析を実施した（図６）。簡単にいうと、５μＬの細胞培養培地中に含まれるような組み換えＩＧＦＢＰ−５を、ｐＰＡ２、ｐＰＡ２−ＫＯ、または空の発現ベクター（実施例６．４参照）を用いてトランスフェクトされた細胞由来の培養上清（１０μＬ）と一緒にインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水を添加して、５０μＬの最終容量とした。３７℃で１２時間インキュベーション後、１５μＬの反応混合物を、１６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元して分離し、ＰＶＤＦ膜状にブロッティングし、Ｃ末端開裂生成物を、ペルオキシダーゼ共役型二次抗体（Ｐ２６０、ＤＡＫＯ）、および化学発光増幅（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃ（クローン９Ｅ１９、ＡＴＴＣ）により検出した。
６．８．ＰＡＰＰ−Ａ２活性の阻害
ＩＧＦＢＰ−５に対するＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性の阻害能について、様々な薬剤を分析した。実験条件は、試験される薬剤を添加することを除いては、本質的には実施例６．７に示される通りであった（図６）。ＰＡＰＰ−Ａ２の蛋白分解活性に影響を与えないと見い出された薬剤としては更に、ＰＭＳＦおよびアプロチニンが挙げられる。
６．９．ＩＧＦＢＰ−５における開裂部位の同定
開裂部位の決定については、精製されたｒＩＧＦＢＰ−５（図６、レーン７）を、精製したＰＡＰＰ−Ａ２で消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６、レーン８）により分析した。ブロットした物質のエドマン分解により、別々の目に見える分解生成物（図６、レーン８）は両方とも、Ｎ末端配列、Ｋ（１４４）ＦＶＧＧＡ（ＩＧＦＢＰ−５は、成熟蛋白のＮ末端Ｌｅｕを残基を１としてナンバリングしている）を含んでいることが示された。２つのバンドは両方とも、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグを含むため（図６、レーン９）、インタクトなＣ末端開裂フラグメントを示しており；それらは精製されたｒＩＧＦＢＰ−５（図６、レーン７）の異質性により、様々にグリコシル化される可能性がある。両方のバンドとも、低レベル（４５％）で、ＩＧＦＢＰ−５に相当する第２の配列、Ｌ（１）ＧＸＦＶＨを含んでいた。Ｓｅｒが存在しないことは、第３のサイクルで予想されるが、Ｓｅｒ−３の炭化水素置換の証拠と考えられた。Ｎ末端開裂フラグメント上のＯ−結合型グリカンが、２つ別々のＣ末端フラグメントの周りをスメアさせる可能性がある。反応混合物（＞１００ｐｍｏｌ）に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離をしない配列分析は、等モルで同一の２つのＩＧＦＢＰ−５配列のみを示した。従って、ＰＡＰＰ−Ａ２は、Ｓｅｒ−１４３とＬｙｓ−１４４との間の１つの部位でＩＧＦＢＰ−５を開裂する。
６．１０．ＰＡＰＰ−Ａ２がＩＧＦＢＰ−５の蛋白分解を引き起こし得る組織
ＩＧＦＢＰ−５に対する蛋白分解活性は、数種の起源、例えば妊婦血清（Ｃｌａｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４，  １９６４−６）、精漿（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ７９，  １３６７−７２）、平滑筋細胞（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００，  ２５９６−６０５）、顆粒膜細胞（Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９，  １２４９−５７）、骨肉腫細胞（Ｃｏｎｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｅｆｅｒ，  １９９３，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ７６，  １１５３−９）、およびまたは骨芽細胞（Ｔｈｒａｉｌｋｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，  ３５２７−３３）由来の培養培地、および線維芽細胞（Ｂｕｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）から広範に報告されている。一般的に、ＩＧＦＢＰ−５の開裂の原因となるプロテアーゼは、同定されないままである。
【０２７９】
線維芽細胞および骨芽細胞（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，  ３１４９−５３）と同様、濾胞液（Ｃｏｎｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８４，  ４７４２−５）、妊婦血清（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、および血管平滑筋細胞（Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ，  Ａ．，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ａｓｈａｉ，  Ｋ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｈｏｌｍｅｓ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｊｒ．，  ａｎｄ  Ｃｏｎｏｖｅｒ，  Ｃ．  Ａ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．、製本中）におけるＩＧＦＢＰ−４プロテアーゼとしてのＰＡＰＰ−Ａの最近の同定は、いくつかの系においてはＰＡＰＰ−ＡおよびＩＧＦＢＰ−４を重要な機能ペアとして完全に確立した。ＰＡＰＰ−Ａに対して見い出されているような基質以外はいずれも、および他のプロテアーゼはいずれも、生理的にＩＧＦＢＰ−４を開裂することが示されていない。それ故、ＰＡＰＰ−Ａ２とＩＧＦＢＰ−５のペアが、上述のおよび／または他の多数の組織において、類似の役割を果たすものと思われる。興味深いことに、ＩＧＦＢＰ−５を平滑筋細胞調整培地と一緒にインキュベーションした結果、Ｓｅｒ−１４３とＬｙｓ−１４４との間が開裂し（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００，  ２５９６−６０５）、これはＰＡＰＰ−Ａ２により本明細書において見られるのと同一の開裂である。このことは、ＰＡＰＰ−Ａ２をこの組織に対する明らかな候補ＩＧＦＢＰ−５プロテアーゼとして直接示唆する。
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Ｇｍｕｎｄｅｒ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｋｏｈｌｉ，  Ｊ．  （１９８９）．  Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇ４１８  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ．  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２０，  ９５−１０１．
Ｈａｄｄｏｗ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｐａｌｏｍａｋｉ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｊ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ａ．  （１９９８）．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｆｏｒ  ｆｅｔａｌ  Ｄｏｗｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８，  ９５５−６１．
Ｈｏ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｈｕｎｔ，  Ｈ．  Ｄ．，  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｐｕｌｌｅｎ，  Ｊ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｐｅａｓｅ，  Ｌ．  Ｒ．  （１９８９）．  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ［ｓｅｅ  ｃｏｍｍｅｎｔｓ］．  Ｇｅｎｅ  ７７，  ５１−９．
Ｈｗａ，  Ｖ．，  Ｏｈ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｒ．  Ｇ．  （１９９９）．  Ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＧＦＢＰ）  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２０，  ７６１−８７．
Ｈａａｎｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｅｂｂｅｓｅｎ，  Ｐ．，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９６）．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃＡＭＰ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７，  １５９−６３．
Ｉｍａｉ，  Ｙ．，  Ｂｕｓｂｙ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｊｒ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｇａｒｍｏｎｇ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｒｅｅｓ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｍｏｎｓ，  Ｄ．  Ｒ．  （１９９７）．  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００，  ２５９６−６０５．
Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｓａｎｄ，  Ｏ．，  Ｍｏｌｌｅｒ，  Ｎ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９４）．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １５９２−８．
Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｇｌｅｉｃｈ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｈａｙｓ，  Ｌ．  Ｇ．，  Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．  Ｒ．，  ３ｒｄ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｏｖｅｒ，  Ｃ．  Ａ．  （１９９９）．  Ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＩＧＦ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＩＧＦ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｓ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，  ３１４９−５３．
Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｏ．，  Ｏｈ，  Ｙ．，  Ｇｉｕｄｉｃｅ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｐｅｅｈｌ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｒ．  Ｇ．  （１９９４）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  （ＩＧＦＢＰ−３）  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ＩＧＦＢＰ−５  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ：  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｖａｓｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ７９，  １３６７−７２．
Ｌｉｎ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｇａｌｂｅｒｔ，  Ｓ．  Ｐ．，  Ｋｉｅｆｅｒ，  Ｄ．，  Ｓｐｅｌｌａｃｙ，  Ｗ．  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｇａｌｌ，  Ｓ．  （１９７４）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １１８，  ２２３−３６．
Ｌｏｇａｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，  Ｔ．  （１９８４）．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｌａｔｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８１，  ３６５５−９．
Ｍａｃｋｅｔｔ，  Ｍ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，  Ｂ．  （１９８２）．  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ：  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７９，  ７４１５−９．
Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．  Ｒ．，  Ｂｏｎｎｅｒｔ，  Ｔ．  Ｐ．，  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，  Ｊ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ａ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．  （１９９１）．  Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｐｈａｇｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２，  ５８１−９７．
Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｄ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ａ．  （１９９３）．  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｈａｇｅ：  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｂｙ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，  １１１３−７．
ＭｃＧｒｏｇａｎ，  Ｍ．，  Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，  Ｃ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｒ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｊ．，  Ｅｌｌｉｓ，  Ｎ．，  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｊ．，  Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ，  Ｄ．，  Ｎａｔｈａｎ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｇａｂａｙ，  Ｊ．  （１９８８）．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８，  ２２９５−３０８．
Ｍｅｌｄａｌ，  Ｍ．  （１９９８）．  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ６５−７４．
Ｍｅｌｄａｌ，  Ｍ．  （１９９８）．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ５１−７．
Ｍｅｌｄａｌ，  Ｍ．  （１９９８）．  Ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｓｓａｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７，  ７５−８２．
Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｋ．  （１９９７）．  Ｆｕｒｉｎ：  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘ２ｐ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｗｉｄｅ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２７，  ６２５−３５．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｊ．，  Ｂｒｕｎａｋ，  Ｓ．，  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，  Ｇ．  （１９９７）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０，  １−６．
Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｈａａｎｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｂｏｌｄｔ，  Ｈ．  Ｂ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ｉ．  Ｍ．，  Ｌａｕｒｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｇｌｅｉｃｈ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｃｏｎｏｖｅｒ，  Ｃ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．  （２０００）．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  Ｍａｊｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ｉｔｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．
Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｃｏｎｏｖｅｒ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｇｌｅｉｃｈ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｈａａｎｉｎｇ，  Ｊ．  （１９９９）．  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６１，  １０８３−９．
Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｈａａｎｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｈｏｊｒｕｐ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９４）．  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｓｅｒｕｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  ３３，  ３２９−３６．
Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｈａａｎｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｒｕｂｉｎ，  Ｉ．，  Ｓｔｉｇｂｒａｎｄ，  Ｔ．，  Ｇｌｅｉｃｈ，  Ｇ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９５）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ３ｄｇ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，  １３６４５−５１．
Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｓａｎｄ，  Ｏ．，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｇｌｅｉｃｈ，  Ｇ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９３）．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ｉｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８，  １２２４３−６．
Ｏｘｖｉｇ，  Ｃ．，  Ｓａｎｄ，  Ｏ．，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９４）．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ａｎｄ  ｐｒｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２０１，  ４１５−２３．
Ｐｅａｒ，  Ｗ．  Ｓ．，  Ｎｏｌａｎ，  Ｇ．  Ｐ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｍ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｄ．  （１９９３）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０，  ８３９２−６．
Ｐｅｔｅｒｓ，  Ｊ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ，  Ｈ．  （１９９２）．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｏｆｆｅｒｓｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）．
Ｒａｊａｒａｍ，  Ｓ．，  Ｂａｙｌｉｎｋ，  Ｄ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｍｏｈａｎ，  Ｓ．  （１９９７）．  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ：  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １８，  ８０１−３１．
Ｒｅｓｎｉｃｋ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ｆｉｅｌｄｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｒ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ａｄａｓｈｉ，  Ｅ．  Ｙ．  （１９９８）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒａｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−５  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ：  ａｎ  ＦＳＨ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９，  １２４９−５７．
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｓ．  Ａ．  （１９９９）．  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３０６，  １５４−６９．
Ｒｕｔｈｅｒ，  Ｕ．，  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，  Ｂ．  （１９８３）．  Ｅａｓｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２，  １７９１−４．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）．
Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｒ．  Ｋ．  （１９８７）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．  （Ｈａｒｒｉｓｏｎｂｕｒｇ，  ＶＡ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）．
Ｓｉｎｏｓｉｃｈ，  Ｍ．  Ｊ．  （１９９０）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １１，  ７０−８．
Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ｓｕｍｍｅｒｓ，  Ｍ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  （１９８３）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，  ２１５６−６５．
Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９３）．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｌｆｃｙｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  ３０，  ７８９−９４．
Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  （１９９５）．  Ａ  ｌｏｗ−ｐＨ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｈｙｄａｎｔｏｉｎｓ  ｏｆ  Ｓ−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓ−ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２５，  １８７−８．
Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｋ．，  Ｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｓｋｅｎｔｏｕ，  Ｈ．，  Ａ，  Ｗ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｋ，  Ｈ．  Ｎ．  （２０００）．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｒｉ−ｓｏｍｙ  １３  ｂｙ  ｆｅｔａｌ  ｎｕｃｈａｌ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｂｅｔａ−ｈＣＧ  ａｎｄ  ＰＡＰＰ−Ａ  ａｔ  １０−１４  ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎ．  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ２０，  ４１１−６．
Ｓｔｏｃｋｅｒ，  Ｗ．，  Ｇｒａｍｓ，  Ｆ．，  Ｂａｕｍａｎｎ，  Ｕ．，  Ｒｅｉｎｅｍｅｒ，  Ｐ．，  Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ，  Ｆ．  Ｘ．，  ＭｃＫａｙ，  Ｄ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，  Ｗ．  （１９９５）．  Ｔｈｅ  ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ−−ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ａｓｔａｃｉｎｓ，  ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ，  ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ，  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘｉｎｓ  （ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４，  ８２３−４０．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｔ．  Ｊ．  （１９９４）．  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２，  ４６７３−８０．
Ｔｈｒａｉｌｋｉｌｌ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｑｕａｒｌｅｓ，  Ｌ．  Ｄ．，  Ｎａｇａｓｅ，  Ｈ．，  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｋ．，  Ｓｅｒｒａ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆｏｗｌｋｅｓ，  Ｊ．  Ｌ．  （１９９５）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，  ３５２７−３３．
Ｗａｌｄ，  Ｎ．，  Ｓｔｏｎｅ，  Ｒ．，  Ｃｕｃｋｌｅ，  Ｈ．  Ｓ．，  Ｇｒｕｄｚｉｎｓｋａｓ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｂａｒｋａｉ，  Ｇ．，  Ｂｒａｍｂａｔｉ，  Ｂ．，  Ｔｅｉｓｎｅｒ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｆｕｈｒｍａｎｎ，  Ｗ．  （１９９２）．  Ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １４  ｉｎ  Ｄｏｗｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ［ｓｅｅ  ｃｏｍｍｅｎｔｓ］．  Ｂｍｊ  ３０５，  ２８．
Ｗａｌｄ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｗａｔｔ，  Ｈ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｈａｃｋｓｈａｗ，  Ａ．  Ｋ．  （１９９９）．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｏｗｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｓｔｓ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒｓ  ［ｓｅｅ  ｃｏｍｍｅｎｔｓ］．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４１，  ４６１−７．
Ｗａｌｓｈ，  Ｐ．  Ｓ．，  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｕｃｈｉ，  Ｒ．  （１９９２）．  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｌｅｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  １，  ２４１−５０．
Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｃｈｅｍｎｉｔｚ，  Ｊ．，  Ｔｅｉｓｎｅｒ，  Ｂ．，  Ｐｏｕｌｓｅｎ，  Ｈ．  Ｋ．，  Ｉｐｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｂｅｃｋ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｇｒｕｄｚｉｎｓｋａｓ，  Ｊ．  Ｇ．  （１９８３）．  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ：  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｎｅｌｉａ  ｄｅ  Ｌａｎｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ３，  ２２５−３２．
【０２８０】
【表３】
2010222341.tif 000004
【０２８１】
［配列表］
【０２８２】
【表４−１】
2010222341.tif 000005
【０２８３】
【表４−２】
2010222341.tif 000006
【０２８４】
【表４−３】
2010222341.tif 000007
【０２８５】
【表４−４】
2010222341.tif 000008
【０２８６】
【表４−５】
2010222341.tif 000009
【０２８７】
【表４−６】
2010222341.tif 000010
【０２８８】
【表４−７】
2010222341.tif 000011
【０２８９】
【表４−８】
2010222341.tif 000012
【０２９０】
【表４−９】
2010222341.tif 000013
【０２９１】
【表４−１０】
2010222341.tif 000014
【０２９２】
【表４−１１】
2010222341.tif 000015
【０２９３】
【表４−１２】
2010222341.tif 000016
【０２９４】
【表４−１３】
2010222341.tif 000017
【０２９５】
【表４−１４】
2010222341.tif 000018
【０２９６】
【表４−１５】
2010222341.tif 000019
【受託番号】
【０２９７】
ＤＳＭ１３７８３
【図１ａ】
2010222341.tif 000020
【図１ｂ】
2010222341.tif 000021
【図１ｃ】
2010222341.tif 000022
【図２】
2010222341.tif 000023
【図３】
2010222341.tif 000024
【図４】
2010222341.tif 000025
【図５】
2010222341.tif 000026
【図６】
2010222341.tif 000027
【図７ａ】
2010222341.tif 000028
【図７ｂ】
2010222341.tif 000029
【図８】
2010222341.tif 000030