(57)【要約】【課題】硫酸基の脱離を実質的に伴うことなく低分子化でき、しかも反応条件を変えることにより容易に分子量制御を可能にする方法、ならびにそのような方法により得られる低分子化コンドロイチン硫酸を提供する。【解決手段】コンドロイチン硫酸を高温高圧水中で処理（熱水処理）するに際し、温度、反応時間およびｐＨを選択することにより、硫酸基の脱離を実質的に伴うことなく低分子化させ、容易に分子量制御を行う方法、ならびに上記方法により得られる低分子化フコイダン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴わない低分子化コンドロイチン硫酸の製造方法であって、硫酸基が実質的に脱離しない水熱条件下にコンドロイチン硫酸の水溶液を保持することを特徴とする方法。
【請求項２】
ｐＨ無調節またはｐＨを２．５よりも高い値〜１２．０に調節したコンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨ無調節またはｐＨを２．５よりも高い値〜１２．０に調節したコンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし６０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ無調節またはｐＨを２．５よりも高い値〜１２．０に調節したコンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし１４０℃の水熱条件下に５分ないし４０分保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを２．５よりも高い値〜６．０未満に調節し、コンドロイチン硫酸の低分子化を促進しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを３．４〜４．０に調節し、コンドロイチン硫酸の低分子化を促進しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを１１．０〜１２．０に調節し、コンドロイチン硫酸の低分子化を抑制しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
コンドロイチン硫酸がコンドロイチン硫酸Ｃである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
コンドロイチン硫酸がコンドロイチン硫酸Ａである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法により得ることのできる低分子化コンドロイチン硫酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化硫酸化多糖、詳細には、低分子化コンドロイチン硫酸の製造方法に関する。詳細には、水熱反応を用いることにより糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴わずにコンドロイチン硫酸を低分子化させることを特徴とする、低分子化コンドロイチン硫酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンドロイチン硫酸はウロン酸とアセチルガラクトサミンを繰り返しユニットとし、その一部が硫酸化された天然由来の硫酸化多糖の一つであり、硫酸基の置換位置、数によりコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅに区別されている。コンドロイチン硫酸は、軟骨再生など様々な生理活性が注目されており、例えば、注射液として腰痛、関節痛、肩関節周囲炎などの治療に用いられ、点眼液として角膜表層の保護に用いられている。また、健康食品にも応用されている。コンドロイチン硫酸のこれらの生物活性は分子量分布、硫酸基の置換度に依存することが知られている。ある程度低分子化されたコンドロイチン硫酸のほうが、体内への吸収がよいと考えられる。さらに、コンドロイチン硫酸は保湿作用を有することから、化粧品等にも用いられている。
【０００３】
コンドロイチン硫酸の分子量と生理活性との相関について調べるためには、分子量の制御が容易で、しかも硫酸基の脱離が少ない低分子化法が必要となる。コンドロイチン硫酸の低分子化法としては酸加水分解法が一般的であるが、この方法は反応時間が短いという利点はあるものの、分子量の制御が困難であり、硫酸基の保持率も低いという欠点を有する。酵素を用いてコンドロイチン硫酸を低分子化する方法もあるが（特許文献１参照）、反応時間が長く、コストもかかるという欠点を有する。このような事情から、分子量制御が容易で、しかも迅速にコンドロイチン硫酸を低分子化させる方法が望まれている。また、コンドロイチン硫酸の生理活性は硫酸基に負うところが大きいので、硫酸基の脱離を抑制しつつコンドロイチン硫酸を低分子化する方法も望まれている。これらの条件を満たすコンドロイチン硫酸の低分子化方法が実現されれば、コンドロイチン硫酸の分子量と生理活性との相関についての詳細な研究が進み、生理活性の高い低分子化コンドロイチンを得ることができると期待される。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００４／９７０２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記事項に鑑みて、本発明は、糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴うことなく低分子化でき、しかも反応条件を変えることにより容易に分子量制御を可能にする方法、ならびにそのような方法により得られる低分子化コンドロイチン硫酸を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、コンドロイチン硫酸を高温高圧水中で処理（熱水処理）するに際し、温度、反応時間およびｐＨを選択することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の方法およびそれにより得られる低分子化コンドロイチン硫酸を提供する：
（１）糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴わない低分子化コンドロイチン硫酸の製造方法であって、硫酸基が実質的に脱離しない水熱条件下にコンドロイチン硫酸の水溶液を保持することを特徴とする方法；
（２）ｐＨ無調節またはｐＨを約２．５よりも高い値〜約１２．０に調節したコンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（３）ｐＨ無調節またはｐＨを約２．５よりも高い値〜約１２．０に調節したコンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約６０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（４）ｐＨ無調節またはｐＨを約２．５よりも高い値〜約１２．０に調節したコンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし約１４０℃の水熱条件下に約５分ないし約４０分保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（５）水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを約２．５よりも高い値〜約６．０未満に調節し、コンドロイチン硫酸の低分子化を促進しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを約３．４〜約４．０に調節し、コンドロイチン硫酸の低分子化を促進しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（７）水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを約１１．０〜約１２．０に調節し、コンドロイチン硫酸の低分子化を抑制しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（８）コンドロイチン硫酸がコンドロイチン硫酸Ｃである、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法；
（９）コンドロイチン硫酸がコンドロイチン硫酸Ａである、（１）〜（７）のいずれか１項記載の方法；
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の方法により得ることのできる低分子化コンドロイチン硫酸。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴うことなく迅速にコンドロイチン硫酸を低分子化でき、しかも反応温度、反応時間、反応ｐＨなどの反応条件を変えることにより容易に分子量制御を行うことができる。また、本発明によれば、糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴うことなく分子量制御された低分子化コンドロイチン硫酸が迅速に提供される。さらに本発明の方法は、実施するにあたりランニングコストを低く抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、コンドロイチン硫酸を水熱処理に付して加水分解することにより低分子化させる方法を提供するものである。さらに本発明は、コンドロイチン硫酸の水溶液を水熱処理に付す前に、水溶液のｐＨを調節することにより低分子化を抑制または促進して、低分子化コンドロイチン硫酸の分子量制御を容易ならしめる方法も提供する。水熱処理を用いることにより、あるいはそれに加えて水熱処理前にコンドロイチン硫酸水溶液のｐＨを調節することにより、従来の他の方法に伴う欠点、例えば、酵素処理では反応時間が長くなりコストも高くつく、酸加水分解では硫酸基の保持率が低い、あるいはこれらの方法では生成物の分子量の制御が困難である等の欠点が克服される。換言すれば、本発明の方法は、安価かつ短時間の処理にて低分子化コンドロイチン硫酸が得られ、しかも低分子化コンドロイチン硫酸の分子量制御が容易で、低分子化後の糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴わないという優れた方法である。
【０００９】
本発明の方法において、コンドロイチン硫酸は精製品であってもよく、粗精製品または部分精製品であってもよく、あるいは材料の抽出物であってもよい。コンドロイチン硫酸の材料は特に限定されず、例えば、サメなどの動物の軟骨あるいは動物の皮膚、軟体動物や魚介類、ヤマイモ、オクラ等の植物であってもよい。したがって、本発明に用いるコンドロイチン硫酸は蛋白類、脂質類、他の糖類などの夾雑物質を含むものであってもよい。例えば、上記材料の抽出物をコンドロイチン硫酸として本発明の方法に使用してもよい。材料からのコンドロイチン硫酸の抽出方法、およびコンドロイチン硫酸の精製方法は公知である。また、得られた抽出物を公知の方法、例えば、プロナーゼ等の蛋白分解酵素による処理、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などのクロマトグラフィー等により精製してから本発明に用いてもよい。本発明において、コンドロイチン硫酸を水などの適当な溶媒に溶解してから低分子化させる。好ましくは、コンドロイチン硫酸水溶液を用いる。コンドロイチン硫酸を水だけに溶解させてコンドロイチン硫酸水溶液としてもよく、コンドロイチン硫酸を塩類などの他の物質が含まれている水に溶解させてコンドロイチン硫酸水溶液を調製してもよい。溶液中のコンドロイチン硫酸の濃度は特に制限はない。本発明の方法により低分子化されるコンドロイチン硫酸の種類は、コンドロイチ硫酸Ａ〜Ｅのいずれであってもよい。
【００１０】
一般に、水熱処理は亜臨界水（１００℃ないし３７４℃の温度で、１気圧ないし２２ＭＰａの圧力）を用いて行われるものであるが、本発明の方法においては、水熱処理による低分子化の際に糖残基の分解および硫酸基の脱離が伴わないような温度範囲および処理時間の範囲とすることが必要である。本発明の方法においてコンドロイチン硫酸を有意に低分子化させるためには、以下に述べる各温度には約５分以上保持することが好ましい。コンドロイチン硫酸の低分子化を確認するには、例えばゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法などの公知の分子量測定方法を用いることができる。
【００１１】
水熱処理によるコンドロイチン硫酸の低分子化において、水熱処理温度が高いほど、そして水熱処理時間が長いほど、コンドロイチン硫酸の低分子化が促進され、得られる低分子化コンドロイチン硫酸の分子量が小さくなる。しかし、水熱処理温度が高いほど、そして水熱処理時間が長いほど、糖残基の分解および硫酸基の脱離が起こりやすくなる。また、水熱処理温度が低いほど、そして水熱処理時間が短いほど、コンドロイチン硫酸の低分子化が進まず、得られる低分子化コンドロイチン硫酸の分子量が大きくなる。当業者は、所望の分子量の、糖残基の分解および硫酸基の脱離が起こっていない低分子化コンドロイチン硫酸を得るための水熱条件を通常の実験によって、容易に定めうる。
【００１２】
本発明において、水熱反応前後でＩＲスペクトルのパターン全体に有意な変化が認められなければ、コンドロイチン硫酸の硫酸基の脱離および糖残基の分解が伴わないと判定される。とりわけ、ピラノース環由来のＩＲ吸収スペクトルのパターン（１１００ｃｍ−１付近）およびイオウの結合に関連したＩＲ吸収スペクトルのパターン（１４００ｃｍ−１付近）に有意な変化がないことが重要である。さらに、硫酸基の量や置換度を測定して硫酸基の脱離がないことを確認することが好ましい。コンドロイチン硫酸の硫酸基の量は元素分析やバリウム沈殿法、あるいはＨＰＬＣを用いる方法などの公知の方法にて測定することができる。これらの方法で測定して、約９２％以上の硫酸基が残存している場合に、低分子化コンドロイチン硫酸の硫酸基が脱離しないと判定することもできる。加えて、硫酸基の置換度（ＤＳ）が水熱反応の前後でほぼ一定値を示すことを確認することも、硫酸基の脱離がないことの１つの判断基準である。ＤＳの測定方法は公知であり、例えば、元素分析法、バリウム沈殿法などを用いることができる。
【００１３】
上記のような判断基準から、コンドロイチン硫酸の糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴わない水熱条件の例としては、コンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分未満保つ条件、コンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約６０分未満保つ条件などが挙げられる。しかし、これらの条件に限定されることはない。コンドロイチン硫酸の糖残基の分解および硫酸基の脱離を伴わない好ましい水熱条件の例としては、コンドロイチン硫酸の水溶液を１００℃ないし約１４０℃の水熱条件下に５分ないし約４０分保つ条件などが挙げられる。しかし、これらの条件に限定されることはない。上記水熱条件は、水熱反応前にコンドロイチン硫酸水溶液のｐＨを調節しない場合であっても、下記のごとくｐＨを約２．５よりも高い値〜約１２に調節する場合であっても同じである。
【００１４】
コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨは、調節しない場合は弱酸性ないし中性領域（典型的にはｐＨ６付近）にあるのが通常である。本発明のコンドロイチン硫酸の低分子化方法において、水熱反応前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを調節しなくてもよいが、以下に述べるように、水熱反応前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを酸性〜アルカリ性に調節してもよい。したがって、さらなる態様において、本発明は、コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを酸性〜アルカリ性に調節し、次いで、硫酸基が脱離しない水熱条件下にコンドロイチン硫酸の水溶液を保持することを特徴とする、低分子化コンドロイチン硫酸の製造方法を提供する。コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付すことによって、コンドロイチン硫酸の低分子化を促進しつつ、低分子化反応を行うことができる。また、コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨをアルカリ性側に調節してから水熱処理に付すことによって、コンドロイチン硫酸の低分子化を抑制しつつ、低分子化反応を行うことができる。ｐＨを水熱反応前に調節する場合において、水熱反応温度や時間をうまくコントロールことにより、所望の分子量のコンドロイチン硫酸を効率よく得ることができる。
【００１５】
コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付す場合において、ｐＨ約２．５あるいはそれ以下に調節してから水熱処理に付すと、１４０℃、２０分の処理でもＩＲスペクトルに変化が見られるので、ｐＨ約２．５よりも高いｐＨ値に調節してから水熱処理に付すことが好ましい。本発明において、コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付す場合の好ましいｐＨ範囲は約２．５よりも高い値〜約６．０未満であり、さらに好ましいｐＨ範囲は約３．４〜約４．０である。このようにコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付すことによって、比較的低分子のコンドロイチン硫酸を迅速に得ることができる。
【００１６】
コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨをアルカリ性側に調節してから水熱処理に付す場合において、ｐＨ約７〜約１０の範囲では得られるコンドロイチン硫酸の低分子化が若干促進される傾向が見られるが、有意な変化とはいえない。したがって、コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨをアルカリ性側に調節してから水熱処理に付すことによって、適度に低分子化が抑制されるので比較的高分子のものを得やすくなり、分子量制御をより精密に行うことも可能となる。本発明において、水熱処理前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨをアルカリ性側に調節してから水熱処理に付す場合において、好ましいｐＨ範囲は約１１〜約１２である。この場合、１４０℃、２０分の水熱反応を行ってもＩＲスペクトルの変化は見られない。しかし、例えばｐＨが約１２を超えるような高ｐＨの条件下においては、低分子化反応が遅すぎて実用的とはいえない。
【００１７】
本発明において水熱反応前にコンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを調節しない場合においては、低分子化の著しい促進または抑制は認められず、処理速度をある程度早く保ちながらも上手く分子量を制御することができる。
【００１８】
コンドロイチン硫酸の水溶液のｐＨを調節するためには、酸または塩基を水溶液に添加するのが通常である。ｐＨの調節に用いられる酸および塩基は当業者によく知られており、適宜選択することができる。典型的には酸または塩基の水溶液を用意し、ｐＨをモニターしながら除々にコンドロイチン硫酸水溶液に滴下して所望のｐＨにすることができる。酸としは塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、その他の有機酸などが挙げられるが、食品や医薬品に適用することを考慮すると、コンドロイチン硫酸と不要な反応をしない、毒性や着色の問題がない、風味を損なわないものが好ましく、このような酸の例としてクエン酸、アスコルビン酸などが挙げられる。塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの金属炭酸水素塩などが挙げられるが、食品や医薬品に適用することを考慮すると、コンドロイチン硫酸と不要な反応をしない、毒性や着色の問題がない、風味を損なわないものが好ましく、このような塩基の例として水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の水熱処理に用いる装置は、試料を上記温度範囲に上記時間保持できるものであればいずれの装置であってもよい。例えば、各種のオートクレーブ用装置や圧力釜のように加圧下で試料を一定温度に保持できる装置が公知であり、市販されているので、それらを用いてもよい。このような装置はあまり高価なものではなく、ランニングコストも比較的安い。また、このような装置は大型化も容易であるので、本発明によれば、安価かつ大量に低分子化コンドロイチン硫酸を得ることができる。また、上記以外の装置として温度調節が可能なプレッシャークッカーなどの装置を本発明の方法に用いてもよい。
【００２０】
上述のように、本発明の方法において、水熱処理温度および／または水熱処理時間を変化させることにより、あるいはそれに加えて水熱処理前にコンドロイチン硫酸水溶液のｐＨを調節することにより、得られるコンドロイチン硫酸の分子量を容易に調節・制御することができる。水熱処理温度が高いほど得られるコンドロイチン硫酸が低分子化し、水熱処理時間が長いほど得られるコンドロイチン硫酸が低分子化する。本発明の方法によれば、上記条件を適宜選択することによって、平均分子量約数千ないし数万の範囲の低分子化コンドロイチン硫酸を容易に得ることができる。しかも、本発明の方法により得られる低分子化コンドロイチン硫酸は不快な味、臭いがなく、硫酸基の脱離も実質的になく、コンドロイチン硫酸としての諸活性を保持しているので、医薬品（例えば、腰痛、関節痛、肩関節周囲炎などの治療剤、角膜表層の保護抗炎症剤）や食品（特に機能性食品、健康食品など）または化粧品や保湿剤に好適に用いることができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、上記低分子化方法により得られた低分子化コンドロイチン硫酸、ならびにそれを含む飲食物、化粧品および医薬品なども提供する。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２２】
実施例１  分子量に及ぼす水熱処理の温度および時間の影響
コンドロイチン硫酸Ｃ（和光純薬製）１％水溶液を試料とした（純水に溶解させるとｐＨ６．０となった）。水熱処理の温度の影響を調べる場合には、処理温度を１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃として、各温度に２０分保持した。水熱処理の時間の影響を調べる場合には、処理温度を１４０℃として、５分間、１０分間、２０分間、４０分間、６０分間保持した。水熱装置としてプレッシャークッカーVＳ−２４１６（（株）協真エンジニアリング）を用いた。低分子化したコンドロイチン硫酸Ｃ試料をＨＰＬＣによるゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて分析した。分析条件は以下のとおり。カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ５２０ＨＱ＋ＧＳ３２０ＨＱ＋ＧＳ２２０ＨＱ、溶出液：０．１Ｍ  ＮａＮＯ３、流速：０．５ｍｌ／分、検出：ＲＩ、カラム温度：４０℃、検量線標品：ＳＨＯＤＥＸ製  Ｐｕｌｌｕｒａｎ  Ｐ８００、Ｐ４００、Ｐ２００、Ｐ１００、Ｐ５０、Ｐ２０、Ｐ１０、Ｐ５。
【００２３】
結果を図１、図２、図３および表１に示す。水熱処理温度が高くなるにつれ、コンドロイチン硫酸Ｃの分子量が低下し、処理温度と分子量の関係はなめらかであった（図１）。本発明の方法によれば処理温度を変化させることによって所望の分子量のコンドロイチン硫酸Ｃが容易に得られることがわかった。また、いずれの反応系においてもＧＰＣチャートのベースラインが低く平坦であり、個々のピークの形が左右対称に近く、クロマトグラフィー装置等を用いて所望の分子量のコンドロイチン硫酸Ｃを分取できることもわかった。また、水熱処理時間が長くなるにつれ、コンドロイチン硫酸Ｃの分子量が低下することが確認された（図２）。１４０℃に５分間〜４０分間保持した試料について調べたが、いずれの反応時間においてもメインピークは１個で、ほぼ左右対称であった。
【００２４】
各反応温度（反応時間は２０分）および反応時間（反応温度は１４０℃）における低分子化コンドロイチン硫酸Ｃ試料のＩＲスペクトルも調べた（図３左パネル：反応温度依存性；図３右パネル：反応時間依存性）。１６０℃、２０分の水熱反応で、ＩＲスペクトルのパターンにわずかな変化が確認され、１８０℃、２０分の水熱反応では、ＩＲスペクトルのパターンが大きく変化していた（図３左パネル）。また、１４０℃、６０分の水熱反応で、ＩＲスペクトルにわずかな変化が認められた（図３右パネル）。このＩＲスペクトル変化はピラノース環に関連したものであり、骨格構造の変化が示唆された。
【００２５】
以上の結果を表１にまとめた。表１の最上段のデータは無処理のコンドロイチン硫酸Ｃのデータである。水熱反応温度が高いほど（反応時間は２０分）、重畳平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）が低下し、低分子化が進むことが確認された。１２０℃および１４０℃においては、Ｍｗ／Ｍｎおよび硫酸基の置換度（ＤＳ）はほぼ一定で、ＩＲスペクトル変化もなかった。１６０℃においてはＩＲスペクトルのわずかな変化（△）とともに、ＤＳの低下が認められた。１８０℃では、２０分の反応でＤＳの値の大幅な変化と、ＩＲスペクトルの明らかな変化（×）（特に、１２００ｃｍ−１付近および１５００ｃｍ−１付近）が確認された。また、反応時間が長いほど（反応温度は１４０℃）、重畳平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）が低下し、低分子化が進むことが確認された。反応時間４０分までは、Ｍｗ／Ｍｎおよび硫酸基の置換度（ＤＳ）はほぼ一定で、ＩＲスペクトルの変化もなかった。６０分反応では、Ｍｗ／Ｍｎが大きくなり、ＩＲスペクトルにもわずかな変化（△）（１１００ｃｍ−１付近）が認められた。
【００２６】
上記結果から判断すると、ＩＲ吸収スペクトルのパターンおよびＤＳの値にて確認される、糖残基の分解および硫酸基の脱離が起こらない水熱処理条件としては、１００℃ないし約１６０℃未満で約５分ないし約２０分未満保持する条件が挙げられる。さらに、ＩＲ吸収スペクトルのパターンおよびＤＳの値にて確認される硫酸基の脱離を含む構造変化がないかほとんどない、もう１つの水熱処理条件としては、１００℃ないし約１４０℃未満で約５分ないし約６０分未満保持する条件が挙げられる。ＩＲ吸収スペクトルのパターンおよびＤＳの値にて確認される、糖残基の分解および硫酸基の脱離が起こらない好ましい水熱条件としては、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約４０分保持する条件が挙げられる。
【表１】
2010077256.tif 000002
【実施例２】
【００２７】
実施例２  分子量に及ぼす水熱処理のｐＨの影響
コンドロイチン硫酸Ｃ（和光純薬製）１％水溶液を試料とした。酢酸水溶液または水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを調節した。ｐＨを２．５、３．４、４．０、６．０、７．０、１０．０、１１．０、１２．０に調節し、１４０℃、２０分水熱反応を行った。水熱装置としてプレッシャークッカーVＳ−２４１６（（株）協真エンジニアリング）を用いた。低分子化したコンドロイチン硫酸Ｃ試料をＨＰＬＣによるゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて分析した。分析条件は以下のとおり。カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ５２０ＨＱ＋ＧＳ３２０ＨＱ＋ＧＳ２２０ＨＱ、溶出液：０．１Ｍ  ＮａＮＯ３、流速：０．５ｍｌ／分、検出：ＲＩ、カラム温度：４０℃、検量線標品：ＳＨＯＤＥＸ製  Ｐｕｌｌｕｒａｎ  Ｐ８００、Ｐ４００、Ｐ２００、Ｐ１００、Ｐ５０、Ｐ２０、Ｐ１０、Ｐ５。
【００２８】
結果を図４および表２に示す。なお、表２のＤＳの空欄は測定しなかったことを示す。ｐＨ６．０よりも低いｐＨにおいては、ｐＨが低いほど、重畳平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）が低下し、低分子化が促進されることがわかった（表２）。ｐＨ７．０〜１０．０においては、ｐＨ６．０の場合と比較して、低分子化がやや促進される傾向があったが、有意な差ではなかった。ｐＨ１１．０〜１２．０においては、重畳平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）の低下が鈍り、低分子化が抑制されることが確認された。試験したすべてのｐＨにおいて、Ｍｗ／Ｍｎの値およびＤＳの値はほぼ同じであった。ｐＨ２．５ではＩＲスペクトルの若干の変化（１１００ｃｍ−１付近）が認められた（表２の△および図４）。ｐＨ２．５以下のｐＨではコンドロイチン硫酸Ｃの構造に何らかの変化が生じると考えられた。したがって、コンドロイチン硫酸Ｃの糖残基の分解および硫酸基の脱離が起こらないｐＨの範囲は約２．５よりも高い値〜約１２．０であることがわかった。なお、表２のＤＳの空欄は測定しなかったことを示す。
【００２９】
以上の結果から、コンドロイチン硫酸Ｃの水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付す場合において、ｐＨ約２．５よりも高いｐＨ値に調節してから水熱処理に付すことが好ましいといえる。コンドロイチン硫酸Ｃの水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付す場合の好ましいｐＨ範囲は約２．５よりも高い値〜約６．０未満であり、さらに好ましいｐＨ範囲は約３．４〜約４．０である。上記の好ましい酸性側のｐＨ範囲に調節してから水熱処理を１４０℃、２０分行ってもＩＲスペクトルの変化は見られず、Ｍｗ／Ｍｎの値、ＤＳの値も、未処理コンドロイチン硫酸Ｃとほぼ同じであった。このようにコンドロイチン硫酸Ｃの水溶液のｐＨを酸性側に調節してから水熱処理に付すことによって、比較的低分子のコンドロイチン硫酸Ｃを迅速に得ることができる。
【００３０】
さらに、以上の結果から、水熱処理前にコンドロイチン硫酸Ｃの水溶液のｐＨをアルカリ性側に調節してから水熱処理に付す場合において、好ましいｐＨ範囲は約１１．０〜約１２．０であるといえる。この場合、１４０℃、２０分の水熱反応を行ってもＩＲスペクトルの変化は見られず、Ｍｗ／Ｍｎの値、ＤＳの値も、未処理コンドロイチン硫酸Ｃとほぼ同じであった。このようにコンドロイチン硫酸Ｃの水溶液のｐＨをアルカリ性側に調節してから水熱処理に付すことによって、適度に低分子化が抑制されるので比較的高分子のものを得やすくなり、分子量制御をより精密に行うことも可能となる。
【表２】
2010077256.tif 000003
【実施例３】
【００３１】
実施例３  コンドロイチン硫酸ＡおよびＣの水熱反応による低分子化
コンドロイチン硫酸Ａについても水熱反応による低分子化を行った。コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）およびコンドロイチン硫酸Ｃ（和光純薬製）のそれぞれを１％水溶液（ｐＨ６．０）として、１４０℃、６０分の水熱処理を行った。反応は各系２回ずつ行った。コンドロイチン硫酸Ａは、コンドロイチン硫酸Ｃと同様に低分子化されることがわかった。コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃとも、２回の実験でＭｗ／Ｍｎの値には若干のばらつきが見られたが、ＤＳの値にはばらつきがなかった。コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃとも、水熱反応によってＭｗ／Ｍｎの値が増加したが、ＤＳの値には変化が見られなかった。
【表３】
2010077256.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、硫酸基の脱離を伴わない低分子化コンドロイチン硫酸の製造方法を提供する。したがって、本発明の方法ならびにそれにより得られる低分子化コンドロイチン硫酸は、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、水熱処理温度と得られる低分子化フコイダンの分子量の関係を示すＨＰＬＣのチャートである。原料（control）は水熱処理していないコンドロイチン硫酸である。水熱反応は、それぞれ１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃にて２０分間行った。retention time (min)はＨＰＬＣの保持時間（分）である。
【図２】図２は、水熱処理時間と得られる低分子化フコイダンの分子量の関係を示すＨＰＬＣのチャートである。原料（control）は水熱処理していないコンドロイチン硫酸である。水熱反応は、１４０℃にて、それぞれ５分、１０分、２０分、４０分間行った。retention time (min)はＨＰＬＣの保持時間（分）である。
【図３】図３左パネルは、水熱処理温度による低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。水熱反応は、それぞれ１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃にて２０分間行った。図３右パネルは、水熱処理時間による低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。水熱反応は、１４０℃にて、それぞれ５分、１０分、２０分、４０分、６０分間行った。それぞれのパネルのいちばん上のチャートは水熱処理していないコンドロイチン硫酸のものである。破線の丸印はＩＲスペクトルのわずかな変化を示し、実線の丸印はＩＲスペクトルの明らかな変化を示す。
【図４】図４は、水熱処理前のｐＨによる低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。水熱反応は１２０℃で２０分間行った。破線の丸印はＩＲスペクトルに若干の変化があったことを示す。
【図１】
2010077256.tif 000005
【図２】
2010077256.tif 000006
【図３】
2010077256.tif 000007
【図４】
2010077256.tif 000008