(57)【要約】      （修正有）【課題】Th2型サイトカインを介してアレルギー疾患に関与するSTAT6の発現をRNA干渉により抑制し得る二本鎖(ds)RNA及び該dsRNAを含むアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物の提供。【解決手段】STAT6遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、(a)一方の鎖が特定の配列のSTAT6遺伝子配列中の１５〜５０個の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖であるdsRNA分子；又は、(b)一方の鎖が特定の配列のSTAT6遺伝子配列中の１５〜５０個の連続した塩基を有する配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、付加した配列であって、STAT6遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖であるdsRNA分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
STAT6遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、以下の(a)又は(b)のdsRNA分子：
(a)  一方の鎖が配列番号１又は３で表されるSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の１５〜５０個の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
(b)  一方の鎖が配列番号１又は３で表されるSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の少なくとも１５〜５０個の連続した塩基を有する配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、STAT6遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項２】
dsRNA分子が、以下の(c)又は(d)である、請求項１記載のdsRNA分子：
(c)  一方の鎖が配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の3426〜3446番目の塩基を有する配列、3432〜3452番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の259〜279番目の塩基を有する配列、及び3026番目〜3046番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
(d)  一方の鎖が配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の3426〜3446番目の塩基を有する配列、3432〜3452番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の259〜279番目の塩基を有する配列、及び3026番目〜3046番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、STAT6遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項３】
dsRNA分子が、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、請求項２記載のdsRNA分子。
【請求項４】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のdsRNA分子。
【請求項５】
請求項４に記載のdsRNA分子のテンプレートDNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のdsRNA分子を１つ又は複数含む、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項７】
請求項５記載のベクターを含む、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項８】
センス鎖の5’末端に１個又は複数のG（グアニン）からなるオーバーハング塩基を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のdsRNA分子。
【請求項９】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項８記載のdsRNA分子。
【請求項１０】
請求項９に記載のdsRNA分子のテンプレートDNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載のdsRNA分子を１つ又は複数含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターを含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項１３】
鼻腔投与するための、請求項６、７、１１又は１２に記載のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項１４】
皮膚に塗布するための軟膏である、請求項６、７、１１又は１２に記載のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、STAT6遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子及び該dsRNA分子を含むアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉(RNAi)は、２本鎖RNA（dsRNA）によって、その配列特異的にmRNAが切断され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象であり、生物共通の核酸レベルの防御システムであることが報告されている（非特許文献１を参照）。RNAiにおいては、dsRNAがダイサー(Dicer)の作用によりプロセッシングされsiRNA(short interfering RNA)が形成され、siRNAがガイドRNAとしてターゲット配列を認識し、ターゲットmRNAを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。
【０００３】
RNAi法は、遺伝子の発現制御による遺伝子機能解析、遺伝子の発現制御機構の解明、RNAiによる遺伝子治療等に利用を目的に種々の検討が行われている。
【０００４】
免疫応答はtype-1 helper (Th1)細胞による細胞性免疫とtype-2 helper (Th2)細胞による体液性免疫からなり、Th1免疫応答は自己免疫疾患や移植拒絶反応、Th2免疫応答はアレルギー疾患に関与することが知られている。また、Th2免疫応答に関与するTh2型サイトカインとしてIL-4及びIL-13が知られている。
【０００５】
転写調節因子STAT6（Signal transducers and activators of transcription 6)は、Th2型サイトカインであるIL-4及びIL-13受容体を介するシグナル伝達の重要な転写調節因子であり、Th2型免疫応答の維持に関与していることが報告されている。STAT6の作用に関してはSTAT6の欠損マウスが作製され、該マウスではIL-4の情報が細胞に伝達されず、その結果アレルギー反応が起こらないことが報告されている（非特許文献２及び３を参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Waterhouse, P.M. et al., Nature, 411: 834-843, 2001
【非特許文献２】Takeda et al., Nature, 1996 Apr 18; 380(6575): 627-30
【非特許文献３】Shimoda et al., Nature, 1996 Apr 18; 380 (6575): 630-3
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Th2型サイトカインを介してアレルギー疾患に関与するSTAT6の発現をRNA干渉により抑制し得る二本鎖(ds)RNA及び該dsRNAを含むアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、STAT6遺伝子配列又はその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が、STAT６遺伝子の発現を特異的に抑制することを見出した。さらに、STAT6遺伝子の発現の抑制により、Th2型サイトカイン又はケモカインの産生が抑制され、アレルギー疾患の予防及び治療に効果を奏することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  STAT6遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、以下の(a)又は(b)のdsRNA分子：
(a)  一方の鎖が配列番号１で表されるSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の１５〜５０個の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
(b)  一方の鎖が配列番号１で表されるSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の１５〜５０個の連続した塩基を有する配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、STAT6遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
【００１０】
[２]  dsRNA分子が、以下の(c)又は(d)である、[１]のdsRNA分子：
(c)  一方の鎖が配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の3426〜3446番目の塩基を有する配列、3432〜3452番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の259〜279番目の塩基を有する配列、及び3026番目〜3046番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
(d)  一方の鎖が配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の3426〜3446番目の塩基を有する配列、3432〜3452番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の259〜279番目の塩基を有する配列、及び3026番目〜3046番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、STAT6遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
【００１１】
[３]  dsRNA分子が、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、[２]のdsRNA分子。
[４]  センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、[１]〜[３]のいずれかのdsRNA分子。
[５]  [４]のdsRNA分子のテンプレートDNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
[６]  [１]〜[４]のいずれかのdsRNA分子を１つ又は複数含む、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
[７]  [５]のベクターを含む、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
[８]  センス鎖の5’末端に１個又は複数のG（グアニン）からなるオーバーハング塩基を有する、[１]〜[３]のいずれかのdsRNA分子。
[９]  センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、[８]のdsRNA分子。
[１０]  [９]のdsRNA分子のテンプレートDNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
[１１]  [８]又は[９]のdsRNA分子を１つ又は複数含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
[１２]  [１０]のベクターを含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、STAT6遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
[１３]  鼻腔投与するための、[６]、[７]、[１１]又は[１２]のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
[１４]  皮膚に塗布するための軟膏である、[６]、[７]、[１１]又は[１２]のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるdsRNA分子を用いて、STAT6遺伝子の発現を特異的に抑制することができ、それによってTh2型サイトカイン及びケモカインの産生を阻害することができ、その結果アレルギー疾患を予防及び治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は転写調節因子STAT6（Signal transducers and activators of transcription 6)のmRNAを標的とする二本鎖からなるdsRNA(double stranded RNA)分子に関する。該dsRNA分子の一方の鎖は転写因子STAT6遺伝子配列又はその一部に同一な塩基配列を有しハイブリダイズし得るセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖であるdsRNA分子であり、該センス鎖とアンチセンス鎖は相補的に結合する。この際、センス鎖とアンチセンス鎖は完全に相補的である必要は必ずしもなく、相補的に結合する限り、１又は複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個若しくは１個のミスマッチがあってもよい。STAT6遺伝子中の標的配列は、コーディング領域であっても、非コーディング領域であってもよい。
【００１４】
本発明においてdsRNA分子は、siRNA分子及びshRNA分子を含む。また、本発明においてdsRNA分子はmiRNA分子を形成し得る。
【００１５】
本発明のdsRNA分子のSTAT6遺伝子の標的配列の塩基数は、特に限定されないが、15〜50塩基、15〜45、15〜40、15〜35若しくは15〜30塩基、好ましくは20〜35塩基、さらに好ましくは21〜35、21〜25若しくは21〜23塩基、特に好ましくは21塩基である。
【００１６】
本発明において、STAT6の遺伝子配列又はその一部に同一な塩基配列を有しハイブリダイズし得るセンス鎖とは、配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列又は配列番号３で表されるマウスSTAT6遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列を有するRNA配列を意味する。本発明のdsRNA分子を構成するセンス鎖は、STAT6の遺伝子配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一な配列であってもよい。すなわち、dsRNA分子のセンス鎖と実際に標的となるSTAT6のmRNA配列がハイブリダイズする限り１又は複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個若しくは１個の塩基が欠失、置換又は付加してミスマッチが生じていてもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のdsRNAを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のdsRNAを試薬としてin vitroで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件あるいは高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃から70℃で12〜16時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。
【００１７】
また、本発明のdsRNAのセンス鎖配列と標的配列は、BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)]、FASTA[Methods. Enzymol., 183, 63-98 (1990)]等の当業者に公知の相同性検索プログラムをデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値で90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは96、97、98若しくは99％以上の配列同一性を有する。
【００１８】
また、本発明のdsRNA分子は、上に定義されたセンス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結され、そのリンカー部でループ構造を形成し折りたたまれたshRNA(short hairpin RNA）分子として提供され得る。shRNA分子はダイサーによってプロセッシングされ、siRNA分子を生じ得る。shRNA分子に含まれるリンカー分子は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知であるポリヌクレオチドリンカーが好ましい。ヘアピンループ配列は限定されないが、５〜12塩基からなるUUで始まる配列、例えばUUCAAGAGAが挙げられる。そのほかのループ配列としては、Lee NS. et al.（2002）Nat. Biotech. 20, 500-505、Paddison PJ. et al.（2002）Genes and Dev. 16, 948-958、Sui G. et al.（2002）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520、 Paul CP. et al.（2002）Nat. Biotech. 20, 505-508、Kawasaki H. et al.（2003）Nucleic Acids Res. 31, 700-707等に記載の配列からなるループを採用することができる。shRNA分子も、上記したように公知の方法に基づいて、in vitro又はin vivoにて合成することが可能である。合成に際しては、センス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む1本のRNA鎖を合成し、その後この1本のRNA鎖を自己相補的結合によって二本鎖構造を形成させshRNA分子を得ることができる。
【００１９】
dsRNA分子を構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖は必要に応じて、3’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１若しくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、dsRNA分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングは標的とするSTAT6遺伝子のDNAを本来的に構成する塩基であってもよい。例えば、本発明のdsRNAは、センス鎖がSTAT6遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列中の連続する21塩基からなり、アンチセンス鎖はセンス鎖の3'末端側の２塩基を除く塩基配列に相補的な配列を有し、センス鎖とアンチセンス鎖の3'末端側に、２塩基からなるオーバーハングを有する構造を有する。
【００２０】
また、センス鎖の5'端に１〜３、好ましくは３、２若しくは１のG（グアニン）からなる配列からなるオーバーハングを有していてもよい。このようにセンス鎖の5’末端に１個又は複数のGからなるオーバーハングを設けることにより、shRNAを導入した細胞においてインターフェロンの発現が誘導されることがない(Gondai et al., Nucleic Acids Research, 2008, Vol.36, No.3, e18, Epub 2008 Jan 21)。
【００２１】
さらに、dsRNA分子を構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖は、遺伝子の配列決定など種々の実験操作を円滑に行うために、siRNA活性に対して影響を与えない範囲で必要に応じて１〜３塩基、さらに好ましくは１若しくは２塩基の置換、付加、欠失をさらに含んでも良い。
【００２２】
また、センス鎖又はアンチセンス鎖は必要に応じて、5’末端がリン酸化されていてもよく、shRNA分子については5’末端に三リン酸（ppp）が結合していてもよい。上記のようにセンス鎖の5'末端のGからなるオーバーハングに三リン酸（ppp）が結合していてもよい。
【００２３】
本発明において、好ましくはセンス鎖が、配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の3426〜3446番目の塩基を有する配列、3432〜3452番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の259〜279番目の塩基を有する配列、及び3026番目〜3046番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一であることが好ましく、特に配列番号１で表されるヒトSTAT6遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の3426〜3446番目の塩基を有する配列、又は3432〜3452番目の塩基を有する配列と同一であることが好ましい。
【００２４】
本願発明のdsRNA分子は、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなり、特に配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖又は配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が好ましい。
【００２５】
本発明のdsRNAは、化学合成や、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いた転写系によりin vitroで合成することができる。化学合成による合成は、互いに相補的な配列を逆方向配列として有し自己相補性を有するRNA１本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれdsRNA用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等モル数）を混合し、二本鎖が解離するまで温度を加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることによって行うことができる。アニーリング条件は、例えば、90℃にて１分間、続いて37℃にて１時間静置することによって行えばよい。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行うことによって、dsRNA分子を得ることができる。また、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いた合成は、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有するテンプレートDNAを合成しRNAポリメラーゼによりRNAを転写すればよい。センス鎖の5’末端にGからなるオーバーハング配列を付加するためには、プロモーターの末端にGからなる配列を付加すればよい。この際、DNA配列には、適宜ターミネーター等の制御配列を含ませる。プロモーター及び／又はその他の制御配列はベクターに機能し得るかたちで連結する。「機能し得るかたちで連結する」とは、当該ベクターが導入された細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御の下、上記dsRNA分子が発現され標的となるSTAT6のmRNAが分解されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。ターミネーター配列としては、例えば、TTTTTT配列を用いればよい。プロモーターとしては、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター等を用いることができ、in vitroで製造する場合、T3プロモーター、T7プロモーター等が用いられる。ベクターに本発明の２本鎖RNAのテンプレートDNAを導入し、該ベクターを生体内に投与して生体内で２本鎖RNAを合成する場合、U6プロモーター、H1プロモーターなどのPolIII系プロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター等を用いればよく、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。なお、本発明のdsRNAの合成にT7プロモーター等を用いた場合、Gからなる配列の存在によりT7プロモーターが活性化され、dsRNAの製造効率が高まるという利点もある。
【００２６】
本発明は、上記dsRNA分子を発現するベクターをも包含する。
【００２７】
本発明のdsRNA分子は、配列特異的にSTAT6のmRNAを切断し、その結果STAT6遺伝子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こし、STAT6遺伝子をノックダウンすることができる。STAT6遺伝子がノックダウンされる結果、Th2サイトカイン、ケモカインの産生が抑制され、例えば、皮膚等の炎症部位において単核球、好酸球、好中球、肥満細胞、リンパ球等の浸潤が抑制され、炎症を抑制する。
【００２８】
本発明のdsRNA分子は、30塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に2塩基のオーバーハングを有する21〜27塩基のsiRNA（small interfering RNA）分子を生じ得る。このsiRNA分子が、RISC(RNA-induced silencing complex)と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、STAT6 mRNAをsiRNA分子との相同性により認識し分解し、STAT６遺伝子の発現抑制を行う。
【００２９】
本発明のdsRNA分子はアレルギー疾患の治療及び予防に用いることができる。ここで、アレルギー疾患には、鼻閉症、アレルギー性気管支炎、アレルギー性結膜炎、炎症性疾患、皮疹、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、炎症性疾患、等が含まれる。
【００３０】
本発明は、STAT6遺伝子を標的とする上記のdsRNA分子を含むアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物を包含する。該組成物は、本発明のdsRNA分子又はベクターの１種又は複数種を組み合わせて含んでもよい。例えば、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなるdsRNA分子の１種、２種又は３種を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明のdsRNAの導入方法としては、被験体が細胞や組織の場合、細胞や組織と同時に培養することにより導入することができる。その他、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。被験体が動物個体の場合、経口ルート、鼻孔ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は非経腸的ルートで投与することができる。喘息や鼻炎等の治療のためには、公知の浸透剤と混合した液体状態又はエアロゾル状態で投与することができる。また、皮膚炎等の治療のためには、軟膏の形態で皮膚の患部に塗布により局所投与され得る。該軟膏は、キャリアとして、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グルコール類、高級アルコール、グリセリン、水若しくは乳化剤、懸濁化剤を含む。この際、正電荷を有するポリマーであるカチオニックポリマーと混合して投与してもよい。カチオニックポリマーとしては、ポリエチエレンイミン（PEI、直鎖型若しくは分岐型）、ポリアミンや市販の遺伝子導入試薬が挙げられる。市販の遺伝子導入試薬として、Lipofectamine（登録商標）、Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAXなどを挙げることができる。
【００３２】
さらに、特定の部位に投与する場合、ドラッグデリバリーシステムを用いて特定部位にデリバリーしてもよい。ドラッグデリバリーシステムは種々の公知の方法があり、投与しようとする部位に応じて適当な方法を採用することができる。ドラッグデリバリーシステムとしては、例えば、キャリアとしてリポソーム、エマルジョン、ポリ乳酸等を利用した公知の方法等が挙げられる。投与は、医薬的に許容され得る希釈剤又はキャリアと混合して行うことが望ましい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。導入するdsRNAの量は、予防、治療しようとする疾患の種類、重篤度、被検体の年齢、体重等により適宜決定することができるが、疾患部の細胞１個当たり少なくとも、１コピーのdsRNAが導入されるような量が好ましい。例えば１投与単位あたり、dsRNA分子量で1nM〜100μM、好ましくは10nM〜50μM、より好ましくは100nM〜20μMである。
【００３３】
本発明において、RNA干渉によりSTAT6遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）するとは、STAT6遺伝子の発現を遺伝子のmRNA又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明のdsRNAを導入しない場合に対して、100％抑制される場合のみならず、75％以上、50％以上あるいは20％以上抑制される場合も含まれる。発現抑制の程度は、STAT6遺伝子のmRNA又はタンパク質の産生量をdsRNA導入前後で比較すればよい。mRNAの場合は、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridization等により測定することができ、タンパク質の場合は、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定等により測定することができる。また、センス鎖の5'端に１個又は数個のGからなるオーバーハングを有する本発明のdsRNAは、細胞や個体に導入しても該細胞、個体でインターフェロン反応を引き起こさない。インターフェロンを誘導しないとは、インターフェロンα又はβの発現を誘導しないことをいい、インターフェロンの合成のみならず、インターフェロンが関与するパスウェイを活性化しないことを含む。インターフェロンの発現が100％抑制される場合のみならず、75％以上、50％以上、20％又は10％以上抑制される場合も含まれる。インターフェロン反応の有無は、インターフェロン自体又はインターフェロンのmRNAの産生を測定することに決定することができる。この測定には、上記のようにノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridization、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定を行えばよい。
【００３４】
さらに、本発明のdsRNAは、細胞や個体に導入しても該細胞や、個体の細胞に細胞障害を誘導しないことを特徴とする。一般的に二本鎖RNAを投与した場合、dsRNA依存的プロテインキナーゼ（PKR）の活性化により、細胞障害を誘導し得るが、本発明のdsRNAはPKRを活性化することがなく細胞障害を誘導することもない。ここで、細胞障害とは、細胞が正常の機能を発揮しないか、あるいは増殖が抑制される程度障害を受けていることをいい、アポトーシス、ネクローシス等の細胞死を含む。本発明において、細胞障害を誘導しないとは、細胞障害を全く誘導しない場合のみならず、センス鎖の5’末端にGからなる配列を付加しない２本鎖RNAを導入した場合に比べ、細胞障害を起こす細胞の数が75％以下、50％以下、20％以下、又は10％以下である場合を含む。細胞障害が誘導されたか否かは、細胞を観察し細胞変性効果（CPE）が出現したかどうかを調べることによりわかり、また、細胞の代謝活性を測定したり、トリパンブルー等の色素排除アッセイにより判断することができる。本発明のdsRNAは、インターフェロン誘導及び細胞障害の両方を誘導しないか、又はインターフェロン誘導又は細胞障害のいずれかを誘導しない。上記のように本発明において、「インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導せずに」とは、誘導が完全に阻害される場合だけではなく、誘導が減じられる場合も含む。また、インターフェロン及び／又は細胞障害の誘導の阻害も試験系や被験体によって、程度が異なってくることがあるが、少なくとも一つの系又は被験体においてインターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しなければ、本発明のインターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しないdsRNAに含まれる。
【００３５】
本発明は、さらに本発明のdsRNAを生物体に投与して、該生物体においてSTAT6遺伝子の発現をインターフェロンの発現を誘導せずに抑制する方法、本発明のdsRNAを動物に投与して、STAT6遺伝子が関与するアレルギー疾患を、インターフェロンの発現を誘導せずに予防、治療する方法を包含する。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
方法
動物
BALB/cマウスは三協ラボサービス株式会社より購入した。全てのマウスは無菌環境施設で、東京医科歯科大学の動物実験ガイドラインに基づき、餌と水を与え飼育した。実験には7-12週齢のマウスを用い、1グループは少なくとも4匹以上とした。
【００３８】
ヒトSTAT6 siRNA（small interfering RNA）及びshRNA（small hairpin RNA）の作成並びにそれらの効果判定
実験に使用するsmall RNAであるSTAT6 siRNA及びSTAT6 shRNAはハプロファーマ社（株）との共同研究により作製した。既存のものよりも強力なRNAiを誘導する理論（Ui-Tei K, et al., Nucleic.Acids.Res.(2004).32: 936-948)を基盤として、BLAST Search（http://www.ncbi.nml.nih,gov/blast/index.shtml；off target効果の回避）の利用並びにmRNAの高次構造を予測（http://www.bioinfo.rpi.edu/~zukerm/）をすることにより、まず、siRNAの候補配列を決定した。
【００３９】
候補配列は6つであり、各々の効果は、ヒトの皮膚組織生検から採取したヒト正常皮膚線維芽細胞に導入して評価した。効率のよいRNA干渉を示す配列のsiRNAを選定した後、その配列をもとにして、導入時の非特異的反応（インターフェロン応答）がほとんどみられないという特長をもつshRNAを作成し、同様にRNAiの効果検討を行った。
【００４０】
マウスSTAT6 siRNAの候補選定
In vivoにおける実験はマウスを用いる予定であったため、マウスSTAT6 siRNAについてもヒトと同様にin vitroにおける検討を行う必要があった。そこでマウスSTAT6 siRNAの配列候補をヒトの場合と同じ理論をもとに3種類設計した。RNA干渉の効果判定に関しては新生児マウス背部の皮膚より採取した正常線維芽細胞を用いた。
【００４１】
細胞の培養と刺激
STAT6 siRNAの細胞内導入はLipofectamineTM 2000（Invitrogen社）にて行った。
細胞内導入は２種類のプロトコールで行った。それぞれのプロトコールを図１A及びBに示す。
【００４２】
実験プロトコール１
6wellプレートに正常線維芽細胞を播種する。培養は培養液としてDullbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma社)に10％ fetal calf serum (FCS; Sigma社)と1% antibiotics/antimycotics (Gibco-BRL社)を添加したものを用い、37℃、5％ CO2の条件下で行った。60〜70％ subconfluentの状態でsiRNA又はshRNAを導入し、導入後、さらに48時間培養を継続し細胞を回収する。
【００４３】
実験プロトコール２
siRNA又はshRNAの導入はプロトコール１と同様に行う。導入後、培養液をDMEMに2％FCSと1 ％ antibiotics/antimycoticsを添加したものに変更した（Serum starvation）。24時間後にrhIL-4（マウスではrmIL-4 10ng/mLとTNFα 40ng/mL）（全てR & D社）で細胞を刺激し、その24時間後に細胞上清を回収する。
shRNAは、ダイサー（Dicer）に分解される前段階で細胞内に導入されるため、二本鎖を別々に発現するsiRNAより特異的に働き、また、導入によるインターフェロン応答を軽減できる。shRNAとsiRNAの構造を図２に示す。
【００４４】
ハプテンによる急性接触過敏反応の誘導
Day0に5％2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) (in acetone: olive oil=4:1) (Nacalai Tesque社)、0.5％ 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) (in acetone: olive oil=4:1) (Nacalai Tesque社)、又は5％ 4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one (Oxazolone) (in acetone: olive oil=4:1) (Sigma社)を剃毛腹部にそれぞれ50μL塗布して感作した。（DNFBのみDays0、1の連日塗布。）その後、Day5で耳介に1% TNCB (in acetone: olive oil =1:4)、0.2％DNFB (in acetone: olive oil=4:1)、又は1％Oxazolone (in acetone: olive oil=4:1)をそれぞれ耳介に20μL塗布して惹起。接触過敏反応の指標として耳介腫脹を、dial thickness gauge (Peacock社)を用いて測定した。
【００４５】
Western blot法
細胞からのタンパク抽出はCell lysis buffer (Cell signaling社)を用いた。電気泳動後、Hybond-P (Amersham pharmacia biotech社)に転写。電気泳動は80V 30min、その後130V 60minの条件で行った。1次抗体として、抗ヒトβ-アクチン抗体又は抗mouse β-アクチン抗体と、抗ヒトSTAT6抗体又は抗mouse STAT6抗体(共にSanta Cruz Biotechnology社)を用いて反応後、2次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラビットimmunoglobulins抗体(DAKO)と反応。発色にはECL plus Western blotting detection Reagents (GE Healthcare)を用いた。
【００４６】
RNAの抽出と逆転写
正常線維芽細胞からのRNAの抽出はISOGEN (ニッポンジーン社)を用いて行った。逆転写はhexanucleotide mixture (A260; 6.25U/ml) (Roche社)、dNTPs (0.125mM) (Takara Bio社)、human placenta RNase inhibitor (80U) (Takara Bio社)、reverse transcriptase (400U; Moloney murine leukemia virus) (Takara Bio社)を含んだ反応緩衝液と800ngのRNAを用いて行った。全量を40μLとし、37℃ 60minで反応を行った。
【００４７】
定量的Polymerase chain reaction (PCR)
定量的PCR反応は、Stratagene社のBrilliant SYBR Green QPCR Master Mixを用いて、プロトコルに従って行った。測定にはMx3000P Real-Time PCR system (Stratagene社)を用いた。
【００４８】
STAT6 siRNAのマウスへの投与
Day3にSTAT6 siRNA (in OPTI-MEM（登録商標）I: LipofectamineTM2000= 50: 1) を耳介皮下に30μL投与(1nmol/ear)した。
【００４９】
STAT6 siRNA含有軟膏
STAT6 siRNA含有軟膏は、親水ワセリンを基剤として2％となるよう調製した。この軟膏を、Day3に耳介に10nmol/earとなるように塗布した。
【００５０】
鼻炎モデルマウスの作成
Days 0, 7, 14, 21にovalbumin (albumin from chicken egg white, Grade V ) (OVA) (Sigma社) 0.1mg、alum 1mgを腹腔内投与して感作。Days 21から27にかけて0.2mg/日のOVAを連日鼻腔内に吸入させて惹起した。鼻炎の症状の指標として、Day 27の最終惹起直後に5分間あたりのくしゃみの回数をカウントした。
【００５１】
病理組織学的検討
接触過敏反応モデルでは、耳介組織を回収し、10%ホルマリンで固定してパラフィンブロックを作成。これを薄切し、May- Grunwald- Giemsa染色にて病理組織学的検討を行った。鼻炎モデルでは、最終惹起12hr後の鼻粘膜組織切片をMay- Grunwald- Giemsa染色にて病理組織学的検討を行った。細胞数は、400倍の視野下で単核細胞、好中球、好酸球、肥満細胞の浸潤細胞数を少なくとも5視野数えて数値化した。
【００５２】
統計学的解析
統計学的有意差は、Student’s t-testを用いて検討した。
【００５３】
結果
１．  ヒトSTAT6 siRNA導入によるSTAT6の発現抑制
作成したヒトSTAT6 siRNAの6つの候補配列について、効率よくSTAT6発現を抑制できる配列の検討をWestern blot法を用いて行った。図３に結果を示す。図３中、2〜7レーンは今回新規に作成した6種類のSTAT6 siRNAであり、既存の配列（Rippmann JF et al., FEBS Lett.(2005).579: 173-178）は8レーンである。新規作成したもののうち4、5レーンについては既存のものに比して明らかに強力なSTAT6発現の抑制効果を示している。
【００５４】
そこで以下の実験にはこの2配列のSTAT6 siRNAを用いることにした（以後、3424=STAT6 siRNA 3、3430=STAT6 siRNA 4とする）。塩基配列は以下のごとくである。
【００５５】
3424 (STAT6 siRNA 3)
5’ - GCUUCUGAUACGUGUAUGAGA   sense strand  （配列番号５）
UCCGAAGACUAUGCACAUACU - 5’   anti-sense strand  （配列番号６）
3430 (STAT6 siRNA 4)
5’ - GAUACGUGUAUGAGACUAUGC   sense strand  （配列番号７）
GACUAUGCACAUACUCUGAUA - 5’   anti-sense strand  （配列番号８）
【００５６】
２．  ヒトSTAT6 siRNAを導入したヒト線維芽細胞によるeotaxin-3産生
IL-4刺激により、STAT6経路に依存してヒト線維芽細胞から産生されるeotaxin-3の産生は、実験１により選定されたSTAT6 siRNA 3あるいはSTAT6 siRNA 4の導入によって有意に抑制された。図４にELISAで測定した結果を示す。また、無刺激状態での線維芽細胞からのeotaxin-3産生には影響を与えなかった(data not shown)。
【００５７】
３．  ヒトSTAT6 shRNAを導入したヒト線維芽細胞におけるSTAT6の発現抑制
上記実験１、２で効果がみられたsiRNA 2つの配列をもとにしてshRNAを作製した（それぞれSTAT6 shRNA3、STAT6 shRNA4）。そして、これらのin vitroでのSTAT6発現への効果を検討した。まず、Real time PCR法にて確認したSTAT6のmRNAレベルの発現は、siRNAの結果と同様、新規配列の2つにおいてより強力な抑制効果が得られた)。図５にELISAで測定した結果を示す。
【００５８】
Western blot法を用いて検討したタンパクレベルにおけるSTAT6の発現も、shRNAの導入によって抑制されている。既存の配列をもとにしたshRNAも同等のSTAT6の発現抑制をみているが（図６の第3レーン）、β-アクチンとの比較をみると今回新たに作成した配列のほうがより強力な抑制効果をもつと考えられる(図６)。
【００５９】
４．  ヒトSTAT6 shRNAを導入したヒト線維芽細胞によるeotaxin-3産生
shRNA導入にても、siRNA導入時と同様、新規作成したものが既存のものより強いeotaxin-3産生抑制効果がみられた。図７にELISAで測定した結果を示す。
【００６０】
５．  マウスSTAT6 siRNA導入による、正常線維芽細胞におけるSTAT6発現への効果
マウスSTAT6 siRNAの候補配列を以下に示す。図８にSTAT6タンパク発現の抑制をWestern blot法にて確認した結果を示す。図８に示すように、STAT6 siRNA 1, 2, 3の全てにSTAT6タンパク発現を抑制する効果が見られた。その中でも最も効率よくSTAT6タンパク発現を抑制したSTAT6 siRNA 3を以後STAT6 siRNAとして用いた。図９にSTAT6 mRNA発現の抑制をRT-PCRにより確認した結果を、図１０にIL-4(10ng/mL)とTNF-alpha(40ng/mL)の共刺激により産生されるeotaxin (CCL11)濃度をELISA法にて定量した結果を示す。図９及び１０に示すように、STAT6 mRNAの発現、eotaxin (CCL11)の産生に関しても、新たに開発したマウスSTAT6 siRNAは抑制効果を示した。
【００６１】
マウスSTAT6 siRNA 1
5’ - GCCGAGGCACCCUGUAUAUCC    sense strand  （配列番号９）
GACGGCUCCGUGGGACAUAUA - 5’    anti-sense strand  （配列番号１０）
マウスSTAT6 siRNA 2
5’ - CCUGGUUCUGUUAAGGAUUCA   sense strand  （配列番号１１）
GGGGACCAAGACAAUUCCUAA - 5’    anti-sense strand  （配列番号１２）
マウスSTAT6 siRNA3
5’ - CGAAUGUGAUACAACUGUAUC   sense strand  （配列番号１３）
GAGCUUACACUAUGUUGACAU - 5’   anti-sense strand  （配列番号１４）
【００６２】
６．  STAT6 siRNAによる接触過敏反応への効果
TNCB、DNFB、Oxazoloneによる接触過敏反応は、STAT6 siRNAの耳介への皮下投与により有意に抑制された(図１１)。また、TNCBに対する接触過敏反応においてギムザ染色により病理組織学的検討を行ったところ、STAT6 siRNAを投与した群において、コントロール群と比較して、顕著な浮腫の軽減と細胞浸潤の減少がみられた(図１２)。浸潤している細胞のプロフィール検討では、単核細胞、好酸球、好中球、脱顆粒している肥満細胞において細胞数の減少がみられた(図１３)。
【００６３】
７．  STAT6 siRNA含有軟膏による接触過敏反応への効果
STAT6 siRNA含有軟膏を作成し、耳介に塗布したところ、コントロール群と比較して耳介腫脹に有意な抑制が得られた（図１４）。この結果から、STAT6 siRNAは軟膏としての使用が可能と考えられた。
【００６４】
８．  鼻炎モデルに対するSTAT6 siRNAの効果
OVA感作マウスの鼻腔にDays 21から27にかけて連日OVAを吸入させて鼻炎反応を誘発。そして、Days 22, 23, 24にPBSに溶解したSTAT6 siRNA (3nmol/day)を鼻腔内に投与して、その治療効果を検討した。その結果、STAT6 siRNAの投与により、くしゃみの回数が有意に減少した(図１５)。炎症反応の抑制は、好酸球浸潤の顕著な減少など、病理組織学的にも確認された。図１６にギムザ染色の結果を、図１７に好酸球浸潤数を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例の実験プロトコール１（A)及び２（B)の概要を示す図である。
【図２】siRNAとshRNAの構造を示す図である。
【図３】ヒトSTAT6 siRNA導入によるSTAT6の発現抑制を示す図である。
【図４】ヒトSTAT6 siRNAを導入したヒト線維芽細胞によるeotaxin-3産生を示す図である。
【図５】ヒトSTAT6 shRNAを導入したヒト線維芽細胞におけるSTAT6のmRNAレベルでの発現抑制を示す図である。
【図６】ヒトSTAT6 shRNAを導入したヒト線維芽細胞におけるSTAT6のタンパク質レベルでの発現抑制を示す図である。
【図７】ヒトSTAT6 shRNAを導入したヒト線維芽細胞によるeotaxin-3産生を示す図である。
【図８】マウスSTAT6 siRNA導入による、正常線維芽細胞におけるSTAT6発現の抑制をWestern blot法により確認した結果を示す図である。
【図９】マウスSTAT6 siRNA導入による、正常線維芽細胞におけるSTAT6発現の抑制をRT-PCRにより確認した結果を示す図である。
【図１０】マウスSTAT6 siRNA導入による、正常線維芽細胞において、IL-4とTNF-alphaの共刺激により産生されるeotaxin (CCL11)濃度をELISA法にて定量した結果を示す図である。
【図１１】STAT6 siRNAによる接触過敏反応への効果を示す図である。図１１Aは、TNCBによる接触過敏反応への効果を、図１１BはDNFBによる接触過敏反応への効果を、図１１CはOxazoloneによる接触過敏反応への効果を示す図である。
【図１２】STAT6 siRNAによる接触過敏反応への効果をギムザ染色により示す図である。
【図１３】STAT6 siRNAによる接触過敏反応への効果を浸潤している細胞のプロフィールにより示す図である。
【図１４】STAT6 siRNA含有軟膏による接触過敏反応への効果を示す図である。
【図１５】鼻炎モデルに対するSTAT6 siRNAの効果をくしゃみの回数により示す図である。
【図１６】鼻炎モデルに対するSTAT6 siRNAの効果をギムザ染色により示す図である。
【図１７】鼻炎モデルに対するSTAT6 siRNAの効果を浸潤している好酸球の数により示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号５から１４  合成
【図１】
2010068723.tif 000002
【図２】
2010068723.tif 000003
【図３】
2010068723.tif 000004
【図４】
2010068723.tif 000005
【図５】
2010068723.tif 000006
【図６】
2010068723.tif 000007
【図７】
2010068723.tif 000008
【図８】
2010068723.tif 000009
【図９】
2010068723.tif 000010
【図１０】
2010068723.tif 000011
【図１１】
2010068723.tif 000012
【図１２】
2010068723.tif 000013
【図１３】
2010068723.tif 000014
【図１４】
2010068723.tif 000015
【図１５】
2010068723.tif 000016
【図１６】
2010068723.tif 000017
【図１７】
2010068723.tif 000018
【配列表】
2010068723000001.app