(57)【要約】【課題】  優れた増幅効率で目的配列を増幅するための核酸増幅方法を提供する。【解決手段】  下記条件（Ｉ）を満たす、少なくとも二種類のプライマーを使用して、ＰＣＲを行う。（Ｉ）一方のプライマーが、鋳型核酸において、他方のプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記一方のプライマーのＴｍ値が、前記他方のプライマーのＴｍ値よりも低いこの条件を満たすプライマーを用いれば、同一反応系で、鋳型核酸における目的配列を、優れた効率で増幅できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅する核酸増幅方法に使用するためのプライマー試薬であって、
少なくとも二種類のプライマーを含み、
前記プライマーのうち任意の二種類のプライマーが、下記条件（Ｉ）を満たすことを特徴とするプライマー試薬。
（Ｉ）一方のプライマーが、前記鋳型核酸における他方のプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記一方のプライマーのＴｍ値が、前記他方のプライマーのＴｍ値よりも低い
【請求項２】
第１プライマーおよび第２プライマーを含み、
前記第２プライマーが、前記鋳型核酸における前記第１プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、
前記第２プライマーのＴｍ値が、前記第１プライマーのＴｍ値よりも低い、請求項１記載のプライマー試薬。
【請求項３】
さらに、第３プライマーを含み、
前記第３プライマーが、前記鋳型核酸における前記第２プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、
前記第３プライマーのＴｍ値が、前記第２プライマーのＴｍ値よりも低い、請求項２記載のプライマー試薬。
【請求項４】
前記鋳型核酸が、センス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖核酸であり、
前記アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能なフォワードプライマーと前記センス鎖にハイブリダイズ可能なリバースプライマーとを有するプライマーセットを、少なくとも二種類含み、
前記プライマーセットのうち任意の二種類のプライマーセットにおいて、各フォワードプライマーおよび各リバースプライマーが、それぞれ、前記条件（Ｉ）を満たすプライマーである、請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマー試薬。
【請求項５】
第１プライマーセットおよび第２プライマーセットを含み、
前記第２プライマーセットのフォワードプライマーが、前記アンチセンス鎖における前記第１プライマーセットのフォワードプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記アンチセンス鎖における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第２プライマーセットのフォワードプライマーのＴｍ値が、前記第１プライマーセットのフォワードプライマーのＴｍ値よりも低く、
前記第２プライマーセットのリバースプライマーが、前記センス鎖における前記第１プライマーセットのリバースプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記センス鎖における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第２プライマーセットのリバースプライマーのＴｍ値が、前記第１プライマーセットのリバースプライマーのＴｍ値よりも低い、請求項４記載のプライマー試薬。
【請求項６】
さらに、第３プライマーセットを含み、
前記第３プライマーセットのフォワードプライマーが、前記アンチセンス鎖における前記第２プライマーセットのフォワードプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記アンチセンス鎖における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第３プライマーセットのフォワードプライマーのＴｍ値が、前記第２プライマーセットのフォワードプライマーのＴｍ値よりも低く、
前記第３プライマーセットのリバースプライマーが、前記センス鎖における前記第２プライマーセットのリバースプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記センス鎖における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第３プライマーセットのリバースプライマーのＴｍ値が、前記第２プライマーセットのリバースプライマーのＴｍ値よりも低い、請求項５記載のプライマー試薬。
【請求項７】
鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅する核酸増幅方法であって、
プライマーとして、請求項１から６のいずれか一項に記載のプライマー試薬を使用することを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼチェーンリアクションに使用するポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損するポリメラーゼである、請求項７記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記反応系が、前記第１プライマーおよび第２プライマーを含み、
前記第１プライマー（Ｘ）と前記第２プライマー（Ｙ）とのモル比（Ｘ：Ｙ）が、１：０．１〜１：１０の範囲である、請求項７または８記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記反応系が、さらに、前記第３プライマーを含み、
前記第１プライマー（Ｘ）と前記第３プライマー（Ｚ）とのモル比（Ｘ：Ｚ）が、１：０．０１〜１：１００の範囲である、請求項９記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
（Ａ）前記鋳型核酸と前記プライマー試薬とを含む反応系を加熱し、前記鋳型核酸を一本鎖にする工程
（Ｂ）前記反応系の温度を降下させ、前記一本鎖の鋳型核酸へのプライマーのアニーリングおよび前記プライマーからの伸長反応を行う工程
（Ｃ）前記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を、繰り返し行う工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼチェーンリアクションによる目的配列の核酸増幅方法に使用するためのプライマー試薬、および、それを用いた核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床や病理学等の様々な分野において、遺伝子の発現解析、機能解析、診断等を目的として、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）が広く利用されている。ＰＣＲは、一般に、（１）熱処理による二本鎖核酸から一本鎖核酸への解離、（２）一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、目的配列を増幅する方法である。そして、ＰＣＲにおいては増幅効率を向上させるために、例えば、ＰＣＲ反応液に、グリセロール、ホルムアルデヒド等を添加する方法（特許文献１）等が提案されている。このような方法によれば、１サイクルあたり、最大２倍の核酸を得ることができる。
【０００３】
しかしながら、近年、１サイクルあたり２倍以上の核酸を複製できる、優れた増幅効率の改良ＰＣＲの提供が望まれている。
【特許文献１】特開２００３−１４４１６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、優れた増幅効率で目的配列を増幅するためのプライマー試薬ならびに核酸増幅方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のプライマー試薬は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する核酸増幅方法に使用するためのプライマー試薬であって、少なくとも二種類のプライマーを含み、前記プライマーのうち任意の二種類のプライマーが、下記条件（Ｉ）を満たすことを特徴とする。
（Ｉ）一方のプライマーが、前記鋳型核酸における他方のプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記一方のプライマーのＴｍ値が、前記他方のプライマーのＴｍ値よりも低い
【０００６】
また、本発明の核酸増幅用試薬は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する核酸増幅方法に使用するための核酸増幅用試薬であって、本発明のプライマー試薬を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する核酸増幅方法であって、本発明のプライマー試薬を使用することを特徴とする。
【０００８】
本発明の核酸増幅物の製造方法は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する、核酸増幅物の製造方法であって、前記目的配列の増幅を、本発明の核酸増幅方法により行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプライマー試薬によれば、前述のような条件を満たすプライマーを二種類以上使用することで、同一反応系において、従来のＰＣＲよりも各段に効率良く、目的配列の増幅を行うことが可能である。また、本発明のプライマー試薬における各種プライマーは、Ｔｍ値を前記条件（Ｉ）を満たすように設計すればたりることから、例えば、プライマーの調製自体を、極めて簡便に行うことができる。このため、簡便に、優れた増幅効率でＰＣＲによる核酸増幅が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
＜プライマー試薬＞
本発明のプライマー試薬は、前述のように、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する核酸増幅方法に使用するためのプライマー試薬であって、少なくとも二種類のプライマーを含み、前記プライマーのうち任意の二種類のプライマーが、下記条件（Ｉ）を満たすことを特徴とする。
（Ｉ）一方のプライマーが、前記鋳型核酸における他方のプライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記一方のプライマーのＴｍ値が、前記他方のプライマーのＴｍ値よりも低い
【００１１】
本発明のプライマー試薬は、後述するような、本発明の核酸増幅方法ならびに核酸増幅物の製造方法に使用できる。なお、具体的な手法については、後述する。なお、Ｔｍ値が相対的に高い程、鋳型核酸に対する結合性は、相対的に高くなる。
【００１２】
本発明のプライマー試薬は、前記条件（Ｉ）を満たすプライマーを少なくとも二種類含んでいればよく、その他の条件や構成は何ら制限されない。前記プライマー試薬は、プライマーとして、例えば、前記条件（Ｉ）を満たす二種類のプライマーのみを含んでもよいし、三種類以上のプライマーを含んでもよい。後者の場合、プライマーのうち、少なくとも二種類が前記条件（Ｉ）を満たすプライマーであればよく、前記条件（Ｉ）を満たす二種類のプライマーは、任意に設定できる。このようなプライマー試薬の具体例としては、例えば、第１プライマーおよび第２プライマーを含むものがあげられる。前記第１プライマーおよび第２プライマーは、例えば、鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能であり、前記第２プライマーは、前記鋳型核酸における前記第１プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第２プライマーのＴｍ値は、第１プライマーのＴｍ値よりも低い。各プライマーは、前記鋳型核酸の目的配列を増幅できればよいことから、前記第１プライマーがハイブリダイズ可能な領域としては、例えば、前記鋳型核酸において、前記目的配列の全体を含む領域、前記目的配列の３’領域またはそれを含む領域、前記目的配列よりも下流（３’側）の領域であることが好ましい。前記第２プライマーがハイブリダイズ可能な領域としては、前述のように、前記鋳型核酸において、前記第１プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側の領域であり、部分的に第１プライマーがハイブリダイズ可能な領域と重複してもよい。
【００１３】
本発明のプライマー試薬が、三種類以上のプライマーを含む場合、前述のように、少なくとも二種類が前記条件を満たすプライマーであればよいが、例えば、各プライマーの間で、各々、前記条件（Ｉ）を満たすことが好ましい。つまり、各プライマーは、鋳型核酸に対するハイブリダイズ領域が３’側である程、そのハイブリダイズ領域より５’側にハイブリダイズするプライマーよりも、相対的にＴｍ値が低いことが好ましい。このようなプライマー試薬の具体例としては、例えば、前記第１プライマーおよび前記第２プライマーに加えて、さらに、第３プライマーを含むものがあげられる。前記第１、第２および第３プライマーは、例えば、鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能であり、前記第３プライマーは、前記鋳型核酸における前記第２プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第３プライマーのＴｍ値は、前記第２プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。つまり、第１、第２および第３プライマーは、例えば、鋳型核酸に対して、前記鋳型核酸の５’側から３’側に向かって、この順序でハイブリダイズし、各Ｔｍ値は、第１プライマー＞第２プライマー＞第３プライマーという関係になることが好ましい。前記第３プライマーがハイブリダイズ可能な領域としては、前述のように、前記鋳型核酸において、前記第２プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側の領域であり、部分的に、前記第２プライマーがハイブリダイズ可能な領域と重複してもよい。
【００１４】
さらに、第４プライマーを含む場合も同様に、前記鋳型核酸における前記第３プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも、前記鋳型核酸における３’側にハイブリダイズ可能であり、前記第４プライマーのＴｍ値は、前記第３プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。このように、本発明のプライマー試薬に含まれるプライマーの種類は、二種類以上であればよく、制限されないが、鋳型核酸において、より３’側にハイブリダイズ可能なプライマーのＴｍ値が、より５’側にハイブリダイズ可能なプライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。
【００１５】
本発明において、鋳型核酸は、例えば、一本鎖核酸でも、二本鎖核酸でもよい。二本鎖核酸の場合、例えば、二本鎖核酸を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方のみにハイブリダイズ可能なプライマーを使用してもよいが、アンチセンスにハイブリダイズ可能なフォワードプライマーおよびセンス鎖にハイブリダイズ可能なリバースプライマーを含むプライマーセットを使用することが好ましい。以下に、本発明のプライマー試薬について、プライマーセットを含む形態を説明する。なお、フォワードプライマーは、センスプライマー、リバースプライマーは、アンチセンスプライマーともいう。
【００１６】
本発明のプライマー試薬は、鋳型核酸がセンス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖核酸の場合、前記アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能なフォワードプライマーと前記センス鎖にハイブリダイズ可能なリバースプライマーとを有するプライマーセットを、少なくとも二種類含むことが好ましい。そして、前記プライマーセットのうち任意の二種類のプライマーセットにおいて、各フォワードプライマーおよび各リバースプライマーが、それぞれ、前記条件（Ｉ）を満たすプライマーであることが好ましい。
【００１７】
本発明のプライマー試薬は、例えば、前記条件（Ｉ）を満たすフォワードプライマーとリバースプライマーとを有する二種類のプライマーセットのみを含んでもよいし、三種類以上のプライマーセットを含んでもよい。後者の場合、プライマーセットのうち、少なくとも二種類が、前記条件（Ｉ）を満たすフォワードプライマーとリバースプライマーとを有するプライマーセットであることが好ましく、これらの条件を満たすプライマーセットは、任意に設定できる。
【００１８】
このようなプライマー試薬の具体例としては、例えば、第１プライマーセットおよび第２プライマーセットを含むものがあげられる。前記第１プライマーセットは、例えば、第１フォワードプライマー（以下、「Ｆ１プライマー」という）と第１リバースプライマー（以下、「Ｒ１プライマー」という）を含み、第２プライマーセットは、例えば、第２フォワードプライマー（以下、「Ｆ２プライマー」という）と第２リバースプライマー（以下、「Ｒ２プライマー」という）を含む。前記第２プライマーセットのＦ２プライマーは、前記アンチセンス鎖において、前記第１プライマーセットのＦ１プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記Ｆ２プライマーのＴｍ値は、前記Ｆ１プライマーのＴｍ値よりも低く、前記Ｒ２プライマーは、前記センス鎖において、前記Ｒ１プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記Ｒ２プライマーのＴｍ値は、前記Ｒ１プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。前記Ｆ１プライマーとＦ２プライマー、および、前記Ｒ１プライマーとＲ２プライマーは、それぞれ、前述の第１プライマーと前記第２プライマーに相当する。鋳型核酸に対するハイブリダイズ領域の関係から、第１プライマーセットは、例えば、内側のプライマーセット、第２プライマーセットは、例えば、外側のプライマーセットということもできる。
【００１９】
本発明のプライマー試薬が、三種類以上のプライマーセットを含む場合、例えば、各プライマーセットの間で、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが、それぞれ、前記条件（Ｉ）を満たすことが好ましい。このようなプライマー試薬の具体例としては、例えば、前記第１プライマーセットおよび前記第２プライマーセットに加えて、さらに、第３プライマーセットを含むものがあげられる。前記第３プライマーセットは、例えば、第３フォワードプライマー（以下、「Ｆ３プライマー」という）と第３リバースプライマー（以下、「Ｒ３プライマー」という）を含む。第３プライマーセットのＦ３プライマーは、前記アンチセンス鎖において、前記Ｆ２プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記Ｆ３プライマーのＴｍ値は、前記Ｆ２プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。また、第３プライマーセットのＲ３プライマーは、前記センス鎖において、前記Ｒ２プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記Ｒ３プライマーのＴｍ値は、前記Ｒ２プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。前記Ｆ３プライマーおよびＲ３プライマーは、それぞれ、前述の第３プライマーに相当する。鋳型核酸に対するハイブリダイズ領域の関係から、第３プライマーセットは、第２プライマーセットに対して、さらに外側のプライマーセットということもできる。
【００２０】
さらに、第４プライマーセットを含む場合も同様である。第４プライマーセットは、例えば、第４フォワードプライマー（以下、「Ｆ４プライマー」という）と第４リバースプライマー（以下、「Ｒ４プライマー」という）とを含む。第４プライマーセットのＦ４プライマーは、前記アンチセンス鎖において、前記Ｆ３プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記Ｆ４プライマーのＴｍ値は、前記Ｆ３プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。また、第４プライマーセットのＲ４プライマーは、前記センス鎖において、前記Ｒ３プライマーがハイブリダイズ可能な領域よりも３’側にハイブリダイズ可能であり、前記Ｒ４プライマーのＴｍ値は、前記Ｒ３プライマーのＴｍ値よりも低いことが好ましい。前記Ｆ４プライマーおよびＲ４プライマーは、それぞれ、前述の第４プライマーに相当する。鋳型核酸に対するハイブリダイズ領域の関係から、第４プライマーセットは、第３プライマーセットに対して、さらに外側のプライマーセットということもできる。このように、本発明のプライマー試薬に含まれるプライマーセットの種類は、特に制限されないが、鋳型核酸（センス鎖およびアンチセンス鎖）において、より３’側（より外側）にハイブリダイズ可能なプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのＴｍ値が、それぞれ、より５’側にハイブリダイズ可能なプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのＴｍ値よりも、低いことが好ましい。
【００２１】
本発明において、各プライマーの構成成分は、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ等の核酸、ペプチド核酸であるＰＮＡ、架橋化核酸であるＢＮＡ等の人工核酸等があげられる。
【００２２】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖核酸における両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ）に解離（融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖核酸が解離して一本鎖核酸になると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖核酸のみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００２３】
プライマーのＴｍ値の設定方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、各プライマーの長さや、ＧＣ含量によって調節できる。長さにより調節する場合、一般的に、プライマーが相対的に短い程、Ｔｍ値を相対的に低く設定することができる。例えば、前述のような第１プライマーと第２プライマーとを使用する場合は、第２プライマーの長さを、第１プライマーよりも短く設定することが好ましい。これによって、第２プライマーのＴｍ値を、第１プライマーのＴｍ値よりも相対的に低い値に設定することができる。また、ＧＣ含量によって調節する場合、例えば、ＧＣ含量が相対的に低い程、Ｔｍ値を相対的に低く設定することができる。例えば、前述のような第１プライマーと第２プライマーとを使用する場合は、前記第２プライマーのＧＣ含量を、第１プライマーよりも低く設定することが好ましい。また、プライマーの長さとＧＣ含量との両方によって、Ｔｍ値を設定することもできる。これらの他にも、例えば、第１プライマーを、前述したＬＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡ等の人工核酸を含む配列、または、第２プライマーよりも含有個数が多い配列とし、第２プライマーを、これらの人工核酸を含まない配列、または、第１プライマーよりも含有個数が少ない配列とすることで、第１プライマーのＴｍ値を相対的に高く、第２プライマーのＴｍ値を相対的に低く設定することができる。
【００２４】
また、Ｔｍ値を考慮したプライマー配列の設計は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）や最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）等により行うこともできる。このようなソフトウエア等を用いて設計したプライマーについては、例えば、実際に行うＰＣＲの条件下で、Ｔｍ値を確認することが好ましい。
【００２５】
プライマー間のＴｍ値の差は、特に制限されないが、鋳型核酸におけるハイブリダイズ領域が隣接するプライマー間のＴｍ値の差（例えば、第１プライマーと第２プライマーとのＴｍ値の差、第２プライマーと第３プライマーとのＴｍ値との差）は、０．１〜２０℃であることが好ましく、より好ましくは１〜１５℃であり、特に好ましくは５〜１０℃である。
【００２６】
各プライマーの長さは、特に制限されないが、例えば、５〜５０塩基であり、好ましくは１０〜４０塩基であり、より好ましくは１５〜３０塩基である。各プライマーは、鋳型核酸とハイブリダイズ可能とするために、前記鋳型核酸と相補的であることが好ましく、具体的には、プライマー配列の８０％以上が相補的であることが好ましく、より好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは１００％である。
【００２７】
本発明のプライマー試薬において、各プライマーの割合は、特に制限されないが、例えば、相対的にＴｍ値が高いプライマーと、相対的にＴｍ値が低いプライマーとのモル比が、１：０．０１〜１：１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：０．１〜１：１０の範囲であり、特に好ましくは、１：０．５〜１：２の範囲である。具体例として、前記第１プライマー（Ｘ）と前記第２プライマー（Ｙ）とのモル比（Ｘ：Ｙ）は、例えば、１：０．０１〜１：１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：０．１〜１：１０の範囲であり、特に好ましくは、１：０．５〜１：２の範囲である。また、さらに、前記第３プライマーを含む場合、前記第１プライマー（Ｘ）と前記第３プライマー（Ｚ）とのモル比（Ｘ：Ｚ）は、例えば、１：０．０１〜１：１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：０．１〜１：１０の範囲であり、特に好ましくは、１：０．５〜１：２の範囲である。また、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む場合、フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）とのモル比（Ｆ：Ｒ）は、例えば、１：０．０１〜１：１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：０．１〜１：１０の範囲であり、特に好ましくは、１：０．５〜１：２の範囲である。
【００２８】
本発明のプライマー試薬の形態は、特に制限されず、例えば、ドライ系（乾燥体）であってもウェット系（液体）であってもよい。本発明の核酸増幅用試薬において、各プライマーは、例えば、それぞれ別個で容器等に収納されてもよいが、同一反応系で使用することから、混合した状態で、同じ容器に収容されていることが好ましい。本発明のプライマーは、例えば、プライマーキットであってもよく、例えば、さらに、使用説明書、ＰＣＲに必要な後述する他の成分を、さらに含んでもよい。
【００２９】
＜核酸増幅用試薬＞
本発明の核酸増幅用試薬は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する核酸増幅方法に使用するための核酸増幅用試薬であって、本発明のプライマー試薬を含むことを特徴とする。本発明の核酸増幅用試薬は、本発明のプライマー試薬を含んでいればよく、その他の構成等は何ら制限されず、使用方法も同様である。
【００３０】
本発明の核酸増幅用試薬の形態は、例えば、本発明のプライマー試薬と同様に、特に制限されず、例えば、ドライ系（乾燥体）であってもウェット系（液体）であってもよい。本発明の核酸増幅用試薬がドライ系の場合、使用時に、適当な溶媒を添加して、核酸増幅反応に使用することが好ましい。また、本発明の核酸増幅用試薬が、例えば、ウェット系であって、プライマーの含有濃度が、後述するような使用時の反応系における濃度よりも高い場合は、適当な溶媒や、鋳型核酸を含有する溶媒等を添加して、核酸増幅反応に使用することが好ましい。また、本発明の核酸増幅用試薬において、各プライマーは、例えば、それぞれ別個で容器等に収納されてもよいが、同一反応系で使用することから、混合した状態で、同じ容器に収容されていることが好ましい。
【００３１】
本発明の核酸増幅用試薬は、例えば、前述のプライマーの他に、核酸増幅に必要な他の成分をさらに含んでもよい。前記他の成分としては、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記他の成分としては、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。この他にも、例えば、グリセロ−ル、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよい。
【００３２】
前記ポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来からＰＣＲ等に使用されているポリメラーゼがあげられる。前記ポリメラーゼとしては、例えば、耐熱性細菌由来のポリメラーゼが好ましく、具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等があげられる。また、ポリメラーゼは、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損するポリメラーゼが好ましい。このように５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損するポリメラーゼによれば、例えば、ポリメラーゼによるプライマーの切断を十分に回避できる。このように５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損するポリメラーゼとしては、例えば、市販品として、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ（ニッポンジーン）、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ（クロンテック）、ΔＴｔｈ（東洋紡）等があげられる。また、ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するものが好ましい。
【００３３】
ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）としては、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰがあげられ、これらの混合物を使用することが好ましい。
【００３４】
前記緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝剤があげられる。前記溶媒としては、例えば、水、前記緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。前記緩衝液において、例えば、ｐＨや含有する緩衝剤の濃度等は、特に制限されず、従来公知の条件が適用できる。
【００３５】
本発明の核酸増幅用試薬は、例えば、核酸増幅用キットであってもよく、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【００３６】
＜核酸増幅方法＞
本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する核酸増幅方法であって、プライマーとして、本発明のプライマー試薬を使用することを特徴とする。本発明においては、プライマーとして、前述した本発明のプライマー試薬を使用することが特徴であって、それ以外の条件は、何ら制限されず、例えば、従来のＰＣＲによって核酸を増幅することができる。
【００３７】
本発明の核酸増幅方法は、例えば、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことが好ましい。
（Ａ）前記鋳型核酸と前記プライマー試薬とを含む反応系を加熱し、前記鋳型核酸を一本鎖にする工程
（Ｂ）前記反応系の温度を降下させ、前記一本鎖の鋳型核酸へのプライマーのアニーリングおよび前記プライマーからの伸長反応を行う工程
（Ｃ）前記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を、繰り返し行う工程
【００３８】
本発明において、ＰＣＲの開始時の鋳型核酸、すなわち、一回目の前記（Ａ）工程における鋳型核酸は、例えば、一本鎖核酸でも二本鎖核酸でもよい。前記一回目の（Ａ）工程における鋳型核酸が二本鎖の場合、加熱で二本鎖が一本鎖に解離されるため、続く、（Ｂ）工程で、一本鎖へのプライマーのアニーリングが可能となる。また、ＰＣＲ開始時の鋳型核酸が一本鎖の場合、一回目の（Ａ）工程は、例えば、省略することもできるが、例えば、前記（Ａ）工程によって、ＰＣＲ開始前に、すでに一本鎖の鋳型核酸にアニーリングしたプライマーを、前記鋳型核酸から解離させておくことが好ましい。
【００３９】
一方、前記（Ｃ）工程の二回目以降の（Ａ）工程において、加熱前の鋳型核酸は、通常、二本鎖核酸である。これは、一回目の前記（Ａ）工程における鋳型核酸が一本鎖核酸であるか二本鎖核酸であるかにかかわらず、（Ｂ）工程により、一本鎖の鋳型核酸と、それにアニーリングしたプライマーの伸長鎖とから、二本鎖核酸が形成されるためである。前記（Ｂ）工程で形成された二本鎖核酸は、引き続き、（Ａ）工程における鋳型核酸となり、加熱処理によって、一本鎖に解離される。
【００４０】
前記（Ｂ）工程では、前記反応系の温度を降下させ、解離した前記一本鎖の鋳型核酸へのプライマーのアニーリングおよび前記プライマーからの伸長反応を行う。本発明における各種プライマーは、相対的に高いＴｍ値を有するプライマーから順に、優先的にアニーリングならびに伸長反応が起こる。具体的なメカニズムについては後述する。
【００４１】
前記（Ｃ）工程において、前記（Ａ）工程および（Ｂ）工程の繰り返し回数は特に制限されないが、（Ａ）工程および（Ｂ）工程を１サイクルとした場合、合計１０〜１００サイクルが好ましく、より好ましくは合計３０〜５０サイクルである。本発明の核酸増幅方法によれば、前述のように、増幅効率に優れることから、例えば、従来のサイクル数（例えば、３７〜３８サイクル）よりも格段に少ないサイクル数（例えば、２８サイクル）で同程度の増幅が可能となる。
【００４２】
以下に、本発明の核酸増幅方法について、本発明のプライマー試薬として、前記第１プライマーセットおよび前記第２プライマーセットを含むプライマー試薬を使用し、二本鎖核酸を鋳型として、目的配列の増幅を行う一例をあげて説明する。なお、本発明で使用するプライマー試薬は、本発明のプライマー試薬であればよく、第１および第２プライマーセットを含むプライマー試薬には制限されない。また、本発明の核酸増幅方法は、この実施形態には制限されない。
【００４３】
まず、前述のＦ１プライマーおよびＲ１プライマーを含む第１プライマーセット、ならびに、Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーを含む第２プライマーセットを準備する。そして、これらのプライマーセットと二本鎖の鋳型核酸を溶媒に混合して、反応系を準備する。前記鋳型核酸としては、特に制限されないが、例えば、二本鎖ＤＮＡがあげられる。二本鎖ＤＮＡとしては、例えば、生体試料や環境試料等の試料に元来含まれている二本鎖ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡやｍＲＮＡ等のＲＮＡから、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ））等の逆転写反応により合成したｃＤＮＡ等があげられる。
【００４４】
前記反応系は、前記第１および第２プライマーセットの他に、前述のように、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を含有することが好ましい。前記溶媒としては、前述のような、水、各種緩衝液、市販のＰＣＲ用緩衝液、市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【００４５】
前記反応系における各プライマーセットの割合は、特に制限されないが、例えば、以下のような濃度があげられる。前記反応系において、前記Ｆ１プライマーの最終濃度は、例えば、０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．２５〜２μｍｏｌ／Ｌであり、前記Ｒ１プライマーの最終濃度は、例えば、０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．２５〜２μｍｏｌ／Ｌである。前記反応系において、前記Ｆ２プライマーの最終濃度は、例えば、０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．２５〜２μｍｏｌ／Ｌであり、前記Ｒ２プライマーの最終濃度は、例えば、０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．２５〜２μｍｏｌ／Ｌである。前記反応系において、前記Ｆ１プライマーと前記Ｆ２プライマーとのモル比、および、前記Ｒ１プライマーと前記Ｒ２プライマーとのモル比は、それぞれ、前述の第１プライマーと第２プライマーとのモル比と同様である。
【００４６】
前記反応系において、ポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、使用するポリメラーゼの種類等に応じて適宜決定できる。前記反応系におけるポリメラーゼの最終濃度は、例えば、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、１００μＭ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００４７】
前記反応系において、ｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００４８】
前記反応系において、鋳型核酸の添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１０８ｃｏｐｉｅｓ／Ｌであり、好ましくは１０〜１０６ｃｏｐｉｅｓ／Ｌであり、より好ましくは１０２〜１０４ｃｏｐｉｅｓ／Ｌである。
【００４９】
前記反応系の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【００５０】
続いて、前記（Ａ）工程として、前記反応系を加熱処理する。これによって、前記反応系に含まれる二本鎖の鋳型核酸が一本鎖に解離される。
【００５１】
前記（Ａ）工程における前記反応系の加熱条件は、特に制限されないが、二本鎖を一本鎖に解離できる温度であることが好ましい。具体例としては、加熱温度は、例えば、９０〜９９℃が好ましく、より好ましくは９２〜９５℃であり、処理時間は、例えば、１〜１２０秒が好ましく、より好ましくは１〜６０秒である。
【００５２】
次に、前記（Ｂ）工程として、前記反応系の温度を降下させる。これによって、前記反応系において、解離した一本鎖の鋳型核酸のそれぞれに、プライマーがアニーリングして、アニーリングした前記プライマーから前記鋳型核酸に相補的な伸長鎖が形成される。
【００５３】
前記（Ｂ）工程において、前記反応系の温度の降下条件は、特に制限されず、使用する各プライマーのＴｍ値に応じて適宜決定できる。前記（Ｂ）工程において、前記反応系の温度は、例えば、使用するプライマーのＴｍ値のうち最も低いＴｍ値よりも低い温度であることが好ましい。具体例としては、前記反応系の処理温度は、例えば、５０〜８０℃が好ましく、より好ましくは５０〜７０℃であり、処理時間は、例えば１〜３００秒が好ましく、より好ましくは５〜６０秒である。
【００５４】
ここで、（Ｂ）工程における各種プライマーのアニーリングと伸長について、図１を用いて説明する。同図は、前記第１プライマーセットおよび第２プライマーセットを用いた、ＰＣＲの一回目のサイクルにおける、目的配列の増幅を模式的に示す概略図である。なお、同図において、矢印が核酸配列を示し、矢印の矢頭側の先端が３’末端、矢印の他端が５’末端を示す。同図において、Ｆ１は、第１プライマーセットのＦ１プライマー、Ｒ１は、第１プライマーセットのＲ１プライマー、Ｆ２は、第２プライマーセットのＦ２プライマー、Ｒ２は、第２プライマーセットのＲ２プライマーを示す。また、同図において、前記（Ａ）工程の加熱処理によって解離した一本鎖核酸のうち、センス鎖を「Ｓ」、アンチセンス鎖を「ＡＳ」で表わし、また、Ｆ１プライマー、Ｒ１プライマー、Ｆ１プライマーおよびＲ２プライマーからの各伸長鎖を、それぞれ、「Ｆ１−ｅ」、「Ｒ１−ｅ」、「Ｆ２−ｅ」および「Ｆ２−ｅ」で表わす。
【００５５】
前記（Ａ）工程の加熱処理によって解離した二本の一本鎖核酸と、Ｆ１プライマーおよびＦ２プライマーとを含む反応系の温度を降下させると、同図（ａ）〜（ｇ）に示す反応が進行する。まず、同図（ａ）に示すように、アンチセンス鎖（ＡＳ）にＦ１プライマーが、センス鎖（Ｓ）にＲ１プライマーが、それぞれ、第２プライマーセットのＦ２プライマーおよびＲ２プライマーよりも優先的にアニーリングする。これは、Ｆ１プライマーは、Ｆ２プライマーよりもＴｍ値が高く、Ｒ１プライマーは、Ｒ２プライマーよりもＴｍ値が高いためである。続いて、同図（ｂ）に示すように、アニーリングしたＦ１プライマーからアンチセンス鎖（ＡＳ）に相補的な伸長鎖（Ｆ１−ｅ１）が、アニーリングしたＲ１プライマーからセンス鎖（Ｓ）に相補的な伸長鎖（Ｒ１−ｅ１）が、それぞれ形成される。続いて、同図（ｃ）に示すように、アンチセンス鎖（ＡＳ）において、Ｆ１プライマーのアニーリング領域よりも外側（３’側）にＦ２プライマーが、センス鎖（Ｓ）において、Ｒ１プライマーのアニーリング領域よりも外側（３’側）にＲ２プライマーが、それぞれアニーリングする。そして、同図（ｄ）に示すように、アニーリングしたＦ２プライマーからアンチセンス鎖（ＡＳ）に相補的な伸長鎖（Ｆ２−ｅ１）が、アニーリングしたＲ２プライマーから、センス鎖（Ｓ）に相補的な伸長鎖（Ｒ２−ｅ１）が、それぞれ形成される。この際、Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーからの伸長鎖（Ｆ２−ｅ１およびＲ２−ｅ１）の形成により、鎖置換が生じ、同図（ｂ）に示す先に形成されたＦ１プライマーおよびＲ１プライマーからの伸長鎖（Ｆ１−ｅ１およびＲ１−ｅ１）は、それぞれアンチセンス鎖（ＡＳ）およびセンス鎖（Ｓ）から解離して一本鎖となる。
【００５６】
そして、同図（ｅ）に示すように、解離した前記伸長鎖（Ｆ１−ｅ１）には、さらに新たなＲ１プライマーおよびＲ２プライマーが、順次アニーリングし、解離した前記伸長鎖（Ｒ１−ｅ１）には、さらに新たなＦ１プライマーおよびＦ２プライマーが、順次アニーリングする。そして、前記同図（ｂ）〜（ｄ）と同様の反応が起こる。つまり、同図（ｆ）に示すように、前記伸長鎖（Ｆ１−ｅ１）にアニーリングした新たなＲ１プライマーから形成された伸長鎖（Ｒ１−ｅ２）は、続いて形成された新たなＲ２プライマーからの伸長鎖（Ｒ２−ｅ２）によって、鋳型である前記伸長鎖（Ｆ１−ｅ１）から解離して一本鎖となる。他方、前記伸長鎖（Ｒ１−ｅ１）にアニーリングした新たなＦ１プライマーから形成された伸長鎖（Ｆ１−ｅ２）は、続いて形成された新たなＦ２プライマーから形成された伸長鎖（Ｆ２−ｅ２）によって、鋳型である前記伸長鎖（Ｒ１−ｅ１）から解離して一本鎖となる。そして、同図（ｇ）に示すように、解離した新たな伸長鎖（Ｒ１−ｅ２）にＦ１プライマーが、伸長鎖（Ｆ１−ｅ２）にＲ１プライマーが、それぞれアニーリングして、相補的な伸長鎖が形成される。前記伸長鎖（Ｒ１−ｅ２）は、Ｆ１プライマーからの伸長鎖（Ｆ１−ｅ１）を鋳型として形成されるため、Ｆ１プライマーよりも外側（つまり３’側）にハイブリダイズ可能なＦ２プライマーのアニーリング領域を有していない。このため、前記伸長鎖（Ｒ１−ｅ２）には、Ｆ１プライマーのみがアニーリングし、伸長鎖（Ｆ１−ｅ３）を形成するが、Ｆ２プライマーが結合できず、一本鎖を解離できないため、このサイクルでの増幅は終了する。また、前記伸長鎖（Ｆ１−ｅ２）も同様に、Ｒ１プライマーからの伸長鎖（Ｒ１−ｅ１）を鋳型として形成されるため、Ｒ１プライマーよりも外側（つまり３’側）にハイブリダイズ可能なＲ２プライマーのアニーリング領域を有していない。このため、前記伸長鎖（Ｆ１−ｅ２）には、Ｒ１プライマーのみがアニーリングし、伸長鎖（Ｒ１−ｅ３）を形成するが、Ｒ２プライマーが結合できず、一本鎖を解離できないため、このサイクルでの増幅は終了する。このように、本実施形態によれば、一回目のサイクルで、例えば、開始時の二本鎖核酸を含めて、最終的に、一本鎖として合計１２本の増幅物を得ることができる。
【００５７】
そして、（Ｃ）工程として、前記（Ｂ）工程後の増幅物について、前記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を繰り返し行い、目的配列のさらなる増幅を行う。なお、（Ｃ）工程における２回目以降の（Ａ）工程および（Ｂ）工程の条件は、特に制限されず、前述と同様である。
【００５８】
前記（Ｂ）工程で得られた二本鎖の増幅物は、続く（Ａ）工程の加熱処理で一本鎖に解離され、それぞれが（Ｂ）工程における鋳型核酸となる。なお、これらの鋳型核酸は、例えば、ＰＣＲ開始時の鋳型の他に、Ｆ１プライマー、Ｆ２プライマー、Ｒ２プライマーおよびＲ２プライマーからの伸長鎖がそれぞれ含まれる。このため、鋳型となる伸長鎖は、その伸長鎖の形成に関与したプライマーの種類によって、（１）Ｆ１プライマーおよびＦ２プライマーの両方がアニーリング可能な伸長鎖、（２）Ｒ１プライマーおよびＲ２プライマーの両方がアニーリング可能な伸長鎖、（３）Ｆ１プライマーのみがアニーリング可能な伸長鎖、（４）Ｒ１プライマーのみがアニーリング可能な伸長鎖に分類できる。前記（１）および（２）の伸長鎖に対しては、第１プライマーおよび第２プライマーがアニーリングできるため、前記図１と同様に、第１プライマー（Ｆ１、Ｒ１）の伸長鎖が、第２プライマー（Ｆ２、Ｒ２）からの伸長によって、鋳型から解離され、さらなるプライマーのアニーリングによって引き続き増幅が起こる。他方、（３）および（４）の伸長鎖は、第２プライマー（Ｆ２、Ｒ２）のアニーリング領域を有していないため、第１プライマー（Ｆ１、Ｆ２）がアニーリングして、伸長鎖を形成し、鋳型と二本鎖を形成することで、そのサイクルにおける増幅は終了する。このように、伸長鎖の形成に関与したプライマーの種類によって、各伸長鎖を鋳型とする目的配列の増幅が行われる。本実施形態によれば、二回目のサイクルにおいて、図１（ｇ）の６対の各二本鎖核酸から解離した計１２本の一本鎖鋳型核酸から、最終的に、一本鎖として、合計４４本の増幅物を得ることができる。さらなるサイクルによって、同様の増幅が行われる。
【００５９】
なお、２回目のサイクルにおける増幅の概略を図２に示す。同図は、前記図１で得られた増幅物を鋳型とする、ＰＣＲの２回目のサイクルにおける目的配列の増幅を、模式的に示す概略図である。同図においては、２回目のサイクルにおける初期段階の増幅のみを示す。
【００６０】
本発明の核酸増幅物の製造方法は、鋳型核酸における目的配列を、前記鋳型核酸の同一鎖上にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用して、同一反応系で、ＰＣＲにより増幅する、核酸増幅物の製造方法であって、前記目的配列の増幅を、本発明の核酸増幅方法により行うことを特徴とする。本発明は、本発明のプライマー試薬を用いる核酸増幅方法により目的配列の増幅を行うことが特徴であり、その他の条件や工程等は何ら制限されない。なお、本発明の核酸増幅物の製造方法は、前述の本発明の核酸増幅方法と同様にして行うことができる。
【００６１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【実施例１】
【００６２】
ヒトビリルビンＵＤＰグルクロン酸転移酵素遺伝子の増幅
ヒトビリルビンＵＤＰグルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１Ａ）遺伝子における目的配列を、各種プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅した。なお、ＵＧＴ１Ａ遺伝子の配列情報は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．Ｍ８４１２５に登録されている。
【００６３】
使用した各種プライマー、ならびに、後述する増幅物の検出に使用する検出用プローブの配列を下記表１に示す。下記表１における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ  ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である。なお、下記表において、各プライマーおよび検出用プライマーのＵＧＴ１Ａ遺伝子に対するアニーリング領域は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．Ｍ８４１２５の配列に基づいて記載した。
【表１】
2010088355.tif 000003
【００６４】
前記各種プライマーのうち、Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマーが、ＵＧＴ１Ａ遺伝子において、最も内側にアニーリングする第１プライマーセットであり、Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーは、前記第１プライマーセットの外側にアニーリングする第２プライマーセットであり、Ｆ３プライマーおよびＲ３プライマーは、前記第２プライマーセットの外側にアニーリングする第３プライマーセットである。そして、各プライマーのＴｍ値は、Ｆ１プライマー＞Ｆ２プライマー＞Ｆ３プライマー、および、Ｒ１プライマー＞Ｒ２プライマー＞Ｒ３プライマーに設定されている。
【００６５】
前記検出用プローブは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のセンス鎖に相補的なプローブであり、その３’末端のシトシン塩基に蛍光物質（ＴＡＭＲＡ）を結合させたグアニン消光プローブである。このグアニン消光プローブは、単独で蛍光を発し、相補鎖とハイブリダイズすることで、蛍光を消失する性質を持つ。このため、後述するＰＣＲにおいてＲＴ−ＰＣＲを行い、経時的な蛍光強度変化（蛍光強度の低下）を測定することにより、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の目的配列の増幅量を測定できる。
【００６６】
ヒト血液から、GFX  Genomic  Blood  DNA  Purification  Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、所定の方法により、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡ０．１μＬを添加した、下記表２に示すＰＣＲ反応液２５μＬにより、ＰＣＲを行った。なお、各反応液サンプルにおいて、添加されたプライマーの組み合わせは、以下の通りである。サンプルＡは、第１プライマーセットのみを使用していることから、比較例に該当し、サンプルＢ〜Ｄは、前記条件（Ｉ）を満たすプライマーセットを二種類または三種類使用していることから、実施例に該当する。
（サンプルＡ）Ｆ１＋Ｒ１
（サンプルＢ）Ｆ１＋Ｒ１＋Ｆ２＋Ｒ２
（サンプルＣ）Ｆ１＋Ｒ１＋Ｆ３＋Ｒ３
（サンプルＤ）Ｆ１＋Ｒ１＋Ｆ２＋Ｒ２＋Ｆ３＋Ｒ３
【００６７】
【表２】
2010088355.tif 000004
【００６８】
ＰＣＲ反応は、ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（Bio-Rad  Laboratories社製）を用いて行った。反応条件は、前記反応液サンプルＡ〜Ｄをそれぞれ、９５℃で６０秒処理した後、９５℃５秒および５０℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、２０サイクルから４０サイクルの間、各反応液サンプルについて、経時的な蛍光強度変化を測定した（波長５８５〜７００ｎｍ）。
【００６９】
これらの結果を図３に示す。図３は、経時的な相対蛍光単位の変化、すなわち、経時的な目的配列の増加量の変化を示すグラフである。同図において、横軸は、ＰＣＲのサイクル数、縦軸は、相対蛍光単位（ＲＦＵ：relative  fluorescence  units）である。縦軸のＲＦＵ値は、測定したＲＦＵ値を、増幅の検出前における各反応液サンプルのＲＦＵ値をバックグラウンドとして除いた値である。同図に示すように、比較例にあたる、一種類のプライマーセットのみを用いたサンプルＡは、約３７サイクル付近から、緩やかな蛍光強度の低下、すなわち増幅物の緩やかな増加が確認された。これに対して、実施例にあたる、二種類のプライマーセットを用いたサンプルＢは、約３２サイクル付近から、サンプルＣは、約３１サイクル付近から、三種類のプライマーセットを用いたサンプルＤは、約２８サイクル付近から、急激な蛍光強度の低下、すなわち増幅物の急激な増加が確認された。以上の結果から、前述の条件（Ｉ）を満たす二種類以上のプライマーを使用することによって、従来のＰＣＲよりも、優れた効率で目的配列を増幅できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上のように、本発明のプライマー試薬によれば、前述のようなプライマーを二種類以上使用することで、同一反応系において、従来のＰＣＲよりも各段に効率良く、目的配列の増幅を行うことが可能である。また、本発明のプライマー試薬における各種プライマーは、Ｔｍ値を前記条件（Ｉ）を満たすように設計すればたりることから、例えば、プライマーの調製自体を、極めて簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明の核酸増幅方法の一実施形態において、ＰＣＲの一回目のサイクルにおける増幅の概略を示す模式図である。
【図２】図２は、前記実施形態において、ＰＣＲの二回目のサイクルにおける増幅の概略を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１における、経時的な相対的蛍光単位の変化を示すグラフである。
【図１】
2010088355.tif 000005
【図２】
2010088355.tif 000006
【図３】
2010088355.tif 000007
【配列表】
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