(57)【要約】 【課題】  本発明は、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材の提供を目的とする。【解決手段】  −５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体である、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材。本発明に係る培養基材は、再生医療において特に有用性の高い間葉系幹細胞を未分化の状態で培養することを可能にする、優れた培養基材である。また本発明の培養基材は、成長因子等の培地への添加を必要としない点で、バイオリスクを回避することができるという特徴を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体である、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材。
【請求項２】
非水溶性ポリマーがポリスチレン、ポリ乳酸、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルメタクリレート、ポリカーボネート及びポリスルホンからなる群より選ばれる、請求項１に記載の培養基材。
【請求項３】
−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体を用意する工程、前記ハニカム状多孔質体に間葉系幹細胞を播種する工程、及び前記間葉系幹細胞を前記ハニカム状多孔質体上で培養する工程を含む、未分化の間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項４】
非水溶性ポリマーがポリスチレン、ポリ乳酸、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルメタクリレート、ポリカーボネート及びポリスルホンからなる群より選ばれる、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の材質からなり、かつ特定の大きさの微小孔を有するハニカム状多孔質体からなる未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材、及び当該培養基材を用いた未分化の間葉系幹細胞を増殖させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多分化能を保持した万能細胞である幹細胞を利用した再生医療は、近年における最先端医療技術の一つである。この医療技術では、ＥＳ細胞などの胚性幹細胞の他に、骨髄、肝臓、筋肉、皮膚、神経その他の各種組織から単離される体性幹細胞も注目を集めている。実際に、白血病、再生不良性貧血、先天性免疫不全症などの血液疾患の治療において、造血幹細胞を含む骨髄移植は既に実用化されている。
【０００３】
間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、骨髄細胞、臍帯血細胞又は末梢血細胞などから回収することのできる、体性幹細胞の一種であり、幹細胞を用いた細胞治療における主役と見られている。実際に、間葉系幹細胞から様々な条件を設定することによって、肝細胞（特許文献１）、ステロイド産生細胞（特許文献２）、象牙芽細胞（特許文献３）、神経細胞（特許文献４）、さらには軟骨細胞（特許文献５）等が分化誘導されることが知られている。
【０００４】
一般に、再生医療を行うためには多量の未分化な幹細胞が必要とされる。一方、前記の間葉系幹細胞を含め、生体組織から採取される幹細胞の数は非常に少なく、生体組織からの採取だけで治療に必要とされる数の未分化の幹細胞を確保することは難しい。そのため、生体組織から採取された幹細胞をそのまま使用するのではなく、インビトロで幹細胞を未分化な状態のままで培養して細胞数を増加させてから使用することが望まれている。
【０００５】
未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための方法としては、セロトニン及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む培地（特許文献６）、１％以下の血清、エタノールアミンを含み、かつインスリン、トランスフェリン、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦからなる群より選択される１以上の物質を含む培地（特許文献７）その他、増殖因子などの特殊な化学物質を通常の液体培地に添加することを特徴とする方法が知られている。
【０００６】
また、増殖因子などの化学物質とは別に、種々の高分子からなる細胞外基質との接着、特に細胞外基質分子の化学的な性質だけでなく基質を構成する高分子が織り成す微細な形状が、細胞の増殖および／または分化に影響を与えることもよく知られており、組織工学の分野において細胞増殖のための培養基材ないし足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の開発は活発に行われている。未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材としても、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリアミノ酸、ポリオルソエステル、ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種である生体吸収性高分子材料から成る多孔質シート（特許文献８）や、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチドを含有してなることを特徴とする幹細胞培養用基材（特許文献９）等が報告されている。
【０００７】
本発明者らは、ハニカム構造体、ハニカムパターン化フィルムあるいはハニカム状多孔質体と呼ばれる、非水溶性ポリマーからなる微細な多数の孔が規則的に配置された薄膜（以下、ハニカム状多孔質体とする）が、肝実質細胞、心筋細胞、軟骨細胞ならびに上皮系細胞などのインビトロでの培養において良好な足場となること（例えば特許文献１０〜１２など）、さらに幹細胞を分化させることなく培養するための培養基材としても有用であることを示してきた（特許文献１３）。
【特許文献１】再表２００５／０２４００４
【特許文献２】再表２００５／０８５４２５
【特許文献３】再表２００６／００９２９１
【特許文献４】特表２００４−５２７２５０号公報
【特許文献５】特開２００６−３１４２９９号公報
【特許文献６】特開２００８−６１５６９号公報
【特許文献７】特開２００６−３２５４４５号公報
【特許文献８】特開２００６−１１６２１２号公報
【特許文献９】特開２００２−３１５５６７号公報
【特許文献１０】特開２００２−３３５９４９号公報
【特許文献１１】特開２００２−３４７１０７号公報
【特許文献１２】特開２００７−６９８７号公報
【特許文献１３】再公表２００６／０９３２０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし意外なことに、これまでに種々の細胞の培養において良好な足場として具体的に使用され、また神経幹細胞を未分化な状態で培養するための培養基材であるポリεカプロラクトンからなるハニカム状多孔質体は、未分化の間葉系幹細胞の培養における足場として使用されると低い誘起能を示すことが、本発明者らの更なる研究で明らかにされた。
【０００９】
したがって本発明は、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材として利用し得る、特定のハニカム状多孔質体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、材質、膜厚、平均孔径その他のハニカム状多孔質体に関する物理化学的特性を詳細に検討する中で、特定の非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体が、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材として利用し得ることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【００１１】
（１）−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体である、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材。
【００１２】
（２）非水溶性ポリマーがポリスチレン、ポリ乳酸、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルメタクリレート、ポリカーボネート及びポリスルホンからなる群より選ばれる、（１）に記載の培養基材。
【００１３】
（３）−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体を用意する工程、前記ハニカム状多孔質体に間葉系幹細胞を播種する工程、及び前記間葉系幹細胞を前記ハニカム状多孔質体上で培養する工程を含む、未分化の間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【００１４】
（４）非水溶性ポリマーがポリスチレン、ポリ乳酸、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルメタクリレート、ポリカーボネート及びポリスルホンからなる群より選ばれる、（３）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る培養基材は、再生医療において特に有用性の高い間葉系幹細胞を未分化の状態で培養することを可能にする、優れた培養基材である。また本発明の培養基材は、成長因子等の培地への添加を必要としない点で、バイオリスクを回避することができるという特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体である、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材に関する。
【００１７】
ハニカム状多孔質体とは、多孔性の薄膜であって、膜の垂直方向に向けられた微少な孔が膜の平面方向に蜂の巣状に（ハニカム状に）設けられているものを意味する。この様なハニカム状という規則的な配置で孔が設けられている多孔質の薄膜は、孔の径、形状あるいは深さなどがまちまちである不規則な孔を有する通常の多孔質体とは全く異なる構造体として理解される。
【００１８】
ハニカム状多孔質体の孔は、薄膜の表面に設けられた窪みでもよく、また薄膜を貫通している孔すなわち貫通孔であってもよい。貫通孔は、薄膜の平面方向に存在する周囲の貫通孔と膜の内部において互いに連通していることが好ましい。推論ではあるが、ハニカム状多孔質体における貫通孔及び貫通孔同士の連通構造は、ハニカム状多孔質体上で増殖する間葉系幹細胞間の相互作用が発揮される、あるいは培地や溶存酸素の供給、老廃物の排出がスムーズに行われるなどの利点をもたらすと考えられる。
【００１９】
本発明におけるハニカム状多孔質体は、−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる。その様な非水溶性ポリマーの例としては、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホンなどを挙げることができる。中でもポリスチレン又はポリ乳酸からなるハニカム状多孔質体が好ましく、特にポリスチレンからなるハニカム状多孔質体が好ましい。以下、−５０〜２００℃のガラス転移温度及び０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーを、「非水溶性ポリマー」と表すこととする。
【００２０】
本発明に係るハニカム状多孔質体の孔の平均孔径は１μｍである。平均孔径は、ハニカムフィルム表面で観察される孔（１００個以上）の顕微鏡画像を画像処理（二値化処理）し、それらの平均値として表される。なお、本発明にいう平均孔径１μｍは±０．１〜０．２μｍ程度の幅を許容する値として理解され、厳格な値として、例えば１．０μｍあるいは１．００μｍとして理解されるものではない。
【００２１】
上記の平均孔径１μｍの孔を有する「非水溶性ポリマー」製のハニカム状多孔質体は、例えば特許文献１０〜１３に記載された、高分子の水不溶性有機溶媒溶液表面上に水滴を結露させ、該水滴を鋳型とするという製造原理に基づく方法において、「非水溶性ポリマー」を高分子として選択し、水不溶性有機溶媒溶液中の「非水溶性ポリマー」濃度、基板への同溶液のキャスト量及び／又は基板からの有機溶媒の蒸発速度を制御することにより、製造することができる。
【００２２】
具体的には、水不溶性有機溶媒、例えば５０ｄｙｎ／ｃｍ以下の表面張力γＬを有する水不溶性有機溶媒に濃度が１．０ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌとなるように「非水溶性ポリマー」を溶解した水不溶性有機溶媒溶液を、表面の表面張力をγＳとし、塗布される「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液の表面張力γＬならびに該基板と該溶媒との間の表面張力γＬＳとした場合にγＳ−γＬＳ＞γＬの関係を満たす基板の表面に液膜厚が１μｍ〜２０００μｍ、好ましくは１０００μｍ以下となるように塗布し、さらに相対湿度３０〜９９％、風速０．０１〜２０ｍ／秒の範囲内で調節した気流に基板上に塗布された「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液を置いて、１〜１０ｍＬ溶媒／分の速度で有機溶媒を蒸発させることで製造することができる。
【００２３】
上記の製造方法における水不溶性有機溶媒は、５０ｄｙｎ／ｃｍ以下の表面張力を有し、かつ該溶液表面に結露した水滴を保持し得る程度の水不溶性と、大気圧下で０〜１５０℃、好ましくは１０〜９０℃の沸点を有する有機溶媒出あることが好ましい。かかる水不溶性有機溶媒の例としては、四塩化炭素、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、メチルイソブチルケトン等の非水溶性のケトン類、二硫化炭素などを挙げることができる。特に好ましい水不溶性有機溶媒はクロロホルムである。
【００２４】
また本発明に係る「非水溶性ポリマー」製のハニカム状多孔質体は、両親媒性ポリマーを含んで調製されることが好ましい。好ましい両親媒性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体、アクリルアミドポリマーを主鎖骨格とし疎水性側鎖としてドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基またはカルボキシル基を併せ持つ両親媒性樹脂、ヘパリンやデキストラン硫酸、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）などのアニオン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩とのイオンコンプレックス、ゼラチン、コラーゲン、アルブミンなどの水溶性タンパク質を親水性基とした両親媒性樹脂、ポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリε−カプロラクトン−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリリンゴ酸−ポリリンゴ酸アルキルエステルブロック共重合体などの両親媒性樹脂などが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい両親媒性ポリマーは、アクリルアミドポリマーを主鎖骨格とし、疎水性側鎖としてドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基またはカルボキシル基を併せ持つ両親媒性樹脂である両親媒性ポリアクリルアミドポリマー（Ｃａｐ、ドデシルアクリルアミド、６−アクリルアミド−ｎ−カプロン酸及び２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）からなるコポリマー、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００２年、第１８巻、第１５号、第５７３４頁）である。
【００２５】
「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液を塗布する基板は、例えば、紙、ガラス板、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、等）がラミネートされた紙、金属板（例えば、アルミニウム、亜鉛、銅等）、プラスチックフィルム（例えば、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアセタール等）、シリコン製板等が挙げられる。
【００２６】
さらにかかる「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液を塗布する基板は、基板表面の表面張力γＳと塗布される水不溶性有機溶媒の表面張力γＬならびに該基板と該溶媒との間の表面張力γＬＳとの間で、γＳ−γＳＬ＞γＬの関係を満たす基板を選択して用いることが望ましい。これは、水不溶性有機溶媒溶液を塗布する基板自体の水不溶性有機溶媒に対する濡れ性が、基板上に形成される液膜の厚みに影響を与え得るためである。基板には、塗布される水不溶性有機溶媒溶液との親和性が高いものであることが好ましい。具体的には、水不溶性有機溶媒の表面張力γＬを指標にして上記式で表すことのできる表面張力を示す表面を有する基板を利用すればよい。そのような基板の好適な例としては、ガラス板、シリコン製板あるいは金属板などを挙げることができる。
【００２７】
また、水不溶性有機溶媒溶液との親和性を高めることのできる加工を表面に施した基板の使用も可能である。この様な基板表面の濡れ性の改良は、基板と使用する水不溶性有機溶媒に合わせて、自体公知の方法、例えばガラス製や金属製の基板に対してはそれぞれシランカップリング処理やチオール化合物による単分子膜形成処理方法などを利用することができる。例えば、クロロホルムなどの疎水性有機溶媒を水不溶性有機溶媒として用いる場合の基板としては、十分に洗浄されたＳｉ基板や、アルキルシランカップリング剤などで表面を修飾したガラス基板などの使用が好ましい。また、フッ素系溶媒を用いる場合は、テフロン基板、あるいはフッ素化アルキルシランカップリング剤などで修飾したガラス基板などの使用が好ましい。
【００２８】
基板に「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液を塗付する方法としては、基板に同溶液を滴下する方法の他、バーコート、ディップコート、スピンコート法などを挙げることができ、バッチ式、連続式の何れも利用することができる。
【００２９】
基板表面に塗布された「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液は、相対湿度３０％以上の空気に接触させることによって蒸発させることが好ましい。１〜１０ｍＬ溶媒／分という蒸発速度は、基板上に塗布した「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液の液膜の面方向に対してほぼ平行ないし上方向に０．１Ｌ（リットル）／分以上の空気層の流れを形成して水不溶性有機溶媒を蒸発させる方法、水不溶性有機溶媒の沸点未満かつ液膜に接触する空気の露点未満で「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液が塗布された基板を加熱（例えばベルチェ素子を用いて加熱）して水不溶性有機溶媒を蒸発させる方法、あるいは水不溶性有機溶媒の沸点ならびに液膜に接触する空気の露点を超えないような減圧下において、「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液を基板に塗布し、水不溶性有機溶媒を蒸発させる方法、等によって達成することができる。ここで、露点とは、ある温度におかれた空気の中に含まれている水蒸気が飽和に達して凝結する温度をいい、相対湿度と絶対温度に対して定まる値である。
【００３０】
好適な例としては、基板に塗布された「非水溶性ポリマー」の非水溶性有機溶媒溶液の液膜に対してほぼ平行ないし上方向に向けた、相対湿度３０〜９９％、風速０．０１〜２０ｍ／秒の範囲内で調節した気流に「非水溶性ポリマー」の水不溶性有機溶媒溶液の液膜を置くことが好ましい。
【００３１】
上記の方法によって製造することができる平均孔径１μｍの貫通孔を有する「非水溶性ポリマー」製のハニカム状多孔質体は、未分化の間葉系幹細胞を増殖させるための培養基材として優れた性質を示す。例えば、本発明の培養基材を用いて培養した間葉系幹細胞は、神経細胞、心筋細胞、骨芽細胞等への高い分化能を維持しており、従来の間葉系幹細胞の培養で最も重要な問題であった分化能の低下を回避することができる。
【００３２】
さらに、本発明に係る培養基材の使用は、培地に含まれる血清濃度を１０％以下とし、またＦＧＦ等の成長因子その他の幹細胞の培養に必要ないし有用とされる化学物質の培地への添加を不要にする。この様な成長因子等の培地への添加は、調製された細胞を患者等に投与する際のバイオリスクを生じさせるものとして望ましくないものであり、従ってかかる成長因子の培地への添加を必要としない本発明の培養基材の使用は、再生医療の安全性の向上に資するものである。
【００３３】
本発明の培養基材を用いた方法により培養される間葉系幹細胞は、再生治療対象となる患者から公知の方法に準じて回収された間葉系幹細胞を用いることが好ましい。間葉系幹細胞の本発明に係るハニカム状多孔質体への播種は、適当な緩衝液又は培地、好ましくはＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、Ｆ−１０培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等に間葉系幹細胞を懸濁した懸濁液を用意し、ウェルプレート又は適当な容器に置いた本発明に係るハニカム状多孔質体の単位面積（ｃｍ２）当たり約１．０×１０3〜１．０×１０6となるように前記懸濁液を添加することで行うことができる。間葉系幹細胞を本発明に係るハニカム状多孔質体に添加後、ｐＨ６．０〜８．０、３０〜４０℃、好ましくは３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、２〜３週間培養を行うことにより、間葉系幹細胞を未分化の状態で分化能を維持したまま増殖させることができ、最終的な細胞数は培養開始時より１００００倍にまで高めることができる。なお、培養中は適当な間隔を置いて培地交換を行うことが好ましい。
【００３４】
上記の培養方法において、培地には特別な成長因子等の化学物質の添加を必要とはしないが、バイオリスクを最小限とし得る範囲で、適当な化学物質を培地に添加することは本発明の実施において特に差し支えることはない。
【００３５】
以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３６】
１）ハニカム状多孔質体と平膜の作製
ポリスチレン（ＰＳ、分子量  ２８万）と両親媒性ポリアクリルアミドポリマー（Ｃａｐ）を重量比１０：１で１〜５ｍｇ／ｍＬとなるようにジクロロメタンに溶解して、ＰＳのジクロロメタン溶液を調製した。
【００３７】
ガラス板（４００ｍｍ×１１０ｍｍ内径）に直径１４ｍｍのカバーガラスを敷き詰め、この上に前記ジクロロメタン溶液を２５ｍLキャストし、相対湿度８０％、流速２．０L／分の雰囲気下でジクロロメタンを蒸発させて、平均孔径１μｍの孔（窪み）を有する膜厚１．２〜１．４μｍのＰＳ製ハニカム状多孔質体（ＰＳ１と表す）を調製した。また前記ジクロロメタン溶液を３５ｍLキャストして同様に溶媒を除去することで、平均孔径３μｍの孔（窪み）を有する膜厚４〜５μｍのＰＳ製ハニカム状多孔質体（ＰＳ３と表す）を作製した。
【００３８】
また、ＰＳをポリεカプロラクトン（ＰＣＬ、分子量７０，０００〜１００，０００）に代えて上記の同様の操作を行い、平均孔径３μｍの孔（窪み）を有する膜厚４〜５μｍのＰＣＬ製ハニカム状多孔質体（ＰＣＬ３と表す）を作製した。
【００３９】
さらに、孔も窪みも有しない平坦なＰＳ製平膜（ＰＳｆｌａｔと表す）及びＰＣＬ製平膜（ＰＣＬｆｌａｔと表す）を、スピンコータ（ＭＩＫＡＳＡ １Ｈ−Ｄ７）を用いて作製した。
【００４０】
上記の膜をそれぞれエタノールで洗浄し、残留溶媒を除去するために真空下に３時間おいた。その後、ＵＶ照射（約４０ｍＷ／ｃｍ２）を３時間行って滅菌した。
【００４１】
２）間葉系幹細胞の培養
１）で作製した３種類のハニカム状多孔質体及び２種類の平膜それぞれを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を含む２４ウェルプレートに置いた。この上に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるようにラット間葉系幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカルより購入）を播種し、３７℃、５%ＣＯ２の条件下で８日間培養し、培養開始（０日）、５日目及び８日目に光学顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス製）で１０箇所（１箇所の観察面積は７００μｍ×４００μｍ）の細胞数をカウントし、その平均値を細胞数として計測した。この結果を図１に示す。
【００４２】
ＰＳｆｌａｔ及びＰＣＬｆｌａｔでは、細胞数は８日間の培養でも殆ど増加することはなかった。またＰＣＬ３でも、細胞数の増加は２倍以下に留まった。一方、ＰＳ１における培養８日目の細胞数は播種直後の約７倍に増加し、この細胞数はＰＳ３における培養８日目のそれの約２倍であった。
３）細胞の形態
光学顕微鏡による細胞の形態観察を行ったところ、ＰＳｆｌａｔ、ＰＣＬｆｌａｔ上の細胞はいずれも播種後１日で球状の形態を呈して接着しているが、培養時間の経過と共に、例えば培養開始３日目には広く伸展した形態を示す細胞が多く観察された（図２）。また細胞のコロニー形成はＰＳｆｌａｔ、ＰＣＬｆｌａｔいずれにも確認されなかった。
【００４３】
これに対して、ＰＳ１及びＰＳ３上の細胞は培養時間が経過しても、例えば培養開始３日目でも球状の形態を保っており（図３）、ＰＳ１上では細胞が分散した接着形態に加えて、細胞のコロニー形成も確認された。
【００４４】
３）間葉系細胞の分化能の確認
ＰＳ１上で培養した間葉系幹細胞に対して、Ｍ．Ｈａｒｔｉｎｇら（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２００８年、第１０巻、第２４３−２５３頁）の方法に従って抗ＣＤ７３抗体及び抗ＣＤ１０５抗体（Ｅｎｄｏｇｌｉｎより購入）を用いた抗体染色（緑色）を行った。また同時にＤＡＰＩ染色により核を染色した。
その結果、抗ＣＤ７３抗体（図４ａ）及び抗ＣＤ１０５抗体（図４ｂ）の何れを用いてもＰＳ１上で培養した間葉系幹細胞は形態（球状）の通りに緑色に染色されることが確認された。このことは、ＰＳ１上で培養した間葉系幹細胞が未分化性の状態を保持していることを意味するものである。
【００４５】
４）間葉系幹細胞の動態観察
ＰＣＬｆｌａｔ上での間葉系幹細胞の細胞分裂の過程を、光学顕微鏡を用いて観察した。その結果、ＰＣＬｆｌａｔ上の間葉系幹細胞は、培養時間の経過と共にいったん伸展した細胞が再び球状に収縮し、その後分裂することが確認された（図５）。一方、ＰＳ１上の間葉系幹細胞は、何れの培養時間経過後も細胞は球状の形態を保っていた。この形態変化の相違が、それぞれの培養基材における増殖速度の違いをもたらしているものと推察される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例で作製した培養基材上を用いて培養した時の間葉系幹細胞の細胞数の変化を示すグラフである。
【図２】ＰＣＬｆｌａｔ及びＰＳｆｌａｔ上で３日間培養した間葉系幹細胞の形態を示す光学顕微鏡写真である。左がＰＣＬｆｌａｔを、右がＰＳｆｌａｔをそれぞれ表す。
【図３】ＰＳ１及びＰＳ３上で３日間培養した間葉系幹細胞の形態を示す光学顕微鏡写真である。左がＰＳ１を、右がＰＳ３をそれぞれ表す。
【図４】ＰＳ１上の間葉系幹細胞に対する抗ＣＤ７３抗体染色（図Ａ）、抗ＣＤ１０５抗体染色（図Ｂ）の結果を示す写真である。図Ａ、Ｂ共に緑色は抗ＣＤ７３抗体及び抗ＣＤ１０５抗体による染色を、青色はＤＡＰＩ染色された核をそれぞれ示す。
【図５】ＰＣＬｆｌａｔでの間葉系幹細胞の細胞分裂の過程を示す光学顕微鏡写真である。ａが播種直後、ｂ〜ｄが培養開始後１５分後、３０分後、５０分後の写真である。
【図１】
2010063372.tif 000002
【図２】
2010063372.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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