(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ安価にヘリカーゼの酵素活性を測定する方法、及び測定試薬を提供する。【解決手段】５’末端及び／または３’末端側にヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）を含んだ配列からなる一本鎖核酸（Ａ−１）と前記（Ａ−１）の核酸のうちヘリカーゼ認識配列以外の部分と相補的な配列からなる一本鎖核酸（Ａ−２）とから構成される部分二本鎖核酸（Ａ）、前記（Ａ−２）の核酸の一部と相補的な配列または前記（Ａ−２）の核酸と完全に相補的な配列からなり、かつ前記（Ａ−２）の核酸と塩基対形成した場合にヘリカーゼ認識配列を含まない配列からなる一本鎖核酸（Ｂ）、並びにヘリカーゼを共存させて反応させ、生成した前記（Ａ−２）及び前記（Ｂ）からなる二本鎖核酸または部分二本鎖核酸（Ｃ）を測定するヘリカーゼ活性の測定方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖核酸（Ａ−１）及び一本鎖核酸（Ａ−２）からなる部分二本鎖核酸（Ａ）と、一本鎖核酸（Ｂ）と、ヘリカーゼとを共存させて反応させ、
生成した一本鎖核酸（Ａ−２）及び一本鎖核酸（Ｂ）からなる二本鎖核酸または部分二本鎖核酸（Ｃ）を測定することを特徴とするヘリカーゼ活性の測定方法であって、
前記（Ａ−１）の核酸が５’末端及び／または３’末端側にヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）を含んだ配列からなり、
前記（Ａ−２）の核酸が前記（Ａ−１）の核酸のうちヘリカーゼ認識配列以外の部分と相補的な配列からなり、
前記（Ｂ）の核酸が、前記（Ａ−２）の核酸の一部と相補的な配列、または前記（Ａ−２）の核酸と完全に相補的な配列からなり、かつ前記（Ａ−２）の核酸と塩基対形成した場合にヘリカーゼ認識配列を含まない配列からなる、前記方法。
【請求項２】
前記（Ａ−１）、（Ａ−２）及び（Ｂ）の核酸が非標識核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記（Ｃ）の核酸の測定を電気泳動を用いて行なうことを特徴とする、請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
ヘリカーゼがコロナウイルス科またはフラビウイルス科のウイルスに由来するヘリカーゼ、またはこれらの変異体、部分欠失体、融合体のいずれかであることを特徴とする、請求項１から３に記載の測定方法。
【請求項５】
一本鎖核酸（Ａ−１）、一本鎖核酸（Ａ−２）、一本鎖核酸（Ｂ）、ヌクレオチド三リン酸、及び二価の金属塩を含んだヘリカーゼ活性の測定試薬であって、
前記（Ａ−１）の核酸が５’末端及び／または３’末端側にヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）を含んだ配列からなり、
前記（Ａ−２）の核酸が前記（Ａ−１）の核酸のうちヘリカーゼ認識配列以外の部分と相補的な配列からなり、
前記（Ｂ）の核酸が、前記（Ａ−２）の核酸の一部と相補的な配列、または前記（Ａ−２）の核酸と完全に相補的な配列からなり、かつ前記（Ａ−２）の核酸と塩基対形成した場合にヘリカーゼ認識配列を含まない配列からなる、前記試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡのような二本鎖核酸を巻き戻して一本鎖にする酵素であるヘリカーゼの活性を簡便に測定する方法、及び測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡのような二本鎖核酸を巻き戻して一本鎖にする活性を有するタンパク質は一般にヘリカーゼと総称される。ヘリカーゼのうち、二本鎖ＤＮＡに作用するものはＤＮＡヘリカーゼ、二本鎖ＲＮＡに作用するものはＲＮＡヘリカーゼと便宜的に呼ばれるが、近年の研究によって多くのＲＮＡヘリカーゼは二本鎖ＤＮＡにも作用して一本鎖ＤＮＡを生成することが明らかになってきている。こうしたことからＲＮＡヘリカーゼの活性測定にもしばしば二本鎖ＤＮＡが基質として用いられている。
【０００３】
ヘリカーゼは多様性に富み生物学的な役割も多岐にわたっていることから、近年生物医学的な研究対象として注目されているが、それとともにウイルスなど特定の病原体に対する薬剤を開発する上でも重要視されている。たとえばＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡヘリカーゼは哺乳動物由来のヘリカーゼと大きく異なることから、抗ウイルス剤のターゲットとして注目されている。たとえば特許文献１及び２は前記利用を意図したヘリカーゼの活性測定法及び薬剤のスクリーニング法を開示している。また、ヘリカーゼはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ増幅技術にも用いられており、前記目的で用いられるヘリカーゼとして大腸菌由来ｕｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ７遺伝子４ヘリカーゼなど数種のヘリカーゼが特許文献３で開示されている。
【０００４】
ヘリカーゼ活性の測定法としては基質が二本鎖ＤＮＡであるか二本鎖ＲＮＡであるかによらず、多くの場合３２Ｐのような放射性同位元素（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）あるいは蛍光色素（特許文献４及び５、非特許文献３及び４）で標識された基質が用いられている。また、特殊な方法として表面プラズモン共鳴を用いる方法（特許文献６）、ビオチンで標識した核酸とストレプトアビジンで標識したアガロースビーズとの反応を利用する方法（特許文献２）などが開示されている。しかしながら、前述したヘリカーゼ活性測定法には、反応基質が高価または化学的に不安定である、測定に必要な装置が特殊であるといった問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許５７０５３４４号公報
【特許文献２】特表２０００−５０８５２１号公報
【特許文献３】特表２００６−５０００２８号公報
【特許文献４】特開２００５−８０５３５号公報
【特許文献５】特開２００８−９９６１９号公報
【特許文献６】特表２００２−５４０８００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｉ，Ｃ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（１２），８４７７−８４８４，１９９６
【非特許文献２】Ｔａｎｎｅｒ，Ｊ．Ａ．ら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８（４１），３９５７８−３９５８２，２００３
【非特許文献３】Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，９１，５４７１−５４７４，１９９４
【非特許文献４】Ｒａｎｅｙ，Ｋ．Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，９１，６６４４−６６４８，１９９４
【非特許文献５】Ｓｅｙｂｅｒｔ，Ａ．ら，ＲＮＡ，６，１０５６−１０６８，２０００
【非特許文献６】Ｓｅｒｅｂｒｏｖ，Ｖ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４３０，４７６−４８０，２００４
【非特許文献７】Ｄｅｎｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（８），６８６２−６８７１，１９９９
【非特許文献８】Ｃｈｏｕｌｊｅｎｋｏ，Ｖ．Ｎ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８２，２９２７−２９３３，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、簡便かつ安価にヘリカーゼの酵素活性を測定する方法、及び測定試薬を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ヘリカーゼ反応によって生じた一本鎖核酸が反応液中で再び二本鎖を形成することを利用して、ヘリカーゼ反応基質とヘリカーゼ反応生成物とを分離して検出することにより、ヘリカーゼ活性の測定を簡便かつ安価に行なえることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、以下の発明を包含する：
第一の発明は、
一本鎖核酸（Ａ−１）及び一本鎖核酸（Ａ−２）からなる部分二本鎖核酸（Ａ）と、一本鎖核酸（Ｂ）と、ヘリカーゼとを共存させて反応させ、
生成した一本鎖核酸（Ａ−２）及び一本鎖核酸（Ｂ）からなる二本鎖核酸または部分二本鎖核酸（Ｃ）を測定することを特徴とするヘリカーゼ活性の測定方法であって、
前記（Ａ−１）の核酸が５’末端及び／または３’末端側にヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）を含んだ配列からなり、
前記（Ａ−２）の核酸が前記（Ａ−１）の核酸のうちヘリカーゼ認識配列以外の部分と相補的な配列からなり、
前記（Ｂ）の核酸が、前記（Ａ−２）の核酸の一部と相補的な配列、または前記（Ａ−２）の核酸と完全に相補的な配列からなり、かつ前記（Ａ−２）の核酸と塩基対形成した場合にヘリカーゼ認識配列を含まない配列からなる、前記方法である。
【００１０】
第二の発明は、前記（Ａ−１）、（Ａ−２）及び（Ｂ）の核酸が非標識核酸であることを特徴とする、第一の発明に記載の測定方法である。
【００１１】
第三の発明は、前記（Ｃ）の核酸の測定を電気泳動を用いて行なうことを特徴とする、第一または第二の発明に記載の測定方法である。
【００１２】
第四の発明は、ヘリカーゼがコロナウイルス科またはフラビウイルス科のウイルスに由来するヘリカーゼ、またはこれらの変異体、部分欠失体、融合体のいずれかであることを特徴とする、第一から第三の発明に記載の測定方法である。
【００１３】
第五の発明は、一本鎖核酸（Ａ−１）、一本鎖核酸（Ａ−２）、一本鎖核酸（Ｂ）、ヌクレオチド三リン酸、及び二価の金属塩を含んだヘリカーゼ活性の測定試薬であって、
前記（Ａ−１）の核酸が５’末端及び／または３’末端側にヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）を含んだ配列からなり、
前記（Ａ−２）の核酸が前記（Ａ−１）の核酸のうちヘリカーゼ認識配列以外の部分と相補的な配列からなり、
前記（Ｂ）の核酸が、前記（Ａ−２）の核酸の一部と相補的な配列、または前記（Ａ−２）の核酸と完全に相補的な配列からなり、かつ前記（Ａ−２）の核酸と塩基対形成した場合にヘリカーゼ認識配列を含まない配列からなる、前記試薬である。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明におけるヘリカーゼとは、二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡのような二本鎖核酸を巻き戻して一本鎖にする活性を有するタンパク質をいう。便宜的に二本鎖ＤＮＡに作用するものはＤＮＡヘリカーゼ、二本鎖ＲＮＡに作用するものはＲＮＡヘリカーゼと呼ばれるが、両基質に対する選択性は各酵素により大きく異なり、両基質にほぼ同等に作用する酵素も多い。ここでは固有名詞として定着しているものを除き、両者を区別せずに単にヘリカーゼと呼称する。ヘリカーゼにはしばしば他の酵素活性が付随しており、そのうち典型的なものはＮＴＰａｓｅ活性である。ヘリカーゼの活性発現にはＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）の加水分解エネルギーが必要であることから、すべてのヘリカーゼにＮＴＰａｓｅ活性が観察される。なお、ＮＴＰのうち最も効率よく利用されるものはＡＴＰ（アデノシン三リン酸）であることが多い。また、ヘリカーゼは他の多くの核酸関連酵素と同様にＭｇ２＋やＭｎ２＋のような二価の金属イオンが活性発現に必要である。
【００１６】
本発明における部分二本鎖核酸とは、室温付近かつ低イオン強度下において安定な鎖間の水素結合を形成する連続したヌクレオチド領域（二本鎖領域）の５’末端及び／または３’末端側に、室温付近かつ低イオン強度下で安定な水素結合を形成しない連続したヌクレオチド領域（一本鎖領域）を持つ核酸をいう。
【００１７】
本発明における非標識核酸とは、３２Ｐのような放射性同位元素、フルオレセインのような蛍光色素、またはビオチンのような特殊な分子間相互作用を可能にする標識化合物などが付加されていない核酸をいう。
【００１８】
本発明におけるヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）とは、特定のヘリカーゼの巻き戻し反応に必要な配列のことをいう。前記認識配列の長さは各ヘリカーゼによって異なり、例えばヒトコロナウイルス２２９Ｅ由来ヘリカーゼの場合は５’末端に約１０塩基長の一本鎖領域が必要であり（非特許文献５）、ヒトＣ型肝炎ウイルスの場合は逆に３’末端側に約２０塩基長の一本鎖領域が必要（非特許文献６では１８塩基長の一本鎖領域を有した部分二本鎖ＤＮＡが調製され、酵素反応に用いられている）である。
【００１９】
次に、本発明のヘリカーゼ活性の測定方法について説明する。
【００２０】
本発明で使用する、一本鎖核酸（Ａ−１）、一本鎖核酸（Ａ−２）及び一本鎖核酸（Ｂ）の核酸の塩基配列には極めて多様なものが許容され、特定の配列に限定されない。また、塩基長についての制限もないが、前記（Ａ−１）及び（Ａ−２）の核酸より形成される部分二本鎖核酸（Ａ）、並びに前記（Ａ−２）及び（Ｂ）の核酸より形成される部分二本鎖核酸（Ｃ）は、二本鎖領域が２０から１０００塩基対、かつ一本鎖領域が１０から１００塩基からなる核酸が好ましい。なお、前記（Ａ−２）及び（Ｂ）の核酸より形成される二本鎖核酸は２０から１０００塩基対からなる核酸が好ましい。
【００２１】
前記（Ａ−１）、（Ａ−２）及び（Ｂ）の核酸は、放射性同位元素、蛍光色素、またはビオチンのような特殊な分子間相互作用を可能にする標識化合物を標識してもよいが、本発明の測定方法は非標識核酸であっても適用可能である。また、非標識核酸は標識核酸と比較し、合成が容易かつ安価にできることから、本発明の測定方法で用いる核酸として好ましい態様といえる。
【００２２】
部分二本鎖核酸は、鎖間で安定な水素結合を形成する２種の一本鎖核酸を等モル混合し、塩基対形成（アニーリング）させることによって容易に調製できる。なお、前記アニーリング操作をより効率よく行なうために、熱処理及びその後の徐冷、または適当な無機塩の添加といった操作を併用してもよい。また意図した部分二本鎖核酸の収率を上げるためには各一本鎖核酸中に自己相補的な配列が少ないほうが好ましく、前記の好ましい配列を設計するためにＧＥＮＥＴＹＸ（商品名）（ゼネティックス社製）のような配列解析プログラムを利用してもよい。
【００２３】
核酸には一本鎖及び二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。二本鎖核酸には構成する鎖の対がＤＮＡ−ＤＮＡであるもの、ＲＮＡ−ＲＮＡであるもの、ＤＮＡ−ＲＮＡであるものが含まれる。非標識ＤＮＡは標準的な核酸合成装置を用いた化学合成により安価に得られる。構成するヌクレオチドの塩基は多くの場合Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）の４種類であるが、Ｉ（イノシン）のような誘導体が含まれていてもよい。また非標識ＤＮＡは遺伝子組換え技術を用いて増殖されたプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で処理することによっても得られる。この場合構成するヌクレオチドの塩基は多くの場合Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）の４種類であるが、宿主細胞によりメチル化された塩基を含む場合もある。前記方法で調製されたＤＮＡ断片は基本的に二本鎖（末端に短い一本鎖領域を含む場合もある）であるが、前記ＤＮＡ断片からＤＮＡポリメラーゼを用いる方法、または熱変性操作と適切なクロマトグラフィー操作を併用することで一本鎖ＤＮＡを調製することができる。一方、非標識ＲＮＡは二本鎖ＤＮＡを鋳型にしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に合成できる。この場合構成するヌクレオチドの塩基は多くの場合Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｃ（シトシン）の４種類である。前記方法で合成した一本鎖非標識核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は通常のクロマトグラフィーや電気泳動操作によって精製後、そのまま使用することができるし、また前述のアニーリング操作によって部分二本鎖核酸として使用することもできる。
【００２４】
ヘリカーゼ活性を測定するための溶液には一本鎖核酸（Ａ−１）、一本鎖核酸（Ａ−２）及び一本鎖核酸（Ｂ）に加え、ＮＴＰ（好ましくはＡＴＰ）、二価の金属塩（好ましくはマグネシウム塩）がそれぞれ適切な濃度で含まれることが必要である。なお、前記組成は測定対象のヘリカーゼに合わせて最適化してもよいし、汎用的な組成に固定してもよい。また、ｐＨ７付近で緩衝能を有する試薬、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のような穏和な還元剤、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びグリセロールのような酵素の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）のような穏和な界面活性剤などを適宜添加してもよい。
【００２５】
ヘリカーゼによる酵素反応温度には特に限定はなく、０℃から８０℃の間で酵素反応に適した温度を選択すればよいが、一般に耐熱性ヘリカーゼの場合には、ヘリカーゼによる酵素反応の速度を高めるためと核酸の二次構造を低減させるために、より高い反応温度が選択される。
【００２６】
ヘリカーゼによる酵素反応によって生成した二本鎖核酸または部分二本鎖核酸（Ｃ）の核酸を測定する方法としては、前記（Ｃ）の核酸を、前記（Ａ）及び（Ｂ）の核酸から分離後、少なくとも前記（Ｃ）の核酸を検出できる方法であればよい。前記（Ｃ）の核酸を、前記（Ａ）及び（Ｂ）の核酸から分離する方法としては、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＮＡ−ＮＰＲ（商品名）（東ソー社製）などの分離剤を充填したカラムを用いた液体クロマトグラフィーによる分離方法や、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動などのゲル電気泳動を用いた分離方法が例示できるが、ゲル電気泳動を用いた分離方法は高価な装置が不要かつ操作が簡便な点で好ましい。特に、前記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の核酸の塩基長が短い（たとえば２００塩基対以下）ときは、短い核酸の分離が容易なポリアクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。なお、キャピラリー電気泳動を用いた分離方法も、Ｐ／ＡＣＥシステム（商品名）（ベックマン・コールター社製）やＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００（商品名）（アプライドバイオシステムズ社製）といった高価な装置が必要なものの精密な分離が行なえる点で好ましい分離方法の一態様といえる。
【００２７】
前記（Ｃ）の核酸を検出する方法としては、前記（Ｃ）の核酸が予め標識されている場合は、標識した放射線同位元素、蛍光色素、または標識化合物を特異的に検出する装置を用いて検出すればよい。また、前記（Ｃ）の核酸が非標識核酸である場合は、前記分離操作前後に、エチジウムブロミドやＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（商品名）（タカラバイオ社製）などの蛍光色素によって前記（Ｃ）の核酸を染色させて検出すればよい。また、前記検出操作の際、濃度既知の核酸を標準物質として用いることにより、前記（Ｃ）の核酸を定量することができる。
【００２８】
前記（Ａ）及び（Ｂ）の核酸が非標識核酸で、ゲル電気泳動で分離された反応生成物をエチジウムブロミドなどの蛍光色素で染色する場合は、基質を０．１から１ｐｍｏｌ／μＬ程度の濃度に調整して反応させればよい。しかしながら、前記付近の濃度ではヘリカーゼ反応の一次生成物である一本鎖核酸が速やかに二本鎖に戻ってしまうため、見かけ上ほとんど反応が進行していないように観察されることがある。前記問題を回避するためには、前記（Ｂ）の核酸を前記（Ａ）の核酸に対して等モル以上、好ましくは５モル比以上添加するのが好ましい。そうすることで、ヘリカーゼの酵素反応により前記（Ａ）の核酸から生成される前記（Ａ−２）の一本鎖核酸は、再び前記（Ａ−１）と塩基対形成して前記（Ａ）の核酸に戻るよりも、前記（Ｂ）の核酸と塩基対形成して前記（Ｃ）の核酸になる確率が高くなる。前記（Ｃ）の核酸はヘリカーゼによる酵素反応に必要な配列（ヘリカーゼ認識配列）を有していないため、結果として前記（Ｃ）の核酸が蓄積しやすくなり、前記（Ｃ）の核酸検出も容易となる。
【００２９】
本発明におけるヘリカーゼの種類に特に限定はないが、本発明の好ましい実施形態は５’末端側あるいは３’末端側の一本鎖領域を反応開始に必要とするヘリカーゼを用いることである。前記ヘリカーゼは多数知られているが、中でも前述したコロナウイルス科に属するウイルスに由来するヘリカーゼは５’末端側に一本鎖核酸を必要とする群として、フラビウイルス科に属するウイルスに由来するヘリカーゼは３’末端側に一本鎖核酸を必要とする群として詳細に解析されているため、本発明の測定方法における対象ヘリカーゼとして好ましい。前者にはヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）が含まれ、本発明の方法はこれらのウイルスに対する薬剤の探索に好ましい。また、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）などはヒトに対する病原性はないが、実験動物や畜産動物の管理の観点で重要なウイルスであり、また前記ウイルスのゲノムはヒトコロナウイルス由来と類縁のヘリカーゼがコードされている（非特許文献７、８）ため、前記ヘリカーゼも本発明の好ましい適用例である。一方後者にはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）が含まれ、本発明の方法はこれらのウイルスに対する薬剤の探索にも好ましい。
【００３０】
ウイルス由来のヘリカーゼはウイルス粒子の構成成分ではなく、また一般にヘリカーゼの細胞内含量は極めてわずかであるため、天然に存在する酵素を集めるには多大な労力を要する。そこで一般的には遺伝子組換えの手法を用いて入手する。遺伝子組換え酵素は通常、
（１）酵素遺伝子の増幅、
（２）増幅した遺伝子のクローニングベクターへの組込み、
（３）宿主細胞の形質転換、
（４）形質転換細胞の培養、
（５）培養液または細胞からの酵素の精製、
といった手順で製造されるが、酵素の生産性を向上させる、及び／または精製を容易にする目的で、天然の酵素と部分的に異なったアミノ酸配列を持ったもの（変異体）、天然の酵素の一部のアミノ酸配列を欠失したもの（部分欠失体）、または他の機能性タンパク質やペプチドと融合したもの（融合体）として生産されることが多い。本発明のヘリカーゼの測定方法は、前記変異体、前記部分欠失体、前記融合体であっても、ヘリカーゼの酵素活性を有しており、かつ前記（Ａ−１）の核酸中のヘリカーゼ認識配列を認識可能であれば、本発明のヘリカーゼの測定方法を適用することができる。
【００３１】
なお、ウイルスの取り扱いにはヒトや動物への感染を防ぐ目的でしばしば格別な設備や操作上の注意を要することから、ウイルスやウイルス感染細胞を用いずに既にクローン化された遺伝子を利用してウイルス由来の酵素遺伝子を増幅することが好ましい。クローン化された遺伝子を入手できない場合には、塩基配列情報に基づいて酵素遺伝子を全合成することもできる。後者の具体的な方法は以下の実施例１で説明する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、ヘリカーゼ活性の測定を簡便かつ安価に行なうことができ、また、化学的に安定かつ安価なヘリカーゼ活性の測定試薬も提供することができる。また、前記測定方法及び測定試薬により、ヘリカーゼ活性を有する、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）といったウイルスに対する薬剤の探索を効率的に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヘリカーゼ活性の測定結果（実施例６）。
【図２】実施例６における反応の概念図。
【図３】ヘリカーゼ活性の測定結果（実施例７）。
【図４】ヘリカーゼ活性の測定結果（実施例８）。
【図５】ヘリカーゼ活性の測定結果（実施例９）。
【図６】実施例９における反応の概念図。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例及び参考例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）へリカーゼ遺伝子の合成
マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）へリカーゼ遺伝子を以下に示す方法で人工的に合成した。
（１）配列番号１及び１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各３０ｐｍｏｌ、配列番号２から１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各１．５ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（タカラバイオ社製）を含んだＰＣＲ反応溶液５０μＬを調製後、ＰＣＲ反応を行ない、６２３塩基対のＰＣＲ産物を得た。
（２）配列番号１３及び２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各３０ｐｍｏｌ、配列番号１４から２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各１．５ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（タカラバイオ社製）を含んだＰＣＲ反応溶液５０μＬを調製後、ＰＣＲ反応を行ない、６２４塩基対のＰＣＲ産物を得た。
（３）配列番号２５及び３６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各３０ｐｍｏｌ、配列番号２６から３５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各１．５ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（タカラバイオ社製）を含んだＰＣＲ反応溶液５０μＬを調製後、ＰＣＲ反応を行ない、６２３塩基対のＰＣＲ産物を得た。
（４）前記（１）から（３）で調製したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を用いて精製後、回収した各ＰＣＲ産物を各約１ｐｍｏｌ、配列番号１及び３６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを各３０ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（タカラバイオ社製）を含んだＰＣＲ反応溶液５０μＬを調製して、ＰＣＲ反応を行ない、１８３０塩基対のＰＣＲ産物を得た。
【００３６】
実施例２  ＭＨＶヘリカーゼ生産大腸菌の調製
実施例１で調製したＭＨＶヘリカーゼ遺伝子より、前記ヘリカーゼを発現する組換え大腸菌を調製した。
（１）実施例１で調製した１８３０塩基対のＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理することで断片の両端をそれぞれＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの付着末端とした後、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理した大腸菌発現プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ１３８７２）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
（２）前記連結したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（タカラバイオ社製）をヒートショック法で形質転換することにより組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＭ  ＨＶ＿ＨＥＬ３を得た。
（３）前記組換え大腸菌を培養し、菌体から抽出したプラスミドの塩基配列解析を行なった結果、設計した通りの配列が含まれていることを確認した。塩基配列解析の結果を翻訳産物のアミノ酸配列とともに配列番号３７に示す。
【００３７】
実施例３  ＭＨＶヘリカーゼ標品の調製
実施例２で調製した組換え大腸菌より、実施例で使用するＭＨＶヘリカーゼを調製した。
（１）実施例２で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＭＨＶ＿ＨＥＬ３を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む１Ｌの２×ＹＴ培地（組成：１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ、１０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７に調整）中３７℃で振とう培養後、ＯＤ６００が約１になった時点で０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに２２℃で１６時間培養を継続した。培養物は氷冷し、以降の操作は４℃冷却下で行なった。
（２）前記培養物を遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０分間）して培養上清を除いた。菌ペレットを９０ｍＬのＬｙｓｉｓ緩衝液（組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で懸濁した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分間）して上清を除き、菌ペレットをプロテアーゼインヒビターカクテル（商品名）（ロシュダイアグノスティックス社製）を含む６０ｍＬのＬｙｓｉｓ緩衝液（Ｌｙｓｉｓ緩衝液５０ｍＬに対して錠剤を１錠溶解）で再懸濁した。
（３）前記懸濁液を超音波破砕機にて菌を破砕し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）して上清を得た。上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を２５％飽和濃度になるように添加し３０分間静置後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）して上清を得た。得られた上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を４５％飽和濃度になるように添加し、３０分間静置してから遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）して上清を除き沈殿を得た。得られた沈殿を、前記のプロテアーゼインヒビターカクテルを含むＬｙｓｉｓ緩衝液５ｍＬに溶解し、Ｌｙｓｉｓ緩衝液２Ｌに対して４時間透析した。
（４）透析後のタンパク質溶液に３倍容量の緩衝液Ｉ（組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．６Ｍ  硫酸アンモニウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を加え、これを緩衝液Ｉで平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ｍＬ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、５０ｍＬの緩衝液を通液してカラムを洗浄した。次に５０ｍｌの緩衝液ＩＩ（組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．３Ｍ  硫酸アンモニウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を用いて同様にカラムを洗浄した。その後緩衝液ＩＩＩ（組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を通液して溶出されるタンパク質を０．５ｍＬずつ分画し、部分精製したＭＨＶヘリカーゼ標品を得た。
【００３８】
実施例４  ヘリカーゼ活性測定用核酸の調製（その１）
（１）一本鎖核酸（Ａ−１）として配列番号３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、一本鎖核酸（Ａ−２）として配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを設計した。
（２）表１に示す各組成の水溶液を調製し、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＣＥＴＵＳ社製）中で９５℃、２分間熱処理したのち、装置の熱源を止めて徐冷することによりアニーリングを行なった。
【００３９】
【表１】
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（３）アニーリング後、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により部分二本鎖ＤＮＡを分離後、ゲルからの電気溶出とエタノール沈殿によって精製することにより、配列番号３８及び３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドが塩基対形成した、５ｐｍｏｌ／μＬの部分二本鎖核酸（Ａ）水溶液（以降部分二本鎖ＤＮＡ−１と呼ぶ）４００μＬを得た。
【００４０】
実施例５  ヘリカーゼ活性測定用核酸の調製（その２）
（１）一本鎖核酸（Ａ−１）として配列番号４１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、一本鎖核酸（Ａ−２）として配列番号４２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを設計した。
（２）表２に示す各組成の水溶液を調製し、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＣＥＴＵＳ社製）中で９５℃、２分間熱処理したのち、装置の熱源を止めて徐冷することによりアニーリングを行なった。
【００４１】
【表２】
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（３）アニーリング後、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により部分二本鎖ＤＮＡを分離後、ゲルからの電気溶出とエタノール沈殿によって精製することにより、配列番号４１及び４２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドが塩基対形成した、５ｐｍｏｌ／μＬの部分二本鎖核酸（Ａ）水溶液（以降部分二本鎖ＤＮＡ−２と呼ぶ）を４００μＬ得た。
【００４２】
実施例６  ヘリカーゼ活性の測定（その１）
実施例３で得られた各画分のヘリカーゼ活性を以下の方法により測定した。
（１）表３に示す組成の反応液を調製し、３０℃、３０分間反応した。なお、一本鎖核酸（Ｂ）として、配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを設計し、使用している。
【００４３】
【表３】
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（２）反応後、反応停止溶液（組成：１％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１０μＬ添加し、うち１０μＬを１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００４４】
電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色した結果を図１に示す。図１において、各レーンにおけるＦ番号は実施例３で取得した各画分を酵素溶液として用いたときの結果を、Ｎは酵素溶液の代わりに水を添加したときの結果を、Ｍは分子量マーカーをそれぞれ表す。また、（Ａ）は実施例４で得られた部分二本鎖ＤＮＡ−１を、（Ｂ）は配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、（Ｃ）はヘリカーゼによる酵素反応で得られた配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドとが塩基対形成した部分二本鎖核酸に相当するバンドをそれぞれ表す。なお、本実施例における反応の概念図を図２に示す（ここで（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は図１と同じ核酸を表す）。図１より、各画分にヘリカーゼ活性が認められ、特に画分５から７の酵素活性が高いことが判明した。
【００４５】
実施例７  ヘリカーゼ活性の測定（その２）
（１）実施例３における画分６（図１のＦ６）を酵素溶液として用い、表３に示す組成の反応液を調製し、３０℃で０分・５分間・１０分間・２０分間・３０分間・４０分間・６０分間それぞれ反応した。
（２）反応後、反応停止溶液（組成：１％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１０μＬ添加し、うち１０μＬを１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００４６】
電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色した結果を図３に示す。図３において各レーンにおける数字は酵素溶液と反応させた時間（分）を、Ｍは分子量マーカーを、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は図１と同じ核酸バンドをそれぞれ示す。経時的に反応生成物が増加していたことから、今回取得したヘリカーゼによる酵素反応が少なくとも反応開始６０分後まで持続していることが判明した。
【００４７】
実施例８  ヘリカーゼ活性の測定（その３）
（１）実施例３における画分７（図１のＦ７）を酵素溶液として用い、表３に示す組成のうち、配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドの代わりにＨ２Ｏを加えた組成からなる反応液を調製後、３０℃、３０分間反応させた。
（２）反応後、反応停止溶液（組成：１％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１０μＬ添加し、うち１０μＬを配列番号３８及び３９のオリゴヌクレオチドとともに１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００４８】
電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色した結果を図４に示す。図４においてＭは分子量マーカーを、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は図１と同じ核酸バンドをそれぞれ示す。配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（一本鎖核酸（Ｂ））が反応液中にない場合（図４のレーン２）は、酵素反応によって生じた一本鎖核酸（Ａ−１）及び（Ａ−２）（配列番号３８及び３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）が速やかに部分二本鎖核酸（Ａ）を形成するため、酵素活性の検出が極めて困難であることがわかる。
【００４９】
実施例９  ヘリカーゼ活性の測定（その４）
（１）実施例３に示した画分６（図１のＦ６）を酵素溶液として用い、表４に示す組成の反応液を調製して３０℃で０分・１０分間・２０分間・３０分間・６０分間それぞれ反応した。なお、一本鎖核酸（Ｂ）として、配列番号４３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを設計し、使用している。
【００５０】
【表４】
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（２）反応後、反応停止溶液（組成：１％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１０μＬ添加し、うち１０μＬを１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００５１】
電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色した結果を図５に示す。図５において各レーンにおける数字は酵素溶液と反応させた時間（分）を、Ｍは分子量マーカーを表す。また、（Ａ）は実施例５で得られた部分二本鎖ＤＮＡ−２を、（Ｂ）は配列番号４３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、（Ｃ）はヘリカーゼによる酵素反応で得られた配列番号４２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドとが塩基対形成した二本鎖核酸に相当するバンドをそれぞれ表す。なお、本実施例における反応の概念図を図６に示す（ここで（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は図５と同じ核酸を表す）。図５より、異なる配列及び長さを有した核酸を用いてもヘリカーゼの活性測定が可能であることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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