(57)【要約】【課題】焼却処分されて環境に悪影響を及ぼしているオカラを原料として積極的に使用することにより環境を保護しつつ、人体に有益なプロチン酵素を製造する方法を提供する。【解決手段】オカラを発酵させてなる発酵オカラと大豆を蒸してペースト状にしてなるペースト状大豆とを混合攪拌し、これにシジミ貝のエキス汁を加えて攪拌し、これに好アルカリ性のバチルス属タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群を混入し、更にこれを６０〜８０℃の温度にて４８時間以上発酵させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オカラを発酵させてなる発酵オカラと大豆を蒸してペースト状にしてなるペースト状大豆とを混合攪拌し、これにシジミ貝のエキス汁を加えて攪拌し、
これに好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群を混入し、
更にこれを６０〜８０℃の温度にて４８時間以上発酵させることを特徴とする、プロチン酵素の製造方法。
【請求項２】
オカラを発酵させてなる発酵オカラ５０〜６０重量部と大豆を蒸してペースト状にしてなるペースト状大豆４０〜５０重量部とを混合攪拌し、これにシジミ貝のエキス汁５〜６重量部を加えて攪拌し、
これに好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群３重量部以上を混入し、
更にこれを６０〜８０℃の温度にて４８時間以上発酵させることを特徴とする、プロチン酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロチン酵素の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に「ピロリ菌」と呼ばれているヘリコバクターピロリ菌は、人の胃の中という特殊な環境で生息し、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の原因になることが近年明らかになっている。
【０００３】
プロチン酵素は、このようなヘリコバクターピロリ菌を抑制し、人の健康を回復させるものであると考えられている。
【０００４】
本発明は、オカラを原料としてプロチン酵素を製造する方法に関するものであるが、このようなプロチン酵素の製造方法は従来知られていない。
【０００５】
本発明者は、特開２００７−３００８８２号公報において、オカラの加工品の製造方法を提供している。
【０００６】
このオカラの加工品の製造方法は、含水率８０〜９０％の生オカラと水分調整材としての米ヌカ又は麦フスマとを、該生オカラと水分調整材との全体の含水率が５０〜６０％になるように、合計１０００重量部発酵槽内に投入し、該発酵槽内に好気性菌群と嫌気性菌群とよりなる有効微生物群１重量部を投入し、該発酵槽内の温度を６０〜８０℃に加温すると共に該発酵槽内に空気を送入しつつ２０〜２８時間攪拌発酵させることによりオカラの加工品を製造するようにしたことを特徴とするものである。
【特許文献１】特開２００７−３００８８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
大豆食品加工工場、特に豆腐製造加工工場、から排出される豆腐のカスであるオカラは、一部が飼料ないし食品の原料として使用されているものの、大部分が焼却処分されている。オカラの焼却処分は、環境に悪影響を及ぼす。
【０００８】
本発明は、焼却処分されて環境に悪影響を及ぼしているオカラを原料として積極的に使用することにより環境を保護しつつ、人体に有益なプロチン酵素を製造するプロチン酵素の製造方法を提供しようとしてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、下記のプロチン酵素の製造方法を提供するものである。
【００１０】
（１）オカラを発酵させてなる発酵オカラと大豆を蒸してペースト状にしてなるペースト状大豆とを混合攪拌し、これにシジミ貝のエキス汁を加えて攪拌し、
これに好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群を混入し、
更にこれを６０〜８０℃の温度にて４８時間以上発酵させることを特徴とする、プロチン酵素の製造方法（請求項１）。
【００１１】
（２）前記発酵オカラ５０〜６０重量部と前記ペースト状大豆４０〜５０重量部とを混合攪拌し、これに前記シジミ貝のエキス汁５〜６重量部を加えて攪拌し、これに前記有効微生物群３重量部以上を混合する（請求項２）。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、焼却処分されて環境に悪影響を及ぼしているオカラを原料として積極的に使用することにより環境を保護しつつ、人体に有益なプロチン酵素を製造することができる。
【００１３】
６０〜８０℃の温度にて４８時間以上発酵させるため、得られるプロチン酵素には大腸菌群、サルモネラ、黄色ブドウ球菌等の食中毒菌類は検出されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においては、オカラを発酵させてなる発酵オカラと大豆を蒸してペースト状にしてなるペースト状大豆とを主原料とする。
【００１５】
発酵オカラは、一例として、含水率８０〜９０％の生オカラと水分調整材としての米ヌカ又は麦フスマとを、該生オカラと水分調整材との全体の含水率が５０〜６０％になるように、合計１０００重量部発酵槽内に投入し、該発酵槽内に好気性菌群と嫌気性菌群とよりなる有効微生物群１重量部を投入し、該発酵槽内の温度を６０〜８０℃に加温すると共に該発酵槽内に空気を送入しつつ２０〜２８時間攪拌発酵させることにより製造する。
【００１６】
この事例における有効微生物群は、好気性菌群５５％と嫌気性菌群４５％とよりなり、次のものが含まれる。
酵母菌、セルロース分解菌、窒素固定菌、乳酸菌、糸状菌（芳香族化合物分解菌）、マンガン還元菌（クロカビ属群−原生担子菌類）、マンガン酸化菌（有機栄養菌）、アンモニア酸化菌（亜硝酸菌）、放線菌（キチン分解菌）、硝酸菌（硝化生成細菌）、硫黄細菌（硫化水素を水素供与体として利用する細菌群）、メタン酸化菌、セルロース放線菌、セルロース糸状菌、納豆菌、リグニン分解菌、鉄酸化菌、鉄還元菌、硫酸還元菌、酢酸菌、バチルス属（Bacillus sp.）、スポロサルシナ属（Sporosarcina sp.）、ペニバチルス属（Paenibacillus sp.）、オーシャノバチルス属（Oceanobacillus sp.）。
【００１７】
前記ペースト状大豆は、好ましくは、有機肥料を用いて栽培してなるものとする。
【００１８】
すなわち、発酵オカラ（好ましくは５０〜６０重量部）とペースト状大豆（好ましくは４０〜５０重量部）とを混合攪拌し、これにシジミ貝のエキス汁（好ましくは５〜６重量部）を加えて攪拌する。
【００１９】
これに好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群（好ましくは３重量部以上）を混入する。
【００２０】
更にこれを６０〜８０℃の温度にて４８時間以上発酵させることによりプロチン酵素を得る。
【００２１】
発酵オカラとペースト状大豆とは植物性蛋白質を有し、シジミ貝のエキス汁は動物性蛋白質を有する。
【００２２】
これらの蛋白質は、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群により元素転換され、アミノ酸を経てプロチン酵素となる。
【００２３】
人がプロチン酵素を摂取したときには、プロチン酵素は、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の原因になるヘリコバクターピロリ菌を抑制し、胃腸内の環境を改善する。
【００２４】
プロチン酵素は、人の体内でビフィズス菌、乳酸菌類、酵母菌類等の善玉菌を作り出し、大腸菌、ウエルッシュ菌類等の悪玉菌を減少させ、腐敗ガスの発生を防ぐ。
【００２５】
嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝（ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０）と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣（ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１）と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２）と、好塩性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ浄土（ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３）と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王（ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４）は、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２６】
好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ薬師と、好塩性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ浄土と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王とについて、同定を実施した。以下、同定方法及び微生物試験結果を示す。
【００２７】
細菌第一段階試験として、光学顕微鏡U-LH１,０００（オリンパス，日本）により、細胞形態、グラム染色性、胞子の有無及び鞭毛による運動性の有無を観察した。NUTRIENT AGAR （OXOID, HAMPSHIRE, ENGLAND）（以下「NT」という。）又はGAM寒天培地（ニッスイ, 東京）（以下「GAM」という。）でのコロニー形態を観察した。カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、グルコースからの酸／ガス産生及びブドウ糖の酸化／発酵（O／F）について試験を行った。
菌学的性状試験結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
次に１６S rDNA塩基配列の遺伝子解析を実施した。ゲノムDNAの抽出には、INSTAGENE MATRIX（BIO RAD, CA, USA）を使用した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、PCRにより全塩基配列約１,５００〜１,６００塩基対の領域を増幅した。その後、増幅された１６S rDNAをシーケンスし、塩基配列を得た。PCR産物の精製、サイクルシークエンスにはBIGDYE TERMINATOR V３.１ CYCLE SEQUENCING KIT（APPLIED BIOSYSTEMS, CA, U.S.A.）を使用した。サーマルサイクラーにはPRIMESTAR HS DNA POLYMERASE（タカラバイオ, 滋賀）、DNAシーケンサーにはABI PRISM ３１００ GENETIC ANALYZER SYSTEM（APPLIED BIOSYSTEMS,
CA, U.S.A.）を使用した。なおプライマーは、文献「放線菌の同定と分類, p８８-１１７, 日本学会事務センター, ２００１.」に従った。
【００３０】
１６S rDNAの塩基配列の解析結果を、バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣については表２に、バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師については表３に、バチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土については表４に、アトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝については表５に、クロストリディウム属（Clostridium
sp.）タテヤマ竜王については表６に、それぞれ示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
2010068759.tif 000005
【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
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【００３５】
【表６】
2010068759.tif 000008
【００３６】
上記塩基配列をアポロンDB細菌基準株データベース（テクノスルガ, 静岡） を用いて相同性検索を行い、得られた１６S rDNAの塩基配列から検体と近縁と考えられる種の相同性検索を行い、上位５株を決定した。
相同性検索結果を、バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣については表７に、バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師については表８に、バチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土については表９に、アトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝については表１０に、クロストリディウム属（Clostridium
sp.）タテヤマ竜王については表１１に、それぞれ示す。
【００３７】
【表７】
2010068759.tif 000009
【００３８】
【表８】
2010068759.tif 000010
【００３９】
【表９】
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【００４０】
【表１０】
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【００４１】
【表１１】
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【００４２】
これまで得られた情報をもとにCLUSTAL WとMEGA VER３.１を用いて、１６S rDNA塩基配列とこれに近縁と考えられる菌群の１６S rDNA塩基配列とを用いて分子系統樹を構築した。分子系統樹の推定には近隣結合法を用い、樹型の妥当性を示すブートストラップは１０００回発生させた。
なお、CLUSTAL Wは文献「Nucleic Acids Research, １９９４, ２２:４６７３-４６８０.」、MEGAは文献「Briefings
in Bioinformatics, ２００４, ５, １５０-１６３.」に従った。
分子系統解析結果を、バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣とバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師とについては図１に、バチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土については図２に、アトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝については図３に、クロストリディウム属（Clostridium
sp.）については図４に、それぞれ示す。
【実施例】
【００４３】
オカラを発酵させてなる発酵オカラ５ｋｇと大豆を蒸してペースト状にしてなるペースト状大豆５ｋｇとを混合攪拌し、これにシジミ貝のエキス汁０．５ｋｇを加えて攪拌し、これに好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９１と、好アルカリ性のバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９２と、好塩性のバチルス属（Bacillus
sp.）タテヤマ浄土ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９３と、嫌気性菌のアトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９０と、嫌気性かつ好塩性のクロストリディウム属（Clostridium sp.）タテヤマ竜王ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６９４とよりなる有効微生物群０．３ｋｇを混入し、  更にこれを６０〜８０℃の温度にて４８時間発酵させてプロチン酵素を得た。
【００４４】
この実施例により得られたプロチン酵素は、人が摂取するに適した安全なものであった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ剣とバチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ薬師の分子系統樹である。
【図２】バチルス属（Bacillus sp.）タテヤマ浄土の分子系統樹である。
【図３】アトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝の分子系統樹である。
【図４】アトポスティペス属（Atopostipes sp.）タテヤマ女汝の分子系統樹である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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