(57)【要約】【課題】ＨＩＶ膜融合のインヒビターを提供すること。【解決手段】少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列ＷＸＷＬ〔式中、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸは任意の残基（moiety）を表す〕を含んでなり、可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合するＤ−ペプチドであって、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドは、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの部分とを含み、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドが、疎水性ポケットが空であり、リガンドによる結合が可能となるように疎水性ポケットを提示する、Ｄ−ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列ＷＸＷＬ〔式中、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸは任意の残基（moiety）を表す〕を含んでなり、可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合するＤ−ペプチドであって、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドは、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの部分とを含み、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドが、疎水性ポケットが空であり、リガンドによる結合が可能となるように疎水性ポケットを提示する、Ｄ−ペプチド。
【請求項２】
ＸがＤ−アミノ酸残基または修飾Ｄ−アミノ酸残基である請求項１記載のＤ−ペプチド。
【請求項３】
４〜２１個のアミノ酸残基を含んでなる請求項１または２記載のＤ−ペプチド。
【請求項４】
ＥＷＸＷＬ（式中、ＥはＤ−グルタミン酸を表し、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸはアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基を表す）である少なくとも５個のアミノ酸残基を含んでなり、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合する請求項１記載のＤ−ペプチド。
【請求項５】
2010180217.tif 000033
2010180217.tif 000034
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる請求項１または請求項４記載のＤ−ペプチド。
【請求項６】
粘膜細胞へのＨＩＶの侵入の妨害方法に使用される医薬の製造のための、請求項１〜５いずれか１つに記載のＤ−ペプチドおよび担体または基剤を含んでなる薬物の使用。
【請求項７】
担体または基剤が、フォーム、ゲル、薬物を保持するのに充分に粘性のその他の物質、水および緩衝液からなる群より選ばれるものである請求項６記載の使用。
【請求項８】
担体または基剤が膣坐剤または直腸坐剤である請求項６または請求項７記載の使用。
【請求項９】
ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された直後または投与もしくは適用された後すぐに、該ペプチドが担体または基剤から放出される、請求項６〜８いずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された後に徐々に、または投与もしくは適用された後の所定の期間の後に、該ペプチドが担体または基剤から放出される、請求項６〜８いずれか１つに記載の使用。
【請求項１１】
薬物を、使用の条件下に該薬物の放出が可能となるような様式で避妊具の表面上に存在させるか、または避妊具内に組み込む、請求項６記載の使用。
【請求項１２】
薬物がｇｐ４１の立体配座変化を防ぎまたは減少させ、それにより、粘膜表面の細胞へのＨＩＶの侵入を妨げる、請求項６〜１１いずれか１つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ膜融合のインヒビターに関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、１９９７年４月１７日に提出された、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質由来のｇｐ４１のコア構造と題するデービッド  シー．チャン（Ｄａｖｉｄ  Ｃ．Ｃｈａｎ）、デボラ  ファス（Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｆａｓｓ）、ミン  ルー（Ｍｉｎ  Ｌｕ）、ジェイムス  エム．バーガー（Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ）およびペーター  エス．キム（Ｐｅｔｅｒ  Ｓ．Ｋｉｍ）による米国仮出願第６０／０４３，２８０号および１９９８年４月１７日に提出された、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質由来のｇｐ４１のコア構造と題するデービッド  シー．チャン、デボラ  ファス、ミン  ルー、ジェイムス  エム．バーガーおよびペーター  エス．キムによる米国出願第０９／０６２，２４１号に関する。本出願は、１９９８年７月３０日に提出された、ＨＩＶ膜融合のインヒビターと題するデービッド  シー．チャン、デブラ  エム．アーゴット（Ｄｅｂｒａ  Ｍ．Ｅｈｒｇｏｔｔ）およびペーター  エス．キムによる米国仮出願第６０／０９４，６７６号；１９９８年９月１４日に提出された、ＨＩＶ膜融合のインヒビターと題するデービッド  シー．チャン、デブラ  エム．アーゴットおよびペーター  エス．キムによる米国仮出願第６０／１００，２６５号および１９９８年９月１８日に提出された、ＨＩＶ膜融合のインヒビターと題するデービッド  シー．チャン、デブラ  エム．アーゴットおよびペーター  エス．キムによる米国仮出願第６０／１０１，０５８号；ならびに１９９９年５月３日に提出された、デブラ  エム．アーゴット、デービッド  シー．チャン、ブラジミール  マラシュケヴィッチ（Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ）およびペーター  エス．キムによる米国仮出願第６０／１３２，２９５号の利益を主張するものである。これらの参照された出願の全ての教示は、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所交付番号Ｐ０１  ＧＭ５６５５２により、全部または一部支援された。米国政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）由来のタンパク質の構造研究は、抗レトロウイルス薬物の開発に必須であった。構造に基づく創薬は、臨床用途におけるＨＩＶ−１薬物の２つのクラスである逆転写酵素インヒビターとプロテアーゼインヒビターに関して、最も熱心であった。ＨＩＶ侵入に対して、構造に基づく創薬を行ないうることも有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＩＶ膜融合のインヒビターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列ＷＸＷＬ〔式中、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸは任意の残基（moiety）を表す〕を含んでなり、可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合するＤ−ペプチドであって、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドは、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの部分とを含み、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドが、疎水性ポケットが空であり、リガンドによる結合が可能となるように疎水性ポケットを提示する、Ｄ−ペプチド、
〔２〕ＸがＤ−アミノ酸残基または修飾Ｄ−アミノ酸残基である〔１〕記載のＤ−ペプチド、
〔３〕４〜２１個のアミノ酸残基を含んでなる〔１〕または〔２〕記載のＤ−ペプチド、
〔４〕ＥＷＸＷＬ（式中、ＥはＤ−グルタミン酸を表し、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸはアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基を表す）である少なくとも５個のアミノ酸残基を含んでなり、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合する〔１〕記載のＤ−ペプチド、
〔５〕
2010180217.tif 000002
2010180217.tif 000003
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる〔１〕または〔４〕記載のＤ−ペプチド、
〔６〕粘膜細胞へのＨＩＶの侵入の妨害方法に使用される医薬の製造のための、〔１〕〜〔５〕いずれか１つに記載のＤ−ペプチドおよび担体または基剤を含んでなる薬物の使用、
〔７〕担体または基剤が、フォーム、ゲル、薬物を保持するのに充分に粘性のその他の物質、水および緩衝液からなる群より選ばれるものである〔６〕記載の使用、
〔８〕担体または基剤が膣坐剤または直腸坐剤である〔６〕または〔７〕記載の使用、
〔９〕ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された直後または投与もしくは適用された後すぐに、該ペプチドが担体または基剤から放出される、〔６〕〜〔８〕いずれか１つに記載の使用、
〔１０〕ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された後に徐々に、または投与もしくは適用された後の所定の期間の後に、該ペプチドが担体または基剤から放出される、〔６〕〜〔８〕いずれか１つに記載の使用、
〔１１〕薬物を、使用の条件下に該薬物の放出が可能となるような様式で避妊具の表面上に存在させるか、または避妊具内に組み込む、〔６〕記載の使用、
〔１２〕薬物がｇｐ４１の立体配座変化を防ぎまたは減少させ、それにより、粘膜表面の細胞へのＨＩＶの侵入を妨げる、〔６〕〜〔１１〕いずれか１つに記載の使用
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＨＩＶ膜融合のインヒビターが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、４，３疎水性ヘプタドリピート（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔｓ）（標識されたヘプタドリピート１およびヘプタドリピート２、それぞれＮ−ぺプチド領域およびＣ−ぺプチド領域ともいう）を含む２つの領域内に位置する、Ｎ３６（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ）（配列番号：１３）およびＣ３４（ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ）（配列番号：１４）のぺプチドを示すＨＩＶ−１  ｇｐ４１の概略図である。Ｃ３４における下線部の残基は、本研究において変異させた。これらの残基のうち３個（Ｗ、ＷおよびＩ）は、Ｎ３６くぼみ内に突出するが、これらの残基のうちの２個（ＭおよびＲ）は突出しない。ＦＰは融合ぺプチド；Ｓ−Ｓはジスルフィド結合；ＴＭは膜貫通領域；ＩＮＴＲＡはウイルス内領域。
【図２】図２は、Ｃ３４阻害能力とＮ３６／Ｃ３４安定性との相関を示すグラフである。Ｔｒｐ631 位における置換を有するＣ３４ぺプチドバリアントを、ウイルス侵入（黒丸）および細胞−細胞融合（白丸）の阻害について試験した。対応するＮ３６／Ｃ３４複合体のTm（融解温度）に対してＩＣ50値を対数スケールでプロットする。置換の態様（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）と化学構造を、対応するデータ点の下に示す。疎水性のかさ高さが増加する順では、置換は：グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、野生型残基トリプトファン（Ｔｒｐ）、およびＬ−β−（１−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ）であった。エラーバーは、３回の実験の標準誤差を示す。
【図３】図３は、Ｄ−ぺプチドのアミノ酸配列（配列番号：３４、３８、１５、３５、１６、１７、３６、４０、４１、１８および１９）ならびにコンセンサス配列（配列番号：１２）を示す。図示のように、各ぺプチドは、Ｎ−末端でＧＡにより、Ｃ−末端でＡＡによりフランキングされており、Ｎ−末端にブロッキング基：（アセチル−ＧＡ−Ｃ−十量体−Ｃ−ＡＡ−ＣＯＮＨ2 ；これはａｃ−ＧＡ−Ｃ−十量体−Ｃ−ＡＡ−ａｍと表すこともできる）を有する。アミノ酸残基を表すために使用する１文字記号は、以下の通りである：Ｇ＝グリシン；Ａ＝アラニン；Ｃ＝システイン；Ｄ＝アスパラギン酸；Ｌ＝ロイシン；Ｋ＝リジン；Ｅ＝グルタミン酸；Ｗ＝トリプトファン；Ｆ＝フェニルアラニン；Ｒ＝アルギニン；Ｈ＝ヒスチジン；Ｓ＝セリン；およびＱ＝グルタミン。
【図４】図４は、Ｄ−ＩＱＮ１７標的による鏡像ファージのディスプレイの概略図である。ここで、（１）ファージ選択のラウンドは、Ｄ−ＩＱＮ１７へのバインダー（ｂｉｎｄｅｒｓ）を同定するために行われる；（２）個々のクローンを配列決定する；（３）結合特異性を、ファージがＤ−ＩＱＮ１７のｇｐ４１領域に結合するか否かを調べることにより評価する；（４）結合するファージ配列であるＤ−ぺプチドを作製する；および（５）Ｄ−ぺプチドの抗ＨＩＶ活性をアッセイする。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｄ１０ｐｅｐ１に結合したＩＱＮ１７の結晶構造を示す。ＩＱＮ１７は、連続的な三本鎖コイルであることを示し、Ｄ１０ｐｅｐ１の保存アミノ酸残基の結合は、ＨＩＶ  ｇｐ４１由来の１７残基により形成される、ＩＱＮ１７の疎水性ポケットに対して存在することを示す。図５Ａは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１残基に融合したＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ残基からなるＩＱＮ１７、およびＩＱＮ１７の疎水性ポケット（囲まれた領域内）へのＤ１０ｐｅｐ１の結合を示す。該ポケットに結合するＤ−ぺプチドは、枝分かれした伸長部により表わされる（すなわち、棒状に示した部分）。図５Ｂは、囲まれた領域の拡大であり、ポケット内に詰められた保存残基（Ｔｒｐ、Ｔｒｐ  Ｌｅｕ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、本明細書に記載のＤ−ぺプチドを用いたシンシチウムアッセイの結果を示す。図６Ａはシンシチウムアッセイの結果のグラフである。図６Ｂは、１回またはそれ以上の実験の結果を伴うＤ−ぺプチドのＩＣ50データを表わす。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−３】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−４】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−５】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−６】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−７】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−８】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−９】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−１０】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−１１】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−１２】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−１３】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図７−１４】図７Ａ〜７Ｎは、ＩＱＮ１７に結合したＤ１０ｐｅｐ１の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、Ａ鎖の０〜２８残基はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ鎖の２９〜４５残基はＨＩＶ  ｇｐ４１配列に由来し、Ｄ鎖の０〜１６残基はＤ−ぺプチドを表し、整列した（ｏｒｄｅｒｅｄ）水分子をＷで表し、結合した塩化物イオンはＩ鎖で表す。残基０はアセチル基を表す。ＰＤＢファイルは一量体を表わし；三量体は結晶学的対称により形成される。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、Ｄ−ぺプチドによるＨＩＶ−１膜融合の阻害の評価の結果を示す。図８ＡはＤ−ぺプチドを用いないシンシチウムアッセイの結果を示す。図８ＢはＤ−ぺプチドを用いるシンシチウムアッセイの結果を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＩＱＮ１７／Ｄ−ぺプチド複合体の芳香族残基を特性付けする1 Ｈ  ＮＭＲ実験の結果を示す。図９Ａは、Ｄ１０ｐｅｐ１ａ（上）、ＩＱＮ１７（中央）およびＤ１０ｐｅｐ１ａとＩＱＮ１７の１：１複合体（下）の１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを示す。ｘ軸は下の（Ｃ）と同じである。Ｔｒｐ−５７１の４個のスカラー結合（ｓｃａｌａｒ−ｃｏｕｐｌｅｄ）芳香環プロトンに割り当てられた高磁場側ピークを示す。下部痕跡のマークしていない（ｕｎｍａｒｋｅｄ）高磁場側ピークは、割り当てられていないＨα共鳴に対応する。図９Ｂは、ＩＱＮ１７と（標識された）各Ｄ−ぺプチドとの１：１複合体の１Ｄスペクトルを示す。同じ４個のプロトンがいくつかのスペクトルにより示されている。図９Ｃは、ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１ａ複合体の２Ｄ−ＮＭＲ  ＴＯＣＳＹスペクトルを示す。これらの４個のトリプトファンプロトンに関連する交差ピーク（ｃｒｏｓｓ−ｐｅａｋ）を、特定の割当（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）とともに示す。ＴＯＣＳＹ混合時間は４２ｍｓであった。
【図１０】図１０は、Ｘ線結晶学により測定した、ＩＱＮ１７との複合体における場合のＤ１０ｐｅｐ１ぺプチドの立体配座を示す。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−３】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−４】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−５】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−６】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−７】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−８】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−９】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１０】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１１】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１２】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１３】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１４】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１５】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１６】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１７】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１８】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−１９】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−２０】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−２１】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【図１１−２２】図１１Ａ〜１１Ｖは、ＩＱＮ１７の結晶構造の原子座標を列挙するＰＤＢファイルであり、ここで、ＩＱＮ１７三量体のＡ、ＢおよびＣ鎖の残基０〜２８はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列（３個の変異を有する）に由来し、Ａ、ＢおよびＣ鎖の残基２９〜４５はＨＩＶ  ｇｐ４１に由来し、整列した水分子をＷで表わし、結合した塩化物イオンをＩ鎖で表す。ＰＤＢファイルは結晶学的に非対称な単位で三量体全体を表わす。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の要旨
本明細書に記載のように、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ４１サブユニット（例えば、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ４１−サブユニット）のＮ−ヘリックスコイルドコイルの表面のくぼみ（ｃａｖｉｔｙ）は、該コイルドコイル表面、とりわけ、くぼみを結合することにより、細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する薬物または他の薬剤の標的である。これは、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２など）の細胞への侵入を阻害する薬物または薬剤を同定およびデザインするための基礎として有用である。
【００１０】
本明細書に記載された結果は、ｇｐ４１コアにおける前記コイルドコイルくぼみ（疎水性ポケットともいう）は、魅力的な薬物標的であり、かつ当該くぼみを結合する分子がＨＩＶ感染性（細胞へのＨＩＶ侵入）を妨害（阻害）することを示す。出願人は、まず、疎水性ポケットに突出する保存残基が、明らかにＣ３４のＨＩＶ−１感染を阻害する能力において主要な役割を果たすことを示した。ｇｐ４１機能に対するくぼみ接近（ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみとＣペプチド領域の残基との間）の重要性は、明らかである。逆に、ｇｐ４１機能の阻害において、かかるくぼみ接近を妨げ、したがって細胞へのＨＩＶ−１侵入を阻害することの重要性も、明らかである。また、ｇｐ４１の中央−コイルドコイルの疎水性ポケットに対する薬物を指向することは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の最も高く保存された領域の１つを標的とするものであり、このことは、コイルドコイル表面、および特にその疎水性ポケットを標的とする薬剤が多岐にわたるＨＩＶ単離物に対する広範な活性を有するであろうことならびに薬剤回避変異体が現れるのが困難であろうことを意味する。
【００１１】
鏡像ファージディスプレイ技術〔ティー．エヌ．シューマッハー（Ｔ．Ｎ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１８５４（１９９６）〕、コンビナトリアルケミストリー〔エー．ボーシャート（Ａ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ），エス．ディー．リバールス（Ｓ．Ｄ．Ｌｉｂｅｒｌｅｓ），エス・アール．ビッガー（Ｓ．Ｒ．Ｂｉｇｇｅｒ），ジー．アール．クラブトゥリー（Ｇ．Ｒ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ），エス．エル．シュレイバー（Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ），Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：９６１（１９９７）；ジェイ．シー．シャバラ（Ｊ．Ｃ．Ｃｈａｂａｌａ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６：６３２（１９９５）〕、合理的な薬物デザインおよび他の薬物スクリーニングならびに医薬化学法などの種々の方法を用いて、ＨＩＶ−１感染を阻害するに十分な親和性によりコイルドコイルくぼみを結合するＤ−ペプチド、ペプチド擬似物および小分子を同定しうる。本明細書に記載のＮ３６／Ｃ３４安定性とＣ３４の効力との間の近密な関係は、かかる化合物の有効性がそれらのくぼみ接近の強度に決定的に依存するであろうことを示唆する。本明細書に記載のように、候補化合物は、Ｃ３４とＮ３６との間の安定な複合体の形成を妨げるそれらの能力または２者の結合を破壊する（複合体を破壊する）能力について調べられ、それにより、ＨＩＶ−１侵入の強力なインヒビターを同定および評価するための迅速な定量的スクリーニングを提供しうる。
【００１２】
一方、スクリーニングを行ない、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの結合を妨げるかあるいは破壊する分子または化合物およびくぼみを結合するペプチドを同定することができ、そうして、「ポケット特異的」結合薬剤または薬物である分子を同定する方法を提供する。本明細書に記載された分子および化合物（薬物または薬剤ともいう）は、ｇｐ４１を不活性化し、そうして細胞へのＨＩＶ−１侵入を防ぎまたは減少（阻害）するのに有用である。理論的に結合されることが期待されない場合、これらのインヒビターがｇｐ４１のプレ−ヘアピン中間体に結合し、かつｇｐ４１の融合活性化段階に対応するｇｐ４１コアの３量体ヘアピン構造へのその変換を防ぐことを提案するのが道理にあう。〔チャン，ディー．シー（Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．）およびピー．エス．キム（Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ）、Ｃｅｌｌ，９３：６８１（１９９８）、図１を参照のこと〕。したがって、本方法は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１エンベロープタンパク質の融合活性化状態の形成を（全体的にまたは部分的に）阻害する薬物または薬剤を同定するのに有用である。本方法において、小分子（例えば、小有機分子）、ペプチド（Ｄ−ペプチドまたはＬ−ペプチド）、ペプチド擬似物、タンパク質または抗体などのいかなるタイプの化合物または分子でありうる候補インヒビター（候補薬物ともいう）のｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合し、安定な複合体を形成する能力を評価する。さらに、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルに結合する化合物または分子を、代表的な方法が、本明細書に記載され、参照されるＨＩＶ−１感染（ウイルス侵入）およびシンシチウム（syncytium ）アッセイを介するなど、ｇｐ４１機能を阻害する（膜融合を阻害する）それらの能力について評価する。かかるアッセイを介してｇｐ４１機能を阻害することが示されるこれらの薬剤を、さらに付加的なイン・ビトロアッセイおよび適切な動物モデルにおいて、それらの活性を評価しうる〔例えば、レトビン，エヌ．エル．（Ｌｅｔｖｉｎ，Ｎ．Ｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，（５３７１）：１８７５−１８８０（１９９８），ハーシュ，ブイ．エム．（Ｈｉｒｓｃｈ，Ｖ．Ｍ．）およびピー．アール．ジョンソン（Ｐ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ），Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（２）：１８３−２０３（１９９４）；レイマン，ケー．エー．（Ｒｅｉｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．）ら，Ｊ．Ｖｉｖｏｌ．，７０（１０）：６９２２−６９２８（１９９６）〕。いかなる適切なアプローチをも用いて、候補インヒビターのＮ−ヘリックスコイルドコイルへの結合と、本明細書に記載された研究の結果、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへの結合とを評価することができる。１つの態様において、候補インヒビターの合成ペプチドＮ３６〔ルー，エム（Ｌｕ，Ｍ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．１５：４６５（１９９７），チャン．ディー．シー．（Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．）ら，Ｃｅｌｌ，８９，２６３（１９９７）および１９９７年４月１７日に提出されたデービッド  シー  チャン，デボラ  ファス，ミン  ルー，ジェイムス  エム．バーガーおよびペーター  エス．キムによる、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質由来のｇｐ４１のコア構造と題した米国仮���願第６０／０４３，２８０号に記載〕を結合する能力を評価する。本明細書に記載の方法を用いて、得られた複合体の安定性を評価する。
【００１３】
Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子（薬物または薬剤）を同定する方法の具体的な態様において、ｇｐ４１コイルドコイルくぼみを提示する可溶性モデルを用いる。ＨＩＶ  ｇｐ４１の６つのヘリックスの束（bundle）は、３量体コイルドコイルの外側における保存された疎水性溝に適合する３つのＣ−ペプチドにより囲まれた３つの同じＮ−ペプチドから構成される内部３量体コイルドコイルからなる。３量体コイルドコイルのＣ末端は、Ｃ−ペプチド由来の巨大な疎水性基に包まれる大きなくぼみを含む。本疎水性ポケットは、抗ＨＩＶ薬物の発見および／またはデザインの標的として用いられる。残念ながら、Ｃ−ペプチドの非存在下に、Ｎ−ペプチドは、凝集され、１００％らせん状でない。したがって、Ｎ３６、Ｎ５１〔ルー，エム．（Ｌｕ，Ｍ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５〕またはＤＰ−１０７（ワイルド（Ｗｉｌｄ）ら、ＰＮＡＳ  ８９：１０５３７−１０５４１（１９９２）などのＨＩＶ−１  ｇｐ４１由来のＮペプチドを単に用いることは、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの有効なモデルを提供する見込みがない。
【００１４】
本明細書に記載のように、出願人は、ＨＩＶ  ｇｐ４１の疎水性ポケットの可溶性非凝集性３量体ペプチドモデルを製造することに成功し、したがって、初めて、（ＨＩＶ  ｇｐ４１構造における対応残基に類似した構造を形成する様式または立体配置で）この疎水性ポケットまたはくぼみを適切に提示するモデルを提供した。（「ポケット」および「くぼみ」は互換的に用いられる）。記載されたように、可溶性３量体コイルドコイル部分と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットまたはくぼみ（Ｎ−ペプチドの残基を含むポケット）を形成するアミノ酸残基を含むＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域由来の部分とを含むペプチド（融合タンパク質ともいう）を製造し、ＨＩＶ  ｇｐ４１機能、例えば、細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する分子または化合物を同定するのに有用なかかる可溶性モデルであることを示した。ペプチドにおける、３量体状のコイルドコイル（融合タンパク質ともいう）は、ＨＩＶのタンパク質ではないタンパク質（ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉなどの非ＨＩＶタンパク質）またはＨＩＶ起源のタンパク質（ＨＩＶ由来のタンパク質またはＨＩＶタンパク質と同一または類似のアミノ酸配列を有するタンパク質）のコイルドコイル領域でありうる。特定の態様において、大きなくぼみを有する、ＩＱＮ１７という可溶性非凝集性３量体ペプチドモデルは、酵母転写活性化因子であるＧＣＮ４の、３量体状のコイルドコイル領域とｇｐ４１のＮペプチドのＣ末端の部分とを含有する。ＩＱＮ１７は、安定性を増大させる３つの変異とＨＩＶの１７残基とを含む、（以前、米国仮出願第６０／１０１，０５８号において、ＧＣＮ４−ｐＩＱと称された）〔エッカート，ディー．エム．（Ｅｃｋｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８４：８５９−８６５（１９９８）〕ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの２９残基を含む；４５残基の融合タンパク質の全長をなす、２つのタンパク質間の１残基のオーバーラップが存在する。ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの配列は：ａｃ−ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＱＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲ（配列番号：１）である。ＨＩＶ配列は：ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号：２０）である。ＩＱＮ１７の配列は：ａｃ−ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ−ａｍ（配列番号：２）である。ＨＩＶ部分を配列番号：２に下線を付す；ａｃ−は、Ｎ末端アセチル基を示し、−ａｍは、Ｃ末端アミドを示す。ＩＱＮ１７におけるＧＣＮ４の、可溶性３量体状のコイルドコイル領域（ＧＣＮ４の可溶性３量体コイルドコイルという）の配列は：ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫ（配列番号：２５）である。ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉコイルドコイルのライズ（ｒｉｓｅ）およびピッチ（ｐｉｔｃｈ）などのスーパーヘリックスパラメーター〔ハーバリー，ピー．ビー．（Ｈａｒｂｕｒｙ，Ｐ．Ｂ．）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：８０−８３（１９９４）；ハーバリーら、ＰＮＡＳ  ９２：８４０８−８４１２（１９９５）〕は、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎヘリックスコイルドコイルとほぼ同一である。したがって、得られた融合タンパク質分子（ＩＱＮ１７）は、Ｃ末端のＮ−���プチド疎水性くぼみを提示する長い３量体コイルドコイルを形成することが予想される。ＩＱＮ１７は、−３６，０００ｄｅｇ  ｃｍ2 ｄｍｏｌ−1 の２２２ｎｍのモル楕円率で円二色性により決定されたように完全にらせん状である。沈降係数により決定されたように、ＩＱＮ１７は、２０μＭの濃度における単量体分子量の３．００〜３．１６倍の範囲の算出分子量に対する観察された分子量の割合を有する別個の３量体種に近い。Ｘ線結晶学により決定されるように、ＩＱＮ１７は、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎヘリックスコイルドコイルにおけるポケットとほぼ同一の様式でＮペプチド疎水性ポケットを提示する。
【００１５】
（天然のＬ掌体またはエナンチオマーＤ掌体の）ＩＱＮ１７分子は、高処理量薬剤スクリーニングを含むスクリーニングに用いて、コイルドコイルポケットに結合する分子を同定することができる。Ｄ掌体のＩＱＮ１７分子は、（天然Ｌ掌体の）ｇｐ４１の疎水性ポケットに結合する小分子（Ｄ−ペプチド）を同定し、ＨＩＶ膜融合を阻害するために、鏡像ファージディスプレイ〔シューマッハ（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１８５４，１９９６〕における標的として用いられている。所望の標的（疎水性ポケットを含むＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス）は、天然由来標的の正しい鏡像である。天然由来のコイルドコイルポケットの鏡像を結合する能力の評価対象の化合物または分子のライブラリーまたはコレクションをスクリーニングするために用いられる。天然由来のｇｐ４１ポケットの鏡像を結合することが見出された化合物または分子の鏡像は、天然の掌体のｇｐ４１ポケットを結合するであろう。スクリーニングされたライブラリーまたはコレクションは、ファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー、ＤＮＡライブラリー、ＲＮＡライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学薬剤もしくは薬物のコレクション、細胞溶解物、細胞培養培地または細胞により産生された産物を含む上清などのいかなる型でもありうる。ファージディスプレイライブラリーの場合、Ｄ−標的を用いてファージコートタンパク質をスクリーニングする。標的に結合する特異的なファージクローンを同定し、発現したタンパク質の鏡像を、Ｄ−アミノ酸を用いて化学合成する。鏡像ファージディスプレイにおいて、ＩＱＮ１７を用いることにより、ｇｐ４１疎水性ポケットに結合するＤ−ペプチドを同定した。記載されているように、さらなる評価を行ない、Ｄ−ペプチドのＨＩＶ  ｇｐ４１機能阻害能を示した。ｇｐ４１疎水性ポケットを結合し、ＨＩＶ感染性を阻害するＤ−ペプチドを同定した。疎水性ポケットを結合するＤ−ペプチドは、（薬物がコイルドコイルポケットに結合し、ＨＩＶ感染力を阻害するものである）創薬のためのリード分子および／または薬物発見のための試薬として有用であろう。天然Ｌ掌体のＩＱＮ１７分子は、高処理量薬剤スクリーニングを含むスクリーニングに用いて、コイルドコイルポケットに結合する分子を同定することができる。ＩＱＮ１７を用いて、疎水性ポケットの結合能の評価対象である化合物または分子のコレクションまたはライブラリーをスクリーニングすることができる。スクリーニングされたライブラリーまたはコレクションは、ファージディスプレイライブラリー、ＲＮＡライブラリー、ＤＮＡライブラリー、ペプチドライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学薬剤もしくは薬物のコレクション、細胞溶解物、細胞培養培地または細胞により産生された産物を含む上清などのいかなる型でもありうる。さらに、疎水性ポケットを結合する化合物または分子は創薬のためのリード分子および／または薬物発見のための試薬として役立つであろう。
【００１６】
ＩＱＮ１７のバリアントである融合タンパク質を生産し、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合する薬物のスクリーニングに用いることができる。これらの変化は、コイルドコイルの３量体状態を変えないのであれば、広範なバリエーションのいずれもがＩＱＮ１７のＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ成分においてなされ得、本方法に用いられうる。コイルドコイルの３量体状態を維持するのであれば、例えば、ＧＣＮ４成分のアミノ酸組成は、１以上のアミノ酸残基の付加、置換、修飾および／または欠失により変えられ得る。例えば、ＩＱＮ１７におけるＡｓｐ残基（コイルドコイルの「ｆ−位」）は、天然アミノ酸のいずれによっても置換されうる。〔オニール（Ｏ’Ｎｅｉｌ）およびデグラード（ＤｅＧｒａｄｏ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：６４６（１９９０）〕。一方、融合タンパク質でのこの成分は、モロニーマウス白血病ウイルス〔ファス，ディー（Ｆａｓｓ，Ｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：４６５（１９９６）〕、ＧＣＮ４−ｐＩＩ〔ハーバリー（Ｈａｒｂｕｒｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１７：８０、１９９４〕またはＡＢＣヘテロ３量体（ナウチャル（Ｎａｕｔｉｙａｌ）およびアルバー（Ａｌｂｅｒ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：８４（１９９９）〕由来などの他のタンパク質の、３量体状のコイルドコイル領域でありうる。
【００１７】
また、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮペプチドのＣ末端部分である融合タンパク質成分のアミノ酸組成を変化させ、ＩＱＮ１７バリアントを生産することができる。Ｃ末端部分は、１以上のアミノ酸残基の付加、置換、修飾および／または欠失により変えられうる。コイルドコイルの３量体状態およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの疎水性ポケットが維持されるのであれば、融合タンパク質のいずれかの成分または両方の成分のアミノ酸組成が変えられ得、可能なアミノ酸残基変化の数または型に限定されない。ＩＱＮ１７、ＩＱＮ１７バリアントまたは大きなくぼみを有する任意の可溶性モデルは、Ｎ−ヘリックスコイルドコイル、特にポケットを結合する薬物またはリード薬物候補物またはワクチン標品に用いるための候補物をスクリーニングし、さらに、高処理量形式などの当業者に公知の方法を用いてさらにスクリーニングするために用いられうる。
【００１８】
本明細書に記載された結果は、以下に記載のように、Ｃ３４のバリアントであるＨＩＶ  ｇｐ４１のインヒビターをスクリーニングするために有用である。Ｎ３６を安定に結合するＣ３４バリアントなどのＣ３４のバリアントが同定されると、それを用い、さらに得られるように評価し、あるいは（例えば、安定性、可溶性、生体利用性を増強するために）所望もしくは必要であれば、それを（例えば、少なくとも１アミノ酸残基を改変、付加、欠失もしくは置換すること、または非アミノ酸置換物を付加することにより）改変しうる。一方、Ｃ３４バリアントを評価して、より短い成分（より少ないアミノ酸残基の領域）もまたインヒビターとして活性であるかどうかを決定することができる。本明細書に記載のように、Ｎ３６  ３量体における深部の保存ポケットに包まれる３つのＣ３４残基Ｔｒｐ628 、Ｔｒｐ631 およびＩｌｅ635 は、阻害活性に重要である。Ｎ３６コイルドコイルへのより高い親和性を有するＣ３４バリアントは、ＨＩＶ感染に対して、より強い阻害活性を有するという観察は、強いインヒビターを同定し評価するためのスクリーニングの基礎をなす。例えば、コンビナトリアルペプチドケミストリーの『分割（ｓｐｌｉｔ）−合成』技術〔チェン，シー．エル．（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｌ．）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２１１−２１９（１９９６）；ラム，ケイ．エス（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４（１９９１）〕を用いて、疎水性性質を変える化学的置換により３つの重要な疎水性残基をランダムに置換されたＣ３４バリアントのライブラリーを合成する。この合成技術は、単一のバリアントＣ３４ペプチドの多くのコピーをそれぞれが含むビーズの巨大ライブラリー（すなわち、『１ビーズ、１化合物』型のライブラリー）の創出をもたらす。Ｎ−ヘリックスコイルドコイルを安定に結合するＣ３４バリアントを同定するために、Ｎ３６（または改変Ｎ−ペプチド）の標識体を、最も高い親和性を有するこれらのＣ３４バリアントのみへの結合に限られる条件下（例えば、高温）にペプチドビーズと混合する。結合は、公知の方法を用いて、Ｎ−ヘリックスペプチドにおける標識の検出により測定される。分割−合成技術の簡単な改変は、質量分析により選別されたペプチド配列の迅速な同定を可能にする（ヤングクイスト，アール．エス．（Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｓ．）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，３９００−３９０６（１９９５）〕。選択されたＣ３４バリアント、とりわけＮ３６に対する最も高い結合親和性を有するものを、ｇｐ４１阻害活性について、シンシチウムアッセイおよび感染アッセイで試験する。くぼみ−結合領域のみを含むこれらのＣ３４バリアントの切形型も、阻害活性を試験されうる。一方、評価対象の他のペプチドのライブラリーを合成して、それぞれが評価対象のペプチドを含む（それに結合した）ビーズのライブラリーを作製することができる。このライブラリーは、Ｃ３４バリアントについて上記のように解析され、得られたヒット（Ｎ３６に対して適切な結合親和性を有するメンバー）が、ｇｐ４１阻害活性についてさらに解析される。別の例として、Ｎ３６ペプチドまたは前記に述べられた、ＩＱＮ１７、ＧＣＮ４−Ｎ−ヘリックスペプチドなどの可溶性バリアントをファージディスプレイまたは鏡像ファージディスプレイ技術の標的として用い、くぼみに結合するペプチドを同定することができる。
【００１９】
さらに、ＩＱＮ１７を用いて、コイルドコイルくぼみに結合する抗体（モノクローナルおよび／またはポリクローナル）を生じさせうる。さらに、ＩＱＮ１７を単独または他の物質と組み合わせて、投与（ワクチン接種）される個体において、コイルドコイルに結合する抗体の生産を惹起し、それにより感染および／または疾患に対する防御を提示するワクチンに用いうる。
【００２０】
ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の３量体Ｎ−ヘリックスコイルドコイルにおける深部の疎水性ポケットに適合するＤ−ペプチドおよびＬ−ペプチドの両方のペプチドも本発明の主題である。Ｄ−ペプチドは、ｇｐ４１疎水性ポケットに排他的に結合することが示されている最初の分子である。これらのＤ−ペプチドがｇｐ４１−媒介膜融合過程（シンシチウム形成およびウイルス感染）を阻害するという観察は、ＨＩＶ−１感染がポケットに特異的に結合する分子により阻害されうるという最初の直接的な説明を提供する。薬物標的としてのｇｐ４１疎水性ポケットの確認は、細胞へのウイルス侵入を阻害することにより働く経口的に生体利用可能な抗ＨＩＶ薬物の新しいクラスの開発の段階を設定する。かかる薬物は、治療との組み合わせでＨＩＶ−１感染を治療するのに用いられる現行の養生法への有用な補助でありうる。本明細書に記載されたＤ−ペプチド、その部分、改変体およびバリアントならびに本明細書に記載のＤ−ペプチドの全部または一部を含有したより大きい分子（例えば、ポリペプチド）などのＤ−ペプチドは、ＨＩＶ膜融合を阻害し、したがって、細胞へのＨＩＶ侵入を阻害するのに有用である。本明細書に記載されたように同定されたファージ配列のＤ−アミノ酸体に対応するＤ−ペプチドがＨＩＶ−１感染およびシンシチウム形成のインヒビターである。これらのＤ−ペプチドインヒビターにおけるＣ−末端残基は、配列パターン：ＣＸＸＸＸＸＥＷＸＷＬＣＡＡ−ａｍを有する。（ファージディスプレイライブラリーにおいて、Ｃ残基に対応する位置はＣまたはＳのいずれかとしてコードされ、ＡＡ残基に対応する位置はそれらとしてコードされ、（Ｘで示された）他の１０個の位置はランダムにコードされた。−ａｍはＣ−末端アミドを表わし、ペプチド合成過程の一部として付加される）。Ｄ−ペプチドインヒビターにおけるＮ−末端残基は、例えば、ａｃ−ＧＡ、ａｃ−ＫＫＧＡまたはａｃ−ＫＫＫＫＧＡである。ａｃ−は、ペプチド合成過程の部分として付加されるＮ−末端アセチル基を表わす。Ｃ−末端アミドおよびＮ−末端アセチル基は、本発明のＤ−ペプチドの任意成分である。他のＮ−末端残基は、前記センテンスにおけるものの代わりまたはそれに加えて、所望のように（例えば、可溶性の増大のために）含みうる。例えば、下記の配列：
2010180217.tif 000004
を有するＤ−ペプチドも本発明の主題である。
【００２１】
アミノ酸残基は１文字表記（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）により表され、Ｘは任意のアミノ酸残基（天然由来もしくは非天然由来）、または修飾されたアミノ酸残基などの他の残基（ｍｏｉｅｔｙ）を表す。
【００２２】
さらに、１２アミノ酸残基ぺプチドの内の１０アミノ酸残基「コア」（システイン残基により両端がフランキングされている十量体）、ならびに該十量体の部分、改変体（modification) およびバリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）も膜融合およびＨＩＶの細胞への侵入を阻害するのに有用である。これらのぺプチドのバリアント、部分および改変体もインヒビターとして有用である。本発明にさらに詳細に記載しているように、コンセンサス配列（例えば、ＷＸＷＬ（配列番号：２３）、ＥＷＸＷＬ（配列番号：２４）、ＣＸＸＸＸＸＥＷＸＷＬＣ（配列番号：１２）またはそれらの部分）を含有するＤ−ぺプチドは、Ｎ−ヘリックス超らせんを結合することが示されており、膜融合およびＨＩＶの細胞への侵入を阻害するのに有用である。鏡像異性ぺプチド（Ｄ−ぺプチド）は、プロテアーゼなどの酵素に対する効率的な基質として働かず、したがってＬ−ぺプチドよりもタンパク質分解に対して耐性があり；それらはＬ−ぺプチドより免疫原性が低い。本発明のＤ−ぺプチドの具体的態様は：
2010180217.tif 000005
2010180217.tif 000006
である。
【００２３】
本明細書に記載のＤ−ぺプチドは、Ｎ−ヘリックスポケットを結合することが示されたリガンドであり、Ｎ−ヘリックスポケットを結合することからＨＩＶのインヒビターでもある化合物または分子（例えば、化合物ライブラリー、組換え的に製造された産物、天然に存在する物質、培養培地または上清み由来）を同定するための薬物スクリーニングにおいても有用である。例えば、Ｎ−ヘリックスくぼみを結合するＤ−ぺプチド（例えば、本明細書に記載のＤ−ぺプチド）；ＩＱＮ１７（例えば、天然のＬ体の）、またはＮ−ヘリックスくぼみを提示する可溶性モデルである別の融合タンパク質；および候補インヒビター（Ｎ−ヘリックスくぼみを結合する能力の評価対象の化合物または分子）を組み合わせることにより、競合アッセイを行うことができる。例えば、Ｄ１０ｐｅｐ５またはＤ１０ｐｅｐ１、ＩＱＮ１７、および候補インヒビター（候補薬物）を、Ｄ１０ｐｅｐ５またはＤ１０ｐｅｐ１のＩＱＮ１７への結合に適するバッファー条件およびぺプチド濃度を用いて組み合わせることができる。Ｄ−ぺプチドの結合が生じる程度を測定し、同一条件下であるが、ＨＩＶありｇｐ４１エンベロープタンパク質のＮ−ヘリックス超らせんくぼみを結合する能力の評価対象の化合物または分子（候補薬物または候補インヒビターという）の非存在下で結合が生じる程度（対照）と比較する。Ｄ１０ｐｅｐ５またはＤ１０ｐｅｐ１の結合が、候補インヒビターの存在下（被検試料）において非存在下（対照試料）よりも低い程度で生じる場合、候補インヒビターは、Ｎ−ヘリックス超らせんくぼみを結合するリガンドであり、したがってインヒビターである。このようにして同定されるインヒビターは、本明細書に記載のようなウイルス感染力アッセイおよびシンシチウム（ｓｙｎｃｔｉａ）形成アッセイにおいてその活性をさらに評価することができる。かかるアッセイにおいて活性を示すそのようなインヒビターは、適当な動物モデルまたはヒトにおいてさらに評価することができる。
【００２４】
Ｎ−ヘリックスくぼみを結合することが知られたＤ−ぺプチドの結合を検出することができる任意の方法を用い、候補インヒビターが結合を妨害するか否かを評価することができる。例えば、Ｄ−ぺプチドは検出可能に標識することができ、候補インヒビターの存在下および非存在下に、標識がＮ−ヘリックスくぼみ上に現れる（Ｄ−ぺプチドの結合の結果）程度を検出する。候補インヒビターの非存在下（対照試料）よりも候補インヒビターの存在下（被検試料）において、より少ない標識がＩＱＮ１７（または他の適当な融合タンパク質）のＮ−ヘリックスくぼみ上に現れる場合、候補インヒビターは、Ｎ−ヘリックスくぼみを結合（およびＤ−ぺプチドの結合を妨害）するリガンドである。あるいはまた、近接したときに発蛍光団の蛍光シグナルを消光する適当な消光物質（例えば、ＤＡＢＣＹＬ；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）とともに、発蛍光団（例えば、ＥＤＡＮＳ；５−（２’アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸）により、Ｄ−ぺプチド（例えば、Ｄ１０ｐｅｐ５またはＤ１０ｐｅｐ１）およびＩＱＮ１７を標識することができる。候補インヒビターがＩＱＮ１７のＮ−ヘリックスくぼみを結合する場合、候補インヒビターの結合の結果、Ｄ−ぺプチドが、レポーターシグナルが消光され得るには消光物質に十分に近接しないため、蛍光が観察される。あるいはまた、蛍光レポーター分子をＩＱＮ１７上に、かつＤ−ぺプチド上に適当な消光物質を存在させ得る。どちらの場合も、ＩＱＮ１７上のレポーターまたは消光物質の位置は、Ｄ−ぺプチドがＮ−ヘリックスくぼみを結合すると、該レポーターおよび消光物質部分が、互いに消光を生じるよう十分に近接するようでなければならない（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９（１９９８））。
【００２５】
また、本発明の主題は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんポケットを結合し、細胞へのＨＩＶ侵入を（部分的または完全に）阻害する薬物（化合物および分子）である。一態様では、これらの薬物は、本明細書に記載のようにして、またはその他の方法によって同定することができる。ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんポケットを結合する薬物は、細胞へのＨＩＶ侵入を妨害または侵入が起こる程度を低減するための治療剤として、例えば、ＨＩＶ  ｇｐ４１機能のメカニズムを研究するための研究ツールとして、および個体（例えば、動物モデルまたは感染したヒト）によるウイルスクリアランスの割合を調べるために有用である。
【００２６】
また、本発明の主題は、粘膜細胞へのＨＩＶの侵入の妨害方法に有用な組成物であり、これらの組成物は、適当な担体または基剤ならびに：
（ａ）Ｃ３４ぺプチド；
（ｂ）ＤＰ１７８；
（ｃ）Ｔ６４９；
（ｄ）Ｔ１２４９；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の誘導体；
（ｆ）ＨＩＶ  ｇｐ４１の疎水性ポケットに結合するＤ−ぺプチド；
（ｇ）（ｆ）の誘導体；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の２種以上の組み合わせ；および
（ｉ）Ｎ−ヘリックス超らせんへの結合によるＨＩＶ感染力を阻害する分子
からなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含有する。該組成物は、かかある成分の１種または２種以上の成分を含有することができる。
【００２７】
本発明のさらなる主題は、ＨＩＶ感染および／または疾患に対して（部分的または完全に）防御するであろう免疫応答（例えば、抗体産生）を顕現させるために使用しうる組成物（例えば、タンパク質またはタンパク質性物質）である。かかる組成物は、防御剤（例えば、ワクチン）として、および研究ツール、診断用ツール、薬物スクリーニング試薬として有用な（モノクローナルおよび／またはポリクローナル）抗体を得るため、ならびに動物モデルまたは感染したヒトにおけるウイルス動力学（ウイルスの生成およびクリアランスの速度）を評価するために有用である。
【００２８】
また、本発明の主題は、ＩＱＮ１７とＤ１０ｐｅｐ１の複合体のＸ線結晶構造の原子座標のリストである。また、本発明の主題は、ＩＱＮ１７のＸ線結晶構造の座標のリストである。これらの座標は、Ｄ１０ｐｅｐ１がどのようにＮ−ヘリックス超らせんくぼみおよびＮ−ヘリックス超らせんくぼみのモデルに結合するのかを示す複合体のモデルを作製するために使用（例えば、コンピューターグラフィックスのプログラムのための電子ファイルとして）することができる。かかるモデルは、コンピューターグラフィックスモデリングなどの当業者に知られた方法において、他のぺプチド、ぺプチド擬似物、小分子、薬物または他の化合物によるＮ−ヘリックス超らせんくぼみへの結合のしやすさを評価するための新しいモデルを構築するために使用することができる。かかるモデルを、Ｎ−ヘリックス超らせんくぼみを結合する分子（ぺプチド、ぺプチド擬似物、小有機分子、薬物または他の化合物）の構造の新しいモデルを構築するためにも使用することができる（例えば、Ｈ．クビニー（Ｋｕｂｉｎｙｉ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１：１６（１９９８）；Ｐ．Ｌ．Ｗｏｏｄ，ｉｂｉｄ，１：３４（１９９８）；Ｊ．Ｒ．Ｍｏｒｐｈｙ，ｉｂｉｄ，１：５９（１９９８））。これらのモデルおよび原子座標の対応するリストを、当業者に知られた方法を用い、ＨＩＶ感染を阻害する、より効果的および／または新しいＤ−ぺプチド、Ｌ−ぺプチド、ぺプチド擬似物、他の小分子または薬物を同定、評価、発見および設計するのに使用することができる。本発明のさらなる主題は、本明細書に記載のＨＩＶ  ｇｐ４１疎水性ポケットの可溶性四量体ぺプチドモデル（例えば、ＩＱＮ１７またはそのバリアント）の結晶、Ｄ−ぺプチドとの複合体であるようなモデル（例えば、Ｄ１０ｐｅｐ１などの本明細書に記載のＤ−ぺプチドとの複合体としてのＩＱＮ１７またはそのバリアント）の結晶、またはＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんのポケットを含むアミノ酸残基を含有するＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ぺプチド領域の結晶などの、結晶の原子座標の使用によるＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんポケットに適合する（内部に詰まる、結合する）薬物の製造または同定方法である。該方法は、エンプティ（ｅｍｐｔｙ）可溶性モデル（Ｄ−ぺプチドとの複合体でない）などの可溶性モデルの結晶を得る工程、該結晶（例えば、ＩＱＮ１７などのエンプティ可溶性モデルの結晶）の原子座標を得る工程；得られた原子座標を使用してＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんポケットを明確化する工程；Ｎ−ヘリックス超らせんポケットに適合する分子または化合物を同定し、該分子または化合物を得る工程；該分子また化合物をＮ−ヘリックス超らせんポケットと〔例えば、該ポケット（例えば、ＩＱＮ１７もしくはそのバリアントまたはＮ−ぺプチド）を含むポリぺプチドと接触させることにより〕接触させ、該分子または化合物のＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットに適合する能力を評価（測定）する工程を含み、ここで、該分子または化合物においてポケットに適合し、そしてＮ−ヘリックス超らせんポケットに適合する薬物であり、それによりポケットに適合する薬物を製造���る。結晶の原子座標はＸ線回折試験により得ることができ、すなわち、ＩＱＮ１７のための本明細書に示されたＰＤＢ（図１１Ａ〜１１Ｖ）などのコンピュータファイルもしくはプロテイン・データ・ベース（ＰＤＢ）を形成し得る。
【００２９】
同様に、該方法は、Ｄ−ぺプチド（例えば、Ｄ１０ｐｅｐ１などの本明細書に記載のＤ−ぺプチド）との複合体の状態の可溶性三量体モデルの結晶、またはＮ−ヘリックス超らせんのポケットを含有するＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ぺプチド領域の結晶を用いて行うことができる。
【００３０】
このようにして製造される薬物は、ポケットに適合する能力をコンフォームするために（例えば、ＮＭＲにより）さらに評価することができ、細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する能力を（例えば、シンシチウムアッセイまたは感染力アッセイにより）評価することができる。
【００３１】
本明細書において引用したすべての文献の教示および全内容は参照により特に本出願に取り込まれる。
【００３２】
発明の詳細な説明
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のｇｐ４１サブユニットは、ウイルス膜と細胞膜との融合を媒介する。ｇｐ４１のエクトドメインコア結晶構造は、逆平行のＣ−ヘリックスと対形成するＮ−ヘリックスからそれぞれがなる３つのらせん状ヘアピンから構成される６回らせんの束である〔Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｄ．Ｆａｓｓ、Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、８９：２６３（１９９７）、Ｗ．Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ、Ａ．Ｄｅｓｓｅｎ、Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｊ．Ｓｋｅｈｅｌ、Ｄ．Ｃ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：４２６（１９９７）；Ｋ．Ｔａｎ、Ｊ．Ｌｉｕ、Ｊ．Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｓｈｅｎ、Ｍ．Ｌｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２３０３（１９９７）〕。３つのＮ−ヘリックスにより、内部に位置する三量体の超らせんが形成され、そして３つのＣ−ヘリックスにより、保存された疎水性の溝に沿ったこのＮ−ヘリックス超らせんの外側が包まれている。この構造は、（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｄ．Ｆａｓｓ、Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、８９：２６３（１９９７）ならびにＤ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰｅｔｅｒ  Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、９３：６８１（１９９８）において議論されている）ｇｐ４１の融合活性状態のコアに対応していることが考えられ、下記のウイルスに由来するエンベロープ融合タンパク質の提案された融合誘導（fusogenic）構造との類似性を示している：インフルエンザ（Ｐ．Ａ．Ｂｕｌｌｏｕｇｈ、Ｆ．Ｍ．Ｈｕｇｈｓｏｎ、Ｊ．Ｊ．Ｓｋｅｈｅｌ、Ｄ．Ｃ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３７１：３７（１９９４））、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｄ．Ｆａｓｓ、Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３：４６５（１９９６））、およびサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）（Ｖ．Ｎ．Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ、Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｃ．Ｔ．Ｃｈｕｔｋｏｗｓｋｉ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：９１３４（１９９８）、Ｍ．Ｃａｆｆｒｅｙ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７：４５７２（１９９８））、ならびにエボラウイルス（Ｗ．Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２：６０５（１９９８）、Ｖ．Ｎ．Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：２６６２（１９９２））。
【００３３】
ＤＰ１７８およびＣ３４などの合成Ｃ−ペプチド（Ｃ−ヘリックスに対応するペプチド）は、ＨＩＶ−１膜融合の強力なインヒビターであり、実験室で使用されている株および直接得られた単離体の両方に対して効果的である〔Ｖ．Ｎ．Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ、Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｃ．Ｔ．Ｃｈｕｔｋｏｗｓｋｉ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：９１３４（１９９８）〕。ＤＰ１７８はＨＩＶ−１  ｇｐ４１の残基６３８〜６７３に対応し、そのアミノ末端がアセチル化され、カルボキシ末端がアミド化されている（Ｃ．Ｔ．Ｗｉｌｄ、Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ、Ｔ．Ｋ．Ｇｒｅｅｎｗｅｌｌ、Ｃ．Ｂ．ＭｃＤａｎａｌ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９７７０（１９９４）、Ｓ．Ｊｉａｎｇ、Ｋ．Ｌｉｎ、Ｎ．Ｓｔｒｉｃｋ、Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：１１３（１９９３））。Ｃ−ペプチドのＤＰ１７８（Ｔ−２０とも呼ばれる）を用いた第Ｉ相臨床試験により、ウイルス量（load）の減少をもたらす抗ウイルス活性をインビボで有していることが示される（Ｍ．Ｓａａｇ他、アメリカ伝染病学会第３５年会（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、１９９７年９月１６日）で発表された抄録＃７７１；Ｋｉｌｂｙ，Ｊ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、４：１３０２〜１３０７（１９９８））。ｇｐ４１コアの構造的特徴に基づいて、これらのペプチドは、外因性のＣ−ペプチドがｇｐ４１の中心に位置する超らせんに結合して、その不活性化をもたらす優性ネガティブ機構によって作用していることが考えられている（Ｄ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、９３：６８１（１９９８）；Ｒ．Ａ．Ｆｕｒｕｔａ他、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５：２７６（１９９８）；Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｄ．Ｆａｓｓ、Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ．、Ｃｅｌｌ、８９：２６３（１９９７）、Ｗ．Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ、Ａ．Ｄｅｓｓｅｎ、Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｊ．Ｓｋｅｈｅｌ、Ｄ．Ｃ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：４２６（１９９７）；Ｋ．Ｔａｎ、Ｊ．Ｌｉｕ、Ｊ．Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｓｈｅｎ、Ｍ．Ｌｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２３０３（１９９７）、Ｍ．Ｌｕ、Ｓ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｌｏｗ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：１０７５（１９９５）ならびにＣ．Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｃ．Ｂ．ＭｃＤａｎａｌ、Ｄ．Ｐ．Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｍ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：３７７１（１９９５））。これらのペプチドは、本来のｇｐ４１構造〔すなわち、遊離ビリオンの表面に存在する非融合誘導性（nonfusogenic）立体配座〕がｇｐ１２０／ＣＤ４／コレセプターの相互作用によって乱されるときに形成されるｇｐ４１のプレヘアピン中間体に作用することが考えられている。このプレヘアピン中間体は、露出したＮ−超らせんを有し、それにより、融合活性なヘアピン構造が形成される前に、Ｃ−ペプチドに結合してｇｐ４１を不活性化し得ることが提案されている（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、９３：６８１（１９９��））。このモデルは、Ｃ−ペプチドのＤＰ１７８がｇｐ４１に結合することを示す免疫沈降実験によってさらに支持されている（Ｒ．Ａ．Ｆｕｒｕｔａ、Ｃ．Ｔ．Ｗｉｌｄ、Ｙ．Ｗｅｎｇ、Ｃ．Ｄ．Ｗｅｉｓｓ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５：２７６（１９９８））。さらに、ＤＰ１７８による阻害を逃れるウイルスには、ｇｐ４１の中心に位置する超らせん領域における変異が明らかにされている（Ｌ．Ｔ．Ｒｉｍｓｋｙ、Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：９８６（１９９８））。
【００３４】
ｇｐ４１の近年の結晶学的研究により、Ｃ−ペプチドと対照的に経口投与される可能性を有する小分子のペプチド模倣薬物の開発が容易になっている。超らせんのそれぞれの境界には、Ｎ−ヘリックスの超らせん内の残基のクラスターによって形成され、抗ウイルス化合物を開発するための興味深い標的である深いくぼみが存在する。Ｃ−ヘリックスの３つの残基（Ｔｒｐ628 、Ｔｒｐ631 およびＩｌｅ635 ）がこのくぼみに進入して、広範囲の疎水性接触が形成される。変異分析により、このくぼみを構成するＮ−ヘリックス残基の２つ（Ｌｅｕ568 およびＴｒｐ571 ）が膜融合活性に極めて重要であることが示されている（Ｊ．Ｃａｏ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：２７４７（１９９３））。従って、このくぼみに対して大きな親和力で結合して、Ｎ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックスの正常な対形成を妨げる化合物は効果的なＨＩＶ−１インヒビターになることが十分に考えられる。さらに、このくぼみ内の残基は様々なＨＩＶ−１単離体において高度に保存されている。構造が高度に保存されているために、この部位を標的とする薬物は、様々なＨＩＶ−１単離体に対して、そしておそらくはＨＩＶ−２単離体に対して広い活性を有する。
【００３５】
この仮説は注目されているが、現在まで、このようなくぼみの接触がＣ３４インヒビターの効力に重要であることは明らかにされていない。実際、くぼみに結合する残基を有しないＣ−ペプチドのいくつか（ＤＰ１７８（Ｃ．Ｔ．Ｗｉｌｄ、Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ、Ｔ．Ｋ．Ｇｒｅｅｎｗｅｌｌ、Ｃ．Ｂ．ＭｃＤａｎａｌ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、同上、９１：９７７０（１９９４）；Ｋｉｌｂｙ，Ｊ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、４：１３０２（１９９８））など）は、ＨＩＶ−１膜融合の非常に効果的なインヒビターである。このようなことにより、Ｃ−ペプチドの活性決定基を同定するために体系的な構造−機能分析が必要であることが強く唱えられている。
【００３６】
阻害活性におけるくぼみ接触の役割を明らかにするために、構造に基づく変異誘発をＣ３４において行った。ｇｐ４１エクトドメインのコア（図１）を、Ｎ３６およびＣ３４と呼ばれる２つの合成ペプチドを用いて再構成した〔Ｍ．Ｌｕ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．、１５：４６５（１９９７）、Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｄ．Ｆａｓｓ、Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、８９：２６３（１９９７）〕。１個のアラニン置換を有するＣ３４ペプチドのバリアント（variants）を合成して、変異型（mutant）Ｎ３６／Ｃ３４複合体のらせん含有量および熱安定性を円二色性により定量した。予想されるように、Ｎ３６の超らせんと接触しないＣ３４残基（Ｍｅｔ629 、Ａｒｇ633 ）の変異は、２２２ｎｍにおける平均残基楕円率（らせん含有量の大きさ）またはＮ３６／Ｃ３６複合体の安定性に対してほとんど影響しなかった（表１）。しかし、Ｎ３６の超らせんくぼみに突き出る３残基の変異（Ｔｒｐ628 →Ａｌａ、Ｔｒｐ631 →ＡｌａまたはＩｌｅ635 →Ａｌａ）は、平均楕円率および安定性が実質的に低下したＮ３６／Ｃ３４複合体をもたらした（表１）。最も大きな不安定化が、野生型の６６℃と比較して、３７℃の見かけの融解温度（Ｔm ）を有するＮ３６／Ｃ３４複合体が形成されたＴｒｐ631 →Ａｌａのバリアントで認められた。これらの結果は、Ｎ３６の超らせんくぼみとの疎水性接触を形成するＣ３４の残基がｇｐ４１エクトドメインコアのらせん−ヘアピン構造の安定化に重要であることを示している。
【００３７】
膜融合を阻害するＣ３４の能力におけるこれらの残基の重要性を明らかにするために、Ｃ３４ペプチドの活性をＨＩＶ−１のウイルス侵入アッセイおよびシンシチウムアッセイで調べた（表１）。Ｎ３６／Ｃ３４複合体の安定性に対してほとんど影響しない変異（Ｍｅｔ629 →ＡｌａおよびＡｒｇ633 →Ａｌａ）はまた、野生型Ｃ３４の阻害活性に対してほとんど影響しなかった（ウイルス侵入およびシンシチウム形成に対するＩＣ50は、それぞれ、約２．１ｎＭおよび約０．５５ｎＭであった）。しかし、完全に保存されているＴｒｐ628 またはＴｒｐ631 のアラニンへの変異は、活性を、それぞれ、約５分の１および約３０分の１に実質的に低下させた（表１）。あまりよく保存されていないＩｌｅ635 の変異は、阻害活性を約２分の１に低下させただけであった。これらの結果により、ｇｐ４１のポケットと接触するＣ３４の残基がＣ３４の阻害能にとって重要であることが初めて明らかにされた。
【００３８】
変異型Ｃ３４ペプチドの効力と変異型Ｎ３６／Ｃ３４複合体の安定性との関係が、Ｔｒｐ631 変異の大きな不安定化作用を利用して、安定性が徐々に変化した一連のＮ３６／Ｃ３４複合体を構築することによって明らかにされた。Ｔｒｐ631 の位置を「ゲスト部位」として使用し、このトリプトファンを、広範囲の疎水性原子団（bulk）を示す天然アミノ酸および非天然アミノ酸で置換した。疎水性原子団が大きくなる順に、下記の置換体を使用した：グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、野生型残基のトリプトファン（Ｔｒｐ）、およびＬ−β−（１−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ）。この方法により、Ｔm が３７℃〜６６℃の範囲にあるＮ３６／Ｃ３４複合体を形成する一組のＣ３４ペプチドが得られた。Ｎ３６／Ｃ３４バリアントに対するＴm および［θ］222 （１０3 ｄｅｇｃｍ2 ｄｍｏｌ-1）（ならびに、ウイルス侵入および細胞融合のＩＣ50値（ナノモル濃度）をそれぞれ括弧内に示す）は下記の通りである：Ｔｒｐ631 →Ｇｌｙ、３５℃、１７．１（３８±６．１、２５±３．８）；Ｔｒｐ631 →Ａｌａ、３７℃、−２４．９（４０±４．３、１５±０．８）；Ｔｒｐ631 →Ａｂｕ、４３℃、−２３．２（１６±４．８、６．９±０．４）；Ｔｒｐ631 →Ｖａｌ、４３℃、−２３．９（１３±２．８、４．５±０．０９）；Ｔｒｐ631 →Ｌｅｕ、５０℃、−２６．７（５．３±１．０、３．２±０．１）；Ｔｒｐ631 →Ｐｈｅ、５９℃、−２６．３（３．６±０．８、１．６±０．０５）；野生型、６６℃、−３１．７（１．５±０．２、０．５５±０．０３）；Ｔｒｐ631 →Ｎａｌ、６２℃、−３２．０（１．４±０．３、０．７９±０．０８）。Ｔｒｐ631 →Ｎａｌペプチドの濃度は、２８２ｎｍでのε＝６９００の吸光係数を使用してＮａｌの吸収によって求めた（Ｊ．Ｂｌａｋｅ、Ｃ．Ｈ．Ｌｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１８：４２３〜４２６（１９７５））。ＨＩＶ−１の感染アッセイおよびシンシチウムアッセイにおいて、この一連のペプチドは、対応するＮ３６／Ｃ３４複合体のＴm と非常に相関する効力を示した（図２）。これらのバリアントの効力の大きさは、野生型〜Ｎａｌ＞Ｐｈｅ＞Ｌｅｕ＞Ｖａｌ〜Ａｂｕ＞Ａｌａ〜Ｇｌｙであり、置換体の疎水性原子団およびＮ３６／Ｃ３４複合体の安定性とよく一致している。Ｔm の関数としてＩＣ50を対数スケールでプロットした場合、驚くほどの一次の関係が存在する（図２）。ΔＧ＝−ＲＴｌｎＫ（ΔＧ、自由エネルギーの変化；Ｒ、気体定数；Ｔ、絶対温度；およびＫ、平衡定数）、およびΔＴm （Ｔm 、 野生型複合体−Ｔm 、 変異型複合体）はΔ（ΔＧ）（ΔＧ野生型複合体−ΔＧ変異型複合体）に比例する（Ｗ．Ｊ．Ｂｅｃｋｔｅｌ、Ｊ．Ａ．Ｓｃｈｅｌｌｍａｎ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２６：１８５９（１９８７））ため、認められた一次の関係により、阻害の優性ネガティブモードによって推定されるように、Ｃ３４バリアントの効力はＮ−ヘリックス超らせんに対するその親和力と直接関連していることが強く示唆される。これらの結果は、ｇｐ４１コアにおける超らせんのくぼみが薬物の興味深い標的であるという考えを強く支持している。疎水性のくぼみ���突き出ている保存された残基が、ＨＩＶ−１感染を妨げるＣ３４の能力における主要な役割を果たしていることは明らかである。このことは、このインヒビターが、Ｎ−ヘリックスの超らせんと大きな親和性複合体を形成することによって作用していることを示している。従来のペプチドを超えて、鏡像ファージディスプレー技術（Ｔ．Ｎ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：１８５４（１９９６））、選択−反射アプタマー技術（Ｋ．Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、ＰＮＡＳ、９４：１１２８５（１９９７）；Ｓ．Ｋｌｕβｍａｎｎ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、４：１１１２（１９９６）；Ａ．Ｎｏｌｔｅ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：１１１６（１９９６））、コンビナトリアルケミストリー（Ａ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ、Ｓ．Ｄ．Ｌｉｂｅｒｌｅｓ、Ｓ．Ｒ．Ｂｉｇｇａｒ、Ｇ．Ｒ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：９６１（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｃｈａｂａｌａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６：６３２（１９９５））、および構造に基づく薬物設計におけるコンピューター法（Ｈ．Ｋｕｂｉｎｙｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、１：１６（１９９８））を使用して、超らせんのくぼみに対して大きな親和力で結合するＤ−ペプチド、ペプチド擬似物および小分子を同定することができる。Ｎ３６／Ｃ３４安定性とＣ３４阻害能との密接な相関により、そのような化合物の有効性がそれらのくぼみ接触の強さに極めて依存していることが示唆される。これらの結果は、候補化合物を、Ｎ３６との安定な複合体を形成する能力について調べることができ、それによって、ＨＩＶ−１侵入の潜在的なインヒビターを同定して評価するための迅速で定量的なスクリーニングに関する基礎が提供され得ることを示唆している。
【００３９】
中心に位置する超らせんのくぼみに対する小分子のインヒビターは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の最も高度に保存された領域の１つを標的とする。ＳＩＶ  ｇｐ４１コアにおける類似したくぼみは、側鎖の立体配座が保存されている本質的には同一の構造を有する（Ｖ．Ｎ．Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ、Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｃ．Ｔ．Ｃｈｕｔｋｏｗｓｋｉ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：９１３４（１９９８））。この高い構造的保存の程度により、実験室で使用されている株ならびに一次単離体に対して効果的なＣ−ペプチドの広範囲の中和活性が説明される（Ｃ．Ｔ．Ｗｉｌｄ、Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ、Ｔ．Ｋ．Ｇｒｅｅｎｗｅｌｌ、Ｃ．Ｂ．ＭｃＤａｎａｌ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９７７０（１９９４）；Ｓ．Ｊｉａｎｇ、Ｋ．Ｌｉｎ、Ｎ．Ｓｔｒｉｃｋ、Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：１１３（１９９３））。注目されることに、ＳＩＶ  Ｃ３４ペプチドは、ＨＩＶ−１感染の阻害においてＨＩＶ−１  Ｃ３４とほぼ同じくらい効果的である（Ｖ．Ｎ．Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ、Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｃ．Ｔ．Ｃｈｕｔｋｏｗｓｋｉ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：９１３４（１９９８））。さらに、くぼみに結合する領域を含有するＣ−ペプチド（Ｔ６４９）は、耐性ウイルスの進化に対して、この領域を有しないＤＰ１７８（Ｔ−２０とも呼ばれる）よりもはるかに低い感受性を有している（Ｌ．Ｔ．Ｒｉｍｓｋｙ、Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：９８６（１９９８）。これらの観察から、超らせんの表面、特に、そのくぼみを標的とする高親和性リガンドは、（ＨＩＶ−２を含む）様々なＨＩＶ単離体に対する広範な活性を有し、かつ薬物から逃れるバリアントによって回避される可能性がほとんどないことが明らかである。
【００４０】
Ｃ−ペプチドの作用機構に関するこれらの研究はまた、ｇｐ４１コアの三量体ヘアピン構造（Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．他、Ｃｅｌｌ、８９：２６３（１９９７）；Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，Ｗ．他、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：４２６（１９９７）；Ｔａｎ，Ｋ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２３０３（１９９７））がｇｐ４１の融合活性状態に対応しているという仮説を支持している。本明細書に記載されている研究により、Ｃ３４の阻害能はｇｐ４１のＮ−超らせんに結合するその能力に依存することが明らかにされている。ｇｐ４１のヘアピン構造は（９０℃を超える融解温度を有して）極めて安定であるために（Ｌｕ，Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：１０７５（１９９５））、特に、変化を受けていないｇｐ４１分子内において非常に効果的な濃度のＮ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックスが提供されたときに、この構造が一旦形成されると、ナノモル濃度のＣ３４によって、この構造が破壊され得ることは考えられない。むしろ、Ｃ−ペプチドは、中心に位置する超らせんが露出した一次的なプレ−ヘアピン中間体に結合することによって、ｇｐ４１のヘアピンが形成される前に作用していることが考えられる。Ｃ−ペプチドがこのプレ−ヘアピン中間体に結合することによって、ｇｐ４１は不活性化され、融合活性なヘアピン構造へのその変換が妨げられる（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃｅｌｌ、９３：６８１（１９９８））。
【００４１】
本明細書中に記載されているように、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のｇｐ４１サブユニットのＮ−ヘリックス超らせんの表面にあるポケットは薬物の標的である。同様に、ＡＩＤＳを引き起こし得る他の病原体（例えば、ＨＩＶ−２）またはＡＩＤＳ様状態を非ヒト哺乳動物において引き起こす病原体（例えば、ＳＩＶ）におけるくぼみもまた薬物の標的である。本明細書中に記載されているように、利用可能な方法（例えば、鏡像ファージディスプレー法、コンビナトリアルケミストリー、コンピューター法、ならびに他の薬物スクリーニング法および医化学的方法）を使用して、ウイルスの細胞内侵入を妨げ、従って、ウイルス感染を妨げるのに十分な親和性で、ＨＩＶ−１（および／またはＨＩＶ−２）の超らせんくぼみを結合するペプチド、Ｄ−ペプチド、ペプチド擬似物および小分子を同定することができる。本明細書中（実施例３）にさらに記載されているように、鏡像ファージディスプレイが、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんの表面におけるくぼみに結合するＤ−ペプチドを同定するために使用されている。
【００４２】
本明細書中に記載されいる研究の結果として、Ｃ３４／Ｎ３６複合体の形成を妨げ、かつ／または一旦形成された複合体を破壊する分子または化合物（薬剤または薬物）を同定するスクリーニングアッセイが行うことができ、それは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんのポケットを結合する分子または化合物（薬剤または薬物）を同定する方法である。そのような薬物または薬剤は、ＨＩＶの細胞内侵入、従って、ＨＩＶによる感染を（完全または部分的に）阻害するのに有用である。
【００４３】
Ｃ３４とＮ３６との安定な複合体の形成を妨げ、あるいはこの２つの分子における複合体を破壊する化合物または分子（薬物または薬剤とも呼ばれる）に関するスクリーニング法、およびＨＩＶｇｐ４１のＮ−ヘリックス超らせんのポケットを結合する化合物または分子に関するスクリーニング法は本発明の主題である。
【００４４】
本発明のスクリーニング法の１つの実施形態において、Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの複合体の形成を妨げる薬物が、Ｃ３４とＮ３６との複合体を形成させるために適切な条件のもとで、候補薬物（Ｃ３４とＮ３６との複合体の形成を妨げるその能力のアッセイ対象の化合物または分子）をＣ３４およびＮ３６と合わせて、そうして、被検試料を形成し、その後、Ｃ３４／Ｎ３６複合体の形成が被検試料中で（部分的または完全に）阻害されているかどうかを測定することによって同定される。この評価の結果は、候補薬物が存在しないことを除いて被検試料と同じ組み合わせである適切な対照の結果と比較することができる；このとき、対照は、被検試料が供されるのと同じ条件に供される。Ｃ３４／Ｎ３６複合体が、（被検試料中において）候補薬物の存在下で形成されず、あるいはその非存在下でより小さい程度で形成される場合、その候補薬物は、Ｃ３４とＮ３６との安定な複合体の形成を妨げる薬物である。そのような薬物はまた、本明細書中ではＣ３４／Ｎ３６複合体形成のインヒビターとして示されている。複合体形成の阻害は、Ｃ３４およびＮ３６のそれぞれが一対のドナー−アクセプター分子のメンバー（menber）によって標識されているか、あるいは、一方のペプチドの一端（例えば、Ｃ３４のＮ末端）がそのような対の一方の成分（ＥＤＡＮＳ）で標識され、Ｎ３６ペプチドに存在する天然の蛍光性トリプトファンがそのようなドナー／アクセプター対のもう一方の成分である蛍光アッセイ（例えば、ＦＲＥＴ）などの手段によって、複合体のこの２成分の結合が生じる程度を測定することによって評価することができる。Ｃ３４およびＮ３６の結合は、発光（ＦＲＥＴ）がアクセプターモデルから生じる程度、および／または放出された光の波長スペクトルが変化する程度によって評価される。候補薬物が結合を妨げることによって、光を発する程度が変化し、かつ／またはＣ３４とＮ３６の結合が生じた場合に生じるであろう波長の変化が妨げられる。あるいは、Ｃ３４は、（例えば、キナーゼおよび放射活性ＡＴＰを用いて標識され得るキナーゼ認識部位を有する変異型Ｃ３４を合成することによって）放射性標識などの検出可能な標識で標識することができる。放射性標識されたＣ３４および候補薬剤は、例えば、固体表面（例えば、ビーズまたはプラスチックウエル）に固定化されたＮ３６と合わされ、そうして被検試料が作製される。標識されたＣ３４と固定化Ｎ３６との結合が生じる程度が測定され、そして候補薬物が（対照試料中に）存在しないことを除いて、被検試料が供されるのと同じ条件下において、固定化Ｎ３６に対する標識されたＣ３４の結合が生じる程度と比較される。典型的には、この評価は、試料が、Ｃ３４／Ｎ３６の結合が生じ、そしてその後、未結合のＣ３４および候補薬物を除くために洗浄されるのに適切な条件下で十分な時間にわたって保持された後に行われる。被検試料において固定化Ｎ３６に結合した放射性標識が対照試料の場合よりも少ないことによって明らかにされるように、結合が、被検試料において、対照試料の場合よりも小さい程度で生じた場合、その候補薬物はＣ３４とＮ３６の結合のインヒビターである。あるいは、Ｃ３４における標識またはタグを結合形成対の一方の成分とすることができ、そのもう一方の成分が、Ｎ３６に対する結合を検出するために使用される。例えば、Ｃ３４は、（例えば、標準的な固相ペプチド合成によって）ビオチンで標識（tagged）することができ、そして溶液状態であり得るか、あるいはビーズ、ウエルまたは平坦／平面の表面などの固体表面に結合させることができるＮ３６と、候補薬物とともに合わせることができ（被検試料）、あるいは候補薬物または非存在下で合わせることができる（対照試料）。Ｎ３６に対するＣ３４の結合は、Ｃ３４におけるビオチンに結合し、その後、その標識によりそれ自体が検出される標識されたストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、ストレプトアビジン−ＡＰ、またはヨウ素化ストレプトアビジン）の使用などによってＮ３６と結合したビオチンの存在を検出することによって評価される。被検試料においてＮ３６で検出されるビオチンが対照試料の場合よりも少ないことによって明らかにされるように、結合が、候補薬物の存在下（被検試料の場合）において、候補薬物の非存在下（対照試料の場合）よりも小さい程度で生じる場合、その候補薬物はＣ３４／Ｎ３６の結合のインヒビターである。そのような候補薬物は、例えば、合成された有機化合物またはランダムなペプチド配列のライブラリーから得ることができる。そのようなライブラリーは、合成的あるいは組換え技術によって作製することができる。
【００４５】
類似する様式で、Ｃ３４／Ｎ３６の結合を破壊する候補薬物の能力を評価して、Ｃ３４／Ｎ３６のインヒビター、従って、ＨＩＶ感染のインヒビターを同定することができる。この実施形態において、事前に形成されたＣ３４／Ｎ３６複合体が、該複合体を破壊するその能力の評価対象の候補薬物と合わされ、そうして被検試料が作製される。対照試料は、対照試料が候補薬物を含有しないことを除いて被検試料と同じである；対照試料は、被検試料と同じように処理される。Ｃ３４／Ｎ３６の結合が候補薬物の存在下で破壊され、対照試料中で破壊されない場合、あるいは複合体の破壊が、被検試料において、対照試料の場合よりも大きな程度で生じる場合、その候補薬物はＣ３４／Ｎ３６のインヒビター（破壊剤）である。結合破壊の検出は、（例えば、ＦＲＥＴまたは蛍光アッセイによって、あるいは放射性標識またはビオチンなどの他の検出可能な標識を検出することによって）Ｃ３４／Ｎ３６結合の防止の／妨害の検出に関して上記に記載されているように行うことができる。
【００４６】
本明細書中に記載されている結果は、ハイブリッド（すなわち、融合タンパク質）がタンパク質（ＧＣＮ４など）の三量体状のコイルドコイル領域とＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルとの間で形成され得ること、およびそのようなハイブリッドが三量体であり（すなわち、凝集しておらず）、１００％のらせん状であることを明らかにしている。本明細書中に記載されている結果はまた、そのような融合タンパク質はＮ−ペプチドの大きなくぼみ（すなわち、疎水性ポケット）の構造を破壊または変化しないことを明確に示している。これは、ＩＱＮ１７（リガンドを含まず、Ｄ１０ｐｅｐ１との複合体状態；実施例５を参照のこと）において、本質的にはＮ３６の場合（すなわち、Ｃ３４との複合体状態；Ｃｈａｎ  Ｄ．Ｃ．他、Ｃｅｌｌ、８９，２６３（１９９７））と同じである。
【００４７】
図５Ａ、図５Ｂおよび図６は、本明細書中に記載されているペプチドの評価結果を示している。図５Ａ〜５Ｂにおいて、ＩＱＮ１７の結晶構造が、３つの鎖からなる連続したコイルドコイルであることが明らかにされている；ＨＩＶ  ｇｐ４１に由来する１７残基により、ｇｐ４１の結晶構造において見出された疎水性ポケットと非常に類似した疎水性ポケットが形成されている。示されているように、Ｄ１０ｐｅｐ１はこのポケットに結合し、そして本明細書中に記載されているＤ−ペプチドインヒビターのすべてに見出されている保存された残基（ロイシン、トリプトファン、トリプトファン）に対応するＤ１０ｐｅｐ１の残基がこのポケットに詰め込まれる。明らかに、このことは、これらの保存された残基を含む他のＤ−ペプチドインヒビターが同じようにＩＱＮ１７に結合するであろうことを示している。図６には、Ｃｈａｎ他（Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５：１５６１３〜１５６１７（１９９８））によって記載された方法に従って行われたシンシチウムアッセイの結果が示されている。図６にその結果が示されている実験では、本明細書中の記載に従って同定されたＤ−ペプチドが使用された。それぞれの場合において、ブロック基（例えば、アセチル基）がそのＮ末端に存在し、ＣＯＮＨ2 （アミド）がそのＣ末端に存在した。これらのアッセイの結果は様々なＩＣ50濃度を示した。この場合、ＩＣ50は、ペプチドを含まない対照と比較して、半数のシンシチウムが認められる濃度である。例えば、Ｎ末端に２個のリジンを有するＤ１０ｐｅｐ５は約６μＭのＩＣ50を有している。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を同定する方法に関する。この場合、さらに、そのアッセイは、上記に記載されているＣ３４／Ｎ３６複合体アッセイとは異なり、結合の喪失または低下を評価することに基づいている。これは、このアッセイが、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域によって形成される溝の任意の部分との相互作用を含み、あるいはそのような相互作用を検出する点でより一般的なアッセイであり、この実施形態は、ＨＩＶ  ｇｐ４１の疎水性ポケット（Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみ）に注目している。この実施形態において、この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみに結合するその能力についての評価対象の候補薬物を、タンパク質のコイルドコイル領域の三量体型、およびＨＩＶ  ｇｐ４１のくぼみを含むのに充分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドを含む融合タンパク質と、ペプチドまたは他の分子による結合のためにＨＩＶ  ｇｐ４１が提示されるのに適切な条件のもとで合わせる工程、および、候補薬物がその融合タンパク質を結合するかどうかを（例えば、高処理能スクリーニングで）測定する工程を含む。結合が生じる場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合する薬物であり得る「当たり（hit）」である。結合が生じる場合、その候補薬物は、Ｎ−ヘリックスのコイルドコイルに結合しており、それがコイルドコイルのくぼみに結合しているかどうかを明らかにすることができる。その後、そのような「当たり」は、その候補薬物が薬物になるかどうかを決定するために、細胞／細胞融合アッセイおよびＨＩＶ感染力アッセイなどの二次アッセイでスクリーニングされ得る。あるいは、さらに、そのような「当たり」は、ポケット結合分子が結合しない他の融合タンパク質（またはペプチド）を用いた対抗スクリーニングの使用によってさらに評価することができる。例えば、（ＩＱＮ１７の場合と同じ３つの表面変異を有する）ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、または疎水性ポケットにおける点変異を有するＩＱＮ１７の一形態であるＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）（これは、グリシン３９が、ポケットへの大きな突出をもたらすトリプトファンに変異している）を対抗スクリーニングにおいて使用することができる。この例において、ＩＱＮ１７には結合するが、（ＩＱＮ１７の場合と同じ３つの表面変異を有する）ＧＣＮ４−ｐＩQ ＩまたはＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）には結合しない候補薬物が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合する薬物である。
【００４９】
さらなる実施形態において、競合的アッセイが行われる。この実施形態において、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合するペプチドまたはタンパク質が、候補薬物および融合タンパク質と合わされ、その後、候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のくぼみを結合するかどうかが、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスのらせん状くぼみを結合するペプチドの存在下で測定される。候補薬物が融合タンパク質を結合する場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のくぼみを結合する薬物である。例えば、ＧＣＮ４の、三量体状のコイルドコイル領域と、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを含むＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドのＣ末端とを含む融合タンパク質（ＩＱＮ１７）が、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合する「参照」Ｄ−ペプチド（例えば、本明細書中に記載されているＤ−ペプチドのいずれかまたはその変異体）、およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と合わされ、そうして被検試料が作製される。その後、被検試料は、くぼみに結合するＤ−ペプチドの結合に関して適切な条件のもとで維持される。候補薬物を除いて被検試料と同じ成分を含み、かつ被検試料と同じように扱われる対照試料もまた評価される。両方の試料において、参照Ｄ−ペプチドの結合が評価される。参照Ｄ−ペプチドの結合が、候補薬物の存在下（被検試料の場合）において、その非存在下の場合（対照試料の場合）よりも小さい程度で生じる場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合する薬物である。結合の検出は、例えば、本発明のＣ３４／Ｎ３６の実施形態に関して上記に記載されているような類似した方法で評価される。例えば、Ｄ−ペプチドは、放射性標識または結合形成対の一方の成分（例えば、ビオチン）などの検出可能な標識で標識され、その後、（参照Ｄ−ペプチドがくぼみに結合するのに適切な条件のもとで被検試料が保持された後において）Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみが有する標識の程度が測定される。放射性標識が使用される場合、融合タンパク質が放射性標識を有する程度が被検試料において評価され、そして対照試料において融合タンパク質が放射性標識を有する程度と比較される。検出可能な標識が結合形成対の一方の成分（例えば、ビオチン）である場合、融合タンパク質が結合する程度を参照Ｄ−ペプチドにより検出するために、その結合形成対の第２成分（結合パートナー）が試料に加えられる。これは、直接的に、あるいは（例えば、結合形成対の第２成分に結合する抗体または他の成分などの分子を加えることによって）間接的に行うことができる。候補薬物がくぼみに対するＤ−ペプチドの結合を（完全または部分的に）阻害する場合、標識は、融合タンパク質（Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみ）にはほとんど存在していない。結合が、被検試料の場合（候補薬物の存在下）において、対照試料の場合（候補薬物の非存在下の場合）よりも小さい程度で生じた場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合する薬物である。
【００５０】
Ｄ−エナンチオマーのＩＱＮ１７またはその変異体は、ライブラリーまたはコレクションの成分であり、かつｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合する分子または化合物を同定するために有用である。例えば、ファージディスプレイライブラリーなどの分子または化合物のライブラリーまたはコレクションは、ポケットを結合する成分を同定するために、Ｄ−エナンチオマーのＩＱＮ１７を用いてスクリーニングすることができる。これは、本明細書中に記載されているように問題なく行われている。ＩＱＮ１７の鏡像体またはその変異体は、標的分子として使用される。本明細書中で使用されている用語である「ポリペプチドのＤ−エナンチオマー」および「Ｄ−ペプチド」は、天然の掌体にある分子の完全な鏡像体をいう。従って、第２のキラル中心を含有するアミノ酸残基（ＩｌｅおよびＴｈｒなど）の場合、天然に存在するアミノ酸残基の完全な鏡像体が、ポリペプチドのＤ体を作製するために使用される。本明細書中で同様に使用されている用語の「Ｄ−アミノ酸」および「Ｌ−アミノ酸」はともに、非キラルなアミノ酸であるグリシンを含むことを意味する。Ｄ−ＩＱＮ１７は、結合形成対の一方の成分（例えば、ビオチン）をそれに付加し、そしてその結合形成対のもう一方の成分（例えば、ストレプトアビジン）を固体表面に付加することなどによって固体表面に固定化することができる。この２成分が結合することにより、ファージパンニングなどのためにＤ−ＩＱＮ１７が固体表面に固定化される。酵素の認識部位であるリンカー（例えば、Ｌ−リジン残基が使用されるＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙなどのアミノ酸リンカー）を、酵素の認識部位（この場合、トリプシンの認識部位）を提供するためにＤ−ＩＱＮ１７配列と結合形成対成分との間（ビオチンとＤ−ＩＱＮ１７との間）に設置することができ、その結果、結合したファージを、酸の添加などの非特異的な溶出よりはむしろ、トリプシン消化によって溶出することができる。ファージディスプレイライブラリーは、適切なファージ遺伝子に融合させた任意の適切な長さのＬ−アミノ酸ペプチドのライブラリーであり得る。１つの実施形態において、そのようなライブラリーは、Ｍ１３ファージのｇＩＩＩ遺伝子に融合させたＬ−アミノ酸ペプチドのファージディスプレイライブラリーである。ペプチドは、１つの実施形態において、両端にシステインまたはセリンのいずれかが隣接した１０個のランダムにコードされたアミノ酸残基を含む。典型的には、数回のパンニングが行われる。Ｄ−ＩＱＮ１７に特異的に結合するファージが同定される。Ｄ−ＩＱＮ１７のｇｐ４１領域のみを結合するファージを、パンニング後の評価によって、例えば、抗原を有しないウエルに対してスクリーニングを行い、その後、一連の分子に対してさらに試験することによって同定することができる。例えば、特異的なポケット結合性ファージには、Ｄ−ＩＱＮ１７を結合するが、（ＩＱＮ１７の場合と同じ３つの表面変異を有する）Ｄ−ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、または疎水性ポケットにおける点変異を有するＤ−ＩＱＮ１７の形態であるＤ−ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）（これは、グリシン３９が、ポケットへの大きな突出をもたらすトリプトファンに変異している���には結合しないファージが含まれる。このような方法で同定されたＤ−ペプチドは、細胞／細胞融合アッセイおよびＨＩＶ感染力アッセイなどの知られているアッセイを使用して、ＨＩＶ  ｇｐ４１を阻害するその能力について評価することができる。本明細書中に記載されている鏡像ファージディスプレイ法により、ＩＱＮ１７およびＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）ならびにそれらのＤ−エナンチオマーの価値が、ｇｐ４１ポケットを結合するＨＩＶ−１侵入のインヒビターを同定する際に明らかにされた。同定された９個の特異的なポケット結合性ファージ配列（Ｄ−ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）にではなく、Ｄ−ＩＱＮ１７に結合するファージ）のうち、８個はＥＷＸＷＬのコンセンサス配列を含有し、Ｄ−ペプチドとして試験されたときにＨＩＶ−１  ｇｐ４１により誘導されるシンシチウム形成を阻害する。９番目のペプチドは細胞に対して毒性を有していたために、それ以上は調べなかった。
【００５１】
Ｄ−ＩＱＮ１７およびＤ−ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）のＤ体は、天然酵素による酵素的分解を受けない他のポケット結合分子を発見するために、他の生物学的にコードされるライブラリーを用いた類似する方法において使用することができる。例えば、他のファージディスプレイライブラリーを使用して、（例えば、両側に位置するＣｙｓ残基間に異なる数の残基を有し、かつ／またはシステイン残基が両側に位置する領域の外側にランダムにコードされたアミノ酸残基を有し、かつ／または３つ以上のシステイン残基を有する）新しいＤ−ペプチドインヒビターを同定することができる。ファージを用いることなくペプチドライブラリーをコードする方法（例えば、この場合、コードするｍＲＮＡがペプチドに結合する）を、Ｄ−ペプチドインヒビターを同定するために使用することができる。ＲＮＡライブラリーまたはＤＮＡライブラリーを（例えば、ＳＥＬＥＸ法とともに）使用して、疎水性ポケットには結合するが、天然のヌクレアーゼに対する基質ではないＬ−リボースまたはＬ−デオキシリボースに基づくＲＮＡアプタマーまたはＤＮＡアプタマーをそれぞれ同定することができる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、ＰＮＡＳ、７４：１１２８５（１９９７））。
【００５２】
天然のＬ掌体にあるＩＱＮ１７およびＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）の形態もまた、生物学的にコードされたライブラリーを用いた類似する方法において使用することはできるが、最も可能性のある適用は、他の非生物学的にコードされたライブラリーとの使用であろう。例えば、（１ビーズに１化合物の多様性を有する）ビーズにおける化学的なコンビナトリアルライブラリーを、（例えば、放射性または発色基により）標識されたＩＱＮ１７を用いてスクリーニングして、ＩＱＮ１７に結合する分子を含有するビーズを同定することができる。この例において、ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）を、そのようなビーズにおける分子がＩＱＮ１７のポケットに結合するかどうかを明らかにするための対抗スクリーニングとして使用することができる（分子がＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）に結合した場合、それらはポケット結合分子であるとは考えられない）。別の例として、ＩＱＮ１７が前もって結合しているビーズを、潜在的なポケット結合分子の混合物（例えば、化学物質または天然産物抽出物の混合物）とインキュベーションすることができる。その後、（ビーズに結合している）ＩＱＮ１７を混合物から分離し、洗浄し、次いで、ビーズ上のＩＱＮ１７に結合している分子を溶出させる条件（例えば、有機溶媒、低いｐＨ、高い温度）に供することができる。溶出された分子（すなわち、潜在的なポケット結合分子）を分析化学的方法（例えば、ＨＰＬＣ、質量分析法）によって同定することができよう。ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）を用いた対抗スクリーニングは、真のポケット結合分子を同定することを助けるために有用である。
【００５３】
上記に記載されている方法によって同定された薬物は、その後、ＨＩＶ  ｇｐ４１の機能（膜融合）、従って、細胞内への侵入を（完全または部分的に）阻害するその能力についてさらに試験される。これは、本明細書中に記載されているシンシチウムアッセイおよび／または感染力アッセイあるいは当業者に知られている他のアッセイなどのインビトロアッセイ、および／または適切な動物モデルもしくはヒトにおけるインビボアッセイをさらに使用して行われる。
【００５４】
本発明の１つの実施形態は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合する薬物、特に、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合する薬物を同定する方法である。この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と、可溶性三量体のコイルドコイル、およびＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットを含むのに充分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドを含むペプチドとを、分子または化合物（例えば、薬物）による結合に関してＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットが提示されるのに適切な条件のもとで合わせる工程、および、その候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットを結合するかどうかを測定する工程を含む。候補薬物とＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットとの結合が生じた場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物である。所望により、候補薬物の結合は、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合するペプチド（ポケットを結合するペプチドとして以前に同定されたペプチド）が候補薬物およびそのペプチドが合わされることを除いて、上記に記載されているアッセイで評価することができる。このような競合的アッセイにおいて、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに対する候補薬物の結合が、既知の結合性成分（moiety）（ポケットを結合する分子または化合物）の存在下で評価される。候補薬物の結合がその既知の結合性成分の存在下で生じた場合、その候補薬物は、既知の結合性成分と充分に競合する充分な親和性でＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物である。この実施形態において使用される融合タンパク質は、可溶性三量体状のコイルドコイル、例えば、タンパク質の、可溶性三量体状のコイルドコイル領域（例えば、ＧＣＮ４またはＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉのタンパク質などの非ＨＩＶタンパク質、しかし、ＨＩＶタンパク質を使用することができる）と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のくぼみを含むのに充分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドとを含む。例えば、この部分は、配列番号：２０を含むことができ、あるいはくぼみを含むの充分な部分を含むことができ、そして適切な融合タンパク質または他の可溶性モデルにおいて存在する場合に、結合が得られるような方法でくぼみを提示し得る。あるいは、本明細書中に示されているＨＩＶ  ｇｐ４１の配列変異体、ヒトウイルスの別の株（例えば、ＨＩＶ−２）に由来する配列、または別の種（例えば、ＳＩＶ、ネコ免疫不全症ウイルス、Ｖｉｓｎａウイルス（Ｍ．Ｓｉｎｇｈ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９０：１０３１（１９９９））に由来する配列を融合タンパク質または可溶性モデルにおいて使用することができる。融合タンパク質は、それがＨＩＶ成分との融合タンパク質である場合、結合が得られるような方法でＨＩＶのくぼみが提示されるときには、任意のタンパク質の、可溶性三量体状のコイルドコイルを含むことができる。例えば、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、ＧＣＮ４−ｐＩＩ、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）またはＡＢＣヘテロ三量体の融合タンパク質であり得る。１つの実施形態において、融合タンパク質はＤ型のＩＱＮ１７である。別の実施形態において、融合タンパ���質は天然のＬ掌体のＩＱＮ１７である。
【００５５】
競合的アッセイ形式において、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合することが知られているペプチドはどれも、知られている結合性成分として使用することができる。例えば、本明細書中に記載されているペプチド（配列番号：３〜１２、１５、１７〜１９、２３、２４）のいずれか、あるいはその変異体またはその一部を使用することができる。また、ペプチドでない任意のポケット結合分子を競合的アッセイ形式において使用することができる。競合的アッセイは、溶液中で、あるいはビーズ上で、あるいは固体表面で行うことができる。
【００５６】
１つの実施形態において、候補薬物は検出可能に標識され、そしてＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルに対する候補薬物の結合が、（標識された候補薬物がＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合する結果として）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルにおける検出可能な標識の存在を検出することにより測定される。可溶性モデルのヘリックスコイルドコイルのポケットにおける標識の検出により、候補薬物がＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合することが示され、そして候補薬物が、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する薬物であることが明らかにされる。標識された候補薬物が融合タンパク質において検出される場合、候補薬物は、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合する薬物である。
【００５７】
ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物を同定する方法の別の実施形態において、薬物による結合が得られるような方法でポケットを提示する可溶性モデルが候補薬物と合わされ、そして候補薬物と可溶性モデルのＮ−ヘリックスコイルドコイルとの結合が生じているかどうかが測定される。結合が生ずる場合、その候補薬物は、ポケットを結合する薬物である。この場合もまた、競合的アッセイ形式を使用することができる。競合アッセイの成分（例えば、ＩＱＮ１７およびＤ−ペプチド）を、蛍光基／消光基の組み合わせを含む様々な検出可能な標識のいずれかで標識することができる。候補薬物を、上記に記載されているように、様々な検出可能な標識のいずれかで標識することができる。この実施形態において使用される可溶性モデル（融合タンパク質）の成分、および競合的アッセイ形式において使用される競合性成分もまた、上記のようでありうる。
【００５８】
本発明はまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物を製造する方法に関する。１つの実施形態において、この方法は下記のように行われる；ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを提示する可溶性モデル、あるいは（例えば、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、ＧＣＮ４−ｐＩＩ、Ｍｏ−ＭＬＶ、ＡＢＣヘテロ三量体などの非ＨＩＶタンパク質またはＨＩＶタンパク質などのタンパク質の）可溶性三量体のコイルドコイルを含む融合タンパク質が、薬物による結合のためにＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットが提示されるのに適切な条件のもとで、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合して、細胞内への侵入を阻害するその能力についての評価対象の候補薬物と合わされる。候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットを結合するかどうかが測定される。この場合、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに対する候補薬物の結合が生ずる場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物である。この実施形態において、融合タンパク質は、（例えば、ＧＣＮ４、ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ、ＧＣＮ４−ｐＩＩ、Ｍｏ−ＭＬＶ、ＡＢＣヘテロ三量体の可溶性三量体コイルドコイルなどの非ＨＩＶタンパク質またはＨＩＶタンパク質などのタンパク質の）可溶性三量体コイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを含むのに充分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド（例えば、配列番号：２０のすべてまたは一部、あるいはその変異体または改変体、あるいは別の株または種から得られる配列）とを含む。本明細書中に記載されているＩＱＮ１７をこの方法において使用することができる；ＩＱＮ１７のＤエナンチオマーもまた、（例えば、鏡像ファージ適用において）使用することができる。ＨＩＶの細胞内侵入を阻害するために製造された薬物の能力は、本明細書中に記載されているように、例えば、シンシチウムアッセイおよび／または感染力アッセイにおいて評価される。そのような能力は、適切な動物モデルにおいて、あるいはヒトにおいてさらに評価することができる。
【００５９】
本発明はまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物を製造する方法に関する。この方法は：ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの可溶性モデル（例えば、本明細書中に記載されている融合タンパク質、および特に、ＩＱＮ１７またはその変異体）を製造するか、またはそのようなモデルを得る工程；ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合するその能力についての評価対象の候補薬物（分子または化合物）と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの可溶性モデルとを合わせる工程、および、候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合するかどうかを測定する工程を含む。候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物である；結果として、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物が製造される。この実施形態において使用される融合タンパク質は、本明細書中に記載されており、例えば、ＩＱＮ１７、ＩＱＮ１７のＤエナンチオマー、またはその変異体であり得る。あるいは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物は、下記に記載される工程を含む方法によって製造することができる：本明細書中に記載されているようにして、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの可溶性モデルを製造するか、またはそのようなモデルを得る工程；そのような可溶性モデルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合するその能力についての評価対象の候補薬物とを合わせる工程；候補薬物が可溶性モデル（融合タンパク質）のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合するかどうかを測定する工程、この場合、結合が生ずる場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合する薬物である；およびＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物の能力を評価する工程、この場合、薬物がＨＩＶの細胞内侵入を阻害する場合、その薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物である。ＨＩＶの細胞内侵入を阻害するその能力は、（例えば、シンシチウムアッセイ、感染力アッセイにおいて）インビトロで、あるいは（例えば、適切な動物モデルまたはヒトにおいて）インビボで評価することができる。可溶性モデルは、タンパク質の可溶性三量体コイルドコイル（例えば、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ）などの可溶性三量体コイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットを含むのに十分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドとを含むペプチドであり得る。
【００６０】
本明細書中に記載されている方法ならびに他の方法によって同定または製造される薬物であって、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物もまた本発明の主題である。
【００６１】
本明細書中に記載されている方法ならびに他の方法によって同定または製造される薬物であって、ＨＩＶ  ｇｐ４１の２つ以上のＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物もまた本発明の主題である。そのような薬物は、阻害の有効性を増大させるために、例えば、適切なリンカー（例えば、アミノ酸残基または他の化学的成分のリンカー）を介して２つ以上のポケット結合分子（薬物）を連結することによって得ることができる。連結されるポケット結合分子は同じであってもよく、異なっていてもよい。本明細書中に記載されている方法または他の方法によって同定または製造される薬物であって、ＨＩＶｇｐ１２０、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、またはＨＩＶ  ｇｐ４１の非ポケット領域に結合することに加えて、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに結合する薬物もまた本発明の主題である。
【００６２】
ＨＩＶ  ｇｐ４１を阻害する薬物はまた、ＩＱＮ１７と、ＩＱＮ１７によって提示されるＮ−ヘリックスコイルドコイルのくぼみを結合するＤ−ペプチドとの複合体のＸ線結晶構造を参照して、例えば、本明細書中に示されているＩＱＮ１７とＤ１０ｐｅｐ１との複合体のＸ線結晶構造を参照して設計または改善することができる。あるいは、さらに、ＨＩＶ  ｇｐ４１を阻害する薬物はまた、本明細書中に示されている遊離のＩＱＮ１７のＸ線結晶構造を参照して設計または改善することができる。
【００６３】
本明細書中に記載されているようにして同定された化合物および分子（薬物）は、ＨＩＶの細胞内侵入を（部分的または完全に）阻害し、従って、未感染個体（ヒト）および感染個体において、（例えば、未感染個体における感染を防止または低減させるために、感染個体におけるさらなる感染を低減または予防するために）治療的に有用であり、そして、ｇｐ４１により誘導される膜融合の機構を研究するための研究用試薬、および個体によるウイルスクリアランス速度を評価するための研究用試薬の両方として有用であり、そしてＨＩＶの細胞内侵入を阻害する他の化合物および分子（薬物）を発見または開発するための試薬として有用である。本明細書中に記載されているＤ−ペプチド（例えば、Ｄ１０ｐｅｐ５、Ｄ１０ｐｅｐ１）は、本明細書中に記載されている感染力アッセイを使用して、細胞の感染を阻害することが示されている。他のＤ−ペプチドは、感染力を阻害するその能力について同様に評価することができる。
【００６４】
上記薬剤は、経口投与、鼻腔投与、腹腔内投与、筋肉内投与、膣投与または直腸投与などの様々な経路で投与できる。各態様では、上記薬剤が、適当な担体または医薬組成物に入れて提供される。例えば、くぼみ結合薬は、適当な緩衝液、食塩水、水、ゲル、フォーム、クリームまたは他の適当な担体に含めて投与することができる。上記薬剤ならびに一般に適当な担体および随意の成分（例えば安定化剤、吸収もしくは取込み促進剤、着香料および／または乳化剤など）を含んでなる医薬組成物を製剤化し、それを個体（ＨＩＶ未感染者またはＨＩＶ感染者）に治療有効量で投与することができる。一態様として、ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合する薬剤（例えば本明細書に記載するもの、ＤＰ１７８（Ｃ．Ｔ．Ｗｉｌｄ，Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ，Ｔ．Ｋ．Ｇｒｅｅｎｗｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．ＭｃＤａｎａｌ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，同上  ９１：９７７０（１９９４））、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１（ＨＸＢ２株）の残基１１７−１５２に相当しアミノ末端がアセチル化されカルボキシ末端がアミド化されているＴ６４９）（Ｌ．Ｔ．Ｒｉｍｓｋｙ，Ｄ．Ｃ．Ｓｈｕｇａｒｓ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：９８６（１９９８）などは、殺微生物薬として投与（または適用）され、細胞へのウイルス侵入を妨害する。例えば、ＨＩＶくぼみを結合する１または複数の薬剤を、膣、直腸または口腔粘膜などの粘膜表面に適用もしくは粘膜表面と接触させる組成物に組み込むことができる。上記組成物は、上記薬剤の他に、粘膜表面または避妊具（例：コンドーム、子宮頚部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）キャップ、ペッサリー）の表面への適用に適した担体または基剤（例：クリーム、フォーム、ゲル、その他、上記薬剤、水、緩衝液を保持するのに十分な粘性を持つ物質）を含んでなる。上記薬剤は、上記薬剤を含有するフォーム、ゲル、クリーム、水または他の担体の適用などによって、粘膜表面に適用することができる。もう一つの選択肢として、使用条件（例えば膣または直腸の温度、ｐＨ、湿度条件）下に（例えば分解、溶解、その他の放出手段によって）薬剤を放出または送達する素材で作られた、１または複数の上記薬剤を含有する担体または基剤である膣坐剤または直腸坐剤を使って適用することもできる。これらの組成物を経口的に投与（例えばカプセル、丸剤、液体、その他の形態で嚥下）して、個体の血流中に移行させることもできる。いずれの態様でも、例えば薬剤を徐々に放出するまたは所定の期間後に放出する組成物に上記薬剤を組み込むことなどによって、薬剤の制御放出または持効性放出（ｔｉｍｅ  ｒｅｌｅａｓｅ）（徐放、投与または挿入後の特定の時点での放出）を達成することができる。もう一つの選択肢として、（例えば膣、口または直腸への）投与または適用後直ちにまたは速やかに薬剤を放出する組成物に、上記薬剤を組み込むこともできる。複合的放出（例えば薬剤の一部を挿入後直ちにまたは速やかに放出すると共に、薬剤の一部を挿入後経時的に、または特定の時点で放出すること）も効果的であり得る（例えば、２種類以上の素材から構成され、一つの素材からは放出または送達が挿入後直ちにまたは速やかに起こり、および／または、一つの素材からは放出または送達が徐々に起こり、および／または、一つの素材からは指定の期間後に放出が起こる組成物を製造することなどによる）。例えば、ＨＩＶくぼみを結合する１または複数の薬剤を、米国特許第４，７０７，３６２号に記載されているような徐放性組成物に組み込むことができる。それらのクリーム、フォーム、ゲルまたは坐剤は、産児制限にも使用されるもの（例えば殺精子剤または他の避妊剤）であってもよいが、そうである必要はない（例えば、抗ＨＩＶ薬を単独で、または別の非避妊剤（抗菌薬、抗真菌薬または潤滑剤など）と組み合わせて送達するためだけに、それらを使用することもできる）。本発明の抗ＨＩＶ薬は、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルを結合する１または複数の薬剤でコーティングされている、または使用条件下での放出が可能な形でそれらの薬剤が組み込まれている避妊具（例えばコンドーム、子宮頚部キャップ、ペッサリー）を使って、個体に投与することもできる。上述のように、薬剤の放出は直ちに、徐々に、または指定した時点で起こりうる。その結果、それらの薬剤は、ＨＩＶと接触しＨＩＶを結合して、細胞へのウイルス侵入を減少させ、または防止する。
【００６５】
もう一つの態様では、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへの結合以外の機序によって細胞へのＨＩＶ侵入を妨害する薬剤（例えば、ＣＤ４段階でｇｐ１２０結合を妨害することによって、ウイルス侵入を妨害する薬剤）が、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルに結合する薬剤について上述したように、粘膜表面に投与または適用される。
【００６６】
本発明の融合タンパク質は、可溶性三量体型または可溶性三量体状のコイルドコイル、例えばある（非ＨＩＶ由来またはＨＩＶ由来の）タンパク質の可溶性三量体型または可溶性三量体状のコイルドコイル領域などと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドのＣ末端のうちＨＩＶコイルドコイルくぼみまたは疎水性ポケットを包含する（構成する）のに十分な部分（Ｎ−ペプチドのポケット構成残基）とを含んでなる。ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、別のＨＩＶ株、または他の種に由来する株（例えばサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全症ウイルスまたはビスナウイルスなど）のものであってよい。例えばＨＩＶ−２配列ＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶＴ（配列番号：２６）、ＳＩＶ配列ＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＴＲＶＴ（配列番号：２７）、またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ中の不変残基からなる配列（ＬＬＸＬＴＶＷＧＸＫＸＬＱＸＲＸＸ（配列番号：４２）で表される；ここにアミノ酸残基Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｋ、ＱおよびＲはアミノ酸残基に使用される一文字コードであり、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）。また本発明の主題はＨＩＶ  ｇｐ４１疎水性ポケットの可溶性三量体モデルであり、これはＤ−ペプチドであってもＬ−ペプチドであってもよく、可溶性三量体コイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドのうちＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル領域のポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに十分な部分とを含んでなる。上記Ｄ−またはＬ−ペプチドは、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、ＧＣＮ４−ｐＩＩ、モロニーマウス白血病ウイルスまたはＡＢＣヘテロ三量体のコイルドコイルを、可溶性三量体コイルドコイルとして含んでなることができる。ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドのうち該ポケットのアミノ酸残基を含むのに十分な部分である成分は、例えばＨＩＶ−１のＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号：２０）、ＨＩＶ−２のＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶＴ（配列番号：２６）、ＳＩＶのＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＴＲＶＴ（配列番号：２７）またはこれらの不変残基、すなわちＬＬＸＬＴＶＷＧＸＫＸＬＱＸＲＸＸ（配列番号：４２）を含んでなることができる。
【００６７】
本発明の一態様は、あるタンパク質（ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉなど）の三量体状のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルとの融合タンパク質であって、Ｎ−ヘリックスくぼみの全部または一部を含むか、Ｎ−ヘリックスくぼみを含まないものである。すなわち、本発明の融合タンパク質は、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの三量体型のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ−１  ｐｇ４１のＮ−ペプチドの一部を含んでなることができ、そのｇｐ４１のＮ−ペプチドの一部は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスくぼみの一部または全部を含むか、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスくぼみを含まない。例えば、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ由来の残基とＮ−３６由来の残基を含有する融合タンパク質を作成することができる。ＩＱＮ２４ｎと表記される融合タンパク質は、溶解性を増すための３つの突然変異を含むＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの２９残基と、Ｎ３６のＮ−末端に由来する２４残基（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴ）（配列番号：２１）を含有し、大腸菌での組換え発現用に、余分のＭｅｔ残基がＮ−末端に追加されている。例えば、融合タンパク質は、（配列番号：２１）のアミノ酸配列を含んでなるＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの一部を含んでなることができる。ＩＱＮ２４ｎの配列は、ＭＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴ（配列番号：２２）である。この融合タンパク質は、化学合成法または組換えＤＮＡ法などの様々な方法によって、もしくは大腸菌での組換え発現によって製造することができ、その場合はＮ−およびＣ−末端はブロックされない。ＧＣＮ４−ｐＩQ ＩコイルドコイルのコイルドコイルパラメーターはＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルとほぼ同一であるので、得られる融合タンパク質分子（ＩＱＮ２４ｎ）は、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの一部を（凝集していない）三量体として提示する長い三量体コイルドコイルを形成すると予想される。
【００６８】
本発明のもう一つの態様は、個体における免疫反応を誘発する方法を提供する。ｇｐ４１  Ｎ−末端領域コイルドコイルの一部分に関する可溶性三量体モデルを作成するために使用した戦略は、ＨＩＶワクチン候補の開発にも役立つ。将来的なＨＩＶワクチンの一つの目標は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質複合体の「プレヘアピン」中間体に結合する中和抗体反応を誘発することである。この過渡的な形態では、ｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域は露出しているが、Ｃ−ヘリックス領域は露出していない。ｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域に対する抗体反応を誘発するには、免疫原として、Ｎ−ペプチド（Ｎ３６、Ｎ５１またはＤＰ−１０７など）を使用することが妥当であるように思われるが、単離されたＮ−ペプチドは凝集し、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイル三量体を正しく提示しない。したがって、一般に、ｇｐ４１疎水性ポケットに関するこの問題を解決するために本明細書に記載する戦略と同じ戦略を、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイル領域の可溶性三量体モデルの開発にも適用することができる。このような三量体モデル（ＩＱＮ１７など、ただし例えばｇｐ４１のポケット残基を含まないペプチドも挙げられる）を免疫原として使用することにより、プレヘアピン中間体に対する抗体反応を誘発し、それによってＨＩＶ−１感染を阻害することができる。例えば、免疫化しようとする個体には、あるタンパク質の三量体型のコイルドコイル領域とＨＩＶ−１  ｇｐ４１由来のＮ−ペプチドの一部とからなり、そのｇｐ４１由来の部分がＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの一部または全部を含むか、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを含まない融合タンパク質を、医薬的に許容できる担体に入れて投与することができる。例えばＩＱＮ２４ｎを単独で、または他の物質と組み合わせて、ワクチンに使用することができ、そのワクチンは、それが投与される個体（ワクチン接種者）中で上記コイルドコイルに結合する抗体の産生を誘発し、それによって感染および／または疾患からの保護を与えるだろう。ＩＱＮ２４ｎはＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合する抗体（モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体）を（ヒト、その他の動物、または抗体ライブラリーから）同定するため、および／または、それらの抗体を産生させるためにも使用できる。これは、ＩＱＮ２４ｎ（またはＩＱＮ１７もしくは他の可溶性三量体モデル）を使って、生物学的試料（例えば血液）中のＮ−ヘリックスコイルドコイルを結合する抗体の存在／不在／レベルを評価する診断法の基礎になる。
【００６９】
本明細書に記載する融合タンパク質（例えばＩＱＮ１７またはＩＱＮ２４ｎ）のＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ成分には、それらの変化がコイルドコイルの三量体状態を変化させないという条件で、任意の多種多様な変異を施し、上記の方法に使用することができる。ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ３６ペプチドに由来する部分である融合タンパク質成分のアミノ酸組成を変化させて、変異体（例えばＩＱＮ１７またはＩＱＮ２４ｎの変異体）を作成することもできる。コイルドコイルの三量体状態およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドコイルドコイルに相当する融合タンパク質の表面の構造が維持されるのであれば、可能なアミノ酸残基変化の数または種類に制限はない。ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドの一部である融合タンパク質成分は、Ｎ−ヘリックスくぼみの全部または一部を含んでもよいし、Ｎ−ヘリックスくぼみを含まなくてもよい。例えば、Ｎ５１、Ｎ３６、ＤＰ−１０７の他の部分またはＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックス領域の他の領域を、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ（または別の三量体状のタンパク質のコイルドコイル領域）に融合して、（凝集していない）三量体らせんコイルドコイル融合タンパク質を作成し、それを上記の方法に使用することができる。コイルドコイルの三量体状態およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドコイルドコイルに相当する融合タンパク質の表面の構造が維持されるのであれば、設計し作成することができる融合タンパク質の数と種類に制限はない。そのような融合タンパク質は、例えばコイルドコイルのヘプタドリピート位置またはコイルドコイルパラメーターを評価するなどといった、当業者に知られている方法を使って、設計し作成できる。
【００７０】
本明細書には、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）のＮ−ヘリックスコイルドコイルの表面にあるくぼみに結合するペプチド（Ｄ−ペプチドであってもＬ−ペプチドであってもよい）が記載される。そのようなペプチドは、それらが、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみとＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域のアミノ酸残基の相互作用を妨害し細胞へのＨＩＶ侵入を防止するような形でくぼみを結合するのに足りる長さを持つのであれば、どのような長さであってもよい。例えば、Ｄ−またはＬ−ペプチドは少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、一般的には約２〜約２１アミノ酸残基になるだろう。すなわち、それらは約２〜約２１個の範囲の任意のアミノ酸残基数からなりうる。アミノ酸残基は、後述するように、天然型または非天然型または修飾型のアミノ酸残基でありうる。ペプチドは直鎖状でも環状でもよい。
【００７１】
本明細書に記述するように同定されるＤ−ペプチドの例を図３に示す。ライブラリーの設計上、各ペプチドには、示したアミノ酸残基に加えて、Ｎ−末端にＧＡが、Ｃ−末端にＡＡが隣接している。Ｎ−末端のリジン残基は水溶性を向上させるために付加した。
【００７２】
一態様として、本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１エンベロープタンパク質のＣ−ヘリックスに対するＮ−ヘリックスコイルドコイルの結合を阻害する化合物を提供する。このような化合物はＨＩＶに感染した患者または潜在的にＨＩＶに感染しやすい患者を治療する方法に役立つ。これらの化合物は、もう一つの化合物のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへの結合能を評価する方法にも役立つ。
【００７３】
一態様として、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１エンベロープタンパク質のＣ−ヘリックスに対するＮ−ヘリックスコイルドコイルの結合を阻害する化合物は、次の式Ｉの化合物である：
2010180217.tif 000007
式中、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥはそれぞれ独立して１つのＤ−アミノ酸残基、１つのＬ−アミノ酸残基、または１つのＮ−置換グリシル残基である。天然アミノ酸残基または非天然アミノ酸残基を使用できる。Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮはそれぞれ独立して１つのアミノ酸残基、または同一でも異なってもよい２〜約６アミノ酸残基のポリペプチド基であり、ｎ、ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１である。Ｆは直接結合または二官能性連結基であり、ｓは０または１である。
【００７４】
式Ｉの化合物の部分集合の一つでは、Ａが次式のＤ−アミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基である：
2010180217.tif 000008
式中、ＲA1とＲA2の一方は、置換されたまたは非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合へテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル、ベンゾ縮合へテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり、他方は水素である。Ｗは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン（例えばフッ素、塩素、臭素またはヨウ素）である。
【００７５】
Ｂは、グリシル残基または次式のＤ−アミノ酸またはＮ−置換グリシル残基である：
2010180217.tif 000009
式中、ＲB1とＲB2の一方は、置換されたまたは非置換の直鎖状、分枝鎖状または環状アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基であり、他方は水素である。Ｘは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など）である。
【００７６】
Ｄは、次式のＤ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基である：
2010180217.tif 000010
式中、ＲD1とＲD2の一方は、置換されたまたは非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合へテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル、ベンゾ縮合へテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり、他方は水素である。Ｙは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など）である。
【００７７】
Ｅは、次式のＤ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基である：
2010180217.tif 000011
式中、ＲE1とＲE2の一方は、置換されたまたは非置換の直鎖状、分枝鎖状または環状アルキル、アリールまたはアリールアルキル基であり、他方は水素である。Ｚは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など）である。
【００７８】
Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮはそれぞれ独立して、１〜約６個の（同一でも異なってもよい）Ｄ−アミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基、Ｎ−置換グリシル残基またはそれらの組み合せからなる。天然アミノ酸残基または非天然アミノ酸残基を使用できる。１つまたは複数のアミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基が、随意に、α−炭素がメチルまたはトリフルオロメチル基もしくはハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子など）で置換されていてもよい。
【００７９】
好ましい一態様として、ＲA1とＲA2の一方およびＲD1とＲD2の一方は独立してフェニル、置換フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ナフチルメチル、置換ナフチルメチル、ベンジルまたは置換ベンジル基であるか、式：
2010180217.tif 000012
［式中、ＪはＯ、ＳまたはＮＲであり、ＲはＨまたは直鎖状、分枝鎖状もしくは環状のＣ1 −Ｃ6 アルキル、好ましくはメチルである。Ｒ1、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 は、水素、ハロゲンおよびアルキル、好ましくは直鎖状、分枝鎖状、または環状のＣ1 −Ｃ4 アルキル（メチルなど）からなる群より独立して選択される］の基である。好適なフェニル、ナフチル、ナフチルメチルおよびベンジル置換基としては、アルキル、好ましくは直鎖状、分枝鎖状または環状のＣ1 −Ｃ4 アルキル（メチルなど）およびハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など）が挙げられる。より好ましくは、ＲA1とＲD1は共に水素であり、ＲA2とＲD2はそれぞれ独立して上述した基の一つである。
【００８０】
ＲB1とＲB2の一方は水素、置換されたまたは非置換の直鎖状、分枝鎖状または環状Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチルまたはナフチルメチルであることが好ましい。好適な置換基としては、直鎖状、分枝鎖状または環状のＣ1 −Ｃ4 アルキル基およびハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など）が挙げられる。より好ましくは、ＲB1は水素であり、ＲB2は上述した基の一つである。
【００８１】
ＲE1とＲE2の一方は、置換されたまたは非置換の直鎖状、分枝鎖状または環状Ｃ1 −Ｃ6 アルキル基であるか、置換されたまたは非置換のフェニルもしくはナフチル基であることが好ましい。好適な置換基としては、直鎖状、分枝鎖状または環状のＣ1 −Ｃ4 アルキル基（メチルなど）およびハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素など）が挙げられる。ＲE1は水素であり、ＲE2は上述した基の一つであることが、より好ましい。
【００８２】
式Ｉの化合物の好ましい部分集合では、ＡとＤが、それぞれＤ−トリプトファン残基であり、ＥはＤ−ロイシン残基である。
【００８３】
Ｋは、アミノ−、カルボキシル−またはスルフヒドリル置換側鎖を含有するＤ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基（システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはリジン残基など）であり、Ｌは２〜３個のＤ−アミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基（それらＤ−またはＬ−アミノ酸残基は同一でも異なってもよい）またはＮ−置換グリシン残基からなるポリペプチドであることが好ましい。例えば一態様として、Ｌは、Ｄ−グリシン、Ｄ−アラニンまたはＤ−α−Ｃ1 −Ｃ4 −アルキルグリシンの中から選択される２〜３個の残基からなる。
【００８４】
Ｍは、２〜約８個のＤ−アミノ酸残基（そのうち少なくとも一つは、アミノ−、カルボキシ−またはスルフヒドリル−置換側鎖を含有するシステイン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはリジン残基などのアミノ酸残基）からなるポリペプチド基であることが好ましい。Ｎは、１〜約６個のアミノ酸残基（そのうち少なくとも一つはリジン残基である）からなるポリペプチド基であることが好ましい。
【００８５】
二価連結基Ｆの独自性は、それが、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみと相互作用する位置にＡ〜Ｅの残基を配置させるのに適した長さであるならば、重要ではない（Ｊ．Ｒ．Ｍｏｒｐｈｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１：５９−６５（１９９８））。例えばＦは、約２〜約４０原子の長さを持つことが好ましい。一態様として、Ｆは直接結合であるか、式：−Ｐn −のポリペプチド連結基である（式中、ｎは１〜約１２であり、各Ｐは独立してＬ−またはＤ−アミノ酸もしくはＮ−置換グリシル残基またはグリシル残基もしくはＮ−置換グリシル誘導体である）。
【００８６】
もう一つの態様では、Ｆが、置換されたまたは非置換のＣ4 −Ｃ40−アルキレン基、例えば式：−（ＣＨ2 ）m −のポリメチレン基（式中、ｍは約４〜約４０である）などであるか、１または複数の位置が窒素、酸素またはイオウ原子などのヘテロ原子によって介在されているアルキレン基である。例えばＦは、（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）q −の基（式中、ｑは１〜約２０である）でありうる。またＦは、１または複数の位置が、フェニレンまたはヘテロアリーレン基もしくは多糖基（例えばグリコシド基、もしくは１または複数のグリコシド基（例えば１〜約１０個のグリコシド基）からなるポリ（グリコシド）基）で介在されているアルキレン基であってもよい。好適なグリコシドとしては、グルコシド、ラクトシド、マンノシド、ガラクトシド、フコシド、フルクトシド、グロシド、アロシド、アルトロシド、タロシド、イドシド、その他当該技術分野で知られれているもの（ピラノシド類およびフラノシド類など）が挙げられる。
【００８７】
Ｃ−末端アミノ酸残基を持つ式Ｉの化合物では、そのＣ末端残基は、当該技術分野で知られているように、例えばアミド、Ｎ−置換アミドまたはカルボン酸保護基の形であってもよい。Ｎ−末端残基の窒素原子は、当該技術分野で知られているように、アシル化（例えばアセチル化）されていてもよく、あるいはアミノ保護基で置換されていてもよい。
【００８８】
本明細書において「Ｄ−アミノ酸残基」という用語は、Ｄ−グリセルアルデヒドと同じ絶対配置を持つα−アミノ酸残基を指す。そのアミノ酸残基が、第１の非水素α置換基と、メチルおよびハロゲンから選択される第２のα置換基とを含む場合、その絶対配置は、グリセルアルデヒドα炭素上に水素原子の代わりに当該第２のα置換基を持つＤ−グリセルアルデヒドと同じである。
【００８９】
本明細書に記載のペプチド、当該ペプチドの一部、当該ペプチドの変異体／誘導体または当該変異体／誘導体の一部は、細胞へのＨＩＶ侵入のインヒビターとして使用できる。図３に記載のペプチド、またはコイルドコイルのＣ末端にある疎水性ポケットに収まり、ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域のＮ−ペプチド領域との相互作用を防ぐのに十分なペプチドの一部は、ＨＩＶ感染を阻止するのに役立つ。記載した任意のペプチドまたはその誘導体の一部は、２〜２０アミノ酸残基（２から２０までの任意の残基数）の大きさをとりうる。本明細書に記載のコンセンサス配列トリプトファン−トリプトファン−ロイシンまたは配列トリプトファン−トリプトファン−ロイシン−グルタミン酸および追加の残基からなるＤ−ペプチドを使用することができる。そのようなＤ−ペプチド中に存在する他の残基とそのＤ−ペプチドの大きさは、本明細書に記載のペプチドを参照して選択することができ、あるいは、そのペプチドが疎水性ポケットに収まりインヒビターとして作用できるような形で上記の３または４残基が配置されるという条件で、本明細書に記載のペプチドとは無関係に設計することもできる。本明細書に記載のＤ−ペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端または両方に追加のアミノ酸残基が存在して、より大きなペプチドになっていてもよい。あるいは、例えば結合親和性を高めるために、選択された他のアミノ酸残基が存在してもよい。あるいは、図３のＤ−ペプチドの保存されたアミノ酸残基を含んでなるペプチドを使用することもできる。例えばそのようなペプチドは１６アミノ酸残基の大きさで、保存されたアミノ酸残基を含むことができ、それら保存されたアミノ酸残基は図３に示すペプチドにおけるそれらの位置と同じ位置にありうる。介在アミノ酸残基は図３に示すいずれかのペプチド中でそれらの位置にあるアミノ酸残基とは異なってもよく（例えばそれら介在アミノ酸残基はイソロイシンまたはアスパラギンまたは図３に記載のペプチドには認められない他のアミノ酸残基であってもよく）、あるいは、それら介在アミノ酸残基で図３に示す別のペプチドの特定の位置に示されるアミノ酸残基を置換するか、それら介在アミノ酸残基を当該別のペプチドの特定の位置に示されるアミノ酸残基で置換することができる（例えばＤ１０ｐｅｐ１中のアスパラギン酸残基をセリン残基で置換することができる）。天然タンパク質中に見出される２０種類のＬ−アミノ酸のＤ−状以外のアミノ酸残基も使用できる。そのような改変は、例えば、ペプチドの生物学的利用能、結合親和性または他の特性を向上させるために施すことができる。Ｄ−ペプチドは図３に示すペプチド中に存在する保存されたアミノ酸残基を含んでなりうるが、それらは図３に示す介在アミノ酸残基の数よりも少ない（または多い）アミノ酸残基で分離されていてもよい。例えば図３に示すコンセンサス配列中の最初のシステインとグルタミン酸との間には、５残基より少ないアミノ酸残基が存在してもよい（例：Ｔａｒｒａｇｏ−Ｌｉｔｖａｋ，Ｌ．ら，ＦＡＳＥＢ，Ｊ．，８：４９７（１９９４）；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２７５：４４０（１９９６）、Ｔａｒｒａｇｏ−Ｌｉｔｖａｋ，Ｌ．ら，ＦＡＳ���Ｂ，Ｊ．，８：４９７（１９９４）；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２７５：４４０（１９９６））。あるいは、これら２つの残基は、５残基より多いアミノ酸残基で分離されてもよい。内部修飾も（例えばペプチドの結合を増進したり、溶解度を増大させるために）施しうる。例えばＤ１０ｐｅｐ５の最初のトリプトファンは、溶解度を増大させるためにアルギニンで置換することができる。Ｄ−ペプチドはそのＮ−末端に追加の成分またはアミノ酸を持つことができる。例えばＮ末端を保護する成分またはＮ末端に本来存在する電荷を除く成分を付加することができる。この成分は、例えば、グリシン（Ｇ）に直接結合したアセチル基などのブロック成分、またはＧのＮ−末端に結合した１または複数の追加のアミノ酸残基に結合したアセチル基、例えばＮ末端のＧに順番に結合している１または複数のリジン残基に結合しているアセチル基などでありうる。一態様として、例えばペプチドの溶解度を増大させるために２つのリジン残基をＮ−末端のＧに結合し（ＫＫＧＡＣ．．．．）、その末端リジンにアセチル基などのブロック成分を結合することができる（アセチル基ＫＫＧＡＣ．．．．）。もう一つの態様として、４つのリジン残基をＮ−末端のＧに結合する。これに加えて、Ｄ−ペプチドはそのＣ−末端にも、追加のおよび／または改変された成分もしくはアミノ酸を持ちうる。例えば、Ｃ末端にあるアラニン残基の１つまたは両方を改変し、および／または、１または複数の残基をＣ末端に追加して、例えば結合を増進させることができる。もう一つの選択肢として、アミノ酸残基以外の官能基（化学基）を組み込んで、本発明のインヒビターを作成することもできる。例えば、これら追加の化学基は、Ｎ末端、Ｃ末端、両末端、または内部に存在できる。また、阻害の有効性を増大させるために、２またはそれ以上のＤ−ペプチドを適当なリンカー（例えばアミノ酸残基または他の化学成分のリンカー）を介して連結することもできる。もう一つの選択肢として、阻害の有効性を増大させるために、１または複数のＤ−ペプチドを、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４またはＨＩＶ  ｇｐ４１の非ポケット領域に結合する分子（薬剤）に、適当なリンカーを介して連結することもできる。
【００９０】
Ｄ−ペプチド（またはＬ−ペプチドもしくはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の両方を含むペプチド）は、化学法や組換え法などの既知の方法を使って製造できる。ポリペプチド主鎖は、そのペプチドの１または複数の位置で、改変（例えばＮ−メチル化）し、または代替骨格（例えばペプトイド）で置換することができる。ペプチドには、例えばそのペプチドのアミノ酸間またはアミノ酸部分間に配置されるリンカー（化学リンカー、アミノ酸リンカー）などの追加の成分を（例えば柔軟性を向上させるために、または剛性を高めるために）組み込んでもよい。本明細書に述べるように、Ｄ−ペプチドを同定する際に使用したライブラリーの設計上、本発明のＤ−ペプチドにはＮ−末端にＧＡが、またＣ−末端にＡＡが隣接している。例えば吸収、分布、代謝および／または排出性が異なるＤ−ペプチドを製造するために、これら４つのアミノ酸残基の一部または全部を、改変、置換または削除することができる。一態様として、Ｃ−末端アミドの直前にグリシン残基を付加することによってＣ−末端を修飾する。もう一つの態様として、最もＣ−末端側のＡを改変／修飾するか、異なるアミノ酸残基で置換するか、削除する。
【００９１】
天然に存在するペプチドの対称性とは反対の対称性を持つＤ−ペプチドは、プロテアーゼなどの酵素にとって効率のよい基質にはならず、したがって、Ｌ−ペプチドほど容易には分解されない。また、Ｄ−ペプチドを標的とする効果的な免疫反応もないので、Ｄ−ペプチドはＬアミノ酸ペプチドによって誘発される免疫反応に匹敵するような免疫反応は誘発しない。
【００９２】
以下、実施例によって本発明を説明するが、これらの実施例は決して限定を意図するものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１  Ｃ３４ペプチドの変異体の合成
固相ＦＭＯＣペプチド化学によって突然変異型ペプチドを合成した。これらの突然変異型ペプチドはアセチル化されたアミノ末端とアミド化されたカルボキシ末端を持つ。樹脂から切り離した後、ペプチドをセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社）で脱塩し、次に直線的水−アセトニトリル勾配および０．１％トリフルオロ酢酸を用いるＶｙｄａｃ  Ｃ１８分取用カラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社）によって精製した。ペプチドの確認はＭＡＬＤＩ質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ、パーセプティブ・バイオシステムズ社）で行なった。ペプチド濃度は６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中でのトリプトファンおよびチロシン吸収によって測定した［Ｈ．Ｅｄｅｌｈｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１９４８（１９６７）］。
【００９４】
実施例２  突然変異型Ｎ３６／Ｃ３４複合体のヘリックス含量と熱安定性の定量  先に記述されているように（Ｍ．Ｌｕ，Ｓ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：１０７５（１９９５））、アビブ（Ａｖｉｖ）製モデル６２ＤＳ分光計を使って、リン酸緩衝食塩水（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で、ＣＤ測定を行なった。各複合体の見かけ上の融点は、温度に関する［θ］222 の一次導関数の極大から見積もった。０℃における平均残基楕円率（［θ］222 、１０3 ｄｅｇ・ｃｍ2 ・ｄｍｏｌ-1）は次の通りだった：野生型、−３１．７；Ｍｅｔ629 →Ａｌａ、−３２．０；Ａｒｇ633 →Ａｌａ、−３０．７；Ｉｌｅ635 →Ａｌａ、−２５．９；Ｔｒｐ628 →Ａｌａ、−２７．０；Ｔｒｐ631 →Ａｌａ、−２４．９。Ｔｒｐ628 →ＡｌａおよびＴｒｐ631 →Ａｌａ突然変異の場合、［θ］222 の減少はヘリックス含量の実際の減少を高く見積もりすぎているようである。モデルヘリックスからトリプトファン残基を除去すると、ヘリックス含量にほとんど変化がない場合でも［θ］222 の絶対値が有意に減少すると報告されている（Ａ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙ，Ｔ．Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｓ．Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．Ｌ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：５５６０（１９９３））。
【００９５】
実施例３  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの表面にあるポケットに結合するペプチドの同定
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの表面にあるくぼみに結合するＤ−ペプチドを同定するのに役立つ方法がある。以下に詳述するように、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの表面にあるくぼみに結合するＤ−ペプチドを、鏡像ファージディスプレイ法（ｍｉｒｒｏｒ−ｉｍａｇｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）によって同定した。この方法では、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、Ｄ−アミノ酸からなるリガンドを同定する。Ｄ−アミノ酸含有リガンドは、基質とインヒビターに対して、天然に存在するＬ−アミノ酸リガンドとは反対のキラル特異性を有する。ファージディスプレイライブラリーを使って、標的または所望のＬ−アミノ酸ペプチドを結合するＤ−アミノ酸ペプチドリガンドが同定されている（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１８５４−１８５７（１９９６））。
【００９６】
ｇｐ４１の疎水ポケットに結合するＤ−ペプチドは、Ｎ−末端にＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの２９残基を含有しＣ末端にｇｐ４１の１７残基を含有するハイブリッド分子ＩＱＮ１７のエナンチオマーである標的を使って同定された。選択に使用したファージライブラリーは、米国特許第５，７８０，２２１号およびＳｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１８５４−１８５７（１９９６）に記載されている。ライブラリーの複雑度は１０8 種類の配列を超える。各配列は両端にシステインまたはセリンを持ち、中間に１０個のランダムな残基がある。これらの配列は、ファージの外面に約５コピーとして発現されるコートタンパク質、ファージのｐＩＩＩ遺伝子中に配置されている。
【００９７】
ここに記載する例では以下の実験手順を使用した。
【００９８】
ファージディスプレイ
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ピアス社、１００μＬの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 中１０μｇ）を９６ウェル高吸着スチレン製プレート（コースター社）の各ウェルに入れ、振盪台上４℃で一晩インキュベートした。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを除去し、ウェルをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄した。ビオチン化Ｄ−ＩＱＮ１７（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 中の１０μＬペプチド溶液１００μＬ）を各ウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。ビオチン化標的を除去し、ブロッキング溶液（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 中の３０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳）を各ウェルに加え、振とうしながら４℃で２時間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを再び上述のようにビオチン化標的でコーティングした。標的を除去し、５ｍＭビオチンを含むブロッキング溶液を添加することにより、リガンドと結合していないＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎをブロックした。ビオチンを除去した後、各ウェルをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で６回洗浄した。次に、ファージストックを各ウェルに加えた（５０μＬのファージストック＋５０μＬのファージ結合緩衝液：ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍｌミルク、０．０５％アジ化ナトリウム）。ウェルでのファージストックのインキュベーション時間は、選択ラウンド数が増すにつれて短くした。インキュベーション後に、ファージ溶液を除去し、結合していないファージを除去するために、ウェルをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１２回洗浄した。奇数回目の洗浄はインキュベーション時間なしですばやく行ない、偶数回目の洗浄は、ファージ選択のラウンド数が増えるごとに時間を増やしてインキュベートした。１００μＬのファージ結合緩衝液および２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2 中のトリプシン２μｇを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、ファージを溶出させた。回収率を決定するために、溶出したファージの希釈液を使って、Ｋ９１  ｋａｎ細胞を感染させた。１時間のインキュベーション後に、細胞１００μＬを取り出し、ＬＢで１：１０、１：１００および１：１００に希釈した液をＬＢ／テトラサイクリンプレートに播種した。ファージ回収率は、回収された形質導入単位（溶出したファージの力価）の、投入した形質導入単位数（そのラウンドで使用したファージストックの力価）に対する割合として決定した。形質導入単位はＬＢ／テトラサイクリンプレート上のテトラサイクリン耐性コロニーの数を数えることによって決定した。非特異的ファージ回収が一般に１０-8〜１０-9の桁の比率を持つのに対して、特異的に増幅されたファージは１０-7以上の比率を持つ。個々のクローンを増幅し、配列決定した。それらを結合測定法で測定して、結合特異性を決定した。
【００９９】
５ラウンドのファージ選択後にＤ１０ｐｅｐ７が同定された。７ラウンドのファージ選択後に、Ｄ１０ｐｅｐ１、Ｄ１０ｐｅｐ３、Ｄ１０ｐｅｐ４、Ｄ１０ｐｅｐ５およびＤ１０ｐｅｐ６が同定された。インキュベーション時間を短く、また洗浄を長くしてファージ選択を再び行ない、３ラウンドの選択後にＤ１０ｐｅｐ１０およびＤ１０ｐｅｐ１２が同定された。（９番目のＤ−ペプチドが同定されたが、細胞に対して毒性であることが分かって、それ以上は調べなかった。）
【０１００】
同定されたファージクローンのＤ−ＩＱＮ１７のポケットに対する結合の特異性を調べるために、それらのファージクローンを、上述のようにＤ−ＩＮＱ１７、Ｄ−ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ（３つの突然変異を持つもの）またはＤ−ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ＝グリシン３６がトリプトファンで置換されているもの）でコーティングした９６ウェルプレートのウェルもしくは標的を含まないウェルに加えた。ファージを、それらが同定された時のラウンドと同じ時間にわたって、プレート上でインキュベートし、洗浄した。溶出したファージを使ってＫ９１  ｋａｎ細胞を感染させ、回収される形質導入単位を上述のように決定した。これらの配列はＤ−ＩＱＮ１７を含むウェルに特異的に結合した。
【０１０１】
ペプチド精製
ＩＱＮ１７と各Ｄ１０ペプチドは、ＦＭＯＣペプチド化学によって合成した。それらはアセチル化されたＮ−末端とＣ−末端アミドを持つ。ＩＱＮ１７はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉに由来する２９残基をＮ−末端に含有し、Ｎ３６のＣ−末端に由来する１７残基をＣ−末端に含有する。ＧＣＮ４−ｐＩQ ＩとＮ３６領域には１残基の重複があるので、４５残基長のペプチドになる。溶解度を改善するために、元のＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ配列と比較して３つのアミノ酸置換を、ＩＱＮ１７のＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ領域に施した（Ｅｃｋｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８４：８５９−８６５，１９９８）。それらの置換はＬ１３Ｅ、Ｙ１７ＫおよびＨ１８Ｋである。したがってＩＱＮ７の配列は、
ａｃ−ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲｌＬ−ａｍ
（ａｃ−はＮ−末端アセチル基を表し、−ａｍはＣ−末端アミドを表す）
であり、下線部はＨＩＶ部分である。鏡像ファージディスプレイのために、Ｄ−アミノ酸を使ってＩＱＮ１７を合成した（ＩｌｅやＴｈｒなどの２つ目のキラル中心を含むアミノ酸残基については、天然に存在するアミノ酸残基の正確な鏡像を使ってＤ型の標的を作成する）。また、ペプチドのＮ−末端をＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンＩＩ（ピアス社、カタログ番号２１３３６）を使ってビオチン化した。ビオチンとＩＱＮ１７配列の間にはＧＫＧの３アミノ酸リンカーがあり、そのリジンは天然に存在するＬ−型である。このリジンはトリプシン認識部位として挿入した。
【０１０２】
Ｄ−ペプチドの配列は次の通りである（全てのアミノ酸はＤ−エナンチオマーであり、２つ目のキラル中心を含むＩｌｅとＴｈｒについては、天然に存在するアミノ酸残基の正確な鏡像を使用した）：
2010180217.tif 000013
【０１０３】
樹脂から切り離した後、ペプチドをセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社）で脱塩し、凍結乾燥した。凍結乾燥ペプチドを、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８分取用カラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社）によって精製した。次に凍結乾燥粉末を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）に溶解し、室温で数日撹拌することにより、それらＤ−ペプチドを空気酸化した。酸化されたペプチドを先と同様にＨＰＬＣ精製した。予想されるペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で確認した（パーセプティブ・バイオシステムズ社）。ペプチド濃度は６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中２８０ｎｍでのチロシン、トリプトファンおよびシステイン吸収を使って決定した（Ｅｄｅｌｈｏｃｈ，１９６７）。ペプチド原液はＤＭＳＯ中に調製した。
【０１０４】
Ｄ１０ｐｅｐ３、Ｄ１０ｐｅｐ５、Ｄ１０ｐｅｐ７ａ、Ｄ１０ｐｅｐ１０およびＤ１０ｐｅｐ１２においてＮ−末端リジンを付加し、ペプチドの水溶性を増大させた。ペプチドの阻害活性に対する添加したリジンの効果を調査するために、Ｄ１０ｐｅｐ１を、２つのＮ末端リジンを有するように合成し（Ｄ１０ｐｅｐ１ａと示す）、リジンを有さないＤ１０ｐｅｐ１と比較した：Ｄ１０ｐｅｐ１ａが、シンシチウム形成の阻害に関してＤ１０ｐｅｐ１（すなわち、リジンなし）よりも約２倍高いＩＣ50を有することを見出した。さらに、ＤＰ１０ｐｅｐ５を、２つのさらなるＮ末端リジン（Ｄ１０ｐｅｐ５ａを意味するペプチドを産生するために合計４つのリジン）を有するように合成した。Ｄ１０ｐｅｐ５ａのシンシチウム形成の阻害に関するＩＣ50は、Ｄ１０ｐｅｐ５よりも約２倍高かった。ＤペプチドへのＮ末端リジン残基の添加は、阻害活性の穏やかな減少を生じただけであった。
【０１０５】
研究のために合成したＮ末端に付加した更なるＤ−Ｌｙｓ残基を有するＤ−ペプチドは、ペプチドの名称に「ａ」を付して示され、下記：
2010180217.tif 000014
を含む。
【０１０６】
これらの配列はまた、図３に示される。各Ｄ−ペプチドの１２アミノ酸「コア」（次いで、１０マーおよび本明細書中に記載されるコンセンサス配列を含む）は下記：
2010180217.tif 000015
【０１０７】
これらのペプチド間に高度に保存されたコンセンサス配列が存在することはただちに明らかである。図３に示される１２アミノ酸ペプチドは、ＣＸＸＸＸＸＥＷＸＷＬＣ（配列番号：１２）で表され得、ここで、複数のペプチドで共通するアミノ酸を示し、Ｘは、ペプチド間で保存されていないアミノ酸残基を示す。
【０１０８】
実施例４  Ｃ３４ペプチドおよびＤ−ペプチドの活性の評価
ウイルス感染を阻害することにおけるＣ３４ペプチドの効力およびＤ−ペプチドのＨＩＶ−１感染阻害活性を、組換えルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１（Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：６５４（１９９４））；Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ、Ｖ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：９１３４（１９９８））。ウイルスを、２９３Ｔ細胞へのエンベロープ欠損ＨＩＶゲノムＮＬ４３ＬｕｃＲ−Ｅ−（Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：６５４（１９９４）およびＨＸＢ２  ｇｐ１６０発現ベクターｐＣＭＶＨＸＢ２ｇｐ１６０（Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５：１１５１３（１９９８））の同時トランスフェクトによって産生した。低速度遠心分離を用いて細胞細片のウイルス上清を清澄化した。上清を、０〜５００μＭの範囲の範囲の濃度のＤ−ペプチドの存在下でＨＯＳ−ＣＤ４／融合細胞（Ｎ，Ｌａｎｄａｕ、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を感染させるために使用した。細胞を、感染の４８時間後に回収し、ルシフェラーゼ活性をＷａｌｌａｃ  ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９５３  ルミノメーター（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でモニターした。ＩＣ50は、ペプチドを欠失した対照試料と比較して５０％の活性の減少を生じるペプチド濃度である。ＩＣ50を、ラングミュア式［ｙ＝ｋ／（１＋（［ペプチド］／ＩＣ50）＋ｘ］（式中、ｙ＝ルシフェラーゼ活性、ｋおよびｘは換算定数（ｓｃａｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）である）にデータを当てはめることにより計算した。
【０１０９】
細胞／細胞融合アッセイ
細胞／細胞融合（すなわち、シンシチウム形成）の阻害を、ＨＸＢ２エンベロープを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｋ．Ｋｏｚａｒｓｋｙら、Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ．Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．、２：１６３（１９８９））およびＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−β−ｇａｌ細胞（Ｍ．Ｅｍｅｒｍａｎ，ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）を、異なる濃度のペプチドの存在下で共培養することによってアッセイした。混合した場合、これらの細胞はシンシチウム、または多核細胞を形成するか、β−ガラクトシダーゼを発現する。細胞を共培養した約２０時間後、シンシチウムを視覚化するために単層を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドで染色した。シンシチウムを顕微鏡で視覚化し、手作業で計数する（シンシチウムを、３またはそれ以上の核を含有する融合細胞として得点づけた）。ＩＣ50を、ラングミュア式［ｙ＝ｋ／（１＋［ペプチド］／ＩＣ50）＋ｘ］（式中、ｙ＝シンシチウムの数、ｋおよびｘは換算定数（ｓｃａｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）である）にデータを当てはめることにより計算した。
【０１１０】
【表１】
2010180217.tif 000016
【０１１１】
変異体Ｃ３４ペプチド（１０μＭ）を、円偏光二色性測定のためにリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．０）中のＮ３６ペプチド（１０μＭ）と複合体化させた。見かけ上の溶解温度（Ｔｍ）を、２２２ｎｍでのＣＤシグナルの温度依存性から推定した。ウイルス侵入の阻害を、組換えルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１を用いた細胞培養感染アッセイにおいて測定した。細胞−細胞融合の阻害を、シンシチウムアッセイにおいて測定した。平均および標準誤差は３連試行に由来する。
【０１１２】
同様に、記載したＤ−ペプチドの活性を、上記の２つのアッセイを用いて評価した。図６Ａ〜６Ｂおよび図８Ａ〜８Ｂに結果を示す。
【０１１３】
実施例５：ＩＱ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１複合体およびリガンド非含有ＩＱＮ１７の結晶化
ペプチド精製、結晶化
ペプチドＩＱＮ１７およびＤ１０ｐｅｐ１を、上記のようにＦＭＯＣペプチド化学によって合成した。
【０１１４】
ＩＱＮ１７とＤ１０ｐｅｐ１との混合物の１０ｍｇ／ｍｌストックを調製した。ＩＱＮ１７の最終濃度は約１．３７ｎＭであり、Ｄ１０ｐｅｐ１の最終濃度は約１．５１ｍＭであった。最初の結晶化の条件を、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｋｉｔ  ＩおよびＩＩ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて見出し、次いで至適化した。最もよい回折用結晶を成長させるために、１μｌの当該ストックを１μｌの貯蔵緩衝液（１０％ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ  ＮａＣｉ  ｐＨ５．６、２０％２−プロパノール）に添加し、貯蔵緩衝液に対して平衡化させた。結晶は、空間群Ｐ３２１（ａ＝ｂ＝４１．８３オングストローム；ｃ＝８４．８２オングストローム、α＝β＝９０°、γ＝１２０°）に属し、非対称単位において１つのＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１モノマーを含有する。有用なオスミウム誘導体を、貯蔵溶液中のＰＥＧ４０００の濃度を４％上昇させ、５ｍＭの最終濃度で（ＮＨ4 ）2 ＯｓＣｌ6 を貯蔵溶液に添加し、得られた溶液の５μｌを、タンパク質結晶を含有するドロップに添加することによって生産した。データ収集の前に、天然および重原子誘導体の結晶を、２０％ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ  ＮａＣｉ  ＰＨ５．６、２０％２−プロパノールを含有するクライオ溶液に移し、Ｘ−ｓｔｒｅａｍ  ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｃｏｏｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて瞬間凍結させた。
【０１１５】
リガンド非含有ＩＱＮ１７の最もよい回折用結晶を、上記と同様の技術で成長させた：１（on）μｌのＩＱＮ１７の１０ｍｇ／ｍｌ水溶液を１μｌの貯蔵緩衝液（１．０Ｍ  酒石酸Ｋ、Ｎａ、０．１Ｍ  ＮａＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０）に添加し、貯蔵緩衝液に対して平衡化させた。瞬間凍結の前に、結晶を、２３％グリセロールの最終濃度に増大した量のグリセロールを有する貯蔵溶液からなる緩衝液に移した。結晶は、空間群Ｃ２２２1 （ａ＝５７．９４オングストローム、ｂ＝１２１．９６オングストローム、Ｃ＝７３．６７オングストローム；α＝β＝γ＝９０°）に属し、非対称単位において１つのＩＱＮ１７トリマーを含む。
【０１１６】
Ｘ線データ収集および処理
最初のデータを、Ｒ軸ＩＶエリア検出器に据え付けたＲｉｇａｋｕ  ＲＵ３００回転陽極Ｘ線発生装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で収集した。ＩＱＮ１７の回折データをＱｕａｎｔｕｍ−４ＣＣＤ検出器を用いて１００Ｋで、そしてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡ）で５．０．２ビームライン（ｂｅａｍｌｉｎｅ）で収集した。ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１に関する最終の天然の、および多波長変則回折（ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ；ＭＡＤ）データを、Ｒａｘｉｓ−ＩＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてＨｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｅａｍｌｉｎｅ  Ｘ４Ａで収集した。ＭＡＤデータに関して、オスミウムＬ−ＩＩＩ吸収端付近の４つの波長を、Ｏｓ誘導体結晶の蛍光スペクトルに基づいて選択した（表２）。４つの波長は：１．１３９８オングストローム、１．１４０３オングストローム、１．１３９３オングストローム、１．１１９７オングストロームであった。データセット間の結晶崩壊を最小化するために、データセットを、２０°バッチで収集し、次のバッチに移る前に各波長で同じバッチを収集することを可能にした。反射を、プログラムＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫで積分し、計測した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．、（１９９３）、Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｓａｗｅｒ，Ｌ．、Ｉｓａａｃｓ，Ｎ．およびＢａｉｌｅｙ，Ｓ．編（ＳＥＲＣ，Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ｐｐ．５５−６２）。
【０１１７】
さらなる回折データ処理、位相決定およびマップ計算を、ＣＣＰ４一式（ｓｕｉｔｅ）のプログラム（ＣＣＰ４、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０：７６０−７６３（１９９４））を用いて行った。強度をプログラムＴＲＵＮＣＡＴＥで振幅に減少させ、Ｏｓ  Ｌ−ＩＩＩ吸収端に最も近い波長（λ１、λ２、λ３）に関するデータセットを、離れた波長（λ４）データセットまでＳＣＡＬＥＩＴで計測し除去した（表２）。
【０１１８】
位相決定および結晶学的精密化
最初に、ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１結晶に関する位相決定を、ポリセリン鎖に切断された側鎖を有する公開されたＧＣＮ４−ｐＩＱＩおよびＨＩＶ  ｇｐ４１構造に由来する理論モデルのＩＱＮ１７構造（ｂｕｉｌｄ）（Ｅｃｋｅｒｔ，Ｄ．Ｍら、（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：８５９−８６５；Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．ら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，２６３−２７３）を用いて分子置換技術で試みた。得られた分子置換溶液は、あいまいであり、電子密度図は、Ｄ１０ｐｅｐ１ペプチドのコンホメーションを示さなかった。しかし、分子置換位相は、差異および多義的なフーリエマップを用いて対応する誘導体中の単一のＯｓ原子の座標を決定するのに充分に良好だった。重原子は、結晶学的３倍軸（ｃｒｙａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ  ａｘｉｓ）（０．２２２、０．６６７、０．０４７）に結合する。次いで、ＭＡＤ位相を、プログラムＭＬＰＨＡＲＥ（表２）で産生し、プログラムＤＭでより高い分解能に拡大した。１．５オングストロームでのＭＡＤ電子密度図の質は、例外的であり、明快さを伴ってＩＱＮ１７およびＤ１０ｐｅｐ１ペプチドの構造的詳細を示した。電子密度図解釈およびモデル構築をプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ら、（１９９１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ４７，１１０−１１９）で行った。ＩＱＮ１７−Ｄ１０ｐｅｐ１複合体の構造を、プログラムＣＮＳ（Ｂｒｅｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４，９０５−９２１（１９９８））を用いて精密化した。構造の正確さを、シミュレートしたアニーリング省略マップおよびプログラムＷＨＡＴ  ＣＨＥＣＫ（Ｈｏｆｆ，Ｒ．ＷＷ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：２７２（１９９６））でチェックした。ＩＱＮ１７およびＤ１０ｐｅｐ１ペプチド（その鏡像に変換されていない場合）の全ての残基は、ラマチャンドランプロットの最も好ましい領域を占める。ＩＱＮ１７の２つの最もＮ末端の残基ならびにＤ１０ｐｅｐ１ペプチドのＡｒｇ−６およびＡｒｇ−８の側鎖以外については、残基の大部分のコンホメーションは充分に規定されている。
【０１１９】
リガンド非含有ＩＱＮ１７の構造を、プログラムＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ５０，１５７−１６３）および試験モデルとして精密化されたＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１構造のＩＱＮ１７部分を用いて解析した。３倍非結晶学的平均化、溶媒平坦化およびプログラムＤＭとのヒストグラムマッチングを位相改善のために使用した。電子密度図解釈およびモデル構築をプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４，９０５−９２１（１９９１））で行った。ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１複合体の構造をプログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４，９０５−９２１（１９９８））を用いて精密化した。
【０１２０】
結晶構造は、ＨＩＶ感染性を阻害するより有効なおよび／または新規のＤ−ペプチド、ペプチド擬似体または他の低分子を設計するために使用され得る。
【０１２１】
実施例６  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス疎水性ポケットに結合する化合物を同定するための核磁気共鳴（ＮＭＲ）法
Ａ．ＩＱＮ１７疎水性ポケットとＤ−ペプチドとの特異的結合アッセイ
ＩＱＮ１７への各Ｄ−ペプチドの結合をアッセイするためにＮＭＲ実験を使用した。ＩＱＮ１７の単一のトリプトファン残基（Ｔｒｐ−５７１で示される）は、ｇｐ４１の疎水性ポケットへの特異的結合の最良のプローブを提供する。酸化重水素（重水素水）緩衝液において、ＩＱＮ１７の単純な均一核一次元1 Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図９Ａ、中段）は、この分子の他の全てのシグナルから特に充分に分離した、Ｔｒｐ−５７１インドール由来の５つのシグナルを示す。ｇｐ４１ポケットへの結合に関して化合物を試験するために、２つの一次元1 Ｈ  ＮＭＲ測定を重水素化緩衝液中の試料で行った。最初に、ＩＱＮ１７の参照（対照）スペクトルを採取し、非結合形態のＴｒｐ５７１化学シフトを同定した。第２のスペクトルを、ＩＱＮ１７および目的の化合物を含有する試料で得た。選択任意の第３のＤ−ペプチド（もしくは他の低分子、または分子の混合物）もまた採取した。1 Ｈ  ＮＭＲ実験をＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ５００スペクトロメーターにおいて行った。データを、Ｓｉｌｉｃｏｎ  ＧｒａｐｈｉｃｓコンピュータにおいてのＦｅｌｉｘ  ９８．０（ＭＳＩ）で処理し、全てのスペクトルをＤＳＳに対して照会した。全ての実験を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）において２５℃で行った。使用した全ての緩衝液は、交換可能な骨格および側鎖のプロトンに由来する重複する共鳴を除去するために＞９９．７％Ｄ2 Ｏであった。溶質濃度は、個々のペプチドに関して０．３〜１．０ｍＭの範囲であり、ＩＱＮ１７と各Ｄペプチドとの１：１複合体に関しては０．８〜１．０ｍＭの範囲であった。
【０１２２】
２またはそれ以上の成分の単結合は、よりブロードなピーク（複合体の増大したサイズによる）および化学シフトにおける変化（遊離形態および結合形態の核により経験される異なる化学環境による）を生じることが予想される。疎水性ポケットへの特異的結合は、Ｔｒｐ−５７１化学シフトにおける変化、ならびにピークのブロード化によって示される。また、結合は、アッセイした分子（例えば、ペプチドおよび低有機分子）の化学シフトにおける類似した変化およびピーク幅により示されうる。図９Ａは、これらの効果の例を示す：ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１ａ複合体のＮＭＲスペクトルは、よりブロードなピークおよび２つの分離した化合物のいずれのスペクトルとも劇的に異なる化学シフトを示す。研究した全てのＩＱＮ１７／Ｄ−ペプチド複合体は、化学シフト分散の程度に違いはあるが、類似した結果を示した。従って、結合は全てのケースで示された。
【０１２３】
Ｄ１０ｐｅｐ１における２つの保存されたＴｒｐ残基、および保存されたＬｅｕ残基が、ＩＱＮ１７ポケットの結合に直接関与するというＸ線結晶学的知見は、他のＤ−ペプチドがポケットに結合する場合にこれらの保存された残基が同様の様式で関与することを強く示唆する。これらの保存されたトリプトファン残基、およびＩＱＮ１７のＴｒｐ−５７１は、結合界面を大いにより詳細に研究する機会を提供する。ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１結晶構造において、ＩＱＮ１７のＴｒｐ−５７１側鎖は、Ｔｒｐ−１０インドール基の平面上のＴｒｐ−５７１のいつかのプロトン（Ｈζ2 ，Ｈη2 ，Ｈζ3 ，Ｈε3 ；芳香族環の４つのスカラー共役プロトン）によりＤ１０ｐｅｐ１のＴｒｐ−１０と密接に接触する。この位置において、芳香族環電流相互作用（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ｆ．Ａ．Ｂｏｖｅｙ，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（１９８８））は、それらのプロトンの内のいくつかの化学シフトを変化させ、理解されるような様式で高磁場にピークを移動させる（図９Ａ、下段）。構造に基づく化学シフト予想プログラムＳＨＩＦＴＳ（３．０ｂ２版、Ｋ．Ｏｓａｐａｙ，Ｄ．Ｓｉｔｋｏｆｆ，Ｄ．Ｃａｓｅ）の使用はまた、Ｔｒｐ−５７１に由来するプロトンのみが、特にＨζ3 プロトンが、大きな高磁場シフトを経験することを予想する。他のＤ−ペプチドがＤ１０ｐｅｐ１と同じ様式でＩＱＮ１７ポケットに結合する場合、Ｔｒｐ−５７１とＴｒｐ−１０との同様の並列（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）が生じ、高磁場シフトしたピークを生じるはずである。研究した全てのＤ−ペプチド／ＩＱＮ１７複合体は、シフトの程度に違いはあるが、このようなピークを示した（図９Ｂ）。Ｄ１０ｐｅｐ１複合体は、最も極度の高磁場シフトを示し、Ｄ１０ｐｅｐ７ａが最も小さな高磁場シフトを示した。これらの変化の振幅は非常に大きく、最も高磁場シフトしたプロトン（割り当てられ得る全てのケースにおいて、Ｈζ3 ）に関しておおよそ０．５〜２ｐｐｍの範囲である。比較すると、ＮＭＲ実験よりＳＡＲにおける結合を検出するのにしばしば使用される化学シフトの差異（Ｓｈｕｋｅｒ，Ｓ．Ｂ．、Ｈａｊｄｕｋ，Ｐ．Ｊ．、Ｍｅａｄｏｗｓ，Ｒ．Ｐ．、Ｆｅｓｉｋ，Ｓ．Ｗ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５３１−１５３４（１９９６））は、頻繁に０．０５〜０．２ｐｐｍの範囲である。広範囲の高磁場化学シフトが観察されたが、環電流効果は、距離および方向に高度に敏感でありうるので、小さな構造の差異が、化学シフトにおいてかなりの変化を生じるかもしれない。（観察された全ての高磁場シフトは、ｘ線結晶構造から予測されたＴｒｐ側鎖のおおよその方向と一致する。）さらに、高磁場シフトしたピークは、これらのＮＭＲスペクトルの他のものと比較して幾分ブロードである（交換プロセスのある型によるようである）、この効果は、Ｄ１０ｐｅｐ５ａとのおよびＤ１０ｐｅｐ７ａとの複合体について特に明白である。
【０１２４】
強く高磁場シフトしたピークが全ての単一の側鎖（ほぼ間違いなくＴｒｐ−５７１）に対応することを確認するために、二次元ＮＭＲ（ＴＯＣＳＹ）実験を、各々のＩＱＮ１７／Ｄ−ペプチド複合体で行った。予想したように、ＴＯＣＳＹ実験は、各複合体において、強く高磁場シフトした共鳴は全て同一の芳香族側鎖に属し、４スカラー共役プロトンの基として同定される。１例のＴＯＣＳＹスペクトルを図９Ｃに示す。研究したいくつかの複合体について、ＮＯＥＳＹ実験はまた、ＩＱＮ１７／Ｄ１０ｐｅｐ１構造から予想したように、この側鎖と他の（割り当てられていない）芳香族基との接触を示している。６．８〜７．６ｐｐｍ領域における激しいスペクトルの重複のために、潜在的なＮＯＥ交差ピークの全てを分離することはできなかった。Ｊ．Ｃａｖａｎａｕｇｈ、Ｗ．Ｊ．Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ、Ａ．Ｇ．Ｐａｌｍｅｒ、Ｎ．Ｊ．Ｓｋｅｌｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （１９９６）に記載されるような２Ｄ  ＮＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹの実験を、ＩＱＮ１７および各複合体の試料で３０〜９０ｍｓ（ＮＯＥＳＹ）および３０〜７０ｍｓ（ＴＯＣＳＹ）の範囲のミックス時間により行った。１１，１１１Ｈｚおよび５５５５Ｈｚのスペクトル幅を、獲得（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（ｔ2 ）および間接（ｉｎｃｉｒｅｃｔ）（ｔ1 ）の次元の各々に使用した。ＴＯＣＳＹ実験には、ＤＩＰＳＩ−２ｒｃミックス配列（Ｊ．Ｃａｖａｎａｕｇｈ，Ｍ．Ｒａｎｃｅ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｅｒｙ．Ａ．，１０５：３２８（１９９３））を使用した。
【０１２５】
我々は、アッセイした全てのＤ−ペプチドが、ＩＱＮ１７の疎水性ポケットに明白に結合すると結論付ける。さらに，これらのＩＱＮ１７複合体の大多数（すなわち、Ｄ１０ｐｅｐ１、Ｄ１０ｐｅｐ３、Ｄ１０ｐｅｐ４、Ｄ１０ｐｅｐ６、Ｄ１０ｐｅｐ１０、およびＤ１０ｐｅｐ１２）において、Ｄ−ペプチドは、非常に類似した結合界面でポケットと接触し、Ｔｒｐ−５７１をＴｒｐ−１０の芳香族環との近接した接触にもたらす。Ｄ１０ｐｅｐ５ａとの複合体およびＤ１０ｐｅｐ７ａとの複合体の場合には、より限られた化学シフト分散およびよりブロードなピークは、幾分他の様式の結合のわずかな可能性を生じさせるが、この結論はまた非常に妥当であるようである。
【０１２６】
本明細書中で使用された結合アッセイはまた、ｇｐ４１（例えば、ＩＱＮ１７中に見出されるような）の疎水性ポケットに他の分子の結合をアッセイするのに使用されうる。上記アッセイは、上記のＤ−ペプチドのセットに関するように、芳香族環がポケットに結合する場合に解釈することが特に容易である。しかし、いかなるポケット結合分子も、容易に注目すべき影響であるＴｒｐ−５７１の化学シフトを混乱させるはずである。さらに、結合において低分子自身によって産生された新規ＮＭＲシグナルもまた、結合の指標である。
【０１２７】
一次元の同核1 Ｈ  ＮＭＲの使用は、特異的結合を決定するための、多次元の異核を超える有意な利点を提供する：（１）感受性がより高く、より迅速に試料をアッセイすることができる；交互に、より高い感受性は、低濃度のＩＱＮ１７と推定上の結合因子との使用は、より高い親和性の化合物を、それらの多くを同時にスクリーニングすることを可能にする。（２）非アイソトープ標識したタンパク質は生産することが容易であり、より経済的である。しかし、同核または異核（15Ｎおよび／または13Ｃアイソトープ標識による）の二次元ＮＭＲ実験もまた使用されうる。
【０１２８】
Ｂ．化学ライブラリースクリーニング
上記（Ａ）に記載される結合アッセイは、化学ライブラリー中に存在する多数の化合物をスクリーニングするのに使用されうる。単純な一次元の同核1 Ｈ  ＮＭＲ実験は、アイソトープ標識を必要とすることなく結合を評価するのに充分である。同核または異核（15Ｎおよび／または13Ｃアイソトープ標識による）二次元ＮＭＲ実験もまた使用されうる。単一化合物を、本プロセスの時にスクリーニングし得る。しかし、多数の化合物もまた、ＩＱＮ１７（またはｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの任意の代表）と同一のアッセイで組み合わされ、同時にスクリーニングされうる。上記混合物の任意の成分によるポケットへの結合は、Ｔｒｐ−５７１化学シフトにおける変化によって示される。多数の化合物からのＮＭＲシグナルは、共にＴｒｐ−５７１からのシグナルを不明瞭にする可能性を有する；非結合分子に由来するこれらのシグナルは、当該技術分野で充分知られているパルスフィールドグラジエント技術を用いて排除されうる。これらの技術および市販されているＮＭＲチューブサンプルチェンジャーの使用により、多数の化合物の自動スクリーニングが容易になる。
【０１２９】
Ｃ．多数の組み合わせ合成の産物の評価
上記（Ｂ）に記載されるスクリーニングプロセスは、組み合わせ有機合成法を利用することを意図しうる。かかる方法は、多数の化学的に関連する化合物を含む各ファミリーに関して、化合物の全ファミリーを作製するために使用されている。上記のシンプルなアッセイにより、全体の組み合わせ合成の産物が、同時にスクリーニングされうる。結合が示されない場合、その化合物のファミリーのいかなるメンバーにおいてもさらに注意を払う必要はない。単純な一次元の同核1 Ｈ  ＮＭＲ実験は、アイソトープ標識を必要とすることなく結合を評価するのに充分である。同核または異核（15Ｎおよび／または13Ｃアイソトープ標識による）の二次元ＮＭＲ実験もまた使用されうる。
【０１３０】
【表２】
2010180217.tif 000017
【０１３１】
本発明を、特にその好ましい態様に関して示し、記載してきたが、形式および細部における種々の変化が、付随する特許請求の範囲に規定される本発明の意図および範囲を逸脱することなくなされ得ることが当業者に理解される。
【０１３２】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］可溶性の三量体型のコイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分とを含んでなるペプチド。
［２］Ｄ−ペプチドである［１］記載のペプチド。
［３］コイルドコイルが：
（ａ）ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉのコイルドコイル；
（ｂ）ＧＣＮ４−ｐＩＩのコイルドコイル；
（ｃ）モロニーマウス白血病ウイルスのコイルドコイル；および
（ｄ）ＡＢＣヘテロ三量体のコイルドコイル、
からなる群より選ばれるものである［２］記載のＤ−ペプチド。
［４］コイルドコイルのアミノ酸配列が：
ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫ（配列番号：２５）
である［３］記載のＤ−ペプチド。
［５］ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチド領域の充分な部分が、配列：ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号：２０）
を含んでなるものである［２］記載のＤ−ペプチド。
［６］ＩＱＮ１７（配列番号：２）である［５］記載のＤ−ペプチド。
［７］配列番号：２５および１７個のアミノ酸残基を含んでなる配列を含んでなり、該１７個のアミノ酸残基が、配列：ＬＬＸＬＴＶＷＧＸＫＸＬＱＸＲＸＸ（配列番号：４２）（式中、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｋ、ＱおよびＲは一文字アミノ酸コードにより表わされたアミノ酸残基であり、ＸはいずれかのＤ−アミノ酸残基である）を含んでなるものである、ＨＩＶ  ｇｐ４１疎水性ポケットの可溶性の三量体ペプチドモデルであるＤ−ペプチド。
［８］１７個のアミノ酸残基を含んでなる配列が、配列番号：２０；配列番号：２６；配列番号：２７および配列番号：４２からなる群より選ばれるものである［７］記載のＤ−ペプチド。
［９］
2010180217.tif 000018
2010180217.tif 000019
（ｙ’）  ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する（ａ）〜（ｘ’）の配列の変異体、
（式中、Ｃ−末端のａｃ−およびＮ−末端の−ａｍは任意である）
からなる群より選ばれるＤ−ペプチド。
［１０］Ｌ−ペプチドである［１］記載のペプチド。
［１１］可溶性の三量体のコイルドコイルが：
（ａ）ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉのコイルドコイル；
（ｂ）ＧＣＮ４−ｐＩＩのコイルドコイル；
（ｃ）モロニーマウス白血病ウイルスのコイルドコイル；および
（ｄ）ＡＢＣヘテロ三量体のコイルドコイル、
からなる群より選ばれるものである［１０］記載のＬ−ペプチド。
［１２］ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチド領域の充分な部分が、配列：ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号：２０）
を含んでなるものである［１０］記載のＬ−ペプチド。
［１３］ＩＱＮ１７（配列番号：２）である［１２］記載のＬ−ペプチド。
［１４］配列番号：２５および１７個のアミノ酸残基を含んでなる配列を含んでなり、該１７個のアミノ酸残基が、配列：ＬＬＸＬＴＶＷＧＸＫＸＬＱＸＲＸＸ（式中、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｋ、ＱおよびＲは一文字アミノ酸コードにより表わされたアミノ酸残基であり、ＸはいずれかのＤ−アミノ酸残基である）を含んでなるものである、ＨＩＶ  ｇｐ１疎水性ポケットの可溶性の三量体モデルであるＬ−ペプチド。
［１５］１７個のアミノ酸残基を含んでなる配列が、配列番号：２０；配列番号：２６；および配列番号：２７からなる群より選ばれるものである［１４］記載のＬ−ペプチド。
［１６］（ａ）Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成に適する条件下に、Ｃ３４ペプチドおよびＮ３６ペプチドと、Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成を妨げるその能力についての評価対象の候補薬物とを合わせ、それにより被検試料を形成する工程；ならびに
（ｂ）Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成が阻害されるか否かを決定する工程、
を含み、複合体の形成が阻害される場合、候補薬物は複合体の形成を妨げる薬物であり、それにより、複合体の形成を妨げる薬物が同定される、Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成を妨げる薬物の同定方法。
［１７］（ａ）において被検試料が形成される条件下と同じ条件下に、Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとを合せることにより対照試料を形成し；Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成を測定し、かつ被検試料において複合体が形成される程度を対照試料において複合体が形成される程度と比較し、複合体が対照試料におけるよりも被検試料においてより低い程度で形成される場合、候補薬物は複合体の形成を妨げる薬物であり、それにより、複合体の形成を妨げる薬物を同定する、［１６］記載の方法。
［１８］Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドを各々１組のドナー−アクセプター分子のメンバーにより標識し、かつＣ３４とＮ３６との間での複合体の形成が生ずる程度を、アクセプター分子から生ずる発光の程度を測定することにより評価し、発光が候補薬物の非存在下よりも候補薬物の存在下においてより低い程度で生ずる場合、候補薬物はＣ３４ペプチドとＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成を妨げる薬物である、［１６］記載の方法。
［１９］Ｃ３４ペプチドとＮ３６ペプチドを各々１組またはドナー−アクセプター分子のメンバーにより標識し、かつ発光が生ずる程度を被検試料においておよび対照試料において評価し、発光が対照試料におけるよりも被検試料においてより少ない場合、候補薬物はＣ３４プルプチド（ｐｒｐｔｉｄｅ）とＮ３６ペプチドとの間での複合体の形成を阻害する薬物である、［１７］記載の方法。
［２０］複合体の形成を妨げる薬物が細胞へのＨＩＶ侵入のインヒビターであるか否かを、細胞／細胞融合または細胞のＨＩＶ感染に対する薬物の影響が薬物の非存在下におけるよりも薬物の存在下においてより低いことを評価することにより評価する工程をさらに含み、該薬物は細胞へのＨＩＶ侵入のインヒビターである、［１６］記載の方法。
［２１］タンパク質の、三量体型のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの一部または全部を形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分とを含んでなるペプチドを個体に導入する工程を含み、かつ該ペプチドは製薬学的に許容され得る担体中に存在するものである、個体における免疫応答の顕現方法。
［２２］筋内、腹腔内、経口、経鼻および経皮からなる群より選択される投与経路により個体にペプチドを導入する［２１］記載の方法。
［２３］コイルドコイルが、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ；ＧＣＮ４−ｐＩＩ；モロニーマウス白血病ウイルスおよびＡＢＣヘテロ三量体からなる群より選ばれるものである［２１］記載の方法。
［２４］ペプチドがＩＱＮ１７である［２１］記載の方法。
［２５］（１）ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ４１サブユニットを結合し、かつ粘膜表面の細胞へのＨＩＶの侵入を妨げる薬物、および（２）担体または基剤を含んでなる組成物を粘膜表面に投与または適用する工程を含む、粘膜細胞へのＨＩＶの侵入の妨害方法。
［２６］薬物がＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ４１サブユニットのＮ−ヘリックスコイルドコイルの表面上のくぼみを結合する、［２５］記載の方法。
［２７］薬物がｇｐ４１の立体配座変化を防ぎまたは減少させ、それにより、粘膜表面の細胞へのＨＩＶの侵入を妨げる、［２６］記載の方法。
［２８］組成物が：
（ａ）Ｃ３４ペプチド；
（ｂ）ＤＰ１７８；
（ｃ）ＤＰ６４９；
（ｄ）Ｔ１２４９；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の誘導体；
（ｆ）ＨＩＶ  ｇｐ４１の疎水性ポケットに結合するＤ−ペプチド；
（ｇ）（ｆ）の誘導体；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の２つまたはそれ以上の組み合わせ；および
（ｉ）Ｎ−ヘリックスコイルドコイルに結合することによりＨＩＶ感染力を阻害する分子、
からなる群より選ばれる成分を含んでなるものである、［２５］記載の方法。
［２９］担体または基剤が、フォーム、ゲル、薬物を保持するのに充分に粘性のその他の物質、水および緩衝液からなる群より選ばれるものである［２８］記載の方法。
［３０］担体または基剤が膣座剤または直腸座剤である［２８］記載の方法。
［３１］薬物が膣、口または直腸に投与もしくは適用された直後または投与もしくは適用された後すぐに、該薬物が担体または基剤から放出される、［２８］記載の方法。
［３２］薬物が膣、口または直腸に投与もしくは適用された後に徐々に、または投与もしくは適用された後、特定の期間の後に、該薬物が担体または基剤から放出される、［２８］記載の方法。
［３３］薬物を、使用の条件下に該薬物の放出が可能となるような様式で避妊具の表面上に存在させるか、または避妊具内に組み込む、［２８］記載の方法。
［３４］（ｅ）のＤ−ペプチドが：
2010180217.tif 000020
2010180217.tif 000021
（ｙ’）  ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する（ａ）〜（ｘ’）の配列の変異体、
（式中、Ｃ−末端のａｃ−およびＮ−末端の−ａｍは任意である）
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるものである、［２８］記載の方法。
［３５］評価対象の化合物または分子を候補インヒビターといい、
（ａ）Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへのＤ−ペプチドの結合に適する条件下に、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するＤ−ペプチド、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを提示する可溶性モデルである融合タンパク質および候補インヒビターを合わせ、それにより、被検試料を作製する工程；
（ｂ）被検試料におけるＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへのＤ−ペプチドの結合の程度を測定する工程；ならびに
（ｃ）対照試料におけるＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみに対する場合と測定した結合の程度を比較する工程、ここで、対照試料は候補インヒビターを含んでいないことを除いて被検試料と同じであり、かつ該対照試料は、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへのＤ−ペプチドの結合に適する被検試料と同じ条件下に維持される、
を含み、被検試料における結合の程度が対照試料における結合の程度より低い場合、候補インヒビターはＨＩＶ−１  ｇｐ４１エンベロープタンパク質のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子である、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１エンベロープタンパク質のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子の同定方法。
［３６］融合タンパク質がＩＱＮ１７である［３５］記載の方法。
［３７］Ｄ−ペプチドを蛍光性レポーターで標識し、かつ融合タンパク質を、蛍光性レポーターに充分に近接した場合に該レポーターからのシグナルを消去する消光物質で標識し、かつ蛍光性レポーターからのシグナルの検出が、候補インヒビターがＨＩＶ−１  ｇｐ４１エンベロープタンパク質のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子であることを示す、［３５］記載の方法。
［３８］ＧＣＮ４の、三量体型のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分とを含んでなり、ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分がＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの一部または全部を含んでなるか、または含まないものである融合タンパク質。
［３９］ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分が、ＨＩＶの以下の２４個のアミノ酸残基：ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴを含んでなるものである、［３８］記載の融合タンパク質。
［４０］可溶性の三量体型のコイルドコイルと、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分とを含んでなる融合タンパク質を個体に導入する工程を含み、該融合タンパク質が製薬学的に許容され得る担体中に存在するものである、個体における免疫応答の顕現方法。
［４１］少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列ＷＸＷＬ（式中、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸはいずれかの残基（moiety）を表わす）を含んでなるＤ−ペプチド。
［４２］ＸがＤ−アミノ酸残基または修飾Ｄ−アミノ酸残基である［４１］記載のＤ−ペプチド。
［４３］２〜２１個のアミノ酸残基を含んでなる［４１］記載のＤ−ペプチド。
［４４］ＥＷＸＷＬ（式中、ＥはＤ−グルタミン酸を表し、ＷはＤ−トリプトファンを表し、ＬはＤ−ロイシンを表し、ならびにＸはアミノ酸残基、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸残基以外の残基を表わす）である少なくとも５個のアミノ酸残基を含んでなるＤ−ペプチド。
［４５］
2010180217.tif 000022
2010180217.tif 000023
（ｙ’）  ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する、（ａ）〜（ｘ’）の配列の変異体、
（式中、Ｃ−末端のａｃ−およびＮ−末端の−ａｍは任意である）
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるＤ−ペプチド。
［４６］（ａ）（１）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と；（２）タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質とを、薬物による結合についてＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみの提示に適する条件下に合せる工程；ならびに
（ｂ）候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを結合するか否かを決定する工程、ここで、結合が生ずる場合、候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物である、
を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物の同定方法。
［４７］（ａ）において、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するペプチドを候補薬物および融合タンパク質と合わせ、かつ（ｂ）において、候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを結合するか否かをＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するペプチドの存在下に測定する、［４６］記載の方法。
［４８］ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するペプチドが、
2010180217.tif 000024
2010180217.tif 000025
2010180217.tif 000026
（ｙ’）  ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する、（ａ）〜（ｘ’）の配列の変異体、
（式中、Ｃ−末端のａｃ−およびＮ−末端の−ａｍは任意である）
からなる群より選ばれるものである、［４２］記載の方法。
［４９］候補薬物を検出可能に標識し、かつＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみへの候補薬物の結合をＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみ上の検出可能な標識の存在を検出することにより測定する、［４６］記載の方法。
［５０］融合タンパク質が、ＧＣＮ４の可溶性の三量体状のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分とを含んでなるものである、［４６］記載の方法。
［５１］融合タンパク質がＩＱＮ１７またはその変異体であり、ＩＱＮ１７のアミノ酸配列が配列番号：２である［５０］記載の方法。
［５２］（ａ）（１）薬物による結合が可能であるような様式でＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを提示する可溶性モデルと（２）Ｎ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物とを合せる工程；ならびに
（ｂ）候補薬物が可溶性モデルのＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するか否かを測定する工程、
を含み、結合が生ずる場合、候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物である、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物の同定方法。
［５３］（ａ）（１）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのＨＩＶ侵入を阻害するその能力についての評価対象の候補薬物と、（２）タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質とを、薬物による結合についてＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみの提示に適する条件下に合わせる工程；
（ｂ）候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを結合するか否かを測定する工程、ここで、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみへの候補薬物の結合が生ずる場合、該候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物であり、それにより、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を製造する；ならびに
（ｃ）（ｂ）において製造された薬物の細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する能力を評価する工程、ここで、薬物が細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する場合、該薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する薬物である、
を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する薬物の製造方法。
［５４］（ａ）（２）の融合タンパク質が、ＧＣＮ４の、可溶性の三量体型のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分とを含んでなり、かつ（ｂ）において製造された薬物の細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する能力をシンシチウムアッセイ、感染アッセイまたは両方で評価する、［５３］記載の方法。
［５５］（ｃ）において同定された薬物を、適切な動物モデルにおけるインビボ評価により細胞へのＨＩＶ侵入を阻害するその能力についてさらに評価する、［５４］記載の方法。
［５６］融合タンパク質がＩＱＮ１７またはその変異体であり、ＩＱＮ１７のアミノ酸配列が配列番号：２である、［５４］記載の方法。
［５７］（ａ）可溶性の三量体型のコイルドコイルと（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分とを含んでなる融合タンパク質を製造する工程を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルの製造方法。
［５８］（ａ）のタンパク質が、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、ＧＣＮ４−ｐＩＩ、モロニーマウス白血病ウイルスまたはＡＢＣヘテロ三量体であり、かつ（ｂ）の充分な部分が、配列番号：２０を含んでなる部分；配列番号：２６を含んでなる部分；配列番号：２７を含んでなる部分および配列番号：４２を含んでなる部分からなる群より選ばれるものである、［５７］記載の方法。
［５９］融合タンパク質がＩＱＮ１７またはその変異体であり、ＩＱＮ１７のアミノ酸配列が配列番号：２である、［５７］記載の方法。
［６０］（ａ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルを製造または得る工程；
（ｂ）（１）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と（２）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルとを合わせる工程；ならびに
（ｃ）候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するか否かを決定する工程、
を含み、候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する場合、候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物であり、それにより、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を製造する、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物の製造方法。
［６１］可溶性モデルが、タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質である、［６０］記載の方法。
［６２］融合タンパク質がＩＱＮ１７またはその変異体であり、ＩＱＮ１７のアミノ酸配列が配列番号：２である、［６１］記載の方法。
［６３］（ａ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルを製造または得る工程；
（ｂ）（１）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と（２）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルとを合わせる工程；
（ｃ）候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するか否かを決定する工程、ここで、候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する場合、該候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物であり、それにより、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を製造する、ならびに；
（ｄ）（ｃ）において製造した薬物の細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する能力を評価する工程、
を含み、薬物が細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する場合、薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する薬物である、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する薬物の製造方法。
［６４］可溶性モデルが、タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１くぼみを含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質である、［６３］記載の方法。
［６５］融合タンパク質がＩＱＮ１７またはその変異体であり、ＩＱＮ１７のアミノ酸配列が配列番号；２である、［６４］記載の方法。
［６６］［６０］記載の方法により製造された薬物。
［６７］［６１］記載の方法により製造された薬物。
［６８］［６２］記載の方法により製造された薬物。
［６９］［６３］記載の方法により製造された薬物。
［７０］［６４］記載の方法により製造された薬物。
［７１］［６５］記載の方法により製造された薬物。
［７２］（ａ）Ｄ−掌体（handedness）のＩＱＮ１７をＬ−アミノ酸ペプチドのファージディスプレイライブラリーと、Ｄ−掌体のＩＱＮ１７への該ライブラリーのメンバーの結合に適する条件下に合わせる工程；ならびに
（ｂ）Ｄ−掌体のＩＱＮ１７とファージディスプレイライブラリーの１つまたは複数のメンバーとの間で結合が生ずるか否かを決定する工程、ここで、結合が生ずる場合、Ｄ−掌体のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合するペプチドが同定される、
を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合するペプチドの同定方法。
［７３］Ｄ−掌体のＩＱＮ１７に結合するファージディスプレイライブラリーの１つまたは複数のメンバーのアミノ酸配列を決定する工程、ならびに決定されたアミノ酸配列を含んでなるＤ型のペプチドを製造する工程をさらに含み、Ｄ型のペプチドが天然のＬ−掌体のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するものである、［７２］記載の方法。
［７４］式Ｉ
2010180217.tif 000027
〔式中、ＡはＤ−アミノ酸残基または式
2010180217.tif 000028
（式中、ＲA1とＲA2の一方は、置換もしくは非置換の、アリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合ヘテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル、ベンゾ縮合ヘテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり；かつ他方は水素であり；およびＷは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン、たとえば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である）
のＮ−置換グリシル残基である；
Ｂはグリシル残基または式
2010180217.tif 000029
（式中、ＲB1とＲB2の一方は、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状の、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロアリール基またはヘテロアリールアルキル基であり；かつ他方は水素であり；およびＸは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等のハロゲンである）
のＤ−アミノ酸もしくはＮ−置換グリシル残基である；
Ｄは式
2010180217.tif 000030
（式中、ＲD1とＲD2の一方は、置換もしくは非置換の、アリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合ヘテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル；ベンゾ縮合ヘテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり；かつ他方は水素であり；およびＹは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等のハロゲンである）
のＤ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基である；
Ｅは式
2010180217.tif 000031
（式中、ＲE1とＲE2の一方は、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状の、アルキル基、アリール基またはアリールアルキル基であり；かつ他方は水素であり；およびＺは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等のハロゲンである）
のＤ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシル残基である；
Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮは各々独立して、アミノ酸残基または２〜約８個のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチド基である；
Ｆは直接結合または二官能性連結基である；ならびに
ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは各々独立して、０または１である〕
の化合物。
［７５］ＲA1とＲA2の一方およびＲD1とＲD2の一方が独立して、フェニル基、置換フェニル基、ナフチル基、置換ナフチル基、ナフチルメチル基、置換ナフチルメチル基、ベンジル基もしくは置換ベンジル基、または式
2010180217.tif 000032
（式中、ＪはＯ、ＳまたはＮＲであり、ＲはＨまたは直鎖、分岐もしくは環状のＣ1 〜Ｃ6 −アルキルであり；ならびに
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 は独立して、水素、ハロゲンおよびアルキルからなる群より選ばれるものである）
の基である、［７４］記載の化合物。
［７６］ＲA1とＲD1が両方とも水素である［７５］記載の化合物。
［７７］ＲB1とＲB2の一方が、水素、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状のＣ1 〜Ｃ4 −アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチルまたはナフチルメチルである、［７４］記載の化合物。
［７８］ＲB1が水素である［７７］記載の化合物。
［７９］ＲE1とＲE2の一方が、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状のＣ1 〜Ｃ6 −アルキル基または置換もしくは非置換のフェニル基もしくはナフチル基であり、かつ他方が水素である、［７４］記載の化合物。
［８０］ＲE1が水素である［７９］記載の化合物。
［８１］ＡおよびＤが各々Ｄ−トリプトファン残基であり、かつＥがＤ−ロイシン残基である［７４］記載の化合物。
［８２］ＫがＤ−アミノ酸残基またはアミノ−、カルボキシル−もしくはスルフヒドリル置換側鎖を含んでなるＮ−置換グリシル残基であり、かつＬが２もしくは３個のＤ−アミノ酸残基またはＮ−置換グリシン残基を含んでなるポリペプチドである［７４］記載の化合物。
［８３］Ｍが２〜約８個のＤ−アミノ酸残基を含んでなり、該アミノ酸残基の少なくとも１つがアミノ−、カルボキシ−もしくはスルフヒドリル置換側鎖を含んでなるポリペプチド基であり、かつＮが１〜約６個のアミノ酸残基を含んでなり、該アミノ酸残基の少なくとも１つがリジン残基であるポリペプチド基である［７４］記載の化合物。
［８４］Ｆが約２〜約４０原子の長さを有する二価の連結基である［７４］記載の化合物。
［８５］Ｆが式−Ｐn −（式中、ｎは１〜約１２の整数であり、かつ各Ｐは独立して、Ｌ−もしくはＤ−アミノ酸もしくはＮ−置換グリシル残基、グリシル残基またはＮ−置換グリシル残基である）のポリペプチド連結基である［８４］記載の化合物。
［８６］Ｆは置換もしくは非置換のＣ4 〜Ｃ40−アルキレン基または１もしくはそれ以上の箇所においてヘテロ原子、フェニレン基もしくはヘテロアリーレン基により介在されているＣ4 〜Ｃ40−アルキレン基である［８４］記載の化合物。
［８７］Ｆが１〜約１０個のグリコシド基を含んでなる多糖類基である［８４］記載の化合物。
［８８］（ａ）ＨＩＶ  ｇｐ４１疎水性ポケットの可溶性の三量体ペプチドモデルの結晶を得る工程；
（ｂ）（ａ）において得られた結晶を用いてＸ線回折研究によりペプチドモデルの原子座標を得る工程；
（ｃ）（ｂ）において得られた原子座標を用いてＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットを明確化する工程；
（ｄ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する分子または化合物を同定する工程；
（ｅ）（ｄ）において同定された分子または化合物を得る工程；ならびに
（ｆ）（ｅ）において得られた分子または化合物をＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットと接触させて、分子または化合物のＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットに適合する能力を評価する工程、
を含み、分子または化合物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する場合、該分子または化合物は該ポケットに適合する薬物であり、それにより、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する薬物を製造する、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する薬物の製造方法。
［８９］可溶性の三量体ペプチド分子が、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の部分とを含んでなるものである、［８８］記載の方法。
［９０］（ｆ）において、分子または化合物をＩＱＮ１７、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスまたはＨＩＶポケットを含んでなるポリペプチドと接触させることにより、該分子または化合物をＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットと接触させる、［８９］記載の方法。
［９１］可溶性モデルがＩＱＮ１７である［８９］記載の方法。
［９２］（ａ）において得られた結晶が空間群Ｃ２２２のＩＱＮ１７の結晶である［８８］記載の方法。
［９３］（ａ）ＩＱＮ１７の原子座標を得る工程；
（ｂ）（ａ）において得られた原子座標を用いてＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットを明確化する工程；
（ｃ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する分子または化合物を同定する工程；
（ｄ）（ｃ）において同定された分子または化合物を得る工程；ならびに
（ｅ）（ｄ）において得られた分子または化合物をＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットと接触させて、分子または化合物のＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットに適合する能力を評価する工程、
を含み、分子または化合物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する場合、該分子または化合物は該ポケットに適合する薬物であり、それにより、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する薬物を製造する、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合する薬物の製造方法。
［９４］原子座標が図１１Ａ〜１１Ｖに表わされるＰＤＢファイルにおける原子座標である［９３］記載の方法。
［９５］（ａ）Ｄ−掌体のＩＱＮ１７をリガンドの生物学的にコードされたライブラリーと、Ｄ−掌体のＩＱＮ１７への該ライブラリーのメンバーの結合に適する条件下に合わせる工程；ならびに
（ｂ）Ｄ−掌体のＩＱＮ１７と生物学的にコードされたライブラリーの１つまたは複数のメンバーとの間で結合が生ずるか否かを測定する工程、ここで、結合が生ずる場合、Ｄ−掌体のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合するリガンドが同定される、
を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合する分子の同定方法。
［９６］Ｄ−掌体のＩＱＮ１７に結合する生物学的にコードされたライブラリーの１つまたは複数のメンバーの配列を決定する工程、ならびに決定された配列を含んでなる、生物学的にコードされたリガンドの鏡像掌体のリガンドを製造する工程をさらに含む［９５］記載の方法。
［９７］生物学的にコードされたライブラリーがファージディスプレイライブラリー、ＤＮＡライブラリー、ＲＮＡライブラリーおよび生物学的にコードされたペプチドライブラリーからなる群より選ばれるものである［９５］記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１１−１１】
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【図１１−１２】
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【図１１−１３】
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【図１１−１４】
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【図１１−１５】
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【図１１−１６】
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【図１１−１７】
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【図１１−１８】
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【図１１−１９】
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【図１１−２０】
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【図１１−２１】
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【図１１−２２】
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【配列表】
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