(57)【要約】      （修正有）【課題】癌標的化合物を固定化させた抗癌剤の提供。【解決手段】水溶性高分子キャリアとしてデキストランをアミノ化し、それにタキソールを共有結合で固定化させ、残りのアミノ基と葉酸のカルボキシル基のイオン吸着固定化させた抗癌剤。【効果】この方法により従来のタキソールの約２倍、水溶性タキソールの約３倍の高い抗癌効果が提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌標的化合物を固定化させた抗癌剤
【請求項２】
癌標的化合物が葉酸であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
癌標的化合物が吸着により抗癌剤に固定化されることを特徴とする請求項１、２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
抗癌剤が、パクリタキセルなどの疎水性抗ガン剤を親水化処理したものであることを特徴とする請求項１から３に記載の抗癌剤。
【請求項５】
前記親水化処理が、パクリタキセルなどの疎水性抗癌剤とデキストラン、キトサン、ポリエチエレングリコールなどの親水性高分子とのコンジュゲートであることを特徴とする請求項１から４に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】  １９６８年にアメリカのカルフォルニア州に設立したアルゼ（現在ジョンソンアンドジョンソン）が薬物を製剤から徐々に放出させることによって効果を長期間持続するように打ち立てたコンセプトがドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）である。それから、今日まで活発に研究され中でも抗癌剤への利用が増えてきている。
増えている理由としては、抗癌剤の強力な副作用の抑制や薬剤の利便性の拡大、薬効の増強など様々なメリットが存在しているからである。例えば、抗癌剤パクリタキセル（タキソール）は、非水溶性のためクレモホールＥＬや無水エタノール等で溶解したものを使用している。このタキソールの水溶化（非特許文献１及び特許文献１）は、Ｌ−グルタミン酸に固定化させた方法の他にアルブミンやデキストリンなどの高分子を主としたものがよく研究されている。このような方法をプロドラッグ化といい薬剤の利便性を向上させる。具体的には、水溶性・脂溶性などの性質への変化や分子量の大きいものを使うことで薬剤粒子径を大きくしＥＰＲ効果（非特許文献２）やＲＥＳ抑制効果が可能となる。ＥＰＲ効果では、薬剤の粒子径数１０〜２００ｎｍで腫瘍組織へ集積していき、ＲＥＳ抑制では肝臓のクッパー細胞や副腎のマクロファージ系の細胞によって粒子径４００ｎｍ以上のものを異物として貪食作用により排除している。また、肝臓で薬物代謝により分解され、腎臓の糸球体でろ過により５ｎｍ以下のものが排泄される。このように最適な粒子径にすることで長期間体内の薬物濃度を維持できる。
さらに薬剤をミセル（非特許文献３）やリポソーム（非特許文献４）などの微粒子へ封入させる手法においても、通常状態では薬剤が流出せず、温度やｐＨ（非特許文献５）の変化によってコントロールリリースが可能である。
ＤＤＳで重要な役割として標的化（ターゲッティング）技術である。プロドラッグ化においても薬剤集積させるための粒子径の最適化をしているがそれ以上に目的部位にのみ運搬されるものであれば、副作用の軽減効果や薬剤をさらに少なくすることが可能になる。例えば、水溶性ビタミンとして知られる葉酸は、体内に吸収されると最終的に補酵素としてはたらき、細胞増殖に関与している。特定の癌組織では葉酸レセプターが高発現しており、多い順に卵巣（９０％）、脳（７５％）、腎臓（４３％）、肺（３７％）、乳房（３２％）と続く（非特許文献６）。卵巣癌患者に対して葉酸を利用したターゲッティングが可能であり、このような特異的なサインを持つ癌に関しては有効な方法である。また、ターゲッティング効果利用したものではミサイル療法として注目された抗体（非特許文献７）、酵素（非特許文献８）などが研究されている。ターゲッティング効果により正常細胞への影響が少なくなり副作用の軽減が可能、薬物量も多くできる。
プロドラッグ化やターゲッティング効果を持たせる薬剤設計では、合成などにより共有結合を主とした結合で固定化させた薬剤またはリガンドが一般的である（特許文献１及び特許文献２）。本発明ではこうした細かな薬剤設計や大掛かりな合成をせずに非常に簡易的な方法で高い抗癌効果をもつ抗癌剤を提供する。
【特許文献１】特開  １９９６−５２３７５５
【特許文献２】特開  ２００６−５５１３７０
【非特許文献１】Ｃｈｕｎ  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，２４０４−２４０９（１９９８）
【非特許文献２】Ｒａｔｈ  Ｄｕｎｃａｎ，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２（５），３４７−３６０（２００３）
【非特許文献３】Ｗｅｉ  Ｙａｎｇ  Ｓｅｏｗ，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８，１７３０−１７４０（２００７）
【非特許文献４】Ｙｕｚｕｒｕ  Ｉｋｅｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６０，１３７−１４５（２００８）
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｓｏｏ  Ｂａｅ，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，１８，１１３１−１１３９（２００７）
【非特許文献６】Ｙｉｎｇｊｕａｎ  Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９１，１７−２９（２００３）
【非特許文献７】Ｙｕｍｉ  Ｔｓｕｔｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１２２，１５９−１６４（２００７）
【非特許文献８】Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｙａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９８，３，８９４−８９９（２００１）
【非特許文献９】Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ，ｅｔ  ａｌ．：Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎｓ，３（１９９７）
【非特許文献１０】Ｅｒｉｃ  Ｋ．Ｒｏｗｉｎｓｋｙ．：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，９，１７０４−１７１２（１９９１）
【非特許文献１１】Ｓｔｅｖｅｎ  Ｄ．Ｗｅｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３３９６−３４０１（１９９２）
【非特許文献１２】Ｃｈｉｋａ  Ｎｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，８２９−８３４（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明の目的は、癌標的物質を新規固定化法によって抗癌剤に固定することにより抗癌効果を高めるものである。
【課題解決のための手段】
本発明の固定化法は、水溶性高分子キャリアとしてデキストランをアミノ化し、タキソールを共有結合で固定化させ、残りのアミノ基と葉酸のカルボキシル基のイオン吸着固定化させた抗癌剤。
【発明の効果】
本発明によれば標的分子の固定化をしないものと比べて約３倍の高い抗癌効果を提供している。
【発明を実施するための最良の形態】  水溶性タキソールと葉酸をリン酸バッファに溶解し、最適な濃度での混合により従来の合成による共有結合の固定化よりも簡易的であり、かつ高い抗癌効果を提供する。
イチイ科の植物から分離、合成される抗癌剤パクリタキセル（タキソール）は、卵巣癌、肺癌、乳癌に対して臨床で使用されている。使用する際にタキソールの溶媒として用いているクレモホールＥＬ（ポリオキシエチレンヒマシ油）が強力な副作用を持っている（非特許文献９及び非特許文献１０）。主に重篤な過敏症状を引き起こしてしまう、タキソールの副作用と同様にクレモホールＥＬの副作用もあることから現在、投薬前にステロイド系の薬剤を投与することで副作用を抑制している。本発明および実施例で使用した葉酸吸着水溶性タキソールは、これらの問題の解決が可能であることを示す。
両親媒性多糖類であるデキストランとエチレンジアミンをコンジュゲートし、得られたアミノ化デキストランにタキソールを固定化させることで水溶性タキソールを合成した。さらに、ターゲッティング効果として水溶性ビタミンの一種である葉酸をこれに固定化させた。先にも記載した共有結合での固定化が一般的ではあるが、本発明では水溶性タキソールと葉酸をリン酸バッファ中で混合し固定化させた。この場合、タキソールの固定化に使用したアミノ化デキストランのアミノ基と葉酸の側鎖に存在するカルボキシル基がリン酸バッファ溶液内で互いに正負のイオンを持つことによりイオン吸着によって固定化されている（上記の図を参照）。
葉酸レセプターを多く持つ特定の癌細胞に対して本発明では、混ぜるのみという簡単な方法で高い抗癌効果を提供している。
【実地例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
葉酸吸着させた水溶性タキソール抗癌剤の作成法の一例を次に示す。
▲１▼  アミノ化デキストラン（アミノ化Ｄｅｘ）の合成
デキストラン（ＭＷ７００００、名糖産業）１０ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業）７０ｍｌに溶解し、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、ＭＷ１６２．１５、和光純薬工業）２ｇをＤＭＳＯ１０ｍｌに溶解して両者を５０℃で１５分間反応させた。次いで、エチレンジアミン（ＭＷ６０．１、和光純薬工業）５ｍｌを加えて５０℃で１８時間反応させた。反応終了後、分画分子量ＭＷ１４０００の透析膜を用いて水道水で一晩透析し、更に蒸留水で１．５時間×２回脱塩処理した。４０℃で１８時間乾燥後、５０℃で１８時間の真空乾燥に供することによりアミノ化デキストランを回収した。トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ、和光純薬工業）を用いてアミノ化度を評価したところ、デキストランの糖残基数に対するアミノ基導入率は、約７〜１０モル％であった。
▲２▼  水溶性タキソール（Ｄｅｘ−ＴＸＬ）の合成
（アミノ基導入率７モル％のアミノ化Ｄｅｘを使用）
▲１▼で合成したアミノＤｅｘ５ｇをＤＭＳＯ７５ｍｌに溶解した。タキソール（ＭＷ８５３．９、Ｓａｍｙａｎｇ  Ｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）０．７ｇをＤＭＳＯ２０ｍｌに溶かし、ＣＤＩ０．６ｇをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解した溶液とを混合し、５０℃で１５分間反応させた。次いで、アミノ化Ｄｅｘ溶液を添加し、５０℃で１８時間反応させた。分離精製は、▲１▼と同様の方法で行い、分光光度計を用いてタキソールの２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによりタキソール導入率を求めた。その結果、アミノ化Ｄｅｘのアミノ基に対してタキソール導入率は、約１５〜１７％であった。従ってデキストランの糖残基に対するタキソール導入率は１〜１．２％となった。
▲３▼  デキストラン−タキソール−葉酸（Ｄｅｘ−ＴＸＬ−ＦＡ）の調製
（タキソール導入率１７％のＤｅｘ−ＴＸＬを使用）
▲２▼で得られたＤｅｘ−ＴＸＬには、未反応のアミノ基が８３〜８５％残っており、これに対して葉酸（ＭＷ４４１．４０、和光純薬工業）を吸着させた。Ｄｅｘ−ＴＸＬは、２．５、葉酸は０．１５Ｗ／ｖ％の濃度になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解し、体積比１：１で混合して２５℃で１８時間静置した。毒性試験で使用する場合は、この混合溶液を培地で希釈して使用した。
＜実地例２＞
ヒト咽頭癌細胞ＫＢ（ＤＳファーマバイオメディカルより購入）、ヒト大腸癌細胞Ｃａｃｏ−２、正常細胞Ｌ９２９（ＡＴＣＣより購入）を用いて増殖抑制試験を行った。ＫＢ細胞は、葉酸を利用したターゲッティング効果を検討する試料としてよく用いられており正常細胞の約１０００倍以上の葉酸レセプターを細胞表面に持っている（非特許文献１１）。Ｃａｃｏ−２もＫＢほどではないがＬ９２９よりは多い葉酸レセプターを持っている。水溶性タキソールに葉酸を吸着固定化した薬剤は、１０％ウシ胎児血清（和光純薬工業）を含有したＲＰＭＩ１６４０（葉酸不含、Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させた。それぞれの細胞を、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１．０×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養後、Ｄｅｘ−ＴＸＬおよびＤｅｘ−ＴＸＬ−ＦＡおよび対照Ｔａｘｏｌのみを最終濃度０−１ｐｐｍとなるように添加し、９６時間後、未添加系に対して細胞の増殖が５０％阻害される濃度をＩＣ５０とし、Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄ法（非特許文献１２）で求めた。その結果を表１に示す。
表１よりＫＢ細胞では、葉酸無添加系のタキソールの約２倍、水溶性タキソール約３倍の抗癌効果を示した。また、細胞種で葉酸レセプターの少ないＬ９２９はタキソールのみが一番高い毒性を示しており、逆に葉酸を固定化させた水溶性タキソールは、その約３倍以上低い毒性を示したことから正常細胞への影響が軽減されていた。  Ｃａｃｏ−２では、ＫＢほどの葉酸ターゲッティング効果はないもののタキソール、水溶性タキソールと比べて約２倍の抗癌効果を示した。
＜実施例３＞
葉酸の吸着処理時間による毒性の影響について検討した。直前混合したものと一晩静置したものとで毒性に変化があるか調べた。実施例２と同様の方法でＫＢ細胞のみ行った。その結果を表２に示す。
表２の結果より、直前混合した場合でも高い抗癌効果を示していることから吸着処理時間による影響もなく混ぜればすぐ使用できるという利点が示された。