(57)【要約】【課題】尿路上皮癌の発生リスク及び予後不良リスク並びに腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを決定するための新規な方法を提供する。【解決手段】本発明は、（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌発生関連領域、尿路上皮癌予後関連領域又は腎盂・尿管癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群、予後不良群又は膀胱内再発高リスク群に分類されるか否かを決定するステップを含む、尿路上皮癌の発生リスク若しくは予後不良リスク、又は腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを検出する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、尿路上皮癌の発生リスクを検出する方法。
【請求項２】
前記尿路上皮癌発生関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記尿路上皮癌発生関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、尿路上皮癌の予後不良リスクを検出する方法。
【請求項５】
前記尿路上皮癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６に含まれるゲノム領域を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記尿路上皮癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎盂・尿管癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が膀胱内再発高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを検出する方法。
【請求項８】
前記腎盂・尿管癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７に含まれるゲノム領域を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腎盂・尿管癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムＤＮＡが、被験体の尿路上皮組織から得られたものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムＤＮＡが、被験体の尿サンプルから得られたものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４を少なくとも含む、尿路上皮癌の発生リスクを評価するためのアレイ。
【請求項１４】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６を少なくとも含む、尿路上皮癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【請求項１５】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７を少なくとも含む、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを決定するためのアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿路上皮癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、尿路上皮癌の発生リスクの評価方法に関する。また、本発明は、尿路上皮癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、尿路上皮癌の予後不良リスクの検出方法に関する。さらに、本発明は、腎盂・尿管癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクの検出方法に関する。特に、本発明は、特定のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、尿路上皮癌の発生リスクの評価方法及び予後不良リスクの評価方法、並びに腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクの評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿路上皮癌とは、尿路上皮に発生する悪性腫瘍を一般的に指す。尿路上皮癌の発生部位は尿路全体にわたり、これは、腎盂、尿管、膀胱、及び尿道を含む。代表的な尿路上皮癌である膀胱癌の日本における罹患率は、人口１０万人に対して２０人程度（男性）であり、近年増加傾向にある。欧米での罹患率は顕著に高く、尿路上皮癌に対しては世界的に対策が求められている。尿路上皮癌の発癌リスクを非侵襲的に、例えば検診の一環として評価することができれば、危険群に対して、リスク因子であると言われている喫煙を制限するなどの尿路上皮癌の予防措置や、頻繁な尿細胞診などの早期診断のための対策を採ることができる。
【０００３】
尿路上皮癌の治療法としては、罹患した器官の全摘術の他に、経尿道的腫瘍切除術（ＴＵＲ）又はＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）注入療法が行われている。膀胱癌の根治治療である膀胱全摘術は、患者のＱＯＬを著しく低下させるので、他の治療法であるＴＵＲ若しくはＢＣＧ注入療法による癌の制御が有効でない、又は有効でないことが予測される場合にのみ適応となる。癌の制御のために、又はアジュバント療法（術後薬物療法）として、化学療法も行われている。器官全摘術、又はアジュバント療法の適応を決定するために、尿路上皮癌の予後予測方法が泌尿器科の現場で求められている。
【０００４】
尿路上皮癌は、尿路全体での時間的・空間的多発性が顕著である、との特徴を有する。これは、発癌のフィールド効果によると考えられている（非特許文献１）。例えば、腎盂癌、尿管癌などの上部尿路上皮癌の患者で、その一次癌を腎尿管全摘術により根治させても、１０〜３０％の患者においては異時性に膀胱内に尿路上皮癌が発生することが知られている。よって、現状では、腎盂・尿管癌の術後患者は、侵襲性のある膀胱鏡検査を反復して受ける必要がある。このような患者の負担を軽減するために、腎盂・尿管癌の非侵襲的な予後予測を可能にすることにより、異時性の尿路上皮癌の診断効率を高めることが求められている。
【０００５】
癌細胞ではゲノム配列の欠失及び増幅、ＣｐＧアイランドのメチル化による発現抑制、ヒストンタンパク質の脱アセチル化による遺伝子の発現抑制、遺伝子点突然変異等が起こっていることが、頻繁に報告されている。
【０００６】
本発明者らは、尿路における多段階の発癌過程の早期、すなわち前癌段階からＤＮＡメチル化異常が寄与するとの分子病理学的知見を蓄積してきた（非特許文献２及び３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｎｅａｌ，Ｄ．Ｅ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９２，３２６：７５９−７６１
【非特許文献２】Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００７，２８：２４３４−２４４２
【非特許文献３】Ｋａｎａｉ，Ｙ．，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．，２００８，５８：５４４−５５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり、尿路上皮癌の発生リスク・予後不良リスクを評価するための指標の開発が望まれ、また、腎盂・尿管癌の再発リスクを評価する方法も望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、尿路上皮組織検体でのゲノム配列のメチル化について、以下に詳細に説明するようにＢＡＭＣＡ法を用いて網羅的に解析し、複数の尿路上皮癌発生関連領域、尿路上皮癌予後関連領域及び腎盂・尿管癌予後関連領域を特定した。
【００１０】
本発明は、具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、尿路上皮癌の発生リスクを検出する方法。
〔２〕前記尿路上皮癌発生関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記尿路上皮癌発生関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕に記載の方法。
〔４〕以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、尿路上皮癌の予後不良リスクを検出する方法。
〔５〕前記尿路上皮癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記尿路上皮癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔４〕に記載の方法。
〔７〕以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎盂・尿管癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が膀胱内再発高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを検出する方法。
〔８〕前記腎盂・尿管癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記腎盂・尿管癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕前記ゲノムＤＮＡが、被験体の尿路上皮組織サンプルから得られたものである、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１〕前記ゲノムＤＮＡが、被験体の尿サンプルから得られたものである、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２〕ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、上記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４を少なくとも含む、尿路上皮癌の発生リスクを評価するためのアレイ。
〔１４〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６を少なくとも含む、尿路上皮癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
〔１５〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７を少なくとも含む、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを決定するためのアレイ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、尿路上皮癌の発生リスク及び予後不良リスク、並びに腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを判定することができる。検診などの一環として尿路上皮癌の発生リスクを知ることができれば、尿細胞診などの尿路上皮癌のスクリーニングを頻繁に行い、尿路上皮癌を早期に発見して治療効果を高めることができる。また、尿路上皮癌の予後不良リスクを評価することができれば、膀胱全摘術の適応となるかどうかの判断など、治療方法の判断をより精密に行うことができる。さらに、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクの評価により、例えば膀胱での異時性の発癌を早期に発見できれば、それらの二次癌を、より侵襲の少ない治療法により根治することできると期待される。したがって、本発明は医療・健康科学分野で非常に大きな利益をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＢＡＭＣＡ法の概略を示す模式図である。
【図２】正常尿路上皮組織検体及び尿路上皮癌症例からの非癌尿路上皮組織検体についての、尿路上皮癌発生関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく発癌リスクの判定のための判断基準の例の一部を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図３】表１の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【図４】非再発例及び再発例の尿路上皮癌検体についての、尿路上皮癌予後関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく予後不良リスクの判定のための判断基準の例の一部を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図５】表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【図６】膀胱内非再発例及び膀胱内再発例の腎盂・尿管癌患者からの非癌尿路上皮組織検体についての、腎盂・尿管癌予後関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく膀胱内再発リスクの判定のための判断基準の例の一部を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図７】表３の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中、「尿路上皮」とは尿路の内腔面を被覆する移行上皮を指す。本明細書中、「尿路上皮癌」とは、腎盂、尿管、膀胱又は尿道の尿路上皮に発生する悪性腫瘍を一般的に指す。本明細書中、「腎盂・尿管癌」とは、腎盂及び／又は尿管で生じる尿路上皮癌を指し、これは、上部尿路上皮癌とも呼ばれる。本明細書中、「膀胱癌」とは、膀胱で生じる尿路上皮癌を指す。本明細書中、「異時性膀胱癌」とは、腎盂・尿管癌患者の膀胱において二次的に発生する尿路上皮癌を指す。本明細書中、「膀胱内再発」とは、腎盂・尿管癌患者での異時的な膀胱内尿路上皮癌の発生を意味する。
【００１４】
一態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、尿路上皮癌の発生リスクを検出する方法に関する。
【００１５】
また、別の態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、尿路上皮癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、尿路上皮癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
【００１６】
さらに、別の態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎盂・尿管癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が膀胱内再発高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを検出する方法に関する。
【００１７】
好ましい実施形態では、上記のゲノムＤＮＡは、被験体の尿路上皮組織サンプルから得られたものである。
別の好ましい実施形態では、上記のゲノムＤＮＡは、被験体の尿サンプルから得られたものである。一般に、尿中には尿路上皮から剥離した細胞が含まれ得るため、尿からのＤＮＡの抽出によって、尿路上皮由来のゲノムＤＮＡを得ることが可能である。尿サンプルの取得は通常侵襲性を伴わないため、本発明の方法を尿サンプルから得た尿路上皮ゲノムＤＮＡに対して行えば、まったく侵襲性のない、癌の発生リスク評価及び予後予測が可能になる。
好ましい実施形態では、上記の態様のステップ（ｂ）において、ＤＮＡメチル化をＢＡＭＣＡ法によって調べる。
【００１８】
ＢＡＭＣＡ法
本明細書中、ＢＡＭＣＡ法とは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法）の略称であり、特定のゲノム領域におけるメチル化を検出することができるアッセイ方法である。
【００１９】
以下に、ＢＡＭＣＡ法の代表的な態様を例示する。被験組織（癌組織など）と対照組織（正常組織など）から、フェノール／クロロホルム法などによりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化する。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で被験組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅する。一方、対照組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ５にて標識する。その両者を混合し、数多くのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイ上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。ここで、被験組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては切断されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅される。当該領域が被験組織由来ＤＮＡのみでメチル化されており、対照組織ではメチル化されていない場合、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（被験組織）／Ｃｙ５（対照組織）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。この一連のＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００２０】
競合ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件により行うことができる：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、場合により、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの存在下にてエタノール沈殿する。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させる。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社など）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせる。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行う。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行う。
【００２１】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、例えば、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ４１００Ａ等）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ５．０等）によって数値化し、癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出することができる。
【００２２】
尿路上皮癌発生関連領域、尿路上皮癌予後関連領域及び腎盂・尿管癌予後関連領域
好ましい実施形態では、本発明において用いる「尿路上皮癌発生関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と尿路上皮癌の発生リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００２３】
本発明者らは、全染色体領域を網羅的に解析するために、正常尿路上皮組織と尿路上皮癌症例より得られた非癌尿路上皮組織に対して、約４５００種類のＢＡＣ  ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイであるＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により、正常尿路上皮組織と尿路上皮癌症例から得られた非癌尿路上皮組織とでメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。すなわち、本発明において、「尿路上皮癌発生関連領域」とは、限定するものではないが、以下の８３のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４。
【００２４】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の８３のＢＡＣクローンのうち５０クローン以上で、以下の実施例に記載する表１に示したものなどの判断基準を満たす場合に、尿路上皮癌の発癌高リスク群に属すると判断することができる。
【００２５】
また、別の好ましい実施形態では、本発明において用いる「尿路上皮癌予後関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と尿路上皮癌の転移再発リスク、すなわち予後不良リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００２６】
本発明者らは、上記と同様、ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により、予後良好群（非再発群）尿路上皮癌組織と予後不良群（再発群）尿路上皮癌組織でメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。すなわち、本発明において、「尿路上皮癌予後関連領域」とは、限定するものではないが、以下の２０のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６。
【００２７】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の２０のＢＡＣクローンのうち１７クローン以上で、以下の実施例に記載する表２に示したものなどの判断基準を満たす場合に、尿路上皮癌の予後不良高リスク群に属すると判断することができる。
【００２８】
さらに、別の好ましい実施形態では、本発明において用いる「腎盂・尿管癌予後関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００２９】
本発明者らは、上記と同様、ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により、異時性膀胱癌非発生群（膀胱内非再発群）と異時性膀胱癌発生群（膀胱内再発群）の腎盂・尿管癌患者から得た非癌尿路上皮組織でメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。すなわち、本発明において、「腎盂・尿管癌予後関連領域」とは、限定するものではないが、以下の１１のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７。
【００３０】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の１１のＢＡＣクローンで、以下の実施例に記載する表３に示したものなどの判断基準を満たす場合に、腎盂・尿管癌患者が膀胱内再発高リスク群に属すると判断することができる。
【００３１】
ここで、上記のＢＡＣクローンは、ＲＰＣＩ  ＢＡＣライブラリー１１に含まれるクローンであり、該ライブラリー中での参照番号により示されている。ＲＰＣＩ  ＢＡＣライブラリー１１は、ヒト男性の血液から採取したゲノムを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＣベクターに挿入することにより作製されたライブラリーである。ＲＰＣＩ  ＢＡＣライブラリーはＲＰＣＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能である。また、一部のクローンについては、その全長配列をデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能である。全長配列がデータベースに登録されていないクローンについても、ＮＣＢＩ  Ｃｌｏｎｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙデータベースから、ゲノム上の位置、末端配列などについての情報を得ることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。全長配列又は末端配列がデータベースから入手可能な１０８クローンについての、全長配列又は末端配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を以下に挙げる：
【００３２】
全長配列 末端配列
尿路上皮癌発生関連領域
ＲＰ１１−７５Ｃ８                                        ＡＱ２６６５９４
ＡＱ２６７１５５
ＲＰ１１−５４７Ｄ１４            ＡＣ００７６１６
ＲＰ１１−１７４Ｂ４              ＡＬ３５４７９５
ＲＰ１１−８０９Ｃ１８            ＡＬ３５８２１６
ＲＰ１１−８９Ｇ６                                        ＡＺ５１７０５２
ＡＺ５１７０５４
ＡＱ２８２７９９
ＡＱ２８２８１５
ＲＰ１１−７４１Ｉ１５            ＡＣ１１４７９９
ＲＰ１１−１３３Ｈ１９                                    ＡＱ３５０２４９
ＡＱ３８５５４６
ＲＰ１１−９１Ｊ３                ＡＣ０９３７６３
ＲＰ１１−５９Ｄ１０                                      ＡＱ１９９８５１
ＡＱ１９９８５５
ＲＰ１１−６１Ｐ１５                                      ＡＱ１９６２１６
ＡＱ１９６２１９
ＲＰ１１−４９２Ａ７              ＡＬ０７９２９９
ＲＰ１１−８９Ｎ６                                        ＡＱ２８６６２７
ＡＱ２８６６２９
ＲＰ１１−９０Ｋ１１                                      ＡＱ２８３４９６
ＲＰ１１−２８２Ｐ１３                                    ＡＱ５０５８０９
ＲＰ１１−１８６Ｏ８                                      ＡＱ４２１７５３
ＲＰ１１−１９２Ｄ１１                                    ＡＱ４１２１４８
ＡＱ４１２１５１
ＲＰ１１−１０５Ｈ１９            ＡＣ０２０７５０
ＲＰ１１−９８Ｈ２３              ＡＬ１３６１０８
ＲＰ１１−７８Ｐ４                                        ＡＱ２８１４６２
ＲＰ１１−６１Ｆ４                ＡＣ００８３７２
ＲＰ１１−９０Ｄ１３                                      ＡＱ２８３６１１
ＡＱ２８３６２３
ＡＺ５１８４０５
ＲＰ１１−８０Ｆ４                                        ＡＱ２８３９９９
ＡＱ２８４０００
ＲＰ１１−４５４Ｃ４                                      ＡＱ５８１８７７
ＡＱ５８１８７９
ＲＰ１１−３９９Ｋ２１            ＡＣ０１０９９７
ＲＰ１１−３４４Ａ５              ＡＬ１３９２４０
ＲＰ１１−４６２Ｋ４                                      ＡＺ０８１８７３
ＡＺ０８１８９７
ＲＰ１１−９４Ａ１８                                      ＡＱ３１４３１１
ＡＱ３１４３１４
ＲＰ１１−３Ｐ８                  ＡＣ０１２１２９
ＲＰ１１−５０Ｎ１０                                      ＡＱ０５２１７１
ＡＱ０５２１７３
ＲＰ１１−８８Ｅ１３                                      ＣＬ９８３２８５
ＣＬ９８３２８４
ＲＰ１１−１３５Ｎ５              ＡＣ０１５７９９
ＲＰ１１−８７Ｎ６                                        ＡＱ２８５０９１
ＲＰ１１−８０Ｄ２２                                      ＡＱ２８３９９０
ＡＱ２８３９９２
ＲＰ１１−２３３Ｅ５                                      ＣＧ７３４３０６
ＣＧ７３４３０５
ＢＺ７４９１０１
ＲＰ１１−１９４Ｆ１３                                    ＡＱ６２９７５６
ＡＱ４１２８６１
ＲＰ１１−１７６Ｊ１６            ＡＣ０７９８２５
ＲＰ１１−８８Ｂ１２                                      ＡＺ５１６１０７
ＡＱ２８６５９４
ＡＱ２８６５９６
ＲＰ１１−１０１Ｊ１４                                    ＡＱ３２１９７６
ＡＱ３２１９７７
ＲＰ１１−４４９Ｂ２１                                    ＡＱ５８４２６０
ＡＱ５８４２５６
ＲＰ１１−９１Ｎ１                                        ＡＱ２８４１７５
ＡＱ２８４１７８
ＲＰ１１−９０Ｂ１１                                      ＡＺ５１７９７８
ＡＱ２８３５２２
ＡＱ２８３５２５
ＲＰ１１−１９Ｃ１８                                      Ｂ８２９５６
ＲＰ１１−２１７Ｆ１１            ＡＣ０２２４７９
ＡＣ０９２９８８
ＲＰ１１−５８Ｇ１９                                      ＢＺ７４９１６２
ＢＺ７４９１６３
ＡＱ１９６０７４
ＡＱ１９６０９４
ＲＰ１１−２３Ｍ９                ＡＣ０１６１８９
ＲＰ１１−１０５Ｆ２２                                    ＡＱ３１８９７２
ＡＱ３１８９７５
ＲＰ１１−７９Ａ２１              ＡＬ５１３４９１
ＲＰ１１−１２１Ｇ２４            ＡＣ００９６４４
ＲＰ１１−５３０Ｃ５              ＡＣ０７３５６９
ＲＰ１１−３５Ｋ２２                                      ＡＱ０４７１８５
ＡＱ０４７１８７
ＣＧ７３４２７５
ＢＺ７４９１２９
ＣＧ７３４２７６
ＲＰ１１−３０３Ｇ２１                                    ＡＺ０８１８８５
ＡＺ０８１８８６
ＲＰ１１−９０Ｇ２２                                      ＡＱ２８２７４２
ＡＱ２８２７４５
ＲＰ１１−５１５Ｉ１２            ＡＬ３５６１３７
ＲＰ１１−８７Ｏ１                ＡＬ１３７８５３
ＲＰ１１−２４Ｎ８                                        Ｂ８４４９０
ＡＱ０１３５８６
ＲＰ１１−１３Ｆ１２                                      Ｂ７６０２７
ＲＰ１１−４５１Ｃ２              ＡＣ００７１６５
ＲＰ１１−９１Ｈ１                                        ＡＺ５１９３０２
ＡＱ２８３３７４
ＡＱ２８３３７７
ＲＰ１１−４７７Ｐ１１                                    ＡＱ６３６４７１
ＲＰ１１−４Ｆ２４                ＡＣ００７８７３
ＲＰ１１−１３５Ｌ１６                                    ＡＱ３８１８９２
ＡＱ３８１８８９
ＲＰ１１−５７Ｃ１３              ＡＬ１３８７６７
ＲＰ１１−２０Ｈ１９                                      Ｂ８５６６２
Ｂ８８７８１
ＡＱ００８１６２
ＲＰ１１−１７０Ｄ９                                      ＡＱ４１８００３
ＲＰ１１−８９Ｉ４                ＡＣ０５５８８２
ＡＣ０９３７６１
ＲＰ１１−２９５Ｈ２４            ＡＣ０２２３０６
ＡＣ０８７５３６
ＲＰ１１−９０Ｉ１５                                      ＡＱ２８１７８８
ＡＱ２８１７９１
ＲＰ１１−９０Ｃ２１                                      ＡＱ２８１４７２
ＡＱ２８１４８２
ＲＰ１１−４５１Ｍ８                                      ＡＱ５８４０５５
ＡＱ５８４０５８
ＲＰ１１−１８４Ｍ２１            ＡＣ０９０７９８
ＲＰ１１−９２Ｉ１８                                      ＡＱ２８６２４３
ＡＱ３２１４３３
ＲＰ１１−２１Ｐ８                                        Ｂ８４０８７
ＲＰ１１−１２６Ｄ１８                                    ＡＱ３４８９９４
ＡＱ３４８９９６
ＲＰ１１−７３Ｎ２２                                      ＢＺ７４９１８１
ＣＧ７３４３００
ＣＧ７３４２９９
ＲＰ１１−３８０Ｋ２１            ＡＬ３５５１５０
ＲＰ１１−３６３Ｇ１              ＡＣ００９５９４
ＡＣ０１３５３９
ＲＰ１１−８９Ｂ１１                                      ＡＱ２８３６３６
ＡＺ５１７７２２
ＡＱ２８３６３４
ＲＰ１１−６７Ｇ２４                                      ＡＱ２３９１７６
【００３３】
尿路上皮癌予後関連領域
ＲＰ１１−７９Ｋ６                                        ＡＺ５１９１８２
ＡＱ２８３１５８
ＡＱ６２９６６４
ＲＰ１１−１３３Ａ７                                      ＡＺ５２０４８６
ＲＰ１１−４６６Ｃ１２                                    ＡＺ２５４４７９
ＡＺ２５４４８０
ＡＱ６３５９１４
ＲＰ１１−１８Ｈ２３                                      Ｂ８２８８２
ＲＰ１１−４７８Ｃ１              ＡＬ１５８０６８
ＲＰ１１−１１Ａ１１              ＡＣ０１１２２７
ＲＰ１１−３３７Ｂ１１            ＡＣ０１８９０３
ＲＰ１１−７９Ａ２２                                      ＡＺ５１９１４２
ＡＱ２８２４１６
ＡＱ５８０４６３
ＲＰ１１−７９Ｋ２３                                      ＡＺ５１９１０４
ＡＱ３１７６１０
ＡＱ３１７６１１
ＲＰ１１−４２６Ｅ１０                                    ＡＱ５２８９０７
ＡＺ６９４８１２
ＡＺ９１６６４８
ＲＰ１１−４３０Ｂ１              ＡＣ０１０６７４
ＡＣ０９０９０６
ＲＰ１１−９０Ｃ７                                        ＡＱ２８１４３０
ＡＱ２８１４３３
ＲＰ１１−８９Ｈ１３                                      ＡＺ５１７７７３
ＡＱ２８４７１７
ＡＱ２８４７１８
ＲＰ１１−１９４Ｈ７                                      ＡＱ４１２８６９
ＲＰ１１−７９Ｏ１２                                      ＡＺ５１９７７５
ＡＱ２８３３２０
ＡＱ２８３３１７
ＡＱ６２９７０１
ＲＰ１１−５９Ｄ１０                                      ＡＱ１９９８５１
ＡＱ１９９８５５
ＲＰ１１−９Ｆ１１                ＡＬ０５０３１２
ＲＰ１１−２０７Ｊ８                                      ＡＱ４１７７２２
ＡＱ４１７７２５
ＲＰ１１−１２Ｌ９                                        Ｂ７５０４２
Ｂ７５０４３
ＲＰ１１−３８３Ｂ１６                                    ＡＺ２５４４９１
ＡＺ２５４４９２
ＡＱ５５０７５８
ＡＱ５５０７６１
【００３４】
腎盂・尿管癌予後関連領域
ＲＰ１１−７２１Ｇ１１            ＡＬ３６０１５５
ＲＰ１１−１０４Ｎ１１                                    ＡＱ３１４０１３
ＡＱ３１４０１０
ＲＰ１１−４０２Ｎ１４            ＡＣ００９９６８
ＲＰ１１−２４４Ｋ２                                      ＡＱ４９１３４４
ＡＱ４９１３４６
ＲＰ１１−３Ｆ７                  ＡＣ０１０８１５
ＲＰ１１−３９９Ｂ２２            ＡＬ３５６９６５
ＲＰ１１−１４８Ｄ２３                                    ＡＱ３７５６９５
ＡＱ３７５６９８
ＲＰ１１−９０Ｋ１５                                      ＡＱ２８３５０５
ＡＱ２８３５０９
ＲＰ１１−１０Ｄ８                                        Ｂ７１６６８
ＡＺ５２０１９８
ＲＰ１１−９１Ｆ７                                        ＡＱ２８３３２８
ＡＱ２８３３３０
【００３５】
データベースに配列情報が開示されていない以下の６クローン：ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、及びＲＰ１１−２２９Ｎ１４に関しては、それぞれについてＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｔｅ）配列が特定されている。ＳＴＳ配列については、以下に示すコード番号を用いてデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｕｎｉｓｔｓ）を検索することにより、具体的な情報を得ることができる。それぞれのクローンに対して特定されているＳＴＳ配列についての情報を、以下に挙げる：
【００３６】
ＲＰ１１−５２８Ｂ２１
ＵｎｉＳＴＳ：１８１６９９
ｓｔｂＫ９６３Ｈ５
フォワードプライマー：ＧＣＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＡＧＣ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣ（配列番号２）
ＰＣＲ産物サイズ：１３９ｂｐ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
【００３７】
ＲＰ１１−２８２Ｊ２４
ＵｎｉＳＴＳ：７８０４６
Ｄ８Ｓ２０７０
フォワードプライマー：ＴＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＧＣＡＣＡＧ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＧＧＴＣＡＧＴＧＡＡ（配列番号４）
ＰＣＲ産物サイズ：１４９ｂｐ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ１４７３３、Ｔ４７８３７
【００３８】
ＲＰ１１−２５４Ａ７
ＵｎｉＳＴＳ：４１６４８
Ｄ４Ｓ１５９７
フォワードプライマー：ＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧ（配列番号５）
リバースプライマー：ＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＧＧＴＡＧＡＴＧＡＣＡＧ（配列番号６）
ＰＣＲ産物サイズ：１５０ｂｐ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ２４１５８
【００３９】
ＲＰ１１−２１６Ｎ１３
ＵｎｉＳＴＳ：２８３６０
Ｄ５Ｓ２０９０
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴ（配列番号７）
リバースプライマー：ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣ（配列番号８）
ＰＣＲ産物サイズ：１８９−２０５ｂｐ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ５１６６８
【００４０】
ＲＰ１１−２８４Ｊ３
ＵｎｉＳＴＳ：６５０１４
Ｄ８Ｓ１１０４
フォワードプライマー：ＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＴＧ（配列番号９）
リバースプライマー：ＧＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＧＴ（配列番号１０）
ＰＣＲ産物サイズ：１２９−１４１ｂｐ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０８６７１
【００４１】
ＲＰ１１−２２９Ｎ１４
ＵｎｉＳＴＳ：１８６５７
ＳＨＧＣ−８８９８
フォワードプライマー：ＡＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＡＣＣＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＴ（配列番号１２）
ＰＣＲ産物サイズ：２５１ｂｐ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ１７３５８
【００４２】
当業者であれば、上記の入手可能な配列情報をもとに、前記ＢＡＣライブラリーから、本発明に係るＢＡＣクローンを入手することが可能である。
【００４３】
繰り返して言うが、本発明の方法を実施するために用いる尿路上皮癌発生関連領域、尿路上皮癌予後関連領域及び腎盂・尿管癌予後関連領域は、上記のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域には限定されず、ＢＡＭＣＡ法などの適切な方法によりそのメチル化が尿路上皮癌と関連付けられる他の領域であり得る。
【００４４】
尿路上皮癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法をはじめとする、下記で例示するような公知の手法を用いて検査することにより、尿路上皮癌の発生リスクを評価することが可能であり、尿路上皮癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化を検査することにより、尿路上皮癌の予後不良リスクを決定することが可能であり、また、腎盂・尿管癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化を検査することにより、腎盂・尿管癌の術後の膀胱内再発リスクを決定することが可能である。
【００４５】
ＤＮＡメチル化
本明細書中、「ＣｐＧアイランド」とは、高等生物、特に哺乳動物のゲノム配列中、非翻訳領域に存在するＧ（グアニン）Ｃ（シトシン）含量が多い領域である。「ＣｐＧアイランド」の「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「ｐ」はシトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表している。すなわち、ＣｐＧアイランドには、隣接したシトシンとグアニンとがホスホジエステル結合で結合されたジヌクレオチドの繰り返し配列が含まれる。ＣｐＧアイランドの長さは約３００〜３０００塩基対である。ＣｐＧアイランドは、一般に、全配列中にＣｐＧ配列を統計的に期待される６％と同じか又はそれを上回る割合で含む。ＣｐＧアイランド以外のゲノム領域では、ＣＧサプレッションのため、ＣｐＧ配列の含量は１％以下である。
【００４６】
本明細書中、「ＤＮＡメチル化」（又は単に「メチル化」）とは、上記のＣｐＧ配列において、シトシンの５位の炭素がメチル化されていることを意味する。
【００４７】
正常尿路上皮組織１８検体及び尿路上皮癌症例からの非癌尿路上皮組織１７検体に対して、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定を利用して、正常尿路上皮組織と尿路上皮癌症例から得られた非癌尿路上皮組織とを区別することが可能な８３ＢＡＣクローンを特定した（表１）。
【００４８】
尿路上皮癌の発生リスクに関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図２に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表１に示す。
【００４９】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された尿路上皮癌発生関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、被験者の検体の中から、尿路上皮癌が発生するリスクが高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００５０】
すなわち、例えば上記の８３クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、尿路上皮癌の発生リスクを評価することができる。
【００５１】
また、異なる予後を有する症例（予後良好群：再発なし、３６検体；予後不良群：術後に再発、４検体）の尿路上皮癌組織の４０検体（膀胱切除術：１２検体；腎尿管切除術：２８検体）について、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定を利用して、予後良好症例と予後不良症例とを区別することが可能な２０ＢＡＣクローンを特定した（表２）。
【００５２】
尿路上皮癌の予後に関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図４に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表２に示す。
【００５３】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された尿路上皮癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、尿路上皮癌症例の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００５４】
すなわち、例えば上記の２０クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、尿路上皮癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００５５】
さらに、腎尿管切除術後の膀胱内再発の有無が異なる腎盂・尿管癌症例（膀胱内非再発群：９検体；膀胱内再発群：４検体）から得た非癌尿路上皮組織の１３検体について、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定を利用して、膀胱内非再発群と膀胱内再発群とを区別することが可能な１１ＢＡＣクローンを特定した（表３）。
【００５６】
腎盂・尿管癌の予後に関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図６に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表３に示す。
【００５７】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された腎盂・尿管癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、腎盂・尿管癌症例の中から、膀胱内再発リスクが高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００５８】
すなわち、例えば上記の１１クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを決定することができる。
【００５９】
ゲノム領域におけるＤＮＡメチル化の状態を調べるためには、上記のＢＡＭＣＡ法（図１）の他に、ＰＣＲを利用する別の方法、及びサザンブロッティングを利用する方法などを用いることができる。
【００６０】
ＰＣＲを利用する別の方法としては、以下のものなどを挙げることができる：
（ａ）バイサルファイトシークエンシング法：ゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換するとシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンにおいてはこの反応がほとんど進まず、シトシンのままとなる。この反応を利用すれば、ＤＮＡメチル化状態の差が塩基配列に変換される。バイサルファイト変換したゲノム領域をＰＣＲ増幅してクローン化するなどし、塩基配列を決定することにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｂ）ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、バイサルファイト変換−制限酵素法）：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換して塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して制限酵素の認識部位が残っているか残っていないかを調べることにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｃ）メチル化特異的ＰＣＲ法：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換し、塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、塩基配列が変化している場合（メチル化がない）に増幅できるプライマー、又は塩基配列が変化していない場合（メチル化がある）に増幅できるプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物の有無によってＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
【００６１】
サザンブロッティングを利用する方法は、以下のように実施することができる。試験する検体中のゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化すると、メチル化されている認識部位は切断されず、メチル化されていない認識部位は切断される。消化済みのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンなどにトランスファーし、３２Ｐなどで標識した標的特異的なプローブをハイブリダイズさせる。このとき、検出されるバンドの長さの違いから、対象となる領域のメチル化の有無を知ることができる。
【００６２】
これらの方法において用いる「メチル化感受性制限酵素」とは、例えばＳｍａＩ及びＨｐａＩＩであり、好ましくはＳｍａＩである。それらのメチル化感受性酵素と同じ認識配列を認識する非メチル化感受性酵素は当業者が容易に知ることができ、これをメチル化感受性酵素と組み合わせて上記のようなＤＮＡメチル化の検査方法において用いることができる。
【００６３】
これらの方法を用いるメチル化の検査における、尿路上皮癌発生関連領域、尿路上皮癌予後関連領域及び腎盂・尿管癌予後関連領域でのメチル化の有無の判定基準は、当業者ならば公知の統計学的手法等を用いて適宜決定することができる。具体的には、例えば、尿路上皮癌検体の予後不良群を陽性対照とし、予後良好群を陰性対照として、所望のＤＮＡメチル化検査法により尿路上皮癌予後関連領域のＤＮＡメチル化状態を調べる。その結果を陽性対照と陰性対照とで比較することにより、各尿路上皮癌予後関連領域について有意な測定値の閾値を決定する。それにより、その閾値を用いたメチル化検査で陽性（又は陰性）と判定された場合に、検査対象の検体を予後不良群に含めるべきであると規定することができる。
【００６４】
アレイ
本発明は、さらに、上記のように特定された８３のＢＡＣクローン、２０のＢＡＣクローン又は１１のＢＡＣクローンを搭載した、尿路上皮癌の発生リスク若しくは予後不良リスク、又は腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを決定するためのアレイにも関する。
【００６５】
この場合、「アレイ」とは、適切な基板上にゲノム配列を含む複数のＤＮＡを位置特異的な様式で定着（スポット）させたデバイスを意味する。基板は、好ましくは固体基板であり、具体的には、ガラス、プラスチック、メンブレン等が挙げられる。好ましい基板はスライドガラスのようなガラス基板である。ガラス製の固体基板には、ＤＮＡの定着の前に、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着によるコーティングを施すことが望ましい。
【００６６】
本発明を、実施例を用いて以下により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
尿路上皮癌発生リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で根治的膀胱癌切除術又は腎尿管切除術を受けた尿路上皮癌患者の外科切除された組織から、非癌尿路上皮組織の１７検体（男性１１検体、女性６検体）を得た。
【００６８】
比較のために、尿路上皮癌を患っていない患者から正常尿路上皮組織の１８検体（男性１３検体、女性５検体）を得た。これらの患者は、１４名が腎細胞癌のために腎切除術を受け、３名が腎臓付近の後腹膜肉腫のために腎切除術を受け、１名が尿膜管癌のために膀胱部分切除術を受けた。
【００６９】
対照として、正常尿路上皮の１７検体（男性１１検体、女性６検体）から得たＤＮＡの混合物を用いた。
【００７０】
ＢＡＭＣＡ法
上記の検体について、ＢＡＭＣＡ法を実施した。以下に説明するＢＡＭＣＡ法の実施の詳細については、文献（Ｍｉｓａｗａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６５：１０２３３−１０２４２，２００５；Ｓｕｇｉｎｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：７４０１−１３，２００７；Ｔａｎａｋａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：６４５６−６８，２００７）にも記載されている。
【００７１】
尿路上皮癌患者から得た非癌尿路上皮組織（被験尿路上皮組織）、正常尿路上皮組織（被験尿路上皮組織）、及び対照として用いた正常尿路上皮組織（対照正常尿路上皮組織）から、フェノール／クロロホルム法によりＤＮＡを調製した。対照正常尿路上皮組織のＤＮＡは、混合して後のステップにおいて用いた。各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化した。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で被験尿路上皮組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅した。一方、対照正常尿路上皮組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ５にて標識した。蛍光色素での標識は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ  ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。アダプターライゲーション及びＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｌ：ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣ（配列番号１３）
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｓ：ＣＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡ（配列番号１４）
ＰＣＲはＡｄａｐｔｏｒ−Ｌと同一の配列を有するプライマーを用いて行った。
【００７２】
被験尿路上皮組織由来のＤＮＡ断片と対照正常尿路上皮組織由来のＤＮＡ断片の両者を混合し、４３６１種類のＢＡＣクローンを搭載した高密度ＣＧＨアレイ（ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００；Ｉｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。競合ハイブリダイゼーションは、以下の条件により行った：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にてエタノール沈殿した。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせた。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行った。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行った。
【００７３】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ４１００Ａ）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ５．０）によって数値化し、解析ソフト（三井情報株式会社のＡｃｕｅ２）によって解析して、被験検体及び正常対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出した。
【００７４】
ここで、尿路上皮癌患者からの非癌尿路上皮組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては認識されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅され、プローブが生成される。その結果、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（被験検体）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌患者由来組織特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。ＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００７５】
尿路上皮癌発生関連領域の同定
ＤＮＡメチル化パターンの解析により尿路上皮癌の発生リスクを決定するのに有効なゲノム領域を特定するために、検体を正常群及び発癌高リスク群に分類するのに有益なＢＡＣクローンを同定した。同定の手順は以下の通りである。
【００７６】
はじめに、正常尿路上皮組織検体と尿路上皮癌症例から得られた非癌尿路上皮組織検体とでメチル化パターンが異なる２０１ＢＡＣクローンをウィルコクソン検定（Ｐ＜０．０１）を用いて特定した。ウィルコクソン検定については、例えば、市原清志著「バイオサイエンスの統計学」（南江堂、１９９０年）、５０ページに記載されている。
【００７７】
続いて、各検体が発癌高リスク群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により発癌高リスク群に属するとされた症例数／尿路上皮癌症例からの非癌尿路上皮組織検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により正常群に属するとされた症例数／正常尿路上皮組織検体数×１００（％）。
【００７８】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
上記で設定した感度及び特異度が７５％以上となった８３のＢＡＣクローンを特定した。それらのクローンに含まれるゲノム領域を、尿路上皮癌発生関連領域と称した。
【００７９】
同定された尿路上皮癌発生関連領域のＢＡＣクローンは、以下の８３クローンである：ＲＰ１１−７５Ｃ８、ＲＰ１１−５４７Ｄ１４、ＲＰ１１−１７４Ｂ４、ＲＰ１１−８０９Ｃ１８、ＲＰ１１−８９Ｇ６、ＲＰ１１−５２８Ｂ２１、ＲＰ１１−２８２Ｊ２４、ＲＰ１１−７４１Ｉ１５、ＲＰ１１−１３３Ｈ１９、ＲＰ１１−９１Ｊ３、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−６１Ｐ１５、ＲＰ１１−４９２Ａ７、ＲＰ１１−８９Ｎ６、ＲＰ１１−９０Ｋ１１、ＲＰ１１−２８２Ｐ１３、ＲＰ１１−１８６Ｏ８、ＲＰ１１−１９２Ｄ１１、ＲＰ１１−２５４Ａ７、ＲＰ１１−１０５Ｈ１９、ＲＰ１１−９８Ｈ２３、ＲＰ１１−７８Ｐ４、ＲＰ１１−６１Ｆ４、ＲＰ１１−９０Ｄ１３、ＲＰ１１−８０Ｆ４、ＲＰ１１−２１６Ｎ１３、ＲＰ１１−４５４Ｃ４、ＲＰ１１−２８４Ｊ３、ＲＰ１１−３９９Ｋ２１、ＲＰ１１−３４４Ａ５、ＲＰ１１−４６２Ｋ４、ＲＰ１１−９４Ａ１８、ＲＰ１１−３Ｐ８、ＲＰ１１−５０Ｎ１０、ＲＰ１１−８８Ｅ１３、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−８７Ｎ６、ＲＰ１１−８０Ｄ２２、ＲＰ１１−２３３Ｅ５、ＲＰ１１−１９４Ｆ１３、ＲＰ１１−１７６Ｊ１６、ＲＰ１１−８８Ｂ１２、ＲＰ１１−１０１Ｊ１４、ＲＰ１１−４４９Ｂ２１、ＲＰ１１−９１Ｎ１、ＲＰ１１−９０Ｂ１１、ＲＰ１１−１９Ｃ１８、ＲＰ１１−２１７Ｆ１１、ＲＰ１１−５８Ｇ１９、ＲＰ１１−２３Ｍ９、ＲＰ１１−１０５Ｆ２２、ＲＰ１１−７９Ａ２１、ＲＰ１１−１２１Ｇ２４、ＲＰ１１−５３０Ｃ５、ＲＰ１１−３５Ｋ２２、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−９０Ｇ２２、ＲＰ１１−５１５Ｉ１２、ＲＰ１１−８７Ｏ１、ＲＰ１１−２４Ｎ８、ＲＰ１１−１３Ｆ１２、ＲＰ１１−４５１Ｃ２、ＲＰ１１−９１Ｈ１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１１、ＲＰ１１−４Ｆ２４、ＲＰ１１−１３５Ｌ１６、ＲＰ１１−５７Ｃ１３、ＲＰ１１−２０Ｈ１９、ＲＰ１１−１７０Ｄ９、ＲＰ１１−８９Ｉ４、ＲＰ１１−２９５Ｈ２４、ＲＰ１１−９０Ｉ１５、ＲＰ１１−９０Ｃ２１、ＲＰ１１−４５１Ｍ８、ＲＰ１１−１８４Ｍ２１、ＲＰ１１−９２Ｉ１８、ＲＰ１１−２１Ｐ８、ＲＰ１１−１２６Ｄ１８、ＲＰ１１−７３Ｎ２２、ＲＰ１１−３８０Ｋ２１、ＲＰ１１−３６３Ｇ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１１、及びＲＰ１１−６７Ｇ２４。
【００８０】
上記で特定した尿路上皮癌発生関連領域８３クローンについて、発癌高リスクの判定基準並びに感度及び特異度を以下の表１に示す。判定基準の数値は、上記で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００８１】
【表１】
2010207162.tif 000002
2010207162.tif 000003
2010207162.tif 000004
【００８２】
検出値の閾値の一例を図２に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−７５Ｃ８については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が１．０１より大きいとき、尿路上皮癌症例から得られた非癌尿路上皮組織検体を感度８３％、特異度９４％で発癌高リスク群に分類することができる。
【００８３】
表１の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図３に示す。正常尿路上皮組織群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図３：左側）、尿路上皮癌症例より得られた非癌尿路上皮組織群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図３：右側）、その差異は明瞭である。このヒストグラムに基づいて、表１の判断基準を５０ＢＡＣクローン以上で満たす非癌尿路上皮組織を発癌高リスク群と判断することとすると、尿路上皮癌症例より得られた非癌尿路上皮組織を感度・特異度ともに１００％で発癌高リスク群に分類することができた。
【００８４】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された尿路上皮癌発生関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、特にこれらの領域のうちの５０領域以上で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、発癌リスクの高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【実施例２】
【００８５】
尿路上皮癌予後不良リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で根治的膀胱切除術又は腎尿管切除術を受けた尿路上皮癌患者の外科切除された組織から、尿路上皮癌組織の４０検体を得た。４０検体のうち、３６検体は術後に再発がなかった患者からのもの（予後良好症例）であり、４検体は術後に再発した患者（３例は骨盤内リンパ節転移、１例は肺及び骨転移）からのもの（予後不良症例）であった。
【００８６】
尿路上皮癌予後関連領域の同定
上記と同様にＢＡＭＣＡ法を行い、予後良好症例と予後不良症例の４０検体についての結果に基づき、ウィルコクソン検定（Ｐ＜０．０１）を用いて、両症例群でＢＡＭＣＡ法のシグナル比が顕著に異なる２０のＢＡＣクローンを選択した。
【００８７】
同定された尿路上皮癌予後関連領域のＢＡＣクローンは、以下の２０クローンである：ＲＰ１１−７９Ｋ６、ＲＰ１１−１３３Ａ７、ＲＰ１１−４６６Ｃ１２、ＲＰ１１−１８Ｈ２３、ＲＰ１１−４７８Ｃ１、ＲＰ１１−１１Ａ１１、ＲＰ１１−３３７Ｂ１１、ＲＰ１１−７９Ａ２２、ＲＰ１１−７９Ｋ２３、ＲＰ１１−４２６Ｅ１０、ＲＰ１１−４３０Ｂ１、ＲＰ１１−９０Ｃ７、ＲＰ１１−８９Ｈ１３、ＲＰ１１−１９４Ｈ７、ＲＰ１１−７９Ｏ１２、ＲＰ１１−５９Ｄ１０、ＲＰ１１−９Ｆ１１、ＲＰ１１−２０７Ｊ８、ＲＰ１１−１２Ｌ９、及びＲＰ１１−３８３Ｂ１６。
【００８８】
続いて、各検体が予後不良群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により予後不良群に属するとされた症例数／予後不良症例検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により予後良好群に属するとされた症例数／予後良好症例検体数×１００（％）。
【００８９】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
上記の尿路上皮癌予後関連領域２０クローンについて、予後不良の判定基準並びに感度及び特異度を以下の表２に示す。判定基準の数値は、実施例１で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００９０】
【表２】
2010207162.tif 000005
【００９１】
検出値の閾値の一例を図４に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−７９Ｋ６については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が１．０６未満であるとき、予後不良クラスターに属する検体を感度１００％、特異度９４．４％で予後不良群に分類することができる。
【００９２】
表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図５に示す。予後良好群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図５：左側）、予後不良群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図５：右側）、その差異は明瞭である。このヒストグラムに基づいて、表２の判断基準を１７ＢＡＣクローン以上で満たす尿路上皮癌組織を予後不良群と判断することとすると、予後不良症例より得られた尿路上皮癌組織を感度・特異度ともに１００％で予後不良群に分類することができた。
【００９３】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された尿路上皮癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、特にこれらの領域のうちの１７領域以上で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【実施例３】
【００９４】
腎盂・尿管癌膀胱内再発リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で腎尿管切除術を受けた尿路上皮癌患者の外科切除された組織から、非癌尿路上皮組織の１３検体を得た。１３検体のうち、９検体は術後に異時性膀胱癌が発生しなかった患者からのもの（膀胱内非再発症例）であり、４検体は術後に異時性膀胱癌が発生した患者からのもの（膀胱内再発症例）であった。
【００９５】
腎盂・尿管癌予後関連領域の同定
上記と同様にＢＡＭＣＡ法を行い、膀胱内非再発症例と膀胱内再発症例の１３検体についての結果に基づき、ウィルコクソン検定（Ｐ＜０．０１）を用いて、両症例群でＢＡＭＣＡ法のシグナル比が顕著に異なる１１のＢＡＣクローンを選択した。
【００９６】
同定された腎盂・尿管癌予後関連領域のＢＡＣクローンは、以下の１１クローンである：ＲＰ１１−７２１Ｇ１１、ＲＰ１１−１０４Ｎ１１、ＲＰ１１−４０２Ｎ１４、ＲＰ１１−２２９Ｎ１４、ＲＰ１１−２４４Ｋ２、ＲＰ１１−３Ｆ７、ＲＰ１１−３９９Ｂ２２、ＲＰ１１−１４８Ｄ２３、ＲＰ１１−９０Ｋ１５、ＲＰ１１−１０Ｄ８、及びＲＰ１１−９１Ｆ７。
【００９７】
続いて、各検体が膀胱内再発高リスク群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により膀胱内再発高リスク群に属するとされた症例数／膀胱内再発症例検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により膀胱内再発低リスク群に属するとされた症例数／膀胱内非再発症例検体数×１００（％）。
【００９８】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
上記の腎盂・尿管癌予後関連領域１１クローンについて、膀胱内再発リスクの判定基準並びに感度及び特異度を以下の表３に示す。判定基準の数値は、実施例１で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００９９】
【表３】
2010207162.tif 000006
【０１００】
検出値の閾値の一例を図６に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−７２１Ｇ１１については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が０．９４未満であるとき、膀胱内再発群に属する検体を感度１００％、特異度１００％で膀胱内再発高リスク群に分類することができる。
【０１０１】
表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図７に示す。膀胱内非再発群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図７：左側）、膀胱内再発群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図７：右側）、その差異は明瞭である。
【０１０２】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された腎盂・尿管癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析し、これらの領域で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、腎盂・尿管癌患者の中から膀胱内再発リスクが高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
上記の実験は、国立がんセンター（日本、東京）倫理委員会により承認を得て行った。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明によれば、尿路上皮癌の発生リスク及び予後不良リスク並びに腎盂・尿管癌の膀胱内再発リスクを判定することができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号１〜１２：プライマー
配列番号１３及び１４：アダプター
【図１】
2010207162.tif 000007
【図２】
2010207162.tif 000008
【図３】
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【図４】
2010207162.tif 000010
【図５】
2010207162.tif 000011
【図６】
2010207162.tif 000012
【図７】
2010207162.tif 000013
【配列表】
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