(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的かつ安定な導入遺伝子の組込みをもたらす細胞を形質転換する方法および組成物を提供する。【解決手段】形質転換は、細胞に、細胞のゲノムに組込まれる受容体ベクター、好ましくはレトロウイルスベクターを導入することにより行われる。この受容体ベクターは、２つの不和合性ｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含んで成る。次に同じＬ１およびＬ２配列により挟まれた導入遺伝子を含んで成る供与体ベクターを細胞に導入する。安定な遺伝子導入が、ｌｏｘＬ１およびＬ２配列をＣｒｅ組換え酵素と接触させることにより開始される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞中で部位特異的組換えを起こす方法であって、組換え酵素を
（ａ）該哺乳動物細胞のゲノムに組込まれる受容体ベクターであって、互いに組換わることができない２つのｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含む受容体ベクター、および
（ｂ）該哺乳動物細胞のゲノム中には組込まれない供与体ベクターであって、該組込まれる受容体ベクターの過剰量で存在している供与体ベクター、と接触させる工程を含んでなり、かつ、該供与体ベクターは受容体ベクターに含まれる同じＬ１およびＬ２配列、またはこれらＬ１およびＬ２配列で組換えることができる配列がそれぞれ両側に配置された状態で選択したＤＮＡを含んで成り、これにより選択したＤＮＡをＬ１およびＬ２配列での組換えにより供与体ベクターから受容体ベクターへ転移させることを、特徴とする上記方法。
【請求項２】
受容体ベクターがレトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｌ１およびＬ２がそれらのスペーサー配列中の１個以上の点突然変異により異なる請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｌ１およびＬ２が、それぞれＬｏｘＰ１およびＬｏｘ５１１ヌクレオチド配列（配列番号１および２）を含んで成り、そして組換え酵素がＣｒｅである請求項１記載の方法。
【請求項５】
受容体ベクターがレトロウイルスベクターである請求項１記載の方法。
【請求項６】
選択したＤＮＡで細胞を形質転換する方法であって、任意の順序で、
（ａ）細胞に、細胞のゲノムに組込まれる受容体ベクターであって、互いに組換わることができない２つの不和合性ｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含む受容体ベクターを導入する工程、
（ｂ）細胞に、受容体ベクター中に含まれる同じＬ１およびＬ２配列、またはこれらＬ１およびＬ２配列で組換えることができる配列がそれぞれ両側に配置された状態で選択したＤＮＡを含む供与体ベクターを導入し、かつ、該供与体ベクターが該受容体ベクターの過剰量で導入される工程、および
（ｃ）Ｌ１およびＬ２をＣｒｅと接触させ、これにより選択したＤＮＡの供与体ベクターから受容体ベクターへの転移を引き起こす工程、
を含んで成る、上記方法。
【請求項７】
受容体ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｌ１およびＬ２が、それらのスペーサー配列中で少なくとも１個のヌクレオチド付加、欠失または置換により異なる請求項６記載の方法。
【請求項９】
Ｌ１またはＬ２のいずれかが、ＬｏｘＰ１ヌクレオチド配列（配列番号１）を含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
Ｌ１またはＬ２のいずれかが、Ｌｏｘ５１１ヌクレオチド配列（配列番号２）を含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ１およびＬ２が、それぞれＬｏｘＰ１およびＬｏｘ５１１ヌクレオチド配列（配列番号１および２）を含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
Ｌ１およびＬ２が同じ方向性を有する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
細胞にＣｒｅ組換え酵素をコードする遺伝子を導入する工程をさらに含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｒｅ組換え酵素をコードする遺伝子が発現ベクターに含まれている、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｃｒｅ組換え酵素をコードする遺伝子が、受容体ベクターまたは供与体ベクターのいずれかに含まれている、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
供与体ベクターが細胞に電気穿孔法により導入される、請求項６記載の方法。
【請求項１７】
供与体ベクターおよびＣｒｅ組換え酵素をコードする遺伝子の両方が、細胞に電気穿孔法により導入される、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
選択したＤＮＡが治療用タンパク質をコードする導入遺伝子である請求項６記載の方法。
【請求項１９】
治療用タンパク質がβ−グロビンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
供与体ベクター、受容体ベクター、または供与体および受容体ベクターの両方が、さらに選択可能なマーカー遺伝子を含んで成る請求項６記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）宿主細胞のゲノムに組込むことができる受容体ベクターであって、互いに組換わることができない２つのｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含む受容体ベクター、
（ｂ）受容体ベクター中に含まれる同じＬ１およびＬ２配列、またはこれらＬ１およびＬ２配列と組換わることができる配列がそれぞれ両側に配置された状態で導入遺伝子を含んで成る供与体ベクター、および
（ｃ）Ｌ１およびＬ２配列で組換えを促進できる組換え酵素をコードする一過性発現ベクター、
を含んで成るＣｒｅ／ｌｏｘが媒介する遺伝子導入系。
【請求項２２】
受容体ベクターが、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターから成る群から選択される、請求項２１記載の系。
【請求項２３】
Ｌ１およびＬ２がそれらのスペーサー配列中の１個以上の点突然変異により異なる請求項２１記載の系。
【請求項２４】
Ｌ１およびＬ２が、それぞれＬｏｘＰ１およびＬｏｘ５１１ヌクレオチド配列（配列番号１および２）を含んで成る、請求項２１記載の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の部位特異的組換えによる形質転換を起こすための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療法の成功は、導入された遺伝子の安定な染色体への組込み、および高レベルの調節された発現を組み合わせて達成できる能力に依るところが大きい。調節された遺伝子発現は、最も容易には強力にシスに作用する調節領域を含む巨大ＤＮＡ断片により行われる。例えば、β−グロビン不全症の遺伝子治療には、延ばした（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）遺伝子およびＬＣＲ配列の高レベルの位置非依存的発現（ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が必要かもしれない。
【０００３】
現在の多くの技法が、巨大ＤＮＡ断片を用いて細胞の効率的な一過性トランスフェクションを可能としている。しかしその後の染色体への組込みは、大変非効率的である。低レベルの組込みを克服するために、許容細胞中に大変効率的に組み込まれるレトロウイルスベクターを使用することができる。しかしそのようなベクターは、大きさおよび配列組成の拘束により大きく制限される。
【０００４】
特許文献１は、真核細胞で遺伝子導入を行うために、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ部位特異的組換えの使用を開示している。記載されたこの系は、導入れたＤＮＡの宿主ゲノムへの効率的または安定な組込みを提供していない（例えば、非特許文献１を参照にされたい）。これは、分子間の部位特異的組換えによるＤＮＡのゲノム中への組込みよりも優位な、分子内交換による導入されたＤＮＡの切り出しという事実に大きく起因している。
【０００５】
導入遺伝子配列をゲノムＤＮＡに高度に効率的かつ安定に組込むことが可能な部位特異的ＤＮＡ組換え系は、大変有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，９５９，３１７号明細書（Ｓａｕｅｒら）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｕｅｒら、（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５：８９８
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系のような組換え酵素／ｌｏｘ系を使用して、効率的かつ安定な部位特異的ＤＮＡ組換えを起こすための方法および組成物に関する。１つの態様では、この方法は組換え酵素（例えばＣｒｅ）を（ａ）２つの不和合ｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２含んで成る受容体ベクター、および（ｂ）Ｌ１およびＬ２配列、またはＬ１およびＬ２配列と和合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）の配列によりフランキング化された選択したＤＮＡ含んで成る供与体ベクターと接触させ、これにより選択したＤＮＡを和合性ｌｏｘ配列で組換えることにより、供与体ベクターから受容体ベクターへ転移することを含んで成る。好適な態様では、受容体ベクターはレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターである。
【０００９】
別の態様では、本発明は選択したＤＮＡを用いて細胞を形質転換する方法を提供し、こ
の方法は、任意の順序で、細胞に細胞のゲノムに組み込まれる受容体ベクターを導入し、この受容体ベクターは２つの不和合ｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含んで成り、（ｂ）細胞に、Ｌ１およびＬ２配列、またはＬ１およびＬ２配列と和合性の配列によりフランキング化された選択したＤＮＡを含んで成る供与体ベクターを導入し、そして（ｃ）Ｌ１およびＬ２をＣｒｅのような組換え酵素と接触させる工程を含んで成り、これにより選択したＤＮＡを供与体ベクターから受容体ベクターに転移させる工程を含んで成る。組換え酵素は、タンパク質またはタンパク質をコードする遺伝子の状態で細胞に導入することができる。
【００１０】
別の態様では、本発明は２つの不和合性ｌｏｘ配列Ｌ１およびＬ２を含んで成るレトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターから成る群から選択されるベクターを提供する。
【００１１】
本発明の方法および組成物は、インビボおよびインビトロ遺伝子導入（例えば遺伝子治療）の方法に使用され、導入遺伝子配列の効率的かつ安定な組込みをもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｃｒｅ／ｌｏｘが媒介する遺伝子導入の図解的説明である。ＬｏｘＡおよびＬｏｘＢは、Ｃｒｅ組換え酵素の存在では互いに組換わることができない相互に関連した不和合性（ｉｍｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ｌｏｘ部位である。
【図２】選択可能なマーカー遺伝子および不和合性ｌｏｘ配列を含む受容体および供与体ベクターの図解的説明である。
【図３】Ｃｒｅ発現ベクターおよび対照Ｃｒｅ発現ベクターの図解的説明である。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明は、例えば細胞の形質転換法において、効率的な部位特異的ＤＮＡ組換えを引き起こすための方法および組成物を提供する。現在の細胞形質転換技法に優る、本発明により提供される利点には、導入遺伝子配列のような巨大ＤＮＡ配列を染色体ＤＮＡに高度に効率的かつ安定に組込むことが含まれる。
【００１４】
１つの態様では、本発明の方法は、Ｃｒｅのような組換え酵素を（ａ）２つの不和合ｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含んで成る受容体ベクター、および（ｂ）Ｌ１およびＬ２配列、またはＬ１およびＬ２配列に和合性であるｌｏｘ配列によりフランキング化された選択したＤＮＡを含んで成る供与体ベクターと接触させ、これにより選択したＤＮＡを供与体ベクターから受容体ベクターへ、和合性ｌｏｘ配列で組換えにより転移すことを含んで成る。
【００１５】
用語「部位特異的組換え」とは、供与体ベクターから受容体ベクターへのＤＮＡ転移を言う。
【００１６】
用語「ｌｏｘ配列」とは、Ｃｒｅまたは組換え酵素Ｉｎｔファミリー他の員（Ａｒｇｏｓら、（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４３３）のような組換え酵素により触媒される時、組換え（例えばＤＮＡの交叉および交換）を受けるヌクレオチド配列を言う。
【００１７】
用語「組換え酵素」とは、部位特異的組換えをｌｏｘ部位で触媒できる任意の組換え酵素を言う。
【００１８】
用語「不和合性（ｉｍｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ｌｏｘ配列」とは、互いに異なり、それ故に互い組換えを受けることができない２つ以上のｌｏｘ配列（本明細書ではＬ１および
Ｌ２と呼ぶ）を言う。例えばｌｏｘ配列は、それらのヌクレオチド配列が特にそれらのスペーサー領域でわずか１ヌクレオチド異なれば、それらのヌクレオチド配列を不和合性にすることができる。対称的に、用語「和合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ｌｏｘ配列」とは、組換え酵素により組換えを触媒される時、組換わることができる２つ以上のｌｏｘ配列を言う。
【００１９】
用語「受容体ベクター」とは、細胞のゲノム中に組込むことができる任意のベクターを言う。好適な態様では、受容体ベクターはレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターのようなウイルス起源のものである。一般的に、受容体ベクターは交換カセット（すなわち、供与体ベクターからのＤＮＡにより置き換えられるＤＮＡ）を含み、そして場合によっては選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。
【００２０】
用語「供与体ベクター」とは、受容体ベクターに転移されるＤＮＡを含む任意のベクター（例えば環状プラスミドＤＮＡ）を言う。一般的に、供与体ベクターはプラスミドＤＮＡを含んで成り、そして場合によっては選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。
【００２１】
本発明の方法は、同一または和合性（すなわち、互いに組換わることができる）のｌｏｘ配列間で起こる組換え酵素が媒介する交換反応を利用する。同一または和合性ｌｏｘ配列間の効率的なＤＮＡ交換は、各々が同一または和合性ｌｏｘ部位を含有する供与体から受容体ベクターへのＤＮＡの転移を可能とする（図１を参照にされたい）。しかし、いったん供与体から受容体ベクターへ転移されれば（すなわち、分子間転移）、転移したＤＮＡは、転移したＤＮＡの分子内交換および切り出しを防ぐ受容体ベクター内の２つのｌｏｘ配列（例えばＬ１およびＬ２）の不和合性のために、その場所に「ロック（ｌｏｃｋｅｄ）」される。したがって、転移したＤＮＡは、高度に安定な様式で組み込まれる。
【００２２】
効率的かつ安定なＤＮＡ交換反応に加えて、本発明の方法は受容体ベクターとして使用するためにレトロウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスのインテグラーゼをコードするベクターのような高度に効率的な組込みベクターを利用する。本明細書に記載する実験では、そのようなベクターが組換え酵素／ｌｏｘ系のような部位特異的ＤＮＡ導入系での使用に適合性があることを示す。
【００２３】
総じて、本発明の部位特異的組換え系は、例えば遺伝子治療法に使用できるような、高度に効率的かつ安定なＤＮＡ導入の手段を提供する。例えば、本発明の方法および組成物は、部位特異的組換え無しで起こるランダムな組込みと比べて、導入遺伝子の組込みおよび発現において１００〜１０，０００倍の増加を達成するために使用できる。
【００２４】
したがって別の態様では、本発明は哺乳動物細胞のような細胞を、選択したＤＮＡを用いて形質転換する方法を提供する。この方法は、（ａ）細胞に、２つの不和合ｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含んで成る受容体ベクターを導入し、（ｂ）細胞に、Ｌ１およびＬ２配列、またはＬ１およびＬ２配列と和合性の配列によりフランキング化された、選択したＤＮＡを含んで成る供与体ベクターを導入し、そして（ｃ）Ｌ１およびＬ２をＣｒｅのような組換え酵素と接触させ、これにより選択したＤＮＡを供与体ベクターから受容体ベクターへ転移させる（和合性のｌｏｘ配列間の交換反応による）工程を含んで成る。必須ではないが、受容体ベクターは、受容体ベクターが供与体ベクターとのＤＮＡ交換前に宿主ゲノム中に組み込まれているように、好ましくは供与体ベクターの導入前に細胞に導入される。
【００２５】
受容体ベクターは、細胞に取り込まれ、そしてゲノムＤＮＡに組み込まれることができる任意のベクターであることができる。好適な受容体ベクターは、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純１型ヘルペスウイルスのような細胞を
直接トランスフェクトするウイルスベクターを含む。レトロウイルスを使用する場合の前提条件は、それらの使用の安全性、特に細胞増殖において野生型ウイルスの伝播の可能性に関する安全性を確保することである。複製−欠損レトロウイルスのみを産する特殊化された細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの使用をますます広げ、そして欠損ウイルスは遺伝子治療を目的とする遺伝子導入の使用に十分に特徴が明らかとなっている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照にされたい）。この組換えレトロウイルスは、レトロウイルスのコーディング配列の部分（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が本発明のｍＡＬＤＨの突然変異したサブユニットをコードする核酸と置き換えられ、レトロウイルスの複製を欠損させるように構築することができる。複製欠損レトロウイルスは、次に標準的技法により、ヘルパーウイルスの使用を通して標的細胞を感染させるために使用することができるビリオンにパッケージされる。組換えレトロウイルスの作成および細胞をインビトロまたはインビボで、そのようなウイルスを用いて感染させるための手法は、分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編集）、グリーネ出版アソシエイツ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、（１９８９）、第９．１０−９．１４章、および他の標準的なラボラトリーマニュアルに見い出すことができる。適当なレトロウイルスの例には、当業者には周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含む。異所性および両種指向性のレトロウイルス系の両方を調製するために、適当なパッケージングウイルス系の例は、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍを含む。レトロウイルスは種々の遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび／またはインビボで導入するために使用された（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４を参照にされたい）。
【００２６】
別の好適な受容体ベクターは、アデノウイルスに由来するベクターである。アデノウイルスのゲノムは、それが目的遺伝子産物をコードし、そして発現するが、その正常な溶菌化ウイルスサイクルを複製する能力に関しては不活化されるように工作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照にされたい。アデノウイルスＡｄ５型ｄｌ３２４株または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３およびＡｄ７等）に由来する適当なアデノウイルスベクターは、当業者には周知である。
【００２７】
受容体ベクターとして有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖的ライフサイクルのために、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような他のウイルスを必要とする天然に存在する欠損ウイルスである。（総説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８−：９７−１２９を参照にされたい）。この２〜３のウイルスの１つは、そのＤＮＡを非−分割細胞中に組込み、そして高頻度の安定な組込みを表すこともできる（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｌｉｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照にされたい）。ＡＡＶの少なくとも３００塩基対を含むベクターをパッケージングし、そして組込むことができる。
【００２８】
本発明の方法に受容体ベクターとして使用できる他のウイルスベクター系は、ヘルペス
ウイルス、ワクシニアウイルスおよび幾つかのＲＮＡウイルスを含む。
【００２９】
供与体ベクターは、インビボまたはインビトロで細胞に取り込まれることができ、そして所望の導入ＤＮＡ配列を運ぶことができる（すなわち供与体）任意のベクター（例えば環状ＤＮＡ）であることができる。適当な供与体ベクターは、組換え細菌性の、または真核プラスミドのようなコスミドまたはＤＮＡプラスミドを含む。供与体ベクターは、種々の既知の方法を使用してインビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞に導入され得る。インビトロの送達には、適当な方法にはプラスミドの直接的注入、ＣａＰＯ４沈殿法、電気穿孔法、カチオン性リポフェクチン法、または人工的なウイルスエンベロップの使用を含む。インビボ送達に適当な方法は、ベクターの静脈内、腹腔内および筋肉内注射を含む。ベクターは、選択した細胞への送達を標的とすることもできる（例えば、米国特許第５，１６６，３２０号明細書を参照にされたい）。
【００３０】
細胞による効率的な取り込みを測定するために、受容体、供与体または受容体および供与体ベクターは場合によっては、抗生物質耐性遺伝子または他の手段により選択可能な遺伝子のようなマーカー遺伝子を含むことができる。このマーカー遺伝子は、発現を駆動するためのプロモーターを含む受容体ベクターに組み込まれた時にのみ発現するように、プロモーターが無い（ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ）ものであることができる。
【００３１】
供与体および受容体ベクターは、分子内組換えが起こり得ないように、各々が少なくとも２つの不和合性ロック配列（「Ｌ１およびＬ２」）を含む。同時に、供与体および受容体ベクター間のＤＮＡ交換を可能にするために、供与体および受容体ベクターのロック配列は、分子間で互いに組換わることができなければならない（例えばＬ１はＬ１と和合性であり、そしてＬ２はＬ２と和合性である）。和合性のｌｏｘ配列間での分子間交換を確実にするために、ｌｏｘ配列は一般的に同方向を向いている。
【００３２】
ロック配列間の不和合性は、配列が異なるように、例えば２つの同一なｌｏｘ配列の１つを、好ましくはそれらのスペーサー配列内で、突然変異または改質することにより（例えばヌクレオチド付加、欠失または置換）達成することができる。どの突然変異が不和合性を与えるかを決定するための試験は、突然変異した、および突然変異していないｌｏｘ配列が組換わる能力に関し試験する標準的な突然変異アッセイを使用して行うことができる。
【００３３】
好適な態様では、２つの不和合性ｌｏｘ配列の１つは、配列番号１に示す配列を有するバクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系のＬｏｘ  Ｐ１配列である（Ｈｏｅｓｓら、（１９９０）「核酸および分子生物学（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第４巻、第９９頁）。このＬｏｘ  Ｐ１配列は、当該技術分野で周知な方法によりバクテリオファージＰ１から単離することができる３４塩基対配列である（例えばＨｏｅｓｓら、（１９８２）ＰＮＡＳ ７９：３３９８を参照にされたい）。Ｌｏｘ  Ｐ１配列は、８塩基スペーサー配列により分けられた２つの１３塩基対の逆向きの反復から成る。Ｌｏｘ  Ｐ１部位は、ＡＴＣＣから入手可能なプラスミド（例えばＡＴＣＣ５３２５４および２０７７３）からも単離することができる。他の適当なｌｏｘ配列は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）から単離され得るＬｏｘＢ、ＬｏｘＬおよびＬｏｘＲ配列を含む（Ｈｏｅｓｓら、（１９８２）。同上）。またＬｏｘ配列は、以下の実施例に記載するように、既知の技法を使用して化学的に合成することができる。
【００３４】
したがって、もう１つの不和合性ｌｏｘ配列は、Ｌｏｘ  Ｐ１配列から突然変異させることができ、例えば８ヌクレオチドスペーサー配列中に１つの点突然変異を有する。１つの態様では、点突然変異は野生型Ｌｏｘ  Ｐ１配列の８塩基スペーサー配列の７位でのＧからＡへの置換であり、本明細書ではＬｏｘ  ５１１配列と呼ぶ（配列番号２）。したが
って、１つの態様では、本発明の２つの不和合性ｌｏｘ配列は以下の配列を有する：
【００３５】
【化１】
2010063463.tif 000002
【００３６】
供与体および受容体ベクター中の和合性ｌｏｘ配列間の分子間組換えは、すでに効率的な組換えを、細菌および真核細胞中のｌｏｘ配列で行うことが示された、Ｃｒｅまたは組換え酵素Ｉｎｔファミリーの他の員のような組換え酵素（Ａｒｇｏｓら、（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４３３）により触媒される（Ｓａｕｃｅｒら、（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．２２５：８９０−９００）。組換え酵素は、タンパク質状態またはタンパク質をコードする発現可能な遺伝子（例えば、Ｓａｕｃｅｒ  Ｂ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５１６６−５１７０により記載されているＣｒｅ遺伝子）として、供与体および受容体ベクターと一緒に細胞に導入することができる。組換え酵素または組換え酵素遺伝子は、供与体および受容体ベクターの導入前、導入中または導入後に宿主細胞に導入されるか、またはトランスフェクトされることができる。
【００３７】
１つの態様では、組換え酵素遺伝子（例えばＣｒｅ）は、受容体ベクターを宿主細胞中に導入し、そして組込んだ後に、供与体ベクターと同時にトランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）される発現ベクター中に含まれる。別の態様では、組換え酵素遺伝子は、受容体または供与体ベクターのいずれかの中に含まれる。供与体ベクターの場合と同じく、組換え酵素遺伝子は、ＣａＰＯ４沈殿法、電気穿孔法、カチオン性リポフェクチン法、または人工的ウイルスエンベロップの使用、直接注射（例えば静脈内、腹腔内または筋肉内）のような周知技法を使用して、インビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞中に導入することができる。またベクターは、選択した細胞への送達を標的とすることができる（米国特許第５，１６６，３２０号明細書を参照にされたい）。
【００３８】
本発明の部位特異的組換え法により、供与体から受容体ベクターへ転移されるＤＮＡは、宿主細胞ゲノム中へ安定に組み込まれることが望まれる任意のＤＮＡであることができる。例えば、遺伝子は遺伝子治療または診断目的に有用な任意の導入遺伝子であることができる。遺伝子は、α、βまたはσグロビン、血液凝固因子（例えば、第VIIIおよびIX因子）遺伝子、細胞表面レセプターおよび他の所望のタンパク質、例えば個体中のこれらのタンパク質の遺伝欠損症を補正するためのような、所望の治療用タンパク質をコードすることができる。
【００３９】
したがって、本発明の方法および組成物は、細胞のゲノムＤＮＡに導入遺伝子配列を安定かつ効率的に組込むことが必要な種々の治療的および診断的応用のために使用することができる。この方法および組成物は、広い範囲の様々な真核細胞（例えば、哺乳動物）細胞を形質転換するために使用し、そして高効率なＤＮＡ導入の利点を提供することができる。
【００４０】
均等物
当業者は、本明細書に記載した本発明の特別な態様の多くの均等物を認識し、日常的な実験を使用するだけで確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。本明細書を通して引用するすべての技術文献および公開された特許明細書は、引用により本明細書に編入する。
【００４１】
実施例
材料および方法
ＤＮＡ構築および細胞培養
ＤＮＡベクターは、標準法を使用して作成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル−第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−２ｎｄ  ｅｄ，）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、米国）。オリゴヌクレオチドは、リサーチ  ジェネティックス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）により合成した。ＤＮＡ構造の正確さは、シークエンシングにより確認した。ＬＸＳＮレトロウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０）はＤ．Ｍｉｌｌｅｒ（シアトルのフレッドハッチンソン癌研究センター：Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）により、ハイグロマイシンＢ（Ｌｕｐｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：３３７４−３３７８）ホスホトランスフェラーゼ遺伝子はＤ．Ｈｏｕｓｍａｎ（ケンブリッジ、ＭＩＴ）により、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子（Ｌｕｐｔｏｎ、同上）はＭ．Ｒ．ｃａｐｅｃｃｈｉ（ユタ州、ソルトレイクシティ）により、Ｕ１９  ＳＶ４０Ｔ突然変異遺伝子（Ｒｅｎｆｒａｎｚ，Ｐ．Ｊ．ら、（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６：７１３−７２９）は、Ｒ．Ｄ．ＭｃＫａｙ（ケンブリッジ、ＭＩＴ）およびＧ．Ａｌｍａｚａｎ（モンテレアル、マックギル大学）により、Ｃｒｅ組換え酵素遺伝子（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５１６６−５１７０）はＤ．Ｗ．Ｏｗ（アルバニー、ＵＣ  バークレー）より、ＣＤ２４（Ｐａｗｌｉｎｋ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８４：２８６８−２８７７）が提供された。ＭＳＣＶ（ネズミ幹細胞ウイルス）レトロウイルスベクター（Ｈａｗｌｅｙ，Ｐ．Ｇ．ら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３６−１３８）、ｐＢａｂｅレトロウイルスベクター（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｅｓ
Ｒｅｓ．１８：３５８７−３５９８）はＲ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（ケンブリッジ、ＭＩＴ）により、ｐｃＤＮＡはインビトロジーン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、そしてｐＯＰＲＳＶＩＣＡＴはストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＡＴＣＣから、ＢＯＳＣ２３細胞（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８３９２−８３９６）Ｗ．ＰｅａｒおよびＤ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（ニューヨーク、ロックフェラー大学）から得た。
【００４２】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気で、１０％熱不活化ウシ血清（ＣＳ）、４．５ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで増殖させた。ＢＯＳＣ２３細胞に関しては、ＣＳを１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に代えた。
【００４３】
細胞感染、トランスフェクションおよび選択
パッケージング細胞系、ＢＯＳＣ２３を記載されているように（Ｐｅａｒ、同上Ｄａｎｏｓ，Ｏ．ら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４）増殖させた。プラスミドＤＮＡはキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）法（キアジェン社）により調製し、そしてＢＯＳ２３細胞にリン酸カルシウム法（５プライム：３プライム社（５ｐｒｉｍｅ：３ｐｒｉｍｅ．Ｉｎｃ．））を使用してトランスフェクトした。実験のウイルス上清は、記載されているように回収し、そして濾過した（Ｐｅａｒ、同上Ｄａｎｏｓ、同上）。すべての感染は８μｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（シグマ：Ｓｉｇｍａ）の存在中で行った。ＢＯＳＣ２３からのウイルス上清は、安定なウイルス法を行うために使用した。ウイルス力価は、すでに記載した（Ｐｅａｒ、同上、Ｄａｎｏ
ｓ、同上）標準的な計算法を使用して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の感染および選択により見積もった。ヘルパーウイルスの検出は、すでに記載した（Ｐｅａｒ、同上、Ｄａｎｏｓ、同上）β−ガラクトシダーゼ起動アッセイにより行った。選択は感染の２日後に行った。
【００４４】
標準濃度（１Ｘ）の選択剤は、ハイグロマイシンＢ（カルビオケム：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）について３２０μｇ／ｍｌであった。パッケージングＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１Ｘ、１／２Ｘを含むＭＤＨＦおよび２Ｘを含むＢＳＭＣ濃度を用いて選択した。
【００４５】
レトロウイルスＣＲＥ／ＬＯＸが媒介する遺伝子組込み
本明細書に記載のＣｒｅ／ｌｏｘが媒介する遺伝子導入系を使用する遺伝子組込み効率を実験するために、以下の手法を使用して行った。
【００４６】
受容体ベクターは、ＭＳＣＶレトロウイルスベクターを使用して構築した。ベクターは順番に：左ＭＳＣＶ  ＬＴＲ（プロモーターを含む）、続いてｌｏｘ  Ｌ１配列、続いてハイグロマイシン−ＴＫ融合遺伝子（選択マーカーとして）、続いてｌｏｘ  Ｌ２配列、続いて右ＭＳＣＶ  ＬＴＲを含んだ（図２を参照にされたい）。レトロウイルスＬＴＲは、ハイグロマイシン−ＴＫ融合遺伝子のプロモーターとして使用した。同様な構築物を、ネオマイシンのような他の選択マーカーを使用して作成した。
【００４７】
受容体ベクターのＬ１およびＬ２  ｌｏｘ配列は、以下に示すヌクレオチド配列を有した（配列番号１および配列番号２に対応する）。Ｌ１は、バクテリオファージＰ１（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、（１９８３）Ｃｅｌｌ ３２：１３０１−１３１１）に由来する野生型Ｌｏｘ  Ｐ１配列（配列番号１）である。Ｌ２は、野生型Ｌｏｘ  Ｐ１配列から突然変異させ、Ｌｏｘ  ５１１と呼ぶが、８ヌクレオチドスペーサー領域の第７位でＧからＡへの点突然変異を有した（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（９）：２２６５−２２６６）。
【００４８】
【化２】
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【００４９】
受容体ベクター（「Ｌ１−ハイグロマイシン−ＴＫ−Ｌ２構築物」）を構築した後、ＢＯＳＣ２３細胞（異所性パッケージング細胞）をリン酸カルシウム法を使用して受容体ベクターで一過性にトランスフェクトした（５プライム：３プライム社）。実験のウイルス上清は、記載されているように回収し、そして濾過した（Ｐｅａｒ、同上Ｄａｎｏｓ、同上）。すべての感染は８μｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（シグマ）の存在中で行った。高力価（１０５ｐｆｕ／ｍｌより高い）レトロウイルスベクターを含有するウイルス上清を、次に同様な手法を使用して宿主ＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させるために使用した。培養４８時間後、感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞をハイグロマイシンを用いて選択した。
【００５０】
供与体ベクターは、骨格としてｐＵＣプラスミドを使用して構築した（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、（１９８５）Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）。このベクターは順番に：Ｌ１  ｌｏｘ配列、続いてプロモーターの無いネオマイシン遺伝子、続いてＬ２  ｌｏｘ配列を含んだ（図２を参照にされたい）。同様な供与体ベクターを、ネオマイシン遺伝子の代わりにハイグロマイシン−ＴＫ、ＣＤ２４およびＢ−グロビン遺伝子を使用して作成した。対照供与体ベクターは、ＰＧＫ（ホスホグリセロール  キナーゼ）プロモーターを含むネオマイシン遺伝子、ＰＧＫ−ネオマイシンを使用して構築した。
【００５１】
ネオマイシン遺伝子を含有する種々の濃度の供与体ベクターを、Ｃｒｅ組換え酵素遺伝子を含有する発現ベクターと一緒に、感染した３Ｔ３細胞に同時に電気穿孔した（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）。供与体ベクター濃度は、１０μｇ〜２００μｇであった。培養４８時間後、形質転換した細胞をネオマイシンを用いて選択した。濃度１００μｇ以上の供与体ベクターは、１０〜３０％の組込み効率を生じた（ハイグロマイシン遺伝子からネオマイシン遺伝子への変換により測定）。
【００５２】
２０：１〜１：１の範囲で異なる比率の供与体ベクターおよびＣｒｅ発現ベクターを、感染した３Ｔ３細胞に同時に電気穿孔した。すべての比率でハイグロマイシンからネオマイシンへの変換が生じた。しかし、３：１の比率（供与体：Ｃｒｅ）が最高の組込み効率を表した。
【００５３】
以下の表では、３部の供与体ベクター 対 １部のＣｒｅ発現ベクター比率の１００μｇの供与体ベクター（ＤＮＡ）濃度で、種々の供与体およびＣｒｅ発現ベクター（図３を参照にされたい）を使用して、ネオマイシンの遺伝子の組込み結果を提供する。実験Ｅ＃１−４は、陰性対照として行った。Ｅ＃５は陽性対照であった。
電気穿孔した細胞 使用した構築物 ＃コロニー
（１０７細胞のうち）
Ｅ＃１      ３Ｔ３              lox 1-PGKNeo-lox2             ５３０
および対照Cre発現ベクター
Ｅ＃２      ３Ｔ３              lox 1-Neo-lox2                 １０
および対照Cre発現ベクター
Ｅ＃３      ３Ｔ３              lox 1-Neo-lox2                   ２
およびCre発現ベクター
Ｅ＃４  lox A-ハイグロ-TK       lox 1-Neo-lox2                 ２１
-loxBを含む3T3    および対照Cre発現ベクター
Ｅ＃５        同じ              lox 1-Neo-lox2            コンフルエント
およびCre発現ベクター        （＞１０５）
【００５４】
Ｅ＃１は、対照供与体ベクター（図２を参照のこと）、ｌｏｘ１−ＰＧＫＮｅｏ−ｌｏｘ２（ネオマイシン遺伝子およびプロモーターを含む）を、対照Ｃｒｅ発現ベクター（図３を参照のこと）（Ｃｒｅをコードする中の配列は、欠失され、そしてＣＡＴをコードする遺伝子により置き換えられた）を使用した。宿主細胞は、組込み受容体ベクターを含まなかった。したがってＥ＃１は、ネオマイシン遺伝子を発現できるＬ１−ＰＧＫＮｅｏ−Ｌ２ベクターのランダムな組込みにより付与されるネオマイシン耐性の量を示した。予想どおり、付与されたネオマイシン耐性は、電気穿孔により得られた組込み効率の範囲であった（例えば、約０．１％の効率）。
【００５５】
Ｅ＃２は、供与体ベクター（プロモーター無し）を対照Ｃｒｅ発現ベクターと共に使用した。宿主細胞は、組み込まれた受容体ベクターを含まなかった。したがってＥ＃２は、受容体ベクターまたはＣｒｅ組換え酵素の不在で与えられた耐性を示した（すなわち、効率的な組換えおよび遺伝子導入が無い）。予想どおり、これは大変低かった。
【００５６】
Ｅ＃３は、供与体ベクター（プロモーター無し）を機能的Ｃｒｅ発現ベクターと共に使
用した。宿主細胞は、組み込まれた受容体ベクターを含まなかった。したがって、Ｅ＃３は、受容体ベクターは不在であるが（すなわち、効率的な組換えおよび遺伝子導入は無い）、Ｃｒｅ組換え酵素が存在中で付与された耐性を示す。予想どおり、これは大変低かった。
【００５７】
Ｅ＃４は、供与体ベクター（プロモーター無し）を、対照Ｃｒｅ発現ベクター（Ｃｒｅ発現無し）と共に使用した。宿主細胞は、組み込まれた供与体ベクター（Ｌ１−ハイグロ−ＴＫ−Ｌ２）を含んでいた。したがって、Ｅ＃４は、Ｃｒｅの不在中、供与体ベクターから受容体ベクターへの遺伝子導入の効率を示した。予想どおり、これは大変低かった。
【００５８】
Ｅ＃５は、供与体ベクター（プロモーター無し）を、機能的Ｃｒｅ発現ベクターと共に使用した。宿主細胞は、組み込まれた供与体ベクター（Ｌ１−ハイグロ−ＴＫ−Ｌ２）を含んでいた。したがってＥ＃５は、Ｃｒｅの存在中、供与体ベクターから受容体ベクターへの遺伝子導入の効率を示した。上記の表に示すように、宿主細胞はコンフルエントになり、遺伝子導入効率および安定性において、１０００倍以上の増大を示した。
【００５９】
結論
全体としてこれらの結果は、本発明のレトロウイルスのＣｒｅ／ｌｏｘが媒介する遺伝子導入系が、哺乳動物細胞の染色体への導入遺伝子の高度に効率的かつ安定な組込みに使用できることを証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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