(57)【要約】【課題】植物中に多種の形態で存在するチューリッポシド類を酵素反応を用いてα−メチレン−γ−ブチロラクトン類を製造する方法の提供を目的とする。【解決手段】下記一般式（５）で示されるα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法は、植物組織内に存在するチューリッポシド類に植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応をさせることを特徴とする。【化１】2010207211.tif 000029  （式中、Ｒ１，Ｒ２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）【選択図】  図１
2010207211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織内に存在するチューリッポシド類に植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応をさせることを特徴とする下記一般式（５）で示されるα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【化１】
2010207211.tif 000024
（式中、Ｒ１，Ｒ２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）
【請求項２】
植物組織内に存在するチューリッポシド−Ａ［化学式（１）］及びその類縁体又はチューリッポシド−Ｂ［化学式（２）］及びその類縁体を植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いてα−メチレン−γ−ブチロラクトン［化学式（３）］及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン［化学式（４）］を生成し、分別抽出することを特徴とするα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【化２】
2010207211.tif 000025
【化３】
2010207211.tif 000026
【化４】
2010207211.tif 000027
【化５】
2010207211.tif 000028
【請求項３】
α−メチレン−γ−ブチロラクトン類を製造する原料が、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）であることを特徴とする請求項１又は２記載のα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【請求項４】
組織内にチューリッポシド−Ａ及びその類縁体を有する植物体に、植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応させ、α−メチレン−γ−ブチロラクトンを製造することを特徴とするα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【請求項５】
植物体は、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、セリバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）のうち、いずれかの植物体であることを特徴とする請求項４記載のα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【請求項６】
組織内にチューリッポシド−Ｂ及びその類縁体を有する植物体に、植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応をさせ、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造することを特徴とするα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【請求項７】
植物体は、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）のうち、いずれかの植物体であることを特徴とする請求項６記載のα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法。
【請求項８】
分子量約７０，２００、サブユニット分子量約３４，９００，至適温度２５〜３０℃、至適ｐＨ６．５〜７．０、エステラーゼやフォスファターゼの阻害剤である重金属、ＮａＦ、ＰＭＳＦにより阻害され、チューリッポシド−Ａ及びＢに基質特異性を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに用いるチューリッポシド変換酵素。
【請求項９】
チューリッポシド変換酵素を抽出する植物組織が、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）のうち、いずれかに由来する植物組織であることを特徴とする請求項８記載のチューリッポシド変換酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応を活用したα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−メチレン−γ−ブチロラクトン類は、耐熱性透明樹脂の原材料，各種生理活性物質の中間体，害虫忌避剤及び抗変異原性剤等の多くの利用価値がある。
従来、α−メチレン−γ−ブチロラクトン類は、化学合成にて製造されていた（特許文献１）。
しかし、化学合成による製造方法は、専用設備が必要となるだけでなく、多大なエネルギーを消費するものであり、環境負荷が大きいものであった。
【０００３】
本願発明者らは、これまでに植物中には下記化学式（１）に示すチューリッポシド−Ａ（Ｔｕｌｉｐｏｓｉｄｅ−Ａ）及びその類縁体又は化学式（２）に示すチューリッポシド−Ｂ（Ｔｕｌｉｐｏｓｉｄｅ−Ｂ）及びその類縁体等の多量のチューリッポシド類が存在し、これらのチューリッポシド類は抗菌性を有するが、チューリップ組織の中にはチューリッポシド類よりさらに抗菌性の強い化学式（３）及び化学式（４）に示すα−メチレン−γ−ブチロラクトン類に変換する酵素を見い出し、本発明に至った。
本明細書では、この酵素をチューリッポシド変換酵素と称し、その後の研究でチューリップ以外の植物組織にも存在することが明らかになった。
なお、化学式（３）に示すα−メチレン−γ−ブチロラクトンは、チューリッパリン−Ａとも称され、化学式（４）に示すα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、チューリッパリン−Ｂとも称される。
【化１】
2010207211.tif 000003
【化２】
2010207211.tif 000004
【化３】
2010207211.tif 000005
【化４】
2010207211.tif 000006
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−２９８１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物中に多種の形態で存在するチューリッポシド類を植物組織に存在する酵素による酵素反応を用いてα−メチレン−γ−ブチロラクトン類を製造する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る下記一般式（５）で示されるα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法は、植物組織内に存在するチューリッポシド類に植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応をさせることを特徴とする。
【化５】
2010207211.tif 000007
（式中、Ｒ１，Ｒ２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）
α−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法としては、植物組織内に存在するチューリッポシド−Ａ［化学式（１）］及びその類縁体又はチューリッポシド−Ｂ［化学式（２）］及びその類縁体を植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いてα−メチレン−γ−ブチロラクトン［化学式（３）］及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン［化学式（４）］を生成し、分別抽出してもよい。
原材料となる植物体は、組織内にチューリッポシド−Ａ及びその類縁体が存在すると、α−メチレン−γ−ブチロラクトンが得られ、チューリッポシド−Ｂ及びその類縁体が存在するとα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが得られる。
そのような植物体としては、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）が好ましく、α−メチレン−γ−ブチロラクトンを製造するには、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、セリバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）のうち、いずれかの植物体にチューリッポシド変換酵素を用いた酵素反応により製造することができる。
また、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造するには、植物体は、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）のうち、いずれかの植物体にチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応させるのがよい。
チューリッポシド変換酵素は、分子量約７０，２００、サブユニット分子量約３４，９００，至適温度２５〜３０℃、至適ｐＨ６．５〜７．０、エステラーゼやフォスファターゼの阻害剤である重金属、ＮａＦ、ＰＭＳＦにより阻害され、チューリッポシド−Ａ及びＢに基質特異性を有することを特徴とする。
ここで、チューリッポシド変換酵素を抽出する植物組織が、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）のうち、いずれかに由来する植物組織であってよい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係るα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法においては、チューリップ等の植物体を原材料とし、酵素反応により製造するものであることから従来の化学合成に比較して、エネルギー消費が少なく、安全である。
これまでは、チューリップの花弁等が富山県内分推定で約１００トン／年強も廃棄されている現状からすると、石油に依存しない優れた製造方法となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】チューリッポシド−Ａの検量線を示す。
【図２】チューリッポシド−Ｂの検量線を示す。
【図３】α−メチレン−γ−ブチロラクトンの検量線を示す。
【図４】α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、植物体に有するチューリッポシド−Ａ又はＢ及びその類縁体から、α−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する点に特徴があり、類縁体には例えば化学式（６）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５（２００４）７３１−７３９；Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（２００５）４６：１２５−１３１）、化学式（７）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１），１５２−１５４，１９９９）、、化学式（８）（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ５１（３），２４４−２４８（１９９７））、化学式（９）及び（１０）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４０  Ｎｏ．１  ４９−５１（１９９５））等が例として挙げられる。
【化６】
2010207211.tif 000008
【化７】
2010207211.tif 000009
【化８】
2010207211.tif 000010
【化９】
2010207211.tif 000011
【化１０】
2010207211.tif 000012
【実施例１】
【００１０】
（チューリップ球根粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）：「紫水晶」の球根２ｇ（生重量）をビーズショッカーにて破砕し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ  ７．０）を２０ｍｌ加えてボルテックスで撹拌後、低温室にて１時間静置した。
遠心分離（２１，５００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）後、上清を１０ｍＭ  ＫＰＢにて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（ゲル３ｍｌ）にかけ、１０ｍＭ  ＫＰＢ及び１００ｍＭ  ＫＰＢ（０．１ＭＮａＣｌ）で溶出し、活性のあるフラクションを回収後、セントリプレップにて濃縮（４，０００×ｇ，４０ｍｉｎ，４℃）した。
これにより、１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素５００Ｕを得ることができた。
酵素活性の測定法は以下に示す手法にて行った。
０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を５μｌ、酵素液を１０μｌ、Ｈ２Ｏを３０μｌ、基質として６−Ｔｕｌｉｐｏｓｉｄｅ  Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ）５μｌを加え、全量を５０μｌとし、室温にて１０分間静置、酵素反応を行った。
１０分後、メタノール１００μｌ、０．５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４  ５０μｌ、Ｈ２Ｏ  ３００μｌを加えて反応を停止し、２５μｌをＨＰＬＣにインジェクションして活性を測定した。
ＨＰＬＣ分析は、流速：０．６５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２０８ｎｍ、カラム：ＲＰ−１８ＧＰ  ２５０×４．６（関東化学製）、溶媒：２０％メタノール（１０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４）の条件で行った。
タンパク量は、ブラッドフォード法（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を用いて定量した。
タンパク溶液１０μｌにブラッドフォード試薬２５０μｌを加え、３０分後、５９５ｎｍの吸光度を測定した。
規定濃度溶液（１．４４ｍｇ／ｍｌ）のＢＳＡを用いて各々の濃度と吸光度の検量線を作成した。
これを元に、球根無細胞抽出液中のタンパク含量を定量した。
【実施例２】
【００１１】
（チューリップ花弁組織からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の抽出）
チューリップ：「紫水晶」の花弁１００ｍｇ（生重量）に１ｍｌの冷水を加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０回）で破砕抽出した。
綿ろ過後、抽出液４９０μｌを量りとり、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、実施例１にて得られた粗酵素液（３１００Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、各溶媒（トルエン、酢酸ブチル、酢酸プロピル、ヘキサン、キシレン）２００μｌで２回、１００μｌで１回の計３回で溶媒抽出してＨＰＬＣ分析にて抽出効率を求めた。
なお、ＨＰＬＣ分析については、流速：０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２０８ｎｍ、カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ５ｍｍ  ４．６ｍｍ×１５ｃｍ（東ソー株式会社製）、溶媒：１０％メタノール（１０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４）、イソクラティックの条件で行った。
ここで抽出効率は、図１〜４にそれぞれ示すような既知の濃度に基づいて検量線を作成し、チューリッポシド−Ａ又はＢがα−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換後、酵素反応液から溶媒抽出できた割合を示す。
【表１】
2010207211.tif 000013
抽出溶媒として非極性溶媒を用いたので、ヒドロキシ基を有するα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの抽出効率が低かった。
【実施例３】
【００１２】
（チューリップ花弁組織からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の分別抽出）
チューリップ：「紫水晶」花弁１００ｍｇ（生重量）に１ｍｌの冷水を加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕抽出した。
綿ろ過後、抽出液４９０μｌを量りとり、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、実施例１にて得られた粗酵素液（５８０Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出した。
残りの水層より、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを各溶媒（ブタノール、酢酸エチル、２−プロパノール、酢酸プロピル、イソアミルアルコール）にて２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出、ＨＰＬＣ分析にて抽出効率を算出した。
【表２】
2010207211.tif 000014
α−メチレン−γ−ブチロラクトンを非極性溶媒で抽出した後に極性溶媒を用いてα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを抽出したので抽出効率が向上した。
【実施例４】
【００１３】
（チューリップ根粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の根１．３ｇ（乾燥重量）を乳鉢にて破砕し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を１５０ｍｌ加えて低温室にて１時間攪拌した。
ガーゼにて組織を濾別後、遠心分離（２１，５００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）した上清に１０ｍＭ  ＫＰＢにて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ４ｇを加え、低温室にて１．５時間攪拌した。懸濁液を２５ｍｌの注射筒に流し入れゲルを回収した。
このゲルより各２０ｍｌの１０ｍＭ  ＫＰＢ、１００ｍＭ  ＫＰＢ、１００ｍＭ  ＫＰＢ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ）にて順次酵素を溶出し、活性のあるフラクションを回収後、セントリプレップ（４，０００×ｇ，４０ｍｉｎ，４℃）及びセントリコン（１０，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）にて濃縮した。
これにより、１８．７Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約１７Ｕを得ることができた。
【実施例５】
【００１４】
（チューリップ茎粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の茎２．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、１１．１Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約１２Ｕを得ることができた。
【実施例６】
【００１５】
（チューリップ葉粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の葉２．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、１５．４Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約６３Ｕを得ることができた。
【実施例７】
【００１６】
（チューリップ花弁粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の花弁１．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、６８．０Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約６０Ｕを得ることができた。
【実施例８】
【００１７】
（チューリップ葯粗酵素液の調製）
凍結乾燥した「紫水晶」の葯２．０ｇ（乾燥重量）から実施例Ｂ−１と同様の手法で精製を行い、４２．１Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約７２Ｕを得ることができた。
【実施例９】
【００１８】
（チューリップ雌しべ粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の雌しべ１．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、１１．４Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約１７Ｕを得ることができた。
【実施例１０】
【００１９】
（チューリップ各組織由来粗酵素を用いたα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の調製）
チューリップ：「紫水晶」の花弁（乾重量１ｇ）を乳鉢で破砕し、冷メタノール５０ｍｌを加え低温室（４℃）にて３０分間撹拌抽出した。
ろ過後、ろ液をシロップ状になるまで減圧濃縮し、メタノールと同量の冷水（４℃）に再溶解して抽出液とした。
このものを均等に分け、酵素反応に供した。
抽出液４９０μｌを量りとり、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各組織由来粗酵素液（球根１０００Ｕ／ｍｌ、葉６３０Ｕ／ｍｌ、茎１２３Ｕ／ｍｌ、根１７１Ｕ／ｍｌ、葯７１９Ｕ／ｍｌ、花弁６０１Ｕ／ｍｌ、雌しべ１６７Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表３に示す。
ここで変換率は、チューリッポシド−Ａ又はＢがα−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換した割合を示し、抽出効率は酵素反応液から溶媒抽出できた割合を示す。
【表３】
2010207211.tif 000015
【００２０】
（比較例１）
（市販リパーゼを用いたα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の調製）
実施例１０同様の抽出液を用い、このものを均等に分け、酵素反応に供した。
抽出液４９０μｌを量りとり、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各種リパーゼ１０ｍｇを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表４に示す。
【表４】
2010207211.tif 000016
この結果、チューリップ組織から抽出したチューリッポシド変換酵素の方が市販のリパーゼよりも優れていることが明らかになった。
【実施例１１】
【００２１】
（チューリップ各組織中からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の調製）
チューリップ：「紫水晶」の各組織（球根２５０ｍｇ、葉１００ｍｇ、茎１００ｍｇ、根１００ｍｇ、葯５０ｍｇ、花弁１００ｍｇいずれも生重量）に冷水１ｍｌを加え、ビーズショッカー（２５００  ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０回）で破砕抽出した。
綿ろ過後、抽出液４９０μｌを量りとり、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、粗酵素液（１０００Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００  μｌ  ２回、１００μｌ  １回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表５に示す。
【表５】
2010207211.tif 000017
【実施例１２】
【００２２】
（アルストロメリア抽出液の調製）
アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）植物体６０ｍｇ（乾燥重量）より冷メタノール３ｍｌにて、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕することで抽出物を得た。
綿ろ過後、ろ液を集め減圧濃縮し、ろ液と同量の冷水に再溶解して抽出液とした。
このものを均等に分け、酵素反応に供した。
なお、抽出にはラピッドスター、マリレーン、エラの３栽培品種を用いた。
【００２３】
（セリバオウレン抽出液の調製）
セリバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）植物体６００ｍｇ（乾燥重量）を乳鉢で破砕後冷メタノール３０ｍｌを加え、室温にて３０分間撹拌した。
ろ過後、ろ液をシロップ状になるまで減圧濃縮し、冷水３ｍｌに再溶解して抽出液とした。このものを均等に分け、酵素反応に供した。
【００２４】
（各植物体からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の生成及び抽出）
上記で調製した抽出液４９０μｌを量りとり、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５ｍｌ、球根粗酵素液（１，０６３Ｕ／ｍｌ）５ｍｌまたはＨ２Ｏを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）にて抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素変換により生成したα−メチレン−γ−ブチロラクトンの濃度及び抽出効率を表６に示す。
【表６】
2010207211.tif 000018
【実施例１３】
【００２５】
紫水晶の各組織（球根、葉、茎、根、葯、花弁、雌しべ）１００ｍｇ（生重量、但し球根は２５０ｍｇ、葯は５０ｍｇ）に１ｍｌのメタノールを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕し、綿ろ過後、ろ液を減圧濃縮し、１ｍＬの冷水（４℃）に再溶解して抽出液とした。
抽出液４９０μｌを量りとり、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、球根粗酵素液（１，０６３Ｕ／ｍｌ）５μｌを添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出した。
残りの水層より、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール：アセトン＝  １：１にて２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出した。
４つの段階（抽出直後、２時間反応後、トルエン抽出後の水層、混合溶媒抽出後の水層）に分け、ＨＰＬＣ分析を行った。
なお、ＨＰＬＣ分析条件は実施例２と同条件である。
分析結果を表７に示す。
ここで濃度は、酵素反応液における両化合物の濃度を、変換率は、チューリッポシド−Ａ又はＢがα−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換した割合を示し、抽出効率は酵素反応液から溶媒抽出できた割合を示す。
【表７】
2010207211.tif 000019
【００２６】
これにより、植物体の各組織からの破砕抽出にメタノールを用いてもα−メチレン−γ−ブチロラクトン類を効率よく得られることが明らかになった。
【実施例１４】
【００２７】
チューリップの各品種（アーリーグローリー、ありさ、アルビノ、ウエディングベールエンパイヤステート、カーニバルデリオ、黄小町、クインオブナイト、グリーンランド、ゲリットファンデルボルク、ゴールデンエンパイヤステート、ゴールデンメロディー、コンプリメント、白雪姫、紫雲、ジュディレスター、スターファイター、デザインインプレッション、初桜、ハミルトン、春乙女、春万葉、バレリーナ、ピンクダイヤモンド、ピンクレディパーロット、ファンシーフリル、フライアウェイ、フランソワーゼ、紫水晶、フレーミングパーロット、メセアポゼラン、ラリベラ、ランバダ、レーンファンデルマーク、レッドウィング、レッドファボリット、ワシントン）の花弁１００ｍｇ（生重量）に１ｍＬのメタノールを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕し、綿ろ過後、ろ液を減圧濃縮し、１ｍＬの冷水（４℃）に再溶解して抽出液とした。
上記、抽出液４９０μｌを量りとり、実施例１３と同様に反応を行い、抽出、定量を行った結果を表８に示す。
なお、濃度、変換率、抽出効率の定義は、実施例１３と同様である。
【表８】
2010207211.tif 000020
【００２８】
これにより、チューリップの品種によらずにα−メチレン−γ−ブチロラクトン類が得られることが明らかになった。
【実施例１５】
【００２９】
シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）植物体５０ｍｇ（乾燥重量）に冷メタノール１ｍｌを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕し、綿ろ過後、ろ液を集め減圧濃縮し、ろ液と同量の冷水に再溶解して抽出液とした。
植物抽出液４９０μｌを量りとり、実施例１３と同様に反応を行い、抽出、定量を行った結果を表９に示す。
なお、濃度、抽出効率の定義は、実施例１３と同様である。
【表９】
2010207211.tif 000021
【００３０】
これにより、植物組織中にチューリッポシド−β及びその類縁体が存在すると、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得ることができることも明らかになった。
【実施例１６】
【００３１】
実施例１０で調製した紫水晶花弁抽出液４９０μｌに、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、実施例１にて得られた粗酵素液（５８０Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加、無添加下で、各種溶媒にて２００μｌで各回数抽出することで、α−メチレン−γ−ブチロラクトン類を溶媒抽出した。
ＨＰＬＣ分析にて抽出効率を算出した結果を表１０に示す。
【表１０】
2010207211.tif 000022
【実施例１７】
【００３２】
実施例１３と同様の酵素反応後、ベンゾトリフルオリドにてα−メチレン−γ−ブチロラクトンを抽出（ＮａＣｌ無添加、２００μｌ×５回抽出）した残りの水層にＮａＣｌを飽和量添加し、２，２，２−トリフルオロエタノールまたは２，２，３，３−テトラフルオロ−１−プロパノールにて２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出したところ、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを９４．７及び９５．８％の効率で抽出できた。
【実施例１８】
【００３３】
アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）植物体２００ｍｇ（乾燥重量）を乳鉢にて破砕し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を１５ｍｌ加えて低温室にて１時間攪拌した。
ガーゼにて組織を濾別後、遠心分離（２１，５００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）した上清に１０ｍＭ  ＫＰＢにて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  １ｇを加え、低温室にて１．５時間攪拌した。
懸濁液を１０ｍｌの注射筒に流し入れゲルを回収した。
このゲルより各５ｍｌの１０ｍＭ  ＫＰＢ、１００ｍＭ  ＫＰＢ、１００ｍＭ  ＫＰＢ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ）にて順次酵素を溶出し、活性のあるフラクションを回収後、セントリプレップ（４，０００×ｇ，４０ｍｉｎ，４℃）及びセントリコン（１０，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）にて濃縮した。
これにより、８．９Ｕ／ｍｇの比活性を有する「エラ」粗酵素約５．６Ｕ、７．５Ｕ／ｍｇの比活性を有する「マリレーン」粗酵素約  ２．３Ｕ、３．５Ｕ／ｍｇの比活性を有する「ラピッドスター」粗酵素約１．２Ｕを得ることができた。
【実施例１９】
【００３４】
カタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｄｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｐｕｒｓｈ．）植物体５０ｍｇ（乾燥重量）に１ｍｌの１０ｍＭ  ＫＰＢを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０回）で破砕抽出した。
綿ろ過後、得られた酵素液をマイクロコン（８，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）にて濃縮した。
これにより、８５．３Ｕ／ｍｇの比活性を有するカタクリ粗酵素約４．９Ｕ、１２６Ｕ／ｍｇの比活性を有するキバナカタクリ粗酵素約  ７．７Ｕを得ることができた。
【実施例２０】
【００３５】
実施例１０に用いた抽出液４９０μｌを量りとり、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各植物由来粗酵素液（アルストロメリア「エラ」１１２Ｕ／ｍｌ、アルストロメリア「マリレーン」４７Ｕ／ｍｌ、アルストロメリア「ラピッドスター」２４Ｕ／ｍｌ、カタクリ９２Ｕ／ｍｌ、キバナカタクリ１５３Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表１１に示す。
【表１１】
2010207211.tif 000023
【００３６】
これにより、チューリッポシド変換酵素はチューリップのみならず、アルストロメリア、カタクリ、キバナカタクリ等の植物組織にも存在することが明らかになった。
【図１】
2010207211.tif 000030
【図２】
2010207211.tif 000031
【図３】
2010207211.tif 000032
【図４】
2010207211.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月4日(2009.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例１０に用いた抽出液４９０μｌを量りとり、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各植物由来粗酵素液（アルストロメリア「エラ」１１２Ｕ／ｍｌ、アルストロメリア「マリレーン」４７Ｕ／ｍｌ、アルストロメリア「ラピッドスター」２４Ｕ／ｍｌ、カタクリ９２Ｕ／ｍｌ、キバナカタクリ１５３Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ  ２回、１００μｌ  １回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表１１に示す。
【表１１】
2010207211.tif 000034