(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の観察時に得られる画像の画質の劣化を防止する測定装置と、該装置に用いる構造体と培養容器の提供。【解決手段】培養液又は培養液中の細胞を区画する区画領域を備えるとともに、少なくとも区画領域が非晶質のフッ素樹脂から形成された構造体と培養容器１０、およびそれらを備えた測定装置。区画領域は細胞と当接される大きさからなる凹部２２を備えており、該凹部は底面側から開口部側に向けて面積が大きくなるように形成され、またその内周面及び底面に、前記細胞を保持するための表面処理が施されていることが好ましい。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液中の細胞を収容する培養容器の細胞付着底面を区画する区画領域を形成するともに、少なくとも前記区画領域が非晶質のフッ素樹脂から形成されたことを特徴とする構造体。
【請求項２】
請求項１に記載の構造体において、
前記区画領域は、前記細胞の一単位の大きさ、或いは前記細胞のコロニー単位の大きさからなる凹部を備えていることを特徴とする構造体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の構造体において、
前記凹部は、該凹部の内壁面及び底面に、前記細胞を保持するための表面処理が施されていることを特徴とする構造体。
【請求項４】
請求項１に記載の構造体において、
前記区画領域は前記培養液を区画する複数の凹部から構成されるとともに、前記複数の凹部は、それぞれ隣り合う通路により連結されていることを特徴とする構造体。
【請求項５】
請求項２から請求項４のいずれか１項に記載の構造体において、
前記区画領域は、該区画領域から突出する突出部を備えるとともに、前記凹部は該突出部に設けられていることを特徴とする構造体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の構造体が培養容器の底面に接着されて成ることを特徴とする培養容器。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の構造体又は請求項６に記載の培養容器と、
前記構造体又は前記培養容器に向けて照明光を照射する照明手段と、
前記照明光が照射された前記構造体又は前記培養容器に保持される細胞の画像を取得する画像取得手段と、
を備えたことを特徴とする測定装置。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の構造体に向けて照明光を照射する照明工程と、
前記照明光が照射された前記構造体に保持される細胞の画像を取得する画像取得工程と、
を備えたことを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液や培養液中の細胞を区画して保持する構造体、これら構造体に保持される培養液や細胞の観察や測定を行う測定装置及びや測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウェルプレートや培養容器を用いて、神経細胞や卵細胞などの細胞を培養することが一般的に行われている。このウェルプレートや培養容器の中には、複数のウェルが設けられ、それぞれのウェルに単一の細胞を収納して培養を行うものも提供されている。このようなウェルプレートや培養容器においては、上述したウェルは円筒形状や円錐形状から形成されているのが一般的である。最近では、マニピュレータやキャピラリーにより培養される細胞を操作しながら該細胞を観察する際の観察視野を確保するために、開口部側が底面側よりも拡径となる、所謂テーパ状のウェルが形成されたウェルプレートや培養容器が提供されている。
【特許文献１】特開２００６−１０９７１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述したテーパ状のウェルを備えたウェルプレートや培養容器の場合、ウェルに収納される細胞を補捉する際に、細胞の移動を防止できるという利点がある。しかしながら、このようなテーパ状のウェルや円筒形状のウェルを備えたウェルプレートや培養容器内の細胞を観察する場合、培養液の屈折率と、ウェルプレートや培養容器における屈折率との違いから、ウェルプレートや培養容器を透過する観察光は屈折してしまい、観察される細胞の画像の画質を劣化させるなど、細胞観察時に悪影響を及ぼすという問題がある。
【０００４】
本発明は、細胞の観察時に得られる画像の画質の劣化を防止することができるようにした構造体、測定装置及び測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の発明の構造体は、培養液中の細胞を収容する培養容器の細胞付着底面を区画する区画領域を形成するともに、少なくとも前記区画領域が非晶質のフッ素樹脂から形成されたことを特徴とする。
【０００６】
第２の発明は、第１の発明において、前記区画領域は、前記細胞の一単位の大きさ、或いは前記細胞のコロニー単位の大きさからなる凹部を備えていることを特徴とする。
【０００７】
第３の発明は、第１又は第２の発明において、前記凹部は、該凹部の内壁面及び底面に、前記細胞を保持するための表面処理が施されていることを特徴とする。
【０００８】
第４の発明は、第１の発明において、前記区画領域は前記培養液を区画する複数の凹部から構成されるとともに、前記複数の凹部は、それぞれ隣り合う通路により連結されていることを特徴とする。
【０００９】
第５の発明は、第２から第４の発明のいずれかにおいて、前記区画領域は、該区画領域から突出する突出部を備えるとともに、前記凹部は該突出部に設けられていることを特徴とする。
【００１０】
第６の発明の培養容器は、第１から第５の発明のいずれかの構造体が培養容器の底面に接着されて成ることを特徴とする。
【００１１】
第７の測定装置は、第１から第５の発明のいずれかに記載の構造体、又は第６の発明に記載された培養容器と、前記構造体又は培養容器に向けて照明光を照射する照明手段と、前記照明光が照射された前記構造体又は前記培養容器に保持される細胞の画像を取得する画像取得手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１２】
第８の測定方法は、第１から第６の発明のいずれかに記載の構造体に向けて照明光を照射する照明工程と、前記照明光が照射された前記構造体に保持される細胞の画像を取得する画像取得工程と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、少なくとも区画領域が非晶質フッ素樹脂から形成されるので、細胞に観察光が到達する前に区画領域を通過する場合には、観察光が屈折せずに細胞に到達する。また、仮に細胞に到達しない観察光が区画領域に到達した場合でも、その観察光は、そのまま区画領域にて反射せずに透過することから、細胞観察時に得られる画像の画質の劣化を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１は、本発明を実施した培養容器の斜視図である。培養容器１０は、上面が開口された円筒形状の容器からなる。培養容器１０は、例えば透明なガラスやプラスチックなどの材質から形成される。この培養容器１０は、例えば卵細胞などの細胞３５を培養するために用いられる。なお、培養容器１０の形状は円筒形状に限定される必要はなく、例えば略方形状の容器であってもよい。
【００１５】
この培養容器１０の底部１０ａには、図中ハッチングで示す領域１５に、培養液３０中の細胞３５を区画する領域が設けられる。以下、この領域を区画領域１５と称して説明する。ここで、細胞３５を区画するとは、細胞３５を位置決めし、位置決めされた状態を保持することである。
【００１６】
区画領域１５は、例えばサイトップ（登録商標）と呼ばれる非晶質のフッ素樹脂により形成される。非晶質のフッ素樹脂は、可視光線の透過率が９５％を超える特性や、また、水の屈折率（１．３３）と非常に近似した屈折率（１．３４）であるという特性を有している。また、この他に、非晶質のフッ素樹脂は、サブミクロン単位の薄膜コーティングが可能であるという特性を有している。以下、培養容器１０の底部１０ａにコーティングされた非晶質のフッ化樹脂の層をフッ化樹脂層２０と称して説明する。
【００１７】
図２に示すように、区画領域１５は、フッ化樹脂層２０の上面２０ａに円柱形状の突出部２１が複数設けられている。これら突出部２１は、例えばマトリクス状に配列される。なお、これら突出部２１の配列状態はマトリクス状に限定される必要はなく、ライン状、或いはハニカム状など適宜の配列状態としてよい。これら複数の突出部２１の上面には凹部２２が設けられている。この区画領域１５に設けられる凹部２２は、細胞３５の一単位の大きさ、或いは細胞３５のコロニー単位の大きさから形成される。凹部２２は、該凹部２２の深さ方向と直交する断面が例えば円形状からなる。また、凹部２２は、底面２２ａ側から開口部側に向けて、該凹部２２の深さ方向と直交する断面の面積が大きくなるように形成される。これら突出部２１や凹部２２は、フッ化樹脂層２０に対して、例えばプラズマエッチング或いはホットエンボス加工などを施すことで形成される。また、この他に、射出成形を行うことで、突出部２１及び凹部２２を備えたフッ化樹脂膜を生成し、このフッ化樹脂膜を培養容器１０の底部１０ａに固着させることも可能である。なお、図示を省略したキャピラリー等により、単一の細胞３５が凹部２２に載置され、位置決め保持される。ここで、凹部２２に載置されると記載したのは、細胞３５の大きさよりも凹部２２が大きい場合には細胞３５は凹部２２に収納されることになるが、細胞３５の大きさよりも凹部２２が小さい場合には細胞３５は凹部２２によって支持されるためである。なお、細胞３５が凹部２２に載置されたときには、その大きさに限らず、凹部２２の底面２２ａ及び内周面２２ｂに当接される。
【００１８】
なお、上述した凹部２２の形状は、培養する細胞３５の種類によって異なるが、細胞３５を区画できる形状であれば、上述した形状に限定する必要はない。ここで示す凹部２２の形状とは、例えば凹部２２の深さ（開口側から底面２２ａまでの長さ）、凹部２２の深さ方向と直交する断面の面積、及び凹部２２の内周面２２ｂの傾斜角度などが挙げられる。図３（ａ）に示すように、例えば凹部２２に細胞３５を収納する必要がある場合には、凹部２２の深さを細胞３５の大きさ（直径）よりも深くする必要がある。一方、図３（ｂ）に示すように、凹部２２に細胞３５を収納しなくてもよい場合には、凹部２２の深さを細胞３５の大きさ（直径）よりも浅くする。この場合には、凹部２２の底面２２ａと内周面２２ｂとで細胞３５を支持することで、細胞３５を保持（位置決め）することができる。また、凹部２２の形状としては、図３に示す形状の他に、例えばすり鉢状の凹部（言い換えれば凹部内の空間が円錐形状からなる凹部）３６であってもよい（図４参照）。この凹部３６も本実施形態と同様に、細胞３５の一単位の大きさ、或いは細胞３５のコロニー単位の大きさから形成される。このような凹部３６であっても、斜面３６ａに細胞３５が付着されることから、本実施形態と同様に、細胞３５を容易に位置決めする、又は保持することができる。
【００１９】
この凹部２２の底面２２ａ及び内周面２２ｂには、細胞３５の保持状態が変化しないように、つまり、細胞３５と凹部２２との接着性を向上させるための表面処理が施されている。例えばフッ化樹脂は疎水性であることから、プラズマ照射等による表面処理を施すことで、凹部２２の底面２２ａ及び内周面２２ｂを親水化する。表面処理としては、プラズマ照射の他に、例えば電荷を有する高分子被膜をフッ化樹脂層２０の表面に形成することが挙げられる。この電荷を有する高分子被膜を形成する場合には、観察時の光学性能に影響を与えない程度の厚みとなるように高分子皮膜を形成すればよい。なお、マニピュレータ又はキャピラリーによる細胞操作により、細胞３５の保持状態を変化させる場合には、フッ化樹脂層２０の表面２０ａ、つまり凹部２２の底面２２ａ及び内周面２２ｂに表面処理を施す必要はない。
【００２０】
図５は、本発明の培養容器１０に培養される細胞を観察する場合の顕微鏡の構成を示す。顕微鏡４０は、光源４１と、照明光学系４２と、共焦点光学系４３と、撮像装置４４と、ステージ４５と、ステージ駆動部４６と、シフト機構４７と、コントローラ４８と、操作部４９と、表示部５０とを備えている。なお、図５においては、顕微鏡とコンピュータなどの外部装置との接続の有無については記載していないが、外部装置と接続可能な顕微鏡であってもよい。
【００２１】
光源４１は例えばレーザ光を照射するレーザ光源が挙げられる。照明光学系４２は、例えばコンデンサレンズからなる。光源４１及び照明光学系４２は、共焦点光学系４３の側方に位置し、後述するビームスプリッタ５７から側方に延びる光軸Ｌ１上に配置される。
【００２２】
共焦点光学系４３は、被検物となる培養容器１０から上方に延びる光軸Ｌ２上に、培養容器１０側から、対物レンズ系５５、ピンホールディスク５６、ビームスプリッタ５７、リレーレンズ系５８の順で配置される。
【００２３】
対物レンズ系５５は、ピンホールディスク５６の共焦点ピンホールを通過した光を、ステージ４５に載置された培養容器１０に共焦点ピンホールの像（点像）として集光照射する。培養容器１０に集光照射された共焦点ピンホールの像は、培養容器１０の底部１０ａ、又は位置決めされた細胞３５の表面で反射されることから、対物レンズ系５５は、反射された光を集光し、ピンホールディスク５６の下面に培養容器１０の底部１０ａ、又は位置決めされた細胞３５の表面の像を生成する。
【００２４】
ピンホールディスク５６は、光を透過する共焦点ピンホール（図示省略）が多数螺旋状に配列された薄い円板からなる。ピンホールディスク５６は、ビームスプリッタ５７で反射された光を遮るように、共焦点光学系４３の光軸Ｌ２に対して直交して配置される。ピンホールディスク５６はモータ６０により所定の回転速度で回転され、共焦点ピンホールを通過した光のみが、対物レンズ系５５に向けて照射される。
【００２５】
ビームスプリッタ５７は、照明光学系４２からの照明光のうち、特定の偏光成分の光を透過させ、残りの偏光成分の光を反射する。このビームスプリッタ５７にて反射された偏光成分の光がピンホールディスク５６の上面に照射される。また、ビームスプリッタ５７は、ピンホールディスク５６の共焦点ピンホールを通過した反射光を透過させ、リレーレンズ系５８に照射する。なお、ビームスプリッタ５７を配置しているが、ビームスプリッタ５７の代わりにハーフミラーを配置することも可能である。リレーレンズ系５８は、ビームスプリッタ５７を透過した反射光を集光し、撮像装置４４の撮像面に共焦点ピンホールの像を結像させる。
【００２６】
撮像装置４４はリレーレンズ系５８の像面位置に設けられる。撮像装置４４は、例えばＣＣＤやＣＭＯＳなどの二次元の撮像素子から構成される。ステージ４５は、培養容器１０を所定位置に保持した状態で、共焦点光学系４３の焦点近傍位置に配置される。
【００２７】
ステージ駆動部４６は、ステージ４５を光軸Ｌ２方向に移動させるとともに、ステージ４５を光軸Ｌ２方向と直交する面上で移動させる。シフト機構４７は対物レンズ系５５を光軸Ｌ２方向に移動させる。コントローラ４８は、顕微鏡４０の各部を制御する。操作部４９は、顕微鏡４０における観察条件の入力操作等の際に操作される。表示部５０は、例えばＬＣＤからなり、撮像装置４４によって撮像される画像や、観察条件の設定などを行う際の画像を表示する。
【００２８】
上述したように、この顕微鏡４０は、光源４１からの照明光のうち、ビームスプリッタ５７にて所定の偏光成分の光のみを反射させた後、ピンホールディスク５６上に結像させる。このピンホールディスク５６は、モータ６０により所定の速度で高速回転させることにより、ピンホールディスク５６に形成された共焦点ピンホールを通過した光のみがスポット光として培養容器１０をスキャンすることとなる。
【００２９】
そして、共焦点ピンホールを通過した培養容器１０の反射像（共焦点像）を撮像装置４４で撮影することで、培養容器１０の各部の高さ情報を含んだ共焦点画像を得ることができる。すなわち、共焦点光学系４３は、培養容器１０が対物レンズ系５５の焦点面の高さ位置にあるときに、反射光がピンホールディスク５６のピンホール形成面に結像し、反射光のほぼ全量が通過光となって共焦点ピンホールを通過するが、培養容器１０が対物レンズ系の焦点面の高さ位置からわずかでも外れると、反射光はピンホール形成面に結像せず、一部しか共焦点ピンホールを通過することができない。このため、培養容器１０及び共焦点光学系４３の少なくともいずれか一方を光軸Ｌ２方向に変位させて培養容器１０の表面に対する焦点面の高さを相対変位させ、培養容器１０からの反射光をピンホールディスク５６を介して撮像装置４４により撮影し、検出される通過光の光強度が最大となる高さ位置を求めることにより、培養容器１０の高さ位置を検出することができる。
【００３０】
このような顕微鏡４０において、培養容器１０に位置決めされた細胞を観察するときには、培養容器１０の突出部２１の突出量と、対物レンズ系５５の光学倍率やＦナンバーによっては、対物レンズ系５５の観察視野内に突出部２１が入り込む場合がある（図６参照）。このような場合には、対物レンズ系５５からの照明光が培養液３０、突出部２１の順で伝播した後、細胞３５に到達する。上述したように、突出部２１は非晶質のフッ化樹脂から形成されていることから、培養液３０の屈折率と突出部２１の屈折率とは、略同一の屈折率となることから、照明光は突出部２１に入射する際には屈折せずに直進することになる。
【００３１】
これによれば、培養容器１０の表面（或いは細胞の表面）に照射される光の集光状態を維持することができる。また、仮に細胞３５に到達しない観察光の場合には、培養容器１０の突出部２１のみを通過することになるが、突出部２１と培養液３０との境界面においては反射せずにそのまま直進する。この観察光はフッ素樹脂層２０と培養容器１０の底部１０ａとの境界にて反射する場合も考えられるが、この反射光は対物レンズ系５５の観察視野から外れるので、観察時に影響することはない。これにより、細胞の表面の高さ位置を測定する他に、細胞の状態変化を正確に測定することが可能となる。
【００３２】
なお、顕微鏡４０の一例として、共焦点光学系を有する顕微鏡を取り上げているが、これに限定される必要はなく、例えば蛍光観察や位相差観察を行う顕微鏡を用いた場合であっても、本実施形態と同様の効果を得ることが可能である。なお、蛍光観察や位相差観察については、周知であることから、ここではその詳細を省略する。
【００３３】
本実施形態では、区画領域１５のみを非晶質のフッ化樹脂から形成した培養容器１０の例を取り上げているが、これに限定される必要はなく、例えば培養容器を非晶質のフッ化樹脂から形成することも可能である。また、区画領域１５に設けられる凹部２２の底面２２ａは必ずしもフッ化樹脂層２０に設ける必要はなく、例えば培養容器１０の底部１０ａを底面としてもよい。
【００３４】
本実施形態では、フッ化樹脂層２０に、その表面２０ａから突出する円柱形状の突起部２１を複数設け、そのそれぞれに凹部２２を設けた実施形態としているが、これに限定されるものではなく、図７に示すように、例えばフッ化樹脂層２０の表面２０ａに複数の凹部２２を設けた構成であってもよい。この場合も、フッ化樹脂層２０に対してプラズマエッチング等を施して凹部２２を形成する。この場合も、区画される細胞を保持する保持力を高める場合には、凹部２２の表面にプラズマ照射等による表面処理を施し、凹部２２の底面２２ａや内周面２２ｂを親水化したり、凹部２２の底面２２ａや内周面２２ｂに、例えば電荷を有する高分子被膜を形成することが挙げられる。
【００３５】
本実施形態では、構造体として培養容器１０を例に取り上げているが、これに限定される必要はなく、例えばマイクロプレート、ウェルプレートやスライドガラス等であってもよい。例えばスライドガラスなどの構造体に本発明を適用することも可能である。図８に示すように、スライドガラス７０の上面７０ａの図８中斜線に示す領域７１に非晶質のフッ化樹脂をコーティングすることで、区画領域を生成する。コーディングすることでフッ化樹脂層がスライドガラス７０の上面７０ａに形成されるので、このフッ化樹脂層に対して、本実施形態と同様の突出部や凹部を形成すればよい。このような構成のスライドガラス７０の使用用途としては、フッ化樹脂層に形成される凹部に細胞を載置した状態で細胞を観察する、又はフッ化樹脂層に形成された凹部に細胞を載置した状態で培養液が貯留された培養容器に沈めて細胞を培養するなどが挙げられる。例えばスライドガラス７０を培養容器に沈める場合には、培養液を交換するときには、培養容器からスライドガラス７０を引き上げて、新たな培養液に交換する、或いは培養液が貯留された新たな培養容器にスライドガラス７０を沈めればよい。この場合も、スライドガラス７０を自体を非晶質のフッ化樹脂から形成することも可能である。
【００３６】
本実施形態では、フッ化樹脂層２０に設けられる凹部２２により培養液中の細胞３５を区画（位置決め）しているが、この他に、例えば細胞３５が培養された培養液をフッ化樹脂層２０に設けられる凹部２２に注入することで、培養液を区画することも可能である。この場合、フッ化樹脂層に設けられる凹部は、一般に提供される培養容器に設けられるウェルの機能を有している。以下、培養容器を取り上げて説明するが、スライドガラスやマイクロプレートであってもよい。図９に示すように、培養容器７５の底面７５ａに設けられるフッ化樹脂層７６に円柱形状の凹部７７を設ける。この場合も、ホットエンボス加工を施すことで円柱形状の凹部７７を形成した非晶質のフッ化樹脂膜、プラズマエッチングにより円柱形状の凹部７７を形成した非晶質のフッ化樹脂膜、又は射出成形を行うことで形成される円柱形状の凹部７７を有する非晶質のフッ化樹脂膜のいずれかを培養容器７５の底面７５ａに固着することでフッ化樹脂層７６を形成する。このような培養容器の場合には、細胞を培養する培養液はそれぞれの凹部７７に注入されることから、それぞれの凹部７７に試薬の注入等により、単一細胞毎に異なる培養環境を作り出すことができる。
【００３７】
なお、この場合の凹部７７の形状を円柱形状としているが、これに限定される必要はなく、凹部の深さ方向に直交する断面の形状が、例えば楕円形状や、三角形、四角形などの多角形状からなる凹部であってもよい。
【００３８】
さらに、培養容器７５に培養液を区画するための凹部７７が設けられている場合には、隣り合う凹部７７を繋ぐ通路７８を設けることも可能である（図１０参照）。例えば神経細胞などを培養した場合、所定時間培養すると、細胞に樹状突起や軸索が形成される。これら細胞に形成される樹状突起や軸索は、ランダムな方向に延び始める。隣り合う凹部７７を繋ぐ通路７８は、凹部７７に保持される細胞の樹状突起と、隣り合う凹部７７に保持される細胞の軸索とを接合させるために用いられる。これら樹状突起や軸索が接合されることにより、細胞回路を形成することが可能となる。例えば培養容器７５に設けられた凹部７７のそれぞれに異なる細胞（例えば神経細胞及び心筋拍動細胞）を隣り合う凹部のそれぞれに保持することで、神経細胞と心筋心筋拍動細胞とからなる細胞回路を生成することが可能となる。また、このように生成される細胞回路を上述した顕微鏡で観察したときには、凹部が形成されるフッ化樹脂層において観察光を屈折することがないので、細胞回路の各部を高精度で観察する、或いは細胞回路の形成状態を高精度で検出することができる。なお、上述した通路７８の形状は、適宜設定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】培養容器の外観を示す斜視図である。
【図２】区画領域の構成を示す斜視図である。
【図３】区画領域の構成を示す断面図である。
【図４】区画領域に設けられる凹部の形状を示す断面図である。
【図５】共焦点光学系を有する顕微鏡の構成を示す図である。
【図６】顕微鏡の観察時における照明光の光路を示す断面図である。
【図７】区画領域の変形例を示す断面図である。
【図８】スライドガラスに区画領域を設けた場合の斜視図である。
【図９】培養液を区画する時に用いられる培養容器の区画領域の構成を示す斜視図である。
【図１０】図９に示す培養容器の区画領域の変形例を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００４０】
１０，７５…培養容器、１５，７１…区画領域、２０，７６…フッ化樹脂層、２１…突出部、２２，７７…凹部、３０…培養液、３５…細胞、４０…顕微鏡、４１…光源、４３…共焦点光学系、４４…撮像装置、７８…通路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010063430.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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