(57)【要約】【課題】微量な反応液で、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことが可能な、生体試料反応用チップ及び生体試料反応方法を得る。【解決手段】反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃと、各々の反応容器に接続された反応液導入用流路１０４と、反応液導入用流路１０４に接続された廃液収容部１０５及び反応液収容部１０６を備え、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃは、容積が異なる３つの反応容器群Ａ，Ｂ，Ｃを構成している。反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ内に未知濃度のターゲット核酸を含む反応液を充填し、同一のプライマーを用いてＰＣＲ処理を行う。ＰＣＲ処理後、各々の反応容器群の中で、ターゲット核酸が検出される反応容器と検出されない反応容器の両方が含まれる反応容器群における、ターゲット核酸が検出されない反応容器の数の割合に基づいて、反応液中のターゲット核酸濃度を定量する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容積が等しい２つ以上の反応容器から各々が構成される複数の反応容器群と、
各々の前記反応容器に接続された反応液導入用流路と、
前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、
前記反応液導入用流路に接続された廃液収容部と、を備え、
各々の前記反応容器群は容積が異なることを特徴とする生体試料反応用チップ。
【請求項２】
各々の前記反応容器には、反応に必要な試薬が塗布されていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料反応用チップ。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の生体試料反応用チップを用いた生体試料反応方法であって、
前記反応液収容部内の前記反応液を前記反応液導入用流路と前記反応容器に充填する第１の工程と、
前記反応液導入用流路内の前記反応液を前記廃液収容部に送出する第２の工程と、
生体試料反応処理を実行する第３の工程と、
前記生体試料反応処理の結果を測定する第４の工程と、を有することを特徴とする生体試料反応方法。
【請求項４】
前記生体試料反応処理は核酸増幅を含む処理であり、
前記反応液には、
未知の濃度のターゲット核酸と、
所定濃度の、核酸を増幅するための酵素及びヌクレオチドが含まれており、
前記反応容器には予めプライマーが塗布されており、
前記第４の工程では、各々の前記反応容器内において前記ターゲット核酸が検出されるか否かを測定し、各々の前記反応容器群の中で、前記ターゲット核酸が検出される前記反応容器と前記ターゲット核酸が検出されない前記反応容器の両方が含まれる前記反応容器群における、前記ターゲット核酸が検出されない前記反応容器の数の割合に基づいて、前記反応液中の前記ターゲット核酸濃度を定量することを特徴とする請求項３に記載の生体試料反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅などを行うための生体試料反応用チップ及び生体試料反応方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。
【０００３】
試料として用いるＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がよく知られている。ＰＣＲ法は、ターゲットのＤＮＡと試薬を混合したものをチューブに入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、ポリメラーゼという酵素の作用により温度サイクル１回あたり、約２倍にターゲットＤＮＡだけを増幅することができる。
【０００４】
近年、特殊な蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲという方法が実用化され、増幅反応を行いながらＤＮＡの定量ができるようになった。リアルタイムＰＣＲは、測定の感度、信頼性が高いことから、研究用、臨床検査用に広く使われている。
【０００５】
しかし、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡの定量を行う場合、一定の蛍光強度に到達した際のサイクル数と初期の標的核酸の量の関係を示す検量線をつくる必要がある。さらに、検体中に増幅反応を阻害する物質が存在する場合、測定結果が検量線からずれるため、信頼性が低くなる場合がある。
【０００６】
また、従来の装置では、ＰＣＲに必要な反応液の量は数十μｌが標準的であり、また、１つの反応系では基本的に１つの遺伝子の測定しかできないという問題があった。蛍光プローブを複数入れてその色で区別することにより４種類程度の遺伝子を同時に測定する方法もあるが、それ以上の遺伝子を同時に測定するためには反応系の数を増やすしかなかった。検体から抽出されるＤＮＡの量は一般に少量であり、また試薬も高価なため同時に多数の反応系を測定することは困難であった。
【０００７】
反応容器を小型化する方法も提案されているが、検体液の分注精度の低下や、１つの反応容器中に含まれる標的核酸の量が少なくなるといった理由により、定量ばらつきが大きくなるという問題があった。
【０００８】
また、標的核酸の量を測定する他の手段として限界希釈法が知られており、例えば特許文献１にも開示されている。限界希釈法では、検体液を段階的に希釈してＰＣＲを行い、標的核酸の増幅が確認できなくなる濃度を調べることにより、初期の標的核酸濃度を推定する。また、１つの反応容器内に存在する標的核酸の平均値が１以下になるように検体液を希釈して複数の反応容器でＰＣＲを行い、標的核酸が検出できた反応容器の割合を求め、ポアソン分布の式から濃度を推定する方法もある。
【特許文献１】特開２００１−２６９１９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、限界希釈法では、濃度が未知の検体については何段階にも検体液を希釈して多数の増幅反応を行う必要があるので、コストも時間もかかってしまうという問題があった。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、微量な反応液で、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことが可能な、生体試料反応用チップ及び生体試料反応方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る生体試料反応用チップは、容積が等しい２つ以上の反応容器から各々が構成される複数の反応容器群と、各々の前記反応容器に接続された反応液導入用流路と、前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、前記反応液導入用流路に接続された廃液収容部とを備え、各々の前記反応容器群は容積が異なるものである。
【００１２】
本発明によれば、反応液導入用流路を通して反応容器内に反応液を供給するのに適しており、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。また、容量の異なる複数の反応容器内で処理を行うことができるため、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことができる。また、反応液導入用流路と反応容器に反応液を充填した後、反応液導入用流路内の反応液を廃液収容部に送出するようにしたので、個々の反応容器を分離することができるため、反応容器間でのコンタミネーションを防ぐことができる。なお、反応容器に反応液を充填する際には遠心力、毛管力、ポンプによる圧力等を用いることができる。
【００１３】
また、各々の前記反応容器には、反応に必要な試薬が塗布されていることが望ましい。  これにより、使用者は反応液を充填するだけで簡易に検査等を行うことができる。
【００１４】
本発明に係る生体試料反応方法は、上記の生体試料反応用チップを用いた生体試料反応方法であって、前記反応液収容部内の前記反応液を前記反応液導入用流路と前記反応容器に充填する第１の工程と、前記反応液導入用流路内の前記反応液を前記廃液収容部に送出する第２の工程と、生体試料反応処理を実行する第３の工程と、前記生体試料反応処理の結果を測定する第４の工程とを有するものである。
【００１５】
本発明によれば、反応液導入用流路を通して反応容器内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。また、容量の異なる複数の反応容器内で処理を行うことができるため、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことができる。また、反応液導入用流路と反応容器に反応液を充填した後、反応液導入用流路内の反応液を廃液収容部に送出するようにしたので、個々の反応容器を分離することができるため、反応容器間でのコンタミネーションを防ぐことができる。なお、反応容器に反応液を充填する際には遠心力、毛管力、ポンプによる圧力等を用いることができる。
【００１６】
また、前記生体試料反応処理は核酸増幅を含む処理であり、前記反応液には、未知の濃度のターゲット核酸と、所定濃度の、核酸を増幅するための酵素及びヌクレオチドが含まれており、前記反応容器には予めプライマーが塗布されており、前記第４の工程では、各々の前記反応容器内において前記ターゲット核酸が検出されるか否かを測定し、各々の前記反応容器群の中で、前記ターゲット核酸が検出される前記反応容器と前記ターゲット核酸が検出されない前記反応容器の両方が含まれる前記反応容器群における、前記ターゲット核酸が検出されない前記反応容器の数の割合に基づいて、前記反応液中の前記ターゲット核酸濃度を定量することが望ましい。
【００１７】
これにより、容積の異なる複数の反応容器群で同時にＰＣＲ処理を行うことができるため、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことができる。また、反応容器の容積の組み合わせを任意に変更することにより、任意の希釈倍率に相当する反応系を得ることができる。また、反応容器の数を増やすことにより統計的な信頼度を上げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイ（生体試料反応用チップ）１０の概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。図に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１，１０２、反応容器１０３ａ（第１の反応容器）、１０３ｂ（第２の反応容器）、１０３ｃ、反応液導入用流路１０４、反応液導入用流路１０４から廃液収容部１０５へ向かう流路１０４ａ、廃液収容部１０５、反応液収容部１０６、反応液供給口１０７を備えている。
【００１９】
図１に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１と透明基板１０２を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１には、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ、反応液導入用流路１０４、流路１０４ａ、廃液収容部１０５、反応液収容部１０６が形成されている。透明基板１０２には、反応液供給口１０７が形成されている。透明基板１０１，１０２は例えば樹脂基板とすることができる。
【００２０】
反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃは、容量が異なる３つの反応容器群を構成している。ここでは、反応容器１０３ａは２０μｌ、反応容器１０３ｂは２μｌ、反応容器１０３ｃは０．２μｌであり、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃはそれぞれ１２個ずつ備えられている。複数の反応容器１０３ａによって構成される反応容器群を容器群Ａ、複数の反応容器１０３ｂによって構成される反応容器群を容器群Ｂ、複数の反応容器１０３ｃによって構成される反応容器群を容器群Ｃとする。なお、反応容器群Ａ，Ｂ，Ｃの配置は図１に示すように、容器群毎にまとまっていなくてもよい。
【００２１】
反応液導入用流路１０４は、反応液の流れる方向に垂直な断面が、幅２００μｍ、深さ１００μｍに形成されている。なお、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ、反応液導入用流路１０４、及び流路１０４ａは、気泡の吸着を防止するため内壁面が親液性となるように表面処理を施しておくことが望ましい。また、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ、反応液導入用流路１０４、及び流路１０４ａの内壁面にはタンパク質などの生体分子の非特異吸着を抑制する表面処理が施されていることが望ましい。
【００２２】
また、透明基板１０１と透明基板１０２の互いに接触する面が撥液性を有するように表面処理を施したり、あるいは、透明基板１０１と透明基板１０２の接触面にシール性を持たせたりすることにより、反応容器１０３から反応液が漏れ、基板表面を伝わって別の反応容器１０３に入ることを防ぐことができる。具体的には接触面をシリコーンゴムやフッ素樹脂でコートするなどの方法が考えられる。
【００２３】
次に、マイクロリアクターアレイ１０に反応液を充填する方法を説明する。反応液を充填する工程では、まず、反応液供給口１０７から、ピペット等を用いて反応液収容部１０６に反応液を供給する。
【００２４】
反応液には、ターゲット核酸、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、蛍光色素のＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（登録商標）が反応に適した所定の濃度で含まれている。
ターゲット核酸は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡなどを用いることができる。
プライマーは反応液に含まれていてもよいが、本実施例のマイクロリアクターアレイでは、各反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ内に、予め塗付され乾燥状態で収容されている。各反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃには、予め同一のプライマーが塗付されている。このため、容量の異なる複数の反応容器内で、１種類のターゲット核酸の増幅反応を同時に行うことができる。
【００２５】
次に、マイクロリアクターアレイ１０を図２に示すような遠心装置５０を用いて回転させる。
図２に示すように、遠心装置５０の回転テーブル５１上にマイクロリアクターアレイ１０を固定し、遠心装置５０を回転させることにより、マイクロリアクターアレイ１０には、反応液収容部１０６から反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに向かう方向に遠心力がかかる。
【００２６】
まず、図３（Ａ）に示す方向に遠心力がかかるようにマイクロリアクターアレイ１０を遠心装置５０に固定し、回転させる。図３（Ａ）に示す状態で遠心装置５０を回転させると、マイクロリアクターアレイ１０に遠心力がかかることにより、反応液は反応液導入用流路１０４を充填しながら進み、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを充填する。反応液よりも比重の軽い空気は反応液導入用流路１０４内へ押し出され、反応液と入れ替わることにより、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃが反応液で満たされる。
【００２７】
図３（Ａ）に示す状態でマイクロリアクターアレイ１０に遠心力をかけた場合、反応液は廃液収容部１０５へは送出されない。これは、図に示すように、反応液導入用流路１０４から廃液収容部１０５へ向かう流路の方向が遠心力の方向に対して１３５度の角度をなしているため、遠心力の廃液収容部１０５へ向かう流路の方向の成分が０以下となるからである。なお、反応液導入用流路１０４から廃液収容部１０５へ向かう流路１０４ａの方向と遠心力の方向のなす角度が９０度以上１８０度以下であれば、反応液は廃液収容部１０５へ送出されない。このように、反応液が廃液収容部１０５の方へ流れていかないため、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに反応液を充填することができる。
【００２８】
次に、遠心装置５０の回転を一端停止し、今度はマイクロリアクターアレイ１０を図３（Ｂ）に示す方向に遠心力がかかるように遠心装置５０に固定する。再び遠心装置５０を回転させることにより、今度は反応液導入用流路１０４内の反応液が廃液収容部１０５に送出される。これは、図３（Ｂ）の状態では、反応液導入用流路１０４から廃液収容部１０５へ向かう流路１０４ａの方向が、遠心力の方向に対して４５度の角度をなしているため、遠心力の廃液収容部１０５へ向かう流路の方向の成分が０以上となるからである。なお、反応液導入用流路１０４から廃液収容部１０５へ向かう流路の方向と遠心力の方向のなす角度が０度以上かつ９０度より小さければ、反応液は廃液収容部１０５へ送出される。なお、反応液導入用流路１０４内の反応液は廃液収容部１０５へ送出されるが、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ内の反応液はそのまま反応容器内に留まる。
【００２９】
このように、反応液導入用流路１０４内の反応液を廃液収容部１０５に送出しておくことにより、各反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを分離することができる。
【００３０】
引き続いて、反応液供給口１０７から、ピペット等を用いて反応液収容部１０６にミネラルオイルを供給し、再度、図３（Ａ）に示す方向に遠心力がかかる状態で回転してもよい。この状態でマイクロリアクターアレイ１０を回転させると、反応液導入用流路１０４にミネラルオイルが充填される。この時、反応液の比重がミネラルオイルよりも重いので、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ内の反応液はミネラルオイルと入れ替わらない。これにより、個々の反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを分離して、反応容器間でのコンタミネーションを防止することができる。また、反応処理中に、反応容器内が乾燥することを防止することもできる。なお、ミネラルオイルの代わりに反応液よりも比重が軽く、反応液と混和せず反応液よりも蒸発しにくい液体を用いても良い。
【００３１】
以上のような手順でマイクロリアクターアレイ１０に反応液を供給したら、次にＰＣＲ処理（生体試料反応処理）を行う。具体的には、マイクロリアクターアレイ１０の開口部をシールした後、マイクロリアクターアレイ１０をサーマルサイクラーに設置してＰＣＲ処理を行う。一般的には、まず、９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約５５℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを５０回繰り返す。
【００３２】
ＰＣＲ処理の後、蛍光顕微鏡を用いて個々の反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ内の蛍光強度を測定する。一定値以上の蛍光強度が観察された反応容器内ではターゲット核酸の増幅処理が行われたことを示しており、すなわち元の反応液中に１つ以上のターゲット核酸が存在したことを示している。容積の異なる反応容器群Ａ，Ｂ，Ｃの中で、増幅の観察される反応容器と増幅の観察されない反応容器の両方が含まれる容器群を選択し、増幅の観察されない反応容器の数を計数し、ターゲット核酸が存在しなかった反応容器の割合を求める。
【００３３】
次に、上記の結果に基づいて反応液中のターゲット核酸の濃度を算出する。濃度の算出にはポアソン分布を利用する。
ポアソン分布によれば、確率ｐで発生する事象がｎ回の試行のうちｘ回だけ起こる確率は  、
ｆ（ｘ）＝ｅ-μμx／ｘ！  ・・・（１）
となる。μは平均値であり、μ＝ｎｐである。１つの反応容器内のターゲット核酸の数の平均値をμとすると、反応容器内のターゲット核酸がゼロになる確率は、式（１）から、
ｆ（０）＝ｅ-μ  ・・・（２）
となる。
【００３４】
ｆ（０）は上記の計数結果から求められた、ターゲット核酸が存在しなかった反応容器の割合に当る。よって、式（２）よりμが求められ、反応容器の容量が既知であることから、反応液中のターゲット核酸の濃度が算出できる。
【００３５】
以上のように、実施の形態１によれば、遠心力を利用して、反応液導入用流路１０４を通して反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。
【００３６】
また、容量の異なる複数の反応容器群Ａ，Ｂ，Ｃで同時にＰＣＲ処理を行うことができるため、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことができる。本実施形態では、容器群Ｂ，Ｃの容積が容器群Ａの容積の１／１０、１／１００に設定されているため、反応液を１０倍、１００倍に希釈してＰＣＲ反応を行った場合に相当する測定ができる。このように、反応液の希釈の手間を省くことが出来る。また、反応容器の容量の組み合わせを任意に変更することにより、任意の希釈倍率に相当する反応系を得ることができる。また、反応容器の数を増やすことにより統計的な信頼度を上げることができる。
【００３７】
また、遠心力により、反応液導入用流路１０４と反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに反応液を充填した後、遠心力のかかる向きを変えて、再度遠心力により、反応液導入用流路１０４内の反応液を廃液収容部１０５に送出するようにしたので、反応処理時には個々の反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを分離することができるため、反応容器間でのコンタミネーションを防ぐことができる。
【００３８】
なお、本実施形態では、反応容器１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに反応液を充填するのに遠心力を利用しているが、遠心力の代わりに、毛管力やポンプによる圧力等を用いて充填するようにしてもよい。
【００３９】
なお、実施の形態１では、マイクロリアクターアレイ１０をＰＣＲ反応用の反応装置として用いたが、遺伝子や生体試料を用いた様々な反応に利用することができる。例えば、特定のタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）する抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等を反応容器内に塗布しておき、反応液からターゲットのタンパク質を検出する処理等に用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイの概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。
【図２】マイクロリアクターアレイに遠心力をかけるための遠心装置の概略構成を示す図である。
【図３】実施の形態１によるマイクロリアクターアレイに反応液を充填する方法を説明する図である。
【符号の説明】
【００４１】
１０  マイクロリアクターアレイ、１０１，１０２  透明基板、１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ  反応容器、１０４  反応液導入用流路、１０４ａ  流路、１０５  廃液収容部、１０６  反応液収容部、１０７  反応液供給口、５０  遠心装置
【図１】
2010063395.tif 000003
【図２】
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【図３】
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