(57)【要約】【課題】酵素免疫測定に際し、検体添加後の展開液の展開開始時間を厳しく管理する必要がなく測定を簡単且つ容易にした。【解決手段】酵素免疫測定器具１は、下部筐体３に設けた毛細管現象で輸液可能な展開基材１４に、検体を添加する検体添加領域１７と、検体添加領域１７上またはその上流側または下流側に設けた酵素標識試薬パッド１８と、これらの下流側に設けた検出領域１９とを有する。展開基材１４の上流側に展開基材１４から分離した基質を含む展開液パッド１６を設ける。上部筐体２に設けた操作部５の裏面に展開液の貯留槽と凸起を設ける。貯留槽に隣接して展開液パッド１６を展開基材１４に接触させる作動片を設ける。操作部５を押すことで、作動片によって展開液パッドが展開基材に接触し、貯留槽の封止膜を凸起で破断して展開液を展開液パッド１６に供給し、基質を含む展開液を展開基材１４に流す。【選択図】図１
2010117213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管現象によって輸液可能な展開基材に、検体を添加する検体添加領域及び酵素標識試薬領域と、これら検体添加領域及び酵素標識試薬領域の下流側に設けた検出領域とが設けられていると共に、前記展開基材の検体添加領域及び酵素標識試薬領域の上流側に前記展開基材に接触可能に分離していて基質を含む展開液領域と、該展開液領域に供給可能な展開液とを設けたことを特徴とする酵素免疫測定器具。
【請求項２】
前記展開液領域はその下流側部分に基質が設けられている請求項１に記載された酵素免疫測定器具。
【請求項３】
前記展開液には酵素阻害剤を含まない請求項１または２に記載された酵素免疫測定器具。
【請求項４】
前記展開液領域において、前記基質を含む区域を設けると共にその上流側に酵素阻害剤を含む区域を設けた請求項１乃至３のいずれかに記載された酵素免疫測定器具。
【請求項５】
前記展開液領域の近傍に展開液を貯留する展開液貯留槽を備えており、該展開液貯留槽から前記展開液領域に展開液を供給するようにした請求項１乃至４のいずれかに記載された酵素免疫測定器具
【請求項６】
前記展開液貯留部には展開液を封止する封止膜が設けられ、該封止膜を開封することで前記展開液領域に展開液を供給させる操作部が更に設けられている請求項５に記載された酵素免疫測定器具。
【請求項７】
前記操作部による前記展開液貯留部の封止膜の開封に連動して、前記展開液領域を前記展開基材に接触させる作動部が設けられている請求項６に記載された酵素免疫測定器具。
【請求項８】
毛細管現象によって輸液可能な展開基材を用いた酵素免疫測定方法において、
前記展開基材と分離して基質を含む展開液領域を設けておき、検体を展開基材上に添加して酵素標識試薬領域の酵素標識試薬と反応させ、その後に前記展開液領域を通して前記展開基材に基質を含む展開液を供給するようにしたことを特徴とする酵素免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の生体成分や薬物等、試料中の被検物質を簡便に測定する酵素免疫測定器具及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応を利用して検体中にタンパク質等の抗原や生体成分、薬物等が入っているかいないかを簡便に検査・測定する器具や方法として、酵素を標識物質として用いて毛細管現象によって送液可能な展開基材上で検体、酵素標識試薬及び基質を反応させる測定方法が提案されている。
例えば、下記特許文献１に記載された酵素免疫測定用試験片においては、毛細管現象によって輸液可能な展開器材の上流側に展開液供給ゾーンを付設し、展開液供給ゾーンには酵素阻害剤を添加した展開液を貯留する展開液槽から展開液を供給可能にしている。また展開液供給ゾーンの下端には乾燥状態の基質を有する基質ゾーンを設けている。
展開器材における基質ゾーンの下流側には、検体を点着する検体点着ゾーンに、検体中の検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原等の免疫反応物質が酵素標識された酵素試薬を点着した酵素標識試薬ゾーンが設けられている。酵素標識試薬ゾーンの下流側に検出ゾーンを設け、更にその下流側に検出ゾーンにトラップされなかった展開液を吸収する吸収パットを設けている。
【０００３】
そして、この試験片を用いた測定では、検体を検体点着ゾーンに添加すると共に展開液供給ゾーンに展開液槽から展開液を供給して基質ゾーンで基質を溶解する。そして、検体点着ゾーンでは、加えられた検体が酵素標識試薬ゾーンの試薬と反応し、展開液供給ゾーンから流れてくる基質を含む展開液に流されて検出ゾーンに到達する。
検体中の抗原または抗体が検体ゾーンに固定化されている抗原または抗体にトラップされると、検体中の抗原または抗体は酵素標識試薬と結合しているために、酵素標識試薬が検出ゾーンに留まる。そして、検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれている場合には、検出ゾーンにトラップされた酵素が展開液中の基質と反応して発色する。そのため、検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれているか否かは、検出ゾーンで発色するか否かによって判別することができる。
しかも、展開液に含まれる酵素阻害剤により酵素反応が阻害されて所定時間後に発色が停止する、としている。
【特許文献１】特許第３３３４５５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、特許文献１に記載された酵素免疫測定方法及び試験片では、検体を試験片の展開器材における検体点着ゾーンに滴下して酵素標識試薬と検体とを反応させ、反応が進んだ一定時間経過後に展開液を展開基材中の検出ゾーンに移送する必要がある。しかしながら、この酵素免疫測定用の試験片では、検体と酵素標識試薬との反応液は展開器材の毛細管現象によって下流側だけでなく上流側にも移送させられるため、上流側に移送する反応液が展開液供給ゾーンの下流端に設けた基質ゾーンのパットに付着している基質と接触して反応してしまう。そのため基質及び酵素標識試薬が消費され、検出領域において正規の反応を生じないおそれがある。
これを防ぐために、特許文献１に記載された酵素免疫測定方法では、検体を検体点着ゾーンに添加した後、検体と酵素標識試薬とを反応させると共にこの反応液が基質ゾーンに到達する前の所定時間経過後に展開液を展開液ゾーンから流す必要があり、検体添加後の時間の管理が煩雑であるという不具合があった。
【０００５】
本発明は、このような実情に鑑みて、酵素免疫測定に際し、検体添加後の時間管理の必要がなく反応による測定を確実に行えるようにした酵素免疫測定器具及び酵素免疫測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明に係る酵素免疫測定器具は、毛細管現象によって輸液可能な展開基材に、検体を添加する検体添加領域及び酵素標識試薬領域と、これら検体添加領域及び酵素標識試薬領域の下流側に設けた検出領域とが設けられていると共に、展開基材の検体添加領域及び酵素標識試薬領域の上流側に展開基材に接触可能に分離した展開液領域と、該展開液領域に供給可能な展開液とを設けたことを特徴とする。
本発明による酵素免疫測定器具によれば、検体添加領域に検体が添加されて酵素標識試薬領域の酵素標識試薬と反応し、この反応液が毛細管現象で展開基材の下流側だけでなく上流側にも流れるが、展開液領域は展開基材と非接触に保持されているから上流側に展開する反応液が基質と反応してしまうことがないので、検出領域において検体、酵素標識試薬、基質の反応が進み、検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれている場合には基質が発色する。
【０００７】
また、本発明に係る酵素免疫測定方法は、毛細管現象によって輸液可能な展開基材を用いた酵素免疫測定方法において、展開基材と分離して基質を含む展開液領域を設けておき、検体を展開基材上に添加して酵素標識試薬領域の酵素標識試薬と反応させ、その後に展開液領域を通して展開基材に基質を含む展開液を供給するようにしたことを特徴とする。
本発明による酵素免疫測定方法によれば、展開基材に検体が添加されて酵素標識試薬領域の酵素標識試薬と反応し、この反応液が毛細管現象で展開基材の下流側だけでなく上流側にも展開するが、展開液領域は展開基材に非接触であるから反応液は基質と反応せず、その後に展開液を、基質を含む展開液領域を通して展開基材に供給することによって、基質が検出領域に供給されてトラップされた酵素標識試薬と基質が反応することになり、検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれている場合には基質が発色する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による酵素免疫測定器具及び酵素免疫測定方法によれば、検体の添加時に、基質を含む展開液領域を展開基材から分離した状態に保持しているため、基質と検出領域でトラップされた酵素とが反応する前に、検体と酵素標識試薬との反応液が展開基材の上流側で基質と反応することを防止できて、検体の反応を確実に行うことができる。そのため、酵素免疫測定に際し、検体添加後、反応液が上流側に展開しないように展開液が展開する時間を厳密に管理する必要がなく測定が簡単且つ容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明による酵素免疫測定器具では、展開液領域はその下流側部分に基質が設けられていることが好ましい。
展開液領域に展開液を供給すると、展開液領域の下流側に含まれる基質が展開液に溶解されて展開基材に移送されることになる。
【００１０】
本発明による酵素免疫測定器具及び酵素免疫測定方法によれば、展開液には酵素阻害剤を含まなくてもよい。本発明の酵素免疫測定器具及び酵素免疫測定方法による酵素免疫測定は短時間で処理・測定され観察されるため、酵素阻害剤によって発色を停止させる必要はない。
また、展開液領域において、基質を含む区域を設けると共にその上流側に酵素阻害剤を含む区域を設けるように構成してもよい。検体を展開基材上に添加して酵素標識領域の酵素標識試薬と反応させ、その後に、展開液領域の基質を含む区域に展開液を供給して展開基材に基質を含む展開液を供給すると、展開液領域では供給される展開液が基質を含んで下流側に展開すると共に、上流側へも流れて酵素阻害剤を含む区域の酵素阻害剤を溶解させて酵素阻害剤を含む展開液が下流側に流れる。展開基材の下流側では、検体と酵素標識試薬との反応液に基質が反応して発色した後で酵素阻害剤を含む展開液が流入して基材の発色を停止させる。
【００１１】
また、本発明による酵素免疫測定器具は、展開液領域近傍に展開液を貯留する展開液貯留槽を備えており、展開液貯留槽から展開液領域に展開液を供給するようにしてもよい。
展開液貯留槽から展開液を展開液領域に供給することで展開液領域に含まれた基質を溶解して展開基材に流すことが可能になる。
また、展開液貯留槽には展開液を封止する封止膜が設けられ、封止膜を開封することで展開液領域に展開液を供給させる操作部が更に設けられていてもよい。
酵素免疫測定器具の操作部を操作することで展開液貯留槽の封止膜は破断して展開液を展開液領域に流出させることができる。
【００１２】
また、操作部による展開液貯留部の封止膜の開封に連動して、展開液領域を展開基材に接触させる作動部が設けられていてもよく、これによって操作部の操作に連動して展開液領域を展開基材に接触できるから、展開液貯留槽から流出した展開液は展開液領域を通ることで基質を溶解させて、展開液領域から展開基材に基質を含む展開液を移送させることができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明による酵素免疫測定器具及び測定方法の実施例について添付の図１乃至図９に基づいて説明する。
図１は本発明の実施例による酵素免疫測定器具を上部筐体と下部筐体とに分離した分解斜視図、図２は下部筐体の斜視図、図３（ａ）、（ｂ）は上部筐体の平面図とＡ−Ａ線中央縦断面図、図４は上部筐体の裏面を示す斜視図、図５は図４に示す上部筐体における展開液貯留槽の分解図、図６は展開液パッドを展開基材に接触させた状態の部分斜視図、図７は操作部を操作する前の状態の酵素免疫測定器具を示す中央縦断面図、図８は操作部を押圧した状態の中央縦断面図、図９（ａ）、（ｂ）は操作部を操作する前と後の状態を示す幅方向縦断面図である。
本実施例による酵素免疫測定器具１は、添加する検体を酵素標識試薬と結合させて抗体または抗原でトラップし、酵素標識試薬と基質とを反応させて、基質の発色の有無によって検体中に検出すべき抗原または抗体を含むか否か等を検査・測定するものであり、例えばイムノクロマト法による測定方法である。図１において、酵素免疫測定器具1は例えば合成樹脂からなる嵌合可能な上部筐体２と下部筐体３とを嵌合して形成されている。
【００１４】
上部筐体２は図１から図３に示すように、例えば略長方形形状の板材を段付きに形成したものであり、その一端部には片持ち押し操作する操作部５が設けられ、長手方向に沿って検体の投入部である投入孔６、検体の反応を観察する検出窓７，余分な展開液を蒸発させるための空気穴８とが設けられている。
なお、本実施例において、上部筐体２及び下部筐体３において、長手方向に見て後述する展開液２６の輸液方向により、操作部５側を上流側とし長手方向他端側を下流側という。
【００１５】
下部筐体３は図２に示すように上部筐体２に嵌合可能な例えば略長方形形状を有している。上部筐体２の操作部５に対向する下部筐体３の一端部は他の領域よりも一段高い段部３ａが形成され、幅方向両端から中央に向けて傾斜するテーパ部１０ａ，１０ａが形成され、その中央下部には複数条の溝が形成された溝部１１が設けられている。溝部１１の溝はテーパ部１０ａから流入する展開液を下部筐体３の他端方向に毛細管現象で流すように傾斜して形成されている。溝部１１に隣接する下部筐体３の底部には長手方向に沿って台座１２が設けられ、台座１２の上にパッド部材からなる帯状の展開基材１４が設置されている（図１参照）。展開基材１４は毛細管現象によって展開液を流動させる材質であればよく、例えばニトロセルロース、スポンジ、吸水性の不織布等が用いられる。
なお、下部筐体３の周壁には所定間隔で筒状凹部１５が植設されている。
【００１６】
図１に示す下部筐体３において、展開基材１４の上流側には、溝部１１上に基質を乾燥状態で含む展開液パッド１６が展開液領域として設けられ、展開液パッド１６の自由端部は段部３ａから展開基材１４の上方に非接触で延びている。展開液パッド１６は、好ましくはその長手方向下流側（自由端側）に基質が乾燥状態で含まれており、後述するように展開液が投入されると基質を溶解して含んだ状態で展開基材１４に吸着させられることになる。
展開基材１４は上部筐体２における検体の投入孔６の下方に検体添加領域１７が設けられ、検体添加領域１７上には、検体の検出すべき抗原、抗体と反応する抗体、抗原等の免疫反応物質が酵素標識された多量の標識試薬を含有させた標識試薬パッド１８が酵素標識試薬領域として設置されている。標識試薬パッド１８は吸水性のある材質であればよく、例えばニトロセルロース、セルロース、ポリビニルアルコール等の多孔質の天然または合成の高分子化合物からなる材料で形成されたスポンジ、吸水性不織布、濾紙等を用いることができる。
標識試薬パッド１８において、付着される標識試薬として用いる酵素は、公知の標識に用いられる任意の酵素があげられる。具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられる。好ましくはより高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼである。かかる酵素は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００１７】
また、基質は、酵素と反応して発色し得る基質であればよく、発色基質、蛍光基質、発光基質等の発色性化学物質を用いることができる。例えば、酵素がアルカリフォスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＡＳ−ＴＲホスフェート等が挙げられる。また、酵素がペルオキシダーゼの場合、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニジジン、５−アミノサリサイクリックアシッド、３，３’−ジアミノベンジシン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等が挙げられる。 
基質としての発色性化学物質の塗布量としては、ＢＣＩＰを例にとると、発色を明瞭にするという観点から塗布部１ｃｍ２ 当たり０．１〜１０ｍｇ程度が好ましい。発色基質の量が低いと発色強度が得られず、一方で発色基質の量が多いとバックグランドが高くなり、検出感度が得られなくなる。  
【００１８】
展開基材１４において、検体添加領域１７の下流側には検出領域１９が設けられている。検出領域１９では検体中の検出すべき抗原または抗体と反応する抗体、抗原等の免疫反応物質を物理的吸着や化学結合等によって展開基材１４に保持する。検体中の抗原または抗体は、検出領域１９に固定化されている抗体または抗原にトラップされ留まり、検体中の抗原または抗体は酵素標識試薬と結合しているために酵素標識試薬が検出領域１９に留まり、検出領域１９ではトラップされた酵素が展開液中の基質と反応する。検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれているか否かを発色の有無によって検出する。
発色の有無は上部筐体２における検出窓７を通して観察できる。
検出領域１９の下流側には吸収パッド２０が配設され、検出領域１９でトラップされない余分な展開液や検体や酵素が吸収される。また検体に検出すべき抗体または抗原を含まない場合には標識試薬や展開液等が吸収パッド２０に吸収される。吸収パッド２０の貯留された展開液は空気孔８を通して乾燥させられる。
【００１９】
図１及び図３において、操作部５は未使用状態で上部筐体２の本体に形成した枠２２に一端部５ａを片持ち支持されており、他端部は容易に破断可能な細いリブ５ｂを介して本体に連結されている。そのため、操作部５を押すことで、リブ５ｂが分断されて下部筐体３内の展開液パッド１６上に傾斜降下し、その状態を維持する。
図４は上部筐体２を上下反転した裏面を示すものであり、操作部５の裏面には操作部５の周囲を囲う側壁２４ａを有する展開液２６の貯留槽２４が形成され、その中央には切り裂き部として例えば略三角錐形状の凸起２５が突出して設けられている。そのため、操作部５は非押圧状態で上に凸の湾曲形状をなすと共に押圧状態では下側へ凹んだ湾曲状態をなすよう、裏面に凸起２５を有する押圧部分の周囲は薄肉形状とされている（図８、図９参照）。
図５に示すように、貯留槽２４内には展開液２６が例えば２００〜４００マイクロリットル貯留されており、貯留槽２４の周囲の壁面には封止膜２７として例えばアルミシールまたはポリエチレンフィルムシート等が緊張状態で液密に密封されている。密封の方法は熱溶着、超音波溶着、接着剤による接着、成形品での嵌着等が用いられる。これによって、上部筐体２が貯留槽２４を下向きに保持しても展開液２６が下方に漏れ出すことはない。封止膜２７はアルミシールまたはポリエチレンフィルムシートに限定されることなく、液密性があって破断容易な構造を形成することが可能な材質であればよい。
展開液２６としては、酢酸緩衝液、硼酸緩衝液、トリス緩衝液、ジェタノールアミン緩衝液等の各種緩衝液が用いられる。
【００２０】
図５において、貯留槽２４の展開基材１４側の前方には側壁２４ａに間隔を開けて展開液パッド１６の自由端を押圧するための作動片２８が設けられている。
そして、操作部５を押してリブ５ｂを分断して操作部５を傾斜させると、凸起２５が封止膜２７を引き裂くことで、貯留槽２４内の展開液２６を展開液パッド１６上に落下させる。また、作動片２８によって展開液パッド１６の先端を押して展開液パッド１６の先端部を展開基材１４に接触させる（図６、図８参照）。また、段部３ａにはテーパ部３０が設けられており、貯留槽２４が傾斜した状態で側壁２４ａに当接して係止させ、指を操作部５から離した際に貯留槽２４が元の位置に戻るのを防止するようにしている（図１、図２参照）
なお、凸起２５は未使用状態で貯留槽２４の側壁２４ａより引っ込んでおり、作動片２８は側壁２４ａより突出している。そのため、操作部５の押圧によって作動片２８が展開液パッド１６を展開基材１４に押圧させた位置で貯留槽２４は停止保持されるため、凸起２５による封止膜２７の引き裂きが容易である。
また、上部筐体２の裏面には周壁に沿ってピン部２９が所定間隔で植設されている。下部筐体３の各筒状凹部１５に上部筐体２の各ピン部２９を嵌合することで、酵素免疫測定器具１を組み立てることができる。
【００２１】
展開液１９には酵素阻害剤は含まれていないが、発色を停止させるために含めてもよい。酵素阻害剤は、酵素の基質結合部位に基質の代わりに結合し、酵素活性を可逆的に阻害する拮抗型酵素阻害剤、または基質結合部位とは異なる部位で酵素と結合して酵素分子の構造を変化させて阻害する非拮抗型酵素阻害剤である。なお、酵素阻害剤は、後述のように展開液パッド１６上の基質より上流側に添加し乾燥させて設けても良い。
ここで、酵素としてアルカリ性ホスファターゼを用いる場合、酵素阻害剤としては、例えばリン酸、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）、リン酸モノエステル、ナフトールリン酸、グリセロールリン酸、フェニルホスフェート、ホスフォエタノールアミン、ホスフォリルコリン、フェナンスロリン、グリコースリン酸等のリン酸化合物、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコースビス四酢酸等のキレート化合物を挙げることができる。
酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、酵素阻害剤として、アスコルビン酸等の還元剤、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム等のアジ化化合物を挙げることができる。酵素としてβ−Ｄガラクトシダーゼを用いる場合には、酵素阻害剤として、ラクトース等を挙げることができる。また、いずれの酵素の場合においても、所定時間後の検出ゾーンでの酵素の至適ｐＨをずらすために、酸又は塩基等を酵素阻害剤として使用することもできる。
【００２２】
本実施形態による酵素免疫測定器具１は上述の構成を備えており、次にこの酵素免疫測定器具１を用いた酵素免疫測定方法について説明する。
酵素免疫測定器具１の未使用状態では、図７及び図９（ａ）に示すように、展開液２６は操作部５の裏面の貯留槽２４内に封止されており、基質を含浸する展開液パッド１６と分離している。展開液パッド１６は展開基材１４とも離間している。
この状態から、検体を投入孔６から展開基材１４の検体添加領域１７に滴下する。すると、検体添加領域１７では、検体が酵素標識試薬を含有させた標識試薬パッド１８の酵素標識試薬と抗原抗体反応し、検体添加領域１８から展開基材１４を毛細管現象によって下流側の検出領域１９に向けて流れると共に上流側にも流れて拡散する。上流側に拡散する検体と酵素標識試薬の反応液は、展開基材１４が展開液パッド１６と非接触であるために反応液中の酵素が基質と反応することはない。
【００２３】
そして、この酵素免疫測定方法では、標識試薬パッド１８を中心に検体と酵素標識試薬との抗原抗体反応が起こってから、展開液２６を標識試薬パッド１８に流す必要があるため、検体の滴下後、所定時間経過した時点で酵素免疫測定器具１の操作部５を押す。すると、図８及び図９（ｂ）に示すように、操作部５のリブ５ｂが容易に分断されて操作部５は一端部５ａを支点として展開液パッド１６側に傾斜し押し込まれる。操作部５の裏面に設けられた作動片２８が展開液パッド１６の自由端部を押して展開基材１４と接触させる。この状態で、裏面の貯留槽２４がテーパ部１０ａ，１０ａに当接し、貯留槽２４の側壁２４ａが一対のテーパ部３０，３０間に挟持されて固定され、操作部５が停止しる。
そして、押された操作部５の裏面中央が内側に凹むことで、凸部２５が貯留槽２４の周壁２４ａに熱溶着された封止膜２７を突き破るために、貯留槽２４内の展開液２６が流出して展開液パッド１６に吸い取られる。展開液２６の一部が貯留槽２４から展開液パッド１６の両側に流出した場合でも、テーパ部１０ａや溝部１１から展開液パッド１６に吸収される。
【００２４】
展開液パッド１６に含まれた基質は展開液２６に溶解し、展開液２６と共に展開基材１４に吸い取られる。そして、標識試薬パッド１８における検体と酵素標識試薬との反応液が展開液２６によって下流側の検出領域１９に到達する。ここで、検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれている場合には、検体中の抗原または抗体が検出領域に固定保持されている抗体または抗原にトラップされ、検体中の抗原または抗体は酵素標識試薬と反応しているため、酵素標識試薬も検出領域１９に留まる。
次に、検出領域１９にトラップされた酵素は展開液２６中の基質と反応し、基質は発色する。検出領域１９における発色の有無は上部筐体２の検出窓７を通して観察できる。展開液２６やトラップされなかった反応液等はその下流側の吸収パッド２０に吸収される。
一方、検体中に検出すべき抗原または抗体が含まれていない場合には、酵素標識試薬が検出領域１９でトラップされないために発色せず、吸収パッド２０に吸収される。
【００２５】
上述のように本実施例による酵素免疫測定器具１及び酵素免疫測定方法によれば、検体の滴下時に、基質を含む展開液パッド１６を展開基材１４から分離した状態に保持して、一定時間経過後に、展開液２６と共に基質を展開液パッド１６を通して展開基材１４に流し、展開基材１４の検体添加領域１７及び酵素標識パッド１８、そして検出領域１９に移送するようにしたから、基質を検出領域１９でトラップされた酵素と反応させる前に、検体と酵素標識試薬の反応液が逆流して上流側で基質と反応するのを防止できて、検体の反応と測定を確実に行える。
しかも、展開液２６に酵素阻害剤を含まないから、その分コストを低減できる。
【００２６】
以上、本発明の実施例について説明したが、本発明は上記の実施例に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
例えば、操作部５の裏面に設けた凸起２５は図１０（ａ）に示すように三角錐等の角錐形状にして封止膜２７を破断し易くしたが、凸起２５はこのような形状に限定されず、封止膜２７等の封止膜を押圧力で容易に切り裂き可能な形状であれば適宜の形状を適用できる。例えば、図１０（ｂ）に示すように、角錐の頂部に更に先鋭に突出する尖頭部２５ａを設けた凸起２５Ａを設けてもよく、或いは図１０（ｃ）に示すように三角板を交差させた凸起２５Ｂを設ける等してもよい。
【００２７】
なお、上述の実施例では、展開基材１４における酵素標識パッド１８は検体添加領域１７上に設けたが、検出領域１９の上流側で且つ展開液パッド１６との接触部の下流側であれば、検体添加領域１７の上流側または下流側に設けてもよい。
また、上述の実施例では、上部筐体２に設けた操作部５の裏面に展開液の貯留槽２４の封止膜２７等を破断する凸起２５と、展開液パッド１６を展開基材１４に接触させる作動片２８を操作部５の傾動により連動するようにしたが、操作部５の凸起２５と作動片２８の作動は個別に行うようにしてもよい。この場合、作動片２８の作動を凸起２５による封止膜２７の破断より遅らすことが、検体中の抗原または抗体と酵素標識試薬の反応液が展開液パッド１６に展開するのを抑制できて好ましい。
また、上述の実施例では、酵素免疫測定器具１は上部筐体２と下部筐体３とからなる容器内に展開基材１４や展開液パッド１６等の各種測定部材が収容されているが、上部筐体２と下部筐体３は設けなくてもよい。この場合、例えば図１に示すように、下部筐体３の底板の台座１２に相当するシート状の基板上に展開基材１４と展開液パッド１６を非接触で設け、展開液パッド１６近傍に展開液の貯留槽２４を破断する操作部５と作動片２８を配設した構成を備えていてもよい。
【００２８】
また、上述の実施例では、短時間での発色反応の有無を見るために検出領域１９における酵素反応を阻害して発色を停止する酵素阻害剤を用いていない。しかし、酵素免疫測定器具１に酵素阻害剤を用いて発色状態で停止させるようにしてもよい。この場合、展開液２６に酵素阻害剤を混ぜてもよい。この場合、酵素と基質との反応で発色が生じた後、酵素反応が阻害されて発色の変化が停止するため所定時間経過後でも観察できる。
また、酵素阻害剤は、展開基材における検体添加領域及び／または酵素標識試薬領域の上流側であって展開液領域の基質の上流側に含有させるようにしてもよい。
【００２９】
次に展開液パッド１６に基質と酵素阻害剤を添加したものを変形例として図１１により説明する。なお、図１１において、上述の実施例と同一または同様な部材、部分などには同一の符号を用いて説明を省略する。
図１１に示す酵素免疫測定器具１において、展開液パッド１６の一部、例えば長手方向の中央部分または下流側部分に例えば乾燥状態の基質を含む区域３１を設ける。この区域３１以外には展開液パッド１６に基質を含まないものとする。そして、展開液パッド１６において、基質を含む区域３１から離間した上流側には例えば乾燥状態の酵素阻害剤を含む区域３２が設けられている。貯留槽２４において凸起２５は基質を含む区域３１に対向する位置        またはその近傍にあり、操作部５を押圧して貯留槽２４の側壁２４ａをテーパ部１０ａ，１０ａに当接するまで傾斜させた際、封止膜２７を破断した凸起２５は展開液パッド１６の基質を含む区域３１の領域またはその近傍に当接し、酵素阻害剤を含む区域３２からは離間している。そのため、破断した封止膜２７の穴から流出する展開液は直接酵素阻害剤を含む区域３２に接触しない。
従って、封止膜２７を破断した穴から流出する展開液は、展開液パッド１６の基質を含む区域３１で溶解された基質を含んで下流側に流れ、展開基材１４に展開する。そして、展開液パッド１６に流出した展開液は毛細管現象で徐々に上流側にも展開するため、酵素阻害剤を含む区域３２へ浸透して酵素阻害剤を溶解してこれを含んで下流側に流れる。そのため、検体と酵素標識と基質とが反応して基質が発色した後、遅れて酵素阻害剤を含む展開液が流れて発色を固定する。
この場合、展開液を展開液パッド１６に投入するタイミングを考慮する必要がなく、操作部５を押した後、酵素免疫測定具１を長時間放置したとしても基質の反応をタイミングよく停止させて正確な判定が行える。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例による酵素免疫測定器具を上部筐体と下部筐体とに分離した分解斜視図である。
【図２】図２は展開基材を除いた下部筐体の斜視図である。
【図３】（ａ）は上部筐体の平面図、（ｂ）は同図（ａ）における上部筐体のＡ−Ａ線中央縦断面図である。
【図４】上部筐体の裏面を示す斜視図である。
【図５】図４に示す上部筐体における貯留槽の分解斜視図である。
【図６】展開液パッドを展開基材に接触させた状態の部分斜視図である。
【図７】操作部を操作する前の未使用状態の酵素免疫測定器具を示す長手方向の中央縦断面図である。
【図８】操作部を押圧した状態の酵素免疫測定器具を示す中央縦断面図である。
【図９】（ａ）は操作部を操作する前の未使用状態の操作部の幅方向縦断面図、（ｂ）は同じく操作部を押圧した状態の操作部の幅方向縦断面図である。
【図１０】（ａ）は実施例による凸起を示す図、（ｂ）、（ｃ）は凸起の変形例を示す図である。
【図１１】変形例による酵素免疫測定器具を上部筐体と下部筐体とに分離した分解斜視図である。
【符号の説明】
【００３１】
１  酵素免疫測定器具
５  操作部
１４  展開基材
１６  展開液パッド（展開液領域）
１７  検体添加領域
１８  酵素標識パッド（酵素標識試薬領域）
１９  検出領域
２０  吸収パッド
２４  貯留槽（展開液貯留槽）
２５、２５Ａ、２５Ｂ  凸起（切り裂き部）
２６  展開液
２７  アルミシール（封止膜）
２８  作動片（作動部）
３１  基質を含む区域
３２  酵素阻害剤を含む区域
【図１】
2010117213.tif 000003
【図２】
2010117213.tif 000004
【図３】
2010117213.tif 000005
【図４】
2010117213.tif 000006
【図５】
2010117213.tif 000007
【図６】
2010117213.tif 000008
【図７】
2010117213.tif 000009
【図８】
2010117213.tif 000010
【図９】
2010117213.tif 000011
【図１０】
2010117213.tif 000012
【図１１】
2010117213.tif 000013