(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを利用した抗体精製用吸着剤、およびそれを用いた抗体精製法を提供する。【解決手段】可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞を用いて製造された前記ＦｃγＲＩを、担体に固定した、前記吸着剤、およびそれを用いた抗体精製法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を精製するための吸着剤であって、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞を用いて製造された前記ＦｃγＲＩを、担体に固定することで得られる、前記吸着剤。
【請求項２】
前記可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち細胞膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
前記担体がリガンド固定化用担体、または金属キレートクロマトグラフィー用担体であることを特徴とする、請求項１または２に記載の吸着剤。
【請求項４】
請求項１から３に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを用いた抗体精製用吸着剤、およびそれを用いた抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターとは免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、あるいは、同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の結合ドメインによって認識する。これによって一定の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる（非特許文献１）。Ｆｃレセプターは、さらに、サブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであり、単球とマクロファージ上に構成的に発現され、好中球および好酸球上においては誘導的に発現される。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸システインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００３】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００４】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列は非特許文献３により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の大腸菌を利用した発現系ではＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量が極めて低く、また、発現したタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、非特許文献４に記載の動物細胞を用いた系では、ＦｃγＲＩの菌体外ドメイン遺伝子をｐＭＳベクターに導入し、それをＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に形質転換させることで細胞外にＦｃγＲＩを発現させているが、一過性の発現のため、ＦｃγＲＩの工業的な生産には不向きであった。
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献４】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献５】Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｋ．等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，６７３，１９９０
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｈｅｎ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４５，１９８７
【非特許文献７】Ｇ．Ｕｒｌａｎｄ等，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７７，４２１６，１９８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以前発明者らは、前記問題点を解決するために遺伝子工学手法を用いてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現可能なＣＨＯ細胞を取得し、前記ＣＨＯ細胞を用いることで、ＩｇＧ分子との結合性を有したヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを生産することを実現している（特願２００８−２０５４９１号）。本発明の課題は、前記ＦｃγＲＩを利用した抗体精製用吸着剤、およびそれを用いた抗体の精製法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）抗体を精製するための吸着剤であって、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞を用いて製造された前記ＦｃγＲＩを、担体に固定することで得られる、前記吸着剤。
【０００９】
（２）前記可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち細胞膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、（１）に記載の吸着剤。
【００１０】
（３）前記担体がリガンド固定化用担体、または金属キレートクロマトグラフィー用担体であることを特徴とする、（１）または（２）に記載の吸着剤。
【００１１】
（４）（１）から（３）に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
１．可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列
本発明の吸着剤で用いるヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現する細胞を取得する際に使用する、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列は、報告されているヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列に適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なＤＮＡ配列である。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは細胞膜貫通領域に挿入する方法、細胞膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、細胞膜貫通領域を除去する方法が好ましい。配列番号１にはヒト型ＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が示されており、このアミノ酸中、細胞外領域はアミノ酸番号１から２７７番のアミノ酸配列に相当し、細胞膜貫通領域は２７８番から２９９番目のアミノ酸配列に相当する（略図を図１に示す）。前記細胞外領域あるいは細胞膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、インビトロミュータジェネシス（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような、ＤＮＡに突然変異を挿入するための市販のキットを用いて行なうことができ、前記細胞膜貫通領域を除去することも、前記市販のキットを用いて行なうことができる。また、適当なオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により、前記細胞外領域あるいは細胞膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記細胞膜貫通領域を除去したものを調製してもよい。
【００１４】
また、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全塩基配列のうち細胞膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であっても、宿主細胞から分泌され、かつ、ヒト型ＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ＤＮＡ配列を有しているものとみなすことができる。ヌクレオチド配列の置換としては、あるアミノ酸をコードするヌクレオチドから別のアミノ酸をコードするヌクレオチドへの変換を例示することができる。なお、前記ＤＮＡ配列はヒト型ＦｃγＲＩのｃＤＮＡ等を出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。
【００１５】
さらに、前記ＤＮＡ配列中には、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製を目的に、タグ配列を付加させてもよい。タグ配列とはヒトＦｃγＲＩに限らず、遺伝子工学に多用されるオリゴアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ポリヒスチジンタグ、ｃ−ｍｙｃタグを例示することができる。タグ配列の付加は前記ＤＮＡ配列の５’末端側、３’末端側いずれに付加してもよい。
【００１６】
２．発現プラスミド
本発明の吸着剤で用いるヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現する細胞を取得する際に使用する、複製可能な発現プラスミドは、前記可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列および宿主中でプラスミドＤＮＡを複製するための複製起点を有し、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであれば、適宜選定し使用できる。前記ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列としては、乳糖プロモータ系、トリプトファンプロモータ系、ＧＡＬ４プロモータ系、ＳＶ４０プロモータ系、アデノウイルスプロモータ系に由来する配列が例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよいが、本発明の細胞株を取得する際に用いるプロモータ系としては、ＳＶ４０プロモータ系に由来する配列が好ましい。また、これらのプラスミドを用いて形質転換する操作にあたり、プラスミドが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするために、発現プラスミド中にアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのＤＮＡ配列を含んでいるのが好ましい。
【００１７】
３．宿主
本発明の吸着剤で用いるヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現させる宿主としては、安定的にタンパク質を発現可能なＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）が好ましい。
【００１８】
また、前記宿主に、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含んだ発現プラスミドを導入し、さらに特定の薬剤に対する耐性も付与した細胞について、薬剤に対する耐性の強さから前記細胞のスクリーニングを行なうことで、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを高発現する細胞を得ることができる。前記スクリーニングにおいて、薬剤としてはメソトレキセート（ＭＴＸ）、耐性濃度としては数μＭ以上がそれぞれ好ましい。ＭＴＸに対する耐性の付与方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列と同一の発現プラスミドに挿入すればよい。
【００１９】
４．ヒト型ＦｃγＲＩの分離回収
本発明の吸着剤で用いるヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩは、前記ＦｃγＲＩを発現する細胞を含んだ培養液、または培養上清中から、通常の生理活性タンパク回収法によって分離回収することができる。分離回収方法としては、市販のＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーを例示することできる。また、培養液中から前記タンパクを生産する際に、培養液中の他のタンパク質の減少、例えば、培養細胞を無血清培地で培養して前記タンパクを発現させることにより分離回収の効率を高めることができる。
【００２０】
５．抗体を精製するための吸着剤
本発明の吸着剤は、前記１から４の工程で得られたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを適切な担体に固定することで得られる。
【００２１】
本発明の吸着剤を得るために用いる担体の材質としては特に制限はなく、架橋結合アルブミンのようなポリペプチドまたはタンパク質、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、澱粉のような多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ペルフルオロカーボンのような合成高分子、シリカ、ガラス、多孔質珪藻土、アルミナ、ジルコニア、酸化鉄または他の金属酸化物のような無機化合物、上記物質を２つまたはそれ以上任意に組み合わせて構成される共重合体といった担体を例示することができる。さらにそれらは、液相分配で使用されるデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは加水分解澱粉のような水溶性の高分子を包含する担体、またはエマルジョンを形成するのに使用されるペルフルオロデカリンのような化合物を含む担体も含まれる。
【００２２】
ヒト型ＦｃγＲＩを担体に固定する方法としては、活性基を有しない担体に、ヒト型ＦｃγＲＩの有するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、水酸基いずれかと共有結合できるような活性化基を周知の方法で付加した後、ヒト型ＦｃγＲＩと固定させる方法でもよいし、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名、以上ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、トレシル基活性化ダイナビーズ（商品名、Ｄｙｎａｌ社製）、エポキシトヨパール、アミノトヨパール、ホルミルトヨパール、カルボキシトヨパール（商品名、以上東ソー社製）といった市販のリガンド固定化担体とヒト型ＦｃγＲＩとを直接結合させる方法でもよい。特に後者の結合方法は、簡便にヒト型ＦｃγＲＩを担体に固定できる点で好ましい。
【００２３】
また、前記１から４の工程で得られたヒト型ＦｃγＲＩが、そのＮ末端側、あるいはＣ末端側にポリヒスチジンタグを有している場合は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）といった市販の金属キレートクロマトグラフィー用担体に前記ＦｃγＲＩを固定させる方法も、簡便にヒト型ＦｃγＲＩを固定できる点で好ましい態様といえる。
【００２４】
６．抗体の精製法
本発明の吸着剤を用いた、試料中に含まれる抗体の精製法としては、本発明の吸着剤を直接試料液に投入して抗体を吸着し、洗浄後、適切な溶出緩衝液を用いて抗体を溶出させるバッチ処理による精製方法や、本発明の吸着剤を適切なカラムに封入後、ＣＣＰＭ８０２０  ＨＰＬＣシステム（商品名、東ソー株式会社製）のようなクロマトグラフィー装置を使用して抗体を精製する方法が例示できる。
【発明の効果】
【００２５】
可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換して得られた、安定的にＦｃγＲＩを発現可能なＣＨＯ細胞を用いて製造されたヒト型ＦｃγＲＩを担体に固定化することで得られる本発明の吸着剤は、ヒトモノクローナル抗体といった抗体を吸着する吸着剤として用いることができる。また、本発明の吸着剤を用いることで、遺伝子組換え抗体生産菌由来の培養物、培養液または培養上清、およびヒト血液といった試料中に含まれる微量の抗体を簡便に分離精製することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの作製
可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの作製は、以下の方法で行なった。
（１）可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを以下の方法で調製した。
（１−１）Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号２（５’−ＧＡ［ＡＧＡＴＣＴ］ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＢｇｌＩＩサイト）と配列番号３（５’−ＣＧ［ＴＣＴＡＧＡ］ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ＦｃγＲＩタンパク質の調製および定量を行なうために、発現させるタンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した。
（１−２）ＰＣＲ反応を、９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の条件で行なった。反応液組成を表１に示す。
【００２８】
【表１】
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（１−３）ＰＣＲ反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動にて、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認した。
（１−４）目的産物に相当するＤＮＡバンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）し、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを調製した。
（２）（１）で調製したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献５）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
（３）（２）の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを含むＬＢ培地により培養（３７℃、１８時間）し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）によりプラスミドを抽出した。
（４）抽出プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、０．９％のアガロース電気泳動に供した。
【００２９】
結果、インサートサイズから設計通りであることを確認し、これをｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒとした。図２にｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造概略を示す。
【００３０】
実施例２  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの配列確認
実施例１で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒプラスミド（図２）に挿入されている、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（商品名、ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、ＰＥアプライドバイオシステム社製）において解析した。なお、シークエンス用プライマーとして配列番号４（５’−ＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＴＣＧ−３’）と配列番号５（５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＣ−３’）と配列番号６（５’−ＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣ−３’）と配列番号７（５’−ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣ−３’）に示すオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３１】
解析の結果、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒに挿入されている可溶性ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００３２】
実施例３  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性の確認
実施例１で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒプラスミド（図２）をリポフェクトアミン（インビトロジェン社製）によりＣＯＳ７細胞に導入し、１０％  ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養することで（３７℃、３日間）、一過的に細胞外へヒト型ＦｃγＲＩを発現させ、培養後、培養液を回収した。回収した培養上清の抗体結合活性を以下の方法でＥＬＩＳＡ法により評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することによりガンマグロブリンを固相に固定化した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を行なった。
（３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、調製した培養上清を１００μＬ添加し、（１）で固定化したヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。
（４）（３）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（５）（４）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３３】
評価結果を図３に示す。図３の通り、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ細胞の培養上清に抗体結合活性が検出された。すなわち、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒに挿入された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列により、細胞膜貫通領域が欠失したヒト型ＦｃγＲＩを得ることができ、かつ、当該ＦｃγＲＩはヒト抗体に結合活性を保持していることを示している。
【００３４】
実施例４  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ細胞の作製
実施例１で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図２）をＣｈｅｎらの方法（非特許文献６）により、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株ＤＢＸ−１１（非特許文献７）に導入することで可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ細胞を作製し、ＭＴＸ（メソトレキセート）を用いて前記細胞のスクリーニングを行なった。
（１）上記発現プラスミドが導入されたＤＢＸ−１１株を５ｎＭのＭＴＸを含む培地で培養し、増殖した細胞株をモノクローナル化し実施例３と同様な方法で活性を評価した。
（２）最も活性の強い株について、さらに、５０ｎＭ  ＭＴＸを含む培地で培養し、耐性を獲得した増殖株の活性を評価した。
（３）（２）の操作を繰り返すことにより、最終的に初期のＭＴＸ濃度に対して１０００倍となる５μＭ  ＭＴＸ存在下においても増殖する細胞宿主、すなわち、ＭＴＸ耐性を獲得することと連動してＦｃγＲＩ遺伝子が高度に集積された細胞株を分離した。
【００３５】
最終スクリーニング結果を図４に示す。図４の通り、モノクローナル化された任意のＣＨＯ細胞株の培養上清中から可溶性ヒト型ＦｃγＲＩが検出された。
【００３６】
実施例５  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現細胞を用いたＦｃγＲＩ生産
実施例４の細胞のうち、ヒト型ＦｃγＲＩ発現量が最も多いＭ５ｕ−１２Ｄ株を用いて、以下の方法でヒト型ＦｃγＲＩ生産を行なった。
（１）Ｍ５ｕ−１２Ｄ株を高密度培養システムＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）を用いて、５％  透析牛胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）で細胞が密な状態まで培養した。
（２）培養後、培地を除き、５％  透析牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）／ＥｘＣｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）の１対１混合培地で培養した。
（３）栄養源が枯渇する前に培養上清を回収し、新たな培地と交換した。
（４）（２）から（３）の操作を繰り返して合計１０Ｌの可溶性ＦｃγＲＩ含有培養上清を得た。
【００３７】
実施例６  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの分離精製
実施例５で得られた可溶性ＦｃγＲＩ含有培養上清を、以下の方法で分離精製した。
（１）実施例５で得られた可溶性ＦｃγＲＩ含有培養上清１０Ｌを、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析し脱塩処理を施した。
（２）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した３００ｍＬのＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰゲル（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を備えた吸着流動床システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１０％グリセロール、１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出し、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ含有濃縮画分を調製した。
（３）（２）で得られた可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ含有濃縮画分を、２０ｍＭ  イミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、同緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＨＳカラム（商品名、ＧＥヘルスケバイオサイエンス社製）に添加し、洗浄後、５００ｍＭ  イミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出することで、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ精製標品を１０ｍｇ得た。なお、タンパク質濃度の定量は、イムノグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法に基づくプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行なった。
【００３８】
図５にＨｉｓＴｒａｐ  ＨＳカラムのクロマトパターンを、図６に精製標品のＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）のクロマトパターンを示す。図６の通り、培養上清からの不純物が除かれ、高純度に精製された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを得ることができた。
【００３９】
実施例７  可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの担体への固定
実施例６で調製した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを、以下の方法で担体に固定した。
（１）金属キレートクロマトグラフィー用担体である、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にニッケルイオンを十分量担持させた後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  イミダゾールを含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液Ａとする）を用いて前記担体を平衡化した。
（２）平衡化した前記担体２００μＬを充填した内径５ｍｍのカラムに、実施例６で調製した可溶性ＦｃγＲＩを、ゲル容量１．０ｍＬあたり、１．０、２．６または６．５ｍｇ結合するように、ＨＰＬＣシステムを用いて流速０．１ｍＬ/ｍｉｎで添加した。
【００４０】
実施例８  ヒト型ＦｃγＲＩ固定化担体による抗体精製
実施例７で調製したヒト型ＦｃγＲＩ固定化担体を用いて抗体の精製を試みた。
（１）実施例７で調製した担体に、実施例７に記載の緩衝液Ａで調製した０．４ｍｇ/ｍＬのヒトモノクローナル抗体（コスモバイオ社製）を、タンパク量にして、前記担体に吸着したヒト型ＦｃγＲＩのおよそ４倍量添加（例えば、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを１．０ｍｇ吸着させた担体の場合、４．０ｍｇのヒトモノクローナル抗体を添加）し、緩衝液Ａで十分洗浄した。
（２）担体に吸着したヒトモノクローナル抗体を、８Ｍ尿素、０．０２Ｍイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）により溶出させた。
【００４１】
可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ固定化担体に吸着した抗体の定量結果を表２に示す。固定化したＦｃγＲＩの量に従い抗体吸着量も向上していた。なお、比較例として可溶性ＦｃγＲＩを固定していない担体についても同様の試験を行なったが、抗体を吸着することはなかった。以上より、今回調製したヒト型ＦｃγＲＩ固定化担体はヒトモノクローナル抗体の精製に有用であることが示された。
【００４２】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの構造を示す図。ＳＳはシグナルペプチド、ＥＣは細胞外部分、ＴＭは細胞膜貫通領域部分、Ｃは細胞質内部分をそれぞれコードする領域を示す。図の上部の数字は、それぞれの領域のＤＮＡがコードするアミノ酸数を示す。
【図２】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造を示す図。
【図３】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒを導入したＣＯＳ細胞培養上清中の抗体結合活性を示す図。横軸は固定化抗体濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度である。
【図４】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現ＣＨＯ細胞のスクリーニング結果を示す図。横軸はスクリーニング対象のＣＨＯ細胞株、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を表す。
【図５】精製クロマトパターンを示す図。横軸はニッケルキレートクロマトの溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度である。図中、矢印の位置が可溶性ＦｃγＲＩ溶出フラクションに対応する。
【図６】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの精製標品のゲルろ過法による純度検定結果を示す図。横軸はゲルろ過クロマトの溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度である。図中、矢印が可溶性ヒト型ＦｃγＲＩである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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