(57)【要約】      （修正有）【課題】防腐剤に対する高い耐性に加えて高い熱安定性を有するグリセロールキナーゼ、及び該酵素を用いた中性脂肪の測定方法を提供する。【解決手段】セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｍａｓ）属の細菌由来の野生型グリセロールキナーゼより熱安定性を向上させた改変型グリセロールキナーゼであって、特定の位置のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を有する改変型グリセロールキナーゼ。及び、該酵素の遺伝子とそれを導入した形質転換体、さらに該酵素を使用する中性脂肪センサーと中性脂肪の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロモナス属の細菌由来の野生型グリセロールキナーゼより熱安定性を向上させた改変型グリセロールキナーゼであって、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列の５０位、および／または１３７位と１３８位、および／または１６３位と１６４位、および／または２７４位、および／または３８６位と３８８位においてアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配列を有することを特徴とする改変型グリセロールキナーゼ。
【請求項２】
アミノ酸置換が、Ｑ５０Ｅ、（Ｇ１３７Ａ＋Ｐ１３８Ｓ）、（Ｎ１６３Ｔ＋Ｔ１６４Ｉ）、Ｌ２７４Ｍ、（Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）、（Ｑ５０Ｅ＋Ｌ２７４Ｍ）、（Ｑ５０Ｅ＋Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）、および（Ｑ５０Ｅ＋Ｌ２７４Ｍ＋Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の改変型グリセロールキナーゼ。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の改変型グリセロールキナーゼをコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型グリセロールキナーゼの製造方法。
【請求項７】
グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪アッセイキットであって、グリセロールキナーゼとして請求項１または２に記載の改変型グリセロールキナーゼを使用することを特徴とする中性脂肪アッセイキット。
【請求項８】
グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪センサーであって、グリセロールキナーゼとして請求項１または２に記載の改変型グリセロールキナーゼを使用することを特徴とする中性脂肪センサー。
【請求項９】
グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪測定方法であって、グリセロールキナーゼとして請求項１または２に記載の改変型グリセロールキナーゼを使用することを特徴とする中性脂肪測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型グリセロールキナーゼより熱安定性を向上させた改変型グリセロールキナーゼに関し、特に、臨床検査薬として有用な改変型グリセロールキナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）は、マグネシウムとＡＴＰに依存したリン酸化反応によりグリセロールをグリセロール−３−リン酸に変える反応を触媒する酵素である。グリセロールキナーゼは、１９３７年に、Ｋａｌｃｋａｒによって、肝臓内に発見（例えば、非特許文献１参照）されて以来、ラット肝、ハト肝、キャンディダ・ミコデルマ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｙｃｏｄｅｒｍａ）、セルロモナス  フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、サーマス  フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）などからの精製が報告され（例えば、非特許文献２〜５および特許文献１参照）、生物全般に広く存在することが知られている。また、ヒト、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サーマス  フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）などからの遺伝子のクローニングが報告されている（例えば、非特許文献６〜９参照）。特に、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において、該酵素は詳しく研究がなされており、１９６７年にＨａｙａｓｈｉらによって精製され（例えば、非特許文献１０参照）、１９８８年にそのクローニングの報告がなされている（例えば、非特許文献１１参照）。また、遺伝子調節の研究、アロステリック阻害剤による阻害の研究など、広い範囲においても既に研究されている。
【０００３】
一方、グリセロールキナーゼは、産業分野への応用では、臨床検査薬用の原料酵素として利用されている。例えば、血中の中性脂肪の測定では、試料中の中性脂肪（トリグリセリド）をリパーゼで加水分解して生じたグリセロールをグリセロール−３−リン酸に変換する際にグリセロールキナーゼが利用されている。
【０００４】
中性脂肪測定用検査薬も含めた現在の生化学検査用臨床検査薬は、溶液状態の検査薬が主流となっており、原料の酵素に必要な特性として、検査薬溶液中での高い安定性が求められるようになっている。検査薬溶液中での酵素の安定性に寄与する特性としては、防腐剤に対する耐性が高いことが特に重要である。なぜなら、一般的に液状検査薬は長期の保存を可能にするため防腐剤を添加されており、この防腐剤が酵素を不安定化することがあるからである。
【０００５】
これまで高い熱安定性を持つ酵素が液状診断薬中で高い安定性を示すと考えられてきており、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）やサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）など好熱菌由来のグリセロールキナーゼが液状診断薬用のグリセロールキナーゼとして汎用されていた。しかし、これらのグリセロールキナーゼは防腐剤に対する耐性が比較的低いという問題を有していた。
【０００６】
本発明者らは、セルロモナス属の細菌から、防腐剤に対する耐性の高いグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術による該酵素の製造方法を確立し、該酵素の中性脂肪及びグリセロールの定量への利用を可能とすることに成功しているが、その反面、該グリセロールキナーゼは、上記好熱性細菌由来のグリセロールキナーゼと比べて熱安定性が低いという弱点を有していた（特許文献２参照）。そこで、別のアプローチとして好熱性細菌由来のグリセロールキナーゼをタンパク質工学的に改変し、高い熱安定性と防腐剤耐性を両立させる試みも行ってきた（特許文献３参照）。しかしながら、近年の臨床検査薬の海外普及などによる要求スペックの変化により、グリセロールキナーゼも一層の耐熱性、防腐剤耐性が要求されるようになり、更なる改良が望まれていた。
【特許文献１】特開昭５６−１２１４８４号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１２３４号公報
【特許文献３】特開２００７−１９５４５３号公報
【非特許文献１】Ｈ．Ｋａｌｃｋａｒ著，「Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ」，１９３７年，第２巻，ｐ４７
【非特許文献２】Ｃ．Ｂｕｂｌｉｔｚら著，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」，１９５４年，第２１１巻，ｐ９５１
【非特許文献３】Ｅ．Ｐ．Ｋｅｎｎｅｄｙ著，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．」，１９６２年，第５巻，ｐ４７６
【非特許文献４】Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら著，「Ｂｉｏｃｈｅｍ．」，１９６１年，第３３３号，ｐ４７１
【非特許文献５】Ｈ．Ｓ．Ｈｕａｎｇら著，「Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．」，１９９７年，第８３号，ｐ３２８
【非特許文献６】Ｃ．Ａ．Ｓａｒｇｅｎｔら著，「Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．」，１９９４年，第３巻，ｐ１３１７
【非特許文献７】Ｃ．Ｈｏｌｍｂｅｒｇら著，「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」，１９９０年，第１３６巻，ｐ２３６７
【非特許文献８】Ｐ．Ｐａｖｌｉｋら著，「Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．」，１９９３年，第２４巻，ｐ２１
【非特許文献９】Ｈ．Ｓ．Ｈｕａｎｇら著，「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」，１９９８年，第１３８２巻，ｐ１８６
【非特許文献１０】Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉら著，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９６７年，第２４２巻，ｐ１０３０
【非特許文献１１】Ｄ．Ｗ．Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗら著，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９８８年，第２６３巻，ｐ１３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、防腐剤に対する高い耐性に加えて高い熱安定性を有するグリセロールキナーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、防腐剤耐性に優れた野生型グリセロールキナーゼをタンパク質工学的に改変することにより、高い熱安定性および防腐剤耐性を有する改変型グリセロールキナーゼを得ることに成功し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、セルロモナス属の細菌由来の野生型グリセロールキナーゼより熱安定性を向上させた改変型グリセロールキナーゼであって、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列の５０位、および／または１３７位と１３８位、および／または１６３位と１６４位、および／または２７４位、および／または３８６位と３８８位においてアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配列を有することを特徴とする改変型グリセロールキナーゼが提供される。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換は、Ｑ５０Ｅ、（Ｇ１３７Ａ＋Ｐ１３８Ｓ）、（Ｎ１６３Ｔ＋Ｔ１６４Ｉ）、Ｌ２７４Ｍ、（Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）、（Ｑ５０Ｅ＋Ｌ２７４Ｍ）、（Ｑ５０Ｅ＋Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）、および（Ｑ５０Ｅ＋Ｌ２７４Ｍ＋Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）からなる群から選択される。
【００１１】
本発明によれば、上記のいずれかに記載の改変型グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型グリセロールキナーゼの製造方法も提供される。
【００１２】
また、本発明によれば、上記のいずれかに記載の改変型グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪アッセイキット、中性脂肪センサー、または中性脂肪測定方法も提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の改変型グリセロールキナーゼは、セルロモナス属の細菌に由来し、しかも、特定の位置にアミノ酸置換が導入されているため、高い防腐剤耐性に加えて高い熱安定性を示す。従って、本発明の改変型グリセロールキナーゼは、溶液状態で長期間安定に保存することができ、保存性に優れた臨床検査薬として有効に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の改変型グリセロールキナーゼは、高い防腐剤耐性を有するが熱安定性に劣るセルロモナス属の細菌由来の野生型グリセロールキナーゼをタンパク質工学的に改変することによって安定性を向上させたものであり、具体的には、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列の特定の位置においてアミノ酸置換を導入することによって熱安定性を向上させたものである。
【００１５】
本発明の改変型グリセロールキナーゼにおいて、アミノ酸置換を導入する位置は、配列表の配列番号で示すアミノ酸配列の５０位、および／または１３７位と１３８位、および／または１６３位と１６４位、および／または２７４位、および／または３８６位と３８８位である。導入するアミノ酸置換は、アミノ酸置換導入後のグリセロールキナーゼの熱安定性が野生型グリセロールキナーゼの熱安定性より向上するようなものを実験により適宜決定すればよく、例えばＱ５０Ｅ、（Ｇ１３７Ａ＋Ｐ１３８Ｓ）、（Ｎ１６３Ｔ＋Ｔ１６４Ｉ）、Ｌ２７４Ｍ、（Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）、（Ｑ５０Ｅ＋Ｌ２７４Ｍ）、（Ｑ５０Ｅ＋Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）、および（Ｑ５０Ｅ＋Ｌ２７４Ｍ＋Ｔ３８６Ｉ＋Ｆ３８８Ｙ）からなる群から選択することができる。
【００１６】
本発明における熱安定性を向上させた状態とは、例えば改変型タンパク質（ａ）および改変前のタンパク質（ｂ）を各々適当な緩衝液中に溶解して、適用な温度で一定期間保存した後の残存活性率が（ａ）＞（ｂ）となるような状態をいう。
ここで、適当な温度で一定期間保存する条件とは、例えば、「６０℃、１５分間保存」などの加速（苛酷）試験の条件が選択されるが、時間が許せば、臨床検査薬が実際に長期保存される温度として汎用される２℃〜１０℃の冷蔵条件下で６ヶ月以上の保存を選択しても良い。
また、適当な緩衝液とは、グリセロールキナーゼが作用するｐＨ範囲で十分な緩衝能力を持つようにその種類と濃度を選べば特に限定されないが、例えば、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、または、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）などが選択される。診断薬用途を想定して、緩衝液は、界面活性剤、塩類、キレート剤、防腐剤などをさらに含んでいてもよい。
保存におけるグリセロールキナーゼの濃度は、特に限定されないが、通常の診断試薬に使用される濃度を想定した０．２〜３０Ｕ／ｍｌが好ましく選択される。さらに好ましくは１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００１７】
本発明の改変型グリセロールキナーゼの製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
まず、特開２００４−１２１２３４号公報の教示に従って、セルロモナス・エスピーＪＣＭ２４７１株（理化学研究所  生物基盤研究部  微生物系統保存施設より購入可能）から染色体ＤＮＡを分離して、公知のグリセロールキナーゼの塩基配列を基に設計したＰＣＲ用プライマーを使用したＰＣＲによりグリセロールキナーゼ遺伝子を増幅させ、配列表の配列番号１で示す塩基配列（配列番号２で示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の配列）を得る。
【００１８】
次に、この塩基配列中の塩基のうち、配列番号２で示すアミノ酸配列の上述の特定の位置のアミノ酸に相当する塩基を改変することにより、配列番号２で示すアミノ酸配列の特定の位置にアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製する。この塩基の改変は、例えば、市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）やＰＣＲ法を利用することに容易に行うことができる。
【００１９】
次に、このようにして作製された遺伝子を、好適なプラスミドと連結して組換えベクターを作製し、このベクターで宿主微生物を形質転換させて、改変型グリセロールキナーゼを生産する形質転換体を得る。
この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリーＤＨ５、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できるが、宿主由来のグリセロールキナーゼの混入を避けるためには、特開２００７−１９５４５３号公報で開示されているグリセロールキナーゼ欠損株のエシェリヒア・コリーＫＭ１株などを用いることが好ましい。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる。代わりに、エレクトロポレーション法や市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００２０】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変型グリセロールキナーゼを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養を行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれば特に限定はなく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば特定に限定はなく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は、菌が発育し、改変型グリセロールキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、改変型グリセロールキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育し、改変型タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２１】
培養終了後、培養物中の改変型グリセロールキナーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取して精製処理に供することもできるが、一般には常法に従って、改変型タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、改変型グリセロールキナーゼ含有溶液を微生物菌体から分離した後に精製処理に供すればよい。改変型タンパク質が菌体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び／または界面活性剤を添加して改変型グリセロールキナーゼを可溶化し、水溶液として分離採取すればよい。
【００２２】
このようにして得られた改変型グリセロールキナーゼ含有溶液から本発明の改変型グリセロールキナーゼを精製するには、溶液を例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法に供して溶液中の改変型グリセロールキナーゼを沈殿せしめればよい。また、加温処理や等電点処理、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーも、有効な精製手段である。
【００２３】
以上のようにして精製された本発明の改変型グリセロールキナーゼは、従来公知の中性脂肪アッセイキット、中性脂肪センサー、または中性脂肪測定方法において従来のグリセロールキナーゼの代替として使用することができ、これらのキットやセンサーの保存性を高めることができる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。なお、実施例で使用した試薬のうち、ＡＴＰはロシュ・ダイアグノスティックス社より購入したものを、牛血清アルブミンはシグマアルドリッチ社より購入したものを、４アミノアンチピリンは第一化学薬品社より購入したものを、グリセロール−３−リン酸酸化酵素（コード番号Ｇ３Ｏ−３０１）、ペルオキシダーゼ（コード番号ＰＥＯ−３０１）は東洋紡績製のものを使用し、その他の試薬はナカライテスク社より購入したものを使用した。
【００２５】
実施例中、グリセロールキナーゼの活性は、以下のように測定した。グリセロールキナーゼの活性は、グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって測定した。０．２３ｍＭ  ４アミノアンチピリン、１．５ｍＭフェノ−ル、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．２％牛血清アルブミン、４ｍＭ  ＡＴＰ、７Ｕ／ｍｌグリセロール−３−リン酸酸化酵素、５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼを含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）を調製し、これを測定のための原液とした。この測定原液３ｍｌにグリセロールキナーゼ酵素溶液０．１ｍｌを加えて混和した。３７℃で約５分間予備加温した後、これに３３ｍＭグリセリン水溶液０．４５ｍｌを加え、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）０．１ｍｌを使用し、上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。得られた吸光度変化量より、下記計算式に基づき、グリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。なお、上記条件で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
計算式：
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．５５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．３×１／２×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．５５（ｍｌ）：反応混液液量
１３．３：キノン色素を上記測定条件下で測定した時のミリモル吸光係数
１／２：酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が１／２分子であることによる係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
【００２６】
実施例１：グリセロールキナーゼの発現プラスミドｐＣＧＫ１４の構築
特開２００４−１２１２３４号公報に開示されている、セルロモナス・エスピーＪＣＭ２４７１株由来のグリセロールキナーゼをコードするＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であって、コドン使用が大腸菌での発現に最適となるように修正され、その５’末端側と３’側に、各々制限酵素ＮｃｏＩとＮｏｔＩの認識配列が付与されたＤＮＡを人工的に合成した。この合成ＤＮＡをＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断して得たＤＮＡ断片と、プラスミドｐＳＥ３８０（インビトロゲン社製）をＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断したものとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させて連結して組換えプラスミドｐＣＧＫ１４を得、この組換えベクターで、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。
【００２７】
次いで、取得した形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ／３０ｍｌ試験管仕込み）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−キット（東洋紡績製）を用いてｐＣＧＫ１４を精製した。組換えプラスミドｐＣＧＫ１４のグリセロールキナーゼ遺伝子をコードするオープンリーディングフレームに該当する塩基配列を配列表の配列番号１に、また該塩基配列から推定されるグリセロールキナーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
【００２８】
実施例２：改変型グリセロールキナーゼをコードする組換え発現プラスミドの構築（１）
（ａ）上記グリセロールキナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＧＫ１４と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２記載のアミノ酸配列の５０番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ１）を取得した。
（ｂ）また、ｐＣＧＫ１４と、配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の１３７番目のグリシンと１３８番目のプロリンがそれぞれアラニンとセリンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ２）を取得した。
（ｃ）また、ｐＣＧＫ１４と、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の１６３番目のアスパラギンと１６４番目のスレオニンがそれぞれスレオニンとイソロイシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ３）を取得した。
（ｄ）また、ｐＣＧＫ１４と、配列表の配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の２７４番目のロイシンがメチオニンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ４）を取得した。
（ｅ）また、ｐＣＧＫ１４と、配列表の配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の３８６番目のスレオニンと３８８番目のフェニルアラニンがそれぞれイソロイシンとチロシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ５）を取得した。
【００２９】
実施例３：改変型グリセロールキナーゼの製造（１）
ｐＣＧＫ１４Ｍ１、ｐＣＧＫ１４Ｍ２、ｐＣＧＫ１４Ｍ３、ｐＣＧＫ１４Ｍ４、ｐＣＧＫ１４Ｍ５の各組換えプラスミドで、グリセロールキナーゼ欠損株であるエシェリヒア・コリーＫＭ１株（特開平１１−９２７９号公報参照）を、ジーン・パルサーを用いたエレクトロポレーション法により形質転換し、形質転換体をそれぞれ取得した。
【００３０】
５ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地を２０ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｌ／ｍｌと１ｍＭになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３７℃で１２時間培養した各形質転換体の培養液を５０μｌを接種し、３７℃で２４時間振とう培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波にて破砕し、更に遠心分離を行い、改変型グリセロールキナーゼＣＧＫＭ１、ＣＧＫＭ２、ＣＧＫＭ３、ＣＧＫＭ４、ＣＧＫＭ５を含む上清を粗酵素液として得た。
【００３１】
比較例１：野生型グリセロールキナーゼの製造
比較例として、ｐＣＧＫ１４によりエシェリヒア・コリーＫＭ１株を形質転換し、実施例３の方法と同様にして形質転換体を培養し、培養液からグリセロールキナーゼを抽出して野生型グリセロールキナーゼを取得した。
【００３２】
実施例４：グリセロールキナーゼ改変体の評価（１）
実施例３で取得した改変型グリセロールキナーゼ（ＣＧＫＭ１、ＣＧＫＭ２、ＣＧＫＭ３、ＣＧＫＭ４、ＣＧＫＭ５）および比較例１で取得した野生型グリセロールキナーゼをそれぞれ、４０℃〜７０℃の範囲で各１５分間熱処理した後の残存酵素活性率（％）を測定し、各温度処理による残存活性率のプロットから残存活性率が５０％になる温度（Ｔｍ（℃））を算出した。その結果を以下の表１に示す。表１から判るように、実施例３で取得した改変型グリセロールキナーゼは、改変前の野生型グリセロールキナーゼと比べて熱安定性が向上していることが確認された。
【００３３】
2010088303.tif 000002
【００３４】
実施例５：改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミドの構築（２）
（ａ）実施例２で取得した改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミドｐＣＧＫ１４Ｍ１と、配列表の配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の５０番目のグルタミンと２７４番目のロイシンがそれぞれグルタミン酸とメチオニンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ６）を取得した。
（ｂ）また、ｐＣＧＫ１４Ｍ１と、配列表の配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の５０番目のグルタミン、３８６番目のスレオニンおよび３８８番目のフェニルアラニンがそれぞれグルタミン酸、イソロイシンおよびチロシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ７）を取得した。
（ｃ）また、上記（ｂ）で取得したｐＣＧＫ１４Ｍ７と、配列表の配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２と同様の操作により、配列番号２記載のアミノ酸配列の５０番目のグルタミン、２７４番目のロイシン、３８６番目のスレオニンおよび３８８番目のフェニルアラニンがそれぞれグルタミン酸、メチオニン、イソロイシンおよびチロシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＧＫ１４Ｍ８）を取得した。
【００３５】
実施例６：改変型グリセロールキナーゼの製造（２）
ｐＣＧＫ１４Ｍ６、ｐＣＧＫ１４Ｍ７、ｐＣＧＫ１４Ｍ８の各組換えプラスミドで、エシェリヒア・コリーＫＭ１株（特開平１１−９２７９号公報参照）を実施例３と同様の手順で形質転換して、形質転換体を取得し、実施例３と同様の手順で培養、抽出することにより、各改変型グリセロールキナーゼＣＧＫＭ６、ＣＧＫＭ７、ＣＧＫＭ８の粗酵素標品を取得した。
【００３６】
実施例７：改変型グリセロールキナーゼの評価（２）
実施例６で取得した改変型グリセロールキナーゼ（ＣＧＫＭ６、ＣＧＫＭ７、ＣＧＫＭ８）をそれぞれ、４０℃〜７０℃の範囲で各１５分間熱処理した後の残存酵素活性率（％）を測定し、各温度処理による残存活性率のプロットから残存活性率が５０％になる温度（Ｔｍ（℃））を算出した。その結果を、実施例３で取得した改変型グリセロールキナーゼＣＧＫＭ１、ＣＧＫＭ４、ＣＧＫＭ５のＴｍおよび比較例１で取得した野生型グリセロールキナーゼのＴｍのデータと共に表２に示す。表２から判るように、実施例６で取得した改変型グリセロールキナーゼＣＧＫＭ６、ＣＧＫＭ７、ＣＧＫＭ８は、改変前の野生型グリセロールキナーゼおよび実施例３で取得した改変型グリセロールキナーゼＣＧＫＭ１、ＣＧＫＭ４、ＣＧＫＭ５と比べて熱安定性が向上していることが確認された。
【００３７】
2010088303.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のグリセロールキナーゼは、高い防腐剤耐性に加えて高い熱安定性を有するため、グリセロールキナーゼの液体状態での長期安定保存が要求される中性脂肪アッセイキットや中性脂肪センサーなどの臨床検査薬の分野において貢献するところ大である。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号１は、実施例１で作製したプラスミドｐＣＧＫ１４に含まれるグリセロールキナーゼ遺伝子の配列である。
配列番号２は、配列番号１の遺伝子によってコードされるグリセロールキナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３〜７は、実施例２または５で変異処理のために使用した合成オリゴヌクレオチドの配列である。
【配列表】
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