(57)【要約】【課題】ステロールおよびサポニンを含むポリヌクレオチド結合複合体の提供。【解決手段】本発明は、ステロールおよびサポニンを含む複合体に関する。複合体は、遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチドを結合し得る。複合体は、親油性部分をさらに含み得るし、任意に親油性部分は接触基および／またはターゲッティングリガンドおよび／または糖質部分を含む。複合体は、免疫原決定基および／または抗原決定基および／または薬剤および／または診断用化合物をさらに含み得る。複合体は、さらなる実施態様において、封入剤、例えば生分解性ミクロスフェアにより封入され得る。本発明は、製剤組成物に、そしてヒトまたは動物身体において実施される療法および／または外科手術による個体の治療方法に、化粧的処置方法に、ならびに診断方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ｉ）核酸と静電的相互作用を形成しうる少なくとも１つのステロール、ここで、該ステロールは、ｐＨ７．０において少なくとも１つの正電荷基又は反応性基を含み、かつ、該ステロールは、少なくとも１つのサポニンと複合体を形成することができる；及び
ｉｉ）少なくとも１つのサポニン、ここで、上記少なくとも１つのサポニンは、上記少なくとも１つのステロールと複合体を形成することができる；
を含む複合体。
【請求項２】
ケージ様マトリクスの形態で微小粒子構造をとる、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
格子状、蜂の巣状、棒状、及び不定形粒子から成る群から選ばれる構造をもつ、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
核酸と相互作用を形成することができない少なくとも1つのステロール、及び核酸と静電的相互作用を形成しうる少なくとも1つのステロール、及び少なくとも1つのサポニンを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記複合体が、コレステロール、ラノステロール、ルミステロール、スチグマステロール、シトステロール、ミコステロール、エルゴステロール及びチオコレステロールから成る群から選択されるステロールを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記複合体が、コレステロールを含むか又は本質的にコレステロールから成るステロールを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
核酸と静電的相互作用を形成することができるステロールが、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）及び／又はＮ−（トリメチルアンモニオエタン）−カルバモイルコレステロール（ＴＣ−コレステロール）を含むか又は本質的にそれらから成る、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記サポニンが、トリテルペングリコシドを含むサポニン、ステロイドグリコシドを含むサポニン及びステロイドアルカロイドグリコシドを含むサポニンから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記サポニンが、アグリコン化合物及び糖質化合物を含むトリテルペングリコシドを含むか又は本質的にそれらから成る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記サポニンが、植物であるセッケンボク（Quillaja）から単離されるトリテルペングリコシドを含むか又は本質的にそれから成る、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
前記サポニンが、セッケンボクの一種であるキラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）から単離される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記サポニンが、セッケンボクの一種であるキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）又はキラヤ・サポナリア・オフィシナリス（Quillaja saponaria Officinalis）から単離される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記サポニンが、クイルＡ（QuilＡ）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１４】
リン脂質をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンを含むか又は本質的にそれから成る、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１７】
糖質構成成分をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
生物活性剤をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１９】
細胞表面受容体部分に対して前記複合体を標的化するターゲッティングリガンドをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２０】
核酸をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記核酸が、治療用タンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドからなる群から選択される、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
免疫原決定基をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２５】
前記免疫原決定基が、細菌性免疫原決定基及びウイルスの免疫原決定基からなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
前記免疫原決定基が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質、及び糖質、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２７】
前記免疫原決定基が、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを含むか又は本質的にそれらから成る、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２８】
前記免疫原決定基が、抗原決定基を含む、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２９】
療法によりヒト又は動物身体の治療のために用いられる薬剤をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３０】
前記薬剤が、抗癌薬である、請求項２９に記載の複合体。
【請求項３１】
球形で、かつ、25 nm〜75 nmの範囲の直径を有する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３２】
生分解性マイクロスフェア又はリポソームとともに請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項３３】
以下のステップ：
ａ）ｐＨ７．０において少なくとも１つの正電荷基又は反応性基を含む少なくとも1つのステロールを含むステロール組成物を、以下の：
ｂ）少なくとも1つのサポニンを含むサポニン組成物、及び
ｃ）少なくとも1つのリン脂質、及び
ｄ）少なくとも1つの有機溶媒
と混合し、ここで、ステップａ）〜ｄ）は同時に又は逐次的に、任意の順序で実行され得る）、そして場合により、
ｅ）余分量の反応体を除去し、そして／又は調製された複合体を精製する、
から成る、請求項１４〜３１のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
【請求項３４】
前記有機溶媒が、エタノール、ＤＭＳＯ、及びＤＭＦから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記溶媒が、最大で25％（vol/vol）の量で存在する、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の複合体、及び少なくとも1つの免疫原決定基を含むキット。
【請求項３７】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の複合体、及び少なくとも1つの遺伝子決定基を含むキット。
【請求項３８】
前記免疫原決定基が、抗原決定基を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
以下の：
ａ）請求項１〜３１のいずれか１項に記載の複合体；及び
ｂ）免疫原決定基；及び
ｃ）抗原決定基；
ここで、上記免疫原決定基は、上記抗原決定基とは異なる、
を含むキット。
【請求項４０】
前記免疫原決定基が、前記抗原決定基内にも含まれる少なくとも1つのエピトープを含むか又はコードする、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記免疫原決定基が、ポリヌクレオチドを含むか又は本質的にそれから成る、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記抗原決定基が、ポリペプチドを含むか又は本質的にそれから成る、請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
前記複合体が、前記免疫原決定基を含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４４】
前記複合体が、前記抗原決定基を含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４５】
少なくとも1つのアジュバントをさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第60/308,609号（2001年7月31日提出）（この記載内容を、本明細書中に援用する）の出願である。当該出願中に、または本発明の出願中に引用された特許および非特許参考文献も全て、それらの記載内容を、本明細書中に援用する。
【０００２】
（産業上の利用分野）
本発明は、ステロールおよびサポニングリコシドの複合体に関する。複合体は、生物活性剤、例えば遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチドと相互作用し得る。本発明に関連する複合体は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびその誘導体の細胞膜を通しての輸送を促すために用いられ得る。
種々の生物活性剤および遺伝子決定基の担体として作用する場合、複合体は、例えばポリヌクレオチドにより含まれる遺伝子を発現するために、および／またはin vivoおよび／またはin vitroで生物学的細胞中で発現されている遺伝子の発現を調節するために、患者、患者の予定領域または患者の予定生物学的細胞中に例えばポリヌクレオチドを導入するための一手段を提供する。
【０００３】
特に本発明は、生物学的細胞をトランスフェクトするための新規の方法に、このような方法に関与する複合体に、そして例えば遺伝子療法およびＤＮＡ予防注射により患者を治療するための診断方法および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
遺伝子決定基を利用するいくつかの医学的用途は、近年に発展してきた。このような用途において、全遺伝子または特定の核酸の細胞中への導入は、中心的重要性を有する。このプロセスはしばしば、細胞の起源、核酸の配列および特徴と関係なく、そして移入がin vivoで実行されるかex vivoで実行されるかにかかわらず、遺伝子トランスフェクションと呼ばれる。
【０００５】
遺伝子トランスフェクションの工程を促すために、いくつかの異なるアプローチが開発されてきた。このようなアプローチは、とりわけｉ）生物学的ベクター（例えばウイルスベクター）を用い、ｉｉ）核酸と陽イオン性リポソームとを会合し、ｉｉｉ）核酸とトランスフェクション剤に共有結合されたペプチドとを会合し、ならびにｉｖ）核酸により微小金粒子を被覆して、被覆粒子を生弾道学的移入のために用いることを包含する。
【０００６】
主要ｉｓｃｏｍ構成成分は、キラヤサポニンおよびコレステロールである。ｉｓｃｏｍの調製手法は、好ましくは非イオン性洗剤中での両親媒性ポリペプチドの可溶化、キラヤサポニン、コレステロールそしておそらくはホスファチジルコリンの付加を包含する。両親媒性タンパク質の存在下では、ｉｓｃｏｍ粒子は洗剤の除去時に生成される。
【０００７】
Morein（例えば米国特許第4,578,269号参照）は、ｉｓｃｏｍが非常に特徴的な構造的複合体を形成するだけでなく、疎水性相互作用により両親媒性抗原がこの複合体中に挿入された場合には、有意の免疫学的特性も保有する、ということを記載した最初の人であった。慣用的ｉｓｃｏｍ（免疫刺激性複合体）は、以来、ワクチン処方物のために用いられてきており、抗原の多重結合性提示とアジュバント機能性を併有する（例えば米国特許第6,080,725号（Marciani）参照）。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要約
本発明は、一局面において、少なくとも1つのステロールおよび／または少なくとも1つのサポニンを含む複合体に関するが、この場合、少なくとも1つのステロールまたは少なくとも1つのサポニンは、少なくとも1つの生物活性剤、例えば遺伝子決定基、例えばポリペプチド、例えばＤＮＡおよびその誘導体との静電的相互作用または疎水性相互作用を生成し得る。少なくとも1つのステロールおよび少なくとも1つのサポニンが、本明細書中に前記されたように少なくとも1つの生物活性剤との静電的相互作用または疎水性相互作用を生成し得ない場合、複合体は、静電的相互作用および疎水性相互作用ならびに接触基による遺伝子決定基のインターカレーションに起因する相互作用により、少なくとも1つの生物活性剤、例えば遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびその誘導体を接触し得る少なくとも1つの接触基を含む。
【０００９】
したがって本発明の一局面では、以下の：
ｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールであって、
少なくとも1つの二次ステロールが静電的相互作用および疎水性相互作用から選択される相互作用により遺伝子決定基を接触し得るし、そして
少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールが少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンとの複合体を形成し得るステロール、ならびに
ｉｉ）少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンであって、
少なくとも1つの二次サポニンが静電的相互作用および疎水性相互作用から選択される相互作用により遺伝子決定基を接触し得るし、そして
少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンが少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールとの複合体を形成し得るサポニン、そして任意に
ｉｉｉ）静電的相互作用および疎水性相互作用から選択される相互作用により遺伝子決定基を接触するための少なくとも1つの接触基
（但し二次ステロールおよび二次サポニンが複合体中に存在しない場合に少なくとも1つの接触基が存在する）
を含む複合体が提供される。
【００１０】
本発明の複合体は、ポリヌクレオチド、例えば天然核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらの誘導体（例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロック核酸（ＬＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）を結合するために有用である。結合ポリヌクレオチドは、その後、生物学的細胞、例えば任意の動物細胞またはヒト細胞中に移入され得る。
【００１１】
本発明の複合体は、好ましい一実施態様において、免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）として既知のものに類似したケージ様マトリクスの形態で微小粒子構造をとる。ｉｓｃｏｍ構造と並んで、ステロールおよびサポニン間の相互作用は、種々の異なる構造的存在、例えば格子状、蜂の巣状、棒状および不定形粒子を生じることが報告されており、これらの構造的存在は全て、本発明により網羅される。しかしながらその他の構造およびマトリクス形成も本発明により意図され、これは決してｉｓｃｏｍ様構造またはマトリクスに限定されない。
【００１２】
本発明の複合体がｉｓｃｏｍまたはｉｓｃｏｍ様構造を形成しない場合、このようなｉｓｃｏｍまたは構造は、例えば本質的には欧州特許第0 109 942 B1号に記載されているように調製され得る。
【００１３】
したがって、少なくとも臨界ミセル結合濃度という濃度で、疎水性および親水性ドメインを有するｆｘコレステロール、リン脂質および１つまたはそれ以上のグリコシド（ｆｘセッケンボク構成成分）を含有するグリコシド溶液が生成され、そして複合体が形成される。複合体はその後単離されおよび／または精製され得る。
【００１４】
任意に、第一過程として、複合体中に挿入される構成成分、ｆｘ生物活性剤、例えばポリヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびその誘導体、免疫原作用物質、抗原作用物質、治療薬、診断剤等が１つまたはそれ以上の可溶化剤と混合され、それにより複合体が構成成分と可溶化剤との間に形成され、その後、構成成分は可溶化剤から分離され、例えばグリコシド溶液に直接移される。
【００１５】
本発明と一致して、グリコシド溶液は最初にポリヌクレオチドと混合され得る。溶液剤中に少なくとも1つのステロールを溶解し、少なくとも1つのグリコシドまたは少なくとも1つのサポニンを付加し、そして任意にその他の親油性部分を付加して、その付加後、完成品に対して非許容可能であることが立証される場合には、溶液剤が除去されることにより製造され得るマトリクスから着手することが可能である。
【００１６】
マトリクスは、その個々の部分が可溶性でない水溶液に移され得る。可溶化剤は、例えばゲル濾過、限外濾過、透析または電気泳動により除去され得る。次に、例えば超遠心分離により、密度勾配によりまたはゲル濾過によって、残りの一次ステロールおよびサポニンからマトリクスが精製され得る。可溶化剤は、米国特許第5,679,354号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記述されたもののうちのいずれかであり得る。
【００１７】
好ましい一実施態様では、本発明の複合体は、本質的には本明細書中の実施例１に記載されているように生成される。
【００１８】
したがって好ましい一実施態様では、以下の：
ｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールであって、
少なくとも1つの二次ステロールが静電的相互作用および疎水性相互作用から選択される相互作用により遺伝子決定基を接触し得るし、そして
少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールが少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンとの複合体を形成し得るステロール、ならびに
【００１９】
ｉｉ）少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンであって、
少なくとも1つの二次サポニンが静電的相互作用および疎水性相互作用から選択される相互作用により遺伝子決定基を接触し得るし、そして
少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンが少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールとの複合体を形成し得るサポニン、そして任意に
ｉｉｉ）静電的相互作用および疎水性相互作用から選択される相互作用により遺伝子決定基を接触するための少なくとも1つの接触基
（但し二次ステロールおよび二次サポニンが複合体中に存在しない場合に少なくとも1つの接触基が存在する）、ならびにさらに任意に
【００２０】
ｉｖ）少なくとも1つの親油性部分
を含む複合体の製造方法が提供されるが、この場合、前記の方法は、以下の：
ａ）少なくとも1つの一次ステロールおよび／または少なくとも1つの二次ステロールを含むステロール組成物を、
ｂ）少なくとも1つの一次サポニンおよび／または少なくとも1つの二次サポニンを含むサポニン組成物、ならびに
ｃ）少なくとも1つの親油性部分、そして
ｄ）少なくとも1つの有機溶媒
と混合し（ここで、過程ａ）〜ｄ）は同時にまたは逐次的に、任意の順序で実行され得る）、そして任意に
ｅ）余分量の反応体を除去し、および／または調製された複合体を精製する
過程を包含する。
【００２１】
有機溶媒は、好ましくはエタノール、ＤＭＳＯおよびＤＭＦから選択され、そして溶媒は、好ましくは最大で25％（vol/vol）、例えば最大で20％（vol/vol）、例えば最大で15％（vol/vol）、例えば最大で10％（vol/vol）、例えば最大で8％（vol/vol）、例えば最大で6％（vol/vol）、例えば最大で4％（vol/vol）、例えば最大で2％（vol/vol）、例えば最大で1％（vol/vol）、例えば最大で0.5％（vol/vol）、例えば最大で0.1％（vol/vol）の量で存在する。
【００２２】
一次および二次ステロールおよびサポニン
以下の一般的区別は、一次および二次ステロール間でなされる。一次および／または二次ステロールは、多数の生物体による二次代謝産物として合成された天然ステロールであり得る。それらは合成ステロールでもあり得るし、あるいはそれらはin vitroまたはin vivoで化学合成または酵素的合成により作られ得る。一次ステロールは一般に、本明細書中で定義されるような遺伝子決定基との会合を形成し得ないが、一方、このような会合は二次ステロールおよび遺伝子決定基間で形成される。
【００２３】
同様に一次および／または二次サポニンは本明細書中で限定されるような任意のサポニンであり、アグリコン部分として、ｉ）トリテルペン部分、ｉｉ）ステロイド部分またはｉｉｉ）ステロイドアルカロイド部分を含み得る。サポニンは、天然または合成のものであり得るし、あるいはそれらはin vitroまたはin vivoで化学合成または酵素的合成により作られ得る。一次サポニンは一般に、本明細書中で定義されるような遺伝子決定基との会合を形成し得ないが、一方、このような会合は二次サポニンおよび遺伝子決定基間で形成される。
【００２４】
その結果として、任意のステロールは一次ステロールまたは二次ステロールであり、そして任意のサポニンは一次サポニンまたは二次サポニンである。原則として、一次および／または二次ステロール、ならびに一次および／または二次サポニンは、陰イオン性、中性または陽イオン性であり得る。陽イオン性ステロールおよび陽イオン性サポニンという用語は、それぞれ、ｐＨ7.0で正味の正の電荷を保有するステロールおよびサポニンを意味する。二次ステロールおよび二次サポニンは、好ましくはそれぞれ陽イオン性ステロールおよび陽イオン性サポニンであり、一方、一次ステロールおよび一次サポニンは、好ましくはそれぞれ陰イオン性または中性ステロールおよびサポニンである。
【００２５】
したがって二次ステロールおよび／または二次サポニンは、好ましくはｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電部分または反応基を含み、そしてこの正荷電部分または反応基は、静電的相互作用により、生物活性剤、例えば遺伝子決定基を接触し得る本発明の好ましい一実施態様によるものである。
【００２６】
別の実施態様では、二次ステロールおよび／または二次サポニンは、好ましくは非荷電部分または非極性反応基を含み、そしてこの非荷電部分または非極性反応基は、疎水性相互作用により、生物活性剤、例えば遺伝子決定基を接触し得る本発明の好ましい別の実施態様によるものである。
【００２７】
静電的相互作用と疎水性相互作用の組合せも、生物活性剤と二次ステロールおよび／またはサポニンとの間の会合を生成するために用いられる。
【００２８】
本発明の複合体が二次ステロールも二次サポニンも含まない場合、複合体は、静電的相互作用または疎水性相互作用のいずれかにより、遺伝子決定基を接触し得る少なくとも1つの接触基を含む。
【００２９】
接触基は、このような複合体が遺伝子決定基との所望の会合を形成するために必要とされる。しかしながら接触基は、二次ステロールおよび／または二次サポニンを含む複合体中にも存在し得る。「接触基」という用語は、本明細書中で用いる場合、遺伝子決定基との会合、例えば静電的相互作用および／または疎水性相互作用により生成される会合を形成し得る二次ステロールおよび／または二次サポニンの任意の部分も指す。
【００３０】
好ましい接触基は、ステロール（一次および／または二次）および／またはサポニン（一次および／または二次）により作られる本発明の複合体と会合を形成し得る少なくとも1つの親油性部分を含む。
【００３１】
本発明の接触基のための「連結基」または「アンカー」として作用するほかに、親油性部分はまた、接触基のための「連結基」またはサポニン−ステロール複合体の一部を形成する任意のその他の官能基として複合体形成中またはその後に本質的には働かずに、サポニン−ステロール複合体形成を促すように働き得る。したがって親油性部分を用いる目的は、2つの部分がある：即ち、本発明の親油性部分が、サポニン−ステロール複合体形成中またはその後に、好ましくはサポニン−ステロール複合体形成中に、複合体形成の促進剤として作用し得ること、そしてそれらが、この作用とは関係なく、任意の官能基のための「連結基」として、例えば本発明の複合体を遺伝子決定基および／またはターゲッティングするためのターゲッティングリガンドを接触するための接触基としても作用し得る。
【００３２】
親油性部分、例えばリン脂質は、好ましくは本発明の複合体の形成工程中に存在する。例えばリン脂質の存在は、広範な濃度範囲に亘って複合体形成を促す。したがって、複合体形成中にサポニンおよびステロールが混合される場合、ホスファチジルコリンが付加され得る。
【００３３】
正荷電ヘッド基を有するリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンを用いるのが好ましい。これに関する理由の1つは、負荷電ポリヌクレオチド、例えばリボ核酸との相互作用を促し得るかまたは生じ得る全体的正電荷を有する複合体中への含入である。この相互作用は、細胞膜を横断しての、その後の組込みおよび／または翻訳および／またはポリペプチド発現のための生物学的細胞中へのポリヌクレオチドの取込みを促す。ホスファチジルコリンは、本発明と関連して用いられ得る別のリン脂質の一例である。
【００３４】
接触基の付加的部分は、遺伝子決定基を用いて形成される会合の性質によって、親油性または親水性であり得る。接触基の好ましい一付加的部分は、イオン基または荷電基、好ましくは正荷電基、例えばｐＨ＝7.0で正電荷を含む基である。このような基の例は、図６、７および８において親油性部分に関して説明されている。このような親油性部分は、とりわけ、Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, ALから入手可能である。
【００３５】
したがって、本発明の複合体の一連の異なる組成を推測し得る。本発明は、好ましい実施態様において、以下の：
ｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｉｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次サポニンを含む複合体、
【００３６】
ｉｉｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｉｖ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの二次サポニンを含む複合体、
【００３７】
ｖ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの二次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｖｉ）少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンを含む複合体、
ｖｉｉ）少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｖｉｉｉ）少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの二次サポニンを含む複合体、
【００３８】
ｉｘ）少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの二次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｘ）少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの二次サポニンを含む複合体、
ｘｉ）少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの二次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｘｉｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンを含む複合体、
【００３９】
ｘｉｉｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｘｉｖ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの二次サポニンを含む複合体、
ｘｖ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの二次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
ｘｖｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも１つの二次サポニンを含む複合体、
ｘｖｉｉ）少なくとも1つの一次ステロールおよび少なくとも1つの二次ステロールおよび少なくとも1つの一次サポニンおよび少なくとも1つの二次サポニンおよび少なくとも1つの接触基を含む複合体、
【００４０】
例えば本明細書中ですく上に列挙した複合体の任意の組合せ、例えば複合体ｉ）〜ｘｖｉｉ）の任意の組合せを含む任意の組成物に関する。このような組合せは、異なる複合体を患者の異なる領域に向けるかまたは標的化しようと試みる場合に、有益であり得る。
【００４１】
接触基が核酸と相互作用するメカニズムは、当該接触基の特性によっている。接触基の一例は、遺伝子決定基との相互作用、例えば任意のＤＮＡ主鎖を含めたポリヌクレオチドの主鎖との静電的相互作用を生成し得るコレステロールの陽イオン性（正荷電）誘導体である。その他の例は、二本鎖ＤＮＡと相互作用する脂質尾アクリジン化合物である。
【００４２】
ステロール（一次および／または二次）、サポニン（一次および／または二次）、ならびに親油性部分を含む接触基のほかに、本発明の複合体はさらに、特定細胞表面または組織に対して特有のポリヌクレオチド、例えば核酸をターゲッティングするためのターゲッティングリガンドを含み得る。これは、本発明の複合体の構造中に特定のターゲッティングリガンドおよび／または受容体結合分子および／またはリガンドを組入れることにより成し遂げられ得る。
【００４３】
したがって、本発明の複合体の生成のための2つの異なる方法が提供される。一方法においては、接触基は粒子の生成中に組入れられ、そしてもうひとつの方法では、接触基は、任意にｉｓｃｏｍ−マトリクスの形態で粒子を予備成形するために付加される。
【００４４】
したがって本発明の一主要局面は、好ましい一実施態様において、ｉ）コレステロールを含有する膜と会合し、そしてその中にまたはそれを通して浸透するｉｓｃｏｍ構造の能力を、ｉｉ）核酸を含めたポリヌクレオチドと接触するかまたは会合する特性と組合せることにより、ポリヌクレオチド、例えば核酸の取込みを強化する新規の系の提供である。特に、裸ＤＮＡを用いた予防接種の用途に関しては、本発明の複合体はＤＮＡの必要量を低減すると思われる。
【００４５】
本発明は、ポリヌクレオチドとの会合を生成し得る複合体に限定されるわけではない、ということに留意すべきである。その他の好ましい実施態様における本発明の複合体は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと接触し得るかまたはそれらとの会合を生成し得る。
【００４６】
したがって本発明は、一実施態様では、伝統的ｉｓｃｏｍの一部を構成する構成成分を含む複合体に関する。しかしながら本発明の複合体は、多数の点で慣用的ｉｓｃｏｍとは異なる。第一に、本発明の複合体は、生物活性剤、例えば遺伝子決定基を、例えばポリヌクレオチドの形態で結合し得る。第二に、好ましい一実施態様における複合体は、約−50 mVより少ない負の−またはそれより正の値−であるゼータ電位を特徴とする。
【００４７】
したがって、約−50 mVより少ない負の−またはより正の値であるゼータ電位、例えば約−45 mVのゼータ電位、例えば約−40mVのゼータ電位、例えば約−37 mVのゼータ電位、例えば約−35 mVのゼータ電位、例えば約−32 mVのゼータ電位、例えば約−30 mVのゼータ電位、例えば約−29 mVのゼータ電位、例えば約−28 mVのゼータ電位、例えば約−27 mVのゼータ電位、例えば約−26 mVのゼータ電位、例えば約−25 mVのゼータ電位、例えば約−20 mVのゼータ電位、例えば約−15 mVのゼータ電位、例えば約−10 mVのゼータ電位、例えば約−5 mVのゼータ電位、例えば約0 mVのゼータ電位、例えば約5 mVのゼータ電位、例えば約10 mVのゼータ電位、例えば約15 mVのゼータ電位、例えば約20 mVのゼータ電位、好ましくは例えば約50 mV未満のゼータ電位を有する複合体が提供される。
【００４８】
したがって好ましい実施態様における複合体は、約−50 mV〜約−40 mV、例えば約−40 mV〜約−35 mV、例えば約−35 mV〜約−30 mV、例えば約−30 mV〜約−25 mV、例えば約−25 mV〜約−20 mV、例えば約−20 mV〜約−15 mV、例えば約−15 mV〜約−10 mV、例えば約−10 mV〜約−5 mV、例えば約−5 mV〜約−0 mV、例えば約0 mV〜約5 mV、例えば約5 mV〜約10 mV、例えば約10 mV〜約15 mV、例えば約15 mV〜約20 mV、例えば約20 mV〜約30 mV、例えば約30 mV〜約40 mV、例えば約40 mV〜約50 mVのゼータ電位を有し得る。
【００４９】
標準参照点として、ｉ）任意の所定の当該サポニン（単数または複数）、およびｉｉ）一次ステロールとしてのコレステロールを含む複合体、ｉ）任意の所定の当該サポニン（単数または複数）、ｉｉ）一次ステロールとしてのコレステロール、ならびにｉｉｉ）任意の所定の当該二次ステロール、好ましくは本明細書中の図５に列挙したようなコレステロール誘導体を含む本発明の複合体を用いる場合、前記の本発明の複合体は、前記の参照複合体より少なくとも約5 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約10 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約15 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約20 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約25 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約30 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約35 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約40 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約45 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位、例えば前記の参照複合体より少なくとも約50 mVより少ない負のまたはより正の値であるゼータ電位を有する。
【００５０】
本発明の複合体に関するゼータ電位の値は、一部は、例えば陽イオン性二次サポニンおよび／または陽イオン性二次ステロールを本発明の複合体中に含入することにより確定される。
【００５１】
本発明の複合体中のサポニン（一次および二次）およびステロール（一次および二次）間のモル比は、好ましくは1000:1未満から、好ましくは1:1000より大きい。好ましい比は、約100:1、例えば約80:1、例えば約60:1、例えば約50:1、例えば約40:1、例えば約30:1、例えば約25:1、例えば約20:1、例えば約18:1、例えば約16:1、例えば約14:1、例えば約12:1、例えば約10:1、例えば約9:1、例えば約8:1、例えば約7:1、例えば約6:1、例えば約5:1、例えば約4:1、例えば約3:1、例えば約2:1、例えば約1.9:1、例えば約1.8:1、例えば約1.7:1、例えば約1.6:1、例えば約1.5:1、例えば約1.4:1、例えば約1.3:1、例えば約1.2:1、例えば約1.1:1、例えば約1:1、例えば約1:1.1、例えば約1:1.2、例えば約1:1.3、例えば約1:1.4、例えば約1:1.5、例えば約1:1.6、例えば約1:1.7、例えば約1:1.8、例えば約1:1.9、例えば約1:2.0、例えば約1:2.5、例えば約1:3、例えば約1:3.5、例えば約1:4、例えば約1:4.5、例えば約1:5、例えば約1:5.5、例えば約1:6、例えば約1:7、例えば約1:10、例えば約1:20、例えば約1:40、例えば約1:60、例えば約1:80、例えば約1:100である。
【００５２】
理論に縛られることなく、本発明の複合体は、目下選択される一仮説によって、ｉｓｃｏｍ様構造を、あるいは例えば天然または合成アミノ酸およびそれらの変異体を含むポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと接触するかまたは会合される場合には、このような構造に類似しない構造をとる。複合体により接触される場合、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、好ましい一仮説により、分解耐性配座で、あるいはそれが本発明の複合体と会合されない場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配座と比較して、低分解傾向の配座である。したがって本発明は、好ましい一実施態様では、実際的環境下で、それぞれヌクレアーゼおよびプロテアーゼにより分解されるとはあまり考えられないポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む複合体に関する。
【００５３】
したがって、好ましい一実施態様では、それを必要とする個体へのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの投与方法が提供されるが、前記のポリヌクレオチドおよび／または前記のポリペプチドは、実質的に同様の条件下で、例えばポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが慣用的担体またはアジュバントと組合せて投与される条件下で、複合体の非存在下でポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが投与される場合に起こる分解と比較して、実際的環境下での分解に感受性でない（あるいは実際的環境下での分解に対して低感受性である）配座での本発明の複合体との会合で投与される。
【００５４】
その結果として、本発明は、特定の一実施態様では、複合体と細胞膜との相互作用により生物学的細胞中に望ましくは移されるポリヌクレオチドおよびその他の遺伝子決定基を含めた生物活性剤のための担体として用いられる修飾化ｉｓｃｏｍの形態での複合体に関する。
【００５５】
したがって本発明の複合体は、生物活性剤、免疫原決定基、遺伝子決定基、酵素、アジュバントおよび薬剤から成る群から選択される1つまたはそれ以上を含み得る。それゆえ例として、本発明の複合体は、遺伝子決定基および抗原決定基、例えば核酸およびポリペプチドを含み得る。
【００５６】
本発明の複合体はさらに、生物活性剤および／または遺伝子決定基、好ましくはポリヌクレオチドのほかに、ｉ）親油性部分、任意に、接触基および／またはターゲッティングリガンドを含む親油性部分、および／またはｉｉ）糖質部分、好ましくは天然サポニンの一部を構成する等質部分（これに限定されない）を含み得る。糖質結合受容体を含有することが既知である細胞表面に複合体を向けるよう意図される場合、本発明の複合体は糖質部分を含む、というのが特に好ましい。
【００５７】
したがって本発明の複合体はさらに、生物活性剤および／または遺伝子決定基および／または免疫原決定基および／または抗原決定基および／または薬剤および／または治療薬および／または診断剤を含み得る。
【００５８】
複合体は、さらなる実施態様では、封入剤、例えばリポソームおよび／または生分解性ミクロスフェアにより封入され得る。複合体との類似性により、リポソームおよび／または生分解性ミクロスフェアは、ヒトまたは動物身体中の特定の位置に対してミクロスフェアをターゲッティングするためにミクロスフェアと適切に会合されるターゲッティングリガンドを含み得る。好ましいターゲッティングリガンドとしては、例えば樹状細胞およびマクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。治療目的のために用いられる場合、リガンドは、例えばビタミン受容体、葉酸塩受容体、高親和性ＩＬ−２受容体、増殖因子受容体、例えばＥＧＦ受容体等に対して標的化される。
【００５９】
一次サポニンおよび／または二次サポニンおよび／または一次ステロールおよび／または二次ステロールは、例えば生分解性ミクロスフェア中にも存在し得る。一実施態様では、ミクロスフェアは全体的正電荷を有する、即ち、負荷電基より多く正荷電基を含有する、というのが特に好ましい。
【００６０】
本発明は、製剤組成物に、そしてヒトまたは動物身体において実施される療法および／または外科手術による個体の治療方法に、化粧的処置方法に、ならびに診断方法にも関する。
【００６１】
本発明の複合体の製造方法も提供され、さらなる局面では、本発明は、このような治療を必要とする個体における症状を治療するための薬剤の製造における、本発明の複合体、またはこのような複合体を含む組成物、例えば製剤組成物の使用に関する。
【００６２】
さらに本発明は、本発明の複合体および少なくとも1つの免疫原決定基を含むキット構成要素に関する。本発明は、本発明の複合体および少なくとも1つの免疫原決定基および少なくとも1つの遺伝子決定基を含むキット構成要素に関する。例えば免疫原決定基は、抗原決定基を含み得る。
【００６３】
本発明のキット構成要素（ならびに複合体それ自体）は、患者における望ましい免疫応答を引き起こすための方法に用いられ得る。前記の方法は、ｉ）本発明の複合体を提供し、そしてｉｉ）遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチド、例えばＤＮＡを提供し、および／またはｉｉｉ）免疫原決定基、例えば抗原決定基、例えばペプチド、例えばエピトープを提供し、ｉｖ）前記複合体を前記遺伝子決定基および／または前記免疫原決定基と混合し、ｖ）患者に、前記患者における望ましい免疫応答を引き起こすのに有効な量で前記混合物を投与し、そしてｖｉ）前記の望ましい免疫応答を引き起こす過程を包含する。
好ましい実施態様では、当該方法は、ａ）遺伝子決定基を含む複合体およびｂ）免疫原決定基、例えば抗原決定基を含む複合体を同時的にまたは任意の順序で逐次的に投与するさらなる過程を包含する。遺伝子決定基は、一実施態様では、免疫原／抗原決定基またはその一部分をコードする。免疫原決定基は、好ましくは脂質会合ペプチド（リポペプチド、例えばリポタンパク質またはその一部分）である。前記の方法がａ）遺伝子決定基を含む複合体およびｂ）免疫原決定基を含む複合体を逐次的に投与する過程を包含する場合には、したがって遺伝子決定基を最初に投与し、そして次に、免疫原決定基を、好ましくは最初に投与された遺伝子決定基によりコードされるエピトープを含む免疫原決定基を含む複合体をその後投与することにより、適切な期間後に、任意の初期免疫応答を高めることが出来る。免疫原決定基の初期投与後、適切な期間をおいた後に、遺伝子決定基の投与が次になされる。同様に、ｉ）遺伝子決定基を含む複合体およびｉｉ）任意の状態の従来方法により投与されるエピトープを含むペプチドを同時的にまたは任意の順序で逐次的に投与し、ならびにｉ）免疫原決定基、例えばペプチドエピトープを含む複合体、およびｉｉ）任意の状態の従来方法により投与されるＤＮＡのようなポリヌクレオチドを、同時的にまたは任意の順序で逐次的に、前記患者に投与することができる。
【００６４】
前記の複合体、またはその個々の構成成分、ならびに遺伝子および免疫原決定基は、キット構成要素に用いる準備が出来た個々のバイアル中に提供され得る。このようにして、本発明の複合体を、遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチド、例えばＤＮＡと、および／または免疫原決定基、例えば抗原決定基、例えばペプチド、例えばエピトープと混合し得る。
【００６５】
定義
アグリコン：グリコシド結合により糖質部分に連結されるサポニングリコシドの一部。
【００６６】
両親媒性部分：水溶性、親水性部分および水不溶性、疎水性部分を有する合成、半合成（修飾された天然の）または天然化合物を含む任意の部分、例えば脂質。好ましい両親媒性化合物は、極性頭基、例えばホスファチジルコリン基、および１つまたはそれ以上の非極性、脂肪族鎖、例えばパルミトイル基を特徴とする。
【００６７】
抗原決定基：抗体またはその結合断片を結合し、そして特異的抗原応答を誘導する能力を有する任意の決定基または物質。抗原決定基は、ポリペプチドの一部を構成し、そして全ポリペプチドが抗原として用いられる場合、特異的抗体応答を引き出すエピトープを含むかまたは本質的にそれから成り得る。このようなエピトープは、当該分子上の単一のまたは2〜3の位置に限定される。
【００６８】
生物活性剤：治療的または診断的である用途に関連して、例えば患者における疾患の存在または非存在を診断するための方法に、および／または患者における疾患の治療のための方法に用いられ得る任意の物質。「生物活性剤」とは、in vitroおよび／またはin vivoで生物学的作用を発揮し得る物質を指す。生物活性剤は、中性、正または負荷電され得る。適切な生物活性剤としては、例えばプロドラッグ、診断剤、治療薬、薬学的作用物質、薬剤、酸素送達剤、代用血液、合成有機分子、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体および遺伝子決定基、例えばヌクレオシド、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６９】
陽イオン性脂質：ｐＨ7.0で正味の正電荷を保有する任意の脂質。
陽イオン性サポニン：ｐＨ7.0で正味の正電荷を保有する任意のサポニン。
陽イオン性ステロール：ｐＨ7.0で正味の正電荷を保有する任意のステロール。
【００７０】
接触基：親油性部分、ならびにｉ）静電的相互作用またはｉｉ）疎水性相互作用により遺伝子決定基と会合し得る部分を含む基。
【００７１】
複合体：遺伝子決定基または免疫原決定基と相互作用し得るサポニンおよびステロールの構成物。相互作用は、一方ではｉ）サポニンおよび／またはステロール、そして他方ではｉｉ）遺伝子決定基および／または免疫原決定基間に形成される静電的相互作用および／または疎水性相互作用に起因し得る。この場合、サポニンおよび／またはステロールはそれぞれ二次サポニンおよび／または二次ステロールと呼ばれる。複合体は、接触基により遺伝子決定基および／または免疫原決定基との静電的および／または疎水性相互作用から二次サポニンおよび二次ステロールを奪う。接触基がサポニンまたはステロールの一部を形成する場合、前記のサポニンまたはステロールは、定義により、二次サポニンまたは二次ステロールである。接触基は、二次サポニンおよび／または二次ステロールの存在とは無関係に、複合体中に存在し得る。したがって接触基は、前記の二次サポニンおよび／または二次ステロールの一部を形成する前記の接触基を伴わずに二次サポニンおよび／または二次ステロールを含む複合体中に存在し得る。当該サポニンまたはステロールの接触基が、遺伝子決定基と会合を生成し得るｐＨ＝7で少なくとも1つの正荷電部分を含む限り、二次サポニンまたは二次ステロールの全体的電荷は、中性であり得るしまたは陰イオン性でさえあり得る。優先的に遺伝子決定基との疎水性相互作用が生成される場合にも、接触基は中性であり得る。
【００７２】
縮重ポリヌクレオチド配列：ヌクレオチドの予定配列を含みそして予定ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと比較して、ポリペプチドをコードしそしてヌクレオチドの変更配列を含むポリヌクレオチド。この場合、ポリペプチドおよび予定ポリペプチドは同一生物学的活性を有する。
【００７３】
診断剤：患者の内部領域を画像化し、および／または患者における疾患の存在または非存在を診断するための方法に関連して用いられ得る任意の作用物質。診断剤としては、例えば超音波画像法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピューター連動断層撮影（ＣＴ）、電子常磁性共鳴（ＥＳＲ）、核医学画像法、光学的画像法、エラストグラフィー、高周波（ＲＦ）およびマイクロ波レーザーに関連して用いるための造影剤が挙げられる。診断剤としては、画像法が用いられても用いられなくても、患者における疾患またはその他の状態の診断を促進するのに有用な任意のその他の作用物質も挙げられ得る。本明細書中で定義する場合、「診断剤」は、生物活性剤の一種である。
【００７４】
診断的方法：臨床症状の診断に達するに際して医療従事者の助けとなる結果を包含する任意の方法。
【００７５】
双極子相互作用：2つまたはそれ以上の極性分子間に起こり得る引力。したがって、「双極子相互作用」とは、二次極性分子の非荷電部分的負末端に対する一次極性分子の非荷電部分的正末端の引力を指す。双極子相互作用は、電気的陽性頭基、例えばホスファチジルコリンのコリン頭基と電気的陰性原子、例えば異種原子、例えば酸素、窒素または硫黄との間の引力により実証される。「双極子相互作用」とは、水素原子が、別個の分子上の電気的陰性原子間の架橋として役立つ、そして水素原子が共有結合により一次分子に、そして静電力により二次分子に保持される分子間水素結合も指す。
【００７６】
静電的相互作用：反対電荷の構成成分が互いにひきつけられる場合の引力による、荷電構成成分、分子またはイオン間に起こる任意の相互作用。例としては、イオン的相互作用、共有的相互作用、イオンと双極子（イオンおよび極性分子）との間の相互作用、2つの双極子間の相互作用（極性分子の部分電荷）、水素結合、即ち例えばｉ）ある分子中の窒素原子、酸素原子またはフッ素原子に結合されるが、一方、同時にｉｉ）別の分子または同一分子中の窒素原子、酸素原子またはフッ素原子に結合される水素、インターカレーション相互作用およびロンドンの分散結合（分極性分子の誘起双極子）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって例えば「イオン的相互作用」または「静電的相互作用」とは、一次正荷電分子および二次負荷電分子間の引力を指す。イオン的または静電的相互作用としては、例えば負荷電生物活性剤、例えば遺伝子決定基と、ｉ）正荷電脂質、例えば陽イオン性脂質、ｉｉ）正荷電サポニン、例えば陽イオン性サポニン、およびｉｉｉ）正荷電ステロール、例えば陽イオン性ステロールのうちの１つまたはそれ以上との間の引力が挙げられる。
【００７７】
遺伝子決定基：遺伝子決定基とは、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。遺伝子決定基は、当業者に既知の合成化学的方法により、または組換え技術の使用により、あるいはそれらの組合せにより作製され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡは、任意に非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、例えばＬＮＡ（ロック核酸）およびＰＮＡ（ペプチド核酸）を含み得るし、そしてそれは一本鎖または二本鎖であり得る。「遺伝子決定基」とは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ中のヌクレオチドの特定配列と相補的であるヌクレオチド配列であるセンスおよびアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡも指す。
【００７８】
水素結合：電気的陰性原子、例えば酸素、硫黄または窒素と共有的に結合される水素原子と別の電気的陰性原子との間に起こり得る引力または架橋。水素結合は、一次分子中の水素原子と二次分子中の電気的陰性原子との間に起こり得る（分子間水素結合）。さらに水素結合は、単一分子中にともに含有される水素原子と電気的陰性原子との間に起こり得る（分子内水素結合）。
【００７９】
疎水性相互作用：極性環境（例えば水）中で互いに引力範囲内に位置する本質的に非極性（疎水性）の構成成分間に起こる任意の相互作用。本明細書中で用いる場合、引力範囲とは、約100 nmの規模である。特定の型の疎水性相互作用は、「ファンデルワールス力」、即ち量子力学により説明される非極性分子間の引力により発揮される。ファンデルワールス力は一般に、隣接分子により誘発され、そして電子分布の変化を伴う瞬時双極子モーメントに関連する。
【００８０】
免疫原決定基：免疫応答、例えば特異的または非特異的抗体応答、あるいは細胞溶解性応答を引き起こす能力を有する任意の決定基または物質。免疫原決定基は、ポリペプチドの一部を構成し、そして全ポリペプチドが抗原として用いられる場合、免疫応答を引き出すエピトープを含むかまたは本質的にそれから成り得る。このようなエピトープは、当該分子上の単一のまたは2〜3の位置に限定される。
【００８１】
相互作用：物理的力、例えば静電性相互作用および疎水性相互作用により媒介される2つまたはそれ以上の部分の互いに対する一時的または長期残存性引力または結合。
【００８２】
インターカレーション：インターカレーションは特に、接触基および遺伝子決定基間の会合を意味し、この場合、接触基は、遺伝子決定基のプリン−ピリミジン塩基対の2つの隣接層と複合体を形成する。インターカレーション基は、塩基対に平行に配向され、そして水素結合力、静電的相互作用および／または疎水性相互作用により遺伝子決定基と相互作用する。
【００８３】
ｉｓｃｏｍ構造：直径約30〜40ナノメートルの二十面体対称により特性化され、そして12ナノメートルの環様サブユニットから成る硬質ケージ様マトリクス。
【００８４】
本質的非極性：同様の性質を有する脂質または親油性部分と接触するかまたは相互作用し得る化合物またはドメインの性質。
【００８５】
親油性部分：ｉ）本質的に非極性である１つまたはそれ以上の化合物の任意の適切な官能基、あるいはｉｉ）本発明の複合体内の本質的非極性ドメインを形成する部分に結合されるかまたは接触する部分。好ましい親油性部分は、一般的に両親媒性である天然、合成または半合成（修飾された天然の）化合物である。脂質は典型的には、親水性構成成分および疎水性構成成分を含む。半合成の（修飾された天然の）という語句は、一応化学的に修飾された天然化合物を意味する。脂質は、本明細書中では、「安定物質」または「安定化合物」とも呼ばれる。
【００８６】
リポソーム：典型的には１つまたはそれ以上の同心層、例えば単層、二重層または多重層の形態の両親媒性化合物、例えば親油性部分の一般的に球形または球様クラスターまたは集塊。それらは、本明細書中では、脂質小胞とも呼ばれる。リポソームは、例えばイオン性脂質および／または非イオン性脂質から処方され得る。非イオン性脂質から処方されるリポソームは、ニオソームと呼ばれ得る。陽イオン性脂質または陰イオン性脂質から、少なくとも一部は処方されるリポソームは、コクリエートcochleateと呼ばれ得る。
【００８７】
患者：脊索動物亜門の任意の成員、個体または「動物身体」、例えば哺乳類、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマおよびヒト、好ましくはヒト；飼育動物、例えばイヌおよびネコ、ならびに鳥類、例えば飼育、野生および狩猟鳥、例えば雄鳥、雌鳥、例えばニワトリ、シチメンチョウおよびその他の家禽（これらに限定されない）。本用語は魚類も包含するが、それは任意の特定齢を意味しない。したがって成体および新生仔が包含されるよう意図される。
【００８８】
リン脂質：グリセロール主鎖、リン酸塩基を含む疎水性部、ならびに2個の脂肪酸の形態の親油性部からなる任意の部分。
【００８９】
ポリヌクレオチド：少なくとも2つの核酸を含む分子。核酸は、天然、またはロック核酸（ＬＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ポリヌクレオチドは、本明細書中で用いる場合、一般的に以下の：
ｉ）予定コード配列を含むポリヌクレオチド、または
ｉｉ）予定アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または
ｉｉｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）または（ｉｉ）によりコードされるポリペプチドの断片であって、本明細書中に明記された少なくとも1つの予定活性を有する断片をコードするポリヌクレオチド、および
【００９０】
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかで限定されたようなポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズする、そして本明細書中に明記されたような少なくとも1つの予定活性を有するポリペプチドまたはその断片をコードする相補鎖であるポリヌクレオチド、ならびに
ｖ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列に縮重されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
あるいはこのようなポリヌクレオチドの相補的鎖
に関する。
【００９１】
ポリペプチド：少なくとも2つのアミノ酸を含む分子。アミノ酸は天然または合成性であり得る。
【００９２】
正荷電部分：負の電荷部分を引きつけ得る正の電荷を含む任意の部分。正荷電部分は、典型的には陽イオン性種中に見出され、その1つは、ｐＨ＝7で少なくとも1つの正荷電部分を含む種である。
【００９３】
クイルQuilＡ：ＱＡ−７、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８およびＱＡ−２１ならびにその他のサポニンを含有する粗製サポニン混合物であるキラヤバルクアラロシデQuillajabark AralosideＡ。
【００９４】
患者の領域：患者の特定の領域または部分、ならびにいくつかの場合には、全患者全体の領域。このような領域の実例は、肺領域、胃腸領域、心臓血管領域（例えば心筋組織）、腎領域、ならびにその他の身体領域、組織、リンパ球、受容体、器官等、例えば脈管構造および循環系、ならびに疾患組織、例えば癌組織である。「患者の領域」としては、例えば生物活性剤で処置される領域、生物活性剤の送達のために標的化される領域、および診断的画像法により画像化される領域が挙げられる。「患者の領域」は、好ましくは内部であるが、しかし所望により、それは外部であり得る。「脈管構造」という語句は、血管（例えば動脈、静脈等）を意味する。「胃腸領域」という語句は、食道、胃、小および大腸ならびに直腸により限定される領域を含む。「腎領域」という語句は、腎臓および腎臓にまたは腎臓から直接導かれる脈管構造、例えば腹大動脈により限定される領域を意味する。
【００９５】
受容体：特定物質の選択的結合により一般に特性化される細胞内または細胞の表面の分子構造。例示的受容体としては、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体断片、免疫グロブリンに対する細胞表面受容体および細胞質受容体が挙げられる。
【００９６】
糖質：本発明のサポニンの糖部分。
サポニン：グルコシド結合により、ｉ）トリテルペンアグリコン部分、ｉｉ）ステロールアグリコン部分、およびｉｉｉ）ステロイドアルカロイドアグリコン部分のうちの1つに連結される糖質部分を含む任意の化合物。サポニンは、本明細書中で用いられる場合、実質的に精製されたサポニン、あるいは粗製組成物または予定精製手段により得られる組成物中に含まれる１つまたはそれ以上のサポニンを意味する。サポニンは、任意のサポニンの任意の生物学的活性断片も意味する。本発明に関するサポニンは、天然または合成であり得るし、もしくはそれらは化学合成、あるいはin vitroまたはin vivoでの１つまたはそれ以上の酵素触媒過程を包含する酵素的合成により製造され得る。一次サポニンは一般に、本明細書中に明記されたような遺伝子決定基との会合を形成できないが、一方、このような会合は二次サポニンおよび遺伝子決定基間で形成される。
【００９７】
二次サポニン：二次サポニンは、陰イオン性、中性または陽イオン性であり得る。二次サポニンは、生物活性剤、例えば遺伝子決定基との静電的相互作用および／または疎水性相互作用を生成し得る。陽イオン性サポニンという用語は、ｐＨ7.0で正味正電荷を保有するサポニンを意味する。二次サポニンは、好ましくは陽イオン性サポニンである。あるいは二次サポニンは、全体的正味電荷が正でないことに関係なく、好ましくはｐＨ7.0で正電荷を保有する少なくとも1つの部分を含む。したがって二次サポニンは、好ましくはｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電部分または反応基を含み、そしてこの正荷電部分または反応基は、本発明の好ましい一実施態様によれば、静電的相互作用により、生物活性基、例えば遺伝子決定基を接触し得る。別の実施態様では、二次サポニンは、好ましくは、疎水性相互作用により、生物活性基、例えば遺伝子決定基を接触し得る非荷電部分または非極性反応基を含む。好ましい二次サポニンの一群は、アグリコン部分として合成または天然の、陽イオン性キラン酸またはｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電基を含むキラン酸を含むサポニンである。
【００９８】
ステロール：ゴナンの形態の、本明細書中で以下に示されるようなステロイドの特徴的骨格構造を含むその任意の誘導体を含めた任意のステロール。ステロイドは全て、文字Ａ、Ｂ、ＣおよびＤにより慣用的に示される4つの環中に整列され、28個の水素原子に結合された17個の炭素原子からなる特徴的分子構造と関連づけられる。
【００９９】
【化１】
2010180249.tif 000002
【０１００】
この骨格構造（１）はゴナンと命名されており、そしてしばしばステロイド核と呼ばれる。この骨格構造は、一度に2〜3の原子、部分または反応基の除去、置換または付加により、特に非限定数の方法で修飾され得る。植物および動物からステロイドを単離し、そして任意に、天然ステロイドの化学的および／または酵素的処置により誘導体を調製する方法を、当業者は既知である。より簡単な化合物あるいは天然前駆体またはその一部から合成ステロイドを合成し、そして任意に、このようにして得られたステロイドの化学的および／または酵素的処置によりこのような化合物の誘導体を調製する方法も、当業者は既知である。したがって本発明の好ましい一ステロイド化合物は、ステロール、およびその任意の陽イオン性誘導体、特に陽イオン性部分または陽イオン性反応基を、例えばステロールのＯＨ基、例えばステロイド骨格の位置３に位置するＯＨ基、例えば位置３に位置するコレステロールのＯＨ基（Ｃ３または３−ＯＨ）に連結することにより得られる陽イオン性誘導体である。
【０１０１】
その結果として、本発明の好ましいステロールは、コレステロール（ＣＡＳ（Chemical Abstract）寄託番号57-88-5）およびその任意の陽イオン性誘導体、特に陽イオン性部分または陽イオン性反応基をステロイド骨格の位置３に位置するＯＨ基（Ｃ３または３−ＯＨ）に連結することにより得られる陽イオン性誘導体である。このような化合物の好ましい例は、図５に示されている。一次ステロールは一般に本明細書中に明記されたように遺伝子決定基との会合を生成し得ないが、一方、このような会合は二次ステロールおよび遺伝子決定基間で形成される。
【０１０２】
二次ステロール：二次ステロールは、陰イオン性、中性または陽イオン性であり得る。二次ステロールは、生物活性剤、例えば遺伝子決定基と静電的相互作用および／または疎水性相互作用を生じ得る。陽イオン性ステロールという用語は、ｐＨ7.0で正味正電荷を保有するステロールを意味する。二次ステロールは、好ましくは陽イオン性ステロールである。あるいは二次ステロールは、全体的正味電荷が正でないにもかかわらず、好ましくはｐＨ7.0で正電荷を保有する少なくとも1つの部分を含む。したがって二次ステロールは、好ましくはｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電部分または反応基を含み、この正荷電部分または反応基は、本発明の好ましい一実施態様によれば、静電的相互作用により生物活性基、例えば遺伝子決定基と接触し得る。別の実施態様では、二次ステロールは好ましくは非荷電部分または非極性反応基を含み、そしてこの非荷電部分または非極性反応基は、本発明の別の好ましい実施態様によれば、疎水性相互作用により生物活性基、例えば遺伝子決定基と接触し得る。
【０１０３】
ステロイドアルカロイドグリコシド：グリコシド結合によりステロイドアルカロイドアグリコン部分に連結される糖質部分を含むサポニン。
ステロイドグリコシド：グリコシド結合によりステロイドアグリコン部分に連結される糖質部分を含むサポニン。
【０１０４】
緊縮（ストリンジェント）条件：緊縮条件とは、本明細書中で用いられる場合、例えばSouthern E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517により記載されたようなサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションとともに普通に適用されるような緊縮性を意味する。このような目的のために、予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの過程を包含することは、常套的慣習である。このような過程は普通は、Sambrook et al., 1989, “Molecular Cloning/ A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように、6xＳＳＰＥ、5％デンハート、0.5％ＳＤＳ、50％ホルムアミド、100 μg/ml変性サケ精巣ＤＮＡ（42℃で18時間インキュベーション）を含有する溶液を用いて実施され、その後2xＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳで洗浄し（室温および37℃で）、そして0.1xＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳ（68℃で30分間インキュベーション）で洗浄する。
【０１０５】
実質的に純粋なサポニン：その天然状態でサポニンと普通に会合される化合物を実質的に含まないサポニンであって、この場合、サポニンは一定の且つ再現可能なクロマトグラフィー応答および／または溶離プロフィールおよび／または生物学的活性を示す。「実質的に純粋な」という用語は、本明細書中で用いる場合、サポニンとその他の化合物の人工的または合成混合物を除外することを意味しない。好ましくは実質的に純粋なサポニンは、１つまたはそれ以上の以下の標準に精製される：ｉ）クロロホルム／メタノール／水（60/45/10, v/v/v）中の40 mm酢酸の溶媒系中でシリカゲルＴＬＣ（EM Science ＨＰＴＬＣ  Ｓｉ６０）上の唯一の主要炭水化物染色帯域として出現、ｉｉ）メタノール／水（70/30, v/v）の溶媒系中で逆相ＴＬＣ（EM Science シリカゲルＲＰ−８）上の唯一の主要炭水化物染色帯域として出現、ｉｉｉ）メタノール／水（58/42, v/v）中の40 mM酢酸中のＶｙｄａｃ  Ｃ４（粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径4.6 mm x長さ25 cm）上の逆相ＨＰＬＣ上の唯一の主要ピークとして出現。
【０１０６】
ターゲッティングリガンド：本発明の複合体中に含まれる場合、本発明の複合体またはこのような複合体を含む組成物、例えば生分解性ミクロフォアまたはリポソームを用いてin vivoまたはin vitroで組織および／または受容体のターゲッティングを促し得る任意の材料または物質。後者の場合、複合体がターゲッティングリガンドも含むか否かに関係なく、組成物はターゲッティングリガンドを含む。ターゲッティングリガンドは、合成、半合成または天然であり得る。ターゲッティングリガンドとして役立ち得る材料または物質としては、例えばタンパク質、例えば抗体、抗体断片、ホルモン、ホルモン、ホルモン類似体、糖タンパク質およびレクチン、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、糖、糖質、例えば単糖および多糖、炭水化物、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補因子、ならびに遺伝子決定基、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド酸構築物、ポリヌクレオチド、任意に誘導化ヌクレオチド、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）および／またはＬＮＡ（ロック核酸）を含む構築物またはポリヌクレオチドが挙げられる。ターゲッティングリガンドに対する「前駆体」とは、ターゲッティングリガンドに転化され得る任意の材料または物質を指す。このような転化は、例えばターゲッティングリガンドに前駆体を固定することを包含し得る。例示的ターゲッティング前駆体部分としては、マレイミド基、ジスルフィド基、例えばオルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン基、アジド基およびα−ヨードアセチル基が挙げられる。
【０１０７】
治療薬：「製薬的作用物質」または「薬物」または「薬剤」という用語は、患者における不調、苦痛、症状、疾患または傷害の処置に用いられ得る任意の治療的または予防的作用物質を指す。治療的に有用な遺伝子決定基、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、製剤または薬物の意味内に含まれ得る。本明細書中で用いる場合、「治療薬」、「製薬的作用物質」または「薬物」または「薬剤」という用語は、生物活性剤の一型である。
【０１０８】
組織：特定の機能を実行し得る特殊化細胞。「組織」という用語は、個々の細胞、あるいは複数の細胞または細胞の集合物、例えば膜または器官を指し得る。「組織」という用語は、異常細胞または複数の異常細胞への言及も包含する。例示的組織としては、肺組織、心筋組織、例えば心筋細胞および心臓筋肉細胞、膜組織、例えば内皮および上皮、板、血液、結合組織、例えば間隙性組織、ならびに腫瘍が挙げられる。「細胞」とは、膜により取り囲まれた原形質の塊、例えば有核および無核細胞ならびに細胞小器官を含む有機的組織を作り上げる微小原形質塊のいずれかを指す。
【０１０９】
治療：ヒトまたは動物身体を含めた個体における臨床症状の外科手術を含めた療法を包含する方法。療法は、予防的、改善的または治癒的であり得る。
トリテルペングリコシド：グリコシド結合によりトリテルペンアグリコン部分に連結された糖質部分を含むサポニン。
ゼータ電位：ゼータ電位のパラメーターは、粒子間の反発力または引力の大きさの測定値である。その測定は、ある程度まで粒子の全体的電荷に関連するが、しかし分散液中の粒子の安定性にも関連する。極性液体中の粒子の表面電荷は粒子の表面の電位に直接的に相関しないが、しかし粒子のすぐ近くの電位と相関する。
【０１１０】
本発明の詳細な説明
本発明は、生物活性剤、例えば遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチド、治療薬、例えばポリペプチド、診断剤およびイメージング剤を結合し得る複合体に関する。本発明の複合体と結合すると、生物活性剤は、生物学的細胞、例えばヒトまたは動物細胞により取り込まれ得る。したがって本発明の複合体は、in vivoまたはin vitroで例えばポリヌクレオチドを用いて生物学的細胞をトランスフェクトするための一手段として有用である。
【０１１１】
その他の好ましい実施態様では、患者に生物活性剤を送達し、および／または患者における症状を治療する方法であって、本発明の複合体またはこのような複合体を含む組成物を患者に投与することを包含する方法が提供される。
【０１１２】
本発明は、患者に生物活性剤を送達し、および／または患者における症状を治療する方法であって、本発明の複合体またはこのような複合体を含む組成物を患者に投与することを包含する方法を記載する。
本発明は、患者における罹患組織の存在の診断方法であって、本発明の複合体またはこのような複合体を含む組成物を患者に投与することを包含する方法も記載する。
本発明は、患者の内部領域の画像の提供方法であって、本発明の複合体またはこのような複合体を含む組成物を患者に投与することを包含する方法も記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、本発明の3つの主要クラスのサポニンの炭素骨格構造を示す。存在するゲニンの種類によって、本発明のサポニンは3つの主要クラス：ｉ）トリテルペングリコシド、ｉｉ）ステロイドグリコシド、およびｉｉｉ）ステロイドアルカロイドグリコシドに分けられ得る。
【図２】図２は、それらがβ−アミリン、α−アミリンまたはルペオール骨格構造を有するか否かによって、3つの主要クラスに分けられる種々の五環式トリテルペンの炭素骨格構造を示す。それに加えて、いくつかの小クラスも存在する。以下のトリテルペングリコシドのアグリコン骨格構造が図に示されている：オレアン（β−アミリン）、ウルサン（α−アミリン）、ルパン、タラキサスタン、タラキセラン、フリエデラン、グルチナンおよびホパン。
【図３】図３は、トリテルペングリコシドのオレアン−１２−エン骨格構造を示す。本発明に関連する多数のこのようなアグリコン変異体は、本明細書中の表１に列挙されている。
【図４】図４は、本発明による、そして本明細書中の表２に列挙されたトリテルペンアグリコンのその他の代表的変異体を示す。図４のアグリコンは、オレアン−１２−エン骨格構造を有さないアグリコンの代表である。例は、本明細書中の表２に列挙されている。
【図５】図５は、本発明による、そして本発明の複合体中に組入れられ得る好ましい二次ステロールを示す。列挙化合物は、Leventis, R. et al. (1989) Biochim Biophys Acta 1023, 124により記載されたようなＣｈｏＴＢおよびＣｈｏＳＣ；Avanti Lipidsにより記載され、本明細書中でさらに特性化されたようなＤＣ−ＣｈｏｌおよびＴＣ−Ｃｈｏｌ；Lee, E.R. et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 1701により記載されたようなリピド６７（ＧＬ−６７としても既知である）；ＢＧＴＣは３−β［Ｎ‘，Ｎ’−（ジグアニジオエチル−アミノエタン）カルバモイル］コレステロールに関する頭字語である；そしてＢＧＳＣは、３−β［４Ｎ−（１Ｎ，８Ｎ−ジグアニジノスペルミジン）−カルバモイル］コレステロールに関する頭字語である。
【図６】図６は、本発明による、そして本発明の複合体中に組入れられ得る好ましい親油性部分を示す。列挙化合物は、ＤＯＴＩＭまたは１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）−エチル］−２−（８（Ｚ）−ヘプタデセニル）−３−（２−ヒドロキシ−エチル）−イミダゾリニウムクロリド、ＤＯＤＡＣはジオレオイルジメチルアンモニウムクロリドに関する頭字語であり、そしてＧＡＰ−ＤＬＲＩＥは（＋／−）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロミドに関する頭字語である。
【図７】図７は、本発明の複合体中に組入れられ得るさらに別の好ましい親油性部分を示す。列挙化合物は、ＤＯＴＭＡまたはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥまたはＮ，Ｎ−ジメチル−１，２−ジミリストイルオキシ−３−アミノプロパン、ＤＯＳＰＡまたは２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートおよびＤＯＧＳ、あるいはBehr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982、米国特許第5171678号に記載されているようなトランスフェクタム(Ｒ)である。
【図８】図８は、本発明の複合体中に組入れられ得るさらに別の好ましい親油性部分を示す。列挙化合物は、ＤＯＴＡＰまたは（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルスルフェート；Ｔｆｘ−５０またはＮ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ‘−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムイオジド；ＤＤＡＢまたはジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド；およびＴＭ−ＴＰＳまたはテトラパルミチルスペルミンである。
【図９】図９は、電子顕微鏡（ＥＭ）による視覚的検査により評価した場合のＩＳＣＯＭ−マトリクスの生成に及ぼす有機溶媒の影響を示す。第一判定基準は、構造の形状および均一性、第二はＩＳＣＯＭ粒子の数であった。パネルＡに示されているように、ＩＳＣＯＭ−マトリクスの生成は、20％v/vの濃度まで、ＤＭＳＯの存在の影響を受けなかった。この限度を超えると、収量は影響を受けた。25％ＤＭＳＯでは、無傷構造は観察され得たが、しかしＩＳＣＯＭの数は低減された。本明細書中の実施例１に詳細に記載されているように、同一パターンがＤＭＦに関して観察された。図９のパネルＢは、ＥｔＯＨが約15％までの濃度で本方法に適合する、ということを実証する。いくつかの異なる構造が、この濃度で調製された無傷構造の間に出現した。
【図１０】図１０は、本発明の非崩壊ＩＳＣＯＭ複合体が、アミノ酸分析中の酸性加水分解の過酷な条件中の加水分解から包埋ペプチドを保護する、ということを示す。この結果は、ＩＳＣＯＭ構造の高安定性ならびにＩＳＣＯＭ内の化学的環境における差異を強調する。
【図１１】図１１は、実施例４に記載したように実施されたＤＣ−コレステロールを含有しないＩＳＣＯＭに関するゼータ電位の測定値を示す。図１２に記載した実験と同様に、ゼータ電位を5回測定した。平均ゼータ電位は約−50 mVであることが判明した(以下の表を参照)が、これは、図１２に示したようなＤＣ−コレステロールを含有するＩＳＣＯＭ(ＤＣ−コレステロール対コレステロール比1:1または1:2)とは有意に異なる。
【表１】
2010180249.tif 000003
【図１２】図１２は、ＤＣ−コレステロールの形態で二次ステロールを含む修飾化ＩＳＣＯＭに関するゼータ電位の測定値を示す。ＤＣ−コレステロール対コレステロール比は、1:1（50％置換）であった。各曲線は、5回の測定値のうちの1つを表す。ゼータ電位は0 mVに近く、測定値間の多少の変動を伴った(以下の表を参照)。1:2のＤＣ−コレステロール対コレステロール比（25％）を有するＩＳＣＯＭが測定された場合、約−25mVの平均ゼータ電位が観察された(データは示されていない)。
【表２】
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【０１１４】
サポニン
本発明に関するサポニンを、以下の本明細書中で詳細に記載する。サポニンは、グリコシド結合により一緒に連結されたアグリコン化合物および糖質化合物を含むグリコシド化合物である。それらの疎水性(アグリコン)および親水性(糖質)部分の不斉分布は、本発明のサポニンに両親媒性特性を付与する。
【０１１５】
サポニンは、二次代謝産物として多数の生物体により産生される。それらは、高等植物の間に、そしていくつかの海洋性無脊椎動物において広範に分布する。植物物質はしばしば、かなりの量でトリテルペンサポニンを含有する。したがってプリムラの根は、約5〜10％のサポニンを、カンゾウの根は2％〜12％のグリシリジンを、セッケンボク樹皮は10％までのサポニン混合物を、そしてセイヨウトチノキの種子は13％までのアエシンaescineを含有する。言い換えれば、植物中のサポニンの濃度は、他の二次代謝産物と比較した場合、高い。
【０１１６】
サポニン分子のアグリコンまたは非糖質部分は、ゲニンまたはサポゲニンと呼ばれる。存在するゲニンの種類によって、サポニンは3つの主要クラス：ｉ)トリテルペングリコシド、ｉｉ)ステロイドグリコシド、およびｉｉｉ)ステロイドアルカロイドグリコシドに分けられる(図１)。
【０１１７】
トリテルペンサポニンを含むサポニンのほかに、本発明は、フロスタン骨格構造またはスピロスタン骨格構造に由来するステロイドサポゲニンを含むサポニンに関する。本発明はさらに、ソラニダン骨格構造またはスピロソラン骨格構造に由来するステロイドアルカロイドサポゲニンを含むサポニンに関する。ステロイドアルカロイドグリコシドまたはグリコアルカロイドは、ステロイドグリコシドとの多数の物理学的および生化学的特性を共有するが、しかしアルカロイドグリコシドは通常、それらのステロイド構造が窒素を含有するため、別個に考えられる。
【０１１８】
トリテルペングリコシドを含むサポニン
トリテルペングリコシドは、本発明の好ましい一クラスのサポニンを代表する。五環式トリテルペンは、それらがβ−アミリン骨格構造を有するか、α−アミリンまたはルペオール骨格構造を有するかによって、3つの主要クラスに分けられ得る。それに加えて、図２に示されているようにいくつかの小クラスも存在し得る。
【０１１９】
本発明によれば、トリテルペングリコシドの形態のサポニンは、好ましくはオレアン（β−アミリン）、ウルサン（α−アミリン）、ルパン、タラキサスタン、フリエデラン、グルチナン、ホパン、ダンマラン、ラノスタン、ホロスタンおよびシクロアルタンから成る化合物の群から選択されるアグリコン骨格構造を含む。
【０１２０】
トリテルペンアグリコンはＣ−３でヒドロキシル化され，そしてある種のメチル基はヒドロキシメチル、アルデヒドまたはカルボキシル官能基に酸化され得る。酸部分がトリテルペンアグリコンにエステル化される場合、エステルサポニンという用語は、それぞれのグリコシドに関して用いられる。このクラスのさらに重要な構造的素子は：Ｃ−１２（１３）での不飽和；Ｃ−２８、Ｃ−２３またはＣ−３０のメチル基の官能化；およびＣ−２、Ｃ−７、Ｃ−１１、Ｃ−１５、Ｃ−１６、Ｃ−１９でのポリヒドロキシル化である。付加的環構造の形成は、エーテル化またはラクトン化により可能であり、そして脂肪族酸によるエステル化も可能である。
【０１２１】
オレアナン骨格構造(オレアン−１２−エン骨格構造)を含むトリテルペングリコシドクラスのサポニンの多数の構造的変異体が存在する。本発明に関する多数のこのようなアグリコン変異体は、本明細書中の以下の表１に列挙されている。それらの骨格は、図３に示されている。
【０１２２】
本発明のトリテルペンアグリコンのその他の代表的変異体は、表２に列挙されている。表２のアグリコンは、オレアン−１２−エン骨格構造を有さないアグリコンの代表的なものである。このような骨格構造の例は、図４に示されている。
TschescheとWulff (1972)(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)による再検討文献は、オレアナンおよびその他のトリテルペンの両方の物理的定数と一緒に、さらなる参照および実例を示す。Mahatoと共同研究者（Das and Mahato, 1983; Mahato et al. 1992(これらの記載内容はともに、参照により本明細書中に含まれる)）は、物理的定数および植物供給源とともに近年単離されたトリテルペン(必ずしもサポニンからでない)の一覧を発表した。
【０１２３】
オレアナントリテルペン(およびそれらのグリコシドのいくつか)は、最新情報（Mallavarapu, 1990；この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）の対象であって、それらの発生および化学的性質についての種々の局面を網羅する。トリテルペンに関する情報の別の権威ある供給源は、Boiteauおよび同僚（1964；この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）によりかかれた本である。
【０１２４】
表１．一般的に発生するオレアン−１２−エンアグリコンの構造
【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
表２．トリテルペンアグリコン(オレアン−１２−エン型以外)。図４に示したように、骨格構造は大文字Ａ〜Ｉで示される。
【０１３０】
【表７】
2010180249.tif 000009
【０１３１】
【表８】
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【０１３２】
【表９】
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【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
本発明の複合体は、例えば約400ダルトンから2,000ダルトンより大きい範囲の分子量を有する。さらなる例は、約500ダルトン、例えば約600ダルトン、例えば約700ダルトン、例えば約800ダルトン、例えば約900ダルトン、例えば約1000ダルトン、例えば約1100ダルトン、例えば約1200ダルトン、例えば約1300ダルトン、例えば約1400ダルトン、例えば約1500ダルトン、例えば約1600ダルトン、例えば約1700ダルトン、例えば約1800ダルトン、例えば約1900ダルトン、例えば約2000ダルトン、好ましくは4000ダルトン未満である。
【０１３５】
本発明の一実施態様では、サポニン化合物は、１つまたはそれ以上の有機酸、例えば酢酸、マロン酸、アンゲリカ酸等でアシル化される(fx Massiot, G. & Lavaud, C., Stud. Nat. Prod. Chem. 15: 187-224 (1995)(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)参照)。
【０１３６】
サポニンの糖質部分
本発明のサポニン、例えば本明細書中の前記の表１および表２に示されたようなアグリコンは、グリコシドエーテルまたはエステル結合を介してアグリコン部分に結合される１つまたはそれ以上の線状または分枝糖鎖を有する。
【０１３７】
アグリコンに結合される糖鎖の数によって、サポニンはモノデスモシドサポニン（単一糖鎖を有する）またはビデスモシドサポニン（2つの糖鎖を有する）であり得る。
本発明のモノデスモシドサポニンにおいて、糖鎖は、好ましくはアグリコンのＣ−３でのグリコシドエーテル結合により結合される。Ｃ−３連結糖鎖のほかに、ビデスモシドサポニンは、エステル結合によりＣ−２８（トリテルペンサポニン）またはＣ−２６（ステロイドサポニン）で結合される二次糖鎖を有する。エステルの典型的不安定性のために、ビデスモシドサポニンは軽度加水分解によりそれらのモノデスモシド形態に容易に転化される（Hostettmann, K., et al., Methods Plant Biochem. 7: 435-471 (1991)）。
【０１３８】
本発明のビデスモシドサポニンは好ましくは2つの糖鎖を有し、このうちの一方はＣ−３でエーテル結合により結合され、そしてもう一方はＣ−２８（トリテルペンサポニン）でエステル結合により、あるいはＣ−２６（フロスタノールサポニン）でエーテル結合により結合され得る。
【０１３９】
ビデスモシドサポニンは、例えばトリテルペンサポニン中のＣ−２８でのエステル化糖の加水分解によりモノデスモシドサポニンに容易に転化され、そしてそれらはいくつかの特性および活性に関してモノデスモシドサポニンと異なる。さらにある糖鎖がＣ−３で結合される場合、二次糖基はアグリコンのＣ−１７でカルボキシル基にエステル化され得る。さらにいくつかのダンマラングリコシドおよびラノスタングリコシドは、二次またはさらに三次のグリコシド結合糖鎖を有し得る。
【０１４０】
本発明のトリデスモシドサポニンは、3つの糖鎖を有する。エステル化糖の加水分解は、ビデスモシドサポニンおよび／またはモノデスモシドサポニンへの転化を引き起こす。あるトリデスモシドトリテルペンの一例は、位置Ｃ−３、Ｃ−６およびＣ−２５でグリコシド的に置換された９，１９−シクロラノスタン(シクロアルタン)である。トリデスモシドオレアン−１２−エンサポニンの一例は、キノシドＡであって、この場合、糖はヘデラゲニンの位置Ｃ−３、Ｃ−２３およびＣ−２８に結合される（Meyer et al. 1990）。さらに１６α−ヒドロキシメジカゲン酸（ツァーン酸）のトリデスモシドは、アルファルファ（Medicago sativa, Leguminosae）の好気性部分に見出されている（Oleszek et al. 1992）。
【０１４１】
本発明のサポニンの糖質部分は、線状または分枝鎖であり、約11が、サポニン中でこれまでに見出された単糖単位の最高数である(クレマチスClematis manshurica(Ranunculaceae)からのクレマトシドＣ；Khorlin et al. 1965)。本発明のサポニンは、10未満の糖部分を、例えば9未満の糖部分、例えば8未満の糖部分、例えば7未満の糖部分、例えば6未満の糖部分、例えば5未満の糖部分、例えば4未満の糖部分、例えば3未満の糖部分、例えば2未満の糖部分、例えば1つの糖部分を含み得る。
【０１４２】
実際、これまでに単離されたほとんどのサポニンが、約2から約5の単糖残基を含有する相対的に短い(そしてしばしば非分枝の)糖鎖を有する傾向がある。KochetkovとKhorlin（1966）は、3〜4より多い単糖を含有するグリコシドに関してオリゴシドという用語を導入した。
【０１４３】
したがって１つまたはそれ以上の糖鎖を、例えば2または3つの糖鎖を含む本発明のサポニンも提供されるが、この場合、１つまたはそれ以上の糖鎖は、例えば約2〜約11の単糖残基、例えば約2〜約10の単糖残基、例えば約2〜約11の単糖残基、例えば約2〜約10の単糖、例えば約2〜約9の単糖残基、例えば約2〜約8の単糖、例えば約2〜約7の単糖残基、例えば約2〜約6の単糖、例えば約2〜約5の単糖残基、例えば約2〜約4の単糖、例えば約2〜約3の単糖残基を含む。
【０１４４】
別の実施態様では、本発明は、１つまたはそれ以上の糖鎖、例えば2または3つの糖鎖を含むサポニンを提供し、この場合、１つまたはそれ以上の糖鎖は、3つより多い単糖、例えば4つより多い単糖、例えば5つより多い単糖、例えば6つより多い単糖、例えば7つより多い単糖、例えば8つより多い単糖、例えば9つより多い単糖を、そして好ましくは11未満の単糖残基を含む。
【０１４５】
オリゴシドとは、本明細書中で用いる場合、4つまたはそれ以上の単糖、例えば5つより多い単糖、例えば6つより多い単糖を、そしてそれとは別々に、好ましくは12未満の単糖、例えば11未満の単糖、例えば10未満の単糖、例えば9未満の単糖、例えば8未満の単糖を含有するサポニングリコシドを指す。
【０１４６】
しかしながら本発明のサポニンは、１つまたはそれ以上の糖鎖、例えば2または3つの糖鎖も含み得るが、この場合、１つまたはそれ以上の前記の糖鎖は、11より多い単糖、例えば約15の単糖、例えば約20の単糖、例えば約25より多い単糖、例えば約40より多い単糖を含む。
【０１４７】
本発明のサポニングリコシドの好ましい単糖残基は、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、Ｄ−ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、Ｌ−ラムノース（Ｒｈａ）、Ｌ−アラビノース（Ａｒａ）、Ｄ−キシロース（Ｘｙｌ）およびＤ−フコース（Ｆｕｃ）である。Ｄ−アピオース（Ａｐｉ）、Ｄ−リボース（Ｒｉｂ）およびＤ−アロース（Ａｌｌ）も好ましい。さらに海洋性生物体から得られるサポニンは、しばしばＤ−キノボースquinovose(Ｑｕｉ)(時としてＤ−キノボーストchinovose記される)を含有する。前記の略号は全て、ＩＵＰＡＣ勧告（Pure Appl. Chem. (1982), vol. 54, p. 1517-1522）にしたがって用いられる。
【０１４８】
前記の単糖のほかに、本発明は、珍しい単糖、例えばいくつかのトリテルペングリコシド中に生じることが既知であるウロン酸にも関する。珍しい単糖の別の例は、アミノ糖質および／またはアシル化糖質を含む単糖である。
【０１４９】
サポニンアグリコンに直接結合される好ましい単糖の中の1つは、グルコース、アラビノース、グルクロン酸およびキシロースである。したがってこのような単糖は、サポニンの糖質部分とアグリコン部分との間の連結を形成する。
【０１５０】
本発明の別の群の糖質は、アシル化糖部分を含む糖質、ならびにメチル化および／または硫酸化糖部分を含む糖質である。
【０１５１】
一般的に同意された命名法にしたがって、グリコシド間の立体配置は本明細書中ではそれぞれαおよびβにより示され、そして本発明のサポニンの糖部分を作り上げる単糖は、ピラノース（ｐ）および／またはフラノース(ｆ)形態をとり得る。
【０１５２】
キラヤサポニン
本明細書中で用いる場合、セッケンボクQuillaja saponaria Molinaからのサポニンは、キラヤサポニンと呼ばれる。キラヤサポニンは、本発明の特に好ましいサポニンの一群を代表する。キラヤサポニンは一次サポニンまたは二次サポニンであり、この場合、後者の群のキラヤサポニンは遺伝子決定基との相互作用を生じ得る。
【０１５３】
キラヤサポニンは、20の構造的に密接に関連したトリテルペングリコシドの混合物として見出されるが、それらの間には小差異がある（Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26: 229 (1987)；同書26: 2357 (1987)；同書27: 1169 (1988)；Kensil et al., 米国特許第5,057,540号（1991）;Kensil et al., Vaccines 92: 35 (1992)）。キラヤサポニンは、化学的および免疫学的に十分に特性化されている（fx Dalsgaard, K. Arch. Gesamte Virusforsch. 44: 243 (1974); Dalsgaard, K., Acta Vet. Scand. 19 (Suppl. 69): 1 (1978); Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26: 229 (1987)；同書26: 2357 (1987)；同書27: 1168 (1988)；Kensil C. et al., J. Immunol. 146: 431 (1991); Kensil et al., 米国特許第5,057,540号（1991）;Kensil et al., Vaccines 92: 35 (1992); Bomford, R. et al., Vaccine 10: 572 (1992); Kensil C. et al.,米国特許第5,273,965号（1993）；Kensil C. et al.,米国特許第5,443,829号（1995）；Kensil C. et al.,米国特許第5,583,112号（1996）；およびKensil C. et al.,米国特許第5,650,398号（1997）(これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる)参照）。
【０１５４】
キラヤサポニンは、密接に関連したＯ−アシル化トリテルペングリコシド構造の一ファミリーに属する。それらは、位置３および２３に結合される分枝糖鎖ならびに位置２３にアルデヒド基を伴うアグリコントリテルペン(キラン酸)を有する。本発明に関するキラヤサポニンの独特の特徴は、エステル結合によりキラン酸の位置２８に結合されたフコピラノースのＣ−３ヒドロキシ基に連結されたある種のアシロイルアシル部分の存在である。好ましいアシル部分は、３，５−ジヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３，５−ジヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノ−ピラノシル−（１→２）−α−Ｌ−アラビノ−フラノシドおよび５−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシドである。
【０１５５】
本発明のキラヤサポニンは、セッケンボク種、例えばキラヤサポナリアモリナQuillaja saponaria Molinaおよびその他のモノから、粗製抽出物として、または種々の開放カラム技術(即ち、例えばイオン交換−、サイズ排除−、疎水性−、アフィニティー−ならびに別の方法によるクロマトグラフィー)により精製された抽出物として得られる。このような精製または半精製サポニンは一般に、当業界では、WO 95/09179（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように、「クイルQuilＡ」または「クアドリQuadriＡ」と呼ばれる。
【０１５６】
サポニンは、高分解能疎水性相互作用技術、例えばＨＰＬＣによっても精製され得るし、そしてこの形態の精製は、例えば「クアドリ１」、「クアドリ２」等として当業界で既知の分画を生じる(例えばWO 95/09179ならびにKamstrup et al. Vaccine (2000), vol 18, no.21, 2244-2249(これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)参照)。
特に好ましいのは、キラヤサポナリアモリナQuillaja saponaria Molinaからのサポニン抽出物、主としてK. Dalsgaard: Saponin Adjuvants, Bull. Off. Int. Epiz. 77(7-8), 1289-1295 (1972)にしたがって製造されるＤＱ−抽出物、ならびにK. Dalsgaard: Saponin Adjuvants III, Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974)にしたがって製造されるクイルＡである。このようなグリコシドの混合物も、本発明に関する。
【０１５７】
付加されるグリコシドの量は、それらの臨界ミセル生成濃度(ＣＭＣ)の少なくとも1〜3倍、好ましくは少なくとも5倍、特に少なくとも7〜12倍であるべきである。好ましくはクイルＡが用いられ、これは0.03重量％の臨界ミセル生成濃度を有する。その場合、クイルＡの量は、少なくとも0.02重量％、特に0.05〜0.5重量％、好ましくは0.2重量％であるべきである。
【０１５８】
本発明のサポニンのさらなる分画は、本明細書中で以下に詳細に記載される。米国特許第5,057,540号(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)によれば、サポニンは、南米産の樹木であるセッケンボク種のキラヤサポナリアモリナQuillaja saponaria Molinaの樹皮の水性抽出物から精製され得る。サポニン活性を有する少なくとも22のピークが分離可能である。
【０１５９】
主な精製キラヤサポニンは、ＱＡ−７、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８およびＱＡ−２１である。これらのサポニンは、高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および低圧シリカクロマトグラフィーにより精製された。ＱＡ−２１は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いてさらに精製され、そして2つのピークＱＡ−２１−Ｖ１およびＱＡ−２１−Ｖ２に分解され、これらは異なる化合物である。
【０１６０】
したがって「ＱＡ−２１」は、メタノール／水（58/42, v/v）中の40 mM酢酸中のＶＹＤＡＣ  Ｃ４（粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径4.6 mm x長さ25 cm）上の逆相ＨＰＬＣ上の単一ピークとして出現する構成成分ＱＡ−２１−Ｖ１およびＱＡ−２１−Ｖ２の混合物を意味する。構成成分分画は、さらなる精製構成成分に関して実施された実験または結果を説明する場合、特にＱＡ−２１−Ｖ１およびＱＡ−２１−Ｖ２と呼ばれる。
【０１６１】
キラヤサポナリアモリナQuillaja saponaria Molina樹皮からサポニンを精製するために、キラヤサポナリアモリナQuillaja saponaria Molina樹皮の水性抽出物が水に対して透析される。透析抽出物は凍結乾燥されて、メタノールで抽出され、そしてメタノール可溶性抽出物はさらに、シリカゲルクロマトグラフィーにより、および逆相高圧液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)により分別される。
【０１６２】
表３：個々のサポニンを示す逆相ＨＰＬＣピークおよびそれらの対応する保持時間
【０１６３】
【表１１】
2010180249.tif 000013
【０１６４】
前記のように、個々のサポニンは逆相ＨＰＬＣにより分離され得る。少なくとも22のピーク（ＱＡ−１〜ＱＡ−２２と呼ばれる）が分離可能である。個々の構成成分は、本明細書中の前記の表３に示したようなＶＹＤＡＣ  Ｃ４ＨＰＬＣカラム上の保持時間により同定される。各ピークは、逆相薄層クロマトグラフィー上に単一帯域のみを示す炭水化物ピークに対応する。
【０１６５】
実質的に純粋なＱＡ−７サポニンは、免疫アジュバント活性を有し、乾燥重量当たり約35％の炭水化物（アントロンにより検定した場合）を含有し、205〜210 nmのＵＶ吸収最大値を有し、1 mL/分の流速でメタノール／水（58/42, v/v）中の40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径4.6 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣで約9〜10分の保持時間を有し、50〜80％メタノールの勾配溶離により、40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径10 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラムから52〜53％メタノールで溶離し、水中で0.06％（w/v）およびリン酸塩緩衝化生理食塩水中で0.07％（w/v）の臨界ミセル濃度を有し、200 μg/mLまたはそれ以下の濃度でヒツジ赤血球の検出可能溶血を引き起こさず、そして単糖残基末端ラムノース、末端キシロース、末端グルコース、末端ガラクトース、３−キシロース、３，４−ラムノース、２，３−フコース、２，３−グルクロン酸およびアピオースを含有するとして特性化される(関連性は確定されない)。
【０１６６】
実質的に純粋なＱＡ−１７サポニンは、アジュバント活性を有し、乾燥重量当たり約29％の炭水化物（アントロンにより検定した場合）を含有し、205〜210 nmのＵＶ吸収最大値を有し、1 mL/分の流速でメタノール／水（58/42, v/v）中の40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径4.6 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣで約35分の保持時間を有し、50〜80％メタノールの勾配溶離により、40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径10 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ
Ｃ４カラムから63〜63％メタノールで溶離し、水中で0.06％（w/v）およびリン酸塩緩衝化生理食塩水中で0.03％（w/v）の臨界ミセル濃度を有し、25 μg/mLまたはそれ以上でヒツジ赤血球の溶血を引き起こし、そして単糖残基末端ラムノース、末端キシロース、２−フコース、３−キシロース、３，４−ラムノース、２，３−グルクロン酸、末端グルコース、２−アラビノース、末端ガラクトースおよびアピオースを含有するとして特性化される(関連性は確定されない)。
【０１６７】
実質的に純粋なＱＡ−１８サポニンは、免疫アジュバント活性を有し、乾燥重量当たり約25〜26％の炭水化物（アントロンにより検定した場合）を含有し、205〜210 nmのＵＶ吸収最大値を有し、1 mL/分の流速でメタノール／水（58/42, v/v）中の40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径4.6 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣで約38分の保持時間を有し、50〜80％メタノールの勾配溶離により、40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径10 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラムから64〜65％メタノールで溶離し、水中で0.04％（w/v）およびリン酸塩緩衝化生理食塩水中で0.02％（w/v）の臨界ミセル濃度を有し、25 μg/mLまたはそれ以上の濃度でヒツジ赤血球の溶血を引き起こし、そして単糖残基末端アラビノース、末端アピオース、末端キシロース、末端グルコース、末端ガラクトース、２−フコース、３−キシロース、３，４−ラムノースおよび２，３−グルクロン酸を含有するとして特性化される。
【０１６８】
実質的に純粋なＱＡ−２１サポニンは、免疫アジュバント活性を有し、乾燥重量当たり約22％の炭水化物（アントロンにより検定した場合）を含有し、205〜210 nmのＵＶ吸収最大値を有し、1 mL/分の流速でメタノール／水（58/42, v/v）中の40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径4.6 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣで約51分の保持時間を有し、50〜80％メタノールの勾配溶離により、40 mM酢酸の溶媒中で粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径10 mm x長さ25 cmを有するＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラムから69〜70％メタノールで溶離し、水中で0.03％（w/v）およびリン酸塩緩衝化生理食塩水中で0.02％（w/v）の臨界ミセル濃度を有し、25 μg/mLまたはそれ以上の濃度でヒツジ赤血球の溶血を引き起こすとして特性化される。構成成分分画である実質的に純粋なＱＡ−２１−Ｖ１およびＱＡ−２１−Ｖ２サポニンは、高速原子衝突−質量分析法(ＦＡＢ−ＭＳ)により同一分子量および同一スペクトルを有する。それらは、ＱＡ−２１−Ｖ１が末端アピオースを有し、ＱＡ−２１−Ｖ２ではキシロースである（したがって2つの末端キシロースを有し、アピオースを有さない）という点でのみ異なる。2つの構成成分は、単糖残基末端アラビノース、末端アピオース、末端キシロース、４−ラムノース、末端ガラクトース、２−フコース、３−キシロースおよび２，３−グルクロン酸を付加的に含有する。
【０１６９】
アルカリ性加水分解産物は、以下のように調製し得る。短時間のアルカリ性加水分解によるＱＡ−１８の処理は、１つの主要炭水化物含有アルカリ性加水分解産物(ＱＡ−１８−Ｈ)を生じた。精製ＱＡ−１８−ＨはＱＡ−１８から調製し、そして以下の方法で単離した。
【０１７０】
1 mLのＱＡ−１８（5 mg/ml）を室温で15分間、25μlの1 NＮａＯＨとともにインキュベート下。100 μlの1N酢酸の付加により、反応を停止させた。これらの加水分解条件を用いて、ＱＡ−１８を主要加水分解産物(ＱＡ−１８−Ｈ)に完全に転化させたが、これは8.0分の保持時間で一ピークで溶離するが、これに比して非加水分解化ＱＡ−１８に関しては66.8分であって、このことは、ＱＡ−１８−Ｈの親水性増大を示す（55/45メタノール／水（v/v）中の0.1％トリフルオロ酢酸中でのＶＹＤＡＣ  Ｃ４(内径4.6 mm x 長さ25 cm)上でクロマトグラフィー処理し、そして流速1 mLで180分間、64/36メタノール／水（v/v）に対する勾配中で溶離）。純ＱＡ−１８−Ｈ（保持時間8.0分）を含有するピークを、さらなる特性化のためにプールした。ＱＡ−２１−Ｈと呼ばれるＱＡ−２１の加水分解産物を調製し、同一方法で精製した。ＱＡ−２１−Ｈは９．３分の保持時間を有したが、これに比してその非水分解化前駆体ＱＡ−２１に関しては80.4分であった。加水分解産物はＨＰＬＣでの保持時間により、そして逆相薄層クロマトグラフィーにより、ＮＨ4ＨＣＯ3中での穏やかなアルカリ性加水分解を用いたHiguchi, R. et al., Phytochemistry 26: 229 (1987)の方法を用いて生成される主要加水分解産物と同一であることが示された(表４)。
【０１７１】
表４．主要アルカリ性加水分解産物の保持時間
【０１７２】
【表１２】
2010180249.tif 000014
【０１７３】
a  Cambridge Biotech加水分解条件：5 mg/mlのサポニン、ｐＨ13、保持時間＝室温で15分。
b  Higuchi等の加水分解条件：5 mg/mlのサポニン、6％ＮＨ4ＨＣＯ3、メタノール／Ｈ2Ｏ（1/1, v/v）、反応時間＝100℃で60分。
【０１７４】
ＨＰＬＣ条件：
ＶＹＤＡＣ  Ｃ４：粒子サイズ5 μm、330Å孔、内径10 mm x長さ25 cm
溶媒Ａ＝水中の0.1％トリフルオロ酢酸
溶媒Ｂ＝メタノール中の0.1％トリフルオロ酢酸
勾配＝55〜64％Ｂ／180分
流速＝1 ml/分
【０１７５】
さらに、これらの生成物ＱＡ−１８−ＨおよびＱＡ−２１−Ｈは、ＱＡ−７、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８およびＱＡ−２１ならびにその他のサポニンを含有する粗製サポニン混合物である「クイル−Ａ」の加水分解からの主要分解産物であることが示されたが、このことは、加水分解産物ＱＡ−２１−ＨおよびＱＡ−１８−Ｈが、構造的特性化のためにHiguchi等(上記)により単離された同一加水分解産物であることを示す。
【０１７６】
本発明のさらに好ましいサポニンは、例えばEP 0 436 620 B1(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)に記載されたもの、例えばＱＨＡ、ＱＨＢ、ＱＨＣと呼ばれる分画、あるいはキラヤサポニンの同様の組成物である。
【０１７７】
アシル化キラヤサポニンは、それらのモノデスモシド形態がそれらのアシル化および非アシル化ビデスモシド形態より有意に低有効性溶血剤であるため、例外的であると思われる（Pillion, D.J., et al., J. Pharm. Sci., 84: 1276-1279 (1996)）。
【０１７８】
キラヤサポニンのほかに、カスミソウGypsophila種およびサボンソウSaponaria種、例えばサポナリアオフィシナリスSaponaria officinalisから生じるサポニンも、本発明にしたがって有用であり、特にカスミソウ種およびサボンソウ種は、サポニングリコシドのアグリコン構成成分として「キラジン酸quillajic acid」を含むことが示されている。さらにカスミソウ種およびサボンソウ種からのこのようなサポニンは、好ましくは、位置４に連結または結合されるアルデヒド基、位置２８においてエステル結合により連結される分枝オリゴ糖、ならびにセッケンボクおよびカスミソウにおいて分枝オリゴ糖に連結される３−Ｏ−グルクロン酸(３−Ｏ−ｇｌｃＡ)を伴うトリテルペンアグリコンを含む。Q. saponariaおよびS. jenisseenisからのサポニンはアシル部分を含むが、一方、カスミソウ、サボンソウおよびAcanthophyllumからのサポニンはアシル部分を含まない。これらの非アシル化または脱アシル化サポニンは、本発明において有用である。
【０１７９】
さらに望ましいトリテルペンサポニンは、アカントフィルムスクアロスムAcanthophyllum squarrosumから単離されるビデスモシドサポニン、スクアロシドＡ；サポニンルシオシドＰ；およびシレネジェニセエンシスウィルドSilene jenisseensis Willdから単離される2つのアシル化サポニンである。これらの化合物の簡単な説明を以下に示す。
【０１８０】
スクアロシドＡは、そのアグリコンギプソゲニンのＣ−３およびＣ−２８に連結された2つのオリゴ糖鎖を含有するアビデスモシドサポニンである。ギプソフィラサポニンと同様に、それはアグリコンのＣ−４に連結されたアルデヒド基を、およびＣ−３にグルクロン酸残基を有する。さらにそれはＣ−２８にアシル化フコース残基を含有する。スクアロシドＡは、in vitroリンパ増殖性試験により測定した場合、免疫調節活性を有する、ということが示されている。これらの見掛け上非特異的な免疫調節作用は用量依存性であった：μg範囲の濃度での抑制作用およびpg範囲の刺激剤作用。
【０１８１】
ルシオシドＰは、そのアグリコンキラン酸のＣ−３およびＣ−２８に連結された炭水化物残基を、ならびにＣ−４にアルデヒド基を有するビデスモシドサポニンである。ルシオシドＰは、Ｃ−３にグルクロン酸残基を有する。
【０１８２】
2つのアシル化サポニンは、カリオフィラセアシレネジェニセエンシスCaryophyllacea Silene jenisseensisから単離された。これらのサポニンは、それらのアグリコンキラン酸のＣ−３およびＣ−２８に連結された炭水化物を有する。Ｃ−３およびＣ−２８に連結された炭水化物残基は、それぞれグルクロン酸およびフコースである。フコース残基は、ｐ−メトキシシンナモイル基でアシル化されて、トランス−およびシス−ｐ−メトキシシンナモイルトリテルペングルコシドを生じる。
【０１８３】
本明細書中ですぐ上に記述したサポニンはアルデヒド基を有するが、しかしそれらは、in vitro化学発光顆粒球検定により検出した場合に、見掛け上、免疫刺激活性または有意低減免疫刺激活性を有さない。
【０１８４】
本発明の有用なサポニンのさらに別の例は、例えばチコセツサポニンChikosetsusaponinＩＶ、カレンデュラCalendula−グルコシドＣ、チクセツサポニンChikusetsusaponinＶ、アキランテスAchyranthes−サポニンＢ、カレンデュラCalendula−グルコシドＡ、アラロシドAralosideＣ、プトランジアPutranjia−サポニンＩＩＩ、ベルサマサポノシドBersamasaponoside、プトランジアPutranjia−サポニンＩＶ、トリコシドTrichosideＡ、トリコシドＢ、サポナシドSaponasideＡ、トリコシドＣ、ギプソシドGypsoside、ヌタノシドNutanoside、ジアントシドDianthosideＣ、サポナシドＤ、好ましくはアエスクルスヒポカスタヌムAesculus hippocastanumからのアエシンaescine（T. Patt and W. Winkler: Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskatanie (Aesculus hippocastanum), Arzneimittelforschung 10(4), 273-275 (1960)）から抽出される極性酸性ビスデスモシドのようなトリテルペンサポニン、あるいははギプソフィラストルチウムからのサポニン（R. Vochten, P. Joos and R. Ruyssen: Physicochemical properties of sapoalbin and their relation to the foam stability, J. Pharm. Belg. 42, 213-226 (1968)）に関する。
【０１８５】
セッケンボクQuillaja saponariaから得られる多数のいわゆる「修飾化サポニン」は、Kensil等により、例えば米国特許第5,273,965号、米国特許第5,443,829号および米国特許第5,650,398号(これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)に開示されている。修飾化キラヤサポニンは、典型的には、天然トリテルペンアルデヒド基の代わりにメチレンアルコール基またはメチレンアミノ基を含む。修飾化サポニンは、それらの糖質部分に関してさらに修飾され得る。
【０１８６】
本発明の興味深い一サポニン組成物は、Ronnberg等によりVaccine (1995), vol. 13, no.14, p. 1375-1382に、ならびにVaccine (1997), vol. 15, no.17-18, p. 1820-1826に記載されているように、各々の分画のそれぞれ7/10（70％）、0/10（0％）ＱＨ−Ｂおよび3/10（30％）ＱＨ−Ｃを含むいわゆる「７−０−３」組成物である。
【０１８７】
両方が存在する複合体中の一次サポニンと二次サポニンとの間の比は、好ましくは1000:1未満から好ましくは1:1000より大きい。好ましい比は、約100:1、例えば約80:1、例えば約60:1、例えば約50:1、例えば約40:1、例えば約30:1、例えば約25:1、例えば約20:1、例えば約18:1、例えば約16:1、例えば約14:1、例えば約12:1、例えば約10:1、例えば約9:1、例えば約8:1、例えば約7:1、例えば約6:1、例えば約5:1、例えば約4:1、例えば約3:1、例えば約2:1、例えば約1.9:1、例えば約1.8:1、例えば約1.7:1、例えば約1.6:1、例えば約1.5:1、例えば約1.4:1、例えば約1.3:1、例えば約1.2:1、例えば約1.1:1、例えば約1:1、例えば約1:1.1、例えば約1:1.2、例えば約1:1.3、例えば約1:1.4、例えば約1:1.5、例えば約1:2、例えば約1:3、例えば約1:4、例えば約1:5、例えば約1:10、例えば約1:20、例えば約1:40、例えば約1:60、例えば約1:80、例えば約1:100である。
【０１８８】
ステロールおよびステロイド
有用なステロールは、この情況においては、サポニンと結合して本発明の複合体の一部を形成するものである。好ましいステロールは、コレステロールならびにその前駆体および誘導体、例えばフィトステロール、例えばラノステロール、ルミステロール、スチグマステロール、シトステロール、ミコステロール、エルゴステロールおよびチオコレステロールであり、この最後のものは、チオール部分により薬剤を結合するために用いられ得る。ノルジヒドロ−エピ−アンドステロールは、本発明のさらに別の好ましいステロールである。
【０１８９】
ステロールとは別に、本発明は、少なくとも1つの一次および／または二次ステロールがステロイドにより一部または全部置換される複合体にも関する。一実施態様では、本発明の複合体は、ステロール化合物の代わりにステロイド化合物を含む。一次およびにジステロールを特性化するために本明細書中で用いられる定義および技術用語は、必要に応じて変更を加えて、一次およびにジステロイドに適用する。
【０１９０】
本発明のステロイドを、本明細書中で以下でさらに詳細に例示する。本発明のステロールはステロイドの特徴的骨格構造を含むので、ステロイドの説明は本発明のステロールの骨格の説明でもあり、それらのうちの1つが、ＣＡＳ（Chemical Abstract）寄託番号57-88-5を有するコレステロール、またはその陽イオン性誘導体、特にＯＨ基、例えばステロイド骨格の位置３に位置するＯＨ基、例えば位置３に位置するコレステロールのＯＨ基(Ｃ３または３−ＯＨ)に、陽イオン性部分または陽イオン性反応基を連結することにより得られる陽イオン性誘導体である。
【０１９１】
ステロイドは全て、文字Ａ、Ｂ、ＣおよびＤにより慣用的に示される4つの環中に整列され、28の水素原子に結合された17の炭素原子から成る特徴的分子構造に関連する。
【化２】
2010180249.tif 000015
【０１９２】
ゴナンと命名され、そしてしばしばステロイド核と呼ばれるこの親構造（１）は、実際的非限定数の方法で、同時の2〜3の原子の除去、置換または付加により、修飾され得る。数百のステロイドが植物および動物から単離され、そして数千以上が、天然ステロイドの化学的処理により、またはより簡単な化合物からのおよびダイより調製されてきた。
【０１９３】
ステロイド核は三次元構造であり、そして原子または基は、空間的有向結合によりそれに結合される。この核の多数の立体異性体が考えられる(そして合成され得る)が、しかし天然ステロイドのほとんどのクラスの飽和核構造は、環ＡおよびＢの接合時を除いて、似ている。単純化三次元図を用いて、立体化学的詳細を説明し得る。例えばアンドロスタンは多数の天然および合成ステロイドに共通であり、それぞれＡ／Ｂ環融合がシスおよびトランスと呼ばれる2つの形態(２および３)で存在する。
【０１９４】
【化３】
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【０１９５】
シス異性体では、メチル基ＣＨ3との、ならびに水素原子Ｈとの結合はともに、残りの分子により限定される全体的平面から上方に突出するが、一方、トランス異性体では、メチル基は上に突き出て、水素は下に突き出る。しかしながら通常は、ステロイド構造は、４および５のような平面投射図として表され、これはそれぞれ２および３に対応する。
【化４】
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【０１９６】
環ＡおよびＢの立体化学は、図の平面の上(αと示される)またはその下(β)のように、Ｃ５(即ち炭素数５；ステロイド番号は以下で説明される)で結合される水素原子の配向を示すことにより、明記されねばならない。α−、β−記号表示は、ステロイド環系内の飽和(完全置換化)炭素に結合される任意の置換基の配向を示すために、同様に用いられる。不飽和炭素に結合される基は、(エチレンの場合と同様に)環系の隣接炭素と同一平面にあり、配向は明記される必要はない。置換基の配向が未知である場合、それは記号ξを割り当てられる。β−結合化置換基の結合は、実践により４におけるように図で示され、α−置換基の結合は５におけるように破線で示され、そしてξ−置換基の場合は波線で示される。
【０１９７】
ステロイド分子の各炭素原子は番号を付され、その番号は、この位置が炭素原子に専有されようとされまいと、仮定親骨格構造（６）中の特定の位置に指定される。
【化５】
2010180249.tif 000018
【０１９８】
ステロイドは、国際理論および応用化学連合International Union of Pure and Applied Chemistryにより同意された体系的規則にしたがった骨格基礎構造の名称の修飾により命名される。適切な基礎構造の名称に接頭語および接尾語を付すことにより、置換基またはその他の構造的修飾の特質が示される。接頭語および接尾語は、修飾が起こる炭素骨格中の位置を示すロカントと呼ばれる数字を含み、そして必要な場合には、置換基の配向がα−またはβ−として示される。例えば位置３の炭素原子は、Ｃ３と呼ばれる；Ｃ３に結合されるヒドロキシル基は、３−ＯＨ基と、または特定的に、３α−ＯＨまたは３β−ＯＨ基と呼ばれる。ステロイド核の細部にわたる差異のほかに、位置１７に結合された原子基(側鎖)のサイズおよび構造の変異により、種々のクラスのステロイドが識別される。天然化合物またはそれらが最も典型的である化合物のクラスの名称からのより共通の基本構造の名称の偏向は、当業者には既知である。このような名称のあいまいでない使用のためには、Ｃ５での水素の配向(αまたはβ)が明記されねばならない。他の修飾が示されない場合には、核は（２）および（３）に示されたのと同様であると考えられるが、但し、カルダノリドおよびブファノリドの場合、これらの種類の化合物は、５β、１４β立体配置を特徴的に保有するが、しかしながらこれは明記されていない。
【０１９９】
好ましい二次ステロールは、陽イオン性ステロールおよびｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電基を含むステロールである。好ましいステロールは、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）および／またはＮ−（トリメチルアンモニオエタン）−カルバモイルコレステロール（ＴＣ−コレステロール）を含むかまたはそれらを本質的にそれらから成る。さらなる好ましい二次ステロールは、図５に記載されている。
【０２００】
二次ステロールは陽イオン性ステロール、例えば陽イオン性コレステロールを含み、この場合、ＯＨ基（コレステロールの場合、位置３に位置する）は正荷電基またはｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正電荷を含む基に置換される、と理解される。
【０２０１】
両方が存在する複合体中の一次ステロールと二次ステロールとの間の比は、好ましくは1000:1未満から好ましくは1:1000より大きい。好ましい比は、約100:1、例えば約80:1、例えば約60:1、例えば約50:1、例えば約40:1、例えば約30:1、例えば約25:1、例えば約20:1、例えば約18:1、例えば約16:1、例えば約14:1、例えば約12:1、例えば約10:1、例えば約9:1、例えば約8:1、例えば約7:1、例えば約6:1、例えば約5:1、例えば約4:1、例えば約3:1、例えば約2:1、例えば約1.9:1、例えば約1.8:1、例えば約1.7:1、例えば約1.6:1、例えば約1.5:1、例えば約1.4:1、例えば約1.3:1、例えば約1.2:1、例えば約1.1:1、例えば約1:1、例えば約1:1.1、例えば約1:1.2、例えば約1:1.3、例えば約1:1.4、例えば約1:1.5、例えば約1:2、例えば約1:3、例えば約1:4、例えば約1:5、例えば約1:10、例えば約1:20、例えば約1:40、例えば約1:60、例えば約1:80、例えば約1:100である。
【０２０２】
リンカー基
デアシルサポニンおよび非アシルサポニンは親油性部分に直接連結され得るし、あるいは連結基を介して連結され得る。「連結基」という用語は、デスアシルサポニン、非アシル化サポニンまたはそれらの混合物を親油性部分に共有的に結合するために用いられ得る１つまたはそれ以上の二価性分子を意図される。
【０２０３】
リンカー基は、一実施態様では、トリテルペンコア構造上の３−Ｏ−グルクロン酸部分のカルボン酸基に、そして親油性部分に存在する適切な官能基に共有的に結合する。
【０２０４】
本発明のサポニンは、親油性部分または生物活性剤、例えば遺伝子決定基に直接的に連結され得る氏、あるいはそれらは連結きを介して連結され得る。「連結基」という用語は、生物活性剤、例えば遺伝子決定基にサポニンまたはサポニン混合物を共有的に結合するために用いられ得る１つまたはそれ以上の二価性分子を意図される。リンカー基は、サポニンの任意の部分に結合され得る。
【０２０５】
典型的には、サポニンの構成成分であるグルクロン酸の活性エステルの調製と、その後の活性エステルと生物活性剤、例えば遺伝子決定基上の求核性官能基との反応により、サポニンは、親油性部分または生物活性剤、例えば遺伝子決定基に連結される。
【０２０６】
いくつかの親油性物質含有化合物、例えば脂肪族アミンおよびアルコール、脂肪酸、ポリエチレングリコールおよびテルペンが、例えばデアシルサポニンの３−Ｏ−ｇｌｃＡ残基(３−グルクロン酸残基)に、そして非アシル化サポニンの３−Ｏ−ｇｌｃＡ残基に付加され得る。親油性物質は、飽和または不飽和され得る脂肪族または環状構造であり得る。例として、脂肪酸、テルペン、脂肪族アミン、脂肪族アルコール、脂肪族メルカプタン、グリコシル−脂肪酸、糖脂質、リン脂質、ならびにモノ−およびジ−アシルグリセロールは、非アシル化サポニンまたはデスアシルサポニンに共有的に結合され得る。
【０２０７】
結合は、３−グルクロン酸部分の酸部分またはこの位置での活性化酸官能基と共有的に反応する親油性部分上の官能基を介してであり得る。あるいは二価性リンカーは、一次および／または二次サポニンの３−Ｏ−ｇｌｃＡ残基に親油性物質を接合するために用いられ得る。
【０２０８】
有用な脂肪酸としては、Ｃ6〜Ｃ24の脂肪酸、例えばＣ7〜Ｃ20の脂肪酸、例えばＣ7〜Ｃ18の脂肪酸が挙げられる。有用な脂肪酸の例としては、飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸およびリグノセリン酸、ならびに不飽和脂肪酸、例えばパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸が挙げられる。
【０２０９】
有用な脂肪族アミン、脂肪族アルコールおよび脂肪族メルカプタンとしては、炭素数約6〜24の、例えば炭素数6〜20の、例えば炭素数6〜16の、例えば炭素数8〜12の直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和脂肪族基を有するアミンおよびアルコールおよびメルカプタン(Ｒ−ＳＨ)が挙げられる。有用な脂肪族アミンの例としては、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、スフィンゴシンおよびフィトスフィンゴシンが挙げられる。有用な脂肪族アルコールの例としては、オクタノール、ノナノール、デカノール、ドデカノール、ヘキサデカノール、キミルアルコールおよびセラキルアルコールが挙げられる。
【０２１０】
有用なテルペノイドとしては、レチノール、レチナール、ビサボロール、シトラール、シトロネラール、シトロネロールおよびシナロオールが挙げられる。
【０２１１】
有用なモノ−およびジ−アシルグリセロールとしては、モノ−およびジ−エステル化グリセロールが挙げられるが、この場合、アシル基は8〜20個の、例えば8〜16個の炭素原子を含む。
【０２１２】
有用なポリエチレングリコールは、式Ｈ−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＯＨ（式中、エチレンオキシドの数であるｎは4〜14である）を有する。有用なポリエチレングリコールの例としては、ＰＥＧ２００(ｎ＝4)、ＰＥＧ４００(ｎ＝8〜9)およびＰＥＧ６００(ｎ＝12〜14)が挙げられる。
【０２１３】
エチレンオキシド単位(ｎ)が1〜8であり、そしてアルキル基がＣ6〜Ｃ18である、有用なポリエチレングリコール脂肪アルコールエーテル。
【０２１４】
両親媒性特質、即ち親水性および疎水性基の不斉分布を有する側鎖は、例えば細胞受容体へのトリテルペンアルデヒドの接近可能性を助長し得る。このような側鎖中の負荷電カルボキシル基の存在は、トリテルペン基の反発作用に寄与し、したがってそれらの回転自由度をより高度にさせ得る。この最後の因子は、イミン生成カルボニル基への細胞受容体の接近可能性を十中八九増大する。
【０２１５】
好ましい一実施態様では、サポニンは、サポニンの構成成分であるグルクロン酸の活性エステルの調製と、その後の活性エステルと親油性部分上の求核性官能基または生物活性剤、例えば遺伝子決定基との反応により、親油性部分に、または生物活性剤、例えば遺伝子決定基に連結され、このような活性エステルとしては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびｐ−ニトロフェノールのグルクロン酸塩が挙げられ得る。活性エステルは、脱水剤、例えばジシクロへきしるカルボジイミド(ＤＣＣ)、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド(ＥＤＣ)および１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミドメチオジド(ＥＤＣｌ)の存在下でのサポニンのカルボキシ基とアルコールとの反応により調製され得る。
【０２１６】
接合体を生成するためのＥＤＣの使用は、米国特許第4,526,714号（Feijen 等）およびＰＣＴ出願公告WO91/01750およびArnon, R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)77: 6769-6772（1980）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示されている。生物活性剤、例えば遺伝子決定基は次に、水性溶液中で活性化エステルと混合されて、接合体を生じる。
【０２１７】
サポニンと生物活性剤、例えば遺伝子決定基との間のリンカー基が望ましい場合、サポニングルクロン酸塩の活性エステルが前記のように調製され、リンカー基、例えば２−アミノエタノール、アルキレンジアミン、アミノ酸、例えばグリシンまたはカルボキシ保護化アミノ酸、例えばグリシンｔｅｒｔ−ブチルエステルと反応する。
【０２１８】
リンカーが保護化カルボキシ基を含有する場合、保護基は除去され、リンカーの活性エステルが調製される(前記のように)。活性エステルは次に、生物活性剤、例えば遺伝子決定基と反応して、接合体を生じる。あるいは生物活性剤、例えば遺伝子決定基は、無水コハク酸を用いて誘導されて抗原コハク酸塩接合体を生じ、これは、WO91/01750に記載されているようにＥＤＣまたはＥＤＣｌの存在下で、リンカー上に遊離アミノまたはヒドロキシル基を有するサポニン−リンカー誘導体と縮合され得る。
【０２１９】
遊離アミノ基(アルキレンジアミン由来)を用いてリンカーを含むサポニン接合体を調製し、その任意の誘導体を含めた生物活性剤、例えば遺伝子決定基の遊離スルフヒドリル基と反応するヘテロ二価性架橋剤、例えばスルホスクシニミジル４−(Ｎ−マレイミドしクロヘキサン)−１−カルボキシレートで遊離アミノ基を架橋することも出来る。
【０２２０】
サポニンはまた、キラン酸のアルデヒド基とアミノリンカーとの反応により中間産物イミン接合体を生じ、その後ホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムにより還元されることによっても、リンカーに結合され得る。このようなリンカーの例としては、アミノアルコール、例えば２−アミノエタノールおよびジアミノ化合物、例えばエチレンジアミン、１，２−プロピレンジアミン、１，５−ペンタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン等が挙げられる。生物活性剤、例えば遺伝子決定基は次に、先ず無水コハク酸を用いてコハク酸化誘導体を生成し、その後サポニン−リンカー接合体をＤＣＣ、ＥＤＣまたはＥＤＣｌと縮合することにより、リンカーに結合され得る。
【０２２１】
さらにサポニンは、過ヨウ素酸塩で酸化され、それから生成されるジアルデヒドが、前記のアミノアルコールまたはジアミノ化合物と縮合される。次にリンカー上の遊離ヒドロキシルまたはアミノ基が、ＤＣＣ、ＥＤＣまたはＥＤＣｌの存在下で、生物活性剤、例えば遺伝子決定基のコハク酸塩誘導体と縮合され得る。
【０２２２】
さらなる有用なリンカー基は当業界で既知であり、例は、例えば米国特許第6,080,725号(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)に開示されている。
【０２２３】
接触基
本発明の接触基は、親油性部分、ならびにｉ)静電的相互作用、またはｉｉ)疎水性相互作用により遺伝子決定基と会合し得る部分を含む基である。好ましくは接触基は、親油性部分、ならびにｉ)静電的相互作用、またはｉｉ)疎水性相互作用により遺伝子決定基と安定複合体を形成し得る部分を含む。一実施態様では、接触基はインターカレーションにより遺伝子決定基と会合し得る。
【０２２４】
好ましい一実施態様では、遺伝子決定基は核酸または核酸の誘導体であり、例えば遺伝子決定基はＤＮＡであり得る。
親油性部分は、一実施態様では、脂質を含むかまたは脂質から成り得るが、しかしながら親油性部分は脂質を含む化合物に限定されない。例えば親油性部分は、親油性ペプチドまたはペプチドの一部、例えば(Ｈｉｓ)6であり得る。
【０２２５】
好ましい一接触基は、陽イオン性化合物またはｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電部分を含む基であり、これは遺伝子決定基と会合し得るし、あるいはこれは遺伝子決定基との安定複合体を形成し得る。このような部分は、例えばサポニンおよびステロール中に見出され、そしてそれらは本発明の親油性部分に見出され得る。
【０２２６】
このような接触基の全体的電荷は、遺伝子決定基との会合を可能にするｐＨ＝7.0で少なくとも1つの正荷電部分を接触基が含む限り、中性であり得るし、あるいは酸性でさえあり得る。接触基は、主として遺伝子決定基との疎水性相互作用が生成される場合にも、中性であり得る。
【０２２７】
本発明の接触基は、このような陽イオン性化合物またはｐＨ＝7で少なくとも1つの正荷電部分を含む化合物を含まず、遺伝子決定基と会合し得ない。それゆえ本発明の接触基は、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミンまたはＮ−デカノイル−Ｎ−メチル−アミンを含まない。
【０２２８】
例としては、第四級アンモニウム化合物；ジアルキルジメチルアンモニウム化合物；塩化ジオクタデシルジメチルアンモニウム；臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム；塩化ジオクタデシル／オクタジエニルジメチルアンモニウム；臭化ジオクタデシル／オクタジエニルジメチルアンモニウム；臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(ＤＤＡＢ)、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム化合物、混合臭化アルキルトリメチルアンモニウム（Cetrimide per BP）、およびテトラデシルトリメチルアンモニウム化合物が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる好ましい接触基は、図５（ステロールに関して）ならびに図６、７および８（親油性部分に関して）に示されている。
【０２２９】
さらに好ましい接触基としては、核酸、例えば一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、一本鎖部分および二本鎖部分の両方を含むＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、小核ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、ＲＮＡおよびＤＮＡのヘテロ二重鎖、例えば一本鎖部分ならびに二本鎖部分の両方を含むＲＮＡおよびＤＮＡのヘテロ二重鎖、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、ロック核酸（ＬＮＡ）等の積重ね塩基間にインターカレーションを形成し得る本質的平面基を含む化合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような接触基の例としては、アクリジンおよびフェナントリジンならびにそれらの誘導体、クマリン、フロクマリン、フィトアレキシン(例えばソラレン)およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。このような接触基は、複合対中に個別に、あるいは本明細書中に前記したような核酸の積重ね塩基間にインターカレーションを形成し得る１つまたはそれ以上の付加的接触基と組合せて生じ得る。
【０２３０】
好ましい接触基のさらに別の例としては、インドールおよびイミダゾール、例えば４‘，６−ジアミジオ−２−フェニルインドール、４‘，６−(ジイミダゾリン−２−イル)−２−フェニルインドール(それぞれHoechst 33258およびHoechst 33342として入手可能)、アクチノマイシンＤのような化合物；シアニン染料、シアニン染料の二量体(例えばＴＯＴＯ(Ｒ)、ＹＯＹＯ(Ｒ)、ＢＯＢＯ(ＴＭ)、ＰＯＰＯ(ＴＭ))およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３１】
核酸部分に対する親和性を有する任意の化合物は、本発明にしたがって接触基として用いられ得る。したがってインターカレーション基のほかに、非インターカレーション性接触基も用いられ得る。一例は、ヒドロキシスチルバミジン(フルオロ−ゴールド(ＴＭ))およびその誘導体である。
【０２３２】
核酸を接触しおよび／または核酸に対する親和性を有し得る接触基の包括的一覧は、例えば「”Handbook of Fluorecent Probes and Researc Chemicals”, by Richard P. Haugland, Sixth Edition, Molecular Probes(c) 1996, chapter 8, “Nucleic Acid Detection”」に見出され得る。Hauglandの参考文献中に列挙された化合物は、そこに列挙された前記の化合物の誘導体および類似体を生成するために、当業者と同様の熟練者により容易に修飾され得る。
【０２３３】
さらに好ましい接触基は、核酸、例えば本明細書中出すぐ上に列挙された核酸に対する親和性を有するペプチドおよびポリペプチド、例えばタンパク質、酵素、補酵素、抗体または抗体の結合断片である。例としては、核酸結合タンパク質、例えばＤＮＡ結合タンパク質、ならびにＤＮＡの結合に関連するへリックス−ターン−へリックスモチーフ、例えばアルファへリックス−βターン−αへリックスモチーフを含むタンパク質、バクテリオファージＴ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌E. coli一本鎖結合タンパク質、ＲｅｃＡおよびその相同体、例えば大腸菌E. coliＲｅｃＡタンパク質、シトクロムＣ、モノクローナル抗体、抗体のＦａｂ‘断片、およびポリクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
接触基は、別の核酸との会合を生成し得る任意の核酸、ならびに類似化合物、例えばＰＮＡおよびＬＮＡ、またはそれらの誘導体でもあり得る。会合は、水素結合または任意のその他の相互作用により生成されて、少なくとも1つの遺伝子決定基を有する塩基対合および／または二重鎖形成および／または三重鎖形成を生じ得る。例としては、オリゴヌクレオチドおよび親油性化合物により修飾されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２３５】
親油性部分
前記のように、親油性部分は複合体系性を促す目的に役立ち得るが、一方同時に、接触基および／またはターゲッティングリガンドのための「ドッキング」基として作用する。したがって親油性部分は、本発明の複合体の一部を形成し得る。
【０２３６】
本発明の親油性部分は、親油性分子の任意の残基を含めた任意の部分であり、これは、ｉ)本質的に非極性である１つまたはそれ以上の化合物の任意の適切な官能基に結合されるかまたはそれと接触し、あるいはｉｉ）本発明の複合体内に本質的非極性ドメインを形成する。
【０２３７】
親油性部分は、両親媒性化合物の一部分であり得る。両親媒性化合物は、その分子が極性および非極性ドメインをともに含有する化合物である。界面活性剤は、両親媒性化合物の例である。界面活性剤は、典型的には、しばしばアルキル、アリールまたはテルペン構造である非極性部分を保有する。さらに界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性または非イオン性であり得る極性部分を保有する。陰イオン性基の例は、カルボン酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩および硫酸塩である。陽イオン性ドメインの例は、アミン塩および第四級アンモニウム塩である。両性界面活性剤は、陰イオン性および陽イオン性ドメインをともに保有する。非イオン性ドメインは、典型的には脂肪酸カルボキシ基の誘導体であり、糖質およびポリオキシエチレン誘導体を包含する。
【０２３８】
親油性部分は、非極性ドメインを保有する2つまたはそれ以上の化合物も含み得るが、この場合、化合物は各々、連結基に結合されており、これは次に、本発明の複合体の構成成分、例えば前記の複合体に含まれる任意のサポニン構成成分および／またはステロール構成成分、例えば前記のステロール構成成分の任意の残基および前記のサポニン構成成分の任意の残基、例えばアグリコン部分および／または任意の糖質部分に共有的に結合される。
【０２３９】
好ましい親油性部分の一群は、リン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、トリグリセリド、脂肪酸および疎水性アミノ酸残基、例えば膜スパニング疎水性アミノ酸セグメントである。
【０２４０】
本発明の複合体がｉ)WO92/06710（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたようなクイルQuilＡ分画由来のサポニン、ｉｉ)コレステロールおよびｉｉｉ)ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンを含む場合、複合体はさらに、本明細書中に記載されたようなその任意の誘導体を含めて少なくとも1つの生物活性剤、例えば遺伝子決定基、例えばポリヌクレオチドを含む。一実施態様では、このような複合体は、1:2より大きい、例えば1.5:2より大きいｉ)脂質およびコレステロール対ｉｉ）サポニンの比(重量／重量)、ならびに1 mg/mlより高い、例えば1.2 mg/mlより高い脂質濃度を有する。
【０２４１】
本発明に関連して用いられ得る親油性部分の例は、ステロール以外の脂質、例えば脂肪または脂肪類似物質、例えばトリグリセリドまたは50までの炭素原子を有する脂肪酸、例えば4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29および30個の炭素原子を有する飽和脂肪酸、例えば酪酸、カプロール酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸；30個までの炭素原子を有する不飽和脂肪酸、例えばヘキサデセン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸；ヒドロキシ−脂肪酸、例えば９，１０−ジヒドロキシステアリン酸；不飽和ヒドロキシ脂肪酸、例えばヒマシ油；分枝鎖脂肪酸、例えばグリセロールエーテル；蝋、即ち高級脂肪酸と一価アルコールとの間のエステル；リン脂質、例えばグリセロールホスフェートの誘導体、例えばホスファチジン酸の誘導体、即ちレシチン、セファリン、イノシトールホスファチド、スピンゴシン誘導体（14、15、16、17、18、19および20個の炭素原子を有する）；糖脂質；イソプレノイド；スルホ脂質；ならびにカロテノイドを含有する混合トリグリセリドである。
【０２４２】
本発明の複合体の一部を形成し得る親油性部分のさらに別の例は、陽イオン性脂質である。陽イオン性脂質は、本明細書中に適用された定義によれば、ｐＨ7.0で正味正電荷を保有する脂質である、と理解される。
【０２４３】
本発明の組成物中に用いられ得る陽イオン性脂質としては、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、グリセロ−３−エチルホスファチジルコリンおよびその脂肪アシルエステル、ジ−およびトリメチルアンモニウムプロパン、ジ−およびトリ−エチルアンモニウムプロパンおよびその脂肪アシルエステルが挙げられる。この群からの好ましい誘導体は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(「ＤＯＴＭＡ」)である。
【０２４４】
さらに広範な一連の合成陽イオン性脂質が、本発明において機能し得る。これらは、１つまたはそれ以上の塩基性官能基を含有するよう誘導された共通の天然脂質を包含する。そのように修飾され得る脂質の例としては、例えば臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、スフィンゴリピド、スフィンゴ−ミエリン、リソリピド、糖脂質、例えばガングリオシドＧＭ１、スルファチド、グリコスフィンゴリピド、コレステロールおよびコレステロールエステルおよび塩、Ｎ−スクシニルジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルホモシステインが挙げられる。
【０２４５】
一実施態様では、本発明の組成物中の陽イオン性脂質は、フッ素化陽イオン性脂質である。本明細書中に記載された陽イオン性脂質のいずれかは、少なくとも1つの水素原子をフッ素原子で置換することによりフッ素化され得る。
【０２４６】
特別に合成された陽イオン性脂質、例えば米国特許第6,120,751号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載された式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物も、本発明において機能する。
【０２４７】
本発明の複合体の一部を形成し得る親油性部分のさらなる例は、例えば四ヨウ化Ｎ，Ｎ‘−ビス(ドデシルアミノカルボニル−メチレン)−Ｎ，Ｎ’−ビス(β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−アミノカルボニル−メチレン)−エチレンジアミン；六ヨウ化Ｎ，Ｎ”−ビス(ヘキサデシルアミノ−カルボニル−メチレン)−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス(β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルアミノカルボニル−メチレンジエチレン)−トリアミン；四ヨウ化Ｎ，Ｎ’−ビス(ドデシルアミノカルボニルメチレン)−Ｎ，Ｎ”−ビス(β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルアミノカルボニルメチレン)シクロヘキシレン−１，４−ジアミン；七ヨウ化１，１，７，７−テトラ−(β−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルアンモニウムメチルアミノ−カルボニルメチレン)−３−ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン−１，３，７−トリアザヘプタン；および四ヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ(β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルアミノカルボニルメチレン)−Ｎ’−（１，２−ジオレオイルグリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）−ジエチレントリアミンである。
【０２４８】
好ましい一実施態様では、陽イオン性脂質はフッ素化陽イオン性脂質である。本明細書中に記載された陽イオン性脂質のいずれかは、少なくとも1つの水素原子をフッ素原子で置換することによりフッ素化され得る。正荷電部分を保有する無数のその他の天然および合成変異体も本発明において機能する、と当業者は認識する。
【０２４９】
前記の陽イオン性脂質のほかに、本発明において用いられ得るその他の適切な脂質としては、例えば脂肪酸、リソリピド，フッ素化脂質、ホスホコリン、例えば血小板活性化因子(ＰＡＦ)（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL）に関連したもの、例えば１−アルキル−２−アセトイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスホコリンおよび１−アルキル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ３−ホスホコリン(これらは血餅を標的化する)；飽和および不飽和脂質の両方に関するホスファチジルコリン、例えばジオレオイルホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)；ジペンタデカノイルホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)；ジステロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)；およびジアラキドニルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)；ホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)およびジステロイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール、例えばジステアロイルホスファチジルグリセロール(ＤＳＰＧ)；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴリピド、例えばスフィンゴミエリン；糖脂質、例えばガングリオシドＧＭ１およびＧＭ２；グルコリピド；スルファチド；グリコスフィンゴリピド；ホスファチジン酸、例えばジパルミトイルホスファチジン酸(ＤＰＰＡ)およびジステアロイルホスファチジン酸(ＤＳＰＡ)；パルミチン酸；アラキドン酸；オレイン酸；リノレン酸；リノール酸；ミリスチン酸；米国特許第5,312,617号(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)に記載された合成脂質が挙げられる。
【０２５０】
さらに好ましい親油性部分としては、糖脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、例えばその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる好ましい親油性部分は、スフィンゴミエリン、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ホスファチジン酸、Ｔｆｘ（商標）試薬、例えばＴｆｘ（商標）−１０試薬、Ｔｆｘ（商標）−２０試薬およびＴｆｘ（商標）−５０試薬、ならびに１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン化合物、アシル基が、別のものとは別々に、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、オレオイル、パルミトイル−オレオイルから成る、そしてジラウロイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル(ＤＯＰＣ＋)から成る群から選択される特定の化合物である。Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンまたは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−エタノールアミン(ＤＯＰＥ)は、特に好ましい一親油性部分を代表する。
【０２５１】
さらに好ましいのは、ＤＯＴＡＰ；ＤＤＡＢ(臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム)；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン  ＤＯＰＥ；Ｌ−β，γ−ジオレオイル−α−セファリン；３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジデオイルＮ−(１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル)−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム；臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム；アブリジン（CP-20,961）およびステアリルチロシンである。
【０２５２】
特に興味深い一親油性部分は、BaldridgeとCrane（1999）によりMethods, vol. 19, no.1, p. 103-107に、ZhouとHuang（1993）によりVaccine, vol. 11, no.11, p. 1139-1144に、そしてRudbach等（1995）により”The Theory and Practical Application of Adjuvants” (Stewart-Tull, ed), Wiley & Sons, Ltd.に記載されたようなモノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)である。ＭＰＬの陽イオン性誘導体も本発明に包含される。ＭＰＬは、Corixa Corp. (www.corixa.com)から入手可能であり得る。
【０２５３】
さらに好ましい親油性部分は、ポリマー、例えばキチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を保有する脂質であって、本明細書中では「ペギル化脂質」とも呼ばれる。ポリマーを保有する好ましい脂質としては、それに結合されるＰＥＧポリマーを有する脂質ＤＰＰＥを表すＤＰＰＥ−ＰＥＧ(ＤＰＰＥ−ＰＥＧ)、例えば約5000の平均分子量を有するＰＥＧポリマーをそれに結合されたＤＰＰＥを表すＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００；スルホン化単−、二−、オリゴ−または多糖を保有する脂質；コレステロール、硫酸コレステロールおよびへミコハク酸コレステロール；ヘミコハク酸トコフェロール；エーテルおよびエステル連結脂肪酸を伴う脂質；重合脂質(当業界で既知の広範な種々のもの)；リン酸ジアセチル；リン酸ジセチル；ステアリルアミン；カルジオリピン；約6〜約8炭素長の短鎖脂肪酸を有するリン脂質；不斉アシル鎖、例えば約6個の炭素を有する一アシル鎖と約12個の炭素を有する別のアシル鎖を有する合成リン脂質；セラミド；非イオン性リポソーム、例えばニオソーム、例えばポリオキシアルキレン(例えばポリオキシエチレン)脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン(例えばポリオキシエチレン)脂肪アルコール、ポリオキシアルキレン(例えばポリオキシエチレン)脂肪アルコールエーテル、ポリオキシアルキレン(例えばポリオキシエチレン)ソルビタン脂肪酸エステル(例えばＴＷＥＥＮ．ＲＴＭと呼ばれる化合物のクラス、例えばＴＷＥＥＮ．ＲＴＭ２０、ＴＷＥＥＮ．ＲＴＭ４０およびＴＷＥＥＮ．ＲＴＭ８０（ICI Americas, Inc., Wilmington, Del.から市販されている）)、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリシンオレエート、アルキルオキシル化(例えばエトキシル化)ダイズステロール、アルキルオキシル化(例えばエトキシル化)ヒマシ油、ポリオキシエチレン−ポリオキシ−プロピレンポリマーおよびポリオキシアルキレン(例えばポリオキシエチレン)脂肪酸ステアレート；
【０２５４】
ステロール脂肪族酸エステル、例えば硫酸コレステロール、酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロールおよびｎ−酪酸フィトステロール；糖酸のステロールエステル、例えばコレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロールおよびグルコン酸エルゴステロール；糖酸およびアルコールのエステル、例えばラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、グルコン酸ラウリル、グルコン酸ミリストイルおよびグルコン酸ステアロイル；糖および脂肪族酸のエステル、例えばラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸およびポリウロン酸；
【０２５５】
サポニン、例えばサルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸およびジギトキシゲニン；二ラウリン酸グリセロール、三ラウリン酸グリセロール、二パルミチン酸グリセロール、グリセロールおよびグリセロールエステル、例えば三パルミチン酸グリセロール、二ステアリン酸グリセロール、三ステアリン酸グリセロール、二ミリスチン酸グリセロール、三ミリスチン酸グリセロール；長鎖アルコール、例えばｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコールおよびｎ−オクタデシルアルコール；６−(５−コレステン−３β−イルオキシ)−１−チオ−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６−(５−コレステン−３β−イルオキシ)−ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マンノ−ピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）−カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）−カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタン酸塩；
【０２５６】
Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロ−ホスホ−エタノールアミンおよびパルミトイルホモシステインおよび／またはそれらの任意の組合せである。
【０２５７】
本明細書中に記載された任意の脂質の電荷(例えば陽イオン性、陰イオン性または中性)を、当業者は容易に確定し得る。好ましい実施態様では、本明細書中に記載された脂質は、フッ素化脂質である。当業者が認識するように、本明細書中に記載された任意の中性脂質は、当業者に周知の方法により、陽イオン性脂質または陰イオン性脂質に改質され得る。例えば中性脂質上の任意の修飾可能基、例えば両イオン性電荷平衡を有する第二級アミン、−ＯＨ基あるいは陰イオン性基または陽イオン性基は、中性脂質に電荷を加えるかまたは差し引くよう、化学的に修飾され得る。
【０２５８】
中性脂質が本発明の組成物中に用いられる場合、中性脂質は、好ましくはホスホコリン、スフィンゴリピド、糖脂質、グリコスフィンゴリピド、リン脂質または重合脂質である。
重合脂質の例としては、不飽和親油性鎖、例えば約50個までの炭素原子を含有するアルケニルまたはアルキニルが挙げられる。さらなる例は、重合可能を保有する基リン脂質、例えばホスホグリセリドおよびスフィンゴリピド；ならびにヒドロキシル基を有する飽和および不飽和脂肪酸誘導体、例えばｄ−１，２−ヒドロキシオレイン酸のトリグリセリド、例えばヒマシ油および麦角油である。生分解に起因する主鎖残基が水溶性であるよう、分散可能性を強化するために、重合は、親水性置換基、例えばカルボキシルまたはヒドロキシル基を含むよう意図され得る。適切な重合可能脂質は、例えば米国特許第5,536,490号(Klaveness等)（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）によっても記載されている。
【０２５９】
本発明の複合体の一部を形成し得る親油性部分のさらに別の例は、例えば欧州特許第0 109 952 B1号(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)ならびに欧州特許第0 436 620 B1号(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)に記載されたものである。特に親油性部分は、リン脂質、例えばホスファチジル−エタノールアミンおよびホスファチジルコリンであり得る。
【０２６０】
親油性部分は、細胞結合構成成分、例えば抗原を結合し得る親油性受容体分子を含み得る。このような受容体の例は、例えば糖脂質、例えばコレラ毒素の受容体ガングリオシドＧＭ１およびフコシル化血液群抗原である。細胞結合構成成分は次に、輸送分子として機能し得る。
【０２６１】
ポリマーに結合される親油性部分
一実施態様では、本発明の複合体の親油性部分は、少なくとも1つのポリマー、例えば親水性ポリマーに共有的に結合される。脂質と共有結合するための適切な親水性ポリマーとしては、例えばポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、ポリビニル−ピロリドン、ポリビニルアルキルエーテル、例えばポリビニルメチルエーテル、ポリアクリルアミド、例えばポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミドおよびポリヒドロキシ−プロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシアルキル（メト）−アクリレート、例えばポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリアルキルオキサゾリン、例えばポリメチルオキサゾリンおよびポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシアルキルオキサゾリン、例えばポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリ(ヒドロキシ−アルキルカルボン酸)、ポリオキサゾリジン、ポリアスパルタミドおよびシアル酸のポリマー(ポリシアリック)が挙げられる。
【０２６２】
好ましくは親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアルキルオキサゾリン、ポリヒドロキシアルキルオキサゾリン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリジン、ポリアスパルタミド、シアル酸のポリマー、ポリヒドロキシアルキル(メト)アクリレートまたはポリ(ヒドロキシアルキルカルボン酸)である。
さらに好ましくは、親水性ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＰＧ、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびそれらのコポリマーであって、ＰＥＧおよびＰＰＧポリマーがより好ましく、そしてＰＥＧポリマーがさらにより好ましい。ポリエチレングリコールは、例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ８０００であり得るが、これらはそれぞれ、2000、5000および8000ダルトンの重量平均分子量を有する。
【０２６３】
好ましくはポリエチレングリコールは、約500〜約20,000、さらに好ましくは約1,000〜約10,000の分子量を有する。その他の適切なポリマー(親水性および別種の)は、本発明の開示に基づいて、当業者には明らかである。
【０２６４】
親水性ポリマーと共有的に結合される例示的脂質としては、例えば時パルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧおよびジステアリルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ、さらに好ましくはジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧが挙げられる。
【０２６５】
リポソーム
前記のポリマーは、一実施態様では、例えば本発明の複合体の親油性部分に結合され得る。結合はアルキル化またはアシル化反応により、そしてこれは、本発明の複合体を含むリポソームの分布の安定性およびサイズを改良するために有用である。
【０２６６】
リポソームは、例えばLipfordとWagner（1994）によりVaccine, vol. 12, no.1, p. 73-80(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)に記載されたように調製され得る。本発明に関するリポソーム組成物の調製に用いるために適合され得る一般的リポソーム調製技法は、例えば米国特許第4,728,578号、第4,728,575号、第4,737,323号、第4,533,254号、第4,162,282号、第4,310,505号および第4,921,706号；英国特許出願GB 2193095A；国際出願PCT/US85/01161およびPCT/US89/05040；Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, 858: 161-168 (1986)；Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, 812: 55-65 (1985)；Mayhew et al., Methods in Enzymology, 149: 64-77 (1987)；Mayhew et al., Biochimica et Biophysica Acta, 755: 169-74 (1984)；Cheng et al. Investigative Radiology, 22: 47-55 (1987)；およびLiposome Technology, Gregoriadis, G., ed., Vol. 1, pp. 29-31, 51-67 and 79-108 (CRC Press Inc., Boca Raton, Fla. 1984)(これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)で考察されている。
【０２６７】
したがって、本発明の複合体を含む本発明のリポソーム組成物は、当業者には明らかである種々の慣用的リポソーム調製技法のいずれかを用いて調製され、その例としては、例えば溶媒透析、フレンチプレス、押出(凍結−解凍を用いてまたは用いずに)、逆相蒸発、単純凍結−解凍、音波処理、キレート化合物透析、均質化、溶媒注入、マイクロエマルション化、自発的生成、溶媒気化、溶媒透析、フレンチ加圧細胞技法、制御化洗剤透析等(各々、種々の方式での組成物の調製を包含する)が挙げられる(例えばMadden et al., Chemistry and Physics of Lipids, 53: 37-46 (1990)参照)(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)。
【０２６８】
適切な凍結−解凍技法は、例えば国際出願PCT/US89/05040（1989年11月8日提出）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されている。凍結−解凍技法を包含する方法は、リポソームの調製に関連して好ましい。リポソームの調製は、溶液中で、例えば水性生理食塩溶液、水性リン酸塩緩衝溶液または滅菌水中で実行され得る。リポソームは、例えば機械的振盪用具、例えばＷｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ．ＴＭ（Crescent Dental, Lyons, III）、ミキソマットMixomat（Degussa AG Frankfurt, Germany）、キャップミックスCapmix（Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH & Co., Seefeld, Oberay Germany）、シラマットプラスSilamat Plus（Vivadent, Lechtenstein）またはビブロスVibros（Quayle Dental, Sussex, England）の使用により達成され得る、振盪または撹拌を包含する種々の工程によっても調製され得る。慣用的マイクロエマルション化装置、例えばMicrofluidizer. TM. (Microfluidics, Woburn, Mass.)も用いられ得る。
【０２６９】
生物活性剤
本発明の複合体は、１つまたはそれ以上の生物活性剤をさらに含み得る。生物活性剤の例は、治療薬、診断剤、ターゲッティングリガンドおよび遺伝子決定基である。しかしながらターゲッティングリガンドおよび遺伝子決定基は、生物活性剤としてでなくとも用いられ得る。後者の場合、ターゲッティングリガンドは、ただ単に所望の細胞位置また刃患者の予定領域に対して複合体を標的化し、そして遺伝子決定基は、例えば対応するポリペプチドの形態で生物活性剤をコードするＤＮＡであり得る。しかしながらＤＮＡそれ自体は、この点では生物活性剤としても作用し得る。
【０２７０】
荷電生物活性剤、例えばＤＮＡは、例えば二次ステロール、二次サポニン間に生成される共有的または非共有的相互作用、例えばイオン的または静電的相互作用により、あるいは前記の接触基の非存在下で、複合体中に容易に組入れられ得る。
生物活性剤、例えばＤＮＡは、その調製の初期段階で、複合体に付加され得る。しかしながら、例えば複合体の構成成分が混合され、そして複合体形成が達成された場合、ＤＮＡは後期段階でも付加され得る。
【０２７１】
広範な種々の生物活性剤は、少なくとも1つの生物活性剤を含む複合体を基礎にした本発明を用いることにより、予定細胞位置に、または患者の特定領域に送達され得る。適切な生物活性剤としては、例えば造影剤、遺伝子決定基、化学療法剤、ペプチドおよび核酸、例えば誘導化核酸、例えばＬＮＡ(ロック核酸)およびＰＮＡ(ペプチド核酸)が挙げられる。
【０２７２】
好ましい一生物活性剤は遺伝子決定基であって、この例としては、例えば天然または合成起源の核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡ、例えば組換えＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、ハンマーヘッド化ＲＮＡ、リボザイム、ハンマーヘッド化リボザイム、抗原核酸、一本鎖および二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡならびにそれらの類似体、リボオリゴヌクレオチド、デオキシリボオリゴヌクレオチド、アンチセンスリボオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスデオキシリボオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２７３】
本発明の複合体は、広範な種々のペプチドおよび非ペプチド生物活性剤の投与にも適している。生物活性剤、例えばペプチドは、それらが疎水性であるか、中性であるかまたは荷電される場合も、組入れられ得る。多くの場合、適切な複合体組成物を用いることにより、複合体と当該ペプチドまたは任意のその他の生物活性剤との間に相互作用が生成され得る。
【０２７４】
組成物中に組入れられ得るペプチドのいくつかの例は、インターフェロンおよびその他のマクロファージ活性化因子、例えばリンフォカイン、ムラミルジペプチド(ＭＤＰ)、γ−インターフェロン、α−インターフェロンおよびβ−インターフェロン、ならびに関連抗ウイルスおよび殺腫瘍薬；レニン阻害剤、例えば新世代抗高血圧薬；コレシストキニン(ＣＣＫ類似体)、例えばＣＣＫ、セルレチドおよびエレドイシン、ならびに関連心臓血管ターゲッティング剤およびＣＮＳ−ターゲッティング剤；ロイコトリエンおよびプロスタグランジン、例えばオキシトシン、ならびに関連抗炎症、分娩促進および流産促進化合物；エリスロポエチンおよびその類似体、ならびに関連造血薬；ＬＨＲＨ類似体、例えばロイプロリド、ブセレリンおよびナファレリン、ならびに下垂体受容体の関連下向き調節剤；上皮小体ホルモンおよびその他の成長ホルモン類似体；酵素、例えばＤナーゼ、カタラーゼおよびα−１アンチトリプシン；免疫抑制薬、例えばシクロスポリン；ＧＭ−ＣＳＦおよびその他の免疫調節薬；ならびにインスリンである。
【０２７５】
本発明の組成物および方法に用いられ得る非ペプチドとしては、例えばβ−アゴニスト、例えばイソプロテレノール、アルブテロール、イソエテリンおよびメトプロテロノール、ならびに関連抗喘息薬；ステロイド、例えばフルニソリド、および同様の抗喘息薬；コリン作動薬、例えばクロモリンおよび関連抗喘息薬；ならびに５−リポキシゲナーゼ阻害剤、例えばジレウトンおよび前記のヒドロキシウレア化合物、ならびに関連ロイコトリエン阻害薬が挙げられる。
【０２７６】
抗腫瘍薬および抗生物質として作用する生物活性剤も、本発明の組成物を用いて送達され得る。これらの例としては、例えば抗生物質、例えばｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、カプレオマイシンスルフェートシクロセリン、エタムブトールヒドロクロリドエチオナミド、ピラジンナミド、リファムピンおよびストレプトマイシンスルフェート、ダプソン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、セフラコル、セファドロキシル、セファレキシン、セファドリンエリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカムピシリン、カルベニシリン、ジクロキシシリン、シクラシリン、ピクロキシシリン、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン(ＧおよびＶ)、チカルシリン、リファムピン、テトラサイクリンおよびアンフォテリシンＢ；
【０２７７】
ならびに抗腫瘍薬、例えばメトトレキセート、フルオロウラシル、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサマイトマイシン、ブレオマイシン、システインアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリシン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、アジドチミジン、メルファラン(例えばＰＡＭ、Ｌ−ＰＡＭまたはフェニルアラニンマスタード)、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジンヒドロクロリドダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸ナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン(ｍ−ＡＭＳＡ)、アスパラギナーゼ、エトポシド(ＶＰ−１６)、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、テニポシド(ＶＭ−２６)、硫酸ビンブラスチン(ＶＬＢ)、硫酸ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジンおよびダカルバジン；有糸分裂阻害剤、例えばビンカアルカロイド、ならびにステロイド、例えばデキサメタソンが挙げられる。
【０２７８】
本発明の組成物中に用いられ得るその他の生物活性剤としては、例えばＬＨＲＨ類似体、５−リポオキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制薬または気管支拡張薬が挙げられる。特に好ましい物質としては、酢酸ロイプロリドが挙げられる。ＬＨＲＨ  Ａｃ−Ｄ−２−ＮａＩ−Ｄ−４−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−３−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−ＭｅＴｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ(Ｎｉｃ)−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ(Ｎ−Ｉｓｐ)−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2(以後、「Ｄ−２−ＮａＩ」)、５−リポキシゲナーゼ阻害剤Ｎ−［３−［５−（４−フルオロフェニルメチル）−２−チエニル］−１メチル−２−プロピニル］−Ｎ−ヒドロキシウレア、免疫抑制薬シクロスポリンＡ、およびアドレナリン作動性気管支拡張薬イソプロテレノールおよびアルブテロール(本明細書中で用いる場合、「５−リポキシゲナーゼ阻害剤」または「５−ＬＯ阻害剤」という用語は、ロイコトリエン生合成に影響を及ぼし得る任意の生理学的活性化合物を指す)。
【０２７９】
本発明の複合体中に組入れられ得るか、またはそれらと会合し得る生物活性剤のさらに別の例としては、アポトーシス誘導タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。アポトーシス誘導タンパク質としては、ＢＡＸ、ＢＡＤ、ｂｃｌ−ｘｓ、ｐ５３およびカスパーゼが挙げられるが、これらに限定されない（Sasaki et al. (2001), Nat. Biotechnol. 19, 543-547）。
【０２８０】
さらに免疫調節薬は、本発明の生物活性剤のさらに別の群である。免疫調節薬の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８１】
抗原提示タンパク質は、生物活性剤のさらに別の群を構成する。抗原提示タンパク質の例としては、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子または抗原提示が可能な断片が挙げられる。好ましいＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ａ２である。
【０２８２】
生物活性剤のさらに別の例は、細胞毒素、例えば細菌毒素であって、例としては破傷風毒素およびコレラ毒素またはＡＤＰ−リボシル化が可能なドメインを有するそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない（Mowat et al. (2001), J. Immunol. 167, 3398-3405）。
【０２８３】
生物活性剤は、抗原／エピトープ提示に関与するポリペプチドでもあり得る。例としては、ＭＨＣクラスＩ分子ペプチド負荷、分子シャペロン、熱ショックタンパク質(例えば保存Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０ファミリーに属するＨＳＰ)の負荷に関与するタパシンが挙げられる(例えばRafiee et al. (2001) Cancer Gene Ther. 8, 974-981参照)。
【０２８４】
親油性薬剤に関しては、相互作用は疎水性であるかまたはファンデルワールス力であり得る。荷電薬および脂質頭基に関しては、相互作用は静電的相互作用であり得る。
【０２８５】
ターゲッティングリガンド
一実施態様では、本発明の複合体はさらに、特定位置に対して複合体を標的化するためのターゲッティングリガンドを含む。このような位置は、特定組織、あるいは特定細胞型の表面であり得る。このような組織または細胞型は、典型的には、複合体のターゲッティングリガンドに対する親和性を有する受容体部分を有する。
【０２８６】
本発明の適切なターゲッティングリガンドは、例えば疎水性受容体結合分子、免疫原性および／または抗原性物質である。本発明のターゲッティングリガンドと接触または相互作用し得る適切な細胞表面受容体は、例えば親油性ドメインを含む受容体、または疎水性タンパク質を含むかまたは本質的にそれから成る受容体である。本発明の複合体と組合せてターゲッティングリガンドを用いることにより、より大きい割合の複合体が予定目標に達する。例えば本発明の複合体のターゲッティング形成部分に対する親和性を有する構成成分を含有することが既知である特定の粘膜に対して複合体を標的化するのが望ましい場合、ターゲッティングリガンドを用いることは有益である。この点における空間的利点は、脂質含有細胞表面受容体結合部分が複合体中の組込み親油性部分として用いられ得る、そして任意に、複合体を作り上げるために用いられる親油性部分を置換するという点である。
【０２８７】
本発明に含まれる受容体結合構成成分の1つは、例えば細菌毒素およびそのサブユニットまたは断片または種々の修飾または誘導体の形態のそれらの活性結合部分、細菌繊毛またはその他の接着分子およびそれらの活性結合部分および／または誘導性構造である。
【０２８８】
好ましいターゲッティングリガンドは、共有的にまたは非共有的に複合体と会合される。ターゲッティングリガンドは、例えば共有または非共有結合を介して、組成物中の少なくとも1つの脂質に結合され得る。好ましくはターゲッティングリガンドは、共有的に複合体に結合される。コレステロールを含む脂質複合体の場合、ターゲッティングリガンドは好ましくはコレステロールに実質的に非共有的でのみ結合され、および／またはターゲッティングリガンドは、組成物の構成成分、例えばコレステロール以外の別の脂質、例えばリン脂質に共有的に結合される。
【０２８９】
本発明の複合体中に組入れられ得るターゲッティングリガンドは、好ましくはin vivoおよび／またはin vitroで受容体および／または組織を標的化し得る物質である。組織のターゲッティングに関しては、ターゲッティングリガンドは、望ましくは心臓組織および膜性組織、例えば内皮および上皮細胞を標的化し得る。受容体の場合には、ターゲッティングリガンドは、望ましくはＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体またはリンパ球受容体、例えばＴ細胞、Ｂ細胞またはインターロイキン−２受容体を標的化し得る。組織および／または受容体、例えば上記で例示された組織および受容体を標的かするのに用いるための好ましいターゲッティングリガンドは、タンパク質、例えば抗体、抗体断片、ホルモン、ホルモン類似体、糖タンパク質およびレクチン、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、糖、例えば糖質、例えば単糖および多糖、ならびに炭水化物、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補因子および遺伝子決定基、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド酸構築物およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、ペプチドが特に好ましい。
【０２９０】
ターゲッティングリガンドとして用いるために選択され得るタンパク質の一例はプロテインＡであり、これは、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのほとんどの菌株により産生される。プロテインＡは、例えばSigma Chemical Co.（St Louis, Mo.）から市販されている。プロテインＡは次に、種々のＩｇＧ抗体を結合するために用いられ得る。概して、ターゲッティングリガンドとして特に有用であるペプチドとしては、血管循環エステラーゼ、アミダーゼまたはペプチダーゼによる分解に対する付加的方式の耐性を組入れる天然、修飾化天然または合成ペプチドが挙げられる。ペプチド部分の安定化の有用な方法は、環化技術の使用を組入れる。一例として、それによりカルボキシ末端が、アミド結合によりアミン末端に共有結合される末端−末端環化は、ペプチド分解を阻止し、循環半減期を増大するために有用であり得る。さらに側鎖−側鎖環化または末端−側鎖環化も、安定性を誘導するのに有用である。さらにペプチドの戦略的領域におけるＤ−アミノに代えてのＬ−アミノの置換は、生物学的分解に対する耐性を提供し得る。
【０２９１】
別の実施態様では、インターロイキン−１(ＩＬ−１)受容体を結合する小ペプチドが有用であり得る。例えばＱＰＹのファージ表示コア配列により生成されたペプチドは、ペプチド結合に不可欠であることが示されたが、その例としては、ＷＹＱＪＹ(ここで、Ｊはアゼチジンである)のコア配列を有する15-merであるＡＦ１２１９８；ならびに10-10〜10-12 MのＫｄを有するＩＬ−１アンタゴニスト、例えばＡｃＰｈｅ−Ｇｌｕ、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｚｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＣＯＮＨ2またはＡｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｚｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−が挙げられる。
【０２９２】
内皮細胞−白血球接着分子(ＥＬＡＭ)は、ストレスの条件下で内皮細胞により発現される抗原であり、これは次に、血管を裏打ちする内皮細胞を通り抜けて周囲組織への白血球の移動を促す。これらの同一の内皮細胞−白血球接着分子は、小胞のターゲッティングのための受容体としても有益に利用され得る。これらの内皮細胞接着分子は、既知の成員、例えばＧＭＰ−１４０が全て内皮−白血球接着に参加するセレクチンとして既知の一ファミリーに属し、例としては、ＥＬＡＭ−１、ＬＡＭＵ−１、血小板活性化依存性顆粒外膜タンパク質(ＰＡＤＧＥＭ)としても既知の顆粒膜タンパク質１４０(ＧＭＰ−１４０)、ＶＣＡＭ−１／ＩＮＣＡＭ−１１０(血管接着分子／誘導性接着分子)およびＩＣＡＭ−１(細胞間接着分子)が挙げられる。
【０２９３】
広範な種々の異なるターゲッティングリガンドは、ＥＬＡＭ分子の細胞質ドメインに結合するために選択され得る。この点でのターゲッティングリガンドとしては、レクチン、広範な種々の炭水化物または糖部分、抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片、例えばＦａｂ‘２、ならびに合成ペプチド、例えば創傷治癒のために標的化され得るアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(Ｒ−Ｇ−Ｄ)が挙げられる。多数のこのような物質が天然供給源から得られるが、しかし分子生物学的組換え技法により合成され得るものもあれば、もともと合成物であるものもある。ペプチドは、当業界で既知の種々の技法により調製され得る。ヒト白血球起源、例えばＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、および白血球細胞表面糖タンパク質(ＬＦＡ−１)に由来するかまたはそれから修飾されたターゲッティングリガンドも、これらは内皮細胞受容体ＩＣＡＭ−１に結合することが既知であるので、用いられ得る。単核球選択性である免疫グロブリンスーパーファミリーＶＣＡＭ−１のサイトカイン誘導性成員も、ターゲッティングリガンドとして用いられ得る。ヒト単球由来のＶＬＡ−４は、ＶＡＣＭ−１を標的化するために用いられ得る。抗体およびその他のターゲッティングリガンドは、内皮細胞増殖マーカーであるエンドグリンを標的化するために用いられ得る。エンドグリンは、多種多様の固形腫瘍中の内皮細胞上で上向き調節される。エンドグリンを標的化するために用いられ得るターゲッティングリガンドは、抗体ＴＥＣ−１１である（Thorpe et al. Breast Cancer Research and Treatment, 36: 237-51 (1995)）。
【０２９４】
アテローム硬化症の環境における内皮細胞活性かは、アテローム硬化症の領域、例えばアテローム硬化プラークに対して複合体を標的化するために本発明において用いられる。用いられ得るこのような一標的は、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭとしてＲｂ１／９により認識される誘導性単核球内皮細胞接着分子である。モノクローナル抗体Ｈ４／１８およびＨ１８／７は、サイトカイン媒介物質により誘導される内皮細胞表面抗原を標的化するために用いられ得る。好ましい実施態様として、適切な医療的または外科的介入が履行され得るよう、重症損害が起こる前に、例えば卒中または心筋梗塞の前に、罹患血管を非侵襲的に検出するために、複合体はアテローム硬化プラークに対して標的化される。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭは、好ましい標的であり、そしてリガンド、例えば抗体、ペプチドあるいはレクチンまたはそれらの組合せは、アテローム硬化症の情況において内皮細胞上に発現されるこの細胞表面エピトープを標的化するために用いられ得る。あるいはリポタンパク質、または低または高密度リポタンパク質に由来するリポタンパク質断片は、ターゲッティングリガンドとして用いられ得る。さらにコレステロールは、内皮細胞を標的化し、そして脂質、小胞等をアテローム硬化プラークに限局するために用いられ得る。ターゲッティングリガンドとしてのコレステロールの使用を包含する実施態様では、コレステロールは好ましくは、その他の化学基、部分およびリガンドで非修飾(非誘導)される。
【０２９５】
プラーク中の血栓性物質に対して向けられるターゲッティングリガンドは、アテローム硬化プラークの活性領域と不活性領域を弁別するために用いられ得る。血栓生成過程における活性プラークは、それらが結局は血管を閉塞するかまたは塞栓を生じ得るため、より危険である。この点で、低分子量ヘパリン断片のほかに、他のターゲッティングリガンド、例えば血小板活性化分画に向けられる抗フィブリン抗体、組織プラスミノーゲン活性剤(ｔ−ＰＡ)、抗トロンビン抗体およびフィブリン抗体は、血餅発生を伴う活性プラークを標的化するために用いられ得る。最も好ましいターゲッティングリガンドは、ターゲッティングＰ−セレクチン、ならびにＧＰＩＩｂＩＩＩａに向けられる抗体または関連抗体断片のほかに、活性化血小板中の形質膜会合ＧＰＩＩｂＩＩＩａを標的かするものである。
【０２９６】
本発明は、急性心筋梗塞の領域を検出するためにも有用である。脂質に抗ミオシン(特にカルジオミオシン)抗体または抗アクチン抗体を結合することにより、梗塞化心筋が本発明の方法により検出され得る。肉芽組織(治癒創傷)に対するターゲッティングに関しては、前記のターゲッティングリガンドの多くが有用であり得る。創傷治癒トリペプチド、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(ＲＧＤ)は、この点におけるターゲッティングリガンドとしても用いられ得る。
【０２９７】
前記の内皮細胞の場合と同様に、広範な種々のペプチド、タンパク質および抗体は、上皮細胞を標的化するためのターゲッティングリガンドとして用いられ得る。好ましくは上皮細胞標的受容体に対する高親和性を有するペプチド、例えば合成、半合成または天然ペプチドが選択され、合成ペプチドがより好ましい。これらの好ましい実施態様に関連して、約5〜約15個のアミノ酸残基を有するペプチドが好ましい。抗体は、天然または組換え体起源の全抗体または抗体断片、例えばＦａｂまたはＦａｂ‘2として用いられ得る。天然起源の抗体は、動物またはヒト機嫌のものであるか、あるいはキメラ(マウス／ヒト)であり得る。ヒト組換え体またはキメラ抗体が好ましく、そして断片が全抗体よりも好ましい。
【０２９８】
本発明の複合体中でターゲッティングリガンドとして用いられ得るモノクローナル抗体の例としてはＣＡＬＡＭ２７が挙げられるが、これは、舌の全ヒト扁平上皮癌でＢＡＬＥｌ／ｃマウスを免疫感作し、そして抽出脾臓細胞とＮＳ１相乗作用性骨髄腫細胞株のものとを交雑することによりハイブリドーマ体を形成することにより、生成される（Gioanni et al, Cancer Research, 47: 4417-4424 (1987)）。ＣＡＬＡＭ２７は、正常および悪性上皮細胞の両方の表面エピトープに向けられる。正常リンパ節は一般に、これらのエピトープを発現する細胞を含有しない(Cancer Research, 47: 4417-4424 (1987)参照)。したがってこの抗体を含む複合体は、リンパ節中の転移を標的化するために用いられ得る。モノクローナル抗体３Ｃ２は、重篤な卵巣癌および類内膜癌の悪性上皮細胞を標的化するためのターゲッティングリガンドとして用いられ得る。別の例示的ターゲッティングリガンドは、Ｍａｂ  ４Ｃ７(Cancer Research, 45: 2358-2362 (1985)参照)であって、これは、粘液性癌腫、類内膜癌および類中腎癌を標的化するために用いられ得る。頭および頚部癌における扁平上皮癌を標的かするために、Ｍａｂ  Ｅ４８（Biological Abstract, Vol. 099 Issue. 066 Ref 082748）がターゲッティングリガンドとして用いられ得る。悪性黒色腫を標的化するためには、モノクローナル抗体２２５．２８ｓ（Pathol. Biol., 38 (8): 866-869 (1990)）が用いられ得る。ＥＰＲ−１（エフェクター細胞プロテアーゼ１）に対して標的かされるモノクローナル抗体ｍＡｂ２Ｅも、用いられ得る。
【０２９９】
ターゲッティングリガンドが選択され得る上皮細胞上の種々の細胞表面エピトープが存在する。例えばタンパク質ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)は、皮膚および粘膜の良性および悪性上皮増殖と関連付けられている。2つのＨＰＶ癌遺伝子タンパク質Ｅ６およびＥ７は、これらがある種の上皮由来癌、例えば頚部癌において発現され得るので、標的化され得る(Curr. Opin. Immunol., 6 (5): 746-54 (1994)参照)。癌細胞増殖に関与するペプチド増殖因子(ＰＧＦ−Ｒ)に対する膜受容体も、腫瘍抗原として選択され得る（Anticancer Drugs, 5 (4): 379-93 （1994））。さらに上皮増殖因子(ＥＧＦ)およびインターロイキン−２(ＩＬ−２)は、これらの受容体を結合する適切なターゲッティングリガンド、例えばペプチドで標的化され得る。悪性黒色腫細胞により発現されるある種の黒色腫関連抗原(ＭＡＡ)、例えば上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)および接着分子（Tumor Biol., 15 (4): 188-202 (1994)）は、本明細書中に提供される複合体で標的化され得る。癌細胞の表面の腫瘍関連抗原ＦＡＢ−７２も標的として選択され得る。
【０３００】
広範な種々のターゲッティングリガンドが、心筋細胞を標的化するために選択され得る。例示的ターゲッティングリガンドとしては、例えばポリクローナル抗体Ｆａｂ‘2断片を含み得るか、あるいはヒト起源、動物起源、例えばマウス起源のもの、またはキメラ起源のものであり得る抗カルジオミオシン抗体が挙げられる。
【０３０１】
さらに別のターゲッティングリガンドとしては、ジピリダモール；ジギタリス；ニフェジピン；アポリポタンパク質；低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)、例えばα−ＬＤＬ、ｖＬＤＬおよびメチルＬＤＬ；リアノジン；エンドセリン；補体受容体タイプ１；ＩｇＧＦｃ；β１−アドレナリン作動薬；ジヒドロピリジン；アデノシン；ミネラロコルチコイド；ニコチン様アセチルコリンおよびムスカリン様アセチルコリン；ヒトα１Ａ−アドレナリン作動性受容体に対する抗体；生物活性剤、例えば薬剤、例えばα１−アンタゴニストプラゾシン；抗β受容体に対する抗体；抗β受容体に結合する薬剤；抗心臓ＲｙＲ抗体；心臓組織に及ぼす強力な陽性筋収縮性作用を発揮する内皮細胞由来血管収縮剤ペプチドであるエンドセリン−１(エンドセリン−１は心臓筋細胞膜小胞に結合する)；
【０３０２】
Ｔ細胞受容体α−β受容体に対して生成され、それによりターゲッティングリガンドを生成するために用いられ得るモノクローナル抗体；補体阻害剤ｓＣＲ１；ジヒドロピリジン受容体に対して生成される薬剤、ペプチドまたは抗体；抗インターロイキン−２受容体に対して向けられるモノクローナル抗体は、この受容体を発現し、そして炎症の状態において上向き調節され得る心筋組織の領域に本発明の複合体を向けるためのターゲッティングリガンドとして用いられ得る；同様に本発明の複合体を炎症心筋組織の領域に向けるためのシクロスポリン；メチルイソブチルイソニトリル；
【０３０３】
心筋細胞および心臓内皮細胞の膜上の特定の糖に結合するレクチン；内因性低血圧および血管弛緩ペプチドであるアドレノメジュリン(ＡＤＭ)；心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ)；内皮起源の22アミノ酸ペプチドであり、そして心房性ナトリウム利尿ペプチドと構造的に関連するが、しかし一般的には異なるものであり、そして血管活性および抗有糸分裂活性を保有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド(ＣＮＰ)；心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ)とＣ型ナトリウム利尿ペプチド(ＣＮＰ)のキメラであり、27個のアミノ酸を含むバソナトリンペプチド(ＶＮＰ)；トロンビン；内皮由来弛緩因子(ＥＤＲＦ)；中性エンドペプチダーゼ１(ＮＥＰ−１)；
【０３０４】
ＥＤＲＦに対する競合的阻害剤、例えばＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン(Ｌ−ＮＭＭＡ)；カリウムチャンネルアンタゴニスト、例えばチャリブドトキシンおよびグリベンクラミド；特発性拡張型心筋症患者で同定され得るが、しかし好ましくは心筋層において細胞溶解を引き出さない抗心臓抗体；アデニンヌクレオチド輸送体、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼまたは心臓ミオシンに対して向けられる抗体；ＢＱ−１２３と呼ばれるエンドセリン−Ａ受容体に対する特異的アンタゴニスト；ならびにアンギオテンシンＩＩ受容体に対する抗体が挙げられる。
【０３０５】
興味深い一実施態様では、本発明は、MahnkeとGuo(2000)によりJ. Cell. Biol., vol. 151, no. 3, p. 673-684に、そしてJiangとSwiggard(1995)によりNature, vol. 375, no. 6527, p. 151-155に記載されているように、エンドサイトーシスに関する樹状細胞受容体ＤＥＣ−２０５を標的化し得るターゲッティングリガンドに関する。
【０３０６】
別の興味深い実施態様では、本発明は、ジヒドロピリジン受容体と同時精製されるカルシウム結合糖タンパク質である、心臓筋細胞膜の2つの主要抗原の形態のターゲッティングリガンドに関する。抗血清、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体が精製筋細胞膜に対して産生され、これらの抗体はターゲッティングリガンドとしても用いられ得る。カルシウム結合糖タンパク質の精製分画は、筋細胞膜の形質膜から単離され、次に抗体を生成するために用いられ得る。前記のように、ターゲッティングリガンドとして用いられ得るＡＮＰは、ヒト大動脈内皮細胞の培養から得られる。ＡＮＰは一般に内皮細胞に限局されるが、しかし内皮または心筋組織にも限局され得る。ＡＮＰは、例えば組換え技法を用いて、ならびに当業界で周知のペプチド合成技法を用いたペプチドの合成により、調製され得る。ＡＮＰに向けられるポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を用いることもできる。同様に、ＡＮＰに向けられるペプチドは、内皮および／または心筋細胞を標的化するために用いられ得る。βおよびα形態の両方の心房性ナトリウム利尿因子が、心筋組織に本発明の複合体を向けるためのターゲッティングリガンドとして用いられ得る。
【０３０７】
遺伝子決定基
遺伝子決定基は、本明細書中で前記で提示されたその定義による生物活性剤の一群を代表する。本発明のある種の実施態様では、遺伝子決定基は、親油性部分を有する複合体中に存在するか、または親油性部分に共有結合され得る。
【０３０８】
遺伝子療法に関する本発明の局面において、核酸組成物は、補償遺伝子または治療性タンパク質をコードする遺伝子を含有する。補償遺伝子の例としては、ジストロフィンまたは機能的断片をコードする遺伝子、嚢胞性繊維症に罹患した患者における欠陥遺伝子を補償するための遺伝子、ＡＤＡに罹患した患者における欠陥遺伝子を補償するための遺伝子、ならびにＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子が挙げられる。治療的タンパク質をコードする遺伝子の例としては、エリスロポエチン、インターフェロン、ＬＤＬ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＴＮＦをコードする遺伝子が挙げられる。さらに、毒性物質と特異的に結合する一本鎖抗体構成成分をコードする核酸組成物が投与され得る。いくつかの好ましい実施態様では、ジストロフィン遺伝子がミニ遺伝子の一部として提供され、筋ジストロフィーに罹患した個体を治療するために用いられる。その他の好ましい実施態様では、部分ジストロフィンタンパク質に関するコード配列を含有するミニ遺伝子が提供される。ジストロフィン異常は、軽症ベッカー型筋ジストロフィー(ＢＭＤ)および重症デュシェーヌ筋ジストロフィー(ＤＭＤ)に関与する。ＢＭＤでは、ジストロフィンは作られるが、しかしそれはサイズおよび／または量が異常である。患者は軽症〜中等度症状である。ＤＭＤでは、タンパク質は作られず、患者は13歳まで車椅子に縛られ、そして通常は20歳までに死亡する。幾名かの患者においては、特にＢＭＤ罹患患者では、本発明により送達されるミニ遺伝子の発現により産生される部分ジストロフィンタンパク質が、筋機能改善を提供し得る。
【０３０９】
いくつかの好ましい実施態様では、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロンまたはＴＮＦをコードする遺伝子は腫瘍細胞に送達され、これは存在するかまたは除去され、そして次に個体に再導入される。いくつかの実施態様では、γ−インターフェロンをコードする遺伝子が、多発性硬化症に罹患した個体に投与される。
【０３１０】
本発明の遺伝子決定基は、アポトーシス誘導タンパク質の一部または全部をコードする核酸でもあり得る。アポトーシス誘導タンパク質としては、ＢＡＸ、ＢＡＤ、ｂｃｌ−ｘｓ、ｐ５３およびカスパーゼが挙げられるが、これらに限定されない（Sasaki et al. (2001), Nat. Biotechnol. 19, 543-547）。
【０３１１】
さらに本発明の遺伝子決定基は、免疫調節薬として機能し得るタンパク質の一部または全部をコードする核酸でもあり得る。免疫調節薬の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１２】
さらに遺伝子決定基は、抗原提示タンパク質の一部または全部をコードする核酸でもあり得る。抗原提示タンパク質の例としては、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子または抗原提示が可能な断片が挙げられる。好ましいＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ａ２である。
【０３１３】
本発明の一実施態様では、遺伝子決定基はアンチセンス核酸(アンチセンス分子とも呼ばれる)またはリボザイムであり得る。
【０３１４】
アンチセンス分子およびリボザイムも、このような活性作用物質のコピーのための鋳型として作用する核酸組成物を導入することにより、個体の細胞に送達され得る。これらの作用物質は、その存在が望ましくないタンパク質をコードする遺伝子の発現を不活性化するか、または相でなければ妨害する。アンチセンス分子をコードする配列を含有する核酸組成物は、細胞内のタンパク質の産生を抑制または阻止するために用いられ得る。したがって癌遺伝子産物のようなタンパク質の産生は、排除されるかまたは低減され得る。同様にリボザイムは、タンパク質に翻訳される前にメッセンジャーＲＮＡを選択的に破壊することにより、遺伝子発現を崩壊させ得る。いくつかの実施態様では、他の治療薬および手法の投与を包含する治療レジメンの一部として、アンチセンスまたはリボザイムをコードする核酸組成物を用いて、本発明にしたがって細胞を処置する。アンチセンス分子およびリボザイムをコードする核酸組成物は、タンパク質産生が望ましい場合に用いられるものと同様のベクターを用いるが、但し、コード配列は、タンパク質へのＲＮＡの翻訳を開始するための開始コドンを含有しない。
【０３１５】
リボザイムは、自己切断または別のＲＮＡ分子の切断が可能な触媒性ＲＮＡである。いくつかの異なる型のリボザイム、例えばハンマーヘッド、ヘアピン、テトラヒメナ群１イントロン、前方、ならびにＲＮアーゼＰが当業界で既知である(S. Edgington, Biotechnology (1992) 10, 256-262参照)。ハンマーヘッドリボザイムは、40ヌクレオチド未満のコアにマッピングされた触媒性部位を有する。植物ウイロイド中のいくつかのリボザイムおよびサテライトＲＮＡは、共通二次構造およびある種の保存ヌクレオチドを共有する。これらのリボザイムは天然で、それら自体の基質として役立つが、しかし酵素ドメインは、保存切断部位と側面を接する配列との塩基対合により、別のＲＮＡ基質に対して標的化され得る。リボザイムを特注するこの能力は、特定のＲＮＡ切断のためにそれらが用いられるのを可能にする(G. Paolella et al., EMBO (1992), 1913-1919参照)。したがって、種々の型のリボザイム、例えばハンマーヘッド触媒性配列とは異なる触媒性配列を用い、そして本明細書中に開示された方法でそれらを設計することは、当業者の認識内である。リボザイムは、種々の標的、例えば病原体ヌクレオチド配列および癌遺伝子配列に対して設計され得る。好ましい実施態様は、切断反応の有効性を保持しながら、ａｂｌ−ｂｃｒ融合転写体を特異的に標的化するのに十分な相補性を包含する。
【０３１６】
標的化アンチセンス送達の代替物として、標的化リボザイムが用いられ得る。「リボザイム」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の特定の塩基配列を標的化し、切断し得るＲＮＡベースの酵素を指す。リボザイムは、リボザイム配列を組入れるＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で細胞に対して直接標的化され得るし、あるいは所望のリボザイム性ＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入され得る。リボザイムは、アンチセンス核酸に関して記載されたのとほぼ同一の方法で、用いられ、適用され得る。
【０３１７】
免疫原決定基および抗原決定基
免疫原決定基および抗原決定基は、本明細書中で前記で提示されたその定義による生物活性剤を代表する。本発明のある種の実施態様では、このような決定基は、親油性部分を有する複合体中に存在し得るし、あるいは親油性部分に共有結合され得る。
【０３１８】
免疫系は、特異的および非特異的免疫を示し得る（Klein, J., et al., Immunology (2nd), Blackwell Science Inc., Boston (1997)）。一般に、所定の抗原に対してそれらの細胞表面に特異的受容体を表示するＢおよびＴリンパ球は、特異的免疫を生じる。免疫系は、以下の2つの方法で異なる抗原に応答し得る：１）体液媒介性免疫。これはＢ細胞刺激および抗体または免疫グロブリンの生成を包含する［その他の細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ；例えばマクロファージ）およびヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）も抗体応答の生成に関与する］、ならびに２）細胞媒介性免疫(ＣＭＩ)。これは一般に、Ｔ細胞、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)を包含するが、しかしその他の細胞もＣＴＬ応答に関与する(例えばＴｈ１および／またはＴｈ２細胞およびＡＰＣ)。
【０３１９】
非特異的免疫は、種々の細胞およびメカニズム、例えばマクロファージまたは顆粒球による食作用（外来粒子または抗原の飲み込み）、ならびにナチュラルキラー(ＮＫ)細胞活性等を包含する。
【０３２０】
非特異的免疫は、進化的にあまり進歩していないメカニズム(例えば重要な宿主防御メカニズムである食作用)によっており、特異的免疫応答の特質である特異性および記憶の後天的性質を表示しない。非特異的免疫は、なにより脊椎動物系に本来備わっている。さらに非特異的免疫に関与する細胞は、ＢおよびＴ細胞と重要な点で相互作用して、免疫応答を生じる。
【０３２１】
特異的免疫と非特異的免疫との重要な差異は、ＢおよびＴ細胞特異性に基づいている。これらの細胞は、主として特異的抗原による活性化合物にそれらの応答性を獲得し、そして特異的抗原への将来的曝露の場合に記憶を表示するためのメカニズムを有する。その結果、予防接種(特異性および記憶を包含する)は、有害病原体に対して防御するための有効なプロトコールである。
【０３２２】
本明細書中に上記したように、免疫原決定基とは、免疫応答、例えば特異的抗体応答を生じ得る任意の物質を意味する。したがって任意の抗原決定基は免疫原決定基であるが、しかし本明細書中で用いられるようなこれらの用語の意味内では、全ての免疫原決定基が抗原決定基であるわけではない。
【０３２３】
本発明の一実施態様では、免疫原決定基は、免疫応答を生じ得る物質をコードする遺伝子決定基であり得る。それゆえ免疫原決定基は、それ自体免疫原決定基である核酸、例えば(ポリ)ペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０３２４】
本発明の複合体は、１つまたはそれ以上の細菌からの細菌免疫原決定基および細菌抗原決定基の担体として用いられ得る。このような担体は、ワクチンとして用いられ得る。ワクチンとは、本明細書中で用いる場合、防御的免疫応答を生じ得る免疫原性組成物を意味する。免疫原決定基および／または抗原決定基の担体として本発明の複合体のために用いるのが望ましい場合、当該決定基はin vitroで合成されるか、またはそれに対して防御的免疫応答を生じるのが望ましい細菌から単離される。
【０３２５】
ワクチンが本発明にしたがって処方され得る細菌としては：ヘリコバクターピロリHelicobacter pylori、クラミジアニューモニエChlamydia pneumoniae、トラコーマクラミジアChlamydia trachomatis、ウレアプラスマウレアリチクムUreaplasma urealyticum、肺炎マイコプラズマMycoplasma pneumoniae、ブドウ球菌属Staphylococcus spp.、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus、連鎖球菌属Streptococcus spp.、化膿連鎖球菌Streptococcus pyogenes、肺炎連鎖球菌Streptococcus pneumoniae、ヴィリダンス型連鎖球菌Streptococcus viridans、エンテロコッカスフェカリスEnterococcus faecalis、髄膜炎菌Neisseria meningitidis、淋菌Neisseria gonorrhoeae、炭疽菌Bacillus anthracis、サルモネラ属Salmonella spp.、チフス菌Salmonella typhi、コレラ菌Vibrio cholera、ペスト菌Pasteurella pestis、緑膿菌Pseudomonas aeruginosa、
【０３２６】
カンピロバクター属Campylobacter spp.、カンピロバクタージェジュニCampylobacter jejuni、クロストリジウム属Clostridium spp.、クロストリジウムジフィシレClostridium difficile、マイコバクテリウム属Mycobacterium spp.、結核菌Mycobacterium tuberculosis、トレポネーマ属Treponema spp.、ボレリア属Borrelia spp.、ボレリアブルグドルフェリBorrelia burgdorferi、レプトスピラ属Leptospira spp.、軟性下疳菌Hemophilus ducreyi、ジフテリア菌Corynebacterium diphtheria、百日咳菌Bordetella pertussis、パラ百日咳菌Bordetella parapertussis、気管支敗血症菌Bordetella bronchiseptica、インフルエンザ菌Hemophilus influenza、大腸菌Escherichia coli、赤痢菌属Shigella spp.、エルリキア属Erlichia spp.およびリケッチア属Rickettsia spp.が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２７】
細菌免疫原決定基および抗原決定基は、ネイティブ、組換え体または合成であり得る。このような細菌免疫原決定基および／または抗原決定基としては、細胞表面に存在する炭水化物決定基に結合する細菌からのセレクチンまたはレクチン；ならびにタンパク質、例えばフィブロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンに対する細菌受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２８】
本発明のワクチンは、ワクチンを生成するための特定のウイルスからの１つまたはそれ以上の免疫原決定基および／または抗原決定基も含み得る。それに対してワクチンが処方され得るウイルスとしては、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス(ヒトおよび動物)、単純ヘルペスウイルス、パルボウイルス(ヒトおよび動物)、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ウシＬＶ、ＦｅｌＶ、イヌジステンパーウイルス、イヌ接触性肝炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ＴＧＥウイルス(ブタ)ならびに手足口病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２９】
ウイルス免疫原決定基および／または抗原決定基は、ネイティブ、組換え体または合成であり得る。このようなウイルス免疫原決定基および／または抗原決定基としては、細胞表面受容体との結合に関与して、感染過程を開始するウイルスタンパク質、例えば(ｉ)レトロウイルス(ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＦｅＬＶ等)およびヘルペスウイルスのエンベロープ糖タンパク質、ならびに(ｉｉ)インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらにこのようなウイルスタンパク質由来のペプチドが、遊離して、あるいは適切な担体に非共有的に会合されて、または共有的に接合されて、用いられ得る。
【０３３０】
本発明のワクチンは、１つまたはそれ以上の腫瘍関連免疫原決定基および／または抗原決定基も含み得る。腫瘍関連免疫原決定基および／または抗原決定基は、ネイティブ、組換え体または合成であり得る。このような腫瘍関連免疫原決定基および／または抗原決定基としては、殺害腫瘍細胞およびその溶解物、ＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３およびそのペプチド断片、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン(ＨＣＧ)およびそのペプチド断片、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)およびそのペプチド断片、アルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)およびそのペプチド断片、膵臓腫瘍胎児性抗原およびそのペプチド断片、ＭＵＣ−１およびそのペプチド断片、ＣＡ１２５、１５−３、１９−９、５４９、１９５およびそのペプチド断片、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)およびそのペプチド断片、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)およびそのペプチド断片、扁平上皮癌抗原(ＳＣＣＡ)およびそのペプチド断片、卵巣癌抗原(ＯＣＡ)およびそのペプチド断片、膵臓癌関連抗原(ＰａＡ)およびそのペプチド断片、Ｈｅｒ１／ｎｅｕおよびそのペプチド断片、ｇｐ−１００およびそのペプチド断片、突然変異体Ｋ−ｒａｓタンパク質およびそのペプチド断片、突然変異体ｐ５３およびそのペプチド断片、切頭化上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、ならびにキメラタンパク質ｐ２１０BCR-ABLが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３１】
これらの腫瘍関連免疫原決定基および／または抗原決定基に由来するペプチドは、遊離で、あるいは適切な担体に非共有的に会合され、または共有的に接合されて、用いられ得る。あるいはガングリオシドが、遊離で、あるいは適切な担体に非共有的に会合され、または共有的に接合されて、用いられ得るし、あるいは癌細胞中に特異的であり、または主としてそこに見出されるオリゴ糖配列は、遊離で、あるいは適切な担体に非共有的に会合され、または共有的に接合されて、用いられ得る。
【０３３２】
特に好ましい一実施態様では、本発明は、抗原決定基、例えば一般的にそれに対して防御的免疫応答を生じるのが望ましい免疫刺激エピトープが、同一抗原決定基、例えば免疫刺激エピトープをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡと組合せ手、複合体中に含まれる複合体に関する。
【０３３３】
別の好ましい実施態様では、複合体のエピトープ形成部分は、ｉ)エピトープそれ自体、およびｉｉ)エピトープを含む抗原決定基の組合せとして存在する。
【０３３４】
複合体がワクチン処方物中に用いられている場合、前記の処方物は１つまたはそれ以上のアジュバントを含み得る。「アジュバント」という用語は、本明細書中で用いる場合、注入される免疫原決定基とのその混和物が免疫応答を修飾する任意の物質である。免疫応答の修飾とは、抗体および細胞免疫応答のいずれかまたは両方の特異性を増大し、強化し、または広げることを意味する。免疫応答の修飾は、ある種の抗原特異的免疫応答、例えば耐性の誘導を低減するかまたは抑制することも意味し得る。
【０３３５】
このようなアジュバントは、当業者に既知の補助薬作用を含む任意の化合物であり得る。例えばこのようなアジュバントは、無機物、細菌、植物、合成または宿主起源のものであり得るし、あるいはそれらは水中油型エマルションであり得る。
【０３３６】
アジュバントは、以下のものから成る群から選択され得る：ＡｌＫ(ＳＯ4)2、ＡｌＮａ(ＳＯ4)2、ＡｌＮＨ4(ＳＯ4)、シリカ、明礬、Ａｌ(ＯＨ)3、Ｃａ3(ＰＯ4)2、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン(ｔｈｒ−ＤＭＰ)、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン(ＣＧＰ１１６８７、ノルＭＤＰとも呼ばれる)、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−(１‘２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる)、2％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−80.RTMエマルション中のＲＩＢＩ(ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ)、リポ多糖およびその種々の誘導体、例えばリピドＡ、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド(例えばポリＩＣおよびポリＡＵ酸)、結核菌Mycobacterium tuberculosisからのワックスＤ、ざ瘡桿菌Corynebacterium parvum、百日咳菌Bordetella pertussis、およびブルセラ属の成員中に見出される物質、リポソームまたはその他の脂質エマルション、チテルマックスTitermax、ＩＳＣＯＭＳ、クイルQuilＡ、ＡＬＵＮ(米国特許第58767号および第5,554,372号参照)、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、熱ショックタンパク質(ＨＳＰ、例えばLehner et al. (2000), Eur. J. Immunol. 30, 594-603参照)、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリクスまたはＧＭＤＰ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５；リポペプチド、例えばBessler等1982（Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 363, 767-770）およびBessler等1985（J. Immunol., 135, 1900-1905）により開示されたもの；アジュバント活性ペプチドおよび生体分子、例えばＴＧＦ−βおよびその断片、例えばWO 01/72331に開示された断片。
【０３３７】
本発明の一実施態様では、ワクチン処方物はさらに担体を含む。担体は、アジュバントとは独立して存在し得る。担体の機能は、例えば決定基の活性または免疫原性を増大し、決定基に安定性を付与し、決定基の生物学的活性を増大し、またはその血清中半減期を増大するために、免疫原決定基または抗原決定基の分子量を増大することであり得る。担体は、当業者に既知の任意の適切な担体、例えばタンパク質であり得る。担体タンパク質は、カギアナカサガイヘモシアニン、血清タンパク質、例えばトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンまたは卵白アルブミン、免疫グロブリン、あるいはホルモン、例えばインスリン、またはパルミチン酸であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫感作のために、担体は、ヒトに許容可能である生理学的許容可能な担体であり、安全でなければならない。しかしながら破傷風毒素および／またはジフテリア毒素は、本発明の一実施態様における適切な担体である。あるいは担体は、デキストラン、例えばセファロースであり得る。担体は、不安定なリンカー、例えばWO 97/49425に開示された種類のリンカーにより、免疫原決定基または抗原決定基に連結され得る。
【０３３８】
免疫原決定基および／または抗原決定基は、1回より多く、例えば2回、例えば3〜5回、例えば5〜10回、例えば10〜20回、例えば20〜50回、個別に投与され得る。各投与間のインキュベーション期間は変わり得るが、しかし通常は1〜7日、例えば1〜4週間、例えば1〜6ヶ月、例えば6〜12ヶ月、例えば1〜5年、例えば5〜15年の範囲内である。
個体は任意の動物であり得るが、しかしながら好ましくは個体はヒトである。
【０３３９】
機能的相同体
ポリペプチド、タンパク質または核酸が名称により本明細書中に特定的に記述される場合はいつでも、名称は前記のポリペプチド、タンパク質または核酸それ自体、ならびにそれらの任意の機能的相同体を含むことを意味する。それゆえ、遺伝子決定基、免疫原決定基、生物活性剤、抗原決定基および薬剤は、例えば特定的に記述されたポリペプチド、タンパク質または核酸のいずれか、あるいはそれらの任意の機能的相同体であり得る。
【０３４０】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質の機能的相同体とは、同一のまたは部分的に同一の機能を発揮し得る任意のポリペプチド配列(単数または複数)を含むことを意味する。
本発明の機能的相同体は、本明細書中の前記に略記されたような予定ポリペプチド配列と少なくとも何らかの相同を共有しているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えばこのようなポリペプチドは、本明細書中の前記に略記されたような予定ポリペプチド配列と少なくとも約40％、例えば少なくとも約50％相同、例えば少なくとも約60％相同、例えば少なくとも約70％相同、例えば少なくとも約75％相同、例えば少なくとも約80％相同、例えば少なくとも約85％相同、例えば少なくとも約90％相同、例えば少なくとも約92％相同、例えば少なくとも約94％相同、例えば少なくとも約95％相同、例えば少なくとも約96％相同、例えば少なくとも約97％相同、例えば少なくとも約98％相同、例えば少なくとも約99％相同である。
【０３４１】
相同は、好ましくは任意の適切なアルゴリズムにより、またはこのようなアルゴリズム、例えばIntelligeneticsによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬの、あるいはWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(ＧＣＧ)におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのコンピューター処理履行により、算定され得る。アミノ酸配列間の相同はさらに、周知のマトリクス、例えばＢＬＯＳＵＭ３０、ＢＬＯＳＵＭ４０、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ５５、ＢＬＯＳＵＭ６０、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＢＬＯＳＵＭ６５、ＢＬＯＳＵＭ７０、ＢＬＯＳＵＭ７５、ＢＬＯＳＵＭ８０、ＢＬＯＳＵＭ８５およびＢＬＯＳＵＭ９０のいずれかの助けを借りて算定され得る。
【０３４２】
本発明の機能的相同体は、1つより多いこのような置換、例えば2つのアミノ酸置換、例えば3または4つのアミノ酸置換、例えば5または6つのアミノ酸置換、例えば7または8つのアミノ酸置換、例えば10〜15のアミノ酸置換、例えば15〜25のアミノ酸置換、例えば25〜30のアミノ酸置換、例えば30〜40のアミノ酸置換、例えば40〜50のアミノ酸置換、例えば50〜75のアミノ酸置換、例えば75〜100のアミノ酸置換、例えば100より多いアミノ酸置換を含み得る。
【０３４３】
アミノ酸の付加または欠失は、2〜5つのアミノ酸、例えば5〜10のアミノ酸、例えば10〜20のアミノ酸、例えば20〜50のアミノ酸の付加または欠失であり得る。しかしながら50より多いアミノ酸の付加または欠失、例えば50〜200アミノ酸の付加も、本発明の範囲内に含まれる。
【０３４４】
その任意の変異体および機能的相同体を含めた本発明のポリペプチドは、一実施態様では、5つより多いアミノ酸残基、例えば10より多いアミノ酸残基、例えば20より多いアミノ酸残基、例えば25より多いアミノ酸残基、例えば50より多いアミノ酸残基、例えば75より多いアミノ酸残基、例えば100より多いアミノ酸残基、例えば150より多いアミノ酸残基、例えば200より多いアミノ酸残基を含み得る。
【０３４５】
本発明の範囲内の核酸配列の相同体は、類似の生物学的機能を有するＲＮＡおよび／またはタンパク質をコード、そして少なくとも50％同一、例えば少なくとも60％同一、例えば少なくとも70％同一、例えば少なくとも75％同一、例えば少なくとも80％同一、例えば少なくとも85％同一、例えば少なくとも90％同一、例えば少なくとも95％同一であるか、あるいは、緊縮条件下で前記核酸配列の相補鎖とハイブリダイズし得る核酸配列である。
【０３４６】
緊縮条件とは、本明細書中で用いる場合、例えばSouthern E. M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517により記載されたようなサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションに関連して普通に適用されるような緊縮性を意味する。このような目的のためには、予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの過程を包含することはルーチンの慣例である。このような過程は普通は、Sambrook et al., 1989, “Molecular Cloning/ A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように、6 x ＳＳＰＥ、5％デンハート、0.5％ＳＤＳ、50％ホルムアミド、100 μg/ml変性サケ精巣ＤＮＡ（42℃で18時間インキュベーション）を含有する溶液を用いて実施され、その後2xＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳで洗浄し（室温および37℃で）、そして0.1xＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳ（68℃で30分間インキュベーション）で洗浄する。
【０３４７】
相同の核酸配列は、付加および／または欠失を含む核酸配列も包含する。このような付加および／または欠失は、内部および末端に存在し得る。付加および／または欠失は、1〜5ヌクレオチド、例えば5〜10ヌクレオチド、例えば10〜50ヌクレオチド、例えば50〜100ヌクレオチド、例えば少なくとも100ヌクレオチドのものであり得る。
【０３４８】
患者の治療方法
本発明にしたがって、過増殖性疾患に特徴的である過増殖性細胞に対する広範に支持された防御免疫応答を付与する方法、ならびに過増殖性疾患に罹患している個体を治療する方法も提供される。本明細書中で用いる場合、「過増殖性疾患」という用語は、細胞の過増殖により特性化される疾患および障害を指すことを意味する。過増殖性疾患の例としては、全ての形態の癌および乾癬が挙げられる。
【０３４９】
免疫原性「過増殖性細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物の個体の細胞中への導入は、個体の予防接種済み細胞におけるそれらのタンパク質の産生を引き起こす、ということが発見された。本明細書中で用いる場合、「過増殖性−関連タンパク質」という用語は、過増殖性疾患と関連するタンパク質を指すことを意味する。過増殖性疾患に対して免疫感作するために、過増殖性疾患に関連したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物が、個体に投与される。
【０３５０】
過増殖性関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、それは、正常細胞と比較した場合、過増殖性細胞中で専らまたは高レベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原としては、このようなタンパク質、その断片、ならびにこのようなタンパク質上に見出される少なくとも1つのエピトープを含むペプチドが挙げられる。いくつかの場合、過増殖性関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異の産物である。突然変異化遺伝子は、正常タンパク質上には見出されない異なるエピトープを生じるわずかに異なるアミノ酸配列を有する以外は、正常タンパク質とほぼ同一であるタンパク質をコードする。その他の腫瘍関連タンパク質、例えば腫瘍細胞中に高レベルで見出されるタンパク質、例えばモノクローナル抗体17−1Ａにより認識されるタンパク質および葉酸塩結合タンパク質が、標的タンパク質として用いられ得る。
【０３５１】
本発明は、数個の形態の癌のうちの１つまたはそれ以上に対して個体を免疫感作するために用いられ得るが、しかし本発明は、特定の癌を発症しやすい、あるいは癌に罹ったことがあり、したがってぶり返しやすい個体を予防的に免疫感作するために特に有用である。遺伝学およびバイオテクノロジー、ならびに疫学の発達は、個体における癌の発症の確率の確定および危険性査定を可能にする。遺伝子スクリーニングおよび／または家族健康歴を用いて、数種類の癌のいずれかの発症に関して特定の個体が有し得る確率を予測することができる。
【０３５２】
同様に、すでに癌を発症したことがある、そして癌を除去するために治療を受けたことがあるか、またはそうでなければ寛解期にある個体は特に、回帰および再発を受け易い。治療レジメンの一部として、このような再発と闘うために、このような個体は、彼等が有すると診断された癌に対して免疫感作され得る。したがって個体がある種類の癌に罹ったことがあり、そしてぶり返す危険があることがわかれば、癌の任意の将来的出現と闘うために彼等の免疫系を調製するために、彼等は免疫感作され得る。
【０３５３】
本発明は、過増殖性疾患に罹患している個体の治療方法も提供する。このような方法において、核酸組成物の導入は、免疫療法薬として役立ち、標的タンパク質を産生する過増殖性細胞と闘うよう、個体の免疫系を指図し、促す。
【０３５４】
本発明は、自己免疫に関連する標的、例えば細胞受容体および「自己」に向けられる抗体を産生する細胞に対する広範に指示された防御的免疫応答を付与することにより、自己免疫疾患および障害に罹患している個体の治療方法も提供する。
【０３５５】
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性結腸炎が挙げられる。これらの疾患は各々、内因性抗原と結合するＴ細胞受容体により特性化され、そして自己免疫疾患に関連した炎症カスケードを開始する。Ｔ細胞の可変部に対する予防接種は、ＣＴＬを含めて免疫応答を引き出して、それらのＴ細胞を排除する。
【０３５６】
ＲＡにおいては、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいくつかの特定可変部が特性化されている。これらのＴＣＲとしては、Ｖβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７およびＶβ−１７が挙げられる。したがって少なくとも1つのこれらのタンパク質をコードする核酸組成物による予防接種は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的化する免疫応答を引き出す（Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925;Paliard, X., et al., 1991 Science 253: 325-329; Williams, W. V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90: 326-333参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
ＭＳでは、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定可変部が特性化されている。これらのＴＣＲとしては、Ｖβ−７およびＶβ−１０が挙げられる。したがって少なくとも1つのこれらのタンパク質をコードする核酸組成物による予防接種は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的化する免疫応答を引き出す（Wucherpfennig, K.W., et al., 1990 Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345: 344-346参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【０３５７】
強皮症では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定可変部が特性化されている。これらのＴＣＲとしては、Ｖβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖｃα７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２が挙げられる。したがって少なくとも1つのこれらのタンパク質をコードする核酸組成物による予防接種は、強皮症に関与するＴ細胞を標的化する免疫応答を引き出す。
【０３５８】
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患に罹患している患者を、特にＴＣＲの可変部がいつか特性化されねばならない患者を治療するために、滑液生検が実施され得る。存在するＴ細胞の試料が採取され、それらのＴＣＲの可変部が標準技法を用いて同定され得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製され得る。
【０３５９】
Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患としては、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーブズ病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息，クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症および悪性貧血が挙げられる。これらの疾患は各々、内因性抗原と結合する抗体により特性化され、そして自己免疫疾患に関連した炎症カスケードを開始する。このような抗体の可変部に対する予防接種は、ＣＴＬを含めて免疫応答を引き出して、抗体を産生するそれらのＢ細胞を排除する。
【０３６０】
Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患に罹患している患者を治療するために、自己免疫活性に関与する抗体の可変部が同定されねばならない。生検が実施され、炎症の部位に存在する抗体の試料が採取され得る。それらの抗体の可変部が標準技法を用いて同定され得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製され得る。
【０３６１】
ＳＬＥの場合、一抗原はＤＮＡであると考えられる。したがってＳＬＥに対して免疫感作されるべき患者において、彼等の血清が抗ＤＮＡ抗体に関してスクリーニングされ、そして血清中に見出されるこのような抗ＤＮＡ抗体の可変部をコードする核酸組成物を含むワクチンが調製され得る。
【０３６２】
ＴＣＲおよび抗体の両方の可変部の間の共通の構造的特徴は周知である。特定のＴＣＲまたは抗体をコードするＤＮＡ配列は一般に、例えばKabat, et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda Md.（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたような周知の方法にしたがって見出され得る。さらに抗体からの機能的可変部をクローニングするための一般的方法は、Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に見出され得る。
【０３６３】
薬剤
本発明の複合体は、一実施態様において、多数の薬剤および製薬的活性物質のいずれかの粘膜および皮膚表面を通した取込みを促すために用いられる。好ましくはこのような製薬的活性物質は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。しかしながら本発明の複合体を含む製剤組成物は、その分子量が約250,000ダルトン未満である限り、任意の製薬的活性物質の取込みを増大するために用いられ得る。
【０３６４】
本発明の製剤組成物と一緒に投与され得るポリペプチドの例としては、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、上皮小体ホルモン、レニン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、コルチコトロピン、濾胞刺激ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出因子、インターフェロン（α、βおよびγ）、リンフォカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）、例えばＩｇＧ、エンケファリン（Su, K.S.E., et al., J. Pharm. Sci. 74: 394-98 (1985)参照）、カルシトニン（McMartin, C. and Peters, G., Delivery Systems For Peptide Drugs, S.S. Davis et al. (eds.), pp. 249-53, Plenum Press New York (1986)）、ソマトスタチン（McMartin, C. and Peters, G., Delivery Systems For Peptide Drugs, Davis S.S. et al. (eds.), pp. 255-63, Plenum Press New York (1986)）、メチオニル成長ホルモン（Moore, J.A. et al., Delivery Systems For Peptide Drugs, Davis S.S. et al. (eds.), pp. 317-329, Plenum Press New York (1986)）、オキシトシン（Hendricks, C.H. and Pose, S.V., J.A.M.A. 175: 384-387 (1961)）、バソプレッシンおよびデスモプレッシン（Richson, D.W. and Robinson, A.G., Ann. Int. Med. 103: 228-239 (1985)）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（Fink, G. et al., J. Endocr. 63: 351-360 (1974)）、酢酸ナファレリン（Anik, S.T. et al., J. Pharm. Sci. 73: 684-685 (1984)）、セクレチン（Ohwaki, T. et al., J. Pharm. Sci. 74 (5): 550-552 (May, 1985)）、グルカゴン（Pontiroli, A.E. et al., Acta Diatetol Let. 22: 102-110 (1985)）、ピモロール（Kaila, T. et al., J. Ocular Pharm. 1: 79-83 (1985)）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（Sandow, J. and Petri, W., Trans Nas. System. Med., (Chien, Y.W. ed.) Elsevier Science Publishers B.B., Amsterdam, pp. 183-199 (1985)）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６５】
さらに本発明の組成物は、酵素、例えばトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、プロテアーゼ、リガーゼおよびオキシドレダクターゼ、例えばエステラーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼおよびペプチダーゼ；酵素阻害剤、例えばロイペプシン、キモスタチンおよびペプスラチン、ならびに増殖因子、例えば腫瘍新脈管形成因子の、粘膜および皮膚表面を通した取込みを増大するためにも用いられ得る。
【０３６６】
その他の適切な製薬的活性物質は、脂溶性ステロイド、例えばプロゲステロン、エストロゲンおよびアンドロゲン、ならびに脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫである。
【０３６７】
低および高分子量ポリペプチドのほかに、製薬的活性物質は、抗炎症薬（例えばインドメタシン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、イブプロフェン、フェニルブタゾン）、抗生物質（例えばβ−ラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、プリリドンカルボン酸、ホスホマイシン）、抗腫瘍薬（例えばアドリアマイシン、シスプラチン、ブレオマイシン、マイトマイシン、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、アミノ酸（例えばアスコルビン酸、Ｎ−アセチルトリプトファン）、抗真菌薬、プロスタグランジン、ビタミン、ステロイド、ワクチン抗原、ワクチンアジュバントおよび抗ウイルス薬（ＡＺＴ、ＤＤＩ、アシクロビル、イドクスウリジン、アマンタジンおよびビダラビン）であり得る。
【０３６８】
本発明の複合体と組合せて投与され得る薬剤は、予防的に、治療的に、あるいはヒトまたは動物身体で実行される診断的方法と関連して投与され得る。複合体は、ヒトまたは任意のその他の動物の化粧的処置方法のために用いられる化粧剤も含み得る。
【０３６９】
薬剤と組合せて本発明の複合体を含む組成物は、複合体および薬剤を封入する生分解性ミクロスフェアをさらに含み得る。生分解性ミクロスフェアは、任意の所望の場所にミクロスフェアをガイドするかまたは標的化し得る任意の適切なターゲッティングリガンドを含み得る。
【０３７０】
直腸投与のための好ましい薬剤としては、ホルモン、抗生物質、麻酔薬、鎮痛薬、抗真菌化合物、殺細菌薬、静菌薬、抗原生動物化合物および抗ウイルス化合物が挙げられる。
本発明の製剤組成物から、そしてヒトまたは動物身体中に放出され得る薬剤の例としては、抗ヒスタミン薬（例えばジメンヒドリネート、ジフェンヒドラミン（50〜100 mg）、クロルフェニラミンおよびデキシクロルフェニラミンマレエート）、鎮痛薬（例えばアスピリン、コデイン、モルヒネ（15〜300 mg）、ジヒドロモルホン、オキシコドン等）、抗炎症薬（例えばナプロキシン、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、アスピリン、スリンダク）、胃腸薬および抗嘔吐薬（例えばメトクロプラミド（25〜100 mg））、抗癲癇薬（例えばフェニトイン、メプロバメートおよびニトラゼパム）、血管拡張薬（例えばニフェジピン、パパベリン、ジルチアゼムおよびニカルジピン）、鎮咳薬および去痰薬（例えばリン酸コデイン）、抗喘息薬（例えばセロフィリン）、鎮痙薬（例えばアトロピン、スコポラミン）、ホルモン（例えばインスリン、ヘパリン）、利尿薬（例えばエタクリン酸、ベンドロフルメチアジド）、抗低血圧薬（例えばプロプラノロール、クロニジン）、気管支拡張薬（例えばアルブテロール）、抗炎症性ステロイド（例えばヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、プレドニソン）、抗生物質（例えばテトラサイクリン）、抗痔疾薬、催眠薬、向精神薬、下痢止め薬、粘膜溶解薬、鎮静薬、うっ血除去薬、緩下薬、制酸薬、ビタミン、刺激薬（例えば食欲抑制薬、例えばフェニルプロパノールアミン）が挙げられるが、これらに限定されない。前記の一覧は、これだけに限定されることを意味しない。
【０３７１】
その他の種類の薬剤としては、フルラゼパム、ニメタゼパム、ニトラゼパム、ペルラピン、エスタゾラム、ハロキサゾラム、バルプロ酸ナトリウム、ナトリウムクロモグリケート、プリミドン、アルクロフェナク、クエン酸ペリソキサル、クリダナク、インドメタシン、スルピリン、フルフェナム酸、ケトプロフェン、スリンダク、メチアジン酸、トルメチンナトリウム、フェンチアザク、ナプロキセン、フェンブフェン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フルルビプロフェン、ジクロフェナクナトリウム、メフェナム酸、イブプロフェン、アスピリン、硫酸デキストラン、カリンダシリンナトリウム等が挙げられる。
【０３７２】
薬剤は、生理学的に活性なポリペプチドの形態であり得るが、これは、インスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、その塩またはその誘導体、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、バソプレッシン、バソプレッシン誘導体、オキシトシン、カルシトニン、上皮小体ホルモン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオチミン、コレシストキニン、アンギオテンシン、ヒト胎盤ラクトゲン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、エンケファリン、エンケファリン誘導体、エンドルフィン、インターフェロン（α、βおよびγ形態のうちの１つまたはそれ以上の形態の）、ウロキナーゼ、カリクライン、サイモポイエチン、サイモシン、モチリン、ジノルフィン、ボムベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラディキニン，サブスタンスＰ、キオトロフィン、
【０３７３】
神経発育因子、ポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン、ブレオマイシンおよびネオカルジノスタチンから成る群から選択される。さらに薬剤は、多糖、例えばヘパリン、抗腫瘍薬、例えばレンチナン、ザイモサンおよびＰＳ−Ｋ（クレスチン）、アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジベカシン、パロモマイシン、カネンドマイシン、リピドマイシン、トブラマイシン、アミカシン、フラジオマイシンおよびシソマイシン、β−ラクタム抗生物質、例えばペニシリン、例えばスルベニシリン、メシリナム、カルベニシリン、ピペラシリンおよびチカルシリン、チエナマイシン、ならびにセファロスポリン、例えばセフォチアム、セフスロジン、セフメノキシメ、セフメタゾール、セファゾリン、セフォタキシメ、セフォペラゾン、セフチゾキシメおよびモキサラクタム、あるいは核酸薬、例えばシトコリン，ならびに同様の抗腫瘍薬、例えばシタラビンおよび５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）であり得る。
【０３７４】
膣投与に適した薬剤は、避妊薬、ホルモン、抗生物質、麻酔薬、鎮痛薬、収縮防止薬、抗真菌薬、殺細菌薬、静菌薬、抗原生動物化合物、抗ウイルス化合物および子宮収縮のための組成物である。その他の適切な薬剤は、皮膚科学的薬剤、例えば抗真菌薬、痒み止め用組成物および皮膚保護用組成物であり得る。
耳に投与するための薬剤（耳性投与）は、例えば抗生物質、コルチコステロイド、局所麻酔薬および鎮痛薬である。
【０３７５】
鼻投与のための薬剤は、例えば止血薬、抗アレルギー化合物、抗ヒスタミン薬、抗コリン作動薬、アドレナリン作動性（腫脹減退）化合物および局所鎮痛薬である。
薬剤は、原則的に、局所作用または全身作用を有し得る。好ましい実施態様では、本発明の製剤組成物は、局所作用を有し、そして本質的にいかなる全身作用も有さない少なくとも1つの薬剤を含む。
【０３７６】
製剤組成物
本発明の製剤組成物は、任意の粘膜、例えば結膜、鼻咽頭、眼咽頭、膣、結腸、尿道、膀胱、肺、大腸（直腸）および小腸（腸内）に適用され得る。本発明の組成物は、経費的に、例えばパッチの一部としても投与され得る。好ましくは本発明の組成物は、点眼薬の一部として眼に、エーロゾルの一部として鼻に、あるいは固形ウエファーの一部として頬に投与される。
【０３７７】
したがって、本発明の複合体または複合体を含む製剤組成物の個体への送達のために、任意の状態の技法が用いられ得る。例としては、ｉ)複合体または複合体を含む製剤組成物を陽イオン性リポソームと会合し、ｉｉ)複合体または複合体を含む製剤組成物をトランスフェクション剤に共有的に連結し、そしてｉｉｉ）複合体または複合体を含む製剤組成物で微小金粒子を被覆し、生物弾道学的移送のために被覆粒子を使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７８】
さらに本発明の製剤組成物は、持放性組成物中にも処方され得る。例えば複合体および薬剤のステロールおよび／またはサポニン構成成分は、長時間にわたって複合体および薬剤を放出するシリコーンエラストマーと併合され得る。シリコーンエラストマーは、アルブミンも含み得る（米国特許第4,985,253号参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。シリコーンエラストマーからの薬剤の放出速度は、シリコーンエラストマー中への水溶性または脂溶性混合剤または補助溶媒（例えばポリエチレングリコール４００、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、Ｌ−アラニン、塩化ナトリウム、ポリジメチルシロキサン）の混入により制御され得る。任意のその他の添加剤も、放出速度を促進する目的のために、シリコーンエラストマー中に混入され得る。
【０３７９】
さらに製薬的活性物質および本発明の複合体は、ポリラクチドおよび／またはポリグリコリドコポリマー、セルロースポリマー（メチル−、メチルヒドロキシエチル−、ヒドロキシプロピル−、ヒドロキシエチル−、ナトリウムカルボキシエチル−セルロース）、ポリアクリル酸、ポリメチルメタクリレート、架橋化ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、アガロース、あるいはスチレンとジビニルアゾベンゼンで架橋されたヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマーを含む制御放出組成物中に処方され得る。
【０３８０】
あるいは製薬的活性物質および本発明の複合体は、ＤＥＡＥ−デキストランミクロスフェア、デンプンミクロスフェア、アルブミンミクロスフェア、あるいは任意の製薬上許容可能な物質製の任意のその他のミクロスフェアまたはマイクロカプセルの一部として処方され得る。
【０３８１】
同様にミクロスフェアは、コーティングとともに提供され得る。このコーティングは、ミクロスフェアの集塊または粘着を防止し、あるいはミクロスフェアの内側の薬剤および／または薬剤を含む溶媒の蒸発を防止する種類のものである。本発明はまた、特定の細胞または組織に対する親和性をミクロスフェアに提供するコーティングの使用を予見する。このような親和性コーティングは、特定のアミノ酸配列の形態、あるいは特定のタンパク質に対する親和性を有する抗体または抗体の一部でさえある形態であり得る。それにより薬剤送達は、薬剤が投与されるべき細胞（例えば癌細胞、転移）に対して精確に標的化し得る。同様にこれは、診断的使用のためのミクロスフェアの使用を可能にし、そして薬剤は、このような場合、標的化細胞を標識するのに適した化合物により置換され得る。
【０３８２】
封入のための作用物質としては、コロイド、親水コロイド、例えばゼラチン、滲出液、例えばアラビアゴム、トラガカントゴム、カリアkaryaゴム、ガッティghattiゴム；海草からの抽出物、例えば寒天、アルギン酸塩、カラジーナンおよびフルセララン；植物からの抽出物、例えばペクチンおよびアラビノガラクタン；海洋性および陸生動物からの抽出物、例えばゼラチンおよびその他のタンパク質様親水コロイド；種子、例えばグアル、イナゴマメ、ダイズからの粉；種子からのタンパク質、例えばダイズタンパク質；穀類からの粉、例えばデンプンおよび微晶質セルロース；生合成または発酵由来親水コロイド、例えばデキストラン、キサンタンおよびクルドラン；化学修飾化親水コロイド、例えば亜セルロース誘導体、例えばメチルセルロースおよびその他の誘導体、例えば変性デンプンおよび低メトキシルペクチン；合成親水コロイド、例えばポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８３】
本発明の一実施態様によれば、ミクロスフェアは、10 μm（マイクロメートル）を超えない最大平均粒子サイズを有し、そして離散微小粒子の形態で水中に分散され得る疎水性／好気性固体物質を含有するが、この場合、マイクロカプセル封入物質中の固体活性物質の量は22〜71重量％である。
【０３８４】
本発明の別の実施態様によれば、ミクロスフェアはマイクロカプセル封入された油または脂肪物質を含み得るが、この場合、少なくとも1つの油または脂肪は、2 μm（マイクロメートル）以下の平均直径を有する粒子または小滴としてマトリクス物質中に分散され、油または脂肪は少なくとも10重量％の高不飽和脂肪酸、好ましくはω−３およびω−６脂肪酸を含有し、遊離脂肪酸のレベルは5.0重量％より低く、好ましくは約0.5重量％より低く、そしてマトリクス物質はカゼイン塩、そして任意に少なくとも1つの炭水化物から成る。油または脂肪は、少なくとも30重量％のω−３脂肪酸を含有する海洋性油、好ましくは魚油であり得る。同様に油または脂肪は、植物油、好ましくはルリチシャ油であり、好ましくは少なくとも20重量％のω−３および／またはω−６脂肪酸を含有し得る。この油または脂肪は、天然、発酵および／または酵素的再エステル化または化学的改質油または脂肪であり、好ましくは10〜65重量％の量であり；マトリクス物質は1〜100重量％のカゼイン塩および0〜70重量％の、グルコースシロップ、マルトデキストリン、サッカロース、マルトースまたはラクトースから成る群から選択される少なくとも1つの炭水化物；0〜10重量％の、ビタミン酸化防止剤ａ−、ｓｓ−、ｒ−および６−トコフェロール、アスコルビン酸およびその誘導体、カロテノイドおよびローズマリー抽出物から成る群から選択される少なくとも1つの酸化防止剤、ならびに0〜35重量％の、コーンスターチ、乳タンパク質、例えばカゼイン、カゼイン塩およびホエイタンパク質、予備煮沸またはゼラチン化でんぷん、ダイズタンパク質単離対、ラクトース、リン酸三カルシウムおよび炭酸カルシウムを含む。
【０３８５】
水溶性薬の場合、ミクロスフェアは、薬剤および任意に薬剤保持または薬剤安定化化合物を含む内部水性相を有する二相系として調製され得る。この内部水性相はその場合、ポリマーを含む油相で乳化されて、水／油エマルションを作る。
マイクロカプセル封入法を実行するに際して油相中に含入されるポリマーは、水にほとんど可溶性でないかまたは不溶性である、そして生体適合性であるポリマーである。例は、脂肪族ポリマー（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリアルキレンオキサレート（例えばポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート）、ポリオルトエステル、ポリオルトカルボネートおよびその他のポリカルボネート（例えばポリエチレンカルボネート、ポリエチレン−プロピレンカルボネート）、ならびにポリアミノ酸（例えばポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸）のような生分解性ポリマーである。その他の生体適合性高ポリマーは、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸−メタクリル酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン）、ポリエチレンテレフタレート（テトロン）、ポリアミノ酸、シリコーンポリマー、デキストランステアレート、エチルセルロース、アセチル−セルロース、ニトロセルロース、ポリウレタン、無水マレイン酸ベースのコポリマー、エチレン−ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド等である。これらのポリマーは、ホモポリマー、あるいは2つまたはそれ以上のモノマーのコポリマー、あるいはポリマーの混合物であり得る。それらは塩形態でもあり得る。
【０３８６】
乳化手法に関しては、分散を実行する既知の方法が用いられる。前記の方法は、例えば断続的振盪法、プロペラ形撹拌機、タービン形撹拌機等を用いる混合法、コロイドミル法、ホモジナイザー法または超音波法である。
【０３８７】
このように調製されたＷ／Ｏエマルションは次に、Ｗ／Ｏ／Ｗ三重相エマルションに乳化され、水中乾燥を施される。したがって前記のＷ／Ｏエマルションはさらに第三水性相に付加されて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを生じ、その後、油相中の溶媒が除去されてミクロスフェアを生じる。
【０３８８】
外部水性相に、乳化剤が付加され得る。乳化剤として、一般的に安定Ｏ／Ｗエマルションを生成し得る任意のもの、例えば陰イオン性界面活性剤（例えばオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム）、非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０（Atlas Powder Co., U.S.A.の製品）））、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体（ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０（Nikko Chemicals, Japanの製品））、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチンまたはゼラチンが用いられ得る。このような乳化剤は、単独で、または任意の組合せで用いられ得る。
【０３８９】
本発明の複合体および製薬的活性物質が持放性組成物中に処方される場合、製剤物質の含量は、投与される用量および放出速度によって適切に制御され得る。組成物がマトリクス型調製物中に造形される場合、製剤物質の含量は、通常は5〜40重量％、さらに好ましくは15重量％以下、例えば9重量％以下であり得る。ペプチドホルモンを投与する場合、その含量は、約6〜10重量％以下であるべきである。アルブミンは、用いられる場合は、50重量％以下、好ましくは約20〜30重量％で存在する。シリコーンエラストマーは、50重量％以上、好ましくは70〜90重量％の量で含入され得る。
【０３９０】
持放性組成物は、任意の順序で構成成分を混合することにより調製され得る。アルブミンが付加される場合、薬剤およびアルブミンが、好ましくは固体状態で、先ず併合される。あるいは製剤物質およびアルブミンの水性溶液が混合され、その結果生じた混合物は、固体混合物を作成するために凍結乾燥される。この混合物は次に、エラストマー基剤とともに、任意に可塑剤（例えばジメチルポリシロキサン）をもちいて、均一に分散され、それに硬化剤を付加して、その結果生じた混合物を撹拌する。混合物は次に、適切な金型中に入れられて、室温で硬化されて、成形組成物が製造される。このようなコア物質は、任意の非毒性物質を含み得る。好ましくはこのようなコア物質は、弾性ポリマーである。
【０３９１】
本発明の持放性組成物は、体腔中の粘膜との有効な接触に適している任意の形状を有し得る。例えば製薬的活性物質が頬に投与される場合、持放性組成物は、ウエファーの形態であり得る。製薬的活性物質が膣に投与される場合、持放性組成物はリングの形態である。眼に投与される場合は、持放性組成物は薄層眼用移植片の形態である。
【０３９２】
本発明の組成物は、サポジラsapodillaのラテックスからのゴムを含むチューインガムの一部としても処方され得る。好ましくはチューインガム組成物は、製薬的活性物質に関連した任意の不快な味を遮蔽する甘味剤（糖、アスパルテーム等）および風味剤（スペアミント油、冬緑油またはペパーミント油等）も含む。
【０３９３】
眼または鼻に投与される場合、本発明の組成物は、製薬上許容可能な緩衝系により、3.0〜8.0のｐＨに、最も好ましくはｐＨ5.0〜5.4に緩衝された水性溶液中に処方され得る。好ましい範囲にｐＨを保持し得る任意の製薬上許容可能な緩衝系は、本発明の実施に際して用いられ得る。典型的緩衝液は、例えば酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液等である。緩衝液の濃度は、0.005〜0.1モルの範囲、最も好ましくは約0.02モルであり得る。
【０３９４】
本発明の組成物が眼に投与される場合、組成物は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物および重炭酸塩イオン、ならびにデキストロースおよびグルタチオンを含有する溶液を含み得る（例えば米国特許第4,550,022号および第4,443,432号参照）。
【０３９５】
あるいは涙液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸を含有する水性溶液を含み得る。水酸化ナトリウムは、約7.25のｐＨ値を確立するために含まれ得るし、硫酸マグネシウムも含まれ得る（英国特許出願第2,064,320号参照。米国特許第4,938,970号（眼に投与した場合に痛みを生じない灌注溶液を開示する）も参照）。この特許によれば、電解質溶液は、2〜10 meq/LのＫ+、0〜3 meq/LのＣａ++、1〜5 meq/LのＭｇ++および110〜150 meq/LのＮａ++を含み、6.85〜8.0のｐＨに緩衝される。
【０３９６】
その他の物質、例えば防腐剤、組織の緊張値を達成するための塩、または既知の鼻または眼用処方物成分により示されたその他の添加剤が、これらの処方物に付加され得る。
「動物」という用語は、本発明の組成物から利益を得るすべての動物を意図する。このような動物の第一のものは、ヒトである。しかしながら本発明は、そのように限定されることを意図せず、本発明の有益な作用を経験し得る任意のそしてすべてのこのような動物を治療することは、本発明の意図内である。
【０３９７】
鼻投与に関しては、本発明の組成物は、好ましくは鼻粘膜への含入組成物の適用を可能にするための手段を、例えば鼻アプリケーター具を装備した容器中に存在する。適切なアプリケーター具は当業界で既知であり、例としては、滴薬またはスプレー形態での鼻粘膜への液体組成物の投与のために適合されたものが挙げられる。ポリペプチドを用いた投薬は可能な場合は精確に制御されるべきであるため、投与量が精確に調節され易くなるスプレーアプリケーターの使用が一般的に好ましい。
【０３９８】
適切な投与具としては、例えばatmosing用具、例えばポップ−アトマイザーおよびエーロゾルディスペンサーが挙げられる。後者の場合、アプリケーターは、鼻用アプリケーター中に用いるのに適した噴射液と一緒に、本発明の組成物を含有する。噴霧用具は、適切なスプレーアダプターを装備されて、鼻粘膜への含入組成物の送達を可能にする。このような用具は、当業界で周知である。
【０３９９】
容器、例えば鼻用アプリケーターまたは点眼薬瓶は、1回の鼻または眼投薬のために、あるいは数回の連続投薬、例えば数日または数週間の期間に亘る投薬のために十分な組成物を含有し得る。
【０４００】
キット構成要素
多数の局面において、本発明は複合体に関するが、この場合、前記の複合体はさらに、例えば遺伝子決定基および／または免疫原決定基を含む。しかしながら、一実施態様では、本発明は前記の複合体のいずれかに関するが、この場合、前記の複合体は、生物活性剤、免疫原決定基、遺伝子決定基、酵素、アジュバントおよびアジュバント活性ペプチドおよび生体分子、ならびに薬剤から成る群から選択される１つまたはそれ以上と混和されていたが、しかしそれらと複合体を形成されない。
【０４０１】
別の実施態様では、本発明はキット構成要素に関するが、この場合、前記のキット構成要素は、本発明の複合体を、ならびに生物活性剤、免疫原決定基、遺伝子決定基、酵素、アジュバントおよび薬剤から成る群から選択される１つまたはそれ以上のものを含む。
【０４０２】
一実施態様では、本発明は、以下の：
ａ）本明細書中に前記された複合体のいずれか、および
ｂ）免疫原決定基、および／または
ｃ)抗原決定基
を含むキット構成要素であって、免疫原決定基が抗原決定基とは異なるキット構成要素に関する。
【０４０３】
特にこのようなキット構成要素は、一次追加免疫感作のために用いられ得る。それゆえ免疫原決定基は、それを必要とする個体に投与され、そしてインキュベーション期間後、抗原決定基が前記の個体に投与され得る。あるいは抗原決定基がそれを必要とする個体に投与され、そしてインキュベーション期間後、免疫原決定基が前記の個体に投与され得る。
【０４０４】
免疫原決定基は、抗原決定基ないにも含まれる少なくとも1つのエピトープを含むかまたはコードする、というのが好ましい。
免疫原決定基は、本明細書中に前記された免疫原決定基のいずれかであり得る。例えば免疫原決定基は、免疫応答を生じ得る物質をコードする遺伝子決定基であり得る。好ましい一実施態様では、免疫原決定基はポリヌクレオチドを含むかまたは本質的にそれから成る。前記のポリヌクレオチドは、好ましくは、抗原決定基内に含まれるエピトープをコードする。
【０４０５】
免疫原決定基は、単離されてまたは本発明の複合体の一部として存在し得るし、あるいはワクチン処方物と混和され得る。それゆえ、例えばキット構成要素内の複合体は、前記の免疫原決定基を含み得る。
【０４０６】
抗原決定基は、本明細書中で前記された抗原決定基のいずれかであり得る。しかしながら好ましい一実施態様では、抗原決定基はポリペプチドを含むかまたは本質的にそれから成る。例えば抗原決定基は、リポペプチド、例えばNardelli et al. (1994), Vaccine 12, 1335-1339; Tam et al. (1998), Dev. Biol. Stand., 92, 109-116; Beekman et al. (1997), J. Pept. Res. 50, 357-364; Beekman et al. (1999), Vaccine 17, 2043-2050; Bessler et al. (1997), Behring Inst. Mitt., 390-399; Bessler et al. (1997), Int. J. Immunopharmacol., 19, 547-550, Deres et al. (1989), Nature 342, 561-564, Hoffmann et al. (1989), Biol. Cham. Hoppe Seyler, 370, 575-582; Schild et al. (1991), Eur. J. Immunol., 21, 2649-2654; Schlecht et al. (1993), Naturwissenschafen, 80, 9-17に記載されたリポペプチドのいずれかであり得る。前記のポリペプチドは、好ましくは、免疫原決定基内にも含まれるかまたはそれによりコードされるエピトープを含む。
【０４０７】
抗原決定基は、単離されてまたは本発明の複合体の一部として存在し得るし、あるいはワクチン処方物中に混合され得る。それゆえ、例えばキット構成要素内の複合体は、前記の抗原決定基を含み得る。
【実施例】
【０４０８】
実施例
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様の単なる説明であって、いかなる点においても、実施例に開示されたものに本発明を限定すると解釈されるべきでない。
【０４０９】
実施例１
ＩＳＣＯＭへの低分子量物質の混入
免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）は、直径約40 nmの均一サイズを有するケージ様構造である。概して、ＩＳＣＯＭという用語は、抗原が構造中に挿入される場合に用いられるが、一方、ＩＳＣＯＭ−マトリクスは、抗原を伴わない構造を意味する。いくつかの報告は、ウイルス膜タンパク質のような両親媒性タンパク質を用いたＩＳＣＯＭの生成を記載する。しかしまた、非両親媒性タンパク質、例えばＢＳＡおよびＯＶＡ、ならびに脂肪酸に連結された親水性タンパク質が用いられた。ＩＳＣＯＭの生成のための2つの重要な構成成分は、洗剤により可溶化されるコレステロールおよびリン脂質である。多数のタンパク質抗原は、ＩＳＣＯＭ精製の過程と適合可能な洗剤により溶液中にもたらされ得るが、一方、他の化合物、例えばリポペプチドは異なる溶媒を要する。ここに報告された方法は、有機溶媒（Ｎ，Ｎ‘−ジメチルスルホキシド）中での予備溶解過程と、その後の洗剤：水による段階的希釈を用いることによる、ＩＳＣＯＭの構造中へのこのようなリポペプチドの埋め込みを可能にする。水と混和性の異なる溶媒（ジメチルホルムアミド、エタノール）の使用により、その他の低分子量化合物がＩＳＣＯＭ中に挿入され得る。これは、蛍光染料Ｄｉｌに関して実証される。無傷ＩＳＣＯＭ構造の生成のための有機溶媒の影響も調べた。試験した3つの溶媒（ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール）に関して、ＩＳＣＯＭ作製中の最大許容濃度は、15％〜25％であった。ＩＳＣＯＭの調製は全て、高臨界ミセル濃度を有する洗剤であるメガ１０（Mega 10）の存在下で実行した。メガ１０が透析後も依然としてＩＳＣＯＭ−マトリクスの構成部分であるか否かを調べるために、放射能標識化メガ１０を調製中に付加した。透析は洗剤を効率的に除去し、そして極わずかの量のみがＩＳＣＯＭ−マトリクスに関連して残存した。
【０４１０】
序論
免疫刺激複合体またはＩＳＣＯＭは、脂質の存在下でアジュバントクイルQuilＡがウイルスタンパク質と組合された場合に発見された。これらのケージ様微小構造は、その名称が示すように、免疫感作実験に一般的に用いられるが、しかしそれらの特徴的特性のために非免疫学的用途にも用いられ得る。ＩＳＣＯＭは、水性溶液中に保存され、凍結または凍結乾燥され得る安定剛性構造である。ＩＳＣＯＭの内部環境は、小水溶性分子が保持され得ないので、周囲の液相とは異なる［１］。ＩＳＣＯＭは、水に可溶性であり、このようなものとして、水溶液中に疎水性分子（例えば抗原）を保有するために用いられ得る。ＩＳＣＯＭの生物学的特性の1つは、細胞膜を通り抜けて包埋分子を細胞の内部に進入させるそれらの能力である。この能力は、おそらくはそれらの疎水性構造、ならびにコレステロール膜と複合体を作るサポニンであるそれらのクイルQuilＡ含量による。クイルQuilＡは、このようなものとして表面活性および溶血性であって、そしてin vivoで適用されると副作用を有し得る。ＩＳＣＯＭ中へのクイルQuilＡの処方時に、溶血性が部分的に阻害され、この望ましくない作用を低下させる。細胞中のＩＳＣＯＭの運命は詳細には明示されていないが、しかしＩＳＣＯＭ保有抗原の実質的部分は、食作用性および非食作用性抗原提示細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞）の両方の細胞質ゾル中で実証されている［２］。その他の報告は、ファゴソーム膜と密接に関連するマクロファージのファゴソーム内の無傷のおよび部分的に分解されたＩＳＣＯＭについての知見を記載する［３］。
【０４１１】
クイルQuilＡ、コレステロールおよびリン脂質（ホスファチジルコリン）を当該タンパク質と混合することにより、多数のタンパク質（抗原）がＩＳＣＯＭ構造中に挿入され得る。ＩＳＣＯＭの生成中、タンパク質は落とし込まれ、安定的に包埋される。このアプローチはしばしば、両親媒性タンパク質、例えば膜に広がる糖タンパク質に関して効率的であり、そして親水性タンパク質は脂肪酸のカップリングにより化学修飾される（例えばパルミチン化）。しかしながらいくつかの親水性タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミンは、化学的修飾を伴わずに挿入を可能にする低ｐＨでの処理により、疎水性領域を明示する［４；５］。その他の物質は、二価性試薬を用いて、予備生成構造（ＩＳＣＯＭまたはＩＳＣＯＭ−マトリクス）に連結される。ＩＳＣＯＭの生成中のホスファチジルエタノールアミンによるホスファチジルコリンの置換は、反応性アミノ基を供給することにより化学的修飾を促す。
【０４１２】
しかしながら混入方法および化学的連結方法はともに、水：洗剤中で可溶性である化合物を必要とする。この要件は、包埋可能な物質の多様性を制限する。水性溶液中に直接溶解しない化合物は、有機溶媒、水および洗剤の混合物中で可溶性を示し得る。この報告において、ｉｓｃｏｍが水および異なる極性有機溶媒の混合物中でそしてどの濃度で生成され得るかを、われわれは調べる。3つの当該溶媒は、Ｎ，Ｎ‘−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびエタノール（ＥｔＯＨ）であり、これは全て、全濃度で水と混合可能である。さらに、これらの溶媒の使用がＩＳＣＯＭ中に新規の化合物を挿入可能にさせるか否かを、われわれは取り扱う。実施例は、合成リポペプチドおよび蛍光親油性トレーサーＤｉｌである。
【０４１３】
一般的に、高ＣＭＣ（臨界ミセル濃度）を有する洗剤の使用により調製されるＩＳＣＯＭは、透析により精製され得る、と考えられる。透析過程は、ＩＳＣＯＭ構造中に組入れられない低分子量構成成分を除去する。しかしながら、洗剤がＩＳＣＯＭの一部を形成して、透析による除去を不可能にさせるか否かについては調べられていなかった。ここに記載されたＩＳＣＯＭはすべて、メガ１０（Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）の使用により調製される。メガ１０が透析中に完全に除去されるか否かを調べるために、放射能標識化メガ１０を合成し、ＩＳＣＯＭ中の洗剤を追跡した。
【０４１４】
材料と方法
メガ１０および14Ｃ−メガ１０の合成
合成経路を立証するために、20 mmolのデカン酸（3.44 g）を20 mlの氷冷エーテルおよび2 gのピリジン（2.04 ml）中に溶解した。10分後、激しく撹拌しながら、わずかに余分量のエチルクロロホルメート（22 mmol; 2.39 g＝2.1 ml）を付加した。沈殿を10分間生成させて、濾過により除去した。濾液を温メタノール（64.5℃）中のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（20 mmol; 3.9 g）の溶液に付加し、室温で1時間反応させた。次に溶液を4℃で一夜貯蔵した。
【０４１５】
蒸発によりエーテルおよびメタノールを除去後、残留油を80 mlのエーテルおよび7 mlのメタノール中に溶解し、40℃に加熱した。混合物を徐々に冷却させると、その時点で白色沈殿が生じた。撹拌しながら沈殿を4℃で一夜継続させた。濾過により白色結晶メガ１０を収集し、乾燥した。総収量5.0 g（74％）。
【０４１６】
逆相ＨＰＬＣにより、生成物の質を、Sigma-Aldrichから入手したメガ１０と比較した；ＨＰＬＣ−プロフィールの差異は観察されなかった（データは示されていない）。
14Ｃ−メガ１０の場合、同一手法に従ったが、しかし1 mgの14Ｃ−デカン酸（ナトリウム塩）を、エーテル中の非標識化デカン酸の溶液に付加した。14Ｃ−デカン酸は、Sigma-Aldrich, St Louis, MOから入手した。14Ｃ／14Ｃ−メガ１０の総収量は4.0 g（59％）であった。
【０４１７】
ＩＳＣＯＭの調製
メガ１０（Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）を、Sigma-Aldrich, St Louis, MOから購入し、20％ストック溶液として用いた。Ｄｉｌ（１，１‘−ジオクタデシル−３，３，３’，３‘−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート）をMolecular Probes, Eugene, ORから入手し、使用前にＤＭＦまたはＥｔＯＨ中に溶解した（1.0 mg/ml）。コレステロールおよびホスファチジルコリン（エピクロンEpikuron２００Ｓ、Lucas Meyer Gmbh, Germany）を、各構成成分に関して1％ w/vの濃度で20％メガ１０中に溶解し、−20℃で貯蔵した。Dalsgaard［６］により記載されたのと同様にクイルQuilＡを調製し、使用するまで−20℃で溶液で貯蔵した。
【０４１８】
クイルQuilＡ、コレステロールおよびホスファチジルコリンを、挿入される構成成分（例えばリポペプチド）と併合することにより、ＩＳＣＯＭを調製した。35℃（14Ｃ／14Ｃ−メガ１０を用いる実験に関しては室温）で撹拌しながら4時間、ＩＳＣＯＭを生成させ、その後、Slide-A-Lyzer（商標）カセット（Pierce, Rockford, IL）または透析管（Visking, London, UK）中のリン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ7.2）に対して透析し、分子量を10,000でカットオフした。クイルQuilＡの反応混合物中の濃度は、異なる調製物に関して0.9 mg/ml〜1.3 mg/mlの範囲であった（セクション３参照）が、一方、コレステロールおよびホスファチジルコリンの濃度は、すべての実験において0.03％であった。メガ１０の最終濃度は、別記しない限り4％ w/vであった。
【０４１９】
ＩＳＣＯＭの精製
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ7.2中の25％（w/v）スクロースから、スクロース勾配を調製した。PolyallomerTM遠心管（サイズ13 x 51 mm、Beckmann Instruments）に4.5 mlのスクロース溶液を充填し、−20℃で貯蔵した。使用時に、必要数の試験管を4℃で徐々に、典型的には一夜かけて解凍させ、それにより勾配が生じた［７］。勾配を室温で少なくとも1時間平衡させた後、ＩＳＣＯＭ調製物を0.5 mlまたはそれ以下の容量で適用した。Beckmann InstrumentsローターＳＷ５５Ｔｉ中で、50,000 rpmで20℃で3時間、遠心分離を実施した。ダイオードアレイＵＶ検出器（Perkin Elmer）を通して無傷ＩＳＣＯＭを収集し、210 nmでモニタリングした［８］。
【０４２０】
アミノ酸分析
Waters CorprationからのピコタグシステムPico-Tag System（商標）を、ＩＳＣＯＭのペプチド含量の確定のために用いた。6 NＨＣｌおよびフェノールを用いて150℃で1時間、Pico-Tag作業台で加水分解を実施し、その後、Pico-Tagプロトコールにしたがってフェニルイソチオシアナレ（ＰＩＴＣ）で誘導した。定量測定値を得るために、1:1ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）を用いて室温で10分間処理してＩＳＣＯＭ構造を崩壊させ、その後、溶媒を真空蒸発させた（セクション３．２の考察参照）。
【０４２１】
結果および考察
有機溶媒の存在下でのＩＳＣＯＭ−マトリクスの生成
ＩＳＣＯＭの生成のための一般的手法はDalsgaard等［９］により記載されているが、しかしクイルQuilＡの濃度をわずかに高くした（1.3 mg/ml; 0.13％ w/v）。コレステロール、ホスファチジルコリンおよび有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはＥｔＯＨ）を併合し、混合した後、クイルQuilＡを付加した。初期シリーズの実験を室温で実施して、非予測可能的に洗剤の沈殿を生じた。クイルQuilＡの付加前に反応混合物を35℃で平衡させることにより、ＩＳＣＯＭ−マトリクスの生成中に沈殿を回避した。さらにまた、それは、透析の初期時間中に高温を維持するために必要であることを示した。クイルQuilＡ、ＩＳＣＯＭおよび脂質は微生物増殖のための基質を構成し、そしてそれは一般的に、5℃より低い温度で透析するために有益である。沈殿を回避するために、透析緩衝液を最初の3〜4時間は約35℃に保持し、その後、室温に冷却させた。透析を少なくとも6時間継続した後、ビーカーを4℃で放置した。透析はSlide-A-Lyzer（商標）（分子量を10,000でカットオフ）カセット（Pierce）中で実行したが、異なる透析系は異なる計時を要する。
【０４２２】
電子顕微鏡（ＥＭ）による視覚的検査により、ＩＳＣＯＭ−マトリクスの生成に及ぼす有機溶媒の影響を評価した。第一判定基準は構造の形状および均一性であり、第二に、ＩＳＣＯＭ粒子の数であった。ＩＳＣＯＭ−マトリクスの生成は、20％ v/vの濃度まではＤＭＳＯの存在による影響は受けなかった（図９Ａ）。この限界を超えると、収量が影響を受けた。25％ＤＭＳＯを用いた場合、無傷構造は観察され得たが、しかしＩＳＣＯＭの数は低減した。ＤＭＦに関して、同一パターンが観察された。ここでは、25％またはそれより低いＤＭＦ濃度を用いて、無傷ＩＳＣＯＭ構造を高濃度で産生し得た。25％より高いＤＭＦの影響は限定数のＩＳＣＯＭ粒子であったが、しかし外見に関しては無傷であった。ＥｔＯＨは、約15％までの濃度で、当該過程に適合性であった。この濃度で調製された無傷構造の中に、多少の逸脱構造が出現した。反応混合物に20％エタノールを付加すると、極限定量の無傷ＩＳＣＯＭ粒子および明らかに形の崩れた構造を生じた（図９Ｂ）。クイルQuilＡおよび脂質の濃度、ならびに洗剤（メガ１０）の濃度は、有機溶媒の濃度に対するＩＳＣＯＭ生成の感受性を偏らせ得る、と推測される。これらの実験では、最終メガ１０濃度は4 ％v/wであった。これらの知見を変えるために、同等濃度の洗剤を利用することが考慮されるべきで洗う。結論として、溶媒の付加は、以下に限定されるべきである：
【０４２３】
【表１３】
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【０４２４】
ＩＳＣＯＭ中へのリポペプチドの埋め込み
ＩＳＣＯＭ中にリポペプチドを組入れるために、リポペプチドは溶液にしなければならない。リポペプチドの溶解度は、実ペプチド配列および脂質尾によっている。ここで用いたリポペプチドＮＰ147−Ｓ−Ｐａｍは、チオエステル結合によりパルミチン酸に連結された12のアミノ酸のペプチド配列からなる。凍結乾燥リポペプチドは、実際的に水：洗剤中に不溶性であるが、しかしＤＭＳＯには容易に溶解する。しかしながらＤＭＳＯ中の溶液を、水：洗剤でさらに希釈して、ＩＳＣＯＭ中へ包埋にリポペプチドを利用可能にし得る。ＮＰ147−Ｓ−Ｐａｍの場合、ＩＳＣＯＭ生成のために、4.5％メガ１０、8％ v/vＤＭＳＯ中の約0.5 mg/mlリポペプチドの最終濃度を用いた。10％メガ１０による段階的希釈と、その後の所望濃度のリポペプチドを得るための水の段階的付加は、リポペプチドの沈殿を伴わずに一貫して進む、ということをわれわれは見出した。洗剤ならびに水はともに、途中で混合しながら、3回で付加した。コレステロール、ホスファチジルコリンおよびクイルQuilＡ（0.13 ％w/v）の付加により、ＩＳＣＯＭが自然に生じた。
【０４２５】
スクロース勾配遠心分離を用いて、無傷ＩＳＣＯＭを精製した。勾配をダイオードアレイＵＶ検出器を通して走査してペプチド含量を測定し、ＩＳＣＯＭを前記［８］と同様に収集した。ＩＳＣＯＭは210 nmで容易に検出されるが、一方、芳香族残基を含有するペプチドは280 nmで異なる吸光度を示す。この波長での空ＩＳＣＯＭの吸光度は非常に限定され、Ａ210／Ａ280比はペプチド含量に関連する。しかしながらペプチド含量を精確に確定するためには、異なる方法を用いなければならない。ＩＳＣＯＭのポリペプチド含量を確定するために、一般的タンパク質検定、例えばビシンコニン酸（ＢＣＡ）法がしばしば用いられる。このような検定はしばしば、タンパク質濃度標準の代わりに参照として用いられる同一ペプチドの溶液を必要とするアミノ酸組成に対して感受性である。
【０４２６】
代替的方法は、標準アミノ酸分析、例えば酸性加水分解、フェニイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）による誘導および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーに基づいたPico-Tag System（商標）（Waters Corporation）である。総ペプチド含量は、各アミノ酸および立証済みの予測相対アミノ酸組成から算定し得る。Pico-Tagプロトコールに適合性である凍結乾燥ＩＳＣＯＭを見出したが、しかしジクロロメタン（ＤＣＭ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）による分析の前に、ＩＳＣＯＭ構造は崩壊されねばならない。非崩壊ＩＳＣＯＭは、アミノ酸分析中の酸性加水分解の過酷な条件中の加水分解から包埋ペプチドを保護する（図１０）が、このことは、ｉｓｃｏｍ構造の高安定性ならびにＩＳＣＯＭ内の化学的環境の差異を強調する。
【０４２７】
Lovgren等は、ＩＳＣＯＭ中に挿入される脂質尾ペプチドによる免疫感作を前に提唱している［１０］。この試験では、手足口病ウイルス（ＶＰ１  144-159）に由来するアミド連結リポペプチドを、ＤＭＳＯ中にリポペプチドを溶解後に、ＩＳＣＯＭ中に包埋した。ＩＳＣＯＭは免疫感作のために用い、しかし抗体の誘導には効果がないことを示した（私信）が、このことは、包埋アプローチがペプチドワクチンには適用不可能であることを示す。したがってその他の方法、例えばペプチド担体としての予備生成ＩＳＣＯＭの使用が調べられた。二価性カップリング剤マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルによりインフルエンザウイルスＩＳＣＯＭに接合された17-merブタ成長ホルモンペプチドによる免疫感作は、効率的であることを示し［１１］、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなタンパク質担体に代わるものとしてのＩＳＣＯＭを確立した。しかしながらインフルエンザウイルスに由来するマウスＣＴＬ−エピトープ（例えばＮＰ147−Ｓ−Ｐａｍ）およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）からの防御的エピトープを含めたチオエステル連結リポペプチドを用いた近年の実験では、ＩＳＣＯＭ中に包埋されたリポペプチドは免疫学的応答をプライミングするのに効果があった［１２；１３］。これらの知見は、ペプチドとＩＳＣＯＭの将来的組合せに関して重要であることを示し得るし、そして、ＩＳＣＯＭ中のアミド連結リポペプチドの低免疫原性は、ＩＳＣＯＭそれ自体の構造中への包埋よりむしろアミド結合の化学的高安定性によるものである、と述べたBeekman等の理論［１４］を支持する。
【０４２８】
染色ＩＳＣＯＭの調製
有機溶媒の使用は、ＩＳＣＯＭ中に貧水溶性リポペプチドを組入れる場合に有益であった。この方法がリポペプチド以外の他の化合物に適用可能であるか否かを調べるために、長鎖ジアルキルカルボシアニン染料Ｄｉｌを含有するＩＳＣＯＭを調製した。予備生成ＩＳＣＯＭおよびＩＳＣＯＭ−マトリクスのＤｉｌによる標識は、リポソーム膜の標識のために開発された方法［１６］の適応により、Claassen等［１５］が以前に記載している。Ｄｉｌを160 μg/ml（200 μg/mgＩＳＣＯＭと等価）の濃度でＩＳＣＯＭに付加し、それにより標識の80％までをＩＳＣＯＭ構造中に組入れたが、一方、非混入染料は、水性緩衝液中で低溶解性であるために沈殿した。
【０４２９】
本発明の試験では、ＤＭＦまたはＥｔＯＨ中に溶解したＤｉｌをメガ１０中のコレステロールおよびホスファチジルコリンに付加し、その後、クイルQuilＡを付加することにより、ＤｉｌをＩＳＣＯＭ中に包埋した。Ｄｉｌの濃度は150 μg/mlで、反応混合物中のＤＭＦ／ＥｔＯＨ濃度は15％ v/vとなった。
【０４３０】
染料の沈殿を防止するために、メガ１０の濃度を5％ w/vに調整した後、Ｄｉｌを付加した。ＤｉｌおよびクイルQuilＡ（1.3 mg/ml）の付加後、洗剤の濃度は4％となった。
用いた有機溶媒（ＤＭＦまたはＥｔＯＨ）とは関係なく、生成反応中または透析後に染料の沈殿は観察されなかったが、このことは、Ｄｉｌの定量的混入を示す。これは、異なる黄色帯域のＩＳＣＯＭを示し、ＩＳＣＯＭ分画の外側は染色されなかったスクロース勾配上での密度遠心分離により確証された（データは示されていない）。ＩＳＣＯＭ中に挿入されたＤｉｌの最大吸光度は552 nmで観察され［１７］、島津ＵＶ−１５０−０２分光光度計を用いて、混入された染料の量をメタノール中のＤｉｌの標準溶液と比較した。
【０４３１】
【表１４】
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【０４３２】
ＩＳＣＯＭ中の洗剤含量の分析
一次実験では、メガ１０透析の動力学を調べた。7％ w/v14Ｃ／14Ｃ−メガ１０および0.9 mg/mlの濃度のクイルQuilＡの存在下で、ＩＳＣＯＭ−マトリクスを生成した。18.3 mlの総容量から、16の1 mlアリコートを取り出して、8つの1000 mlビーカー中での水に対する透析を準備した（2 x 1 ml袋／水1000 ml）。4つのビーカーを室温で、4つを4℃で、撹拌しながら放置した。後日の各時点で、両温度から1つのビーカーを取り出して、容量の差を補償するために水を付加した後、個々の透析袋（2 x 2袋）の含量を計数した。表１は、一定期間透析後の各袋中に残存する14Ｃ−メガ１０の量（初期14Ｃ含量と比較したｃｐｍ（計数／分）のパーセンテージとして示される）を列挙する。結果は、室温での透析が4℃での透析のおよそ1日勝っている、ということを示す。しかしながら14Ｃ−メガ１０の同一終点濃度は、温度にかかわらず、4日以内に到達された（0.4〜1.1％）。メガ１０が透析膜を通って自由に拡散すると予測すると、2つの袋（1つのビーカーからの）の容積は平衡時に5.1 mlで、ビーカー中には約995 mlが残存した（5.1 ml/995 ml*100％＝0.51％）ので、透析袋の含量は総14Ｃ−メガ１０の0.51％を表すと予測し得る。そして、室温での透析は4℃での透析より速いが、しかし両方法はＩＳＣＯＭ−マトリクスからのメガ１０の除去に際して等しく効果がある、と結論づけられる。
【０４３３】
【表１５】
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【０４３４】
表１．14Ｃ−メガ１０の平衡透析。異なる時点で透析袋中に残存する洗剤の量（初期ｃｐｍのパーセンテージとして示される）。透析緩衝液（水）は取り換えなかった。
【０４３５】
メガ１０がＩＳＣＯＭマトリクスから完全に除去され得るか否かをさらに調べるために、二次実験を計画した。ここで、3.3％w/v14Ｃ／14Ｃ−メガ１０を用いて調製した1 mlのＩＳＣＯＭ−マトリクスを含有する4つの透析袋を、水1000 mlを含入する個々のビーカー中に入れた。室温で撹拌しながら、透析を実施した。各日に1つのビーカーを取り出して、透析袋の含量を計数し、その後、残りのビーカーの透析緩衝液（水）を取り換えた。透析開始前の濃度と比較した14Ｃ−メガ１０の測定含量を、表２に示す。
【０４３６】
平衡を得るためには、1回の水換えを伴う単に2日の透析を必要とする、と結論される。これは、平衡が3〜4日以内に達成された従来の実験の場合より有意に速い。さらに、洗剤の元の量の0.07％だけが透析袋内に残存するので、メガ１０が除去される効率は、因数約10だけ増大した。この知見は、微量の洗剤が透析後にＩＳＣＯＭ構造と関連して残存する、ということを示す。
【０４３７】
【表１６】
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【０４３８】
表２．14Ｃ−メガ１０の終点透析。透析緩衝液（水）を毎日取り換えた後に袋中に残存する洗剤の量。
【０４３９】
参考文献
【０４４０】
【化６】
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【０４４１】
【化７】
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【０４４２】
【化８】
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【０４４３】
実施例２
本発明のＤＮＡ結合複合体の調製
この実施例は、静電的相互作用によりＤＮＡとの会合を形成する能力を有する微小粒子の調製方法を実証する。複合体の生成中に、コレステロールの一分画をＤＣ−コレステロールに置換することにより複合体を調製した。
【０４４４】
ステロールおよびリン脂質のストック溶液。    20％w/vメガ１０（Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）（Sigma-Aldrich）中に、コレステロール、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）（Avanti Polar Lipids）およびホスファチジルコリン（エピクロン２００Ｓ）（Lucas Meyer Gmbh, Germany）を溶解することにより、3つの脂質ストック溶液を調製した。3つのストックの濃度（w/v）を以下に示す：
【０４４５】
【表１７】
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【０４４６】
撹拌し、40℃に加熱することにより、脂質を溶解させた。ストック溶液は、使用するまで−20℃で貯蔵した。
【０４４７】
複合体生成。    ストックＡ、ＢまたはＣを10％w/vメガ１０および水で希釈することにより、5％w/vメガ１０中に1.7 mg/mlの濃度のクイルQuilＡ（キラヤサポニン）および0.034％w/vのホスファチジルコリンを含有する反応混合物を調製した。ＤＣ−コレステロールおよびコレステロールの最終濃度は、選択脂質ストック溶液の組成によって変化した：
【０４４８】
【表１８】
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【０４４９】
クイルQuilＡの付加により複合体生成を開始し、反応混合物を30℃で2時間、磁気撹拌しながらインキュベートし、これにより微小粒子が生成する。
【０４５０】
複合体精製。    インキュベーション後、分子量を10,000でカットオフする透析管（Pierce, Slide-A-Lyzer, MWCO 10,000）を用いて、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して微小粒子懸濁液を透析した。透析は室温で24時間継続し、12時間後に透析緩衝液を1回取り換える。
【０４５１】
微小粒子構造の評価。    透析後、ＩＳＣＯＭを電子顕微鏡グリッド上に受動的に吸収させて、乾燥し、酢酸ウラシルで陰性染色した。全超生物が、ＩＳＣＯＭであることが既知の特徴的ケージ様構造を有する粒子を産生した。
【０４５２】
実施例３
ＤＮＡ結合ＩＳＣＯＭに結合された線状プラスミドＤＮＡの分解
本実施例の目的は、ＤＮＡ結合ＩＳＣＯＭと会合したＤＮＡがＤＮアーゼＩによる分解から保護されるか否かを調べることである。線状化プラスミドＤＮＡを32Ｐで酵素的に標識した。標識ＤＮＡをＩＳＣＯＭと結合させて、ＤＮアーゼを用いてまたは用いずに処理した。濾過によりＩＳＣＯＭを収集し、保持された標識の量を、分解から保護されたＤＮＡの量の測定値として用いた。
【０４５３】
ＤＮＡのラベリング。    ＢａｍＵＨ１で消化したプラスミドｐＵ１８（Amersham Pharmacia,  ｐＵＣ１８  ＢａｍＨ１／ＢＡＰ）を、25 μlのＥｃｏＰｏｌ緩衝液（New England BioLabs, 10 mMトリス−ＨＣｌ、5 mMＭｇＣｌ2、7.5 mMＤＴＴ、ｐＨ7.5）中の1 μgのＤＮＡに10 μCiの［α−32Ｐ］ｄＧＴＰ（Amersham Pharmacia,ＡＡ0066）を付加することにより、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片を用いて標識した。1単位のクレノウ断片（New England BioLabs,Ｍ0212Ｓ）をさらに付加することにより、反応を開始させた。室温で15分間のインキュベーション後、70℃で5分間加熱することにより、反応を停止させた。水で容積を50 μlに調整し、使用説明書に記載されているようにMicroSpinＳ−４００ＨＲカラム（Amersham Pharmacia, 27-5140-01）を用いたスピンカラム精製により、非混入ヌクレオチドを除去した。
【０４５４】
非混入32Ｐの除去後、Ｅｃｏ−Ｐｏｌ緩衝液（New England BioLabs）によりプラスミドをさらに希釈して400 μlとし、PackardＴｒｉ−Ｃａｒｄ４０００シンチレーション計数器を用いてCerenkov計数により取込みを検査した。
【０４５５】
ＩＳＣＯＭとの標識化ＤＮＡの結合。    1:1の比率でＤＣ−コレステロール／コレステロールを含有するＩＳＣＯＭを、標識化ＤＮＡと会合させた。2つの別個の試験管（Ａ、Ｂ）中で、100 μlの標識化線状プラスミド（約150 ngに相当する）を10 μgのＩＳＣＯＭ（30 μlのｉｓｃｏｍリン酸塩緩衝化生理食塩水、ｐＨ7.2）と混合し、室温で1時間インキュベートした。対照実験として、ＤＣ−コレステロールを含有しない普通のＩＳＣＯＭ（リン酸塩緩衝化生理食塩水中10 μg）を等量の標識化ＤＮＡと混合して、容積を130 μlに調整した。この試料（Ｃ）を、ＤＣ−コレステロールＩＳＣＯＭを含有する試料と平行してインキュベートした。
【０４５６】
ＤＮＡの分解。    標識化ＤＮＡをＩＳＣＯＭとともにインキュベート後、10単位のＤＮアーゼＩ（Stratagene; 600031）を試験管Ａ（ＤＮＡ結合ＩＳＣＯＭ）およびＣ（対照ＩＳＣＯＭ）に付加した。付加前に、酵素を10倍希釈して、10単位／1μlＤＮアーゼ反応緩衝液（40 mMトリス−ＨＣｌ、6 mMＭｇＣｌ2、2 mMＣａＣｌ2、ｐＨ7.5）とした。ＤＮアーゼで37℃で1時間、ＤＮＡを消化させて、その後、5 μlの500 mMＥＤＴＡ、ｐＨ8.0の付加により反応を停止させた。
【０４５７】
分解ＤＮＡおよびＩＳＣＯＭ結合ＤＮＡの分離。    ＤＮアーゼ処理試料（Ａ、Ｃ）および非消化試料（Ｂ）をともに微小遠心管フィルター（Millipore, Ultrafree-MC, 30,000 NMWL Filter Units）に移して、4,000 xgで10分間の遠心分離によりフィルター膜を強制通過させた。フィルターキャップをシンチレーションバイアルに移しながら、流出液を捨てた。2 mlのシンチレーション液（Packard, Opti-Flour O）を各フィルターに付加し、その後、PackardＴｒｉ−Ｃａｒｄ４０００シンチレーション計数器で計数することにより、フィルターに残存する標識の量を測定した。
【０４５８】
結果。    計数／分（ｃｐｍ）の測定量とフィルターに捉えられた無傷ＤＮＡの量との間の線状相関が存在する、と予測される。対照反応（Ｃ）に関して測定された特異的活性は1525±305 cpmであったが、これに比して、ＤＣ−コレステロールと組合せた非消化ＤＮＡ（Ｂ）は18,235±456 cpmで、これは、ＤＮＡを結合するこれらのＩＳＣＯＭの能力を立証する。
【０４５９】
さらに、濾過の前にＤＮアーゼを用いてＤＮＡを分解した場合、フィルター（Ａ）で測定された活性は7.315±183 cpmに低減された。これは非消化試料（Ｂ）より低く、このことは、ＤＮアーゼＩによるＤＮＡの分解のために、多少の標識がＩＳＣＯＭから放出されたことを示す。
【０４６０】
しかしながら消化試料（Ａ）の測定値は対照（Ｃ）より少なくとも4因数高いので、ＤＮアーゼ処理にもかかわらず、ＤＮＡの実質量はフィルター上に保持される。ＤＣ−コレステロールを含有するＩＳＣＯＭはＤＮＡを結合するだけでなく、結合された場合、ＤＮアーゼＩによる分解からＤＮＡを保護する、と結論づけられる。
【０４６１】
実施例４
ＤＮＡ結合ＩＳＣＯＭのゼータ電位の確定
ゼータ電位のパラメーターは、粒子間の反発力または引力の大きさの測定値である。その測定は、ある程度まで粒子の全体的電荷に関連するが、しかし分散液中の粒子の安定性にも関連する。極性液体中の粒子の表面電荷は粒子の表面の電位に直接的に相関しないが、しかし粒子のすぐ近くの電位と相関する。
Zetasizer（Malvern Instruments Ltd., UK）を用いて、ＩＳＣＯＭの3つの異なる組成物のゼータ電位を分析した。
【０４６２】
ＩＳＣＯＭの調製。    実施例２の手法にしたがって、粒子の生成中にコレステロールの25％または50％がＤＣ−コレステロールに置換されるように、ＩＳＣＯＭを調製した。ＤＣ−コレステロールを含有しないＩＳＣＯＭも、同様のぷこにより調製した。リン酸塩緩衝化生理食塩水（0.85％ＮａＣｌ、0.01 Mリン酸塩緩衝液、ｐＨ7.2）に対する透析によりＩＳＣＯＭを精製し、使用するまで−20℃で貯蔵した。
【０４６３】
ゼータ電位の測定。    測定前に、ＩＳＣＯＭをリン酸塩緩衝化生理食塩水（前記と同じ）で希釈して最終濃度を5〜20 μg/mlとした。各測定のために、約5 mlの希釈ＩＳＣＯＭを測定小室中に注入した。
【０４６４】
使用説明書に記載されたような標準手法を用いて、ゼータ電位を測定した。各注入試料に関して、ゼータ電位を5連続回（5 x 1分）測定した。
【０４６５】
図１１は、ＤＣ−コレステロールを含有しないＩＳＣＯＭの測定値を示す。各曲線は、5回の測定の1つを表す。平均ゼータ電位は約−50 mVであることが判明したが、これは、図８に示したようなＤＣ−コレステロールを含有するＩＳＣＯＭ(ＤＣ−コレステロール対コレステロール比1:1または1:2)の測定から得られたデータとは有意に異なる。
【０４６６】
図１２は、修飾化ＩＳＣＯＭの測定値を示す。ＤＣ−コレステロール対コレステロール比は1:1（50％置換）であった。前記および図７に示した実験と同様に，ゼータ電位を5回測定した。ゼータ電位は0 mVに近く、測定値間の多少の変動を伴った。1:2のＤＣ−コレステロール対コレステロール比（25％）を有するＩＳＣＯＭが測定された場合、約−25mVの平均ゼータ電位が観察された(データは示されていない)。
【０４６７】
実施例５
ＤＮＡ結合ＩＳＣＯＭと組合せたプラスミドＤＮＡによるトランスフェクション
ＩＳＣＯＭの溶血特性が培養細胞中のＤＮＡの取込みを増大し得るか否かを調べるために、ＤＣ−コレステロール含有ＩＳＣＯＭへの結合後、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレポータープラスミドをトランスフェクトした。
【０４６８】
ＤＮＡ−ＩＳＣＯＭ複合体の調製。    プラスミドＤＮＡ（2 μg）を実施例２で調製したようなＤＣ−コレステロールおよびコレステロールを1:1の比で含有するＩＳＣＯＭ2 μgと併合した。これを、40 μl（10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5）の容積中で実行し、室温で1時間、複合体を生成させた。容積を100 μlに調整した。
【０４６９】
ＤＮＡ−リポフェクチン複合体の調製。    ＩＳＣＯＭ対周知のものの有効性を比較するために、効率的トランスフェクション試薬（リポフェクタミン試薬、Gibco BRL, 18292-011）を実験に含入した。さらに2 μgのプラスミドＤＮＡを併合し、水50 μlで希釈して、50 μlの溶液（35 μlの水で希釈した15 μlのリポフェクチン試薬）と併合した。
【０４７０】
細胞のトランスフェクション。    10％ウシ胎仔血清（ＦＳＣ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中でＲＤＭ４細胞を培養した。細胞（105）を小組織培養皿（直径40 mm）中で24〜36時間増殖させた後、トランスフェクトした。トランスフェクション前に、細胞を無血清培地で3回洗浄した。トランスフェクションの直前にＤＮＡ懸濁液を2 mlの無血清培地に付加し、細胞に付加した。細胞を4時間インキュベートし、次に血清を含有する培地で洗浄した。トランスフェクション混合物の除去後、細胞を24時間増殖させた後、ＧＦＰ活性を調べた。
【０４７１】
トランスフェクション結果。    紫外線抗原を装備した立体顕微鏡で蛍光細胞を計数し、トランスフェクト化細胞の分画を概算した。リポフェクチンによるトランスフェクションは高効率で、80％より多くの細胞が明らかに蛍光性であった。ＩＳＣＯＭも、この場合細胞をトランスフェクトし得たが、しかし低効率であった。ここでは、細胞の約25％が蛍光表現型を有したが、しかし蛍光の強度は控えめで、細胞毎に変化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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