(57)【要約】【課題】質量分析方法において、高分子量の物質の高感度な質量分析を可能にする。【解決手段】基板１として、透明基板を用い、試料Ｓとして、マトリクス剤Ｍが混合されたマトリクス混合試料を用意し、試料Ｓを基板１の表面１ａに供給し、基板１の裏面１ｂ側から、該基板１の表面１ａで全反射するように、該基板１に励起光Ｌoを入射させることにより、該基板１の表面１ａにエバネッセント光Ｌｅを生じさせ、エバネッセント光Ｌｅの照射により、被分析物質Ａを基板１から脱離させ、イオン化し、該イオン化した被分析物質Ａを捕捉して質量分析を行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析用基板の表面に供給され、該基板に付着した試料に光を照射することにより、該試料中の被分析物質を前記基板から脱離させ、イオン化し、該イオン化した前記被分析物質を捕捉して質量分析を行う質量分析方法において、
前記基板として、透明基板を用い、
前記試料として、マトリクス剤が混合されたマトリクス混合試料を用意し、
前記試料を前記基板の表面に供給し、
前記基板の裏面側から、該基板の表面で全反射するように、該基板に励起光を入射させることにより、該基板の表面にエバネッセント光を生じさせ、
該エバネッセント光の照射により、前記被分析物質を前記基板から脱離させることを特徴とする質量分析方法。
【請求項２】
前記基板として、該基板の表面に、光吸収材料、電場増強材料および／または脱離促進剤を備えた基板を用いることを特徴とする請求項１記載の質量分析方法。
【請求項３】
前記脱離促進剤としてニトロ化合物を用いることを特徴とする請求項２記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面に接触された試料を、該基板表面から脱離させ、イオン化した、試料中の被分析物質を捕捉して質量分析する質量分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
物質の同定等に用いられる分析法において、基板の表面に付着した被分析物質を基板表面から脱離させ、イオン化させてその物質の質量と荷電の比によって物質を同定する、質量分析方法が知られている。例えば、飛行時間型質量分析法（Time of Flight Mass Spectroscopy : TOF-MS）は、イオン化した被分析物質を高電圧電極間で所定距離飛行させて、その飛行時間により物質の質量を分析するものである。
【０００３】
このような質量分析法における被分析物質の脱離、イオン化の一つとして、レーザ照射を用いたレーザ脱離イオン化法がある。レーザ光を用いたイオン化法では、微小量の試料での分析が可能である一方、高いパワーのレーザ光を必要とする。高いパワーのレーザ光を用いた場合、被分析物質が損傷する（フラグメント化や変性などを生じる）恐れがあり、特に、高分子量の物質脱離、イオン化が困難であった。これを解決する手段として、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）が提案され、広く知られている。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ法は、被分析物質を含む試料をマトリクス剤と呼ばれるシナピン酸やグリセリン等に混入したマトリクス混合試料を用い、マトリクス剤が吸収した光エネルギーを利用して被分析物質をマトリクス剤と共に気化させるとともに、被分析物質をイオン化させる方法である。ＭＡＬＤＩ法は、被分析物質に対しフラグメント化や変性等の化学的な影響の少ないソフトイオン化法として、難揮発性の物質や生体分子、合成高分子等の高分子量の物質の質量分析に幅広く用いられている（特許文献１など）。
【０００５】
一方で、ＭＡＬＤＩ法では、試料中にマトリクスと被分析物質が混晶状態を作るために試料中の被分析物質の存在比率が場所によって変化してしまうこと、試料表面が粗く、光侵入長が定義できないなどの理由から、被分析物質を定量することが難しい。
【０００６】
定量性を議論するためには、マトリクス剤を用いない試料の脱離、イオン化を図る方法として、基板裏面に配置されたプリズムから、レーザ光を入射させ、基板表面内側で全反射させることにより生じるエバネッセント光を用いる方法および装置が特許文献２において提案されている。
【特許文献１】特開平９−３２０５１５号公報
【特許文献２】特開２００７−２２５３９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既述の通り、レーザ光等の照射光を試料に直接照射することにより、試料の脱離、イオン化を図る場合、被分析物質のフラグメント化および変性が生じるという問題がある。
【０００８】
図５はＭＡＬＤＩ法による試料の基板５１からの脱離、イオン化を模式的に示す図である。図５に示すように、ＭＡＬＤＩ法によれば、被分析物質Ａがマトリクス剤Ｍと混合されており、レーザ光Ｌの直接照射の影響を一部和らげることはできるが、レーザ光Ｌはマトリクス剤Ｍだけでなく、同時に被分析物質Ａにも照射されるため、被分析物質Ａへのレーザ光直接照射によるダメージ抑制は未だ十分とは言えず、被分析物質Ａの一部は、フラグメント化、変性等を生じた状態（図中符号ａで示す。）で脱離、イオン化される。
【０００９】
図６は、特許文献２に開示されている、エバネッセント光を用いて試料の脱離、イオン化をさせる形態を模式的に示す図である。図６に示すように、プリズム６１の一面（試料面）６１ａに付着させた試料に対し、レーザ光Ｌをプリズム６１の他の一面６１ｂから、試料面６１ａで全反射するように入射させ、試料面６１ａ上にエバネッセント光Ｌｅを生じさせ、このエバネッセント光Ｌｅの照射により被分析物質Ａを脱離させ、イオン化させる。この方法によれば、レーザ光を直接照射する場合と比較して、被分析物質Ａのフラグメント化および変性は抑制できると考えられる。しかしながら、特許文献２のように定量分析を前提とし、マトリクス剤を用いない分析方法においては、エバネッセント光Ｌｅが直接被分析物質Ａに照射されることとなるために、やはり被分析物質Ａの一部は、フラグメント化、変性等を生じた状態（図中ａで示す。）で脱離、イオン化され、光の直接照射による被分析物質の損傷についての問題は未だ残されている。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、被分析物質への照射光による損傷を従来以上に抑制し、高分子量の物質の質量分析が可能な質量分析方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の質量分析方法は、質量分析用基板の表面に供給され、該基板に付着した試料に光を照射することにより、該試料中の被分析物質を前記基板から脱離させ、イオン化し、該イオン化した前記被分析物質を捕捉して質量分析を行う質量分析方法において、
前記基板として、透明基板を用い、
前記試料として、マトリクス剤が混合されたマトリクス混合試料を用意し、
前記試料を前記基板の表面に供給し、
前記基板の裏面側から、該基板の表面で全反射するように、該基板に励起光を入射させることにより、該基板の表面にエバネッセント光を生じさせ、
該エバネッセント光の照射により、前記被分析物質を前記基板から脱離させることを特徴とする。
【００１２】
前記基板として、該基板の表面に、光吸収材料、電場増強材料および／または脱離促進剤を備えた基板を用いることが望ましい。特に、前記脱離促進剤としては、ニトロ化合物を用いることが望ましい。ニトロ化合物としては、例えば、ニトロセルロース、トリニトロトルエン(TNT)、ジニトロトルエン(DNT)、ニトロナフタレン、硝酸エステル、アルキルニトラトエチルニトラミン、ニトログアニジン、ヘキソゲン、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−５−オンおよびヘキサニトロヘキサアザイソウルチタンなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の質量分析方法は、試料として、マトリクス剤混合試料を用いており、かつ、励起光の全反射に伴い生じるエバネッセント光により被分析物質の脱離、イオン化を行うものである。かかる構成により、レーザ光を直接、マトリクス剤混合試料に照射する場合と比較して、試料への光照射によるダメージ（被分析物質の損傷、フラグメント化など）を抑制することができ、マトリクス剤を用いずエバネッセント光を被分析物質に照射する場合と比較しても、光によるダメージをよりよく抑制することができる。本発明の質量分析方法によれば、試料への光によるダメージを従来よりも効果的に抑制することができるため、従来と比較して精度の高い測定が可能となると共に、光によるダメージが大きい分子量の大きな被測定物質の測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面を参照して本発明の実施形態の質量分析方法について説明する。
【００１５】
まず、図１を参照して、質量分析方法を実施するための質量分析装置の一実施形態について説明する。本実施形態の質量分析装置は飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）である。図１は本実施形態の質量分析装置１０の構成を示す概略図である。
【００１６】
図示されるように、質量分析装置１０は、真空に保たれたボックス１１内に、質量分析用基板１の裏面１ｂ側から、該基板１の表面１ａで全反射するように、該基板１に励起光Ｌoを入射させることにより、該基板１の表面１ａにエバネッセント光Ｌｅを生じさせるためのプリズム２１および光源２２からなる励起光照射手段２０と、エバネッセント光Ｌｅの照射により基板１から脱離した被分析物質Ａを検出して被分析物質Ａの質量を分析する分析手段１４とを備え、質量分析用基板１と分析手段１４との間に、基板１の表面１ａに対向する位置に配された引き出しグリッド１５と、引き出しグリッド１５の質量分析用基板１側の面と反対側の面に対向して配されたエンドプレート１６を備えた構成としている。
【００１７】
質量分析用基板１は透光部材から構成されており、測定対象となる試料Ｓが表面１ａに供給され、該表面１ａに試料Ｓが付着した状態で、プリズム２１の一面２１ａ上に載置されるものである。
【００１８】
励起光照射手段２０において、プリズム２１は、基板１と試料Ｓとの界面１ａで励起光Ｌoを全反射させるように基板１内に励起光Ｌoを入射させるための導光部材であり、光源２２は、プリズム２１の他の一面２１ｂから基板１の表面１ａ（基板と試料との界面）で励起光Ｌoであるレーザ光が全反射するように配置構成されている。光源２２としては、例えば、波長３３７ｎｍ、パルス幅５０ｐｓ〜５０ｎｓ程度のパルスレーザ光源を用いる。光源２２とプリズム２１との間には、必要に応じて、光源２２から出射される励起光Ｌoを導光するミラー、レンズなどの導光系を備えていてもよい。プリズム２１上には、屈折率マッチングオイルが塗布されており、プリズム２１と基板１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触される。なお、プリズム２１と基板１とが一体的に形成されたセンサチップとして質量分析装置に挿入出されるように構成されていてもよい。
【００１９】
分析手段１４は、エバネッセント光Ｌｅの照射により質量分析用基板１の表面１ａから脱離され、引き出しグリッド１５およびエンドプレート１６の中央の孔を通過して飛行してきた被分析物質Ａを検出する検出器１７と、検出器１７の出力を増幅させるアンプ１８と、アンプ１８からの出力信号を処理するデータ処理部１９により概略構成されている。
【００２０】
以下に上記構成の質量分析装置１０を用いた、本発明の実施形態にかかる質量分析方法について説明する。
【００２１】
まず、試料Ｓとして、被分析物質Ａを含む試料とマトリクス剤Ｍとの混合試料を用意する。マトリクス剤Ｍとしては、従来のＭＡＬＤＩ法で用いられている既知のマトリクス剤を用いることができる。具体的には、ニコチン酸、ピコリン酸、3-ヒドロキシピコリン酸、3-アミノピコリン酸、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、2-（４-ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、2-メルカプトベンゾチアゾール、5-クロロ-２-メルカプトベンゾチアゾール、2,6-ジヒドロキシアセトフェノン、2,４,６-トリヒドロキシアセトフェノン、ジスラノール、ベンゾ[a]ピレン、9-ニトロアントラセン、2-[(2E)-3-(4-tret-ブチルフェニル)-2-メチルプロプ-2-エニリデン]マロノ二トリルなどをマトリクス剤Ｍとして用いることができる。
【００２２】
試料Ｓが表面１ａに供給された基板１を装置１０のプリズム２１の一面２１ａ上に載置する。その後、質量分析用基板１に電圧Ｖｓが印加され、所定のスタート信号により光源２２から特定波長のレーザ光である励起光Ｌoが出力され、プリズム２１を介して質量分析用基板１の裏面１ｂから入射される。励起光Ｌoは基板１の表面１ａ（基板と試料Ｓとの界面）に全反射以上の角度で入射し、該表面１ａで全反射する。これにより、基板１の表面１ａ上にエバネッセント光Ｌｅが生じ、試料Ｓに照射される。試料Ｓ内のマトリクス剤Ｍがエバネッセント光Ｌｅの光エネルギーを吸収して熱エネルギーに変換し、この熱エネルギーにより、被分析物質Ａはマトリクス剤Ｍと共に気化され、基板表面１ａから脱離され、同時にイオン化される。
【００２３】
脱離され、イオン化された被分析物質Ａは、質量分析用基板１と引き出しグリッド１５との電位差Ｖｓにより引き出しグリッド１５の方向に引き出されて加速し、中央の孔を通ってエンドプレート１６の方向にほぼ直進して飛行し、更にエンドプレート１６の孔を通過して検出器１７に到達して検出される。
【００２４】
検出器１７からの出力信号は、アンプ１８により所定レベルに増幅され、その後データ処理部１９に入力される。データ処理部１９では、上記スタート信号と同期する同期信号が入力されており、この同期信号とアンプ１８からの出力信号とに基づいて被分析物質Ａの飛行時間を求めることができるので、その飛行時間から質量を導出して質量スペクトルを得ることができる。
【００２５】
本実施形態では、ボックス１１内に、すべてが備えられた構成について説明したが、少なくとも、引き出しグリッド１５、エンドプレート１６および検出器１７がボックス１１内に配置されていれば、他はボックス外に配置されていてもよい。
【００２６】
本実施形態では、質量分析装置１０がＴＯＦ−ＭＳである場合を例に説明したが、イオン化された試料イオンの質量分析を行う装置としては、ＴＯＦ型のものに限らず、ＩＴ（Ion Trap；イオントラップ型）、ＦＴ（ＩＣＲ）（Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance；フーリエ変換型）、また複数の質量分析手法を組み合わせた手法であるＱｑＴＯＦ（Quadrupole-TOF；四重極-TOF型）、ＴＯＦ−ＴＯＦ（TOF連結型）などの質量分析装置を用いることができる。
【００２７】
また、本発明の質量分析法としては、上記実施形態において用いた質量分析用基板に代えて、図２〜４に示す質量分析用基板２〜４を用いてもよい。図２〜４は、本発明の質量分析方法に適用可能な、他の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図である。
【００２８】
図２に示す質量分析用基板２は、透明基板３１の表面に、電場増強材料である金属薄膜３２を備えたものである。金属薄膜３２の材料としては、自由電子を有する任意の金属でよく、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。測定される試料Ｓは金属薄膜３２上に供給される。図２に示す質量分析用基板２を用いる場合には、励起光Ｌoとして、金属薄膜３２に表面プラズモンが生じる特定の角度でｐ偏光として入射させる。このような質量分析用基板２を用いれば、励起光Ｌoの照射により表面プラズモンＳＰが発生し、これに伴い基板２表面上の電場が増強されることから、光エネルギーが増強されてこれを吸収して熱変換するマトリクス剤の作用も増強されるため、被分析物質Ａの脱離、イオン化を効果的に行うことができる。
【００２９】
なお、電場増強材料としては、光の照射により局在プラズモンを生じる金属ナノ構造体を備えていてもよい。このような金属ナノ構造体として、金属メッシュ、金属ナノ粒子、金属ナノロッドなどが透明基板３１上に固着された質量分析用基板も、基板表面上の電場増強効果を得ることができ好ましい。メッシュ、粒子、ロッドの配列はランダムなものであっても、規則的なものであってもよいが、配列ピッチは、励起光Ｌoの波長より小さいことが好ましい。これらの金属材料としても、自由電子を有する任意の金属でよく、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。
【００３０】
図３に示す質量分析用基板３は、透明基板３３の表面に脱離促進剤３４が塗布されてなるものである。脱離促進剤３４は、エバネッセント光Ｌｅの照射により、爆発を生じてその上に付着している試料Ｓの脱離を補助する（促進させる）ものであればよく、具体的には、ニトロセルロース、トリニトロトルエン(TNT)、ジニトロトルエン(DNT)、ニトロナフタレン、硝酸エステル、アルキルニトラトエチルニトラミン、ニトログアニジン、ヘキソゲン、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−５−オンおよびヘキサニトロヘキサアザイソウルチタンなどのニトロ化合物が挙げられる。試料Ｓ内のマトリクス剤Ｍがエバネッセント光Ｌｅの光エネルギーを吸収して熱エネルギーに変換し、この熱エネルギーにより、被分析物質Ａはマトリクス剤Ｍと共に気化され、基板表面１ａから脱離される際に、同時にバネッセント光の発生により、脱離促進剤３４が爆発し、被分析物質の脱離を促進することができる。
【００３１】
図４に示す質量分析用基板４は、透明基板３５の表面に光吸収と電場増強の性質を有する金ナノ粒子３６が固着され、さらに脱離促進剤３７が塗布されてなるものである。このような質量分析用基板４を用いれば、エバネッセント光により局在プラズモンが生じ、局在プラズモンの発生に伴い、基板表面上の電場が増強されることから、光エネルギーが増強されてこれを吸収して熱変換するマトリクス剤の作用も増強されるため、被分析物質Ａの脱離、イオン化を効果的に行うことができると共に、エバネッセント光の照射により、脱離促進剤３７の爆発が生じてその上に付着している試料の脱離をさらに促進することができる。なお、光吸収材料であれば、光熱変換に伴う熱により脱離促進剤の効果をより増強させることができる。
なお、光吸収材料としては、金ナノ粒子のほか、色素（あるいは、染料、顔料）、具体的には、カーボンブラック、アゾ染料、金属錯塩アゾ染料、ピラゾロンアゾ染料、アントラキノン染料、フタロシアニン染料、カルボニウム染料、キノンイミン染料、ポリメチン染料、シアニン染料、他の金属ナノ粒子などが挙げられ、他の電場増強材料と共に、あるいは単独で基板表面に塗布あるいは固着して用いてもよい。
【００３２】
本発明の質量分析方法によれば、マトリックス剤によるエバネッセント光の光エネルギーの吸収を利用して被分析物質の脱離、イオン化を行っているため、被分析物質の損傷（フラグメント化、変性など）が効果的に抑制され、被分析物質が難揮発性の物質や高分子量の物質であっても、被分析物質のフラグメント化や変性が従来と比較して抑制され、高感度に質量分析することができる。
【実施例】
【００３３】
ポリペプチドの一種であるアンジオテンシン（angiotensin)を被分析物質として、以下に示す実施例１、２および比較例１の方法で質量分析を行い、それぞれのマススペクトルを測定した。それぞれのマススペクトルを図７Ａ，図８Ａおよび図９に示す。なお、図７Ｂ，図８Ｂはそれぞれ図７Ａ，図８Ａの一部（図中点線で囲む部分）を拡大して示した図である。各図において、横軸はｍ／ｚ値（ここで、ｍはイオンの質量を統一原子質量単位で割って得られた無次元量、ｚはイオン化された被分析物質の電荷の価数である。）、縦軸はイオン量を示す信号値（a.u.)である。このマススペクトルから、アンジオテンシンイオン（フラグメント化されていないイオン化被分析物質）信号の強度（ｍ/ｚ≒1294.5における信号強度）を求め、その強度および割合を比較した。
実施例１、２および比較例１についてのいずれの例においても、被分析物質をマトリックス剤と混合させた混合試料を用意し、質量分析装置（BRUKER製  autoflex(TM) III  MALDI-TOF-MS ）を用いてマススペクトルを取得した。マトリックス剤としてはα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を用いた。測定サンプルである被分析物質Angiotensin Iの濃度が１μＭになるようにマトリックス剤と混合し、混合試料とした。
【００３４】
（実施例１）図１に示すように、透明基板上にマトリックス混合試料を供給し、裏面側から励起光を全反射条件で入射させることにより、エバネッセント光を生じさせ、混合試料にエバネッセント光を照射した。
（実施例２）図３に示すように、脱離促進剤を塗布した透明基板上にマトリックス混合試料を供給し、実施例と同様にして混合試料にエバネッセント光を照射した。
（比較例）図５に示すように、基板上にマトリックス混合試料を供給し、混合試料に直接レーザ光を照射した。
【００３５】
比較例の場合、図９に示すように、アンジオテンシンイオン量が実施例１および実施例２と比較して極めて小さかった。これは試料のフラグメント化が実施例１および実施例２と比較して非常に多かったことに起因する。
図７Ａおよび図８Ａの横軸における領域Ｆはフラグメント化された成分による信号である。実施例１は比較例と比較するとアンジオテンシンイオン信号が倍増しており、フラグメント化が従来例よりも抑制されていると考えられる。実施例２は実施例１と比較してもアンジオテンシンイオン信号値が高く、フラグメント化も非常に効果的に抑制されていた。これは、脱離促進剤の付加により、フラグメント化を抑制することができることを示すものである。実施例１および２は直接レーザ光を照射する比較例と異なり、エバネセント光を照射光として用いているため、従来例と比較してフラグメント化が抑制され、さらに、実施例２は、脱離促進剤の付加により、エバネセント光のパワーも小さくすることができることからさらなるフラグメント化の抑制効果を得ることができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に係る実施形態の質量分析方法を実施するための質量分析装置の概略構成図
【図２】第２の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図
【図３】第３の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図
【図４】第４の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図
【図５】従来のマトリクス支援レーザ脱離方法を示す模式図
【図６】従来のエバネッセント光による脱離方法を示す模式図
【図７Ａ】実施例１のマススペクトル
【図７Ｂ】図７Ａに示す実施例１のマススペクトルの一部拡大図
【図８Ａ】実施例２のマススペクトル
【図８Ｂ】図８Ａに示す実施例２のマススペクトルの一部拡大図
【図９】比較例のマススペクトル
【符号の説明】
【００３７】
１、２、３、４  質量分析用基板
１０  質量分析装置
１１  筐体
１４  分析手段
１７  検出手段
３１、３３、３５    透明基板
３２  金属薄膜
３４、３７  脱離促進剤
３６  金ナノ粒子
Ａ  被分析物質
ａ  フラグメント化（あるいは変性）した被分析物質
Ｍ  マトリクス剤
Ｓ  試料
Ｌ  レーザ光
Ｌo  励起光
Ｌｅ  エバネッセント光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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