(57)【要約】【課題】養子免疫療法に適用可能なリンパ球を効率よく製造する手段を提供すること。【解決手段】リンパ球又はリンパ球の前駆細胞をＶＬＡ−６に結合しうる物質の存在下で培養する工程を包含するリンパ球の製造方法を提供する。前記方法には、ＶＬＡ−６に結合しうる物質としてラミニンのフラグメントを使用することができる。また、前記方法により製造されるリンパ球を含有する細胞集団は癌や感染性疾患の治療に有用である。さらに、新規なラミニンのフラグメントとその用途も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球又はリンパ球の前駆細胞をＶＬＡ−６に結合しうる物質の存在下で培養する工程を包含するリンパ球の製造方法。
【請求項２】
ＶＬＡ−６に結合しうる物質がラミニンのフラグメントである請求項１記載のリンパ球の製造方法。
【請求項３】
ラミニンのフラグメントが、ラミニンα鎖の球状ドメイン領域由来のポリペプチドである請求項２記載のリンパ球の製造方法。
【請求項４】
ラミニンのフラグメントが配列表の配列番号１又は１１に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである請求項３記載のリンパ球の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載のリンパ球の製造方法により得られるリンパ球を含有する細胞集団。
【請求項６】
請求項５記載の細胞集団を有効成分として含有する細胞医薬。
【請求項７】
配列表の配列番号１又は１１に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加して生じるアミノ酸配列を含有し、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸に相補的な配列の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能で、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項７記載のポリペプチドを有効成分として含有するリンパ球増殖促進剤。
【請求項１１】
請求項７記載のポリペプチドを有効成分として含有するリンパ球培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なリンパ球を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
【０００３】
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチド及びＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
【０００４】
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特にヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染及び腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的細胞傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
【０００５】
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の課題であるといえる。一方、ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持及び増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。
【０００６】
抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とＩＬ−２（例えば、非特許文献１）、あるいは抗ＣＤ３抗体とインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離並びに大量培養する方法（例えば、非特許文献２）が報告されている。
【０００７】
さらに、特許文献１にはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬ及びヘルパーＴ細胞を含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくした末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。
【０００８】
また、特許文献２には改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はＰＢＭＣとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、ＰＢＭＣの使用量を低減させる方法である。
【０００９】
ＣＴＬ以外の疾病の治療に有効なリンパ球としては、例えば、リンフォカイン活性化細胞（例えば、非特許文献３、４）、高濃度のＩＬ−２を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（例えば、非特許文献５）が知られている。
【００１０】
リンフォカイン活性化細胞は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。リンフォカイン活性化細胞の培養工程において、抗ＣＤ３抗体を加えることにより、さらにリンフォカイン活性化細胞の増殖は加速する。このようにして得られたリンフォカイン活性化細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。
【００１１】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用することについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献３、４及び５）。
【００１２】
ラミニンは細胞接着、器官形成、組織再生など、さまざまな生命現象に深くかかわる多機能分子である。ラミニンはα、β、γの３つのサブユニットで構成される、分子量５０万〜９０万のヘテロ３量体であり、さらに、各サブユニットに複数の分子種が存在することから、サブユニット構成の異なる１５種ものアイソフォームが存在している。ラミニンはα３β１インテグリン（ＶＬＡ−３）、α６β１インテグリン（ＶＬＡ−６）と結合することが知られている。また、ラミニンは休止状態のＣＤ４陽性細胞の増殖促進作用を有すると言われている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第９６／０６９２９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／３２９７０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（ジャーナル  オブ  イムノロジー）、１９９１年、第１４６巻、第２７９５〜２８０４頁
【非特許文献２】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ジャーナル  オブ  イムノロジカル  メソッヅ）、１９９０年、第１２８巻、第１８９〜２０１頁
【非特許文献３】Ｂｌｏｏｄ（ブラッド）、１９９３年、第８１巻、第２０９３〜２１０１頁
【非特許文献４】Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．（ニューイングランド  ジャーナル  オブ  メディシン）、１９８７年、第３１６巻、第８８９〜８９７頁
【非特許文献５】Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、１９８８年、第３１９幹、第１６７６〜１６８０頁
【非特許文献６】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９０年、第１４５巻、第５９〜６７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用することについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献３、４及び５）。しかしながら、養子免疫療法が多様化しているという現状を考えた場合、上記文献の方法以外の、さらなる細胞増殖方法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明を概説すれば、本発明は、
［１］リンパ球又はリンパ球の前駆細胞をＶＬＡ−６に結合しうる物質の存在下で培養する工程を包含するリンパ球の製造方法、
［２］ＶＬＡ−６に結合しうる物質がラミニンのフラグメントである［１］のリンパ球の製造方法、
［３］ラミニンのフラグメントが、ラミニンα鎖の球状ドメイン領域由来のポリペプチドである［２］のリンパ球の製造方法、
［４］ラミニンのフラグメントが配列表の配列番号１又は１１に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである［３］のリンパ球の製造方法、
［５］［１］〜［４］いずれか記載のリンパ球の製造方法により得られるリンパ球を含有する細胞集団、
［６］［５］の細胞集団を有効成分として含有する細胞医薬、
［７］配列表の配列番号１又は１１に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加して生じるアミノ酸配列を含有し、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチド、
［８］［７］のポリペプチドをコードする核酸、
［９］［８］の核酸に相補的な配列の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能で、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチドをコードする核酸、
［１０］［７］のポリペプチドを有効成分として含有するリンパ球増殖促進剤、及び
［１１］［７］のポリペプチドを有効成分として含有するリンパ球培養用培地、
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のリンパ球の製造方法は、ＣＴＬやリンフォカイン活性化細胞のような、養子免疫療法に利用可能な細胞、細胞集団を効率よく製造可能な方法であり、特に医療分野で有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法に関する。
【００１９】
本発明は、ＶＬＡ−６に対して結合活性を有する物質の存在下で培養を実施することにより、その非存在下にリンパ球を培養した場合には、その非存在下での培養に比較して拡大培養率が向上することを見出し、完成するに至ったものである。
【００２０】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、例えば、養子免疫療法への利用に好適である。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規なラミニンフラグメントが提供される。
【００２１】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２２】
（１）ＶＬＡ−６に結合しうる物質
本発明は、リンパ球又はその前駆細胞をＶＬＡ−６に結合しうる物質の存在下に培養する工程を包含することを特徴とする。
【００２３】
ＶＬＡ−６に結合しうる物質には特に限定はなく、生体内でＶＬＡ−６のリガンドとして機能している物質、その断片、そのホモローグ又は誘導体、及びＶＬＡ−６を認識する抗体又はその断片が例示される。
【００２４】
ラミニンはＶＬＡ−６のリガンドとして知られており、本発明に使用することができる。しかしながら、
ラミニンは分子量５０万を超える巨大分子であることから、天然の材料から高純度のラミニンを精製することは困難である。さらにヒトや動物から得られたラミニンにはその材料に由来するウイルス等の混入の恐れがあり、治療等への使用を意図したリンパ球の製造に使用することは好ましくない。本発明には、遺伝子工学的に製造された組換えラミニンの使用が好ましく、その製造、取扱いの容易さの観点から、ラミニンのフラグメント、特に組換えフラグメントが好適である。
【００２５】
本発明に使用されるラミニンのフラグメントは、ＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有している範囲において、そのサイズに特に限定はない。製造や取扱いの容易さの観点からは、３０００〜１５万、好ましくは４０００〜１０万、さらに好ましくは５０００〜８万、特に好ましくは６０００〜２万の分子量のラミニンフラグメントが使用される。本発明の一つの態様として、ラミニンα鎖の球状ドメイン領域に由来するアミノ酸配列を有するフラグメントが例示される。当該フラグメントとしては、本発明を特に限定するものではないが、例えばＧ１ドメイン又はＧ２ドメイン由来のアミノ酸配列を含有するラミニンフラグメント、特に好適には配列表の配列番号１又は１１に示されるラミニンα１鎖由来のアミノ酸配列を含有するラミニンフラグメント（ポリペプチド）が例示される。配列番号１、１１のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは、それぞれ下記実施例にＡＧ１−５−４、ＡＧ２−１０−７として記載されている。
【００２６】
さらに、配列表の配列番号１又は１１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加して生じるアミノ酸配列を含有し、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチドも本発明に使用することができる。前記のポリペプチドとしては、配列表の配列番号１又は１１に示されるアミノ酸配列との間に８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドが例示される。
【００２７】
以上に説明したラミニンフラグメントや、当該フラグメントと配列同一性を有しかつ同等の機能を保持するポリペプチドは本発明に包含されるものである。前記のラミニンフラグメントやポリペプチドは、ＶＬＡ−６との結合を介してリンパ球にシグナルを伝達し、リンパ球の増殖を促進する。すなわち、本発明により、ＶＬＡ−６との結合を介してリンパ球にシグナルを与えることを特徴とするリンパ球の増殖方法が提供される。
【００２８】
前記のラミニンフラグメントやポリペプチドを組換えポリペプチドとして製造するにあたっては、その精製を容易にする目的で公知のペプチドを付加することができる。前記ペプチドに特異的に結合するリガンドを使用して、所望のフラグメントやポリペプチドを簡便な操作で精製することができる。前記のペプチドとしては、ヒスチジン−タグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が例示される。これらのペプチドが付加された前記のラミニンフラグメントやポリペプチドも本発明に包含される。
【００２９】
さらに、前記のラミニンフラグメントやポリペプチドをコードする核酸は、前記のペプチドが付加されたものをコードするものを含め、本発明に包含される。ヒトラミニンα１鎖遺伝子中の、配列番号１記載のアミノ酸配列のラミニンフラグメントをコードする領域の塩基配列を配列番号２に示す。また、配列番号１１記載のアミノ酸配列のラミニンフラグメントをコードする領域の塩基配列を配列番号１２に示す。配列番号２又は１２の塩基配列を含有し、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチドをコードする核酸は本発明の核酸の一例である。また、配列番号２の塩基配列に相補的な配列の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能で、かつＶＬＡ−６に結合する能力並びにリンパ球の増殖を促進する能力を有しているポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液、０．０１％  変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、６５℃にて１２〜２０時間インキュベートする条件が挙げられる。このハイブリダイゼーションには配列番号２の塩基配列に相補的な配列の核酸又はその断片がプローブとして使用される。プローブにハイブリダイズした核酸は、例えば０．５％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、３７℃で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。
【００３０】
（２）本発明のリンパ球の製造方法
本発明のリンパ球の製造方法は、ＶＬＡ−６に結合しうる物質の存在下で培養する工程（以下、本発明の培養工程と称することがある）を包含することを特徴とする。
【００３１】
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球又はその前駆細胞を生体外で培養する工程を包含する。この培養工程の全期間、もしくは任意の一部の期間において、本発明の培養工程が実施される。すなわち、リンパ球の製造工程の一部がＶＬＡ−６に結合しうる物質の存在下で実施されるものであれば本発明に包含される。リンパ球の製造工程の一部に本発明の培養工程を含む場合、好適には培養初期に本発明の培養工程を含むことが好ましく、より好適には培養開始時に本発明の培養工程を含むことが好ましい。
【００３２】
本発明において使用されるリンパ球又はその前駆細胞には特に限定はない。リンパ球としては、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞等が例示される。リンパ球の前駆細胞としては、リンパ球に分化しうる能力を有する細胞もしくは当該細胞を含有する細胞集団を本発明に使用することができ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞等が例示される。培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００３３】
本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、リンフォカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団等が挙げられる。さらに、前記の細胞集団より分離された特定の細胞亜集団（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、例えばＣＤ８陽性細胞集団やＣＤ４陽性細胞集団も本発明により得られるリンパ球に包含される。
【００３４】
これらのうち、本発明はリンフォカイン活性化細胞の製造により適している。なお、本明細書においてリンフォカイン活性化細胞とは、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間培養することにより得られる機能的細胞集団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞（例えば、ナイーブ細胞等）も含まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性化細胞と称することとする。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群をも包含する。他の細胞についても当該細胞を含有する細胞群をも包含するものとする。
【００３５】
なお、本発明の製造方法により得られるリンパ球の細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に本発明の方法で得られたリンパ球を接触させ、破壊された標的細胞に由来する放射活性や蛍光強度を測定することによってその細胞傷害活性を評価できる。また、細胞傷害性リンパ球や標的細胞より特異的に遊離される顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカイン量を測定することにより評価することもできる。
【００３６】
本発明は、疾病の治療等を目的として個体（患者）に投与されるリンパ球を大量に供給することを目的とするものである。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜設定してリンパ球の培養を行うことにより、例えば養子免疫療法等に有用なリンパ球を製造することができる。
【００３７】
本発明の培養工程において使用される細胞培養器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００３８】
本発明においてＶＬＡ−６に結合しうる物質（以下、本発明の有効成分と記載することがある）の存在下とは、リンパ球の培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させて使用する場合、培地中の本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０００１〜１００００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．００５〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍＬである。
【００３９】
本発明の有効成分を含め、培地中に使用される成分（例えば後述の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２等）は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養器材（開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。前記担体は、細胞培養時に細胞培養器材中の培養液に浸漬して使用される。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。各成分を固定化して使用する場合、使用時の固定化された成分量／使用される培地量が各成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように固定化するのが好適であるが、それらの固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４０】
例えば、各成分の固定化は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、並びに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンのフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法によりリンパ球を培養した後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、該リンパ球と本発明の有効成分とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
【００４１】
培養条件は、リンパ球の公知の培養条件で行なえばよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養器材を交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は後述のとおり、製造するリンパ球の種類によって、適宜設定することができる。
【００４２】
また、国際公開第０３／０８０８１７号パンフレットに記載されたフィブロネクチンや公知のフィブロネクチンのフラグメントを前記成分と共に用いて培養してもよい。好適には、前記の文献に記載されているＨ−２９６やＣＨ−２９６等を使用することができる。
【００４３】
さらに、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットや国際公開第０３／０１６５１１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な物質を前記成分と共に用いて培養してもよい。
【００４４】
本発明の培養工程に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、さらに後述するとおり製造するリンパ球の種類に応じて各種サイトカイン等を添加すれば良い。
【００４５】
本発明の培養工程においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０〜２０容量％、特に自己由来の血清又は血漿を用いる場合、患者への負担を考慮して、０〜５容量％とするのが好ましい。また、リンパ球の培養工程において、培地中の血清や血漿濃度は段階的に低減させることができる。例えば、リンパ球の培養工程において培地の交換や添加を行う際に、新たな培地中の血清や血漿濃度を低く調整することにより、使用する血漿や血漿を低減させてリンパ球の培養を実施することができる。このように、培地中の血清や血漿の添加量を低減させることができることは、本発明の有効な効果の１つである。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養するリンパ球と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
【００４６】
例えば、本発明の方法において、リンパ球の拡大培養を行う場合、本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００４７】
以下、本発明の製造方法によりリンフォカイン活性化細胞を製造する例（以下、本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００４８】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法は、リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞を用いて、ＩＬ−２の存在下で本発明の培養工程を実施することを特徴とする。ここで本発明の培養工程の実施は、培養の全期間であっても一部の期間であってもよく、好適には培養開始時に本発明の培養工程を実施することが好ましい。本発明の培養工程の培養期間については、例えば１〜８日、好適には２〜７日、より好適には３〜７日が好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点からは３日以上が好ましい。
【００４９】
リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞としては、特に限定されるものではなく、例えばＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられ、血球系細胞であれば使用できる。また、前記細胞を含有する材料、例えば末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００５０】
また、リンフォカイン活性化細胞を培養するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、細胞工学、１９９５年、第１４巻、第２２３〜２２７頁；組織培養、１９９１年、第１７巻、第１９２〜１９５頁；Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ（ザ  ランセット）、２０００年、第３５６巻、第８０２〜８０７頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（カレント  プロトコル  イン  イムノロジー）、補遺  １７、ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施され、培養初期に本発明の培養工程を実施することが好ましいことは前述のとおりである。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養器材を交換する工程を行っても良い。
【００５１】
使用される培地については特に限定はなく、リンパ球の培養に適した公知の培地を使用することができる。また、本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００５２】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、より好適にはＯＫＴ３を共存させることが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。また、さらに副刺激を与えるために抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体を共存させることもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を共存させてもよい。さらに、これらの成分は前述のとおり、適当な固相に固定化して使用することもできる。
【００５３】
本発明はその一態様として、前述したリンパ球の製造方法において、さらに外来遺伝子を導入する工程を包含するリンパ球の製造方法も提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００５４】
本発明のリンパ球の製造方法により、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。当該方法により遺伝子導入されたリンパ球や当該リンパ球を含有する細胞集団が得られる。
【００５５】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法中の細胞増殖時に実施するのが好適である。
【００５６】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００５７】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際に導入効率を向上させる物質を使用してもよく、例えばレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）やその他のフィブロネクチンフラグメントを使用することもできる。
【００５８】
レトロウイルスベクター並びにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【００５９】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００６０】
本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、リンフォカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【００６１】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、又は人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【００６２】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）が例示される。
【００６３】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【００６４】
その他、導入する遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子や、標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域（ＣＤ３等）を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。
【００６５】
（３）本発明の製造方法により得られるリンパ球、当該リンパ球を含有する医薬、当該医薬を用いた疾患の治療方法
さらに本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたリンパ球や当該リンパ球を含有する細胞集団、前期細胞集団から分離された細胞亜集団を提供する。また、本発明は当該リンパ球等を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。
【００６６】
本発明の製造方法により得られるリンパ球や細胞集団を含有する治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈より患者に投与される。当該治療剤は後述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製されたリンパ球や細胞集団を有効成分として、例えば、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜決定でき、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０５〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、５×１０５〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０６〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。通常、リンパ球は注射や点滴により静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与される。
【００６７】
本発明の医薬の投与においては、特に限定はないが、例えば、治療しようとする疾病に対してワクチンとして機能しうる成分を投与することもできる。例えば、がんの治療に際しては腫瘍抗原、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、人為的操作により増殖能を失った腫瘍組織由来の細胞や、腫瘍組織からの抽出物などを投与することもできる。また、当該医薬の投与においては、リンパ球刺激因子、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、リンフォカインやサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ，ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β等）、ケモカイン等を適宜投与することもできる。なお、本願明細書において、リンパ球刺激因子とはリンパ球増殖因子を包含するものである。
【００６８】
本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、白血病等の悪性腫瘍疾患、肝炎、インフルエンザ、ＨＩＶ等のウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患（例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症）が例示される。また、前述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
【００６９】
本発明の方法により製造されるリンパ球の医薬の製造における使用、例えばがん性疾患や感染性疾患治療用の医薬の製造における使用も本発明に包含される。
【００７０】
また、本発明の別の態様として、前記医薬を用いた疾患の治療方法が提供される。当該疾患の治療方法は、前述のリンパ球の製造方法により製造されたリンパ球を用いることを特徴とし、当該医薬の投与の諸条件については、公知の養子免疫療法や前述の医薬の投与の開示に従って実施できる。
【００７１】
（４）本発明の有効成分を含有するリンパ球増殖剤、リンパ球培養用培地
本発明のさらなる態様として、本発明の有効成分を含有するリンパ球増殖剤が提供される。当該リンパ球増殖剤は前記の本発明の有効成分を含有するものであれば特に限定はない。例えば、用時に溶解して使用可能な乾燥品、本発明の有効成分を高濃度で含む溶液、細胞培養器材や細胞培養用担体の固定化に適した溶液といった任意の形態となすことができる。
【００７２】
さらに、本発明の有効成分を含有する培地が提供される。当該培地は、前記の本発明の有効成分を含有するものであれば特に限定はなく、例えば公知の細胞培養に用いられる培地成分を含有するものが例示される。さらにその他の任意の成分、例えばタンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分を含有させることができる。当該培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。本発明の培地の一態様としては、本発明の有効成分が固定化された細胞培養用担体を含有する培地、本発明の有効成分が固定化された細胞培養器材に封入して提供される培地が包含される。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
【００７４】
実施例１  組換えラミニンフラグメント  ＡＧ１−５−４の調製
（１）ｃＤＮＡのクローニング
Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）及びプライマーＡ１Ｆ５４８２（ＡｇｅＩ）、Ａ１Ｒ８６０８（ＮｏｔＩ）を用いてＲＴ−ＰＣＲをおこなった。プライマーＡ１Ｆ５４８２（ＡｇｅＩ）、Ａ１Ｒ８６０８（ＮｏｔＩ）の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号３、４に示す。得られた増幅断片をＭｉｇｈｔｙ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いて当該キットに添付されたｐＭＤ２０−Ｔベクターに挿入し、ヒトラミニンα１鎖をコードする遺伝子断片（ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００５５５９．２の５４８２−８６０８位に相当するｃＤＮＡ）を保持するクローンを選択した。このクローンのプラスミドをｐＭＤ２０−Ａ１（５４８２−８６０８）３５と命名した。
【００７５】
（２）発現プラスミドの構築
プラスミドベクターｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩサイト間にＳＴＰＵ１、ＳＴＰＬ２の２種の合成ＤＮＡ（ＳＴＰＵ１、ＳＴＰＬ２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号５、６に示す）をアニーリングさせたものを挿入し、ＭＣＳ改変型ｐＣｏｌｄＩを作製した。ｐＭＤ２０−Ａ１（５４８２−８６０８）３５を鋳型とし、プライマーＡＧ１Ｆ５、ＡＧ１Ｒ４を用いたＰＣＲをおこなった。プライマーＡＧ１Ｆ５、ＡＧ１Ｒ４の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号７、８に示す。得られた増幅断片をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、前記のＭＣＳ改変型ｐＣｏｌｄＩのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した。これによりＮ末端にヒスチジン−タグが付加された、ヒトラミニンα１鎖アミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００５５５０．２）のアミノ酸番号２１５９−２２４５の領域（配列番号１）を含有する組換えラミニンフラグメント（ＡＧ１−５−４：ヒスチジン−タグを含んで１０６残基、分子量１１８８２．６３）の発現プラスミド、ｐＣ１ｂＡＧ１−５−４を得た。
【００７６】
（３）ラミニンフラグメントの製造
ｐＣ１ｂＡＧ１−５−４を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンで選択した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が０．５付近になった時点で１５℃に冷却した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現誘導した。発現誘導後、１５℃で一晩培養を継続し、その後に菌体を回収した。
【００７７】
前記の菌体を０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波処理を行った。得られた菌体破砕液を遠心分離して上清を回収した。この遠心上清にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（ＳＩＧＭＡ社製）を終濃度０．１％（ｖ／ｖ）となるように添加した後、０．５ＭのＮａＣｌと０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社製）４ｍｌと混合し、さらに容器を回転させながら４℃で１時間保持した。この樹脂懸濁液をカラムに詰め、以下の順序で緩衝液をカラムに添加してクロマトグラフィーをおこなった。
【００７８】
洗浄１：０．５ＭのＮａＣｌと０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
洗浄２：０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
洗浄３：０．５ＭのＮａＣｌと５０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
洗浄４：０．５ＭのＮａＣｌと７５ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
溶出：０．５ＭのＮａＣｌと３００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
【００７９】
溶出操作で回収された画分をＲＣ透析チューブ  ポア３（スペクトラポア社製）に封入し、以下の順序で外液を交換する透析をおこなった。
（１）０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
（２）０．３５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
（３）０．２ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
【００８０】
以上の透析により溶媒置換したタンパク質溶液をＡｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｐｏｓｉｄｙｎｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、孔径０．２μｍ、ＰＡＬＬ社製）で濾過し、濾液を回収してＡＧ１−５−４タンパク質標品とした。
【００８１】
実施例２  ラミニンフラグメントによる細胞増殖の促進
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られた健常人より成分採血を実施後、採血液をＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いた分離操作に供し、ＰＢＭＣを回収した。採取したＰＢＭＣはＲＰＭＩ１６４０に懸濁後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ヒト血清アルブミン（ブミネート：バクスター社製）を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製）で洗浄した。
【００８２】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ１−５−４の固定化
９６ウェル細胞培養プレート（コーニング社製）に終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を８０μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、上清を除去し、実施例１で調製したＡＧ１−５−４をそれぞれ終濃度１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬで含むＰＢＳを８０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃（５％ＣＯ２存在下）で５時間インキュベートした。対照として、抗ヒトＣＤ３抗体固定後にＡＧ１−５−４を含まない０．００１％のＴｒｉｔｏｎＸ―１１４溶液を用いて同様のインキュベート操作を行う群も設定した。上記のプレートは使用直前にＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。
【００８３】
（３）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例２−（１）で分離したＰＢＭＣ  ０．３×１０５ｃｅｌｌｓを０．５％ヒトＡＢ型血清（ＬＯＮＺＡ社製、以下血清と記載）、終濃度２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（カイロン社製、製剤名Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を含むＧＴ−Ｔ５５１  ０．２ｍＬに懸濁し、実施例２−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ１−５−４固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養３日目に終濃度０．１ｍＣｉ／ｍＬ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を含む０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を１０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃（５％ＣＯ２存在下）で１６時間インキュベートした。培養後の細胞をセルハーベスター（ＳＫＡＴＯＲＯＮ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、ＦｉｌｔｅｒＭＡＴ（ＳＫＡＴＯＲＯＮ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）上に回収し、エタノール（ナカライテスク社製）で固定後、水で洗浄し、乾燥させた。細胞へのチミジン取り込みは、細胞が固定化されたＦｉｌｔｅｒＭＡＴの放射活性を、Ａｑｕａｓｏｌ−２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）をシンチレーションカクテルとして、液体シンチレーションカウンターＬＳ６５００（ベックマン・コールター社製）により測定することで評価した。各初期刺激における放射活性の値を表１に示す。また、表中において「＋」は「及び」を意味し、以降の表においても同様である。
【００８４】
【表１】
2010063455.tif 000002
【００８５】
表１に示されるように、初期刺激として抗ＣＤ３抗体とラミニンフラグメント（ＡＧ１−５−４）を組み合わせることにより、放射活性が高くチミジン取り込み量が多いことが確認された。すなわちＡＧ１−５−４による細胞増殖促進効果が示された。
【００８６】
実施例３  ラミニンフラグメントを用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ１−５−４の固定化
実施例２−（２）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ１−５−４を固定化したプレートを作製した。ただし、プレートは１２ウェル細胞培養プレート（コーニング社製）に変更し、抗ヒトＣＤ３抗体を含むＰＢＳは０．４５ｍＬ／ウェルずつ添加した。またＡＧ１−５−４固定化時には、終濃度１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬのＡＧ１−５−４を含むＰＢＳを０．４５ｍＬ／ウェルずつ添加した。
【００８７】
（２）リンパ球の拡大培養
０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁した。実施例３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ１−５−４固定化プレートに０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を１．０ｍＬ／ウェルで添加しておき、前記の細胞懸濁液を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。続いて終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養４日目及び７日目に、各群の培養液を０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いてそれぞれ約１４倍（４日目）及び約２倍（７日目）希釈した。また、この希釈の際に希釈液１０ｍＬをそれぞれＴ２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養７日目及び１０日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２に示す。
【００８８】
【表２】
2010063455.tif 000003
【００８９】
表２に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とラミニンフラグメント（ＡＧ１−５−４）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、ラミニンフラグメント（ＡＧ１−５−４）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。
【００９０】
実施例４  組換えラミニンフラグメント  ＡＧ２−１０−７の調製
（１）発現プラスミドの構築
実施例１−（１）で作製したｐＭＤ２０−Ａ１（５４８２−８６０８）３５を鋳型とし、プライマーＬＭＡＧ２Ｆ１０、ＬＭＡＧ２Ｒ７を用いたＰＣＲをおこなった。プライマーＬＭＡＧ２Ｆ１０、ＬＭＡＧ２Ｒ７の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号９、１０に示す。得られた増幅断片をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、実施例１−（２）記載のＭＣＳ改変型ｐＣｏｌｄＩのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ  サイトに挿入した。これによりＮ末端にヒスチジン−タグが付加された、ヒトラミニンα１鎖アミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００５５５０．２）のアミノ酸番号２３４６−２４３８の領域（配列番号１１）を含有する組換えラミニンフラグメント（ＡＧ２−１０−７：ヒスチジン−タグを含んで１１２残基、分子量１２７４４．７３）の発現プラスミド、ｐＣ１ｂＡＧ２−１０−７を得た。
【００９１】
（２）ＡＧ２−１０−７の製造
ｐＣ１ｂＡＧ２−１０−７を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンで選択した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が０．５付近になった時点で１５℃に冷却した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現誘導した。発現誘導後、１５℃で一晩培養を継続し、その後に菌体を回収した。
【００９２】
前記の菌体を０．２ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波処理を行った。得られた菌体破砕液を遠心分離して上清を回収した。この遠心上清に終濃度５０ｍＭとなるようにイミダゾールを添加した後、０．２ＭのＮａＣｌと５０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース４ｍＬと混合し、さらに容器を回転させながら４℃で１時間保持した。この樹脂懸濁液をカラムに詰め、以下の順序で緩衝液をカラムに添加してクロマトグラフィーをおこなった。
【００９３】
洗浄：０．２ＭのＮａＣｌと５０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
溶出：０．２ＭのＮａＣｌと３００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。
【００９４】
溶出操作で回収された画分をＲＣ透析チューブ  ポア３に封入し、０．２ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析をおこなった。こうして溶媒置換したタンパク質溶液をＡＧ２−１０−７タンパク質標品とした。
【００９５】
実施例５  組換えラミニンフラグメント（ＡＧ２−１０−７）を用いたリンパ球の拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
実施例２-（１）と同様の方法でＰＢＭＣの分離及び保存を行った。
【００９６】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ２−１０−７の固定化
実施例２−（２）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及び実施例４で調製したＡＧ２−１０−７を固定化したプレートを作製した。ただし、プレートは２４ウェル細胞培養プレート（コーニング社製）に変更し、抗ヒトＣＤ３抗体を含むＰＢＳは０．２４ｍＬ／ウェルずつ添加した。またＡＧ２−１０−７固定化時には、終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようにＡＧ２−１０−７を添加した。
【００９７】
（３）リンパ球の拡大培養
０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例５−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁した。実施例５−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ヒトＣＤ３抗体及びＡＧ２−１０−７固定化プレートに０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を０．５６ｍＬ／ウェルで添加しておき、前記の細胞懸濁液を０．２４ｍＬ／ウェルずつ添加した。続いて終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養４日目及び７日目に、各群の培養液を０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いてそれぞれ約５．７１４倍（４日目）及び約２倍（７日目）希釈した。また、この希釈の際に希釈液２ｍＬをそれぞれ新しい２４ウェル細胞培養プレートに移し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養４日目と培養７日目及び１０日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表３に示す。
【００９８】
【表３】
2010063455.tif 000004
【００９９】
表３に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とラミニンフラグメント（ＡＧ２−１０−７）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、ラミニンフラグメント（ＡＧ２−１０−７）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、養子免疫療法に有用なリンパ球の拡大培養方法が提供される。また、リンパ球の拡大培養に有用な新規なラミニンフラグメントも提供される。高い効率でリンパ球を拡大培養可能な本発明の方法は、細胞医薬の製造技術として極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of the gene encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:3 ; Primer to amplify the fragment of cDNA encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:4 ; Primer to amplify the fragment of cDNA encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:5 ; Synthetic DNA STPU1.
SEQ ID NO:6 ; Synthetic DNA STPL2.
SEQ ID NO:7 ; Primer to amplify the fragment of cDNA encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:8 ; Primer to amplify the fragment of cDNA encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:9 ; Primer to amplify the fragment of cDNA encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:10 ; Primer to amplify the fragment of cDNA encoding human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:11 ; Partial region of human laminin alpha 1 chain.
SEQ ID NO:12 ; Partial region of the gene encoding human laminin alpha 1 chain.
【配列表】
2010063455000001.app