(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ１９３５５として同定された腫瘍壊死因子を提供する。【解決手段】ヒトＤＮＡ１９３５５を単離して、酵母形質転換体を作成し、１９３５５ポリペプチドを取得する。更に、該１９３５５ポリペプチドを用いて、抗体を取得する。該１９３５５ポリペプチドは哺乳動物癌細胞においてアポトーシス活性を有し、炎症誘発性反応に含まれうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなり、Ｘが図１（配列番号：１）のアミノ酸残基４８〜５７の任意のものである、単離された核酸。
【請求項２】
図１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４】
ベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が酵母菌細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの製造方法において、請求項５に記載の宿主細胞を、ＤＮＡ１９３５５の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤＮＡ１９３５５を回収することを含んでなる方法。
【請求項１０】
図１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含んでなる、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１１】
図１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含む天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１に記載のＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１２に記載のＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがヒトＧＩＴＲに結合する、請求項１１に記載のＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）図１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７であって、Ｘが図１（配列番号：１）のアミノ酸残基残基４８〜５７の任意のものであるアミノ酸残基；又は
（ｂ）（ａ）の断片を含んでなり、前記断片が生物学的に活性な、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ２０９４６６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされた、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１７】
異種アミノ酸配列に融合したＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１８】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
前記異種アミノ酸配列がロイシンジッパーである、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
非タンパク質様ポリマーに融合したＤＮＡ１９３５５ペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項２２】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを誘発する方法において、哺乳動物癌細胞を有効量のＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに暴露することを含んでなる方法。
【請求項２５】
哺乳動物細胞における炎症誘発性反応を刺激する方法において、前記哺乳動物細胞を有効量のＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに暴露することを含んでなる方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物細胞がＴ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連する出願）
これは、1997年12月18日に出願された仮出願番号60/065,635及び1997年12月12日に出願された仮出願番号60,069,661に基づく119条(e)の下での優先権を主張した非仮出願であり、それらの内容は出典明示して取り入れる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、新規なＤＮＡの同定及び単離、並びに、ここに「ＤＮＡ１９３５５」と命名する新規ポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物における細胞数のコントロールは、部分的には、細胞増殖と細胞死のバランスにより決定されると考えられている。壊死性細胞死と称されることのある細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barrら, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Stellerら, Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択及び胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら, Cell, 66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、及びヘルペスウイスル感染を含む種々の病理学的状態に関連している［Thompson, Science, 267：1456-1462(1995)］。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、発作、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理学的状態に関連している［上掲のThompsonを参照］。
【０００４】
アポトーシス性細胞死は、典型的には、細胞における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Raff, Nature, 356：397-400(1992)；Steller, 上掲；Sachsら, Blood, 82：15(1993)］。例えば、それらは、ホルモン性刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunagaら, Nature, 356：314-317(1992)］。また、幾つかの同定された発癌遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサー、例えばｐ５３が、アポトーシスの誘発において役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある形態の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている［Thompson, 上掲］。
【０００５】
腫瘍壊死因子-α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」又は「リンホトキシン−α」）、リンホトキシン−β（「ＬＴ−β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、及びＡｐｏ-２リガンド（トレイル(TRAIL)とも称される）等の様々な分子が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Browning等, Cell. 72: 847-856 (1993)；Armitage等, Nature, 357: 80-82 (1992)］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性細胞死を誘発することが報告されている［Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)； Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。ゼング(Zheng)らは、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞の刺激後アポトーシスに関与していることを報告している［Zhengら, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者等は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawaら, プログラムされた細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要旨集、第10巻、(1995)］。
【０００６】
マウスＦａｓ／Ａｐｏ-１又はリガンド遺伝子（各々1pr及びg1dと呼ばれる）における変異は幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢における自己反応性リンパ球のクローン欠失の調節において役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994)；Nagata等, Science, 267: 1449-1456 (1995)］。また、  Ａｐｏ-１リガンドは、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びＢリンパ球における細胞刺激後アポトーシスを誘発すると報告されており、もはやそれらの機能が必要でない場合の活性化されたリンパ球の除去に含まれ得る［Krammer等, 上掲；Nagata等, 上掲］。Ａｐｏ-１レセプターに特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yoneharaら, J. Exp. Med., 169：1747-1756 (1989)］。
【０００７】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応の誘導は、それらが特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたEp 417,563］、双方のレセプターの型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscherら, Cell, 61：351(1990)；Schallら, Cell, 61：361(1990)；Smithら, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に付随している［例えば、Takaoら, Immunogenetics, 37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。さらに最近になって、組換え可溶性ＴＮＦレセプターのクローン化がヘイル(Hale)らにより報告されている［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００８】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して１〜４に設定される４つのシステインに富むドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−アミノ酸１４から約５３まで；ＣＲＤ２−アミノ酸約５４から約９７まで；ＣＲＤ３−アミノ酸約９８から約１３８まで；ＣＲＤ４−アミノ酸約１３９から約１６７まで。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Bannerら, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)らにより記載されている。
【０００９】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekeら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら, 上掲、及びItohら, Cell, 66:233-243 (1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様Ｔ２タンパク質にも見出される［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称されることがある。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：159-163(1991)］又はこのドメインにおける５-アミノ酸の挿入［Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合にはほとんど又は全く影響を持たないことが示された［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲは、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に、ＮＧＦ結合に関与しない約６０のアミノ酸のプロリンに富む伸展を含む［Peetre, Cら, Eur. J. Hematol., 41：414-419(1988)；Seckinger, Pら, J. Biol. Chem., 264：11966-11973(1989)；Yan. H. 及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富む領域はＴＮＦＲ２に見出されているがＴＮＦＲ１にはない。
【００１０】
イトー(Itoh)らは、Ａｐｏ-１レセプターが５５-ｋＤａのＴＮＦＲ１によりシグナル化されるものと類似のアポトーシス性細胞死をシグナル化し得ることを開示している［Itohら, 上掲］。また、Ａｐｏ-１抗原の発現は、細胞をＴＮＦ-α又は抗-Ａｐｏ-１マウスモノクローナル抗体で処理した場合に、ＴＮＦＲ１のものと共にダウンレギュレーションされることが報告されている［Krammerら, 上掲；Nagataら, 上掲］。従って、Ａｐｏ-１及びＴＮＦＲ１レセプターの双方を同時発現する株化細胞が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死滅を媒介しているとの仮説を唱える研究者もいた［同］。
【００１１】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク質分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能する同種三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク質分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【００１２】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定された。これらの新たに同定されたＴＮＦＲファミリーのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテゲリン(osteoprotegerin)（ＯＰＧ）を含む［Brajatsh等, Cell, 87:845-855 (1996)；Montgomery等, Cell, 87:427-436 (1996)；Marsters等, J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997)；Simonet等, Cell, 89:309-319 (1997)］。他の知られたＴＮＦＲ様分子とは異なり、上掲のシモネット(Simonet)等は、ＯＰＧが疎水的膜貫通スパンニング配列を含まないことを報告している。
【００１３】
マースターズ(Marsters)ら、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者等は、細胞外のシステインに富む反復においてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ている、Ａｐｏ-３と称されるヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Marstersら, Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ-３は、ＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyanら, Science, 274：990(1996)；Kitsonら, Nature, 384：372(1996)；Bodmerら, Immunity, 6：79(1997)］。
【００１４】
パン(Pan)らは、「ＤＲ４」と称されるＴＮＦレセプターファミリーの他のメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。パンらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
【００１５】
シェリダン(Sheridan)ら, Science, 277:818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)には、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）のレセプターと考えられる他の分子が記載されている。この分子は、ＤＲ５と称される（また、Ａｐｏ-２とも称されている）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質死亡ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達ができる。
【００１６】
上掲のシェリダンらには、ＤｃＲ１（またはＡｐｏ-２ＤｃＲ）が、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）の潜在的デコイレセプターであると開示されている。シェリダンらは、ＤｃＲ１がインビトロでＡｐｏ-２リガンド機能を阻害することができると報告している。また、ＴＲＩＤと称されるデコイレセプターに関する開示については、上掲のパン等を参照。
ＴＮＦファミリーのサイトカイン及びそれらのレセプターについての概説は、Gruss及びDower, 上掲参照。
【００１７】
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な成分−活性化剤、阻害剤及びエフェクターを含む；線虫(C. elegans)において、これらの成分は各々３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-９及びＣｅｄ-３によりコードされている［Steller, Science, 267：1445(1995)；Chinnaiyanら, Science, 275：1122-1126(1997)；  Wang等, Cell, 90: 1-20 (1997)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ(ＣＤ９５)は、アポトーシス性細胞死を活性化し得る［Chinnaiyan及びDixit, Current Biology, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell, 85：781-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を媒介することも知られている［Tartagliaら, Cell, 74：845-853(1993)；Hsuら, Cell, 84：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ＩＣＤ)での相同性を共有する［Tartagliaら, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997)］。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節する幾つかの後生動物タンパク質、すなわちＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Cleaveland及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、ＴＮＦＲ１とＣＤ９５は死亡誘発性シグナル伝達複合体にＦＡＤＤを補充するものと考えられている。言われるところによれば、ＣＤ９５はＦＡＤＤに直接結合する一方、ＴＮＦＲ１はＴＲＡＤＤを介して間接的にＦＡＤＤに結合する［Chinnaiyanら, Cell, 81：505-512(1995)；Boldinら, J. Biol. Chem., 270：387-391(1995)；Hsuら, 上掲；Chinnaiyanら, J. Biol. Chem., 271：4961-4965(1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３-関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ(キャスパーゼ８)を、死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプタータンパク質となることが報告されている［Boldinら, Cell, 85：803-815(1996)；Muzioら, Cell, 85：817-827(1996)］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン-１β変換酵素(ＩＣＥ)及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる［Fraser及びEvan, 上掲］。
【００１８】
プログラムされた細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害され得る［Rayら, Cell, 69：597-604(1992)；Tewariら, Cell, 81：801-809(1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を阻害し得ることが示されている［Enariら, Nature, 375：78-81 (1995)；Tewariら, J. Biol. Chem., 270：3255-3260 (1995)］。
【００１９】
テワリ(Tewari)らにより最近概説されているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調させる［Tewariら, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含む二量体転写因子のファミリーの原型である［Vermaら, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκＢ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；ある刺激に反応してのＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。ＫＦ-κＢは、ＩＬ-１及びＴｏｌｌ様レセプターＴＬＲ２を介して作用するＬＰＳを含む種々の炎症誘発性シグナル及びサイトカインによって誘発される［Baeuerle等, Ann. Rev. Immunol., 12: 141-79 (1994)；Verma等, 上掲］。
【００２０】
（発明の概要）
本出願人は、本出願において「ＤＮＡ１９３５５」と命名される新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
【００２１】
一実施態様において、本発明は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子を提供する。場合によっては、単離された核酸分子は、図１（配列番号：１(SEQ ID NO:1)）のアミノ酸残基１〜１７７又は５２〜１７７を有するＤＮＡ１９３５５ポリぺプチドをコードするＤＮＡを含み、又はこのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高い厳密性条件下でそれへの安定した結合を維持する。単離された核酸分子は、ＡＴＣＣ２０９４６６として寄託されたベクターのＤＮＡ１９３５５ｃＤＮＡ挿入物、特にＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む挿入物を含んでいてもよい。
【００２２】
他の実施態様において、本発明はＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。また、このようなベクターを含有する宿主細胞も提供する。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。さらに、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの生産方法も提供され、その方法は宿主細胞をＤＮＡ１９３５５の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤＮＡ１９３５５を回収することを含んでなる。
【００２３】
他の実施態様では、本発明は単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、一実施態様においては図１（配列番号：１）の残基１〜１７７又は５２〜１７７を含んでなるアミノ酸配列を含む、単離された天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９４６６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされたポリペプチドを発現させることにより得られ又は得られうる。
【００２４】
他の実施態様においては、本発明は単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド変異体を提供する。変異体は、図１（配列番号：１）の推定アミノ酸配列又はここで同定されるドメイン配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは天然配列又は天然発生ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの活性を有する。
【００２５】
他の実施態様において、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例には、エピトープタグ配列又は免疫グロブリン配列のＦｃ領域と融合したＤＮＡ１９３５５が含まれる。
【００２６】
他の実施態様において、本発明はＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
【００２７】
さらなる実施態様において、本発明はＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを用いる診断及び治療方法も提供される。例えば、哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘発する方法が提供される。
【００２８】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用されるときの「ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド」及び「ＤＮＡ１９３５５」という用語には、天然配列ＤＮＡ１９３５５及びＤＮＡ１９３５５変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。ＤＮＡ１９３５５は種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。ここで用いられるときの「ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド」及び「ＤＮＡ１９３５５」という用語は、文献において「グリッター(GLITTER)」と呼ばれているのと同じポリペプチドを意味する。「天然配列ＤＮＡ１９３５５」は、天然由来のＤＮＡ１９３５５と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＤＮＡ１９３５５は、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＤＮＡ１９３５５」という用語には、特に、ＤＮＡ１９３５５の自然に生じる切断、可溶性又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列又は可溶性形態)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＤＮＡ１９３５５の自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＤＮＡ１９３５５は、図１(配列番号：１)のアミノ酸１〜１７７を含有する成熟又は全長天然配列ＤＮＡ１９３５５である。あるいは、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、図１（配列番号：１）のアミノ酸５２〜１７７を含む。場合によっては、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９４６６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドを発現させることにより得られ又は得られうる。
【００２９】
「ＤＮＡ１９３５５細胞外ドメイン」又は「ＤＮＡ１９３５５ＥＣＤ」は、ＤＮＡ１９３５５の膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＤＮＡ１９３５５の型を意味する。通常、ＤＮＡ１９３５５ＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。場合によっては、ＤＮＡ１９３５５ＥＣＤは、図１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７を含み、ここで、Ｘは図１（配列番号：１）のアミノ酸残基４８〜５７の任意のものである。当業者には、本発明のＤＮＡ１９３５５ポリペプチドについて同定された膜貫通ドメインが、この分野におけるその種の疎水性ドメインの同定に日常的に用いられる基準に従って同定されることを理解するであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変動するが、最も可能性が高いのは、ここに特に述べたドメインのいずれかの末端における約５アミノ酸以下である。
【００３０】
「ＤＮＡ１９３５５変異体」とは、全長天然配列ヒトＤＮＡ１９３５５に対して図１（配列番号：１）に示されている推定アミノ酸配列又はここで同定されるドメイン配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義するＤＮＡ１９３５５を意味する。このようなＤＮＡ１９３５５変異体には、例えば、図１(配列番号：１)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加され、もしくは欠失されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチドが含まれる。ＤＮＡ１９３５５変異体は、図１（配列番号：１）のアミノ酸残基５２〜１７７未満を有する配列を含むＥＣＤ断片を含む。通常、ＤＮＡ１９３５５変異体は、図１(配列番号：１)のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％又は８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００３１】
ここで同定されるＤＮＡ１９３５５配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合に、ＤＮＡ１９３５５配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００３２】
ここで同定されるＤＮＡ１９３５５配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した場合に、ＤＮＡ１９３５５配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウエアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００３３】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＤＮＡ１９３５５、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得る又は幾つかの他の試薬により同定され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、ＤＮＡ１９３５５の活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００３４】
「単離された」とは、ここで開示される種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され及び分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、典型的にはポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様(proteinaceous)又は非タンパク質様(nonproteinaceous)の溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(２)クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。ＤＮＡ１９３５５の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３５】
「単離された」ＤＮＡ１９３５５核酸分子は、ＤＮＡ１９３５５核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され分離された核酸分子である。単離されたＤＮＡ１９３５５核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＤＮＡ１９３５５核酸分子は、天然の細胞中に存在するＤＮＡ１９３５５核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＤＮＡ１９３５５核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある場合にＤＮＡ１９３５５を通常発現する細胞に含まれるＤＮＡ１９３５５核酸分子を含む。
【００３６】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３７】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に配置されているときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現されるなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合しており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３８】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗-ＤＮＡ１９３５５モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＤＮＡ１９３５５抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。
【００３９】
ここで意図している「生物学的に活性な」及び「所望の生物学的活性」とは、（１）インビボ又はエキソビボで少なくとも１つの型の哺乳動物細胞において（作用的又は刺激的方法あるいは拮抗的又は阻害的方法のいずれかで）アポトーシスを変調させる能力を持つこと、又は（２）インビボ又はエキソビボで少なくとも１つの型の哺乳動物細胞において炎症誘発性反応を誘発又は刺激する能力を持つことを意味する。
【００４０】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば全てこの分野で知られている細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法により決定及び測定することができる。
【００４１】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
【００４２】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００４３】
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００４４】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＤＮＡ１９３５５と称されるポリペプチドをコードする、新たに同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＤＮＡ１９３５５（図１及び配列番号：１に示す）が、ＴＮＦファミリーの幾つかのメンバーとある程度のアミノ酸同一性を有することを見いだした（例えば、図２及び下記の実施例１参照）。下記の実施例に示されるように、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、アポトーシス活性及びＧＩＴＲへの特異的結合性を有することが見出された。また、ＤＮＡ１９３５５がインビトロでの一次Ｔ細胞におけるＴＮＦ-アルファの分泌（実施例１４）及びモルモット皮膚生検アッセイにおける好中球の浸潤及び流入（実施例１５に記載するような）を刺激することも見出され、ＤＮＡ１９３５５の炎症誘発性反応における役割を示唆している。
【００４５】
ここに記載する全長天然配列ＤＮＡ１９３５５及びＤＮＡ１９３５５の可溶性形態に加えて、ＤＮＡ１９３５５変異体も調製できると考えられる。ＤＮＡ１９３５５変異体は、ＤＮＡ１９３５５核酸配列に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又は望まれるＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの合成により調製できる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数又は位置の変化又は膜固着特性の変更等のＤＮＡ１９３５５の翻訳後プロセスを変え得ることを認めるであろう。
【００４６】
天然全長配列ＤＮＡ１９３５５又はここに記載するＤＮＡ１９３５５の種々のドメインにおける変異は、例えば、保存的又は非保存的突然変異についての、例えば米国特許第5,364,934号に記載された、任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、天然配列ＤＮＡ１９３５５と比較してＤＮＡ１９３５５のアミノ酸配列の変化をもたらす、ＤＮＡ１９３５５をコードする１又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、少なくとも１つのアミノ酸の、ＤＮＡ１９３５５の１又は複数のドメインの他の任意のアミノ酸による置換による。望ましい活性に悪影響を及ぼすことなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失するかを決定する指針は、ＤＮＡ１９３５５の配列を相同の周知のタンパク質分子と比較し、高い相同性の領域内でなされたアミノ酸配列変化の数を最小にすることにより見出しうる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的特性を持つ他のアミノ酸で置き換えた結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲としてもよい。許容される変異は、配列におけるアミノ酸の体系的な挿入、欠失又は置換作成、及び得られた変異体の下記の実施例に記載する任意のインビトロアッセイにおける活性についての試験によって決定されうる。
【００４７】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位指向性）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発などのこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の周知の技術が、ＤＮＡ１９３５５変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
【００４８】
また、近接配列に沿った１又は複数のアミノ酸を同定するためにスキャニングアミノ酸分析も用いることができる。中でも好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さく中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、典型的にはこれらの群の中で好ましいスキャニングアミノ酸であるのは、それがベータ-炭素を越える側鎖を持たず、変異体の主鎖構造を変えにくいと思われるからである。また、アラニンも、最もありふれたアミノ酸であるため、典型的には好ましい。さらに、それは隠れた及び露出した位置の両方にしばしば見られる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freemann & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が適切な量の変異体を生じないならば、異性体(isoteric)アミノ酸が用いられる。
【００４９】
Ｂ．ＤＮＡ１９３５５の修飾
ＤＮＡ１９３５５の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。
共有結合的修飾の一型は、ＤＮＡ１９３５５の標的化されたアミノ酸残基を、ＤＮＡ１９３５５の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＤＮＡ１９３５５を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＤＮＡ１９３５５抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００５０】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５１】
本発明の範囲内に含まれるＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＤＮＡ１９３５５に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列ＤＮＡ１９３５５に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００５２】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更を伴うこともある。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＤＮＡ１９３５５（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＤＮＡ１９３５５アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００５３】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【００５４】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００５５】
ＤＮＡ１９３５５の共有結合的修飾の他の型は、ＤＮＡ１９３５５ポリぺプチドの、種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００５６】
また、本発明のＤＮＡ１９３５５は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＤＮＡ１９３５５を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＤＮＡ１９３５５との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＤＮＡ１９３５５のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＤＮＡ１９３５５のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＤＮＡ１９３５５を容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はＤＮＡ１９３５５の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価の形態には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。特に、キメラ分子は、Ｈｉｓタグ分子に融合したＤＮＡ１９３５５のＥＣＤを含んでもよい。
【００５７】
種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は、この分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ-ｈｉｓ-ｇｌｙ）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255: 192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)］を含む。
【００５８】
また、本発明のＤＮＡ１９３５５は、ロイシンジッパーに融合したＤＮＡ１９３５５を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。種々のロイシンジッパーがこの分野で記載されている。例えば、Landschulz等, Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe等, FEBS Letters, 344: 1991 (1994)参照。ＤＮＡ１９３５５に融合したロイシンジッパーの使用は、溶液中での可溶性ＤＮＡ１９３５５に二量体化又は三量体化を助けるのに望ましい。当業者は、ロイシンジッパーがＤＮＡ１９３５５分子の５’又は３’末端の何れかに融合しうることを認めるであろう。
【００５９】
Ｃ．ＤＮＡ１９３５５の調製
以下の説明は、主として、ＤＮＡ１９３５５核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養してＤＮＡ１９３５５を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＤＮＡ１９３５５を調製することができると考えられる。例えば、ＤＮＡ１９３５５配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって製造してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動化によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動化合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＤＮＡ１９３５５の種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＤＮＡ１９３５５を製造してもよい。
【００６０】
１．  ＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡの単離
ＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ１９３５５ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＤＮＡ１９３５５ＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＤＮＡ１９３５５コード遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【００６１】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＤＮＡ１９３５５に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているような標準的な手順を使用して実施することができる。ＤＮＡ１９３５５をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００６２】
以下の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載する。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高い厳密性を含むハイブリッド形成条件は、Sambrookら, 上掲に提供されている。
【００６３】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公的データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、同一性を測定するのに様々なアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
【００６４】
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００６５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞は、ここに記載したＤＮＡ１９３５５生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
【００６６】
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願第ＷＯ89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336: 348-352 (1988)を参照のこと。
【００６７】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、グラム陰性又はグラム陽性生物体などの真正細菌、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５ ７７２（ATCC53,635）が公に利用可能である。
【００６８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＤＮＡ１９３５５をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア(Saccharomyces cerevisiae)は、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
【００６９】
グリコシル化ＤＮＡ１９３５５の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の技量の範囲内にある。
【００７０】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＤＮＡ１９３５５をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローン化(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分は、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの形成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００７１】
ＤＮＡ１９３５５は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＤＮＡ１９３５５ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のＥＰ 362,179)、又は1990年11月15日に発行された国際特許出願第WO90/13646号に記載されているシグナルであってよい。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００７２】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【００７３】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質あるいは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンに耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、バシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼを供給するタンパク質をコードする。
【００７４】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＤＮＡ１９３５５核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282: 39 (1979)；Kingmanら, Gene, 7: 141 (1979)；Tschemperら, Gene, 10: 157 (1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85: 12 (1977)］。
【００７５】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＤＮＡ１９３５５核酸配列に作用可能に結合してｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。多種の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に適したプロモーターは、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275: 615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281: 544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776］、及びｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００７６】
酵母宿主と共に用いるのに好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17: 4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７７】
成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターである他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝を伴う分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素がある。酵母での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００７８】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＤＮＡ１９３５５転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、このようなプロモーターは宿主細胞系に適合し得る場合に限られる。
【００７９】
より高等の真核生物による本発明のＤＮＡ１９３５５をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動エレメントである。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインシュリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＤＮＡ１９３５５コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００８０】
また、真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、ときには３'の非翻訳領域から通常取得できる。これらの領域は、ＤＮＡ１９３５５をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【００８１】
組換え脊椎動物細胞培養でのＤＮＡ１９３５５の合成への適応化するのに適切な他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; 及び欧EP 117,058に記載されている。
【００８２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いるてもよい。次いで、抗体を標識してアッセイを実施することができるが、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００８３】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定してもよい。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＤＮＡ１９３５５ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００８４】
５．ポリペプチドの精製
ＤＮＡ１９３５５の形態は、培養培地又は宿主細胞の溶解液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＤＮＡ１９３５５の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【００８５】
ＤＮＡ１９３５５を、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。以下の手順は適切な精製手順の例である：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＤＮＡ１９３５５のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された、この分野で知られた多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＤＮＡ１９３５５の性質に依存する。
【００８６】
Ｄ．ＤＮＡ１９３５５の用途
ＤＮＡ１９３５５をコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド形成プローブとして、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成においての使用を含む、分子生物学における種々の用途を有している。また、ＤＮＡ１９３５５核酸は、ここに記載される組換え技術によるＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの調製にも有用であろう。
【００８７】
全長天然配列ＤＮＡ１９３５５（図１；配列番号：２）遺伝子、又はその一部は、図１（配列番号：２）に開示されたＤＮＡ１９３５５配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＤＮＡ１９３５５の天然発生変異体又は他の種からのＤＮＡ１９３５５をコードするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリのためのハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、配列番号：２の核酸配列又は天然配列ＤＮＡ１９３５５のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＤＮＡ１９３５５遺伝子のコード領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＤＮＡ１９３５５遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。
【００８８】
また、ＤＮＡ１９３５５をコードする核酸配列は、そのＤＮＡ１９３５５をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体標識に対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００８９】
スクリーニングアッセイは、天然配列ＤＮＡ１９３５５又はＤＮＡ１９３５５のリガンド又はレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００９０】
また、ＤＮＡ１９３５５又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＤＮＡ１９３５５をコードするｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＤＮＡ１９３５５をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列は、ＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば、米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＤＮＡ１９３５５導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＤＮＡ１９３５５をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの態様に従えば、動物を試薬で治療し、その導入遺伝子を有する未治療の動物に比べて病理的状態の発症率が低くければ、その病理的状態に対する治療的処置の可能性が示されている。
【００９１】
あるいは、ＤＮＡ１９３５５の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＤＮＡ１９３５５をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＤＮＡ１９３５５をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＤＮＡ１９３５５をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＤＮＡ１９３５５「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＤＮＡ１９３５５をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＤＮＡ１９３５５をコードするゲノムＤＮＡのクローン化に使用できる。ＤＮＡ１９３５５をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは数キロベースの無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞系に(例えばエレクトロポレーション等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69: 915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性育成動物に移植し、胚を期間をおいて「ノックアウト」動物につくりあげる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術により同定され、動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させるのに利用することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理的状態に対する防御能力及びＤＮＡ１９３５５ポリペプチドが不在であることによるその病理的状態の発達によって特徴付けられる。
【００９２】
また、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、例えば、哺乳動物組織におけるレセプター「ＧＩＴＲ」の存在を検出するための診断アッセイに用いてもよい。このようなアッセイは、この分野で知られた技術を用いて、例えば、ここに述べる結合アッセイを用いて実施することができる。
【００９３】
さらに、ＤＮＡ１９３５５はポリペプチドは、ＤＮＡ１９３５５に対する抗体を生ずる免疫原として用いてもよい。抗体を生成する技術及び方法は以下に記載する。
【００９４】
また、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、治療的に用いることもできる。例えば、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘発するのに用いることができる。一般的に、哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘発する方法は、細胞を有効（又はアポトーシスを誘発する）量のＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに暴露することを含む。ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの癌治療のための治療的応用は以下に詳細に記述する。
【００９５】
癌の治療方法において、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、癌を持つと診断された哺乳動物に投与される。当然のことながら、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、他のアポトーシス誘発剤、化学治療薬、放射線治療及び手術を含むさらに他の治療的組成物及び技術と組み合わせて用いることができる。
【００９６】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、許容される担体、好ましくは製薬的に許容される担体中で投与される。好適な担体及びそれらの処方は、Osloらにより編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７．４〜約７．８である。例えば投与経路又は投与されるＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの濃度に応じて、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
【００９７】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、注射(例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋内)、又は点滴のように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法により哺乳動物に投与することができる。また、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドはインビボ又はエキソビボ遺伝子治療により投与できるとも考えられる。
【００９８】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの投与の有効な用量とスケジュールは経験的に決定することができ、そのような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。現在では、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの有効投与量又は量は、１日当たりに、約１マイクログラム／ｋｇ〜薬１００mg／ｋｇ体重の範囲であると考えられている。投与量の種内スケーリングは、例えば、Mordenti等, Pharmaceut. Res., 8: 1351 (1991)に記載されたような、この分野で知られた方法で実施できる。当業者は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの投与すべき用量が、例えば、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを受容する哺乳類、投与経路、及び哺乳類に投与される他の薬剤又は治療薬に応じて変化することを理解するであろう。
【００９９】
哺乳類に施される１又は複数の他の治療は、これらに限られないが、化学治療薬及び／又は放射線治療、イムノアジュバント、サイトカイン、及び抗体ベースの治療薬を含む。例として、インターロイキン（例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-６）、白血病抑制因子、インターフェロン、エリスロポエチン、抗-ＶＥＧＦ抗体、及びＨｅｒ-２抗体を含む。哺乳動物細胞でアポトーシスを誘発することが知られた他の薬剤も用いることができ、そのような薬剤は、ＴＮＦ-アルファ、ＴＮＦ-ベータ、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド及びＡｐｏ−１リガンドを含む。
【０１００】
本発明で考慮される化学治療薬は、この分野で知られ市販されている化学物質又は薬剤、例えば、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、ロイコボリン、シトシンアラビノシド(Ａｒａ-Ｃ)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチンを含む。このような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまた化学治療サービス, M.C.Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
【０１０１】
化学治療薬は、上述したような、許容される担体の、好ましくは製薬的に許容される担体で投与される。化学治療薬の投与形態は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに採用したのと同じでもよく、又は異なる形態を通して哺乳動物に投与してもよい。例えば、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは注射し、化学治療薬は哺乳動物に経口投与してもよい。
【０１０２】
放射線治療は、この分野で通常用いられ当業者に知られたプロトコールに従って施される。このような治療は、セシウム、イリジウム、ヨウ素、又はコバルト放射腺を含む。放射腺は全身照射でもよく、又は身体中又は上の特定の部位又は組織を局所的に指向してもよい。典型的には、放射線治療は約１から約２週間までの期間に渡ってパルス的に施される。場合によっては、放射線治療は単一用量として、又は多重、連続用量として施してもよい。
【０１０３】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド及び１又は複数の他の治療は、哺乳動物に同時に又は連続して施してよい。ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド及び１又は複数の他の治療を哺乳動物に施した後、哺乳動物の生理学的状態を、熟練した実務者に良く知られた種々の方法で監視することができる。例えば、腫瘍重量は、生検により、又はｘ-線画像化技術により物理的に観察できる。
【０１０４】
また、上記のＤＮＡ１９３５５投与の様式及び方法は、熟練した実務者によって、それによって炎症誘発性反応の刺激又は誘発が望まれる状態の治療のために使用されうる。
【０１０５】
Ｅ．抗-ＤＮＡ１９３５５抗体
本発明は、さらに抗-ＤＮＡ１９３５５抗体を提供する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
【０１０６】
１．ポリクローナル抗体
ＤＮＡ１９３５５抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び望ましいならばアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択され得る。
【０１０７】
２．モノクローナル抗体
あるいは、ＤＮＡ１９３５５抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256: 495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するか又は生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
【０１０８】
免疫化剤は、典型的にはＤＮＡ１９３５５ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれる場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の成長を阻止する。
【０１０９】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫系であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのサルク・インスティチュート・セル・ディストリビューション・センター（Salk Institute Cell Distribution Center）やバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０１１０】
次いでハイブリドーマ細胞を培養する培地を、ＤＮＡ１９３５５に対するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合アッセイによって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１１１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程を経てサブクローン化し、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボの腹水で成長させることもできる。
【０１１２】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から単離又は精製されうる。
【０１１３】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法により(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されれば、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4816567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに換えて置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに換えて置換し、キメラ二価抗体を産生することができる。
【０１１４】
本発明の抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０１１５】
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている日常的技術を使用して達成できる。
【０１１６】
３．ヒト化抗体
本発明のＤＮＡ１９３５５抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２あるいは抗体の他の抗原結合性サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含み、それは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１１７】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによる、ウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って本質的に行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(U.S. Patent No.4,816,567)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾つかのＣＤＲ残基及びことによっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１１８】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)］。
【０１１９】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＤＮＡ１９３５５に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
【０１２０】
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において公知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305: 537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に組み合わせるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日発行のWO93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J., 10: 3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１２１】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有するのが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
【０１２２】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合体抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合体抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化させるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために(WO91/00360; WO92/200373; EP 03089)提案されている。これらの抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより免疫毒素を作成することができる。この目的のために好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【０１２３】
Ｅ．ＤＮＡ１９３５５抗体の用途
本発明のＤＮＡ１９３５５抗体は様々な有用性を有している。例えば、ＤＮＡ１９３５５抗体は、ＤＮＡ１９３５５の診断アッセイ、例えば特定細胞、組織、又は血清でのその発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接のいずれかで検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
【０１２４】
また、ＤＮＡ１９３５５抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＤＮＡ１９３５５のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＤＮＡ１９３５５に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製すべきＤＮＡ１９３５５を含む試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＤＮＡ１９３５５以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＤＮＡ１９３５５を抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１２５】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１２６】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明に従い使用した。次の実施例及び明細書全体を通してＡＴＣＣ受入番号により特定している細胞の供給源は、バージニア州、マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。
【０１２７】
実施例１
ヒトＤＮＡ１９３５５の単離
Klein等, PNAS, 93: 7108-7113 (1996)に記載された方法に以下の修正をして用いた。酵母の形質転換は、多重形質転換された酵母細胞の数を減らすために制限された量の形質転換ＤＮＡで実施した。酵母からのプラスミドの単離は、Klein等, 上掲, に記載されたように大腸菌の形質転換に従ったが、ＰＣＲ分析は単一の酵母コロニーに対して実施した。これは、元のスクロース陽性コロニーを新鮮なスクロース培地上に再画線培養して陽性クローンを精製することにより達成した。次いで、単一の精製コロニーを以下のプライマー：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCTCAGAGAAACAAGCAAAAC（配列番号：７）及びCAGGAAACAGCTATGACCGAAGTGGACCAAAGGTCTATCGCTA（配列番号：８）を用いたＰＣＲに使用した。ＰＣＲプライマーは、インベルターゼ遺伝子の挿入物及び小部分を増幅し（挿入物がインベルターゼのフレーム内であることを決定できるようにし）、そして全配列プライマー部位に付加するために二連となっている。
【０１２８】
インベルターゼに融合したヒトＨＵＶＥＣ細胞から誘導されたｃＤＮＡ断片のライブラリを酵母に形質転換させ、形質転換体をＳＣ−ＵＲＡ培地上で選択した。ＵＲＡ及び形質転換体は、インベルターゼを分泌するクローンを同定するためにスクロース培地にレプリカ法で蒔いた。陽性クローンを再試験し、ＰＣＲ生成物を配列決定した。１つのクローンであるＤＮＡ１８４０の配列は、シグナルペプチドコード配列を含むと決定された。オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、ＤＮＡ１８４０の核酸配列を用いて設計された。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からのｃＤＮＡの全長プラスミドライブラリを滴定し、約１００，０００ｃｆｕを、５００ｃｆｕ／プールの１９２プールに９６-ウェルの丸底プレート中で蒔いた。プールを３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら終夜成長させた。ＰＣＲは個々の培地でＤＮＡ１８４０に特異的なプライマーを用いて実施した。アガロースゲル電気泳動を実施し、陽性ウェルを予想されるサイズのバンド可視化によって同定した。個々の陽性クローンはコロニーリフトによって得て、次いで３２Ｐ-標識オリゴヌクレオチドでハイブリッド形成した。これらのコロニーは、ＰＣＲ、制限消化、及びサザンブロット分析によって特徴付けされた。
【０１２９】
ｃＤＮＡクローンは全部配列決定された。ＤＮＡ１９３５５の核酸配列は図１（配列番号：２）に示す。クローンＤＮＡ１９３５５−１１５０は、ヌクレオチド位置２１−２３に見かけの転写開始部位を持つ単一の読み枠を含む［Kozak等, 上掲］（図１；配列番号：２）。予測されるポリペプチド前駆体は１７７アミノ酸長であり、約２０，３０８ダルトンの計算上の分子量を持つ。ヒドロパシー分析は、推定細胞質領域（アミノ酸）１−２５）；膜貫通領域（アミノ酸２６−５１）；及び細胞外領域（アミノ酸５２−１７７）を持つＩＩ型の膜貫通タンパク質類型を示唆した。図１（配列番号：１）に示すように、２つの潜在的なＮ-結合グリコシル化部位が位置１２９（Ａｓｎ）及び位置１６１（Ａｓｎ）に同定された。クローンＤＮＡ１９３５５−１１５０は、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４６６が付与された。ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、寄託されたＡＴＣＣ２０９４６６ベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされる分子の発現によって得られ又は得られうる。ベクターのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素での消化は、１４１１塩基対の断片及び６６８塩基対の断片を生じた。
【０１３０】
細胞外配列の（ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを用いた）ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメント分析に基づいて、ＤＮＡ１９３５５は、ＴＮＦサイトカインファミリの幾つかのメンバー、特にヒトＡＰｏ-２Ｌ（１９．８％）、Ｆａｓ／Ａｐｏ１-リガンド（１９．０％）、ＴＮＦ-アルファ（２０．６％）及びリンホトキシン-アルファ（１７．５％）に対してアミノ酸配列同一性を示した（図２参照）。殆どのアミノ酸配列同一性は、ＴＮＦ-アルファの結晶構造におけるベータ-鎖に対応する領域で見られた［Banner等, Cell, 73: 431-435 (1993); Eck等, J. Biol. Chem., 264: 17595-605 (1989); Lewit-Bentley等, J. Mol. Biol., 199: 389-92 (1988)］。鎖Ｃの配列は、特にこのファミリーの全てのメンバーに保存されている（図２参照）。推定膜貫通ドメインとＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの第１のベータ-鎖との間の配列は、ＴＮＦ-アルファ、ＣＤ９５Ｌ又はＡｐｏ-２リガンドにおける約３０から約８０までの残基に比較して短く、５残基を含む。
【０１３１】
実施例２
ノーザンブロット分析
ヒト組織及び腫瘍株化細胞におけるＤＮＡ１９３５５ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって試験した（図３参照）。ヒトＲＮＡブロットを、全長ＤＮＡ１９３５５ｃＤＮＡをコードするｐＲＫ５をＸｂａＩ-Ｉで消化することにより生成した３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリッド形成したが；このプローブは、全コード配列プラス幾つかのフランキング５’及び３’配列に相当する。
【０１３２】
ヒト胎児、成人、又は癌株化細胞ｍＲＮＡブロット(クローンテック)を、ＤＮＡプローブと共にハイブリッド形成用バッファー(５Ｘ ＳＳＰＥ；２Ｘ デンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ)中で、４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを２Ｘ ＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳ中、室温で１時間、数回洗浄し、次いで０．１Ｘ ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳ中、５０℃で３０分間洗浄した。ブロットを終夜暴露した後、リン光体イメージャー分析(Fuji)により展開した。
【０１３３】
図３に示すように、約３．２ｋＢの優勢なｍＲＮＡ転写物を、胎児腎臓及び肺、及び成人小腸に検出した。また、発現は試験した８つのヒト腫瘍株化細胞中の６つでも検出され、それらは、ほぼ同じの３．２ｋＢ転写物を示し、並びに約１．５及び５ｋＢ転写物のより弱い発現も検出された。
【０１３４】
結果は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドのｍＲＮＡ発現が、正常組織では比較的抑制されるが、リンパ系並びに非リンパ系由来からの腫瘍株化細胞では顕著に増大することを示している。
【０１３５】
実施例３
大腸菌におけるＤＮＡ１９３５５の発現
ＤＮＡ１９５３３ポリペプチドの細胞外領域（図１のアミノ酸５２〜１７７；配列番号：１）をコードするＤＮＡ配列配列（図１；配列番号：２）を、各々：正：５’-GAC GAC AAG CAT ATG TTA GAG ACT GCT AAG GAG CCC TG-３’（配列番号：３）；逆：５’-TAG CAG CCG GAT CCT AGG AGA TGA ATT GGG GATT-３’（配列番号：４）のフランキングＮｄｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーで増幅した。ＰＣＲは消化し、Met Gly His１０配列に続く１２アミノ酸エンテロキナーゼ切断部位（プラスミドから誘導）：Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met（配列番号：５）の下流かつ枠内の、プラスミドｐＥＴ１９Ｂ（Novagen）のＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位にクローン化した。
【０１３６】
得られたプラスミドは、大腸菌株ＪＭ１０９（ATCC 53323）のSambrook等, 上掲に記載された方法を用いた形質転換に使用した。形質転換体はＰＣＲによって同定した。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認された。
【０１３７】
選択されたクローンは、抗生物質を添加した液体培養培地ＬＢで終夜成長させた。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられた。細胞は所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
【０１３８】
細胞をさらに数時間の培養した後、細胞を採集して遠心分離した。遠心分離で得られた細胞ペレットは、マイクロフリューダイザを用いて０．１ＭのＴｒｉｓ、０．２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファー、ｐＨ８．０中に可溶化した。可溶化ＤＮＡ１９３５５タンパク質は、ニッケル−セファロース親和性クロマトグラフィを用いて精製した。
【０１３９】
ＤＮＡ１９３５５タンパク質は、ＤＳＤ−ＰＡＧＥ、次いでニッケル抱合セイヨウワサビペルオキシダーゼでのウェスタンブロット、次いでＥＣＬ検出（Boehringer Mannheim）により分析した。３つの優勢なタンパク質バンドが検出され、それらはタンパク質の単量体、同種二量体、及び同種三量体型のサイズに相当した（図４）。この結果に基づいて、可溶性ＤＮＡ１９３５５タンパク質は、その未変性型において、ＤＳＤ変性無しに同種三量体を形成できると考えられる。
【０１４０】
実施例４
ＤＮＡ１９３５５のアポトーシス活性
全長ＤＮＡ１９３５５タンパク質をコードするｐＲＫ５プラスミド、又は空のｐＲＫ５プラスミド、又は全長ヒトＡｐｏ-２リガンド（Ａｐｏ-２Ｌ）をコードするｐＲＫ５を、リン酸カルシウム沈殿によりヒト２９３細胞（１０６細胞／１０ｃｍ皿）に一過性形質移入した。幾つかの場合、ポックスウィルス由来のキャスパーゼ(caspase)阻害剤ＣｒｍＡ、又はＦａｓ／Ａｐｏ１及びＴＮＦＲ１による死亡シグナル伝達を媒介する死亡アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（ＦＡＤＤ-ＤＮ）のドミナントネガティブな変異型とともに同時形質移入された。１６時間後、細胞をヘキスト３３３４２染料（１０μｇ／ｍｌ）で染色し、ホフマン光学系を備えたライカ蛍光顕微鏡下でアポトーシス性又は正常な核を数えた。幾つかの場合、キャスパーゼ阻害剤ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ（Research Biochemicals）（２００μＭ）を形質移入の直後に皿に添加した。
【０１４１】
図５に示すように、ＤＮＡ１９３５５による形質移入は、良好に確立されたアポトーシス誘発剤であるＡｐｏ-２Ｌで観察される増加と同様に、ｐＲＫ５に比較してアポトーシスレベルをかなり増加させている。ＤＮＡ１９３５５によるアポトーシス誘発における増加はＣｒｍＡ又はｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋによって阻止され、この効果にキャスパーゼが含まれることを示している。さらに、Ａｐｏ-２ＬではなくＤＮＡ１９３５５に誘発されるアポトーシスの増加はＦＡＤＤ-ＤＮによって阻止され、ＦＡＤＤアダプタータンパク質が、死亡シグナルをＤＮＡ１９３５５からキャスパーゼ機構に伝達するのに必須の役割を果たすことを示している。
【０１４２】
実施例５
ＤＮＡ１９３５５によるＮＦ-κＢの活性化
全長ＤＮＡ１９３５５タンパク質をコードするｐＲＫ５プラスミド、又は空のｐＲＫ５プラスミド、又は全長ヒトＡｐｏ-２ＬをコードするｐＲＫ５を、リン酸カルシウム沈殿によってヒト２９３細胞（１０６細胞／１０ｃｍ皿）に形質移入した。細胞を、空のｐＲＫ５プラスミド、又はＴＮＦによるＮＦ-κＢ活性化を媒介する［Malinin等, Nature, 385: 540-544 (1997)］セリン／スレオニンキナーゼＮＩＫ（ＮＩＫ-ＤＮ）のドミナントネガティブ、キナーゼ欠失変異型をコードするｐＲＫ５プラスミドとともに同時形質移入した。１６時間後、細胞を収集し、核抽出物を調製し、１μｇの核タンパク質を３２Ｐ-標識ＮＦ-κＢ-特異的合成オリゴヌクレオチドプローブATCAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCG（配列番号：６）と反応させた［また、MacKay等, J. Immunol., 153: 5274-5284 (1994)も参照のこと］。
【０１４３】
図６に示すように、ＤＮＡ１９３５５による形質移入は、電気泳動移動度シフトアッセイ［Marsters等, PNAS, 92: 5401-5405 (1995)］で測定したところ、有意なＮＦ-κＢ活性化を誘発し；活性化のレベルはＡｐｏ-２Ｌで得られたレベルより大きかった。ＮＩＫ-ＤＮとの同時形質移入は、ＤＮＡ１９３５５によるＮＦ-κＢ活性化を減少させたが、Ａｐｏ-２Ｌによる活性化はさせなかった。この結果は、ＴＮＦ-アルファと同様に、ＤＮＡ１９３５５はＮＩＫタンパク質を含むシグナル化経路を通してＮＦ-κＢを活性化することを示唆している。
【０１４４】
実施例６
哺乳動物細胞におけるＤＮＡ１９３５５の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、ＤＮＡ１９３５５の型の調製を例示する。
発現ベクターとして、ベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＤＮＡ１９３５５ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いてＤＮＡ１９３５５ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターをｐＲＫ５−ＤＮＡ１９３５５と呼ぶ。
【０１４５】
一実施態様では、選択される宿主細胞を２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化させた。約１０μｇのｐＲＫ５−ＤＮＡ１９３５５ＤＮＡを約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴状で添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、ＰＢＳ中２０％グリセロールの２ｍｌを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１４６】
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍのｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに負荷した。処理したゲルを乾燥させ、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの存在を現すのに選択された時間に渡ってフィルムに暴露しうる。形質移入した細胞を含む培地は、さらなるインキュベーション（無血清培地）を施し、培地を選択したバイオアッセイで試験してもよい。
【０１４７】
それに換わる技術において、ＤＮＡ１９３５５は、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入されうる。２９３細胞をスピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＤＮＡ１９３５５ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮してＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。発現されたＤＮＡ１９３５５を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製できる。
【０１４８】
他の実施態様では、ＤＮＡ１９３５５はＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＤＮＡ１９３５５は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの周知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入できる。上記のように、細胞培地をインキュベートし、その培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニンなどの放射性標識を含む培地で置換することができる。ＤＮＡ１９３５５の存在を測定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＤＮＡ１９３５５を含む培地を濃縮し、任意の選択した方法で精製することができる。
【０１４９】
また、エピトープタグＤＮＡ１９３５５を宿主ＣＨＯ細胞で発現させることもできる。ＤＮＡ１９３５５はｐＲＫ５ベクターからサブクローン化される。サブクローン挿入物にＰＣＲを施して、ポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合させてバキュロウイルス発現ベクターとすることができる。ポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ１９３５５挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲなどの選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローン化できる。最後に、ＳＶ４０誘導ベクターでＣＨＯ細胞を（上記のように）形質移入できる。標識化を上記のように実施して発現を検証してもよい。次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ１９３５５を含む培養培地を濃縮し、Ｎｉ２＋-キレート親和性クロマトグラフィといった任意の選択した方法で精製することができる。
【０１５０】
実施例７
酵母菌でのＤＮＡ１９３５５の発現
以下の方法は、酵母菌におけるＤＮＡ１９３５５の組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＤＮＡ１９３５５の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを形成する。ＤＮＡ１９３５５、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターをコードするＤＮＡを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＤＮＡ１９３５５の細胞内発現を制御する。分泌のために、ＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＤＮＡ１９３５５の発現のためのリンカー配列とともに、選択したプラスミドにクローン化することができる。
【０１５１】
酵母菌株ＡＢ１１０などの酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、次いでクマシーブルー染色でのゲル染色により分析することができる。
【０１５２】
次いで、組換えＤＮＡ１９３５５は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＤＮＡ１９３５５を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１５３】
実施例８
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＤＮＡ１９３５５の発現
以下の方法は、昆虫細胞におけるＤＮＡ１９３５５の組換え発現を記載する。
ＤＮＡ１９３５５は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＤＮＡ１９３５５又はＤＮＡ１９３５５の所定部分（細胞外ドメインをコードする配列等）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、フランキングの（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、これらの選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローン化される。
【０１５４】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより生成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているようにして実施した。
【０１５５】
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ１９３５５は、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362: 175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、非特異的に結合したタンパク質を溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に抱合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＤＮＡ１９３５５を含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。
【０１５６】
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＤＮＡ１９３５５の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィを含む周知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１５７】
実施例９
ＤＮＡ１９３５５に結合する抗体の調製
この実施例は、ＤＮＡ１９３５５に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は当該分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられる免疫原は、精製ＤＮＡ１９３５５、ＤＮＡ１９３５５を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＤＮＡ１９３５５を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０１５８】
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化し、皮下又は腹膜内に１−１００マイクログラムで注入したＤＮＡ１９３５５免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射でまた追加免疫してもよい。ＤＮＡ１９３５５抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血によって血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１５９】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ＤＮＡ１９３５５の最後の静脈内注射の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ １５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択したマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、それをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
【０１６０】
ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡ１９３５５に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＤＮＡ１９３５５に対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は当該分野の技量の範囲内である。
【０１６１】
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹膜内注入し、抗ＤＮＡ１９３５５モノクローナル抗体を含む腹水を生成できる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１６２】
実施例１０
ＤＮＡ１９３５５のハイブリッド形成プローブとしての使用
以下の方法は、ハイブリッド形成プローブとしてのＤＮＡ１９３５５をコードする核酸配列の使用を記載する。
ＤＮＡ１９３５５のコード配列を含むＤＮＡ（図１、配列番号：２に示したような）は、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおいて（ＤＮＡ１９３５５の天然発生変異体をコードするもののような）相同ＤＮＡのスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
【０１６３】
何れかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド化及び洗浄は、以下の高い厳密性条件下で実施する。放射性標識したＤＮＡ１９３５５由来のプローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％のホルムアルデヒド、５ｘ ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘ デンハード液、及び１０％のデキストラン硫酸の溶液中、４２℃で２０時間実施される。フィルターの洗浄は、０．１ｘ ＳＳｃ及び０．１％ ＳＤＳの水溶液中、４２℃で実施される。
【０１６４】
次いで、全長天然配列ＤＮＡ１９３５５をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を持つＤＮＡは、この分野で知られた標準的な技術を用いて同定できる。
【０１６５】
実施例１１
染色体マッピング
ヒトＤＮＡ１９３５５遺伝子の染色体局在化を、放射性ハイブリッド（ＲＨ）パネル分析によって試験した。ＲＨマッピングを、マウス−ヒト細胞の放射線ハイブリッドパネル(Research Genetics)及びＤＮＡ１９３５５ ｃＤＮＡのコード領域に基づくプライマーを使用するＰＣＲにより実施した［Gelb等, Hum. Genet., 98: 141 (1996)］。スタンフォードヒトゲノムセンターデータベースを使用したＰＣＲデータの解析は、ＤＮＡ１９３５５がＳＴＳマーカーＤ１Ｓ２７９０及びゲネトンマーカーＡＦＭｂ３５２ｘｅ９に結合し、ヒト染色体１ｑ２３にマッピングされることを示した。特記すべきは、ＣＤ９５Ｌも染色体１ｑ２３にマッピングされるが［Takahashi等, Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994)］、ＯＸ４０リガンドは染色体１ｑ２５にマッピングされることである［Baum等, EMBO J., 13: 3992-4001 (1994)］。従って、これらのＴＮＦファミリーは共通の祖先遺伝子の複製及び分岐によって生じ得る。
【０１６６】
実施例１２
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドのヒトＧＩＴＲレセプターに対する結合特異性
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドが「ＧＩＴＲ」と呼ばれるレセプター分子のヒト相同体と相互作用及び特異的結合をするか否化を決定するためにアッセイを行った。マウスＧＩＴＲ（ｍＧＩＴＲ）ポリペプチドは、Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 6216-6221 (1997)に記載されている。何がｍＧＩＴＲのヒト相同体と考えられるかが記載されている。全長ヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）のアミノ酸配列は、PCTの1998年2月19日に発行されたWO98/06842中の配列番号：４に示されている。ｈＧＩＴＲとｍＧＩＴＲのアミノ酸配列の比較は図７に示す。
【０１６７】
結合性を試験するために、ｈＧＩＴＲ細胞外ドメイン（図７のアミン酸１−１６７参照）を含む可溶性免疫グロブリン融合タンパク質（イムノグロブリン）を昆虫細胞で発現させた。ｈＧＩＴＲのＥＣＤを、（上記実施例８に記載したように）バキュロウイルスを用いて昆虫細胞においてＣ-末端ＩｇＧ-Ｆｃタグ型として発現させた。
【０１６８】
また、可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを、ＥＣＤを（上記実施例３に記載したように）大腸菌細胞で発現させることにより調製した。可溶性ＤＮＡ１９３５５のＥＣＤ分子は、次いで、１２５Ｉで標識した。比較のため、イムノアドヘシン形成物も以下のＴＮＦレセプターファミリーのメンバー：ＣＤ９５、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、及びＡｐｏ-３で作成した。ＣＤ９５、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、及びＡｐｏ-３イムノアドヘシンは、ＴＮＦＲ１について既に記載されているように［Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)］、各レセプターのＥＣＤをヒトＩｇＧのヒンジ及びＦｃ部分に融合することにより調製した。各ＴＮＦレセプターファミリーメンバーは、発明の背景の部分に記載した（そして関連する参考文献を挙げた）。
【０１６９】
共沈殿アッセイのために、各イムノアドヘシン（５マイクログラム）を１２５Ｉ標識した可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド（１マイクログラム）とともに２４℃で１時間インキュベートし、次いで氷上で３０分間プロテインＡ−セファロースを施した。反応混合物をスピン沈殿させ、ＰＢＳで数回洗浄し、２０ｍＭのジチオトレイトールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフで解析した。
【０１７０】
結果を図８に示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置を図に示した。ｈＧＩＴＲ−ＩｇＧは、放射性ヨウ素化した可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに結合した。しかしながら、ｈＧＩＴＲ-ＩｇＧはＣＤ９５、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、又はＡｐｏ-３のイムノアドヘシン形成物には結合しなかった。
【０１７１】
他のアッセイにおいて、ヒト２９３細胞をＤＮＡ１９３５５で一過性形質移入し、ｈＧＩＴＲ、ＴＮＦＲ１、ＨＶＥＭ、及びＤｃＲ１についてのレセプターイムノアドヘシン形成物のこれらの形質移入した細胞に結合する能力をＦＡＣＳ分析で測定した。２９３細胞を、１０％のウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）、２ｍＭのグルタミン、１００マイクログラム／ｍｌのペニシリン、及び１００マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ培地中に維持した。形質移入した細胞（１ｘ１０５）は、各レセプター又はリガンドイムノアドヘシン１マイクログラムを含む２００マイクロリットルの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中、４℃で６０分間インキュベートした。次いで、細胞を２％のＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、Ｒ-フィコエリトリン-抱合ヤギ抗-ヒト抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）で染色した。次に、細胞をＦＡＣＳで分析した。各イムノアドヘシンの一過性形質移入された細胞への結合を試験するために、ＣＤ４に対する発現ベクター（ｐＲＫ５−ＣＤ４；Smith等, Science, 328: 1704-1707 (1987)）をＤＮＡ１９３５５発現ベクターと同時形質移入した（実施例３参照）。次いで、ＦＩＴＣ抱合抗-ＣＤ４（Pharmingen, San Diego, CA）を、ＦＡＣＳ分析において形質移入された細胞集団を同定しゲートするのに用いた。
【０１７２】
図９Ａに示すように、ｈＧＩＴＲ−ＩｇＧは、全長ＤＮＡ１９３５５をコードする発現プラスミドで形質移入した細胞表面に特異的に結合した。そのような結合は、ＴＮＦＲ１、ＨＶＥＭ又はＤｃＲ１については観察されなかった。ｈＧＩＴＲ−ＩｇＧは、対照プラスミドで形質移入した細胞には結合しなかった（データは示さず）。
【０１７３】
結果は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドのｈＧＩＴＲとの特異的結合性相互作用、及びＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは試験した他のいかなるＴＮＦレセプターファミリーメンバーとは相互作用しないことを示した。
【０１７４】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ライブラリにおいて同定され、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド転写物は、ＨＵＶＥＣにおいてＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出可能である（データは示さず）。ＦＡＣＳ分析アッセイは、ｈＧＩＴＲ−ＩｇＧの特異的結合がＨＵＶＥＣでＦＡＣＳ分析により示されるか否かを試験するために行った。ＨＵＶＥＣ細胞は、Cell System（Kirkland, WA）から購入し、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、及び１０ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦを含む、ハムのＦ１２及び低グルコースＤＭＥＭ培地の５０：５０混合物中で成長させた。細胞は、ＰＢＳ、一次抗体としてのｈＧＩＴＲ-ＩｇＧ、ＴＮＦＲ１-ＩｇＧ又はＦａｓ-ＩｇＧ、及びフィコエリトリンに抱合したヤギ抗-ヒトＦ(ａｂ’)２（CalTag, Burlingame, CA）とともにＦＡＣＳ貯蔵した。
【０１７５】
ｈＧＩＴＲ−ＩｇＧはＨＵＶＥＣに特異的に結合することが見出された。（図９Ｂ参照）。Ｆａｓ−ＩｇＧもＴＮＦＲ１−ＩｇＧもＨＵＶＥＣ細胞に特異的に結合しないことが示された。
【０１７６】
実施例１３
ＤＮＡ１９３５５によるＮＦ-κＢの活性化
ＤＮＡ１９３５５／ｈＧＩＴＲがＮＦ-κＢ活性化を誘発するか否かを、Ｅ-セレクチン遺伝子からのＮＦ-κＢ反応性エレメントを含むプロモーターによって誘導されたレポーター遺伝子の発現を分析することにより決定するためにアッセイを行った。
【０１７７】
ヒト２９３細胞（２ｘ１０５）を、０．５マイクログラムのホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３．ＥＬＡＭ．ｔｋ［Yang等, Nature, 395: 284-288 (1998)］及び０．０５マイクログラムのレニラルシフェラーゼレポータープラスミド（内部形質移入対照用として）（Pharmacia）、並びに表示したＤＮＡ１９３５５及びｈＧＩＴＲの付加的発現ベクター（上記）（０．１マイクログラムのｈＧＩＴＲ；０．５マイクログラムの他の発現ベクター）、及び形質移入間の定常ＤＮＡを維持するための担体プラスミドｐＲＫ５Ｄとともに、リン酸カルシウム形質移入によって一過性形質移入をした。２４時間後、細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を製造者（Pharmacia）に推奨されたように検定した。活性はホタルルシフェラーゼ活性をレニラルシフェラーゼ活性で除することにより形質移入効率における相違を規格化し、添加した発現ベクター無しで見られたものに対する活性として表現した。
【０１７８】
図１０に見られるように、ｈＧＩＴＲの過剰発現は有意な遺伝子活性化をもたらし、得られた結果は、ＤＮＡ１９３５５とｈＧＩＴＲの両方の同時発現によって向上した。
【０１７９】
実施例１４
ＴＮＦ−アルファ生成の刺激
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドによる刺激に応じた、単離した一次Ｔ細胞及びマクロファージからのＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−１ベータの生成を試験するためにアッセイを行った。
【０１８０】
一次Ｔ細胞又は単球／マクロファージはヒト供与者から単離した。一次ヒトＴ細胞は、Ｔ細胞富化カラム（R & D Systems）により全血から単離した。単球／マクロファージは、組織培養フラスコへの接着により全血から単離した。次いで、単離した各細胞は、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中の５マイクログラム／ｍｌのＤＮＡ１９３５５イムノアドヘシン（上記実施例３参照）で２４時間処理した。次に培地上清中のＴＮＦ−アルファレベルをＥＬＩＳＡ（R & D Systems；製造者の指示に従って）で測定した。
【０１８１】
結果を図１１に例示した。ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、Ｔ細胞から分泌されたＴＮＦ−アルファレベルにおいて約２０倍の増加を誘発したが、マクロファージからのＴＮＦ−アルファ又はＩＬ−１ベータの放出には影響しなかった（データは示さず）。ヒトＴ細胞からの誘発されたＴＮＦ−アルファ生成は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド／ｈＧＩＴＲが炎症誘発性反応に寄与することを示唆している。
【０１８２】
実施例１５
モルモット皮膚生検アッセイ
炎症誘発性反応における候補分子の活性を決定するためにインビボアッセイを行った。詳細には、候補分子（ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド等）をモルモットに注射し、処理した動物からの皮膚生検を、多形核／単核細胞浸潤又は好酸球浸潤について分析した。
【０１８３】
モルモットを筋肉内のケタミン（７５−８０ｍｇ／ｋｇプラス５ｍｇ／ｋｇキシラジン）で麻酔した。次いで候補分子を動物の背中１６部位の皮膚に注射した（各部位１００マイクロリットルの皮内）。約１ｍｌのエバンスブルー染料／ＰＢＳを心臓内（intracordially）に注射した。
【０１８４】
１時間及び６時間に注射部位の斑点を測定（ｍｍ径）した。皮膚注射の６時間後にモルモットを屠殺した。注射部位の皮膚試料を切除し、パラホルムアルデヒドに固定した。次いで、組織を標準的な染色技術を用いて組織学的評価用に調製した。組織の分析は炎症性浸潤における細胞型の特徴付け及び血管周囲の浸潤の評価を含む。
【０１８５】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）, 10801 ユニバーシティ通り、マナッサス、バージニア州 アメリカ合衆国に寄託した：
材料              ATCC寄託番号         寄託日
DNA19355-1150     209466            1997年11月18日
【０１８６】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
【０１８７】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０１８８】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【０１８９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１Ａ】ヒトＤＮＡ１９３５５に対するｃＤＮＡの核酸配列（配列番号：２）及びその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１）を示す図である。
【図１Ｂ】ヒトＤＮＡ１９３５５に対するｃＤＮＡの核酸配列（配列番号：２）及びその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１）を示す図である。
【図１Ｃ】ヒトＤＮＡ１９３５５に対するｃＤＮＡの核酸配列（配列番号：２）及びその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１）を示す図である。
【図２】ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外アミノ酸配列の、ヒトＡｐｏ-２Ｌ、Ｆａｓ／Ａｐｏ１リガンド（ＣＤ９５Ｌ）、ＴＮＦ-アルファ及びＬＴ-アルファとのアラインメント及び比較を示す図である。各々のアミノ酸同一性（％）は、約１９．８、１９．０、２０．６、及び１７．５である。
【図３】ヒト組織（同定された成人及び胎児組織）及び腫瘍株化細胞（ＨＬ６０前骨髄球性白血病、ＨｅＬａ Ｓ３頸部癌、Ｋ５６２慢性骨髄性白血病、ＭＯＬＴ４リンパ芽球性白血病、ラージバーッキットのリンパ腫、ＳＷ４８０結腸直腸腺癌、Ａ５４９肺癌、及びＧ３６１黒色腫）でのＤＮＡ１９３５５ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す図である。
【図４】可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す図である。
【図５Ａ】ｐＲＫ５（ａ）；ＤＮＡ１９３５５をコードするｐＲＫ５（ｂ）；Ａｐｏ-２リガンドをコードするｐＲＫ５（ｃ）；ＤＮＡ１９３５５ｐＲＫ５プラスＣｒｍＡをコードするｐＲＫ５（ｄ）；及びＤＮＡ１９３５５をコードするｐＲＫ５プラスＦＡＤＤ-ＤＮをコードするｐＲＫ５（ｅ）；Ａｐｏ-２リガンドをコードするｐＲＫ５プラスＦＡＤＤ-ＤＮをコードするｐＲＫ５（ｆ）で形質移入した細胞からのヘキスト染色した核の蛍光画像を示す図である。
【図５Ｂ】形質移入されたＤＮＡ１９３５５又はＡｐｏ-リガンドによるアポトーシスの誘発及びキャスパーゼ(caspase)阻害剤及びＦＡＤＤ-ＤＮの効果を示すグラフである。
【図６】ＮＦ-κＢ活性に対するＤＮＡ１９３５５の影響を示す図である。ｐＲＫ５、又はＤＮＡ１９３５５をコードするｐＲＫ５、又はＡｐｏ-２リガンドをコードするｐＲＫ５で形質移入した細胞における電気泳動移動度シフト分析。各場合において、細胞はｐＲＫ５（左の３レーン）又は顕性不活性ＮＩＫをコードするｐＲＫ５（ＮＩＫ-ＤＮ、右の３レーン）で同時形質移入した。
【図７】ヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）及びマウスＧＩＴＲ（ｍＧＩＴＲ）についてのアミノ酸配列のアラインメント及び比較を示す図である。３つのシステインに富むドメイン（ＣＲＤ１、ＣＲＤ２及びＣＲＤ３）及び膜貫通領域（ＴＭ）を示す。
【図８】上記の実施例１２に記載する共沈殿アッセイの結果を示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフは、放射性ヨウ素化されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに結合したｈＧＩＴＲ-ＩｇＧ分子を明らかにした。同定された他のイムノアドヘシン作成物では結合が観察されなかった。
【図９Ａ】同定されたレセプター又はリガンドイムノアドヘシン作成物への結合について検定された、形質移入２９３細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】同定されたレセプターイムノアドヘシン作成物への結合について検定された、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１０】ＤＮＡ１９３５５／ｈＧＩＴＲによるＮＦ-κＢ活性化を示すために行ったルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドとともにインキュベートされた一次Ｔ細胞及び単球／マクロファージからの培養上清におけるＴＮＦ-アルファレベルを決定するために行ったＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月16日(2009.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなり、ＸがＦｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基４８〜５７の任意のものである、単離された核酸。
【請求項２】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４】
ベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が酵母細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの製造方法において、請求項５に記載の宿主細胞を、ＤＮＡ１９３５５の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤＮＡ１９３５５を回収することを含んでなる方法。
【請求項１０】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含んでなる、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含む天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含む天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、哺乳動物細胞においてＮＦ−κＢを活性化する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基５２〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外ドメイン配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する単離された可溶性ポリペプチドであって、ヒトＧＩＴＲ受容体と結合するか、あるいは、哺乳動物Ｔ細胞を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることのできる可溶性ポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１ないし１３の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７であって、ＸがＦｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基残基４８〜５７の任意のものであるアミノ酸残基；又は （ｂ）（ａ）の断片を含んでなり、前記断片が生物学的に活性な、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ２０９４６６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされた、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１７】
異種アミノ酸配列に融合したＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１８】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
前記異種アミノ酸配列がロイシンジッパーである、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
非タンパク質様ポリマーに融合したＤＮＡ１９３５５ペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項２２】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを誘発する方法において、Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含む天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの有効量に哺乳動物癌細胞を暴露することを含んでなる方法。
【請求項２５】
哺乳動物細胞における炎症誘発性反応を刺激する方法において、Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基５２〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外ドメイン配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する単離された可溶性ポリペプチドであって、ヒトＧＩＴＲ受容体と結合するか、あるいは、哺乳動物Ｔ細胞を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることのできる可溶性ポリペプチド、の有効量に哺乳動物細胞を暴露することを含んでなる方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物細胞がＴ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７からなる天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸であって、コードされたポリペプチドが哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する核酸。
【請求項２８】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７からなる天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸であって、コードされたポリペプチドが哺乳動物細胞においてＮＦ−κＢを活性化する核酸。
【請求項２９】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基５２〜１７７からなるＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外ドメイン配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸であって、コードされた可溶性ポリペプチドがヒトＧＩＴＲ受容体と結合するか、あるいは、哺乳動物Ｔ細胞を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることのできる核酸。
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月22日(2009.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなり、ＸがＦｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基４８〜５７の任意のものである、単離された核酸。
【請求項２】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４】
ベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が酵母細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの製造方法において、請求項５に記載の宿主細胞を、ＤＮＡ１９３５５の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤＮＡ１９３５５を回収することを含んでなる方法。
【請求項１０】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含んでなる、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含む天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７を含む天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、哺乳動物細胞においてＮＦ−κＢを活性化する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基５２〜１７７を含むＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外ドメイン配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する単離された可溶性ポリペプチドであって、ヒトＧＩＴＲ受容体と結合するか、あるいは、哺乳動物Ｔ細胞を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることのできる可溶性ポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１ないし１３の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基Ｘ〜１７７であって、ＸがＦｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基残基４８〜５７の任意のものであるアミノ酸残基；又は （ｂ）（ａ）の断片を含んでなり、前記断片が生物学的に活性な、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ２０９４６６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされた、単離されたＤＮＡ１９３５５ポリペプチド。
【請求項１７】
異種アミノ酸配列に融合したＤＮＡ１９３５５ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１８】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
前記異種アミノ酸配列がロイシンジッパーである、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
非タンパク質様ポリマーに融合したＤＮＡ１９３５５ペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項２２】
ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７からなる天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸であって、コードされたポリペプチドが哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する核酸。
【請求項２５】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１７７からなる天然配列ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸であって、コードされたポリペプチドが哺乳動物細胞においてＮＦ−κＢを活性化する核酸。
【請求項２６】
Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸残基５２〜１７７からなるＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外ドメイン配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸であって、コードされた可溶性ポリペプチドがヒトＧＩＴＲ受容体と結合するか、あるいは、哺乳動物Ｔ細胞を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることのできる核酸。
【外国語明細書】
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2010088448000003.pdf
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