(57)【要約】      （修正有）【課題】スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のための方法の提供。【解決手段】生物学的サンプルにおいて、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のために使用すべき１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子間のＩＴＳ領域から誘導される前記新規の核酸分子。サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の前記スペーサー領域の増幅のために使用すべき核酸プライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、その相補形態、またはそれに由来するＲＮＡ形態よりなる単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、その相補形態、またはそれに由来するＲＮＡ形態よりなる単離された核酸分子。
【請求項３】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいは前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメント、あるいはそれらのいずれかの相同物に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号１４、１６〜２２、２５〜３２、３５〜４２、５１、５２、５３、５５、５８、６５、６７、６８、６９および７０よりなる群から選択される核酸よりなる、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
２つのポリヌクレオチドプローブの組であって、前記２つのプローブは、配列番号１もしくは配列番号２または相同物、あるいはそれらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいはそれらの相補形態に特異的にハイブリダイズし、ここで、前記２つのプローブ間には２５以下のヌクレオチドが存在する、２つのポリヌクレオチドプローブの組。
【請求項６】
配列番号１５および２０、または配列番号１５および２１、または配列番号１７および１６、または配列番号１７および１９、または配列番号２６および１４、または配列番号２７および２８、配列番号２９および２２、または配列番号３２および３９、または配列番号３２および２３、または配列番号３０および１８、または配列番号３６および３８、または配列番号３７および３５、または配列番号４０および２５、または配列番号４１および３１、または配列番号４２および４３よりなる、請求項５に記載の２つのポリヌクレオチドプローブの組。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子ならびに／あるいは請求項５または請求項６に記載の２つのポリヌクレオチドプローブの組を含んでなる組成物。
【請求項８】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいは前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメント、あるいはそれらのいずれかの相同物よりなる核酸分子の使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子を使用して、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を検出または同定するための方法。
【請求項１０】
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）必要であれば、少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、または標的配列を含んでなるフラグメント、または標的配列もしくはそのフラグメントを増幅する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）または（ｉｉ）のポリ核酸と、標的配列（ここで、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の標的配列は、配列番号１もしくは２またはその相同物よりなる）、あるいはそれらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいはそれらの相補形態、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出する工程、ならびに
（ｖ）得られるシグナルを解釈し、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推論し、および／またはサンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる、サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
適切なプライマー対は、配列番号４５、４９、５０、５２、５６、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８およびそれらの相同物よりなる群から選択される順方向プライマーポリヌクレオチド、ならびに配列番号４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６２、およびそれらの相同物よりなる群から選択される逆方向プライマーポリヌクレオチドの任意の組み合わせよりなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
２つのポリヌクレオチドプローブが使用される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
２つのポリヌクレオチドプローブは、間に２５未満のヌクレオチドを伴って相互に隣接する標的配列にハイブリダイズする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
２つのポリヌクレオチドプローブは、配列番号１５および２０、または１５および２１、または１７および１６、または配列番号１７および１９、または２６および１４、または２７および２８、２９および２２、または３２および３９、または３２および２３、または３０および１８、または３６および３８、または３７および３５、または４０および２５、または４１および３１、または４２および４３のポリヌクレオチドよりなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の成分：
・請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子ならびに／あるいは請求項５または６に記載の２つのポリヌクレオチドプローブの組、
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＴＳ（転写領域内部のスペーサー）領域から誘導される新規の核酸配列を使用する、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のための方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のために使用すべき１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子間のＩＴＳ領域から誘導される前記新規の核酸配列に関する。
【０００３】
それはまた、サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の前記スペーサー領域の増幅のために使用すべき核酸プライマーにも関する。
【背景技術】
【０００４】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属は、現在、３２種の記載された種および１５種の亜種を含む。ヒトの臨床的見地から、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が最も重要な種であるが、いくつかのコアグラーゼ陰性種は、特に重症患者間の院内感染における突発出現病原体である。
【０００５】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の特定の種は、ヒトにおける様々な感染の病因として、より頻繁に単離される。最も重要な因子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ルグデュネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ワルネリ（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ）およびＳ．サプロフィティカス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）である。
【０００６】
Ｓ．シュレイフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）は、いくつかの欧州国において重要な病原体とみなされているが、米国ではごく稀にしか報告されておらず、病原体の地方疫学の多様性を実証している。
【０００７】
獣医学では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．インターメディウス（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）およびＳ．ヒカス（Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ）は、最も顕著な病原体である。
【０００８】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は最も一般的な院内病原体の１つである。それは、表皮膿瘍から生命を脅かす血管内感染までの範囲のいくつかの疾患の原因である。入院患者環の長期の保菌および抗生物質に対する耐性の増加を確立するその経口は、病院内におけるこの生物体の制御を極めて困難にする。
【０００９】
患者間のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）コロニー化の疫学に関する知識により、院内感染を妨害することが潜在的に困難であることが、新たに解明されている。病院ならびに共同体内におけるＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の有効な制御には、補筋患者の早期診断を含む、言い換えれば、スクリーニングの工程を含むより積極的な手段が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）菌血症の頻度はなお増加しているため、より感受性かつより特異的なプローブおよび／またはプライマーを使用する、検出ならびに／あるいは同定のためのより迅速な方法を提供することが、必要かつ急務である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のために使用することができるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種のＩＴＳの特定の領域から誘導される新規の核酸配列を提供することである。
【００１２】
従って、本発明は、配列番号１、前記配列番号１のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１の相補形態、または任意の相同物よりなる単離された核酸分子、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための標的としての前記核酸分子の使用を提供する。
【００１３】
本発明の態様は、標的として、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域の特定の領域を有し、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定を可能にするプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
従って、本発明は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための配列番号１、または前記配列番号１のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいは前記配列番号１の相補形態、あるいはその任意の相同配列、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントに特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、サンプルにおけるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のためのプローブの組に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域の特異的増幅を可能にするプライマーに関する。
【００１７】
本発明の目的は、本発明のいずれかの新規の配列、または本発明のプローブおよび／もしくはプライマーのいずれかの新規の組、あるいはそれらの組み合わせを含有する組成物である。
【００１８】
本発明の別の目的は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のために、前記プローブおよび／またはプライマーが使用されるキットである。
【００１９】
本発明の別の目的は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための迅速かつ信頼できるハイブリダイゼーション方法である。
【００２０】
本発明の別の目的は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のためのリアルタイムＰＣＲに基づくハイブリダイゼーション方法である。
【００２１】
表の説明
表１：配列表。
表２：プライマー対。
表３：プローブの組。
表４：スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下の説明は、以下に記載の本発明の異なる実施形態において使用される用語および表現を例示するのに役立つ。
【００２３】
用語「スペーサー」および「ＩＴＳ」（転写領域内部のスペーサー）は、両方とも、１６Ｓと２３Ｓ  ｒＲＮＡとの間または１６Ｓと２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子との間の領域を指す省略形の用語である。
【００２４】
用語「プローブ」は、検出しようとする標的配列にハイブリダイズするにの十分相補的である配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【００２５】
好ましくは、本発明のプローブは、検出しようとする標的配列の正確な相補体に７０％、８０％、９０％、または９５％を超えて相同である。これらの標的配列は、ゲノムＤＮＡもしくは前駆体ＲＮＡ、またはそれらの増幅されたバージョンのいずれかである。
【００２６】
本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入物を含有する組換えプラスミドのクローニングによって、必要であれば、適切なヌクレアーゼを使用して、クローニングされたプラスミドから該配列を切り出し、例えば、分子量に従う分画によってそれらを回収することにより、形成することができる。
【００２７】
本発明に従うプローブはまた、化学的、例えば、従来のホスホ−トリエステル法によって合成することもできる。
【００２８】
本明細書で使用する用語「相補的」核酸は、核酸配列が、相互に完全な塩基対形成された二重螺旋を形成し得ることを意味する。
【００２９】
用語「ポリ核酸」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０もしくは５０連続ヌクレオチドを含有する２本鎖もしくは１本鎖のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかに対応する。１００ヌクレオチド長より短いポリ核酸は、「オリゴヌクレオチド」と称される。
【００３０】
それらはまた、イノシンなどの修飾されたヌクレオチドまたはそれらのハイブリダイゼーション特徴を本質的に変更しない修飾された基を含有するヌクレオチドを指す。
【００３１】
１本鎖のポリ核酸配列は、本発明においては、常に５’末端〜３’末端で提示する。
【００３２】
それらはそのままの形、またはそれらの相補形態、またはＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）で使用することができる。
【００３３】
用語「最も緊密な近傍」は、ＤＮＡ相同性について最も緊密に関連することが公知であるかまたは予想され、目的の生物体と区別されるべきであるタクソンを意味する。
【００３４】
表現「タクソン特異的ハイブリダイゼーション」または「タクソン特異的プローブ」は、プローブが、それが設計されたタクソン由来のＤＮＡまたはＲＮＡにのみハイブリダイズし、他の分類群からのＤＮＡまたはＲＮＡにはハイブリダイズしないことを意味する。
【００３５】
タクソンという用語は、完全な属または属内のサブグループ、種または種内のサブタイプ（亜種、血清型、配列型（ｓｅｑｕｅｖａｒ）、生物型．．．）を指すことができる。
【００３６】
用語「特異的増幅」または「特異的プライマー」は、前記プライマーが、それらが設計されたこれらの生物体由来のスペーサー領域のみを増幅し、他の生物体由来のスペーサー領域は増幅しないという事実を指す。
【００３７】
用語「感受性」は、偽陰性の数を指し、即ち、検出すべき１００株のうち１株が見過ごされる場合、試験は（１００−１／１００）％＝９９％の感受性である。
【００３８】
用語「特異性」は、偽陽性の数を指し、即ち、検出された１００株に対し、２株は、試験が設計されていない生物体に属するように思われる場合、試験の特異性は（１００−２／１００）％＝９８％である。
【００３９】
「優先的」であるとして選択されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、８０％を超える、好ましくは９０％を超えるおよび最も好ましくは９５％を超える感受性ならびに特異性を示す。
【００４０】
用語「固相支持体」は、ポリヌクレオチドプローブを結合させることができる任意の基体を指すことができるが、但し、それは、そのハイブリダイゼーション特徴を保持し、かつ但し、ハイブリダイゼーションのバックグランドレベルは低いままである。通常、固相基体は、マイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）である。膜への適用または固定化の前に、固定化を容易にするかまたはハイブリダイゼーション効率を改善するためには、核酸プローブを修飾することが簡便であり得る。そのような修飾は、ホモポリマーテーリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボキシル基などの異なる反応基とのカップリング、またはビオチン、ハプテンもしくはタンパク質とのカップリングを包含し得る。
【００４１】
用語「標識された」は、標識された核酸の使用を指す。標識化は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８８）またはベジュ（Ｂｅｊ）ら（１９９０）によって例示されるような増幅のポリメリゼーション工程中に組み入れられた標識されたヌクレオチドの使用または標識されたプライマーの使用、または当業者に既知の他の任意の方法によって行うことができる。標識の性質は、同位体（３２Ｐ、３５Ｓなど）であってもまたは非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光染料、ビオチン、酵素など）であってもよい。
【００４２】
用語「シグナル」は、一連の電磁波（例えば、蛍光）、または情報を担持する電流の変化を指す。シグナルは、直接目視することができるか、あるいは異なる手段またはデバイスによって可視化および／もしくは解釈可能にすることができる。
【００４３】
「サンプル」は、任意の生物学的材料であってもよい。この生物学的材料は、感染したヒト、もしくは動物から直接、または培養もしくは富化後に、または食物、環境などから採取することができる。
【００４４】
生物学的材料は、例えば、任意の種類の喀出物、気管支洗浄、血液、皮膚組織、生検、リンパ球血液培養材料、コロニーなどであってもよい。前記サンプルは、当該分野において公知である任意の技術に従って調製または抽出することができる。
【００４５】
本発明の意味において臨床的に関連性のあるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．アウリクラシス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カピティス（Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ）、Ｓ．カプラレ（Ｓ．ｃａｐｒａｅ）、Ｓ．コーニー（Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ）、Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｓ．ルグデュネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．パステウリ（Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉ）、Ｓ．サッカロライティカス（Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．サプロフィティカス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．シュレイフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）、Ｓ．シムランス（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）、Ｓ．ワルネリ（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ）、およびＳ．キシロサス（Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ）である（表４）。
【００４６】
ＩＴＳは、いくつかのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種について既に公知である（国際公開第９６／００２９８号パンフレット）。
【００４７】
さらなる研究では、異なるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の全ゲノム配列決定により、これらの生物体が、それらのゲノムにおいて５つのリボソームＲＮＡオペロンで含有することが示されている。
【００４８】
特に、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種内では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は１つの単一単離体内でさえも様々なスペーサー配列を示す。
【００４９】
それらの異なるＩＴＳは、１６を超えるタイプの配列であり、その長さも３００〜５５０塩基対の範囲で変動する。
【００５０】
この極めて高い多様性によって発生する問題を解決するために、本発明は、すべてのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、臨床的に関連するすべてのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、より詳細にはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための独特な標的配列を付与するその大きな利点について同定され、範囲設定されたＩＴＳの特定の領域を提供する。
【００５１】
実際、すべてのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、臨床的に関連するすべてのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種のすべてのタイプのスペーサーにおいて、本発明の標的配列が認められることを発見した。
【００５２】
ＩＴＳのこの特定の領域はまた、「標的領域」または「標的配列」とも呼ばれ、配列番号１もしくは配列番号２よりなる核酸分子、または配列番号１もしくは２に相同である核酸分子、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいはそれらの相補形態として規定することができる。
【００５３】
用語「標的配列」は、任意のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種のＩＴＳにおいて見出されるすべての相同配列を含み、以後、前記相同配列はまた、本明細書において「相同物」と称される。次いで、相同性の程度は、７５％より高い、一般的に、８０％より高い、さらに９０％より高い。
【００５４】
本発明の体系において、次いで、「相同物」は、配列番号１もしくは２または任意のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種のＩＴＳ領域に位置するその任意のフラグメントに対する相同配列であり、配列番号１および２は、それぞれＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株から誘導される。
【００５５】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出ならびに／あるいは同定のために本発明の標的配列から設計されたプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドもまた、本発明の目的である。
【００５６】
言い換えれば、本発明の目的は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出ならびに／あるいは同定のために本発明の標的配列とハイブリダイズするプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドに関する。
【００５７】
特に、本発明の目的は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいは前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメント、あるいはそれらのいずれかの相同物に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子である。
【００５８】
好適なポリヌクレオチドプローブは、約５〜約５０塩基長、より好ましくは、約１０〜約２５ヌクレオチドの間であり、標的配列に十分に相同である。
【００５９】
配列番号１〜７０のポリヌクレオチドおよびそれらの任意の相同物は、プローブとして使用することができる。
【００６０】
好適なプローブは、配列番号１４、１６〜２３、２５〜３２、３５〜４２のポリヌクレオチドおよび相同物である。
【００６１】
本発明の好適なプライマーは、本発明の標的配列の合成の開始点として作用することが可能である１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明のプライマーの長さおよび配列は、それらが、伸張産物の合成を誘導（ｐｒｉｍｅ）することが可能であるようなものでなければならない。
【００６２】
好ましくは、本発明のプライマーは、約５〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約２５である。その特定の長さならびに配列は、温度およびイオン強度などの使用される条件に依存して選択されるべきである。
【００６３】
本発明の好適なプライマーは標的配列を増幅する。言い換えれば、本発明の好適なプライマーは、配列番号１もしくは配列番号２および／または相同物を増幅する。
【００６４】
本発明の好適なプライマーは、配列番号５１、５２、５３、５５、５８、６５、６７、６８、６９、７０、および相同物である。
【００６５】
増幅プライマーは、適切な増幅を保障するために、必ずしも対応するテンプレート配列に正確に一致する必要はないという事実が、参考文献（クウォク（Ｋｗｏｋ）ら、１９９０）に詳細に記載されている。
【００６６】
使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８８）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、１９８８；ウー（Ｗｕ）＆ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、１９８９；バーラーニ（Ｂａｒａｎｙ）、１９９１）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；グアテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０；コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、１９９１）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ、クウォホ（Ｋｗｏｈ）ら、１９８９）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、ダック（Ｄｕｃｋ）、１９９０；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２）もしくはＱβレプリカーゼによる増幅（リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、１９８８；ローメリ（Ｌｏｍｅｌｉ）ら、１９８９）または当該分野において既知の核酸分子を増幅するための他の任意の適切な方法のいずれかであり得る。
【００６７】
プライマーまたはプローブとしての使用のための本発明の好適なポリヌクレオチドを表１に列挙する。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、１つもしくはいくつかのヌクレオチドのそれらの任意の代表的末端への付加または除去、あるいは前記配列内の１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの変更、あるいはそれらの両方の組み合わせのいずれかによって、表１において特定されたいずれのポリヌクレオチド、またはそれらの相同物と配列が異なっていてもよいが、但し、次いで得られる等価物はなお、対応する修飾されていないポリヌクレオチドとして標的配列とハイブリダイズする。前記等価なポリヌクレオチドは、対応する修飾されていないポリヌクレオチドと少なくとも７５％相同性、好ましくは８０％を超える、より好ましくは８５％を超える相同性を共有する。
【００６９】
ポリヌクレオチドの等価物を使用する場合、対応する修飾されていないポリヌクレオチドと同じ特異性を得るために、ハイブリダイゼーション条件を修飾する必要があり得る。
【００７０】
結果として、ポリヌクレオチドを同じハイブリダイゼーション条件下の組で使用すべき場合、従って、他のポリヌクレオチドの配列を修飾する必要があり得る。これらの修飾は、例えば、ヘイムズＢ（Ｈａｍｅｓ  Ｂ）およびヒギンズＳ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ）（編）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、英国（ＵＫ）、１９８５などの当該分野において公知の原理に従って行うことができる。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブもまた、ホスホロチオエート（マツクラ（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ）ら、１９８７）、アルキルホスホロチオエート（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９７９）またはペプチド核酸（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９９１；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９９３）などのヌクレオチド類似体を含んでなり得るか、あるいは挿入剤（アッセライン（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）ら、１９８４）などを含有し得る。
【００７２】
修飾されたプライマーまたはプローブは、要求される特異性および感受性を得るためにそれらが使用される条件に関する適応性を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションの結果は、依然として、修飾されていないポリヌクレオチドで得られる結果と本質的に同じものであるべきである。
【００７３】
これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション動力学、ハイブリッド形成の可逆性、ポリヌクレオチド分子の生物学的安定性などのいくつかの特徴に影響を及ぼすために有利であり得る。
【００７４】
本発明のプローブおよびプライマーは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法、また目的において使用される。
【００７５】
標的配列の検出および／または同定は、電気泳動方法、ハイブリダイゼーション方法もしくは配列決定方法を使用することによって実施することができる。
【００７６】
サンプル中の１種もしくはそれ以上のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出のための本発明の方法は、以下の工程を含んでなる。
・第１に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および／またはハイブリダイゼーションに利用可能な状態にする。
・第２に、また必要であれば、核酸が存在するならば、以下に特定するように、１つもしくは別の標的増幅システムで増幅する。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するのに必要である。しかし、いくつかのサンプル、またはいくつかの高感度シグナル増幅システムでは、増幅は必要ないかもしれない。
・第３に、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物をプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、簡便かつ互換性の検出システムを使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、１種もしくは数種のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の有無を推測することができる。
【００７７】
使用される増幅システムは、必要とされる特定のアプリケーションに依存して、多かれ少なかれ普遍的であり得る。
【００７８】
ｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域（１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子）に位置する普遍的プライマーを使用することによって、腸球菌由来のすべてではないがほとんどの生物体のスペーサー領域が増幅される。
【００７９】
いくつかのアプリケーションでは、サンプル中に存在するすべての生物体ではないが、１種もしくは数種のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を増幅することが適切であり得る。これは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の標的領域に位置する特異的プライマーを使用して達成することができ、例えば、配列番号６９および７０のポリヌクレオチドまたはそれらの相同物をそのままプライマー対として、または好ましくは配列番号５８および６８のポリヌクレオチドもしくはそれらの相同物を使用してもよい。
【００８０】
特に、サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、とりわけ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法は、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）必要であれば、少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、または標的配列を含んでなるフラグメント、または標的配列もしくはそのフラグメントを増幅する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）または（ｉｉ）のポリ核酸と、標的配列（ここで、標的配列は、配列番号１もしくは２またはその相同物よりなる）、あるいはそれらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、あるいはそれらの相補形態、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出する工程、ならびに
（ｖ）得られるシグナルを解釈し、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推論し、および／またはサンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる。
【００８１】
好ましくは、本発明のプローブは、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。
【００８２】
高いストリンジェンシー条件下では、相補的核酸ハイブリッドのみが形成される。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、標的および非標的核酸により形成されるハイブリッド間の安定性の差異を最大にするために、選択される。
【００８３】
ハイブリダイゼーション条件は、本発明のポリヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズする場合に得られるハイブリダイゼーションのシグナルが、前記ポリヌクレオチドが非特異的様式で標的配列にハイブリダイズする場合に得られるシグナルと異なるような方法で選択される。
【００８４】
実際には、例えば、標的に対する特異的ハイブリダイゼーションにより、標的配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションと比較して、シグナルの強度が２、５、１０倍もしくはそれ以上強度である（例えば、ＬｉＰＡシステム）場合、異なるシグナルが可視化され得る。
【００８５】
融解曲線解析において異なるピークが描かれる場合、例えば、リアルタイムＰＣＲ方法を使用する場合にも、異なるシグナルが可視化され得る。
【００８６】
本発明の任意の方法の増幅またはハイブリダイゼーション工程において言及されるフラグメントは、配列番号１または２あるいは任意の相同物の２０〜５０、２０〜８０もしくは２０〜１００連続ヌクレオチドを含んでなり得る。
【００８７】
１つの実施形態では、サンプル中に潜在的に存在する標的配列の検出に極めて簡便かつ有利な技術は、リアルタイムＰＣＲである。
【００８８】
増幅されたＤＮＡの検出のための異なる形式、とりわけタックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブ、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブが存在する。
【００８９】
タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブに関して、１本鎖ハイブリダイゼーションプローブは２つの成分で標識される。蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従い、第１の成分、いわゆる蛍光剤を適切な波長の光で励起する場合、吸収されたエネルギーが第２の成分、いわゆる消光剤に移動する。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、伸張相中、ポリメラーゼ、例えば、タック・ポリメラーゼ（Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって消化される。結果として、励起された蛍光成分および消光剤は、空間的に相互に離れており、従って、第１の成分の蛍光放射を測定することができる（ＥＰ  Ｂ  ０  ５４３  ９４２号明細書および米国特許第５，２１０，０１５号明細書）。
【００９０】
モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブに関して、プローブもまた、第１の成分および消光剤で標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的なプローブの異なる末端に位置する。プローブの２次構造の結果として、両方の成分は、溶液において空間的に近接する。適切な波長の光による励起後、第１の成分の蛍光放射を測定することができるように、標的核酸のハイブリダイゼーション後、両方の成分は相互に分離される（米国特許第５，１１８，８０１号明細書）。
【００９１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、すべての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である（マシューズ、Ｊ．Ａ．（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ａ．）およびクリッカ、Ｌ．Ｊ．（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６９（１９８８）１−２５）。それは、同時に使用され、（増幅される）標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である２つの１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは、異なる蛍光成分で標識される。適切な波長の光で励起される場合、両方のハイブリダイゼーションプローブが、検出しようとする標的分子の隣接位置に結合する場合にのみ、第２の成分を測定することができるように、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第１の成分は吸収されたエネルギーを第２の成分に伝達する。
【００９２】
標的配列に対してアニールされる場合、ハイブリダイゼーションプローブは、頭尾整列で相互に極めて近傍に位置しなければならない。通常、第１のプローブの標識された３’末端と第２のプローブの標識された５’末端との間のギャップはできるだけ小さく、とりわけ、約０〜２５塩基、好ましくは約１〜約５塩基よりなる。このことは、典型的に１０〜１００オングストロームであるＦＲＥＴ供与化合物およびＦＲＥＴ受容化合物の緊密な接近を可能にする。
【００９３】
あるいは、ＦＲＥＴ受容化合物の蛍光の増加をモニターするために、ハイブリダイゼーション事象の定量測定としてＦＲＥＴ供与化合物の蛍光減少をモニターすることも可能である。
【００９４】
リアルタイムＰＣＲの分野において公知のすべての検出形式の間で、ＦＲＥＴ−ハイブリダイゼーションプローブ形式は、高感度、正確かつ信頼できることが証明されている（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１２号パンフレット、国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）。なお、適切なＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、時々、検出しようとする標的核酸配列の空間的特徴によって制限され得る。
【００９５】
２つのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用に対する代替物として、蛍光標識プライマーおよびただ１つの標識されたポリヌクレオチドプローブを使用することも可能である（バーナード、Ｐ．Ｓ．（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｐ．Ｓ．）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５（１９９８）１０１−７）。このことに関して、プライマーをＦＲＥＴ供与またはＦＲＥＴ受容化合物のいずれで標識するかを任意に選択することができる。
【００９６】
融解曲線解析のために、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）またはＦＲＥＴ−プローブ）を使用することもできる（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１２号パンフレット、国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）。そのようなアッセイでは、標的核酸は、最初に、適切な増幅プライマーにより典型的なＰＣＲ反応において増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応中、常に存在し得るかまたはその後添加され得る。ＰＣＲ反応の完了後、サンプルの温度は連続して増加する。蛍光は、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合する限り検出される。融解温度で、ハイブリダイゼーションプローブはそれらの標的から遊離し、蛍光シグナルはバックグランドレベルにまで直ちに減少する。この減少は、１次導関数（ａ  ｆｉｒｓｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の負の値が計算できるように、適切な蛍光対温度−時間プロットでモニターされる。次いで、そのような関数の得られる最大値に対応する温度の値を、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの前記の対の決定された融解温度として採用する。
【００９７】
標的核酸内の点変異または多型は、標的核酸とＦＲＥＴプローブとの間の１００％未満の相補性を生じ、従って、融解温度の減少を生じる。このことは、ＦＲＥＴ−ハイブプローブ（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ）ハイブリダイゼーションによる配列変異体のプールの共通検出を可能にする一方、以後、前記プールの異なるメンバーは、融解曲線解析を実施することによって、識別されるようになり得る。
【００９８】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの代わりに、融解曲線解析のためにモレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）を代替的に使用してもよい。
【００９９】
リアルタイムＰＣＲおよび相同なリアルタイムＰＣＲ融解曲線解析が利用可能であるとき、サイバー・グリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）ＴＭＩなどの２本鎖ＤＮＡ結合染料か、または代替的に、異なるが類似の標的配列にハイブリダイズするように特異的に設計されたハイブリダイゼーションプローブのいずれかを使用して、特定のタイプの種または株の識別が能になった。
【０１００】
第１の場合、作製された２本鎖ＰＣＲ産物の融解温度を決定しなければならない。なお、配列の変動が少ないとわずかな融解温度の差異しか生じないことから、少量の差異を効率的にモニターすることができないため、この方法は極限られた用途しか有さない。
【０１０１】
あるいは、プローブ／標的核酸ハイブリッドの融解温度が決定されるような方法で、ハイブリダイゼーションプローブを使用してもよい。
【０１０２】
ＡＢＩ／ＰｒｉｓｍＴＭ設備、特にライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＴＭ装置などの異なるリアルタイムＰＣＲプラットフォームが存在し、それらはすべて、光放射を測定すること、融解サイクル中の放射ピークを連続的にモニターすること、標識されたプローブが増幅産物から分離する温度（融解ピーク）を決定および可視化することよりなる同じ原理に基づく。プローブと標的との間のミスマッチは、融解の動力学に影響を及ぼし、目的のそれぞれの種に対して異なる融解ピークを生じるため、融解ピークのデータは、特定の［プローブ：標的］配列の特徴である。
【０１０３】
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＴＭプラットフォームは、多くの利点、特に、時間を稼ぐことおよびハイブリダイゼーションプローブ（ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ））、タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）およびビプローブ（ｂｉｐｒｏｂｅ）（サイバー・グリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）Ｉ）などのいくつかの異なる配列特異的蛍光プローブ検出システムの可能な使用を付与する。
【０１０４】
本発明の好適な方法では、頭尾配向において、数ヌクレオチド、一般に、０〜２５、好ましくは、約１〜約５の間隔を置いた、本発明の標的領域から誘導される２つの隣接するポリヌクレオチドプローブよりなるハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）システムが使用される。プローブの一方は、供与染料によって３’末端で標識され、他方は、５’末端で受容分子により標識され、（プライマーとして作用することを防止するために）３’末端でリン酸ブロックされる。供与染料は、一般にフルオレセインであり、受容分子は、一般にＬＣレッド（ＬＣ  Ｒｅｄ）６４０または７０５である。
【０１０５】
本発明の標的配列の検出は、内部標識ＰＣＲ鎖および対向鎖に位置する検出プローブによっても達成することができる。シグナルは、染料の空間的接近に依存し、標的の量に依存する。
【０１０６】
両プローブをそれらの標的配列にハイブリダイズさせる場合、供与体の放射光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、受容体フルオロフォアに移動し、放射された蛍光（６４０または７０５ｎｍ）を検出することができる。放射された蛍光の強度は、標的ＤＮＡ、増幅の産物と平行して増加する。
【０１０７】
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）プローブは、加水分解を必要とせず、および従って、ＰＣＲ時間（アニーリング〜伸張≦１２秒）のさらなる延長を必要としない点で、タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＭプローブよりも有利である。従って、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）の高速熱サイクルを利用し、わずか４５分間でＰＣＲプログラムを完了することが可能である。
【０１０８】
そして、このリアルタイムＰＣＲプラットフォームの極最近の世代は、単一反応においていくつかのプローブをモニターすることが可能であり、種レベルおよびまたより低い分類学的レベルでの異なるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）の検出ならびに／あるいは同定を可能にする。
【０１０９】
さらに、タックマン（ＴａｑＭａｎ）技術のために設計された方法は、等価な結果を伴うハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）技術に容易に変換することができることが明らかにされている（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８５巻（１２）１２４８〜１２５４頁、２０００年１２月）。
【０１１０】
従って、本発明の別の目的は、ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）とも称される少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブの組に関し、両方のハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）は、前記２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）間が、２５ヌクレオチド以下、好ましくは、１０ヌクレオチド以下、特に５ヌクレオチド以下で相互に隣接する同じ標的配列にハイブリダイズする。
【０１１１】
標的配列と２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）をハイブリダイゼーションすると、供与体および受容体フルオロフォアが相互に０〜２５ヌクレオチド内、好ましくは、相互に０〜５ヌクレオチド内にあるように、一方のハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）は受容体フルオロフォアで標識され、他方は蛍光エネルギー移動対の供与体フルオロフォアで標識される。
【０１１２】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、臨床的に関連するスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を検出および／または同定するために、２つのポリヌクレオチドプローブの組を使用することができ、前記２つのプローブは、配列番号１もしくは配列番号２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいは相補物にハイブリダイズし、ここで、前記２つのプローブ間に２５以下のヌクレオチド、好ましくは５以下のヌクレオチドが存在する。
【０１１３】
本発明のプローブの組はまた、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上のプローブよりなるが、好ましくは、それは２〜５つのプローブ、より好ましくは２または３つのプローブよりなる。
【０１１４】
表３に列挙したプローブの組およびそれらの相同物は本発明の好適な組である。
【０１１５】
２つのポリヌクレオチドの組（一方はプライマーとしての使用のためであり、他方はプローブとしての使用のためである）も使用することができ、前記プライマーおよびプローブの両方は、配列番号１もしくは配列番号２、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、または相補物よりなる標的配列にハイブリダイズし、ここで、前記プライマーおよび前記プローブ間に２５以下のヌクレオチド、好ましくは５以下のヌクレオチドが存在する。
【０１１６】
本発明の少なくとも２つのポリヌクレオチドの組は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに／あるいは同定のための方法に使用される。
【０１１７】
サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための本発明の方法は、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、または標的配列、または標的配列を含んでなるスペーサーの部分、または標的配列の部分を増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸と標的配列にハイブリダイズする少なくとも２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の少なくとも１つの組とをハイブリダイズさせる工程であって、ここで、標的配列は、配列番号１もしくは２、または前記配列番号のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号の相補形態、あるいは任意の相補物、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる上記工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られる特異なハイブリダイゼーションシグナルから、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推論し、またはサンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる。
【０１１８】
例えば、増幅工程において使用されるプライマー対は、配列番号４５、４９、５０、５２、５６、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８またはそれらの相同物よりなる順方向プライマー、および配列番号４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６２またはそれらの相同物よりなる逆方向プライマーの任意の組み合わせである。
【０１１９】
例えば、ハイブリダイゼーション工程において使用される２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の組は、配列番号３〜７０またはそれらの相同物のポリヌクレオチドの間から選択される２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の任意の組み合わせであるが、但し、標的配列にハイブリダイズする場合の前記２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）間のギャップは、２５ヌクレオチド未満、好ましくは５ヌクレオチド未満である。
【０１２０】
ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）システムの利点の１つは、該システムが、以下の分子概念に基づいて、変異、多型および他の変異核酸種を含む配列のバリエーションの検出を可能にするという事実にある。ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の１つは強固に結合する「アンカープローブ」である一方、隣接する「センサープローブ」は配列のバリエーションの領域に渡る。最終的なＰＣＲ産物の融解の間、配列の変更は、センサープローブの融解温度（Ｔｍ）の変化として、検出される。
【０１２１】
例えば、サンプルが配列番号１のみを含有する場合、前記配列番号１に特異的にハイブリダイズするハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）を使用して、単一の融解ピークが作製される。サンプル中に相同物も存在する場合、一般に、容易に観察することが可能な温度シフトを誘導する１つのミスマッチした塩基が存在する限り、同じ２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）を使用することによって、２つのピークが作製される。
【０１２２】
選択されたポリヌクレオチド、それらのＴｍおよびハイブリダイゼーション条件に依存して、増幅工程中に蛍光を測定することができ、次いで、増幅曲線を作成するか、または増幅工程後、融解曲線解析のための融解曲線を作成する。
【０１２３】
従って、得られるシグナルは、増幅曲線の形かまたは融解曲線の形で可視化することができ、該シグナルから、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推論するおよび／またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）のどの種が存在するかを推論することが可能である。
【０１２４】
特に、サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出および／または同定のための方法はまた、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）標識されたプライマー対で、標的配列、またはその部分を増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、間に２５未満のヌクレオチドを伴って前記標識されたプライマーに隣接する、配列番号１、または前記配列番号１のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１の相補形態、あるいは任意の相補物、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも１つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）とをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られるシグナルから、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在を推論し、および／またはサンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を同定する工程、
を含んでなる。
【０１２５】
ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）システムを使用する本発明の方法を、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の検出ならびに同定に適応し、他の種からＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、特にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（ＣｏＮＳ）を区別することが可能である。
【０１２６】
次いで、増幅工程では、適切なプライマーは、配列番号１、または前記配列番号のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号の相補形態よりなる標的配列を特異的に増幅するプライマー対である。
【０１２７】
ハイブリダイゼーション工程では、ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）は、配列番号１もしくは２、またはＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または相補形態に特異的にハイブリダイズすべきである。
【０１２８】
従って、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は、融解曲線解析によって試験される他のすべての生物体から明白に識別することができる。
【０１２９】
さらに、ＣｏＮＳのみが融解ピークを生じ、関連のないシグナルは、非ブドウ菌（ｎｏｎ−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）またはヒトゲノムＤＮＡによって得られる。
【０１３０】
この特定の例で使用される好適なプライマー対は、配列番号６８もしくは６９またはそれらの相同物の間で選択される順方向プライマーおよび配列番号５８もしくは７０またはそれらの相同物の間で選択される逆方向プライマーの任意の組み合わせである。
【０１３１】
表３に列挙されたハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）またはそれらの相同物の組は、本発明のハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の好適な組である。２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）のより好適な組は、配列番号１７または相同物および配列番号１９または相同物よりなる。
【０１３２】
配列番号１７および１９よりなるハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の組は、高い感受性でＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、およびＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を検出することが可能である。
【０１３３】
配列番号１〜配列番号７０およびそれらの任意の相同物に対応する表１に列挙した各ポリヌクレオチドは、プライマーおよび／またはプローブとして、本発明の任意の方法において、単独あるいは組み合わせて使用することができる。
【０１３４】
ハイブリダイゼーション方法にも基づく第２の実施形態は、ライン・プローブ・アッセイ（Ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ）技術である。ライン・プローブ・アッセイ（Ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ）（ＬｉＰＡ）は、いくつかのポリヌクレオチドプローブ（陰性または陽性コントロールポリヌクレオチドを含む）が平行ラインとして簡便に適用することができる膜ストリップを使用する逆ハイブリダイゼーション形式（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８９）である。
【０１３５】
ストイフェル（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら（１９９３）および国際出願国際公開第９４／１２６７０号パンフレットに記載のＬｉＰＡ技術は、迅速かつ使い勝手がよいハイブリダイゼーション試験を提供する。結果は、増幅の開始後、４時間以内に読み取ることができる。通常、非同位体標識が増幅された産物に組み入れられる増幅、およびアルカリ変性後、増幅された産物は、膜上でプローブと接触され、約１〜１．５時間、ハイブリダイゼーションが行われる。従って、形成されるハイブリッドは、酵素的手順によって検出され、目に見える紫褐色の沈殿を生じる。ＬｉＰＡ形式は、市販のスキャニングデバイスと完全に互換性があり、従って、結果の自動的解釈を可能にする。それらのすべての利点は、ＬｉＰＡ形式を日常的設定での使用に対して信頼可能にする。
【０１３６】
ＬｉＰＡ形式は、種レベル、しかしまた、より高いまたはより低い分類学的レベルでの病原体の検出ならびに／あるいは同定のための有利な道具である。例えば、ＬｉＰＡストリップに対するプローブ形状構成は、それらが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の完全な属を検出することができるか、あるいは属内の種（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、およびエピダーミディス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）など）を同定することができるか、あるいは場合により、種内のサブタイプ（亜種、血清型、配列型（ｓｅｑｕｅｖａｒ）、生物型など、臨床的に関連するあらゆるもの）を検出することができるような様式で、選択することができる。
【０１３７】
多数のプローブによってハイブリダイゼーション結果を同時に作成する能力は、ＬｉＰＡ技術の別の利益である。多くの場合、プローブの特定の組み合わせによって得ることができる情報の量は、単一のプローブアッセイを使用することによって得られるデータよりも顕著に多い。従って、プローブの最適化された組は最大限の情報を可能にするため、膜ストリップに対するプローブの選択は最も重要である。
【０１３８】
これらのプローブは、異なる位置で膜ストリップに適用することができ、これらのプローブのうちの少なくとも１つが陽性である場合、結果は陽性と解釈される。あるいは、これらのプローブは、同じ位置に混合物として適用することができ、それによって、ストリップ上のラインの数が減少する。ストリップをより簡潔にするか、１つのストリップ上のプローブの合計数を拡張することを可能にするために、このような減少は簡便であり得る。
【０１３９】
実際的有益性の観点において、別の代替的アプローチは、次いで、さらに処理され、１つのポリヌクレオチド分子としてストリップに適用することができる変性プローブと称される２つもしくはそれ以上の異なるプローブの配列を有するポリヌクレオチドの合成である。このアプローチは、ＬｉＰＡ−ストリップの製造手順をかなり簡単にする。例えば、ヌクレオチド配列ＡおよびＢを伴うプローブは、両方ともタクソンＸのすべての株を検出することが必要である。後者の代替物では、ヌクレオチド配列ＡＢを有するプローブを合成することができる。このプローブは、プローブＡおよびＢの組み合わされた特徴を有する。
【０１４０】
上記で言及した特性によって、ＬｉＰＡシステムは、ハイブリダイゼーション方法のための効率的な形式とみなすことができ、ここで、いくつかの生物体がサンプルにおいて同時に検出される必要がある。
【０１４１】
しかし、他の任意のハイブリダイゼーションアッセイでは、それによって、異なるプローブが同じハイブリダイゼーション下で使用され、上記で言及した検出および／または選択方法のための洗浄条件が使用され得ることが明らかであるべきである。例えば、標的核酸を固相支持体に固定化し、すべてが別に標識された異なるプローブの混合物を使用することが可能であり得、標的にハイブリダイズされたそれぞれのプローブに対して異なる検出シグナルを生じる。そして、現在、異なる多くの支持体が利用可能である。
【０１４２】
例として、ＬｉＰＡ形式を使用するサンプル中の１つもしくはそれ以上のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出のための従うべき手順を以下に概説する。
・第１に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および／またはハイブリダイゼーションに利用可能な状態にする。
・第２に、存在するならば、核酸を、以下に記載のように、１つもしくは別の標的増幅システムで増幅させる。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するのに必要である。
・第３に、終局的に、変性工程後、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物を、目的の生物体の検出を可能にする１つもしくはそれ以上のプローブ（ＤＮＡ−、ＲＮＡ−、変性もしくは修飾されたプローブ）が固定化されたＬｉＰＡストリップと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、終局的に洗浄工程を実施した後、簡便かつ互換性の検出システムを使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、特定の生物学的サンプルにおいてスクリーニングされた１種もしくは数種の生物体の有無を推測することができる。
【０１４３】
使用される増幅システムは、必要とされる特定のアプリケーションに依存して、多かれ少なかれ普遍的であり得る。
【０１４４】
ｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域、即ち、１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子に位置する普遍的プライマーを使用することによって、真正細菌由来のすべてではないがほとんどの生物体のスペーサー領域が増幅される。
【０１４５】
いくつかのアプリケーションでは、サンプル中に存在するすべての生物体ではないが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種をより特異的に増幅することが適切であり得る。これは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の標的領域に位置する特異的プライマーを使用して達成することができ、例えば、配列番号６９および７０のポリヌクレオチドまたはそれらの相同物をそのようなプライマー対として使用することができる。
【０１４６】
サンプル中のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法は、
（ｉ）必要であれば、サンプル中に存在するポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）必要であれば、少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域、またはその部分を増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号の相補形態、あるいは任意の相同物、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブとをハイブリダイズさせる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られる異なるハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中に存在する微生物を同定する工程、
を含んでなる。
【０１４７】
増幅の工程において言及されるＩＴＳの部分は、標的配列を含んでなるポリヌクレオチド、または標的配列自体、配列番号１もしくは２、または前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、または前記配列番号１もしくは２の相補形態、あるいは任意の相同物、あるいはその少なくとも２０連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列である。
【０１４８】
好ましくは、本発明は、上記の方法を提供し、ここで、少なくとも２種の微生物が同時に検出される。
【０１４９】
工程（ｉｉｉ）に記載のプローブの組は、本発明の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくはそれ以上のプローブ、またはその等価物を含んでなる。
【０１５０】
本発明の好適な実施形態では、工程（ｉｉｉ）に記載のプローブの組は少なくとも２つのプローブを含んでなる。
【０１５１】
好適なプローブは配列番号１〜７０およびそれらの相同物のポリヌクレオチドである。
【０１５２】
本発明はまた、上記の方法を提供し、ここで、工程（ｉｉｉ）において特定されるプローブが、好ましくは１６Ｓ〜２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域由来の少なくとも１つの他のプローブと組み合わされ、サンプル中に存在しやすい異なる病原性細菌の同時検出を可能にする。
【０１５３】
好適なプローブは、それらを同時ハイブリダイゼーションのための組で使用することができるような同じハイブリダイゼーション条件下での最適な実施を達成するために設計され、これは、これらのプローブの有用性を高度に増加し、時間および労力が顕著に獲得される。
【０１５４】
本発明の任意のポリヌクレオチドを含有するキットもまた、本発明の目的である。
【０１５５】
本発明のキットは、以下の成分、
・配列番号１もしくは２よりなる標的配列、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、またはそれらのいずれかの相同物にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド、
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる。
【０１５６】
好適なキットは、
・２５ヌクレオチド未満、好ましくは、５ヌクレオチド未満で相互に隣接する、配列番号１もしくは２よりなる標的配列、前記配列番号１もしくは２のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵによって置き換えられる）、前記配列番号１もしくは２の相補形態、またはそれらのいずれかの相同物にハイブリダイズする２つのハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）の少なくとも１つの組、
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる。
【０１５７】
【表１−１】
2010088447.tif 000002
【表１−２】
2010088447.tif 000003
【表１−３】
2010088447.tif 000004
【０１５８】
【表２】
2010088447.tif 000005
【０１５９】
【表３】
2010088447.tif 000006
【０１６０】
【表４】
2010088447.tif 000007
【０１６１】
【表５】
2010088447.tif 000008
【０１６２】
【表６】
2010088447.tif 000009
【０１６３】
【表７】
2010088447.tif 000010
【０１６４】
【表８】
2010088447.tif 000011
【０１６５】
【表９】
2010088447.tif 000012
【実施例】
【０１６６】
実施例において使用する方法は、配列番号１７および１９のハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）を、配列番号５８および６８のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属プライマー組との組み合わせで使用する、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、特に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の検出のための方法である。
【０１６７】
ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）は、配列番号１７の３’側がフルオレセインで、配列番号１９の５’側がＬＣレッド（ＬＣｒｅｄ）６４０で標識される。
【０１６８】
合計で、地理的由来が異なる６３株のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）単離物（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）亜種嫌気性細菌の代表を１つ含む）、４８株のＳ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）単離物、および１６株のＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）単離物について調べた。
【０１６９】
単離体が予想される結果を与えなかった場合、ｔ−ＲＮＡ  ＰＣＲ（ベインエコッテ、Ｍ．（Ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔｔｅ，Ｍ．）ら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（４８）１２７−１３９））によりｇＤＮＡを再分類し、および／または培養物をＡｐｉＳＴＡＰＨ（バイオメリエックス（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ））によって再分類した。
【０１７０】
器具は、リアルタイム蛍光ＰＣＲ検出を可能にする適切なソフトウェア（ＬＣ−ソフトウェア、バージョン３．５）を備えたライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＴＭ（バージョン１．２）である。
【０１７１】
実施例１：試験しようとするサンプルの調製
１／．純培養物由来のＤＮＡ
純培養物由来のＤＮＡを調製するために、異なる精製方法を使用することができる。
・リソスタフィン（５μｇ／μｌ）で１時間、３７℃での溶解およびＱＩＡａｍｐ血液ＤＮＡ単離キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））による精製
・ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）らの方法（１９８９）
・ＭａｇＮＡＰｕｒｅ器具上のＭａｇＮＡＰｕｒｅ  ＬＣ  ＤＮＡ単離キットＩＩＩ（細菌、真菌）。ＬＢプレートまたはスラント上Ｏ／Ｎで増殖させた細菌細胞を、−２０℃での保存のために１００〜１０００μｌ  ＴＥ  ｐＨ８に懸濁させた。製造者の推奨に従って、２μｌ〜２０μｌを抽出のために使用した。
・ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（カタログ番号５１３０６−キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））。リゾチームおよびリソスタフィンを使用して、培養物を酵素的に前処置した。
【０１７２】
２／．陽性血液培養ボトル由来のＤＮＡ
血液サンプルを通気血液培養ボトル（ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＦＡ）に播種し、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ  ３Ｄシステム（オルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ））中、３７℃、陽性になるまでインキュベートした。暗緑色から黄色への色の変化によって、陽性をモニターした。
【０１７３】
血液培養物のアリコート（１．５ｍｌ）を、使用するまで−７０℃で凍結した。
【０１７４】
ゲノムＤＮＡを、ＭＰＬＣ  ＤＮＡ単離キットＩＩＩの包装挿入物に記載のように、調製した。オルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）血液培養ボトルについて推奨されているように、ＰＣＲの前に、溶出物を１０秒間、１４０００ｒｐｍで遠心分離して、抽出された炭素粒子をスピンダウンした。
【０１７５】
実施例２：ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（ＬＣ）プロトコル
キットＬＣ−ファストスタート（ＬＣ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ）ＤＮＡマスター（Ｍａｓｔｅｒ）ハイブリダイゼーションプローブ（カタログ番号３００３２４８または２２３９２７２）の製造者の指示に従って、
・精製、濃縮、および阻害剤の非存在について、ＰＣＲに適切な任意のサンプル材料を使用することができる、
・プライマーは、それぞれ０．３〜１μＭの最終濃度であるべきである、
・それぞれ０．２μＭ、または２倍の最終濃度のハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）、
・ＭｇＣｌ２の濃度は最適化されるべきであり、１〜５ｍＭに変動し得る、
・そして、陰性コントロールを稼動させるべきである。
【０１７６】
増幅および融解条件を以下に記載する。ＬＣソフトウェアのバージョン３．５を使用した。定量設定はＦ２／ｂａｃｋ  Ｆ１（サンプル）であった。ベースラインの調整については、算術モードを使用した。クロスポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｃｔ）の計算は、２次最大微分（ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）に基づいた。融解ピークの計算方法は多項式法であった。ピーク面積を使用して、Ｔｍを計算した。
【０１７７】
【表１０】
2010088447.tif 000013
【０１７８】
実施例３：精製されたＤＮＡ、包括性および交差反応性試験の結果
１／包括性
試験したすべてのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）単離物（ｎ＝６３）を首尾よく増幅（Ｃｔ範囲１７．２５〜３３．５１）し、どのような地理的または種由来についても５３．１３℃±０．５２℃の平均Ｔｍを有する１つの均質な融解ピークを得た。
【０１７９】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）種と共に亜種のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）亜種嫌気性細菌も属することに留意すべきである。
【０１８０】
Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）単離物（ｎ＝４８）、およびＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ｎ＝１６）として受容されたすべての単離物を、融解曲線を使用して、検出することができた。定量曲線は、通常観察されなかった。Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）単離物の平均Ｔｍ値は４４．５５℃±０．２１℃であり、Ｓ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）では、それは４４．９６℃±０．２４℃であった。異なる地理的または種由来の単離物間で差異は認められなかった。
【０１８１】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）として受容されたすべての単離物は、予想通りに反応した。しかし、５つのＳ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）単離物については、逸脱した結果が得られた。
【０１８２】
これらのうち２株（１つは英国（ＵＫ）由来であり、１つはイタリア（Ｉｔａｌｙ）由来である）は、後にＳ．ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）として同定された。英国由来の別のＳ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）単離物は、４９．０２℃のＴｍ値を示し、後に、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）またはＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）以外）として決定することができた。該英国の単離物は後にＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）として再分類された。そして、特徴的でない小さな融解ピークを生じるスペイン（Ｓｐａｉｎ）由来の１つの単離物は、Ｓ．インターメディウス（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）またはＳ．クロモゲネス（Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）として再分類された。
【０１８３】
２／．交差反応性
５０を超える異なる細菌種について試験し（マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）など）、また若干の真菌についても試験した。試験した生物体のうち、アッセイにより定量曲線または融解ピークを作成したものは認められなかった。
【０１８４】
３／．結果：
調査したすべてのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）単離物が検出され（１００％の感受性）、研究した他のすべての単離物から明白に識別することができた。
【０１８５】
Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）についても、感受性は１００％であった。
【０１８６】
従って、配列番号１７および１９のハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）のこの特定の組を使用して、相互または他のＣｏＮＳから識別することなく、両方の種が検出される。
【０１８７】
試験した病原体由来の生物体との所望されない交差反応は観察されなかった。
【０１８８】
【表１１】
2010088447.tif 000014
【０１８９】
実施例４：血液培養物の結果
患者サンプルと共に播種された合計で１６個の陽性血液培養ボトルのアリコートについて試験した。
【０１９０】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が増殖した５つのボトルから、４つはそのまま同定することができた。１つはピークを示さなかった。実際、サンプルのＤＮＡは、Ｓ．シュレイフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）として再分類された。
【０１９１】
Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に対して陽性が認められた１０個のボトルのうち、７つが４４℃〜４５℃のピークを示し（予想した通り）、一方３つが４７℃にシフトしたピークを示した。逸脱したサンプルのＤＮＡを再分類した後、それらはＳ．ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）として同定された。
【０１９２】
Ｓ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）について陽性である１つのボトルは、４４．５９℃の予想された溶解ピークを生じた。
【０１９３】
実施例５：他の検出
Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）以外の合計で５１株のＣｏＮＳ株について研究した。結果を以下の表にまとめる。
【０１９４】
結果が不明瞭である２種（Ｓ．シュレイフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）およびＳ．シウリ（Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ））を除くすべての種のすべての株について、ゲル上において増幅が観察された（以下にも示す）。いくつかのＣｏＮＳは、対応するＣｔ値で増殖曲線（増幅）を生じたが、エンドポイントの蛍光は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について得られる値（例えば、１０３コピーについて０．０３）と比較して極めて低かった（０．００４以下）。
【０１９５】
試験したほとんどの種は、Ｓ．クロモゲネス（Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ヒカス（Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ）およびＳ．シムランス（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）を除いて、融解曲線解析によって検出可能であった。
【０１９６】
Ｓ．シュレイフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）およびＳ．シウリ（Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ）の結果は不明瞭であり、両方の種については、融解ピークが観察されたが、潜在的な混入因子から確実に識別することはできなかった。普遍的プライマーで得られた結果より、両方の種がおそらく検出可能ではないことが示唆され、ゲル上での明確な証拠は認められたが、ハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）は、ＬＣにおいてシグナルを生じなかった。
【０１９７】
ＣｏＮＳについて観察されるＴｍの範囲は、３９〜４８℃である。これは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合とは明らかに異なるが、Ｓ．エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびＳ．ハエモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の範囲に完全に重複する。
【０１９８】
【表１２】
2010088447.tif 000015
【配列表】
2010088447000001.app