(57)【要約】【課題】ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が、乏しいか或いは欠損している一部の癌細胞や血球系細胞等に於いても、遺伝子導入を可能とすることを、本発明の目的とする。【解決手段】細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤であって、該細胞内移行ペプチドにＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基を結合させたことを特徴とする遺伝子導入補助剤、および前記遺伝子導入補助剤を、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質の表面に共有結合させることを特徴とする遺伝子導入方法とする。【選択図】図１
2010041919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤であって、該細胞内移行ペプチドにＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基を結合させたことを特徴とする遺伝子導入補助剤。
【請求項２】
前記細胞内移行ペプチドが、Ｔａｔペプチドである請求項１に記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項３】
配列番号１〜４からなる群より選択される何れか一つのアミノ酸配列で示される細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤であって、該細胞内移行ペプチドにＮＨＳ基を結合させたことを特徴とする遺伝子導入補助剤。
【請求項４】
前記細胞内移行ペプチドのアミノ酸配列に於いて、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる群より選択される何れか１つである請求項３に記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項５】
遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質の表面に共有結合させることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項６】
遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスがアデノウイルスである請求項５に記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項７】
前記遺伝子導入補助剤と遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスとの間に於ける共有結合が、１０〜５０℃、１００〜１０００ｒｐｍ、５分〜６０分の条件下で行われる請求項５又は６に記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項８】
遺伝子導入対象となる細胞種が、接着細胞または浮遊細胞である請求項１乃至７何れか記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項９】
遺伝子導入対象となる細胞種が、ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか、或いは欠損している細胞種である請求項１乃至８何れか記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項１０】
凍結乾燥粉末の形態である請求項１乃至９何れか記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項１１】
遺伝子治療用に供される請求項１乃至１０何れか記載の遺伝子導入補助剤。
【請求項１２】
遺伝子導入前の段階に於いて、請求項１乃至１１何れか記載の遺伝子導入補助剤が、外殻蛋白質表面に共有結合していることを特徴とする遺伝子導入用ウイルスベクター。
【請求項１３】
遺伝子導入前の段階に於いて、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質表面に、請求項１乃至１１何れか記載の遺伝子導入補助剤を共有結合させることを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤および該遺伝子導入補助剤を利用した遺伝子導入方法に関する。更に詳しくは、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質に共有結合させることで、ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか或いは欠損している一部の癌細胞や血球系細胞に於いても、遺伝子導入を可能とする「細胞内移行ペプチドを有効成分とした遺伝子導入補助剤」および「該遺伝子導入補助剤を利用した遺伝子導入方法」に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物などの細胞における遺伝子発現の調節機構と遺伝子産物である蛋白質の機能解析は、現在の医薬学、生物学の中心テーマであり、それらの解析のためには動物細胞に目的遺伝子を導入する技術が不可欠である。現在、遺伝子導入法は、リポソームなどの非ウイルスベクターを用いる方法とウイルスベクターを用いる方法に大別されるが、遺伝子導入・発現効率の観点からウイルスベクターを用いる方法が主流を占めている。
ウイルスベクターの中でも、特にアデノウイルスベクター（以下「Ａｄ」と称す）による遺伝子導入法は、高い遺伝子導入・発現効率を示すことから、細胞や動物個体レベルでの基礎研究を進める上で非常に重要なツールであることが知られている。
【０００３】
現在、遺伝子治療研究及び基礎研究に広く用いられているＡｄは、２型或いは５型Ａｄを基盤として開発されており、その遺伝子導入機構はＡｄの感染機構をそのまま利用している。Ａｄは、直径約８０ｎｍのウイルス粒子に２５２個のカプソメアからなる正２０面体構造をしており、そのうち頂点にある１２個は突起構造をもったペントンと呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ペントンはペントン・ベースとファイバーからなり、ファイバーは更にテール、シャフト、ノブに分けられる。
Ａｄの標的細胞内への侵入は、ファイバーノブが感染受容体であるＣＡＲ（ｃｏｘａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合し、続いてペントン・ベースのＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフが細胞表面上のαｖ−インテグリンに結合するという２段階の過程を経て、エンドサイトーシスにより起こる。エンドソームに達したＡｄは、酸性条件下でカプシド蛋白質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して細胞内へと移行する。その後、Ａｄは微小管に沿った逆行性輸送により核近傍まで運ばれ、核膜孔複合体に結合して目的遺伝子の組み込まれたゲノムを核内へと送達する。
上述した機序に基づき、アデノウイルスベクター（Ａｄ）は広範な種類の細胞・組織に分裂期・静止期を問わず効率良く遺伝子導入できる。又、動物個体への投与による発現が可能である為、遺伝子治療用ベクターとしての開発が盛んに為されている。
しかしながら、悪性腫瘍細胞や血球系細胞のようなＡｄ感染受容体（ＣＡＲ）の発現が乏しい、或いは欠損している細胞種では、遺伝子治療の重要なターゲットでありながらＡｄを用いてさえ十分な遺伝子発現が得られない。
【０００４】
Ａｄ感染受容体（ＣＡＲ）の発現が乏しい一部の癌細胞や血球系細胞に対しては、遺伝子導入効率が低いという、Ａｄの問題点を克服すべく、Ａｄのファイバー先端部にＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチドを提示させることによって、αｖ−インテグリン（integrin）指向性を付与した改良型Ａｄ（以下「ＡｄＲＧＤ」と称す）が開発された。
ＡｄＲＧＤは、従来型Ａｄでは遺伝子導入が困難であった細胞（ＣＡＲの発現が乏しい細胞等）にも極めて効率良く遺伝子発現させることができる（非特許文献１、２）。
ＡｄＲＧＤは、従来型Ａｄと同様にＥ１欠損領域に目的遺伝子の発現カセットを搭載しており、さらにファイバーノブをコードする領域にはαｖ−インテグリンに親和性を有するＲＧＤ配列に相当するオリゴヌクレオチドが挿入されており、このファイバー領域の改変により、ＡｄＲＧＤは、αｖ−インテグリン指向性を獲得し、従来型Ａｄでは遺伝子導入が困難であったＣＡＲの発現が乏しい、或いは欠損している細胞に対しても効率よく遺伝子を導入することができる。
実際、本発明者らにより、ＡｄＲＧＤを応用して、（１）サイトカイン遺伝子や自殺遺伝子を用いた癌遺伝子治療の最適化（非特許文献２〜４）、（２）遺伝子修飾による樹状細胞機能の強化に基づく細胞免疫療法の最適化（非特許文献１、５）、（３）ケモカイン・ケモカイン受容体遺伝子導入による免疫細胞の体内動態制御法の構築（非特許文献５）が進められており、従来のベクターシステムでは達成し得なかった新規ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）戦略の先端医療への導入が図られている。
しかしながら、ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか或いは欠損している、一部の癌細胞や血球系細胞等に於いては、ＡｄＲＧＤであっても、依然として十分な遺伝子発現を得ることはできない（図１参照）。その為、ＣＡＲ及びインテグリンに非依存的に遺伝子導入が可能なベクターの開発が求められている。
【０００５】
上記の如く、ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか或いは欠損している、一部の癌細胞や血球系細胞等に於いては、ＡｄＲＧＤであっても依然として十分に遺伝子導入するのは困難であった。
又、ＣＡＲ及びインテグリンの発現がみられる細胞種に於いても、従来のウイルスベクター（Ａｄ，ＡｄＲＧＤ等）が十分な遺伝子導入活性を発揮する為には、高用量投与する必要があり、例えば、遺伝子治療に応用するにあたっては副作用の問題がある。その為、低用量で臨床適用可能な遺伝子導入活性の強い新規なベクターが求められていた。
更に基礎研究の観点からも、レセプター低発現の細胞に対する遺伝子導入を目的とし、ＣＡＲおよびインテグリンに非依存的に遺伝子導入が可能なベクターの開発や、あらゆる細胞に対して効率良く遺伝子導入可能なベクターの開発が求められている。
【０００６】
【非特許文献１】Okada,N.et al.: Cancer Res.,61: 7913-7919, 2001
【非特許文献２】Okada,N.et al.: Cancer Lett.,177: 57-63, 2002
【非特許文献３】Okada,N.et al.: Gene Ther.,10: 700-705, 2003
【非特許文献４】Okada,N.et al.: Cancer Gene Ther.,12: 608-616, 2005
【非特許文献５】Okada,N.et al.: Gene Ther.,12: 129-139, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が、乏しいか或いは欠損している一部の癌細胞や血球系細胞等に於いても、遺伝子導入を可能とする。
以下の（１）〜（３）の要件を具備する新たな遺伝子導入ベクターを提供することを目的とする。
（１）ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が、乏しいか或いは欠損している一部の癌細胞や血球系細胞等に於いても、遺伝子導入が可能であること（適用域の拡大）。
（２）遺伝子治療用ベクターとして、低用量で臨床適用可能であること（即ち、副作用が軽減され、且つ遺伝子導入活性が強いこと）。
（３）基礎研究における遺伝子機能解析ツールとして、あらゆる細胞に対して効率良く遺伝子導入が可能であること。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｔａｔペプチドをはじめとする細胞内移行ペプチドにＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基を結合させたものを遺伝子導入補助剤として、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質に共有結合させることによって、（従来の遺伝子導入ベクターでは）遺伝子導入が困難であった血球系癌等へ適用域を拡大されること、及び細胞種に関らず（レセプター発現の有無に関らず）、遺伝子導入活性が非常に強いものとなることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、請求項１に係る発明は、細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤であって、該細胞内移行ペプチドにＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基を結合させたことを特徴とする遺伝子導入補助剤に関する。
請求項２に係る発明は、前記細胞内移行ペプチドが、Ｔａｔペプチドである請求項１に記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項３に係る発明は、配列番号１〜４からなる群より選択される何れか一つのアミノ酸配列で示される細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤であって、該細胞内移行ペプチドにＮＨＳ基を結合させたことを特徴とする遺伝子導入補助剤に関する。
請求項４に係る発明は、前記細胞内移行ペプチドのアミノ酸配列に於いて、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる群より選択される何れか１つである請求項３に記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項５に係る発明は、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質の表面に共有結合させることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項６に係る発明は、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスがアデノウイルスである請求項５に記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項７に係る発明は、前記遺伝子導入補助剤と遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスとの間に於ける共有結合が、１０〜５０℃、１００〜１０００ｒｐｍ、５分〜６０分の条件下で行われる請求項５又は６に記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項８に係る発明は、遺伝子導入対象となる細胞種が、接着細胞または浮遊細胞である請求項１乃至７何れか記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項９に係る発明は、遺伝子導入対象となる細胞種が、ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか、或いは欠損している細胞種である請求項１乃至８何れか記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項１０に係る発明は、凍結乾燥粉末の形態である請求項１乃至９何れか記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項１１に係る発明は、遺伝子治療用に供される請求項１乃至１０何れか記載の遺伝子導入補助剤に関する。
請求項１２に係る発明は、遺伝子導入前の段階に於いて、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質表面に、請求項１乃至１１何れか記載の遺伝子導入補助剤が結合していることを特徴とする遺伝子導入用ウイルスベクターに関する。
請求項１３に係る発明は、遺伝子導入前の段階に於いて、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質表面に、請求項１乃至１１何れか記載の遺伝子導入補助剤を共有結合させることを特徴とする遺伝子導入方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明にかかる『ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基を結合させた細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤』を、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質表面に共有結合させたことを特徴とするウイルスベクターは、従来の遺伝子導入ベクター（ＡｄやＡｄＲＧＤ等）では、遺伝子導入が困難であった一部の癌細胞や血球系細胞（ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか、或いは欠損している細胞種）に対しても、十分な遺伝子導入効果を発揮することができる（「適用域の拡大」）。同時に、従来の遺伝子導入ベクターでも遺伝子導入が可能であった細胞種に於いても、従来のものと比して、格段に高い遺伝子導入活性を発揮することができる（「遺伝子導入効率の向上」）。
即ち、レセプター低発現の細胞に対する遺伝子導入（ＣＡＲ、インテグリン非依存的な遺伝子導入）を可能とするので、癌遺伝子治療における（Ａｄなどの）ウイルスベクターの適用域拡大が図れると同時に、あらゆる細胞種（レセプター発現の有無を問わず）に於いて、生体内（インビボ）における投与量低減を達成し得る（即ち、より低用量で臨床適用できるので、副作用軽減に資する）遺伝子導入ベクターとなる。
又、あらゆる細胞に対して効率良く遺伝子導入が可能なので、遺伝子導入ツールとして基礎研究で応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、Ｔａｔペプチドをはじめとする細胞内移行ペプチドにＮＨＳ基が結合したものを遺伝子導入補助剤として、（遺伝子導入前の段階に於いて）ウイルスベクターの外殻蛋白質に共有結合させることによって、遺伝子導入が困難であった一部の癌細胞や血球系細胞（ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が、乏しいか或いは欠損している細胞種）等へ適用域を拡大されると同時に、（従来のウイルスベクターでも遺伝子導入可能であった細胞種に於いても）遺伝子導入活性が非常に強いものになるという知見に基づく。
従って、本発明にかかる遺伝子導入補助剤が、外殻蛋白表面に共有結合されたウイルスベクターは、生体内での遺伝子導入効率が向上した効果的な薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ；ＤＤＳ）と考えられる。
以下、本発明の実施形態について説明するが、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味であるものとし、単数形の表現は特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むものとする。
【００１２】
先ず、本発明にかかる遺伝子導入補助剤の必須成分となる「細胞内移行ペプチド（ＰＴＤ）」について説明する。細胞内移行ペプチドは、塩基性アミノ酸を多く含む１０〜２０アミノ酸からなるペプチドで、膜透過型ペプチド（Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＭＰＰ）とも呼ばれる。その細胞内移行メカニズムの詳細は不明であるが、略全ての細胞の表面に存在するヘパラン硫酸等の糖鎖を介して細胞内に移行することが示唆されている。代表的な細胞内移行ペプチドに、ＨＩＶ−１由来のＴａｔペプチド等が挙げられるが、〔表１〕に本発明に好ましく用いられる細胞内移行ペプチドを列挙する。
【００１３】
【表１】
2010041919.tif 000003
【００１４】
本発明にかかる遺伝子導入補助剤の必須成分となる「細胞内移行ペプチド」としては、〔表１〕に示されるとおり、Ｔａｔペプチド（配列番号１）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（配列番号２）、Ｒｅｖ（配列番号３）、ＶＰ２２（配列番号４）等を列挙することができるが、上記した本発明の効果（適用域の拡大、遺伝子導入効率の向上等）を発揮する為には、Ｔａｔペプチドを用いるのが最適である。Ｔａｔペプチドは、ＨＩＶの転写活性化因子に由来し、塩基性アミノ酸を多く含むペプチド配列『Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ』を有するが、細胞内移行ペプチドの中でも、特に高い細胞内移行活性を有し、蛋白、リポソーム等への細胞内への導入キャリアとしても利用されている。
細胞内移行機能（膜透過機能）を有するものであれば、〔表１〕に示された代表的な細胞内移行ペプチド以外にも、これらのアミノ配列（配列番号１〜４）において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するであっても、本発明にかかる遺伝子導入補助剤の有効成分である。
【００１５】
本発明は、上記したＴａｔペプチドに代表される細胞内移行ペプチドに、「ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基」を結合させたものを「遺伝子導入」の補助剤として、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質に共有結合させることによって、遺伝子導入が困難であった一部の癌細胞や血球系細胞等へ適用域が拡大されると同時に、「遺伝子導入効率」および「遺伝子導入活性」そのものも（より一層）高めるものである。
本明細書において「遺伝子導入」とは、目的のポリヌクレオチド配列（核酸）を細胞内に導入することを意味する。又、遺伝子導入とは、該核酸が導入された細胞内でその核酸の作用を発揮することであってもよい。例えば、発現単位（プロモーターおよびその下流に連結された遺伝子）を含む核酸を遺伝子導入することにより、該発現単位にコードされる遺伝子が細胞内で発現（転写、翻訳、またはその両方）する。
本明細書において「遺伝子導入効率」とは、細胞への核酸の導入の効率をいい、例えば、全細胞中のトランスフェクションされた細胞の割合、細胞集団における核酸の取り込み量、または全細胞集団における導入遺伝子の発現レベルである。該遺伝子が細胞内で発現される場合は、好ましくは、全細胞集団における導入遺伝子の発現レベルである。発現レベルは、例えばトランスフェクションの２４時間後に測定する。
細胞集団における導入遺伝子の発現レベルは、細胞試料を調製し、全細胞蛋白質１ｍｇ相当の細胞抽出物当りの該核酸の発現量を測定する。発現量は、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベル、または該蛋白質の活性レベルにより決定することができる。
本明細書において「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出される。
【００１６】
本発明者らは、後述の実施例にも示されるとおり、Ｔａｔペプチドに「ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）基」を結合させたものを、遺伝子導入の補助剤として、アデノウイルスベクターの外殻蛋白質に共有結合させた遺伝子導入ベクター（以下「Ｔａｔペプチド修飾Ａｄ」と称す場合がある）が、ＣＡＲ陰性・陽性細胞にかかわらず、従来型Ａｄと比較して、約１０〜５００倍もの強い遺伝子発現活性を示すことを明らかとし、本発明を完成するに至った。
「ＮＨＳ基」を、上述の細胞内移行ペプチドに結合させる方法は、通常、当業者が容易に行える範囲内の実験方法であれば、特に限定されるものではない。
本発明の遺伝子導入補助剤は、有効成分となる細胞内移行ペプチド（具体的には、細胞内移行ペプチドがＴａｔペプチドの場合、そのリジン基）に「ＮＨＳ基」を結合させることにより、より強固な細胞内移行活性を（結合させた細胞内移行ペプチドに）付与するものであり、レセプター（ＣＡＲ、インテグリン等）の有無に関らず、強い遺伝子発現活性を発揮することができる。
【００１７】
上記した本発明の「ＮＨＳ基が結合した細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤」については、適宜、変化・変形をなし得るものであり、これらについても実質的に本発明の技術的範囲内に属するものである。例えば、細胞内移行ペプチドに結合させる化学リンカーとしては、ＮＨＳ基以外にも、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）、Ｎ−エチルオキシカルボニル−２−エチルオキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、Ｎ−イソブチルオキシ−カルボニル−２−イソブチルオキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＩＩＤＱ）を列挙することができる。但し、上記した本発明の効果（適用域の拡大、遺伝子導入効率の向上等）を発揮するに際しては、「ＮＨＳ基」を用いるのが望ましい。
【００１８】
Ｔａｔペプチド等の細胞内移行ペプチドにＮＨＳ基が結合したものを有効成分とする本発明の遺伝子導入補助剤は、遺伝子導入ベクターとして使用される「ウイルス（不活性化させたもの）」の外殻蛋白質の表面に共有結合させることによって、従来のウイルスベクター（ＡｄやＡｄＲＧＤ等）では遺伝子導入が困難であった一部の癌細胞や血球系細胞に対しても、十分な遺伝子導入効果を発揮し得る。
本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルス等が挙げられるが、本発明においてより好ましく使用されるウイルスは「アデノウイルス」である。アデノウイルスは、広範な種類の細胞・組織に分裂期・静止期を問わず効率良く遺伝子導入できることに加え、哺乳動物への遺伝子導入ベクターとして、一過性に高い遺伝子導入効率及び発現効率を示すので、本発明の目的（適用域の拡大／遺伝子導入効率の向上等）を達成する為（又、本発明の遺伝子導入補助剤によって修飾されるウイルスベクターとして）、最適と考えられるからである。
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス（例えば、アデノウイルス）について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、当業者が通常行い得る種々の手段よって達成される。
【００１９】
本発明の遺伝子導入補助剤と、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスとの間に於ける「共有結合」は、通常、当業者が容易に行える範囲内の実験方法であれば、特に限定されるものではないが、効率良く、前記遺伝子導入補助剤とウイルスベクターとの複合体（例えば「Ｔａｔペプチド修飾Ａｄ」）を作製する為には、１０〜５０℃、１００〜１０００ｒｐｍ、５分〜６０分の条件下で（共有結合が）行われるのが望ましい。ここで本発明の遺伝子導入補助剤には、細胞内移行ペプチドにＮＨＳ基が結合しているので、（ＮＨＳ基の反応性により）ウイルスベクターと共有結合し易いものとなっている（図３参照）。
本発明の遺伝子導入補助剤が、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質の表面に共有結合したか否かの確認は、通常、当業者が容易に行える範囲内の実験方法で行うことができ、具体的には、分子量の観点から『ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結合確認』（図４参照）や、Ｔａｔペプチド等の細胞内移行ペプチドは「＋」に滞電していることから『表面電価（ｍＶ）』等によって（間接的に）結合の有無を確認することができる。
【００２０】
本発明の遺伝子導入補助剤を、遺伝子導入前に（積極的に）ウイルスベクターの外殻蛋白質の表面に共有結合させることによって、当該遺伝子導入用ウイルスベクターの適用域は拡大し、その遺伝子導入効率も向上する（図９及び１０参照）。
即ち、遺伝子導入用ベクターとして、単に細胞内移行ペプチドとウイルスベクターを混合させたものと比べ、（前記のとおり）本発明の遺伝子導入補助剤をウイルスベクターに結合させたもの（Ｔａｔペプチド修飾Ａｄ等）を用いることにより、遺伝子導入活性（効率）等が強化される。このことは遺伝子発現の増強等にウイルス表面に結合したペプチドが関与していることを示す。
【００２１】
本発明の遺伝子導入補助剤を用いることにより、該遺伝子導入補助剤なしでトランスフェクションを行った場合に比べ、「遺伝子導入効率（活性）」は統計学的に有意（例えば、有意水準 ｐ＜０．０５）に上昇する（図５〜８及び１０参照）。即ち（遺伝子導入前の段階で）、ウイルスの外殻蛋白質表面に、本発明の遺伝子導入補助剤が共有結合した遺伝子導入用ウイルスベクターは、生体内での遺伝子導入効率（活性）が向上した効果的な薬物送達システム（ＤＤＳ）となる。遺伝子導入効率（活性）の測定は、通常、当業者が容易に行える範囲内の実験方法であれば、特に限定されるものではなく、ルシフェラーゼ活性による測定（ルシフェラーゼアッセイ）〔ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）／ｗｅｌｌ〕が例示できる。本発明の遺伝子導入補助剤による遺伝子導入効率の上昇は、該遺伝子導入補助剤なしの場合と比べ、約１０〜５００倍の上昇が（ルシフェラーゼ活性〔ＲＬＵ／ｗｅｌｌ〕で）確認できる。即ち、遺伝子導入前の段階に於いて、遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルス（アデノウイルス等）の外殻蛋白質表面に、本発明の遺伝子導入補助剤を結合させた遺伝子導入用ウイルスベクターは、その遺伝子導入効率が、約１０〜５００倍上昇するので、例えば遺伝子治療用ベクターとして臨床適用する場合、低用量で臨床適用可能である為、副作用が軽減され、非常に有益である。
【００２２】
本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合している遺伝子導入用ウイルスベクターの導入対象となる細胞種は特に限定されるものではない。即ち、小腸、鼻粘膜、皮膚組織、皮下組織、骨組織、軟骨組織等の任意の型の細胞であってもよく、その起源についてもヒト細胞やヒト以外の動物細胞、これらの他にも微生物、魚類、爬虫類、鳥類、昆虫等全ての生物種の細胞が使用できる。尚、細胞培養に関しても、特に制限されず、各細胞の種類に応じた公知の液体培地を用いて、公知の培養条件に従って行うことができる。
本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合している遺伝子導入用ウイルスベクターの導入対象となる細胞種として、好ましくは「接着系細胞」や「浮遊系細胞」等の細胞種を例示することができる（後述の実施例より）。
【００２３】
本発明の遺伝子導入補助剤が結合したウイルスベクターの遺伝子導入対象となる細胞種としては、一般的に使用されている培養細胞、例えば、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞上皮癌細胞）、Ｂ１６ＢＬ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＥＬ４細胞（マウス胸腺由来Ｔ細胞）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＴ１０８０細胞（ヒト繊維肉腫細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、ＫＧ−１ａ細胞（ヒト骨髄性白血病細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
しかしながら、レセプターとなるＣＡＲ／インテグリンの何れもが発現していない為、既存の遺伝子導入用ウイルスベクター（Ａｄ，ＡｄＲＧＤ等）では、遺伝子導入が困難であった一部の癌細胞や血球系細胞等（図１及び２参照）に於いても、本発明の遺伝子導入補助剤が結合した遺伝子導入用ウイルスベクターであれば、遺伝子導入が可能（十分な遺伝子発現活性も発揮できる）である。このことから『ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか、或いは欠損している細胞種（一部の癌細胞や血球系細胞等）』が、（従来のウイルスベクターにはない有利な効果を奏するという観点から）好ましい遺伝子導入対象となる細胞種である。ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が確認できない細胞種として、具体的には「ＫＧ−１ａ細胞」が挙げられる。
【００２４】
更に、本発明の遺伝子導入補助剤が結合したウイルスベクターは、従来のウイルスベクターでも遺伝子導入が可能であった細胞種、即ち、『ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が十分に確認できる細胞種』（例えば、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅＬａ細胞等）や、『ＣＡＲの発現が確認できず、インテグリンの発現が十分に確認できる細胞種』（例えば、Ｂ１６ＢＬ６細胞等）に於いても、従来のベクターと比して、格段に高い遺伝子導入活性を発揮することができる（遺伝子導入効率の向上）。このことから、本発明の遺伝子導入補助剤が結合したウイルスベクターを遺伝子治療用ベクターとして使用する場合、低用量でも臨床適用可能なものとなる（即ち、副作用が軽減される）。
【００２５】
本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合している遺伝子導入用ウイルスベクターは『凍結乾燥粉末』の形態としても好ましく使用できる。
凍結乾燥粉末は、本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合している遺伝子導入用ウイルスベクターを凍結乾燥することによって得られるが、凍結乾燥は公知の方法を用いることができ、例えば、液体窒素で凍結後、凍結乾燥機（フィンアクア社製）により行うことができる。凍結乾燥した遺伝子導入補助剤はバイアル中に封入し、好ましくは低温で使用時まで保管する。本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合している遺伝子導入用ウイルスベクターは使用時に水で再生することができる。
【００２６】
以上、「ＮＨＳ基が結合した細胞内移行ペプチドを有効成分とする遺伝子導入補助剤」について特記したが、変化、変形をなし得るものであり、これらは本発明の技術的範囲内に属するものである。又、本発明の遺伝子導入補助剤は、アデノウイルスベクターをはじめ、現在汎用されているあらゆるウイルスベクターに適用可能である。
【００２７】
本発明の遺伝子導入補助剤を用いた遺伝子導入方法（以下「本方法」と称す）は、遺伝子導入前の段階に於いて遺伝子導入用ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質表面に、上記遺伝子導入補助剤を共有結合させたウイルスベクターを使用することを特徴とする方法であるが、ＣＡＲ依存的に感染・遺伝子発現する従来のＡｄと比較して、本方法は細胞内移行ペプチドの細胞内移行活性を利用してＡｄを細胞内に効率的且つ迅速に移行させることによって遺伝子導入効率を高める新しい発想に基づいた遺伝子導入法である。即ち、ＣＡＲ非依存的な感染・遺伝子導入経路を辿る為、数多くのＣＡＲ陰性細胞に対しても効率良く遺伝子導入・発現可能なシステムである。
【００２８】
本方法において処置の対象とされる遺伝子としては、例えば、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫系に影響を与えるポリペプチド、免疫調節因子、抗体などをコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、これらの遺伝子は、例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン２、腫瘍壊死因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球マクロファージ（ＧＭＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などをコードする遺伝子があげられるがそれらに限定されない。これら遺伝子は、本発明の遺伝子導入補助剤が結合しているウイルスベクターにおいて、核酸形態またはポリペプチドの形態で存在し得る。
【００２９】
本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合しているウイルスベクターは、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース及び水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独、或いは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアは薬学的に不活性である。
【００３０】
本発明の遺伝子導入補助剤及び該補助剤が結合している遺伝子導入用ウイルスベクターの投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頸動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、または腹腔内の投与が挙げられる。本方法は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
【００３１】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
（１）Ｔａｔペプチド修飾Ａｄの作製
本発明にかかる遺伝子導入補助剤として、ＴａｔペプチドにＮＨＳ基を結合させたもの（以下「Ｔａｔ−ＮＨＳ」と称す）を作製し、凍結状態で保存した。
凍結状態にしたＴａｔ−ＮＨＳ溶液にＡｄ希釈液を加え、Ｔａｔ−ＮＨＳを溶かした。その後、ボルテックスミキサーで混合し、３７℃、３００ｒｐｍ、３０ｍｉｎの条件下で、インキュベートすることにより、「Ｔａｔ−ＮＨＳ」が結合した遺伝子導入用アデノウイルスベクター（以下「Ｔａｔ−Ａｄ」と称す）を作製した（〔図３〕参照）。
以下に「Ｔａｔ−Ａｄ」作製の具体例（実験例１〜３）を示す。
【００３３】
〔実験例１〕
i）Ｔａｔ−ＮＨＳ
アミノ酸配列：  Ａｃ−ＧＲＫＫＲＲＥＲＲＲＰＰＱＧ−ＧＣ−ＮＨＳ
分子量      ：  約２０００
濃度（量）  ：  ５ｍｇ／５０μＬ／ｔｕｂｅ＝  ２．５×１０−６ｍｏｌ／ｔｕｂｅ
＝１．５×１０１８ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｔｕｂｅ
ii）反応条件
Ａｄの外殻蛋白質に存在するリジン残基〔７５００／ｖｐ（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）〕：「Ｔａｔ−ＮＨＳ」＝１:１０００
必要なＡｄ粒子数は、２×１０１１ｖｐ／ｔｕｂｅ
iii）「Ａｄ」，「Ｔａｔ−ＮＨＳ」懸濁液（組成）
・  Ａｄ（７×１０１２ｖｐ／ｍｌ）：    ２８．６μＬ
・  ＰＢＳ                      ：  １２１．４μＬ
・  Ｔａｔ−ＮＨＳ              ：    ５０μＬ
⇒  ２×１０１１ｖｐ／２００μＬ
iv）「Ｔａｔ−Ａｄ」作製
凍結状態にあるi）の「Ｔａｔ−ＮＨＳ」を用い、ii）の「反応条件」のもと、iii）で示した組成で懸濁液を調整し、ボルテックスミキサーで混合。次に、３７℃、３００ｒｐｍ、３０ｍｉｎの条件下で、インキュベートして「Ｔａｔ−Ａｄ」を得た。
【００３４】
〔実験例２〕
i）Ｔａｔ−ＮＨＳ
アミノ酸配列：  Ａｃ−ＧＲＫＫＲＲＥＲＲＲＰＰＱＧ−ＧＣ−ＮＨＳ
分子量      ：  約２０００
濃度（量）  ：  ５ｍｇ／５０μＬ／ｔｕｂｅ＝  ２．５×１０−６ｍｏｌ／ｔｕｂｅ＝  １．５×１０１８ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｔｕｂｅ
ii）反応条件
Ａｄ外殻蛋白に存在するリジン残基（７５００／ｖｐ）：「Ｔａｔ−ＮＨＳ」＝１：２００
必要Ａｄ粒子数は、１×１０１２ｖｐ／ｔｕｂｅ
iii）「Ａｄ」，「Ｔａｔ−ＮＨＳ」懸濁液（組成）
・  Ａｄ（２．３×１０１２ｖｐ／ｍｌ）：  ４３５μＬ
・  ＰＢＳ                        ：  ５１５μＬ
・  Ｔａｔ−ＮＨＳ                ：    ５０μＬ
⇒１×１０１２ｖｐ／１ｍＬ
iv）「Ｔａｔ−Ａｄ」作製
凍結状態にあるi）の「Ｔａｔ−ＮＨＳ」を用い、ii）の「反応条件」のもと、iii）で示した組成で懸濁液を調整し、ボルテックスミキサーで混合。次に、３７℃、３００ｒｐｍ、３０ｍｉｎの条件下で、インキュベートして「Ｔａｔ−Ａｄ」を得た。
【００３５】
〔実験例３〕
i）Ｔａｔ−ＮＨＳ
アミノ酸配列：  Ａｃ−ＧＲＫＫＲＲＥＲＲＲＰＰＱＧ−ＧＣ−ＮＨＳ
分子量      ：  約２０００
濃度（量）  ：  ２．５ｍｇ／１００μＬ／ｔｕｂｅ＝  １．２５×１０−６ｍｏｌ／ｔｕｂｅ＝  ７．５×１０１７ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｔｕｂｅ
ii）反応条件
Ａｄの外殻蛋白質に存在するリジン残基（７５００／ｖｐ）：「Ｔａｔ−ＮＨＳ」＝１:１０００
必要Ａｄ粒子数は、１×１０１１ｖｐ／ｔｕｂｅ
iii）「Ａｄ」，「Ｔａｔ−ＮＨＳ」懸濁液（組成）
・  Ａｄ（２．５×１０１２ｖｐ／ｍｌ）：  ４０μＬ
・  ＰＢＳ                      ：    ８６０μＬ
・  Ｔａｔ−ＮＨＳ              ：    １００μＬ
⇒  １×１０１１ｖｐ／１ｍＬ
iv）「Ｔａｔ−Ａｄ」作製
凍結状態にあるi）の「Ｔａｔ−ＮＨＳ」を用い、ii）の「反応条件」のもと、ボルテックスミキサーで混合し、３７℃、３００ｒｐｍ、４５ｍｉｎの条件下で、インキュベートして「Ｔａｔ−Ａｄ」を得た。
v）その他
尚、インキュベートに於ける反応時間を（３０ｍｉｎから）４５ｍｉｎに変更した点を除いては、実施例１及び２と同じ手法で「Ｔａｔ−Ａｄ」を作製したが、ＮＨＳ基の反応性を考えると、前記変更による影響はほとんどないものと考えられる。
【００３６】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結合確認
Ｔａｔ−ＮＨＳがＡｄの外殻蛋白質の表面に共有結合したか否かについて、分子量（ｋＤａ）の観点からＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
具体的には、エバポレーターを用いて２×１０１０ｖｐ（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）の「Ａｄ」および「Ｔａｔ−Ａｄ」を濃縮した。その後、ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ＋ ２ＭＥを、９５:５で混合し、前記懸濁液（Ａｄ，Ｔａｔペプチド修飾Ａｄ）に１５μＬ加えた。そして、ピペッティングした後、９６℃、５ｍｉｎの条件下で、インキュベートし、ゲル（ＰＡＧ ミニ第一 ４／２０）にアプライした。そして、２０ｍＡで電気泳動し、ＣＢＢ染色液で２時間染色、ＣＢＢ脱色液で２時間脱色した後、スキャナでゲルの画像を取り込んだ。尚、「Ｔａｔ−Ａｄ」としては、上記〔実験例２〕のサンプルを、「ｍａｒｋｅｒ」には「ＦＵＬＬ ＲＡＮＧＥ ＲＡＩＮＢＯＷ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃ＲＰＮ８００）」を用いた。
結果を〔図４〕に示す。〔図４〕のゲル画像から明らかなとおり、ｈｅｘｏｎの分子量が増大したことから、Ａｄ表面へのＴａｔ−ＮＨＳ結合が示唆された。即ち、Ｔａｔペプチド修飾Ａｄでは、通常のＡｄと比して、「Ｔａｔ−ＮＨＳ」に相当する分子量（ｋＤａ）だけ大きい結果となった。これにより、上記（１）で作製した「Ｔａｔ−Ａｄ」に於いて、Ｔａｔ−ＮＨＳがＡｄの外殻蛋白質の表面に共有結合していると考えられた。
【００３７】
（３）表面電荷（ｍＶ）による結合確認  〔Ｚｅｔａ電位測定〕
「Ａｄ」が（−）の電荷を有するのに対し、塩基性アミノ酸に富む「Ｔａｔペプチド」は正電荷（＋）を有する為、上記（１）で作製した「Ｔａｔ−Ａｄ」に於いて、Ｔａｔ−ＮＨＳが（Ａｄの外殻蛋白質表面に）結合していれば、表面電荷は（−）から（＋）にシフトしているはずである。そこで、Ｔａｔ−ＮＨＳがＡｄの外殻蛋白質の表面に共有結合しているか否かを表面電荷（ｍＶ）により確認した。具体的には、サンプルとなる「Ｔａｔ−Ａｄ」をＰＢＳで希釈し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．）により表面電荷（ｍＶ）を測定した。尚、「Ｔａｔ−Ａｄ」としては、上記〔実験例２〕のサンプルを用いた。
結果を〔表２〕に示すが、表面電荷が（＋）にシフトしていることから、即ち、Ａｄに比して、「Ｔａｔ−Ａｄ」は（＋）に帯電していることから、Ｔａｔ−ＮＨＳがＡｄの外殻蛋白質の表面に共有結合しているものと考えられた。
【００３８】
【表２】
2010041919.tif 000004
【００３９】
「Ｔａｔ−Ａｄ」の有用性を、「遺伝子導入対象（／適用対象域）」および「遺伝子発現効率（／遺伝子発現活性）」の観点から、評価／検討すべく、後述の実験を行った。
上記評価／検討に際しては、Ｔａｔ−Ａｄの比較対象として、通常のアデノウイルスベクター（Ａｄ）及びインテグリン指向性を付与した改良型Ａｄ（ＡｄＲＧＤ）を用いた。
又、上記評価／検討に際して用いられる細胞種は、接着細胞および浮遊細胞であるが、具体的には下記の〔表３〕に列挙される培養細胞を用いた。
【００４０】
【表３】
2010041919.tif 000005
【００４１】
（４）遺伝子発現効率に関する「Ｔａｔ−Ａｄ」の有用性評価（Ｂ１６ＢＬ６細胞）
Ｂ１６ＢＬ６細胞（ＣＡＲの発現が確認できず、インテグリンの発現が確認できる細胞種）に於いて、「Ｔａｔ−Ａｄ」の遺伝子発現効率（活性）をルシフェラーゼアッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）によって検討した。
併せて、Ｔａｔ−Ａｄの遺伝子発現効率（活性）が量依存的に見られるか否かについても検討した。具体的には、以下の手順に従い、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００４２】
〔手順〕Ｂ１６ＢＬ６細胞に於けるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ
１）Ｂ１６ＢＬ６細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ ｉｎ ５００μＬ ｍｅｄｉｕｍで、４８ｗｅｌｌ平底プレートに播種した。
２）２４時間、インキュベートした。
３）培地（ｍｅｄｉｕｍ）（各細胞種に対するｍｅｄｉｕｍは、上記表３参照）を吸引し、新たに４００μＬのｍｅｄｉｕｍを加えた。
４）３×１０７ｖｐ／ｍｌ、１×１０８ｖｐ／ｍｌ、３×１０８ｖｐ／ｍｌ、１×１０９ｖｐ／ｍｌに希釈した各種ベクター（「Ｔａｔ−Ａｄ」は上記実験例３のサンプルを用いた）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた（即ち、３００ｖｐ／ｃｅｌｌ、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌ、３０００ｖｐ／ｃｅｌｌ、１００００ｖｐ／ｃｅｌｌ加えた）。
５）２４時間、インキュベートした。
６）培地（ｍｅｄｉｕｍ）を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄した。
７）ＭｉｌｉＱ水で希釈したＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ ５ｘ（ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１５３１）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
８）細胞溶解液を１０μＬとり、ルミノチューブに入れた。
９）反応基質（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１５０１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を１０μＬ加え、軽くボルテックスした後、ルミノメーターで〔ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）／ｗｅｌｌ〕を測定した。
尚、ＲＬＵが１０７を超えたサンプルは、ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔで細胞溶解液を１００倍希釈し、希釈液１０μＬに基質１００μＬを加え、同様にルミノメーターで測定した。測定値を１００倍することで補正した。
【００４３】
結果を図５に示す。図５は、遺伝子発現効率について、Ｔａｔ−Ａｄの有用性を評価すべく、Ｂ１６ＢＬ６細胞に於けるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）を、「Ａｄ」、「ＡｄＲＧＤ」および「Ｔａｔ−Ａｄ」との間で比較したグラフである。
図５の横軸は、感染させたウイルス粒子数（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｃｅｌｌ）を、縦軸は、ルミノメーターで測定したルシフェラーゼ活性値〔ＲＬＵ／ｗｅｌｌ〕を示すが、この結果より、各感染ウイルス数（ｖｐ／ｃｅｌｌ）区域に於いて、「Ｔａｔ−Ａｄ」は、「Ａｄ」および「ＡｄＲＧＤ」よりも格段に高い遺伝子導入活性を示すことが明らかとなった。特に、ＣＡＲの発現が確認できないＢ１６ＢＬ６細胞に於いて、「Ｔａｔ−Ａｄ」は「Ａｄ」の４００倍のルシフェラーゼ活性、即ち、４００倍もの遺伝子導入活性を示した。更に、ＣＡＲの発現が確認できない細胞種であっても遺伝子導入が可能な「ＡｄＲＧＤ」と比較しても、格段に高い遺伝子導入活性を示した。
又、図５の結果より、Ｔａｔ−Ａｄの遺伝子発現効率（活性）は（Ａｄ，ＡｄＲＧＤ同様）量依存的に見られることについても確認された。
以上より、Ｔａｔ−ＡｄはＣＡＲ低発現のＢ１６ＢＬ６細胞に対して、従来にウイルスベクターと比して、高い遺伝子導入活性を示すことが証明された。
【００４４】
（５）遺伝子発現効率に関する「Ｔａｔ−Ａｄ」の有用性評価（接着細胞）
各種接着細胞として、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞上皮癌細胞）、ＨＴ１０８０細胞（ヒト繊維肉腫細胞）に於ける（何れもＣＡＲおよびインテグリンの発現が確認できる細胞種）、「Ｔａｔ−Ａｄ」の遺伝子発現効率（活性）をルシフェラーゼアッセイにて検討した。
具体的には、以下の手順に従い、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００４５】
〔手順〕接着細胞に於けるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ
１）各種細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ ｉｎ ５００μＬ ｍｅｄｉｕｍで、４８ｗｅｌｌ平底プレートに播種した。
２）２４時間、インキュベートした。
３）培地（ｍｅｄｉｕｍ）（各細胞種に対するｍｅｄｉｕｍは、上記表３参照）を吸引し、新たに４００μＬのｍｅｄｉｕｍを加えた。
４）１０８又は１０９ｖｐ／ｍｌに希釈した各種ベクター（「Ｔａｔ−Ａｄ」は実験例１のサンプルを用いた）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
・  １０７又は１０８ｖｐ／ｗｅｌｌ
・  １０３又は１０４ｖｐ／ｃｅｌｌ
５）２４時間、インキュベートした。
６）培地（ｍｅｄｉｕｍ）を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄した。
７）ＭｉｌｉＱ水で希釈したＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ ５ｘ（ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１５３１）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
８）細胞溶解液を１０μＬとり、ルミノチューブに入れた。
９）反応基質（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１５０１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を１０μＬ加え、軽くボルテックスにて混合した後、ルミノメーターでＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）／ｗｅｌｌを測定した。
尚、ＲＬＵが１０７を超えたサンプルは、ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔで細胞溶解液を１００倍希釈し、希釈液１０μＬに基質１００μＬを加え、同様にルミノメーターで測定した。測定値を１００倍することで補正した。
【００４６】
結果を図６に示す。図６は、遺伝子発現効率（活性）について、Ｔａｔ−Ａｄの有用性を評価すべく、各種接着細胞（ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞）に於けるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）を、「Ａｄ」、「ＡｄＲＧＤ」および「Ｔａｔ−Ａｄ」との間で比較したグラフである。
ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＨＴ１０８０細胞は、何れもＣＡＲ及びインテグリンの発現が確認できる細胞種なので、「Ａｄ」と「ＡｄＲＧＤ」との間で、その遺伝子導入活性に差異はなかった。しかしながら、「Ａｄ」及び「ＡｄＲＧＤ」と、「Ｔａｔ−Ａｄ」との間では、その遺伝子導入活性に有意な差がみられた（ｐ＜０．０１）。
又、「Ｔａｔ−Ａｄ」は、ＨｅＬａ細胞では「Ａｄ」のルシフェラーゼ活性の１０倍、Ａ５４９細胞では３０倍、ＨＴ１０８０細胞では４０倍のルシフェラーゼ活性、即ち、遺伝子導入活性を有することも示された。
以上より、Ｔａｔ−Ａｄは各種接着細胞（ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞）に対して、従来にウイルスベクターと比して、高い遺伝子導入活性を示すことが証明された。同時に、Ｔａｔ−Ａｄは、癌遺伝子治療に於けるＡｄの適用域拡大，生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における投与量低減（即ち、副作用軽減）を達成し得るベクターであることが示された。
【００４７】
次に、接着細胞として、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＢ１６ＢＬ６細胞に於ける「Ｔａｔ−Ａｄ」の遺伝子発現効率（活性）について、ルシフェラーゼアッセイにて検討した結果を図７に示す。実験手順は（夫々の細胞に於いて）上述のとおりである。
図７は、遺伝子発現効率について、Ｔａｔ−Ａｄの有用性を評価すべく、各種接着細胞（Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｂ１６ＢＬ６細胞）に於けるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）を、「Ａｄ」、「ＡｄＲＧＤ」および「Ｔａｔ−Ａｄ」との間で比較したグラフである。Ａ５４９細胞とＨＴ１０８０細胞は、何れもＣＡＲ及びインテグリンの発現が確認できる細胞種であるが、「Ａｄ」及び「ＡｄＲＧＤ」と、「Ｔａｔ−Ａｄ」との間では、その遺伝子導入活性に有意な差がみられた（ｐ＜０．０１）。又、「Ｔａｔ−Ａｄ」は、Ａ５４９細胞では「Ａｄ」のルシフェラーゼ活性（即ち、遺伝子導入活性）の３０倍、ＨＴ１０８０細胞では４０倍のルシフェラーゼ活性を有することも示された。
一方、Ｂ１６ＢＬ６細胞では、ＣＡＲの発現が確認できない（インテグリンの発現が確認できる）ので、「Ａｄ」と「ＡｄＲＧＤ」との間に於いても有意な差が見られたが、「Ｔａｔ−Ａｄ」では「ＡｄＲＧＤ」よりも更に遺伝子導入活性が確認でき、「Ａｄ」の５００倍のルシフェラーゼ活性が確認できた。
【００４８】
（６）遺伝子発現効率に関する「Ｔａｔ−Ａｄ」の有用性評価（浮遊細胞）
ＥＬ細胞（マウス胸腺由来Ｔ細胞）およびＫＧ−１ａ細胞（ヒト骨髄性白血病細胞）に於いて、「Ｔａｔ−Ａｄ」の遺伝子発現効率（活性）をルシフェラーゼアッセイにて（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）検討した。尚、ＥＬ細胞は、ＣＡＲとインテグリン、双方の発現が確認できる細胞種で、ＫＧ−１ａ細胞は、ＣＡＲとインテグリン、双方の発現が確認できない細胞種である。具体的には、以下の手順に従い、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００４９】
〔手順〕浮遊細胞に於けるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ
１）各種細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ ｉｎ ４００μＬ ｍｅｄｉｕｍ（各細胞種に対するｍｅｄｉｕｍは、上記表３参照）で、４８ｗｅｌｌ平底プレートに播種した。
２）２４時間、インキュベートした。
３）１０９ｖｐ／ｍｌに希釈した各種ベクター（「Ｔａｔ−Ａｄ」は実験例１のサンプルを用いた）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
・１０８ｖｐ／ｗｅｌｌ      ・１０４ｖｐ／ｃｅｌｌ
４）２４時間、インキュベートした。
５）細胞懸濁液を１００μＬ、ルミノチューブに採った。
６）Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ２６１０）を１００μＬ加えた。
７）常温で数分間放置した。
８）軽くボルテックスにて混合した後、ルミノメーターによってＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）／ｗｅｌｌを測定した。
【００５０】
結果を図８に示す。図８は、遺伝子発現効率（活性）について、Ｔａｔ−Ａｄの有用性を評価すべく、各種浮遊細胞（ＥＬ細胞、ＫＧ−１ａ細胞）に於けるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）を、「Ａｄ」、「ＡｄＲＧＤ」および「Ｔａｔ−Ａｄ」との間で比較したグラフである。
ＥＬ細胞は、ＣＡＲ及びインテグリンの発現が確認できる細胞種なので、「Ａｄ」と「ＡｄＲＧＤ」との間で、そのルシフェラーゼ活性（遺伝子導入活性）に顕著な差異はみられなかったが、「Ｔａｔ−Ａｄ」は、「Ａｄ」および「ＡｄＲＧＤ」と比べ、格段に高いルシフェラーゼ活性を示し、「Ａｄ」の５倍のルシフェラーゼ活性が確認できた。
一方、ＫＧ−１ａ細胞は、ＣＡＲ及びインテグリン何れの発現も確認できない細胞種なので、「Ａｄ」および「ＡｄＲＧＤ」では十分な遺伝子導入活性を発揮することができないが、「Ｔａｔ−Ａｄ」はＫＧ−１ａ細胞に於いても、十分な遺伝子導入活性を示すことができ、「Ａｄ」の１０倍のルシフェラーゼ活性を有することが確認された。
以上より、Ｔａｔ−Ａｄは、従来のウイルスベクターでは、遺伝子導入が困難であった細胞種（ＣＡＲ及びインテグリン双方の発現が乏しいか、或いは欠損している細胞種）に於いて、十分な遺伝子導入効果を発揮できることが示された。同時に、従来のウイルスベクターでも遺伝子導入が可能であった細胞種に於いても、従来のものと比して、格段に高い遺伝子導入活性を発揮することができることも示された。
【００５１】
（７）遺伝子導入ベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質の表面に「Ｔａｔ−ＮＨＳ」を共有結合させることによる遺伝子発現活性（効率）の比較（Ｂ１６ＢＬ６細胞）
「Ｔａｔ−ＮＨＳ」を、遺伝子導入前に、（積極的に）ウイルスベクターの外殻蛋白質の表面に共有結合させることによる遺伝子発現活性（効率）の影響を評価／検討する為に、Ｂ１６ＢＬ６細胞に於いて、「Ｔａｔ−Ａｄ」と「Ｔａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｅｄ Ａｄ（ＮＨＳ基を付与していないＴａｔペプチドとＡｄを混合し、非特異的に吸着させたもの）」とを（ルシフェラーゼアッセイにより）比較した（図９参照）。
尚、「Ｔａｔ−Ａｄ」としては、上記〔実験例３〕のサンプルを用い、実験手順（ルシフェラーゼアッセイ等）およびサンプルとなる「Ｔａｔ−Ａｄ」は上述のとおりである。又、遺伝子発現活性の比較対象として、「Ａｄ」および「ＡｄＲＧＤ」も用いた。
【００５２】
ルシフェラーゼアッセイによる検討結果を図１０に示す。
図９及び１０は、遺伝子発現効率（活性）について、遺伝子導入前に（積極的に）アデノウイルスの外殻蛋白質の表面に共有結合させることによる有用性を評価すべく、Ｂ１６ＢＬ６細胞に於けるルシフェラーゼアッセイにより、「Ａｄ」、「ＡｄＲＧＤ」、「Ｔａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｅｄ Ａｄ」及び「Ｔａｔ−Ａｄ」との間で比較したグラフである。
図１０からも明らかなとおり、「Ｔａｔ−Ａｄ」は「Ｔａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｅｄ Ａｄ」のルシフェラーゼ活性よりも顕著に高かった。
このことは、「Ｔａｔ−Ａｄ」をベクターとして使用されるウイルス（この場合、Ａｄ）と単に混合する場合と比べ、顕著に遺伝子導入活性が上昇することを示す。即ち、遺伝子導入前にベクターとして使用されるウイルスの外殻蛋白質表面に「Ｔａｔ−ＮＨＳ」を共有結合させることによって、従来のウイルスベクターや、単に細胞内移行ペプチドとウイルスベクターとを混合しただけのものと比して、顕著に遺伝子導入の活性が増強されることが示された。
以上より、遺伝子発現の増強には、ベクターとして使用されるウイルスの表面に化学的に結合した「Ｔａｔ−ＮＨＳ」が関与していることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＡｄおよびＡｄＲＧＤの細胞内侵入様式を、レセプターとの関係で示した図である。
【図２】Ａｄ、ＡｄＲＧＤおよびＴａｔ修飾Ａｄの細胞内侵入様式を、レセプターとの関係で示した図である。
【図３】Ｔａｔ修飾Ａｄ作製の具体例を示した図である。
【図４】ＡｄとＴａｔ−ＮＨＳとの結合の確認をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した図である。
【図５】Ｂ１６ＢＬ６細胞に於ける遺伝子発現効率を「Ａｄ、ＡｄＲＧＤおよびＴａｔ修飾Ａｄ」との間で比較したグラフである。
【図６】各種接着細胞（ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞）に於ける遺伝子発現活性を「Ａｄ、ＡｄＲＧＤおよびＴａｔ修飾Ａｄ」との間で比較したグラフである。
【図７】各種接着細胞（Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｂ１６ＢＬ６細胞）に於ける遺伝子発現活性を「Ａｄ、ＡｄＲＧＤおよびＴａｔ修飾Ａｄ」との間で比較したグラフである。
【図８】各種浮遊細胞（ＥＬ細胞、ＫＧ−１ａ細胞）に於ける遺伝子発現効率を「Ａｄ、ＡｄＲＧＤおよびＴａｔ修飾Ａｄ」との間で比較したグラフである。
【図９】「Ｔａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｉｘｅｄ Ａｄ」および「Ｔａｔ修飾Ａｄ」を表した模式図である。
【図１０】遺伝子発現活性を「Ａｄ、ＡｄＲＧＤ、Ｔａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｉｘｅｄ ＡｄおよびＴａｔ修飾Ａｄ」との間で比較したグラフである。
【図１】
2010041919.tif 000006
【図２】
2010041919.tif 000007
【図３】
2010041919.tif 000008
【図４】
2010041919.tif 000009
【図５】
2010041919.tif 000010
【図６】
2010041919.tif 000011
【図７】
2010041919.tif 000012
【図８】
2010041919.tif 000013
【図９】
2010041919.tif 000014
【図１０】
2010041919.tif 000015
【配列表】
2010041919000001.app