(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪組織や骨髄等の生体組織または末梢血等の血液から幹細胞を短時間でかつ健全な状態で分離する方法の提供。【解決手段】生体組織から単離された単核球細胞を含む細胞懸濁液を親水性容器内に収容して静置することによりスフェロイドを形成させるステップＳ３と、形成されたスフェロイドをサイズにより分離するステップＳ４とを備える幹細胞の分離方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織または血液から単離された単核球細胞を含む細胞懸濁液を親水性容器内に収容して静置することによりスフェロイドを形成させるステップと、
形成されたスフェロイドをサイズにより分離するステップとを備える幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記スフェロイドを分離するステップが、フィルタによりスフェロイドを他の単核球細胞から分離する請求項１に記載の幹細胞の分離方法。
【請求項３】
前記スフェロイドを分離するステップが、クロスフローフィルトレーションによりスフェロイドを他の単核球細胞から分離する請求項２に記載の幹細胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ヒトから採取した脂肪組織を洗浄し、消化酵素液とともに攪拌することにより脂肪組織から脂肪由来細胞を単離させる生体組織処理装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この生体組織処理装置により単離された脂肪由来細胞には、幹細胞の他、他の単核球細胞が含まれているので、幹細胞のみを抽出するには、単離された脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液を疎水性処理を施したシャーレに播種して培養することにより、幹細胞の接着性を利用して、幹細胞をシャーレの底面に接着させて分離することが行われている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０５／０１２４８０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、幹細胞をシャーレに接着させて分離する従来の方法では、培養に時間がかかるという不都合がある。また、接着した幹細胞を剥離させるために、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を添加する必要があり、幹細胞にダメージが与えられるという不都合がある。さらに、幹細胞はシャーレに接着するとその性質が変化する可能性があることが報告されている。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、脂肪組織や骨髄等の生体組織または末梢血等の血液から幹細胞を短時間で、かつ健全な状態で分離することができる幹細胞の分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織または血液から単離された単核球細胞を含む細胞懸濁液を親水性容器内に収容して静置することによりスフェロイドを形成させるステップと、形成されたスフェロイドをサイズにより分離するステップとを備える幹細胞の分離方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、生体組織または血液から単離された単核球細胞を含む細胞懸濁液を親水性容器に収容すると、単核球細胞の内の幹細胞も親水性容器の底面に接着することができず、浮遊した状態に維持される。したがって、その状態で静置することにより、接着性を有する幹細胞どうしが相互に接着してスフェロイドを形成するようになる。スフェロイドは他の単核球細胞とはそのサイズが異なるので、分離するステップにおいて容易に他の単核球細胞から分離することが可能となる。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、培養処理を行うことなく単核球細胞の中から幹細胞を抽出し、タンパク質分解酵素によって培養容器から剥離することなく分離回収することができる。その結果、幹細胞を分離するまでに要する時間を短縮し、かつ、ダメージを与えることなく健全な状態の幹細胞を回収することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記スフェロイドを分離するステップが、フィルタによりスフェロイドを他の単核球細胞から分離することとしてもよい。
このようにすることで、スフェロイドを構成した幹細胞がフィルタを通過できずに捕捉され、フィルタを通過するそれよりも小さい他の単核球細胞から容易に分離することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記スフェロイドを分離するステップが、クロスフローフィルトレーションによりスフェロイドを他の単核球細胞から分離することとしてもよい。
このようにすることで、スフェロイドは主流路を流れて回収され、サイズの小さい単核球細胞はメンブレンを通過して簡易に分離される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、脂肪組織や骨髄等の生体組織または末梢血等の血液から幹細胞を短時間で、かつ健全な状態で分離することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る幹細胞の分離方法について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る幹細胞の分離方法は、図１に示されるように、生体組織、例えば、脂肪組織から単核球細胞を単離するステップＳ１と、単離された単核球細胞から赤血球を除去するステップＳ２と、赤血球が除去された単核球細胞からスフェロイドを形成させるステップＳ３と、形成されたスフェロイドを他の単核球細胞から分離するステップＳ４とを含んでいる。
【００１３】
単核球細胞を単離するステップＳ１は、脂肪組織と消化酵素液とを混合して攪拌することにより行われる。脂肪組織が分解されて単核球細胞が単離された細胞懸濁液が生成される。
【００１４】
赤血球細胞を除去するステップＳ２は、ステップＳ１において生成された細胞懸濁液を遠心分離機にかけることにより、比重の差によって単核球細胞内の赤血球細胞を分離する。分離された赤血球細胞を選択的に除去することにより、赤血球細胞を含まない単核球細胞が得られる。遠心分離に代えて、細胞懸濁液に低浸透圧液を加えることにより、赤血球細胞を選択的に除去してもよい。
【００１５】
スフェロイドを形成させるステップＳ３は、ステップＳ２において得られた単核球細胞を親水性処理（例えば、２−methacryloyloxyethylphosphorylcholine処理）を施したディッシュに単核球細胞を播いて放置することにより行われる。ディッシュとしては任意のものを採用できるが、Ｕ底のマルチウェルプレートを採用することにより、スフェロイドの形成が促進される。これにより、図２に示されるように、スフェロイドが形成される。
【００１６】
スフェロイドを分離するステップＳ４は、スフェロイドより小さく単核球細胞単体より大きな口径の透孔を有する多孔質のフィルタに、ステップＳ３において形成されたスフェロイドを含む細胞懸濁液を透過させる。これにより、スフェロイドがフィルタに捕捉されて残り、それよりもサイズの小さい他の単核球細胞が、フィルタに捕捉されずに透孔を透過してスフェロイドから分離される。そして、フィルタに捕捉されたスフェロイドを逆洗等によってフィルタから取り出すことにより、スフェロイドが回収される（図３参照。）。
【００１７】
分離回収されたスフェロイドを播種して分化誘導培地内において培養した結果、脂肪への分化（図４参照。）および骨分化（図５参照。）が確認され、スフェロイドが多分化能を有する幹細胞であることが確認された。
【００１８】
このように、本実施形態に係る細胞分離方法によれば、細胞懸濁液をディッシュに播いて培養することにより、ディッシュの底面に接着した細胞を幹細胞として回収する従来の方法とは異なり、培養を行うことなく幹細胞を分離できる。したがって、従来、培養に要していた時間を節約することができ、短時間の内に幹細胞を回収することができる。
【００１９】
また、従来の培養による幹細胞の分離方法では、培養によってディッシュに接着した幹細胞を剥離する作業を伴わないので、タンパク質分解酵素等によって回収される幹細胞がダメージを受けることを防止でき、健全な幹細胞を回収することができる。
【００２０】
なお、本実施形態においては、フィルタによりスフェロイドを他の単核球細胞から分離することとしたが、これに代えて、図６に示されるように、クロスフローフィルトレーションフィルタ（例えば、seiler社製）１により分離することとしてもよい。
【００２１】
クロスフローフィルトレーションフィルタ１は、スフェロイドＡより小さく単核球細胞Ｂより大きな（例えば、口径１０μｍ〜５０μｍ、好ましくは５０μｍ〜１００μｍの）透孔を有する多孔質体２に設けられた主流路３内面にクロスフローメンブレン４を配置したもので、主流路３にスフェロイドＡや他の単核球細胞Ｂを含む細胞懸濁液Ｃを流動させるようになっている。これにより、クロスフローメンブレン４および多孔質体２を通過して主流路３から他の単核球細胞Ｂを排出して、主流路３の出口でスフェロイドＡを回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態に係る幹細胞の分離方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の分離方法のステップＳ３においてスフェロイドが形成されている状態を示す顕微鏡写真である。
【図３】図１の分離方法のステップＳ４において分離されたスフェロイドを示す顕微鏡写真である。
【図４】図１の分離方法により分離されたスフェロイドを分化誘導培地を用いて培養した結果、得られた脂肪を示す顕微鏡写真である。
【図５】図１の分離方法により分離されたスフェロイドを分化誘導培地を用いて培養した結果、得られた骨を示す顕微鏡写真である。
【図６】図１の分離方法のステップＳ４に用いられるフィルタの変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００２３】
Ｓ３  スフェロイドを形成させるステップ
Ｓ４  スフェロイドを分離するステップ
１  クロスフローフィルトレーションフィルタ（フィルタ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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