(57)【要約】【課題】水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体に対して、水溶性高分子を変質させることなく結合させたリンカー分子を介して抗体を修飾することで、分散性と触媒活性を失うことなく選択的な結合能を付与した、酸化チタン−抗体複合体である膀胱癌治療剤の提供。【解決手段】本発明の膀胱癌治療剤は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を備えた酸化チタン複合体と、その表面に結合されてなるリンカー分子と、リンカー分子を介して結合されてなる抗体とを含んでなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を備えてなる、酸化チタン複合体と、
該酸化チタン複合体の表面に結合されてなるリンカー分子と、
該リンカー分子を介して結合されてなる抗体と
を含んでなり、超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン−抗体複合体である膀胱癌治療剤であって、
前記膀胱癌治療剤が、膀胱内に注入されて抗原である膀胱癌細胞の表面抗原と結合され、排尿もしくは膀胱内洗浄によって未結合の膀胱癌治療剤が除去されることにより投与されることを特徴とする、膀胱癌治療剤。
【請求項２】
前記リンカー分子が、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０の飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物であって、
該官能基を介して前記酸化チタンと結合され、
該官能基同士で重合することが無い、請求項１に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項３】
前記リンカー分子の結合量は前記酸化チタン粒子の質量あたり、１×１０−６〜１×１０−３  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇであることを特徴とする、請求項２に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項４】
前記リンカー分子がカテコール類である、請求項２または３に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項５】
前記リンカー分子が、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項６】
前記水溶性高分子が重量平均分子量５０００〜４００００である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項７】
前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミンの群から選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項８】
２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項９】
前記抗体が膀胱癌細胞の表面抗原に対して特異的に結合する抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項１１】
前記リンカー分子を介してさらに蛍光分子が結合されてなる、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項１２】
前記リンカー分子を介してさらに低原子価遷移金属を含む分子が結合されてなる、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の膀胱癌治療剤と、該膀胱癌治療剤が分散される溶媒とを含んでなる、分散液。
【請求項１４】
前記溶媒が、水系溶媒である、請求項１３に記載の分散液。
【請求項１５】
前記溶媒のｐＨが５〜８である、請求項１３または１４に記載の分散液。
【請求項１６】
前記溶媒が、生理食塩水である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１７】
前記膀胱癌治療剤が、０．００１〜１質量％含有される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体に対して、水溶性高分子を変質させることなくリンカー分子を酸化チタン表面に結合させ、さらに該リンカー分子を介して抗体が結合されてなり、超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン−抗体複合体であることを特徴とする、膀胱癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化チタンはｐＨ６前後に等電点を有すると言われている。このため、酸化チタン粒子は中性付近の水系溶媒中では凝集を生じてしまい、これを均一に分散させることは極めて難しい。そのため、酸化チタン粒子を水系の分散媒に均一に分散させるため、今まで種々の試みがなされてきた。
【０００３】
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を分散剤として添加して、分散媒中における酸化チタン粒子の分散性を向上させることが知られている（特許文献１（特開平２−３０７５２４号公報）および特許文献２（特開２００２−６０６５１号公報）参照）。
【０００４】
あるいは酸化チタン微粒子に、ポリアクリル酸等の親水性高分子を、カルボキシル基を介して結合させた、表面改質酸化チタン微粒子も知られている（特許文献３（ＷＯ２００４／０８７５７７）参照）。この技術は、ポリアクリル酸等といったアニオン性ポリマーの使用を念頭としたものである。アニオン性ポリマーのもつカルボキシル基等の官能基により表面電荷を与え、それにより生体内環境に近い中性の生理食塩水においても安定した分散性を示し、かつ紫外線照射時の光触媒活性機能を有するものである。
【０００５】
更に、酸化チタンに機能性を付与する検討がなされている。例えば、前記表面改質酸化チタン微粒子に対して、前記親水性高分子の結合に関与していないカルボキシル残基に、目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化した、分子識別能を有する二酸化チタン複合体が提案されている（特許文献４（特許第３８３５７００号）参照）。この技術は、アニオン性ポリマーのもつカルボキシル基等の官能基により、分子が固定化されていても表面電荷を与え、安定した分散性を示すものである。一方で、官能基によって与えられる表面電荷は分散性に直接寄与しており、結合に関与していない残基に分子を固定化することで表面電荷は減少する。このことが固定化される分子の量等に対して制限を与える。
【０００６】
膀胱癌は、泌尿器領域の一般的な癌である。膀胱癌では浸潤（筋層浸潤とも言う）の程度がリンパ節や遠隔転移の頻度と相関することが知られている。膀胱癌の７割から８割は浸潤のない表在性の癌である。表在性膀胱癌の患者は経尿道的腫瘍切除を受け、その後、一部の患者では、膀胱内の免疫療法／化学療法で治療を受ける。その結果、表在性膀胱癌の患者の５年間の生存率は９０％に近い。しかし、表在性膀胱癌の患者の５割から７割は再発し、その内５〜２０％は筋層に浸潤する膀胱癌へと進展することが知られている。再発の原因は、膀胱癌が多発性であることが多く、手術等の治療によって除去しきれない膀胱癌細胞が残存するためである。再発防止を目的として、免疫療法／化学療法での治療が行われることがあるが、例えばＢＣＧ膀胱内注入療法においては、正常部位にも作用してしまうため、膀胱炎等の副作用を伴うことがほとんどである。いったん再発した患者はその後再発を繰り返しながら、最終的には膀胱の全摘出をよぎなくされる場合もあり、膀胱癌治療における患者のＱＯＬ（クオリティーオブライフ）の向上が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−３０７５２４号公報
【特許文献２】特開２００２−６０６５１号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８７５７７号パンフレット
【特許文献４】特許第３８３５７００号公報
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散性を保ち、超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン複合体に対して、水溶性高分子を変質させることなくリンカー分子を介して抗体を修飾することで、分散性と触媒活性を失うことなく選択的な結合能を付与した酸化チタン−抗体複合体であることを特徴とする膀胱癌治療剤の提供をその目的としている。
【０００９】
本発明者らは、今般、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体の酸化チタン表面にリンカー分子を結合させることにより、前記水溶性高分子を変質させることなく、分散性と触媒活性を保ちながら、新たに抗体を付与することが可能である、との知見を得た。
【００１０】
すなわち、本発明の膀胱癌治療剤によれば、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体の酸化チタン表面にリンカー分子を結合し、さらに該リンカー分子を介して抗体を結合させることにより、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持し、なおかつ超音波の照射による触媒活性を有し、さらに抗原と結合可能な酸化チタン−抗体複合体粒子であることを特徴とする膀胱癌治療剤を作製することができる。該抗体として膀胱癌細胞の表面抗原に対して特異的に結合する抗体を用い、膀胱癌治療剤が抗原である膀胱癌細胞の表面抗原と結合している状態で超音波照射をすることで、生成されたラジカル種が膀胱癌細胞に対して作用し、治療効果を高めることが期待できる。さらに、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波照射を行うことで、膀胱癌治療剤が集積した局所のみで効果を発揮し、副作用の低減が期待できる。また、この超音波照射において、膀胱表面の広い範囲に照射を行うことで、多発性の膀胱癌に対する治療が可能であり、手術等の治療によって除去しきれない膀胱癌細胞に対しても作用し、再発防止の効果を期待できる。よって本発明の膀胱癌治療剤は、患部に集積させ、さらに超音波を照射することにより行われる超音波膀胱癌治療を促進する薬剤として利用可能である。
【００１１】
そして、本発明の膀胱癌治療剤は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を備えてなる、酸化チタン複合体と、
該酸化チタン複合体の表面に結合されてなるリンカー分子と、
該リンカー分子を介して結合されてなる抗体と
を含んでなり、超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン−抗体複合体である膀胱癌治療剤であって、
前記膀胱癌治療剤が、膀胱内に注入されて抗原である膀胱癌細胞の表面抗原と結合され、排尿もしくは膀胱内洗浄によって未結合の膀胱癌治療剤が除去されることにより投与されることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明による分散液は、膀胱癌治療剤と、該膀胱癌治療剤が分散される溶媒とを含んでなるものである。
【００１３】
本発明によれば、水溶性高分子により水系溶媒中で分散性を保ち、超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン複合体に対して、水溶性高分子を変質させることなくリンカー分子を介して抗体を修飾することで、分散性と触媒活性を失うことなく選択的な結合能を付与した酸化チタン−抗体複合体であることを特徴とした膀胱癌治療剤およびその分散体を提供できる。
【００１４】
また、本発明による膀胱癌治療剤は、膀胱癌治療剤または膀胱癌治療剤が分散された分散液を含んでなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の膀胱癌治療剤の一例を示す図である。
【図２】例９において各種粒子について測定された、超音波照射による一重項酸素の発生に起因する、一重項酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図３】例１０において酸化チタン−抗体複合体について表面プラズモン共鳴法で測定されて得られたセンサグラムを示す図である。
【図４】例１５において酸化チタン複合体Ｅについて測定された、超音波照射後のヒドロキシラジカルの発生に起因する、ヒドロキシラジカル検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図５】例１８において試験溶液Ａ、試験溶液Ｂおよびコントロールについて、フローサイトメトリー法で測定された、腫瘍細胞への結合に伴う細胞数に対する蛍光強度分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の膀胱癌治療剤は、酸化チタン粒子と、水溶性高分子と、リンカー分子と、抗体とからなる酸化チタン−抗体複合体を含む。図１に、膀胱癌治療剤の一例を示す。図１に示されるように、複合体粒子は、酸化チタン粒子１の表面に水溶性高分子２およびリンカー分子３が結合され、リンカー分子３を介して抗体４が結合されたものである。酸化チタン粒子１と水溶性高分子２との結合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。
【００１７】
すなわち、これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性に関わらず分散性を保持できる。また、リンカー分子を介して抗体の結合を保持することが可能である。なお、本発明における結合形態は、体内における安全性の観点から、体内への投与後２４〜７２時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であればよい。生理条件での分散が安定しており、かつ超音波照射後も水溶性高分子の遊離が無く、正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合であるのが望ましい。
【００１８】
カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基は、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００１９】
そして、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子は、電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって、本発明の膀胱癌治療剤を分散させることができる。抗体を、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子に対して導入する方法については公知である。このような場合は、水溶性高分子と抗体を化学結合するために、水溶性高分子は反応性の高い極性基を含んでなることが必要である。この水溶性高分子に含まれる極性基は、抗体が結合されると失われる。このことにより、水溶性高分子の極性自体に変化が生じる。つまり、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって分散しているバランスが、抗体の結合前後において変化すると考えられる。この酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子の変質に伴う電荷あるいは水和のバランスをうまくコントロールすることでのみ達成しうる。一方、本発明における酸化チタン粒子の表面に結合したリンカー分子を介して結合した抗体については、水溶性高分子を変質させることなく結合させることにより、水溶性高分子による高い分散性を保持できる。このため、水溶性高分子の変質によって生じる分散性の変化を考慮することなく、抗体の結合に際して自由度の高い分子設計が可能である。
【００２０】
本発明の膀胱癌治療剤によれば、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体の酸化チタン表面にリンカー分子を結合し、さらに該リンカー分子を介して抗体を結合させることにより、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持する酸化チタン−抗体複合体であることを特徴とする膀胱癌治療剤を作製することができる。このように抗体を結合することにより、本発明の膀胱癌治療剤が抗原と結合することを可能とする。また、本発明の膀胱癌治療剤に対して超音波照射をすることでラジカル種を発生することができる。一般的にラジカル種は高い反応性をもつが寿命が短く、ごく僅かに拡散して近傍の物質と反応する。このため、本発明の膀胱癌治療剤が抗原と結合している状態で超音波照射をすることで、ラジカル種と抗原との反応性を高めることが期待できる。該抗体として膀胱癌細胞の表面抗原に対して特異的に結合する抗体を用い、膀胱癌治療剤が抗原である膀胱癌細胞の表面抗原と結合している状態で超音波照射をすることで、生成されたラジカル種が膀胱癌細胞に対して作用し、治療効果を高めることが期待できる。、さらに、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波照射を行うことで、膀胱癌治療剤が集積した局所のみで効果を発揮し、副作用の低減が期待できる。また、この超音波照射において、膀胱表面の広い範囲に照射を行うことで、多発性の膀胱癌に対する治療が可能であり、手術等の治療によって除去しきれない膀胱癌細胞に対しても作用し、再発防止の効果を期待できる。よって本発明の膀胱癌治療剤は、患部に集積させ、さらに超音波を照射することにより行われる超音波膀胱癌治療を促進する薬剤として利用可能である。
【００２１】
また、本発明の膀胱癌治療剤によれば、酸化チタン−抗体複合体の酸化チタン表面に対し、リンカー分子を介して光応答性の分子や放射性物質を結合することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。特に、放射性物質に関しては、安全性の観点からなるべく少ない工程で用いることが必要であるが、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体に対して、酸化チタン表面に放射性物質を結合した後に、未結合の放射性物質を適当な方法で分離除去するだけの、簡易でかつ少ない工程によって粒子の標識ができる。このため、放射性物質が外部に広がる機会が少なく、安全性の面において優れる。また、これを適当な機器により測定することで粒子のイメージングや定量の測定が可能である。そのため、本発明の膀胱癌治療剤は、体内に投与後に体内動態を確認するためのトレーサー実験用材料や、患部に超音波照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料としても利用可能である。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して結合されてなることが好ましい。これによって、酸化チタン粒子の表面に強固に結合することが可能であり、また、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を多く確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制し、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン−抗体複合体を水系溶媒中で分散させることができれば特に限定されない。本発明に用いる水溶性高分子において、電荷を有するものとしては、アニオン性またはカチオン性を有する水溶性高分子、また、電荷を有さずに水和によって分散性を与えるものとしてはノニオン性を有する水溶性高分子が挙げられ、これらの少なくとも一種を含んでなる。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、前記水溶性高分子は重量平均分子量２０００〜１０００００である。水溶性高分子の重量平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて求めた値である。前記分子量をこの範囲とすることで、水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン−抗体複合体を分散させることができる。より好ましい範囲は５０００〜１０００００であり、さらに好ましくは５０００〜４００００である。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、アニオン性を有する水溶性高分子が、本発明の膀胱癌治療剤を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能である。アニオン性を有する水溶性高分子は、複数のカルボキシル基を有するものが好適に利用可能であり、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用され、さらに好ましくはポリアクリル酸である。
【００２６】
アニオン性を有する水溶性高分子として、ポリアクリル酸を用いる場合、分散性の観点からポリアクリル酸の重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、カチオン性を有する水溶性高分子が、本発明の膀胱癌治療剤を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能である。カチオン性を有する水溶性高分子は、複数のアミノ基を有するものとしてが好適に利用可能であり、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用され、さらに好ましくはポリエチレンイミンである。
【００２８】
カチオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレンイミンを用いる場合、分散性の観点からポリエチレンイミンの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、ノニオン性を有する水溶性高分子が、本発明の膀胱癌治療剤を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能である。ノニオン性を有する水溶性高分子は、好ましくは水酸基および／またはポリオキシアルキレン基を有する高分子が挙げられる。そのような水溶性高分子の好ましい例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらを含有するコポリマーが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランであり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。
【００３０】
ノニオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレングリコールを用いる場合、分散性の観点からポリエチレングリコールの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００である。
【００３１】
以上に例示した水溶性高分子は、本発明の膀胱癌治療剤の分散性を妨げない範囲内において、これまでに記載した各要素を自由に組み合わせることができる。
【００３２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いるリンカー分子は、酸化チタン粒子表面に結合してなるが、該機能性分子はカルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を有する。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いるリンカー分子は、ａ）炭素数６〜４０の飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物である。
【００３４】
上記炭素数よりなるリンカー分子は、前記水溶性高分子と比べて分子の大きさが小さい。また、リンカー分子は酸化チタン表面に結合してなる。このため、本発明の酸化チタン−抗体複合体において、外殻に水溶性高分子が位置するのに対し、より内部の位置にリンカー分子を有する構造をとる。該外殻は本発明の膀胱癌治療剤の分散性に対する影響が最も大きい。すなわち外殻に位置する水溶性高分子に対して、内部に位置するリンカー分子が分散性に与える影響は小さくなり、好適に用いることができる。
【００３５】
本発明の膀胱癌治療剤に結合されたリンカー分子の量は、酸化チタン粒子の質量：１ｇあたり１．０×１０−６〜１．０×１０−３  ｍｏｌであり、より好ましくは１．０×１０−６〜１．０×１０−４  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである。この範囲であると、本発明の膀胱癌治療剤は生体内環境に近い、１０％タンパク質溶液を溶媒としても分散することができるため、好適に用いることができる。さらに、この範囲であると、本発明の膀胱癌治療剤は超音波を照射する際に触媒活性を有し、ラジカル種を発生することができるため、好適に用いることができる。
【００３６】
そのようなリンカー分子の例としては、芳香族化合物やアルキル構造をもつ分子等が考えられ、より具体的には、ベンゼン環をもつ分子として、カテコール、メチルカテコール、ターシャリーブチルカテコールドーパ、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルエタノール、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジヒドロキシフェニル酢酸等の、分子内にカテコールの構造を有する、カテコール類などが挙げられる。また、他の環状分子として、フェロセン、フェロセンカルボン酸、アスコルビン酸、ジハイドロキシシクロブテンジエン、アリザリン、ビナフタレンジオール等が好適に使用できる。さらに、アルキル構造をもつ分子としては、ヘキシル基、オクチル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基などのアルキル基を有する分子が挙げられる。あるいは、ヘキセニル基、オクテニル基、オレイル基などのアルケニル基、または、シクロアルキル基などの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基をもつものなどが挙げられる。
【００３７】
以上に例示したリンカー分子およびその量は、これまでに記載した各構成要素と好適に組み合わせることができる。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が意図され、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。特異的な結合能や薬剤製造の品質管理の観点等から、モノクローナル抗体が好ましい。また、これらの作製方法は特に限定されない。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、リンカー分子を介して結合する抗体としては、膀胱癌細胞の表面抗原に対して特異的に結合する抗体が望ましい。より具体的には、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＥＧＦレセプター抗体等が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の膀胱癌治療剤を積極的に膀胱癌部位へ集積させるため、リンカー分子を介して結合する分子は抗体に限らず、例えば膀胱癌細胞の表面抗原に対して特異的に結合するペプチドやアミノ酸配列であってもよい。より具体的には５−アミノレブリン酸、メチオニン、システイン、グリシン等が挙げられる。あるいは、糖鎖を含んでもよい。さらに、結合性を有する核酸を含んでいても良い。核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸塩基、ＰＮＡ等のペプチド核酸、あるいはそれらが高次構造を形成するアプタマー等を用いることもできる。以上に記載したペプチドやアミノ酸配列は、抗体と組み合わせて使用しても良い。また、これらのペプチドやアミノ酸配列はこれまでに記載した各構成要素と好適に組み合わせることができる。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、リンカー分子を介して結合する抗体以外にも、リンカー分子を介してさらに別の機能性分子が結合しても良い。機能性分子の例として光応答性分子が挙げられ、光応答性分子としては蛍光性分子を用いることができる。
【００４２】
また、機能性分子の他の例としては放射性化合物が挙げられる。放射性化合物としては同位体元素を含む化合物が挙げられ、例えば１４Ｃを有する１４Ｃ標識カテコールなどが好適に用いられる。
【００４３】
また、機能性分子の他の例としてはラジカル応答性化合物が挙げられる。ラジカル応答性化合物としては、ラジカルと特異的な反応性を示す化学発光性分子や蛍光性分子、またはスピントラップ剤を含んでなる。より具体的には、化学発光性分子や蛍光性分子として、ルミノール、海ホタルルシフェリン類縁体、シュウ酸エステル、アクリジニウム、パラヒドロキシフェニルフルオレセイン、パラアミノフェニルフルオレセイン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロローダミン６Ｇ、トランス‐１‐（２’‐メトキシビニル）ピレン、ジヒドロキシエチジウム、葉酸、（２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（インビトロジェン）、）、５−ｏｒ６−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｙ色素（アマシャムバイオサイエンス社製）、プテリンなどであり、スピントラップ剤としては、４，６−Ｔｒｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、２−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎｉｔｒｏｓｏｐｒｏｐａｎｅ、３，３，５，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ  Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ  Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、５−（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ  Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−ａｌｐｈａ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ−１−ｏｘｉｄｅ）ｎｉｔｒｏｎｅ、Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ、Ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ  Ｎ−ｏｘｉｄｅ、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｏｘｙ，  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ、２−（５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２λ５−［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ  １−ｏｘｉｄｅ、５−Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅなどである。
【００４４】
また、機能性分子の他の例としては、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メソトレキセート、シクロホスファミド、塩酸ダウノルビシン、アドリアマイシン、塩酸イダルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ネダプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、塩酸イリノテカン等から少なくとも一つの抗がん剤、ペニシリン系、マクロライド系、ニューキノロン系、テトラサイクリン系等の抗菌剤、ラミブジン、ネルフィナビル、インジナビ、サキナビル、インターフェロン、アマンタジン、アシクロビル等のウイルス治療薬、そして、ニュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン等のホルモン疾患治療薬、イブプロフェン等の鎮痛薬等が挙げられる。
【００４５】
また、機能性分子の他の例としては、低原子価遷移金属を含む分子が挙げられる。低原子価遷移金属はＨａｒｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ機構によって過酸化水素を分解してヒドロキシラジカルを発生することが知られており（活性酸素種の化学〔季刊  化学総説  Ｎｏ．７〕  日本化学会編）、低原子価遷移金属として、例えば二価の鉄イオンを用いた場合はＦｅｎｔｏｎ反応としてよく知られている。また、ヒドロキシラジカルを含む各種のラジカルは細胞障害作用を有している。そのため、リンカー分子を介してこれらの低原子価遷移金属を含む分子が結合していれば、過酸化水素が存在する限りラジカルを発生することが可能となり、細胞障害作用を持続することができる。すなわち、超音波照射を停止した後も、系中に蓄積した過酸化水素と、本発明の膀胱癌治療剤に結合した低原子価遷移金属を含む分子とのフェントン反応によって、より酸化力の強いヒドロキシラジカルを発生を継続的に行い、これに伴う持続的な抗腫瘍効果を得ることが可能である。ただし、低原子価遷移金属を含む分子として錯体を用いた場合、フリーのヒドロキシラジカルだけではなく、例えば鉄錯体を用いた場合に生じうるフェリル錯体等、いわゆるＣｒｙｐｔｏ−ＨＯ・の形で酸化反応に関与することも考えられる。このような低原子価遷移金属としては、二価の鉄の他に、三価のチタン、二価のクロム、一価の銅などが挙げられる。さらに、このような低原子価遷移金属を含む分子としては、フェロセンカルボン酸、ビシンコニン酸と一価の銅との錯体等が挙げられる。
【００４６】
以上の機能性分子はこれまでに記載した各構成要素と好適に組み合わせて、本発明の効果を妨げずに上述した各種の効果を奏することができる。
【００４７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いるリンカー分子は、上記機能性分子と酸化チタン表面に結合する官能基がさらに別のリンカーを介して結合してなる分子であってもなんら問題はない。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、前記リンカーは、例えば生体分子同士を異なる官能基同士で結合する際に用いられるヘテロバイファンクショナルなクロスリンカーなどが考えられる。リンカーの具体例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、スクシンイミジル  ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  ヨードアセテート、Ｎ−スクシンイミジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート］、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノネート、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルチチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、Ｎ−［ε−トリフルオロアセチルカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、クロロトリアジン、ジクロロトリアジン、トリクロロトリアジン、スクシンイミジル−４−ヒドラジノニコチネート−アセトンヒドラゾン、Ｃ６−スクシンイミジル−４−ヒドラジノニコチネート−アセトンヒドラゾン、スクシンイミジル−４−ヒドラジドテレフタレート−ハイドロクロライド、スクシンイミジル−４−フォルミルベンゾエイト、Ｃ６−スクシンイミジル−４−フォルミルベンゾエイト等が挙げられる。また、リンカーはさらに他のリンカー同士が結合されるような複数種類のリンカーから構成されてもよい。以上のリンカーは、これまでに記載した各構成要素と好適に組み合わせることができる。
【００４９】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子と水溶性高分子およびまたはリンカー分子との結合に用いられるジオール基としては、エンジオール基であることが好ましく、より好ましくはα−ジオール基である。これらの官能基を用いることで、優れた酸化チタン粒子への結合を実現することができる。
【００５０】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子が、アナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンであるのが好ましい。紫外線や超音波の照射による高い触媒活性を利用する場合にはアナターゼ型酸化チタンが好ましく、化粧料のように高い屈折率等の性質を利用する場合にはルチル型酸化チタンが好ましい。酸化チタン粒子としてアナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンを用いることは、これまでに記載した各構成要素と好適に組み合わせることができ、かつ上述した新たな効果を奏することができる。
【００５１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の膀胱癌治療剤は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、癌腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ（ＥＰＲ効果）により癌組織に効率的に到達して蓄積される。そして、上述の通り、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの超音波の照射によりラジカル種の特異的生成が起こる。したがって、超音波の照射により高い効率で癌組織を殺傷することができる。
【００５２】
本発明の別の好ましい態様によれば、膀胱癌治療剤が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。すなわち、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように半導体粒子同士を多官能リンカーで連結する等の方法にて結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。
【００５３】
本発明において半導体粒子の粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。具体的には、粒径分布測定装置（ゼータサイザーナノ、マルバーンインスツルメント社製）を用いて、キュミュラント解析で得られる、Ｚ−ａｖｅｒａｇｅ  ｓｉｚｅで示される値として得ることができる。
【００５４】
本発明の膀胱癌治療剤を上記の粒子径とすることは、これまでに記載した各構成要素と好適に組み合わせることができ、かつ上述した新たな効果を奏することができる。
【００５５】
本発明の膀胱癌治療剤として、単一種類の酸化チタン複合体のみならず、複数種類の半導体粒子の混合物あるいは複合物も包含する。具体例としては、酸化チタン粒子と酸化鉄ナノ粒子との複合物、酸化チタン粒子と白金との複合物、およびシリカ被覆された酸化チタン等が挙げられる。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の膀胱癌治療剤が、溶媒に分散されて分散液の形態とされてなるのが好ましい。これにより、本発明の膀胱癌治療剤を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与する薬剤として用いることができる。分散液の液性は限定されず、ｐＨ３〜１０の広範囲にわたって高い分散性を実現可能である。なお、体内投与における安全性の観点から、分散液は、ｐＨ５〜９であるのが好ましく、より好ましくは５〜８、特に中性の液性を有するのが好ましい。また、本発明の好ましい態様によれば、溶媒は水系溶媒であるのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ緩衝液または生理食塩水である。水系溶媒の好ましい塩濃度は２Ｍ以下であり、体内投与における安全性の観点から２００ｍＭ以下がより好ましい。本発明の膀胱癌治療剤は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００５７】
本発明の膀胱癌治療剤は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。特に静脈または皮下による投与経路で用いられる場合は、粒子の大きさによるＥＰＲ効果と、血中の滞留性および粒子に結合した抗体と患部に由来する抗原との相互作用を利用して、所謂ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された膀胱癌治療剤は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して集積される。
【００５８】
本発明の膀胱癌治療剤は、患部に近い血管や臓器等を経由する投与経路で用いられる場合は、生体内環境での高い分散性および粒子に結合した抗体と患部に由来する抗原との相互作用により、所謂局所ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された膀胱癌治療剤は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して集積される。
【００５９】
本発明の膀胱癌治療剤を用いて膀胱癌を治療するため、本発明の膀胱癌治療剤を膀胱内注入し、一定の期間の排尿もしくは膀胱内洗浄によって結合しなかった膀胱癌治療剤を除去した後、膀胱癌治療剤が抗原である膀胱癌細胞の表面抗原と結合している状態で、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波照射を行うことで、膀胱癌治療剤が集積した局所のみで効果を発揮し、副作用の低減が期待できる。また、この超音波照射において、膀胱表面の広い範囲に照射を行うことで、多発性の膀胱癌に対する治療が可能であり、手術等の治療によって除去しきれない膀胱癌細胞に対しても作用し、再発防止の効果を期待できる。
【００６０】
本発明の膀胱癌治療剤は、超音波または紫外線の、好ましくは超音波の照射を受け、該照射により細胞毒となることができる。この膀胱癌治療剤は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒を生成することで、細胞を殺傷することができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を殺傷することができる。本発明において、殺対象は膀胱癌細胞であるのが好ましい。すなわち、本発明の膀胱癌治療剤によれば、超音波や紫外線の照射により活性化して膀胱癌細胞を殺傷する薬剤として用いることができる。
【００６１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の膀胱癌治療剤が集積された癌組織に超音波処理が行われる。使用する超音波の周波数は、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、より好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、さらに好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で殺傷して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の膀胱癌治療剤と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の膀胱癌治療剤が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の膀胱癌治療剤を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００６２】
ところで、これらの半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を殺傷する効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあり、これらのラジカル種が細胞毒となると考えられる。その理由は以下の通り推察されるが、以下の理由はあくまで仮説であって、本発明は何ら下記説明に限定されるものではない。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時の周波数が４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲、好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲、より好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲で顕著に観察される現象であると考えられる。
【００６３】
製造方法
本発明の膀胱癌治療剤に用いられる酸化チタン複合体は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を有する水溶性高分子を酸化チタン粒子に結合させることにより、製造することができる。この方法による酸化チタン複合体の製造は、例えば、非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を有するノニオン性水溶性高分子とを分散させ、得られた分散液を８０〜２２０℃で、例えば１〜１６時間、加熱することにより行うことができる。なお、好ましい非プロトン系溶媒の例としては、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、およびジメチルスルホキシドが挙げられる。
【００６４】
本発明の膀胱癌治療剤は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介してリンカー分子を結合させ、さらにリンカー分子を介して抗体を修飾した、酸化チタン−抗体複合体にすることにより、製造することができる。この方法による膀胱癌治療剤の製造は、例えば、水溶液中に、酸化チタン複合体と、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を有するリンカー分子とを分散させ、例えば０℃〜５０℃で１〜１６時間加熱し、膜分離等で未結合のリンカー分子を除去後、酸化チタン複合体に結合したリンカー分子の有するアミノ基等の官能基を、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド剤と反応して活性化後、膜分離等で未反応のカルボジイミド剤を除去し、抗体を混合して例えば０℃〜室温で１〜１６時間反応し、膜分離等で未反応の抗体を除去することにより行うことができる。
【００６５】
あるいは、本発明の膀胱癌治療剤は、抗体と、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介してリンカー分子を例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド剤と反応して活性化後、例えば０℃〜室温で１〜１６時間反応し、膜分離等で未結合のリンカー分子を除去後、さらに水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体を混合して、例えば０℃〜室温で１〜１６時間反応し、酸化チタン表面に抗体とリンカー分子の複合体を結合し、膜分離等で未反応の抗体を除去することにより行うことができる。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を示す。特に断りのない限り、「％」は質量％を意味する。
【００６７】
例１：ポリエチレングリコールを結合した酸化チタン複合体の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３６．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００６８】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加し加水分解後得られた溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍＭとなるように混合に調整した。調整した溶液に４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を濃度５０ｍＭになるよう混合して４ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて７２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア  ＣＥ  透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００６９】
次にＤＭＦを用いて４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、先に得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調整し、２．５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１ｍｌを添加してポリエチレングリコールを結合した酸化チタン複合体の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して７２時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコールを結合した酸化チタン複合体の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５４．２ｎｍであった。
【００７０】
例２：ポリアクリル酸を結合した酸化チタン複合体の作製
例１と同様に、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７１】
この酸性酸化チタンゾル０．６ｍｌをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２０ｍｌとなるよう調整して分散させ、平均分子量５０００のポリアクリル酸（和光純薬工業製）０．３ｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノールを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えてポリアクリル酸を結合した酸化チタン複合体の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリアクリル酸を結合した酸化チタン複合体の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５３．６ｎｍ、ゼータ電位は−４５．０８ｍＶであった。
【００７２】
例３：ポリエチレンイミンを結合した酸化チタン複合体の作製
例１と同様に、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７３】
得られた酸化チタンゾル３ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、平均分子量１００００のポリエチレンイミン（和光純薬工業製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のアセトンを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えてポリエチレンイミンを結合した酸化チタン複合体の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミンを結合した酸化チタン複合体の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５７．５ｎｍ、ゼータ電位は４７．５ｍＶであった。
【００７４】
例４：酸化チタン複合体へのジヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合
例１で得られた、酸化チタン複合体とジヒドロキシフェニルプロピオン酸を用いて、超純水中で表１に示す組成で混合し、合計１ｍｌに調製した。それぞれの組成において酸化チタン複合体Ａ〜Ｃとした。
【００７５】
【表１】
2010180192.tif 000003
【００７６】
調整した溶液を室温で４時間静置した。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、吸光度の増大が認められたため、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で、フォトダイオードアレイ検出器の吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりジヒドロキシフェニルプロピオン酸の変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ  ５０μｍ  ｉ．ｄ  ×  ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ  ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量より、酸化チタン粒子の質量あたり結合したジヒドロキシフェニルプロピオン酸量は表２で表される結果であった。
【００７７】
【表２】
2010180192.tif 000004
【００７８】
さらに、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を除去した。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸の除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのジヒドロキシフェニルプロピオン酸がないことを確認した。これらからジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン複合体（酸化チタン複合体Ａ〜Ｃ）の作製を確認した。
【００７９】
例５：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン複合体への抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合
例４で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン複合体のうち、酸化チタン複合体Ｂの溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が２０ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合した。混合した溶液を室温にて１０分間反応した。脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶液交換し、酸化チタン濃度にして２０ｍｇ／ｍｌの粒子の溶液を得た。これと同一の緩衝液で調製した抗抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ：バイオマトリックス研究所製）を３ｍｇ／ｍｌになるように添加し、全量で１ｍｌの溶液とした。４℃で２４時間反応後、終濃度が０．５Ｍとなるようエタノールアミンを添加して、さらに４℃で１時間反応した。この溶液を酸化チタン濃度にして１ｍｇ／ｍｌに調製し、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に１ｍｌ付したところ、素通り画分および結合に用いた抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分にＵＶ吸収のピークが確認され、これらの画分を回収した。素通り画分は分離された分子の大きさから抗体分子を結合した酸化チタン−抗体複合体を含む溶液だと考えられた。また、抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体が単体で確認される画分については、ブラッドフォード法でタンパク質濃度を測定した結果、反応前後で抗体濃度の減少が確認された。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン複合体の、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して膀胱癌細胞の表面抗原に対して特異的に結合する抗体分子を結合した、酸化チタン−抗体複合体が作製できることを確認した。
【００８０】
例６：酸化チタン−抗体複合体への蛍光色素の結合
例５で得られた、酸化チタン−抗体複合体を超純水にて固形成分１％の分散液とした。次に、ドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を２００ｍＭとなるよう調整した。調整した溶液と分散液を１：９で混合して１ｍｌとし、室温で４時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、ドーパミンが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりドーパミンの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ  ５０μｍ  ｉ．ｄ×６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりドーパミンは酸化チタン粒子の質量あたり４．０×１０−５  ドーパミン−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。このことからリンカー分子全体としては、酸化チタン粒子の質量あたり９．０×１０−５  リンカー分子−ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇであった。
【００８１】
さらに、この溶液１．０ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のドーパミンを除去した。ドーパミンの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのドーパミンがないことを確認した。これらからドーパミンを結合した酸化チタン−抗体複合体の作製を確認した。次にこのドーパミンを結合した酸化チタン−抗体複合体を終濃度で０．３％、またＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ピアース製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭホウ酸緩衝液中で混合調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置した。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅを除去した。ＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅがないことを確認した。得られた溶液を蛍光分光光度計にてスペクトル解析を行い、励起波長５５５ｎｍ、蛍光波長５７５ｎｍで蛍光を示すことを確認した。これらのことから、ドーパミンを結合した酸化チタン−抗体複合体へ、ドーパミンを介して蛍光分子を結合した、蛍光分子結合酸化チタン−抗体複合体の作製を確認した。
【００８２】
例７：酸化チタン複合体の分散性評価
例１で得られた酸化チタン複合体（酸化チタン複合体Ｄとする）および例４で得られた酸化チタン複合体Ａ〜Ｃを、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に対して、固形成分０．０５％になるように添加し、１時間、室温にて静置した。その後、例１と同様にゼータサイザーナノＺＳを用いて分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。結果を表３に示す。酸化チタン複合体Ａ〜Ｄにおいて、分散粒径およびゼータ電位に大きな変化がないことが確認された。
【００８３】
【表３】
2010180192.tif 000005
【００８４】
例８：酸化チタン−抗体複合体の分散性評価
例５で得られた酸化チタン−抗体複合体を、リン酸緩衝生理食塩水に対して、固形成分０．０５％になるように添加し、１時間、室温にて静置した。その後、例１と同様にゼータサイザーナノＺＳを用いて分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。その結果、分散粒径は５０．４ｎｍでゼータ電位は−７．１９ｍＶであり、例７の結果と比べて大きな変化がないことが確認された。
【００８５】
例９：酸化チタン複合体の超音波照射による一重項酸素生成能の評価
例１で得られた酸化チタン複合体（酸化チタン複合体Ｄとする）および例４で得られた酸化チタン複合体Ａ〜Ｃを、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に対して、固形成分０．０５％になるように調製した。また、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水のみを調製した。各溶液３ｍｌに対して、一重項酸素の生成を測定する試薬のＳｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をマニュアルに従い混合して試験溶液とした。超音波照射装置（オージー技研製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）を用いて、０．４Ｗ／ｃｍ２で５０％  ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で３分間超音波を照射し、測定サンプルとして照射前後の溶液を４００μｌずつ採取した。各測定サンプルについて一重項酸素生成に起因する、Ｅｘ＝４８８ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）により測定した。その結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、コントロールと比べて酸化チタン複合体Ａ〜Ｄは、超音波照射により一重項酸素をより効率的に生成することが確認された。また、酸化チタン粒子の質量あたり結合したリンカー量が多いほど、一重項酸素の生成は抑制されると考えられた。
【００８６】
例１０：酸化チタン−抗体複合体の抗原結合評価
ＳＰＲセンサによる抗原への結合確認のため、ＳＰＲセンサ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ１０００，ＢＩＡｃｏｒｅ製）にセンサチップＣ１（ＢＩＡｃｏｒｅ製）をセットし、メーカーのマニュアルに従ってＥｐＣＡＭ−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ製）の固定化反応を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＢＩＡｃｏｒｅ製）に含まれる５０μｌのＮＨＳ−ＥＤＣ混合溶液を５μｌ／ｍｉｎで流してセンサチップ表面のカルボキシル基をスクシニル化した後に、１０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５．０）に１ｇ／ｌになるよう溶解したＥｐＣＡＭ−Ｆｃキメラタンパク質の溶液を５０μｌ、流速５μｌ／ｍｉｎでロードして反応を行った。反応後、ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔに含まれる１ｍｏｌ／ｌのエタノールアミンを５０μｌ、流速５μｌ／ｍｉｎでロードして、結合に関与しなかったスクシニル基のブロッキング処理を行った。これによって約０．８ｎｇ／ｍｍ２のＥｐＣＡＭ−Ｆｃキメラタンパク質結合が得られた。次に、例５で得られた酸化チタン−抗体複合体の分散液を０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％のに調製したものを流速３０μｌ／ｍｉｎで６０μｌロードした。センサグラムの反応確認後、１００ｍｍｏｌ／ｌのｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝溶液（ｐＨ１２．０）を３０μｌ／ｍｉｎで３０μｌロードし、センサからの解離反応を行った。センサグラムの解析はＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５，ＢＩＡｃｏｒｅ製）を用いて行った。バックグラウンドとして例１で得られた酸化チタン複合体を同様にロードして得た結果を差し引いた。それらの結果は、図３に示される通りであった。これらの結果から酸化チタン−抗体複合体は抗原に対して強く結合することが示された。
【００８７】
例１１：酸化チタン複合体へのジヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合２
例１で得られた、酸化チタン複合体およびジヒドロキシフェニルプロピオン酸を用いて、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）、２）２０ｍｍｏｌ／ｌのＭＥＳ緩衝溶液（同仁化学製；ｐＨ＝６．０）、３）２０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（同仁化学製；ｐＨ＝８．１）中で、酸化チタン複合体が終濃度２％、またジヒドロキシフェニルプロピオン酸が終濃度で５０ｍｍｏｌ／ｌとなるよう混合し、合計０．８ｍｌに調製した。
【００８８】
調製した溶液を４０℃で２５時間攪拌した。それぞれの溶液について紫外−可視光域（２００−６００ｎｍ）における吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認した。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸のみを混合した溶液について、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中においては、調整後０時間と比べてほとんど変化がなかったのに対し、２）２０ｍｍｏｌ／ｌのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝６．０）および３）２０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝８．１）中においては、調整後０時間と比べて吸収スペクトルの変化が確認され、目視によっても薄赤色に変色していることが確認された。これらのことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸はｐＨ＝６．０以上において変化を生じ、不安定であると考えられた。また、酸化チタン複合体およびジヒドロキシフェニルプロピオン酸を混合した溶液について、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中においては、調整後０時間と比べて吸収スペクトルの変化が確認され、目視によっても濃茶色に変色していることが確認された。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸のみにおいては大きな変化がなかったことから、この変化は酸化チタン複合体にジヒドロキシフェニルプロピオン酸が結合、電荷移動を生じたためと考えられた。
【００８９】
次に、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中において、調整後０時間と２５時間攪拌後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で、フォトダイオードアレイ検出器の吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりジヒドロキシフェニルプロピオン酸の変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ  ５０μｍ  ｉ．ｄ  ×  ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ  ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量より、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中における酸化チタン粒子の質量あたり結合したジヒドロキシフェニルプロピオン酸量は７．７×１０−４  ジヒドロキシフェニルプロピオン酸‐ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇであった。
【００９０】
例１２：超音波照射による細胞殺傷試験
例５で得られた酸化チタン−抗体複合体を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）３ｍｌに１／１０量添加して、終濃度０．０５％および０％となるように試験溶液を調整した。各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）を用いて、１５秒間超音波照射（０．５Ｗ／ｃｍ２、５０％パルス）を行なった。ＭＴＴアッセイ（同仁化学製）でメーカーの手順書に従い細胞数を計測し、照射前の細胞数を細胞生存率１００％として、各試験溶液における細胞生存率を算出した。その結果、終濃度０．０５％においては細胞生存率７８．７％、また、終濃度０％において細胞生存率９０．３％となった。これらのことから、酸化チタン−抗体複合体の超音波照射による細胞殺傷効果が確認された。
【００９１】
例１３：酸化チタン複合体へのフェロセンカルボン酸およびドーパミンの結合
フェロセンカルボン酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を１ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ  Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、２０ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／１０となるよう混合してＤＭＦで２０ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。
【００９２】
反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ−１８ｅ  １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ  メタノール（和光純薬工業製）Ｂ  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、フェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。
【００９３】
反応溶液の残りを減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。この溶液について可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ増大が認められたため、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合したと考えられた。これらからフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン複合体の作製を確認した。
【００９４】
例１４：酸化チタン−抗体複合体へのフェロセンカルボン酸およびドーパミンの結合
例１３において、例１で得られた酸化チタン複合体の代わりに、例５で得られた酸化チタン−抗体複合体を用いた以外はまったく同様にしてフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン−抗体複合体を作製した。
【００９５】
例１５：フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン複合体の超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
例１３で得られたフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン複合体（酸化チタン複合体Ｅとする）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に対して、固形成分０．０５％になるように調製した。また、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）のみを用いた。各溶液３ｍｌを用意して試験溶液とした。超音波照射装置（オージー技研製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）を用いて、３分間超音波照射（０．４Ｗ／ｃｍ２、５０％パルス）を行い、照射後に各溶液に対して、ヒドロキシラジカルの生成を測定する試薬のヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）をマニュアルに従い混合し、室温で１５分および３０分静置、各静置時間における測定サンプルとして照射前後の溶液を４００μｌずつ採取した。各測定サンプルについてヒドロキシラジカル生成に起因する、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）により測定した。その結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、コントロールと比べて酸化チタン複合体Ｅは、超音波照射によりヒドロキシラジカルを効率的に生成することが確認された。また、酸化チタン複合体Ｅは静置時間に伴って蛍光値が増大することから、持続的にヒドロキシラジカルを生成すると考えられた。
【００９６】
例１６：ドーパミンを介した酸化チタン複合体への抗体の結合
抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ：バイオマトリックス研究所製）０．１ｍｇをＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５；Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１５３−６０５４、バイオラッド製）を用いて１．８ｍｌに調製し、そこに２５ｍｇ／１．２ｍｌの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）水溶液を０．２ｍｌ加えて室温にて１時間反応後、超純水を加えて２．５ｍｌとした溶液に対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．５）で３．２ｍｌ回収して未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ＝５０００；ミリポア製）で遠心分離（１５００ｇ、１５ｍｉｎ）して０．７ｍｌに濃縮し、酸化された抗体溶液を得た。また、２００ｍＭの塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）水溶液０．５ｍｌと７０ｍＭのスクシンイミジル−４−ヒドラジノニコチネート−アセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ；ＰＩＥＲＣＥ製）水溶液０．１ｍｌを混合し、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ８．１）および超純水で総量１ｍｌに調製し、室温にて１時間反応後、薄層クロマトグラフィーによりＳＡＮＨとドーパミンの結合を確認、ＳＡＮＨとドーパミンの複合体溶液を得た。これら、酸化された抗体溶液０．７ｍｌとＳＡＮＨとドーパミンの複合体溶液０．１ｍｌとＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５；Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１５３−６０５４、バイオラッド製）０．２ｍｌを混合して、４℃にて１６時間反応後、バッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてＰＢＳ緩衝液（リン酸生理食塩水）で溶出し、抗体とＳＡＮＨとドーパミンの複合体と、未反応のＳＡＮＨとドーパミンの複合体を除去した。こうして、抗体とＳＡＮＨとドーパミンの複合体を得た。次に、例１で得られた、５（ｗｔ／ｖｏｌ）％の酸化チタン複合体２ｍｌと、抗体とＳＡＮＨとドーパミンの複合体１ｍｌを混合し、４℃にて１６時間反応後、４４．５  ｍｍ  ＰＢＣＣ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  （ＭＷＣＯ＝３０００００；Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＰＢＭＫ０４３１０、ミリポア製）および攪拌式セルＭｏｄｅｌ８０５０（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５１２２、ミリポア製）を用いて、メーカーのプロトコルに従い１０ｐｓｉで３３４ｍｌの溶液交換に伴う、未結合の抗体とＳＡＮＨとドーパミンの複合体除去を行った。このようにして酸化チタン−抗ＥｐＣＡＭ抗体複合体粒子の分散液を得た。
【００９７】
次に、抗体として抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の代わりに抗αフェトプロテイン（抗ＡＦＰ）抗体（マウスＩｇＧ：ＮＢ０１３、日本バイオテスト研究所製）を用いた以外はまったく同様にして、酸化チタン−抗ＡＦＰ抗体複合体粒子の分散液を得た。
【００９８】
例１７：酸化チタン−抗体複合体の抗原結合評価
ＳＰＲセンサによる抗原への結合確認のため、ＳＰＲセンサ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ１０００，ＢＩＡｃｏｒｅ製）にセンサチップＣ１（ＢＩＡｃｏｒｅ製）をセットし、メーカーのマニュアルに従ってＥｐＣＡＭ−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ製）の固定化反応を行った。移動相にはリン酸緩衝液の混合溶液（１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた。ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＢＩＡｃｏｒｅ製）に含まれる２００μｌのＮＨＳ−ＥＤＣ混合溶液を３０μｌ／ｍｉｎで流してセンサチップ表面のカルボキシル基をスクシニル化した後に、９０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５．０）に１００μｇ／ｍｌになるよう溶解したＥｐＣＡＭ−Ｆｃキメラタンパク質の溶液を１８０μｌ、流速３０μｌ／ｍｉｎでロードして反応を行った。反応後、ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔに含まれる１ｍｏｌ／ｌのエタノールアミンを１５０μｌ、流速３０μｌ／ｍｉｎでロードして、結合に関与しなかったスクシニル基のブロッキング処理を行った。これによって約５００ＲＵのレスポンスが得られた。例１６で作製した０．０１（ｗｔ／ｖｏｌ）％の酸化チタン−抗ＥｐＣＡＭ抗体複合体粒子の分散液および酸化チタン−抗ＡＦＰ抗体複合体粒子をそれぞれ流速３０μｌ／ｍｉｎで９０μｌロードした。センサグラムの反応確認後、１００ｍｍｏｌ／ｌのｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝溶液（ｐＨ１２．０）を３０μｌ／ｍｉｎで１００μｌロードし、センサからの解離反応を行った。センサグラムの解析はＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５，ＢＩＡｃｏｒｅ製）を用いて行った。バックグラウンドとして例１で得られた酸化チタン複合体を同様にロードして得た結果を差し引いた。それらの結果、酸化チタン−抗ＥｐＣＡＭ抗体複合体粒子では１５０ＲＵ、酸化チタン−抗ＡＦＰ抗体複合体粒子においては３ＲＵのレスポンスを得た。これらの結果から酸化チタン−抗ＥｐＣＡＭ抗体複合体粒子は抗原に対して強く結合することが示された。また、酸化チタン−抗ＡＦＰ抗体複合体粒子は抗原に結合しなかった。
【００９９】
例１８：酸化チタン−抗体複合体の抗原結合評価（ＦＡＣＳ）
酸化チタン−抗体複合体の膀胱癌細胞に対する結合確認のため、フローサイトメロリー（ＦＡＣＳ）法を用いて評価を行った。まず対数増殖期のヒト膀胱癌細胞株ＲＴ１１２をＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液（ＰＢＳ緩衝液（リン酸生理食塩水）＋０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％ウシ血清アルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）＋２ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン４酢酸（和光純薬工業製））で２×１０５ｃｅｌｌｓの細胞数にし、５ｍｌチューブに分注後、遠心分離（１５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）して上清を除去した。そこに例１６で作製した酸化チタン−抗ＥｐＣＡＭ抗体複合体粒子の分散液をＰＢＳ緩衝液（リン酸生理食塩水）を用いて０．１（ｗｔ／ｖｏｌ）％にしたものを１ｍｌを加えて懸濁後、氷上で３０ｍｉｎ静置した。次に洗浄のためＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液を３ｍｌ加え、遠心分離（１５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）して上清を除去した。二次抗体としてＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ製）を１μｌ加え、氷上で３０ｍｉｎ静置した。次に洗浄のためＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液を３ｍｌ加え、遠心分離（１５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）して上清を除去した。標識のため、Ｓｔｒｅｐｔ  Ａｖｉｄｉｎｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ−６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１μｌ加え、氷上で３０ｍｉｎ静置した。次に洗浄のためＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液を３ｍｌ加え、遠心分離（１５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）して上清を除去した。この洗浄は２回繰り返した。そして、ＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液を２００μｌ加えて懸濁し、試験溶液Ａとした。
【０１００】
また、対数増殖期のヒト膀胱癌細胞株ＲＴ１１２をＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液（で２×１０５ｃｅｌｌｓの細胞数にし、５ｍｌチューブに分注後、遠心分離（１５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）して上清を除去した。そこに抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ：バイオマトリックス研究所製）をＰＢＳ緩衝液（リン酸生理食塩水）を用いて０．１ｍｇ／ｍｌにしたものを１ｍｌを加えて懸濁後、氷上で３０ｍｉｎ静置した。次に洗浄のためＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液を３ｍｌ加え、遠心分離（１５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）して上清を除去した。標識のため、Ｚｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ−６４７  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、メーカーのプロトコルに従い、溶液を標識した後、最終的にＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液２００μｌに懸濁し、試験溶液Ｂとした。
【０１０１】
上記で得られた試験溶液Ａ、試験溶液Ｂおよび対数増殖期のヒト膀胱癌細胞株ＲＴ１１２を２×１０５ｃｅｌｌｓの細胞数でＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＥＤＴＡ混合溶液２００μｌに懸濁したコントロールを用意し、それぞれＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン製）を用いてメーカーのプロトコルに従い、励起レーザー６３３ｎｍ、蛍光検出フィルタ６５０−６７０ｎｍの設定で検出を行った。その結果を図５に示す。コントロールにおいて蛍光強度の高い細胞群が確認されなかった。一方、試験溶液Ａ、試験溶液Ｂは同様に蛍光強度の高い細胞群が確認された。これらのことから、酸化チタン−抗ＥｐＣＡＭ抗体複合体粒子は抗原を有する膀胱癌細胞に対して強く結合することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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