(57)【要約】【課題】検出器としてチャンネル数が多い光電子倍増管を使用しても、試料から発せられる蛍光を高感度で検出することが可能で、かつ装置全体をコンパクト化することができる光学的測定装置を提供する。【解決手段】流路内を通流する試料に光を照射する光照射部３と、レーザ光が照射された試料から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出部４を備えた光学的測定装置１において、蛍光検出部４に、少なくとも、複数の光を同時に検出可能な多チャンネル光電子倍増管４９と、蛍光６を波長毎に分光する透過型回折格子４７と、透過型回折格子４７で分光された複数の光を、その光軸を相互に平行にして、多チャンネル光電子倍増管４９の各検出チャンネルに向けて出射するテレセントリック集光レンズ４８を設ける。【選択図】図１
2010117344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内を通流する試料に光を照射する光照射部と、
前記レーザ光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部と、
を有し、
前記蛍光検出部は、少なくとも、
複数の光を同時に検出可能な多チャンネル光電子倍増管と、
透過型回折格子又はプリズムからなり前記蛍光を波長毎に分光する分光器と、
前記分光器で分光された複数の光を、その光軸を相互に平行にして、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに向けて出射するテレセントリック集光レンズと、
を備える光学的測定装置。
【請求項２】
前記テレセントリック集光レンズは、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成されており、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率が９０％以上である請求項１に記載の光学的測定装置。
【請求項３】
前記分光器はプリズムで構成されており、前記テレセントリック集光レンズは非球面レンズを含んでいる請求項２に記載の光学的測定装置。
【請求項４】
前記分光器には、屈折率の温度係数が正のプリズムと負のプリズムとが少なくとも１個ずつ設けられている請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
【請求項５】
前記蛍光検出部には、前記テレセントリック集光レンズと前記多チャンネル光電子倍増管との間に、マイクロレンズアレイが配設されており、
前記テレセントリック集光レンズから出射した光は、前記マイクロレンズアレイを介して前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに入射する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
【請求項６】
前記マイクロレンズアレイは、前記多チャンネル光電子倍増管の検出チャンネル数に対応する数のシリンドリカルレンズを、長手方向が相互に平行になるように配列したものであり、
該シリンドリカルレンズの配列方向と、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルの配列方向とが一致するように配置されている請求項５に記載の光学的測定装置。
【請求項７】
前記蛍光検出部は、更に、前記試料から発せられた蛍光を集光するための対物レンズを備えており、
該対物レンズは、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成されており、焦点距離が８ｍｍ以上、開口数ＮＡが０．８以上、視野φが１５０μｍ以上である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
【請求項８】
前記蛍光検出部には、前記対物レンズと前記分光器との間に、長さが０．２〜１．５ｍｍ、幅が０．４ｍｍ以下の矩形状のスリットが配設されており、
該スリットは、その長軸が前記試料の通流方向と平行になるように配置されている請求項７に記載の光学的測定装置。
【請求項９】
前記蛍光検出部には、前記対物レンズと前記分光器との間にピンホールが配設されている請求項７に記載の光学的測定装置。
【請求項１０】
前記蛍光検出部には、前記対物レンズと前記分光器との間に、
少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光を水平偏光成分と垂直偏光成分とに分光可能な偏光ビームスプリッターと、
該偏光ビームスプリッターで分光された一の偏光成分の偏光方向を９０°回転させるフレネル菱面体と、
が配設されている請求項７乃至９のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流路を通流する微小粒子などの試料を識別するための光学的測定装置に関する。より詳しくは、特定波長のレーザ光が照射されたときに試料から発せられる蛍光を検出し、その種類などを識別する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する方法である。
【０００３】
具体的には、フローセル内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態でフローセルにレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの光検出器を用いて検出する。そして、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造などを判定する。
【０００４】
また、従来、マルチアノード光電子倍増管などのように、複数の検出チャンネルを備えるマルチチャンネル光検出器を使用したフローサイトメーターも提案されている（例えば、特許文献１，２参照）。これら特許文献１，２に記載の装置のように、マルチチャンネル光検出器を用いることにより、複数の波長域の光を同時に測定することが可能となる。また、特許文献２に記載の装置では、光検出器にマルチアノード光電子増倍管を使用し、各チャンネルで検出される光強度をフォトンカウンティングすることにより、検出感度及び再現性の向上を図っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７２８０２０４号明細書
【特許文献２】特開平５−１０９４６号公報
【非特許文献１】中内啓光監修，「細胞工学別冊  実験プロトコルシリーズ  フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１，２に記載されているような多チャンネル光検出器を使用した従来のフローサイトメーターには、以下に示す問題点がある。即ち、近年、３２チャンネルなどのようにチャンネル数が多い光電子増倍管が開発されており、これらの多チャンネル光電子増倍管を検出器として使用すると、より多くの色素を同時に検出可能となる。その一方で、チャンネル数が多い光電子増倍管を検出器として使用すると、１チャンネルあたりの検出光子数が減少するため、検出感度が低下するという問題点がある。
【０００７】
また、フローセルの代わりに、プラスチック基板内に流路が形成されたチップを使用して測定を行う場合、チップを構成するプラスチックからも蛍光が発せられるためノイズ成分が増加し、検出精度が低下するという問題点がある。このような試料以外から発せられる外乱成分は、光路中にピンホールを配設することで除去可能であるが、その場合、ピンホールの径が小さいと検出感度が低下し、大きいとノイズ成分が多くなるという問題点がある。
【０００８】
更に、フローサイトメーターなどの光学的測定装置では、試料から発せられた蛍光を特定波長毎に分離するために、回折格子、ビームスプリッター及び集光レンズなどの各種光学部品が配設されており、装置サイズが大きくなるという問題点もある。
【０００９】
そこで、本発明は、検出器としてチャンネル数が多い光電子倍増管を使用しても、試料から発せられる蛍光を高感度で検出することが可能で、かつ装置全体をコンパクト化することができる光学的測定装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る光学的測定装置は、流路内を通流する試料に光を照射する光照射部と、前記レーザ光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部と、を有し、前記蛍光検出部は、少なくとも、複数の光を同時に検出可能な多チャンネル光電子倍増管と、透過型回折格子又はプリズムからなり前記蛍光を波長毎に分光する分光器と、前記分光器で分光された複数の光を、その光軸を相互に平行にして、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに向けて出射するテレセントリック集光レンズと、を備える。
本発明の光学的測定装置においては、透過型回折格子又はプリズムにより蛍光を分光しているため、従来の反射型回折格子に比べて、蛍光の損失が少なく、省スペース化することができる。また、透過型回折格子又はプリズムで分光された光を、テレセントリック集光レンズで、多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに集光しているため、チャンネル数が多い光電子倍増管を使用しても、試料から発せられる蛍光を高感度で検出することが可能である。
特に、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成され、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率が９０％以上のテレセントリック集光レンズを使用すると、蛍光の損失が大幅に抑制され、焦点位置もより短くなる。
また、分光器がプリズムである場合は、テレセントリック集光レンズに非球面レンズが含まれていることが望ましい。
更に、分光器をプリズムで構成する場合は、屈折率の温度係数が正のプリズムと負のプリズムとが少なくとも１個ずつ設けられていることが望ましい。
一方、この光学的測定装置では、前記蛍光検出部における前記テレセントリック集光レンズと前記多チャンネル光電子倍増管との間にマイクロレンズアレイを配設し、前記テレセントリック集光レンズから出射した光が、前記マイクロレンズアレイを介して前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに入射するようにしてもよい。
その場合、前記マイクロレンズアレイとして、例えば、前記多チャンネル光電子倍増管の検出チャンネル数に対応する数のシリンドリカルレンズが、長手方向が相互に平行になるように配列されたものを使用し、該シリンドリカルレンズの配列方向と、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルの配列方向とが一致するように配置することができる。
また、前記蛍光検出部に、前記試料から発せられた蛍光を集光するための対物レンズを設けてもよく、その場合、該対物レンズとしては、例えば、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成され、焦点距離が８ｍｍ以上、開口数ＮＡが０．８以上、視野φが１５０μｍ以上のものを使用することができる。
更に、前記蛍光検出部には、前記対物レンズと前記透過型回折格子との間に、長さが０．２〜１．５ｍｍ、幅が０．４ｍｍ以下の矩形状のスリットを、その長軸が前記試料の通流方向と平行になるように配置してもよく、又はピンホールを配置してもよい。
更にまた、前記蛍光検出部における前記対物レンズと前記分光器との間には、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光を水平偏光成分と垂直偏光成分とに分光可能な偏光ビームスプリッターと、該偏光ビームスプリッターで分光された一の偏光成分の偏光方向を９０°回転させるフレネル菱面体と、を配設することもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、透過型回折格子又はプリズムで分光された光を、テレセントリック集光レンズで、多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに集光しているため、チャンネル数が多い光電子倍増管を使用しても、試料から発せられる蛍光を高感度で検出することが可能であり、更に、焦点位置が短くなるため、装置のコンパクト化も実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】（ａ）は図１に示す検出部４における各部品の配置と効率を示す模式図であり、（ｂ）は横軸に波長をとり、縦軸に回折効率をとって、透過型回折格子４７を使用した場合の波長と回折効率との関係を示すグラフ図である。
【図３】（ａ）は反射型回折格子を使用した従来の装置の検出部の構成を示す模式図であり、（ｂ）は横軸に波長をとり、縦軸に回折効率をとって、反射型回折格子を使用した場合の波長と回折効率との関係を示すグラフ図である。
【図４】（ａ）はテレセントリック集光レンズの構成例を示す図であり、（ｂ）は横軸に波長をとり、縦軸に透過率をとって、（ａ）に示すテレセントリック集光レンズにおける波長と透過率との関係を示すグラフ図である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。
【図６】図５に示すマイクロレンズアレイ５０に光が入射したときの状態を模式的に示す斜視図である。
【図７】図５に示すマイクロレンズアレイ５０に入射した光の光路の変化を模式的に示す拡大断面図であり、（ａ）はシリンドリカルレンズ５１の長軸方向から見た図であり、（ｂ）はシリンドリカルレンズ５１の配列方向から見た図である。
【図８】本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。
【図９】図８に示すスリット５２の構成を模式的に示す平面図である。
【図１０】本発明の第４の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。
【図１１】図１０に示す偏光ビームスプリッター４５の動作を模式的に示す図である。
【図１２】図１０に示すフレネル菱面体５３の動作を模式的に示す図である。
【図１３】本発明の第５の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。
【図１４】本発明の第６の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。
【図１５】図１４に示す分光器７１の配置例を示す模式図である。
【図１６】図１４に示すテレセントリック集光レンズ７９の構成例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
（透過型回折格子とテレセントリック集光レンズを用いた装置の例）
２．第２の実施の形態
（マイクロレンズアレイを配設した装置の例）
３．第３の実施の形態
（スリットを用いた装置の例）
４．第４の実施の形態
（偏光ビームスプリッターとフレネル菱面体を用いた装置の例）
５．第５の実施の形態
（散乱光測定機能などを備えた装置の例）
６．第６の実施の形態
（プリズムとテレセントリック集光レンズを用いた装置の例）
【００１４】
＜１．第１の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図１は本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の光学的測定装置１には、流路内を通流する試料にレーザ光５を照射する光照射部３と、レーザ光５が照射された試料から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出部４が設けられている。そして、この光学的測定装置１では、内部に微細な流路が形成されたチップ（以下、流路チップ２という）を使用して測定を行う。
【００１５】
［光照射部３の構成］
本実施形態の光学的測定装置１における光照射部３は、例えば、レーザ光源３１、集光レンズ３２、アナモレンズ３３ａ，３３ｂ、バンドパスフィルター３４及び対物レンズ３６を、この順に配置した構成とすることができる。ここで、バンドパスフィルター３４は、特定波長の光のみを透過し、それ以外の光は反射する特性をもつ光学フィルターである。このようなフィルターを設けることにより、不要な光成分を除去することができる。
【００１６】
また、レーザ光源３１には、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ(Second Harmonic Generation)レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Light Emitting Diode:発光ダイオード）などを使用することができるが、本発明はこれに限定されるものではなく、測定内容などに応じて適宜選択することができる。更に、光照射部３には、波長が異なる複数の光源を設けることもできる。なお、光照射部３は、特定波長の光を、流路チップ２の流路内を通流する試料に照射可能な構成であればよく、光源、レンズ及び光学フィルターなどの各種光学部品の種類及び配置は適宜選択可能であり、上述した構成に限定されるものではない。
【００１７】
［蛍光検出部４の構成］
光学的測定装置１の蛍光検出部４には、少なくとも、３２チャンネルＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの多チャンネルＰＭＴ４９と、透過型回折格子４７と、テレセントリック集光レンズ４８とが設けられている。また、蛍光検出部４には、試料から発せられた蛍光６を集光する対物レンズ４１、試料以外から発せられた外乱成分を除去するためのピンホール４４を設けることもできる。更に、必要に応じて、対物レンズ４１とピンホール４４との間に特定波長の光を反射するバンドカットフィルター４２及び集光レンズ４３ａ，４３ｂを、ピンホール４４と透過型回折格子４７間に集光レンズ４３ｃ，４３ｄを、それぞれ設けてもよい。
【００１８】
（多チャンネルＰＭＴ４９）
この蛍光検出部４に配設される多チャンネルＰＭＴ４９は、試料から発せられた蛍光６を検出する検出器であり、複数の検出チャンネルを備え、複数の光を同時に検出することができる。このようなＰＭＴでは、検出チャンネルの入射窓から入射した光子が光電面において光電子に変換され、増幅された後、電気信号として出力される。このため、多チャンネルＰＭＴ４９の光電面の量子効率が低いと、後述する構成によって各検出チャンネルに入射する光子数を多くしても、出力のポアゾン分布広がりを抑えることができない。よって、多チャンネルＰＭＴ４９は、光電面の量子効率ができるだけ高いものを使用することが望ましい。これにより、より大きな信号量を得ることができるため、検出感度を向上させることができる。具体的には、波長４９０ｎｍの光を照射したときの光電面の最大量子効率を１８％から２５％に改善すると、ＰＭＴの感度を改善前の１．５倍にすることができる。
【００１９】
（透過型回折格子４７）
また、透過型回折格子４７は、試料から発せられた蛍光６を波長毎に分光する分光器である。図２（ａ）は図１に示す検出部４における各部品の配置と効率を示す模式図であり、図２（ｂ）は横軸に波長をとり、縦軸に回折効率をとって、透過型回折格子４７を使用した場合の波長と回折効率との関係を示すグラフ図である。また、図３（ａ）は反射型回折格子を使用した従来の装置の検出部の構成を示す模式図であり、図３（ｂ）は横軸に波長をとり、縦軸に回折効率をとって、反射型回折格子を使用した場合の波長と回折効率との関係を示すグラフ図である。
【００２０】
多チャンネルＰＭＴ４９では、各検出チャンネルの間に光を検出しない不感帯が存在する。このため、図３（ａ）に示す従来の装置のように、反射型回折格子１０１から直接多チャンネルＰＭＴ４９に回折光を入射させると、不感帯を避けて各検出チャンネルに効率的に集光させることは難しく、検出効率が低下してしまう。また、各検出チャンネルに効率良く集光するため、レンズなどの光学部品を設置するには、スペースが必要であり、装置が大型化してしまうという問題がある。
【００２１】
これに対して、図２（ａ）に示すように、本実施形態の光学的測定装置１では、透過型回折格子４７を使用しているため、反射型回折格子１０１に比べて、設置スペースを要しない。このため、透過型回折格子４７と多チャンネルＰＭＴ４９との間に、集光光学系を設置するためのスペースを確保することができる。
【００２２】
更に、図２（ｂ）及び図３（ｂ）に示すように、透過型回折格子４７に、矩形溝構造を採用することにより、４００〜８００ｎｍにおいて反射型回折格子１０１と同等以上の回折効率を達成することができる。なお、透過型回折格子４７の回折効率は、少なくとも５００〜８００ｎｍの範囲において、反射型回折格子１０１と同等又はそれ以上であればよい。このように、検出器に多チャンネルＰＭＴ４９を使用した場合でも、透過型回折格子４７を使用することにより、検出効率の向上及び、蛍光検出部４の省スペース化を実現することができる。
【００２３】
（テレセントリック集光レンズ４８）
一方、テレセントリック集光レンズ４８は、透過型回折格子４７で分光された複数の光（回折光）を、その光軸を相互に平行にして、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに向けて出射するものである。このテレセントリック集光レンズ４８を、透過型回折格子４７と多チャンネルＰＭＴ４９との間に配置することにより、複数の光学部品を配置しなくても、分光された各光を多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに効率良く集光することができる。
【００２４】
また、テレセントリック集光レンズ４８は、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率が９０％以上であることが好ましい。これにより、テレセントリック集光レンズ４８での光損失を抑制し、多チャンネルＰＭＴ４９での検出効率を向上することができる。このようなテレセントリック集光レンズは、例えば、特性が異なる複数のレンズを組み合わせることで実現することができる。
【００２５】
図４（ａ）はテレセントリック集光レンズの構成例を示す図であり、図４（ｂ）は横軸に波長をとり、縦軸に透過率をとって、図４（ａ）に示すテレセントリック集光レンズにおける波長と透過率との関係を示すグラフ図である。例えばテレセントリック集光レンズ４８を、図４（ａ）に示すような形状や特性が異なる複数のレンズ４８１〜４８５を組み合わせた構成にした場合、図４（ｂ）に示すように、５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率を９０％以上にすることができる。
【００２６】
また、テレセントリック集光レンズ４８を構成する各レンズに、屈折率は大きいがアッベ数の大きい硝材からなるレンズを組み込むことにより、収差悪化を抑制しつつ、透過率を大幅に改善することができる。このような硝材としては、例えばＳＬＡＨ６０及びＳＮＰＨ２などが挙げられる。更に、レンズ表面には、多層膜からなるＡＲ（Anti-Reflection）コートが施されていることが望ましい。これにより、各レンズの反射率を低減することができる。本実施形態の光学的測定装置１で使用されるテレセントリック集光レンズ４８では、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の反射率が、０．２〜０．８％程度であることが望ましい。このようなＡＲコートとしては、例えばこの範囲の波長の光の透過率が高く、屈折率が異なる２種類の誘電体膜を、所定の膜厚で交互に積層したものなどが挙げられる。
【００２７】
（対物レンズ４１）
蛍光検出部４に配設される対物レンズ４１は、例えば、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成されたものを使用することができる。また、その特性は、焦点距離が８ｍｍ以上、開口数ＮＡが０．８以上、視野φが１５０μｍ以上であることが望ましい。対物レンズ４１の開口数ＮＡが低いと、補足できる光子数が少なくなり、量子化誤差により、信号出力がポアゾン分布に従って広がりを持つため、多チャンネルＰＭＴ４９におけるＳ／Ｎが低下する。
【００２８】
そこで、本実施形態の光学的測定装置１においては、対物レンズ４１に焦点距離が長いレンズを使用し、視野φを広げることとした。このように、広視野高開口数の対物レンズ４１で蛍光６を捕捉することにより、流路を通流する試料からの蛍光をより高効率で長時間にわたって検出することができるため、捕捉できる光子数を増やすことができる。その結果、多チャンネルＰＭＴ４９における検出感度が向上する。
【００２９】
このような対物レンズ４１は、形状や特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成することができる。例えば、対物レンズ４１を、８群１０枚のレンズで構成した場合は、全長が３０ｍｍ以下、作動距離が０．５ｍｍ以上、テレセン性（レンズからの出射光の光軸に対する倒れ角）が１度以下であることが望ましい。また、少なくとも５００〜８００ｎｍの光に対して、平均透過率が９０％以上、φ１５０μｍの視野内における波面収差が６０ｍλｒｍｓ以下、像面湾曲が１μｍ以下であることが望ましい。
【００３０】
また、前述したテレセントリック集光レンズ４８と同様に、対物レンズ４１を構成する各レンズに、屈折率は大きいがアッベ数の大きい硝材からなるレンズを組み込むことにより、収差悪化を抑制しつつ、透過率を大幅に改善することができる。更に、各レンズの表面に多層膜からなるＡＲコートを施すことにより、５００〜８００ｎｍの波長の光の反射率を抑え、検出効率を向上させることができる。
【００３１】
［光学的測定装置１の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１の動作、即ち、光学的測定装置１を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。なお、光学的測定装置１により測定される試料は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
【００３２】
本実施形態の光学的測定装置１においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、ビームカットフィルタ４２及びピンホール４４で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。その後、透過型回折格子４７により蛍光６を波長毎に分光し、分光された各波長の光を、それぞれテレセントリック集光レンズ４８を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光する。
【００３３】
上述の如く、本実施形態の光学的測定装置１では、透過型回折格子４７で分光した光を、テレセントリック集光レンズ４８により多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光しているため、少ないスペース及び部品数で、検出効率を向上させることができる。これにより、検出器に多チャンネルＰＭＴ４９を使用しても、試料から発せられる蛍光６を高感度で検出することができ、更に、装置全体をコンパクト化することが可能となる。
【００３４】
また、テレセントリック集光レンズ４８について、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率を９０％以上とすることにより、検出感度を高めることができる。更に、試料から発せられる蛍光６を捕捉する対物レンズ４１を、広視野高開口数のものにすることにより、検出感度をより向上させることができる。
【００３５】
なお、本実施形態の光学的測定装置１は、例えば、フローサイトメトリー装置及びビーズアッセイ装置などとして使用することができる。
【００３６】
＜２．第２の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
次に、本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図５は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図５においては、図１に示す第１の実施形態の光学的測定装置１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図５に示すように、本実施形態の光学的測定装置１０は、蛍光検出部１４にマイクロレンズアレイ５０が配設されている以外は、前述した第１の実施形態の光学的測定装置１と同様である。
【００３７】
［蛍光検出部１４の構成］
本実施形態の光学的測定装置１０における蛍光検出部１４には、テレセントリック集光レンズ４８と多チャンネルＰＭＴ４９との間に、マイクロレンズアレイ５０が配設されている。即ち、この光学的測定装置１０では、テレセントリック集光レンズ４８から出射した光が、マイクロレンズアレイ５０を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに入射する構成となっている。
【００３８】
（マイクロレンズアレイ５０）
図６はマイクロレンズアレイ５０に光が入射したときの状態を模式的に示す斜視図である。蛍光検出部１４に配設されるマイクロレンズアレイ５０は、図６に示すように、多チャンネルＰＭＴ４９の検出チャンネル数に対応する数のシリンドリカルレンズ５１が、その長軸が相互に平行になるように配列されたものを使用することができる。そして、このマイクロレンズアレイ５０は、シリンドリカルレンズ５１の配列方向と、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルの配列方向とが一致するように配置される。
【００３９】
例えば、多チャンネルＰＭＴ４９が０．７ｍｍ×２．５ｍｍのスリット状の検出チャンネルを３２個備えており、各検出チャンネルが１ｍｍピッチで１列に配置されている場合、結像光を多チャンネルＰＭＴ４９に投影しただけでは、検出チャンネル（検出窓）の開口率（７０％）を超えて検出することはできない。これに対して、各検出チャンネルの直前に、幅１ｍｍのシリンドリカルレンズ５１を３４個配列したマイクロレンズアレイ５０を配置すると、本来遮光されるはずの光線束を屈折させて、検出チャンネルに入射させることができる。
【００４０】
その結果、多チャンネルＰＭＴ４９の検出効率を向上させることができる。なお、３２個の検出チャンネルに対して、３４個のシリンドリカルレンズ５１を配列しているのは、樹脂の射出成形によりマイクロレンズアレイ５０を形成した場合、最外端のレンズ形状が歪む可能性があり、その影響を抑制するためである。
【００４１】
前述したように、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネル間には、不感帯が存在する。一方、本実施形態の光学的測定装置１０のように、多チャンネルＰＭＴ４９の検出面の直前にマイクロレンズアレイ５０を設置すると、不感帯を避けて、全ての光を検出チャンネルに誘導することができる。これにより、試料から発せられた蛍光６を、効率よく検出することができる。このとき、テレセントリック集光レンズ４８の焦点位置を、マイクロレンズアレイ５０のシリンドリカルレンズ５１の継ぎ目に合わせることにより、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネル間のクロストークを最小限に抑えることが可能となる。
【００４２】
［光学的測定装置１０の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１０の動作、即ち、光学的測定装置１０を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１０においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１及びサブ光源３７から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。
【００４３】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、ビームカットフィルタ４２及びピンホール４４で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。その後、透過型回折格子４７により蛍光６を波長毎に分光し、分光された各波長の光を、それぞれテレセントリック集光レンズ４８を介し、マイクロレンズアレイ５０に入射させる。
【００４４】
図７はマイクロレンズアレイ５０に入射した光の光路の変化を模式的に示す拡大断面図であり、図７（ａ）はシリンドリカルレンズ５１の長軸方向から見た図、図７（ｂ）はシリンドリカルレンズ５１の配列方向から見た図である。図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、マイクロレンズアレイ５０に入射した光は、シリンドリカルレンズ５１により、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光される。このように、多チャンネルＰＭＴ４９の検出面の直前に、マイクロレンズアレイ５０を設置すると、波長毎に分光された光を、不感帯を避けて、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに誘導することができる。
【００４５】
上述の如く、本実施形態の光学的測定装置１０では、テレセントリック集光レンズ４８と多チャンネルＰＭＴ４９との間にマイクロレンズアレイ５０を配設しているため、各検出チャンネルへの入射効率が向上する。その結果、多チャンネルＰＭＴ４９における検出感度をより高めることができる。
【００４６】
なお、本実施形態の光学的測定装置１０における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。
【００４７】
＜３．第３の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
次に、本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図８は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図８においては、図５に示す第２の実施形態の光学的測定装置１０の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図８に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１は、ピンホール４４に代えて、蛍光検出部１６にスリット５２が配設されている以外は、前述した第２の実施形態の光学的測定装置１０と同様である。
【００４８】
［蛍光検出部１５の構成］
本実施形態の光学的測定装置１１の蛍光検出部１５には、対物レンズ４１と透過型回折格子４７との間に、矩形状のスリット５２が、その長軸が試料の通流方向と平行になるように配設されている。前述したように、試料以外から発せられる外乱成分を除去するためにピンホールを使用すると、ノイズ成分を低減しつつ検出感度を向上させることは難しい。そこで、ピンホールに代えて、矩形状のスリット５２を使用すると、試料が通流する方向にのみ開口サイズを大きくすることができるため、不要な光を遮断し、試料からの蛍光６を最大限捕捉することが可能となる。
【００４９】
（スリット５２）
図９はスリット５２の構成を模式的に示す平面図である。図９に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１に配設されるスリット５２は、試料の通流方向に伸びる矩形状の開口を備えている。そして、その開口長ｌは０．２〜１．５ｍｍであり、開口幅ｗは０．４ｍｍ以下である。開口長ｌが０．２ｍｍ以下の場合、光量が減少して検出感度が低下し、開口長ｌが１．５ｍｍを超えるか、又は開口幅ｗが０．４ｍｍを超えると、ノイズ成分が多くなり検出感度が低下するからである。
【００５０】
［光学的測定装置１１の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１１の動作、即ち、光学的測定装置１１を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１１では、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１及びサブ光源３７から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。
【００５１】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、ビームカットフィルタ４２及びスリット５２で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。その後、透過型回折格子４７により蛍光６を波長毎に分光し、分光された各波長の光を、テレセントリック集光レンズ４８及びマイクロレンズアレイ５０を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光する。
【００５２】
上述の如く、本実施形態の光学的測定装置１１では、矩形状のスリットを、その長軸が試料の通流方向と平行になるように配設しているため、不要な光を遮断しつつ、試料からの蛍光６を最大限捕捉することが可能となる。これにより、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルへの入射効率が向上するため、検出感度を向上させることができる。
【００５３】
なお、本実施形態の光学的測定装置１１における上記以外の構成及び効果は、前述した第１及び第２の実施形態と同様である。
【００５４】
＜４．第４の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
次に、本発明の第４の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図１０は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図１０においては、図８に示す第３の実施形態の光学的測定装置１１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図１０に示すように、光学的測定装置１２では、蛍光６を水平方向偏光成分と垂直方向偏光成分とに分光し、その一方を回転させて他の偏光方向と揃えた後、これら２光線束をテレセントリック集光レンズ４８で結像する構成となっている。
【００５５】
［蛍光検出部１６の構成］
本実施形態の光学的測定装置１０における蛍光検出部１４には、前述した第３の実施形態の光学的測定装置１１の蛍光検出部１５の各構成要素に加えて、偏光ビームスプリッター４５と、フレネル菱面体５３とが設けられている。また、この蛍光検出部１５には、２枚の透過型回折格子４７ａ，４７ｂが設けられている。そして、一方の透過型回折格子４７ｂには、偏光ビームスプリッター４５から直接偏光成分が入射し、他方の透過型回折格子４７ａには、フレネル菱面体５３で偏光方向が回転された偏光成分が入射するようになっている。
【００５６】
更に、偏光ビームスプリッター４５とフレネル菱面体５３との間には、偏光ビームスプリッター４５から出射した偏光成分を、フレネル菱面体５３に導くミラー４６が設けられていてもよい。なお、蛍光検出部１６における上記以外の構成は、前述した第３の実施形態の光学的測定装置１１の検出部１５と同様である。
【００５７】
（偏光ビームスプリッター４５）
図１１は偏光ビームスプリッター４５の動作を模式的に示す図である。図１１に示すように、偏光ビームスプリッター４５は、入射した光を水平方向偏光成分と垂直方向偏光成分とに分離するものである。本実施形態の光学的測定装置１２で使用される偏光ビームスプリッター４５は、４５０〜８００ｎｍの波長の光を分光可能なものあればよく、これにより、分光による損失を抑制することができる。また、この偏光ビームスプリッター４５も、反射面の波長帯域特性を改善することにより、４００〜８００ｎｍの波長の光を分光可能とすることが望ましい。
【００５８】
（フレネル菱面体５３）
図１２はフレネル菱面体５３の動作を模式的に示す図である。フレネル菱面体５３は、直線偏光を円偏光に変換するものである。そして、図１２に示すように、このフレネル菱面体５３を２度通過させることにより、偏光成分の偏光方向を９０°回転することができる。即ち、このフレネル菱面体５３により、偏光ビームスプリッター４５で反射された水平方向偏光成分を、垂直方向偏光成分に変換することができる。
【００５９】
［光学的測定装置１２の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１６の動作、即ち、光学的測定装置１６を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１６においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１及びサブ光源３７から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。
【００６０】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、ビームカットフィルタ４２及びスリット５２で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。次に、偏光ビームスプリッター４５で、蛍光６を水平方向偏光成分と垂直方向偏光成分とに分光し、垂直方向偏光成分は直接透過型回折格子４７ｂに向けて出射される。一方、水平方向偏光成分は、ミラー４６を介してフレネル菱面体５３に入射し、このフレネル菱面体５３において直線偏光のまま９０°回転して垂直方向偏光成分と同じ方向に揃えられ、透過型回折格子４７ａに向けて出射される。
【００６１】
その後、垂直方向偏光成分に揃えた２本の光線束は、それぞれ透過型回折格子４７ａ，４７ｂで分光されて、２層で扇状に発散するスペクトル光となる。そして、これらを１個のテレセントリック集光レンズ４８で結像し、更に、マイクロレンズアレイ５０を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光する。
【００６２】
なお、本実施形態においては、蛍光６の偏光成分を垂直方向偏光成分に揃える場合を例に説明したが、本発明はこれに限定するものではなく、偏光ビームスプリッター４５及びフレネル菱面体５３の配置などを変更し、偏光成分を水平方向偏光成分に揃えてもよい。
【００６３】
蛍光６を特定波長毎に分光する回折格子（透過型回折格子４７ａ，４７ｂ）は、入射光の偏光に依存して回折効率が変化し、Ｐ偏光及びＳ偏光の両方に対して同時に高い回折効率を得ることは難しい。例えば、回折格子に入射する光のうち、一方向の偏光成分、特にＳ偏光入射成分の回折効率を上げることは比較的容易に実現することができるが、その場合、もう一方の偏光成分の損失が大きくなってしまう。一方、損失が大きくなる方の偏光成分を取りだして、偏光方向を直線偏光のままで９０°回転させ、回折効率が高い方に合わせ込むことで、回折効率を最大限利用することができる。しかしながら、通常の波長板を使用して広い波長帯域をもつ蛍光を、同時に同じ回転角で回転させるのは困難である。
【００６４】
これに対して、本実施形態の光学的測定装置１６では、分光検出で利用する波長帯域に対応した広帯域の偏光ビームスプリッター４５を使用しているため、どの波長の蛍光６でも損失を最大限抑制した偏光分離が可能となる。また、フレネル菱面体５３を使用しているため、波長変化の影響をほとんど受けずに、偏光成分の偏光方向を９０°回転させ、回折格子に対してＳ偏光又はＰ偏光のいずれか一方に揃えることができる。これにより、蛍光６の偏光成分を、回折効率が高い偏光方向に揃えることができるため、各検出チャンネルへの入射効率を高めることができる。その結果、多チャンネルＰＭＴ４９における検出感度が向上する。
【００６５】
なお、本実施形態の光学的測定装置１２における上記以外の構成及び効果は、前述した第１〜第３の実施形態と同様である。
【００６６】
＜５．第５の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
次に、本発明の第５の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図１３は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図１３においては、図１０に示す第４の実施形態の光学的測定装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図１３に示すように、光学的測定装置１３には、流路内を通流する試料にレーザ光５を照射する光照射部９と、試料から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出部１７に加えて、試料から発せられた散乱光７，８を検出する散乱光検出部２０，６３が設けられている。また、この光学的測定装置１３においても、前述した各実施形態の光学的測定装置と同様に、内部に微細な流路が形成された流路チップ２を使用して測定を行う。
【００６７】
［光照射部９の構成］
本実施形態の光学的測定装置１３の光照射部９には、励起光（レーザ光５）の照射部を、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）５６によってモニターするための光（照明光）を出射するサブ光源３７が設けられている。例えばレーザ光源３１にレーザダイオードを使用した場合は、サブ光源３７にはＬＥＤ又はハロゲンランプなどを使用することができる。また、光照射部９には、サブ光源３７と併せて、集光レンズ３８及びショートパスフィルター３５を設けてもよい。ショートパスフィルター３５は、レーザ光５のような短波長側の光は透過し、長波長側の光を反射する特性をもつ光学フィルターであり、例えばバンドパスフィルター３４と対物レンズ３６との間に配置される。この場合、サブ光源３７から出射した光は、集光レンズ３８で集光された後、ショートパスフィルター３５で反射されて、対物レンズ３６に入射する。なお、光照射部９における上記以外の構成は、前述した第１の実施形態の光学的測定装置１の光照射部３と同様である。
【００６８】
［散乱光検出部２０，６３の構成］
散乱光検出部２０は、試料から発せられた側方散乱光７を検出するものであり、例えば、ミラー２５、バンドパスフィルター２４、レンズ２３、ピンホール２２及びＰＭＴ２１を、この順に配置した構成とすることができる。ここで、ＰＭＴ２１は、散乱光７を検出するための検出器であり、その検出チャンネル数は、単チャンネル又は多チャンネルのどちらでもよい。また、バンドパスフィルター２４及びピンホール２２は、いずれも散乱光７以外の外乱成分を除去し、検出感度を向上させるためのものである。更に、ミラー２５及びレンズ２３は、散乱光７をＰＭＴ２１に導くためのものである。
【００６９】
一方、散乱光検出部６３は、試料から発せられた前方散乱光８を検出するものであり、蛍光検出部１７と光路の一部を共有する構成となっている。具体的には、蛍光検出部１７の対物レンズ４１とバンドカットフィルター４２との間に、蛍光６と前方散乱光８とを分離するロングパスフィルター５７を配設する。そして、ロングパスフィルター５７で分光された前方散乱光８が、バンドパスフィルター５８、マスク５９、レンズ６０及びピンホール６１を介して、検出器であるフォトダイオード６２に入射する構成とすることができる。
【００７０】
［蛍光検出部１７の構成］
この光学的測定装置１３の蛍光検出部１７には、対物レンズ４１とバンドカットフィルター４２との間に、蛍光６とサブ光源３７から出射された光とを分離するビームスプリッター５４が設けられている。そして、このビームスプリッター５４で分光された光（サブ光源３７から出射された光）が、レンズ５５を介して、励起光照射部をモニターするためのＣＣＤに入射する構成となっている。なお、蛍光検出部１７における上記以外の構成は、前述した第４の実施形態の光学的測定装置１２の検出部１６と同様である。
【００７１】
［光学的測定装置１３の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１３の動作、即ち、光学的測定装置１３を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１３においては、先ず、レーザ光５を試料に照射する。その際、光照射部９のレーザ光源３１から出射したレーザ光５は、集光レンズ３２、アナモレンズ３３ａ，３３ｂを透過し、バンドパスフィルター３４で不要な光成分が除去された後、ショートパスフィルター３５を透過し、対物レンズ３６に入射する。そして、対物レンズ３６で集光されて、流路チップ２に形成された流路内を通流する試料に照射される。
【００７２】
また、レーザ光５と併せて、その照射部に照明光を照射する。具体的には、サブ光源３７から出射した光を、集光レンズ３８で集光した後、ショートパスフィルター３５で反射して、対物レンズ３６に入射させる。そして、レーザ光５と同様に、対物レンズ３６で集光して、励起光（レーザ光５）照射部に照射する。
【００７３】
次に、レーザ光５が照射された試料から発せられた蛍光６及び散乱光７，８を、蛍光検出部１７及び散乱光検出部２０，６３で検出する。具体的には、試料から発せられた光などを、蛍光検出部４の対物レンズ４１で捕捉した後、ビームスプリッター５４によりサブ光源３７からの光を分離する。このビームスプリッター５４で反射された光（サブ光源３７からの光）は、レンズ５５で集光され、ＣＣＤ５６でモニターされる。一方、ビームスプリッター５４を透過した光は、更に、ロングパスフィルター５７によって、長波長側の光（蛍光６）と、短波長側の光（前方散乱光８）とに分離する。このロングパスフィルター５７において反射された前方散乱光８は、バンドパスフィルター５８、マスク５９、レンズ６０、ピンホール６１を介して、フォトダイオード６２で検出される。
【００７４】
また、ロングパスフィルター５７を透過した光は、ビームカットフィルタ４２及びピンホール４４で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去した後、偏光ビームスプリッター４５によって、水平偏光成分と垂直偏光成分とに分光する。そして、偏光ビームスプリッター４５を透過した垂直偏光成分は、透過型回折格子４７ｂに直接入射し、偏光ビームスプリッター４５で反射された水平偏光成分は、ミラー４６を介してフレネル菱面体５３に入射する。この水平偏光成分は、フレネル菱面体５３において直線偏光のまま９０°回転して垂直偏光成分に揃えられた後、透過型回折格子４７ａに向けて出射される。
【００７５】
その後、偏光方向が揃えられた２本の光線束は、それぞれ透過型回折格子４７ａ，４７ｂで分光されて、２層で扇状に発散するスペクトル光となる。そして、これらを１個のテレセントリック集光レンズ４８で結像し、更に、マイクロレンズアレイ５０を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光する。
【００７６】
上述の如く、本実施形態の光学的測定装置１３では、蛍光検出部１７に加えて、散乱光検出部２０，６３を設けているため、試料について、より多くの情報を得ることができる。なお、本実施形態の光学的測定装置１３における上記以外の構成及び効果は、前述した第１〜第４の実施形態と同様である。
【００７７】
＜６．第６の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
次に、本発明の第６の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図１４は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図１４においては、前述した第１〜第５の実施形態の光学的測定装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図１４に示すように、本実施形態の光学的測定装置７０は、流路チップ２に設けられた流路内を通流する試料にレーザ光５を照射する光照射部３と、レーザ光５が照射された試料から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出部１８とを備えている。
【００７８】
［蛍光検出部１８の構成］
光学的測定装置７０の蛍光検出部１８には、試料から発せられた蛍光６を波長毎に分光する分光器７１と、検出器である多チャンネルＰＭＴ４９とが設けられており、これらの間にはテレセントリック集光レンズ７９が配置されている。また、蛍光検出部１８には、試料から発せられた蛍光６を集光する対物レンズ７２、及び試料以外から発せられた外乱成分を除去するためのピンホール７７を設けることが望ましい。更に、必要に応じて、対物レンズ７２とピンホール７７との間に、集光レンズ７４、ミラー７５及びフィルター７６を、ピンホール７７と分光器７１との間に、ピンホール７７から出射された発散光を平行光にするコリメーターレンズ７８を、それぞれ配設することもできる。
【００７９】
（分光器７１）
図１５は図１４に示す分光器７１の構成例を示す模式図である。図１４及び図１５に示すように、本実施形態の光学的測定装置７０では、分光器７１として、複数のプリズム７１ａ〜７１ｊが連続的に配置されている。これらプリズム７１ａ〜７１ｊは、相互に平行でない２以上の平面（入射面，出射面）を備えており、回折格子に比べて偏光依存性が小さく、無偏光状態でも効率よく分光できるという特徴がある。
【００８０】
一方、回折格子は偏光依存性が高いため、より高効率で分光するには、蛍光６を一旦直交偏光成分に分離し、それぞれの偏光に対して最大の回折効率となるように、最適な偏角を与えなければならず、そのための光学系が必要となる。そこで、分光器７１としてプリズム７１ａ〜７１ｊを使用することにより、回折格子に比べて、少ないスペース及び部品数で高精度の測定が可能となり、光学的測定装置を、より一層小型化及び低コスト化することができる。
【００８１】
また、プリズム７１ａ〜７１ｊには、屈折率の温度係数が正のものと負のものの両方が含まれていることが望ましい。回折格子は温度により熱膨張又は収縮して回折角が変化するが、本実施形態の光学的測定装置７０のように、分光器７１を、硝材の屈折率温度係数が正のプリズムと負のプリズムの両方を含む構成にすることで、回折角温度依存性を小さくすることができる。例えば、屈折率温度係数が正の硝材Ｓ−ＮＢＨ５３を使用したプリズムと、屈折率温度係数が負の硝材Ｓ−ＨＰＨ１を使用したプリズムを組み合わせればよい。
【００８２】
本実施形態の光学的測定装置７０においては、屈折率の温度係数が正のプリズムと負のプリズムとが少なくとも１個ずつ設けられていればよいが、プリズムの数を増やすことにより、波長による回折角の差を広げることができる。しかしながら、その数が多くなると、分光器７１全体としての透過率が低下してしまうため、プリズムの数は１０個前後とすることが望ましい。
【００８３】
この光学的測定装置７０では、図１５に示すように１０個のプリズム７１ａ〜７１ｊを使用した場合でも、その対応波長を５００〜８００ｎｍとすることにより、容易に９０％以上の透過率を達成することができる。即ち、反射防止膜を設ける上での技術は確立されているため、波長帯域幅３００ｎｍで可視光用光学素子の標準的な範囲と同じ帯域幅とすることにより、特段の技術を要することなく、９０％以上の透過率を得ることができる。更に、この対応波長においては、プリズム自体の透過率が１０個トータルで９０％以上得られるような硝材選定も、容易になされる。
【００８４】
（テレセントリック集光レンズ７９）
テレセントリック集光レンズ７９は、プリズム７１で分光された複数の光（回折光）を、その光軸を相互に平行にして、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに向けて出射するものである。具体的には、プリズム７１ａ〜７１ｊにより分光された蛍光６は、テレセントリック集光レンズ７９を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルの検出面近傍を像面として結像される。
【００８５】
そして、このテレセントリック集光レンズ７９を、分光器７１（プリズム７１ａ〜７１ｊ）と多チャンネルＰＭＴ４９との間に配置することにより、複数の光学部品を配置しなくても、分光された各光を多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに効率良く集光することができる。
【００８６】
本実施形態の光学的測定装置７０で使用するテレセントリック集光レンズ７９は、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率が９０％以上であることが好ましい。これにより、テレセントリック集光レンズ７９での光損失を抑制し、多チャンネルＰＭＴ４９での検出効率を向上することができる。このようなテレセントリック集光レンズは、例えば、特性が異なる複数のレンズを組み合わせることで実現することができる。
【００８７】
図１６は図１４に示すテレセントリック集光レンズ７９の構成例を示す模式図である。分光器７１としてプリズムを使用すると、回折格子を使用した場合に比べて、分光された光の光線束の波長と回折角のリニアリティが低下する。そこで、プリズム７１ａ〜７１ｊを使用する場合は、テレセントリック集光レンズ７９を、図１６に示すように、少なくとも１枚の非球面レンズ７９３を含んだ構成とすることが望ましい。これにより、リニアリティの低下を抑制することができる。
【００８８】
また、テレセントリック集光レンズ７９は、１枚以上のミラーを備えることが望ましく、これにより、光学系を折り返して、集光光学系全体を小型化することができる。なお、本実施形態の光学的測定装置７０では、テレセントリック集光レンズ７９の代わりに、曲面反射ミラーを配設してもよい。ミラーは反射角の波長依存性がないので、これにより、色収差を抑えた集光光学系とすることができる。
【００８９】
更に、テレセントリック集光レンズ７９は、軸対称で２群以上のレンズ群を有する構成とすることが望ましい。これにより、回折角リニアリティが改善されると共に、多チャンネルＰＭＴ４９の像高を０〜３２ｍｍとしても、全画角において、主光線の光軸に対する最大傾斜角（テレセン性）を１０度以下にすることができる。更に、テレセントリック集光レンズ７９を、非球面レンズを含む３群４枚の構成にすることで、像高が０〜３２ｍｍの範囲において、テレセン性を６．５度以下、かつ全分光光線束のＲＭＳスポット径をφ１００μｍ以下にすることができる。
【００９０】
例えば、多チャンネルＰＭＴ４９の検出面における有効検出幅が、検出チャンネルピッチの７０％しかない場合は、各検出チャンネルに到達するフォトンの総量も７０％を超えることはなく、蛍光６の光量が少ない場合は、ショットノイズによりＳ／Ｎが低下する。しかしながら、本実施形態の光学的測定装置７０では、多チャンネルＰＭＴ４９の検出面の直前にマイクロレンズアレイ５０を設置しているため、不感帯を避けて、全光線束を検出チャンネルに入射させることができる。
【００９１】
このとき、テレセントリック集光レンズ７９により、入射光（蛍光６）のテレセン性を１０度以下とすると、全ての光を、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに到達させることができる。更に、入射光（蛍光６）のテレセン性を６．５度以下にすることにより、製造マージンを含めて、全光線束を検出チャンネルに到達させることが可能となる。その結果、マイクロレンズアレイ５０による多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルへの入射効率向上効果を高めることができ、多チャンネルＰＭＴ４９における検出感度をより高めることができる。
【００９２】
また、テレセントリック集光レンズ７９を前述した構成にすることにより、回折角のリニアリティも３０％程度改善することができる。なお、このリニアリティの改善の比率は、検出波長帯域（例えば５００〜８００ｎｍ）の両端での結像位置のずれを３２ｍｍとし、結像位置が直線補完される場合を理想的とした場合に、この波長帯域間の任意波長での回折角における結像位置が、理想的な結像位置になる方向に補正できた割合を指す。
【００９３】
（対物レンズ７２）
対物レンズ７２は、試料から発せられた蛍光６を捕捉するものであり、少なくとも５００〜８００ｎｍの範囲において、開口数ＮＡの２乗と透過率の積が０．５以上であり、かつ非球面レンズを含む２群以上のレンズ群で構成されていることが望ましい。これにより、試料から発せられた蛍光６を、十分なカップリング効率で捕捉して、検出器（多チャンネルＰＭＴ４９）に向けて送り出すことができる。
【００９４】
対物レンズは、開口数ＮＡが大きくなると、光量捕捉効率が開口数ＮＡの２倍で増加するのに対して、焦点深度がＮＡの２乗で減少する。このため、フローサイトメトリー装置及びビーズアッセイ装置などのように、物点が安定しない系で開口数ＮＡを大きくすると、結像特性が低下してしまう。例えば、開口数ＮＡが０．８５で、透過率が７３％以上の対物レンズは、開口数ＮＡの２乗と透過率との積が０．５２７であり、０．５以上となっているため、十分な光量透過は得られるが、焦点深度が不足する。
【００９５】
この指標（開口数ＮＡの２乗と透過率との積）は、光量捕捉効率に比例するため、透過率を９５％とすることで、開口数ＮＡが０．７５の対物レンズを使用しても、で前述した開口数ＮＡが０．８５の対物レンズと同等の光量捕捉効率が得られる。この開口数ＮＡが０．７５の対物レンズを使用すると、前述した開口数ＮＡが０．８５の対物レンズを使用した場合よりも、焦点深度が約３０％大きくなるため、光学的なマージンが広がり、更に、非球面モールドレンズを用いた２群レンズ構成といった安価なレンズ設計も可能となる。
【００９６】
（ピンホール７７）
ピンホール７７は、光学系を共焦点系にして、非測定対象物から発せられた蛍光に由来するノイズを除去するものである。本実施形態の光学的測定装置７０においては、例えば円形状で、被測定領域への逆投影サイズがφ４０μｍ程度のもの、つまり被測定領域からピンホール７７への投影倍率が１０倍であれば、ピンホール径がφ４００μｍのものなどを使用することができる。このように、対物の視野を絞ることにより、連続的に試料を検出する場合でも、各試料に由来する信号を、容易に分離することができる。
【００９７】
（フィルター７６）
試料にレーザ光５が照射されると、例えば試料に含まれる蛍光色素が励起されて蛍光６が放出される。このとき、励起光の散乱も発生し、その散乱光も蛍光６と共に対物レンズ７２で捕捉される。そこで、本実施形態の光学的測定装置７０では、ピンホール７７の直前にフィルター７６を配置して、この散乱光波長を除去している。このフィルター７６としては、例えば特定波長の光を反射するバンドカットフィルターなどを使用することができる。このように、ピンホール７７の直前にフィルター７６を配置することにより、波長が異なる複数のレーザ光を照射して検出を行う場合でも、各レーザスポットがピンホール７７の直前に投影されるため、効率的に散乱光波長を除去することができる。
【００９８】
［光学的測定装置７０の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置７０の動作、即ち、光学的測定装置７０を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。なお、光学的測定装置７０により測定される試料は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
【００９９】
本実施形態の光学的測定装置７０においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。このとき、レーザ光源（励起用レーザ）３１としては、例えば、中心波長が４８８ｎｍの半導体レーザ（ＬＤ）を使用することができる。半導体レーザは、ロット間のばらつきや発振パワー及び温度に依存して発光波長がシフトするが、蛍光色素の励起スペクトルピーク波長に対して、レーザ光５の波長が５ｎｍ程度シフトしても、蛍光６の光量に大きな変化はないため、問題はない。
【０１００】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１８の対物レンズ７２で捕捉し、集光レンズ７４で集光する。集光された蛍光６は、ミラー７５を介してフィルター７６に入射し、このフィルター７６及びピンホール７７により、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分が除去される。その後、ピンホール７７を通過した蛍光６を、コリメーターレンズ７８で平行光に変換し、プリズム７１ａ〜７１ｊにより分光する。プリズム７１ａ〜７１ｊにより分光された各波長の光は、それぞれテレセントリック集光レンズ７９を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに入射する。
【０１０１】
なお、図１４に示す光学的測定装置７０では、光照射部３にレーザ光源３１が１個しか搭載されていないが、本発明はこれに限定されるものではなく、光照射部には波長の異なる複数の光源を搭載することができる。その際、少なくとも１つの光源は、出射するレーザ光の中心波長が４８８ｎｍであることが望ましい。また、光照射部に複数の光源を搭載する場合は、蛍光検出部１８に、各レーザ光に由来する複数の蛍光を分離し、効率よく検出するための光学系を設けてもよい。
【０１０２】
上述の如く、本実施形態の光学的測定装置７０では、分光器７１にプリズム７１ａ〜７１ｊを使用しているため、回折格子を使用した場合に比べて、より少ないスペース及び部品数で、高精度の測定が可能となる。その結果、検出器に多チャンネルＰＭＴ４９を使用した場合でも、試料から発せられる蛍光６を高感度で検出することができ、更に、装置全体をより小型化することが可能となる。
【０１０３】
なお、本実施形態の光学的測定装置７０における上記以外の構成及び効果は、前述した第１〜第３の実施形態と同様である。また、本実施形態の光学的測定装置７０は、前述した第５の実施形態のように、蛍光検出部１８に加えて、散乱光検出部を設けることもでき、その場合でも同様の効果が得られる。
【実施例】
【０１０４】
以下、本発明の実施例と比較例とを挙げて、本発明の効果について具体的に説明する。本実施例においては、図１０に示す第４の実施形態の光学的測定装置１２（実施例１）と、図１４に示す第６の実施形態の光学的測定装置７０（実施例２）と、従来の光学的測定装置の検出効率を比較した。
【０１０５】
その際、実施例１の光学的測定装置では、対物レンズ４１に、焦点距離が８ｍｍ、視野φが１５０μｍ、開口数ＮＡが０．８、波長４００〜８００ｎｍの光の透過率が９０％以上のレンズを使用した。また、スリット５２は、開口長ｌが１．５ｍｍ、開口幅ｗが０．４ｍｍの矩形状のものを使用した。このスリット５２への集光レンズの焦点距離は８０ｍｍとし、対物レンズ４１の焦点に対して、スリット５２を共焦点の関係になるように配置した。
【０１０６】
更に、スリット５２は、その長軸が試料の通流方向と平行になるように配置した。一方、偏光ビームスプリッター４５は、波長５００〜８００ｎｍの光に対応した広帯域のものを使用した。そして、偏光ビームスプリッター４５により分光された光のうち、Ｐ偏光を、偏光面に対して４５°傾斜したフレネル菱面体５３に、連続２回透過させることにより、その偏光方向を９０°回転させた。そして、Ｓ偏光に揃えられた２本の光線束を、それぞれ透過型矩形溝回折格子４７ａ，４７ｂに入射させた後、２層で扇状に発散するスペクトル光を、色収差補正された１個のテレセントリック集光レンズ４８で結像した。
【０１０７】
実施例２の光学的測定装置では、対物レンズ７２に、焦点距離が４ｍｍ、視野φが１５０μｍ、開口数ＮＡが０．７５、波長４００〜８００ｎｍの光の透過率が９０％以上のレンズを使用した。また、ピンホール７７は、穴径φ１．２ｍｍのものを使用した。このピンホール７７への焦点距離は１２０ｍｍとし、対物レンズ７２の焦点に対して、ピンホール７７を共焦点の関係になるように配置した。更に、プリズム７１ａ〜７１ｂには、下記表１に示す硝材Ｐ１，Ｐ２からなるものを使用した。具体的には、７１ａ，７１ｃ，７１ｄ，７１ｇ，７１ｈ，７１ｊの計６個をＰ１で形成し、７１ｂ，７１ｅ，７１ｆ，７１ｉの計４個をＰ２で形成した。
【０１０８】
【表１】
2010117344.tif 000003
【０１０９】
そして、実施例１，２のいずれの装置も検出器には、波長４９０ｎｍにおける光電面の最大量子効率が２５％の３２チャンネルマルチアレーＰＭＴを使用した。また、ＰＭＴの検出面の直前には、その検出チャンネルピッチと同じ１ｍｍのピッチでシリンドリカルレンズが配列されたマイクロレンズアレイを配置した。このとき、テレセントリック集光レンズの焦点位置は、マイクロレンズアレイの各シリンドリカルレンズの継ぎ目に合わせた。
【０１１０】
下記表２に、上述した構成の実施例１，２の光学的測定装置と、従来の光学的測定装置との性能を比較した結果を示す。
【０１１１】
【表２】
2010117344.tif 000004
【０１１２】
上記表２に示すように、本実施例の光学的測定装置では、従来に比べて、蛍光の検出効率を大幅に向上できることが確認された。
【符号の説明】
【０１１３】
１、１０、１１、１２、１３、７０  光学的測定装置
２  流路チップ
３、９  光照射部
４、１４〜１８  蛍光検出部
５  レーザ光
６  蛍光
７、８  散乱光
２０、６３  散乱光検出部
２１  ＰＭＴ
２２、４４、６１、７７  ピンホール
２３、３２、３３ａ、３３ｂ、３６、３８、４３ａ〜４３ｄ、５５、６０、７４、７８、４８１〜４８５、７９１〜７９３  レンズ
２４、３４、３５、４２、５７、５８、７６  フィルター
２５、４６、７５  ミラー
３１  レーザ光源
３７  サブ光源
４１、７２  対物レンズ
４５  偏光ビームスプリッター
４７、４７ａ、４７ｂ  透過型回折格子
４８、７９  テレセントリック集光レンズ
４９  多チャンネルＰＭＴ
５０  マイクロレンズアレイ
５１  シリンドリカルレンズ
５２  スリット
５３  フレネル菱面体
５４  ビームスプリッター
５６  ＣＣＤ
５９  マスク
６２  フォトダイオード
７１  分光器
７１ａ〜７１ｊ  プリズム
１０１  反射型回折格子
【図１】
2010117344.tif 000005
【図２】
2010117344.tif 000006
【図３】
2010117344.tif 000007
【図４】
2010117344.tif 000008
【図５】
2010117344.tif 000009
【図６】
2010117344.tif 000010
【図７】
2010117344.tif 000011
【図８】
2010117344.tif 000012
【図９】
2010117344.tif 000013
【図１０】
2010117344.tif 000014
【図１１】
2010117344.tif 000015
【図１２】
2010117344.tif 000016
【図１３】
2010117344.tif 000017
【図１４】
2010117344.tif 000018
【図１５】
2010117344.tif 000019
【図１６】
2010117344.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月26日(2010.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
流路内を通流する試料に光を照射する光照射部と、
前記光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部と、
を有し、
前記蛍光検出部は、少なくとも、
複数の光を同時に検出可能な多チャンネル光電子倍増管と、
透過型回折格子又はプリズムからなり前記蛍光を波長毎に分光する分光器と、
前記分光器で分光された複数の光を、その光軸を相互に平行にして、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに向けて出射するテレセントリック集光レンズと、
を備える光学的測定装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明に係る光学的測定装置は、流路内を通流する試料に光を照射する光照射部と、前記光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部と、を有し、前記蛍光検出部は、少なくとも、複数の光を同時に検出可能な多チャンネル光電子倍増管と、透過型回折格子又はプリズムからなり前記蛍光を波長毎に分光する分光器と、前記分光器で分光された複数の光を、その光軸を相互に平行にして、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに向けて出射するテレセントリック集光レンズと、を備える。
本発明の光学的測定装置においては、透過型回折格子又はプリズムにより蛍光を分光しているため、従来の反射型回折格子に比べて、蛍光の損失が少なく、省スペース化することができる。また、透過型回折格子又はプリズムで分光された光を、テレセントリック集光レンズで、多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに集光しているため、チャンネル数が多い光電子倍増管を使用しても、試料から発せられる蛍光を高感度で検出することが可能である。
特に、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成され、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光の透過率が９０％以上のテレセントリック集光レンズを使用すると、蛍光の損失が大幅に抑制され、焦点位置もより短くなる。
また、分光器がプリズムである場合は、テレセントリック集光レンズに非球面レンズが含まれていることが望ましい。
更に、分光器をプリズムで構成する場合は、屈折率の温度係数が正のプリズムと負のプリズムとが少なくとも１個ずつ設けられていることが望ましい。
一方、この光学的測定装置では、前記蛍光検出部における前記テレセントリック集光レンズと前記多チャンネル光電子倍増管との間にマイクロレンズアレイを配設し、前記テレセントリック集光レンズから出射した光が、前記マイクロレンズアレイを介して前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルに入射するようにしてもよい。
その場合、前記マイクロレンズアレイとして、例えば、前記多チャンネル光電子倍増管の検出チャンネル数に対応する数のシリンドリカルレンズが、長手方向が相互に平行になるように配列されたものを使用し、該シリンドリカルレンズの配列方向と、前記多チャンネル光電子倍増管の各検出チャンネルの配列方向とが一致するように配置することができる。
また、前記蛍光検出部に、前記試料から発せられた蛍光を集光するための対物レンズを設けてもよく、その場合、該対物レンズとしては、例えば、特性が異なる複数のレンズを組み合わせて構成され、焦点距離が８ｍｍ以上、開口数ＮＡが０．８以上、視野φが１５０μｍ以上のものを使用することができる。
更に、前記蛍光検出部には、前記対物レンズと前記分光器との間に、長さが０．２〜１．５ｍｍ、幅が０．４ｍｍ以下の矩形状のスリットを、その長軸が前記試料の通流方向と平行になるように配置してもよく、又はピンホールを配置してもよい。
更にまた、前記蛍光検出部における前記対物レンズと前記分光器との間には、少なくとも５００〜８００ｎｍの波長の光を水平偏光成分と垂直偏光成分とに分光可能な偏光ビームスプリッターと、該偏光ビームスプリッターで分光された一の偏光成分の偏光方向を９０°回転させるフレネル菱面体と、を配設することもできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本実施形態の光学的測定装置１においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、バンドカットフィルタ４２及びピンホール４４で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。その後、透過型回折格子４７により蛍光６を波長毎に分光し、分光された各波長の光を、それぞれテレセントリック集光レンズ４８を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
［光学的測定装置１０の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１０の動作、即ち、光学的測定装置１０を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１０においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、バンドカットフィルタ４２及びピンホール４４で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。その後、透過型回折格子４７により蛍光６を波長毎に分光し、分光された各波長の光を、それぞれテレセントリック集光レンズ４８を介し、マイクロレンズアレイ５０に入射させる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
＜３．第３の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
次に、本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図８は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図８においては、図５に示す第２の実施形態の光学的測定装置１０の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図８に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１は、ピンホール４４に代えて、蛍光検出部１５にスリット５２が配設されている以外は、前述した第２の実施形態の光学的測定装置１０と同様である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１４の対物レンズ４１で捕捉し、更に、バンドカットフィルタ４２及びスリット５２で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。その後、透過型回折格子４７により蛍光６を波長毎に分光し、分光された各波長の光を、テレセントリック集光レンズ４８及びマイクロレンズアレイ５０を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに集光する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
［蛍光検出部１６の構成］
本実施形態の光学的測定装置１２における蛍光検出部１６には、前述した第３の実施形態の光学的測定装置１１の蛍光検出部１５の各構成要素に加えて、偏光ビームスプリッター４５と、フレネル菱面体５３とが設けられている。また、この蛍光検出部１６には、２枚の透過型回折格子４７ａ，４７ｂが設けられている。そして、一方の透過型回折格子４７ｂには、偏光ビームスプリッター４５から直接偏光成分が入射し、他方の透過型回折格子４７ａには、フレネル菱面体５３で偏光方向が回転された偏光成分が入射するようになっている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
［光学的測定装置１２の動作］
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１２の動作、即ち、光学的測定装置１２を使用して、細胞又はマイクロビーズなどの試料を光学的に測定する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１２においては、流路チップ２に形成された流路内に試料を通流させ、光照射部３のレーザ光源３１から出射されたレーザ光５を、対物レンズ３６で集光し、試料に照射する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
そして、試料から発せられた蛍光６を、蛍光検出部１６の対物レンズ４１で捕捉し、更に、バンドカットフィルタ４２及びスリット５２で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去する。次に、偏光ビームスプリッター４５で、蛍光６を水平方向偏光成分と垂直方向偏光成分とに分光し、垂直方向偏光成分は直接透過型回折格子４７ｂに向けて出射される。一方、水平方向偏光成分は、ミラー４６を介してフレネル菱面体５３に入射し、このフレネル菱面体５３において直線偏光のまま９０°回転して垂直方向偏光成分と同じ方向に揃えられ、透過型回折格子４７ａに向けて出射される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
これに対して、本実施形態の光学的測定装置１２では、分光検出で利用する波長帯域に対応した広帯域の偏光ビームスプリッター４５を使用しているため、どの波長の蛍光６でも損失を最大限抑制した偏光分離が可能となる。また、フレネル菱面体５３を使用しているため、波長変化の影響をほとんど受けずに、偏光成分の偏光方向を９０°回転させ、回折格子に対してＳ偏光又はＰ偏光のいずれか一方に揃えることができる。これにより、蛍光６の偏光成分を、回折効率が高い偏光方向に揃えることができるため、各検出チャンネルへの入射効率を高めることができる。その結果、多チャンネルＰＭＴ４９における検出感度が向上する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
次に、レーザ光５が照射された試料から発せられた蛍光６及び散乱光７，８を、蛍光検出部１７及び散乱光検出部２０，６３で検出する。具体的には、試料から発せられた光などを、蛍光検出部１７の対物レンズ４１で捕捉した後、ビームスプリッター５４によりサブ光源３７からの光を分離する。このビームスプリッター５４で反射された光（サブ光源３７からの光）は、レンズ５５で集光され、ＣＣＤ５６でモニターされる。一方、ビームスプリッター５４を透過した光は、更に、ロングパスフィルター５７によって、長波長側の光（蛍光６）と、短波長側の光（前方散乱光８）とに分離する。このロングパスフィルター５７において反射された前方散乱光８は、バンドパスフィルター５８、マスク５９、レンズ６０、ピンホール６１を介して、フォトダイオード６２で検出される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
また、ロングパスフィルター５７を透過した光は、バンドカットフィルタ４２及びスリット５２で、試料から発せられた蛍光６以外の外乱成分を除去した後、偏光ビームスプリッター４５によって、水平偏光成分と垂直偏光成分とに分光する。そして、偏光ビームスプリッター４５を透過した垂直偏光成分は、透過型回折格子４７ｂに直接入射し、偏光ビームスプリッター４５で反射された水平偏光成分は、ミラー４６を介してフレネル菱面体５３に入射する。この水平偏光成分は、フレネル菱面体５３において直線偏光のまま９０°回転して垂直偏光成分に揃えられた後、透過型回折格子４７ａに向けて出射される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
（テレセントリック集光レンズ７９）
テレセントリック集光レンズ７９は、分光器７１で分光された複数の光（回折光）を、その光軸を相互に平行にして、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルに向けて出射するものである。具体的には、プリズム７１ａ〜７１ｊにより分光された蛍光６は、テレセントリック集光レンズ７９を介して、多チャンネルＰＭＴ４９の各検出チャンネルの検出面近傍を像面として結像される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例２の光学的測定装置では、対物レンズ７２に、焦点距離が４ｍｍ、視野φが１５０μｍ、開口数ＮＡが０．７５、波長４００〜８００ｎｍの光の透過率が９０％以上のレンズを使用した。また、ピンホール７７は、穴径φ１．２ｍｍのものを使用した。このピンホール７７への焦点距離は１２０ｍｍとし、対物レンズ７２の焦点に対して、ピンホール７７を共焦点の関係になるように配置した。更に、プリズム７１ａ〜７１ｊには、下記表１に示す硝材Ｐ１，Ｐ２からなるものを使用した。具体的には、７１ａ，７１ｃ，７１ｄ，７１ｇ，７１ｈ，７１ｊの計６個をＰ１で形成し、７１ｂ，７１ｅ，７１ｆ，７１ｉの計４個をＰ２で形成した。