(57)【要約】      （修正有）【課題】硝子体液および／または房水をプラスミンの触媒ドメインを含む短縮形態のプラスミン（ＴＰＣＤ）を含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法の提供。【解決手段】ＴＰＣＤには、ミニプラスミン、マイクロプラスミン、ならびにその誘導物および変異型が含まれるが、これらに限定されない。この方法を使用して、硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、眼由来の出血の減少、眼に有毒な物質の除去または減少、眼由来の眼球内異物の除去または減少、眼に投与した組成物の拡散の増加、網膜外新血管形成の減少、ならびにその任意の組み合わせを行うことができる。硝子体切除を使用しないか、その補助として方法を使用することができる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、硝子体液および／または房水を有効量のプラスミンの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質（ＴＰＣＤ）を含む組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＴＰＣＤの分子量が約４０，０００ダルトン未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＰＣＤの分子量が約２０，０００ダルトンと３０，０００ダルトンとの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＰＣＤの分子量が還元形態で約２６，５００ダルトンであるか非還元形態で２９，０００ダルトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＰＣＤの分子量が約２０，０００ダルトン未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＰＣＤがミニプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＰＣＤが安定化ミニプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＰＣＤが組換えミニプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＰＣＤが安定化組換えミニプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＰＣＤがマイクロプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＰＣＤが安定化マイクロプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＰＣＤが組換えマイクロプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＰＣＤが安定化組換えマイクロプラスミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＰＣＤがマイクロプラスミンの変異型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法により硝子体の粘度が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法により後部硝子体剥離が誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法により硝子体液および／または房水由来の出血が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法により硝子体液および／または房水由来の眼球内異物が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法により硝子体液および／または房水に投与した薬剤または組成物の拡散が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法により網膜外新血管形成が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が溶液であり、硝子体液および／または房水を組成物と接触させる工程が、前記溶液を前記硝子体液および／または房水に注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
硝子体切除を使用せずに前記方法を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
硝子体切除の補助として前記方法を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＰＣＤの有効量が０．００５ｍｇ〜０．２ｍｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることと、硝子体液および／または房水を有効量の組換えマイクロプラスミンまたはその変異型を含む組成物と接触させる工程と、前記方法により硝子体液化および／または後部硝子体剥離が起こることとを含む、方法。
【請求項２８】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることと、硝子体液および／または房水を有効量の安定化組換えマイクロプラスミンまたはその変異型を含む組成物と接触させる工程と、前記方法により硝子体液化および／または後部硝子体剥離が起こることとを含む、方法。
【請求項２９】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることと、硝子体液および／または房水を有効量の組換えミニプラスミンまたはその変異型を含む組成物と接触させる工程と、前記方法により硝子体液化および／または後部硝子体剥離が起こることとを含む、方法。
【請求項３０】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることと、硝子体液および／または房水を有効量の安定化組換えミニプラスミンまたはその変異型を含む組成物と接触させる工程と、前記方法により硝子体液化および／または後部硝子体剥離が起こることとを含む、方法。
【請求項３１】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、硝子体液および／または房水を少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程と、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることとを含む、方法。
【請求項３２】
前記少なくとも２つのＴＰＣＤが、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、硝子体液および／または房水を少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物と接触させる工程と、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることとを含む、方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物が、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物を被験体に実質的に同時または異なる時間で投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法において、硝子体液および／または房水を少なくとも１つのＴＰＣＤおよび少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物と接触させる工程と、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることとを含む、方法。
【請求項３７】
前記ＴＰＣＤが、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択され、前記第２の薬剤が、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、コンドロイチナーゼ、コラゲナーゼ、ＲＧＤ含有ペプチド、抗インテグリン抗体、尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、Ｐ２Ｙ受容体アゴニスト、血管形成インヒビター、ＶＥＧＦインヒビター、ＰＩＧＦインヒビター、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
被験体の硝子体切除方法において、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項３９】
前記接触工程を硝子体切除前に行う、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記接触工程を硝子体切除と同時に行う、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＰＣＤが、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体がヒトである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
眼の障害または障害の合併症を治療または予防するために前記硝子体切除を行い、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記硝子体切除を、硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体由来の出血の除去または減少、硝子体由来の眼球内異物の除去または減少、網膜に有毒な物質の除去または減少、硝子体液および／または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、網膜外新血管形成の減少、ならびにその任意の組み合わせからなる群から選択される目的のために実施する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が溶液であり、硝子体液または房水を組成物と接触させる工程が、前記溶液を前記硝子体液または房水に注射することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＴＰＣＤの有効量が０．００５ｍｇ〜０．２ｍｇの範囲である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
被験体の硝子体切除方法において、硝子体の除去前に被験体の眼の硝子体液および／または房水を有効量の安定化組換えマイクロプラスミンを含む組成物と接触させ、前記被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防するために前記硝子体切除を行う工程と、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることとを含む、方法。
【請求項４８】
被験体の硝子体切除方法において、硝子体の除去前に被験体の眼の硝子体液および／または房水を有効量の安定化組換えミニプラスミンを含む組成物と接触させ、前記被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防するために前記硝子体切除を行う工程と、前記眼の障害が、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択されることとを含む、方法。
【請求項４９】
被験体の硝子体液および／または房水に有効量の安定化組換えマイクロプラスミンを含む溶液を注射する工程を含む、被験体の硝子体を液化する方法。
【請求項５０】
被験体の硝子体液および／または房水に有効量の安定化組換えミニプラスミンを含む溶液を注射する工程を含む、被験体の硝子体を液化する方法。
【請求項５１】
被験体の硝子体液および／または房水に有効量の安定化組換えマイクロプラスミンを含む溶液を注射する工程を含む、被験体の眼の後部硝子体剥離を誘導する方法。
【請求項５２】
被験体の硝子体液および／または房水に有効量の安定化組換えミニプラスミンを含む溶液を注射する工程を含む、被験体の眼の後部硝子体剥離を誘導する方法。
【請求項５３】
被験体の硝子体液および／または房水に有効量の安定化組換えマイクロプラスミンを含む溶液を注射する工程を含む、被験体の眼の網膜外新血管形成を減少する方法。
【請求項５４】
被験体の硝子体液および／または房水に有効量の安定化組換えミニプラスミンを含む溶液を注射する工程を含む、被験体の眼の網膜外新血管形成を減少する方法。
【請求項５５】
少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物。
【請求項５６】
少なくとも１つのＴＰＣＤおよび少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、哺乳動物の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法における、触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体ヒトの眼は、およそ矢状径が２４〜２５ｍｍ、横径２４ｍｍ、および体積約６．５ｃｃのわずかに非対称の球体である。ヒトの眼を、３つの異なる層（すなわち、外層、中間層、および内層）に分類することができる。眼の外層は、しばしば「白眼」と呼ばれる強膜および眼の前面を覆う角膜からなる。中間層は、前部および後部に分類され、前部は円形の色素含有虹彩、水晶体、および毛様体からなり、後部は脈絡膜からなる。内層は、眼の感覚部分である網膜からなる。網膜は、本質的に、脈絡膜の裏側に沿って走る神経組織層であり、視覚性部分および非視覚性部分に分類することができる。視覚機構に関与する視覚性部分は、有効な視覚器である桿体細胞および錐体細胞を含む。
【０００３】
ヒトの眼を、３つの房に分類することもできる。角膜と虹彩との間の前房および虹彩と水晶体との間の後房は房水で満たされている。対照的に、水晶体と網膜との間の硝子体腔は、硝子体（硝子体または硝子体液としても公知）と呼ばれるより粘度の高い液体で満たされている。正常な眼中の硝子体液は、眼球体積の約８０％を占める透明なゲルである。角膜、瞳孔、およびレンズと通して眼に入る光を、硝子体を介して網膜に伝達する。
【０００４】
正常なヒトの眼の硝子体液は、約９９％の水および１％の高分子であるゲルである。これらの高分子には、膠原線維網、ヒアルロン酸、可溶性糖タンパク質、糖、および他の低分子量の代謝産物が含まれる。ＩＩ型コラーゲンは、硝子体の主な線維性コラーゲンであるが、硝子体はＶ型、ＩＸ型、およびＸＩ型コラーゲンも含む。硝子体の前部（硝子体の後面（後部硝子体皮質としても公知））は、最も著しくは硝子体基部および視神経円板で網膜内面に直接接触しており、且つ主な網膜血管に沿っている。網膜への硝子体の正常な接着は、後部硝子体皮質と網膜の内境界膜（ＩＬＭ）との間の細胞および分子の相互作用によって媒介される。ＩＬＭは、本質的に、網膜ミューラー細胞の基底膜である。ＩＬＭは、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどの糖タンパク質、ならびに他の複合糖質を含む。これらの成分は、硝子体とＩＬＭとの間のコラーゲン線維の空間を埋めて結合する。
【０００５】
加齢に伴って、硝子体液はゲルから液体に変化し、それに伴って段階的に萎縮して網膜のＩＬＭから離れる。このプロセスは、「後部硝子体剥離」（ＰＶＤ）として公知であり、通常は４０歳以降に発症する。しかし、硝子体の変性変化は、糖尿病、イールズ病、およびブドウ膜炎などの病理学的状態によっても誘導され得る。また、ＰＶＤは、健常者よりも近視の人および白内障手術を受けた人で早期に発症し得る。通常、硝子体は網膜から完全に分離する。しかし、時折、硝子体は一定の場所で網膜と強固に接着する。硝子体の抵抗性ある異常に強固な接着によるこれら小規模病巣は、接着部位で硝子体から網膜に強い牽引力を伝達し得る。硝子体によるこの持続的な牽引力により、しばしば網膜が蹄鉄型に裂ける。網膜裂傷が修復されない限り、この裂傷を介して硝子体液が網膜内または網膜下部に漏れだし、網膜剥離、つまり非常に重症な視力を脅かす病態を起こし得る。さらに、硝子体とＩＬＭとの間の持続的接着により、血管の破裂部から出血し、硝子体が濁り、混濁し得る。
【０００６】
不完全なＰＶＤの発生は、硝子体黄斑牽引症候群、硝子体出血、黄斑円孔、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑症、および網膜剥離を含む、多数の硝子体網膜疾患に影響を与える。したがって、硝子体手術の重要な目的は、硝子体牽引を防止する様式で硝子体を網膜から分離することである。
【０００７】
眼から硝子体を除去するために、通常は硝子体切除と呼ばれる超微細手術手順を行う。この手順では、小型手持ち式切断デバイスを使用して眼から硝子体を除去すると同時に眼の破壊を防止するために除去した硝子体を生理食塩水に置換する。この方法を使用した硝子体の外科的除去は高度な技術に依存し、硝子体皮質の完全な除去は困難な業務である。さらに、機械的硝子体切除には、瘢痕化、裂傷、および網膜の他の損傷などの合併症のリスクがある。明らかに、術後の患者の視力に悪影響を与え得るので、このような損傷は非常に望ましくない。
【０００８】
したがって、網膜から硝子体を除去するための別の方法は最近の研究の中心課題である。このような方法は、硝子体の液化および／または硝子体網膜境界の分離（ＰＶＤ）の誘導／促進に使用することができる酵素および化学物質の使用が模索されている。「薬理学的硝子体切除」と呼ばれるこれらのアプローチは、ＰＶＤを誘導するために実験および／または臨床試験で硝子体内注射されるα−キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、細菌コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、およびディスパーゼなどのいくつかのタンパク質分解酵素を含んでいた。しかし、これらの技術のほとんどは、ＩＬＭから後部硝子体を完全にまたは合併症を伴うことなく遊離しない。さらに、これらの場合のいくつかでは、副作用のリスクが高い。例えば、哺乳動物系における細菌プロテアーゼの使用により免疫応答が起こり、増殖性硝子体網膜症を発症し、その結果複雑な網膜再剥離が起こる。コラゲナーゼは硝子体を液化することが報告されているが、網膜の外層を破壊することも示されている。α−キモトリプシンは、注射した眼において傍乳頭網膜出血および硝子体出血を起こすことが報告されている。最後に、ディスパーゼは、注射１５分後に網膜の内層に有毒であることが報告されている。ディスパーゼの使用濃度に依存して、注射した眼において増殖性網膜症または黄斑前膜（ｅｐｉｒｅｔｉｎａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を発症し得る。
【０００９】
免疫原性および細菌プロテアーゼの他の副作用を考慮すると、内因性ヒト由来プロテアーゼを使用した薬理学的硝子体融解が望ましい。プラスミンは、プラスミノゲン由来のセリンプロテアーゼである。プラスミノゲンは、哺乳動物血液の重要な成分である。ヒトプラスミノゲンは、７９１アミノ酸からなる分子量が約９２，０００ダルトンの一本鎖糖タンパク質である（非特許文献１を参照のこと）。アミノ末端にグルタミン酸を有する天然のプラスミノゲン（「Ｇｌｕ−プラスミノゲン」）は、プラスミンによるＡｒｇ68−Ｍｅｔ69、Ｌｙｓ77−Ｌｙｓ78、またはＬｙｓ78−Ｖａl79ペプチド結合の限定分解限定的消化によって一般に「Ｌｙｓ−プラスミノゲン」と呼ばれるタンパク質に変換される。ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどのプラスミノゲンアクチベーターによるプラスミノゲンの活性化により、Ａｒｇ561とＶａｌ562との間のペプチド結合が切断されてプラスミノゲン分子がプラスミンと呼ばれる二本鎖の酵素活性形態に変換される。プラスミンは、２つのポリペプチド、２つのジスルフィド結合によって軽Ｂ鎖に結合した重Ａ鎖を含み、Ｂ鎖はセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含む。プラスミンのセリンプロテアーゼ触媒活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその血餅溶解能力に関与する。
【００１０】
最近、プラスミンは、硝子体切除の補助物質としても示唆されている。さらに、自己プラスミン酵素（ＡＰＥ）は、薬理学的硝子体切除の薬剤として示唆されている。しかし、プラスミン使用に関連する欠点がいくつか存在する。第１に、今までのところプラスミンを使用した全ての臨床介入はＡＰＥの使用に依存しており、その単離は、患者からの採血、プラスミノゲンの単離、単離プラスミノゲンのプラスミンへの活性化、ならびにプラスミン酵素の精製および安定性試験を含む骨の折れる時間のかかるプロセスを必要とする。さらに、この手順はコストがかかり、且つ血液感染病原体の存在がこの手順をさらに複雑にし得る。また、プラスミンは非常に分解しやすいので、使用前に長期間保存することができない。さらなる欠点は、６５，０００ダルトンと８３，０００ダルトンとの間の範囲であるプラスミンの分子量の大きさである。従って、より小さな分子と比較して硝子体中の注射位置から硝子体網膜境界へのプラスミンのような高分子の拡散が妨げられる。
【非特許文献１】Ｆｏｒｓｇｒｅｎ Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１３（２）：２５４−６０，１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、薬理学的硝子体融解のためのプラスミンの欠点を克服した被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法が当該分野で必要である。詳細には、プラスミンよりも硝子体から硝子体網膜境界に速く拡散することができ、遅延や個々の患者における自己プラスミノゲン酵素の単離に関する他の付随する問題もなく容易且つ大量に得ることができる、プラスミンよりも小さな分子を使用した眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、プラスミンの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質（ＴＰＣＤ）を含む組成物を使用した被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。１つの実施形態では、ＴＰＣＤは、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１３】
本発明はまた、修飾ＴＰＣＤを含む組成物を使用した被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。修飾ＴＰＣＤは、プラスミンの修飾触媒ドメインを含むＴＰＣＤである。
【００１４】
本発明は、被験体の硝子体液および／または房水のＴＰＣＤを含む組成物との接触による被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明は、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出（ｍａｃｕｌａｒ ｅｘｕｄａｔｅ）、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせなどであるが、これらに限定されない眼の障害を治療または防止する方法を提供する。本発明の方法を、硝子体切除とは独立して、または硝子体切除の補助として実施することができる。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明のこの態様の１つの実施形態では、硝子体液および／または房水と少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物との接触によって組成物を投与する。
【００１６】
本発明は、さらに、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物を被験体に投与する工程を含む、眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を含む。本発明のこの態様の１つの実施形態では、硝子体液および／または房水との接触によって少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物を被験体に投与する。本発明のこの態様の別の実施形態では、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物のＴＰＣＤは同一のＴＰＣＤである。本発明のこの態様のさらに別の実施形態では、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物のＴＰＣＤは異なるＴＰＣＤである。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物のＴＰＣＤを、実質的に同時に被験体に投与する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物のＴＰＣＤを、異なる時間で被験体に投与する。
【００１７】
本発明は、さらに、少なくとも１つのＴＰＣＤおよび少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物の投与による被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。第２の薬剤には、単独またはＴＰＣＤとの組み合わせによって眼の障害または障害の合併症の治療または予防に有用な任意の物質が含まれる。第２の薬剤には、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、コンドロイチナーゼ、コラゲナーゼ、ＲＧＤ含有ペプチド、抗インテグリン抗体、尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、Ｐ２Ｙ受容体アゴニスト、および任意の血管形成インヒビター（ＶＥＧＦインヒビターおよびＰＩＧＦインヒビターが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明はまた、第２の薬剤を含む組成物の投与前または投与後の少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物の被験体への投与による被験体の眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を含む。
【００１９】
本発明の方法を使用して、硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体液および／または房水由来の出血の除去または減少、硝子体液および／または房水由来の眼球内異物の除去または減少、網膜に有毒な物質の除去または減少、硝子体液および／または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、網膜外新血管形成の減少、ならびにその任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない１つまたは複数の転帰による、被験体の眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防することができる。
【００２０】
本発明はまた、被験体の硝子体をＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む硝子体切除方法を提供する。硝子体切除の前もしくは同時または硝子体切除から独立して接触工程を行うことができる。
【００２１】
本発明はまた、少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、少なくとも１つのＴＰＣＤおよび少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書中に引用された特許出願、特許、および引用文献は、この分野の当業者の知識を示し、その全体が本明細書中で参考として援用される。本明細書中で引用した任意の引用文献と本開示の特定の教示との間に矛盾が生じた場合、本開示を優先する。
【００２４】
以下の詳細な説明およびそれに伴う実施例を、本発明の一定の好ましい実施形態を記載および説明することのみを目的として提供し、決して本発明の範囲を制限することを意図しない。他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。
【００２５】
本発明を詳細に説明する前に、以下で使用する一定の用語の定義を記載することはその理解の一助となろう。
【００２６】
定義
「処置」は、任意の内科的疾患の任意の程度への軽減または改善を意味し、障害の完全な治癒が含まれるが、その必要はない。
【００２７】
「防止」は、障害の発症を防御または保護すること、すなわち、予防薬として機能することを意味する。
【００２８】
「障害」は、任意の疾患、機能障害、症候群、病態、痛み、またはその任意の組み合わせを意味する。障害には、任意の障害、機能障害、症候群、病態、痛み、またはその任意の組み合わせ由来の任意の合併症も含まれる。
【００２９】
「被験体」は、任意の哺乳動物、特にヒトを意味する。
【００３０】
「接触」は、組成物と接触対象（例えば、硝子体、房水など）との間で相互作用する任意の投与様式を意味する。組成物の接触対象との相互作用は、実質的に組成物の投与と同時、組成物のおよそ投与時から始まって長期間、または組成物の投与時から遅れて起こり得る。
【００３１】
「組成物」は、１つまたは複数の物質の組み合わせまたは混合物を意味する。
【００３２】
「物質」は、質量を有し、且つ空間を占めるものを意味する。
【００３３】
「異物」は、医師、臨床医学者、獣医師、または研究者によって被験体の眼に有害または有毒と決定される任意の物質および／または健常な哺乳動物の眼に通常見出されない物質を意味する。
【００３４】
「眼科的に許容可能なキャリア」は、（医師、臨床医学者、獣医師、または研究者が決定したところ）被験体の眼におけるその意図する使用に第２の物質が不適切とならないように第２の物質（例えば、ＴＰＣＤ）を組み合わせることができる物質である。眼科的に許容可能なキャリアの非限定的な例には、平衡塩類溶液（ＢＳＳ）およびＢＳＳ−ＰＬＵＳ（登録商標）が含まれる。
【００３５】
「客学的に許容可能なキャリア」には、水、緩衝化食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、またはその適切な混合物が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なキャリアならびにこのようなキャリアおよびその処方物の作製方法の他の例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００）に見出される。
【００３６】
「有効量」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者によって模索されたヒトまたは他の哺乳動物の眼の応答を誘発する物質または組成物の量を意味する。
【００３７】
「誘導する」は、所望の結果をもたらすか刺激することを意味する。
【００３８】
「軽減する」は、任意の範囲に減少することを意味する。
【００３９】
「眼に対する毒作用」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者によって被験体に有害と決定された被験体の眼の任意の副作用を意味する。
【００４０】
「硝子体（ｖｉｔｒｅｏｕｓ）」は、眼の水晶体と網膜との間の房を占める硝子体（ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｂｏｄｙ）とも呼ばれる硝子体液を意味する。
【００４１】
「ＴＰＣＤ」は、「プラスミンの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質」の頭文字である。「短縮プラスミンタンパク質」は、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、Ｖａｌ79−プラスミン（すなわち、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸７９〜７９１）の１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって得られる任意のプラスミンタンパク質を意味する。このようなアミノ酸の欠失は、Ｎ末端（例えば、配列番号１０のアミノ酸４４４〜７９１、５４３〜７９１、または５６２〜７９１からなるＴＰＣＤが得られる）および／またはＣ末端および／または配列番号１０のアミノ酸７９〜７９１の任意の内部の一部または位置に存在し得る。配列番号１０由来の短縮タンパク質が酵素的に不活性な形態として作製された場合、プラスミノゲンアクチベーターを使用して短縮タンパク質の対応する活性形態に活性化しなければならないと理解すべきである。例えば、配列番号１０のアミノ酸５４３〜７９１からなるタンパク質を組換えによって作製する場合、タンパク質はその酵素活性形態ではない可能性が非常に高い。したがって、Ａｒｇ561とＶａｌ562との間のペプチド結合を切断してタンパク質を活性化するために、タンパク質をプラスミノゲンアクチベーターで処理すべきである。ＴＰＣＤの非限定的な例には、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、およびマイクロプラスミンの変異型（マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型はプラスミンの触媒ドメインを含む）が含まれる。
【００４２】
「プラスミンタンパク質」は、ヒトプラスミノゲンのＡｒｇ561とＶａｌ562との間のペプチド結合が切断されたヒトプラスミノゲンのアミノ酸配列（配列番号１０）から作製されたかこれに由来する任意のタンパク質を意味する。プラスミノゲンアクチベーターを使用してＡｒｇ561とＶａｌ562との間のペプチド結合を切断することができる。プラスミノゲンタンパク質の非限定的な例には、Ｌｙｓ−プラスミン、ミニプラスミン、およびマイクロプラスミンが含まれる。
【００４３】
「プラスミンの触媒ドメイン」は、プラスミンの触媒三つ組み（すなわち、Ｈｉｓ603、Ａｓｐ646、およびＳｅｒ741）を含み、且つアミノ酸配列がセリンプロテアーゼ活性を有する、配列番号１０（ヒトプラスミノゲン）のアミノ酸５４３〜７９１に由来する約１３０〜２４０アミノ酸のアミノ酸配列を意味する。
【００４４】
「プラスミンの修飾触媒ドメイン」は、１つまたは複数のアミノ酸の付加および／または欠失および／または置換による触媒ドメインのアミノ酸配列の変化によって変化したプラスミンの触媒ドメインを意味する。勿論、プラスミンの触媒三つ組み（すなわち、Ｈｉｓ603、Ａｓｐ646、およびＳｅｒ741）に対応するアミノ酸を変化させないと理解すべきである。修飾により、タンパク質のプラスミン様触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。例えば、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの修飾触媒ドメインは、これらのタンパク質の触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。
【００４５】
「修飾ＴＰＣＤ」は、ＴＰＣＤがプラスミン様セリンプロテアーゼ触媒活性を有する、プラスミンの修飾触媒ドメインを含むＴＰＣＤである。
【００４６】
「第２の薬剤」は、被験体の眼の障害または眼の障害の合併症の治療または防止における単独またはＴＰＣＤと組み合わせて使用することができる任意の物質を意味する。好ましくは、第２の薬剤は、ＴＰＣＤの触媒活性を妨げない。
【００４７】
「タンパク質の安定化」は、１つまたは複数の安定剤の使用によるタンパク質の分解および／または不活化からの保護を意味する。
【００４８】
本明細書中に記載のものに類似または等価な任意の方法および物質を本発明の実務または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。
【００４９】
薬理学的硝子体融解は、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防するための１つまたは複数のタンパク質薬および／または化学薬品および／または核酸薬の使用方法である。本発明は、少なくとも１つの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質（ＴＰＣＤ）を使用した薬理学的硝子体融解方法を提供する。詳細には、本発明は、硝子体液および／または房水と有効量のＴＰＣＤを含む組成物との接触による眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。これらの方法により、硝子体の液化、後部硝子体剥離、硝子体液および／または房水由来の出血の除去または減少、硝子体液および／または房水由来の眼球内異物の除去または減少、硝子体液および／または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、網膜外新血管形成の減少、ならびにその任意の組み合わせであるが、これらに限定されない転帰となる。硝子体切除の補助として、または硝子体切除を用いずに、これらの方法を使用することができる。
【００５０】
したがって、本発明は、第１の態様として、硝子体液および／または房水を有効量のＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。１つの実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、約４０，０００ダルトン未満である。別の実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、還元形態で約２６，５００ダルトンであるか非還元形態で２９，０００ダルトンである。さらに別の実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、約２０，０００ダルトンと３０，０００ダルトンとの間である。さらなる実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、約２０，０００ダルトン未満である。
【００５１】
第２の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。
【００５２】
第３の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および有効量の少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明のこの態様の１つの実施形態では、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物は、同一のＴＰＣＤを含み得る。本発明のこの態様の別の実施形態では、少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物は、異なるＴＰＣＤを含み得る。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、第１および第２の組成物を、実質的に同時または異なる時間で被験体に投与することができる。
【００５３】
第４の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つのＴＰＣＤおよび少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明のこの態様では、第２の薬剤は、ＴＰＣＤであることを意図しない。
【００５４】
第５の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物と接触させる前、同時、または後に硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。
【００５５】
第６の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、硝子体を液化する方法を提供する。本発明のこの態様の１つの実施形態では、硝子体の液化により、硝子体液の粘度が減少する。本発明の他の実施形態では、硝子体の液化により、硝子体腔および／または房水からの血液、沈殿物、異物、および／または眼、特に網膜に有毒な物質のクリアランス速度が増加する。本発明のこの態様の別の実施形態では、硝子体の液化により、網膜外新血管形成が減少する。本発明のこの態様のさらに別の実施形態では、硝子体の液化により、硝子体液および／または房水に投与した薬剤または組成物の拡散が増加する。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、硝子体の液化は、標準的な硝子体切除または２５ゲージ（またはより小さな）硝子体切除中の硝子体の除去の一助となる。
【００５６】
第７の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を有効量の少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、後部硝子体剥離を誘導する方法を提供する。
【００５７】
上記の本発明の任意の第１から第７の態様では、硝子体切除の補助としてまたは硝子体切除を用いずに硝子体液および／または房水をＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を行うことができる。
【００５８】
第８の態様では、本発明は、硝子体液および／または房水を少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる工程を含む、硝子体切除方法を提供する。硝子体切除と同時またはその前に接触工程を行うことができる。
【００５９】
第９の態様では、本発明は、少なくとも２つのＴＰＣＤを含む組成物を提供する。
【００６０】
第１０の態様では、本発明は、少なくとも１つのＴＰＣＤおよび少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物を提供する。
【００６１】
本発明の全ての態様の１つの実施形態では、ＴＰＣＤは、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。本発明の全ての態様の別の実施形態では、眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法および硝子体切除方法により、１つまたは複数の以下の結果によって眼の障害が改善される：硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体、硝子体腔、および／または房水由来の出血の除去または減少、硝子体、硝子体腔、および／または房水由来の眼球内異物の除去または減少、硝子体、硝子体腔、および／または房水由来の網膜に有毒な物質の除去または減少、硝子体液および／または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、または網膜外新血管形成の減少。本発明の全ての態様のさらに別の実施形態では、治療または防止が模索される眼の障害または眼の障害の合併症は、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６２】
ＴＰＣＤには、プラスミンの触媒ドメインを含む任意の短縮プラスミンタンパク質が含まれる。短縮プラスミンタンパク質は、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、Ｖａｌ79−プラスミン（すなわち、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸７９〜７９１）の１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって得られる任意のプラスミンタンパク質を含む。したがって、全てのＴＰＣＤは、プラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、Ｈｉｓ603、Ａｓｐ646、およびＳｅｒ741を含まなければならない。配列番号１０（ヒトプラスミノゲン）のアミノ酸７９〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって、Ｖａｌ79−プラスミンを短縮することができる。このような欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、または配列番号１０のアミノ酸７９〜７９１の内部の位置に存在し得る。配列番号１０（ヒトプラスミノゲン）のアミノ酸７９〜７９１の短縮に起因するタンパク質が酵素的に不活性な形態で作製された場合、プラスミノゲンアクチベーターを使用してタンパク質をＴＰＣＤと見なされる活性形態に変換しなければならないと理解すべきである。プラスミノゲンアクチベーターは、Ａｒｇ561とＶａｌ562との間のペプチド結合を切断して、タンパク質を活性化する。１つの実施形態では、ＴＰＣＤには、本質的に配列番号１０のアミノ酸４４４〜７９１からなるタンパク質が含まれる。別の実施形態では、ＴＰＣＤには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸４４４〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、ＴＰＣＤには、本質的に配列番号１０のアミノ酸５４３〜７９１からなるタンパク質が含まれる。さらに別の実施形態では、ＴＰＣＤには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸５４３〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、ＴＰＣＤには、本質的に配列番号１０のアミノ酸５６２〜７９１からなるタンパク質が含まれる。別の実施形態では、ＴＰＣＤには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸５６２〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、または配列番号１０（ヒトプラスミノゲン）のアミノ酸４４４〜７９１、５４３〜７９１、および５６２〜７９１の内部の位置に存在し得る。タンパク質中のアミノ酸の欠失方法は当業者に周知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００１；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００）。呈色基質Ｓ２４０３（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ａｎｔｗｅｒｐ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（実施例２を参照のこと）または任意の他の呈色基質を使用したＴＰＣＤのアミド分解活性の測定または当該分野で公知の任意の他の方法によってＴＰＣＤの触媒活性を決��することができる。
【００６３】
本発明はまた、修飾ＴＰＣＤの使用を想定する。修飾ＴＰＣＤは、修飾ＴＰＣＤがプラスミン様セリンプロテアーゼ触媒活性を有する、プラスミンの触媒ドメインの修飾形態を有するＴＰＣＤである。触媒ドメインの修飾には、プラスミンの触媒ドメインにおけるアミノ酸の挿入および／または欠失および／または置換が含まれる。しかし、プラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、ヒスチジン603、アスパラギン酸646、およびセリン741、に対応するアミノ酸は変化しない。好ましくは、触媒ドメインの修飾は、触媒三つ組みの一部ではないアミノ酸の１つまたは複数の保存的置換を含む。保存的アミノ酸置換およびこのような保存的アミノ酸置換の作製方法は、当業者に周知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｕｐｒａを参照のこと）。これらの修飾により、元のドメインの触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。呈色基質Ｓ２４０３（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ａｎｔｗｅｒｐ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（実施例２を参照のこと）または当該分野で公知の任意の他の方法を使用したＴＰＣＤのアミド分解活性の測定によって、修飾ＴＰＣＤの触媒活性を決定することができる。
【００６４】
ＴＰＣＤには、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、およびマイクロプラスミンの変異型が含まれるが、これらに限定されない。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型には、これらのタンパク質のアミノ酸欠失によって産生することができるマイクロプラスミンおよびミニプラスミンのより短い形態が含まれる。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全ての変異型は、これらがそれぞれマイクロプラスミンおよびミニプラスミンと同一の触媒活性レベルを有さない場合でさえセリンプロテアーゼ触媒活性を有すると予想される。したがって、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全変異型は、ヒトプラスミノゲンのプラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、Ｈｉｓ603、Ａｓｐ646、およびＳｅｒ741を含む配列番号１０のアミノ酸６０３〜７４１を含むことが必要である。１つの実施形態では、ミニプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸４４４〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、マイクロプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸５４３〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。さらに別の実施形態では、マイクロプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸５６２〜７９１中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、または配列番号１０のアミノ酸４４４〜７９１、５４３〜７９１、および５６２〜７９１の内部の位置に存在し得るが、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全変異型は、配列番号１０のアミノ酸６０３〜７４１を含む必要がある。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型には、これらのタンパク質のアミノ酸の挿入および／または置換が含まれるが、これらに限定されない。マイクロプラスミンまたはミニプラスミンのアミノ酸置換は好ましくは保存的置換であると想定される。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンまたは任意の他のＴＰＣＤの変異型を、組換え法によって調製し、プラスミノゲンアクチベーターを使用して活性プラスミン形態に活性化することができる。あるいは、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンまたは任意の他のＴＰＣＤの変異型を、当該分野で周知の任意の他の手段（ヒトプラスミノゲンのエラスターゼでの消化またはプラスミン、マイクロプラスミン、もしくはミニプラスミンの部分的還元およびアルキル化などであるが、これらに限定されない）によって調製することができる。マイクロプラスミン、ミニプラスミン、またはさらに言えば任意のＴＰＣＤのこれらの変異型を、呈色基質Ｓ２４０３または任意の他の呈色基質を使用してセリンプロテアーゼ触媒活性についてアッセイすることができる。さらに、マイクロプラスミン、ミニプラスミン、または任意の他のＴＰＣＤの変異型を、ブタ、ネコ、または死後ヒトの眼への異なる用量の変異型を含む任意の平衡塩類溶液の注射によってＰＶＤを誘導する能力および／または硝子体液化能力について試験することができる。ＴＰＣＤにより任意のこれらの眼のＰＶＤ誘導および／または硝子体液化が可能である場合、このＴＰＣＤを哺乳動物の眼の障害の治療に有用であると見なす。好ましくは、ＴＰＣＤは、注射した眼に有毒ではない。マイクロプラスミン変異型の非限定的な例を、表１に示す。
【００６５】
表１：マイクロプラスミン変異型の非限定的な例
以下に列挙したマイクロプラスミンの変異型は、アミノ酸１〜７９１からなるヒトプラスミノゲンのアミノ酸配列および番号に対応する（図１、配列番号１０を参照のこと）。
【００６６】
【表１】
2010222369.tif 000003
2010222369.tif 000004
2010222369.tif 000005
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2010222369.tif 000011
【００６７】
ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンは、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、組織型プラスミノゲンアクチベーター、またはウロキナーゼなどであるが、これらに限定されないプラスミノゲンアクチベーターによるミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンの活性化によって産生される。ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンは、哺乳動物の重要な血液成分である一本鎖糖タンパク質であるプラスミノゲンに由来する。ヒトプラスミノゲンは、Ｎ末端前活性化ドメイン、それぞれ約８０アミノ酸の５つの相同クリングルドメイン、セリンプロテアーゼ触媒ドメイン、およびドメイン間連結配列から構成される７９１残基（配列番号１０）の多ドメインタンパク質である。プラスミンまたはプラスミノゲンアクチベーターは、ヒトプラスミノゲンのＮ末端のＡｒｇ68−Ｍｅｔ69間、Ｌｙｓ77−Ｌｙｓ78間、またはＬｙｓ78−Ｖａ79間のペプチド結合を切断して、Ｌｙｓ−プラスミノゲン（例えば、アミノ酸６９〜７９１または７８〜７９１または７９〜７９１からなるタンパク質）と呼ばれるより短いプロ酵素が得られる。酵素エラスターゼによるさらなる切断により、最初の４つのクリングルドメインが除去されてプロ酵素であるミニプラスミノゲン（典型的には、アミノ酸４４２〜７９１）が産生される。第５のクリングルのさらなる切断により、プロ酵素マイクロプラスミノゲン（典型的には、アミノ酸５４３〜７９１）が得られる。プラスミノゲンのクリングルは、プラスミノゲンのフィブリンなどの基質への特異的結合を媒介するリジン結合部位を含む。プラスミノゲンのプロ酵素形態は、Ａｒｇ561とＶａｌ562との間のペプチド結合の切断によってその酵素活性形態に活性化されて対応するタンパク質のジスルフィド結合二本鎖形態が得られる。プラスミノゲンタンパク質の活性化産物は、プラスミンと呼ばれる。したがって、Ｌｙｓ−プラスミノゲンの活性化産物はＬｙｓ−プラスミンと呼ばれ、ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンの活性化産物はそれぞれミニプラスミンおよびマイクロプラスミンと呼ばれる。Ｌｙｓ−プラスミンのその非グリコシル化形態の分子量は６５，０００であり、その完全にグリコシル化された形態の分子量は約８３，０００ダルトンであり、ミニプラスミンの分子量は約３８，０００であり、マイクロプラスミンの分子量は、還元形態で約２６，５００ダルトンであり、非還元形態で約２９，０００ダルトンである。プラスミンと同様に、ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンは触媒活性を有する。プラスミンを超えるミニプラスミンおよびマイクロプラスミンの利点は、プラスミンと比較してそのサイズが小さいことである。したがって、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンは共にプラスミンよりも硝子体中での拡散速度が速いと予想される（Ｘｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：６６４−６６９，２０００）。
【００６８】
１つの実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、約４０，０００ダルトン未満である。別の実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、約２０，０００ダルトンと約３０，０００ダルトンとの間である。さらに別の実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、還元形態で２６，５００および非還元形態で約２９，０００である。さらなる実施形態では、ＴＰＣＤの分子量は、約２０，０００未満である。
【００６９】
米国特許第４，７７４，０８７号に記載のように、マイクロプラスミンを、ｐＨが約９．５〜１１．５の範囲の高アルカリ溶液中でのプラスミンおよびプラスミノゲンの自己分解によって調製することができる。あるいは、ＰＣＴ出願ＷＯ０２／５０２９０号に記載のように、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンを、組換え法によって調製することができる。簡単に述べれば、ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンをコードするＤＮＡを、メチロトローフ酵母（例えば、ハンセヌラ属、ピキア属、カンジダ属、およびトルロプシス属）中でのこれらのタンパク質の発現に使用することができる酵母発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクター）に単独でクローン化する。最も高いミニプラスミン活性およびマイクロプラスミン活性を有するタンパク質を産生する酵母クローンを、大量産生のために選択する。これらのクローンを、任意の規模で成長させることができるが、典型的には約２０リットル〜約５００リットルの規模で行う。分泌されたミニプラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲンを、陽イオン交換流動層クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを含む３工程プロセスで精製する。このプロセスによって得られた精製マイクロプラスミノゲンおよびミニプラスミノゲンを、１モル比のプラスミノゲンアクチベーター（例えば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ＳＹ１６２スタフィロキナーゼ変異型など）を使用してその活性形態に活性化する。ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンの組換え産生プロセスを拡大して任意のＴＰＣＤを産生することができることに留意すべきである。自己プラスミン酵素と比較した組換えＴＰＣＤ使用の利点は、巨大産生バッチから組換えタンパク質を調製して活性が均一な酵素を得ることができることである。これらの酵素は均一な活性を有するので、標準化したプロトコールを実施することができる。さらなる利点は、遅延や各患者におけるプラスミンの単離および精製に関する他の付随する問題もなくこれらのタンパク質を容易に利用することができることである。
【００７０】
上記プロセスによって得られたＴＰＣＤを、濃縮、安定化、および／または凍結乾燥することができる。タンパク質の濃縮方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｌ．Ｖ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ，Ｓ．（ｅｄｓ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｌｉｖｅ  Ｄｅｎｎｉｓｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３；ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｄａｎｉｅｌ  Ｍ．Ｂｏｌｌａｇ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｄ．Ｒｏｚｙｃｋｉ，Ｓｔｕａｒｔ  Ｊ．Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，１９９６を参照のこと）。
【００７１】
安定化は、（例えば、ＴＰＣＤの安定剤との接触または安定剤の存在下でのＴＰＣＤの精製による）１つまたは複数の安定剤の使用による分解および／または不活化からのタンパク質の保護方法である。安定剤には、トラネキサム酸、ヘキサン酸、リジン、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、多価アルコール、薬学的に許容可能な炭水化物、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミド、任意の酸性緩衝液（クエン酸、酢酸、塩酸、炭酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、または安息香酸を含む）、および塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどの塩、ならびにその任意の誘導体または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。自己プラスミン酵素と比較した安定化組換え産生ＴＰＣＤ使用の１つの利点は、これらのタンパク質が患者毎の採血、精製、プラスミン酵素の調製および保存によって得られた自己プラスミン酵素よりも安定なことである。その調製直後に使用する必要がある自己プラスミン酵素と異なり、安定化組換えＴＰＣＤは、精製から相当な時間を経た後でさえも使用することができる。
【００７２】
精製タンパク質の濃縮直後または安定化直後に本発明のＴＰＣＤを凍結乾燥することができる。タンパク質の凍結乾燥方法は、当業者に周知である。凍結乾燥ＴＰＣＤを、任意の量、好ましくは使用時に容易に再構成することができる量をバイアル（例えば、ガラス）に保存することができる。
【００７３】
凍結乾燥したマイクロプラスミン、ミニプラスミン、または任意の他のＴＰＣＤを、眼科的に許容可能なキャリア中に再構成し、その後硝子体液および／または房水への接触に使用することができる。１つの実施形態では、眼科的に許容可能なキャリアは、被験体の硝子体に適合するｐＨおよび浸透圧を有する滅菌溶媒である。眼科的に許容可能なキャリアの非限定的な例は、等張生理食塩水、平衡塩類溶液（ＢＳＳ）、およびＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）である。平衡塩類溶液は、典型的には、０．６４％塩化ナトリウム、０．０７５％塩化カリウム、０．０４８％脱水塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム六水和物、０．３９％酢酸ナトリウム三水和物、０．１７％クエン酸ナトリウム二水和物、ｐＨ調整のための水素化ナトリウム／塩酸、および水を含む。
【００７４】
ＴＰＣＤを含む組成物を使用した硝子体液および／または房水の接触方法は、特定の被験体、治療される病態の重症度、および有効な治療に必要な投薬量に依存し、患者ごとに医師が決定することができる。有効量のＴＰＣＤが得られる硝子体液および／または房水の硝子体液および／または房水への任意の接触方法を使用することができる。硝子体液および／または房水とのこのような接触は、ＴＰＣＤを含む組成物の投与と同時に行ってはならないと理解すべきである。接触を遅らせるか、投与時から長期間にわたって接触させることができる。硝子体液および／または房水の１つの接触方法は、硝子体液および／または房水への１回または複数回の各眼内注射による。結膜下注射、筋肉内注射、または静脈内注射によって、硝子体液および／または房水に接触させることもできる。当該分野で周知の手順にしたがって、ＴＰＣＤを含む溶液を使用して、これらの任意の注射を行うことができる。しかし、あるいは、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または防止するために硝子体液および／または房水にＴＰＣＤを十分に拡散させる任意の他の適切な方法によって、硝子体液および／または房水をＴＰＣＤと接触させることができる。硝子体内移植可能デバイス（ＯＣＵＳＥＲＴ（登録商標）（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌａｍｂ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）が含まれるが、これらに限定されない）の移植によって、ＴＰＣＤを含む組成物を投与することもできる。本発明は、ＴＰＣＤが継続的に供給されるように、持続性製剤、徐放性処方物、または任意の移植可能なデバイスを使用して、硝子体液および／または房水をＴＰＣＤに接触させることができることも想定する。
【００７５】
当業者は、ＴＰＣＤの投与計画を容易に決定することができ、これは患者および模索される効果に依存して変化する。眼（詳細には、網膜）または関連する解剖学的構造に有意な毒性を生じることなく所望の治療効果（硝子体の液化、後部硝子体剥離、および／または硝子体腔からの血液、有毒物質、または異物の除去が含まれるが、これらに限定されない）が得られる任意の用量でＴＰＣＤを使用することができる。さらに、単回用量または複数回用量としてＴＰＣＤを投与することができる。典型的なＴＰＣＤ投薬量は、約０．００５ｍｇ／眼〜約０．２ｍｇ／眼の範囲である。注射する場合、ＴＰＣＤを、約０．０５ｍｌ〜約０．３ｍｌの滅菌溶液（例えば、滅菌ＢＳＳまたはＢＳＳ ＰＬＵＳ（登録商標））／眼の送達体積で投与することができる。硝子体切除が行われる場合、硝子体が除去される前の約１５分間と１２０分間との間硝子体液および／または房水中にＴＰＣＤが残存する。本発明の１つの実施形態では、眼あたり０．１２５ｍｇのＴＰＣＤを含む０．１ｍｌの滅菌ＢＳＳまたはＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）を送達させる。別の実施形態では、眼あたり０．１２５ｍｇのＴＰＣＤを含む０．１ｍｌの滅菌ＢＳＳまたはＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）を硝子体切除前に約１５〜１２０分間送達させる。
【００７６】
本発明はまた、１つを超えるＴＰＣＤを含む組成物の使用を意図する。したがって、本発明の１つの態様では、硝子体液および／または房水を第１のＴＰＣＤおよび第２のＴＰＣＤを含む組成物と接触させる。本発明のこの態様の１つの特定の実施形態では、第１および第２のＴＰＣＤは、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。本発明の別の態様では、硝子体液および／または房水を少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第１の組成物および少なくとも１つのＴＰＣＤを含む第２の組成物と接触させる。ＴＰＣＤは、同一または異なるタンパク質であってよく、実質的に同時または異なる時間で投与することができる。さらに、ＴＰＣＤを、少なくとも１つの第２の薬剤をさらに含む組成物として投与することもできる。さらに、硝子体液および／または房水を少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させ、その後少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物と接触させるかその逆を行うことができる。これらの各組成物に必要な時間が異なる場合（すなわち、一方の組成物が他方と比較して作用するのにより多くの時間を必要とする場合）、これが必要であり得る。第２の薬剤は、眼の障害または眼の障害の合併症の治療または予防に有用な任意のタンパク質（しかしＴＰＣＤではない）、化学物質、または他の物質である。このような第２の薬剤は、米国特許第４，８２０，５１６号；同第５，２９２，５０９号；同第５，８６６，１２０号；同第６，０５１，６９８号；同第６，４６２，０７１号；同第６，５９６，７２５号；および同第６，６１０，２９２号に記載されている。本発明で有用な第２の薬剤の非限定的な例には、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチン４−スルファターゼ、コンドロイチン６−スルファターゼ、およびＢ−グルクロニダーゼなどのグリコサミノグリカナーゼ酵素；コラゲナーゼ酵素；ディスパーゼ；ＲＧＤ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＴＰ、エキスタチン、およびファルボリジンなどのＲＧＤ含有ペプチド；抗インテグリン抗体；Ｐ２Ｙ受容体アンタゴニスト；尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、および抗血管形成薬（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）インヒビター（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦアプタマー、可溶性ＶＥＧＦ受容体など）および胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）インヒビター（例えば、抗ＰＩＧＦ抗体、ＰＩＧＦアプタマー、可溶性ＶＥＧＦ受容体など）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。これらのほとんどの第２の薬剤自体が、硝子体液化の促進および／または後部硝子体剥離の誘導が可能である。第２の抗血管形成薬は、眼の新血管形成の防止に有用であり得る。低酸素性網膜からのＶＥＧＦおよび／またはＰＩＧＦの発現により、網膜外新血管形成が起こり得る。したがって、ＶＥＧＦおよび／またはＰＩＧＦの阻害は、新血管形成の防止に有効な方法である。
【００７７】
ＴＰＣＤを含む組成物は、硝子体の液化および／または網膜および他の組織（例えば、網膜上皮、黄斑）からの硝子体の解離（ｄｉｓｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）または剥離に有用である。この硝子体液化および／または硝子体剥離の結果として、網膜および他の組織に対する硝子体の牽引力が最小になり、硝子体内の流動物の天然の代謝回転速度が加速される。したがって、ＴＰＣＤを含む組成物は、眼の多数の障害の治療または予防に特に適切であり、硝子体液化、後部硝子体剥離、網膜外新血管形成の減少、および／または眼の後眼房および／または後眼房の隣接組織（例えば、網膜または黄斑）由来の毒素もしくは他の有害物質（例えば、血管新生因子、浮腫液、出血など）のクリアランスの加速に有利である。このような眼の障害の例には、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびこれらの障害の臨床症状ＴＰＣＤ投与に応答する他の障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、硝子体とＴＰＣＤを含む組成物との接触を含む眼の障害の治療を意図する。このような接触により、硝子体が液化し、そして／または後部硝子体剥離が誘導され、そして／または硝子体腔からの血液または他の有毒物質が除去され、そして／または網膜外新血管形成が減少し、それにより障害が治療または防止されると予想される。
【００７８】
本発明はまた、網膜への硝子体の接着および硝子体萎縮の結果またはであるかこれによって悪化する眼の種々の障害発症を防止または阻害する方法に関する。１つの実施形態では、本発明の方法により、眼から硝子体を除去することなく被験体の眼の障害または障害の由来の合併症を防止または阻害することができる。特に、本発明は、硝子体萎縮または硝子体への新血管形成に関連する障害の発症の防止または遅延の予防工程としての後部硝子体剥離の誘導による増殖性障害患者（糖尿病患者などであるが、これらに限定されない）または増殖性障害の発症リスクのある患者の治療プロセスに関する。本発明の１つの実施形態では、糖尿病性網膜症の進行を阻害するために糖尿病患者の眼に組成物を導入する。好ましくは、増殖性障害が発症する前に組成物を眼に導入する。１つの実施形態では、増殖性障害の発症前に組成物を眼の硝子体に導入し、眼から硝子体を除去することなく組織を無期限に眼にとどめることが可能である。さらなる実施形態では、本発明は、治療を必要とする患者の後部硝子体剥離の誘導による網膜新血管形成および黄斑浮腫などの網膜中心静脈閉塞症および網膜静脈分枝閉塞症の合併症を防止するためのプロセスに関する。本発明は、後部硝子体剥離の誘導による切迫黄斑円孔または全層性黄斑円孔（特発性または外傷性）の治療プロセスを提供する。硝子体萎縮に起因する網膜剥離、網膜裂傷、および網膜出血の発症を、このような障害が起こる前に眼から硝子体を除去することなく後部網膜剥離の誘導によって防止または軽減することができる。
【００７９】
多数の眼科障害の原因は、血液網膜膜の不安定化である。この不安定化により、脈絡毛細管の種々の成分（例えば、血清成分、脂質、タンパク質）が硝子体腔に侵入して網膜表面に損傷を与える。この不安定化はまた、新血管形成として公知の硝子体腔の血管浸潤の前兆である。硝子体の新血管形成は、硝子体の基質に依存する。したがって、重合硝子体形態の基質を除去する硝子体の液化により新血管形成が遮断される。１つの実施形態では、本発明は、硝子体をＴＰＣＤを含む組成物と接触する工程を含む、網膜新血管形成の発症の防止または減少による眼の障害を治療または防止する方法を提供する。
【００８０】
糖尿病性網膜症および外傷を含むいくつかの眼科障害により、網膜血管が破裂または漏出して硝子体に出血する（すなわち、硝子体出血）。硝子体出血は、典型的には、硝子体の濁りまたは混濁として現れ、いつもではないが時折網膜の裂傷または剥離を伴う。網膜の裂傷または剥離が硝子体の出血を伴う場合、このような網膜の裂傷または剥離を迅速に診断し、手術によって修復することが重要である。網膜の裂傷または剥離を迅速に診断および修復できない場合、裂傷または剥離領域中の網膜の光受容細胞は壊死し得る。網膜の光受容体細胞の壊死により失明し得る。さらに、網膜剥離が長期間未修復のままであるとさらに硝子体が出血し、そして／または出血部位に線維組織が形成され得る。線維組織により、硝子体と網膜との間に望ましくない不変の線維の接着物が形成され得る。いかなる治療も行わない場合、出血性の硝子体混濁において網膜が硝子体を通して十分に視覚可能になるまで透明になるのに６〜１２ヶ月またはそれ以上かかり得る。このような場合、医師が任意の網膜表面部分を修復する必要がある場合または医師が混濁または濁った硝子体によって妨げられた患者の網膜表面を見えるようにする必要がある場合、硝子体切除として公知の超微細手術手順を実施する必要があり得る。この手順は、超微細手術カッターを使用した硝子体の全部または一部の除去および眼窩の形状を維持する透明な液体または他の物質への硝子体の置換を含む。標準的な硝子体切除手術手段は当業者に周知である。１つの実施形態では、本発明は、硝子体切除の補助としての硝子体と少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物との接触を意図する。他の実施形態では、硝子体切除を行わずに硝子体を少なくとも１つのＴＰＣＤを含む組成物と接触させる。
【００８１】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、本明細書中に記載の特定の手順に対する範囲または精神において本発明を制限すると解釈されない。対照的に、本明細書中の説明の解釈後、手段には種々の他の実施形態、修正形態、および等価物が含まれ、これら自体が本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく当業者に示唆されることが示唆され得ることが明らかに理解される。
【実施例１】
【００８２】
ピキア・パストリス（Ｐiｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中でのヒトマイクロプラスミノゲンおよびヒトミニプラスミノゲンの発現のためのベクター構築
（ａ）ｐＰＩＣＺαＡベクター
ＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入したｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクターを使用して、ピキア・パストリス中での組換えヒトマイクロプラスミノゲンおよびミニプラスミノゲンの発現および分泌を行った。このベクターの顕著な特徴には、（ｉ）ピキア属において組換えタンパク質のメタノール誘導性高レベル発現が可能なアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターを含む９４２ｂｐフラグメントおよびＡＯＸ１染色体遺伝子座へのプラスミド組み込みのターゲティング；（ｉｉ）天然の転写終結およびＡＯＸ１遺伝子由来のポリアデニル化シグナル；（ｉｉｉ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）およびピキア・パストリスにゼオシン耐性を付与する発現カセット、（ｉｖ）大腸菌中でのプラスミドの増殖および維持のためのＣｏｌＥ１複製起点、（ｖ）タンパク質の検出および精製に使用することができるｃ−ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ、および（ｖｉ）ピキアゲノムへの有効な組み込みのためにＡＯＸ１遺伝子座でベクターを線状化可能な固有の制限部位（例えば、ＳａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＢｓｔＸＩ）が含まれる。
【００８３】
上記特徴に加えて、本ベクターは、培地に分泌タンパク質として異種タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエα因子プレプロペプチドの分泌シグナルを含む。ｐＰＩＣＺ中でのα因子接合シグナル配列のプロセシングは以下の２工程で起こる。
【００８４】
１．配列Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ*  Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（*は切断部位である）中のアルギニンとグルタミンとの間に起こるＫＥＸ２遺伝子産物によるシグナル配列の予備切断。しかし、Ｇｌｕ−Ａｌａ反復は、Ｋｅｘ２による切断に常に必要ではない。
【００８５】
２．Ｇｌｕ−Ａｌａ反復は、ＳＴＥ１３遺伝子産物によってさらに切断される。いくつかの場合、Ｓｔｅｌ３切断は効率的ではなく、Ｇｌｕ−Ａｌａ反復は、目的の発現タンパク質のＮＨ2末端上に残存する。
【００８６】
ｐＰＩＣＺαＡベクター中のα因子シグナル配列の操作されたすぐ下流に、外来遺伝子のクローニングを容易にするための酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩＩ、およびＸｂａＩの認識配列を有する多クローニング部位が存在する。他クローニング部位中のＸｈｏＩ部位に加えて、Ｌｙｓ−Ａｒｇ Ｋｅｘ２切断部位のすぐ上流にα因子分泌シグナルのカルボキシル末端にＸｈｏＩ認識配列が存在する。このＸｈｏＩ制限部位を使用して、ＰＣＲクローニングアプローチおよびＸｈｏＩ部位からアルギニンコドンへの配列の再構築のための適切な正方向プライマーの使用によって、Ｋｅｘ２切断部位と同一面の目的の遺伝子をクローン化することができる。次いで、天然のＮＨ2末端を含む目的の組換えタンパク質を発現する。
【００８７】
（ｂ）マイクロプラスミノゲンのための発現ベクターの構築
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されているＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡポリメラーゼミックスを使用して、ヒトマイクロプラスミノゲンタンパク質（アミノ酸５４３〜７９１（配列番号４））をコードする核酸配列を、ベクターＦｍｙｃ−ｐＰｌｉから増幅した（ＰＣＲレスキュー）（Ｌａｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：９４６，１９９７）。９４℃で３分間のＤＮＡテンプレートの分解後、３０ラウンドの熱サイクリングを行い（９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、その後７２℃で２分間の最終伸長を行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマーＬＹ−ＭＰＬＧ１（センス）およびＬＹ−ＭＰＬＧ２（アンチセンス）を本反応で使用した：
ＬＹ−ＭＰＬＧ１：５’ＧＧＧＧＴＡＴＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＧ（配列番号１）
ＬＹ−ＭＰＬＧ２：５’ＧＴＴＴＴＴＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ（配列番号２）。
【００８８】
ＬＹ−ＭＰＬＧ１プライマーは、α因子接合シグナル（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ  Ａｒｇ）の最後の４つの残基を含む非アニーリング伸長が先行したヒトプラスミノゲンの残基５４３〜５４８（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）に対応するアニーリング領域を有していた。この伸長では、Ｌｅｕ−ＧｌｕコドンによりＸｈｏＩ制限部位（下線）が決定され、Ｋｅｘ２切断部位と同一面の目的の遺伝子をクローニング可能である。ＬＹ−ＭＰＬＧ２プライマーは、プラスミノゲンの最後の７残基に対応するアニーリング領域、その後にＴＡＡ終止コドンおよびＸｂａＩ認識配列（下線）を含む非アニーリング領域を有していた。
【００８９】
予想サイズ（〜７８０ｂｐ）を有する増幅フラグメントを、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、ベクターｐＰＩＣＺαＡに方向性にクローン化した。ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限によってレシピエントベクター−フラグメントを調製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，ドイツ）を使用してアガロースゲルから精製した。Ｅ．コリＴＧ１株（ＤＳＭＺコレクション番号１２０８，ドイツ）を、ライゲーション混合物で形質転換し、ゼオソン耐性クローンを選択した。制限分析に基づいて、予想サイズのインサートを含むプラスミドクローンをさらなる特徴付けのために保持した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＥａｓｙＳｅｌｅｃｔピキア発現キットに含まれるプライマー５’ＡＯＸおよび３’ＡＯＸを使用したベクターｐＰＩＣＺα−ＭＰＬＧ１（クローン番号５）の配列決定により、α因子接合シグナルに融合したマイクロプラスミノゲンコード領域の正確な挿入およびコード領域中の望ましくない変異の不在を確認した。
【００９０】
使用したヒトマイクロプラスミノゲンの決定したヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４に示す。Ｆｏｒｓｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１３：２５４，１９８７によって以前に決定された配列と比較して、１０の位置でヌクレオチド配列が異なる。しかし、アミノ酸配列は同一であった。
【００９１】
（ｃ）ミニプラスミノゲンのための発現ベクター構築
上記ｐＰＩＣＺα−ＭＰＬＧ１ベクターを使用して、ミニプラスミノゲンの発現のためのｐＰＩＣＺα由来の分泌ベクターを以下のように構築した。
【００９２】
ミニプラスミノゲンタンパク質（配列番号１０のアミノ酸４４４〜６０４）のクリングル５および触媒ドメイン一部をコードする５００ｂｐＤＮＡフラグメントを、ベクターＦｄＴｅｔ−ＳＮ−ｍｉｎｉＰｌｇ（Ｌａｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、前出）から増幅させた「ＰＣＲレスキュー」）。９４℃で３分間のＤＮＡテンプレート変性工程後、３０サイクルの熱サイクリング（９４℃で１０秒間、５０℃で１０秒間、７２℃で１秒間）、その後７２℃で２分間の最終伸長工程を行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマーＬＹ−ＭＩＮＰＬＧ１（センス）およびＬＹ−ＭＩＮＰＬＧ２（アンチセンス）を本反応で使用した：
ＬＹ−ＭＩＮＰＬＧ１：５’ＧＧＧＧＴＡＴＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＣＣ（配列番号５）
ＬＹ−ＭＩＮＰＬＧ２：５’ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ（配列番号６）。
【００９３】
ＬＹ−ＭＩＮＰＬＧ１プライマーは、因子接合シグナルの最後の４つの残基（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を含む非アニーリング伸長が先行したプラスミノゲンの残基４４４〜４５２（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）に対応するアニーリング領域を有していた。この伸長では、Ｌｅｕ−ＧｌｕコドンによりＸｈｏＩ制限部位（下線）が決定され、Ｋｅｘ２切断部位と同一面の目的の遺伝子をクローニング可能である。
【００９４】
ＬＹ−ＭＩＮＰＬＧ２プライマーは、ヒトプラスミノゲンの残基５９６〜６０４（Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）に対応するアニーリング領域を有する。触媒ドメインのこのアニーリング領域はまた、マイクロプラスミノゲン発現ベクター中に存在し、固有のＰｓｔＩ認識配列（下線）を含む。
【００９５】
予想されるサイズを有する増幅フラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで消化し、ベクターｐＰＩＣＺα−ＭＰＬＧ１由来のレシピエントベクターフラグメントに方向性にクローン化した。ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩ制限によってレシピエントベクター−フラグメントを調製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，ドイツ）を使用してアガロースゲルから精製した。Ｅ．コリＴＧ１株（ＤＳＭＺコレクション番号１２０８，ドイツ）を、ライゲーション混合物で形質転換し、ゼオソン耐性クローンを選択した。制限分析に基づいて、予想サイズのインサートを含むプラスミドクローンをさらなる特徴付けのために保持した。プライマー５’ＡＯＸおよび３’ＡＯＸを使用したベクターｐＰＩＣＺα−ＫＭＰＬＧ１（クローン番号３）の配列決定により、α因子接合シグナルに融合した増幅フラグメントの正確な挿入およびコード領域中にいかなる変異も存在しないことを確認した。
【実施例２】
【００９６】
組換え安定化マイクロプラスミンの調製方法
（ａ）ｐＰＩＣＺα−ＭＰＬＧ１でのピキア属の形質転換。１０μｇのベクターｐＰＩＣＺα−ＭＰＬＧ１を、５’ＡＯＸ１領域中でベクターを線状化するＰｍｅＩで消化した。ＤＮＡを沈殿させ、滅菌蒸留水中に０．３３μｇ／μｌに濃縮し、５μｌを使用してＥａｓｙＳｅｌｅｃｔＰｉｃｈｉａ発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスＸ３３細胞を形質転換した。
【００９７】
（ｂ）高発現株の選択
高発現株の選択を以下のように行った。ゼオシン耐性形質転換体を、ＹＰＤＳＺプレート（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、１Ｍソルビトール、２％寒天、１００μｇ／ｍｌゼオシン）上で選択した。３４個の単一コロニーを、１０ｍｌ ＢＭＹＺ−グリセロール培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グリセロール、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０-5％ビオチン、１００μｇ／ｍｌゼオシン）を含む５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブ中でインキュベートし、３０℃で１６時間培養した。細胞をペレット化し、ＡＯＸ１プロモーター由来の発現を誘導するために、２ｍｌのＢＭＹＺ─メタノール培地（ＢＭＹＺ−グリセロールと同一であるが、グリセロールの代わりに０．５％メタノールを含む）中に再懸濁し、４０時間培養した。この期間中（６、２２、２６、および３０時間後）に培養物に４パルスの０．５％メタノールを供給した。インキュベーション培養後、培養上清中のマイクロプラスミノゲンの存在を、Ｌｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｒｏｃｈｅｎｔ．１２０：１４９，１９８１に記載のように評価した。簡単に述べれば、無希釈または１０倍希釈の上清中のマイクロプラスミノゲンを、ウロキナーゼと３０分間インキュベートして、マイクロプラスミノゲンをマイクロプラスミンに活性化した。異なる時間の呈色基質Ｓ２４０３（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ａｎｔｗｅｒｐ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって決定されたそのアミド分解活性によって決定された、得られたマイクロプラスミン活性を、既知量の精製プラスミンまたはマイクロプラスミン調製物の活性と比較した。その後の大量産生のために、ウロキナーゼ活性化後に高マイクロプラスミン活性を示すクローンＸ３３−ＭＰＬＧ１番号５を選択した。２００１年１２月１２日にブダペスト条約の条項にしたがってこのクローンをＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ−ＭＵＣＬ−ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）に寄託し、アクセッション番号ＭＵＣＬ４３６７６で受託された。
【００９８】
（ｃ）発酵
以下の４つの工程で５０リットル規模のＸ３３−ＭＰＬＧ１番号５の発酵を行った。０．７ｍｌの接種物（細胞バンクウイルス番号グリセロールＯＯＣ１７）を使用して、４００ｍｌＹＳＧ＋（６ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのダイズペプトン、２０ｇ／ｌのグリセロール）中にて、２７０ｒｐｍで震盪しながら２リットルフラスコでの細胞培養を３０℃で２３時間行い、ＯＤ６００ １５を得た（予備培養工程後）。次いで、６００ｍｌの接種物を使用して、大気圧で５０ｌ／分通気し、溶存酸素（ＤＯ）が２０％超であり、２００〜５００ｒｐｍで震盪し、１２．５％アンモニアでｐＨ５．８に維持した３０ｌ基本培地（２６．７ｍｌ／ｌの８５％Ｈ3ＰＯ4、１．０５ｇ／１  ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ、１８．２ｇ／ｌ Ｋ2ＳＯ4 １４．９ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、４．１３  ｇ／ｌ  ＫＯＨ、４０ｇ／ｌ１００％グリセロールならびに４．７６ｍｌ／ｌ  ＰＴＭ１塩溶液（６ｇ／ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０８ｇ／ｌ  ＮａＩ、３．３６ｇ／ｌ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．２ｇ／ｌ ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ／ｌホウ酸、０．８２  ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２０ｇ／ｌ ＺｎＣ１2、６５ｇ／ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ／ｌ  ｄ−ビオチン、および５ｍｌ／ｌ ＨＳＳＯ4を含む））を含むＭＲＰ８０発酵デバイス中にて３０℃で発酵させた。２４時間後且つ５０のＯＤ６００後（バッチ工程後）、溶存酸素の急速な増加によってグリセロールの枯渇が証明された。グリセロール供給（６３２ｇ／ｌの１００％グリセロールおよび１２ｍｌ／ ＰＴＭ１）により、２４時間でＯＤ６００が２５８まで増加した。次いで、６時間以内に２５０ｍｌ／時間まで流速を増加させてメタノールを供給し、９８８ｍｌ／ｌメタノールおよび１２ｍｌ／ｌ ＰＴＭ１を使用して６６時間維持し、培養終了時にＯＤ６００が３２５に達した。３５０リットル規模のＸ３３−ＭＰＬＧ１番号５の発酵により、比例的に類似の結果が得られた。
【００９９】
（ｄ）精製
次いで、回収物を、陽イオン交換流動層クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを含む３工程プロセスで精製する。
【０１００】
ｉ）陽イオン交換流動層クロマトグラフィ。ベッド体積が５，１２０ｃｍ3であり、２カラム体積の１Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ＣＨ3ＣＯＯＮａ・３Ｈ2Ｏ）緩衝液（ｐＨ  ６．０）およびその後の１カラム体積の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇流によって層流を起こさせて平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔ  Ｎｏ．１８−１１００−２２）中にパッケージングされたＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０９９３−０１／０２にて利用可能）を使用して陽イオン交換流動層吸着クロマトグラフィを行った。発酵ブロスを水でオンライン式にて希釈し（７倍）、流速１０００ｍｌ／分で層流ベッドを上方へ通過させた。弱く結合した物質を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇流で洗浄した。次いで、カラムアダプターを高さ１６．３ｃｍの沈殿ベッド表面まで低下させた。逆流させ、捕捉タンパク質を２カラム体積の０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶離した。固体硫酸アンモニウムを、３０％飽和に達するまで溶離Ｓｔｒｅｍｌｉｎｅ画分に添加し（溶離Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ画分１リットルあたり１６４ｇのリュ三アンモニウム）、混合物を４〜８℃で１時間ゆっくりと撹拌した。
【０１０１】
ｉｉ）疎水性クロマトグラフィ。４〜８℃でパッケージング体積２，７００ｃｍ3のＶａｎｔａｇｅ １８０／５００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８７０１８００１から利用可能）にパッケージングされたＨｅｘｙｌ ＴＳＫ ６５０Ｃ（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１９０２７から利用可能）を使用して、疎水性クロマトグラフィを行った。溶離ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ画分を、３８ｌ／時間の流速でカラムにロードした。次いで、カラムを、１６４ｇ／ｌ硫酸アンモニウムを含む１．５倍体積の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、７カラム体積の２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を使用してカラムから溶離した。
【０１０２】
ｉｉｉ）アフィニティクロマトグラフィ。パッケージング体積３，１８６ｃｍ3のＶａｎｔａｇｅ  １３０／５００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８７０１３００１から利用可能）にパッケージングされたＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０９４８−０２／０３から利用可能）を使用して、４〜８℃でアフィニティクロマトグラフィを行った。溶離画分を、流速２０ｌ／時間でカラムにロードし、１カラム体積の２５ｍＭリン酸一水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ）緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。マイクロプラスミノゲンタンパク質画分を、５カラム体積の０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ リン酸一水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムから溶離し、−２０℃で凍結保存した。ＳＤＳゲル電気泳動によって証明したところ、物質の純度は９８％超であった。
【０１０３】
（ｅ）マイクロプラスミンの定量的活性化および安定化。ｉ）定量的活性化。０．５％のスタフィロキナーゼ変異型ＳＹ１６２を含む０．５ＭＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸一水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ）緩衝液（ｐＨ７．０）のモル比で２３℃で３０分間マイクロプラスミノゲンのマイクロプラスミンへの活性化を行った。ＷＯ９９／４０１９８に記載のように、ＳＹ１６２は、野生型と比較して、１２アミノ酸置換（Ｋ３５Ａ、Ｅ６５Ｑ、Ｋ７４Ｒ、Ｅ８０Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｔ９０Ａ、Ｅ９９Ｄ、Ｔ１０１Ｓ、Ｅ１０８Ａ、Ｋ１０９Ａ、Ｋ１３０Ｔ、およびＫ１３５Ｒ）を含む免疫原性が減少したスタフィロキナーゼ変異型である。最終濃度１Ｍ（１３２ｇ／ｌ）までマイクロプラスミンに固体硫酸アンモニウムを添加し、混合物を４〜８℃で１５分間撹拌した。
【０１０４】
ｉｉ）疎水性クロマトグラフィ。パッケージング体積が１，７３８ｃｍ3であり、４カラム体積の０．１Ｍの安定剤、トラネキサム酸（Ｂｏｕｒｎｏｎｖｉｌｌｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｂｒａｉｎｅ−Ｌ’Ａｌｌｅｕｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍから利用可能）、および１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ ７．０）を含む２５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ緩衝液（ｐＨ ７．０）で平衡化したＢＰＧ １００／５００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１０３−０１から利用可能）中にパッケージングしたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０９６５−０３／０５から利用可能）  を使用して４〜８℃で疎水性クロマトグラフィを行った。活性化産物を、１８ｌ／時間の線形流速でカラムにロードし、０．１Ｍトラネキサム酸および１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む４．５カラム体積の２５ｍＭＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。線形流速６ｌ／時間の０．１Ｍトラネキサム酸および０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む５カラム体積の２５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ緩衝液（ｐＨ７．０）でマイクロプラスミンをカラムから溶離し、０．１Ｍトラネキサム酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水で平衡化した。０．１Ｍトラネキサム酸を含む２５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムからスタフィロキナーゼ変異型ＳＹ１６２を溶離した。特異的ＥＬＩＳＡアッセイで証明されるように、この手順により、マイクロプラスミンピークから９９％超のスタフィロキナーゼを除去した。
【０１０５】
ｉｉｉ）接線限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による濃縮およびダイアフィルトレーション。この工程では、工程（ｉｉ）からの溶離物を濃縮し、緩衝液を低ｐＨクエン酸緩衝液と交換した。工程（ｉｉ）のトラネキサム酸をこの工程で除去し、低ｐＨクエン酸緩衝液によってマイクロプラスミンを安定化した。
【０１０６】
２つのＰｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｂｉｏｍａｘメンブレン（５ｋＤａ、２．５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２Ｂ００５Ａ２５から利用可能）を使用して、２〜８℃で限外濾過を行った。メンブレンを、Ｍｉｃｒｏｇｏｎ  Ｐｕｍｐ  Ｃａｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ，Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから利用可能）に接続したＰｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｈｏｌｄｅｒにマウントした。メンブレンを精製水で洗浄し、操作前にメンブレンの完全性を試験した。０．５Ｍ  ＮａＯＨで６０分間および０．１Ｍ  ＮａＯＨで６０分間の連続的再循環によって浄化した。浄化工程によってメンブレンが深部まで浄化されて、サンプルの適用前にメンブレン上に残存するいかなる潜在的な微量タンパク質も除去する。次いで、通過物のｐＨが３．１に達するまで、メンブレンを５ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．１）でリンスした。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶離物のｐＨを、３．１に調整し、限外濾過によってタンパク質を４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。５倍体積の５ｍＭクエン酸（ｐＨ３．１）に対して６０〜９０分間ダイアフィルトレーションを行った。５０リットルの発酵装置で実施した３つの運転の収量（ｇで示す）を、表２にまとめる。
【０１０７】
【表２】
2010222369.tif 000012
【０１０８】
ｉｖ）濾過滅菌（０．２μｍ）。微生物汚染がないことを確認するために、この工程を行った。
【０１０９】
２〜８℃でマンニトールを濃度１．５ｇ／ｇのタンパク質に添加し、２３℃でＭｉｌｌｉｐａｋ１００フィルター（サイズ５００ｃｍ2）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＰＧＬ１０ＣＡ３から利用可能）にて滅菌濾過を行い、ペリスタリックポンプにて５００ｍｌ／分の流速で約５００ｍｌの５ｍＭクエン酸（ｐＨ３．１）を用いてリンスした。濾過物を滅菌無発熱物質バッグに回収し、−２０℃で保存した。
【実施例３】
【０１１０】
組換え安定化ミニプラスミンの調製方法
２０μｌの反応物中の約１５μｇのベクターｐＰＩＣＺα−ＭＰＬＧ１を、５’ＡＯＸ１領域中でベクターを線状化するＰｍｅＩで消化する。線状ＤＮＡ（３μｇ）を使用して、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔＰｉｃｈｉａ発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスＸ３３細胞を形質転換した。
【０１１１】
高発現株の選択を本質的に以下のように行った。ゼオシン耐性形質転換体を、ＹＰＤＳＺプレート（実施例２に定義）上で選択した。５０個の単離コロニーを、１５ｍｌ ＢＭＹＺ−グリセロール培地（実施例２に定義）を含む５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブ中でインキュベートし、３０℃で１６時間培養した。細胞をペレット化し、ＡＯＸ１プロモーター由来の発現を誘導するために、１．５ｍｌのＢＭＹＺ─メタノール培地（実施例２に定義）中に再懸濁し、４０時間培養した。この期間中に培養物に３または４パルスの０．５％メタノールを定期的に供給した。インキュベーション培養後、培養上清中のミニプラスミノゲンの存在を、Ｌｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（前記）に記載のように評価した。簡単に述べれば、１０倍希釈の上清中のミニプラスミノゲンを、ストレプトキナーゼと１０分間インキュベートして、活性複合体を形成させた。異なる時間の呈色基質Ｓ２４０３（実施例２に定義）を使用して決定した得られたミニプラスミン活性を、既知量の精製プラスミノゲン調製物の活性と比較した。これらの条件下では、全ての試験クローンは、３ｍｇ／ｌと１５ｍｇ／ｌとの間で変化する収量のミニプラスミノゲンを産生した。その後の大量産生のために、最も高いミニプラスミン活性を示す２つのクローンＸ３３−ＫＭＰＬＧ１番号６およびＸ３３−ＫＭＰＬＧ１番号２５を選択した。２００３年１２月４日にブダペスト条約の条項にしたがってこれら２つのクローンをＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ−ＭＵＣＬ−ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）に寄託し、アクセッション番号ＭＵＣＬ４５３０９（クローンＸ３３−ＫＭＰＬＧ１番号６）およびアクセッション番号ＭＵＣＬ４５３０８（クローンＸ３３−ＫＭＰＬＧ１番号２５）で受託された。
【実施例４】
【０１１２】
新規の固定方法
正常なブタ眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）に対する培地および異なる薬剤の効果を調査するための信頼のおける固定技術を確立するために、本実験を行った。
【０１１３】
食肉処理場から得た新たに単離したブタの眼を、直後に処理するか、室温で６時間まで放置した。固定を容易にするために角膜を除去した。酵素反応を停止させるために、眼を０℃のＰｅｔｅｒ液（１．２５％グルタルアルデヒド／１％パラホルムアルデヒドを含む０．０８Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４））中で２４〜３６時間固定した。次いで、眼を、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、１００％までの漸増濃度のエタノール中で段階的に脱水した。
【０１１４】
新たに処理した眼および６時間放置した眼は、共に網膜の超微細構造は有意に変化せず、硝子体は網膜表面に接着したままであった。したがって、この方法は、眼組織のための非外傷性固定手順を提供し、網膜表面から硝子体が分離する可能性を最小にする。さらに、この手順により、視神経から網膜周辺部までの全網膜表面を研究可能である。
【実施例５】
【０１１５】
死後のブタの眼における硝子体網膜境界に対するマイクロプラスミンの効果
網膜表面の内境界膜から後部硝子体皮質を解離するマイクロプラスミンの能力を決定するために、本実験を行った。
【０１１６】
体積０．１ｍｌの眼内灌流液ＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）中、以下の用量でマイクロプラスミンを使用した：０．０６２５、０．１２５、０．１５６、０．２５、および０．３９０ｍｇ。これらのマイクロプラスミン溶液のｐＨは、０．０６２５ｍｇの用量のための７．９２〜０．３９０ｍｇの用量のための６．５２の範囲であった。
【０１１７】
上記開示のマイクロプラスミン溶液を、室温（２４℃）で新たに屠殺したブタから得た眼の硝子体液に個別に注射した。実施例４に記載のように、マイクロプラスミン注射から１５分後、３０分後、６０分後、または１２０分後に眼を固定した。０．０６２５ｍｇのマイクロプラスミン注射処置から１時間後に後部硝子体剥離（ＰＶＤ）が認められたのに対して、０．１２５ｍｇのマイクロプラスミンを含むか超える全ての用量での注射から約３０分でＰＶＤが認められた。この剥離は、硝子体基部付近（硝子体への接着が強固な網膜周辺部から鋸状縁までにわたる領域）以外の全ての網膜表面切片で注射から約１２０分後に最も明らかであった（図４、パネルＡ）。後部硝子体剥離に加えて（図４、パネルＢ〜Ｅ）、電子顕微鏡法により、硝子体の構造が線維性の低い構造に変化することが示された。線維性構造は、硝子体液の液化を示すより不定形且つ一様にすりガラス状に改変された（図４、パネルＦ）。
【０１１８】
肉眼的試験または組織病理学（電子顕微鏡法が含まれる）によって決定したところ、０．２５ｍｇ未満の用量ではいかなる眼または網膜に対しても有毒ではなかった。特に、自己消化の徴候は認められなかった。自己消化の初期徴候として細胞の空砲形成がしばしば認められ、０．３９０ｍｇ未満の用量では空砲形成は認められなかった。電子顕微鏡法によって、他の眼組織も試験した（図５、パネルＡおよびＢ）。０．３９ｍｇ未満の用量では、網膜の構造変化は認められなかった。しかし、０．２５ｍｇのマイクロプラスミンで処置したいくつかの眼では、網膜の隆起および少数の炎症細胞が網膜表面上に疎らに分布していた。最も高い用量のマイクロプラスミン（０．３９０ｍｇ）で処置した眼の肉眼的組織学は、網膜境界が白っぽい外観を有することを示した。この眼の電子顕微鏡法により、局在化網膜剥離が示唆される網膜表面の複数の小さな隆起が存在することが明らかとなった。
【０１１９】
これらの実験は、０．０６〜０．２ｍｇの投薬量で使用したマイクロプラスミンによりいかなる網膜の超微細構造の変化を誘導することなく後部硝子体を一貫して分離することを示す。後部硝子体分離は、視神経だけでなく硝子体基部までずっと存在する。後部硝子体分離によって透明でなめらかな網膜表面が遊離し、高分解能走査電子顕微鏡（倍率１２，０００倍）（非検出線維の可能性の排除に十分な倍率）を使用してコラーゲン線維を認識することができなかった。
【実施例６】
【０１２０】
ヒト死後の眼における後部硝子体剥離
マイクロプラスミンがヒト眼の硝子体網膜分離を有効に誘導することができるかどうかを決定するために本実験を行った。
【０１２１】
（方法）
（ａ）ヒト死後の眼の投与および処置
眼の疾患が認められていない２６個のヒトの眼球を、Ｍｕｎｉｃｈアイバンクから得た。これらの眼球を、死後１９時間以内に３４〜６９歳の範囲の１３人のドナーから取り出した。直径１４ｍｍのトレフィンを使用した角膜の回収後、２６個の眼球を３７℃の湿室で１５分間インキュベートした。次いで、０．２ｍｌのマイクロプラスミンを、１３個の眼の硝子体腔に注射した。詳細には、１．２５ｍｇのマイクロプラスミンを、それぞれ４ｍｌ、２ｍｌ、または１．５ｍｌの眼内灌流溶液ＢＢＳＰＬＵＳ（登録商標）にて０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、および０．９３７５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。総体積が０．２ｍｌのこれらの溶液を硝子体腔に注射し、眼内の最終マイクロプラスミン用量をそれぞれ６２．５μｇ、１２５μｇ、および１８８μｇとした。コントロールとして使用した１３個の他方の眼に、０．２ｍｌの平衡塩類溶液（ＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標））を注射した。
【０１２２】
マイクロプラスミンで処置した１３個の眼のうち、９個の眼を、マイクロプラスミンのみの硝子体内注射によって処置した。６２．５μｇのマイクロプラスミン（ｐＨ７．４）を、２つの眼の硝子体腔に注射し、１２５μｇのマイクロプラスミン（ｐＨ７．２）を、５つの眼の硝子体腔に注射し、１８８μｇのマイクロプラスミン（ｐＨ７．２）を、２つの眼に投与した。残りの４個の眼のうち、２個の眼を６２．５μｇのマイクロプラスミンおよび０．６ｍｌのスルフヘキサフルオリド（ＳＦ6）で処置し、２個を１２５μｇのマイクロプラスミンおよび０．６ｍｌのスルフヘキサフルオリド（ＳＦ6）で処置した。硝子体切除またはガス注射と組み合わせたプラスミンのみによるＰＶＤの誘導が以前に報告されているので、ＳＦ6でさらに処置した。上記で考察した投与および処置を、表３にまとめる。
【０１２３】
【表３】
2010222369.tif 000013
【０１２４】
処置後、全ての眼を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、眼球を４％パラホルムアルデヒド中に入れ、眼内の酵素作用を停止させるために、０．１ｍｌの固定剤（パラホルムアルデヒド）を硝子体腔にも注射した。マイクロプラスミンおよびＳＦ6で処置した眼球を、立位で後極を固定した。
【０１２５】
（ｂ）走査型および透過型電子顕微鏡法
次いで、眼球を、扁平部に沿って二等分し、前部を破棄した。直径１２．５ｍｍの角膜トレフィンを硝子体を通過してゆっくり移動させ、後極を打ち抜いた。次いで、走査型および透過型電子顕微鏡法のための網膜試料を、直径４ｍｍの角膜トレフィンを使用して後極から得た。
【０１２６】
走査型電子顕微鏡法用の網膜ディスクを、２％四酸化オスミウム（Ｄａｌｔｏｎ固定剤）で前固定し、エタノール中で脱水し、臨界点乾燥を行い、金でスパッタコーティングし、ＩＳＭ−３５ＣＦ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ（登録商標），東京，日本）を使用して撮影した。
【０１２７】
透過型電子顕微鏡法用の試料を、Ｄａｌｔｏｎ固定剤で後固定し、脱水し、ＥＰＯＮ（商標）に包埋した。半薄切片を、２％トルイジンブルーで染色した。超薄切片を、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を使用して対比させ、Ｚｅｉｓｓ ＥＭ９電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，ドイツ）を使用して分析した。
【０１２８】
２人の観察者が個別に電子顕微鏡写真を評価した。各観察者は、内境界膜（ＩＬＭ）に覆われたコラーゲン原線維網が連続または不連続のいずれであるか、コラーゲン原線維がＩＬＭに単独または疎らに存在するかどうか、またはＩＬＭがいかなるコラーゲン原線維を欠く（露呈したＩＬＭ）かどうかの決定によって硝子体網膜分離の程度を評価した。
【０１２９】
（結果）
（ａ）走査型電子顕微鏡
６２．５μｇのマイクロプラスミンを注射した死後ヒトの眼の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により、ＩＬＭに覆われた不連続なコラーゲン原線維網が遊離した後部硝子体剥離が明らかとなった（図６、パネルＡ）。１２５μｇ（図６、パネルＢ）および１８８μｇ（図６、パネルＣ）のマイクロプラスミンをそれぞれ注射した眼のＳＥＭにより、完全な硝子体網膜分離と一致する露呈したＩＬＭが明らかとなった。これらの両方のより高い用量により、硝子体網膜境界の類似の超微細構造が得られた。
【０１３０】
６２．５μｇのマイクロプラスミンおよびＳＦ6を注射した眼では、ＩＬＭを覆う硝子体皮質の断片が認められた（図６、パネルＤ）。しかし、１２５μｇのマイクロプラスミン注射およびその後のガスタンポン挿入（ｇａｓ ｔａｍｐｏｎａｄｅ）を行った眼では、露呈したＩＬＭと一致する完全な硝子体網膜分離が認められた（図６、パネルＥ）。
【０１３１】
上記で考察したマイクロプラスミン処置眼と対照的に、ＳＥＭで決定したところ、コントロール眼では後部硝子体剥離は認められなかった（図６、パネルＦ）。これらの結果を、表４にまとめる。
【０１３２】
【表４】
2010222369.tif 000014
【０１３３】
（ｂ）透過型電子顕微鏡法
全てのマイクロプラスミン処置眼の網膜内の形態学的性質は、コントロール眼と比較して変化しなかった。ＩＬＭの超微細構造は、コントロール眼（図７、パネルＢ）と比較してマイクロプラスミン処置眼（図７、パネルＡ）で十分に保存された。
【０１３４】
（結論）
これらのデータは、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって、硝子体切除または任意の他の手術介入を行うことなくヒトの眼の硝子体皮質と内境界膜との間の切断を誘導することができることを示す。１２５μｇのマイクロプラスミンにより、３０分以内にヒト硝子体網膜接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が切断される。酵素作用に関して、１２５μｇのマイクロプラスミンは、２Ｕのプラスミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，ドイツ）と同用量であり、ブタ死体眼およびヒトドナー眼において完全な硝子体網膜分離を引き起こす。これらのデータはまた、マイクロプラスミン処置眼の硝子体への気泡の適用は硝子体網膜接合部の切断に必要な用量に影響を与えなかったことを示す。
【実施例７】
【０１３５】
マイクロプラスミン誘導後部硝子体剥離のｉｎｖｉｖｏ分析
これらの実験の目的は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＶＤに対するマクロプラスミンの有用性を決定することであった。
【０１３６】
（方法）
（ａ）ネコモデル
解剖学者および生理学者によってネコ網膜は広く研究されており、薬理学的誘導ＰＶＤの安全性の評価に有用なモデルとなる。ヒト網膜と同様に、ネコ網膜は桿体細胞に支配されており、眼窩外側の網膜内循環を有する。これは、網膜内血管を有さないウサギと対照的である。ウサギ内部網膜は硝子体表面上に存在する脈管構造によって灌流しており、これはウサギの硝子体網膜境界に主に注目する実証研究の価値を制限する。何年もの間、ネコモデルから網膜の剥離に対する細胞応答に関する高品質のデータが得られている。したがって、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＶＤの実施におけるマイクロプラスミンの有用性の研究にネコモデルを使用した。
【０１３７】
５頭の１２月齢と２３月齢の間の成体飼いネコを０．５ｍｌのケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ，Ｐａｒｋ−Ｄａｖｉｓ，Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ，イギリス）および０．３ｍｌのメデトミド（Ｄｏｒｍｉｔｏｒ，Ｐｆｉｚｅｒ，イギリス）の筋肉内注射を用いて麻酔した。麻酔したネコに、１４．５μｇまたは２５μｇのマイクロプラスミンを硝子体内注射し、これらのネコの他方の眼に平衡塩類溶液（ＢＳＳ−ＰＬＵＳ（登録商標））を注射し、コントロールとして使用した。本研究で使用した５頭のネコのうち、３頭のネコに２５μｇのマイクロプラスミンを硝子体内注射した。これらのネコのうちの１頭を、注射から１日後に屠殺し、第２のネコを３日後に屠殺し、第３のネコを３週間後に屠殺した。２頭の残りのネコに１４．５μｇのマイクロプラスミンを注射した。これらのうち、一方を３日後に屠殺し、他方を３週間後に屠殺した。
【０１３８】
（ｂ）走査型および透過型電子顕微鏡
実施例６のヒト死後眼について記載のように、屠殺したネコから眼球を取出し、固定し、電子顕微鏡法のために処理した。２人の観察者が個別に電子顕微鏡写真を評価した。各観察者は、ＩＬＭに覆われたコラーゲン原線維網が連続または不連続のいずれであるか、コラーゲン原線維がＩＬＭに単独または疎らに存在するかどうか、またはＩＬＭがいかなるコラーゲン原線維を欠くかどうかの決定によって硝子体網膜分離の程度を評価した。
【０１３９】
（ｃ）共焦点顕微鏡法
眼の試料を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、ＰＢＳ中で調製した５％アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，アメリカ）で泳動した。厚さ１００μｍの切片を、ビブラトーム（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，アメリカ）を使用して切断し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，アメリカ）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）、および０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，ドイツ）を含む正常なロバ血清（２０倍；Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を含むＰＢＳ（ＢＳＡ、Ｔｒｉｔｏｎ、およびアジドを含むこのＰＢＳ溶液を、ＰＢＴＡという）中で回転させながら４℃で一晩インキュベートした。ブロッキング血清の除去後、以下の６セットの対に一次抗体を添加した：抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；５００倍；ＤＡＫＯ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）と抗ＩＶ型コラーゲン（５０倍；ＤＡＫＯ）との対；抗ビメンチン（５０倍；ＤＡＫＯ）と抗フィブロネクチン（４００倍；ＤＡＫＯ）との対；抗シナプトフィジン（５０倍；ＤＡＫＯ）と抗神経フィラメント（２５倍；ＤＡＫＯ）との対；抗ラミニン（２５倍；ＤＡＫＯ）と抗ＣＤ６８（５０倍；ＤＡＫＯ）との対；抗赤色／緑色オプシン（１００倍；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，アメリカ）と抗ロドプシン（２００倍；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）との対；抗青色オプシン（１００倍；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，アメリカ）と抗ロドプシン（２００倍；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）との対。この実験で使用した抗体の特異性を表５に列挙する。
【０１４０】
【表５】
2010222369.tif 000015
【０１４１】
回転しながら４℃で一晩のインキュベーション後、切片をＰＢＴＡでリンスし、二次抗体と共に４℃で一晩再度インキュベートした。Ｃｙ２またはＣｙ３（Ｄｉａｎｏｖａ，．Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）と抱合した一次抗体の各組み合わせのためにロバ抗マウス二次抗体およびロバ抗ウサギ二次抗体を使用した。全ての二次抗体を１００倍希釈で使用し、全ての抗体をＰＢＴＡで希釈した。次いで、切片をリンスし、Ｎ−没食子酸プロピルを含むグリセロール中にマウントし、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）で観察した。
【０１４２】
（結果）
（ａ）走査型電子顕微鏡法
２５μｇマイクロプラスミンの硝子体内注射の１日後、疎らなコラーゲン原線維がＩＬＭを覆った（図８、パネルＡ）。治療３日後、２５μｇマイクロプラスミンにより完全な硝子体網膜分離が認められた（図８、パネルＢ）；硝子体網膜境界上に残存するコラーゲン原線維の断片は存在しなかった。１４．５μｇのマイクロプラスミンを投与した眼は、注射３日後にＩＬＭを覆う疎らなコラーゲン原線維が明らかであった（図８、パネルＣ）。処置２１日後、１４．５μｇ（図８、パネルＤ）および２５μｇのマイクロプラスミン（図８、パネルＥ）では、露呈したＩＬＭが認められた。全ての他方のコントロール眼は、網膜を覆った密集したコラーゲン原線維網が認められた（図８、パネルＦ）。これらのデータを、表６にまとめる。
【０１４３】
【表６】
2010222369.tif 000016
【０１４４】
（ｂ）光学顕微鏡法および透過型電子顕微鏡法
網膜の細胞構築に関して、マイクロプラスミン処置眼（図９、パネルＡ）とコントロール眼（図９、パネルＢ）との間に相違は認められなかった。マイクロプラスミン処置眼の内部網膜およびＩＬＭの超微細構造（図９、パネルＣおよびＥ）は、コントロール眼の内部網膜およびＩＬＭ（図９、パネルＤおよびＦ）と比較して十分に保存されていた。
【０１４５】
（ｃ）レーザー共焦点顕微鏡法
マイクロプラスミン処置眼およびコントロール眼では、ミューラー細胞の末端部分は、抗ＧＦＡＰ（図１０、パネルＡおよびＢ）および抗ビメンチン（図１０、パネルＣおよびＤ）で明白に標識された。内顆粒層上のミューラー細胞プロセスの広範な染色は存在しなかった。抗ＩＶ型コラーゲンおよび抗フィブロネクチンを使用して有意な染色は認められなかった（データ示さず）。これは、これらの抗体の種特異性に関し得る。ＩＬＭは、抗ラミニンによって染色された。処置眼およびコントロール眼の両方でマクロファージはほとんど存在しなかった。神経節細胞の軸索および樹状突起、水平細胞、ならびに内網状層および外網状層は、抗神経フィラメントおよび抗シナプトフィジンによって明白に標識された（図１０、パネルＥおよびＦ）。光受容細胞層は、抗神経フィラメントによって標識された。任意の使用抗体に関して、いかなる研究の測定点においてもマイクロプラスミン処置眼（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）とコントロール眼（図１０、パネルＢ、Ｄ、およびＦ）との間に相違は存在しなかった。
【０１４６】
（考察）
ｉｎ ｖｉｖｏでの硝子体網膜境界におけるマイクロプラスミンの除去効果を評価するために、２つの異なる用量を５頭の成体ネコの硝子体腔に投与した。第１の使用用量は、ヒト死後眼における完全なＰＶＤの誘導に十分であることが見出された用量の１／５である２５μｇのマイクロプラスミンであった。明らかに、２５μｇのマイクロプラスミンは０．４Ｕのプラスミン（Ｓｉｇｍａ）に等価であり、臨床的に０．４Ｕの自己プラスミンを黄斑円孔および糖尿病網膜症を罹患したヒトの眼の硝子体腔に適用した。ネコの眼のより小さな硝子体体積のために調整する場合（ヒト眼の硝子体体積の約６０％）、第２の用量である１４．５μｇのマイクロプラスミンは、ヒト眼において２５μｇのマイクロプラスミンの用量に等価である。
【０１４７】
ネコ眼における２５μｇマイクロプラスミンの硝子体内投与から３日後に、完全な硝子体網膜分離が存在するのに対して、処置から１日後では硝子体網膜境界に幾らかのコラーゲン原線維が依然として存在していた。これは、マイクロプラスミンの効果が２４時間を超えて継続し、その天然のアゴニストであるα−２−抗プラスミンによる血中プラスミノゲンの急速な不活化と非常に対照的であることを示す。マイクロプラスミン活性の寿命についての１つの理由は、α−２−抗プラスミンが別の基質によって飽和するかマイクロプラスミンがプラスミンと比較して抗プラスミンアンタゴニストに対する親和性が異なることであり得る。別の可能性のある理由は、α−２−抗プラスミンによってマイクロプラスミンが不活化された後にマイクロプラスミンの経路の下流（例えば、コラゲナーゼまたは基質金属プロテイナーゼの活性化）が活性なままであることであり得る。
【０１４８】
マイクロプラスミン処置眼の網膜の細胞構築はコントロールと比較して変化しなかった。超微細構造に関して、マイクロプラスミン処置眼とコントロール眼との間に網膜の解剖学的性質の相違は存在しなかった。ＩＬＭおよび網膜は、全ての試料で十分に保存された。さらに、マイクロプラスミン注射後にいかなる炎症反応の徴候も認められなかった。詳細には、電子顕微鏡法およびレーザー供焦点顕微鏡法では、網膜の炎症性細胞浸潤のいかなる証拠も認められなかった。
【０１４９】
ネコモデルでは、網膜剥離により、ミューラー細胞が有意に増殖し、その細胞質中の中間フィラメントタンパク質（グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびビメンチンなど）が大量に上方制御される。このミューラー細胞応答は、グリオーシスとして広く公知であり、網膜の剥離に対する複雑な細胞応答で重要な役割を果たすと考えられる。正常な網膜では、ミューラー細胞は休止しており、非常に少量のＧＦＡＰおよびビメンチンを発現する。しかし、網膜剥離を誘導しない硝子体切除でさえもＧＦＡＰの上方制御を生じると示された。本発明者らのグループによる最近の研究は、ネコ眼におけるＩＬＭの意図する剥離後の中間フィラメントタンパク質の顕著な上方制御を証明した（未公開データ）。これらのデータは、外科手術による外傷の任意の形態に対するミューラー細胞の高い反応性を示す。
【０１５０】
本研究では、マイクロプラスミンによるＰＶＤ誘導後にミューラー細胞反応性のいかなる変化も認められなかった。さらに、いかなる適用抗体に関しても処理眼とコントロール眼との間に相違は存在しなかった。網膜の変化しない超微細構造および免疫反応性に関連する研究の任意の測定点のミューラー細胞の休止状態により、ＰＶＤ誘導におけるマイクロプラスミンの安全性を示す実験的証拠が得られる。
【０１５１】
要するに、これらの研究は、マイクロプラスミンはｉｎ ｖｉｖｏでのＰＶＤの誘導に有効であることを示す。さらに、これらの研究は、超微細構造レベルで網膜の変化が認められないという点でマイクロプラスミンは安全なようであることを示す。
【実施例８】
【０１５２】
動的光散乱の使用によるブタ硝子体に対するマイクロプラスミンの効果の評価
非浸襲性動的光散乱（ＤＬＳ）技術を使用したｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｓｉｔｕでの新鮮な死後ブタ網膜に対するμＰｉの生物物理学的効果を特徴づけるためのマイクロプラスミン（μＰｉ）の効果を評価するために、本研究を行った。ＤＬＳにより、散乱光の強度における時間関数測定によって溶液および懸濁液中の粒子および高分子の力学に関する情報が得られる。
【０１５３】
ＤＬＳ実験では、流動物中に懸濁した小粒子集団を光が通過する場合、非常に離れた場所に絶えず変動する斑点パターンが認められる（Ｃｈｕ  Ｂ．，Ｌａｓｅｒ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｉｃｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照のこと）。この斑点パターンは、光路中の干渉の結果であり、これは、散乱媒質中の粒子が、粒子自体と流動物の分子との間の衝突に起因する１μ秒以上のタイムスケールで無作為に運動する（ブラウン運動）につれて変動する。粒子−粒子相互作用の非存在下で（希釈懸濁液）、小粒子から散乱した光が急速に変動し、大粒子から散乱した光はより遅く変動する。
【０１５４】
本研究のために構築したＤＬＳ装置により、拡散係数、サイズ、散乱強度、および多分散性（不均一性の測定）などの力学情報が得られる。一般に、粒子サイズの増加（ｎｍから数ミクロンまで）およびこれらの粒子の数または密度の増加により、散乱光強度が増加する。多分散性は、異なるサイズの種の異なる群の数の測定である。ＤＬＳ測定では、異なるタイムスケールで分散するので（小粒子はより早く、より大きなものはより遅く移動する）、サイズの異なる３群までを同定することができる。したがって、散乱光の強度および多分散性の変化は、粒子サイズデータを補足することができる。薬理学的介入後に硝子体粒子サイズが減少して散乱光強度が増加する場合、より大きな分子種の破壊および／またはこれらの実験の場合の固有の硝子体構造によってあらかじめ排除された２０ｎｍポリスチレンナノスフェアの流入のいずれかに起因する溶液中のより小さなサイズの分子種数がおそらく増加する。多分散性が増加する場合、サンプル中の分子種集団中の均一性が増加すると説明される可能性が最も高く、あらかじめ排除した２０ｎｍポリスチレンナノスフェア流入をさらに示す。ＤＬＳの最も魅力的な特徴は、非浸潤性且つ定量的であり、数ｎｍから数μｍまで範囲のサイズで有効に作用し、小サンプル体積のみを必要とし、多分散系または複数のサイズ（２〜３成分まで）の分散液のために妥当に十分に作用することである。本明細書中に示すデータを、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＹから入手した累積サイズおよび指数サイズ拡散ルーチンを使用して分析した。これらのスキームは、Ｓｔｏｃｋ  Ｒ．Ｓ．ａｎｄ  Ｒａｙ  Ｗ．Ｈ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２３：１３９３，１９８５に概説されている。例として、図１１は、全ブタ硝子体（多分散系）および直径２０ｎｍのポリスチレンナノスフェア溶液（単分散系）についての時間自己相関関数またはＴＣＦに関する典型的なＤＬＳ測定を示す。
【０１５５】
（方法と材料）
（ａ）硝子体研究のためのＤＬＳ装置の組み立て
本明細書中に記載の硝子体研究のために新規の小型ＤＬＳ光ファイバープローブ（米国特許第５，９７３，７７９号）を組み立てた。これは、１対の０．２５ピッチのＳｅｌｆｏｃＧＲＩＮレンズから構成され、侵入度が〜１６ｍｍであり、散乱角が１６０°である。２つの単一モードの光ファイバーおよび２つのＧＲＩＮレンズを含む光ファイバープローブにより、眼における高分子の力学的特徴の研究のための小型のリモコン手段が得られる。それぞれステンレススチール性フェルールに格納された２つの単一モードの光ファイバーを個別のステンレススチールハウジングにマウントする。散乱体積中の強く集中した点を得るためにファイバーハウジングとレンズハウジングとの間に意図的に空気ガスを残す。そのハウジング中の２つの光ファイバーを整列させ、マイクロレンズと軸外の位置に固定する。２つのハウジングを、ステンレススチール製の第３の（外側の）ハウジングの内側に入れ、ハウジングの後部を熱収縮チューブで覆う。レーザーおよび光検出器モジュールとの容易な合わせのために、光ファイバーの２つの自由端をＥＣ／ＰＣ型オス・コネクタで終端処理を行った。
【０１５６】
実験装置の主な構成要素は、  ＤＬＳ小型光ファイバープローブ（上記）、デジタル相関カード（ＢＩ−９０００  Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＮＹ）を含むコンピュータ（Ｇａｔｅｗａｙ  ＰＣ５００Ｓ）、波長６３５ｎｍの１ｍＷ固体レーザ（ＯＺ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｃａｎａｄａ）、およびアバランシェフォトダイオード検出器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｎａｄａ）からなる。プローブを、プローブにアクセスして眼内の所望の位置に向かうように手作業で制御した翻訳ステージを介して接続した光学アセンブリ上にマウントする。
【０１５７】
各一過性自己相関関数（ＴＣＦ）は、回収に２０秒かかる（１分間を要するフィルタリングキュベット研究を除く）。全測定のために５μ秒の遅延時間を一定に保持した。硝子体研究の開始前に、ポリスチレン標準（直径２０ｎｍのラテックスナノスフェア）の水性分散物の使用によって、装置を、その安定性、信頼性、および再現性について十分に試験した。
【０１５８】
（ｂ）硝子体の動的光散乱および粘度の問題
ＤＬＳは、溶液（この場合、硝子体）中に懸濁する粒子の平均直径を非侵襲性で客観的に定量することができる。粒子サイズを正確に計算するために、溶媒の粘度を知るか推測することが必要である。前に記載のように、現在非ニュートン流体の粘度を正確に測定することができないので、仮定しなければならない。硝子体が約９９％の水を含む場合、硝子体の粘度を水の粘度とすることが妥当である。この仮定の妥当性を試験するために、全硝子体ゲル、濾過器を通過しない硝子体の亜分画（ゲル）、濾過器を通過する硝子体の亜画分（非ゲル）、および０．２２μｍＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通過した硝子体の亜画分（液体硝子体）についてＤＬＳを測定した。光学キュベット中でこれらの研究を行い、極めて均一な既知の直径の拡散２０ｎｍポリスチレンナノスフェアをトレーサーとして添加した。全硝子体および全ての異なる亜画分におけるＤＬＳ測定により、硝子体の微小粘度（ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）が実際に純粋のそれに非常に近いことを示す類似の結果が得られた。硝子体の微小粘度は、ヒアルロナン（ＨＡ）分子およびコラーゲン線維束が懸濁した捕捉された水の粘度をいう。ＨＡ分子のブラウン運動は、ＨＡ分子と比較してわずかにサイズが大きいコラーゲン線維束よりもはるかに速い。ＤＬＳスペクトルでは、ＨＡ分子情報をより速い（短い）遅延時間で組み込み、コラーゲンはより遅い（長い）遅延時間で組み込む。得られた情報を、粒子サイズ分布に示す。
【０１５９】
（ｃ）試薬
ＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）（ＡＬＣＯＮ Ｌａｂｓ，Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を使用して全ての溶液を調製した。マイクロプラスミンを、４ｍｇ／ｍｌストック溶液の濃度で使用した。直径２０ｎｍであり且つ二重蒸留脱イオン水に懸濁したポリスチレンナノスフェア（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）を、全サンプル中のナノスフェア数が確実に一定になる固定比で全サンプル中に添加した。
【０１６０】
（ｄ）オープンスカイモデル（Ｏｐｅｎ Ｓｋｙ Ｍｏｄｅｌ）
新鮮な非固定ブタ眼（ｎ＝１１）を、扁平面切開を介して後部セグメントを切開し、前部硝子体から離れてレンズ／虹彩絞りを鋭く切開した。この組織を切開することなくできるだけ水晶体後面の近くに切片を運んだ。眼を、以下の後部セグメントと共にホルダーに維持した。
【０１６１】
試料を、６０μＬの２０ｎｍポリスチレンナノスフェア溶液を含む溶液（３００μｌ）を露呈した硝子体の前面に注ぐことによって、コントロールおよび０．０８、０．１２５、０．４、０．６、および０．８ｍｇの用量のμＰｉを用いて室温で処置した。硝子体／空気境界より１、２、および４ｍｍ下に存在する中心光軸に沿った単一のポイントでＤＬＳを行った。１５分毎に９０〜３６０分間ＤＬＳを読み取った。
【０１６２】
（ｅ）眼閉鎖モデル（Ｃｌｏｓｅｄ Ｅｙｅ Ｍｏｄｅｌ）
インタクトなブタ眼（ｎ＝３９）の扁平部での穿刺切開を介して３０Ｇニードルを使用して、ポリスチレンナノスフェアおよび０．０１２５、０．００２５、０．０５、０．１２５、０．２５、０．５、０．６、および０．８ｍｇのμＰｉを含む３００μＬの実験溶液およびコントロール溶液を注射した。眼を、角膜を上にし且つ後部を下にして（仰臥位の模倣）保持したホルダー中にて３７℃で３０分間または１２０分間インキュベートした。眼を温度制御水浴中に入れる前（常に試料と水との間のいかなる接触も回避する）およびその後１５分毎に、眼をほぼ光軸に対して１０〜１５秒間回転させた。インキュベーション後、扁平部切開を介して眼の前部を切開した。硝子体／空気境界の後ろの深さ４ｍｍの光軸（平均＝１８．６、ｓ．ｄ．＝１１．８）および水平軸（平均＝３０．８ポイント、ｄ．ｄ．＝１８．０）に沿ったいくつかのポイントでＤＬＳを行った。
【０１６３】
（結果）
（ａ）ブタ硝子体の分子形態学
アイカップ（ｅｙｅ ｃｕｐ）（前部を切開して除去したもの）の光軸に沿った複数のポイントから得た全（インタクトな）硝子体のＤＬＳ測定により、空気−硝子体境界の１．２５ｍｍ〜４．７５ｍｍ下の全てのポイントで非常に類似した所見が証明された。これらの所見はまた、キュベットに入れた切開した全硝子体、濾過後に保持された残存硝子体、および濾過器を通過した硝子体の亜画分で得られた所見と類似している。全てほぼ同一の粒子サイズ分布を示した。より大きな粒子サイズの群（右側）の平均サイズは約１０００ｎｍであり、主にコラーゲンを示す。より小さな粒子サイズ分布（左側）は主にヒアルロナン（ＨＡ）を示す。この粒子サイズ分布パターンは、ポリスチレンナノスフェア注射を受けた眼で同一であった。
【０１６４】
（ｂ）オープンスカイモデル
図１２は、比較のために、５つの異なるブタ眼中の空気／硝子体境界から４ｍｍ下のポイントおよび２０ｎｍポリスチレンナノスフェア溶液から得たＴＣＦを示す。μＰｉ用量が増加するにつれて遅い成分（より大きな分子種）の消滅と共にＴＣＦの勾配が減少し、最終的に２０ｎｍナノスフェアのみ（すなわち、全てがより小さいサイズの分子種）のＴＣＦに近づくことが認められる。
【０１６５】
室温で種々の溶液での処置後の深さ１ｍｍでのＤＬＳ測定（ｎ＝５）の結果：偽薬および０．０８ｍｇは全体として本質的に同一であった。０．１２５ｍｇの用量を使用して、２１０分後の全平均粒子サイズは約１／３に減少した。６０分後に平均粒子サイズは約８０％減少し、０．６ｍｇでの平均粒子サイズはほぼ完全に減少した（２０ｎｍポリスチレンナノスフェアのみが検出された）。
【０１６６】
空気／硝子体境界から２ｍｍ下の測定では（ｎ＝３）、１８０分後に全平均粒子サイズは約１／３に減少した（データ示さず）。３７℃での試料のインキュベーションおよびＤＬ５測定時のその温度の維持により、２つの異なる時間での２つの異なる眼において０．５ｍｇμＰｉで６０分間での処置後の全平均粒子サイズは４０％減少した。これら全ての試料についての全強度の測定および多分散性の測定により、粒子サイズ決定が支持および裏付けられた。
【０１６７】
（ｃ）眼閉鎖モデル
０．０１２５〜０．８ｍｇの用量範囲のμＰｉとの３７℃で３０分間のインキュベーション後、光軸および水平軸の両方に沿って有意な変化は存在しなかった。光軸では、最も高用量の０．８ｍｇで正規化平均粒子サイズは１／７に減少した。０．１２５ｍｇの用量では、３０分後に正規化平均粒子サイズは約１／３に減少した。最も低用量の０．０１２５ｍｇではいかなる有意な効果も認められないようであった。全範囲の用量と通して、粒子サイズの減少はμＰｉの用量に反比例した（相関係数＝０．９３）。データを、線形（直線）フィッティングルーチンに適合させた。正規化全強度および多分散性プロットにより、このデータの信頼性がされに支持される。粒子サイズ分散は、漸増用量のμＰｉを使用して、粒子サイズ分布の左側への有意なシフトを証明する。これにより、μＰｉは、種々の化学結合の有意な脆弱化および破壊ならびに硝子体高分子構造の溶解に有効であることが示唆される。
【０１６８】
０．０１２５〜０．６ｍｇの用量範囲のμＰｉとの３７℃で２時間のインキュベーション後にも有意な変化が存在した。最も高い用量では、光軸に沿って測定した正規化平均粒子サイズが８７．５％減少した。正規化散乱強度および正規化多分散性プロットによりこのデータが裏付けされる。粒子サイズ分布は、用量の漸増に伴う左へのシフトを示し、より高い用量で有意な比率が達成された。４ｍｍ下の水平軸に沿ったＤＬＳ測定によって、正規化平均粒子サイズが約８５％減少し、正規化散乱強度および多分散プロットにおける支持される所見が得られる類似の結果が示された。
【０１６９】
３０分後および２時間後の結果の比較により、インキュベーションが長くなるにつれて粒子サイズの破壊度がより高いことが証明された。０．６ｍｇの用量で正規化平均粒子直径は３０分間のインキュベーションで約２０％であり、２時間のインキュベーションで約１０％と見なされた。したがって、インキュベーションが長くなるにつれて粒子サイズが約１／２未満に減少した。
【０１７０】
ＤＬＳ測定由来の主なパラメーターは、拡散係数である。拡散係数の変化は、μＰｉに応答した硝子体の高分子構造の変化を示す。μＰｉ用量の増加により、硝子体の拡散係数が増加する。μＰｉの用量範囲にわたり、拡散係数はμＰｉ用量に正比例する。したがって、μＰｉの増加によって拡散係数が増加し、粒子サイズ決定と同様に、この相関は統計的に有意であった（ｒ＝０．９３）。
【０１７１】
（考察）
この実験では、ＤＬＳを使用して、粒子サイズ、散乱強度、および多分散性の測定によって硝子体の分子構造を非浸襲的に評価した。結果は、全硝子体内の硝子体の位置において類似のＤＬＳプロフィールが認められることを示した。マイクロプラスミンの最も顕著な効果は、特により高い用量で３７℃で３０分間インキュベートした全硝子体に対する効果であった。正規化平均粒子サイズが実質的に減少し、統計的に有意な用量−応答関係が確立された。これにより、現在の手術実施を妨害しない薬物効果に３０分の時間枠が妥当であるので、μＰｉが硝子体−網膜手術のためのアジュバントとして有用であることが示唆される。μＰｉが硝子体−網膜境界の裂開を誘導することが示唆される前の実施例のデータと組み合わせて、この薬物は、以下の２つの薬理学的硝子体融解の所望の成分が達成されるようである：後部硝子体剥離および硝子体高分子の破壊、ならびにその後の硝子体の拡散係数の増加および最終的な液化。
【実施例９】
【０１７２】
外科的硝子体切除のアジュバントとしてのマイクロプラスミン
外科的硝子体切除を必要とする硝子体網膜疾患を示す患者を、外科的硝子体切除手順の前にマイクロプラスミン注射で処置する。患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科試験を受けるべきである。眼科試験には、間接的検眼鏡検査、スリットランプ生体顕微鏡法、網膜周辺部試験、眼圧測定、視力（裸眼視力および矯正視力）、徴候学、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影法、網膜電図写真、およびＡスキャン測定が含まれる。
【０１７３】
硝子体切除の３０分前までまたは１日前までに、処置すべき眼に０．０２５〜０．１２５ｍｇのマイクロプラスミンを含む０．２ｍｌの眼内灌流溶液または硝子体液化の促進および／または後部硝子体剥離の誘導のためのＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）または他の灌流溶液を注射する。
【０１７４】
硝子体液化および／または後部硝子体剥離の促進により、医原性網膜外傷および外科合併症のリスクを抑えて外科的硝子体切除をより迅速且つ容易に実施することができる。より完全な硝子体の除去により、増殖性硝子体網膜症などの術後合併症のリスクを減少させることもできる。
【実施例１０】
【０１７５】
マイクロプラズマを使用した糖尿病性網膜症の治療
本実施例では、糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者を、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって処置する。
【０１７６】
糖尿病患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科試験を受けるべきである。眼科試験には、間接的検眼鏡検査、スリットランプ生体顕微鏡法、網膜周辺部試験、眼圧測定、視力（裸眼視力および矯正視力）、徴候学、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影法、網膜電図写真、およびＡスキャン測定が含まれる。
【０１７７】
予備試験後、患者の罹患した眼にマイクロプラスミンの硝子体内注射を行う。両眼が作用した場合、個別に処置することができる。処置すべき眼に０．００５〜０．１２５ｍｇのマイクロプラスミンを含む０．０５〜０．２ｍｌの硝子体液化の促進および／または後部硝子体剥離の硝子体内誘導のためのＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）または他の灌流溶液を注射する。
【０１７８】
処置後、患者の眼を定期的に試験すべきである。患者によって示される糖尿病性網膜症の範囲を、静脈出血、ＩＲＭＡ、網膜虚血、牽引性網膜剥離、硝子体出血、硝子体切除の必要性、または糖尿病性網膜症の他の合併症の範囲をモニタリングするための定期的網膜試験およびフルオレセイン血管造影図によって継続的にモニタリングする。
【実施例１１】
【０１７９】
死後ブタ眼におけるフルオレセイン拡散速度に対するプラスミンと比較したマイクロプラスミンの効果
マイクロプラスミンは、全長プラスミンの分子量の約１／３である。そのより小さなサイズにより、マイクロプラスミンは、プラスミンよりも硝子体内でより迅速に拡散すると予想される（Ｘｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，前出）。より迅速な拡散により、より迅速な薬理学的効果が誘導されると予想される。マイクロプラスミンがプラスミンより迅速に拡散することおよびマイクロプラスミンが硝子体ゲルを変化させることができることの両方を確認するために本研究を行った。
【０１８０】
（方法）
食肉処理場から得た新たに単離したブタ眼を使用した。第１の実験では、一方の眼にマイクロプラスミン（０．１２５ｍｇ）を注射し、他方の眼に賦形剤コントロール（ＢＳＳ−ＰＬＵＳ（登録商標））を注射した。室温で２時間両眼の維持後、両眼にフルオレセインを注射し、さらに３０分間インキュベートした。０、１０、２０、および３０分後に写真撮影を行った。
【０１８１】
第２の実験では、眼にマイクロプラスミン０．１２５ｍｇ（Ｎ＝２）またはプラスミン１Ｕ（Ｓｉｇｍａから販売、Ｎ＝２）を注射し、３７℃で２時間インキュベートした。対で、４つ全ての眼にフルオレセインを注射し、さらに３０分間インキュベートし、０、１０、２０、および３０分後に写真撮影を行った。
【０１８２】
（結果）
第１の実験では、コントロール眼は事実上硝子体内フルオレセイン拡散は認められなかった（データ示さず）。しかし、マイクロプラスミン処置眼では、明らかなフルオレセイン拡散が認められた（データ示さず）。
【０１８３】
第２の実験では、マイクロプラスミン処置眼は、２０分にわたりフルオレセイン拡散が１４％および１６％であり（図１３）、プラスミン処置眼の蛍光拡散は１０％減少した（図１４）。
【０１８４】
（考察）
マイクロプラスミンは、賦形剤コントロールと比較してフルオレセイン分散の明らかな促進を証明した。さらに、マイクロプラスミンの分子量の分子量に基づいて予想したところ、このフルオレセイン拡散は、全長プラスミン投与で認められた拡散よりも範囲が広い。この所見は、マイクロプラスミンはプラスミンよりも迅速に拡散するという予測を支持する。これらの所見は、より迅速に薬理学的効果が得られる臨床的利点を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】ヒトプラスミノゲンのＤＮＡ配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。
【図２】ヒトマイクロプラスミノゲンのＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図３】ヒトミニプラスミノゲンのＤＮＡ配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
【図４】マイクロプラスミンでのブタの眼の治療効果を示す図である。パネルＡは、０．１２５ｍｇのマイクロプラスミンを含む０．１ｍｌのＢＳＳ ＰＬＵＳ（登録商標）で１２０分間処置したブタの眼の緩慢な脱水後の網膜の中心周辺（ｍｉｄ−ｐｅｒｉｐｈｅｒｅａｌ）の低倍率の画像（１１倍）である。この画像の中央は、硝子体ストランドである。この硝子体ストランドは、網膜表面で崩壊している硝子体である可能性が高い。残りのパネルに示されるように、ほとんどの網膜表面は硝子体が存在しない。パネルＢは、血管に隣接する露出網膜を示す（倍率８００倍）。網膜表面上に細胞はほとんど認められない。不規則な表面は、血管自体の表面である。パネルＣおよびＤは、それぞれ多くの硝子体または細胞物質を欠くなめらかな網膜表面を示す１２００倍および３６００倍のＢの網膜領域の拡大図である。３６００倍では、線維性のストランドがいくつか認められる。パネルＥは、本質的にパネルＣと同一の所見であるがより中央の網膜位置を示す１５００倍の画像であり、パネルＦは、その線維性構造を喪失した硝子体の粗い粒子構造を示す。マイクロプラスミン処理眼中の硝子体構造は、コントロール眼中の硝子体と比較して外観が非常に異なる（データ示さず）。
【図５】ブタの眼の毛様体突起は、マイクロプラスミンでの１２０分間の処置後にインタクトであることを示す図である（パネルＡおよびＢ）。
【図６】ヒトの死後の眼における硝子体網膜境界の走査型電子顕微鏡写真（倍率３６００倍）を示す図である。６２．５μｇのマイクロプラスミンの硝子体内注射により、ＩＬＭを覆うコラーゲン原線維の断片が不連続に遊離する後部硝子体剥離（ＰＶＤ）が起こる（パネルＡ）。１２５μｇ（パネルＢ）および１８８μｇ（パネルＣ）のマイクロプラスミンにより完全なＰＶＤが起こり、ＩＬＭが露呈する。パネルＤは、６２．５μｇのマイクロプラスミンおよびガスで処置した眼におけるＩＬＭに対するコラーゲン原線維の圧縮を示す。パネルＥは、１２５μｇのマイクロプラスミンおよびガスでの処置後の完全なＰＶＤを示す。マイクロプラスミン処置眼で認められたＰＶＤと異なり、コントロール眼ではコラーゲン原線維の密集した網状構造が存在する（パネルＦ）。
【図７】ヒト死後の眼におけるＩＬＭの透過型電子顕微鏡写真を示す図である。マイクロプラスミン処置眼においてＩＬＭ状にコラーゲン原線維が存在しないことに留意のこと（矢印）（パネルＡ、倍率１３，６００倍）。対照的に、コントロール眼においてはＩＬＭ上にコラーゲン原線維が依然として存在する（矢印）（パネルＢ；倍率６８００倍）。
【図８】ネコの眼における硝子体網膜境界の走査型電子顕微鏡写真（倍率３６００倍）を示す図である。２５μｇのマイクロプラスミンの硝子体内注射により、処置１日後にＩＬＭ上にコラーゲン原線維の断片が遊離した（パネルＡ）。処置から３日後、２５μｇのマイクロプラスミンにより、完全なＰＶＤが起こった（パネルＢ）。１４．５μｇのマイクロプラスミンでの処置から３日後にコラーゲン原線維の断片が認められた（パネルＣ）。１４．５μｇのマイクロプラスミン注射（パネルＤ）および２５μｇのマイクロプラスミン注射（パネルＥ）から３週間後に、露呈したＩＬＭが認められた。著しく対照的に、コントロール眼は密集して結合した硝子体皮質を示した（パネルＦ）。
【図９】ネコの眼のやや薄い切片の光学顕微鏡研究の結果を示す図である。これらの研究は、コントロール眼で認められた正常な網膜の細胞構築（パネルＢ）がマイクロプラスミン処置眼（パネルＡ）でも認められることを示した。透過型電子顕微鏡法により、コントロール眼（パネルＤおよびＦ）で認められるようなマイクロプラスミン処置眼（パネルＣおよびＥ）において十分に保存された内部網膜およびＩＬＭが明らかとなった。パネルＡおよびＢで使用した倍率は２５０倍であり、パネルＣおよびＤの倍率は６０００倍であり、パネルＥおよびＦの倍率は３０，０００倍であった。
【図１０】グリア線維酸性タンパク質（パネルＡおよびＢ、緑）およびビメンチン（パネルＣおよびＤ、赤）に対するプローブを使用した共焦点レーザー走査顕微鏡の結果を示す図である。マイクロプラスミン処置眼（パネルＡおよびＣ）とコントロール眼（パネルＢおよびＤ）との間のＧＦＡＰおよびビメンチンの染色における相違は存在しない。シナプトフィジン（緑）および神経フィラメント（赤）に対するプローブを使用した二重標識免疫組織化学は、マイクロプラスミン処置眼（パネルＥ）とコントロール眼（パネルＦ）との間に相違は認められない。パネルＡ、Ｂ、およびＣの倍率は４００倍であり、パネルＤの倍率は２５０倍であり、パネルＥおよびＦの倍率は１６０倍であった。
【図１１】２０ｎｍポリスチレンナノスフェア溶液と比較した全ブタ硝子体の時間相関関数（ＴＣＦ）を示す図である。硝子体では、曲線に対して２つの成分が存在する。初期（速い）成分は、自由に拡散し、相当な分子運動（ブラウン運動）を示すヒアルロナン（ＨＡ）の存在に起因する。後期（遅い）成分は、より大きいので拡散の自由度が低く（より不自然）、ブラウン運動がより遅いコラーゲンに起因する。対照的に、ポリスチレンナノスフェア溶液は、溶液中で非常に速く運動するナノスフェアのサイズの小ささおよびその完全な球形構造に起因する非常に速いたった１つの成分（単分散）を有する。
【図１２】異なる用量のマイクロプラスミン（μＰｌｉ）薬理学的硝子体融解および２０ｎｍポリスチレンナノスフェアを受けた５つのブタの眼についての正規化時間相関関数を示す図である。空気／硝子体境界から４ｍｍ下の光軸でＤＬＳ測定を行った。非処置（賦形剤）硝子体では、曲線に対して２つの成分が存在する。初期（速い）成分は、自由に拡散し、相当な分子運動（ブラウン運動）を示すヒアルロナン（ＨＡ）の存在に起因する。後期（遅い）成分は、より大きいので拡散の自由度が低く（より不自然）、ブラウン運動がより遅いコラーゲンに起因する。他の極端な場合に、ポリスチレンナノスフェア溶液は、溶液中で非常に速く運動するナノスフェアのサイズの小ささおよびその完全な球形構造に起因する非常に速いたった１つの成分（単分散）を有する。漸増用量のμＰｌｉでは、低速成分（より大きな分子種）の消滅によりＴＣＦの勾配が減少し、最終的には２０ｎｍナノスフェアのみ（全てがより小さなサイズの分子種）のＴＣＦに近づく。
【図１３】マイクロプラスミンおよびフルオレセインの注射後のブタの眼の代表的な写真を示す図である。両画像は同一の眼であり、右の画像は左の画像の２０分後に撮影し、硝子体中のフルオレセイン分散を示す。
【図１４】プラスミンおよびフルオレセインの注射後のブタの眼の代表的な写真を示す図である。両画像は同一の眼であり、下の画像は上の画像の２０分後に撮影し、硝子体中のフルオレセイン分散がマイクロプラスミン処置眼よりも低い程度であることを示す（図１３）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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