(57)【要約】【課題】簡単な操作で短時間のうちに、消化酵素を充分に除去し、脂肪由来細胞を高収率に回収する。【解決手段】脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、その一側に、択一的に切替可能な第１の切替弁６を介して接続された、脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液Ａを収容するための細胞ソース容器３、洗浄液Ｂを収容するための第１の洗浄液容器４および回収容器５と、細胞捕捉フィルタ２の他側に、択一的に切替可能な第２の切替弁１０を介して接続された、細胞捕捉フィルタ２を通液する廃液を収容するための廃液容器７、洗浄液Ｂを収容するための第２の洗浄液容器８および細胞回収用の溶出液Ｃを供給する溶出液供給手段９とを備える細胞回収装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
該細胞捕捉フィルタの一側に、択一的に切替可能な第１の切替弁を介して前記細胞捕捉フィルタに接続された、脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液を収容するための細胞ソース容器、洗浄液を収容するための第１の洗浄液容器、および回収容器と、
前記細胞捕捉フィルタの他側に、択一的に切替可能な第２の切替弁を介して前記細胞捕捉フィルタに接続された、前記細胞捕捉フィルタを通液した廃液を収容するための廃液容器、洗浄液を収容するための第２の洗浄液容器および細胞回収用の溶出液を供給する溶出液供給手段とを備える細胞回収装置。
【請求項２】
脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液を、脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに対し一側から通液させる細胞捕捉ステップと、
前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのと同じ側から洗浄液を通液させる第１の洗浄ステップと、
前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのとは逆側から洗浄液を通液させる第２の洗浄ステップと、
前記細胞捕捉フィルタに捕捉された脂肪由来細胞を回収するための溶出液を、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのとは逆側から通液させる溶出ステップと、
該溶出ステップにより前記細胞捕捉フィルタを通液した液体を回収する回収ステップとを備える細胞回収方法。
【請求項３】
前記細胞捕捉ステップにおいて、脂肪由来細胞が、重力により細胞捕捉フィルタを通液する請求項２に記載の細胞回収方法。
【請求項４】
請求項１の細胞回収装置を用いて回収された脂肪由来細胞含有液。
【請求項５】
請求項２または請求項３に記載の細胞回収方法により得られた脂肪由来細胞含有液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞回収装置および細胞回収方法、ならびにこれらにより回収される脂肪由来細胞含有液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨髄、末梢血、あるいは臍帯血などから白血球のような単核球を分離するフィルタが知られている（特許文献１参照。）。またこのようなフィルタを、脂肪組織を消化する酵素等を含む脂肪組織消化液に対して用いることで、脂肪由来細胞を高収率で回収する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特許第３９３８９７３号公報
【特許文献２】特開２００７−２８９０７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、脂肪組織消化液をフィルタにより分離する場合には、脂肪組織消化液内に含まれている消化酵素がフィルタに捕捉され、最終的な回収が望まれる脂肪由来細胞とともに回収されてしまうという不都合がある。フィルタに捕捉された消化酵素を回収前に除去するために乳酸リンゲル液等をフィルタに流通させて洗浄することも考えられるが、フィルタに捕捉されている脂肪由来細胞がフィルタの奥深くに入り込んでしまい、逆に回収率が低下してしまうという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な操作で短時間のうちに消化酵素を充分に除去でき、高収率にて細胞を回収可能な細胞回収装置および細胞回収方法、ならびにこれらにより得られる脂肪由来細胞含有液を提供すること目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段等を提供する。
本発明は、脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、該細胞捕捉フィルタの一側に、択一的に切替可能な第１の切替弁を介して前記細胞捕捉フィルタに接続された、脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液を収容するための細胞ソース容器、洗浄液を収容するための第１の洗浄液容器、および回収容器と、前記細胞捕捉フィルタの他側に、択一的に切替可能な第２の切替弁を介して前記細胞捕捉フィルタに接続された、前記細胞捕捉フィルタを通液する廃液を収容するための廃液容器、洗浄液を収容するための第２の洗浄液容器および細胞回収用の溶出液を供給する溶出液供給手段とを備える細胞回収装置である。
【０００７】
また本発明は、脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液を、脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに対し一側から通液させる細胞捕捉ステップと、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのと同じ側から洗浄液を通液させる第１の洗浄ステップと、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのとは逆側から洗浄液を通液させる第２の洗浄ステップと、前記細胞捕捉フィルタに捕捉された脂肪由来細胞を回収するための溶出液を、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのとは逆側から通液させる溶出ステップと、該溶出ステップにより前記細胞捕捉フィルタを通液した液体を回収する回収ステップとを備える細胞回収方法である。また本発明は、前記細胞捕捉ステップにおいて、脂肪由来細胞が、重力により細胞捕捉フィルタを通液する細胞回収方法である。
更に、本発明は、前記細胞回収装置を用いて回収された脂肪由来細胞含有液である。
更にまた本発明は、前記細胞回収方法により得られた脂肪由来細胞含有液である。
【０００８】
本発明によれば、細胞捕捉フィルタの上方に細胞ソース容器を配置して、第１の切替弁を操作して細胞捕捉フィルタの入口側（一側）に細胞ソース容器側に接続し、第２の切替弁を操作して細胞捕捉フィルタの出口側に廃液容器を接続することにより、細胞ソース容器内の細胞懸濁液を重力等によって細胞捕捉フィルタに流入させると、細胞懸濁液内の脂肪由来細胞は細胞捕捉フィルタに捕捉され、他の含有物は細胞捕捉フィルタを通液して廃液容器に流入する。このとき、細胞懸濁液に含まれている消化酵素の一部も、脂肪由来細胞とともに細胞捕捉フィルタに残留する。
【０００９】
この状態で、第１の切替弁を第１の洗浄液容器に切り替えることにより、第１の洗浄液容器内の洗浄液を重力等によって細胞捕捉フィルタの入口側（一側）から流入させる。これにより、細胞捕捉フィルタに残留している消化酵素液が細胞捕捉フィルタの出口側（他側）から押し流されて廃液容器に流入する。これと同時に、細胞捕捉フィルタに捕捉されている脂肪由来細胞は、フィルタ内に深く押し込まれる。
【００１０】
この後に、本発明の細胞回収装置自体を反転することにより、細胞捕捉フィルタの上方に第２の洗浄液容器を配置されるようにし、第２の切替弁を操作して細胞捕捉フィルタの出口側（他側）に第２の洗浄液容器を接続し、第１の切替弁を操作して細胞捕捉フィルタの入口側（一側）に第１の洗浄液容器を接続する。すると、第２の洗浄液容器内の洗浄液が、重力等によって細胞捕捉フィルタに出口側（他側）から流入し、入口側に向かって通液する。これにより、細胞捕捉フィルタ内に深く押し込められていた脂肪由来細胞が、その入口側（一側）に向かって、細胞捕捉フィルタ内の浅い位置まで押し戻され、かつ、細胞捕捉フィルタ内に残留していた消化酵素も入口側（一側）から細胞捕捉フィルタ外に押し出される。
【００１１】
すなわち、脂肪由来細胞は、細胞懸濁液を細胞捕捉フィルタに通過させただけの状態と同様の浅い位置で細胞捕捉フィルタ内に留められ、一方、細胞捕捉フィルタに残留した消化酵素を充分に排除することができる。細胞捕捉フィルタを通液した液体は第１の洗浄液容器内に流入する。
【００１２】
この状態で、第２の切替弁を溶出液供給手段側に切り替え、第１の切替弁を回収容器側に切り替えて、溶出液供給手段を作動させて溶出液を細胞捕捉フィルタに供給することにより、溶出液によって細胞捕捉フィルタの浅い位置に捕捉されていた脂肪由来細胞が、細胞捕捉フィルタから剥離されて回収容器に流入し回収される。これにより、消化酵素が充分に排除された脂肪由来細胞、および該脂肪由来細胞を含む脂肪由来細胞含有液を効率的に得ることができる。
【００１３】
また、本発明は、脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液を、脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに対し一方側から重力等によって通液させる細胞捕捉ステップと、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのと同じ側から洗浄液を通液させる第１の洗浄ステップと、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液を通液させるのとは逆側から洗浄液を通液させる第２の洗浄ステップと、前記細胞捕捉フィルタに捕捉された脂肪由来細胞を回収するための溶出液を、前記細胞捕捉フィルタに対し前記細胞懸濁液とは逆側から通液させる溶出ステップと、該溶出ステップにより前記細胞捕捉フィルタを通液した液体を回収する回収ステップと、を備える細胞回収方法、およびこれにより得られ脂肪由来細胞含有液を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞回収装置および細胞回収方法によれば、簡単な操作で短時間のうちに、消化酵素が充分排除された脂肪由来細胞を、高収率に回収することができる。また本発明の細胞回収装置により得られる、又は、本発明の細胞回収方法により得られる脂肪由来細胞を含む本発明の脂肪由来細胞含有液においては、前述したように消化酵素が充分排除されているため、例えば、生体に移植等する際にも、酵素による生体への悪影響が充分に低減されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る細胞回収装置１、細胞回収方法および本発明の一実施形態により得られる脂肪由来細胞含有液について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞回収装置１は、図１に示されるように、脂肪由来細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２に対し、その入口２ａ側に配置される細胞ソース容器３、第１の洗浄液容器４および回収容器５と、これら細胞ソース容器３、第１の洗浄液容器４および回収容器５を択一的に細胞捕捉フィルタ２の入口２ａ側に接続させる第１の切替弁６と、細胞捕捉フィルタ２に対し、その出口２ｂ側に配置される廃液容器７、第２の洗浄液容器８および溶出液供給手段９と、これら廃液容器７、第２の洗浄液容器８および溶出液供給手段９を択一的に細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側に接続させる第２の切替弁１０とを備えている。初期状態において、第１の切替弁６および第２の切替弁は全閉状態となっている。
【００１６】
細胞捕捉フィルタ２としては、ポリエステルあるいはポリプロピレン等を含む６平均繊維径約０．０１〜１０μｍの不織布フィルタを積層したもの等が採用されている。
また、前記細胞ソース容器３、第１の洗浄液容器４、回収容器５、廃液容器７、第２の洗浄液容器８は、いずれも輸血バッグのような柔軟なポリエステル等の材料からなる容器等でもよく、いずれも無菌的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。
【００１７】
細胞ソース容器３には、細かく切断された脂肪組織と該脂肪組織を消化して脂肪由来細胞を単離させるための消化酵素液とを混合してなる細胞懸濁液Ａが収容されている。
第１，第２の洗浄液容器４，８には、例えば、生理食塩水、乳酸リンゲル液のような洗浄液Ｂが収容されている。また、回収容器５および廃液容器７は最初の状態では何も収容されていない。
【００１８】
第１の切替弁６は、２つの三方弁６ａ，６ｂによって構成されている。第１の三方弁６ａは、供給配管１１に対して、細胞ソース容器３と第１の洗浄液容器４とを択一的に切り替えるようになっている。第２の三方弁６ｂは、細胞捕捉フィルタ２に対して供給配管１１と回収容器５とを択一的に切り替えるようになっている。第１の三方弁６ａと第２の三方弁６ｂとの間に配置されているのは、比較的大きな脂肪組織片を捕捉して、細胞捕捉フィルタ２に流入するのを防止するメッシュチャンバ１２である。
第２の切替弁１０は、単一の４方弁によって構成されている。
【００１９】
溶出液供給手段９は、溶出液Ｃとして、脂肪由来細胞の変性が少ない、例えば、生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）、ハンクス液等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の培地等が収容されたシリンジである。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る細胞回収装置１を用いた細胞回収方法について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞回収装置１を用いて脂肪組織と消化酵素液とを含む細胞懸濁液Ａから脂肪由来細胞を分離回収するには、まず、図２に示されるように、細胞捕捉フィルタ２の上方に、細胞ソース容器３が配置されるようにして、第１の切替弁６を構成する第１の三方弁６ａを細胞ソース容器３に、第２の三方弁６ｂを供給配管１１に切り替える。また、第２の切替弁１０を廃液容器７に切り替える（図中、三方弁６ａ，６ｂ、第２の切替弁１０において黒塗りされた部分は閉止された方向を示している。）。
【００２１】
このようにすることで、細胞ソース容器３内の細胞懸濁液Ａが、重力によって、第１の三方弁６ａを介して供給配管１１に流入し、メッシュチャンバ１２を通過させられた後に、第２の三方弁６ｂを介して細胞捕捉フィルタ２に通液させられる。メッシュチャンバ１２を通過させられることにより、細胞懸濁液Ａ内の比較的大きな脂肪組織等はメッシュチャンバ１２に捕捉され、脂肪組織から単離した脂肪由来細胞および消化酵素液が細胞捕捉フィルタ２に通液する。
【００２２】
細胞捕捉フィルタ２には、主として、脂肪由来細胞が捕捉される（細胞捕捉ステップ）。この状態における脂肪由来細胞の細胞捕捉フィルタ２における捕捉深さは、０．４〜４．０ｃｍである（第１の深さ位置）。消化酵素液等の液体成分の大部分は捕捉フィルタ２を通過するが、その一部は付着して残留する。細胞捕捉フィルタ２を通過した液体は、第２の切替弁１０を介して廃液Ｄ（図３参照。）として廃液容器７に回収される。
【００２３】
細胞ソース容器３内の全ての細胞懸濁液Ａが排出された時点で、図３に示されるように、第１の切替弁６の第１の三方弁６ｂを第１の洗浄液容器４側に切り替える。これにより、第１の洗浄液容器４内の洗浄液Ｂが細胞捕捉フィルタ２に、重力によって、その入口２ａ側から流入し、細胞捕捉フィルタ２内を流通させられる（第１の洗浄ステップ）。細胞捕捉フィルタ２内に残留していた消化酵素が洗浄液Ｂによって押し流されて、廃液Ｄとして廃液容器７に流入させられる。一方、細胞捕捉フィルタ２内に捕捉されていた脂肪由来細胞も洗浄液Ｂによって押されるので、細胞捕捉フィルタ２内のより深い位置（第２の深さ位置）まで入り込む。
【００２４】
ほぼ全ての洗浄液Ｂが第１の洗浄液容器４から排出された時点で、第２の切替弁１０を第２の洗浄液容器８側に切り替えて、細胞回収装置１全体を反転させる（図４）。これにより、第２の洗浄液容器８内の洗浄液Ｂが、重力等の影響で、第２の切替弁１０を介して細胞捕捉フィルタ２に出口２ｂ側から流入し、細胞捕捉フィルタ２内を通液させられる（第２の洗浄ステップ）。これにより、前記第１の洗浄ステップにおいて、洗浄液Ｂにより、細胞捕捉フィルタ２における、第２の深さ位置まで入り込んでいた脂肪由来細胞は、より浅い、第１の深さ位置まで押し戻される。
【００２５】
この状態で、図５に示すように、第２の三方弁６ｂを回収容器５側に切り替え、第２の切替弁１０を溶出液供給手段９側に切り替えて、溶出液供給手段９を作動させることにより、溶出液Ｃを細胞捕捉フィルタ２に、その出口２ｂ側から通液する（溶出ステップ）。これにより、細胞捕捉フィルタ２の入口２ａ側の第１の深さ位置に捕捉されていた脂肪由来細胞が細胞捕捉フィルタ２から剥離される。
そして、このようにして剥離された脂肪由来細胞は溶出液Ｃとともに、第２の三方弁６ｂを介して回収容器５内に流入し、回収される（回収ステップ）。
【００２６】
このように本実施形態に係る細胞回収装置１および細胞回収方法によれば、細胞捕捉フィルタ２に捕捉された脂肪由来細胞等をそのまま回収するのではなく、洗浄液Ｂによって一旦洗浄するので、回収される脂肪由来細胞に混入する消化酵素液の量を低減することができる。その結果、ダメージの少ない脂肪由来細胞を効率的に回収することができ、回収された脂肪由来細胞を健全な状態に維持することができる。
【００２７】
また、単に洗浄液Ｂによって洗浄しただけの場合には、脂肪由来細胞が細胞捕捉フィルタ２の奥深くまで入り込んでしまい、該脂肪由来細胞の回収率が低下してしまうが、本実施形態においては、第２の洗浄ステップにおいて、細胞捕捉フィルタに対して逆側から洗浄液Ｂを供給することにより、細胞捕捉フィルタの奥深くまで入り込んだ脂肪由来細胞を、一旦捕捉フィルタ内の浅い位置に戻してから更にフィルタから剥離し、溶出液Ｃによって回収するので、脂肪由来細胞の回収率の低下を防止することができる。
すなわち、本実施形態に係る細胞回収装置１および細胞回収方法によれば、簡易な構成によって消化酵素液の含有量を充分に低減した脂肪由来細胞を、高い回収率で回収することができるという利点がある。
【００２８】
なお、本実施形態においては、第１，第２の切替弁６，１０として、いずれか位置の経路に選択的に切り替えられる３方弁または４方弁を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、ピンチコックのようなクランプによって択一的に経路を選択することにしてもよい。また本実施形態においては、脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液Ａを、重力の影響により細胞捕捉フィルタに通液させたが、脂肪由来細胞をフィルタに通過させる方法としてはこれに限定されることはなく、例えば、ベリスタポンプ、加圧式装置等を用いて通液させてもよい。
【００２９】
本実施形態に係る細胞回収装置１により、高い回収率で回収された本実施形態に係る脂肪由来細胞を含む脂肪由来細胞含有液において、脂肪由来細胞には、血管内皮細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、血球系の細胞、脂肪由来幹細胞などが含まれる。ここで、幹細胞は、細胞治療などの目的で、脂肪組織から採取される細胞であり、多分化能、自己再生能を有する細胞を指す。
また脂肪組織としては、ヒト由来の皮下脂肪組織、内臓脂肪組織、白色脂肪組織、褐色脂肪組織等でよく、ヒト等の脂肪部位をハサミ等の鋭利な器具で採取されたもの、脂肪吸引等の方法によって採取されたものなどであってよい。
本実施形態に係る脂肪由来細胞含有液においては、前述したように消化酵素が充分排除されているため、生体に移植等する際にも、酵素による生体への悪影響が充分低減されている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞回収装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞回収装置において、細胞捕捉フィルタに脂肪由来細胞を捕捉させる捕捉ステップを示す図である。
【図３】図１の細胞回収装置において、細胞捕捉フィルタに捕捉された脂肪由来細胞を順方向に洗浄する第１の洗浄ステップを示す図である。
【図４】図１の細胞回収装置において、細胞捕捉フィルタに捕捉された脂肪由来細胞を逆方向に洗浄する第２の洗浄ステップを示す図である。
【図５】図１の細胞回収装置において、細胞捕捉フィルタに捕捉された脂肪由来細胞を溶出し回収するステップを示す図である。
【符号の説明】
【００３１】
１  細胞回収装置
２  細胞捕捉フィルタ
２ａ  入口
２ｂ  出口
３  細胞ソース容器
４  第１の洗浄液容器
５  回収容器
６  第１の切替弁
７  廃液容器
８  第２の洗浄液容器
９  溶出液供給手段
１０  第２の切替弁
Ａ  細胞懸濁液
Ｂ  洗浄液
Ｃ  溶出液
Ｄ  廃液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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