(57)【要約】【課題】非拡散植物ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法を提供する。【解決手段】キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とする植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム、その発現方法。【効果】ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能であり、意図せぬ組換えウイルスの拡散を回避できる新しい非拡散植物ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。
【請求項２】
上記植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、請求項１に記載の植物ウイルスベクター。
【請求項３】
上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では、感染及び増殖が成立しない、請求項１又は２に記載の植物ウイルスベクター。
【請求項４】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とする植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
【請求項５】
上記細胞間移行に係る遺伝子が、植物体の細胞間の原形質連絡糸の拡大あるいはウイルスゲノムとの結合によりウイルスの移行に関与する遺伝子である、請求項４に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
【請求項６】
上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、請求項４又は５に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
【請求項７】
上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、請求項４から６のいずれかに記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
【請求項８】
上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項４から７のいずれかに記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
【請求項９】
上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、請求項４から８のいずれかに記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
【請求項１０】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
【請求項１１】
上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
【請求項１２】
上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
【請求項１３】
上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
【請求項１４】
上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非拡散植物ウイルスベクターに関するものであり、更に詳しくは、ウイルスの植物体の細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターと、別に植物体への細胞間移行に必要なタンパク質遺伝子を植物体に導入することにより、通常の植物に接種しても増殖できないが、上記細胞間移行に必要なタンパクを発現する植物体でのみ増殖可能な非拡散ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法に関するものである。本発明は、土壌伝染、昆虫媒介、接触伝播等の無秩序なウイルスベクターの拡散が起きないようにした非拡散植物ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物ＲＮＡウイルスベクターの研究は、感染植物における増殖能が非常に高いタバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）とブロモモザイクウイルス（Ｂｒｏｍｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ，ＢＭＶ）の感染性クローンを用いて行われてきた。そして、この分野では、ウイルス遺伝子の発現様式の違いなどから、今までに、いくつかの外来遺伝子の発現方式が開発されている。
【０００３】
ここで、それらを紹介すると、例えば、ＴＭＶやポティウイルス属（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）では、ウイルスＣＰ遺伝子と外来遺伝子が融合したタンパク質を発現するベクターが開発されている（非特許文献１〜２参照）。また、ＴＭＶと近縁のウイルス（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）のサブゲノミックプロモーターを導入することにより、サブゲノムを介して外来遺伝子を発現させるベクターも開発されている（非特許文献３参照）。
【０００４】
ただ、これまでは、このようなウイルスベクターの開発には、主にＴＭＶやポティウイルス属に代表される、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。それは、棒状、ひも状のウイルスベクターは、球状ウイルスに比べ、挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点があるからである。一方、球状ウイルスであるＢＭＶにおける発現ベクターの系としては、１ａタンパク質、２ａタンパク質の複製酵素遺伝子を発現するタバコに、外来遺伝子をもつＲＮＡ３を接種するという方法が報告されている（非特許文献４参照）。
【０００５】
また、ＣＭＶにおいても、ウイルスベクターについて、幾つかの研究がなされている。その一つは、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  による４分節ＣＭＶベクターの開発である（非特許文献５参照）。ＣＭＶのＲＮＡ３にはＭＰとＣＰがコードされており、ウイルスの細胞間移行にはＭＰとＣＰの両方が必須である（非特許文献５参照）。
【０００６】
そこで、これまでに、本発明者らは、ＲＮＡ３分子を改変し、ＭＰ領域をＧＦＰ遺伝子に置換したＲＮＡ３ＡとＣＰ遺伝子を持たないＲＮＡ３Ｂを構築し、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  により細胞間移行するウイルスベクターを開発した。これを、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムを持つＣＭＶとして、ベンタミアーナに接種したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ  ｖｅｉｎでＧＦＰ蛍光が観察された。
【０００７】
また、ＲＮＡ３Ｂで欠失させたＣＰ領域にマルチクローニングサイトを挿入し、そこに、ＧＵＳ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ−β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子やＢＹＭＶ（Ｂｅａｎ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）のＣＰ遺伝子を導入したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ  ｖｅｉｎにおいて、ＧＵＳ活性やＢＹＭＶ−ＣＰが検出された。しかし、このＲＮＡ３Ａ、ＲＮＡ３Ｂが、互いにｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを起こし、上葉では、導入遺伝子の発現は見られなかった。
【０００８】
その他に、先行技術として、種々の異なった宿主植物に適用可能なキュウリモザイクウイルスベクターで各種タンパク質を生産すること等、各種の関連技術が開発されている（非特許文献７〜１１）。
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｈａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５９，２４７−２５０（１９９５）
【非特許文献２】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃａｓａｌ，Ｊ．Ｉ．ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｌｕｍ  ｐｏｘ  ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２７，２２９−２３５（１９９８）
【非特許文献３】Ｄｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ａ  ｔａｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２０４−７２０８（１９９１）
【非特許文献４】Ｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｋａｉｄｏ，Ｍ．，Ｏｋｕｎｏ，Ｔ．ａｎｄ  Ｆｕｒｕｓａｗａ，Ｉ．，ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３３６，１７１−１７４（１９９３）
【非特許文献５】Ｚｈａｏ，Ｙ，，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔｏｕｓｉｇｎａｎｔ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｒ．Ｗ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４５，２２８５−２２９５（２０００）
【非特許文献６】Ｃａｎｔｏ，Ｔ．，Ｐｒｉｏｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｅｌｌｗａｒｄ  Ｋ．Ｈ．，Ｏｐａｒｋａ，Ｋ．Ｊ．，Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ，Ｐ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ．ＩＶ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｅ  ｂｏｔｈ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３７，２３７−２４８（１９９７）
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ，Ｈｏｎｇ，ＪＳ，Ｔａｂａｙａｓｈｉ，Ｎ，Ｉｔｏ，Ａ，Ｍａｓｕｔａ，Ｃ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｏｓｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｌａｎｔａ（２００７）２２５：２７７−２８６
【非特許文献８】Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，ＤＣ，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓ．Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ（１９９５）７：１０４５−１０５３
【非特許文献９】Ｗａｎｇ，ＺＤ，Ｕｅｄａ，Ｓ，Ｕｙｅｄａ，Ｉ，Ｙａｇｉｈａｓｈｉ，Ｈ，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｈ，Ｔａｃａｈａｓｈｉ，Ｙ，Ｓａｔｏ，Ｍ，Ｏｈｙａ，Ｋ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｃ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｖｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ（２００３）６９：３２７−３３４
【非特許文献１０】Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，Ｉ，Ｕｇａｋｉ，Ｍ，Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ，Ｈ，Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｍ，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ，Ｇｏｔｏｈ，Ｙ，Ｋａｔａｙｏｓｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ，Ｈｏｎｋｕｒａ，Ｒ，Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ，Ｓ，Ｕｅｎｏ，Ｋ，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ａ，Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｈ，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｈ，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｙ，Ｏｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９６）３７：４９−５９
【非特許文献１１】Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ，Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ（１９６２）：１５４７３−１５４９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、従来の植物ウイルスベクターのように、無秩序に宿主植物に感染が成立し、意図せぬ組換えウイルスの遺伝子の拡散が引き起こされる、という問題を確実に解消することが可能な、拡散しない新しい非拡散植物ウイルスベクターを開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、ウイルスの植物体での細胞間移行に関与するタンパク質を発現させた特定の組換え植物体のみで感染、増殖が可能で、意図せぬウイルスベクターの無秩序な感染拡大が起こらない、新しい非拡散植物ウイルスベクターを開発することに成功し、本発明を完成させるに至った。本発明は、土壌伝染、昆虫媒介、接触伝播等の意図せぬウイルスベクターの無秩序な感染拡大が起こらない、新しい非拡散植物ウイルスベクターを提供することを目的とするものである。また、本発明は、植物体での細胞間移行に必要なタンパク質を別に発現させた特定の組換え植物体と、上記非拡散植物ウイルスベクターとを組み合わせて、植物を利用した物質生産技術を提供することを目的とするものである。
【００１１】
従来のすべての植物ウイルスベクターは、無秩序に宿主植物に感染が成立し、意図せぬ組換えウイルス遺伝子の拡散が引き起こされ、特に昆虫によって伝播されるものによってはその危険度が高い。本発明は、ウイルス増殖に係る遺伝子を導入した特定の組換え植物体においてのみ、ウイルスベクターの感染、増殖を可能にして、昆虫や接触による意図せぬ組換えウイルスの拡散を回避可能にした植物ウイルスベクターの初めての選択的・特異的発現システムを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。
（２）上記植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、前記（１）に記載の植物ウイルスベクター。
（３）上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では、感染及び増殖が成立しない、前記（１）又は（２）に記載の植物ウイルスベクター。
（４）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とする植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
（５）上記細胞間移行に係る遺伝子が、植物体の細胞間の原形質連絡糸の拡大あるいはウイルスゲノムとの結合によりウイルスの移行に関与する遺伝子である、前記（４）に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
（６）上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、前記（４）又は（５）に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
（７）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、前記（４）から（６）のいずれかに記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
（８）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、前記（４）から（７）のいずれかに記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
（９）上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、前記（４）から（８）のいずれかに記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
（１０）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１１）上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１２）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１３）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１４）上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とするものである。本発明において、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子とは、ウイルスゲノムを隣接細胞に移行させるために、原形質連絡（高等植物の隣接細胞同士をつなげている細胞間橋）の排除分子量限界を拡大することのできる蛋白質（ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、植物ウイルスゲノムにコードされる遺伝子として定義される。
【００１４】
また、本発明は、上記植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムであって、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とするものである。
【００１５】
更に、本発明は、上記植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法であって、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明では、上記植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターであること、また、上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターであること、を好ましい実施の態様としている。
【００１７】
また、本発明では、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体であること、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体であること、を好ましい実施の態様としている。
【００１８】
本発明では、植物ウイルスが感染植物体内で細胞間移行するのに必要なゲノム遺伝子情報を欠落させた植物ウイルスベクターを構築する。一方で、当該ウイルスが細胞間移行に必要な遺伝子だけを発現させた組換え植物体を作出する。この組換え体に、当該植物ウイルスベクターを接種したときのみ、ウイルスベクターが全身に移行し、増殖可能となるが、他の植物体においては、細胞間移行に必要な遺伝子産物がないため、ウイルスベクターの増殖及び他植物体への伝播が起きない。
【００１９】
従来のウイルスベクターは、接種、感染植物体から他の宿主植物対へ無秩序に感染が拡大する可能性がある。感染植物体内で移動するのに必要な遺伝子を欠落させたウイルス（ベクター）は、接種した植物では増殖ができない。欠失させた移動に必要な遺伝子を導入した形質転換植物体、あるいは、当該遺伝子を他のウイルスベクターで導入した植物体では、上記のウイルスベクターが増殖可能になる。しかし、このウイルスベクターは、普通の植物体では、増殖ができないため、従来のウイルスベクターのように、無秩序に感染が拡大することはない。
【００２０】
本発明では、ウイルスの細胞間移行能力を欠失したウイルスベクターを構築した。植物ウイルスベクターとして、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）を用いた。このＣＭＶウイルスの植物体での細胞間移行に必要な遺伝子産物は、ＲＮＡ３にコードされている３ａタンパク質であり、ＣＭＶの３ａタンパク質が、細胞間移行に関与している。そこで、ＣＭＶベクターの３ａ遺伝子を欠失させた３ａ遺伝子産物を発現しない△３ａＣＭＶベクターを構築した。
【００２１】
ＣＭＶの遺伝子産物である３ａタンパク質は、植物体細胞に侵入すると、となりの細胞に対して原形質連絡糸を拡げ、ウイルスの細胞間移行を可能にする。ＣＭＶの３ａタンパク質遺伝子を欠失させたＣＭＶベクターは、原形質連絡糸を拡げられないので、ウイルスの細胞間移行ができないことになり、ウイルスが植物体の全身に広がらず、無秩序にウイルスが拡散することはない。しかし、このままでは、ベクターとして役立たないことになる。
【００２２】
そこで、本発明者らは、３ａタンパク質を外から供給することで、△３ａＣＭＶベクターの増殖、細胞間移行を可能にするために、他のウイルスベクターでＣＭＶの３ａタンパク質を発現させるベクターを構築し、植物体におけるＴｉｓｓｕｅ  ｐｒｉｎｔｉｎｇによる△３ａＣＭＶベクターの感染の確認テストを試みた。その結果、他のウイルスベクターから供給された３ａタンパク質がトランスに機能して、△３ａＣＭＶベクターの全身移行及び目的物質（抗Ｄｘ抗体）の発現を可能にすることが分かった。
【００２３】
次に、３ａタンパク質遺伝子を欠失させたベクター（△３ａ）でも、細胞間移行可能なＣＭＶ（△３ａ）用組換え植物を開発するために、ＣＭＶの３ａ遺伝子を組み込んだ他のベクターと、△３ａＣＭＶベクターをタバコに混合接種することを試みた。その結果、３ａ形質転換タバコでは、△３ａＣＭＶベクターが植物体全身に移行可能になることが分かった。その結果、ウイルスの細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターは、単独では増殖できず、拡散、伝播できないか、別に細胞間移行可能なタンパク質を導入することで、△３ａＣＭＶベクターの全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができることが分かった。
【００２４】
実際に用いた植物ウイルスベクターは、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）である。このウイルスの細胞間移行に必要な遺伝子は、ＲＮＡ３にコードされている３ａタンパク質である。そこで、３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクター、即ち、△３ａＣＭＶベクターを構築した。このベクターを単独で宿主植物（タバコ）に接種しても感染が認められないことを確認した。
【００２５】
一方、ＣＭＶの３ａ遺伝子を、他のウイルスベクターに組み込み、このベクターと△３ａＣＭＶベクターをタバコに混合接種すると、全身感染が認められた。具体的には、ＣＭＶの３ａ遺伝子をクローバー葉脈黄化ウイルスベクター（ＣｌＹＶＶベクター）等に組み込み、このベクターと△３ａＣＭＶベクターをタバコに混合接種すると、全身感染が認められた。即ち、ＣＭＶとは異なるウイルスベクターからＣＭＶの３ａタンパク質が接種植物体内でトランスに供給されることにより、△３ａＣＭＶベクターが細胞間移行して全身感染が成立したためである。
【００２６】
この結果から、本発明の技術思想、即ち、ウイルスの細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターは、単独では増殖できない、即ち、単独では拡散、伝播できないが、細胞間移行に必要なタンパク質を別途供給することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができることが証明された。
【００２７】
更に、３ａタンパク質遺伝子を導入した組換えタバコを作出し、これに△３ａＣＭＶベクターを接種した場合、ウイルスベクターの細胞間移行、更には全身感染が確認できた。これらの結果から、△３ａＣＭＶベクターは、通常の植物に接種しても増殖できないが、３ａタンパク質を発現する植物体でのみ増殖可能であること、即ち、△３ａＣＭＶベクター単独での無秩序なウイルスベクターの拡散は起きないこと、を証明できた。
【００２８】
本発明は、非拡散植物ウイルスベクター、及び非拡散植物ウイルスベクターと特定の形質転換植物体とを組み合わせた当該非拡散植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムに係るものであり、本発明は、遺伝子組換え技術と同様に、個別的なベクター及び宿主植物体の種類に制限されず、昆虫媒介、接触伝播等を行う植物ウイルスベクターであれば、広く適用可能な一般的、普遍的な技術である。したがって、本発明においては、昆虫媒介、接触伝播等を行う植物ウイルスベクター及び宿主植物体の種類は、特に制限されるものではない。
【００２９】
本発明において、特に、非拡散植物ウイルスベクターを利用した植物体の形質転換方法に係る発明は、方法に係る発明として、本発明の非拡散植物ウイルスベクターと、特定の形質転換植物体を組み合わせることで、植物ウイルスベクターが無秩序に宿主植物に感染が成立し、意図せぬ組換えウイルス遺伝子が拡散することを抑制するための新しい技術思想を提供するものであり、昆虫媒介、接触伝播等を行う個別な植物ウイルスベクターの種類、及び形質転換植物体の種類に制限されることなく、広く適用可能な一般的技術である。尚、後記する実施例に示したように、本発明では、植物ウイルスベクターとして、具体的には、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）を用いて、非拡散植物ウイルスベクター及び形質転換植物体の選択的・特異的感染及び増殖系の成立を証明した。本発明は、ＣＭＶベクターに適用されるが、植物ウイルスベクターの使用の態様として、他の植物ウイルスベクターの場合についても同様に適用可能である。
【００３０】
従来のウイルスベクターは、接種した感染植物体から意図せぬウイルスベクターの感染拡大は避けられなかった。本発明は、ウイルス移行に関与するタンパク質（ＣＭＶ  ３ａタンパク質）を発現する組換え植物のみで、感染・増殖が可能であるため、意図せぬウイルスベクターの感染拡大が起こらない。即ち、野外等で使用しても、ウイルスベクターの拡散が起こらないため、ウイルスベクターの使用範囲を飛躍的に拡大することが可能になる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、次のような効果を奏するものである。
（１）無秩序に宿主植物に感染し、意図せぬ組換えウイルスの拡散リスクを回避することができる非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。
（２）ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能なため、意図せぬウイルスの拡散を回避できる新しい組換え植物のシステムを提供することができる。
（３）単独では、拡散、伝播できないが、細胞間移行に必要なタンパク質遺伝子を別に導入することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができる、非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。
（４）野外等で使用しても、植物ウイルスベクターの拡散が起こらないため、植物ウイルスベクターの利用範囲が飛躍的に拡大する。
（５）本発明の植物ウイルスベクターを使用して組換え植物体を作出しても、ウイルスベクターの増殖、他の植物体への伝播は起きないことから、安全性を確保して、植物ウイルスベクターの利用を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
（１）野生型供試植物の育成
ベンタミアーナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の育成を、以下の方法により行った。Ｊｉｆｆｙ−７（サカタのタネ）を吸水させた後、１ポットにつき２−３粒程度の種子を播種し、高温条件を保った。植物体の生育ステージをそろえるために、間引きを行い、植物体は、１２時間明条件（８，０００ｌｕｘ）、１２時間暗条件で生育させ、気温２８℃で育てた。その後は、植物体の成長に合わせて施肥した。
【００３４】
（２）ベクターの増殖に用いる植物の育成
ＣｌＹＶＶベクターの増殖に用いるソラマメの育成には、培養土（三共）を用いた。４号鉢に土を入れ、十分に水を含ませ、種子を１粒播種した。出芽後、１０日たった植物体を、接種に用いた。
【００３５】
（３）接種試験
接種には、播種後３−４週間ほど経過し、本葉が３−５枚展開したベンタミアーナ個体を使用した。接種源には、モザイクや縮葉などのウイルス病徴が見られる植物体の上葉の粗汁液、あるいは逆転写ＲＮＡを使用した。接種ステージに達した植物において、接種する葉全体にカーボランダム（Ｎａｃａｌａｉ−メッシュ６００−乾熱済み）を薄くふりかけた。ウイルス接種用粗汁液は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに、ＤＩＥＣＡ（Ｎ，Ｎジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）、接種直前に添加）を終濃度１０ｍＭになるように加えて、接種源となる感染葉０．１ｇとともに、乳鉢で磨砕して調製した。
【００３６】
接種用逆転写ＲＮＡは、後述する方法で合成し、その総量と等量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて調製した。いずれの接種においても、ラテックス製指サックに接種液を塗布し、指先で葉の表面を軽くなでるように塗布した。接種後は、直ちに葉面から余分な粗汁液とカーボランダムを水洗し、翌日まで遮光した。０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液は、０．１Ｍリン酸水素カリウムと０．１Ｍリン酸二水素カリウムを混合し、ｐＨ８．０に調整したものを用いた。
【００３７】
（４）コンピテントセルの調製
下記のＳＯＢ液体培地２ｍｌに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（ＴａＫａＲａ）を入れ、３７℃で１２〜１４時間振盪培養した。ＳＯＢ液体培地５０ｍｌに、前培養液を０．５ｍｌ接種し、３７℃で約１時間半（ＯＤ５５０＝０．４〜０．８）振盪培養した。氷上に１０分間静置した後、チューブに移し、３５００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心した後、上清を捨て、氷冷した下記のＴＦＢ１７ｍｌで穏やかに懸濁した。
【００３８】
氷上で２０分間静置した後、再び３５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。上清を捨て、氷冷したＴＦＢ２ｍｌを加え、液面で沈殿を穏やかに懸濁した。氷上で３０分間静置した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド−Ｎａｃａｌａｉ）１５０μｌを一滴ずつゆっくり加え、再度、氷上で１０分間静置した。先太チップで、１．５ｍｌチューブに１００μｌずつ分注し、−８０℃で凍結保存した。
【００３９】
ＳＯＢ液体培地は、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２０ｇ：ＢａｃｔｏＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５ｇ：１Ｍ  ＮａＣｌ溶液１０ｍｌ、１Ｍ  ＫＣｌ溶液２．５ｍｌを混合し、蒸留水でメスアップし、１Ｌとした後、オートクレーブにより滅菌した。使用直前に濾過滅菌した１Ｍ  ＭｇＣｌ２  溶液（Ｎａｃａｌａｉ）と、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  溶液（Ｎａｃａｌａｉ）を１／１００量加えて調製した。
【００４０】
また、ＴＦＢ（形質転換緩衝液）は、３５ｍＭ酢酸カリウム（Ｎａｃａｌａｉ）、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２（和光純薬）、４５ｍＭ  ＭｎＣｌ２（Ｎａｃａｌａｉ）、１００ｍＭ  ＲｂＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ）、１５％  ショ糖（和光純薬）−酢酸（和光純薬）の組成でｐＨ５．８に調整し、濾過滅菌して調製した。
【００４１】
（５）形質転換
緩やかに溶かしたコンピテントセル１００μｌに、プラスミド１μｌ（ライゲーション反応液の場合５μｌ程度）を加え、氷上で３０分間静置して混合した。４２℃のウォーターバスに４５秒間入れ、ヒートショックを行った後、直ちに氷冷し、大腸菌内に組換えプラスミドを導入した。下記の２ＹＴ液体培地を加え、３７℃で３０分間静置培養した。その後、３７℃で１時間振盪培養を行った。このうち、１００μｌを、下記のＬＢ−ａｍｐ培地に広げた。
【００４２】
ブルーホワイトセレクションをする場合には、あらかじめ、２％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎａｃａｌａｉ）で２％濃度に溶解）５０μｌ、１００ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド溶液（和光純薬）−濾過滅菌）１０μｌを、ＬＢ培地上に塗布した後、大腸菌培養液１００μｌを培地に播いた。１２〜１６時間、３７℃のインキュベーター内で培養した。
【００４３】
２ＹＴ液体培地は、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとし、オートクレーブして調製した。また、ＬＢ−ａｍｐ培地は、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、Ａｇａｒ（Ｗａｋｏ）１５ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとした後、オートクレーブし、５０℃ぐらいに冷ましてから５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック（Ｗａｋｏ−濾過滅菌済み）を１／１０００量加え、固まる前に滅菌シャーレに分注して調製した。
【００４４】
（６）プラスミド抽出
濃度５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック２μｌを加えた２ＹＴ液体培地２ｍｌの中に、形質転換によって得られた大腸菌のコロニーを、滅菌済み爪楊枝で、拾い入れ、３７℃で１２〜１４時間振盪培養した。この培養液を１．５ｍｌチューブに入れ、１００００ｒｐｍで３分間遠心した。アスピレーターで、上清を取り除き、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−１を１００μｌずつ加え、チューブミキサーで完全に懸濁した。これに、下記にＳｏｌｕｔｉｏｎ−２を２００μｌずつ加え、転倒混和した。
【００４５】
次に、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−３を、１５０μｌずつ加え、再び、転倒混和した。これを、１４０００ｒｐｍで４℃、５分間遠心し、上清をとってチューブに移し、もう一度遠心（１４０００ｒｐｍ  ５分間）にかけ、タンパクを完全に除去した。上清を移し、回収した上清と同量のイソプロピルアルコール（Ｗａｋｏ）を加え、転倒混和した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノール（Ｎａｃａｌａｉ）を５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨てた。ＲＮａｓｅＡを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で終濃度２μｇ／ｍｌに希釈して、５０μｌずつ加え、軽くミキサーにかけ、３７℃で３０分間静置した。
【００４６】
これに、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−４を、３０μｌ加え、ボルテックスミキサーで撹拌して、氷上で４５分間静置した。１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノールを５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ、５分間遠心した。上清を捨て、５〜１０分間減圧乾燥し、滅菌水３０μｌで懸濁した。このプラスミドサンプルは、−３０℃で保存した。
【００４７】
ａ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−１：
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｗａｋｏ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセティックアシッド／同仁化学）、５０ｍＭグルコース（Ｗａｋｏ）
【００４８】
ｂ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−２：
０．２Ｎ  ＮａＯＨ（Ｗａｋｏ）、１％  ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム−Ｎａｃａｌａｉ）
【００４９】
ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−３：
５Ｍ  酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌ
【００５０】
ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−４：
２０％ＰＥＧ＃６０００（ポリエチレングリコール−Ｎａｃａｌａｉ）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ
【００５１】
（７）基本的な遺伝子操作の方法
１）制限酵素処理
各メーカーの制限酵素０．５μｌと、その添付バッファーを使用し、１０μｌの反応系で、指定の温度下において、１時間以上静置した。
２）電気泳動
目的のＤＮＡの長さに適した濃度のＴＢＥ（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、８９ｍＭホウ酸（Ｗａｋｏ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）アガロース（Ｇｅｎｅ  ｐｕｒｅ（登録商標）ＬＥ  ＡＧＡＲＯＳＥ−ＢＭ）ゲルを用い、ＴＢＥを泳動緩衝液として、泳動を行なった。泳動後、エチジウムブロマイド溶液（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）で染色した。
【００５２】
３）フェノールクロロホルム抽出
サンプルＤＮＡ液に滅菌水を加え、１００μｌにし、５０μｌのＴＥ飽和フェノール（ニッポンジーン）と、５０μｌのクロロホルム（Ｗａｋｏ）を加え、チューブミキサーにかけて、１分撹拌して、タンパクを失活させた。１４０００ｒｐｍで、５分間遠心し、１．５ｍｌチューブに水層だけを移した。
【００５３】
４）エタノール沈殿
サンプルＤＮＡ液１００μｌに、３Ｍ酢酸ナトリウム（ニッポンジーン）１０μｌ、１００％エタノール２５０μｌを加えて、撹拌して、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清を取り除いた。５００μｌの８０％エタノールを加え、１４０００ｒｐｍで、５分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。
【００５４】
５）クローニング
ゲルからＤＮＡを回収する場合、ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＣ（登録商標）ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）を使い、直接、ＥｔＢｒを終濃度０．５μｇ／ｍｌで入れたアガロースゲルを使用し、電気泳動を行った。目的のバンドを含むゲル片を切り出し、ＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  １５０（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡを回収した。
【００５５】
回収したＤＮＡ溶液を、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿した後、５μｌの滅菌水に懸濁した。ベクターとインサートのライゲーションには、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を使用した。回収したＤＮＡ溶液と、等量のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ液を加えて、懸濁した。１６℃で、３０分間静置した後、ライゲーション反応液５μｌを、Ｅ．ｃｏｌｉのコンピテントセルに形質転換した。
【００５６】
（８）感染性クローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写
アルカリ−ＳＤＳ法で抽出した感染性クローン４μｌを、ｒｕｎ−ｏｆｆ転写に用いる制限酵素で線状化し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿をした後、得られたペレットを３．５μｌの滅菌水に懸濁した。転写反応液を、以下のように混合した。
【００５７】
（転写反応液）
テンプレート溶液  ３．５μｌ
５０ｍＭ  ＤＴＴ  ２μｌ
０．１％  ＢＳＡ  ２μｌ
１０×Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ＊１１  ２μｌ
２．５×Ｃａｐ／ＮＴＰ  ｍｉｘ＊１２  ８μｌ
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ＊１３  ０．５μｌ
Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μｌ
【００５８】
＊１１・・・Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）に添付
＊１２・・・２．５×Ｃａｐ／ＮＴＰ  ｍｉｘ（５ｍＭ  ｍ７  Ｇ（５’）ｐｐｐ  （５’）  Ｇ  ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ａｎａｌｏｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３．８ｍＭ  ＡＴＰ、３．８ｍＭ  ＣＴＰ、３．８ｍＭ  ＵＴＰ、０．８ｍＭ  ＧＴＰ−Ｒｏｃｈｅ）
＊１３・・・Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｓｏｌｎ（Ｗａｋｏ）
【００５９】
３７℃で、２時間静置した。ＲＮＡの転写は、電気泳動で確認した。すぐに接種しない場合、転写産物は−８０℃で保存した。
【００６０】
（９）ＲＮＡ抽出
（フェノール−ＳＤＳ法）
ＲＮＡ抽出バッファー５００μｌと、ＴＥ飽和フェノール５００μｌで、試料０．１ｇを磨砕して、１．５ｍｌチューブに移した。２０秒ほど、ボルテックスミキサーにかけ、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却遠心した。上清（水層）を別のチューブに移し、上清と等量のフェノールクロロホルム（１：１）を加え、ボルテックスミキサーにかけて、激しく撹拌した後、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却遠心した。上清を別のチューブに移し、白いタンパクの層がなくなるまで繰り返し、フェノールクロロホルム抽出を行った。最後に、等量のクロロホルムでリンスした後、水層をとりわけ、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、３倍量の１００％エタノールを加えた。
【００６１】
ボルテックスをかけ、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却遠心した。上清を捨て、８０％エタノール５００μｌを加え、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却、遠心した。５〜１０分間減圧乾燥後、ＲＮＡ用滅菌水５０μｌで懸濁し、１４０００ｒｐｍで、１分間ほど、遠心した。沈殿があった場合は、上清だけを、別のチューブに移しかえた。ＲＮＡ抽出バッファーは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１％  ＳＤＳの組成である。
【００６２】
（１０）ＲＴ−ＰＣＲ
１）逆転写反応
以下に示す反応溶液を調製した。
ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ２  Ｏ＊１５  ７．５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ ＊１５  ４μｌ
ｅａｃｈ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ＊１５  ２μｌ
１０×ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ＊１５  ２μｌ
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．５μｌ
３’プライマー  １μｌ
サンプルＲＮＡ  ２μｌ
ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（ＴａＫａＲａ
）０．５μｌ
＊１５・・・ＲＮＡ  ＰＣＲＴＭ  ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲ
ａ）に添付
【００６３】
これを、４５℃で１時間静置した。その後、逆転写酵素を不活性化するため、これを、５分間ボイルし、５分間急冷した。
【００６４】
２）ＰＣＲ反応
以下のようなＰＣＲミックスを調製した。
滅菌水  ８．４μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ ＊１６  ２μｌ
１０×ＬＡ  ＰＣＲＴＭ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）＊１６  ２μｌ
ｅａｃｈ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ２μｌ
５’プライマー  ０．２μｌ
３’プライマー  ０．２μｌ
＊１６・・・ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭに添付
【００６５】
これに、逆転写反応液５μｌを加え、更に、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ０．２μｌを加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで電気泳動し、目的の断片が増幅されているのを確認した。
【００６６】
（１１）シークエンス
プラスミドを鋳型に配列を確認する際には、アルカリ−ＳＤＳ法で抽出したサンプル１００ｎｇをシークエンス反応に用いた。また、ダイレクトシークエンスの際には、ゲル片から回収した目的のＤＮＡ１０ｎｇを、シークエンス反応に用いた。テンプレートＤＮＡに、プライマー１ｐｍｏｌ、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１．３μｌ、添付のバッファーを３．４μｌ加え、蒸留水で２０μｌとしたサンプルをシークエンス反応液とし、下の条件でＰＣＲをかけた。
【００６７】
９６℃  １分    １サイクル
９６℃  １０秒
５０℃  ５秒
６０℃  ４分    （９６℃  １０秒  →  ６０℃  ４分：３０サイクル）
１０℃  ∞
【００６８】
ＰＣＲ反応後、１００％エタノール６４μｌ、蒸留水１６μｌ加え、室温で１５分静置し、１４０００ｒｐｍで、１５分間遠心した。上清を取り除き、８０％エタノール２５０μｌ加え、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。ＨｉＤｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌ加え、溶解した後、９５℃で３分間変成させ、急冷した。このサンプルを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｉｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にセットし、配列を解析した。
【００６９】
（１２）ティシュプリント
ろ紙を２枚平滑な面を上にし、その上に葉を置き、更に、平滑な面が葉側になるように、２枚ろ紙を重ね、ハンマーで叩き、葉の内容物をろ紙にブロットした。ろ紙が乾燥してから、プラスチック容器中に２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて、３０分間室温で振とうして、クロロフィルなどの色素を落とし、その後、ＰＢＳＴ−スキムミルク液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．９％  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、３％スキムミルク）を加えて、室温で３０分間振とうすることで、ブロッキング処理を施した。
【００７０】
そのろ紙に、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗ＣＭＶ抗体を、５，０００倍希釈したＰＢＳＴ−スキムミルク液を加えて、３７℃で、１時間振とうして、抗体処理を行った。その後、ＰＢＳＴ−スキムミルク液で、５分間振とうしながら、洗浄し、それを、３回繰り返した。
【００７１】
ＡＰバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で、５分間振とうし、ろ紙にしみ込んだＰＢＳＴ−スキムミルク液を除き、更に、ＡＰバッファーを加えて、３０分間振とうして、緩衝液の交換が確実に行われるようにした。０．０３３％ニトロブルーテトラゾリウム（Ｗａｋｏ）と０．０１６５％  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（Ｗａｋｏ）を含むＡＰバッファー１０ｍｌを加えて、室温で振とうさせて発色させた。
【００７２】
（１３）ウエスタンブロット法
葉重量の５倍量のＰＢＳ（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．９％  ＮａＣｌ）で磨砕し、１２０００ｒｐｍで、５分間遠心し、上清を、別のチューブに分注して、下記の２×サンプルバッファーを、等量加えた。これを、５分間９５℃で、変性した後、５分間、室温で放置したサンプルを、泳動に用いた。泳動には、コンパクトＰＡＧＥ（アトー株式会社）を用いた。下記の１０×ランニングバッファー１０ｍｌに、蒸留水を９０ｍｌ加えたものを、泳動バッファーとして用いた。
【００７３】
ｃ−ＰＡＧＥＬ（登録商標）電気泳動用既製ゲル１２．５％（アトー株式会社）で、泳動し、泳動終了後、コンパクトブロット（アトー株式会社）を使い、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）へブロッティングした。ＰＶＤＦメンブレンは、事前にメタノールに数分浸した後、下記のブロッティングバッファーに浸しておいた。ブロッティング終了後、メンブレンをＰＢＳＴスキムミルクに入れ、３０分振とう後、ＰＢＳＴスキムミルク３ｍｌで下記の１次抗体１μｌを希釈し、１時間ハイブリバッグで反応させた。
【００７４】
ＰＢＳＴスキムミルクで、３回洗浄し、ＰＢＳＴスキムミルク３ｍｌで、ＡＰ標識抗マウス抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ（Ｈ＋Ｌ）−ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）１μｌを希釈し、１時間ハイブリバッグで反応させた。ＰＢＳＴスキムミルクで、２回、ＡＰバッファーで２回、洗浄後、０．０３３％ニトロブルーテトラゾリウムと０．０１６５％  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を含むＡＰバッファーにより、検出した。また、２次抗体にＨＲＰ標識抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＥＣＬ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ｆｒｏｍ  ｓｈｅｅｐ））又は、ＨＲＰ標識ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ；ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｈｕｇａｔｅ）を用いる際には、ＥＣＬ−ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を使用した。
【００７５】
１次抗体は、ＤｘｓｃＦｖの検出には、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ０．２ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＨＦＲの検出には、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた。ＣＭＶの検出には、抗ＣＭＶ−ｃｐ抗体（日植防）を用いた。
【００７６】
２×サンプルバッファー：０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２５ｍｌに２−メルカプとエタノール５ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、Ｓｕｃｒｏｓｅ５ｇ、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ２μｇ加え、蒸留水で５０ｍｌとした。１０×ランニングバッファー：Ｔｒｉｓ１５．１４ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ７２．０６７ｇ、ＳＤＳ５ｇに、蒸留水を加え、５００ｍｌとした。ブロッティングバッファー：Ｔｒｉｓ０．６０４ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ２．８８ｇ、メタノール４０ｍｌに、蒸留水を加え、２００ｍｌとした。
【００７７】
（１４）ＣＭＶ−Ｙ  ３ａタンパク質の非発現ウイルスの作出  
３ａ遺伝子を欠くベクター（３ａ−Ｓｔｏｐ）を作出するために、ｐＣＹ３の３ａタンパク質の４番目のアミノ酸グルタミンをコードするＣＡＡコドンを、終止コドンであるＴＡＡコドンに置換した。図１に、導入のプロセスを示す。ｐＣＹ３を鋳型として、Ｙ３−Ｔ７−５Ｂｍプライマーと３ａ−Ｓｔｏｐ−３プライマー、３ａ−Ｓｔｏｐ−５プライマーとＹ３−３Ｈｉｎｄプライマーで、それぞれ、ＰＣＲ反応を行った。
【００７８】
両ＰＣＲ産物の増幅を確認後、１μｌずつ混合した液を鋳型として、Ｙ３−Ｔ７−５Ｂｍプライマーと、Ｙ３−３Ｈｉｎｄプライマーで、再度、ＰＣＲし、産物のサイズを、泳動で確認した。この産物を、ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＣＹ３のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングすることで、３ａ遺伝子を欠くベクターを作出した。
【００７９】
（１５）ＣＭＶ−Ｙ  ＲＮＡ２への外来遺伝子ＤＨＦＲの導入
Ｃ２−Ｈ１ベクター（Ｐｌａｎｔａ  ｖｏｌ．２２５  ２７７−２８６，２００７）のＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に、ＤＨＦＲの配列を挿入した。図２に、Ｃ２−Ｈ１ベクターへの外来遺伝子（ＤＨＦＲ）の導入のプロセスを示す。ＰＲＯＴＥＩＯＳ  Ｐｌａｍｉｄ  ｓｅｔ（東洋紡）のｐＥＵ−ＤＨＦＲを鋳型として、ＤＨＦＲ５プライマーと、ＤＨＦＲ−３Ｆｌｇプライマーを用いて、ＰＣＲすることで、ＤＨＦＲの３‘末端に、ＦＬＡＧタグとＭｌｕＩサイトを有するＤＨＦＲ遺伝子が得られる。これを、ＭｌｕＩで処理し、Ｃ２−Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイトへ、クローニングした。
【００８０】
（１６）ＣＭＶ−Ｙ  ＲＮＡ２への外来遺伝子ＤｘｓｃＦｖの導入
Ｃ２−Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に、ＤｘｓｃＦｖの配列を挿入した。図３に、ＣＭＶ−Ｙ  ＲＮＡ２への外来遺伝子（ＤｘｓｃＦｖ）の導入のプロセスを示す。ｐＢＥ２１１３−ＤｘｓｃＦｖをテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ＤｘｓｃＦｖ  ＯＲＦの５′にＳｔｕＩサイトを、３′にＭｌｕＩサイトを付加した。次に、Ｃ２−Ｈ１ベクターのＳｔｕＩ−ＭｌｕＩ領域に、ＤｘｓｃＦｖ断片をクローニングし、Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖを構築した。
【００８１】
（１６）ＰＶＸ−３ａベクター及びＣｌＹＶＶ−３ａベクターによる３ａタンパク質の供給
ＰＶＸベクター（Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ｖｏｌ．７  １０４５−１０５３，１９９５）のＣｌａＩサイトとＳａｌＩサイト領域に、ＣＭＶ−Ｙ由来の３ａタンパク質配列を挿入した。ｐＣＹ３を鋳型に、Ｙ３ａ−５ＣｌプライマーＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧと、Ｙ３ａ−３ＸｈプライマーＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴでＰＣＲすることで、ＣｌａＩとＸｈｏＩサイトを有する３ａ遺伝子断片を得た。
【００８２】
これを、ＣｌａＩ，ＸｈｏＩで処理し、ＰＶＸベクターのＣｌａＩ，ＸｈｏＩサイトへクローニングした。得られたプラスミドを、ＳｐｅＩで処理し線状化し、ＣＭＶのクローンと同様に転写して、接種に用いた。また、ＣｌＹＶＶベクター（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ｖｏｌ．６９  ３２７−３３４，２００３）のＥｃｏＲＩサイトとＳａｌＩサイト領域に、ＣＭＶ−Ｙ３ａ由来の３ａタンパク質配列を挿入した。
【００８３】
ｐＣＹ３を鋳型に、Ｙ３ａＬｅｃｏプライマーＧＧＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣと、Ｙ３ａＲｓａｌプライマーＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴＧでＰＣＲすることで、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩサイトを有する３ａ遺伝子断片を得た。これを、ＣｌＹＶＶベクターのＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩサイトへクローニングした。
【００８４】
このＣｌＹＶＶベクターは、３５Ｓプロモーターを有することから、接種は、プラスミドを直接ソラマメの葉にカーボランダムでこすりつけることで行った。ウイルスの病徴が確認された上位葉を、接種源として用いた。
【００８５】
図４に、ＣｌＹＶＶ−３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ−Ｓｔｏｐ及びＰＶＸ−３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ―Ｓｔｏｐを用いたティッシュプリントの結果を示す。前者は、ＣｌＹＶＶ−３ａの感染葉を用いて、野生型ベンタミアーナに接種し、接種３週間程度経過してから、Ｙ１／Ｙ２／３ａ−Ｓｔｏｐの転写ＲＮＡを接種し、１０日後に、ティッシュプリントにより、ＣＭＶを検出した。
【００８６】
後者は、それぞれの転写ＲＮＡを混合接種し、５日後に、ティッシュプリントにより、ＣＭＶを検出した。また、図５に、ＰＶＸ−３ａ／Ｙ１／Ｈ１：ＤＨＦＲ（あるいはＨ１：ＤｘｓｃＦｖ）／３ａ―ＳｔｏｐのＲＮＡ転写産物を野生型ベンタミアーナに混合接種し、６〜１２日後にウエスタンブロットにより、ＤＨＦＲ及びＤｘｓｃＦｖを検出した結果を示す。いずれの結果からも、３ａがトランスに供給されて、外来タンパク質が、ウイルスベクター接種植物体の上葉において、発現することを示している。
【００８７】
３ａ遺伝子を欠くＣＭＶが、再び３ａを獲得していないことを確認するために、上位葉からＲＮＡを抽出し、Ｙ３−Ｔ７−５Ｂｍプライマーと、Ｙ３−３Ｈｉｎｄプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行うことで、ＣＭＶの３ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この断片とＹ３−Ｔ７−５Ｂｍプライマーでダイレクトシークエンスを行い、変異を導入した部位の配列を調べ、終止コドンが維持されていることを確認した。
【００８８】
（１７）３ａタンパク質形質転換ベンサミアーナの作出
植物発現用ベクターであるｐＢＥ２１１３（ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．３７  ４９−５９，  １９９６）のＸｂａＩサイトとＳａｃＩ領域にＣＭＶ−Ｙ３ａ由来の３ａタンパク質配列を挿入した。図６に、ｐＢＥ２１１３への細胞間移行タンパク質（３ａ）の導入のプロセスを示す。
【００８９】
ｐＣＹ３をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物（約８４０ｂｐ）を、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に導入した。次に、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩ領域で、制限酵素処理を行って得られた３ａ断片を、ｐＢＥ２１１３のＸｂａＩ及びＳａｃＩ領域に導入して、植物発現用ベクターｐＢＥ２１１３−３ａを作出した。
【００９０】
これを、凍結溶解による直接導入法によって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ  ４４０４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入した。具体的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ  ４４０４を、５０ｍＬのＬＢ液体培地中（１％  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ，０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ，１％塩化ナトリウム）で、Ａ６００の吸光値が、約１．０になるまで、２８℃で、振盪培養した後、氷上で冷却して、４℃で、３０００ｇの遠心分離を行い、集菌した。
【００９１】
菌体は、１ｍＬの氷冷した２０ｍＭ塩化カルシウム溶液に浮遊させ、これを、０．１ｍＬ毎にエッベンドルフチューブに分注した。これに、組換えプラスミドｐＢＥ２１１３−３ａを、１μｇを加え、液体窒素中で、急速に凍結した。次に、得られた凍結細胞を、３７℃で溶解した後、５分間静置した。
【００９２】
これに、１ｍＬのＬＢ培地を加え、２８℃で、２〜４時間振盪培養を行った後、約１００００ｇで、１分間、遠心分離を行い、集菌して、０．１ｍＬのＬＢ培地に浮遊させた。リファンピシン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ固形培地に、菌体を接種した。２〜３日間、２８℃で培養して、ｐＢＥ２１１３−３ａが組み込まれた形質転換菌を得た。
【００９３】
ｐＢＥ２１１３−３ａを組み込んだＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ  ４４０４は、ＬＢ液体培地で、２８℃下で、振盪培養後、４℃で、３０００ｇの遠心分離を行い、集菌して、ＭＳ液体培地〔Ｐｈｙｓｉｏｌ，Ｐｌａｎｔ．１５：４７３（１９６２）〕中に浮遊させ、これを、植物の形質転換操作に用いた。形質転換操作は、上述した組換えアグロバクテリウムを用いて、リーフティスク法により行った。
【００９４】
ベンタミアーナ葉を、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で、１５分間殺菌し、滅菌蒸留水で、６回洗浄した。この葉から、殺菌したコルクボーラーで直径約１ｃｍの円形状にくり抜き、リーフディスクとした。このディスクを、上記で作出したｐＢＥ２１１３−３ａを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ  ４４０４のＭＳ液体培地懸濁液に１５分間浸した。
【００９５】
この後、ＭＳ固形培地〔３％蔗糖、Ｂ５ビタミン、０．８％寒天を含む（ｐＨ５．７）、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）０．１ｍｇ／Ｌ〕上で、２８℃で３日間培養後、ディスクを、抗生物質カナマイシン５０μｇ／ｍＬ及びカーベニシリン５００μｇ／ｍＬ（いずれもシグマ社製）を含むＭＳ液体培地で洗浄した。洗浄後のディスクは、上記抗生物質を含むＭＳ固形培地（３％  蔗糖を含む）上で、２５℃下、２週間毎に継代培養した（１６時間照明、８時間暗期）。培養４〜８週間目に、ディスク表面上に、カルスが形成され、更に、継代培養することにより、シュートが誘導された。
【００９６】
このシュートを根本から切り取り、ホルモンを含まないＭＳ固形培地〔３％蔗糖、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、カーベニシリン５００μｇ／ｍＬを含む（ＰＨ５．７）〕上に移植し、培養した。２〜４週間後に発根してきた植物体は、培養土を入れたポットに移植し、閉鎖系組換え温室の中で、栽培して、次世代（Ｔ１）種子を得た。
【００９７】
（１８）供試形質転換植物の育成
上記で得た３ａ形質転換植物体のＴ１種子を、滅菌水で給水し、４日間４℃で低温処理を行った後、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した１．５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で、５分間、種子表面を滅菌した後、１２５ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む１／２ＭＳ培地〔１％蔗糖、Ｂ５ビタミン、１％寒天を含む（ｐＨ５．７）〕に無菌播種を行い、２２℃で７−１０日間培養後、カナマイシン耐性を示す芽生えを選抜して、Ｊｉｆｆｙ−７に移植し、閉鎖系組換え温室の中で栽培した。
【００９８】
（１９）３ａタンパク質形質転換ベンタミアーナからの３ａタンパク質の供給によるＤｘｓｃＦｖの発現
プラスミドＨ１：ＤｘｓｃＦｖを鋳型にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写し、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３あるいは３ａ−ＳｔｏｐのＲＮＡ転写産物とともに、野生型ベンタミアーナあるいは３ａトランスジェニックベンタミアーナに接種し、接種５日後の接種葉及び１３日後の接種葉及び上葉のＤｘｓｃＦｖ発現をウエスタンブロット法を用いて検出した。図７に、Ｙ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／Ｙ３（ＲＮＡ転写産物）、又はＹ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／３ａ−ｓｔｏｐ（ＲＮＡ転写産物）の接種における野生型ベンタミアーナ及び３ａ形質転換ベンタミアーナでのＤｘｓｃＦｖ検出結果を示す。
【００９９】
（２０）結果
接種後５日目の接種葉及び１３日目の接種葉及び上葉のＤｘｓｃＦｖの発現を、ウエスタンブロット法で検出した結果、Ｙ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／３ａ−ｓｔｏｐ（ＲＮＡ転写産物）を接種した３ａ形質転換体において、接種葉では、わずかに発現が認められ、上葉では、非常に高い発現量のＤｘｓｃＦｖが検出された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
以上詳述したように、本発明は、非拡散植物ウイルスベクターに係るものであり、本発明により、無秩序に宿主植物に感染し、意図せぬ組換えウイルスの拡散リスクを回避することができる非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。また、本発明は、ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能であるため、意図せぬウイルスの拡散を回避できる新しい組換え植物のシステムを提供することができる。また、本発明は、単独では、拡散、伝播できないが、植物体への全身移行に必要なタンパク質遺伝子を別に導入することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができる、非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。また、本発明は、野外等で使用しても、植物ウイルスベクターの拡散が起こらないため、植物ウイルスベクターの利用範囲が飛躍的に拡大する。本発明は、植物ウイルスベクターを使用して組換え植物体を作出しても、ウイルスベクターの増殖、他植物体への伝播は起きないことから、安全性を確保して、植物ウイルスベクターの利用を図ることを実現可能にするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ｐＣＹ３の３ａタンパク質の４番目のアミノ酸グルタミンをコードするＣＡＡコドンを終止コドンであるＴＡＡコドンに置換することにより、３ａ遺伝子を欠くベクター（３ａ−Ｓｔｏｐ）を作出するプロセスを示す。
【図２】Ｃ２−Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に外来遺伝子（ＤＨＦＲ）の配列を挿入して、外来遺伝子を導入するプロセスを示す。
【図３】Ｃ２−Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に、ＤｘｓｃＦｖの配列を挿入して、ＣＭＶ−Ｙ  ＲＮＡ２へ、外来遺伝子（ＤｘｓｃＦｖ）を導入するプロセスを示す。
【図４】ＣｌＹＶＶ−３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ−Ｓｔｏｐ及びＰＶＸ−３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ−Ｓｔｏｐを用いたティッシュプリントの結果を示す。
【図５】ＰＶＸ−３ａ／Ｙ１／Ｈ１：ＤＨＦＲ（あるいはＨ１：ＤｘｓｃＦｖ）／３ａ―ＳｔｏｐのＲＮＡ転写産物を野生型ベンタミアーナに混合接種し、６〜１２日後にウエスタンブロットにより、ＤＨＦＲ及びＤｘｓｃＦｖを検出した結果を示す。
【図６】植物発現用ベクターであるｐＢＥ２１１３のＸｂａＩサイトとＳａｃＩ領域にＣＭＶ−Ｙ３ａ由来の３ａタンパク質の配列を挿入し、ｐＢＥ２１１３への細胞間移行タンパク質（３ａ）を導入するプロセスを示す。
【図７】Ｙ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／Ｙ３（ＲＮＡ転写産物）又はＹ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／３ａ−ｓｔｏｐ（ＲＮＡ転写産物）の接種における野生型ベンタミアーナ及び３ａ形質転換ベンタミアーナでのＤｘｓｃＦｖの検出結果を示す。
【図１】
2010041932.tif 000003
【図２】
2010041932.tif 000004
【図３】
2010041932.tif 000005
【図４】
2010041932.tif 000006
【図５】
2010041932.tif 000007
【図６】
2010041932.tif 000008
【図７】
2010041932.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月3日(2009.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010041932000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月2日(2009.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
従来のウイルスベクターは、接種、感染植物体から他の宿主植物体へ無秩序に感染が拡大する可能性がある。感染植物体内で移動するのに必要な遺伝子を欠落させたウイルス（ベクター）は、接種した植物では増殖ができない。欠失させた移動に必要な遺伝子を導入した形質転換植物体、あるいは、当該遺伝子を他のウイルスベクターで導入した植物体では、上記のウイルスベクターが増殖可能になる。しかし、このウイルスベクターは、普通の植物体では、増殖ができないため、従来のウイルスベクターのように、無秩序に感染が拡大することはない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
ＰＢＳＴスキムミルクで、３回洗浄し、ＰＢＳＴスキムミルク３ｍｌで、ＡＰ標識抗マウス抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ（Ｈ＋Ｌ）−ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）１μｌを希釈し、１時間ハイブリバッグで反応させた。ＰＢＳＴスキムミルクで、２回、ＡＰバッファーで２回、洗浄後、０．０３３％ニトロブルーテトラゾリウムと０．０１６５％  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を含むＡＰバッファーにより、検出した。また、２次抗体にＨＲＰ標識抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＥＣＬ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ｆｒｏｍ  ｓｈｅｅｐ））又は、ＨＲＰ標識ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ；ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ））を用いる際には、ＥＣＬ−ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を使用した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
２×サンプルバッファー：０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２５ｍｌに２−メルカプトエタノール５ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、Ｓｕｃｒｏｓｅ５ｇ、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ２μｇ加え、蒸留水で５０ｍｌとした。１０×ランニングバッファー：Ｔｒｉｓ１５．１４ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ７２．０６７ｇ、ＳＤＳ５ｇに、蒸留水を加え、５００ｍｌとした。ブロッティングバッファー：Ｔｒｉｓ０．６０４ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ２．８８ｇ、メタノール４０ｍｌに、蒸留水を加え、２００ｍｌとした。