(57)【要約】      （修正有）【課題】固有の標識化試薬もしくは固有の標識化試薬からなるセットを用いた質量分析よって分析物を測定するための方法、混合物、キット、および／または組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、固有の標識化試薬もしくは固有の標識化試薬からなるセットを用いた質量分析よって分析物を測定するための方法、混合物、キット、および／または組成物に関する。標識化試薬は、異性体的または同重体的であり、標識分析物の多重化分析に適した混合物の生成に用いることができる。分析物の標識は、該分析物を式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの化合物またはその塩である標識化試薬と反応させておこなうことができる。複数のセットの異性体的または同重体的標識化試薬を用いて、２種類以上の異なる試料からなる分析物を標識することができる。【選択図】図１Ａ
2010190902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／４４３，６１２号（２００３年１月３０日出願）の優先権を主張するもので、該米国特許出願は本明細書において参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、質量分析による分析物測定の分野に関する。
【０００２】
（１．序論）
本発明は、１つの分析物または複数の分析物を質量分析によって測定するための方法、混合物、キットおよび／または組成物に関する。分析物は、目的とする任意の分子とすることができる。分析物の非限定的例として、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、および分子量が１，５００ダルトン未満の低分子が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
分析物の標識は、該分析物を式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの化合物またはその塩である標識化試薬と反応させておこなうことができる。ここで、式中、ＲＧは分析物と反応する反応基であり、ＲＰ、Ｘ、ＬＫ、およびＹは、以下でより詳細に記載される。したがって、標識分析物は、一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物を持つことができる。複数のセットの異性体的または同重体的標識化試薬を用いて、２種類以上の異なる試料からなる分析物を標識することができる。ここで、それらの標識化試薬は、各々の異なる試料に対して異なるものとし、また標識分析物をもたらす試料と結合しうる固有のレポータ（ＲＰ）を該標識化試薬が含むものとすることができる。したがって、情報（例えば、レポーターの有無および／または量）を試料中の分析物の有無および／または量（しばしば濃度および／または分量）に相関させることができ、このことは異なる試料を標識して得られた複数の産物を混合することよって生じた複数の標識分析物の複合混合物を分析して得られる情報であっても、言える。そのような複合混合物の分析は、単一の試料または多重式に多数の試料から１種類または複数の分析物を測定することを可能とさせる。したがって、本発明の方法、混合物、キット、および／または組成物は、複合試料混合物の多重化分析に、特によく適している。例えば、それらを、プロテオーム分析および／またはゲノム分析、同様にゲノムおよびプロテオーム分析に関連した相関研究に用いることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（２．定義）
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用されるとともに、単数形で用いられた用語は、適当である場合は常に、複数形をも包含するものであり、その逆もあてはまる。すなわち、
ａ．本明細書で用いられる「分析物（ａｎａｌｙｔｅ）」とは、測定されうる目的とする分子をいう。分析物の非限定的例として、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡの両方）、炭水化物、脂質、ステロイド、および／または分子量が１，５００ダルトン未満の低分子を挙げることができる。上記分析物または上記分析物を含む試料の源として、限定されるものではなく、どのような源に由来するものでもよい。１つの分析物または複数の分析物を、天然のものまたは合成したものとすることができる。分析物または該分析物を含む試料の源の非限定的な例として、限定されるものではないが、細胞もしくは組織、またはそれらの培養物（または継代培養物）が挙げられる。分析物源の非限定的例として、限定されるものではないが、粗または加工済みの細胞溶解物、体液、組織抽出物、または細胞抽出物が挙げられる。上記分析物源のさらに別の非限定的例として、限定されるものではないが、クロマトグラフィー分離または電気泳動分離等の分離プロセスから得られる画分が挙げられる。体液として、限定されるものではないが、血液、尿、大便、髄液、脳脊髄液、羊水、リンパ液、または腺分泌液が挙げられる。加工済み溶解物（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が意味することは、細胞を溶解する上で必要とされる処理に加えて、回収された材料に対してさらに加工を施すために、細胞溶解物が処理されることである。例えば、試料は、ペプチドである１種類以上の分析物を含む細胞溶解物であり、該ペプチドは粗細胞溶解物の全タンパク質成分をタンパク質分解酵素処理し、前駆タンパク質を消化することによって形成される。
【０００５】
ｂ．本明細書で用いられる「フラグメンテーション（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」とは、共有結合の破壊をいう。
【０００６】
ｃ．本明細書で用いられる「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、フラグメンテーション（名詞）の産物またはフラグメンテーションを起こす（動詞）操作の産物をいう。
【０００７】
ｄ．原子または分子の質量が、多くの場合、最も近い整数原子質量単位または原子質量単位のもっと近い０．１位もしくは０．０１位に近似しうることは、十分に認められている。本明細書で用いられる場合、「総質量（ｇｒｏｓｓ  ｍａｓｓ）」とは、絶対質量のことをいうとともに、一定の範囲内の近似質量のこともいう。ここで、一定の範囲とは、使用した異なる同位体種での質量の非常にわずかな差が検出されようがなかろうが、レポーターおよび／またはリンカー部分の質量を釣り合わせる目的に対してそれらの同位体が機能的に等価である範囲であるように（レポーター／リンカー組み合わせの総重量が一セットまたはキットの同重体的または異性体的標識化試薬において同じになるように）、異なる原子種の同位体の使用が質量の点で近似していることをいう。
【０００８】
例えば、酸素の一般的な同位体は、総質量が１６．０（実際の質量１５．９９４９）および１８．０（実際の質量１７．９９９２）であり、炭素の一般的な同位体は、総質量が１２．０（実際の質量１２．０００００）および１３．０（実際の質量１３．００３３６）であり、さらに窒素の一般的な同位体は、総質量が１４．０（実際の質量１４．００３１）および１５．０（実際の質量１５．０００１）である。これらの値が近似値であるのに対して、当業者は、もしあるセットの１レポーターに１８Ｏ同位体を使用する場合、例えば、そのセットの１６Ｏを含む異なるレポーターにおいて、（総質量が１６．０である酸素に加えて）さらに２質量単位を補うことができ、該レポーターのどこか他のところに、１２Ｃ原子２つの代わりに１３Ｃ原子２つ、１４Ｎ原子２つの代わりに１５Ｎ原子２つ、さもなければ１２Ｃおよび１４Ｎのかわりに１３Ｃ原子１つおよび１５Ｎ原子１つを取り込むことで、１８Ｏを補うことができることを当業者ならば理解する。このようにして、上記セットの２つの異なるレポーターが機能的質量等価である（すなわち、同一総質量を持つ）。なぜなら、１３Ｃ原子を２つ（１２Ｃ原子２つの代わりに）、１５Ｎ原子を２つ（１４Ｎ原子２つの代わりに）、１３Ｃ原子を１つと１５Ｎを１つ（１２Ｃ原子と１４Ｎ原子の代わりに）、もしくは１８Ｏ原子１つ（１６Ｏ原子１つの代わりに）を使用することによって、セットもしくはキットの標識物の全てで、２ダルトンの質量の増加が生ずる質量の実際の違いが僅かであることは、分析の性質に対して障害とはならないからである。
【０００９】
このことは、図８を参照して例証することができる。図８では、化合物ＸＶＩＩのレポーター／リンカー組み合わせ（図８、化学式：Ｃ５１３ＣＨ１０１５Ｎ２Ｏ）は、２つの１５Ｎ原子と１つの１３Ｃ原子とを有し、全理論質量が１２９．１３８である。比較してみると、同重体ＸＶ（図８、化学式Ｃ５１３ＣＨ１０Ｎ２１８Ｏ）は、１つの１８Ｏ原子と１つの１３Ｃ原子とを有し、全理論質量が１２９．１５１である。化合物ＸＶＩＩおよびＸＶは、同重体であり、重原子同位体含有量以外は構造的および化学的に見分けはつかないが、わずかながら絶対質量に差異がある（それぞれ、質量１２９．１３８対質量１２９．１５１）。しかし、本発明の目的のために、化合物ＸＶＩＩおよびＸＶの総質量は１２９．１である。なぜなら、この総質量は、同重体ＸＶＩＩの絶対質量と同重体ＸＶの絶対的質量とのあいだの小さな違いを測定するのに質量分析計が十分な感度であるかどうかにかかわらず、分析の妨げとはならないからである。
【００１０】
図８から、同一重原子同位体の１つの構造内での分布が、異性体的および／または同重体的標識化試薬のセットを生成する上で検討すべき唯一のことではないことが明らかである。所望の総重量の異性体または同重体を達成するために、重原子同位体種を混合することが可能である。これによって、重原子同位体の選択（組み合わせ）とそれらの分布との両方が、本発明の実施形態にとって有用な異性体的および／または同重体的標識化試薬の生産の際の検討に利用可能である。
【００１１】
ｅ．本明細書で用いられる「同位体的にエンリッチされた（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」は、１つ以上の重原子同位体（例えば、重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌ、または８１Ｂｒなどの安定な同位体）が合成的にエンリッチされた化合物（例えば、標識化試薬）をいう。同位体的エンリッチメントは、１００％有効であるわけではないので、エンリッチメントの状態が劣る化合物の不純物が存在し、質量がより低くなる。同様に、過剰なエンリッチメント（不要なエンリッチメント）のため、また天然同位体が豊富なため、より質量の大きな不純物が存在しうる。
【００１２】
ｆ．本明細書で用いられる場合、「標識化試薬（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は測定のために分析物に印を付けるのに適した部分をいう。標識（ｌａｂｅｌ）という用語は、タグおよびマーク、さらに他の等価な用語や句と同義である。例えば、標識分析物（ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎａｌｙｔｅ）はまた、タグ付き分析物またはマーク付き分析物とも呼ばれる。したがって、用語「標識」、「タグ」、「マーク」、およびそれらの用語の派生物は、相互に置き換え可能であり、測定のために分析物に印を付けるのに適した部分、または印が付けられた部分のことをいう。
【００１３】
ｇ．本明細書で用いられる場合、「支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）」、「固体支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）」、または「固体担体（ｓｏｌｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒ）」は、標識化試薬が固定化されうる任意の固相材料を意味する。固定化は、例えば、支持体上で標識がおこなわれるかどうかにかかわりなく、分析物を標識するのに用いられ、あるいは標識化試薬を調製するのに用いられる。固体支持体は、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」、「膜」、および／または「支持体」を包含する。固体支持体を、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、同様にそれらのコポリマーおよびグラフト）から構成することができる。同様に、固体をガラス、シリカ、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカ等、無機的なものにすることができる。固体支持体の形態は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面状である。面は、平面的、実質的に平面的、または非平面的である。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり、膨潤または非膨潤特性を持つことができる。固体支持体をウエル、凹部、または他の入れ物、容器、外観または配置とすることができる。複数の固体支持体を、試薬のロボティック送達にとって、または検出方法および／もしくは器具によってアドレス可能な種々の位置で、一つの配列に構成することができる。
【００１４】
ｈ．本明細書で用いられる場合、「天然同位体存在比」とは、自然界での１種類の同位体または複数の同位体が天然に広く行き渡っていることに基づく、化合物に見いだされる１種類以上の同位体のレベル（または分布）のことをいう。例えば、生きている植物から得た天然化合物は、代表的には、約０．６％１３Ｃを含む。
【００１５】
（３．概要）
（反応基）
方法、混合物、キット、および／または組成物実施形態で用いる標識化試薬の反応基「ＲＧ」は、求電子試薬または求核試薬のいずれかであり、一試料の１種類以上の反応性分析物と反応することが可能である。反応基は事前に存在しうるか、もしくは該反応基をｉｎ−ｓｉｔｕで調製することができる。反応基のｉｎ−ｓｉｔｕ調製は、反応性分析物の不在下で進行することができ、または反応性分析物の存在下で進行することができる。例えば、カルボン酸基の修飾は、水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド；ＥＤＣ）によりｉｎ−ｓｉｔｕでおこなうことができ、それによってアミノ基等の求核試薬と反応しうる求電子性試薬を調製する。いくつかの実施形態では、標識化試薬のカルボン酸基をＥＤＣにより活性化させることは、アミン（求核試薬）を含む分析物の存在下でおこなうことができる。いくつかの実施形態で、アミン（求核試薬）を含む分析物はまた、ＥＤＣによる初期反応がおこなわれた後に付加することができる。いくつかの実施形態では、反応基は、保護基をｉｎ−ｓｉｔｕで取り除くことで、ｉｎ−ｓｉｔｕで生成することができる。その結果、求核試薬および／または求電子試薬の反応によって分析物の誘導体化をもたらしうる任意の既存または新たに生成された試薬または複数の試薬は、本発明の方法、混合物、キット、および／または組成物実施形態によって、検討される。
【００１６】
標識化試薬の反応基が求電子試薬である場合、該反応基は１つの分析物または複数の分析物の適当な求核性基と化学反応することができる。標識化試薬の反応基が求核試薬である場合、該反応基は１つの分析物または複数の分析物の適当な求電子性基と反応することができる。適当な求核性基と救電子性試薬との数多くの対が知られており、化学的および生化学的技術分野でしばしば使われている。分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、または１，５００ダルトン未満の他の低分子）と連結することでそれらの誘導体化を起こすことができる適当な求核性または求電子性基を含む試薬の非限定的例が、文献（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （ａ  Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ），  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ  ６１１０５，  ＵＳＡ）に記載されている。他の適当な試薬は当該技術分野で周知であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等、数多くの他のベンダーから市販されている。
【００１７】
標識化試薬の反応基を、アミン反応基とすることができる。例えば、アミン反応基を活性エステルとすることができる。活性エステル（ａｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｅｒ）とは、ペプチド合成で周知であり、ペプチド合成で一般に使用される条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応を起こす特定のエステルのことをいう。アミン反応性の活性エステルを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、または２，４−ジハロフェニルエステルとすることができる。例えば、活性エステルのアルコールまたはチオール基は、以下の式を持つことができる。すなわち、
【００１８】
【化３３】
2010190902.tif 000003
式中、ＸはＯまたはＳ、しかし好ましくはＯである。前述のすべてがアルコールまたはチオール基になっており、該アルコールまたはチオール基はペプチド化学の分野で活性エステルを形成することが知られており、アミノ酸のＮ−αアミノとエステルのカルボニル炭素との反応によって置換される。本明細書に記載した任意の適当な標識化／タグ化試薬の活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）が周知の方法を用いて調製可能であることが明らかにならなければならない（Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）．  ”Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ”  ｉｎ  ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｐａｇｅｓ  １３７−１６５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  （ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと。同様に、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｏｇｅｒ  Ｅｐｔｏｎ，  ＳＰＣＣ  （ＵＫ）  Ｌｔｄ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  １９９０）を参照のこと）。一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識化試薬の代表例であるＮ−置換ビペラジン酢酸化合物の活性エステルを形成する方法は、米国特許出願第１０／７５１，３５４号（本明細書に援用）に記載されている。
【００１９】
別の実施形態では、混合無水物がアミノ基と効率的に反応してアミド結合を生ずることから、標識化試薬の反応基を混合無水物にすることができる。
【００２０】
標識化試薬の反応基を、チオール反応基にすることができる。例えば、チオール反応基を、α−ハロアシルのハロゲン化アリール、ハロゲン化アルキル、またはマレイミドとすることができる。ハロゲン化もしくはハロゲン化物（ｈａｌｉｄｅ）またはハロ（ｈａｌｏ）は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の原子を意味するものとする。
【００２１】
標識化試薬の反応基を、ヒドロキシル反応基とすることができる。例えば、ヒドロシキル反応基を、トリチル−ハロゲン化物（ｔｒｉｔｙｌ−ｈａｌｉｄｅ）部分またはシリル−ハロゲン化物（ｓｉｌｙｌ−ｈａｌｉｄｅ）部分とすることができる。トリチル−ハロゲン化物反応性部分を、置換されたもの（例えば、Ｙ−メトキキシトリチル、Ｙ−ジメトキシトリチル、Ｙ−トリメトキシトリチル等）または非置換のものとすることができ、ここでＹは以下のように定義される。シリル反応性部分を、アルキル置換シリル・ハロゲン化物、例えばＹ−ジメチルシリル、Ｙ−ジトリエチルシリル、Ｙ−ジプロピルシリル、Ｙ−ジイソプロピルシリル等）とすることができ、ここでＹは以下のように定義される。
【００２２】
標識化試薬の反応基を、アミン基、ヒドロキシ基、またはチオール基等の求核試薬とすることができる。
【００２３】
（レポーター部分）
方法、混合物、キット、および／または組成物実施形態で用いられる１つの標識化試薬または複数の標識化試薬のレポーター部分は、測定しうる固有の質量（または質量と電荷との比（質量電荷比））を持つ基である。したがって、一つのセットの各々のレポーターは、固有の総質量を持つことができる。異なるレポーターは、１種類以上の重原子同位体を持つことで固有の質量を達成することができる。例えば、炭素の同位体（１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃ）、窒素の同位体（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素の同位体（１６Ｏおよび１８Ｏ）、または水素の同位体（水素、重水素、および三重水素）が存在し、レポーター部分の多様な群の調製に用いることができる。安定した重原子同位体の例として、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、および重水素が挙げられる。他の軽および重原子同位体もレポーターで用いることができるので、これらに限定されるものではない。軽および重原子同位体を含むレポーターの調製に適した出発原料は、種々の市販元、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｎｄｏｖｅｒ，  ＭＡ  （ｗｗｗ．ｉｓｏｔｏｐｅ．ｃｏｍでリストまたは「出発原料」を参照のこと）  およびＩｓｏｔｅｃ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの一事業部）から入手可能である。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃは、特注合成契約のもとで所望の化合物も調製する。同上（Ｉｄ）。
【００２４】
固有のレポーターを目的とする試料に対応づけることで、その試料の１つまたは複数の分析物にレポーターを標識することができる。このように、レポーターに関する情報に、上記試料の分析物のうちの１つまたはすべてに関する情報を対応づけることができる。しかし、レポーターを測定する際に、レポーターが分析物に物理的に連結する必要はない。むしろ、レポーターの固有の総質量を、例えば、標識分析物のイオンをフラグメント化して娘フラグメント・イオンおよび検出可能なレポーターを生成した後、タンデム質量分析器の第２の質量分析で測定することができる。測定されたレポーターは、測定された分析物が由来する試料の同定に用いることができる。さらに、他のレポーターの量と比較した場合または較正基準（例えば、特定のレポーターで標識した分析物）と比較した場合の固有のレポーターの量を用いて、１つの試料または複数の試料に含まれる分析物の相対量または絶対量（しばしば、濃度および／または分量として表現される）を測定することができる。したがって、情報（例えば特定の試料に含まれる１種類以上の分析物の量）を、各特定の試料標識するために使用されるレポーター部位を対応づけることができる。１つの分析物または複数の分析物の同一性も測定する場合、その情報を異なるレポーターに関連する情報と相関させることで、１つの試料または複数の試料に含まれる各々の標識分析物の同一性および量の測定が促進される。
【００２５】
レポーターは、固定された電荷を含むものか、もしくはイオン化することが可能なものであるかのいずれかである。レポーターが固定化された電荷を含むか、もしくはイオン化することが可能なものであるかのいずれかであることから、標識化試薬を単離するか、または塩類または双性イオンの形状で反応性分析物の標識に用いることが可能である。レポーターのイオン化は、質量分析計での該レポーターの測定を促進する。したがって、レポーターをイオン（時々、サイン・イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎ）とも呼ばれる）として測定することができる。イオン化した時、レポーターは正味の正または負電荷を１つ以上含むことができる。したがって、レポーターは１種類以上の酸性基または塩基性基を含むことができる。なぜなら、そのような基は質量分析計内で容易にイオン化しうるからである。例えば、レポーターは、１種類以上の塩基性窒素原子（正荷電）または１種類以上のイオン性の酸性基、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、またはリン酸基（負電荷）を含むことができる。塩基性窒素を含むレポーターの非限定的例として、置換または非置換のモルホリリン、ピペリジン、またはピペラジンが挙げられる。
【００２６】
レポーターは、置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環窒素原子を有する５、６、または７員複素環であり得、この酢酸部分に、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して分析物が結合する。ここで、各々の異なる標識が１種類以上の重原子同位体を含む。複素環を、置換または非置換のものとすることができる。複素環を、脂肪族または芳香族のものとすることができる。複素環部分の可能な置換基として、アルキル、アルコキシ、およびアリール基が挙げられる。置換基は、支持体に分析物を結合させるのに適した保護または非保護基、例えばアミン、ヒドロキシ、またはチオール基を含むことができる。複素環は、一つ以上の窒素、酸素、またはイオウ原子等のヘテロ原子をさらに含むことができる。
【００２７】
レポーターの選択は、分析物の分析にとって典型的な条件下で、実質的にサブ・フラグメント化（ｓｕｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ）が起こらないように、おこなうことができる。レポーターの選択は、質量分析計で標識分析物の選択されたイオンの少なくとも一部の結合ＸおよびＹの両方でフラグメンテーションを起こさせるために印加される解離エネルギーの条件下で、実質的にサブ・フラグメント化が起こらないように、おこなうことができる。「実質的にサブ・フラグメント化を起こさない（ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｕｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、レポーターのフラグメントが、目的とする分析物の好結果の分析に適用した場合に、バックグラウンド・ノイズよりも高く検出することが困難または不可能であることを意味する。レポーターの総質量は、測定されようとする分析物の質量と比較して、または該分析物の予想フラグメントのいずれかの質量と比較して、意図的に異なるように選択される。例えば、タンパク質またはペプチドが分析物である場合、レポーターの総質量は、任意の天然に生ずるアミノ酸もしくはアミノ酸、あるいはその予測フラグメントと比較して異なるように選択されうる。このことは、分析物の測定を促すことができる。なぜなら、分析物に依存して、同一一致（ｓａｍｅ  ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ）質量を持つ試料の任意の可能な構成要素の欠如は任意の分析の結果に対して信頼を加えることができるからである。
【００２８】
レポーターを、ポリマーではない低分子とすることができる。レポーターはバイオポリマー（例えば、ペプチド、タンパク質、または核酸）またはバイオポリマーの構成要素（例えば、アミノ酸、ヌクレオシド、またはヌクレオチド）である必要はない。レポーターの総質量は、２５０ダルトン未満である。そのような低分子は、第１の質量分析において同一一致の質量を有する試料の他の成分なしで、第２の質量分析で容易に測定することができる。この文脈において、第２の質量分析を、一般的にはタンデム質量分析計で、第１の質量分析で測定される選択されたイオンに対しておこなうことができる。特定の質量電荷比を持つイオンを、起こりうるフラグメンテーションとさらなる質量分析とのために、第１の質量分析から特異的に選択することができるので、第１の質量分析からの非選択イオンが第２の質量分析に持ち込まれず、そのため第２の質量分析のスペクトルにコンタミが生ずることはない。さらに、質量分析計の感度および検出器の直線性（定量化を目的として）を、この低質量範囲でかなり強くすることができる。さらに質量分析計技術の現状は、この質量範囲で１ダルトン未満のベースライン質量解像度を可能にさせることができる（例えば、図６参照）。これらの因子が、当該技術分野の状態に対して有用な前進であると判明される可能性がある。
【００２９】
（リンカー部分）
方法、混合物、キット、および／または組成物実施形態で用いる１つの標識試薬または複数の標識試薬のリンカー部分は、分析物による反応が生じたかどうかに応じて、レポーターを分析物に結合させるか、あるいはレポーターを反応基に結合させる。リンカーの選択は、結合ＸおよびＹの両方がフラグメント化した場合に中性種を生成する（結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションに対して、ニュートラル・ロス（ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｏｓｓ）を起こす）ためにおこなうことができる。リンカーは、非常に小さな部分であり、例えばカルボニルまたはチオカルボニル基である。例えば、リンカーは少なくとも１種類の重原子同位体を含み、かつ下記の式を有する。すなわち、
【００３０】
【化３４】
2010190902.tif 000004
式中、Ｒ１は同一または異なるものであり、１ないし８個の炭素原子を含むアルキル基とすることができ、該アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここでアルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む。リンカーを、より大きな部分とすることもできる。リンカーを、ポリマーまたはバイオポリマーとすることができる。リンカーが解離エネルギー・レベルにさらされた場合に、サブ・フラグメント化（リンカーの中性フラグメントのみを生成するサブ・フラグメンテーションを含む）するようにリンカーを設計することができる。
【００３１】
リンカー部分は、その質量が、混合物の各々の分析物に対するレポーター間、または試薬のセットおよび／もしくはキットに対するレポーター間の総重量における差異を補正するように、１種類以上の重原子同位体を含むことができる。
【００３２】
さらに、レポーター／リンカー組み合わせの統合総質量（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｇｒｏｓｓ  ｍａｓｓ）（すなわち、全体として得た総質量）は、混合物の各標識分析物にとって、またはセットおよび／もしくはキットとなった試薬にとって、同一であることができる。さらに具体的には、リンカー部分は、異なる試料から得た標識分析物のレポーター間での総質量の違いを補正することができる。この場合、レポーターの固有総質量は標識分析物が由来する試料と相関し、またレポーター／リンカー組み合わせの統合総質量は、それが由来する試料に関わりなく試料混合物の各標識分析物について同一である。このようにして、２つ以上の異なる試料中の同一分析物の総質量は、標識およびその後の混合によって試料混合物を生成する時に、同一総質量を持つことができる。
【００３３】
例えば、標識分析物または分析物を標識するためのセットおよび／またはキットの試薬を、異性体または同重体とすることができる。したがって、もし試料混合物の初期質量分析の質量分析計において、特定の質量電荷比（試料混合物から得た）のイオンが選択される場合（すなわち、選択されたイオン）、試料混合物を構成する別の試料から得た同一の分析物は、試料混合物での各々の濃度および／または分量に比例して、選択されたイオンで表現される。したがって、リンカーはレポーターを分析物に結合させるだけではなく、固有のレポーター部分の異なる質量を補正することもでき、それによって種々の質量の標識分析物内のレポーター／リンカー組み合わせの総質量を調和する。
【００３４】
リンカーは標識化試薬内でレポーターの質量平衡として作用することができるので、レポーター／リンカー組み合わせの統合総質量がセットまたはキットのすべての試薬に対して同一であるように、リンカーの原子の数が多くなればなるほど、セットおよび／またはキットの異なる異性体的／同重体的標識化試薬の可能な数が大きくなる。別の言い方をすれば、一般に、リンカーが含む原子の数が増えれば、存在する潜在的なレポーター／リンカーの組み合わせの数が増える。なぜなら、同位体を、多くてもリンカーの任意の場所で置換することができ、それによってリンカー部分の異性体または同重体が生成されるからであり、リンカー部分がレポーター部分の異なる質量をオフセットするのに用いられ、それによって１セットのレポーター／リンカー異性体または同重体を生成する。そのような複数の標識試薬からなる多様なセットは、同一の試料および／または異なる試料の分析物を多重化分析するのに、特に十分適している。
【００３５】
セットおよび／またはキットの標識化試薬の総数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。セットまたはキットの標識化試薬の多様性は、レポーターおよびリンカー部分の原子の数、軽同位体を置換するのに利用される重原子同位体、および同位体が合成的に置かれる種々の合成的形態によってのみ制限される。しかし、すでに示唆したように、同位体的にエンリッチされた数多くの出発原料を、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  およびＩｓｏｔｅｃ等の製造元から容易に入手可能である。そのような同位体的にエンリッチされた出発原料は、同重体的および異性体的標識化試薬のセットを生産するために使うことができるか、あるいは同重体的および異性体的標識化試薬のセットを生産するために使われる合成プロセスで使用することができる同位体的にエンリッチされた出発原料を生産するために使うことができる。１セットの標識試薬での使用に適した同重体的標識化試薬の調製のいくつかの例は、後述の実施例の欄で見いだすことができる。
【００３６】
（レポーター／リンカー組み合わせ）
本明細書に記載した標識化試薬は、レポーターとリンカーとから構成され、これらは結合Ｘを介して結合している。上記したように、レポーター／リンカー組み合わせは、１セットおよび／またはキットの標識化試薬の各構成要素に対して総質量が同じである。さらに、標識化試薬のレポーター／リンカー組み合わせの結合Ｘを、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、選択されたイオンの少なくとも一部分でフラグメント化し、それによって、分析物からレポーターが放出されるように設計することができる。したがって、レポーター（ｍ／ｓ比として）の総質量およびその強度をＭＳ／ＭＳ分析で観察することができる。
【００３７】
レポーター／リンカー組み合わせは、セットまたはキットのさまざまな標識化試薬の間に、同一または異なる重原子同位体の種々の組み合わせを含むことができる。科学文献では、このことは時にはコーディングまたは同位体コーディングと呼ばれていた。例えば、Ａｂｅｒｓｏｌｄ他は同位体コード化親和性タグ（ｉｓｏｔｏｐｅ  ｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ）を開示した（ＩＣＡＴ；  ＷＯ００／１１２０８を参照のこと）。ある点で、Ａｂｅｒｓｏｌｄ他の試薬は、Ａｂｅｒｓｏｌｄが異性体的または同重体的標識化試薬等の２つ以上の同質量の標識化試薬を教示していないことから、本発明の標識化試薬とは異なる。
【００３８】
（質量分析計／質量分析法（ＭＳ））
本発明の方法は、タンデム質量分析計と分子イオンを選択してフラグメント化する能力を有する他の質量分析計とを用いて、実施することができる。タンデム質量分析計（および低度１段式（ｌｅｓｓｅｒ  ｄｅｇｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｇｅ）質量分析計）は、質量電荷（ｍ／ｚ）比にもとづいて分子イオンの選択およびフラグメント化をおこなって、結果として得られたフラグメント（娘）イオン・スペクトルを記録する能力を有する。より具体的には、選択されたイオンが解離エネルギー・レベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））を受けることによって、娘フラグメント・イオン・スペクトルを生成することができる。例えば、特定のｍ／ｚ比の標識化ペプチドに対応するイオンを、第１の質量分析から選択し、フラグメント化し、さらに第２の質量分析で再度分析することができる。そのようなタンデム質量分析を実行することができる代表的装置として、限定されるものではないが、磁場４セクタ、タンデム飛行時間、三連四重極、イオン・トラップ、およびハイブリッド四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計が挙げられる。
【００３９】
これらのタイプの質量分析計を、種々のイオン化源とともに用いてもよい。そのようなイオン化源として、限定されるものではないが、エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。イオン化源は、分析物が予め固定電荷を持つものではない第１の質量分析に対して、電荷種を生成するために用いられうる。追加の質量分析機器およびフラグメンテーション方法として、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ機器での遅延引き出し機構（ｐｏｓｔ−ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅｃａｙ）とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間型）−ＴＯＦ  ＭＳを用いた高エネルギーＣＩＤとが挙げられる。タンデム質量分析計についての最近の概説については、Ｒ．  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１：  ２６９−２９５  （２００１）を参照されたい。また、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析技術の議論について、米国特許第６，３１９，４７６号（本明細書に援用）を参照のこと。
【００４０】
（解離エネルギー・レベルによるフラグメンテーション）
結合が質量分析計で起こるプロセスの結果として、フラグメント化することができることがよく理解されている。さらに、結合フラグメンテーションは、イオンを解離エネルギー・レベルにさらすことで質量分析計で得られる結果である。例えば、解離エネルギー・レベルを、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって質量分析計内に生成することができる。質量分析法の当業者は、フラグメンテーションを引き起こす解離エネルギーを改善するための他の典型的な技術として、限定されるものではないが、光解離、電子捕獲、および表面誘起解離が挙げられることを理解する。
【００４１】
衝突誘起解離によって結合をフラグメント化するプロセスは、不活性ガスによる衝突を介して、選択されたイオンの運動エネルギー状態を結合フラグメンテーションが起こる点に高めることがともなう。例えば、衝突セル内で不活性ガス（例えば、窒素、ヘリウム、またはアルゴン）による衝突によって、運動エネルギーを移すことができる。イオンに移されうる運動エネルギーの量は、衝突セルに入るのを許された気体分子の数に比例する。より多くの気体分子が存在する場合、選択されたイオンに対して、より多くの運動エネルギーが移り、より少ない気体分子が存在する場合、より低い運動エネルギーが移される。
【００４２】
したがって、質量分析計での解離エネルギー・レベルを制御できることが明らかである。また、ある種の結合が他の結合よりも不安定であることが十分に認められる。分析物またはレポーター／リンカー部分での結合の不安定性は、分析物の性質またはレポーター／リンカー部分の性質に依存する。したがって、分析物および／または標識（例えば、レポーター／リンカー組み合わせ）を、測定可能とする方法で、フラグメント化することができるように、解離エネルギー・レベルを制御できる。そのようなルーチンの調整を質量分析計の構成要素にどのようにおこなうかは、当業者に理解されることであり、それによって、解離エネルギーの適当なレベルが達成され、標識分析物のイオンの少なくとも一部分がイオン化レポーター部分および娘フラグメント・イオンにフラグメント化される。
【００４３】
例えば、解離エネルギーを、第１の質量分析から選択／分離されるイオンに適用することができる。タンデム質量分析計では、抽出イオンが解離エネルギー・レベルを受けて、第２の質量分析計へ移される。選択されたイオンは、選択された質量電荷比を持つことができる。質量電荷比を、質量分析計の特性によって質量電荷比の範囲内にすることができる。衝突解離が使用される場合、解離エネルギーを印加することできる衝突セルにイオンを通すことで、第１の質量分析計から第２の質量分析計に、該イオンを移すことができ、それによってフラグメント・イオンが発生する。例えば、分析のために第２の質量分析計に送られるイオンは、いくつかの、または一部の残留する（フラグメント化していない）選択されたイオンを、標識分析物の娘フラグメント・イオンおよびレポーター・イオン（サイン・イオン）と同様に、含むことができる。
【００４４】
（コンピュータ支援データベース分析による分析物測定）
いくつかの実施形態では、娘イオン・フラグメンテーション・パターンに基づいて分析物を測定することができる。ここで、フラグメンテーション／パターンは、既知または「理論上」の分析物のスペクトルとコンピュータ支援で比較することによって分析される。例えば、低エネルギーＣＩＤの条件下でフラグメント化したペプチド・イオンの娘フラグメント・イオン・スペクトルは、多くの離散的なフラグメンテーション・イベントの合計と考えられる。一般の命名法は、分解するアミド結合と結合分裂後の電荷を保持するペプチド・フラグメントにもとづいて、娘フラグメント・イオンを区別する。分裂性アミド結合のＮ末端側の電荷保持は、ｂ−型イオンの形成をもたらす。もし、壊れたアミド結合のＣ末端側に電荷が残るならば、フラグメント・イオンをｙ型イオンと呼ぶ。ｂおよびｙ型イオンに加えて、ＣＩＤ質量スペクトルは、他の診断用フラグメント・イオン（娘フラグメント・イオン）を含むものであってもよい。これらは、グルタミン、リジン、およびアルギニンからのアンモニア（−１７ａｍｕ）のニュートラル・ロスあるいはセリンおよびスレオニン等のヒドロキシル含有アミノ酸からの水（−１８ａｕｍ）の喪失によって生成されたイオンを含む。ある種のアミノ酸が、他のものよりも低エネルギーＣＩＤの条件下で、より容易にフラグメント化することが観察されている。このことは、特に、プロリンまたはアスパラギン酸残基を含むペプチドであきらかであり、さらにアスパルチル−プロリン結合でなおさらそうである（Ｍａｋ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，  １２：  ８３７−８４２）  （１９９８）。したがって、Ｚ−ｐｒｏダイマーまたはＺ−ａｓｐダイマーのペプチド結合（ここで、Ｚは任意の天然アミノ酸、ｐｒｏはプロリン、およびａｓｐはアスパラギン酸）は、すべての他のアミノ酸ダイマー組み合わせの間でのペプチド結合と比較して、よりいっそう不安定となる傾向にある。
【００４５】
したがって、ペプチドおよびタンパク質試料に関して、低エネルギーＣＩＤスペクトルは、重複ｂ−およびＹ−系イオン、同一ペプチド由来の内部フラグメント・イオン、ならびにイモニウムおよび他のニュートラル・ロス・イオンの冗長配列特異的情報を含む。新たに親ペプチドのアミノ酸配列を組み立てるためにそのようなＣＩＤスペクトルを解釈することは、挑戦的で時間がかかる。ペプチド配列を同定する上で最も顕著な進歩は、ペプチドＣＩＤスペクトルを、タンパク質およびＤＮＡ配列データベースにすでに存在するペプチド配列で補正するコンピュータ・アルゴリズムの発達であった。そのようなアプローチは、ＳＥＱＵＥＳＴ  （Ｅｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ａｎｘ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，  ５：９７６−９８９  （１９９４））およびＭＡＳＣＯＴ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２０：３５５１−３５６７（１９９９））等のプログラムによって例示される。
【００４６】
手短に言えば、実験的ペプチドＣＩＤスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）は、タンパク質またはゲノム配列データベースから得たペプチド配列から計算により生成した「理論的」娘フラグメント・イオン・スペクトルと一致または相関する。一致または相関は、ＭＳ／ＭＳモードでの娘フラグメント・イオンの予測質量と観測質量との類似性に基づいている。潜在的一致または相関は、実験的フラグメント・パターンと「理論的」フラグメント・パターンとがどれぐらいよく一致するかにもとづいて記録される。所定のペプチド・アミノ酸配列をサーチするデータベース上の制約は、シングル・ペプチドＣＩＤスペクトルが全ゲノムまたは発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの任意の所定のタンパク質の同定に適切になるほど、見分けられている。他の概説については、Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．Ｒ．  Ｔｒｅｎｄｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６：  ５−８  （２０００）  ａｎｄ  Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：  ８９３−９００  （１９９８）を参照されたい。
【００４７】
したがって、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘フラグメント・イオン分析は、標識分析物の分析物を測定することだけではなく、測定された分析物が由来する分析物を測定することにも用いられる。例えば、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘フラグメント・イオン分析は、タンパク質の酵素的消化の結果としてペプチドが開裂したタンパク質の測定に用いることができる。そのような分析が他の分析物、例えば核酸に適用しうることが考えられる。
【００４８】
（結合ＸおよびＹ）
Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子とのあいだの結合である。Ｙは、リンカーの原子と、反応基もしくは標識化試薬が反応性分析物と反応している場合は該分析物のいずれかとのあいだの結合である。本発明の実施形態で使用しうる種々の標識化試薬（すなわち、ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ）の結合ＸおよびＹは、解離エネルギー・レベルにさらされた場合、選択されたイオンの少なくとも一部分で、フラグメント化することができる。したがって、結合ＸおよびＹが標識分析物（すなわち、ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物）の選択されたイオンの少なくとも一部分にフラグメント化されるように、解離エネルギー・レベルを質量分析計で調節することができる。結合Ｘのフラグメンテーションは、レポーターを別個に分析物から測定することができるように、該分析物からレポーターを離す。結合Ｙのフラグメンテーションは、結合Ｘがすでにフラグメント化されているかどうかに依存して、分析物からレポーター／リンカー組み合わせを、または分析物からリンカーを離す。結合Ｙを結合Ｘよりも不安定化させることができる。結合Ｘを結合Ｙよりも不安定化させることができる。結合ＸおよびＹの両方を同じく相対的に不安定なものとすることができる。
【００４９】
目的とする分析物がタンパク質またはペプチドである場合、結合ＸおよびＹの相対的不安定性は、アミド（ペプチド）結合に関して調節することができる。結合Ｘ、結合Ｙ、または結合Ｘおよび結合Ｙの両方を、典型的なアミド（ペプチド）結合と比較して、よりいっそう、等しく、またはより少なく不安定化させることができる。例えば、解離エネルギーの条件下で、結合Ｘおよび／または結合Ｙが、ｚ−ｐｒｏダイマーまたはｚ−ａｓｐダイマー（ここで、Ｚは任意の天然アミノ酸、ｐｒｏはプロリン、およびａｓｐがアスパラギン酸である）のペプチド結合と比較して、フラグメンテーションがより劣る傾向にある。いくつかの実施形態では、結合ＸおよびＹが、典型的なアミド結合と比較して、解離エネルギーがほぼ等しい。いくつかの実施形態で、結合ＸおよびＹは、典型的なアミド結合と比較して、解離エネルギーのレベルがよりいっそう大きい。
【００５０】
結合ＸおよびＹは、結合Ｙのフラグメンテーションが結合Ｘのフラグメンテーションを誘導し、またその逆も起こるようにして、存在することもできる。このようにして、結合ＸおよびＹの両方が、相当量の分析物またはその娘フラグメント・イオンが第２の質量分析で部分的標識を含まないようにして、実質的に同時にフラグメント化することができる。「相当量の分析物（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｅ）」とは、２５％未満、好ましくは１０％未満、部分的に標識された分析物がＭＳ／ＭＳスペクトルで測定されることを意味する。
【００５１】
分析物の標識フラグメントと非標識フラグメントとのあいだの明瞭な区分が第２の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）のスペクトルにあることから、この特徴によって、娘フラグメント・イオン・スペクトルのコンピュータ支援分析からの分析物の同定を単純化することができる。さらに、いくつかの実施形態では、分析物のフラグメント・イオンを、レポーター／リンカー部分により完全標識または非標識（しかし部分的標識ではない）することができるので、分裂した結合にわたって同位体分布によって生じた娘フラグメント・イオンの質量がほとんど散乱またはまったく散乱することがなく、例えば、第２の質量分析で通常決定される部分的に標識された分析物の不安定な単一の結合の各々の側に、同位体が存在する場合が考えられる。
【００５２】
（試料の加工）
本発明のいくつかの実施形態では、分析物の標識後と同様に、該標識に先立って、試料を加工することができる。この加工によって分析物の標識を促進することができる。この加工で試料の構成要素の分析を促進することができる。この加工によって、試料の取り扱いを簡素化することができる。この加工は、前述したことの２つ以上を促進することができる。
【００５３】
例えば、試料を酵素で処理することができる。酵素は、プロテアーゼ（タンパク質およびペプチドを分解するため）、ヌクレアーゼ（核酸を分解するため）、または何らかの他の酵素である。酵素の選択は、かなり予測可能な分解パターンを持つように、おこなうことができる。２種類以上のプロテアーゼおよび／または２種類以上のヌクレアーゼ酵素も一緒にもちいてもよく、あるいは他の酵素も一緒に用いてもよく、それによって試料構成要素の分解が生ずる。
【００５４】
例えば、タンパク質分解酵素であるトリプシンは、リジンまたはアルギニンと非特異的なアミノ酸とのあいだのペプチド結合を切断して、アミン末端（Ｎ−末端）とリジンまたはアルギニン・カルボキシル末端アミノ酸（Ｃ−末端）とを有するペプチドを生成するセリンプロテアーゼである。このようにして、タンパク質の切断により生じるペプチドが予測可能であり、その存在および／または分量によって、トリプシン消化の試料では、該試料が由来するタンパク質の存在および／または分量を示すことができる。さらに、ペプチドの遊離アミン末端は、標識化を促進する良好な求核試薬となりうる。他の典型的なタンパク質分解酵素として、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、およびカルボキシペプチダーゼＣが挙げられる。
【００５５】
例えば、あるタンパク質（例えば、タンパク質Ｚ）は、トリプシン等のプロテアーゼによる消化を受けた場合、３種類のペプチド（例えば、ペプチドＢ、Ｃ、およびＤ）を生ずる可能性がある。したがって、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって消化を受けており、また分析によってペプチドＢ、Ｃ、およびＤを含むことが確認された試料は、本来はタンパク質Ｚを構成したものであるといえる。ペプチドＢ、Ｃ、およびＤの量もまた、消化した試料に含まれるタンパク質Ｚの量と相関する。このようにして、１つの試料（またはその分画）に含まれるペプチドＢ、Ｃ、およびＤの１種類以上を同定および／または定量するいずれの測定も、元の試料（またはその分画）に含まれるタンパク質Ｚの同定および／または定量に用いることができる。
【００５６】
酵素の活性を予測することが可能であることから、配列が既知のタンパク質を分解することで生ずるペプチドの配列を、予測することができる。この情報によって、「理論的」ペプチド情報が生成される。したがって、実際の試料の質量分析から得られた娘フラグメント・イオン（上記したとおり）のコンピュータ支援分析での「理論的」ペプチド・フラグメントの測定を、１種類以上の未知の試料に含まれる１種類以上のペプチドまたはタンパク質の測定に用いることができる。
【００５７】
（試料混合物の分離）
いくつかの実施形態では、標識分析物の試料または試料混合物の加工に、分離を含むことができる。例えば、複数の異なる試料由来の複数の差異的標識分析物を含む１つの試料混合物を、調製することができる。差異的標識（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ）とは、標識の各々が同定可能な固有の性質を持つことを意味する（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析で固有の「サイン・イオン」を作る固有のレポーター部分を含む）。試料混合物を分析するために、試料混合物の構成要素を分離して、質量分析を該試料混合物の一分画のみに実施することができる。このようにして、分離された分析物の質量を個々に分析して分析プロセスの感度を高めることができるので、分析の複雑性を実質的に減らすことができる。もちろん、この分析を上記試料混合物の１種類以上の別の分画に対して１回以上繰り返して、該試料混合物のすべての分画を分析することが可能となる。
【００５８】
同一の複数の差異的標識分析物が、試料混合物での存在量に比例した濃度または量で、共溶出する分離条件を、試料混合物に加えられる各試料の量が知られているという条件で試料混合物を含む各々の試料での各標識分析物の量を測定するために、用いることができる。したがって、いくつかの実施形態では、試料混合物の分離によって分析を簡素化することができる一方で、試料混合物で複数の差異的標識分析物による質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析）で測定されたシグナル間の相関を保つことができる。
【００５９】
上記分離はクロマトグラフィーによっておこなうことができる。例えば、液体クロマグログラフィ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、そのような試料の分離および質量分析をおこなうことができる。さらに、目的とする分析物の分離に適した任意のクロマトグラフィー分離プロセスを用いることができる。例えば、クロマトグラフィーによる分離を、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーとすることができる。
【００６０】
上記分離を電気泳動的におこなうことができる。使用しうる電気泳動的分離技術の非限定的例として、限定されるものではないが、１次元電気泳動による分離、２次元電気泳動による分離、および／またはキャピラリー電気泳動による分離が挙げられる。
【００６１】
１種類の同重体的標識化試薬または１セットの試薬を用いて、１つの試料の複数の分析物を標識することができる。分離工程を実行する場合、複数の同重体的標識化試薬が有用である。なぜなら、１セットの標識化試薬の同重体的標識は、構造的および化学的に識別可能である（また、フラグメンテーションが分析物からレポーターを除去するまで、総質量によって識別可能である）からである。したがって、異なる同重体的標識により標識される同一組成のすべての分析物を、正確に同じ方法でクロマトグラフィーにかけることができる（すなわち、共溶出）。それらは構造的および化学的に識別可能であるので、分離プロセスによって生じた溶出液は、試料混合物に含まれる標識分析物の量に比例している一定量の各々の同重体標識された分析物を含むことができる。さらに、どのようにして試料混合物を調製したかの知見から（試料の割合、試料混合物を得るために加えられた他の任意の構成要素（例えば、較正基準））、試料混合物に含まれる標識分析物の量を、それが由来する試料に含まれるその標識分析物のもとの量に対応させることが可能である。
【００６２】
標識化試薬を、異性体的なものにすることもできる。同位体をクロマトグラフィーにより分離することも時には可能ではあるが、条件依存的である状況が存在し、該状況では分離プロセスを実行して複数の同一差異的標識分析物のすべてを共溶出させることができ、ここでは、標識分析物全ての量が試料混合物中でのそれらの濃度および／または分量に比例して存在する。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、同重体は同位体と異なる。同重体は名目総質量（例えば、図１参照）が同じ化合物（同位体含有量および／または分布を除く）と構造的および化学的に識別することができない。それに対して、異性体は名目総質量が同じではあっても構造的および／または化学的に該異性体同士を区別することができる。
【００６４】
（分析物の相対的および絶対的定量化）
いくつかの実施形態では、１つの試料混合物で同一の差異的標識分析物の相対的定量化が可能である。同一の差異的標識分析物の相対的定量化は、第１の質量分析で観察された選択標識分析物に対する第２の質量分析で測定されるレポーターの相対量（例えば、報告されたピークの面積または高さ）と比較することによって、可能である。言い換えれば、試料混合物を生成するために用いられる特定の試料に対する情報と各レポーターとを相関させることができる場合には、第２の質量分析で観察された他のレポーターに関して、そのレポーターの相対量は試料混合物に含まれるその分析物の相対量である。試料混合物を形成するために組み合わされた構成要素が既知である場合には、試料混合物を調製するために用いられる各試料に含まれる分析物の相対量を、第１の質量分析から選択された標識分析物のイオンに対して観察されたレポーターのもとの相対量に基づいて、計算することができる。このプロセスを、第１の質量分析で観察された異なる標識分析物の全てに対して、繰り返すことができる。このようにして、試料混合物を生成するために用いる複数の異なる試料の各々に含まれる各反応性分析物の相対量（しばしは、濃度および／または分量で表現される）を、測定することができる。
【００６５】
他の実施形態では、分析物の絶対定量を測定することができる。これらの実施形態のために、１種類以上の差異的標識分析物の既知量（１つの較正基準または複数の較正基準）を試料混合物に添加することができる。較正基準は、期待される分析物であり、この分析物は、試料混合物を形成するために用いられる複数の試料のうちの任意のものと比較して、較正基準用のレポーターが固有なものであるという条件で、試料混合物の分析物を標識するのに用いられる標識セットの異性体標識または同重体標識で標識される。較正基準用のレポーターの相対量が、試料混合物の差異的標識分析物のレポーターの相対量に関して、ひとたび測定されると、該試料混合物に含まれる差異的標識分析物のすべての絶対量（しばしば、濃度および／または分量で表現される）を計算することが可能である。このようにして、各々の差異的標識分析物（分析物が由来する試料に較正基準がある）の絶対量もまた、どのようにして試料混合物が調製されたかの知見に基づいて、測定される。
【００６６】
前述のことにもかかわらず、必要に応じて、天然に生じた、または人工的に創出したレポーター内の同位体含有量について、レポーター（サイン・イオン）の強度に対する補正をおこなうことができる。そのような補正の一例を実施例３に見いだすことができる。そのような補正の洗練された例もまた、「回旋状スペクトルを脱回旋状にするための方法および装置（Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅ−Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ  Ａ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）」と題された同時係属かつ共有の米国仮特許出願第６０／５２４，８４４号（２００３年１１月２６日出願）に見いだすことができる。各レポーターの強度を正確に定量するためによりいっそう注意を払うことで、もとの試料での分析物の相対量および絶対量の定量がよりいっそう正確になる。
【００６７】
（プロテオミックス分析）
本発明の方法、混合物、キット、および／または組成物を複合分析に用いることができる。なぜなら、質量分析技術を用いて、素早くかつ繰り返して、試料を多重化し、分析し、さらに再分析することができるからである。例えば、試料混合物の分析を、１つ以上の試料に含まれる個々の分析物の量について実施することができる。上記試料混合物を構成する試料に対して、これらの分析物の量（しばしば、濃度および／または分量で表される）を測定することができる。試料加工および質量分析を素早くおこなうことができることから、これらの方法を数多く繰り返すことで、試料混合物の多くの差異的標識分析物の量を、分析物が由来する試料中でのそれらの相対量および／または絶対量に関して、測定することができる。
【００６８】
そのような急速多重化分析が有用な１つの応用として、プロテオミックス分析の領域がある。プロテオミクスを、構造、機能、および生物学的プロセスの調節に関してゲノム配列にコード化される情報を説明するための実験的なアプローチとして見ることができる。このことは、細胞または組織によって発現される総タンパク質構成要素の系統的分析によって達成可能である。本発明の方法、混合物、キット、および／または組成物実施形態と組み合わせて使用される質量分析は、そのような全体的なタンパク質分析にとって、考えられるツールの１つである。
【００６９】
例えば、４種類の同重体的標識化試薬からなるセットによって、１回の実験で、タンパク質の上方制御および下方制御を測定するために、例えば特定の刺激物に対する増殖細胞の応答に基づいて、４時点を得ることが可能である。より少ない時点で実行することも可能ではあるが、１種類または２種類の対照群を組み込むことが可能である。すべての場合において、タンパク質発現の上方または下方制御を、必要に応じて対照群に関して、単一多重化実験で測定することができる。さらに、加工が平行して実行されるので、結果は直接比較可能である。なぜなら、プロトコールでのわずかな変化が結果に影響を及ぼしかねないというリスクがないためである。
（項目１）
以下：
ａ）各々の試料が１種類以上の反応性分析物を含む２種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が１種類以上の標識分析物を含む２種類以上の差次的標識試料を生成し、上記セットの上記異なる標識化試薬の各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはその塩（式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させ、
ｖｉ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する）を含む、工程；ならびに
ｂ）上記２種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で１種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成し、ここで、ＲＰは、
ｉ）２５０ダルトン未満の総質量を有し、かつ／または、
ｉｉ）質量分析計で標識分析物の結合ＸおよびＹ両方の少なくとも一部のフラグメンテーションを起こさせるために印加される解離エネルギーの条件下で、実質的にサブ・フラグメント化が起こらず、かつ／または、
ｉｉｉ）ポリマーではないか、または生体ポリマーではない、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
以下：
ａ）各々の試料が１種類以上の反応性分析物を含む２種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が１種類以上の標識分析物を含む２種類以上の差次的標識試料を生成し、上記セットの上記異なる標識化試薬の各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧまたはその塩（式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させ、
ｖｉ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する）を含む、工程；ならびに
ｂ）上記２種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で１種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成し、ここで、上記リンカーＬＫは、質量分析計で結合ＸおよびＹ両方のフラグメンテーションを起こす印加された解離エネルギーの条件下で、ニュートラル・ロスを受ける工程、
を包含する、方法。
（項目３）
以下：
ａ）各々の試料が１種類以上の反応性分析物を含む２種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が１種類以上の標識分析物を含む２種類以上の差次的標識試料を生成し、上記セットの上記異なる標識化試薬の各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧまたはその塩（式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させ、
ｖｉ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する）を含む、工程；ならびに
ｂ）上記２種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で１種類以上の較正基準とを混合することによって、試料混合物を生成する工程、
を包含し、
質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合ＸまたはＹの一方のフラグメンテーションが結合ＸまたはＹの他方のフラグメンテーションを誘導することを特徴とする、方法。
（項目４）
以下：
ａ）各々の試料が１種類以上の反応性分析物を含む２種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が１種類以上の標識分析物を含む２種類以上の差次的標識試料を生成し、ここで、上記セットの上記異なる標識化試薬の各々が、以下の式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはその塩（式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させ、
ｖｉ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する）を含む、工程；ならびに
ｂ）上記２種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で１種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成する工程、
を包含し、
ｉ）質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Ｘは、結合Ｙに比べてフラグメンテーションの傾向が少なく、かつ／または
ｉｉ）質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Ｘは、Ｚ−ｐｒｏアミノ酸ダイマーまたはＺ−ａｓｐアミノ酸ダイマーのペプチド結合と比べて、フラグメンテーションの傾向が少なく、ここで、Ｚは、任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏは、プロリンであり、ａｓｐは、アスパラギン酸であることを特徴とする、方法。
（項目５）
以下：
ａ）各々の試料が１種類以上の反応性分析物を含む２種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が１種類以上の標識分析物を含む２種類以上の差次的標識試料を生成し、上記セットの上記異なる標識化試薬の各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧまたはその塩、
（式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、
ａ）上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、かつ
ｂ）上記リンカーは、少なくとも１種類の重原子同位体を含み、以下の式：
【化１】
2010190902.tif 000005
を有し、
式中、Ｒ１は、同一または異なるものであり、１ないし８個の炭素原子を含むアルキル基とし、上記アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここで上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させる）を含む、工程；ならびに
ｂ）上記２種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で１種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成する工程、
を包含する、方法。
（項目６）
以下：
ｃ）上記試料混合物またはその分画上で第１の質量分析を実行する工程；
ｄ）上記第１の質量分析で選択された標識分析物のイオンを解離エネルギー・レベルにさらすことによって、イオン化されたレポーター部分と、少なくとも複数の上記選択されたイオンのイオン化された娘フラグメント・イオンとを形成する工程；ならびに
ｅ）上記選択されたイオン、上記イオン化されたレポーター部分、および上記娘フラグメント・イオン、またはそれらの分画上で第２の質量分析を実行する工程、
をさらに包含する、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
以下：
ｆ）上記第２の質量分析で、各レポーター部分の総質量および相対量と、上記娘フラグメント・イオンの総質量とを測定する工程、
をさらに包含する、項目６に記載の方法。
（項目８）
電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程（ｄ）ないし（ｆ）を１回以上繰り返すことをさらに包含する、項目７に記載の方法。
（項目９）
工程（ａ）ないし（ｆ）を１回以上繰り返し、各回が上記試料混合物の異なる分画を用いることをさらに包含する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記２種類以上の試料が酵素的消化反応の産物である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
上記２種類以上の試料がタンパク質分解酵素的消化反応の産物である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記タンパク質酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
各試料が粗または加工済みの細胞溶解物、体液、組織抽出物、あるいは細胞抽出物である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
各試料が分離プロセスから得た分画である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
上記分離プロセスがクロマトグラフィー分離または電気泳動分離である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記体液が血液、尿、髄液、脳脊髄液、羊水、リンパ液、または腺分泌液である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
上記１種類以上の分析物がタンパク質、核酸分子、炭化水素、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の低分子である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
上記１種類以上の分析物がペプチドである、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
上記ペプチドが少なくとも１種類のタンパク質の消化によって形成される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記ペプチドが粗細胞溶解物の全タンパク質成分の消化によって形成される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記セットの各試薬の上記反応基が上記反応性分析物との反応のためにｉｎ  ｓｉｔｕで調製される、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
上記セットの上記各試薬の上記反応基が、水溶性カルボジイミドで活性化されたカルボン酸基である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記水溶性カルボジイミドが１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３エチルカルボジイミドハイドロクロリド（ＥＤＣ）である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記セットの各試薬の上記反応基がアミン反応性の活性エステル基である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
上記活性エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、または２，４−ジハロフェニルエステルである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記セットの各試薬の上記反応基がチオール反応求電子性基である、項目１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
上記チオール反応基がマレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、およびα−ハロアシルからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記セットの各試薬の上記反応基がヒドロキシル反応求電子性基である、項目１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
各試薬の上記反応基がアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基からなる群から選択される求核性試薬である、項目１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
上記レポーターが置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジン化合物、あるいはそれらの塩である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
上記レポーターがカルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基含有化合物、あるいはそれらの塩である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
上記レポーター部分が、上記分析物を測定するために用いられる条件下で、実質的にサブ・フラグメント化を起こさないことを特徴とする、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
上記レポーター部分が生体ポリマーではないことを特徴とする、項目２ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
上記レポーター部分がポリマーではないことを特徴とする、項目２ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
上記リンカーがカルボニルまたはチオカルボニル基である、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
上記リンカーがポリマーまたはバイオポリマー部分である、項目１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
上記ポリマー部分がサブ・フラグメント化することができる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記１種類以上の差次的標識分析物の各々が、上記差次的標識分析物をもたらす上記試料を同定する異性体的標識を含む、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
上記１種類以上の差次的標識分析物の各々が、上記差次的標識分析物をもたらす上記試料を同定する同重体的標識を含む、項目１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
各同重体的標識分析物の上記標識が、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して上記分析物が結合する置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環状窒素原子を有する５、６、または７員複素環であり、各々の異なる標識が１種類以上の重原子同位体を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記試料混合物中の上記同重体的標識分析物の各々が、以下の式：
【化２】
2010190902.tif 000006
を含み、
式中、
ａ）Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり、
ｂ）各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり、
ｃ）Ｗは、上記環状窒素にオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、ＮＨ、Ｎ−Ｒ１、Ｎ−Ｒ２、Ｐ−Ｒ１、Ｐ−Ｒ２、Ｏ、またはＳであり、
ｄ）上記複素環の各炭素は、式ＣＪ２を有し、
ｅ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｆ）Ｒ２は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または上記試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、上記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
上記同重体的標識分析物がペプチドである、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
上記試料混合物が、以下の式：
【化３】
2010190902.tif 000007
の１種類以上の同重体的標識分析物を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
上記試料混合物が、以下の式：
【化４】
2010190902.tif 000008
の１種類以上の同重体的標識分析物を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
上記試料混合物が、以下の式：
【化５】
2010190902.tif 000009
の１種類以上の同重体的標識分析物を含み、
式中、各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
上記試料混合物が、以下の式：
【化６】
2010190902.tif 000010
の１種類以上の同重体的標識分析物を含み、
式中、
ａ）Ｇ’は、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基であり、ここで、上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｂ）上記複素環の各炭素は式ＣＪ２を有し、ここで、各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｃ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
上記試料混合物中の上記同重体的標識分析物の各々が、以下の式：
【化７】
2010190902.tif 000011
を含み、
式中、
ａ）Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり、
ｂ）各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｃ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４８）
上記同重体的標識分析物がペプチドである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記試料混合物が、以下の式：
【化８】
2010190902.tif 000012
の１種類以上の同重体的標識分析物を含み、
式中、各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
上記セットの各異なる標識化試薬が支持体結合性であり、異なる標識化試薬を保持する支持体と各異なる試料を反応させるように切断可能なリンカーを介して上記支持体に結合され結合され、かつ、上記方法は、工程（ｂ）を実行する前に、
ｉ）任意で樹脂を洗浄し、上記標識化試薬の上記反応基と反応しない上記試料の成分を除去する工程；および
ｉｉ）上記切断可能なリンカーを切断する工程であって、該工程によって、各々の試料が１種類以上の標識分析物を含む上記２種類以上の差次的標識試料を回収する、工程、
をさらに包含し、
特定の試料に関連する上記標識分析物が、そこに結合する固有の上記レポーターによって同定可能および／定量可能である、項目１ないし５のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
上記セットの各異なる標識化試薬が、以下の式：
Ｅ−Ｆ−ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
の固体支持体であり、
式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させ、
ｖｉ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ｖｉｉ）Ｅは、固体支持体であり、
ｖｉｉｉ）Ｆは、上記固体支持体へ結合され、かつ上記レポーターへ切断可能に結合される切断可能なリンカーである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
標識化試薬の上記セットが、１種類以上の以下の支持体結合標識化試薬、すなわち、
【化９】
2010190902.tif 000013
を含み、
式中、
ｉ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、上記試料の上記１種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）Ｅは、固体支持体であり、
ｉｉｉ）Ｆは、上記固体支持体へ結合され、かつ上記レポーターへ切断可能に結合される切断可能なリンカーであり、
ｉｖ）Ｇは、上記切断可能なリンカーに切断可能に結合させるアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、上記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｖ）上記複素環の各炭素は式ＣＪ２を有し、ここで、各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｖｉ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記支持体がポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミド、ガラス、シリカ、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカから構成される、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
上記固体支持体がビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面状である、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
以下：
ｃ）工程ａ）を実行する前に、各試料を少なくとも１種類の酵素で消化して、上記試料の成分を部分的または完全に分解する工程、をさらに包含する、項目１ないし５のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
上記酵素がタンパク質分解酵素である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
上記タンパク質分解酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記方法が、以下：
ｃ）上記試料混合物を分離する工程、
をさらに包含する、項目１ないし５のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
上記分離がクロマトグラフィーによって実行される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
上記クロマトグラフィー分離の方法が順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティー・クロマトグラフィーである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記分離が電気泳動によっておこなわれる、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
上記電気泳動分離が１次元電気泳動分離、２次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
上記方法が、以下：
ｃ）工程ａ）を実行する前に、各試料を少なくとも１種類の酵素で消化して、上記試料の成分を部分的または完全に分解する工程；および
ｄ）上記試料混合物を分離する工程、
をさらに包含する、項目１ないし５のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
上記酵素がタンパク質分解酵素である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
上記タンパク質分解酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
上記分離がクロマトグラフィーによって実行される、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
上記クロマトグラフィー分離の方法が順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティー・クロマトグラフィーである、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
上記分離が電気泳動分離である、項目６３に記載の方法。
（項目６９）
上記電気泳動分離が１次元電気泳動分離、２次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
電荷比に対する選択された質量に関連する上記標識分析物の同一性が上記娘フラグメント・イオンの分析によって測定される、項目７に記載の方法。
（項目７１）
上記第２の質量分析での各レポーターの相対量が他のレポーターを基準にして測定される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
上記同定された分析物に関連する各レポーターの相対量を、上記試料混合物を形成するために添加される各試料の量に相関させることによって、上記混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の上記分析物の相対量を測定する、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
（ｉ）上記試料混合物が上記同定された分析物に対する既知量の較正基準を含み、各レポーターの絶対量が上記較正基準に関連するレポーターの量を基準にして測定され、
（ｉｉ）上記試料混合物の各異なる試料中の上記同定された分析物の絶対量が各レポーターの量を基準にして測定される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程（ｄ）ないし（ｆ）を１回以上繰り返すことによって、上記試料混合物を形成するために組み合わされた上記２種類以上の試料の各々中の１種類以上の他の分析物の相対量を同定および／または測定することをさらに包含する、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程（ｄ）ないし（ｆ）を１回以上繰り返すことによって、上記試料混合物を形成するために組み合わされた上記２種類以上の試料の各々中の１種類以上の他の分析物の絶対量を同定および／または測定することをさらに包含する、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
上記分析物がペプチドであり、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の１種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の上記１種類以上のペプチドの同一性および相対量にもとづいて測定される、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
上記分析物がペプチドであり、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の１種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の上記１種類以上のペプチドの同一性および絶対量にもとづいて測定される、項目７３に記載の方法。
（項目７８）
以下：
ｃ）工程（ａ）を実行する前に、各試料を少なくとも１種類の酵素で消化して、上記試料の成分を部分的または完全に分解する工程；および
ｄ）工程（ｃ）を実行する前に、上記試料混合物を分離する工程、
をさらに包含する、項目７に記載の方法。
（項目７９）
上記酵素がタンパク質分解酵素である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
上記タンパク質分解酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
上記分離がクロマトグラフィーによって実行される、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
上記クロマトグラフィー分離の方法が順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティー・クロマトグラフィーである、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
上記分離が電気泳動分離である、項目７８に記載の方法。
（項目８４）
上記電気泳動分離が１次元電気泳動分離、２次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
電荷比に対する選択された質量に関連する上記標識分析物の同一性が上記娘フラグメント・イオンの分析によって測定される、項目７８に記載の方法。
（項目８６）
上記第２の質量分析での各レポーターの相対量が他のレポーターを基準にして測定される、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
上記同定された分析物に関連する各レポーターの相対量を、上記試料混合物を形成するために添加される各試料の量に相関させることによって、上記混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の上記分析物の相対量を測定する、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
（ｉ）上記試料混合物が上記同定された分析物に対する既知量の較正基準を含み、各レポーターの絶対量が上記較正基準に関連するレポーターの量を基準にして測定され、
（ｉｉ）上記試料混合物の各異なる試料中の上記同定された分析物の絶対量が各レポーターの量を基準にして測定される、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程（ｄ）ないし（ｆ）を１回以上繰り返すことによって、上記試料混合物を形成するために組み合わされた上記２種類以上の試料の各々中の１種類以上の他の分析物の相対量を同定および／または測定することをさらに包含する、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程（ｄ）ないし（ｆ）を１回以上繰り返すことによって、上記試料混合物を形成するために組み合わされた上記２種類以上の試料の各々中の１種類以上の他の分析物の絶対量を同定および／または測定することをさらに包含する、項目８８に記載の方法。
（項目９１）
上記分析物がペプチドであり、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の１種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の上記１種類以上のペプチドの同一性および相対量にもとづいて測定される、項目８７に記載の方法。
（項目９２）
上記分析物がペプチドであり、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の１種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、上記試料混合物を形成するために組み合わされる上記２種類以上の試料の各々の中の上記１種類以上のペプチドの同一性および絶対量にもとづいて測定される、項目８８に記載の方法。
（項目９３）
少なくとも２種類の標識分析物を含む混合物であって、上記２種類の標識分析物の各々が上記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物
またはその塩を含み、
式中、
ａ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
ｂ）ＬＫは、上記分析物と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように上記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
ｃ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｄ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記分析物の原子との間の結合であり、
ｅ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、ＲＰは、
ｉ）２５０ダルトン未満の総質量を有し、かつ／または、
ｉｉ）質量分析計で標識分析物の結合ＸおよびＹ両方の少なくとも一部のフラグメンテーションを起こさせるために印加される解離エネルギーの条件下で、実質的にサブ・フラグメント化が起こらず、かつ／または、
ｉｉｉ）ポリマーではないか、または生体ポリマーではない、混合物。
（項目９４）
少なくとも２種類の標識分析物を含む混合物であって、上記２種類の標識分析物の各々が上記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物またはその塩を含み、
式中、
ａ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
ｂ）ＬＫは、上記分析物と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように上記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
ｃ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｄ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記分析物の原子との間の結合であり、
ｅ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、上記リンカーＬＫは、質量分析計で結合ＸおよびＹ両方のフラグメンテーションを起こす印加された解離エネルギーの条件下で、ニュートラル・ロスを受ける、混合物。
（項目９５）
少なくとも２種類の標識分析物を含む混合物であって、上記２種類の標識分析物の各々が上記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物
またはその塩を含み、
式中、
ａ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
ｂ）ＬＫは、上記分析物と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように上記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
ｃ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｄ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記分析物の原子との間の結合であり、
ｅ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合ＸまたはＹの一方のフラグメンテーションが結合ＸまたはＹの他方のフラグメンテーションを誘導する、混合物。
（項目９６）
少なくとも２種類の標識分析物を含む混合物であって、上記２種類の標識分析物の各々が上記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物
またはその塩を含み、
式中、
ａ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
ｂ）ＬＫは、上記分析物と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように上記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
ｃ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｄ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記分析物の原子との間の結合であり、
ｅ）結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、上記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、
ｉ）質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Ｘは、結合Ｙに比べてフラグメンテーションの傾向が少なく、かつ／または
ｉｉ）質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Ｘは、Ｚ−ｐｒｏアミノ酸ダイマーまたはＺ−ａｓｐアミノ酸ダイマーのペプチド結合と比べて、フラグメンテーションの傾向が少なく、ここで、Ｚは、任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏは、プロリンであり、ａｓｐは、アスパラギン酸であることを特徴とする混合物。
（項目９７）
少なくとも２種類の標識分析物を含む混合物であって、上記２種類の標識分析物の各々が上記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物
またはその塩を含み、
式中、
ａ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
ｂ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、
ｉ）上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの上記異なる標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、かつ
ｉｉ）上記リンカーは、少なくとも１種類の重原子同位体を含み、以下の式：
【化１０】
2010190902.tif 000014
を有し、
式中、Ｒ１は、同一または異なるものであり、１ないし８個の炭素原子を含むアルキル基とし、上記アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここで上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｃ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｄ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記分析物の原子との間の結合であることを特徴とする混合物。
（項目９８）
上記１種類以上の分析物がペプチドである、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目９９）
上記１種類以上の分析物がタンパク質である、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１００）
上記１種類以上の分析物が核酸分子である、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１０１）
上記レポーターが置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジン化合物、あるいはそれらの塩である、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１０２）
上記レポーターがカルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基含有化合物、あるいはそれらの塩である、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１０３）
上記リンカーがカルボニルまたはチオカルボニル基である、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１０４）
上記少なくとも２種類の標識分析物の各々が異性体的標識を含む、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１０５）
上記少なくとも２種類の標識分析物の各々が同重体的標識を含む、項目９３ないし９７のいずれか１項に記載の混合物。
（項目１０６）
上記少なくとも２種類の標識分析物の各々が、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して上記分析物が結合する置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環状窒素原子を有する５、６、または７員複素環である同重体的標識を含み、各々の異なる標識が１種類以上の重原子同位体を含む、項目１０５に記載の混合物。
（項目１０７）
上記混合物中の上記少なくとも２種類の同重体的標識分析物の各々が、以下の式：
【化１１】
2010190902.tif 000015
を含み、
式中、
ａ）Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり、
ｂ）各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり、
ｃ）Ｗは、上記環状窒素にオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、ＮＨ、Ｎ−Ｒ１、Ｎ−Ｒ２、Ｐ−Ｒ１、Ｐ−Ｒ２、Ｏ、またはＳであり、
ｄ）上記複素環の各炭素は、式ＣＪ２を有し、
ｅ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｆ）Ｒ２は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または上記試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、上記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目１０６に記載の混合物。
（項目１０８）
上記混合物が、以下の式：
【化１２】
2010190902.tif 000016
の１種類以上の同重体的標識分析物を含む、項目１０７に記載の混合物。
（項目１０９）
上記混合物が、以下の式：
【化１３】
2010190902.tif 000017
の１種類以上の同重体的標識分析物を含む、項目１０７に記載の混合物。
（項目１１０）
上記混合物が、以下の式：
【化１４】
2010190902.tif 000018
の１種類以上の同重体的標識分析物を含み、
式中、
ａ）Ｇ’は、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｂ）上記複素環の各炭素は式ＣＪ２を有し、ここで、各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｃ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目１０７に記載の混合物。
（項目１１１）
上記混合物が、以下の式：
【化１５】
2010190902.tif 000019
の１種類以上の同重体的標識分析物を含み、
式中、
ａ）Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり、
ｂ）各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｃ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目１０５に記載の混合物。
（項目１１２）
１種類以上の較正基準をさらに包含する、項目９３ないし９７のいずれかに記載の混合物。
（項目１１３）
Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して活性エステルのアルコール部分が結合する置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環状窒素原子を有する５、６、または７員複素環である活性エステル化合物であって、上記化合物が１種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされていることを特徴とする化合物。
（項目１１４）
上記化合物が３種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされている、項目１１３に記載の化合物。
（項目１１５）
上記複素環が１種類以上の置換基で置換されている、項目１１３に記載の化合物。
（項目１１６）
上記１種類以上の置換基がアルキル、アルコキシ、またはアリール基である、項目１１５に記載の化合物。
（項目１１７）
上記１種類以上の置換基が保護または非保護のアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基である、項目１１６に記載の化合物。
（項目１１８）
上記複素環が脂肪族である、項目１１３に記載の化合物。
（項目１１９）
上記複素環が芳香族である、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２０）
上記複素環が１個以上の付加的な窒素、酸素、またはイオウ原子を含む、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２１）
上記活性エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２２）
上記化合物が塩である、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２３）
上記化合物がモノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩、またはビスＨＣｌ塩である、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２４）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも８０％の同位体純度で存在する、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２５）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９３％の同位体純度で存在する、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２６）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９６％の同位体純度で存在する、項目１１３に記載の化合物。
（項目１２７）
以下の式：
【化１６】
2010190902.tif 000020
のＮ−置換モルホリン酢酸活性エステル化合物またはその塩であって、
式中、
ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含み、
ここで、上記Ｎ−置換モルホリン酢酸活性エステルが１種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされることを特徴とする化合物。
（項目１２８）
上記Ｎ−置換モルホリン酢酸活性エステルが３種類以上の重原子同位体でエンリッチされる、項目１２７に記載の化合物。
（項目１２９）
ＬＧが
【化１７】
2010190902.tif 000021
であり、ＸがＯまたはＳである、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３０）
ＬＧがＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３１）
各Ｚが別々に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３２）
各Ｚが別々に水素、メチル、またはメトキシである、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３３）
Ｘが１６Ｏまたは１８Ｏである、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３４）
上記モルホリンの環の窒素原子が１４Ｎまたは１５Ｎである、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３５）
以下の式：
【化１８】
2010190902.tif 000022
の上記化合物であり、
式中、
各Ｃ＊は、別々に１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３６）
上記化合物がモノＴＦＡ塩またはモノＨＣｌ塩である、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３７）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも８０％の同位体純度で存在する、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３８）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９３％の同位体純度で存在する、項目１２７に記載の化合物。
（項目１３９）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９６％の同位体純度で存在する、項目１２７に記載の化合物。
（項目１４０）
以下の式：
【化１９】
2010190902.tif 000023
のＮ−置換ピペリジン酢酸活性エステル化合物またはその塩であって、
式中、
ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含み、
ここで、上記Ｎ−置換ピペリジン酢酸活性エステルが１種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされることを特徴とする化合物。
（項目１４１）
上記Ｎ−置換ピペリジン酢酸活性エステルが３種類以上の重原子同位体でエンリッチされる、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４２）
ＬＧが
【化２０】
2010190902.tif 000024
であり、ＸがＯまたはＳである、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４３）
ＬＧがＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４４）
各Ｚが別々にて水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４５）
各Ｚが別々に水素、メチル、またはメトキシである、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４６）
Ｘが１６Ｏまたは１８Ｏである、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４７）
上記ピペリジンの環の窒素原子が１４Ｎまたは１５Ｎである、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４８）
以下の式：
【化２１】
2010190902.tif 000025
の上記化合物であり、
式中、
各Ｃ＊は、別々に１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む、項目１４０に記載の化合物。
（項目１４９）
上記化合物がモノＴＦＡ塩またはモノＨＣｌ塩である、項目１４０に記載の化合物。
（項目１５０）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも８０％の同位体純度で存在する、項目１４０に記載の化合物。
（項目１５１）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９３％の同位体純度で存在する、項目１４０に記載の化合物。
（項目１５２）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９６％の同位体純度で存在する、項目１４０に記載の化合物。
（項目１５３）
以下の式：
【化２２】
2010190902.tif 000026
のＮ−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物またはその塩であって、
式中、
ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含み、
ここで、上記Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステルが１種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされることを特徴とする化合物。
（項目１５４）
上記Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステルが３種類以上の重原子同位体でエンリッチされる、項目１５３に記載の化合物。
（項目１５５）
ＬＧが
【化２３】
2010190902.tif 000027
であり、ＸがＯまたはＳである、項目１５３に記載の化合物。
（項目１５６）
ＬＧがＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、項目１５３に記載の化合物。
（項目１５７）
各Ｚが別々に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である、項目１５３に記載の化合物。
（項目１５８）
各Ｚが別々に水素、メチル、またはメトキシである、項目１５３に記載の化合物。
（項目１５９）
Ｘが１６Ｏまたは１８Ｏである、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６０）
上記ピペラジンの環の各窒素原子が１４Ｎまたは１５Ｎである、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６１）
以下の式：
【化２４】
2010190902.tif 000028
の上記化合物であり、
式中、
各Ｃ＊は、別々に１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６２）
上記化合物がモノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩、またはビスＨＣｌ塩である、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６３）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも８０％の同位体純度で存在する、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６４）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９３％の同位体純度で存在する、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６５）
組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも９６％の同位体純度で存在する、項目１５３に記載の化合物。
（項目１６６）
ａ）セットの各々の試薬が、以下の式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはその塩を含む分析物の標識に適した２種類以上の試薬の上記セットと、
（式中、
ｉ）ＲＧは、求電子試薬である反応基であり、上記試料の１種類以上の上記反応性分析物と反応することが可能であり、
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、上記セットの各試薬に対して異なるものとし、
ｉｉｉ）ＬＫは、上記反応基と上記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、
ａ）上記リンカーの質量は、上記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が上記セットの各試薬に対して同じものであるように上記セットの異なる上記標識化試薬に対する上記レポーター間の総質量での差異を補正し、かつ
ｂ）上記リンカーは、少なくとも１種類の重原子同位体を含み、以下の式：
【化２５】
2010190902.tif 000029
を有し、
式中、Ｒ１は、同一または異なるものであり、１ないし８個の炭素原子を含むアルキル基とし、上記アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここで上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｉｖ）Ｘは、上記レポーターの原子と上記リンカーとの間の結合であり、
ｖ）Ｙは、上記リンカーの原子と上記反応基の原子との間の結合であり、ここで、上記標識化試薬が上記反応性分析物と反応したら、結合Ｙは上記分析物に上記リンカーを結合させる。）
ｂ）１種類以上の試薬、容器、酵素、緩衝剤、または指示書と、
を含む、キット。
（項目１６７）
上記キットがタンパク質分解酵素を含む、項目１６６に記載のキット。
（項目１６８）
上記セットの各試薬の上記反応基が活性エステルである、項目１６６に記載のキット。
（項目１６９）
上記活性エステルのアルコール部分が、以下の式：
【化２６】
2010190902.tif 000030
の基であり、式中、ＸはＯまたはＳである、項目１６８に記載のキット。
（項目１７０）
上記活性エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、項目１６８に記載のキット。
（項目１７１）
上記レポーターが置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジンである、項目１６６に記載のキット。
（項目１７２）
上記レポーターがカルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基を含む、項目１６６に記載のキット。
（項目１７３）
上記リンカーがカルボニルまたはチオカルボニル基である、項目１６６に記載のキット。
（項目１７４）
上記セットの各試薬が、別々に、切断可能なリンカーを介して固体支持体に結合する、項目１６６に記載のキット。
（項目１７５）
上記セットの全ての試薬が異性体的である、項目１６６に記載のキット。
（項目１７６）
上記セットの全ての試薬が同重体的である、項目１６６に記載のキット。
（項目１７７）
上記セットの全ての試薬が、以下の式：
【化２７】
2010190902.tif 000031
を含み、
式中、
ａ）ＲＧは、求電子試薬である反応基であり、
ｂ）Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり、
ｃ）各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｄ）Ｗは、上記環状窒素にオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、ＮＨ、Ｎ−Ｒ１、Ｎ−Ｒ２、Ｐ−Ｒ１、Ｐ−Ｒ２、Ｏ、またはＳからなる群から選択され、ｅ）上記複素環の各炭素は、式ＣＪ２を有し、
ｆ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、
ｇ）Ｒ２は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または上記試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、上記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに上記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目１７６に記載のキット。
（項目１７８）
上記セットが、以下の４種類の試薬、すなわち、
【化２８】
2010190902.tif 000032
の１種類以上を含み、式中、ＲＧは、上記反応基である、項目１７７に記載のキット。
（項目１７９）
上記セットが、以下の４種類の試薬、すなわち、
【化２９】
2010190902.tif 000033
の１種類以上を含み、式中、ＲＧは、上記反応基である、項目１７７に記載のキット。
（項目１８０）
上記セットが、以下の４種類の支持体結合試薬、すなわち、
【化３０】
2010190902.tif 000034
の１種類以上を含み、
式中、
ａ）ＲＧは、上記反応基であり、
ｂ）Ｅは、固体支持体であり、
ｃ）Ｆは、上記固体支持体へ結合される切断可能なリンカーであり、
ｄ）Ｇは、切断可能なリンカーに切断可能に結合させるアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、上記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに上記アルキルおよびアリール基の記炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、ｅ）上記複素環の各炭素は式ＣＪ２を有し、ここで、各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｆ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目１７７に記載のキット。
（項目１８１）
上記セットの全ての試薬が、以下の式：
【化３１】
2010190902.tif 000035
を含み、
式中、
ａ）ＲＧは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、
ｂ）Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり、
ｃ）各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
ｄ）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、上記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む、項目１７６に記載のキット。
（項目１８２）
上記セットが、以下の４種類の試薬、すなわち、
【化３２】
2010190902.tif 000036
の１種類以上を含み、式中、ＲＧは上記反応基である、項目１８１に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】図１Ａは、分析物と２種類の同重体的標識化試薬（例えば、化合物ＩおよびＩＩ）との反応を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示した標識分析物のフラグメンテーションを示すもので、該フラグメンテーションによって、同重体的標識分析物から異なる質量のレポーター部分（例えば、サイン・イオンとしての化合物ＶＩＩおよびＶＩＩＩ）が生成される。
【図２】図２は、標識分析物の質量スペクトル拡大プロットである。
【図３】図３は、図２の拡大プロットで同定された選択標識分析物の第２の質量分析から得られた完全な質量スペクトルである。
【図４】図４は、第２の質量分析で測定された分析物の優勢ｙイオン娘フラグメント・イオンの質量スペクトルの拡大プロットである。
【図５】図５は、第２の質量分析で測定された分析物の優勢ｂイオン娘フラグメント・イオンの質量スペクトルの拡大プロットである。
【図６】図６は、第２の質量分析で測定された２つのレポーター（すなわち、サイン・イオン）の質量スペクトルの拡大プロットである。
【図７】図７は、標識ペプチドの種々の混合物に対する第２の質量分析によって測定されたレポーターの観察対予測比のプロットであり、その混合物の各々のペプチドが２つの異なるレポーターのいずれか１つを含む。
【図８】図８は、同一の同位体（化合物Ｘ〜ＸＩＩＩ）と異なる同位体（化合物ＸＶ〜ＸＶＩＩＩ）とを用いた２通りの同重体的標識化試薬セットを示すもので、それによって、該セット内で総質量が異なるレポーター部分を有するが、同一総質量のレポーター／リンカー部分が達成される。
【図９Ａ】図９Ａは、元の出発原料から同位体標識ピペラジン標識化試薬を合成する合成経路を示す。この経路は、非同位体標識出発原料が用いられる非同位体標識ピペラジン試薬の調製に用いることもできる。
【図９Ｂ】図９Ｂは、元の出発原料から同位体標識ピペラジン標識化試薬を合成する合成経路を示す。この経路は、非同位体標識出発原料が用いられる非同位体標識ピペラジン試薬の調製に用いることもできる。
【図１０】図１０は、元の出発原料から同位体標識Ｎ−アルキル・ピペラジン標識化試薬および非同位体標識Ｎ−アルキル・ピペラジン標識化試薬を合成する合成経路を示す。
【図１１】図１１は、元の出発原料から同位体標識Ｎ−アルキル・ピペラジン標識化試薬および非同位体標識Ｎ−アルキル・ピペラジン標識化試薬を合成する合成経路を示す。
【図１２】図１２は、出発原料から同位体標識ピペラジン標識化試薬および非同位体標識ピペラジン標識化試薬を合成する固相をベースとした合成経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
（４．本発明の種々の実施形態の説明）
（Ａ．方法）
本発明の方法によれば、測定すべき分析物を標識する。標識分析物、分析物それ自体、分析物の１つ以上のフラグメントおよび／または標識のフラグメントを、質量分析によって測定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２種類以上の異なる試料に含まれる複数の同一および／または異なる分析物の多重化分析のためにと同様に、同一試料に含まれる複数の異なる分析物の分析のために、用いられる。２種類以上の試料を混合して、１つの試料混合物とすることができる。多重化分析では、標準化試料を用いて、試料混合物のどの試料から分析物が由来するかを測定することができる。分析物の絶対および／または相対（異なる試料に含まれる同一の分析物に関して）量（しばしば濃度または分量で表される）を、試料混合物を形成するために組み合わされた２種類以上の試料で、測定することができる。さらに、分析物のフラグメント（例えば、娘フラグメント・イオン）の質量分析は、分析物および／または該分析物に対する前駆体の同定（例えば分析物に対する前駆体が分解された場合）に用いられる。
【００７２】
記載されたアプローチの特徴の１つは、異なる試料からの複数の分析物が、化学的異性体または同重体（等しい質量を持つ）的でありかつ分析物が由来する試料を同定する固有の標識による差異的に同位体標識（すなわち、同位体によるコード化）されうるという事実にある。差異的標識分析物は、ＭＳモードの質量分析計では区別がつかない。なぜなら、該差異的標識分析物はすべて同一の（総）質量電荷比を持つからである。しかし、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）を介して、解離エネルギー・レベルを受けた場合、標識がフラグメント化して、質量分析計で質量（質量電荷比）により分解しうる固有のレポーターを生ずることができる。質量スペクトルで観察されたレポーターの相対量と、試料混合物に含まれる標識分析物の相対量、また含蓄的に、分析物が由来する試料に含まれる該分析物の量とを、相関させることができる。したがって、レポーター（すなわち、サイン・イオン）の相対的強度を用いて、試料混合物を形成するために組み合わさった２種類以上の試料に含まれる１種類の分析物または複数の分析物の相対量を測定することができる。
【００７３】
レポーター情報から、２種類以上の試料に含まれる１つの分析物または複数の分析物の絶対量（しばしば濃度および／または分量で表される）を、絶対的定量化が望まれる各々の分析物に対する較正基準が試料混合物に取り込まれる場合、誘導することができる。
【００７４】
例えば、分析物は、試料を処理するために酵素の消化反応を使用しているタンパク質の分解から生じたペプチドであってもよい。タンパク質分解は、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣ）で試料を処理することで達成することができる。試料混合物に含まれるペプチドの同一性および量を測定することで、またそれが由来する試料を同定することで、任意にその試料から得た他のペプチドの測定と結びつけて、分解ペプチドに対する前駆体タンパク質を、それが由来する試料について、同定および／または定量することができる。この方法は複数の試料（すなわち、試料混合物から）でのタンパク質の多重測定を可能とすることから、多重方法である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、１種類以上の反応性分析物を各々が含む２種類以上の試料の各々を、標識化試薬セットの異なる標識化試薬と反応させる工程を含み、上記標識化試薬セットの異なる標識化試薬の各々が式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧを有する方法に関する。その結果、各試料の１種類以上の分析物が、異なる標識化試薬の各々の求電子性または求核性の反応基（ＲＧ）と分析物の求核試薬または求電子試薬との反応によって、「ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−」部分により標識される。この標識化プロセスによって、各々が１種類以上の標識分析物を含む２種類以上の差異的標識試料が生成される。上記セットの標識化試薬を、異性体的または同重体的なものにすることができる。各標識化試薬のレポーターを、各標識分析物が由来する試料によって同定することができ、またそのことにより、該試料を同定するために使うことができる。
【００７６】
ＲＧは反応基であり、その特性はすでに記載されている。ＲＰはレポーター部分であり、その特性はすでに記載されている。上記セットの各々の試薬に関して、各レポーターの総質量が異なる。ＬＫはリンカー部分であり、その特性はすでに記載されている。リンカーの総質量は、レポーター／リンカー組み合わせの統合総質量が上記セットの各試薬について同一であるように、異なる標識化試薬に対するレポーター間の総質量における差異を補正することができる。Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子とのあいだの結合である。Ｙは、リンカーの原子と反応基とのあいだの結合である（または分析物との反応後、Ｙはリンカーの原子と分析物の原子とのあいだの結合である）。結合ＸおよびＹは、質量分析計で解離エネルギー・レベルを受けた場合、標識分析物の少なくとも一部分でフラグメント化する。結合ＸおよびＹの特徴はすでに説明されている。
【００７７】
ひとたび各々の試料の分析物が、該試料に固有の標識化試薬によって標識されると、２種類以上の異なる標識試料またはその一部分を混合して試料混合物を生成することができる。定量化が必要な場合、該試料混合物を生成するために組み合わされた各々の試料の容積および／または分量を記録することができる。試料混合物の全試料容積および／または分量に対する各試料の容積および／または分量は、試料混合物の分析から得た各試料に含まれる同定された分析物の量（しばしば濃度および／または分量として表される）を測定するために必要な比の測定に用いることができる。したがって、試料混合物は複合混合物を含むことができ、同一および／または異なる分析物の相対量を、２種類以上の試料の各々に含まれる分析物の量を相対的に定量すること、または較正基準も試料混合物に加えて絶対的に定量することのいずれかによって、同定および／または定量化することができる。
【００７８】
次に、混合物をスペクトロメトリー技術にかける。この技術では、第１の質量分析計を用いて、第１の質量分析を試料混合物またはそのフラクションに対して実行することができる。第１の質量分析から得た特定の質量電荷比のイオンを、次に選択することができる。続いて、選択されたイオンを解離エネルギー・レベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））にさらして、選択されたイオンのフラグメンテーションを誘導する。特定の質量電荷比の、標識分析物の、選択されたイオンを、解離エネルギー・レベルにさらすことで、結合ＸおよびＹの両方が、選択されたイオンの少なくとも一部分でフラグメント化することができる。結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションは、荷電またはイオン化したレポーターを分析物から離すととともに、レポーター／リンカー部分のフラグメンテーションを引き起こすことができる。解離エネルギー・レベルにさらされたイオンもまた、分析物のフラグメンテーションを引き起こすことができ、それによって分析物の娘フラグメント／イオンを生成する。イオン（残留の選択されたイオン、娘フラグメント・イオン、または荷電もしくはイオン化レポーター）、あるいはそのフラクションを、第２の質量分析計に向けることができる。
【００７９】
第２の質量分析計では、第２の質量分析が選択されたイオンおよびそのフラグメントに対して実行される。第２の質量分析は、試料混合物の少なくとも１つの反応性分析物の娘フラグメント・イオンの総質量と同様に、選択された質量電荷比で存在する各々の固有のレポーターの総質量（またはｍ／ｚ）および相対量を測定することができる。選択された質量電荷比で存在する各分析物について、娘フラグメントイオンを用いて、選択された質量電荷比で存在する１種類の分析物または複数の分析物を同定することができる。例えば、この分析は、すでに「コンピュータ支援データベース分析よる分析物測定」と題されたセクションで説明されたように、おこなうことができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、プロセスのいくつかの工程を１回以上繰り返すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、すでに選択されたいずれの質量電荷比とも異なる、第１の質量分析による分析から選択された質量電荷比のイオンは、解離エネルギー・レベルに対して処理され、すでに説明したように、選択されたイオンの少なくともいくつかのイオン化娘フラグメント・イオンとイオン化レポーター部分とが形成される。選択されたイオン、イオン化したレポーター部分、および娘フラグメント・イオン、またはそれらのフラクションの第２の質量分析を実行することができる。第２の質量分析での各レポーター部分の総質量および相対量と娘フラグメント・イオンの総質量とを測定することもできる。このように、この情報を、第１の質量分析から１種類以上の別の分析物を同定および定量化することに利用することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、プロセス全体を１回以上繰り返すことができる。例えば、試料混合物がフラクション化した場合（例えば、クロマトグラフィーまたは電気泳動によって分離）、プロセスを１回以上繰り返すことが有用であると思われる。各試料に対してプロセスを繰り返すことで、試料混合物全体のすべてを分析することが可能である。いくつかの実施形態で、プロセス全体が１回以上繰り返され、これらの繰り返しの各々の範囲内で、特定の工程も上記したように１回以上繰り返されることが、考えられる。このようにして、試料混合物の含有量を問い合わせ、可能な限り十分な範囲で測定することができる。
【００８２】
質量分析の当業者は、第１および第２の質量分析がタンデム質量分析計で実行できることを理解する。タンデム質量分析を実行する上で適当な機器は、本明細書ですでに説明されている。タンデム質量分析計が好ましいが、１段質量分析計を用いてもよい。例えば、分析物フラグメンテーションは、コーン電圧フラグメンテーションの結果であり得、続いて得られたフラグメントを１段四重極もしくは飛行時間型質量分析計を用いて質量分析する。別の実施例では、レーザ源を用いて分析物を解離エネルギー／レベルにさらすことが可能であり、その結果得られたフラグメントは、時間飛行またはタンデム時間飛行（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計でのポスト・ソース分解後に記録されうる。
【００８３】
先に開示した多重方法にもとづくと、いくつかの実施形態で、結合Ｘは、分析物の結合（例えば、ペプチド骨格にあるアミド（ペプチド）結合）のフラグメンテーションと比較して、フラグメンテーションする傾向がより高い、もしくは低い、または実質的に等しい。いくつかの実施形態で、結合Ｙは、分析物の結合（例えば、ペプチド骨格にあるアミド（ペプチド）結合）のフラグメンテーションと比較して、フラグメンテーションする傾向がより高い、もしくは低い。いくつかの実施形態で、上記セットの各試薬に対するリンカーは、結合ＸおよびＹのフラグメンテーション後に電荷が中性である（すなわち、リンカーがフラグメント化して質量のニュートラル・ロスを生じ、そのためＭＳ／ＭＳスペクトルでは観察されない）。さらにいくつかの別の実施形態では、結合ＸおよびＹの位置は、１つのセットの複数の標準化試薬内で、１つの混合物の複数の標識分析物内で、あるいは１つのキットの複数の標識化試薬内で、変化しない。さらにいくつかの別の実施形態では、上記セットの各試薬に対するレポーターは、分析物（例えば、ペプチド骨格のアミド（ペプチド）結合）をフラグメント化するのに用いられる条件下では、実質的にサブ・フラグメント化しない。さらにいくつかの他の実施形態では、結合Ｘは、結合Ｙと比較してフラグメンテーションする傾向が少ない。さらにいくつかの他の実施形態では、結合Ｙは、結合Ｘと比較して、フラグメンテーションする傾向が少ない。いくつかの別の実施形態では、結合ＸおよびＹは、おおよそ同一の不安定性を持つものであり、さもなければ、結合ＸまたはＹの一方のフラグメンテーションが結合ＸまたはＹの他方のフラグメンテーションを含むようにして、選択される。標識分析物のＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−部分に対する基の別の特性は、すでに説明されている。
【００８４】
いくつかの実施形態で、各同重体的標識分析物の標識は、環窒素原子を含む５、６、または７員複素環であり、該環窒素原子は置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化されており、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して分析物が結合する。ここで、各々の異なる標識は１種類以上の重原子同位体を含むことができる。複素環は置換されていても非置換であってもよい。複素環を脂肪族または芳香族とすることができる。複素環部分の可能な置換基として、アルキル、アルコキシ、およびアリール基が挙げられる。置換基は、分析物を支持体に結合させるのに適している、保護された基または保護されていない基、例えば、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含むことができる。複素環は、さらに、１つ以上の窒素、酸素、またはイオウ原子等のヘテロ原子を含むことができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、試料混合物に含まれる標識分析物を同重体とすることができ、各々が以下の一般式を持つ。すなわち、
【００８６】
【化３５】
2010190902.tif 000037
式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり；各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり；Ｗは、環窒素に対してオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、ＮＨ、Ｎ−Ｒ１、Ｎ−Ｒ２、Ｐ−Ｒ１、Ｐ−Ｒ２、Ｏ、またはＳであり；複素環の各炭素は、式ＣＪ２を有し；各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含む炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合された水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み；さらに、Ｒ２は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含むものであってもよく、さらにアルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合された水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む。
【００８７】
例えば、試料混合物が以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。
【００８８】
【化３６】
2010190902.tif 000038
式中、炭素１３および酸素１８の同位体は、異なる標識化試薬のモルホリン・レポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。
【００８９】
この一般的構造の標識分析物を生成するのに適したモルホリン標識化試薬は、多数の合成経路によって調製することができる。例えば、同位体で標識されたモルホリン化合物または同位体で標識されていないモルホリン化合物が、実施例１に記載したように、同位体標識したブロモ酢酸化合物または同位体で標識されていないブロモ酢酸化合物と反応させられうる。同様に明らかであることは、環置換モルホリンおよび／または置換ブロモ酢酸出発原料もまた、過度の実験を行うことなしに（上記した方法または当業者に周知の他の方法に対してほとんどまたはまったく変化を加えることなく）、当業者によって選択かつ使用され、それによってモルホリンをベースとする種々の異なる標識化試薬を生成することができ、該標識化試薬は重原子同位体含有量が異なり（すなわち、同位体的にコード化された）、本発明のセットまたはキットに用いることができるということである。
【００９０】
モルホリンの代わりに、所望の同位体的分布の置換または非置換ピペリジンを選択することが可能である。ピペリジンを選択した場合、同位体Ｄ（重水素）、１３Ｃ、または１５ＮがＨ、１２Ｃ、および１４Ｎとそれぞれ置換することができ、ピペリジンの場合に１８Ｏが環原子として用いられないことを除いて、モルホリンについて説明した場合と類似の方法で、標識化試薬のセットの試薬の総質量を変えるために用いることができる。典型的なピペリジン合成は、任意に同位体的にエンリッチされた出発原料を用いるもので、実施例６に記載されている。
【００９１】
試料混合物は、以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。
【００９２】
【化３７】
2010190902.tif 000039
式中、炭素１３、酸素１８，および窒素１５の同位体は、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。この一般的構造の標識分析物を生成するのに適したピペラジン標識化試薬は、多数の合成経路によって調製することができる。例えば、重または軽ピペラジン化合物を、実施例７に記載したように、重または軽標識ブロモ酢酸化合物と反応させることができる。図９Ａおよび９Ｂは、容易に入手可能な重または軽出発材料を用いた同位体的にエンリッチされたピペラジンに対する２つの異なる合成経路を示す。
【００９３】
特に図９Ａを参照すると、２当量の１５Ｎ標識グリシン１を縮合してビス−同位体標識ジ・ケト・ピペラジン２（図中、同位体標識は＊で示す）を形成することができる。次に、ジ・ケト・ピペラジン２を還元して同位体標識ピペラジンとする。同位体標識ピペラジンをブロモ酢酸と反応させ、実施例７に示すように、活性エステル３に変換させる。
【００９４】
特に図９Ｂを参照すると、ビス−１５Ｎ−標識エチレンジアミン４をシュウ酸５と縮合させて、ビス−同位体標識ジ・ケトピペラジン６とすることができる（図中、同位体標識は＊で示す）。次に、ジ・ケトピペラジンを還元して同位体標識ピペラジンにすることができる。さらに、同位体標識ピペラジンをブロモ酢酸と反応させて、実施例７に示すように、活性エステル３に変換させる。
【００９５】
同様に明らかであることは、環置換ピペラジンを、適当に置換された出発原料を単に選択することで、上記方法を用いて作ることができるということである。適切な場合は、置換ブロモ酢酸（重または軽のいずれか）を同様に用いることができる。重（ｈｅａｖｙ）とは、１つ以上の重原子同位体によって化合物が同位体的にエンリッチされていることを意味する。軽（ｌｉｇｈｔ）とは、同位体的にエンリッチされていないことを意味する。
【００９６】
したがって、適当に置換した出発原料を選択することで、本発明のセットで用いることができる種々の異なるピペラジン系標識試薬が生成できる。
【００９７】
例えば、試料混合物は、以下の式で表される１種類以上の同重体標識分析物を含むことができる。すなわち、
【００９８】
【化３８】
2010190902.tif 000040
式中、炭素１３、酸素１８，および窒素１５の同位体は、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。ここで、（１）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合された水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み；また（２）各Ｋは、別々に、水素またはアミノ酸側鎖として選択される。この一般構造の標識分析物を生成するのに適した置換ピペラジン標識化試薬は、多くの合成経路によって調製することができる。
【００９９】
例えば、図１０を参照すると、Ｎ−アルキル置換ピペラジン試薬を、図示した手順にもとづいて合成することができる。ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）保護グリシン１０をＮ−メチル−グリシン１１のエステル（例えば、エチルエステル）と縮合させることで、ｔ−ｂｏｃ保護グリシン−Ｎ−メチル−グリシン二量体１２のエステルを形成することができる。次に、ｔ−ｂｏｃ保護基を除去してグリシン二量体１２を環状化し、その後に縮合をおこない、Ｎ−メチル−ジ−ケトピペラジン１３の酸塩を形成することができる。１３の酸塩を中和および還元してＮ−メチル−ピペラジン１４を形成する。次に、Ｎ−メチル−ピペラジン１４をブロモ酢酸１５（またはその置換バージョン）と反応させ、実施例７に示すように、活性エステル１６に変換することができる。
【０１００】
明らかであることは、環置換ピペラジンを、グリシン以外のアミノ酸またはＮ−メチルアミノ酸（またはそのエステル）（例えば、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸等）を単に選択することで、上記方法を用いて作ることができるということである。同様に明らかであることは、アミノ酸を、同重体的標識化試薬のセットを調製するために必要な同位体の所望の分布を持つ環置換ピペラジンの調製に適した方法で、同位体標識することができるということである。
【０１０１】
Ｎ−アルキル置換ピペラジン試薬は、さらに別の図示した手順によって調製することができる。図１１を参照すると、グリシンメチルエステル２１をブロモ酢酸２２のエチルエステルと反応させて、ジエチルイミノジアセテート２３を形成することができる。ジエチルイミノジアセテート２３のジエステルを、適当な試薬（例えば、塩化チオニル）処理によって、二酸塩化物２４に変換することができる。次に、二酸塩化物２４を、例えば、アルキルアミン（例えば、メチルアミン）と反応させて、Ｎ−アルキル−ジ−ケトピペラジン２５を形成することができる。次に、Ｎ−アルキル−ジ−ケトピペラジン２５を還元してＮ−アルキル−ピペラジン２６を形成することができる。次に、Ｎ−アルキル−ピペラジンをブロモ酢酸と反応させて、実施例７に示すように、活性エステル２７に変換することができる。
【０１０２】
明らかであることは、環置換ピペラジンを、グリシン以外のアミノ酸（例えば、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸等）のエステルまたはブロモ酢酸の置換バージョンを単に選択することで、上記方法を用いて作ることができるということである。同様に明らかであることは、アミノ酸ならびにブロモ酢酸（およびその置換誘導体）を、同重体的標識化試薬のセットを調製するために必要な同位体の所望の分布を持つ環置換ピペラジンの調製に適した方法で、同位体標識することができるということである。さらに明らかであることは、アルキルジアミン、ヒドロキシルアルキルアミン、またはチオアルキルアミン、あるいはそれらの同位体標識されたバージョンを、アルキルアミンの代わりに選択することは、以下にさらに詳細に説明するように、支持体結合標識化試薬を生成するために用いることができるということである。
【０１０３】
方法のさらに別の実施形態では、試料混合物の標識分析物は同重体であり、各々が以下の式から構成される。すなわち、
【０１０４】
【化３９】
2010190902.tif 000041
式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり；各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され；各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含む炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合された水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む。
【０１０５】
例えば、試料混合物は、以下の式で表される２種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１０６】
【化４０】
2010190902.tif 000042
式中、炭素１３および酸素１８の同位体は、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。この一般構造の標識分析物を生成するのに適した置換標識化試薬を、実施例８に記載した一般プロセスによって調製することができる。
【０１０７】
本発明のさらに別の実施形態では、標識化試薬のセットまたはキットを構成する各々の異なる標識化試薬が、各々の異なる試料が、異なる標識化試薬を担持する支持体と反応することができるように、切断可能なリンカーを介して支持体に結合することができる。いくつかの実施形態では、支持体は、それ自体、反応性分析物の標識化に用いられる。いくつかの実施形態では、標識化試薬を支持体から取り除き、いくつかの場合ではそれに続く加工の後（例えば、反応基の保護）、反応性分析物の標識化に用いることができる。
【０１０８】
いくつかの実施形態にもとづくと、試料の分析物が固体支持体と反応することができ（各々の試料が、異なる固形の支持体と、したがって異なるレポーターと反応を起こす）、反応基と反応しない試料の樹脂結合構成要素を任意に洗い流すことができる。次に、１種類の標識分析物または複数の標識分析物を、切断可能なリンカーが切断される条件下で支持体を処理することで、各固体支持体から除去し、それによって該支持体からレポーター／リンカー／分析物複合体を放出することができる。各支持体は、切断可能なリンカーを切断することによって２種類以上の異なる試料が得られる条件下で同様に処理することができるので、各々の試料が１種類以上の標識分析物を含んでいる。ここで、特定の試料に対応づけられた標識分析物は、それに結合した固有のレポーターによって同定および／または定量化される。次に、すでに述べたように、回収された試料を混合して試料混合物を形成することができる。
【０１０９】
例えば、すでに述べた方法で用いるセットの各々の異なる標識化試薬を、式：Ｅ−Ｆ−ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの固体支持体とすることができる。式中、ＲＧ、Ｘ、Ｙ、ＲＰ、およびＬＫについてはすでに説明している。Ｅは固体支持体であり、またＦはレポーターに対して切断可能に結合し、かつ該固体支持体に結合した切断可能なリンカーである。この一般式の支持体は、実施例９に記載したように、調製することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態で、支持体結合標識化試薬のセットは、標識Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン誘導体、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン誘導体、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体をベースとすることができる。重および軽ピペラジン誘導体の両方を調製することができる。標識Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン誘導体、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン誘導体、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体は、例えば、Ｎ−アルキルアミンとしてアルキルジアミン、チオアルキルアミン、またはヒドロキシアルキルアミンにより開始される図１１に示した手順を用いて、形成することができる（図１１の議論を参照のこと。上記）。アルキルジアミン、チオアルキルアミン、またはヒドロキシアルキルアミンは、所望のＮ−（アミノアルキル）ピペラジン誘導体、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン誘導体、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体の合成にとって適当である場合に、重または軽である。Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン誘導体、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン誘導体、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体のアミノ、ヒドロキシル、またはチオール基を必要に応じて保護することができる。アルキルジアミン、チオアルキルアミン、またはヒドロキシアルキルアミンを用いる場合、ピペラジンは、Ｎ−アミノアルキル、Ｎ−チオアルキル、またはＮ−ヒドロキシアルキル部分を含むことができる。ここで、この部分のアミノ、ヒドロキシル、またはチオール基を支持体上の切断可能なリンカーと反応させることで、Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン誘導体、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン誘導体、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体から調製したピペラジンを切断可能なかたちで支持体に結合させることができる。
【０１１１】
標識化試薬を含む支持体を、いくつかの方法のいずれかによって調製することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジンのアミノ、ヒドロキシル、またはチオール基を、適当な支持体の切断可能なリンカーと反応させることができる。切断可能なリンカーは、「立体的に込み合った切断可能なリンカー（ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」（実施例９を参照）である。ピペラジンを、標識化試薬のセットに求められる標識化試薬の性質に依存して、同位体標識または非同位体標識ハロ酢酸（置換または非置換）と、反応させることができる。その後、カルボン酸を活性エステルに変換することができる。活性エステルは、試料の分析物と反応して、支持体の標識化試薬によって分析物を標識することができる。切断可能なリンカーが切断されると、支持体から標識分析物が放出される。このプロセスは、標識化支持体のセットを構成する異なる支持体を調製するために、固有のピペラジンをベースとした標識化試薬により、繰り返される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジンは、同位体標識または非同位体標識されたハロ酢酸（置換または非置換）、もしくはそのエステルと最初に反応することができる。好ましくは、Ｎ−（アミノアルキル）ピペラジン、Ｎ−（チオアルキル）ピペラジン、またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジンのアミノ、ヒドロキシル、またはチオール基を、適当な保護試薬によって保護することができる（適当な保護基のリストについては、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９を参照のこと）。結果として得られるビス−アルキル化ピペラジンの保護されていないアミノ、チオール、またはヒドロキシル基は、次に適当な支持体の切断可能なリンカーと反応することができる。その後、カルボン酸が活性エステルに変換される。もしハロ酢酸化合物がエステルであったら、該エステルを活性エステルへの変換前に鹸化することができる。活性エステルを、試料の分析物と反応させて、支持体の標識化試薬で分析物を標識することができる。切断可能なリンカーが切断されると、支持体から標識分析物が放出される。このプロセスは、標識化支持体のセットを構成する異なる支持体を調製するために、固有のピペラジンをベースとした標識化試薬により、繰り返される。
【０１１３】
したがって、いくつかの実施形態では、標識化試薬のセットは１種類以上の以下の支持体結合標識試薬を含むことができる。すなわち、
【０１１４】
【化４１】
2010190902.tif 000043
式中、ＲＧ，Ｅ、およびＦについては、すでに説明されている。本方法によれば、Ｇはアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、切断可能なリンカーに対して切断可能に結合しており、ここで、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、１ないし８個の炭素原子を含み、ヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここでアルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む。複素環の各炭素は、式ＣＪ２を有し、各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり、各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含む炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合された水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、標識分析物は、切断可能なリンカーを介して支持体と切断可能に結合した標識化試薬を含む支持体に、分析物を最初に反応させて、該標識分析物を支持体から切断することで、生成することができる。したがって、試料混合物は、以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１１６】
【化４２】
2010190902.tif 000044
式中、Ｇ’は、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素および／または重水素を含む。複素環の各炭素は式ＣＪ２を有し、ここで、各Ｊは、同一または異なるものであり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択される。各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含む。ここで、アルキルアミン基、ヒドロキシアルキル基、またはチオアルキル基を、固体支持体の切断可能なリンカーに結合した部分とすることができる。各切断反応の産物を結合させて、本明細書に記載の方法による標識分析物の分析に適した試料混合物を生成することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料の分析物を標識する前に、少なくとも１種類の酵素によって、各試料を消化し、該試料の構成要素を部分的または完全に分解する工程を、さらに含むことができる（「試料加工」と題された上記セクションも参照のこと）。例えば、酵素を、プロテアーゼ（タンパク質およびペプチドを分解するため）またはヌクレアーゼ（核酸を分解するため）とすることができる。また、複数の酵素を一緒に用いることで、試料構成要素を分解してもよい。酵素を、タンパク質分解酵素、例えばトリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣとすることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の質量分析の実施に先立って、試料混合物を分離する工程を、さらに含むことができる（「試料混合物の分離」と題された上記セクションも参照のこと）。このようにして、第１の質量分析は、試料混合物のフラクションのみで実行される。任意の分離方法で、上記分離を実施することができ、該分離方法として、クロマトグラフィーまたは電気泳動が挙げられる。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、そのような試料分離および質量分析をおこなうことができる。さらに、目的とする分析物を分離するのに適した任意のクロマトグラフィー分離プロセスを用いることができる。本明細書では、適当なクロマトグラフィーおよび電気泳動分離プロセスの非限定的例を説明している。
【０１１９】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、試料構成要素を分解する酵素処理および分離工程の両方を含むことができる。
【０１２０】
すでに説明したように、娘フラグメント・イオンの総質量を分析することで、選択されたイオンが対応づけられた分析物を測定することが可能である。そのような測定方法の一つは、「コンピュータ支援データベース分析による分析物測定」と題されたセクションで説明されている。ひとたび分析物が測定されると、第２の質量分析での各レポーター部分の総質量および相対量と娘フラグメント・イオンの総質量とに関する情報が、試料混合物に関する他の情報を判断する基礎を提供する。レポーターの量を、質量スペクトルでのピーク強度によって測定することができる。いくつかの実施形態では、質量分析計を用いて得られるレポーター（サイン・イオン）シグナルのピーク高さまたはピーク幅の分析よって、レポーター量を測定することができる。各試料を異なる標識化試薬で標識することができ、また各標識化試薬が特定の試料と相関することができる固有のレポーターを含むことができることから、第２の質量分析での異なるレポーターの測定が、選択された分析物のイオンが由来する試料を同定する。多数のレポーターが見つかる場合（例えば、本発明の多重方法にもとづく）、他のレポーターに関する各レポーターの相対量を決定することができる。第２の質量分析で測定された各レポーターの相対量は、試料混合物に含まれる分析物の相対量と相関するので、試料混合物を形成するために組み合わさった各試料での分析物の相対量（しばしば濃度および／または分量で表される）を測定することができる。必要に応じて、レポーターに対応づけられたピーク強度の補正は、先に述べたように、自然に生ずる、または人工的に生成される同位体存在度について、実施することができる。より具体的には、試料混合物に結合される各試料の容積および／または分量が知られている場合、各試料の相対量（しばしば濃度および／または分量として表される）を、第２の質量分析で測定された各レポーターの相対量に基づいて計算することができる。この分析は、異なる質量電荷比の選択されたイオンに対して１回以上繰り返され、それによって、組み合わさって試料混合物を形成する各試料に含まれる１種類以上の別の分析物の相対量を得ることができる。必要に応じて、レポーターに対応づけられたピーク強度の補正は、天然に生ずる、または人工的に生成した同位体存在度について、実行される。
【０１２１】
あるいは、選択された質量電荷比を持つ分析物に結合した固有のレポーターを含む較正基準が既知量（しばしば濃度／または分量として表される）で試料混合物に加えられる場合、較正基準に対応づけられた固有のレポーターの量は、組み合わさって試料混合物を形成する各試料の分析物の絶対量（しばしば濃度および／または分量として表される）を決定するために用いることができる。このことは可能である。なぜなら、較正基準用のレポーターに対応づけられた分析物の量が知られており、また他のレポーターのすべての相対量を、選択されたイオンに対応づけられた標識分析物に対して、測定することができるからである。固有のレポーター（較正基準用のレポーターを含む）の各々に対して測定されたレポーターの相対量が、組み合わさって試料混合物を形成する各試料に対応づけられた分析物の量に比例することから、各々の試料に含まれる分析物の絶対量（しばしば濃度および／または分量として表される）を、試料混合物を生成するために用いられる処方に対して計算された比率に応じて、測定することができる。必要に応じて、レポーターに対応づけられたピーク強度の補正は、天然に生じる、または人工的に生成した同位体存在度について、実行される。
【０１２２】
この分析を、異なる質量電荷比の選択されたイオンに対して１回以上繰り返すことで、組み合わさって試料混合物を形成する各々の試料に含まれる１種類以上の別の分析物の絶対量を得ることができる。必要に応じて、レポーターに対応づけられたピーク強度の補正は、天然に生じる、または人工的に生成した同位体存在度について、実行される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、上記方法は、消化および／または分離工程を伴っておこなうことができる。いくつかの実施形態で、消化および／または分離工程を含む、または含まない方法の工程を１回以上繰り返して、１つの試料に含まれる１種類以上の他の分析物あるいは２つ以上の試料（支持体結合標識化試薬で標識された試料を含む）に含まれる１種類以上の分析物を同定および／または定量することができる。較正基準が特定の分析物の試料混合物に存在するか否かに応じて、定量が他の標識分析物に対して相対的でありうるか、またはそれが絶対的でありうる。そのような分析方法は、１つの複雑な性質の多重試料のプロテオミックス分析にとって特に有用であり、特に標識分析物の予備的分離（例えば、液体クロマトグラフィーまたは電気泳動分離）が第１の質量分析に先立つ場合である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、試料または試料混合物に含まれるペプチドを分析物とすることができる。試料または試料混合物に含まれるペプチドの分析は、試料または試料混合物に含まれる識別可能なタンパク質の量（しばしば濃度および／または分量として表される）を測定するために用いられ、１種類以上の試料に含まれるタンパク質が第１の質量分析に先立って分解される。さらに、異なる試料から得た情報を、測定をおこなうために、例えば細胞増殖に影響する可能性のある物質の濃度を変えて培養する細胞内のタンパク質の量に対する効果の比較のために、比較することができる。他の非限定的例として、罹患または健康な組織または細胞培養物の発現タンパク質成分の比較が挙げられる。このことは、細菌もしくはウイルス等の病原体または他の疾患状態（例えば癌）等による感染後、細胞、組織、または生物学的液体の発現タンパク質レベルの比較を包含することが可能である。他の例では、時間経過（経時変化）に伴ったタンパク質濃度の変化に関する研究をおこなって、細胞または組織の発現タンパク質成分に対する薬物療法の効果を調べることが可能である。さらに別の例では経時的に採取された異なる試料から得られる情報を用いて、疾患（例えば、癌）または感染の結果としての、組織、器官、または生物学的液体中の特定のタンパク質の濃度を、検出および監視することが可能である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、分析物は試料または試料混合物に含まれる核酸フラグメントである。核酸フラグメント上の情報は、試料または試料混合物に含まれる識別可能な核酸分子の量（しばしば濃度および／または分量として表される）を決定するために、用いられ、該試料を第１の質量分析に先立って分解した。さらに、異なる試料から得た情報は、上記したように測定をおこなう目的で比較することができる。
【０１２６】
（Ｂ．混合物）
いくつかの実施形態では、本発明は混合物（すなわち、試料混合物）に関する。混合物は、少なくとも２種類の差異的標識分析物を含むことができ、これら２種類の標識分析物の各々は異なる試料から生ずることができ、また式ＲＰ−Ｘ−ＬＫーＹ−分析物を有する。各々の異なる標識について、混合物の標識分析物のいくつかが同一であり、該標識分析物のいくつかが異なる。原子、部分または結合、Ｘ、Ｙ、ＲＰ、およびＬＫについては、すでに説明されており、またそれらの特性が開示された。混合物は、２種類以上の標識化反応の産物のすべてまたは一部を混合することによって、形成される。ここで、各標識化反応では、一般式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの異なる標識化試薬が用いられ、式中、原子、部分、または結合Ｘ、Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧについてはすでに説明されており、またそれらの特性が開示されている。標識化試薬は、同位体的にコード化された異性体的または同重体的標識化試薬である。各々の異なる標識化試薬の固有のレポーターは、２種類以上の標識分析物の各々がどの標識反応に由来するかについて指示することができる。標識化試薬は、異性体的または同重体的である。それゆえ、混合物の２種類以上の標識分析物は、異性体的または同重体的である。上記方法のいずれかに開示されるように、混合物は試料混合物である。それらの方法に対応づけられた標識化試薬および標識分析物の特性はすでに述べられている。
【０１２７】
混合物の分析物をペプチドとすることができる。混合物の分析物をタンパク質とすることができる。混合物の分析物をペプチドおよびタンパク質とすることができる。混合物の分析物を核酸分子とすることができる。混合物の分析物を炭水化物とすることができる。混合物の分析物を脂質とすることができる。混合物の分析物をステロイドとすることができる。混合物の分析物を１，５００ダルトン未満の低分子とすることができる。混合物の分析物は、２種類以上の分析物種を含む。分析物種は、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、および／または１，５００ダルトン未満の低分子から選択される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、各同重体的標識分析物の標識が、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して分析物が結合する置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環窒素原子を有する５、６、または７員複素環であり、各々の異なる標識が１種類以上の重原子同位体を含む。複素環を、置換または非置換のものとすることができる。複素環を、脂肪族または芳香族のものとすることができる。複素環部分の可能な置換基として、アルキル、アルコキシ、およびアリール基が挙げられる。置換基は、支持体に分析物を結合させるのに適した保護された基または保護されていない基、例えばアミン、ヒドロキシ、またはチオール基を含むことができる。複素環は、一つ以上の窒素、酸素、またはイオウ原子等のヘテロ原子をさらに含むことができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、混合物の標識分析物は同重体および各々が以下の式を有する。すなわち、
【０１３０】
【化４３】
2010190902.tif 000045
式中、Ｚ、Ｊ、およびＷはすでに説明されており、それらの特性が開示されている。例えば、試料混合物は以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含む。すなわち、
【０１３１】
【化４４】
2010190902.tif 000046
式中、炭素１３および酸素１８の同位体は、異なる標識化試薬のモルホリン・レポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、試料混合物は以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１３３】
【化４５】
2010190902.tif 000047
式中、炭素１３、酸素１８、および窒素１５の同位体は、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。いくつかの実施形態では、試料混合物は以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１３４】
【化４６】
2010190902.tif 000048
式中、炭素１３、酸素１８、および窒素１５の同位体は、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられ、式中、（１）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、また（２）各Ｋは、別々に、水素またはアミノ酸側鎖である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、混合物の標識分析物は同重体であり、各々が以下の式を有する。すなわち、
【０１３６】
【化４７】
2010190902.tif 000049
式中、Ｚ、Ｊ、およびＲ１についてはすでに説明されており、それらの特性も開示されている。例えば、試料混合物は以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１３７】
【化４８】
2010190902.tif 000050
式中、炭素１３および酸素１８の同位体は、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。
【０１３８】
別の実施形態では、標識分析物は、切断可能なリンカーを介して支持体と切断可能に結合した標識化試薬を含む支持体に、分析物を最初に反応させて、該標識分析物を支持体から切断することで、生成することができる。例えば、混合物の標識分析物は、以下の一般式を有する１種類以上の同重体である。すなわち、
【０１３９】
【化４９】
2010190902.tif 000051
式中、Ｇ’についてはすでに説明されており、その特性も開示されている。
【０１４０】
（Ｃ．キット）
いくつかの実施形態では、本発明はキットに関する。キットは、式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの２種類以上の標識化試薬のセットおよび１種類以上の試薬、容器、酵素、緩衝液、および／または取扱説明書を含むことができる。原子、部分、結合Ｘ、Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧについてはすでに説明されており、またそれらの特性も開示されている。キットの標識化試薬を異性体的または同重体的なものとすることができる。キットの標準化試薬の他の特性も同様に開示されている。例えば、キットは、同一試料または２種類以上の異なる試料に含まれる１種類以上の分析物の多重化分析にとって有用である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、各同重体的標識分析物の標識が、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して分析物が結合する置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環窒素原子を有する５、６、または７員複素環であり、各々の異なる標識が１種類以上の重原子同位体を含む。複素環を、置換または非置換のものとすることができる。複素環を、脂肪族または芳香族のものとすることができる。複素環部分の可能な置換基として、アルキル、アルコキシ、およびアリール基が挙げられる。置換基は、支持体に分析物を結合させるのに適した保護された基または保護されていない基、例えばアミン、ヒドロキシ、またはチオール基を含むことができる。複素環は、一つ以上の窒素、酸素、またはイオウ原子等のヘテロ原子をさらに含むことができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、キットの異なる試薬は同重体であり、各々が以下の式を有する。すなわち、
【０１４３】
【化５０】
2010190902.tif 000052
式中、ＲＧ、Ｚ、Ｊ、およびＷについてはすでに説明されており、それらの特性も開示されている。例えば、キットの試薬は以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１４４】
【化５１】
2010190902.tif 000053
式中、ＲＧは反応基であり、炭素１３および酸素１８の同位体が、異なる標識化試薬のモルホリン・レポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、キットは、以下の式で表される１種類以上の同重体的標識試薬を含むことができる。すなわち、
【０１４６】
【化５２】
2010190902.tif 000054
式中、ＲＧは反応基であり、炭素１３、酸素１８、および窒素１５の同位体が、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、キットの試薬は、以下の式で表される１種類以上の同重体的標識試薬を含むことができる。すなわち、
【０１４８】
【化５３】
2010190902.tif 000055
式中、炭素１３、酸素１８、および窒素１５の同位体が、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられ、式中、（１）各Ｒ１は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数１ないし８個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および／またはフッ素原子を含み、また（２）各Ｋは、別々に、水素またはアミノ酸側鎖である。さらに別の実施形態では、キットの標識分析物は同重体であり、各々が以下の式を有する。すなわち、
【０１４９】
【化５４】
2010190902.tif 000056
式中、ＲＧ、Ｚ、Ｊ、およびＲ１についてはすでに説明されており、それらの特性も開示されている。例えば、キットの試薬は以下の式で表される１種類以上の同重体的標識分析物を含むことができる。すなわち、
【０１５０】
【化５５】
2010190902.tif 000057
式中、ＲＧは反応基であり、炭素１３および酸素１８の同位体が、異なる標識化試薬のレポーターとカルボニル・リンカーとのあいだの総質量を釣り合わせるために用いられる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体のセット１種類以上を含む複数のキットに関するもので、各支持体は、切断可能なリンカーを介して支持体に切断可能に結合した異なる標識化試薬を含む。例えば、切断可能なリンカーは、化学的または光分解的に切断可能である。支持体は、異なる試料と反応することができ、それによって試料の分析物を同一のレポーター／リンカーで標識することができ、また異なる試料の分析物を異なるレポーター／リンカー組み合わせで標識することができる。本発明の実施形態で使用しうるセットの支持体は、一般式：Ｅ−Ｆ−Ｇ−ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧを有し、式中、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＲＰ、Ｘ、ＬＫ、Ｙ、およびＲＧについてはすでに説明されており、それらの特性も開示されている。上記セットの各々の異なる支持体は、固有のレポーターを含むことができる。
【０１５２】
例えば、キットの支持体は以下の式で表される２種類以上の試薬支持体を含むことができる。すなわち、
【０１５３】
【化５６】
2010190902.tif 000058
式中、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＲＧについてはすでに説明されており、それらの特性も開示されている。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、キットはタンパク質分解酵素を含む。タンパク質分解酵素をトリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼＣとすることができる。いくつかの実施形態では、キットは、標識化試薬を用いて異なる試料の分析物を差異的に標識するための取扱説明書を含むことができる。
【０１５５】
（Ｄ．組成物）
複数の実施形態では、本発明は、標識化試薬として用いることができる組成物に関する。該組成物は、式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識化試薬でありえ、式中、原子、部分、または結合Ｘ，Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧは、先述しており、それらの特性は開示した。標識化試薬は、異性体的または同重体的でありうる。標識化試薬の他の特性も同様に開示した。例えば、標識化試薬は、同じ試料中または２種類以上の異なる試料中の１種類以上の分析物の多重化分析に有用である。
【０１５６】
標識化試薬は、少なくとも１個の重原子同位体で同位体的にエンリッチ（コード）されうる。標識化試薬は、同位体的にエンリッチされ、２個以上の重原子同位体を含むことができる。標識化試薬は、同位体的にエンリッチされ、３個以上の重原子同位体を含むことができる。標識化試薬は、同位体的にエンリッチされ、４個以上の重原子同位体を含むことができる。複数の実施形態では、少なくとも１個の重原子同位体を標識化試薬のカルボニルまたはチオカルボニル基に組み込み、少なくとも１個の他の重原子同位体を標識化試薬のレポーターの基に組み込む。
【０１５７】
組み込まれる重原子同位体の各々は、少なくとも８０％の同位体純度で存在することができる。組み込まれる重原子同位体の各々は、少なくとも９３％の同位体純度で存在することができる。組み込まれる重原子同位体の各々は、少なくとも９６％の同位体純度で存在することができる。
【０１５８】
標識化試薬は、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター基を含む。したがって、レポーター基は、容易にイオン化される塩基性または酸性部分を含むことができる。複数の実施形態では、レポーターは、モルホリン、ピペリジン、またはピペラジン化合物でありうる。複数の実施形態では、レポーターは、カルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基含有化合物でありうる。したがって、複数の実施形態では、標識化試薬をそれらの塩形態で単離することができる。例えば、ピペラジン含有標識化試薬をモノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩、またはビスＨＣｌ塩として得ることができる。標識化試薬中に存在する対イオンの数は、標識化試薬中に存在する酸性および／または塩基性基の数に依存しうる。
【０１５９】
複数の実施形態では、標識化試薬は、カルボニルまたはチオカルボニル・リンカーを含むことができる。カルボニルまたはチオカルボニル・リンカーを含む標識化試薬を、分析物の標識のために、活性エステル形態で用いることができる。活性エステルでは、アルコール基は、脱離基（ＬＧ）を形成する。複数の実施形態では、活性エステルのアルコール（ＬＧ）は、式
【０１６０】
【化５７】
2010190902.tif 000059
を有することができ、式中、Ｘは、ＯまたはＳである。活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルでありうる。
【０１６１】
複数の実施形態では、活性エステル化合物は、Ｎ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して活性エステルのアルコール部分が結合する置換または非置換酢酸部分によってＮ−アルキル化される環窒素原子を有する５、６、または７員複素環でありえ、ここで、該化合物は、１個以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされる。活性エステルの複素環は、１個以上の置換基で置換されうる。１個以上の置換基は、アルキル、アルコキシ、またはアリール基でありうる。１個以上の置換基は、アルキルアミン、アルキルヒドロキシ、またはアルキルチオ基でありうる。１個以上の置換基は、保護または非保護のアミン基、ヒドロキシ基、またはチオール基でありうる。複素環は、脂肪族でありうる。複素環は芳香族でありうる。複素環は、１個以上の付加的な窒素、酸素、またはイオウ原子を含むことができる。
【０１６２】
複数の実施形態では、活性エステル化合物は、式
【０１６３】
【化５８】
2010190902.tif 000060
のＮ−置換モルホリン酢酸活性エステル化合物またはその塩でありえ、式中、ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む。複数の実施形態では、Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素でありうる。複数の実施形態では、Ｚは、別々に、水素、メチル、またはメトキシでありうる。複数の実施形態では、Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。モルホリンの環の窒素原子は、１４Ｎまたは１５Ｎでありうる。複数の実施形態では、活性エステルは、式
【０１６４】
【化５９】
2010190902.tif 000061
を含む化合物であり、式中、各Ｃ＊は、別々に、１２Ｃまたは１３Ｃであり、ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む。
【０１６５】
複数の実施形態では、活性エステル化合物は、式
【０１６６】
【化６０】
2010190902.tif 000062
のＮ−置換ピペリジン酢酸活性エステル化合物またはその塩でありえ、式中、ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む。複数の実施形態では、Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素でありうる。複数の実施形態では、Ｚは、別々に、水素、メチル、またはメトキシでありうる。複数の実施形態では、Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。ピペリジンの環の窒素原子は、１４Ｎまたは１５Ｎでありうる。複数の実施形態では、活性エステルは、式
【０１６７】
【化６１】
2010190902.tif 000063
を含む化合物であり、式中、各Ｃ＊は、別々に、１２Ｃまたは１３Ｃであり、ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む。
【０１６８】
複数の実施形態では、活性エステル化合物は、式
【０１６９】
【化６２】
2010190902.tif 000064
のＮ−置換ピペリジン酢酸活性エステル化合物またはその塩であり、式中、ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、Ｐｇは、アミン保護基であり、各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む。複数の実施形態では、Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素でありうる。複数の実施形態では、Ｚは、別々に、水素、メチル、またはメトキシでありうる。複数の実施形態では、Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。ピペラジンの環の窒素原子は、１４Ｎまたは１５Ｎでありうる。複数の実施形態では、活性エステルは、式
【０１７０】
【化６３】
2010190902.tif 000065
を含む化合物であり、式中、各Ｃ＊は、別々に、１２Ｃまたは１３Ｃであり、ＬＧは、活性エステルの脱離基であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、Ｐｇは、アミン保護基であり、各Ｚは、別々に、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは任意で置換または非置換のアリール基を含んでもよい直鎖または分岐鎖状Ｃ１ないしＣ６アルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、それぞれ別々に、結合した水素、重水素、またはフッ素原子を含む。
【０１７１】
本発明の実施形態を説明してきたが、この概念を包含した他の実施形態を用いることが可能であることは当業者には明らかであろう。したがって、これらの実施形態は、開示した実施形態に限定されるべきではなく、むしろ本発明の精神および範囲によってのみ限定されるべきものであると考えられる。
【実施例】
【０１７２】
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
【０１７３】
（実施例１  モルホリン酢酸の合成）
ブロモ酢酸（２ｇ、１４．４ｍｏｌｅ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２０ｍＬ）中のモルホリン（３．７６ｇ、４３．２ｍｏｌｅ）の攪拌した溶液に滴下した。溶液を室温で３日間攪拌した。白色の固体（４．１７ｇ）を濾過し、ＴＨＦ（１００ｍＬ）で洗浄し、温エタノール（ＥｔＯＨ）から再結晶化した（収率２．５９ｇ、ＩＲ１７４０ｃｍ−１）。２種類の異なる同重体型のモルホリン酢酸に対して、１−１３Ｃブロモ酢酸（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ−１−１３Ｃ  ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ２７，９３３−１）または２−１３Ｃブロモ酢酸（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ−２−１３Ｃ  ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ２７，９３５−８）のいずれかをブロモ酢酸の代わりに用いた。
【０１７４】
（実施例２  モルホリン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成）
ジメチルホルムアミド（乾燥、１．７５ｇ、０．０２４Ｍ）をテトラヒドロフラン（乾燥、３０ｍＬ）に溶解した。この溶液を、テトラヒドロフラン（乾燥、２０ｍＬ）に溶解した塩化チオニル（２．８５ｇ、０．０２４Ｍ）の攪拌した溶液に滴下し、氷浴で冷却した。添加の完了および氷上での３０分後に、氷浴を除去し、固形Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２ｇ、０．０１７Ｍ）を添加（完全に溶解させる）し、その後即座に、固形予め粉末にしたモルホリン酢酸（または１−１３Ｃもしくは−２−１３Ｃモルホリン酢酸）（３．６４ｇ、０．０１６Ｍ）を添加した。モルホリン酢酸は徐々に溶解し、急速に白濁する均一な溶液を得た。室温で一晩、激しく攪拌しながら反応させた。白色固体をテトラヒドロフランで洗浄し、真空乾燥させた（重量３．６５ｇ（６７％）、ＩＲスペクトル１８２８．０ｃｍ−１、１７９０．０ｃｍ−１、１７３６．０ｃｍ−１）。
【０１７５】
（実施例３  ２種類の試料での分析物測定および相対的定量化）
氷上で３０分間、氷冷０．５Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．８）中で、凍結乾燥Ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢ（Ｇｌｕ−Ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂ）（Ｓｉｇｍａ）１００ｐｍｏｌｅ量を、ＩまたはＩＩ（構造に関しては図１Ａ、調製に関しては実施例１および２を参照）いずれかの新たに作製した２％ｗ／ｖ溶液２００μｌと反応させた。０．５％ｖ／ｖ最終濃度になるようにＴＦＡを添加して、反応を停止させた。その後、修飾ペプチドを、差次的標識ペプチドの１：１０ないし１０：１範囲をほぼ網羅する種々の所定の比率で混合した。ミリポアＣ１８ジップ−チップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃ１８  Ｚｉｐ−Ｔｉｐ）を用いた逆相脱塩によって、各ペプチド混合物を個々に精製した。過剰な試薬および緩衝液は、逆相パッキング上に保持されないので、ＭＳ分析前に効率的に除去された。その後、混合物（０．５μｌ）をＭＡＬＤＩターゲット・プレート上にスポッティングし、５０％中の水性アセトニトリル中１％ｗ／ｖα−シアノケイ皮酸０．５μｌを用いてオーバー・スポッティングし、ＱＴＯＦ分析計に装着したＭＡＬＤＩ源を用いて各試料を分析した。
【０１７６】
図２は、試薬ＩおよびＩＩで修飾されたＧｌｕ−フィブリノペプチドの１：１混合から得られたＭＳスペクトルの拡大プロットである。ｍ／ｚ１６９９でのピークは、Ｇｌｕ−フィブリノペプチドのＮ−末端修飾質量を表し、予想したように、２種類の異なる形態のペプチド（図１Ａ（ＩＩＩ）および１Ａ（ＩＶ）参照）のｍ／ｚでは観測可能な差異はない。修飾ペプチドは同重体的である。ピークに対して観測された同位体クラスタは、厳密に、単一種に関して予測したとおりである。
【０１７７】
その後、ｍ／ｚ１６９９の単一荷電前駆イオンを低エネルギーＣＩＤ（約−７０Ｖの衝突オフセット）によるフラグメンテーション用に選択し、図３で見出されるＭＳ／ＭＳスペクトルを生成した。予想したように、観測されたイオン系列は、圧倒的に、ｂ型およびｙ型であった。これらのイオン全ては、差次的標識ペプチド種の１：１混合物を含むことは確認されずに、単一種として生じた。例えば、ｍ／ｚ１０５６．５で優勢なｙイオンの拡大を図４として拡大プロットに示し、ｍ／ｚ８８６．３で優勢なｂイオンを図５として拡大プロットに示す。
【０１７８】
しかし、約１００ｍ／ｚでのスペクトル（図６）の精密検査によって、種ＶＩＩおよびＶＩＩＩ（図１Ｂ）両方の存在が明らかになり、それらはそれぞれ、種ＶおよびＶＩ（図１Ｂ）のフラグメンテーション産物である。ｍ／ｚ１２８．１でピークが観測されないことによって、種ＶおよびＶＩは観測するために十分に安定していないことが示される。したがって、この例では、ペプチドのカルボニル基とアミノ末端アミノ酸との間のアミド結合（例えば、結合Ｙ）のフラグメンテーションによって、レポーター／リンカー部分（結合Ｘ）のその後のフラグメンテーションおよびニュートラルＣＯとしてのカルボニル部分のロスを生じる可能性がある。機器に備わった計測手段を用いてピーク積分を実行した。約６％の天然に生ずる第２のＣ−１３同位体の寄与に対する補正後に、ＶＩＩＩ／ＶＩＩ（１０１／１００）の測定された相対比は１．０３であった（予測値１．００）。表１は、天然に生ずる第２のＣ−１３の寄与に対する補正で調製した追加の実験混合物に対する実測比対観測比を示す（強度ｍ／ｚ１０１／ｍ／ｚ１００として表される比）。このデータを図７でグラフとしても表す。観測値と予測値との間には平均誤差＜１０％の優れた一致がある。
【０１７９】
【表１】
2010190902.tif 000066
（実施例４  プロテオーム分析）
実践上は、代表的なプロテオーム分析を以下のように実行することができる。比較のための全細胞タンパク質抽出物（例えば、試料ＡおよびＢ）を、別々に、トリプシンまたは別のタンパク質分解酵素で消化する。得られたペプチド混合物を、別々に、異なる異性体または同重体標識化試薬（例えば、化合物ＩおよびＩＩ）と反応させ、ペプチドのＮ末端およびリジンアミンの完全修飾をおこなう。例えば、試料Ａを化合物Ｉと反応させることができ、試料Ｂを化合物ＩＩと反応させることができる。その後、修飾ペプチド／タンパク質を含有する試料の各々をまとめて混合した後、クロマトグラフィー分離（多くの場合、多次元ＨＰＬＣを用いて）をおこない、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術によって分析する。基が同重体的であるとき、単一の標識処理（第２の試薬を用いたリジン基の事前のブロッキングは必要ではない）を用いて標識を実行することができる。その後、標識タンパク質／ペプチドの混合物をクロマトグラフィーによって分離し、溶出物またはその分画を上記実施例３に記載したように質量分析によって分析する。三連四重極質量分析計またはＱトラップ質量分析計を用いて、有効な感度を有意に増加させることも可能であり、ここで、１００よび１０１のｍ／ｚ領域を前駆イオン・モードでモニタリングする。２つの「署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」ピークの相対比を、試料ＡおよびＢ各々の中の目的とするペプチド／タンパク質分析物各々の比と直接相関させる。本明細書で使用するように「署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」ピークとは、レポーターに対するピークである。
【０１８０】
（実施例５  内部基準を基準にした分析物測定および定量化）
比較のための全細胞タンパク質抽出物（例えば、試料ＡおよびＢ）を、別々に、トリプシンで消化する。得られたペプチド混合物を、別々に、ＸおよびＸＩ（図８）と反応させ、上述のように、Ｎ末端およびリジンアミンの実質的に完全な修飾をおこなう。例えば、試料ＡペプチドをＸと反応させ、試料ＢペプチドをＸＩと反応させる。その後、実質的に修飾されたペプチドを含有する試料ＡおよびＢの既知量または各々をまとめて混合する。組み合わされたＡおよびＢの混合物に、試料ＡおよびＢの混合物中に存在する可能性のあるペプチド（群）にアミノ酸配列および／または翻訳後修飾（例えば、リン酸化）で厳密に対応する合成ペプチド（群）のセット（１種類以上）を正確に測定された量で添加し、ここで、該合成ペプチド（群）を同重体標識化試薬のセットの別の構成要素（例えば、化合物ＸＩＩまたはＸＩＩＩ、図８参照）で標識する。試料Ａ、試料Ｂ、および合成内部基準ペプチドに由来する組み合わされたペプチド混合物を、任意で、例えば多次元ＨＰＬＣによってクロマトグラフィー分離するか、または電気泳動分離し、その後、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術によって、上述のように分析することができる。試料Ａ、試料Ｂ，および同一配列の合成対応物に由来する等価物標識ペプチドの全ては、同重体的であり、実質的に同一のクロマトグラフィー特性を有する。「実質的に同一のクロマトグラフィー特性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」とは、差次的に標識されているが同一なペプチドの分離がたとえあるとしても、ほとんどおこなわれないことを意味する。ＭＳ／ＭＳ分析に続いて、同重体セットの付加的な構成要素（例えば、ＸＩＩまたはＸＩＩＩ）で標識された基準ペプチドに起因するレポーターの強度（「署名ピーク（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅａｋ）」を基準にして、Ｘ（試料Ａ）およびＸＩ（試料Ｂ）に対するレポーターの相対強度の比較によって、試料ＡおよびＢに由来するペプチドの絶対濃度を正確に測定することが可能である。
【０１８１】
前述の事項は、２種類の試料（すなわち、試料ＡおよびＢ）に関する説明であるが、このプロセスは、多くの実用的な方法に当てはめることが可能である。例えば、標識化試薬の十分に幅広いセットがある場合、多数の試料を同時に分析することが可能である。
【０１８２】
二重（または、より多くの分析すべき試料がある場合は二重以上）の内部基準を存在させることが可能である（例えば、試料Ａペプチドを、試薬ＸＩＩで標識された合成ペプチドで「スパイクする（ｓｐｉｋｅｄ）」ことが可能であり、試料Ｂペプチドを、試薬ＸＩＩＩ（既知の絶対濃度の）で標識された合成ペプチドでスパイクすることが可能である）。全てを上述のように組み合わせ、分離し、かつ分析する際は、試料Ａペプチドを化合物ＸＩＩに対する署名ピークを基準にして定量化することができ、試料Ｂペプチドを化合物ＸＩＩＩに対する署名ピークを基準にして定量化することができる。
【０１８３】
（実施例６  ピペリジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの典型的な合成）
ブロモ酢酸をテトラヒドロフラン（または別の好適な非求核性溶剤）に溶解し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、またはたは別の好適な非求核性溶剤）中の過剰なピペリジンを含有する攪拌した溶液に滴下する。溶液を室温で１ないし３日間攪拌する。固体を濾過し、ＴＨＦ（または別の好適な非求核性溶剤）で洗浄し、任意で再結晶化する。２種類の異なる同重体型のピペリジン酢酸に対して、１−１３Ｃブロモ酢酸（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ−１−１３Ｃ  ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ２７，９３３−１）または２−１３Ｃブロモ酢酸（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ−２−１３Ｃ  ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ２７，９３５−８）のいずれかをブロモ酢酸と置換する。異性体置換ピペリジンを好適な出発材料から調製することができ、またはケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはアイソテック（Ｉｓｏｔｅｃ）等のソースから特別注文ベースで入手することができる。
【０１８４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル等の活性エステルに酢酸誘導体を変換するために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をテトラヒドロフラン（または別の好適な非求核性溶剤）に溶解する。この溶液を、テトラヒドロフラン（または別の好適な非求核性溶剤）に溶解した等モル量の塩化チオニル（ＤＭＦのモル量にもとづいて）の攪拌した溶液に滴下し、氷浴で冷却する。添加の完了および氷上での３０分後に、氷浴を除去し、固形Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、その後即座に、ピペリジン酢酸（または１−１３Ｃもしくは−２−１３Ｃピペリジン酢酸）を添加する。室温で一晩、激しく攪拌しながら反応させる。その後、産物ピペリジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、可能であれば濾過のみによって、反応混合物から単離する。任意で、再結晶化および／またはクロマトグラフィーを用いて、粗産物を精製することができる。
【０１８５】
（実施例７  ピペラジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの典型的な合成）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した２当量のピペラジンのを含有する溶液を、テトラヒドロフランに溶解した１当量のブロモ酢酸（ピペラジンの量に対して）を含有する溶液に滴下する。この２つの溶液は、実用的であるように濃縮すべきである。得られた反応溶液を室温で１ないし３日間攪拌する。固体を濾過し、ＴＨＦで洗浄し、任意で再結晶化する。２種類の異なる同重体型のピペリジン酢酸に対して、１−１３Ｃブロモ酢酸（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ−１−１３Ｃ  ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ２７，９３３−１）または２−１３Ｃブロモ酢酸（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ−２−１３Ｃ  ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ２７，９３５−８）のいずれかをブロモ酢酸の代わりに用いうる。
【０１８６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル等の活性エステルに酢酸誘導体を変換するために、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１．７５ｇ、０．０２４Ｍ）をテトラヒドロフランに溶解することができる。この溶液を、テトラヒドロフランに溶解した等モル量の塩化チオニル（ＤＭＦのモル量にもとづいて）の攪拌した溶液に滴下し、氷浴で冷却することができる。添加の完了および氷上での３０分後に、氷浴を除去し、固形Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、その後即座に、ピペラジン酢酸（または１−１３Ｃもしくは−２−１３Ｃピペリジン酢酸）を添加することができる。室温で一晩、激しく攪拌しながら反応させることができる。その後、産物ピペラジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、可能であれば濾過のみによって、反応混合物から単離することができる。その後、再結晶化および／またはクロマトグラフィーを用いて、粗産物を精製することができる。
【０１８７】
（実施例８  Ｎ，Ｎ′−（２−メトキシエチル）−グリシン活性エステルの典型的な合成（米国特許第６，３２６，４７９号からの転写））
ビス（２−メトキシエチル）アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）１．１ｍｏｌｅに、ｔｅｒｔ−ブチルクロロアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）５００ｍｍｏｌを滴下した。この反応物を３日間攪拌して、その後反応を後処理した。最終反応内容物に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）２５０ｍＬおよび水２００ｍＬを添加した。この攪拌溶液に、固形炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）３００ｍｍｏｌを少しずつ添加した。混合が完了した後に、層を分離した。ＤＣＭ層を１容量の水で１回洗浄して、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過およびエバポレートし、非常に薄い黄色の油６６．３ｇを得た。この粗産物を６０℃でＫｕｇｅｌｒｏｈｒで蒸留し（２００ないし５００μＭ  Ｈｇ）、無色透明の油５８．９ｇ（２３８ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【０１８８】
精製した（攪拌）Ｎ，Ｎ′−（２−メトキシエチル）−グリシン−ｔｅｒｔ−ブチルエステルに、濃塩酸１２．１ｍＬを徐々に添加した。一晩攪拌して、反応させ、その後、副産物（例えば、水、ＨＣｌ、イソブチレン）を真空蒸発によって除去した。１Ｈ−ＭＮＲ分析によって、ｔ−ブチルエステルは加水分解されたことが示されたが、水およびＨＣｌは依然として存在していると考えられた。粗産物をアセトニトリル（ＡＣＮ）から２回共エバポレーションしたが、水およびＨＣｌは依然存在した。夾雑物を除去するために、４．４ｇアリコートを粗産物から取り出し、１３５ないし１５５℃でＫｕｇｅｌｒｏｈｒで蒸留した（蒸留開始後に急速に圧力が下降する１００ないし２００μＭ  Ｈｇ）。収率４．２ｇ（１８．４ｍｍｏｌ、濃厚な無色透明の油の９５％回収）。蒸留した産物は、水もＨＣｌもまったく含有していなかった。
【０１８９】
その後、任意の好適な同位体的に標識された置換または非置換のＮ，Ｎ′−（２−メトキシエチル）−グリシンの活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を本明細書に記載される方法等の当該技術分野で公知の方法によって調製することができる。
【０１９０】
（実施例９  標識化／タグ化試薬を含む固体支持体を調製するための典型的な方法）
「立体的に込み合った切断可能なリンカー（ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」を含む市販のペプチド合成樹脂を、少なくとも２倍過剰なアミノアルキルピペラジン（例えば、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ／Ｎ  Ａ５，５２０−９、本明細書内の記載と組合させて図１１に説明されるプロセスによって異性体型を作製することができる）と反応させる。「立体的に込み合った切断可能なリンカー（ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」とは、リンカーが、固体支持体と切断可能なリンカーに反応する原子または基との間の切断可能な共有結合を形成する第２級または第３級原子を含むことを意味する。立体障害された固体支持体の非限定的例としては、塩化トリチル樹脂（トリチル−Ｃｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４）、２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  Ｑ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４００３７７）、４−メチルトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７５）、４−メトキシトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７６）、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−０３４５）、リンク・アシッド樹脂（Ｒｉｎｋ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｉｎ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−０３８０および０１−６４−０２０２）、ノバシンＴＧＴ（ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴ）アルコール樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４）が挙げられる。その後、支持体を洗浄することによって、過剰な試薬を除去する。その後、トリエチルアミン等の第３級アミンの存在下で、支持体結合ピペラジンの第２級アミンを過剰なブロモ酢酸と反応させる。その後、支持体を洗浄することによって、過剰な試薬を除去する。カルボン酸の活性エステルを生成するために使用する方法（例えば、活性エステルの合成に、カルボン酸の塩が必要であるか否か）に応じて、ビス−アルキル化ピペラジンの支持体結合カルボン酸基をプロトン化するために調整されるｐＨを有するように洗浄を選択することができる。その後、上記に記載される方法等の、カルボン酸の活性エステルの生成のための当該技術分野で公知の手順を用いて、支持体結合ピペラジンのカルボン酸基を活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）に変換する。その後、得られた固体支持体を用いて、求核性官能基を有する試料の分析物（例えば、ペプチド）を標識することができる。その後、製造元の製品指示書に記載されるように、標識分析物を支持体から遊離させることができる。その後、各切断反応の産物を組み合わせて、試料混合物を形成することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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