(57)【要約】【課題】安価かつ小型の被検試料中の多数の被検物質を高精度に同時に検出することができる生体物質計測方法及び装置を提供する。【解決手段】被検物質を異なる抗体が固定化されたアスペクト比が異なる金ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆが形成されたセル１０５に供給し、前記セル１０５に複数の波長を含む光を照射し、前記セル１０５を透過、または、散乱、または、反射した光を分光し、分光された光を検出し、前記セル１０５にて発生したそれぞれのアスペクト比の金ナノロッドの局在型表面プラズモン共鳴波長シフト量を算出する。得られた局在型表面プラズモン共鳴波長シフト量に基づき、それぞれの被検物質の濃度を同時かつ高精度に算出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
局在型表面プラズモン共鳴を利用して被検物質濃度を計測する方法であって、
ａ）被検物質と結合する物質が固定化された複数のアスペクト比が異なる金属ナノロッドが存在するセルに被検物質を供給する工程
ｂ）前記セルに複数の波長を含む光を照射する工程
ｃ）前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を分光し、分光された光を検出する工程
ｄ）工程ｃ）により得られた結果から前記セル中のアスペクト比の異なる金属ナノロッドにて発生した局在型表面プラズモン共鳴波長を算出する工程、および
ｅ）工程ｄ）により求められた局在型表面プラズモン共鳴波長から被検物質濃度を算出する工程
を含む被検物質濃度計測方法。
【請求項２】
被検物質は、生体に含まれる成分である請求項１に記載の被検物質濃度計測方法。
【請求項３】
前記被検物質と結合する物質が、モノクロナール抗体である請求項１に記載の被検物質濃度計測方法。
【請求項４】
前記被検物質と結合する物質は、金属ナノロッドのアスペクト比ごとに異なることを特徴とする請求項１に記載の被検物質濃度計測方法。
【請求項５】
複数の波長の光を放射する光源と、被検物質と結合する物質が固定化された複数のアスペクト比が異なる金属ナノロッドが存在するセルと、前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を分光する分光手段と、前記分光手段により分光された前記光を検出する検出手段と、前記検出手段の出力により前記アスペクト比の異なる金属ナノロッドごとに発生した局在型表面プラズモン共鳴の共鳴波長を算出し、前記局在型表面プラズモン共鳴の共鳴波長から被検物質濃度を算出する演算部とを備える請求項１に記載の方法を利用する被検物質濃度計測装置。
【請求項６】
前記光源は、前記アスペクト比の異なる金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長の光を含むことを特徴とする請求項５に記載の被検物質濃度計測装置。
【請求項７】
前記金属ナノロッドの短軸長さが３ｎｍ以上、５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の被検物質濃度計測装置。
【請求項８】
前記金属ナノロッドのアスペクト比が1より大きく、１０より小さいことを特徴とする請求項５〜７に記載の被検物質濃度計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属に光を照射することで発生する表面プラズモン共鳴を利用して、特定の物質の濃度を計測する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療診断や遺伝子解析を迅速、高効率、かつ簡便に行うために、微量な生体成分を高感度に検出する技術が重要になっている。
生体中の成分、例えば、血液、汗、尿などの被検試料中の蛋白質、ホルモンや低分子化合物などの被検物質を検出する方法としては、表面プラズモン共鳴が利用されている。この表面プラズモン共鳴とは、金属中の自由電子と電磁波（光）が相互作用することによって起きる共鳴現象であり、蛍光検出法や、電気化学法のように被検物質に標識する必要がないために簡便な手法として注目されている。表面プラズモン共鳴を用いたセンサには伝搬型表面プラズモン共鳴と局在型表面プラズモン共鳴とがある。
【０００３】
伝搬型表面プラズモン共鳴センサは、三角プリズムの一面に金属の薄膜を形成したものである。そして、プリズムの別の面から金属薄膜の面に光を照射している。この光が金属薄膜に入射する角度が特定の値になると、表面プラズモン共鳴が発生する。表面プラズモン共鳴が発生するときの光が金属薄膜に入射する角度（共鳴角度）は、金属薄膜近傍（約１００ｎｍ）にある物質の屈折率（誘電率）に依存するため、周辺物質の物性変化を高感度に検出する方法として用いることができる。特にバイオセンサとして用いる場合は、あらかじめ金属薄膜の表面に抗体を固定化しておく。その金属薄膜表面に被検試料を接触させることにより、ターゲットとする被検物質（抗原）が抗体と結合することで金属薄膜近傍の屈折率が変化し、共鳴角度が変化する。したがって、共鳴角度を計測することで、被検試料中の抗原濃度を算出できる。
【０００４】
一方、局在型表面プラズモン共鳴センサは、金属微粒子や、誘電体微粒子に金属がコーティングされた微細構造体に光を照射すると発生する局在型表面プラズモン共鳴を利用した方法である。局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長は、金属微粒子や微細構造体周辺（球形金属微粒子の場合は、その半径程度）の領域にある被検試料の屈折率に依存する。この金属、微粒子や微細構造体上に抗体を固定化しておくと、被検試料中の抗原と抗体が結合することで、金属微粒子や微細構造体周辺の屈折率が変化する。従って、金属微粒子や微細構造体の透過光や反射光を分光して吸収スペクトルを観測し、共鳴波長を計測することで、被検試料中の抗原濃度を算出できる。
【０００５】
この局在化表面プラズモン共鳴を利用した方法としては、平均粒径が数十ｎｍの金属微粒子を用いて金属ナノ構造を実現したものがある（例えば、特許文献１参照）。このセンサにあっては、金属微粒子のコロイド溶液にガラス基板を浸漬し、ガラス基板の表面に金属微粒子を分布させる。そして、ガラス基板の裏面側から光を垂直に入射させ、ガラス基板を透過した光の強度を計測する。受光した透過光を分光手段によって分光し、各波長における吸光度を求めると、ある波長（共鳴波長）で吸光度のピークが生じる。この現象も金属微粒子の周囲の誘電率（屈折率）の影響を受けるので、金属微粒子に何らかの誘電体物質（例えば、抗原）が付着すると、吸光度が変化する。よって、吸光度のピーク値の変化を読み取ることにより誘電体物質の付着の有無や付着量を検知できる。
【０００６】
また、基板上の複数領域に微細構造体を形成し、領域毎の局在化表面プラズモン共鳴を観測し、その共鳴波長より濃度を算出する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。ここでは、ある領域に形成された微細構造体には生体分子と結合する抗体等が固定化され、この領域（信号領域）は生体分子の濃度を反映した共鳴波長を示す。別な領域に形成された微細構造体には、異なる光学特性の微粒子または異なる生体分子が固定化され、それぞれの領域の光学特性を検出することにより、異なる生体分子を検出している。
【特許文献１】特許第３４５２８３７号公報
【特許文献２】特許第３５２８８００号公報
【特許文献３】特開２００７−０７１６６７号公報（特に実施例１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来の局在型表面プラズモンセンサにおいては、簡便かつ高感度な生体成分の検出が可能であるとされているが、同じ被検試料中に混在する多種の被検物質を同時に検出しようとすると、その被検物質分だけ領域を形成する、もしくは、被検物質を分離しなければならず、センサ構造が複雑になり、高価かつ小型化に不向きであるという課題を有していた。本発明は、前記従来の課題を解決するもので、安価かつ小型の被検試料中の多数の被検物質を高精度に同時に検出することができる生体物質計測方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、局在型表面プラズモン共鳴を利用して被検物質濃度を計測する方法であって、
ａ）被検物質と結合する物質が固定化された複数のアスペクト比が異なる金属ナノロッドが存在するセルに被検物質を供給する工程
ｂ）前記セルに複数の波長を含む光を照射する工程
ｃ）前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を分光し、分光された光を検出する工程
ｄ）工程ｃ）により得られた結果から前記セル中のアスペクト比の異なる金属ナノロッドにて発生した局在型表面プラズモン共鳴波長を算出する工程、および
ｅ）工程ｄ）により求められた局在型表面プラズモン共鳴波長から被検物質濃度を算出する工程
を含む。
【０００９】
また、本発明の被検物質濃度計測装置は、複数の波長の光を放射する光源と、被検物質と結合する物質が固定化された複数のアスペクト比が異なる金属ナノロッドが存在するセルと、前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を分光する分光手段と、前記分光手段により分光された前記光を検出する検出手段と、前記検出手段の出力により前記アスペクト比の異なる金属ナノロッドごとに発生した局在型表面プラズモン共鳴の共鳴波長を算出し、前記局在型表面プラズモン共鳴の共鳴波長から被検物質濃度を算出する演算部とを備える。本構成によって、被検試料中の多数の被検物質の濃度を同時かつ高精度に測定することができる。
【発明の効果】
【００１０】
アスペクト比の異なる金属ナノロッドを用いることによって、局在型表面プラズモン共鳴の共鳴波長が異なる。本発明の被検物質濃度計測方法および本方法を用いた被検物質濃度計測装置によれば、アスペクト比の異なる金属ナノロッドに、異なる被検物質と結合する物質を固定することにより、被検物質ごとに局在型表面プラズモン共鳴の共鳴波長が異なるので、被検試料中の多数の被検物質の濃度を同時かつ高精度に測定することができる。
【００１１】
複数の被検物質が、血液、尿、唾液、汗等の体液中に存在する疾患マーカーやホルモン等の場合には、複数の疾患についてのマーカーやホルモンの濃度を簡便かつ同時に計測できるので特に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１３】
（実施の形態１）
本発明の第１の実施の形態について図１〜３を用いて説明する。
【００１４】
図１は、本発明の実施の形態１における被検物質濃度計測装置１００の構成を示す図である。図１において、局在型表面プラズモン共鳴波長を含む光を放射するハロゲン光源１０１、ハロゲン光源１０１から放射された光を整形するレンズ系１０２、被検物質を保持し、抗体が固定化された金属ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆが設けられている固定部１０３を持つセル１０５、セル１０５を透過した光を成形するレンズ系１０４、グレーティング分光を行う際に光を略点光源状に整形するスリット１０７、スリット１０７を透過した光を波長に応じて分散させながら反射するグレーティング素子１０８、分散した光を検出する複数の受光領域を持つ光検出器１０９、光検出器１０９が受光した光の強度を算出し、算出した強度から局在型表面プラズモン共鳴波長を算出し、算出した局在型表面プラズモン共鳴波長に基づき被検物質の濃度を算出するマイクロコンピュータ１１０である。ここで、ハロゲン光源１０１、マイクロコンピュータ１１０はそれぞれ、本発明における光源、演算部に相当する。また、スリット１０７、グレーティング素子１０８は本発明における分光手段に相当し、光検出器１０９は検出手段に相当する。本実施の形態において分光手段、検出手段として、グレーティング素子１０８と複数の受光領域を持つ光検出器１０９を用いたが、所定の波長を分光できる公知技術であれば、特に限定することなく利用できる。例えば、干渉フィルター等の分光フィルターや、音響光学素子と単一の受光領域を持つ光検出器等を利用することができる。
【００１５】
また、本発明の被検物質濃度計測装置１００は、メモリ１１１を備えていることが好ましい。メモリ１１１には、複数の受光領域を持つ光検出器１０９の各セルに対応する波長のデータや、被検物質の濃度を算出するための局在型表面プラズモン共鳴波長やの共鳴波長シフト量と被検物質の濃度の相関関係に関するデータ等を保持している。
【００１６】
図２は、本発明の第１の実施の形態におけるセル１０５の断面を示す図である。セル１０５は、抗体（図示せず）が固定化された金属ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆが設けられている固定部１０３、スペーサー１０６ｂ、基板１０６ｃ、カバーガラス１０６ｅ、スペーサー１０６ｂとカバーガラス１０６ｅで形成される被検溶液保持空間１０６ｄ、被検溶液の供給口、排出口（図示せず）から構成されている。基板１０５ｃとしては、ハロゲン光源１０１の波長の光が透過するものであれば、公知技術を特に限定することなく利用することができる。例えば、ＳｉＯ２は、前記光の波長に対して透明であり好ましい。
【００１７】
図３は、本発明の第１の実施の形態における抗体が固定化された金属ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆが設けられている固定部１０３を図２中のｘ方向から見た図を示す。固定部１０３には、短軸５ｎｍ、アスペクト比が２．５、３、３．５、４、４．５、５の金ナノロッド１０５ａ−１０５ｆが固定化されており、アスペクト比の異なる金ナノロッドには、異なる被検物質と特異的に結合する抗体が固定化されている。ここで、短軸５ｎｍ、アスペクト比が２．５、３、３．５、４、４．５、５の金ナノロッド１０５ａ−１０５ｆは本発明における金属ナノロッドに相当する。金属ナノロッドの合成法としては、公知の技術を特に限定なく利用することができる。例えば、例えば、金電極を用いる電解法（Y.Y.Yu, S.S.Chang, C.L.Lee, C.R.C.Wang, J. Phys, Chem.B,101,6661(1997)）、化学反応による合成法（N.R.Jana, L.Gearheart and C.J.Murphy,Adv.Mater.,2001,13,1389）、光反応を用いる方法（F.Kim, J.H.Song, P.Yang, J. Am. Chem. Soc.,2002,124,14316、Y.Niidome, K.Nishioka, H.Kawasaki, S.Yamada, Chem.Commun.,2003,2376）などが適用可能である。
【００１８】
本実施の形態では、金属ナノロッドはランダムに固定化しているが、単粒子膜状に分散していればよく、特に、これに限定されるものではない。例えば、配列していてもよい。また、金属ナノロッドの単粒子膜の作製方法は、公知の技術を特に限定なく利用することができる。水面に形成された金属ナノロッドの単粒子膜をガラス基板で掬い取る方法や、金属ナノロッド溶液をスピンコートや塗布等の手法により単粒子膜を作製する方法などが適用可能である。
【００１９】
本発明の実施の形態１において用いる金属ナノロッドとして短軸５ｎｍ、アスペクト比が２．５、３、３．５、４、４．５、５の金ナノロッドを用いたが、特にこれに限定することなく利用できる。本発明に用いる金属ナノロッドは、銀、金、銅、アルミニウム、白金のいずれかあるいは少なくとも１種類含み、短軸の長さが３〜５０ｎｍ好ましくは５〜２５ｎｍ、アスペクト比が１〜１０のものである。但し、金属ナノロッドの形状は棒状の異方性粒子であればよく、円柱状、三角柱状、四角柱状、ドッグボーン状等の形状であればよい。例えば、金ナノロッドは、短軸方向に由来する５２０ｎｍ付近と長軸に由来する６００〜１５００ｎｍの二つの局在型表面プラズモン共鳴バンドを示す。実施の形態１で用いる短軸５ｎｍ、アスペクト比が２．５、３、３．５、４、４．５、５の金ナノロッドは、７００〜１０００ｎｍに局在型表面プラズモン共鳴波長を持つ。この局在型表面プラズモン共鳴波長はアスペクト比が大きくなるにしたがって、長波長側に現れる。それぞれの金ナノロッドに対する局在型表面プラズモン共鳴波長が少なくとも４０ｎｍ以上はなれているので、周辺物質の屈折率変化で局在型表面プラズモン共鳴波長がシフトしても局在型表面プラズモン共鳴波長同士が、重なることがないので好ましい。このようにアスペクト比が異なる金ナノロッドに異なる抗体が固定化されたものを用いれば、アスペクト比ごとに、異なる局在型表面プラズモン共鳴波長を示すので、それぞれの被検物質ごとに、異なる共鳴波長を観測でき、同時かつ簡便に被検物質濃度を検出できる。７００ｎｍ〜１０００ｎｍで少なくとも８種類の異なる被検物質の濃度を測定することができる。
【００２０】
本発明の実施の形態１では、金属ナノロッドが固定されているとしたが、固定されていなくてもよい。例えば、溶液中に金属ナノロッドを分散させておき、測定する際に被検試料と混合してもよい。
【００２１】
ここで、本実施の形態において、光源として、ハロゲン光源１０１を用いたが、局在型表面プラズモン共鳴波長を含む光を放射する光源であれば、特に限定することなく利用することができる。本実施の形態における金ナノロッドの共鳴波長７００〜１０００ｎｍの光を含む光を放射する光源であれば利用できる。
【００２２】
次に本実施の形態における被検物質濃度計測方法および本方法を利用した被検物質濃度計測装置の動作について、図面を参照しながら説明する。まず、セル１０５に複数の被検物質が含まれる被検溶液を供給する。セル１０５に被検溶液が満たされたあと、ハロゲン光源１０１の電源を入れる。ハロゲン光源１０１から放射された光は、セル１０５中の固定部１０３を通過する際、金ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆに応じた局在型表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が極大となる。金ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆを透過した光がスリット１０７を透過し、グレーティング素子１０８により分散され、光検出器１０９における各受光領域に到達する。マイクロコンピュータ１１０は、光検出器１０９の各受光領域が検出した光の量に基づいて光の消衰が極大となる複数の波長を決定する。この時、被検溶液が満たされたかどうかを判定するためのセンサを備えていることが好ましい。例えば、カバーガラス１０６ｅと基板１０６ｃに電極を設けておき、電極に弱い電圧をかけておく。被検溶液が例えば血液である場合、血液には電解質が含まれることから、被検溶液が満たされると電極間に電流が流れ、被検溶液がセル１０５内に満たされたどうかが判定できる。さらに前記センサの出力を利用してハロゲン光源１０１の電源を自動的にＯＮにすることが、測定を自動化できるため好ましい。
【００２３】
光の消衰が極大となる複数の波長を決定した後、マイクロコンピュータ１１０は、メモリ１１１からあらかじめ格納されている金ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆの被検物質が結合する前の局在型表面プラズモン共鳴波長を読み出し、光の消衰が極大となる複数の波長と比較する。読み出した金ナノロッド１０５ａの被検物質が結合する前の局在型表面プラズモン共鳴波長に対して長波長側に存在し、金ナノロッド１０５ａよりアスペクト比の大きな金ナノロッドの被検物質が結合する前の局在型表面プラズモン共鳴波長より短波長側にある光の消衰が極大となる波長を金ナノロッド１０５ａに被検物質が結合した後の局在型表面プラズモン共鳴波長とする。さらに、被検物質が結合した後の局在型表面プラズモン共鳴波長と被検物質が結合する前の局在型表面プラズモン共鳴波長との差を共鳴波長シフト量とする。他のアスペクト比の金ナノロッド１０５ｂ〜１０５ｆにおいても、同様に共鳴波長シフト量を算出する。ただし、アスペクト比の最も大きな金ナノロッド１０５ｆは、被検物質が結合する前の局在型表面プラズモン共鳴波長より長波長側にある光の消衰が極大となる波長を被検物質が結合した後の局在型表面プラズモン共鳴波長とし共鳴波長シフト量を求める。その後、マイクロコンピュータ１１０は、メモリ１１１にあらかじめ格納されている金ナノロッド１０５ａ〜１０５ｆのそれぞれの共鳴波長シフト量と被検物質濃度の相関関係を参照し、複数の被検物質の濃度を算出する。算出された被検物質の濃度は、例えば、スピーカー（図示せず）を通じて音声での通知や、ディスプレイ等（図示せず）に表示させることにより、ユーザに通知される。
【００２４】
ここで、複数の受光領域を持つ光検出器１０９としては、公知技術を特に限定することなく利用することができる。例えば、ＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ、１次元フォトディテクターアレイ等を利用することができる。また、受光領域の数としては、例えば４０９６個の受光領域を持つ１次元ＣＣＤ素子を利用することができる。
【００２５】
メモリ１１１に格納されている、局在型表面プラズモン共鳴波長と被検溶液中の被検物質の濃度との相関を示す相関データは、例えば、以下の手順によって取得することができる。
【００２６】
まず、既知の被検成分濃度（例えば、血糖値）を有する患者について、局在型表面プラズモン共鳴波長を測定する。この測定を、異なる被検成分濃度を有する複数の患者について行うことにより、局在型表面プラズモン共鳴波長それらに対応する被検物質濃度とからなるデータの組を得ることができる。
【００２７】
本実施の形態によれば、被検物質を含む被検溶液をセル１０５に供給し、アスペクト比の異なる金ナノロッドごとに異なる共鳴波長を測定することができ、異なる金ナノロッドごとに共鳴波長シフト量を算出できるので、多数の被検物質の濃度を簡便かつ同時に測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明にかかる被検物質濃度計測方法及び本方法を用いた被検物質濃度計測装置は、被検試料中の多数の被検物質の濃度を同時かつ高精度に測定することができるため有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施の形態における被検物質濃度計測装置の構成を示す図
【図２】本発明の一実施の形態におけるセル１０５の断面を示す図
【図３】本発明の一実施の形態における固定部１０２の図２におけるｘ方向から見た面を示す図
【符号の説明】
【００３０】
１００  被検物質濃度計測装置
１０１  ハロゲン光源
１０２  レンズ
１０３  固定部
１０４  レンズ
１０５  セル
１０５ａ  アスペクト比２．５の金ナノロッド
１０５ｂ  アスペクト比３の金ナノロッド
１０５ｃ  アスペクト比３．５の金ナノロッド
１０５ｄ  アスペクト比４の金ナノロッド
１０５ｅ  アスペクト比４．５の金ナノロッド
１０５ｆ  アスペクト比５の金ナノロッド
１０６ｂ  スペーサー
１０６ｃ  基板
１０６ｄ  被検溶液保持空間
１０７  スリット
１０８  グレーティング素子
１０９  複数の受光領域を持つ光検出器
１１０  マイクロコンピュータ
１１１  メモリ
【図１】
2010185738.tif 000003
【図２】
2010185738.tif 000004
【図３】
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