(57)【要約】      （修正有）【課題】新規のヒトＧタンパク質共役レセプター、および構成的活性の証拠のある変異（非内因性）バージョンを提供する。【解決手段】内因性リガンドが未知であるヒトＧタンパク質共役レセプター、および構成的活性の証拠のある変異（非内因性）バージョンに関し、この特定のアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターおよびその構成的活性化バージョン、および、前記ヒトＧタンパク質共役レセプターをコードするｃＤＮＡおよびベクターを含むプラスミド、ならびに、前記プラスミドを含む宿主細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する引用）
本出願は、米国特許出願番号０９／１７０，４９６（１９９８年１０月１３日に米国特許商標庁に提出）およびその対応ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３９３８（２０００年４月２０日にＷＯ  ００／２２１２９として公開）の一部継続出願である。本出願は、以下の仮出願からの優先権の利益を請求する（以下の仮出願は、すべて、示された日付に、Ｕ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍａｉｌを介して、米国特許商標庁に提出された）：米国仮特許出願番号６０／２５３，４０４（２０００年１１月２７日提出）；米国仮特許出願番号６０／２５５，３６６（２０００年１２月１２日提出）；米国仮特許出願番号６０／２７０，２８６（２００１年２月２０日提出）；米国仮特許出願番号６０／２８２，３５６（２００１年４月６日提出）（この仮出願は、米国仮特許出願番号６０／２７０，２６６（２００１年２月２０日提出）からの優先権を主張する）；米国仮特許出願番号６０／２８２，０３２（２００１年４月６日提出）；米国仮特許出願番号６０／２８２，３５８（２００１年４月６日提出）；米国仮特許出願番号６０／２８２，３６５（２００１年４月６日提出）；米国仮特許出願番号６０／２９０，９１７（２００１年５月１４日提出）；米国仮特許出願番号６０／３０９，２０８（２００１年７月３１日提出）；これらの開示は、その全体が参考として援用される）。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、膜貫通レセプターに関し、いくつかの実施形態においては、Ｇタンパク質共役レセプターに関し、いくつかの実施形態においては、そのレセプターの構成的活性を確立または増強するように変化した内因性ＧＰＣＲに関する。いくつかの実施形態において、この構成的活性化ＧＰＣＲは、治療剤としての適用性を有するレセプターアゴニストまたは逆のアゴニストとしての候補化合物の直接的同定のために使用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
多数のレセプタークラスがヒトにおいて存在するが、断然豊富でありかつ治療上適切であるのは、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）クラスにより示される。ヒトゲノム中には、約３０，０００〜４０，０００個の遺伝子が存在することが推定され、これらのうち、約２％がＧＰＣＲをコードすると推定される。内因性リガンドが同定されているレセプター（ＧＰＣＲを含む）は、「既知の」レセプターと呼ばれ、一方、内因性リガンドが同定されていないレセプターは、「オーファン」レセプターと呼ばれる。
【０００４】
ＧＰＣＲは、医薬品の開発のための重要な領域を示す：１００個の既知のＧＰＣＲのうちの約２０個から、処方箋薬剤すべてのうちの約６０％が、開発されている。例えば、１９９９年、トップ１００の商品名処方箋薬物のうち、以下の薬物が、ＧＰＣＲと相互作用する（処置される疾患および／または障害が、括弧中に示される）：
Ｃｌａｒｉｔｉｎ（登録商標）（アレルギー）  Ｐｒｏｚａｃ（登録商標）（抑鬱）  Ｖａｓｏｔｅｃ（登録商標）（高血圧）  Ｐａｘｉｌ（登録商標）（抑鬱）  Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標）（抑鬱）  Ｚｙｐｒｅｘａ（登録商標）（精神病）  Ｃｏｚａａｒ（登録商標）（高血圧）  Ｉｍｉｔｒｅｘ（登録商標）（片頭痛）  Ｚａｎｔａｃ（登録商標）（逆流）  Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ（登録商標）（逆流疾患）  Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ（登録商標）（精神分裂病）  Ｓｅｒｅｖｅｎｔ（登録商標）（喘息）  Ｐｅｐｃｉｄ（登録商標）（逆流）  Ｇａｓｔｅｒ（登録商標）（潰瘍）  Ａｔｒｏｖｅｎｔ（登録商標）（気管支痙攣）  Ｅｆｆｅｘｏｒ（登録商標）（抑鬱）  Ｄｅｐａｋｏｔｅ（登録商標）（癲癇）  Ｃａｒｄｕｒａ（登録商標）（前立腺肥大）  Ａｌｌｅｇｒａ（登録商標）（アレルギー）  Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）（前立腺癌）  Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標）（前立腺癌）  Ｄｉｐｒｉｖａｎ（登録商標）（感覚脱失）  ＢｕＳｐａｒ（登録商標）（不安）  Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）（気管支痙攣）  Ｈｙｔｒｉｎ（登録商標）（高血圧）  Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ（登録商標）（抑鬱）  Ｚｙｒｔｅｃ（登録商標）（鼻炎）  Ｐｌａｖｉｘ（登録商標）（心筋梗塞／発作）  Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ（登録商標）（高血圧）
Ｔｅｎｏｒｍｉｎ（登録商標）（アンギナ）  Ｘａｌａｔａｎ（登録商標）（緑内障）
Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（登録商標）（喘息）  Ｄｉｏｖａｎ（登録商標）（高血圧）  Ｈａｒｎａｌ（登録商標）（前立腺肥大）  （非特許文献１）。
【０００５】
ＧＰＣＲは、共通の構造モチーフを共有し、この構造モチーフは、７つのαヘリックスを形成する２２〜２４個の疎水性アミノ酸からなる７つの配列を有し、このαヘリックスの各々は、膜に広がる（各広がりは、数により同定される。すなわち、膜貫通１（ＴＭ−１）、膜貫通２（ＴＭ−２）など）。この膜貫通ヘリックスは、膜貫通２と膜貫通３との間、膜貫通４と膜貫通５との間、ならびに膜貫通６と膜貫通７との間で、アミノ酸ストランドによって、細胞膜の外部（すなわち、「細胞外」側）で連結される（これらは、それぞれ「細胞外」領域１（ＥＣ−１）、細胞外領域２（ＥＣ−２）、および細胞外領域３（ＥＣ−３）と呼ばれる）。この膜貫通ヘリックスはまた、膜貫通１と膜貫通２との間、膜貫通３と膜貫通４との間、ならびに膜貫通５と膜貫通６との間で、アミノ酸ストランドによって、細胞膜の内部（すなわち、「細胞内」側）で連結される（これらは、それぞれ「細胞内」領域１（ＩＣ−１）、細胞内領域２（ＩＣ−２）、および細胞内領域３（ＩＣ−３）と呼ばれる）。このレセプターの「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は、細胞中の細胞内空間に存在し、そしてこのレセプターの「アミノ」（「Ｎ」）末端は、細胞外部の細胞外空間に存在する。
【０００６】
一般に、内因性リガンドが、このレセプターに結合した（「しばしば、そのレセプターの「活性化」と呼ばれる）場合、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」との間の共役を可能にする、細胞内領域のコンフォメーション変化が存在する。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に関して「無差別」である、すなわち、ＧＰＣＲは、１つより多くのＧタンパク質と相互作用し得ると、報告されている。Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｔ．，４３  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９５（１９８８）を参照のこと。他のＧタンパク質が存在するけれども、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧＺおよびＧＯが、同定されているＧタンパク質である。Ｇタンパク質と共役するリガンド活性化ＧＰＣＲは、シグナル伝達カスケードプロセス（「シグナル伝達」と呼ばれる）を開始する。通常の条件下では、シグナル伝達は、最終的には、細胞活性化または細胞阻害を生じる。理論に拘束されることは望まないが、このレセプターのＩＣ−３ループおよびカルボキシ末端が、Ｇタンパク質と相互作用すると、考えられる。
【０００７】
生理学的条件下で、ＧＰＣＲは、２つの異なるコンフォメーションである、「不活性」状態と「活性状態」との間で平衡して、細胞膜中に存在する。不活性状態にあるレセプターは、細胞内シグナル伝達経路に連結してシグナル伝達を開始して生物学的応答をもたらすことが、できない。活性状態へとレセプターのコンフォメーションが変化すると、（Ｇタンパク質を介する）この伝達経路への連結が可能になり、生物学的応答を生じる。
レセプターは、リガンドまたは化合物（例えば、薬物）により、活性状態で安定化され得る。最近の発見（このレセプターのアミノ酸配列に対する改変が挙げれられるが、排他的には限定しない）により、活性状態のコンフォメーションにこのレセプターを促して安定化させるための、リガンドとも薬物とも異なる手段が、提供される。これらの手段は、このレセプターへのリガンドの結合の効果を模倣することによって、活性状態にてこのレセプターを効果的に安定化させる。このようなリガンド非依存性手段による安定化は、「構成的レセプター活性」と呼ばれる。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｅｄ  Ａｄ  Ｎｅｗｓ  １９９９  Ｄａｔａ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本明細書中において、内因性バージョンおよび非内因性バージョンのヒトＧＰＣＲ、ならびにこれらの使用が、開示される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その非内因性の構成的活性化バージョン、およびそれを含む宿主細胞に関する。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号１のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号４のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号３のｃＤＮＡを含むプラスミド、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号６のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号５のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号７のｃＤＮＡを含むプラスミド、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１０のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号９のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１２のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その非内因性の構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号１１のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１４のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号１３のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１６のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号１５のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号１７のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号２０のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役レセプター、その構成的活性化バージョン、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態は、ベクターおよび配列番号１９のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれを含む宿主細胞に関する。
本発明は、以下を提供する。
（項目１）  配列番号２のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目２）  項目１に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目３）  ベクターおよび配列番号１のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目４）  項目３に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目５）  配列番号４のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目６）  項目５に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目７）  ベクターおよび配列番号３のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目８）  項目７に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目９）  配列番号６のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目１０）  項目９に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目１１）  ベクターおよび配列番号５のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目１２）  項目１１に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目１３）  配列番号８のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目１４）  項目１３に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目１５）  ベクターおよび配列番号７のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目１６）  項目１５に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目１７）  配列番号１０のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目１８）  項目１７に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目１９）  ベクターおよび配列番号９のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目２０）  項目１９に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目２１）  配列番号１２のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目２２）  項目２１に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目２３）  ベクターおよび配列番号１１のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目２４）  項目２３に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目２５）  配列番号１４のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目２６）  項目２５に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目２７）  ベクターおよび配列番号１３のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目２８）  項目２７に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目２９）  配列番号１６のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目３０）  項目２９に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目３１）  ベクターおよび配列番号１５のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目３２）  項目３１に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目３３）  配列番号１８のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目３４）  項目３３に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目３５）  ベクターおよび配列番号１７のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目３６）  項目３５に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目３７）  配列番号２０のアミノ酸配列によってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプター。
（項目３８）  項目３７に記載のＧタンパク質共役レセプターの、非内因性の構成的活性化バージョン。
（項目３９）  ベクターおよび配列番号１９のｃＤＮＡを含む、プラスミド。
（項目４０）  項目３９に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、セカンドメッセンジャーアッセイにおける、ＲＵＰ３２、Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ，Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉと同時トランスフェクトしたＲＵＰ３２、およびＣＭＶ（コントロール；発現ベクター）の活性化のグラフ表示であり、このアッセイは、２９３細胞を使用して、イノシトールリン酸塩（ＩＰ３）の蓄積を測定する。
【図２】図２は、コントロール（「ＣＭＶ」）と比較した、内因性バージョンのＲＵＰ３５およびＲＵＰ３６からのセカンドメッセンジャーＩＰ３の生成の図示を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
レセプターに関して発展した科学文献は、レセプターに対する種々の効果を有するリガンドを指すために、多数の用語を採用している。明確さおよび一貫性のために、以下の定義を、本特許出願全体を通して使用する。これらの定義がこれらの用語に関する他の定義と矛盾する程度までは、以下の定義が支配する：
「アゴニスト」とは、レセプターに結合した場合に細胞内応答を活性するか、または膜へのＧＴＰの結合を増強する、物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味するものとする。いくつかの実施形態において、「アゴニスト」は、レセプターに結合した場合に細胞内応答を活性化すること、または膜へのＧＴＰへの結合を増強することが、以前には既知でなかった物質である。
本明細書中にて使用される「アミノ酸の略語」が、表Ａに示される：
表Ａ
【００３２】
【表１】
2010166925.tif 000002
【００３３】
「アンタゴニスト」とは、アゴニストと同じ部位でレセプターに競合的に結合するが、そのレセプターの活性形態により開始される細胞内応答を活性化せず、それによりアゴニストによる細胞内応答を阻害し得る、物質（例えば、リガンド、候補化合物など）を意味するものとする。アンタゴニストは、アゴニストの非存在下では、ベースライン細胞内応答を減少させない。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、レセプターに結合した場合に細胞内応答を活性化すること、または膜へのＧＴＰの結合を増強することが、以前は既知でなかった物質である。
【００３４】
「候補化合物」とは、スクリーニング技術を受けることができる分子（例えば、化合物であるが、限定ではない）を意味するものとする。好ましくは、句「候補化合物」は、間接的同定プロセスにより以前に決定された、レセプターに対する逆のアゴニスト、レセプターに対するアゴニスト、またはレセプターに対するアンタゴニストかなる群より選択される、公に公知であった化合物（「間接的に同定された化合物」）を含まない；より好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物において治療効力を有すると以前に決定された、間接的に同定された化合物を含まない；最も好ましくは、ヒトにおいて治療効力を有すると以前に決定された、間接的に同定された化合物を含まない。
【００３５】
「組成物」とは、少なくとも１つの成分を含む物質を意味するものとする；「薬学的組成物」は、組成物の一例である。
【００３６】
「化合物効力」とは、化合物が、レセプター機能を阻害または刺激する能力（すなわち、レセプター結合親和性とは対照的に、シグナル伝達経路を活性化／阻害する能力）の尺度を意味するものとする。化合物効力を検出する例示的手段は、本明細書の実施例の節に開示される。
【００３７】
「コドン」とは、リン酸基に結合したヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ））を一般的には含み、翻訳されるとアミノ酸をコードする、３つのヌクレオチド（またはヌクレオチド等価物）の分類を意味するものとする。
【００３８】
「構成的活性化レセプター」とは、構成的レセプター活性化に供されるレセプターを意味するものとする。構成的活性化レセプターは、内因性であってもまたは非内因性であってもよい。
【００３９】
「構成的レセプター活性化」とは、レセプターとそのリガンドまたは化学的リガンド等価物との結合以外の手段によって、活性状態でのレセプターの安定化を意味するものとする。
【００４０】
「接触」または「接触する」とは、インビトロ系においてであろうとインビボ系においてであろうと、少なくとも２つの部分を一緒に合わせることを意味するものとする。
【００４１】
句「候補化合物」に関連する「直接的に同定する」または「直接的に同定された」とは、構成的活性化レセプター（好ましくは、構成的活性化オーファンレセプター、最も好ましくは、構成的活性化Ｇタンパク質共役細胞表面オーファンレセプター）に対して候補化合物をスクリーニングし、そしてそのような化合物の化合物効力を評価することを意味するものとする。この句は、いかなる状況においても、句「間接的に同定する」または「間接的に同定された」により包含されるともこの句を包含するとも解釈も理解もされるべきではない。
【００４２】
「内因性」とは、哺乳動物が天然で産生する物質を意味するものとする。例えば、限定ではないが、用語「レセプター」に関する「内因性」とは、哺乳動物（例えば、限定ではないが、ヒト）またはウイルスによって、天然に産生されることを意味するものとする。対照的に、この文脈における用語「非内因性」とは、哺乳動物（例えば、限定ではないが、ヒト）またはウイルスによって、天然に産生されないことを意味するものとする。例えば、限定ではないが、その内因性形態では構成的に活性ではないが、構成的に活性であるように操作された、レセプターは、最も好ましくは、本明細書中で、「非内因性の、構成的活性化レセプター」と呼ばれる。両方の用語は、「インビボ」系および「インビトロ」系の両方を記載するために使用され得る。例えば、限定ではないが、スクリーニングアプローチにおいて、内因性レセプターまたは非内因性レセプターは、インビトロスクリーニング系に関してであり得る。さらなる例として、限定ではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的活性化レセプターを含むように操作された場合、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが、実行可能である。
【００４３】
本明細書中に開示される本発明の文脈における「Ｇタンパク質共役レセプター融合タンパク質」および「ＧＰＣＲ融合タンパク質」とは、各々、少なくとも１つのＧタンパク質（最も好ましくは、そのようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これは、ＧＴＰに結合するサブユニットである））と融合された、内因性の構成的活性化ＧＰＣＲまたは非内因性の構成的活性化ＧＰＣＲを含む、非内因性タンパク質を意味し、このＧタンパク質は、好ましくは、内因性オーファンＧＰＣＲと天然で共役するＧタンパク質と同じ型である。例えば、限定ではないが、内因性状態で、そのＧタンパク質「Ｇｓα」が、ＧＰＣＲと共役する優性なＧタンパク質である場合、特定のＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇｓαに融合したＧＰＣＲを含む、非内因性タンパク質である；いくつかの状況において、以下に示されるように、非優性Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲに融合され得る。このＧタンパク質は、構成的活性化ＧＰＣＲのＣ末端に直接的に融合され得るか、またはこの二者の間にスペーサーが存在し得る。
【００４４】
「宿主細胞」とは、中に組み込まれたプラスミドおよび／またはベクターを有することができる、細胞を意味するものとする。原核生物宿主細胞の場合、プラスミドは、代表的には、宿主細胞が複製するときに自己由来分子として複製する（一般に、このプラスミドは、真核生物宿主細胞中への導入のためにその後単離される）；真核生物宿主細胞の場合、プラスミドは、その真核生物宿主細胞が複製した場合にそのプラスミドが複製するように、その宿主細胞の細胞ＤＮＡ中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、真核生物宿主細胞であり、より好ましくは、哺乳動物宿主細胞であり、最も好ましくは、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、およびＣＯＳ−７細胞からなる群より選択される。
【００４５】
「間接的に同定する」または「間接的に同定された」とは、薬物発見プロセスへの伝統的アプローチを意味し、このプロセスは、内因性レセプターに特異的な内因性リガンドの同定、そのリガンド−レセプター相互作用を妨害および／または競合する化合物を決定するための、そのレセプターに対する候補化合物のスクリーニング、ならびに活性化レセプターに関連する少なくとも１つのセカンドメッセンジャーに影響することについてその化合物の効力を評価する工程を包含する。
【００４６】
「阻害する」または「阻害」とは、用語「応答」に関連して、ある化合物の存在下で、その化合物の非存在下とは対照的に、応答が減少または妨害されることを意味するものとする。
【００４７】
「逆のアゴニスト」とは、内因性形態のレセプターまたは構成的活性化形態のレセプターのいずれかに結合し、そのレセプターの活性化形態により開始されるベースライン細胞内応答を、アゴニストの非存在下で観察される正常なベースラインレベル活性より低く阻害するかまたは膜へのＧＴＰの結合を減少させる、物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味するものとする。好ましくは、このベースライン細胞内応答は、その逆のアゴニストの非存在下でのベースライン応答と比較して、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、その逆のアゴニスト存在下で阻害される。
【００４８】
「既知のレセプター」とは、そのレセプターに特異的な内因性リガンドが同定された、内因性レセプターを意味するものとする。
【００４９】
「リガンド」とは、天然に存在するレセプターに特異的な分子を意味するものとする。
【００５０】
「変異体」または「変異」とは、内因性レセプターの核酸配列および／またはアミノ酸配列に関して、内因性の非構成的活性化レセプターの変異形態がそのレセプターの構成的活性化を示すような、そのような内因性配列に対する特定の変化を意味するものとする。特定の配列に対する等価物に関して、（ａ）ヒトレセプターの後で変異した形態の構成的活性化のレベルが、そのレセプターの最初の変異により示されるレベルと実質的に同じである場合；および（ｂ）そのレセプターの後で変異した形態と、そのレセプターの最初の変異との間の配列（アミノ酸配列および／または核酸配列）の相同性パーセントが、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％である場合に、そのヒトレセプターの後で変異した形態は、そのヒトレセプターの最初の変異と等価であると見なされる。いくつかの実施形態において、構成的活性化を達成するための本明細書中に開示されるいくつかの好ましいカセットが、そのＧＰＣＲの内因性形態と非内因性形態との間で単一アミノ酸変化および／または単一コドン変化を含むという事実が原因で、この配列相同性パーセントは、少なくとも９８％であるべきことが、好ましい。
【００５１】
「非オーファンレセプター」は、同定されたリガンドに特異的な、内因性の天然に存在する分子であって、ここで、レセプターに対するリガンドの結合は、細胞内シグナル伝達経路を活性化する、分子を意味するものとする。
【００５２】
「オーファンレセプター」は、そのレセプターに特異的なリガンドが、同定されていないかまたは未知である内因性レセプターを意味するものとする。
【００５３】
「薬学的組成物」は、少なくとも１つの活性成分を含む組成物であって、それによって、この組成物が、哺乳動物（例えば、限定ではなく、ヒト）における、指定された有効な結果についての調査に従う組成物を意味するものとする。当業者は、活性成分が、当業者の必要性に基づいて、所望の効力のある結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解し、そして認識する。
【００５４】
「プラスミド」は、ベクターとｃＤＮＡとの組み合わせを意味するものとする。一般に、プラスミドは、ｃＤＮＡの複製および／またはタンパク質としての発現の目的のために宿主細胞へと導入される。
【００５５】
「セカンドメッセンジャー」は、レセプター活性化の結果として生成される細胞内応答を意味するものとする。セカンドメッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｃｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）およびサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を含み得る。セカンドメッセンジャーの応答は、レセプター活性化の決定のために測定され得る。さらに、セカンドメッセンジャーの応答は、例えば、逆のアゴニスト、アゴニストおよびアンタゴニストを含む、候補化合物の直接同定のために測定され得る。
【００５６】
「シグナル対ノイズ比」は、活性化、増幅または刺激に応じて生じたシグナルであって、ここで、このシグナルは、バックグラウンドノイズまたは非活性化、非増幅もしくは非刺激に応じた基底レベルよりも高い、シグナルを意味するものとする。
【００５７】
「スペーサー」は、遺伝子（例えば、目的のＧＰＣＲ）の最後のコドンまたは最後のアミノ酸の後に位置するが、目的のＧタンパク質の開始コドンまたは開始領域の前に位置する、翻訳された多数のアミノ酸であって、ここで、翻訳された多数のアミノ酸は、目的のＧタンパク質の開始領域とインフレームで配置される、翻訳された多数のアミノ酸を意味するものとする。翻訳されたアミノ酸の数は、当業者の必要性に従って調整され得、そして一般に、約１アミノ酸、好ましくは２アミノ酸、より好ましくは３アミノ酸、より好ましくは４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、より好ましくは６アミノ酸、より好ましくは７アミノ酸、より好ましくは８アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは１１アミノ酸、そしてさらにより好ましくは１２アミノ酸からである。
【００５８】
用語「応答」との関係において、「刺激する」または「刺激している」は、応答が、化合物の非存在下でとは逆に、化合物の存在下で増大することを意味するものとする。
【００５９】
「実質的に」は、コントロールの結果の４０％以内、好ましくはコントロールの結果の３５％以内、より好ましくは３０％以内、より好ましくは２５％以内、より好ましくは２０％以内、より好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは２％以内、そして最も好ましくは１％以内である結果をいうものとする。例えば、レセプター機能性に関しては、本明細書中に教示される方法または当業者に公知の類似の方法を用いて測定した場合に、伝達されるシグナルが、コントロールのシグナルによって生成されるシグナルの４０％以内であるならば、試験レセプターは、コントロールレセプターと実質的に類似の結果を示し得る。
【００６０】
ｃＤＮＡに関してベクターは、少なくとも１つのｃＤＮＡを組み込み得、かつ宿主細胞へ組み込み得る、環状ＤＮＡを意味するものとする。
【００６１】
以下の節の順番を、表示効率のために示し、以下の開示についても特許請求の範囲についても、限定であることを意図せず、かつ、そのように解釈すべきではない。
【００６２】
（Ａ．序論）
レセプターの伝統的研究は代表的に、発見が進行して、このレセプターに影響を与え得るアンタゴニストおよび他の分子を見出し得る前に最初に、内因性リガンドが同定されなければならないという、（歴史的に基づく）事前の仮定から進行した。アンタゴニストが最初に知られ得た場合でさえ、この探索は直ちに、内因性リガンドを探すことに広げられた。この思考形態は、構成的に活性化されたレセプターが見出された後でさえ、レセプター調査において持続した。これまで認識されてこなかったのは、このレセプターのアゴニストおよび逆のアゴニストを見出すために最も有用なのは、活性状態のレセプターであるということである。過度に活性なレセプターまたは活性が低すぎる（ｕｎｄｅｒ−ａｃｔｉｖｅ）レセプターからもたらされる疾患に関しては、治療薬物において所望されるのは、内因性リガンドに対するアンタゴニストである薬物では必ずしも無い、それぞれ、レセプターの活性状態を低下させるように作用するかまたはレセプターの活性を増強するように作用する化合物である。これは、活性なレセプター状態の活性を低減または増強する化合物が、内因性リガンドと同じ部位に結合する必要は無いことによる。従って、本発明の方法によって教示されるように、治療化合物についての任意の探索は、リガンド非依存性の活性状態を排除するように化合物をスクリーニングすることによって開始されるべきである。
【００６３】
（Ｂ．ヒトＧＰＣＲの同定）
ヒトゲノムプロジェクトの努力によって、ヒトゲノム内に位置する核酸配列に関する過度の情報が同定された；この努力における事実は、任意の特定のゲノム配列が、ヒトタンパク質を翻訳するオープンリーディングフレーム情報を含むかもしくは含み得るかまたはそうでないかについて理解することも認識することもなく、遺伝子供配列情報が利用可能になったということである。ヒトゲノム内の核酸配列を同定するいくつかの方法は、当業者の範囲内である。例えば、そして限定ではないが、本明細書中に開示された種々のヒトＧＰＣＲを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭデータベースを検討することによって見出した。以下の表Ｂは、本発明者らが見出したいくつかの内因性ＧＰＣＲを、開示されたＧＰＣＲに相同である他のＧＰＣＲと一緒に列挙する。
【００６４】
【表２】
2010166925.tif 000003
【００６５】
レセプター相同性は、ヒトの身体内でのこのレセプターの役割の正しい認識の獲得に関して有用である。特許文献が進むにつれて、これらのレセプターを変異させて、これらのレセプターの非内因性の構成的活性化バージョンを確立するための技術が考察される。
【００６６】
本明細書中に開示された技術はまた、当業者に明らかなように、当該分野で公知の他のヒトＧＰＣＲに適用可能である。
【００６７】
（Ｃ．レセプタースクリーニング）
本明細書中に開示されたＧＰＣＲの非内因性の構成的活性化バージョンを排除した、候補化合物のスクリーニングは、レセプターの内因性リガンドの使用を必要とすることなく、細胞表面レセプターに作用する候補化合物の直接同定を可能にする。慣用的な、そしてしばしば商業的に利用される技術を用いて、本明細書中に開示されたヒトＧＰＣＲの内因性バージョンが発現および／または過剰発現する身体内領域を決定し得る。特定の組織におけるレセプターの発現位置によって、このレセプターの生理学的機能的役割を割り当てる能力が科学者に提供される。これらの技術を用いて、このレセプターの発現および／または過剰発現に関連した、関連の疾患／障害状態を決定することもまた可能である；このようなアプローチは、本特許文献中に開示される。さらに、罹病器官におけるレセプターの発現は、このレセプターの臨床的関連の大きさを決定することを補助し得る。
【００６８】
本明細書中に開示されるＧＰＣＲの構成的活性化は、ＧＰＣＲのＴＭ６内に位置すると予測されるプロリン残基からの距離に基づく；このアルゴリズム技術は、同時係属中でかつ同一人に譲渡された特許文書ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３９３８号（ＷＯ  ００／２２１２９として２０００年４月２０日に公開）（本明細書中に列挙される他の特許文書とともに、本明細書中に参考として援用される）に開示される。アルゴリズム技術は、伝統的な配列「アラインメント」に基づいては予測されておらず、むしろ、上記のＴＭ６プロリン残基（またはもちろん、このようなプロリン残基についての内因性の構成的置換）からの特定の距離について予測されている。この残基（おそらく、このレセプターのＩＣ３領域に存在する）から１６アミノ酸残基の位置に存在するアミノ酸残基を最も好ましくはリジン残基に変異させることによって、このレセプターの構成的活性化が得られ得る。他のアミノ酸残基は、この目的を達成するために、この位置での変異において有用であり得、そして以下で詳細に考察される。
【００６９】
（Ｄ．疾患／障害の同定および／または選択）
以下でずっと詳細に示すように、非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲに対する逆のアゴニストおよびアゴニストは、本発明の方法論によって同定され得る。このような逆のアゴニストおよびアゴニストは、このレセプターに関連する疾患を処置するための薬物発見プログラムにおけるリード化合物として理想的な候補である。ＧＰＣＲに対する逆のアゴニストを直接的に同定し、それによって薬学的組成物の開発を可能にする能力があるので、ＧＰＣＲに関連した疾患および障害についての探索は適切である。特定の組織におけるレセプターの発現位置によって、レセプターに対する生理学的機能を割り当てる能力が科学者に提供される。例えば、罹病組織サンプルおよび正常組織サンプルの両方を、ＧＰＣＲの存在について走査することは今や、学問的課題または特定のＧＰＣＲに対する内因性リガンドを同定する経路に伴って遂行され得るもの以上のものとなる。組織走査は、広範囲の健常組織および罹病組織にわたって実施され得る。このような組織走査は、特定のレセプターを疾患および／または障害と関連付ける際の潜在的第一工程を提供する。さらに、罹病器官におけるレセプターの発現は、このレセプターの臨床的関連性の大きさを決定する際に同定することを補助し得る。
【００７０】
ＧＰＣＲのＤＮＡ配列を用いて、プローブ／プライマーを作製し得る。いくつかの好ましい実施形態では、このＤＮＡ配列を用いて、以下のためのプローブを作製する：（ａ）組織ｍＲＮＡに対するドット−ブロット分析、および／または（ｂ）組織サンプルにおけるこのレセプターの発現のＲＴ−ＰＣＲ同定。組織供給源もしくは罹病組織におけるレセプターの存在、または罹病した組織における、正常組織と比較して上昇した濃度でのこのレセプターの存在を用いて、位置を機能に対して相関させ得、そしてレセプターの生理学的役割／機能を示し得、そしてその機能／役割に関連した疾患を含むがこれらに限定されない処置レジメンを生成し得る。レセプターはまた、この技術によって、器官の領域に局在され得る。レセプターが局在させられる特定の組織の既知または推定の役割／機能に基づいて、このレセプターの推定の生理学的機能が推測され得る。例えば、そして限定ではないが、視床の領域において位置および／または発現するタンパク質は、感覚運動処理および覚醒に関連する（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，４６５頁（１９９６）を参照のこと）。海馬またはＳｃｈｗａｎｎ細胞において発現されたタンパク質は、それぞれ、学習および記憶、ならびに末梢神経の髄鞘形成に関連する（それぞれ、Ｋａｎｄｅｌ，Ｅ．ら，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ、６５７頁、６８０頁および２８頁（１９９５））。
【００７１】
（Ｅ．候補化合物のスクリーニング）
（１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
Ｇタンパク質レセプターが構成的に活性になる場合、これは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合し、そしてＧタンパク質に対するＧＴＰの結合を刺激する。次いで、このＧタンパク質は、ＧＴＰａｓｅとして作用し、そしてＧＴＰをＧＤＰへと加水分解し、それによって、このレセプターは、正常条件下で、不活化されることとなる。しかし、構成的に活性化されたレセプターは、ＧＤＰをＧＴＰへと交換し続ける。ＧＴＰの加水分解可能でないアナログ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、構成的に活性化されたレセプターを発現する膜に対する増強された結合をモニタリングし得る。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、リガンドの非存在下および存在下での膜に対するＧタンパク質カップリングをモニタリングし得ることが報告されている。このモニタリングの一例は、当業者に周知および利用可能な他の例の中でも、ＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって１９９５年に報告された。このアッセイ系の使用は代表的に、候補化合物の最初のスクリーニングのためである。なぜなら、この系は包括的に、このレセプターの細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらず、全てのＧタンパク質共役レセプターに適用可能である。
【００７２】
（２．特異的ＧＰＣＲスクリーングアッセイ技術）
「包括的」Ｇタンパク質共役レセプターアッセイ（すなわち、アゴニストまたは逆のアゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いて候補化合物が一旦同定されたら、この化合物がレセプター部位で相互作用したことを確認するさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセイによって同定される化合物は、レセプターに結合しないかもしれないが、その代わり、Ｇタンパク質を細胞内ドメインから単に「脱共役」し得る。
【００７３】
（ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ）
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。一方、Ｇｉ（ならびにＧｚおよびＧｏ）は、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼは、ｃＡＭＰへのＡＴＰの変換を触媒する；従って、Ｇｓタンパク質を共役する、構成的に活性化されたＧＰＣＲは、上昇した細胞レベルのｃＡＭＰに関連する。一方、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質を共役する、構成的に活性化されたＧＰＣＲは、低下した細胞レベルのｃＡＭＰに関連する。一般的に、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、そのレセプターに対する逆のアゴニストである（すなわち、このような化合物は、ｃＡＭＰのレベルを減少させる）か否かを決定し得る。ｃＡＭＰを測定するための、当該分野で公知の種々のアプローチが利用され得る；最も好ましいアプローチは、ＥＬＩＳＡベースの形式における抗ｃＡＭＰ抗体の使用に頼る。利用され得る別の型のアッセイは、細胞全体のセカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進することによって遺伝子発現を駆動し、ＣＲＥＢは次いで、特定の部位（ｃＡＭＰ応答性エレメント）でプロモーターに結合し、そして遺伝子の発現を駆動する。プロモーターを有するレポーター系であって、このプロモーターが、レポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）の前に複数のｃＡＭＰ応答エレメントを含むレポーター系が構築され得る。従って、構成的に活性化されたＧｓ連結レセプターは、ｃＡＭＰ蓄積を引き起こし、このことは次いで、この遺伝子を活性化して、このレポータータンパク質の発現を導く。次いで、レポータータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）は、標準的生化学アッセイ（Ｃｈｅｎら  １９９５）を用いて検出され得る。
【００７４】
（ｂ．ＧｏおよびＧｑ）
ＧｑおよびＧｏは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、これは次いで、リン脂質ＰＩＰ２を加水分解して、以下の２つの細胞内メッセンジャーを放出する：ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｃｌｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｐｈｏｉｓｐｈａｔｅ）（ＩＰ３）。ＩＰ３の増大した蓄積は、Ｇｑ関連レセプターおよびＧｏ関連レセプターの活性化と関連する。一般的に、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）。ＩＰ３蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、Ｇｑ関連レセプターまたはＧｏ関連レセプターに対する逆のアゴニストである（すなわち、このような化合物は、ＩＰ３のレベルを低下させる）か否かを決定し得る。Ｇｑ関連レセプターをまた、ＡＰ１レポーターアッセイを用いて試験し得、ここで、Ｇｑ依存的ホスホリパーゼＣは、ＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こす；従って、活性化されたＧｑ関連レセプターは、このような遺伝子の発現における増大を立証し、それによって、それに対する逆のアゴニストは、このような発現における減少を立証し、そしてアゴニストはこのような発現における増大を立証する。このような検出のための市販のアッセイが利用可能である。
【００７５】
（３．ＧＰＣＲ融合タンパク質）
逆のアゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングにおいて使用するための、内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲの使用において、明らかに、レセプターが、それに結合する内因性リガンドの非存在下でさえ、活性であるという点で、アゴニストは、興味深いスクリーニングチャレンジを提供する。従って、例えば、候補化合物の存在下の非内因性レセプターと、その化合物の非存在下での非内因性レセプターとの識別のような識別によって、このような化合物が逆のアゴニストもしくはアゴニストであり得る、またはこのようなレセプターに対して何の効果も有さないかについての理解を可能にすることを目的として、候補化合物の存在下の非内因性レセプターと、その化合物の非存在下での非内因性レセプターとを識別するために、このような識別を増強し得るアプローチを利用することが好ましい。好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【００７６】
一般に、上記のアッセイ技術（ならびに他の技術）を用いて、非内因性ＧＰＣＲが構成的に活性化されていることが一旦決定されたら、内因性ＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲに対するＧタンパク質の共役は、評価され得るシグナル伝達経路を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物発現系を用いてスクリーニングを行うことが好ましく、このような系は、その中に内因性Ｇタンパク質を有すると予測される。従って、明らかに、このような系では、非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲは、連続してシグナルを発する。いくつかの実施形態では、このシグナルが増強され、その結果、例えば、レセプターに対する逆のアゴニストの非存在下では、逆のアゴニストと接触した場合のこのレセプターとの間を（特に、スクリーニングの状況において）より容易に識別し得る可能性がより高いことが好ましい。
【００７７】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内因性ＧＰＣＲとのＧタンパク質共役の効力を増強することが意図される。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲのいずれかを用いたスクリーニングのために好ましい。なぜなら、このようなアプローチは、このようなスクリーニング技術において利用されるシグナルを増大させるからである。これは、顕著な「シグナル対ノイズ」比を容易にする際に重要である；このような顕著な比は、本明細書中に開示されたような候補化合物のスクリーニングのために好ましい。
【００７８】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現のために有用な構築物の構築は、当業者の範囲内にある。市販の発現ベクターおよび系は、調査者の特定の必要性に適合し得る種々のアプローチを提供する。このようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の構築についての重要な基準としては、内因性ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列が両方ともインフレームであること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲについての配列がＧタンパク質配列の上流にある）、およびＧＰＣＲの発現の際にこのＧタンパク質もまた発現され得るように、ＧＰＣＲの「停止」コドンが欠失または置換されていることが挙げられるがこれらに限定されない。他の実施形態としては、内因性ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列がインフレームでなく、そして／または「停止」コドンが欠失も置換もされていない構築物が挙げられる。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に対して直接的に連結され得るか、または２つ（好ましくは約１２以下だがこの数は当業者によって容易に確認され得る）の間にスペーサー残基が存在し得る。便宜性に基づいて、スペーサーを使用することが好ましい。好ましくは、非内因性ＧＰＣＲに共役するＧタンパク質は、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の作製の前に同定されている。Ｇタンパク質はほんのいくつかしか同定されていないので、Ｇタンパク質の配列を含む構築物（すなわち、ユニバーサルＧタンパク質構築物（実施例を参照のこと））が、その中への内因性ＧＰＣＲ配列の挿入のために利用可能であることが好ましい；このことは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模スクリーニングの状況においてさらなる効率を提供する。
【００７９】
上記のように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに共役する、構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの形成を阻害すると予測され、このことは、これらの型のＧＰＣＲに基づくアッセイを困難なものとする（すなわち、ｃＡＭＰシグナルは、活性化されると減少し、それゆえ、例えば、逆のアゴニスト（これはさらにこのシグナルを減少させる）の直接同定を困難なものとする）。本明細書中に開示されるように、本発明者らは、これらの型のレセプターについて、実行可能なシクラーゼベースのアッセイを確立する努力において、ＧＰＣＲ内因性Ｇタンパク質に基づかないＧＰＣＲ融合タンパク質を作製することが可能であることを確認した。従って、例えば、内因性Ｇｉ共役レセプターは、Ｇｓタンパク質へと融合され得る−このような融合構築物は、発現の際に、内因性ＧＰＣＲを「天然の」Ｇｉタンパク質ではなく、例えば、Ｇｓと共役するように「駆動」または「強要」し、その結果、シクラーゼベースのアッセイが確立され得る。従って、Ｇｉ共役レセプター、Ｇｚ共役レセプターおよびＧｏ共役レセプターは、いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ融合タンパク質が用いられ、そしてアッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づく場合、融合構築物が、Ｇｓ（または酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する等価なＧタンパク質）を用いて確立されることが好ましい。
【００８０】
【表３】
2010166925.tif 000004
【００８１】
同等に有効であるのは、Ｇｓタンパク質、Ｇｉタンパク質、Ｇｚタンパク質またはＧｏタンパク質と融合したＧｑタンパク質を利用するＧタンパク質融合構築物である。いくつかの実施形態では、好ましい融合構築物は、Ｇｑタンパク質を用いて達成され得、ここで、Ｇタンパク質α−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６個のアミノ酸は欠失しており、そしてＧａｑのＣ末端の最後の５個のアミノ酸は、目的のＧタンパク質のＧαの対応するアミノ酸で置換されている。例えば、融合構築物は、Ｇｉタンパク質と融合したＧｑ（６個のアミノ酸欠失）を有し得、「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築物」をもたらす。この融合構築物は、内因性Ｇｉ共役レセプターがその非内因性Ｇタンパク質Ｇｑに対して共役するように強要し、その結果、セカンドメッセンジャー（例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロール）が、ｃＡＭＰ生成の代わりに測定され得る。
【００８２】
（４．標的Ｇｉ共役ＧＰＣＲとシグナルエンハンサーＧｓ共役ＧＰＣＲとの同時トランスフェクション（ｃＡＭＰベースのアッセイ））
Ｇｉ共役レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害することが公知であり、それゆえ、ｃＡＭＰ生成のレベルを低下させ、このことは、ｃＡＭＰレベルの評価を困難にし得る。活性化されるとＧｉと優先的に共役するレセプターの構成的活性化の指標として、ｃＡＭＰの生成における減少を測定する際の１つの有効な技術は、シグナルエンハンサー（例えば、活性化されるとＧｓと優先的に共役する非内因性の構成的に活性化されたレセプター）（例えば、以下に開示されるＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）をＧｉ連結ＧＰＣＲと同時トランスフェクトすることによって達成され得る。明らかであるように、Ｇｓ共役レセプターの構成的活性化は、ｃＡＭＰの生成における増加に基づいて決定され得る。Ｇｉ共役レセプターの構成的活性化は、ｃＡＭＰ生成における減少を導く。従って、同時トランスフェクションアプローチは、これらの「逆の」効果（ａｆｆｅｃｔ）を有利に利用することが意図される。例えば、非内因性の構成的に活性化されたＧｓ共役レセプター（「シグナルエンハンサー」）と内因性Ｇｉ共役レセプター（「標的レセプター」）との同時トランスフェクションは、ベースラインのｃＡＭＰシグナルを提供する（すなわち、Ｇｉ共役レセプターはｃＡＭＰレベルを低下させるが、この「低下」は、構成的に活性化されたＧｓ共役シグナルエンハンサーによって確立される、ｃＡＭＰレベルにおける実質的上昇と比較してである）。次いで、このシグナルエンハンサーを、構成的活性化バージョンの標的レセプターと同時トランスフェクトすることによって、ｃＡＭＰは、Ｇｉ標的の上昇した機能的活性（すなわち、これは、ｃＡＭＰを減少させる）に起因して、（ベースラインと比較して）さらに減少すると予想される。
【００８３】
次いで、ｃＡＭＰベースのアッセイを用いた候補化合物のスクリーニングは、内因性レセプター／Ｇタンパク質融合物の使用と比較した２つの「変化」を用いて達成され得る：第一に、Ｇｉ共役標的レセプターと比較して、「逆の」効果がもたらされる（すなわち、Ｇｉ共役標的レセプターの逆のアゴニストは、測定されるｃＡＭＰシグナルを増加させ、一方、Ｇｉ共役標的レセプターのアゴニストは、このシグナルを減少させる；第二に、明らかなように、このアプローチを用いて直接的に同定される候補化合物は、独立して評価されて、これらがシグナル増強レセプターを標的としないことを確実にするべきである（これは、同時トランスフェクトされたレセプターに対するスクリーニングの前または後に行われ得る）。
【００８４】
（Ｆ．医薬品化学）
一般に、しかし常にではなく、候補化合物の直接同定は、コンビナトリアルケミストリー技術を介して生成される化合物に関連して行われ、それによって、数千の化合物が、このような分析のためにランダムに調製される。一般に、このようなスクリーニングの結果は、独特のコア構造を有する化合物である；その後、これらの化合物は、好ましいコア構造の周囲のさらなる化学修飾に供されて、その医学的特性がさらに増強され得る。このような技術は、当業者に公知であり、そして本特許文書において詳細に取り扱われない。
【００８５】
（Ｇ．薬学的組成物）
さらなる開発のために選択された候補化合物は、当業者に周知の技術を用いて薬学的組成物中に処方され得る。適切な、薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に利用可能である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｏｓｏｌら編）を参照のこと。
【００８６】
（Ｈ．他の有用性）
本明細書中に開示された非内因性バージョンのＧＰＣＲの好ましい使用は、（好ましくは薬学的薬剤としての使用のための）逆のアゴニストまたはアゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであり得るが、これらのバージョンのＧＰＣＲの他の用途が存在する。例えば、ＧＰＣＲを取り込んだインビトロおよびインビボでの系を利用して、これらのレセプターが、ヒトの（正常および罹病の両方の）状態において果たす役割をさらに解明および理解し得、そしてシグナル伝達カスケードを理解するためにこれを適用する場合、構成的活性化の役割を理解し得る。いくつかの実施形態では、内因性レセプターが「オーファンレセプター」、すなわち、レセプターに対する内因性リガンドが同定されていないことが好ましい。それゆえ、いくつかの実施形態では、それゆえ、内因性リガンドが同定される前に、改変された非内因性ＧＰＣＲを用いて、ヒトの身体における内因性レセプターの役割を理解し得る。このようなレセプターをまた用いて、既知のレセプターおよびそれらがシグナルを伝達する経路をさらに解明し得る。開示されたレセプターの他の用途は、とりわけ、本特許文書の概説に基づいて当業者に明らかになる。
【００８７】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の解明の目的で提示され、限定の目的で提示されるわけではない。特定の核酸配列およびアミノ酸配列が本明細書中に開示されているが、当業者は、以下に報告されるのと同じまたは実質的に類似の結果を達成しながらも、これらの配列に対するマイナーな改変を行う能力があると考えられる。ある配列由来の配列カセットの、別の配列由来の配列カセットへの（例えば、ラットレセプターからヒトレセプターへの、またはヒトレセプターＡからヒトレセプターＢへの）適用または理解のための伝統的アプローチは一般的に、配列アラインメント技術に対して推定され、それによって、配列は、共通性のある領域を決定するための努力においてアラインメントされる。本明細書中に開示された変異アプローチは、このアプローチに頼らないが、その代わりにアルゴリズムアプローチおよびヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する保存されたプロリン残基からの位置的距離に基づく。一旦このアプローチが確実にされたら、当業者は、それに対するマイナーな改変を行って、本明細書中に開示されたのと実質的に同じ結果（すなわち、構成的活性化）を達成する能力があると考えられる。このような改変版のアプローチは、本開示の範囲内にあると考えられる。
【００８８】
（実施例１：内因性ヒトＧＰＣＲＳ）
（１．ヒトＧＰＣＲの同定）
開示された内因性ヒトＧＰＣＲを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭデータベース情報の概要に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、以下のｃＤＮＡクローンを、以下（表Ｃ）に証明するように同定した。
【００８９】
【表４】
2010166925.tif 000005
【００９０】
（２．全長クローニング）
（ａ．ｈＲＵＰ２８（配列番号１および２））
開示されたヒトＲＵＰ２８を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＣ０７３９５７のｃＤＮＡクローンを、第７染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【００９１】
全長ＲＵＰ２８を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒト成人肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲによってクローニングした：
５’−ＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号２１；センス、開始コドンの５’側）、５’−ＣＴＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２２；アンチセンス、停止コドンの３’側）。ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる、５０μｌ反応における増幅のために用いた：９５℃で５分間；９４℃で３０秒間；５８℃で３０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【００９２】
１．１６ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号１を、そして推定アミノ酸配列については配列番号２を参照のこと。
【００９３】
（ｂ．ｈＲＵＰ２９（配列番号３および４））
開示されたヒトＲＵＰ２９を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＣ００８３８６５のｃＤＮＡクローンを、第７染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【００９４】
全長ＲＵＰ２９を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒトゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによってクローニングした：
【００９５】
【化１】
2010166925.tif 000006
【００９６】
ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによって、５０μｌ反応における増幅のために用いた：９４℃で５分間；９４℃で３０秒間；５４℃で３０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【００９７】
９３０ｂｐのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。
【００９８】
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を、ヒト白血球および卵巣のＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行って、ＲＵＰ２９  ｃＤＮＡの正確な５’末端を決定した。ＲＵＰ２９特異的プライマー（１）（配列：５−ＧＧＴＡＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＣＣ−３’（配列番号２５）を有する）およびＡＰ１プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、１回目のＰＣＲ反応のために用い、そしてＲＵＰ２９特異的プライマー（２）（以下の配列を有する：５’−ＧＧＡＡＣＧＴＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２６））およびＡＰ２プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、２回目のＰＣＲ反応のために用いた。ＲＡＣＥ反応の産物を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして配列決定した。核酸配列については配列番号３を、そして推定アミノ酸配列については配列番号４を参照のこと。
【００９９】
（ｃ．ｈＲＵＰ３０（配列番号５および６））
開示されたヒトＲＵＰ３０を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＣ０５５８６３のｃＤＮＡクローンを、第１７染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１００】
全長ＲＵＰ３０を、テンプレートとしてのヒト膵臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ
ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲによってクローニングし、そして以下のオリゴヌクレオチド：５’−ＧＣＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２７；センス、開始コドンを含む）、およびＡＰ１プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１回目のＲＴ−ＰＣＲのために用い、そしてオリゴヌクレオチド：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’（配列番号２８；アンチセンス、停止コドンを含む）およびＡＰ２プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を２回目のＰＣＲのために用いた。５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって作製されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＳＰ６／Ｔ７プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて配列決定した。
【０１０１】
５’ＲＡＣＥ産物の配列に基づいて、全長ＲＵＰ３０を、以下のプライマーならびにテンプレートとしてのヒト膵臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした：
【０１０２】
【化２】
2010166925.tif 000007
【０１０３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる５０μｌの反応における増幅のために用いた：９４℃で４０秒間；９４℃で２０秒間；６４℃で２０秒間；７２℃で２分間；および７２℃で５分間。
【０１０４】
１．２ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしていくつかのクローンを、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号５を、そして推定アミノ酸配列については配列番号６を参照のこと。
【０１０５】
（ｄ．ｈＲＵＰ３１（配列番号７および８））
開示されたヒトＲＵＰ３１を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＬ３５６２１４のｃＤＮＡクローンを、第１０染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１０６】
全長ＲＵＰ３１を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒト乳腺Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした：
【０１０７】
【化３】
2010166925.tif 000008
【０１０８】
ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによって、５０μｌ反応における増幅のために用いた：９４℃で４０秒間；９４℃で２０秒間；６６℃で２０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で５分間。
【０１０９】
１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号７を、そして推定アミノ酸配列については配列番号８を参照のこと。
【０１１０】
（ｅ．ｈＲＵＰ３２（配列番号９および１０））
開示されたヒトＲＵＰ３２を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＬ５１３５２４のｃＤＮＡクローンを、第６染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１１１】
全長ＲＵＰ３２を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲによってクローニングした：
【０１１２】
【化４】
2010166925.tif 000009
【０１１３】
ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる増幅のために用いた：９４℃で３分間；９４℃で２０秒間；５８℃で２０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【０１１４】
１．０６のｋｂ  ＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号９を、そして推定アミノ酸配列については配列番号１０を参照のこと。
【０１１５】
（ｆ．ｈＲＵＰ３３（配列番号１１および１２））
開示されたヒトＲＵＰ３３を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＬ５１３５２４のｃＤＮＡクローンを、第６染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１１６】
全長ＲＵＰ３３を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲによってクローニングした：
【０１１７】
【化５】
2010166925.tif 000010
【０１１８】
ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる増幅のために用いた：９４℃で３分間；９４℃で２０秒間；５６℃で２０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【０１１９】
１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号１１を、そして推定アミノ酸配列については配列番号１２を参照のこと。
【０１２０】
（ｇ．ｈＲＵＰ３４（配列番号１３および１４））
開示されたヒトＲＵＰ３４を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＬ５１３５２４のｃＤＮＡクローンを、第６染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１２１】
全長ＲＵＰ３４を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲによってクローニングした：
【０１２２】
【化６】
2010166925.tif 000011
【０１２３】
ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる増幅のために用いた：９４℃で３分間；９４℃で２０秒間；６０℃で２０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【０１２４】
１．２７ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号１３を、そして推定アミノ酸配列については配列番号１４を参照のこと。
【０１２５】
（ｈ．ｈＲＵＰ３５（配列番号１５および１６））
開示されたヒトＲＵＰ３５を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＣ０２１０８９のｃＤＮＡクローンを、第１６染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１２６】
ＲＵＰ３５の５’配列を、テンプレートとしてヒト胎児脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって決定した。オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＴＡＴＧＡＧＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号３９；センス）およびＡＰ１プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１回目のＲＴ−ＰＣＲのために用い、そしてオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＴＡＣＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号４０；アンチセンス）およびＡＰ２プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を２回目のＰＣＲのために用いた。５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって生成されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＳＰ６／Ｔ７プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて配列決定した。
【０１２７】
５’ＲＡＣＥ産物の配列に基づいて、全長ＲＵＰ３５を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒト脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした：
【０１２８】
【化７】
2010166925.tif 000012
【０１２９】
ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、工程２〜工程４を４５回繰り返す以下のサイクルによる１００μｌの反応における増幅のために用いた：９５℃で２分間；９５℃で２０秒間；６０℃で２０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で５分間。
【０１３０】
１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号１５を、そして推定アミノ酸配列については配列番号１６を参照のこと。
【０１３１】
（ｉ．ｈＲＵＰ３６（配列番号１７および１８））
開示されたヒトＲＵＰ３６を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、登録番号ＡＣ０９００９９のｃＤＮＡクローンを、第１１染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１３２】
全長ＲＵＰ３６を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲによってクローニングした：
５’−ＣＡＴＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４３；センス、開始コドンの５’側）、
５’−ＧＡＣＡＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＣＧＴＣＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号４４；アンチセンス、停止コドンの３’側）。ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３０回繰り返す以下のサイクルによる５０μｌの反応における増幅のために用いた：９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；７０℃で３０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【０１３３】
１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号１７を、そして推定アミノ酸配列については配列番号１８を参照のこと。
【０１３４】
（ｊ．ｈＲＵＰ３７（配列番号１９および２０））
開示されたヒトＲＵＰ３７を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。データベースを検索する間に、登録番号ＡＣ０９００９９のｃＤＮＡクローンを、第１１染色体由来のヒトゲノム配列と同定した。
【０１３５】
全長ＲＵＰ３７を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲによってクローニングした：５’−ＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧ−３’（配列番号４５；センス）；５’−ＧＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号４６；アンチセンス）。ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる増幅のために用いた：９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；６２℃で３０秒間；７２℃で１分３０秒間；および７２℃で７分間。
【０１３６】
９６９塩基対を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。核酸配列については配列番号１９を、そして推定アミノ酸配列については配列番号２０を参照のこと。
【０１３７】
（実施例２：非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲの調製）
当業者は、核酸配列の変異のための技術を選択する能力を有すると考えられる。以下に提示されるのは、上記で開示されたヒトＧＰＣＲのいくつかの非内因性バージョンを作製するために利用されるアプローチである。以下に開示される変異は、アルゴリズムアプローチに基づき、それによって、保存されたプロリン（またはそれについての内因性の保存的置換）残基（ＴＭ６／ＩＣ３界面付近のＧＰＣＲのＴＭ６領域に位置する）から１６番目のアミノ酸（ＧＰＣＲのＩＣ３領域に位置する）を、好ましくはアラニン、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｍｉｎｅ）、アルギニンまたはリジンのアミノ酸残基、最も好ましくはリジンのアミノ酸残基へと変異させる。
【０１３８】
（１．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＴＭ変異誘発）
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、とりわけ、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＴＭ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造業者の指示に従って用いて、ヒトＧＰＣＲにおいて達成され得る。いくつかの実施形態では、２つの変異誘発プライマー（好ましくは、リジン変異を作製するリジン変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド）が用いられる。便宜のために、ヒトＧＰＣＲに組み込まれるべきコドン変異もまた、標準形態で注記される（表Ｄ）：
【０１３９】
【表５】
2010166925.tif 000013
【０１４０】
（実施例３：レセプター発現）
タンパク質の発現のために当業者に種々の細胞が入手可能であるが、哺乳動物細胞が利用されることが好ましい。この主な理由は、実際的なことに基づいて推定される。すなわち、例えば、ＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用は、可能であるが、哺乳動物系について進化したレセプター共役、遺伝的機構および分泌経路を含まないかもしれない（実際、酵母の場合含まない）非哺乳動物細胞をこのプロトコルに導入し、従って、非哺乳動物細胞において得られる結果は、潜在的用途はあるとはいえ、哺乳動物細胞を用いて得られる結果ほど好ましくはない。哺乳動物細胞のうち、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞および２９３Ｔ細胞は特に好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は、当業者の特定の必要性に基づいて推定され得る。
【０１４１】
（ａ．一過性トランスフェクション）
１日目に、６×１０６細胞／１０ｃｍディッシュの２９３細胞のウェルをプレーティングした。２日目に、２つの反応チューブを調製した（各チューブについての以下の比率は、１プレートあたりである）：チューブＡを、０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中の４μｇ  ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；レセプターｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクターなど）を混合することによって調製した；チューブＢを、０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中の２４μｌのリポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することによって調製した。チューブＡおよびＢを、（数回）反転することによって混合し、続いて室温で３０分間〜４５分間にわたってインキュベートした。この混合物を、「トランスフェクション混合物」という。プレーティングした２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍｌ無血清ＤＭＥＭを添加した。１ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて３７℃／５％  ＣＯ２で４時間にわたってインキュベートした。トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍを添加した。細胞を３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、細胞を収集し、そして分析のために利用した。
【０１４２】
（ｂ．安定な細胞株）
約１２×１０６個の２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレートにプレーティングし、そして１０％ウシ胎仔血清および１パーセントのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含有するＤＭＥ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ中で増殖させる。２９３細胞のプレーティングの２４時間後（約８０％コンフルエンシーまで）、細胞を、１２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを、６０μｌのリポフェクトアミンおよび２ｍＬの無血清ＤＭＥ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍと合わせる。培地をこのプレートから吸引し、そして細胞を無血清培地で１回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクトアミンおよび培地混合物を、１０ｍＬの無血清培地とともにこのプレートに添加する。４〜５時間にわたる３７℃でのインキュベーション後、培地を吸引し、そして２５ｍｌの血清含有培地を添加する。トランスフェクションの２４時間後、再度培地を吸引し、そして新鮮な血清含有培地を添加する。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、そしてジェネティシン（Ｇ４１８薬物）を５００μｇ／ｍＬの最終濃度で含有する血清含有培地を添加する。次いで、トランスフェクトした細胞を、Ｇ４１８耐性遺伝子を含む、ポジティブにトランスフェクトされた細胞について選択する。培地を、選択をしながら、４〜５日毎に交換する。選択の間、細胞を増殖させて、安定なプールを作製するか、または安定なクローン選択のために分ける。
【０１４３】
（実施例４：非内因性ＧＰＣＲの構成的活性の決定のためのアッセイ）
種々のアプローチが、非内因性ヒトＧＰＣＲの構成的活性の評価のために利用可能である。以下は例示である；当業者は、当業者の要求に優先的に有益である技術を決定する能力を有すると考えられる。
【０１４４】
（１．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
Ｇタンパク質共役レセプターが、リガンド結合または構成的活性化の結果のいずれかとして、その活性な状態にある場合、このレセプターは、Ｇタンパク質に共役し、そしてＧＤＰの放出およびその後の、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質−レセプター複合体のαサブユニットはＧＴＰａｓｅとして作用し、そしてＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解し、この時点で、このレセプターは通常非活化される。構成的に活性化されたレセプターは、ＧＤＰをＧＴＰへと交換し続ける。加水分解可能でないＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを利用して、構成的に活性化されたレセプターを発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の増強を実証し得る。構成的活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いることの利点は、以下を含むがこれらに限定されない：（ａ）これは、全てのＧタンパク質共役レセプターに包括的に適用可能である；（ｂ）これは、膜表面に近位であり、細胞内カスケードに影響を与える分子を拾い上げる可能性を少なくする。
【０１４５】
このアッセイは、Ｇタンパク質共役レセプターが、関連するレセプターを発現する膜に対する［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する能力を利用する。それゆえ、このアッセイを直接同定法において用いて、構成的に活性化されたＧタンパク質共役レセプターに対する候補化合物をスクリーニングし得る。このアッセイは包括的であり、そして全てのＧタンパク質共役レセプターでの薬物の発見に適用される。
【０１４６】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭと約２０ｍＭとの間（この量は、結果の最適化のために調整され得るが、２０ｍＭが好ましい）のＭｇＣｌ２（ｐＨ７．４）、約０．３ｎＭと約１．２ｎＭとの間の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は、結果の最適化のために調整され得るが、１．２が好ましい）を含む結合緩衝液、および１２．５μｇ〜７５μｇの膜タンパク質（例えば、Ｇｓ融合タンパク質を発現する２９３細胞；この量は、最適化のために調整され得る）、および１０μＭ  ＧＤＰ（この量は最適化のために変更され得る）中で１時間にわたってインキュベートする。次いで、コムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そして混合物をさらに３０分間にわたって室温でインキュベートする。次いで、チューブを１５００×ｇで５分間にわたって室温で遠心分離し、次いで、シンチレーションカウンター中で計数する。
【０１４７】
（２．アデニリルシクラーゼ）
細胞ベースのアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）を、粗製原形質膜を用いた使用のために改変し得る。Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異抗体をまた含むシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）コーティングを含み得る。ウェル中で生成されたｃＡＭＰを、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接的競合によって定量し得る。以下は、このレセプターを発現する細胞全体におけるｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡略なプロトコルとして役立つ。
【０１４８】
トランスフェクトされた細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に収集する。培地を注意深く吸引して捨てる。１０ｍｌのＰＢＳを、細胞の各ディッシュに穏やかに添加し、続いて注意深く吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを各プレートに添加する。細胞をピペットでプレートから取り出し、そして細胞懸濁液を５０ｍｌの円錐形遠心管に収集する。細胞を室温で、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）中に注意深く再懸濁する。次いで、細胞を、血球計算板を用いて計数し、そしてさらなるＰＢＳを添加して、（約５０μｌ／ウェルの最終容量になるように）適切な数の細胞を得る。
【０１４９】
ｃＡＭＰ標準およびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１１ｍｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ  ｃＡＭＰ（５０μｌ］を含む）を、製造業者の指示に従って調製し、そして維持する。Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを、スクリーニングのために新たに調製し、そしてこれは、５０μｌのＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、３μｌの試験化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含む。Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを、利用するまで氷上で保存する。このアッセイを、適切なウェルへの５０μｌのｃＡＭＰ標準の添加、続いてウェルＨ−１１およびＨ１２への５０μｌのＰＢＳＡの添加によって開始する。５０μｌのＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを全てのウェルに添加する。ＤＭＳＯ（または選択された候補化合物）を、１２μＭ試験化合物の最終アッセイ濃度および１００μｌ総アッセイ容量で３μｌの化合物溶液を分配し得るピンツールを用いて適切なウェルに添加する。次いで、細胞をウェルに添加し、そして室温で６０分間にわたってインキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘをウェルに添加する。プレートをさらに２時間にわたってインキュベートし、続いてＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭシンチレーションカウンター中で計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０１５０】
（３．Ｇｉ共役標的ＧＰＣＲについての細胞ベースのｃＡＭＰ）
ＴＳＨＲは、活性化されるとｃＡＭＰの蓄積を引き起こす、Ｇｓ共役ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を変異させる（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変更する）ことによって構成的に活性化される。Ｇｉ共役レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害すると考えられ、それゆえ、ｃＡＭＰ生成のレベルを低下させ、それによって、ｃＡＭＰレベルの評価を魅力的にし得る。Ｇｉ共役レセプターの構成的活性化の指標としてｃＡＭＰの生成の減少を測定するための有効な技術は、「シグナルエンハンサー」として、（最も好ましくは非内因性の）構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（または内因性の構成的に活性なＧｓ共役レセプター）を、Ｇｉ連結標的ＧＰＣＲで同時トランスフェクトして、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確立することによって達成され得る。非内因性バージョンのＧｉ共役レセプターが作製されたら、次いで、この非内因性バージョンの標的ＧＰＣＲを、このシグナルエンハンサーで同時トランスフェクトし、そしてスクリーニングに用いられ得るのはこの物質である。このアプローチを利用して、ｃＡＭＰアッセイを用いる場合、シグナルを効果的に生じる；このアプローチは好ましくは、Ｇｉ共役レセプターに対する候補化合物の直接同定において用いられる。Ｇｉ共役ＧＰＣＲに関して、このアプローチを用いる場合、標的ＧＰＣＲの逆のアゴニストは、ｃＡＭＰシグナルを増大させ、そしてアゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させることが注記される。
【０１５１】
１日目に、２×１０４個の２９３細胞／ウェルをプレーティングする。２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについての以下の比率は、１プレートあたりである）：チューブＡは、哺乳動物細胞中にトランスフェクトされた各レセプターのＤＮＡ  ２μｇ（合計４μｇ  ＤＮＡ）（例えば、ｐＣＭＶベクター；変異したＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲなど）を１．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中に混合することによって調製される；チューブＢを、１．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中に１２０μｌのリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することによって調製する。次いで、チューブＡおよびチューブＢを、（数回）反転することによって混合し、続いて室温で３０分間〜４５分間にわたってインキュベートする。この混合物を、「トランスフェクション混合物」という。プレーティングした２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて１０ｍｌ無血清ＤＭＥＭを添加する。次いで、２．４ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて３７℃／５％  ＣＯ２で４時間にわたってインキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍを添加する。次いで、細胞を３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートする。２４時間のインキュベーション後、細胞を収集し、そして分析のために利用する。
【０１５２】
Ｆｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）は、細胞ベースのアッセイのために設計されたとはいえ、当業者の必要に依存して、粗製原形質膜についての使用のために改変され得る。Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異抗体をまた含むシンチラントコーティングを含む。ウェル中で生成されたｃＡＭＰを、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接的競合によって定量し得る。以下は、このレセプターを発現する細胞全体におけるｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡略なプロトコルとして役立つ。
【０１５３】
トランスフェクトされた細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に収集する。培地を注意深く吸引して捨てる。１０ｍｌのＰＢＳを、細胞の各ディッシュに穏やかに添加し、続いて注意深く吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを各プレートに添加する。細胞をピペットでプレートから取り出し、そして細胞懸濁液を５０ｍｌの円錐形遠心管に収集する。細胞を室温で、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）中に注意深く再懸濁する。次いで、細胞を、血球計算板を用いて計数し、そしてさらなるＰＢＳを添加して、（約５０μｌ／ウェルの最終容量になるように）適切な数の細胞を得る。
【０１５４】
ｃＡＭＰ標準およびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１１ｍｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ  ｃＡＭＰ（５０μｌ］を含む）を、製造業者の指示に従って調製し、そして維持する。Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを、スクリーニングのために新たに調製すべきであり、そしてこれは、５０μｌのＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、３μｌの試験化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含むべきである。Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを、利用するまで氷上で保存し得る。このアッセイを、適切なウェルへの５０μｌのｃＡＭＰ標準の添加、続いてウェルＨ−１１およびＨ１２への５０μｌのＰＢＳＡの添加によって開始し得る。５０μｌのＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを全てのウェルに添加する。選択された化合物（例えば、ＴＳＨ）を、１２μＭ試験化合物の最終アッセイ濃度および１００μｌ総アッセイ容量で３μｌの化合物溶液を分配し得るピンツールを用いて適切なウェルに添加する。次いで、細胞をウェルに添加し、そして室温で６０分間にわたってインキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘをウェルに添加する。次いで、プレートをさらに２時間にわたってインキュベートし、続いてＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター中で計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０１５５】
（４．レポーターベースのアッセイ）
（ａ．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ結合レセプター））
２９３細胞および２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０４細胞の密度でプレーティングし、そして翌日、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトする。ＤＮＡ／脂質混合物を、以下のとおりに各６ウェルトランスフェクションのために調製する：１００μｌのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌのＤＭＥＭ中の脂質２μｌと穏やかに混合する（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド２００ｎｇ、内因性レセプターもしくは非内因性レセプターを含むｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独（５０ｎｇ）およびＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＧＰＲＳ）１０ｎｇからなっていた）。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを以下のとおりに調製する：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌを、ラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって得る。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントを、アデノウイルステンプレートＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８８３（１９９６）を参照のこと）からのＰＣＲによって得て、そしてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクター中のＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位にクローニングして、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを得る。８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にて、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）由来のルシフェラーゼ遺伝子で置換することによって生成する。室温での３０分間のインキュベーション後、ＤＮＡ／脂質混合物を４００μｌのＤＭＥＭで希釈し、そして１００μｌの希釈した混合物を各ウェルに添加する。１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１００μｌを、細胞培養インキュベーター中での４時間のインキュベーション後に各ウェルに添加する。翌日、トランスフェクトした細胞を、１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（２００μｌ／ウェル）を用いて交換する。８時間後、ウェルを、ＰＢＳで１回洗浄した後に、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（１００μｌ／ウェル）に交換する。ルシフェラーゼ活性を、ＬｕｃＬｉｔｅＴＭレポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を製造業者の指示に従って用いて翌日測定し、そして１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭシンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）で読み取る。
【０１５６】
（ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ結合レセプター））
Ｇｑ刺激を検出する方法は、ＡＰ１エレメントをプロモーター内に含む遺伝子の活性化を引き起こすという、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＡＰ−１  ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃  ２１９０７３）を、リン酸カルシウム沈澱物の成分が４１０ｎｇ  ｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミドおよび２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰであること以外は、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関する上記のプロトコールセットに従って利用し得る。
【０１５７】
（ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ結合レセプター））
Ｇｑ刺激を検出する１つの方法は、血清応答因子をプロモーター中に含む遺伝子の活性化を引き起こすという、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を利用して、（例えば、ＣＯＳ７細胞における）Ｇｑ共役活性についてアッセイし得る。細胞を、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃２００２８５）を製造業者の指示に従って用いて、この系のプラスミド成分、および内因性または非内因性のＧＰＣＲをコードする示される発現プラスミドでトランスフェクトする。手短に述べると、４１０ｎｇ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミドおよび２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌されるアルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性を、トランスフェクトした細胞の培地中で測定して、サンプル毎のトランスフェクション効率の変動を制御する）を、製造業者の指示に従って、リン酸カルシウム沈澱物中で合わせる。沈澱物の半分を、９６ウェルプレート中の３つのウェルの間で等しく分布させ、細胞を無血清培地中で２４時間維持する。示される場合、最後の５時間において、細胞を１μＭ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎとともにインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、そしてＬｕｃｌｉｔｅＴＭ  Ｋｉｔ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｃａｔ．＃  ６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を製造業者の指示に従って用いて、ルシフェラーゼ活性についてアッセイする。このデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて分析され得る。
【０１５８】
（ｄ．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ結合レセプター））
１日目に、レセプター（内因性および／または非内因性）を含む細胞を、通常１×１０５細胞／ウェルで（しかし、この数は最適化され得る）２４ウェルプレートにプレーティングする。２日目に、細胞を、５０μｌ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の０．２５μｇ  ＤＮＡと、５０μｌ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の２μｌリポフェクトアミンとを最初に混合することによってトランスフェクトする。この溶液を穏やかに混合し、そして１５分間〜３０分間にわたって、室温でインキュベートする。次いで、細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳおよび４００μｌの無血清培地で洗浄し、次いでトランスフェクション培地と混合し、そして細胞に添加する。細胞を３時間〜４時間にわたって３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートし、次いでトランスフェクション培地を除去し、そして１ｍｌ／ウェルの通常の増殖培地と置き換える。３日目に細胞を３Ｈ−ミオ−イノシトールで標識する。手短に述べると、培地を除去し、そして細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄する。次いで、１ウェルあたり０．５ｍｌのイノシトール非含有／無血清培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を、１ウェルあたり０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオ−イノシトールとともにウェルに添加し、そして細胞を１６時間〜１８時間にわたって一晩、３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートする。４日目に、細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、そしてイノシトール非含有／無血清培地、１０μＭパルグリン（ｐａｒｇｙｌｉｎｅ）、１０ｍＭ  塩化リチウムを含む０．４５ｍｌのアッセイ培地または０．４ｍｌのアッセイ培地および１０μＭの最終濃度にするための５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を添加する。次いで、細胞を３０分間にわたって３７℃でインキュベートする。次いで、細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、そして２００μｌの新鮮／氷冷停止溶液（１Ｍ  ＫＯＨ；１８ｍＭ  Ｎａ−ボレート；３．８ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各ウェルに添加する。この溶液を氷上で５分間〜１０分間にわたって（または細胞が溶解するまで）保持し、次いで２００μｌの新鮮／氷冷中和溶液（７．５％  ＨＣＬ）によって中和する。次いで、溶解産物を１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、そして１チューブあたり１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）を添加する。この溶液を１５秒間にわたってボルテックスにかけ、そして上層をＢｉｏｒａｄ  ＡＧ１−Ｘ８ＴＭ陰イオン交換樹脂（１００メッシュ〜２００メッシュ）に適用する。最初に、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖの水で洗浄し、そして０．９ｍｌの上層をこのカラムにローディングする。次いでカラムを１０ｍｌの５ｍＭミオ−イノシトールおよび１０ｍｌの５ｍＭ  Ｎａ−ボレート／６０ｍＭ  Ｎａ−ホルメートで洗浄する。イノシトールｔｒｉｓホスフェートを、２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを含むシンチレーションカクテル１０ｍｌを含むシンチレーションバイアル中に溶出する。このカラムを、１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄することによって再生し、そしてｄｄ
Ｈ２Ｏで２回リンスし、そして水中で４℃で保存する。
【０１５９】
図１を参照する。図１では、２９３細胞を、６つのアミノ酸欠失を含むＧｑタンパク質「Ｇｑ（ｄｅｌ）」；Ｇｉタンパク質に融合したＧｑタンパク質「Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ」；内因性ＲＵＰ３２；およびＧｑ（ｄｅｌ）を含むＲＵＰ３２（「ＲＵＰ３２＋Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ」）でトランスフェクトした。このデータは、Ｇｑ（ｄｅｌ）／ＧｉのＲＵＰ３２同時トランスフェクションのＩＰ３蓄積を測定することに基づいて、ＲＵＰ３２がＧｑタンパク質に内因的に共役しないことを示す。しかし、ＲＵＰ３２をＧｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ融合タンパク質で同時トランスフェクトした場合、ＲＵＰ３２は、Ｇｑタンパク質に強制的に共役させられた。ＲＵＰ２７＋Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉは、内因性ＲＵＰ３２と比較した場合の、ＩＰ３蓄積における約９倍の増加を実証する。このデータは、Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＣｏｎｓｔｒｕｃｔがＧＰＣＲで同時トランスフェクトされ得、そしてアゴニストまたは逆のアゴニストについてスクリーニングするために用いられ得ることを実証する。
【０１６０】
図２を参照する。図２では、２９３細胞を、ＲＵＰ３５およびＲＵＰ３６レセプターでトランスフェクトし、そしてコントロールのｐＣＭＶに対して比較した。このデータは、ＲＵＰ３５およびＲＵＰ３６レセプターは両方とも内因性で構成的に活性であることを示す。ＲＵＰ３５は、ｐＣＭＶと比較した場合の細胞内イノシトールホスフェート蓄積における約６倍の増加を実証し、そしてＲＵＰ３６は、ｐＣＭＶと比較した場合の約４倍の増加を実証する。
【０１６１】
（実施例５：融合タンパク質の調製）
（ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物）
構成的に活性化されたＧＰＣＲ−Ｇタンパク質の融合構築物の設計を以下のとおりに達成し得る：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長い形態；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ら，８３  ＰＮＡＳ  ３７７６（１９８６））の５’末端および３’末端の両方を操作して、その中にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含ませる。正確な配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）の確認後、配列全体を、ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にサブクローングすることによって、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｖ７９５−２０）中にシャトルする。Ｇｓα配列についての正確な方向を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）へのサブクローニング後に決定する。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列にラットＧｓα遺伝子を含む改変されたｐｃＤＮＡ３．１（−）を確認する；次いで、このベクターは、「ユニバーサル」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用可能である。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の周知の制限部位を含み、従ってＧｓタンパク質の上流に、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲのコード配列を挿入する能力を有益に提供する。この同じアプローチを利用して、他の「ユニバーサル」Ｇタンパク質ベクターを作製し得、そしてもちろん、当業者に公知の他の市販または特許のベクターが利用され得る。いくつかの実施形態では、重要な基準は、ＧＰＣＲについての配列がＧタンパク質の配列の上流でかつインフレームに存在することである。
【０１６２】
Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間の制限部位におけるスペーサーは、任意である。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー（制限部位に起因する）がＧタンパク質とＧＰＣＲとの間に存在するように、それぞれ、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶについての制限部位を含んでいた。
【０１６３】
次いで、ＰＣＲを利用して、各々について以下のプロトコルを用いて、融合のためのそれぞれのレセプター配列が、上記で開示されたＧｓαユニバーサルベクター内にあることを確実にする：ＧＰＣＲについてのｃＤＮＡ（１００ｎｇ）を、以下を含む別々のチューブに添加する：２μｌの各プライマー（センスおよびアンチセンス）、３μｌの１０ｍＭ
ｄＮＴＰ、１０μｌの１０×ＴａｑＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ緩衝液、１μｌのＴａｑＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ：＃６００２１１）および８０μｌの水。ＧＰＣＲについての反応温度およびサイクル回数は、サイクル工程２〜工程４を３５回繰り返して、以下のとおりである：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間；６２℃で２０秒間；７２℃で１分４０秒間；および７２℃で５分間。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに泳動し、次いで精製する。精製された産物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、そして所望の挿入物を精製し、そしてそれぞれの制限部位でＧｓユニバーサルベクター中に連結する。ポジティブクローンを、形質転換の後に単離し、そして制限酵素消化によって決定する；２９３細胞を用いた発現は、以下に示すプロトコルに従って達成される。ＧＰＣＲ−Ｇｓ融合タンパク質についての各ポジティブクローンを配列決定して、正しいことを確認する。
【０１６４】
（ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物）
Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ融合構築物の設計を、以下のとおりに達成した：ＴＬＥＳＩＭ（配列番号４７）という配列を有するＮ末端の６アミノ酸（アミノ酸２〜７）であるＧαｑサブユニットを欠失させ、そして配列ＥＹＮＬＶ（配列番号４８）を有するＣ末端の５アミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号４９）を有する、Ｇαｉタンパク質の対応するアミノ酸で置換した。この融合構築物を、以下のプライマーおよびテンプレートとしてのプラスミド６３３１３（赤血球凝集素タグを有するマウスＧαｑ−野生型バージョンを含む）を用いたＰＣＲによって入手した：５’−ｇａｔｃＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号５０）および５’−ｇａｔｃＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５１）。小文字（ｌｏｗｅｒ  ｃａｐ）のヌクレオチドは、スペーサーとして含まれる。
【０１６５】
ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、工程２〜工程４を３５回繰り返す以下のサイクルによる増幅のために利用した：９５℃で２分間；９５℃で２０秒間；５６℃で２０秒間；７２℃で２分間；そして７２℃で７分間。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定する。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローン由来の挿入物を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に、２工程クローニングプロセスによってＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にシャトルする。
【０１６６】
（実施例６：開示されたヒトＧＰＣＲの組織分布：ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲを適用して発現を確認し、そしていくつかの新規ヒトＧＰＣＲの組織分布を決定した。利用したオリゴヌクレオチドはＧＰＣＲ特異的であり、そしてヒト複数組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして使用した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、４０μｌ反応物において、製造業者の指示にしたがって増幅のために利用した。２０μｌの反応物を１．５％アガロースゲルにローディングして、ＲＴ−ＰＣＲ産物を分析する。以下の表Ｅは、レセプター、サイクル条件および利用したプライマーを列挙し、そしてまたこれらのレセプターに関連した例示的な疾患／障害を列挙する。
【０１６７】
【表６】
2010166925.tif 000014
【０１６８】
2010166925.tif 000015
【０１６９】
これらの組織または領域に位置するレセプターに関連する疾患および障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：心臓の障害および疾患（例えば、血栓症、心筋梗塞；アテローム性動脈硬化症；心筋症）；腎臓の疾患／障害（例えば、腎不全；尿細管性アシドーシス；腎性糖尿；腎性尿崩症；シスチン尿；多発性嚢胞腎疾患）；好酸球増加症；白血球増加症；白血球減少症；卵巣癌；性機能障害；多嚢胞性卵巣症候群；膵炎および膵臓癌；過敏性腸症候群；結腸癌；クローン病；潰瘍性大腸炎；憩室炎；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；肺炎；肺高血圧症；結核および肺癌；パーキンソン病；運動障害および運動失調；学習障害および記憶障害；摂食障害（例えば、食欲不振；過食症など）；肥満症；癌；胸腺腫；重症筋無力症；循環器障害；前立腺癌；前立腺炎；腎臓の疾患／障害（例えば、腎不全；尿細管性アシドーシス；腎性糖尿；腎性尿崩症；シスチン尿；多発性嚢胞腎臓疾患）；感覚運動処理障害および覚醒障害；強迫性障害；精巣癌；持続勃起；前立腺炎；ヘルニア；内分泌障害；性機能障害；アレルギー；鬱病；精神障害；片頭痛；灌流；精神分裂病；潰瘍；気管支痙攣；癲癇；前立腺肥大；不安；鼻炎；アンギナ；および緑内障。従って、本発明の方法はまた、これらおよび他の疾患および障害の診断および／または処置において有用であり得る。
【０１７０】
（実施例７：プロトコル：逆のアゴニストおよびアゴニストの直接同定）
（Ａ．［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
内因性の構成的に活性なＧＰＣＲは、完全には理解されていないという理由から、例えば、逆のアゴニストとしての候補化合物の直接同定のために用いられているが、アッセイ内変動が悪化することになり得る。いくつかの実施形態では、上記に開示されたとおりのＧＰＣＲ融合タンパク質はまた、非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲと一緒に利用される。このようなタンパク質が用いられる場合、アッセイ内変動は、実質的に安定化されるようであり、それによって有効なシグナル対ノイズ比が得られる。これは、候補化合物のより頑健な同定を可能にするという有益な結果を有する。従って、いくつかの実施形態では、直接同定のためにＧＰＣＲ融合タンパク質を用いることが好ましく、そして利用する場合、以下のアッセイプロトコルを利用することが好ましい。
【０１７１】
（１．膜の調製）
構成的に活性な、目的のオーファンＧＰＣＲ融合タンパク質を含み、そして逆のアゴニストまたはアゴニストとしての候補化合物の直接同定において使用するための膜は好ましくは以下のとおりに調製される：
（ａ．材料）
「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｒａｐｅ  Ｂｕｆｆｅｒ」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）から構成される；「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）から構成される；「Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ
ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．４）構成される。
【０１７２】
（ｂ．手順）
全ての材料を、手順をとおして氷上に保持する。最初に、培地を、コンフルエントな単層の細胞から吸引し、続いて１０ｍｌの冷ＰＢＳでリンスし、続いて吸引する。その後、５ｍｌのＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｒａｐｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して、細胞を掻きとる；これに続いて、細胞抽出物を５０ｍｌ遠心管に移す（２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離する）。その後、上清を吸引し、そしてペレットを３０ｍｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、続いて２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離する。次いで、上清を吸引し、そしてペレットをＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。次いで、再懸濁したペレットを、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭホモジナイザー（材料が懸濁するまで、１５〜２０秒間のバースト）を用いて均質化する。これを本明細書中では、「膜タンパク質（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）」という。
【０１７３】
（２．Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ）
均質化後、膜のタンパク質濃度を、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて決定する（タンパク質を、約１．５ｍｇ／ｍｌになるように希釈し、アリコートに分け、そして後の使用まで凍結（−８０℃）し得る；凍結した場合、使用のためのプロトコルは、以下のとおりである：アッセイの当日に、凍結した膜タンパク質を室温で解凍し、続いてボルテックスにかけ、次いでＰｏｌｙｔｒｏｎを約１２×１，０００ｒｐｍで約５〜１０秒間用いて均質化する；複数の調製に関して、ホモジナイザーを異なる調製物の均質化の間に徹底的に浄化することに留意した）。
【０１７４】
（ａ．材料）
Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（上記のとおり）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄを、製造業者の指示（Ｂｉｏｒａｄ，ｃａｔ．ｎｏ．５０００００６）に従って利用する。
【０１７５】
（ｂ．手順）
二連のチューブを調製し、一方は、膜を含み、そして他方はコントロールの「ブランク」である。各々は、８００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを含む。その後、１０μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（１ｍｇ／ｍｌ）を各チューブに添加し、次いで１０μｌの膜Ｐｒｏｔｅｉｎを、（ブランクではない）１つのチューブにのみ添加する。その後、２００μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを各チューブに添加し、続いてボルテックスにかける。５分後、チューブを再度ボルテックスにかけ、そしてその中の材料をキュベットに移す。次いで、キュベットを、ＣＥＣＩＬ
３０４１分光光度計を用いて波長５９５で読み取る。
【０１７６】
（３．直接同定アッセイ）
（ａ．材料）
ＧＤＰ  Ｂｕｆｆｅｒは、３７．５ｍｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒおよび２ｍｇ
ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ７１２７）からなっており、続いて、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中での一連の希釈によって０．２μＭ  ＧＤＰを得た（各ウェル中でのＧＤＰの最終濃度は０．１μＭ  ＧＤＰであった）；候補化合物を含む各ウェルは、ＧＤＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（最終濃度０．１μＭ  ＧＤＰ）（１００μｌ）、Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ中の膜タンパク質（５０μｌ）およびＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（５０μｌ）（１０ｍｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒあたり２．５μｌの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）からなる、２００μｌの最終容量を有する。
【０１７７】
（ｂ．手順）
候補化合物を好ましくは、９６ウェルプレート形式（これらは−８０℃で凍結され得る）を用いてスクリーニングする。膜タンパク質（またはコントロールとして、ＧＰＣＲ融合タンパク質を除く発現ベクターを含む膜）を、懸濁するまで短時間均質化する。次いで、タンパク質濃度を、例えば、上記のＢｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて決定する。次いで、膜タンパク質（およびコントロール）を、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中に０．２５ｍｇ／ｍｌになるように希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μｌのＧＤＰ  Ｂｕｆｆｅｒを、Ｗａｌｌａｃ  ＳｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐＴＭ（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに添加する。次いで、５μｌのピンツールを用いて、５μｌの候補化合物をこのようなウェル中に移す（すなわち、２００μｌの総アッセイ容積中の５μｌは、４０：１の比であり、その結果、候補化合物の最終スクリーニング濃度は、１０μＭである）。さらに、夾雑を回避するために、各移動工程の後に、ピンツールを、水（１×）、エタノール（１×）および水（２×）を含む３つのレザバ中でリンスする−過剰の液体を、各リンスの後にツールから振り落とし、そしてツールを紙およびキムワイプで乾燥させる。その後、５０μｌの膜タンパク質を各ウェルに添加し（ＧＰＣＲ融合タンパク質を含まず、膜を含むコントロールウェルもまた利用した）、そして５分間〜１０分間、室温でプレインキュベートする。その後、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（５０μｌ）を各ウェルに添加し、続いてシェーカーで６０分間にわたって、室温でインキュベートする（さらに、この実施例において、プレートをホイルで覆った）。プレートを４０００ＲＰＭで１５分間にわたって２２℃でスピンすることによってアッセイを停止させる。次いで、プレートを８チャネルマニホルドで吸引し、そしてプレートカバーでシールする。次いで、プレートを、（製造業者の指示に従って）Ｗａｌｌａｃ  １４５０で「Ｐｒｏｔ．＃３７」の設定を用いて読み取る。
【０１７８】
（Ｂ．サイクリックＡＭＰアッセイ）
候補化合物を直接的に同定するための別のアッセイアプローチを、シクラーゼベースのアッセイを利用して達成する。直接的同定に加えて、このアッセイアプローチを、上記のとおりの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の確認を提供する、独立したアプローチとして利用し得る。
【０１７９】
改変版Ｆｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）を好ましくは、以下のプロトコルに従って、ＧＰＣＲに対する逆のアゴニストおよびアゴニストとしての候補化合物の直接同定のために用いる。
【０１８０】
トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの約３日後に収集する。膜を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中での懸濁細胞の均質化によって調製する。均質化を、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭを用いて氷上で約１０秒間にわたって行う。得られるホモジネートを、４９，０００×ｇで１５分間にわたって、４℃で遠心分離する。次いで、得られるペレットを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中に再懸濁し、１０秒間均質化し、続いて４９，０００×ｇで１５分間にわたって４℃で遠心分離する。次いで、得られるペレットを、利用するまで−８０℃で保存する。直接同定スクリーニングの当日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解凍し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中に再懸濁して、０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得る（再懸濁した膜を、使用するまで氷上に置く）。
【０１８１】
ｃＡＭＰ標準およびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を１１ｍｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに含む）を、製造業者の指示に従って調製し、そして維持する。Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒをスクリーニングのために新鮮に調製し、そしてこれは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１単位／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）および０．２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含む；Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを、利用するまで氷上で保存する。
【０１８２】
上記によって同定された候補化合物（凍結した場合、室温で解凍する）を、好ましくは９６ウェルプレートウェル（３μｌ／ウェル；１２μＭ最終アッセイ濃度）に、４０μｌの膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５０μｌのＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒと一緒に添加する。この混合物を、穏やかに攪拌しながら、３０分間にわたって室温でインキュベートする。
【０１８３】
インキュベーション後、１００μｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに添加し、続いて２〜２４時間にわたってインキュベートする。次いで、プレートを、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭプレートリーダーにおいて、「Ｐｒｏｔ．＃３１」（製造業者の指示によって）を用いて計数する。
【０１８４】
（Ｃ．メラニン保有細胞スクリーニングアッセイ）
ＧＰＣＲについての候補アゴニストまたは逆のアゴニストを同定するための方法を、特定の刺激に応じて色素を分散または凝集し得、そしてＧＣＰＲをコードする外因性クローンを発現する、色素細胞株の試験細胞を導入することによって実施し得る。ＧＰＣＲの活性化が色素の分散を誘導する場合、刺激因子（例えば、光）は、色素が試験細胞内に凝集している、凝集配置の最初の状態を設定する。しかし、ＧＰＣＲの活性化が色素の凝集を誘導する場合、細胞を刺激因子で刺激して、色素が分散されている、色素配置の最初の状態を設定する。次いで、試験細胞を化合物と接触させ、そして細胞内での色素の配置が、色素の配置の最初の状態から変化したか否かを決定する。色素細胞の分散は、ＧＰＣＲへの候補化合物のカップリングに起因して、ペトリ皿では暗く見え、一方、色素細胞の凝集は明るく見える。
【０１８５】
材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および米国特許第６，０５１，３８６号（これらの各々は、参考として援用される）の開示に従う。
【０１８６】
種々の発現ベクターは当業者に入手可能であるが、内因性ヒトＧＰＣＲおよび非内因性ヒトＧＰＣＲの両方について利用する目的のためには、いくつかの実施形態では、利用されるベクターがｐＣＭＶであることが好ましい。このベクターを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に１９９８年１０月１３日に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規約の下で寄託した。このＤＮＡは、ＡＴＣＣによって試験されて、生存していることが決定された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに以下の受託番号を割り当てた：ＡＴＣＣ  ＃２０３３５１。
【０１８７】
本特許文書を通じて引用される参考文献は、同時係属中の特許出願および関連の特許出願を含め、他に示されない限り、本明細書中に参考として充分に援用される。当業者の範囲内にある、開示された発明の改変および拡大は、上記の開示および上記の特許請求の範囲内に包含される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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