(57)【要約】【課題】Ｚスタック画像を取得する際に振動等があってもボケの少ないＺスタック画像を取得することができる顕微鏡および画像取得方法を提供する。【解決手段】オートフォーカス制御に用いる制御信号に対して所定の電気信号を周期的にかつ累積して加えて対物レンズと試料の被検面との合焦位置を光軸方向に所定間隔に変更し、対物レンズまたはステージを合焦位置の変更に追従して移動させ、各合焦位置に試料の基準の被検面が位置するごとに撮像装置に試料を撮影させて試料の複数の画像を取得する。【選択図】図４
2010191000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを備えた観察光学系と、
試料を載置するステージと、
前記試料を撮影する撮像装置と、
光源からの照明光像を前記対物レンズを介して前記試料に投影するフォーカス用照明光学系と、
前記照明光像の前記試料からの反射像を前記対物レンズを介して該反射像を検出するための検出手段に結像させるフォーカス用結像光学系と、
前記対物レンズと前記試料の被検面との合焦位置を調整するために、前記検出手段で検出される前記反射像の情報に基づいて、前記対物レンズまたは前記ステージを前記観察光学系の光軸方向へ移動する制御信号を生成する信号処理手段と、
前記制御信号に対して所定の電気信号を周期的にかつ累積して加えて前記合焦位置を前記光軸方向に所定間隔に移動させ、前記各合焦位置に前記試料の基準の被検面が位置するごとに前記撮像装置に前記試料を撮影させて前記試料の複数の画像を取得する制御手段と、を有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記フォーカス用照明光学系は、該フォーカス用照明光学系の光軸方向へ移動して前記照明光像の焦点位置を変えることができる焦点位置調整レンズを備え、
前記焦点位置調整レンズの位置を変更するための焦点位置調整レンズ用回転操作手段と、
前記ステージを前記観察光学系の光軸方向へ移動するためのステージ用回転操作手段と、
前記焦点位置調整レンズ用回転操作手段の１回転当たりの前記レンズの移動量を、前記ステージ用回転操作手段の１回転当たりの前記ステージの移動量と略等しくするための、前記対物レンズの種類に対応した前記焦点位置調整レンズの駆動情報を記憶した記憶手段とを有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記記憶手段は、環境温度に対応した前記焦点位置調整レンズの駆動情報をさらに備えたことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
対物レンズを備えた観察光学系と、
試料を載置するステージと、
前記試料を撮影する撮像装置と、
光源からの照明光像を前記対物レンズを介して前記試料に投影するフォーカス用照明光学系と、
前記照明光像の前記試料からの反射像を前記対物レンズを介して該反射像を検出するための検出手段に結像させるフォーカス用結像光学系と、
前記対物レンズと前記試料の被検面との合焦位置を調整するために、前記検出手段で検出される前記反射像の情報に基づいて、前記対物レンズまたは前記ステージを前記観察光学系の光軸方向へ移動する制御信号を生成する信号処理手段と、
前記制御信号に基づいて前記対物レンズまたは前記ステージを移動させる制御手段と、を有する顕微鏡における画像取得方法であって、
前記制御手段は、前記制御信号に対して所定の電気信号を加えて前記合焦位置を前記光軸方向に移動させるステップと、移動後の合焦位置に前記試料の基準の被検面が位置するように前記対物レンズまたは前記ステージを移動させるステップと、前記試料の基準の被検面が前記移動後の合焦位置に位置したら前記撮像装置に前記試料を撮影させるステップと、を所定回繰り返して前記試料の複数の画像を取得することを特徴とする顕微鏡における画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡および顕微鏡における画像取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡を用いて生物試料のＺ方向画像を撮像する場合、ステージ或いは対物レンズを観察光学系の光軸方向（Ｚ方向）に予め決めた間隔で移動させ、焦点位置を試料の上側（或いは下側）から少しずつＺ方向に変えながら多数の試料像を撮像している。（例えば特許文献１）。
【０００３】
立体的な生物試料を撮像する場合は、取得したこれらのＺ方向画像（Ｚスタック画像）を合成して全体として焦点が合っている画像を取得している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１２８４９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料のＺスタック画像を取得する際、焦点位置をＺ方向に変えるときに、例えば対物レンズ或いはステージをずらして焦点位置を所定量下げたとしても、振動でステージが沈んでしまうことがある。このような場合、焦点位置がずれてしまい、取得される画像のＺ位置がずれたり、画像がボケてしまったりするという問題がある。
【０００６】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、Ｚスタック画像を取得する際に振動等があってもボケの少ないＺスタック画像を取得することができる顕微鏡およびボケの少ないＺスタック画像の取得方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明に係る顕微鏡は、対物レンズを備えた観察光学系と、試料を載置するステージと、前記試料を撮影する撮像装置と、光源からの照明光像を前記対物レンズを介して前記試料に投影するフォーカス用照明光学系と、前記照明光像の前記試料からの反射像を前記対物レンズを介して該反射像を検出するための検出手段に結像させるフォーカス用結像光学系と、前記対物レンズと前記試料の被検面との合焦位置を調整するために、前記検出手段で検出される前記反射像の情報に基づいて、前記対物レンズまたは前記ステージを前記観察光学系の光軸方向へ移動する制御信号を生成する信号処理手段と、前記制御信号に対して所定の電気信号を周期的にかつ累積して加えて前記合焦位置を前記光軸方向に所定間隔に移動させ、前記各合焦位置に前記試料の基準の被検面が位置するごとに前記撮像装置に前記試料を撮影させて前記試料の複数の画像を取得する制御手段と、を有することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明に係る顕微鏡における画像取得方法は、対物レンズを備えた観察光学系と、試料を載置するステージと、前記試料を撮影する撮像装置と、光源からの照明光像を前記対物レンズを介して前記試料に投影するフォーカス用照明光学系と、前記照明光像の前記試料からの反射像を前記対物レンズを介して該反射像を検出するための検出手段に結像させるフォーカス用結像光学系と、前記対物レンズと前記試料の被検面との合焦位置を調整するために、前記検出手段で検出される前記反射像の情報に基づいて、前記対物レンズまたは前記ステージを前記観察光学系の光軸方向へ移動する制御信号を生成する信号処理手段と、前記制御信号に基づいて前記対物レンズまたは前記ステージを移動させる制御手段と、を有する顕微鏡における画像取得方法であって、前記制御手段は、前記制御信号に対して所定の電気信号を加えて前記合焦位置を前記光軸方向に移動させるステップと、移動後の合焦位置に前記試料の基準の被検面が位置するように前記対物レンズまたは前記ステージを移動させるステップと、前記試料の基準の被検面が前記移動後の合焦位置に位置したら前記撮像装置に前記試料を撮影させるステップと、を所定回繰り返して前記試料の複数の画像を取得することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、Ｚスタック画像を取得する際に振動等があっても、ボケの少ないＺスタック画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】第１実施形態に係る顕微鏡の全体の構成を示す模式図である。
【図２】第１実施形態に係る顕微鏡の光学系の構成を示す模式図である。
【図３】（ａ）はフォーカスエラー信号を示す図であり、（ｂ）は光電変換器からの信号の総和と被検体面の位置との関係を示す図である。
【図４】Ｚスタック画像を取得する際のフロー図である。
【図５】Ｚスタック画像を取得する際の対物レンズの動作を示す図である。
【図６】第２実施形態に係る顕微鏡の全体の構成を示す模式図である。
【図７】第２実施形態に係る顕微鏡の光学系の構成を示す模式図である。
【図８】第２実施形態に係る顕微鏡におけるオフセットレンズの駆動制御のためのフローチャートを示す図である。
【図９】第２実施形態に係る顕微鏡のメモリに格納されている、基準温度でのオフセットゼロ位置からの各距離のパルス数を対物レンズごとに示したテーブルである。
【図１０】第２実施形態に係る顕微鏡のメモリに格納されている、各温度におけるオフセットゼロ位置のパルス数を対物レンズごとに示したテーブルである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の第１実施形態について図面を参照しつつ説明する。
【００１２】
図１は本発明の第１実施形態に係る顕微鏡１の全体の構成を示す模式図であり、図２は顕微鏡１の光学系の構成を示す図である。
図１および図２に示すように、第１実施形態に係る顕微鏡１の本体部１ａは、ステージ３に載置された試料５を観察する観察光学系７と、ステージ３上の試料５を照明するための観察用照明光学系９とを備えている。
【００１３】
図２に示すように、観察用照明光学系９は、試料５を照明する照明用光源３１と集光レンズ３３とを備えている。光源３１は可視光を射出する。また、観察光学系７は、試料５に近い方から順に、レボルバ１０（図１参照）に保持された対物レンズ１１と、ダイクロイックミラー１３と、ビームスプリッタ１５と、結像レンズ１７とを備えている。結像レンズ１７の結像位置には、試料像を撮影する撮像装置（本実施形態においてはデジタルカメラ）１９の撮像面が配置されている。撮像装置１９は表示部２１（本実施形態においてはパーソナルコンピュータ、以下ＰＣと略記する。）に接続されていて、撮像装置１９に結像した像を表示し、観察することができる。ＰＣ２１は顕微鏡本体部１ａ（図１参照）の制御部２５に接続されており、ＰＣ２１の図示しないキーボードから指示をして顕微鏡１の操作を行うようになっている。
【００１４】
顕微鏡本体部１ａには対物レンズ１１を観察光学系７の光軸方向、すなわちＺ方向に移動する駆動部２７が設けられている。駆動部２７は本体部１ａの制御部２５に接続されており、制御部２５は後述するフォーカスエラー信号に基づいて対物レンズ１１を駆動する。
【００１５】
また、図２に示すように、本体部１ａ（図１参照）はフォーカス用照明光学系３５とフォーカス用結像光学系３７とを備えている。フォーカス用照明光学系３５は、近赤外光を照射する光源３９と、コリメータレンズ４２と、スリット孔４１ａが設けられたスリット板４１と、コリメータレンズ４３と、ビームスプリッタ４４と、ダイクロイックミラー１３とを備えている。ダイクロイックミラー１３は観察光学系７と共用である。フォーカス用結像光学系３７は、ダイクロイックミラー１３と、ビームスプリッタ４４と、集光レンズ４８と、ビームスプリッタ４９と、第１の光電変換機４５と、第２の光電変換機４６とを備えている。なお、ビームスプリッタ４４とダイクロイックミラー１３は、フォーカス用照明光学系３５と共用である。
【００１６】
光源３９から照射された近赤外光はスリット板４１のスリット孔４１ａを通過してスリット状の光像となる。スリット状の光像は、ビームスプリッタ４４で反射され、さらにダイクロイックミラー１３で反射されて観察光学系７に入り、対物レンズ１１を通って試料５に投影される。試料５に投影されたスリット状の光像は試料５の表面で反射し、この反射像は対物レンズ１１を通りフォーカス用結像光学系３７を通って、フォーカス用結像光学系３７における収束点の前後にそれぞれ配置された第１および第２光電変換器４５、４６に結像される。フォーカス用結像光学系３７の収束点の前に配置された第１光電変換器４５に結像されるスリット状の光像の幅は、対物レンズ１１と試料５の被検面とが離間すれば太くなり、接近すれば細くなる。一方、収束点の後に配置された第２光電変換器４６に結像されるスリット状の光像の幅は、対物レンズ１１と試料５の被検面とが離間すれば細くなり、接近すれば太くなる。２つの光電変換器４５、４６は、このように結像される反射像の情報から、観察光学系７と試料面との距離の変化に応じて互いに逆方向の大きさに変化する第１および第２の光量信号を生成する。
【００１７】
第１および第２光電変換器４５、４６によって生成された第１および第２の光量信号は、制御部２５の信号処理回路４７によって第１の光量信号と第２の光量信号との差信号であるフォーカスエラー信号に変換される。
【００１８】
フォーカスエラー信号は、図３（ａ）に示すように、信号強度を縦軸に、試料５の被検面の光軸方向位置を横軸にとるとＳ字状カーブのグラフＳａを描く。図３（ａ）のＳ字状のグラフＳａにおいて、第１および第２の光量信号が等しいときはフォーカスエラー信号強度がゼロとなり、この位置が対物レンズ１１の焦点位置と試料５の基準の被検面との合焦位置である。制御部２５は、フォーカスエラー信号に基づいてオートフォーカス制御する。すなわち、駆動部２７を駆動し、試料５の被検面に対物レンズ１１が合焦するように、つまりフォーカスエラー信号がゼロになるように対物レンズ１１を移動させる。このように、通常の観察状態では、制御部２５はオートフォーカス制御を行っている。
【００１９】
図３（ｂ）は第１および第２の光量信号の和信号の強度と被検面の位置を表すグラフＳｂである。この和信号Ｓｂは、フォーカス用結像光学系３７が合焦位置にある時に最大になり、合焦位置から離れるに従い減少する。制御部２５は前述したようにフォーカスエラー信号がゼロとなるように対物レンズ１１を移動し、基準の被検面に対物レンズ１１を合焦させているが、このフォーカスエラー信号を利用してオートフォーカス制御を行い、焦点を合わせられる範囲は、第１および第２の光量信号の和信号の強度が所定の強度である閾値Ｔ１以上の範囲Ｌ１である（図３（ｂ）参照）。試料５の基準の被検面が範囲Ｌ１に位置するときはオートフォーカス制御によって焦点を合わせることができる。
【００２０】
つまり、図３（ｂ）に示す範囲Ｌ１内であれば、電気的に焦点位置を指定すれば、対物レンズ１１を移動させて試料５の基準の被検面を指定位置に移動させることができる。焦点位置を指定するとは、Ｓ字状を描くフォーカスエラー信号に電気的なオフセット信号を加えることにより、フォーカスエラー信号がゼロとなる位置を当初の位置からずらすことである。焦点位置をずらすと、制御部２５はフォーカスエラー信号がゼロとなるように、焦点位置の変更に追従して対物レンズ１１を移動する。ずらした焦点位置に基準の被検面が移動したら、さらにオフセット信号を加えて焦点位置をずらす。すると、制御部２５はフォーカスエラー信号がゼロとなるように、焦点位置の変更に追従してさらに対物レンズ１１を移動する。このような動作を繰り返せば、図３（ｂ）に示す範囲Ｌ１内で自由に対物レンズ１１を移動させることができる。本実施形態は、オートフォーカス制御のこのような動作を利用して、対物レンズ１１の焦点位置を試料５上でＺ軸方向に所定間隔で移動させて複数の画像（以下、Ｚスタック画像という。）を取得している。以下、Ｚスタック画像を取得する際の動作を、図４のフロー図を参照しつつ説明する。
【００２１】
観察者はＺスタック画像を取得しようとする試料の基準の被検面である試料の上部（または下部）に対物レンズ１１の焦点を合焦させる（Ｓ−１）。ここがＺスタック画像取得の初期位置となる。次に、観察者はＰＣ２１のキーボード（図示省略）を操作し、制御部２５に試料５のＺスタック画像を取得するよう指示をする（Ｓ−２）。このとき、合焦位置をずらす間隔（例えば１μｍ）と方向（例えば下方向）を設定する。制御部２５は、Ｚスタック画像取得の指示があると、まず当該合焦位置で試料５を撮像するよう撮像部１９に指示をする（Ｓ−３）。そしてフォーカスエラー信号に対し、所定のオフセット信号を加える（Ｓ−４）。フォーカスエラー信号にオフセット信号を加えると、図３（ａ）におけるＳ字のグラフが所定量ずれる。つまり、対物レンズ１１と試料５の基準の被検面とが電気的にオフセットされ、試料５の合焦位置がずれる（Ｓ−５）。試料５の合焦位置が所定量ずらされると、制御部２５はフォーカスエラー信号がゼロとなる位置まで対物レンズ１１を移動する。移動後の、フォーカスエラー信号がゼロとなる位置が対物レンズ１１と試料５との合焦位置となる（Ｓ−６）。この合焦位置は、試料５の当初の焦点位置から上方（または下方）、つまりＺ方向に所定量移動した位置である。制御部２５は移動後の合焦位置で試料５を撮像するよう撮像装置１９に指示をする（Ｓ−７）。
【００２２】
ここで合焦位置の移動は、図５に示すように、１μｍ単位の距離で移動が可能である。すなわち、合焦位置を所定量移動させるに必要なＳ字グラフを移動させるオフセット信号の強さは、対物レンズ１１の焦点距離から予め求めることが可能である。例えば、レボルバに装着する対物レンズ１１ごとに合焦位置を１μｍオフセットさせるための信号の強さを算出し、制御部２５の記憶部２５ａまたはＰＣ２１の記憶部２１ａに記憶させておけば、適宜データを呼び出し、または該データを加工して移動間隔を変更して適用することができる。
【００２３】
制御部２５は移動後の合焦位置での試料５の撮像が終了すると、上記移動後の合焦位置におけるフォーカスエラー信号、すなわち初期位置のフォーカスエラー信号にオフセット信号を加えたものに対して、再び上記と同じ所定のオフセット信号を加える（Ｓ−４）。つまり、２回目以降のオフセット信号の印加は、初期位置のフォーカスエラー信号と直前までに加えたオフセット信号との総和に対して累積的に印加される。すると対物レンズ１１と試料５の被検面とが再び電気的にずらされる（Ｓ−５）。１回目と２回目以降とで全て同じ強さのオフセット信号を周期的に印加することで、焦点位置がずらされる方向および距離が毎回同じとなり、合焦位置は同一方向に同一間隔で段階的にずれていくこととなる。
【００２４】
合焦位置が再びずらされると、制御部２５は再び駆動部２７を駆動し、フォーカスエラー信号がゼロとなる位置まで対物レンズ１１を移動する。再度の移動後の、フォーカスエラー信号がゼロとなる位置が対物レンズ１１の焦点と試料５との新たな合焦位置となる（Ｓ−６）。制御部２５は当該移動後の合焦位置で試料を撮像するよう撮像装置１９に指示をする（Ｓ−７）。以後、上記Ｓ−４からＳ−７までの動作が所定回数繰り返される。
【００２５】
制御部２５が上記Ｓ−４からＳ−７までの制御を繰り返し、試料５の所望の範囲のＺスタック画像が取得できたら、操作者はＰＣ２１のキーボードを操作し、Ｚスタック画像取得の指示を解除する（Ｓ−８）。あるいは、予め試料５のＺスタック画像の撮像範囲、つまり合焦位置をずらす距離を指定し、指定した撮像範囲の撮影が完了したら自動的にＺスタック画像取得の指示が解除されるようにしても良い。Ｚスタック画像取得の指示が解除されると、制御部２５はオフセット信号の印加を停止し、通常のフォーカスエラー信号に基づいてオートフォーカス制御する。
【００２６】
制御部２５の上記のような制御により、Ｚ方向に少しずつ合焦位置のずれた試料像を取得することができる。このような方法によってＺ方向に少しずつ対物レンズ１１を移動させれば、振動の影響を大幅に低減してＺスタック画像を取得することができる。
【００２７】
なお、第１実施形態では対物レンズ１１をＺ方向に移動させることでＺスタック画像を取得したが、対物レンズ１１に替えてステージ３をＺ方向に移動させても同様の画像を取得することができる。
【００２８】
（第２実施形態）
次に本発明の第２実施形態について説明する。
【００２９】
第２実施形態は、オートフォーカス用の照明光像の焦点位置を、試料の所望の位置にずらす焦点位置調整用のレンズを有するオートフォーカス装置を備えた顕微鏡に本発明を採用したものである。以下、図面を参照しつつ、第１実施形態と同じ構成については同じ符号を用いて説明する。
【００３０】
図６は第２実施形態に係る顕微鏡の構成を示す図である。
【００３１】
図６に示すように、第２実施形態に係る顕微鏡１００は、試料５を載置するステージ３と、ステージ３の下方に配置された対物レンズ１１およびフォーカス装置部５０と、ステージ３の上方に配置された透過照明装置５２と、フォーカス制御用スイッチボックス５４とを備えている。
【００３２】
顕微鏡本体１００ａの内部には、ステージ３を対物レンズ１１の光軸方向へ移動するためのステージ駆動部５６と、ステージ３の光軸方向の位置を検出する位置検出部５８とを備えている。ステージ駆動部５６と位置検出部５８とはそれぞれ制御部２５に接続されている。制御部２５にはフォーカス制御用スイッチボックス５４と、メモリ６０と、入力部６２とが接続されている。入力部６２には、キーボード（図示省略）、対物レンズ切替えスイッチ（図示省略）、オートフォーカス制御開始スイッチ（図示省略）、および合焦位置記憶スイッチ（図示省略）等が設けられている。
【００３３】
顕微鏡本体１００ａには、ステージ３を光軸方向へ移動操作するためのダイヤル（以下、ステージダイヤルという。）６４が設けられている。
【００３４】
また、フォーカス制御用スイッチボックス５４には、後述する焦点位置調整レンズ６６を当該焦点位置調整レンズ６６の光軸方向へ移動操作するためのダイヤル（以下、オフセットダイヤルという。）６８が設けられている。
【００３５】
図７は、第２実施形態に係る顕微鏡の光学系の構成を示す図である。
【００３６】
図７に示すように、第２実施形態に係る顕微鏡１００の光学系は、試料５の下方に配置された観察光学系７と、フォーカス装置５０の光学系であるフォーカス用照明光学系３５およびフォーカス用結像光学系３７からなる。
【００３７】
観察光学系７は、試料５側から光軸に沿って、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１３、観察用結像レンズ１７を備えている。観察用結像レンズ１７の後方には、肉眼観察用の接眼レンズ（図示省略）が配置されている。なお、本実施形態においては、観察用結像レンズ１７の結像位置に撮像装置（第２実施形態においてはＣＣＤセンサ）１９を配置して試料像を撮影している。
【００３８】
フォーカス用照明光学系３５は、試料５に対してスリット状の照明光像を投影するための光学系である。フォーカス用照明光学系３５は、光軸に沿って、赤外光を照射する光源３９、第１コレクタレンズ７０、スリット板４１、第２コレクタレンズ７２、瞳の半分を遮光する瞳制限マスク７４、ハーフミラー７６、および焦点位置調整レンズ（以下、オフセットレンズという。）６６を備えている。
【００３９】
オフセットレンズ６６は、ダイクロイックミラー１３側から順に、凸レンズ６６ａと凹レンズ６６ｂとからなり、凹レンズ６６ｂには当該凹レンズ６６ｂを光軸方向へ移動するためのオフセットレンズ駆動部７８が接続されている。凸レンズ６６ａは固定である。
【００４０】
フォーカス用結像光学系３７は、フォーカス用照明光学系３５によって試料５に投影された照明光像の試料５からの反射像を受光するための光学系であり、ハーフミラー７６の反射光路上に配置されたオートフォーカス用結像レンズ８０および反射像を検出するＣＣＤセンサ８２を有している。
【００４１】
対物レンズ１１の焦点位置とフォーカス用照明光学系３５からの照明光像の集光位置とが合った状態において、入力部６２のオートフォーカス制御開始のスイッチ（図示省略）が操作されると、フォーカス用照明光学系３５によってスリット板４１のスリット孔４１ａを通ったスリット状の照明光像が試料５に投影され、該光像の試料５からの反射像はフォーカス用結像光学系３５によってＣＣＤセンサ８２上に結像される。制御部２５はＣＣＤセンサ８２上に結像した反射像から焦点情報、すなわち対物レンズ１１の焦点位置から試料５の被検面までの相対的な距離を求め、この焦点情報に基づいてステージ３を駆動して、試料５の被検面を対物レンズ１１の焦点位置へ配置する。これにより、対物レンズ１１の焦点位置と試料５の被検面が合い、フォーカス用照明光学系３５からの集光位置が同じく被検面に合い、またその反射像がＣＣＤセンサ８２上に結像されることとなる。この位置をオフセットゼロ位置という。
【００４２】
オフセットゼロ位置から観察位置を試料５内部に移動させる場合、オフセットダイヤル６８を回転させてオフセットレンズ６６の凹レンズ６６ｂを駆動して、フォーカス用照明光学系３５からの照明光の集光位置を光軸方向で試料５内部側へ任意の移動量分だけ移動させる。そしてこれと同時に制御部２５がオートフォーカス制御を行うことでステージ３が駆動され、試料５の被検面はフォーカス用照明光学系３５からの照明光の集光位置に合わせられる。このとき、対物レンズ１１の焦点位置は固定であるため、試料５の被検面は対物レンズ１１の焦点位置からずれた位置、つまり試料５内部に配置されることとなる。こうして、対物レンズ１１の焦点位置に試料５内部の任意の位置を合わせることが可能となる。
【００４３】
次に、図８に示す制御フローを参照して顕微鏡１００におけるオートフォーカス制御を説明する。
【００４４】
顕微鏡１００は、図８に示す制御フローを用いることで、オフセットダイヤル６８を回転させた際のステージ３の移動量が環境温度や対物レンズ１１の種類によらず一定であり、その移動量はステージダイヤル６４を同じ回転角だけ回転させた際のステージ３の移動量と同じになるように構成されている。
【００４５】
まず観察者は入力部６２のオートフォーカス制御開始スイッチを押す。すると制御部２５はタイマー（図示省略）をスタートさせる（Ｓ１０１）。制御部２５は所定の時間（第２実施形態では１０ミリ秒）が経過したと判断したら（Ｓ１０２）、オフセットレンズ６６用のレンズ駆動部７８とともに備えられた回転角検出部（図示省略）を介して、オフセットダイヤル６８の回転角を読み取る（Ｓ１０３）。その後制御部２５は、オフセットダイヤル６８が回転操作されているか否か、つまり読み取った回転角がメモリ６０に記憶されている前回検出分の回転角と異なるか否かを判断する（Ｓ１０４）。回転角が前回検出分の回転角と同じ場合は本制御フローは終了する。回転角が前回と異なる場合は、制御部２５は読み取った回転角から、この回転角に対応する角度でステージダイヤル６４を操作したと仮定した時のステージ３の上下方向移動量を算出する（Ｓ１０５）。このステージ３の上下方向移動量を算出する方法は、ステージダイヤル６４を回転させた際に移動量を算出する方法と同じである。すなわち、ステージダイヤル６４によるステージの単位回転移動量が用いられる。
【００４６】
Ｓ１０５ステップにおいて、制御部２５はさらに、算出されたステージ３の上下方向移動量から、これに対応する移動量分だけオフセットレンズ６６を駆動するために必要なパルス数を後述する計算方法により計算する。
【００４７】
その後、ステップＳ１０３で得られたオフセットダイヤル６８の回転角とステップＳ１０５で得られたオフセットレンズ６６を駆動するためのパルス数とがメモリ６０に記憶される（Ｓ１０６）。記憶された回転角とパルス数は、次回ステップＳ１０４が実行される際に用いられ、次回の移動量の算出およびパルス数の計算に用いられる。制御部２５はステップＳ１０５で得られたオフセットレンズ６６を駆動するためのパルス数をレンズ駆動部７８へ出力してオフセットレンズ６６を駆動する。そしてステップＳ１０３に戻る。
【００４８】
次にステップＳ１０５におけるオフセットレンズ６６を駆動するためのパルス数の計算について、図９および図１０を参照して説明する。
【００４９】
図９および図１０は、ともにメモリ６０に格納された情報であって、図９は基準温度でのオフセットゼロ位置からの各距離のパルス数を対物レンズ１１ごとに示したテーブルであり、図１０は各温度におけるオフセットゼロ位置のパルス数を対物レンズ１１ごとに示したテーブルである。当該パルス数の計算はこれらのテーブルに基づいて行われる。
【００５０】
まず、図９の基準温度によるテーブルを用いて、上記ステージ３の上下方向移動量と、現在のオフセットレンズ６６のパルス数Ｑ（ｘ１，ｙ）から移動するパルス数Ｑ（ｘ２，ｙ）を求める。次に、図１０の温度センサ（図示省略）によって温度を測定し、各温度によるテーブルを用いてオフセットゼロ位置のずれ量Ｔ（ｗ１，ｙ）を求める。最後に移動するパルス数Ｑ（ｘ２，ｙ）＋Ｔ（ｗ１，ｙ）を計算し、これがオフセットレンズを駆動するためのパルス数となる。
【００５１】
以上述べてきた構成の第２実施形態に係る顕微鏡１００において、例えば上記オフセットゼロ位置を基準としてＺスタック画像を取得する場合の動作は、以下の通りである。
【００５２】
観察者はオフセットゼロ位置で入力部６２を操作し、制御部２５にＺスタック画像取得の指示をする。すると制御部２５は、フォーカス用結像光学系３７に設けられたＣＣＤセンサ８２に結像した照明光像の反射像から求められた焦点情報を信号処理回路４７（図７参照）で解析、処理をして当該オフセットゼロ位置におけるフォーカスエラー信号、すなわち第１実施形態で述べたＳ字カーブのグラフＳａで表される信号を取得する。制御部２５はフォーカスエラー信号に基づいてオートフォーカス制御を行う。つまりフォーカスエラー信号がゼロになるようにステージ駆動部５６を介してステージ３を観察光学系７の光軸方向に移動させる。
【００５３】
制御部２５はまず、Ｚスタック画像取得の初期位置となるオフセットゼロ位置で試料５を撮像するよう撮像装置１９（本実施形態ではＣＣＤセンサ）に指示をする。次に制御部２５は第１実施形態と同様に、当該Ｓ字カーブを描くフォーカスエラー信号に所定のオフセット信号を加える。すると対物レンズ１１と試料５の基準の被検面とが電気的にオフセットされ、試料５の合焦位置がずれる。制御部２５はステージ駆動部５６を介してフォーカスエラー信号がゼロとなる位置にステージ３を移動させる。移動後の位置が対物レンズ１１と試料５との合焦位置になる。この合焦位置は、オフセットゼロ位置から上方（または下方）、つまりＺ方向に所定量移動した位置である。制御部２５は移動後の合焦位置で試料５を撮像するよう撮像装置１９に指示をする。以後は、第１実施形態と同様に、オフセット信号の印加、フォーカスエラー信号ゼロ位置へのステージ３の移動、移動後の位置での試料５の撮像という動作を複数回繰り返すことで所望の範囲のＺスタック画像が取得できる。所望の範囲のＺスタック画像が取得できたら、入力部６２を操作してＺスタック画像取得指示を解除する。すると制御部２５は元のオートフォーカス制御に切り替わる。
【００５４】
このように第２実施形態においても、第１実施形態と同様に振動の影響を大幅に低減してＺスタック画像を取得することができる。
【００５５】
なお、第２実施形態はオフセットゼロ位置を初期位置としてＺスタック画像を取得する場合を説明したが、オフセットゼロ位置に限らず任意の位置からＺスタック画像を取得する事が可能である。
【００５６】
第２実施形態において、オフセットレンズ６６ｂを駆動して対物レンズ１１の焦点位置を試料５内部の任意の位置に調節する場合、焦点位置の移動距離は約５０μｍ間隔で調節することが可能である。これに対し、本発明の画像取得方法によれば、合焦位置は１μｍの間隔でＺ方向へ移動可能である。そこで第２実施形態に係る顕微鏡１００では、次のような観察方法が可能となる。
【００５７】
試料５の観察中に、オフセットレンズ６６ｂを駆動して試料５のより詳しく観察したいポイント近傍に焦点位置を合わせる。焦点位置が合ったら、その位置を初期位置としてフォーカスエラー信号を取得し、上述したように電気的に合焦位置をずらす。すると、初期位置を基準として詳細なＺスタック画像を取得することができる。このように、オフセットレンズ６６の特徴と本発明の特徴とが融合し、より多様な観察および撮像が可能となる。
【００５８】
また、オフセットレンズ６６ｂを駆動することでオフセットさせることが可能な焦点位置の移動距離は、オフセットレンズ６６の焦点距離により物理的に決まってくる。オフセットレンズ６６と本発明を組み合わせることで、この物理的な制限を超えて焦点位置をオフセットさせることが可能となる。すなわち、オフセットレンズ６６で物理的にオフセットさせることができる限界までオフセットさせ、その位置を初期位置としてフォーカスエラー信号を取得し、上述したように電気的に合焦位置をずらす。こうすることで、オフセットレンズ６６を備えた顕微鏡のＺスタック画像を取得できる範囲を実質的に拡張することができる。
【００５９】
なお、上記各実施形態はスリット状の光像を用いてオートフォーカス制御を行っているが、スリット状の光像に代えてスポット光を用いてオートフォーカス制御を行っても良い。このように本発明の構成は上記実施形態に限定されるものではなく、適宜変更が可能である。
【符号の説明】
【００６０】
１、１００  顕微鏡
１ａ、１００ａ  本体部
３  ステージ
５  試料
７  観察光学系
１０  レボルバ
１１  対物レンズ
１９  撮像装置
２５  制御部
２７  駆動部
３５  フォーカス用照明光学系
３７  フォーカス用結像光学系
３９  (赤外光)光源
４５  光電変換器
４７  信号処理回路
５０  フォーカス装置部
５４  フォーカス制御用スイッチボックス
５６  ステージ駆動部
５８  位置検査部
６０  メモリ
６４  ステージダイヤル
６６  焦点位置調整レンズ
６８  オフセットダイヤル
７８  オフセットレンズ駆動部
８０  オートフォーカス用結像レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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