(57)【要約】【課題】  種々の用途の中でも特に食品用途に適した安全な原料を用いて効率良くリン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質及び該リン脂質を効率よく製造する方法を提供すること。【解決手段】  ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質と脂肪酸のエステル化反応において、該エステル化反応をグリセリン中で行い、当該反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチドを添加することを特徴とするリン脂質の製造方法により上記課題が解決される。例えば、リゾホスファチジルコリンにＤＨＡ、グリセリンを加え、さらにグリシン、ホスホリパーゼＡ２を加えて反応させることにより、ＤＨＡが２位に結合したリン脂質を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質と脂肪酸のエステル化反応において、該エステル化反応をグリセリン中で行い、当該反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチドを添加することを特徴とするリン脂質の製造方法。
【請求項２】
前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のリン脂質の製造方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、グリシン、アラニン、セリンの組み合わせからなる請求項１又は２に記載のリン脂質の製造方法。
【請求項４】
前記エステル化反応を３５℃以上８０℃以下で行う請求項１〜３の何れかに記載のリン脂質の製造方法。
【請求項５】
前記リゾリン脂質が大豆由来である請求項１〜４の何れかに記載のリン脂質の製造方法。
【請求項６】
前記エステル化反応後に、ケトン溶剤を加えてグリセリン溶液層とケトン溶剤層を形成させ、該ケトン溶剤層を分離し、その後ケトン溶剤層中の溶剤を留去した後、脂肪酸を除去してリン脂質を得る請求項１〜５何れかに記載のリン脂質の製造方法。
【請求項７】
前記エステル化反応後に、炭素数４以下のアルコールを加えた後、更に炭化水素溶剤及び／又はケトン溶剤及び／又はエステル溶剤からなる溶剤を加えてグリセリン溶液層と溶剤層を形成させ、該溶剤層を分離し、その後前記溶剤層中の溶剤を留去した後、脂肪酸を除去してリン脂質を得る請求項１〜５何れかに記載のリン脂質の製造方法。
【請求項８】
前記ケトン溶剤がアセトンである請求項６又は７に記載のリン脂質の製造方法。
【請求項９】
前記炭素数４以下のアルコールがエタノールである請求項７に記載のリン脂質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載の方法により製造された、高度不飽和脂肪酸が２位に結合した食用リン脂質。
【請求項１１】
ホスホリパーゼＡ２によりリン脂質の２位を加水分解して得られたリゾリン脂質を含む反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチド、及び脂肪酸を混合してから、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応を行うことで、リン脂質の２位に脂肪酸を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質の製造方法に関し、特に食用に適したリン脂質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の脂質に関する研究から、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸が学習機能向上、動脈硬化性予防、脂質代謝改善機能など様々な機能を持つことが明らかになっている。特にＤＨＡは、ホスファチジルコリンのようなリン脂質に結合した形態で摂取することにより、トリグリセリド型と比較して抗酸化性が強く安定性が高まり、また吸収が良いためＤＨＡの持つ生理活性が発現しやすいことが明らかになっている。ＤＨＡ以外のＥＰＡや共役リノール酸、アラキドン酸などの機能性脂肪酸においてもリン脂質に結合することで生理活性が高まることが期待できる。
【０００３】
ＤＨＡをはじめとする機能性の脂肪酸が結合したリン脂質の製造方法は、天然に存在するものを抽出する方法と、大豆リン脂質などを原料として合成する方法に分けられる。具体的には、水産動物の卵を原料としてＤＨＡ結合リン脂質を抽出する方法（特許文献１）、イカなどの海産物から有機溶剤により抽出する方法などが挙げられる（特許文献２）。
【０００４】
しかし、これらの方法では原料が高価であり供給が必ずしも安定しておらず、またリン脂質の組成が原料に依存しているため、ＤＨＡ以外の機能性脂肪酸を結合させたものは製造することはできない。
【０００５】
原料の組成によらず所望の脂肪酸を導入できる方法として、微生物の培養液に任意の脂肪酸を添加し、微生物に該脂肪酸を組み込ませたリン脂質を製造する方法が挙げられるが（特許文献３）、この方法では大量の培養液から少量のリン脂質しか得られず、生産効率が良いものではない。
【０００６】
一方、大豆リン脂質等にＤＨＡを結合させる方法としては、リパーゼ及びホスホリパーゼの反応系に高誘電率水素結合形成物を添加する方法が挙げられるが（特許文献４）、この方法ではリパーゼによるリゾリン脂質と脂肪酸の反応で高反応率が得られているものの、ホスホリパーゼＡ２による反応では高い反応率が得られなかった。ＤＨＡ結合リン脂質の生理活性の発現にはＤＨＡがリン脂質の２位に結合していることが重要であるところ、リパーゼによる反応では主に目的の脂肪酸はリン脂質の１位に結合するため、実用性が高いとは言えない。
【０００７】
また、ホスホリパーゼＡ２を用いて高い反応率でリン脂質の２位に脂肪酸を導入できる方法としてトルエンを溶剤として反応させる方法（非特許文献１）、グリセリンとホルムアミドを添加する系で反応させる方法（非特許文献２）が挙げられるが、これらはトルエンやホルムアミドなどの有害な物質を使用する必要があるため食品への用途には適さない。
【０００８】
そこで、食用として用い得る原料のみを使用し、高い反応率でリン脂質の２位に脂肪酸を導入できる方法、とりわけＤＨＡのような高度不飽和脂肪酸を２位に導入したリン脂質及びその製法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平８−５９６７８号公報
【特許文献２】特開平８−３２５１９２号公報
【特許文献３】特開２００７−１２９９７３号公報
【特許文献４】特開平８−５６６８３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９９７年、１３４３巻、７６−８４項
【非特許文献２】Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６年、７２巻、９０９−９１１項
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、種々の用途の中でも特に食品用途に適した安全な原料を用いて効率良くリン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質及び該リン脂質を効率よく製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ホスホリパーゼＡ２を含む系でのリゾリン脂質と脂肪酸の反応の際に、当該反応系にアミノ酸を添加することにより効率よく反応を行うことができ、所望の脂肪酸をリゾリン脂質の２位に導入したリン脂質を大量に得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明の第一は、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応において、該エステル化反応をグリセリン中で行い、かつ当該反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチドを添加することを特徴とするリン脂質の製造方法に関する。また、前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である上記記載のリン脂質の製造方法、前記アミノ酸３残基以下のペプチドが、グリシン、アラニン、セリンの組み合わせからなるペプチドである上記記載のリン脂質の製造方法、前記エステル化反応を３５℃以上８０℃以下で行う上記記載のリン脂質の製造方法、前記リゾリン脂質が大豆由来である上記記載のリン脂質の製造方法に関する。
【００１４】
更に、前記エステル化反応後に、ケトン溶剤を加えてグリセリン溶液層とケトン溶剤層を形成させ、該ケトン溶剤層を分離し、その後ケトン溶剤層中の溶剤を留去した後、脂肪酸を除去してリン脂質を得る上記記載のリン脂質の製造方法、前記エステル化反応後に、炭素数４以下のアルコールを加えた後、炭化水素溶剤及び／又はケトン溶剤及び／又はエステル溶剤からなる溶剤を加えてグリセリン溶液層と溶剤層を形成させ、該溶剤層を分離し、その後前記溶剤層中の溶剤を留去し、脂肪酸を除去してリン脂質を得る上記記載のリン脂質の製造方法、前記ケトン溶剤がアセトンである上記記載のリン脂質の製造方法、前記炭素数４以下のアルコールがエタノールである上記記載のリン脂質の製造方法に関する。
【００１５】
本発明の第二は、上記記載の方法により製造された、高度不飽和脂肪酸が２位に結合した食用リン脂質に関する。
【００１６】
本発明の第三は、ホスホリパーゼＡ２によりリン脂質の２位を加水分解して得られたリゾリン脂質を含む反応系に、アミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチド、及び脂肪酸を混合してから、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応を行うことで、リン脂質の２位に脂肪酸を導入する方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、安全な原料を用いて効率良くリン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質、特に食品用途に適したリン脂質及び該リン脂質を効率よく製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明のリン脂質は、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応において、反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチドを添加することにより製造することができる。
【００１９】
本発明におけるリゾリン脂質は、リン脂質から２位の脂肪酸を除いたものを指し、リン脂質とは異なる脂質を意味する。本発明に用いるリゾリン脂質は、リン脂質を改質したものを用いることができ、入手のし易さからは大豆由来、菜種由来、卵黄由来のものが好ましく、価格面からは大豆由来のものがより好ましいが、その他の植物由来のリゾリン脂質も用いることができる。
【００２０】
リン脂質を改質してその２位の脂肪酸を除く方法としては、有害な物質を使用しない限り特に限定はないが、例えばホスホリパーゼＡ２などを用いてリン脂質の２位の脂肪酸を加水分解する方法などが挙げられる。この場合に用いることができるリン脂質は、グリセリン骨格とリン酸基及び２つの脂肪酸エステルを持つ分子で、ホスホリパーゼＡ２の基質になり得るものであり、スフィンゴシン骨格を持つものは含まれない。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンなどが例示できる。
【００２１】
本発明で行うリゾリン脂質と脂肪酸のエステル化反応において、リゾリン脂質の２位に導入する脂肪酸としては、特に限定はないが、昨今の消費者の健康志向から、生理活性を高められる脂肪酸が好ましく、共役リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸が例示できる。前記ＤＨＡやＥＰＡは、主に海産動物油や藻類から得られる油脂を加水分解し遊離脂肪酸の形態にしたものを用いることができる。
【００２２】
尚、本発明で高度不飽和脂肪酸とは、炭素−炭素間の２重結合の数が３つ以上の不飽和脂肪酸、又は共役リノール酸を意味するものとする。
【００２３】
本発明に用いる脂肪酸はリン脂質１００重量部に対して、３０〜１０００重量部を用いることが好ましい。３０重量部未満であると、反応後に脂肪酸の結合していないリゾリン脂質が多く残存し反応効率が悪くなる場合があり、１０００重量部を超えて使用するとコスト面で不利な場合がある。
【００２４】
また、ＤＨＡなどのように、天然由来のものを単体で入手が困難である場合は、所望の脂肪酸を含有する脂肪酸の混合物を用いることができる。その際、脂肪酸混合物中の所望の脂肪酸の含有量は、概ね２０重量％以上であることが望ましい。ＤＨＡの場合を例示すると、ＤＨＡ含有脂肪酸中のＤＨＡの濃度は好ましくは２０重量％以上であり、４５重量％以上のＤＨＡ濃度を持つものを用いることがより好ましい。尚、本発明によるエステル化反応の後に溶剤分別などを行い反応生成物であるリン脂質の濃度を高めても構わない。
【００２５】
本発明に用いるホスホリパーゼＡ２は、特にその由来は問わないが、一般に食用に用いることができるものが好ましく、例えばブタ膵臓由来のものや微生物由来のものが挙げられる。
【００２６】
本発明に用いるアミノ酸は、主にタンパク質の構成要素となるもので分子内にカルボキシル基とアミノ基を有する分子を指し、食用として用いることができるものが好ましい。中でも、酵素の電荷状態に比較的影響を与えず酵素を活性化できることから、中性アミノ酸が好ましく、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシンなどが例示でき、本発明のリン脂質の製造方法に用いる場合は、それらの群より選ばれる少なくとも１種を用いることができる。
【００２７】
本発明に用いるアミノ酸が３残基以下のペプチドとは、アミノ酸同士がアミド結合により主に２量体または３量体になったものを指し、アミノ酸から合成したものであるか、タンパク質を酵素などにより分解したものであるかは問わないが、グリセリンに対する溶解度が比較的高いことからグリシン、アラニン、セリンからなるペプチドであることが好ましく、グリシルグリシンなどが例示できる。
【００２８】
本発明では、前記のとおりアミノ酸が３残基以下のペプチドであることを特徴の一つとするものであるが、その理由は、アミノ酸残基が少ない方がグリセリンに溶解した際に高いモル濃度が得られ、効率的にホスホリパーゼＡ２を活性化できるためである。
【００２９】
前記のようなアミノ酸やアミノ酸が３残基以下のペプチドは、少なくとも何れかがホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応において添加されていればよく、その添加量としては、リゾリン脂質１００重量部に対して１０〜２０００重量部加えることが好ましく、より好ましくは５０〜５００重量部である。１０重量部未満であると反応効率が悪くなる場合があり、２０００重量部を超えるとコストが不利になり、また反応効率も悪くなる場合がある。さらにアミノ酸や、アミノ酸が３残基以下のペプチドは、エステル化反応系中における合計の溶解量を多くするために２種類以上を組み合わせて添加してもかまわない。
【００３０】
本発明では、必要に応じて抗酸化剤を添加してもよい。本発明において使用できる抗酸化剤は、食品用途として用いることができ、ＤＨＡなどの脂肪酸に対する抗酸化力が期待できるものであれば種類を問わないが、トコフェロール、カテキンなどのポリフェノール、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などが好適に用いられる。尚、この場合、後述の製造方法で得られるリン脂質は、抗酸化剤との混合物であってもよい。
【００３１】
また、同様に脂肪酸の酸化を防止するため、リゾリン脂質のエステル化反応は酸素を遮断し、窒素雰囲気下で行ってもよい。
【００３２】
本発明では、前記エステル化反応は、アミノ酸を溶解し得る溶剤を用いて行うことができるが、食品への使用が可能で、極性の高いグリセリンを使用する。
【００３３】
本発明のリン脂質の製造方法の好適例の一つを以下に示す。
まず、リゾリン脂質およびＤＨＡなどの脂肪酸を、グリセリンに溶解し、アミノ酸、又は／及びアミノ酸が３残基以下のペプチドおよびホスホリパーゼＡ２を加え攪拌することによりリゾリン脂質のエステル化反応を行う。この際、酵素の活性化のためにカルシウムイオンが反応系に存在していることが好ましい。カルシウム源としては、溶解度が比較的高く、食品原料としても用いられることから、塩化カルシウムが好ましい。
【００３４】
この際、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応は、酵素の至適温度や脂肪酸の酸化等の観点から、３５℃〜８０℃の温度範囲で行うことが好ましく、４５℃〜７０℃の範囲で行うことがより好ましい。また、前記反応中の脂肪酸の酸化を防ぐため、予め抗酸化剤を添加してリゾリン脂質のエステル化反応を行ってもよいし、酸素を遮断して窒素雰囲気下で前記反応を行っても良く、これらを単独であるいは併用してもよい。また、ホスホリパーゼＡ２による反応では、反応が進行すると水が生成するなどして、加水分解が進行し過ぎる場合は、反応の途中で減圧等の操作を適宜行うことにより水分を除去してもよい。減圧により水分を除去する場合、その条件としては、例えば、温度が３５〜８０℃、１５０ｔｏｒｒ（２０ｋＰａ）以下で、１２〜２４時間行えばよい。尚、エステル化反応の進行は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）等により確認することができる。
【００３５】
以上のようにしてリゾリン脂質と脂肪酸のエステル化反応を行うことによりリゾリン脂質の２位に所望の脂肪酸を導入した本発明のリン脂質が生成される。本発明では、上記のような反応液の状態でも、リン脂質溶液として種々の用途に使用可能であるが、後述の抽出操作を行うことにより、純度の高いリン脂質を得ることもできる。
【００３６】
本発明では、純度の高いリン脂質を得るための抽出操作として、次の操作を行うのが好ましい。
即ち、上述のエステル化反応終了後の反応液に、炭化水素溶剤及び／又はケトン溶剤及び／又はエステル溶剤からなる溶剤を加えて、グリセリン溶液層と溶剤層を形成させる。この際、当該溶剤層（上層）にリン脂質と脂肪酸が、グリセリン溶液層（下層）にはそれら以外の物質が移行する。そして当該溶剤層を分離（分取）する。尚、このような所定溶剤の添加および分取操作は、純度の向上と作業効率を考慮し、適宜繰り返しても良い。
【００３７】
ここで前記炭化水素溶剤とは、炭素と水素のみから構成される化合物のうち溶剤として用いることができるものを指す。具体的にはペンタン、ヘキサン、ヘプタン等であるが、沸点が低いため留去しやすくかつ食品添加物として使用できることからヘキサンがより好ましい。
【００３８】
また前記ケトン溶剤とは、分子内にケト基を持つ分子のうち溶剤として用いることができるものを指す。具体的にはアセトン、ブタノン等であるが、沸点が低いため留去しやすくかつ食品添加物として使用できることからアセトンが好ましい。
【００３９】
さらに前記エステル溶剤とは、分子内にエステル結合を持つものうち、溶剤として利用できるものを指し、具体的には酢酸メチル、酢酸エチル等であるが、食品用途として用いられることから酢酸エチルが好ましい。
【００４０】
本発明では、上述のエステル化反応終了後、前記の溶剤を添加する前に炭素数４以下のアルコールを添加するのが好ましい。これにより、抽出操作中の加水分解を防ぎ、ホスホリパーゼＡ２を失活させると共にグリセリンの粘度を下げて抽出を行いやすくなる傾向にある。尚、前記の溶剤として、前記ケトン溶剤のみからなる溶剤を用いる場合は、上記のような抽出操作中の加水分解、ホスホリパーゼＡ２の活性、グリセリンの粘度の影響は低いため、前記アルコールを添加しなくてもよい。
【００４１】
ここで前記炭素数４以下のアルコールとは、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールのことを指すが、毒性が低く食品添加物として利用できることからエタノールが好ましい。
【００４２】
上記のように溶剤層を分離（分取）した後、脂肪酸を除去する方法としては特に限定はなく、ケトン溶剤、エタノール−ヘキサン混合溶剤などで脱脂する方法、シリカゲルを用いて脂肪酸を除去する方法などが例示できる。
【００４３】
例えば、ケトン溶剤等を用いる方法としては、分離（分取）した溶剤層中の前記溶剤を留去した後に別途新たにケトン溶剤等を加え、冷却することでリン脂質を析出させ、脂肪酸の溶解したケトン溶剤を分離除去することで、リゾリン脂質の２位に所望の脂肪酸を導入した、純度の高い本発明のリン脂質を得ることができる。ここで、上記溶剤留去後に加えるケトン溶剤等は、沸点が低く、留去し易く且つ食品添加物として使用できるアセトンが好ましい。
【００４４】
またシリカゲルを用いて脂肪酸を除去する方法としては、上記溶剤層を分離後に、当該溶剤層を、シリカゲルを充填したカラムに流してリン脂質を吸着させ、脂肪酸を流出させることにより取り除き、その後カラムに流出溶剤を流してシリカゲルに吸着したリン脂質を脱着させ、所望のリン脂質画分のみを分取した後、リン脂質を再結晶化することで、リゾリン脂質の２位に所望の脂肪酸を導入した、純度の高い本発明のリン脂質を得ることができる。
【００４５】
尚、本発明には、リゾリン脂質を直接使用することに代えて、リン脂質を出発原料とする場合も含まれる。例えば、ホスホリパーゼＡ２によりリン脂質の２位を加水分解した後、得られたリゾリン脂質、アミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチド、及び所望の脂肪酸をグリセリン中で反応させ、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応を行うことで、リン脂質の２位の脂肪酸を所望の脂肪酸に交換することができる。
【００４６】
本発明のリン脂質の製造方法は、食用リン脂質の製造に好適に用いることができ、その為には製造過程で食用に適さない原料やトルエン、ホルムアミドなどの溶剤などを使用さえしなければよい。また、このようにして得られたリン脂質、特に、その２位に高度不飽和脂肪酸が導入されたものは、高機能の食用リン脂質として好適に用いることができる。
【実施例１】
【００４７】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
＜リン脂質の脂肪酸組成の測定＞
実施例および比較例において、エステル化反応終了後、反応溶液５０μｌにエタノール５０μｌと飽和塩化ナトリウム溶液０．５ｍｌを加えて攪拌し、ヘキサン２００μｌでリン脂質、リゾリン脂質及び脂肪酸を抽出する操作を４回繰りかえした。リン脂質、リゾリン脂質及び脂肪酸を有する有機層をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で展開し、リン脂質及びリゾリン脂質画分を分取して、ナトリウムメチラートでメチルエステル化を行い、リン脂質及びリゾリン脂質に結合している脂肪酸の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィー（島津製作所製「ＧＣ−１４Ｂ」）で測定し、各脂肪酸に対応する面積比を、各脂肪酸の脂肪酸組成全体中の重量比とした。
【００４９】
＜リン脂質・リゾリン脂質の抽出量比測定＞
実施例９〜１３，比較例７〜８で得られた各上層とクロロホルム−メタノール層（アセトン層と分別した下層）をクロロホルム：メタノール＝２：１の溶剤５０μｌに溶解させ、それぞれ２μｌずつＴＬＣにスポットし、ホスファチジルコリン及びリゾホスファチジルコリンのスポットについて画像解析ソフト「ＩｍａｇｅＪ」を用いて計算し、それぞれホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリンごとの抽出量比を各層の合計が１００％になるよう百分率で表した。
【００５０】
＜各抽出法の総合評価＞
実施例９〜１３，比較例７〜８において、前記リン脂質・リゾリン脂質の抽出量比測定で得られた各上層中のホスファチジルコリン抽出量比（ｘ）は多いほど良く、逆に各上層中のリゾホスファチジルコリン抽出量比（ｙ）は少ないほど良く、以下の基準で評価した。評価点は、
ｘに関しては、５点：１００％＞ｘ＞８０％、４点：８０％≧ｘ＞６０％、３点：６０％≧ｘ＞４０％、２点：４０％≧ｘ＞２０％、１点：２０％≧ｘ、
ｙに関しては、３点：３０％≧ｙ、２点：６０％≧ｙ＞３０％、１点：ｙ＞６０％
とし、抽出方法としての総合評価をそれぞれの評価点の和として、
◎：（ｘの評価点）＋（ｙの評価点）≧７点、即ち、反応したリン脂質が十分量抽出され、なおかつ未反応のリゾリン脂質の抽出量が少なく、品質の良いリン脂質が得られた、
○：７点＞（ｘの評価点）＋（ｙの評価点）≧６点、即ち、反応したリン脂質が十分量抽出された、
△：６点＞（ｘの評価点）＋（ｙの評価点）≧５点、即ち、反応したリン脂質の抽出量が不十分である、
×：５点＞（ｘの評価点）＋（ｙの評価点）、即ち、反応したリン脂質の抽出量が著しく不十分である、
とした。
【００５１】
（実施例１）
リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０Ｈ」）３５ｍｇにオレイン酸（東京化成工業社製）９７ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（和光純薬工業社製）５０ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（ノボザイムズジャパン社製「レシターゼ１００Ｓ」、１３０Ｉｕ／ｍｇ）１０ｍｇと１．０ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液２．５μｌを加えて６０℃で２４時間反応させ、オレイン酸が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、オレイン酸含量は３９．２重量％であった。
【００５２】
（実施例２）
リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ（東京化成工業社製）１１３ｍｇ、グリセリン（和光純薬工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（和光純薬工業社製）５０ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（ノボザイムズジャパン社製「レシターゼ１００Ｓ」、１３０Ｉｕ／ｍｇ）１０ｍｇと１．０ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（和光純薬工業社製）溶液２．５μｌを加え、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン３ｍｇ（和光純薬工業社製）を加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は３４．２重量％であった。
【００５３】
（実施例３）
リゾホスファチジルコリン（辻製油社製ＳＬＰ−ＬＰＣ７０）３５ｍｇにＤＨＡ（東京化成工業社製）１１３ｍｇ、グリセリン（和光純薬工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシルグリシン（和光純薬工業社製）６０ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製、粉末リゾナーゼ、５３Ｉｕ／ｍｇ）２０ｍｇと１．２ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（和光純薬工業社製）溶液２．５μｌを加え、さらに抗酸化剤としてカテキンを含有するサンカトールＮＯ１（太陽化学社製）３ｍｇ、及びアスコルビン酸３ｍｇ（和光純薬工業社製）を加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は３０．７重量％であった。
【００５４】
（実施例４）
ＤＨＡ１１３ｍｇの代わりにＥＰＡ（ナカライテスク社製）１０４ｍｇを用い、さらにグリシルグリシン６０ｍｇの代わりにグリシン６０ｍｇを用いた以外は実施例２と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＥＰＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＥＰＡ含量は２８．５重量％であった。
【００５５】
（実施例５）
ＤＨＡ１１３ｍｇの代わりにアラキドン酸（シグマアルドリッチジャパン社製）１０３ｍｇを用い、さらにグリシルグリシン６０ｍｇの代わりにグリシン４０ｍｇを用いた以外は実施例２と同様にして高度不飽和脂肪酸（アラキドン酸）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、アラキドン酸含量は３２．３重量％であった。
【００５６】
（実施例６）
リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ−５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ５１．８重量％含有）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸１０５ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）７５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は１５．５重量％であった。
【００５７】
（実施例７）
リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ−５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ５１．８重量％含有）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸１０５ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）３７．５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）３７．５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は１７．２重量％であった。
【００５８】
（実施例８）  ホスファチジルコリン純度向上用リン脂質含有エステル化反応溶液の作製
リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ−５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ５１．８重量％含有）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸３０ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）３７．５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）３７．５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」）２０ｍｇを加え、さらに０．５ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液６μｌを加え、０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分減圧して水分を除去し、５０℃で２４時間反応させ、ホスファチジルコリン純度向上用のリン脂質含有エステル化反応溶液を得た。該反応液中に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１５．３重量％であった。
【００５９】
（比較例１）
グリシンを用いなかった以外は実施例１と同様にしてオレイン酸が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、オレイン酸含量は１９．４重量％であった。
【００６０】
（比較例２）
グリシルグリシンを用いなかった以外は実施例３と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は１２．９重量％であった。
【００６１】
（比較例３）
グリシンを用いず、水を６０μｌ加えた以外は実施例４と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＥＰＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質の及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＥＰＡ含量は８．９重量％であった。
【００６２】
（比較例４）
グリシンを用いなかった以外は実施例５と同様にして高度不飽和脂肪酸（アラキドン酸）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、アラキドン酸含量は５．５重量％であった。
【００６３】
（比較例５）
グリシンを用いなかったこと以外は実施例６と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質の、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は４．４重量％であった。
【００６４】
（比較例６）
グリシン及びアラニンを用いなかったこと以外は実施例８と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質の、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は７．６重量％であった。
【００６５】
（実施例９）  アセトン抽出
実施例８で得られた反応液１００ｍｇにアセトン１００μｌを加えて分液し、アセトン層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。またアセトン層と分別した下層にクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ＝２：１）を２００μｌ加え、飽和塩化ナトリウム水溶液３００μｌを加えて分液してクロロホルム−メタノール層（アセトン層と分別した下層）を抽出した。アセトン層（上層）とクロロホルム−メタノール層（アセトン層と分別した下層）についてそれぞれＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００６６】
（実施例１０）  エタノール＋ヘキサン抽出
実施例８で得られた反応液１００ｍｇにエタノール５０μｌを加えて撹拌した後、ヘキサン５０μｌを加えて分液してヘキサン層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。またヘキサン層と分別した下層は、実施例８と同様に処理しそれぞれヘキサン層（上層）、ヘキサン層と分別した下層についてＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００６７】
（実施例１１）  エタノール＋アセトン抽出
実施例８で得られた反応液１００ｍｇにエタノール２５μｌを加えて撹拌した後、アセトン７５μｌを加えて分液してアセトン層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。またアセトン層と分別した下層は、実施例８と同様に処理しそれぞれアセトン層（上層）、アセトン層と分別した下層についてＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００６８】
（実施例１２）  エタノール＋アセトン／ヘキサン抽出
実施例８で得られた反応液１００ｍｇにエタノール１００μｌを加えて撹拌した後、アセトン５０μｌとヘキサン５０μｌの混合溶媒を加えて分液してアセトン／ヘキサン混合溶媒層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。またアセトン／ヘキサン混合溶媒層と分別した下層は、実施例８と同様に処理しそれぞれ上層、下層についてＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００６９】
（実施例１３）  エタノール＋酢酸エチル抽出
実施例８で得られた反応液１００ｍｇにエタノール２５μｌを加えて撹拌した後、酢酸エチル７５μｌを加えて分液して酢酸エチル層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。酢酸エチル層と分別した下層は、実施例８と同様に処理しそれぞれ酢酸エチル層（上層）、酢酸エチル層と分別した下層についてＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００７０】
（参考例１）
実施例８で得られた反応液１００ｍｇにヘキサン１００μｌを加えて分液し、ヘキサン層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。ヘキサン層と分別した下層は、実施例８と同様に処理し、それぞれヘキサン層（上層）、ヘキサン層と分別した下層についてＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００７１】
（参考例２）
実施例８で得られた反応液１００ｍｇに酢酸エチル１００μｌを加えて分液し、酢酸エチル層（上層）を分取する操作を２回繰り返した。酢酸エチル層と分別した下層は、実施例８と同様に処理し、それぞれ酢酸エチル層（上層）、酢酸エチル層と分別した下層についてＴＬＣを行い、抽出法としての総合評価も行った。それらの結果を表１にまとめた。
【００７２】
【表１】
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