(57)【要約】【課題】確度が高く臨床上有用なメタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査（易罹患性の判定）を可能にすることを課題とする。また、メタボリック症候群又はその関連疾患の発症の阻止ないし遅延や、メタボリック症候群又はその関連疾患に罹患した患者の生活の質の向上に資する有益な情報を提供することを課題とする。【解決手段】被検者から採取された核酸検体において、多型(1)、即ち米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）と、多型(2)、即ち、前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）とを検出し、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスクを評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取された核酸検体について、以下の二つの多型(1)及び(2)を検出するステップを含む、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査法：
(1)米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）；
(2)前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）。
【請求項２】
以下の(a)及び(b)の基準の組合せ、以下の(c)及び(d)の基準の組合せ、又は以下の(e)の基準、に従いリスクを判定することを特徴とする、請求項１に記載のリスク検査法：
(a)  多型(1)について、塩基がAのアレルが検出されるとリスクが高い；
(b)  多型(2)について、塩基がAのアレルが検出されないとリスクが高い；
(c)  多型(1)について、GG型のリスク  ＜  GA型のリスク  ＜  AA型のリスク；
(d)  多型(2)について、AG型又はAA型のリスク  ＜  GG型のリスク；
(e)  多型(1)がAA型で多型(2)がGG型の場合にリスクが最大である。
【請求項３】
被検者から採取された血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載のリスク検査法。
【請求項４】
以下の(a)'の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、請求項３に記載のリスク検査法：
(a)'  血中レジスチン濃度が高いとリスクが高い。
【請求項５】
多型(1)、即ち米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）についての遺伝子型と、多型(2)、即ち前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）についての遺伝子型との組合せに対して、組合せ毎に血中レジスチン標準濃度範囲を予め関連付けておき、以下のステップ(A)〜(D)を行うことを特徴とする、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査法：
(A)被検者から採取された核酸検体及び血液検体を用意するステップ；
(B)前記核酸検体においてレジスチン遺伝子の前記多型(1)及び前記多型(2)を検出し、該二つの多型について遺伝子型を決定するステップ；
(C)前記血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップ；及び
(D)ステップ(C)で得られたレジスチン濃度が、ステップ(B)で決定した二つの遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べるステップ。
【請求項６】
ステップ(D)において、ステップ(C)で得られたレジスチン濃度が、血中レジスチン標準濃度範囲に属する、血中レジスチン標準濃度範囲の下限値よりも低い、及び血中レジスチン標準濃度範囲の上限値よりも高い、のいずれであるかを決定することを特徴とする、請求項５に記載のリスク検査法。
【請求項７】
前記血液検体として血清又は血漿が用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリスク検査法。
【請求項８】
多型(1)、即ち米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）の検出用核酸と、
多型(2)、即ち前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）の検出用核酸と、を含む、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査用キット。
【請求項９】
血液検体中のレジスチン濃度を測定するための成分を更に含む、ことを特徴とする請求項８に記載のリスク検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメタボリック症候群又は心血管疾患のリスク検査法、及び該リスク検査法に利用される検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進国において過体重または肥満の数が著明に増加している（参考文献１）。肥満はインスリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、脂質代謝異常や心血管疾患といった、多くの慢性疾患のリスクを増加させる（参考文献２）。中心性肥満、耐糖能障害、高血圧、脂質代謝異常を含む疾患群であるメタボリック症候群もまた先進国で流行しており、動脈硬化性心血管疾患の増加との関連がある。脂肪組織はかつては内在性のエネルギー貯蔵所と考えられていたが、脂肪組織中の脂肪細胞とマクロファージは主要な内分泌器官として注目されてきている（参考文献３）。脂肪組織はアディポサイトカインとして知られる種々の因子（アディポネクチン、レプチン、TNF-α、PAI-1そしてレジスチンなどが含まれる）産生・分泌する。
【０００３】
レジスチンはFIZZ蛋白として知られるレジスチン様分子ファミリーに属するシステイン豊富なサイトカインであり、肥満とインスリン抵抗性との連結に関わる原因と示唆されている。レジスチンは白色脂肪組織において発現が認められており、脂肪細胞の分化過程で誘導されるシグナル伝達分子である。遺伝的および食餌性肥満のマウスモデルで、循環血中レジスチン濃度は著明に増加する。さらに、マウスをPPARγと相互作用のあるインスリン感受性改善剤のロシグリタゾンで治療を行うことにより、血清レジスチン濃度が減少することが認められた。これらの観察からレジスチンは肥満と関連したインスリン抵抗性および２型糖尿病において何らかの役割を果たしていることが示唆されている（参考文献４（非特許文献１））。
【０００４】
ヒトでは、循環血中のレジスチンの主な産生源はマクロファージであると考えられている（参考文献５、６）。レジスチンは代謝性疾患や炎症性疾患のバイオマーカーまたはメディエーターとも考えられている（参考文献７〜１０（非特許文献２〜５））。増加した血清レジスチン濃度と、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧、動脈硬化性心血管疾患などの代謝性疾患との関連を示した報告がいくつかなされている（参考文献１１〜１７（非特許文献６〜１２））。さらに、ヒトレジスチン遺伝子の多型とこれらの疾患との関連も認められている（参考文献１８〜２７（非特許文献１３〜２２））。しかしながら、すべての報告で再現性があるわけではない（参考文献２８〜３０（非特許文献２３〜２５））。ヒトレジスチン遺伝子のプロモーター領域の多型が循環血中のレジスチン濃度に影響を与えることが認められているが（参考文献２７、３１（非特許文献２２、２６））、循環血中のレジスチン濃度の遺伝的および環境上の決定要因は明らかではない。尚、レジスチン遺伝子の多型を利用して疾患のリスクを評価する試みがなされている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−６２９７４号公報
【特許文献２】特開２００７−２０２４１５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Steppan CM, Bailey ST, Bhat S, Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM, Patel HR, Ahima RS, Lazar MA: The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature 409:307-312, 2001
【非特許文献２】Lehrke M, Reilly MP, Millington SC, Iqbal N, Rader DJ, Lazar MA: An inflammatory cascade leading to hyperresistinemia in humans. PLoS Med 1:e45, 2004
【非特許文献３】Reilly MP, Lehrke M, Wolfe ML, Rohatgi A, Lazar MA, Rader DJ: Resistin is an inflammatory marker of atherosclerosis in humans. Circulation 111:932-939, 2005
【非特許文献４】Silswal N, Singh AK, Aruna B, Mukhopadhyay S, Ghosh S, Ehtesham NZ: Human resistin stimulates the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-12 in macrophages by NF-κB-dependent pathway. Biochem Biophys Res Commun 334:1092-1101, 2005
【非特許文献５】Lago F, Dieguez C, Gomez-Reino J, Gualillo O: The emerging role of adipokines as mediators of inflammation and immune responses. Cytokine Growth Factor Rev 18:313-325, 2007
【非特許文献６】McTernan CL, McTernan PG, Harte AL, Levick PL, Barnett AH, Kumar S: Resistin, central obesity, and type 2 diabetes. Lancet 359:46-47, 2002
【非特許文献７】Degawa-Yamauchi M, Bovenkerk JE, Juliar BE, Watson W, Kerr K, Jones R, Zhu Q, Considine RV: Serum resistin (FIZZ3) protein is increased in obese humans. J Clin Endocrinol Metab 88:5452-5455, 2003
【非特許文献８】Verma S, Li SH, Wang CH, Fedak PW, Li RK, Weisel RD, Mickle DA: Resistin promotes endothelial cell activation: further evidence of adipokine-endothelial interaction. Circulation 108:736-740, 2003
【非特許文献９】Banerjee RR, Rangwala SM, Shapiro JS, Rich AS, Rhoades B, Qi Y, Wang J, Rajala MW, Pocai A, Scherer PE, Steppan CM, Ahima RS, Obici S, Rossetti L, Lazar MA: Regulation of fasted blood glucose by resistin. Science 303:1195-1198, 2004
【非特許文献１０】Fujinami A, Obayashi H, Ohta K, Ichimura T, Nishimura M, Matsui H, Kawahara Y, Yamazaki M, Ogata M, Hasegawa G, Nakamura N, Yoshikawa T, Nakano K, Ohta M: Enzyme-linked immunosorbent assay for circulating human resistin: resistin concentrations in normal subjects and patients with type 2 diabetes. Clin Chim Acta 339:57-63, 2004
【非特許文献１１】Ohmori R, Momiyama Y, Kato R, Taniguchi H, Ogura M, Ayaori M, Nakamura H, Ohsuzu F: Associations between serum resistin levels and insulin resistance, inflammation, and coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 46:379-380, 2005
【非特許文献１２】Lazar MA: Resistin- and obesity-associated metabolic diseases. Horm Metab Res 39:710-716, 2007
【非特許文献１３】Pizzuti A, Argiolas A, Di Paola R, Baratta R, Rauseo A, Bozzali M, Vigneri R, Dallapiccola B, Trischitta V, Frittitta L: An ATG repeat in the 3'-untranslated region of the human resistin gene is associated with a decreased risk of insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab 87:4403-4406, 2002
【非特許文献１４】Smith SR, Bai F, Charbonneau C, Janderova L, Argyropoulos G: A promoter genotype and oxidative stress potentially link resistin to human insulin resistance. Diabetes 52:1611-1618, 2003
【非特許文献１５】Tan MS, Chang SY, Chang DM, Tsai JC, Lee YJ: Association of resistin gene 3'-untranslated region +62G→A polymorphism with type 2 diabetes and hypertension in a Chinese population. J Clin Endocrinol Metab 88:1258-1263, 2003
【非特許文献１６】Conneely KN, Silander K, Scott LJ, Mohlke KL, Lazaridis KN, Valle TT, Tuomilehto J, Bergman RN, Watanabe RM, Buchanan TA, Collins FS, Boehnke M: Variation in the resistin gene is associated with obesity and insulin-related phenotypes in Finnish subjects. Diabetologia 47:1782-1788, 2004
【非特許文献１７】Mattevi VS, Zembrzuski VM, Hutz MH: A resistin gene polymorphism is associated with body mass index in women. Hum Genet 115:208-212, 2004
【非特許文献１８】Osawa H, Yamada K, Onuma H, Murakami A, Ochi M, Kawata H, Nishimiya T, Niiya T, Shimizu I, Nishida W, Hashiramoto M, Kanatsuka A, Fujii Y, Ohashi J, Makino H: The G/G genotype of a resistin single-nucleotide polymorphism at -420 increases type 2 diabetes mellitus susceptibility by inducing promoter activity through specific binding of Sp1/3. Am J Hum Genet 75:678-686, 2004
【非特許文献１９】Gouni-Berthold I, Giannakidou E, Faust M, Kratzsch J, Berthold HK, Krone W: Resistin gene 3'-untranslated region +62G→A polymorphism is associated with hypertension but not diabetes mellitus type 2 in a German population. J Intern Med 258:518-526, 2005
【非特許文献２０】Menzaghi C, Coco A, Salvemini L, Thompson R, De Cosmo S, Doria A, Trischitta V: Heritability of serum resistin and its genetic correlation with insulin resistance-related features in nondiabetic Caucasians. J Clin Endocrinol Metab 91:2792-2795, 2006
【非特許文献２１】Ochi M, Osawa H, Hirota Y, Hara K, Tabara Y, Tokuyama Y, Shimizu I, Kanatsuka A, Fujii Y, Ohashi J, Miki T, Nakamura N, Kadowaki T, Itakura M, Kasuga M, Makino H: Frequency of the G/G genotype of resistin single nucleotide polymorphism at -420 appears to be increased in younger-onset type 2 diabetes. Diabetes 56:2834-2838, 2007
【非特許文献２２】Osawa H, Tabara Y, Kawano R, Ohashi J, Ochi M, Onuma H, Nishida W, Yamada K, Nakura J, Kohara K, Miki T, Makino H: Plasma resistin, associated with single nucleotide polymorphism -420, is correlated with insulin resistance, lower HDL, and high sensitivity CRP in the Japanese general population. Diabetes Care 30:1501-1506, 2007
【非特許文献２３】Lee JH, Chan JL, Yiannakouris N, Kontogianni M, Estrada E, Seip R, Orlova C, Mantzoros CS: Circulating resistin levels are not associated with obesity or insulin resistance in humans and are not regulated by fasting or leptin administration: cross-sectional and interventional studies in normal, insulin-resistant, and diabetic subjects. J Clin Endocrinol Metab 88:4848-4856, 2003
【非特許文献２４】Heilbronn LK, Rood J, Janderova L, Albu JB, Kelley DE, Ravussin E, Smith SR: Relationship between serum resistin concentrations and insulin resistance in nonobese, obese, and obese diabetic subjects. J Clin Endocrinol Metab 89:1844-1848, 2004
【非特許文献２５】Utzschneider KM, Carr DB, Tong J, Wallace TM, Hull RL, Zraika S, Xiao Q, Mistry JS, Retzlaff BM, Knopp RH, Kahn SE: Resistin is not associated with insulin sensitivity or the metabolic syndrome in humans. Diabetologia 48:2330-2333, 2005
【非特許文献２６】Azuma K, Oguchi S, Matsubara Y, Mamizuka T, Murata M, Kikuchi H, Watanabe K, Katsukawa F, Yamazaki H, Shimada A, Saruta T: Novel resistin promoter polymorphisms: association with serum resistin level in Japanese obese individuals. Horm Metab Res 36:564-570, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、メタボリック症候群（MetS）又は心血管疾患を対象とした臨床上有用なリスク検査法（易罹患性の判定法）を提供することを課題とする。また、MetS又は心血管系疾患の予防（発症の阻止ないし遅延）又は改善に資する有益な情報を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の背景の下、本発明者らは、血漿レジスチン濃度と、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧、脂質代謝異常といった代謝性疾患との関連を明らかにし、血漿レジスチン濃度の決定要因を明らかにすることを目的として大規模な横断的研究を行った。その結果、レジスチン遺伝子の二つの多型（rs34861192多型とrs3219175多型）が血漿レジスチン濃度の独立した強い決定因子であることが明らかとなった。また、血漿レジスチン濃度が腹部肥満と関連し、同時にインスリン抵抗性や脂質代謝異常といった、肥満と関連した心血管疾患危険因子とも関連することが示唆された。さらに本発明者らは、レジスチン濃度の実測値は遺伝的素因と環境要因を反映したものであることに着目し、レジスチン遺伝子の上記二つの多型を検出した結果とレジスチン濃度の実測値を併用すれば、MetSや心血管疾患について環境要因の影響（換言すれば生活習慣）を評価できると考えた。評価結果は、MetSや心血管疾患の予防や改善を促すための有益な情報となる。例えば、多型の検出結果から予想されるレジスチン濃度範囲よりもレジスチン濃度の実測値が高いようであれば、環境要因の影響によってレジスチン濃度が高い状態が形成されていると判断できることから、生活習慣の改善を促すことが病態ないし症状の改善に有効となる。尚、ハプロタイプ解析の結果、SNPデータベースに番号rs3219175で登録されている多型は上記rs34861192多型と完全な連鎖不平衡にあり、rs34861192多型と同様の目的（即ちMetsのリスク判定など）に利用できることが示された。
本発明は、主として以上の知見に基づき完成されたものであり、以下の通りである。
［１］被検者から採取された核酸検体について、以下の二つの多型(1)及び(2)を検出するステップを含む、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査法：
(1)米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）；
(2)前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）。
［２］以下の(a)及び(b)の基準の組合せ、以下の(c)及び(d)の基準の組合せ、又は以下の(e)の基準、に従いリスクを判定することを特徴とする、［１］に記載のリスク検査法：
(a)  多型(1)について、塩基がAのアレルが検出されるとリスクが高い；
(b)  多型(2)について、塩基がAのアレルが検出されないとリスクが高い；
(c)  多型(1)について、GG型のリスク  ＜  GA型のリスク  ＜  AA型のリスク；
(d)  多型(2)について、AG型又はAA型のリスク  ＜  GG型のリスク；
(e)  多型(1)がAA型で多型(2)がGG型の場合にリスクが最大である。
［３］被検者から採取された血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップをさらに含む、［１］又は［２］に記載のリスク検査法。
［４］以下の(a)'の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、［３］に記載のリスク検査法：
(a)'  血中レジスチン濃度が高いとリスクが高い。
［５］多型(1)、即ち米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）についての遺伝子型と、多型(2)、即ち前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）についての遺伝子型との組合せに対して、組合せ毎に血中レジスチン標準濃度範囲を予め関連付けておき、以下のステップ(A)〜(D)を行うことを特徴とする、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査法：
(A)被検者から採取された核酸検体及び血液検体を用意するステップ；
(B)前記核酸検体においてレジスチン遺伝子の前記多型(1)及び前記多型(2)を検出し、該二つの多型について遺伝子型を決定するステップ；
(C)前記血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップ；及び
(D)ステップ(C)で得られたレジスチン濃度が、ステップ(B)で決定した二つの遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べるステップ。
［６］ステップ(D)において、ステップ(C)で得られたレジスチン濃度が、血中レジスチン標準濃度範囲に属する、血中レジスチン標準濃度範囲の下限値よりも低い、及び血中レジスチン標準濃度範囲の上限値よりも高い、のいずれであるかを決定することを特徴とする、［５］に記載のリスク検査法。
［７］前記血液検体として血清又は血漿が用いられる、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のリスク検査法。
［８］多型(1)、即ち米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）の検出用核酸と、
多型(2)、即ち前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）の検出用核酸と、を含む、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査用キット。
［９］血液検体中のレジスチン濃度を測定するための成分を更に含む、ことを特徴とする［８］に記載のリスク検査用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】レジスチン遺伝子の10 SNPの連鎖不平衡解析の結果。Haploview 4.0を用いたペアワイズ連鎖不平衡D’値を示した。-638G→A、-537A→C、-420C→G、-358G→A、-167C→T、+157C→T、+299G→A、及び+602C→T SNPsが連鎖不平衡ブロックを形成し、-638G→Aと-358G→Aは完全な連鎖不平衡にあった。
【図２】レジスチン遺伝子多型と血漿レジスチン濃度の関連を示すグラフ。-638G→A(A)、-420G→C(B)、+1084G→A(C)、およびATGリピート(D)の遺伝子多型ごとの大規模集団での血漿レジスチン濃度を示した。データは平均値±標準誤差で示した。One-way ANOVAでのP値は-638G→AでP<1 × 10-15、-420G→CでP<1 × 10-15、+1084G→AでP=5.32 × 10-6、そしてATGリピートでP=1.17 × 10-4であった。
【図３】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度を示したグラフ。
【図４】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度を示した表。各組合せの例数、積算平均値、上側95%点の値、下側95%点の値が示される。
【図５】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度（95%信頼区間）を示したグラフ。
【図６】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度を示した表。各組合せの例数、積算平均値、上側95%点の値、下側95%点の値が示される。+1084G→AについてはGGの群とAG又はAAの群に分けた。
【図７】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度（90%信頼区間）を示したグラフ。
【図８】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度（80%信頼区間）を示したグラフ。
【図９】2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度（70%信頼区間）を示したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査法）
本発明の第１の局面はメタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査法に関する。本発明においてメタボリック症候群又はその関連疾患のリスクとは、メタボリック症候群又はその関連疾患の易罹患性（疾患への罹りやすさ）をいう。「メタボリック症候群」とは、肥満・内臓脂肪の蓄積を基盤としてインスリン抵抗性、動脈硬化惹起性リポ蛋白異常、高血圧を合併し、心血管病に罹るリスクが高くなった状態をいう。メタボリック症候群の診断基準を以下に示す。尚、特に言及しない限り、本明細書では国際糖尿病連合（IDF）基準を優先的に適用する。その理由は、日本内科学会等８学会による日本基準に関してはその腹囲の決定に議論があるからである（Oka R, Reassessment of the cutoff values of waist circumference and visceral fat area for identifying Japanese subjects at risk for the metabolic syndrome. Diabetes Research and Clinical Practice. 2008;79(3):474-481.を参照)。
（１）日本内科学会等８学会による日本基準（日本内科学金雑誌 第94巻 第4号・平成17年4月10日を参照）
以下の(a)に加え、(b)〜(d)の中の二つ以上を満たす。
(a)腹囲：  ≧85cm（男性）、≧90cm（女性）
(b)中性脂肪：  ≧150mg/dl  かつ／又はHDL-C：  ＜40mg/dl
(c)血圧：  ≧130/85mmhg
(d)空腹時血糖：  ＞110mg/dl
【００１１】
（２）国際糖尿病連合（IDF）基準（非特許文献５を参照）
以下の(a)に加え、(b)〜(e)の中の二つ以上を満たす。
(a)腹囲：  ≧90cm（男性）、≧80cm（女性）
(b)中性脂肪：  ≧150mg/dl
(c)空腹時血糖：  ＞100mg/dl
(d)HDL-C：  ＜40mg/dl（男性）、＜45mg/dl（女性）
(e)血圧：  ≧130/85mmhg
【００１２】
本発明における「その関連疾患」とは、メタボリック症候群の構成疾患又はメタボリック症候群がリスク因子となる心血管疾患を指す。ここでの「構成疾患」とは、糖尿病、高血圧症、高脂血症若しくは動脈硬化症を指す。動脈硬化症は、脳動脈硬化症及び冠動脈硬化症を含む。また、ここでの「心血管疾患」は、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症等を包含する。
【００１３】
本発明のリスク検査法の一態様では、被検者から採取された核酸検体について、特定の一塩基多型（慣例に従い、SNPともいう）を検出する。そして、検出結果に基づきリスクを判定・評価する。検出対象のSNPの詳細は後述する。
【００１４】
まず、被検者から採取された核酸検体を用意する。本発明では、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク判定を必要とする者（被検者）に由来する核酸検体を使用する。核酸検体は、被検者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。検出対象の多型部位を含むものであれば任意の長さのゲノムDNAを核酸検体として用いることができる。
【００１５】
被検者は特に限定されない。即ち、メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。例えば、メタボリック症候群又はその関連疾患の患者についての判定結果は、より適切な治療方針の決定に役立ち、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促す。一方、健常者又はメタボリック症候群又はその関連疾患を発症する世代ではない若年者についての判定結果はメタボリック症候群又はその関連疾患の予防や早期診断に役立つ。即ち、リスクが高いとの情報に基づいて予防的措置や生活習慣の改善等を図れば、メタボリック症候群又はその関連疾患の発症可能性（罹患可能性）を低下させることができる。また、リスクが高いとの情報はメタボリック症候群又はその関連疾患の検診を受診させる契機となり、これによってメタボリック症候群又はその関連疾患の早期診断、早期発見が可能となる。尚、ここでの「健常者」とは、本発明のリスク検査法を適用する時点において、メタボリック症候群又はその関連疾患に罹患しているとの判断が行われていない者のことをいう。
【００１６】
本発明の適用範囲は日本人に限られない。即ち、日本人以外のモンゴロイドやその他の人種（コーカサイド等）に対しても本発明を適用可能である。但し、遺伝的に近い集団（例えば日本人集団に対して中国人集団や韓国人集団は近い）では多型の種類・頻度が同様の傾向を示すことが多いという事実を考慮すると、本発明における被検者は好ましくはモンゴロイド（日本人、中国人、韓国人など）であり、更に好ましくは日本人である。
【００１７】
本発明では、レジスチン遺伝子の多型を検出する。具体的には、検出対象の多型は次の多型(1)と多型(2)である。
(1)米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースにおける登録番号34861192で特定される一塩基多型（rs34861192多型）又は登録番号3219175で特定される一塩基多型（rs3219175多型）
(2)前記SNPデータベースにおける登録番号3745368で特定される一塩基多型（rs3745368多型）
【００１８】
後述の実施例に示す通り、rs34861192多型とrs3219175多型はハプロタイプ解析によって完全な連鎖不平衡にあることが判明した。そこで本発明では、多型(1)としてこれらのいずれかを検出対象とする。
【００１９】
rs34861192多型の染色体上の位置は19p13.2（7639575bp「NCBI build 36.3」）である。また、添付の配列表の配列番号１の配列における256番目の塩基が当該多型位置に相当する。本明細書では当該多型のことを-638 G→A多型と呼ぶことがある。
【００２０】
rs3219175多型の染色体上の位置は19p13.2（7639855bp「NCBI build 36.3」）である。また、添付の配列表の配列番号２の配列における99番目の塩基が当該多型位置に相当する。本明細書では当該多型のことを-358 G→A多型と呼ぶことがある。
【００２１】
もう一つの検出対象である多型(2)、即ちrs3745368多型の染色体上の位置は19p13.2（7641297bp）である。また、添付の配列表の配列番号３の配列における256番目の塩基が当該多型位置に相当する。本明細書では当該多型のことを+1084 G→A多型と呼ぶことがある。
【００２２】
尚、ヒトレジスチン遺伝子は例えば、For genomic structure of the RETN gene [accession number NT_077812]及びRETN cDNA [accession number NM_020415]としてGenBankに登録されている。
【００２３】
本発明において用語「多型を検出する」は、用語「多型を解析する」又は用語「アレルを検出する」と置換可能である。多型の検出によって多型位置の状態（即ち、塩基の種類や塩基の配列）が明らかとなる。
【００２４】
本発明では多型の検出結果、即ち検出されたアレルの種類又はアレルの組合せ（遺伝子型）を基にリスクを判定する。ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
【００２５】
後述の実施例に示す通り、多型(1)（rs34861192多型、rs3219175多型）ではAアレルがリスクアレルであることが判明した（メジャーアレル：G、マイナーアレル：A）。一方、多型(2)（rs3745368多型）ではGアレルがリスクアレルであることが判明した（メジャーアレル：G、マイナーアレル：A）。そこで、好ましくは以下の基準(a)と(b)の組合せに従ってリスクを判定・評価する。
(a)  多型(1)について、塩基がAのアレルが検出されるとリスクが高い
(b)  多型(2)について、塩基がAのアレルが検出されないとリスクが高い
【００２６】
上記組合せに従った判定・評価手法の具体例を以下に列挙する。
例１：多型(1)ついて、塩基がAのアレルが検出されること（条件１）と、多型(2)について、塩基がAのアレルが検出されないこと（条件２）の両方を満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
例２：多型(1)ついて、塩基がAのアレルが検出されること（条件１）と、多型(2)について、塩基がAのアレルが検出されないこと（条件２）の両方を満たす場合に最高リスクと判定し、いずれか片方を満たす場合に中程度リスクと判定し、いずれも満たさない場合に最低リスクと判定する。
例３：多型(1)ついて、塩基がAのアレルが検出されること（条件１）と、多型(2)について、塩基がAのアレルが検出されないこと（条件２）の少なくとも一つを満たす場合に高リスクと判定し、条件１及び２のいずれも満たさない場合に低リスクと判定する。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、多型の検出結果より、各多型について遺伝子型（アレルの組合せ）を決定する。具体的には、多型(1)について、GG型（多型位置の塩基がGのアレルのホモ接合型）、GA型（多型位置の塩基がGのアレルと多型位置の塩基がAのアレルのヘテロ接合体）及びAA型（多型位置の塩基がAのアレルのホモ接合体）のいずれであるかを決定する。同様に多型(2)についても、GG型（多型位置の塩基がGのアレルのホモ接合型）、GA型（多型位置の塩基がGのアレルと多型位置の塩基がAのアレルのヘテロ接合体）及びAA型（多型位置の塩基がAのアレルのホモ接合体）のいずれであるかを決定する。この態様の場合、好ましくは以下の基準(c)及び(d）の組合せに従ってリスクを判定・評価する。或いは、以下の基準(e)に従ってリスクを判定・評価する。尚、このように遺伝子型を用いれば、より確度の高い判定・評価が可能になる。
【００２８】
(c)  多型(1)について、GG型のリスク  ＜  GA型のリスク  ＜  AA型のリスク
(d)  多型(2)について、AG型又はAA型のリスク  ＜  GG型のリスク
(e)  多型(1)がAA型で多型(2)がGG型の場合にリスクが最大である
【００２９】
基準(c)及び(d）の組合せに従った判定・評価手法の具体例を以下に列挙する。
例１：多型(1)に関する遺伝子型がAA型であること（条件１）、多型(2)に関する遺伝子型がGG型であること（条件２）の両方を満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
例２：多型(1)に関する遺伝子型がAA型であること（条件１）、多型(2)に関する遺伝子型がGG型であること（条件２）の両方を満たす場合に最高リスクと判定し、いずれか片方を満たす場合に中程度リスクと判定し、いずれも満たさない場合に最低リスクと判定する。
例３：多型(1)に関する遺伝子型がAA型であること（条件１）、多型(2)に関する遺伝子型がGG型であること（条件２）の少なくとも一つを満たす場合に高リスクと判定し、条件１及び２のいずれも満たさない場合に低リスクと判定する。
【００３０】
多型の検出法（解析法）は特に限定されるものではなく例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって検出する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号パンフレット、特開2004-121232号公報など）、ASP-PCR（Allele Specific Primer-PCR)法（国際公開第01/042498号公報など）、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の多型部分を直接シークエンスすることにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型を検出してもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの検出方法を適用することもできる。
【００３１】
多数の核酸検体を検出する場合にはアレル特異的PCR法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、FRETを利用した方法、ASP-PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で検出可能な検出法を用いることが特に好ましい。
【００３２】
以上の方法では、各方法に応じたプローブやプライマー等の核酸（本発明において「多型検出用核酸」ともいう）が使用される。プローブとして利用される多型検出用核酸の例としては、検出対象の多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。例えば、検出対象の多型がrs34861192多型であれば、位置：19p13.2（7639575bp）を含む染色体領域を標的としてプローブを設計すればよい。ここでの「部分染色体領域」の長さは、例えば16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。また、当該核酸は好ましくは部分染色体領域に相補的な配列を有するが、特異的なハイブリダイゼーションに支障のない限り、多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは1〜3個である。ここでの「特異的なハイブリダイゼーション」とは、核酸プローブによる検出の際に通常採用されるハイブリダイゼーション条件（好ましくはストリンジェントな条件）の下、標的の核酸（部分染色体領域）に対してハイブリダイズする一方で、他の核酸との間にクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。尚、当業者であれば例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参考にしてハイブリダイゼーション条件を容易に設定可能である。
【００３３】
プライマーとして利用される多型検出用核酸の例としては、検出対象の多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸を挙げることができる。プライマーとして利用される多型検出用核酸の他の例として、検出対象の多型部位がいずれかの塩基である場合にのみ当該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には、検出対象の多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの塩基であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域（多型部位の近傍領域）に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。ここで、増幅されるDNAフラグメントの長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、更に好ましくは30〜200塩基長である。
【００３４】
尚、プローブの場合と同様、プライマーとして利用される多型核酸用核酸についても、増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り、鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。
【００３５】
多型検出用核酸（プローブ、プライマー）には、検出法に応じて適宜DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA:Peptide nucleic acid：)等が用いられる。多型検出用核酸の塩基長はその機能が発揮される長さであればよく、プローブとして用いられる場合の塩基長の例としては16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。他方、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50塩基長、好ましくは15〜40塩基長、更に好ましくは15〜30塩基長である。
【００３６】
多型検出用核酸（プローブ、プライマー）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型検出用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkやCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））を参考にすることができる。
【００３７】
本発明における多型検出用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として多型を検出することができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アレル特異的センスプライマー）をフルオレセインイソチオシアネートとテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分DNA領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００３８】
多型検出用核酸の標識に用いられる標識物質としては7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin（APC）、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド（Texas Red（登録商標））、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC-CyTM7、オレゴングリーン（Oregon Green）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００３９】
以上の多型検出用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の検出をより簡便に行うことができる。
【００４０】
アミノ酸の変化を伴う多型については、遺伝子発現産物であるペプチドないしタンパク質を用いて多型の検出を行うことにしてもよい。この場合、多型部位に対応するアミノ酸を含んでいる限り、発現産物の大きさ（長さ）は特に限定されない。遺伝子発現産物を用いた検出方法としては、多型部位のアミノ酸を直接検出する方法、又は立体構造の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては、例えば、周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有する抗体を用いた、ELISA法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等などを用いることができる。
【００４１】
標的（多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物）に対する抗体は免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。標的に対する抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。標的（又はその一部）を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。標的（又はその一部）としては、生体材料から調製したもの（天然抗原）又は組換え抗原を用いることができる。免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタールアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、CD46（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
【００４２】
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
【００４３】
以上の方法で得られたポリクローナル又はモノクローナル抗体は必要に応じて標識化される。標識物質としては7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin（APC）、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド（Texas Red（登録商標））、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC-CyTM7、オレゴングリーン（Oregon Green）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示できる。
【００４４】
本発明の一態様では、更なるステップとして、被検者から採取された血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップが行われる。即ちこの態様では、レジスチン遺伝子の２種類の多型と血中レジスチン濃度という二つの指標を併用してメタボリック症候群又はその関連疾患のリスクを判定する。このように血中レジスチン濃度をも考慮して判定すれば確度の更なる向上が図られる。
【００４５】
血液検体としては全血、血漿又は血清を用いる。好ましくは血漿又は血清を用いる。血漿や血清の調製は常法に従えばよい。尚、本明細書では、血液検体中のレジスチン濃度のことを「血中レジスチン濃度」という。用語「血中レジスチン濃度」は、用語「全血中レジスチン濃度」、用語「血漿レジスチン濃度」及び用語「血清レジスチン濃度」を包括する表現として使用される。
【００４６】
血中レジスチン濃度は、これに限定されるものではないが、好ましくは免疫学的手法を利用して測定する。免疫学的手法によれば迅速に且つ感度よくレジスチン濃度を測定できる。また、操作も簡便である。免疫学的手法によるレジスチン濃度の測定ではレジスチンに特異的結合性を有する物質が使用される。当該物質としては通常は抗レジスチン抗体が使用されるが、レジスチンに特異的結合性を有し、その結合量を測定可能な物質であれば抗レジスチン抗体に限らず使用することができる。
【００４７】
免疫学的手法の中でもELISA法（サンドイッチELISAや競合ELISA等）を利用してレジスチン濃度を測定することが好ましい。ELISA法は検出感度が高いことや特異性が高いこと、定量性に優れること、操作が簡便であること、多検体の同時処理に適することなど、多くの利点を有する。ELISA法を利用する場合の具体的な操作法の一例を以下に示す。まず、抗レジスチン抗体を不溶性支持体に固定化する。具体的には例えばマイクロプレートの表面を抗モノクローナル抗体で感作する（コートする）。このように固相化した抗体に対して血液検体を接触させる。この操作の結果、固相化した抗レジスチン抗体に対する抗原（レジスチン）が検体中に存在していれば免疫複合体が形成される。洗浄操作によって非特異的結合成分を除去した後、酵素を結合させた抗体を添加することで免疫複合体を標識し、次いで酵素の基質を反応させて発色させる。そして、発色量を指標として免疫複合体を検出する。尚、ELISA法の詳細については数多くの成書や論文に記載されており、各方法の実験手順や実験条件を設定する際にはそれらを参考にできる。また、レジスチン測定用のキットとしてHuman Resistin Quantikine ELISA Kit（R&D systems製）、Resistin ELISA（Biovendor Laboratory Medicine製、コスモ・バイオ株式会社販売）、Resistin ELISA Kit（Alexis Corporation製、コスモ・バイオ株式会社販売）、ヒトレジスチンELISAキット／Resistin ELISA Kit（American Research Products,Inc製、コスモ・バイオ株式会社販売）、Resistin ELISA Development（Pepro Tech Ec, Inc.製、コスモ・バイオ株式会社販売）などのELISAキットが市販されており、本発明ではこれらのキットを利用してレジスチン濃度を測定してもよい。
【００４８】
血中レジスチン濃度の評価には、「血中レジスチン濃度が高いとリスクが高い」という基準が採用される。レジスチン濃度の高低を分ける境界値として、ある集団を対象としてレジスチン濃度を測定したときの中央値又は平均値を用いることができる。ここでの「ある集団」とは例えば、特定の疾患（例えば糖尿病）の患者集団、特定の疾患に罹患した特定の年齢層（例えば３０代、４０代、５０代など）の集団、或いは病歴や年齢などに関係なく無作為に集めた集団などである。レジスチン濃度の高低を分ける境界値は例えば 4ng/ml〜50ng/ml（血漿又は血清濃度）の範囲内において設定することができる。より具体的には、4ng/ml〜43ng/ml（血漿又は血清濃度）の範囲内（例えば、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml）に境界値を設定することができる。尚、以上ではレジスチン濃度の範囲を高低の二つに分けることにしたが、これに限られるものではない。即ち、レジスチン濃度の範囲を３以上に分けた上で区分の設定をしてもよい。
【００４９】
本発明は更なる態様として、メタボリック症候群又はその関連疾患の環境因子に関する有益な情報が得られるリスク検査法を提供する。この態様のリスク検査法によって得られる情報は、メタボリック症候群又はその関連疾患の予防や、メタボリック症候群又はその関連疾患に罹患した患者の生活の質（QOL）の向上を促す上で有用である。この態様のリスク検査法では、上記の多型(1)（rs34861192多型、rs3219175多型）についての遺伝子型と、多型(2)（rs3745368多型）についての遺伝子型との組合せに対して、組合せ毎に血中レジスチン標準濃度範囲（血中レジスチン濃度の標準的な範囲）を予め関連付けておき、以下のステップ(A)〜(D)を行う。
(A)被検者から採取された核酸検体及び血液検体を用意するステップ。
(B)前記核酸検体においてレジスチン遺伝子の前記多型(1)及び前記多型(2)を検出し、該二つの多型について遺伝子型を決定するステップ。
(C)前記血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップ。
(D)ステップ(C)で得られたレジスチン濃度が、ステップ(B)で決定した二つの遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べるステップ。
【００５０】
この態様では、被検者の検体を用いた多型の検出及びレジスチン濃度の測定に先立って、２種類の遺伝子型の組合せ毎に血中レジスチン標準濃度範囲を関連付けておく。例えば、以下に示すような表を作成しておく。
【００５１】
二つの遺伝子型の組合せ１：血中レジスチン標準濃度範囲１
二つの遺伝子型の組合せ２：血中レジスチン標準濃度範囲２
二つの遺伝子型の組合せ３：血中レジスチン標準濃度範囲３
・
・
二つの遺伝子型の組合せｎ：血中レジスチン標準濃度範囲ｎ
【００５２】
二つの遺伝子型の組合せとして、以下の９個の組合せを設定することができる。
多型(1)についての遺伝子型がAA、多型(2)についての遺伝子型がGGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAA、多型(2)についての遺伝子型がAGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAG、多型(2)についての遺伝子型がGGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAG、多型(2)についての遺伝子型がAGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAG、多型(2)についての遺伝子型がAAである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がGG、多型(2)についての遺伝子型がGGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がGG、多型(2)についての遺伝子型がAGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がGG、多型(2)についての遺伝子型がAAである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAA、多型(2)についての遺伝子型がAAである組合せ
【００５３】
二つの遺伝子型の組合せとして、以下の６個の組合せを設定することにしてもよい。
多型(1)についての遺伝子型がAA、多型(2)についての遺伝子型がGGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAA、多型(2)についての遺伝子型がAG又はAAである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAG、多型(2)についての遺伝子型がGGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がAG、多型(2)についての遺伝子型がAG又はAAである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がGG、多型(2)についての遺伝子型がGGである組合せ
多型(1)についての遺伝子型がGG、多型(2)についての遺伝子型がAG又はAAである組合せ
【００５４】
多型の組合せに関連付けられる血中レジスチン標準濃度範囲は、多数の検体を用いた統計的解析によって決定することができる。具体例として、後述の実施例に示す解析によって決定された血中レジスチン標準濃度範囲（３種類の例）を、対応する多型の組合せとともに示す。
＜例１（95%信頼区間による）＞
（多型(1)の遺伝子型、多型(2)の遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約12 ng/ml〜約48 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約8 ng/ml〜約37 ng/ml
（AG、GG）：約7 ng/ml〜約30 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約5 ng/ml〜約25 ng/ml
（GG、GG）：約3 ng/ml〜約17 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約2 ng/ml〜約15 ng/ml
【００５５】
＜例２（90%信頼区間による）＞
（多型(1)の遺伝子型、多型(2)の遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約14 ng/ml〜約43 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約9 ng/ml〜約33    ng/ml
（AG、GG）：約8 ng/ml〜約27 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約6 ng/ml〜約22    ng/ml
（GG、GG）：約4 ng/ml〜約15 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約3 ng/ml〜約13    ng/ml
【００５６】
＜例３（80%信頼区間による）＞
（多型(1)の遺伝子型、多型(2)の遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約16 ng/ml〜約38 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約11 ng/ml〜約29 ng/ml
（AG、GG）：約9 ng/ml〜約23 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約7 ng/ml〜約19    ng/ml
（GG、GG）：約4 ng/ml〜約13 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約3 ng/ml〜約11 ng/ml
【００５７】
＜例４（70%信頼区間による）＞
（多型(1)の遺伝子型、多型(2)の遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約17 g/ml〜約35 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約12 ng/ml〜約26 ng/ml
（AG、GG）：約10 ng/ml〜約22 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約8 ng/ml〜約17 ng/ml
（GG、GG）：約5 ng/ml〜約12 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約4 ng/ml〜約10 ng/ml
【００５８】
この態様のリスク検査法ではまず、ステップ(A)〜(C)を実施し、被検者の遺伝子多型の組合せを決定するとともに、レジスチン濃度の測定値を得る。ステップ(A)〜(C)の操作は、上記各態様における対応する操作と同様であるため、その説明を省略する。
【００５９】
続くステップ(D)では、レジスチン濃度の測定値が、遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べる。レジスチン濃度が血中レジスチン標準濃度範囲内から逸脱していれば、その原因・理由が遺伝的素因ではなく環境因子にあると判断できる。
【００６０】
好ましくは、レジスチン濃度が、(1)血中レジスチン標準濃度範囲に属する、(2)血中レジスチン標準濃度範囲の下限値よりも低い、及び(3)血中レジスチン標準濃度範囲の上限値よりも高い、のいずれであるかを決定する。(1)の場合、遺伝的素因から予想される範囲内にレジスチン濃度があり、環境要因による悪影響はないと判断できる。従って、「現在の生活様式（ライフスタイル）を維持するとよい」といった助言を行うことができる。(2)の場合も同様に、環境要因による悪影響はないと判断でき、「現在の生活様式（ライフスタイル）を維持するとよい」といった助言を行うことができる。一方、(3)の場合、遺伝的素因ではなく環境要因にその原因があると判断でき、助言としては環境要因の改善を促すことになる。
【００６１】
（メタボリック症候群又はその関連疾患のリスク検査用キット）
本発明の第２の局面は、本発明のリスク検査法に使用されるキット（タボリックシンドローム又は心血管疾患のリスク検査用キット）を提供する。本発明のキットには多型(1)（rs34861192多型、rs3219175多型）検出用核酸と、多型(2)（rs3745368多型）検出用核酸（以下、これら三つをまとめて「多型検出用核酸」と呼ぶ）が含まれる。血中レジスチン濃度の測定も行う態様に使用されるキットの場合は、血液検体中のレジスチン濃度を測定するための成分（レジスチン濃度測定用成分）が更に含まれる。
【００６２】
多型検出用核酸は、それが適用される検出法（上述したアレル特異的核酸等を用いたPCR法を利用する方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP、TaqMan（登録商標）-PCR法、Invader（登録商標）法等）に応じて適宜設計される。多型検出用核酸の詳細については既述の通りであるが、キットの成分として利用可能な多型検出用核酸又は多型検出用核酸のセットの具体例を以下に示す。
【００６３】
＜rs34861192多型検出用＞
(1)多型位置の塩基がGである染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)多型位置の塩基がAである染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)多型位置の塩基がGである場合にのみ、該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)多型位置の塩基がAである場合にのみ、該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)多型位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型位置の塩基がGである、当該多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又は多型位置の塩基がAである、当該多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、当該部分染色体領域の近傍領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
【００６４】
＜rs3219175多型検出用＞
(1)多型位置の塩基がGである染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)多型位置の塩基がAである染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)多型位置の塩基がGである場合にのみ、該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)多型位置の塩基がAである場合にのみ、該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)多型位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型位置の塩基がGである、当該多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又は多型位置の塩基がAである、当該多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、当該部分染色体領域の近傍領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
【００６５】
＜rs3745368多型検出用＞
(1)多型位置の塩基がGである染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)多型位置の塩基がAである染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)多型位置の塩基がGである場合にのみ、該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)多型位置の塩基がAである場合にのみ、該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)多型位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型位置の塩基がGである、当該多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又は多型位置の塩基がAである、当該多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、当該部分染色体領域の近傍領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
【００６６】
一方、レジスチン濃度測定用成分についても測定方法に応じた物質が採用される。例えば免疫学的測定法の実施に必要な抗レジスチン抗体（例えばELISA法用として固相化抗レジスチン抗体と標識化抗レジスチン抗体の組合せ）をレジスチン濃度測定用成分として用いることができる。
【００６７】
多型検出用核酸を使用する際（即ち多型検出の際）に必要な試薬（DNAポリメラーゼ、制限酵素、緩衝液、発色試薬など）や容器、器具等、及び／又はレジスチン濃度測定用成分を使用する際（即ちレジスチン濃度の測定の際）に必要な試薬（緩衝液、ブロッキング用試薬、発色試薬など）や容器、器具等を本発明のキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００６８】
血漿レジスチン濃度と、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧、脂質代謝異常といった代謝性疾患との関連を明らかにし、血漿レジスチン濃度の決定要因を明らかにするため、高齢日本人コホートにおける大規模で地域住民を対象とした横断的研究を行った。
【００６９】
１．方法
（１）対象
2005年5月から2007年12月の間に北名古屋市の自治体健康診断を受けた3133名（男性1396、女性1737名）を対象とした。この研究の参加者は50歳から80歳であり、すべてが日本人である。検査及びDNA抽出のための血液検体は一晩絶食の後、対象から採血した。BMI、腹囲、血圧、空腹時血糖(FPG)、空腹時血清免疫学的インスリン濃度（IRI）、HbA1c、および血清脂質値はすべての対象で測定した。HOMA-IRも次のように算出した：FPG×IRI/405。肥満はBMI≧ 26kg/m2; 糖尿病はFPG≧126mg/dl、HbA1c≧6.5%または糖尿病治療薬の使用; 高血圧は収縮期圧≧140mmHg、拡張期圧≧90mmHgまたは降圧薬の使用; 脂質代謝異常は血清総コレステロール≧220mg/dl、血清HDLコレステロール＜40mg/dl、血清トリグリセライド≧150mg/dlまたは高脂血症治療薬の使用と定義した。メタボリック症候群の診断はIDFの診断基準に基づいて評価した。全対象の臨床背景を表１に示した。本研究は名古屋大学医学部倫理委員会により承認され、全対象から文書によるインフォームドコンセントを得た。
【表１】
2010207153.tif 000002
対象の背景。平均±SD
【００７０】
（２）血漿レジスチン濃度の測定
血漿レジスチン濃度は、ヒトレジスチンELISAキットを用いて測定した（LINCO Research）。この検査法による測定限界下限は0.16ng/ml、検査間および検査内の変動係数はそれぞれ7.0%と7.7%であった。
【００７１】
（３）多型選択
PubMedとOMIMを含む公共データベースを用いて、血漿レジスチン濃度と関連しうる、又は肥満、2型糖尿病、高血圧、脂質代謝異常、心血管疾患などの代謝性疾患との関連が指摘されている、あるいは日本人において少数アリル頻度が1％より大きい11多型を選択した（表２）。多型は遺伝子の転写開始点からの相対的塩基数により番号付けを行った。
【表２】
2010207153.tif 000003
使用したプライマー（表の上から順に配列番号４〜２５）、プローブ（表の上から順に配列番号２６〜３５）、PCRの条件。refSNP IDは、Entrez SNPのウェブサイトから取得した。
【００７２】
（４）多型解析
各対象から7mlの静脈血を採取し、EDTA 50 mmol/lとなるように調節した採血管に分注し、キット(Qiagen)を用いてDNAを分離した。過去の報告（参考文献３２）に従い、蛍光または比色によるアリル特異的DNAプライマープローブ解析法を用いて10 SNPを解析した（東洋紡ジーンアナリシス）。遺伝子の多型を含む領域は、5’末端をフルオレセインイソチオシアネートまたはテキサスレッドでラベルしたアレル特異的センスプライマー（またはアンチセンスプライマー）を用いPCR法により増幅し、同様に5’末端をビオチンでラベルしたアンチセンスプライマー（またはセンスプライマー）を用いPCR法により増幅した。反応混合物は20 ngのDNA、5 pmolのそれぞれのプライマー、0.2 mmol/lの各々のデオヌクレオシド三リン酸、1〜4 mmol/lのMgCl2及び1 UのDNAポリメラーゼ(rTaq or KODplus, Toyobo)を含む。増幅プロトコールは以下の通りである。即ち、最初の変性には95℃で5分、95℃30秒の変性を40〜50サイクル、アニーリングは65または70℃で30秒、伸長反応は72℃で30秒、そして最後の伸長反応は72℃で2分間行った（表２）。
【００７３】
蛍光発色による多型解析には、増幅したDNAを室温で96穴のプレートでストレプタビジンを結合させた電磁ビーズとともにインキュベートした。プレートは磁性のスタンドに置き、浮遊物を最終濃度が10 mmol/lになるように調節したNaOHを含む96穴プレートに移し、励起と発光の蛍光測定はフルオレセインイソチオシアネートの場合は、各々485と538nmで、テキサスレッドの場合は各々584と612nmの波長で測定した。比色法では増幅されたDNAを0.3mol/lのNaOHで変性させ、96穴プレートの底にアレル特異的捕捉プローブを固定し30〜45%のホルムアミドを含むハイブリダイゼーションバッファーの中で、37℃30分間ハイブリダイゼーションを行った。穴の洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合させたストレプタビジンを各々の穴に加え37℃、15分間攪拌しインキュベートを行った。穴を再度洗浄し、0.8 mmol/lの 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium (monosodium salt)と 0.4 mmol/l 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (p-toluidine salt)を含む溶液を加えた後、検体の450nmの波長の吸光光度を測定した。
【００７４】
ヒトレジスチン遺伝子の3’非転写領域のATG繰り返し回数はフラグメント解析により決定した。ゲノムDNA(20ng)を鋳型とし、5’末端を6-カルボキシ-フルオレセインでラベルしたフォワードプライマーとリバースプライマーで最終容量が25μlになるようにPCRを行った（表２）。反応混合物の1μlを9 μlのホルムアミドと0.2 μlのROX-500 size markers (Applied Biosystems)と混和し、94℃で2分間加熱し、ABI3100システムを用いたキャピラリー電気泳動により分画した。
【００７５】
（５）統計解析
アリル頻度はgene-counting methodで評価し、そして、Hardy-Weinberg平衡からの逸脱はχ二乗検定を用いた。連鎖不平衡の検出のため、Haploview4.0ソフトウェア(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/index.php )を用いてハプロタイプ解析を行った。遺伝子型ごとの血漿レジスチン濃度は一元配置分散分析(ANOVA)とScheffeの多重比較テストで比較した。血漿レジスチン濃度に独立して影響を与える多型を確認するため、多重線形回帰分析stepwise forward selection法を行った。従属変数は血漿レジスチン濃度、独立変数はそれぞれの多型の遺伝子型とした。遺伝子型はScheffe’s testの結果決定された遺伝モデルに基づいてコード化された。モデルへの包除の有意水準は0.05とした。また、血漿レジスチン濃度と、性、年齢、BMI、腹囲、FPG、HbA1c、IRI、HOMA-IR、収縮期および拡張期血圧、総コレステロール、HDLコレステロール、トリグリセライド、2型糖尿病の既往、高血圧の既往、脂質代謝異常の既往、メタボリック症候群、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞といった身体および臨床指標との関連を評価するため、単回帰分析を行った。血漿レジスチン濃度とこれらの身体および臨床指標との独立した関連を明らかにするため、性及び年齢で補正した多重回帰分析をした。従属変数は血漿レジスチン濃度、独立変数は年齢、性、各々の身体および臨床指標とした。すべての解析にはSPSSバージョン14.0Jソフトウェア(SPSS、シカゴ、イリノイ)を用い、P値0.05未満を統計学的に有意と判断した。
【００７６】
（６）研究デザイン
まず、全体の参加者から500例をランダムに選択し、レジスチン遺伝子の11多型をスクリーニングスタディとして解析した。一元配置分散分析(ANOVA)と多重線形回帰分析stepwise forward selection法の結果、血漿レジスチン濃度と独立して関連する3つの多型を確認した。これらの3多型に加え-420C→G多型を、残りの2633例を用いた大規模解析に供し、血漿レジスチン濃度との関連を調査した。さらに、すべての対象で血漿レジスチン濃度と身体的および臨床的指標との関連を調査した。
【００７７】
２．結果
（１）スクリーニング解析
まず一元配置分散分析(ANOVA)により500例のスクリーニング集団において、11の多型（平均間隔177 bp）と血漿レジスチン濃度との関連を評価した。11の遺伝子多型の多型分布は、この集団においてHardy-Weinberg平衡にあった。11多型中8つの多型で血漿レジスチン濃度との有意な関連が認められ（表３）、これらのうち-638G→Aおよび-358G→Aが最も低いP値を示した(<1 × 10-15)。500例のスクリーニング集団におけるハプロタイプ解析の結果、-638G→A、-537A→C、-420C→G、-358G→A、-167C→T、+157C→T、+299G→A、および+602C→Tは連鎖不平衡にあり、-638G→Aと-358G→Aは完全な連鎖不平衡にあった（図１）。Scheffeの多重比較検定により、各々の多型の最も効果的な遺伝モデル（優性、劣性、付加）を次の検討のために決定した(表３)。
【表３】
2010207153.tif 000004
MAFは少数アレル頻度（Minor allele frequency）を表す。血漿レジスチン濃度は平均±SE（標準誤差）で表した。†χ二乗検定によりP値を計算し、Hardy-Weinberg平衡からの逸脱量を求めた。‡Scheffeの多重比較検定のためのP値。§多重線形回帰分析stepwise forward selection法で使用したモデル。
【００７８】
多重線形回帰分析stepwise forward selection法により、-638G→A、+1084G→A、およびATGリピートが有意に血漿レジスチン濃度との関連が示された(表４)。
【表４】
2010207153.tif 000005
スクリーニング解析でのScheffeの多重比較検定の結果を踏まえ、採用するモデルを決定した。
【００７９】
（２）大規模解析
スクリーニング解析における多重線形解析の結果に基づき、-638G→A、+1084G→A、およびATGリピート多型を大規模解析に用いた。さらに、血漿レジスチン濃度や2型糖尿病に関連することが過去に報告されている-420C→G多型も解析対象とした（参考文献２３）。まず、一元配置分散分析(ANOVA)およびScheffeの多重比較検定により、残りの2633例において4つの多型と血漿レジスチン濃度との関連を評価した。これらの多型の多型分布は、これらの集団でもHardy-Weinberg平衡にあった。一元配置分散分析(ANOVA)およびScheffeの多重比較検定において、全4多型が有意に血漿レジスチン濃度と関連していた(図２)。
【００８０】
多重線形回帰分析stepwise forward selection法により、-638G→Aと+1084G→A多型のみが、独立して有意に血漿レジスチン濃度と関連していた(表５)。尚、この2つの遺伝子多型の組み合わせにより、レジスチン血中濃度の実に36.6%が決定される（遺伝子多型が血中濃度に影響を与える割合が36.6%）。これらの遺伝子多型はレジスチン血中濃度の決定的因子といえる。
【表５】
2010207153.tif 000006
大規模解析でのScheffeの多重比較検定の結果を踏まえ、採用するモデルを決定した。
【００８１】
-638G→Aと-420C→Gはヒトレジスチン遺伝子のプロモーター領域に存在し、連鎖不平衡にある。これらの二つの多型には9つの組み合わせが予測されたが、大規模解析では6つの組み合わせしか確認できなかった。これらの2つの多型では有意な相互作用は認められず、血漿レジスチン濃度には-420C→Gよりも-638G→A多型の遺伝子型が主に作用していた。
【００８２】
（３）血漿レジスチン濃度と身体および臨床指標との関連
最後に、すべての対象(n=3133)において身体および代謝の指標と血漿レジスチン濃度との関連を評価した。単回帰分析の結果、年齢、性、腹囲、BMI、収縮期および拡張期血圧、血清トリグリセライド、HDLコレステロール、IRI、HOMA-IRが血漿レジスチン濃度と有意に関連していた。身体および代謝の指標と血漿レジスチンの独立した関連を明らかにするため、年齢・性で補正した多重線形回帰分析を行った。腹囲、BMI、血清トリグリセライド、血清HDLコレステロール、IRIおよびHOMA-IRが年齢・性とは独立して血漿レジスチン値と関連していた(表６)。さらに血漿レジスチンと、高血圧、2型糖尿病、脂質代謝異常、メタボリック症候群、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞との関連について、年齢・性により補正した多重線形回帰分析をした。その結果、メタボリック症候群のみが血漿レジスチン値と有意に関連していた（表６）。
【表６】
2010207153.tif 000007
【００８３】
３．考察
血漿レジスチン濃度とヒトレジスチン遺伝子の11多型および身体的臨床的指標との関連を調査した。3133例の高齢日本人集団において、-638G→Aおよび+1084G→A SNPが血漿レジスチン濃度に最も強い有意な影響を与えることが明らかとなった。-358G→A多型と完全な連鎖不平衡にある-638G→A多型が、同様に-638G→Aと連鎖不平衡にある-420C→G多型よりも血漿レジスチン値には強い影響を与えていた。SRE結合タンパク1c(ADD1としても知られるSREBP1c)の優先的な結合部位である少なくとも3つの推定sterol regulatory element(SRE)モチーフが、ヒトレジスチン遺伝子の転写開始点の上流600から760塩基対の間に認められている（参考文献３３）。ACCAAT/enhancer結合タンパクα(C/EBPα)もこの遺伝子の転写開始点より231塩基対上流に位置している（参考文献３３）。SREBP1cおよびC/EBPαはluciferase reporter assayによりレジスチン遺伝子の発現を調節することが示されている（参考文献３３）。レジスチン遺伝子の-420C→G多型は過去に転写因子Sp1およびSp3の結合レベルとプロモーター活性を調節し、血漿レジスチン濃度の決定因子であると報告されている（参考文献２３）。しかしながら、今回の結果は、レジスチン遺伝子のプロモーターの-638G→A近傍に結合するSRENP1cのような他の転写因子が、Sp1/3よりも血漿レジスチン値の決定に重要な役割を果たしていることを示唆する。
【００８４】
更に、レジスチン遺伝子の3’非転写領域における+1084G→A多型が-638G→A多型とは独立して血漿レジスチン濃度と有意に関連していることを発見した。完全に処理を受けた真核生物のmRNAの3’末端には、poly(A)ポリメラーゼにより作成されるpoly(A)tailを含んでおり、すくなくともpoly(A)結合タンパクの結合領域をもたらすことによって、mRNAの安定性と翻訳の調節に重要である。哺乳類の細胞では、以下の3つの要素が、ポリアデニレーションを定義する中心的なものと考えられている。即ち、AAUAAA６量体またはポリアデニレーション追加部位の10から30塩基上流に位置する非常によく似た変異または切断部位(CS)、CSから10から30塩基下流に位置するU/GUが豊富な部位、およびCS自体である。+1084G→A多型はレジスチン遺伝子の3’非転写領域のAATAAA６量体の10塩基対上流に位置している。したがってレジスチンmRNAのポリアデニレーションに影響を与える可能性がある。
【００８５】
年齢・性とは独立して、血漿レジスチン濃度が血清HDLコレステロールと負の相関を示し、トリグリセライド、IRI、HOMA-IR、腹囲、BMIとは正の相関を示した。肥満、特に腹部肥満はインスリン抵抗性や脂質代謝異常、高血圧といった従来より言われている心血管疾患の危険因子との関連が指摘されている（参考文献３７）。今回の結果も、血漿レジスチン濃度は腹部肥満と関連し、同時にインスリン抵抗性や脂質代謝異常といった肥満と関連した心血管疾患危険因子とも関連していることを示唆している。多くの報告で循環レジスチン濃度と炎症マーカーとの関連が示されている（参考文献７〜９、１６、１７、３８）。さらに、TNF-αやIL-6といった炎症性サイトカインがレジスチン発現の誘導にとって必要かつ十分な条件であることも示されている（参考文献７）。CRP、IL-6、IL-8、TNF-αの増加によって反映されるように、肥満とインスリン抵抗性も慢性の低レベルの炎症と関連していることがヒトや動物モデルにおいて示されている（参考文献３９）。遺伝要因によるあるいは肥満による慢性炎症に基づく高レジスチン血症はこのようにインスリン抵抗性の進展に寄与するかもしれない。
【００８６】
レジスチンが糖や脂質代謝に悪影響を与える機序は不明な点が多い。レジスチンは肝や横紋筋においてエネルギー消費と同時に糖および脂質代謝の調節の中心的な役割を果たすAMPKを阻害する働きがある（参考文献１４、４０、４１）。またレジスチンはマウスの脂肪細胞及び脂肪組織でSOCS3を活性化する（参考文献４２）。SOCS3はIRS1、IRS2のチロシンリン酸化のレベルを下げ、その結果としてIRS関連フォスファチディルイノシトール3合成酵素活性のレベルを下げることによってインスリンのシグナル伝達経路を調節する（参考文献４３）。さらにSOCS3(SOCS1も含め)はSREBP1c発現を上方調節（up-regulate）することで肝における脂肪酸合成を増加させ、おそらくSTAT3の抑制を介して持続的な高インスリン血症をもたらす（参考文献４４、４５）。
【００８７】
以上の通り、高齢日本人集団においてレジスチンイデンシの-638G→Aおよび+1084G→A多型が血漿レジスチン濃度に影響することを示した。血漿レジスチン値はまた、血清HDLコレステロールおよびトリグリセライド、IRI、腹囲、BMI、HOMA-IRとも関連していた。遺伝的な高レジスチン血症は、このように肥満と関連したインスリン抵抗性および脂質代謝異常につながる可能性がある。したがって、腹部脂肪の減量が、レジスチンと関連した代謝異常の改善に繋がることを期待できる。
【００８８】
ここで、2多型（-638G→A、+1084G→A）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度の平均値と上側95%点及び下側95%点の値を算出した（図３、４）。多型の組合せ毎、下側95%点の濃度〜上側95%点の濃度（95%信頼区間）を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えることができる。具体的には次の通りとなる。
（-638G→Aの遺伝子型、+1084G→Aの遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約12 ng/ml〜約48 ng/ml
（AA、AG）：約8 ng/ml〜約39 ng/ml
（AG、GG）：約7 ng/ml〜約30 ng/ml
（AG、AG）：約6 ng/ml〜約25 ng/ml
（AG、AA）：約5 ng/ml〜約20 ng/ml
（GG、GG）：約3 ng/ml〜約17 ng/ml
（GG、AG）：約2 ng/ml〜約15 ng/ml
（GG、AA）：約2 ng/ml〜約11 ng/ml
（AA、AA）：約10 ng/ml〜約20 ng/ml
【００８９】
表５に示した解析結果を踏まえ、+1084G→AについてはGGの群とAG又はAAの群に分けて集計した結果を図５及び６に示す。上記と同様に血中レジスチン標準濃度範囲を求めると、次の通りとなる。尚、図３及び４に示した結果に比較して、組合せ間の差異が明確になることがわかる。
（-638G→Aの遺伝子型、+1084G→Aの遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約12 ng/ml〜約48 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約8 ng/ml〜約37 ng/ml
（AG、GG）：約7 ng/ml〜約30 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約5 ng/ml〜約25 ng/ml
（GG、GG）：約3 ng/ml〜約17 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約2 ng/ml〜約15 ng/ml
【００９０】
95%信頼区間に代えて、下側90%の濃度〜上側90％点の濃度を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えた場合の例を以下示す（図７を参照）。
（-638G→Aの遺伝子型、+1084G→Aの遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約14 ng/ml〜約43 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約9 ng/ml〜約33    ng/ml
（AG、GG）：約8 ng/ml〜約27 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約6 ng/ml〜約22    ng/ml
（GG、GG）：約4 ng/ml〜約15 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約3 ng/ml〜約13    ng/ml
【００９１】
同様に、下側80%の濃度〜上側80％点の濃度を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えた場合の例を以下示す（図８を参照）。
（-638G→Aの遺伝子型、+1084G→Aの遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約16 ng/ml〜約38 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約11 ng/ml〜約29 ng/ml
（AG、GG）：約9 ng/ml〜約23 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約7 ng/ml〜約19    ng/ml
（GG、GG）：約4 ng/ml〜約13 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約3 ng/ml〜約11 ng/ml
【００９２】
同様に、下側70%の濃度〜上側70％点の濃度を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えた場合の例を以下示す（図９を参照）。
（-638G→Aの遺伝子型、+1084G→Aの遺伝子型）：血中レジスチン標準濃度範囲
（AA、GG）：約17 g/ml〜約35 ng/ml
（AA、AG又はAA）：約12 ng/ml〜約26 ng/ml
（AG、GG）：約10 ng/ml〜約22 ng/ml
（AG、AG又はAA）：約8 ng/ml〜約17 ng/ml
（GG、GG）：約5 ng/ml〜約12 ng/ml
（GG、AG又はAA）：約4 ng/ml〜約10 ng/ml
【００９３】
以上のような方法によって、遺伝的素因から想定される血中レジスチン標準濃度範囲を決定することができる。被検者の血中レジスチン濃度を調べ、その値が血中レジスチン標準濃度範囲内にあるか否かを判定すれば、遺伝的素因ではなく環境要因の影響の有無及び程度を把握することができる。このようにして得られる情報は、動脈硬化性疾患の発症の阻止ないし遅延や、動脈硬化性疾患に罹患した患者の生活の質（Quality of Life: QOL）の向上を図る上で有用である。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のリスク検査法は、MetS又は心血管疾患に関して確度が高く臨床上有用なリスク情報（易罹患性に関する情報）を与える。リスク情報は、MetS又は心血管疾患の予防や早期診断、より適切な治療方針の決定、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life：生活の質）の向上などに役立つ。また、無駄な医療行為を未然に防止することによる医療経済への貢献も期待される。尚、多型によっては、集団（日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。その一方で、遺伝的に近い集団（例えば日本人集団に対して中国人集団や韓国人集団は近い）では多型の種類・頻度が同様の傾向を示すことが多い。この事実を考慮すれば、日本人を対象とした大規模解析によって得られた知見に基づくものであるものの、本発明の適用範囲は日本人に限られないといえる。
【００９５】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【００９６】
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【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号４〜２５：人工配列の説明：プライマー
配列番号２６〜３４：人工配列の説明：プローブ
【図２】
2010207153.tif 000008
【図３】
2010207153.tif 000009
【図４】
2010207153.tif 000010
【図５】
2010207153.tif 000011
【図６】
2010207153.tif 000012
【図７】
2010207153.tif 000013
【図８】
2010207153.tif 000014
【図９】
2010207153.tif 000015
【図１】
2010207153.tif 000016
【配列表】
2010207153000001.app