(57)【要約】      （修正有）【課題】従来明らかにされていないプロテインキナーゼ阻害剤及びその製造方法、並びに癌治療用医薬組成物及び試薬を提供する。【解決手段】ヴィオラセイン（下記構造）を有効成分とするプロテインキナーゼ阻害剤、並びに癌治療用医薬組成物。該ヴィオラセインは、海洋細菌Pseudoalteromonas sp.株を接種・培養し、該培養した細菌をヴィオラセインとともに回収し、回収物から分離・濃縮・精製により得ることができる。2010126469.tif 000006【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヴィオラセインを有効成分とするプロテインキナーゼ阻害剤。
【請求項２】
阻害するプロテインキナーゼが、プロテインキナーゼＡ又はプロテインキナーゼＣであることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ阻害剤。
【請求項３】
前記ヴィオラセインが海洋細菌Pseudoalteromonas sp.株から精製されたものであることを特徴とする請求項１又は２記載のプロテインキナーゼ阻害剤。
【請求項４】
海水からヴィオラセインを産生する細菌を接種・培養し、
該培養した細菌をヴィオラセインとともに回収し、
回収物からヴィオラセインを分離・濃縮することによりヴィオラセインを精製し、
該精製したヴィオラセインを用いてプロテインキナーゼ阻害剤を製造するプロテインキナーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
ヴィオラセインを有効成分とし、プロテインキナーゼＣの活性を阻害することを特徴とする癌治療用医薬組成物。
【請求項６】
ヴィオラセインを有効成分とし、プロテインキナーゼが関与する代謝を抑制することを特徴とする試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヴィオラセイン(violacein)を用いた、プロテインキナーゼの活性を阻害するプロテインキナーゼ阻害剤及びその製造方法、並びに癌治療用医薬組成物及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼ（ＰＫ）（タンパク質リン酸化酵素）は、タンパク質のセリン、スレオニン、チロシンの水酸基をリン酸化する酵素であり、細胞の増殖や分化等のシグナル伝達を担う酵素群である。プロテインキナーゼをコードする遺伝子としては、これまでに２００種以上がクローニングされている。そして、プロテインキナーゼは細胞内のいたる所に存在し、細胞の増殖や分化或いは機能発現等の調節や制御に深く関与している。
【０００３】
また、多数の疾患において異常なプロテインキナーゼ活性が確認されており、プロテインキナーゼ活性を阻害することによる疾患の治療も行われている。
例えば、細胞の癌化に関与する癌遺伝子の多くがプロテインキナーゼをコードしていることが知られている。また、発癌プロモータであるホルボールエステルがプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化させることから、プロテインキナーゼＣが発癌に関与すること（下記非特許文献１，２参照）や、プロテインキナーゼＣ阻害剤が抗癌作用を示すこと（下記非特許文献３乃至５参照）等が知られている。
【０００４】
このように、プロテインキナーゼは生体の多くの機能に関与し、プロテインキナーゼの活性を制御することにより疾患の予防や治療も期待できる。そのため、プロテインキナーゼの活性を阻害する物質の開発が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】Mackay, H.J. and Twelves, C.J. (2003) Endocrine-Related Cancer 10, 389-396
【非特許文献２】Griner, E.M. and Kazanietz, M.G. (2007) Nature Reviews Cancer 7, 281-294
【非特許文献３】Meyer, T. et al. (1989) Int. J. Cancer 43, 851-856
【非特許文献４】Mizuno, K. et al. (1995) FEBS Letters 359, 259-261
【非特許文献５】Nomura, M. et al. (1996) Biol. Pharm. Bull. 19, 1611-1613
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記現状に鑑みてなされたものであり、従来明らかにされていないプロテインキナーゼ阻害剤及びその製造方法、並びに癌治療用医薬組成物及び試薬を提供することを解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る発明は、ヴィオラセインを有効成分とするプロテインキナーゼ阻害剤に関する。
【０００８】
請求項２に係る発明は、阻害するプロテインキナーゼが、プロテインキナーゼＡ又はプロテインキナーゼＣであることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ阻害剤に関する。
【０００９】
請求項３に係る発明は、前記ヴィオラセインが海洋細菌Pseudoalteromonas sp.株から産生されたものであることを特徴とする請求項１又は２記載のプロテインキナーゼ阻害剤に関する。
【００１０】
請求項４に係る発明は、海水からヴィオラセインを産生する細菌を接種・培養し、該培養した細菌をヴィオラセインとともに回収し、回収物からヴィオラセインを分離・濃縮することによりヴィオラセインを精製し、該精製したヴィオラセインを用いてプロテインキナーゼ阻害剤を製造するプロテインキナーゼ阻害剤の製造方法に関する。
【００１１】
請求項５に係る発明は、ヴィオラセインを有効成分とし、プロテインキナーゼＣの活性を阻害することを特徴とする癌治療用医薬組成物に関する。
【００１２】
請求項６に係る発明は、ヴィオラセインを有効成分とし、プロテインキナーゼが関与する代謝を抑制することを特徴とする試薬に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ヴィオラセインを有効成分とすることにより、プロテインキナーゼの活性を効果的に阻害することができる。
また、阻害するプロテインキナーゼとしては、プロテインキナーゼＡやプロテインキナーゼＣを挙げることができる。
プロテインキナーゼ阻害剤の有効成分であるヴィオラセインは、海洋細菌Pseudoalteromonas sp.株から容易に精製することができる。
さらに、海水からヴィオラセインを産生する細菌を接種・培養し、ヴィオラセインを精製することにより、プロテインキナーゼ阻害剤の有効成分であるヴィオラセインを容易に精製することができる。
また、ヴィオラセインを有効成分とする癌治療用医薬組成物は、発癌に関与するプロテインキナーゼＣの活性を効果的に阻害し、癌の予防又は治療に効果を奏する。
ヴィオラセインを有効成分とする試薬は、プロテインキナーゼが関与する代謝を解明するための実験に好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、本発明に係るプロテインキナーゼ阻害剤について説明する。
本発明に係るプロテインキナーゼ阻害剤は、青紫色素「ヴィオラセイン（violacein）」を有効成分とし、プロテインキナーゼの活性を阻害するものである。
ヴィオラセインとは、下記式１（Ｃ２０Ｈ１３Ｎ３Ｏ３、分子量３４３、ＣＡＳ登録番号548-54-9）で示される化合物である。
ヴィオラセインはプロテインキナーゼの活性を阻害することができる。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
図１はヴィオラセインを産生する細菌の系統図を示す図である。なお、Pseudoalteromonas denitrificansはプロディジオシン生産細菌であり、ヴィオラセインは産生しない。また、（）内はGenBank/EMBL/DDBJの塩基配列の登録番号を示す。
ヴィオラセインは図１に記載の細菌（Pseudoalteromonas denitrificans以外）により産生することができる。また、図１に示した細菌以外にも、ヴィオラセインを産生する細菌として、Pseudoalteromonas tunicataを挙げることができる。
【００１７】
ヴィオラセインが活性を抑制するプロテインキナーゼとしては、プロテインキナーゼＡやプロテインキナーゼＣを挙げることができる。
特に、プロテインキナーゼＣは発癌に関与することから、プロテインキナーゼＣの活性を抑制することにより、癌治療用組成物として使用することができる。
また、プロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣ以外にも、他のセリン／スレオニンキナーゼ（ホスホリラーゼキナーゼ、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、Ｍｏｓ／Ｒａｆキナーゼ、ｃｄｃ２等）、チロシンキナーゼ、ヒスチジンキナーゼ、アスパラギン酸／グルタミン酸キナーゼ等の活性も阻害することができる。
【００１８】
プロテインキナーゼ阻害剤の有効成分であるヴィオラセインは、海水からヴィオラセインを産生する細菌を接種・培養し、該培養した細菌をヴィオラセインとともに回収し、回収物からヴィオラセインを分離・濃縮することにより得ることができる。
具体的には、海水中の細菌を培養し、培養した細菌からヴィオラセインを産生する細菌（図１に記載の細菌（Pseudoalteromonas denitrificans以外）等）を接種する。そして、ヴィオラセインを産生する細菌を培養し、ヴィオラセインとともに回収する。そして、回収物からヴィオラセインを分離・濃縮することによりヴィオラセインを精製する。
ヴィオラセインの分離・濃縮は、遠心分離、減圧濃縮、カラムクロマトグラフィー等を用いて行うことができる。なお、Janthinobacterium lividum及びChromobacterium violaceumは海洋細菌ではなく、培養に使用する培地も海洋細菌の培養に使う培地とは異なり、海水を含まない。
また、精製されたヴィオラセインは、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等に溶解し、保存することができる。
ヴィオラセインを産生する細菌の培養に使用する海水としては海洋深層水が好ましい。海洋深層水とは、水深が２００ｍ以下の深海に分布する、表層とは違った物理的・化学的特徴を持つ海水のことである。海洋深層水は、表層の海水に比して汚染物質が少ないからである。
【００１９】
次いで、ヴィオラセインを有効成分とする癌治療用医薬組成物及び試薬について説明する。
＜癌治療用医薬組成物＞
まず、ヴィオラセインを有効成分とする癌治療用医薬組成物について説明する。
上記したように、ヴィオラセインは発癌に関与するプロテインキナーゼＣの活性を抑制することができるため、ヴィオラセインは癌治療用医薬組成物の有効成分として最適である。
【００２０】
本発明に係る癌治療用医薬組成物には、経口投与用および非経口投与用のどちらも含まれ、投与経路によって適宜選択すればよい。
ヴィオラセインは、動物実験で経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ体重）による毒性が認められないので、経口投与でも安全である。
【００２１】
癌治療用医薬組成物を経口投与する場合は、薬剤の形態として、固形製剤（錠剤、丸剤、散剤、被覆錠剤、顆粒剤、カプセル剤等）、液状製剤（液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等）等を挙げることができる。
また、癌治療用医薬組成物として用いる場合は、ヴィオラセインと共に薬学的に許容される製剤担体を用いて、医薬製剤の形態として実用される。製剤担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤、賦形剤等を例示することができ、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００２２】
癌治療用医薬組成物を非経口投与する場合は、薬剤の形態として、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び腹腔内注射等に使用される注射剤（液剤、乳剤、懸濁剤等）、液剤（例えば、点眼剤、点鼻薬等）、点滴剤、吸入剤（エアロゾル剤、粉末吸入剤等）等が挙げられる。
【００２３】
さらに、癌治療用医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。
【００２４】
＜試薬＞
次いで、ヴィオラセインを有効成分とする試薬について説明する。本試薬は、ヴィオラセインがプロテインキナーゼの活性を阻害することを利用したものであり、プロテインキナーゼが関与する代謝を抑制するための試薬である。
【００２５】
例えば、プロテインキナーゼＡは、グリコーゲン代謝に関与するため、グリコーゲン代謝を抑制するための試薬として使用することができる。
図２は肝細胞内でのグリコーゲン代謝を示す概略図である。なお、図２はプロテインキナーゼＡによる代謝調節の一例であり、プロテインキナーゼＡは図２以外の多様な代謝の制御に関与している。
図２に示すように、活性形のプロテインキナーゼＡ（図２中（１））は、グリコーゲンを分解するのに必要なホスホリラーゼｂキナーゼを活性化する役割を果たすものである。プロテインキナーゼＡの活性を抑制することにより、図２中（２）の経路が遮断されることとなる。それにより、グリコーゲンが分解されてグルコースが生成されるのを抑制することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例を示すことにより、本発明をより明確なものとする。
本実施例では、ヴィオラセインがプロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣの活性を抑制することを検証した。以下、詳細について説明する。
【００２７】
（青紫色素産生細菌の分離と培養）
まず、高知県室戸岬沖の水深３２０ｍより採取した海水をPPES-II平板寒天培地に塗布し、２０℃で数日間培養した。そして、当該平板寒天培地上に現れた青紫色素を産生する細菌コロニーを分離し、色素産生細菌株とした。
（青紫色素の抽出）
次いで、PPES-II液体培地に色素産生細菌を接種し、２０℃で１０日間静置培養した。培養後、遠心分離により菌体及び色素を沈殿させ回収し、回収した沈殿をエタノールで懸濁した。そして、懸濁液を遠心分離し、色素を含む透明な上清を得た。
上清をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固し、これにエタノールを加えて懸濁し、懸濁液を遠心分離することで、色素を含む透明な上清を得た。この上清を粗色素抽出液とした。
（青紫色素の精製）
粗色素抽出液をシリカゲルカラムに添着し、２−プロパノールを用いて色素を溶出した。そして、色素を含む溶出画分をＯＤＳカラムに添着し、４０％(ｖｏｌ／ｖｏｌ)アセトニトリル水溶液を用いて色素を溶出した。得られた色素画分を固体の色素が生じるまでロータリーエバポレーターで濃縮し、色素を遠心分離又はろ過により回収した。色素を石油エーテルおよびクロロホルムで順次洗浄し、減圧下で色素を乾燥し、精製色素とした。
【００２８】
（色素の紫外可視光スペクトルの測定）
上記方法で得られた精製色素をエタノールに溶解し、吸光度を紫外可視分光光度計（Beckman DU640 spectrophotometer）により測定した。
測定の結果、５７５ｎｍのピークが確認でき、精製色素が青紫色素であることが確認できた。
【００２９】
（質量分析・核磁気共鳴によるヴィオラセインの同定）
次いで、得られた精製色素について、質量分析計（Thermo Finnigan LCQ quadrupole ion-trap mass spectrometer）を用い、電子イオン化質量分析（ESI-MS）及びタンデム質量分析（ESI-MS/MS）を行った。このとき、イオン化は電圧−４．５ｋＶ、温度１５０℃で行った。
また、核磁気共鳴装置（Varian Unity INOVA 400）を用い、ジメチルスルホキシド−ｄ６に溶解した精製色素の１Ｈ−核磁気共鳴および１３Ｃ−核磁気共鳴の測定を行った。
質量分析・核磁気共鳴の解析結果より、精製色素がヴィオラセイン（上記した[化１]）であることを同定した。
【００３０】
（遺伝子解析による細菌の同定）
また、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system 9700）を用いて色素産生細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。増幅には、プライマーとして5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’と5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’を用いた。
そして、Cy5.5 dye terminator kit（Amersham Bioscinences）を用いて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
決定した塩基配列のＢＬＡＳＴ法を用いた相同性検索及び近隣結合法による系統樹の作成により、色素産生細菌をシュードアルテロモナス(Pseudoalteromonas)属の新規細菌と同定した（図１に下線を施している）。
【００３１】
（プロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣの活性阻害実験）
ヴィオラセインと同定された精製色素を用い、ヴィオラセインがプロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣの活性を阻害することを確かめた。
プロテインキナーゼＡの活性阻害の測定方法は以下の通りである。
プロテインキナーゼＡが溶解した溶液１ｍＬに対して、ヴィオラセインが溶解したＤＭＳＯ溶液を１１．４μＬずつ加え、酵素反応時のヴィオラセインの終濃度が１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭとなるようした。そして、夫々の溶液についてプロテインキナーゼＡの活性を測定した。なお、プロテインキナーゼＡの活性の測定にはStressXpress Protein Kinase Activity Assay Kitを用いた。
また、プロテインキナーゼＣの活性阻害の測定方法は以下の通りである。
プロテインキナーゼＣが溶解した溶液１ｍＬに対して、ヴィオラセインが溶解したメタノール溶液を１６μＬずつ加え、酵素反応時のヴィオラセインの終濃度が５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭとなるようにした。そして、夫々の溶液についてプロテインキナーゼＣの活性を測定した。なお、プロテインキナーゼＣの活性の測定にはCyLex PKC Super Family Kinase Assay Kitを用いた。
【００３２】
表１はプロテインキナーゼＡの活性を示した表であり、夫々の濃度の溶液について測定したプロテインキナーゼＡの活性の平均値を示している。なお、ヴィオラセインを含まないＤＭＳＯを加えた溶液のプロテインキナーゼＡの活性を１００％としている。
図３，表２はプロテインキナーゼＣの活性を示した図である。なお、プロテインキナーゼＣの活性の測定実験は二回行っており、一方を図３に、他方を表２にまとめている。また、表２には、プロテインキナーゼＣ阻害剤として知られているスタウロスポリン（５ｎＭ添加）とＨ−７（６μＭ添加）を用いた場合の活性についても示している。また、ヴィオラセインを含まないメタノールを加えた溶液のプロテインキナーゼＣの活性を１００％としている。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
【表２】
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【００３５】
表１から、ヴィオラセインがプロテインキナーゼＡの活性を阻害することがわかる。
図３及び表２から、ヴィオラセインがプロテインキナーゼＣの活性を阻害することがわかる。また、ヴィオラセインは濃度を高めることにより、スタウロスポリンやＨ−７と同等又はそれ以上の阻害効果を有することもわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、プロテインキナーゼ阻害剤として、癌治療用医薬組成物や試薬として好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヴィオラセインを産生する細菌の系統図を示す図である。
【図２】肝細胞内でのグリコーゲン代謝を示す概略図である。
【図３】プロテインキナーゼＣの活性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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