(57)【要約】      （修正有）【課題】培養室に検体を入れてから、灌流培養の準備に掛かる時間を短縮できる、灌流培養システムの提供。【解決手段】培養室２１を複数有する培養槽２と、第１供給管４４を複数有する培養液容器と、第１排出管５３を複数有する複数の培養液回収容器と、各培養室２１の上面を塞ぎ培養液の供給口３２及び排出口３３が形成された蓋部３と、各第１供給管４４が取り付けられた第１供給用コネクタ４５と、各第１排出管５３が取り付けられた第１排出用コネクタ５４と、各供給口３２から延びる第２供給管４６が取り付けられた第２供給用コネクタ４７と、各排出口３３から延びる第２排出管５５が取り付けられた第２排出用コネクタとを備えている、灌流培養システム。第１及び第２供給用コネクタ４５，４７を接続すると各第１及び第２供給管４４，４６が接続され、第１及び第２排出用コネクタ５４，５６を接続すると各第１及び第２排出管５３，５５が接続される。【選択図】図１
2010207174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面が開口した複数の培養室を有する培養槽と、
前記各培養室に供給する培養液を収容する培養液供給源と、
前記培養液供給源から延びる複数の第１の供給管と、
前記培養室内から排出された培養液を回収する複数の回収容器と、
前記各回収容器から延びる複数の第１の排出管と、
前記培養槽の各培養室の上面を塞ぐとともに、前記各培養室に対応する位置に設けられた供給口及び排出口を複数対有するとともに、前記各供給口から延びる第２の供給管及び前記各排出口から延びる第２の排出管を有する１つの蓋部と、
前記各第１の供給管が取り付けられた第１の供給用コネクタと、
前記各第１の排出管が取り付けられた第１の排出用コネクタと、
前記第２の供給管が取り付けられ、前記第１の供給用コネクタに接続可能な第２の供給用コネクタと、
前記第２の排出管が取り付けられ、前記第１の排出用コネクタに接続可能な第２の排出用コネクタと、を備え、
前記第１の供給用コネクタと第２の供給用コネクタとが接続されたとき、前記各第１の供給管と第２の供給管とが接続され、
前記第１の排出用コネクタと第２の排出用コネクタとが接続されたとき、前記各第１の排出管と第２の排出管とが接続される、灌流培養システム。
【請求項２】
上面が開口した複数の培養室を有する培養槽と、
前記各培養室に供給する培養液を収容する培養液供給源と、
前記培養液供給源から延びる複数の供給管と、
前記各培養室内から排出された培養液を回収する複数の回収容器と、
前記各回収容器から延びる複数の排出管と、
前記培養槽の各培養室の上面を塞ぐとともに、前記各培養室に対応する位置に設けられた供給口及び排出口を複数対有する１つの蓋部と、
前記各供給管及び各排出管が取り付けられており、前記蓋部に接続可能なコネクタと、を備え、
前記コネクタを前記蓋部に接続したとき、前記各供給管が前記各供給口と接続し、前記各排出管が前記各排出口と接続する、灌流培養システム。
【請求項３】
前記培養室に供給する薬剤を収容する薬剤供給源と、
前記薬剤供給源から延びる複数の薬剤供給管と、
前記各薬剤供給管と前記各供給管とを接続し、前記培養室への培養液又は薬剤の供給を切り替える複数のバルブと、
をさらに備えた、請求項１又は２に記載の灌流培養システム。
【請求項４】
前記バルブを切り替える制御部をさらに備えた請求項３に記載の灌流培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、灌流培養システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細胞や組織片などの検体を収容した培養槽へ、培養液を連続的に供給しつつ、培養槽内に発生した老廃物などを含む古い培養液を連続的に排出する灌流培養が提案されている。この灌流培養は常に新しい培養液を供給できるために長期間検体を生育させることが可能となる。また、この灌流培養では、検体からの分泌物を連続的に回収できるため、ホルモン分泌量の経時変動をモニターしたり（非特許文献１参照）、分泌性発光プローブ（ウミホタル・ルシフェラーゼ）を利用して遺伝子の転写活性の経時変動をモニターする（非特許文献２参照）ことも可能である。さらには、培養液を薬剤に一時的に切り替えて検体に薬剤を投与することで、薬剤の有無による検体の応答を調べることにも利用されている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Naoto Hayasaka, et al., The Journal of Neuroscience, March 1, 2002, 22(5):1600-1607
【非特許文献２】Yusuke Tanahashi, et al., Analytical Biochemistry 289, 260-266(2001)
【非特許文献３】Kazutoshi Yamagishi, et al., Analytical Biochemistry 354, 15-21(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、対照実験との比較を行うなどの理由で細胞などの検体を複数同時に灌流培養することがある。この場合、検体が収容された培養槽を複数用意し、それぞれの培養槽と培養液供給源とを接続したり、またそれに薬剤供給源等を接続することもある。このような各供給源との接続は、雑菌などのコンタミネーションを防止するために細心の注意を払う必要があり、非常に時間が掛かるという問題がある。このように培養槽内に検体を入れてから灌流培養を始めるまでの準備に長時間を要すると、培養槽内の検体に培養液が供給されない状態が続くこととなり、検体が衰弱したり死に至るという事態が生じてしまう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る第１の灌流培養システムは、上面が開口した複数の培養室を有する培養槽と、前記各培養室に供給する培養液を収容する培養液供給源と、前記培養液供給源から延びる複数の第１の供給管と、前記培養室内から排出された培養液を回収する複数の回収容器と、前記各回収容器から延びる複数の第１の排出管と、前記培養槽の各培養室の上面を塞ぐとともに、前記各培養室に対応する位置に設けられた供給口及び排出口を複数対有するとともに、前記各供給口から延びる第２の供給管及び前記各排出口から延びる第２の排出管を有する１つの蓋部と、前記各第１の供給管が取り付けられた第１の供給用コネクタと、前記各第１の排出管が取り付けられた第１の排出用コネクタと、前記第２の供給管が取り付けられ、前記第１の供給用コネクタに接続可能な第２の供給用コネクタと、前記第２の排出管が取り付けられ、前記第１の排出用コネクタに接続可能な第２の排出用コネクタと、を備え、前記第１の供給用コネクタと第２の供給用コネクタとが接続されたとき、前記各第１の供給管と第２の供給管とが接続され、前記第１の排出用コネクタと第２の排出用コネクタとが接続されたとき、前記各第１の排出管と第２の排出管とが接続される。
【０００６】
上記灌流培養システムによれば、灌流培養の準備は、まず、培養槽の各培養室内に検体を入れた後、蓋部によって各培養室の上面を塞ぐ。そして、蓋部から延びた第２の供給管が取付けられた第２の供給用コネクタに、培養液供給源から延びた第１の供給管が取り付けられた第１の供給用コネクタを接続する。また、蓋部から延びた第２の排出管が取り付けられた第２の排出用コネクタに、回収容器から延びた第１の排出管が取り付けられた第１の排出用コネクタに接続する。このように、各供給管や排出管同士を一つずつ接続するのではなく、第１の供給用コネクタと第２の供給用コネクタを接続するとともに、第１の排出用コネクタと第２の排出用コネクタとを接続するだけでよい。この結果、培養室内に検体を入れてからの灌流培養の準備に掛かる時間を短縮することができ、ひいては、検体が衰弱したり死に至ることを防止することができる。なお、上記第１の供給用コネクタと第１の排出用コネクタとは別々の部材としてもよいし、これらを併せて一つの部材としても良い。同様に、第２の供給用コネクタと第２の排出用コネクタも別々の部材としてもよいし、一つの部材としてもよい。また、上記培養液供給源は、培養液が収容された一つ又は複数の培養液容器とすることができる。
【０００７】
また、本発明に係る第２の灌流培養システムは、上面が開口した複数の培養室を有する培養槽と、前記各培養室に供給する培養液を収容する培養液供給源と、前記培養液供給源から延びる複数の供給管と、前記各培養室内から排出された培養液を回収する複数の回収容器と、前記各回収容器から延びる複数の排出管と、前記培養槽の各培養室の上面を塞ぐとともに、前記各培養室に対応する位置に設けられた供給口及び排出口を複数対有する１つの蓋部と、前記各供給管及び各排出管が取り付けられており、前記蓋部に接続可能なコネクタと、を備え、前記コネクタを前記蓋部に接続したとき、前記各供給管が前記各供給口と接続し、前記各排出管が前記各排出口と接続する。
【０００８】
上記灌流培養システムによれば、灌流培養の準備は、まず、培養槽の各培養室に検体を入れた後、蓋部によって各培養室の上面を塞ぐ。そして、培養液供給源や回収容器から延びる供給管や排出管が取り付けられたコネクタを蓋部に接続することで、灌流培養の準備が完了する。このように、コネクタを蓋部に接続するだけで灌流培養の準備を完了することができるため、培養室に検体を入れてからの灌流培養の準備に掛かる時間を短縮することができ、ひいては検体が衰弱したり死に至ることを防止することができる。なお、上記培養液供給源は、培養液が収容された一つ又は複数の培養液容器とすることができる。
【０００９】
上記第１及び第２の灌流培養システムは種々の構成をとることができる。例えば、培養室に供給する薬剤を収容する薬剤供給源と、薬剤供給源から延びる複数の薬剤供給管と、をさらに備えるとともに、各薬剤供給管と培養液を供給する各供給管とを接続し、培養室への培養液又は薬剤の供給を切り替える複数のバルブをさらに備えた構成とすることもできる。この場合、バルブを切り替える制御部をさらに備えていることが好ましい。この構成によれば、各培養室内の検体に対して薬剤を供給し各培養室内の検体の応答を調べることができる。また、制御部によってバルブを切り替えることにより、培養室内の検体へ薬剤を投与する時間やタイミングを自動で設定することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培養室に検体を入れてからの灌流培養の準備に掛かる時間を短縮することができ、ひいては培養室内の検体が衰弱したり死に至ることを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は本発明に係る灌流培養システムの実施形態を示した概略図である。
【図２】図２は本実施形態に係る灌流培養システムにおいて薬剤を投入する時間を示す図である。
【図３】図３は本発明に係る灌流培養システムの他の実施形態を示した概略図である。
【図４】図４は本実施形態に係る蓋部の変形例を示した概略正面断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係る灌流培養システムの実施形態について図面を参照しつつ説明する。図１は、本実施形態に係る灌流システムの概略図である。
【００１３】
図1に示すように、灌流培養システム１は、複数の培養室２１を有する培養槽２と、各培養室２１の上面を塞ぐ蓋部３と、培養室２１内に培養液及び薬剤を供給する供給ユニット４と、培養室２１から排出された老廃物などを含む古い培養液を回収する回収ユニット５と、を備えている。
【００１４】
培養槽２は、横に４個並ぶ培養室２１を有しているが、この培養室２１の数は特に限定されるものではない。この培養室２１は上面が開口しており、後述する蓋部３によって上面が塞がれる。この培養槽２は、外部から観察できるように少なくとも一部が透明であることが好ましく、材質は、ポリカーボネートやポリスチレン、アクリル等の樹脂やガラス等とすることが好ましい。
【００１５】
蓋部３は、培養槽２上に載置されることで、培養槽２の各培養室２１上面を塞ぐように構成されており、両端部に設けられた固定部（図示省略）によって培養槽２に固定されている。また、蓋部３は、各培養室２１と対応する位置にそれぞれ供給口３２及び排出口３３が形成されている。また、蓋部３も、各培養室２１内が外部から観察できるよう、少なくとも一部を透明とすることが好ましく、材質は、ポリカーボネートやポリスチレン、アクリル等の樹脂やガラス等とすることが好ましい。
【００１６】
培養室２１に培養液を供給する供給ユニット４は、培養液が収容された４個の培養液容器（培養液供給源）４１と、薬剤が収容された４個の薬剤容器（薬剤供給源）４２と、この培養液又は薬剤を培養室２１へ送る動力源である供給ポンプ４３とを備えている。また、供給ユニット４は、各培養液容器４１から延びる４本の第１の供給管４４が取り付けられた第１の供給用コネクタ４５と、蓋部３の各供給口３２から延びる４本の第２の供給管４６が取り付けられた第２の供給用コネクタ４７とを備えている。この第１の供給用コネクタ４５と第２の供給用コネクタ４７とは互いに接続可能となっており、これらを接続すると、各第１の供給管４４と各第２の供給管４６とが接続されて培養液を各培養室２１内に供給できるようになる。また、薬剤容器４２のそれぞれからは薬剤供給管４８が延びており、この各薬剤供給管４８はバルブ４９を介して第１の供給管４４に接続されている。このバルブ４９は、培養室２１に培養液か薬剤のどちらかを供給するよう制御部４０によって流路を切り替えるよう構成されている。
【００１７】
培養室２１内から排出された老廃物を含む古い培養液を回収する回収ユニット５は、回収された培養液が溜められる４個の回収容器５１と、培養室２１内の古い培養液を回収容器５１へ送る動力源である回収ポンプ５２と、を備えている。また、回収ユニット５は、各回収容器５１から延びる４本の第１の排出管５３が取り付けられた第１の排出用コネクタ５４と、蓋部３の各排出口３３から延びる４本の第２の排出管５５が取り付けられた第２の排出用コネクタ５６とを備えている。この第１の排出用コネクタ５４と第２の排出用コネクタ５６とは互いに接続可能となっており、これらを接続すると、第１の排出管５３と第２の排出管５５とが接続されて培養室から回収された培養液を各回収容器５１に送ることができる。
【００１８】
次に上述した灌流培養システム１を使用する際の流れについて説明する。
【００１９】
まず、培養槽２の各培養室２１内に細胞や組織片等の検体を入れる。より詳細には、細胞を培養室２１内に入れる場合は、まず、培養液が入った別の容器に細胞を入れて懸濁させ、この液を培養槽２の各培養室２１内に分注する。そして、供給口や排出口が形成されていない別の蓋によって各培養室２１の上面を塞ぎ、培養槽２をCO2インキュベータに収めて、細胞が各培養室２１の底面に接着するまで半日から一晩程度置いておく。続いて、培養槽２をCO2インキュベータから取り出して、蓋をはずし、蓋部３によって各培養室２１の上面を塞ぐ。また、細胞ではなく組織片を培養室２１内に入れる場合は、組織切片をカルチャーインサート（例えばミリポア社のミリセル-CMなど）の膜表面に置き、これを培養槽２の各培養室２１に収めた後、蓋部３によって各培養室２１の上面を塞ぐ。
【００２０】
以上のように検体を各培養室２１内に入れて蓋部３によって各培養室２１の上面を塞いだ後、第２の供給用コネクタ４７に対して第１の供給用コネクタ４５を差し込み、各第１の供給管４４と第２の供給管４６とを接続する。また、第２の排出用コネクタ５６に対して第１の排出用コネクタ５４を差し込み、各第１の排出管５３と第２の排出管５５とを接続する。
【００２１】
続いて、制御部４０によって供給ポンプ４３及び回収ポンプ５２を作動させて、各培養液容器４１内の培養液を各第１及び第２の供給管４４，４６を介して各培養室２１内へ送るとともに、各培養室２１内の老廃物を含む培養液を各第１及び第２の排出管５３，５５を介して回収容器５１へ回収する。なお、このときバルブ４９は、制御部４０によって培養液容器４１内の培養液が各培養室２１内へ送られるような流路を形成している。これにより、各培養室２１内には常に新しい培養液が送られ、且つ各培養室２１内の古い培養液を回収容器へ回収させることができる。
【００２２】
以上のように、この灌流培養システム１は、検体を各培養室２１に入れてから、蓋部３をセットし、第１の供給用コネクタ４５と第２の供給用コネクタ４７とを接続するとともに、第１の排出用コネクタ５４と第２の排出用コネクタ５６とを接続するだけで、灌流培養の準備が完了する。このため、検体を各培養室２１に入れてからの時間を短縮することができ、ひいては検体の衰弱などを防止することができる。なお、各供給管４４，４６は、培養液容器４１や供給口３２、第１の供給用コネクタ４５、第２の供給用コネクタ４７に固定されていてもよいし、取り外し可能であってもよい。各供給管４４，４６が取り外し可能である場合は、検体を各培養室２１に入れる前に各供給管４４，４６を培養液容器４１や供給口３２、第１の供給用コネクタ４５、第２の供給用コネクタ４７に取り付けておくことが好ましい。また、各排出管５３，５５も、回収容器５１や排出口３３に対して、各供給管４４，４６と同様の構成とすることができる。
【００２３】
次に、図２に示したようなタイミングで、薬剤を培養室２１内へ投入する方法について説明する。投入する薬剤としては、細胞の概日時計のリズムを同調させるデキサメタゾンや、分泌阻害剤ブレフェルディン、炭水化物の代謝調整に関与するインスリン、アレルギー反応に関与するヒスタミン、発がんや内分泌かく乱作用に関与するとされるダイオキシン類等が挙げられる。また、環境中の毒性物質の研究等においては、土壌や河川、海水等からの抽出物等も挙げられる。なお、図１の培養液容器４１を上から順に第１培養液容器４１ａ、第２培養液容器４１ｂ、第３培養液容器４１ｃ、第４培養液容器４１ｄとし、薬剤容器４２も上から順に第１薬剤容器４２ａ、第２薬剤容器４２ｂ、第３薬剤容器４２ｃ、第４薬剤容器４２ｄとし、さらにバルブ４９も上から順に第１バルブ４９ａ、第２バルブ４９ｂ、第３バルブ４９ｃ、第４バルブ４９ｄとする。また、図１の培養室２１を右から順に第１培養室２１ａ、第２培養室２１ｂ、第３培養室２１ｃ、第４培養室２１ｄとし、回収容器５１は左から順に第１回収容器５１ａ、第２回収容器５１ｂ、第３回収容器５１ｃ、第４回収容器５１ｄとする。
【００２４】
まず、キーボードやタッチパネルなどの入力部６から制御部４０に各培養室２１へ薬剤を投入するタイミングや時間などを入力する。このように各データが入力された制御部４０は、まず、上述したように培養液容器４１内の培養液が各培養室２１内へ送られるようバルブ４９の流路を切り替える。そして、供給ポンプ４３及び回収ポンプ５２を作動させて各培養液容器４１内の培養液を各培養室２１へ送るとともに、培養室２１内の古い培養液を各回収容器５１へと回収させる。
【００２５】
そして、培養液をｔ1秒間流し続けた後、制御部４０は、第１、３、４バルブ４９ａ、４９ｃ、４９ｄを操作し、第１、３、４培養液容器４１ａ，４１ｃ，４１ｄからの培養液の供給を停止するとともに、第１、３，４薬剤容器４２ａ、４２ｃ、４２ｄからの薬剤の供給を開始する。これにより、第１，３，４培養室２１ａ、２１ｃ、２１ｄには培養液ではなく、薬剤が供給される。
【００２６】
次に、灌流培養の開始からｔ2秒後になると、制御部４０によって、第２バルブ４９ｂが操作され、第２培養液容器４１ｂからの培養液の供給が停止されるとともに、第２薬剤容器４２ｂからの薬剤の供給が開始される。また、第３バルブ４９ｃも操作されて、第３薬剤容器４２ｃからの薬剤の供給が停止され、再度第３培養液容器４１ｃからの培養液の供給が開始される。この段階では、第１，２，４培養室２１ａ、２１ｂ、２１ｄに薬剤が供給されるとともに、第３培養室２１ｃには培養液が供給されている。
【００２７】
続いて、開始からｔ3秒後になると、制御部４０によって、第１、２バルブ４９ａ、４９ｂが操作され、第１，２薬剤容器４２ａ、４２ｂからの薬剤の供給が停止されるとともに、第１，２培養液容器４１ａ、４１ｂからの培養液の供給が再度開始される。この段階では、第１〜３培養室２１ａ、２１ｂ、２１ｃには培養液が供給されており、第４培養室２１ｄには薬剤が供給されている。
【００２８】
そして、開始からｔ4秒後になると、制御部４０によって第４バルブ４９ｄが操作され、第４薬剤容器４２ｄからの薬剤の供給が停止されるとともに、第４培養液容器４１ｄからの培養液の供給が再開される。これにより、ｔ4秒以降は、全ての培養室２１に培養液が供給された状態となっている。
【００２９】
以上のように薬剤を投入するタイミングや時間を変更したことによって検体に与える影響を、第１〜４回収容器５１ａ、５１ｂ、５１ｃ、５１ｄに回収された培養液を分析して調査する。また、各回収容器５１に回収された培養液を分析するのではなく、顕微鏡やCCDカメラ、光電子増倍管などを用いて、各培養室２１内の検体を直接観察したり分析したりすることもできる。なお、上記方法では、各バルブ４９を切り替えたタイミングと、切り替え後の培養液や薬剤が培養室２１に到達するタイミングとの間にタイムラグがある。このため、入力部６に入力したタイミングで培養室２１に培養液や薬剤を到達させたい場合は、バルブ４９から各培養室２１に培養液や薬剤が到達する時間を考慮すればよい。このバルブ４９から各培養室２１に培養液や薬剤が到達する時間は、バルブ４９から培養室２１までの距離（第１の供給管４４の長さと第２の供給管４６の長さを足した距離）に第１及び第２の供給管４４，４６の断面積を乗じ、これを供給ポンプの設定流速で除することで算出することができる。このように算出された時間を計算に入れることで、入力部６に入力したタイミングで各培養室２１に培養液や薬剤が到達するようなシステムとすることができる。
【００３０】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能である。例えば、上記実施形態では、第１の供給用コネクタ４５と、第１の排出用コネクタ５４とが別々の部材となっていたが、これらを１つの部材として構成することもできる。すなわち、各培養液容器４１から延びる第１の供給管４４と、各回収容器５１から延びる第１の排出管５３とを、一つのコネクタに取付け、このコネクタに第２の供給用コネクタ４７と第２の排出用コネクタ５６とを接続することもできる。なお、この第２の供給用コネクタ４７と第２の排出用コネクタ５６も一つの部材として構成しても良い。このように、各コネクタは種々の組み合わせを採用することができる。
【００３１】
また、図３に示すように、各培養液容器４１から延びる供給管４４と各回収容器５１から延びる排出管５３とをコネクタ５０に取り付け、このコネクタ５０が蓋部３に直接接続可能となるように構成することもできる。なお、このようにコネクタ５０を蓋部３に接続すると、各供給管４４が各供給口３２に接続され、各排出管５３が各排出口３３に接続される。
【００３２】
また、上記実施形態では、培養室２１の数に合わせて培養液容器４１や薬剤容器４２を準備したが、これらを一つの培養液容器４１や一つの薬剤容器４２とすることもできる。
【００３３】
また、図４に示すように、蓋部３の各培養室２１と対応する部分に貫通孔を形成し、その貫通孔内にゴム栓などの弾性体７を収容する構成とすることもできる。この構成によれば、例えば、供給口３２からではなく、注射器などを用いてゴム栓を介して薬剤などを各培養室２１内に投入することができる。
【符号の説明】
【００３４】
１    灌流培養システム
２    培養槽
２１  培養室
３    蓋部
３２  供給口
３３  排出口
４１  培養液容器（培養液供給源）
４２  薬剤容器（薬剤供給源）
４４  第１の供給管
４５  第１の供給用コネクタ
４６  第２の供給管
４７  第２の供給用コネクタ
４８  薬剤供給管
４９  バルブ
５１  回収容器
５３  第１の排出管
５４  第１の排出用コネクタ
５５  第２の排出管
５６  第２の排出用コネクタ
【図１】
2010207174.tif 000003
【図２】
2010207174.tif 000004
【図３】
2010207174.tif 000005
【図４】
2010207174.tif 000006