(57)【要約】【課題】簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供する。【解決手段】生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを定量又は検出する方法であって、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを検体中から取得する第一工程、第一工程で取得した被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する第二工程等を有することを特徴とする方法等を提供する。【選択図】図１
2010068800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれるゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する第一工程、
（２）第一工程で調製した検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、
該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、
該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、
該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する第二工程、
（３）第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
検出オリゴヌクレオチドが、メチル化ＤＮＡを複数含むオリゴヌクレオチド、複合検出オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、検出オリゴヌクレオチドのメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体の識別機能である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列又はその一部からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列又はその一部からなるＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＬＩＮＥ又はＡｌｕ配列に分類される塩基配列からなるＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列が以下に示されるいずれかの塩基配列からなる請求項４に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【請求項８】
検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【請求項９】
特定オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【請求項１０】
検出オリゴヌクレオチドがメチル化シトシンを含むメチル化オリゴヌクレオチドである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出オリゴヌクレオチドの識別機能がメチルシトシンの検出、メチル化ＤＮＡ抗体による検出、又はメチルシトシン抗体による検出である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
検体が、下記のいずれかの検体である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｄ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
【請求項１３】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ生物由来検体が、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ
（ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ
（ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
を有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
【請求項１７】
検体が、哺乳動物由来の血清である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡを定量又は検出する方法としては、例えば、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）によってＤＮＡを増幅させて検出する方法や、生物由来検体中のＤＮＡが有する目的のＤＮＡ領域に蛍光標識したオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて検出する方法等が知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chiquet C., Lina G., Benito Y., Cornut P.L., Etienne J., Romanet J.P., Denis P., Vandenesch F.，Polymerase chain reaction identification in aqueous humor of patients with postoperative endophthalmitis.，J. Cataract. Refract. Surg.，2007;33(4):635-641．
【非特許文献２】Brandriff B.F., Gordon L.A., Trask B.J.，DNA sequence mapping by fluorescence in situ hybridization.，Environ. Mol. Mutagen.1991;18(4):259-262.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、前記ＰＣＲにおいては、ＰＣＲで増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記プライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、それらの操作は繁雑であった。また、蛍光標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして利用する場合、組織切片の染色等には利用されているものの、臨床の現場等、迅速性が要求される場面で、簡便に検体を検出することが困難であった。
本発明はこのようなこと情に鑑みてなされたものであり、簡便に生物由来検体を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を含む。
[発明１]
検体中に含まれるゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する第一工程、
（２）第一工程で調製した検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、
該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、
該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、
該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する第二工程、
（３）第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
[発明２]
検出オリゴヌクレオチドが、メチル化ＤＮＡを複数含むオリゴヌクレオチド、複合検出オリゴヌクレオチドである発明１に記載の方法。
[発明３]
検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、検出オリゴヌクレオチドのメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体の識別機能である発明１又は２に記載の方法。
[発明４]
ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列又はその一部からなる発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明５]
ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列又はその一部からなるＤＮＡである発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明６]
ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＬＩＮＥ又はＡｌｕ配列に分類される塩基配列からなるＤＮＡである発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明７]
ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列が以下に示されるいずれかの塩基配列からなる発明４に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
[発明８]
検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する発明１〜７のいずれか一に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
[発明９]
特定オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する発明１〜７のいずれか一に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
[発明１０]
検出オリゴヌクレオチドがメチル化シトシンを含むメチル化オリゴヌクレオチドである発明１〜９のいずれか一に記載の方法。
[発明１１]
検出オリゴヌクレオチドの識別機能がメチルシトシンの検出、メチル化ＤＮＡ抗体による検出、又はメチルシトシン抗体による検出である発明１〜１０のいずれか一に記載の方法。
[発明１２]
検体が、下記のいずれかの検体である発明１〜１１のいずれか一に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｄ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
[発明１３]
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ生物由来検体が、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである発明１〜１２のいずれか一に記載の方法。
（ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ
（ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ
（ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
[発明１４]
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である発明１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
[発明１５]
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である発明１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
[発明１６]
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１〜１５のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
[発明１７]
検体が、哺乳動物由来の血清である発明１６に記載の方法。
[発明１８]
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
；等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、簡便に生物由来検体を検出する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図1は、実施例1において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が500 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が50 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が5 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
【図２】図２は、実施例２において、目的とするＤＮＡ領域Ｙを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が500 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が50 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が5 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
【図３】図３は、実施例３において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が500 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が50 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が5 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
【図４】図４は、実施例４において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が500 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が50 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が5 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
【図５】図５は、実施例５において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が500 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が50 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が5 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
【図６】図６は、実施例６において、目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が500 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が50 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が5 ng/20 μL TEバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
【図７】図７は、実施例７において、目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルAについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルBについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルCについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。Dはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルD (ネガティブコントロール液) について処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図８】図８は、実施例７において、目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルAについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルBについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルCについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。Dはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルD (ネガティブコントロール液) について処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図９】図９は、実施例８において、目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルAについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルBについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルC (ネガティブコントロール液) について処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図１０】図１０は、実施例８において、目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルAについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルBについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはメチル化オリゴヌクレオチドM1を用いて血清サンプルC (ネガティブコントロール液) について処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図１１】図１１は、実施例９において、ヒト血清中に含まれる目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、メチルシトシン抗体とメチル化オリゴヌクレオチドM1および5'末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて検出した結果と、リアルタイムPCRにより定量した結果を比較した図である。検出結果を縦軸に、リアルタイムPCRによる定量結果を横軸にとり、プロットした。またグラフ中の直線は回帰直線（太線）および標準誤差範囲（細線）を示してある。
【図１２】図１２は、実施例９において、ヒト血清中に含まれる目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、59歳以下のヒト血清サンプルについて、メチルシトシン抗体とメチル化オリゴヌクレオチドM1および5'末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いてDNAを検出した結果を、癌患者と健常者に分けてプロットしたものである。◆は健常者、▲は癌患者の測定結果を示しており、それぞれについて平均値および標準偏差を示してある。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に本発明（以下、本発明方法と記すこともある）を詳細に説明する。
本発明方法は、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する第一工程、（２）第一工程で調製した検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する第二工程、（３）第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第三工程と、を有する検体中に含まれるゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法に関するものである。
【０００９】
本発明方法における「検体」としては、非生物由来検体と生物由来検体とが挙げられる。非生物由来検体とは、例えば食品、河川、土壌、一般市販製品の表面付着物等の真菌、細菌、ウイルス等の混入微生物や核酸が含まれ得るものを意味する。
尚、特に食品においては食中毒菌の有無の検査と原因菌の特定が重要であり、通常は微生物表面の抗原を利用した免疫法が使用される。しかし、免疫法は、抗原を作るために多大の労力を必要とし、更に病原菌の特定が必要となる。即ち、微生物検査における免疫法は、微生物種の特異性を利用しているため、一回の検査で複数菌種をまとめて、その有無を検査することが難しいだけでなく、免疫法を確立できない微生物に対しては、ＰＣＲ法等を用いる等、検査には多大の労力が必要となる。本発明方法は、まず、免疫法による検査が難しい場合でも、遺伝子から検査方法を確立でき、次に、複数の微生物を同時に検出することが可能な検査方法を提供できる。即ち、本発明方法は、非生物由来検体中に存在する真菌類、微生物類、ウイルス等の検査に利用できる。また、本発明方法を用いることにより、例えば食品中の混入微生物やウイルスを検出することが可能となり、感染症の検査や食品汚染検査等で利用が期待できる。
【００１０】
生物由来検体とは、（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ、（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、（ｄ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、等が挙げられる。尚、前記組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味であり、前記体液とは血漿、血清、リンパ液等を意味し、前記体分泌物とは尿や乳汁等を意味する。
【００１１】
検体中に含まれるＤＮＡとしては、前記生体試料や前記混入微生物から抽出して得られたゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片、若しくはＲＮＡ等を挙げることができる。また、哺乳動物由来の検体がヒトの血液、体液又は体分泌物等である場合には、ヒトの定期健康診断における臨床検査等で採取したものを利用することができる。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
【００１２】
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いればよい。また、ＲＮＡからＤＮＡを得るためには、市販のｃＤＮＡ作製キット等の逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成するようなキットを用いればよい。また、本発明方法においては、検体としては、人工的に合成されたＤＮＡであってもよい。
【００１３】
本発明方法における「哺乳動物」とは、哺乳動物に属する動物の全てを意味する。哺乳動物に属する動物とは、動物界 脊索動物門 脊椎動物亜門 哺乳綱（Mammalia）に分類される動物の総称であり、より具体的には、ヒト、サル、マーモセット、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等を意味する。
【００１４】
本発明における「体液」とは、個体を構成する細胞間に存在する液体を意味し、血漿と間質液を意味し、多くの場合、個体の恒常性の維持機能を果たす。より具体的には、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）、脳脊髄液、等を意味する。
【００１５】
本発明における「体分泌液」とは、外分泌腺からの分泌液を意味する。より具体的には、唾液、胃液、 胆汁、 膵液、腸液、 汗、 涙、 鼻水、 精液、 膣液、 羊水、 乳汁、等を意味する。
【００１６】
本発明における「細胞溶解液」とは、細胞培養用の10cmプレート等で培養した細胞、即ち細胞株や初代培養細胞、血球細胞等を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液を意味する。細胞膜を破壊する方法としては、超音波による方法、界面活性剤を用いる方法、アルカリ溶液をを用いる方法等が挙げられる。尚、細胞を溶解するためには、様々なキット等を利用してもよい。
例えば具体的には、10cmプレートでコンフルエントになるまで細胞を培養した後、培養液を捨てて、0.6mLのRIPAバッファー（1x TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxysholate, 0.1% SDS, 0.004% sodium azide）を10cmプレートに加える。4℃で15分間プレートをゆっくり揺り動かしてから、10cmプレート上の接着細胞を、スクレーパー等を用いて剥がし、プレート上の溶解液をマイクロチューブに移す。溶解液の１/10容量の10mg/mL PMSFを添加してから、氷上で30-60分間放置する。4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を細胞溶解液として取得する。
【００１７】
本発明における「組織溶解液」とは、哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壊することにより取得する細胞内液を含む溶解液を意味する。
より具体的には、動物から取得した組織の重量を測定した後、カミソリ等を用いて組織を小片に裁断する。凍結組織をスライスする場合は、更に小さい小片にする必要がある。裁断後、氷冷RIPAバッファー（プロテアーゼインヒビター、フォスファターゼインヒビター等を添加してもよく、例えば、RIPAバッファーの１/10容量の10mg/mL PMSFを添加してもよい）を組織1gあたり3mLの比率で添加し、４℃でホモジナイズする。ホモジナイズには、ソニケーターや加圧型細胞破砕装置を用いる。ホモジナイズの作業では、溶液を常に４℃に維持し、発熱を抑えるようにする。ホモジナイズ液を、マイクロチューブに移して、4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を組織溶解液として取得する。
【００１８】
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）とは、検体中に含まれるＤＮＡのうち、本発明方法により検出又は定量したい（目的とする）ＤＮＡ領域である。検体がＤＮＡである場合の目的とするＤＮＡ領域とは、ＤＮＡの塩基配列上の所定の塩基配列を意味し、検体がＲＮＡである場合には、ＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡ上の塩基配列であって、ＲＮＡ上の検出又は定量対象となる所定の塩基配列の相補的塩基配列を意味する。
【００１９】
第一工程は、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する工程である。
【００２０】
本発明方法における「被検オリゴヌクレオチド」とは、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を含むオリゴヌクレオチドである。
「ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域」としては、ゲノム中に複数見られる塩基配列（以下、反復配列と記すこともある。）であればなんでも良く、疾患の指標となる塩基配列であれば更によい。例えば、癌においては、血液中のゲノムＤＮＡ由来の遊離ＤＮＡが増加することが知られており、この場合、被検オリゴヌクレオチドとは血液中の遊離ＤＮＡ中の反復配列やその部分配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これら反復配列やその部分配列を有するオリゴヌクレオチドの定量された値は、癌の進行程度を表す指標とすることができる。尚、後述するが反復配列としては、単純反復配列（縦列反復配列又はタンデムリピートと呼ばれる）、散在反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子等でもよい。
【００２１】
目的とするＤＮＡ領域の塩基配列を含むゲノムＤＮＡを取得するには、例えば、検体が哺乳動物由来の場合は、市販のＤＮＡ抽出用キット（Genfind v2 Kit（ベックマン・コールター社製）、FastPure DNA Kit（タカラバイオ社製））等を用いればよい。
また、検体が真菌等の微生物である場合、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法等を用いればよく、検体が大腸菌のような原核生物である場合、Molecular Cloning -A Laboratory Manual-（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているような一般的な微生物ゲノム調製法等を用いればよい。
また、検体が食品（一般食料品）である場合、食品から微生物等を分離してからＤＮＡを取得してもよく、食品に含まれる微生物以外の例えばウイルス等のゲノムＤＮＡと微生物由来のゲノムＤＮＡを同時に取得してもよい。
また、検体が哺乳動物由来の組織であり、目的とするＤＮＡ領域がウイルス由来のＤＮＡである場合は、組織中から市販のＲＮＡ抽出用キット（ISOGEN（311-02501）NIPPON GENE社製）、或いは、FastRNA Pro Green Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Blue Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Red Kit (フナコシ社製)等を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によってＤＮＡを取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の検体である場合、ウイルス粒子を抽出してからウイルスのＤＮＡを抽出してもよく、或いはウイルス粒子を抽出してから市販のキット（QuickGene RNA tissue kit S ＩＩ、富士フィルム社製）等を用いてウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得してもよい。ウイルスが感染した組織からＲＮＡを抽出し逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得してもよいし、ウイルスが感染した組織からＤＮＡを取得して、ウイルス由来のＤＮＡを取得してもよい。尚、ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを取得する場合には、市販のキット（トランスクリプターハイフィデリティcDNA合成キット、ロシュディアグノスティク社製）等を用いてもよい。
また、検体が哺乳類由来の組織や細胞株等からのＲＮＡを鋳型として調製されたＤＮＡである場合、組織や細胞株等から市販のＲＮＡ抽出用キットで抽出したＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりＤＮＡを取得してもよい。
【００２２】
また、本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域」は、該ＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域内の塩基配列に認識切断部位を有さない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡであってもよく、また予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。他に、第一工程で取得されるＤＮＡとしては、血液中の遊離ＤＮＡ、微生物ゲノム由来のＤＮＡ、検体中のＲＮＡから逆転写酵素によって合成されたＤＮＡ等であってもよい。
また、「目的とするＤＮＡ領域」として、ＲＮＡから逆転写酵素により合成されたＤＮＡ領域を用いる場合、具体的には、リボソーマルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、及び、マイクロＲＮＡ等から合成されたＤＮＡであってもよいことを意味する。ＲＮＡとしては宿主のゲノムからＲＮＡポリメラーゼから転写されたものだけでなく、ＲＮＡをゲノムとするウイルスゲノム等も含むものであり、ＲＮＡであれば何でもよいことを意味する。
【００２３】
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌、真菌、ウイルス、病原性原虫等の微生物等由来のＤＮＡや、これら微生物等由来のＲＮＡから逆転写酵素により取得したＤＮＡを挙げることができる。例えば、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma pneumoniae、Borrelia burgdorferi B31、Rickettsia prowazekii、Treponema pallidum、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Helicobacter pylori J99、Helicobacter pylori 26695、Haemophilus influenzae Rd、Mycobacterium tuberculosis H37Rv、Pseudomonas aeruginosa、Legionella pneumophila、Serratia marcescens、Escherichia coli、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Trichophyton ruburum、Trichophyton mentagrophytes、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatus、Pneumocystis carinii、Coccidioides immitis、Cytomegalovirus、human herpesvirus 5、Epstein-Barr virus、Human Immunodeficiency Virus、Human Papilloma Virus、Enterovirus、Norovirus Influenza Virus、Toxoplasma gondii、Cryptosporidium parvum、Entamoeba histolyticaのゲノムＤＮＡ又はＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡは、検体中の感染症原因菌や食品中の食中毒原因菌等の検出に利用できる。
検出対象の塩基配列としては、ゲノム中に複数見出される塩基配列であるCRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)領域等が挙げられる。
本発明方法を用いた微生物の同定・検出は、感染症診断、食中毒菌の同定、土壌や河川や湖沼の底質等に存在する微生物の種類と数の同定（環境中の微生物調査等）や、有用な化合物を生産する微生物や食品醗酵等に利用できる微生物等の産業上有用な微生物の同定や、汚水処理、食品醗酵等の微生物を工業的に利用している状態での菌層（微生物層）の確認等に利用可能である。
【００２４】
本発明方法における「反復配列」とは、ゲノム中に同じ所定の配列が複数個見られる塩基配列を意味している。このような反復配列としては、単純反復配列（縦列反復配列又はタンデムリピートと呼ばれる）や散在反復配列等が知られている。
単純反復配列は、同じ配列が同じ向きに隣り合って存在することを特徴とし、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト、セントロメア、テロメア、動原体、リボソーム集団遺伝子のような一連の塩基配列等が知られている。
散在反復配列は、隣り合わず散在することを特徴とし、レトロトランスポゾンに由来するＤＮＡと考えられている。散在反復配列は、塩基配列の長さにより、ＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列）に分類され、ヒトの塩基配列としては、各々、Ａｌｕ配列やＬＩＮＥ−１配列が代表的な反復配列として知られている。また、ＲＮＡやタンパク質から逆転移した不活性なプロセッシング済みの偽遺伝子、遺伝子重複により増幅した遺伝子配列も知られている。
重複遺伝子とは、一つのゲノム上に複数の高い相同性を有する遺伝子が存在する場合を指し、多くの場合は、一遺伝子の近傍にタンデムに並んで存在する塩基配列である。尚、偽遺伝子にも重複遺伝子に含まれるものが知られている。
【００２５】
ゲノム中に複数個見られる塩基配列としては、まず、比較的短い塩基配列からなる繰り返しが挙げられる。具体的には、(A)n、(T)n、(GA)n、(CA)n、(TAA)n、(GGA)n、(CAGC)n、(CATA)n、(GAAA)n、(TATG)n、(TTTG)n、(TTTA)n、(TTTC)n、(TAAA)n、(TTCA)n、(TATAA)n、(TCTCC)n、(TTTCC)n、(TTTAA)n、(TTTTC)n、(TTTTA)n、(TTTTG)n、(CAAAA)n、(CACCC)n、(TATATG)n、(CATATA)n、(TCTCTG)n、(AGGGGG)n、(CCCCCA)n、(TGGGGG)n（ｎは繰返し数を意味する）等の配列が挙げられる。次に、転写因子に由来する配列が挙げられる。具体的には、hATグループとして、MER１-Charlie、Zaphodが知られており、Tc-1グループとして、MER2-Tigger、Tc-1、Marinerが知られている。その他、Tigger1、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等が知られている。これらの「比較的短い塩基配列」、「転写因子に由来する配列」は、後述の特定接着配列及び検出用接着配列が設定可能であれば、本発明方法にも利用可能である。また、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト等は、単純反復配列に分類される反復配列であり、後述の特定接着配列及び検出用接着配列が設定可能であれば、本発明方法にも利用可能である。また、遺伝子中に多コピー存在する配列として、セントロメアに存在する配列としてALR6が、またsnRNAとしてU2やU6が、tRNAやrRNAのように生物的な機能を有する塩基配列の中にもゲノム中に多コピー存在する塩基配列があることが知られている。このような遺伝子としては、遺伝子重複によりゲノム中に複数コピー存在する遺伝子である重複遺伝子を挙げることができる。
【００２６】
重複遺伝子とは、遺伝子重複によりゲノム中の特定の遺伝子や遺伝子断片が倍加することにより生じた遺伝子又はその遺伝子断片を意味する。遺伝子重複とは、遺伝子を含むDNAのある領域が重複する現象のことである。遺伝子重複が起こる原因としては、遺伝的組換えの異常、レトロトランスポゾンの転移、染色体全体の重複等がある。例えば、1つの遺伝子がコピーされてゲノムＤＮＡに挿入されることを意味し、異なる染色体位置へ挿入される場合と元の遺伝子の近傍に挿入される場合がある。元の遺伝子の近傍への挿入により、コピーされた遺伝子が並んでいる場所をタンデムリピートと呼び、遺伝子重複によって作り出された遺伝子のグループを遺伝子族(遺伝子ファミリー)と呼ぶ。 
【００２７】
偽遺伝子とは、ＤＮＡの配列のうち、遺伝子産物（特にタンパク質）をコードしていたことを想像させるような特徴のある塩基配列を有しているが、現在は機能を失っている遺伝子をいう。元の機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと考えられている。例えば、突然変異によりストップコドンが生じてタンパク質のペプチド鎖が短くなってしまいタンパク質として機能を果たせなくなる場合や、一塩基置換等の突然変異により正常な転写に必要な調節配列が機能を失う場合等がある。偽遺伝子は元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、単独で偽遺伝子になるものもある。偽遺伝子は、遺伝子配列の特徴により3タイプに分類できる。ｍＲＮＡからレトロトランスポゾンの逆転写酵素によって作られたＤＮＡがゲノムに挿入される場合（プロセス型偽遺伝子）、ゲノム内で元の遺伝子配列が重複し、そのコピーのうち一部が突然変異等により機能を喪失して偽遺伝子になる場合（重複偽遺伝子又は非プロセス型偽遺伝子）、及びゲノム内の遺伝子が（重複遺伝子がなく単独の遺伝子のまま）機能を失うことにより偽遺伝子になる場合がある。
尚、現在、偽遺伝子として知られる遺伝子の中には、転写されている例や、遺伝子機能を有する例（偽遺伝子と呼ぶべきかどうかは定まっていない）も知られるようになっていることから、本発明方法における、「偽遺伝子」とは、遺伝子機能の有無、或いは転写されるか否かではなく、前記の「プロセス型偽遺伝子」と「重複偽遺伝子（非プロセス型偽遺伝子）」を意味するものである。
【００２８】
本発明方法における「反復配列」である「ゲノム中に複数個見られる塩基配列」としては、レトロウイルスや、末端にLTR（Lomg terminal repeat）を有するレトロトランスポゾン、MaLRs（Mammalian apparent LTR-Retrotransposons）のような、ウイルス由来と考えられる内在配列や、レトロウイルス由来のLTR等を挙げることができる。
例えば、レトロウイルス由来のLTRとしては、具体的には、LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48、MLT2CB等のサブファミリーが知られている。また、レトロトランスポゾン由来のLTRは、ERV、ERVK、ERVLの各クラスに分類され、具体的には、LTR8A、LTR28、MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL、LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、MLT2A1、MLT2E 、MER11C、MER11C等のサブファミリーを挙げることができる。更に、ＭａＬＲｓは、典型的なレトロトランスポゾンと同様にその配列の両端にLTRを含むが、LTRにはさまれた内部配列がレトロウイルス由来ではない配列のＤＮＡ因子を指す。例えば、MLT1A1、MLT1A2、MLT1B、MLT1C、MLT1D 、MLT1F、MLT1G 、MLT1H、MLT1J 、MLT1K 、MLT1I 、MLT2CB 、MSTA、MSTA-int、MSTB 、THE1A、THE1B、THE1B-internal、THE1等のサブファミリーを挙げることができる。
【００２９】
「散在反復配列」は、隣り合わず散在することを特徴としており、レトロトランスポゾンに由来すると考えられている。また、散在反復配列は、その長さにより、ＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列）に分類されてる。ＳＩＮＥのうち、大部分はＡｌｕファミリーに属する配列である。特徴としては、７ＳＬ ＲＮＡの３’側の配列或いは５’側の配列を有し、尚且つLeft-monomerとRight-monomerと呼ばれる領域にはさまれたＡＴ−Ｒｉｃｈ領域を有している。Ａｌｕファミリーのサブファミリーとしては、Alu、AluJb、AluJo、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluYを、更には、ＦＡＭ（Fossil Alu Monomer）と、ＦＡＭの配列を有するＦＬＡＭ（Free Left Alu Monomer）とＦＲＡＭ（Free Right Alu Monomer）を挙げることができる。Ａｌｕファミリー以外のＳＩＮＥとしては、ＭＩＲ、及びＴｈｅｒ／ＭＩＲ３が知られており、夫々、サブファミリーとして、MIR、MIR3が知られている。その他、他の生物種のＡｌｕファミリーのサブファミリーとしては、B1、B2、B4、PB1、PB1D等が知られている。ＬＩＮＥとしては、LINE1からLine23のサブファミリーが報告されているが、LINE-1、LINE2、LINE3が広くゲノム中に存在することが知られている。尚、LINE-1については、例えば、L1M1、L1M2、L1M3、L1M3d、L1M4、L1M4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、L1MB1、L1MB1、L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、L1MCa、L1MCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、L1MC4a、L1MC5、L1MDa、L1ME、L1MEc、L1MEd、L1MEg、L1ME1、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、L1ME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、L1PB1、L1PB3、L1PB4、L1PREC2、HAL1のサブファミリーが知られており、LINE-2としては、L2、L2cのサブファミリーが知られている。尚例えば、Aluファミリー又はAluのサブファミリーに共通の配列、LINE-1ファミリー或いはLINE-1のサブファミリーに共通の配列に対して、後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定できれば、一ゲノム中に複数の検出対象を設定することができるため、ゲノムの検出をより高感度にすることができる。
目的とするＤＮＡ領域としては、具体的に例えばＬＩＮＥ−１の部分配列（配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列）やＡｌｕの部分配列（配列番号３に示す塩基配列）又はそれらの相同性を示す塩基配列等を挙げることができる。
【００３０】
尚、例えばある領域中の反復配列を調べたい場合、PubMed等の一般的な配列検索のデータベースで検索することは難しく、通常は、Repbase（http://www.girinst.org/repbase/）、RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org/）等のデータベースを用いればよい。これらの反復配列を測定することは、例えば、血液中の遊離ＤＮＡ量のサロゲートマーカーとして扱うことが可能であり、また例えば、生物種特異的な反復配列に注目する場合は、生物種の特定等に利用することができる。
【００３１】
ゲノム中の反復配列としては、具体的に以下に示される塩基配列からなるものを挙げることができる。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号９で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【００３２】
第二工程は、第一工程で調製した検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する工程である。
【００３３】
第二工程における「検出オリゴヌクレオチド」とは、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得るものであり、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基が、該検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量するための識別機能を有し、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ（被検オリゴヌクレオチド）と相補性によって結合するための塩基配列である検出用接着配列と、該検出用接着配列に連結した検出配列とを有しているオリゴヌクレオチドである。また、「検出オリゴヌクレオチド」は、後述するヒトゲノム中の反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなってもよい。尚、本発明方法の第二工程における「検出オリゴヌクレオチド」は、後述する複合検出オリゴヌクレオチドの形態をとってもよい。また、検出オリゴヌクレオチドはメチル化ＤＮＡを複数含むオリゴヌクレオチドであってもよく、メチル化シトシンを含むメチル化オリゴヌクレオチドであってもよい。
【００３４】
検出オリゴヌクレオチドにおける「検出用接着配列」とは、目的とするＤＮＡ領域を有する塩基配列に相補的な塩基配列の一部分からなるオリゴヌクレオチドであって、検出用接着配列が対合し得る目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡの塩基配列部分と７５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する配列である。また、検出用接着配列は、被検オリゴヌクレオチドにおける目的とするＤＮＡ領域又は目的とするＤＮＡ領域の近傍に結合する塩基配列を有し、第二工程で後述する検出複合体を形成できるように設定されていればよい。
尚、検出用接着配列は、検出オリゴヌクレオチド、被検オリゴヌクレオチド、後述する特定オリゴヌクレオチド及び支持体が結合してなる検出複合体を形成できればどのような塩基配列であっても良く、特に後述する特定オリゴヌクレオチドと被検オリゴヌクレオチドとの結合を阻害しないものが好ましい。また、検出用接着配列は同一反復配列中（目的とするＤＮＡ領域中）に一つ設計されていてもよく、二つ以上設計されていてもよい。二つ以上設計する場合、複数の検出用接着配列と後述する特定接着配列は、互いに目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡとの結合を阻害しないものが好ましい。検出用接着配列の塩基配列の長さは、５ｂｐ〜５０ｂｐ、望ましくは１０ｂｐ〜３０ｂｐである。
【００３５】
「検出配列」とは、前記検出用接着配列に結合させて使用でき、識別機能を有する塩基配列であればよい。即ち、検出或いは定量するために特有の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、或いは識別機能を有する分子そのもの、或いは識別機能を有する分子が結合したオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、ＦＩＴＣ、放射性標識、ＦＩＴＣ又は放射性同位体で標識されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
また、例えば、検出配列はメチル化されたＤＮＡであってもよい。具体的には、メチル化オリゴヌクレオチドが5-メチルシトシンである場合には、識別機能を有するメチルシトシン抗体を結合させることで、検出配列を検出・定量することができる。また、検出配列は、メチル化オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る塩基配列であってもよい。
「識別機能を結合しうる分子」とは、識別機能を検出オリゴヌクレオチドに付与させるために、オリゴヌクレオチド以外の分子を用いることを意味する。例えば、識別機能が、後述のＦＩＴＣ抗体に標識されたhorseradish Peroxidase（ＨＲＰ）である場合、検出オリゴヌクレオチドにＦＩＴＣが結合された場合、ＦＩＴＣは「識別機能を結合しうる分子」であることを意味する。
【００３６】
「識別機能」とは、検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量できる機能である。即ち、識別機能は検出オリゴヌクレオチドの有する機能であれば何でも良く、例えば、検出オリゴヌクレオチドの標識に基づく識別機能や、検出オリゴヌクレオチドに結合する検出分子によって検出オリゴヌクレオチドに付与される識別機能を意味する。具体的には、検出オリゴヌクレオチドに、その５’末端若しくは３’末端にユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識等がなされた検出オリゴヌクレオチドの蛍光・発色等の特性を挙げることができる。
ユーロピウムの検出のためには、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、約４５分間室温で静置した後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定すればよい。また、検出オリゴヌクレオチドがメチル化オリゴヌクレオチドである場合には、検出分子としては、具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体や、オスミウム錯体（非特許文献３）等が挙げられる。メチル化オリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基の少なくとの一つががメチル化されているオリゴヌクレオチドを意味し、より具体的には５-メチルシトシン、６-メチルアデニン等を含むオリゴヌクレオチドを意味する。更に、検出オリゴヌクレオチドがＦＩＴＣ標識されている場合には、検出分子としてＦＩＴＣ抗体を挙げることができる。
【非特許文献３】Tanaka K., Tainaka K., Kamei T., Okamoto A., Direct labeling of 5-methylcytosine and its applications.，J. Am. Chem. Soc.，2007;129:5612-5620．
【００３７】
「検出分子」とは、検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する性質を有していればよい。また、検出分子は、検出オリゴヌクレオチドの検出配列を認識するものであっても良く、予め検出オリゴヌクレオチドに結合されていても構わない。即ち、検出分子は、検出オリゴヌクレオチドに特異的に結合する性質を有し、且つ、定量又は検出のために利用される機能・特性である「識別機能」を有するか、或いは識別機能を付与され得るものであればよい。具体的には、検出分子は、検出配列がメチル化オリゴヌクレオチドの場合、該メチル化オリゴヌクレオチドに結合して該メチル化オリゴヌクレオチドを検出できるものであれば良く、該メチル化オリゴヌクレオチドに特異的に結合して識別機能を示すものであればよい。他に例えば、検出分子はメチル化ＤＮＡ抗体であってもよい。また、検出配列が検出分子そのものである場合、検出オリゴヌクレオチドを検出するために、新たな検出分子を添加しなくとも良く、検出オリゴヌクレオチドに組み込まれた検出分子を検出することにより、該検出オリゴヌクレオチドの検出が可能になる。
【００３８】
検出分子がメチル化ＤＮＡ抗体である場合には、以下の方法により、定量又は検出のために利用される識別機能として利用することができる。具体的には、ユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識等、標識が蛍光・発色等を利用した機能である。尚、これら検出分子としての抗体に識別機能を付与する方法としては、検出分子である抗体に直接に識別機能を結合させてもよいし、識別機能を有した二次抗体又は三次抗体を検出分子である抗体に結合させてもよい。具体的には、蛍光物質で標識された抗体、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識された抗体、アルカリホスファターゼ標識された抗体、ビオチン標識された抗体、ユーロピウム標識された抗体を二次抗体又は三次抗体として利用することができる。また、酵素サイクル法で検出可能な基質を結合した抗体を利用してもよい。これら識別機能の定量又は検出手段としては、例えば、放射線検出器、分光光度計等による測定、又は目視等が挙げられる。例えば、検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能により検出又は定量する場合として、具体的にユーロピウムが付加された二次抗体を使用する場合、後述する検出複合体に二次抗体を結合させた後、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定すればよい。
検出オリゴヌクレオチド上のメチル化ＤＮＡにメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、その機能により検出又は定量する場合には、具体的には検出複合体にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させた後、メチル化ＤＮＡ抗体に対する二次抗体（例えば、Eu-N1標識マウスIgG抗体：PerkinElmer社製）を添加し、室温で約１時間静置し、二次抗体の複合体への結合を促す。その後、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、例えば約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定することにより、検出又は定量する。
また、検出オリゴヌクレオチド上のメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体をＦＩＴＣで標識する場合には、二次抗体としてＦＩＴＣを結合させた抗体を用いることもできる。この場合、公知の方法により、ＦＩＴＣの蛍光を測定し、検出又は定量することもでき、抗ＦＩＴＣ抗体を二次抗体として検出又は定量することもできる。更に、検出オリゴヌクレオチドにＦＩＴＣを直接結合させた場合は、ＦＩＴＣを識別機能として利用することもできるし、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識されたＦＩＴＣ抗体、アルカリホスファターゼ標識されたＦＩＴＣ抗体、ビオチン標識されたＦＩＴＣ抗体、ユーロピウム標識されたＦＩＴＣ抗体等により標識機能を付与することもできる。具体的には、検出オリゴヌクレオチドとして、ＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドを検出オリゴヌクレオチドとして使用する場合は、該検出オリゴヌクレオチドを含む後述する支持体に固定化された検出複合体に、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識された抗体（例えば、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories社製））を添加し、室温で約１時間〜2時間静置し、ＦＩＴＣ抗体の検出複合体への結合を促す。その後、ＦＩＴＣ抗体溶液を洗浄除去してから、適切な基質（例えば、Substrate Reagent Pack #DY999：R&D SYSTEMS社製）を添加・混合する。約５〜６０分間室温で静置した後、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を添加してhorseradish Peroxidase（ＨＲＰ）の反応を停止させ、反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定すればよい。また、メチル化ＤＮＡ抗体の固定化にビオチンを利用しない場合、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量に用いることができる。ビオチン化された検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する場合には、例えば、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを固定化された検出複合体に添加・混合し、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドとＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの結合体を形成・分離した後、公知の方法によりＨＲＰの活性を測定することによりビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出又は定量できる。
また、識別機能としては、酵素サイクル法等の高感度検出法で用いられる基質等を利用するものであってもよい。具体的には、酵素サイクル法で用いられる酵素を結合した抗体を検出分子として、検出複合体に結合させればよい。尚、本発明方法において検出分子に付与される識別機能としては、上記の記載の方法に限定されるものではない。
【００３９】
本発明において「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作製できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。尚、このようなメチル化ＤＮＡ抗体の性質（１つのメチル化された塩基（シトシン）に１つの抗体が結合すること）から考えると、目的とするＤＮＡ領域としては、数多くのメチル化された塩基（シトシン）、即ちＣｐＧ、が存在する領域を選抜することが望ましく、また、定量精度及び検出感度の向上が期待できる。
【００４０】
尚、動物に抗原を接触させて得られる抗体として、動物から精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本発明においてはメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
【００４１】
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫してもよい。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ  Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫してもよい。最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法等が挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしてもよい。細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
【００４２】
本発明方法における「特定オリゴヌクレオチド」とは、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡと相補性により結合しうる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ、後述する支持体に結合する機能を有していればよい。具体的には、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと相補的に結合する特定接着配列を有し、支持体に結合して後述する検出複合体を形成できるものである。
【００４３】
「特定接着配列」とは、目的とするＤＮＡ領域を有する塩基配列（被検オリゴヌクレオチド）に相補的に結合し得る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。特定接着配列が対合しうる被検オリゴヌクレオチドの塩基配列部分の相補的塩基配列は、特定接着配列の塩基配列と７５％以上、望ましくは９０％以上の相同性を有している。特定接着配列の塩基配列の長さは、５ｂｐ〜５０ｂｐ、望ましくは１０ｂｐ〜３０ｂｐである。また、特定接着配列は、被検オリゴヌクレオチドにおける目的とするＤＮＡ領域又は目的とするＤＮＡ領域の近傍に結合する塩基配列を有し、第二工程で後述する検出複合体を形成できるように設定されていればよい。また、特定接着配列は、検出オリゴヌクレオチド、被検オリゴヌクレオチド、特定オリゴヌクレオチド及び支持体が結合してなる検出複合体を形成できればどのような塩基配列であってもよく、特に特定オリゴヌクレオチドと被検オリゴヌクレオチドとの結合を阻害しないものが好ましい。尚、特定接着配列は同一反復配列中（目的とするＤＮＡ領域中）に通常は一つ設計されていればよいが、二つ以上設計されていてもよい。二つ以上設計する場合、互いに目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡとの結合を阻害しないものが好ましい。
【００４４】
「相補的に結合」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続したチミンとアデニン、グアニンとシトシンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的に結合する」と呼ぶこともある。「相補的に結合」は、「相補的な結合」、「相補性により結合」、「相補的な（塩基対合による）結合」、「相補的な塩基対合」、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性によって結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」、[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作製されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンが、シトシン、又はアデニン、又はチミンと水素結合で結合することも意味する。「相補的な塩基配列」、「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」、「相補性により結合しうる塩基配列」、又は「相補的な配列」と表現することもある。
「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
【００４５】
また、本発明方法において、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドが「相補性により結合」する場合、特定オリゴヌクレオチドの特定接着配列を構成する塩基配列の全てが目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合も含める。例えば、特定接着配列を構成する塩基のうち、少なくとも７５％、望ましくは８０％以上の塩基が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しており、尚且つ、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと、少なくと７５％以上、望ましくは８０%以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドと結合できる場合も含める。
同様に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドが「相補性により結合」する場合、検出オリゴヌクレオチドの検出用接着配列を構成する塩基配列の全てが目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合も含める。例えば、検出用接着配列を構成する塩基のうち、少なくとも７５％、望ましくは８０％以上の塩基が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しており、尚且つ、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと、少なくと７５％以上、望ましくは８０%以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドと結合できる場合も含める。
尚、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがゲノム中の前述する反復配列である場合には、反復配列が相同性を有する一群の塩基配列であることから、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定接着配列の相補的な塩基対合は、塩基配列の全てが目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合が発生する可能性がある。即ち本発明方法においては、特定接着配列として、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがＬＩＮＥ配列やＳＩＮＥ（Ａｌｕ）配列等の反復配列では、８０％以上の相同性を有する塩基配列に対して相補性により結合しうる特定接着配列も含むことを意味する。
【００４６】
本発明方法において「相同性を示す塩基配列」とは、配列同一性を有する塩基配列を意味する。本発明方法において、配列相同性の比率を記述しない場合は、少なくとも７５％以上、望ましくは８０％以上の配列同一性を有する塩基配列のことを言う。具体的に「配列番号１と相同性を示す塩基配列」とは、配列番号１の塩基配列或いは配列番号１の塩基配列と少なくとも７５％以上の配列同一性を有する塩基配列で、望ましくは８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であることを意味する。
【００４７】
本発明方法における「支持体」としては、後述する検出複合体が結合可能な支持体であれば材質や形状は特定されない。例えば、形状は使用目的に適っていればよく、チューブ状、テストプレート状、フィルター状、ディスク状、ビーズ状等が挙げられる。また、材質は通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ナイロン等の合成樹脂、或いは前記合成樹脂にスルホン基、アミノ基等の反応性官能基を導入したものでもよい。また、ガラス、多糖類又はその誘導体（セルロース、ニトロセルロース等）、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等でもよい。
【００４８】
「検出複合体」とは、前記被検オリゴヌクレオチドと前記検出オリゴヌクレオチドと前記特定オリゴヌクレオチドと前記支持体とが結合した複合体のことをいう。検出複合体を調製するには具体的に例えば、被検オリゴヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ水溶液（0.1pmol/10μl、ゲノムＤＮＡの場合、予め適切な制限酵素で処理し、ＤＮＡを断片化しておくことが望ましい。）又は被検オリゴヌクレオチド水溶液（0.1pmol/10ul）に、被検オリゴヌクレオチドと相補性により結合する特定オリゴヌクレオチドとして0.02μMのビオチン化された特定オリゴヌクレオチドを5μL加え、被検オリゴヌクレオチドと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチド水溶液（0.02μM）を夫々5μL加え、更に100mMのＭｇＣｌ２を20μL、及び最適な10×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を10μl加え 、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を100μLとし、支持体の存在下で、95℃で10分間加熱し、70℃で10分間保温の後、更に50℃で10分間保温してから、37℃で10分間冷却処理することにより、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を形成させればよい。
このようにして形成された被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を、支持体であるアビジンプレートに移し、30分間、室温で静置することにより、支持体へ結合させればよい。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05%のTween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、２００μＬ/ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、アビジンプレートを支持体とした検出複合体を形成させる。
「支持体に結合」させる方法としては、例えば特定オリゴヌクレオチドを通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従い、支持体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には、特定オリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化された特定オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、特定オリゴヌクレオチドの５’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを５個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。また更に、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、特定オリゴヌクレオチドの末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
上記方法では、被検オリゴヌクレオチド、ビオチン化特定オリゴヌクレオチド、検出オリゴヌクレオチドを同時に添加し、該被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を取得し、その後、該結合体中のビオチン化特定オリゴヌクレオチドを用いて固定化（選択）しているが、その順番は、特に限定されない。即ち、先にビオチン化特定オリゴヌクレオチドをアビジンプレート（支持体）に固定化しておき、その後、被検オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドを添加し、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を取得し、固定化（選択）してもよい。
また、前記被検オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を取得し選択する場合に、予め得られている被検オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端をビオチン化し、上記と同様の方法を実施することにより、被検オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を、直接、支持体へ結合させ、選択してもよい。
【００４９】
本発明方法においては、検出オリゴヌクレオチドや後述する複合検出オリゴヌクレオチドの識別機能として、支持体として用いられる微粒子と同じ微粒子がこれらのオリゴヌクレオチドに結合されていても構わない。微粒子としては、ラテックスビーズ、金コロイド（金ナノ粒子）等が挙げられる。本発明方法において支持体と検出オリゴヌクレオチドの識別機能として同一種類の微粒子を用いる場合、支持体である微粒子と検出オリゴヌクレオチドに結合されている微粒子は、支持体である微粒子上に被検オリゴヌクレオチドが固定化され、且つ、被検オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドが相補的な結合により検出複合体を形成することにより微粒子の凝集体として検出できる。この場合、微粒子がラテックスビーズであれば、凝集体は濁度の変化によって検出することが可能となる。また、微粒子が金コロイド（金ナノ粒子）であれば、凝集体は、色調変化（ピンクから紫色）によって検出することが可能となる。
また、目的とするＤＮＡ領域上に「検出用接着配列」に相補的な塩基配列が複数存在する場合には、目的とするＤＮＡ領域に微粒子が結合された検出オリゴヌクレオチドが複数結合することにより支持体が凝集しうる。この場合、特定オリゴヌクレオチドを添加せずに実施しても特定オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の結果を得ることができる。従って、本発明方法は、目的とするＤＮＡ領域上に検出オリゴヌクレオチドが結合可能な「検出用接着配列」と相補的に結合しうる塩基配列が複数存在する場合には、特定オリゴヌクレオチドを添加せずに微粒子の凝集を検出できる方法も含むものである。
同様に、目的とするＤＮＡ領域上に「特定接着配列」に相補的な塩基配列が複数存在する場合には、目的とするＤＮＡ領域に、支持体として微粒子が結合された特定オリゴヌクレオチドが複数結合することにより支持体が凝集しうる。この場合、検出オリゴヌクレオチドを添加せずに実施しても検出オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の結果を得ることができる。従って、本発明方法は、目的とするＤＮＡ領域上に、特定オリゴヌクレオチドの特定接着配列と相補的に結合しうる塩基配列が複数存在する場合には、検出オリゴヌクレオチドを添加せずに微粒子の凝集を検出できる方法も含むものである。
尚、微粒子凝集体として検出される量を被検オリゴヌクレオチドに含まれる目的とするＤＮＡ領域の検体中の量に相関した指標とすることができる。
【００５０】
「検出用接着配列」と「特定接着配列」は、検出オリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列か、特定オリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列かの違いのみであるため、夫々該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドは、被検オリゴヌクレオチドへ同時に結合可能なオリゴヌクレオチドである。即ち、「検出用接着配列」は「特定接着配列」としても利用できるし、「特定接着配列」は「検出用接着配列」としても利用可能である。
例えば具体的には、配列番号１に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」として、夫々配列番号４および配列番号１２の塩基配列を設定して、配列番号４に示される特定接着配列をビオチン化して特定オリゴヌクレオチドとし、また、配列番号１２に示される接着用接着配列に検出配列を連続して合成して配列番号５に示す検出オリゴヌクレオチドを作製すると、該特定オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドを用いて、配列番号１に示す塩基配列を検出することができる。一方で、配列番号１に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」として、夫々配列番号１２および配列番号４の塩基配列を設定して、配列番号１２に示される特定接着配列をビオチン化して特定オリゴヌクレオチドとし、配列番号５に示される接着用接着配列の塩基配列に検出配列を連続して合成して検出オリゴヌクレオチドを作製し、該特定オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドを用いて、同様に、配列番号１に示す塩基配列を検出することができる。
即ち、被検オリゴヌクレオチドに結合して検出複合体を構成しうる特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドを構成する「特定接着配列」と「検出用接着配列」は、検出複合体を形成しうる被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合可能な塩基配列の組み合わせとして扱うことが可能であり、片方を特定接着配列として利用する場合には、残り片方は検出用接着配列として利用すればよい。
【００５１】
本発明方法における「複合検出オリゴヌクレオチド」とは、被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し、且つ、識別機能を有する複数のオリゴヌクレオチドが結合（複合）したヌクレオチドである。この複合検出オリゴヌクレオチドの形態としては、各々のオリゴヌクレオチドが有する互いに相補的な塩基配列からなる接着塩基配列により結合させてなるものであってもよく、また複合検出オリゴヌクレオチドを構成する個々のオリゴヌクレオチドの全て或いはその一部がメチル化されていても構わない。本発明方法において、複合検出オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がメチル化されたものを、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドと呼ぶこともある。また、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドは、メチル化オリゴヌクレオチドを含む複合検出オリゴヌクレオチドであってもよい。メチル化オリゴヌクレオチドを相補的に結合させて複合検出オリゴヌクレオチドを形成させる場合は、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドは、例えばメチル化オリゴヌクレオチドのみを結合させてなるものでもよく、メチル化オリゴヌクレオチドとメチル化されていない（非メチル化）オリゴヌクレオチドを組み合せて結合させてなるのもでもよく、夫々のオリゴヌクレオチドの数は制限されない。
【００５２】
「メチル化オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基がメチル化されたオリゴヌクレオチドを意味するものであり、本発明においては人工的に合成されたものであってもよい。また、人工的に合成されたオリゴヌクレオチドやゲノムＤＮＡを断片化して得られたオリゴヌクレオチドを、メチル基転移酵素で修飾することで調製してもよい。いくつかのメチル基転移酵素（メチル化酵素）は、オリゴヌクレオチド中の「ＣｐＧ」中のシトシンの５位をメチル化することが知られており、このようなメチル基転移酵素の具体例としては、SssＩ methylase、Dmnt1 methylase等を挙げることができる。尚、ゲノムＤＮＡは部分的にメチル化されているので、細胞等から取得したゲノムＤＮＡを断片化すると、ゲノム中でメチル化されている領域がメチル化オリゴヌクレオチドとして取得できる場合もある。また、シトシンの５位がメチル化されたメチル化オリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシンをシトシンの代わりに用いて人工的に合成されたメチル化オリゴヌクレオチドであってもよい。この場合、「ＣｐＧ」のシトシンだけでなく全てのシトシン（例えば、５’−ＣＡ−３’、５’−ＣＴ−３’、５’−ＣＣ−３’等）を、５−メチルシトシンとして合成することが可能である。
【００５３】
「ＤＮＡメチル化酵素」とは、ＤＮＡ中の塩基をメチル化する酵素であり、哺乳動物細胞、細菌等から、多くのＤＮＡメチル化酵素が単離されている。ＤＮＡメチル化酵素は、基質の塩基の種類から、アデニンメチル化酵素、シトシンメチル化酵素等、数種類に分類される。シトシンメチル化酵素は、ＤＮＡ塩基配列中の特定の配列を認識し、その配列の近くのシトシンをメチル化する酵素であり、認識する塩基配列により異なったシトシンメチル化酵素が知られている。
また、ＤＮＡメチル化酵素の触媒するＤＮＡのメチル化反応は、制限修飾系と呼ばれる原始的な免疫系から多数見出されている。制限修飾系とは、細菌で機能するゲノム全体を定期的にメチル化することにより、特定の配列を認識する制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）によって消化されないようにした上で、外来ＤＮＡ（特にバクテリオファージ）を制限酵素によって消化する機能で、バクテリオファージ感染から微生物ゲノムを防御するシステムのことである。ゲノムのメチル化に機能している酵素は、シトシン又はアデニンをメチル化し、多くはプリン残基の６位の窒素（Ｎ６）、或いは５位の炭素（Ｃ５）をメチル化することが知られている。このような酵素のうち、シトシンのＣ５をメチル化するシトシンメチル化酵素としては、SssI(M.SssI)メチラーゼ、AluIメチラーゼ、HhaIメチラーゼ、HpaIIメチラーゼ、MspIメチラーゼ、HaeIIIメチラーゼ等が知られている。また、これらシトシンのＣ５位をメチル化する酵素は、認識する塩基配列が異なっており、ＣpＧを認識するシトシンメチル化酵素は、SssIのみである。
また、ヒトゲノム中のＤＮＡのメチル化反応としては、エピジェネティクス（遺伝子配列によらない遺伝子発現の多様性を生みだす仕組み）として、ＣｐＧのシトシンの５位（Ｃ５）のメチル化が知られており、このようなシトシンメチル化酵素として、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが知られている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとしては、DnmtIメチルトランスフェラーゼが知られている。
従って、ヒト細胞中ではＣｐＧ配列のシトシンのＣ５位がメチル化されているため、人為的にゲノムをメチル化する場合には、SssIを用いることで、ヒト細胞内でのメチル化と同じ配列（ＣｐＧ）の、同じシトシンの、同じ位置をメチル化することが可能となる。
シトシンメチル化酵素によりメチル化されたＤＮＡにするためには、具体的には例えば、以下のように実施すればよい。ＤＮＡ試料に、最適な10×緩衝液（NEBuffer2 (NEB社製)）を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーションすればよい。
【００５４】
本発明方法では、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドが相互に相補的に直列に結合（連結）する場合（「直列型」と呼ぶこともある）、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）のうち、被検オリゴヌクレオチドと相補性によって結合する検出用接着配列を有するオリゴヌクレオチドを第１オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
【００５５】
第１オリゴヌクレオチドは、前記検出用接着配列を有し、且つ、被検オリゴヌクレオチドの前記検出用接着配列以外の塩基配列とは相補的な結合をせず、第１オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第２オリゴヌクレオチドの相補接着配列と相補的に結合しうる接着塩基配列である第１接着塩基配列を有する。
また、第１接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第１接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を第２オリゴヌクレオチドと呼ぶ。第２オリゴヌクレオチドは、前記相補第１接着塩基配列を有し、且つ、第１接着配列以外の、被検オリゴヌクレオチド及び第１オリゴヌクレオチドとは相補的な結合をせず、第２オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）ある第３オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうる接着塩基配列である第２接着塩基配列を有する。第２接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第２接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を第３オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
【００５６】
同様に、第Ｎ接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第Ｎ接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドと呼ぶ。第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドは、該相補第（Ｎ）接着塩基配列を有し、且つ、第Ｎ接着配列以外の被検オリゴヌクレオチド及び第１オリゴヌクレオチドから第Ｎオリゴヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドとは相補的な結合をせず、第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第（Ｎ＋２）オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうる接着塩基配列である第（Ｎ＋１）接着塩基配列を有する。第（Ｎ＋１）接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第（Ｎ＋１）接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を、第（Ｎ＋２）オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
【００５７】
同様に、第（Ｎ−１）接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第（Ｎ−１）接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を、第Ｎオリゴヌクレオチドと呼ぶ。第Ｎオリゴヌクレオチドは、該相補第（Ｎ−１）接着塩基配列を有し、且つ、第（Ｎ−１）接着配列以外の被検オリゴヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドから第（Ｎ−１）オリゴヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドとは相補的な結合をせず、第Ｎオリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうる接着塩基配列である第Ｎ接着塩基配列を有する。
尚、第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドが存在しない場合には、第Ｎオリゴヌクレオチドを、終末オリゴヌクレオチドと呼び、該第Ｎオリゴヌクレオチドは第Ｎ接着塩基配列を有していなくても構わない。
即ち、本発明方法における複合検出オリゴヌクレオチドの一つの形態は、第１オリゴヌクレオチドから終末オリゴヌクレオチドまでが、接着塩基配列と相補接着塩基配列との相補的な結合により連結されたものである。尚、複合検出オリゴヌクレオチドが、第１オリゴヌクレオチドのみで形成されている場合は、上記に従い、その第１オリゴヌクレオチドは、接着塩基配列を有していなくても良く、更に、メチル化オリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５８】
接着塩基配列と相補接着塩基配列は、オリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）が相補的に結合しうる塩基配列であればよく、該オリゴヌクレオチドの末端に位置していてもよく、中間に位置していてもよい。
更に、第Ｎ接着塩基配列は、相補第Ｎ接着塩基配列以外の塩基配列と相補的な結合をせず、且つ、第Ｎ接着塩基配列は、相補第Ｎ接着塩基配列以外の、いずれの相補的な結合も阻害しないことを特徴とすることが望ましい。第Ｎ接着塩基配列は、相補第Ｎ接着塩基配列以外の、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチド、検体中に含まれる核酸、被検オリゴヌクレオチド及び特定オリゴヌクレオチドを含むその他のオリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な結合をしないことが望ましい。
【００５９】
本発明方法では、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドが相互に相補的に分岐して（直列以外で）結合（連結）しうる場合（「分岐型」と呼ぶこともある）、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）のうち、第Ｎオリゴヌクレオチド上に、複数の接着塩基配列が複数存在してもよい。例えば、第Ｎオリゴヌクレオチドに、接着塩基配列が、Ｍ個存在する場合には、夫々、第（Ｎ,１）接着塩基配列、第（Ｎ,２）接着塩基配列、第（Ｎ,３）接着塩基配列、・・・、第（Ｎ,（Ｍ−１））接着塩基配列、第（Ｎ,Ｍ）接着塩基配列、と呼び、その接着塩基配列に相補性によって結合するオリゴヌクレオチドを夫々第（（Ｎ＋１）,１）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１）,２）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１）,３）オリゴヌクレオチド、・・・、第（（Ｎ＋１）,（Ｎ−１））オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１）,Ｍ）オリゴヌクレオチド、と呼ぶ。この際例えば、第（（Ｎ＋２）,１）オリゴヌクレオチドが存在しない場合、第（（Ｎ＋１）,１）オリゴヌクレオチドは、終末オリゴヌクレオチドであり、第（（Ｎ＋１）,１）接着塩基配列は存在しなくともよい。
【００６０】
更に、同様に、第（Ｎ,１）オリゴヌクレオチド上に複数の接着塩基配列が存在する場合は、例えば第（Ｎ，１）オリゴヌクレオチドに、接着塩基配列がＬ個存在する場合には、夫々第（Ｎ,１,１）接着塩基配列、第（Ｎ,１,２）接着塩基配列、第（Ｎ,１,３）接着塩基配列、・・・、第（Ｎ,１,（Ｌ−１））接着塩基配列、第（Ｎ,１,Ｌ）接着塩基配列、と呼び、その接着塩基配列に相補性によって結合するオリゴヌクレオチドを夫々、第（（Ｎ＋１）,１,１）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１）,１,２）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１）,１,３）オリゴヌクレオチド、・・・、第（（Ｎ＋１）,１,（Ｌ−１））オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１）,１,Ｌ）オリゴヌクレオチド、と呼ぶ。この際、例えば、第（（Ｎ＋２）,１,１）オリゴヌクレオチドが存在しない場合、第（（Ｎ＋１）,１,１）オリゴヌクレオチドは、終末オリゴヌクレオチドであり、第（（Ｎ＋１）,１,１）接着塩基配列は存在しなくともよい。
【００６１】
尚、分岐型の複合オリゴヌクレドとは、複合検出オリゴヌクレオチドが分岐型であるだけでなく、第１オリゴヌクレオチドが数種類存在し、被検オリゴヌクレオチド上に複数の第１オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）が結合する場合も含むものである。この場合、被検オリゴヌクレオチド上にＭ個の第１オリゴヌクレオチドがある場合には、被検オリゴヌクレオチド上の第１連結配列、第２連結配列・・・・第Ｍ連結配列に対して相補的に結合しうる、第（１,１）接着配列、第（１,２）接着配列、第（１,３）接着配列・・・第（１、Ｍ）接着配列を有する、第（１,１）オリゴヌクレオチド、第（１,２）オリゴヌクレオチド、第（１,３）オリゴヌクレオチド・・・第（１、Ｍ）オリゴヌクレオチドであればよい。また、第１オリゴヌクレオチド上にＭ個の第２オリゴヌクレオチドがある場合には、第１オリゴヌクレオチド上の第１連結配列、第２連結配列・・・・第Ｍ連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（２,１）接着配列、第（２,２）接着配列、第（２,３）接着配列・・・第（２,Ｍ）接着配列を夫々有する、第（２,１）オリゴヌクレオチド、第（２,２）オリゴヌクレオチド、第（２,３）オリゴヌクレオチド・・・第（２、Ｍ）オリゴヌクレオチドであればよい。
さらに、第Ｎオリゴヌクレオチド上にＭ個の第Ｎ＋１オリゴヌクレオチドがある場合には、第Ｎオリゴヌクレオチド上の第１連結配列、第２連結配列・・・・第Ｍ連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（Ｎ＋１,１）接着配列、第（Ｎ＋１,２）接着配列、第（Ｎ＋１,３）接着配列・・・第（Ｎ＋１,Ｍ）接着配列を夫々有する、第（Ｎ＋１,１）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１,２）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１,３）オリゴヌクレオチド・・・第（Ｎ＋１、Ｍ）オリゴヌクレオチドであればよい。
なお、第（Ｎ,Ｍ）オリゴヌクレオチド上にＰ個の第Ｎ＋１オリゴヌクレオチドがある場合には、第（Ｎ,Ｍ）オリゴヌクレオチド上の第（Ｎ＋１,Ｍ,１）連結配列、第（Ｎ＋１,Ｍ,２）連結配列・・・・第（Ｎ＋１,Ｍ,Ｐ）連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（Ｎ＋１,Ｍ,１）接着配列、第（Ｎ＋１,Ｍ,２）接着配列、第（Ｎ＋１,Ｍ,３）接着配列・・・第（Ｎ＋１,Ｍ,Ｐ）接着配列を夫々有する、第（Ｎ＋１,Ｍ,１）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１,Ｍ,２）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１,Ｍ,３）オリゴヌクレオチド・・・第（Ｎ＋１,Ｍ,Ｐ）オリゴヌクレオチドであればよい。
さらに、第（Ｎ,Ｍ,・・・,Ｘ）オリゴヌクレオチド上にＰ個の第Ｎ＋１オリゴヌクレオチドがある場合には、第（Ｎ,Ｍ,・・・,Ｘ）オリゴヌクレオチド上の第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,１）連結配列、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,２）連結配列・・・・第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,Ｐ）連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,１）接着配列、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,２）接着配列、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,３）接着配列・・・第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,Ｐ）接着配列を夫々有する、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,１）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,２）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,３）オリゴヌクレオチド・・・第（Ｎ＋１,Ｍ, ・・・,Ｘ,Ｐ）オリゴヌクレオチドであればよい。
【００６２】
以上の如く、様々な組み合わせを行い複合検出オリゴヌクレオチドを高感度化することが可能であり、検出したい感度又は精度に応じ、各オリゴヌクレオチド、終末オリゴヌクレオチドの組み合わせを調整することができる。
尚、一つのオリゴヌクレオチド上に、複数の接着塩基配列が存在する場合、それら接着塩基配列は、同じでもよく、異なっていてもよい。具体的に例えば、前記第（Ｎ,１）接着塩基配列、第（Ｎ,２）接着塩基配列、第（Ｎ,３）接着塩基配列の塩基配列は、全て同じでもよいし、夫々異なる塩基配列であってもよい。連結接着配列と相補連結塩基配列、及び、接着塩基配列と連結塩基配列は互いに相補的に結合しうる塩基配列であればよく、具体的には、９０％以上の相同性を有していれば差し支えなく、通常５〜１００ｂｐ、望ましくは１０〜５０ｂｐであればよい。塩基配列は、ゲノムとの相補的な結合をしないように設計されることが望ましく、より望ましくは人工的に合成したＤＮＡが望ましい。設計された接着塩基配列と連結塩基配列等が、ゲノムとの相補的な結合をしないことを簡便に確認するためには、ＰｕｂＭｅＤ等の公的機関等のゲノムデータベースでＢｌａｓｔ検索を実施し、８０％以上の相同性を示す塩基配列がないことを確認すればよい。
【００６３】
即ち、「複合検出オリゴヌクレオチド」は、連結塩基配列と相補連結塩基配列との相補的な結合により被検オリゴヌクレオチドと連結され、検出複合体をを形成する。検出複合体は、一つの被検オリゴヌクレオチドに一つの検出オリゴヌクレオチドが結合したものであっても良く、或いは複数の複合検出オリゴヌクレオチドが結合したものであってもよい。複合検出オリゴヌクレオチドは、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドであってもよい。また、複数の複合検出オリゴヌクレオチドが、一つの被検オリゴヌクレオチドに結合する場合は、各々複合検出オリゴヌクレオチドは、同一の複合検出オリゴヌクレオチドであってもよく、異なる複合検出オリゴヌクレオチドであってもよい。また、被検オリゴヌクレオチド上の連結塩基配列は、数種類の連結塩基配列が各々一つずつであっても良く、一種類の連結塩基配列が複数あってもよい。
【００６４】
本発明の第一工程で取得される「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡであってもよい。被検オリゴヌクレオチドを、検体中から一本鎖ＤＮＡとして取得するための方法は何でもよい。具体的には、目的とするＤＮＡ領域が、ゲノムＤＮＡ水溶液（0.1pmol/10μl、ゲノムＤＮＡの場合、予め適切な制限酵素で処理し、ＤＮＡを断片化しておくことが望ましい。）或いは被検オリゴヌクレオチド水溶液（0.1pmol/10ul）に、最適な10×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を10μl加え 、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を100μLとして、95℃で10分間加熱し、4℃で急冷処理をすればよい。緩衝液を使用せずに滅菌超純水のみで100μLとして、95℃で10分間加熱し、4℃で急冷処理をしてもよい。また、目的とするＤＮＡ領域が、ウイルスゲノムＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）やＲＮＡから逆転写酵素で合成されたＤＮＡ等、検体中では一本鎖ＤＮＡ、又は、ＲＮＡとのハイブリッドで存在する可能性のあるＤＮＡの場合、同様に、緩衝液或いは滅菌超純水の溶液中で、95℃で10分間加熱し、4℃で急冷処理をすることが望ましい。
【００６５】
本発明方法において「該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する」とは、例えば、被検オリゴヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ水溶液（0.1pmol/10μl、ゲノムＤＮＡの場合、予め適切な制限酵素で処理し、ＤＮＡを断片化しておくことが望ましい。）或いは被検オリゴヌクレオチド水溶液（0.1pmol/10ul）に、被検オリゴヌクレオチドと相補性により結合する特定オリゴヌクレオチドとして0.02μMのビオチン化された特定オリゴヌクレオチドを5μL加え、被検オリゴヌクレオチドと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチド水溶液（0.02μM）を夫々5μL加え、更に100mMのＭｇＣｌ２を20μL、及び最適な10×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を10μl加え 、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を100μLとし、95℃で10分間加熱し、70℃で10分間保温の後、更に50℃で10分間保温してから、37℃で10分間冷却処理すればよい。
このようにして形成された被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を支持体であるアビジンプレートに移し、30分間、室温で静置することで、検出複合体を取得すればよい。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05%のTween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、２００μＬ/ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、アビジンプレートを支持体とした検出複合体を取得する。
【００６６】
第三工程は、第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する工程である。第三工程である「第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する」方法としては、具体的に例えば、前記検出オリゴヌクレオチドがメチル化オリゴヌクレオチドである場合、前記被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体が結合されたアビジンプレートに検出分子としてメチル化ＤＮＡ抗体を添加し、検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドに結合させる。その後、残溶液を除去し、洗浄バッファーを用いて洗浄を行い検出複合体を残す。より具体的に例えば、前記の方法具体例で得られた被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体が固定化されたプレートに、1μg/ｍLに調製したメチルシトシン抗体（1mg/mL）を、１００μＬ/ウェルの割合で添加し、1時間室温で静置する。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05%のTween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、２００μＬ/ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、検出複合体に結合したメチルシトシン抗体を残す。
他に具体的には例えば、メチル化ＤＮＡ抗体が結合している検出複合体に、メチル化ＤＮＡ抗体と結合するユーロピウム（以下、「Ｅｕ」と記載することもある）標識された抗体（二次抗体）を結合させ、Enhancement solution（Perkin Elmer社製）を添加後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定すればよい。Ｅｕ標識の代わりに、ＦＩＴＣ標識を用いることもできる。また、ＦＩＴＣ標識した抗体（二次抗体）は、更に、ＨＲＰ標識したＦＩＴＣ抗体を結合させ、ＨＲＰの酵素活性により検出することもできる。ＨＲＰの酵素活性を利用して検出する場合、基質（R&D社、#DY999）を添加して室温でインキュベーションした後、Stop solution (1M H2SO4: 50 μL/well) を添加して、吸光450 nm (Reference 650 nm) を測定すればよい。また、酵素サイクル法で検出可能な基質を結合した抗体を二次抗体としてもよい。
より具体的に例えば、前記の方法具体例で得られたメチル化ＤＮＡ抗体が結合している検出複合体（支持体は、アビジンプレート）に、0.25μg/ｍLに調製したマウス IgG抗体Eu-N1（Perkin Elmer社製）を、１００μＬ/ウェルの割合で添加し、1時間室温で静置後、残溶液を除去し、洗浄バッファー[例えば、0.05%のTween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、２００μＬ/ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返す。Enhancement solutionを200 μL/wellで添加し、攪拌してから45分間、室温でインキュベーションする。続いて、励起340nm / 蛍光612nmで測定（Lag Time 400msec, Integration 400msec）する。
また、前記の方法具体例で得られたメチル化ＤＮＡ抗体が結合している検出複合体（支持体は、アビジンプレート）に、2μg/ｍLに調製したFITCで標識したマウスIgG抗体（ヤギ）を、１００μＬ/ウェルの割合で添加し、1時間室温で静置後、残溶液を除去し、洗浄バッファー[例えば、0.05%のTween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、２００μＬ/ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返す。更に、ＦＩＴＣに対する二次抗体（例えば、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体：Jackson ImmunoResearch Laboratories社製）を１００μＬ/ウェルの割合でアビジンコートプレートに添加し室温でインキュベーションする。洗浄バッファー[例えば、0.05%のTween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、２００μＬ/ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返す。基質（R&D社、#DY999）を１００μＬ/ウェルの割合で添加し、10秒ほど攪拌する。室温でインキュベーションし、Stop solution (1M H2SO4: 50 μL/well) を添加し、10秒ほど攪拌する。30分以内に吸光450 nm (Reference 650 nm) を測定する（遮光が望ましい）。
【００６７】
本発明は、下記のような場面において利用すればよい。
例えば、癌等の診断においては、血液中の遊離ＤＮＡの定量により定期健康診断におけるスクリーニング検査として利用が可能である。また、感染症等の診断においては、疾患原因となる細菌、ウイルスのＤＮＡ、ＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡの定量又は検出により、感染症の原因菌や原因ウイルス、食中毒菌の簡易な特定方法の提供が可能となる。また、従来の技術では、これら血液中の遊離ＤＮＡや微生物由来のＤＮＡ或いはＲＮＡを鋳型として合成されるＤＮＡは、ＰＣＲ等を実施してＤＮＡを増幅した後に定量又は検出していた。しかし、本発明方法を用いることによりＰＣＲ等の煩雑な方法を行わずともＤＮＡの定量又は検出を可能にする。
【００６８】
血液、尿等の生体試料中に含まれるタンパク質や低分子生体物質の検出若しくは定量する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。当該免疫学的測定方法のうち、クロマトグラフィーを用いた所謂イムノクロマト法は操作が簡単であり、検定に要する時間も短いため、現在、例えば、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の多くの場面で広く利用されている。また、近年、標識されたＤＮＡ（遺伝子）をクロマトストリップ上で展開し、目的ＤＮＡ（遺伝子）を捕獲できるプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、目的ＤＮＡ（遺伝子）を検出する、所謂ハイブリッドクロマト法が利用されるようになってきた。この方法も操作が簡便であり、検定に要する時間も短いため、現在、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の場面で広く利用され始められている。本発明測定方法は、上記のイムノクロマト法とハイブリッドクロマト法とを混合した方法を概念的に可能としている。本発明測定方法では、複合体形成及び複合体取得に関して、その順序は特に限定されないため、種々の方法が可能である。具体的には例えば、以下のように実施すればよい。
例えば、第二工程終了直後の試料に、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドとビオチン化特定オリゴンクレオチドとを結合させて、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドの結合体が支持体に結合した検出複合体を形成させる。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記検出複合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域有するＤＮＡを検出若しくは定量できる。
目的とするＤＮＡ領域に複数の検出用塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列（目的とするＤＮＡ領域上の夫々異なる塩基配列と相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いる）を設定し、各目的とするＤＮＡ領域を順次検出若しくは定量することも可能であり、また、複数の目的とするＤＮＡ領域と検出複合体を形成できるように、ゲノム中の反復配列や重複遺伝子或いは複数の異なる遺伝子を同時に検出するような、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いても、検出感度を飛躍的に上げることができる。
また、複数の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが複数存在する場合、夫々の目的とするＤＮＡ領域を有する被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合する夫々の特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の形成が、他の、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの存在下でも形成可能であるならば、複数の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを同時に検出することも可能である。
【００６９】
また、検出オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドは、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する。（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号７で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号７で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【００７０】
また、例えば配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約２８０コピーあり、配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約２６０コピーあり、配列番号３で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約８２０コピーある。従って、夫々の塩基配列中に検出用接着配列と特定接着配列を設定できれば、ゲノムの中に一種類しかない配列に対して検出用接着配列と特定接着配列を設定する場合に比べると、ゲノムの検出感度を、理論上で２６０〜８２０倍上げることが可能となる。
【００７１】
検出オリゴヌクレオチド、ビオチン化特定オリゴヌクレオチド、及び、目的とするＤＮＡ領域或いは目的とするＲＮＡ領域から作成されたＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドとの結合体を支持体へ結合させて検出複合体を取得する過程を実施する方法としては、前記の方法に限定されるものではなく、免疫抗体法を用いる方法であれば何でもよい。例えば、ELISA法では、クロマトストリップ法と同様の原理を用いるため、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を形成させて支持体へ結合させる過程を記載の順番で実施することは可能である。
【００７２】
本発明方法の第一工程において、高濃度のナトリウム塩が存在する系により検体からＤＮＡを抽出することが好ましい。具体的には、本発明方法の第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液（例えば、緩衝液）中のナトリウム塩の濃度としては、少なくとも５０ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ以上を挙げることができる。より具体的には、５０ｍＭ以下１０００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下が挙げられる。また、ナトリウムイオンを含む塩であれば、ＮａＣｌ、ＮａＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４等を含むどのような塩でも構わないが、好ましくは、ＮａＣｌを挙げることができる。
【００７３】
本発明は、癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１〜１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法を含む。当該発明の好ましい態様としては、検体が哺乳動物由来の血清である発明、また更に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明を挙げることができる。これら発明を利用すれば、血液検査により、癌患者を簡便に特定することが可能となろう。
【００７４】
ここで「癌患者」とは、癌を発症した被験者を意味しており、癌としては、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌（肝細胞癌、胆管細胞癌）、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、結腸癌、肛門癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、前立腺癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣（睾丸）癌、上顎癌、舌癌、（上、中、下）咽頭癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病 、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、甲状腺癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌）等の、ヒトおよび哺乳類の臓器で発症する固形癌と、ヒトおよび哺乳類の血液で発症する非固形癌のいずれの癌も含むことを意味する。
【００７５】
このような本発明における、メチル化オリゴヌクレオチド等は、検出用キットの試薬として有用である。また、本発明方法の権利範囲は、該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットのような形態での使用も含むものである。
【実施例】
【００７６】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７７】
実施例１
【００７８】
クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のTEバッファー溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ： 500 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 50 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 5 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液D： 0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【００７９】
上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【００８０】
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Genbank Accession No. M80340に示される塩基番号１１４２-１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在し、これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号４で示される塩基配列からなる5'末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM1を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。
【００８１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ：5’- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACGTGAAGAATGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAATGAAATGAAGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACTATGTGAAAAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACACTCTGCAGGATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC -3’（配列番号１）
【００８２】
＜5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- GGCTCCTGAGGCTTCTGCAT -3’  （配列番号４）
【００８３】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ１：5’- TAAGCACTTCTCTGTATTGGATATNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号５）
【００８４】
前記で得たゲノムDNAの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol）を１０μLと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００ μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、本PCRチューブを95 ℃で10分間加熱し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50 ℃まで冷却し10分間保温し、更に37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【００８５】
得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップに移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4 7H2O、154 mM NaCl pH7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【００８６】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、０．５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【００８７】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、０．０５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【００８８】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した。
【００８９】
その結果を図１に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液Ａ（500ng）、溶液Ｂ（50ng）、及び溶液Ｃ（5ng）において、溶液Ｄ（0ng：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
【００９０】
本実験において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするDNA領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするDNA領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
【００９１】
実施例２
【００９２】
クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のTEバッファー溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ： 500 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 50 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 5 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液D： 0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【００９３】
上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【００９４】
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｙ、配列番号２、Genbank Accession No. M80340に示される塩基番号２６９２-２９５８に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在し、これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｙと相補性によって結合する配列番号６で示される塩基配列からなる5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ２を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｙを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｙと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM２を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。
【００９５】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ：5’- TAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAGCCGCTCAACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAAGGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAACGAGAACAAAGACACCACATACCAGAATCTCTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGGGAAATTTATAGCACTAAATGCCTACAAGAGAAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAAC -3’（配列番号２）
【００９６】
＜5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Ｂ２：5’- CCAGTAGTCATTCAGGAGCAG -3’  （配列番号６）
【００９７】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ２：5’- TGAGTGAGATTCTTAATCCTGAGNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号７）
【００９８】
前記で得たゲノムDNAの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol）を１０μLと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００ μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、本PCRチューブを95 ℃で10分間加熱し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50 ℃まで冷却し10分間保温し、更に37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【００９９】
得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップに移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4 7H2O、154 mM NaCl pH7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１００】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、０．５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１０１】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、０．０５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１０２】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した。
【０１０３】
その結果を図２に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液Ａ（500ng）、溶液Ｂ（50ng）、及び溶液Ｃ（5ng）において、溶液Ｄ（0ng：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
【０１０４】
本実験において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするDNA領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするDNA領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
【０１０５】
実施例３
【０１０６】
クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のTEバッファー溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ： 500 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 50 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 5 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液D： 0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０７】
上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１０８】
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Genbank Accession No. M80340に示される塩基番号１１４２-１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在し、これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号８で示される塩基配列からなる5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM1を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０１０９】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ：5’- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACGTGAAGAATGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAATGAAATGAAGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACTATGTGAAAAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACACTCTGCAGGATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC -3’（配列番号１）
【０１１０】
＜5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- TCAGGTACACCAATCAGACGTA -3’  （配列番号８）
【０１１１】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ１：5’- TAAGCACTTCTCTGTATTGGATATNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号５）
【０１１２】
前記で得たゲノムDNAの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol）を１０μLと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００ μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、本PCRチューブを95 ℃で10分間加熱し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50 ℃まで冷却し10分間保温し、更に37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０１１３】
得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップに移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4 7H2O、154 mM NaCl pH7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１１４】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、０．５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１１５】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、０．０５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１１６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した。
【０１１７】
その結果を図３に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液Ａ（500ng）、溶液Ｂ（50ng）、及び溶液Ｃ（5ng）において、溶液Ｄ（0ng：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
【０１１８】
本実験において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするDNA領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするDNA領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
【０１１９】
実施例４
【０１２０】
クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のTEバッファー溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ： 500 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 50 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 5 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液D： 0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１２１】
上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１２２】
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Genbank Accession No. M80340に示される塩基番号１１４２-１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在し、これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号８で示される塩基配列からなる5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM３を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０１２３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ：5’- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACGTGAAGAATGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAATGAAATGAAGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACTATGTGAAAAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACACTCTGCAGGATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC -3’（配列番号１）
【０１２４】
＜5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- TCAGGTACACCAATCAGACGTA -3’  （配列番号８）
【０１２５】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ３：5’- ATCGGCTCCTGAGGCTTCTGNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号９）
【０１２６】
前記で得たゲノムDNAの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol）を１０μLと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００ μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、本PCRチューブを95 ℃で10分間加熱し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50 ℃まで冷却し10分間保温し、更に37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０１２７】
得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップに移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4 7H2O、154 mM NaCl pH7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１２８】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、０．５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１２９】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、０．０５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１３０】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した。
【０１３１】
その結果を図４に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液Ａ（500ng）、溶液Ｂ（50ng）、及び溶液Ｃ（5ng）において、溶液Ｄ（0ng：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
【０１３２】
本実験において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするDNA領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするDNA領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
【０１３３】
実施例５
【０１３４】
クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のTEバッファー溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ： 500 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 50 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 5 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液D： 0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１３５】
上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１３６】
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Genbank Accession No. M80340に示される塩基番号１１４２-１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在し、これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号８で示される塩基配列からなる5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM1、及び目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM３を合成し、夫々の検出オリゴヌクレオチドの濃度が０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０１３７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ：5’- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACGTGAAGAATGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAATGAAATGAAGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACTATGTGAAAAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACACTCTGCAGGATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC -3’（配列番号１）
【０１３８】
＜5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- TCAGGTACACCAATCAGACGTA -3’  （配列番号８）
【０１３９】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ１：5’- TAAGCACTTCTCTGTATTGGATATNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号５）
【０１４０】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ３：5’- ATCGGCTCCTGAGGCTTCTGNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号９）
【０１４１】
上記で得た反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol）を１０μLと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００ μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、本PCRチューブを95 ℃で10分間加熱し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50 ℃まで冷却し10分間保温し、更に37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０１４２】
得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップに移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4 7H2O、154 mM NaCl pH7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１４３】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、０．５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１４４】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、０．０５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１４５】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した。
【０１４６】
その結果を図５に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液Ａ（500ng）、溶液Ｂ（50ng）、及び溶液Ｃ（5ng）において、溶液Ｄ（0ng：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
【０１４７】
本実験において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするDNA領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするDNA領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
【０１４８】
実施例６
【０１４９】
クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のTEバッファー溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ： 500 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 50 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 5 ng/20 μL TEバッファー溶液
溶液D： 0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１５０】
上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素MspIを４Ｕと、MspIに最適な１０ｘ緩衝液（100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、500mM NaCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１５１】
ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Z、配列番号３、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号１７８-２６２に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在し、これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性によって結合する配列番号１０で示される塩基配列からなる5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM４を合成し、０．２ pmoL/１０ μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０１５２】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ：5’- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3’（配列番号３）
【０１５３】
＜5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3’  （配列番号１０）
【０１５４】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
Ｍ４：5’- GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA -3’  （配列番号１１）
【０１５５】
上記で得た反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol）を１０μLと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００ μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、本PCRチューブを95 ℃で10分間加熱し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50 ℃まで冷却し10分間保温し、更に37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０１５６】
得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップに移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4 7H2O、154 mM NaCl pH7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１５７】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、０．５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１５８】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、０．０５μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１５９】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した。
【０１６０】
その結果を図６に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液Ａ（500ng）、溶液Ｂ（50ng）、及び溶液Ｃ（5ng）において、溶液Ｄ（0ng：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
【０１６１】
本実験において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするDNA領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするDNA領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
【０１６２】
実施例７
【０１６３】
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液とラット (Wistar Hannover) より採取した血清との混合液を以下のとおり夫々4連で調製した。
血清サンプルＡ： 100 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルＢ： 10 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルＣ： 1 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルD： 0 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL (ネガティブコントロール液)
【０１６４】
上記に調製した血清サンプルA〜Dについて、以下に示す処理1または処理2を夫々2連でおこなった。
処理1：
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
処理2：
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate (pH 7.9), 100 mM Mg(OAc)2, 5 mM DTT, 660 mM KOAc) 4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
【０１６５】
上記の処理1または処理2により調製した溶液を20 μLと、制限酵素MspIを4Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを夫々調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１６６】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号１０で示される塩基配列とからなる5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を合成し、当該合成物を含む0.2 pmoL/10 μLのTEバッファー溶液（特定オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
【０１６７】
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３）
【０１６８】
＜5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号１０）
【０１６９】
また目的とするDNA領域Zを検出するための、目的とするDNA領域Ｚと相補性により結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM1を合成し、0.2 pmol/10 μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０１７０】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
M1：5'- GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA -3'  （配列番号１１）
【０１７１】
上記で得た反応液を30 μLと、特定オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、検出オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（すなわち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０１７２】
得られた反応液100 μLをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドとからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１７３】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）溶液]を100 μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）] 200 μＬで3回洗浄した。
【０１７４】
その後、Eu-N1標識マウスIgG抗体 [Perkin Elmer社製、0.05 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] 200 μＬで3回洗浄した。
【０１７５】
Enhancement Solution (Perkin Elmer社製) を各ウェルに150 μLの割合で添加し、混合し、約5分間室温で振盪した。その後、励起340 nm／蛍光612 nmで蛍光を測定した。
【０１７６】
その結果を図７および図８に示した。処理1では、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (100 ng)、溶液B (10 ng)、および溶液C (1 ng) において、溶液D (0 ng：コントロール溶液) に比べて蛍光強度が濃度依存的に増加した (図７)。一方、処理2では、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (100 ng) において、溶液D (0 ng：コントロール溶液) に比べて蛍光強度が増加したが、溶液B (10 ng) および溶液C (1 ng) において、蛍光強度の増加は見られなかった。
【０１７７】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化オリゴヌクレオチドと、5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理2に比べて処理1では血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出された。
【０１７８】
実施例８
【０１７９】
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液とコージンバイオ社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)の混合液を以下のとおり夫々4連で調製した。
血清サンプルＡ： 10 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルＢ： 1 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルＣ： 0 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL (ネガティブコントロール液)
【０１８０】
上記に調製した血清サンプルA〜Cについて、以下に示す処理1または処理2を夫々2連でおこなった。
【０１８１】
処理1：
血清サンプル50 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)20 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、当該混合物を95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
処理2：
血清サンプル50 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)10 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、当該混合物を95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
【０１８２】
上記の処理1または処理2により調製した夫々の溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１８３】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号１０で示される塩基配列とからなる5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を合成し、当該合成物を含む0.2 pmoL/10 μLのTEバッファー溶液（特定オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
【０１８４】
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３）
【０１８５】
＜5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号１０）
【０１８６】
また目的とするDNA領域Zを検出するための、目的とするDNA領域Zと相補性により結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM1を合成し、0.2 pmol/10 μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０１８７】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
M1：5'- GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA -3'  （配列番号１１）
【０１８８】
上記で得た反応液を30 μLと、特定オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、検出オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（すなわち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、当該混合物を95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０１８９】
得られた反応液100 μLをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドとからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０１９０】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）溶液]を100 μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）] 200 μＬで3回洗浄した。
【０１９１】
その後、Eu-N1標識マウスIgG抗体 [Perkin Elmer社製、0.05 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、1時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] 200 μＬで3回洗浄した。
【０１９２】
Enhancement Solution (Perkin Elmer社製) を各ウェルに150 μLの割合で添加した後、混合し、約5分間室温で振盪した。その後、励起340 nm／蛍光612 nmで蛍光を測定した。
【０１９３】
その結果を図９および図１０に示した。処理1および処理2のいずれでも、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (10 ng) および溶液B (1 ng) において、溶液C (0 ng：コントロール溶液) に比べて蛍光強度が濃度依存的に増加した。
【０１９４】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化オリゴヌクレオチドと、5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理2に比べて処理1では血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出された。
【０１９５】
実施例９
【０１９６】
血清サンプルとして、以下に示すヒト血清を用いた。
コージンバイオ社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)
Lot No.:
N51438 (健常者)
N51439 (健常者)
N51441 (健常者)
ProMedDx社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)
Lot No.:
11171268 (健常者、56歳、男性)
11171292 (健常者、62歳、男性)
11171297 (健常者、67歳、男性)
11171314 (健常者、75歳、男性)
11171327 (健常者、70歳、男性)
11202510 (健常者、67歳、女性)
11202522 (健常者、64歳、女性)
11202527 (健常者、52歳、女性)
11202615 (健常者、75歳、女性)
11202618 (健常者、78歳、女性)
10958886 (健常者、56歳、男性)
10958979 (健常者、39歳、男性)
10958980 (健常者、45歳、男性)
10960268 (健常者、37歳、男性)
10960272 (健常者、50歳、男性)
10960276 (健常者、30歳、男性)
10960285 (健常者、39歳、男性)
11003457 (健常者、38歳、男性)
11003479 (健常者、51歳、男性)
11003480 (健常者、48歳、男性)
11324997 (健常者、59歳、男性)
11325001 (健常者、61歳、男性)
10325022 (健常者、61歳、男性)
11325032 (健常者、60歳、男性)
11325062 (健常者、69歳、男性)
10870623 (乳がん患者、33歳、女性)
10929521 (乳がん患者、55歳、女性)
10989644 (乳がん患者、45歳、女性)
11209430 (乳がん患者、80歳、女性)
10929514 (乳がん患者、57歳、女性)
10843055 (乳がん患者、59歳、女性)
10984680 (乳がん患者、64歳、女性)
11209428 (乳がん患者、55歳、女性)
10840414 (肺がん患者、54歳、女性)
10929506 (肺がん患者、55歳、男性)
11091955 (肺がん患者、76歳、女性)
11103346 (肺がん患者、66歳、女性)
11142322 (肺がん患者、62歳、女性)
11152564 (肺がん患者、67歳、男性)
11152571 (肺がん患者、67歳、男性)
11153198 (肺がん患者、69歳、女性)
11209435 (肺がん患者、61歳、男性)
11230621 (肺がん患者、71歳、女性)
11153192 (肺がん患者、59歳、男性)
10715942 (肺がん患者、64歳、男性)
10840422 (肺がん患者、78歳、女性)
10935547 (前立腺がん患者、83歳、男性)
11000243 (前立腺がん患者、78歳、男性)
11071226 (前立腺がん患者、84歳、男性)
【０１９７】
上記の血清サンプルについて、以下に示す処理をおこなった。
【０１９８】
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
【０１９９】
上記の処理により調製した夫々の溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０２００】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号１０で示される塩基配列とからなる5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を合成し、当該合成物を含む0.2 pmoL/10 μLのTEバッファー溶液（特定オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
【０２０１】
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３）
【０２０２】
＜5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号１０）
【０２０３】
また目的とするDNA領域Zを検出するための、目的とするDNA領域Zと相補性により結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が12箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドM1を合成し、0.2 pmol/10 μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０２０４】
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞  Nはメチル化シトシンを示す。
M1：5'- GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA -3'  （配列番号１１）
【０２０５】
上記で得た反応液を30 μLと、特定オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、検出オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするDNA領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（すなわち、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０２０６】
得られた反応液100 μLをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドとからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０２０７】
各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）溶液]を100 μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）] 200 μＬで3回洗浄した。
【０２０８】
その後、Eu-N1標識マウスIgG抗体 [Perkin Elmer社製、0.05 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] 200 μＬで3回洗浄した。
【０２０９】
Enhancement Solution (Perkin Elmer社製) を各ウェルに150 μLの割合で添加した後、混合し、約5分間室温で振盪した。その後、励起340 nm／蛍光612 nmで蛍光を測定した。
【０２１０】
上記の酵素処理（MspI処理）により得られた溶液中のDNAをリアルタイムPCRにより定量した。
【０２１１】
濃度測定用スタンダードサンプルとしてMspI処理ヒトゲノムDNA溶液を以下のとおり調製した。ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)の5 ng/μL TEバッファー溶液を調製し、この溶液を20 μLと、制限酵素MspIを２Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを夫々の処理について調製した。当該反応液を、37 ℃にて1時間インキュベーションした。得られた反応液について、TEバッファーによる希釈により、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 ng/5 μL溶液を調製した。
【０２１２】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３で示された塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を増幅してリアルタイムPCRで定量するためにフォワードプライマー (F) およびリバースプライマー (R) を設計した。
【０２１３】
＜目的とするDNA領域＞
Ｚ：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３）
【０２１４】
＜フォワードプライマー＞
F：5'- GGTGGCTCACGCCTGTAATC -3'  （配列番号１６）
【０２１５】
＜リバースプライマー＞
R：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号１７）
【０２１６】
PCRの反応液としては、鋳型とする上記に調製したMspI処理ヒトゲノムDNA溶液5 μまたは上記に調製した濃度測定用スタンダードサンプルと、配列番号１６および配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーの5 μＭ溶液をそれぞれ1.5 μＬと、SYBR（登録商標）Green I (Lonza社) を0.1x分と、each 2 mM dNTPを2.5 μLと、10xPCR緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2、0.01％ Gelatin) を2.5 μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ (AmpliTaq Gold, 5 U/μＬ, ABI社)を0.125 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25 μLとしたものを用いた。リアルタイムPCRは、Mx3005P (Stratagene社)を用いて実施した。当該反応液を、95 ℃にて10分間保温した後、95 ℃にて30秒間、61 ℃にて30秒間、72 ℃にて45秒間を１サイクルとして40サイクル繰り返すことにより、目的とするDNA領域を増幅した。当該リアルタイムPCRの結果により、血清サンプル中のDNAを定量した。
【０２１７】
その結果を図１１および図１２に示した。本手法による測定値と、リアルタイムPCRにより定量した値とを比較したところ、相関があることが示された（相関係数：R = 0.88）(図１１)。また、59歳以下のヒト血清サンプルについて定量した結果を、癌患者と健常者で比較したところ、癌患者では血清中DNA濃度が上昇していることが示された(図１２)。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明により、簡便に生物由来検体を検出する方法を提供することができる。また、被験者由来の検体（好ましくは血清）を用いて、当該検体での結果と健常者由来の検体での結果との比較に基づき癌患者由来の検体を選抜する方法等を提供することが可能となる。
［配列表フリーテキスト］  
配列番号１
目的とするＤＮＡ領域Ｘからなるオリゴヌクレオチド
配列番号２
目的とするＤＮＡ領域Ｙからなるオリゴヌクレオチド
配列番号３
目的とするＤＮＡ領域Ｚからなるオリゴヌクレオチド
配列番号４
実験のために設計された5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号５
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６
実験のために設計された5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号７
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８
実験のために設計された5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号９
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１０
実験のために設計された5’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号１１
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１４
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１５
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１６
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
【図１】
2010068800.tif 000003
【図２】
2010068800.tif 000004
【図３】
2010068800.tif 000005
【図４】
2010068800.tif 000006
【図５】
2010068800.tif 000007
【図６】
2010068800.tif 000008
【図７】
2010068800.tif 000009
【図８】
2010068800.tif 000010
【図９】
2010068800.tif 000011
【図１０】
2010068800.tif 000012
【図１１】
2010068800.tif 000013
【図１２】
2010068800.tif 000014
【配列表】
2010068800000001.app