(57)【要約】【課題】発光量のレンジが異なる被測定物を、一度に測定することが出来るマイクロアレイとそれを用いた測定方法を提供する。【解決手段】基板１上に、抗原又は抗体を定着した複数のスポット２がアレイ状に配列されてなる複数のアレイ領域３〜６と、これら複数のアレイ領域３〜６の外周を覆うように壁を形成する外枠７と、各アレイ領域３〜６の表面積が等しくなるように前記外枠７の内側に設けられ、高さが前記外枠７よりも低く形成された内枠８とでマイクロアレイを構成し、希釈倍率の異なる複数の希釈物溶液をそれぞれ複数のアレイ領域３〜６に内枠を乗り越えない量添加するようにした。【選択図】図１
2010236997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に、
抗原又は抗体を定着した複数のスポットがアレイ状に配列されてなる複数のアレイ領域と、
これら複数のアレイ領域の外周を覆うように壁を形成する外枠と、
各アレイ領域の表面積が等しくなるように前記外枠の内側に設けられ、高さが前記外枠よりも低く形成された内枠とで構成されたマイクロアレイ。
【請求項２】
複数のスポットは、それぞれ結合対象の異なる抗原又は抗体を固定化した請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
一つのアレイ領域の中に、発光量差が小さい複数のスポットを配置した請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
一つのアレイ領域の中に、発光量差が大きい複数のスポットを配置した請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
内枠は、撥水性材料を基板表面に塗布して形成する請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載されたマイクロアレイを用いて体液又は排泄物内の抗原又は抗体を測定する生体情報測定方法であって、
同一検体を希釈液と混合して希釈率の異なる複数の希釈物溶液を生成する工程と、
前記複数の希釈物溶液をそれぞれ複数のアレイ領域に内枠を乗り越えない量添加する工程と、
複数のスポットに固定化された抗原又は抗体と前記検体とを反応させる工程と、
前記複数のアレイ領域に前記内枠を乗り越えない量の洗浄剤を添加する工程と、
前記洗浄剤を用いて前記複数のアレイ領域をそれぞれ洗浄する工程と、
前記複数のアレイ領域に前記内枠の高さより高く外枠の高さよりも低く標識剤を添加する工程と、
前記複数のスポットに固定化された抗原又は抗体と前記検体との反応物と前記標識剤とを反応させる工程と、
前記複数のアレイ領域に前記内枠の高さより高く外枠の高さよりも低く洗浄剤を添加する工程と、
前記洗浄剤を用いて前記複数のアレイ領域を洗浄する工程と、
前記複数のアレイ領域に前記内枠の高さより高く外枠の高さよりも低く基質を添加する工程と、
全てのアレイ領域における前記抗原又は抗体及び前記検体及び前記標識剤との反応物と前記基質との反応により生じる発光を同時に測定する工程と、
測定した前記発光から前記検体の解析を行う工程からなる生体情報測定方法。
【請求項７】
前記解析を行う工程は、
第一に最も希釈率の低い検体が添加されたアレイ領域の発光を測定したデータを用いて解析を行い、
前記発光の輝度が飽和したスポットがある場合は、
次に２番目に希釈率が低いアレイ領域の発光を測定したデータの前記飽和したスポットに対応するスポットの情報を用いて解析を行う請求項４に記載の生体情報測定方法。
【請求項８】
複数のアレイ領域をそれぞれ洗浄する工程と標識剤を添加する工程の間に、内枠を取り除く工程を設けた請求項６または７に記載の生体情報測定方法。
【請求項９】
希釈物溶液を生成する工程において、
前記複数の希釈物溶液の希釈率が、検体中の測定対象物のうち、最も発光量が少ないスポットの発光を測定可能な希釈率になるように調製する請求項６から８のいずれか一項に記載の生体情報測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原又は抗体を測定するためのマイクロアレイと、このマイクロアレイを用いた生体情報測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは生体分子の解析に利用されている。その利用は、遺伝子の解析や遺伝子から発現したタンパク質の機能解析など多岐に渡っている。例えば、マイクロアレイを利用した遺伝子解析であれば、個々の細胞、組織あるいは個体での遺伝子の発現の様子を網羅的に解析することが可能である。
【０００３】
マイクロアレイはＤＮＡチップとも呼ばれる。ガラスやシリコン製の１×３インチ大の小基板上に、ナノリットル単位の遺伝子溶液の液滴を高密度に点着させてマイクロメートル単位の微小なスポットを形成することで、ガラスやシリコン製の基板上に遺伝子断片を固定化する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、プレート状基板に生体試料中の複数種の被測定物質の各々に対応した特異的認識部位が設けられた測定キットが開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献２】特開２００２−２２１５２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの技術を組み合わせれば、検体中の多項目の被測定物質を同時に測定するマイクロアレイを構成することは可能である。ところが、被測定物質の定性定量を発光量で測定する場合には、被測定物質間で発光量のレンジが異なると、一度に測定することが出来ないという課題があった。
【０００６】
そこで本発明は、被測定物質間で発光量のレンジが異なっても、一度に測定することが出来るようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そしてこの目的を達成するために、本発明のマイクロアレイは、基板上に、抗原又は抗体を定着した複数のスポットがアレイ状に配列されてなる複数のアレイ領域と、これら複数のアレイ領域の外周を覆うように壁を形成する外枠と、各アレイ領域の表面積が等しくなるように前記外枠の内側に設けられ、高さが前記外枠よりも低く形成された内枠とで構成されたことを特徴としたものである。
【０００８】
さらに本発明の生体情報測定方法は、マイクロアレイを用いて体液又は排泄物内の抗原又は抗体を測定する生体情報測定方法であって、同一検体を希釈液と混合して希釈率の異なる複数の希釈物溶液を生成する工程と、前記複数の希釈物溶液をそれぞれ複数のアレイ領域に内枠を乗り越えない量添加する工程と、複数のスポットに固定化された抗原又は抗体と前記検体とを反応させる工程と、前記複数のアレイ領域に前記内枠を乗り越えない量の洗浄剤を添加する工程と、前記洗浄剤を用いて前記複数のアレイ領域をそれぞれ洗浄する工程と、前記複数のアレイ領域に前記内枠の高さより高く外枠の高さよりも低く標識剤を添加する工程と、前記複数のスポットに固定化された抗原又は抗体と前記検体との反応物と前記標識剤とを反応させる工程と、前記複数のアレイ領域に前記内枠の高さより高く外枠の高さよりも低く洗浄剤を添加する工程と、前記洗浄剤を用いて前記複数のアレイ領域を洗浄する工程と、前記複数のアレイ領域に前記内枠の高さより高く外枠の高さよりも低く基質を添加する工程と、全てのアレイ領域における前記抗原又は抗体及び前記検体及び前記標識剤との反応物と前記基質との反応により生じる発光を同時に測定する工程と、測定した前記発光から前記検体の解析を行う工程からなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のマイクロアレイ及びこれを用いた生体情報測定方法は、基板上に、抗原又は抗体を定着した複数のスポットがアレイ状に配列されてなる複数のアレイ領域と、これら複数のアレイ領域の外周を覆うように壁を形成する外枠と、各アレイ領域の表面積が等しくなるように前記外枠の内側に設けられ、高さが前記外枠よりも低く形成された内枠とで構成されたマイクロアレイを用いて、同一検体を希釈液と混合して希釈率の異なる複数の希釈物溶液を生成する工程と、前記複数の希釈物溶液をそれぞれ複数のアレイ領域に内枠を乗り越えない量添加する工程と、複数のスポットに固定化された抗原又は抗体と前記検体とを反応させる工程と、前記複数のアレイ領域に前記内枠を乗り越えない量の洗浄剤を添加する工程と、前記洗浄剤を用いて前記複数のアレイ領域をそれぞれ洗浄する工程を含むので、被測定物質間で発光量のレンジが異なっても、一度に測定することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明のマイクロアレイ及びこれを用いた生体情報測定方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１１】
（実施の形態１）
まず図１を用いてマイクロアレイの構成について説明する。図１（ａ）は、マイクロアレイの斜視図を、図１（ｂ）は、マイクロアレイの上面図を示している。図１に示すようにマイクロアレイは、基板１上に、抗原又は抗体を定着した複数のスポット２がアレイ状に配列されてなる複数のアレイ領域３〜６と、これら複数のアレイ領域の外周を覆うように壁を形成する外枠７と、各アレイ領域の表面積が等しくなるように前記外枠７の内側に設けられ、高さが前記外枠よりも低く形成された内枠８とで構成されている。
【００１２】
本実施の形態では、複数のスポット２に固定化する抗原として、複数種のアレルゲン物質を固定化し、生体情報として、各アレルゲンに特異的に結合する人体の血液中のＩｇＥ抗体を定性定量する例を用いて説明する。
【００１３】
図２は、図１に示した複数のアレイ領域３〜６の各スポットへのアレルゲンのマッピングを示した例である。図２の例では、１６種類のアレルゲンＡ〜Ｐを各スポットに固定化している。これらのアレルゲンは、例えば、ダニ、スギ、ムギ等である。固定化する順は、アレルゲンと検体中のＩｇＥ抗体との反応性能が最も良く、高い発光量を示すものをスポット２ｍ〜２ｐに固定化し、この次に反応性能が良く、高い発光量を示すものをスポット２ｉ〜２Ｌに固定化し、比較的反応性能が悪く、低い発光量を示すものをスポット２ｅ〜２ｈに固定化し、反応性能が最も悪く、低い発光量を示すものをスポット２ａ〜２ｄに固定化する。
【００１４】
このように固定化したアレルゲンに対して、同じ希釈倍率の検体で測定を行った場合、スポット２ｍ〜２ｐにおいて、最も高い発光量が検出され、スポット２ｉ〜２Ｌ、スポット２ｅ〜２ｈ、スポット２ａ〜２ｄの順に発光量は低下していくことになる。しかしながら、後述するようにアレイ領域毎に異なる希釈倍率の検体を添加することにより、全てのアレイ領域において同程度の発光量に調整することが出来る。
【００１５】
外枠７及び内枠８は、反応液が外部に漏れ出すことが無く、抗原抗体反応、酵素反応及び発光反応に影響を示さないものであれば何でも利用可能であり、例えば、合成樹脂、ガラスや金属が利用でき、それらの表面に撥水処処理や親水処理を施した材質が利用できる。
【００１６】
内枠８で仕切られた各アレイ領域は、面積が等しくなるように規定される。これは、微小な検体量で攪拌操作を行った場合、面積の違いで攪拌ムラが発生し、結果的に測定値にバラツキをもたらす可能性がある。このような測定バラツキを回避するためである。
【００１７】
次に図３を用いて、上述したマイクロアレイを用いた生体情報測定方法について説明する。図３は本実施の形態における生体情報測定方法の処理手順を記載したフローチャートである。
【００１８】
まず、ステップＳ０１において、検体（生体から採取した血液）を希釈液で希釈したものを生成する。希釈液としては、抗原抗体反応、酵素反応及び発光反応に影響しない水溶液であれば何でも良く、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液、生理食塩水を用いる。そして、検体と希釈液の比を１：１にした希釈物Ａと、検体と希釈液の比を１：２にした希釈物Ｂと、検体と希釈液の比を１：３にした希釈物Ｃと、検体と希釈液の比を１：４にした希釈物Ｄを用意する。この時、希釈倍率は、希釈物Ａに対して、希釈物Ｂは２倍、希釈物Ｃは３倍、希釈物Ｄは４倍となる。
【００１９】
次に、ステップＳ０２において、ステップＳ０１で作成した希釈物Ａ〜Ｄをマイクロアレイ上に添加する。希釈物Ａをアレイ領域３、希釈物Ｂをアレイ領域４、希釈物Ｃをアレイ領域５、そして希釈物Ｄをアレイ領域６に添加する。この時、添加する各希釈物の量は同じにし、かつ、マイクロアレイの内枠８の高さを超えない量を添加する。内枠８を超える量を添加してしまうと、各アレイ領域での検体の希釈率が変わってしまうためである。
【００２０】
そして、ステップＳ０３で、各スポットに固定化したアレルゲンと希釈物を結合させる一次反応を実施する。この一次反応は一般的な抗原抗体反応を促す手段で行われる。
【００２１】
一次反応が終了すると、続いて、アレルゲンと反応しなかった検体を取り除くため、洗浄工程を実施する。ステップＳ０４は、洗浄剤を各アレイ領域に添加する工程である。この時も、ステップＳ０２と同じく、洗浄剤は、各アレイ領域を区分けする内枠８を乗り越えないように添加する。これは、洗浄剤が他のアレイ領域と混ざると、検体の希釈倍率が異なってしまう可能性があるためである。
【００２２】
そして、ステップＳ０５で各アレイ領域の洗浄を個別に行う。ここでの洗浄は、一般的な洗浄工程を用いる。これで、各スポットにアレルゲンとＩｇＥ抗体の結合物のみが残される。
【００２３】
次に、各スポットのアレルゲンとＩｇＥ抗体の結合物に標識を行う。標識には、ＩｇＥ抗体に結合する抗ＩｇＥ抗体と、この抗ＩｇＥ抗体に結合する標識酵素を用いる。
【００２４】
まず、ステップＳ０６で抗ＩｇＥ抗体と標識酵素を混合した標識剤を外枠７内に添加する。この時、全てのアレイ領域にこの標識剤が均等に添加されるように、内枠８の高さよりも高くなるように添加量を調整する。
【００２５】
そして、ステップＳ０７で、各スポットのアレルゲンとＩｇＥ抗体の結合物に、抗ＩｇＥ抗体と標識酵素を結合させる二次反応を実施する。この二次反応は、一次反応と同じく一般的な抗原抗体反応を促す手段と、抗体と酵素の結合反応を促す手段で行われる。
【００２６】
ここで、ステップＳ０６で添加する標識剤として、予め抗ＩｇＥ抗体と標識酵素を結合したものでも良いし、ＩｇＥ抗体に直接結合する標識酵素があれば、それのみを用いても良い。
【００２７】
二次反応が終わると、洗浄工程を実施する。ステップＳ０８で洗浄剤を添加する。この時は、ステップＳ０４の洗浄剤の添加とは異なり、全てのエリア領域に均等に洗浄剤が行き渡るように内枠８の高さよりも高くなるように添加量を調整する。
【００２８】
そして、ステップＳ０９で未反応物の洗浄を行う。この洗浄は、ステップＳ０５での洗浄工程と同じである。
【００２９】
その後、ステップＳ１０にて、標識酵素の発光を促す基質を添加する。
【００３０】
基質を添加し、標識酵素と基質が反応すると、標識酵素が発光を開始するので、例えばＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）カメラ等で全てのアレイ領域を画像撮影し、発光量を輝度値として測光する（ステップＳ１１）。
【００３１】
最後に、ステップＳ１２にて、撮影した画像を解析し、各スポットに対応する画素の輝度値の大きさから、発光量を推定し、これを検量線に当てはめることで、ＩｇＥ抗体の量を特定する。この時、エリア領域４〜６は、エリア領域３に比べて２〜４倍に希釈しているため、それぞれ、各スポットの輝度値を２〜４倍する。
【００３２】
なお、内枠８をマイクロアレイの基板１から取り外し可能な構成として、ステップＳ０５の洗浄工程が終了した後に、この内枠８を取り外すようにしても良い。
【００３３】
また、内枠８は、上述した合成樹脂、ガラスや金属を用いるのではなく、マイクロアレイの基板１上に直接撥水性試薬を塗布したものであっても良い。この撥水性材料の塗布幅と厚みを変えることで、各エリア領域に分注する各種溶液の量を選択可能とすることが出来る。
【００３４】
このようにすると、検出システムの測定レンジ幅自体が狭い場合や、固定化抗体または抗原との反応性が良いなどの理由により、検量線の傾きが良すぎて必要な測定レンジが広い場合でも測定することが可能となる。
【００３５】
以上のように、本実施の形態によれば、基板上に、抗原又は抗体を定着した複数のスポットがアレイ状に配列されてなる複数のアレイ領域と、これら複数のアレイ領域の外周を覆うように壁を形成する外枠と、各アレイ領域の表面積が等しくなるように前記外枠の内側に設けられ、高さが前記外枠よりも低く形成された内枠とで構成されたマイクロアレイを用いて、同一検体を希釈液と混合して希釈率の異なる複数の希釈物溶液を生成する工程と、前記複数の希釈物溶液をそれぞれ複数のアレイ領域に内枠を乗り越えない量添加する工程と、複数のスポットに固定化された抗原又は抗体と前記検体とを反応させる工程と、前記複数のアレイ領域に前記内枠を乗り越えない量の洗浄剤を添加する工程と、前記洗浄剤を用いて前記複数のアレイ領域をそれぞれ洗浄する工程を含むので、被測定物質間で発光量のレンジが異なっても、一度に測定することが出来る。
【００３６】
なお、各スポットへのアレルゲンのマッピングについては、上述したものとは別に、次のように配置しても良い。例えば、アレイ領域４のスポット２ｅに固定化したアレルゲンＥの検量線を予め求めた際に、この検量線の、検体量に比例する発光量の傾きが大きい時は、１つの希釈倍率では、発光量が測定レンジよりも大きい、または小さくなってしまい測定困難となる可能性もある。
【００３７】
そこで、このアレルゲンＥをスポット２ａ、スポット２ｉ及びスポット２ｍにも固定化し、測定の際には、アレイ領域のアレルゲンＥを固定化した全てのスポットの発光量を測光し、発光量が最も測定が安定するレンジに入っているものを選択して測定値とする。このためには、全てのアレイ領域における検量線の一部が重複するように、各アレイ領域に添加する検体の希釈倍率を調整する必要がある。
【００３８】
〔実施例１〕
上述したマイクロアレイの基板１の各スポット２にダニアレルゲンを固定化し、３通りの希釈倍率で検体を希釈した希釈物を用いて、モデル実験を行った。図４が、このモデル実験を行ったマイクロアレイの模式図を示したものである。このマイクロアレイは、基板９と３列に６個ずつ並んだスポット１０と、これら１列を一つのアレイ領域１１として、これら３つのアレイ領域１１〜１３を囲む外枠１４と内枠１５、１６で構成した。
【００３９】
基板１にはアレイ領域１１〜１３にニトロセルロース処理が行なわれた基板（ＧｅｎＴｅｌ社、 ＰＡＴＨ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｌｉｄｅ）を用いた。各スポット１０への塗布溶液中には、診断用ＡＬＧスクラッチエキス  ダニ（鳥居薬品株式会社）にグリセロール、ＢＳＡ及びＰＢＳを添加後、混合した。グリセロールは自身が持つ粘性のために塗布時のばらつきを抑制できるので、塗布時の再現性向上剤として添加した。ＢＳＡ及びＰＢＳは、ダニ  アレルゲンの溶液時の構造安定化剤として添加した。塗布用混合液は、グリセロール、ＢＳＡ及びＰＢＳを添加することで、診断用ＡＬＧスクラッチエキス  ダニが１５倍希釈されるように調整した。調整した塗布用混合液を、１スポットあたりの塗布量が３ｎＬになるように、ＭｉｃｒｏＣａｓｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて基板表面へ塗布を行なった。塗布サンプルは、濡らした布を敷いたタッパー中で、２５℃の下、１晩放置し固定化させた。
【００４０】
外枠１４は、市販品のＳｉｎｇｌｅ  Ｗｅｌｌ  Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）及びＣｈｉｐ  ＣｌｉｐＴＭ  Ｓｌｉｄｅ  Ｈｏｌｄｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用い、ゴムパッキンを要するＳｉｎｇｌｅ  Ｗｅｌｌ  Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒにスライドガラスの一辺を当てて、スライドガラスとともにＳｉｎｇｌｅ  Ｗｅｌｌ  Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＣｈａｍｂｅｒをＣｈｉｐ  ＣｌｉｐＴＭ  Ｓｌｉｄｅ  Ｈｏｌｄｅｒの溝の部分に押し込むことで作成した。
【００４１】
内枠１５、１６は、撥水性材料を基板１上に塗布することで形成した。具体的には、スーパー・パップペン  リキッドブロッカー（コスモバイオ株式会社）を基板１の表面上に塗布し、内枠１５、１６を形成した。内枠１５、１６として用いたリキッドブロッカー液を十分に乾燥させるために、室温で２時間乾燥させた。
【００４２】
次に、３％スキムミルクに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものをブロッキング剤として基板１上に添加した。ブロッキング剤の添加時には、内枠を飛び越え全てのアレイ領域１１〜１３にブロッキング剤が満たされるように５００μＬ添加した。ブロッキング処理は、振とう機で攪拌しながら、３０分行なった。このブロッキング剤は、スポット１０に固定化されたアレルゲンとは結合せず、むき出しの基板表面にのみ結合する高分子のものであるため、このブロッキングを行なうことで、検体中に含まれるタンパク質や核酸がスポット１０以外へ吸着し、この後の処理で悪影響を及ぼすことを抑制することができる。このようにして、マイクロアレイを作成した。
【００４３】
次に、このマイクロアレイを用いて測定を行った。まず、希釈物溶液を生成する工程を行った。希釈物溶液として、次のように濃度の異なる３つを準備した。１つ目は血清５μＬとＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ）を２５μＬとを混合したもの。
【００４４】
２つ目は、血清２μＬと１×ＰＢＳ３μＬとＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉを２５μＬとを混合したもの。３つ目は血清０．５μＬと１×ＰＢＳ４．５μＬとＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉを２５μＬとを混合したものである。Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉは、反応効率を高めるために添加した。
【００４５】
次に、希釈検体の添加と一次反応を行った。１つ目の希釈物溶液をアレイ領域１３に、２つ目の希釈物溶液をアレイ領域１２に、３つ目の希釈物溶液をアレイ領域１１に添加した。その後、振とう機で１時間の攪拌を行った。添加から一次反応にかけて内枠１５、１６を希釈物溶液が越えて混合していないことを確認した。
【００４６】
引き続き、洗浄剤の添加と洗浄を行った。各アレイ領域１１〜１３から希釈物溶液を除去した後に洗浄液を５０μＬずつ添加し、各アレイ領域１１〜１３内で別々に洗浄を行った。
【００４７】
次に、標識剤の添加と二次反応を実施した。本実施例では、先に抗体を添加して検体と反応させた後、標識酵素を添加して、先に添加した抗体と結合させるようにした。まず、抗体として、抗ＩｇＥ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社、Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ）を含むビオチン化した抗体溶液を添加した。この時、内枠１５、１６を超えて全てのアレイ領域１１〜１３に等しく抗体溶液が行き渡る様に、４５０μＬ添加した。その後、２５℃に保って、振とう機を用いて１時間攪拌しながら反応を促した。  そして、洗浄液を５００μＬ添加して、３回の洗浄を行った。
【００４８】
その後、標識酵素として、ルシフェラーゼ（キッコーマン社、Ｉｎｔｅｌｉｔｅ  ＡＢのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）を含むストレプトアビジン化した標識酵素溶液を添加した。抗体溶液と同様に４５０μＬ添加し、２５℃に保ったまま振とう機で１時間攪拌を行った。そして、洗浄液を５００μＬ添加して、３回の洗浄を行った。
【００４９】
その後、２次測光用の基質溶液と同じ組成で基質だけ除いた溶液を基板上に内枠を飛び越え外枠全面に満たされるように５００μＬ添加することでバッファ交換を１回行なった。ここで、バッファ交換とは、次の反応（発光反応）を行うときの効率の良いｐＨで反応を行うための下準備である。具体的な処理としては、発光基質のみを除いた試薬溶液で基板表面を洗浄することで、基板表面にそれまでの洗浄操作で存在していた化合物を、より効率の良い化合物に置き換える操作を実施する。
【００５０】
その後、基質添加と測光を実施した。基質を添加すると発光が始まるので、基質を添加する前にマイクロアレイをＣＣＤカメラと対向したステージに固定した。そして、基質溶液として、ルシフェリン溶液（キッコーマン社、Ｉｎｔｅｌｉｔｅ  ＡＢのＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を４５０μＬ添加した。添加開始と共にＣＣＤカメラでマイクロアレイを５分間撮影し、ＣＣＤカメラの各画素の輝度の５分間の積算値をマッピングした画像を生成した。
【００５１】
そして、画像解析の工程で、マイクロアレイの各スポットに対応する画素を特定し、その輝度値を測定値とした。
【００５２】
図５は、測光の工程で出力された、各画素の輝度の５分間の積算値をマッピングした画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白くなっている。図内の白い四角枠１７〜１９は、アレイ領域１１〜１３を視覚的に判別しやすいように画像に後付けしたものであり、実際の画像の輝度値を表した物ではない。四角枠１７がアレイ領域１１、四角枠１８がアレイ領域１２、四角枠１９がアレイ領域１３に対応している。
【００５３】
図５から明らかなように、検体量に比例して発光量が多いことが分かる。図６にこの発光量とＩｇＥ値の関係をプロットしたグラフを示す。本実施例で用いた血清は予めダニＩｇＥ抗体の割合が既知のものを用いたので、希釈倍率から実際のダニＩｇＥ抗体量は自明である。よって、横軸は希釈倍率ではなくダニＩｇＥ抗体量を示した。左から順にアレイ領域１１、アレイ領域１２、アレイ領域１３の輝度値の総和をプロットしており、この３点から、回帰法の決定係数Ｒ２が得られるが、これがＲ２＝０．９９８５であり、このことから、検体量に比例した発光量が得られていることが分かる。
【００５４】
〔実施例２〕
実施例１と同様の実験を行ったが、希釈物溶液を作成する際の添加物として、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉの代わりにＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加した。
【００５５】
この時の希釈物溶液の希釈度合いは次の通りである。１つ目の希釈物溶液は、血清２μＬとＴＢＳＴ２８μＬ。２つ目の希釈物溶液は、血清１μＬと１ＸＰＢＳ１μＬとＴＢＳＴ２８μＬ。３つ目の希釈物溶液は、血清０．５μＬと１ＸＰＢＳ１．５μＬとＴＢＳＴ２８μＬである。
【００５６】
図７に測定結果をプロットしたグラフを示す。図７のプロットは、左から３つ目の希釈物溶液を添加したアレイ領域、２つ目の希釈物溶液を添加したアレイ領域、１つ目の希釈物溶液を添加したアレイ領域の発光量となっている。実施例１で用いた血清と同じであり、ダニＩｇＥ抗体量を横軸に示した。この３点から、回帰法の決定係数Ｒ２が得られるが、これがＲ２＝０．９９９４であり、このことから、実施例１と同様に検体量に比例した発光量が得られていることが分かる。
【００５７】
但し、実施例１に比較して全体的に発光量が低い傾向がある。これは希釈物溶液に加えた、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ＩとＴＢＳＴとの違いによる検体の定着度の違いであると考えられる。このように、添加物によって発光量の相対値が変わる時には、本発明を用いれば、希釈倍率を変更することで、同じ測定レンジに収めることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明にかかるマイクロアレイ及びこれを用いた生体情報測定方法は、相対的な発光量の差から同じ測定レンジで測定するものが困難な測定対象物も同時に測定出来るようにしたので、さまざまな生体情報を同時に測定する装置等にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の実施の形態におけるマイクロアレイの構成を示す図
【図２】アレルゲンのマッピングを説明する図
【図３】生体情報測定方法のフローチャート
【図４】実施例１及び２におけるマイクロアレイの構成を示す図
【図５】実施例１における測光画像を示す図
【図６】実施例１における輝度値のグラフ
【図７】実施例２における輝度値のグラフ
【符号の説明】
【００６０】
１  基板
２  複数のスポット
３、４、５、６  アレイ領域
７  外枠
８  内枠
９  基板
１０  スポット
１１、１２、１３  アレイ領域
１４  外枠
１５、１６  内枠
１７、１８、１９  四角枠
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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