(57)【要約】【課題】臓器特異性と感度に優れる膵癌の診断方法を提供する。【解決手段】ヒト膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体または抗体断片を含む第１の認識物質を固定化した固定化担体に、被験体に由来する血液試料を接触させる第１の接触工程と、前記第１の接触工程後の固定化担体に、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質を接触させる第２の接触工程と、前記第２の接触工程後に、前記固定化担体上の第２の認識物質を検出する検出工程と、前記検出工程における第２の認識物質の検出レベルに基づいて、膵癌細胞の存在を判定する判定工程と、を含む膵癌の診断方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓リボヌクレアーゼ１を認識するモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２】
配列番号１のポリペプチドを抗原として得られる請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項３】
溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、かつ、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体または抗体断片。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６６のハイブリドーマまたは受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６７のハイブリドーマが、産生する抗体。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片と、被験体に由来する血液試料とを接触させる膵癌の診断方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含む第１の認識物質を固定化した固定化担体に、被験体に由来する血液試料を接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程後の固定化担体に、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質を接触させる第２の接触工程と、
前記第２の接触工程後に、前記固定化担体上の第２の認識物質を検出する検出工程と、
前記検出工程における第２の認識物質の検出レベルに基づいて、膵癌細胞の存在を判定する判定工程と、
を含む請求項５に記載の膵癌の診断方法。
【請求項７】
前記第２の認識物質は、フコースおよびシアル酸の少なくとも一方を認識するレクチンである請求項６に記載の膵癌の診断方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体および抗体断片の少なくとも１種を含む第１の認識物質と、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質とを含む膵癌の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵癌の診断方法および膵癌の診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓の疾患には、大きく分けて膵癌と膵炎とがあり、膵癌は、近年日本人の死亡率が上昇してきている癌の一つである。膵癌の診断のための血中腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、エラスターゼ１、Ｓｐａｎ−１、ＤＵＰＡＮ−２などがある（例えば、特許文献１参照）が、これらのマーカーでは膵癌のみならず、他の消化器癌や膵炎も検出されてしまう。
また、フコースなどの特定の糖を腫瘍マーカーとする癌の診断方法が知られている（例えば、特許文献２参照）が、臓器特異性が不十分で膵癌を特異的に検出することはできなかった。
【０００３】
膵臓リボヌクレアーゼ１は、膵臓が消化管に外分泌する糖タンパク質であり、一般的に健常人の血液中には膵臓リボヌクレアーゼ１は検出されない。しかし膵炎や膵癌等の病態においては、血液中に膵臓細胞由来のリボヌクレアーゼ１が検出されることを知られている。また健常人においても、血管内皮細胞などからリボヌクレアーゼ１が産生されていることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３２３４９９号公報
【特許文献２】特開２００４−０７３０１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、臓器特異性と感度に優れる膵癌の診断方法および膵癌の診断用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、血液試料中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識するモノクローナル抗体または抗体断片である。前記モノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号１のポリペプチドを抗原として得られることが好ましい。
また本発明の第２の態様は、溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、かつ、担上に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体または抗体断片である。
また本発明の第３の態様は、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６６のハイブリドーマ１-１Ｇまたは受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６７のハイブリドーマ１-２Ａが産生する抗体である。
【０００７】
本発明の第４の態様は、前記抗体または抗体断片と、被験体に由来する血液試料とを接触させる膵癌の診断方法である。前記膵癌の診断方法は、前記抗体または抗体断片を含む第１の認識物質を固定化した固定化担体に、被験体に由来する血液試料を接触させる第１の接触工程と、前記第１の接触工程後の固定化担体に、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質を接触させる第２の接触工程と、前記第２の接触工程後に、前記固定化担体上の第２の認識物質を検出する検出工程と、前記検出工程における第２の認識物質の検出レベルに基づいて、膵癌細胞の存在を判定する工程を含むことが好ましい。
前記第２の認識物質は、フコースおよびシアル酸の少なくとも一方を認識するレクチンであることが好ましい。
【０００８】
さらに本発明の第５の態様は、前記抗体および抗体断片の少なくとも１種を含む第１の認識物質と、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質とを含む膵癌の診断用キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、臓器特異性と感度に優れる膵癌の診断方法および膵癌の診断用キットを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、血液試料中の膵臓リボヌクレアーゼ１を特異的に認識する。前記膵臓リボヌクレアーゼ１はヒトに由来することが好ましい。また前記モノクローナル抗体または抗体断片は、下記表１に示した配列番号１のポリペプチドを認識することがより好ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、通常用いられる方法で調製することができる。例えば、膵癌細胞が産生する膵臓リボヌクレアーゼ１を抗原として用いて、常法により調製できる。また、膵癌細胞が産生する膵臓リボヌクレアーゼ１に代えて、下記配列番号１のポリペプチドを培養細胞に発現させて得られるヒト膵臓リボヌクレアーゼ１を抗原として用いて、上記と同様にして本発明のモノクローナル抗体を調製することができる。前記培養細胞は、大腸菌等の微生物であっても、動物由来の培養細胞であってもよい。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
また本発明の抗体断片は、膵臓リボヌクレアーゼ１を認識するモノクローナル抗体に由来し、前記膵臓リボヌクレアーゼ１を認識できるものであれば特に制限はない。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）およびジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）から選ばれる抗体断片のいずれであってもよい。
【００１３】
また本発明の抗体または抗体断片は、溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、かつ、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１は認識しないことを特徴とする。かかる抗体または抗体断片は、前記膵臓リボヌクレアーゼ１中の特定のエピトープを認識するものである。このように特定のエピトープのみを認識することで、血液試料中の膵臓リボヌクレアーゼ１を特異的かつ感度よく認識することができる。
【００１４】
溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、かつ、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１は認識しない抗体は、例えば、溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体を調製し、得られた抗体から、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体を選択することで調製することができる。
【００１５】
前記溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体は、上述のモノクローナル抗体と同様にして調製したモノクローナル抗体であっても、膵臓リボヌクレアーゼ１を抗原として用い、通常の方法で調製されるポリクローナル抗体であってもよい。本発明では特異性と感度の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
尚、抗体の調製に用いられる膵臓リボヌクレアーゼ１は、上記モノクローナル抗体の調製に用いることができる膵臓リボヌクレアーゼ１と同様の方法で調製することができる。
【００１６】
また、膵臓リボヌクレアーゼ１を固定化する担体としてはタンパク質を固定化できる担体であれば特に制限はなく、例えば、ポリ塩化ビニル樹脂、アクリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂等のプラスチック製の担体やガラス製の担体を挙げることができ、ポリ塩化ビニル樹脂製の担体であることが好ましい。
膵臓リボヌクレアーゼ１を担体に固定化する方法としては、通常用いられるタンパク質の固定化方法を特に制限なく適用することができる。例えば、膵臓リボヌクレアーゼ１を０．１〜１０ｍｇ/ｍｌの濃度でポリ塩化ビニル樹脂製のマイクロタイタープレートのウェルに０．０５〜０．１ｍｌずつ分注し、室温１時間〜１日、あるいは４℃で１時間〜１日放置して、その後、プレートの表面をブロックするために血清アルブミンを加えて処理する方法を適用することができる。
【００１７】
溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体から、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体を選択する方法は、通常用いられる抗体の選択方法を特に制限なく適用することができる。
例えば、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１に、溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体を反応させ、反応した抗体を標識した２次抗体等を用いて検出し、検出されなかった抗体を、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体として選抜する方法を挙げることができる。
【００１８】
また前記抗体断片は、溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体に由来するものであれば、特に制限はなく、前記モノクローナル抗体における抗体断片と同様のものを挙げることができる。
【００１９】
本発明の溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、かつ、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１は認識しない抗体としては、例えば、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６６（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、２００９年２月６日付で受領）のハイブリドーマ１−１Ｇにより産生される抗体、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６７（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、２００９年２月６日付で受領）のハイブリドーマ１−２Ａが産生する抗体等を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されない。
また、溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１および担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１の両方を認識する抗体としては、例えば、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６８（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、２００９年２月６日付で受領）のハイブリドーマ２−６Ｆを挙げることができる。
【００２０】
本発明の膵癌の診断方法は、上述した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体または抗体断片と、被験体に由来する血液試料とを接触させることを特徴とする。前記抗体または抗体断片を用いて血液試料中の前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を検出することで、特異的かつ高感度に膵癌を検出することができる。
【００２１】
本発明においては、膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体を少なくとも１種、好ましくは２種以上を同時に用いてもよい。この場合、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体（例えば、ハイブリドーマ１−１Ｇまたは１−２Ａが産生する抗体）を血液試料から膵臓リボヌクレアーゼ１を検出する抗体として用いることが、感度の観点から好ましい。
【００２２】
本発明の膵癌の診断方法は、膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体または抗体断片を含む第１の認識物質を固定化した固定化担体に、被験体に由来する血液試料を接触させる第１の接触工程と、前記第１の接触工程後の固定化担体に、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質を接触させる第２の接触工程と、前記第２の接触工程後に、前記固定化担体上の第２の認識物質を検出する検出工程と、前記検出工程における第２の認識物質の検出レベルに基づいて、膵癌細胞の存在を判定する判定工程と、を含んで構成されることが好ましい。
【００２３】
前記第１の接触工程においては、担体に固定化された第１の認識物質と被験体に由来する血液試料とを接触させる。
前記被験体としては特に制限はなく、霊長類などの哺乳類を用いることができる。中でもヒトを被験体とすることが好ましい。また血液試料としては、被験体から採取した血液そのものであっても、採取した血液に通常行われる遠心分離等の処理を行ったものであってもよい。
【００２４】
前記第１の認識物質は、膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体に由来する抗体または抗体断片を含み、担体に固定化可能であれば特に制限はない。本発明における膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体は、特異性と検出感度の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましく、前記ハイブリドーマ１−１Ｇ、前記ハイブリドーマ１−２Ａ、および前記ハイブリドーマ２−６Ｆのいずれかが産生する抗体であることが、より好ましい。
【００２５】
また、膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体は、特異性と検出感度の観点から、前記ハイブリドーマ１−１Ｇおよび前記ハイブリドーマ１−２Ａのように溶液中の膵臓リボヌクレアーゼ１を認識し、かつ、担体に固定化した膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体であることが好ましく、前記ハイブリドーマ１−１Ｇおよび前記ハイブリドーマ１−２Ａのいずれかが産生する抗体であることがより好ましい。
【００２６】
前記第１の認識物質が膵臓リボヌクレアーゼ１を認識することで、リボヌクレアーゼ１を分泌しない膵癌以外の癌と、膵癌とを感度よく識別することができる。
【００２７】
第１の認識物質を固定化する担体としては、通常の免疫化学的方法に用いられる担体を目的に応じて適宜選択して用いることができる。例えば、後述の検出工程を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等で行なう場合には、通常用いられるプレート等を用いることができる。また電気化学的方法で行なう場合には磁気ビーズ等を用いることができる。
第１の認識物質を担体に固定化する方法には通常の方法が用いられる。また担体の非特異的な結合を抑制するため、ＢＳＡ等のタンパク質や界面活性剤を用いてブロッキング操作を行なってもよい。
【００２８】
第１の認識物質と血液試料とを接触させる方法としては、第１の認識物質が固定化された固定化担体に血液試料を接触させて、インキュベーションする通常の方法を用いることができる。またインキュベーション後に洗浄等をさらに行なってもよい。
【００２９】
前記第２の接触工程では、前記第１の接触工程後の固体化担体に、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質を接触させる。第１の認識物質と第２の認識物質とを用いることで、特異的かつ高感度に前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を検出することができる。
【００３０】
前記第２の認識物質としては、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識することができ、前記第１の認識物質が認識する部位とは異なる部位を認識する物質であれば、特に制限はない。また第２の認識物質が認識する部位は、前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼの糖鎖部分であっても、タンパク質部分であってもよい。
【００３１】
本発明においては、癌特異性の観点から、第２の認識物質は糖鎖部分を認識する物質であることが好ましく、癌特異的な糖鎖部分を認識する物質であることがより好ましい。かかる態様であることで、第１の認識物質に結合した糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１の糖鎖部分のうち、癌細胞に由来する糖鎖部分をより高感度に検出することができる。また、膵癌細胞由来の膵臓リボヌクレアーゼ１は癌細胞特有の糖鎖構造を有している（例えば、Peracaula R et al., Glycobiol., Vol 13, pp.227-244, 2003、Barrabes S et al., Glycobiol., Vol17, pp.388-400 2007参照）。すなわち、第２の認識物質として癌特異的な糖鎖部分を認識する物質を用いることで、膵炎に由来するリボヌクレアーゼ１や血管内皮細胞等に由来するリボヌクレアーゼ１と、膵癌細胞に由来するリボヌクレアーゼ１とを感度よく識別することができる。
【００３２】
前記糖鎖部分を認識する物質としては、例えば、レクチン、抗体等を挙げることができる。
前記レクチンは、公知のレクチンの中から、必要に応じて適宜選択して用いることができる。中でも、特異性と感度の観点から、フコースおよびシアル酸の少なくとも一方を認識するレクチンであることが好ましい。具体的には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、コムギバクガレクチン（ＷＧＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、マッシュルームレクチン（ＡＢＡ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）を挙げることができ、中でも、ＡＡＬ、ＷＧＡ、ＡＢＡを用いることが好ましい。
また糖鎖部分を認識する抗体としては、例えば、ＣＡ１９−９抗体等を挙げることができる。
【００３３】
本発明において、第２の認識物質として糖鎖部分を認識する物質を用いる場合、検出感度の観点から、前記第１の認識物質は膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体の抗体断片であることが好ましく、膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ’）２断片から選ばれる抗体断片であることがより好ましい。
【００３４】
第１の接触工程後の固定化担体と第２の認識物質とを接触させる方法には通常の方法が適用できる。例えば、前記固定化担体に第２の認識物質を含む液体を付与してインキュベーションすることが挙げられる。また、インキュベーション後、遊離の第２の認識物質を除去するために、洗浄工程を設けてもよい。
【００３５】
前記検出工程における、前記第２の認識物質を検出方法には、特に制限なく、具体的には例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学的発光法、吸光度測定、蛍光抗体法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴等を挙げることができる。本発明においては、検出感度、特異性と簡便性の観点から、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることが好ましい。
【００３６】
本発明における酵素免疫測定法としては、公知の方法を特に制限なく用いることができる。具体的には例えば、第２の認識物質を標識化し、その標識を検出することで行うことができる。第２の認識物質の標識化には通常行なわれる方法が適用できる。例えば、第２の接触工程前に予め第２の認識物質を標識化しておいても、第２の接触工程後に標識化された第３の認識物質で第２の認識物質を標識化してもよい。
酵素免疫測定法における標識としては、物理的、化学的方法で定量可能な酵素であれば特に制限はない。例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ等の酵素を挙げることができる。また標識の検出方法は、標識に用いた酵素に応じて適宜選択して行うことができる。
【００３７】
本発明における判定工程は、第２の認識物質の検出レベルに基づいて膵癌細胞の存在を判定する。
前記第２の認識物質の検出レベルとしては、被験体に由来する血液試料中に含まれる膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１の濃度又はそれに対応する定量値又は半定量値であれば、特に制限なく用いることができる。標識物質に応じて例えば、吸光度、発光強度、蛍光強度、放射線計数等を挙げることができる。
【００３８】
本発明の判定工程は、被験体に由来する血液試料中の前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１の検出レベルと対照となる健常体に由来する血液試料中の前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１の検出レベルとを比較する工程と、前記被験体に由来する血液試料中の前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１の検出レベルが対照となる健常体に由来する血液試料中の前記糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１の検出レベルよりも大きい場合と膵癌細胞の存在とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。
【００３９】
ここで対照となる健常体とは、膵癌が存在しないことが予め判明している個体を意味する。また、検出レベルが大きいとは、例えば、対照となる健常体群に由来する血液試料群における前記特定ペプチドの検出レベルの平均値と標準偏差とを考慮して設定した正常検出レベル（カットオフ値）よりも、被験体に由来する前記特定ペプチドの検出レベルのほうが大きいことである。カットオフ値は、通常、健常体群の検出レベルの平均値に、標準偏差を２倍あるいは３倍した値を加算した値として定めることができる。
【００４０】
本発明の膵癌の診断用キットは、前記膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する抗体および抗体断片の少なくとも１種を含む第１の認識物質と、膵癌細胞由来の糖結合膵臓リボヌクレアーゼ１を認識する第２の認識物質とを含む。第１の認識物質と第２の認識物質とを用いて診断することにより、膵癌を特異的かつ高感度で検出することができる。
前記第１の認識物質および第２の認識物質は、前記膵癌の診断方法における第１の認識物質および第２の認識物質と同義であり、好ましい態様も同様である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００４２】
［ヒトリボヌクレアーゼ１の調製］
ヒト膵臓リボヌクレアーゼ１を、Biochem Biophys Res Commun. 1995 Nov 2;216(1):406-13.に記載の方法に準拠して調製した。
具体的には、配列番号１のヒト膵臓リボヌクレアーゼ１をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ３ａベクターに挿入し、このベクターで大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）/ｐＬｙｓＳを形質転換した。この形質転換した大腸菌をＬＢ培地（０．４％グルコース、０．０５ｍｇ/ｍｌアンピシリン、０．０１ｍｇ/ｍｌクロラムフェニコール添加）で培養し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside）で発現を誘導した。この大腸菌をオスモティックショックと凍結融解によって破砕し、遠心沈澱によって封入体を取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８Ｍ尿素、０．１Ｍメルカプトエタノール、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦに分散させた。遠心沈殿によって上清を得た。この上清をDEAE-Toyopearl 650MとCM-Toyopearl 650Mで精製して、リコンビナントのヒト膵臓リボヌクレアーゼ１を得た。
【００４３】
［抗ヒトリボヌクレアーゼ１モノクローナル抗体の調製］
上記で調製したヒトリボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ１）がＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸ナトリウム＋０．１４Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に２ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液とフロイント完全アジュバントを１:１（ｖ／ｖ）で混合し、超音波によって油中水型エマルションを形成させた。これをＢＡＬＢ／ｃオスマウス（６週齢）に５０μＬ／匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。
１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ１のＰＢＳ溶液（以下、「ＲＮａｓｅ１（ｉｎ  ＰＢＳ）」ということがある）とフロント不完全アジュバントを１:１（ｖ／ｖ）で混合し、エマルションを形成させた。５０μＬ／匹を腹腔内投与して、２次免疫を７日から１０日後に、その後７日間間隔で３〜４次免疫を行なった。
大腸菌リコンビナントＲＮａｓｅ１を固相化したマイクロタイタープレートを用いて、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、抗血清の抗体価を測定し、１万倍希釈まで陽性となったマウスをに最終免疫を行い、ついで細胞融合に用いた。
最終免疫は、０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ１（ｉｎ  ＰＢＳ）を１００μ Ｌ／匹を尾静脈から投与しておこなった。
【００４４】
最終免疫の３日後、マウスを心臓穿刺により採血（下記のように保存）した後、頚椎脱臼により殺し脾臓を摘出した。脾臓を破砕して無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、５９μｍメッシュに通した。Ficoll-paqueの入ったコニカルチューブに脾細胞懸濁液を静かに重層し、２０℃にて１５００ｒｐｍ、３０分間遠心した。界面部分にある細胞（脾リンパ球）を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して脾臓リンパ球細胞液を調製した。
得られた脾リンパ球４×１０６ｃｅｌｌｓを、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）細胞８×１０６ｃｅｌｌｓと、混合し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。培地を完全に除き、ペレットを崩した後、３５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ１０００溶液ｉｎ ７．５％ ＤＭＳＯを添加した無血清ＲＰＭＩ１６４０培地０．５ｍＬを加え１分間混ぜた。無血清ＲＰＭＩ１６４０培地１．５ｍＬを更に加え、ＨＡＴ培地（１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン in ＧＩＴ培地）４ｍＬをゆっくりと加え２分間混ぜた。これを２回繰り返した。ＨＡＴ培地１０ｍＬをゆっくりと加え混ぜた後、37℃の恒温槽で1時間インキュベートした。ＨＡＴ培地２０ｍＬと３ｎｇ／μＬ ＩＬ−６ １３．３μＬ（終濃度 １ｎｇ／ｍＬ）を加え、９６穴プレート２００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
約1週間後に培地を徐々にＨＡＴからＨＴに交換した。ハイブリドーマが十分に成育した時点で、その培養上清を取り出し、ＥＬＩＳＡ法によって選択的な抗体の有無をスクリーニングして、抗体を産生しているハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングした。これにより、ハイブリドーマ１−１Ｇ、１−２Ａ、２−１Ｇ、２−３Ｇ、２−６Ｆ、２−９Ｅを得た。
得られたハイブリドーマが産生する抗ヒトリボヌクレーゼ１抗体（ｉｎ ＰＢＳ）を常法により調製した。また免疫沈降によって、得られた抗体がすべてヒトリボヌクレアーゼ１を認識することを確認した。
【００４５】
（ＲＮａｓｅ１固定化プレートの作製）
リコンビナントのヒトＲＮａｓｅ１を１μｇ／ｍｌの濃度でポリ塩化ビニルのマイクロタイタープレート（ＢＤ ファルコン社製、ＲＥＦ３４３９１２）に入れて、４℃で一昼夜放置した。その後、ウシ血清アルブミンを加えてブロッキング処理し、ヒトＲＮａｓｅ１を固定化したプレートを作製した。
【００４６】
（クローンの選抜）
上記で得られた抗ヒトリボヌクレアーゼ１抗体と、作製したＲＮａｓｅ１固定化プレートとを用いて、ＥＬＩＳＡ法によりクローンの選抜を行なった。ＥＬＩＳＡ法の結果を表２に示した。ＥＬＩＳＡ法の結果から、固定化したヒトＲＮａｓｅ１を認識する抗体を産生するクローンとして２−１Ｇ、２−３Ｇ、２−６Ｆ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６８）と、固定化したヒトＲＮａｓｅ１を認識しない抗体を産生するクローンとして１−１Ｇ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６６）、１−２Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７６７）を得た。
【００４７】
【表２】
2010180174.tif 000003
【００４８】
この結果から、クローン２−１Ｇ、２−３Ｇおよび２−６Ｆが産生する抗体は、免疫血清と同じように１０から１００ｎｇ／ｍＬの低濃度でも抗原との反応が観察された。一方、クローン１−１Ｇと１−２Ａは非免疫血清と変わらない反応性を示した。すなわち、１−１Ｇと１−２Ａは、ＲＮａｓｅ１固定化プレートとを用いたＥＬＩＳＡ法では反応しなかった。
【００４９】
［サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＲＮａｓｅ１の検出］
フレキシブルアッセイプレート（ＢＤ ファルコン社製、ＲＥＦ３４３９１２）のウェルに、ハイブリドーマ１−１Ｇが産生した抗体（ｉｎ ＰＢＳ）（以下、「１-１Ｇ抗体」という）を１μｇ/ｍＬまたは１０μｇ/ｍＬ添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）１５０μＬでブロッキングして１−１Ｇ抗体を固定化した。
ここに、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ１遺伝子を導入してトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清をＰＢＳで、３倍、９倍、２７倍、８１倍に希釈して添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、検出抗体として、２-６Ｆ抗体を常法によりビオチン化したビオチン化２-６Ｆ抗体（in ０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）を１μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、セイヨウワサビ・パーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）標識ストレプトアビジンを５ｎｇ/ｍＬとなるように添加し、室温で２時間さらにインキュベートし、ＰＢＳＴ洗浄した。４０ｍｇ/ｍＬ ＯＰＤ（o-phenylene diamine）+８０００倍希釈Ｈ２Ｏ２ in ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０）を測定した。
上記ＥＬＩＳＡにおいて、１−１Ｇ抗体の代わりに２−６Ｆ抗体を、２−６Ｆ抗体の代わりに１−１Ｇ抗体を用いた以外は同様にしてＥＬＩＳＡを実施した。結果を表３に示す。表の値はＯ．Ｄ．４５０の値である。
【００５０】
【表３】
2010180174.tif 000004
【００５１】
表３から、固定化したヒト膵臓リボヌクレアーゼ１を認識しない抗体（１−１Ｇ抗体）を固定化抗体として用いることで、より高感度にヒト膵臓リボヌクレアーゼ１を検出できることが分かる。
【００５２】
［各種細胞の培養上清からのリボヌクレアーゼ１の検出］
上記「サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＲＮａｓｅ１の検出」において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清の代わりに、膵癌細胞株Ｃａｐａｎ−１、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株ＨＵＶＥＣ、胃癌細胞株ＭＫＮ７およびＭＫＮ４５、肺癌細胞株ＥＢＣ−１、ならびにヒト胎児繊維芽細胞ＨＥＦの培養上清をそれぞれ用い、希釈倍率を、３倍、９倍、２７倍、８１倍に変更した以外は、上記と同様にしてＥＬＩＳＡを実施した。結果を表４に示した。
【００５３】
【表４】
2010180174.tif 000005
【００５４】
表４から、膵癌細胞株Ｃａｐａｎ−１、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株ＨＵＶＥＣにおいてヒトリボヌクレアーゼ１が検出されたのに対して、他の癌細胞株の培養上清からはヒトリボヌクレアーゼ１が検出されなかった。すなわち細胞培養上清によって、膵癌細胞と他の癌細胞とを識別できることが分かる。
【００５５】
［膵癌細胞由来のリボヌクレアーゼ１の検出］
フレキシブルアッセイプレート（ＢＤ ファルコン社製、ＲＥＦ３４３９１２）のウェルに抗ＲＮａｓｅ１抗体  １-１Ｇ のＦ（ａｂ’）２断片  in ＰＢＳを１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２時間インキュベートした。０．１％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳを８０μＬ/ｗｅｌｌ加え、４℃一晩放置して、ブロッキングした。
ＨＰＢＳＴ（２％（Ｖ/Ｖ）Hanks’ Balanced Salt Solution Mg2+(+) Ca2+(+) + 0.05% Ｔｗｅｅｎ２０ in PBS）を１５０μＬ／ｗｅｌｌ加えて洗浄した。
Ｃａｐａｎ−１細胞培養上清をＨＰＢＳＴで３倍、９倍、２７倍、８１倍と希釈し、８０μＬ／ｗｅｌｌ加えて、室温で２時間インキュベートした。
ＨＰＢＳＴで洗浄後、ビオチン化した各種レクチンまたは抗ＲＮａｓｅ１抗体２−６Ｆ ｉｎ ＨＰＢＳＴを１μｇ／ｍＬ添加して、さらに室温で２時間インキュベートした後、ＨＰＢＳＴで洗浄した。
セイヨウワサビ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジンin ＨＰＢＳＴを５ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で１時間インキュベート後、ＨＰＢＳＴで洗浄した。４ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ（o-phenylene diamine）in ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）＋８０００倍希釈のＨ２Ｏ２を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて発色させ、マイクロプレートリーダーでＯ．Ｄ．４５０を測定した。結果を表５に示した。
また、上記において、Ｃａｐａｎ−１細胞培養上清の代わりに、ＨＵＶＥＣ細胞培養上清を用いた以外は上記と同様にしてＯ．Ｄ．４５０を測定した。
尚、陰性コントロールは、培養上清を添加しないＨＰＢＳＴのみとした。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
表５から、第２の認識物質としてレクチンを用いることで、膵癌細胞株Ｃａｐａｎ−１の細胞培養上清中のヒト膵臓リボヌクレアーゼ１が高感度に検出できたことが分かる。一方、内皮細胞株ＨＵＶＥＣの細胞培養上清中のリボヌクレアーゼ１は検出されなかった。すなわち、膵癌細胞に由来するヒト膵臓リボヌクレアーゼ１と、他の細胞に由来するリボヌクレアーゼ１とを感度よく識別できることが分かる。
【００５８】
以上から、本発明によって、臓器特異性と感度に優れる膵癌の診断方法が提供できることが分かる。
【配列表】
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