(57)【要約】【課題】ヌクレオシドアナログを、ＨＩＶ  ＲＴによって取り込まれそして不正確な塩基対合を引き起こす能力についてスクリーニングすることに関連した種々の方法、およびそのようなアナログの使用を提供すること【解決手段】ＨＩＶに関係する方法および組成物を開示する。本発明の方法を使用して、ヌクレオシドアナログを、ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（「ＨＩＶＲＴ」）によって取り込まれる能力および不正確な塩基対合を引き起こす能力についてスクリーニングし得る。このようなヌクレオシドアナログによるこのウイルスの進行性変異は、ウイルスを生存不能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的には、ＨＩＶ感染個体の治療のためのヌクレオシドアナログを同定するためのアッセイに関する。本発明は、より具体的には、候補のヌクレオシドアナログを、ＨＩＶ逆転写酵素によって取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こす能力についてスクリーニングすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
致死的なヒト疾患である後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）は、一般的に、人類を冒すより深刻な疾患の一つであると考えられ、そして世界中で多くの個体を冒している。この疾患は、アフリカに起源を発し、次いで他の場所（例えば、ヨーロッパ、ハイチおよび米国）に広がったようである。ＡＩＤＳは、１９７０年代中頃に別個の新たな疾患として認識され始めた。米国だけで、報告された症例の数は、１００，０００を超える。感染している人の数は、米国だけで１００万人を超えると推定されている。
【０００３】
患者に対するＡＩＤＳの壊滅的な影響、およびこの疾患が広がっている徴候のために、この疾患の原因を解明および同定する多くの努力がなされてきた。疫学的データは、ＡＩＤＳが、血液または血液製剤への暴露により伝染する病原体によって引き起こされることを示唆した。最も高い危険性でＡＩＤＳに接触すると報告されているグループには、同性愛または両性愛の男性および静脈内薬物常用者が含まれる。何回も輸血をしたドナーおよびレシピエントからプールされた血液製剤を投与される血友病患者もまた、危険である。
【０００４】
ＡＩＤＳは、身体の免疫系を損ない、犠牲者を日和見性感染、悪性腫瘍または（正常な免疫系であれば保護できる）他の病的状態に罹患し易い状態にする疾患である。患者がＡＩＤＳの症状を発現した後、一般には、診断の２〜３年以内に死が訪れる。この疾患の最終段階の臨床的徴候には、カポジ肉腫の出現および／または種々の日和見性感染を伴う、患者の免疫防御の崩壊（これには、一般的には、ヘルパーＴ細胞の涸渇が含まれる）が含まれる。ＡＩＤＳ患者に生じる細胞性免疫の顕著な抑制およびＴリンパ球のサブ集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の量的な改変は、Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットがこの病原体の中心標的であることを示唆する。
【０００５】
ＡＩＤＳおよび関連疾患の病因は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；以前にはＨＴＬＶまたはＬＡＶとして知られていた）と名付けられた新たなクラスのリンパ栄養性レトロウイルスによる感染に関連すると同定された。このウイルスは、感染個体由来の体液（例えば、精液、膣液または血液）が非感染者に受け取られた場合に、広がるようである。上記のように、ＡＩＤＳは、損傷した細胞性免疫およびリンパ球減少症、特に、Ｔ４（ＣＤ４）糖タンパク質を発現するＴ細胞の涸渇に関連した疾患によって特徴づけられる。このことは、ＨＩＶがＣＤ４リンパ球集団（ＣＤ４細胞）に優先的に感染するという事実による。感染し易い標的細胞へのウイルスの結合と、ＨＩＶ誘導細胞病理の特徴的徴候である細胞融合とは、両方とも、ウイルスのエンベロープ中の糖タンパク質とＣＤ４細胞の細胞表面との間の特異的な相互作用を含む。
【０００６】
ＨＩＶは、２つの高度にグリコシル化された外部エンベロープタンパク質であるｇｐ１２０およびｇｐ４１を含む。これらは、ビリオンのグリコシル化された細胞表面レセプター分子への付着を仲介する。これらの糖タンパク質は、ｅｎｖ遺伝子によってコードされ、そして前駆体ｇｐ１６０として翻訳される。このｇｐ１６０が、続いてｇｐ１２０とｇｐ４１とに切断される。ｇｐ１２０は、ヘルパーＴリンパ球、マクロファージ、および他の細胞の表面に存在するＣＤ４タンパク質と結合し、従ってウイルス感染の組織特異性を決定する。
【０００７】
ＣＤ４タンパク質は、約６０，０００の分子量の糖タンパク質であり、そして成熟胸腺由来（Ｔ）リンパ球の細胞膜上で、およびより低い程度ではあるが単球／マクロファージ系統の細胞上で発現される。ＣＤ４細胞は、通常、活性化シグナルをＢ細胞に提供すること、相互（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）ＣＤ８マーカーを有するＴリンパ球を細胞傷害性／サプレッサー細胞になるよう誘導すること、および／または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスII分子を有する標的と相互作用することによって機能するようである。ＣＤ４糖タンパク質は、細胞性免疫を仲介することにおいて重要な役割を演じることに加えて、ＨＩＶのレセプターとしても働く。種々の提案された治療アプローチは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＴ細胞ＣＤ４との相互作用を混乱させる試みに基づいている。
【０００８】
一旦、ＨＩＶが細胞に感染すると、ＨＩＶは複製してウイルスのコピー数を増加させる。ＨＩＶゲノムの複製は、一連の酵素反応によって進行する。この一連の酵素反応には、２つのウイルスにコードされる酵素である逆転写酵素（「ＨＩＶ  ＲＴ」）およびインテグラーゼ、ならびに宿主細胞にコードされるＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＨＩＶ  ＲＴは、ウイルスＲＮＡをテンプレートとして使用することによって、デオキシリボヌクレオチドを重合し、そしてまた、新たに合成されたマイナス鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用して二本鎖ＤＮＡを作製することによって、ＤＮＡポリメラーゼとして作用する。より具体的には、ＨＩＶ  ＲＴは、ウイルスＲＮＡをコピーしてＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを生成する。ハイブリッドのＲＮＡ鎖は分解し、次いでウイルスのポリメラーゼは、得られた一本鎖ＤＮＡをコピーして二本鎖ＤＮＡを生成する。二本鎖ＤＮＡは宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。
【０００９】
ウイルスによる宿主生物の侵襲におけるＨＩＶ  ＲＴの基本的な役割のために、治療アプローチは、ＨＩＶ  ＲＴを阻害する試み、またはウイルスＤＮＡの合成を終結させるヌクレオシドアナログを取り込む試みに基づいている。最も一般的に使用されるＨＩＶ  ＲＴに対する薬物は、鎖終結剤である。これらの分子は、おそらく、ＨＩＶ  ＲＴによってポリヌクレオチド鎖中に取り込まれるが、続くヌクレオチドの付加工程で伸長され得ない。例えば、アジドチミジン（「ＡＺＴ」）は、ＡＩＤＳの処置のために最も一般的に使用される薬物の一つであり、ＨＩＶ  ＲＴに対して指向する。しかし、ＨＩＶ  ＲＴのこれらインヒビターでさえ、ＨＩＶの広い遺伝子変化および高い変異速度のために、成功が制限されている。従って、ＨＩＶの迅速な進化によって、ＨＩＶ  ＲＴの変異が感染個体において頻繁に生じ、そしてこのウイルスをＨＩＶ  ＲＴインヒビターに対して抵抗性とする。このことは、従来の処置の重大な欠点である。
【００１０】
ＡＺＴのような２〜３の薬物が、いくつかのＡＩＤＳ感染個体の生命を延長するが、現在、ＡＩＤＳのための治療法は存在しない。治療剤は、ＡＩＤＳ感染のすべての段階について、一旦感染が起こると、このウイルスの作用をブロックするため、および免疫系が損傷された患者において完全な機能を回復させるために必要とされている。ＡＩＤＳの治療に関して以前に示唆された組成物についての成功が制限されているために、当該分野において、新たな治療法、および新たな治療法において有用であり得る薬物をスクリーニングするための方法に関しての必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、さらに他の関連の利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ  ＲＴ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＨＩＶ  ＲＴによるヌクレオシドアナログの取り込みおよび伸長を測定する工程；および
（ｂ）該アナログの変異原性能力を試験する工程、
を包含する、方法。
（項目２）ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ  ＲＴ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法であって：
（ａ）複数のヌクレオシドアナログをＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験する工程；
（ｂ）該アナログを精製して複数の精製アナログを生成する工程；
（ｃ）ＨＩＶ  ＲＴによる精製アナログの取り込みおよび伸長を測定する工程；および
（ｄ）該精製アナログの変異原性能力を試験する工程、
を包含する、方法。
（項目３）ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ  ＲＴ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法であって、該アナログは、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれ、該方法は：
（ａ）ＨＩＶ  ＲＴによるヌクレオシドアナログの取り込みおよび伸長を測定する工程；
（ｂ）該アナログの変異原性能力を試験する工程；
（ｃ）哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる該アナログの取り込みを測定する工程；および
（ｄ）工程（ａ）および（ｃ）の取り込みを比較して、該アナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目４）ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ  ＲＴ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法であって、該アナログは、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれ、該方法は：
（ａ）ヌクレオシドアナログの変異原性能力を試験する工程；
（ｂ）ＨＩＶ  ＲＴによる該アナログの伸長を測定する工程；および
（ｃ）ＨＩＶ  ＲＴによる該アナログの取り込みを哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、該アナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目５）ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ  ＲＴ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法であって、該アナログは、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれ、該方法は：
（ａ）複数のヌクレオシドアナログをＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験する工程；
（ｂ）該アナログを精製して複数の精製アナログを生成する工程；
（ｃ）ＨＩＶ  ＲＴによる精製アナログの取り込みおよび伸長を測定する工程；
（ｄ）該精製アナログの変異原性能力を試験する工程；
（ｅ）哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる該精製アナログの取り込みを測定する工程；および
（ｆ）工程（ｃ）および（ｅ）の取り込みを比較して、該精製アナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目６）ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ  ＲＴ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法であって、該アナログは、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれ、該方法は：
（ａ）複数のヌクレオシドアナログをＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験する工程；
（ｂ）該アナログを精製して複数の精製アナログを生成する工程；
（ｃ）精製アナログの変異原性能力を試験する工程；
（ｄ）ＨＩＶ  ＲＴによる該アナログの伸長を測定する工程；および
（ｅ）ＨＩＶ  ＲＴによる該精製アナログの取り込みを、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、該精製アナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目７）前記ヌクレオシドアナログの構造を同定する工程をさらに包含する、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）化合物Ｏ４−イソブチルチミジン。
（項目９）項目８に記載の化合物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含有する組成物。
（項目１０）化合物５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシシチジン。
（項目１１）項目１０に記載の化合物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含有する組成物。
（項目１２）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のための医薬の製造のためのヌクレオシドアナログの使用であって、該アナログが、ＨＩＶ逆転写酵素によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こす、使用。
（項目１３）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のための医薬の製造のためのヌクレオシドアナログの使用であって、該アナログが、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼと比べてＨＩＶ逆転写酵素によって高い効率で伸長しそして優先的に取り込まれ、そして不正確な塩基対合を引き起こす、使用。
（項目１４）前記ヌクレオシドアナログが、８−ヒドロキシデオキシグアノシン；Ｏ６−メチルデオキシグアノシン；Ｏ６−エチルデオキシグアノシン；Ｏ６−イソプロピルデオキシグアノシン；Ｏ６−イソブチルデオキシグアノシン；５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン；Ｏ４−メチルチミジン；Ｏ４−エチルチミジン；Ｏ４−イソプロピルチミジン；Ｏ４−イソブチルチミジン；３，Ｎ４−エテノデオキシシチジン；３，Ｎ２−エテノデオキシグアノシン；１，Ｎ６−エテノデオキシアデノシン；８−アミノデオキシグアノシン；５−ヒドロキシデオキシシチジン；または５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシシチジンである、項目１２または１３に記載の使用。
【００１２】
発明の要旨
ＡＩＤＳの治療における有効性について化合物をスクリーニングするための当該分野における現在の方法は、主に、ＨＩＶ  ＲＴを阻害する能力またはＨＩＶ  ＲＴによる取り込みの後のＤＮＡ合成を終結させる能力に関する。このような方法の欠点には、上記でまとめたものが含まれる。本発明の方法は、従来型でないアプローチに基づき、このアプローチは、高い効率で改変ヌクレオチドを取り込みそして伸長させるＨＩＶ  ＲＴの能力を、阻害するというよりむしろ利用する。
【００１３】
簡単に述べると、本発明は、ヌクレオシドアナログを、ＨＩＶ  ＲＴによって取り込まれそして不正確な塩基対合を引き起こす能力についてスクリーニングすることに関連した種々の方法、およびそのようなアナログの使用を提供する。１つの局面において、本発明は、ＨＩＶ  ＲＴによって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法を提供する。１つの実施態様において、この方法は、（ａ）ＨＩＶ  ＲＴによるヌクレオシドアナログの取り込みおよび伸長を測定する工程、および（ｂ）このアナログの変異原性能力を試験する工程を包含する。
【００１４】
別の実施態様において、この方法は、（ａ）複数のヌクレオシドアナログをＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験する工程、（ｂ）このアナログを精製して複数の精製アナログを生成する工程、（ｃ）ＨＩＶ  ＲＴによる精製アナログの取り込みおよび伸長を測定する工程、および（ｄ）この精製アナログの変異原性能力を試験する工程を包含する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、ＨＩＶ  ＲＴによって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法を提供する。ここで、このアナログは、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれる。１つの実施態様において、この方法は、（ａ）ＨＩＶ  ＲＴによるヌクレオシドアナログの取り込みおよび伸長を測定する工程、（ｂ）このアナログの変異原性能力を試験する工程、（ｃ）哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによるこのアナログの取り込みを測定する工程、および（ｄ）工程（ａ）および（ｃ）の取り込みを比較してこのアナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程を包含する。
【００１６】
別の実施態様において、この方法は、（ａ）ヌクレオシドアナログの変異原性能力を試験する工程、（ｂ）ＨＩＶ  ＲＴによるこのアナログの伸長を測定する工程、および（ｃ）ＨＩＶ  ＲＴによるこのアナログの取り込みを哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、このアナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程を包含する。
【００１７】
別の実施態様において、この方法は、（ａ）複数のヌクレオシドアナログをＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験する工程、（ｂ）このアナログを精製して複数の精製アナログを生成する工程、（ｃ）ＨＩＶ  ＲＴによる精製アナログの取り込みおよび伸長を測定する工程、（ｄ）この精製アナログの変異原性能力を試験する工程、（ｅ）哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる精製アナログの取り込みを測定する工程、および（ｆ）工程（ｃ）および（ｅ）の取り込みを比較して、この精製アナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程を包含する。
【００１８】
別の実施態様において、この方法は、（ａ）複数のヌクレオシドアナログをＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験する工程、（ｂ）このアナログを精製して複数の精製アナログを生成する工程、（ｃ）精製アナログの変異原性能力を試験する工程、（ｄ）ＨＩＶ
ＲＴによるこのアナログの伸長を測定する工程、および（ｅ）ＨＩＶ  ＲＴによるこの精製アナログの取り込みを、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、この精製アナログがＨＩＶ  ＲＴによって優先的に取り込まれるかどうかを決定する工程を包含する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ヌクレオシドアナログであるＯ４−イソブチルチミジンを提供する。組成物は、この化合物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含有する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、単離されたヌクレオシドアナログである５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシシチジンを提供する。組成物は、この化合物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含有する。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、ＨＩＶに感染した個体を処置するための医薬の製造のための特定の性質を有するヌクレオシドアナログの使用を提供する。１つの実施態様において、使用されるヌクレオシドアナログは、ＨＩＶ逆転写酵素によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすアナログを含有する。別の実施態様において、使用されるヌクレオシドアナログは、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼと比べてＨＩＶ逆転写酵素によって、高い効率で伸長し、そして優先的に取り込まれ、そして不正確な塩基対合を引き起こすアナログを含有する。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、変異原性ヌクレオシドアナログを含有する混合物を試験するためのプロトコールを図示する。テンプレートは、ｌａｃＺ遺伝子の３６１ｎｔ  ｇａｐに及ぶ部分を作出するように、ウラシルを欠く線状不完全相補鎖とアニールした、ウラシル残基を含有する環状Ｍ１３ｍｐ２  ＤＮＡである。酸化ｄＣＴＰ誘導体の取り込みをＨＩＶ−ＲＴを用いて行った。部分的に二本鎖のＤＮＡ産物を精製し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ  Ｉ）のラージフラグメントを用いて合成を完全にし、そして伸長産物をＥ．ｃｏｌｉ（ＣＳＨ５０）中に移した。ｌａｃＺにおける変異を同定しそして配列決定した。同定は、Ｘ−ｇａｌ，５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシドを用いて行う。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、高い効率で改変ヌクレオチドを取り込みそして伸長させるＨＩＶ  ＲＴの能力を利用する、従来型でなくそしてこれまで利用されていないアプローチに基づく。特に、本発明は、１つの局面において、ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（以下、「ＨＩＶ  ＲＴ」と呼ぶ）によって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする。このようなアナログは、高頻度で不正確に塩基対合し、これによってＨＩＶの変異速度を増加させる。変異は、ウイルスゲノム全体を通じて誘導され、生存能に必須である部位を含む。一旦生存能の変異閾を越えると、生存ウイルス子孫を生じる可能性は、ウイルス複製の回を経るごとに徐々に小さくなる。その最終結果は、生存不能な変異ウイルスゲノムである。従って、ヌクレオシドアナログは、ＨＩＶ  ＲＴを阻害するかまたはＤＮＡ合成に１度だけ取り込まれてそしてＤＮＡ合成を終結させるというよりはむしろ、ＨＩＶ  ＲＴによって伸長されるがＨＩＶに対して致死的な変異原性である。
【００２４】
本発明に適切なヌクレオシドアナログは、ＨＩＶ  ＲＴによって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログである。本明細書中で使用されるように、用語「ヌクレオシドアナログ」には、ヌクレオシドのアナログおよびその三リン酸エステル（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が含まれる。このような化合物の例には、８−ヒドロキシデオキシグアノシン；Ｏ６−メチルデオキシグアノン；Ｏ６−エチルデオキシグアノシン；Ｏ６−イソプロピルデオキシグアノシン；Ｏ６−イソブチルデオキシグアノシン；５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン；Ｏ４−メチルチミジン；Ｏ４−エチルチミジン；Ｏ４−イソプロピルチミジン；３，Ｎ４−エテノデオキシシチジン；３，Ｎ２−エテノデオキシグアノシン；１，Ｎ６−エテノデオキシアデノシン；８−アミノデオキシグアノシン；５−ヒドロキシデオキシシチジン；および５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシシチジンが含まれる。
【００２５】
簡単に述べれば、８−ヒドロキシデオキシグアノシンは、Ｂｏｄｅｐｕｄｉら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．５：６０８−６１７，１９９２）およびＬｉｎら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：１１９４−１１９８，１９８５）の手順の組み合わせに従って、出発物質として市販の２’−デオキシグアノシンを使用して調製される。Ｏ６−メチルデオキシグアノシン、Ｏ６−エチルデオキシグアノシンおよびＯ６−イソプロピルデオキシグアノシンは、Ｆａｔｈｉら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３：３１９−３２２，１９９０）の手順に従って、出発物質として市販の２’−デオキシグアノシンを使用して調製される。５−ヒドロキシメチルデオキシシチジンはＩｔａｈａｒａら（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５９１−１５９４，１９９１）の手順に基づいて、出発物質として市販の５−メチル−２’−デオキシシチジンを用いて調製される。Ｏ４−メチルチミジン、Ｏ４−エチルチミジンおよびＯ４−イソプロピルチミジンは、Ｘｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４０６１−４０６５，１９９０）の手順に従って、出発物質として市販のチミジンを使用して調製する。３，Ｎ４−エテノデオキシシチジンは、Ｅｂｅｒｌｅら（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １０：２７５１−２７５６，１９８９）の手順に従って、出発物質として市販の２’−デオキシシチジンを使用して調製する。３，Ｎ２−エテノデオキシグアノシンは、Ｋｕｓｍｉｅｒｅｋら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５：６３４−６３８，１９９２）の手順に従って、出発物質として市販の２’−デオキシグアノシンを使用して調製する。１，Ｎ６−エテノデオキシアデノシンは、市販されている。８−アミノデオキシグアノシンは、Ｌｏｎｇら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２：２７５１−２７５６，１９６７）の手順に従って、出発物質として市販の２’−デオキシグアノシンを使用して調製される。５−ヒドロキシデオキシシチジンは、Ｅａｔｏｎら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３１９：２８１−２８７，１９７３）の手順に基づいて、出発物質として市販の２’−デオキシシチジンを使用して調製される。５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシシチジンは、Ｂａｓｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７６７７−７６８１，１９８９）の手順に基づいて、出発物質として市販のチミジンを用いて調製される。
【００２６】
さらに、適切な性質（すなわち、高い効率でＨＩＶ  ＲＴによって取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こす能力）を有する誘導体もまた、本発明内で適切である。誘導体の例には、メチル基またはエチル基のブチル基との置換が含まれる。Ｏ４−イソブチルチミジンは、そのような誘導体の例である。この化合物は、メタノールをイソブチルアルコールと取り替えることを除いて、Ｏ４−メチルチミジンに関するＸｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４０６１−４０６５，１９９０）の手順に基づいて調製される。
【００２７】
デオキシヌクレオシドアナログの三リン酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）レベルへのリン酸化は、ホスホリルトランスフェラーゼ反応を使用する一リン酸レベルへの酵素的リン酸化と、次いで５’−三リン酸を形成するための一リン酸の化学的変換との組み合わせによって実施される。酵素的リン酸化は、粗小麦シュート抽出物をホスホトランスフェラーゼ活性として使用して実施される（ＧｉｚｉｅｗｉｃｚおよびＳｈｕｇａｒ，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．２２：８７−９８，１９７５；Ｓｕｇａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｌｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９１，ｐｐ．２４０−２７０）。例えば、このアプローチは、Ｓｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１４７８−１４８３）によるＯ２−アルキルチミジンのリン酸化のために使用されてきた。ヒト末梢赤血球溶解物は、ホスホトランスフェラーゼ活性のための別の供給源として使用され得る。あるいは、リン酸化は、ＢｌａｃｋおよびＬｏｅｂ（Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ  ３２：１１６１８−１１６２６，１９９３）により記載されるように、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはこれに由来する変異体によって実施され得る。ヘルペスチミジンキナーゼは広い基質特異性を有し、そして種々のヌクレオシドアナログをリン酸化する。得られるデオキシヌクレオシド一リン酸は、高速液体クロマトグラフィーによって精製される。
【００２８】
５’−デオキシヌクレオシド一リン酸アナログの、この三リン酸への変換は、ＨｏａｒｄおよびＯｔｔ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７：１７８５−１７８８，１９６５）の手順による。２ｍｌのジメチルホルムアミド中の、無水トリブチルアンモニウム塩としての０．１ｍｍｏｌのデオキシヌクレオシド５’−一リン酸の溶液に、０．５ｍｍｏｌの１，１’−カルボニルジイミダゾールを加える。この混合物を、４時間２４℃にてインキュベートし、そして０．８ｍｍｏｌのメタノールで処理する。５ｍｌのＤＭＦ中のピロリン酸トリブチルアンモニウム（０．５ｍｍｏｌ）を加え、そして沈澱したピロリン酸イミダゾリウムを遠心分離によって除去する。上清を等量のメタノールで処理し、エバポレートして乾燥させ、ＤＥＡＥ−セルロースでクロマトグラフし、そしてｐＨ７．５の重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配によって溶出する。重炭酸トリエチルアンモニウムを、エタノールでのエバポレーションによる反応の生成物から除去する。
【００２９】
本発明は、ＨＩＶ  ＲＴによって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすヌクレオシドアナログについてスクリーニングする方法を提供する。簡単に述べると、ＨＩＶ  ＲＴによる三リン酸形態のヌクレオシドアナログの取り込みは、４種全ての塩基を含む天然のＲＮＡテンプレートを使用して測定し得る。反応混合物は、３つの相補的デオキシヌクレオシド三リン酸を含有する。その１つは、トリチウムまたはα−３２Ｐのようなアイソトープで標識される。省かれる（ｏｍｍｉｔｅｄ）デオキシヌクレオチド基質は、アナログ中で改変された塩基に対応する。標識されたヌクレオチドの任意の広範な取り込みは、ＨＩＶ  ＲＴによるこのアナログの取り込みおよび伸長に依存する。新たに合成されたＤＮＡ中に取り込まれるこのアナログの能力は、基質濃度の関数として、対応する天然のデオキシヌクレオシド三リン酸のこの能力と直接比較される。このアナログの取り込みは、相補的デオキシヌクレオチドの取り込みパーセントとして表現される。本明細書中で使用されるように、高い効率でのＨＩＶ  ＲＴによる取り込みおよび伸長は、天然の相補的デオキシヌクレオチド三リン酸で達成される取り込みおよび伸長の１％に等しいかまたはそれ以上を意味する。
【００３０】
不正確な塩基対合を引き起こすアナログの能力は、このアナログの変異原性能力を試験することによって測定され得る。例えば、アナログの変異原性能力は、アナログのギャップ化ＤＮＡ（ｇａｐｐｅｄ  ＤＮＡ）への取り込みによって作製される変異の頻度およびスペクトルを検査することによって試験され得る。簡単に述べると、ギャップ化ＤＮＡが、Ｍ１３ｍｐ２  ＤＮＡ中のｌａｃＺ遺伝子の部分にわたるギャップからなる場合、変異は、β−ガラクトシダーゼ活性のα−相補性（α−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の減少によって同定され得る。ギャップ化ＤＮＡは、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４９４−１４９８，１９８４）の方法によって、ＦｅｉｇおよびＬｏｅｂ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：４４６６−４４７３，１９９３）によって改変されたように、調製される。テンプレートはウラシルを含有するＭ１３ｍｐ２であり、そしてギャップはｌａｃＺ調節領域とコード配列の５’側の１４５塩基とにわたる３６１ヌクレオチドの標的配列の反対側にある。取り込みは、３つの相補的デオキシヌクレオシド三リン酸および指定されたデオキシヌクレオシド三リン酸アナログを用いてＨＩＶ
ＲＴを使用して実施される。必要であれば、さらなる伸長は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、そして欠失する相補的デオキシヌクレオシド三リン酸の付加を用いて実施される。二本鎖ＤＮＡ産物は、ＭＣ１０６１細胞中にトランスフェクトされる。ウラシル含有鎖は、ウラシルグリコシラーゼおよびアプリン酸エンドヌクレアーゼによって迅速に加水分解され、そして得られるファージは、このアナログを含有するテンプレート鎖からインビボで作製される。変異体ファージプラークは、ＩＰＴＧとのインキュベーションの後、淡青色であるかまたは無色である。作製されたこのタイプの変異は、ファージＤＮＡの単離、そしてＳａｎｇｅｒ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：２２５−２４６，１９７８）の方法によって、ｌａｃＺαコード配列の＋１７９〜＋１９４セグメントに相補的な１５マーオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ギャップに対応するヌクレオチドセグメントを配列決定することによって決定され得る。ヌクレオシドアナログがＡＩＤＳの処置において効果的であるためには、それが、インビトロアッセイにおいて変異原性であることが必要である。インビトロアッセイにおいて取り込まれるヌクレオチド残基あたり誤って取り込まれる頻度は、等量の対応する相補的デオキシヌクレオシド三リン酸を使用して観察される頻度より３倍またはそれ以上であるはずである。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法は、１つのアナログあるいは２つまたはそれ以上のアナログを含有する混合物を用いて使用され得る。混合物を、適切な取り込み／伸長および変異原性の性質を有するアナログの存在についてスクリーニングすることが望まれる場合、代表的には、混合物またはその一部が、ＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについて試験される。混合物におけるアナログの精製は、例えば、ギャップ化ＤＮＡへの取り込みを、上記のように、測定することによってモニターされ得る。精製技術は当業者に周知であり、そしてイオン交換樹脂または逆相カラムを使用するＨＰＬＣのようなクロマトグラフィーを含む。一旦、アナログを精製すると、化学構造を同定することが望まれ得る。化学構造を決定することへのアプローチは、ＨＰＬＣ、ＵＶ分光法、および質量分析の組み合わせ（例えば、Ｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：７０２４−７０３２，１９９０）を使用することである。質量分析のためには、サンプルは、無機塩から分離され（例えば、逆相ＨＰＬＣによって）、トリエチルアンモニウム塩に転換され、ギ酸中で加水分解され、トリメチルシリル誘導体に転換され、そして確立された方法（例えば、Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２９５：１０３−１２１，１９８４；Ｇａｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：７８７６−７８８２，１９９０）を使用するガスクロマトグラフィー／質量分析によって分析され得る。
【００３２】
本発明の方法は、ＨＩＶ  ＲＴによって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こす能力に加えて性質を有するアナログについてスクリーニングするために変化させ得る。例えば、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比べてＨＩＶ  ＲＴによってまた優先的に取り込まれ、そしてヒトＤＮＡ修復酵素によって修復されないアナログについてスクリーニングすることが望まれ得る。宿主ゲノムは、細胞区画化による（すなわち、ＨＩＶ  ＲＴ転写が、核およびミトコンドリア中の宿主ＤＮＡから物理的に単離される宿主細胞細胞質において生じる）および宿主のＤＮＡ修復系によるアナログからの保護を有するが、にもかかわらず、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼに対してＨＩＶ  ＲＴにより優先的に取り込まれるアナログについて選択することにより、さらに保護されることが望まれ得る。
【００３３】
ＨＩＶ  ＲＴによるアナログの取り込みと哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによるアナログの取り込みとは、直接または別々に比較され得、そして別個の試験結果は続いて比較され得る。簡単に述べると、ＨＩＶ  ＲＴとＤＮＡポリメラーゼとの間のアナログの取り込みの比較は、ヌクレオチド取り込みのための「マイナス（ｍｉｎｕｓ）」配列決定ゲルアッセイの改変型を使用して実施され得る。５’−３２Ｐ標識プライマーは、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸のうちの３種および三リン酸形態のアナログを含有する反応物中において伸長される。テンプレートはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。反応物から省かれるヌクレオチドに相補的なテンプレートヌクレオチドを越えるプライマーの伸長は、アナログの取り込みに依存し、そしてこれに比例する。このアナログの取り込みの量は、ある位置から次の位置への配列決定ゲル上で伸長されるオリゴヌクレオチドの割合の関数として計算される。取り込みは、オートラジオグラフィー、続いて各バンドのデンシトメトリーまたは切り取りのいずれか、および液体シンチレーション分光法により放射能を計数することによって測定される。本明細書中で使用されるように、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによるアナログの取り込みが優先的であるとは、ＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートのいずれかを使用して任意の哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼで達成される取り込みに対して２倍以上であることを意味する。
【００３４】
本明細書中で提供されるスクリーニング方法の工程が実施される順序が、容易に変化され得ることは、当業者に明らかである。例えば、アナログの変異原性能力は、ＨＩＶ  ＲＴによる取り込みまたは伸長を測定する前またはこれに続いて試験され得る。
【００３５】
本発明は、別の局面において、ＨＩＶに感染した個体を処置するための医薬の製造に適切なヌクレオシドアナログの使用を提供する。適切なヌクレオシドアナログは、ＨＩＶ  ＲＴによって高い効率で取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を引き起こすものである。アナログは、さらなる性質を有し得、これは、例えば、哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みと比較して、ＨＩＶ  ＲＴによる取り込みが優先的であることである。本発明のこの局面では、ヌクレオシドアナログは、好ましくは、三リン酸形態よりむしろ非リン酸化形態である。非リン酸化ヌクレオシドアナログは、対応する三リン酸形態より容易に細胞の膜を横切って細胞質中へ移動し得る。一旦、細胞の細胞質中に入ると、非リン酸化アナログは、内在性キナーゼによって三リン酸形態に転換される。次いで、三リン酸形態のヌクレオシドアナログは、ＨＩＶ  ＲＴによる取り込みおよび伸長に利用され得る。
【００３６】
アナログは、単独、あるいは他のアナログまたは他の治療剤（例えば、他のメカニズムによって作働する化学療法剤または免疫療法剤）と組み合わせて、使用され得るかまたは処方され得る。種々の送達経路が使用され得る。代表的には、送達は、注射によるか、経口的か、または経皮的である。別のアナログおよび／または治療剤が使用される場合、送達は同時であるかまたは連続的であり得る。特定のアナログの正確な最適な量は、アナログおよび個体に依存して変化し得る。しかし、一般的には、アナログの治療有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重までである。特定のアナログの最適有効量を決定する方法、および送達の数および頻度は個体の応答に依存することは、当業者に明らかである。アナログは、一般的には、送達のために薬学的に受容可能な形態に処方され、そしてこの形態がアナログの物理化学的性質および血流への吸着または吸収の経路に依存し得ることは、当業者に明らかである。適切なキャリアまたは希釈剤には、注射のための生理食塩水が含まれる。
【００３７】
以下の実施例は例示のために提供され、そして限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例Ｉ）
（ヌクレオシドアナログの調製）
Ａ．８−ヒドロキシデオキシグアノシン
８−ヒドロキシデオキシグアノシン（７，８−ジヒドロ−８−オキソデオキシグアノシンまたは８−オキソデオキシグアノシンとしても知られる）を、Ｂｏｄｅｐｕｄｉら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．５：６０８−６１７，１９９２）の公開された手順とＬｉｎら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：１１９４−１１９８，１９８５）の公開された手順との組み合わせに従って合成する。Ｂｏｄｅｐｕｄｉらによって記載されるように、３０ｍＬの水中の２’−デオキシグアノシン（５．０ｇ、１９．０ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能）の冷却（０℃）溶液に、臭素−水の飽和溶液（１２０ｍＬ）を、この懸濁液が不透明になり、そして黄色が維持されるまで、滴下して加える。沈澱した８−ブロモデオキシグアノシンを、濾過によって除去し、冷水、続いてアセトンで洗浄する。次いで、この固体を、重炭酸ナトリウムを含有するメタノール−水から再結晶化させ、８−ヒドロキシデオキシグアノシンを生成する。
【００３９】
２００ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、ナトリウムベンゾイレート（ベンジルアルコール（７５ｍＬ）およびナトリウム（２．１４ｇ）から作製）の調製したばかりの溶液に、アルゴン雰囲気下で加える。ＤＭＳＯ（８０ｍＬ）中の８−ブロモデオキシグアノシン（１０ｇ、２９ｍｍｏｌ）を、得られる混合物に加えて、そして反応物を６５℃に２４時間加熱する。室温まで冷却した後、反応混合物を氷酢酸で中和し、そしてＤＭＳＯを６５℃での減圧蒸留によって除去する。残りの溶液を、撹拌しながらエーテル中に注ぐ。エーテルをデカントした後に残る油状残渣をアセトンに加え、そして得られる白色沈澱を濾過によって除去する。水で撹拌後、スラリーを濾過し、そして回収した白色固体をメタノールから再結晶化して、８−（ベンジルオキシ）−２’−デオキシグアノシンを得る。
【００４０】
この合成の最終段階は、Ｌｉｎら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：１１９４−１１９８，１９８５）の公開された手順に従って行う。メタノール（８ｍＬ）と水（８ｍＬ）との混合物中の８−（ベンジルオキシ）−２’−デオキシグアノシン（０．２０ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の溶液を、５０ｐｓｉおよび室温にて１８時間、１０％パラジウムカーボン（０．３ｇ）上で水素化する。触媒を濾過によって除去し、そして溶媒をエバポレートして乾燥し、８−ヒドロキシデオキシグアノシンを生成する。
【００４１】
Ｂ．Ｏ６−メチルデオキシグアノシン、Ｏ６−エチルデオキシグアノシンおよびＯ６−イソプロピルデオキシグアノシン
Ｏ６−メチルデオキシグアノシン、Ｏ６−エチルデオキシグアノシンおよびＯ６−イソプロピルデオキシグアノシンを、Ｆａｔｈｉら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３１９−３２２，１９９０）の公開された手順に従って合成する。トリフルオロ酢酸無水物（２．３ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１０ｍＬ）中の２’−デオキシグアノシン（２ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）の冷却した（０℃）溶液に加える。１０分後、３００ｍＬの適切なアルコール中の適切なアルコシキド（４．３ｇ）（Ｏ６−メチルデオキシグアノシンについては、メタノール中のナトリウムメトキシド、Ｏ６−エチルデオキシグアノシンについては、エタノール中のナトリウムエトキシド、Ｏ６−イソプロピルデオキシグアノシンについては、イソプロピルアルコール中のナトリウムイソプロポキシド）を滴下して加え、そして反応混合物を２４時間（またはエチル誘導体に関しては６０時間、およびイソプロピル誘導体に関しては２日間）撹拌する。反応物を、ピリジニウムヒドロクロライドの溶液（１２ｍＬのピリジンおよび４ｍＬの塩酸から作製）でクエンチし、そして過剰な酸を重炭酸ナトリウム（２ｇ）で破壊する。次いで、この混合物をエバポレートして乾燥させ、水中に再懸濁し、そして水中２％〜５％のアセトニトリルの勾配を使用するＤｙｎａｍａｘ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）逆相ＨＰＬＣカラムで４５分間にわたって精製して、上記で使用する特定のアルコキシドに依存して、Ｏ６−メチルデオキシグアノシン、Ｏ６−エチルデオキシグアノシンまたはＯ６−イソプロピルデオキシグアノシンを生成する。
【００４２】
Ｃ．５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン
５−ヒドロキシメチルデオキシシチジンを、Ｉｔａｈａｒａら（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５９１−１５９４，１９９１）の公開された手順に従って合成する。１００ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の５−メチル−２’−デオキシシチジン（０．５ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）にＮａ２Ｓ２Ｏ８（０．５ｍｍｏｌ）を加え、そして反応混合物をアルゴン下で７５℃にて４時間撹拌する。次いで、反応混合物を濃縮し、そして粗５−ヒドロキシメチルデオキシシチジンを、０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）での溶出および適切な画分のエバポレーションによって、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ逆相ＨＰＬＣカラムで精製する。
【００４３】
Ｄ．Ｏ４−メチルチミジン、Ｏ４−エチルチミジンおよびＯ４−イソプロピルチミジン
Ｏ４−メチルチミジン、Ｏ４−エチルチミジンおよびＯ４−イソプロピルチミジンを、Ｘｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４０６１−４０６５，１９９０）の公開された手順に従って合成する。ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドを、チミジン（１２．１ｇ、５０ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入）、イミダゾール（１０．２ｇ、１５０ｍｍｏｌ）、およびジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）の溶液に室温で加える。３時間後、この溶液を濃縮し、そして残渣をエーテル中に溶解し、そして飽和塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄する。有機層を分離し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そしてエバポレートして、３’，５’−Ｏ−ジ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジンを生成する。
【００４４】
無水アセトニトリル（３００ｍＬ、ＣＨ３ＣＮ）中の１，２，４−トリアゾール（２５．６ｇ、３７０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃）懸濁液に、ホスホリルクロライド（３ｍＬ）を加え、続いてトリエチルアミン（６０ｍＬ）を加える。１時間後、１００ｍＬのＣＨ３ＣＮ中の３’，５’−Ｏ−ジ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（１１．７５ｇ、２５ｍｍｏｌ）を３０分かけて加え、そしてこの溶液を１６時間撹拌する。次いで、この反応混合物を濾過し、酢酸エチルで希釈し、そして重炭酸ナトリウムで洗浄する。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、そして溶媒をエバポレートして、３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−４−（１，２，４−トリアゾロ）チミジンを生成する。
【００４５】
４０ｍＬのジメチルホルムアミド中の３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−４−（１，２，４−トリアゾロ）チミジン（５．１１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃）溶液に、３ｍＬの適切なアルコール（メタノール、エタノールまたはイソプロパノール）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク（ｕｎｄｅｃ）−７−エン（２．５ｍＬ）を加える。この溶液を室温まで加温し、次いでメタノールに関してはさらに３時間、あるいはエタノールまたはイソプロパノールに関しては一晩撹拌する。ＫＨ２ＰＯ４でのこの溶液の中和後、生成物をクロロホルム中に抽出し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ２上で乾燥させ、そして濾過する。濾液を濃縮し、残渣を、テトラヒドロフラン中のテトラブチルアンモニウムフルオライドで処理する。反応を１時間で終了し、そして反応混合物を、クロロホルム中の２％メタノールで溶出するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製する。適切な画分のエバポレーション後、次いで、所望の生成物（上記で反応させる特定のアルコールに依存して、Ｏ４−メチルチミジン、Ｏ４−エチルチミジンまたはＯ４−イソプロピルチミジン）を、酢酸エチル中の５％メタノールから再結晶化する。
【００４６】
Ｅ．Ｏ４−イソブチルチミジン
Ｏ４−イソブチルチミジンを、Ｘｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４０６１−４０６５，１９９０）の公開された手順と同様の様式で、上記のＤ節で記載したように、３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−４−（１，２，４−トリアゾロ）チミジンから出発して合成する。ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中の３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−４−（１，２，４−トリアゾロ）チミジン（５．１１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃）溶液に、イソブチルアルコール（３ｍＬ）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（２．５ｍＬ）を加える。この溶液を室温まで加温し、次いで、反応が終了するまで撹拌する。ＫＨ２ＳＯ４での溶液の中和後、生成物をクロロホルム中に抽出し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、そして濾過する。濾液を濃縮し、そして残渣を、テトラヒドロフラン中のテトラブチルアンモニウムフルオライドで処理する。反応を約１時間で終了し、そしてシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製後、所望の０４−イソブチルチミジンを生成する。
【００４７】
Ｆ．３，Ｎ４−エテノデオキシシチジン
３，Ｎ４−エテノデオキシシチジンを、Ｅｂｅｒｌｅら（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １０：２７５１−２７５６，１９８９）の公開された手順に従って合成する。０．４ｍＬのＤＭＳＯ中の２’−デオキシシチジン（８ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）に、０．０４ｍＬの４５％クロロアセトアルデヒド水溶液を加え、そして反応混合物を１時間７０℃にて撹拌する。次いで、反応混合物をエバポレートして乾燥させ、そして得られる残渣を、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８カラム（Ａｌｔｅｃｈ）での逆相ＨＰＬＣによって精製して、３，Ｎ４−エテノデオキシシチジンを生成する。
【００４８】
Ｇ．３，Ｎ２−エテノデオキシグアノシン
３，Ｎ２−エテノデオキシグアノシンを、Ｋｕｓｍｉｅｒｅｋら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．５：６３４−６３８，１９９２）の公開された手順に従って合成する。５ｍＬのＤＭＦ中の２’−デオキシグアノシン（０．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）および炭酸カリウム（０．２１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０．２５ｍＬの４５％クロロアセトアルデヒド水溶液を加える。１２時間後、反応混合物を水で希釈し、そしてＤｏｗｅｘ  １×２（２００／４００、ＨＣＯ３型）イオン交換カラムで、５０％メタノール水溶液中の０〜０．５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３の２リットルの線形勾配で溶出して精製する。適切な画分のエバポレーションにより３，Ｎ２−エテノデオキシグアノシンを得る。
【００４９】
Ｈ．１，Ｎ６−エテノデオキシアデノシン
１，Ｎ６−エテノデオキシアデノシンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能である。
【００５０】
Ｉ．８−アミノデオキシグアノシン
８−アミノデオキシグアノシンを、Ｌｏｎｇら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２：２７５１−２７５６，１９６７）の公開された手順に従って合成する。２５ｍＬの水中の２’−デオキシグアノシン（５．０ｇ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）の冷却した（０℃）溶液に、臭素−水の飽和溶液を、この懸濁液が不透明になり、そして黄色が維持されるまで、滴下して加える。沈澱した８−ブロモデオキシグアノシンを濾過によって除去し、そして冷水、続いてアセトンで洗浄する。次いで、固体を、重炭酸ナトリウムを含有するメタノール−水から再結晶化させて、８−ブロモデオキシグアノシンを生成する。
【００５１】
ヒドラジンを、水：メタノール（１５０ｍＬ，１：２）中の８−ブロモデオキシグアノシンの懸濁液に加え、そして得られる溶液を、還流で２４時間加熱する。得られる沈澱物を濾過によって除去し、そして濾液をエバポレートして固体を得る。エタノールからのエバポレーションを繰り返した後、生成物をメタノールから再結晶化させる。精製８−アジド−２’−デオキシグアノシン（１．３ｇ）を、メタノール：水（１６０ｍＬ，５：３）の混合物中に溶解し、ラニーニッケル（１０．０ｇ）を加え、そしてこの混合物を還流で１８時間加熱する。触媒を、セライトを経る濾過によって除去し、そして水およびメタノールでの洗浄後、濾液をエバポレートして乾燥させる。得られる固体をメタノールから再結晶化して、８−アミノデオキシグアノシンを生成する。
【００５２】
Ｊ．５−ヒドロキシデオキシシチジン
５−ヒドロキシデオキシシチジンを、５−ヒドロキシデオキシシチジン−３’，５’−二リン酸のためのＥａｔｏｎら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３１９：２８１−２８７，１９７３）の公開された手順と同様の方式に従って合成する。臭素を、水中の２’−デオキシシチジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）の冷却した（０℃）溶液に、黄色が維持されるまで加える。過剰の臭素をシクロヘキセンでクエンチし、そして２，４，６−コリジンを加える。２時間後、反応混合物をエーテルで洗浄し、そして減圧下でエバポレートして乾燥させる。次いで、粗５−ヒドロキシデオキシシチジンを、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）での逆相ＨＰＬＣによって、Ａ中の０％〜２０％Ｂ（溶媒Ａ：０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、溶媒Ｂ：０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ中の５０％ＣＨ３ＣＮ）の線形勾配を使用して精製する。
【００５３】
Ｋ．５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシシチジン（シチジングリコール）
デオキシヌクレオシドであるシチジングリコールを、チミジングリコールの合成のためのＢａｓｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：７６７７−７６８１，１９８９）の公開された手順に基づいて合成する。チミジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）に、３７℃にて、ｐＨ８．６のオスミウムテトロキシドを加える。この溶液を１０分間インキュベートする。過剰のオスミウムテトロキシドをエーテルで抽出し、そして粗反応混合物を、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによって、Ａ中の０％〜２０％Ｂ（溶媒Ａ：０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、溶媒Ｂ：０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ中の５０％ＣＨ３ＣＮ）の線形勾配を使用して精製する。
【００５４】
（実施例ＩＩ）
（ＨＩＶ  ＲＴによって取り込まれそして伸長され、そして不正確な塩基対合を生じるヌクレオシドアナログのスクリーニング）
Ａ．アナログの混合物のＨＩＶ  ＲＴによる取り込みについての試験
ｄＣＴＰの酸化誘導体の精製を、ギャップ化ＤＮＡへの取り込みを測定することによってモニターする。ギャップ化ＤＮＡは、ウラシルを含有しない直鎖状不完全相補鎖にアニールした、ウラシル残基を含有する一本鎖環状Ｍ１３ｍｐ２  ＤＮＡからなり、その結果ｌａｃＺ遺伝子の部分にわたる３６１−ｎｔのギャップを生じる（ＦｅｉｇおよびＬｏｅｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：４４６６−７３，１９９３に記載のように調製した）。反応混合物（０．０２  ｍｌ）は以下を含有する：２００  ｎｇのギャップ化ＤＮＡ、６０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、１０  ｍＭ  ＫＣｌ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、０．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００μＭ（各々）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰ、１μＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、または改変ｄＣＴＰ（６９２  ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、ならびに１．２５単位の組換えＨＩＶ−ＲＴ（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１１６８−１１７１，１９８８）（１単位は、１時間３７℃で、１ｎｍｏｌのｄＮＴＰのＤＮＡへの取り込みを触媒するために必要な酵素の量である）。この反応物におけるヌクレオチドの偏りは、ｌａｃＺα遺伝子中のグアノシンの反対の部位での、改変シトシンのみの取り込みを強制する。サンプルをフェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）でそれぞれ１回抽出し、その後４００  ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０μｇのグリコーゲン（共沈剤として）の存在下でエタノール沈殿を行う。サンプルをＨ２Ｏ中に再懸濁し、そしてギャップフィリング（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）合成を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメント（ｐｏｌ−１ｌｆ）を用いて、ＨＩＶ−ＲＴを用いる反応由来のＤＮＡ、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．８、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ（各々）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、ならびに５単位のｐｏｌ−１ｌｆを含有する２０μｌの反応物中で、完成させた。反応物を３７℃で４５分間インキュベートし、そして８０μｌの２５  ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により停止し、そして酸不溶性沈殿への取り込みを測定する（ＦｅｉｇおよびＬｏｅｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，４４６６−７３，１９９３）。
【００５５】
Ｂ．ｄＣＴＰアナログの混合物の作製および精製
ｄＣＴＰの酸化を、以下を含有する２００μｌの反応物中で実施する：５．４  ｍＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（６９２ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ｄＣＴＰ）、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５０μＭ  ＦｅＳＯ４、１５  ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、および１．５  ｍＭアスコルビン酸。サンプルを１．７  ｍｌチューブ中で３７℃で４０分間インキュベートする。反応を５μｌの１００  ｍＭデフェロキサミン（キレート剤）の添加により停止し、そしてこの混合物を直ちに５０  ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ  ７．０で平衡化したＢｅｃｋｍａｎ  ＯＤＳ、逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０  ｍｍ）にロードする。ヌクレオチドを１５  ｍｌの酢酸トリエチルアンモニウムで溶出し、その後１ｍｌ／分の一定流速で４５  ｍｌの０％〜２５％アセトニトリルの直線４５  ｍｌ勾配を行う。６０の１ｍｌ画分を採集し、そして２５４  ｎｍでのＵＶ吸光度について（ＨＰＬＣ  ＵＶ吸光度検出器により測定する）、放射能について、およびＨＩＶ逆転写酵素によるギャップ化ＤＮＡへの取り込みについてスクリーニングする。最も効率的にＤＮＡに取り込まれ、そして非損傷ｄＣＴＰから十分に分離した画分をプールし、そして凍結乾燥する。Ｃ１８カラム由来の凍結乾燥画分を、１２５  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１２５  ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ４．４中に再懸濁し、そして１２５  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１２５  ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ４．４中で平衡化したＷｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ  １０  ＳＡＸ  ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０  ｍｍ）にロードする。１２５  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１２５  ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ４．４の無勾配移動相を、２ｍｌ／分の流速で流す。１５０の１ｍｌ画分を採集し、そして放射能およびギャップ化ＤＮＡへの取り込みについてスクリーニングする。
【００５６】
カラム画分をｄＣＴＰの代わりにＤＮＡ合成反応のために使用する。ＤＮＡテンプレートは、細菌βガラクトシダーゼのｌａｃＺ遺伝子の部分にわたる３６１−ｎｔ一本鎖ギャップを有する二本鎖Ｍ１３ｍｐ２分子である。ウラシル含有鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のトランスフェクションの際に迅速に加水分解され、その結果ウラシルを含有しない鎖の１０４倍の優先的な発現を生じ、そしてウラシルを含有しない鎖に取り込まれた改変シチジンの修復を防止する。ＤＮＡ合成を、ＨＩＶ  ＲＴにより、２００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰならびに１μＭの逆相カラム由来の各画分の存在下で触媒する。部分的二本鎖ＤＮＡ産物を精製し、そしてギャップフィリング合成をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用して完成する。酸化シトシン誘導体の取り込みをシンチレーションカウンターで定量し、そして画分の毒性を、改変ヌクレオチドを含有する画分を用いることにより合成されるＤＮＡのトランスフェクション効率を、同じカラムに通したｄＣＴＰを用いて合成したＤＮＡのトランスフェクション効率と比較することにより評価する。各画分の変異原性を、βガラクトシダーゼのｌａｃＺ遺伝子中の正方向の変異を記録することにより測定する（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４９４−１４９８，１９８４）。
【００５７】
逆相カラムを用いると、全ての３２Ｐ含有種がＤＮＡに取り込まれるわけではない。これはおそらく、これらがもうＨＩＶ−ＲＴの基質ではないからである。ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰは、逆相カラムからそれぞれ画分２９〜３１および３４〜３５に溶出する。画分１２〜１４は高度に変異原性であり、そして非損傷ヌクレオチドを含有しない。画分１２〜１４を合わせ、強アニオン交換（ＳＡＸ）カラムにロードし、そして６つの種α、β、γ、δ、ε、ζを分離する。化合物γおよびεは、ＨＩＶ−ＲＴによりｄＣＴＰについての効率の約５６％および２７％の効率でＤＮＡに取り込まれる。いずれの種も哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼαによっては認められるほどに取り込まれず、そしてγのみが哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼβの基質である（ｄＣＴＰに比較して１８％）。
【００５８】
γの精製における連続的な工程由来の画分を、ＴＬＣにより分析した。シチジンに対する酸化的損傷は、４０を超える改変ヌクレオチド種を生じ得る。逆相工程は、γ種を大部分のその他の産物から分離し、そして強アニオン交換カラムがこれをさらに精製する。
【００５９】
Ｃ．変異原性能力試験
ｄＣＴＰの酸化誘導体のギャップ化ＤＮＡへの取り込みにより生成された変異を、βガラクトシダーゼ活性の減少したα相補性により同定する。対数期のＭＣ１０６１  ［ｈｓｄＲ、ｍｃｒＲ、ａｒａＤ、（１３９Δ−ａｒａＡＢＣ−ｌｅｕ）７６７９ΔｌａｃＸ７４、ｇａｌＵ、ｇａｌＫ、ｒｓｐＬ、ｔｈｉ−］を、細胞を滅菌Ｈ２０で４回洗浄することによりエレクトロポレーションのために調製する。次いで、細胞をペレット化し、そして充填した細胞の体積と等容量のＨ２Ｏ中に再懸濁する。５０ナノグラムのフィリングしたギャップＤＮＡ産物を３００μｌの細胞と混合し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いるエレクトロポレーションに供する（２５  ｍＦ、４００  Ｗ、２．０  ＫＶ、および時間定数６．０と７．５との間）。サンプルを氷上に置き、そして１ｍｌのＬＢ培地と混合する。トランスフェクション混合物のアリコート（１０〜４０μｌ）を３ｍｌの溶解したトップアガー（４２℃）（０．９％ＮａＣｌ、０．８％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ、ジメチルホルムアミドに溶解した０．０８％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド、および０．２  ｍｌのＣＳＨ５０  ［Δ（ｐｒｏＢｌａｃ）／Ｆ’＋ｒａＤ３６，ｔｈｉ−，ａｒａ−，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃＩαＺ−Δｍ１５］対数期細胞からなる）に添加し、そして１．５％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒおよび１５  ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を補足した３０  ｍｌの固形化Ｍ９培地を含有するプレートに重層した。表現型を、変異体ファージを等量の野生型Ｍ１３ｍｐ２ファージと混合し、そして再プレーティングすることにより確認する。ファージＤＮＡを単離し（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４９４−１４９８，１９８４）、そしてＳａｎｇｅｒら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：２２５−２４６，１９７８）の方法により、ｌａｃＺαコード配列の＋１７９〜＋１９４セグメントに相補的な１５マーのオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用して配列決定する。
【００６０】
γの変異原性能力を、正方向変異アッセイを使用して評価する。ＨＩＶ−ＲＴによる非相補性ヌクレオチドの取り込みから生じる変異の頻度を減少させるために、このインキュベーションを２分間のみ実施する。これらの条件下において、ＨＩＶ−ＲＴはテンプレートの分子当たり約５分子のγまたは９分子の非損傷ｄＣＴＰを取り込む。次いで、ギャップ化ＤＮＡを、ｐｏｌ−Ｉｌｆ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメント）により４つの非損傷ヌクレオチドを基質として使用して完全にフィリングする。トランスフェクション効率および変異頻度を表Ｉに示す。ＨＩＶ−ＲＴを用いない反応において、１ｎｇのＤＮＡ当たり１０４０のトランスフェクタントを得、一方ＨＩＶ−ＲＴおよび非損傷ｄＣＴＰ（逆相および強アニオン交換クロマトグラフィーにより「精製した」）を用いると、収率は１ｎｇのＤＮＡ当たり１６５のトランスフェクタントである。γのｄＣＴＰへの置換は、さらにトランスフェクション効率を減少させる（１ｎｇのＤＮＡ当たり７３のトランスフェクタント）。ＨＩＶ−ＲＴの非存在下において、変異頻度は４．６×１０−４である（表Ｉ、第１行目）。ＨＩＶ−ＲＴおよびｄＣＴＰを用いる反応は、変異頻度を２．４倍増加させる。これはおそらく、ＨＩＶ−ＲＴによる高頻度の取り込み違いおよび反応混合物中のヌクレオチドプールの偏りに由来する。最も重要なことに、テンプレートＤＮＡ当たり平均５分子のγの取り込みに派生する変異頻度は１２００×１０−４であり、これは１０９倍の増加である。３ｎｔのみを用いるコントロール反応における相対的に低い変異頻度（表Ｉ、第４行目）は、γにより誘発される変異誘発が混合物中にｄＣＴＰを含有しないことから生じるのではないことを示す。
【００６１】
【表１】
2010068809.tif 000002
ＨＩＶ−ＲＴを使用してｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰのみを、ｄＣＴＰと共に、またはγと共に、第２欄に示すように取り込ませた。トランスフェクション効率および変異頻度を第３欄および第４欄に示す。各々のクラスの反応について単離された変異体の数を括弧内に示す。データは数回の実験の累積である。
【００６２】
γのｌａｃＺ標的遺伝子への取り込みから生じる変異スペクトルを、単離した１９６の変異体のうち９２の各々におけるギャップ内の約２００  ｎｔの配列決定に基づいて調製する。観察された１８１の置換のうち、１７８（９８．３％）がシトシンで生じる（ギャップ化ＤＮＡのテンプレート鎖における反対のグアニン）。この結果は、ｄＣＴＰに対するプール偏り（ｐｏｏｌ  ｂｉａｓ）にかかわらず、ＨＩＶ−ＲＴによるＤＮＡ合成の間に、γがほとんど変わらずグアニンと塩基対合することを示す。変異のうち、１７３（９５．６％）がＣ→Ｔへのトランジションであった。このことは、γにより生じる変異の強い特異性を示す。
【００６３】
Ｄ．構造的同定
γの化学的構造は、ＨＰＬＣ、ＵＶ分光、および質量分析の組み合わせにより、５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸であると決定される。γをデオキシヌクレオシドに酵素的に脱リン酸化し、そしてＨＰＬＣにより分析する。γに由来するデオキシヌクレオシドのＵＶスペクトル（２９２  ｎｍの最大吸光度）およびクロマトグラフィーの保持時間の両方は、５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジンのオーセンティック（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）なサンプルと同一である。次いで、γの画分を無機塩から逆相ＨＰＬＣにより分離し、トリエチルアンモニウム塩に転換し、ギ酸中で加水分解し、トリメチルシリル（ＴＭＳ誘導体）に転換し、そして確立された方法（Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２９５：１０３−１２１，１９８４；Ｇａｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：７８７６−７８８２，１９９０）を使用してガスクロマトグラフィー／ＭＳにより分析する。γ誘導体のクロマトグラフィーの保持時間および質量スペクトルの両方は、５−ヒドロキシシトシンのＴＭＳ誘導体と一致する。γから誘導される５−ヒドロキシシトシンのＴＭＳ誘導体の質量スペクトルにおける優勢イオンは、ｍ／ｚ  ３４３（親イオン）、ｍ／ｚ  ３４２  ［Ｍ−Ｈ］＋およびｍ／ｚ  ３２８  ［Ｍ−ＣＨ３］＋であり、これは公開されたデータと一致する。しかし、γのＵＶスペクトルは、塩基部分が５−ヒドロキシシトシンであり、酸加水分解の前のシトシングリコールではなかったことを明らかに示す。
【００６４】
Ｅ．ＨＩＶ  ＲＴ対哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによるデオキシヌクレオシド三リン酸アナログの取り込みの比較
１．ＨＩＶ  ＲＴによる取り込みの決定
ＨＩＶ  ＲＴ．または任意の逆転写酵素によるヌクレオシド三リン酸の取り込みは、通常、標識されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸のポリリボヌクレオチドテンプレートを有する酸不溶性産物への取り込みの初速度を測定することにより決定される（Ｈａｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２Ｌ：１５４８，１９８６）。このようなアッセイの例は、テンプレートとしてのポリｒＣオリゴｄＧおよび放射標識基質としての［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰの使用である。これは、ＨＩＶ  ＲＴの活性を定量するための最も容易な方法であり、そして培養物中の感染細胞の系列継代の間のウイルスの産生を評価するために本明細書中に記載されるが、それらの三リン酸形態のヌクレオシドアナログの取り込みを評価することについては不適切である。
【００６５】
ヌクレオシドアナログの取り込みの測定のために、４つの塩基全てを含有する天然のＲＮＡテンプレートが用いられる。最初に、これらのテンプレートは、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためにインビボでＨＩＶ  ＲＴにより用いられるテンプレートを模倣する。第２に、１つのみまたは２つのヌクレオチド種を含有するポリリボヌクレオチドは、鎖伸長アッセイについて不適切である。なぜなら、ＨＩＶ  ＲＴは、伸長的に触媒する間に反復配列でスリップするからである（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：４６９，１９８９）。最後に、ホモポリマーについて、ヌクレオチドアナログのそれぞれの種を試験するために異なるホモポリマーを必要とする。天然のＲＮＡテンプレートを用いる実験では、反応混合物は、３つの相補的なデオキシヌクレオシド三リン酸を含有する。これらの内の１つは、トリチウムまたはα−３２Ｐのようなアイソトープで標識される。省かれるデオキシヌクレオチド基質は、アナログにおいて改変される塩基に相当する。任意の大規模な標識ヌクレオチドの取り込みは、ＨＩＶ  ＲＴによる三リン酸形態のヌクレオシドアナログの取り込みおよび伸長に依存する。例えば、基質として８−ヒドロキシグアニン（８−オキソ−ｄＧＴＰ）のデオキシヌクレオシド三リン酸誘導体を用いると、反応はｄＧＴＰを欠失し；５−ＯＨ−ｄＣＴＰを用いると、省かれるヌクレオチドは、ｄＣＴＰである。代表的な反応混合物は、５０ｍＬの総容量中に、以下を含有する：６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．２）、１．０ｍＭジチオトレイトール、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５０μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、５．０μＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰ（比放射能、１０００〜１０，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、ｄＧＴＰのアナログ、２０ユニットのＨＩＶ  ＲＴ、および５μｇのプライム（ｐｒｉｍｅｄ）ＲＮＡテンプレート。インキュベーションは、３０分間３７℃であり、そして取り込みは、酸不溶産物を大規模に洗浄し、そして液体シンチレーションにより計数した後に決定される（ＢａｔｔｕｌａおよびＬｏｅｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４０８６，１９７４）。三リン酸形態のヌクレオシドアナログが新規に合成されたＤＮＡに取り込まれる能力は、基質濃度の関数として、相当する天然のデオキシヌクレオシド三リン酸の能力と直接比較される。このアナログの取り込みは、相補的なデオキシヌクレオチドの取り込みのパーセントとして表される。
【００６６】
ａ．取り込みおよびゲル伸長のためのＲＮＡテンプレートの調製
２つの異なるプライムＲＮＡテンプレートは、取り込み研究およびポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による産物の分析の両方で用いられる。前者は、ｌａｃＺα遺伝子の一部に相補的であるＲＮＡを含有する。ｌａｃＺ遺伝子の一部を用いることにより、ＨＩＶ  ＲＴによるコピーの結果として産生されるヌクレオチド置換（変異）のタイプおよび頻度は、α相補性の原理を用いて測定される（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：５７８７，１９８５）。ＲＮＡは、以前に記載された（ＪｉおよびＬｏｅｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：９５４，１９９２）ようなｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで転写される。５０μＬの容量における転写反応は：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭジチオトレイトール、５００μＭ  ４つのｒＮＴＰのそれぞれ、３μｇの直鎖状ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ、３０ユニットのＴ３  ＲＮＡポリメラーゼおよび２ユニットのＲＮａｓｉｎを含有する。６０分間３７℃でのインキュベーションの後、反応産物は、ＲＮａｓｅ非含有ＤＮアーゼで消化され、そして６０分間インキュベートされる。ＲＮＡは、フェノール／クロロホルムでの抽出により精製され、そしてエタノールで沈澱される。プライムＲＮＡテンプレートは、記載された（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８６８２，１９９０）ような配列（ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＴ
ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ）からなる標識プライマーをアニーリングすることによりアセンブリされる。
【００６７】
取り込みを測定するための代わりのテンプレートは、ＨＩＶ−１（ｅｎｖ−Ｖ−１）のエンベロープタンパク質の一部である。ＲＮＡテンプレートは、エンベロープ転写開始部位から数えて３１７〜５３３の領域に相補的なヌクレオチド配列を含有する。テンプレートは、エンベロープ配列３１７〜３３９および５１３〜５３３（これらの各々は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合配列および５’末端に好ましい転写開始部位を含有する）に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋由来プラスミドｐＭＥ２３５（ＪｉおよびＬｏｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：３２３，１９９４）のＰＣＲ増幅より構築される。オリゴヌクレオチドの配列は、以下のようである：
オリゴＩ（ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＴＡ
ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＣ）およびオリゴＩＩ（ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＡＣＣ）。ＰＣＲ増幅に関する手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。デオキシヌクレオシド三リン酸アナログの取り込みにおける研究のためのＲＮＡエンベロープ遺伝子フラグメントは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により詳細に説明されるようにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成される。
【００６８】
ｂ．哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みの測定
５つの異なる哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼが、同定され、精製され、そして特徴付けられている。これらは、アミノ酸配列、細胞内の位置、および細胞内ＤＮＡ代謝における推定される役割に基づいて、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、と称される（ＦｒｙおよびＬｏｅｂ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。デオキシヌクレオシド三リン酸アナログを取り込むヒトＤＮＡポリメラーゼの能力は、ＨＩＶ  ＲＴによる取り込みを分析するために用いられるＲＮＡテンプレートの配列に相当するＤＮＡテンプレートを用いて決定される。直接的な比較は、ヒトＤＮＡポリメラーゼを用いる三リン酸形態のヌクレオシドアナログの取り込みとＨＩＶ  ＲＴの取り込みとにおいて行う。
【００６９】
ｃ．ＤＮＡ修復の評価
ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＤＮＡ鎖へのヌクレオシドアナログの挿入後、ヌクレオシドアナログのＤＮＡ修復を分析することが望ましくあり得る。この産物は、ＨＩＶ  ＲＴによる第１鎖合成から生じる。このハイブリッドは、感染細胞の細胞質中に存在し、従って、細胞のグリコシラーゼおよびヌクレアーゼによる修復には利用可能でないはずである。細胞内酵素による削除に対するヌクレオチドアナログの感受性を定量するために、特定の位置に放射標識アナログを含有するオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載のプロトコルに基づいて合成される。３０ヌクレオチドの長さのオリゴリボヌクレオチドは、３’テンプレートの末端の最初の１５ヌクレオチドに相補的である１５ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーにハイブリダイズさせる。これは、ＤＮＡポリメラーゼまたはウイルスの逆転写酵素によりコピーされ得る１５の不対ヌクレオチドのストレッチを残す。プライマーは、３’プライマー末端からの下流の最初のヌクレオチドに相補的である標識デオキシリボヌクレオシド三リン酸アナログを取り込むことによる単一の付加工程により伸長される（Ｚａｋｏｕｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：６６１５，１９８４）。伸長されたプライマーは、ＲＮａｓｅとともにインキュベートされ、次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製され、そして塩抽出により分離される。その後、１つのヌクレオチド伸長プライマーは、本来のオリゴリボヌクレオチドテンプレートの新鮮なアリコートに再ハイブリダイズされ、そして全ての相補的なヌクレオシド三リン酸の存在下でＨＩＶ  ＲＴを用いる合成により伸長される。この反応の産物は、フェノール／クロロホルムでの抽出により精製され、そしてエタノールで沈澱される。取り込まれたアナログの修復を定量するために、ヌクレオチドアナログを含有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、植物性血球凝集素の存在下で３日間培養されたヒト末梢血リンパ球から得られたサイトゾル抽出物とともにインキュベートされる。このアナログの除去の比率は、インキュベーションの時間の関数として酸可溶性を与えられた放射能の量により定量される。コントロールテンプレートは、同じ位置の標識非付加ヌクレオチドからなる。同一のアッセイが、ＨＩＶが潜伏する細胞の異なるタイプにおける付加物の除去の分析について用いられ得る。
【００７０】
ｄ．取り込みの比較
精製ＤＮＡポリメラーゼと逆転写酵素との間のヌクレオチドアナログの取り込みの詳細な比較は、ヌクレオチド取り込みのための「マイナス」配列決定ゲルアッセイの改変を用いて実施される。３’末端を３２Ｐで標識した２倍モル過剰量のオリゴデオキシリボヌクレオチド（２０マー）は、ＨＩＶエンベロープ遺伝子（ｅｎｖ−１）の領域のヌクレオチド配列を含有するＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかにハイブリダイズされる。これらのオリゴヌクレオチドテンプレートの合成は、上記に詳細に説明されている。得られる５’−３２Ｐ標識プライマーは、４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の内の３つおよび研究されるべきヌクレオシド三リン酸アナログを含有する反応において伸長される。伸長のために用いられる酵素は、公知の真核生物のＤＮＡポリメラーゼ、異なるＲＮＡ腫瘍ウイルスおよびＨＩＶ  ＲＴ由来の逆転写酵素のそれぞれを含む。ＨＩＶ  ＲＴは、以前に記載のように精製される（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１１６８，１９８８；ＪｉおよびＬｏｅｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：９５４，１９９２）。このアッセイにおいて、反応から省かれるヌクレオチドに相補的であるテンプレートヌクレオチドを通過したプライマーの伸長は、ヌクレオシド三リン酸アナログの取り込みに依存し、そして比例する。
【００７１】
一例として、オリゴヌクレオチドテンプレートプライマー複合体を、ＨＩＶ  ＲＴとともに３０℃にて３０分間、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ，８），２５ｍＭ  ＫＣｌ，６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，５０μＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ、ならびに５−ＯＨ−ｄＣＴＰおよび１．０ユニットのＨＩＶ  ＲＴを含有する１０μＬの総容量とともにインキュベートする。この反応の産物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のクロマトグラフィーにより単離し、そして１５％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルを通す電気泳動により分析する（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３８２１，１９８７）。ヌクレオチドアナログの取り込みの量は、ある位置から次の位置へと配列決定用ゲル電気泳動上で伸長されるオリゴヌクレオチドのパーセントの関数として計算される。取り込みは、オートラジオグラフィー、およびそれに続くデンシトメトリー、または各バンドを切り取り、そして液体シンチレーション分光法による放射能計数のいずれかにより測定される。この方法は、異なるＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素による取り込みおよび伸長の両方の直接的な比較を提供する。
【００７２】
（実施例ＩＩＩ）
（ＨＩＶに対して致命的な変異原性であるヌクレオシドアナログについての試験）
本発明は、一つの局面では、伝搬するウイルスの増殖能を超過するレベルまでＨＩＶに変異を導入するための組成物および方法を提供する。ＨＩＶ  ＲＴを阻害するヌクレオチドアナログの試験に関する刊行されたプロトコルにおいて、ＨＩＶ感染の細胞変性効果を逆転する能力により、抗ウイルス活性を示すヌクレオシドアナログを試験する（Ｐａｕｗｅｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：３０９，１９８８；Ｂａｂａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２３５６，１９９１；Ｂｕｓｓｏら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，４：４４９，１９８８）。本発明は、ウイルスのゲノムにおいて進行性のエラーの蓄積を引き起こすヌクレオシドアナログで、感染個体を処置する。このエラーの蓄積をモニターするために、感染性ウイルス粒子の産生の比率が、ヌクレオシドアナログの存在下で感染細胞における系列継代の関数として分析される。分析されるアナログは、取り込み、鎖延長、ＤＮＡ修復、および変異原性の分析において試験されたヌクレオシド三リン酸と一致する。
【００７３】
Ａ．培養細胞の感染後のＨＩＶの産生
生存可能なＨＩＶの複製の比率は、ヒト末梢血リンパ球の培養において決定される。ヒト末梢血リンパ球は、正常なドナーから得られ、そしてＦｉｃｏｌｌグラジエント分画により分離される。精製細胞は、２０％胎児ウシ血清、抗生物質（Ｌｏｅｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６１：８２７，１９６８）、およびインターロイキン２（Ｂａｂａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２３５６，１９９１）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地において懸濁され、次いで植物性血球凝集素での刺激により複製が誘導される。インキュベーションの３日後、１ｎｇのｐ２４に相当するＨＩＶの種菌は、１．０ｍｌの培養物中の１０６  ＨＰＢＬに添加される（Ｒｏｍｅｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８０６，１９９１）。ＨＩＶ複製のレベルは、キャプシド抗原、ｐ２４（ＭｃＱｕａｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：４５４，１９９０）の定量的ＥＬＩＳＡアッセイ（抗体は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能である）を用いて上清を分析することによるか、または逆転写酵素活性を測定すること（Ｂａｔｔｕｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：８４０４，１９７５；Ｒｅｓｎｉｃｋら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５４：１０２７，１９８６）により培養物中で４日後に測定される。上清は、４〜１０日毎に新鮮な培地に系列的に移され、そしてウイルスの量は、培養物中のヌクレオシドアナログの濃度および継代の数の結果として測定される。ウイルスの収率および感染力は、ヌクレオシドアナログの添加により得られるウイルスの収率および感染力に対するコントロールのパーセントとして表される。
【００７４】
代替の系は、ＭＴ−４細胞（Ｈａｒａｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：５６３，１９８５）においてＨＩＶを増殖させることである。この系では、ウイルス産生は、ポリエチレングリコール（１０％）およびＮａＣｌ（０．１Ｍ）でのウイルスの沈澱により上清において測定される（Ｌａｒｄｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１７３１，１９８９）。ウイルスのペレットは、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．５ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、および５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中に可溶化される。ウイルスの量は、テンプレートプライマーとしてポリｒＣオリゴｄＧを用いて、ＨＩＶ  ＲＴ活性の量により定量される。上清中の感染性ビリオンの産生は、１時間３７℃で、９６−ウェルマイクロタイタープレートにおける上清とＤＥＡＥ−デキストラン−処理標的ＭＴ−２とのインキュベーションおよび巨大なシンシチウム（ｓｙｎｃｙｔｉａ）の形成について各ウェルをモニターすることによりモニターされる（Ｂｕｓｓｏら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．＆Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ４：４４９，１９８８）。
【００７５】
Ｂ．ＨＩＶ  ＲＮＡにおける変異の蓄積
本発明において、ヌクレオシドアナログは、ウイルスゲノム全体にわたってランダム変異を誘導する能力に基づいて、ＨＩＶ感染の処置のために選択される。導入される変異の比率およびタイプは、ＨＩＶゲノムの一部を配列決定することにより決定される。変異はランダムに導入されるので、配列決定の前に、個々のＨＩＶ  ＲＮＡ分子を増幅およびクローン化することがまず必要である。ＨＩＶ  ＲＮＡは、ヌクレオシドアナログの存在の関数としてのウイルスの産生を減少する系列継代の後に感染細胞から単離される。次いで、単離されたＨＩＶ  ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅される。ＰＣＲによるエラーの蓄積を最小化するために、ウイルスのＲＮＡの一部は、マウスの白血病ウイルス逆転写酵素によりコピーされ、次いでｃＤＮＡコピーは、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼにより増幅される。新鮮なＴ７  ＤＮＡポリメラーゼが、各増幅工程の後に添加される。なぜなら、この酵素は、熱に安定ではなく、そしてＰＣＲ反応における９５℃までの加熱により変性されるからである。各サンプルについて、エンベロープ遺伝子または逆転写酵素遺伝子の領域のいずれかをそれぞれ含有する最少の１０のクローンが配列決定される。それぞれの遺伝子セグメント内のヌクレオチド置換の頻度は、配列決定されるヌクレオチドの数の関数として決定される。蓄積された変異の数とＨＩＶ感染力の損失との比較は、それぞれのヌクレオシドアナログの効力を評価するために用いられる。
【００７６】
本発明の特定の実施態様が説明の目的のために本明細書中に記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることは、上述から明らかである。
【図１】
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