(57)【要約】      （修正有）【課題】安全性が高く、食品用途への展開が可能なマンノシルエリスリトールリピッドを製造し、かつＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ又はＭＥＬ‐Ｃを選択的に製造する技術を提供する。【解決手段】サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属及びギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物のいずれかから単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する工程を含む、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属及びギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物のいずれかから単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴とする下記一般式（１）
【化１】
2010041991.tif 000010
（上記一般式（１）においてＲ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜１８の脂肪酸基を表す）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項２】
サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属の植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴とする下記一般式（２）
【化２】
2010041991.tif 000011
（上記一般式（２）においてｍ、ｎは互いに独立して１〜１６の整数である）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド‐Ｂの製造方法。
【請求項３】
上記微生物がウスチラゴ  サイタミネア（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ）であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
上記培養工程にて用いる培地は、糖を炭素源とし、油脂の含有量が０〜８重量％以下であることを特徴とする請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴とする下記一般式（３）
【化３】
2010041991.tif 000012
（上記一般式（３）においてｍ、ｎは互いに独立して１〜１６の整数である）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド‐Ｃの製造方法。
【請求項６】
上記微生物がウスチラゴ  シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属及びアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属のいずれかの植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴とする下記一般式（４）
【化４】
2010041991.tif 000013
（上記一般式（４）においてｍ、ｎは互いに独立して１〜１６の整数である）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド‐Ａの製造方法。
【請求項８】
上記培養工程にて得られた培養液から菌体を取り除き、硫酸アンモニウムを添加して沈殿物を得る濃縮工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食用植物や日常的に接触する植物由来の微生物によりバイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法に関するものである。より具体的には、食用植物や日常的に接触する植物由来の微生物を用いたマンノシルエリスリトールリピッドのうちの１種類を選択的に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）が利用されていた。
【０００３】
近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となっている。現在、一般に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで考慮すると、数千種類にものぼる。親水基・疎水基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じでも分子量や立体構造の違いによって親水性疎水性バランス（ＨＬＢ）の異なる同族体など、あらゆる化合物が開発されており、これらを単一種類で用いるだけでなく、混合して用いることで、幅広い産業分野において要求される性能に対応している。しかしながら、このような合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。従って、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性剤の開発が望まれている。
【０００４】
微生物などが生産する界面活性物質であるバイオサーファクントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品、化粧品、医薬品、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く応用することは、環境調和型の社会を実現し、高機能な製品を提供する上で極めて有意義である。微生物由来のバイオサーファクタントは、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の５つに分類されている。なかでも、糖脂質系の界面活性物質については最もよく研究されており、酵母が生産する糖脂質系の界面活性物質としてカンジダ属酵母によるソホロースリピッド（特許文献１参照）やマンノシルエリスリトールリピッド（非特許文献１から６参照）などが知られている。
【０００５】
マンノシルエリスリトールリピッド（ｍａｎｎｏｓｙｌ  ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｌｉｐｉｄ、以下、「ＭＥＬ」と略記することもある）は、界面活性能以外にも抗微生物活性、白血病細胞、神経系細胞などの細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など多様な機能が知られている。
【０００６】
ＭＥＬはマンノースにエリスリトールと０〜２個の脂肪酸と２個のアセチル基が結合した糖脂質であり、アセチル基の結合位置と数によって、４種類のＭＥＬ（ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃ、ＭＥＬ‐Ｄ）が存在することが知られている。これまで説明したようにＭＥＬの生産については多くの微生物菌株の発見、及び培養技術の改良が成されている。
【０００７】
ＭＥＬの生産方法については、これまで酵母を利用する方法等、多くの報告がされており、生産量向上を目的として菌株の選択、培養条件、培地組成が検討されている。酵母によるＭＥＬ生産に関する報告としては、たとえば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．  Ｂ‐７株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ/Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬを生産した例（非特許文献１及び２参照）、Ｃａｎｄｉａ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ‐３４を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ/Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬを生産した例（非特許文献３及び４参照）、Ｐ．  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｔ‐３４を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬを生産した例（非特許文献５参照）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．  ＳＹ‐１６株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬを生産し、また、２０質量％の植物油から流加培養法により２００時間で１２０ｇ／Ｌ（生産速度：０．６ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬを生産した例（非特許文献６参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓを用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ（生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬを生産した例（非特許文献７参照）などがある。また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油を原料としてＰ．  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｔ‐３４を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることも報告されている（特許文献２参照）。また、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓがＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃの混合物を生産することが知られている（非特許文献１４参照）。
【０００８】
また、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の酵母を用いて、ＭＥＬ‐Ａと、ＭＥＬ‐Ｂと、ＭＥＬ‐Ｃとを選択的に量産する方法が報告されている（例えば、非特許文献８参照）。このように、マンノシルエリスリトールリピッドのバリエーションは大きく拡充され、実用化に向けた研究が展開されている。
【０００９】
ＭＥＬ‐Ａは、これまで説明した微生物の他にも、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｒｕｇｕｌｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｐａｒａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｆｕｊｉｆｏｒｍａｔａを用いて量産可能であることが報告されている（例えば、非特許文献９参照）。
【００１０】
ＭＥＬ‐ＢについてはＫｌｕｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｔｏｕｓ  ｓｐ．Ｉ‐１１（特許文献３参照）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．ＳＹ‐１６（非特許文献６参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓを用いて量産可能であることが知られている。（非特許文献１０）。
【００１１】
ＭＥＬ‐Ｃについては、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｈｕｂｅｉｅｎｓｉｓ（非特許文献１１参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ（非特許文献１２参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｈａｎｘｉｅｎｓｉｓ（非特許文献１３参照）を用いて量産可能であることが報告されている。
【００１２】
このように、多くのＭＥＬ生産微生物の発見に伴って、製造可能なＭＥＬの構造のバリエーションは拡大し、ＭＥＬの製造技術は大きく向上してきている。
【特許文献１】特開２００２−４５１９５（２００２年２月１２日公開）
【特許文献２】特開２００２−１０１８４７（２００２年４月９日公開）
【特許文献３】特開２００４−２５４５９５（２００４年９月１６日公開）
【非特許文献１】T. Nakahara，H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi：J. Ferment. Technol., 61, 19 (1983）
【非特許文献２】H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi：J. Ferment. Technol., 61, 143（1983)
【非特許文献３】D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi：Agric. Biol. Chem., 54, 31 (1990)
【非特許文献４】D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi：Agric. Biol. Chem., 54, 37 (1990）
【非特許文献５】D. Kitamoto, K. Fujishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T.Nakahara：Biotechnol. Lett., 14, 305 (1992)
【非特許文献６】金，伊炳大，桂樹徹，谷吉樹：平成１０年日本生物工学会大会要旨，p.195
【非特許文献７】Rau U, Nguyen LA, Roeper H, Koch H, Lang S.: Appl Microbiol Biotechnol., 68(5),607-13 (2005)
【非特許文献８】Konishi M, Morita T, Fukuoka T, Imura T, Kakugawa K, Kitamoto D.: Appl Microbiol Biotechnol., 75(3),521-31 (2007)
【非特許文献９】Morita T, Konishi M, Fukuoka T, Imura T, Kitamoto HK, Kitamoto D.: FEMS Yeast Res., 7 (2),286-92 (2007)
【非特許文献１０】Fukuoka T, Morita T, Konishi M, Imura T, Kitamoto D.: Carbohydr Res., 343(3):555-60 (2008)
【非特許文献１１】Konishi M, Morita T, Fukuoka T, Imura T, Kakugawa K, Kitamoto D.: Appl Microbiol Biotechnol., 78(1),37-46 (2008)
【非特許文献１２】Morita T, Konishi M, Fukuoka T, Imura T, Yamamoto S, Kitagawa M, Sogabe A, Kitamoto D.: J Oleo Sci., 57(2),123-31 (2008)
【非特許文献１３】Fukuoka T, Morita T, Konishi M, Imura T, Kitamoto D.: J Oleo Sci., 56(8),435-421 (2007)
【非特許文献１４】Spoeckner S, Wray V, Nimtz M, Lang S.: Appl Microbiol Biotechnol., 51,33-39 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ところで、これらＭＥＬ生産微生物は様々な自然環境中から単離されたものであるため、人体に対する病原性は知られていないが、その安全性に対する知見はほとんどない。特に、微生物生産物を食品用途等へ展開するためには、使用する微生物の単離源が重要視される。例えば、酒やパンの製造に関わる出芽酵母、乳酸菌や枯草菌（納豆菌）などは、食品分野で活躍する微生物として一般的によく知られている。これらの微生物は全て食品中から容易に単離可能な微生物である。
【００１４】
しかしながら、上述したＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ属の単離源は不明であるため、これらに由来するＭＥＬは食用に適しているとは言い難い。
【００１５】
そこで、食用植物又は日常的に接触する植物群から単離した微生物を用いたＭＥＬ製造技術を開発することで用途範囲は拡大し、かつ安全性の面で大きな利点を得られることが期待される。
【００１６】
また、ウスチラゴ  メイディス（Ｕ．  ｍａｙｄｉｓ）はトウモロコシに感染する植物病原菌であり、Ｕ．  ｍａｙｄｉｓが感染したトウモロコシは、ウイトラコーチェという名で一般的に食されている。特に、メキシコでは伝統的な高級食材として食されている。しかし、Ｕ．  ｍａｙｄｉｓはＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃだけでなく、セロビオースリピッドも同時に生産するため、それぞれの成分を選択的に生産することは実用上、不可能である。しなしながら、ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃはそれぞれ物性が異なるため、それぞれを選択的に製造することができれば、新たな食品用途への利用が期待される。
【００１７】
以上の状況から、日常的に接触する安全性の高いことが判明している植物群又は食用植物群からＭＥＬ生産微生物を単離し、さらにＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのいずれかを選択的に生産できる方法が開発されれば、ＭＥＬの用途拡大に多大な影響を与え、ひいてはバイオサーファクタントの普及に繋がるものと期待される。
【００１８】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、安全性が高く、食品用途への展開が可能なマンノシルエリスリトールリピッドを製造し、かつＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ又はＭＥＬ‐Ｃを選択的に製造する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、食用植物又は日常的にヒト又は動物が接触する（物理的に接触したり、動物種によっては口に含んだりする）植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属に属する微生物を培養することで、ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのいずれかを選択的に生産することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２０】
また、当該微生物が生産するＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ及びＭＥＬ‐Ｃの化学構造を調べると、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の微生物が生産するＭＥＬと同様の構造を有しており、その物性・機能はシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の微生物が生産するＭＥＬと同様であった。
【００２１】
つまり、本発明者らは、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属に属するＭＥＬ生産菌の単離源として、食用植物又は日常的にヒト又は動物が接触する植物の中から特定の植物を見出し、かつこれらのＭＥＬ生産菌を用いれば、従来報告されているＭＥＬと同様の物性・機能を有するＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのいずれかを選択的に生産することができることを見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【００２２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００２３】
本発明に係る下記一般式（１）
【００２４】
【化１】
2010041991.tif 000002
【００２５】
（上記一般式（１）においてＲ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜１８の脂肪酸基を表す）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属及びギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物のいずれかから単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴としている。
【００２６】
また、本発明に係る下記一般式（２）
【００２７】
【化２】
2010041991.tif 000003
【００２８】
（上記一般式（２）においてｍ、ｎは互いに独立して１〜１６の整数である）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド‐Ｂの製造方法は、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属の植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴としている。
【００２９】
さらに、本発明に係るＭＥＬ‐Ｂの製造方法では、上記微生物がウスチラゴ  サイタミネア（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ）であることがより好ましい。
【００３０】
さらに、本発明に係るＭＥＬ‐Ｂの製造方法では、上記培養工程にて用いる培地は糖を炭素源とし油脂の含有量が０〜５重量％以下であることがより好ましい。
【００３１】
また、本発明に係る下記一般式（３）
【００３２】
【化３】
2010041991.tif 000004
【００３３】
（上記一般式（３）においてｍ、ｎは互いに独立して１〜１６の整数である）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド‐Ｃの製造方法は、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴としている。
【００３４】
さらに、本発明に係るＭＥＬ‐Ｃの製造方法では、上記微生物がウスチラゴ  シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）であることがより好ましい。
【００３５】
また、本発明に係る下記一般式（４）
【００３６】
【化４】
2010041991.tif 000005
【００３７】
（上記一般式（４）においてｍ、ｎは互いに独立して１〜１６の整数である）
で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド‐Ａの製造方法は、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属及びアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属のいずれかの植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含むことを特徴としている。
【００３８】
また、本発明に係る製造方法は、上記培養工程にて得られた培養液から菌体を取り除き、硫酸アンモニウムを添加して沈殿物を得る濃縮工程をさらに含むことがより好ましい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明に係る製造方法は、上述のようにサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属及びギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物のいずれかから単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する工程を含んでいるので、安全性が高く、食品用途等への展開が可能なマンノシルエリスリトールリピッドを製造し、かつＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ又はＭＥＬ‐Ｃを選択的に製造することができるという効果を奏する。
【００４０】
また、本発明によれば、これまでに報告されたＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃの３種類のうちのいずれかを選択的に生産可能なシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の微生物、及び、上記３種類のうちのいずれかを選択的に生産することができないウスチラゴ  メイディス（Ｕ．  ｍａｙｄｉｓ）とは異なり、食用植物又は日常的に接触する植物を単離源とする微生物を使用して、かつ、３種類のＭＥＬのいずれかを選択的に生産できる。つまり、本発明により、安全性が高い上記３種類のいずれかのＭＥＬを、新たな食品用途に展開することが可能となった。
【００４１】
特に、本発明にて生産するＭＥＬ‐Ｂ及びＭＥＬ‐ＣはＭＥＬ‐Ａに比べて水溶性が高く、期待される応用範囲がより広いことから、ＭＥＬの構造・機能的バリエーションの拡充に貢献するだけでなく、用途展開の効率化にも貢献できるという更なる効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４３】
本発明に係る上記一般式（１）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属及びギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物のいずれかから単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する工程を含めばよい。
【００４４】
サトウキビ属、リンゴ属、シソ属、アブラナ属及びギョウギシバ属の植物は、いずれも食用植物であるか、又は日常的に接触する植物である。よって、これらの植物から単離されたウスチラゴ属の微生物は安全性が高いといえる。なお、本明細書において「植物から単離される」とは、植物中、植物の表面、植物の根圏などの植物から単離されることを意味し、具体的には植物中等から、ここに生息する菌を取得することを意味する。
【００４５】
サトウキビ属の植物の具体例としては特に限定されないが、サッカリウム  オフィシナルム（Ｓ．  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、サッカリウム  スポンタネウム（Ｓ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、サッカリウム  ロブスツム（Ｓ．  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、サッカリウム  バーバリ（Ｓ．  ｂａｒｂｅｒｉ）、サッカリウム  サイネンセ（Ｓ．  ｓｉｎｅｎｓｅ）、サッカリウム  エヂュール（Ｓ．  ｅｄｕｌｅ）等が挙げられる。中でもサッカリウム  オフィシナルムが好ましい。
【００４６】
なお、ウスチラゴ属の微生物は感染する宿主の種類によって分類されているため、サトウキビから単離されたウスチラゴ属の微生物は全てＵｓｔｉｌａｇｏ  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａである。同様に、後述するバミューダグラスから単離されたウスチラゴ属の微生物は全てＵｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓである。
【００４７】
リンゴ属の植物の具体例としては特に限定されないが、リンゴ（Ｍ．  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、クラブアップル（Ｍ．  ｐｕｍｉｌａ）、ヒメリンゴ（Ｍ．  ｂａｃｃａｔａ）等が挙げられる。中でもヒメリンゴ（Ｍ．  ｂａｃｃａｔａ）が好ましい。
【００４８】
シソ属の植物の具体例としては特に限定されないが、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。
【００４９】
アブラナ属の植物の具体例としては特に限定されないが、ミズナ（Ｂ．  ｒａｐａ）、チンゲンサイ（Ｂ．  ｃｈｉｎｇｅｎｓａｉ）、ハクサイ（Ｂ．  ｈａｋｕｓａｉ）、カラシナ（Ｂ．  ｋａｒａｓｈｉｎａ）、コマツナ（Ｂ．  ｋｏｍａｔｓｕｎａ）等が挙げられる。中でも、ミズナ（Ｂ．  ｒａｐａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｎｉｐｐｏｓｉｎｉｃａ）が好ましい。
【００５０】
ギョウギシバ属の植物の具体例としては特に限定されないが、バミューダグラス（ギョウギシバ、Ｃ．  ｄａｃｔｙｌｏｎ）、アフリカギョウギシバ（Ｃ．  ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎｓｉｓ）、マクニスバーミューダグラス（Ｃ．  ｍａｂｅｎｎｉｓｉｉ Ｈｕｒｃｏｍｂｅ）、オニギョウギシバ（Ｃ．  ｐｌｅｃｔｏｓｔａｃｈｙｓ）、キノドン  インコンプレツス（Ｃ．  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｕｓ）、等が挙げられる。中でもバミューダグラスが好ましい。
【００５１】
また、これらの植物から単離されたウスチラゴ属の微生物はＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃの３種のＭＥＬのうちのいずれかを選択的に生産することができる。
【００５２】
本明細書において「選択的に生産する」とは、生産する対象物が複数種類想定し得る場合、そのうちの一つの対象物を他の対象物に比べて多く生産ことを意味する。具体的には、生産する上記一般式（１）で表されるＭＥＬの全量に対して、８５重量％以上を占める割合にて、３種のＭＥＬのうちの１種を製造することを意味する。
【００５３】
〔１．植物からの単離方法〕
上述した各植物からウスチラゴ属の微生物を単離する方法としては特に限定されない。従来公知の方法を適用してもよい。例えば、植物を破砕して水又は適切な緩衝液に懸濁させ、懸濁液を栄養塩固形培地に塗布し、形成されたコロニーをＭＥＬ合成確認用培地に植えて、ＭＥＬ形成能を有する菌株を単離した上で、従来公知の同定方法によりウスチラゴ属であることを確認してもよい。また、植物を破砕して、栄養塩液体培地に混合して培養した後、ＭＥＬの生産が確認できた液体培地を栄養塩固形培地に塗布して、形成されたコロニーを合成確認用培地に植えて、ＭＥＬ形成能を確認した上で、ウスチラゴ属か否かを同定してもよい。ＭＥＬ合成確認用培地としてはＭＥＬの合成を確認できるものであれば特に限定されないが、例えば、培地に大豆油等の油脂を混合しておけばよい。当該油脂が乳化するか否かでＭＥＬの形成を確認することができる。
【００５４】
〔２．本発明に係るＭＥＬ‐Ｂの製造方法に用いる微生物〕
本発明に係る上記一般式（２）で表される構造を有するＭＥＬ‐Ｂの製造方法は、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属の植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含めばよい。
【００５５】
つまり、本発明に係るＭＥＬ‐Ｂの製造方法では、これまでの説明で例示した植物のうち、サトウキビ属の植物から単離されたウスチラゴ属の微生物を用いるとよい。
【００５６】
サトウキビ族の植物から単離されたウスチラゴ属の微生物の具体例としては、特に限定されないが、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａが挙げられる。この微生物はマンノシルアルジトールリピッド生産微生物として知られていなかったものであるが、本発明者等により、シュードザイマ  アンタクチカ等の既知のマンノシルアルジトールリピッド生産菌と同等の生産性を有することが初めて確認されたものである。しかも、ウスチラゴ  サイタミネアはサトウキビから分離された微生物であり、マンノシルアルジトールリピッドの中のＭＥＬ‐Ｂのみを選択的に生産することができる。
【００５７】
Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａは従来公知の方法でサトウキビ属の植物から単離して得ればよいが、ＮＢＲＣ３２７３０株を用いてもよい。ＮＢＲＣ３２７３０株を用いれば極めて高効率にＭＥＬ‐Ｂを選択的に生産することができる。また、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａを培養する際は、炭素源として油脂を用いずに、糖を用いればよい点で有利である。即ち、従来公知のＭＥＬ生産菌では炭素源として油脂を含む培地で培養する必要があった。これでは、培養後に油脂を除去しＭＥＬを精製する必要があったが、これには煩雑な作業を要した。しかし、糖を炭素源として、油脂を含まず（含んだとしても炭素源の５重量％以下）であれば、容易に精製できるので、高純度のＭＥＬ‐Ｂを簡便に製造することができる。
【００５８】
〔３．本発明に係るＭＥＬ‐Ｃの製造方法に用いる微生物〕
本発明に係る上記一般式（３）で表される構造を有するＭＥＬ‐Ｃの製造方法は、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属の植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含めばよい。
【００５９】
つまり、本発明に係るＭＥＬ‐Ｃの製造方法では、これまでの説明で例示した植物のうち、ギョウギシバ属の植物から単離されたウスチラゴ属の微生物を用いるとよい。ギョウギシバ属の植物から単離されたウスチラゴ属の微生物の具体例としては、特に限定されないが、ウスチラゴ  シノドンティス（Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）が挙げられる。ウスチラゴ  シノドンティスはバミューダグラスから分離された微生物であり、ＭＥＬのうちのＭＥＬ‐Ｃを選択的に生産することができる。なお、バミューダグラスは、グラウンドや庭に敷き詰められるシバであり、安全かつ日常的に接触頻度の高い植物である。
【００６０】
ウスチラゴ  シノドンティスは従来公知の方法でギョウギシバ属の植物から単離して得ればよいが、ＮＢＲＣ７５３０株を用いてもよい。ＮＢＲＣ７５３０株を用いれば極めて高効率にＭＥＬ‐Ｃを選択的に生産することができる。
【００６１】
〔４．本発明に係るＭＥＬ‐Ａの製造方法に用いる微生物〕
本発明に係る一般式（４）で表される構造を有するＭＥＬ‐Ａの製造方法は、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属及びアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属のいずれかの植物から単離されたウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を培養する培養工程を含めばよい。
【００６２】
つまり、本発明に係るＭＥＬ‐Ａの製造方法では、これまでの説明で例示した植物のうち、リンゴ属、シソ属及びアブラナ属のいずれかの植物から単離されたウスチラゴ属の微生物を用いればよい。当該微生物は、従来公知の方法でリンゴ属、シソ属及びアブラナ属の植物から単離して得ればよい。
【００６３】
〔５．培養工程〕
上述した本発明に係るＭＥＬの製造方法、ＭＥＬ‐Ａの製造方法、ＭＥＬ‐Ｂの製造方法、ＭＥＬ‐Ｃの製造方法（なお、説明の便宜のため、これらの製造方法の総称として、単に「本発明に係る製造方法」と表記することもある）における、培養工程については、従来公知の方法でそれぞれの発明におけるウスチラゴ属の微生物を培養すればよい。
【００６４】
培養に用いる培地としては、ウスチラゴ属がＭＥＬを生産する条件で培養可能なものであれば特に限定されない。ウスチラゴ属を培養すると通常ＭＥＬを生産するので、一般にウスチラゴ属等の酵母の培養に用いられる培地を用いればよい。例えばＹＰＤ培地（例えば水１Ｌにイーストエキストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ及びグルコース２０ｇを溶解させて作製する）等の酵母に対して一般に用いられる培地を使用することができる。
【００６５】
また、培養に用いる培地には油脂を添加してもよい。油脂を添加する場合、培地中の油脂の含有量としては、特に限定されるものではないが、０〜８重量％以下が好ましく、０〜５重量％以下がさらに好ましい。油脂は培養開始時にその全量を添加しても、培養中に連続的または間欠的に添加してもよい。油脂の具体的な種類としては、植物油脂又は動物油脂等のいずれでもよく、目的に応じて適宜選定することができる。植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、大豆油が好ましい。動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。
【００６６】
培地に添加する油脂類以外の他の成分としては、当該技術分野で通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、炭水化物（グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等）、アルコール類（エタノール、プロパノール等）が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。また、上記の炭水化物、有機酸、窒素源を含む植物体の搾汁（例えば、サトウキビ、トウモロコシ、穀類、果実など）も炭素源および窒素源を含む成分として使用可能である。
【００６７】
ウスチラゴ  サイタミネアを培養する場合、油脂を添加しなくても好適にＭＥＬ‐Ｂを生産することができる。培地に油脂を含ませない場合、炭素源としては糖を用いることが好ましい。糖としては、グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等の多糖が単独であるいは二種以上を組み合わせて用いられる。より好ましくは、スクロース、グルコース、フルクトース、マンノースのいずれかが単独で用いられる。培地中の糖の含有量としては、５〜２０重量％が好ましい。油脂類を添加しない場合、培養後、ＭＥＬの精製が容易に行なえるという利点等がある。なお、当該利点から、ウスチラゴ  サイタミネアを培養する場合、油脂を含有しない培地で培養することが好ましいが、油脂を培地に含有させる場合であっても５重量％以下とすることが、容易に精製できることから好ましい。つまり、炭素源として糖を用いる場合、油脂の含有量は０〜８重量％以下であることが精製の観点から好ましく、０〜５重量％以下がさらに好ましい。
【００６８】
培養温度は、２０〜３０℃、好ましくは２２〜２８℃である。培養日数としては、ＭＥＬの生産量に応じて適宜設定すればよいが、３〜２０日間が好ましい。培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。良好な微生物の生育及びＭＥＬの生産のためには、培養液に酸素を供給することが好ましく、そのためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するか、振とう培養を行なえばよい。
【００６９】
本発明において、例えば、前記ウスチラゴ  サイタミネア（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ）又はウスチラゴ  シノドントィス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉａ）を用いてＭＥＬ‐Ｂ又はＭＥＬ‐Ｃを生産する場合、増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりのマンノシルエリスリトールリピッド生産量が高くなるため好ましい。そのため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これを本培養の培地に接種して培養を行なうことが好ましい。例えば、種培養、本培養及びＭＥＬ生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における、具体的な培地組成、培養条件を例示すると以下のとおりである。
【００７０】
グルコース１０〜５０ｇ／Ｌ、酵母エキス１〜２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１〜５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地２ｍＬが入った試験管に、保存菌株を１白金耳接種し、２２〜２８℃で１〜３日振とう培養を行なう（種培養）。次に、２０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは５０〜１００ｇ／Ｌの植物油脂等の油脂類を加えた上記と同じ組成の液体培地５０〜１００ｍＬの入った坂口フラスコに上記の種培養を行った培養液を接種して、２２〜２８℃で３〜７日間振とう培養を行なう(本培養）。さらに、上記の本培養と同じ組成の液体培地１〜２Ｌが入ったジャーファメンターに上記の本培養を行った培養液を接種して、２２〜２８℃で１〜２Ｌ／分の通気速度と６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度で培養する（ＭＥＬ生産培養）。このときの培養温度は２２〜２８℃、培養時間は、７〜２８日間である。この培養においては、培養途中から油脂類を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を５０〜１００ｇ／Ｌに保持することが好ましい。
【００７１】
微生物菌株の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地１Ｌあたり、１０〜２００ｍＬ、好ましくは５０〜１００ｍＬの種培養液あるいは本培養液中に含まれる量であればよい。
【００７２】
本発明に係る製造方法における、培養工程は、培養液中の所望のＭＥＬ生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中のＭＥＬをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行なうことが好ましい。
【００７３】
培養液中に蓄積されたＭＥＬは、培養終了後、培養液を抽出することによって取得できる。
【００７４】
抽出は、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて行なう。抽出は当該分野において通常行われる方法に従って行なえばよく、例えば、培養液１Ｌあたり０．５〜１．５Ｌ程度の有機溶媒を用いて１〜数回抽出操作を行ない、酢酸エチル層を合わせて溶媒を留去する。
【００７５】
酢酸エチル抽出物に含まれるＭＥＬを分画するには、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分離精製を行なう。酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンを溶出液として用い、当該抽出物中の成分を分離精製する。クロロホルムのみを流した後、クロロホルムとアセトンの混合液で当該抽出物中の成分を溶出する。この時、クロロホルムとアセトンの混合液中におけるアセトンの割合は、段階的に上げていく。例えば、９：１から始め、次に、８：２あるいは７：３としていく。各溶出液は収集し、ＴＬＣにて精製度を確認する。
【００７６】
また、本発明に係る製造方法においては、抽出する前に濃縮を行なってもよい。濃縮方法としては特に限定されないが、上記培養工程にて得られた培養液から菌体を取り除き、硫酸アンモニウムを添加して沈殿物を得る濃縮工程を行なうことが好ましい。この沈殿物中にＭＥＬが大量に濃縮されているので、当該沈殿物を上述の抽出に供する等、有機溶剤を用いてＭＥＬ‐Ｂを回収すれば、高純度なＭＥＬ‐Ｂを容易に回収できる。特に、工場等の大規模スケールの場合、濃縮技術は保管及び運搬のみでなく有機溶剤の使用量を削減するという観点からも重要な技術である。この濃縮工程によればＭＥＬを容易に回収することができる。
【００７７】
添加する硫酸アンモニウムの濃度としては、特に限定されないが、例えば、培養液に対して１０質量％以上、３０質量％以下にするとよい。
【００７８】
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物（例えば、菌体破砕物）などをいう。
【００７９】
微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖（アセチルセルロース、アガロース）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物）、合成高分子（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖（アルギン酸、カラギーナン）、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【００８０】
〔６．ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのいずれかを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドの用途〕
上述した本発明に係る製造方法によれば、ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのいずれかを選択的に製造することができる。これにより、ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのいずれかを主成分とするＭＥＬを得ることができるともいえる。なお、主成分とは、ＭＥＬ‐Ａ、Ｂ、Ｃのうちの１種において、他の２種の量に比べて高い含有量で含まれているものを意味する。
【００８１】
上記の方法により得られたマンノシルエリスリトールリピッドの主成分であるＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ又はＭＥＬ−Ｃの構造は、シュードザイマ属の酵母が生産する既知のＭＥＬと同じである。これらＭＥＬは、温度範囲が室温から７０℃まで、濃度範囲が０．０００１％から９０％までの幅広い条件下でリオトロピック液晶を形成することが可能である。リオトロピック液晶は、高濃度の水溶性成分と油溶性成分の双方を内包安定化できるという性質を有している。従って、当該マンノシルエリスリトールリピッドは、食品等の種々の組成物に含有させることにより、その界面活性作用により主成分の分散性、製品の酸化安定性向上をはかることができる。食品の形態は特に限定されないが、マンノシルエリスリトールリピッドの生理活性を活用した機能性食品・動物飼料などが挙げられる。
【００８２】
また前記のとおり、マンノシルエリスリトールリピッドは界面活性能以外にも抗微生物活性、細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など種々の生理活性作用を有する。従って、ＭＥＬ、公知の種々の方法にて各種製剤形態に調製し、それ自体を有効成分とする医薬（例えば、抗癌剤など）として用いることができる。各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００８３】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００８４】
〔実施例１〕
（１：ＭＥＬ生産菌の探索）
ウスチラゴ属はトウモロコシ、サトウキビ、シバ、ススキといった植物体中に生息する糸状菌であり、人類が生活の中で日常的に接触してきた微生物群である。ウスチラゴ属に属する微生物は５００種以上存在するが、そのうちトウモロコシから分離されるＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓのみがバイオサーファクタント生産菌として知られていた。Ｕ．  ｍａｙｄｉｓがＭＥＬ生産能を有することは知られているが、ＭＥＬのうち、ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ及びＭＥＬ‐Ｃを混合物として生産するので、ＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ又はＭＥＬ‐Ｃのいずれかを選択的に製造することはできない。そこで、全くバイオサーファクタント生産能は知られていないが、食用植物あるいは日常的に接触頻度の高い植物から単離された微生物に着目し、油脂含有培地中で培養し、それらの中からバイオサーファクタント生産微生物の探索を試みた。
【００８５】
本実施例では、サトウキビ属及びギョウギシバ属の植物から単離されたウスチラゴ属の微生物を用いた。具体的にはサトウキビ属由来のウスチラゴ属の微生物としてＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０を用いた。また、ギョウギシバ属由来のウスチラゴ属の微生物として、Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ  ＮＢＲＣ７５３０及びＮＢＲＣ９７２７を用いた。
【００８６】
（２：Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓの培養）
（２−ａ：種培養）
保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいた上記のＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓとＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａを、グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地２ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し２５℃で振とう培養を２日間行なった。
【００８７】
（２−ｂ：本培養）
上記２−ａで得られた菌体培養液を、４０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地２０ｍＬが入った坂口フラスコに接種し、振とう培養を２５℃にて７日間行なった。
【００８８】
それぞれの微生物を培養して得た培養液の酢酸エチル抽出液を薄層クロマトグラフィー分析した。この結果を図１に示す。図１は、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓの培養液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す。薄層クロマトグラフィーについては、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ（Ｗａｋｏ社製）を用い、展開溶媒としてはクロロホルム：メタノール：７Ｎアンモニア＝６５:１５:２とした。検出は、展開後のプレートにアンスロン試薬を吹き付け、１１０℃で５分間加熱した。
【００８９】
なお、比較のためＭＥＬの標準サンプル及びＵ．  ｍａｙｄｉｓＮＢＲＣ５３４６及びＮＢＲＣ６９０７から得たＭＥＬを薄層クロマトグラフィーに供した。標準サンプルとしてはシュードザイマ  アンタクチカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）ＪＣＭ１０３１７株を、２−ａ及びここに記載した方法と同じ方法で種培養及び本培養して、原料油脂等の不純物を取り除いて得た。Ｕ．  ｍａｙｄｉｓＮＢＲＣ５３４６及びＮＢＲＣ６９０７由来のＭＥＬについても、同様にして得た。これらの標準サンプル、ＮＢＲＣ５３４６及びＮＢＲＣ６９０７由来のＭＥＬを薄層クロマトグラフィーに供した。図１のレーンＳが標準サンプルを薄層クロマトグラフィーに供した結果を示している。
【００９０】
図１に示すように、両株ともＭＥＬを生産した。Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａはＭＥＬ‐Ｂを選択的に生産したことが確認できた（図１、レーンＡ）。また、Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓはＭＥＬ‐Ｃを選択的に生産したことが確認できた（図１、レーンＢ１及びＢ２）。以上の結果から、Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓはＭＥＬ‐Ｃのみを選択的に生産し、また、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａはＭＥＬ‐Ｂのみを選択的に生産することは明らかである。
【００９１】
（３：Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓにより生産されるＭＥＬの構造解析）
（３‐ａ：精製標品の高速液体クロマトグラフィーによる分析）
上記２−ａ及び２−ｂと同じ方法でＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏの培養を行ない、培養終了後の培養液を採取し、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル可溶分中のＭＥＬを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて検出した。結果を図２に示す。図２はＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓが生産するＭＥＬを高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を示す図である。なお、図２の各サンプルの結果の上に記載されている「ＭＥＬ‐Ａ：Ｂ：Ｃ」は、培養液中に含まれていたＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃの重量比である。また、比較のため、上記２−ｂで用いた標準サンプル及びＵ．  ｍａｙｄｉｓ  ＮＢＲＣ５３４６から得たＭＥＬを同様にＨＰＬＣに供して検出した。高速液体クロマトグラフィーによる検出には、ＤＰ‐８０２０（ＴＯＳＯＨ社製）を用いた。カラムとしては、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＳＩＬ  １００Ａ  ５μｍ、４．６×２５０ｍｍ（ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、クロロホルムとメタノールを１００：０〜０：１００のグラジエントをかけて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。
【００９２】
なお、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａについては、大豆油の代わりにグルコース１００ｇ／Ｌを培地に加えて培養することで得られたＭＥＬ‐ＢもＨＰＬＣによる検出に供した。
【００９３】
図２に示すように、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａから得られたＭＥＬのピークは、ＪＣＭ１０３１７株とは異なった。また、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａから得られたＭＥＬのメインピークは、ＪＣＭ１０３１７株から得たＭＥＬ中のＭＥＬ‐Ｂとのピークと一致した。Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａは、高いＭＥＬ‐Ｂ生産能を有し、一週間で約９．６ｇ／ＬのＭＥＬ‐Ｂを生産した。なお、ＭＥＬ−Ｂおよび後述のＭＥＬ−Ｃの生産量は、精製したＭＥＬ−ＢおよびＭＥＬ−Ｃを用いて作成した検量線を用い、ＨＰＬＣの分析結果から定量した。
【００９４】
また、図２に示すように、Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓから得られたＭＥＬのピークはＪＣＭ１０３１７株から得たＭＥＬのピークとは異なった。また、Ｕ．  ｃｕｎｏｄｏｎｔｉｓから得たＭＥＬのメインピークは、ＪＣＭ１０３１７株から得たＭＥＬ中のＭＥＬ‐Ｃのピークと一致した。Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓは、高いＭＥＬ‐Ｃ生産能を有し、一週間で約１．４ｇ／ＬのＭＥＬ‐Ｃを生産した。
【００９５】
なお、Ｕ．  ｍａｙｄｉｓ  ＮＢＲＣ５３４６については、ＭＥＬ‐Ａ：ＭＥＬ‐Ｂ：ＭＥＬ‐Ｃ：ＣＬｓの重量比は２１：０：９：２３であり、ＭＥＬ中の７割程度しかＭＥＬ‐Ａを生産せず、ＭＥＬの３種類のうちの１種類を選択的に製造するものではないことが分かった。また、ＭＥＬの生産の際、セロビオースリピッド（ＣＬｓ）を大量に混合することが示された。
【００９６】
（３‐ｂ：ＮＭＲによる構造解析）
Ｕ．  ｃｉｔａｍｉｎｅａの培養液の酢酸エチル可溶分から、主成分であるＭＥＬ‐Ｂをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製分離した後、１Ｈと１３ＣＮＭＲによる構造解析を行なった。結果を表１に示す。また、標準的なＭＥＬの構造解析結果の例としてＰ．  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ＪＣＭ  １０３１７株が生産するＭＥＬの分析結果も表１に示す。表１によれば、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａが生産する物質は典型的なＭＥＬ‐Ｂの構造を有することが確認できた。なお、ＮＭＲによる測定ついては、ＭＥＬ精製標品重クロロホルム中に溶解し、３０℃で、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ（４００ＭＨｚ）を用いて行なった。
【００９７】
【表１】
2010041991.tif 000006
【００９８】
また、Ｕ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓの培養液の酢酸エチル可溶分から、主成分であるＭＥＬ‐Ｃをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製分離した後、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲによる構造解析を行った。結果を下記表２に示す。また、標準的なＭＥＬの構造解析結果の例としてＰ．  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ＪＣＭ  １０３１７株が生産するＭＥＬの分析結果も表２に示す。表２によれば、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａが生産する物質は典型的なＭＥＬ‐Ｂの構造を有することが確認できた。
【００９９】
【表２】
2010041991.tif 000007
【０１００】
〔実施例２〕
（１：微生物の単離）
本実施例では、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属（ミズナ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属及びシソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）属の植物からそれぞれウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物を単離した。
【０１０１】
具体的にはヒメリンゴ（Ｍ．  ｂａｃｃａｔａ）、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、ミズナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｎｉｐｐｏｓｉｎｉｃａ）の切片を培養液（４０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌ）中に浸し、２５℃で３〜７日間振とう培養し、培地中の大豆油の乳化を指標として、バイオサーファクタント生産性を判定した。生育してきた微生物を、寒天培地（４０ｇ/Ｌのグルコースと酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌ、及び寒天３０ｇ/Ｌ）上で単離した後、さらに、得られた微生物を２５℃で３〜７日間振とう培養し（培養液：４０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌ）、培養液中に分泌生産されたＭＥＬを薄層クロマトグラフィーにて検出することで、ＭＥＬ生産微生物を単離した。
【０１０２】
なお、得られた微生物のＩＴＳ１領域における約２６０ｂｐの配列をＢＬＡＳＴ解析により比較した結果、より具体的には、ウスチラゴ  ツラガナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒａｇａｎａ）の近縁種であることが分かった。ＩＴＳ１領域のＰＣＲによる増幅は、プライマーＡ（配列番号１）及びプライマーＢ（配列番号２）を用いて行なった。ＰＣＲのテンプレートとして用いた上記微生物のゲノムＤＮＡは、ＧｅｎＴＬＥ(ＴａＫａＲａ社製)を用いて抽出した。その後、増幅した遺伝子断片の塩基配列を解析した。その結果を配列番号３（ミズナ由来の微生物Ａ１）、配列番号４（ヒメリンゴ由来の微生物Ｂ１）、配列番号５（シソ由来の微生物Ｃ１）、配列番号６（シソ由来の微生物Ｃ２）、配列番号７（シソ由来の微生物Ｃ３）に示す。得られた遺伝子配列について、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ解析によって相同性検索を行ったところ、ウスチラゴ  ツラガナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒａｇａｎａ）の対応するＩＴＳ１領域の塩基配列と９４％一致した。このことから、本実施例で同定を行なった微生物はウスチラゴ属の微生物（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐ．）であることが分かった。
【０１０３】
（２：培養及び生産されたＭＥＬの確認）
本実施例２で得た微生物を使用し、また、大豆油の代わりにオリーブ油を用いた以外は、実施例１の２−ａ及び２−ｂに記載の方法で微生物の培養を行なった。
【０１０４】
次に、得られたＭＥＬを実施例１に記載の方法と同じ方法で薄層クロマトグラフィーに供した。結果を図３に示す。図３は本実施例で得たＭＥＬを薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。図３に示すように、本実施例で得た微生物はいずれもＭＥＬ‐Ａを選択的に生産することが確認された。
【０１０５】
また、上記微生物Ｃ１から実施例１と同じ方法で得た酢酸エチルの抽出液をＨＰＬＣ解析に供した。結果を図４に示す。なお、図４に記載されている「ＭＥＬ‐Ａ：Ｂ：Ｃ」は、培養液中に含まれていたＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃの重量比である。図４に示すように、上記のウスチラゴ  ツラガナ近縁種から得られたＭＥＬのピークはＪＣＭ１０３１７株から得たＭＥＬ−Ａのピークと一致した。上記のウスチラゴ  ツラガナの近縁種は、高いＭＥＬ‐Ａ生産能を有し、一週間で約１１．６ｇ／ＬのＭＥＬ‐Ａを生産した。なお、ＭＥＬ−Ａの生産量は、ＭＥＬ−Ａの精製標品を用いて作成した検量線を用い、ＨＰＬＣの分析結果から定量した。また、ＭＥＬ‐Ａの化学構造は、実施例１の３−ａ及び３−ｂに記載の方法に従って行ない、その結果を表３に記載した。表３によれば、上記のウスチラゴ  ツラガナ近縁種が生産する物質は典型的なＭＥＬ‐Ａの構造を有することが確認できた。
【０１０６】
【表３】
2010041991.tif 000008
【０１０７】
〔実施例３〕
本実施例では、様々な炭素源を用いたＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０の培養を行ないＭＥＬの生産を試みた。
【０１０８】
培地としては、炭素源１０重量％、硝酸ナトリウム０．３重量％、リン酸２水素カリウム０．０３重量％、硫酸マグネシウム０．０３重量％、酵母エキス０．１重量％を含み、残部を水とし、全量を１０ｍｌとした液体培地を用いた。また、培養期間を７日間、培養温度を２５℃として、２００ｒｐｍにて振とう培養した。
【０１０９】
炭素源としては、スクロース、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、リビトール、アラビトール、イノシトール、エリトリトール、メチルオレイン酸、オリーブ油をそれぞれ用いた。
【０１１０】
それぞれの炭素源を用いることで得られた培養液の酢酸エチル抽出液１μｌを、実施例１に記載の方法と同じ方法で薄層クロマトグラフィーに供した。結果を図５に示す。図５は本実施例にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。図５に示すように糖を炭素源としてＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａを培養することでＭＥＬ‐Ｂを選択的に生産できることが示された。一方、糖アルコールを炭素源とした場合、ＭＥＬ‐Ｂを生産しなかった。
【０１１１】
次に、上記酢酸エチル抽出液を実施例１の記載と同じ方法でＨＰＬＣ解析に供した。結果を図６に示す。なお、図６に記載されている「ＭＥＬ‐Ａ：Ｂ：Ｃ」は、培養液中に含まれていたＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃの重量比である。また、図６に示すように、ＭＥＬのピークはＪＣＭ１０３１７株から得たＭＥＬ−Ｂのピークと一致した。そのＭＥＬ−Ｂ生産量は、一週間で約９．８ｇ／Ｌに達した。なお、ＭＥＬ−Ｂの生産量は、ＭＥＬ−Ｂの精製標品を用いて作成した検量線を用い、ＨＰＬＣの分析結果から定量した。図６から明らかなように、炭素源として、スクロース等の糖質を用いた場合、メチルオレイン酸やオリーブ油を用いた場合と比較して、培地中に油脂等の混在はなく、少なくとも９５％以上の純度である。この結果は、スクロース等の糖質を炭素源することでＭＥＬの精製プロセスを大幅に簡略化できることを示している。また、スクロース等の糖質を多く含む溶液（例えば、サトウキビ、トウモロコシ、穀類、果実などの搾汁）であればMEL生産のための培地と成り得ることも、この結果から容易に類推できる。このように、スクロース等の糖質を原料として用いた場合、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０のＭＥＬ生産量は、従来のＭＥＬ生産微生物を凌駕するものである。
【０１１２】
〔比較例〕
本比較例では、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ）属、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）属、メヒシバ（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）属（アキメヒシバ）、及びヒエ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）属の植物からそれぞれウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の微生物が、ＭＥＬを生産するか否か確認した。
【０１１３】
具体的にはオオムギ属の植物から単離されたＵ．  ｎｕｄａ  ＮＢＲＣ６９０６、マダケ属の植物から単離されたＵ．  ｓｈｉｒａｉａｎａ  ＮＢＲＣ  ３０１４９、Ｕ．  ｓｈｉｒａｉａｎａ  ＮＢＲＣ  ８８０９、ススキ属の植物から単離されたＵ．  ｋｕｓａｎｏｉ  ＮＢＲＣ９０７０、アキメヒシバから単離されたＵ．  ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉａｎａ  ＮＢＲＣ８９９５、ヒエ属の植物から単離されたＵ．  ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ  ＮＢＲＣ１００１５５、Ｕ．  ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ  ＮＢＲＣ１００１５６、Ｕ．  ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ  ＮＢＲＣ１００１５７、Ｕ．  ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ  ＮＢＲＣ１００１５８、Ｕ．  ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ  ＮＢＲＣ１００１５９、Ｕ．  ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ  ＮＢＲＣ１００１６０を用いた。
【０１１４】
また、比較のため実施例１にて用いたＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０、ＭＥＬ‐Ａ生産菌として公知のＵ．  ｍａｙｄｉｓ（ＮＢＲＣ５３４６及びＮＢＲＣ６９０７）も用いた。
【０１１５】
微生物の培養、培養液からＭＥＬの抽出、薄層クロマトグラフィーについては実施例２に記載の方法と同じ方法で行なった。結果を図７に示す。図７は本比較例における薄層クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【０１１６】
図７に示すように、本発明に係る製造方法で用いるＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ以外はＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃのうちの一つを選択的に生産することは確認できなかった。
【０１１７】
〔実施例４〕
本実施例では、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  に分類される様々な菌株について、実施例３と同様にして培養し、ＭＥＬ生産能力があるかどうか調べた。結果を図８に示す。図８は実施例４にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。図８に示すように、本実施例にて用いたＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  は全てＭＥＬ‐Ｂ生産能力を有することが明らかとなった。
【０１１８】
〔実施例５〕
本実施例では、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０によって生産されたＭＥＬ‐Ｂの、回収・分離方法について検討した。
【０１１９】
まず、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０を培養液（スクロース１００ｇ/Ｌ、酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌ）中に浸し、２５℃で７日間振とう培養し、得られた培養液を実験に用いた。図９に本実施例におけるＭＥＬ‐Ｂの回収方法及び結果を示す。
【０１２０】
図９に示すように、得られた培養液に酢酸エチルを等量添加して５８００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後の酢酸エチル抽出画分を画分１とした。また、培養液を５８００ｇで５分間遠心分離すると、上層、沈殿層、これらの中間層が生じるため、当該上層、当該中間層、当該沈殿層のそれぞれを分取して、それぞれに酢酸エチルを等量（培養液と等量）添加し、５８００ｇで５分間遠心分離した。当該上層、当該中間層、当該沈殿層のそれぞれから得られた酢酸エチル抽出画分を、画分２、３、４とした。
【０１２１】
また、上記培養液を４００ｇで５分間遠心分離した。得られた上層および沈殿層を分取して、それぞれに酢酸エチルを等量（培養液と等量）添加し、５８００ｇで５分間遠心分離した。当該上層、当該沈殿層のそれぞれから得られた酢酸エチル抽出画分を画分５、６とした。画分１〜６を薄層クロマトグラフィーに供してＭＥＬ‐Ｂの存在を確認した。
【０１２２】
図９に示すように、培養液に等量の酢酸エチルを添加することで、ＭＥＬ‐Ｂを回収することができることが示された。また、培養液を５８００ｇで遠心分離すると、上層、中間層、沈殿層が得られ、それぞれに培養液と等量の酢酸エチルを添加することで、ＭＥＬ‐Ｂを回収することができるが、この場合、ＭＥＬ‐Ｂは遠心分離によって一部分が沈殿することが示された。一方、培養液を４００ｇで遠心分離すると、上層及び沈殿層が得られ、それぞれに培養液と等量の酢酸エチルを添加してＭＥＬ‐Ｂを回収した結果、沈殿にはＭＥＬ‐Ｂが検出されず、全て上層から検出された。すなわち、培養液を４００ｇで遠心分離することで、ＭＥＬ‐Ｂを沈殿させることなく、菌体と完全に分離し、ＭＥＬ‐Ｂ溶液を回収することが可能であることが示された。
【０１２３】
また、画分１〜６におけるＭＥＬ‐Ｂの含有量は、それぞれ、２．３ｇ／ｌ、０．７ｇ／ｌ、０．５ｇ／ｌ、１．８ｇ／ｌ、０．４ｇ／ｌ、１．５ｇ／ｌであった。
【０１２４】
〔実施例６〕
本実施例では実施例５において得た画分５（本実施例において以下「培養液」いう。）を用いて、ＭＥＬ‐Ｂの濃縮方法について検討した。
【０１２５】
検討した条件は（ａ）培養液を６０℃の環境下に３時間静置、（ｂ）培養液を４℃の環境下に３時間静置、（ｃ）培養液のｐＨを２に調整して、４℃の環境下に３時間静置、（ｄ）培養液に硫酸アンモニウムを２０質量％添加して、４℃の環境下に３時間静置、（ｅ）培養液に塩化ナトリウムを１０質量％添加して、４℃の環境下に３時間静置の５通りである。
【０１２６】
（ａ）〜（ｅ）の処理を行なった後、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行なった。得られた上清と沈殿物とをわけて、それぞれに４ｍｌの酢酸エチルを添加して混合した。酢酸エチル中のＭＥＬ‐Ｂを薄層クロマトグラフィー及びＨＰＬＣによって検出した。また、上清中のＭＥＬ‐Ｂと沈殿物中のＭＥＬ‐Ｂとの質量の比を算出した。この結果を、ＭＥＬ‐Ｂを検出するまでのプロセスと共に図１０に示す。図１０は本実施例においてＭＥＬ‐Ｂを濃縮して得た結果を示す図である。なお、図１０において「ＴＬＣ検出結果」と「ＨＰＬＣ定量結果」との間に記載の「上清」は上清からＭＥＬ‐Ｂを検出した結果を示し、「沈殿」は沈殿物からＭＥＬ‐Ｂを検出した結果を示す。図１０に示すように、温度、ｐＨの調整においてＭＥＬ‐Ｂは沈殿せず、遠心分離後の上清及び沈殿物の両方に分布していた。一方、硫酸アンモニウムを添加することによって、ＭＥＬ‐Ｂは効率よく沈殿し、７９％のＭＥＬ‐Ｂを沈殿物として回収することができることが示された。また、ＮａＣｌを添加した場合、ＭＥＬ‐Ｂのほとんどは沈殿せず、上清画分として回収することができることが示された。以上の結果によれば、培養液から、低速遠心分離によって菌体の大部分を除いた後、硫酸アンモニウムを添加し、再度遠心分離することで、ＭＥＬ‐Ｂを濃縮できることが示された。
【０１２７】
〔実施例７〕
本実施例では、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０を、炭素源としてスクロース、グルコース又は大豆油のみを炭素源として添加した培地で培養し、ＭＥＬを生産するか否か確認した。まず、それぞれの菌株を培養液（炭素源（スクロース、グルコース又は大豆油）１００ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ）中に浸し、２５℃で７日間振とう培養し、得られた培養液中のＭＥＬを薄層クロマトグラフィーにて検出した。図１１に結果を示す。図１１は本実施例で得られたＭＥＬを薄層クロマトグラフィーによって検出した結果を示す図である。
【０１２８】
図１１に示すように、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０は、スクロース又はグルコースのみを炭素源として得られた培養液中にＭＥＬを蓄積した。また、図１１に示すように、スクロース又はグルコースを炭素源として培養したＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０により生産された主なＭＥＬは、薄層クロマトグラフィーの結果から、大豆油のみを炭素源として培養した場合と同様、ＭＥＬ−Ｂであった。この結果から、この菌株が、スクロース等の糖類のみを炭素源としてＭＥＬを生産できる菌株であることが示された。
【０１２９】
さらに、本実施例では、スクロース培養で得られたＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０の主なＭＥＬをカラムクロマトグラフィーにて均一精製した後、ＭＥＬの脂肪酸組成および界面物性について検討した。ＭＥＬの脂肪酸組成は、塩酸メタノール処理後のヘキサン抽出液を用い、ＧＣ−ＭＳによって解析した。その結果を表４に示す。
【０１３０】
【表４】
2010041991.tif 000009
【０１３１】
表４に示されるように、スクロース由来のＭＥＬ−Ｂの脂肪酸組成は、Ｃ８、Ｃ１０及びＣ１２であった。一方、植物油由来のＭＥＬの脂肪酸組成は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２及びＣ１４であった。従って、炭素源が異なると、生産されるＭＥＬの脂肪酸組成が変化することが示された。
【０１３２】
また、界面物性の指標である、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）については、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０のＭＥＬ−Ｂは２．８×１０−６Ｍであった。このＣＭＣ測定の結果から、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０由来のＭＥＬは、優れた界面活性を有する界面活性剤であることが示された。さらに、ＭＥＬの液晶形成能を、顕微鏡用スライドガラスにＭＥＬ標品を塗布してカバーガラスをかぶせた後、カバーガラスの横から水を浸入させて、ＭＥＬと水との接触面を光学顕微鏡下で偏光観察することにより判定した。結果を図１２に示している。図１２は本実施例において得られたＭＥＬの液晶形成能を観察した結果を示す図である。図１２に示されるように、液晶形成能が認められた。すなわち、スクロースで生産したＭＥＬは、大豆油で生産したものと脂肪酸組成が多少異なるが、優れた界面活性を有しており、かつ液晶形成能（高度な自己集合特性）をも有する、高機能な界面活性剤として使用可能であることが確認できた。なお、脂肪酸組成の違いは微生物のＭＥＬ合成経路に依存しており、大豆油等の油脂類の場合は分解反応の中間体がＭＥＬ生合成に用いられていると考えられ、一方、スクロースの場合、脂肪酸は細胞内で合成されるため、比較的短い脂肪酸が構成成分となっていると考えられる。
【０１３３】
〔実施例８〕
本実施例では、スクロース又はオリーブ油を炭素源として用い、炭素源の流下培養法によってＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ  ＮＢＲＣ３２７３０の培養を行ない、ＭＥＬの生産を試みた。
【０１３４】
培地としては、炭素源（スクロース及びオリーブ油）１５〜２３重量％、硝酸ナトリウム０．３重量％、リン酸２水素カリウム０．０３重量％、硫酸マグネシウム０．０３重量％、酵母エキス０．１重量％を含み、残部を水とし、全量を２０ｍｌとした液体培地を用いた。また、培養期間を７日間、培養温度を２５℃として、２００ｒｐｍにて振とう培養した。その後、炭素源のみを培養液中に添加して、７日間の培養を２回繰り返した。それぞれの培養で得られた培養液の酢酸エチル抽出液を用いて、実施例１（３−ａ）に記載のＨＰＬＣ法によってＭＥＬ生産量を定量した。結果を図１３に示す。図１３は炭素源の量とＭＥＬ生産量との関係を示す図である。図１３に示すように１５重量％のスクロースのみを炭素源としてＵ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａを培養することでＭＥＬ‐Ｂを生産した場合、その生産量は２１日間で１２ｇ／Ｌに達した。１５重量％のスクロール及び１重量％のオリーブ油を含む培地で培養した場合、ＭＥＬ−Ｂの生産量は２５ｇ／Ｌに達した。さらに、１５重量％のスクロール及び２重量％のオリーブ油を含む培地で培養した場合、ＭＥＬ−Ｂの生産量は３１ｇ／Ｌに達した。１５重量％のスクロール及び４重量％のオリーブ油を含む培地で培養した場合、ＭＥＬ−Ｂの生産量は３７ｇ／Ｌに達した。１５重量％のスクロール及び８重量％のオリーブ油を含む培地で培養した場合、ＭＥＬ−Ｂの生産量は３７ｇ／Ｌに達した。以上の結果から、Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａを用いたＭＥＬ−Ｂの培養において、スクロースのみからＭＥＬ−Ｂを生産可能であり、さらに油脂を添加することで生産量を向上させることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明に係る製造方法により得られたＭＥＬは、食用植物や日常的に接触する植物から単離された微生物を培養して得られたものであり、安全性がより高く、食品用途への展開等が期待される。また、培養に用いる微生物を適宜選択することにより、用途に応じて、親水性が異なるＭＥＬ‐Ａ、ＭＥＬ‐Ｂ、ＭＥＬ‐Ｃをそれぞれ選択的に得ることができるので、新たな食品用途に適用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓの培養液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す。
【図２】Ｕ．  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ及びＵ．  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓが生産するマンノシルエリスリトールリピッドを高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図３】実施例２にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。
【図４】実施例２にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図５】実施例３にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。
【図６】実施例３にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図７】比較例における薄層クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図８】実施例４にて得た培養液の酢酸エチル抽出液を薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。
【図９】実施例５におけるＭＥＬ‐Ｂの回収方法及び結果を示す図である。
【図１０】実施例６においてＭＥＬ‐Ｂを濃縮して得た結果を示す図である。
【図１１】実施例７で得られたＭＥＬを薄層クロマトグラフィーによって検出した結果を示す図である。
【図１２】実施例７において得られたＭＥＬの液晶形成能を観察した結果を示す図である。
【図１３】実施例８にて確認した炭素源の量とＭＥＬ生産量との関係を示す図である。
【図２】
2010041991.tif 000014
【図４】
2010041991.tif 000015
【図６】
2010041991.tif 000016
【図１３】
2010041991.tif 000017
【図１】
2010041991.tif 000018
【図３】
2010041991.tif 000019
【図５】
2010041991.tif 000020
【図７】
2010041991.tif 000021
【図８】
2010041991.tif 000022
【図９】
2010041991.tif 000023
【図１０】
2010041991.tif 000024
【図１１】
2010041991.tif 000025
【図１２】
2010041991.tif 000026
【配列表】
2010041991000001.app