(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒラタケ属のキノコの突然変異育種に用いることのできる使い勝手のよいマーカー、そのマーカーを用いたヒラタケ属のキノコの胞子欠損性変異株の効率的な育種法を提供する。【解決手段】ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットであって、特定の塩基配列を含む第一のプライマーと、特定の塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せを含む、プライマーセット。前記プライマーセットを用いて選抜する、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株の育種方法。【選択図】図５
2010207111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットであって、
（ｉ）配列番号：１で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せ、
（ｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せ、または、
（ｉｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せ、
のいずれかを含む、プライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットにおいて、
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーが、いずれも１５塩基以上の長さからなる、プライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２記載のプライマーセットにおいて、
前記第一のプライマーが、配列番号：１で示される塩基配列を含み、
前記第二のプライマーが、配列番号：２で示される塩基配列を含む、
プライマーセット。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のプライマーセットにおいて、
第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの少なくとも一方が標識されている、
プライマーセット。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のプライマーセットと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ヌクレオチドと、
を含む、
ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出キット。
【請求項６】
ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットであって、
（ｉｖ）配列番号：３で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せ、
（ｖ）配列番号：３で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せ、または、
（ｖｉ）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せ、
のいずれかを含む、プライマーセット。
【請求項７】
請求項６記載のプライマーセットにおいて、
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーが、いずれも１５塩基以上の長さからなる、プライマーセット。
【請求項８】
請求項６または７記載のプライマーセットにおいて、
前記第一のプライマーが、配列番号：３で示される塩基配列を含み、
前記第二のプライマーが、配列番号：４で示される塩基配列を含む、
プライマーセット。
【請求項９】
請求項６ないし請求項８のいずれかに記載のプライマーセットにおいて、
第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの少なくとも一方が標識されている、
プライマーセット。
【請求項１０】
請求項６ないし請求項９のいずれかに記載のプライマーセットと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ヌクレオチドと、
を含む、
ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出キット。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のプライマーセットと、
請求項６ないし請求項９のいずれかに記載のプライマーセットと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ヌクレオチドと、
を含む、
ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出キット。
【請求項１２】
ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株の育種方法であって、
ヒラタケ属キノコの胞子に人工変異処理を施して、変異型胞子および未変異型胞子の混在した人工変異処理済の胞子混合物を得る工程と、
前記人工変異処理済の胞子混合物を発芽させて得られる一核菌株の単胞子コロニーから抽出したゲノムＤＮＡについて、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のプライマーセット、および／または、請求項６ないし請求項９のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニーを核酸増幅法によって一次選抜する工程と、
前記一次選抜されたヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニー同士を交配させて二核菌株を作出し、該二核菌株を培養して得られる子実体の胞子の有無を確認することによって、胞子欠損性変異を有する二核菌株を二次選抜する工程と、
を含む、育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子欠損性変異検出マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
食用キノコ類は、我国において特用林産物の主要品目として扱われており、近年では消費嗜好の多様化や健康志向の高まりなどを背景に以前より他種類のキノコが栽培されるようになっている。その中でウスヒラタケは分類学的にはヒラタケ属のキノコで、我国における生産量は他のキノコに比べてまだ多くはないものの、徐々に増加してきている。一方、ヒラタケ属のキノコ全体での世界的な生産量をみると、ツクリタケ（いわゆるマッシュルーム）、シイタケに次ぐ第３位に位置しており、本菌はその主要品目となっている。
【０００３】
近年、キノコ類の生産は大規模化し、温度と湿度が制御された閉鎖空間で管理されるようになった。その結果、栽培過程において子実体（一般に言う“キノコ”）より放出される大量の胞子による様々な問題が顕在化してきた。たとえば、胞子吸引がアレルギーを引き起こすことで栽培従事者の健康に悪影響を及ぼし、さらには栽培施設の汚染や病害の発生、子実体の発生不良といった商品価値低下の原因ともなっている。また健康被害や汚染といった問題以外にも栽培品種の莫大な量の胞子が自然界に飛散することによって、栽培種による自然集団の遺伝的多様性の画一化が進行している。特にウスヒラタケを含めたヒラタケ属は、他種と比較して子実体形成の早期から多数の胞子を放出し始めるという特徴があるため、胞子による問題は栽培における大きな障害となり易く、栽培が中止されたケースも見られる。
【０００４】
たとえば、近年、エリンギは生産量が急激に増加しているが、その栽培面でキノコから飛散する多量の胞子が栽培施設を汚染することによりキノコが立ち枯れとなる問題が起きている。これに対して、特許文献１には、それらの問題に対応するため突然変異によりエリンギの担子胞子形成欠損の有用変異体を作出した旨が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２４１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のような子実体の生産に伴う大量の胞子飛散に起因する諸問題の解決には、無胞子性の菌株の育成が最も有効であることから、以前より自然あるいは人工的に作られた胞子欠損性変異体を用いた突然変異育種が進められてきた。しかしながら、突然変異育種には膨大な労力や時間を必要とし、育成効率がきわめて低いなど多くの欠点がある。そのため、現在までに我国において商業的に栽培されている無胞子品種はエリンギ、ヤナギマツタケの２品種のみであり、効率的な無胞子性品種の育種法の開発が期待されている。
【０００７】
また、上記文献記載の従来技術では、無胞子性品種育成の障害として、胞子欠損性を確認するための観察は子実体からの胞子の落下に頼る他なかった。すなわち、この技術では、子実体の発生には３０〜４０日を要するとともに、発生環境に結果が大きく依存するため客観的判断が困難であり、発生試験の反復を要するという点で、突然変異育種の選抜方法をさらに改善する余地があった。このように、ヒラタケ属のキノコの突然変異育種には多大な時間と労力を要するため、さらに効率的な胞子欠損性変異株の育種法の開発が期待されていた。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ヒラタケ属のキノコの突然変異育種に用いることのできる使い勝手のよいマーカーを提供することである。また、本発明の別の目的は、上記のマーカーを用いたヒラタケ属のキノコの胞子欠損性変異株の効率的な育種法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットであって、（ｉ）配列番号：１で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せ、（ｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せ、または、（ｉｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せ、のいずれかを含む、プライマーセットが提供される。
【００１０】
この構成によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を効率的に検出することができる。
【００１１】
また、本発明によれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットであって、（ｉｖ）配列番号：３で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せ、（ｖ）配列番号：３で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せ、または、（ｖｉ）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せ、のいずれかを含む、プライマーセットが提供される。
【００１２】
この構成の場合にも、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を効率的に検出することができる。
【００１３】
また、本発明によれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株の育種方法であって、ヒラタケ属キノコの胞子に人工変異処理を施して、変異型胞子および未変異型胞子の混在した人工変異処理済の胞子混合物を得る工程と、その人工変異処理済の胞子混合物を発芽させて得られる一核菌株の単胞子コロニーから抽出したゲノムＤＮＡについて、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せ、および／または、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いて、胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニーを核酸増幅法によって一次選抜する工程と、その一次選抜されたヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニー同士を交配させて二核菌株を作出し、その二核菌株を培養して得られる子実体の胞子の有無を確認することによって、胞子欠損性変異を有する二核菌株を二次選抜する工程と、を含む、育種方法が提供される。
【００１４】
この方法によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せ、および／または、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニーをＰＣＲ法によって効率的に一次選抜することができる。そのため、あらかじめ一次選抜によって絞り込んだ一核菌株の単胞子コロニー同士を交配させて二核菌株を作出し、その二核菌株を培養して得られる子実体の胞子の有無を確認することによって胞子欠損性変異を有する二核菌株を二次選抜すれば済むので、ヒラタケ属キノコの突然変異育種にかかる多大な時間と労力を節減することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せ、および／または、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を効率的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒラタケ属の栽培において胞子により汚染された換気扇を説明するための写真(小畠靖氏撮影)である。
【図２】ウスヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ（下線はイタリックであることを示す））の外観について説明するための写真（長沢栄史氏撮影）である。
【図３】実施例において連鎖地図作製に用いた胞子欠損性変異株と野生株との概観を説明するための写真である。
【図４】実施例において作成した連鎖地図における胞子欠損性変異領域の座乗位置と近傍マーカーとの関係を示した概念図である。
【図５】実施例において行った胞子欠損性変異検出ＳＴＳマーカーによる１５野生株におけるＰＣＲ法による増幅結果を説明するための電気泳動写真である。
【図６】実施例において行った胞子欠損性変異検出ＳＴＳマーカーによるＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲへの応用結果について説明するための電気泳動写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
〔用語の説明〕
本実施形態における「ヒラタケ属」とは、キノコの生物学的分類の一種であり、菌界  真菌門  担子菌亜門  真正担子菌綱  帽菌亜綱  ハラタケ目  ヒラタケ科  ヒラタケ属を意味する。また、本実施形態における「ウスヒラタケ」とは、学名：Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ（下線はイタリックであることを示す）のヒラタケ科  ヒラタケ属のキノコの一種であり、梅雨期から秋にかけて各種の広葉樹枯れ木上に発生する。よく似たヒラタケは晩秋から春にかけての発生が多い。同じくヒラタケ科  ヒラタケ属のヒラタケとともに食用にされる。外観的な特徴としては、傘ははじめ饅頭形で後には開いて半円形になる。表面の色は淡灰褐色から淡黄色で湿っているときは弱い粘性がある。ひだは柄に垂生し、並び方はやや密、色は白色。柄は一般に短く、傘の片側にかたよってつき、色はほとんど白色に近い。ヒラタケに比べて傘の厚みは薄く、肉も軟らかい。
【００１８】
また、本実施形態における「ヌクレオチド」もしくは「核酸」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）及びポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本実施形態に係るヌクレオチドもしくは核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマー又はポリマーを含む。
【００１９】
また、本実施形態における「プライマー」とは、核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいう。核酸増幅反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を行えるように、例えば、特異的なＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法等での生成物（鎖長あるいは配列において）を生成可能なように、好ましくはプライマー自身がその鋳型特異的な配列を含むように、設計される。また、一般的なプライマーは、これに限られないが、通常、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計される。
【００２０】
プライマーの３’側の領域は鋳型鎖に対し相補的であることが好ましいが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどの機能的な配列を付加することも可能である。また、後述するように、例えば核酸増幅法としてＩＣＡＮ法を用いる場合などにおいては、プライマーはＤＮＡだけでなくＲＮＡを含むか、あるいは必要に応じてＲＮＡのみで構成されていてもよい。特に本実施形態に好適なプライマーについては、後述する。ＰＣＲ法又はその他の協奏的核酸増幅反応においては、一般に、センスプライマー（第一のプライマー）とアンチセンスプライマー（第二のプライマー）とからなる一組、あるいはそれ以上のプライマーを含むプライマーセットが用いられる。
【００２１】
また、本実施形態において、「特異的にハイブリダイズする」とは、あるヌクレオチドに対し、別のヌクレオチドが水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべきヌクレオチドには同条件では結合しない状態をいう。必ずしも、他の全てのヌクレオチドに対して特異的である必要は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。例えば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためには、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性領域以外のヒラタケ属キノコのゲノムＤＮＡのヌクレオチドに対して結合しなければ、「特異的にハイブリダイズする」といってもよい。
【００２２】
ハイブリダイズの条件は、そのヌクレオチドの使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲ法に用いるプライマーとしてのヌクレオチドであれば、ＰＣＲ法でのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選択される。また、核酸プローブとして用いられる時には、そのハイブリダイゼイション条件下においてハイブリダイズするように選択される。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼイション条件でハイブリダイズするものが選択される。
【００２３】
また、本実施形態における「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼイション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。また、ハイブリダイゼイション条件の温度については、用いる核酸増幅反応あるいはハイブリダイズ反応に応じて定めることができるが、例えば、４２℃、４３℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、６８℃、７０℃、７２℃である。
【００２４】
また、本実施形態において、「核酸増幅」法としては、標的の核酸を増幅させる方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよいが、プライマー及びプライマーセットを用いる方法として、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法あるいは他の核酸の協奏的核酸増幅方法が用いられる。
【００２５】
また、本実施形態において、増幅産物の検出法としては、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよい。例えば、増幅後の核酸を電気泳動して検出しても、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法を用いて検出してもよいが、多数検体処理、自動化、再現性や二次汚染等の点で有利な、以下に記す方法を用いてもよい。
【００２６】
たとえば、簡便にＤＮＡを検出する方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを用いることができる。このようなプローブを用いた検出方法は、標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分がその相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、核酸増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、この方法により一定温度、一段階かつ密閉容器内で核酸増幅および検出（測定）を同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
【００２７】
増幅核酸の検出方法は、上記に限られず、例えば、ＬＡＭＰ法では、副産物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を指標に検出してもよく、増幅核酸を直接測定しない方法等であっても、それぞれの核酸増幅方法に適用可能な公知の増幅産物検出方法であれば、何れの方法でも用いることができる。
【００２８】
また、本実施形態において、「標識される」とは、生物学及び医学の分野で用いることのできる任意のシグナル生成手段で標識されていることをいう。このような検出可能なシグナル生成手段による標識としては、例えば、α−３３Ｐなどの放射性標識、蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識、有色化合物などによる色素標識、あるいはＨＲＰやＡＰなどの酵素標識が挙げられるが、好ましくは蛍光色素標識である。また、相補的二本鎖を形成することで標識の特性が変化するものがより好ましく、更に好ましくは、相補的二本鎖を形成することで蛍光特性の変化するインターカレーター性蛍光色素標識である。当業者であれば、各種標識試薬・キットの使用法又は常法に従い、これらの標識を行うことは容易に可能である。
【００２９】
また、本実施形態における「相同性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合は間隙を導入した上で、目的の塩基と同一である候補配列中の核酸塩基数のパーセントとして定義される。この際に、同一の塩基（チミンとウラシルも同一とみなす）を有するＤＮＡとＲＮＡとは結合特性が非常に近いため、同一の核酸塩基として定義される。相同性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ又はＡＬＩＧＮのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能であるが、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑにおいて標準的な初期パラメーターを用いて計算された値などを用いることもできる。
【００３０】
なお、核酸増幅のためのプライマーやその他のプローブなどにおいては、ある塩基配列の代わりに、その塩基配列と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上あるいは９８％以上（１００％以下）の相同性を有する塩基配列、あるいは、その塩基配列に対し、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、又は数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いることもできる（相同性の定義の際と同様に、同一の塩基を有するＲＮＡとＤＮＡの置換は、ここでの置換・欠失・挿入には含まれない）。
【００３１】
〔実施形態１〕
以下、本発明の第１の実施の形態について詳細に説明する。
【００３２】
本実施形態に係るヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットは、（ｉ）配列番号：１で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せ、（ｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せ、または、（ｉｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せ、のいずれかを含む、プライマーセットである。
【００３３】
配列番号１：５’−ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＣ−３’（ＳＤ１９２  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号２：５’−ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＣＣ−３’ （ＳＤ１９２  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
【００３４】
この構成によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を効率的に検出することができる。
【００３５】
なぜなら、後述する実施例の図４で示すように、配列番号：１で示される塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセットを用いてＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことを確認しているからである。
【００３６】
そのため、当然のことではあるが、配列番号：１で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様にＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：１〜２で示される塩基配列に対して、それぞれ８０％以上の相同性を有することが好ましいが、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００３７】
また、当然のことではあるが、配列番号：１で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様にＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：１〜２で示される塩基配列に対して、それぞれ１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むことが好ましいが、１塩基のみ欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む場合には、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００３８】
さらに、当然のことではあるが、配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様にＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。なお、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするという用語の意味については、既に〔用語の説明〕の項目で説明しているため、煩雑をさけるため説明を繰り返さない。
【００３９】
なお、第一のプライマーおよび前記第二のプライマーは、いずれも１５塩基以上の長さからなることが好ましい。なぜなら、一般的なＰＣＲ法に適したプライマーは、ＰＣＲサイクルにおいて、それぞれのステップで鋳型ＤＮＡに対して結合・解離がスムーズに進行するようにするために、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計されることが多いためである。
【００４０】
また、第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの少なくとも一方が標識されていてもよい。このとき、標識の種類は特に限定されず、α−３３Ｐなどの放射性標識、蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識、有色化合物などによる色素標識、あるいはＨＲＰやＡＰなどの酵素標識が挙げられるが、安全性および使い勝手のよい蛍光色素標識を用いることが好ましい。このように、第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの少なくとも一方が標識されていれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株のゲノムＤＮＡのうちこれらのプライマーに挟まれた領域の増幅を検出することが容易になる利点がある。
【００４１】
そして、本実施形態のプライマーセットは、さらにＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、組み合わせることによって、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出キットとして好適に用いることができる。このように、本実施形態のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、を組み合わせて提供すれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出に必要な試薬が一度に入手できるために、試験を行う研究者の手間が省ける利点がある。また、あらかじめ本実施形態のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、の組み合わせによって、うまくＰＣＲサイクルが進行してヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出することができる条件を設定して、キットの説明書に詳細に記載しておけば、やはり試験を行う研究者の手間が省ける利点がある。さらに、第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの少なくとも一方が標識されていなくても、これらのキットに含まれるヌクレオチド自体があらかじめ標識されていれば、やはり試験を行う研究者がプライマーの標識を行わずに済むために手間が省ける利点がある。
【００４２】
なお、本実施形態に係るヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出キットに含まれるＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖のＤＮＡを鋳型として、それに相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素であればよく、特に限定するものではないが、たとえば、ＰＣＲ法による核酸増幅を行うのであれば、Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性を持つＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ここで、Ｔａｑポリメラーゼとは、好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（下線はイタリックであることを示す）が産生するＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ．２．７．７．７）であり、９０℃以上の高温でも比較的安定である（ＤＮＡポリメラーゼ活性は低下する）ため、ＰＣＲに利用されている。なお、もちろん、本実施形態で用いるＴａｑポリメラーゼは、天然のＴａｑポリメラーゼに限らず、各種特性を調整するために人工的に改変されたＴａｑポリメラーゼ（例えば、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（Ｒ）、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｒ）など）を用いてもよい。
【００４３】
〔実施形態２〕
以下、本発明の第２の実施の形態について詳細に説明する。尚、本実施形態は、プライマーの塩基配列の違いをのぞいては、基本的には上記の実施形態１と同様の構成および作用効果を有するため、実施形態１と同様の内容については、適宜説明を省略する。
【００４４】
本実施形態に係るヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットは、（ｉｖ）配列番号：３で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せ、（ｖ）配列番号：３で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せ、または、（ｖｉ）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せ、のいずれかを含む、プライマーセットである。
【００４５】
配列番号３：５’−ＣＧＴ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＣＣＴ−３’（ＳＤ２９６  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号４：５’−ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＧＧＡ−３’（ＳＤ２９６  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
【００４６】
この構成によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を効率的に検出することができる。
【００４７】
なぜなら、後述する実施例の図４で示すように、配列番号：３で示される塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセットを用いてＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことを確認しているからである。
【００４８】
そのため、当然のことではあるが、配列番号：３で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様にＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：３〜４で示される塩基配列に対して、それぞれ８０％以上の相同性を有することが好ましいが、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していれば、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００４９】
また、当然のことではあるが、配列番号：３で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様にＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：３〜４で示される塩基配列に対して、それぞれ１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むことが好ましいが、１塩基のみ欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む場合には、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００５０】
さらに、当然のことではあるが、配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなる第一のプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様にＰＣＲ法による核酸増幅を行った場合、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有さない野性株では、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。なお、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするという用語の意味については、既に〔用語の説明〕の項目で説明しているため、説明を繰り返さない。
【００５１】
〔実施形態３〕
以下、本発明の第３の実施の形態について詳細に説明する。尚、本実施形態は、マルチプレックスＰＣＲ法用のキットである点をのぞいては、基本的には上記の実施形態１および２と同様の構成および作用効果を有するため、実施形態１および２と同様の内容については、適宜説明を省略する。
【００５２】
本実施形態に係るヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するための検出キットは、実施形態１に係るプライマーセットと、実施形態２に係るプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、を含む、検出キットである。このように、実施形態１に係るプライマーセットと、実施形態２に係るプライマーセットと、を組み合わせてマルチプレックスＰＣＲ法を行うことによって、後述する実施例で示すように、単独のプライマーセットのみでＰＣＲ法を行う場合に比べて、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出する精度が著しく向上する。
【００５３】
ここで、一般的なＰＣＲ法は通常、特異的な配列を増幅するプライマーを１組しか使用しない。一方、マルチプレックスＰＣＲ法では、同時に多くの配列を増幅するための複数組のプライマーを使用する。そのため、１つのチューブ中に多数のＰＣＲプライマーが存在することになり、ミスプライミングＰＣＲ産物、プライマーダイマー、短いＤＮＡ断片に偏った増幅などの多くの問題の原因になる可能性がある。しかしながら、実施形態１に係るプライマーセットと、実施形態２に係るプライマーセットと、を組み合わせて用いた場合には、後述する実施例で示すように、ミスプライミングＰＣＲ産物、プライマーダイマー、短いＤＮＡ断片に偏った増幅などの問題がほとんど生じていない。そのため、この点からも実施形態１に係るプライマーセットと、実施形態２に係るプライマーセットと、の組み合わせは、マルチプレックスＰＣＲ法に好適なプライマーセットの組み合わせであることが明らかである。
【００５４】
〔実施形態４〕
以下、本発明の第４の実施の形態について詳細に説明する。尚、本実施形態は、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株の育種方法である点をのぞいては、基本的には上記の実施形態１〜３と同様の構成および作用効果を有するため、実施形態１〜３と同様の内容については、適宜説明を省略する。
【００５５】
本実施形態に係るヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株の育種方法は、ヒラタケ属キノコの胞子に人工変異処理を施して、変異型胞子および未変異型胞子の混在した人工変異処理済の胞子混合物を得る工程と、人工変異処理済の胞子混合物を発芽させて得られる一核菌株の単胞子コロニーから抽出したゲノムＤＮＡについて、実施形態１に係るプライマーセット、および／または、実施形態２に係るプライマーセットを用いて、胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニーを核酸増幅法によって一次選抜する工程と、一次選抜されたヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニー同士を交配させて二核菌株を作出し、二核菌株を培養して得られる子実体の胞子の有無を確認することによって、胞子欠損性変異を有する二核菌株を二次選抜する工程と、を含む、育種方法である。
【００５６】
この方法によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せ、および／または、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異を有する一核菌株の単胞子コロニーをＰＣＲ法によって効率的に一次選抜することができる。そのため、あらかじめ一次選抜によって絞り込んだ一核菌株の単胞子コロニー同士を交配させて二核菌株を作出し、その二核菌株を培養して得られる子実体の胞子の有無を確認することによって胞子欠損性変異を有する二核菌株を二次選抜すれば済むので、ヒラタケ属キノコの突然変異育種にかかる多大な時間と労力を節減することができる。
【００５７】
一方、従来技術では、無胞子性品種育成の障害として、胞子欠損性を確認するための観察は子実体からの胞子の落下に頼る他なかった。すなわち、従来技術では、子実体の発生には３０〜４０日を要するとともに、発生環境に結果が大きく依存するため客観的判断が困難であり、発生試験の反復を要するという点で、突然変異育種の選抜方法をさらに改善する余地があった。
【００５８】
これに対して、後述する実施例で示すように、本発明者らがヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることを発見した、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのプライマーの組合せ、および／または、上記の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかのプライマーの組合せを用いているため、子実体の発生にかかる３０〜４０日を要することなく、わずか数時間〜数日の時間しか要さないＰＣＲ法によって効率的に一次選抜することができる。そして、こうしてあらかじめ一次選抜によって絞り込んだ一核菌株の単胞子コロニー同士のみを交配させて少数の二核菌株を作出し、その少数の二核菌株を培養して得られる子実体の胞子の有無を確認することによって胞子欠損性変異を有する二核菌株を二次選抜すれば済むので、３０〜４０日をかけて子実体を発生させなければならないサンプル数を著しく提言できるため、ヒラタケ属キノコの突然変異育種にかかる多大な時間と労力を節減することができる。
【００５９】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００６０】
例えば、上記実施の形態では、２種類のプライマーセットを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲ法としたが、特にこれらの２種類に限定されるわけではなく、将来的に他の種類のプライマーセットも、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出するために有用であることが明らかになれば、３種類、４種類のプライマーセットを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲ法としてもよい。このようにすれば、さらにヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異株を検出する精度が向上する。
【００６１】
また、例えば、上記実施の形態では、ヒラタケ属キノコとして、ウスヒラタケの胞子欠損性変異株を検出するためのプライマーセットについて説明したが、特にウスヒラタケに限定する趣旨ではなく、ヒラタケ属キノコであれば、同様の胞子欠損性変異領域をゲノムＤＮＡ上に有していると考えられるため、他のヒラタケ属キノコのヒラタケ（シメジ）、エリンギなどの種にも適用可能であることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
【００６３】
＜実験の目的＞
食用キノコ栽培において、子実体から放出される大量の胞子は、図１に示すように、栽培従事者の健康被害や施設の汚染などの原因となる。この有効な解決策のひとつとして２，３のキノコ種では突然変異育種による胞子欠損性変異株が利用されている。しかしながら、突然変異育種は多大な時間と労力を要することから効率的な胞子欠損性変異株の育種法の開発が期待されている。そこで、本発明者らは、図３に示すように、単一の劣性変異によるウスヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ（下線はイタリックであることを示す））の胞子欠損性変異株（ＴＭＩＣ−３００５８）を材料として、図４に示すように、ＡＦＬＰマーカーに基づく遺伝連鎖地図を作製し、胞子欠損性変異領域の座乗部位を推定した。また、Ｂｕｌｋｅｄ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓを利用することで胞子欠損性変異領域と同じ位置に座乗する１２マーカーを含めた近傍２０マーカーを同定した。
【００６４】
以下の実施例に示す実験では、マーカーアシスト選抜による胞子欠損性変異株の育種に利用できるＤＮＡマーカーの開発を目的に、これまでに得られた近傍マーカーのＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ  Ｓｉｔｅｓ）化を実施した。具体的には、図４に示すように、これまでの研究で得た胞子欠損性変異領域近傍マーカーのうち胞子欠損性変異領域から５ｃＭ以内の計１８マーカーについてＳＴＳ化を試みた。
【００６５】
＜実験の材料＞
ＤＮＡポリメラーゼ：タカラバイオ社製、商品名  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（下線はイタリックであることを示す）
電気泳動のゲル：ニッポンジーン社製、商品名  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ
バッファー：タカラバイオ社製、商品名  ＴＢＥ  ｐｏｗｄｅｒ
【００６６】
＜実験方法＞
ＰＣＲ法の条件および手順
滅菌蒸留水１３．４４  μｌ、１０ｘ  Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ２  μｌ、ｄＮＴＰ  １．６  μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ  （１０μＭ）  ０．２ｘ  ２μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（下線はイタリックであることを示す）  ０．１６  μｌ、鋳型ＤＮＡを２  μｌずつ混合し、計２０  μｌの反応液中でＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ条件は以下のように設定した。つまり９４℃で２分間、初期変性を実施し、次に９４℃にて変性１０秒間、５６℃にてアニーリング１０秒間、７２℃にて伸長反応３０秒間のサイクルを３０回繰り返す。
【００６７】
電気泳動および検出の条件および手順
ＴＢＥ  ｐｏｗｄｅｒを用いて調製したＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒにＡｇａｒｏｓｅ  Ｓを１％濃度で作製したゲルを用意する。ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ中でゲルのウェルにサンプルをアプライし、１００Ｖにて３０分間電気泳動を実施する。電気泳動後、エチルブロマイド液にて１５分間ゲルを浸漬後、流水にて５分間洗浄した。洗浄後、ゲルをＵＶ下にて増幅産物の有無を確認する。
【００６８】
＜実施例１＞
本実施例では、まず、近傍マーカーの増幅断片をクローニングし、配列を決定した。そして、この配列を基に胞子欠損性変異検出のためのプライマーペア（プライマーセットとも言う）を設計し、各プライマーペアによる増幅の有無と遺伝連鎖地図作製に用いた分離世代１５０株の表現型との関係を調査した。さらに胞子欠損性変異株（ＴＭＩＣ−３００５８）と下記の表１に示す任意の野生株１５菌株における増幅の有無についても解析し、胞子欠損性変異の検出能力を評価した。
【００６９】
具体的には、図４に示す遺伝連鎖地図作製に用いた胞子欠損性変異株ＴＭＩＣ−３００５８および野生株ＴＭＩＣ−３１６６４のそれぞれを由来とする単胞子分離株（ｍＳＰ．  １およびｗＳＰ．１）を親株として調製した分離集団１５０株および任意に選抜した野生株１５株（表１）から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを実施し、それぞれのプライマーペアのマーカーアシスト選抜における有用性を評価した。
【００７０】
【表１】
2010207111.tif 000003
【００７１】
実際にこれらの近傍２０マーカーについて、マーカー配列を基に設計したプライマーペアのうち、下記の表２に示す配列からなるＳＤ１９２およびＳＤ２９６のプライマーペアは、図５に示すように、供試菌株における胞子欠損性変異の検出に有効であった（もっとも、ＳＤ２９６のプライマーペアは、２種類の野生株についてノイズのバンドが観察された）。
【００７２】
ＳＴＳマーカーとしての検出効率を計算してみると、ＳＤ１９２のプライマーペアの検出効率は、野生株１５株に対して１００％、ＳＤ２９６のプライマーペアの検出効率は、野生株１５株に対して８６．７％であった。特に、ＳＤ１９２のプライマーペアは供試した全ての菌株の表現型に対応する結果を示した。このことから、これら２プライマーペアは胞子欠損性変異株の育種に有用であると考えられる。
【表２】
2010207111.tif 000004
【００７３】
また有用性が示された２つのプライマーペアであるＳＤ１９２およびＳＤ２９６については、図６に示すように、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲへの応用を試みた。その結果、２つのプライマーペアであるＳＤ１９２およびＳＤ２９６を組み合わせて用いた場合、ミスプライミングＰＣＲ産物、プライマーダイマー、短いＤＮＡ断片に偏った増幅などの問題がほとんど生じず、供試菌株における胞子欠損性変異を精度よく検出できた。
【００７４】
＜結果の考察＞
本実施例では、ＡＦＬＰとＢｕｌｋｅｄ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓをベースとしたＡＦＬＰにより明らかにした胞子欠損性変異領域（Ｓｐｏｒｅｌｅｓｓ）近傍に連鎖する１８マーカーを用いてＳＴＳ化することで胞子欠損性変異形質検出マーカーを開発することに成功した。特にＳＤ１９２のプライマーペアは、供試した任意の野生株を含めた全ての菌株の表現型に対応する結果を示したため、胞子欠損性変異形質検出マーカーとして優れている。また、また今回開発した２つのＳＴＳマーカー（２つのプライマーペアであるＳＤ１９２およびＳＤ２９６）を用いてＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法への応用を試みたところ、供試菌株における胞子欠損性変異をさらに精度よく検出できた。
【００７５】
これらの結果から、２つのＳＴＳマーカーであるＳＤ１９２およびＳＤ２９６のプライマーペアは、いずれも単独のプライマーセットとして用いても、あるいは両者を組み合わせてマルチプレックスＰＣＲ法などで用いても、胞子欠損性変異形質のマーカーアシスト選抜に利用可能であることが明らかである。
【００７６】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上のように、本発明において開発されたプライマーセットは、ヒラタケ属キノコの胞子欠損性変異形質の検出のための初めての遺伝子マーカーであるため、ＰＣＲ法などの核酸増幅技術を用いて無胞子性変異保有の検出を可能にする。そのため、子実体を発生させることなく菌糸体の段階で無胞子性変異株をスクリーニングすることができ、大幅に育種年月を短縮できる。以上のように開発した遺伝子マーカーは、ウスヒラタケの無胞子性を備えた様々な品種の開発を効率的に進めることを実現するものであり、そのことはウスヒラタケの生産環境の改善と向上、そして生産量の増大につながり、ひいては国内のキノコ産業の活性化につながるものと考えられる。
【図１】
2010207111.tif 000005
【図２】
2010207111.tif 000006
【図３】
2010207111.tif 000007
【図４】
2010207111.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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