(57)【要約】【課題】気泡の混入を防止し、分析対象物質の検出、定量精度を高めることのできる反応方法及び反応装置を提供する。【解決手段】反応装置１１は、マイクロ流体チップ１の第１の流路ＣＨ１において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行うものであって、前記第１の流路ＣＨ１に接続した第２の流路ＣＨ２に前記分析対象物質及び該分析対象物質に結合する標識物質を含む検体液を流し、該検体液を該第１の流路ＣＨ１に送液する工程と、前記検体液の後端が前記第１の流路ＣＨ１に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、前記第１の流路ＣＨ１に接続する前記第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに合流した第３の流路ＣＨ３に洗浄液を流し、前記第１の流路ＣＨ１に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路ＣＨ１に送液する工程と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の流路において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法であって、
前記第１の流路に接続した第２の流路に前記分析対象物質及び該分析対象物質に結合する標識物質を含む検体液を流し、該検体液を該第１の流路に送液する工程と、
前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、
前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流し、前記第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、
前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路に送液する工程と、
を備える反応方法。
【請求項２】
請求項１記載の反応方法であって、
前記第１の流路に、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を設け、
前記第１の流路の内圧の変化に基づいて、前記検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出する反応方法。
【請求項３】
請求項２記載の反応方法であって、
前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項記載の反応方法であって、
前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応方法。
【請求項５】
第１〜第３の流路、及びこれら第１〜第３の流路の基端部にそれぞれ設けられた第１〜第３のポートを含むマイクロ流体チップと、
前記第１〜第３のポートにそれぞれ圧力を作用させ、前記第１〜第３の流路に送液する送液手段と、
前記送液手段を駆動する制御手段と、
を備え、
前記第１の流路及び前記第２の流路は、それらの先端部において互いに接続し、前記第３の流路は、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流しており、
前記第１の流路は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行い、
前記制御手段は、前記分析対象物質及び該分析対象物質に結合する標識物質を含み前記第２の流路に流れる検体液を前記第１の流路に送液し、該検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出して、該検体液の送液を停止させると共に前記第３の流路に流れる洗浄液を該第１の流路に停止する該検体液の後端に合流させ、該検体液の後端に該洗浄液が合流した後に該洗浄液を該第１の流路に送液する反応装置。
【請求項６】
請求項５記載の反応装置であって、
前記第１のポートに作用する圧力を測定する圧力測定手段をさらに備え、
前記第１の流路が、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を有しており、
前記制御手段は、前記圧力測定手段から送出される測定信号に基づいて、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出する反応装置。
【請求項７】
請求項６記載の反応装置であって、
前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応装置。
【請求項８】
請求項５〜請求項７のいずれか一項記載の反応装置であって、
前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法及び反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の分子生物学の進歩により、血液等の生体物質を分析する事により、病気の治療における薬剤投与の効果や副作用の体質による個人差を予知することが可能であることが示されてきており、これを利用して、個人個人にとって最適な治療を施していこうという気運が高まっている。
【０００３】
例えば、特定の遺伝子と、特定の治療薬剤の効果や副作用が強く相関することがわかっている場合、この情報を特定の患者の治療に役立てるためには、患者の遺伝子の塩基配列を知る必要がある。内因性遺伝子の変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）に関する情報を得るための遺伝子診断は、そのような変異又は一塩基多型を含む標的核酸の増幅及び検出により行なうことができる。このため、サンプル中の標的核酸を迅速且つ正確に増幅及び検出し得る簡便な方法が求められる。
【０００４】
この場合、分析対象物質を特異的に吸着する抗体又は抗原等のタンパク質或いは一本鎖の核酸をプローブに使い、分析対象物質と抗原抗体反応又は核酸ハイブリダイゼーションを行う。そして、分析対象物質には、分析対象物質に特異的に結合する上記のタンパク質や核酸などを担持した酵素等の検知感度の高い標識物質を結合させておき、この標識物質を検出、定量して、分析対象物質の検出、定量を行っている。
【０００５】
この種の技術として、単一の流路に複数の液を順次投入し、流路内で抗原抗体反応及び洗浄操作を行う技術が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。そして、単一の流路に複数の液を順次投入するものにおいて、液の間に気泡が介入することを防止する技術も知られている（例えば、特許文献３参照）。特許文献３に開示された技術は、流路を疎水性とし、そこに、空気抜き用の穴と撥水バルブとを設け、加圧送液することにより液の間の空気を排出するようにしている。
【特許文献１】国際公開０３／０６２８２３号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−３３７２２１号公報
【特許文献３】特開２００７−８３１９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の特許文献１、２に開示された技術では、順次投入される液の間に気泡が介入する虞がある。気泡が介入すると、液が流路の一辺のみを伝わって不均一な流れとなり易く、送液が安定しない。また、気泡が混入すると先に流れる液の後端に気液界面が生じ、これが流路の反応部を通過することに起因して非特異的吸着が生じやすくなる。
【０００７】
ここで、非特異的吸着とは、本来的に相互作用しない分子に物質が吸着されることをいう。例えば抗原抗体反応において、抗原を分析対象物質とし、反応部に固定された抗体で抗原を特異的に吸着し、吸着された抗原に結合している標識物質を検出、定量して、抗原を検出、定量するところ、標識物質が単独で反応部に吸着されてしまうようなことをいう。
【０００８】
上記の特許文献３に開示された技術では、流路が疎水性であり、標識物質を抗原に結合させるために標識物質に担持させた抗体が疎水面に付着し易いため、標識物質の非特異的吸着が増加し、それに起因して分析対象物質の検出、定量精度の低下が懸念される。
【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みなされたものであり、その目的は、気泡の混入を防止し、分析対象物質の検出、定量精度を高めることのできる反応方法及び反応装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）  第１の流路において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法であって、前記第１の流路に接続した第２の流路に前記分析対象物質及び該分析対象物質に結合する標識物質を含む検体液を流し、該検体液を該第１の流路に送液する工程と、
前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流し、前記第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路に送液する工程と、を備える反応方法。
【００１１】
上記の反応方法によれば、第２の流路に流れる検体液の後端が第１の流路に流入した後、検体液の送液を停止させ、第２の流路とは異なる流路であって、第１の流路に接続する第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流して、第１の流路に停止する検体液の後端に洗浄液を合流させているので、検体液と洗浄液との間に気泡が介入しない。それにより、送液を安定させることができ、また、第１の流路における非特異的吸着を抑制することができる。
【００１２】
（２）  （１）記載の反応方法であって、前記第１の流路に、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を設け、前記第１の流路の内圧の変化に基づいて、前記検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出する反応方法。
【００１３】
上記の反応方法によれば、第２の流路より小さい断面積の狭小区間において作用する毛管力は、第２の流路のそれに比べて大きく、よって、検体液の後端が第２の流路から狭小区間に流入すると、狭小区間の毛管力に勝る程に第１の流路の内圧が減圧されるまで検体液は停止し、その間に反応流路の内圧は徐々に減圧される。そこで、第１の流路の内圧の変化により、検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、検体液の送液を停止させることができる。
【００１４】
（３）  （２）記載の反応方法であって、前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応方法。
【００１５】
上記の反応方法によれば、狭小区間の毛管力が、第２の流路のそれに比べて比較的大きく、検体液の後端が第１の流路に流入したことを、より確実に検出できる。
【００１６】
（４）  （１）〜（３）のいずれか一項記載の反応方法であって、前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応方法。
【００１７】
上記の反応方法によれば、液がエッジを伝って容易に第１の流路に流入することを防止して、第２の流路の接続部を液で満たすことができ、より確実に気泡を排除することができる。
【００１８】
（５）  第１〜第３の流路、及びこれら第１〜第３の流路の基端部にそれぞれ設けられた第１〜第３のポートを含むマイクロ流体チップと、前記第１〜第３のポートにそれぞれ圧力を作用させ、前記第１〜第３の流路に送液する送液手段と、前記送液手段を駆動する制御手段と、を備え、前記第１の流路及び前記第２の流路は、それらの先端部において互いに接続し、前記第３の流路は、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流しており、前記第１の流路は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行い、前記制御手段は、前記分析対象物質及び該分析対象物質に結合する標識物質を含み前記第２の流路に流れる検体液を前記第１の流路に送液し、該検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出して、該検体液の送液を停止させると共に前記第３の流路に流れる洗浄液を該第１の流路に停止する該検体液の後端に合流させ、該検体液の後端に該洗浄液が合流した後に該洗浄液を該第１の流路に送液する反応装置。
【００１９】
上記の反応装置によれば、第２の流路に流れる検体液の後端が第１の流路に流入した後、検体液の送液を停止させ、第２の流路とは異なる流路であって、第１の流路に接続する第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流して、第１の流路に停止する検体液の後端に洗浄液を合流させているので、検体液と洗浄液との間に気泡が介入しない。それにより、送液を安定させることができ、また、第１の流路における非特異的吸着を抑制することができる。
【００２０】
（６）  （５）記載の反応装置であって、前記第１のポートに作用する圧力を測定する圧力測定手段をさらに備え、前記第１の流路が、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を有しており、前記制御手段は、前記圧力測定手段から送出される測定信号に基づいて、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出する反応装置。
【００２１】
上記の反応装置によれば、第２の流路より小さい断面積の狭小区間において作用する毛管力は、第２の流路のそれに比べて大きく、よって、検体液の後端が第２の流路から狭小区間に流入すると、狭小区間の毛管力に勝る程に第１の流路の内圧が減圧されるまで検体液は停止し、その間に反応流路の内圧は徐々に減圧される。そこで、第１の流路の内圧の変化により、検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、検体液の送液を停止させることができる。
【００２２】
（７）  （６）記載の反応装置であって、前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応装置。
【００２３】
上記の反応装置によれば、狭小区間の毛管力が、第２の流路のそれに比べて比較的大きく、検体液の後端が第１の流路に流入したことを、より確実に検出できる。
【００２４】
（８）  （５）〜（７）のいずれか一項記載の反応装置であって、前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応装置。
【００２５】
上記の反応装置によれば、液がエッジを伝って容易に第１の流路に流入することを防止して、第２の流路の接続部を液で満たすことができ、より確実に気泡を排除することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、吸着反応を行う第１の流路に順次供給される検体液と洗浄液との間に気泡が介入せず、それにより送液が安定すると共に非特異的吸着が抑制されるので、分析対象物質の検出、定量精度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を参照して説明する。
【００２８】
図１は本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図、図２は図１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図、図３は図１のマイクロ流体チップのIII−III線断面図である。
【００２９】
図１に示すマイクロ流体チップ１は、第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、及び第３の流路ＣＨ３と、これらの流路ＣＨ１〜ＣＨ３の基端部にそれぞれ設けられた第１のポートＰＴ１、第２のポートＰＴ２、及び第３のポートＰＴ３と、を備えている。ポートＰＴ１〜ＰＴ３には、各流路ＣＨ１〜ＣＨ３の内圧を制御するように圧力が作用し、また、必要に応じて、マイクロ流体チップ１に供給される液が投入される。
【００３０】
第１の流路ＣＨ１及び第２の流路ＣＨ２は、それらの先端部ＣＨ１ａ，ＣＨ２ａにおいて互いに接続している。また、第３の流路ＣＨ３は、第１の流路ＣＨ１に接続した第２の流路ＣＨ２の接続部（先端部）ＣＨ２ａに合流している。この第１の流路ＣＨ１は、第２の流路ＣＨ２との接続部（先端部）ＣＨ１ａから続く区間であって、その断面積ａが第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さい狭小区間ＣＨ１ｂを有している。
【００３１】
接続部ＣＨ１ａの開口４ａは、第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａの底面にあって、該底面を形成するエッジから離れた位置にある（図３参照）。エッジから離れていることで、第２の流路ＣＨ２に流れる液が、そのエッジを伝って容易に狭小区間ＣＨ１ｂに流入してしまうことが防止される。それにより、まず第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａが液で満たされ、その後に狭小区間ＣＨ１ｂに流入する。そこで、第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに気泡が残留することが防止される。
【００３２】
このマイクロ流体チップ１は、図２及び図３に示すように、複数の層Ｌ１〜Ｌ５を積層した構造となっている。第１の層Ｌ１は基板とされ、その上に積層される第２の層Ｌ２には、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが、層を貫通して形成されている。第２の層Ｌ２が第１の層Ｌ１と第３の層Ｌ３とで表裏から挟まれて、溝２ａの位置に狭小区間ＣＨ１ｂが構成される。
【００３３】
第３の層Ｌ３の上に積層される第４の層Ｌ４には、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１を構成するための溝２ｂ、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃ、及び第３の流路ＣＨ３を構成するための溝２ｄが、それぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４が第３の層Ｌ３と第５の層Ｌ５とで表裏に挟まれて、溝２ｂ〜２ｄの位置に、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、及び第３の流路ＣＨ３がそれぞれ構成される。また、第４の層Ｌ４には、ポート孔３ｂ〜３ｄが、各溝２ｂ〜２ｄの基端部に層を貫通して形成されている。
【００３４】
第２の層Ｌ２と第４の層Ｌ４との間に介在する第３の層Ｌ３には、通孔４ａ，４ｂがそれぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４の溝２ｃの先端部（第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに相当）と第２の層Ｌ２の溝２ａの一端部（第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａに相当）とは上下に重なっており、通孔４ａはその間に配置されるようになっている。また、第４の層Ｌ４の溝２ｂの先端部と第２の層Ｌ２の溝２ａの他端部とは上下に重なっており、通孔４ｂはその間に配置されるようになっている。通孔４ａは、第２の流路に接続する第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａの開口を構成する。また、通孔４ｂは、狭小区間ＣＨ１ｂ及び該区間を除く第１の流路ＣＨ１を繋ぐ。
【００３５】
マイクロ流体チップ１の蓋となる第５の層Ｌ５には、ポート孔５ｂ〜５ｄがそれぞれ層を貫通して形成されている。ポート孔５ｂ〜５ｄは、第４の層Ｌ４のポート孔３ｂ〜３ｄに重なってポートＰＴ１〜ＰＴ３をそれぞれ構成し、外部から各ポートＰＴ１〜ＰＴ３への接続を提供する。
【００３６】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは、第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくなっており、それらの断面積は、各層の厚みによって変えられている。例えば、流路の幅を２ｍｍで一定とし、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃが形成された第４の層Ｌ４の厚みが０．５〜３ｍｍとし、狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが形成された第２の層Ｌ２の厚みを０．０１〜０．２ｍｍとする。狭小区間ＣＨ１ｂの幅を第２の流路ＣＨ２の幅よりも小さくして、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａを第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくしてもよい。好ましくは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは、第２の流路ＣＨ２の断面積Ａの２／５〜１／３００である。
【００３７】
以上の層Ｌ１〜Ｌ５は、例えばポリスチレンやアクリルなどの合成樹脂製の板で形成することができ、層間に両面粘着シートなどの接着材を適宜介在させて相互に接合されるが、例えば第２の層Ｌ２などは、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを形成するために比較的厚みが小さくなるので、それ自体を両面粘着シートで形成するようにしてもよい。各層の溝、ポート孔、及び連通孔は、例えばレーザー加工により形成される。
【００３８】
尚、第３の層Ｌ３において、少なくとも第２の層Ｌ２の溝２ａに重なる部位には透明な窓部６ａが設けられており、また、第４の層Ｌ４及び第５の層Ｌ５において、同じく第２の層Ｌ２の溝２ａに重なる部位には、窓孔６ｂ，６ｃが形成されている。層Ｌ１〜Ｌ５が順次積層された状態で、窓孔６ｂ，６ｃ及び窓部６ａにより検出部６が構成され、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、この検出部６を通して外部より視認可能である。
【００３９】
次に、マイクロ流体チップ１の使用例を説明する。図４は、マイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図であり、以下に説明するマイクロ流体チップの使用例では、マイクロ流体チップに分析対象物質としての抗原を含む検体液を供給し、マイクロ流体チップの流路内で抗原抗体反応を行って抗原を検出し、定量するものである。
【００４０】
図４に示すように、マイクロ流体チップ１の第２のポートＰＴ２には、抗原を含む検体液（第１の液）が投入される。また、第３のポートＰＴ３には洗浄液（第２の液）が投入される。第２のポートＰＴ２に投入された検体液は第２の流路ＣＨ２に流れ、また第３のポートＰＴ３に投入された洗浄液は第３の流路ＣＨ３に流れ、それらは第１の流路ＣＨ１に順次供給される。
【００４１】
第２の流路ＣＨ２の中間部位には、抗原に結合する抗体を担持した標識物質としての蛍光微粒子が固定された前処理部ＣＨ２ｂが設けられている。検体液が前処理部ＣＨ２ｂを流れる際に、蛍光微粒子は前処理部ＣＨ２ｂへの固着を溶解され、検体液に含まれる抗原に結合する。尚、検体液に含まれる抗原に予め蛍光微粒子を結合させた状態で検体液を第２のポートＰＴ２に投入するようにしてもよい。
【００４２】
検体液及び洗浄液が順次供給される第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、検体液に含まれる抗原を特異的に吸着するプローブとしての抗体が固定され、抗原抗体反応を行う反応部とされている。尚、少なくとも反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの表面は、適宜な表面処理が施されて親水性とされている。
【００４３】
反応装置１１は、上記のマイクロ流体チップ１と、電磁バルブＳＶ１〜ＳＶ４と、空気を作動流体とするポンプ１２と、圧力センサ（圧力測定手段）１３と、液位置検出手段１４と、蛍光検出手段１５と、制御手段１６と、を備えている。
【００４４】
第１のポートＰＴ１、及び第２のポートＰＴ２は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２に接続されている。ポンプ１２と第２のポートＰＴ２とを接続する配管には電磁バルブＳＶ１〜ＳＶ３が介在している。また、第３のポートＰＴ３は、ポートパッド（不図示）及び配管を介して電磁バルブＳＶ４に接続されている。
【００４５】
圧力センサ１３は、ポンプ１２と第１のポートＰＴ１との間に設けられ、第１のポートＰＴ１に作用する圧力、即ち第１の流路１の内圧を測定する。
【００４６】
液位置検出手段１４は、流路ＣＨ１〜ＣＨ３の適宜な位置において、その位置に検体液又は洗浄液の先端が到達したことを検出する。検出方法としては、検出位置に光を照射して反射光を検出し、空気と液体との屈折率変化に基づく反射光の光量変化から、液体の有無を判定する方法を例示することができる。
【００４７】
図示の例では、検出位置として、第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂから第１のポートＰＴ１側に若干下った位置に第１の検出位置ＰＨ１が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第２の流路ＣＨ２に合流する手前の位置に第２の検出位置ＰＨ２が設けられ、また、第１の流路ＣＨ１において第１のポートＰＴ１の手前の位置に第３の検出位置ＰＨ３が設けられている。
【００４８】
蛍光検出手段１５は、マイクロ流体チップ１の検出部６を通して、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに特定波長の励起光を照射する。狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着された抗原に結合している蛍光微粒子が励起光を吸収して蛍光を発し、蛍光検出手段１５は、この蛍光を検出して抗原を検出し、また、その蛍光強度により抗原を定量する。
【００４９】
制御手段１６は、検査シーケンスを記憶したＲＯＭやＣＰＵなどを有し、圧力センサ１３から送出される測定信号、及び液位置検出手段１４から送出される検出信号を受け、それらの信号などに基づいて適宜なタイミングでポンプ１２及びバルブＳＶ１〜ＳＶ４を駆動し、ポートＰＴ１〜ＰＴ３を加圧、減圧、大気開放、密閉する。それにより、流路ＣＨ１〜ＣＨ３内で検体液及び洗浄液が自在に搬送される。
【００５０】
上記の反応装置１１を用いた検査シーケンスを説明する。図５〜図７は検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図、図８は検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。以下において、図８の制御タイミングＶ１−１〜Ｖ１−７と、図５〜図７の各ステップＳ１−１〜Ｓ１−１５を対応させて説明する。
【００５１】
まず、マイクロ流体チップ１を用意し（Ｓ１−１）、マイクロ流体チップ１の第３のポートＰＴ３に洗浄液を投入し（Ｓ１−２）、第２のポートＰＴ２に検体液を投入する（Ｓ１−３）。
【００５２】
マイクロ流体チップ１を反応装置１１にセットし、ポートＰＴ１〜ＰＴ３にポートパッドをそれぞれ押し付ける。この時、各ポートパッドは大気開放とされ、パッドの押し付けにより検体液及び洗浄液が移動することはない。
【００５３】
反応装置１１のスタートスイッチが押されると（Ｖ１−１）、第１のポートＰＴ１が減圧され、検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第２の流路ＣＨ２から第１の流路ＣＨ１に流れる（Ｓ１−４〜Ｓ１−７）。検体液が第２の流路ＣＨ２の前処理部ＣＨ２ｂを通過する際に、検体液に含まれる抗原に前処理部ＣＨ２ｂの蛍光微粒子が結合する。
【００５４】
検体液の先端が第１の検出位置ＰＨ１に到達し、第１の検出位置ＰＨ１について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｓ１−８、Ｖ１−２）、第１のポートＰＴ１が大気開放となり、検体液がその位置で停止する。この動作により、検体液を所定の位置で精度よく停止させることができる。この時に検体液の後端が第２の流路ＣＨ２にあるように、第１の検出位置ＰＨ１は設定される。
【００５５】
第１のポートＰＴ１が大気開放となって所定時間（例えば０．５秒）経過すると（Ｖ１−３）、第１のポートＰＴ１が再び減圧され、検体液が低速（例えば８μＬ／ｍｉｎ）で第１の流路ＣＨ１に流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応が所定時間（例えば５分間）行われる（Ｓ１−９）。
【００５６】
検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入すると、検体液が自動的に停止する（Ｓ１−１０）。これは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａが第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくなっており、狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力が搬送圧力よりも大きくなるためである。ポンプ１２は継続して吸引し続け、第１の流路ＣＨ１は徐々に減圧されるが、搬送圧力が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力よりも大きくなるまで、検体液は停止している。
【００５７】
そこで、第１の流路ＣＨ１の内圧の変動を圧力センサ１３で測定することにより、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを検出することができる。好ましくは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは第２の流路ＣＨ２の断面積Ａの２／５〜１／３００である。これによれば、狭小区間ＣＨ１ｂの毛管力が第２の流路ＣＨ２のそれに比べて十分に大きく、検体液の後端が狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを、より確実に検出することができる。
【００５８】
第１の流路ＣＨ１の内圧が所定圧力（例えば０．３ｋＰａ）まで減圧されると（Ｖ１−４）、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したとして、第３のポートＰＴ３が大気開放となり、第２のポートＰＴ２が減圧される。それにより、第３のポートＰＴ３に収容されている洗浄液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ１−１１）。この時、第１のポートＰＴ１及び第２のポートＰＴ２は同一の圧力となるようにポンプ１２で吸引され、検体液が第１の流路ＣＨ１から第２の流路ＣＨ２に逆流することはない。
【００５９】
検体液が第１の流路ＣＨ１に停止している間に、洗浄液の先端が第２の検出位置ＰＨ２に到達し、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態になり（Ｓ１−１２、Ｖ５）、それから所定時間（例えば３秒）経過すると（Ｖ１−６）、洗浄液は、第３の流路ＣＨ３が合流する第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに到達する。第２の流路ＣＨ２は、その接続部ＣＨ２ａにおいて第１の流路ＣＨ１に接続していることから、洗浄液は、気泡の介入なく検体液の後端に合流する（Ｓ１−１３）。
【００６０】
第２のポートＰＴ２が密閉され、第１のポートＰＴ１のみ減圧される。洗浄液が、気泡の介入なく検体液に連なって、低速（例えば８μＬ／ｍｉｎ）で狭小区間ＣＨ１ｂに流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの洗浄が行われる（Ｓ１−１４）。それにより、未反応の抗原及び蛍光微粒子は狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。
【００６１】
検体液及び洗浄液の全てが第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂより下流に流れ、液の先端が第３の検出位置ＰＨ３に到達し、第３の検出位置ＰＨ３について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ１−７）、ポンプ１２が停止して液が停止する（Ｓ１−１５）。また、第１のポートＰＴ１、及び第２のポートＰＴ２が大気開放となる。
【００６２】
図９に、反応部における抗原抗体反応を模式的に示す。図９（ａ）〜（ｂ）に示すように、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに、蛍光微粒子（標識物質）Ｉｄが結合した抗原（分析対象物質）Ａｇを含む検体液が流れると、それらの抗原Ａｇは、狭小区間ＣＨ１ｂに固定された抗体（プローブ）Ｉｇに特異的に吸着される。尚、一部の抗原Ａｇ´が、狭小区間ＣＨ１ｂに固定された抗体Ｉｇに吸着されることなく検体液中に分散している場合もある。また、検体液には、抗原Ａｇに結合することなく単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄも含まれている。
【００６３】
図９（ｃ）に示すように、狭小区間ＣＨ１ｂに洗浄液が流れると、抗体Ｉｇに吸着されずに検体液中に分散している抗原Ａｇ´及び検体液中に単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄは、検体液又は洗浄液に乗って狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。ここで、検体液中に単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄが抗体Ｉｇに非特異的に吸着されることがあり、非特異的に吸着された蛍光微粒子Ｉｄ´は、洗浄によっても狭小区間ＣＨ１ｂに残留する。
【００６４】
蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【実施例】
【００６５】
図１〜図３に示す構成のマイクロ流体チップを用い、上述した検査シーケンスを経た後に反応部に存在する標識物質を検出、定量した。
【００６６】
マイクロ流体チップは、ポリスチレン製基板の第１の層（１００×３０×１ｍｍ）、両面粘着シートである第２の層（１００×３０×０．０５ｍｍ）、アクリル製基板の第３の層（１００×３０×０．２ｍｍ）、表面に両面粘着シートを貼付したアクリル製基板の第４の層（１００×３０×０．７ｍｍ）、アクリル製基板の第５の層（１００×３０×０．２ｍｍ）を順次積層して構成されている。各層には、上述のとおり第１〜第３の流路となる溝、及び第１〜第３のポートとなるポート孔がレーザー加工で形成されている。第１の流路の狭小区間は、幅２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍに形成されており、また、反応部とされている。第１の流路に接続する第２の流路は、幅２ｍｍ、深さ０．７ｍｍに形成されている。
【００６７】
以上の第１〜第５の層を下記の手順により積層した。
１）第１の層には、前処理として、蒸留水で洗浄を行い、乾燥させた後、ＵＶオゾン処理を行う。
２）第１の層と第２の層を、第２の層がチップの上層となるように積層する。
３）第１の層と第２の層を積層して形成した第１の流路の狭小区間の底面部分に、分析対象物質を特異的に吸着するためのプローブを固定する。その後、非特異的吸着を抑制するためのブロッキング処理、固定されたプローブの活性を維持するためのイムノスタビライザー処理を施す。
４）第３〜第５の層にはそれぞれブロッキング処理を施す。
５）第２の層の上に、さらに第３〜第５の層を順次積層する。
【００６８】
分析対象物質をｈＣＧ抗原とし、反応部に固定されるプローブには抗ｈＣＧ抗体を用いた。検体液には、抗ｈＣＧ抗体を担持したポリスチレン製蛍光微粒子（Yellow Green、φ500nm）を標識物質として含むものを用いた。この検体液には、ｈＣＧ抗原は含まれておらず、よって、マイクロ流体チップの反応部に存在する蛍光微粒子は、非特異的に吸着されたものである。尚、洗浄液にはＰＢＳ−Ｔ溶液を用いた。
【００６９】
上述した検査シーケンスにて反応を行った場合、即ち、検体液と洗浄液との間に気泡が介入していない場合（実施例）、及び従来手法のように検体液と洗浄液との間に気泡が介入している場合（比較例）について、反応部に非特異的に吸着された蛍光微粒子を定量した。結果を図１０に示す。
【００７０】
図１０に示すとおり、検体液と洗浄液との間に気泡が介入していない場合（実施例）に、蛍光微粒子の非特異的吸着は、検体液と洗浄液との間に気泡が介入している場合（比較例）の１／１０以下になっており、よって、分析対象物質の検出・定量の精度が向上する。
【００７１】
以上、分析対象物質を抗原とし、これを抗原抗体反応により特異的に吸着して検出、定量するものとして説明したが、これに限定されるものではない。例えば、分析対象物質を核酸とし、これをハイブリダイゼーションにより特異的に吸着して検出、定量するものにも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図である。
【図２】図１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。
【図３】図１のマイクロ流体チップのIII-III線断面図である。
【図４】図１のマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図である。
【図５】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図６】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図７】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図８】図４の反応装置による検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。
【図９】反応部における抗原抗体反応を示す模式図である。
【図１０】実施例及び比較例の蛍光微粒子の定量結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７３】
１  マイクロ流体チップ
１１  反応装置
１２  ポンプ（送液手段）
１３  圧力センサ（圧力測定手段）
１６  制御手段
ＣＨ１  第１の流路
ＣＨ１ａ  第２の流路に接続する接続部
ＣＨ１ｂ  狭小区間
ＣＨ２  第２の流路
ＣＨ２ａ  第１の流路に接続する接続部
ＣＨ３  第３の流路
ＰＴ１  第１のポート
ＰＴ２  第２のポート
ＰＴ３  第３のポート
ＳＶ１  電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ２  電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ３  電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ４  電磁バルブ（送液手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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