(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害を再現するモデル動物として使用可能である遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物を提供する。【解決手段】ＳＯＤ２酵素の発現がＲＮＡ干渉法によりノックダウンされている、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。このＲＮＡ干渉法では、特定の第１の塩基配列と、他の第２の塩基配列と、第１の塩基配列および第２の塩基配列を連結するループ配列と、を含む塩基配列からなるｓｈＲＮＡを発現可能なアデノウイルスベクターを非ヒト哺乳動物に感染させることにより、ＳＯＤ２酵素の発現を抑制する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＯＤ２遺伝子がノックダウンされている、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
ＳＯＤ２酵素の発現がノックダウンされている、請求項１記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記ＳＯＤ２酵素の発現がＲＮＡ干渉法によりノックダウンされている、請求項２記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記ＲＮＡ干渉法が、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現させる干渉法である、請求項３記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記ＲＮＡ干渉法が、前記ｓｈＲＮＡまたは前記ｓｉＲＮＡを発現可能なアデノウイルスベクターを前記非ヒト哺乳動物に感染させる干渉法である、請求項４記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物がラットである、請求項１乃至５いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるＳＯＤ２ｍＲＮＡの発現量、ＳＯＤ２タンパク質の発現量、またはＳＯＤ２酵素活性のいずれかが有意に低い、請求項１乃至６いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
ヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害を再現するモデル動物として使用可能である、請求項１乃至７いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物、その肝臓組織またはその肝臓細胞を用いる、ヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害の原因候補化合物についての薬物動態の試験方法。
【請求項１０】
（ａ）配列番号：１に記載される第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される第２の塩基配列と、前記第１の塩基配列および前記第２の塩基配列を連結するループ配列と、を含む塩基配列、
（ｂ）配列番号：１に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第２の塩基配列と、前記第１の塩基配列および前記第２の塩基配列を連結するループ配列と、を含む塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に記載される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する第２の塩基配列と、前記第１の塩基配列および前記第２の塩基配列を連結するループ配列と、を含む塩基配列、
（ｄ）配列番号：１に記載される塩基配列に対して相補的な塩基配列と特異的に結合する第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列相補的な塩基配列と特異的に結合する第２の塩基配列と、前記第１の塩基配列および前記第２の塩基配列を連結するループ配列と、を含む塩基配列、
のいずれかの塩基配列からなるｓｈＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ｓｈＲＮＡをラットの細胞内で発現させることにより、前記ラットの細胞内におけるＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる、請求項１０記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項１２】
（ａ）配列番号：１に記載される第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される第２の塩基配列と、を含む塩基配列、
（ｂ）配列番号：１に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第２の塩基配列と、を含む塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に記載される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する第２の塩基配列と、を含む塩基配列、
（ｄ）配列番号：１に記載される塩基配列に対して相補的な塩基配列と特異的に結合する第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列相補的な塩基配列と特異的に結合する第２の塩基配列と、を含む塩基配列、
のいずれかの塩基配列からなるｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡをラットの細胞内で発現させることにより、前記ラットの細胞内におけるＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる、請求項１２記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
請求項１０または１１記載のｓｈＲＮＡまたは請求項１２または１３記載のｓｉＲＮＡを発現可能なアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
前記アデノウイルスベクターをラットに感染させ、前記ｓｈＲＮＡまたは前記ｓｉＲＮＡを発現させることにより、ＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる、請求項１４記載のアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物、それを用いる薬物動態の試験方法、並びにそれを作成するためのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびアデノウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床で問題となる薬物による副作用の３分の１以上は、代謝反応に起因するものであると言われている。そのうちの９０％以上がチトクロムＰ４５０による代謝反応が関与する。最近、代謝反応に起因する薬物相互作用に関心が高まり、医療用医薬品の添付文書も相互作用をチトクロムＰ４５０の分子種レベルで説明するように改訂されてきている。
【０００３】
さらに、１９９７年米国ＦＤＡの「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」でも示されたように、薬の開発から臨床での適切な使用に至るまで、代謝反応が関わる薬物相互作用に充分注意をする必要があると言われるようになってきた。特に、すでに臨床で使用されている薬に見いだされている様々な薬物相互作用について代謝レベルで主にｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討することにより、相互作用についてさらに理解を深めることが重要となってきた。
【０００４】
実験動物やｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験結果からヒトでの結果を予測することを「外挿」と言う。すなわち、実験動物で得られた代謝物が本当にヒトにも生成し得るものであるか等が問題となる。ラットやマウスの齧歯類よりも、ヒトに近いイヌやサルを用いた研究も盛んに行われているが、膨大な数の実験動物の使用を少しでも減らすためにも、適切にヒトへの外挿ができる実験手段の開発が望まれている。こうした観点から、ヒトの薬物代謝酵素の遺伝子を導入したあらたな試験系の開発が望まれている。
【０００５】
ヒトの薬物代謝酵素の遺伝子を導入した公知の薬理学的および毒性学的研究のための非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウス（特許文献１の実施例６）などが挙げられる。
【０００６】
一方、薬物誘導性肝障害を惹起する原因の一つとして、酸化ストレスが知られており、酸化ストレスの引き金となるスーパーオキシドの９０％以上がミトコンドリア中で産生される。Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ２（ＳＯＤ２）はミトコンドリア中に局在しており、スーパーオキシドの除去に重要な役割を果たしている。
【０００７】
ここで、非特許文献１および非特許文献２には、ＳＯＤ２へテロノックアウトマウスにおけるＳＯＤ２遺伝子の発現抑制が薬物誘導性肝障害を引き起こす原因となる旨が記載されている。すなわち、非特許文献１および非特許文献２には、マウスのＳＯＤ２ヘテロノックアウトによって薬物誘導性肝障害がおきる旨が記載されている。特に、非特許文献１には、ＳＯＤ２へテロノックアウトマウスにトログリタゾンを投与すると、ミトコンドリアの酸化ストレスのバイオマーカー（ＡＣＯ２）の減少や、タンパク質の酸化物（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｂｏｎｙｌｓ）の増加が観察される旨が記載されている。 
【０００８】
なお、トログリタゾンによる薬物性肝障害については、例えば非特許文献３において代謝性特異体質性肝障害に分類されている。
【０００９】
【特許文献１】特表２００４−５３３８２６号公報
【非特許文献１】Lee YH, Chung MC, Lin Q, Boelsterli UA., “Troglitazone-induced hepatic mitochondrial proteome expression dynamics in heterozygous Sod2(+/-) mice: two-stage oxidative injury.”, Toxicol Appl Pharmacol. 2008 Aug 15; 231(1):43-51. Epub 2008 Apr 12.
【非特許文献２】Ong MM, Latchoumycandane C, Boelsterli UA., “Troglitazone-induced hepatic necrosis in an animal model of silent genetic mitochondrial abnormalities.”, Toxicol Sci. 2007 May; 97(1):205-13. Epub 2006 Dec 5.
【非特許文献３】池田敏彦著、「肝機能障害」日本薬理学雑誌 Vol.127 (2006), No.6 454-459
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１に記載されているヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスは、ヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物としてはさらなる改善の余地がある。なぜなら、ラットおよびマウスの肝臓組織におけるグルタチオン合成能は、ヒトの肝臓組織におけるグルタチオン合成能よりも著しく高いため、活性代謝物をグルタチオン抱合して解毒する能力に優れるためである。
【００１１】
特に、グルタチオン抱合の速度はラットよりマウスが４倍速いことが知られている（Liu J et al., “Characterization of the acetaminophen-glutathione conjugation reaction by liver microsomes: species difference in the effects of acetone.”, Toxicol Lett., 1991, May;56(3):269-274）ことから、ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスでは、薬物誘導性肝障害が起こりにくく、ヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物としては使用困難である。
【００１２】
また、非特許文献１および非特許文献２に記載されているＳＯＤ２へテロノックアウトマウスでは、トログリタゾンを投与することによって薬物誘導性肝障害が引き起こされている。ここで、トログリタゾンによって引き起こされる薬物誘導性肝障害は、非特許文献３にもあるように、代謝性特異体質性の薬物誘導性肝障害（非用量依存性の薬物誘導性肝障害）に分類されており、アセトアミノフェンによって引き起こされる非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）とは作用機序が全く異なっている。そのため、非特許文献１および非特許文献２に記載されているＳＯＤ２へテロノックアウトマウスを、アセトアミノフェンによって引き起こされる非特異体質性の薬物誘導性肝障害のモデルマウスとして使用することは困難である。
【００１３】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アセトアミノフェンなどによって引き起こされるヒトにおける非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）を予測するモデル動物として活用できる、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、ＳＯＤ２遺伝子がノックダウンされている、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が提供される。
【００１５】
この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、ＳＯＤ２遺伝子がノックダウンされているため、薬物の活性代謝物のＳＯＤ２酵素による解毒作用を抑制することができる。その結果、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００１６】
上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、別の視点から見れば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるＳＯＤ２ｍＲＮＡの発現量、ＳＯＤ２タンパク質の発現量、またはＳＯＤ２酵素活性のいずれかが有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物である。
【００１７】
この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるＳＯＤ２ｍＲＮＡの発現量、ＳＯＤ２タンパク質の発現量、またはＳＯＤ２酵素活性のいずれかが有意に低いため、薬物の活性代謝物のＳＯＤ２酵素による解毒作用を抑制することができる。その結果、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００１８】
また、本発明によれば、上記のいずれかの遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物、その肝臓組織またはその肝臓細胞を用いる、ヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害の原因候補化合物についての薬物動態の試験方法が提供される。
【００１９】
この薬物動態の試験方法によれば、上記のいずれかの遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物、その肝臓組織またはその肝臓細胞を用いるため、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となり、その薬物の活性代謝物によるヒトにおける毒性発現予測が可能となる。
【００２０】
また、本発明によれば、後述する特定の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが提供される。
【００２１】
これらの特定の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをラットの細胞内で発現させることにより、ラットの細胞内におけるＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる。
【００２２】
そして、このラットでは、ＳＯＤ２酵素がノックダウンされているため、薬物の活性代謝物のＳＯＤ２酵素による解毒作用を抑制することができる。その結果、このラットでは、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルラットが得られる。
【００２３】
また、本発明によれば、上記のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかを発現可能なアデノウイルスベクターが提供される。
【００２４】
このアデノウイルスベクターをラットに感染させ、上記のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかを発現させることにより、ＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる。
【００２５】
そして、このラットでは、ＳＯＤ２酵素がノックダウンされているため、薬物の活性代謝物のＳＯＤ２酵素による解毒作用を抑制することができる。その結果、このラットでは、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルラットが得られる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、薬物の活性代謝物のＳＯＤ２酵素による解毒作用が抑制されるため、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００２７】
また、本発明によれば、上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物を用いることにより、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２９】
＜本研究の経緯＞
図１で説明するように、薬物誘導性肝障害を惹起する原因の一つとして、酸化ストレスが知られており、酸化ストレスの引き金となるスーパーオキシドの９０％以上がミトコンドリア中で産生される。Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ２（ＳＯＤ２）は、ミトコンドリア中に局在しており、スーパーオキシドの除去に重要な役割を果たしている。本研究ではラットＳＯＤ２−ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ）を発現するアデノウイルス（ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ）を構築することで、ＳＯＤ２を減少させた細胞実験系およびラットにおけるモデル動物実験系を作製し、薬物誘導性のスーパーオキシドが関与する肝障害を高感度に予測する系を確立することを目的とした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏではアデノウイルスを用いたｓｈＲＮＡ発現法を用いてラット肝由来ＢＲＬ３Ａ細胞においてＳＯＤ２を減少させる検討を行い、被検薬物による細胞生存率への影響を検討した。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＳＯＤ２減少ラットを作製し、肝障害性を引き起こす典型的な化合物であるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の肝障害性への影響を検討した。
【００３０】
ここで、酵素活性を抑制する主な方法にノックアウトとノックダウンがあるが、ノックアウトでは、遺伝子を欠損させることにより、他の遺伝子の発現に及ぼす影響が無視できない場合がある。また、図２で説明するように、ＳＯＤ２遺伝子を完全にノックアウトするとマウス胎児は致死性となるため、ＳＯＤ２遺伝子のノックアウトマウスを得ることは不可能であり、非特許文献１および非特許文献２のようにＳＯＤ２へテロノックアウトマウスしか得ることができない。そこで、本発明者は、ラットのＳＯＤ２遺伝子をノックダウンする方法を採用した。なかでもスモールヘアピンＲＮＡの発現ベクターをアデノウイルスの系で用いることを考えた。
【００３１】
すなわち、図２で説明するように、本研究では、スーパーオキシドを除去する能力を持つＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ２（ＳＯＤ２）酵素に注目し、この酵素の産生をアデノウイルスの系を用いてＲＮＡ干渉法によりノックダウンすることを検討した。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＳＯＤ２酵素の発現を阻害し、ＳＯＤ２酵素によるスーパーオキシド除去能を減少させた細胞実験系またはモデル動物実験系を作成し、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明および、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることを目的として検討した。
【００３２】
その結果、本発明者は、後述するように、ＳＯＤ２酵素の産生をアデノウイルスの系を用いてＲＮＡ干渉法によりノックダウンすることにより、ラットの肝臓組織におけるＳＯＤ２酵素の含有量を実際に低減できることを見出した。そして、本発明者は、その結果、ラットの肝臓組織において実際にｉｎ  ｖｉｖｏでアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の投与による用量依存性の肝障害が発症することを見出した。すなわち、本発明者は、この遺伝子ノックダウンラットが、ヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害の原因候補化合物についての薬物動態の研究に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物であることを確認した。
【００３３】
＜ＳＯＤ２＞
本願において、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）とは、スーパーオキシドの除去に重要な役割を果たす酵素である。ＳＯＤは、図１に示すように、スーパーオキシド陰イオン（・Ｏ２−）を過酸化水素と酸素分子とにする不均化反応を触媒する重要な抗酸化酵素の１つである。ＳＯＤは、様々な疾患や老化を引き起こすといわれている活性酸素種に対し防御的に働く酵素の1つであり、構成する遷移金属や局在する場所によって様々な種類（例えば、ＳＯＤ１（Ｃｕ／Ｚｎ  ＳＯＤ）、ＳＯＤ２（Ｍｎ  ＳＯＤ）など）に分類される。これらの中でも、ＳＯＤ２はミトコンドリア中に局在しており、スーパーオキシドの除去に重要な役割を果たしている。
【００３４】
＜活性酸素＞
本願において、活性酸素とは、酸素が化学的に活性になった化学種を指す用語であり、一般に非常に不安定で強い酸化力を示す。活性酸素のうちスーパーオキシドアニオンラジカルおよび一重項酸素は、酸素原子のみでできており、その分子構造は普通の酸素分子とそれほど大きく違わないが電子配置が異なっている。一般に活性酸素とフリーラジカルとは混同されることが多いが、活性酸素にはフリーラジカルとそうでないものがある。スーパーオキシドアニオンラジカルやヒドロキシルラジカルはフリーラジカルである。過酸化水素や一重項酸素はフリーラジカルではない。広義の活性酸素には一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質などを含む。
【００３５】
活性酸素・フリーラジカルは生命を維持するために無くてはならないものであり、肺から取り込んだ酸素は赤血球中のヘモグロビンにより全身の細胞に運び込まれ、細胞中のミトコンドリアで酸素は糖質から電子を奪いスーパーオキシド→過酸化水素→ヒドロキシラジカルを経て水になる。つまりこの反応中に酸素は何度か活性酸素・フリーラジカルに変わることになる。この過程をミトコンドリア電子伝達系といい、食事で摂取した糖質がこれによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）というエネルギー物質に変わる。しかし全ての活性酸素・フリーラジカルが水になる訳ではなく、余った活性酸素・フリーラジカルは細胞に損傷を与える。それを防ぐために各組織には抗酸化酵素と呼ばれる、活性酸素・フリーラジカルを消去あるいは除去する酵素が存在する。その抗酸化酵素としてカタラーゼやスーパーオキシドディスムターゼ、ペルオキシダーゼなど、活性酸素を無害化する酵素がある。
【００３６】
＜トログリタゾン＞
トログリタゾン（商品名  ノスカール（登録商標））は、三共株式会社が開発した糖尿病治療薬であり、日本では１９９７年３月から販売されている。また、海外ではこれまでに米国、英国などで承認されている。トログリタゾンの肝障害については治験段階では認められていなかったが、２０００年に、米食品医薬品局（ＦＤＡ）が、肝障害への副作用を理由に販売の中止を要請し、米国での販売元のワーナー・ランバート社（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）がそれに応じたため、三共株式会社も日本での販売を中止している。トログリタゾンによって引き起こされる薬物誘導性肝障害のメカニズムは完全に解明されたわけではないが、非特許文献３に示すように、トログリタゾンによって引き起こされる薬物誘導性肝障害は、一般的には代謝性特異体質性の薬物誘導性肝障害（非用量依存性の薬物誘導性肝障害）に分類されている。
【００３７】
＜アセトアミノフェン＞
化合物アセトアミノフェン（別名パラセタモール）は、解熱鎮痛薬の一つである。軽い発熱や、寒け、頭痛などの症状を抑える解熱剤、鎮痛剤として用いられる薬物の主要な成分の一つとなっている。一般に解熱剤は禁忌とされるインフルエンザの際にも解熱剤としてしばしば用いられるなど標準的な服用法では非常に安全な薬物であるが、その広い薬効のため、服用量が過剰となる事が少なくない。
【００３８】
人体内に存在するシトクロムＰ４５０はアセトアミノフェンを酸化し、アセトアミドキノンを生成する。アセトアミドキノンは強い求電子試薬であり、グルタチオン（ＧＳＨ）のチオール基や細胞内タンパク質と反応する。従ってアセトアミノフェンを多量に摂取すると肝臓毒性が現れる。ただし、治療レベルならこれは問題にならない。アセトアミノフェンによって引き起こされる薬物誘導性肝障害のメカニズムは、非特許文献３に示すように、一般的には非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）に分類されており、上記のトログリタゾンによって引き起こされる薬物誘導性肝障害のメカニズムとは大きく異なると考えられている。
【００３９】
＜非特異体質性の薬物誘導性肝障害＞
薬物性肝障害には、非特許文献３に示されているように、（１）用量依存的で動物実験でも再現される非特異体質性肝障害と、（２）動物実験では再現できない特異体質性肝障害が知られている。ここで、本願で非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）とは、非特許文献３に示されている（１）用量依存的で動物実験でも再現される非特異体質性肝障害のことを意味するものとする。
【００４０】
すなわち、アセトアミノフェンに代表される非特異体質性肝障害においては、反応性代謝物による細胞傷害と細胞ストレスが進行すると、クッパー細胞が細胞傷害性リンパ球を肝臓に動員し、これらの細胞からインターフェロンγが分泌されることによって種々なサイトカインの産生が刺激されることが、肝障害発現に重要な鍵となると考えられている。よって、アセトアミノフェン以外の薬物であっても、ヒトをはじめとする哺乳動物に投与すると、反応性代謝物による細胞傷害と細胞ストレスが進行し、クッパー細胞が細胞傷害性リンパ球を肝臓に動員し、これらの細胞からインターフェロンγが分泌されることによって種々サイトカインの産生が刺激される結果、用量依存的に肝障害発現するものは、非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）の原因候補化合物に含まれるものとする。
【００４１】
このような非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）の原因候補化合物としては、アセトアミノフェン以外にも、メトトレキサート、テトラサイクリンなどが挙げられる。
【００４２】
＜ＲＮＡ干渉＞
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞に導入された２本鎖ＲＮＡが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制する現象のことである。この方法は、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を抑制（ノックダウン）するため、遺伝子の機能解析に有効な方法として近年急速に注目されている。哺乳動物細胞では、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡが導入されると抗ウイルス応答により非特異的抑制を引き起こし、アポトーシスを誘発しやすいが、短いＲＮＡでは単一のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のみが特異的に抑制される。
【００４３】
特異的発現抑制を制御する最も有効なＲＮＡ長は２１ｍｅｒで、３’末端に２塩基がオーバーハングしたｄｓＲＮＡであるとされている。このような２０ｍｅｒ前後の短い２本鎖のＲＮＡはｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれている。また、ヘアピン構造に折り畳んだ小さなＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））もｓｉＲＮＡと同様に遺伝子の発現を抑制することが知られている。
【００４４】
ｓｉＲＮＡを発現ベクターで発現する場合は、例えば、ベクター内に、ｓｉＲＮＡ配列をｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列としてもつＤＮＡ断片を組み込む。ベクターから発現したｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔをもつ一本鎖ＲＮＡは、細胞内で相補配列が水素結合を行い、ヘアピン構造を作り、ｓｈＲＮＡと呼ばれる。ｓｈＲＮＡは、細胞内でループ構造部分が切断され、２本鎖のｓｉＲＮＡとなり、ＲＮＡｉ効果をもたらす。
【００４５】
なお、一般に、ｓｉＲＮＡと比較し、ｓｈＲＮＡは安定した発現が可能であり、アデノウイルスへの組み込みも容易である。また、ラット個体および肝臓細胞といった遺伝子導入効率の低い標的に対しても、アデノウイルスを使うことである程度の高効率での遺伝子発現が可能である。これらの特徴から、一過性のＲＮＡ干渉を行う際には、ｓｈＲＮＡ  アデノウイルスによる遺伝子のノックダウンを用いることが好ましい。もっとも、このことは、特に本願発明の範囲から他のＲＮＡ干渉法を除去する趣旨ではなく、ｓｈＲＮＡ  アデノウイルスを用いることが好ましいことを述べるに過ぎないものである。
【００４６】
ラットおよびマウスの肝臓組織におけるＳＯＤ２酵素活性をノックダウンするには、当然のことながら、肝臓組織におけるＳＯＤ２タンパク質の発現量をノックダウンすればよく、そのためには肝臓組織におけるＳＯＤ２ｍＲＮＡの発現量をノックダウンすればよい。
【００４７】
この場合、ラットのＳＯＤ２酵素活性をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ配列としては、下記の配列番号１および配列番号２を含む配列を用いることが好ましい。下記の配列番号１および配列番号２を含む塩基配列からなるこれらの配列を含むｓｈＲＮＡを用いることにより、ラットのＳＯＤ２酵素の発現を好適に抑制することができ、ヒトにおけるアセトアミノフェンなどの薬物による用量依存性の薬物誘導性肝障害を再現するために活用できるモデルラットが得られることが後述する実施例の実験データで確認されているからである。
【００４８】
配列番号１：ＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＡ
配列番号２：ＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧ
なお、配列番号１および配列番号２は互いに相補的な配列である。また、配列の左側が５’末端であり、右側が３’末端である。
【００４９】
より具体的には、ＳＯＤ２酵素をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ配列としては、下記の配列番号３を含む配列を用いることが好ましい。この配列を含むｓｈＲＮＡを用いることにより、ラットのＳＯＤ２酵素の発現を好適に抑制することができ、ヒトにおけるアセトアミノフェンなどの薬物による用量依存性の薬物誘導性肝障害の予測に役立てることのできるモデルラットが得られることが後述する実施例の実験データで確認されているからである。
【００５０】
配列番号３：ＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＡｇａａｇｃｔｔｇＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧ
なお、配列番号３は、配列番号１および配列番号２がループ配列によって連結された配列である。また、配列の左側が５’末端であり、右側が３’末端である。また、小文字で示した塩基配列がループ配列部分である。
【００５１】
なお、この配列からなるｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡアデノウイルスとして静脈内注射により投与することが好ましい。この場合、ｓｈＲＮＡアデノウイルスの投与ウイルス量は、後述の実験データに示すように、２．５×１０１０ＰＦＵ以上であることが好ましく、より好ましくは５．０×１０１０ＰＦＵ以上であり、さらに好ましくは１０×１０１０ＰＦＵ以上であり、特に２０×１０１０（２×１０１１）ＰＦＵであればＳＯＤ２酵素のノックダウン効率も高く肝臓機能にも悪影響がでない量であるので好適である。これらの投与ウイルス量以上であれば、ラットの細胞内におけるＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法により好適にノックダウンさせることができることが図８に示すように実験的に確認されているからである。
【００５２】
＜作用効果＞
以下、本実施形態の作用効果について説明する。
本実施形態のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、上記の特定の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであるため、これらのｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかをラットの細胞内で発現させることにより、後述する実施例の実験データで示すように、ラットの細胞内におけるＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる。
【００５３】
そして、本実施形態の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物では、肝臓組織におけるＳＯＤ２ｍＲＮＡの発現量がノックダウンされているため、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるＳＯＤ２タンパク質の発現量が有意に低くなる。したがって、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるＳＯＤ２酵素活性が有意に低くなり、薬物の活性代謝物のＳＯＤ２酵素による解毒作用を抑制することができる。
【００５４】
ここで、本実施形態の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物では、アデノウイルスベクターを用いてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかをラットの細胞内で発現させることにより、後述する実施例の実験データで示すように、ラットの細胞内におけるＳＯＤ２酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせている。そして、医学・薬学・生化学などの技術分野においては、アデノウイルスベクターは肝臓特異的に感染・発現することは技術常識である。そのため、ＳＯＤ２ヘテロノックアウトマウスの場合にはないメリットとして、本実施形態のＳＯＤ２酵素の発現をノックダウンさせたラットの場合には、肝臓のみでＳＯＤ２酵素の発現が減少しているため、全身でＳＯＤ２酵素の発現が減少しているＳＯＤ２ヘテロノックアウトマウスよりも、薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物として優れている。
【００５５】
その結果、本実施形態の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、後述する実施例の実験データで示すように、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物によるヒトにおける毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることができる。特に、この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、アセトアミノフェンなどのヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害の原因候補化合物についての薬物動態の試験のモデル動物として好適に用いることができる。
【００５６】
そして、本実施形態の薬物動態の試験方法によれば、上記のいずれかの遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物、その肝臓組織またはその肝臓細胞（例えば、後述の実施例で示すＳＯＤ２酵素の発現をノックダウンしたＢＲＬ３Ａ細胞）を用いるため、通常であれば活性代謝物がＳＯＤ２酵素により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となり、その薬物の活性代謝物によるヒトにおける毒性発現予測が可能となる。特に、この試験方法によれば、アセトアミノフェンなどのヒトにおける用量依存性の薬物誘導性肝障害の原因候補化合物についての薬物動態の試験を好適に行うことができる。
【００５７】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５８】
例えば、上記実施の形態では配列番号１および配列番号２を含む配列（すなわち配列番号３）からなるｓｈＲＮＡを用いたが、特に限定する趣旨ではなく、他の配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。
【００５９】
例えば、配列番号：１に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第２の塩基配列と、を含む配列（すなわち、配列番号３に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第３の塩基配列）からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。なぜなら、一般的には、ＲＮＡ干渉作用を示す塩基配列のうち１以上の塩基を欠失、置換、付加しても、同様のＲＮＡ干渉作用を示すためである。
【００６０】
また、配列番号：１に記載される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する第２の塩基配列と、を含む配列（すなわち、配列番号３に記載される塩基配列に対してループ配列を除くステム配列部分で８０％以上の相同性を有する第３の塩基配列）からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。なぜなら、一般的には、ＲＮＡ干渉作用を示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を用いても、同様のＲＮＡ干渉作用を示すためである。
【００６１】
また、配列番号：１に記載される塩基配列に対して相補的な塩基配列と特異的に結合する第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して相補的な塩基配列と特異的に結合する第２の塩基配列と、を含む配列（すなわち、配列番号３に記載される塩基配列に対して相補的な塩基配列と特異的に結合する第３の塩基配列）からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。なぜなら、一般的には、ＲＮＡ干渉作用を示す塩基配列に対して相補的な塩基配列と特異的に結合する塩基配列を用いても、同様のＲＮＡ干渉作用を示すためである。
【００６２】
さらに、上記の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにおいて、配列番号１の代わりに、下記の配列番号４〜７に置き換えた場合のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。
配列番号４：５’−ＣＣＣＴＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡ−３’
配列番号５：５’−ＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧＡ−３’
配列番号６：５’−ＧＧＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡ−３’
配列番号７：５’−ＧＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＴ−３’
これらの配列番号４〜７についても、ラットＳＯＤ２遺伝子をノックダウンするためのｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡに含まれる塩基配列として、Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社製の信頼性の高い配列予測ソフトウェア（非公開）によって、配列番号１と同様に好適な配列としてリストアップされた配列であるため、当然ながら同様のＲＮＡ干渉作用を示すと推測されるためである。
【００６３】
また、上記実施の形態では、薬物誘導性肝障害の原因候補化合物として、アセトアミノフェンをはじめとする非特異体質性の薬物誘導性肝障害（用量依存性の薬物誘導性肝障害）の原因候補化合物を中心に説明したが、上記のモデルラットが特異体質性の薬物誘導性肝障害（非用量依存性の薬物誘導性肝障害）の原因候補化合物の薬物動態の試験に用いることができないわけではない。当然のことではあるが、上記のモデルラットは、トログリタゾンをはじめとする特異体質性の薬物誘導性肝障害（非用量依存性の薬物誘導性肝障害）の原因候補化合物の薬物動態の試験にも好適に用いることができる。
【００６４】
このような特異体質性の薬物誘導性肝障害（非用量依存性の薬物誘導性肝障害）の原因候補化合物としては、トログリタゾン以外にも、例えば、特に限定する趣旨ではないが、現時点で知られている限りでも、アカルボース、アミオダロン、イソニアジド、イトラコナゾール、経口避妊薬、ザフィルルカスト、ジクロフェナクナトリウム、ジスルフィラム、タモキシフェン、蛋白同化ステロイド、ダントロレンナトリウム、テガフール・ウラシル、塩酸テルビナフィン、バルプロ酸ナトリウム、塩酸ヒドララジン、フルコナゾール、フルタミド、ペモリン、塩酸ラベタロールなどが挙げられる。
【００６５】
また、上記実施の形態で、薬物誘導性肝障害のモデル動物としてラットを用いたが、特に限定する趣旨ではなく、他の非ヒト哺乳動物であっても好適に使用可能である。例えば、非ヒト哺乳動物の種類がマウスであれば、マウスのＳＯＤ２酵素の塩基配列に対応した配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。このようにすれば、マウスのＳＯＤ２酵素の発現を好適に抑制でき、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルマウスが得られるからである。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６７】
＜実験材料＞
Ｆ−３４４系ラット（雄性、７週齢）は日本ＳＬＣ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｄｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）はタカラバイオ株式会社（Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＫｉｔｓはＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．）より購入した。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）は和光純薬工業（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。トログリタゾンおよびロシグリタゾンは第一三共株式会社（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より御供与頂いた。その他の試薬は和光純薬工業等の特級またはＨＰＬＣ用のものを用いた。
【００６８】
＜実験方法１＞
ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの作成
Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．）に依頼し、ラットＳＯＤ２  ｍＲＮＡの配列からｓｉＲＮＡ配列（下記参照）を選択し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてノックダウン効果を確認した後、その配列を用いて二本鎖オリゴＤＮＡを作成し、ｐＵ６プロモーターを持つｐＧＳＵ６−ＧＦＰベクターに組み込んだ。制限酵素Ｈｉｎｃ  ＩＩで目的配列およびｐＵ６プロモーターを切り出し、ｐＡｘｃｗｉｔコスミドベクターに組み込んだ。以後のアデノウイルス作成はＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｄｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）を用い、マニュアルに従って図３に示すように行った。
【００６９】
Ｒａｔ  ＳＯＤ２  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの認識配列（実際に実験で使用したもの）
配列番号１：５’−ＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＡ−３’
配列番号２：５’−ＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧ−３’
なお、配列番号１および配列番号２は互いに相補的な配列である。
【００７０】
Ｒａｔ  ＳＯＤ２  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの認識配列（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅより得た上記以外の配列）
配列番号４：５’−ＣＣＣＴＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡ−３’
配列番号５：５’−ＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧＡ−３’
配列番号６：５’−ＧＧＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡ−３’
配列番号７：５’−ＧＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＴ−３’
【００７１】
アデノウイルスベクターに組み込んだｓｈＲＮＡの配列
Ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ（配列番号８）：５’−ｇａｔｃｃＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＡｇａａｇｃｔｔｇＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧｔｔｔｔｔｔｇｇａａｇｃ−３’
Ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ（配列番号９）：５’−ｇｇｃｃｇｃｔｔｃｃａａａａａａＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＡｃａａｇｃｔｔｃＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧｇ−３’
【００７２】
なお、上記のＴｏｐ  ｓｔｒａｎｄと  Ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄをアニールさせることで２本鎖のｓｈＲＮＡを作製してアデノウイルスベクターに組み込める。すなわち、合成した個々の１本鎖からアニールして、２本鎖を作成してアデノウイルスベクターに組み込める。
【００７３】
＜実験方法２＞
ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの細胞への感染
細胞はラット肝由来細胞のＢＲＬ３Ａ細胞、ラット肝癌由来のＨ４ＩＩＥ細胞、マウス肝癌由来細胞のＨｅｐａ１−６細胞、ヒト肝癌由来細胞ＨＬＥ細胞を用いた。細胞を６ｗｅｌｌまたは１２ｗｅｌｌプレートにまき、７０〜１００％コンフルエントまで培養した。培地を除き、ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスをＭＯＩ  １００で１時間感染させた。対照としてＬｕｃ（ルシフェラーゼ）ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを同様に感染させた。１時間感染操作を行った後に培地を添加し、その３日後におけるｍＲＮＡの発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ  ＰＣＲにて測定した（ｐｒｉｍｅｒの配列に関しては下記表１を参照）。
【００７４】
【表１】
2010068785.tif 000003
【００７５】
＜実験方法３＞
テストステロン６β水酸化酵素活性の測定
ＹａｍａｚａｋｉとＳｈｉｍａｄａの方法に従い測定した（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３４６：１６１−１６９：１９９７）。実験操作は以下に従って行った。ＢＲＬ３Ａ細胞にＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡウイルス液をＭＯＩ  １００で、ＡｄＣＹＰ３Ａ４ウイルス液をＭＯＩ  ０、５、１０、２０、５０および１００で感染させた。感染７２時間後に培養液をアスピレーターで吸引し、１００μＭテストステロンを含む培地１ｍＬを加えた。１時間後に培地を採取して生成した代謝物である６β水酸化テストステロンを以下の方法により測定した。採取した培地５００μＬにジクロロメタン４ｍＬ、精製水５００μＬ、内部標準物質として１００μＭのコルチコステロン２０μＬを加えて激しく撹拌した。３，０００ｒｐｍ（７００ｇ）で１０分間遠心分離後、ジクロロメタン層を別の試験管に移し、窒素気流下乾固させた。すべての溶液を乾固させた後、試験管に２００μＬの４５％メタノールを加え、１分間ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、２，０００ｒｐｍ（５００ｇ）で５分間遠心分離し、４０μＬをＨＰＬＣに注入して分析した。ＨＰＬＣによる分析には、ポンプ（日立Ｌ−２１３０）、オートサンプラー（日立Ｌ−２２００）、カラムオーブン（日立分光ＣＯ−９６５）、ＵＶ検出器（日立Ｌ−２４００）を用いて、溶離液を２４０ｎｍでモニターした。カラムはＭｉｇｈｔｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ−１５０−４−６  ５μＭ（関東化学）を用いた。移動相は５０％ＭｅＯＨ／１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を使用し、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は３５°Ｃとした。
【００７６】
＜実験方法４＞
ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス感染細胞への薬物処置後ＣＣＫ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）による細胞生存率の検討
ＢＲＬ３Ａ細胞を９６  ｗｅｌｌプレートにまき、コンフルエントとした後、ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを１時間感染させた。７２時間後に肝障害性化合物であるトログリタゾンおよびダプソンを、ネガティブコントロールとしてロシグリタゾンを処置し、２４時間後に各ｗｅｌｌに試薬１０μＬを加え、１ｈｒ培養した。その後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のプレートリーダーで吸光度を測定した。
【００７７】
＜実験方法５＞
スーパーオキシドの測定
Ｃａｒｔｅｒらの方法に準じて測定を行った（Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ５５：２５３−２５８：１９９４）。すなわち、ＢＲＬ３Ａ細胞にＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡまたはＡｄＬｕｃ  ｓｈＲＮＡウイルス液をＭＯＩ  １００で、またＡｄＣＹＰ３Ａ４ウイルス液をＭＯＩ  ５０で感染させた。４８時間後に培養液をアスピレーターで吸引し、薬物含む培地１００μＬを加えた。処置後２４時間後にジヒドロエチジウムが１０μＭになるよう加え、３０分間インキュベートし、１×ＰＢＳでｗａｓｈし、トリプシンで細胞をはがし懸濁させた液をｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３５２ｎｍ、  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５９０  ｎｍで測定した。
【００７８】
＜実験方法６＞
活性酸素種の測定
Ｐｏｓｓｅｌらの方法に準じて測定を行った（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１６：１７５−１７８：１９９７）。すなわち、ＢＲＬ３Ａ細胞にＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡまたはＡｄＬｕｃ  ｓｈＲＮＡウイルス液をＭＯＩ  １００で、またＡｄＣＹＰ３Ａ４ウイルス液をＭＯＩ  ５０で感染させた。４８時間後に培養液をアスピレーターで吸引し、薬物を含む培地１００μＬを加えた。処置後２４時間後にジクロロフルオレセインジアセテートが３０μＭになるよう加え、２時間インキュベートし、１×ＰＢＳで２回ｗａｓｈし、１×ＰＢＳを２００μＬ加え、１時間インキュベートしたあとｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ４８５  ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５３８ｎｍで測定した。
【００７９】
＜実験方法７＞
ＡＳＴおよびＡＬＴ値の測定
ラットの末梢血を尾静脈または下行大静脈より採取した。１時間室温で放置し、７，０００ｒｐｍ（３，０００ｇ）、４°Ｃで１５分間遠心分離した後、血清約５０μＬをサンプルチューブに採取した。ＡＳＴおよびＡＬＴ値をトランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコーキットを用い、マニュアルに従って以下の方法で定量した。血清１０μＬにＡＳＴまたはＡＬＴ用基質酵素液を２５０μＬ加えた後よく混合し、３７°Ｃで５分間インキュベートした後、発色試液を加えよく混合し、３７°Ｃで正確に２０分間加温した。２０分後に反応停止液を加えて反応を停止させ、よく混合後、５５５ｎｍでの吸光度を測定し、ＡＳＴおよびＡＬＴ活性を測定した。
【００８０】
＜実施例１＞
ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスによるノックダウン効率の確認
ラット、マウスおよびヒト肝由来細胞を用い、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ  ＰＣＲで各々の動物種におけるＳＯＤ２  ｍＲＮＡを定量した。その結果、ラット肝由来細胞であるＢＲＬ３Ａにおいては対照群と比べて６０％以上の有意な減少を示した。なおラット肝癌由来細胞Ｈ４ＩＩＥ細胞、マウス肝癌由来細胞Ｈｅｐａ１−６細胞、およびヒト肝癌由来細胞ＨＬＥ細胞においては、対照群と比べ有意な差ではなかった（図４）。
【００８１】
＜実施例２＞
テストステロン６β水酸化酵素活性の測定
薬物誘導性肝障害は主としてＣＹＰなどにより代謝的活性化を受けることで起こることが知られている。また、臨床で使用されている薬物の半数以上がＣＹＰ３Ａ４で代謝されることが知られている。しかしながらＢＲＬ３Ａ細胞にはＣＹＰがほとんど発現していなく、そのため、ＣＹＰ３Ａ４を発現させることとし、本研究室に既存のＣＹＰ３Ａ４発現アデノウイルス（ＡｄＣＹＰ３Ａ４）との同時感染の至適条件を検討した。図５ではＡｄＣＹＰ３Ａ４単独感染、およびＡｄＣＹＰ３Ａ４・ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ同時感染におけるテストステロン６β水酸化酵素活性を示した。ＡｄＣＹＰ３Ａ４のＭＯＩ依存的に活性値は上昇した。ＭＯＩ  ５０でほぼプラトーに達した。これより、今後の薬物処置における細胞障害性の実験はＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ  ＭＯＩ  １００、ＡｄＣＹＰ３Ａ４  ＭＯＩ  ５０で行うことにした。
【００８２】
＜実施例３＞
ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの細胞への薬物障害性の影響
ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡをＢＲＬ３Ａ細胞に感染させ、３日後に肝障害化合物であるダプソン１０、２０、３０  μＭおよびトログリタゾン２５、５０、７５μＭを２４時間処置したところ、対照群と比べて細胞障害性への影響に有意な差が認められた（図６）。また、ダプソン３０μＭ、トログリタゾン５０μＭを２４時間処置したところ、対照群と比べてスーパーオキシドおよび活性酸素種の有意な上昇が認められた（図７）。なお、図７のＲＯＳは、Reactive Oxygen Speciesの略称である。
【００８３】
＜実施例４＞
ウイルス投与量および時間依存的なラット肝ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ、ＳＯＤ２タンパク量およびＳＯＤ２酵素活性の変動
アデノウイルスは主に肝組織に感染することが知られている。そこで、ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡをラット尾静脈より投与し、ラット肝臓中のＳＯＤ２  ｍＲＮＡ、ＳＯＤ２タンパク質およびＳＯＤ２酵素活性の変化を検討した。ＳＯＤ２  ｍＲＮＡにおいては５×１０１０（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群ではＰＢＳ投与群と比べて最大約３５％の減少が認められ、２×１０１１（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群では最大約７０％の減少が認められた。ＳＯＤ２タンパク質においては５×１０１０（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群では最大約３３％の減少が認められ、２×１０１１（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群では最大約６５％の減少が認められた。ＳＯＤ２酵素活性においては５×１０１０（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群では最大約３５％の減少が認められ、２×１０１１（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群では最大約６０％の減少が認められた。また、５×１０１０（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群および２×１０１１（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与群ともに投与後７日目にＳＯＤ２酵素活性値が最も減少した（図８）。
【００８４】
＜実施例５＞
ＳＯＤ２ノックダウンラットにおけるＡＰＡＰによる肝障害の検討
ＳＯＤ２酵素活性値が最も低下した条件は２×１０１１（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）投与後７日目であったことから（図８）、ＡＰＡＰの投与はＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡの２×１０１１（ｐｆｕ／ｂｏｄｙ）感染後７日目に行うことにした。ＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ投与群において、１，０００ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰ投与によるＡＳＴ値およびＡＬＴ値の上昇は認められなかった。しかし、ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ投与群においては１，０００ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰ投与によりＡＳＴ値およびＡＬＴ値の有意な増加が認められた（図９）。
【００８５】
一方、３００ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰ投与ではいずれの群においても有意なＡＳＴ値・ＡＬＴ値の増加は認められなかった。ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ投与ラットにおけるＡＰＡＰ投与による肝障害性への影響を検討するため、ＨＥ染色による肝組織像の検討を行った（図１０）。その結果、ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ投与を行ったラットにおいてのみ、ＡＰＡＰ１，０００ｍｇ／ｋｇ投与によって中心静脈周辺に肝細胞の壊死が認められた。これは薬物誘導性肝障害の一般的な所見である。ＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ投与を行ったラットにおいて、肝細胞壊死は全く認められなかった。
【００８６】
＜考察＞
本研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを感染することで、解毒的な代謝能を低下させ、肝障害性化合物による障害を増強できる系の構築について検討した。
【００８７】
様々な動物種由来肝細胞を用いた検討では、ラット肝由来のＢＲＬ３Ａ細胞において約６０％のＳＯＤ２  ｍＲＮＡの減少が認められた（図４）が、ラット肝癌由来細胞であるＨ４ＩＩＥ細胞ではＳＯＤ２  ｍＲＮＡの有意な減少は認められなかった。Ｈ４ＩＩＥ細胞にＭＯＩ  １００でＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡを感染させると細胞変性が認められたため、ノックダウンの影響が明確に見られなかった。また、マウスおよびヒト肝癌由来細胞ではＳＯＤ２  ｍＲＮＡの有意な減少は認められなかった。これはｓｈＲＮＡが認識するＳＯＤ２  ｍＲＮＡに対する塩基配列の相同性が関与していると考えられる。本研究において、標的としたラットＳＯＤ２遺伝子に対しては１００％の相同性を持つようにｓｈＲＮＡを設計した。この配列における相同性は、マウスＳＯＤ２遺伝子に対しては６３％、ヒトＳＯＤ２遺伝子に対しては５８％であった。本実験によりラット肝由来細胞であるＢＲＬ３ＡでＳＯＤ２  ｍＲＮＡの有意な減少が認められた。
【００８８】
ＡｄＣＹＰ３Ａ４とＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ同時感染させたＢＲＬ３Ａ細胞で細胞生存率の検討（図６）および、活性酸素種とスーパーオキシドアニオンの生成量への影響について検討を行った（図７）。ダプソン、トログリタゾンにおいて細胞生存率が対照群のＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ感染群に比べて有意に減少し、活性酸素種およびスーパーオキシドアニオンの生成量の有意な増加が認められた。ネガティブコントロールとして用いたロシグリタゾンにおいては対照群のＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ感染群との細胞生存率、活性酸素種およびスーパーオキシドアニオン生成量への有意な差は認められなかった。トログリタゾンはＣＹＰ３Ａ４によりキノン体を、ダプソンはＮ−水酸化体を生じることが報告されている。一般にキノン体・Ｎ−水酸化体は活性酸素を産生することが知られている。以上、本研究において、ＳＯＤ２とＣＹＰ３Ａ４が関与する薬物の細胞障害性のスクリーニングに使用できる高感度なｉｎ  ｖｉｔｒｏの検出系を構築することができた。
【００８９】
ラットｉｎ  ｖｉｖｏにおいてアデノウイルスを用い、ＳＯＤ２遺伝子のノックダウンについて検討した。本研究においては主に肝組織に感染するアデノウイルスベクターを用いて行い、ＳＯＤ２ノックダウンの影響が最も見やすい条件を検討した。５×１０１０ｐｆｕ／ｂｏｄｙ投与群ではＳＯＤ２  ｍＲＮＡが投与後５日目で最も減少し、ＳＯＤ２タンパク質およびＳＯＤ２酵素活性値においては投与後７日目で最大の減少（活性値の約３５％減少）が認められた。２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙ投与群においてはＳＯＤ２  ｍＲＮＡ、ＳＯＤ２タンパク質およびＳＯＤ２酵素活性値いずれにおいても投与後７日目において最大の減少（活性値の約６０％減少）が認められた（図８）。また、２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙ投与のいずれのラットにおいてもＡＳＴ値およびＡＬＴ値の上昇は認められなかったため（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、投与量は２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙが適当であると考えられる。こうした予備検討の結果、単回肝障害性試験の検討はＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ投与後７日目に行うこととした。
【００９０】
薬物誘導性肝障害を引き起こす薬物としてＡＰＡＰの単回投与肝障害性試験を行うこととし、ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡのネガティブコントロールとしてはＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡの投与を行った。ＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを感染させたラットにおいてはＡＰＡＰ投与によるＡＳＴ値およびＡＬＴ値の有意な上昇は認められなかったが、ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡを投与したラットにおいてＡＰＡＰ投与によるＡＳＴ値およびＡＬＴ値の有意な上昇が認められた（図９）。また、ラット肝の組織像においてもＡｄＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ投与ラットにおいてはＡＰＡＰ投与による肝細胞の変性・脱落は認められなかったが、ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ投与ラットにおいてはＡＰＡＰ投与による肝細胞壊死が認められた（図１０）。以上、これまでの検討において、本検出系はラットｉｎ  ｖｉｖｏにおいても適用可能であることを示すことができた。
【００９１】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【００９２】
たとえば、上記実施例では、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物としてＦ−３４４系ラットを用いたが、特に限定する趣旨ではなく、Ｗｉｓｔｅｒ系をはじめとする他の系統のラットを用いてもよい。さらに、薬物動態および毒性の前臨床試験において、ラットが第一選択肢として多用されるため、実施例はラットで示したが、上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、ラットに限られず、ラットと同様の齧歯類であるマウスであってもよい。そして、上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、齧歯類に限られず、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギなどのヒト以外のほ乳類であればよい。もっとも、これらの場合には、適宜ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡの設計を変更することが好ましいことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）について説明するための概念図である。
【図２】本研究の目的について説明するための概念図である。
【図３】本研究で作成したＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの作成方法について説明するための概念図である。
【図４】ＳＯＤ２  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスによるＳＯＤ２  ｍＲＮＡのノックダウン効率の肝細胞株による違いを確認した結果を示すグラフである。
【図５】ＡｄＣＹＰ３Ａ４単独感染、およびＡｄＣＹＰ３Ａ４・ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ同時感染におけるテストステロン６β水酸化酵素活性を示したグラフである。
【図６】ＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡをＢＲＬ３Ａ細胞に感染させ、３日後に肝障害化合物であるダプソン１０、２０、３０  μＭおよびトログリタゾン２５、５０、７５μＭを２４時間処置した場合のＭＴＴアッセイの結果を示したグラフである。
【図７】ダプソン３０μＭ、トログリタゾン５０μＭを２４時間処置した場合の対照群と比べたスーパーオキシドおよび活性酸素種の変化を示したグラフである。
【図８】Ｆ３４４系統のラットにおけるウイルス投与量および時間依存的なラット肝ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ、ＳＯＤ２タンパク量およびＳＯＤ２酵素活性の変動を示したグラフである。
【図９】Ｆ３４４系統のラットにおけるＳＯＤ２ノックダウンした場合のＡＰＡＰによる肝障害の検討結果を示したグラフである。
【図１０】Ｆ３４４系統のラットにおけるＡｄＳＯＤ２−ｓｈＲＮＡ投与による肝障害を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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