(57)【要約】【課題】  吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、特にペプチドを固定化できる生理活性物質固定化用基板を提供すること。【解決手段】ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有することを特徴とする生理活性物質固定化用基板で、好ましくは、疎水性基がシクロヘキシルである生理活性物質固定化用基板。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有することを特徴とする生理活性物質固定化用基板。
【請求項２】
前記疎水性基がシクロヘキシルである請求項１記載の生理活性物質固定化用基板。
【請求項３】
ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット、及び一級アミノ基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有する基板から一級アミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換したものである請求項１又は２記載の生理活性物質固定化用基板。
【請求項４】
前記一級アミノ基がオキシルアミノ基である請求項３記載の生活性物質固定化用基板。
【請求項５】
前記高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である請求項１〜４いずれか記載の生理活性物質固定化用基板。
【請求項６】
前記基板の形状が、スライド形状基板、マイクロプレート、容器、マイクロフルイディスク基板、粒子のいずれかである請求項１〜５いずれか記載の生理活性物質固定化用基板。
【請求項７】
前記基板の材質がプラスチック製である請求項１〜６いずれか記載の生理活性物質固定化用基板。
【請求項８】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである請求項７記載の生理活性物質固定化用基板。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の生理活性物質固定化用基板にペプチドを固定化した生理活性物質固定化基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材に固定された生理活性物質等を利用して、生体試料中の対象物質の並列検出および分析等に用いる生理活性物質固定化用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。一方、ペプチドは、生物において多彩な生理機能を発揮し、生物の生命の恒常性を維持する基本的な物質であり、近年、この極めて強力な作用を有し、しかも安全性と特異性の高いペプチドを基本とした創薬はドラッグデリバリーシステムの進歩とともにますます重要視されている。
【０００３】
「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究やペプチドの研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。そのため、この目的の分子アレイとしてペプチドを有する生理活性物質を固定化した基材の開発・研究が進められている。
【０００４】
しかし、プロテインチップなどは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
蛋白質等の検体の検出および定量において一般的に用いられている方法にサンドイッチ法がある。この方法は、固相に抗体（一次抗体）を結合させ、不溶化した抗体に標的となる蛋白をトラップさせ、次いで標的蛋白の別のエピトープを認識して結合する標識抗体（二次抗体）を反応させて、この標識物を測定することで蛋白を定量的に測定する方法である（例えば非特許文献１参照）。しかしこの方法では、例えばプロテインチップのように、一度に大量種の蛋白を検出しようとした場合、各々の標的蛋白に対して互いに競合しない複数種の抗体が必要となるため、条件の最適化は解決すべき多くの問題を含んでいる。
【０００６】
また、蛋白質を捕捉する分子（以下、捕捉分子と略す）を基板上に固定化した後、例えばサンドイッチ法のように該表面上で他の蛋白質（抗原抗体反応の場合、抗原に相当）と反応させ、更に、標識された蛋白質を反応させ最終的に検出機等で検出する場合、捕捉分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質、すなわち、抗原や標識された蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献２参照）。特に、臨床診断等で用いられる血清や血漿においては、夾雑蛋白の非特異的吸着が多くノイズが高く出てしまい、Ｓ／Ｎ比が低くなる傾向にあった。
【０００７】
このため通常のサンドイッチ法では、一次抗体を固定化した後に抗原および二次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また、一次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまう場合があり、二次抗体と反応できないという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。
【０００８】
一方、一次抗体を固定化する際、抗体の抗原結合部位が機能しやすいように固定化することが重要である。たとえば特許文献２には、特定の固定化物質を、基盤に作製した微細穴に結合させる方法が記載されている。しかし、この方法では、固定化物質が抗体の場合、アミノ基末端（Ｎ末端）とを用いて基盤とペプチド結合させることになり、抗原結合部位が十分に機能しない場合があった。
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特開２００５−２１４８８９号公報
【非特許文献１】「酵素免疫測定法」、石川榮治、河合忠、宮井潔編、医学書院、1987年、p.44-45
【非特許文献２】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、特にペプチドを固定化できる生理活性物質固定化用基板を提供することを目的とする。ここで言う基材とは、各種チップ、プレート、粒子、容器等、バイオアッセイに利用可能なあらゆる材料を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の通りである。
（１）ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有することを特徴とする生理活性物質固定化用基板。
（２）前記疎水性基がシクロヘキシルである（１）記載の生理活性物質固定化用基板。
（３）ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット、及び一級アミノ基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有する基板から一級アミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換したものである（１）又は（２）記載の生理活性物質固定化用基板。
（４）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基である（３）記載の生活性物質固定化用基板。
（５）前記高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である（１）〜（４）記載の生理活性物質固定化用基板。
（６）前記基板の形状が、スライド形状基板、マイクロプレート、容器、マイクロフルイディスク基板、粒子のいずれかである（１）〜（５）記載の生理活性物質固定化用基板。
（７）前記基板の材質がプラスチック製である（１）〜（６）記載の生理活性物質固定化用基板。
（８）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（７）記載の生理活性物質固定化用基板。
（９）（１）〜（８）記載の生理活性物質固定化用基板にペプチドを固定化した生理活性物質固定化基板。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の生理活性物質固定化用基板を用いれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、生理活性物質を固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有する生理活性物質固定化用基板であり、好ましくは、前記疎水性基がシクロヘキシルである生理活性物質固定化用基板である。
この高分子化合物は、検出対象物質の基材への物理的吸着（非特異的吸着）を抑制する性質を有する。さらに、生理活性物質を固定化する性質を併せ持つ。ホスホリルコリン基が非特異的吸着を抑制する役割を果たし、アルデヒド基、およびマレイミド基が生理活性物質を固定化する役割を果たす。
該生理活性物質固定化用基板は、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット、及び一級アミノ基を有するユニット、から構成される高分子化合物Ａを表面に有する基板から一級アミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換して作製することが好ましい。
【００１３】
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれるホスホリルコリン基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、下記一般式［１］の構成単位の左部の構成単位で示されるように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。なかでもXはエチレンオキシ基であることが最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基Ｘの繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００１４】
【化１】
2010117189.tif 000002
【００１５】
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｌの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して５〜９８ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると、非特異的吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中高分子化合物が溶出してしまう恐れが出てくる。ただし、高分子化合物のいずれかの部分に、基材と共有結合できる官能基類を導入し、基材と化学的に結合させる場合はこの限りではない。たとえば、高分子化合物中にシランカップリング剤を導入しておく方法などが簡便で好ましい。
【００１６】
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる疎水性基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、前記一般式［１］の構成単位の中央部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基が炭素数２〜２０のアルキル基である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。高分子化合物に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチック等、疎水性の基材に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。式中、ｍは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００１７】
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｍの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して、１〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは２０〜８０ｍｏｌ％である。上限値を上回ると非特異的吸着が増加する恐れが出てくる。
【００１８】
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式［１］の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基とオキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は特に制限されるものではないが、下記一般式［２］または［３］（式中ｑ、ｒは１〜２０の整数である。）であることが好ましい。
【００１９】
【化２】
2010117189.tif 000003
【００２０】
【化３】
2010117189.tif 000004
【００２１】
前記オキシルアミノ基またはヒドラジド基は、基板上に塗布後各館の右記に変換することができる。また、スペーサーがあることにより、アミノ基が主鎖部分から離れるため、生理活性物質が固定化されやすい。さらにスペーサーにアルキレングリコール残基が含まれていることから非特異的吸着性を発現させることができる。アルキレングリコール残基の炭素数は制限されるものではないが、炭素数２のエチレングリコール残基が最も好ましい。
【００２２】
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる一級アミノ基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｎの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは５〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると、糖、糖鎖および／またはこれらを有する生理活性物質を十分に固定化できなくなる。一方、上限値を上回ると非特異的吸着が増加する恐れが出てくる。      
【００２３】
本発明に使用する高分子化合物Ａの化学構造は、少なくともホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及び一級アミノ基を有するユニットを含む構造であれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００２４】
本発明に使用する高分子化合物Ａの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００２５】
ホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００２６】
疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートである。
【００２７】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［４］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子またはＮＨ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。
【００２８】
【化４】
2010117189.tif 000005
【００２９】
保護基Ｗとしてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）などが好適に用いられる。
【００３０】
具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【化５】
2010117189.tif 000006
【００３１】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００３２】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００３３】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【化６】
2010117189.tif 000007
【００３４】
本発明に使用する高分子化合物Ａの合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N，N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００３５】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３６】
本発明に使用する高分子化合物Ａの分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３７】
本発明に使用する高分子化合物Ａで基材表面を被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
【００３８】
基材表面への高分子化合物Ａの被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００３９】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００４０】
本発明に用いる基材としては、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられる。プラスチック製基板の具体例としては、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサロフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。
【００４１】
高分子化合物Ａを塗布した基材は、高分子化合物Ａ中のアミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換することにより好適にペプチド化合物を固定化できるようになる。置換する方法としては、例えば、高分子化合物Ａを塗布した基材をアルデヒド基又はマレイミド基を有する化合物の溶液に浸漬することが挙げられる。
【００４２】
アルデヒド基への置換には、次のような1分子内にアルデヒド基を２つ持つ化合物が好適に使用できる。グルタルアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジボアルデヒド、ナフタレン‐２，６‐ジカルボアルデヒド、クロセチンジアール、テレフタルアルデヒド、ｏ‐フタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、２‐メチルマロンアルデヒド、スペルミンジアルデヒド、２Ｅ，４Ｅ）‐２，４‐ヘキサジエンジアールなどが挙げることができる。これらの試薬は、単独または２種以上の組み合わせで用いても良い。
【００４３】
マレイミド基への変換には次のような１分子内にアミノ基と反応できる官能基とマレイミド基を持つ化合物が好適に使用できる。Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシこはく酸イミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（マレイミドシクロヘキシリルオキシ）スクシンイミドなどが挙げることができる。これらの試薬は、単独または２種以上の組み合わせで用いても良い。
【００４４】
このようにして得られた基板は生理活性物質を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。生理活性物質としては、特にペプチドが好適に用いられる。さらにペプチドの片末端をシステイン化してあるペプチドがさらに好ましい。アルデヒド基とシステインとで環化反応によりペプチドの末端で固定化でき、分子の配向性がよくなる。またマレイミド基とシステインのチオール基と結合することによりペプチドの末端で固定化でき、分子の配向性がよくなる。又、ペプチドに限らずとも、生理活性物質の分子内にチオール基を有する化合物が好適に使用できる。
【００４５】
これらの生理活性物質の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、生理活性物質が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。
【００４６】
生理活性物質を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス‐塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝剤などが用いられる。
【００４７】
生理活性物質を溶解する溶液のｐHとしては、４〜１０であることが好ましく、さらに好ましくは７−９である。
【００４８】
生理活性物質の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４９】
生理活性物質の溶液を固定化する温度としては、０℃から１００℃が好ましい。
【実施例】
【００５０】
（高分子化合物の合成例１）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ｎ−シクロヘキシルメタクリレート（ＣＭＡ）、Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド（ＯＡ、式［５］で示した化合物）をそれぞれ順に０．３５ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌ、０．３０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を回収した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００５１】
【表１】
2010117189.tif 000008
【００５２】
（比較高分子化合物の合成例２）
ＭＰＣ、ＢＭＡ、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５−エチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯ４．５ＮＰ）、をそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．６０ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．０１ｍｏｌ／ＬのＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を回収した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子化合物の組成比を算出した。表２に結果を示した。
【００５３】
【表２】
2010117189.tif 000009
【００５４】
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を高分子化合物の合成例１にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、乾燥することにより、基板表面に合成例１のポリマーを含む層を導入した。
次いで前記基板を２ＮのＨＣｌ水溶液で３７℃２時間処理することにより、ＢＯＣ基の除去を行った。さらに該基板をグルタルアルデヒド（和光純薬製０７３−００５３６）を１重量％となるように０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）（和光純薬製：１９７−０１３０２）に溶解した溶液に室温で２時間浸漬することによりアルデヒド基を表面に有する基板を得た。
【００５５】
（実施例２）
Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（和光純薬性：３４７−０５０４１）をグルタルアルデヒドの代わりに用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、マレイミド基を表面に有する基板を得た。
【００５６】
（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を高分子化合物の合成例２にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、乾燥することにより、基板表面に合成例２のポリマーを含む層を導入した。
【００５７】
《実験１》
工程１（ペプチドの固定化）
実施例で得られた基板上にペプチドを固定化した。詳細は、先ず下記構造のペプチドＡとペプチドＢをそれぞれ０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）（和光純薬製：１９７−０１３０２）に１０μg/ｍＬになるように溶解した。
ペプチドA : CIHSDRFDTYRSKKESERLV  (20mer)                            
ペプチドB : CERIKIKALIPKNAGVSD  (18mer)    
該基板に自動スポッターによりスポット後、室温の環境下に１４時間静置することによりペプチドA及びBを基板に固定化した。
次に比較例で得られた基板上でも同様の操作を行い、基板上にペプチドA及びBを固定化した。
【００５８】
工程２（吸着防止処理）
その後、実施例１の基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間処理することにより残りのアルデヒド基を失活させた。実施例２の基板は０．１Mのメルカプトエタノール（和光純薬製）水溶液に１時間処理することにより残りのマレイミド基を失活させた。
比較例の基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りの活性エステル部を失活させた。
【００５９】
工程３（抗原抗体反応１）
その後、ラビットにペプチドAを免疫し、得られた抗血清をCy3-monoreactive dye（GEヘルスケア社製）にて蛍光ラベルしたサンプルをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈した溶液を室温にて２時間、各基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。
抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間３回洗浄した。
【００６０】
《実験２》
ラビットにペプチドBを免疫し、得られた抗血清をCy3-monoreactive dye（GEヘルスケア社製）にて蛍光ラベルしたサンプルを用いた以外は実験１と同様に操作をした。
【００６１】
各基板について蛍光量測定を行いスポットシグナル強度値とバックグランド値を評価した。バックグランド値の結果を表３に示す。
【００６２】
実施例および比較例における蛍光量の測定には、ＰａｃｋａｒｄＢｉｏＣｈｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
実施例は、いずれの比較例よりもスポットシグナル値が強く、Ｓ／Ｎ比が大きい結果になった。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【００６５】
【表５】
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【００６６】
【表６】
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