(57)【要約】【課題】塩分過剰摂取実験モデル動物として有用な、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物、例えばＮａV２チャネル遺伝子欠損非ヒト動物を提供すること。【解決手段】ラットＮａＧｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ゲノムＤＮＡのＮａV２遺伝子を単離し、ＮａV２のエキソン部分に、ネオ遺伝子等マーカー遺伝子を挿入してターゲットベクターを作製し、作製されたターゲットベクターをＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択し、このＥＳ細胞系を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス同士を交配させることによってＮａV２ノックアウトマウスを作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの、非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換により不活性化され、ＮａV２を発現する機能を失ったヌル変異非ヒト動物を、
水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すことを特徴とするヌル変異非ヒト動物として使用する方法：
（Ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｃ）６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの、非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換により不活性化され、ＮａV２を発現する機能を失い、かつ、
水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物を、
塩分過剰摂取実験モデル動物として使用する方法：
（Ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｃ）６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質の、細胞外Ｎａイオンレベルのセンサーとしての使用：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質：
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質：
（ｃ）６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示す、ＮａV２チャネル遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質や、それをコードする遺伝子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性ナトリウムチャネルは、電位依存性カリウムチャネルとともに、神経細胞、筋肉細胞等の興奮性細胞において活動電位の発生と伝播に中心的役割を担うイオンチャネルとして知られている。ナトリウムチャネルタンパク質は、電位検出系をもつイオン選択的チャネルを構成し、２７０ｋＤａの糖タンパク質からなるα−サブユニットと、１つ又は２つのより小さいβ−サブユニットから構成されている。電位依存性ナトリウムチャネルは、細胞膜が静止電位（通常−７０〜−９０ｍＶ）にある時は閉じているが、細胞膜が脱分極するとチャネルが開き、１ｍｓｅｃ程度の後にチャネルが閉じることから、ナトリウムチャネルタンパク質分子は、膜電位を感受する電位センサーとそれに連動して動く活性化依存性、ナトリウムイオンを選択的に透過するための選択性フィルター、及び不活性化依存性を構成しているといわれている。
【０００３】
本発明者等による脳のナトリウムチャネルタンパク質α−サブユニットｃＤＮＡタイプＩ、II及びIIIの同定（非特許文献１、２）以来、多くの構造的に関連するα−サブユニットのアイソフォームが各種の組織からクローニングされており、これらは多重遺伝子族を形成している。最近になって興奮性細胞のほかにも、グリア細胞もまた電位感受性ナトリウム電流を発現することが見出され（非特許文献３）、in situハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット及び免疫細胞化学などの手法によって、グリア細胞における脳−タイプＩ、II、III、Ｈ１、ＮａS、ＮａＣＨ６等の存在が報告されている（非特許文献４）。しかし、いわゆる電気的に非興奮性の細胞における電位依存性ナトリウムチャネルの機能は解明されていない。
【０００４】
数年前、電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットと相同性のある部分ｃＤＮＡがラット星状膠細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーからクローニングされＮａＧと命名された（非特許文献５）。これに引き続き同様なα−サブユニットアイソフォームが各種の動物種から独立にクローニングされている。例えば、ヒトの心臓からのＮａV２．１（非特許文献６）、マウスの動脈腫瘍細胞株からのＮａV２．３（非特許文献７）及びＮａＧのスプライシングヴァリアントに相当するラットの脊髄神経節由来のＳＣＬ１１が報告されている（非特許文献８）。これらは配列の相同性から、異なる種における対応する遺伝子（species ortholouges）とも考えられ、電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＣｈ）α−サブユニットファミリーの中で異なるサブファミリーすなわちサブファミリー２ＮａＣｈ（ＮａV２）に分類することができる。それらの全アミノ酸配列は、先にクローニングされた電位依存性ナトリウムチャネル群に比べ相同性が５０％以下と低く、イオン選択性や電位依存性の活性化・不活性化に関連する領域においてすらもその配列は特異的である。それらの領域は他の全てのサブファミリーメンバーにおいては完全に保存されていることから、ＮａV２は特別なチャネル特性をもっていると考えられるが、機能的ＮａV２チャネルをアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを用いる異種発現系で発現させる試みはこれまで成功しておらず、生体内におけるＮａV２チャネルの機能については全くわかっていなかった。
【０００５】
ＮａＧ／ＳＣＬ１１は、星状膠細胞からクローンニングされたので、星状膠細胞で発現される電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＣｈ）の１つと考えられてきたが、その後のin situハイブリダイゼーションによりＮａV２は生体内では星状膠細胞に発現しておらずシュワン（Schwann）細胞及び脊髄感覚ニューロンにおいて発現していることが明らかにされた（非特許文献９）。ＮａＧのｍＲＮＡは神経系以外、特に肺や心臓に比較的高レベルで検出され、さらに、ＮａＧのｍＲＮＡが中枢神経系に存在することがＲＮａｓｅプロテクション及びノーザンブロット法で示されたが、非同位体プローブを用いるin situハイブリダイゼーションによってはＮａＧのｍＲＮＡは中脳核Ｖ（mesencephalic nucleus V)以外において検出できないことが報告されている(非特許文献１０）。このことから、ＮａＧのｍＲＮＡは中枢神経系全体に低レベルで発現するか又は中枢神経系の特定の領域で限定的に発現しているであろうと考えられる。ＮａＧチャネルがこのように幅広い組織、電気的に非興奮性の細胞を含む幅広い細胞種に分布していることから、ＮａＧチャネルは活動電位の発生と伝播以外の機能があると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature 320,188-192(1986)
【非特許文献２】FEBS Lett.228,187-194(1988)
【非特許文献３】Trends Neurosci.19,325-332(1996)
【非特許文献４】Glia 26,92-96(1999)
【非特許文献５】Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,7272-7276(1992)
【非特許文献６】Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,4893-4897(1992)
【非特許文献７】J.Biol.Chem.269,30125-30131
【非特許文献８】FEBS Lett.400,183-187(1997)
【非特許文献９】Glia 21,269-276(1997)
【非特許文献１０】Mol.Brain Res.45,71-82(1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在まで、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ異常な高張塩分の摂取挙動を示す、塩分過剰摂取実験モデル動物は知られていない。また、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質やそれをコードする遺伝子は知られていない。本発明の課題は、かかる塩分過剰摂取実験モデル動物として有用な、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物、例えばＮａV２チャネル遺伝子欠損非ヒト動物や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質やそれをコードする遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、生体内における機能が不明であったＮａV２チャネルの機能や役割を明らかにするために鋭意研究し、ＮａV２チャネルノックアウトマウスを作製し、ＮａV２チャネルが脳内脊髄液におけるナトリウムイオンレベルを感知して指令を出す役割を担っていることを確認し、このＮａV２チャネルノックアウトマウスが水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ高張塩分を多量に摂取するという異常な挙動を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの、非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換により不活性化され、ＮａV２を発現する機能を失ったヌル変異非ヒト動物を、
水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すことを特徴とするヌル変異非ヒト動物として使用する方法：
（Ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｃ）６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
に関する。
【００１０】
また本発明は、
（２）非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする上記（１）記載の方法
に関する。
【００１１】
また本発明は、
（３）齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする上記（２）記載の方法
に関する。
【００１２】
また本発明は、
（４）以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの、非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換により不活性化され、ＮａV２を発現する機能を失い、かつ、
水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物を、
塩分過剰摂取実験モデル動物として使用する方法：
（Ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｃ）６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子：
に関する。
【００１３】
また本発明は、
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質の、細胞外Ｎａイオンレベルのセンサーとしての使用：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質：
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質：
（ｃ）６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質：
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物、例えばＮａV２チャネル遺伝子欠損マウスは、塩分過剰摂取実験モデル動物として有用である。またこのＮａV２チャネル遺伝子欠損マウスを用いることにより、ＮａV２チャネルが脳内脊髄液におけるナトリウムイオンレベルを感知して指令を出す役割を担っていることや、ＮａV２チャネルが中枢神経系の限られた部位におけるニューロンや上衣細胞、特に体液ホメオスタシスに関与する脳室周囲器官で発現することや、ＮａV２チャネルが体液オスモル濃度知覚と食塩摂取行動の制御に重要な役割を果していることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のＮａV２ノックアウトマウスの遺伝子地図(ａ)、ゲノムＤＮＡのサザンブロットの結果(ｂ)、ゲノムＰＣＲの結果(ｃ)及びウエスタンブロッドの結果(ｄ)を示す図である。
【図２】本発明のＮａV２ノックアウトマウスの胚、脊髄神経節及び胸部におけるｌａｃＺ発現部位を示す図である。
【図３】本発明のＮａV２ノックアウトマウスの脳におけるｌａｃＺ発現部位を示す図である。
【図４】本発明のＮａV２ノックアウトマウスにおけるＦｏｓ核タンパクの発現に対する水分飢餓の及ぼす影響に関する結果を示す図である。
【図５】本発明におけるマウスＮａV２チャネル欠損がマウスの水分及び食塩摂取に及ぼす影響に関する結果を示す図である。
【図６】本発明のＮａV２ノックアウトマウスにおける各種の味刺激に対する鼓索神経における反応の結果を示す図である。
【図７】本発明のＮａV２ノックアウトマウスにおける２４時間水分飢餓の前後において０．３ＭのＮａＣｌに対する嗜好率と総摂取量の測定結果を示す図である。
【図８】本発明のＮａV２ノックアウトマウスにおけるナトリウム欠乏処理誘導性の食塩欲求試験の結果を示す図である。
【図９】野性型マウス及びＮａv２遺伝子欠損型マウスから調製した脊髄後根神経節の神経細胞について、細胞内ナトリウムイオン及び細胞内カルシウムイオンの蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の蛍光イメージング結果を示す図である。
【図１０】野性型マウス及びＮａv２遺伝子欠損型マウスから調製した脊髄後根神経節の神経細胞について、細胞内ナトリウムイオン及び細胞内カルシウムイオンの蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の蛍光イメージング結果を示す図である。
【図１１】野性型マウス及びＮａv２遺伝子欠損型マウスから調製した脳弓下器官の神経細胞について、細胞内ナトリウムイオン及び細胞内カルシウムイオンの蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の蛍光イメージング結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のヌル変異非ヒト動物としては、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示す非ヒト動物であれば特に制限されるものではないが、かかる非ヒト動物として、ＮａV２遺伝子機能が染色体上で欠損したヌル変異非ヒト動物を具体的に例示することができる。ここで、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動とは、例えばマウスにおいては２４時間水分飢餓条件下で０．３Ｍの食塩水の摂取量が野生型、好ましくは同腹の野生型に比べ１．５倍以上、より好ましくは２倍以上摂取する挙動をいい、また、ＮａV２遺伝子機能が染色体上で欠損したヌル変異非ヒト動物とは、ＮａV２をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化され、ＮａV２を発現する機能を失った非ヒト動物をいい、また非ヒト動物とは、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１７】
ＮａV２ノックアウトマウスの作製法としては、ＮａV２を発現する機能を失ったノックアウトマウスを作製することができる方法であればどのような作製法でもよいが、例えば、マウスＮａV２の種対応物であるラットＮａＧをコードするｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ゲノムＤＮＡのＮａV２遺伝子を単離し、ＮａV２のエキソン部分に、例えばネオ遺伝子等マーカー遺伝子を挿入してターゲットベクターを作製し、作製されたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択し、このＥＳ細胞系を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するＮａV２ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを作製することができる。
【００１８】
本発明の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質としては、脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するものであれば特に制限されるものではなく、例えば、配列番号３に示されるＮａV２（GenBankのアクセッション番号：Ｌ３６１７９）や、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質や、これらの組換えタンパク質を具体的に挙げることができる。かかる脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。
【００１９】
また、本発明の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子としては、配列表の配列番号３に示されるＮａV２をコードする遺伝子、例えば、配列番号２に示されるＮａV２遺伝子や、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡや、これら遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードするＤＮＡも包含され、これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えば細胞株Ｒ１から作られたマウスのゲノムライブラリーや、１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー等から公知の方法により調製することができる。
【００２０】
また、配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、マウス由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ＮａV２遺伝子と同効な目的とするヒトＮａv２．１（GenBankアクセッション番号：Ｍ９１５５６）やラットＮａＧ／ＳＣＬ１１（GenBankアクセッション番号：Ｙ０９１６４）等の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２１】
本発明の融合タンパク質とは、ＮａV２等の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させたものをいい、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の精製や、かかるタンパク質の検出や、かかるタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２２】
本発明の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、ヒトの塩分過剰摂取による慢性疾患などのＮａV２の変異又は欠失に起因する疾病の診断や、ＮａV２等の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００２３】
脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原ペプチドを免疫原としてウサギ等を免疫し、常法により抗血清を作製し、作製した抗血清を、免疫原に用いたペプチドが固定化されたカラムによって精製することにより調製することができる。また、モノクローナル抗体は、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法により調製することができる。以下に脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質として、マウス由来のＮａV２を例に挙げてマウス由来のＮａV２に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗ｍＮａV２モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００２４】
上記抗ｍＮａV２モノクローナル抗体は、抗ｍＮａV２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００２５】
抗ｍＮａV２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、マウス等から得られたＮａV２を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ｍＮａV２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００２６】
また、本発明の前記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に対する抗体は、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００２７】
また上記抗ｍＮａV２モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、前記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２８】
本発明はまた、前記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。
【００２９】
また、発現系としては、上記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００３０】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質は、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができ、また、かかる脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、抗ＮａV２モノクローナル抗体等の抗脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質抗体を結合させたカラムや、上記ＮａV２等の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合には、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらの脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を得ることができる。
【００３１】
本発明において、前記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を大量に産生する非ヒト動物をいう。本発明における非ヒト動物としては、ウサギや、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質のトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００３３】
脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質のトランスジェニックマウスは、ＮａV２等の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３４】
そしてまた、前記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質や、かかるタンパク質をコードする遺伝子や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質に対する抗体や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物や、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現する細胞等を用いると、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能促進若しくは抑制物質や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の発現促進若しくは抑制物質をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニングにより得られたものは、ヒトの塩分過剰摂取による慢性疾患の抑制剤、予防剤又は治療薬や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の欠失又は異常に起因する疾病等の診断・治療に有用な物質である可能性がある。
【００３５】
上記スクリーニング方法としては、例えば、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本発明の水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物又は脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。
【００３６】
上記脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、例えば、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質を発現している細胞と被検物質とを接触せしめ、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能又は発現の変化を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００３７】
本発明の水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物又は脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、水分充足条件下では野生型と同様な食塩の摂取挙動を示し、水分飢餓条件下では野生型に比べ多量の高張塩分の摂取挙動を示すヌル変異非ヒト動物又は脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物から得られる神経細胞と被検物質とをインビトロで接触せしめ、前記タンパク質の機能又は発現の変化を測定・評価する方法や、前記ヌル変異非ヒト動物又は前記トランスジェニック非ヒト動物にあらかじめ食塩水を投与した後、該非ヒト動物から得られる神経細胞を被検物質の存在下で培養し、前記タンパク質の機能又は発現の変化を測定・評価する方法や、前記ヌル変異非ヒト動物又は前記トランスジェニック非ヒト動物にあらかじめ被検物質と食塩水を投与した後、該非ヒト動物から得られる神経細胞における前記タンパク質の機能又は発現の変化を測定・評価する方法や、前記ヌル変異非ヒト動物又は前記トランスジェニック非ヒト動物にあらかじめ被検物質と食塩水を投与した後、該非ヒト動物における前記タンパク質の機能又は発現の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００３８】
また、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能又は発現の変化を測定・評価するに際し、対照として野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。なお、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能とは、生体中の浸透圧調節機能、すなわち脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターしている脳内神経細胞において、Ｎａイオンレベルのセンサーとして作用する機能をいい、かかる機能の変化としては、体液オスモル濃度の感覚経路における機能の変化や、水分及び食塩の摂取に対する嗜好−嫌悪応答の変化などを具体的に例示することができるがこれらに限定されるものではない。
【００３９】
また、本発明の医薬組成物は、有効成分として前記本発明の脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能促進若しくは抑制物質又は脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の発現促進若しくは抑制物質を含んでものであれば特に制限されるものではなく、これら医薬組成物は、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能促進又は発現増強を必要としている患者や、脳脊髄液及び血中の浸透圧をモニターする脳内神経細胞においてＮａイオンレベルのセンサーとして作用するタンパク質の機能又は発現の抑制を必要としている患者を治療するのに用いることができる。
【００４０】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
［ターゲッティングベクターの構築］
ターゲッティングベクターを構築するため、タンパクコーディングエクソン１，２及び３を含むマウスのゲノム断片を、ラットのＮａＧ／ＳＣＬ１１プローブによってクローニングした。まず、細胞株Ｒ１から作られたマウスのゲノムライブラリー（大阪大学の森博士から供与）から、ラットのＮａＧｃＤＮＡの４４６ｂｐ断片（最初の３つのコーディングエクソンを含むヌクレオチド残基１１−４５６：GenBankアクセッション番号Ｙ０９１６４：配列番号１）でハイブリダイズさせて９個の独立のゲノムクローンを分離した。数種の制限酵素を用いるサザンブロット分析により、これら全てのオーバーラップクローンが単一のゲノム遺伝子座に由来することを確認した。ハイブリダイゼーションポジティブな３．２ｋｂ及び３．７ｋｂのHind III断片をpBluescriptIISK(-)（Stratagene社製）にサブクローンした後、ＤＮＡ配列を決定した（配列はGenBankのアクセッション番号ＡＦ１９０４７２：配列番号４）。３．２ｋｂ断片は、タンパクコーディングエクソン１（５′非翻訳領域の１３塩基とマウスＮａV２タンパクコーディング配列の最初の２３８塩基：GenBankアクセッション番号Ｌ３６１７９のヌクレオチド残基２３８−４９０）を含み、３．７ｋｂ断片はエクソン２（同ヌクレオチド残基４９１−６０９）及びエクソン３（同ヌクレオチド残基６１０−７０１）を含んでいた。この３つのエクソンをコードしているＤＮＡ配列はTamkun等（J.Biol.Chem.269,30125-30131(1994)）によってクローニングされたマウスのＮａV２．３ｃＤＮＡと同じであった。クローニングされたゲノム断片は４つの制限酵素（BamH I，Bgl II，EcoR I，Hind III）についてのサザンブロットの結果、マウスのゲノムＤＮＡと同じ制限酵素地図を示した。この知見から、マウスのＮａV２．３はラットのＮａＧの種対応物であることが明らかになった。したがって、ＮａV２．３、ＮａＧ及びＳＣＬ１１をＮａV２と命名した。
【００４２】
ターゲッティングベクターを構築するために、ｌａｃＺ遺伝子をマウスＮａV２遺伝子のタンパクコーディングエクソン１に挿入し、マウスＮａV２のＮ末端の２０アミノ酸配列がβ−ガラクトシダーゼと融合するようにデザインした。すなわち、３つのエクソンを含む１２．５ｋｂのSal I断片をpDT-A（Anal. Biochem.214、77-86(1993)）のXho Iサイトに挿入し、次いで、ｌａｃＺ−ｎｅｏカセットのSal I-Xho I断片をエクソン１の内因性のXho Iサイトに導入した（図１ａ参照）。これによってマウスＮａV２タンパクの最初の２０アミノ酸をβ−ガラクトシダーゼのＮ末端に融合した蛋白が発現する。また、ターゲットマウスにおいてマウスＮａV２遺伝子の代わりにｌａｃＺ遺伝子を確実に発現させるために、ｌａｃＺ−ｎｅｏカセットを挿入したこと以外は、元のマウスＮａV２遺伝子のゲノム構造そのままとした。サザンブロットスクリーニングにおいて外因的制限サイトとして利用することができるように、ｌａｃＺ−ｎｅｏカセットの５′末端にEcoR Iリンカーを予め挿入した。なお、図１ａ中、上段はターゲットベクターの制限酵素地図を、中段は野生型のマウスＮａV２遺伝子座を、下段は組換え体の遺伝子座をそれぞれ示し、図中の制限サイトＢはBamH I、ＢｇはBgl II、ＥはEcoR I、ＨはHind III、ＸはXho Iをそれぞれ意味する。
【００４３】
［ＮａV２ノックアウトマウスの作製］
線状化した上記ターゲットベクターを、エレクトロポレーション法によってＥＳ細胞（１２９／ＳＶマウス由来のＲ１セルライン）に導入した。文献（Neurosci.Lett.247,135-138(1998)）記載の方法に準じて、ネオマイシン耐性ＥＳクローンをＧ４１８によって選択し、ターゲットクローンのスクリーニングを行った。相同組換え体をプローブ１（図１ａ参照；エクソン１のXho Iから約８ｋｂ上流に位置している０．３ｋｂのEcoR I−Xba I断片）によりEcoR I消化を用いるサザンブロット法で確認した。また、選択されたクローンをプローブ２（ｎｅｏ遺伝子由来の０．６ｋｂのPst I断片）でチェックした。１つのセンスプライマー（プライマー１、エクソン１の５′末端領域にあるＡＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣ：配列番号５）及び２つのアンチセンスプライマー（プライマー２、ｌａｃＺの５′末端領域にあるＡＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＴＣ：配列番号６、プライマー３、エクソン１の３′末端領域にあるＣＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡ：配列番号７）を用いるゲノムＰＣＲにより標的とされる遺伝子座を確認した。ＰＣＲ増幅は、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ（Takara社製）によりその製造者のプロトコールに従いプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて２段階で実行した（第１段階；９５℃５分間、６０℃１分間、７２℃１分間。第２段階；９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間）。
【００４４】
９８個のＥＳクローンから得られた、相同組換えが起こったアレルをもっていることが確認された２個のＥＳクローンを、８細胞期のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚に導入した。導入された胚はＭ１６培地中で１夜胚盤胞まで培養し、７〜１０個の胚盤胞をＩＣＲマウスの子宮に移植した。このようにして得られた雄キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスと交配させ、同腹子からヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）を作出し、次いで、ホモ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせ、メンデルの法則に従い産生するＮａV２欠損マウスを作製した。
【００４５】
このヌル変異体動物（マウスＮａV２-/-）は健康で、繁殖可能で見た目に正常であった。ヘテロ接合型動物の繁殖から得られた４５８匹の４週令のマウスの遺伝子型解析の結果、野生型は２９．５％（ｎ＝１３５）、ヘテロ接合型は４８．２％（ｎ＝２２１）、ホモ接合型は２２．３％（ｎ＝１０２）であり、メンデル比率に近かった。これらのことは、ヘテロ接合体及びホモ接合体における胚の発育及び身体機能が大きく障害されないことを示している。マウスＮａV２は周生期に一過性に子宮平滑筋に発現が誘導されることが報告されている（J.Biol.Chem.269,30125-30131(1994)及びAm.J.Physiol.270,C688-696(1996)）が、ＮａV２-/-マウスにおいては子は正常に生まれたことは注目に値する。また、ヌル変異体におけるｌａｃＺ発現パターンは発現の強さに差があるもののヘテロ接合体のそれと同じであったことは、マウスＮａV２の欠損はマウスＮａV２発現細胞の分化又は生存能力に影響しないことを示している。
【００４６】
野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/-)及びホモ接合型(-/-)のそれぞれのマウスの尾からサンプルゲノムＤＮＡを採取し、EcoR Iで消化したゲノムＤＮＡをブロットした膜をターゲットベクターの５′側にある前記プローブ１とハイブリダイズさせたサザンブロット分析の結果を図１ｂに示す。図１ｂの右側には、野生型（１８ｋｂ）及び組換型（１０ｋｂ）の遺伝子型のサイズが示されている。また、野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/-)及びホモ接合型(-/-)のそれぞれのマウスのゲノムＰＣＲ分析の結果を図１ｃに示す。図１ｃの右側には、野生型（２００ｂｐ）と組換型（４００ｂｐ）の遺伝子型のサイズが示されている。
【００４７】
［ＮａV２ノックアウトマウスにおけるＮａV２不発現の確認］
変異体マウスのマウスＮａV２タンパク発現をウエスタンブロットで試験した。野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/-)及びホモ接合型(-/-)のそれぞれのマウスの肺組織サンプルをKnittle等の方法（Am.J.Physiol.270、C688-696(1996)）により調製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティングを文献（Neurosci.Lett.247,135-138(1998)）記載の方法で行った。抗マウスＮａV２．３抗血清（コロラド州立大学Tumkun博士から供与）をＰＢＳで１：５００に希釈して使用した。イムノブロットは数種の非免疫血清とインキュベートし、非特異的な結合でないことを確認した。結果を図１ｄに示す。図１ｄの右側には、ＮａV２タンパク（２２０ｋＤａ）の位置が示されている。ＮａV２タンパクは高度にグリコシル化されておりＳＤＳ−含有緩衝液においてすら容易に凝集するため、ナトリウムチャネルは広いバンドとなっているが、ヘテロ接合体（ＮａV２+/-）マウスでは野生型の約半量のマウスＮａV２タンパクが肺膜から検出され、ホモ接合体（ＮａV２-/-）マウスではマウスＮａV２タンパクは検出されなかった。マウスＮａV２タンパクが発現していないことから、このアレルがヌル変異体であることがわかる。
【００４８】
［Ｘ−Ｇａｌ染色によるＮａV２ノックアウトマウスにおけるｌａｃＺ発現の確認］
胚を３．５％のホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中に室温にて１時間浸漬して固定し、正中線に沿って矢状面にかみそりでカットした。図２ａは胚令１５日（Ｅ１５）のマウスＮａV２+/-の胚全体のＸ−Ｇａｌ染色を示しており、強いβ−ガラクトシダーゼ活性が三叉神経節（図２ａ中の矢頭）及び脊髄神経節（同矢印）において観察された（参考写真１参照）。また、ｌａｃＺはこのＥ１５マウスの肺（同星印）においても発現していた。これらの器官におけるｌａｃＺの発現は成長しても持続し、脊髄神経節をＸ−Ｇａｌ染色後に薄い切片とした時、β−ガラクトシダーゼ活性が種々の大きさの脊髄感覚ニューロンで検出された。図２ｂには、生後２日目のＮａV２+/-マウスの脊髄神経節をＸ−Ｇａｌで染色したクリオスタット組織切片が示されている（参考写真１参照）。ｌａｃＺ発現は脊髄神経節のニューロン細胞体（図２ｂ中、神経路が星印で示されている。）に限定されており、軸索からは検出されなかった。また、同じようなｌａｃＺ発現のパターンが三叉神経節の組織切片でも観察することができた。図２ｃには、胸部における成育した交感神経幹のクリオスタット切片が示されている（参考写真１参照）。強く染色された多くの細胞は、細胞体の出現、分布、サイズからして、シュワン（Schwann）細胞であると考えられる。また、ｌａｃＺ発現は心臓自律神経及び舌神経でも観察された。ｌａｃＺ発現のこれらのパターンは、ラットＮａV２及びマウスＮａV２発現に関する結果（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,7272-7276(1992)、FEBS Lett.400,183-187(1997),Glia、21,269-276(1997)）とよく一致する。このことからｌａｃＺ遺伝子発現はマウスＮａV２遺伝子の制御領域によって制御されていることがわかる。なお、図２ｃ中、矢頭はシュワン細胞の細胞体を示し、スケールバーは５０μｍを表している。
【００４９】
［ＮａV２の生理学的な役割］
マウスＮａV２の生理学的な役割を調べるため、ＮａV２+/-マウスとＮａV２-/-マウスの脳を用いて中枢神経系におけるｌａｃＺ発現を調べた。生後間のない動物をペントバルビタール麻酔下において最初にＰＢＳでついで固定剤で灌流した。固定された脳を冠状に又は矢方向に２ｍｍの厚さにかみそりで切った。ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ、５ｍＭのＫ3Ｆｅ(ＣＮ)6、５ｍＭのＫ4Ｆｅ(ＣＮ)6、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２％のＮＰ−４０を含むＰＢＳ中で３７℃において一晩インキュベートした。免疫染色のため、Ｘ−Ｇａｌ染色された切片を冠状の１４μｍの切片にクリオスタットミクロトームで切り、ゼラチンで被覆されたスライド上に載置した。抗ニューロフィラメント２００ウサギポリクローナル抗体（Sigma、Ｎ−４１４２）又は抗グリア原繊維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）ウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biochemistry、ｓｃ−６１７０）を用いて免疫染色した（Neurosci.Lett.247,135-138(1998)）。マウスＮａV２が成長個体の中枢神経系における特定のニューロン及び上衣細胞で発現していることを図３は示す（参考写真２参照）。
【００５０】
図３ａ−ｅはＮａV２+/-マウスの、図３ｆはＮａV２-/-マウスの中枢神経系におけるｌａｃＺ発現を示している。また、図３ａ，ｂ，ｄ，ｅ及びｆは固定された成長個体の脳を冠状に、図３ｃは正中矢状面でそれぞれ２ｍｍに切断し、Ｘ−Ｇａｌで染色したものである。なお、図３ｃにおいては脳の下の頭蓋は除去しなかった。図３ｅにおいて、ホモ接合変異体マウスが低レベル発現部位を検出する分析に用いられた。図３において、ＡＨ：前方視床下部領域（anterior hypothalamic area）、ＭＨ：中央手綱核（medial habenular nuleus）、ＭＥ：正中隆起（median eminence）、ＯＶＬＴ：終板器官（organum vasculosum laminae terminalis）、ＭＰＯ：中央視索前領域（medial preoptic area）、ＤＭＨ：背中視床下部（dorsomedial hypothalamus）、ＩＰＤＭ：背中部位の脚間核 (interpeduncularnucleus of the dorsomedial part）、ＭＭＲ：正中縫線の中央部（medial partof the median raphe）、ＮＨＰ：神経下垂体（neurohypophysis）、ＳＦＯ：脳弓下器官（subfornical organ）、ＣＸ：大脳皮質（cerebral cortex）、ＢＬＡ：扁桃体側低（basolateral amygdala）をそれぞれ意味する。図３ｃにおいて、ＯＶＬＴは中枢神経系から除去され頭蓋に付けられた。冠状の半全量脳は５０μｍの厚さにクリオスタットミクロトームで切り、抗ニューロフィラメントポリクローナル抗体（図３ｇ及びｈ）、抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（図３ｉ）、又はクレシルバイオレット（cresyl violet）（図３ｊ）により染色された。茶色のシグナルは、抗体と反応した部位である。サンプルはＡＨ（図３ｇ）、ＳＦＯ（図３ｈ及びｉ）及びＭＥ（図３ｊ）である。矢頭はダブルポジティブニューロンを示す。図３ｊの星印は、第三脳室を示す。背面はパネルの上方を向いている。図３ｇ−ｈのスケールバーは３０μｍであり、図３ｊのスケールバーは１００μｍである。
【００５１】
図３からわかるように、ｌａｃＺ発現は中枢神経系の次の特定部位に限られていることが判明した（図３ａ−ｆ）。すなわち、ＭＰＯ、ＡＨ、ＤＭＨ、ＩＰＤＭ、ＭＭＲ、ＭｅＶ、ＭＨ、ＭＥ、ＳＦＯ、ＯＶＬＴ及びＮＨＰである。ＭＥ、ＳＦＯ、ＯＶＬＴ及びＮＨＰは脳室周囲器官（ＣＶＯ）として知られ、高密度、高透過性の毛細血管ネットワークをもち、血中への物質の分泌や中枢組織への物質浸入を促進する（FASEB J,7、678-686(1993)）。ＮａV２+/-マウスでは比較的弱いｌａｃＺの発現がＣＸ及びＢＬＡに見られたのに対し、ＮａV２-/-マウスにおけるこれらの部位でのｌａｃＺの発現はより顕著であった（図３ｆ）。ｌａｃＺを発現している細胞種を調べるため、脳をＸ−Ｇａｌで染色しクリオスタットミクロトームで組織切片に切り、ついで抗ニューロフィラメントポリクローナル抗体又は抗グリア原繊維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）ポリクローナル抗体で免疫染色するか、クレシルバイオレット染色を行ったところ、ｌａｃＺ発現細胞の大部分はＭＰＯ、ＡＨ（図３ｇ）、ＩＰＤＭ、ＭＭＲ、ＭＨ及びＭｅＶ中のニューロフィラメントに対して陽性であった。また、ＧＦＡＰ陽性細胞はｌａｃＺ発現に対して陰性であり、このことは星状膠細胞がマウスＮａV２に対し陰性であることを示している。
【００５２】
ＣＶＯにおけるｌａｃＺ発現細胞の分布は特に重要であり、ＭＥにおけるｌａｃＺ発現細胞は第３脳室の床に並んでいた（図３ｊ）。この分布は線毛を持たない上衣細胞の位置と対応している。この細胞は脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞及び血管の間を結合している特殊な細胞であるタニサイトと考えられる（Neuroscience 3,277-283(1978)）。これらはＣＳＦと毛細管周縁空間の間の物質交換に関与していると考えられている。ｌａｃＺ陽性細胞はＳＦＯ全体に亘ってまばらに分布し、その大部分はニューロフィラメントと共在し（図３ｈ）、ＧＦＡＰに対し陰性であった（図３ｉ）。ｌａｃＺ陽性細胞は第３脳室の全体に並んで集中的に存在し、これが上衣細胞であることを示唆している。ＮＨＰには、Ｘ−Ｇａｌで密に染色された。これらはいわゆる下垂体細胞（J.Exp.Biol.139,67-79(1988)）に対応すると思われる。
【００５３】
［Ｆｏｓ−イムノ組織化学］
ｌａｃＺ発現の解析によって、マウスＮａV２は４つの脳周囲器官及び中枢神経系のいくつかの神経核において発現することや、マウスＮａV２発現細胞は組織分布のみならず細胞タイプにおいても多様性があることが判明したことから、ＮａV２チャネルの機能、特性の決定が困難となったが、４つの脳周囲組織が体液ホメオスタシスに関与していると考えられていることから（FASEB J 7,678-686(1993)、Annu.Rev.Physiol.59,601-619(1997)、Physiol.Rev.78,583-686(1997)、Physiol.Rev.58,582-603(1978)、Ann.NY Acad.Sci,877,258-280(1999)）、マウスＮａV２チャネルが体液容量オスモル濃度の感覚経路において機能していると仮定すれば、これらの器官におけるそのチャネルの活性と遺伝子発現はマウスＮａV２変異体マウスにおいて影響を受けると想定された。そこで、マウス及びラットにおける細胞外液バランスに応じた神経活動の変化のマーカーであるＦｏｓ核タンパクの中枢性発現に対して、水分飢餓がどのように影響するかを以下のように調べた。
【００５４】
水分充足状態及び水分飢餓状態におかれた、脳の中央視索前核（ＭｎＰＯ）、終板器官（ＯＶＬＴ）、脳弓下器官（ＳＦＯ）、室旁核（ＰＶＮ）及び視索上核（ＳＯＮ）の５つの領域におけるＦｏｓ−イムノポジティブ細胞の密度変化（時間に対する）について、水欠乏時間がゼロのマウス（マウスＮａV２+/+につきｎ＝４、マウスＮａV２-/-につきｎ＝４）、水欠乏１２時間のマウス（ｎ＝５及び５）、同２４時間のマウス（ｎ＝６及び７）、同４８時間のマウス（ｎ＝６及び５）を用いて調べた。前記固定液で灌流したマウスの脳を同じ固定液に４℃で一夜浸漬した後、脳をビブラトーム（Ｌｅｉｃａ，ＶＴ１０００Ｓ）上で５０μｍの厚さの冠状切片とした。抗Ｆｏｓヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biochemistry、ｓｃ−５２−Ｇ）のＰＢＳ１０００倍希釈液を用いてイムノ染色した。関連する領域を含む切片を選び、Ｆｏｓ−イムノ陽性核を数えた。各領域はイメージ分析システム（ＫＳ４００が付属したＡｘｉｏｐｈｏｔｏ２）を用いて測定した。上記脳の５つの領域１ｍｍ2当たりの核の数を測定した。結果を図４に示す（参考写真３参照）。
【００５５】
図４ａは、水分充足状態又は２４時間水分飢餓状態の野生型(+/+)マウス及びヌル変異体(-/-)マウスの終板器官（ＯＶＬＴ）含有組織切片の典型的な像であり、スケールバーは２００μｍを示している。また図４ｂは、水分飢餓状態における脳弓下器官（ＳＦＯ）、視索上核（ＳＯＮ）、室旁核（ＰＶＮ）、終板器官（ＯＶＬＴ）及び中央視索前核（ＭｎＰＯ）１ｍｍ2当たり中のＦｏｓ−イムノポジティブ細胞の数（平均）をプロットしたものであり、図中の縦棒はＳ．Ｅ．を示し、星印はＮａV２-/-マウスとＮａV２+/+マウスの間で有意差（ｐ<０．０５）が認められることを示している。水分充足条件下においては、Ｆｏｓ−イムノポジティブ細胞はテストしたどの領域においても検出されなかった。水分飢餓１２、２４及び４８時間条件下においてＦｏｓ−イムノポジティブ核を有する細胞数は、ＮａV２-/-マウスでもＮａV２+/+マウスでも顕著に増加した。しかし、ＳＦＯ及びＯＶＬＴにおけるＮａV２-/-マウスにおけるＦｏｓ−イムノポジティブ核は、ＮａV２+/+マウスに比べ２倍増加することが観察された。ＭｎＰＯ、ＰＶＮ、及びＳＯＮにおいてはグループ間に差はなかった。
【００５６】
［行動解析］
次いでマウスＮａV２チャネル欠損がマウスの水分及び食塩摂取に及ぼす影響を調べた。行動解析を行うにあたって変異体マウスを雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊと戻し交配させた。その結果、Ｆ１マウスとＮ４マウスで同様の結果を得た。ホモ接合型、ヘテロ接合型、野生型の同腹子における嗜好−嫌悪行動を、４８時間２瓶嗜好性試験によって測定した。マウスは蒸留水と味溶液の選択を４８時間自己のケージで行った。全ての行動解析には１２−２４週令の雄のマウスが使われた。マウスは一定の室温、湿度及び１２／１２時間明−暗サイクルにおいて各別にケージに入れられた。２つの瓶の位置は２４時間毎に代えてサイド嗜好性の影響を回避した。動物毎の総摂取量を測定し、式；嗜好率＝味溶液の量（ｍｌ）／味溶液及び水の総摂取量（ｍｌ）により嗜好性を計算した。結果を図５に示す。図５ａは段階的濃度の食塩水、図５ｂは濃度固定の３種類の基本的な味物質についての結果を示し、ホモ接合型(-/-)、ヘテロ接合型(+/-)、野生型(+/+)とも５匹のマウスを用いた。図５ａから、水分及び食塩充足条件下では食塩に対する濃度感受性は３つのグループにおいて変わらず、全てのグループにおいて０．１ＭのＮａＣｌを最も好み、０．３Ｍ又はそれ以上の濃度に対し嫌悪を示し、ヌル変異体が水分及び食塩が充足した条件下では各種の味物質に対して正常な嗜好を示すことがわかった。また図５ｂから、甘味（０．５Ｍの蔗糖）、酸味（０．０１ＭのＨＣｌ）、苦味（０．０２Ｍのキニン塩酸塩）に対する嗜好性に差が無いことがわかる。
【００５７】
［電気生理学］
ヌル変異体の味反応の正常性を調べるため、ＮａＣｌ味をつかさどる鼓索神経に関する電気生理学的分析を行った。１２−２４週令の雄マウス（正常条件のために野生型４匹とホモ接合型マウス５匹；急性食塩欲求条件のための上記マウス３匹及び５匹）にペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して深く麻酔した後に各マウスを気管切開し、頭保持具で固定した。鼓索神経を露出させて周囲の器官から隔離させ、ブラ（bulla）の入口部位で切断した。神経の全束を切断し白金ワイヤー記録電極上（０．１ｍｍ直径）に持ち上げた。中性電極を近傍の組織に付けた。神経活動は増幅され、オシロスコープに表示され、オーディオアンプリファイアーでモニターされた。増幅された信号は時間定数０．３秒で積分機に通され、スリップチャート記録計上に表示された。
【００５８】
味溶液としては０．１ＭのＮＨ4Ｃｌ、０．１ＭのＮａＣｌ，０．５Ｍの蔗糖、０．０１ＭのＨＣｌ、０．０２Ｍのキニン塩酸塩（Ｑ−ＨＣｌ）、０．１ＭのＫＣｌ及び０．１ＭのＣＨ3ＣＯＯＮａ（ＡｃＮａ）を用いた。これらの溶液は蒸留水及び０．１ｍＭのアミロライド溶液を用いて作られた。各溶液及び洗浄水は室温（２５±２℃）において舌の前面に適用された。舌は連続刺激の間に少なくとも４５秒洗浄された。全神経反応は刺激開始１０秒後における基線からの総和反応の高さとして測定された。各種の味刺激に対する鼓索神経における反応の記録結果を図６ａに示す。また、０．１ＭのＮＨ4Ｃｌに対する鼓索神経における反応を１とした場合の各種の味刺激に対する反応の強さを図６ｂに示す。
【００５９】
０．０２Ｍのキニン塩酸塩及び０．１Ｍの酢酸ナトリウムに対する神経生理学的反応は、ヌル変異体マウスと野生型マウスの間で同じ強さであった。０．１ＭのＮａＣｌ及び０．１Ｍの酢酸ナトリウムに対する反応はアミロライドによって両グループとも同じように減少したので、変異体マウスの味蕾におけるアミロライド感受性チャネルは正常に機能していると判断される。急性食塩欲求条件下でヌル変異体及び野生型マウスは同じような結果を示した。これらの知見を、水及び食塩充足条件下における各種味物質に対する正常な反応（図５）と併せ考えれば、ヌル変異体の味覚受容体は障害を受けていないことがわかる。
【００６０】
水分飢餓条件下では高張状態を脱するために、動物は大量の水分を摂取し高張食塩水の摂取を避ける。次に２４時間水分飢餓の前後における高張食塩水（０．３ＭのＮａＣｌ）に対する嗜好を調べた。試験に先立ちマウスは２つの瓶から水を飲むように１週間訓練された。水分欠乏の１日前の１０時に水と０．３ＭのＮａＣｌの選択を与え、１６時に液摂取量を測定した。翌日１０時に両方の瓶を除き、水分飢餓期間中乾燥飼料が与えられた。２４時間水分飢餓の後、両方の瓶を戻し液摂取量を１６時に測定した。結果を図７に示す。ヌル変異体は水分不足状態で高張食塩水の異常摂取を示した。２４時間水分飢餓の前後において０．３ＭのＮａＣｌに対する嗜好率（図７ａ）と総摂取量（図７ｂ）を測定した。この実験におけるｎ数（匹）は、６(+/+)、６(+/-)、６(-/-)であり、図中の縦棒はＳ．Ｅ．を示し、＊印はＮａV２-/-マウスとＮａV２+/+マウスの間で有意差（ｐ<０．０５）が認めらることを表している。水分飢餓の後には高張食塩水に明らかに低下した嗜好を示した野生型及びヘテロ接合型マウスと異なり、ヌル変異体マウスは嗜好率において変化が無かった（図７ａ）。総水分摂取量（水と０．３ＭのＮａＣｌの合計）は２４時間水分飢餓の前後で変わらなかった。総水分摂取量は全てのグループが水分飢餓後には４倍以上となっていた（図７ｂ）。
【００６１】
また、水分飢餓処理の前後における血液を断頭術により回収し、血漿電解質の濃度を電解質分析器（９１８０、AVL Scientific、ＧＡ）によって測定した。水分飢餓の前後における血清中の電解質濃度は、野生型及びホモ接合型マウス（各ｎ＝６）の両方で正常であった。野生型及びホモ接合型マウスにおける水分飢餓処理前のＮａ+濃度（ｍＭ）はそれぞれ１５３．６±０．６及び１５３．０±１．２、Ｋ+濃度（ｍＭ）はそれぞれ４．６±０．１及び４．７±０．１、Ｃｌ-濃度（ｍＭ）はそれぞれ１１８．５±０．６及び１１８．３±０．９であった。また、水分飢餓処理後のＮａ+濃度（ｍＭ）はそれぞれ１５１．６±０．８及び１５０±０．３、Ｋ+濃度（ｍＭ）はそれぞれ６．５±０．２及び６．７±０．２、Ｃｌ-濃度（ｍＭ）はそれぞれ１１６．０±１．０及び１１６．４±０．８であった。これらのデータは、ヌル変異体は過剰量のナトリウムを直ちに尿中に排泄し、腎臓機能が正常であることを示している。
【００６２】
更に利尿剤であるフロセミドを腹腔内注射する方法及び食塩欠乏食を与える方法で食塩欲求を誘導し、ナトリウム欠乏処理誘導性の食塩欲求試験を次の方法で行った。試験の前に水及び０．３ＭのＮａＣｌ摂取の対照測定を数日間にわたり行った。１０時に０．１２ｍｌの通常食塩水（０．９％のＮａＣｌ）をマウス腹腔内に注射した。０．３ＭのＮａＣｌの瓶を取り除き、ナトリウム欠乏食を通常食の代わりに与えた。１６時に通常食塩水の２回目の注射をした。その次の日の１０時に水及び０．３ＭのＮａＣｌを与え１２時、１４時、１６時に水及び０．３ＭのＮａＣｌの摂取量を測定した。その後同様なプロトコールで、同じマウスにより、フロセミド注射（０．１２ｍｌの通常食塩水中に０．６ｍｇ含有）、ナトリウム欠乏食でテストした（急性食塩欲求状態）。最後に通常のナトリウム含有食を与える点のみを変更したプロトコールによりナトリウム欠乏食の効果を評価した。結果を図８に示す。
【００６３】
図８には、摂取された水及び０．３ＭのＮａＣｌ量が２時間毎の蓄積量として示されている。図８の上段にはナトリウムの無い食餌を通常の食塩水注射と組み合わせた結果が、中段にはナトリウムの無い食餌をフロセミド注射と組み合わせた結果が、下段にはナトリウムを含む食餌をフロセミド注射と組合せた結果が、実験処理直後から２時間毎の０．３ＭのＮａＣｌ（右側）及び水（左側）の蓄積合計摂取量の平均値プロットとして示されている。この実験のｎ数（匹）は１０(+/+)、１０(+/-)、１０(-/-)であり、図８中の縦棒はＳ．Ｅ．を示し、＊印はＮａV２-/-マウスとＮａV２+/+マウスの間で有意差（ｐ<０．０５）が認められたことを表している。図８からもわかるように、フロセミドの代わりに等張食塩水を腹腔内注射した場合（対照試験）に摂取した水及び０．３ＭのＮａＣｌの量はどのグループも同じであった（上段のグラフ）。フロセミド注射とナトリウム欠乏食によって誘導した急性食塩欲求条件下ではヌル変異体は野生型及びヘテロ接合型と比べて０．３ＭのＮａＣｌ摂取量の増加は約２倍であった（中段右のグラフ）。この異常な高張食塩水の摂取はナトリウム含有食を与えた場合には止まった（下段のグラフ）。
【００６４】
［Ｎａv２チャネルはナトリウム濃度依存性ナトリウムチャンネル］
Ｎａv２チャネルがナトリウム濃度依存性ナトリウムチャンネルであることを以下の実験により確認した。まず、抗Ｎａv２抗体を次のようにして作製した。ラットＮａv２チャンネルのインタードメイン２−３に存在するアミノ酸配列（ＳＶＳＥＴＶＰＩＡＳＧＥＳＤＩＫ；配列番号８）からなるペプチドにヘモシアニンを結合させ、このヘモシアニン結合ペプチドを免疫原として白色ウサギを免疫し、常法により抗ラットＮａv２ウサギ抗血清を作製した。作製した抗血清を、免疫原に用いたペプチドが固定化されたカラムによって精製し、抗Ｎａv２抗体を得た。この抗Ｎａv２抗体の特異性はウエスタンブロットと免疫組織化学的解析によって確認した。精製した抗Ｎａv２抗体を使用すると、遺伝子欠損マウスから作製した脳、肺、脊髄後根神経節、舌の切片には非特異的な陽性シグナルは認められなかった。
【００６５】
次に、脊髄後根神経節の神経細胞を単離した。脊髄後根神経節を８〜１６週令の野性型マウス及びＮａv２遺伝子欠損型マウスから調製した。Renganathanらの方法（J Newrophysiol 84, 710-718(2000)）に従って、脊髄後根神経節から神経細胞を分散単離した。イオンイメージング実験に用いる前に、分散単離した神経細胞は、湿度１００％、温度３７℃、５％二酸化炭素の条件下で培養し、培養皿のガラスに接着させた。野性型マウス由来の脊髄後根神経節の神経細胞を、上記抗Ｎａv２抗体を用いて染色することにより、すべての神経細胞がＮａv２陽性であることを確認した。また、分散単離した神経細胞の大きさは、小型（直径２５ミクロン以下：約５０％）、中型（直径２５から４０ミクロン：約４０％）、大型（直径４０ミクロン以上：約１０％）から構成されていたが、これら三つの細胞種の大きさ、形状、生存率は、野性型マウスから単離したものも遺伝子欠損型マウスから単離したものも違いはなかった。なお、生存率については、トリパンブルーの染色によって検証した。
【００６６】
また、脳弓下器官の神経細胞についても単離した。脳弓下器官を８〜１６週令の野性型マウス及びＮａv２遺伝子欠損型マウスから調製した。脳弓下器官を可視化するためにエバンスブルーを前もって腹腔内に注入した。脳弓下器官の分散は、Jurzakらの方法（Brain Res 662, 198-208(1994)）に従って行った。分散単離した神経細胞は、脊髄後根神経節の神経細胞の場合と同様に、湿度１００％、温度３７℃、５％二酸化炭素の条件下で培養し、培養皿のガラスに接着させ、実験に用いた。野性型マウス由来のいくつかの脳弓下器官の神経細胞を、上記抗Ｎａv２抗体を用いて染色したところ、Ｎａv２陽性神経細胞は２０〜３０％であった。なお、野性型マウスから単離した神経細胞と遺伝子欠損マウスから単離した神経細胞とは、大きさや生存率においても違いはなかった。
【００６７】
上記野性型マウス及びＮａv２遺伝子欠損型マウスから調製した、脊髄後根神経節の神経細胞や脳弓下器官の神経細胞について、細胞内ナトリウムイオン及び細胞内カルシウムイオンの測定を実施した。細胞内ナトリウムイオンの測定には、ＳＢＦＩ／ＡＭ（sodium-binding benzofuran isophthalate acetoxymethyl ester）を用い、細胞内カルシウムイオンの測定には、Ｆｕｒａ−２／ＡＭを用いた。これらの指示薬をロードした培養細胞を付着させた培養皿を顕微鏡のステージに固定した。蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）は蛍光イメージングシステムによってモニターした。データ測定のため、脊髄後根神経節の神経細胞については１０秒毎に、また脳弓下器官の神経細胞については２０秒毎に、それぞれサンプリングした。測定する前に、神経細胞は生理的な等張液（１４５ｍＭの細胞外ナトリウム濃度）で３０〜６０分間インキュベートし、測定中、神経細胞は一定の環流液（５ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＯＨ、所定濃度のＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＨＣｌによる中和）に暴露し、環流液（細胞外液）は室温下一定流速（１ｍｌ／ｍｉｎ）で環流した。
【００６８】
脊髄後根神経節の神経細胞における蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の蛍光イメージング結果を図９（参考写真４参照）及び図１０に示す。図９からわかるように、細胞外ＮａＣｌ濃度を１４５〜１７０ｍＭに上昇させると、野性型マウス由来脊髄後根神経節の神経細胞の細胞内ナトリウムイオン濃度は急激に上昇し、そのまま定常状態に達したが、これに対し、遺伝子欠損マウス由来脊髄後根神経節の神経細胞では、野性型マウスにおけるような細胞内ナトリウムイオン濃度の上昇は全く観察されなかった（図９ａとｂ）。また、野性型マウス由来脊髄後根神経節の神経細胞内ナトリウムの上昇は、すべての大きさの神経細胞で観察された（図９ｃ）。これはＮａv２が全ての野性型マウスの脊髄後根神経節の神経細胞に発現することと一致する。
【００６９】
また図１０からわかるように、細胞内ナトリウムイオン濃度の上昇は、マンニトールを用いた浸透圧刺激や塩化コリンを用いた塩素イオン単独の刺激ではおこらず、メタンスルフォン酸ナトリウムを用いたナトリウムイオン単独の刺激によって引き起こされた（図１０ａ）。よってこの現象はナトリウムイオン濃度の上昇によってのみ引き起こされることがわかった。また、塩化ナトリウムを用いて、細胞外ナトリウム濃度を１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１６５、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭの１０段階に調整し、細胞内ナトリウムイオン濃度の変化を解析したところ１２０〜１５０ｍＭの間では全く反応が無く、１６０と１６５ｍＭの細胞外ナトリウムイオン濃度で上昇が観察され、１７０ｍＭ以上の細胞外ナトリウムイオン濃度では、非常に大きな上昇が観察された（図１０ｂ）。このとき、細胞外ナトリウムを元の１４５ｍＭに戻すと、徐々に細胞内ナトリウム濃度は元に戻っていく様子が観察された。細胞内のナトリウムストアは存在しないことから、この細胞内ナトリウム濃度の上昇は、Ｎａv２チャネルを介した細胞外からの流入であると結論した。また、そのチャネル開口の閾値は１６０〜１７０ｍＭの間にあると推察できる。
【００７０】
この細胞外ナトリウムイオン濃度の上昇に伴う細胞内へのナトリウムの流入にＮａv２チャネル以外の分子が関与している可能性を検討するために、各種ナトリウムイオンポンプ、ナトリウムイオントランスポーター、ナトリウムイオンチャンネルの各ブロッカーの効果を調べた。その結果、ＴＴＸ感受性の電位依存性ナトリウムチャネル（図１０ｃ）、アミロライド感受性ナトリウムチャネル（図１０ｃ）、ナトリウムグルコースコトランスポーター、ナトリウムカルシウムアンチポーター、ナトリウムカリウムクロライドトランスポーター、ナトリウムカリウムポンプの影響はないことがわかった。また、ＴＴＸ非感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルは、小型の脊髄後根神経節の神経細胞に特異的に発現しているため、全ての大きさの細胞種に反応が見られるこの現象には関与していないと結論した。ナトリウムカルシウムアンチポーターに関しては、カルシウムイメージングによっても関与が無いことを確かめた（図１０ｄ）。
【００７１】
脳弓下器官の神経細胞における蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の蛍光イメージング結果を図１１（参考写真５参照）に示す。図１１からわかるように、中枢神経系のナトリウムイオン濃度検出器官である脳弓下器官の神経細胞においても、脊髄後根神経節の神経細胞と基本的に同様の結果が得られた。ただし、脳弓下器官の神経細胞のうち約２０から３０％の細胞が、Ｎａv２免疫陽性細胞であり、これらＮａv２免疫陽性細胞は細胞内ナトリウムイオン濃度の上昇が観察されたが、Ｎａv２免疫陰性細胞では、Ｎａv２遺伝子欠損型マウスと同様に、細胞内ナトリウムイオン濃度の上昇は観察されなかった。これらのことから、脳弓下器官においてもＮａv２は、細胞外ナトリウムイオン濃度に依存して細胞内にナトリウムイオンを流入させるナトリウムチャンネルであることが証明できた。すなわち、Ｎａv２はナトリウム濃度依存性ナトリウムチャンネルという新規ナトリウムチャンネルであることがわかった。
【図１】
2010284169.tif 000002
【図２】
2010284169.tif 000003
【図３】
2010284169.tif 000004
【図４】
2010284169.tif 000005
【図５】
2010284169.tif 000006
【図６】
2010284169.tif 000007
【図７】
2010284169.tif 000008
【図８】
2010284169.tif 000009
【図９】
2010284169.tif 000010
【図１０】
2010284169.tif 000011
【図１１】
2010284169.tif 000012
【配列表】
2010284169000001.app