(57)【要約】【課題】  感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクター、遺伝子導入用組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法を提供する。【解決手段】  （ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項２】
（ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡの上流に（ｂ）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
さらに、（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項５】
（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡが、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡの下流に配置される（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡと（ａ）との間に配置されていることを特徴とする請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、ボルナ病ウイルスのＰ遺伝子及びボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を含むことを特徴とする遺伝子導入用組換えウイルス。
【請求項７】
ウイルスベクターが（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まないものであり、遺伝子導入用組換えウイルスが、さらにウイルスのＧ遺伝子を含むことを特徴とする請求項６に記載の遺伝子導入用組換えウイルス。
【請求項８】
請求項１〜３に記載のウイルスベクターと共に、ヘルパーププラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）並びにウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドを導入する工程、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程、及び該組換えウイルスを精製する工程を含むことを特徴とする遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法。
（１）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
【請求項９】
請求項４又は５に記載のウイルスベクターと共に、ヘルパーププラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）を細胞に導入する工程、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程、及び該組換えウイルスを精製する工程を含むことを特徴とする遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法。
（１）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
【請求項１０】
請求項６若しくは７に記載の遺伝子導入用組換えウイルス、又は請求項８若しくは９に記載の方法により作製された遺伝子導入用組換えウイルスを細胞に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来性遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクター、遺伝子導入用組換えウイルス及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外来性遺伝子を生体又は細胞に運搬する手段として、ウイルスベクターを利用する方法が知られている。これまでに、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスを利用するベクターが開発されている。
【０００３】
しかしながら、これらの既存のウイルスベクターでは、例えばＤＮＡウイルスの場合には宿主染色体にウイルス遺伝子が組み込まれることにより宿主（例えば、ヒト）への病原性が発現するという問題点があった。また、ウイルスによっては感染可能な宿主域が狭く、特定の生物にしか適用できないという問題点や、外来性遺伝子のウイルスゲノムへの組込み部位により遺伝子導入効率に差があり、遺伝子導入効率が悪いという問題点があった。また、生体内での免疫応答によりウイルスが排除されたり、ウイルス遺伝子の変異やプロモーター効率の変化が生じたりすることから、安定性及び持続性が悪いという問題点もあった。
【０００４】
さらに、遺伝子治療等においては、目的とする細胞のみに遺伝子を導入することができる遺伝子導入技術が期待されている。特に、神経系疾患の治療には遺伝子治療が有効であると考えられるため、神経細胞に選択的に遺伝子を導入でき、しかも安全性、安定性、持続性及び遺伝子導入効率が高いウイルスベクターの開発が望まれている。
【０００５】
ボルナ病ウイルス（Borna disease virus：以下、ＢＤＶともいう）は、非分節のマイナス鎖、１本鎖のＲＮＡをゲノムとして持つモノネガウイルス目に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。さらに、ＢＤＶは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴や、感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する（非特許文献１及び２等）。
【０００６】
ＢＤＶを利用する外来性遺伝子の細胞への導入技術として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現カセットをＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域に挿入し、この組換えウイルスを高活性のポリメラーゼと共にラットに感染させると、ラットの神経細胞においてＧＦＰ遺伝子が発現したことが報告されている（非特許文献３）。
【０００７】
ＢＤＶを利用する上記技術によれば、中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を挿入することができると考えられる。しかしながら、上記ＢＤＶを用いる技術においては、遺伝子の導入効率が十分高くないため、遺伝子の導入効率をより高くするための改良の余地があった。従って、感染可能な宿主域が広く、安全性及び外来性遺伝子の導入効率が高く、安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクターは、未だ開発されていなかった。
【非特許文献１】蛋白質  核酸  酵素、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．１０、ｐ．１１６８−１１７４（２００７）
【非特許文献２】朝長啓造、「ボルナ病ウイルス感染と中枢神経系疾患」、最新医学・第６０巻・第２号（2005年２月号別刷）、７９−８５頁
【非特許文献３】U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクター、遺伝子導入用組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明者らはＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）における外来性遺伝子の挿入部位について鋭意研究を行った。その結果、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡの種々の部位に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを作製し、これらを後述するヘルパープラスミド（ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド（群）、並びに必要に応じてこれらのプラスミド（群）と共に使用されるウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミド）と共に細胞に導入して組換えウイルスを産生させ、得られた組換えウイルスを細胞に感染させたところ、ウイルスベクターにおいてＧ遺伝子のＯＲＦ中に外来性遺伝子を挿入した場合に、細胞において外来性遺伝子が効率よく発現されること、すなわち細胞に外来性遺伝子を非常に効率よく導入することができることを見出した。
【００１０】
なお、ＢＤＶゲノムには、少なくとも６つの蛋白質、すなわち核蛋白質（Ｎ蛋白質）、Ｘ蛋白質、リン酸化蛋白質（Ｐ蛋白質）、マトリックス蛋白質（Ｍ蛋白質）、表面糖蛋白質（Ｇ蛋白質）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）がコードされている（図１）。図１において、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬは、それぞれの遺伝子のＯＲＦを模式的に示している。本明細書中、Ｇ蛋白質、Ｍ蛋白質、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質をコードするウイルスＲＮＡを、それぞれＧ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子という。また、例えば、「Ｇ遺伝子のｃＤＮＡ」とは、Ｇ遺伝子をコードするｃＤＮＡを意味する。
【００１１】
また、（１）上記ウイルスベクターをウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まないものとすると該ウイルスベクターが一過性感染型ベクターとなるため、該ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド（群）、並びにＢＤＶ又はＢＤＶ以外のウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入して組換えＢＤＶ（遺伝子導入用組換えウイルス）を産生させると、産生される組換えＢＤＶが一過性感染型のウイルスとなる、つまり該組換えＢＤＶを細胞に感染させた際にウイルスの感染を一過性とすることができる（細胞において一過的に外来性遺伝子が発現される）ことや、（２）ウイルスベクターにおいて、組換えウイルスのｃＤＮＡの下流にＢＤＶ又はＢＤＶ以外のウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを挿入すると自己複製型（持続感染型）ベクターとすることができるため、該ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド（群）を細胞に導入して組換えＢＤＶを産生させると、産生される組換えＢＤＶが自己複製型のウイルスとなり、該組換えＢＤＶを細胞に感染させると、感染が持続的なものとなる（細胞において外来性遺伝子が持続的に発現される）ことを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき更に研究を行い、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の項１〜項１０に関する。
項１．  （ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
項２．  （ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする項１に記載のウイルスベクター。
項３．  （ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡの上流に（ｂ）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする項１又は２に記載のウイルスベクター。
項４．  さらに、（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含むことを特徴とする項１〜３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項５．  （ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡが、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡの下流に配置される（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡと（ａ）との間に配置されていることを特徴とする項４に記載のウイルスベクター。
項６．  項１〜５のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、ボルナ病ウイルスのＰ遺伝子及びボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を含むことを特徴とする遺伝子導入用組換えウイルス。
項７．  ウイルスベクターが（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まないものであり、遺伝子導入用組換えウイルスが、さらにウイルスのＧ遺伝子を含むことを特徴とする項６に記載の遺伝子導入用組換えウイルス。
【００１３】
項８．  項１〜３に記載のウイルスベクターと共に、ヘルパーププラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）並びにウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドを導入する工程、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程、及び該組換えウイルスを精製する工程を含むことを特徴とする遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法。
（１）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
項９．  項４又は５に記載のウイルスベクターと共に、ヘルパーププラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）を細胞に導入する工程、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程、及び該組換えウイルスを精製する工程を含むことを特徴とする遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法。
（１）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにボルナ病ウイルスのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
【００１４】
項１０．  項６若しくは７に記載の遺伝子導入用組換えウイルス、又は項８若しくは９に記載の方法により作製された遺伝子導入用組換えウイルスを細胞に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため宿主細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクター及び遺伝子導入用組換えウイルスを作製することができる。また、本発明によれば、外来性遺伝子を中枢神経系の細胞に効率よく導入することができ、該細胞において外来性遺伝子を持続的又は一過的に発現させることができる。さらに、本発明のウイルスベクターから産生される遺伝子導入用組換えウイルスは、脳神経細胞の核内で持続感染を起こすため、宿主免疫の攻撃を受け難く、排除が起こりにくい。また、本発明の遺伝子導入用組換えウイルスが持つＰ蛋白質には、宿主免疫の応答経路を阻害するという働きがあり、ウイルス感染細胞では自然免疫の活性化も起こらない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明を説明する。
１．ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているものである。以下、「（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ」を、単に「（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ」という。
本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）以外の配列を含んでもよい。
【００１７】
（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ
本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）をコードするｃＤＮＡにおいて、ＢＤＶのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子が挿入されたものである。
【００１８】
本発明におけるＢＤＶゲノムは、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（ボルナウイルス科）に属するウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。ボルナウイルス科に属するウイルスとしては、例えば、Ｈｅ８０、Ｈ１７６６、Ｓｔｒａｉｎ  Ｖ、ｈｕＰ２ｂｒ等の菌株が挙げられる。変異株としては、例えば、Ｎｏ／９８、Ｂｏ／０４ｗ、ＨＯＴ６等が挙げられる。これらのゲノム配列は、例えば、以下から入手可能である。
Ｈｅ８０；GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
Ｈ１７６６；GenBank Accession# AJ311523, Pleschka,S., Staeheli,P., Kolodziejek,J., Richt,J.A., Nowotny,N. and Schwemmle,M. Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 82 (PT 11), 2681-2690 (2001).
Ｓｔｒａｉｎ  Ｖ；GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J.,
Park,Y.S., Kim,S., Ludwig,H. and Lipkin,W.I. Genomic organization of Borna disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (10), 4362-4366 (1994).
ｈｕＰ２ｂｒ；GenBank Accession# AB258389, Nakamura, Y., Takahashi, H., Shoya, Y., Nakaya, T., Watanabe, M., Tomonaga, K., Iwahashi, K., Ameno, K., Momiyama, N., Taniyama, H., Sata, T., Kurata, T., de la Torre, J. C., Ikuta, K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
Ｎｏ／９８；GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Ｂｏ／０４ｗ；GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.
【００１９】
また、ＢＤＶとしての機能が保持されている限り、これらのゲノム配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。
【００２０】
ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡゲノムから、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＲＮＡゲノムの配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【００２１】
（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、任意の外来性遺伝子がＢＤＶのＧ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）に挿入されている。これにより、本発明のウイルスベクターを細胞に導入又は該ウイルスベクターから産生される組換えＢＤＶを細胞に感染させた際に、任意の外来性遺伝子が効率よく細胞に導入される。すなわち、外来性遺伝子が細胞内において効率よく発現されることになる。Ｇ遺伝子のＯＲＦにおける外来性遺伝子の挿入部位としては、Ｇ遺伝子内のスプライスドナーとスプライスアクセプターの間（ＢＤＶゲノムの塩基の番号で２４１０から３７０３）が好ましく、Ｇ遺伝子のＯＲＦと置換するように任意の外来性遺伝子が挿入されていることがより好ましい。
【００２２】
（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、任意の外来遺伝子のｃＤＮＡの３’末端とＧ遺伝子のスプライスドナーサイトとの間に、さらにコンセンサス配列が配置されていることが好ましい。これにより、外来性遺伝子の発現効率がより高くなる。コンセンサス配列は、細胞や導入する外来性遺伝子に応じて適宜決定すればよい。
【００２３】
本発明における外来性遺伝子の種類や長さは特に限定されず、目的に応じて所望の遺伝子を用いることができる。例えば、蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、short hairpin RNA (shRNA)、microRNA (miRNA)をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーをコードするｃＤＮＡ等を用いることができる。
【００２４】
（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ
リボザイムとしては、（ａ）組換えウイルスのｃＤＮＡから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。（ｂ）としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードする配列が挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするｃＤＮＡも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、１〜数個（数個とは、例えば、１０個、好ましくは５個、より好ましくは３個、さらに好ましくは２個である）の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）が好ましい。また、（ａ）組換えＢＤＶのｃＤＮＡの上流、すなわち３’末端側に（ｂ）ＨａｍＲｚをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流、すなわち５’末端側に（ｂ）ＨＤＶＲｚをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることが特に好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。
【００２５】
ＨａｍＲｚの塩基配列は、Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529、Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027及びInoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236等に記載されている。
ＨＤＶＲｚの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A.   Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)
等に記載されている。本発明においては、これらの文献に記載されているＨａｍＲｚの塩基配列をコードするｃＤＮＡを用いることができる。本発明における特に好ましいＨａｍＲｚ及びＨＤＶＲｚの塩基配列を、以下に示す。
ＨａｍＲｚ：
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’（配列番号２）
ＨＤＶＲｚ：
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
（配列番号３）
【００２６】
（ｃ）プロモーター配列
本発明における（ｃ）プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼＩ系プロモーター配列、Ｔ７ポリメラーゼ系プロモーター配列が挙げられるが、中でもＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーターが挙げられる。中でも、ＣＡＧＧＳプロモーターが特に好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。
【００２７】
（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡ
本発明のウイルスベクターは、さらに、（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含むことができる。これにより、ウイルスベクターから産生される遺伝子導入用組換えウイルスを自己複製型（持続感染型）のウイルスとすることができる。自己複製型とは、ウイルスベクターのゲノム内に完全長のウイルスＧ遺伝子のｃＤＮＡを含むことにより、後述するヘルパープラスミドによるＧ遺伝子の導入がない場合においても、ウイルスベクターから産生された遺伝子導入用組換えウイルスが伝播能力を有する完全なウイルス粒子として発現され、自ら感染を広げることができるタイプとなることを言う。ウイルスベクターから産生される遺伝子導入用組換えウイルスを一過性感染型のウイルスとする場合には、ウイルスベクター中に（ｄ）を配置しないことが好ましい。本発明のウイルスベクターが（ｄ）を含む場合には、図３に示すように（ｄ）は、（ａ）の下流に配置される（ｂ）と（ａ）との間に配置されていることが好ましい。
【００２８】
本発明におけるウイルスのＧ遺伝子としては、エンベロープウイルスのＧ蛋白質として機能する蛋白質をコードする遺伝子であればよく、例えば、ＢＤＶのＧ遺伝子、ＢＤＶ以外のウイルスのＧ遺伝子が挙げられる。ＢＤＶ以外のウイルスのＧ遺伝子としては、ラブドウイルス科ヴェシキュロウイルス属（Vesicular Stomatitis Virus:ＶＳＶ）ウイルスのＧ遺伝子が好適である。
【００２９】
ＢＤＶのＧ遺伝子は、例えば、Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C.  Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている。このＢＤＶのＧ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号４に示す。ラブドウイルス科ヴェシキュロウイルス属（ＶＳＶ）ウイルスのＧ遺伝子は、例えば、Rose,J.K., Welch,W.J., Sefton,B.M., Esch,F.S. and Ling,N.C.  Vesicular stomatitis virus glycoprotein is anchored in the viral membrane by a hydrophobic domain near the COOH terminus., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77 (7), 3884-3888 (1980)に記載されている。このＶＳＶのＧ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号５に示す。本発明におけるＧ遺伝子のｃＤＮＡとしては、上記の配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。さらに、Ｇ遺伝子（ＲＮＡ）から、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することもできる。また、Ｇ遺伝子は、ウイルスのＧ蛋白質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＧ遺伝子の配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＲＴ−ＰＣＲによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。
【００３０】
また、ウイルスのＧ遺伝子は、該遺伝子にコードされる蛋白質がＧ蛋白質の機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。このようなＧ遺伝子として、例えば、ＢＤＶ又はＶＳＶのＧ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列相同性を有し、かつエンベロープウイルスのＧ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡが挙げられる。
【００３１】
本発明におけるウイルスベクターの構造の一例を、図２及び３に模式的に示す。図２のウイルスベクターは、（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まない一過性感染型ウイルスベクターである。図２においては、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの上流に（ｂ）ＨａｍＲｚをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの下流に（ｂ）ＨＤＶＲｚをコードするｃＤＮＡ配列が配置されている。また、（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターの下流に配置されている。
【００３２】
図３のウイルスベクターは、（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含む自己複製型ウイルスベクターである。図３のウイルスベクターにおいては、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの５’末端と（ｂ）ＨＤＶＲｚをコードするｃＤＮＡ配列との間に（ｄ）が配置されている。
【００３３】
（ｅ）その他の塩基配列
本発明のウイルスベクターは、ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列を含む場合には、該配列は（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）の下流に配置されていることが好ましい。ＳＶ４０ウイルスＤＮＡの複製開始点／プロモーター領域配列の一部としては、ＳＶ４０複製開始点／プロモーター領域内の５’側の１１３塩基からなる断片が好適である。
ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列（配列番号６）は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。
【００３４】
本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、さらに、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、本発明のウイルスベクターは、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。
【００３５】
本発明のウイルスベクターは、線状ＤＮＡであっても環状ＤＮＡであってもよいが、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。環状のウイルスベクターとしては、例えば、本発明のウイルスベクターの必須の配列である上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のｃＤＮＡ、並びに必要に応じて含まれる上記（ｄ）のｃＤＮＡ及び／又は（ｅ）のＤＮＡが、上述した所定の順番で、好ましくは図２又は３に示す形態で、市販のプラスミドベクター中に配置されているもの等が挙げられる。市販のプラスミドベクターとしては、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、例えば、pBluescript SKII(-)、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。
【００３６】
２．ウイルスベクターの作製方法
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、ＣＡＴ遺伝子をＢＤＶのゲノム配列に置き換え、さらにＧ遺伝子領域を目的とする外来性遺伝子に置き換えることによって、環状のウイルスベクター（一過性感染型）を作製することができる。また、この一過性感染型のウイルスベクターにおいて、Ｌ遺伝子をコードしている領域の下流にＢＤＶ又はＶＳＶのＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡを制限酵素を用いて挿入することにより、自己複製型（持続感染型）のウイルスベクターを作製することができる。
ウイルスベクターが線状の場合には、上記環状のウイルスベクターを、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ領域、（ｃ）プロモーター配列の領域、及びその他蛋白質発現に必要なシグナル配列領域以外の領域で１箇所切断する制限酵素を該ベクターの種類にあわせて適宜選択し、該制限酵素により環状のウイルスベクターを切断することにより線状のウイルスベクターを作製することができる。
【００３７】
本発明のウイルスベクターに含まれる外来性遺伝子を目的細胞に導入する方法としては、該ウイルスベクターを後述するヘルパープラスミドと共に目的細胞に導入する方法、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを目的細胞に感染させる方法があるが、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを用いる方法が好ましい。本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、野生型ＢＤＶゲノムの代わりに上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを有する組換え型ＢＤＶである。
【００３８】
３．遺伝子導入用組換えウイルス
上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ遺伝子、ＢＤＶのＰ遺伝子及びＢＤＶのＬ遺伝子を含む遺伝子導入用組換えウイルスも、本発明の１つである。本発明の遺伝子導入用組換えウイルスは、ウイルスベクターが（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まないものである場合には、さらにウイルスのＧ遺伝子を含むことが好ましい。
【００３９】
上記（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含むウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を含む遺伝子導入用組換えウイルスは、自己複製型（持続感染型）の遺伝子導入用組換えウイルスである。
（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まないウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、ウイルスのＧ遺伝子、並びにＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を含む遺伝子導入用組換えウイルスは、一過性感染型の遺伝子導入用組換えウイルスである。
【００４０】
本発明の遺伝子導入用組換えウイルスは、例えば、上記ウイルスベクターと共に、ヘルパーププラスミドとしてＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）並びにウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドを導入する工程、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程、及び該組換えウイルスを精製する工程を含む方法により作製することができる。
（１）ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
【００４１】
このような遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法も、本発明の１つである。上記方法において、ウイルスベクターとして（ｄ）ウイルスのＧ遺伝子のｃＤＮＡを含まないものを用いると、得られる遺伝子導入用組換えウイルスを一過性感染型のものとすることができる。
【００４２】
持続感染型の遺伝子導入用組換えウイルスは、例えば、上記のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する上記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）を細胞に導入する工程、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程、及び該組換えウイルスを精製する工程を含む方法により作製することができる。このような遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法も、本発明の１つである。
【００４３】
ヘルパープラスミドは、ＢＤＶゲノム複製に必要なウイルス蛋白質を提供するものであり、ウイルスベクターと共にヘルパープラスミドを細胞に導入することにより、感染性のある遺伝子導入用組換えウイルスを産生することができる。ヘルパープラスミドにおけるＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する上記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）としては、（１）〜（３）のいずれかのプラスミド群が好ましい。また、本発明の遺伝子導入用組換えウイルスの作製方法に用いられるウイルスベクター及びウイルスのＧ遺伝子、並びにこれらの好ましい態様としては、上述したのと同様である。
【００４４】
本発明におけるヘルパープラスミドは、上記ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子（並びにウイルスのＧ遺伝子）を発現することができるものであればよい。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＰ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＬ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。
【００４５】
ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｌ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。
ウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にウイルスのＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡが配置されているプラスミドが好ましい。
【００４６】
ＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｐ遺伝子のｃＤＮＡ及びＬ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子の配列報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡから、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＲＮＡの配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【００４７】
ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子としては、例えば、上述したCubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C.  Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている配列の遺伝子を用いることができる。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、ＢＤＶのＮ、Ｐ又はＬ蛋白質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子の配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＲＴ−ＰＣＲによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。さらに、本発明におけるＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子は、該遺伝子にコードされる蛋白質がそれぞれＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質の機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。
【００４８】
このようなＮ遺伝子として、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列相同性を有し、かつＮ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＮ遺伝子として使用できる。また、ＢＤＶのＰ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列相同性を有し、かつＰ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＰ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＬ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列相同性を有し、かつＬ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＬ遺伝子として使用できる。
【００４９】
ヘルパープラスミドは、細胞に導入する際には線状であっても問題はないが、環状であることが好ましい。環状のヘルパープラスミドは、例えば、本発明におけるヘルパープラスミドの必須の配列であるプロモーター配列及び蛋白質のｃＤＮＡが配置された形態で、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。ヘルパープラスミドは、該ヘルパープラスミドを導入する細胞内で自己複製可能な市販のプラスミドベクターを使用して構築するのが好ましく、市販のプラスミドベクターとしては、例えば、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。ヘルパープラスミドにおけるプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターが好ましい。
【００５０】
これらのヘルパープラスミドは、自体公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミドは、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法により作製することができる。ウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、Gonzalez-Dunia et al., Journal of Virology 71 (1997), 3208-3218の“Materials and methods”のConstruction of expression vectors and recombinant vaccinia viruses.に記載されている方法により作製することができる。ただし作製したＧ遺伝子を発現するプラスミドに挿入されているＧ遺伝子のｃＤＮＡ配列には、Ｇ遺伝子の発現効率を上昇させるために、Ｇ遺伝子内のスプライシングサイト（塩基番号２４１０と３７０３）に任意の点変異を導入することが可能である。
【００５１】
ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶのＰ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶのＬ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ただし、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡ領域とＬ遺伝子又はＰ遺伝子のｃＤＮＡが挿入された領域との間の領域にＬ遺伝子又はＰ遺伝子の発現を促進するようなプロモーター配列や配列内部リボソーム進入部位などの配列を挿入することも可能である。
【００５２】
上記のウイルスベクターを細胞に導入する際は、例えば、該ウイルスベクターを含むベクター組成物を用いることができる。ベクター組成物は、ウイルスベクター以外にヘルパープラスミドを含んでいてもよい。ベクター組成物は、ウイルスベクター及びヘルパープラスミド以外にも、導入方法及び導入対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養標準液等を含んでいてもよい。
【００５３】
ベクター組成物中の上記ウイルスベクターの含有量としては、感染方法及び感染対象等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ＤＮＡ濃度として約０．２５〜２．０μｇ／μＬのウイルスベクターを含むことが好ましい。
【００５４】
ベクター組成物中の上記（１）〜（４）のいずれかに含まれる各ヘルパープラスミドの含有量としては、上記ウイルスベクター１μｇに対して約０．０１２５〜０．１２５μｇとすることが好ましい。
【００５５】
一過性感染型の組換えウイルスを作製する際には、ベクター組成物中のウイルスのＧ遺伝子を発現するプラスミドの含有量を、上記ウイルスベクター１μｇに対して約０．０１〜０．５μｇとすることが好ましく、約０．０２５〜０．５μｇとすることが最も好ましい。
【００５６】
上記ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを細胞に導入する方法としては特に限定されず、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いる自体公知の方法を採用することができる。市販のトランスフェクション試薬としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)等が挙げられるが特に限定されない。具体的には、例えば、上記量のウイルスベクター及びヘルパープラスミド、並びに緩衝液等を含むベクター組成物に、市販のトランスフェクション試薬を適量加え、これをウイルスベクター１μｇに対して通常約１０３〜１０７個、好ましくは約１０４〜１０７個の細胞に加えることによりウイルスベクター及びヘルパープラスミドを該細胞に導入することができる。なお、ウイルスベクター及びヘルパープラスミドは、同時に細胞に導入してもよく、別々に導入してもよい。別々に導入する際の導入順序は、特に限定されない。
【００５７】
ウイルスベクターを導入する細胞としては、ウイルスベクターの導入により本発明における遺伝子導入用組換えウイルスを産生することができる哺乳類の細胞であればよいが、例えば、ヒト腎臓由来の２９３細胞、ＢＨＫ細胞が挙げられる。
【００５８】
次いで、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して遺伝子導入用組換えウイルスを産生させる。遺伝子導入用組換えウイルスを産生させるための培地、培養温度及び培養時間等の培養条件は、細胞の種類により適宜設定すればよい。培養温度は、２９３細胞又はＢＨＫ細胞を用いる場合は、通常約３６〜３７℃とする。培地は、ダルベッコ変法イーグル培地を用いることが好ましい。培養時間は、通常約２４〜９６時間、好ましくは約３６〜４８時間とする。
【００５９】
上記培養により、ウイルスベクターを導入した細胞においてウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を含む、又は、これらと共にウイルスのＧ遺伝子を含む遺伝子導入用組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターを導入した細胞において遺伝子導入用組換えウイルスが産生されたことは、例えば、細胞を培養した培地の上澄みを遠心分離などにより回収し、該上澄みを用いてＢＤＶが感染性を有する細胞、例えば、サル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ラットグリア由来Ｃ６細胞、ヒトグリア由来ＯＬ細胞などに感染をさせることで確認される。遺伝子導入用組換えウイルスが産生されたことの確認は、後述する遺伝子導入用組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なった後行ってもよい。
例えば、一過性感染型の組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。
【００６０】
本発明の作製方法においては、上記のように細胞にウイルスベクター等を導入して遺伝子導入用組換えウイルスを産生させた後、効率よく遺伝子導入用組換えウイルスを増殖させるために、該遺伝子導入用組換えウイルスを産生した細胞（例えば、２９３細胞、ＢＨＫ細胞）を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なうことが好ましい。遺伝子導入用組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養することにより、感染性を持つ遺伝子導入用組換えウイルスは増殖速度が速い細胞に感染する。該増殖速度が速い細胞を培養すると、細胞の増殖と共に感染したウイルスも増殖するため、遺伝子導入用組換えウイルスを効率よく増殖させることができる。増殖速度が速い細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等が好適である。遺伝子導入用組換えウイルスを産生した細胞と、増殖速度の速い細胞との混合比率としては、例えば、遺伝子導入用組換えウイルスを産生した細胞１個に対して増殖速度の速い細胞を０．５〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度とする。混合培養後、増殖速度が速い細胞を培養させる条件としては特に限定されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞を用いる場合には、培養温度を約３６〜３７℃とし、ダルベッコ変法イーグル培地で３日〜５週間程度、好ましくは３日〜３週間程度培養を行なう。
【００６１】
本発明の作製方法においては、細胞に遺伝子導入用組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該遺伝子導入用組換えウイルスを精製する工程を行う。精製方法としては特に限定されず、自体公知の方法によって行うことができ、遺伝子導入用組換えウイルスの感染対象に応じて精製方法を適宜選択すればよい。
【００６２】
例えば、遺伝子導入用組換えウイルスを培養細胞に感染させる場合には、上記のように遺伝子導入用組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該遺伝子導入用組換えウイルスを産生させた培養細胞上清を回収し、細胞を破砕する。細胞の破砕は、例えば、凍結及び融解、又は超音波破砕機を用いて行うことができる。次いで、細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く。細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く方法としては、遠心分離（例えば、４℃、８００ｇで１０分間程度）等が挙げられる。細胞の破砕成分を取り除いた後に、０．２２又は０．４５μｍのポアサイズを有する濾過膜を通すことにより遺伝子導入用組換えウイルスを含む上澄みを得ることができる。培養細胞に遺伝子導入用組換えウイルスを感染させる際は、この上澄みを用いることができる。
生体細胞に遺伝子導入用組換えウイルスを感染させる場合には、この遺伝子導入用組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。
【００６３】
４．外来性遺伝子の導入方法
上記遺伝子導入用組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、遺伝子導入用組換えウイルスを細胞に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の１つである。
【００６４】
ウイルスベクターを感染させる細胞としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等の細胞が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ等の哺乳類の細胞が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、マウス又はヒトがさらに好ましい。また、ＢＤＶは神経細胞に感染指向性があることから、哺乳類の神経細胞が特に好ましい。中でも、ラット、マウス又はヒトの神経細胞が好ましい。細胞は、培養細胞であってもよく、生体細胞であってもよい。
【００６５】
遺伝子導入用組換えウイルスを細胞に感染させる方法としては、例えば、培養細胞に感染させる場合には、上記精製方法により得られた遺伝子導入用組換えウイルスを含む上清をダルベッコ変法イーグル等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製する。希釈液中の遺伝子導入用組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよいが、例えば、哺乳類の神経細胞であればＭＯＩ(multiplicity of infection、感染価)約０．０１〜１０(細胞１個に対してウイルス粒子０．０１から１０個が感染する量)、好ましくはＭＯＩ約１〜１０となるようにする。この希釈液を用いて、遺伝子導入用組換えウイルスを細胞に感染させる。
【００６６】
遺伝子導入用組換えウイルスを生体細胞に感染させる際には、上記のように高度に精製されたウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、該リン酸緩衝生理食塩水により希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。希釈液中の遺伝子導入用組換えウイルスの濃度は、感染対象により適宜選択すればよい。例えば、感染対象が哺乳類の神経細胞であれば、遺伝子導入用組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価（focus-forming unit (FFU)）を約１０-１〜１０９ＦＦＵとして個体に接種することが好ましい。また、遺伝子導入用組換えウイルスを含む希釈液は、マウス又はラットに摂取する際には、ウイルス力価通を常約１０-１〜１０７ＦＦＵとすることが好ましく、ヒトに摂取する際には、ウイルス力価を通常約１０５〜１０９ＦＦＵとすることが好ましい。
【００６７】
遺伝子導入用組換えウイルスを感染させる方法としては、例えば、哺乳類の神経細胞に感染させる場合には、上記遺伝子導入用組換えウイルスを含む希釈液を哺乳類の鼻腔に接種する方法が好適である。また、マウスやラット等の動物実験の神経細胞に感染させる場合には、動物の脳内に遺伝子導入用組換えウイルスを含む希釈液を直接接種することもできる。
遺伝子導入用組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の遺伝子導入用組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では１回につき約１０〜１００μＬ、脳内接種では１回につき約５〜５０μＬ接種する。
【００６８】
５．ウイルスベクターの利用
本発明のウイルスベクター、遺伝子導入用組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明の遺伝子導入用組換えウイルスは、中枢神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。中枢神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。また、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術に使用することができる。さらに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアダプマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７０】
実施例１
１．プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドｐＣＡＧ−ＨＲ−ＳＶ３を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのＨｅ／８０株のゲノムの配列（配列番号１）に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
【００７１】
サイトメガウイルス（ＣＭＶ）由来のＢＤＶミニゲノムベクター（ｐＣＭＶ−ＨＲ）を得るために、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 11486-11489、及びLe Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027）及びＢＤＶの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C., Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)）をアニールし、ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社、San Diego， CA）のKpnI及びXhoIサイトに連結した。得られたプラスミドをEco47III及びXbaIサイトで切断した。このプラスミドに、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨｄＲｚ）と融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲと、ＢＤＶ  Ｈｅ／８０株のゲノムをコードするｃＤＮＡクローンを挿入してプラスミドｐｃ−ＨＲを得た。なお、ＨｄＲｚと融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲは、プラスミドｐｈｕＰｏｌ  Ｉ−ＭＧ（Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104）から増幅した。最後に、ｐｃ−ＨＲのBglII及びXbaI断片をpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）のBamHI及びXbaIサイトに挿入することによって、ｐＣＭＶ−ＨＲを作製した。
【００７２】
ＣＡＧ（Chicken β-actin promoterとCMV enhancerとの複合体）由来のＢＤＶミニゲノムベクターｐＣＡＧ−ＨＲは、ＣＡＧプロモーターをpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクローニングすることによって得た（ｐＢＳ−ＣＡＧ）。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルスＩＥエンハンサーにニワトリβ−アクチンプロモーターが融合してなるハイブリッドプロモーターであり、Sawichi et al., Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。ｐＣＭＶ−ＨＲのＨａｍＲｚとＨｄＲｚの配列にまたがる領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＢＳ−ＣＡＧのSalI及びEcoRIサイトの平滑末端に挿入した。
【００７３】
次に、ＳＶ４０開始点／プロモーター内の５’側の１１３塩基からなる断片（ＳＶ３領域）を、ＰＣＲ（Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA）によってｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech社製）から増幅し、ｐＣＡＧ−ＨＲのＮｏｔＩサイトに挿入した。これにより、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔを得た。
【００７４】
２．Ｇ遺伝子欠損−ＧＦＰ挿入ＢＤＶゲノムプラスミド（ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰ）の作製
ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰの作製手順を、図４に模式的に示した。
Ａ）ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ（ボルナウイルスのＨｅ８０株（配列番号１）がクローニングされているプラスミド）を鋳型に、Bst1107IからBsiW Iサイトまでの領域をＰＣＲで増幅した（図４の（１））。その際にＧ遺伝子内のメチオニンをコードする塩基に変異を導入（２２３７番目及び２２４９番目の塩基において、ＡＴＧ→ＡＣＧ）することにより、２つのメチオニンに変異を挿入（図４、黒星印）してトレオニンに変換した。
Ｂ）Ａ）の（１）をpT7Blue T（Novagen社製）にクローニングした（図４（２））
Ｃ）peGFP N1（Clontech社製、図４の（３））を鋳型にＧＦＰコード領域を増幅した。その際にＧＦＰ配列の５末端側にBgl II制限酵素配列＋tcacc配列を、3末端側にAfl II制限酵素配列を付加した（図４の（４））。
Ｄ）Ｂ）の（２）にBgl IIとAfl IIとを用いてＧＦＰを挿入した（図４の（５））。
Ｅ）Bst1107IとBsiW Iとを用いて、Ｄ）の（５）をpF7853（Ｈｅ８０のフラグメントがサブクローニングされたプラスミド；図４の（６））に挿入した（図４、p7853-GFP（７）が完成）。
Ｆ）Bst1107IとNhe Iとを用いて上記（７）をｐＣＡＧ−Ｆｃｔへと組込みｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰを完成させた。
なお、ＧＦＰを他の遺伝子に代えることにより、ＧＦＰ以外の発現ベクターの作製も可能である。
【００７５】
３．ヘルパープラスミドの作製
ヘルパープラスミド、すなわちＢＤＶのＮ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＮ）、ＢＤＶのＰ遺伝子発現プラスミド（ｐＣＸＮ２−Ｐ）及びＢＤＶのＬ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＬ）を以下の手順で作製した。
ｐｃＮは、ｐＨＡ−ｐ４０Ｎプラスミド（Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001)からＮ遺伝子領域をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＡＧ（上述）へと挿入することで作製した。
プラスミドｐＣＸＮ２−Ｐは、ｐｃＤ−Ｐ（Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003)）からゲル抽出した断片をｐＣＸＮ２（Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199）のEcoRI及びXhoIサイトに挿入することによって作製した。
ｐｃＬについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認した。
【００７６】
４．Ｇ遺伝子欠損プラスミドを用いたシュードタイプウイルスの作製
ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰ及びヘルパープラスミド（Ｎ遺伝子発現プラスミド、Ｐ遺伝子発現プラスミド及びＬ遺伝子発現プラスミド；それぞれｐｃＮ、ｐＣＸＮ２−Ｐ及びｐｃＬ）に加えて、Vesicular Stomatitis Virus（ＶＳＶ）又はボルナウイルスのＧ蛋白質を発現するプラスミドを、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)又Lipofectamine（登録商標）2000、Invitrogen）を用いて２９３Ｔ細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、１０４〜１０６の細胞（２９３Ｔ細胞）に対して、ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰを１〜４μｇ使用し、ｐｃＮ（０．１２５〜０．５μｇ）、ｐＣＸＮ２−Ｐ（０．０１２５〜０．０５μｇ）、ｐｃＬ（０．１２５〜０．５μｇ）及びＧ遺伝子発現プラスミド（０．０２５〜０．１μｇ）の割合でヘルパープラスミドを加えた。
【００７７】
なお、ＶＳＶのＧ蛋白質を発現するプラスミドとして、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株のＧ蛋白質を発現するプラスミドを、ＢＤＶのＧ蛋白質を発現するプラスミドとして、ＢＤＶのＨｅ８０のＧ蛋白質を発現するプラスミドをそれぞれ用いた。
ＶＳＶのIndiana株のＧ蛋白質を発現するプラスミドの作製方法は、Perez et al., Journal of Virology 75 (2001), 7078-7085.に記載されている。ＢＤＶのＧ蛋白質を発現するプラスミドの作製方法は、Gonzalez-Dunia et al., Journal of Virology 71 (1997), 3208-3218に記載されている。
【００７８】
ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入後、２９３Ｔ細胞を３７℃で４８時間ダルベッコ変法イーグル培地で培養後に上清を回収して、８００ｇで１０分遠心後、０．２２から０．４５μｍのフィルタで濾過してＧＦＰを発現する組換えウイルスを精製した。
【００７９】
培養細胞への感染後、４８時間以降における細胞間での感染の広がり、並びに感染細胞上清中へのウイルスベクターの放出を、間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法により調べたところ、感染後２４時間後には、感染細胞において組換えウイルスの産生が確認されたが、感染後１週間後には組換えウイルスの産生が確認されなくなった。この結果、作製した組換えウイルスは、一過性感染型のウイルスであることが確認された。
【００８０】
実施例２
１．自己複製型組換えＢＤＶの作製
ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰのＬ遺伝子をコードしている領域の下流にＢＤＶあるいはＶＳＶのＧ遺伝子をコードしている配列をBstNI及びPacIを用いて挿入したプラスミド（自己複製型ウイルスベクター）並びにヘルパープラスミド（ＢＤＶのＮ遺伝子発現プラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子発現プラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子発現プラスミド；それぞれｐｃＮ、ｐＣＸＮ２−Ｐ及びｐｃＬ）に加えて、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)又Lipofectamine（登録商標）2000、Invitrogen）を用いて、これらのプラスミドを２９３Ｔ細胞に導入した。なお、１０４〜１０６の細胞（２９３Ｔ細胞）に対して、自己複製型ウイルスベクターを１〜４μｇ、ｐｃＮを０．１２５〜０．５μｇ、ｐＣＸＮ２−Ｐを０．０１２５〜０．０５μｇ、及びｐｃＬを０．１２５〜０．５μｇそれぞれ用いた。
【００８１】
ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入後、ダルベッコ変法イーグル培地で３７℃で４８時間２９３Ｔ細胞を培養後に、導入２９３Ｔ細胞をＶｅｒｏ細胞（２９３Ｔ細胞１個に対して約１個）とダルベッコ変法イーグル培地中で３７℃で混合培養することで、感染性を持つ自己複製型ウイルスベクターから産生された組換えウイルスをＶｅｒｏ細胞へと感染させ、ウイルスベクター粒子を増殖させた。混合培養後、適当な期間（３日から３週間）の後に細胞の回収を行い、細胞を凍結・融解又は超音波破砕機を用いて破砕を行った後に、８００ｇで１０分遠心後、０．２２〜０．４５μｍのフィルタで濾過してＧＦＰを発現する自己複製型組換えウイルスを精製した。もしくは、破砕液中に含まれているベクター粒子を超遠心により精製を行い自己複製型組換えウイルスを精製した。
【００８２】
自己複製型ウイルスベクターの確認には、培養Ｖｅｒｏ細胞への感染後、ＧＦＰの蛍光を発する細胞数の増加と、細胞中又は培養細胞上清中へのＧ蛋白質を持ったウイルス粒子の産生とを間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法により確認を行った。その結果、培養Ｖｅｒｏにおいて、感染後１週間後においても持続的にウイルス粒子が産生されていることが確認された。
【００８３】
実施例３
実施例１で作製した組換えウイルスをラットの脳へ感染させた。
精製された組換えウイルスを、ＰＢＳ又は培養メディウムで１．０ＦＦＵに希釈後、生後２４時間以内の新生仔ラットの頭蓋内に、左側頭部より４〜１０μＬ接種した（図５）。接種後、３、６及び１０日後に採材を行って、図６（ａ）に示すように脳を各領域に分割し、個別に組換えウイルスの感染をＰＣＲにてチェックした。ＰＣＲは、挿入した遺伝子（ＧＦＰ）に特異的なプライマーとＢＤＶのＭ遺伝子に特異的なプライマーとを用いた（図６（ｂ））。これらのプライマーの配列を以下に示す。
ＢＤＶのＭ遺伝子に特異的なＦｏｗａｒｄプライマーの配列；
5-CGCAATTAAcGCAGCTTTCAAcGTCTTCTCTT-3    （配列番号７）
ＧＦＰに特異的なＲｅｖｅｒｓｅプライマー配列；
5-ggggcttaagTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3    （配列番号８）
【００８４】
ＰＣＲ産物を１％のアガロース電気泳動法で確認した。この結果、左脳中部にウイルスを接種後１０日後のラットにおいて、接種部位に加えて、右側小脳部位でも組換えウイルスが検出された（図７の右脳３のレーン）。図７において「Specific band」で示すバンドが、導入したＧＦＰの発現を示すバンドである。なお、図７中のＭｒとは、マーカーであり、ＰＣは、陽性コントロールであり、ＮＣは、ＢＤＶのｃＤＮＡである。ＤＷは、蒸留水である。この結果より、摂取した組換えウイルスが脳の他の箇所に感染伝播したと考えた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のウイルスベクター及び遺伝子導入用組換えウイルスは、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現できるものであり、また、ウイルスゲノムがＲＮＡであることから宿主染色体に挿入されることがなく安全なベクターである。さらに、ボルナ病ウイルスは神経細胞に感染指向性があることから外来性遺伝子を中枢神経系に選択的に導入することができる特異性に優れたベクターである。このため、本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、中枢神経系疾患治療、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に使用することができる。さらに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアダプマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ボルナ病ウイルスのゲノムの構造を示す図である。
【図２】一過性感染型ウイルスベクターの構造の一例を示す図である。
【図３】自己複製型ウイルスベクターの構造の一例を示す図である。
【図４】プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−ΔＧ−ＧＦＰの作製手順を示す図である。
【図５】ラット脳へのウイルスの感染を調べる実験方法を説明するための図である。
【図６】（ａ）は、ラット脳へのウイルスの接種部位を示す図である。（ｂ）は、ＰＣＲにより増幅させた箇所を説明するための図である。
【図７】組換えウイルスを接種したラット脳における組換えウイルスの伝播と外来性遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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