(57)【要約】      （修正有）【課題】膜結合性のプレニルトランスフェラーゼのＤＮＡを単離する方法、その単離方法によって得られるＤＮＡ、および膜結合性のプレニルトランスフェラーゼの提供。【解決手段】膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける、NDxxDxxxD、NQxxDxxxD、NQxxExxxD、DDxxDxxxD、DQxxDxxxD、DQxxExxxD、NExxDxxxD、NExxExxxD及びDExxExxxDからなる群より選択される少なくとも１つの保存モチーフを有し、かつ、ナリンゲニン等のフラボノイド、ゲニステイン等のイソフラボノイドあるいはイソリキリチゲニン等のカルコンを基質としてにプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合性プレニルトランスフェラーゼであって、
NDxxDxxxD、NQxxDxxxD、NQxxExxxD、DDxxDxxxD、DQxxDxxxD、DQxxExxxD、NExxDxxxD、NExxExxxD及びDExxExxxDからなる群より選択される少なくとも１つの保存モチーフを有し、かつ
化学式（Ｉ）：
【化１】
2010022323.tif 000016
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
【化２】
2010022323.tif 000017
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
【化３】
2010022323.tif 000018
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
【化４】
2010022323.tif 000019
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
プレニルドナーとしてジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、フィチル二リン酸（ＰＤＰ）からなる群より選択される少なくとも１種を基質とする、請求項１に記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチド：
（ｉ）    配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）  （ｉ）のポリペプチドにおいて、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
植物由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
植物が、マメ科、クワ科、オトギリソウ科、ミカン科、セリ科、キク科またはアサ科あるいはホップから選択される、請求項４に記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
以下の（ｉｉｉ）〜（ｖ）のいずれかに示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｉｉｉ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｖ）    （ｉｉｉ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｖ）      （ｉｉｉ）の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを導入した形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体および／またはその培養物から膜結合性プレニルトランスフェラーゼを採取する工程を含んでなる膜結合性プレニルトランスフェラーゼの調製方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の遺伝子によってコードされる膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
請求項８に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体および／またはその培養物から芳香族プレニル化化合物を採取する工程を含んでなる芳香族プレニル化化合物の製造方法。
【請求項１２】
形質転換体が酵母、植物又は植物細胞である、請求項９又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ、その製造方法、当該トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、および当該ＤＮＡの単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の生産する二次代謝産物の数は五万種を超えるとされ、天然有機化合物の大きなリソースとなっている。構造上の特徴から便宜上いくつかのグループに分類されるが、実際には異なったグループ間の特徴を併せ持つ化合物も非常に多い。プレニル化された芳香族化合物はその好例で、プレニル基は植物二次代謝産物の構造や生理活性の多様性に大きく貢献している。生合成的には複合経路と呼ばれる経路で生合成されるこれらの化合物は、耐虫性や耐病性などを担うことで植物の生命維持に必要な役割を担う一方で、薬用植物において生理活性本体としてその薬理作用に寄与しているものもある（非特許文献１）。例えば、プレニルフラボノイドには、抗腫瘍活性や抗菌作用といった様々な生理活性をもつものが多数報告されており（非特許文献２）、医薬及び食品産業でも非常に重要な化合物群となっている。これらはまた植物にとっては食害、感染防御において重要な役割を果たしている。
【０００３】
とりわけ、プレニルフラボノイドなどプレニル芳香族化合物の生理活性に対するプレニル基の重要性は多くの研究者により指摘されており、実際プレニル基を持たない母核化合物には生理活性が見られないことも少なくない。従って、これら芳香族化合物のプレニル化を触媒する酵素は、産業的にも非常に重要と認識されている。しかし、芳香族を基質とするプレニルトランスフェラーゼは膜結合性のものが多く、生化学的研究の困難さから、これまで分子生物学的な解析が遅れており、フラボノイドを基質とする植物プレニルトランスフェラーゼに至っては、その遺伝子のクローニングは未だ一例も報告されていなかった。
【非特許文献１】S. Mesia-Vela et al., Phytomedicine, 8 (2001), p.481-488
【非特許文献２】H.Y. Sohn et al., Phytomedicine, 11 (2004), p.666-672
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって本発明は、芳香族を基質とする、膜結合性のプレニルトランスフェラーゼのＤＮＡを単離する方法、その単離方法によって得られるＤＮＡ、および膜結合性のプレニルトランスフェラーゼの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、従来、大腸菌を用いた発現系では膜蛋白質を発現させるのは困難であったところ、酵母でライブラリーを作成し、複数のスクリーニング方法を組み合わせることにより植物由来の膜結合性プレニルトランスフェラーゼのｃＤＮＡの単離に成功し、さらに改良を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下のものを提供する。
項１．
膜結合性プレニルトランスフェラーゼであって、
NDxxDxxxD、NQxxDxxxD、NQxxExxxD、DDxxDxxxD、DQxxDxxxD、DQxxExxxD、NExxDxxxD、NExxExxxD及びDExxExxxDからなる群より選択される少なくとも１つの保存モチーフを有し、かつ
化学式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2010022323.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
【０００９】
【化２】
2010022323.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
【００１１】
【化３】
2010022323.tif 000004
【００１２】
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
【００１３】
【化４】
2010022323.tif 000005
【００１４】
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項２．
プレニルドナーとしてジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、フィチル二リン酸（ＰＤＰ）からなる群より選択される少なくとも１種を基質とする、項１に記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項３．
以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチド：
（ｉ）    配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）  （ｉ）のポリペプチドにおいて、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
項４．
植物由来である、項１〜３のいずれかに記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項５．
植物が、マメ科、クワ科、オトギリソウ科、ミカン科、セリ科、キク科またはアサ科あるいはホップから選択される、項４に記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項６．
以下の（ｉｉｉ）〜（ｖ）のいずれかに示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｉｉｉ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｖ）    （ｉｉｉ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｖ）      （ｉｉｉ）の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
項７．
項６に記載の遺伝子を含むベクター。
項８．
項７に記載のベクターを導入した形質転換体。
項９．
項８に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体および／またはその培養物から膜結合性プレニルトランスフェラーゼを採取する工程を含んでなる膜結合性プレニルトランスフェラーゼの調製方法。
項１０．
項６に記載の遺伝子によってコードされる膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項１１．
項８に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体および／またはその培養物から芳香族プレニル化化合物を採取する工程を含んでなる芳香族プレニル化化合物の製造方法。
項１２．
形質転換体が酵母、植物又は植物細胞である、項９又は１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、
以下の化学式（Ｉ）：
【００１６】
【化５】
2010022323.tif 000006
【００１７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
【００１８】
【化６】
2010022323.tif 000007
【００１９】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
【００２０】
【化７】
2010022323.tif 000008
【００２１】
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
【００２２】
【化８】
2010022323.tif 000009
【００２３】
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す、プレニルトランスフェラーゼおよび当該酵素をコードする遺伝子が提供される。
【００２４】
また、本発明の酵素により、様々な有用な生理活性を示すプレニル芳香族化合物を大量かつ安価に生産できる。さらに、本発明の遺伝子の配列を用いて、プレニル化二次代謝物を多く含有する植物などから、芳香族化合物をプレニル化する酵素の遺伝子を単離することが可能となる。
【００２５】
また、農業分野における分子育種のツールとしても、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼ遺伝子を利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（膜結合性プレニルトランスフェラーゼ）
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける保存モチーフを少なくとも１つ有し、かつ
以下の化学式（Ｉ）：
【００２７】
【化９】
2010022323.tif 000010
【００２８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
【００２９】
【化１０】
2010022323.tif 000011
【００３０】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
【００３１】
【化１１】
2010022323.tif 000012
【００３２】
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
【００３３】
【化１２】
2010022323.tif 000013
【００３４】
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼである。
【００３５】
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼが有する保存モチーフとしては、例えば、NDxxDxxxD、NQxxDxxxD、NQxxExxxD、DDxxDxxxD、DQxxDxxxD、DQxxExxxD、NExxDxxxD、NExxExxxD及びDExxExxxDからなる群より選択される少なくとも１つの保存モチーフが挙げられる。これらの保存モチーフにおいて、ｘで表された箇所はいかなるアミノ酸であってもよい。以下も同様である。  
【００３６】
なかでも、N(Q/E)LxDx(D/E)xDの保存モチーフを有するものが好ましい。これらの保存モチーフにおいて、(Ａ/Ｂ)と表された箇所は、Ａ又はＢのアミノ酸であることを表す。以下も同様である。
【００３７】
さらに、上記の保存モチーフのいずれか１つの直後に連続して、K(V/I)NKのアミノ酸配列を有する膜結合性プレニルトランスフェラーゼが、より好ましい。
【００３８】
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、さらにVIAxxKDのアミノ酸配列モチーフを有するものが好ましい。また、VIAxxKDxxxxxGDのアミノ酸配列モチーフを有するものがより好ましく、特にVIAxxKDIPDxxGDのものが好適である。
【００３９】
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、またさらにYxxxxxxxG*AT、LxFxIG(W/L)LQ、(S/A)Gxx(S/T)FR, TxPxxxxFCxxIおよびAEYxxxPLFからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを有していてもよい。ｘで表された箇所は上記と同様である。また、これらのモチーフは、相互に、後述の図３のマルチアラインメントで示す程度の間隔をおいた位置に存するのが好ましいが、これらに限定はされない。
【００４０】
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼが活性を示す基質としては、フラボノイド、イソフラボノイド、プテロカルパン、クマリン、カルコンおよび／またはフロログルシノールなどが挙げられる。
【００４１】
好ましいフラボノイドとしては、ナリンゲニン、ヘスペレチン、リキリチゲニン(liquiritigenin)、ガランギン、クリシン、サクラネチン、イソサクラネチン、タキシフォリン、アピゲニン、ケンフェロール、ケルセチンなどが挙げられる。
【００４２】
好ましいイソフラボノイドとしては、ゲニステイン(genistein)、ダイゼイン(daidzein)、ビオカニンA (biochanin A)、フォルモノネチン (formononetin)などが挙げられる。
【００４３】
好ましいカルコンとしては、イソリキリチゲニン(isoliquiritigenin)、 ２’，４’，４−トリヒドロキシ−６’−メトキシカルコン、ナリンゲニンカルコン、メチルナリンゲニンカルコンなどが挙げられる。
【００４４】
好ましいプテロカルパンとして、グリシノール（glycinol: 別名(6aS, 11aS)-3,9,6a-trihydroxypterocarpan）マーキアイン(maackiain)などが挙げられる。
【００４５】
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、プレニルドナーとしてジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、フィチル二リン酸（ＰＤＰ）などを基質とする。
【００４６】
例えば、本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼの例としては、以下の（ａ）〜（ｊ）のポリペプチドが挙げられる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号３において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号５において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｈ）配列番号７において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｊ）配列番号９において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
（ｋ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｌ）配列番号１１において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｎ）配列番号１３において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
【００４７】
（ｂ）のポリペプチドは、（ａ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｂ）のポリペプチドは、（ａ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４８】
（ｄ）のポリペプチドは、（ｃ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｄ）のポリペプチドは、（ｃ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４９】
（ｆ）のポリペプチドは、（ｅ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｆ）のポリペプチドは、（ｅ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００５０】
（ｈ）のポリペプチドは、（ｇ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｈ）のポリペプチドは、（ｇ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００５１】
（ｊ）のポリペプチドは、（ｉ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｊ）のポリペプチドは、（ｉ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００５２】
（ｌ）のポリペプチドは、（ｋ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｌ）のポリペプチドは、（ｋ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００５３】
（ｎ）のポリペプチドは、（ｍ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。また、（ｎ）のポリペプチドは、（ｍ）のポリペプチドと７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチドであってもよい。
【００５４】
限定はされないが、具体的には、以下のように置換することが可能である：例えばアミノ酸の置換の場合は、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００５５】
好ましい置換の具体例としては、例えば、配列表の配列番号１で表すアミノ酸配列において、１２６番目のメチオニンのアラニンへの置換、１５８番目のバリンのメチオニンへの置換などが挙げられる。
【００５６】
なお、本発明でアミノ酸配列の相同性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムのデフォルト設定によって解析した場合の数値である。また、好ましくは（Database:nr、Matrix:BLOSUM62、GapCosts:Existence=11,Extension=1、）を用い得る。
【００５７】
また、本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、植物由来であることが好ましく、特に、マメ科、クワ科、オトギリソウ科、ミカン科、セリ科、キク科またはアサ科、ホップ由来であることが好ましい。
（膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子）
本発明には、以下の（ｏ）〜（ｚ）及び（α）（β）のいずれかのＤＮＡからなる膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる：
（ｏ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｑ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｒ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｓ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｔ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｕ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｖ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｗ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（ｘ）配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
（ｙ）配列番号１２の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（ｚ）配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
（α）配列番号１４の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（β）配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
【００５８】
ここで、本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、例えば、検出対象となるポリヌクレオチドを固定化した支持体に、プローブを作用させ、０．７〜１．０MのNaCl存在下において４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行った後、０．７〜１．０MのNaCl存在下において４２℃にて１２〜１６時間ハイブリダイゼーションを行い、その後０．１〜２倍程度のSSC溶液（
１倍濃度のSSC溶液の組成は、１５０mM塩化ナトリウム、１５mMクエン酸ナトリウム）を用いて４２℃でフィルターを洗浄することにより同定できるDNA等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed.,（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５９】
本発明には、（ｏ）〜（ｚ）及び（α）（β）のいずれかのＤＮＡと、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。
【００６０】
なお、本発明で塩基配列の相同性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムのデフォルト設定によって解析した場合の数値である。また、好ましくは（Database:nr、Match,Mismatch:1,-2、GapCosts:Linear）を用い得る。
（ベクター）
本発明のベクターは、上記（ｏ）〜（ｚ）及び（α）（β）のいずれか１または２以上のＤＮＡ、あるいは上記の（ｏ）〜（ｚ）及び（α）（β）のいずれかのＤＮＡと相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挿入された組み換えベクターである。ベクターとしては公知の酵母用、植物細胞用等のものを広く使用できる。公知のベクターとしては、酵母用ベクターとしてはpDR196、pYES-DEST 52、Yip5、Yrp17、Yep24など、植物細胞用としては、pGWB vector(pGWB2、pGWB5、pGWB80など；島根大学、中川強先生よりご分与)、pBiEl2-GUS、pIG121-Hm、pBI121、pBiHyg-HSE、pB119、pBI101、pGV3850、pABH-Hm1などが挙げられる。本発明において使用されるベクターは、必要に応じて、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子）を含有する。
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の組み換えベクターを保持する形質転換体である。宿主は、ベクターに適したものを使用すればよい。例えば、酵母、植物、植物細胞、昆虫細胞（Sf9など）などが好ましい。特に好ましい形質転換体としては、酵母、植物又は植物細胞などが挙げられる。形質転換方法は当業者に周知である。
（膜結合性プレニルトランスフェラーゼの調製方法）
上記形質転換体および／またはその培養物の培養液から膜結合性プレニルトランスフェラーゼを回収することで、活性を保持した組換え膜結合性プレニルトランスフェラーゼを得ることができる。
【００６１】
具体的には、例えば、Yazaki et al (JBC, 2002, Vol. 277, p. 6240-6246)に記載の方法を用いて行うことが出来る。
【００６２】
また、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼは、例えば、酵母発現系を用いた大量生産により、または大豆などの食用植物で発現させることにより、得ることができる。
【００６３】
より具体的には、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼは、酵母において高い活性を持ったタンパク質として発現できるため、形質転換酵母の培養液にナリンゲニン等のフラボノイド、ゲニステイン等のイソフラボノイドあるいはイソリキリチゲニン等のカルコンを基質として投与する事で、効率よくプレニル化フラボノイドの大量生産が可能である。ナリンゲニン、ゲニステイン、イソリキリチゲニン等は適度な水溶性と疎水性を持つため、生体膜を通過する事ができ、酵母細胞内のプレニルトランスフェラーゼと接触できる。酵母はサイトゾルにプレニルドナーとなるDMAPPを生合成する経路（メバロン酸経路）を有しているため、プレニル基質はインビボで供給される。生産されたプレニル化フラボノイド、プレニル化イソフラボノイド、プレニル化カルコン等は、酵母細胞あるいは培地から回収する事で、効率のよい生産が見込まれる。
【００６４】
あるいは、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼを大豆等の植物、あるいは植物細胞で発現させる事で、プレニル化フラボノイド、プレニル化イソフラボノイド、プレニル化カルコン等を植物で生産する事も可能である。植物細胞の場合、DMAPPを生合成する経路は２つあり、一つはサイトゾルのメバロン酸経路、もう一方はプラスチド内に局在する非メバロン酸経路である。前者のDMAPPを利用してプレニル化フラボノイド、プレニル化イソフラボノイド、プレニル化カルコン等を生産させるためには、プラスチド局在化シグナルを除いた改変遺伝子を発現させる。また、後者のDMAPPを利用したプレニル化フラボノイド、プレニル化イソフラボノイド、プレニル化カルコン等の生産を行うためには、内在性のプラスチド局在化シグナルを使うかRuBisCo小サブユニットなど他遺伝子のプラスチド局在化シグナルを連結して発現させ、プレニルトランスフェラーゼをプラスチドに局在させる。フラボノイド、イソフラボノイド、カルコン等の基質は、内在性のものがプレニル化されるため、植物を育成させてその組織からプレニル化されたものを回収する。あるいは、フラボノイド、イソフラボノイド、カルコン等を吸収させてプレニル化させ、それを植物組織から回収する事も効率の良い生産に有効である。植物のどの組織でプレニル化フラボノイドを生産させるのが良いかは、組織特異的なプロモータを利用する事で制御可能である。
【００６５】
プレニル化フラボノイド、プレニル化イソフラボノイド、プレニル化カルコン等を生産する植物は、上記のように化合物生産の目的にも利用可能であるが、これらの化合物の多くがファイトアレキシンとして生産されており、高い抗菌活性を有する事から、病原菌、病害虫に対して高い抵抗性を示す事が考えられる。従って、農業分野における分子育種のツールとしても、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼ遺伝子は利用可能である。
【００６６】
すなわち、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼを、穀物、野菜、イモ、果実等の作物植物内で発現させることで、病原菌、病害虫に対して高い抵抗性を持たせることができる。
（遺伝子の単離方法）
また、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれかに記載の塩基配列あるいはその一部を含んでなる塩基配列との相同性を利用すれば、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することができる。
【００６７】
具体的な方法としては、例えば、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれると予想される遺伝子ライブラリーを、前記塩基配列をプローブとしてスクリーニングする方法、あるいは、前記塩基配列情報に基づいたプライマーを調製し、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれると予想されるサンプルを鋳型としたＰＣＲを実施する方法などが挙げられる。
【００６８】
あるいは、塩基配列データベースを適当な相同性検索プログラム（例えばBLAST）でサーチすることにより、前記塩基配列と高い相同性を示すDNA配列を有する遺伝子を探索する方法等も挙げられる。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明を、実施例を示してより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７０】
１．発現ライブラリーの構築
S.flavescens培養細胞を、フラボノイドのプレニル化酵素を誘導させるために、0.1Mのジャスモン酸メチルDMSO溶液20μlを添加し、３６時間培養した(終濃度0.1 mM)。培養細胞よりOligotex-MAG mRNA Purification Kit(タカラバイオ社)を使用してpoly(A)+RNAを単離した。cDNAプラスミドライブラリーを、cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE)を使用し、膜結合性タンパク質の酵母発現用ベクターpDR196を用いて、構築した。cDNAの第１鎖を、7μgのポリ(A)+RNA、XhoI制限部位を含むoligo(dT)18アンカープライマーを使用して合成した。cDNAの第２鎖を合成した後、EcoRI制限サイトを含む平滑末端アダプターを二本鎖DNAへ結合させ、次いで当該フラグメントを、構成的プロモーターPMA1を有するプラスミド、pDR196中に組み込んだ。
【００７１】
２．SfN8DT cDNAのクローニングおよび機能解析
上記構築したｃＤＮＡライブラリーをEscherichia coli DH10Bに導入し、約10,000個のクローンをランダムに選出し、ＰＭＡ１プロモーター領域にアニールするプライマーを用いて５’末端から配列決定した。そのうち、既知の膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける保存モチーフ6種(NDxxDxxxD, NQxxDxxxD, NQxxExxxD, DDxxDxxxD, DQxxDxxxD, DQxxExxxD)のいずれかを有する２００クローンを選出した。当該ｃＤＮＡクローンを、ＳＯＳＵＩプログラム（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)を用いて分析し、少なくとも配列決定した領域において膜貫通領域を有する２０クローンを検出した。２００クローンを３つの細胞内局在予測プログラム：ChloroP, PSORT, およびWoLF_PSORT（ChloroP;http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/, PSORT; http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html, WoLF_PSORT; http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)を用いて分析し、３０クローンがプラスチド移行シグナルを有していることがわかった。
【００７２】
これらのクローンを、酢酸リチウム法を用いて酵母株W303-1A-Δcoq2に導入した。SD-Ura液体培地（１８０ｍｌ）中で対数増殖期に達するまで培養することによって、酵母形質転換体中で組換えタンパク質発現させ、そこからYazakiら（JBC, 2002, 277, 6240-6246）に記載の方法を用いてミクロソーム画分を調製した。それぞれの形質転換体の膜フラクションを５００μｌの0.1 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)中に再懸濁し、次いで、ナリンゲニンとDMAPPを基質として酵素活性によるスクリーニングを行った。
【００７３】
酵素生成物はＨＰＬＣ分析を用いてスクリーニングした。ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った：
Shimadzu LC-10A system (島津製作所、日本、京都): column YMC-Pack Pro C18 RS (YMC,日本、京都) 4.6 x 250 mm; 溶媒システム, メタノール:H2O:酢酸(70: 30: 0.3); 流速,1 ml min-1; 検出, SPD6A フォトダイオード・アレイ検出器で230-320 nm。
【００７４】
その結果、２００個の酵母形質転換体中、１つの酵母形質転換体の生成物が、８−ジメチルアリルナリンゲニンと同じ保持時間を有することがわかった（図１）。さらに、その生成物はフォトダイオード・アレイ検出において、標品と同等のＵＶスペクトルを示した（図１）。
【００７５】
このことから、当該１つ酵母形質転換体の形質転換に用いたクローンにはプレニルトランスフェラーゼがコードされていることがわかった。
【００７６】
こうして、sophoraflavanone G (SFG)生合成における最初のフラボノイド・プレニルトランスフェラーゼであるナリンゲニン 8-ジメチルアリルトランスフェラーゼ(以下SfN8DTと称す)のcDNA(全長1,495 bp, ORF 410 a.a.)が得られた。
【００７７】
SfN8DTの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。また、SfN8DTのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、SfN8DTが行うプレニル化反応の機構の一例を図２に示す。
【００７８】
なお、SfN8DTはSfN8DT-1とも称する。
【００７９】
３．SfN8DT以外のHPT様クローンのクローニング
クララcDNAライブラリーのシーケンス情報から、SfN8DT同様にホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼ（HPT）と高い相同性を有する６クローン（それぞれSf1c12f、Sf1C12c、SfL17a、SfL17b、SfG6DT、SfN8DT-2と称する。なお、Sf1C12fはSfN8DT-3とも称し、Sf1C12cはSfChal1DTとも称する。）を見出し、RACE法によりcDNAを単離した。
【００８０】
具体的には、RACEの鋳型としてはInvitrogen社のGeneRacerキットを用いて作製したcDNA混合物を用い、PCRにより各cDNAの5’-末端あるいは3’-末端を特異的に増幅した。ここで用いたRNA試料は、ライブラリーを作成したものと同じ、ジャスモン酸メチル処理したクララ培養細胞由来の全RNAである。このPCRにおいて、5’-RACEのフォワードプライマーは、上記キットのアダプター配列を、リバースプライマーは、各遺伝子の内部配列とした。3’-RACEの場合には、フォワードプライマーを各遺伝子の内部配列とし、リバースプライマーにはoligo-dT (20 mer) を用いた。増幅されたDNA断片はシーケンシングにより、各遺伝子のcDNA末端である事を確認した。全長cDNAを取得するためには、改めて5’-末端とoligo-dT (20 mer)をプライマーに、GeneRacerの混合物を用いてPCRを行った。
【００８１】
これらのうち、SfL17b、Sf1C12f、Sf1C12c、SfL17a、SfL17bおよびSfN8DTとホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼとの間のシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列の相同性を比較した(図３)。その結果、Sf1C12f、Sf1C12c、SfL17a、およびSfL17bはSfN8DTと高い相同性を有していた。Sf1C12f（全長1684bp, ORF 410a.a.)、Sf1C12c(全長1527bp, ORF 391a.a.)、SfL17a(全長1325bp, ORF 407a.a.)、およびSfL17b(全長1373bp, ORF 379a.a.)の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号４、６、８および１０に示す。なお、これらのアミノ酸配列をそれぞれ配列表の３、５、７および９に示す。
【００８２】
また、SfN8DT-1（SfN8DT）、SfN8DT-2、SfG6DT、SfChal1DT（Sf1C12c）それぞれの部分配列とホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼの部分配列を用いて作製したマルチプルアライメントを図４に示す。その結果、SfN8DT-1（SfN8DT）、SfN8DT-2、SfG6DT、SfChal1DT（Sf1C12c）は高い相同性を有していた。SfG6DT（ORF 407a.a.）及びSfN8DT-2（ORF 407a.a.）の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１２、１４に示す。また、これらのアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号１１、１３に示す。
【００８３】
４．SfN8DTと高い相同性を有する各クローンの機能解析
上記「２．SfN8DT cDNAのクローニングおよび機能解析」で実施したのと同様にして、SfN8DT-2、SfN8DT-3（Sf1C12f）、SfG6DTの機能解析を行った。
【００８４】
すなわち、SfN8DTの機能解析時と同様に、これらの cDNAクローンをそれぞれ酵母に導入し、培養して組み換えタンパク質を発現させ、そこからミクロソーム画分を調製した。そして、当該画分（膜フラクション）を５００μｌの0.1 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)中に再懸濁し、次いで、ナリンゲニン（naringenin）もしくはゲニステイン（genistein）とDMAPPを基質としたときの酵素活性を測定した。
【００８５】
酵素活性の測定は、SfN8DTの機能解析時と同じＨＰＬＣ分析条件で、酵素生成物を測定することで行った。
【００８６】
酵素活性の測定の結果、SfN8DT-2及びSfN8DT-3（Sf1C12f）を発現させ、ナリンゲニンを基質に用いて調製した画分は、８−ジメチルアリルナリンゲニンと同じ保持時間を有する物質を含むことがわかった。さらに、その生成物はフォトダイオード・アレイ検出において、８−ジメチルアリルナリンゲニン標品と同等のＵＶスペクトルを示した。
【００８７】
このことから、SfN8DT-2及びSfN8DT-3（Sf1C12f）もフラボノイド・プレニルトランスフェラーゼであるナリンゲニン 8-ジメチルアリルトランスフェラーゼであることがわかった。
【００８８】
またさらに、酵素活性の測定の結果、SfG6DTを発現させ、ゲニステイン及びDMAPPを基質に用いて調製した画分は、6−ジメチルアリルゲニステインと同じ保持時間を有する物質を含んでいた（図５）。また別途、化学合成した標品と直接比較することで酵素反応産物は6-ジメチルアリルゲニステインであると同定した。
【００８９】
このことから、SfG6DTはプレニルトランスフェラーゼであり、少なくともゲニステイン  ６−ジメチルアリルトランスフェラーゼとして働くことがわかった。
【００９０】
なお、SfG6DTが行うプレニル化反応の機構の一例（ゲニステイン  ６−ジメチルアリルトランスフェラーゼとして働く例）を図６に示す。
【００９１】
５．酵母発現系を用いた組換えSfG6DTの基質特異性の解析
上述の組換えSfG6DTの基質特異性解析を薄層クロマトグラフィーを用いたRadioactive assayによって行った。
すなわち、まず上述したSfG6DTの機能解析方法と同様にして、SfG6DTを発現した酵母のミクロソーム画分を調製した。
【００９２】
次に、当該画分（膜フラクション）を５００μｌの0.1 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)中に再懸濁し、次いで、14Cでラベルしたゲニステインと、DMAPP、GPP、FPP、GGPPからなる群から選ばれる１種とを基質として反応させた。
【００９３】
また、これとは別に、当該画分（膜フラクション）を５００μｌの0.1 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)中に再懸濁し、次いで、ゲニステイン、ダイゼイン、ビオカニンＡ（Biochanin A）からなる群から選ばれる１種と、14CでラベルしたDMAPPとを基質として反応させた。
【００９４】
そして、反応後、各サンプルを薄膜クロマトグラフィープレート（Silica Gel 60 F254；Merck）を用いて分離し（展開溶媒はToluene: EtOAc: AcOH = 70: 30: 0.3）、BAS1800（Fuji Film）によって検出を行った。
【００９５】
その結果、組換えSfG6DT は、ゲニステイン以外にも同じイソフラバノン骨格を有するビオカニンＡ（Biochanin A）も基質とすることがわかった。さらに、プレニルドナーとしては、DMAPP、GPP、FPPを基質とできることがわかった（図７）。
【００９６】
６．組換えSfN8DT及びSfG6DTの酵素化学的解析
上述の酵母発現系を用いて、組換えSfN8DT及びSfG6DTのKm、至適温度、至適pH、二価カチオン要求性を調べた。
【００９７】
具体的には、前述と同様の方法にて組み換え酵母ミクロソーム画分を調製し、ＨＰＬＣにより生成物の量を検出した。
【００９８】
Km値の結果を表１に、至適温度、SfN8DTの至適pH、二価カチオン要求性の結果を図８〜１０に、SfG6DTの結果を図１１〜１３に示す。なお、組換えSfN8DTの至適温度は、７０〜８０℃であり（図８）、組み換えSfG6DTの至適温度は２５〜３５℃であった（図１１）。
【００９９】
【表１】
2010022323.tif 000014
【０１００】
７．SfN8DT及びSfG6DTのｍＲＮＡの発現解析
ノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲによりクララ植物体及びクララ培養細胞におけるSfN8DT及びSfG6DTの発現解析を行った。(プローブ: 全長ORF)組織別発現解析には、武田薬草園でサンプリングしたクララ植物体（草丈：約１７０ｃｍ、根直径：〜３ｃｍ）を用いた。ノーザンブロット解析の結果、SfN8DT、SfG6DTとも根のみで発現が見られた（図１４）が、さらにＲＴ−ＰＣＲ解析を行ったところ、SfN8DTは根の皮部分特異的に発現し、一方SfG6DTは根の皮より内側で特異的に発現していることがわかった（図１５）。
【０１０１】
また、培養細胞においてもMJ（ジャスモン酸メチル）、SA（サリチル酸）及びYE（yeast extract）への発現応答を調べた。植え継ぎ3日後に、MJ、SA、YEをそれぞれ終濃度100 μM、100 μM、5 mg / ml になるよう添加し、24時間後に回収した。その結果、SfN8DTはMJ、SA、YEによりその発現が著しく上昇し、SfG6DTはSAによりその発現が著しく上昇した（図１６）。
【０１０２】
８．SfN8DTを用いた植物体でのプレニルフラボノイドの生産
Sf8DTを植物体内で発現させ、植物体内でプレニルフラボノイドを生産できるかを以下のようにして検討した。
＜SfN8DT遺伝子の導入及び発現＞
SfN8DT遺伝子全長を、上記のようにクローニングしたクローンをテンプレートとし、SfN8DTfull_Fwプライマー（配列番号１５）及びSfN8DTfull_Rvプライマー（配列番号１６）を用いてＰＣＲによって増幅した。増幅したものをpENTR1Aベクターにサブクローンし、GATEWAYエントリーベクターとした。さらにこれをpGWB2ベクターに組み込み、GATEWAYデスティネーションベクターとした。当該pGWB2-SfN8DTfullベクターを、Agrobacterium tumefaciens GV3101を用いてフローラルディップ法によりシロイヌナズナ（Columbia野生株）へ導入した。Ｔ１世代をカナマイシン50μg/mL含有培地で育ててセレクションを行い、さらにＴ２世代ではSfN8DTfull_Fwプライマー（配列番号１５）及びSfN8DTfull_Rvプライマー（配列番号１６）を用いてRT-PCRを行って、SfN8DT遺伝子が導入され、発現していることを確認した。
＜SfN8DT遺伝子発現株でのプレニルフラボノイドの生産＞
上記のSfN8DT遺伝子が発現しているシロイヌナズナ（Ｔ２世代）を、ナリンゲニン（naringenin）100μMを加えた寒天培地で2週間栽培した後フリーズドライし、これを約100mg（およそ300〜500植物体のフリーズドライ）収集した。このフリーズドライされたシロイヌナズナを試料として80％アセトン抽出を行い、抽出物を解析して8DN（8-dimethylallyl naringenin）、8DK（des-O-methylanhydroicaritin）、DA（dimethylallylated apigenin）、DQ（dimethylallylated quercetin）が生産されているかを調べた。なお、対照として、シロイヌナズナ野生株を用いて同様の実験を行った。
酵素生成物はＨＰＬＣ分析を用いてスクリーニングした。ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った：
Shimadzu LC-10A system (島津製作所、日本、京都): column YMC-Pack Pro C18 RS (YMC,日本、京都) 4.6 x 250 mm; 溶媒システム, メタノール:H2O:酢酸(70: 30: 0.3); 流速,1 ml min-1; 検出, SPD6A フォトダイオード・アレイ検出器で230-320 nm。
【０１０３】
結果を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
2010022323.tif 000015
【０１０５】
表２に示されるように、野生株においては8DN、8DK、DA、DQのいずれも生産されないのに対し、SfN8DT遺伝子発現株では8DN、8DK、DA、DQの全てが生産されることがわかった。
【０１０６】
以上のことから、植物体中でSfN8DT遺伝子を発現させることにより、プレニルフラボノイドを生産できることが確認できた。
【０１０７】
９．SfChal1DTの機能解析
SfN8DTの機能解析時と同様に、SfChal1DTの cDNAクローンを酵母に導入し、培養して組み換えタンパク質を発現させ、そこからミクロソーム画分を調製した。そして、当該画分（膜フラクション）を５００μｌの0.1 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)中に再懸濁し、次いで、カルコンであるイソリキリチゲニン（isoliquiritgenin）とDMAPPを基質としたときの酵素活性を測定した。
【０１０８】
酵素活性の測定には、LC/MSを用い、以下の条件で行った：
Shimadzu model 2010A system LC/MS（島津製作所）（LC-10AD Solvent Delivery systemを使用）
column ：4 x 250 mm LiChrospere 100RP-18 (Merck, Tokyo, Japan)
solvent system：エタノール: H2O: ギ酸 (90: 10: 0.3)
flow rate：0.2 ml min-1
サンプルは陽イオンモードで測定し、質量分析の測定範囲は m/z 50 to 600と設定した。
【０１０９】
その結果、プレニル化イソリキリチゲニンの分子量３２５でトレースしたクロマトグラムにおいて、図１７に示されるように、イソリキリチゲニンのジメチルアリル体が酵素反応により生成していることが確認された。このことから、SfChal1DTはカルコンをプレニル化できるプレニルトランスフェラーゼであることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】SfN8DTで形質転換した酵母のミクロソーム画分に、ナリンゲニンとDMAPPを加えたときの生成物をＨＰＬＣで解析した結果を示す。ａは8-DN、3’DN、6DNの各標品をＨＰＬＣで解析したクロマトグラムを、ｂは空ベクターを導入した酵母の生成物をＨＰＬＣで解析したクロマトグラムを、ｃはSfN8DTで形質転換した酵母の生成物のＨＰＬＣで解析したクロマトグラムを、ｄはSfN8DTで形質転換した酵母の生成物のフォトダイオード・アレイ検出結果を示す。
【図２】SfN8DTが行うプレニル化反応の機構の一例を示す。
【図３】SfL17b、SfN8DT、SfL17a、Sf1C12cおよびSf1C12fとその他のホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼとの間のシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列の相同性の比較を示す。GmVTE2-1, AtVTE2-1, TaVTE2-1, ZmVTE2-1, ApVTE2-1およびCpVTE2-1:Eva Collakova et al, Plant Phys., 2001, 127, 1113-1124およびBeth Savidge etal., Plant Phys., 2002, 129, 321-332参照。HvHGGT, TaHGGTおよびOsHGGT: Edgar B Cahoon et al., Nature Biotech, 2003, 21, 1082-1087参照。GmVTE2-2およびAtVTE2-2:Venkatech et al., Planta, 2006, 223, 1134-1144参照。
【図４】SfN8DT-1（SfN8DT）、SfN8DT-2、SfG6DT、SfChal1DT（Sf1C12c）それぞれの部分配列とホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼの部分配列を用いて作製したマルチプルアライメントを示す。
【図５】SfG6DTで形質転換した酵母のミクロソーム画分に、ゲニステインとDMAPPを加えたときの生成物をＨＰＬＣで解析した結果を示す。
【図６】SfG6DTが行うプレニル化反応の機構の一例を示す。
【図７】SfG6DTの基質特異性をRadioactive assayによって検討した結果を示す。赤矢印及び青矢印が、検出された6−ジメチルアリルゲニステインを示す。
【図８】組換えSfN8DTの至適温度を示すグラフである。
【図９】組換えSfN8DTの至適ｐＨを示すグラフである。
【図１０】組換えSfN8DTの二価カチオン要求性を示すグラフである。
【図１１】組換えSfG6DTの至適温度を示すグラフである。
【図１２】組換えSfG6DTの至適ｐＨを示すグラフである。
【図１３】組換えSfG6DTの二価カチオン要求性を示すグラフである。
【図１４】クララ各器官におけるSfN8DT及びSfG6DTの発現を検討したノザンブロット解析結果のイメージを示す。
【図１５】クララの根におけるSfN8DT及びSfG6DTの発現部位を検討したＲＴ−ＰＣＲ解析結果のイメージを示す。なお、IFSはイソフラボン合成酵素を、CHSはカルコン合成酵素を、CHIはカルコンイソメラーゼを、それぞれ示す。
【図１６】MJ、SA、YEのSfN8DT及びSfG6DTの発現に対する影響を検討したノザンブロット解析結果のイメージを示す。
【図１７】SfChal1DTで形質転換した酵母のミクロソーム画分に、イソリキリチゲニンとDMAPPを加えたときの生成物をLC/MSで解析した結果を示す。
【図１】
2010022323.tif 000020
【図２】
2010022323.tif 000021
【図３】
2010022323.tif 000022
【図４】
2010022323.tif 000023
【図５】
2010022323.tif 000024
【図６】
2010022323.tif 000025
【図７】
2010022323.tif 000026
【図８】
2010022323.tif 000027
【図９】
2010022323.tif 000028
【図１０】
2010022323.tif 000029
【図１１】
2010022323.tif 000030
【図１２】
2010022323.tif 000031
【図１３】
2010022323.tif 000032
【図１４】
2010022323.tif 000033
【図１５】
2010022323.tif 000034
【図１６】
2010022323.tif 000035
【図１７】
2010022323.tif 000036
【配列表】
2010022323000001.app