(57)【要約】【課題】  本発明は、細菌の耐性獲得も少なく、抗生物質とは異なる特徴を有し、細胞障害性を有さない１５Ｋグラニュライシンと組み合わせて投与することで、15Kグラニュライシンを単独で用いるよりも強い殺菌効果を有する感染症治療剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、有効成分として１５Kグラニュライシンと１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの組み合わせ、１５KグラニュライシンとIL-6、IL-２３またはＩＬ−２７の組み合わせ、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-6、ＩＬ−２３またはＩＬ−２７の組み合わせ及び１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP65DNAとIL-12DNA体内発現ベクターの組み合わせを含み、副作用が少なく、かつ、細菌が耐性獲得をし難い、有効な感染症治療剤を提供することによって上記の課題を解決した。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５Ｋグラニュライシンと１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで、１５Ｋグラニュライシンを体内発現させるベクターを有効成分として含む感染症治療剤。
【請求項２】
１５Ｋグラニュライシンと以下の物質（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つを有効成分として含む感染症治療剤。
（ａ）  インターロイキン６
（ｂ）  インターロイキン２３
（ｃ）  インターロイキン２７
【請求項３】
１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで、１５Ｋグラニュライシンを体内発現させるベクターと以下の物質（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つを有効成分として含む感染症治療剤。
（ａ）  インターロイキン６
（ｂ）  インターロイキン２３
（ｃ）  インターロイキン２７
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）を有効成分として含む感染症治療剤。
（ａ）１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで、１５Ｋグラニュライシンを体内発現させるベクター
（ｂ）センダイウイルスのエンベロープにヒト型結核菌H37Rvの６５KDaヒートショックプロテインをコードする遺伝子とインターロイキン１２をコードする遺伝子を組み込んで、６５KDaのヒートショックプロテインとインターロイキン１２を体内発現させるベクター
【請求項５】
前記１５Ｋグラニュライシンが、組換え蛋白質であることを特徴とする請求項1又は２に記載の感染症治療剤。
【請求項６】
感染症の原因菌が結核菌である請求項1乃至５のいずれかに記載の感染症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核等の感染症を治療するための感染症治療剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
医療において、感染症治療剤の存在が不可欠であることは言うまでもないことである。現在、数多くの抗生物質や合成抗菌剤等の感染症治療剤が提供されており、医療現場において用いられている。
【０００３】
しかしながら、現在、感染症治療剤として、主に提供されている抗菌剤には、耐性菌の出現という、不可避の問題が伴っていることも事実である。つまり、新たな抗菌剤が提供されることにより、新たな耐性菌が生み出されている、という皮肉な状態が続いている。
【０００４】
例えば、単一感染症において、死亡率第１位を占めている結核は、最近の増加傾向が、世界的な問題となっている。さらに、殆どの抗生物質に対して耐性を有する耐性菌の存在も確認されており、この問題も顕在化しつつある。
【０００５】
現在グラニュライシンと呼ばれる、ＮＫ細胞やＣＴＬに発現している分子が、結核菌等の細菌に対する直接の殺傷能力を有することが明らかとなっている〔Stenger,S.et al.,Science ２８２,１２１-１２５(１９９８)〕。
【０００６】
グラニュライシンは、１５Ｋとして造られた後、細胞傷害性顆粒内で、９Ｋにプロセシングされる。１５Ｋと９Ｋのグラニュライシンはそれぞれ、マクロファージに入り込み、マクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌を殺傷する。
しかし、９Ｋグラニュライシンがマクロファージに入り込むためには、同じ細胞傷害性顆粒内分子であるパーフォリンを必要とする。これは、９Ｋグラニュライシンが細胞内に入るためにはパーフォリンによって標的細胞に穴を空ける必要があるからである。従って、９Ｋグラニュライシンは細胞障害性がある。
ところが、１５Ｋグラニュライシンは標的細胞に穴をあけるパーフォリンを必要とせず、マクロファージに入り込み、マクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌を殺傷する。よって１５Kグラニュライシンには細胞障害性がない。
【０００７】
本発明者らは、9Kグラニュライシントランスジェニックマウスと１５Kグラニュライシントランスジェニックマウスを作製し、それぞれのマウスとWild型コントロールマウスに５×１０５CFU、H３７Rvヒト型結核菌を尾静脈から静脈内投与し、４週後のそれぞれの肺臓中の結核菌数を測定した。その結果１５Kグラニュライシントランスジェニックマウスの肺臓では統計学的有意差（Student のt 検定でp＜０．０５）をもって９Kグラニュライシントランスジェニックマウスの肺臓より結核菌数の減少が認められた。このことより、１５Kグラニュライシンは９Kグラニュライシンよりも生体内において抗結核殺傷効果、抗結核抑制効果が有意に強力であることが初めて発見され、また、９Kグラニュライシンは生体内において抗結核抑制効果が極めて弱いことが示唆された。
【０００８】
上記の結果を踏まえて本発明者らは、細胞障害性を有さず９Ｋグラニュライシンよりも強力な結核抑制効果を有する１５Ｋグラニュライシンを有効成分とした感染症治療剤及び１５Kグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで１５Kグラニュライシンを体内発現させるベクターを有効成分として含む感染症治療剤を既に出願し、登録を受けている。（特許文献１）。
しかしながら、更に強力な感染症治療剤を作製するために、１５Kグラニュライシンと組み合わせて投与することで１５Kグラニュライシン単独で投与するよりもマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌による感染症に効果のある感染症治療剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４１４９７１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細菌の耐性獲得も少なく、抗生物質とは異なる特徴を有し、細胞障害性を有さない１５Ｋグラニュライシンと組み合わせて投与することで、１５Kグラニュライシンを単独で用いるよりも強力にマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌を殺傷する効果を有する感染症治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１に係る発明は、１５Ｋグラニュライシンと１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで、１５Ｋグラニュライシンを体内発現させるベクターを有効成分として含む感染症治療剤に関する。
請求項２に係る発明は１５Ｋグラニュライシンと以下の物質（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つを有効成分として含む感染症治療剤に関する。
（ａ）  インターロイキン６
（ｂ）  インターロイキン２３
（ｃ）  インターロイキン２７
請求項３に係る発明は１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで、１５Ｋグラニュライシンを体内発現させるベクターと以下の物質（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つを有効成分として含む感染症治療剤に関する。
（ａ）  インターロイキン６
（ｂ）  インターロイキン２３
（ｃ）  インターロイキン２７
請求項４に係る発明は、以下の（ａ）、（ｂ）を有効成分として含む感染症治療剤に関する。
（ａ）１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで、１５Ｋグラニュライシンを体内発現させるベクター
（ｂ）センダイウイルスのエンベロープにヒト型結核菌H３７Rvの６５KDaヒートショックプロテインをコードする遺伝子とインターロイキン１２をコードする遺伝子を組み込んで、６５KDaのヒートショックプロテインとインターロイキン１２を体内発現させるベクター
請求項５に係る発明は、前記１５Ｋグラニュライシンが、組換え蛋白質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の感染症治療剤に関する。
請求項６に記載の発明は感染症の原因菌が結核菌である請求項1乃至５のいずれかに記載の感染症治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
請求項１に係る発明によれば、１５Ｋグラニュライシンと１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を組み込んで１５Kグラニュライシンを体内発現させるベクター（以下１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターと称する。）を有効成分として含む感染症治療剤を投与することによって細胞障害活性を示さず、１５Ｋグラニュライシン単独もしくは１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを単独で投与するよりも強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
【００１３】
請求項２に係る発明によれば、１５Ｋグラニュライシンとインターロイキン６（以下IL-６と称する）、もしくはインターロイキン２３（以下IL-２３と称する）、もしくはインターロイキン２７（以下ＩＬ−２７と称する）のいずれか一つを有効成分として含む感染症治療剤を投与することによって細胞障害活性を示さず１５Ｋグラニュライシン単独、もしくはIL-６、またはIL-２３、またはIL−２７を単独で投与するよりも強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
【００１４】
請求項３に係る発明によれば、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６、もしくはIL-２３、もしくはIL-２７のいずれか一つを有効成分として含む感染症治療剤を投与することによって１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを単独、もしくはIL-６、またはIL-２３、またはIL-２７を単独で投与するよりも強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
【００１５】
請求項4に係る発明によれば、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターと、本発明者らによって開発された結核菌に対する体内発現ベクターで、マウスの系だけではなく、ヒトの結核感染に最も近いモデルとされているカニクイザルの系でも結核の強い治療効果を示すHVJ-エンベロープHSP６５DNAとIL-１２のDNAの体内発現ベクター（以下HSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターと称する）を有効成分として含む感染症治療剤を投与することによって、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを単独、もしくはHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクター単独で投与するよりも更に強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
尚、HSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターはヒト型結核菌H３７Rvの６５KDaヒートショックプロテインのDNA(HSP６５DNA)とIL-１２のDNAをセンダイウイルス（HVJ）のエンベロープに組み込んだ体内発現ベクターで、結核菌に対して強い治療効果を有することが知られている（Okada et.al, Jpn.J.Clin.Immunol.,３１ (5) ３５６〜３６８（２００８））。
【００１６】
請求項５に係る発明によれば、１５Ｋグラニュライシン蛋白質を安定して大量に供給することができる。
【００１７】
請求項６に係る発明によれば、結核菌に有効な感染症治療剤を提供することができる。
【００１８】
本発明により、１５Kグラニュライシンと１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの組み合わせ、１５KグラニュライシンとIL-６、IL-２３またはＩＬ−２７の組み合わせ及び１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６、ＩＬ−２３またはＩＬ−２７の組み合わせ及び１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの組み合わせによって副作用が認められず、１５Kグラニュライシンを単独で投与するよりもさらにマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌に対して殺傷性のある感染症治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】結核菌に腹腔内感染させたマウス（DBA/１）の肝臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシン発現ベクターの治療効果示す図である。
【図２】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の脾臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と、IL-６の治療効果を示す図である。
【図３】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の脾臓における１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６の治療効果を示す図である。
【図４】結核菌にエアゾル感染させたマウス（BALB/ｃ）の肝臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６の治療効果を示した図である。
【図５】結核菌にエアゾル感染させたマウス（BALB/ｃ）の肺臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６の治療効果を示した図である。
【図６】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の肝臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの治療効果を示した図である。
【図７】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の脾臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの治療効果を示した図である。
【図８】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の脾臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２３の治療効果を示した図である。
【図９】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の肝臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２３の治療効果を示した図である。
【図１０】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の肺臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２３の治療効果を示した図である。
【図１１】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の脾臓における１５Kグラニュライシン体内発現ベクターとIL-２３の治療効果を示した図である。
【図１２】結核菌にエアゾル感染させたマウス（BALB/ｃ）の肺臓における１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２７の治療効果を示した図である。
【図１３】結核菌にエアゾル感染させたマウス（DBA/１）の肝臓における１５Kグラニュライシン体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの治療効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本治療剤の有効成分として用いる１５Ｋグラニュライシンは、生体から分離して用いることも可能であるが、生体微量成分である故、１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を発現させて得られる、組換え蛋白質として用いることが好適である。また、１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子が組み込まれた、１５Ｋグラニュライシンの体内発現ベクターを有効成分として、体内で１５Ｋグラニュライシンを産生させることも、好適な手段である。
【００２１】
（１５Ｋグラニュライシンの組換え蛋白質の作製方法）
１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子配列は、既に報告されており、これを基に、１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を効率的に調製して、この遺伝子を発現させることにより、１５Ｋグラニュライシンの組換え蛋白質を調製することが可能である。
【００２２】
具体的には、１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子配列の両端に対して相補的なヌクレオチド鎖を増幅用プライマーとして、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により、１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子の遺伝子増幅産物を調製する。
これを、適切な遺伝子発現用ベクターに組み込み、かかる組換えベクターで形質転換を行った大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞などの適切な宿主から、所望する１５Ｋグラニュライシンを得ることができる。
【００２３】
ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通常発現しようとする遺伝子の上流域にプロモーター，エンハンサー，および下流域に転写終了配列などを保有するものを用いるのが好適である。
【００２４】
また、１５Ｋグラニュライシン遺伝子の発現は、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子，グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子やチオレドキシン遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とすることもできる。
【００２５】
遺伝子発現用ベクターとしては、例えば、宿主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥＸ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，ｐＮＴ２６ＣIIなどを例示することができる。また、宿主を枯草菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０などを例示することができる。
【００２６】
また、宿主を酵母とするものとしては、ｐＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，ＹＥｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０などを例示することができる。
【００２７】
また、宿主を哺乳動物細胞または昆虫細胞とするものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡＩなどを例示することができる。
【００２８】
これらの遺伝子発現ベクターは、１５Ｋグラニュライシンを発現させる目的に応じて選択することができる。例えば、１５Ｋグラニュライシンを発現させる場合には、宿主として大腸菌，枯草菌または酵母などを選択し得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ましく、少量でも確実に活性を有するように１５Ｋグラニュライシンを発現させる場合には、哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主として選択し得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ましい。
【００２９】
また、上記のように既存の遺伝子発現ベクターを選択することも可能であるが、目的に応じて適宜遺伝子発現ベクターを作出して、これを用いることも勿論可能である。
【００３０】
１５Ｋグラニュライシン遺伝子を組み込んだ上記遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入およびこれによる形質転換法は、一般的な方法、例えば宿主細胞が大腸菌や枯草菌である場合には、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法などの手段により行うことができ、宿主が哺乳動物細胞や昆虫細胞の場合はリン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法またはリポソーム法などの手段により行うことができる。
【００３１】
このようにして得られる形質転換体を常法に従い培養することにより、所望する１５Ｋグラニュライシンが蓄積される。かかる培養に用いられる培地は、宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培地などが、宿主が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭＩ１６４０培地などを適宜用いることができる。
【００３２】
この培養により得られる培養物からの１５Ｋグラニュライシンの単離および精製は、常法に従い行うことが可能であり、例えば培養物を、１５Ｋグラニュライシンの物理的および／または化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。
【００３３】
具体的には、タンパク沈澱剤による処理，限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー，透析法などを単独でまたはこれらの方法を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
（１５Ｋグラニュライシンの体内発現ベクターの作製方法）
この形態の本治療剤の有効成分は、上記の組換え蛋白質の発現に用いられた、１５Ｋグラニュライシンをコードする遺伝子を、体内発現ベクターに組み込んだ、組換えベクターである。
【００３５】
体内発現ベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。体内発現ベクターは、例えば、上記のウイルス遺伝子を組み込んだコスミドベクターに、さらに、１５Ｋグランニュライシンを発現可能な遺伝子を組み込んで、このコスミドベクターと、制限酵素処理を行った親ウイルスＤＮＡ−ＴＰを、２９３細胞にトランスフェクションすることにより、この２９３細胞内で相同組換えが起こり、所望する体内発現ベクターが生産される。
【００３６】
（１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを有効成分とした本治療剤）
１５Kグラニュライシンの組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの両物質を用いることにより、単独で用いるよりも強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
【００３７】
１５Ｋグラニュライシンは適切な医薬製剤担体を配合して、製剤組成物の形態に調製することが可能である（１５Ｋグラニュライシンのみでも勿論可能である）。医薬製剤担体としては、例えば、具体的な剤型に応じて、適宜医薬製剤担体として慣用され得る、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、安定剤、溶解補助剤、崩壊剤、表面活性剤などの賦形剤や希釈剤を自由に選択することができる。製剤組成物の形態は、１５Ｋグラニュライシンを、感染症の治療用途に効果的に用い得る形態であれば特に限定されず、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤などの固剤であっても、液剤、懸濁剤、乳剤などの注射剤形態とすることもできる。また、１５Ｋグラニュライシンに適切な担体を添加することによって、用時に液状とするべき乾燥品とすることも可能である。
【００３８】
１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは上述のようにして調製され得る体内発現ベクターを、単離・精製して、これを生体に投与することにより、生体内に１５Ｋグラニュライシンが産生され、この１５Ｋグラニュライシンの薬理効果が発揮され得る。
【００３９】
投与量は、剤の投与方法、投与形態、患者の症状などに応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるべきものではないが、有効成分である１５Kグラニュライシン組換え蛋白質１００００μg/５０ｋｇは１日１回または数回に分けて、また、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクター、２０００μｇ/５０kgは1日1回、、それぞれを数日間の間隔をあけて６回投与することが好ましい。
【００４０】
尚、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは注射剤形態が一般的であるので、１５Kグラニュライシンの組換え蛋白質に適切な担体を添加することによって注射剤形態として、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを静脈内、筋肉内、骨内、関節内、皮下、皮内、腹腔内に同時または間隔をあけて交互に投与することもできる。
【００４１】
（１５Ｋグラニュライシンの組換え蛋白質とIL-６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７のいずれか一つを有効成分とした本治療剤）
１５Kグラニュライシンの組換え蛋白質とIL-６またはＩＬ−２３またはＩＬ−２７のいずれか一つを用いることにより、単独で用いるよりも強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
【００４２】
１５Ｋグラニュライシンの組換え蛋白質とIL-６またはＩＬ−２３またはＩＬ−２７は、適切な医薬製剤担体を配合して、製剤組成物の形態に調製することが可能である。医薬製剤担体としては、例えば、具体的な剤型に応じて、適宜医薬製剤担体として慣用され得る、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、安定剤、溶解補助剤、崩壊剤、表面活性剤などの賦形剤や希釈剤を自由に選択することができる。製剤組成物の形態は、１５Ｋグラニュライシンの組換え蛋白質とIL-６またはＩＬ−２３、またはＩＬ−２７のいずれか一つを、感染症の治療用途に効果的に用い得る形態であれば特に限定されず、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤などの固剤であっても、液剤、懸濁剤、乳剤などの注射剤形態とすることもできる。また、１５Ｋグラニュライシンの組換え蛋白質とIL-６またはＩＬ−２３、またはＩＬ−２７のいずれか一つに適切な担体を添加することによって、用時に液状とするべき乾燥品とすることも可能である。
【００４３】
このようにして得られる本治療剤の投与量は、剤の投与方法、投与形態、患者の症状などに応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるべきものではないが、有効成分である１５Kグラニュライシン組換え蛋白質１００００μg/５０ｋｇ、IL-６の場合は２５００μg/５０kg、IL-２３の場合は５０００μg/５０kg、IL-２７の場合は２５００μg/５０kgを１日１回または数回に分け、数日間から１週間以上の間隔をあけて６回投与することが好ましい。投与は両物質を同時または間隔をあけて交互に投与することもできる。
【００４４】
尚１５Kグラニュライシン蛋白質とインターロイキンの組み合わせは強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を有するため治療回数を３回に減らすことも可能である。
【００４５】
このような各種の形態の医薬製剤は、その形態に応じて適当な投与経路、例えば、注射剤形態の場合には、静脈内、筋肉内、骨内、関節内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより、固剤形態の場合には、経口や経腸投与などにより投与され得る。
【００４６】
（１５Ｋグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６またはＩＬ−２３またはＩＬ−２７のいずれか一つを有効成分とした本治療剤）
１５Ｋグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６またはＩＬ−２３またはＩＬ−２７のいずれか一つを用いることにより、単独で用いるよりも強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を得ることができる。
【００４７】
１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６またはＩＬ−２３、またはＩＬ２７は、上述のように適切な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調整して使用することができる。このようにして得られる本治療剤の投与量は、剤の投与方法、投与形態、患者の症状などに応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるべきものではないが、有効成分である１５Kグラニュライシンの体内発現ベクター２０００μg/５０ｋｇは1日1回、IL-６の場合は２５００μg/５０kg、IL-２３の場合は５０００μg/５０kg、IL-２７の場合は２５００μg/５０kgを１日１回または数回に分け、それぞれを数日間から１週間以上の間隔をあけて６回投与することが好ましい。
【００４８】
尚、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは注射剤形態が一般的であるので、IL-６またはＩＬ−２３、またはＩＬ−２７のいずれか一つに適切な担体を添加することによって注射剤形態として両物質を同時または交互に投与することもできる。
【００４９】
（１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターを有効成分とした本治療剤）
１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの投与形態は、注射剤形態であることが一般的であり、静脈内、筋肉内、骨内、関節内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより、投与され得る。このような本治療剤の投与量は、剤の投与方法、投与形態、患者の症状などに応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるべきものではない。
【００５０】
一般には、有効成分である１５Ｋグラニュライシンの体内発現ベクター２０００μg/５０ｋｇ及びHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクター２０００μg/５０ｋｇを１日１回、数日間の間隔をあけて６回投与することが好ましい。
【００５１】
尚１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの組み合わせは強いマクロファージに取り込まれた結核菌等の細菌の殺傷効果を有するため治療回数を３回に減らすことも可能である。
【実施例】
【００５２】
以下に、本発明の実施例を記載する。
【００５３】
（１）１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクター、（２）１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７のいずれか一つ、（３）１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７のいずれか一つ及び（４）１５Ｋグラニュライシンの体内発現ベクターとＨＳＰ６５DNAとＩＬ−１２ＤＮＡ体内発現ベクターを用いた時の細菌に対する殺傷効果の向上について説明する。
【００５４】
以下に用いる相乗効果という用語はそれぞれの物質を単独で用いるよりも、二つの物質の組み合わせて用いる方が細菌に対する殺傷効果が向上した場合のことを言う。
【００５５】
実験において用いるG１群からG１０群の表示は以下の表１の通りである。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
（使用試薬等）
１５Kグラニュライシン組換え蛋白質はR&D Systems社の精製蛋白質を使用した。IL-６はMiltenyi Biotec(Auburn, CA)社製の精製蛋白質を使用した。ＩＬ−２３、ＩＬ−２７はR&D Systems  社のrecombinant mouse IL-２３及びrecombinant mouse IL-２７の精製蛋白質を使用した。
【００５８】
１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは15Ｋグラニュライシンの遺伝子をＣＡＧベクターに連結し、センダイウイルス（ＨＶJ）のエンベロープに組み込んだ。また、ＨＳＰ６５ＤＮＡとＩＬ−１２ＤＮＡの体内発現ベクターはそれそれの遺伝子をｐｃＤＮＡ３・1ベクターに連結しセンダイウイルス（ＨＶJ）エンベロープに組み込んだものを用いた。
マウスはDBA/１とBALB/cを用いた。これらのマウスは結核菌に易感染性である。
有意差検定にはStudentのｔ検定を用いた。
【００５９】
以下の実験において１５Kグラニュライシン組換え蛋白質を投与する場合は１匹（２０ｇ）あたり１日に4μg投与した。
１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは１匹（２０g）あたり１日に１００μg/０.２mlを５０μｇずつ両側下肢の前頸骨筋に筋肉注射することによって投与した。
IL-６は１匹（２０ｇ）あたり１日に１μg（≧５×１０４International Unit）、IL−２３は１匹（２０ｇ）あたり２μg（≧５×１０４International Unit）、IL-２７は１匹（２０ｇ）あたり１日に１μg（≧５×１０４International Unit）を３回に分けて１/３ずつ腹腔内投与した。
【００６０】
感染させる細菌はヒト型結核菌H３７Rvを用いた。
結核菌を腹腔内感染させる場合は１×１０７CFUを生理食塩水０．２mlに懸濁し、これを腹腔内に投与することによって行った。
結核菌を肺感染させる場合にはエアゾルチャンバーで１×１０３CFUをマウス気道内に投与することによって行った。
【００６１】
（実験１）
（腹腔内感染における１５Ｋグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの結核菌に対する相乗効果について）
８週齢のDBA/１マウスに結核菌を腹腔内感染させた。そのマウスを何も与えない群（G１群）、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを与える群（G２群）、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを与える群（G５群）、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを与える群（G６群）に分けた。
【００６２】
G２群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質を４回、間隔をあけて投与した。また１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを７回、間隔をあけて投与した。G５群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを、G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみをG２群と同日に投与した。G１群には与えなかった。
【００６３】
その後解剖して肝臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００６４】
その結果、G２群のコロニー数はG５群、G６群と比べて少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG２群はG５群,G６群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【００６５】
また、コントロールであるG１群とG２群、G５群、G６群について同じ方法で有意差検定を行ったところG２群、G５群、G６群の全てにおいてG１群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図１）。
【００６６】
従って１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは肝臓において、それぞれ単独でも効果があるが、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【００６７】
（実験２）
（DBA/１マウスにおける１５Ｋグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６の結核菌に対する相乗効果について）
８週齢のDBA/１マウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを何も与えない群（G１群）、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６を与える群（G３群）と１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを与える群（G５群）、IL-６のみを与える群（G７群）に分けた。
【００６８】
G３群には、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６をそれぞれ交互に６回ずつ投与した。G５群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを、G７群にはIL-６のみをそれぞれ６回ずつ投与した。G１群には投与しなかった。
【００６９】
その後解剖して脾臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００７０】
その結果、G３群のコロニー数はG５群及びG７群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG３群はG５群,G７群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【００７１】
また、コントロールであるG１群とG３、G５、G７群について同じ方法で有意差検定を行ったところG３群、G５群、G７群、の全てがG１群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図２）。
【００７２】
従って１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６は脾臓において、それぞれ単独でも効果があるが、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【００７３】
（実験３）
（１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６の結核菌に対する相乗効果について）
エアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた８週齢のDBA/１マウスを何も投与しない群（G１群）、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６を投与する群（G９群）と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを投与する群（G６群）、IL-６のみを投与する群（G１０群）に分けた。
【００７４】
G９群には１５Ｋグラニュライシン体内発現ベクターとIL-６をそれぞれ６回ずつ投与した。投与は１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを全実験期間の前半に行い、IL-６を後半に行った。G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみ、G１０群にはIL-６のみを６回投与した。G１群には投与しなかった。
【００７５】
その後解剖して脾臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００７６】
その結果、G９群のコロニー数はG６群及びG１０群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG９群はG６群、G１０群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【００７７】
また、コントロールであるG１群とG９、G６、G１０群について同じ方法で有意差検定を行ったところG９群、G６群、G１０群、の全てがG１群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図３）。
【００７８】
従って、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６の組み合わせは脾臓においてそれぞれ単独で用いるよりも結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【００７９】
（実験４）
（BALB/cマウスにおける１５Kグラニュライシンの組換えタンパク質とIL-６の結核菌に対する相乗効果について）
結核の感染実験によく用いられるBALB/cマウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを何も投与しない群（G１群）、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６を投与する群（G３群）と１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを投与する群（G５群）、IL-６のみを投与する群（G７群）に分けた。
【００８０】
G３群には、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-６をそれぞれ交互に６回ずつ投与した。G５群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを、G７群にはIL-６のみをそれぞれ６回投与した。G１群には投与しなかった。
【００８１】
その後解剖して肝臓及び肺臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００８２】
その結果、G３群のコロニー数はG５群及びG７群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG３群はG５群,G７群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【００８３】
また、コントロールであるG１群とG３、G５、G７群について同じ方法で有意差検定を行ったところG３群、G５群、G７群、の全てがG１群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（肝臓（図４）、肺臓（図５））。
【００８４】
従って１５KグラニュライシンとIL-６は肝臓及び肺臓において、それぞれ単独でも効果があるが、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【００８５】
（実験５）
（肺感染における、DBA/１マウスにおける１５Ｋグラニュライシンの組換えタンパク質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの結核菌に対する相乗効果について）
８週齢のDBA/１マウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを投与する群（G２群）と１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを投与する群（G５群）、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを投与する群（G６群）に分けた。
【００８６】
G２群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを間隔をあけて６回、同日に投与した。G５群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを、G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを６回投与した。
【００８７】
その後解剖して肝臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００８８】
その結果、G２群のコロニー数はG５群、G６群と比べて少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG２群はG５群,G６群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図６）。
【００８９】
従って１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは肝臓において、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【００９０】
（実験６）
（肺感染における１５Ｋグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの結核菌に対する相乗効果について）
８週齢のDBA/１マウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを何も投与しない群（G１群）、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを投与する群（G２群）と１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを投与する群（G５群）、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを投与する群（G６群）に分けた。
【００９１】
G２群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターを、間隔をあけて６回、同日に投与した。G５群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを、G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを６回投与した。G１群には投与しなかった。
【００９２】
その後解剖して脾臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００９３】
その結果、G２群のコロニー数はG５群、G６群と比べて少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG２群はG５群,G６群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【００９４】
また、コントロールであるG１群とG２、G５、G６群について同じ方法で各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG２、G５群、G６群の全てにおいてG１群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。（図７）
【００９５】
従って１５Kグラニュライシン組換え蛋白質と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターは脾臓において、それぞれ単独でも効果があるが、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【００９６】
（実験７）
（１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２３の結核菌に対する相乗効果について）
ＤＢＡ／１マウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを何も投与しない群（G１群）、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２３を投与する群（G３群）と１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを投与する群（G５群）、IL-２３のみを投与する群（G７群）に分けた。
【００９７】
G３群には、１５Kグラニュライシン組換え蛋白質とIL-２３をそれぞれ交互に６回ずつ投与した。G５群には１５Kグラニュライシン組換え蛋白質のみを、G７群にはIL-２３のみをそれぞれ６回投与した。G１群には投与しなかった。
【００９８】
その後解剖して脾臓、肝臓及び肺臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【００９９】
その結果、脾臓、肝臓及び肺臓の全てにおいてG３群のコロニー数はG５群及びG７群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG３群はG５群,G７群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【０１００】
また、コントロールであるG１群とG３、G５、G７群について同じ方法で各群３匹ずつの有意差検定を行ったところG３群、G５群、G７群、の全てがG１に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（脾臓（図８）、肝臓（図９）、肺臓（図１０））。
【０１０１】
従って１５KグラニュライシンとIL-２３は脾臓、肝臓、肺臓の全てにおいて、それぞれ単独でも効果があるが、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【０１０２】
（実験８）
（１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２３の結核菌に対する相乗効果について）
ＤＢＡ／１マウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを何も投与しない群（G１群）、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２３を投与する群（G４群）と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを投与する群（G６群）、IL-２３のみを投与する群（G７群）に分けた。
【０１０３】
G４群には、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２３をそれぞれ交互に６回ずつ投与した。G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを、G７群にはIL-２３のみをそれぞれ６回ずつ投与した。G１群には投与しなかった。
【０１０４】
その後解剖して脾臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【０１０５】
その結果、G４群のコロニー数はG６群及びG７群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG４群はG６群,G７群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた。
【０１０６】
また、コントロールであるG１群とG４、G６、G７群について同じ方法で有意差検定を行ったところG４群、G６群、G７群、の全てがG１に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図１１）。
【０１０７】
従って１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２３は脾臓において、それぞれ単独でも効果があるが、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【０１０８】
（実験９）
（１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２７の結核菌に対する相乗効果について）
BALB/ｃマウスにエアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた。これらのマウスを１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２７を投与する群（G４群）と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを投与する群（G６群）、IL-２７のみを投与する群（G７群）に分けた。
【０１０９】
G４群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２７をそれぞれ交互に６回ずつ投与した。G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを、G７群にはIL-２７のみをそれぞれ６回ずつ投与した。
【０１１０】
その後解剖して肺臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【０１１１】
その結果、G４群のコロニー数はG６群及びG７群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG４群はG６群,G７群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図１２）。
【０１１２】
従って１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-２７は肺臓において、組み合わせて用いると結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【０１１３】
（実験１０）
（１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの結核菌に対する相乗効果について）
エアゾルチャンバーで結核菌を肺感染させた８週齢のDBA/１マウスを１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターを投与する群（G１１群）と１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみを投与する群（G６群）、HSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターのみを投与する群（G１２群）に分けた。
【０１１４】
G１１群には１５Ｋグラニュライシン体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターをそれぞれ６回ずつ交互に投与した。G６群には１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターのみ、G１２群にはHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターのみを６回投与した。
【０１１５】
その後解剖して肝臓の細胞を７H１１平板寒天培地で１４日間培養し、結核菌のコロニー数を測定した。
【０１１６】
その結果、G１１群のコロニー数はG６群及びG１２群に比べ少なく、各群３匹ずつのコロニー数を対数（log１０）にして有意差検定を行ったところG１１群はG６群、G１２群に対して統計学的有意差（P＜０．０５）をもって結核菌数の減少が認められた（図１３）。
【０１１７】
従って、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの組み合わせは肝臓においてそれぞれ単独で用いるよりも結核菌に対する殺傷性が有意に向上し相乗効果があることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明により、有効成分として、１５Kグラニュライシンと１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターの組み合わせ、１５KグラニュライシンとIL-６、IL-２３またはＩＬ−２７の組み合わせ、１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとIL-６、ＩＬ−２３またはＩＬ−２７の組み合わせ及び１５Kグラニュライシンの体内発現ベクターとHSP６５DNAとIL-１２DNA体内発現ベクターの組み合わせを含み、副作用が少なく、かつ、細菌が耐性獲得をし難い、有効な感染症治療剤を提供することができる。
【図１】
2010254662.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010254662.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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