(57)【要約】【課題】バチルス・リケニホルミスＢ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１）菌株、好アルカリ性酵素液及びその製造方法を提供する。【解決手段】上記課題を達成するため、本発明は、バチルス・リケニホルミスＢ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１）菌株を用いてｐＨ１０〜１３で最適活性を示す好アルカリ酵素であるセルラーゼを生産する。このように生産された好アルカリ酵素及びこれを含む酵素液はアルカリ環境で優れた活性を有することにより、洗剤またはバイオ燃料の製造工程のような様々な用途に活用できる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ領域で最適な活性を示すセルラーゼが生産可能であることを特徴とするバチルス・リケニホルミスＢ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１）菌株。
【請求項２】
前記バチルス・リケニホルミスＢ１は、ＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰである請求項１に記載のバチルス・リケニホルミスＢ１菌株。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のバチルス・リケニホルミスＢ１菌株から誘導されたセルラーゼを含み、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ領域で最適な活性を示すことを特徴とする好アルカリ性酵素液。
【請求項４】
ｐＨ３〜７の領域に比べ、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ性領域において、より高い酵素活性数値を示す場合を、前記ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すことの指標として用いた請求項３に記載の好アルカリ性酵素液。
【請求項５】
前記ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すとは、ｐＨ１３で８０％以上の酵素活性数値を示すものである請求項３又は請求項４に記載の好アルカリ性酵素液。
【請求項６】
前記セルラーゼは、１０番目〜４６０番目のアミノ酸領域のうち、１０番目〜３８番目に信号シーケンスが位置し、前記信号シーケンスのアミノ末端にＬｙｓ−Ａｒｇのような塩基性アミノ酸の反復領域及び疏水性領域が位置するアミノ酸の配列を有するβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅであることを特徴とする請求項３〜請求項５のいずれかに記載の好アルカリ性酵素液。
【請求項７】
ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すセルラーゼが含まれる好アルカリ性酵素液を製造する方法であって、
バチルス・リケニホルミスＢ１菌株を、セルロースを基質にして培養した後、遠心分離して上澄み液を得るステップと、
前記上澄み液を、再び遠心分離して３０００Ｄａ以上の物質を分離するステップ、
とを含むことを特徴とする好アルカリ性酵素液の製造方法。
【請求項８】
前記バチルス・リケニホルミスＢ１は  ＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰである請求項７に記載の好アルカリ性酵素液の製造方法。
【請求項９】
前記セルラーゼは、１０番目〜４６０番目のアミノ酸領域のうち、１０番目〜３８番目に信号シーケンスが位置し、前記信号シーケンスのアミノ末端にＬｙｓ−Ａｒｇのような塩基性アミノ酸の反復領域及び疏水性領域が位置するアミノ酸の配列を有するβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅである請求項７又は請求項８に記載の好アルカリ性酵素液の製造方法。
【請求項１０】
ｐＨ３〜７の領域に比べ、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ性領域において、より高い酵素活性数値を示す場合を、前記ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すことの指標として用いた請求項７〜請求項９のいずれかに記載の好アルカリ性酵素液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・リケニホルミスＢ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１）菌株に関するものである。より詳しくは、バチルス・リケニホルミスＢ１菌株を用いてアルカリ環境で最適活性を示す酵素を生産することにより、生産された酵素を洗剤製造のような様々の用途で使用可能とする。
【背景技術】
【０００２】
近年、韓国の伝統的発酵食品である清麹醤が、整腸、血液循環改善等の機能性食品として脚光を浴びている。この清麹醤は、国によっては、テンペ、豆?、キネマ、納豆等と呼ばれる場合がある。清麹醤は、大豆の発酵食品であって、発酵が行われることで、非特許文献１に開示されているように、本来、大豆には存在しなかった微細物、酵素及び様々な生理活性物質が新たに作り出される。
【０００３】
そして、清麹醤の発酵は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物を用いて行われるが、清麹醤属の一つの酵素であるＢａｃｉｌｌｕｓタンパク質分解酵素は、非特許文献２にも開示があるように、日本でも納豆キナーゼと呼ばれ、人体で血栓溶解の効果があることが知られている。
【０００４】
ここで、本件出願に係る発明の発明者等は、特許文献１の韓国特許（発明の名称：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１菌株及びその利用）で、多量のプロテアーゼ及びアミラーゼを分泌しながら成長することで、ポリグルタム酸として知られているバイオポリマーを大量生産するバチルス・リケニホルミスＢ１菌株（ＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰ）とその菌株を用いる清麹醤及び醤油の製造方法を提唱してきたことを明記しておく。
【０００５】
【非特許文献１】李在重など、１９９９，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１による清麹醤及び醤油発酵、微細物学会紙３５，２９６−３０１
【非特許文献２】Ｓｕｍｉ，  Ｈ．，  Ｈ．  Ｈａｍａｄａ，  Ｋ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｈｉｒａｔａｎｉ．  １９９０．  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ．  Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．８４，１３９−１４３
【特許文献１】韓国特許  第１０−０３６８１８３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述の大豆を発酵させて得られる清麹醤には、粘質性のポリグルタミン酸やプロテアーゼが存在するということが広く知られているにも拘わらず、清麹醤で炭水化物を分解するセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）に対する研究が置き去りにされている。即ち、高分子炭水化物が分解して転化するｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅは、様々な生理活性を有することが知られているが、この有用な特性を発揮するセルラーゼの安定生産が困難であり、当該セルラーゼの新たな製造方法とその生産に使用可能な菌株に対する研究が望まれてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本件出願に係る発明の発明者等は、特許文献１の韓国特許で開示したバチルス・リケニホルミスＢ１菌株（ＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰ）を用いて、長年の研究と努力の末、このような清麹醤発酵菌株バチルス・リケニホルミスＢ１から炭水化物を分解するセルラーゼの生成を確認し、以下の発明内容に想到した。以下、本件発明の概要に関して述べる。
【０００８】
本件発明に係るバチルス・リケニホルミスＢ１菌株：  本件発明に係るバチルス・リケニホルミスＢ１菌株は、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ領域で最適な活性を示すセルラーゼが生産可能であることを特徴とする菌株である。
【０００９】
本件発明に係るバチルス・リケニホルミスＢ１菌株は、ＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰのバチルス・リケニホルミスＢ１菌株を用いることが好ましい。
【００１０】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液：    本件発明に係る好アルカリ性酵素液は、上述のバチルス・リケニホルミスＢ１菌株から誘導されたセルラーゼを含み、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ領域で最適な活性を示すことを特徴とする。
【００１１】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液において、ｐＨ３〜７の領域に比べ、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ性領域において、より高い酵素活性数値を示す場合を、前記ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すことの指標として用いることが好ましい。
【００１２】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液において、前記ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すとは、ｐＨ１３で８０％以上の酵素活性数値を示すことが好ましい。
【００１３】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液において、前記セルラーゼは、１０番目〜４６０番目のアミノ酸領域のうち、１０番目〜３８番目に信号シーケンスが位置し、前記信号シーケンスのアミノ末端にＬｙｓ−Ａｒｇのような塩基性アミノ酸の反復領域及び疏水性領域が位置するアミノ酸の配列を有するβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅであることが好ましい。
【００１４】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液の製造方法：  本件発明に係る好アルカリ性酵素液の製造方法は、ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すセルラーゼが含まれる好アルカリ性酵素液を製造する方法であって、バチルス・リケニホルミスＢ１菌株を、セルロースを基質にして培養した後、遠心分離して上澄み液を得るステップと、前記上澄み液を、再び遠心分離して３０００Ｄａ以上の物質を分離するステップ、とを含むことを特徴とするものである。
【００１５】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液の製造方法において、前記バチルス・リケニホルミスＢ１は  ＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰのバチルス・リケニホルミスＢ１菌株を用いることが好ましい。
【００１６】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液の製造方法において、前記セルラーゼは、１０番目〜４６０番目のアミノ酸領域のうち、１０番目〜３８番目に信号シーケンスが位置し、前記信号シーケンスのアミノ末端にＬｙｓ−Ａｒｇのような塩基性アミノ酸の反復領域及び疏水性領域が位置するアミノ酸の配列を有するβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅであることが好ましい。
【００１７】
本件発明に係る好アルカリ性酵素液の製造方法において、ｐＨ３〜７の領域に比べ、ｐＨ１０〜ｐＨ１３のアルカリ性領域において、より高い酵素活性数値を示す場合を、前記ｐＨ１０〜ｐＨ１３で最適な活性を示すことの指標として用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、アルカリ性ｐＨの領域で、良好な高い活性を示すセルラーゼの生産が可能なバチルス・リケニホルミスＢ１菌株の提供が可能になる。また、このバチルス・リケニホルミスＢ１菌株から誘導されたセルラーゼを含み、アルカリ性ｐＨの領域で最適な活性を示す好アルカリ性酵素液の提供が可能になる。更に、上記菌株を培養し、遠心分離し、アルカリ性ｐＨと塩基性範囲で最適活性を示すセルラーゼを含有する好アルカリ性酵素液の製造を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の具体的な実施例を詳説することで、本件発明の最良の実施形態を理解できるようにすることとする。
【００２０】
本発明者等は、従来からタンパク質分解酵素を生産することで広く知られている清麹醤発酵菌株であるバチルス・リケニホルミスＢ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１）から炭水化物を分解するセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）の生成を確認し、このセルラーゼがアルカリ性環境（ｐＨ１０〜ｐＨ１３）で最適活性を示すβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅであることを確認して、本件発明に想到したと言う経緯を有している。
【００２１】
従って、本発明は、アルカリ性ｐＨと塩基性範囲で活性の高いセルラーゼを生産するバチルス・リケニホルミスＢ１菌株に関するものであり、このような本発明により生産された酵素及びこれを含む酵素液は、アルカリ環境で優れた活性を有するため、洗剤又はバイオ燃料の分野、その他様々の分野での用途に利用可能である。
【００２２】
以下の実施例及び実験例で種菌として使用したバチルス・リケニホルミスＢ１は、本発明者等の特許文献１（韓国特許出願番号：第２０００−１８７２４号，韓国登録特許第０３６８１８３号）に開示のＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰ菌株である。このＫＣＴＣ  ０７５５ＢＰ菌株は、２０００年３月１４日付けで生命工学研究所（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）に寄託した。
【００２３】
以下、本発明の構成を実施例及び実験例を例示して詳説するが、本発明の権利範囲は、これらの実施例に限定解釈されるものではないことを明記しておく。
【実施例１】
【００２４】
この実施例１では、本発明に係る好アルカリ性酵素液の製造に関して述べる。ここでは、基質として、１％のセルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を添加したＬＢ液体培地を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１を１６時間かけて培養した後、遠心分離して、その上澄み液を得た。その上澄み液を３０００Ｄａのメンブランフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ）に入れて、遠心分離することで、３０００Ｄａ以上のタンパク質を得た。即ち、当該メンブレンフィルターに付着している３０００Ｄａ以上のタンパク質を、ｐＨ７．０のＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に溶解させ、本発明に係る好アルカリ性酵素液を製造した。
【実施例２】
【００２５】
この実施例２では、本発明に係る好アルカリ性酵素液のセルラーゼ生成の確認を行った。この実施例２は、実験例１〜実験例３を順に行ったものであり、以下に各実験例に関して順に述べる。
【００２６】
実験例１：  この実験例１は、「Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  テスト」である。このＣｏｎｇｏ  ｒｅｄ  テストは、以下のようにして実施した。最初に、０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で、Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  （Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ／以下、単に「ＣＭＣ」と称する。）を入れたＬＢ寒天培地に「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１」を塗布し、３７℃×１４時間の培養を行った。この培養後の平板培地に、０．１％（ｗ／ｖ）濃度の「Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  溶液」を添加して処理した後、３０分間放置した。１Ｍ濃度のＮａＣｌ溶液で、「Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  溶液」を洗浄した後、活性測定を行った。
【００２７】
その結果、ＣＭＣが含まれている培地に「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１」を接種したときから、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１」によりＣＭＣの分解が始まり、その分解された部分が染色剤である「Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ」により染色された。これにより、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１」菌株は、ＣＭＣを分解してセルラーゼを分泌することが推定できる。
【００２８】
実験例２：  この実験例２は、「活性染色テスト」である。この「活性染色テスト」は、以下のようにして実施した。基質と反応させるために「ＳＤＳ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ」に入れる蒸留水の代わりに、１％（ｗ／ｖ）濃度のＣＭＣ水溶液を使用した。そして、実施例１で準備した好アルカリ性酵素液を用いて、これを電気泳動した後、０．１Ｍ濃度のＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ｐＨ７）で洗浄し、室温の２．５％（ｖ／ｖ）濃度の非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の中に３０分間浸漬した。そして、同一緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて、４０℃×４時間の酵素−基質反応を行わせた。その後、０．１％濃度の「Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  溶液」で１５分間染色し、１Ｍ濃度のＮａＣｌ溶液で十分に洗浄した後、活性バンドを観察した。
【００２９】
その結果、ｇｅｌ相における酵素活性を調べるための活性染色を施したときも、一つの活性バンドが確認された（資料の添付は省略している。）。このことから、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１」菌株は、セルラーゼを分泌することが推察できる。
【００３０】
実験例３：  この実験例３は、「ＴＬＣ分析」である。この「ＴＬＣ分析」は、以下のようにして実施した。実施例１で準備した酵素液０．５  ｍｌと１％ＣＭＣを溶かした基質０．５ｍｌとを混合し、４０℃×２４時間の反応をさせた後に、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  ＴＬＣ  ｐｌａｔｅ  （Ｍｅｒｃｋ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポット（ｓｐｏｔ）した。この際、［ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ］：［ｅｔｈａｎｏｌ］：［ａｍｍｏｎｉａ］：［ｗａｔｅｒ］＝５０：６０：１：３０の割合になるように混合して展開溶媒として使用した。展開した後、空気中で乾燥させ、［４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ］：［Ｈ２ＳＯ４］：［ｇｌａｃｉａｌ  ａｃｅｔａｔｅ］：［ｅｔｈａｎｏｌ］＝５：５：１：９０の割合で混合した溶液をスプレーした後、１２０℃×１０分間の発色を行わせた。
【００３１】
図１は、本発明の好ましい一実施例によるセルラーゼ酵素液により分解されたＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）のＴＬＣ（Ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析写真である（ここで、ライン１は本発明による酵素液が処理されず、ライン２、３は本発明による酵素液が０．１％ＣＭＣ溶液に含まれたことである）。示したように、本発明による酵素液によるＣＭＣの加水分解産物がｇｌｕｃｏｓｅの下方で見えることから、加水分解物は２炭糖以上のｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅと考えられる（図１を参照）。また、ＣＭＣを分解することから本発明による酵素液はセルラーゼを含有すると考えられる。
【実施例３】
【００３２】
この実施例３では、本発明に係る好アルカリ性酵素液の最適ｐＨ及び温度決定を行った。この実施例３は、以下の実験例１及び実験例２を順に行ったものであり、以下に各実験例に関して順に述べる。
【００３３】
実験例１：  この実験例１では、本発明に係る好アルカリ性酵素液の最適ｐＨ決定を行った。この好アルカリ性酵素液の最適ｐＨ決定は、以下のようにして実施した。最初に、０．１Ｍ濃度のＴｒｉｓ−ＣｌのｐＨを、ＨＣｌやＮａＯＨで調節して、様々な範囲のｐＨ  ｂｕｆｆｅｒを製造した。実施例１で準備した酵素液０．５ｍｌと１％濃度のＣＭＣを溶かした基質０．５ｍｌとを混合し、各ｐＨにおいて、４０℃×１時間の反応を行わせた後、ＤＮＳ法を用いて吸光度を測定した。この加水分解により生成した還元糖は、３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｄ  （ＤＮＳ）による方法に準じて、５５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００３４】
その結果、図２に示したように、ｐＨ７以下では酵素の活性が弱く、ｐＨ１０で最高活性を示し、それ以上のｐＨ範囲でも良好な活性を維持した。今までに、幾つかの好アルカリ性  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１、４−ｇｌｕｃａｎａｓｅの存在が報告されているが、本発明に係る好アルカリ性酵素は、ｐＨ１０という強いアルカリで最適活性を示す点に特徴がある。特に、ｐＨ１３という最強のアルカリ領域でも、優れた活性を示すことが特徴である。すなわち、ｐＨ１０〜１３の強いアルカリ領域で、８０％〜１００％の範囲、好ましくは８５％〜９５％の範囲の酵素活性数値を示す。特に、ｐＨ１３というアルカリ環境においても８０％以上の酵素活性数値を示し、好ましくは８０％〜８５％の範囲の酵素活性数値を示すことである。
【００３５】
このように本発明に係る酵素は、ｐＨ１０〜１３の強いアルカリ領域で、良好な活性を示すことから、新たな洗剤開発に応用することも好ましい。従来の大部分の洗剤は、カビから抽出したＢａｃｉｌｌｕｓ菌株を培養して使用してきたが、カビから抽出したＢａｃｉｌｌｕｓ菌株から洗剤製造するのに比べて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１菌株から製造した好アルカリ性酵素液を用いることの方が、遙かに優れた洗剤の生産効率が得られることが明らかである。更に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１菌株から製造した好アルカリ性酵素液は、バイオ燃料の生産のように、強アルカリ環境下で高い酵素活性を必要とする様々の用途での使用等に好適であり、強アルカリ環境下で高い酵素活性を必要とする用途であれば、特段の制限無しに使用可能である。
【００３６】
実験例２：  この実験例２では、本発明に係る好アルカリ性酵素液の使用に際しての最適温度の決定を行った。この好アルカリ性酵素液の使用最適温度決定は、以下のようにして実施した。  
【００３７】
ｐＨ１０の０．１Ｍ濃度のＴｒｉｓ−Ｃｌに１％濃度のＣＭＣを溶かした基質０．５ｍｌと、実施例１で準備した好アルカリ性酵素液０．５ｍｌを混合し、各温度で１時間反応させた後、ＤＮＳ法を用いて吸光度を測定することにより行った。
【００３８】
その結果、図３に示したように、本発明に係る好アルカリ性酵素の酵素活性に関する最適温度は、４０℃であり、２０℃では最大活性の４０％、５０℃では最大活性の６８％を示しており、一定のレベルの耐熱性を示している。そして、この温度が６０℃を超えると、酵素の活性は急激に減少することが分かった。
【実施例４】
【００３９】
この実施例４では、清麹醤及び麦清麹醤からの本発明に係る好アルカリ性酵素の生成確認を行った。この生成確認は、以下のようにして実施した。  
【００４０】
バチルス・リケニホルミスＢ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１）を、ＬＢ培地で３７℃×１８時間培養し、この培養した菌株培養液をｓｔａｒｔｅｒとして利用し、精選された白太を１８時間水漬けした。そして、１２０℃×３０分間の加熱処理を施し滅菌した原料大豆５００ｇあるいは当該原料大豆に５ｇの粉末麦を含ませた大豆（麦清麹醤用）に、上記菌株培養液含有量が１％となるように接種した。この接種の後、４０℃の温度に保持した培養機で発酵を行わせた。
【００４１】
このようにして、大豆に対して、本発明による  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１菌株を接種して清麹醤発酵させた後、一定量を水に溶かし、その上澄み液を得て、その上澄み液のＤＮＳ分解能を測定すると、図４に示したように、培養時間が６時間〜３０時間の間で、活性が更に増加することが確認できた。図４は、本発明により清麹醤及び麦含有清麹醤内に含まれたセルラーゼ酵素の培養時間に応じた活性度を例示的に示したグラフである。ここで、図４の表中で、プロット点■は清麹醤における酵素活性であり、プロット点□は麦含有清麹醤における酵素活性を示す。
【００４２】
これは、菌株の分解酵素が、培養時間が６時間経過したときから誘導されると考えられる。このように分解酵素が誘導されるため、大豆自体にも酵素の基質が多量に存在すると推定される。また、大豆に対して麦を含ませて発酵させると、大豆を単独で使用した場合に比べ、酵素活性がより増加することが分かった（図４参照）。これは、麦にも酵素の基質が相当量存在していることを裏付ける。このことから、麦の加水分解物に含まれるβ−１，３結合は、免疫増強効果があると推定できる。
【００４３】
麦内胚乳のβグルカン（β−ｇｌｕｃａｎ）は、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）を基本単位として構成され、β−１，３−１，４結合からなるホモポリマー（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）である。β−Ｇｌｕｃａｎａｓｅには、β−１，３、β−１，４、β−１，３−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ等の３種類があり、そのうち、β−１，３−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅは、麦やｌｉｃｈｅｎａｎのβ−１，３に隣接したβ−１，４結合を認識して選択的に切断する。本研究で使用した清麹醤発酵菌株でも、このような酵素が存在するか否かを、後述する該当遺伝子のクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）と酵素活性などにより確認した結果、β−１，３−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅでないβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅが確認された（図５参照）。これにより、清麹醤にもβ−１，３結合を有する麦を添加し、発酵させることで、人体の免疫効果を増大させる効果が期待できることが確認できる。
【実施例５】
【００４４】
この実施例５では、本発明に係る好アルカリ性酵素の遺伝子分析を行った。以下に、この実施例５に関して述べる。
【００４５】
まず、β−１，４−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ遺伝子を、クロニーングするため、本発明に係る手法で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１から生産されたβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅのｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡを、分離、精製した。ＰＣＲのためのｐｒｉｍｅｒとしてのフォワードプライマ（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）は「５’−ＡＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＡＴ−３’」、リバースプライマ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）としては「５’−ＣＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡ−３’」を使用した。ＰＣＲは、１サイクル当たり、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分３０秒の条件で３０サイクルを実施した。このＰＣＲで得られた結果物を、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＥＡＳＹ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）に連結して、プラスミドを準備した。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）とクロニーングされた遺伝子を有しているＥ．ｃｏｌｉで発現されたタンパク質とを電気泳動実験により比較して確認した結果、図６に示したように、クロニーングされた遺伝子を有しているＥ．ｃｏｌｉのみで、５０ｋＤａに該当するセルラーゼ（ｇｌｕｃａｎａｓｅ）を確認することができた。
【００４６】
さらに、本発明による  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１菌株から生産されたβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅのアミノ酸の配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１１（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＦ０７０１９５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＵＭＡＳ  １００２  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（ｅｎｇＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３６３６３５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＬＧ  ｅｎｄｏ−β−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１６１８５）と比較した（ｈｔｔｐ／／：ｂｉｏｉｎｆｏ．  ｇｅｎｏｐｏｌｅ−ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｐｒｄ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇを用いて分析した）。
【００４７】
このようにクロニーングされた本発明によるセルラーゼ遺伝子を、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて検索した結果、図５に示したように、相同性が非常に高い、三つの他のβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ遺伝子を確認した。すなわち、本発明による  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１  ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｂ１）のタンパク質のシーケンスを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１１  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（Ｋ１１）、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＵＭＡＳ  １００２  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（ＵＭＡＳ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＬＧ  ｅｎｄｏ−β−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ＤＬＧ）と比較した。
【００４８】
その結果、タンパク質をコーティングする領域１０番目〜４６０番目のアミノ酸の領域のうち、四つのｇｌｕｃａｎａｓｅは、３２箇所でｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ断片を示した（図５を参照）。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１と、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＬＧとを比較すると、上記領域のうち１６箇所で差を示した（図５参照）。また、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１と、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｋ１１とを比較すると、同一領域の２０箇所でｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ断片の差が見られた（図５参照）。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅと比較したとき、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１  ｇｌｕｃａｎａｓｅは、１２箇所で一致しなかったが、残りの部分では全部一致した（図５を参照）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＫＳＭ−Ｎ２５２のｅｎｄｏ−β−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｅｇ１）とアミノ酸とで相同性を比較した結果、本発明による菌株のｇｌｕｃａｎａｓｅは、Ｅｇ１等とは全く異なる種類のものであることが判明した（資料省略）。
【００４９】
そして、既に公知のＤＬＧと比較した結果、このｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅの信号シーケンスは１０〜３８であり、Ａｌａ３６−Ｓｅｒ−Ａｌａ３８のＡｌａ３８の後ろで切断が発生し、ｍａｔｕｒｅ酵素のアミノ末端は、Ａｌａ３９−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ４７を含むと考えられる。本酵素の信号シーケンスにおけるアミノ末端には  Ｌｙｓ−Ａｒｇのような塩基性アミノ酸の反復、その次に疏水性領域が位置するなど、信号シーケンスにおける典型的な特徴を示している（図５参照）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＬＧの酵素活性に対しては簡略な報告があるが、残るｇｌｕｃａｎａｓｅの生化学的な特性に対する報告は、全く行われていない状態である。特に、これら三つのβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅの最適ｐＨが塩基性であるというものは全く見受けられない。一旦、本実施例から理解できるように、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ遺伝子がクロニーングされているため、これに基づいて本酵素遺伝子発現の調節機作、酵素の大量生産、分離精製及び生化学的特性決定等の作業が、より容易となると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上に述べてきた本発明によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１菌株から生産されたセルラーゼ酵素及びこれを含む酵素液は、アルカリ環境で優れた活性を有することにより、洗剤またはバイオ燃料製造工程のような様々な用途に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の好ましい一実施例によるセルラーゼ酵素液により分解されたＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）のＴＬＣ（Ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析写真である。
【図２】本発明の好ましい一実施例によるセルラーゼ酵素のｐＨによる活動度を示したグラフである。
【図３】本発明の好ましい一実施例によるセルラーゼ酵素の温度による活動度を示したグラフである。
【図４】本発明により清麹醤及び麦含有清麹醤内に含まれたセルラーゼ酵素の培養時間による活動度を例示的に示したグラフである。
【図５】本発明の好ましい一実施例によるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂ１と従来のβ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅ遺伝子のアミノ酸のシーケンスを示した模式図である。
【図６】本発明によりクロニーングされた遺伝子を有しているＥ．Ｃｏｌｉのみで５０ｋＤａに該当するｃｅｌｌｕｌａｓｅ（ｇｌｕｃａｎａｓｅ）が確認できる電気泳動実験結果写真である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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