(57)【要約】【課題】スループットの更なる向上を図ったシーケンサを提供する。【解決手段】本発明では低価格な高輝度ＬＥＤ光源を使用して、蛍光励起強度の１０倍以上のパワー密度を達成する。これにより検出における励起光照射時間を１／１０以下とすることで検出に要する時間を短縮する。これにより従来律速となっていた最小ユニットの反応時間内に３枚以上の複数の反応基板を並列に処理することにより、スループットの向上を図ることが可能となる。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液を注入する穴を少なくとも２個以上保持する基板と、注入される水溶液中に含まれる微粒子と強く結合する表面処理を施されている光透過性を持つ基板と、２つの基板の間隔を一定に保つためのスペーサと、前記スペーサを２つの基板で挟んで張り合わせることにより形成されることを特徴とする反応容器。
【請求項２】
請求項１記載の反応容器において、前記微粒子の表面に増幅された複数の核酸断片が結合していること特徴とした反応容器。
【請求項３】
請求項２記載の反応容器において、前記核酸断片の配列解析を前記基板上に結合した微粒子からの４色以上の蛍光信号に基づいて前記核酸断片の配列解析すること特徴とした反応容器。
【請求項４】
請求項３記載の反応容器において、前記スペーサの厚みが３５０±５０ｕｍであることを特徴とした反応容器。
【請求項５】
請求項４記載の反応容器において、前記光透過性を持つ基板の大きさが２５×７５mmであることを特徴とした反応容器。
【請求項６】
請求項５記載の反応容器において、前記微粒子の直径が１ｕｍであることを特徴とした反応容器。
【請求項７】
水溶液を注入する穴を少なくとも２個以上保持する基板と、複数の微粒子を結合させた光透過性を持つ基板と、２つの基板の間隔を一定に保つためのスペーサと、前記スペーサを２つの基板で挟んで張り合わせることにより形成されることを特徴とする反応容器。
【請求項８】
請求項７記載の反応容器において、前記微粒子がランダムに前記光透過性を持つ基板上に結合していることを特徴とした反応容器。
【請求項９】
請求項７記載の反応容器において、前記微粒子が格子状に前記光透過性を持つ基板上に結合していることを特徴とした反応容器。
【請求項１０】
請求項９記載の反応容器において、前記微粒子の大きさが１ｕｍであり、かつ格子間が３ｕｍであることを特徴とした反応容器。
【請求項１１】
複数の反応容器をｎ個保持し、前記反応容器１個の最小ユニットの反応が完了する間に前記複数の反応容器ｎ−１個の計測を自動で完了させ、順次反応を自動で進行させていくことで、計測のスループットをｎ倍に向上させる並列処理装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の装置において、前記反応が請求項１或いは７の容器内で進行することを特徴とする基板表面上におけるシーケンス反応であり、かつ前記シーケンスの最小ユニットの反応に要する時間が９０分以上であり、かつシーケンス反応に用いる蛍光色素の数が４種以上であることを特徴とするシーケンサ。
【請求項１３】
請求項１２記載の装置において、前記蛍光画像測定に用いる光源が２種類以上のＬＥＤであり、かつ蛍光検出方法が対物レンズを介した落射蛍光検出法であり、前記蛍光色素に最適化されたバンドパスフィルタ，ダイクロイックミラー，エミッションフィルタを装着したキューブを回転ターレットにより回転制御し、かつオートフォーカスを行い、蛍光検出に用いるセンサが２次元ＣＣＤカメラであることを特徴とするシーケンサ。
【請求項１４】
請求項１３記載の装置において、前記ＬＥＤ光源のＯＮ−ＯＦＦを回路上から制御することにより蛍光励起のための光の遮断を不要とし、シャッタレスであることを特徴とするシーケンサ。
【請求項１５】
請求項１４記載の装置において、前記ＬＥＤ光源の出力が全て１５ｍＷ／mm2以上であることを特徴とするシーケンサ。
【請求項１６】
請求項１５記載の装置において、２種類のＬＥＤ光源の一つがRoyal Blue色、もう一つがWarm-White色のＬＥＤであり、かつダイクロイックミラーで前記２種類のＬＥＤ光源から発する光を混合し、光路を同一にして照射することを特徴とするシーケンサ。
【請求項１７】
請求項１６記載の装置において、前記ＬＥＤから発する光を高い開口角を持つ非球面レンズにより集光し、対物レンズの後焦点面にＬＥＤの像を結像させることにより、前記反応容器の基板表面で光源の照明ムラを除去した均一な照明であるケーラー照明を行うことを特徴とするシーケンサ。
【請求項１８】
請求項１７記載の装置において、前記反応容器をＸＹステージにより前記対物レンズの計測視野の大きさだけ逐次移動していくことにより前記反応容器の全表面でスキャンすることを特徴とするシーケンサ。
【請求項１９】
請求項１８記載の装置において、前記反応容器を移動させるＸＹステージが反応容器を環状回転させるθステージを含み、反応容器の溶液交換および温度調節を順次回転に伴い処理していくことを特徴とするシーケンサ。
【請求項２０】
請求項１７記載の装置において、対物レンズの後焦点面の外周付近にＬＥＤを結像させることにより前記反応容器の基板表面で臨界角近傍における全反射照明により蛍光を４倍増強することを特徴とするシーケンサ。
【請求項２１】
請求項２０記載の装置において、１００ｎｍのビーズを用いることによりビーズに結合した蛍光色素を全て蛍光増強場内に配置させることにより蛍光を４倍増強することを特徴とするシーケンサ。
【請求項２２】
請求項５記載の反応容器において、前記微粒子の直径が２ｕｍであり、１ｕｍの微粒子と比較してＤＮＡ断片の結合サイトが４倍に増加したことによる蛍光増強効果を特徴とする反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光検出用反応制御装置に関わる。より具体的には、ＤＮＡあるいはＲＮＡなどの核酸の塩基配列を解読するための方法および核酸配列解析装置に関わる。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年から２００５年の間に３０億ドルの予算を投じたヒトゲノム計画では、解読が最も容易な部分（全体の９３％）を予定よりも２，３年早く読み取ることができ、非特許文献１にみられるように解読に必要な技術や方法を遺産として残した。そうした技術はその後もさらに改良が進み、今日では約２０００万ドル（＄２×１０7）程度で、実用に耐えられる精度でのゲノム解読が可能になった。それでもなお、この金額では大規模な塩基配列解読ができるのは、専門の解読センターか、巨額の予算を得た大きな研究プロジェクトに限られる。しかし、配列決定のコストが下がれば、より大量のゲノムを多数扱うことができる。例えば患者と健常者のゲノムの比較が可能となり、結果としてゲノム情報の価値の向上が期待される。非特許文献２にみられるようにこのような基礎的データの取得は将来のテーラーメード医療への発展に大きく寄与することが予想される。
【０００３】
上述した状況の下、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）が資金援助している「革新的ゲノム配列決定技術」のための２つのプログラムは、２００９年までにヒトゲノム解読１人分で１０万ドル（＄１×１０5）、そしてそれを２０１４年までに１０００ドル（＄１×１０3）にすることを目標としている。いわゆる「１０００ドルゲノム」解読技術の開発である。
【０００４】
既に非特許文献３にみられるように４５４Life Science社，Solexa社およびＡＢ社の３社の次世代シーケンサが商品化されている。これらの技術は既に従来技術の１／１０〜１／１００のコストを達成している。また、１回の解析により計測可能な塩基数も１０9オーダーを達成している。しかしながらこれらのシーケンサのコスト面での向上はほぼ頭打ちであり、既に商品化されている装置・方式による＄１０００ゲノムの達成は困難と予想されている。
【０００５】
また、現在市販されている次世代シーケンサは１０9程度までの塩基配列を解読できるものの、１０9塩基に相当する大量データの配列解読のランタイムのみで２，３日以上の時間を要している。医療現場において個人レベルのゲノム配列解読がルーチン・ワークとなるためにはコストのみならず配列解読の高速化が必要となる。
【０００６】
特許文献１にはＡＢ社の次世代シーケンサにおけるシステムの詳細が述べられている。システムは、ＣＣＤカメラ，蛍光顕微鏡，可動ステージ，Peltierフローセル，温度制御装置，液体操作装置および専用のコンピュータを備える。ＡＢ社のシステムでは、Olympusエピ蛍光顕微鏡本体（横向きに設置）を主部とし、自動オートフォーカシングステージおよびＣＣＤカメラを備える。回転式ホルダ内の４つのフィルタキューブにより、さまざまな励起および発光波長での４色検出が可能である。装置はカメラが常時作動中で維持されるように設計されている。そのためにＡＢ社やHelicos社の次世代シーケンサは２つのフローセルを装着して、１つのフローセルの反応時間中にもう１つのフローセルを用いて蛍光画像の取得を行うシステムを採用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５２８０４０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature Reviews, vol5, pp335, 2004
【非特許文献２】『ヒトゲノム完全解読から「ヒト」理解へ』、pp253，服部正平、東洋書店、2005
【非特許文献３】Nature, vol.449, pp627, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記背景技術で説明したように、次世代シーケンシング技術においては更なるスループットの向上が望まれている。しかしながら、シーケンシングのスループット向上において伸長反応に代表される生化学反応が律速となっている。ポリメラーゼを用いる伸長反応及びリガーゼを用いるライゲーション反応のいずれも反応が完了するまでに９０分程度のインキュベーションを要する。このインキュベーション時間をデッドタイムとしないために、ＡＢ社やHelicos社は装置に２つのフローセルを装着して、１つのフローセルの反応時間中にもう１つのフローセルを用いて蛍光画像の取得を行うシステムを採用している。しかしながら、上述の方式でも依然最小ユニットの反応に要する時間が律速なために、スループットの更なる向上が困難であった。
【００１０】
また、次世代シーケンシング技術では、光源ＯＮ／ＯＦＦ時の挙動が不安定なレーザあるいは或いは高出力の水銀ランプやＸｅランプを用いている。これらの光源そのもののＯＮ／ＯＦＦを秒のオーダーで制御することには困難が伴った。そのため、上記いずれの方式においてもＣＣＤのデータ転送時には高価なシャッタにより励起光を遮断する必要があった。
【００１１】
また、蛍光検出を行うための基板として表面修飾を施したスライドガラスが広く用いられている。実験時においてはユーザが手動でスライドガラス上にビーズを吸着させる必要があるが、スライドガラスが剥き出しであるためハンドリングに細心の注意を要するため、使い勝手の改善が待たれている。
【００１２】
また、従来の落射蛍光照明においては通常スライド面に対して励起光を対物レンズの後焦点面の中央に垂直に集光させることでケーラー照明といわれる均一な照明を行っている。この後焦点面の縁に入射後を垂直に集光させスライドガラス表面で全反射照明を達成することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では低価格な高輝度ＬＥＤ光源を使用して、従来用いられてきた水銀ランプなどのアーク光源による蛍光励起の１０倍以上のパワー密度を達成する。これにより検出における励起光照射時間を１／１０以下とすることで検出に要する時間を短縮する。これにより従来律速となっていた最小ユニットの反応時間内に３枚以上の複数の反応基板を並列に処理することにより、従来律速となっていた最小ユニットの反応時間に限定されることなくスループットの向上を図ることが可能となる。
【００１４】
また、ＬＥＤを用いることでシャッタを用いることなく、電流制御により励起光の照射を制御できる。従って、シャッタレスのシステムの構築が可能となり、低コスト化が図れる。
【００１５】
また、スライドガラスをパッケージングすることにより、スライドガラスのハンドリングを容易なものとする。更にパッケージングしたスライドガラス中に蛍光色素の発光の基点となるビーズを予め配置することにより、更にユーザの負担を軽減することが可能となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の蛍光測定装置は低価格なＬＥＤ光源を使用して、検出に要する時間を短縮する。これにより最小ユニットの反応時間内のスキャン枚数を３枚以上に並列化する。本発明の効果として低コストかつハイスループットなＤＮＡシーケンサのシステムを実現する。
【００１７】
また、ＬＥＤの採用によるシャッタレスのシステムを構築し、装置の低コスト化を実現する。
【００１８】
更にスライドガラスのパッケージ化を図ることにより、ユーザの操作性を向上させる効果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１におけるスライドガラスのパッケージングについての説明図。
【図２】実施例２におけるシーケンス反応についての説明図。
【図３】実施例３において用いる蛍光色素の吸収スペクトルと蛍光スペクトル。
【図４】実施例３における２個或いは４個のＬＥＤより構成される光源についての説明図。
【図５】実施例３におけるＬＥＤ照明のために用い光学素子の配置についての説明図。
【図６（ａ）】実施例３におけるRoyal BlueのＬＥＤの発光スペクトル。
【図６（ｂ）】実施例３におけるWarm WhiteのＬＥＤの発光スペクトル。
【図６（ｃ）】実施例３におけるＬＥＤからの発光を混合するためのダイクロイックミラーの透過特性。
【図６（ｄ）】実施例３における４蛍光色素用のバンドパスフィルタの透過特性。
【図６（ｅ）】実施例３における４蛍光色素用のエミッションフィルタの透過特性。
【図６（ｆ）】実施例３における４蛍光色素用のダイクロイックミラーの透過特性。
【図７】実施例３における落射蛍光装置についての説明図。
【図８】実施例３においてシャッタレス化した場合のタイミングチャート。
【図９】実施例４における複数のスライドガラスの並列処理する方法についての説明図。
【図１０】実施例４における複数のスライドガラスの並列処理する方法についての説明。
【図１１】実施例４における複数のスライドガラスの並列処理する方法についての説明。
【図１２】実施例５におけるスライドガラスのパッケージングについての説明図。
【図１３】ＤＮＡ断片が多数結合したビーズをスライドガラスに固定する説明図。
【図１４】ビーズが予め配列されたスライドガラスがパッケージングされている場合の説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の実施例として、解析すべきＤＮＡ断片を複数結合したビーズを予めパッケージングされたスライドガラス上に固定する方法について図１を用いて以下に説明する。パッケージングされたスライドガラスは上面のカバー１０３とスライドガラス１０７によってスペーサ１０４を挟み込むことにより形成する。溶液交換を円滑に行うため、スペーサの１０４厚みは３５０ｕｍ程度が望ましい。カバー１０３上面には溶液のインレットとなるセプタ１０１及びアウトレットとなるセプタ１０２が形成されている。このセプタ１０１、１０２に注射針などを挿入し、溶液を注入することでフローセル内に溶液を満たすことができる。この場合、セプタ１０１をインレットとして、溶液を注入する。セプタ１０２はアウトレットとして空気抜きの役割を担う。溶液内にはプローブオリゴ１０９を複数固定したビーズ１０８が多数存在している。ビーズ１０８はスライドガラス１０７と接触した際に共有結合を形成するように化学処理されているため、溶液を満たしたスライドガラス１０７を遠心することによりビーズ１０８はスライドガラス１０７上に沈降し、固定される。
【００２１】
パッケージングされていないままのスライドガラス１０７を用いる場合、スライドガラス１０７の表面をユーザが不注意に触れてしまう危険性があった。また、スライドガラス１０７に固定したビーズ１０８は乾燥すると化学状態が変化してしまうため、後段のシーケンシング反応が円滑に進行しなくなる。従ってビーズ１０８が結合したスライドガラス１０７の表面には乾燥を発生させないため、常時水溶液内に存在させる必要がある。従って、本実施例で説明したパッケージングされたスライドガラス１０７を用いることにより、スライドガラス１０７への接触及びスライドガラス１０７上のビーズ１０８の乾燥を防止することが可能となる。また、予めパッケージングされたスライドガラス１０７を使用することにより、操作性よくビーズ１０８をスライドガラス１０７上に固定することが可能となる。
【００２２】
次に本発明の第２の実施例として、シーケンス反応について図２を用いて以下に説明する。フローセル２１３内のスライドガラス表面には反応液がセプタ２１１，２１２を通して注入されている。反応液はそれぞれ異なる蛍光色素でラベルされた４種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼを含む。各ヌクレオチドはそれぞれＦＡＭ−ｄＣＴＰ２１４，Ｃｙ３−ｄＡＴＰ２１５，ｙ５−ｄＣＴＰ２１６，Ｃｙ５−ｄＣＴＰ２１７である。各ヌクレオチドの濃度は２００ｎＭである。また、反応液は伸張反応が効率よく行われるように塩濃度，マグネシウム濃度およびｐＨが最適化されている。計測領域２１８は、サンプル面上における対物レンズの計測可能な視野である。従ってスライドガラス全面を計測するためには、少なくともスライドガラス全面の面積を計測領域２１８の面積で除した数だけスキャンする必要がある。反応開始前に配列を解読したいＤＮＡ断片２０６とプローブオリゴ２０５はハイブリダイゼーションさせる。反応溶液中にはポリメラーゼが含まれており、ＤＮＡ断片２０６に相補的な蛍光ヌクレオチドが１塩基だけ取り込まれる。２塩基目の伸長が発生しないのは、１塩基目の蛍光色素がバルキーであるため、２塩基目の取り込みについて立体障害を起こすからである。１塩基が取り込まれた後、浮遊する蛍光ヌクレオチドを洗浄により除去した後、蛍光計測を行う。なお、以降の最小ユニットの反応を行うために、蛍光計測後、解離溶液により塩基から蛍光色素を解離させる工程が必須である。この工程により、最小ユニットの反応における蛍光色素の立体障害をリセットすることができる。これにより反応の継続が可能となる。再び蛍光ヌクレオチドをフローセル内に送液し、反応を繰り返すことにより、ＤＮＡ断片２０６の逐次的なシーケンスが可能となる。
【００２３】
次に本発明の第３の実施例として、ＬＥＤを蛍光色素の励起用光源として用いるシーケンス反応計測にいついて図３，図４，図５，図６，図７，図８を用いて以下に説明する。シーケンス反応には実施例２で説明したように４種類の蛍光色素を用いる。より具体的な４種類の蛍光色素セットの例としては図３に示すようにＦＡＭ，Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５を挙げることが可能である。図３（ａ）および（ｂ）にＦＡＭ，Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５の吸収および発光特性を示す。図３（ａ）よりＦＡＭ，Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５の最適な励起波長は４９５，５１２，５９０，６５０ｎｍであることがわかる。この４つの蛍光色素を励起するために、図４（ａ）で示すように２つのＬＥＤを用いることが考えられる。より具体的には１つはRoyal Blue色のＬＥＤであり、これはＦＡＭの励起に用いる。もう１つは広い波長範囲に渡って励起光を発生することができるWarm-White色のＬＥＤであり、これはＣｙ３，Texas Red，Ｃｙ５の励起に用いる。この２つのＬＥＤの発光特性を図６（ａ），（ｂ）に示す。Royal Blue色のＬＥＤ４０１はスペクトル幅が小さく、４５０ｎｍ付近に発光中心波長を持ち、ＦＡＭ蛍光色素を効率よく励起することができる。Warm-white色のＬＥＤ４０２は白色光源に近い広いスペクトル幅を示し、Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５を効率よく励起することができる。それぞれのＬＥＤのカタログに記載されている出力は５１５ｍＷ，１８０lumenである。また、これらのＬＥＤから発せられた光より色素励起に最適な波長成分を通過させるためのバンドパスフィルタの波長特性を図６（ｄ）に示す。４つの色素の励起時にはこれらのバンドパスフィルタを光源であるＬＥＤの前に順次設置することにより、各色素に最適な励起光を選択することができる。
【００２４】
ＬＥＤ４０１，４０２は７００ｍＡの電流を流すことにより発光する。ＬＥＤ４０１，４０２の素子サイズは１mm角であるが、砲弾レンズのために見かけの素子サイズは１.３９mm角となる。
【００２５】
ＬＥＤ照明を行う場合の光学素子の配置について図５を用いて以下に説明する。ＬＥＤ１２１で発光した光は非球面レンズ１２２により集光され、バンドバスフィルタ１２３を通過し、対物レンズ１２４の瞳面に結像する。対物レンズ１２４の瞳にＬＥＤ１２１の像を置いた場合には、ケーラー照明が達成される。ケーラー照明とは光源自体に輝度ムラがあった場合においてもサンプル面での照明を均一に行うことができる照明法のことである。像のある位置から射出した光は、射出した位置に対応した角度でサンプル面を通過・照明する。以上の構成でスライドガラス１２５上に固定された上の蛍光色素１２６をＬＥＤ光源の輝度ムラに依存することなく均一に照明することが可能となる。
【００２６】
より詳細な光学素子の大きさおよび位置について以下に説明する。非球面レンズ１２２の直径は１６mmで前焦点距離（ＢＦＬ）は１１.２mm、後焦点距離（ＢＦＬ）は７.８mm、厚みは６mmである。また、ＬＥＤの発光面は１mm角の大きさであるが、砲弾レンズがＬＥＤに被さっているため、ＬＥＤの見かけの大きさは１.３９mmとなる。また、２０倍対物レンズ（ＮＡ０.４５）と焦点距離１８０mmの集光レンズを用いる場合、対物レンズの焦点距離は１８０／２０＝９mmとなる。対物レンズがサンプル面で発光したビーズから光を集光できる角度はＮＡ＝ｎsinθの公式よりsinθ＝ＮＡ／ｎ＝０.４５／１＝０.４５である。従って対物レンズの瞳の直径は２×９mm×０.４５＝８.１mmとなる。従って１.３９mmのＬＥＤを８.１mm以下に結像する光学系の構築が必要である。この場合、光学系の倍率は８.１／１.３９＝５.８倍である。前焦点距離１１.２mmの比球面レンズを用いて５.８倍の拡大像を作りたい場合、物体を置くべき位置を計算することができる。結論としてＬＥＤ固定面から光軸上での非球面レンズの像側の面までの距離を１５.８mmとすれば、非球面レンズの像側の面からＬＥＤの像が形成される距離は一意に７６.０mmと決定される。従ってこの位置に対物レンズの瞳面を設置することによりケーラー照明が達成される。
【００２７】
次にＬＥＤから出射した光をサンプル面上に集光できるパワー密度について以下に見積もる。例としてＦＡＭの励起に用いるRoyal Blue のLEDを用いて説明する。このＬＥＤの出力はカタログ値で５１５ｍＷである。５１５ｍＷの光は非球面レンズ１２２より１／３以上集光できる。非球面レンズ１２２を通過後、集光する光路上にＦＡＭ用のバンドパスフィルタ（図６（ｄ）に図示）を設置することによりＦＡＭ励起に適した波長帯域が選択される。バンドパスフィルタにより選択されるエネルギー量はバンドパスフィルタの幅にも依存するが、図６（ｄ）のバンドパスフィルタを用いた場合は約３０％のエネルギーが選択される。また、バンドパスおよびダイクロイックミラー，対物レンズ通過時に失うエネルギー量の割合をそれぞれ９５％，９０％，９０％とする。最終的にスライドガラスのサンプル面上に到達する光のパワー密度は５１５ｍＷ×１／３×０.３×０.９５×０.９×０.９＝３５.７ｍＷを得る。２０倍対物レンズの照明範囲は１mm以下であるため、最終的なパワー密度は３５.７ｍＷ／mm2以上となる。Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５におけるパワー密度についても図６（ｂ）に示されるWarm-White LEDのスペクトルについてＣｙ３，Texas Red，Ｃｙ５のバンドパスフィルタを通過させた場合の光量を見積もることで算出できる。結果として得られたパワー密度はＣｙ３，Texas Red，Ｃｙ５につきそれぞれ１５.０，１５.７，１４.８ｍＷ／mm2である。この値は一般に蛍光色素の観察に必要とされるパワー密度である１.５ｍＷ／mm2よりも１０倍以上大きいため、従来よりも短い露光時間で信号を取得することが可能である。
【００２８】
次にＬＥＤを用いた照明光源について図４を用いて説明する。ＬＥＤ４０１，４０２は発生した熱を大気中に逃がすためにヒートシンク４０３，４０４にそれぞれ固定されている。更に詳細には図５で示されるように発生した熱はサーミスタ１２９でモニタされ、熱を効率よく外部へと散逸させるためにファン１２８により送風される。また、フォトダイオード１３０を用いることでＬＥＤ１２１の劣化をモニタすることができる。図４においてＬＥＤ４０１，４０２で発光した光は０.７以上のＮＡを持つ非球面レンズ４０６及び４０７で集光される。ＬＥＤ４０１及び４０２から発した光はダイクロイックミラー４０８により同一光路上に導かれる。本実施例で用いたダイクロイックミラーの分光特性を図６（ｃ）に示す。このダイクロイックミラーは５００ｎｍ近傍で急峻に立ち上がるため、ＬＥＤ４０１からの光は反射し、ＬＥＤ４０２からの光を直進させることで効率よく２つのＬＥＤからの光を混合することができる。混合された光はミラー４０９で反射され、測定対象物に対して照射される。なお図４（ｂ）では４色の蛍光色素の励起波長に最適化された４つのＬＥＤ４１０，４１１，４１２，４１３を用いる。（ａ）と比較して強い信号を取得することができる反面、ダイクロイックミラーおよびミラーなどを（ａ）よりも多数用意する必要があるため、コスト高であるという問題も発生する。従って以下より２つのＬＥＤを用いた説明を行う。
【００２９】
更に図７を用いて４蛍光色素の蛍光計測装置について説明する。ＬＥＤ光源５０１は電源５１９から駆動回路５１８を経て駆動され、発光する。ＬＥＤ４０１，４０２が格納されたＬＥＤ光源５０１より射出した光は、回転ターレット５０２に保持されたキューブ５０４，５０５，５０６，５０７に向かう。キューブ５０４，５０５，５０６，５０７にはそれぞれ図６（ｄ），（ｅ），（ｆ）で図示されたバンドパスフィルタ５２１，ダイクロイックミラー５２２，エミッションフィルタ５２３が装着されている。キューブ５０４，５０５，５０６，５０７内の光学フィルタはそれぞれＦＡＭ，Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５について最適化されている。回転ターレット５０２は測定すべき蛍光色素に適したキューブを回転させることで光路上に設置する。ＬＥＤ４０１及び４０２から発した光はバンドパスフィルタ５２１を経てダイクロイックミラー５２２により上方に反射され、対物レンズ５０９により集光され、スライドガラス上に固定されたビーズに照射される。伸長反応に伴ってビーズ上に取りこまれた蛍光色素は励起され、蛍光を発する。スライドガラス上で等方的に発光した蛍光のうち一部が再び対物レンズ５０９により回収され、平行光となる。更に蛍光はダイクロイックミラー５２２，エミッションフィルタ５２３を通過し、集光レンズ５１７を経てＣＣＤ５１６の検出面で像を形成する。伸長反応に伴い、フローセル上では固定されたビーズ上で蛍光色素が取り込まれ、４色のうち伸長した塩基に相当する１色の蛍光を発する。以下ＦＡＭの場合を例として説明する。伸長反応に伴い、取り込まれたＦＡＭ−ｄＣＴＰを励起するためにＬＥＤ４０１がＯＮとなりＬＥＤ４０２はＯＦＦとなる。また、回転ターレットはキューブ５０４を回転させて光路に導く。これによりＦＡＭに最適な励起光がサンプル面に照射され、ＦＡＭ−ｄＣＴＰが取り込まれたビーズのみが発光する。この蛍光像をＣＣＤカメラ５２０で取得・保存する。次にＣｙ３，Texas Red，Ｃｙ５の蛍光像を取得するためにＬＥＤ４０１はＯＦＦ、ＬＥＤ４０２をＯＮとする。Ｃｙ３の励起を行うために光路にキューブ５０５を導く。これによりＣｙ３に最適な励起光がサンプル面に照射され、Ｃｙ３−ｄＡＴＰが取り込まれたビーズのみが発光する。蛍光像取得の直前にはピントを合わせるため、対物レンズオートフォーカス用モータ５０８により対物レンズ５０９をＺ方向に駆動し、オートフォーカスを行う。
【００３０】
ＬＥＤ４０１，４０２のＯＮ／ＯＦＦは駆動回路５１８によって容易に行うことができる。従来のシーケンサの光源はレーザ或いは水銀ランプやキセノンランプなどに用いられるアーク光源だった。しかし、これらの光源は光源ＯＮ／ＯＦＦ時の挙動が不安定だった。従ってレーザあるいはアーク光源を光源として用いる場合にはＣＣＤの転送時において高価なシャッタを用いて励起光を遮断する必要があった。この状態を図８（ａ）に示す。ＬＥＤ４０１，４０２のＯＮ／ＯＦＦは駆動回路５１８によって容易に行うことができるため、図８（ｂ）のようにシャッタレスのシステムの構築が可能となり、装置の低コスト化が図れる。
【００３１】
スライドガラス５２４は２５×７５mmの大きさであり、そのうちビーズを結合している反応領域は２０×６０mmの大きさである。計測に用いる対物レンズ５０９は視野数２２の２０ｘ対物レンズである。従って計測可能な領域の大きさは７７０ｕｍ角程度の大きさである。従ってスライドガラス５２４の全ての反応領域を計測するためにはスライドガラス５２４を移動させ、画像を取得する必要がある。２０×６０mmの領域を７７０ｕｍ角の計測で網羅するためには２１００回程度のスライドガラス５２４の移動が必要となる。この場合、スライドガラス５２４はＸＹステージにより移動する。
【００３２】
次に本発明の第４の実施例として、ＬＥＤを蛍光色素の励起用光源として用いるシーケンス反応計測の並列化について図９，図１０，図１１を用いて以下に説明する。
【００３３】
一般に１つの塩基の伸長に要する反応時間は９０分程度と長い。従来の次世代シーケンサでは塩基伸長を行っている時間を有効に活用するため、１枚のスライドガラスで伸長反応を行っている９０分の間にもう１枚のスライドガラスをスキャンできるように、２枚のスライドガラスの装着が可能なように設計されているものが多い。具体的な例としてはLifeTech社のSOLiDやHelicos社のHeliscopeなどを挙げることができる。
【００３４】
本発明ではＬＥＤを用いた照明を行い、ＦＡＭ，Ｃｙ３，Texas Red，Ｃｙ５についてのパワー密度は３５.７，１５.０，１５.７，１４.８ｍＷ／mm2を得た。これは通常の水銀ランプなどを用いて蛍光色素を励起するために必要なパワー密度の１.５ｍＷ／mm2の１０倍以上のパワー密度である。このことは純粋に光照射している時間を１／１０以下に短縮できるということを意味する。露光時間を短縮することはスキャニング時間の大幅な短縮に繋がる。一方化学反応である最小ユニットの反応の短縮は反応効率の低下を招くため、短縮は困難である。従ってスループットの向上のためには最小ユニットの反応の９０分の間に複数のスライドをどれだけ並列処理できるかによって決定される。図９（ｂ）の表に示されるとおり、反応とスキャンに要する時間の比が１：１の場合は２枚のスライドの並列処理が可能である。ここで注目すべき点は、対物レンズやＣＣＤカメラが１つであるため、スキャニングは並列化できないが、最小ユニットの反応については溶液をフローセルに満たすだけなので、並列化できるという点である。
【００３５】
反応とスキャンに要する時間の比が２：１の場合は３枚のスライドの並列処理が可能である。同様に反応とスキャンに要する時間の比が３：１の場合は４枚のスライドの並列処理が可能である。これを一般化して反応とスキャンに要する時間の比がｎ：１の場合はｎ＋１枚のスライドの並列処理が可能である。
【００３６】
図９（ａ）では４枚のスライドガラス７０４，７０５，７０６，７０７を同時並列処理する場合を示す。この場合、スライドガラス４枚を同時に搭載可能なＸＹステージが必要となる。スライドガラス７０７で伸長反応が進行している間にスライドガラス７０４，７０５，７０６のスキャンを完了し、次にスライドガラス７０６の伸長反応に移行する。この伸長反応の間にスライドガラス７０４，７０５，７０７のスキャンを行う。以上の手続きを繰り返すことで複数のスライドガラスの並列処理が可能となり、スループットをこの場合においては４倍向上させることが可能となる。
【００３７】
図１０でも同様の処理を１０枚のスライドガラスについて行っている。１０枚のスライドガラスを同時並列処理する場合を示す。この場合、１０枚のスライドガラスを同時に搭載可能なＸＹステージが必要となる。スライドガラス８０４で伸長反応が進行している間にそれ以外のスライドガラスのスキャンを完了し、次にスライドガラス８０５の伸長反応に移行する。この間にスライドガラス８０５以外のスキャンを行う。以上の手続きを繰り返すことで１０枚のスライドガラスの並列処理が可能となり、スループットを向上させることが可能となる。
【００３８】
図１１ではスライドガラスを環状ステージに設置し、複数のスライドガラスを同時並列処理する実施例を説明する。環状のステージには８枚のフローセルが設置されている。フローセル内にはスライドガラスが保持されている。フローセル９１１にはピペッタ９０７，９０８を介して反応液がフローセル内に送液される。環状ステージは反応時間／（８−１）≒１３分毎に隣接するフローセルの位置まで回転する。ピペッタ９１２，９１３はスキャン直前に反応溶液を洗浄溶液で洗浄する。フローセル９１０のスキャン時には環状ステージはＸＹ方向へ駆動し、フローセル９１０内のスライドガラス上に固定されたビーズから発せられる蛍光信号をスライド表面全体について取得することが可能である。プライマの解離反応などのために必要な温調装置９０６を設置する。環状ステージであるため８つのスライドガラス８０４について８つの温調装置を設置しなくてもよい。それはスライドガラス８０４は円運動を行うため、いずれのスライドガラス８０４も温調装置９０６を順次通過していくからである。ピペッタの設置個数についても同様の効果がある。従って環状ステージを採用することにより、ピペッタ９０７，９０８，９１２，９１３の能動的駆動を省略し、かつ温調装置９０６の個数を１個にできるという効果をもたらす。また、環状ステージは常時同じ速度で回転することも可能である。ステップ動作をしないで常時定常速度で回転しているため、装置としての安定性が向上する。
【００３９】
次に第５の実施例として、全反射照明による蛍光増強方法について図１２を用いて以下に説明する。図１２（ａ）に示すように通常の落射蛍光法では対物レンズを介してサンプル面に垂直に励起光が入射する。一方全反射照明ではスライドガラスと溶液の界面に励起光を臨界角よりも大きい角度で入射させることで、スライドガラスよ溶液の界面にエバネッセント場が形成され、試料側の厚さ数百ナノメートルの領域が照明される。従って、この厚みの範囲でのみ励起光が当たった試料からの蛍光が発生する。図１２（ｂ）に示すように入射角を臨界角に近づけるにつれて、境界面の光強度が入射光強度に対して増加することが知られている。臨界角ではその増強倍率は４倍である。シーケンス反応後の蛍光検出においても従来の落射照明法の代わりに全反射照明を用いることで境界面近傍から発せられる蛍光量を増大させることが可能となる。現状では直径１ｕｍのビーズを用いているが、高スループット化の要求に伴ってビーズの高密度化が要求され、ひいてはビーズの微小化が必要となる。特に全反射照明においては１００ｎｍ以下の領域において増強効果が得られるため、１００ｎｍ程度のビーズを用いることも有効である。この場合、落射照明と比較して４倍の蛍光増強効果が得られる。また、落射照明において２ｕｍのビーズを用いることも有効である。現在は１ｕｍのビーズを用いて蛍光信号を取得しているが、装置関数にマッチしたビーズの径は２ｕｍである。より具体的には１ｕｍのビーズを分解するためにＣＣＤカメラの３ピクセルを使用した場合、周辺に像が滲む影響を考慮すると現実には１ｕｍのビーズにも５ピクセルを用いていることとなる。２ｕｍのビーズを用いた場合にはすでに十分ビーズは大きいため、１ｕｍビーズのような滲みは発生しない。従って１ｕｍのビーズも２ｕｍのビーズも結局解像するために５−６ピクセル程度を要している。従って像の大きさという観点からは１ｕｍと２ｕｍビーズの差は殆どない。一方１ｕｍビーズと２ｕｍビーズの表面積の大きさは４倍であるため、ＤＮＡ断片が結合する量も４倍となり、取得可能な蛍光量の増大が見込める。また、図１３に示すように、ＤＮＡ断片が多数結合した直径５００ｕｍのビーズ１０８をスライドガラス１１２に固定する。このビーズ１０８の内部は微小な空隙が多数存在しているため、遠心処理によりビーズ１０８に対して加圧すると扁平につぶれてしまい、円盤状のスポット１１３を形成する。円盤状のスポットの直径は１ｕｍ、高さは０.１ｕｍとなる。この状態で全反射照明を行うと、ビーズ１０８から発せられる蛍光をエバネッセント場に含むことが可能となり、落射照明法と比較して４倍に近い蛍光増強が確認される。
【００４０】
第６の実施例として、ビーズが予め配列されたスライドガラスがパッケージングされている場合について図１４を用いて以下に説明する。実施例１で説明したように、従来は外部で調整したビーズを計測直前にスライドガラスへ流し込むことにより固定していた。しかし、計測者にとってより望ましいのは予めビーズ１１１１がスライドガラス１１１２表面に固定されている状態である。これにより計測者に必要な作業は調整したサンプルをフローセル内に注入することのみとなり、外部でビーズを用いて化学処理などを行う手間を省略できる。また、ビーズを流路に流さないため、流路の詰まりを回避することが可能となる。将来は更なるビーズの高密度化が進むことが予想されるため、ビーズ１１１１を格子状に配置したスライドガラス１１１２をパッケージングすることが望ましい。本実施例についてはビーズ１１１１がスライドガラス１１１２表面に格子状に配置されている以外は実施例１と同じである。
【００４１】
本発明の課題は、次のように表現できる。次世代シーケンシング技術スループット向上において１塩基伸長反応に代表される生化学反応が律速となっている。ポリメラーゼと用いる伸長反応及びリガーゼを用いるライゲーション反応のいずれも最小ユニットの反応が完了するまでに９０分程度のインキュベーションを要する。このインキュベーション時間をデッドタイムとしないために、ＡＢ社やHelicos社はは２つのフローセルを装着して、１つのフローセルの反応時間中にもう１つのフローセルを用いて蛍光画像の取得を行うシステムを採用している。しかしながら、上述の方式でも依然最小ユニットの反応に要する時間が律速なるために、スループットの更なる向上が困難であった。
【００４２】
また、この課題を解決するための手段は次のように表現できる。本発明では低価格な高輝度ＬＥＤ光源を使用して、蛍光励起強度の１０倍以上のパワー密度を達成する。これにより検出における励起光照射時間を１／１０以下とすることで検出に要する時間を短縮する。これにより従来律速となっていた最小ユニットの反応時間内に３枚以上の複数の反応基板を並列に処理することにより、スループットの向上を図ることが可能となる。また、ＬＥＤを用いることでシャッタを用いることなく、電流制御により励起光の照射を制御できる。従って、シャッタレスのシステムの構築が可能となり、低コスト化が図れる。また、スライドガラスをパッケージングすることにより、スライドガラスのハンドリングを容易なものとする。更にパッケージングしたスライドガラス中に蛍光色素の発光の基点となるビーズを予め配置することにより、更にユーザの負担を軽減することが可能となる。
【００４３】
また、本発明の効果は次のように表現できる。本発明の蛍光測定装置は低価格なＬＥＤ光源を使用して、検出に要する時間を短縮する。これにより最小ユニットの反応時間内のスキャン枚数を３枚以上に並列化する。本発明の効果として低コストかつハイスループットなＤＮＡシーケンサのシステムを実現する。また、ＬＥＤの採用によるシャッタレスのシステムを構築し、装置の低コスト化を実現する。更にスライドガラスのパッケージ化を図ることにより、ユーザの操作性を向上させる効果をもたらす。
【符号の説明】
【００４４】
１０１，１０２，２１１，２１２  セプタ
１０３  カバー
１０４  スペーサ
１０７，１１２，１２５，５２４，７０４，７０５，７０６，７０７，８０４，８０５，９０４，９１０，  スライドガラス
１０８，１１１  ビーズ
１０９  プローブオリゴ
１１３  円盤状のスポット
１２１，４０１，４０２，４１０，４１１，４１２，４１３  ＬＥＤ
１２２，４１８，４１９，４２０，４２１  非球面レンズ
１２３，５２１  バンドパスフィルタ
１２４，５０９，７０３，８０３，９０３  対物レンズ
１２６  蛍光色素
１２７，４０３，４０４，４１４，４１５，４１６，４１７  ヒートシンク
１２８  ファン
１２９  サーミスタ
１３０  フォトダイオード
２０６  ＤＮＡ断片
２１３  フローセル
２１４  ＦＡＭ−ｄＣＴＰ
２１５  Ｃｙ３−ｄＡＴＰ
２１６  Texas Red−ｄＣＴＰ
２１７  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ
２１８  計測領域
４０８，４２３，４２４，４２５，５２２  ダイクロイックミラー
４０９，４２６  ミラー
５０１  ＬＥＤ光源
５０２，７０１，８０１，９０１  回転ターレット
５０４，５０５，５０６，５０７  キューブ
５０８，７０２，８０２，９０２  対物レンズオートフォーカス用モータ
５１６  ＣＣＤカメラ
５１７  集光レンズ
５１８  駆動回路
５１９  電源
５２０  ＰＣ
５２３  エミッションフィルタ
５２５，５２６，９０７，９０８，９１２，９１３  送液用チューブ
９０５  環状ステージ
９０６  温調装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
2010284101.tif 000009
【図６（ｃ）】
2010284101.tif 000010
【図６（ｄ）】
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【図６（ｅ）】
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【図６（ｆ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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