(57)【要約】      （修正有）【課題】補酵素結合型酵素が本来保持している様々な機能を維持しつつ、安定性を向上させることができる補酵素結合型酵素の安定化方法、当該安定化方法を利用して調製した組成物、酵素センサー、及び燃料電池を提供する。【解決手段】補酵素結合型酵素を構成成分とする組成物に、補酵素結合型酵素の機能発現に要求され、かつ補酵素結合型酵素に結合能を有する補酵素を添加することによって補酵素結合型酵素を安定化させる、および前記方法により安定化させた状態で含む安定化された補酵素結合型酵素組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素結合型酵素の安定化方法であって、
前記補酵素結合型酵素を構成成分とする組成物に、前記補酵素結合型酵素の機能発現に要求され、かつ前記補酵素結合型酵素に結合能を有する補酵素を添加することによって前記補酵素結合型酵素を安定化させる方法。
【請求項２】
前記補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、ピロロピロリンキノンから選択される少なくとも１つの補酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補酵素結合型酵素が、酸化還元酵素である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化還元素が、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素、及びサーマス  サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のPPQ依存型グルコース脱水素酵素から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記補酵素結合型酵素を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により安定化させた状態で含む安定化された補酵素結合型酵素組成物。
【請求項６】
補酵素結合型酵素を請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により安定化させた状態で電極上に固定化した酵素センサー。
【請求項７】
前記補酵素結合型酵素を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により安定化させた状態で含み、前記補酵素結合型酵素の触媒反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補酵素結合型酵素の安定化方法、及びその利用に関する。詳細には、本発明は、補酵素結合型酵素の安定化方法、当該安定化方法を利用して調製した組成物、酵素センサー、及び燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、その優れた分子識別機能によりさまざまな用途に応用されている。例えば、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野で、種々の物質を分析定量する技術に利用されている。そして、定量分析を簡便に行える手段として、酵素の持つ分子識別機能をセンサー素子として利用するバイオセンサーが着目されている。バイオセンサーは、センサー素子である酵素が測定対象である基質を認識して生じる生化学信号を電気信号に変換することにより、測定対象を分析定量するものである。
【０００３】
また、近年、バイオ資源を利用したバイオ燃料電池が、その高いエネルギー効率及び低い環境負荷から次世代のエネルギーとして提案されている。微生物を始めとする生物は、酵素等の生体触媒により、炭水化物、タンパク質、脂質等を酸化分解する生体内代謝過程において、ATP等の高エネルギー物質を生成して、生命活動に必要なエネルギーを獲得している。バイオ燃料電池は、かかる生体内代謝過程において発生するエネルギーを電気エネルギーとして電極に取り出す発電装置である。
【０００４】
酵素の触媒機能を利用した酵素バイオセンサーや燃料電池の実用化に当たっては、酵素の選択がその成否を左右する。しかしながら、酵素は、生体が生存可能な緩和な条件下でその触媒活性を発揮するものであることから、その活性は温度等に依存し、一般的に熱安定性が低く、長期間の保存において酵素が失活する等の問題があった。したがって、酵素バイオセンサーや燃料電池への適用に際しては、多様な環境において一定期間にわたって安定して活性を保持できる酵素が不可欠であり、特に、酵素寿命に対して相関があるといわれる熱安定性の向上が要求される。
【０００５】
このため、酵素の熱安定を向上させるため技術が報告されている。例えば、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（以下、「PQQ依存型グルコース脱水素酵素」と称する）のホモダイマー構造において、２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド結合を介して連結させることにより、高い熱安定性を示すよう改変されることが記載されている（例えば、特許文献１を参照）。これは、PQQ依存型グルコース脱水素酵素のＸ線結晶構造解析による高次構造に基づいて、ダイマー酵素が構築されたときに、モノマー界面上で互いに近接する位置に配置される特定のアミノ酸残基をシステインに遺伝子工学的手法を用いて置換することによりモノマー間にジスルフィド結合を形成させるものである。しかしながら、かかる技術は、Ｘ線結晶構造解析による高次構造に基づくものであることから、結晶構造情報が利用できない酵素については実施できないという問題点があった。また、遺伝子レベルでの改変等の人為的な改変は、タンパク質の立体構造に変化が生じるため、熱安定性が向上しても酵素活性等の酵素が本来保持している様々な機能が低下若しくは欠失するという問題もあった。さらに、タンパク質の立体構造の変化は、大腸菌等を用いたタンパク質発現系での酵素産生時に十分な生産量が得られないという問題を引き起こすことが多く、産業上利用における大きな障害となっていた。
【０００６】
そして、PQQ依存型グルコース脱水素酵素に加温処理を施すことにより、立体構造を安定化させ、それによって、熱安定性を向上させる方法も報告されている。しかしながら、加熱処理によっては、タンパク質の立体構造に変化が生じるため、上述の方法と同様に酵素が本来保持している様々な機能が低下若しくは欠失するという問題があった。また、かかる方法は、繊細な加温時間、温度等の条件設定を要することから、その適用範囲が限定されていた。
【０００７】
したがって、酵素が本来保持している様々な機能を維持しつつ、安定性、特には熱安定性を向上させることができる技術の確立が依然と望まれていた。
【特許文献１】国際公開第2002-072839号公報
【特許文献２】特開第2007-129966号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、補酵素結合型酵素が本来保持している様々な機能を維持しつつ、安定性を向上させることができる補酵素結合型酵素の安定化方法、当該安定化方法を利用して調製した組成物、酵素センサー、及び燃料電池の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、補酵素結合型酵素を構成成分とする組成物に、当該酵素に対する補酵素を添加することにより、当該酵素の安定性を向上できることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［７］に示す発明を提供する。
［１］  補酵素結合型酵素の安定化方法であって、
前記補酵素結合型酵素を構成成分とする組成物に、前記補酵素結合型酵素の機能発現に要求され、かつ前記補酵素結合型酵素に結合能を有する補酵素を添加することによって前記補酵素結合型酵素を安定化させる方法。ここで、例えば、前記安定性が、熱安定性である。
［２］  前記補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、ピロロピロリンキノンから選択される少なくとも１つの補酵素である上記［１］の方法。
［３］  前記補酵素結合型酵素が、酸化還元酵素である上記［１］又は［２］の方法。
［４］  前記酸化還元酵素が、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素、及びサーマス  サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のPPQ依存型グルコース脱水素酵素から選択される上記［３］の方法。
【００１１】
上記［１］〜［４］の構成によれば、補酵素結合型酵素が本来保持している様々な機能を維持しつつ、熱安定性及び保存安定性をはじめとする当該酵素の安定性を高めることが可能となる。したがって、本発明の安定化方法によって安定性を向上させた補酵素結合型酵素を、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野における当該酵素の媒機能等の機能が要求される技術分野に適用できる。
【００１２】
［５］  前記補酵素結合型酵素を、上記［１］〜［４］のいずれかの方法により安定化させた状態で含む安定化された補酵素結合型酵素組成物。
【００１３】
上記［５］の構成によれば、補酵素結合型酵素が本来保持している様々な機能を維持しつつ、熱安定性及び保存安定性をはじめとする安定性を高められた補酵素結合型酵素を含む安定化された補酵素結合型酵素組成物を提供できる。したがって、本発明の補酵素結合型酵素組成物を、当該酵素の触媒機能を利用した測定技術等、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野における当該酵素の機能が要求される技術分野に適用できる。
【００１４】
［６］  補酵素結合型酵素を上記［１］〜［４］のいずれかの方法により安定化させた状態で電極上に固定化した酵素センサー。
【００１５】
上記［６］の構成によれば、本発明の安定化方法によって安定性を向上させた補酵素結合型酵素を利用した酵素センサーが提供でき、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野における当該酵素の機能が要求される技術分野に適用できる。特に、ここで利用される補酵素結合型酵素は熱安定性及び保存安定性が高い状態で維持されることから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００１６】
［７］  前記補酵素結合型酵素を、上記［１］〜［４］のいずれかの方法により安定化させた状態で含み、前記補酵素結合型酵素の触媒反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【００１７】
上記［７］の構成によれば、本発明の安定化方法によって安定性を向上させた補酵素結合型酵素を利用した燃料電池が提供できる。特に、ここで利用される補酵素結合型酵素は熱安定性及び保存安定性が高い状態で維持されることから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく持続的に発電を行なうことが可能となり、燃料電池の性能向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。
【００１９】
（本発明の補酵素結合型酵素の安定化方法）
本発明の補酵素結合型酵素の安定化方法は、補酵素結合型酵素を構成成分とする組成物に、前記補酵素結合型酵素に対する補酵素を添加するものである。これにより、触媒機能等の当該酵素が本来保持している様々な機能を維持しつつ、酵素自体の安定性を向上させるものである。
【００２０】
「酵素の安定化」とは、熱、及び保存に対する酵素の安定化であり、一定期間の熱処理及び保存に対して、酵素の触媒機能の失活や活性低下が抑制できることを意味する。具体的に本明細書では、補酵素結合型酵素を当該酵素に対する補酵素と共存させた組成物とすることにより、補酵素と共存させていない組成物の状態よりも、一定期間の熱処理又は保存に供した後に維持されている当該酵素の機能の残存率が高いことを意味する。例えば、通常、酵素機能が維持される25℃での当該法酵素結合型酵素の触媒活性値を100%として、一定期間の熱処理及び保存後の活性値を酵素活性の残存率として算出する。この残存率が、補酵素と共存させた組成物を、補酵素と共存させていない組成物と比較して増大していた場合、当該酵素の熱安定性が向上したと判断できる。一例として、常温で安定な補酵素結合型酵素を、50℃にて30分間の加熱により50％以上、特には80％以上の残存活性を維持できることが好ましい。また、高温条件下で安定な補酵素結合型酵素の更なる安定化に関しても、本発明の概念として含まれる。
【００２１】
ここで、本発明の安定化方法の対象となるのは、補酵素結合型酵素である。補酵素結合型酵素とは、補酵素と結合することによりその触媒機能を発揮することができる酵素を指す。そして、かかる性質を有する限り何れも本発明の対象とすることができる。したがって、当該酵素の由来等に対する制限も無く、天然に存在する細菌、酵母、及び動植物等の何れの生物体から調製されたものであってもよく、細菌としては、好熱菌、好塩菌、好酸菌、好アルカリ菌等の極限環境下で生育する細菌をも含む。そして、遺伝子工学的手法により組換え体として製造されたもの、あるいは化学的に合成されたものであってもよい。さらに、天然由来の酵素に人為的に変異を施した改変体であってもよい。また、蛍光物質、放射線同位体等の各種標識化合物による修飾、抗体やタグペプチド等の他のタンパク質と融合した形態のものであってもよい。
【００２２】
ここで、改変体とは、天然由来の酵素の特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものを意味する。改変とは、改変の基礎となるタンパク質のアミノ酸配列のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および付加の少なくとも１つからなる改変が生じていることを意味する。そして、「１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。例えば、このような改変体は、配列番号１、２、４、５及び６等に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで70％以上、好ましくは80％ 以上、更に好ましくは90％以上の相同性を保持するものとすることができる。
【００２３】
本発明の安定化方法の対象となる酵素の種類は、特に制限されないが、好ましくは酸化還元酵素である。ここで、酸化還元酵素とは、生体物質の酸化還元反応を触媒する酵素であり、酸化還元反応の様式、性質、供与体、受容体の種類等によって、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）、還元酵素（レダクターゼ）、酸化酵素（オキシダーゼ）、酸素添加酵素（オキシゲナーゼ）等と称されるが、これらの何れもが含まれる。具体的には、グルコース脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、コレステロール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド還元酵素、チオレドキシン還元酵素、グルコース酸化酵素、ピルビン酸酸化酵素、コレステロール酸化酵素、乳酸酸化酵素、アスコルビン酸酸化酵素、シトクロム酸化酵素、キサンチン酸化酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等が例示されるが、これらに限定するものではない。
【００２４】
好ましくは、NAD+をその触媒活性の発現において要求するNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素、PQQをその触媒活性の発現において要求するPQQ依存型グルコース脱水素酵素等が例示され、特には、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素（配列情報につき、推定アミノ酸配列を配列番号１に示すと共に、GenBank Accession Number P46154を参照のこと）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素（配列情報につき、推定アミノ酸配列を配列番号２に示すと共に、GenBank Accession Number CAA30222を参照のこと）、高度好熱菌由来の耐熱性酵素であるサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素（配列情報につき、塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列番号３、４に示すと共に、GenBank Accession Number YP_143836を参照のこと）、バチルス属細菌（Bacillus sp.）由来のグルコース脱水素酵素（配列情報につき、推定アミノ酸配列を配列番号５に示すと共に、GenBank Accession Number ZP_01173628を参照のこと）、及びシュードモナス・プチダ由来のグルコースsorbosone脱水素酵素（配列情報につき、推定アミノ酸配列を配列番号６に示すと共に、GenBank Accession Number YP_143836）等が好ましく例示される。
【００２５】
補酵素とは、酵素のタンパク質部分と結合して酵素の触媒機能の発現に寄与する物質である。つまり、具体的には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、ピロロピロリンキノン（PQQ）、チアミン二リン酸（ＴＴＰ）等が例示されるが、これに限定するものではない。また、これらと同様の機能を有する類似体であってもよい。
【００２６】
ここでは、対象補酵素結合型酵素の機能発現に要求され、かつ前記補酵素結合型酵素に結合能を有する補酵素を添加するものである。例えば、NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素の場合にはNAD+を、また、PQQ依存型グルコース脱水素酵素の場合にはPQQを添加する。対象酵素が、２種以上の補酵素を要求する場合には、２種以上の補酵素を組み合わせてもよいし、また１種類の補酵素であってもその効果を発揮することができる。以上は、一例であってこれらに限定されるものではない。
【００２７】
補酵素結合型酵素と補酵素の割合は、特に制限されないが、一般に、補酵素結合型酵素がホロ酵素として存在するために必要とされる補酵素量よりも多く添加することが好ましい。具体的な補酵素結合型酵素と添加する補酵素の割合は、当該酵素と補酵素との親和性、及び緩衝液のｐH及び塩濃度を考慮して適宜設定される。好ましくは、補酵素は、補酵素結合型酵素に対して等モル量、若しくは過剰に添加されるべきであり、例えば、補酵素モル濃度：補酵素結合型酵素モル濃度比＝１：１〜１００：１である。しかしながら、コスト等を勘案して、補酵素を補酵素結合型酵素に対して等モル量以下で使用してもよく、例えば、補酵素モル濃度：補酵素結合型酵素モル濃度比＝１：１０〜１：１で添加することもできる。
【００２８】
（補酵素結合型酵素組成物）
本発明の組成物は、補酵素結合型酵素を、前記補酵素結合型酵素に対する補酵素を添加することによって安定化させた状態で含んで構成される。当該組成物中の補酵素結合型酵素と補酵素の割合は、特に制限されないが、一般に、補酵素結合型酵素がホロ酵素として存在するために必要とされる補酵素量よりも多く添加することが必要である。詳細については上述した。
【００２９】
さらに、本発明の組成物は、液体組成物、固体組成物の別を問わない。そして、補酵素結合型酵素及び補酵素に加え、製剤学的に許容可能な担体を含ませることができる。このような担体は、固体、液体の別を問わず、補酵素及び補酵素結合型酵素の生物学的活性が安定して維持可能なものであれば、特に制限はない。
【００３０】
液体組成物としては、適当な緩衝液を担体として調製した溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。緩衝液としては、一般的に本技術分野で使用されるものであれば特に制限はない。例えば、トリス塩酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、クエン酸、フタル酸およびそれらの塩等の緩衝液が挙げられ、pH5.0〜9.0、特にはpH 6.0〜7.0 に調製したものが好ましい。さらに、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等を担体として使用することもできる。さらに、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤のような補助剤を含んでもよい。
【００３１】
固形製剤としては、例えば、凍結乾燥や真空乾燥により酵素溶液を粉末化等することにより調製することができる。更に、適当な担体を含ませることができ、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等と混合し、常法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等に調製することもできる。ここで、固形担体としては、一般的に本技術分野で使用されるものであれば特に制限はない。例えば、賦形剤としては、デンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等、結合剤としては、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース等、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース、タルク等が挙げられる。
【００３２】
そして、本発明の組成物は、その構成成分である補酵素結合型酵素の触媒機能を利用した測定試薬等に利用でき、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野における当該酵素の機能が要求される技術分野に利用できる。特に、本発明の組成物中において補酵素結合型酵素は熱安定性及び保存安定性が高い状態で維持されことから、幅広い技術分野に適用できる。ここで、試料としては、例えば、血液、尿、唾液等の生物体由来の生物試料、食品試料、環境試料等が例示されるがこれに限定されるものではない。また、必要に応じてこれらの試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。
【００３３】
（酵素センサー）
本発明は、補酵素結合型酵素を、前記補酵素結合型酵素に対する補酵素を添加することによって安定化させた状態にして利用する酵素センサーを提供する。酵素センサーは、電極材上にアノード極側には安定性を向上させた補酵素結合型酵素を固定化した作用電極、及びその対極を設けて構成される。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多糖類、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
【００３４】
基質の測定は、例えば、測定対象となる試料を接触させると、試料中に含まれる基質が作用極上に固定された本発明により安定性が向上した酵素組成物と反応し、続いて電子メディエーターが還元される。そして、電極系に電圧を印加して電子受容体の還元体を酸化し、得られる酸化電流値の変化により試料中の基質を検出することができる。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度の基質溶液により作製した標準曲線を作成することにより、得られた酸化電流値に基づいて基質濃度を求めることができる。
【００３５】
本発明の酵素センサーは、熱安定性及び保存安定性が向上した酵素の触媒能力を利用することから、酵素センサー製作時における劣化をも防止することができ、また、酵素の触媒機能の劣化を招くことなく測定精度の向上、及び連続測定を可能とする。ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。ここで、試料としては、例えば、血液、尿、唾液等の生物体由来の生物試料、食品試料、環境試料等が例示されるがこれに限定されるものではない。したがって、本発明の酵素センサーは、医療、食品、環境分野において利用可能である。また、必要に応じてこれらの試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。
【００３６】
（燃料電池）
本発明は、補酵素結合型酵素を、前記補酵素結合型酵素に対する補酵素を添加することによって安定化させた状態にして利用する燃料電池を提供する。本発明の燃料電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極と、還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。そして、アノード電極側では、安定性を向上させた補酵素結合型酵素が基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。一方、カソード側では、アノード側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。そして、アノード極側には、安定性を向上させた状態で補酵素結合型酵素が供給される。このとき、適当な緩衝液中に溶解させた形態で供給してもよいが、電極上に固定化されることが好ましい。カソード極側には、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素を必要に応じて供給してよい。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多糖類、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
【００３７】
以上のように構成することにより、当該酵素が作用しえる基質を燃料として、かかる基質を酸化する際に生じた電子がアノード極に電子を受け渡す。そして、アノード極に渡された電子は、外部回路を経てカソード極に到達することで電流が発生する。
【００３８】
本発明の燃料電池は、熱安定性及び保存安定性を向上させた補酵素結合型酵素の触媒機能を利用することから、持続的に発電を行なうでき、高性能の燃料電池として構築することができ、また、燃料電池製作時における酵素の劣化をも防止することができる。ひいては、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【実施例】
【００３９】
〔調製例１〕NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素の調製
以下の実験で安定性向上の検討対象とするための補酵素結合型酵素として、NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素を調製した。
【００４０】
１．遺伝子クローニング
NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）株のゲノムDNAより、PCR 法を利用してクローニングした。
【００４１】
まず、独立行政法人製品評価技術基盤機構（国内の微生物・遺伝子バンク：NITE）から分譲を受けたシュードモナス・プチダ株につき、分譲業者の指示に従って培養して菌体を取得した。続いて、菌体からゲノムDNA抽出キット（プロメガ社製）を使用して抽出及び精製を行うことによりゲノムDNA調製した。
【００４２】
PCR反応は、PCRキット、PrimeStar（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM 、上記で調製した鋳型DNAを50ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、98℃にて10秒間の熱変性、55℃にて５秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、30サイクルの増幅反応を行った。
【００４３】
ここで使用したプライマーの配列情報を示す。
シュードモナス・プチダ用プライマー
5'-  GAGCA TATGT CTGGT AATCG TGGTG T  - 3'（配列番号７）
5'-  CTAAA GCTTA GGCCG CGCTG AGGTC T  - 3'（配列番号８）
下線はクローニング用の制限酵素認識部位を示す。
【００４４】
PCR増幅反応後の反応液を、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）により精製し、PCR増幅産物を確認した。その結果、予想される DNA増幅産物（約1.2 kbp）の取得が確認できた。
【００４５】
２．発現ベクターの構築、及び大腸菌細胞内での発現
PCR増幅で得られたDNA断片（約1.2 kbp）を、制限酵素Nde-IとHind-IIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後の各DNA断片を、タンパク質発現用プラスミドのpET22bベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位（Nde-I及びHind-III）にライゲーション反応より組み込み発現ベクターを構築した。
【００４６】
得られた発現ベクターにより、大腸菌BL21（DE3）株（ノバジェン社製）の形質転換を行った。大腸菌の培養は、50 mg/l アンピシリンを含むLuria-Bertani（LB）培地中にて37℃で行った。なお、形質転換は、Sambrook 及び Russell著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法に従って行なった。続いて、得られた形質転換体を、50 mg/lアンピシリンを含むLB培地中で、培養液の吸光度がOD600=0.6になるまで培養した。そして、組換えタンパク質の合成誘導のため終濃度0.5 mM のイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（isopropyl-s-D-thiogalactopyranoside：IPTG）を添加して更に4時間培養した。
【００４７】
培養液1 mlを遠心分離して回収した菌体を、200μlの可溶化液中に懸濁した。続いて、後、超音波破砕処理（30-s pulses; maximum power; high intensity; 0.5-s repeating duty cycle）により菌体を破砕した後、菌体破砕液を15,000×g で10分間遠心して上清を得た。この上清を３分間95℃で熱処理した後、12.5％アクリルアミドゲル（アトー社製）電気泳動に供した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（以下、「CBB」と略する）染色（和光純薬社製）によりタンパク質を可視化することにより、組換えタンパク質の発現を確認した。
【００４８】
３．酵素の精製
また、上記で発現させたタンパク質を疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過により、常法に従って、分離、及び精製した。
【００４９】
〔調製例２〕PQQ依存型グルコース脱水素酵素の調製
以下の実験で安定性向上の検討対象とするための補酵素結合型酵素として、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素を調製した。
【００５０】
１．遺伝子クローニング
PQQ依存型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を、アシネトバクター・カルコアセティカスのゲノムDNAより、PCR 法を利用してクローニングした。
【００５１】
詳細な手順については、Yuhashi N.他著、“Development of novel glucose enzyme fuel cell system employing protein engineered PQQ glucose dehydrogenase", Biosens Bioelectron.、2005年、第20巻、第2145〜2150頁の記載に準じて行った。
【００５２】
２．発現ベクターの構築、及び大腸菌細胞内での発現
上記で得られた発現ベクターにより、大腸菌BL21（DE3）株（ノバジェン社製）の形質転換を行った。得られた形質転換体を、LB培地中で、培養液の吸光度がOD600=0.6になるまで振とう培養した。そして、終濃度0.01 mMのIPTGを添加して組換えタンパク質の発現誘導を行った。発現誘導後、更に28℃で一晩培養した。
【００５３】
培養液を遠心分離して回収した菌体を、リン酸緩衝液中に懸濁した。続いて、リゾチームを添加し凍結融解を３回繰り返すことにより菌体を破砕した。菌体破砕液にベンゾネースを適量添加して室温で放置した後、遠心分離に供し上清を得た。
【００５４】
３．酵素の精製
ここで得られたタンパク質はHisタグペプチドが融合していることから、メタルイオンアフィニティークロマトグラフィーにより、酵素の分離、及び精製を行った。詳細な分離・精製手順を以下に示す。具体的には、Hisタグ精製レジンであるTALON樹脂（CLONTECH社製）を使用した。
【００５５】
分離・精製手順の詳細は以下の通りである。
１．カラムをリン酸緩衝液で平衡化
２．サンプルの添加
３．１mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液でカラムを洗浄
４．100mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液でタンパク質を溶出
【００５６】
得られた溶出画分を、Hitrap desalting colum（GEヘルスケア社製）を用いて、イミダゾールを除去すると共に、1mM CaCl2を含む30mMのMOPS緩衝液（pH 7.0）に置換した。次に、酵素のホロ化のためPQQを終濃度30μMで添加し、一晩、暗所に４℃にて放置した。放置後、Hitrap desalting columにて過剰なPQQを除去した。
【００５７】
〔調製例３〕  耐熱性ＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素の調製
補酵素結合型酵素の例として、サーマス  サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素を調製した。かかる酵素は、耐熱性を有する。
【００５８】
１．遺伝子クローニング
耐熱性ＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を、サーマス  サーモフィラスのゲノムDNAより、PCRを利用してクローニングした。
【００５９】
鋳型として、サーマス  サーモフィラスHB8（Thermus thermophilus HB8）のゲノムDNA（タカラバイオ：カタログ番号No.3071）を用いた。プライマーは、サーマス  サーモフィラス HB8由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素のオープンリーディングフレーム（以下、「ORF」と称する）の塩基配列（YP_143836）に基づいて、ORFの開始コドンと終始コドンの間の領域が増幅されるように設計した。このとき、開始コドン側のプライマーtth_gdh_f1には、ベクター連結用の制限酵素NdeI認識配列（CATATG）を導入して設計した。また、終始コドン側のプライマーtth_gdh_r1には、同様にベクター連結用の制限酵素HindIII認識配列（AAGCTT）を導入して設計した。なお、プライマーtth_gdh_r1は、カルボキシル末端に精製用のHisタグ標識を付加させるため終止コドンをグリシン（GCC）に対応するよう設計した。
【００６０】
具体的な配列情報は以下の通りである。
プライマーtth_gdh_f1
5'-ACATTCATATGGACCGGAGGCGCTTTCTCGT-3'  （配列番号９）
プライマーtth_gdh_r1
5'-ATACCAAGCTTGCCAAGGAGGCGTAGCACCCGGTC-3'  （配列番号10）
【００６１】
PCR反応液の組成、及びPCRプログラムは、以下の通りである。
PCR反応液の組成：
１×KOD plus buffer（東洋紡）、
0.4 mM  dNTPs、
0.5 μM  プライマーtth_gdh_f1、
0.5 μM  プライマーtth_gdh_r1、又は、0.5 μM  プライマーtth_gdh_r1、
10 ％（v/v） ジメチルスルフォキシド、
1.25 mM  MgSO4、
0.5 unit  KOD plus（東洋紡）、
5 ng  Thermus thermophilus HB8ゲノムDNA。
【００６２】
反応プログラム：
98 ℃ １分→、〔98 ℃ 10 秒→（65 ℃−0.5 ℃ / ２サイクル）→68 ℃ １分〕× 35 サイクル→68 ℃  １分。
【００６３】
２．発現ベクターの構築、及び大腸菌細胞内での発現
PCR増幅後、約１ kbpのDNAの増幅断片を精製した。精製後の増幅断片、及びプラスミドベクターpET22b（Novagen）を、それぞれ制限酵素NdeI及びHindIIIで消化した。続いて、増幅断片とプラスミドベクターpET22bとを混合し、連結反応を行った。なお、連結反応は、DNA ligation kit（タカラバイオ）を用いた。連結後の反応液を、大腸菌XL1-Blue（Stratagene）に導入し、形質転換させた。続いて、抗生物質アンピシリン含有LB寒天培地のプレート上に接種し培養した。培養後、プレート上に形成されたXL1-Blueの単一コロニーを選択し、このコロニーを、少量の培地（1.5 ml）で培養した。次いで、培養菌体から、プラスミドをplasmid mini kit（QIAGEN）にて精製し、プラスミドに挿入された断片の塩基配列をチェーンターミネーター法で決定した。その塩基配列、及び推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号３、４にそれぞれ示す。ここで、増幅されたDNA断片の塩基配列は、YP_143836の塩基配列と一致し、PQQ依存型グルコース脱水素酵素をコードする核酸分子がクローニングされたことが確認された。
上記で得られた発現ベクターにより、調製例２と同様に大腸菌BL21（DE３）株を形質転換し、導入遺伝子の発現を誘導させた。
【００６４】
３．酵素の精製
上記調製例２と同様にして、菌体からタンパク質を精製して、PPQ依存型グルコース脱水素酵素を得た。
【００６５】
〔実施例１〕酵素の安定化（ホルムアルデヒド脱水素酵素）
補酵素存在下における補酵素結合型酵素の熱安定性を確認した。ここでは、調製例１で得られたシュードモナス・プチダ由来のNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素について検討を行った。
【００６６】
補酵素結合型酵素であるNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素の補酵素存在下での熱安定性を確認した。上記調製例１で得られたシュードモナス・プチダ由来のNAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素溶液に、最終濃度10mMとなるようNAD+を添加し、２０ｍＭ トリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ 7.5）中で、様々な温度条件（熱処理なし（25℃）、50、60、70℃）下で20分間保温し、氷中に30分間置いた後の残存活性を確認した。
【００６７】
比較例として、NAD+を添加しない酵素溶液についても同様に熱処理を行い酵素の残存活性を求めた。
【００６８】
なお、酵素活性は、ホルアルデヒド脱水素酵素の触媒反応で生成するNADHを波長340 nmの吸光度を測定することに定量し、これを指標として、ホルムアルデヒド分解活性を求めることにより測定した。つまり、ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性は、ホルムアルデヒド及びNAD+から、ギ酸及びNADHを生成する触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定できる。
【００６９】
標準的な反応条件を例に詳細には、適量の酵素溶液を、1 mM ホルムアルデヒド、1 mM NAD+、0.01% BSAを含む50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）と混合し200μlとした。続いて、この反応液中のNAD+からNADH変化に伴う340 nmの吸光度変化を37℃にて測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行った。吸光度は、本実施例においては蛍光マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）により測定し、30秒毎の吸光度の経時変化を測定することで活性評価試験を行った。
【００７０】
結果を図１（Ａ）〜（Ｄ）、及び図２に示す。
図１（Ａ）は、25℃で保温した場合のNAD+添加及び無添加での比較、
図１（Ｂ）は、50℃で保温した場合のNAD+添加及び無添加での比較、
図１（Ｃ）は、60℃で保温した場合のNAD+添加及び無添加での比較、
図１（Ｄ）は、70℃で保温した場合のNAD+添加及び無添加での比較を示すグラフである。
図２は、NAD+添加せず25℃で保温した場合の活性を100とし、NAD+添加、及び無添加の酵素溶液の各温度における残存活性を相対活性で表したグラフである。
【００７１】
60℃の熱処理では、NAD+を添加しない場合には、酵素活性は０であったが、添加することにより約90％の活性が保持されることが確認された。
【００７２】
以上の結果より、NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素は、当該酵素の補酵素であるNAD+を添加することにより、顕著にその熱安定性が向上することが確認された。
【００７３】
〔実施例２〕酵素の安定化（ホルムアルデヒド脱水素酵素）
補酵素存在下における補酵素結合型酵素の熱安定性を、酵素の活性構造を追跡することにより確認した。
【００７４】
シュードモナス・プチダ由来のホルムアルデヒド脱水素酵素は、その活性型構造として４量体を形成する。したがって、熱処理によりかかる４量体構造が維持されているか否かを確認することにより当該酵素の熱安定性を確認した。実施例２で処理したサンプルを、４〜16％未変性アクリルアミドゲル電気泳動に供することにより、酵素の活性構造の保持を確認した。
【００７５】
結果を図３（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
図３（Ａ）は、NAD+無添加の場合の酵素溶液の電気泳動結果を示し、レーン１は25℃、レーン２は50℃、レーン３は60℃、レーン４は70℃で保温した場合の結果である。
なお、レーンMは、分子量マーカーである。
図３（Ｂ）は、NAD+を添加した場合の酵素溶液の電気泳動結果を示し、レーン１は25℃、レーン２は50℃、レーン３は60℃、レーン４は70℃で保温した場合の結果である。
なお、矢印は、当該酵素の活性型構造、即ち、４量体構造のバンドシグナルの推定位置を示す。かかる４量体の推定分子量は170kDaである。
【００７６】
図３（Ａ）〜（Ｂ）より、50℃の熱処理では、NAD+を添加しない場合には、酵素の活性型構造は解離することが確認された。一方、NAD+を添加することにより60℃ぐらいのまでの熱処理では活性型構造を完全に保持できることが確認された。
【００７７】
以上の結果より、NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素は、当該酵素の補酵素であるNAD+を添加することにより、顕著にその熱安定性が向上することが確認され、活性型構造の維持の観点からも実施例１の結果が追認された。
【００７８】
〔実施例３〕酵素の安定化（グルコース脱水素酵素）
補酵素存在下における補酵素結合型酵素の熱安定性を確認した。ここでは、調製例２で得られたアシネトバクター・カルコアセティカス由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素について検討を行った。
【００７９】
補酵素結合型酵素であるPQQ依存型グルコース脱水素酵素の補酵素存在下での熱安定性を確認した。上記調製例２で得られたアシネトバクター・カルコアセティカス由来のPQQ依存型グルコース脱水素酵素を、１％のBSAと１mMのCaCl2を含む30mMのMOPS緩衝液（pH7.0）にて10μg/mlの酵素溶液を調製し、最終濃度10mMとなるようPQQを添加し、様々な温度条件（熱処理なし（25℃）、50、60、70℃）下で30分間保温し、氷中に10分間置いた後の残存活性を確認した。
【００８０】
比較例として、PQQを添加しない酵素溶液についても同様に熱処理を行い酵素の残存活性を求めた。
【００８１】
なお、酵素活性は、10mMのグルコース存在下、フェナジンメソサルフェート（PMS）をメディエーターとした2、6-ジクロロフェノールインドフェノール（DCIP）の還元速度を測定することにより行った。DCIPの還元速度は、波長600nMの吸光度の消失で評価した。
【００８２】
結果を図４に示す。
図４は、PQQ添加せず25℃で保温した場合の活性を100とし、PQQ添加、及び無添加の酵素溶液の各温度における残存活性を相対活性で表したグラフである。
【００８３】
図４より、60℃の熱処理では、PQQを添加しない場合には、酵素活性が約70％低下したが、添加することにより約80％の活性が保持されることが確認された。
【００８４】
以上の結果より、PQQ依存型グルコース脱水素酵素は、当該酵素の補酵素であるPQQを添加することにより、顕著にその熱安定性が向上することが確認された。
【００８５】
〔実施例４〕酵素の安定化（グルコース脱水素酵素）
補酵素存在下における補酵素結合型酵素の熱安定性を、酵素の活性構造を追跡することにより確認した。
【００８６】
実施例３で処理したサンプルを、１２．５％変性アクリルアミドゲル電気泳動に供することにより、酵素のタンパク質構造の保持を確認した。
【００８７】
結果を図５に示す。
レーン１及び２は、25℃で保温した場合の電気泳動結果であり、レーン１はPQQを添加した場合、レーン２はPQQ無添加の場合の結果を示す。
レーン３及び４は、50℃で保温した場合の電気泳動結果であり、レーン３はPQQを添加した場合、レーン４はPQQ無添加の場合の結果を示す。
レーン５及び６は、60℃で保温した場合の電気泳動結果であり、レーン５はPQQを添加した場合、レーン６はPQQ無添加の場合の結果を示す。
レーン７及び８は、70℃で保温した場合の電気泳動結果であり、レーン７はPQQを添加した場合、レーン８はPQQ無添加の場合の結果を示す。
なお、レーンMは分子量マーカーである。
【００８８】
図５より、70℃の熱処理では、PQQを添加しない場合には、タンパク質構造が変性することが確認された。一方、PQQを添加することにより70℃位までの温度での熱処理ではタンパク質構造は変性しないことが確認された。
【００８９】
以上の結果より、PQQ依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素は、当該酵素の補酵素であるPQQを添加することにより、顕著にその熱安定性が向上することが確認され、タンパク質構造の維持の観点からも実施例３の結果が追認された。
【００９０】
そして、実施例１〜４の結果をも鑑みると、補酵素結合型酵素は、対応する補酵素を添加することにより、その熱安定性を向上できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、補酵素結合型酵素の安定化方法に関し、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】（Ａ）補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性（25℃）を確認した実施例１の結果を示すグラフ  （Ｂ）補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性（50℃）を確認した実施例１の結果を示すグラフ  （Ｃ）補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性（60℃）を確認した実施例１の結果を示すグラフ  （Ｄ）補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性（70℃）を確認した実施例１の結果を示すグラフ
【図２】補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性を確認した実施例１の結果を示すグラフ
【図３】（Ａ）補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性を、酵素の活性構造を追跡することにより確認した実施例２の結果（補酵素無添加）を示す電気泳動図  （Ｂ）補酵素存在下における補酵素結合型酵素（NAD+依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素）の熱安定性を、酵素の活性構造を追跡することにより確認した実施例２の結果（補酵素添加）を示す電気泳動図。
【図４】補酵素存在下における補酵素結合型酵素（PQQ依存型グルコース脱水素酵素）の熱安定性を確認した実施例３の結果を示すグラフ
【図５】補酵素存在下における補酵素結合型酵素（PQQ依存型グルコース脱水素酵素）の熱安定性を、酵素の活性構造を追跡することにより確認した実施例４の結果を示す電気泳動図。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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