(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＨＡ生成能を有する新規微生物、ＰＨＡ重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、ＰＨＡ重合酵素活性を有するポリペプチド、ＰＨＡ重合酵素の製造方法、およびＰＨＡの製造方法を提供する。【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエート生成能を有し、特定な塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物であって、活動温度範囲の最適温度が少なくとも４５℃であり、ｐＨ６〜１０で生育可能であり、好気性かつグラム陰性で極鞭毛を有する桿菌状細菌であって、一定の資化性を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート生成能を有し、配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する微生物であって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の特性を有する新規微生物：
（ａ）活動温度範囲の最適温度が少なくとも４５℃であり、
（ｂ）ｐＨ６〜１０で生育可能であり、
（ｃ）好気性かつグラム陰性で極鞭毛を有する桿菌状細菌であって、カタラーゼ、オキシダーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、３７℃の４％ＮａＣｌ、および５０℃の４％ＮａＣｌに耐性であり、
（ｄ）クエン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、ベタイン、Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、ドデカン、トリデカン、ヘキサデカン、ノナデカン、エイコサン、パルミチン酸、オクタナール、１−オクタノール、ラウリルアルコール、Ｔｗｅｅｎ８０、および安息香酸ナトリウムに資化性を有する。
【請求項２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）であるポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する新規微生物。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の塩基配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列；
（ｂ）塩基配列（ａ）またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）塩基配列（ａ）において１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｄ）塩基配列（ａ）と少なくとも８０％以上の塩基配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子：
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の塩基配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子：
（ａ）配列番号４に示される塩基配列；
（ｂ）塩基配列（ａ）またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）塩基配列（ａ）において１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｄ）塩基配列（ａ）と少なくとも８０％以上の塩基配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項７】
請求項３または請求項４に記載のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子、請求項５または請求項６に記載のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子、および以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を含む、遺伝子発現カセット：
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
請求項３または請求項４に記載のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子、請求項５または請求項６に記載のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子、および以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の塩基配列を含むポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を含む、遺伝子発現カセット：
（ａ）配列番号６に示される塩基配列；
（ｂ）塩基配列（ａ）またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）塩基配列（ａ）において１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｄ）塩基配列（ａ）と少なくとも８０％以上の塩基配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の遺伝子発現カセットを含むベクター。
【請求項１０】
組換えプラスミド ｐＣ１ＺＣ２＿ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７９）であるベクター。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である形質転換体。
【請求項１３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチド
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）アミノ酸配列（ｄ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｆ）アミノ酸配列（ｄ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１または請求項２に記載の新規微生物、もしくは請求項１１または請求項１２に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を採取するポリヒドロキシアルカノエート重合酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項１または請求項２に記載の新規微生物、もしくは請求項１１または請求項１２に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からポリヒドロキシアルカノエートを採取するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法により得られたポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を用いて、ポリヒドロキシアルカノエートを生成するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１７】
請求項１６において、α−不飽和脂肪酸を基質としてポリ３−ヒドロキシアルカノエートを生成するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１８】
請求項１７において、前記α−不飽和脂肪酸と前記ポリ３−ヒドロキシアルカノエートとが、２−ヘキセン酸とポリ３−ヒドロキシヘキサノエート、および／またはクロトン酸とポリ３−ヒドロキシブチレートであるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する新規微生物、ポリヒドロキシアルカノエート重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、ポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド、ポリヒドロキシアルカノエート重合酵素の製造方法、およびポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な高分子化合物のうち、例えば、石油等の化石燃料由来の化学合成プラスチック等は自然環境下で分解されないため、自然界において半永久的に蓄積してしまい、環境問題の要因となっている。近年、環境問題への意識が高まり、化石燃料由来ではない再生可能な資源からの高分子化合物の開発が行われている。
【０００３】
このような背景の下、糖や油脂等の再生可能な生物有機資源（バイオマス）から発酵法により生成されるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、熱可塑性を有し、かつ優れた生分解性と生体適合性とを有することから、環境に負荷を与えない高分子化合物である生分解性プラスチック（グリーンプラ）として注目され、実用化に向けての開発が行われている。また、生体機能材料（バイオマテリアル）として、生物・医学領域への新たな展開も期待されている。
【０００４】
ＰＨＡは、現在までに数多くの微生物において菌体内に蓄積されるポリエステル型有機分子ポリマーであることが知られており、例えば、特開２００６−３２０２５６号公報には、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を菌体内に蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属のＰＨＢ生成能を有する細菌が開示されている（特許文献１）。
【０００５】
一方、微生物により生成されて菌体内に蓄積されるＰＨＡポリマー中においては、９０種類以上のモノマー構造が確認されている（非特許文献１）。また、ＰＨＡを構成するモノマーユニットはその物性に大きな影響を与えるものであり、例えば、微生物によって生成される代表的なＰＨＡとして、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）を主要構成モノマーユニットとしたＰＨＡが挙げられるが、３ＨＢを主要構成モノマーユニットとしたＰＨＡは結晶性が高く、柔軟性が低いという性質を有しており、その利用範囲は限定されている。
【０００６】
３ＨＢ以外のモノマーユニットからなるＰＨＡを得るためには、ＰＨＡを生成する微生物の種類や培地組成、培養条件等の変更を行い、微生物を単離し、あるいは遺伝子組換え技術を用いて形質転換した形質転換体を用いる等の必要がある。例えば、特開２００１−１７８４８４号公報には、酢酸またはその塩を単一炭素源として含む培地中で培養したPseudomonas cichorii YN2により、炭素数６（以下、「Ｃ６」のように示す。）、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４のモノマーユニットを少なくとも一種類含むＰＨＡを製造する方法が開示されている（特許文献２）。また、特開２００４−３２１１６７号公報には、所定の形質転換体を、Ｃ６からＣ１０を炭素源として含む培地で培養することにより、Ｃ６からＣ１０のモノマーユニットから構成されたＰＨＡを生成する方法が開示されている（特許文献３）。
【０００７】
ＰＨＡを構成するモノマーユニットの比は、ＰＨＡ重合酵素の基質特異性と宿主におけるモノマー合成経路とによって変化する。ＰＨＡ重合酵素遺伝子はこれまでに複数クローニングされており、その一次構造と基質特異性とからI〜IIIの３つのグループに分類されている。タイプIとタイプIIIとは、Ｃ３〜６程度の短鎖長のヒドロキシアシルＣｏＡに、タイプIIは、Ｃ６〜１２程度の中鎖長のヒドロキシアシルＣｏＡに基質特異性を示す。ＰＨＡの物性はそのモノマー組成に依存しており、様々な物性のＰＨＡを製造するためには、幅広い基質特性を有するＰＨＡ重合酵素が必要となる。
【０００８】
また、特開２００２−３３５９６６号公報には、中温付近（４０℃〜５０℃）でポリ−３−ヒドロキシブチレートを生成するBacillus sp. に属する菌株、ＰＨＡ重合酵素、およびこれをコードする遺伝子等が開示されている（特許文献４）。当該菌株を培養することや、得られたＰＨＡ重合酵素を用いることにより、中温付近でも安定して、熱安定性の高いＰＨＡの製造を行うことができる。
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−３２０２５６号公報
【特許文献２】特開２００１−１７８４８４号公報
【特許文献３】特開２００４−３２１１６７号公報
【特許文献４】特開２００２−３３５９６６号公報
【非特許文献１】FEMS Microbiol. Lett., 1995, 128219-228
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１〜４には、３ＨＢを主要構成モノマーユニットとしないＰＨＡを、中温付近で生成することができる微生物やＰＨＡ重合酵素については開示されていない。
【００１１】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、ＰＨＡ生成能を有する新規微生物、ＰＨＡ重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、ＰＨＡ重合酵素活性を有するポリペプチド、ＰＨＡ重合酵素の製造方法、およびＰＨＡの製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る新規微生物は、ポリヒドロキシアルカノエート生成能を有し、配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する微生物であって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の特性を有する：
（ａ）活動温度範囲の最適温度が少なくとも４５℃であり、
（ｂ）ｐＨ６〜１０で生育可能であり、
（ｃ）好気性かつグラム陰性で極鞭毛を有する桿菌状細菌であって、カタラーゼ、オキシダーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、３７℃の４％ＮａＣｌ、および５０℃の４％ＮａＣｌに耐性であり、
（ｄ）クエン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、ベタイン、Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、ドデカン、トリデカン、ヘキサデカン、ノナデカン、エイコサン、パルミチン酸、オクタナール、１−オクタノール、ラウリルアルコール、Ｔｗｅｅｎ８０、および安息香酸ナトリウムに資化性を有する。
【００１３】
本発明に係る新規微生物は、Pseudomonas sp. SG4502（NITE P-578）であってもよい。
【００１４】
本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドをコードする：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
【００１５】
また、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の塩基配列を含む：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列；
（ｂ）塩基配列（ａ）またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）塩基配列（ａ）において１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｄ）塩基配列（ａ）と少なくとも８０％以上の塩基配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１６】
本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドをコードする：
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
【００１７】
また、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の塩基配列を含む：
（ａ）配列番号４に示される塩基配列；
（ｂ）塩基配列（ａ）またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）塩基配列（ａ）において１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｄ）塩基配列（ａ）と少なくとも８０％以上の塩基配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１８】
次に、本発明に係る遺伝子発現カセットは、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子、および以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を含む：
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するポリペプチド。
【００１９】
また、本発明に係る遺伝子発現カセットは、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素I遺伝子、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素II遺伝子、および以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の塩基配列を含むポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を含む：
（ａ）配列番号６に示される塩基配列；
（ｂ）塩基配列（ａ）またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）塩基配列（ａ）において１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｄ）塩基配列（ａ）と少なくとも８０％以上の塩基配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００２０】
さらに、本発明に係るベクターは、本発明の遺伝子発現カセットを含んでいてもよく、組換えプラスミドであるpC1ZC2_SG4502（受託番号：NITE P-579）であってもよい。
【００２１】
また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを含んでおり、前記形質転換体は大腸菌（Escheichia coli）であってもよい。
【００２２】
次に、本発明に係るポリペプチドは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）である。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）アミノ酸配列（ｄ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド；
（ｆ）アミノ酸配列（ｄ）と少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート重合酵素活性を有するポリペプチド。
【００２３】
次に、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素の製造方法は、本発明に係る新規微生物または本発明に係る形質転換体を培養し、得られた培養物からポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を採取する方法である。
【００２４】
また、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、本発明に係る新規微生物または本発明に係る形質転換体を培養し、得られた培養物からポリヒドロキシアルカノエートを採取する方法、すなわちin vivoにおける製造方法である。
【００２５】
一方、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法の異なる態様は、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート重合酵素の製造方法により得られたポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を用いて、ポリヒドロキシアルカノエートを生成する方法、すなわちin vitroにおける製造方法である。
【００２６】
本発明において、α−不飽和脂肪酸を基質としてポリ３−ヒドロキシアルカノエートを生成することができる。また、α−不飽和脂肪酸のうち２−ヘキセン酸を基質として選択した場合にはポリ３−ヒドロキシヘキサノエートを生成することができ、α−不飽和脂肪酸であるクロトン酸を基質として選択した場合には３−ヒドロキシブチレートを生成することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ＰＨＡ生成能を有する新規微生物、この新規微生物由来のＰＨＡ重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、およびＰＨＡ重合酵素活性を有するポリペプチドを提供することができ、この新規微生物由来のＰＨＡ重合酵素、およびこの酵素を用いたＰＨＡを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明において生成されるＰＨＡは、下記式［１］で表されるヒドロキシアルカノエート（ＨＡ）をモノマーユニットとして少なくとも含むものが例示される。
【化１】
2010017124.tif 000003
（式中のＲは炭素数０または１以上の炭化水素を示し、式中のｎは０または１以上の整数を示す）
【００２９】
本発明において生成されるＰＨＡのモノマーユニットとして含まれるＨＡとしては、例えば、乳酸（２−ヒドロキシプロピオネート；ＬＡ）、グリコール酸、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨｘ）、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシウンデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート、３−ヒドロキシヘキサデカノエート、３−ヒドロキシオクタデカノエート、４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、６−ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシラウリレート等を挙げることができる。
【００３０】
本発明に係る新規微生物（新菌株）は、ＰＨＡ生成能を有し、配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物であって、活動温度範囲の最適温度が少なくとも４５℃であり、ｐＨ６〜１０で生育可能であり、好気性かつグラム陰性で極鞭毛を有する桿菌状細菌であって、カタラーゼ、オキシダーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、３７℃の４％ＮａＣｌ、および５０℃の４％ＮａＣｌに耐性であり、クエン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、ベタイン、Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、ドデカン、トリデカン、ヘキサデカン、ノナデカン、エイコサン、パルミチン酸、オクタナール、１−オクタノール、ラウリルアルコール、Tween80、および安息香酸ナトリウムに資化性を有するものであればいずれの微生物も包含されるが、例えば、Pseudomonas属やThiobacillus属、Vibrio属、Xanthomonas属、Acidovorax属、Comamonas属、Gluconobacter属、Rhizobium属、Zoogloea属等に属する微生物を挙げることができる。
【００３１】
なお、本発明において「微生物」は、「菌」、「菌株」、「微生物株」あるいは「細菌」と交換可能に用いられる。従って「新規微生物」は、例えば「新規菌株」としても表すことができる。
【００３２】
また、本発明に係る新規微生物は、活動温度範囲の最適温度が少なくとも４５℃であるが、本発明における「活動温度範囲」とは、生育可能な範囲であるとともに菌体内でＰＨＡが生成される範囲をいう。
【００３３】
後述の実施例に示すように、ＰＨＡを生成する能力を有し、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する公知の種に含まれない新規微生物が発見された。その新規微生物は、Pseudomonas sp. SG4502株（以下、「本菌株」または「SG4502」と略すことがある。）と命名され、平成２０年６月２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号NITE P-578が与えられているため、この機関より入手することができる。
【００３４】
本発明に係る新規微生物は、バイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）製造装置周辺から単離されている。また本願においては、本発明に係る新規微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列が開示されている（配列番号１）。従ってもっとも簡易には、当業者であれば、この配列情報を基にして、本発明に係る新規微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするプローブやプライマーを合成し、ＢＤＦやＢＤＦ副産物（ＢＤＦＢ）に目的の菌が存在するかを検出し、それを単離することもできる。特にその１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により特異的に増幅し、定量することもできる。
【００３５】
さらに、例えば、保存性の高いｒＲＮＡ領域を増幅して得られる核酸混合物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）により分離して、分離した核酸の配列を決定し濃度を測定することにより、その試料中の、同一試料中に存在する同種ないし近縁の微生物群における各種微生物の存在比を示す菌相構造を知ることも可能である。すなわち、本発明において「１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする検出」に言及する場合は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを用いた検出のほか、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としたＰＣＲ等、当該遺伝子の存在を知るためのあらゆる検出法が含まれる。
【００３６】
また、本発明に係る微生物には、SG4502のほか、自然にもしくは人工的手段によって変異させて得られる変異株および子孫であっても、SG4502を有するものはすべて本発明に係る微生物に包含される。
【００３７】
一方、本発明に係る微生物は、配列番号１に記載の部分塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有している。一般に、比較対象の微生物が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の５００ｂｐ程度の部分塩基配列との相同性が９９％以上であれば同じ属に属する可能性が高いとされる。
【００３８】
ここで、微生物の種は系統的にほぼ７０％またはそれ以上のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を示す菌株であると定義されている（国際細菌分類命名委員会特別委員会報告、L. G. Wayne, D. J. Brenner, R. R. Colwell, P. A. D. Grimont, O. Kandler, M. I. Krichevsky, L. H. Moore, W. E. C. Moor, R. G. E. Murray, E. Stackebrandt, M. P. Starr and H. G. Truper: Report of the adhoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. International Systematic Bacteriology, 37, 463-464, 1987）。E. Stackerbrandt等は、上記定義におけるＤＮＡ−ＤＮＡ相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡ全長の相同性との関係について、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡ全長の相同性との比較からＤＮＡ−ＤＮＡ相同性７０％以上のものと１６Ｓ ｒＤＮＡ全長の相同性９７％以上のものとは対応するとし、１６Ｓ ｒＤＮＡ全長の相同性９７％以上のものを同一の種とみなされると述べている（Stackebrandt, E. and Goebel, B. M. ：Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 846-849, 1994）。
【００３９】
すなわち、上記の１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性と種との関係から鑑みれば、１６Ｓ ｒＤＮＡ全長の塩基配列が同定された場合においては、SG4502菌株またはSG4502菌株と１６Ｓ ｒＤＮＡ全長との相同性において９７％以上の菌株は、これら菌株と同一種とみなされ、本発明に包含される。
【００４０】
次に、本発明において、「１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」という場合の、置換、挿入、および／または付加されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列を有する蛋白質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列をコードするのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００４１】
また、本発明においては、配列番号３または配列番号５に記載のアミノ酸配列の全部または少なくともシグナル配列を除いた部分を含む一部と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＨＡ重合酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００４２】
本発明において、「１または２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」および「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、アミノ酸配列を整列させ、最大のパーセントアミノ酸配列同一性（相同性という場合もある）が得られるように間隙を導入してもよく、保存的置換を配列同一性の一部と考えないとした、ＰＨＡ重合酵素I遺伝子またはＰＨＡ重合酵素II遺伝子がコードするアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性に関する検索や解析は、当業者に周知のアルゴリズムまたはプログラム、例えば、ＤＮＡＳＩＳ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＪＡＬＶＩＥＷ、あるいはＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア等により可能である。なお、当業者であれば、必要な任意のアルゴリズムを含む配列を測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００４３】
次に、本発明における「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、６Ｍ尿素，０．４％ＳＤＳ，０．５×ＳＳＣの条件、またはこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じて、よりストリンジェンシーの高い条件を適用してもよく、例えば、６Ｍ尿素，０．４％ ＳＤＳ，０．１×ＳＳＣ、またはこれと同等のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。それぞれの条件において、温度は約４０℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば、約５０℃乃至６５℃としてもよい。なお、ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第二版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４４】
また、本発明において、「１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列」という場合の、置換、挿入、および／または付加される塩基配列（ヌクレオチド）の個数は、その塩基配列（ポリヌクレオチド）がコードする蛋白質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列をコードするのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００４５】
また、本発明においては、配列番号２または配列番号４に記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列からなり、かつＰＨＡ重合酵素活性を有する蛋白質をコードする塩基配列が含まれる。ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００４６】
本発明において、「１または２以上の塩基配列が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列」および「パーセント(％)塩基配列同一性」は、塩基配列を整列させ、最大のパーセント塩基配列同一性（相同性という場合もある）が得られるように間隙を導入してもよく、ＰＨＡ重合酵素I遺伝子またはＰＨＡ重合酵素II遺伝子に含まれる塩基配列と同一である候補配列中の塩基配列のパーセントとして定義される。パーセント塩基配列同一性に関する検索や解析は、当業者に周知のアルゴリズムまたはプログラム、例えば、ＤＮＡＳＩＳ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＪＡＬＶＩＥＷ、あるいはＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア等により可能である。なお、当業者であれば、必要な任意のアルゴリズムを含む配列を測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００４７】
本発明において、遺伝子のクローニングは、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、Current Protocols in Molecular Biologyユニット２・４やDNA Cloning 1: Core Techniques, A PracticalApproach, Second Edition, Oxford University Press（1995）等に記載の方法に従って、あるいは市販のキット、例えば、DNeasy Blood & Tissue Kit（キアゲン）、The illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス）やPrepMan Ultra Reagent｛アプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）｝を用いて染色体ＤＮＡを調製することができる。
【００４８】
目的遺伝子は得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅・入手することでできる。またその遺伝子を常法により適当なベクターへとクローニングすることも可能である。
【００４９】
本発明において用いられる宿主細胞としては、動物細胞や真菌、酵母、大腸菌、グラム陽性菌であるActinoplanes属、Alicyclobacillus属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Lactobacillus属、Mycobacterium属、Mycoplasma属、Bacillus属、Clostridium属、Deinococcus属、Streptomyces属、Staphylococcu属、Enterococcus属、Streptococcus属、グラム陰性菌であるEscherichia属、Salmonella属、Agrobacterium属、Azotobacter属、Methylobacterium属、Pseudomonas属、Rhodopseudomonas属、Zymomonas属、Chloropseudomonas属、Flavobacterium属、Myxococcus属、Nannocystis属、Borrelia属、Ralstonia属、Alcaligenes属、Aeromonas属、光合成グラム陰性細菌であるChromatium属、Rhodospirillum属、古細菌であるArchaeoglobus属、Methanobacterium属、Methanococcus属、Pyrococcus属、Cardarella属、Halobacterium属、Sulfolobus属、藍藻であるAnabaena属、Anacystis属、Phormidium属、Synecoccus属、Synecocystis属、緑藻であるChlorella属、Scenedesmun属等に属するものを挙げることができる。
【００５０】
また、本発明において用いられるクローニングベクターとしては特に限定されないが、大腸菌中で自律複製できるものが好適であり、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター等を使用することができる。具体的には、ZAP Express（ストラタジーン）、pBluescript II SK（+）（Nucleic Acids Research）、Lambda ZAP II（ストラタジーン）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（DNA Cloning, A Practical Approach）、λTriplEx（クローンテック）、λExCell（ファルマシア）、pT7T318U（ファルマシア）、pTrc99A（ファルマシア）、pKK223-3（ファルマシア）、ｐｃＤ２（H.Okayama and P.Berg）、ｐＭＷ２１８（和光純薬）、ｐＵＣ１１８および１１９（宝酒造）、ｐＵＣ１８および１９（宝酒造）、ｐＳＴＶ２８および２９（宝酒造）、ｐＥＧ４００（J. Bac.）、ｐＱＥ−３０（キアゲン）、ｐＱＥ８０（キアゲン）、pTA2（TOYOBO）、pGEM-T（プロメガ）、pGEM-T eazy（プロメガ）等を挙げることができる。さらに、大腸菌やシュードモナス属菌等の２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種シャトルベクターを用いることも可能である。この場合、上記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００５１】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。
【００５２】
宿主微生物に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば、宿主微生物が大腸菌の場合は塩化カルシウム法｛Current Protocols in Molecular Biologyユニット１・４、Lederberg, E. M. et al., J. Bacteriol. 119, 1072（1974)｝やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）、プロトプラスト法（特開昭63-2483942号公報）、Gene, 17,107（1982）、Molecular & General Genetics, 168, 111（1979）に記載の方法等を採用することができ、宿主微生物がファージＤＮＡの場合はインビトロ・パッケージング法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，5.7.1 頁, 1994年）等を採用することができる。また、宝酒造、TOYOBO、ニッポンジーン、インビトジェンン、ストラタジーン等より市販のコンピセントセルを購入し使用することも可能である。本発明では、インビトロ・パッケージング用キット（例えばGigapack III Gold；ストラタジーン）を用いてもよい。
【００５３】
また、得られた形質転換体より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを取得する方法としては、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press（1995）等に記載された方法により取得することができる。
【００５４】
ところで、ＰＨＡ重合酵素のアミノ酸配列については、既に何種類かのものが知られている｛Gabriel J. McCool and Maura C. Cannon, J. Bacteriol., 181, 585（1999）; Liebergesell, M. and Steinbuchel, Eur. J. Biochem., 209, 135（1992）;Kaneko, T., et al., DNA Res., 3, 109（1996）;  Liebergesell, M. and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, 493（1993）ほか｝。そこで、これらのアミノ酸配列のうち、よく保存されている領域を選択し、それをコードする塩基配列を推定してオリゴヌクレオチドを設計する。
【００５５】
次に、ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知方法、例えばサンガー法（Molecular Cloning, 2巻, 13.3頁, 1989年）等によって行うことができ、塩基配列自動分析装置、例えば種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）、ダイエナミック・ＥＴ・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（アマシャム・ファルマシア）およびＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ）を用いて、常法に従って行うことができる。
【００５６】
なお、本発明に係る遺伝子は、化学合成により、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により、あるいはこの塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより得ることができる。
【００５７】
次に、本発明に係る遺伝子発現カセットは、プロモーターと、ＰＨＡ重合酵素活性およびＰＨＡ分解酵素活性を有する遺伝子、例えば、ＰＨＡ重合酵素I遺伝子、ＰＨＡ重合酵素II遺伝子、およびＰＨＡ分解酵素遺伝子からなる群から選択される１または２以上のＤＮＡを含み、上記プロモーターに対応するターミネーターを含むもので、これらが５’末端方向から３’末端方向に連結されたものである。この遺伝子発現カセットを１または２以上の組換えベクターに組み込み、宿主に導入することで、本発明に係る形質転換体を得ることができ、さらには、この形質転換体において発現を調節することができる。
【００５８】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子発現カセットによる組換えベクターを宿主中に形質転換および形質導入することにより得られる。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、Alcaligenes属に属する微生物、Pseudomonas属に属する微生物、Bacillus属に属する微生物、大腸菌等の細菌、Saccharomyces属、Candida属等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞等を挙げることができる。
【００５９】
大腸菌等を宿主として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡが上記宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するpLA2917（ATCC 37355）やRSF1010複製起点を有するpJRD215（ATCC 37533）、pBBR122（MoBiTec GmbH）、pBHR1（MoBiTec GmbH）等を挙げることができる。
【００６０】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであれば特に限定されないが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ５プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, 1.8.1頁，1994年）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4頁，1994年）等を挙げることができる。
【００６１】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50等を挙げることができる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法｛Methods Enzymol., 194, 182-187（1990）｝、スフェロプラスト法｛Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933（1978）｝、酢酸リチウム法｛J. Bacteriol., 153, 163-168（1983）｝等を挙げることができる。
【００６２】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（インビトロジェン）等を用いることができる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を挙げることができる。
【００６３】
次に、本発明のＰＨＡ重合酵素は、本発明の細菌または変異体を培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のＰＨＡ重合酵素を生成蓄積させ、この培養物からＰＨＡ重合酵素を採取することにより行われる。本発明の細菌および変異体を培養する方法は、通常の方法に従って行われる。
【００６４】
さらに、ＰＨＡの製造は、本発明の細菌または変異体を培養し、培養物または培養菌体中に本発明のＰＨＡを生成蓄積させ、この培養菌体または培養物からＰＨＡを採取することにより行われる。本発明の細菌および変異体を培養する方法は、通常の方法に従って行われる。
【００６５】
細菌および変異体を培養する培地としては、完全培地または合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、ｐＨ７〜９、培養温度は３０〜５０℃の範囲で好気的に４〜２４時間培養することによりＰＨＡ重合酵素およびＰＨＡを菌体内に蓄積させ、回収する。
【００６６】
ＰＨＡ重合酵素の精製は、培養終了後、この培養物から採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波破砕処理等で等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて菌体を溶菌して酵素を抽出する。そして、得られる粗酵素をイオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過による各種クロマトグラフィーを用いて精製する。
【００６７】
菌体および変異体から得られたＰＨＡの精製は、例えば、以下のように行うことができる。培養液から遠心分離によって菌体および変異体を集め、蒸留水で洗浄した後、乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した菌体および変異体を懸濁し、加熱することによってＰＨＡを抽出する。なお、残渣は濾過によって取り除く。このクロロホルム溶液にメタノールを加えてＰＨＡを沈殿させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥して精製ＰＨＡを得る。
【００６８】
次に、本発明に係る新規微生物は、脂肪酸のうち、α−不飽和脂肪酸を基質としてポリ３−ヒドロキシアルカノエート｛Ｐ（３ＨＡ）｝を生成する能力を有し、特に、２−ヘキセン酸を基質とする場合はポリ３−ヒドロキシヘキサノエート｛Ｐ（３ＨＨｘ）｝を、クロトン酸を基質とする場合はポリ３−ヒドロキシブチレート｛Ｐ（３ＨＢ）｝を生成する特性を有している。本発明におけるα−不飽和脂肪酸としては、例えば、２−ヘキセン酸やクロトン酸、アクリル酸、２−ペンテン酸、２−オクテン酸、２−デセン酸、２−ヘプテン酸、２−ノネン酸等を挙げることができる。
【００６９】
以下、ＰＨＡ生成能を有する新規微生物、ＰＨＡ重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、ＰＨＡ重合酵素活性を有するポリペプチド、ＰＨＡ重合酵素の製造方法、およびＰＨＡの製造方法の実施例について説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例１】
【００７０】
本発明者等はＢＤＦ製造装置周辺から以下の方法にてＰＨＡ合成細菌を単離し、本菌株を同定した。
【００７１】
＜ＰＨＡ合成細菌の単離＞
具体的には、ＢＤＦ製造装置周辺部（床や廃水口、廃水貯蔵タンクの側面等）の汚れを、薬さじを用いて採取したサンプルを滅菌水１０ｍＬに入れ、常温下で１０００×ｇにて３分間遠心することにより上清を得、この上清１００μＬを、水酸化ナトリウムでＢＤＦＢを中和して得たＢＤＦＢ（中和ＢＤＦＢ）を１重量％含むＭＳ培地５０ｍＬに植菌して、４５℃で３日間集積培養した。この培養液１００μＬを、新しい中和ＢＤＦＢを１重量％含むＭＳ培地５０ｍＬに添加し、４５℃にて培養した。その後、培養液をＮＲ寒天平板培地に画線し、４５℃にて３日間培養した後、この平板培養培地に形成されたコロニーから釣菌した。さらにその釣菌した菌株をＮＲ培地２ｍＬに植菌し、４５℃にて一晩浸振盪培養して凍結保存した。
【００７２】
次に、この培養液５ｍＬを、ＭＳ培地１００ｍＬを含む５００ｍＬ羽根付き三角フラスコ（イワキ）に加え、４５℃，１６０ｒｐｍで４８時間培養した。培養開始時と２４時間経過時とに中和ＢＤＦＢを１％（ｗｔ／ｖｏｌ）になるように加えた。この培養液を遠心分離後、蒸留水、１００％メタノール、蒸留水の順に用いて洗菌し、凍結乾燥した。さらにこの凍結乾燥菌体をメタノリシス処理し、ガスクロマトグラフ法にてポリマー蓄積を検出した。このポリマー蓄積の確認された菌株を、中和ＢＤＦＢを炭素源としてＰＨＡを生成する菌株として選択した。
【００７３】
なお、本実施例で用いているＮＲ培地およびＭＳ培地の組成は、以下のとおりである｛J. Bacteriol. V179, p4821-4830（1997），Appl. Microbiol. Biotechnol. V45, p363-370（1996）｝。
【００７４】
（ＮＲ培地の組成）培地１Ｌ中
バクトイーストエクストラクト              ３ｇ
バクトペプトン                          １０ｇ
エルリッヒカツオエキス                  １０ｇ
【００７５】
（ＭＳ培地）培地１Ｌ中
リン酸水素二ナトリウム                ３．６ｇ
リン酸二水素カリウム                  １．５ｇ
塩化アンモニウム                      ０．５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物        ０．０１０４ｇ
トレースエレメント水溶液            ０．０５ｍＬ
【００７６】
＜Pseudomonas sp. SG4502の同定＞
（１）菌学的性状試験
単離した菌株について、財団法人食品分析センターにおいて菌学的性状試験を行った。その結果は次のとおりである。
１）形態学的性状
一般寒天培地上、４５℃
形態的性質
１．細胞形態                                桿状
２．運動性                                  あり
３．グラム染色                              陰性
２）生理学的性状
１．カタラーゼ                              ＋
２．オキシダーゼ                            ＋
３．硝酸塩の還元                            −
４．硝酸塩存在下での嫌気下生育              −
５．脱窒反応                                −
６．ウレアーゼ                              −
７．アルギニンジヒドロラーゼ                ＋
８．極鞭毛                                  ＋
９．加水分解
９−１．エスクリン                          −
９−２．ゼラチン                            −
９−３．スターチ                            −
９−４．スキムミルク                        −
９−５．Ｔｗｅｅｎ  ２０                    ＋
９−６．Ｔｗｅｅｎ  ８０                    ＋
１０．３％ＮａＣｌ存在下での生育            ＋
１１．４％ＮａＣｌ存在下での生育（３７℃）  ＋
１２．４％ＮａＣｌ存在下での生育（５０℃）  ＋
１３．ｐＨ５での生育                        −
１４．ｐＨ６での生育                        ＋
１５．ｐＨ１０での生育                      ＋
１６．ｐＨ１１での生育                      −
１７．４６℃での生育                        ＋
１８．５０℃での生育                        ＋
１９．資化性試験
１９−１．フルクトース                      −
１９−２．Ｄ−マンノース                    −
１９−３．Ｄ−トレハロース                  −
１９−４．Ｄ−セロビオース                  −
１９−５．Ｌ−アラビノース                  −
１９−６．Ｄ−グルコース                    −
１９−７．Ｌ−ソルボース                    −
１９−８．Ｄ−スクロース                    −
１９−９．Ｄ−キシロース                    −
１９−１０．Ｄ−マルトース                  −
１９−１１．グルコン酸カリウム              −
１９−１２．酢酸フェニル                    −
１９−１３．クエン酸ナトリウム              ＋
１９−１４．アジピン酸ナトリウム            −
１９−１５．Ｄ−マンニトール                −
１９−１６．グリセロール                    −
１９−１７．ピルビン酸ナトリウム            ＋
１９−１８．コハク酸ナトリウム              ＋
１９−１９．酢酸ナトリウム                  ＋
１９−２０．プロピオン酸ナトリウム          ＋
１９−２１．カプロン酸ナトリウム            ＋
１９−２２．リンゴ酸ナトリウム              ＋
１９−２３．ベタイン                        ＋
１９−２４．Ｌ−リジン                      ＋
１９−２５．グリシン                        −
１９−２６．Ｌ−システイン                  −
１９−２７．Ｌ−フェニルアラニン            −
１９−２８．Ｌ−ヒスチジン                  −
１９−２９．Ｌ−アスパラギン                ＋
１９−３０．Ｌ−アルギニン                  −
１９−３１．Ｌ−セリン                      ＋
１９−３２．Ｌ−グルタミン                  ＋
１９−３３．Ｌ−アラニン                    ＋
１９−３４．Ｌ−イソロイシン                ＋
１９−３５．Ｌ−プロリン                    ＋
１９−３６．Ｎ−アセチルグルコサミン        −
１９−３７．デカン                          −
１９−３８．ドデカン                        ＋
１９−３９．トリデカン                      ＋
１９−４０．ヘキサデカン                    ＋
１９−４１．ノナデカン                      ＋
１９−４２．エイコサン                      ＋
１９−４３．パルミチン酸                    ＋
１９−４４．オクタン酸                      −
１９−４５．オクタナール                    ＋
１９−４６．１−オクタノール                ＋
１９−４７．ラウリルアルコール              ＋
１９−４８．Ｔｗｅｅｎ  ８０                ＋
１９−４９．ＳＤＳ                          −
１９−５０．安息香酸ナトリウム              ＋
１９−５１．サリチル酸ナトリウム            −
１９−５２．ナフタレン                      −
１９−５３．アントラセン                    −
１９−５４．フェナントレン                  −
【００７７】
本菌株は、本実施例（１）の菌学的性質に基づいて、International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology（2002）53, pp. 2203-2209を参照することにより、Pseudomonas sp. であることが確認された。
【００７８】
（２）塩基配列解析
次に、単離した本菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を決定した。まず、MicroSeq 500 16S rDNA RNA Kit（ＡＢＩ）を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、この増幅遺伝子の塩基配列をMicroSeq 500 16S rDNA Sequencing Kit（ＡＢＩ）を用いて解析した。その塩基配列を配列番号１に示す。
【００７９】
（３）分類学的考察
次に、本実施例（２）の部分塩基配列（配列番号１）をＢＬＡＳＴ検索（Altschul, S. F. etal., Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410）を利用した遺伝子データベース上の既知遺伝子と比較したところ、次のようにPseudomonas thermotoleran strain CM3Tの配列が見つかった。
【００８０】
Pseudomonas thermotolerans strain CM3Tの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列は、配列番号１の塩基配列と９９％の相同性を示した。しかしながら、この微生物はＰＨＡを生成する菌株であるかどうかは不明である。さらに、４％塩化ナトリウム存在下での生育（３７℃）結果と、クエン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、オクタン酸、およびＳＤＳの資化性試験の結果とがPseudomonas thermotolerans strain CM3Tのものと異なっていた。以上の結果から本菌株は新規微生物であり、Pseudomonas sp. SG4502と命名し、平成２０年６月２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号NITE P-578として寄託した。
【実施例２】
【００８１】
＜Pseudomonas sp. SG4502によるＰＨＡ生成＞
上記実施例１にて単離・同定したSG4502を用いてＰＨＡを生成した。この際、培養培地に添加する炭素源を変えてＰＨＡの生成を試みることにより、炭素源の違いによるＰＨＡ生成量、生成ＰＨＡの分子構造、分子量および組成（モノマー構成比）について比較検討した。
【００８２】
具体的には、まず、フリーズストックされているSG4502をＮＲ培地２ｍＬに植菌し、４５℃で８時間培養した後、その培養液を新しいＮＲ培地１００ｍＬに植菌し一晩浸振盪培養した。この培養液６０ｍＬを、ＭＳ培地１．２Ｌを含む３Ｌ三角フラスコ（イワキ）に添加して、４５℃，３７℃，および３０℃で振盪培養した。培養開始時と１２、２４、３６時間経過時に炭素源を１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ずつ加えた。炭素源として、４５℃での培養にはドデカン酸ナトリウム、オクタン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、中和ＢＤＦＢを各々用いた。３７℃および３０℃での各々の培養には、炭素源として中和ＢＤＦＢを用いた。各々４８時間培養後、４℃、８０００×ｇにて１５分間遠心して菌体を回収し、２０％エタノール水溶液、１００％エタノール水溶液、蒸留水の順に用いてこの菌体を洗浄後、凍結乾燥して乾燥菌体を得た。各乾燥菌体量を図１に示す。
【００８３】
（１）ＰＨＡの抽出
上記にて得られた各乾燥菌体を、クロロホルムを溶媒としてソックスレー抽出機（柴田）を用いてＰＨＡを抽出した後、エバポレーターにて溶媒を除去し、減圧乾燥させて生成物（ＰＨＡ）を得た。得られた各生成物（ＰＨＡ）の生成量を図１に示す。
【００８４】
図１に示すように、中和ＢＤＦＢを炭素源とした場合には、酢酸ナトリウム、オクタン酸ナトリウム、およびドデカン酸ナトリウムを各々炭素源とした場合と比較して、同程度以上のＰＨＡを生成することができた。
【００８５】
（２）分子構造解析
上記にて得られた各生成物（ＰＨＡ）の分子構造を核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いた１Ｈ−ＮＭＲによって確認した。ＮＭＲ測定は、ＭＳＬ４００分光器（Ｂｒｕｋｅｒ）を用い、１Ｈに対し周波数４００ＭＨｚにて２５℃で行った。ドデカン酸ナトリウム、オクタン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および中和ＢＤＦＢを各々炭素源として得られた各生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、各々図３〜図６に示す。
【００８６】
その結果、図３〜図６に示すように、全ての生成物がＰＨＡであることを確認することができた。また、図３〜図５に示すように、酢酸ナトリウム、オクタン酸ナトリウム、およびドデカン酸ナトリウムを各々炭素源として生成されたＰＨＡは、不飽和結合を有しないポリマーであることが明らかとなった。これに対し、図６に示すように、中和ＢＤＦＢを炭素源として生成されたＰＨＡは、不飽和結合を有しないモノマーユニットと不飽和結合を有するモノマーユニットとで構成されるコポリマーであることが明らかとなった。
【００８７】
（３）分子量測定
つづいて、上記にて得られた各ＰＨＡの分子量をゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ測定方法は、TSKgel SuperHZM-Hカラム（６．０ｎｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ；東ソー）を２本直列に接続し、移動相としてクロロホルムを用い、４０℃、流速０．３ｍＬ／分にて測定した。純正のポリスチレンを用いて検量線を作成し、各数平均分子量（Ｍｎ）、各重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｎ／Ｍｗ）を算出した。その結果を図１に示す。
【００８８】
図１に示すように、中和ＢＤＦＢを炭素源として生成されたＰＨＡは、ドデカン酸ナトリウム、オクタン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムを各々炭素源として生成されたＰＨＡと比較して、低分子量化していることが示された。これは、中和ＢＤＦＢに含有されているグリセリン等による影響ではないかと発明者等は推測している。
【００８９】
（４）組成分析
さらに、上記にて得られた各ＰＨＡの組成をガスクロマトグラフ法によって分析した。測定方法と条件とを以下に示す。まず、各ＰＨＡを１５重量％濃度の硫酸メタノール溶液２ｍＬとクロロホルム２ｍＬとの混合液に溶解し、１００℃で１４０分間処理しアルコリシスした。冷却後、超純水を１ｍＬ加えよく混合し静置し２層に分離させ、この下層を回収しフィルター濾過により不溶物を除去した。このうち０．５ｍＬと、０．１ｖｏｌ％カプリル酸メチルを含むクロロホルム溶液０．５ｍＬとを混合し、ＦＩＤを備えたキャピラリーガスクロマトグラフＧＣ−２０１０（島津製作所）にて昇温分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。カラムは、ヒューズド・シリカ・キャピラリーカラムＤＢ−５（カラム内径０．２５ｍｍ、液層膜厚０．２５μｍ、カラム長３０ｍ；島津製作所）を使用した。初発温度９０℃で５分、昇温速度５℃／分、および最終温度２５０℃で２分の分析条件にて行った。その結果を図２に示す。
【００９０】
その結果、図２に示すように、炭素源の違いにより生成ＰＨＡの組成が異なることが明らかとなった。１Ｈ−ＮＭＲの結果、中和ＢＤＦＢを炭素源として生成されたＰＨＡは不飽和結合を有するモノマーユニットを構成モノマーとして含むという解析結果を得ているが、その含有量が非常に少ないためガスクロマトグラフ法では検出されなかったと発明者等は考えている。
【００９１】
以上、上記（２）〜（４）における結果から、SG4502は、多種類の炭素源を利用して多種類のＰＨＡを生成可能な菌株であるといえる。つまり、SG4502を用いたＰＨＡの生成では、炭素源を適宜選択することによって所望の物性を有するＰＨＡを選択的に生成することが可能となる。
【実施例３】
【００９２】
＜Pseudomonas sp. SG4502のＰＨＡ重合酵素遺伝子のクローニング＞
SG4502のＰＨＡ重合酵素を以下の方法にてクローニングした。
【００９３】
（１）Pseudomonas sp. SG4502の染色体ＤＮＡの調製
まず、SG4502を２ｍＬの滅菌したＮＲ培養液において４５℃で一晩培養した。培養液１００μＬを２ｍＬの新しいＮＲ培地に入れ、培養液の濁度（吸光度６００ｎｍ）が０．７になるまで４５℃で振盪培養した。培養終了後、培養液から７０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離処理により菌体を分離し、DNeasy Blood & Tissue Kit（キアゲン）にて染色体ＤＮＡを１００μＬ（ＤＮＡ濃度１２０ｎｇ／μＬ）調製した。
【００９４】
（２）ＰＨＡ重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得
次に、公知である数種のＰＨＡ重合酵素遺伝子の保存領域を２つ選択し、これらをコードするＤＮＡ塩基配列を推定して、FEMS Micobiology Letters（2001）198, pp. 165-170を参考としながら２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列は、
５’−ccatgacagc ggcctgttca cctg−３’（配列番号８）
５’−tcgacgatca ggtgcaggaa cagcc−３’（配列番号９）
で表される。
【００９５】
上記配列番号８および配列番号９のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを以下の条件で行った。
−反応試薬−
TaKaRa LA Taq with GC Buffer（宝酒造）の付属のマニュアルに従って反応液を調製した。反応には２×ＧＣ緩衝液Iを用い、染色体ＤＮＡとしては本実施例（１）で得たものを１μＬ用いた。
−反応条件−
９４℃で１分、９４℃で３０秒、７０℃で５分の各反応を１サイクルとして１０サイクル行い、その後、９４℃で３０秒、６８℃で５分の各反応を１サイクルとして２０サイクル行い、さらに６８℃で１０分の反応を行った。
その結果、約５．２ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。
【００９６】
次いで、この増幅されたＤＮＡ断片をTOPO TA Cloning kit with TOP 10 cells（Invitrogen）用いて、プラスミドベクターpCR2.1-TOPOにＴＡクローニングした。操作は付属のマニュアルに従って行った。形質転換液を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間静置培養した。生じたコロニーをＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した後にプラスミドＤＮＡを調製した。この得られたプラスミドをpC1ZC2_SG4502と命名し、平成２０年６月２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号NITE P-579として寄託した。
【００９７】
（３）ＰＨＡ重合酵素遺伝子の塩基配列解析及びＰＨＡ重合酵素遺伝子の検索
つづいて、プラスミドpC1ZC2_SG4502をテンプレートとして、各々のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）およびＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ）を用いて、常法に従って行った。ＴＡクローニングされた挿入ＤＮＡを、種々の合成ＤＮＡをプライマーとして用いて、ジデオキシ法により約５．２ｋｂｐの塩基配列を決定した。
【００９８】
さらに、この塩基配列について遺伝子領域を予測するORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)とＢＬＡＳＴとを用いた相同性解析の結果、３つのオープンリーディングフレームが確認された。オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）は１６８０塩基で構成されるとともにPseudomonas stutzeri由来ＰＨＡ重合酵素Iをコードする遺伝子｛FEMS Microbiol. Lett. 234（2）, 231-237（2004）、Accession No. AY278219｝とアミノ酸配列レベルで約８９％の相同性を有することが、オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）は９０６塩基で構成されるとともにPseudomonas stutzeri由来ＰＨＡ分解酵素をコードする遺伝子（同前）とアミノ酸配列レベルで約９５％の相同性を有することが、オープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）は１６９２塩基で構成されるとともにPseudomonas stutzeri由来ＰＨＡ重合酵素IIをコードする遺伝子（同前）とアミノ酸配列レベルで約９０％の相同性有することが、各々確認された。
【００９９】
得られた塩基配列を基にして、pC1ZC2_SG4502にクローニングされたSG4502由来の約５．２ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成した。この制限酵素地図を図７に示す。
【０１００】
そして、ＯＲＦ１の塩基配列を配列番号２に、ＯＲＦ１によりコードされるアミノ酸配列を配列番号３に、ＯＲＦ３の塩基配列を配列番号４に、ＯＲＦ３によりコードされるアミノ酸配列を配列番号５に、ＯＲＦ２の塩基配列を配列番号６に、および塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号７に、各々示した。また、ＯＲＦ１の塩基配列をＰＨＡ重合酵素I遺伝子とし、ＯＲＦ３の塩基配列をＰＨＡ重合酵素II遺伝子とした。
【実施例４】
【０１０１】
＜Pseudomonas sp. SG4502由来のＰＨＡ重合酵素によるＰＨＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成＞
SG4502由来のＰＨＡ重合酵素IおよびＰＨＡ重合酵素IIを、以下の方法にて単離・調製し、これを用いてＰＨＡのin vitro合成を試みた。
【０１０２】
（１）ＰＨＡ重合酵素IおよびＰＨＡ重合酵素IIの単離・調製
１）ＰＨＡ重合酵素I
上記実施例３（４）のpC1ZC2_SG4502をテンプレートとして、下記条件にてＰＣＲ法によりＰＨＡ重合酵素I遺伝子を増幅し、約１．７ｋｂｐのＢａｍＨIサイトとＫｐｎIサイトとを有するＰＨＡ重合酵素Iの遺伝子断片を得た。この遺伝子断片をＢａｍＨIとＫｐｎIで処理したベクターｐＱＥ８０（キアゲン）にライゲーションし、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体からＰＨＡ重合酵素I遺伝子を有するプラスミドpQC1SGを得た。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１に導入し、ＰＨＡ重合酵素I調製用の大腸菌を作製した。
【０１０３】
ＰＣＲ条件：
センスプライマーcgggatccaacaagatcgccgaagacctacag（配列番号１０）
アンチセンスプライマーggggtacctcatcgttcgtgcacgtaggttcc（配列番号１１）
Pyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を用い、付属のマニュアルに従って反応液を調製した。９８℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分４０秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１０４】
２）ＰＨＡ重合酵素II
pC1ZC2_SG4502をテンプレートとして、下記条件にてＰＣＲ法によりＰＨＡ重合酵素II遺伝子を増幅し、約１．７ｋｂｐのＢｇｌIIサイトとＫｐｎIサイトを有するＰＨＡ重合酵素IIの遺伝子断片を得た。この遺伝子断片をＢａｍＨIとＫｐｎIで処理したベクターｐＱＥ８０（キアゲン）にライゲーションし、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体からＰＨＡ重合酵素II遺伝子を有するプラスミドpQC2SGを得た。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１に導入し、ＰＨＡ重合酵素II調製用の大腸菌を作製した。
【０１０５】
ＰＨＡ重合酵素II遺伝子についてのＰＣＲ条件：
センスプライマーgaagatctcccacgcgccatcaacccgctgtc（配列番号１２）
アンチセンスプライマーggggtacctcagcgcaccagcacgtaggtgccc（配列番号１３）
Pyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を用い、マニュアルに従って反応液を調製した。９８℃で２０秒、６５℃で２０秒、７２℃で１分４０秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１０６】
本実施例（１）１）および２）で得られたＰＨＡ重合酵素調製用の大腸菌を、各々アンピシリンを含む１０００ｍＬのＬＢ培地中において２０℃で８時間培養した後、ＩＰＴＧを終濃度０．２５ｍＭになるように添加して、さらに１６時間培養し、菌体内にＰＨＡ重合酵素を蓄積させた。この菌体を超音波破砕によって破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。この回収したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラム（キアゲン）に供し、（６×Ｈｉｓ）−ＰＨＡ重合酵素Iまたは（６×Ｈｉｓ）−ＰＨＡ重合酵素IIをワンステップで精製した。
【０１０７】
（２）ＰＨＡ生成試験
次に、本実施例（１）で得られたＰＨＡ重合酵素IおよびＰＨＡ重合酵素IIを用いて、図８（ａ）または（ｂ）に示す反応経路によりＰＨＡの生成を試みた。この際、複数の基質を用いてＰＨＡ生成量および生成ＰＨＡの性質について比較した。
【０１０８】
１）基質が２−ヘキセン酸の場合
具体的には、水相反応溶液として、１００ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ８．０）と、１．０ｍＭＣｏＡと、１００ｍＭ２−ヘキセン酸と、１．０ｍｇアシルＣｏＡシンセターゼと、３０ｍＭＡＴＰと、１０ｍＭＭｇＣｌ２と、０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡと、０．４Ｕピロフォスファターゼと、ヒドラターゼとを含む溶液５ｍＬを調製した。最後に１．０ｍｇのＰＨＡ重合酵素IまたはＰＨＡ重合酵素IIを水相に添加し、３０℃で７２時間反応させた。この反応経路を図８（ａ）に示す。
【０１０９】
反応終了後、各反応液にクロロホルムを５ｍＬ加え、７０℃で３時間、生成物の抽出を行った。各抽出液をフィルター（０．２μｍＰＴＦＥメンブラン；アドバンテック）にてろ過し、５０ｍＬのメタノールを加えて４℃で一晩放置した後、生成した沈殿物をフィルター（同前）を用いてろ過し回収した。生成物を真空乾燥させて収量を測定したところ、ＰＨＡ重合酵素Iにおいて１．８ｍｇの生成量、ＰＨＡ重合酵素IIにおいて２．４ｍｇの生成量であった。
【０１１０】
次に、得られた各生成物の分子構造解析をＮＭＲにより行った。測定条件は、上記実施例２（２）と同様である。ＰＨＡ重合酵素Iを用いて得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図９に、ＰＨＡ重合酵素IIを用いて得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１０に示す。その結果、図９および図１０に示すように、どちらの生成物もポリ３−ヒドロシキヘキサノエート｛Ｐ（３ＨＨｘ）｝であることが確認できた。
【０１１１】
つづいて、得られた各ＰＨＡの分子量測定をＧＰＣにより行った。測定条件は、上記実施例２（３）と同様である。その結果、ＰＨＡ重合酵素Iを用いて得られたＰＨＡは、Ｍｎ＝３３．８×１０４，Ｍｗ＝７２．６×１０４，Ｍｎ／Ｍｗ＝１．７であった。一方、ＰＨＡ重合酵素IIを用いて得られたＰＨＡは、Ｍｎ＝１７．１×１０４，Ｍｗ＝１９．１×１０４，Ｍｎ／Ｍｗ＝２．１であった。これらの結果から、ＰＨＡ重合酵素IまたはＰＨＡ重合酵素IIを用いることによって、高分子量のＰＨＡが生成できることが明らかとなった。
【０１１２】
２）基質がクロトン酸の場合
上記（１）の２−ヘキセン酸に変えてクロトン酸を用いて同様の操作を行った。この反応経路を図８（ｂ）に示す。その結果、ＰＨＡ重合酵素IまたはＰＨＡ重合酵素IIのどちらを用いた場合でも生成物を確認することができた。ＰＨＡ重合酵素IIにおいては、０．３ｍｇの生成量であり、生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１１）から、生成物がポリ３−ヒドロキシブチレート｛Ｐ（３ＨＢ）｝であることが確認できた。
【実施例５】
【０１１３】
＜Pseudomonas sp. SG4502由来のＰＨＡ重合酵素遺伝子を用いたＰＨＡのin vivo合成＞
次に、SG4502由来のＰＨＡ重合酵素遺伝子を導入してＰＨＡ生成能を有する形質転換体を作製し、これを用いてＰＨＡ生成を試みた。
【０１１４】
（１）形質転換体の作製
まず、上記実施例３（１）で得たSG4502の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、KOD FX（TOYOBO）の付属のマニュアルに従って反応液を調製し、下記条件のＰＣＲ法によりＰＨＡ重合酵素I遺伝子およびＰＨＡ重合酵素II遺伝子を各々増幅した。
【０１１５】
ＰＣＲ条件：
−ＰＨＡ重合酵素I遺伝子−
センスプライマーgccatgggca acaagatcgc cgaagaccta cagc（配列番号１４）
アンチセンスプライマーtctagattca tcgttcgtgc acgtaggttc（配列番号１５）
−ＰＨＡ重合酵素II遺伝子−
センスプライマーccatgggtcc cacgcgccat caacccgctg tcaac （配列番号１６）
アンチセンスプライマーtgctctagat tcagcgcacc agcacgtagg（配列番号１７）
９４℃で２分を１サイクル行った後、９４℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分４５秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１１６】
この各増幅産物をTArget Clone-Plus-（TOYOBO）を用いてＴＡクローニングし、得られた各プラスミドを各々pTA-phaC1sg，pTA-phaC2sgとした。これをテンプレートとして、上記実施例３（３）の方法によりＰＨＡ重合酵素I遺伝子およびＰＨＡ重合酵素II遺伝子の塩基配列を確認した。その後、各プラスミドを制限酵素ＮｃｏIとＸｂａIとで処理し、ＰＨＡ重合酵素I遺伝子およびＰＨＡ重合酵素II遺伝子を得た。
【０１１７】
次に、Ralstonia eutropha H16由来の合成酵素遺伝子を含むプラスミドpTI305（J. Biosci. Bioeng., v94, pp. 343-350, 2002）をテンプレートとして、KOD-plus-（TOYOBO）の付属のマニュアルに従って反応液を調製し、下記条件にてＰＣＲ法によりＰＨＡ合成酵素の遺伝子発現プロモーター領域を増幅した。これにより、HindiIIIサイトを有する遺伝子発現プロモーター領域の遺伝子断片を得た。
【０１１８】
ＰＣＲ条件：
センスプライマーaaaccaagct tcccgggcaa gtaccttg（配列番号１８） 
アンチセンスプライマーaaccaagctt ccatggtttg attgtctctc tgc（配列番号１９）
９４℃で２分を行った後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分の各反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１１９】
この遺伝子断片を制限酵素HindiIIIで処理したクローニングベクターｐＵＣ１８（宝酒造）にライゲーションし、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターに対して逆方向にこの遺伝子断片を挿入したプラスミドをpUC-Preとした。
【０１２０】
プラスミドpUC-Preを制限酵素ＮｃｏIとＸｂａIとで処理し、上記にて得られたＮｃｏIサイトとＸｂａIサイトとを有するＰＨＡ重合酵素I遺伝子およびＰＨＡ重合酵素II遺伝子を挿入して、各々、pUC-PrephaC1sgとpUC-PrephaC2sgとを得た。
【０１２１】
これらpUC-PrephaC1sg、pUC-PrephaC2sg、およびpUC-Preを用いて、Ralstonia eutropha H16由来のモノマー合成関連遺伝子（β−ケトチオラーゼ遺伝子およびＮＡＤＰ依存性アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子）を含むプラスミドpSRAB（J. Biosci. Bioeng., v94, pp. 343-350, 2002）を有する大腸菌ＢＬ２１を常法にて、各々形質転換した。これにより、pUC-PrephaC1sg形質転換体と、pUC-PrephaC2sg形質転換体と、pUC-Pre形質転換体とを作製した。
【０１２２】
（２）ＰＨＡ生成試験
つづいて、本実施例（１）にて作製されたpUC-PrephaC1sg形質転換体と、pUC-PrephaC2sg形質転換体と、pUC-Pre形質転換体とを用いてＰＨＡ生成を試みた。
【０１２３】
まず、各形質転換体を、各々１００μｇ／ｍＬアンピシリンと３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールとを含むＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液の全量を、１％グルコースと１００μｇ／ｍＬアンピシリンと３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールとを含むＬＢ培地１００ｍＬの入った５００ｍＬの羽根付き三角フラスコ（イワキ）に添加して、３７℃、１６０ｒｐｍにて培養した。培養８時間後にＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭになるように添加して、さらに４０時間培養した。培養終了後、菌体を遠心分離して回収し、蒸留水にて２回洗浄し凍結乾燥した。乾燥菌体約５０ｍｇを常法によりメタノリシス処理し、上記実施例２（４）と同様、ガスクロマトグラフ法による解析を行った。その結果を図１２（ａ）〜（ｃ）に示す。（ａ）はpUC-Pre形質転換体を、（ｂ）はpUC-PrephaC1sg形質転換体を、（ｃ）はpUC-PrephaC2sg形質転換体を用いたＰＨＡ生成試験の解析結果である。
【０１２４】
その結果、図１２（ｂ）および（ｃ）に示すように、pUC-PrephaC1sg形質転換体と、pUC-PrephaC2sg形質転換体とを用いた生成試験において、ＰＨＡ、特にＰ（３ＨＢ）に由来するピークが検出された。一方、図１２（ａ）に示すように、pUC-Pre形質転換体を用いた場合においてはＰＨＡに由来するピークが検出されなかった。これらの結果から、pUC-PrephaC1sg形質転換体はＰＨＡ重合酵素Iを、pUC-PrephaC2sg形質転換体はＰＨＡ重合酵素IIを発現し、これによりＰ（３ＨＢ）を重合することができることが確認された。
【０１２５】
以上のような本実施形態によれば、ＰＨＡ生成能を有する新規微生物、ＰＨＡ重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、ＰＨＡ重合酵素活性を有するポリペプチド、ＰＨＡ重合酵素の製造方法、およびＰＨＡの製造方法を提供することができる。
【０１２６】
なお、本発明に係るＰＨＡ生成能を有する新規微生物、ＰＨＡ重合酵素遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、ＰＨＡ重合酵素活性を有するポリペプチド、ＰＨＡ重合酵素の製造方法、およびＰＨＡの製造方法は、前述した実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】実施例２における、SG4502により生成されたＰＨＡ生成量と分子量とを示す図表である。
【図２】実施例２における、SG4502により生成されたＰＨＡ組成を示す図表である。
【図３】実施例２（２）における、ドデカン酸ナトリウムを炭素源としてSG4502により生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図ある。
【図４】実施例２（２）における、オクタン酸ナトリウムを炭素源としてSG4502により生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】実施例２（２）における、酢酸ナトリウムを炭素源としてSG4502により生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図ある。
【図６】実施例２（２）における、中和ＢＤＦＢを炭素源としてSG4502により生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図７】Pseudomonas sp. SG4502株由来の約５．２ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図８】実施例４における、ＰＨＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成反応経路を示す図である。（ａ）は２−ヘキセン酸を、（ｂ）はクロトン酸を基質とする反応経路を示す。
【図９】実施例４（２）における、２−ヘキセン酸を基質としてＰＨＡ重合酵素Iを用いて生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】実施例４（２）における、２−ヘキセン酸を基質としてＰＨＡ重合酵素IIを用いて生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】実施例４（２）における、クロトン酸を基質としてＰＨＡ重合酵素IIを用いて生成された化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１２】実施例５（２）における、生成された化合物のガスクロマトグラフィーチャートを示す図である。（ａ）はpUC-Pre形質転換体を、（ｂ）はpUC-PrephaC1sg形質転換体を、（ｃ）はpUC-PrephaC2sg形質転換体を用いて生成された化合物のガスクロマトグラフィーチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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