(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＤＭ２とＭＤＭＸの細胞増殖阻害剤を提供。【解決手段】下記一般式で表される化合物：2010105992.tif 000015（Ｉ）Ｒ１〜Ｒ６は、水素、アルキル基等、Ｒ７とＲ８は、水素等、Ｒ９は、水素等、Ｘは、−ＮＨ−等である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉ
【化１】
2010105992.tif 000013
（Ｉ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、相互に独立して水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アルキルチオ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ヘテロアリール基、スルフォニル基、又はアシルアミノ基であり、Ｒ２とＲ３は互いにまとまって、それらが結合しているベンゼン環とともに縮環となり、インドール環、カルバゾール環を形成してもよく、
Ｒ６は、独立して水素原子、又はハロゲン原子であり、
Ｒ７とＲ８は、独立して水素原子であるか、又はＲ７とＲ８は互いにまとまって二重結合を形成し、
Ｒ９は、水素原子、アルキル基、アリール基、アリールアミノ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、アラルキル基、又はヘテロアリール基であり、
Ｘは、−ＮＨ−、又は−Ｓ−である）
で表される化合物又はその医薬的に許容し得る塩からなる、細胞増殖阻害剤。
【請求項２】
下記一般式ＩＩ
【化２】
2010105992.tif 000014
（ＩＩ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、相互に独立して水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキルチオ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ヘテロアリール基、スルフォニル基、又はアシルアミノ基であり、Ｒ２とＲ３は互いにまとまって、それらが結合しているベンゼン環とともに縮環となり、インドール環、カルバゾール環を形成してもよく、
Ｒ６は、独立して水素原子、又はハロゲン原子であり、
Ｒ７とＲ８は、独立して水素原子であるか、又はＲ７とＲ８は互いにまとまって二重結合を形成し、
Ｒ９〜Ｒ１３は、相互に独立して水素原子、カルボキシル基、アルキル基、アリール基、アリールアミノ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、アラルキル基、又はヘテロアリール基であり、
ＸとＹは、独立して窒素原子、又は炭素原子であり、
Ｒ９とＲ１３は、Ｘ部分及びＹ部分のうち何れか又は両者が窒素原子の場合は、存在しなくてもよい）
で表される化合物又はその医薬的に許容し得る塩からなる、細胞増殖阻害剤。
【請求項３】
３−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）−１−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ピロリジン−２，５−ジオン；
１−（２，５−ジクロロフェニル）−３−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）ピロリジン−２，５−ジオン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）ピロリジン−２，５−ジオン；
１−（２，６−ジメチルフェニル）−３−（｛５−［（２−フルオロフェニル）アミノ］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル｝スルファニル）ピロリジン−２，５−ジオン；及び
１−（４−メトキシフェニル）−３−［（５−フェニル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）スルファニル］ピロリジン−２，５−ジオン；
から選ばれる１以上、又はその医薬的に許容し得る塩からなる、細胞増殖阻害剤。
【請求項４】
前記化合物がＭＤＭ２とｐ５３との結合及びＭＤＭＸとｐ５３との結合の両方を阻害する作用を有する、請求項１〜３何れか記載の細胞増殖阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４何れか記載の細胞増殖阻害剤と、医薬的に許容し得る担体と、を含んでなる細胞増殖性疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項６】
前記増殖性疾患が癌である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法：
ａ）ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質を調製し、精製する工程；
ｂ）前記ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質と結合する化合物を選定する工程；
ｃ）ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質を調製し、精製する工程；及び
ｄ）前記工程ｂ）において選定した化合物のうち、前記ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質と結合する化合物を抗癌剤として選定ないし認定する工程。
【請求項８】
以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法：
ａ）ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片、及びｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド又はタンパク質断片を調製し、精製する工程；
ｂ）前記ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片とｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド若しくはタンパク質断片との相互作用を阻害する化合物を選定する工程；
ｃ）ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片、及びｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド又はタンパク質断片を調製し、精製する工程；並びに
ｄ）前記工程ｂ）において選定した化合物のうち、前記ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片とｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド又はタンパク質断片との相互作用を阻害する化合物を抗癌剤として選定ないし認定する工程。
【請求項９】
前記ヒトＭＤＭ２タンパク質のＳＷＩＢドメイン領域が、１０アミノ酸残基以下のペプチド配列が付加されていてもよい前記ヒトＭＤＭ２タンパク質のアミノ酸残基１７−１２４を含む領域であり、前記ヒトＭＤＭＸタンパク質のＳＷＩＢドメイン領域が、１０アミノ酸残基以下のペプチド配列が付加されていてもよい前記ヒトＭＤＭＸタンパク質のアミノ酸残基２６−１０６を含む領域である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識物質が、標識タンパク質又は標識化合物である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質であり、前記標識化合物が、蛍光色素である請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質相互作用阻害剤及びこれに基づく増殖性疾患の治療剤に関する。より詳細には、細胞増殖阻害剤ないしＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤（デュアル阻害剤）並びにこれを含む抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３腫瘍抑制因子は、細胞の癌化を防ぐ主要な経路を制御する転写因子である。正常細胞ではｐ５３はユビキチン依存性プロテアソーム経路を通じて速やかに分解されるため細胞内でのレベルは低い。ＭＤＭ２は、このｐ５３に結合してユビキチンＥ３リガーゼとして働き、ｐ５３の代謝回転を調節しているタンパク質である。ＭＤＭ２の過剰発現はｐ５３の機能を阻害する。ヒト骨原性肉腫、及び柔軟組織の肉腫の凡そ３０％では遺伝子増幅によるＭＤＭ２の過剰発現が認められる。ＭＤＭ２によるｐ５３制御モデルから、細胞をＭＤＭ２−ｐ５３相互作用阻害剤で処理すれば、ｐ５３タンパク質の安定化と蓄積、ＭＤＭ２発現の活性化、他のｐ５３制御遺伝子及びｐ５３経路の活性化が起きると考えられた。
【０００３】
ｐ５３のＭＤＭ２結合領域は、転写活性化領域と重複するため、ＭＤＭ２の結合はｐ５３の転写活性を抑制し、効果的にその機能を阻害する。このＭＤＭ２とｐ５３との相互作用は、ＭＤＭ２のＮ末端側（１７〜１２５番目のアミノ酸残基）のＳＷＩＢドメインに対して、ｐ５３のＮ末端領域（１５〜２９番目のアミノ酸残基）が結合していることが知られ、その複合体構造も報告されている（ＰＤＢ：１ＹＣＲ）。そして、その複合体の構造解析から、ＭＤＭ２とｐ５３の相互作用は、タンパク表面の限られた数のアミノ酸残基に依存していることがわかり、このことから、本相互作用が低分子化合物による阻害のターゲットとなる可能性が示された。
【０００４】
ＭＤＭ２とｐ５３との結合を阻害する化合物であるシス−２，４，５−トリフェニル−イミダゾリン類やイソインドリン−１−オン化合物及び腫瘍の処理へのそれらの使用が報告されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００５】
近年見出されたＮｕｔｌｉｎ−３は、ｐ５３相互作用部位でＭＤＭ２に特異的に結合し、相互作用を阻害する低分子化合物である（特許文献１）。本化合物は、ＳＪＳＡ−１のようなｐ５３が正常な培養癌細胞で、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害することによってｐ５３タンパク質分解を減少させ、ＭＤＭ２の量を増加させ、アポトーシスを誘導する。しかし、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、ＭＤＭＸ−ｐ５３相互作用阻害には不活性で、ＭＤＭＸによる活性制御に影響しない。したがって、ＪＥＧ３やＵ２ＯＳのようなＭＤＭＸ高発現細胞では、Ｎｕｔｌｉｎ−３によるｐ５３経路の活性化は、ＭＤＭＸにより阻害される（非特許文献１及び２）。
【０００６】
ＭＤＭＸ（ＭＤＭ４と称する場合もある）は、ＭＤＭ２と相同性が高いもう一つのｐ５３結合タンパク質で、ｐ５３の転写活性を抑制する。ＭＤＭ２とは異なり、ＭＤＭＸはユビキチンＥ３リガーゼ活性を有さずｐ５３の分解を促進しないが、Ｃ末端側のＲＩＮＧドメインを介してＭＤＭ２と相互作用し、ＭＤＭ２のユビキチン化活性とｐ５３の分解を促進する。
【０００７】
本発明者らにより、ＭＤＭＸは、癌化過程でのｐ５３の不活化に寄与していると考えられることから、腫瘍細胞においてｐ５３を完全に活性化するためには、ＭＤＭＸ−ｐ５３相互作用阻害剤が必要であることが見出されている（特願２００８−１２９９５３）。さらに望ましくは、ＭＤＭ２とｐ５３との結合及びＭＤＭＸとｐ５３との結合の両方を阻害する化合物、すなわちＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤（ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が必要となることも見出されている（特許文献３）。
【０００８】
一方、従来、タンパク質−タンパク質或いはタンパク質−ペプチド相互作用の検出は表面プラズモン共鳴測定法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）で、阻害剤のスクリーニングは酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）で実施されてきた。
【０００９】
【特許文献１】特表２００５−５１１７６６号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０２４８３７
【特許文献３】ＷＯ２００８／１０６５０７
【非特許文献１】Hu B, et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 281, pp.    33030-33035 (2006)
【非特許文献２】Hu B, et al., Cancer Research, Vol. 67, pp. 8810-8817 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３相互作用の場合、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤は、生物学的機能研究と新規の特異的薬剤開発の両方に有用である。しかしながら、現在までのところ、ＭＤＭ２−ｐ５３、及びＭＤＭＸ−ｐ５３の両者の相互作用をデュアルで阻害する低分子は報告されていない。
【００１１】
また、表面プラズモン共鳴測定法や、酵素免疫測定法等の測定法では、タンパク質またはペプチドのセンサーチップ或いはプラスチックプレートへの固定が必要であり、これが立体障害をもたらし、相互作用検出能を著しく減少或いは消滅させることがあった。
【００１２】
Ｎｕｔｌｉｎ−３は、ＭＤＭ２高発現細胞においては高い致死性を与える。しかしながら、通常のヒト細胞株においては、細胞中に多量に存在するＭＤＭＸが、ＭＤＭ２に代わって作用することによって、Ｎｕｔｌｉｎ−３単独では細胞死を引き起こす活性が弱い。ＭＤＭＸは、ＭＤＭ２と同様にｐ５３のＮ末端領域に結合するが、Ｎｕｔｌｉｎ−３によるｐ５３との結合阻害作用は弱い。従って、腫瘍細胞においてｐ５３を完全に活性化するためにはＭＤＭ２とＭＤＭＸとの両方の阻害剤が必要となる。本発明は、ＭＤＭＸとｐ５３との相互作用を高感度且つ効率的に検出することによって、これらの相互作用を阻害する化合物をスクリーニングし、細胞増殖の阻害剤を見出すことを目的とする。
【００１３】
さらに、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用阻害剤であるＮｕｔｌｉｎ−３の活性は、主としてｐ５３依存的な腫瘍細胞の増殖抑制活性であるため、腫瘍細胞の半数を占める、ｐ５３欠損癌細胞に対しては効果がない。本発明のもう一つの課題は、ｐ５３欠損癌細胞に対しても効果を発揮し、かつＭＤＭ２とｐ５３との結合及びＭＤＭＸとｐ５３との結合の両方を阻害する化合物、すなわちＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明で見出された細胞増殖阻害剤ないしＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤（特にＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３デュアル阻害剤）、具体的には２，５−ジオキシチオピロリジン誘導体は、ｐ５３欠損癌細胞株に対しても顕著な増殖抑制活性を示す。
【００１５】
試料の固相化がタンパク質−タンパク質相互作用研究にもたらす影響を避けて、ＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３ペプチド相互作用阻害剤（デュアル阻害剤）のスクリーニングを行うため、溶液中の分子の並進拡散運動を測定する蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｏｒｓｃｏｐｙ、ＦＣＳ）を使用した。ＦＣＳは、熱力学的揺らぎにより生じる微少計測領域（共焦点体積）への蛍光分子の出入りにより生じる蛍光強度の揺らぎを検出し解析するものである。共焦点体積中に分子がとどまる並進拡散時間（τD）は、流体力学的半径に依存する。球状粒子の並進拡散時間は、分子量の３乗根に比例する。したがって、プローブ分子の計測領域への出入りにより生じる蛍光強度の揺らぎから自己相関関数を計算し、並進拡散時間を実験的に測定することが出来る。そこで、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸとｐ５３との相互作用を蛍光相関分光法で解析する際に、これらの相互作用を阻害する低分子化合物を存在させるとタンパク質間相互作用が抑止され、検出される蛍光強度の揺らぎが変化する。この蛍光強度の揺らぎに基づいてタンパク質間相互作用の有無を検出した。ＦＣＳは、溶液中の分子の並進拡散運動を測定するため、試料を固相化するＳＰＲやＥＬＩＳＡなどの従来の方法に比べ高感度かつ効率的であり、タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニングには、非常に有用であった。
【００１６】
本発明は、第一の視点において、下記一般式Ｉ
【００１７】
【化１】
2010105992.tif 000002
（Ｉ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、相互に独立して水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アルキルチオ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ヘテロアリール基、スルフォニル基、又はアシルアミノ基であり、Ｒ２とＲ３は互いにまとまって、それらが結合しているベンゼン環とともに縮環となり、インドール環、カルバゾール環などを形成してもよく、
Ｒ６は、独立して水素原子、又はハロゲン原子であり、
Ｒ７とＲ８は、独立して水素原子であるか、又はＲ７とＲ８は互いにまとまって二重結合を形成し、
Ｒ９は、水素原子、アルキル基、アリール基、アリールアミノ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、アラルキル基、又はヘテロアリール基であり、
Ｘは、−ＮＨ−、又は−Ｓ−である）
で表される化合物又はその医薬的に許容し得る塩からなる、細胞増殖阻害剤を提供することができる。
【００１８】
また、本発明は、第二の視点において、下記一般式ＩＩ
【００１９】
【化２】
2010105992.tif 000003
（ＩＩ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、相互に独立して水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキルチオ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ヘテロアリール基、スルフォニル基、又はアシルアミノ基であり、Ｒ２とＲ３は互いにまとまって、それらが結合しているベンゼン環とともに縮環となり、インドール環、カルバゾール環などを形成してもよく、
Ｒ６は、独立して水素原子、又はハロゲン原子であり、
Ｒ７とＲ８は、独立して水素原子であるか、又はＲ７とＲ８は互いにまとまって二重結合を形成し、
Ｒ９〜Ｒ１３は、相互に独立して水素原子、カルボキシル基、アルキル基、アリール基、アリールアミノ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、アラルキル基、又はヘテロアリール基であり、
ＸとＹは、独立して窒素原子、又は炭素原子であり、
Ｒ９とＲ１３は、Ｘ部分及びＹ部分のうち何れか又は両者が窒素原子の場合は、存在しなくてもよい）
で表される化合物又はその医薬的に許容し得る塩からなる、細胞増殖阻害剤を提供することができる。
【００２０】
また、本発明は、第三の視点において、３−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）−１−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ピロリジン−２，５−ジオン；
１−（２，５−ジクロロフェニル）−３−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）ピロリジン−２，５−ジオン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）ピロリジン−２，５−ジオン；
１−（２，６−ジメチルフェニル）−３−（｛５−［（２−フルオロフェニル）アミノ］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル｝スルファニル）ピロリジン−２，５−ジオン；及び
１−（４−メトキシフェニル）−３−［（５−フェニル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）スルファニル］ピロリジン−２，５−ジオン；
から選ばれる１以上、又はその医薬的に許容し得る塩からなる、細胞増殖阻害剤を提供することができる。
【００２１】
本発明において、前記化合物は、ＭＤＭ２とｐ５３との結合及びＭＤＭＸとｐ５３との結合の両方を阻害する作用を有するものである。
【００２２】
また、本発明は、第四の視点において、前記記載の阻害剤（本発明の阻害剤）と、医薬的に許容し得る担体と、を含んでなる細胞増殖性疾患の治療のための医薬組成物を提供することができる。
【００２３】
本発明において、前記増殖性疾患は好ましくは癌である。
【００２４】
さらに、本発明は、第五の視点において、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質、及びヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質を用いて、これらと結合する化合物を抗癌剤として選定する抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【００２５】
具体的には、以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる：
ａ）ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質を調製し、精製する工程；
ｂ）前記ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質と結合する化合物を選定する工程；
ｃ）ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質を調製し、精製する工程；及び
ｄ）前記工程ｂ）において選定した化合物のうち、前記ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片と標識物質との融合タンパク質と結合する化合物を抗癌剤として選定ないし認定する工程。
【００２６】
さらに、本発明は、第六の視点において、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片とｐ５３由来で標識物質で標識したペプチドやタンパク質断片との相互作用を阻害し、且つヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片とｐ５３由来で標識物質で標識したペプチドやタンパク質断片との相互作用を阻害する化合物を抗癌剤として選定する抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【００２７】
具体的には、以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる：
ａ）ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片、及びｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド又はタンパク質断片を調製し、精製する工程；
ｂ）前記ヒトＭＤＭ２タンパク質、ヒトＭＤＭ２タンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭ２タンパク質の断片とｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド若しくはタンパク質断片との相互作用を阻害する化合物を選定する工程；
ｃ）ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片、及びｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド又はタンパク質断片を調製し、精製する工程；並びに
ｄ）前記工程ｂ）において選定した化合物のうち、前記ヒトＭＤＭＸタンパク質、そのＳＷＩＢドメイン領域、又はＳＷＩＢドメイン領域を含むヒトＭＤＭＸタンパク質の断片とｐ５３由来で標識物質で標識したペプチド又はタンパク質断片との相互作用を阻害する化合物を抗癌剤として選定ないし認定する工程。
【００２８】
本発明において、標識物質とは、標識タンパク質又は標識化合物等をさす。標識タンパク質は、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質である。標識化合物は、ＴＡＭＲＡ等の蛍光色素をさす。ＳＷＩＢドメイン領域は、ヒトＭＤＭ２タンパク質の場合には、そのアミノ酸残基１７−１２４を含む領域であり、ヒトＭＤＭＸタンパク質の場合には、そのアミノ酸残基２６−１０６を含む領域である。なお、ヒトＭＤＭ２タンパク質及びヒトＭＤＭＸタンパク質の何れも、１０アミノ酸残基以下のペプチド配列が付加されていてもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る上記化合物は、ＭＤＭ２とｐ５３との相互作用を阻害すると共に、ＭＤＭＸとｐ５３との相互作用をも阻害するため、特にＭＤＭ２に加えてＭＤＭＸが発現することによってｐ５３の機能が抑制されている腫瘍細胞のｐ５３を活性化し、アポトーシスへ導くことができる。これらはＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤（ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤）であり、ｐ５３タンパク質量の増加、ｐ２１タンパク質の誘導作用を有し、様々な増殖阻害活性も発揮する。
【００３０】
本発明に係るＦＣＳは、溶液中の分子の並進拡散運動を測定するため、試料を固相化するＳＰＲやＥＬＩＳＡなどの従来の方法に比べ高感度かつ効率的であり、タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニングには、非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（本発明の細胞増殖阻害剤）
本発明に係る細胞増殖阻害剤は、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸの両方の相互作用を阻害する活性に基づくものであり、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤である。本明細書において、「ＭＤＭ２」とは、形質転換したマウス３Ｔ３細胞の二重微小染色体において最初に見出されたガン遺伝子ｍｄｍ−２がコードするタンパク質ＭＤＭ２をいう。その後、ＭＤＭ２タンパク質はｐ５３と複合体を形成することが見出された。ＭＤＭ２タンパク質のヒト相同体タンパク質は、４９０個のアミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ等の公的データベースに登録番号：Ｑ００９８７として登録されている。「ＭＤＭＸ」とは、同じくマウスの二重微小染色体に由来し、ＭＤＭ２と相同性が高く、且つｐ５３と結合するタンパク質である。ＭＤＭＸのヒト相同体タンパク質は、４９０個のアミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列はＳＷＩＳＳＰＲＯＴ等の公的データベースに登録番号：Ｏ１５１５１として登録されている。
【００３２】
本明細書において、「阻害する」又は「阻害剤」とは、上記タンパク質間の相互作用、すなわち複合体の形成を阻害すること、又は哺乳動物由来培養癌細胞株の生存を阻害すること、及びそのような化合物を意味し、しばしば当該活性を５０％阻害するような化合物濃度で表される。用語「ＩＣ５０」は、このような活性の５０％を阻害する化合物濃度を意味する。
【００３３】
本発明のＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤、特にＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤、又は細胞増殖阻害剤には、下記一般式（Ｉ）で表す化合物、下記一般式（ＩＩ）で表す化合物、或いはその医薬的に許容しうる塩又はその水和物等が含まれる。
【００３４】
【化３】
2010105992.tif 000004
（Ｉ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、相互に独立して水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アルキルチオ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ヘテロアリール基、スルフォニル基、又はアシルアミノ基であり、Ｒ２とＲ３は互いにまとまって、それらが結合しているベンゼン環とともに縮環となり、インドール環、カルバゾール環などを形成してもよく、
Ｒ６は、独立して水素原子、又はハロゲン原子であり、
Ｒ７とＲ８は、独立して水素原子であるか、Ｒ７とＲ８は互いにまとまって二重結合を形成し、
Ｒ９は、水素原子、アルキル基、アリール基、アリールアミノ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、アラルキル基、又はヘテロアリール基であり、
Ｘは、−ＮＨ−、又は−Ｓ−である。）
【００３５】
【化４】
2010105992.tif 000005
（ＩＩ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、相互に独立して水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキルチオ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ヘテロアリール基、スルフォニル基、又はアシルアミノ基であり、Ｒ２とＲ３は互いにまとまって、それらが結合しているベンゼン環とともに縮環となり、インドール環、カルバゾール環などを形成してもよく、
Ｒ６は、独立して水素原子、又はハロゲン原子であり、
Ｒ７とＲ８は、独立して水素原子であるか、Ｒ７とＲ８は互いにまとまって二重結合を形成し、
Ｒ９〜Ｒ１３は、相互に独立して水素原子、カルボキシル基、アルキル基、アリール基、アリールアミノ基、ハロゲノアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、アラルキル基、又はヘテロアリール基であり、
ＸとＹは、独立して窒素原子、又は炭素原子であり、
Ｒ９とＲ１３は、Ｘ部分及びＹ部分のうち何れか又は両者が窒素原子の場合は、存在しなくてもよい。）
【００３６】
用語「医薬的に許容し得る塩」とは、医薬上許容できる無毒の塩基又は酸から調製される塩を意味する。本発明に係る化合物は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、又は硝酸塩のような無機酸の塩、又は有機スルホン酸塩若しくは有機カルボン酸塩のような有機酸の塩を含む当該化合物の製薬上許容される塩の形態で提供されてもよい。上記有機スルホン酸塩としては、例えば、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられ、有機カルボン酸塩としては、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、マンデル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩等が挙げられる。
【００３７】
他の場合において、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は１以上の酸性の官能基を含むことができ、それ故、医薬的に許容可能な塩基と医薬的に許容可能な塩を形成することができる。これらの例において、用語「医薬的に許容可能な塩」とは、本発明の化合物の比較的非毒性の無機塩基及び有機塩基付加塩をいう。これらの塩は、投与溶媒中又は剤形の製造工程中のその場で調製することができ、或いは遊離の酸型の精製された本発明の化合物と、医薬的に許容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、又は重炭酸塩のような適切な塩基と、アンモニアと、又は医薬的に許容可能な有機一級アミン、二級アミン若しくは三級アミンとを別個に反応させて調製することができる。塩基付加塩の生成に有用な代表的な有機アミンは、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等を含む。
【００３８】
本発明に係る化合物はまた、プロドラッグの形であってもよい。用語「プロドラッグ」とは、生体内において（例えばｐＨの変化による）自発的な化学変化により又は生体内に通常存在する酵素により又は生体内に導入ないし操作された酵素により活性となる医薬的に不活性の化合物を意味する。当該技術分野において様々な形のプロドラッグ、例えば、生体内加水分解性エステル又はエーテル等が知られている。このようなプロドラッグは、試験中の化合物を、例えば試験動物に静脈内投与した後、試験動物の体液を調べることによって同定することができる。無機酸エステルとしては、リン酸エステル等が含まれ、有機酸エステルには、脂肪族カルボン酸エステル、芳香族カルボン酸エステル、カルバミン酸エステル等が含まれる。エーテルとしては、アセトキシメチルエーテル、及びピバロイルオキシメシルエーテル等のアシルオキシアルキルエーテル等が含まれるがこれらに限定されない。
【００３９】
本発明に係る若干の化合物は、溶媒和の形で、例えば、水和した形で、更には、非溶媒和の形で存在しうるということも理解されるであろう。
【００４０】
本発明に係る化合物については、当業者に既知の反応を用いて合成（製造）したものを使用することができるが、また、市販品を購入することで容易に入手することができる。なお、本発明に係る化合物を製造するために採用しうる合成経路はいくつか存在する。
【００４１】
（本発明の医薬組成物）
本発明の細胞増殖阻害剤ないしＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤は、後述する実施例において具体的に示されるように、ヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し、又は死滅させることから、細胞増殖の調節異常によって引き起こされる病気、又はこれと関連した病気の治療薬、特に、抗癌剤として用いることができる。医薬として投与する場合、そのまま又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体と共に医薬組成物としてヒトを含む哺乳動物に投与される。
【００４２】
「医薬的に許容し得る担体」とは、液体又は固体の賦形剤、希釈液、潤滑剤、又は物質をカプセル化する溶媒のような、医薬的に許容し得る物質、組成物又は媒体を意味する。各担体は、前記製剤の他の成分との適合性があり且つ患者に対し傷害性でないという意味において、「許容し得る」ものでなければならない。医薬的に許容し得る担体として供することが可能な物質の例には、例えば、ラクトース、グルコース及びショ糖のような糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプンのようなデンプン；セルロース、及びナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロース酢酸塩のようなその誘導体；粉末のトラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；カカオバター及び坐薬ワックスのような賦形剤類；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油のような油；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝化剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；水素イオン指数緩衝溶液；ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物類；並びにその他の医薬製剤に使用される無毒の適合性物質を含む。
【００４３】
本明細書において、「増殖する」又は「増殖」とは、細胞が有糸分裂することをいう。「細胞増殖性疾患」とは、乳癌、卵巣癌、結腸直腸線癌、膵臓癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、食道癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病及び前立腺癌等の癌；並びに乾癬等の増殖性皮膚疾患を含む。本発明の医薬組成物は、治療の必要のある対象に単剤として又は他の抗癌剤と組み合わせて投与によって、上記各種癌の治療の一部として使用し得る。
【００４４】
ある実施形態においては、本発明は、治療の必要のある対象に治療上有効量の上述の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法に関する。また、ある実施形態において、前記方法は放射線療法又はその他の抗癌化学療法剤と組み合わせて使用される。その他の化学療法剤とは、ゲムシタビン、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、プレドニゾロン、デキサメサゾン、シタラビン、カンパセシン類、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、及びドセタキセルを含むがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明の医薬組成物を、上記の疾患の治療或いは予防を目的としてヒトに投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、又は注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本発明化合物の有効量を、その剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とする。
【００４６】
本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、又は体重によっても異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、成人に経口で投与する場合、通常、０．１−１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、１−２０ｍｇ／ｋｇ／日、非経口で投与する場合、通常、０．０１−１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．１−２ｍｇ／ｋｇ／日を投与する。これを１回或いは数回に分割して投与すればよい。
【００４７】
（本発明のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、後述する実施例において具体的に示されるように、抗癌剤のスクリーニング方法として使用できる。
【００４８】
例えば、候補化合物に対して、以下の工程を含む方法を実施することによって、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤のスクリーニングを行うことができる：
ＭＤＭ２タンパク質を調製し、精製する工程；
ＭＤＭ２結合性相互作用阻害化合物をスクリーニングする工程
ＭＤＭＸタンパク質を調製し、精製する工程；及び
前記化合物（ＭＤＭ２結合性相互作用を阻害する化合物）のＭＤＭＸ結合性相互作用阻害化合物をスクリーニングする工程）
【００４９】
具体的には、例えば、ｐ５３由来でＴＡＭＲＡ等の蛍光色素で標識したペプチドやタンパク質断片など、充分濃度のＭＤＭ２、適切な濃度の候補化合物を適切なバッファー中で混合し、蛍光粒子の並進拡散速度を測定する。得られた並進拡散時間を、上記遊離標識ペプチドの並進拡散時間と標識ペプチド−ＭＤＭ２タンパク質複合体の並進拡散時間の二成分に二成分分析し、相互作用している標識ペプチドの存在割合を算出する。ＭＤＭ２結合性相互作用阻害の有無は、ペプチド−ＭＤＭ２タンパク質複合体形成の割合が減少するのを確認することで判定することができ、その結果、ＭＤＭ２結合性相互作用阻害剤の存在をスクリーニングできる。次いで、前記同様に、例えば、ｐ５３由来でＴＡＭＲＡ等の蛍光色素で標識したペプチドやタンパク質断片など、充分濃度のＭＤＭＸ、適切な濃度の候補化合物を適切なバッファー中で混合し、蛍光粒子の並進拡散速度を測定する。得られた並進拡散時間を、上記遊離標識ペプチドの並進拡散時間と標識ペプチド−ＭＤＭＸタンパク質複合体の並進拡散時間の二成分に二成分分析し、相互作用している標識ペプチドの存在割合を算出する。ＭＤＭＸ結合性相互作用阻害の有無を、ペプチド−ＭＤＭＸタンパク質複合体形成の割合が減少するのを確認することで判定する。その結果、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤の存在をスクリーニングできる。
【実施例１】
【００５０】
本実施例では、２，５−ジオキシチオピロリジン誘導体を市販化合物からインシリコスクリーニングにより探索し、これを候補化合物として蛍光相関分光法によるＭＤＭ２及びＭＤＭＸとｐ５３との相互作用阻害剤のスクリーニングを行なった。
【００５１】
［材料及び方法］
１  化合物
本実施例で用いた化合物は、Ａｓｉｎｅｘ社、ＣＢＩ社、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ社、Ｅｎａｍｉｎｅ社、ＩｎｔｅｒＢｉｏＳｃｒｅｅｎ社、Ｌａｂｏｔｅｓｔ社、ＬｉｆｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ社、Ｏｔａｖａ社、Ｐｈａｒｍａ  Ｄｅｓｉｇｎ社、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社、ＶｉｔａｓＭ社から購入した。これらの化合物は１０ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して用いた。
【００５２】
２  蛍光相関分光法用蛍光色素
ｐ５３との相互作用を検出するために、ｐ５３由来１５ｍｅｒペプチド（分子量：２．３ｋＤａ）のＣ末側にＴＡＭＲＡ標識したｐ５３Ｎ末ペプチド（ＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ−Ｋ−ＴＡＭＲＡ）を購入した。
【００５３】
［ＭＤＭ２タンパク質試料の調製］
ＭＤＭ２（１７−１２４）（１３．４ｋＤａ）試料の調製は、以下の方法によった。ここで、ＭＤＭ２断片としては、該タンパク質の１７−１２４アミノ酸残基を含むタンパク質断片でよく、ＭＤＭ２のＣ末端側でＧＦＰ等のタンパク質と融合したものでもよい。大腸菌無細胞タンパク質合成系（Kigawa et al., FEBS Lett., 442-1: 15-19、 1999）（内液９ｍｌ／外液９０ｍｌ）を用いて３０℃、４時間の反応によりタンパク質を発現させた。発現させたタンパク質は、４％ＰＥＧ８０００を含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールに対して４℃、一晩透析を行なった。
【００５４】
得られたサンプルには、ＴＥＶプロテアーゼによる切断部位、及びヒスチジンタグが付加されているため、タグを利用してアフィニティー精製を行なった。サンプルをＨｉｓＴｒａｐカラムに通し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出したサンプルは脱塩カラムにかけ、イミダゾールの除去と、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴへのバッファー交換を行なった。このサンプルにＴＥＶプロテアーゼを４０００ユニット加え、４℃、一晩、転倒混和し、ヒスチジンタグを切断した。タグを切断したサンプルは、再びＨｉｓＴｒａｐによるアフィニティー精製を行なうことで、切断したタグと目的のタンパク質に分離した。得られた目的タンパク質は、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ＭＷＣＯ  ５０００）により濃縮した。濃縮した最終サンプルをブラッドフォードの方法を用いて定量した結果、３６ｍｇ／ｍｌであった。タンパク質液量としては３５０μｌ得られた。
【００５５】
［ＭＤＭＸタンパク質試料の調製］
ＭＤＭＸ（２６−１０６）（１０．３ｋＤａ）試料の調製は、以下の方法によった。ここで、ＭＤＭＸ断片としては、該タンパク質の２６−１０６アミノ酸残基を含むタンパク質断片でよく、ＭＤＭＸのＣ末端側でＧＦＰ等のタンパク質と融合したものでもよい。上掲の大腸菌無細胞タンパク質合成系を用いて３０℃、４時間の反応によりタンパク質を発現させた。発現させたタンパク質は、４％ＰＥＧ８０００を含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールに対して４℃、一晩透析を行なった。
【００５６】
得られたサンプルには、ＴＥＶプロテアーゼによる切断部位、及びヒスチジンタグが付加されているため、タグを利用してアフィニティー精製を行なった。サンプルをＨｉｓＴｒａｐカラムに通し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出したサンプルは脱塩カラムにかけ、イミダゾールの除去と、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴへのバッファー交換を行なった。このサンプルにＴＥＶプロテアーゼを４０００ユニット加え、４℃、一晩、転倒混和し、ヒスチジンタグを切断した。タグを切断したサンプルは、再びＨｉｓＴｒａｐによるアフィニティー精製を行なうことで、切断したタグと目的のタンパク質に分離した。得られた目的タンパク質は、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ＭＷＣＯ  ５０００）により濃縮した。濃縮した最終サンプルをブラッドフォードの方法を用いて定量した結果、３ｍｇ／ｍｌであった。タンパク質液量としては２ｍｌ得られた。
【００５７】
［ＭＤＭ２−ｐ５３ペプチド相互作用阻害剤のスクリーニング］
ＭＤＭ２−ｐ５３ペプチド相互作用阻害活性の測定
候補化合物４４個について、蛍光相関分光法で、ＭＤＭ２を結合阻害対象とする阻害剤のスクリーニングを行なった。蛍光相関分光測定用バッファーとしては、ＦＣＳバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化カリウム(ｐＨ７．４)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、ＤＭＳＯの終濃度が０．５％となるように調製したものを反応溶液とした。ｐ５３ペプチドは、１ｎＭで一定濃度とし、ＴＡＭＲＡ標識をしていないｐ５３ペプチド（１５ｍｅｒ）を用いて陽性コントロールとした。１ｎＭｐ５３−ＴＡＭＲＡペプチド、５００ｎＭのＭＤＭ２、１０μＭ候補化合物をアッセイプレートの最終条件としてスクリーニングを行なった。
【００５８】
得られた並進拡散時間を、上記遊離ペプチドの並進拡散時間とタンパク質−ペプチド複合体の並進拡散時間の二成分に二成分分析し、相互作用しているペプチドの存在割合を算出した。その結果、表１に示す７化合物が、ＭＤＭ２−ｐ５３のタンパク質間相互作用を強く阻害することが分かった。
【００５９】
【表１】
2010105992.tif 000006
【００６０】
ヒット化合物の分析
得られたヒット化合物について、１Ｈ−核磁気共鳴測定（1H NMR）と質量分析（ＭＳ）で分析した。分析データを以下に示す。
【００６１】
化合物番号１；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 2.93 (1H, dd, J = 18.3, 4.4 Hz), 3.45 (1H, dd, J = 18.3, 9.5 Hz), 4.70-4.75 (1H, m), 7.59-7.62 (2H, m), 7.75-7.86 (2H, m), 8.63 (1H, s), 14.3 (1H, s).
MS (m/z) : 343 ([M+H]+).
【００６２】
化合物番号２；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 2.95-3.01 (1H, m), 3.38-3.50 (1H, m), 4.80-4.84 (1H, m), 7.30-7.34 (1H, m), 7.67 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.03 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz), 8.28-8.35 (2H, m), 8.55-8.64 (1H, m), 13.7 (1H, br s). 
MS (m/z) : 408 ([M+H]+).
【００６３】
化合物番号３；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 1.37 (3H, t, J = 6.9 Hz), 2.78-2.94 (1H, m), 3.56-3.68 (1H, m), 4.20 (2H, q, J = 6.9 Hz), 4.84-5.03 (1H, m), 7.30-7.35 (1H, m), 7.51-7.70 (5H, m), 7.92-7.95 (1H, m), 13.3 (1H, s).
MS (m/z) : 417 ([M+H]+). 
【００６４】
化合物番号４；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 2.90 (1H, dd, J = 18.3, 4.4 Hz), 3.43 (1H, dd, J = 18.3, 9.5 Hz), 4.68-4.72 (1H, m), 7.31 (1H, dd, J = 8.4, 2.2 Hz), 7.54 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.82 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.63 (1H, s), 14.3 (1H, s).
MS (m/z) : 343 ([M+H]+). 
【００６５】
化合物番号５；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 2.89 (1H, dd, J = 18.3, 5.1 Hz), 3.40 (1H, dd, J = 18.3, 9.5 Hz), 3.79 (3H, s), 4.62-4.66 (1H, m), 7.03 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.16 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.63 (1H, s), 14.3 (1H, br s). 
MS (m/z) : 305 ([M+H]+).
【００６６】
化合物番号６；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 2.06 (6H, s), 3.25 (1H, dd, J = 18.3, 5.9 Hz), 3.55 (1H, dd, J = 18.3, 9.5 Hz), 5.01-5.06 (1H, m), 7.03-7.10 (1H, m), 7.15-7.32 (5H, m), 8.26-8.33 (1H, m), 10.3 (1H, s). 
MS (m/z) : 429 ([M+H]+).
【００６７】
化合物番号７；
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 2.99-3.08 (1H, m), 3.45 (1H, dd, J = 18.3, 9.5 Hz), 4.67-4.74 (1H, m), 7.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.15 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.47-7.54 (3H, m),  7.88-7.91 (2H, m), 14.7 (1H, br s).
MS (m/z) : 381 ([M+H]+). 
【００６８】
［ＭＤＭＸ−ｐ５３ペプチド相互作用阻害剤のスクリーニング］
ＭＤＭＸ−ｐ５３ペプチド相互作用阻害活性の測定
ＭＤＭ２−ｐ５３のタンパク質間相互作用阻害活性が認められた上記７化合物について、上掲の蛍光相関分光法で、ＭＤＭＸを結合阻害対象とする阻害剤のスクリーニングを行なった。蛍光相関分光測定用バッファーとしては、ＦＣＳバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化カリウム(ｐＨ７．４)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、ＤＭＳＯの終濃度が０．５％となるように調製したものを反応溶液とした。ｐ５３ペプチドは、１ｎＭで一定濃度とし、ＴＡＭＲＡ標識をしていないｐ５３−ペプチド（１５ｍｅｒ）を用いて陽性コントロールとした。１ｎＭのｐ５３−ＴＡＭＲＡペプチド、５００ｎＭのＭＤＭＸ、１０μＭ候補化合物をアッセイプレートの最終条件としてスクリーニングを行なった。
【００６９】
得られた並進拡散時間を、上記遊離ペプチドの並進拡散時間とタンパク質−ペプチド複合体の並進拡散時間の二成分に二成分分析し、相互作用しているペプチドの存在割合を算出した。その結果、表２に示すように、７化合物全て、ＭＤＭＸ−ｐ５３のタンパク質間相互作用阻害活性を示した。これらのうち、５種類の化合物（化合物番号１、４、５、６及び７）については、特に強い阻害活性が示された。
【００７０】
【表２】
2010105992.tif 000007
【００７１】
以上から、表１及び２に示す７化合物が、ＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のタンパク質間相互作用を阻害する、すなわちＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤であることが分かった。これらの化合物を、表３に示す。
【００７２】
【表３】
2010105992.tif 000008
2010105992.tif 000009
【実施例２】
【００７３】
［ヒット化合物のＩＣ５０の測定］
本実施例では、上記７種類の化合物の中で、特に強い結合阻害活性を示した２化合物（化合物番号４及び６）について、上記で調製したＭＤＭ２タンパク質を用いて、蛍光相関分光法によりＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の５０％阻害濃度ＩＣ５０を測定した。
【００７４】
蛍光相関分光測定用バッファーとしては、ＦＣＳバッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ−水酸化カリウム(ｐＨ７．４)、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、ＤＭＳＯの最終濃度が０．５%となるように調製したものを反応溶液とした。ＭＤＭ２濃度を８０ｎＭ（ＩＣ５０測定時のＭＤＭ２タンパク質濃度としては、常法に従い、該相互作用アッセイ系において、ＭＤＭ２タンパク質のｐ５３ペプチドに対するＫＤ値の２倍を用いた）とし、最終濃度３０、１０、３、１、０.３、０.１μＭの各種化合物と２５℃、1時間インキュベートした。ｐ５３ペプチドは、ｐ５３のＭＤＭ２及びＭＤＭＸとの相互作用部位であるN末端から１５〜２９残基に相当するペプチドＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（１５ｍｅｒ）を合成し、そのＣ末端を蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識し、１ｎＭで添加した。調製したサンプル３０μｌを用い、蛍光相関分光法により蛍光色素の並進拡散時間を測定した。測定は励起波長５４３ｎｍで１０秒、５回行った。
【００７５】
その結果から実施例１と同様に複合体形成の割合を算出し、ＩＣ５０を決定した。その結果を表４に示す。表４に示されたように、高い相互作用阻害活性が得られた。
【００７６】
【表４】
2010105992.tif 000010
【実施例３】
【００７７】
［ヒット化合物のＩＣ５０の測定］
本実施例では、上記７種類の化合物の中で、特に強い結合阻害活性を示した２化合物（化合物番号４及び６）について、上記実施例１で調製したＭＤＭＸタンパク質を用いて、蛍光相関分光法によりＭＤＭＸ−ｐ５３相互作用の５０％阻害濃度ＩＣ５０を測定した。
【００７８】
蛍光相関分光測定用バッファーとしては、ＦＣＳバッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ−水酸化カリウム(ｐＨ７．４)、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、ＤＭＳＯの最終濃度が０．５%となるように調製したものを反応溶液とした。ＭＤＭＸ濃度を１２０ｎＭ（ＩＣ５０測定時のＭＤＭＸタンパク質濃度としては、常法に従い、該相互作用アッセイ系において、ＭＤＭＸタンパク質のｐ５３ペプチドに対するＫＤ値の２倍を用いた）とし、最終濃度３０、１０、３、１、０.３、０.１μＭの各種化合物と２５℃、1時間インキュベートした。ｐ５３ペプチドは、ｐ５３のＭＤＭ２及びＭＤＭＸとの相互作用部位であるN末端から１５〜２９残基に相当するペプチドＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（１５ｍｅｒ）を合成し、そのＣ末端を蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識し、１ｎＭで添加した。調製したサンプル３０μｌを用い、蛍光相関分光法により蛍光色素の並進拡散時間を測定した。測定は励起波長５４３ｎｍで１０秒、５回行った。
【００７９】
その結果から上記実施例１と同様に複合体形成の割合を算出し、ＩＣ５０を決定した。その結果を表５に示す。表５に示すように、高い相互作用阻害活性が得られた。
【００８０】
【表５】
2010105992.tif 000011
【実施例４】
【００８１】
［ヒット化合物の癌細胞増殖阻害活性の測定］
上記７種類の化合物を用いて、２種類のヒト由来培養癌細胞ＳＪＳＡ−１（骨肉腫細胞で野生型ｐ５３を発現し、且つＭＤＭ２を高発現するＮｕｔｌｉｎ−３高感受性株）及びＪＥＧ３（絨毛癌細胞で野生型ｐ５３を発現し、且つＭＤＭＸを高発現している細胞株）に対する細胞増殖阻害活性を測定した。
【００８２】
細胞株
２種類のヒト由来培養癌細胞ＳＪＳＡ−１（骨肉腫細胞で野生型ｐ５３を発現し、且つＭＤＭ２を高発現するＮｕｔｌｉｎ−３高感受性株）、及びＪＥＧ３（絨毛癌細胞で野生型ｐ５３を発現し、且つＭＤＭＸを高発現している細胞株）はＡＴＣＣより購入した。
【００８３】
炭酸インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)で培養した上記細胞を回収し、９６ウェルプレートに１ウェルに１０００個播種した。２４時間培養後に化合物を最終濃度０〜５０μＭとなるように添加して炭酸インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)で培養し、３日目に、ＷＳＴ−８試薬（ナカライテスク製：生細胞数測定試薬ＳＦ）を１ウェルに１０μｌ加え炭酸インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)で１時間培養し反応後、マイクロプレートリーダーＰＯＷＥＲＳＣＡＮ ＨＴ（ＤＳファーマバイオメディカル製）にて４５０ｎｍ、６２０ｎｍの吸光度差を測定した。培養液のみのウェルの吸光度をブランクとしサンプルのウェルの値から差し引いた後、０.５％ＤＭＳＯのみが入っているウェルの値を１００％としてサンプルの生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を計算した。１化合物につき３ウェルずつ測定を行い（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）その平均値を用いた。
【００８４】
その結果、表６に示すように、これらの化合物は、化合物番号２及び３を除く５種類の化合物（化合物番号１、４、５、６及び７）がＳＪＳＡ−１細胞株に対して強い細胞増殖阻害効果を示した。さらに、本５化合物は、Ｎｕｔｌｉｎ−３とは異なり、ＭＤＭＸ高発現株であるＪＥＧ３細胞株にも効果を示し、強力なＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤である可能性が示唆された。
【００８５】
【表６】
2010105992.tif 000012
【実施例５】
【００８６】
［ヒット化合物の癌細胞増殖阻害活性ＩＣ５０の検討］
本実施例では、上記５種類の化合物の中で、特に細胞増殖阻害効果が強かった化合物番号４及び６の化合物を用いて、ヒト由来培養癌細胞ＳＪＳＡ−１及びＪＥＧ３に対する細胞増殖阻害活性ＩＣ５０を測定した。
【００８７】
細胞株
２種類のヒト由来培養癌細胞ＳＪＳＡ−１（骨肉腫細胞で野生型ｐ５３を発現し、且つＭＤＭ２を高発現するＮｕｔｌｉｎ−３高感受性株）及びＪＥＧ３（絨毛癌細胞で野生型ｐ５３を発現し、且つＭＤＭＸを高発現している細胞株）はＡＴＣＣより購入した。
【００８８】
炭酸インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)で培養した上記細胞を回収し、９６ウェルプレートに１ウェルに１０００個播種した。２４時間培養後に化合物を最終濃度０〜２５μＭとなるように添加して炭酸インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)で培養し、３日目に、ＷＳＴ−８試薬（ナカライテスク製：生細胞数測定試薬ＳＦ）を１ウェルに１０μｌ加え炭酸インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)で１時間培養し反応後、マイクロプレートリーダーＰＯＷＥＲＳＣＡＮ ＨＴ（ＤＳファーマバイオメディカル製）にて４５０ｎｍ、６２０ｎｍの吸光度差を測定した。培養液のみのウェルの吸光度をブランクとしサンプルのウェルの値から差し引いた後、０.５％ＤＭＳＯのみが入っているウェルの値を１００％としてサンプルの生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を計算した。１化合物につき３ウェルずつ測定を行い（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）その平均値を用いた。
【００８９】
その結果、図１に示す通り、ＳＪＳＡ−１細胞に対するＩＣ５０は、化合物番号４が１０μＭ、化合物番号６が５μＭ、ＪＥＧ３細胞に対するＩＣ５０は、化合物番号４が５μＭ、化合物番号６が３μＭという高い活性を示した。この時、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、非特許文献１と同様に、ＳＪＳＡ−１細胞に対してはＩＣ５０が３μＭの増殖阻害活性を示し、ＪＥＧ３細胞に対しては顕著な阻害活性を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、タンパク質相互作用阻害剤、特に、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ結合性相互作用阻害剤を提供することができる。
【００９１】
また、前記阻害剤を使用（配合）して、特に抗癌剤を、容易かつ簡便に製造することができる。さらに、本発明によりこれらの相互作用を阻害する化合物をスクリーニングし、細胞増殖の阻害剤を見出すことができ、本発明は、このようなスクリーニング方法を利用することにより、ヒト及び動物に対する抗癌剤開発に資することができる。したがって、本発明は特に医薬又は製薬分野において、工業的に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＭＤＭ２−ｐ５３及びＭＤＭＸ−ｐ５３のデュアル阻害剤について、ＳＪＳＡ−１細胞株及びＪＥＧ３細胞株に対する細胞増殖阻害活性ＩＣ５０（阻害剤添加後３日目）を測定した結果である。
【図１】
2010105992.tif 000016