(57)【要約】【課題】レジオネラ属菌の生菌を、死菌や損傷菌に比べて選択的に検出する方法、及びレジオネラ属菌の生菌を検出するキットを提供する。【解決手段】被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌とを識別する検出方法であって、以下の工程を含む検出方法：ａ）前記被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理し、被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を行う工程、ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのmip遺伝子に相当する領域を核酸増幅法により増幅する工程、並びにｃ）増幅産物を解析する工程。【選択図】  図２
2010017144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌とを識別する検出方法であって、以下の工程を含む検出方法：
ａ）前記被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理し、被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を行う工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのmip遺伝子に相当する領域を
核酸増幅法により増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記増幅産物の解析を、レジオネラ属菌の標準試料を用いて作成された細菌量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸増幅法がＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、又はＬＣＲ法のいずれかにより行い、核酸増幅と増幅産物の解析を同時に行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記被検試料が、温泉水、浴槽水、冷却水、プール水、工業用水、市水、地下水、河川水又は雨水のいずれかである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
被検試料中のレジオネラ属菌の生菌を核酸増幅法により検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、培地、及び
検出対象のレジオネラ属菌のＤＮＡのmip遺伝子に相当する領域を核酸増幅法により増
幅するためのプライマー。
【請求項７】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、又はＬＣＲ法である請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイドである請求項６又は７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温泉水、浴槽水、プール水、工業用水、市水等の環境中に含まれるレジオネラ属菌の生菌の選択的な検出法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌はグラム陰性桿菌であり、ヒトに対してはレジオネラ感染症を引き起こす。レジオネラ属菌は、環境水、湿った土壌等、どこにでも居る細菌であり、マクロファージ等の免疫細胞に寄生する細胞内寄生細菌である。特に、温泉、公衆浴場、冷却塔はレジオネラ感染症の発生源である。このような、レジオネラによる感染症を防ぐため、冷却塔、シャワー器、水道水のパイプラインは定期的に管理することが必須となっている。
【０００３】
環境や臨床検体から生きたレジオネラ属菌を分離・検出するためには、通常、４〜７日間要するが、プール、水道水、公衆浴場、温泉等の衛生管理において、感染初期段階における感染源を追究するうえでは、迅速な生菌の検出法の開発が課題となっている。
【０００４】
環境試験の技術向上や工業用水や市水等の工程管理へのニーズの高まりにより、微量であっても被検試料中に存在する微生物の生死の状態を識別する手法に関する研究が進展している。特に、細菌の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各細菌の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各細菌の存在の有無を判別及び定量する試みがなされている。
【０００５】
しかし、細菌のＤＮＡにターゲットを当てた場合、被検試料に元来含まれている死菌のバックグラウンドまで検出されるため、ＰＣＲで陽性判定がでた場合、必ずしも生きた細菌の存在を示唆しているとは限らなかった。そのために、ＰＣＲは高感度・迅速でありながら普及していないのが現状であった。
【０００６】
最近では、ｍＲＮＡをターゲットにして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製後、各細菌の特異プライマーを用いてＰＣＲを行い、被検試料中の生菌のみを検出・定量する試みがなされている。しかし、この方法では死菌のｍＲＮＡの逆転写そのものが阻害されるわけではなく、１０4ｃｆｕ／ｍｌ又は１０4ｃｆｕ／ｇ以上の死菌が被検試料に含まれている場合、死菌のバックグラウンドを検出してしまうため、生死の判別法としては十分なものとは言えなかった。
【０００７】
ＰＣＲにより微生物の生菌を選択的かつ迅速に検出する方法として、被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程、前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに増幅産物を解析する工程からなる方法が開示されている（特許文献１）。また、この方法において、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤としてエチジウムモノアザイドを用い、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する方法が開示されている。しかし、被検試料を可視光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理し、mip遺伝子をターゲット領域とすることにより、レジオネラ属菌を選択的か
つ迅速に検出できることは知られていなかった。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００７／０９４０７７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、温泉、入浴施設、プール等の公共施設における水、工業用水や市水等の環境中に含まれるレジオネラ属菌の生菌（Live cell又はViable-and-Culturable cell）を、
死菌（Dead cell）や損傷菌（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell；「VNC
cell」）に比べて選択的に検出する方法、すなわち、培養法の特性をそのまま引き継い
だ迅速代替検出法、及びレジオネラ属菌の生菌を検出するキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、検出感度が高い環境衛生検査に適した微生物の生死の判別法、特に温泉入浴施設、プール等の公共施設におけるレジオネラ属菌の生菌の検出が可能な方法について鋭意検討したところ、被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌を判別する方法において、被検試料を可視光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理して可視光照射を行った後、レジオネラ属菌中の染色体ＤＮＡ中のmip遺伝子に相当する領域
を選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、前記判別を迅速に行うことかできることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）本発明の検出方法
本発明は、被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌とを識別する検出方法であって、以下の工程を含む検出方法を提供する：
ａ）前記被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理し、被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を行う工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのmip遺伝子に相当する領域を
核酸増幅法により増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
なお、前記検出方法は、前記増幅産物の解析を、レジオネラ属菌の標準試料を用いて作成された細菌量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを望ましい態様としている。
また、前記核酸増幅法は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、又はＬＣＲ法のいずれかにより行い、核酸増幅と増幅産物の解析を同時に行うことを望ましい態様としている。
また、前記架橋剤が、エチジウムモノアザイドであることを望ましい態様としている。
また、前記被検試料は、温泉水、浴槽水、冷却水、プール水、工業用水、市水、地下水、河川水又は雨水のいずれかであることを望ましい態様としている。
【００１１】
（２）本発明の検出キット
本発明は、被検試料中のレジオネラ属菌の生菌を核酸増幅法により検出するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、培地、及び
検出対象のレジオネラ属菌のＤＮＡのmip遺伝子に相当する領域を核酸増幅法により増
幅するためのプライマー。
なお、前記検出キットは核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、又はＬＣＲ法であることを望ましい態様としている。
また、前記検出キットにおける架橋剤は、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）であることを望ましい態様としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、温泉、入浴施設、プール等の公共施設における水、工業用水や市水等の環境中に存在するレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌について、核酸増幅法により簡易かつ迅速に高感度で判別が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好
ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明の方法においては、その検出の対象として、結果的に増幅することが可能であれば、核酸全般、具体的には１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、及び２本鎖ＲＮＡを例示することができ、中でもＤＮＡを検出対象とすることが好ましく、２本鎖ＤＮＡが特に好ましい。
【００１４】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む検出方法である。
被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と死菌又は損傷菌とを識別する検出方法であって、以下の工程を含む検出方法：
ａ）前記被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理し、被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を行う工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域、好ましくはmip遺伝子に相当する領域を核酸増幅法により増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００１５】
本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在するレジオネラ属菌の生菌を検出する対象であり、核酸増幅法による染色体ＤＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、温泉水、浴槽水、冷却水、プール水、工業用水、市水、地下水、河川水、又は雨水などが挙げられ、特に水温２０℃以上の人工環境水等が好適に挙げられる。冷却水としては、冷却塔の冷却に用いられる冷却水が挙げられる。また、浴槽水としては、循環式浴槽水が挙げられる。
【００１６】
特に、温泉水、プール水、循環式浴槽水にあっては、殺菌等に使用される次亜塩素酸ナトリウム等による塩素が残留（残留塩素濃度は１ｐｐｍ以下）されていてもレジオネラ属菌の検出が可能である。また、水道法（昭和三十二年法律第百七十七号）第四条第二項の規定に基づき、水質基準に関する省令により、水道により供給される水が厚生労働大臣が定める方法によって行う塩素酸濃度の検査において定められている、０．６ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。
【００１７】
本発明においては、被検試料は、前記のような試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。また、前記の温泉水、プール水、循環式浴槽水等の塩素系薬剤が混入している恐れがある試料を検出に用いる場合は、チオ硫酸ナトリウム等を例えば、終濃度０．０５％添加して、残留塩素を不活性化した後に、これを被検試料として使用することができる。
【００１８】
また、被検試料中にタンパク質コロイド粒子、及び脂肪等の夾雑物が存在する場合は、酵素処理等によって除去又は低減させてもよい。前記酵素としては、前記夾雑物を分解することが可能な脂質分解酵素及び／又はタンパク質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方を用いることが好ましい。脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはプロテイナーゼＫ、プロナーゼ等がそれぞれ挙げられる。
【００１９】
本発明の方法により検出される対象は、グラム陰性の桿菌に含まれるレジオネラ属に属する細菌であり、核酸増幅法により検出することが可能であって、かつ、架橋剤の微生物に対する作用が生菌と死菌や損傷菌とで異なるものであれば特に制限されない。
【００２０】
レジオネラ属菌に属する細菌としては、具体的に、Legionella pneumophila（レジオネラ・ニューモフィラ：L. pneumophila）に属する80-045株、Philadelphia-1 株（ATCC33152）、NIIB0733株、NIIB0805株、NIIB0744株、NIIB0802株、NIIB0784株、NIIB0797株、NIIB0792株、NIIB0864株、NIIB0794株、NIIB0806株、及びこれらの菌株に類縁の細菌等が例示される。なお、本発明の検出方法においては、後記する核酸増幅用プライマーを変更することによって、菌株を限定せずに、レジオネラ属菌に属する細菌を広く検出することも可能である。80-045株は、レジオネラ症患者から分離された菌株である（Saito, A. et al. 1981, Japan Kansenshogaku Zasshi 55:124-128; Chang, B. et al. 2005, Infect. Immun. 73(7): 4272-4280）。NIIB番号が付与された菌株は、国立感染症研究所に保存されている菌株である。Philadelphia-1 株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110）から入手することができる。
【００２１】
本発明において「生菌」（Live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した
際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞壁の損傷はほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝
活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。
【００２２】
「死菌」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は
不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。
【００２３】
「損傷菌」（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生菌と比較すると低下しているものの死菌と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。
【００２４】
特に、入浴施設等における水質検査において、殺菌処理が不十分等の衛生管理上の問題で生じるレジオネラ属菌の発生や、損傷菌の状態を呈したレジオネラ属菌の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌と、死菌及び／又は損傷菌との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【００２５】
尚、生菌、死菌及び／又は損傷菌の菌数単位は、通常、いずれも細胞数（cells）／ｍ
ｌで表される。生菌の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ（colony forming units / ml））で近似させることができる。
また、損傷菌の標準試料は、例えば、生菌懸濁液を沸騰水中で加熱処理や、塩素系薬剤による処理を行うことにより調製することができるが、その場合、損傷菌の細胞数は処理する前の生菌懸濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。
【００２６】
なお、損傷菌を調製するための沸騰水中での加熱時間は、レジオネラ属菌の種類により異なるが、例えば実施例に記載されたレジオネラ属菌では、５０秒程度で損傷菌を調製することができる。さらに、損傷菌の標準試料は、塩素系薬剤等の処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、生菌懸濁液を塩素系薬剤で処理した後、残留する塩素を不活性化し、可視光（波長６００ｎｍ）の透過度、すなわち濁度を測定し、生菌数濃度が予め判っている生菌懸濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ）で近似させることができる。
【００２７】
本発明の方法は、生菌の検出が目的であり、生菌と区別されるレジオネラ属菌は、死菌
であっても損傷菌であってもよい。本発明において、「生菌の検出」とは、被検試料中の生菌の有無の判別及び生菌の量の決定のいずれをも含む。また、生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。
以下、本発明の検出方法を工程毎に説明する。
【００２８】
（１）ステップａ）
被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理する。
本発明に用いる架橋剤とは、染色体ＤＮＡにインターカレートし、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光、例えば可視光等を照射することにより染色体ＤＮＡに共有結合して、ＤＮＡの分子間を架橋するものである。
【００２９】
前記架橋剤は、レジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生菌の細胞壁よりも損傷菌もしくは死菌の細胞壁に対して透過性が高いものであることが好ましい。
【００３０】
前記架橋剤としては、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５’，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren：ＰＭＡ）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）等が挙げられる。なかでも、エチジウムモノアザイドが特に好まし
い。架橋剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００３１】
架橋剤による処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象のレジオネラ属菌の生菌及び死菌もしくは損傷菌の懸濁液に、種々の濃度の架橋剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生菌と、死菌及び／又は損傷菌を区別しやすい条件を決定することができる。
【００３２】
このような条件として、具体的には、エチジウムモノアザイドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間、エチジウムジアジドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間、プソラーレンでは終濃度１×１０-5〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、４，５’，８−トリメチルプソラーレンでは終濃度１×１０-5〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、８−メトキシプソラーレンでは終濃度１×１０-5〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間が挙げられる。なかでも、エチジウムモノアザイドを使用して、終濃度２０〜５０μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５〜３０分間作用させることが特に好ましい。
【００３３】
次に、架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う。
上記架橋剤は、レジオネラ属菌の生菌の細胞壁よりも、死菌又は損傷菌の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌もしくは死菌の細胞膜は透過すると考えられる。その結果、架橋剤は、死菌又は損傷菌の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡと無秩序に共有結合し、もしくはインターカレートし、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を行うことによりＤＮＡの分子間を架橋し、染色体ＤＮＡ内に歪みが生じる結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化・切断）されると推定される。
【００３４】
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光とは、少なくとも３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光を含んでいればよく、単波長光であってもよく、複合光であってもよい。また、すべての成分が３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内にあってもよく、３５０ｎｍよりも短波長の光、及び／又は７００ｎｍ以上の長波長の光を含んでいてもよいが、強度分布におけるピー
クが３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。尚、光照射のみによって微生物の染色体ＤＮＡを切断する程の短波長の成分は含まないことが好ましい。
【００３５】
レジオネラ属菌の生菌よりも死菌や損傷菌の染色体ＤＮＡが優先的に破壊されると、生菌では染色体ＤＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、死菌や損傷菌ではターゲット領域が破壊（切断）される結果、核酸増幅反応が阻害され、生菌を死菌や損傷菌に比べて選択的に検出することができる。
【００３６】
本発明の好ましい態様は、前記架橋剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光線を照射する工程を含む。エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）は、レジオネラ属菌の生菌の細胞壁よりも死菌や損傷菌の細胞壁を透過しやすい。したがって、ＥＭＡは生菌の細胞壁は実質的に透過せず、死菌や損傷菌の細胞壁の細胞膜は透過すると考えられる。ＥＭＡは、レジオネラ属菌の死菌又は損傷菌の細胞内に進入して核内ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりインターカレートしたＥＭＡのみがナイトレンに変換され、核内ＤＮＡに共有結合し、ＤＮＡの分子間を架橋する。そして、染色体ＤＮＡの各塩基およびデオキシリボースに対して至るところで共有結合したＥＭＡにより、染色体ＤＮＡ内に大きな歪みが生じ、その結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化）されると推定される。
【００３７】
エチジウムモノアザイド以外の架橋剤であっても、レジオネラ属菌の生菌の細胞壁よりも死菌や損傷菌の細胞壁を透過しやすく、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光線（長波長紫外線、又は可視光線）を照射することによりＤＮＡを架橋し、染色体ＤＮＡを破壊するものであれば、本発明に使用することができる。
【００３８】
ＥＭＡによる処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象のレジオネラ属菌の生菌、並びに死菌及び／又は損傷菌の懸濁液に、種々の濃度のＥＭＡを加えて、種々の時間置いた後、可視光を照射して、必要に応じて遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法により分析することによって、生菌と死菌又は損傷菌とを区別しやすい条件を決定することができる。また、光照射の条件も、照射時間を変えて上記の実験を行うことにより、好ましい条件を決定することができる。光照射の条件として具体的には、被検試料から１０〜５０ｃｍの距離から１００〜７５０Ｗの前記波長の光を５分〜２時間照射する条件が挙げられる。光照射は、低温下で、例えば試料を氷冷して行うことが好ましい。
【００３９】
（２）ステップｂ）
ステップａ）で処理された被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡの特定の遺伝子領域（本発明においては、この遺伝子領域を「ターゲット領域」と記載することがある）を核酸増幅法により増幅する。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（White,T.J. et al.,
Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification：新規遺伝子増幅法（LAMP法）の原理と応用 、納富継宣、長谷哲、BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：Edward L.
Chan, Ken Brandt, Karen Olienus, Nick Antonishyn, Greg B. Horsman., Performance
characteristics of the Becton Dickinson ProbeTec System for direct detection of
Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male and female urine specimens in comparison with the Roche Cobas system. Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）等がそれぞれ例示される。なお、本発明においては
、ＰＣＲ法を利用することが特に好ましいが、これに制限されない。
【００４０】
被検試料からのＤＮＡの抽出は、抽出されたＤＮＡが核酸増幅反応における鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法に従って行うことができる。
【００４１】
ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001に記載されている。
【００４２】
本発明において増幅される「遺伝子領域（ターゲット領域）」とは、染色体ＤＮＡのうち、本発明に用いられるプライマーを使用した核酸増幅法により増幅され得る領域であり、検出対象のレジオネラ属菌を検出することができるものであれば特に制限されないが、本発明の検出方法においては、mip遺伝子（マクロファージ侵入性遺伝子 (macrophage infectivity potentiator gene)）に相当する領域を利用することが特に望ましい。mip遺伝子に相当する領域とは、染色体ＤＮＡ上のmip遺伝子全体又はその一部をいい、レジオネ
ラ属菌を選択的に検出することができる限り特に制限されてない。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。ターゲット領域の長さは特に制限されないが、通常５０〜５０００塩基、好ましくは５０〜２０００塩基、特に好ましくは５０〜１０００塩基が挙げられる。
【００４３】
核酸の増幅に用いるプライマーは、各種核酸増幅法の原理に基づいて、適宜設定することが可能であって、前記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
【００４４】
複数種のレジオネラ属菌の細菌に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種のレジオネラ属菌の生菌を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定のレジオネラ属菌の生菌を検出することができる。
【００４５】
レジオネラ・ニューモフィラ Philadelphia-1株の染色体の全塩基配列はGenBankデータベースに登録されており（GenBank accession NC_002942）、mip遺伝子の塩基配列は、GenBank accession NC_002942 REGION: 866844..867551, VERSION NC_002942.5  GI:52840256として登録されている。また、他の種々のレジオネラ属菌の全塩基配列も公開されており、例えば、レジオネラ・ニューモフィラに属する菌株であるCorby株、Paris株、Lens株の全塩基配列は、各々GenBank accession NC_009494、NC_006368、NC_006369の番号でGenBankデータベースに登録されており、mip遺伝子は、これらの塩基配列中2717927..2718628（相補鎖）、959508..960209、及び939432..940133に位置している。なお、Philadelphia-1株、Corby株、Paris株、及びLens株のmip遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号３〜６に示す。これらの塩基配列に基づいて、レジオネラ属菌の検出に好適なプライマーを適宜設定することができる。レジオネラ・ニューモフィラを検出可能なプライマーとして具体的には、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
核酸増幅反応の条件は、各核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法等）の原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【００４７】
（３）ステップｃ）
続いて、核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。尚、核酸増幅法にＰＣＲ法を用いた場合は、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al./ Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al./ Appl
ication of the 5'-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of Campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）を利用することが可能である。
【００４８】
電気泳動法によれば、核酸増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出し、そのＳＤ値に１０を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００４９】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
【００５０】
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
【００５１】
本発明の検出方法によってレジオネラ属菌の生菌を検出する場合、核酸増幅産物の解析は、同定されているレジオネラ属菌の細菌の標準試料を用いて作成された細菌量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め細菌量とＤＮＡ量との相関を調べておけば、その細菌から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。
【００５２】
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、被検試料中のレジオネラ属菌の生菌を核酸増幅法により検出するためのキットであって、架橋剤、培地、及び検出対象のレジオネラ属菌のＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマーを含む。ターゲット領域及びプライマーについては、上記の本発明の方法において記載したのと同様である。
【００５３】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、又はＬＣＲ法であることが好ましい。なお、上記キットにおいて、架橋剤や培地は、本発明の方法で説明したものと同様である。
【００５４】
本発明のキットの好ましい態様は、架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）を使用することが特に好ましい。
【００５５】
本発明のキットは、さらに、希釈液、架橋剤反応用の反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
mip遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法により、被検試料中のレジオネラ属菌の生菌と
、死菌及び／又は損傷菌を識別するために試験を行った。
【００５７】
（１）試料の調製
ａ）レジオネラ（生菌）の調製
以下に示すレジオネラ・ニューモフィラ（L. pneumophila）に属する菌株、80-045 株
、Philadelphia-1株、NIIB0733株、NIIB0805株、NIIB0744株、NIIB0802株、NIIB0784株、NIIB0797株、NIIB0792株、NIIB0864株、NIIB0794株、及びNIIB0806株を、それぞれbuffered charcoal yeast extract（ＢＣＹＥ）寒天培地（ベクトンディッキンソン社製）で３
７℃で培養した。形成直後のコロニーを生理食塩水に懸濁し、各種レジオネラ懸濁液（生菌：１．０×１０7cells/ml）の調製を行って試験に供した。
【００５８】
ｂ）加熱処理レジオネラの調製
前記１２種のレジオネラ生菌懸濁液（１．０×１０7cells/ml）を、９５℃、２分間加
熱処理し、ＢＣＹＥ寒天培地でコロニーを形成しないことを確認した。その一方、菌液を４℃、１０分間、１５，０００×ｇの条件で冷却遠心処理し、上清を除去後、同容量の生理食塩水でペレット（菌体）を再懸濁して、加熱処理レジオネラ懸濁液（１．０×１０7cells/ml）を調製し、これを試験に供した。
【００５９】
ｃ）塩素処理レジオネラの調製
前記１２種のレジオネラ生菌懸濁液（１．０×１０7cells/ml）に、次亜塩素酸ナトリ
ウム水溶液を終濃度１．０ｐｐｍとなるように添加し、次いで２５℃、３０分間放置した。このようにして塩素処理された懸濁液に、チオ硫酸ナトリウム（sodium thiosulfate）溶液を終濃度０．０５％濃度となるように添加して残留塩素を不活性化した。
【００６０】
その後、ＢＣＹＥ寒天培地でコロニーを形成しないことを確認した。その一方、菌液を４℃、１０分間、１５，０００×ｇの条件で冷却遠心処理し、上清を除去後、同容量の生理食塩水でペレットを再懸濁して、塩素処理レジオネラ懸濁液（１．０×１０7cells/ml
）を調製し、これを試験に供した。
【００６１】
（２）架橋剤（エチジウムモノアザイド：ＥＭＡ）処理
前記で調製したレジオネラ懸濁液、加熱処理レジオネラ懸濁液、及び塩素処理レジオネラ懸濁液に、ＥＭＡの終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにＥＭＡ溶液を添加し、次いで遮光下で４℃、１０分間放置し、その後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF: １００Ｖ、５００Ｗ、岩崎電気社製、波
長：５００〜７００ｎｍ）を５分間照射した。
【００６２】
（３）架橋剤処理された各種レジオネラからのＤＮＡの精製
架橋剤処理された各種レジオネラ懸濁液を、４℃で１０分間、１５，０００×ｇにて冷却遠心分離してペレットを回収し、回収した各菌体について、High PureTM PCR template
preparation kit（ロシュ社製）を使用してＤＮＡの精製を行った。
【００６３】
（４）核酸増幅及び増幅産物の電気泳動
各種レジオネラ懸濁液から精製したＤＮＡは、Ex TaqTM（タカラバイオ社製）を用いて、ＰＣＲ法にて核酸増幅を行った。すなわち、ＤＮＡに対し、ＰＣＲバッファー濃度、プライマーの濃度、dNTP mixtureの濃度は、キットに添付の作業手順書に従い、これに基づいて各試薬を添加し、ＰＣＲ増幅装置としてGeneAmpTM PCR System 9700（アプライドバ
イオシステム社製）を使用して増幅を行った。
【００６４】
なお、プライマーとして、Legionella pneumophilaに属する菌株を特異的に検出するマクロフファージ侵入性遺伝子（mip遺伝子）検出用プライマー（配列表の配列番号１：Lmip-L、及び配列番号２：Lmip-Rに記載されたＰＣＲ用プライマー）を用いた。なお、前記
検出用プライマーは、mip遺伝子上の５’末端から９２０番〜１５６９番の塩基をターゲ
ットとして増幅するためのプライマーである。
また、ＰＣＲ増幅の際のサーマルサイクルは、表１のとおりである。
【００６５】
【表１】
2010017144.tif 000003
【００６６】
前記方法によって調製されたＰＣＲ増幅産物は、２％アガロースゲルによる電気泳動（１０μｌ量アプライ）を行った。
【００６７】
（５）試験結果
本試験の結果は図１、図２に示すとおりである。
図１は、レジオネラ属菌の80-045株生菌、加熱処理80-045株菌（死菌、損傷菌）、塩素処理80-045株菌（死菌、損傷菌）について、それぞれエチジウムモノアザイド処理を行わずに、核酸増幅及び増幅産物の電気泳動を行った結果を示している（ＥＭＡ未処理試験）。
【００６８】
図２は、いずれも、レーン１：生菌／ＥＭＡ未処理、レーン２：生菌／ＥＭＡ処理、レーン３：死菌、損傷菌（加熱殺菌）／ＥＭＡ処理、レーン４：死菌、損傷菌（塩素殺菌）／ＥＭＡ処理、をそれぞれ示している。
その結果、図１より明らかなとおり、生菌、死菌及び／又は損傷菌のいずれも電気泳動でバンドが確認され、ＥＭＡ未処理では、生菌と、死菌及び／又は損傷菌の識別は困難であった。
【００６９】
これに対し、図２から明らかなとおり、いずれのレジオネラ属菌の菌株においても、細胞数が１．０×１０7cells/mlのように高い条件であっても、ＥＭＡ処理を行うことによ
って、加熱処理菌又は塩素処理菌に由来する電気泳動上のバンドは消失（レーン３，４）し、同様の菌濃度でＥＭＡ処理を施した生菌（レーン２）とは、バンドの有無によって明らかに識別ができることが判明した。
【００７０】
これにより、被検試料にレジオネラ属菌の死菌及び／又は損傷菌が高い細胞数の状態で存在していても、本発明による架橋剤処理を行い、mip遺伝子に相当する領域を核酸増幅
することによって、被検試料中に混在するレジオネラ属菌の生菌を高感度で検出できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）処理を行っていないレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌における核酸増幅産物の電気泳動写真。  写真のレーン１：レジオネラ（生菌）／ＥＭＡ未処理、レーン２：加熱処理レジオネラ（死菌、損傷菌）／ＥＭＡ未処理、レーン３：塩素処理レジオネラ（死菌、損傷菌）／ＥＭＡ未処理
【図２】エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）処理を行ったレジオネラ属菌の生菌と、死菌及び／又は損傷菌における核酸増幅産物の電気泳動写真。  各写真のレーン１：生菌／ＥＭＡ未処理、レーン２：生菌／ＥＭＡ処理、レーン３：死菌、損傷菌（加熱処理）／ＥＭＡ処理、レーン４：死菌、損傷菌（塩素処理）／ＥＭＡ処理
【図１】
2010017144.tif 000004
【図２】
2010017144.tif 000005
【配列表】
2010017144000001.app