(57)【要約】【課題】糖混合物から高純度のマンノース含有物を簡便な操作でしかも安価に取得することができるマンノースの精製方法を提供する。【解決手段】コプラミール又はパーム核ミールを酸及び/又は酵素で分解して得られるマンノースと、マンノース以外の単糖、すなわちグルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択される１種類以上の単糖が混在する混合糖液に、マンノースの資化能がないもしくは弱い枯草菌（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ））を作用させてマンノース以外の単糖を1種類以上資化させることによりマンノースの含有率を高めることを特徴とするマンノースの精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノースとマンノース以外の単糖が1種類以上混在する混合糖液に、マンノースの資化能がないもしくは弱い枯草菌（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ））を作用させてマンノース以外の単糖を1種類以上資化させることによりマンノースの含有率を高めることを特徴とするマンノースの精製方法。
【請求項２】
マンノースとマンノース以外の単糖が１種類以上混在する混合糖液が、植物由来の原料を酸及び/又は酵素で分解して得られるものである請求項１記載のマンノースの精製方法。
【請求項３】
植物由来の原料が、コプラミール又はパーム核ミールである請求項２記載のマンノースの精製方法。
【請求項４】
マンノース以外の単糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択される１種類以上の単糖である請求項1〜３のいずれかに記載のマンノースの精製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の精製方法によって製造されたことを特徴とする高純度マンノース。
【請求項６】
全単糖中のマンノース含有率が９０質量％以上である請求項５記載の高純度マンノース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノースの精製方法に関するものであり、さらに詳しくはマンノース含有糖液から高純度のマンノースを取得することが出来るマンノースの精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マンノースにはマクロファージ活性化による傷の治癒の促進や細菌感染阻害、乳がん細胞の増殖抑制といった様々な機能が存在する。最近では、糖尿病性白内障の進行を抑制し、また先天的糖化障害においてマンノースの経口投与により症状が改善するという報告もあり、今後、糖鎖医薬として重要になってくる。
【０００３】
これまでのマンノースの調製方法として、ゾウゲヤシの種子から得られるマンナンを酸加水分解する方法（非特許文献１）、コプラミール又はパーム核ミールにヘミセルラーゼを作用させる方法（特許文献１）が報告されている。また、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースから、及びグルコースイソメラーゼとマンノースイソメラーゼを用いてグルコースから、それぞれマンノース含有糖液を得る方法が報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
さらに、特許文献２に代表されるようにＤ−グルコースとモリブデン酸等の金属を含む水溶液を加熱エピメリ化し、マンノース含有糖液を製造する試みがなされている。最近ではマンノースの分離取得方法に関し、マンノース含有糖液を原料液として、該原料液中のマンノースとその他の糖をイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィーによって分画する方法（特許文献３）、乳酸菌を用いる培養方法にて分画し、高純度のマンノース画分を取得する方法も報告されている（特許文献４）。
【非特許文献１】H.S.Isbell,Method in Carbohydrate Chemistry, R.L.Whistler, M.L.Wolfrom Eds (Academic Press, New York, 1962) pp 145-147
【特許文献１】特開２００２−５１７９５号公報
【非特許文献２】高崎義幸、「食品工業」、Vol.38、p.40-45 (1995)
【特許文献２】特公昭６３−１２０７２号公報
【特許文献３】特開平６−２３７７８２号公報
【特許文献４】特開平１０−５７０９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ゾウゲヤシ中に存在するマンナンを酸加水分解する方法は、原料の供給量等に限度があり、従って、これにより製造されるマンノースは非常に高価なものであった。
【０００６】
さらに上記のように酵素を用いる方法及びエピメリ化反応により得られたマンノース含有糖液は、通常、マンノースの他にグルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ラムノース等の単糖が含まれており、さらにマンノース含有糖液中のマンノース含量は原料や調製方法により様々であり、マンノースを単離するためには何らかの分離取得する方法が必要であった。
【０００７】
マンノースの分離取得方法に関しては、上記したようにクロマトグラフィーで分画する方法および乳酸菌により高純度のマンノース画分を取得する方法が提案されているが、前者は多量の単糖が不純物として混在する糖液から、目的のマンノースを分離するためには、複雑な工程が必要であり、後者ではマンノース含有糖液に対して乳酸菌を３％添加しており、乳酸菌の価格が高く前培養が必要であり二糖やグリセリンの資化は難しく、簡便で安価な方法で混在する不必要な糖質を除去し、マンノースの含有量を高める技術開発が望まれていた。
【０００８】
本発明は、糖混合物から高純度のマンノース含有物を簡便な操作でしかも安価に取得することができるマンノースの精製方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意検討の結果、マンノース以外の単糖が１種類以上混在するマンノース含有糖液に、マンノース資化能がないもしくは弱い枯草菌を作用させることにより、マンノースの含有率を高めることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第一の本発明は、マンノースとマンノース以外の単糖が1種類以上混在する混合糖液に、マンノースの資化能がないもしくは弱い枯草菌を作用させてマンノース以外の単糖を1種類以上資化させることによりマンノースの含有率を高めることを特徴とするマンノースの精製方法を要旨とするものであり、好ましくは、マンノースとマンノース以外の単糖が１種類以上混在する混合糖液が、植物由来の原料を酸及び/又は酵素で分解して得られるものであり、さらに好ましくは、植物由来の原料が、コプラミール又はパーム核ミールである。また前記のマンノースの精製方法において、好ましくは、マンノース以外の単糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択される１種類以上の単糖であるものである。
【００１１】
第二の本発明は、前記した第一の本発明であるマンノースの精製方法によって製造されたことを特徴とする高純度マンノースを要旨とするものであり、好ましくは、全単糖中のマンノース含有率が９０質量％以上であるものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、糖混合物から高純度のマンノース含有物を簡便な操作でしかも安価に取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明におけるマンノース以外の単糖としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、アラビノースの他、ラムノース、ソルボース、リボース、タガトース、タロース、リキソース等が挙げられる。
【００１５】
本発明で用いるマンノースとマンノース以外の単糖が１種類以上混在する混合糖液（以下、「混合糖液」という。）は、マンノースと、上記したようなマンノース以外の単糖の１種又は２種以上が含有する糖液であり、その製造法は特に限定されないが、より安価に得るためには、食品産業廃棄物であるコプラミール、パーム核ミール等の植物由来の原料を酸加水分解または酵素分解することで得ることができる。このような廃棄物や副産物などを原料として用いることは、安価に製造する目的に則するだけでなく、廃棄物の有効利用という環境保護的側面から見ても、非常に望ましい方法であるといえる。
【００１６】
上記したコプラミール、パーム核ミール等は、構成糖としてマンノースを含んでいるものであれば特に制限はなく、酸加水分解または酵素分解によりマンノースが遊離し、それ以外に１種類以上の単糖が混在するものであれば、どのようなものにでも使用することができる。
【００１７】
上記した原料の酸加水分解の条件としては、一般的に知られている条件を適用すればよい。一般的には鉱酸あるいは有機酸の存在下で、６０〜１２０℃、２〜３０時間処理すればよい。加水分解に使用する酸の濃度は、０．０５〜６Ｎが適当であり、塩酸、硫酸、シュウ酸等の酸が使用できる。また、加水分解の後、必要に応じて水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどの塩基を加え中和するか、イオン交換樹脂などによる脱イオン処理を行っても差し支えない。
【００１８】
一方、原料の酵素処理の条件としては、一般的に知られている条件を適用すればよい。使用する酵素としては、マンナン、ガラクトマンナン又はグルコマンナンに作用してマンノースを遊離する活性を有する酵素、例えばマンナナーゼ、マンノシダーゼ等のマンノース分解酵素が挙げられる。また、分岐した側鎖に存在するグルコースやガラクトースを遊離する酵素としてはグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼが挙げられる。さらに、これら異なる活性を有する２種類以上の酵素を混合することによりマンノース収量を上げることができる。また、使用する酵素はその酵素の起源である菌株の培養物のうち、マンノースを遊離する活性を有するいかなる画分を用いてもよく、また必要に応じてこれらの酵素を含有する画分を常法により精製あるいは部分精製して使用することもできる。
【００１９】
本発明においては、上記のようにして得られる、混合糖液に、マンノースの資化能がないもしくは弱い枯草菌（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ））を作用させることが必要である。本発明において作用させる枯草菌は、マンノースの資化能がないもしくは弱いものである限り、特に限定されないが、中でも納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ）が好ましい。納豆菌は市販されているものを購入しても良いし、公的機関から分譲されたもの、食品の納豆から分離したもの等を使用できるが、種菌として市販されているものが作業上好ましい。これらのうち好ましい例としては、（株）成瀬発酵化学研究所の菌、納豆素本舗  高橋祐蔵研究所の菌、宮城野納豆菌製造所の菌が挙げられる。これらのマンノース資化能のないもしくは弱い枯草菌を単独もしくは数種類を組み合わせて用いることも可能であり、単糖のみでなく二糖類やグリセリンも資化することが出来る。
【００２０】
上記の枯草菌を混合糖液に作用させる方法は、特に限定されない。最適な方法は、混合糖液に枯草菌の菌体を添加すればよい。枯草菌の菌体の添加量は、糖液１ｍＬ当たり１白金耳〜０．０１ｍｇ（乾燥重量）程度が適当であり、菌体を添加した糖液を処理する条件、例えば温度、時間などについては、不純物として混在する糖質が効率よく消失する条件を適用すればよい。一般的な処理温度としては５〜７０℃、好ましくは１０〜６０℃、さらに好ましくは２０〜５０℃が用いられる。一般的な処理時間としては１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間、さらに好ましくは１６〜２４時間が好適である。
【００２１】
また、用いる枯草菌にとって好ましい環境とするために、混合糖液を希釈、濃縮、脱塩等の操作により糖濃度や塩濃度の調節を行なうことができる。さらに、枯草菌を作用させる際には通気は必ずしも必要ではないが、必要に応じて通気を行い、撹拌、超音波、振盪などの方法により菌体を均一に分散させても差し支えない。
【００２２】
混合糖液をマンノース資化能のないもしくは弱い枯草菌で処理することにより得られるマンノース含有率を高めた糖液は、必要に応じて各種の樹脂、膜、クロマトグラフィー、結晶化等の一般的な方法を用いてマンノース含有率をさらに高めることが可能である。
【実施例】
【００２３】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、ＨＰＬＣによる糖の分析条件を１）に、グリセリンの分析条件を２）に示す。
１）ＨＰＬＣ分析条件カラム：Aｍｉｎex HPX87P（７．８×３００ｍｍ、BIO RAD製）、移動相：水、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出：示差屈折計（ＲＩ）
２）ＨＰＬＣ分析条件カラム：Aｍｉｎex HPX87H（７．８×３００ｍｍ、BIO RAD製）、移動相：0.005N 硫酸、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出：示差屈折計（ＲＩ）
【００２４】
参考例１（パーム核ミールを用いたマンノース含有糖液の調製）
パーム核ミール１００ｇに酵素セルロシンGM5（HBI製 マンナナーゼ）１．２ｇ、水３００ｍＬおよびシュウ酸１．８ｇを加え、６０℃で４８時間反応させ、珪藻土ろ過を行った。ろ液をpH６．６、Bx（可溶性固形分量）６％に調整した遠心上清の糖成分をＨＰＬＣにより分析した結果、マンノースが２８．７６ｇ／Ｌ、フルクトースが２．８２ｇ／Ｌ、グルコースが１．９８ｇ／Ｌ、ガラクトースが０．３０ｇ／Ｌ及び含まれており、これら単糖中のマンノース含量率は８６％であった。またショ糖は０．６０ｇ／Ｌ、グリセリンは１．０６ｇ／Ｌ含まれていた。
【００２５】
実施例１
参考例１で得られた糖液を１２１℃、２０分の熱処理を行った後、糖液１０ｍLに対して成瀬菌の粉末菌体（（株）成瀬発酵化学研究所製）） ０．１ｍｇを添加し３７℃で２４時間振盪処理を行った。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により菌体を除去した。得られた遠心上清の糖成分を分析したところ、ＨＰＬＣ分析において単糖中のマンノース含有率は１００％となり、そのマンノース濃度は２８．８３ｇ／Ｌであり、ショ糖は４３％、グリセリンは６０％ほど資化されていた。
【００２６】
実施例２
成瀬菌を高橋菌の粉末菌体（納豆素本舗  高橋祐蔵研究所製）に変えた以外は実施例１と同様に処理した。ＨＰＬＣ分析における単糖中のマンノース含有率は８７％、マンノース濃度３１．７９ｇ／Ｌから菌処理によりマンノース含有率は１００％、マンノース濃度は３０．２０ｇ／Ｌとなり、ショ糖は７４％、グリセリンは９８％ほど資化されていた。
【００２７】
実施例３
宮城野菌（宮城野納豆菌製造所製）をTSB培地で３７℃、２４時間、前培養した後、遠心分離により集菌した。参考例１と同様にマンノース含有糖液を調製し、糖液１０mLに対して湿菌体量０．１ｍｇ添加し３７℃で２４時間振盪処理を行った。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により菌体を除去した。得られた遠心上清の糖成分を分析したところ、ＨＰＬＣ分析における単糖中のマンノース含有率は７７％、マンノース濃度２３．３０ｇ／Ｌから菌処理によりマンノース含有率は１００％、マンノース濃度は２１．０５ｇ／Ｌとなり、ショ糖は８３％、グリセリンは８８％ほど資化されていた。
【００２８】
実施例４
枯草菌（Bacillus subtilis NBRC  no.３００９）をLB培地で３７℃、２４時間、前培養した後、遠心分離により集菌した。参考例１と同様にマンノース含有糖液を調製し、糖液１０mLに対して湿菌体量０．１ｍｇ添加し３７℃で２４時間振盪処理を行った。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により菌体を除去した。得られた遠心上清の糖成分を分析したところ、ＨＰＬＣ分析における単糖中のマンノース含有率は８１％、マンノース濃度２２．５７ｇ／Ｌから菌処理によりマンノース含有率は１００％、マンノース濃度は１７．００ｇ／Ｌとなり、ショ糖は２３％、グリセリンは１００％資化されていた。
【００２９】
比較例１
乳酸菌（Lactobacillus plantarum  東亜薬品工業のLP菌末トーア）をMRS培地で３０℃、２４時間、前培養した後、遠心分離により集菌した。参考例１と同様にマンノース含有糖液を調製し、糖液1０mLに対して乾燥菌体量１０ｍｇ添加し３７℃で２４時間振盪処理を行った。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により菌体を除去した。得られた遠心上清の糖成分を分析したところ、ＨＰＬＣ分析において単糖中のマンノース含有率は９５％、マンノース濃度は４５．３７ｇ／Ｌから菌処理により９９％となったが、マンノース自体が２６％ほど資化されマンノース濃度は３３．４３ｇ／Ｌになり、糖液中のガラクトースは３４％しか資化されていなかった。
【００３０】
比較例２
酵母（Candida versatilis  NBRC  no.10056）をYPD培地で３７℃、２４時間、前培養した後、遠心分離により集菌した。参考例１と同様にマンノース含有糖液を調製し、糖液１０mLに対して湿菌体量１０ｍｇ添加し３７℃で２４時間振盪処理を行った。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により菌体を除去した。得られた遠心上清の糖成分を分析したところ、ＨＰＬＣ分析において単糖中のマンノース含有率は９５％、マンノース濃度は３３．３４ｇ／Ｌから菌処理により９７％となったが、マンノース自体が８３％も資化されマンノース濃度は５．７４ｇ／Ｌになり、さらに糖液中のガラクトースは１７％しか資化されていなかった。
【００３１】
以上の実施例１〜４、比較例１、２について得られた結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】
2010022267.tif 000002