(57)【要約】【課題】細胞の健全性を維持しつつ、細胞に付着している消化酵素や不純物を除去する。【解決手段】細胞懸濁液Ａ′を収容した容器内を遠心運動させて、上清と細胞群とに遠心分離する分離ステップと、該分離ステップにおいて分離された上清を除去する上清除去ステップと、該上清除去ステップにおいて上清が除去されて容器内に残った細胞群Ｂに洗浄液Ｅを供給して細胞群Ｂを再懸濁させつつ、キャビテーションを発生させない出力の超音波を付与する洗浄ステップとを含む細胞洗浄方法を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を収容した容器内を遠心運動させて、上清と細胞群とに遠心分離する分離ステップと、
該分離ステップにおいて分離された上清を除去する上清除去ステップと、
該上清除去ステップにおいて上清が除去されて容器内に残った細胞群に洗浄液を供給して細胞群を再懸濁させつつ、キャビテーションを発生させない出力の超音波を付与する洗浄ステップとを含む細胞洗浄方法。
【請求項２】
前記洗浄ステップが、周波数２０〜３０ｋＨｚ、エネルギ１５０Ｊ以下の超音波振動を付与する請求項１に記載の細胞洗浄方法。
【請求項３】
細胞懸濁液を収容して底部を半径方向外方に向けて遠心運動させられる容器本体と、
該容器本体内に配置される吐出口を有し、容器本体内に洗浄液を供給する供給管と、
前記容器本体内に配置され前記供給管から洗浄液が供給されている間に、キャビテーションを発生させない出力の超音波振動を発振する超音波振動子とを備える細胞洗浄容器。
【請求項４】
前記超音波振動子が、周波数２０〜３０ｋＨｚ、エネルギ１５０Ｊ以下の超音波振動を発振する請求項３に記載の細胞洗浄容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞洗浄方法および細胞洗浄容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、患者の脂肪組織を採取して、消化酵素および生理食塩水とともに攪拌することにより脂肪組織内に含まれる脂肪由来細胞群を分離する技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この技術において、生体組織が消化されることで得られた細胞懸濁液から脂肪由来細胞を抽出するには、細胞懸濁液を遠心処理して上清と細胞群とに分離し、上清を除去し、洗浄液を供給して細胞群を再懸濁する処理を繰り返す。これにより、細胞懸濁液内の消化酵素や脂肪組織等の不純物を除去して、高純度の細胞群を採取することができる。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０３／０５３３４６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞に強固に付着している消化酵素や不純物を除去するために遠心分離、上清除去および洗浄液供給の各ステップの繰り返し回数を増やすと、細胞にダメージが与えられるという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の健全性を維持しつつ、細胞に付着している消化酵素や不純物を除去することができる細胞洗浄方法および細胞洗浄容器を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液を収容した容器内を遠心運動させて、上清と細胞群とに遠心分離する分離ステップと、該分離ステップにおいて分離された上清を除去する上清除去ステップと、該上清除去ステップにおいて上清が除去されて容器内に残った細胞群に洗浄液を供給して細胞群を再懸濁させつつ、キャビテーションを発生させない出力の超音波を付与する洗浄ステップとを含む細胞洗浄方法を提供する。
【０００６】
本発明によれば、分離ステップにおいて遠心運動させられることにより容器内に上清と細胞群とが分離された状態で、上清除去ステップにおいて上清を除去することにより、容器内に細胞群が残るので、洗浄ステップにおいて洗浄液を供給して細胞群を攪拌し再懸濁することにより、細胞懸濁液内の消化酵素や不純物の濃度を低下させることができる。この場合において、洗浄液の供給と同時に超音波を付与することにより、超音波振動によって細胞に付着している消化酵素や不純物が剥離され、さらに除去し易くなる。超音波振動はキャビテーションを発生させない出力に抑えられているので、細胞にダメージを与えることなく、細胞に付着している消化酵素等の不純物を簡易に除去することができる。
【０００７】
上記発明においては、前記洗浄ステップが、周波数２０〜３０ｋＨｚ、エネルギ１５０Ｊ以下の超音波振動を付与することとしてもよい。
このようにすることで、細胞にかかるダメージを十分に抑えつつ細胞群から効果的に不純物を除去することができる。
【０００８】
また、本発明は、細胞懸濁液を収容して底部を半径方向外方に向けて遠心運動させられる容器本体と、該容器本体内に配置される吐出口を有し、容器本体内に洗浄液を供給する供給管と、前記容器本体内に配置され前記供給管から洗浄液が供給されている間に、キャビテーションを発生させない出力の超音波振動を発振する超音波振動子とを備える細胞洗浄容器を提供する。
【０００９】
本発明によれば、容器本体内に収容されている細胞に対して供給管から洗浄液を供給することにより、洗浄液によって細胞が再懸濁される。この際に、超音波振動子から超音波振動を発振することにより、細胞に付着している消化酵素や不純物が剥離され、さらに除去し易くなる。超音波振動はキャビテーションを発生させない出力に抑えられているので、細胞にダメージを与えることなく、細胞に付着している消化酵素等の不純物を簡易に除去することができる。
上記発明においては、前記超音波振動子が、周波数２０〜３０ｋＨｚ、エネルギ１５０Ｊ以下の超音波振動を発振することが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞の健全性を維持しつつ、細胞に付着している消化酵素や不純物を除去することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施形態に係る細胞洗浄方法および細胞洗浄容器１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞洗浄方法は、生体組織、例えば、脂肪組織と消化酵素とを混合して攪拌することにより、脂肪組織から分離された脂肪由来細胞を洗浄して高純度の細胞群を採取する方法である。
【００１２】
本実施形態に係る細胞洗浄容器１は、図１に示されるように、先端に向かって先細になる底部２ａを有する円筒状の容器本体２と、該容器本体２の開口部２ｂを閉塞する蓋部材３と、該蓋部材３を貫通して軸方向に延び、先端の吐出口４ａを底面近傍に配置する供給管４と、該供給管４の吐出口４ａよりも底面から離れた位置に吸引口５ａを有する上清吸引管５とを備えている。また、上清吸引管５の先端部は、超音波振動を発振する超音波振動子６を構成している。
【００１３】
本実施形態に係る細胞洗浄方法は、図２に示されるように、細胞懸濁液Ａを細胞群Ｂと上清Ｃとに遠心分離する分離ステップと、図３に示されるように、分離された上清Ｃを除去する上清除去ステップと、図４に示されるように、上清Ｃが除去された細胞群Ｂに対して洗浄液Ｄを供給する洗浄ステップとを含んでいる。
分離ステップは、細胞懸濁液Ａを収容した容器本体２をその底面２ａが半径方向外方に向かうように遠心運動させることにより、図２に示されるように、細胞懸濁液Ａ内に含有されている細胞群Ｂと上清Ｃとをその比重によって容器本体２の軸方向に積層状態に分離するようになっている。
【００１４】
上清除去ステップは、図３に示されるように、分離ステップにおいて容器本体２内に細胞群Ｂの上層に分離された上清Ｃを上方から吸引することにより除去するようになっている。上清Ｃ内には、細胞懸濁液Ａ内に含まれていた消化酵素や組織片のような不純物が含まれているので、上清除去ステップにおいて上清Ｃを除去することにより、そのような不純物を取り除くことができる。
【００１５】
洗浄ステップは、上清除去ステップにおいて上清Ｃが除去されることにより容器本体２内に残った細胞群Ｂに対して、図４に示されるように、洗浄液Ｅを供給することにより、洗浄液Ｅによって細胞群Ｂを解して攪拌し、細胞群Ｂに付着している消化酵素等の不純物を剥離させるようになっている。そして、これにより、細胞群Ｂが再懸濁されて細胞懸濁液Ａ′が生成される。生成された細胞懸濁液Ａ′は、上清除去ステップにおいて不純物が除かれているので、最初の細胞懸濁液Ａよりも消化酵素等の不純物の濃度が低下させられている。
【００１６】
また、本実施形態においては、図４に示されるように、洗浄ステップにおいて、洗浄液Ｅの供給によって攪拌されている状態の細胞懸濁液Ａ′に対し、超音波振動を付与するようになっている。
超音波振動としては、周波数２０〜３０ｋＨｚ、エネルギ１５０Ｊ以下の超音波振動を付与する。
【００１７】
周波数２０ｋＨｚ以下の超音波振動は、ノイズが大きく精度良く制御できないため使用に適さず、周波数３０ｋＨｚを越える超音波振動は、細胞懸濁液Ａ′内にキャビテーションを発生させるため細胞にダメージを与えてしまう不都合がある。これに対して周波数２０〜３０ｋＨｚの超音波振動は、キャビテーションを生じさせないので、細胞に与えるダメージが小さく、細胞を健全な状態に維持することができる。
【００１８】
図５に、周波数２３．５ｋＨｚの超音波振動のエネルギと細胞生存率との関係、図６に、その超音波振動の持続時間と細胞生存率との関係をそれぞれ示す。図５の横軸は、出力１００％で５０Ｗの超音波振動子６を使用した場合の出力を％表示したものである。この図によれば、出力３０％以下の場合には安定的に細胞生存率が高いが、出力３０％を越えると、出力が高くなればなるほど細胞生存率が低下することがわかる。この超音波振動子６の場合、出力３０％は、１５Ｗであるため、１０秒間持続することにより、１５０Ｊのエネルギを付与することになる。
【００１９】
また、図６の横軸は、超音波振動の照射時間であり、１０秒以下の場合には、安定的に細胞生存率が高いが、１０秒越えると、照射時間が長くなればなるほど細胞生存率が低下することがわかる。
【００２０】
図７に、上記条件の超音波振動を付与しながら洗浄液Ｅを供給して攪拌した場合の、細胞懸濁液Ａ′中の消化酵素の残留濃度を示す。超音波振動を付与しない場合（出力なし）の残留酵素濃度を１００％として、出力１５％１０秒、出力３０％５秒および出力３０％１０秒の条件で超音波振動を付与した場合の残留酵素濃度の比率を比較して示す。
【００２１】
この図によれば、超音波振動を付与しながら洗浄した場合には、いずれの条件の場合においても超音波振動を付与しなかった場合と比較して残留酵素濃度を低下させることができることがわかる。したがって、細胞に付着している消化酵素等を効果的に剥離させて洗浄液中に放出させ、不純物を含まない高純度の細胞群を得ることができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞洗浄装置を示す縦断面図である。
【図２】図１の細胞洗浄装置による分離ステップを示す縦断面図である。
【図３】図１の細胞洗浄装置による上清除去ステップを示す縦断面図である。
【図４】図１の細胞洗浄装置による洗浄ステップを示す縦断面図である。
【図５】図１の細胞洗浄装置を用いた細胞洗浄方法において、細胞懸濁液に照射する超音波振動の出力と細胞生存率との関係を表すグラフを示す図である。
【図６】図１の細胞洗浄装置を用いた細胞洗浄方法において、細胞懸濁液に照射する超音波振動の照射時間と細胞生存率との関係を表すグラフを示す図である。
【図７】図１の細胞洗浄装置を用いた細胞洗浄方法における超音波振動により細胞懸濁液に加えるエネルギと残留酵素濃度との関係を表すグラフを示す図である。
【符号の説明】
【００２３】
Ａ，Ａ′  細胞懸濁液
Ｅ  洗浄液
１  細胞洗浄容器
２  容器本体
４  供給管
４ａ  吐出口
６  超音波振動子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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