(57)【要約】【課題】移植用の輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などを効率よく臨床応用できる抗菌性保存液を開発する。【解決手段】抗菌性ペプチドであるポリリジン（ε結合を有する）単独、あるいはポリリジンと緑茶ポリフェノールの一種である（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）を添加した保存液を用いる。例えば、１０〜１００μｇ／ｍＬのポリリジン、及び、１０〜１００μｇ／ｍＬのＥＧＣｇを、輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液に含有させることで、好気性グラム陰性菌やグラム陽性菌に対して高活性を示し、さらに嫌気性菌やマイコプラズマ等に対しても強力な抗菌力を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、あるいは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を分散させた保存液に、０．００１−１．０重量％の濃度となるようにε−ポリ−Ｌ−リジンを添加したことを特徴とする抗菌性保存液。
【請求項２】
上記ε−ポリ−Ｌ−リジンと、緑茶ポリフェノールの一種である（−）−エピガロカテキン−３−０−ガレート（ＥＧＣｇ）を添加したことを特徴とする輸血用血液、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの抗菌性保存液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、添加することで、保存温度−１９６〜＋３７℃において、混入細菌の増殖速度を無菌状態に抑制することが可能となり、有効期間延長できる輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液に関する。更に、当該担体を用いた雑菌やマイコプラズマ、またはウイルスに汚染された細胞培養溶液からの汚染除去方法に関する。
【背景技術】  ２１世紀は再生医療の時代といわれている。この再生医療とは、病気や事故により機能不全に陥った組織や臓器の機能を再生する新しい医療である。その方法としては、自己や他人の細胞を患者に投与したり、それらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し組織を構築した後、患者に移植する治療法である。これまでの医療では、薬で治らない疾病には生体組織の移植や人工臓器の置換術などで治療されてきたが、移植医療と人工臓器の限界が見えてきたため、今世紀に入り再生医療への期待が大きく高まって来ている。近年、この再生医療の研究開発が急速に熱を帯びてきているが、これはあらゆる生体組織のもとになるＥＳ細胞（胚性幹細胞）やＥＧ細胞（胚性生殖細胞）等の「万能細胞」をヒトや動物の受精卵から取り出して育てることが可能になってきたためである。また最近、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の転写因子（遺伝子）を導入することにより、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に似た分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持たせた細胞である人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ）が開発された。これらの幹細胞を用いたこの再生医療が実現することになれば、不治の病や事故により臓器移植しか蘇生できる手立てがない重篤な患者を救うことができるため、遺伝子を手掛かりにした新薬開発と並び、大きな市場を開く可能性を秘めている。
さて、この再生医療には高度な知識と技術および時間を要するが、その初期段階として細胞工学や組織工学が再生医療の発展にとって極めて重要である。
採血などで提供された輸血用血液、臍帯血、骨髄、あるいは細胞等は約３０％もマイコプラズマ等の細菌が混入していることが報告されている。これらの混入細菌のため移植には不適合で廃棄されるか、もしくは検出限界の細菌数でも保存後に増殖し移植後重篤な危険性を伴うことになる。従って、増殖を抑制することが可能になれば、血液製剤や幹細胞製剤の有効期間延長に繋がることが期待できる。
そこで本特許では、輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの−１９６〜＋３７℃保存において、抗菌性ペプチドであるポリリジン（ε結合を有する）、あるいはそれらポリリジンと緑茶ポリフェノールの一種である（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）を添加した保存液が有用であることを明らかにした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明の解決しようとする課題は、混入細菌やウイルスの増殖を抑制し、輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織など保存液の機能の低下を防ぐことにより保存期間の延長を計ることである。
【課題を解決するための手段】  本発明の保存剤は、ポリリジンあるいはポリフェノールの混合成分からなり、これを保存輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、あるいは造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液に添加させることで、混入細菌やウイルスの増殖を抑制する。
【発明の効果】  本発明では、ポリリジンあるいは、それらポリリジンとポリフェノールを添加したの混合成分により、混入細菌やウイルスの増殖抑制と保存効果を高めることができる。つまり、保存時に混入細菌やウイルスの増殖抑制を阻害することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明で用いるポリリジンは、塩基性アミノ酸であるリジンのポリマーである。そのポリマー分子構造中のアミノ基の位置によりα−ポリリジンとε−ポリリジンの二つの構造を取り得るが、ε−ポリリジンは、既存の食品添加物であり、安全性と価格の観点からε−ポリリジンを用いる方が好ましい。
本発明におけるε−ポリ−Ｌ−リジンは、具体的には、例えば、次のようにして得られらるものを用いることができる。日本特許第３５２５１９０号または日本特許第３６５３７６６号に記載の菌株であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを用いる。そして、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・採取する。
本発明においては、ポリリジンは遊離、又は塩の形態で用いることができる。塩の形態には、塩酸塩や硫酸塩等の無機酸塩の他、琥珀酸塩、クエン酸塩やリンゴ酸塩等の有機酸塩が用いることが出来る。
また、本発明におけるポリフェノールについては、限定されない。カテキン類、タンニン類、プロアントシアニジン又はリスベラトロールが使用され得る。特に好ましいのは、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、（−）−ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣｇ）である。エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレートの純度は９０重量％以上が望ましく、９８重量％以上がより望ましい。
またポリフェノールは、例えば、茶、ワイン、チョコレート、サボテン、海藻、野菜（たまねぎ（最外部の黄褐色の皮）、アロエ抽出物パセリの葉、白色野菜など）、柑橘類（温州みかん、だいたい、ポンカンの皮、夏みかんの皮、グレープフルーツ、レモンなど）、リンゴなどの果実類、穀物（こうりゃん、大豆、そば、小麦など）、ダリアの花などの種々の食品・植物に多く含まれているので、茶抽出物、海草抽出物、果実抽出物、サボテン抽出物又はワイン抽出物などの抽出物でも良い。例えば茶抽出物は、水、エタノール、酢酸エチルなどの溶剤を用いて茶の葉より抽出することで得られ、エピガロカテキンガレートを最も多く含むカテキン類を主成分とする。また、得られた茶抽出物あるいは市販の茶抽出物から、クロロフィルの除去、さらにカラムクロマトグラフ法による精製をすることによって、高純度のエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を得ることが可能である。
本発明において、ポリリジンとポリフェノールの濃度は、０．００１−１．０重量％（１０〜１００００ｐｐｍ）が好ましい。より好ましい濃度は０．００５〜０．１重量％（５０〜１０００ｐｐｍ）である。さらに好ましくは０．００５〜０．０３重量％（５０〜３００ｐｐｍ）である。また、ポリリジンとポリフェノールの混合割合は、ポリリジン／ポリフェノール＝０．１−９９．１／９９．１−０．１で任意に用いることができる。
本発明においてポリリジンとポリフェノールを安定化させるため、Ｌ−アスコルビン酸および二亜硫酸カリウムが添加されていても良い。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は０．０００１〜０．３重量％（１〜３００ｐｐｍ）である。二亜硫酸カリウムの濃度は０．０００１〜０．３重量％（１〜３００ｐｐｍ）である。
本発明の保存液には、用途に応じて抗酸化剤、安定化剤等の薬剤が適宜添加されても良い。そのような成分として、以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンＥまたはグルタチオン）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類、及び多糖類の化合物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（商標））、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ、商標））またはポリエチレングリコール）；血栓溶解剤；血管拡張剤；組織賦活化剤；カテコラミン；ＰＤＥＩＩ阻害剤；カルシウム拮抗剤；βブロッカー；ステロイド剤；脂肪酸エステル；抗炎症剤；抗アレルギー剤；抗ヒスタミン剤等。
本発明の輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液は、微生物に対して広範な増殖抑制効果や殺菌効果を有しており、また、それらの効果はｐＨに大きな影響を受けず、およそｐＨ４〜９の範囲で使用できる。その点眼液への添加量は、保存液に対して、０．００１〜１０重量％であることが好ましい。本発明の保存液は、抗菌性ポリリジンを含有することから、各種微生物感染の防御に有効であり、また、天然物由来の成分であることから、安全性も高い。本発明の保存液は、特に黄色ブドウ球菌及びその耐性菌（ＭＲＳＡ等）、並びに緑膿菌やマイコプラズマ等に対する抗菌性に優れる。本発明の保存液は、抗菌性ポリリジンやその塩、またはポリフェノールを含有することを特徴とする。
【実施例】以下、本発明を具体的に明らかにするために実施例を示すが、本発明は該実施例の記載により何等の制約も受けるものではない。
実施例１：抗菌試験
ε−ポリ−Ｌ−リジン（チッソ社製、分子量４０００）は２５％水溶液をダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチ製）に２、４、６、１０ｗ／ｗ％となるように添加し、ｐＨは７．０−８．０の範囲になるように１Ｎの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液で中和した。。各サンプルに、滅菌生理食塩水に浮遊させたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１：）をそれぞれ混合し、最終菌濃度（理論値）が１０３、１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌ、最終サンプル濃度が１０００μｇ／ｍｌになるように、シリコン処理したマイクロチューブに取った。そして、３７℃で２時間反応させた後、各サンプルを最終菌濃度を１０３、１０４、ＣＦＵ／ｍｌとしたものはそのまま、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌとしたものは滅菌生理食塩水でそれぞれ１０倍、１００倍希釈してミューラー・ヒントン寒天培地（ミューラー・ヒントン・ブロス：ベクトン・ディッキンソン製、寒天：和光純薬製）に塗抹し、更に３５℃で２４時間培養した後の各サンプルの菌の発育状況を調べた。
本発明の保存液は１．１×１０２〜２．３×１０５ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、ε−ポリ−Ｌ−リジン２％保存液は１．１×１０２〜２．８×１０３ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、ε−ポリ−Ｌ−リジン４％保存液は１．１×１０２〜１．９×１０４ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、１００μｇ／ｍｌで抗菌作用を示した。同様に、１．２×１０３〜６．９×１０５ＣＦＵ／ｍｌの緑膿菌に対しても、本発明のε−ポリ−Ｌ−リジン２、４、６、１０％保存液は、１００μｇ／ｍｌで抗菌作用を示した。
実施例２：
マイコプラズマ（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）の感染したＫＧ１ａ（＋）細胞（抗ＣＤ３４抗体産生細胞）１０６個と１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌとを分取し、これにε−ポリ−Ｌ−リジンとエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を添加した後、炭酸ガス培養器で３日間培養した。培地交換５回目にＫＧ１ａ（＋）細胞の培養後の培地について、マイコテクトキット（大日本製薬製）を用いてマイコプラズマの検査を行なった。その結果、当該培地には、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓは検出されなかった。
実施例３：
黄色ブドウ球菌の感染したＳ−１細胞１０６個と１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌとを分取し、これにε−ポリ−Ｌ−リジンとエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を添加した後、炭酸ガス培養器で３日間培養した。培地交換３回目のＮＳ−１細胞の培養後の培地について、ブドウ球菌の検索を行なった。その結果、当該培地からブドウ球菌の検出は出来なかった。
実施例４：
臍帯血（２０ｍＬ）にポリリジンを各種濃度で添加した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＢ．ｃｅｒｅｕｓの各菌液を２０ｃｆｕ／ｍＬになるように添加し４℃で保存した。添加直後、２日、５日、８日に少量の臍帯血試料をサンプリングし、適宜希釈後にトリプトソイ寒天培地のプレートに塗布し、一晩３７℃にて培養し、コロニー数をカウントした。また、ＥＧＣｇをポリリジンとともに添加した菌液についても同様のスパイク実験を行った。通常の１００％血漿中に浮遊した臍帯血に上記いずれかの細菌を２０ｃｆｕ／ｍＬで２単位血小板に添加するスパイク実験を行い、その際事前にポリリジンを各種濃度で添加後に２２℃にて振盪保存し、１、２、５、８日目の生菌数を測定した。ポリリジン非添加群では、両細菌とも急速な増殖を認めた。一方、ポリリジン２００μｇ／ｍＬ、およびポリリジン５０μｇ／ｍＬ添加系にて、両細菌の生菌数は８日目まで０ｃｆｕ／ｍＬとなり、ポリリジンの有効性が認められた。
実施例５：ラットを用いる安全性試験
ラット（体重約３００ｇ）をエチルエーテル及びネンブタールにて麻酔した後、尾静脈よりポリリジンまたは生理食塩液を適宜投与した。投与量は、ヒト（体重５０ｋｇ）にポリリジン５０μｇ／ｍＬを含む血小板製剤２０単位（最大容量の３００ｍＬ）を投与する場合の体重ｋｇ当たりのポリリジン濃度を基準として、体重ｋｇ当たりその２〜１０倍量でラットにポリリジン単体を週に１〜３回静脈注射した。その後、餌摂取量、体重変化及び外観状態を調べた。その結果、餌摂取量及び体重変化においては、両群間に顕著な差異は認められず、外観状態においても特に異常は認められなかった。