(57)【要約】      （修正有）【課題】天然の動植物、微生物等の体内に含まれる化学物質として見出されたもののうち人体に有用な効果をもたらす新規な化学物質、およびそれを用いた薬剤の提供。【解決手段】マメ科植物Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ｓｕｃｃｉｒｕｂｒｕｍから新規化学物質エリストフレシンＡ（下記化学式で提示）、Ｂ、ＣおよびＤを有機溶媒による抽出単離し、これらの有する細胞増殖阻害作用を癌治療薬として利用したこれらを有効成分とした薬剤。2010254638.tif 000034【選択図】図１
2010254638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で示されるエリスロフレシンＡ。
【化１】
2010254638.tif 000026
【請求項２】
下記式で示されるエリスロフレシンＢ。
【化２】
2010254638.tif 000027
【請求項３】
下記式で示されるエリスロフレシンＣ。
【化３】
2010254638.tif 000028
【請求項４】
下記式で示されるエリスロフレシンＤ。
【化４】
2010254638.tif 000029
【請求項５】
下記式で示されるエリスロフレシンＡ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化５】
2010254638.tif 000030
【請求項６】
下記式で示されるエリスロフレシンＢ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化６】
2010254638.tif 000031
【請求項７】
下記式で示されるエリスロフレシンＣ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化７】
2010254638.tif 000032
【請求項８】
下記式で示されるエリスロフレシンＤ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化８】
2010254638.tif 000033
【請求項９】
癌の治療薬である請求項４、５、６又は７記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物であるエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに関し、更には、これらを用いた薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の我々の生活において、天然の動植物、微生物等の体内に含まれる化学物質（以下「天然物」という。）として見出されたもののうち人体に有用な効果をもたらすものは生薬、医薬品の有効成分として使用されている。また、このようなものは更に有用な医薬品を開発するための研究材料としても様々な役割を有しており、非常に重要なものとなっている。
【０００３】
このように、人体に有益な効果をもたらす天然物の探索に関する報告としては、例えば下記非特許文献１に、変形菌からビスインドール化合物、ナフトキノン化合物、グリセリド化合物等を抽出した報告がある。
【０００４】
【非特許文献１】石橋正己、“未利用菌類の資源化：変形菌からの天然物探索”、有機合成化学協会誌、２００３年、第６１巻、第２号、１５２〜１６３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら一方で、天然物の探索が多数の者によって行なわれているにもかかわらず、探索の材料として検討、調査されたものは、地球上の全生物種の中で１０％にも満たないといわれている。
【０００６】
本発明は、新規な化学物質を資源として提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一手段に係るエリスロフレシンＡは、下記式で示される。
【化１】
2010254638.tif 000003
【０００８】
また、本発明の他の一手段に係るエリスロフレシンＢは、下記式で示される。
【化２】
2010254638.tif 000004
【０００９】
また、本発明の他の一手段に係るエリスロフレシンＣは、下記式で示される。
【化３】
2010254638.tif 000005
【００１０】
また、本発明の他の一手段に係るエリスロフレシンＤは、下記式で示される。
【化４】
2010254638.tif 000006
【００１１】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるエリスロフレシンＡ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化５】
2010254638.tif 000007
【００１２】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるエリスロフレシンＢ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化６】
2010254638.tif 000008
【００１３】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるエリスロフレシンＣ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化７】
2010254638.tif 000009
【００１４】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるエリスロフレシンＤ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化８】
2010254638.tif 000010
【００１５】
なお、上記の薬剤は、限定されるわけではないが、癌の治療薬として有用であることが期待される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、新規な化学物質を資源として提供することができる。特に、本発明に係る化学物質は、癌細胞に対し細胞増殖抑制作用を発揮するため、例えば癌の治療薬として利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態についての記載にのみ狭く解釈されるものではない。
【００１８】
本発明の一形態に係るエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、下記にそれぞれ示される。
【化９】
2010254638.tif 000011
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
2010254638.tif 000014
【００１９】
本実施形態に係るエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、後述の実施例から明らかなように、マメ科植物Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ｓｕｃｃｉｒｕｂｒｕｍから抽出することができるが、これに限定されず、合成することが可能である。
【００２０】
本実施形態に係るエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、癌細胞に対し細胞増殖抑制作用を発揮するため、薬剤、例えば癌の治療薬として利用が期待される。なおエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを癌の治療薬として利用する場合、エリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにこれらの塩のうち少なくともいずれかを有効成分として含有しておくことが好ましい。
【００２１】
また、本実施形態に係る癌の治療薬は、上記エリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにこれらの塩のうち少なくともいずれかの他、薬学的に許容しうる通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝剤（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を含有させることができる。
【００２２】
またこの癌の治療薬は、患者の性別、体重、症状に見合った適切な投与量を経口的又は非経口的に投与することができる。経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。また、非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを直接患部に投与する方法、注射等により投与する形態を採用することができる。
【実施例】
【００２３】
本実施例では、マメ科植物Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ｓｕｃｃｉｒｕｂｒｕｍからエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを抽出し、検討した結果を示す。図１に、エリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの単離についてのスキームの概略を示しておく。
【００２４】
まず、マメ科植物Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ｓｕｃｃｉｒｕｂｒｕｍの葉部１９．３ｇを、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ブタノールを用いて溶媒分配を行い、各可溶部を得た。
【００２５】
上記可溶部のうち、得られた酢酸エチル可溶部について、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ＰＳＱ  １００Ｂを担体とするカラム（φ３６×２２０ｍｍ）に付し、クロロホルム、メタノールを用いて溶出し、溶出順に１Ａから１Ｎの各画分を得た。また、上記溶出した１Ｍと１Ｎを併せて、得られたフラクションについてＣｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳを担体とするカラム（φ２８×４００ｍｍ）に付し、フラクション２Ａから２Ｎを得た。このうちのフラクション２Ｇのメタノール可溶部を、下記表１に示すＨＰＬＣ条件（１）を用いてＨＰＬＣによる分画を行い、エリスロフレシンＡ（１１．５ｍｇ）、Ｂ（２．１ｍｇ）、Ｃ（７．３ｍｇ）及びＤ（０．９ｍｇ）をそれぞれ単離した。
【表１】
2010254638.tif 000015
【００２６】
（エリスロフレシンＡ）
エリスロフレシンＡは白色非結晶固体として単離された。エリスロフレシンＡに対してＦＡＢＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を行い、［Ｍ＋Ｈ］＋と推測されるｍ／ｚ７１１のピーク、［Ｍ＋Ｎａ］＋と推測されるｍ／ｚ７３３のピーク、［Ｍ＋Ｋ］＋と推測されるｍ／ｚ７４９のピーク、をそれぞれ観測した。また、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＤＥＰＴにより、分子式をＣ４１Ｈ５８Ｏ１０と決定した。
【００２７】
また、エリスロフレシンＡに対して赤外吸収測定（以下「ＩＲ測定」という。）を行い、赤外吸収スペクトル（以下「ＩＲスペクトル」という。）を得た。この結果、３４４９、１７０９ｃｍ−１、１６４５ｃｍ−１にそれぞれ吸収をそれぞれ観測した。
【００２８】
また、エリスロフレシンＡに対して紫外吸収測定（以下「ＵＶ測定」という。）を行い、紫外吸収スペクトル（以下「ＵＶスペクトル」という。）を得た。この紫外吸収測定は、メタノールを溶媒として、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果、２２３ｎｍに吸収ピークを有しており、共役二重結合化合物であることが推定できた。
【００２９】
また、エリスロフレシンＡに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は−９８．３度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表２に、旋光角、ＦＡＢＭＳ、ＨＲＦＡＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表２】
2010254638.tif 000016
【００３０】
また、エリスロフレシンＡに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果を表３に示す。１Ｈ  ＮＭＲでは６個のメチル基由来のシグナル、２個のメトキシ基由来のシグナルが観測された。また、２Ｈ分のオレフィンプロトンシグナル及び３本のオキシメチンのシグナルも観測された。また、１３Ｃ  ＮＭＲでは６個のメチル基に由来する炭素シグナル、２個のメトキシ基に由来する炭素シグナル、及び５個のカルボニル基に由来する炭素シグナルが観測された。また１３Ｃ  ＮＭＲでは４１個の炭素シグナルが観測されたこと、及び１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルにおいて多くのシグナルがペアとして観測されたことから、本化合物はジテルペンの二量体構造を有することが示唆された。なお、エリスロフレシンＡの１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの結果について下記表３に示しておく。
【表３】
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【００３１】
また、エリスロフレシンＡに対し、ＣＯＳＹスペクトル、ＨＭＱＣスペクトル等の二次元ＮＭＲスペクトルを用い、各プロトンシグナル及び各炭素シグナルを帰属した。更にＨＭＢＣスペクトルの解析により、本化合物はｃａｓｓａｉｎｅ型ジテルペンであるｃａｓｓｉｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ及びノルジテルペンＮｏｒｅｒｙｔｈｒｏｆｏｒｄｉｎ  Ａのメチルエステルを分子内に有することが判明した。さらに、ｎｏｒｅｒｙｔｈｒｏｆｏｒｄｉｎ  Ａのメチルエステルの３’位からＣａｓｓｉｍｉｃ  ａｓｉｄの１６位にＨＭＢＣ相関が観測された。以上の結果より、本化合物の平面構造は、下記化学式に示すようＮｏｒｅｒｙｔｈｒｏｆｏｒｄｉｎ  Ａのメチルエステル体とＣａｓｓｉｍｉｃ  ａｃｉｄがエステル結合した新規ジテルペン二量体であることが明らかとなった。本化合物の立体化学については、各種のＮＯＥ実験及び化学シフト、結合定数の文献値との比較により、ｃａｓｓｉｍｉｃ  ａｃｉｄ及びｎｏｒｅｒｙｔｈｒｏｆｏｒｄｉｎ  Ａと同一の立体配置を有すると推定した。
【化１３】
2010254638.tif 000018
【００３２】
以上、エリスロフレシンＡの構造を上記式で示すように決定した。
【００３３】
（エリスロフレシンＢ）     
エリスロフレシンＢは白色非結晶固体として単離された。エリスロフレシンＢに対してＦＡＢＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を行い、［Ｍ＋Ｈ］＋と推測されるｍ／ｚ７６９のピークを、［Ｍ＋Ｎａ］＋と推測されるｍ／ｚ７９１のピークを観測し、更に１３Ｃ  ＮＭＲ及びＤＥＰＴより分子式をＣ４３Ｈ６０Ｏ１２と決定した。
【００３４】
また、エリスロフレシンＢに対してＩＲ測定を行い、ＩＲスペクトルを得た。この結果は非常に上記エリスロフレシンＡに類似しており、３４６３、１７１７、１６４６ｃｍ−１にそれぞれ吸収をそれぞれ観測した。
【００３５】
また、エリスロフレシンＢに対してＵＶ測定を行い、ＵＶスペクトルを得た。このＵＶ測定は、メタノールを溶媒として、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果は上記エリスロフレシンＡに類似していた。すなわち２２２ｎｍに吸収ピークを有しており、共役二重結合化合物であることが推定できた。
【００３６】
また、エリスロフレシンＢに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は−１１１．３度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表４に、旋光角、高分解ＦＡＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表４】
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【００３７】
また、エリスロフレシンＢに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果は上記表３に示された通りである。１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定により、エリスロフレシンＢはエリスロフレシンＡとよく類似していることがわかり、本化合物はエリスロフレシンＡと同様、ｃａｓｓａｉｎｅ型ジテルペンの二量体構造を有することが示唆された。ただし、１Ｈ  ＮＭＲにおいて、新たに１個のメトキシ基に由来するシグナルが観測された。また１３Ｃ  ＮＭＲにおいて新たに１個のメトキシ基に由来する炭素シグナル、１個のカルボキシル基に由来する炭素シグナルがそれぞれ観測された。これらの結果及びエリスロフレシンＡとエリスロフレシンＢの分子量の差が５８であることを考慮すると、新たに観測されたシグナルは、１個のメトキシカルボニル基に由来するものと考えられた。各種二次元ＮＭＲの詳細な解析を行い、特にＨＭＢＣスペクトルにおいて３’位及び５’位のプロトンから１９のカルボニル炭素への相関が観測され、更にメトキシ基に由来するプロトン（２１’位）からも１９’位のカルボニル炭素への相関が観測され、更にメトキシ基に由来するプロトン（２１’位）からも１９’位カルボニル炭素への相関が観測されたことから、メトキシカルボニル基は、４’位に結合していることが判明した。以上の結果より、エリスロフレシンＢの構造を下記式で示すように決定した。
【化１４】
2010254638.tif 000020
【００３８】
（エリスロフレシンＣ）
エリスロフレシンＣは白色非結晶固体として単離された。エリスロフレシンＣに対してＦＡＢＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を行い、［Ｍ＋Ｈ］＋と推測されるｍ／ｚ７５４のピークを、［Ｍ＋Ｎａ］＋と推測されるｍ／ｚ７７６のピークを、［Ｍ＋Ｋ］＋と推測されるｍ／ｚ７９２のピークを、それぞれ観測した。分子量が７５３であることから、エリスロフレシンＣは、分子内に窒素原子を含むことが示唆された。また、ＭＳデータ、１３Ｃ  ＮＭＲ及びＤＥＰＴより本化合物の分子式をＣ４３Ｈ６３ＮＯ１０と決定した。
【００３９】
また、エリスロフレシンＣに対してＩＲ測定を行い、ＩＲスペクトルを得た。この結果、３４４８、１７１４ｃｍ−１に吸収を観測した。
【００４０】
また、フザニンＣに対しＵＶ測定を行い、ＵＶスペクトルを得た。この紫外吸収測定は、メタノールを溶媒として、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果、２０４ｎｍに吸収ピークを有しており、芳香族化合物又は共役二重結合化合物であることが推定できた。
【００４１】
また、エリスロフレシンＣに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は−７３．１度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表５に、旋光角、高分解ＦＡＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表５】
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【００４２】
また、エリスロフレシンＣに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果を表６に示しておく。
【表６】
2010254638.tif 000022
【００４３】
１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルは、いずれもエリスロフレシンＡに類似していたことから、本化合物はエリスロフレシンＡと同様にｃａｓｓａｉｎｅ型ジテルペンとノルｃａｓｓａｉｎｅ型ジテルペンの二量体構造を有することが示唆された。しかし、エリスロフレシンＡの１Ｈ  ＮＭＲでは構成するモノマーであるｎｏｒｅｒｙｔｈｒｏｆｏｒｄｉｎ  Ａのメチルエステルのメトキシ基が観測されたのに対して、エリスロフレシンＣの１Ｈ  ＮＭＲでは観測されず、その代りに窒素に隣接したメチルプロトン、窒素に隣接したメチレンプロトン、及びオキシメチレンプロトンのシグナルが新たに観測された。また、１３Ｃ  ＮＭＲにおいても窒素に隣接したメチル基、窒素が隣接したメチレン、及びオキシメチレンに由来する炭素シグナルがそれぞれ観測された。更に、ＣＯＳＹスペクトルにおいて、窒素に隣接したメチレンプロトンとオキシメチレンプロトンに相関が観測されたこと、またｈＨＭＢＣスペクトルにおいて窒素に隣接したメチルプロトン及び窒素が隣接したメチレンプロトンから１６’位のカルボニル炭素への相関が観測されたことより、エリスロフレシンＣでは１６’位に（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ（ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）基が結合していることが判明した。
【００４４】
以上の結果より、エリスロフレシンＣの構造を下記式で示すように決定した。
【化１５】
2010254638.tif 000023
【００４５】
（エリスロフレシンＤ）
エリスロフレシンＤも白色非結晶固体として単離された。エリスロフレシンＤに対してＦＡＢＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を行い、［Ｍ＋Ｈ］＋と推測されるｍ／ｚ８１２のピークを、［Ｍ＋Ｎａ］＋と推測されるｍ／ｚ８３４のピークを、それぞれ観測した。この結果、分子式をＣ４５Ｈ６５ＮＯ１２と決定した。
【００４６】
また、エリスロフレシンＤに対してＩＲ測定を行った。この結果、３５４５、１７１６ｃｍ−１、に吸収ピークを観測した。
【００４７】
また、エリスロフレシンＤに対しＵＶ測定を行い、ＵＶスペクトルを得た。この紫外吸収測定は、メタノールを溶媒として、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果、２１８ｎｍ、に吸収ピークを有しており、芳香族化合物又は共役二重結合化合物であることが推定できた。
【００４８】
また、エリスロフレシンＤに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は−５４．９度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表７に、旋光角、ＨＲＥＩＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表７】
2010254638.tif 000024
【００４９】
また、エリスロフレシンＤに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果は上記表６に示されている。１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルを比較したところ１’から１１’位及び１８’から２１’位まではエリスロフレシンＢとよく類似し、１２’から１７’位及び２２’から２４’位まではエリスロフレシンＣとよく類似していた。これよりエリスロフレシンＤは、４’位にメチルエステルを有し、１６’位に（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）（ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ基が結合した構造を有することが判明した。
以上の結果より、エリスロフレシンＤの構造を下記式で示すように決定した。
【化１６】
2010254638.tif 000025
【００５０】
（細胞増殖阻害活性）
次に、上記単離したエリスロフレシンＡ、Ｂ及びＣについて、ヒト胃がん細胞株ＡＧＳに対するＴＲＡＩＬ耐性克服作用を検討した。この結果を図２乃至図４に示す。この結果、エリスロフレシンＡ、Ｂ、ＣはＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）との併用処理により優位に細胞生存率の低下を示した。従ってこれらの化合物はＴＲＡＩＬ耐性克服作用を有することを確認した。特にエリスロフレシンＡ、Ｃは、１０μｇ／ｍＬの濃度でこれらの化合物の単独処理に比べて、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）併用処理により各々３６％及び３７％細胞生存率を低下させることができることを確認した。念のためエリスロフレシンＡ、Ｂ及びＣに関する細胞生存率に関する結果を図５に示しておく。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は新規化合物を有効成分とし、薬剤として産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例におけるエリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの単離スキームの概略を示す図である。
【図２】エリスロフレシンＡのＴＲＡＩＬ耐性克服作用を示す図である。
【図３】エリスロフレシンＢのＴＲＡＩＬ耐性克服作用を示す図である。
【図４】エリスロフレシンＣのＴＲＡＩＬ耐性克服作用を示す図である。
【図５】エリスロフレシンＡ、Ｂ、Ｃの細胞生存率に関する結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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