(57)【要約】      （修正有）【課題】線虫を用いた効率的で安価なタンパク質生産系を提供する。【解決手段】(1)生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターとしてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子プロモーターやUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子を導入したトランスジェニック線虫を培養し、増殖させるステップ；(2)増殖した線虫における、外来遺伝子の発現を誘導するステップ；及び(3)外来遺伝子の発現産物であるタンパク質（ヒトインスリンーGST融合蛋白質）を回収するステップを行い、目的タンパク質を取得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ(1)〜(3)を含む、タンパク質の生産方法：
(1)生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子が導入された線虫を培養し、増殖させるステップ；
(2)増殖した線虫における、前記外来遺伝子の発現を誘導するステップ；
(3)前記外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を回収するステップ。
【請求項２】
前記生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子プロモーターである、請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記GST遺伝子プロモーターがGST-4遺伝子プロモーターである、請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
前記生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターがUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGP）遺伝子プロモーターである、請求項１に記載の生産方法。
【請求項５】
前記UGP遺伝子プロモーターがUGP-13遺伝子プロモーターである、請求項４に記載の生産方法。
【請求項６】
前記外来遺伝子にタグ配列が連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項７】
GST遺伝子からなるタグ配列が前記外来遺伝子の5'側に連結されている、請求項２又は３に記載の生産方法。
【請求項８】
UGT遺伝子からなるタグ配列が前記外来遺伝子の5'側に連結されている、請求項４又は５に記載の生産方法。
【請求項９】
前記外来遺伝子と前記タグ配列との間に、酵素切断配列をコードする配列が存在する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１０】
前記酵素切断配列が、Factor Xa認識配列である、請求項９に記載の生産方法。
【請求項１１】
ステップ(2)の誘導が、誘導物質を培地に添加すること又は誘導物質を添加した培地に切り替えること、によって行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１２】
前記誘導物質が生体異物代謝酵素の誘導物である、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１３】
誘導物質がアクリルアミドである、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１４】
前記誘導物質がアリルイソチオシアネート（AITC）である、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１５】
前記線虫が土壌自由生活線虫である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１６】
前記線虫が雌雄同体の生殖様式である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１７】
前記線虫がＣ．エレガンス（Caenorhabditis elegans）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質生産系に関する。詳しくは、線虫を用いて所望のタンパク質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線虫類は、あらゆる生態系に適応した動物であるといわれる。多くの土壌線虫は（１）雌雄同体であること（遺伝的同一性を得やすい）、（２）世代交代及び寿命が短いこと、（３）小さく扱いやすいこと、（４）長期間に亘り生きたまま凍結保存可能であること、（５）体細胞数が少ないこと、（６）３胚葉真正後生動物（ヒトと同じ）であること、（７）簡単な体構造でありながら組織・器官が充実していること、（８）ヒトに近い遺伝子数を有すること、（９）一生を通じて透明であること、などの特性を有し、これまでにモデル生物として様々な研究に利用されてきた。線虫類の研究から発展し、現在は一般常識となっている生命現象としてアポトーシスやRNAiがある。また、線虫類の研究を基礎として寿命のメカニズムや感染症・肥満・寿命の相互の関係などが解明されることが期待されている。線虫類の研究はまた、様々な生物学的又は遺伝子工学的手法の開発にも多大な貢献をしてきた。
【０００３】
ところで、線虫類は動物界で最も種類が多く、極地、砂漠、灼熱の海域を含む地球上のほとんど全てを住空間としている。従って、極めて広範な種類のタンパク質を生産していると考えられる。このような特徴を有する線虫類はタンパク質生産系として有望である。実際、線虫（C. elegans）を利用したタンパク質生産系が報告されている（例えば特許文献１）。特許文献１に開示されたタンパク質生産系は温度応答性プロモーターを利用しており、線虫に対して熱ショックを与えると外来遺伝子の発現が誘導され、目的タンパク質が生産される。当該生産系の場合、目的タンパク質を生産させるためには線虫に熱ショックを与える必要がある。熱ショックは線虫にダメージを与え、その生存、増殖に多大な悪影響を及ぼす。従って、決して効率的な生産系とはいえない（特に、継続的ないし連続的な生産には向かない）。
【特許文献１】特表２００５−５１０２４３号公報
【特許文献２】特開２００８−０２９２２０号公報
【非特許文献１】Hasegawa, K., Miwa, S., Isomura, K., Tsutsumiuchi, K., Taniguchi, H. and Miwa, J. (2008) Acrylamide-resonsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicological Sciences 101, 215-225.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記背景の下で本発明は、線虫を用いた効率的なタンパク質生産系を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ねた。その中で、アクリルアミド等に応答性の遺伝子である生体異物代謝酵素遺伝子（非特許文献１）に注目した。そして、以下の(1)〜(3)のステップ、即ち(1)生体異物代謝酵素遺伝子（特にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子プロモーター又はUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター）の制御下にある外来遺伝子が導入された線虫を培養し、増殖させるステップ、(2)増殖した線虫における、前記外来遺伝子の発現を誘導するステップ、及び(3)前記外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を回収するステップを実施して目的タンパク質を生産するという生産系を創出した。当該生産系によれば、少量のアクリルアミドなどを添加することによって外来遺伝子の発現を誘導できる。従って、任意の時期に且つ生存や増殖に大きな影響を及ぼすことなく、線虫に目的タンパク質を生産させることができる。従って、遺伝子操作（GSTなどの遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子の導入）をした線虫を増殖させた後に発現誘導すれば、一度に大量の目的タンパク質を生産させることが可能である。このように、当該生産系によれば効率的に大量の目的タンパク質を得ることができる。尚、後述の実施例に示す通り、GFP（緑色蛍光タンパク質）とヒトインスリンを目的タンパク質として実験を行った結果、当該生産系の有用性が確認された。
以下、本願が提供する発明を列挙する。
［１］以下のステップ(1)〜(3)を含む、タンパク質の生産方法：
(1)生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子が導入された線虫を培養し、増殖させるステップ；
(2)増殖した線虫における、前記外来遺伝子の発現を誘導するステップ；
(3)前記外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を回収するステップ。
［２］前記生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子プロモーターである、［１］に記載の生産方法。
［３］前記GST遺伝子プロモーターがGST-4遺伝子プロモーターである、［２］に記載の生産方法。
［４］前記生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターがUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGP）遺伝子プロモーターである、［１］に記載の生産方法。
［５］前記UGP遺伝子プロモーターがUGP-13遺伝子プロモーターである、［４］に記載の生産方法。
［６］前記外来遺伝子にタグ配列が連結されている、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の生産方法。
［７］GST遺伝子からなるタグ配列が前記外来遺伝子の5'側に連結されている、［２］又は［３］に記載の生産方法。
［８］UGT遺伝子からなるタグ配列が前記外来遺伝子の5'側に連結されている、［４］又は［５］に記載の生産方法。
［９］前記外来遺伝子と前記タグ配列との間に、酵素切断配列をコードする配列が存在する、［６］〜［８］のいずれか一項に記載の生産方法。
［１０］前記酵素切断配列が、Factor Xa認識配列である、［９］に記載の生産方法。
［１１］ステップ(2)の誘導が、誘導物質を培地に添加すること又は誘導物質を添加した培地に切り替えること、によって行われる、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の生産方法。
［１２］前記誘導物質が生体異物代謝酵素の誘導物である、［１１］に記載の生産方法。
［１３］誘導物質がアクリルアミドである、［１１］に記載の生産方法。
［１４］前記誘導物質がアリルイソチオシアネート（AITC）である、［１１］に記載の生産方法。
［１５］前記線虫が土壌自由生活線虫である、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の生産方法。
［１６］前記線虫が雌雄同体の生殖様式である、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の生産方法。
［１７］前記線虫がＣ．エレガンス（Caenorhabditis elegans）である、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の生産方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は線虫を利用してタンパク質を生産する方法に関する。本発明の生産方法は以下のステップ(1)〜(3)を含む。
(1)生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子が導入された線虫を培養し、増殖させるステップ
(2)増殖した線虫における、前記外来遺伝子の発現を誘導するステップ。
(3)前記外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を回収するステップ。
【０００７】
１．ステップ(1)・・組換え線虫の培養
ステップ(1)では、生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子が導入された線虫を用意し、それを培養に供する。生体異物代謝酵素とは、線虫に対して異物の物質の代謝に関与する酵素であり、薬物代謝酵素或いは一般的には解毒代謝酵素とも呼ばれる。好ましくは、生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターとして、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子プロモーター（以下、「GST遺伝子プロモーター」という）を用いる。「GST遺伝子プロモーター」とは、GST遺伝子の転写を調節する機能領域である。GST遺伝子プロモーターとして、GST-30遺伝子のプロモーター（配列の一例を配列番号１に示す）、GST-4遺伝子のプロモーター（配列の一例を配列番号２に示す）、GST-7遺伝子のプロモーター（配列の一例を配列番号３に示す）などを用いることができる。GST遺伝子プロモーターはアクリルアミド等に対して良好な応答性を示す（上掲の特許文献２（特開２００８−０２９２２０号公報））。このような特徴のGST遺伝子プロモーターを利用することによって、応答性に優れたタンパク質生産系となる。生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターとしてUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGP）遺伝子プロモーターを用いることもできる。（以下、「UGP遺伝子プロモーター」という）。「GST遺伝子プロモーター」とは、UGT遺伝子の転写を調節する機能領域である。UGP遺伝子プロモーターの例としてUGP-13遺伝子のプロモーター（配列番号４）を用いることができる。
【０００８】
本明細書において「生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子」とは、外来遺伝子の発現状態が当該プロモーターによって制御されている状態をいい、「外来遺伝子が生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターに作動可能に連結している」と同義である。通常、プロモーターの3'下流に同一の方向性で外来遺伝子が連結される。プロモーターと外来遺伝子の間に他の配列が介在していてもよいが、プロモーターによる適切且つ良好な制御のために両者を近接して配置するのが通常である。
【０００９】
本明細書において「外来遺伝子」とは、本発明の方法によって生産するタンパク質（「目的タンパク質」と呼ぶ）をコードする遺伝子のことをいう。線虫が本来的に保有する遺伝子（内在性遺伝子）と区別するために当該呼称を用いる。尚、目的タンパク質の例は、医薬や食品等の成分として有用なタンパク質（例えばインターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、抗体卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト成長ホルモン、各種サイトカイン）、試薬として有用なタンパク質（例えば各種酵素）である。
【００１０】
生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子の線虫への導入には核酸コンストラクトを利用する。生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下に外来遺伝子が配置されるように核酸コンストラクトを構築する。ここでの核酸はDNA又はRNAである。好ましくは二本鎖DNAからなる核酸コンストラクトが構築される。核酸コンストラクトの形態は特に限定されず、線虫染色体内への外来遺伝子の組み込みを可能とする形態であっても、導入後にそれ自体が線虫染色体外因子として存在する形態であってもよい。
【００１１】
通常は、生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターの制御下にある外来遺伝子を含む発現ベクターが用いられる。「発現ベクター」とは、それが含む外来遺伝子を細胞等のターゲット内へと輸送し、発現させることが可能な核酸性分子をいう。様々な種類の発現ベクターを利用可能である。発現ベクターの種類の例を挙げれば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、YACベクター、BACベクター、ウイルスベクター、リポソームベクター、正電荷型リポソームベクター（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan)-リポソーム（Dzau, V.J., Mann, M., Morishita, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:11421-11425, 1996、Kaneda, Y., Saeki, Y. & Morishita, R., Molecular Med. Today, 5:298-303, 1999）である。
【００１２】
発現ベクター内にポリＡ付加シグナル配列、ポリＡ配列、エンハンサー配列、選択マーカー配列等を配置することもできる。ポリＡ付加シグナル配列又はポリＡ配列の使用によって、発現ベクターから生ずるmRNAの安定性が向上する。ポリＡ付加シグナル配列又はポリＡ配列は下流側において外来遺伝子に連結される。一方、エンハンサー配列の使用によって発現効率の向上が図られる。また、選択マーカー配列を含有する発現ベクターを使用すれば、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及び導入率）を確認することができる。
【００１３】
組換え操作（外来遺伝子、プロモーター、選択マーカー遺伝子等のベクターへの挿入等）には、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた方法等、標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を利用することができる。
【００１４】
例えば、市販のプラスミドのクローニングサイトに、生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターと外来遺伝子を挿入することによって、本発明に使用する核酸コンストラクトを容易に構築することができる。市販のプラスミドとしてpGEM-T (Promega)、pDONR221 (Invitrogen)、pUC18/19 (Takara)等を利用することができる。
【００１５】
以上の核酸コンストラクトを線虫に導入して形質転換線虫体を得る。導入法としてはマイクロインジェクション法が一般的であるが、遺伝子銃を用いた方法（Praitis, V. et al.: Genetics, 157:1217-1226, 2001）やエレクトロポレーション（electroporation）法を採用することもできる。
【００１６】
本発明の一態様では、タグ配列が連結された外来遺伝子を含む核酸コンストラクトを用いる。外来遺伝子の5'側又は3'側にタグ配列が連結される。前者の場合、生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターと外来遺伝子の間にタグ配列が介在することになる。タグ配列が連結された外来遺伝子を含む核酸コンストラクトを用いると、後述のステップ(2)において、タグと目的タンパク質が融合したもの（融合タンパク質）が生産される。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。タグ配列としてGSTタグ（GST遺伝子）、ヒスチジンタグ（（His）6）、FLAGタグ等を用いることができる。
【００１７】
タグ配列を利用する場合には、タグ配列と外来遺伝子の間に酵素認識配列をコードする配列（酵素切断部位を形成するための配列）を挿入しておくことが好ましい。生産された融合タンパク質からタグ部分を切断・除去できるようにするためである。酵素認識配列の一例はFactor Xa認識配列（Ile-Glu-Gly-Arg（配列番号５）であるが、これに限定されるものではない。その他のタグ配列として、Thrombin認識配列（P4-P3-Pro-Arg/Lys-P1-P2：P1とP2は非酸性アミノ酸、P3とP4は疎水性アミノ酸）、PreScission認識配列（Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro（配列番号６））等を利用することも可能である。
【００１８】
線虫として、C.エレガンス（Caenorhabditis elegans）に代表される自由生活性（自活性）土壌線虫、なかでも雌雄同体線虫を用いることが好ましい。雌雄同体型自由生活性（自活性）土壌線虫の中でも、入手が容易である、全ゲノムが解読されている、飼育が容易、固形培地培養でも液体培養でも可能、大量培養が可能、凍結保存が可能、経済的、統計処理に有利等からC.エレガンスを用いることが好ましい。具体的には例えばC.エレガンスのN2株（Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, 6-160 Jackson Hall, 321 Church Street S.E., Minneapolis, MN 55455）などを使用することができる。C.エレガンスの種類、特性、取り扱い方などについては、W.B. WoodらによるThe nematde Caenorhabditis elegans, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)、D.L. RiddleらによるC. ELEGANS II, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)、H. Epstein及びD. ShakesによるCaenorhabditis elegans, Modern Biological analysis of an organism, Methods in Cell Biology, Vol 48, 1995、http://www.wormbase.org/を参照することができる。
【００１９】
以下、遺伝子導入からトランスジェニック体（形質転換体）の取得までの操作の一例を説明する。まず、核酸コンストラクトを線虫（親世代F0）の生殖巣にマイクロインジェクション法で導入する。そして、第１世代（F1）の中から、適切に遺伝子導入された形質転換体を選択する。選択マーカーを利用することによって、ここでの選択操作を容易に行うことができる。選択マーカーとしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子などを利用することができるが、rol-6遺伝子（Mol. Cell. Biol. 10, 2081(1990)）などの、それが導入されたことが線虫の肉眼観察によって容易に把握できるものを利用することが好ましい。例えば、rol-6遺伝子を含むDNAコンストラクトを用意し、これを上記の核酸コンストラクトと同時に線虫に導入し、rol-6遺伝子の発現を指標として形質転換体を選択する。rol-6は体表のクチクラを構成するコラーゲンの一種をコードする遺伝子であり、その優性変異遺伝子su1006をもつ個体はクチクラ構造が体軸に沿って螺旋状に形成される。そのため前進あるいは後退の際には体が体軸を中心に回転し、弧を描くような運動すなわちローラー（roller）表現型を示す。形質転換体は導入操作を受けた雌雄同体から生まれる第一世代（F1）中のローラー個体として検出される。一方、線虫の形質転換体を得る選択マーカーとしてunc-119遺伝子(Gene 183, 77-85 (1996))の欠損変異体を用いることができる。unc-119遺伝子は運動能に必須の遺伝子であり、それを欠損する線虫では運動能が障害される。野生型のunc-119遺伝子を獲得することで運動能が回復する。unc-119遺伝子を用いることで、形質変換体を容易に作製することができる。
【００２０】
線虫の場合、生殖巣に導入された核酸コンストラクトは通常、多数結合した大きな分子となり、比較的高い確率で次世代へと引き継がれていく。つまり、F1のみならず次世代（F2等）であっても、導入された核酸コンストラクトを保持するものが現れる。そこで、導入された核酸コンストラクトを保持する限り、F1のみならずF2等の次世代の線虫を本発明の生産方法に使用することが可能である。
【００２１】
線虫の培養は常法に従えばよい。培地にはNGM（Nematode Growth Medium）培地、LB（Luria Bertani）培地（Becton Dickinson社等）、T（Trypton）培地（Becton Dickinso社等）、SLB培地（LB培地の標準量×10に、スープ用固形ビーフブイヨンを付加したもの）等を用いることができる。固形培地に限らず、液体培地（例えば、SLB培地（=LB培地×10倍））を用いることもできる。餌としては大腸菌（K10株やK12株、あるいはW3110株など）を好適に用いることができる。培養温度は例えば15℃〜25℃である。培養時間は特に限定されない。培養時間の例を挙げれば、12時間〜7日である。線虫の培養は適当な容器内で行うことができる。容器の例として培養皿（例えば、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、９ cmシャーレ）、三角フラスコ、数十〜数千リットルの培養タンクを挙げることができる。
【００２２】
２．ステップ(2)・・発現誘導
ステップ(2)では、増殖した線虫（形質変換体）における外来遺伝子の発現を誘導する。これによって、外来遺伝子の発現産物であるタンパク質の産生が開始される。発現誘導は、例えば誘導物質（生体異物代謝酵素遺伝子プロモーターを直接あるいは間接的に作動ないし活性化させる物質）を線虫が増殖中の培地に添加することによって行えばよい。あるいは、誘導物質を含む培地に切り替えることによっても外来遺伝子の発現を誘導することができる。培地を切り替えるには、例えば、増殖した線虫を回収した後、誘導物質を含む培地へ播種すればよい。
【００２３】
誘導物質の例はアクリルアミド、アリルイソチアシアネート、クロロプロパノール類、メチル水銀、パラコートであるが、これらに限定されるものではない。２種類以上の誘導物質を併用してもよい。好ましくは誘導能が強く比較的毒性のないアクリルアミドを採用する。GST遺伝子プロモーターはアクリルアミドに対して極めて高い応答性を示す。従って、アクリルアミドを誘導物質として用いれば、線虫の生存や増殖に実質的な影響を与えない少量の使用によって外来遺伝子を高発現させることができる。この特徴は連続的又は継続的に発現誘導できることも意味する。つまり、アクリルアミドを誘導物質とすれば、連続的又は継続的にタンパク質を生産可能な生産系となり、効率的に大量の目的タンパク質が得られる。
【００２４】
誘導物質の使用量は、外来遺伝子の発現誘導を達成できる限り特に限定されない。適当な使用量は予備実験を通して容易に決定できる。アクリルアミドを採用した場合の使用量の例を示せば、培地1 Lあたり200mg〜500mgである。
【００２５】
誘導物質は少なくとも１回添加される。換言すれば、誘導物質を２回以上添加することにしてもよい。連続的な生産系では、適宜線虫用の餌と誘導物質を添加することになる。
【００２６】
培地への誘導物質の添加などによって発現誘導を開始した後、培養を継続する。例えば、６時間〜３日間、培養を継続する。好ましくは誘導物質添加後１２時間以上、培養を継続する。誘導物質による発現誘導の効果を十分に発揮させるためである。
【００２７】
３．ステップ(3)・・タンパク質の回収
このステップでは外来遺伝子の発現産物である目的タンパク質を線虫の体内から回収する。線虫を破砕した後、遠心処理、ろ過、塩析、透析及び各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）等を適宜組み合わせることによって、目的タンパク質を回収、精製すればよい。タグ（例えばGSTタグ：因みに、GSTは水溶性が極めて高いので本願には好適なタグである）との融合タンパク質として目的タンパク質が生産される場合には、タグに対して特異的に結合するアフィニティー担体を用いたクロマトグラフィー（グルタチオンを担体に用いたアフィニティークロマトグラフィー）によって、簡便且つ高度に精製することができる。必要に応じて、精製した融合タンパク質のタグを切断・除去する。融合タンパク質が切断酵素（例えば、Factor Xa）認識配列を含むように設計しておけば、酵素処理によってタグ部分を切断することができる。
【００２８】
以下、本発明の実施例（実験例を含む）を説明する。尚、特に記載のない限り、本明細書における遺伝子工学的操作は例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いはCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参考にして行うことができる。
【実施例】
【００２９】
＜遺伝子組み換え（トランスジェニック）線虫によるタンパク質の生産＞
１．材料と方法
（１）線虫株と培養
土壌線虫であるC.エレガンス（Caenorhabditis elegans）のN2株とそれから由来したunc-119欠損変異体（unc-119(-)）を使用した。当該変異体は、運動能に障害をもち、野生型の示すS字型進行ができないという表現型を示す。当該変異体は、世界中のC．エレガンス研究室の多くから入手できるが、一般には入会金を支払うことでUniversity of Minnesotaが米国政府の補助金で経営するCaenorhabditis Genetics Centerから入手することができる。勿論、C.エレガンスN2株を遺伝子操作して作製しても何ら問題はない。
【００３０】
トランスジェニック線虫用のマーカー遺伝子としてunc-119遺伝子を使用した。トランスジェニック個体（unc-119(+)）では運動能が回復する。即ち、運動能の変化を指標にして形質転換されたことが確認できる。
【００３１】
線虫の培養法は、NGM（Nematode growth Medium）培地（Brenner, Genetics 77:71-94, 1974）に餌である大腸菌（Escherichia coli OP50）を撒いた固形培地を使用した。
【００３２】
（２）ヒトインスリン発現用ベクターの作製
以下のプライマー１〜８を使用した（下線部分は制限酵素認識配列）。
プライマー１（GST4ForVer3_SalI）：GGGTCGACTTTTGCAGACTAAAAATAACTACTCTG（配列番号７）
プライマー２（GST4p_SjGST_Rev (20080319)）：TAACCTAGTATAGGGGACATAATTAGAATTCAGTAATTGA（配列番号８）
プライマー３（GST4p_SjGST_For）：TCAATTACTGAATTCTAATTATGTCCCCTATACTAGGTTA（配列番号９）
プライマー４（SjGST_Insulin_Rev (20080319)）：AGGCGCATCCACAGGGCCATACGACCTTCGATCAGATCCG（配列番号１０）
プライマー５（SjGST_Insulin_For）：CGGATCTGATCGAAGGTCGTATGGCCCTGTGGATGCGCCT（配列番号１１）
プライマー６（Insulin_RevNotI）：TAGTTTAGCGGCCGCTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCT（配列番号１２）
プライマー７（UNC54_3UForEcoRI）：GGAATTCCGGTCGCTACCATTACCAACTTG（配列番号１３）
プライマー８（UNC54_3URevSpeI）：CGACTAGTAGGAAACAGTTATGTTT（配列番号１４）
【００３３】
プライマー１及び２は、線虫C. elegans N2株の染色体DNAを鋳型にPCRを行うと5’末端にSal I制限酵素認識配列、3’末端に日本住血吸虫Schistosoma japonicum由来gstタンパク質コード配列（Sj-gst）の一部（20 bp）を付加したCe-gst-4プロモーター（726bp（配列番号１５））DNA断片（アンプリコンＡ）が増幅されるようにデザインした。同様に、プライマー３及び４は、GSTベクターpGEX-5X-2 (GE Healthcare, England, UK)を鋳型にPCRを行うと5’末端にCe-gst-4プロモーターの一部（20 bp）、3’末端にFactor Xaコード配列（12bp（配列番号１６））およびインスリン配列の一部（3 bp）を付加したSj-gstタンパク質コード配列（配列番号１７）のDNA断片（アンプリコンＢ）が増幅されるようにデザインした。さらに、プライマー５及び６は、ヒトインスリンcDNAクローン(Catalog No. SC128255, ORIGENE, MD, USA)を鋳型にPCRを行うと5’末端にFactor Xa配列（12bp（配列番号１６））およびインスリン配列の一部（3bp）、3’末端にNot I制限酵素認識配列を付加したヒトインスリンをコードするDNA断片（アンプリコンＣ）が増幅されるべくデザインした。付加した部分はオーバーラップするようにデザインしてあるので、アガロースゲルで精製した３種類のアンプリコンを等量混合した後、プライマー１及び６を用いてPCRをおこなうと、オーバーラップする箇所で３つのアンプリコンが結合した1つのDNA断片（配列番号１８）が完成する（図１）。
【００３４】
プライマー７及び８を用いて、線虫用GFPレポータープラスミドベクターpPD95.77（A. Fire氏から細野氏を通して供与）を鋳型にPCRを行うと、5’末端にEco RI制限酵素認識配列、Spe I制限酵素認識配列を付加したミオシン重鎖をコードする遺伝子unc-54の3’末端非翻訳領域のDNA断片が得られる。これをpAmCyan (Clontech)のEco RI制限酵素認識配列、Spe I制限酵素配列部位に挿入しpMH07.01-Cyanとした。Sal IとNot I制限酵素部位を利用し、このベクター内にある青色蛍光タンパクをコードするcDNA領域を、PCRで増幅したDNA断片（図１に示した、３つのアンプリコンを接合したもの）で置き換え、Ce-gst-4プロモーターの制御によってSj-gstとヒトインスリンの融合タンパク質を発現する発現ベクター（ヒトインスリン発現ベクター（配列番号１９））とした。
【００３５】
（３）GFP発現用ベクターの作製
プライマー９（SjGST_BamHI_Rev）：GGGGATCCACGACCTTCGATCAGATCCGATTTTGG（配列番号２０）
【００３６】
プライマー１及び２は、上に示したように線虫C. elegans N2株の染色体DNAを鋳型にPCRを行うと5’末端にSal I制限酵素認識配列、3’末端に日本住血吸虫Schistosoma japonicum由来gstタンパク質コード配列（Sj-gst）の一部（20 bp）を付加したCe-gst-4プロモーター（726bp（配列番号１５））DNA断片（アンプリコンＡ）が増幅されるようにデザインした。プライマー３及び９は、GSTベクターpGEX-5X-2 (GE Healthcare, England, UK)を鋳型にPCRを行うと5’末端にCe-gst-4プロモーターの一部（20 bp）、3’末端にBam HI制限酵素認識配列を付加したSj-gstタンパク質コード配列（配列番号２１）のDNA断片（アンプリコンＤ）が増幅されるようにデザインした。アガロースゲルで精製したアンプリコンＡとＤを等量混合した後、プライマー１及び９を用いてPCRをおこなうと、オーバーラップする箇所で２つのアンプリコンが結合した1つのDNA断片（配列番号２２）が完成する（図２）。
【００３７】
Sal IとBam HI制限酵素部位を利用し、図２に示した2つのアンプリコンを結合したDNA断片を線虫用GFPレポータープラスミドベクターpPD95.77（A. Fire氏から細野氏を通して供与）のSal l制限酵素認識配列、Bam HI制限酵素配列部位に挿入し、GFP発現用ベクターとした（配列番号２３）。
【００３８】
（４）形質転換
マーカープラスミドであるpDP#MM016Bを上記発現ベクター（GFP発現ベクター又はヒトインスリン発現ベクター）ととともにマイクロインジェクション法でunc-119欠損変異体の生殖巣に導入した。トランスジェニック線虫（形質転換体）はS字型の軌跡を描きながら活発に動き回る野生型の表現型を示す。尚、トランスジェニック線虫にUV照射することで、組み込んだ遺伝子を染色体内に挿入し、次世代に組み込んだ遺伝子が100％受け継がれるように安定化させた株を作製することができる。
【００３９】
（５）発現誘導及びタンパク質精製
目的タンパクを生産するために、トランスジェニック線虫は、３日間培養した。続いて、培地に400mg/L濃度となるようにアクリルアミドを添加した（発現誘導）。このアクリルアミド処理によってCe-gst-4プロモーター下流の遺伝子発現が強力に誘導される。発現誘導開始後、24時間培養を継続した後、線虫をすりつぶし、常法で総タンパク質を抽出した。続いてGSTアフィニティーカラム（GE Healthcare社）で精製し、GSTと目的タンパク質の融合体（融合タンパク質）を分離した。
【００４０】
（６）SDS-PAGE及びウエスタンブロット分析
GSTアフィニティーカラム（GE Healthcare社）で精製した融合タンパク質をSDS-PAGEに供した。泳動後のゲルをニトロセルロース膜に転写した後、抗GFP抗体又は抗ヒトインスリン抗体を一次抗体として免疫染色した（ウエスタンブロット）。また、転写後のゲルをクマシ−ブリリアントブルー（CBB）染色した。
【００４１】
２．結果
GFP発現ベクターをマイクロインジェクションして得られたトランスジェニック線虫を観察した（図３）。アクリルアミドの添加による発現誘導前（図３左）では、395 nmの光（GFPの励起光）を照射しても蛍光は観察されない。他方、アクリルアミドの添加による発現誘導後（図３右）に395 nmの光（GFPの励起光）を照射すると、全身にGFPの蛍光が観察される。共焦点レーザースキャン顕微鏡で断面を撮影した結果、生殖細胞以外のあらゆる組織、器官部位（筋肉、表皮、腸など）でGFPの発現を認めた（図４）。
【００４２】
アフィニティークロマトグラフィーで精製した融合タンパク質をウエスタンブロット分析に供した。免疫染色したニトロセルロース膜及びCBB染色したゲルを図５に示す。GSTとGFPの融合タンパク質の発現（左）及びGSTとヒトインスリンの融合タンパク質の発現（右）を確認できる。即ち、目的タンパク質（GFP又はヒトインスリン）がGSTとの融合タンパク質として生産されたことが示された。
【００４３】
３．考察
組換え操作後の線虫を大量に増殖させた後、少量のアクリルアミドを培地に添加することによって、線虫のほぼ全身でGSTと目的タンパク質（GFP又はヒトインスリン）の融合タンパク質を効率的に生産することができた。タンパク質分解酵素Factor Xa (Promega社)で融合タンパク質を処理し、GSTを切り離すと、目的タンパク質が得られる。
【００４４】
以上の実験に使用した生産系によれば、100 mgの浸潤状態線虫（約１万頭）から可溶性タンパク質が2.8〜10 mg得られる。その中の約0.4％（10 μg〜40 μg）を目的タンパク質として回収できる。1 Lの液体培養で約10 gの線虫（約100万頭）が回収できるとすると、回収できる目的タンパク質の量は1 mg〜4 mgとなる。尚、計算の根拠を以下に示す。
(a)成虫線虫の体積
長さ1000μm; 幅200 μmで頭部，尾部にかけて幅が無くなるとする。成虫１頭の体積は1000 × 100 × 100(μm3)、即ち11-11 m3である。１ mL＝ 10-6 m3なので、1 mLあたり10-6／ 11-11 頭となる。即ち、1 gの線虫（1 mLの線虫）は約10万頭になる。
(b)シャーレ１枚で飼育可能な線虫の数
9 cmシャーレの面積は約64×10-4 m2である。成虫１頭が占める面積は、1000 × 100 (μm)2＝10-7 m2である。よって、64×10-4m2／ 10-7m2＝6.4 × 104頭となる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の生産方法によれば目的タンパク質を効率的に生産可能である。また、従来方法に比べて安価に生産ができる。タンパク質の受託生産に関する市場価格では、バキュロウイルスを使った生産方法で１mg当たり50万円程度、繭を使ったものが100万円以上、動物細胞を使ったものは数百万円である。本願での方法によれば、培地代、設備費、人件費などの大幅な低減を図ることができる。本発明の生産方法は、様々な有用タンパク質の極めて効率的な生産系として利用され得る。
【００４６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ヒトインスリン遺伝子を線虫に導入するためのDNA断片の作製方法。
【図２】GFP遺伝子を線虫に導入するためのDNA断片の作製方法。
【図３】アクリルアミドの添加による発現誘導前後の形質転換線虫。発現誘導前（左）では395 nmの光（GFPの励起光）を照射しても蛍光は観察されない。発現誘導後（右）の場合、395 nmの光（GFPの励起光）を照射すると、全身にGFPの蛍光が観察された。スケールバーは500μm。
【図４】共焦点レーザースキャン顕微鏡による像。発現誘導後のトランスジェニック線虫（形質転換体）について、共焦点レーザースキャン顕微鏡で断面撮影した。スケールバーは50μm。
【図５】生産された融合タンパク質をウエスタンブロット分析した結果。GSTとGFPの融合タンパク質の発現（左）及びGSTとヒトインスリンの融合タンパク質の発現（右）を確認できる。レーンM：分子量マーカー。レーンA及びB：サンプル（線虫総タンパク質）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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