(57)【要約】      （修正有）【課題】複雑な免疫応答を誘発する多くの複雑な細胞シグナリングを誘導するペプチドを明らかにすること。【解決手段】ヒトのモノサイト又は好中球においてスーパーオキシド生成を誘導したり、ヒト末梢血モノサイト又は好中球による細胞内カルシウムの上昇を誘導したり、ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に結合したり、in vitroにおいてヒトモノサイト又は好中球の走化性移動を誘導したり、ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現細胞において脱顆粒を誘導したり、ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の活性化を通じてＥＲＫのリン酸化を刺激したり、ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の活性化を通じてＡｋｔのリン酸化を刺激する、特定の配列のペプチド並びに該ペプチドの混合物よりなる群を特定した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
白血球を活性化し、分離され、実質的に純粋な形態で存在することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質。
【請求項４】
（ａ）ヒトのモノサイト又は好中球によりスーパーオキシド生成を誘導し、
（ｂ）ヒト末梢血単核球又は好中球により細胞内カルシウムの上昇を誘導し、
（ｃ）ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に結合し、
（ｄ）in vitroにおいてヒトのモノサイト又は好中球の走化性による移動を誘導し、
（ｅ）ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞において脱顆粒を誘導し、
（ｆ）ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の活性化を通じてＥＲＫのリン酸化を刺激し、及び、
（ｇ）ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の活性化を通じてＡｋｔのリン酸化を刺激する特性のうち、少なくとも１つの特性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチド、又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を含む医薬組成物。
【請求項６】
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドをコードする塩基配列を含む分離されたヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節ペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ホルミルペプチド受容体ファミリー（ホルミルペプチド受容体（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＰＲ）とホルミルペプチド受容体様１（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ１，ＦＰＲＬ１））は、好中球やモノサイトのような貪食細胞に発現しており、病原体の感染に対する宿主の防御において重要な役割を果たしている（１，２）。これら受容体は百日咳毒素に感受性があるＧｉ蛋白質と結合することが知られている（１，２）。ＦＰＲの活性化は、ＧαｉサブユニットからＧβγサブユニットの分離を誘導し、そのβγサブユニットはホスホリパーゼＣβあるいはホスホイノシチド３−キナーゼの活性化を誘導する（１，２）。このような影響を与える分子の活性化は、走化性による移動及び脱顆粒、スーパーオキシドの生成のような細胞間の反応を多様化にして複雑な下流のシグナリングを誘導する。
【０００３】
多くのアゴニストは、結果として複雑な免疫応答を誘発する多くの複雑な細胞シグナリングを誘導する。免疫応答の間に、それらの多くは、侵入する病原体を排除するための宿主細胞の適した機能として必然的に必要とされたのだが、いくつかの応答は免疫応答で好ましくない面での影響を与える。薬剤開発の分野では、薬剤候補物質のその影響を減少させたり、あるいは、除去することが主要な関心事である。このため、多くの研究グループでいくつかのアプローチを通じて、特異的なレセプターに対する選択的な免疫応答調節因子あるいは選択的なアンタゴニストの開発が試みられている（３，４）。
【０００４】
ＦＰＲに対する様々なアゴニストは、内因性の供給源又は人工的な合成により同定されてきた（１，２）。それらには、バクテリアのペプチド（Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，ｆＭＬＦ）やＨＩＶ−外皮ドメイン（Ｔ２０及びＴ２１）、宿主由来のアゴニスト（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｉ及びＡβ42）が含まれている（５−７）。以前、本発明者は、合成ペプチドリガンドであるＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（以下、ＷＫＹＭＶｍという）がモノサイト及び好中球のような白血球を刺激することを報告した（８−１１）。Ｌｅ等はＷＫＹＭＶｍがＦＰＲ及びＦＰＲＬ１に結合することを報告した（１２）。ＷＫＹＭＶｍは広い範囲の受容体に対して高い親和性をもつ短いペプチドであるので、ＦＰＲあるいはＦＰＲＬ１が介在するシグナリングの研究に対して、非常に有効な素材となりうる。しかしながら、特異的な受容体に対する選択的な免疫調節因子あるいは選択的なアンタゴニストを開発する研究は、分子の多様性を調べる研究と同様に、小さい化合物から構成されており、今までは非常に制限的に行われていたので、新規の化合物を同定することが望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Le, Y., Li, B., Gong, W., Shen, W., Hu, J., Dunlop, N. M.,Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2000) Immunol Rev. 177, 185-194.
【非特許文献２】Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105.
【非特許文献３】White, J. R., Lee, J. M., Young, P. R., Hertzberg, R. P., Jurewicz, A. J., Chaikin, M. A., Widdowson, K., Foley, J. J., Martin, L. D.,Griswold, D. E., and Sarau, H. M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10095-10098.
【非特許文献４】Zagorski, J., and Wahl, S. M. (1997) J. Immunol. 159, 1059-1062.
【非特許文献５】Prossnitz, E. R., and Ye, R. D. (1997) Pharmacol. Ther. 74, 73-102.
【非特許文献６】Su, S. B., Gong, W. H., Gao, J. L., Shen, W. P., Grimm, M. C., Deng, X., Murphy, P. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (1999) Blood 93, 3885-3892.
【非特許文献７】Walther, A., Riehemann, K., and Gerke, V. (2000) Mol. Cell. 5, 831-840.
【非特許文献８】Baek, S. H., Seo, J. K., Chae, C. B., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8170-8175.
【非特許文献９】Seo, J. K., Choi, S. Y., Kim, Y., Baek, S. H., Kim, K. T., Chae, C. B., Lambeth, J. D., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1997) J. Immunol. 158, 1895-1901.
【非特許文献１０】Bae, Y. S., Ju, S. A., Kim, J. Y., Seo, J. K., Baek, S. H., Kwak, J. Y., Kim, B. S., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 241-248.
【非特許文献１１】Bae,Y. S., Kim, Y., Kim, Y., Kim, J. H., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 66, 915-922.
【非特許文献１２】Le, Y., Gong, W., Li, B., Dunlop, N. M., Shen, W., Su, S. B., Ye, R. D., and Wang, J. M. (1999) J. Immunol. 163, 6777-6784.
【非特許文献１３】He, R., Tan, L., Browning, D. D., Wang, J. M., and Ye, R. D. (2000) J. Immunol. 165, 4598-4605.
【非特許文献１４】Bae, Y. S., Bae, H., Kim, Y., Lee, T. G., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (2001) Blood 97, 2854-2862.
【非特許文献１５】Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R. Y. (1986) J. Biol. Chem. 260, 3440-3450.
【非特許文献１６】Hu, J. Y., Le, Y., Gong, W., Dunlop, N. M., Gao, J. L., Murphy, P. M., and Wang, J. M. (2001) J. Leukoc. Biol. 70, 155-1561.
【非特許文献１７】King, J., and Laemmli, U. K. (1971) J. Mol. Biol. 62, 465-477.
【非特許文献１８】Haribabu, B., Zhelev, D. V., Pridgen, B. C., Richardson, R. M., Ali, H., and Snyderman, R. (1999) J. Biol. Chem. 274, 37087-37092.
【非特許文献１９】Franke, T. F., Yang, S. I., Chan, T. O., Datta, K., Kazlauskas, A., Morrison, D. K., Kaplan, D. R., and Tsichlis, P. N. (1995) Cell. 81, 727-736.
【非特許文献２０】Jin, X., Shepherd, R. K., Duling, B. R., and Linden, J. (1997) J. Clin. Invest. 100, 2849-2857.
【非特許文献２１】Thomas, W. G., Qian, H., Chang, C. S., and Karnik, S. (2000) J. Biol. Chem. 275, 2893-2900.
【非特許文献２２】Palanche, T., Ilien, B., Zoffmann, S., Reck, M. P., Bucher, B., Edelstein, S. J., and Galzi, J. L. (2001) J. Biol. Chem. 276, 34853-34861.
【非特許文献２３】Prossnitz, E. R., Quehenberger, O.,Cochrane, C. G., and Ye, R. D. (1993) Biochem. J. 294, 581-587.
【非特許文献２４】Miettinen, H. M., Gripentrog, J. M., Mason, M. M., and Jesaitis, A. J. (1999) J Biol. Chem. 274, 27934-27942.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の第１の目的は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む新規の免疫調節ペプチド、又は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を提供することにある。
【０００７】
本発明の第２の目的は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列をもつペプチド、又は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を含む医薬組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明の第３の目的は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードする分離されたヌクレオチドを提供することにある。
【０００９】
本発明の第４の目的は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードする分離されたヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に記載の発明に係るペプチドは、
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００１１】
また、請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のペプチドにおいて、
白血球を活性化し、分離され、実質的に純粋な形態で存在することを特徴とする。
【００１２】
また、請求項３に記載の発明に係るペプチドから誘導される物質は、
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導されることを特徴とする。
【００１３】
また、請求項４に記載の発明は、請求項１に記載のペプチドにおいて、
（ａ）ヒトのモノサイト又は好中球によりスーパーオキシド生成を誘導し、
（ｂ）ヒト末梢血単核球又は好中球により細胞内カルシウムの上昇を誘導し、
（ｃ）ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に結合し、
（ｄ）in vitroにおいてヒトのモノサイト又は好中球の走化性による移動を誘導し、
（ｅ）ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞において脱顆粒を誘導し、
（ｆ）ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の活性化を通じてＥＲＫのリン酸化を刺激し、及び、
（ｇ）ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の活性化を通じてＡｋｔのリン酸化を刺激する特性のうち、少なくとも１つの特性を有することを特徴とする。
【００１４】
また、請求項５に記載の発明に係る医薬組成物は、
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチド、又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、請求項６に記載の発明に係るヌクレオチドは、
［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドをコードする塩基配列を含む分離されたヌクレオチドであることを特徴とする。
【００１６】
また、請求項７に記載の発明に係るベクターは、
請求項６に記載のヌクレオチドを含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む新規の免疫調節ペプチド、又は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を提供することができる。
また、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列をもつペプチド、又は、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を含む医薬組成物を提供することができる。
また、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードする分離されたヌクレオチドを提供することができる。
また、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードする分離されたヌクレオチドを含むベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下の図面は組み込まれて明細書の一部を構成するものであり、発明の具体化を明らかにし、記述と共に発明の原理を説明するのに役立つものである。
【図１】図１は、ＷＫＹＭＶｍ及び本発明に係るペプチド（ＷＫＧＭＶｍ，ＷＫＲＭＶｍ，ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ）、ｆＭＬＦのＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（Ａ）又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（Ｂ）での遊離したカルシウムイオンの濃度に対する影響を示している。
【図２】図２は、ＷＫＹＭＶｍ及び本発明に係るペプチド（ＷＫＧＭＶｍ，ＷＫＲＭＶｍ，ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ）、ｆＭＬＦにより、ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に結合した125Ｉ−標識化されたＷＫＹＭＶｍの置換を示している。
【図３】図３は、ＷＫＹＭＶｍ及び本発明に係るペプチド（ＷＫＧＭＶｍ，ＷＫＲＭＶｍ，ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ），ｆＭＬＦ，ｗｋｙｍｖｍのＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞でのＥＲＫリン酸化における影響を示している。
【図４】図４は、ＷＫＹＭＶｍ及び本発明に係るペプチド（ＷＫＧＭＶｍ，ＷＫＲＭＶｍ，ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ），ｆＭＬＦ，ｗｋｙｍｖｍのＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞でのＡｋｔリン酸化における影響を示している。
【図５】図５は、ＷＫＹＭＶｍが、細胞内カルシウムの上昇を通じてＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞でのエキソサイトーシスを刺激することを示している。
【図６】図６は、ＷＫＹＭＶｍ及び本発明に係るペプチド（ＷＫＧＭＶｍ，ＷＫＲＭＶｍ，ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ），ｆＭＬＦ，ｗｋｙｍｖｍのペプチドが誘導する遊離したカルシウムイオンの濃度上昇時のＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＦ）のエキソサイトーシスに対する影響を示している。
【図７】図７は、ＷＫＹＭＶｍが、ＰＩ３Ｋ及びＭＥＫの活性化を通じて、ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞での走化性の移動を刺激することを示している。
【図８】図８は、ＷＫＹＭＶｍ及び本発明に係るペプチド（ＷＫＧＭＶｍ，ＷＫＲＭＶｍ，ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ），ｆＭＬＦ，ｗｋｙｍｖｍの走化性に与える影響を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の他の特徴及び利点は、付随する図面を以下の記述と考慮させることで明白になり、前記図面中において関連する符号は図を通じて同一又は類似の部分を示している。
【００２０】
ホルミルペプチドレセプター（ＦＰＲ）及びホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１）は免疫応答で重要な役割を果たしている。本発明は、ＷＫＹＭＶｍから誘導されるペプチドを提供するものである。多くのペプチドはＦＰＲ及びＦＰＲＬ１を刺激してカルシウム上昇を引き起こすが、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドのような本発明のペプチドは、ＦＰＲＬ１発現細胞においてカルシウムを上昇させるが、ＦＰＲ発現細胞ではカルシウムを上昇させない。125Ｉ−ＷＫＹＭＶｍを使用した競合分析では、ＦＰＲ発現細胞において多くのペプチドがカルシウムを上昇させる効果をもつだけでなく、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドも、ＦＰＲに対する結合で125Ｉ−ＷＫＹＭＶｍと競合させることができることを示している。ホスホリパーゼＣが介在するカルシウム上昇とは異なり、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドは、ＦＰＲ発現細胞において細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）とＡｋｔの活性化を刺激することができる。ＷＫＹＭＶｍの機能的な影響を考えると、このペプチドは特にＦＰＲ細胞において、カルシウムイオン及びＥＲＫ経路を通じて脱顆粒及び細胞の走化性を刺激する。しかしながら、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドのようなペプチドは、ＦＰＲ細胞を走化性移動の誘導により刺激するのであって、脱顆粒により刺激しない。これらを合わせて考えることで、重要な化学的誘引性の受容体として、ＦＰＲは、リガンド特異的な振る舞いにおいて異なるペプチドリガンドにより異なる調節がなされていることを初めて説明した。
【００２１】
本発明の好ましい第一実施形態によると、下記に示す［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、本発明のペプチドは［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物のペプチドから誘導される物質を含む。［配列番号：１］から［配列番号：２５］は、次のようである。
【００２２】
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＧＭＶｍ；配列番号：１）及び、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＧｍ；配列番号：２）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＧ；配列番号：３）、
Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＲＹＭＶｍ；配列番号：４）、
Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＥＹＭＶｍ；配列番号：５）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＨＹＭＶｍ；配列番号：６）、
Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＤＹＭＶｍ；配列番号：７）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＨＭＶｍ；配列番号：８）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＥＭＶｍ；配列番号：９）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＷＭＶｍ；配列番号：１０）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＲＭＶｍ；配列番号：１１）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＤＭＶｍ；配列番号：１２）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＦＭＶｍ；配列番号：１３）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＹｍ；配列番号：１４）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＦｍ；配列番号：１５）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＥ；配列番号：１６）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＶ；配列番号：１７）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＲ；配列番号：１８）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＷ；配列番号：１９）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶ；配列番号：２０）、
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＫＹＭＶｍ；配列番号：２１
）、
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＮＨ２（ＫＹＭＶ；配列番号：２２）、
Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＹＭＶｍ；配列番号：２３）、
Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＭＶｍ；配列番号：２４）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＷｍ；配列番号：２５）である。
【００２３】
［配列番号：１］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：２４］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物のペプチドは分離された形態又は実質的に純粋な形態で存在する。
【００２４】
前記ペプチドはカルボキシル基をアミノ基に選択的に置換されたアミノ酸残基を含む。
【００２５】
本発明のペプチドは
（ａ）ヒトのモノサイト又は好中球によりスーパーオキシド生成を誘導し、
（ｂ）ヒト末梢血モノサイト又は好中球により細胞内カルシウムの上昇を誘導し、
（ｃ）ＦＰＲ（ホルミルペプチド受容体）またはＦＰＲＬ１（ホルミルぺプチド受容体様１）に結合し、
（ｄ）in vivoにおいてヒトのモノサイト又は好中球の走化性移動を誘導し、
（ｅ）ＦＰＲ（ホルミルペププチド受容体）発現細胞またはＦＰＲＬ１（ホルミルペプチド受容体様１）発現細胞において脱顆粒を誘導し、
（ｆ）ＦＰＲ（ホルミルペプチド受容体）またはＦＰＲＬ１（ホルミルペプチド受容体様１）の活性化を通じて細胞外シグナル制御キナーゼを刺激し、
（ｇ）ＦＰＲ（ホルミルペプチド受容体）またはＦＰＲＬ１（ホルミルペプチド受容体様１）の活性化を通じてＡｋｔのリン酸化を刺激する特性のうち少なくとも一つの特性を有する。
【００２６】
本発明の好ましい第２実施形態によると、［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、本発明は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
前記ペプチド又は前記物質を活性成分として含む前記医薬組成物は生理食塩水、緩衝液、デキストロース、水、グリセロール及びエタノールより選択される医薬用希釈剤のうち、１種以上含むことができるが、希釈剤はこれらに限定されない。
【００２８】
前記医薬組成物は投与の目的及び疾病によって相異なるように適用できる。実質的に投与される活性成分の量は多様な要素、つまり処置される状態、患者の症状の程度、他の薬剤（例えば、化学的療法の薬剤）と共同投薬、患者個人の年齢、性別、体重、食べ物、投薬時間、投与経路、及び組成物の投与比率を考慮して決定しなければならない。前記組成物は投与量及び投与経路が疾病の形態及び程度によって調節できるが、１日に１回又は１〜３回に分けて投与できる。
【００２９】
本発明のペプチド又は物質を含む組成物は経口又は非経口で投与できる。非経口投与とは、経口以外の投与経路、つまり、直腸、静脈、腹膜及び筋肉、動脈、経皮、鼻腔、吸入、眼球及び皮下を通じた薬剤の投与を意味する。
【００３０】
前記ペプチド又は物質を含む医薬組成物はどのような形態で調合されてもよく、経口投与、あるいは注射可能な溶液、局所的な調合剤というような形態で調合されてもよい。前記組成物は経口投与、注射による投与（純粋な溶液又は懸濁液、乳化剤）に適するように調合するのが好ましく、最も好ましいのは錠剤、カプセル、軟質カプセル、水性薬剤、丸剤、顆粒等のような経口の形態に調合することである。
【００３１】
前記組成物の調合において、前記ペプチドは賦形剤なく軟質カプセルに充填され、あるいは担体と混合されたり希釈された後に適当な形態をとる組成物に調合される。適当な担体の例としては、澱粉、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース等があげられる。
【００３２】
また、白血球の数又は白血球の活性化の状態の変化を伴ったり、そのような変化によって誘発される疾病を治療する方法を提供することができる。前記方法は［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を前記疾病の治療を必要とする宿主に治療に有効な量を投与することを含む。前記疾病はバクテリア、マイコプラズマ、酵母、カビ、ウィルスによる感染又は炎症であってもよい。
【００３３】
また、宿主に白血球の数を増加させたり、白血球の活性化の状態を向上させる方法を提供することができる。前記方法は［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を白血球の数の増加又は白血球の高い活性化状態を必要とする宿主に治療に有効な量を投与することを含む。
【００３４】
また、白血球での細胞外のカルシウムの上昇を誘導する治療を必要とする患者において、白血球での細胞外のカルシウムの上昇を誘導する方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００３５】
また、ヒトモノサイト又は好中球によるスーパーオキシド生成を誘導する治療を必要とする患者において、ヒトモノサイト又は好中球によるスーパーオキシド生成を誘導する方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００３６】
また、ヒトの末梢血単核細胞による走化性移動を誘導する治療を必要とする患者において、ヒトの末梢血単核細胞による走化性移動を誘導する方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００３７】
また、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞での脱顆粒を誘導する治療を必要とする患者において、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞での脱顆粒を誘導する方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００３８】
また、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞においてそれぞれＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の結合に対してＷＫＹＭＶｍとペプチドを競合させる治療を必要とする患者において、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞においてそれぞれＦＰＲ又はＦＰＲＬ１の結合に対してＷＫＹＭＶｍとペプチドを競合させる方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００３９】
また、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞において細胞外シグナル制御キナーゼを刺激する治療を必要とする患者において、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞において細胞外シグナル制御キナーゼを刺激する方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００４０】
また、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞においてＡｋｔを刺激する治療を必要とする患者において、ＦＰＲ発現細胞又はＦＰＲＬ１発現細胞においてＡｋｔを刺激する方法を提供することができる。前記方法は診断された患者に［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又は［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を治療又は予防のために誘導または脱感作を得るのに有効な量を投与することを含む。
【００４１】
また、前記治療が施される宿主又は患者は感染によって誘発される疾病に患わされる場合があり、特に前記疾病はサイトメガロウィルス感染、リューマチ性関節炎、ライム関節炎、痛風、敗血症、異常高熱、潰瘍性結腸炎、全腸炎、骨粗鬆症、歯周疾患、糸球体腎炎、慢性非感染性肺炎、類肉腫症、呼吸細気管支炎、肉芽腫形成、肝繊維症、肺繊維症、移植拒絶、移植細胞対宿主病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、腫瘍性疾患、気管支喘息、Ｉ型インシュリン非依存性糖尿病、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、慢性Ｂリンパ球白血病、分類不能型免疫不全症、播種性血管内凝固症候群、全身性硬化症、脳脊髄炎、肺炎、高ＩｇＥ免疫不全症候群、癌転移、癌成長、養子免疫療法、後天性呼吸窮（促）迫症候群、再潅流症候群、手術後の炎症、臓器移植、又は脱毛症である場合がある。
【００４２】
本発明は［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドを有するペプチドをコードする分離されたヌクレオチドを提供する。
【００４３】
本発明は［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドを有するペプチドをコードする分離されたヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００４４】
本発明は［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち、［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【実施例】
【００４５】
実施例に用いられた物質
Ｆｍｏｃアミノ酸はミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。Ｒａｐｉｄａｍｉｄｅ樹脂はデュポン社（Ｄｕｐｏｎｔ）（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）、シトクロムｃ及びｆＭＬＦはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。フラ−２ペンタアセトキシメチルエステル（ｆｕｒａ−２／ＡＭ）はモレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。ＲＰＭＩ１６４０はライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。透析されたウシ胎児血清及び添加されたウシ血清はハイクローンラボラトリーズ社（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）（Ｌｏｇｅｎ，ＵＴ）から購入した。ＰＴＸ，ＧＦ１０９２０３Ｘ及びＰＤ９８０５９はカルバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＬＹ２９４００２はバイオモルリサーチラボラトリーズ社（ＢＩＯＭＯＬ  ｒｅｓｅｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）（Ｐｏｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から購入した。
【００４６】
ペプチドは先に記載されている固相法で合成した（８，９）。簡単に説明すると、ペプチドをＲａｐｉｄａｍｉｄｅ支持体樹脂上で合成して標準的なＦｍｏｃ／ｔ−ｂｕｔｙｌ法により酸不安定性（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ）リンカー上に組み立てた。ペプチドの組成は以前に記載されているようなアミノ酸分析法で確認した（８）。
【００４７】
ＲＢＬ−２Ｈ３、ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３及びＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は２０％ＦＢＳ及び２００ｇ／ｍｌのＧ４１８が添加されたＤＭＥＭで培養した（１３）。
【００４８】
実施例１：好中球の分離
末梢血白血球濃縮液は蔚山赤十字血液センターから提供された。ヒト好中球は先に記載されているようなデキストラン沈降、赤血球の低浸透圧の溶解（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｌｙｓｉｓ）及び溶媒の勾配によるリンパ球分離を標準的な方法に従って分離した（９）。分離されたヒト好中球は直ちに用いられた。
【００４９】
実施例２：ヒト好中球でのスーパーオキシド生成に対するペプチドの効果
ＷＫＹＭＶｍ、［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物のペプチド及びｗｋｙｍｖｍのヒト好中球でのスーパーオキシド生成に与えるペプチドの活性を測定した。参考文献に記載されているように、スーパーオキシドアニオン生成をミクロタイタ９６穴プレートＥＬＩＳＡリーダ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｂｉｏ−Ｔｅｋｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＥＬ３１２ｅ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用してシトクロムｃの還元を測定し定量を行った（１４）。ヒト好中球（９６穴プレートの各ウェル当たりに１×１０６細胞／１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地）は３７℃で１分間５０μＭシトクロムｃと共に予め培養し、その後、表示された濃度のペプチドと共に培養した。スーパーオキシド生成は１分間隔で５分にわたって５５０ｎｍでの光吸収における変化として測定した。少なくとも４回の独立した実験から各位置での活性アミノ酸を有するペプチドを選定した。これらの結果は表１に記載されている。
【００５０】
多様な濃度のＷＫＹＭＶｍペプチドで好中球を刺激すると、濃度依存的にスーパーオキシド生成を引き起こし、１００ｍＭのペプチドで最大の活性を示した（データは省略。）。ＷＲＹＭＶｍ、ＷＥＹＭＶｍ、ＷＫＦＭＶｍ及びＫＹＭＶｍのようないくつかのペプチドでは細胞内でスーパーオキシド生成を刺激しているのに対して、多くのペプチドでは１００ｎＭのペプチドでのスーパーオキシド生成に対して弱い活性を示した。
【００５１】
【表１】
2010000077.tif 000003
ａスーパーオキシド生成はシトクロムｃ還元を観測して測定する。
ｂ処理されたペプチドの濃度は１００ｎＭであり、ＷＫＷＭ（Ｆ／Ｗ）ｍ−ＮＨ２は、ＷＫＷＭＦｍ−ＮＨ２とＷＫＷＭＷｍ−ＮＨ２の混合物である。
【００５２】
また、１０μＭ濃度のスーパーオキシド生成に対するペプチドの効果を測定して、その結果を表２に記載した。ｗｋｙｍｖｍを除いた全てのペプチドが１０μＭ濃度のＷＫＹＭＶｍと同程度強力にスーパーオキシド生成を刺激した。その中でもＷＫＷＭＶｍ，ＷＫＦＭＶｍ及びＷＫＹＭＶＷはＷＫＹＭＶｍより強い活性を示した。
【００５３】
【表２】
2010000077.tif 000004
aスーパーオキシド生成はシトクロムｃ還元を観測して測定する。
ｂ処理されたペプチドの濃度は１０μＭであり、ＷＫＷＭ（Ｆ／Ｗ）ｍ−ＮＨ２は、ＷＫＷＭＦｍ−ＮＨ２とＷＫＷＭＷｍ−ＮＨ２の混合物である。
【００５４】
実施例３：ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞での遊離したカルシウムイオンの濃度上昇に対するペプチドの効果
ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で、ＷＫＹＭＶｍ、［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物のペプチド及びｗｋｙｍｖｍのペプチドが遊離したカルシウムイオンの濃度上昇に与える活性を測定した。ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１０μＭのペプチドで刺激し、遊離したカルシウムイオンの濃度を測定した。遊離したカルシウムイオンの濃度の基準はｆｕｒａ−２／ＡＭを使用してＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ方法で蛍光測定して決定した（１５）。準備した細胞を新鮮な無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で継続して攪拌しながら５０分間３７℃で３μＭのｆｕｒａ−２／ＡＭで培養した。２×１０６細胞をカルシウムイオンが存在しないＬｏｃｋｅ´ｓ溶液（１５４ｍＭのＮａＣｌ、５．６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１０ｍＭのグルコース及び０．２ｍＭのＥＧＴＡ）で各分析に用いられるように分取した。３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの二重励起波長の蛍光変化及び５００ｎｍでの発光波長を測定して、測定された蛍光率を遊離カルシウムイオンの濃度に互換し、上昇した遊離したカルシウムイオンの濃度のピークレベルを測定した。その結果を表３及び図１Ａに示した。データは３つの独立した実験の代表値である。
【００５５】
【表３】
2010000077.tif 000005
ａ細胞内カルシウムの増加はｆｕｒａ−２をロードした細胞から測定する。
ｂＷＫＷＭ（Ｆ／Ｗ）ｍ−ＮＨ２は、ＷＫＷＭＦｍ−ＮＨ２とＷＫＷＭＷｍ−ＮＨ２の混合物である。
【００５６】
ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で、ＷＫＹＭＶｍペプチドは濃度依存的に遊離したカルシウムイオンの濃度上昇を誘導しており、３００ｎＭで最大の活性を示した（データは省略する。）。ＦＰＲ細胞内で遊離したカルシウムイオン濃度の上昇活性に対するＷＫＹＭＶｍのＥＣ50は４７ｎＭであった（表３）。本発明のペプチドの中でＷＨＹＭＶｍ、ＷＫＷＭＶｍ及びＷＫＦＭＶｍはＷＫＹＭＶｍペプチドに対抗し、ＦＰＲに対してより上昇した親和度を示したが、他のペプチドはＷＫＹＭＶｍほどの活性を示さなかった（表３）。特に、ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＹＭＧｍ及び６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドはＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で２０μＭ処理時まで遊離したカルシウムイオンの濃度に影響を与えなかった（表３及び図１Ａ）Ｎ末端又はＣ末端が切断されたペプチドはまたＦＰＲ細胞における遊離したカルシウムイオンの濃度の上昇活性に対して不活性を示した（表３）。これらの結果は遊離したカルシウムイオン濃度の上昇におけるＦＰＲの活性化に対して３番目のＴｙｒ残基及び６番目のＤ−Ｍｅｔ残基が重要であるという事実を示している。
【００５７】
ＷＫＹＭＶｍ、［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物のペプチド及びｗｋｙｍｖｍのペプチドが遊離したカルシウムイオンの濃度上昇に与える効果をＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で調べた。ＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１０μＭのペプチドで刺激し、遊離したカルシウムイオンの濃度を測定した。遊離したカルシウムイオンの濃度のレベルは前記と同様な方法で測定した。上昇した遊離カルシウムイオン濃度のピークレベルを測定した。その結果は表４及び図１Ｂに示した。データは３つの独立した実験の代表値である。
【００５８】
ＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において、ＷＫＹＭＶｍは１０ｎＭの濃度で最大の活性を示した（データは省略する）。ＦＰＲＬ１細胞における遊離したカルシウムイオン濃度の上昇活性に対してＷＫＹＭＶｍのＥＣ５０は０．６ｎＭであった（表４）。ＦＰＲ細胞とは異なり、全てのペプチドがＦＰＲＬ１細胞における遊離したカルシウムイオン濃度の上昇活性に対して活性を示した（表４）。ＷＲＹＭＶｍ、ＷＫＷＭＶｍ、ＷＫＦＭＶｍ、ＷＫＹＭＹｍ並びにＷＫＹＭＦｍ及びＷＫＹＭＷｍの混合物のようないくつかのペプチドはＦＰＲＬ１に対してさらに高い親和度を示した（表４）。ＦＰＲ細胞において遊離したカルシウムイオンの濃度上昇に影響を与えなかったＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＹＭＧｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔ残基を置換したペプチドも、ＦＰＲＬ１細胞における遊離したカルシウムイオン濃度の上昇活性を示し、ＦＰＲＬ１に対しわずかに親和度を有することが示された（表４及び図１Ｂ）。Ｎ末端又はＣ末端が切断されたペプチドも、ＦＰＲＬ１細胞における遊離したカルシウムイオン濃度の上昇を刺激する（表４）。これらの結果は３番目のＴｙｒ残基及び６番目のＤ−Ｍｅｔ残基が遊離したカルシウムイオンの濃度上昇に帰着するＦＰＲに対抗するＦＰＲＬ１の活性化に対してほとんど重要性がないことを示している。
【００５９】
【表４】
2010000077.tif 000006
ａ細胞内カルシウムの増加はｆｕｒａ−２をロードした細胞から測定する。
ｂＷＫＷＭ（Ｆ／Ｗ）ｍ−ＮＨ２は、ＷＫＷＭＦｍ−ＮＨ２とＷＫＷＭＷｍ−ＮＨ２の混合物である。
【００６０】
実施例４：ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に対する［１２５Ｉ］ＷＫＹＭＶｍの結合におけるペプチドの効果
いくつかのペプチド（ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチド）が細胞質性のカルシウムの上昇を誘導することができないという事実から、前記ペプチドがＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に結合できるかどうかについて調べた。ペプチドによりＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に対して結合する［１２５Ｉ］が標識されたＷＫＹＭＶｍが置換される程度を測定した。標識されていないＷＫＹＭＶｍ又は［配列番号：１］から［配列番号：２５］のうち［配列番号：２］から［配列番号：１４］、［配列番号：１６］から［配列番号：１９］並びに［配列番号：１５］及び［配列番号：２５］の混合物のペプチドの非存在下、あるいはペプチドの存在下でこれらのペプチドの量を増加させた状態でＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を［１２５Ｉ］ＷＫＹＭＶｍと共に培養した。
【００６１】
リガンド結合分析を従来から知られた方法に変更を加えて実施した（１６）。簡単に述べると、放射線を発する125Ｉが標識されたＷＫＹＭＶｍはＮＥＮ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０5細胞播いて一晩培養した。細胞をブロッキングバッファー（３３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ）で２時間ブロッキングした後、５０μＭの標識されていないペプチドの存在あるいは非存在下で、バインディングバッファー（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）と共に単一濃度の125Ｉが標識されたＷＫＹＭＶｍを細胞に添加し、攪拌しながら４℃で３時間培養した。その次に、試料を氷冷のバインディングバッファーで５回洗浄した後、１ウェル当たりに２００μｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。常温で２０分溶解させた後、溶解物を集めた。結合した125Ｉが標識されたＷＫＹＭＶｍをγ線計測器にて放射性活性を測定した。
【００６２】
リガンド結合の分析結果は図２に示した。図２に示したように、標識されていないＷＫＹＭＶｍだけでなく、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶｍの６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドまでもが、濃度依存的に［125Ｉ］ＷＫＹＭＶｍの結合を阻害した。これらの結果は、ＷＫＧＭＶｍ又はＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶｍの６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドはＦＰＲに結合できるが、その全てのペプチドがＦＰＲ発現ＲＢＬ細胞で細胞質性のカルシウム上昇を誘導できるわけではないという事実を示している。
【００６３】
実施例５：ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＥＲＫリン酸化に対するペプチドの効果
ｉ）ペプチドによる細胞の刺激
培養されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２×１０6細胞分取して示された濃度のＷＫＹＭＶｍ及び本発明のペプチドで示された時間刺激した。１μＭのＷＫＹＭＶｍでＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を多様な時間で刺激した（図３Ａ）。２つの細胞を１μＭのＷＫＹＭＶｍ処理前にビークル又は１００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸ（２４時間）、５０μＭのＬＹ２９４００２（１５分）、５μＭのＧＦＸ（１５分）、１０μＭのＢＡＰＴＡ／ＡＭ（６０分）、５０μＭのＰＤ９８０５９（６０分）と共に予め培養した（図３Ｂ）。ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１０μＭの本発明のペプチドで２分又は５分間刺激した（図３Ｃ）。
【００６４】
刺激後、細胞を無血清ＲＰＭＩで洗浄して、溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１０％グリセロール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１０μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した。溶解液中の不溶性物質を遠心分離（１２，０００×ｇ，１５分，４℃）してペレット化し、可溶性の上清分画を取り除き、−８０℃で保管あるいは直ちに使用した。溶解物中でのタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質分析試薬を用いて測定した。
【００６５】
ii）電気泳動及び免疫ブロットの分析
各試料（３０ｇペプチド）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理してリン酸化されたＥＲＫを抗リン酸化ＥＲＫ抗体を用いた免疫ブロット法により決定した。タンパク質試料は濃縮された試料バッファーを添加して電気泳動用に準備した。試料のうち一部をＬａｅｍｍｌｉに記載されたバッファーシステムを使用して１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって分離した（１７）。
【００６６】
電気泳動に続いて、抗ＥＲＫ２抗体でウェスタンブロット分析を実施し同一量の試料が実験に用いられたことを確認した。タンパク質はニトロセルロース膜にブロットされた。前記ニトロセルロース膜を５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で培養してブロッキングした。その後、前記膜をＴＢＳで洗浄された抗リン酸化ＥＲＫ抗体、又は抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体と共に培養した。ＰＫＣトランスロケーション分析の間、ＰＫＣアイソザイムに特異的な抗体が培養される。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合される１：５０００希釈のゴート抗ラビットＩｇＧ、又はゴート抗マウスＩｇＧ抗体と共に膜を培養した後、高性能化学発光検出システムを使用して抗原抗体複合体を可視化した。
【００６７】
iii）結果
ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＦＰＲ又はＦＰＲＬ１を通じた細胞シグナリングに対するペプチドの効果を評価して、その結果を図３に示した。図３の結果は３回の独立した実験の代表値を表している。
【００６８】
いくつかのペプチドはＦＰＲに結合はできるが、ＰＬＣが介在するカルシウムの上昇を刺激させることはできないので、いくつかのＧＰＣＲｓの下流においてＰＬＣに依存しない他のシグナリング（ＥＲＫｓとＡｋｔ）に与える効果を調べた。ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１μＭのＷＫＹＭＶｍで刺激すると、ペプチド処理してから２分又は５分経過した後に最大の活性を示すＥＲＫｓの一過性の活性化を誘導した（図３Ａ）。ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＷＫＹＭＶｍ刺激の前にいくつかの阻害剤で予め処理する場合、ＷＫＹＭＶｍが誘導するＥＲＫｓの活性化はＰＴＸ及びＰＤ９８０５９に感受性を示しており、このような現象はＰＴＸ感受性Ｇタンパク質及びＭＥＫ依存性であることを示している（図３Ｂ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）、ＰＫＣ阻害剤（ＧＦ１０９２０３Ｘ、又はＲｏ-３１-８２２０）、カルシウムキレート剤（ＢＡＰＴＡ／ＡＭ）の前処理はＷＫＹＭＶｍが誘導するＥＲＫ活性化に影響を与えない（図３Ｂ）。これは、この現象がＰＩ３Ｋ、及びカルシウムイオン、ＰＫＣの活性化に依存しないということを示唆するものである。それゆえ、ＷＫＹＭＶｍが独立的なシグナリング経路を通じて遊離したカルシウムイオンの濃度上昇及びＥＲＫ活性化を誘導したかのようにみえる。ＥＲＫ活性化に与える本発明のペプチドの効果を抗リン酸化ＥＲＫｓ抗体を利用したウェスタンブロット法で解析した。細胞質性のカルシウムの上昇活性とは異なり、ペプチド（ＷＫＧＭＶｍ、及びＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＲ、ＷＫＹＭＶＥ）はＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞においてＥＲＫｓのリン酸化を刺激した（図３Ｃ）。注目すべきことは、前記ペプチドがＰＬＣが介在する遊離したカルシウムイオンの濃度の上昇活性に影響を与えることができないということであり、これは非常に興味深い結果である。ＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＷＫＹＭＶｍ及び本発明のペプチドで刺激する場合、大部分のペプチドはまた、ＦＰＲＬ１細胞でＥＲＫｓリン酸化を誘導した（図３Ｃ）。この結果は全てのペプチドがＦＰＲＬ１発現細胞で細胞質性のカルシウム上昇を刺激することができるという先の結果（図１Ｂ）と相関している。
【００６９】
実施例６：ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＡｋｔリン酸化に対するペプチドの効果
化学誘引物質受容体の活性化はＰＩ３Ｋを通じて、Ａｋｔの活性化を誘導することはよく知られている（１９）。前記ペプチドで細胞の刺激、及び電気泳動、免疫ブロット分析を実施例５と同一の方法で実施した。
【００７０】
１μＭのＷＫＹＭＶｍでＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を多様な時間で刺激した（図４Ａ）。二つの細胞を１μＭのＷＫＹＭＶｍで処理する前にビークル又は１００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸ（２４時間）、５０μＭのＬＹ２９４００２（１５分）、５μＭのＧＦＸ（１５分）、１０μＭのＢＡＰＴＡ／ＡＭ（６０分）又は５０μＭのＰＤ９８０５９（６０分）で予め培養した（図４Ｂ）。ＦＰＲ及びＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１０μＭのＷＫＹＭＶｍ及び本発明のペプチドでそれぞれ２分又は５分刺激した（図４Ｃ）。各試料（３０μｇのタンパク質）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、リン酸化されたＡｋｔを抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いて免疫ブロット分析により測定を行った。抗Ａｋｔ抗体でウェスタンブロット分析を実施して、同一量の試料が実験に用いられたことを確認した。この結果は図４に示した。図４の結果は３つの独立した実験の代表値を示している。
【００７１】
ＷＫＹＭＶｍの刺激は、ＦＰＲ及びＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で時間依存的にＡｋｔのリン酸化を誘導した（図４Ａ）。ＷＫＹＭＶｍが誘導するＡｋｔのリン酸化はＰＴＸ、ＬＹ２９４００２に感受性を示すが、ＧＦＸ及びＢＡＰＴＡ／ＡＭには感受性を示さなかった。これはＰＴＸ感受性Ｇタンパク質及びＰＩ３Ｋ依存性であることを示している（図４Ｂ）。ＷＫＹＭＶｍだけでなく、本発明のペプチド（ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＥ、ＷＫＹＭＶＲ）でＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を刺激すると、Ａｋｔのリン酸化を誘導した（図４Ｃ）。ＷＫＹＭＶｍ及び本発明のペプチドはまた、ＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞においてもＡｋｔのリン酸化を刺激した（図４Ｃ）。これらの結果は２種類の形態の細胞において、ペプチドによるＥＲＫｓのリン酸化と相関する（図３Ｃ）。ＷＫＹＭＶｍが誘導するＥＲＫｓ及びＡｋｔの活性化はＰＩ３Ｋの活性化により介在されるので、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＥ、ＷＫＹＭＶＲはＦＰＲの下流でＰＩ３Ｋが介在するシグナリングを誘導するかのように思われる。
【００７２】
実施例７：エキソサイトーシスに対するペプチドの効果
顆粒の分泌は肥満細胞で最も重要な作用の一つである（２０）。顆粒分泌に与えるＷＫＹＭＶｍの効果を先に記載しているようなβ−ヘキソサミニダーゼ分泌の測定により調べた（１８）。簡単に述べると、ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（２×１０5／ウェル）を２４ウェル組織培養プレートで一晩培養した。細胞をＴｙｒｏｄｅ’ｓバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、５．６ｍＭ  グルコース、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．１ｇ／１００ｍｌ  ＢＳＡ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、各ペプチドで刺激した。多様な濃度のＷＫＹＭＶｍがＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において処置された（図５Ａ）。１μＭのＷＫＹＭＶｍを１０μＭのＢＡＰＴＡ／ＡＭの存在又は非存在下で二つの細胞株を刺激するために使用した（図５Ｂ）。刺激してから２０分後に氷上にプレートを置くことにより反応を終了させた。β−ヘキソサミニダーゼの培養液中への分泌は５０μｌの上層液又は細胞溶解液を２５μｌの５ｍＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミドと共に０．１ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）で３７℃、２時間培養することにより測定された。培養の最後に５０μｌの０．４Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3を添加した。４０５ｎｍでの吸光度を測定してその結果を図５に示した。データは３点測定を３回実施した実験の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）である。数値（平均値±標準誤差）は細胞に存在するβ−ヘキソサミニダーゼの全体量に対する百分率で示した。
【００７３】
ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を多様な濃度のＷＫＹＭＶｍで刺激すると、濃度依存的にβ−ヘキソサミニダーゼの産生を誘導した（図５Ａ）。ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において１００ｎＭ又は１０ｎＭのペプチドで刺激した時、最大の活性を示した（図５Ａ）。細胞質性のカルシウム上昇はＲＢＬ−２Ｈ３のような肥満細胞で顆粒の分泌に非常に重要であると報告されている（１８，２０）。また、ペプチドの刺激前のＢＡＰＴＡ／ＡＭ処理による細胞内カルシウムのキレート化がＷＫＹＭＶｍが誘導する顆粒の分泌をほとんど完全に阻害することも確認された（図５Ｂ）。
【００７４】
細胞質性のカルシウムの産生はＷＫＹＭＶｍ及びＷＫＹＭＶｍの置換された多くのペプチドによって誘導されるが、これらの中でいくつかのペプチド（ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチド）はそうではないという新たな発見から、ＲＢＬ細胞での顆粒分泌における前記ペプチドの効果を調べた。１０μＭの各ペプチドをＦＰＲ（図６Ａ）及びＦＰＲＬ１（図６Ｂ）発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に処置した。β−ヘキソサミニダーゼのペプチドが誘導する分泌は前記したように決定される。データは３点測定を３回実施した実験の平均値±標準誤差である。
【００７５】
ＦＰＲ細胞をペプチド（ＷＫＹＭＶｍ、ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＥ、ＷＫＹＭＶＲ）で刺激する場合、ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ，６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドを除いていくつかの置換ペプチドで顆粒の分泌が観察された（図６Ａ）。ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドはＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞では顆粒分泌に影響を与えなかった（図６Ａ）。このような結果はＷＫＧＭＶｍ、及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドが細胞質性のカルシウム上昇を誘導できないという先の結果（図１Ａ）と完全に相関している。ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞とは異なり、ｆＭＬＦ又はｗｋｙｍｖｍを除いた全てのぺプチド（ＷＫＹＭＶｍ、ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＥ，ＷＫＹＭＶＲ）はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において顆粒分泌を刺激した（図６Ｂ）。これもまた、ＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において前記ペプチドが細胞質性のカルシウムの上昇を刺激するという先の結果（図１Ｂ）と完全に相関している。
【００７６】
実施例８：細胞の走化性に対するペプチドの効果
走化性分析はＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒを修正した多重ウェルチャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して実施した。簡単に述べると、ポリカーボネートフィルター（８μｍ孔径）をＨＥＰＥＳが緩衝剤として働くＲＰＭＩ培地に５０μｇ／ｍｌのラットタイプIコラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で予めコーティングする。乾燥コーティングされたフィルターを異なる濃度のペプチドを含む９６ウェルチャンバー上に置く。ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１を発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞は１×１０6／ｍｌの無血清ＲＰＭＩの濃度でＲＰＭＩに懸濁され、その懸濁液のうち２５μｌを９６ウェル走化性チャンバーの上側ウェル上に載せた。３７℃で４時間培養した後、移動しなかった細胞を擦り落として除去し、フィルターを通過して移動した細胞を脱水、固定し、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ,Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。染色された細胞を前記ウェル中で無作為に選択された５つの高倍率視野（４００倍）で計数した。図７Ａは前記走化性分析結果を示している。ビークル、５０μＭのＬＹ２９４００２（１５分）、及び５０μＭのＰＤ９８０５９（６０分）で予め処理された細胞は１μＭのＷＫＹＭＶｍと共に走化性分析に使用され、その結果を図７Ｂに示した。移動した細胞の数を高倍率視野（４００倍）で計数して決定した。データは各々２点測定を３回実施した実験の平均値±標準誤差を示している。
【００７７】
ＷＫＹＭＶｍがモノサイト及び好中球のような貪食細胞の走化性移動を誘導できるという事実は知られている（１１）。Ｌｅ等はＦＰＲ及びＦＰＲＬ１への結合を通じてＷＫＹＭＶｍが誘導する細胞の走化性を明らかにした（１２）。予想したようにＷＫＹＭＶｍはＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞においてつり鐘状に濃度依存的な走化性移動の活性を示した（図７Ａ）。ＷＫＹＭＶｍが誘導する細胞走化性はＬＹ２９４００２及びＰＤ９８０５９に感受性を示した（図７Ｂ）。この結果はＷＫＹＭＶｍが誘導する細胞の走化性がＰＩ３Ｋ及びＭＥＫ依存性であることを示唆する。ＷＫＹＭＶｍはＰＩ３Ｋ及びＭＥＫの活性化を通じてＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の走化性移動を刺激する。
【００７８】
ＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における細胞の走化性について本発明のペプチドの効果を測定した。多様な濃度の各ペプチドをＦＰＲ又はＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞と共に走化性分析に使用した。移動した細胞の数は高倍率の視野（４００倍）で計数を測定した。データは２点測定を２回実施した実験の平均値±標準誤差を示している。
【００７９】
ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞では、ＷＫＹＭＶｍだけでなく置換したペプチド（ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＥ、ＷＫＹＭＶＲ）も細胞間の走化性を誘導した（図８Ａ）。置換したペプチドによる走化性に必要な濃度はＷＫＹＭＶｍによる場合より高かった（図８Ｂ）。置換したペプチドが誘導する走化性に関与するシグナリング経路で、ＰＩ３Ｋ及びＭＥＫが介在するシグナリングの関与に対して解析した。ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞がＬＹ２９４００２又はＰＤ９８０５９で前処理される場合、ＷＫＹＭＶｍ及び置換したペプチドが誘導するＲＢＬ細胞の移動はほとんど完全に阻害された（図７Ｂ及びデータは示さない）。ＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞では、ＷＫＹＭＶｍ及びペプチド（ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＥ、ＷＫＹＭＶＲ）はまた、濃度依存的に細胞の走化性を誘導した（図８Ｂ）。
【００８０】
本発明ではＦＰＲが異なるリガンドによって調節され、異なる細胞のシグナリング及び作用機能的な結果を導くという事実が初めて明らかになった。ＦＰＲのリガンド特異的な調節を知るために、多様なペプチド、ＦＰＲに対して影響を及ぼすリガンドを表１に記載するように作製した。前記ペプチドのうち、ＷＫＧＭＶｍ、ＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドはＦＰＲに結合し、ＰＩ３Ｋが介在するＡｋｔ及びＭＥＫが介在するＥＲＫｓの活性化を誘導する細胞の走化性移動に帰着する。これらペプチドは細胞質性のカルシウムの上昇に影響を与えることができない。ＷＫＹＭＶｍペプチドはＥＲＫｓ活性化だけでなく、細胞質性のカルシウムの上昇を刺激して走化性及び脱顆粒を導くので、ＦＰＲは異なるリガンドにより異なるように調節されうるということを示唆する。
【００８１】
最近、いくつかの報告によると、ＧＰＣＲｓは互いに異なるリガンドにより調節されるという事実が記載されている（２１，２２）。ＧＰＣＲのリガンド特異的な調節の過程において、異なるリガンドは受容体の互いに異なる構造的変化を誘導し、一定のエフェクター分子又はＧタンパク質受容体の選択的結合を誘導するということが示唆されている。表３及び図１Ａにおいて、ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチドは、ＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞においてＰＬＣが介在する細胞質性のカルシウムの上昇を刺激できないということが説明されている。しかし、これらペプチドはＦＰＲ発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞においてＥＲＫｓ及びＡｋｔリン酸化を刺激した（図３Ｃ）。ＷＫＹＭＶｍ及び本発明のペプチドが介在する細胞のシグナリングでは、細胞質性のカルシウムの上昇はＰＬＣ−βの活性化を通じてのＰＩの加水分解によって誘導されるが、ＥＲＫｓ及びＡｋｔリン酸化はそれぞれＭＥＫ及びＰＩ３Ｋの活性化により誘導される。これらの結果に注意を払うと、ＦＰＲに対するペプチドリガンドの結合はＦＰＲに構造的な変化を誘導し、このような構造的な変化はＧタンパク質が介在するＰＬＣ−β又はＧタンパク質が介在するＰＩ３Ｋと受容体の結合を従える。細胞質性のカルシウムの上昇を誘導できないいくつかの本発明のペプチド（ＷＫＧＭＶｍ及びＷＫＲＭＶｍ、６番目のＤ−Ｍｅｔを置換したペプチド）はＰＩ３Ｋ依存性の経路を通じてＥＲＫｓリン酸化を刺激できるために、前記ペプチドはＦＰＲに結合してＰＩ３Ｋ及びＭＥＫが介在するシグナリングの活性化に必要な構造変化を誘導してＲＢＬ−２Ｈ３細胞の走化性移動が行われるようにみえる。
【００８２】
ホルミルペプチド受容体ファミリーの２つの互いに異なる受容体であるＦＰＲ及びＦＰＲＬ１は、自然免疫応答において、重要な役割を果たすと報告されている（１，２）。現在まで、ホルミルペプチドリポキシンＡ４を含むいくつかの異なるリガンドの起源はＦＰＲ又はＦＰＲＬ１に結合すると報告されてきた（１）。Ｌｅ等はＷＫＹＭＶｍがＦＰＲ及びＦＰＲＬ１に結合すると報告した（１２）。
【００８３】
本発明において、本発明者は３番目のＴｙｒ又は６番目のＤ−Ｍｅｔを他のアミノ酸に置換すると、ＦＰＲのＰＬＣが介在する細胞質性のカルシウム上昇活性を消失するが、ＦＰＲＬ１の場合にはそうではないことを説明した（図１）。これらの結果は３番目のＴｙｒ及び６番目のＤ−ＭｅｔがＦＰＲによるＰＬＣの活性化には重要であるが、ＦＰＲＬ１による場合にはそうではないことを示している。この結果からＦＰＲ及びＦＰＲＬ１のリガンド結合箇所が互いに異なるということを導き出すことができる。
【００８４】
ＦＰＲを含むＧＰＣＲｓはヘテロ３量体Ｇタンパク質に対する結合を通じて細胞内シグナリングを誘導し、多くの研究グループではＧタンパク質の結合に関与する受容体の重要なアミノ酸残基を明らかにすることが試みられている（２３，２４）。ＦＰＲにおいて、Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ等は３５変異ＦＰＲｓを作製してＧタンパク質の結合及びＦＰＲの細胞シグナリングに与える変異の影響を調べた。その論文によると、Ｓ６３，及びＤ７１，Ｒ１２３，Ｃ１２４／Ｃ１２６がＦＰＲに対するＧタンパク質の結合に重要であることが示された（２４）。前記変異の中にはカルシウムの動員を介在させることができないＲ１２３Ａ変異がｆＭＬＦによりＥＲＫｓリン酸化の誘導を可能にしている（２４）。また、Ａｓｐ１２２及びＡｒｇ１２３は、保存された（Ｄ／Ｅ）ＲＹモチーフ（ＦＰＲにおけるＤＲＣ）を形成するものであるが、これらは受容体の不活性の構造を安定化させる水素結合ネットワークに関与すると仮定されている（２４）。その仮定において、受容体に対するリガンドの結合は水素結合ネットワークの変形を引き起こし、さらに一定のアミノ酸残基、例えばＤＲＹモチーフにおけるアルギニンが露出されてＧタンパク質と相互作用することができるようになる（２４）。ＷＫＧＭＶｍのようないくつかのペプチドはＥＲＫｓのリン酸化を誘導するが、カルシウムの動員は誘導できないことが示された。ＦＰＲに対してＷＫＹＭＶｍ又はＷＫＧＭＶｍの結合がレセプターの構造の変化を異なるように誘導するかどうか、すなわちＷＫＹＭＶｍがＤＲＹモチーフの水素結合の変形を含むＦＰＲの構造的変化を誘導するが、ＷＫＧＭＶｍは単にＤＲＹの水素結合に影響を与えずに受容体の特徴的な構造変化だけを誘導するかどうかを決定することが重要である。ＦＰＲＬ１の場合には、ＤＲＹモチーフを含む（ＦＰＲＬ１におけるＤＲＣ）が、Ｇタンパク質結合での役割は確認されなかった。この結果として、ＷＫＹＭＶｍだけでなくＷＫＧＭＶｍもＦＰＲＬ１発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞でカルシウムの動員を誘導した（図１Ｂ）。これらの結果はＷＫＹＭＶｍ又はＷＫＧＭＶｍがＦＰＲ又はＦＰＲＬ１においてＤＲＹモチーフの水素結合に影響を与えないことを示唆する。他の結合ポケットがペプチドの結合に関与し、さらなる働きとして、ＦＰＲに対するＷＫＹＭＶｍ又はＷＫＧＭＶｍの異なる結合パターンに関与する残基を同定することが重要になるだろう。
【００８５】
現在まで一定の天然リガンドがＦＰＲを互いに異なるように調節することは報告されていない。免疫系において脱顆粒又は走化性移動の異なる調節はさらに限定された調節を必要とする。このような観点において本発明のようにＦＰＲを異なるように調節するリガンドを同定することが重要である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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