(57)【要約】【課題】大きさが等しい複数種の細胞群を含む細胞懸濁液の中から所望の種類の細胞のみを選択的に分離する。【解決手段】細胞を含む細胞懸濁液Ａを流動させる主流路２と、該主流路２から分岐する分岐流路３と、主流路２の流量を調節して層流を形成する主流路流量調節部６と、分岐流路３の上流に配置された電極４と、該電極４に高周波電圧を印加し主流路２の分岐流路３側の壁面２ａからの距離に応じて電位傾度が変化する高周波不平等電界を発生させる電圧供給部５とを備える細胞分離装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を流動させる主流路と、該主流路から分岐する分岐流路と、前記主流路の流量を調節して層流を形成する主流路流量調節部と、前記分岐流路の上流に配置された電極と、該電極に高周波電圧を印加し前記主流路の前記分岐流路側の壁面からの距離に応じて電位傾度が変化する高周波不平等電界を発生させる電圧供給部とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
前記分岐流路の流量を調節する分岐流路流量調節部を備える請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記分岐流路が、前記主流路の流動方向に間隔をあけて複数設けられ、前記電極が各分岐流路の上流に配置されている請求項１または請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記電圧供給部が、前記各分岐流路の上流に配置された電極に異なる周波数の高周波電圧を印加する請求項３に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
細胞懸濁液を層流状態で流動させる主流路内に、該主流路の壁面からの距離に応じて電位傾度が変化する高周波不平等電界を形成し、該高周波不平等電界の下流において前記壁面に沿って流動する細胞懸濁液を分岐する細胞分離方法。
【請求項６】
前記主流路から分岐される細胞懸濁液の流量を調節する請求項５に記載の細胞分離方法。
【請求項７】
前記高周波不平等電界を、前記主流路の流動方向に間隔をあけて複数形成し、各高周波不平等電界の下流において前記壁面に沿って流動する細胞懸濁液を分岐する請求項５または請求項６に記載の細胞分離方法。
【請求項８】
前記各高周波不平等電界の周波数が異なる請求項７に記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置および細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の細胞の中から所望の細胞のみを分離する方法として水力学的フィルトレーション法が知られている（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照。）。この水力学的フィルトレーション法は、層流を形成しつつ細胞懸濁液を流動させる主流路内の壁面に設けた複数の微細な分岐流路によって主流路内に流動する細胞懸濁液を吸引することにより、主流路の壁面に沿って全ての細胞を整列させ、その下流において分岐流路に分岐する細胞懸濁液の流量を調節することで壁面に沿うごく薄い流れの層内に配置される大きさの細胞のみを選択的に分離する方法である。
【０００３】
【非特許文献１】松田美由紀、“水力学的フィルトレーションを利用した血球細胞の分離”、[online]、平成１８年９月１７日、化学工学会、[平成２０年４月３日検索]、インターネット＜URL;http://www2.scej.org/bio/news/news17.html#03＞
【非特許文献２】ＮＥＤＯ技術開発機構研究評価部、平成１８年度プロジェクトの評価報告書、p.III-599−p.III-601、[online]、平成１８年９月、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、[平成２０年４月３日検索]、インターネット＜URL;http://www.nedo.go.jp/iinkai/hyouka/houkoku/18h/jigo/15_4.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の水力学的フィルトレーション法は、細胞の大きさによって分離することはできるが、異なる種類の細胞であっても大きさが同じであれば同時に分離されてしまうという問題点がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、大きさが等しい複数種の細胞群を含む細胞懸濁液の中から所望の種類の細胞のみを選択的に分離することができる細胞分離装置および細胞分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液を流動させる主流路と、該主流路から分岐する分岐流路と、前記主流路の流量を調節して層流を形成する主流路流量調節部と、前記分岐流路の上流に配置された電極と、該電極に高周波電圧を印加し前記主流路の前記分岐流路側の壁面からの距離に応じて電位傾度が変化する高周波不平等電界を発生させる電圧供給部とを備える細胞分離装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、主流路に流動する細胞懸濁液の流量を主流路流量調節部で調節して主流路内に層流を形成する。電圧供給部の作動により電極に高周波電圧を印加すると主流路内に高周波不平等電界が発生する。該高周波不平等電界を通過する細胞には誘電泳動特性によって高周波電圧の周波数に依存する誘電泳動力が作用し、正の誘電泳動特性をもつ細胞は電位傾度が大きくなる方向へ、負の誘電泳動特性をもつ細胞は電位傾度が小さくなる方向へ移動する。その結果、特定の誘電泳動特性をもつ細胞が主流路の壁面に沿って流動することになり、主流路の分岐流路側の壁面に沿って流動する細胞のみが下流の前記分岐流路において吸引され該分岐流路へ分岐される。
【０００８】
すなわち、微細な分岐流路によって全ての細胞を吸引して壁面に沿って流動させる従来の水力学的フィルトレーション法とは異なり、高周波電圧の周波数を調節するだけで、所望の誘電泳動特性をもつ細胞のみを選択的に壁面に沿って流動させることができる。その結果、同じ大きさを有する細胞の中から所望の種類の細胞のみを精度よく分離することができる。
【０００９】
上記発明においては、上記分岐流路の流量を調節する分岐流路調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、分岐流路の流量の増減が可能となり、前記主流路の壁面に沿って流動し、分岐流路に流れ込む薄い流れの層の厚さを変化させて、前記分岐流路において分岐する細胞の大きさを調節することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記分岐流路が主流路の流動方向に間隔をあけて複数設けられ、前記電極が各分岐流路の上流に配置されていてもよい。
このようにすることで、主流路内の壁面に沿って流動する細胞のうち、上流側の分岐流路で分岐できなかった細胞を下流側の分岐流路で分岐することが可能となり、所望の細胞の回収率を向上させることができる。また、下流において分岐流路の流量を段階的に増加させることにより、下流の分岐流路ほど大きな細胞を分岐することができ、同じ誘電泳動特性をもつ細胞を大きさによって分離することもできる。
【００１１】
上記発明においては、前記電圧供給部が前記各分岐流路の上流に配置された電極に異なる周波数の高周波電圧を印加してもよい。
このようにすることで、複数の電極に異なる周波数の高周波電圧を印加し、前記各分岐流路上流において異なる誘電泳動特性をもつ細胞を主流路内の前記分岐流路側の壁面に沿って流動させることができ、誘電泳動特性の異なる複数の種類の細胞を分離することができる。
【００１２】
また、本発明は、細胞懸濁液を層流状態で流動させる主流路内に、該主流路からの距離に応じて電位傾度が変化する高周波不平等電界を形成し、該高周波不平等電界の下流において前記壁面に沿って流動する細胞懸濁液を分岐する細胞分離方法を提供する。
【００１３】
本発明によれば、細胞懸濁液が層流状態で流動する主流路内に該主流路からの距離に応じて電位傾度が変化する高周波不平等電界を形成すると、該高周波不平等電界を通過する細胞には誘電泳動特性によって誘電泳動力が作用する。正の誘電泳動特性をもつ細胞は電位傾度が大きくなる方向へ、負の誘電泳動特性をもつ細胞は電位傾度が小さくなる方向へ移動する。その結果、特定の誘電泳動特性をもつ細胞を主流路内の壁面側に引き寄せ該壁面に沿って流動させ、下流の分岐流路において分岐し分離することができる。
【００１４】
上記発明においては、前記主流路から分岐される細胞懸濁液の流量を調節してもよい。
このようにすることで、前記主流路内壁面に沿って流動する細胞のうち分岐流路へ分岐させる細胞の大きさを選択することができる。
【００１５】
上記発明においては、前記高周波不平等電界を、前記主流路の流動方向に間隔をあけて複数形成し、各高周波不平等電界の下流において前記壁面に沿って流動する細胞懸濁液を分岐してもよい。
このようにすることで、主流路内の壁面に沿って流動する細胞のうち上流側の分岐流路で分岐できなかった細胞を下流側の分岐流路で分岐させることが可能となり、細胞の回収率を向上させることができる。また、下流において分岐流路の流量を段階的に増加することにより、特定の誘電泳動特性をもつ細胞を大きさによって分離することができる。
【００１６】
上記発明においては、各高周波不平等電界の周波数が異なってもよい。
このようにすることで、各分岐流路上流で異なる誘電泳動特性をもつ細胞を主流路内の壁面に沿って流動させ各分岐流路へ分岐することにより、ひとつの工程で誘電泳動特性の異なる複数の種類の細胞を分離することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、大きさが等しい複数種の細胞群を含む細胞懸濁液の中から所望の種類の細胞のみを選択的に分離することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、細胞を含む細胞懸濁液Ａを流動させる主流路２と、該主流路２の流動方向に間隔をあけて複数設けられた分岐流路３と、各分岐流路３の上流の分岐流路３側の壁面２ａに配置された電極４と、該電極４に高周波電圧を印加し高周波不平等電界を発生させる電圧供給部５とを備えている。細胞には正の誘電泳動特性を有する細胞Ａ１，Ａ２と、負の誘電泳動特性を有する細胞Ａ３とがある。細胞Ａ２は細胞Ａ１より大きい粒径を有している。
【００１９】
主流路２には、その流量を調節して層流を形成する主流路流量調節部６が設けられ、分岐流路３には、その流量を調節する分岐流路流量調節部７が設けられている。
各流量調節部６，７は、例えば、主流路２または分岐流路３に設けられたバルブであり、その開度を調節することにより、流量を調節できるようになっている。
【００２０】
電極４は、例えば、図２に示されるように、複数の直棒状電極部４ａ，４ｂを壁面２ａに沿う方向に平行に間隔をあけて配列してなる２つの櫛歯状電極４Ａ，４Ｂを、各櫛歯状電極４Ａ，４Ｂの直棒状電極部４ａ，４ｂが交互に配置されるように配置することにより構成されている。
【００２１】
このような櫛歯状電極４Ａ，４Ｂに高周波電圧を印加すると、図３に示されるように電界強度の勾配（電位傾度）を有する高周波不平等電界が発生するようになっている。図３は電界強度を等高線により示しており、電界強度は、直棒状電極部４Ａ，４Ｂに近いほど強く、離れるほど弱くなっている。電位傾度はこの等高線の密度が密であるほど大きく、疎であるほど小さい。本実施形態においては、電極４に近づくほど電位傾度が大きくなっているので、壁面２ａから離れるに従って電位傾度が小さくなるように設定されている。
【００２２】
各電極４の電圧供給部５は、異なる周波数の高周波電圧をそれぞれの電極４に印加するようになっている。したがって、主流路２内の各電極４の周囲に発生する高周波不平等電界は相違し、そこを通過する細胞Ａ１〜Ａ３に作用する誘電泳動力も相違するようになっている。
【００２３】
細胞Ａ１〜Ａ３に誘電泳動力が作用すると、図４に示されるように、細胞Ａ１〜Ａ３は電極４に近づく方向あるいは電極４から離れる方向へ移動する。ここでは正の誘電泳動特性を有する細胞Ａ１，Ａ２のみが主流路２の分岐流路３側の壁面２ａに引きつけられ該壁面２ａに沿って流動するようになっている。細胞Ａ１〜Ａ３に作用する誘電泳動力は細胞Ａ１〜Ａ３の誘電泳動特性と電極４に印加する高周波電圧の周波数に依存し、電極４に異なる周波数の高周波電圧を印加することで異なる種類の細胞を前記壁面２ａに沿って流動させることができるようになっている。
【００２４】
その結果、図４に示されるように、所望の種類の細胞Ａ１，Ａ２のみを分岐流路３の上流において該分岐流路３側の壁面２ａに沿って流動させることができ、下流の分岐流路３内に流れ込む薄い流れの層８内に配置されている大きさの細胞Ａ１のみが前記分岐流路３において分岐することができるようになっている。
【００２５】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて、複数の種類の細胞Ａ１〜Ａ３を含む細胞懸濁液Ａから、特定の誘電泳動特性と大きさを有する細胞Ａ１を分離する細胞分離方法について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて所望の種類の細胞Ａ１を分離するには、主流路２内に細胞懸濁液Ａを流動させ、主流路流量調節部６により主流路２内の流量を調節することによって、細胞懸濁液Ａを層流状態で流動させる。
【００２６】
次いで、主流路２の流動方向に間隔をあけて配置された電極４に異なる周波数の高周波電圧を印加して主流路２の分岐流路３側の壁面２ａから離れるに従って電位傾度が小さくなる高周波不平等電界を発生させる。
そして、各分岐流路３に設けられた分岐流路流量調節部７により各分岐流路３内に流れ込む薄い流れの層８の厚さを分離したい細胞Ａ１の大きさに合わせて設定しておく。
【００２７】
主流路２内を流動する細胞Ａ１〜Ａ３は、高周波不平等電界が発生している領域に差し掛かると、細胞Ａ１〜Ａ３のもつ誘電泳動特性によって誘電泳動力を受け、主流路２の流動方向に交差する方向へ移動するようになる。つまり、正の誘電泳動特性をもつ細胞Ａ１，Ａ２は電位傾度の大きな主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａの方向へ、負の誘電泳動特性をもつ細胞Ａ３は電位傾度の小さな主流路２の分岐流路３と反対側の壁面２ｂの方向へ移動する。
【００２８】
その結果、各電極４によって発生されている周波数の高周波不平等電界において正の誘電泳動特性を有する特定の種類の細胞Ａ１，Ａ２が主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａに沿って流動するようになる。そして、前記壁面２ａに沿って流動する特定の種類の細胞Ａ１，Ａ２のうち、下流の分岐流路３内へ流れ込む薄い流れの層８内に配置されている大きさの細胞Ａ１のみが分岐流路３へ分岐される。
【００２９】
すなわち、本実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法によれば、微細な分岐の流路によって全ての細胞を吸引して壁面に沿って流動させる従来の水力学的フィルトレーション法とは異なり、高周波電圧の周波数の調節をするだけで、所望の誘電泳動特性をもつ細胞のみを選択的に壁面に沿って流動させ、大きさが等しい細胞群の中から所望の種類の細胞のみ選択的に分離することができるという利点がある。
【００３０】
なお、本実施形態においては、各分岐流路３を分岐流路流量調節部７によって流量を調節することにより、下流に向かうほど流量が増加するように設定してもよい。このようにすることで、主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａに沿って流動する細胞のうち、下流になるほど大きな細胞を分岐流路３へ分岐することができ、細胞を大きさによって分離することができる。
【００３１】
また、本実施形態においては、主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａから離れるに従って電位傾度が小さくなる高周波不平等電界を発生させ、正の誘電泳動特性を有する細胞を分離することとしたが、これに代えて、主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａから離れるに従って電位傾度が大きくなる高周波不平等電界を発生させ、負の誘電泳動特性を有する細胞を分離することとしてもよい。
【００３２】
また、本実施形態においては、電極４を主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａに設置したが、これに代えて、電極４を主流路２内の分岐流路３と反対側の壁面２ｂに設置してもよい。
このようにすることで、同じ構造と機能をもつ電極４を用いて負の誘電泳動特性を有する細胞を分離することができる。また、電極４を設置する箇所を選択でき細胞分離装置１の設計の自由度を増すことができる。
【００３３】
また、本実施形態においては、櫛歯状の電極４を主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａに配置することとしたが、これに代えて、図５に示されるように、ピン電極４ｃと平板電極４ｄを主流路２内の分岐流路３の上流の壁面に対向させて設置してもよい。
このようにすることで、電極４の構造を簡易にすることができる。
【００３４】
また、本実施形態においては、主流路２の流動方向に間隔をあけて配置された複数の電極４において異なる周波数の高周波不平等電界を発生させることとしたが、これに代えて、主流路２の流動方向に間隔をあけて配置された複数の電極４において同一の周波数の高周波不平等電界を発生させてもよい。
このようにすることで、所望の種類の細胞を複数の分岐流路３の上流において主流路２内の分岐流路３側の壁面２ａに沿って流動させることができ、上流側の分岐流路３で分岐できなかった細胞を下流側の分岐流路３で分岐させることができる。その結果、所望の種類の細胞の回収率を向上させることができる。また、下流において分岐流路３の流量を段階的に増加することにより、特定の誘電泳動特性をもつ細胞を大きさによって分離することができる。
【００３５】
また、本実施形態においては、分岐流路３は主流路２の側面、上面、底面のいずれに設けてもよいが、底面が好ましい。
分岐流路３を流動する細胞には、重力と浮力が作用するが、重力の方が浮力より大きいため細胞は重力に従って鉛直方向下向きへ移動していく。分岐流路３を主流路２の底面に設けることで、細胞は作用する重力に逆らうことなく分岐流路３を鉛直方向下向きへ流動することができるようになり、細胞懸濁液Ａを主流路２から分岐流路３へ吸引するための力を最小限に抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置の電極の一例である櫛歯状電極の構成を示す図である。
【図３】図２の櫛歯状電極の周囲に形成される高周波不平等電界と電位傾度の関係を等高線により示す図である。
【図４】流路内の細胞が誘電泳動力により移動する様子の一例を示す図である。
【図５】図１の細胞分分離装置の電極の一例であるピン電極と平板電極の構成および電位傾度との関係を示す図である。
【符号の説明】
【００３７】
Ａ  細胞懸濁液
１  細胞分離装置
２  主流路
３  分岐流路
４  電極
５  電圧供給部
６  主流路流量調節部
７  分岐流路流量調節部
８  主流路の分岐流路側壁面に沿って流動し、下流の分岐流路内に流れ込む薄い流れの層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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