(57)【要約】【課題】培地にＬ−アミノ酸を析出させながら蓄積させる、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造において、生産性の向上、又はＬ−アミノ酸結晶中の純度を向上させる。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地にＬ−アミノ酸を析出させながら蓄積させる、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法において、前記培地に、水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビニル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビニル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含ませる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地にＬ−アミノ酸を析出させながら蓄積させる、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法において、前記培地が、水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビニル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビニル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アルギン酸ソータ、及びポリアクリル酸ソーダからなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン及びＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーがメチルセルロースであり、液体培地がメチルセルロースを１ｇ／Ｌ以上含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵工業に関し、微生物を利用した発酵法によりＬ−アミノ酸、特に疎水性アミノ酸、並びにＬ−スレオニン及びＬ−グルタミン酸を効率よく製造する方法に関する。疎水性Ｌ−アミノ酸は、医療を目的とする栄養混合物の成分として利用されている。さらに、動物用飼料添加物、製薬業及び化学工業における試薬としてさまざまに利用されている。また、Ｌ−フェニルアラニンは、甘味料の原料としても用いられる。また、Ｌ−スレオニンは飼料用として、Ｌ−グルタミン酸は、調味料原料等として広く用いられている。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌又は腸内細菌科に属するアミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのアミノ酸生産菌としては、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株、あるいは遺伝子組換えによりＬ−アミノ酸生合成酵素が増強された組換え体等が用いられている。
【０００３】
例えば、疎水性アミノ酸のＬ−トリプトファン発酵においては、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、トリプトファンシンターゼ活性が増強された細菌（WO94/08031号参照）、及びトリプトファンオペロンが増幅された細菌が挙げられる（特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、米国特許第4,371,614）。
【０００４】
また、Ｌ−グルタミン酸発酵においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gdh）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（icdA）、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（acnA, acnB）、及びクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が挙げられる（特開昭６３−２１４１８９号公報）。
【０００５】
また、Ｌ−スレオニン発酵においては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）を強化した微生物（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【０００６】
上述のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産能はかなり高まっているが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な疎水性Ｌ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００７】
一方、培養液中に蓄積するＬ−アミノ酸を晶析せしめながら発酵を行う方法が知られている（特開昭62-288号、欧州特許公報第1078989号）。この方法は、培養液中に蓄積するＬ−アミノ酸を析出させることにより、培養液中のＬ−アミノ酸の濃度を一定に維持することを目的にしている。
【０００８】
また、Ｌ−グルタミン酸については、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら蓄積させることができる微生物を用いてＬ−グルタミン酸を製造する方法が開示されている（米国特許第6905819号）。
【０００９】
また、これまでに疎水性Ｌ−アミノ酸の晶析法としては、水溶性セルロース誘導体を用いてＬ−アミノ酸を精製する方法（特公平5-76463）が知られていた。しかし、Ｌ−アミ
ノ酸を析出させながら発酵を行う方法において、水溶性セルロース誘導体等のポリマーを培地中に添加して、Ｌ−アミノ酸の生産能を高めながら培地中にＬ−アミノ酸を析出させる方法は知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の発酵生産における生産性の向上、又はＬ−アミノ酸結晶中の純度の向上を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意研究の結果、発酵培地中に、水溶性セルロース誘導体、ポリビニル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを添加することによって、Ｌ−アミノ酸の生産性が向上すること、及び培地中に析出するＬ−アミノ酸の結晶中の不純物を低減させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地にＬ−アミノ酸を析出させながら蓄積させる、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法において、前記培地が、水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビニル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビニル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含むことを特徴とする方法。
（２）前記ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アルギン酸ソータ、及びポリアクリル酸ソーダからなる群より選ばれる前記方法。
（３）前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である前記方法。
（４）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌である前記方法。
（５）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン及びＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる前記方法。
（６）前記ポリマーがメチルセルロースであり、液体培地がメチルセルロースを１ｇ／Ｌ以上含むことを特徴とする前記方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の生産法において、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させること、及び／又は、培地中に析出するＬ−アミノ酸の結晶中の不純物を低減させることが可能となる。Ｌ−アミノ酸の生産性には、対糖収率の向上、及び／又は生産速度の向上が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の製造法は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地にＬ−アミノ酸を析出させながら生成蓄積させることを含む、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法において、培地が水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビニル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビニル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含むことを特徴とする方法である。
【００１５】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸」は、微生物を用いた発酵法において培地中に析出し
ながら蓄積するものであれば特に制限されない。具体的には、疎水性アミノ酸及び酸性アミノ酸が挙げられる。疎水性アミノ酸としては、分岐鎖Ｌ−アミノ酸である、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、芳香族Ｌ−アミノ酸であるＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としてはＬ−グルタミン酸が挙げられる。また、前記Ｌ−アミノ酸には、Ｌ−スレオニンも含まれる。
【００１６】
本発明において、水溶性セルロース誘導体としては、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート等が、水溶性ポリビニル化合物又は極性有機溶媒溶解性ポリビニル化合物としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート等が、水溶性澱粉誘導体としては、ヒドロキシプロピルスターチ、ゼラチン等が、アルギン酸塩としては、アルギン酸アルカリ金属塩等が、またはポリアクリル酸塩としては、ポリアクリル酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００１７】
これらのポリマーは、単独で培地に添加されてもよく、２種又はそれ以上の任意の組合わせで添加されてもよい。
【００１８】
培地中に添加するポリマーの濃度は、目的のＬ−アミノ酸の生成及び析出が阻害されない濃度であれば特に制限されない。好適なポリマーの濃度は、使用する微生物、目的Ｌ−アミノ酸、及び用いるポリマーの種類に応じて、適宜設定することができる。例えば、ポリマーを種々の濃度で培地に添加し、Ｌ−アミノ酸の収率又は生産速度、及び析出量を測定することによって、好適な濃度を決定することができる。ポリマーの濃度として具体的には、例えば、好ましくは10mg/L以上、より好ましくは1g/L以上、特に好ましくは1.7g/L以上が挙げられる。濃度の上限は、目的のＬ−アミノ酸の生成及び析出が阻害されない濃度であればいずれでもよいが、例えば2g/Lが挙げられる。
【００１９】
培地中のポリマーの量は、ポリマーの種類に応じた方法によって測定することができる。例えば、メチルセルロース等は、メトキシル基定量法によって測定できる。メトキシル基定量法は、試料にヨウ化水素酸を加えて加熱し、生じるヨウ化メチルを臭素で酸化し，生じたヨウ素酸をチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定してメトキシル基を定量する方法である（参考：http://www.tokyo-eiken.go.jp/additives/kijun-1.html）。
【００２０】
本発明において、ポリマーを培地に添加する時期は、目的のＬ−アミノ酸が析出しながら蓄積する限りいずれでもよく、培養当初からポリマーが培地中に添加されていてもよく、培養途中に添加してもよい。また後述する流加培養によってポリマーを培地に添加してもよい。
【００２１】
本発明で用いられる培地は、栄養源として炭素源、窒素源とポリマーを含んでいればいずれでもよい。また、本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed−batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができる。
【００２２】
ここで本発明において、上記流加培養とは、培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また、連続培養とは、培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に流加するとともに、容器から培地（通常、流加する培地と当量）を抜き取る方法をいう。また、「初発培地」とは、流加培養又は連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地のことを意味し、「流加培地」とは、流加培養又は連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地のことを意味する。流加培地は、微生物の生育に必要な成分の全てを含んでいてもよいが、一部のみを含むものであってもよい。また、本発明において「発酵培地」とは、発酵槽
中の培地を意味し、この発酵培地から疎水性Ｌ−アミノ酸が回収される。また、本発明において、「発酵槽」とは、疎水性Ｌ−アミノ酸生産を行う器を意味し、その形状は問わず、発酵タンクを用いてもジャーファーメンターを用いてもよい。また、その容量は疎水性Ｌ−アミノ酸を生成・回収できる容量であればいずれでもよい。
【００２３】
尚、前記のとおり、ポリマーは、培養初期に添加しても、培養途中に添加してもよいが、例えば、本発明の方法が、Ｌ−アミノ酸生産能を持つ微生物を増殖させる段階（増殖期）と、Ｌ−アミノ酸を産生させる段階（Ｌ−アミノ酸生産期）を含む場合、少なくともＬ−アミノ酸生産期において一定濃度含んでいることが好ましい。
本発明における「増殖期」とは、培養開始から３時間、好ましくは６時間、特に好ましくは、１０時間以内の、炭素源が主に菌体生育に使用されている時期、すなわち微生物が対数的に増殖している時期を意味し、本発明における「Ｌ−アミノ酸生産期」とは、培養開始から３時間以降、好ましくは６時間以降、特に好ましくは１０時間以降炭素源が主にＬ−アミノ酸生産に用いられている時期を意味する。
【００２４】
本発明に用いられる培地に含まれる炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、特にグルコース、スクロースが好ましい。その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。また、炭素源となる原料としては、ケインモラセス、ビートモラセス、ハイテストモラセス、シトラスモラセスを用いてもよいし、セルロース、デンプン、コーン、シリアル、タピオカ等の天然原料の加水分解物を用いてもよい。また培養液中に溶存した二酸化炭素も炭素源として使用出来る。これらの炭素源が初発培地にも流加培地にも用いることができる。培地中にこれらの炭素源を１種のみ含んでいてもよいし、２種以上含んでいてもよい。また、初発培地、流加培地とも、同じ炭素源を用いてもよいし、流加培地の炭素源を初発培地と変更してもよい。例えば、初発培地の炭素源をグルコースとし、流加培地の炭素源をスクロースとする場合である。
【００２５】
本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含んでいてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【００２６】
また本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源を含んでいることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。
【００２７】
また本発明の培地には、炭素源、窒素源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）を含んでいてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。特に芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸の場合、生合成系が共通しているので、微生物が後述のように、目的アミノ酸以外の生合成が弱化されている場合がある。このような場合、生合成系が弱化されたアミノ酸を培地中に添加することが好ましい。例えば目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラニン及び/またはチロシン、目的アミノ酸がＬ−フェニルアラニンの場合、Ｌ−トリプトファン及び/またはＬ−チロシンを添加することが望ましい（WO2003048374号パンフレット）。
【００２８】
微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12、ピリドキシン等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【００２９】
また本発明の培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−アミノ酸生産菌は、後述のようにＬ−アミノ酸生合成経路が強化されており、Ｌ−アミノ酸分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−リジン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。
【００３０】
初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地の両方がポリマーを含む場合は、ポリマー濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００３１】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３０〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和する。尚、目的アミノ酸が酸性アミノ酸、例えばＬ−グルタミン酸の場合には、ｐＨは３〜９、好ましくは３〜５で行うことが望ましい。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ−アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。尚、Ｌ−アミノ酸は培地中に溶解していても、析出していてもよいが、少なくとも一部は析出していることが好ましい。
【００３２】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００３３】
本発明においては、Ｌ−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、回分培養又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【００３４】
これらの培養法の場合、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を添加して繰り返し培養を行ってもよい。新たに添加する培地とは、炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましい。炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００３５】
本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的に糖や栄養源の供
給が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【００３６】
炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【００３７】
また、流加培養を行う際に、糖の量が、流加培養液あるいは発酵培地全体の炭素源量として、30g/Lを超えない程度で流加させることが好ましく、20g/L以下、10g/L以下で制御することが好ましい。特に、微生物の対数増終了時以降に、糖濃度が前記濃度範囲となるように制御することが好ましい。炭素源の流加速度は、米国特許5,912,113号明細書記載の方法を用いて制御することが出来る。また、糖とリン酸が菌体生育の制限因子となる濃度で糖とリン酸を流加することが好ましく、流加培養液に含まれるリン酸の量としては、P/C ratioで２以下、好ましくは1.5以下、さらに好ましくは1以下である（米国特許5,763,230号明細書参照）。
【００３８】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ−アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【００３９】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行う。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように培養することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【００４０】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに開始することが望ましく、例えば開始時間としては最大で流加を始めた5時間後、望ましくは3時間後、さらに望ましくは最大で1時間後である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。
【００４１】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ−アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【００４２】
本発明に用いる微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、液体培地で培養したときに培地にＬ−アミノ酸を析出させながら蓄積させることができる微生物である。
【００４３】
各アミノ酸の20℃での溶解度は、表１の通りであり、Ｌ−トリプトファン発酵の場合10.6g/L以上、Ｌ−フェニルアラニン発酵の場合27.4g/L以上、Ｌ−チロシン発酵の場合0.38g/L、Ｌ−イソロイシン発酵の場合41.2g/L以上、Ｌ−ロイシン発酵の場合23.8g/L以上、Ｌ−バリン発酵の場合57.5g/L以上、Ｌ−グルタミン酸発酵の場合、7.2g/L以上のＬ−アミノ酸を蓄積できる菌株が望ましい。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
Ｌ−グルタミン酸を含む水溶液のｐＨを低下させると、Ｌ−グルタミン酸はγ−カルボキシル基のｐＫａ（４．２５）付近で溶解度は著しく減少し、等電点（ｐＨ３．２）で溶解度は最も低くなる。培地組成によっても異なるが、通常には、Ｌ−グルタミン酸は約３０℃においては、ｐＨ３．２では１０〜２０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．０では３０〜４０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．７では５０〜６０ｇ／Ｌ溶解する。
【００４６】
本発明の微生物又はそれを育種するための親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物や、コリネ型細菌等を用いることができる。また、メタノールからＬ−アミノ酸を生産できる、メチロフィラス属細菌、メチロバチルス属細菌などのメタノール資化性細菌を用いてもよい。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌が挙げられ、またその他の微生物としては、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等に属する酵母などが挙げられる。
【００４７】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America ）。
【００４８】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、
パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００４９】
メチロフィラス属細菌として具体的には、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられ、代表的な株としてはAS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株はナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。
【００５０】
メチロバチラス属細菌として具体的には、メチロバチラス・グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes）、メチロバチラス・フラゲラタム(Methylobacillu flagellatum)等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスとしては、T-11株（NCIMB 11375）、ATCC 21276株、 ATCC 21371株、ATR80株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載)、A513株（Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスNCIMB 11375株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。また、メチロバチラス・フラゲラタムとしては、KT株(Arch. Microbiol., (1988), 149巻、p441-446に記載)等が挙げられる。
【００５１】
コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在はコリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００５２】
このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシェンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００５３】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス  AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００５４】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる（住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている（http://www.atcc.org/参照）。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM  BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００５５】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。
【００５６】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００５７】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
以下、具体的にアミノ酸生産能を付与する方法とアミノ酸生産菌について例示する。
【００５８】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる（欧州出願公開763127号明細書）。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラニン生合成系、Ｌ−チロシン生合成系を弱化させてもよい（US4,371,614）。
【００５９】
また、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、aroFの場合、Ｎ末端より１４７番目のＬ−アスパラギン酸または１８１番目のＬ−セリンが他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６番目のＬ−アスパラギン酸、１４７番目のＬ−メチオニン、１５０番目のＬ−プロリンもしくは２０２番目のＬ−アラニンの１アミノ酸残基、または１５７番目のＬ−メチオニン及び２１９番目のＬ−アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族生産アミノ酸生産菌を得ることができる（EP0488424）。
【００６０】
また、分岐鎖アミノ酸の合成に関与する遺伝子として、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが挙げられるが、同オペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを微生物に保持させることによって、これらのＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができる。
【００６１】
芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸はそれぞれ生合成系が共通しており、目的とするＬ−アミノ酸以外の芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸に固有の生合成系を弱化した株を用いることが好ましい。例えば、目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラ
ニン、Ｌ−チロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がＬ−フェニルアラニンの場合、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がＬ−バリンの場合、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がＬ−イソロイシンの場合、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がＬ−ロイシンの場合、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン固有の生合成系を弱化することによって、目的Ｌ−アミノ酸を効率よく生産する菌株を得ることができる。生合成系を弱化することは、その生合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を導入すること、また弱化したい生合成系により合成されるＬ−アミノ酸を要求する株を、同Ｌ−アミノ酸を含有する合成培地を用いて取得することにより達成できる。
以下に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。
【００６２】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００６３】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６４】
また、Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、３−フォスフォセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株(WO2004/090125)、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された株（WO2005/103275）が挙げられる。
【００６５】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプト
ファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６６】
コリネ型細菌としてはサルフアグアニジンに耐性株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ１２１１８（FERM BP-478  特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開S63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナ−ゼをコ−ドする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。
【００６７】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６８】
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したCornebacterium glutamicum BPS-13株
(FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号  JP 02303495）、チロシン要求性株（JP 05049489）等を使用することができる。
【００６９】
また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB,mtrや、Ｌ−チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ−フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
【００７０】
Ｌ−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。
【００７１】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。ilvGMEDAオペロンのアテニュエーションに必要な領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００７２】
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Mosc
ow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００７３】
コリネ型細菌のＬ−バリン生産菌としては、例えば、Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼやivlCによりコードされるイソメロリダクターゼ(国際公開パンフレットWO00-/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン及び/又はＬ−イソロイシン及び/又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。
【００７４】
Ｌ−バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD-パントセナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開パンフレットWO0050624号）。
【００７５】
Ｌ−バリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。
例えば、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニン要求性，ならびにＤ−リボ−ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつＬ−バリン生産能を有する変異株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034） や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(-フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。
【００７６】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDＬ−エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００７７】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α−ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【００７８】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンな
どのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００８０】
コリネ型細菌のＬ−ロイシン生産菌としては、２−チアゾールアラニンかつβ−ハイドロキシロイシン耐性株（特開平８−２６６２９５）、バリンアナログ耐性株（特開昭６３−２４８３９２）、バリン要求性株（特公昭３８−４３９５）、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）耐性株（特公昭５１−３７３４７）、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン要求性株（特公昭５４−３６２３３）が挙げられる。
【００８１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌として好適な菌株は、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221A、EP1033407Aに開示されたものが挙げられる。
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００８３】
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を用いて改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERMBP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERMBP−4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERMBP−4174；フランス特許公報9401748号明細書参照)
パントエア・アナナティス  AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス  AJ13355 (FERM BP-6614)
ここで、パントエア・アナナティス AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、エンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランス AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、パントエア・アナナティスに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、本明細書では、パントエア・アナナティスとして記載する。
【００８４】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance.[gi:19552490]；WO2006/070944）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である。
【００８５】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【００８６】
本発明に用いられるＬ−スレオニン生産菌として好ましいものとしては、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された腸内細菌科に属する細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【００８７】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。このアテニュエーションの解除又は低減は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner,
J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００８８】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非固有（non-native）のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）。また、Ｌ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても得られる。
【００８９】
このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が増大していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００９０】
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。
【００９１】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００９２】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、及び／又はＬ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００９３】
Ｌ−スレオニン生産菌として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することが出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に登録番号VKPM B-3996のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y.
D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００９４】
また、エシェリヒア・コリVKPM B-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も好適なＬ−スレオニン生産菌として例示することができる。VKPM B-5318株は、1990年5月3日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、PRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。
【００９５】
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【００９６】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（fbp;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００９７】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米
国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochrome bo type oxidase）遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００９９】
〔参考例１〕Ｌ−トリプトファン生産菌の構築
＜1−１＞serA遺伝子の導入
プラスミドpGH5（国際公開第9408031号パンフレット）上のホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）の、トランスポゾンMudを用いたゲノム上への挿入を試みた。MudII1734を含有するプラスミドpCE1134（特開平2-109985号公報）をBamHIで切断してlacオペロン含有DNA断片を除去し、平滑末端後SmaIリンカーを挿入した。このプラスミドをSmaIで再切断し自己閉環して得られたプラスミドをpMu1134と命名した。E. coli由来のserA遺伝子を含有するプラスミドpGH5からScaI、SalI切断にてserA含有DNA断片を切り出し、平滑末端後、上記のpMu1134のSmaIサイトに挿入することによって、pGH5由来のserA遺伝子が挿入されたMud（MudserAと命名）を搭載したプラスミドpMudserAを構築した。
【０１００】
脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するＬ−トリプトファン生産菌SV164株（国際公開第9408031号パンフレット）を受容菌として、pMudserAを用いて定法に従いカナマイシン耐性付与を指標にしてMudserAをゲノム上に転移させた菌株L1株を取得した。L1株は、サザンハイブリダイゼーション実験の結果、MudserAの挿入位置は一箇所のみと推定された。また、PCRによるMudserA含有ゲノムDNA断片のクローニングとその塩基配列決定にて、E. coli K-12ゲノム（GenBank Accession No. U00096）上のNo.240,950の位置に挿入されていると同定された。
【０１０１】
＜１−２＞trpオペロンの導入
次に、trpオペロンのトランスポゾンを用いたゲノム上への挿入によるコピー数の追加を試みた。trpオペロン遺伝子はプラスミドpGX100より切り出した。pGX100は、pBR313に、脱感作型trpE遺伝子を有するE. coli MTR#2株（米国特許第4,371,614号明細書）由来のDNA断片を挿入したものであり、XhoI、SmaI切断によって約7.6 kbのtrpオペロン含有DNA断片を切り出すことができる。pGX100からXhoI、SmaI切断にてtrpオペロン含有DNA断片を切り出し、平滑末端後、上記のpCE1134のSmaIサイトに挿入した。同様のtrpオペロン含有DNA断片は、E. coli MTR#2株ゲノムDNAより、配列表に記載した配列番号１及び２のプライマーを用いて直接PCR法によってクローニングすることも可能である。以上のようにして、MTR#2株由来のtrpオペロン遺伝子が挿入されたMud（MudtrpG' lacと命名）を搭載するプラスミドpMudtrpG'lacが構築された。
【０１０２】
MudtrpG' lacのゲノム上への挿入によるコピー数の追加に先立ち、挿入株の選択マーカーとしてラクトース資化能相補を用いる目的で、宿主株へのラクトース資化能欠損の性質付与を実施した。L1株に、Ｌ−スレオニン生産菌VKPM B-3996由来のilvG遺伝子をP1形質導入することによって（米国特許第5,175,107号明細書）Ｌ−バリン耐性を導入した（国際公開WO2005/103228号パンフレット参照）。定法に従い、P1形質導入実験を実施し、M9最小培地（4 g/L glucose、12.8 g/L Na2HPO4・7H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、5 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、1 mg/L thiamine、20 mg/l L-Phe、20 mg/L L-Tyr、20 mg/L L-Met、3 mg/L pyridoxine、20 mg/L L-Val、20 mg/L tetracycline）に塗布し、出現したコロニーをVal耐性株として取得し、L1ValRと名づけた。
【０１０３】
ME8581株（HfrH(valS←uxuAB):lacZ98::Tn10 relA1 thi-1、国立遺伝学研究所に寄託）よりTn10由来のテトラサイクリン耐性を指標として、lacZ98::Tn10を定法に従いL1ValRに
P1形質導入した。得られた株は、予想通りラクトース資化能は欠損していた。次いで、ラクトース資化能は欠損しているが、Tn10自体は除去された株を取得するため、形質導入株からテトラサイクリン感受性株14-1-lac-tetsを、レプリカ処理によって取得した。14-1-lac-tets株は、ラクトース資化能は欠損したままであった。サザンハイブリダイゼーション実験にて同株のTn10の状況を確認したところ、tet遺伝子にハイブリするバンドは検出されなかったが、Tn10のIS10領域にハイブリするバンドは検出されたので、本株ではlacZ遺伝子上にIS10が残存していると考えられた。
【０１０４】
14-1-lac-tets株を受容菌として、pMudtrpG' lacを用いて定法に従いラクトース資化能相補を指標にしてMudtrpG' lacをゲノム上に転移させた菌株N0.202株を取得した。得られたトランスポゾン挿入株から挿入トランスポゾンあるいはトランスポゾン上の遺伝子が脱落しやすい場合には、栄養培地上で植え継ぎ、カナマイシン耐性、ラクトース資化能等を安定に保持する菌株を選択すればよい。No.202株は、サザンハイブリダイゼーション実験の結果、MudtrpG' lacの挿入位置は一箇所のみと推定された。また、PCRによるMudtrpG' lac含有ゲノムDNA断片のクローニングとその塩基配列決定にて、E. coliK-12ゲノム（GenBank Accession No. U00096）上のNo.530,249の位置に挿入されていると同定された。
【０１０５】
次にシュクロース資化性に関与する遺伝子scrK, scrY, scrA, scrB, scrRをP1形質導入により、No.202に導入し、本菌株をNo.202 scrとした（国際公開パンフレットWO90/04636号参照）。
＜１−３＞iclR破壊用プラスミド構築
【０１０６】
添付説明書にしたがってPyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を用いたPCR法によりiclR断片を増幅した。PCR反応には、RNA/DNA maxi Kit（キアゲン）を用いて抽出したW3110ゲノムを鋳型とし、プライマーには配列表に示した配列番号３、配列番号４のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR後の増幅DNA断片は、Wizard PCR Preps（プロメガ）を用いて精製した。精製したDNA断片を制限酵素EcoRI、HindIII（宝酒造）にて切断したのち、フェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿を行い精製した。この切断断片と、同酵素にて切断し精製したpUC18（宝酒造）とを、DNA ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて結合した。この結合反応液にてJM109コンピテント細胞（宝酒造）を形質転換し、アンピシリン（Amp）（明治製菓）を50μg/mL含むLB寒天プレート（LB+Ampプレート）にまき、37℃でコロニーを選択した。コロニーを50μg/mL のAmpを含むLB培地で37℃にて試験管培養し、自動プラスミド抽出機PI-50（クラボウ）を用いてプラスミド抽出を行った。
【０１０７】
得られたプラスミドpUCiclRを制限酵素EcoO65I（宝酒造）にて切断した後、BKL kit（宝酒造）を用いて末端平滑化及び結合を行った。結合反応液にてJM109を形質転換し、上記のようにコロニーの選択、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをEcoRI、HindIIIで切断後精製し、同酵素で切断後精製した温度感受性プラスミドpTS1（pMAN031（J. Bacteriol. 162, 1196-1202 (1985)、図１参照）とpBR322（宝酒造）のそれぞれのPstI-HindIII断片を繋ぎ換えたもの）と結合した。結合反応液にてJM109を形質転換し、LB+Ampプレートにて30℃でコロニーを選択した。コロニーを50 μg/mL のAmpを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、上記のようにプラスミドを抽出した。EcoRI、HindIIIで切断して目的長断片が得られるプラスミドを、iclR破壊用プラスミドpTSΔiclRとした。
【０１０８】
＜１−４＞iclR破壊株の取得
pTSΔiclR でNo.202scrを形質転換し、LB+Ampプレート上30℃でコロニーを選択した。30℃で液体培養を一晩おこなった後10−３希釈してLB+Ampプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。30℃でLB+Ampプレートに塗り広げた後、1/8プレート分の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4-5時間振とう培養した。10-5希釈した菌体をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋Ampプレートに植菌し生育を確認
することで、Amp感受性・耐性を確認した。Amp感受性株について配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてコロニーPCRを行い、増幅断片がEcoO65Iにより切断されないものをiclR欠損株（No.202ΔiclR）として取得した。
【０１０９】
〔実施例１〕Ｌ−トリプトファンの製造
トリプトファン生産菌No.202ΔiclRのグリセロールストックを、LB-アガロースプレート培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム１%、アガロース1.5%）に１エーゼ植菌し、30℃で24時間、静地培養した。この培養菌体を500ml坂口フラスコに入れた50mlのLB培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム１%）に1エーゼ（約10μl）接種し、30℃で7〜8時間、振盪下（115回転／分）で前培養した。
【０１１０】
前述の前培養液1mlを、表２に示した組成を有する300mlの種培地に接種した。全容1Lの小型発酵槽を用いて、30℃で約14時間、800回転／分で、滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気を1vvm通気しながら培養した。また、培養中温度は30℃に保持し、pHはアンモニアガスで6．5に保持した。
【０１１１】
【表２】
2010017082.tif 000003
【０１１２】
表３に示した組成を有する300mlの主培養培地に、1.95 g/L濃度のメチルセルロース（MC:和光純薬工業株式会社「メチルセルロース 100cP」）を添加した培地と、MCを添加しない培地を準備し、それぞれに種培養液30mlを接種した。全容1Lの小型発酵槽を用いて、31℃、800回転／分の撹拌下で、滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気を1vvm通気しながら主培養を実施した。また、培養期間中温度は31℃に保持し、pHはアンモニアガスで6.7に保持した。培養中、700g/Lのグルコース溶液を適宜流加することによって、小型発酵槽内の糖濃度を5〜20g/Lに調節した。
【０１１３】
【表３】
2010017082.tif 000004
【０１１４】
主培養49.5時間後に、培地中（溶存しているものと結晶の両方を含む）のＬ−トリプトファン濃度を測定した。対糖収率及び生産性（生産速度）を表３に示す。表４は、メチルセルロース無添加を１とした比率で表している。その結果、メチルセルロース無添加であったものに比べ、メチルセルロースを添加すると、対糖収率及び生産速度のいずれも向上することが判明した。
【０１１５】
【表４】
2010017082.tif 000005
【０１１６】
培養終了後の発酵液中の結晶を緩衝液で溶解した後、発酵液中の不純物の総量をHPLCを用いて分析した結果、メチルセルロース無添加を1としたとき、メチルセルロース添加条件では0.637となり、Trp以外の主な不純物総量の低減が確認された。
【配列表】
2010017082000001.app