(57)【要約】      （修正有）【課題】リケッチア・ジャポニカ感染症の迅速かつ正確な診断のための検査法の提供。【解決手段】リケッチア・ジャポニカゲノム中の特定ＤＮＡ塩基配列、および／またはその相補配列から、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマー、および／またはプローブを設計し、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法から選択される少なくとも１つの方法によるリケッチア・ジャポニカ感染症の診断のための、被検体ＤＮＡの検査法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リケッチア・ジャポニカのゲノム中に存在するＤＮＡ塩基配列であって、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマー、および／またはプローブとして利用できる領域を含む、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかの塩基配列、および／またはその相補配列。
（ａ）配列番号１または２で示される塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列。
【請求項２】
請求項１に記載したリケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマーとして利用できる領域の塩基配列、およびその相補配列が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの塩基配列。
（ａ）配列表の配列番号５および６に示される塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列、
（ｃ）配列番号１または２の塩基配列において、選択される１０〜４０個の連続した塩基配列と同一の塩基配列、および、対をなすプライマーが、配列番号１または２の塩基配列において、選択される１０〜４０個の連続した塩基配列と相補的な塩基配列であって、被検体ＤＮＡの増幅が可能な塩基配列。
【請求項３】
請求項１に記載したリケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプローブとして利用できる領域の塩基配列、および／またはその相補配列が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの塩基配列。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列、
（ｃ）配列番号１または２の塩基配列において、選択される２０〜５０個の連続した塩基配列と同一の塩基配列。
【請求項４】
請求項２および／または請求項３の塩基配列を用いた、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法から選択される少なくとも１つの方法によるリケッチア・ジャポニカ感染症の診断のための、被検体ＤＮＡの検査法。
【請求項５】
前記リアルタイムＰＣＲ法が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢを用いたリアルタイムＰＣＲ法である請求項４に記載の検査法。
【請求項６】
リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するための、請求項４または５のいずれかに記載の検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、日本紅斑熱の原因菌であるリケッチア・ジャポニカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）感染症の診断に使用するリケッチア・ジャポニカに特異的な領域の塩基配列に関する。さらに、当該塩基配列から設計したプライマーおよび／またはプローブを利用してリケッチア・ジャポニカ感染症の診断をするための検査法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リケッチア属は、偏性細胞内細菌で、通常節足動物に伝染し、病原因子となるリケッチア感染症は世界中で広く分布していることが知られている（非特許文献１）。リケッチア感染症熱と、その病原因子は以下のように明らかにされている。ロッキー山紅斑熱：リケッチア・リケッチ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）の感染で起こり、西半球における最も重症なダニ媒介リケッチア疾患（非特許文献２、３）、リッケチア痘：ヨーロッパにおいてリケッチア・アカリ（Ｒ．ａｋａｒｉｉ）の感染で起こるリケッチア疾患（非特許文献４）、ボタン熱：地中海沿岸、アフリカ、インド、南西アジアにおいて、リケッチア・コノリ（Ｒ．ｃｏｎｏｒｉｉ）の感染で起こるリケッチア疾患（非特許文献４、５）、シベリアマダニチフス：シベリア、モンゴル、中国北方において、リケッチア・シビリカ（Ｒ．ｓｉｂｉｒｉｃａ）の感染で起こるリケッチア疾患（非特許文献１、６）、クイーンズランドマダニチフス：オーストラリアにおいて、リケッチア・オーストラリス（Ｒ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ）の感染で起こるリケッチア疾患（非特許文献１、７）である。また、リケッチア・プロワゼキ（Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）と、リケッチア・ティフィ（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）は、流行性の発疹チフスや発疹熱の病原因子であることが知られている（非特許文献８、９）。１９８４年、３人の日本人が紅斑熱類のリケッチア症を確認した（非特許文献１０）。このリケッチア症について、内田らは、他の病原性のリッケチア属菌とは違った新しい種として、分類学上の名前を‘リケッチア・ジャポニカ’と提案した（非特許文献１１）。リケッチア・ジャポニカの感染により起こる日本紅斑熱について、国家的サーベランス（データの収集，比較，解析，公表のプロセス）は毎年５０件以上の例を示しており、リケッチア・ジャポニカの感染による致死の例も示している（非特許文献１２）。リケッチア感染症は、風邪様の症状を示すため、正しい診断が行われず誤った治療で重篤になりうる疾患であり、そのため、患者発生時における高感度でかつ迅速な診断法が望まれている。
【０００３】
近年、医学・生物学的研究の進歩により、生物の全ゲノムが解明されてきており、それぞれのゲノム配列における特異的領域を利用して、生物、特に有害菌を検出する方法が考えられている。リケッチア属のリケッチア・アフリカ、リケッチア・プロワゼキ、リケッチア・スロバカ、リケッチア・マシリア、リケッチア・ベリ、リケッチア・リケッチ、リケッチア・アカリ、リケッチア・カナデンシス、リケッチア・フェリス、リケッチア・ティフィ、リケッチア・シビリカとリケッチア・コノリにおいても、ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅに完全に明らかにされている。日本紅斑熱の病原因子であるリケッチア・ジャポニカの分子診断は、他のリケッチア症におけるＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を用いた従来のＰＣＲを使用して行われた（非特許文献１３）。
【０００４】
また、近年発達したリアルタイムＰＣＲ法は、リケッチア感染症の迅速で感度良い診断法として使用された（非特許文献２、１２、１４、１５）。さらに、新しい微生物感染症の診断法として、従来のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法より優れたＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭＧＢ法が明らかになった。ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭＧＢ法は、高い特異性と正確さでゲノムＤＮＡ領域を同定することが知られている（非特許文献１６）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭＧＢプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによる特異的病原菌の検出法として特許文献１では、塹壕熱病原体（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）遺伝子のｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎの１領域鋳型にして検出できる方法を明らかにしている。
【非特許文献１】Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４５  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３９−４４，２００７）
【非特許文献２】Ｅｒｅｍｅｅｖａ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５４６６−７２，２００３
【非特許文献１】Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：２８６６−８，１９８９
【非特許文献４】Ｂｒｏｕｑｕｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：２−１２，２００７
【非特許文献５】Ｇｉａｍｍａｎｃｏ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：６０２７−３１，２００５
【非特許文献６】Ｔａｒａｓｅｖｉｃｈ，Ｉ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７８：４８−５９，２００６
【非特許文献７】Ｕｎｓｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ.  Ｄｉｓ．１３：１１０５−７，２００７
【非特許文献８】Ｍａｓｓｕｎｇ，Ｒ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３２：９７９−８２，２００１
【非特許文献９】Ｓｖｒａｋａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２：４２８−３２，２００６
【非特許文献１０】Ｍａｈａｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｋａｎｓｅｎｓｈｏｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ  ５９：１１６５−７１，１９８５
【非特許文献１１】Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４２：３０３−５，１９９２
【非特許文献１２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１７  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ４８−５５，２００７
【非特許文献１３】Ｆｕｒｕｙａ，Ｙ．,ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３３：４８７−４８９，１９９５
【非特許文献１４】Ｆｅｎｏｌｌａｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ３０  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ７−１５，２００７
【非特許文献１５】Ｋｉｄｄ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２９４−３０３，２００８
【非特許文献１６】Ｋｕｔｙａｖｉｎ，Ｉ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２８：６５５−６１，２０００
【特許文献１】特開２００８−１５４４７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまで、リケッチア・ジャポニカの特異的な検出法による高感度で迅速なリケッチア・ジャポニカ感染症の診断法は確立されていなかった。本発明は、リケッチア・ジャポニカ感染症の迅速かつ正確な診断のための検査法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、リケッチア・ジャポニカのゲノムにおいて、リケッチア・コノリのゲノムとの比較で見いだしたリケッチア・ジャポニカに特異的な領域の塩基配列、および、リケッチア属菌のゲノムとの配列相同性検索により見いだした塩基配列を基に、リケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡを高感度で検出する方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【０００８】
（１）リケッチア・ジャポニカのゲノム中に存在するＤＮＡ塩基配列であって、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマー、および／またはプローブとして利用できる領域を含む、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかの塩基配列、および／またはその相補配列。
（ａ）配列番号１または２で示される塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列。
【０００９】
（２）上記（１）に記載したリケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマーとして利用できる領域の塩基配列、およびその相補配列が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの塩基配列。
（ａ）配列表の配列番号５および６に示される塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列、
（ｃ）配列番号１または２の塩基配列において、選択される１０〜４０個の連続した塩基配列と同一の塩基配列、および、対をなすプライマーが、配列番号１または２の塩基配列において、選択される１０〜４０個の連続した塩基配列と相補的な塩基配列であって、被検体ＤＮＡの増幅が可能な塩基配列。
【００１０】
（３）上記（１）に記載したリケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプローブとして利用できる領域の塩基配列、および／またはその相補配列が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの塩基配列。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列、
（ｃ）配列番号１または２の塩基配列において、選択される２０〜５０個の連続した塩基配列と同一の塩基配列。
【００１１】
（４）上記（２）および／または（３）の塩基配列を用いた、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法から選択される少なくとも１つの方法によるリケッチア・ジャポニカ感染症の診断のための、被検体ＤＮＡの検査法。
【００１２】
（５）前記リアルタイムＰＣＲ法が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢを用いたリアルタイムＰＣＲ法である上記（４）に記載の検査法。
【００１３】
（６）リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するための、上記（４）または（５）のいずれかに記載の検査用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断を行うための、迅速かつ特異的な検査法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のリケッチア・ジャポニカ感染症の診断のためには、被験者の全血、血餅、尿などの有機物を検体として検査する。検体から抽出したＤＮＡを、被検体ＤＮＡとするためには、Ｆｕｒｕｙａ  Ｙ．らの方法（Ｆｕｒｕｙａ，Ｙ．，Ｔ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｉ．Ｋａｉｈｏ,Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：４８７−４８９，１９９５）など、公知の方法で調整することができる。
【００１６】
本発明のリケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡ塩基配列は、他のリケッチア属菌のＤＮＡ配列とは相同性のない塩基配列からなるものであり、リケッチア・ジャポニカ感染症の正確な検査法に使用するための基準となる塩基配列である。他のリケッチア属菌のＤＮＡ塩基配列との比較は、種々のリケッチア属菌からＤＮＡを抽出して行う。
【００１７】
各リケッチア属菌から得られたＤＮＡは、適当なプライマーと、ポリメラーゼによりＰＣＲを行い増幅して配列決定を行う。配列決定は、例えば、ＡＢＩ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などの解析装置を用いることができる。リケッチア・ジャポニカの各株間でのＤＮＡ配列比較のためには、ＣｌａｓｔａｌＷ  ｓｏｆｔｗａｒｅ等を用い、アライメントを行うことにより、リケッチア・ジャポニカ間で共通の配列を確認することができる。
【００１８】
配列決定のために使用するＰＣＲ用プライマーの設計は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（富士通社製）等の市販のソフトウエアを用いて設計することができる。リケッチア・ジャポニカの配列決定のためには、具体的な例として、配列番号３および配列番号４に示される塩基配列を有するＤＮＡをＰＣＲ用プライマーとして使用することができる。
【００１９】
各リケッチア属菌から得られたＤＮＡ配列の相同性は、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔｅ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などの配列データバンクにアクセスし、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用した配列相同性検索システムによって決定することができる。ＦＡＳＴＡは、連続して一致する配列の断片を高速に検索し、それらの断片の中で類似度の高いものに着目して局所的なアライメントを行い、最後にギャップを考慮したうえでこれらを結合しアライメントを行う方法であり、一方、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．,ｅｔ  ａｌ,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）によって開発されたＢＬＡＳＴは、配列を固定長の断片（ワード）に区切り、ワード単位で類似する断片を検索し、これらを類似度が最大になるまで両方向に伸ばして局所的なアライメントを行い、最後にこれらを結合して最終的なアライメントを行う方法である。
【００２０】
ＢＬＡＳＴによる配列相同性検索は，次のステップからなる。第一に、検索配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からデータベース検索用の文字列リスト（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｌｉｓｔ）を作成すること、第二に、リストにある文字列をデータベース中で探すこと、第三に、見つかった文字列を使い、相同性の高い領域の範囲を決定すること。リケッチア・ジャポニカ以外のリッケチア属菌、例えば、リケッチア・ベリ、リケッチア・カナデンシス、リケッチア・コノリ、リケッチア・シベリカ、リケッチア・アフリカ、リケッチア・マシリア、リケッチア・モナセンシス、リケッチア・アカリ、リケッチア・フェリス、リケッチア・プロワゼキでは、完全なゲノムが報告されており、データベースは種々の検索フィールドで提供されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。これらの塩基配列と、リケッチア・ジャポニカから得られる塩基配列との相同性検索を行い、いずれのリケッチア属菌にも相同性を見いだせなかった領域は、リケッチア・ジャポニカに特異的な塩基配列を有するＤＮＡの領域と認定することができる。
【００２１】
本発明のリケッチア・ジャポニカに特異的な塩基配列、およびその相補配列は、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマーおよびプローブとして利用できる領域を含み、プライマーおよびプローブの塩基配列を設計するための重要な情報となり得る。例えば、リケッチア・ジャポニカに特異的な塩基配列としては、配列表の配列番号１をおよび２に示される塩基配列をあげることができるが、配列番号１に示される塩基配列は、リケッチア・コノリＲＣ１３３８  ＯＲＦのホモログ中に存在し、当該ＤＮＡ塩基配列は、ＮＣＢＩのＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において、他のＤＮＡ配列との同一性は全くない。また、配列番号２に示される塩基配列は、リケッチア・ジャポニカ菌株が有する共通の塩基配列で、コンピュータを用いた配列相同性検索の結果、他のリケッチア属菌で既知となっている塩基配列とは相同性がないことが確認されている。
【００２２】
リケッチア・ジャポニカ感染症の診断に使用するプライマーおよびプローブは、前記配列番号１または２で示される塩基配列およびその相補配列を鋳型として設計することができるが、配列番号１または２で示される塩基配列の１個ないし数個が、欠失、付加、置換されてなる塩基配列およびその相補配列を鋳型として設計することもできる。
【００２３】
リケッチア・ジャポニカに特異的な領域の塩基配列は、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断のための検査法に利用することができる。検査法としては、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法をあげることができる。
【００２４】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法では、菌体識別標識としての利用が期待される。これらの方法では、リケッチア・ジャポニカ菌体の宿主細胞内での存在や局在、感染の有無等の確認が期待できる。
【００２５】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、標的遺伝子の６つの領域に対して４種類のプライマーを設定し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることを特徴とし、被検体ＤＮＡ、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって反応が進み、検出までの工程を１ステップで行うことができ、増幅効率が高いことからＤＮＡを１５分〜１時間で検出可能な量まで増幅することができる。また、極めて高い特異性を有し、増幅産物の有無から目的とする標的遺伝子配列の有無を判定することができる。ＬＡＭＰ法は、迅速、簡易、精確な遺伝子増幅法である。
【００２６】
ＰＣＲ法、およびリアルタイムＰＣＲ法によるリケッチア・ジャポニカ感染症の診断のための検査法は、リケッチア・ジャポニカに特異的な領域の塩基配列を鋳型として設計した２つのプライマーセットを用いる。リアルタイムＰＣＲ法では、リアルタイムＰＣＲ用プライマーセットと、リアルタイムＰＣＲ用プローブを用いて、被検体ＤＮＡ断片を増幅することにより、リケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡの存在を検出することを特徴とする検査方法である。
【００２７】
本発明の２つのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは、本発明のリケッチア・ジャポニカの特異的な領域の塩基配列において、選択される１０〜４０個、好ましくは１５〜３５個の連続した塩基配列と同一の塩基配列を、被検体ＤＮＡの５‘末端側のプライマーとして設計し、また、３’末端側のプライマーとしては、本発明のリケッチア・ジャポニカの特異的な領域の塩基配列において、選択される１０〜４０個、好ましくは１５〜３５個の連続した塩基配列と相補的な塩基配列から設計することができる。具体的には、配列番号５と配列番号６に示した塩基配列を例としてあげることができる。これらのプライマーセットを用いて、リケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡの存在を検出することができる。これらのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは、塩基配列に従って公知の方法により合成することができる。
【００２８】
本発明のリアルタイムＰＣＲ用プローブとしては、５’末端に蛍光タグを有し、３’末端に非蛍光消去タグとＭＧＢを有するプローブである。プローブの設計に用いる塩基配列は、本発明のリケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡ塩基配列において、いずれの部分かの連続した５０個以上の塩基配列と同一の塩基配列を用いることができるが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブの形で使用する場合は、上記連続した２０数個の塩基配列と同一の塩基配列を用いることができる。例として、配列番号７に示した塩基配列をあげることができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブは、アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）から提供されているＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ合成試薬により作製することができる。
【００２９】
本発明のキットは、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断のための検査に使用できるＤＮＡ断片、試薬および酵素等を含むものである。例えば、リアルタイムＰＣＲ用のプライマーと、プローブ、リアルタイムＰＣＲ用ポリメラーゼを含むもの、あるいは、ＰＣＲ用のプライマーセットとＰＣＲ用ポリメラーゼを含むもの、さらに、ＬＡＭＰ法用の被検体ＤＮＡを増幅するための４つのプライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを含むもの、などのキットがあげられる。これらのキットは、他の構成要素として、各種バッファー、滅菌水、固定化単体等を含めることもできる。
【００３０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３１】
＜リアルタイムＰＣＲによるリケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡの検出＞
【００３２】
ＤＮＡテンプレートの調整
表１にあげたリケッチア菌株を使用した。リケッチア・プロワゼキ、リケッチア・リケッチのゲノムＤＮＡは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｌｉｄｅ（Ｐａｎｂｉｏ社製）から、Ｆｕｒｕｙａ  Ｙ．等の方法（Ｆｕｒｕｙａ，Ｙ．，Ｔ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｉ．Ｋａｉｈｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：４８７−４８９，１９９５）で調整した。リケッチア・ジャポニカ  ＹＨ株、リケッチア・コノリ、リケッチア・シビリカ、リケッチア・ティフィのゲノムＤＮＡは、Ｌ９２９細胞を用いて繁殖させた。他のリケッチアＤＮＡはダニ類から抽出したものを用いた。
【００３３】
【表１】
2010124773.tif 000002
【００３４】
ＤＮＡシークエンス
ターゲット領域を含むＤＮＡの増幅は、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）とそれぞれ作製したプライマーにより、リアルタイムＰＣＲで行った。リケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡの増幅は、表２に示したプライマーを用いた。増幅したＤＮＡ断片は精製後、ＤＮＡコピー数換算用および、シークエンス用のＤＮＡテンプレートとして用いた。ＤＮＡシークエンスは、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＡＢＩ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）装置で解析した。各リケッチア・ジャポニカ株間でのＤＮＡ配列比較として、ＣｌａｓｔａｌＷ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を使用してアライメントを行った。アライメントのパラメーター設定は、Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙが１５、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙが６．６６、Ｇａｐ  ｄｉｓｔａｎｃｅが８、Ｍａｘｉｍｕｍ  ｄｅｖｉｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙが４０の条件で行った。リケッチア・ジャポニカの特異的なＯＲＦを、リケッチア・コノリのゲノムと比較した結果、この配列はリケッチア・コノリＲＣ１３３８  ＯＲＦの中に挿入されているかたちで存在した（図１Ａ）。この特異的な領域の塩基配列は、５種類のリケッチア・ジャポニカ菌株（ＤＴ−１、ＦＬＡ−１、ＨＨ−８、ＨＨ−９、ＹＨ）間で保存されていることがわかった（図１Ｂ）。このＯＲＦは、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ (ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ)において、他のＤＮＡ塩基配列との同一性は全くないことから、リケッチア・ジャポニカに特異的な領域の塩基配列を、アクセッションナンバー：ＡＢ４３７２８１として登録した。
【００３５】
【表２】
2010124773.tif 000003
【００３６】
リケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡの検出のためのプライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ
表３に示したプライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢのプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって抽出された候補から、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用して、ヒト、マウスや微生物など他の有機体に対して相同性の無いものを選択した。ＳｐＲｉｊａＭＧＢの５‘末端をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＦＡＭ）で蛍光標識し、３’末端を非蛍光消去剤とＭＧＢで標識した。
【００３７】
【表３】
2010124773.tif 000004
【００３８】
リアルタイムＰＣＲアッセイ
リアルタイムＰＣＲアッセイは、ＡＢＩ  ７５００  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）は、タカラバイオ株式会社から入手した。反応液は説明書に従って作製した。１０  μｌ  の  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ｔａｑ（タカラバイオ社製）、０．４μｌの１０μＭ  ＰＣＲ  フォワード  プライマー、０．４μｌの１０μＭ  ＰＣＲ  リバース  プライマー、０．４μｌの１０μＭ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢ  プローブ、０．４μｌのＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ＩＩ、１．５μｌのＤＮＡテンプレート、６．９μｌの蒸留水からなる２０μｌのサンプルを９６穴のマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウエルで調整した。感度評価の実験では、マイクロチューブ中のＤＮＡ断片の吸収を消去するためのＤＮＡ希釈液として１００μｇ／ｍｌのＳａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍを含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡを使用した。加熱サイクルは次のような２つの段階をとった。１段階は、９５°Ｃで２０秒間、２段階は、９５°Ｃで５秒間と６０°Ｃで３４秒間処理し、これを４５回繰り返した。リアルタイムＰＣＲの結果の解析において、検出閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅ）は、非特異的蛍光の影響を避けるため０．２とした。各ＤＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定した。
【００３９】
検量線
リアルタイムＰＣＲの検量線を作成した。コピー数換算用ＤＮＡ断片を、１０２から１０９コピー数（ゲノムＤＮＡ数）の範囲で５点設定した。リアルタイムＰＣＲは独立的に３回行い、平均値と標準誤差を求めた。コピー数換算用のＤＮＡは上記のシークエンス時に使用したＤＮＡ精製物を希釈して使用した。図２に、作製した検量線を示した。リアルタイムＰＣＲの反応性は、Ｒ（相関係数）＞０．９９の直線性を示すことが明らかになった。
【００４０】
従来のＰＣＲ検査法との感度の比較
日本では、臨床検査においてリケッチア症の分子診断としてＰＣＲ法が使用されている。リアルタイムＰＣＲと感度を比較するために、リケッチア症診断ＰＣＲ法であるＦｕｒｕｙａ  Ｙ．等の従来検出法（Ｒ１−Ｒ２法：Ｆｕｒｕｙａ，Ｙ．，Ｔ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｉ．Ｋａｉｈｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：４８７−９，１９９５）との比較検討を行った。従来のＰＣＲ診断法は、５‘プライマーとして、Ｒ１：ＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＴ（配列番号８）、３‘プライマーとして、Ｒ２：ＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９）を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ組成は、説明書のとおり行った。被検体ＤＮＡは、０．５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（５ｕ／μｌ、タカラバイオ社製）、５μｌのＥｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）、０．５μｌの５’プライマー（１００μＭ）、０．５μｌの３’プライマー（１００μＭ）および１μｌのＤＮＡテンプレートに蒸留水を使用し５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９４°Ｃで３分間の反応後、９４°Ｃで３０秒間、５２°Ｃで３０秒間、７２°Ｃで３０秒間を３０サイクル繰り返し、７２°Ｃで３分間反応させた。その後、１０μｌのＰＣＲ産物を、ＴＡＥ緩衝液で調整した１．５％アガロースで電気泳動を行い、臭化エチジウムで蛍光発色させた。リアルタイムＰＣＲでは、サイクル数だけを６０と設定して同様の濃度で行った。
【００４１】
ゲノムＤＮＡにおけるターゲット配列の推定コピー数は、上記に述べたリアルタイムＰＣＲで得た結果から推定した。感度をコピー数（ゲノムＤＮＡ数）で表したとき、Ｒ１−Ｒ２法は、ターゲットＤＮＡの１０４コピー数を検出する反応性を示したが（図３）、ＭＧＢプローブのリアルタイムＰＣＲは、１０２コピー数を検出する反応性を示した（図４）。このように、このリアルタイムＰＣＲは、Ｒ１−Ｒ２法の少なくとも１００倍の感度を有した。
【００４２】
リアルタイムＰＣＲの特異性
表１の１２菌種合計２６個のＤＮＡサンプルを、作製したＭＧＢプローブの特異性・感度・正確さを決定するために使用した。結果を表４に示した。リケッチア・ジャポニカＭＧＢプローブは、４株すべてのリケッチア・ジャポニカ株（ＤＴ−１、ＦＬＡ−１、ＨＨ−８、ＨＨ−９）由来のＤＮＡを検出でき、１００％の正確性を示す結果が得られた。また、リケッチア・ジャポニカＭＧＢプローブが、リケッチア・ジャポニカ由来のＤＮＡのみを検出し、他を検出できなかったことから、１００％の特異性を有することが示された。
【００４３】
【表４】
2010124773.tif 000005
【実施例２】
【００４４】
＜臨床サンプルにおけるリケッチア・ジャポニカ＞
日本紅斑熱と血清学上で陽性と確定した２人の患者由来の血餅から実施例１と同じ方法でゲノムＤＮＡを抽出した。ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）は、この実験のネガティブコントロールとして用いた。臨床サンプルの取り扱いについては、国立感染症研究所の規定に基づいて使用した。表５でＣ１と示した臨床検体は、８３歳の女性由来で発熱の５日目の血液から採取した血餅より抽出したＤＮＡサンプルであるである。表５でＣ２と示したもう１つの検体は、６５歳の女性由来で発熱３日目の血液から、上記と同様に採取したＤＮＡである。これらのＤＮＡは冷凍庫に約１０年保存されていた検体から抽出したものである。新規に開発したリアルタイムＰＣＲ検出系は、これらの臨床サンプル中にリケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡの存在を示した。また、Ｒ１−Ｒ２法では、リケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡは検出されていなかったことから、ＭＧＢプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出感度の高さが証明された。  
【００４５】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、リケッチア・ジャポニカ感染症の診断が、高精度で迅速に行えるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ａ：リケッチア・ジャポニカとリケッチア・コノリのゲノムマップの比較を示す図である。Ｂ：リケッチア・ジャポニカ種のＤＴ−１、ＦＬＡ−１、ＨＨ−８、ＨＨ−９とＹＨにおいて、特異的なＯＲＦのＤＮＡ塩基配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図２】リアルタイムＰＣＲ法によるリケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡ量の検量線を示す図である。
【図３】従来のＰＣＲ法によるリケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡの検出感度を示す図面に代える電気泳動の写真である（コピー数：１０５、１０４、１０３、１０２  、ＮＴＣ：ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図４】リアルタイムＰＣＲ法によるリケッチア・ジャポニカ由来のゲノムＤＮＡの検出感度を示す図面に代える増幅曲線の写真である（コピー数：１０５、１０４、１０３、１０２、ＮＴＣ：ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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