(57)【要約】【課題】  効率的なアシアロ糖鎖化合物の作製方法を提供する。【解決手段】ガングリオシドのシアル酸残基を除去する目的で行われるシアリダーゼによる酵素反応液中に、シクロデキストリンを添加することにより様々な構造を持ったガングリオシドのアシアロ化効率を高める。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシド型の糖鎖化合物にシアリダーゼを作用させる際、シクロデキストリンを添加してアシアロ糖鎖型化合物を作製する方法。
【請求項２】
ガングリオシド型の糖鎖化合物がガングリオシドである請求項１記載のアシアロ型糖鎖化合物を作製する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアシアロ糖鎖型化合物を作製する方法であって、終濃度０．０５ｍＭから１０mMのシクロデキストリンを添加する方法。
【請求項４】
請求項3に記載するアシアロ糖鎖型化合物を作製する方法であって、シクロデキストリンを加えることにより、糖脂質ＧＭ１に見られる−ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３）Ｇａｌ−という構造で結合したシアル酸を遊離する効率を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬・医療・研究用素材などに利用されるアシアロ糖鎖化合物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
酸性スフィンゴ糖脂質(ガングリオシド)は、ラクトシルセラミドを基本骨格として、これにシアル酸を含有する糖鎖が結合した一群の糖脂質である。ガングリオシドは脊椎動物の脳神経系に豊富に存在し、現在までに数多くの構造が同定されてきた。現在40種類以上が発見されており、それぞれシアル酸（N-置換又はO-置換ノイラミン酸）の数と位置が異なっている。
【０００３】
ガングリオシドは、細胞の表面に存在し細胞間の認識など種々の生理活性を有していることが古くから知られているが、最近、シアル酸がはずれたアシアロ糖脂質の生理作用も分かってきている。例えば、NK細胞は、細胞膜表面に、糖脂質のアシアロGM1を有しており、NK細胞は、細胞膜表面のCD161により、標的細胞の細胞膜に存在する特定の糖鎖構造（アシアロGM2など）と結合する。また、肝細胞の細胞膜には、血中の老朽化した糖タンパク質を細胞内に取り込んで処理するためのアシアロ糖タンパク質レセプターが存在している。このアシアロ糖タンパク質レセプターは、老朽化した糖タンパク質の糖鎖先端のシアル酸が欠失することによって露出されたガラクトースを特異的に認識するメカニズムを持っており、肝細胞の接着を効率よくすることから、細胞培養あるいは細胞分離技術への応用に期待がかかる。
【０００４】
シアル酸は通常、酸に不安定なα結合によって複合糖質に結合している。糖鎖の末端にシアル酸が結合している場合、５０ｍＭ塩酸中で、80℃にて１時間程度加熱することにより簡単に遊離することが知られている。しかし、糖脂質ＧＭ１に見られる−ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３）Ｇａｌ−という構造で結合したシアル酸は、Ｎ−アセチルガラクトサミンとの立体障害のため加水分解を受けにくい。また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓやＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）を用いた場合、通常の酵素量ではシアル酸は遊離しない。また、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（ナカライテスク）においても、完全に脱シアリル化するには、多量の酵素を要したり、或いはコール酸ナトリウムを加える方法もあるが界面活性剤であり分離が困難であるといった問題がある(非特許文献１）
【非特許文献１】Iwamori, M., Kaido, T., Iwamori, Y., Ohta, Y., Tsukamoto, K. and Kozaki, S. 2005, J. Biochem., 138, 327-334.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
糖脂質ＧＭ１に見られる−ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３）Ｇａｌ−という構造で結合したシアル酸は、酸加水分解や通常の酵素反応では、Ｎ−アセチルガラクトサミンとの立体障害のため加水分解を受けにくい。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、種々のカングリオシドから、効率良くアシアロ化する方法を  提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、シアリダーゼによる酵素反応液中に、γ−シクロデキストリンを添加することによりアシアロ糖鎖化合物を効率的に生産する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
【発明の効果】
【０００８】
以上のように、本発明を適用することによって、これまで反応効率の低かったガングリオシドのアシアロ化を容易に行うことができ、様々のガングリオシドを作用させることにより、種々のアシアロ糖鎖化合物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１０】
本発明は、シアル酸を有するガングリオシドのシアル酸残基を効率よくアシアロ化を行うことにより、アシアロ糖鎖化合物を得ることを特徴とする。ここで、シアル酸を遊離する効率を高め、アシアロ化を行うことは、糖脂質ＧＭ１に見られる−ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３）Ｇａｌ−という構造で結合した、従来の方法では切断されにくいシアル酸を、効率よく切断することをいう。
【００１１】
反応基質となるシアル酸を有するガングリオシドとは、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１、ＧＱ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＤ1ｃ、ＧＤ１ｂなどが挙げられる。ガングリオシド型の糖鎖化合物とは、その類似構造を持つ化合物を示す。例えば、スフィンゴ脂質にＳｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｎ-ｄｅａｃｙｌａｓｅを作用させて生じるリゾ体や、糖鎖プライマー法で得られるセラミド部分がアルキル基のものを指す。また、得られるアシアロ糖鎖化合物としては、ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ２が挙げられる。アシアロ糖鎖型化合物とは、その類似構造を持つ化合物を示す。例えば、スフィンゴ脂質にＳｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｎ-ｄｅａｃｙｌａｓｅを作用させて生じるリゾ体や、糖鎖プライマー法で得られるセラミド部分がアルキル基のものを指す。
【００１２】
先ず、シアル酸を有するガングリオシドを溶解する場合、蒸留水を用いるのが好ましいが、水以外にもメタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド等の親水性の有機溶媒を０．１から９９．９％含んでいても構わない。
【００１３】
用いる酵素としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ等、由来は問わないが、特に、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼが望ましい。
【００１４】
反応液のｐＨは、４．０から８．０の範囲で反応させることができるが、４．５から6．０の範囲が望ましい。
【００１５】
反応液中に加えるシクロデキストリンとしては特に限定はないが、反応効率からγ−シクロデキストリンが好ましい。
【００１６】
反応液中に加えるシクロデキストリンを終濃度としては、０．０５ｍＭから１０mMの範囲が好ましく、更に好ましくは、１．２５ｍＭから１０mMの範囲である。
【００１７】
反応は、２０〜５０℃にて、１〜４８時間、インキュベートすることにより行える。
【００１８】
精製方法は、特に限定はされないが、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する、液液分配クロマトグラフィなどを用いておこなうことができる。液液分配クロマトグラフィには、さらに、遠心液液分配クロマトグラフィ(ＣＰＣ)、高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）などが含まれる。
【００１９】
液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。
【００２１】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。
【００２２】
精製工程には、その他、Sep-Pak C-18カラムを使用した精製、強イオン交換カートリッジカラム、固体吸着剤として、スチレン系合成吸着体、メタクリル系合成吸着体、およびフェノール系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である吸着剤を使用する方法が含まれる。培養物中または培養上清中の糖鎖化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。
【００２３】
強イオン交換カートリッジカラムを使用する場合には、四級アンモニウム基などの官能基を有する充填剤など、当業者に公知のいずれの強イオン交換樹脂も使用することができる。中性のアシアロ糖鎖は非吸着画分に回収される。未反応のガングリオシドの溶出に用いる溶媒系は、クロロホルム、酢酸アンモニウム、アルコール類、エーテル類、および水からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性糖脂質の抽出には、クロロホルム、メタノール、酢酸アンモニウム水溶液の混和液が特に好ましい。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
１０μｇのガングリオシドミックス（GM1、GD1a 、GD1b 、GT1bが主成分の混合物）（フナコシ）及び、３μｇのGM1をノイラミニダーゼ（ナカライテスク）200ｍＵが含まれる50ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ5.5）200μｌ中で、様々な量(最終濃度が0ｍＭ、15ｍＭ、35ｍＭ、50ｍＭ)のγ-シクロデキストリンを添加したものについて、37℃で24時間反応させた。また、γ-シクロデキストリンをコール酸ナトリウムに換え、同様の実験を行った。反応後の産物は、Sep-Pak（C18）を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図１に示すように、ガングリオシドミックス、GM1のいずれにおいても、γ-シクロデキストリンを添加することにより、切れ残りであるGM1が殆どなくなった。また、コール酸ナトリウムでは、Sep-Pak（C18）による簡易精製では除くことができず、HPTLCにおいて目的物の分析が困難であった。
（実施例２）
GM1（3μｇ）、GD1a（6μｇ）、GD1b（6μｇ）、GT1b（6μｇ）を、それぞれ50ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ5.5）200μｌ中で、ノイラミニダーゼ（ナカライテスク）200ｍＵのみを添加して37℃で24時間反応させたものと、ノイラミニダーゼ（ナカライテスク）200ｍＵとγ-シクロデキストリン(最終濃度50ｍＭ)を添加して37℃で24時間反応させたものとの比較を行った。反応後の産物は、Sep-Pak（C18）を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図２に示すように、いずれのガングリオシドも、ノイラミニダーゼのみでは、−ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３）Ｇａｌ−という構造で結合したシアル酸の切断効率は悪かった。
【００２５】
一方、ノイラミニダーゼとγ-シクロデキストリンを添加した場合、GM、GD1a、GD1b、GT1bのいずれの場合も、シアル酸は完全に切断され、GA1が検出された。
（実施例３）
3μｇのGM1を200ｍＵのノイラミニダーゼ（ナカライテスク）が含まれる50ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ5.5）200μｌ中で、様々な量(最終濃度が0ｍＭ、0.01ｍＭ、0.05ｍＭ、0.25ｍＭ、1.25ｍＭ、5ｍＭ、10ｍＭ)のγ-シクロデキストリンを添加し、37℃で24時間反応させた。反応後の産物は、Sep-Pak（C18）を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図３に示すように、γ-シクロデキストリンの濃度が高くなるにつれてGM1がGA1に変化する割合が高くなり、γ-シクロデキストリンを最終濃度5ｍＭ以上添加すると、完全にGM1をアシアロ化できることがわかった。
（実施例４）
3μｇのGM1をγ-シクロデキストリン(最終濃度5ｍＭ)が含まれる50ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ5.5）200μｌ中で、様々な量(0mU、2ｍＵ、10mU、25mU、50mU、100mU、200mU)のノイラミニダーゼ（ナカライテスク）を添加し、37℃で24時間反応させた。反応後の産物は、Sep-Pak（C18）を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図４に示すように、100ｍＵのノイラミニダーゼの添加することにより、完全にGM1をアシアロ化できることがわかった。
（実施例５）
アシアロ化によって得られたGA１を、HPTLCで分離した後、プレートよりスポットをかきとり、クロロホルム／メタノール（２：１）で溶出し回収した。さらに、イオントラップ型質量分析装置ＨＣＴｐｌｕｓ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）により、ＭＳn解析を行い、構造を確認した結果を図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】シアリダーゼをガングリオシドに作用させる時、反応液中へのγ-シクロデキストリンとコール酸ナトリウムの添加効果を調べた結果を示す。
【図２】シアリダーゼを各種ガングリオシドに作用させる時、反応液中へのγ-シクロデキストリンの添加効果を調べた結果を示す。
【図３】シアリダーゼをGM1に作用させる時、反応液中へ添加するγ-シクロデキストリンの必要量を調べた結果を示す。
【図４】シアリダーゼをγ-シクロデキストリン存在下でGM1に作用させる時、反応液中へ添加するシアリダーゼの必要量を調べた結果を示す。
【図５】GA１のＭＳn解析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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