(57)【要約】【課題】被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供する。【解決手段】動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における特定のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。マーカー物質は２種以上を組み合わせて用いる。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。【選択図】図１
2010190804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）：
（ＭＡ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０００のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０９０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５６０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＭＡ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度、並びに、
下記（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）：
（ＭＢ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約４２４０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＭＢ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約５０７０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（ａ）マーカー物質（ＭＡ１）はアポリポタンパク質Ａ２の断片である、
（ｂ）マーカー物質（ＭＡ２）はアポリポタンパク質Ｃ１の断片である、
（ｃ）マーカー物質（ＭＡ３）はアポリポタンパク質Ｃ１である、
（ｄ）マーカー物質（ＭＡ６）はアポリポタンパク質Ａ２である、
（ｅ）マーカー物質（ＭＢ１）はα１−アンチトリプシン１−１の断片である、
（ｆ）マーカー物質（ＭＢ２）はアポリポタンパク質Ａ２の断片である。
【請求項３】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）：
（ＮＡ１）：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
（ＮＡ２）：配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
（ＮＡ３）：配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＮＡ４）：配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度、並びに、
下記（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）：
（ＮＢ１）：配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＮＢ２）：配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項４】
前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項５】
前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項７】
前記被験物質は、食品素材又は医薬であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被験物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１４】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化改善・予防効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する動脈硬化改善・予防効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる動脈硬化改善・予防効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発現、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚して弾力性がなくなる病態の総称である。動脈硬化にはいくつかの種類があるが、アテローム動脈硬化（粥状硬化）と呼ばれる病態が最も多くみられる。特に注記しない場合には、動脈硬化とはアテローム動脈硬化を指すことも多い。アテローム動脈硬化は、動脈内壁に粥状のプラーク（アテローム）が沈着して血流に支障をきたす状態であり、脳、心臓、腎臓、手足などに重篤な損傷をもたらすおそれがある。すなわち、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、腎不全、手足の壊死など、生命に直接かかわる症状につながるおそれがある。動脈硬化が起こる原因については、まだ完全には解明されていない部分もあるが、上記のように肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等が発症の危険因子とされている。
【０００４】
動脈硬化のような生活習慣病に属する疾病については、予防することの重要性が強調されている。すなわち、生活習慣病は徐々に進行するものが多く、発症初期には自覚症状があまりないことが多い。その結果、発見されたときにはすでに重篤な状態まで進んでいることがあり、予防の重要性が特に高い。このような背景の下、疾病の将来の発症リスクを検出することができるようなバイオマーカー、すなわち「予防マーカー」あるいは「リスクマーカー」と呼ばれるマーカー物質の探索が盛んに行われている。生活習慣病の予防マーカーを用いれば、例えば、当該疾病の将来の発症リスクを判定することが可能となり、事前に生活習慣の是正、食事制限、運動等の適切な処置を行って当該疾病の発症を予防することが可能となる。また、予防マーカーを用いることで、被験物質が当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有するかを容易に調べることも可能となり、食品素材の機能性評価やスクリーニングにも有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、生活習慣病を容易に予防することが可能となる。
【０００５】
生活習慣病関連では、例えば特許文献１に糖尿病の予防マーカー、特許文献２に高脂血症の予防マーカーについての開示がある。ただし、これらは動脈硬化に特化したバイオマーカーではない。一方、動脈硬化に特化したバイオマーカーを探索する試みもあり、例えば特許文献３には炎症のバイオマーカーであるＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）が、特許文献４には腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が動脈硬化のバイオマーカーとしても使えるとの記載がある。しかしながら、ＣＲＰやＡＦＰについては動脈硬化とは全く異なる臨床的意義（炎症や発がん）が確立しており、動脈硬化のバイオマーカーとしては特異性の面で使いにくい。したがって、動脈硬化の将来の発症リスク診断や、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を可能にする新たなマーカー物質を特定することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７３１９５号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−０６４７４７号公報
【特許文献３】特表２００１−５２５０５８号公報
【特許文献４】特開２００７−０１０５６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、動脈硬化の予防マーカーとなり得るマーカー物質を新たに特定し、該マーカー物質を用いて被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）：
（ＭＡ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０００のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０９０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５６０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＭＡ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度、並びに、
下記（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）：
（ＭＢ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約４２４０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＭＢ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約５０７０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【０００９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）の少なくとも１種、並びに、上記（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）の少なくとも１種の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）及び（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、体液中のマーカー物質を指標とするので、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を容易に評価することができる。また本発明では、（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）から選ばれたマーカー物質と（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）から選ばれたマーカー物質との組み合わせからなる複数種のマーカー物質を指標とするので、当該効果を高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１０】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約４２４０」、「約６８３０」、「約８７２０」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約４２４０は概ね４２４０±０．２％、約６８３０は概ね６８３０±０．２％、約８７２０は概ね８７２０±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（ＭＡ２）、（ＭＡ３）、及び（ＭＢ１）の濃度はより低値を示し、（ＭＡ１）、（ＭＡ４）、（ＭＡ５）、（ＭＡ６）、及び（ＭＢ２）の濃度はより高値を示す。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、  下記（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（ａ）マーカー物質（ＭＡ１）はアポリポタンパク質Ａ２の断片である、
（ｂ）マーカー物質（ＭＡ２）はアポリポタンパク質Ｃ１の断片である、
（ｃ）マーカー物質（ＭＡ３）はアポリポタンパク質Ｃ１である、
（ｄ）マーカー物質（ＭＡ６）はアポリポタンパク質Ａ２である、
（ｅ）マーカー物質（ＭＢ１）はα１−アンチトリプシン１−１の断片である、
（ｆ）マーカー物質（ＭＢ２）はアポリポタンパク質Ａ２の断片である。
【００１２】
アポリポタンパク質Ａ２、アポリポタンパク質Ｃ１、及びα１−アンチトリプシン１−１は、いずれも物理化学的性質がよく知られている物質であるので、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によればマーカー物質（ＭＡ１）、（ＭＡ２）、（ＭＡ３）、（ＭＡ６）、（ＭＢ１）、及び（ＭＢ２）の解析が容易である。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）：
（ＮＡ１）：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
（ＮＡ２）：配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
（ＮＡ３）：配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＮＡ４）：配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度、並びに、
下記（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）：
（ＮＢ１）：配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＮＢ２）：配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００１４】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）の少なくとも１種、並びに、上記（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）の少なくとも１種の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）及び（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）のマーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１５】
（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）及び（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）のマーカー物質は、いずれも主に血液中に存在する。被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（ＮＡ２）、（ＮＡ３）、及び（ＮＢ１）の濃度はより低値を示し、（ＮＡ１）、（ＮＡ４）、及び（ＮＢ２）の濃度はより高値を示す。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００１７】
かかる構成により、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００１８】
請求項５に記載の発明は、前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００１９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。かかる構成により、動物の飼育が容易となり、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウス（以下、「アポＥ欠損マウス」と略記する。）が挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常の飼育でアテロームを形成し、動脈硬化発症モデル動物の標準として各分野で採用されているものである。
【００２０】
請求項６に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２１】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２２】
請求項７に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材又は医薬であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２３】
かかる構成により、機能性食品や医薬の開発を目的として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２４】
請求項８に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２６】
請求項９に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２７】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、複数種のマーカー物質の濃度を測定する際に、１個の担体で同時測定することが可能となり、作業効率がよい。また、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することも可能となる。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００２８】
請求項１０に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３０】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被験物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３１】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）の少なくとも１種、並びに、上記（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）の少なくとも１種の濃度を基準値と比較し、あるいは、上記（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）の少なくとも１種、並びに、上記（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）の少なくとも１種の濃度を基準値と比較し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記マーカー物質（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）、（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）、（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）、及び（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材や医薬の場合は、動脈硬化の改善効果を有する機能性食品や医薬又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品や医薬の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３２】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３３】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３４】
請求項１３に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３５】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３６】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１４）。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００３８】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】質量／電荷比が５２００（平均値）のイオンピークについての箱髭図であり、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は紅花種子抽出物を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【図２】質量／電荷比が６８３２（平均値）のイオンピークについての箱髭図であり、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は発酵乳を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【図３】質量／電荷比が７００４（平均値）のイオンピークについての箱髭図であり、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は発酵乳を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【図４】質量／電荷比が７０９３（平均値）のイオンピークについての箱髭図を示す。
【図５】質量／電荷比が７５６２（平均値）のイオンピークについての箱髭図を示す。
【図６】質量／電荷比が８７２３（平均値）のイオンピークについての箱髭図であり、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は紅花種子抽出物を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【図７】質量／電荷比が４２３９（平均値）のイオンピークについての箱髭図を示す。
【図８】質量／電荷比が５０６５（平均値）のイオンピークについての箱髭図を示す。
【図９】実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１０】実施例２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１１】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】実施例３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１３】実施例４で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１４】実施例４で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１５】実施例５で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１６】実施例５で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１７】実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１８】実施例６で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００４２】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法（以下、「本発明の評価方法」と略記することがある。）の１つの様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物（以下、「動脈硬化発症・高リスク動物」と称することがある。）に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）：
（ＭＡ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０００のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０９０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
（ＭＡ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５６０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＭＡ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度、並びに、
下記（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）：
（ＭＢ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約４２４０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＭＢ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約５０７０のイオンピークを生じるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果（以下、「動脈硬化の改善等効果」と称することがある。）を評価する。以下、（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）からなるマーカー物質の群を「ＭＡ群」、（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）からなるマーカー物質の群を「ＭＢ群」と称することがある。
【００４３】
ＭＡ群、ＭＢ群に属するマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、動脈硬化の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（ＭＡ２）、（ＭＡ３）、及び（ＭＢ１）の各マーカー物質は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被験物質が動脈硬化の改善等効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより低値を示す（以下、これらのマーカー物質を包含するグループを「グループ１」と称することがある。）。一方、（ＭＡ１）、（ＭＡ４）、（ＭＡ５）、（ＭＡ６）、及び（ＭＢ２）の各マーカー物質は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被験物質が動脈硬化の改善等効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより高値を示す（以下、これらのマーカー物質を包含するグループを「グループ２」と称することがある。）。
【００４４】
Ｎ末端アミノ酸解析の結果と質量／電荷比の情報から、マーカー物質（ＭＡ１）と（ＭＢ２）は「アポリポタンパク質Ａ２の断片」と同定され得る。また、ある条件のペプチドマッピングと質量／電荷比の情報から、マーカー物質（ＭＡ２）は「アポリポタンパク質Ｃ１の断片」、マーカー物質（ＭＡ３）は「アポリポタンパク質Ｃ１」、マーカー物質（ＭＡ６）は「アポリポタンパク質Ａ２」、マーカー物質（ＭＢ１）は「α１−アンチトリプシン１−１の断片」とそれぞれ同定され得る。すなわち、ある実施形態では、下記（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つを満たす。
（ａ）マーカー物質（ＭＡ１）はアポリポタンパク質Ａ２の断片である、
（ｂ）マーカー物質（ＭＡ２）はアポリポタンパク質Ｃ１の断片である、
（ｃ）マーカー物質（ＭＡ３）はアポリポタンパク質Ｃ１である、
（ｄ）マーカー物質（ＭＡ６）はアポリポタンパク質Ａ２である、
（ｅ）マーカー物質（ＭＢ１）はα１−アンチトリプシン１−１の断片である、
（ｆ）マーカー物質（ＭＢ２）はアポリポタンパク質Ａ２の断片である。
【００４５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の他の様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）：
（ＮＡ１）：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
（ＮＡ２）：配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
（ＮＡ３）：配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＮＡ４）：配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度、並びに、
下記（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）：
（ＮＢ１）：配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、及び
（ＮＢ２）：配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのホモログ、
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。以下、（ＮＡ１）〜（ＮＡ４）からなるマーカー物質の群を「ＮＡ群」、（ＮＢ１）〜（ＮＢ２）からなるマーカー物質の群を「ＮＢ群」と称することがある。
【００４６】
ここで「ホモログ」とは、アミノ酸残基の数が略同じで、アミノ酸配列の相同性が概ね７０％以上であるタンパク質又はポリペプチドをいう。アミノ酸配列の相同性については、例えば、BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) データベースを用いて調べることができる。具体的には、SWISS-PLOT等のアミノ酸配列を検索した結果「identities」で示される値を、相同性の値とすることができる。
【００４７】
ホモログは、例えば、異なる動物由来の同機能タンパク質同士で見出される。例えば、マウス由来のα１−アンチトリプシン１−１断片（配列番号７）のホモログとしては、ラット由来（配列番号２２；相同性８５％）、ウシ由来（配列番号２３；相同性８２％）、サル由来（配列番号２４；相同性８８％）、ヒト由来（配列番号２５；相同性８８％）の各α１−アンチトリプシン１−１断片が挙げられる。
【００４８】
同様に、マウス由来のアポリポタンパク質Ａ２断片（配列番号３）のホモログとしては、ラット由来（配列番号２６；相同性７６％）、ウシ由来（配列番号２７；相同性７７％）、サル由来（配列番号２８；相同性７７％）、ヒト由来（配列番号２９；相同性７７％）の各アポリポタンパク質Ａ２断片が挙げられる。同様に、マウス由来の別のアポリポタンパク質Ａ２断片（配列番号２）のホモログとしては、ラット由来（配列番号３０；相同性８０％）、ウシ由来（配列番号３１；相同性８２％）、サル由来（配列番号３２；相同性８６％）、ヒト由来（配列番号３３；相同性８６％）の各アポリポタンパク質Ａ２断片が挙げられる。
【００４９】
ホモログは、例えば、同種の動物由来のアイソフォーム同士でも見出される。例えば、α１−アンチトリプシンには、アミノ酸配列がわずかに異なる５種のアイソフォーム（α１−アンチトリプシン１−１から１−５）が見出されている。そしてマウス由来のα１−アンチトリプシン１−１断片（配列番号７）のホモログとして、マウス由来のα１−アンチトリプシン１−２断片（配列番号３４；相同性９７％）、同α１−アンチトリプシン１−３断片（配列番号３５；相同性９２％）、同α１−アンチトリプシン１−４断片（配列番号３６；相同性９４％）、同α１−アンチトリプシン１−５断片（配列番号３７；相同性８３％）が挙げられる。
【００５０】
上記した「タンパク質又はそのホモログ」には、翻訳後に修飾を受けたものも含まれるものとする。修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００５１】
タンパク質の全長と断片との関係については、例えば、マウス由来アポリポタンパク質Ａ２（配列番号１）のアミノ酸番号１８（Ｐｈｅ）〜６３（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片（配列番号２）と、アミノ酸番号２９（Ｖａｌ）〜７３（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片（配列番号３）は、いずれも「アポリポタンパク質Ａ２の断片」である。
【００５２】
また、シグナル配列が切断された後のアポリポタンパク質Ｃ１(配列番号４）のＮ末端アミノ酸配列は「Ａｌａ−Ｐｒｏ」から始まるが、これら２つのアミノ酸は切断され得ることが報告されている（Oleg Chertov et al., Proteomics, Vol. 4, No. 4, 2004）。このようなＮ末端の２アミノ酸が欠損したアポリポタンパク質Ｃ１のタンパク質断片（配列番号５）は「アポリポタンパク質Ｃ１の断片」である。
【００５３】
さらに、マウス由来α１−アンチトリプシン１−１（配列番号６）のアミノ酸番号３５４（Ｓｅｒ）〜３８９（Ｌｙｓ）に相当するＣ末端側の３６アミノ酸からなるタンパク質断片（配列番号７）は、「α１−アンチトリプシン１−１の断片」である。
【００５４】
ＮＡ群、ＮＢ群に属するマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、動脈硬化の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。通常、（ＮＡ１）、（ＮＡ２）、（ＮＡ３）、（ＮＡ４）の各マーカー物質は、ぞれぞれ（ＭＡ１）、（ＭＡ２）、（ＭＡ３）、（ＭＡ６）の各マーカー物質に相当する。また、（ＮＢ１）、（ＮＢ２）の各マーカー物質は、ぞれぞれ（ＭＢ１）、（ＭＢ２）の各マーカー物質に相当する。すなわち、（ＮＡ２）、（ＮＡ３）、（ＮＢ１）の各マーカー物質は「グループ１」に属し、（ＮＡ１）、（ＮＡ４）、（ＮＢ２）の各マーカー物質は「グループ２」に属する。
【００５５】
本発明の評価方法では、ＭＡ群に属するマーカー物質の少なくとも１種とＭＢ群に属するマーカー物質の少なくとも１種、あるいは、ＮＡ群に属するマーカー物質の少なくとも１種と、ＮＢ群に属するマーカー物質の少なくとも１種を組み合わせて用いる。ここで、ＭＡ群又はＮＡ群とＭＢ群又はＮＢ群とから各々１種のみを選択して用いてもよいし、いずれか一方又は両方の群から複数種のマーカー物質を選択して用いてもよい。複数種を選択する場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質とグループ２から選択したマーカー物質とを組み合わせることができる。
【００５６】
本発明の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物（動脈硬化発症・高リスク動物）に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果（動脈硬化の改善等効果）を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、動脈硬化発症・高リスク動物に、動脈硬化の改善等効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【００５７】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物（以下、「動脈硬化未発症・低リスク動物」と称することがある。）における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、
（１）動脈硬化未発症・低リスク動物に、普通食又は被験物質を摂取させる群（正常値を示す群）、
（２）動脈硬化発症・高リスク動物に、「動脈硬化の改善等効果を有さない既知物質」を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、
（３）動脈硬化発症・高リスク動物に被験物質を摂取させる群、
の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【００５８】
さらに、基準値として、
（４）動脈硬化発症・高リスク動物に、「動脈硬化の改善等効果を有する既知物質」を摂取させる群、
の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００５９】
「動脈硬化の改善等効果を有する既知物質」の例としては、アゼルニジピン等の降圧剤（カルシウム拮抗薬）が挙げられる。さらに、食品素材では、発酵乳、紅花種子抽出物などが挙げられる。なお、発酵乳の動脈硬化に対する効果等については、例えば、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.calpis.co.jp/corporate/press/nrl_00007.html＞（２００７年７月１３日  日本動脈硬化学会にて発表）に記載されている。また、紅花種子抽出物の動脈硬化に対する効果等については、例えば、国際公開第０３／０８６４３７号パンフレット、国際公開第２００５／０３４９７５号パンフレットに記載されている。
【００６０】
「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」（動脈硬化発症・高リスク動物）における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、動脈硬化発症・高リスク動物としては、動脈硬化の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、アポＥ欠損マウスが挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常飼育で動脈硬化を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
【００６１】
なお、アポＥ欠損マウスを通常飼育するといずれ動脈硬化を発症するが、その発症は飼育２０週目ごろから検出可能となることが分かっている（例えば、Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology; 2004; 24; 1006-1014）。よって、飼育２０週目以前、例えば飼育１４週目のアポＥ欠損マウスは、動脈硬化の発症直前段階にあるといえる。本発明の評価方法で用いるマーカー物質（ＭＡ１）〜（ＭＡ６）及び（ＭＢ１）〜（ＭＢ２）は、飼育１４週目のアポＥ欠損マウスの体液中に存在し、動脈硬化の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてアポＥ欠損マウスを用いる場合には、例えば、飼育１４週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
【００６２】
一方、高コレステロール食を摂取するとアテローム形成するような動脈硬化自然発症モデル動物を用いることもできる。この場合には、例えば、被験物質とコレステロールとを同時摂取させることにより、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００６３】
本発明の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００６４】
本発明の評価方法における被験物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。すなわち、食品素材や医薬原体を評価対象とする場合は、機能性食品や医薬の開発に役立てることができる。
【００６５】
本発明の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６６】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６７】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６８】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６９】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００７０】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００７１】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００７２】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００７３】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００７４】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００７５】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７６】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７７】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被験物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果（動脈硬化の改善等効果）を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７８】
本発明の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、動脈硬化の改善等効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７９】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚以上
（２）強陰イオン交換基板：１枚以上
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００８０】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８１】
１．動脈硬化発症モデル動物を使った動物実験（１）
動脈硬化発症モデル動物としてアポＥ欠損マウス（The Jackson Laboratory社）、正常動物としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（日本チャールス・リバー社。以下、単に「正常マウス」と略記する。）を採用した。また、与える飼料としてＣＥ−２（日本クレア社。以下、単に「通常飼料」と略記する。）と、アゼルニジピンを０．００６％（３ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＣＥ−２（以下、単に「アゼルニジピン含有飼料」と略記する。）を採用した。アゼルニジピンとしては、カルブロック（登録商標、三共株式会社製）を採用した。
【００８２】
マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定し、飼育を開始した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
第２群：アポＥ欠損マウスを通常飼料で飼育
第３群：アポＥ欠損マウスをアゼルニジピン含有飼料で飼育
第４群：正常マウスをアゼルニジピン含有飼料で飼育
すなわち、第１群は動脈硬化を発症しない群、第２群は動脈硬化を発症する群、第３群は動脈硬化の発症が抑制される群、に相当する。第４群はアゼルニジピンの作用検証用の群である。
【００８３】
アポＥ欠損マウスにおいて動脈硬化が発症し始める飼育期間である１４週目に各群のマウスから血漿を採取し、体液試料とした。これにより、動脈硬化の発症直前段階の体液試料が得られた。
【００８４】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８５】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として２９個の候補ピークを１次選抜した。
【００８６】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）アゼルニジピン効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８７】
３．動脈硬化発症モデル動物を使った動物実験（２）
アゼルニジピンの代わりに紅花種子抽出物を用いて第３群と第４群を設定し、同様の動物実験を行った。第３群と第４群に与える飼料（紅花種子抽出物含有飼料）として、紅花種子抽出物を２％（１０００ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有する通常飼料を採用した。血漿の採取は飼育１３週目とした。上記（１）〜（３）の条件を指標として９個の候補ピークを１次選抜した。
【００８８】
４．動脈硬化発症モデル動物を使った動物実験（３）
アゼルニジピンの代わりに発酵乳を用いて第３群と第４群を設定し、同様の動物実験を行った。第３群と第４群に与える飼料（発酵乳含有飼料）として、発酵乳を１０％（５ｇ／ｋｇ体重に相当）含有する通常飼料を採用した。血漿の採取は飼育１３週目とした。上記（１）〜（３）の条件を指標として５個の候補ピークを１次選抜した。
【００８９】
５．マーカー物質の２次選抜
１次選抜された各候補ピークを比較し、アゼルニジピン摂取で増減するピーク６種（ＭＡ群；ＭＡ１〜ＭＡ６）と、アゼルニジピン摂取で増減しないピーク２種（ＭＢ群；ＭＢ１〜ＭＢ２）の計８種を最終選抜した。
【００９０】
６．マーカー物質（ＭＡ１）の特定
第３群と第４群にアゼルニジピン又は紅花種子抽出物を摂取させたときの画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が５２００（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した（グループ２）。図１（ａ），図１（ｂ）に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図１（ａ）はアゼルニジピン、図１（ｂ）は紅花種子抽出物を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのｐ値は０．０００２（アゼルニジピン；第１群ｖｓ第２群）、０．００８（アゼルニジピン；第２群ｖｓ第３群）、０．００６（紅花種子抽出物；第１群ｖｓ第２群）、０．０２７（紅花種子抽出物；第２群ｖｓ第３群）であった。なお、マーカー物質（ＭＡ１）は発酵乳摂取で増減しないものであった。
【００９１】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＡ１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物（動脈硬化発症・高リスク動物）の体液中におけるマーカー物質（ＭＡ１）の濃度を指標として、被験物質が有する「動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果」（動脈硬化の改善等効果）の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【００９２】
他のマーカー物質についても同様の手順で解析を行った。以下に、実験条件と結果を順次示す。
【００９３】
７．マーカー物質（ＭＡ２）の特定
・第３群と第４群への摂取：アゼルニジピン又は発酵乳
・質量／電荷比：６８３２（平均値）
・画分：画分３（ｐＨ３．０）
・プロテインチップ：強陰イオン交換チップＱ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ９．０
・ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ
・増減パターン：第１，３，４群で低値、第２群で高値（グループ１）
・ｐ値（発酵乳；第１群ｖｓ第２群）：０．０００２
・ｐ値（発酵乳；第２群ｖｓ第３群）：０．０００７
・紅花種子抽出物摂取で増減しない
・箱髭図：図２
図２の各箱髭図において、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は発酵乳を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【００９４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６８３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＡ２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＡ２）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６８３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【００９５】
８．マーカー物質（ＭＡ３）の特定
・第３群と第４群への摂取：アゼルニジピン又は発酵乳
・質量／電荷比：７００４（平均値）
・画分：画分４（有機溶媒）
・プロテインチップ：弱陽イオン交換チップＣＭ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ３．０
・ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ
・増減パターン：第１，３，４群で低値、第２群で高値（グループ１）
・ｐ値（アゼルニジピン；第１群ｖｓ第２群）：０．０００２
・ｐ値（アゼルニジピン；第２群ｖｓ第３群）：０．００４
・ｐ値（発酵乳；第１群ｖｓ第２群）：０．０００２
・ｐ値（発酵乳；第２群ｖｓ第３群）：０．００１
・紅花種子抽出物摂取で増減しない
・箱髭図：図３
図３の各箱髭図において、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は発酵乳を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【００９６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＡ３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＡ３）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【００９７】
９．マーカー物質（ＭＡ４）の特定
・第３群と第４群への摂取：アゼルニジピン
・質量／電荷比：７０９３（平均値）
・画分：画分３（ｐＨ３．０）
・プロテインチップ：強陰イオン交換チップＱ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ９．０
・ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ
・増減パターン：第１，３，４群で高値、第２群で低値（グループ２）
・ｐ値（アゼルニジピン；第１群ｖｓ第２群）：０．０００２
・ｐ値（アゼルニジピン；第２群ｖｓ第３群）：０．０００２
・紅花種子抽出物摂取、発酵乳摂取で増減しない
・箱髭図：図４
【００９８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０９０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＡ４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＡ４）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０９０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【００９９】
１０．マーカー物質（ＭＡ５）の特定
・第３群と第４群への摂取：アゼルニジピン
・質量／電荷比：７５６２（平均値）
・画分：画分３（ｐＨ３．０）
・プロテインチップ：弱陽イオン交換チップＣＭ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ３．０
・ＥＡＭ：ＣＨＣＡ
・増減パターン：第１，３，４群で高値、第２群で低値（グループ２）
・ｐ値（アゼルニジピン；第１群ｖｓ第２群）：０．０００２
・ｐ値（アゼルニジピン；第２群ｖｓ第３群）：０．０００９
・紅花種子抽出物摂取、発酵乳摂取で増減しない
・箱髭図：図５
【０１００】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７５６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＡ５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＡ５）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７５６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【０１０１】
１１．マーカー物質（ＭＡ６）の特定
・第３群と第４群への摂取：アゼルニジピン又は紅花種子抽出物
・質量／電荷比：８７２３（平均値）
・画分：画分１（ｐＨ９．０）
・プロテインチップ：弱陽イオン交換チップＣＭ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ３．０
・ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ
・増減パターン：第１，３，４群で高値、第２群で低値（グループ２）
・ｐ値（アゼルニジピン；第１群ｖｓ第２群）：０．０００７
・ｐ値（アゼルニジピン；第２群ｖｓ第３群）：０．０２８
・ｐ値（紅花種子抽出物；第１群ｖｓ第２群）：０．０００１
・ｐ値（紅花種子抽出物；第２群ｖｓ第３群）：０．００６
・発酵乳摂取で増減しない
・箱髭図：図６
図６の各箱髭図において、（ａ）はアゼルニジピン、（ｂ）は紅花種子抽出物を、第３群と第４群に摂取させた場合を示す。
【０１０２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８７２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＡ６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＡ６）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８７２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【０１０３】
１２．マーカー物質（ＭＢ１）の特定
・第３群と第４群への摂取：紅花種子抽出物
・質量／電荷比：４２３９（平均値）
・画分：画分３（ｐＨ３．０）
・プロテインチップ：強陰イオン交換チップＱ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ９．０
・ＥＡＭ：ＣＨＣＡ
・増減パターン：第１，３，４群で低値、第２群で高値（グループ１）
・ｐ値（紅花種子抽出物；第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
・ｐ値（紅花種子抽出物；第２群ｖｓ第３群）：０．０１５
・アゼルニジピン摂取、発酵乳摂取で増減しない
・箱髭図：図７
【０１０４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４２４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＢ１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＢ１）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４２４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【０１０５】
１３．マーカー物質（ＭＢ２）の特定
・第３群と第４群への摂取：紅花種子抽出物
・質量／電荷比：５０６５（平均値）
・画分：画分３（ｐＨ３．０）
・プロテインチップ：弱陽イオン交換チップＣＭ１０
・プロテインチップ結合バッファー：ｐＨ３．０
・ＥＡＭ：ＣＨＣＡ
・増減パターン：第１，３，４群で高値、第２群で低値（グループ２）
・ｐ値（紅花種子抽出物；第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
・ｐ値（紅花種子抽出物；第２群ｖｓ第３群）：０．００２
・アゼルニジピン摂取、発酵乳摂取で増減しない
・箱髭図：図８
【０１０６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５０７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ＭＢ２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化発症・高リスク動物の体液中におけるマーカー物質（ＭＢ２）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善等効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングを行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５０７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質が「動脈硬化の改善等効果を有する」と評価することができる。
【実施例２】
【０１０７】
マーカー物質（ＭＡ１）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて４℃で２０分間変性処理した。変性処理したサンプルを１２，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順に洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１０８】
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）にて平衡化した。分取したピーク画分に対して等量の５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）を添加・混合し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、約１ｍＬずつ分取した。各画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、３〜５番目の画分にマーカー物質（ＭＡ１）の質量／電荷比（平均値：５２００）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１０９】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図９）。図９中、レーン１〜５はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５．２ｋＤａのバンド（図９の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＡ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１０の矢印）。
【０１１０】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約５．２ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号８で表される１０アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列はマウスアポリポタンパク質Ａ２（配列番号１）の一部と完全一致していた。さらに、配列番号１のアミノ酸番号１８（Ｐｈｅ）〜６３（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片（配列番号２）の予想される等電点が６．７７、分子量が５１９５であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（ＭＡ１）は「アポリポタンパク質Ａ２の断片」（配列番号２）と同定された。
【実施例３】
【０１１１】
マーカー物質（ＭＡ２）、（ＭＡ３）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収した。
【０１１２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１１）。図３６中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．０ｋＤａ付近のバンド（図１１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＡ３）の質量／電荷比（平均値：７００４）と同等の質量／電荷比を示すピーク（図１２のａ）、並びに、マーカー物質（ＭＡ２）の質量／電荷比（平均値：６８３２）と同等の質量／電荷比を示すピーク（図１２のｂ）を確認した。
【０１１３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．０ｋＤａ付近のバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」のペプチドはそれぞれ配列番号９〜１１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」（配列番号４）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。
【０１１４】
【表１】
2010190804.tif 000003
【０１１５】
マーカー物質（ＭＡ３）は、その電荷／質量比（平均値：７００４）から、アポリポタンパク質Ｃ１の全長（配列番号４）と同定された。一方、アポリポタンパク質Ｃ１については、Ｎ末端の２アミノ酸残基（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損したタンパク質断片（配列番号５）が血清中に存在することが確認されている。そしてマーカー物質（ＭＡ２）は、その電荷／質量比（平均値：６８３２）から、当該アポリポタンパク質Ｃ１の断片（配列番号５）と同定された。アミノ酸配列から計算される質量は、図１２のピークａが６９９３Ｄａ、図１２のピークｂが６８２５Ｄａであった。
【実施例４】
【０１１６】
マーカー物質（ＭＡ６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（Innovative Research社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、５０％ アセトニトリル，０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１１７】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１３）。図１３中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．７ｋＤａのバンド（図１３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＡ６）の質量／電荷比（平均値：８７２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１４の矢印）。
【０１１８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８３２．０１」及び「１１９３．６９」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１８３２．０１」と「１１９３．６９」のペプチドはそれぞれ配列番号１２，１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」（配列番号１）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
【０１１９】
【表２】
2010190804.tif 000004
【実施例５】
【０１２０】
マーカー物質（ＭＢ１）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（５ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５．５ｍＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７．５ｍＬ加えて変性処理した。変性処理したサンプルをＭｉｌｌｅｘ ＨＶ ０．４５μｍフィルター（ミリポア社）でろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で洗浄後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）で溶出した（８段階）。各画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、３〜５番目の画分に、マーカー物質（ＭＢ１）の電荷比（平均値：４２３９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。３〜５番目の画分を混合した（計１８ｍＬ）。
【０１２１】
Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を８５０ｍＭ 硫酸アンモニウム／１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。３〜５番目の混合画分（計１８ｍＬ）に等量の８５０ｍＭ 硫酸アンモニウム／１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）を添加し、攪拌の後、氷上で３０分間静置した。１２，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。平衡化した前記カラムに、回収した上清を５ｍＬずつ添加し、素通り画分を回収した。
【０１２２】
ＲＥＳＯＵＲＣＥ １５ ＲＰＣ ４．６／１００（ＧＥヘルスケア社）を０．０５％ ＴＦＡにて平衡化した。この平衡化したカラムに、回収した素通り画分を１０ｍＬずつ添加した。Ａ液（０．０５％ ＴＦＡ）とＢ液（アセトニトリル／０．０５％ ＴＦＡ）を用いたグラジエント溶出（Ｂ液：０％→７０％／３０ＣＶ、流速１ｍＬ／分）を行い、溶出された画分を回収した。回収画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＢ１）の電荷比（平均値：４２３９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２３】
回収画分を遠心エバポレーターにかけて有機溶媒を除去した後、凍結乾燥して濃縮した。試料の一部をＰＡＧＥ（６Ｍ尿素を含む１６．５％ポリアクリルアミドゲルを使用）に供した（図１５）。図１５中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約４．２ｋＤａのバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＢ１）の電荷比（平均値：４２３９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６の矢印）。
【０１２４】
あらためて同様のＰＡＧＥを行って約４．２ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「９６２．５２」、「２６４８．３８」、及び「７９５．４５」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１４〜１６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「α１−アンチトリプシン」と同定された。さらにその分子量から、マーカー物質（ＭＢ１）は、α１−アンチトリプシン１−１（配列番号６）のアミノ酸番号３５４（Ｓｅｒ）〜３８９（Ｌｙｓ）に相当する「α１−アンチトリプシン１−１の断片」（配列番号７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１２５】
【表３】
2010190804.tif 000005
【実施例６】
【０１２６】
マーカー物質（ＭＢ２）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５．５ｍＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清１．２ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．８ｍＬ加えて変性処理した。変性処理したサンプルをＭｉｌｌｅｘ ＨＶ ０．４５μｍフィルター（ミリポア社）でろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）、１００ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）でカラムを順次洗浄した後、３３．３％イソプロパノール／１６．７％ 
アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで溶出・回収した。回収画分２．５ｍＬを遠心エバポレーターにかけて有機溶媒を除去した後、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＢ２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２７】
強陽イオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（８０μＬ）を５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で平衡化した。この平衡化したカラムに、先の回収画分１ｍＬを添加した。５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを順次洗浄した後、２５ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ１１．０）／３３．３％ イソプロパノール／１６．７％ アセトニトリルで溶出・回収した。回収画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＢ２）の電荷比（平均値：５０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２８】
回収画分を遠心エバポレーターにかけて有機溶媒を除去し、さらにアセトン沈殿処理した後、ＰＡＧＥ（６Ｍ尿素を含む１６．５％ポリアクリルアミドゲルを使用）に供した（図１７）。図１７中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５．１ｋＤａのバンド（図１７の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（ＭＢ２）の電荷比（平均値：５０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１８の矢印）。
【０１２９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約５．１ｋＤａのバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも４個のピークが検出され、それらの精密質量は「１６５７．７９」、「２８３２．４３」、「１８３１．９７」、及び「１１９３．６９」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１７〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
あらためて同様のＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約５．１ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号２１で表される１０アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列はマウスアポリポタンパク質Ａ２（配列番号１）の一部と完全一致していた。さらに、配列番号１のアミノ酸番号２９（Ｖａｌ）〜７３（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片（４５アミノ酸）の予想される等電点が８．３６、分子量が５０５９であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（ＭＡ２）は「アポリポタンパク質Ａ２の断片」と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号１のアミノ酸番号２９（Ｖａｌ）〜７３（Ｌｅｕ）の部分のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１３２】
各マーカー物質について、対応するＮＡ／ＮＢ群のマーカー、ｍ／ｚ値（平均値）、摂取素材ごとの増減の有無、グループ１と２の区別、箱髭図の番号、同定結果、および配列番号を、第５表に示す。
【０１３３】
【表５】
2010190804.tif 000007
【図１】
2010190804.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010190804.tif 000013
【図７】
2010190804.tif 000014
【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【配列表】
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