(57)【要約】【課題】生体内の移動物体の速度、特に生体内の血流の速度を簡易に測定する。【解決手段】生体内の移動物体の画像を同一の視野で異なる時刻に複数枚取得する画像取得ステップＳ２と、該画像取得ステップＳ２で取得された複数枚の画像を重ね合わせて投影画像を合成する画像合成ステップＳ４と、該画像合成ステップＳ４において合成された投影画像内から前記移動物体を検出する検出ステップＳ５と、該検出ステップＳ５で検出された移動物体間の距離を測定する測定ステップＳ６と、該測定ステップＳ６で測定された距離と前記画像の取得時刻とに基づいて前記移動物体の速度を算出する算出ステップＳ７とを備える生体観察方法を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内の移動物体の画像を同一の視野で異なる時刻に複数枚取得する画像取得ステップと、
該画像取得ステップで取得された複数枚の画像を重ね合わせて投影画像を合成する画像合成ステップと、
該画像合成ステップにおいて合成された投影画像内から前記移動物体を検出する検出ステップと、
該検出ステップで検出された移動物体間の距離を測定する測定ステップと、
該測定ステップで測定された距離と前記画像の取得時刻とに基づいて前記移動物体の速度を算出する算出ステップとを備える生体観察方法。
【請求項２】
前記画像合成ステップの前または後に、前記画像または前記投影画像の輝度値を反転する輝度値反転ステップを備える請求項１に記載の生体観察方法。
【請求項３】
前記画像取得ステップの前に前記生体に標識物質を投与する投与ステップを備える請求項１または請求項２に記載の生体観察方法。
【請求項４】
前記移動物体が生体の血管内を流れる血球であり、
前記画像取得ステップの前に、
前記生体から血液を採取する採取ステップと、
該採取ステップで採取された血液に標識物質を添加する添加ステップと、
該添加ステップで標識物質を添加された血液を前記生体内へ戻す還元ステップとを備える請求項１または請求項２に記載の生体観察方法。
【請求項５】
前記標識物質が、蛍光色素である請求項３または請求項４に記載の生体観察方法。
【請求項６】
前記標識物質が、蛍光色素と、該蛍光色素が結合され、移動物体または移動物体外部の領域に存在する特定物質に結合する被標識物認識部である請求項３または請求項４に記載の生体観察方法。
【請求項７】
前記被標識物認識部が、抗体である請求項６に記載の生体観察方法。
【請求項８】
前記標識物質が、蛍光色素と、該蛍光色素が結合され前記生体内の物質と結合しない非結合性分子化合物である請求項３または請求項４に記載の生体観察方法。
【請求項９】
前記非結合性分子化合物が、多糖類である請求項８に記載の生体観察方法。
【請求項１０】
前記非結合性分子化合物が、ポリペプチドである請求項８に記載の生体観察方法。
【請求項１１】
生体内の移動物体の画像を同一の視野で異なる時刻に複数枚取得する画像取得部と、
該画像取得部で取得された複数枚の画像を重ね合わせて投影画像を合成する画像合成部と、
該画像合成部で合成された投影画像内の前記移動物体を検出する検出部と、
該検出部で検出された前記移動物体間の距離を測定する測定部と、
該測定部で測定された距離と前記画像の取得時刻に基づいて前記移動物体の速度を算出する算出部とを備える生体観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体観察方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学や分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）や、生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポータとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質を蛍光標識や発光標識して生体細胞を観察する必要が高まっている。また、小動物など生体の内部の様子を生きたままの状態（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で、光を使って体外計測する手法は、医学研究等にとって重要である。特に、薬物動態解析等のために、血流の速度計測など移動物体の形状や速度を画像解析によって知ることは重要な技術となっている。
【０００３】
この種の解析方法として、パルス光またはシャッタを用いて断続的に血管を照射しながら、赤血球が通過することによって生じる輝度値の時間変化を血管の２箇所で測定し、得られた時間と輝度値の２つのグラフの相関から血流速度を算出する計測装置および方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】特開平２−２５７９３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の装置および方法では、パルス光やシャッタとカメラとを連動させて画像を取得する必要があるため、装置が複雑かつ高価になってしまうという課題がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体内の移動物体の速度、特に血流の速度を簡易に測定することができる生体観察方法および装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体内の移動物体の画像を同一の視野で異なる時刻に複数枚取得する画像取得ステップと、該画像取得ステップで取得された複数枚の画像を重ね合わせて投影画像を合成する画像合成ステップと、該画像合成ステップにおいて合成された前記投影画像内から前記移動物体を検出する検出ステップと、該検出ステップで検出された移動物体間の距離を測定する測定ステップと、該測定ステップで測定された距離と前記画像の取得時刻とに基づいて前記移動物体の速度を算出する算出ステップとを備える生体観察方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、画像取得ステップにおいて移動物体の画像を取得し、画像合成ステップにおいて、取得された画像のうち複数枚の画像を合成して投影画像を作成する。そして、投影画像内の移動物体が検出ステップにおいて検出され、検出された移動物体間の距離を測定ステップにおいて測定する。この測定された距離と、合成に用いられた画像の取得時刻の間隔から、算出ステップにおいて速度を算出すると、生体内の移動物体を観察してその速度を測定することができる。
【０００９】
この場合に、視野が同一で取得時刻が異なる画像を合成することで、取得時刻の異なる各画像内の移動物体の像が、各画像内と同一の位置に、ひとつの投影画像内に表示される。すなわち、移動物体が、移動した軌跡に沿って取得時刻の間隔で並んだ投影画像を得る。これにより、移動物体の移動距離を容易に測定することができる。
【００１０】
また、投影画像を作成するための画像は、従来の方法で撮影される光学画像でよい。したがって、簡易な構成の顕微鏡やカメラなどを用いることができると同時に、生体内の移動物体の速度をｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記画像合成ステップの前または後に、前記画像または前記投影画像の輝度値を反転する輝度値反転ステップを備えてもよい。
移動物体の輝度に応じて輝度値を反転することにより、移動物体をより鮮明に表示して容易に検出することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記画像取得ステップの前に、前記生体に標識物質を投与する投与ステップを備えてもよい。
このようにすることで、移動物体または移動物体以外の観察領域を標識し、移動物体を容易に検出することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記移動物体が生体の血管内を流れる血球であり、前記画像取得ステップの前に、生体から血液を採取する採取ステップと、該採取ステップで採取された血液に標識物質を添加する添加ステップと、該添加ステップで標識物質を添加された血液を前記生体内へ戻す還元ステップとを備えてもよい。
このようにすることで、生体の血管内の血球または血球以外の観察領域を標識し、血球を容易に検出することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記標識物質が、蛍光色素であってもよい。
このようにすることで、移動物体または移動物体以外の観察領域を蛍光色素で標識して蛍光画像を取得し、移動物体を明部または暗部としてより容易にかつ正確に検出することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記標識物質が、蛍光色素と、該蛍光色素が結合され、移動物体または移動物体外部の領域に存在する特定物質に結合する被標識物認識部であってもよい。
また、上記発明においては、前記被標識物認識部が、抗体であってもよい。
このようにすることで、移動物体または移動物体外部の観察領域を蛍光色素で選択的に標識して蛍光画像を取得し、移動物体を明部または暗部として容易に検出することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記標識物質が、蛍光色素と、該蛍光色素が結合され前記生体内の物質と結合しない非結合性分子化合物であってもよい。
また、上記発明においては、前記非結合性分子化合物が、多糖類であってもよく、ポリペプチドであってもよい。
【００１７】
このようにすることで、移動物体外部の観察領域に蛍光色素を分散させ、移動物体を暗部として容易に検出することができると同時に、生体親和性の高い化合物を用いることにより生体への影響を低減することができる。
【００１８】
また、本発明は、生体内の移動物体の画像を同一の視野で異なる時刻に複数枚取得する画像取得部と、該画像取得部で取得された複数枚の画像を重ね合わせて投影画像を合成する画像合成部と、該画像合成部で合成された投影画像内の前記移動物体を検出する検出部と、該検出部で検出された前記移動物体間の距離を測定する測定部と、該測定部で測定された距離と前記画像の取得時刻に基づいて前記移動物体の速度を算出する算出部とを備える生体観察装置を提供する。
【００１９】
本発明によれば、画像取得部において移動物体の画像を複数枚取得し、これらの画像のうち複数枚を用いて画像合成部において投影画像を作成する。そして、投影画像内の移動物体が検出部において検出され、測定部で移動物体間の距離が測定される。この距離と、各画像の取得時刻の間隔から、算出部において移動物体の速度が算出されることにより、生体内の移動物体を観察してその速度を測定することができる。
【００２０】
このようにすることで、投影画像内から容易に移動物体の移動距離を測定することができる。また、画像は従来の光学画像でよいので、移動物体の画像の取得には簡易な構成の顕微鏡やカメラを用いて移動物体の画像の取得および測定をｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、生体内の移動物体の速度、特に生体内の血流の速度を簡易に測定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置１および生体観察方法について、図１〜図４を参照して以下に説明する。また、本実施形態においては、生きたマウスＡの血管内を流れる赤血球Ｂの速度ｖを測定し、測定された速度ｖに基づいて血流の速度を解析することとする。
本実施形態に係る生体観察装置１は、図１に示されるように、一般の正立型光学顕微鏡２と、光源３と、画像取得部４と、コンピュータ５とを備えている。
【００２３】
正立型光学顕微鏡２は、マウスＡを載せるステージ６と、対物光学系７と、該対物光学系７並びに画像取得部４および光源３との間に配置されたダイクロイックミラー８と、第１および第２の波長フィルタ９，１０とにより構成されている。
【００２４】
光源３からの光は、第１の波長フィルタ９において所定の波長の光のみが透過してダイクロイックミラー８で反射され、対物光学系７を介してマウスＡを照射する。
また、マウスＡからの光は対物光学系７で集光されてダイクロイックミラー８を透過し、第２の波長フィルタ１０で不要な波長の光がカットされて画像取得部４で検出される。
【００２５】
画像取得部４は、例えば、ＣＣＤカメラである。
コンピュータ５は、光源３およびＣＣＤカメラに接続されており、ＣＣＤカメラの画像取得の条件の制御、取得された画像の表示および光源３の光量の調節を行う。
また、コンピュータ５は、投影画像の合成、投影画像内の赤血球Ｂの検出、赤血球Ｂ間の距離Ｌの測定および速度ｖの算出を行う。
【００２６】
このように構成された生体観察装置１を用いた生体観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係る生体観察方法は、図２に示されるように、マウスＡに蛍光色素を投与する投与ステップＳ１１と、マウスＡの血管をタイムラプス観察して蛍光画像を取得する画像取得ステップＳ２と、取得された蛍光画像の輝度値を反転させる輝度値反転ステップＳ３と、輝度値を反転させた画像から投影画像を合成する画像合成ステップＳ４と、投影画像内から赤血球Ｂを検出する検出ステップＳ５と、検出された赤血Ｂ球間の距離Ｌを測定する測定ステップＳ６と、測定された距離Ｌと蛍光画像の取得時刻から速度ｖを算出する算出ステップＳ７とを備えている。
【００２７】
マウスＡは、図示しないが、予め麻酔をかけておく。
投与ステップＳ１１は、例えば、注射器を使用してマウスＡの血管内に近赤外蛍光色素を投与し、近赤外蛍光色素を体内に循環させる。
そして、画像取得ステップＳ２において、光源３によりマウスＡを照明してマウスＡの血管を所定の時間間隔でタイムラプス観察する。ＣＣＤカメラで取得された全蛍光画像は、輝度値反転ステップＳ３において、各ピクセルの輝度値が反転させられ、明部が暗部として、暗部が明部として表示される。
【００２８】
画像合成ステップＳ４は、例えば、図３（ａ），（ｃ）に示されるように、時刻ｔ１，ｔ２に取得された２枚の輝度値の反転した画像を選択して、図３（ｂ），（ｄ）のような投影画像を合成する。具体的には、２枚の画像内の各ピクセルの輝度値を比較し、輝度値の低い方や高い方、あるいは２つの輝度値の平均をそのピクセルの輝度値として１枚の投影画像を作成する。本実施形態においては、２つの輝度値のうち高い方を選択してそのピクセルの輝度値とする。
【００２９】
続いて、検出ステップＳ５において、投影画像内から丸い形状のものを赤血球Ｂとして検出したら、測定ステップＳ６において、検出された赤血球Ｂの重心位置の距離Ｌを測定する。
そして、算出ステップＳ７において距離Ｌおよび各画像の取得時刻の間隔ｔ＝ｔ２−ｔ１から、赤血球Ｂの速度ｖ＝Ｌ／ｔが算出される。
画像合成ステップＳ４から算出ステップＳ７の処理を、取得した全蛍光画像について行い、算出された速度を統計処理することにより、血流の速度を解析することができる。
【００３０】
本実施形態においては、このようにすることで、血管内の血漿中に近赤外蛍光色素を分散させて血管内の赤血球Ｂ以外の領域を標識し、蛍光画像内で赤血球Ｂを暗部として観察することができる。そして、蛍光画像の輝度値を反転させることにより、赤血球Ｂを明部として表示し、赤血球Ｂをより容易に識別することができる。
【００３１】
また、投影画像を合成する際に、輝度値の反転した２枚の画像内の各ピクセルにおいて高い方の輝度値を選択する。このようにすることで、赤血球Ｂが表示された輝度値の高い部位が各画像から選択されるので、投影画像内には、時刻ｔ１，ｔ２に存在していた各位置に赤血球Ｂの像が表示され、赤血球Ｂが時刻ｔ１から時刻ｔ２までに移動した距離Ｌを一つの画像上で容易に測定することができる。
【００３２】
また、一般の蛍光画像を用いるので、簡易な構成の正立型光学顕微鏡２、光源３およびＣＣＤカメラを用いることができると同時に、生きたマウスＡの血管を観察して容易にｉｎ  ｖｉｖｏの赤血球Ｂの速度ｖを測定することができる。
【００３３】
なお、本実施形態においては、投影画像内の赤血球Ｂの像が不鮮明な場合、コンピュータ５に表示される画像上で、マウスデバイス等を用いて手動で点、円、楕円などで赤血球Ｂをマーキングして検出してもよい。
このようにすることで、赤血球Ｂの検出の精度を向上させることができる。
【００３４】
また、上記実施形態においては、標識物質として近赤外蛍光色素を用いたが、これに代えて、蛍光色素が結合された多糖類またはポリペプチドを用いてもよい。
生体内に存在する化合物を用いることにより、マウスＡへの影響を低減することができる。
【００３５】
また、上記実施形態においては、標識物質として蛍光色素が結合された抗体を用いてもよい。
このようにすることで、血漿中または赤血球Ｂ表面に存在する蛋白質などの生体分子を選択的に蛍光色素で標識することができる。
【００３６】
また、上記実施形態においては、光源からの光を対物光学系を介してマウスに照射したが、これに代えて、図４に示されるように、光源からの光をファイバで導光してマウスを照射してもよい。
この場合、生体観察装置１は、光源３にファイバ１１を備え、ダイクロイックミラー８が不要である。
【００３７】
光源３からの光は、第１の波長フィルタ９を透過した所定の波長の光のみがファイバ１１内を導光してマウスＡに照射される。
また、マウスＡからの発光は、対物光学系７により集光され、第２の波長フィルタ１０によって不要な波長の光がカットされてＣＣＤカメラで検出される。
【００３８】
本発明の第２の実施形態について、図５から図７を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る生体観察装置１と構成を共通とする箇所には同一の符号を付して説明を省略する。また、第１の実施形態と同様に、生きたマウスＡの血管内の赤血球Ｂを測定の対象とする。
本発明の第２の実施形態に係る生体観察装置１は、図５に示されるように、走査型光学顕微鏡１２と、画像取得部４と、コンピュータ５と、アナログ処理部１３と、記憶部１４と、入力部１５と、表示部１６とにより構成されている。
【００３９】
走査型光学顕微鏡１２は、ステージ６と、光源３と、対物光学系７と、該対物光学系７と光源３との間に配置された２次元スキャナ１７と、ダイクロイックミラー８と、波長フィルタ１０とを備えている。
【００４０】
光源３はレーザ光源であり、該レーザ光源から出力されたレーザ光は、ダイクロイックミラー８で反射されて２次元スキャナ１７によって光軸方向に対して垂直な面（ＸＹ面）に振られ、対物光学系７を介してマウスＡを走査する。
また、マウスＡからの発光は対物光学系７により集光され、２次元スキャナ１７内と、ダイクロイックミラー８を透過して、波長フィルタ１０によって不要な波長の光がカットされ、画像取得部４で検出される。
【００４１】
画像取得部４は、例えば、受光素子であり、検出した光の情報をアナログ電気信号に変換して出力するようになっている。
アナログ処理部１３は、オフセット演算部１３ａと、アナログ増幅器１３ｂと、Ａ／Ｄ変換器１３ｃにより構成されている。
【００４２】
受光素子から出力されたアナログ信号は、オフセット演算部１３ａでオフセットが加えられてアナログ増幅器１３ｂで信号が増幅され、Ａ／Ｄ変換器１３ｃでデジタル信号に変換された後コンピュータ５へ出力される。
【００４３】
記憶部１４は、例えば、ＣＤ‐ＲＯＭ等の記憶媒体やハードディスクであり、画像を処理する処理プログラムが記憶されている。この処理プログラムをコンピュータ５で呼び出して、コンピュータ５上で投影画像の合成、赤血球Ｂの検出、赤血球Ｂ間の距離Ｌの測定、および速度ｖの算出を行うようになっている。
また、入力部１５は、例えば、コンピュータ５に接続されるマウスデバイスであり、表示部１６は、受光素子で検出されコンピュータ５で画像化された発光画像を表示する。
【００４４】
このように構成された生体観察装置１を用いた生体観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係る生体観察方法は、図６に示されるように、マウスＡから血液を採取する採取ステップＳ１２と、採取した血液に蛍光色素を添加する添加ステップＳ１３と、蛍光色素を添加した血液をマウスＡの体内へ戻す還元ステップＳ１４と、画像取得ステップＳ２と、画像合成ステップＳ４と、検出ステップＳ５と、測定ステップＳ６と、算出ステップＳ７により構成されている。
【００４５】
採取ステップＳ１２においてマウスＡから採取した血液に、添加ステップＳ１３において赤血球Ｂを標識する蛍光色素、例えば、ＤｉＩやＤｉＯ（共にｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加する。そして、還元ステップＳ１４において、標識された赤血球ＢをマウスＡの体内へ戻してマウスＡの体内に循環させる。
【００４６】
画像取得ステップＳ２は、レーザ光源からレーザ光を出力してマウスＡを走査し、所定時間間隔でタイムラプス観察して赤血球Ｂからの発光を受光素子で検出する。検出された光の信号はアナログ処理部１３で処理されてコンピュータ５に送られる。そして、記憶部１４に記憶されている処理プログラムをコンピュータ５上に読み出し、画像合成ステップＳ４から算出ステップＳ７までの処理を行う。
【００４７】
画像合成ステップＳ４は、例えば、図７（ａ），（ｃ）に示されるように、時刻ｔ１，ｔ２における蛍光画像内の各ピクセルの輝度値のうち高い方を選択し、図７（ｂ），（ｄ）に示されるように投影画像を作成する。検出ステップＳ５から算出ステップＳ７までは、第１の実施形態と同様に行われる。取得された全蛍光画像について画像合成ステップＳ４から算出ステップＳ７を行い、算出された速度ｖを統計処理すると、血流の速度を解析することができる。
【００４８】
このようにすることで、赤血球Ｂを蛍光色素で標識して容易に識別することができる。また、投影画像内には、赤血球Ｂが移動した軌跡上の時刻ｔ１，ｔ２における各位置に赤血球Ｂの蛍光像が表示される。
これより、容易に赤血球Ｂが移動した距離Ｌを測定できると同時に、従来の構成の走査型光学顕微鏡と受光素子を用いて、マウスＡの体内を移動する赤血球Ｂおよび血流の速度をｉｎ  ｖｉｖｏで容易に測定することができる。
【００４９】
なお、検出ステップＳ５において、表示部１６に表示された画像上の赤血球Ｂを、入力部１５を用いて点や円などでマーキングして検出してもよい。
このようにすることで、赤血球Ｂの検出の精度を向上させることができる。
【００５０】
また、上記実施形態においては、光源および受光素子をそれぞれ１つずつ備えているが、それぞれ複数備えていてもよい。
このようにすることで、励起波長の異なる複数の種類の蛍光色素により、例えば、赤血球Ｂおよび他の生体分子を標識し、両者の速度を同時に測定することができる。
【００５１】
なお、第１および第２の実施形態においては、赤血球Ｂを移動物体として測定を行っているが、赤血球Ｂに限らず他の移動物体にも応用可能である。
また、第１および第２の実施形態においては、正立型の光学顕微鏡を用いているが、倒立型の光学顕微鏡および一般の生体観察装置にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置を示す全体図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る生体観察方法を示すフローチャートである。
【図３】（ａ）時刻ｔ１，ｔ２における血管の蛍光画像の輝度を反転した画像、（ｂ）投影画像、（ｃ）図３（ａ）の模式図、（ｄ）図３（ｂ）の模式図である。
【図４】本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置の変形例である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る生体観察装置を示す全体図である。
【図６】本発明の第２の実施形態に係る生体観察方法を示すフローチャートである。
【図７】（ａ）時刻ｔ１，ｔ２における血管の蛍光画像、（ｂ）投影画像、（ｃ）図７（ａ）の模式図、（ｄ）図７（ｂ）の模式図である。
【符号の説明】
【００５３】
１  生体観察装置
２  正立型光学顕微鏡
３  光源
４  画像取得部
５  コンピュータ（画像合成部、検出部、測定部、算出部）
６  ステージ
７  対物光学系
８  ダイクロイックミラー
９  第１の波長フィルタ
１０  第２の波長フィルタ
１１  ファイバ
１２  走査型光学顕微鏡
１３  アナログ処理部
１３ａ  オフセット演算部
１３ｂ  アナログ増幅器
１３ｃ  Ａ／Ｄ変換器
１４  記憶部
１５  入力部
１６  表示部
１７  ２次元スキャナ
Ｓ１１  投与ステップ
Ｓ１２  採取ステップ
Ｓ１３  添加ステップ
Ｓ１４  還元ステップ
Ｓ２  画像取得ステップ
Ｓ３  輝度値反転ステップ
Ｓ４  画像合成ステップ
Ｓ５  検出ステップ
Ｓ６  測定ステップ
Ｓ７  算出ステップ
Ａ  マウス
Ｂ  赤血球
Ｌ  距離
【図１】
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【図２】
2010017396.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010017396.tif 000009