(57)【要約】【課題】簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法等を提供する。【解決手段】（１）検体中に含まれるＤＮＡから、目的とする領域の塩基配列を含むＤＮＡを取得する第一工程、（２）第一工程で得られた前記ＤＮＡをメチル化酵素で処理し、メチル化ＤＮＡを取得する第二工程、（３）第二工程で得られた前記メチル化ＤＮＡから、一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、（４）第三工程で選択された前記一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、特定オリゴヌクレオチドと、を結合させて、該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドと、の複合体を形成させて、該複合体を取得する第四工程等を含む検体中に含まれるＤＮＡ中の目的とする領域のメチル化されたＤＮＡの含量を定量または検出する方法等を提供する。【選択図】図１
2010017178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、
（４）第三工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、該一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域のメチル化された部分と該メチル化ＤＮＡ抗体との結合を阻害せず、且つ、該一本鎖ＤＮＡと相補性により結合し得る塩基配列を有する特定オリゴヌクレオチドと、を混合させて、
該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドとの複合体を形成させる第四工程、
（５）第四工程で形成した複合体に含まれる前記メチル化ＤＮＡ抗体をその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第四工程において、二価陽イオンを含有する反応系中で複合体を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二価陽イオンがマグネシウムイオンである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第五工程開始までに、第四工程で形成される複合体に含まれる抗体と支持体とを結合させる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第五工程開始までに、第四工程で形成される複合体に含まれる特定オリゴヌクレオチドと支持体とを結合させる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡメチル化酵素が、シトシンメチル化酵素である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡメチル化酵素が、SssIメチラーゼである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
メチル化ＤＮＡ抗体が、メチルシトシン抗体である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
検体が、下記のいずれかの検体である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
【請求項１０】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ
（ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ
（ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
【請求項１１】
第四工程における複合体形成時にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
【請求項１５】
検体が、哺乳動物由来の血清である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法としては、例えば、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）によってＤＮＡを増幅させて検出する方法や、生物由来検体中のＤＮＡが有する目的のＤＮＡ領域に蛍光標識したオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて検出する方法等が知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chiquet C., Lina G., Benito Y., Cornut P.L., Etienne J., Romanet J.P., Denis P., Vandenesch F.,Polymerase chain reaction identification in aqueous humor of patients with postoperative endophthalmitis.,J. Cataract. Refract. Surg.,2007;33(4):635-641.
【非特許文献２】Brandriff B.F., Gordon L.A., Trask B.J.,DNA sequence mapping by fluorescence in situ hybridization.,Environ. Mol. Mutagen.1991;18(4):259-262.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記方法は、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要する。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を調製して液相中にてＰＣＲ反応が行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作や、目的領域を増幅させるための前記プライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、それらの操作は極めて繁雑である。
また、in situ hybridizationは、検体の病理標本の作製のために、多大な時間と労力を要する方法である。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
[発明１]
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、
（４）第三工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、該一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域のメチル化された部分と該メチル化ＤＮＡ抗体との結合を阻害せず、且つ、該一本鎖ＤＮＡと相補性により結合し得る塩基配列を有する特定オリゴヌクレオチドと、を混合させて、
該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドとの複合体を形成させる第四工程、
（５）第四工程で形成した複合体に含まれる前記メチル化ＤＮＡ抗体をその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法。
[発明２]
第四工程において、二価陽イオンを含有する反応系中で複合体を形成させる発明１に記載の方法。
[発明３]
二価陽イオンがマグネシウムイオンである発明２に記載の方法。
[発明４]
第五工程開始までに、第四工程で形成される複合体に含まれる抗体と支持体とを結合させる発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明５]
第五工程開始までに、第四工程で形成される複合体に含まれる特定オリゴヌクレオチドと支持体とを結合させる発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明６]
ＤＮＡメチル化酵素が、シトシンメチル化酵素である発明１〜５のいずれか一に記載の方法。
[発明７]
ＤＮＡメチル化酵素が、SssIメチラーゼである発明１〜６のいずれか一に記載の方法。
[発明８]
メチル化ＤＮＡ抗体が、メチルシトシン抗体である発明１〜７のいずれか一に記載の方法。
[発明９]
検体が、下記のいずれかの検体である発明１〜８のいずれか一に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
[発明１０]
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである発明１〜９のいずれか一に記載の方法。
（ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ
（ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ
（ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
[発明１１]
第四工程における複合体形成時にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明１〜１０のいずれか一に記載の方法
[発明１２]
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である発明１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
[発明１３]
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である発明１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
[発明１４]
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１〜１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
[発明１５]
検体が、哺乳動物由来の血清である発明１４に記載の方法。
[発明１６]
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
；等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施例１において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２】図２は、実施例２において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図３】図３は、実施例３において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図４】図４は、実施例３において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図５】図５は、実施例３において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬと５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図６】図６は、実施例４において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(1000 ng each/30 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (500 ng each/30 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(200 ng each/30 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng each/30 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図７】図７は、実施例５において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(1000 ng each/30 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (500 ng each/30 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(200 ng each/30 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng each/30 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図８】図８は、実施例６において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(500 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (50 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(5 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図９】図９は、実施例７において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１０】図１０は、実施例８において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１１】図１１は、実施例９において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１２】図１２は、実施例９において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１３】図１３は、実施例９において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬと５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１４】図１４は、実施例１０において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(100 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１５】図１５は、実施例１１において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(100 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１６】図１６は、実施例１２において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１７】図１７は、実施例１３において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１８】図１８は、実施例１４において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図１９】図１９は、実施例１４において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２０】図２０は、実施例１４において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬと５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２１】図２１は、実施例１５において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２２】図２２は、実施例１６において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２３】図２３は、実施例１７において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２４】図２４は、実施例１８において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/20 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２５】図２５は、実施例１９において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２６】図２６は、実施例１９において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２７】図２７は、実施例１９において、メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬと５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を励起340 nm/蛍光612 nmにて測定した値を示している。
【図２８】図２８は、実施例２０において、処理1により目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルAについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルBについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルC (ネガティブコントロール液) について処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図２９】図２９は、実施例２０において、処理2により目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルAについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルBについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルC (ネガティブコントロール液) について処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図３０】図３０は、実施例２１において、目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルAについて処理1を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルBについて処理1を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルC (ネガティブコントロール液) について処理1を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図３１】図３１は、実施例２１において、目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Aはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルAについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Bはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルBについて処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Cはビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて血清サンプルC (ネガティブコントロール液) について処理2を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
【図３２】図３２は、実施例２２において、ヒト血清中に含まれる目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、メチルシトシン抗体および5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いて検出した結果と、リアルタイムPCRにより定量した結果を比較した図である。検出結果を縦軸に、リアルタイムPCRによる定量結果を横軸にとり、プロットした。またグラフ中の直線は回帰直線（太線）および標準誤差範囲（細線）を示してある。
【図３３】図３３は、実施例２２において、ヒト血清中に含まれる目的とするDNA領域Zを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、59歳以下のヒト血清サンプルについて、メチルシトシン抗体および5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を用いてDNAを検出した結果を、癌患者と健常者に分けてプロットしたものである。◆は健常者、▲は癌患者の測定結果を示しており、それぞれについて平均値および標準偏差を示してある。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法（以下、本発明方法と記すこともある。）に関するものである。
【０００９】
本発明方法における「検体」としては、非生物由来検体と生物由来検体とが挙げられる。非生物由来検体とは、例えば食品、河川、土壌、一般市販製品の表面付着物等の真菌、細菌、ウイルス等の混入微生物や核酸が含まれ得るものを意味する。
尚、特に食品においては食中毒菌の有無の検査と原因菌の特定が重要であり、通常は微生物表面の抗原を利用した免疫法が使用される。しかし、免疫法は、抗原を作るために多大の労力を必要とし、更に病原菌の特定が必要となる。即ち、微生物検査における免疫法は、微生物種の特異性を利用しているため、一回の検査で複数菌種をまとめて、その有無を検査することが難しいだけでなく、免疫法を確立できない微生物に対しては、ＰＣＲ法等を用いる等、検査には多大の労力が必要となる。本発明方法は、まず、免疫法による検査が難しい場合でも、遺伝子から検査方法を確立でき、次に、複数の微生物を同時に検出することが可能な検査方法を提供できる。即ち、本発明方法は、非生物由来検体中に存在する真菌類、微生物類、ウイルス等の検査に利用できる。
また、本発明方法を用いることにより、例えば食品中の混入微生物やウイルスを検出することが可能となり、感染症の検査や食品汚染検査等で利用が期待できる。
【００１０】
生物由来検体とは、（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ、（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、等が挙げられる。尚、前記組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味であり、前記体液とは血漿、血清、リンパ液等を意味し、前記体分泌物とは尿や乳汁等を意味する。
【００１１】
検体中に含まれるＤＮＡとしては、前記生体試料や前記混入微生物から抽出して得られたゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片、若しくはＲＮＡ等を挙げることができる。
また、哺乳動物由来の検体がヒトの血液、体液又は体分泌物等である場合には、ヒトの定期健康診断における臨床検査等で採取したものを利用することができる。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
【００１２】
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いればよい。また、ＲＮＡからＤＮＡを得るためには、市販のｃＤＮＡ作製キット等の逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成するようなキットを用いればよい。また、本発明方法においては、検体としては、人工的に合成されたＤＮＡであっても良い。
【００１３】
本発明方法における「哺乳動物」とは、哺乳動物に属する動物の全てを意味する。哺乳動物に属する動物とは、動物界 脊索動物門 脊椎動物亜門 哺乳綱（Mammalia）に分類される動物の総称であり、より具体的には、ヒト、サル、マーモセット、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等を意味する。
【００１４】
本発明における「体液」とは、固体を構成する細胞間に存在する液体を意味し、血漿と間質液を意味し、多くの場合、固体の恒常性の維持機能を果たす。より具体的には、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）、脳脊髄液、等を意味する。
【００１５】
本発明における「体分泌液」とは、外分泌腺からの分泌液を意味する。より具体的には、唾液、胃液、 胆汁、 膵液、腸液、 汗、 涙、 鼻水、 精液、 膣液、 羊水、 乳汁、等を意味する。
【００１６】
本発明における「細胞溶解液」とは、細胞培養用の10cmプレート等で培養した細胞、即ち細胞株や初代培養細胞、血球細胞等を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液を意味する。細胞膜を破壊する方法としては、超音波による方法、界面活性剤を用いる方法、アルカリ溶液をを用いる方法等が挙げられる。尚、細胞を溶解するためには、様々なキット等を利用してもよい。
例えば具体的には、10cmプレートでコンフルエントになるまで細胞を培養した後、培養液を捨てて、0.6mLのRIPAバッファー（1x TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxysholate, 0.1% SDS, 0.004% sodium azide）を10cmプレートに加える。4℃で15分間プレートをゆっくり揺り動かしてから、10cmプレート上の接着細胞を、スクレーパー等を用いて剥がし、プレート上の溶解液をマイクロチューブに移す。溶解液の１/10容量の10mg/mL PMSFを添加してから、氷上で30-60分間放置する。4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を細胞溶解液として取得する。
【００１７】
本発明における「組織溶解液」とは、哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壊することにより取得する細胞内液を含む溶解液を意味する。
より具体的には、動物から取得した組織の重量を測定した後、カミソリ等を用いて組織を小片に裁断する。凍結組織をスライスする場合は、更に小さい小片にする必要がある。裁断後、氷冷RIPAバッファー（プロテアーゼインヒビター、フォスファターゼインヒビター等を添加してもよく、例えば、RIPAバッファーの１/10容量の10mg/mL PMSFを添加しても良い）を組織1gあたり3mLの比率で添加し、４℃でホモジナイズする。ホモジナイズには、ソニケーターや加圧型細胞破砕装置を用いる。ホモジナイズの作業では、溶液を常に４℃に維持し、発熱を抑えるようにする。ホモジナイズ液を、マイクロチューブに移して、4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を組織溶解液として取得する。
【００１８】
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）とは、検体中に含まれるＤＮＡ領域のうち、本発明方法により検出又は定量したいＤＮＡ領域である。検体がＤＮＡである場合の目的とするＤＮＡ領域とは、ＤＮＡの塩基配列上の塩基配列を意味し、検体がＲＮＡである場合には、ＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡの塩基配列上の塩基配列を意味する。本発明方法においては、シトシンをメチル化して検出又は定量する方法であるため、目的領域はシトシン或いは後述のＣｐＧに富む領域を含むことが望ましい。
【００１９】
第一工程は、検体中から目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを取得する工程である。
「目的とするＤＮＡ領域」とは、例えばゲノムＤＮＡ上の検出対象となる所定の塩基配列を意味する。また、検体中に含まれるＲＮＡを検出する場合、「目的とするＤＮＡ領域」とは、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素により合成されたＤＮＡ上の塩基配列であって、ＲＮＡ上の検出対象となる所定の塩基配列の相補的塩基配列を意味する。
【００２０】
第一工程で取得されるＤＮＡは、該ＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であってもよく、また予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。他に、第一工程で取得されるＤＮＡ試料として、血液中の遊離ＤＮＡ、微生物ゲノム由来のＤＮＡ、検体中のＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡ等が挙げられる。更には、「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」は人工的に合成されたＤＮＡであっても良い。
【００２１】
目的とするＤＮＡ領域の塩基配列を含むゲノムＤＮＡを取得するには、例えば、検体が哺乳動物由来の場合は、市販のＤＮＡ抽出用キット（Genfind v2 Kit（ベックマン・コールター社製）、FastPure DNA Kit（タカラバイオ株式会社製））等を用いればよい。
また、検体が真菌等の微生物である場合、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法等を用いればよく、検体が大腸菌のような原核生物である場合、Molecular Cloning -A Laboratory Manual-（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているような一般的な微生物ゲノム調製法等を用いればよい。
また、検体が食品である場合、食品から微生物等を分離してからＤＮＡを取得してもよく、食品に含まれる微生物以外のゲノムＤＮＡと微生物由来のゲノムを同時に取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の組織であり、目的とするＤＮＡ領域がウイルス由来のＤＮＡである場合は、組織中から市販のＲＮＡ抽出用キット（ISOGEN（311-02501）（NIPPON GENE社製）、或いは、FastRNA Pro Green Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Blue Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Red Kit (フナコシ社製)、等）等を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によってＤＮＡを取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の検体である場合、ウイルス粒子を抽出してからウイルスのＤＮＡを抽出してもよく、或いはウイルス粒子を抽出してから市販のキット（QuickGene RNA tissue kit S ＩＩ、富士フィルム社製）等を用いてウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得しても良い。ウイルスが感染した組織からＲＮＡを抽出し逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得しても良いし、ウイルスが感染した組織からＤＮＡを取得して、ウイルス由来のＤＮＡを取得しても良い。尚、ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを取得する場合には、市販のキット（トランスクリプターハイフィデリティcDNA合成キット、ロシュディアグノスティク社製）等を用いてもよい。
【００２２】
本発明方法における、「メチル化ＤＮＡ」とは、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のいずれかがメチル化されていることを意味する。例えば、哺乳動物では、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンのみがメチル化されるという現象が知られている。シトシンのメチル化部位は５位である。ＣｐＧのシトシンメチル化現象は、細胞分裂に先立つＤＮＡ複製により新生二本鎖ＤＮＡにおいては、親細胞由来のＤＮＡ鎖中の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態であるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生されたＤＮＡ鎖中の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。このシトシンメチル化は、親細胞由来のＤＮＡ鎖中のメチル化されたシトシンを含むＣｐＧと相補的に結合する新生ＤＮＡ鎖のＣｐＧのシトシンをメチル化する。従って、親細胞のＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後の、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。尚、「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖ＤＮＡを意味するものである。
また、本発明方法における「一本鎖メチル化ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡの塩基配列中の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンの５位がメチル化された一本鎖ＤＮＡを意味する。
【００２３】
本発明方法における前記「目的とするＤＮＡ領域」を換言すると、検体中のＤＮＡ含量を調べたいＤＮＡ領域ともいえる。例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）等を挙げることができる。前記「目的とするＤＮＡ領域」においてメチル化されたＤＮＡを個々に検出又は定量することは勿論であるが、例えば、１つの検出系において、該「目的とするＤＮＡ領域」をより多く用いれば、それだけ定量精度及び検出感度が向上する。
【００２４】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。
【００２６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。
【００２７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。
【００２８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。
【００２９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。
【００３０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。
【００３１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列があげられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。
【００３２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。
【００３３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。
【００３４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。
【００３５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。
【００３６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。
【００３７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。
【００３８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。
【００３９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。
【００４０】
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌、真菌、ウイルス、病原性原虫等の微生物等由来のＤＮＡや、該微生物等由来のＲＮＡから逆転写酵素により取得したＤＮＡを挙げることができる。例えば、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma pneumoniae、Borrelia burgdorferi B31、Rickettsia prowazekii、Treponema pallidum、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Helicobacter pylori J99、Helicobacter pylori 26695、Haemophilus influenzae Rd、Mycobacterium tuberculosis H37Rv、Pseudomonas aeruginosa、Legionella pneumophila、Serratia marcescens、Escherichia coli、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Trichophyton ruburum、Trichophyton mentagrophytes、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatus、Pneumocystis carinii、Coccidioides immitis、Cytomegalovirus、human herpesvirus 5、Epstein-Barr virus、Human Immunodeficiency Virus、Human Papilloma Virus、Enterovirus、Norovirus Influenza Virus、Toxoplasma gondii、Cryptosporidium parvum、Entamoeba histolyticaのゲノムＤＮＡ或いはＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡは、検体中の感染症原因菌、或いは食品中の食中毒原因菌等の検出に利用できる。
【００４１】
第二工程は、第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する工程である。
第二工程における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する」とは、第一工程で得られたＤＮＡをメチル化酵素で処理し、メチル化ＤＮＡを取得することを意味する。
【００４２】
「ＤＮＡメチル化酵素」とは、ＤＮＡ中の塩基をメチル化する酵素であり、哺乳動物細胞、細菌等から、多くのＤＮＡメチル化酵素が単離されている。ＤＮＡメチル化酵素は、基質の塩基の種類から、アデニンメチル化酵素、シトシンメチル化酵素等、複数種類に分類される。シトシンメチル化酵素は、ＤＮＡ塩基配列中の特定の配列を認識し、その配列の近くのシトシンをメチル化する酵素であり、認識する塩基配列により異なったシトシンメチル化酵素が知られている。
また、ＤＮＡメチル化酵素の触媒するＤＮＡのメチル化反応は、制限修飾系と呼ばれる原始的な免疫系から多数見出されている。制限修飾系とは、細菌で機能するゲノム全体を定期的にメチル化することにより、特定の配列を認識する制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）によって消化されないようにした上で、外来ＤＮＡ（特にバクテリオファージ）を制限酵素によって消化する機能で、バクテリオファージ感染から微生物ゲノムを防御するシステムのことである。ゲノムのメチル化に機能している酵素は、シトシン又はアデニンをメチル化し、多くはプリン残基の６位の窒素（Ｎ６）、或いは５位の炭素（Ｃ５）をメチル化することが知られている。このような酵素のうち、シトシンのＣ５をメチル化するシトシンメチル化酵素としては、SssI(M.SssI)メチラーゼ、AluIメチラーゼ、HhaIメチラーゼ、HpaIIメチラーゼ、MspIメチラーゼ、HaeIIIメチラーゼ等が知られている。また、これらシトシンのＣ５位をメチル化する酵素は、認識する塩基配列が異なっており、ＣpＧを認識するシトシンメチル化酵素は、SssIのみである。
また、ヒトゲノム中のＤＮＡのメチル化反応としては、エピジェネティクス（遺伝子配列によらない遺伝子発現の多様性を生みだす仕組み）として、ＣｐＧのシトシンの５位（Ｃ５）のメチル化が知られており、このようなシトシンメチル化酵素として、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが知られている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとしては、DnmtIメチルトランスフェラーゼが知られている。
従って、ヒト細胞中ではＣｐＧ配列のシトシンのＣ５位がメチル化されているため、人為的にゲノムをメチル化する場合には、SssIを用いることで、ヒト細胞内でのメチル化と同じ配列（ＣｐＧ）の、同じシトシンの、同じ位置をメチル化することが可能となる。
シトシンメチル化酵素によりメチル化されたＤＮＡにするためには、具体的には例えば、以下のように実施すればよい。ＤＮＡ試料に、最適な10×緩衝液（NEBuffer2 (NEB社製)）を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーションすればよい。
【００４３】
第三工程は、第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する工程である。
第三工程における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する」とは、第二工程で取得した前記メチル化ＤＮＡから、一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する工程である。例えば、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである場合には、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離することを意味する。具体的には、第二工程でＤＮＡメチル化酵素によりメチル化された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＴris-HClバッファー（10 mM）で1ng/μLの溶液に調製し、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLと、を混合し、該混合液に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとする。その後、９５℃で１０分間加熱し、その後数分間、氷冷水上で急冷すればよい。尚、例えば、検体が血液等に含まれる遊離ＤＮＡである場合、第二工程でメチル化されたＤＮＡは一本鎖ＤＮＡである可能性がある。このように第二工程で得られたＤＮＡが一本鎖である場合には、高次構造を形成している場合があるので、二本鎖ＤＮＡの場合と同様の操作をする事が望ましい。
【００４４】
第四工程は、第三工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、該一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域のメチル化された部分と該メチル化ＤＮＡ抗体との結合を阻害せず、且つ、該一本鎖ＤＮＡと相補性により結合し得る塩基配列を有する特定オリゴヌクレオチドと、を混合させて、該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドとの複合体を形成させる工程である。
【００４５】
本発明において「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作製できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。尚、このような固定化メチル化ＤＮＡ抗体の性質（１つのメチル化された塩基（シトシン）に１つの抗体が結合すること）から考えると、目的とするＤＮＡ領域としては、数多くのメチル化された塩基（シトシン）、即ちＣｐＧ、が存在する領域を選抜することが望ましく、また、定量精度及び検出感度の向上が期待できる。
【００４６】
動物に抗原を接触させて得られる抗体としては、動物から精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本発明においてはメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
【００４７】
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ  Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法等が挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
【００４８】
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明の方法における「メチル化された」とは、ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されているＤＮＡを意味しており、ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されているＤＮＡに限った意味ではない。
【００４９】
本発明方法における「特定オリゴヌクレオチド」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと相補性により結合しうる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ、後述する支持体に結合する機能を有していれば良い。具体的には、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと相補的に結合する特定接着配列と支持体に結合して「複合体を取得」できることを意味する。特定接着配列とは、「目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと相補性により結合しうる塩基配列」を意味する。
【００５０】
「目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと相補性により結合しうる塩基配列」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの塩基配列の一部、又は、目的とするＤＮＡ領域の５’末端より更に５’末端側ＤＮＡ領域の塩基配列の一部、又は、目的とするＤＮＡ領域の３’末端より更に３’末端側の塩基配列の一部に対する相補的な塩基配列を有しており、目的とするＤＮＡ領域の一部分と相補的に結合しうる塩基配列であることを意味する。
【００５１】
本発明方法の第四工程における、「一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域のメチル化された部分と該メチル化ＤＮＡ抗体との結合を阻害せず」とは、特定オリゴヌクレオチドの塩基配列が、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化された一本鎖ＤＮＡへの結合に要する占有空間内で、特定オリゴヌクレオチドと前記一本鎖ＤＮＡの相補的な結合がおこらないような塩基配列であることを意味する。メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化された塩基（シトシン）に結合するには、直接結合するメチル化された塩基（シトシン）のみならず、メチル化された塩基（シトシン）の存在する周辺空間も占有すると考えられる。故に、特定オリゴヌクレオチドは、メチル化ＤＮＡである目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ上のメチル化ＤＮＡ抗体が結合する際に要する占有空間において、前記一本鎖ＤＮＡ（目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ）と相補的な結合をしないものであれば良いことを意味する。尚、前記一本鎖ＤＮＡに結合させる特定オリゴヌクレオチドは、１種類である必要は無く、メチル化ＤＮＡ抗体の結合を阻害しなければ、２種類以上用いても良い。複数の特定オリゴヌクレオチドを使用すれば、定量精度及び検出感度を向上させることができる。
【００５２】
第四工程における「一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、該一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域のメチル化された部分と該メチル化ＤＮＡ抗体との結合を阻害せず、且つ、該一本鎖ＤＮＡと相補性により結合し得る塩基配列を有する特定オリゴヌクレオチドと、を混合させて、該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドとの複合体を形成させる」とは、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである一本鎖メチル化ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとを相補的に結合させ、更に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡであるメチル化ＤＮＡにメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ、特定オリゴヌクレオチド、メチル化ＤＮＡ抗体からなる複合体を形成させて、特定オリゴヌクレオチドを支持体に固定化することにより、複合体を支持体に固定化することを意味する。
【００５３】
第四工程において「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである一本鎖メチル化ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドを相補的に」させるためには、例えば、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである一本鎖メチル化ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドを相補的に結合させて後、特定オリゴヌクレオチドを支持体に固定化した後、メチル化ＤＮＡ抗体をメチル化された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡに結合させればよい。「一本鎖メチル化ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドを相補的に結合」させるには、具体的には、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ溶液と該目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと相補的に結合しうる特定オリゴヌクレオチドをＴris-HClバッファー（10 mM）で0.02μMの溶液に調製し、夫々のオリゴヌクレオチド溶液と緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を、各１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを混合し、更に該混合液に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとする。その後、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した後、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温してから、室温に戻すことで、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと、特定オリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促せばよい。
【００５４】
「相補的に結合」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとアデニン、グアニンとシトシンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的に結合する」と呼ぶこともある。「相補的に結合」は、「相補的な結合」、「相補性により結合」、「相補的な（塩基対合による）結合」、「相補的な塩基対合」、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性によって結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」、[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作製されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンが、シトシン、又はアデニン、又はチミンと水素結合で結合することも意味する。「相補的な塩基配列」、「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」、「相補性により結合しうる塩基配列」、又は「相補的な配列」と表現することもある。
【００５５】
また、本発明方法において、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドが「相補性により結合」する場合、特定オリゴヌクレオチドの特定接着配列を構成する塩基配列の全てが目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合も含める。例えば、特定接着配列を構成する塩基のうち、少なくとも７５％、望ましくは８０％以上の塩基が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しており、尚且つ、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと、少なくと７５％以上、望ましくは８０%以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドと結合できる場合も含める。
尚、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがゲノム中の後述する反復配列である場合には、反復配列が相同性を有する一群の塩基配列であることから、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定接着配列の相補的な塩基対合は、塩基配列の全てが目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合が発生する可能性がある。即ち本発明方法においては、特定接着配列として、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがＬＩＮＥ配列やＳＩＮＥ（Ａｌｕ）配列等の反復配列では、８０％以上の相同性を有する塩基配列に対して相補性により結合しうる特定接着配列も含むことを意味する。
【００５６】
目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる際の好ましい態様としては、二価陽イオンを含有する反応系中で形成させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで「二価陽イオンを含有する反応系」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、特定オリゴヌクレオチドとを結合させるために用いられるアニーリングバッファー中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には、例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩（例えば、ＭｇＯＡｃ２、ＭｇＣｌ２等）を１ｍＭ〜６００ｍＭまでの濃度で含まれることがよい。
【００５７】
第四工程とは、第三工程で取得したメチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、特定オリゴヌクレオチドを結合させて検出複合体を取得する工程である。
【００５８】
本発明方法における第四工程では、２種類以上の目的とするＤＮＡ領域に対する特定オリゴヌクレオチドを混合して複合体を形成させる工程であってもよく、また１種類の目的とする領域に対して、２種類以上の特定オリゴヌクレオチドを混合して複合体を形成させる工程であってもよい。また、第四工程は目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、特定オリゴヌクレオチドとの複合体を形成させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で形成させる工程であってもよい。
【００５９】
本発明方法において「複合体を形成」させた場合、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである一本鎖メチル化ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとメチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体は後述する支持体に結合して固定される。
【００６０】
「複合体を形成」とは、具体的には例えば、支持体に固定可能な特定オリゴヌクレオチドとして、末端がビオチン標識された「ビオチン化特定オリゴヌクレオチド」を使用して、以下のように実施すれば良い。
（ａ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に、アニーリングバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol）及び、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにするために、９５℃で例えば数分間加熱する。その後、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させるために、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で例えば数分間保温し、その後、室温に戻す。
（ｂ）ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記（ａ）で得られた混合物を添加し、更に、これを３７℃で例えば数分間保温することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化特定オリゴヌクレオチドの結合体をストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4））を例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化特定オリゴヌクレオチドと目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体をウエル上に残す。
（ｃ）メチル化ＤＮＡ抗体を適当量（例えば、4μg/mL溶液を100μL/ウエル）ウエルに添加し、その後、室温で例えば約３時間静置し、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうちメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチド、との複合体の形成を促す（複合体の形成）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4））を例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、複合体をウエル上に残す（複合体の選択）。
（ａ）において使用するアニーリングバッファーとしては、特定オリゴヌクレオチドと、生物試料由来の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとを結合させるのに、適していれば良く、前記アニーリングバッファーに限ったわけではない。二価イオン、望ましくはマグネシウムイオンが１〜６００ｍＭの濃度で溶解しているものを使用すれば結合の安定性が増加する。
（ｂ）及び（ｃ）における洗浄操作は、特定オリゴヌクレオチドと結合しなかったＤＮＡ、支持体に固定化されていないメチル化ＤＮＡ抗体、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化ＤＮＡ抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どれが先でも構わない。即ち、例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化特定オリゴヌクレオチドに、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を添加することにより混合物を得る。生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、得られた混合物を９５℃で例えば数分間加熱し、その後ビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させるために、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で例えば数分間保温する。その後、（ｃ）の操作を実施し複合体を形成・選択してもよい（この段階で、メチル化されてない目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない）。
【００６１】
上記（ａ）〜（ｃ）の操作を、クロマトストリップを用いて行うことも可能である。その場合は、具体的には、以下のように実施する。生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させた溶液を、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップにより展開する。本操作により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合体が、ストレプトアビジンで被覆した部分に固定化されることになる。次いで、メチル化ＤＮＡ抗体を適量、前記のクロマトストリップにより展開する。これら操作により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有するメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと、メチル化ＤＮＡ抗体からなる複合体が、ストレプトアビジンで被覆した部分に固定化されることになる（複合体の形成・選択）。これら操作についても、複合体形成の順番は、どれが先でも構わない。例えば、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと、メチル化ＤＮＡ抗体からなる複合体を形成させた後、これをクロマトストリップで展開し、ストレプトアビジンで被覆した部分に、該複合体を固定化しても良い。これら操作では、溶液をクロマトストリップにより展開することで、不要な成分を除去することができ、洗浄操作を省略することが可能となる。勿論、各操作間に、洗浄操作（洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）によるクロマトストリップの展開）を実施しても何ら問題はない。
【００６２】
「支持体」としては、複合体が結合可能な支持体であれば、材質及び形状はなんでもよい。例えば、形状は、使用目的に適っていればよく、チューブ状、テストプレート状、フィルター状、ディスク状、ビーズ状等が挙げられる。また、材質としては、通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ナイロン等の合成樹脂、或いは、前記合成樹脂にスルホン基、アミノ基等の反応性官能基を導入したものでもよい。また、ガラス、多糖類又はその誘導体（セルロース、ニトロセルロース等）、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等でもよい。
【００６３】
複合体が支持体に固定化される場合は、最終的にメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとメチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成した状態で、該複合体が支持体に固定化されていればよく、
（１）前記一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドが相補的に結合した段階で特定オリゴヌクレオチドが支持体に固定化され、その後に、該一本鎖ＤＮＡにメチル化ＤＮＡ抗体が結合していもよく、また、
（２）前記一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとメチル化ＤＮＡ抗体とが複合体を形成した後に、特定オリゴヌクレオチドが支持体に固定化してもよい。
【００６４】
特定オリゴヌクレオチドを支持体に固定化するためには、具体的には、特定オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端をビオチン化して得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップ等）に固定する方法を挙げることができる。また、特定オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、或いは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合には、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる。更に、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、特定オリゴヌクレオチドの末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
【００６５】
「前記一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドが相補的に結合した段階で特定オリゴヌクレオチドが支持体に固定化され、その後に、前記一本鎖ＤＮＡにメチル化ＤＮＡ抗体を結合」する場合、メチル化ＤＮＡ抗体とマスキングオリゴヌクレオチドを同時に添加しても構わない。
【００６６】
本発明方法における「マスキングオリゴヌクレオチド」とは、特定オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチドであって、「一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドが相補的に結合した段階で特定オリゴヌクレオチドが支持体に固定化」された段階で、前記一本鎖ＤＮＡである目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと結合せず且つ支持体に固体化された一本鎖状態の特定オリゴヌクレオチドと相補的に結合することにより二本鎖の状態にして、メチル化ＤＮＡ抗体が一本鎖の状態で存在する特定オリゴヌクレオチドと非特異的に結合することを抑制するために添加するオリゴヌクレオチドを指す。マスキングオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、特定オリゴヌクレオチドの相補的な塩基配列を有していれば良く、特定オリゴヌクレオチドと相補的に結合した結果、一本鎖となる部分が生じないオリゴヌクレオチドであればよい。
尚、マスキングオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドの結合体にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて複合体を形成させる前に添加しても良く、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドの結合体にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて複合体を形成させる際にメチル化ＤＮＡ抗体と同時に添加しても良い。
【００６７】
第五工程は、第四工程で形成した複合体に含まれる前記メチル化ＤＮＡ抗体をその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する工程である。
第五工程における「検出」とは、メチル化ＤＮＡ抗体の識別機能により、第一工程で取得されたメチル化ＤＮＡと第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化ＤＮＡの総和量が、検出限界を超えて存在している場合に判別が可能であるということを意味する。メチル化されたＤＮＡが検出されなかった場合、検体中に目的とするＤＮＡ領域において、第一工程で取得されたメチル化ＤＮＡと第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化ＤＮＡとしては検出限界未満であることを示している。
【００６８】
また、第五工程における「定量」とは、メチル化ＤＮＡ抗体の識別機能により検出される検出量の数値を意味するものである。即ち、第一工程で取得されたメチル化ＤＮＡと第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化ＤＮＡの総和量に相関する値が得られる事を意味する。例えば、識別機能としてメチル化ＤＮＡ抗体の量を定量した値は、検体中での目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡの量と相関する値であり、例えば、検体が１mLの血清であった場合、血清１mL中に含まれる目的領域のＤＮＡの、第一工程で取得されたメチル化ＤＮＡと第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化ＤＮＡの総和量に相関する値を取得することを意味する。
【００６９】
第五工程における「識別機能」とは、メチル化ＤＮＡ抗体を検出又は定量できる機能であればよい。即ち識別機能はメチル化ＤＮＡ抗体の有する機能であれば何でも良く、例えば、メチル化ＤＮＡ抗体の標識に基づく識別機能や、メチル化ＤＮＡ抗体に結合する検出分子によってメチル化ＤＮＡ抗体に付与される識別機能を意味する。具体的には、ユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識等がなされたメチル化ＤＮＡ抗体の蛍光・発色等の特性を挙げることができる。これら標識が蛍光・発色等の機能であり、また、抗体自身の特性（抗体自身が二次抗体と結合する特性等）等により、これら標識された分子がメチル化ＤＮＡ抗体に結合されても良い。メチル化ＤＮＡ抗体に結合する抗体（二次抗体とも言う）が、ユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識等されていも良い。二次抗体としては、メチル化ＤＮＡ抗体が何らの標識もされていない場合には、該メチル化ＤＮＡ抗体を抗原としうる抗体を二次抗体とすればよい。また、メチル化ＤＮＡ抗体が、標識されている場合には、該標識に対する抗体を二次抗体として利用しても良い。具体的には、ＦＩＴＣ標識されたメチル化ＤＮＡ抗体に対して、検出分子二次抗体としてＦＩＴＣ抗体が利用可能である。これら機能の定量又は検出手段としては、例えば、放射線検出器、分光光度計等による測定、又は目視等が挙げられる。
【００７０】
本発明方法においては、特定オリゴヌクレオチドを固定化する支持体は微粒子でも良く、更に、メチル化ＤＮＡ抗体には、支持体と同じ微粒子が結合されていても構わない。微粒子としては、ラテックスビーズ、金コロイド（金ナノ粒子）等が挙げられる。
本発明方法において支持体とメチル化ＤＮＡ抗体に、同一種類の微粒子が結合されていれば、支持体である微粒子とメチル化ＤＮＡ抗体に結合されている微粒子は、微粒子に固定化されたメチル化ＤＮＡと目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ、及び、メチル化ＤＮＡ抗体が複合体の形成により微粒子の凝集を検出できる。この場合、微粒子がラテックスビーズであれば、凝集体は濁度の変化によって検出することが可能となる。また、微粒子が金コロイド（金ナノ粒子）であれば、凝集体は、色調変化（ピンクから紫色）によって検出することが可能となる。
更に、本発明方法においては、一つの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ上に同時に複数の微粒子が結合されたメチル化ＤＮＡ抗体が結合する場合にも微粒子の凝集を検出できる。メチル化ＤＮＡ抗体に結合された微粒子がラテックスビーズである場合、凝集体は濁度の変化によって検出することが可能であり、メチル化ＤＮＡ抗体に結合された微粒子が金コロイド（金ナノ粒子）である場合、凝集体は、色調変化（ピンクから紫色）によって検出することが可能となる。尚、この場合、特定オリゴヌクレオチドを付加せずに実施してもメチル化ＤＮＡ抗体を添加した場合と同様の結果を得ることができる。
即ち、メチル化ＤＮＡ抗体と、特定オリゴヌクレオチドと、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡが結合して検出複合体を形成することにより、特定オリゴヌクレオチドが結合する支持体である微粒子と、メチル化ＤＮＡ抗体に結合する微粒子が凝集体となることを意味する。このように微粒子の凝集によりメチル化の程度を検出しようとする場合、特定オリゴヌクレオチドを付加せずに実施しても特定オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の結果を得ることができる。
尚、微粒子の凝集体で検出される量は、第二工程までにメチル化されているＤＮＡの総和に相関する値となる。第一工程で取得するＤＮＡが組織中の細胞に含まれるＤＮＡである場合、組織中の細胞に含まれるＤＮＡのメチル化の程度は組織毎に異なっている為、第二工程で得られるＤＮＡのメチル化の程度は、組織中の細胞でのメチル化の程度と、第二工程でメチル化されるの程度の双方を含む。即ち、第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理を実施しない場合に微粒子の凝集体で検出される量は、組織中の細胞でのメチル化の程度に相関する値となる。
【００７１】
また、本発明方法において、「検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」が、該ＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる場合には、該一本鎖ＤＮＡは、目的とするＤＮＡ領域を含んでいれば短い方がより複合体を形成させ易いだけでなく、操作性もよいと考えられる。一本鎖ＤＮＡを短くするには、元のゲノムＤＮＡの時点で短くしておくのが効率的である。従って、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施しておいてもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。尚、検体が、予め精製されてなるＤＮＡ試料である場合は、一般的に用いられる量の制限酵素を用いて処理を実施すればよく、検体が、組織溶解液、細胞溶解液等の場合は、大過剰の制限酵素、例えば、ＤＮＡ量に対して５００倍量又はそれ以上の制限酵素を用いて処理を実施すれば良い。
【００７２】
尚、血液、尿等の生体試料中に含まれる微量物質の定量又は検出する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。その手法のうち、クロマトグラフィーを用いたいわゆるイムノクロマト法は、操作が簡単であり、検定に要する時間も短いため、現在、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。また、近年、標識したＤＮＡ（遺伝子）をクロマトストリップ上で展開し、目的ＤＮＡ（遺伝子）を捕獲できるプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、目的ＤＮＡ（遺伝子）を検出する、いわゆるハイブリッドクロマト法が用いられるようになってきた。この方法も操作が簡便であり、検定に要する時間も短いため、現在、病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われ始めている。本発明方法は、上述のイムノクロマト法とハイブリッドクロマト法を混合した方法を概念的に可能にしている。本発明方法では、複合体形成及び複合体の選択に関して、その順序は、特に限定されないため、種々の方法が可能である。具体的には、例えば、以下のように実施すればよい。
方法１：  メチル化されたＤＮＡ（目的とするＤＮＡ領域がＤＮＡメチル化酵素によりメチル化されたシトシンを有するＤＮＡ）に、支持体に固定化する機能としてビオチンを結合された特定オリゴヌクレオチドであるビオチン化特定オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖メチル化ＤＮＡとビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させ、次いで、識別機能を有するメチル化抗体を添加し、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成させる。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記複合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、得られた複合体を形成しているメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能により定量又は検出することで、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを定量又は検出できる。
方法２：  メチル化されたＤＮＡ（目的とするＤＮＡ領域がＤＮＡメチル化酵素によりメチル化されたシトシンを有するＤＮＡ）に、支持体に固定化する機能としてビオチンを結合された特定オリゴヌクレオチドであるビオチン化特定オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化特定オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記結合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、識別機能を有するメチル化抗体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のメチル化されたシトシンに結合し、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する。得られた複合体を形成しているメチル化ＤＮＡ抗体をその識別機能により定量又は検出することで、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを定量又は検出できる。
方法３：  ビオチン化特定オリゴヌクレオチドをクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記オリゴヌクレオチドが、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。次いで、一本鎖メチル化されたＤＮＡ（目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡ）を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているビオチン化特定オリゴヌクレオチドに、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡが結合体を形成した形で捕獲される（この段階で形成された結合体は、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとの結合体の他、メチル化されてない目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる）。その後、識別機能を有するメチル化抗体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のメチル化されたシトシンに結合し、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、メチル化されてない目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない）。得られた複合体を形成しているメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能により定量又は検出することで、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを定量又は検出できる。
方法４：  ビオチン化特定オリゴヌクレオチドをクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記オリゴヌクレオチドが、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。一本鎖メチル化されたＤＮＡ（目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡ）に、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体を添加し、メチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡ（この中には、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと目的以外の一本鎖ＤＮＡが存在する）と識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体との結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる）。得られた結合体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているビオチン化特定オリゴヌクレオチドに、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡが結合し、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体は、複合体を形成しない）。得られた複合体を形成しているメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能により定量又は検出することで、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを定量又は検出できる。
【００７３】
一つのクロマトストリップ上に複数の検出部位（それぞれ異なる目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるような特定オリゴヌクレオチドを支持体に固定する）を存在させ、各目的とするＤＮＡ領域を順次定量又は検出することも可能であり、また、１つの検出部位に複数の目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるように、即ち、１つの検出部位に、複数の目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるような特定オリゴヌクレオチドを数多く固定化しておけば、検出感度を飛躍的に上げることができる。
【００７４】
本発明における第四工程において、複合体形成時にカウンターオリゴヌクレオチドを添加してもよい。
「カウンターオリゴヌクレオチド」とは、二本鎖ＤＮＡ中のメチル化された塩基であるメチル化塩基にメチル化ＤＮＡ抗体を結合しやすくするために作製されるオリゴヌクレオチドである。通常、メチル化塩基は二本鎖ＤＮＡ中でメチル化されている塩基であるが、ＤＮＡが二本鎖の状態においては、メチル化ＤＮＡ抗体が結合することが困難である。即ち、メチル化ＤＮＡ抗体が結合しうる領域を一本鎖ＤＮＡにするために、目的配列（正鎖）と同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（正鎖）を設計し、目的領域と対合する塩基配列（負鎖）に結合させることで、目的領域を一本鎖ＤＮＡにすることで、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化ＤＮＡ塩基に結合しやすくする。
例えば、目的領域中のメチルシトシンにメチルシトシン抗体を結合させようとする場合、目的領域と同じ塩基配列を有する塩基配列であるカウンターオリゴヌクレオチドを添加する。尚、本発明方法においては、カウンターオリゴヌクレオチドは、特定オリゴヌクレオチドとは対合しない塩基配列を有しており特定オリゴヌクレオチドが目的領域を含むＤＮＡ断片との結合を阻害しないことを特徴とする。具体的には、カウンターオリゴヌクレオチドは、５〜１００塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、１０〜５０塩基からなるオリゴヌクレオチドである。尚、目的領域の塩基配列を有するカウンターオリゴヌクレオチドは、通常、複数種類を混合して使用する。
【００７５】
尚、前記第二工程における目的とする領域を含むＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素によるメチル化を行わずに前記第五工程で測定されたメチル化されたＤＮＡの量（メチル化されたＤＮＡの総量）と、第二工程で目的とする領域を含むＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素によりメチル化して第五工程で測定されたＤＮＡの量（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）と、を比較することにより、前記目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出することができる（以下、本メチル化割合測定方法と記すこともある）。
【００７６】
本メチル化割合測定方法は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合い（程度）を測定することが可能と考えられている。例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について本発明方法又は本メチル化割合測定方法を実施すれば、検出又は定量されるメチル化されているＤＮＡの量は多く、一方、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について本発明方法又は本メチル化割合測定方法を実施すれば、検出又は定量されるメチル化されているＤＮＡの量はほぼ０に近い値となる。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が高いＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明方法又は本メチル化割合測定方法を実施すれば、健常者の場合には、検出又は定量されるメチル化されているＤＮＡの量は０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における前記値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い（程度）」を判定することができる。
ここでの「疾患の度合い」とは、一般に該分野において使用される意味と同様であって、具体的に例えば、生物由来検体が細胞である場合には該細胞の悪性度を意味し、また、生物由来検体が組織である場合には該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。従って、本発明方法又は本メチル化割合測定方法は、メチル化異常の程度（度合い）を調べることにより、各種疾患の程度を診断することを可能にする。
【００７７】
本発明方法で使用し得る制限酵素、特定オリゴヌクレオチド、或いはメチル化ＤＮＡ抗体は、検出用キットの試薬として有用である。本発明方法により、これら制限酵素、特定オリゴヌクレオチド、或いはメチル化ＤＮＡ抗体等を試薬として含有する血中遊離ＤＮＡの検出用キットやサンプル中の微生物検出用キットの提供が可能となる。
【００７８】
尚、前記目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡは特定オリゴヌクレオチドとの相補的な結合により選択される。即ち、目的とするＤＮＡ領域中のＣｐＧのシトシンがメチル化されている場合、メチルシトシン抗体が結合することによる検出対象となるため、特定オリゴヌクレオチドは目的とするＤＮＡ領域中のシトシンやＣｐＧと塩基対合しない方が望ましいため、目的とするＤＮＡ領域は、近傍に特定オリゴヌクレオチドとの特異的な塩基対合可能な塩基配列を有することが望ましい。また、目的領域の内部に特定オリゴヌクレオチドを相補的な塩基対合により結合させる場合には、特定オリゴヌクレオチドが目的とするＤＮＡ領域中の塩基配列と相補性によって結合する塩基配列はＣｐＧを含まない配列である方が望ましい。
【００７９】
目的領域が、微生物由来の塩基配列である場合、検体中から抽出したゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ断片、或いは、検体中から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によりＤＮＡとした塩基配列を意味する。従って、特定オリゴヌクレオチドとの相補的な結合が可能な塩基配列としては、該微生物に特異的な領域を選択すればよい。例えば、本発明における目的領域が微生物の塩基配列である場合、目的領域を検体中から選択的に抽出するためには、微生物ゲノムＤＮＡ、或いは、検体中から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によりＤＮＡ等の塩基配列のうち、目的領域近傍にある微生物特有の塩基配列を特定オリゴヌクレオチドと特異的に結合する塩基配列とすればよい。
【００８０】
通常、生検サンプルや食品中に含まれる病原性微生物の有無を検査する場合、各々微生物抗原に対して免疫法による検査により、該病原性微生物の有無を調べたり、該病原性微生物を特定する。しかし、この免疫法に用いる抗体の作製は容易ではなく、更に複数の病原性微生物を検出するためには、各々の病原性微生物の抗原に対する抗体を作製する必要がある。そこで、本発明方法を用いることにより、これら煩雑な抗体作製を行うことなく病原性微生物に対する簡易な検査が可能となる。また、本発明方法では、異なる病原性微生物の塩基配列を同時に検査できることから、一つの検体中に含まれる数種類の病原性微生物を、同時に検出できるようになる。具体的には、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Clostridium perfringens等の食中毒菌が知られているが、これらのうち数種類の食中毒菌を同時に検出する技術は知られていない。しかし、本発明方法を用いることで数種類の食中毒菌の塩基配列を同時に検出することが可能となる。また、検出対象の塩基配列として、CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)領域のように、ゲノム中に複数見出される塩基配列を特定オリゴヌクレオチドにより選択する場合、一ゲノム中の一遺伝子を検出するよりも高感度での検出が可能となる。このような技術は、感染症の診断や食中毒菌の迅速検出にも有用である。また、本発明方法は環境中の微生物のゲノムを検出することにより、産業上の有用な菌の同定や土壌、河川、湖沼の底質等の微生物群の簡易調査にも用いることができる。環境中の微生物のうち、例えば、Methanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH、Aquifex aeolicus、Pyrococcus horikoshii OT3、Archaeoglobus fulgidus、Thermotoga maritima MSB8、Aeropyrum pernix K1、Haloferax mediterraneiの生息を確認することが可能となる。また、Geobacter sulfurreducensのように工業上利用でき得る細菌やStreptococcus thermophilusのような醗酵に用いられる微生物の検出、同定も可能となる。
【００８１】
例えば、微生物中のゲノムを検出するための目的領域と検出オリゴヌクレオチドが相補的に結合する領域としては、具体的には、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域（配列番号３８）、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685（配列番号６５）のように、遺伝子をコードしない塩基配列でもよい。また、種々の病原性微生物に共通する特徴的な遺伝子の、病原性微生物で保存された塩基配列を検出対象とすることは、複数の病原性微生物を同時に検出する方法を提供しうるものであるため有用である。具体的には、mce-family遺伝子（Micobacterium tuberculosis）、13番染色体上のtRNA-Tyr塩基配列（Cryptococcus neoformans）、chitin synthase activator (Chs3) は、Aspergillus fumigatus及びNeosartorya 属に特有の塩基配列を有することから、ヒトの痰、肺の生検サンプル中から抽出したＤＮＡ中に、これら微生物由来のＤＮＡが含まれるか否かを検定することで、微生物による感染症の検定に用いることができる。また、actA（Listeria monocytogenes）、pyrG（NC_002163、Campylobacter jejuni subsp. jejuni）等は食中毒菌に特有共通した遺伝子であることから、これらの遺伝子は、食中毒における微生物検定に用いることができる。また、thrAは、Salmonella enterica、Yersinia enterocolitica、Escherichia coliで保存された配列を有しており、一つの遺伝子で複数の微生物を検出することも可能である。
【００８２】
データベース上で公開されている塩基配列のうち、微生物特有の塩基配列を検索し、微生物特有の塩基配列を探索することができる。例えば、ＰｕｂＭｅｄ等の公開データベース上にある塩基配列であれば、通常の手続きにより取得することが可能であり、取得した塩基配列は、通常の手続きによるＢｌａｓｔ検索をかけることにより、特有の塩基配列であるか否かを検討することができる。尚、特有の塩基配列とは、検出対象中の塩基配列が検出対象となる微生物のゲノム塩基配列以外の生物由来の塩基配列と相同性を示す塩基配列を有さないことを意味する。
特に、検体がヒト生検サンプルである場合、ヒト遺伝子と相補的な結合をしない特定オリゴヌクレオチドを設計することは重要である。また、同様に、検体が食品である場合、食品に含まれる検出対象以外の生物由来の塩基配列と相補的な結合をしない特定オリゴヌクレオチドを設計することは重要である。
【００８３】
血液中の遊離ＤＮＡを検出するためには、遊離ＤＮＡの量と相関する領域であれば何でもよく、遊離ＤＮＡの定量又は検出を目的とする場合、ゲノム中の同じ配列が、特に数回以上、反復して見られる、いわゆる反復配列が望ましく、単純反復配列（縦列反復配列、或いは、タンデムリピートと呼ばれる）や、散在反復配列であれば、更によい。
【００８４】
単純反復配列は、同じ配列が同じ向きに隣り合って存在することを特徴とし、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト、セントロメア、テロメア、動原体、リボソーム集団遺伝子のような一連の塩基配列等が知られている。
【００８５】
散在反復配列は、隣り合わず散在することを特徴とし、レトロトランスポゾンに由来するＤＮＡと考えられている。散在反復配列は、塩基配列の長さにより、ＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列）に分類され、ヒトの塩基配列としては、各々、Ａｌｕ配列やＬＩＮＥ−１配列が代表的な反復配列として知られている。また、ＲＮＡやタンパク質から逆転移した不活性なプロセッシング済みの偽遺伝子、遺伝子重複により増幅した遺伝子配列も知られている。
【００８６】
重複遺伝子とは、一つのゲノム上に複数の高い相同性を有する遺伝子が存在する場合を指し、多くの場合は、一遺伝子の近傍にタンデムに並んで存在する塩基配列である。尚、偽遺伝子も重複遺伝子の一つである事が多い。
【００８７】
反復配列の具体的な例としては、例えば、比較的短い塩基配列からなる繰り返しとしては、(A)n、(T)n、(GA)n、(CA)n、(TAA)n、(GGA)n、(CAGC)n、(CATA)n、(GAAA)n、(TATG)n、(TTTG)n、(TTTA)n、(TTTC)n、(TAAA)n、(TTCA)n、(TATAA)n、(TCTCC)n、(TTTCC)n、(TTTAA)n、(TTTTC)n、(TTTTA)n、(TTTTG)n、(CAAAA)n、(CACCC)n、(TATATG)n、(CATATA)n、(TCTCTG)n、(AGGGGG)n、(CCCCCA)n、(TGGGGG)n（ｎは繰返し数を意味する）等の配列が知られていおり、転写因子に由来する配列としては、hATグループとして、MER１-Charlie、Zaphodが該当し、Tc-1グループとして、MER2-Tigger、Tc-1、Marinerが該当する。その他、具体的には、Tigger1、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等が知られている。これらの配列は、一般的に短く且つ単純な塩基配列であり、後述の特定接着配列を設定することは難しいが、本発明方法における、後述の特定接着配列及び検出用接着配列の設定対象と設定可能な配列を有していれば、本発明方法にも利用可能であることから、必ずしも、本発明方法の対象として排除するものではない。また、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト等は、単純反復配列に分類される反復配列である。
また、遺伝子中に多コピー存在する配列としては、セントロメアに存在する配列としてALR6、snRNAとしてU2やU6、その他、tRNAやrRNAのように一般的にゲノム中に多コピー存在することが知られている遺伝子の他、遺伝子重複によりゲノム中に複数コピー存在する遺伝子等を挙げることができる。
【００８８】
更に、レトロウイルス、末端にLTR（Lomg terminal repeat）を有するレトロトランスポゾン、MaLRs（Mammalian apparent LTR-Retrotransposons）のような、ウイルス由来と考えられる内在配列や、レトロウイルス由来のLTRについても、一ゲノム中に複数存在することが知られている。
例えば、レトロトウイルス由来のLTRとしては、具体的には、LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48、MLT2CB等のサブファミリーが知られている。また、レトロトランスポゾン由来のLTRは、ERV、ERVK、ERVLの各クラスに分類され、具体的には、LTR8A、LTR28、MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL、LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、MLT2A1、MLT2E 、MER11C、MER11C等のサブファミリーを挙げることができる。更に、ＭａＬＲｓは、典型的なレトロトランスポゾンと同様にその配列の両端にLTRを含むが、LTRにはさまれた内部配列がレトロウイルス由来ではない配列のＤＮＡ因子を指す。例えば、MLT1A1、MLT1A2、MLT1B、MLT1C、MLT1D 、MLT1F、MLT1G 、MLT1H、MLT1J 、MLT1K 、MLT1I 、MLT2CB 、MSTA、MSTA-int、MSTB 、THE1A、THE1B、THE1B-internal、THE1等のサブファミリーを挙げることができる。
【００８９】
散在反復配列は、隣り合わず散在することを特徴としており、レトロトランスポゾンに由来すると考えられている。また、散在反復配列は、その長さにより、ＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列）に分類されてる。ＳＩＮＥのうち、大部分はＡｌｕファミリーに属する配列である。特徴としては、７ＳＬ ＲＮＡの３’側の配列或いは５’側の配列を有し、尚且つLeft-monomerとRight-monomerと呼ばれる領域にはさまれたＡＴ−Ｒｉｃｈ領域を有している。Ａｌｕファミリーのサブファミリーとしては、Alu、AluJb、AluJo、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluYを、更には、ＦＡＭ（Fossil Alu Monomer）と、ＦＡＭの配列を有するＦＬＡＭ（Free Left Alu Monomer）とＦＲＡＭ（Free Right Alu Monomer）を挙げることができる。Ａｌｕファミリー以外のＳＩＮＥとしては、ＭＩＲ、及びＴｈｅｒ／ＭＩＲ３が知られており、夫々、サブファミリーとして、MIR、MIR3が知られている。そのほか、他の生物種のＡｌｕファミリーのサブファミリーとしては、B1、B2、B4、PB1、PB1D等が知られている。ＬＩＮＥとしては、LINE1からLine23のサブファミリーが報告されているが、LINE-1、LINE2、LINE3が広くゲノム中に存在することが知られている。尚、LINE-1については、例えば、L1M1、L1M2、L1M3、L1M3d、L1M4、L1M4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、L1MB1、L1MB1、L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、L1MCa、L1MCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、L1MC4a、L1MC5、L1MDa、L1ME、L1MEc、L1MEd、L1MEg、L1ME1、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、L1ME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、L1PB1、L1PB3、L1PB4、L1PREC2、HAL1のサブファミリーが知られており、LINE-2としては、L2、L2cのサブファミリーが知られている。尚、例えば、AluファミリーまたはAluのサブファミリーに共通の配列、LINE-1ファミリー或いはLINE-1のサブファミリーに共通の配列に対して、後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定できれば、一ゲノム中に複数の検出対象を設定することができるため、ゲノムの検出をより高感度にすることができる。
【００９０】
目的とするＤＮＡ領域としては、具体的に例えばＬＩＮＥ−１の部分配列（配列番号２８、配列番号６２、或いは配列番号６３に示す塩基配列）やＡｌｕの部分配列（配列番号６４に示す塩基配列）又はそれらの相同性を示す塩基配列等を挙げることができる。
【００９１】
尚、例えばある領域中の反復配列を調べたい場合、PubMed等の一般的な配列検索のデータベースで検索することは難しく、通常は、Repbase（http://www.girinst.org/repbase/）、RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org/）等のデータベースを用いればよい。本発明方法の特定接着配列を設定できれば、検出感度を上げることができる。更に、これらの反復配列を測定することは、例えば、血液中の遊離ＤＮＡ量のサロゲートマーカーとして扱うことが可能であり、生物種特異的な反復配列に注目する場合は、生物種の特定等に利用することができる。
【００９２】
尚、本発明方法において、反復配列を測定することは、一ゲノム中に複数存在する塩基配列を同時に測定することを意味し、例えば配列番号２８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約２８０コピーあり、配列番号６４で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約８２０コピーある。従って、夫々の塩基配列中に特定接着配列を設定できれば、１ゲノムの中に一種類しかない配列に対して特定接着配列を設定する場合に比べると、１ゲノムの検出感度を、理論上で２８０〜８２０倍上げることが可能となる。
【００９３】
重複遺伝子とは、遺伝子重複により、ゲノム中の特定の遺伝子或いは遺伝子断片が倍加することにより生じた遺伝子或いは遺伝子断片を意味する。遺伝子重複とは、遺伝子を含むDNAのある領域が重複する現象のことである。遺伝子重複が起こる原因としては、遺伝的組換えの異常、レトロトランスポゾンの転移、染色体全体の重複等がある。例えば、1つの遺伝子がコピーされてゲノムＤＮＡに挿入されることを意味し、異なる染色体位置へ挿入される場合と、元の遺伝子の近傍に挿入される場合がある。元の遺伝子の近傍への挿入により、コピーされた遺伝子が並んでいる場所をタンデムリピートと呼び、遺伝子重複によって作り出された遺伝子のグループを遺伝子族(或いは遺伝子ファミリー)と呼ぶ。 
【００９４】
偽遺伝子とは、ＤＮＡの配列のうち、遺伝子産物（特にタンパク質）をコードしていたことを想像させるような特徴のある塩基配列を有しているが、現在は機能を失っている遺伝子をいう。元の機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと考えられている。例えば、突然変異によりストップコドンが生じてタンパク質のペプチド鎖が短くなってしまいタンパク質として機能を果たせなくなる場合や、一塩基置換等の突然変異により正常な転写に必要な調節配列が機能を失う場合等がある。偽遺伝子は元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、単独で偽遺伝子になるものもある。
偽遺伝子は、遺伝子配列の特徴により3タイプに分類できる。ｍＲＮＡからレトロトランスポゾンの逆転写酵素によって作られたＤＮＡがゲノムに挿入される場合（プロセス型偽遺伝子）、ゲノム内で元の遺伝子配列が重複し、そのコピーのうち一部が突然変異等により機能を喪失して偽遺伝子になる場合（重複偽遺伝子または非プロセス型偽遺伝子）、及び、ゲノム内の遺伝子が、（重複遺伝子がなく単独の遺伝子のまま）機能を失うことにより偽遺伝子になる場合がある。
尚、現在、偽遺伝子として知られる遺伝子の中には、転写されている例や、遺伝子機能を有する例（偽遺伝子と呼ぶべきかどうかは定まっていない）も知られるようになっていることから、本発明方法における、「偽遺伝子」とは、遺伝子機能の有無、或いは転写されるか否かではなく、前記の「プロセス型偽遺伝子」と「重複偽遺伝子（非プロセス型偽遺伝子）」を意味するものである。
【００９５】
本発明方法の第一工程において、高濃度のナトリウム塩が存在する系により検体からＤＮＡを抽出することが好ましい。具体的には、本発明方法の第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液（例えば、緩衝液）中のナトリウム塩の濃度としては、少なくとも５０ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ以上を挙げることができる。より具体的には、５０ｍＭ以下１０００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下が挙げられる。また、ナトリウムイオンを含む塩であれば、ＮａＣｌ、ＮａＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４等を含むどのような塩でも構わないが、好ましくは、ＮａＣｌを挙げることができる。
【００９６】
本発明は、癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１〜１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法を含む。当該発明の好ましい態様としては、検体が哺乳動物由来の血清である発明、また更に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明を挙げることができる。これら発明を利用すれば、血液検査により、癌患者を簡便に特定することが可能となろう。
【００９７】
ここで「癌患者」とは、癌を発症した被験者を意味しており、癌としては、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌（肝細胞癌、胆管細胞癌）、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、結腸癌、肛門癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、前立腺癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣（睾丸）癌、上顎癌、舌癌、（上、中、下）咽頭癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病 、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、甲状腺癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌）等の、ヒトおよび哺乳類の臓器で発症する固形癌と、ヒトおよび哺乳類の血液で発症する非固形癌のいずれの癌も含むことを意味する。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９９】
実施例１
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１９、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
【０１００】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF1：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’  （配列番号１７）
PR１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１８）
【０１０１】
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１９）
【０１０２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
【０１０３】
ＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０４】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０１０５】
また、配列番号１９で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＸに相補性により結合可能な配列番号２０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を合成し、０．０２μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１０６】
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１９）
【０１０７】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’  （配列番号２０）
【０１０８】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０１０９】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０１１０】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１１１】
配列番号２０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１と相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ１を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１１２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’  （配列番号２０）
【０１１３】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ１：5’- ATCTCCAGTTTGGCCAG -3’  （配列番号２１）
【０１１４】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１１５】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１１６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０１１７】
その結果を図１に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０１１８】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０１１９】
実施例２
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号２４、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
【０１２０】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5’- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’  （配列番号２２）
PR２：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号２３）
【０１２１】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
【０１２２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
【０１２３】
ＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１２４】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０１２５】
また、配列番号２４で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＹに相補性により結合可能な配列番号２５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２を合成し、０．０２μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１２６】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
【０１２７】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ２：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’  （配列番号２５）
【０１２８】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０１２９】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０１３０】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１３１】
配列番号２５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２と相補性により結合可能な配列番号２６で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ２を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１３２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ２：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’  （配列番号２５）
【０１３３】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ２：5’- CCGAGAACGAGGCGTTGTCT -3’  （配列番号２６）
【０１３４】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１３５】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０１３６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０１３７】
その結果を図２に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０１３８】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０１３９】
実施例３
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１９、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
【０１４０】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF1：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’  （配列番号１７）
PR１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１８）
【０１４１】
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG（配列番号１９）
【０１４２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
【０１４３】
また、クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号２４、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
【０１４４】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5’- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’  （配列番号２２）
PR２：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号２３）
【０１４５】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
【０１４６】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
【０１４７】
ＤＮＡフラグメントＸ及びＤＮＡフラグメントＹ夫々について、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１４８】
次いで、前記のＤＮＡフラグメントＸ及びＤＮＡフラグメントＹの夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、ＤＮＡフラグメントＸ及びＤＮＡフラグメントＹを等量ずつ混合したＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＭＤを夫々２連で、更にそれを３セット（後述の処理が異なる）調製した。
【０１４９】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０１５０】
また、配列番号１９で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＸに相補性により結合可能な配列番号２０で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１及び配列番号２４で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＹに相補性により結合可能な配列番号２５で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号２０で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１及び配列番号２５で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．０２μＭ）を調製した。
【０１５１】
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG（配列番号１９）
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
【０１５２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’  （配列番号２０）
Ｂ２：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’  （配列番号２５）
【０１５３】
前記のＤＮＡフラグメント溶液ＭＡ〜ＭＤの夫々の反応液について、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液夫々を用いて、以下の処理を施した。
【０１５４】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０１５５】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１５６】
配列番号２０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１と相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ１及び配列番号２５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２と相補的性により結合可能な配列番号２６で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ２を合成し、夫々０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号２０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１と相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ１及び配列番号２５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２と相補的性により結合可能な配列番号２６で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ２を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．１μＭ）を調製した。
【０１５７】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’  （配列番号２０）
Ｂ２：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’  （配列番号２５）
【０１５８】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ１：5’- ATCTCCAGTTTGGCCAG -3’  （配列番号２１）
Ｍ２：5’- CCGAGAACGAGGCGTTGTCT -3’  （配列番号２６）
【０１５９】
前記のＤＮＡフラグメント溶液ＭＡ〜ＭＤの夫々の反応液について、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液夫々を用いて、以下の処理を施した。添加するマスキングオリゴヌクレオチド溶液は、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１処理溶液に対してマスキングオリゴヌクレオチドＭ１溶液、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２処理溶液に対してマスキングオリゴヌクレオチドＭ２溶液、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２混合処理溶液に対してマスキングオリゴヌクレオチドＭ１及びマスキングオリゴヌクレオチドＭ２混合溶液とした。
【０１６０】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１６１】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１６２】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０１６３】
その結果を図３〜図５に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１（図３）、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２（図４）、及び、前記２種を混合した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド（図５）と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。特に２種の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを混合した場合（図５）では、単独オリゴヌクレオチドでの検出（図３及び図４）に比べて感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０１６４】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。更に複数の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いることによって１種の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域を用いるだけでなく、同時に、複数の目的とするＤＮＡ領域を用いることによって）、感度良く定量・検出できることが明らかとなった。
【０１６５】
実施例４
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、ゲノムＤＮＡを７μgと、制限酵素ＡｌｕＩを４８Ｕと、ＡｌｕＩに最適な１０ｘ緩衝液（100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、500mM NaCl）４０μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を４００μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて４時間インキュベーションした。酵素処理を行った後、1.5％アガロースゲル電気泳動により切断を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、酵素処理ゲノムＤＮＡを精製した。
【０１６６】
得られた酵素処理ゲノムＤＮＡを用いて以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：1000ng/30μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：500ng/30μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：200ng/30μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１６７】
前記で調製した酵素処理ゲノムＤＮＡ溶液30μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０１６８】
配列番号２７で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＸ’に相補性により結合可能な配列番号２０で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１６９】
＜目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメント＞
Ｘ’：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’  （配列番号２７）
【０１７０】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’  （配列番号２０）
【０１７１】
前記の酵素処理ゲノムＤＮＡ溶液Ａ〜Ｄの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０１７２】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０１７３】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１７４】
配列番号２０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１と相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ１を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１７５】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’  （配列番号２０）
【０１７６】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ１：5’- ATCTCCAGTTTGGCCAG -3’  （配列番号２１）
【０１７７】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１７８】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１７９】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０１８０】
その結果を図６に示した。酵素処理したヒトゲノムＤＮＡ溶液では、ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０１８１】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ゲノムＤＮＡの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０１８２】
実施例５
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡを用いて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：500ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：50ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：5ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０１８３】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１８４】
前記で調製した酵素処理ゲノムＤＮＡ溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０１８５】
配列番号２８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＺ（Genbank Accession No. M80340等に示される塩基番号115-386に相当する領域）に相補性により結合可能な配列番号２８で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１８６】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｚ：5’- TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3’  （配列番号２８）
【０１８７】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3’  （配列番号２９）
【０１８８】
前記の酵素処理ゲノムＤＮＡ溶液Ａ〜Ｄの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０１８９】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０１９０】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１９１】
配列番号２９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３と相補性により結合可能な配列番号３０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ３を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１９２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3’  （配列番号２９）
【０１９３】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5’- ACGGCGCACCACGAGACTAT -3’  （配列番号３０）
【０１９４】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１９５】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０１９６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０１９７】
その結果を図７に示した。酵素処理したヒトゲノムＤＮＡ溶液では、ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０１９８】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ゲノムＤＮＡの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０１９９】
実施例６
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡを用いて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：500ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：50ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：5ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０２００】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０２０１】
前記で調製した酵素処理ゲノムＤＮＡ溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０２０２】
配列番号２８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＺ（Genbank Accession No. M80340等に示される塩基番号115-386に相当する領域）に相補性により結合可能な配列番号２９で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２０３】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｚ：5’- TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3’  （配列番号２８）
【０２０４】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3’  （配列番号２９）
【０２０５】
配列番号２８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＺの負鎖（相補鎖）に相補性により結合可能な配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、及びＣ５の各濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２０６】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｚ：5’- TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3’  （配列番号２８）
【０２０７】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’- CAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGA-3’  （配列番号３１）
Ｃ２：5’-  GGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCA-3’  （配列番号３２）
Ｃ３：5’-  GGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCA-3’  （配列番号３３）
Ｃ４：5’-  ACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3’  （配列番号３４）
Ｃ５：5’-  TCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGC-3’  （配列番号３５）
【０２０８】
前記の酵素処理ゲノムＤＮＡ溶液Ａ〜Ｄの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０２０９】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０２１０】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２１１】
配列番号２９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３と相補性により結合可能な配列番号３０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ３を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２１２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’- ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3’  （配列番号２９）
【０２１３】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5’- ACGGCGCACCACGAGACTAT -3’  （配列番号３０）
【０２１４】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２１５】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２１６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０２１７】
その結果を図８に示した。酵素処理したヒトゲノムＤＮＡ溶液では、ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０２１８】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ゲノムＤＮＡの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０２１９】
実施例７
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０２２０】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０２２１】
＜DNAフラグメント＞
S：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０２２２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントSを精製した。
【０２２３】
ＤＮＡフラグメントSについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０２２４】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０２２５】
配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントSに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２２６】
＜DNAフラグメント＞
S：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０２２７】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０２２８】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０２２９】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０２３０】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２３１】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２３２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０２３３】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
【０２３４】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２３５】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０２３６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０２３７】
その結果を図９に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０２３８】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０２３９】
実施例８  
【０２４０】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０２４１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０２４２】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０２４３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０２４４】
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０２４５】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０２４６】
配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２４７】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０２４８】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０２４９】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０２５０】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０２５１】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２５２】
配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５と相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２５３】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０２５４】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０２５５】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２５６】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０２５７】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について２連の平均値を算出した。
【０２５８】
その結果を図１０に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０２５９】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０２６０】
実施例９
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０２６１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０２６２】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０２６３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【０２６４】
また、得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０２６５】
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０２６６】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０２６７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０２６８】
ＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントT夫々について、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
【０２６９】
次いで、前記のＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴの夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、ＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴを等量ずつ混合したＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＭＤを夫々２連で、更にそれを３セット（後述の処理が異なる）調製した。
【０２７０】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０２７１】
配列番号３８で示されるＤＮＡフラグメントＳに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び配列番号４３で示されるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．０２μＭ）であるビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０２７２】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
T：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０２７３】
前記のＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＤの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０２７４】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０２７５】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２７６】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及び配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５と相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、夫々０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及び配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．１μＭ）を調製した。
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０２７７】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０２７８】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２７９】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２８０】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。。
【０２８１】
その結果を図１１〜図１３に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４（図１１）、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５（図１２）、及び、前記２種を混合した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド（図１３）と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。特に２種の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを混合した場合（図１３）では、単独オリゴヌクレオチドでの検出（図１１及び図１２）に比べて感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０２８２】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。更に複数の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いることによって１種の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域を用いるだけでなく、同時に、複数の目的とするＤＮＡ領域を用いることによって）、感度良く定量・検出できることが明らかとなった。
【０２８３】
実施例１０
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０２８４】
得られた酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｃ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）  
【０２８５】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０２８６】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０２８７】
配列番号４６で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＳ’に相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２８８】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ’：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号４６）
【０２８９】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０２９０】
前記の酵母ゲノムDNA溶液Ａ〜Ｄの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０２９１】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０２９２】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２９３】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４を合成し、夫々０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２９４】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０２９５】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
【０２９６】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２９７】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０２９８】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０２９９】
その結果を図１４に示した。酵母ゲノムＤＮＡ溶液において、ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０３００】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ゲノムＤＮＡの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０３０１】
実施例１１
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０３０２】
得られた酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｃ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）  
【０３０３】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０３０４】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０３０５】
配列番号４７で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴ’に相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３０６】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ’：5’- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC-3’（配列番号４７）
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０３０７】
前記の酵母ゲノムDNA溶液Ａ〜Ｄの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０３０８】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０３０９】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３１０】
配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５と相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、夫々０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０３１１】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０３１２】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３１３】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３１４】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０３１５】
その結果を図１５に示した。酵母ゲノムＤＮＡ溶液において、ＤＮＡフラグメントが固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０３１６】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ゲノムＤＮＡの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０３１７】
実施例１２
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０３１８】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０３１９】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０３２０】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【０３２１】
ＤＮＡフラグメントＳについて、クロンテック社より購入したヒト血液ゲノムＤＮＡを添加した以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
【０３２２】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０３２３】
配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＳに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、０．０２μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３２４】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０３２５】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０３２６】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０３２７】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０３２８】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３２９】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３３０】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０３３１】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
【０３３２】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３３３】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０３３４】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０３３５】
その結果を図１６に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０３３６】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ヒトゲノムＤＮＡ中の酵母由来ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０３３７】
実施例１３
【０３３８】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０３３９】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０３４０】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０３４１】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０３４２】
ＤＮＡフラグメントＴについて、クロンテック社より購入したヒト血液ゲノムＤＮＡを添加した以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
【０３４３】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０３４４】
配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３４５】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０３４６】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０３４７】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０３４８】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０３４９】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３５０】
配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５と相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３５１】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０３５２】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０３５３】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３５４】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０３５５】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０３５６】
その結果を図１７に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０３５７】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ヒトゲノムＤＮＡ中の酵母由来ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０３５８】
実施例１４
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０３５９】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０３６０】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０３６１】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【０３６２】
また、得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０３６３】
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０３６４】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０３６５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０３６６】
ＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴについて、クロンテック社より購入したヒト血液ゲノムＤＮＡを添加した以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｂ：1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｃ：0.1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
【０３６７】
次いで、前記のＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴの夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、ＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴを等量ずつ混合したＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＭＤを夫々２連で、更にそれを３セット（後述の処理が異なる）調製した。
【０３６８】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０３６９】
配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＳに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．０２μＭ）を調製した。
【０３７０】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０３７１】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０３７２】
前記のＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＤの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０３７３】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０３７４】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３７５】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４に相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及び配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５に相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、夫々０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及び配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．１μＭ）を調製した。
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０３７６】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０３７７】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３７８】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３７９】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０３８０】
その結果を図１８〜図２０に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４（図１８）、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５（図１９）、及び、前記２種を混合した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド（図２０）と、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。特に２種の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを混合した場合（図２０）では、単独オリゴヌクレオチドでの検出（図１８及び図１９）に比べて感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０３８１】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ヒトゲノムＤＮＡ中の酵母由来ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。更に複数の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いることによって１種の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域を用いるだけでなく、同時に、複数の目的とするＤＮＡ領域を用いることによって）、感度良く定量・検出できることが明らかとなった。
【０３８２】
実施例１５
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０３８３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０３８４】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０３８５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【０３８６】
ＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）  
【０３８７】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０３８８】
配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントSに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３８９】
＜DNAフラグメント＞
S：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０３９０】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０３９１】
また、配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントSの負鎖に対して相補性により結合可能な、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC６、C７、C８、C９、C１０、C１１、C１２、C１３、及びC１４を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３９２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C６：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号４８）
C７：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号４９）
C８：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号５０）
C９：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号５１）
C１０：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号５２）
C１１：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号５３）
C１２：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号５４）
C１３：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号５５）
C１４：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号５６）
【０３９３】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０３９４】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０３９５】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０３９６】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４に相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０３９７】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０３９８】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
【０３９９】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４００】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０４０１】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０４０２】
その結果を図２１に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０４０３】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０４０４】
実施例１６
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０４０５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０４０６】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０４０７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０４０８】
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）  
【０４０９】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０４１０】
配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４１１】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０４１２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０４１３】
また、配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴの負鎖に相補性により結合可能な、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１５、C１６、C１７、及びC１８を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４１４】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C１５：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号５７）
C１６：5’- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’  （配列番号５８）
C１７：5’- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’  （配列番号５９）
C１８：5’- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’  （配列番号６０）
【０４１５】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０４１６】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０４１７】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４１８】
配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５に相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４１９】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０４２０】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０４２１】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４２２】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０４２３】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０４２４】
その結果を図２２に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０４２５】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０４２６】
実施例１７
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０４２７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０４２８】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０４２９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【０４３０】
ＤＮＡフラグメントＳについて、クロンテック社より購入したヒト血液ゲノムＤＮＡを添加した以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
【０４３１】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０４３２】
配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントSに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４３３】
＜DNAフラグメント＞
S：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０４３４】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０４３５】
また、配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントSの負鎖に相補性により結合可能な、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号６１で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC６、C７、C８、C９、C１０、C１１、C１２、C１３、C１４、及びC１９を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４３６】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C６：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号４８）
C７：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号４９）
C８：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号５０）
C９：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号５１）
C１０：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号５２）
C１１：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号５３）
C１２：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号５４）
C１３：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号５５）
C１４：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号５６）
C１９：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号６１）
【０４３７】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０４３８】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０４３９】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４４０】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４４１】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
【０４４２】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
【０４４３】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４４４】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０４４５】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０４４６】
その結果を図２３に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０４４７】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ヒトゲノムＤＮＡ中の酵母由来ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０４４８】
実施例１８
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０４４９】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０４５０】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０４５１】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０４５２】
ＤＮＡフラグメントＴについて、クロンテック社より購入したヒト血液ゲノムＤＮＡを添加した以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｂ：1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）  
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  ＴＥバッファー溶液（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）（5ng/μＬヒト血液ゲノムDNA含有）
【０４５３】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０４５４】
配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４５５】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０４５６】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０４５７】
また、配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴの負鎖に相補性により結合可能な、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１５、C１６、C１７、及びC１８を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４５８】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C１５：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号５７）
C１６：5’- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’  （配列番号５８）
C１７：5’- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’  （配列番号５９）
C１８：5’- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’  （配列番号６０）
【０４５９】
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０４６０】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０４６１】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４６２】
配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５に相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【０４６３】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０４６４】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０４６５】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４６６】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。
【０４６７】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０４６８】
その結果を図２４に示した。ＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドにより精度よく選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０４６９】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ヒトゲノムＤＮＡ中の酵母由来ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。
【０４７０】
実施例１９
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14ｍM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３６及び配列番号３７で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号３８、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０４７１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号３６）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３７）
【０４７２】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
【０４７３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【０４７４】
また、得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号４３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）を増幅した。
【０４７５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号４１）
PR４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号４２）
【０４７６】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０４７７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０４７８】
ＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴ夫々について、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL  ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｃ：0.1ng/10μL  ＴＥバッファー溶液  
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）  
【０４７９】
次いで、前記のＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴの夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、ＤＮＡフラグメントＳ及びＤＮＡフラグメントＴを等量ずつ混合したＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＭＤを夫々２連で、更にそれを３セット（後述の処理が異なる）調製した。
【０４８０】
得られた夫々の溶液20μLと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした。
【０４８１】
配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＳに相補性により結合可能な配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴに相補性により結合可能な配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５の０．０２μＭ  ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．０２μＭ）を調製した。
【０４８２】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３８）
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号４３）
【０４８３】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０４８４】
また、配列番号３８で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＳの負鎖に相補性により結合可能な、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号６１で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC６、C７、C８、C９、C１０、C１１、C１２、C１３、C１４、及びC１９を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した（カウンターオリゴヌクレオチド溶液１）。また、配列番号４３で示される目的とするＤＮＡ領域からなるＤＮＡフラグメントＴの負鎖に相補性により結合可能な、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１５、C１６、C１７、及びC１８を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した（カウンターオリゴヌクレオチド溶液２）。また、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドC６、C７、C８、C９、C１０、C１１、C１２、C１３、C１４、C１５、C１６、C１７、Ｃ１８及びC１９について、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した（カウンターオリゴヌクレオチド溶液３）。
【０４８５】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C６：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号４８）
C７：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号４９）
C８：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号５０）
C９：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号５１）
C１０：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号５２）
C１１：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号５３）
C１２：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号５４）
C１３：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号５５）
C１４：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号５６）
C１５：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’  （配列番号５７）
C１６：5’- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’  （配列番号５８）
C１７：5’- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’  （配列番号５９）
C１８：5’- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’  （配列番号６０）
C１９：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号６１）
【０４８６】
５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液とカウンターオリゴヌクレオチド溶液の組み合わせとして、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４溶液とカウンターオリゴヌクレオチド溶液１、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５溶液とカウンターオリゴヌクレオチド溶液２、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５混合溶液とカウンターオリゴヌクレオチド溶液３を使用し、前記のＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＤの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０４８７】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、カウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した。
【０４８８】
得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済みウエルに移し、約３０分間室温で放置し、ウエルに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体を固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４８９】
配列番号３９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４に相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及び配列番号４４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５に相補性により結合可能な配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を合成し、夫々０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。また、配列番号４０で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及び配列番号４５で示される塩基配列からなるマスキングオリゴヌクレオチドＭ５を等量ずつ混合したＴＥバッファー溶液（各０．１μＭ）を調製した。
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’  （配列番号３９）
Ｂ５：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’  （配列番号４４）
【０４９０】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号４０）
Ｍ５：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’  （配列番号４５）
【０４９１】
５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４溶液で処理した反応液に対してマスキングオリゴヌクレオチドＭ４溶液、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５溶液で処理した反応液に対してマスキングオリゴヌクレオチドＭ５溶液、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４及び５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ５混合溶液で処理した反応液に対してマスキングオリゴヌクレオチドＭ４及びマスキングオリゴヌクレオチドＭ５混合溶液を使用し、以下の処理を施した。
【０４９２】
各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと、前記のマスキングオリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４９３】
その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。
【０４９４】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウエルに１５０μLの割合で添加、5分間室温で撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０４９５】
その結果を図２５〜図２７に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントが、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチルシトシン抗体で複合体を形成し、選択され、感度良く定量・検出されることが明らかとなった。特に２種の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを混合した場合（図２７）では、単独オリゴヌクレオチドでの検出（図２５及び図２６）に比べて感度良く定量・検出されることが明らかとなった。
【０４９６】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その識別機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの定量・検出が可能であることが明らかとなった。更に複数の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いることによって１種の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域を用いるだけでなく、同時に、複数の目的とするＤＮＡ領域を用いることによって）、感度良く定量・検出できることが明らかとなった。
【０４９７】
実施例２０
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液とラット (Wistar Hannover) より採取した血清との混合液を以下のとおり夫々4連で調製した。
血清サンプルA： 100 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルB： 10 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルC： 0 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL (ネガティブコントロール液)
【０４９８】
上記に調製した血清サンプルA〜Cについて、以下に示す処理1または処理2を夫々2連でおこなった。
処理1：
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
処理2：
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate (pH 7.9), 100 mM Mg(OAc)2, 5 mM DTT, 660 mM KOAc) 4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
【０４９９】
上記の処理1または処理2により調製した夫々の溶液を30 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０５００】
上記の酵素処理により得られた溶液を40 μLと、SssI methylase (NEB社製) を0.5 μLと、10ｘNEBuffer2 (NEB社製) を5 μLと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製) を0.5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μLとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて30分間インキュベーションした。
【０５０１】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号６６で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号６６、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号６７で示される塩基配列とからなる5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を合成し、当該合成物を含む0.2 pmoL/10 μLのTEバッファー溶液（特定オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
【０５０２】
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号６６）
【０５０３】
＜5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号６７）
【０５０４】
上記で得た反応液50 μLと、特定オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０５０５】
得られた反応液100 μLをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとからなる複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０５０６】
固定化されたフリーの特定オリゴヌクレオチドをマスキングするために用いるマスキングオリゴヌクレオチドとして特定オリゴヌクレオチドと相補性により結合する配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドMを合成し、当該混合物を含む0.1 pmoL/μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０５０７】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
M：5'- GTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'  （配列番号６８）
【０５０８】
各ウェルにメチルシトシン抗体 [Aviva Systems Biology社製、0.5 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4) 溶液] を100 μLを添加し、さらにマスキングオリゴヌクレオチド溶液1 μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] 200 μLで3回洗浄した。
【０５０９】
その後、Eu-N1標識マウスIgG抗体 [Perkin Elmer社製、0.05 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) ] 200 μLで3回洗浄した。
【０５１０】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに150 μLの割合で添加し、5分間室温で撹拌し、15分間室温で放置した。その後、励起340 nm／蛍光612 nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０５１１】
その結果を図２８および図２９に示した。処理1および処理2のいずれにおいても、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (100 ng) および溶液B (10 ng) において、溶液C (0 ng：コントロール溶液) に比べて蛍光強度が濃度依存的に増加した。
【０５１２】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたDNAフラグメントと、5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理2に比べて処理1では血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出された。
【０５１３】
実施例２１
【０５１４】
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液とコージンバイオ社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)との混合液を以下のとおり夫々4連で調製した。
血清サンプルＡ： 50 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルＢ： 5 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルＣ： 0 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL (ネガティブコントロール液)
【０５１５】
上記に調製した血清サンプルA〜Cについて、以下に示す処理1または処理2を夫々2連でおこなった。
【０５１６】
処理1：
血清サンプル50 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)20 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
処理2：
血清サンプル50 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)10 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
【０５１７】
上記の処理により調製した溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを夫々調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０５１８】
上記の酵素処理により得られた溶液を30 μLと、SssI methylase (NEB社製) を0.5 μLと、10ｘNEBuffer2 (NEB社製) を5 μLと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製) を0.5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μLとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて30分間インキュベーションした。
【０５１９】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号６６で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号６６、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号６７で示される塩基配列とからなる5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を合成し、当該合成物を含む0.2 pmoL/10 μLのTEバッファー溶液（特定オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
【０５２０】
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号６６）
【０５２１】
＜5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号６７）
【０５２２】
上記で得た反応液50 μLと、特定オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０５２３】
得られた反応液100 μLをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとからなる複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０５２４】
固定化されたフリーの特定オリゴヌクレオチドをマスキングするために用いるマスキングオリゴヌクレオチドとして特定オリゴヌクレオチドと相補性により結合する配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドMを合成し、当該合成物を含む0.1 pmoL/μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０５２５】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
M：5'- GTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'  （配列番号６８）
【０５２６】
各ウェルにメチルシトシン抗体 [Aviva Systems Biology社製、0.5 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4) 溶液] を100 μLを添加し、さらにマスキングオリゴヌクレオチド溶液1 μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] 200 μLで3回洗浄した。
【０５２７】
その後、Eu-N1標識マウスIgG抗体 [Perkin Elmer社製、0.05 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) ] 200 μLで3回洗浄した。
【０５２８】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに150 μLの割合で添加し、5分間室温で撹拌し、15分間室温で放置した。その後、励起340 nm／蛍光612 nmで蛍光を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
【０５２９】
その結果を図３０および図３１に示した。処理1では、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (50 ng) および溶液B (5 ng) において、溶液C (0 ng：コントロール溶液) に比べて蛍光強度が濃度依存的に増加した (図３０)。一方、処理2では、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (50 ng)において、溶液C (0 ng：コントロール溶液) に比べて蛍光強度が増加したが、溶液B (5 ng) において蛍光強度の増加は見られなかった (図３１)。
【０５３０】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたDNAフラグメントと、5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理2に比べて処理1では血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出された。
【０５３１】
実施例２２
【０５３２】
血清サンプルとして、以下に示すヒト血清を用いた。
コージンバイオ社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)
Lot No.:
N51438 (健常者)
N51439 (健常者)
N51441 (健常者)
ProMedDx社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)
Lot No.:
11171268 (健常者、56歳、男性)
11171292 (健常者、62歳、男性)
11171297 (健常者、67歳、男性)
11171314 (健常者、75歳、男性)
11171327 (健常者、70歳、男性)
11202510 (健常者、67歳、女性)
11202522 (健常者、64歳、女性)
11202527 (健常者、52歳、女性)
11202615 (健常者、75歳、女性)
11202618 (健常者、78歳、女性)
10958886 (健常者、56歳、男性)
10958979 (健常者、39歳、男性)
10958980 (健常者、45歳、男性)
10960268 (健常者、37歳、男性)
10960272 (健常者、50歳、男性)
10960276 (健常者、30歳、男性)
10960285 (健常者、39歳、男性)
11003457 (健常者、38歳、男性)
11003479 (健常者、51歳、男性)
11003480 (健常者、48歳、男性)
11324997 (健常者、59歳、男性)
11325001 (健常者、61歳、男性)
10325022 (健常者、61歳、男性)
11325032 (健常者、60歳、男性)
11325062 (健常者、69歳、男性)
10870623 (乳がん患者、33歳、女性)
10929521 (乳がん患者、55歳、女性)
10989644 (乳がん患者、45歳、女性)
11209430 (乳がん患者、80歳、女性)
10929514 (乳がん患者、57歳、女性)
10843055 (乳がん患者、59歳、女性)
10984680 (乳がん患者、64歳、女性)
11209428 (乳がん患者、55歳、女性)
10840414 (肺がん患者、54歳、女性)
10929506 (肺がん患者、55歳、男性)
11091955 (肺がん患者、76歳、女性)
11103346 (肺がん患者、66歳、女性)
11142322 (肺がん患者、62歳、女性)
11152564 (肺がん患者、67歳、男性)
11152571 (肺がん患者、67歳、男性)
11153198 (肺がん患者、69歳、女性)
11209435 (肺がん患者、61歳、男性)
11230621 (肺がん患者、71歳、女性)
11153192 (肺がん患者、59歳、男性)
10715942 (肺がん患者、64歳、男性)
10840422 (肺がん患者、78歳、女性)
10935547 (前立腺がん患者、83歳、男性)
11000243 (前立腺がん患者、78歳、男性)
11071226 (前立腺がん患者、84歳、男性)
【０５３３】
上記の血清サンプルについて、以下に示す処理を夫々2連でおこなった。
【０５３４】
血清サンプル40 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)20 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、95 ℃で10分間保温し、当該混合物を4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gまたは20400gで10分間遠心してから上清を回収した。
【０５３５】
上記の処理により調製した夫々の溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０５３６】
上記の酵素処理により得られた溶液を30 μLと、SssI methylase (NEB社製) を0.5 μLと、10ｘNEBuffer2 (NEB社製) を5 μLと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製) を0.5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μLとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて30分間インキュベーションした。
【０５３７】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号６６で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号６６、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号６７で示される塩基配列とからなる5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドB1を合成し、当該合成物を含む0.2 pmoL/10 μLのTEバッファー溶液（特定オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
【０５３８】
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号６６）
【０５３９】
＜5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号６７）
【０５４０】
上記で得た反応液50 μLと、特定オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、当該混合物を95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
【０５４１】
得られた反応液100 μLをストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約30分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と特定オリゴヌクレオチドとからなる複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
【０５４２】
固定化されたフリーの特定オリゴヌクレオチドをマスキングするために用いるマスキングオリゴヌクレオチドとして特定オリゴヌクレオチドと相補性により結合する配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドMを合成し、当該合成物を含む0.1 pmoL/μLのTEバッファー溶液を調製した。
【０５４３】
＜マスキングオリゴヌクレオチド＞
M：5'- GTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'  （配列番号６８）
【０５４４】
各ウェルにメチルシトシン抗体 [Aviva Systems Biology社製、0.5 μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4) 溶液] を100 μLを添加し、さらにマスキングオリゴヌクレオチド溶液1 μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] 200 μLで3回洗浄した。
【０５４５】
その後、Eu-N1標識マウスIgG抗体 [Perkin Elmer社製、0.05 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) ] 200 μLで3回洗浄した。
【０５４６】
Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに150 μLの割合で添加し、5分間室温で撹拌し、15分間室温で放置した。その後、励起340 nm／蛍光612 nmで蛍光を測定した。
【０５４７】
上記の酵素処理（MspI処理）により得られた溶液中のDNAをリアルタイムPCRにより定量した。
【０５４８】
濃度測定用スタンダードサンプルとしてMspI処理ヒトゲノムDNA溶液を以下のとおり調製した。ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)の5 ng/μL TEバッファー溶液を調製し、この溶液を20 μLと、制限酵素MspIを２Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを夫々の処理について調製した。当該反応液を、37 ℃にて1時間インキュベーションした。得られた反応液について、TEバッファーによる希釈により、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 ng/5 μL溶液を調製した。
【０５４９】
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号６６で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号６６、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を増幅してリアルタイムPCRで定量するためにフォワードプライマー (F1、配列番号６９) およびリバースプライマー (R1、配列番号７０) を設計した。
【０５５０】
＜目的とするDNA領域＞
Ｚ：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号６６）
【０５５１】
＜フォワードプライマー＞
F1：5'- GGTGGCTCACGCCTGTAATC -3'  （配列番号６９）
【０５５２】
＜リバースプライマー＞
R1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3'  （配列番号７０）
【０５５３】
PCRの反応液としては、鋳型とする上記に調製したMspI処理ヒトゲノムDNA溶液5 μLまたは上記に調製した濃度測定用スタンダードサンプルと、フォワードプライマーF1およびリバースプライマーR1の5 μＭ溶液をそれぞれ1.5 μＬと、SYBR（登録商標） Green I (Lonza社) を0.1x分と、each 2 mM dNTPを2.5 μLと、10xPCR緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2、0.01％ Gelatin) を2.5 μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ (AmpliTaq Gold, 5 U/μＬ, ABI社)を0.125 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25 μLとしたものを用いた。リアルタイムPCRは、Mx3005P (Stratagene社)を用いて実施した。当該反応液を、95 ℃にて10分間保温した後、95 ℃にて30秒間、61 ℃にて30秒間、72 ℃にて45秒間を１サイクルとして40サイクル繰り返すことにより、目的とするDNA領域を増幅した。当該リアルタイムPCRの結果により、血清サンプル中のDNAを定量した。
【０５５４】
その結果を図３２および図３３に示した。本手法による測定値と、リアルタイムPCRにより定量した値とを比較したところ、相関があることが示された（相関係数：R = 0.74）(図３２)。また、59歳以下のヒト血清サンプルについて定量した結果を、癌患者と健常者で比較したところ、癌患者では血清中DNA濃度が上昇していることが示された(図３３)。
【０５５５】
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたDNAフラグメントと、5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により定量・検出することにより、ヒト血清中遊離DNAが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０５５６】
本発明により、検体中に含まれるＤＮＡ中の目的とする領域の塩基配列の含量を定量又は検出する方法等を提供することが可能となる。また、被験者由来の検体（好ましくは血清）を用いて、当該検体での結果と健常者由来の検体での結果との比較に基づき癌患者由来の検体を選抜する方法等を提供することが可能となる。
【０５５７】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２０
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号２１
実験のために設計されたマスキングオリゴヌクレオチド
配列番号２２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２５
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号２６
実験のために設計されたマスキングオリゴヌクレオチド
配列番号２７
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２８
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２９
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたマスキングオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号３９
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計されたマスキングオリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４４
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号４５
実験のために設計されたマスキングオリゴヌクレオチド
配列番号４６
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４７
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号６３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号６４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号６５
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号６６
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号６７
実験のために設計された5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号６８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号６９
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2010017178.tif 000003
【図２】
2010017178.tif 000004
【図３】
2010017178.tif 000005
【図４】
2010017178.tif 000006
【図５】
2010017178.tif 000007
【図６】
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【図７】
2010017178.tif 000009
【図８】
2010017178.tif 000010
【図９】
2010017178.tif 000011
【図１０】
2010017178.tif 000012
【図１１】
2010017178.tif 000013
【図１２】
2010017178.tif 000014
【図１３】
2010017178.tif 000015
【図１４】
2010017178.tif 000016
【図１５】
2010017178.tif 000017
【図１６】
2010017178.tif 000018
【図１７】
2010017178.tif 000019
【図１８】
2010017178.tif 000020
【図１９】
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【図２０】
2010017178.tif 000022
【図２１】
2010017178.tif 000023
【図２２】
2010017178.tif 000024
【図２３】
2010017178.tif 000025
【図２４】
2010017178.tif 000026
【図２５】
2010017178.tif 000027
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2010017178.tif 000030
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2010017178.tif 000033
【図３２】
2010017178.tif 000034
【図３３】
2010017178.tif 000035
【配列表】
2010017178000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月1日(2009.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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