(57)【要約】【課題】増殖反応の検出精度を向上し得る核酸量検出装置及び核酸量検出方法を提案する。【解決手段】増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる各光源素子から、該容器に入れられる蛍光物質に対する励起光を照射する照射ステップと、基板と、各光源素子との間において、各光源素子の光軸を基準とする周囲に配される複数の受光素子で受光される、各光源素子から照射される励起光の散乱光量が一定となるように、各光源素子に対する照射光量を調整する光量調整ステップとを経る。【選択図】図７
2010022315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられ、該容器に入れられる蛍光物質に対する励起光を照射する複数の光源素子と、
上記基板と、上記複数の光源素子との間において、各光源素子の光軸を基準とする周囲に配され、当該光源素子から照射される励起光の散乱光を受光する複数の受光素子と、
上記複数の受光素子で受光される散乱光量が一定となるように、各光源素子に対する照射光量を調整する光量調整部と
を有する核酸量検出装置。
【請求項２】
上記光量調整部は、
上記増殖反応のサイクル間に設けられる期間ごとに、上記各光源素子に対する照射光量を調整する、請求項１に記載の核酸量検出装置。
【請求項３】
上記基板と、上記複数の光源素子との間に該基板と平行に配され、上記励起光以外の光を反射する反射板
をさらに有し、
上記複数の受光素子は、
上記反射板のうち上記複数の光源素子に対向される面に配される、請求項１に記載の核酸量検出装置。
【請求項４】
上記複数の受光素子ごとに、現在の期間での散乱光量と、該期間よりも１つ前の期間での散乱光量とを比較し、前回の増殖反応における上記複数の容器での反応結果を示す値のうち、当該差を有する散乱光量を照射する光源素子に対応付けられる容器での反応結果を示す値を、上記差に応じて調整する反応結果調整部
をさらに有する、請求項２に記載の核酸量検出装置。
【請求項５】
上記反応結果調整部は、
上記差を有する散乱光量を照射する光源素子に対応付けられる容器での反応結果を示す値に、上記差に比例する値を加算又は減算する、請求項４に記載の核酸量検出装置。
【請求項６】
増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる各光源素子から、該容器に入れられる蛍光物質に対する励起光を照射する照射ステップと、
上記基板と、上記各光源素子との間において、各光源素子の光軸を基準とする周囲に配される複数の受光素子で受光される、上記各光源素子から照射される励起光の散乱光量が一定となるように、上記各光源素子に対する照射光量を調整する光量調整ステップと
を有する、核酸量検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸量検出装置及び核酸量検出方法に関し、ＰＣＲ (Polymerase  Chain  reaction) 装置に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸の増殖反応の場となる複数の微小容器に対する熱源として、薄膜トランジスタを用いるようにしたリアルタイムＰＣＲ装置が本出願人により提案されている（例えば特許文献１）。
【０００３】
このリアルタイムＰＣＲ装置における増殖反応の検出系として、微小容器に入れられる蛍光物質の励起光を照射する光源と、該励起光によって励起される蛍光物質の蛍光を受光する受光素子とが、微小容器ごとに設けられている。
【特許文献１】特開２００３−２９８０６８公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、各光源には一般に製造上のばらつきがあるため、当該光源に対する制御を同一としても、このばらつきに起因して各微小容器に対する励起光量が相違する。この相違は、受光素子から微小容器での増殖反応結果として出力される信号に反映されるため、該信号に示される核酸量の信頼性が乏しいものとなってしまう。
【０００５】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、増殖反応の検出精度を向上し得る核酸量検出装置及び核酸量検出方法を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するため本発明は、核酸量検出装置であって、核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられ、該容器に入れられる蛍光物質に対する励起光を照射する複数の光源素子と、基板と、複数の光源素子との間において、各光源素子の光軸を基準とする周囲に配され、当該光源素子から照射される励起光の散乱光を受光する複数の受光素子と、複数の受光素子で受光される散乱光量が一定となるように、各光源素子に対する照射光量を調整する光量調整部とをもつ。
【０００７】
また本発明は、核酸量検出方法であって、増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる各光源素子から、該容器に入れられる蛍光物質に対する励起光を照射する照射ステップと、基板と、各光源素子との間において、各光源素子の光軸を基準とする周囲に配される複数の受光素子で受光される、各光源素子から照射される励起光の散乱光量が一定となるように、各光源素子に対する照射光量を調整する光量調整ステップとを経る。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、容器への中途段階にある光量（散乱光量）が一定となるため、各光源素子における製造上のばらつきがあっても、該ばらつきに起因する光量差は相殺されることになる。つまり、各容器に到達される励起光量は光源素子のばらつきにかかわらず一定となる。したがって本発明によれば、励起光によって励起される蛍光量を、各容器での核酸量自体を反映したものとすることができ、この結果、増殖反応の検出精度を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下図面について、本発明を適用した一実施の形態を詳述する。
【００１０】
（１）リアルタイムＰＣＲ装置の構造
図１において、本実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置１の構造を示す。このリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室に対して、複数の基板１１〜１６を所定間隔で層状に配置した構造を有する。
【００１１】
反応基板１１は、基準層となる基板であり、該基板には、核酸の増殖反応の場とされる容器（以下、これをウェルとも呼ぶ）ＵＬが高密度に形成される。これらウェルＵＬには、増殖対象の標的核酸及びその標的核酸の増殖に要する各種物質（プライマー、緩衝液、酵素、ｄＮＴＰ、蛍光色素等）が与えられる。
【００１２】
例えば６［ｃｍ］四方の反応基板１１を用いた場合、１［μＬ］以下の容量でなる４万個程度のウェルＵＬを形成することが可能となる。したがって、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室を小型化した場合であっても、同種又は異種でなる多くの標的核酸を取り扱うことが可能となる。
【００１３】
発熱基板１２は、反応基板１１に対して下側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１１と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応付けて熱源素子ＨＤが配され、これら熱源素子ＨＤの周囲には複数の検温素子ＴＤが配される。この熱源素子ＨＤには例えばＴＦＴ(Thin  Film  Transistor)等が用いられ、検温素子ＴＤには例えばピンダイオード等が用いられる。
【００１４】
このリアルタイムＰＣＲ装置１では、各ウェルＵＬに対応する熱源素子ＨＤが、該熱源素子ＨＤを囲む複数の検温素子ＴＤでセンシングされる温度に応じて個別に制御される。したがって、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、例えば各ウェルＵＬに与えられる標的核酸の種が異なる等に起因して温度条件が異なる場合であっても、高密度に配される各ウェルＵＬの温度を、増殖サイクルとして規定される変性段階、アニーリング段階、伸長段階の各段階に要する温度を基準として高精度で調整することができるようになされている。
【００１５】
発熱補助基板１３は、発熱基板１２に対して下側の層として配される基板である。この発熱補助基板１３は、反応室全体における熱を吸収又は発散することで、該反応室を設定温度に維持する。
【００１６】
したがって、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、現段階で設定される温度から次段階で与えるべき温度にウェルＵＬの温度を移行させるまでの時間（温度勾配の時間）を高速化できるようになされている。ちなみに、発熱補助基板１３には例えばペルチェ素子等が用いられる。
【００１７】
発光基板１４は、反応基板１１に対して上側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１１と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、インターカレータ等の蛍光物に対する励起光を照射する光源素子ＬＳが配される。この光源素子ＬＳには例えばＬＥＤ(Light  Emitting  Diode)が用いられる。
【００１８】
励起光透過基板１５は、反応基板１１と発光基板１４との中間層として配される基板であり、光源素子ＬＳから照射される励起光を透過し、該励起光以外の光を反射する。この励起光透過基板１５には例えばダイクロイックミラーが用いられる。
【００１９】
蛍光透過基板１６は、発熱基板１２と発熱補助基板１３との中間層として配される基板であり、励起光によって励起される蛍光物の蛍光を透過し、該蛍光以外の光を反射する。また発熱補助基板１３と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、当該ウェルで励起される蛍光を受光する受光素子ＬＤＡが配される。リアルタイムＰＣＲ装置１では、これら受光素子ＬＤＡで受光される蛍光量に応じた標的核酸量が、増殖サイクル単位で算出される。
【００２０】
この実施の形態におけるリアルタイムＰＣＲ装置１では、励起光透過基板１５における発光基板１４と対向する面のうち、該発光基板１４の各光源素子ＬＳの光軸に対応する位置を基準とする周囲に対して、当該光源素子ＬＳから照射される励起光の散乱光を受光する受光素子ＬＤＢが配される。
【００２１】
またこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、１回の増殖サイクルが終了した時点で直ちに次の増殖サイクルを開始するのではなく、図２に示すように、各回の増殖サイクルの終了時点から、光源素子ＬＳの光量を調整するための期間（以下、これをキャリブレーション期間ＣＦとも呼ぶ）が設けられている。
【００２２】
そしてこのキャリブレーション期間ＣＦごとに、各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量が一定となるように、各ウェルＵＬに対応する光源素子ＬＳの光量が個別に制御される。したがって、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、規定回数の増殖サイクルを終了するまで、各ウェルＵＬに対して一定量の励起光を照射することができるようになされている。
【００２３】
（２）発熱基板の具体的な構成
次に、発熱基板１２（図１）の具体的な構成について、図３を用いて説明する。発熱基板１２は、励起光が透過可能な例えばガラス等の基板でなり、複数対の発熱回路３０及び温度センシング回路４０と、走査駆動部５０と、温度制御部６０とを有する。
【００２４】
各発熱回路３０はそれぞれ１つのＴＦＴ３１を有し、これらＴＦＴ３１は、反応基板１１に形成される各ウェルにそれぞれ対応させてマトリクス状に配される。一方、各温度センシング回路４０はそれぞれ複数のピンダイオード４１を有し、これらピンダイオード４１は、対となる発熱回路３０がもつＴＦＴ３１の周囲に一定の距離をもって所定間隔ごとに配される。
【００２５】
ここで、発熱回路３０及び温度センシング回路４０における具体的な回路構成を説明する。ただし、各対の発熱回路３０及び温度センシング回路４０はそれぞれ同一の構成であるため、１対の発熱回路３０及び温度センシング回路４０に着目して説明する。
【００２６】
図４に示すように、発熱回路３０は、熱源素子として機能するＴＦＴ３１と、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ１，Ｔ２，Ｔ３と、発熱制御素子として機能するコンデンサ３２とによって構成される。
【００２７】
一方、温度センシング回路４０は、検温素子として機能する複数のピンダイオード４１と、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ４，Ｔ５と、電圧計４２とによって構成される。
【００２８】
発熱回路３０におけるトランジスタＴ１，Ｔ２，Ｔ３のゲートには、パルス信号ＰＳ１が第１の走査駆動部５０Ａ（図３）から与えられ、温度センシング回路４０におけるトランジスタＴ３，Ｔ４のゲートには、パルス信号ＰＳ１とは反転した関係にあるパルス信号ＰＳ２が第２の走査駆動部５０Ｂ（図３）から与えられる。
【００２９】
例えば、パルス信号ＰＳ１が「Ｈｉｇｈ」状態にある場合（発熱回路３０が駆動状態にある場合）、パルス信号ＰＳ２が「Ｌｏｗ」状態にある（温度センシング回路４０が非駆動状態にある）。この状態では、発熱回路３０におけるトランジスタＴ１，Ｔ２はオン状態にあり、発熱回路３０におけるトランジスタＴ３と、温度センシング回路４０におけるトランジスタＴ４，Ｔ５はオフ状態にある。
【００３０】
この状態の場合、発熱回路３０には、加熱すべき温度に相当する電流値の信号（以下、これを加熱制御信号とも呼ぶ）Ｉｓｉｇが温度制御部６０（図３）与えられる。発熱回路３０では、ＴＦＴ３１におけるドレインとゲートがトランジスタＴ２により短絡されているため、発熱制御信号ＩｓｉｇはトランジスタＴ１を介してＴＦＴ３１に流れる。
【００３１】
この結果、ＴＦＴ３１には、発熱制御信号Ｉｓｉｇに応じたゲート・ソース間電圧が発生し、この電圧が、ＴＦＴ３１に発生させるべき熱源要素として、コンデンサ３２に保持されることとなる。
【００３２】
ＴＦＴ３１がエンハンスメント型トランジスタ（すなわち閾値Ｖｔｈ＞０）である場合、該ＴＦＴ３１は飽和領域で動作することになるので、ＴＦＴ３１におけるゲート・ソース間電圧をＶｇｓとすると、該電圧Ｖｇｓと発熱制御信号Ｉｓｉｇとの間には、次式
【００３３】
【数１】
2010022315.tif 000003
【００３４】
の関係が成立する。ちなみにこの（１）式における「μ」はキャリアの移動度を、「Ｃｏｘ」は単位面積当たりのゲート容量を、「Ｗ」はチャネルの幅を、「Ｌ」はチャネルの長さを示す記号である。
【００３５】
これに対して、パルス信号ＰＳ１が「Ｌｏｗ」状態にある場合（発熱回路３０が非駆動状態にある場合）、パルス信号ＰＳ２が「Ｈｉｇｈ」状態にある（温度センシング回路４０が非駆動状態にある）。この状態における発熱回路３０では、トランジスタＴ１，Ｔ２はオフ状態にあり、トランジスタＴ３がオン状態にあるため、電源電圧ＶＤＤからＴＦＴ３１におけるソース端のＧＮＤに向かって電流が流れる。
【００３６】
この電源電圧ＶＤＤからＴＦＴ３１に与えられる電圧は、該ＴＦＴ３１が飽和領域で動作する電圧よりも高く設定される。つまり、ＴＦＴ３１が飽和領域で動作するように、該ＴＦＴ３１に対する電源電圧ＶＤＤは十分に高く、トランジスタＴ３のオン抵抗は十分に低く設定される。
【００３７】
したがって、ＴＦＴ３１に流れる電流Ｉｄｒｖはドレイン・ソース間電圧Ｖｄｓには依存せず、次式
【００３８】
【数２】
2010022315.tif 000004
【００３９】
によって与えられる。
【００４０】
一般に、ＴＦＴでは（１）式及び（２）式の右辺に現れる各パラメータがばらつくものであるが、この発熱回路３０では、ＴＦＴ３１が飽和領域で動作するので、該パラメータの値に関係なく、電流Ｉｄｒｖと発熱制御信号Ｉｓｉｇとは一致することとなる。
【００４１】
したがって、ＴＦＴ３１での発熱量は、該ＴＦＴ３１の特性ばらつきによらず、温度制御部６０（図３）から与えられる発熱制御信号Ｉｓｉｇと、電源電圧ＶＤＤとの積で決まる正確なものとなる。
【００４２】
また発熱制御信号Ｉｓｉｇは、温度制御部６０（図３）において、その電流値を正確に可変することができるものである。したがって、この発熱回路３０は、温度制御部６０での電流制御によって、ＴＦＴ３１を通じてウェルに対する温度を正確に可変することが可能となる。
【００４３】
一方、温度センシング回路４０には、パルス信号ＰＳ１が「Ｌｏｗ」状態（発熱回路３０が非駆動状態）、かつ、パルス信号ＰＳ２が「Ｈｉｇｈ」状態（温度センシング回路４０が駆動状態）にある場合、側温制御信号Ｉｄｅｔが温度制御部６０（図３）与えられる。
【００４４】
この場合、温度センシング回路４０では、側温制御信号ＩｄｅｔはトランジスタＴ４を介して直列に接続された複数のピンダイオード４１に流れる。この結果、これらピンダイオード４１には電圧が加わり、該電圧が電圧計４２によって計測されることになる。
【００４５】
この電圧計３２における計測値は、温度制御部６０（図３）によってＴＦＴ３１周囲における平均的な温度を示すパラメータとして取り込まれ、該温度制御部６０（図３）において、発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値を決定するために用いられる。
【００４６】
このようにして各対の発熱回路３０及び温度センシング回路４０は、温度制御部６０の制御のもとで、交互に動作するようになされている。
【００４７】
走査駆動部５０（図３）は、各発熱回路３０に対して、所定間隔ごとに駆動期間をもつ同位相又は異位相のパルス信号を第１の走査駆動部５０Ａから送出する一方、各温度センシング回路４０に対して、対とされる発熱回路３０に送出されるパルス信号とは反転した関係にあるパルス信号を第２の走査駆動部５０Ｂから送出する。
【００４８】
このようにして走査駆動部５０は、発熱回路３０の駆動と、温度センシング回路４０の駆動とを単位（以下、これを駆動サイクルとも呼ぶ）として、各発熱回路３０及び温度センシング回路４０を対ごとに循環駆動させるようになされている。
【００４９】
温度制御部６０は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)と、ＲＯＭ(Read Only Memory)と、当該ＣＰＵのワークメモリとしてのＲＡＭ(Random Access Memory)とを含むコンピュータとして構成される。
【００５０】
この温度制御部６０は、ウェルに与えるべき温度（以下、これをウェル温度とも呼ぶ）として、変性段階に要する温度（９５℃）から標的核酸の種に応じて増減した温度を初期設定する。
【００５１】
そして温度制御部６０は、増殖サイクルにおける変性段階，アニーリング段階，伸長段階への移行タイミングを計測し、該移行タイミングとなったときには、ウェル温度の設定を、その移行すべき段階に要する温度（９５℃、５５℃又は７２℃）から標的核酸の種に応じて増減した温度に変更する。
【００５２】
また温度制御部６０は、ウェル温度を基準として、加熱すべき温度に相当する電流値の信号（以下、これを加熱制御信号とも呼ぶ）を駆動サイクルごとに生成するようになされている。
【００５３】
すなわち温度制御部６０は、駆動対象の温度センシング回路４０に対して、例えば１００［μＡ］の側温制御信号Ｉｄｅｔ１と、１０［μＡ］の側温制御信号Ｉｄｅｔ２とを与え、これらを与えたときの電圧計４２（図４）の計測値から、該温度センシング回路４０に対の発熱回路３０での温度を求める。
【００５４】
具体的には、側温制御信号Ｉｄｅｔ１を与えたときの電圧値と、側温制御信号Ｉｄｅｔ２を与えたときの電圧値との差が電圧計４２（図４）の計測値となるが、この計測値をΔＶとすると、次式
【００５５】
【数３】
2010022315.tif 000005
【００５６】
により求める。この（３）式における「５．００７２」はボルツマン定数である。
【００５７】
また温度制御部６０は、駆動対象の温度センシング回路４０を用いて、対となる発熱回路３０での温度を求めた場合、この求めた温度（測定温度）と、ウェル温度との温度差に比例する電流値を発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値として決定し、該決定した電流値の発熱制御信号Ｉｓｉｇを生成する。
【００５８】
そして温度制御部６０は、この発熱制御信号Ｉｓｉｇを、かかる温度センシング回路４０に対の発熱回路３０が駆動対象となったとき、該発熱回路３０に対して送出する。
【００５９】
このようにして温度制御部６０は、規定された回数分の増殖サイクルを経るまで、発熱回路３０に対の温度センシング回路４０で測定した温度とウェル温度との温度差に応じて、駆動サイクルごとに発熱回路３０に送出すべき加熱制御信号を生成するようになされている。
【００６０】
したがって、この温度制御部６０は、ウェル温度に至るまでそのウェル温度に応じた固定の電流値でなる加熱制御信号を与え続ける場合に比して、温度勾配を滑らかに（一定に）推移させることができ、この結果、急激な温度変化に起因する標的核酸等の劣化を回避できるようになされている。
【００６１】
（３）光源基板の具体的な構成
次に、発光基板１４（図１）の具体的な構成について、図５を用いて説明する。発光基板１４は、複数の発光回路７０と、走査駆動部８０と、調整部９０とを有する。
【００６２】
各発光回路７０はそれぞれ１つのＬＥＤ７１を有し、これらＬＥＤ７１は、反応基板１１に形成される各ウェルにそれぞれ対応させてマトリクス状に配される。ここで、発光回路７０における具体的な回路構成を説明する。ただし、各発光回路７０はそれぞれ同一の構成であるため、１つの発光回路７０に着目して説明する。
【００６３】
図６に示すように、発光回路７０は、光源素子ＬＳとして機能するＬＥＤ７１と、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ１０，Ｔ１１と、発光量制御素子として機能するコンデンサ７２とによって構成される。
【００６４】
発光回路７０におけるトランジスタＴ１０のゲートには、パルス信号ＰＳが走査駆動部８０（図５）から与えられる。例えば、パルス信号ＰＳが「Ｈｉｇｈ」状態（駆動期間）にある場合、発光回路７０におけるトランジスタＴ１０はオン状態とされる。
【００６５】
この状態の場合、発光回路７０には、照射すべき発光量に相当する電流値の信号（以下、これを発光制御信号とも呼ぶ）Ｉｓｇが調整部９０（図５）から与えられ、トランジスタＴ１０を介して流れる。
【００６６】
これによりトランジスタＴ１０のソースとトランジスタＴ１１のゲート間には、発光制御信号Ｉｓｇに応じた電圧が発生し、この電圧は、当該ソース・ゲート間に設けられたコンデンサ７２に保持される。
【００６７】
この結果、コンデンサ７２に保持される電圧に応じた量の電流が、電源電圧ＶＤＤからＬＥＤ７１に対して与えられ、該ＬＥＤ７１では、その電流量に応じた発光量の励起光が照射されることとなる。
【００６８】
コンデンサ７２に対する保持電圧は、発光制御信号Ｉｓｇの値に応じて決まるものであるが、この値は調整部９０（図５）によって可変される。したがって、この発光回路７０は、調整部９０での電流制御に応じて、ＬＥＤ７１ごとに、各ウェルＵＬに対する励起光を一定量で照射することが可能となる。
【００６９】
走査駆動部８０（図５）は、キャリブレーション期間ＣＦ（図２）を駆動区間とするパルス信号を各発光回路７０に与えて、当該発光回路７０を同時期又は所定順に循環駆動させるようになされている。
【００７０】
調整部９０は、ＣＰＵ、ＲＯＭおよび当該ＣＰＵのワークメモリとしてのＲＡＭを含むコンピュータとして構成される。
【００７１】
この調整部９０は、ＲＯＭに格納されるプログラムに基づいて、現増殖サイクルから次の増殖サイクルに移行するまでのキャリブレーション期間ＣＦ（図２）ごとに、各ＬＥＤ７１に対する光量が一定となるように対応する発光回路７０に与えるべき電流量を調整する。
【００７２】
またこの調整部９０は、現在のキャリブレーション期間ＣＦにおいて各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量と、前回のキャリブレーション期間ＣＦにおいて各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量との差に応じて、前回の増殖サイクルで算出された標的核酸量をウェルＵＬ単位で個別に調整するようになされている。
【００７３】
この調整部９０での具体的な調整処理は、例えば図７に示すフローチャートにしたがって行われる。
【００７４】
すなわち調整部９０は、増幅反応の開始操作が行われるとこの調整処理手順を開始し、ステップＳＰ１において、初期値として設定される電流値の発光制御信号Ｉｓｉｇを生成し、これを各発光回路７０に送出する。
【００７５】
そして調整部９０は、次のステップＳＰ２に進んで、増殖サイクルにおける伸長段階に対して指定される時間を経過したか否かを判定し、該時間を経過したものと判定した場合には、次のステップＳＰ３に進んで、規定されたサイクル数を終了したか否かを判定する。
【００７６】
ここで、規定されたサイクル数を終了していない場合、調整部９０は、キャリブレーション期間ＣＦに移行したものと認識し、次のステップＳＰ４に進んで、各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量を取得し、これを内部のメモリにデータとして保存する。
【００７７】
また調整部９０は、続くステップＳＰ５において、各受光素子ＬＤＢから取得した散乱光量が一定となるように、各発光回路３０に与えるべき発光制御信号Ｉｓｉｇの電流値を設定する。
【００７８】
そして調整部９０は、次のステップＳＰ６に進んで、ステップＳＰ４において各発光回路３０に対して設定した発光制御信号Ｉｓｉｇを生成し、これを対応する発光回路７０に送出する。
【００７９】
この後、調整部９０は、ステップＳＰ７に進んで、キャリブレーション期間ＣＦへの移行が２回目以降である場合には、現在のキャリブレーション期間ＣＦ内にステップＳＰ３で取得した各受光素子ＬＤＢの散乱光量と、前回のキャリブレーション期間ＣＦ内にステップＳＰ３で取得した各受光素子ＬＤＢの散乱光量とを、対応する受光素子ＬＤＢ同士で比較する。
【００８０】
ここで、現キャリブレーション期間ＣＦと、前キャリブレーション期間ＣＦとの散乱光量の差を有する受光素子ＬＤＢが１つでもある場合、このことは、その受光素子ＬＤＢに対応するＬＥＤ７１では、経時的な光量差があることを意味する。
【００８１】
この場合、調整部９０は、ステップＳＰ８に進んで、現キャリブレーション期間ＣＦと、前キャリブレーション期間ＣＦとの散乱光量の差を有する受光素子ＬＤＢが照射対象とするウェルＵＬについて、前回の増殖サイクルのときに受光素子ＬＤＡで受光される蛍光量に応じて算出された標的核酸量を示すデータを取得する。
【００８２】
そして調整部９０は、このデータにおける標的核酸量に対して、現キャリブレーション期間ＣＦと、前キャリブレーション期間ＣＦとの散乱光量の差に比例する量を加算又は減算することによって、ＬＥＤ７１での経時的な光量差に起因するずれ量を補正した後、ステップＳＰ２に戻る。なお、この「差に比例する量」には、標的核酸の種に応じた比例定数を加味するようにしてもよい。このようにすれば、より真値に近いる標的核酸量を得ることができる。
【００８３】
これに対して、現キャリブレーション期間ＣＦと、前キャリブレーション期間ＣＦとの散乱光量の差を有する受光素子ＬＤＢが１つもない場合、調整部９０は、ステップＳＰ８を経ることなくステップＳＰ２に戻る。
【００８４】
このようにして調整部９０は、ステップＳＰ３において、規定されるサイクル数の増殖サイクルを経るまで、次の増殖サイクルまでのキャリブレーション期間ＣＦ内に、各ＬＥＤ７１に対する光量を調整するとともに、前回の増殖サイクルで算出された標的核酸量を適宜補正するようになされている。
【００８５】
（４）動作及び効果
以上の構成において、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、複数のウェルＵＬにそれぞれ対応付けられるＬＥＤ３１（光源素子ＬＳ）から照射される励起光の散乱光を受光する受光素子ＬＤＢ（図１）が、当該ウェルＵＬとＬＥＤ３１（光源素子ＬＳ）との間に設けられる。これら受光素子ＬＤＢは、対応するＬＥＤ３１（光源素子ＬＳ）の光軸を基準とする周囲に配される（図１）。
【００８６】
このリアルタイムＰＣＲ装置１における調整部９０（図６）は、これら受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量が一定となるように、各ＬＥＤ３１から照射すべき発光量を調整する。
【００８７】
このリアルタイムＰＣＲ装置１では、ウェルＵＬへの中途段階にある光量（散乱光量）が一定となるため、各ＬＥＤ３１における製造上のばらつきがあっても、該ばらつきに起因する光量差は相殺されることになる。つまり、各ウェルＵＬに到達される励起光量はＬＥＤ３１のばらつきにかかわらず一定となる。
【００８８】
したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、励起光によって励起される蛍光量を、各ウェルＵＬでの核酸量自体を反映したものとすることができ、この結果、増殖反応の検出精度を向上することができる。
【００８９】
この実施の形態の場合、調整部９０は、かかる調整を初回のみとせずに、増殖サイクルが終了するたびに（キャリブレーション期間ＣＦごとに）実行する（図２）。
【００９０】
したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、次の増殖サイクルの開始前における各ＬＥＤ３１それぞれの状態に応じて、ウェルＵＬへの中途段階にある光量（散乱光量）を一定とすることができる。つまり、各ＬＥＤ３１における製造上のばらつきのみならず、当該ＬＥＤ３１の経時的変動のばらつきがあっても、各ウェルＵＬに到達される励起光量を一定とすることができる。この結果、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、増殖反応の検出精度をより一段と向上することができる。
【００９１】
リアルタイムＰＣＲ装置１では、温度変化の激しい密閉空間に各ＬＥＤ３１が配されるため、各ＬＥＤ３１の経時的変動のばらつきは生じ易い。したがって、ＬＥＤ３１の経時的変動のばらつきがあっても、各ウェルＵＬに到達される励起光量を一定とすることができるということは特に有用となる。
【００９２】
ところで、現在のキャリブレーション期間ＣＦにおいて受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量と、前回のキャリブレーション期間ＣＦにおいて受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量とに差がある場合（ＬＥＤ３１に経時的変動があった場合）、該現在のキャリブレーション期間ＣＦにおいて、ウェルＵＬに到達される励起光量が一定とされる。このため、次の増殖サイクルにおいて励起光によって励起される蛍光量は、各ウェルＵＬでの核酸量自体を反映したものなる。
【００９３】
しかしながら、次回の増殖サイクルで得られる蛍光量と、前回の増殖サイクルでの蛍光量との関係では、ＬＥＤ３１における経時的な差が残ることになる。この実施の形態の場合、調整部９０は、現在と前回との散乱光量とに差がある場合、その差を有する散乱光量を照射するＬＥＤ３１に対応付けられるウェルＵＬでの核酸量を、該差に応じて調整する。
【００９４】
したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、ＬＥＤ３１に経時的変動があったとしても核酸量の換算を均一化でき、この結果、増殖反応の検出精度をより一段と向上することができる。
【００９５】
さらにこの実施の形態の場合、受光素子ＬＤＢ（図１）は、複数のウェルＵＬと、ＬＥＤ３１（光源素子ＬＳ）との間に配される励起光透過基板１５のうち、該ＬＥＤ３１に対向される面に配される。
【００９６】
したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、励起光透過基板１５の表面までの段階にある光量（散乱光量）を一定にさえすれば、該励起光透過基板１５において励起光以外の光が遮断されるため、励起光透過基板１５からウェルＵＬまでにノイズ光の混在を未然に防ぐことができる。この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１では、各ウェルＵＬに到達される励起光量を確実に一定とすることができる。
【００９７】
以上の構成によれば、各ウェルＵＬに到達される励起光量をＬＥＤ３１のばらつきにかかわらず一定としたことにより、増殖反応の検出精度を向上し得るリアルタイムＰＣＲ装置１を実現できる。
【００９８】
（５）他の実施の形態
上述の実施の形態では、発光回路７０として図６に示す回路構成が適用された。しかしながら、回路構成はこの実施の形態に限定されるものではなく、種々の回路構成を適用することができる。
【００９９】
また上述の実施の形態ＰＣＲ法を適用したがこれ以外の増殖反応法を適用することができる。例えば、ｄｓＤＮＡからＲＮＡを得るＩＶＴ(In  Vitro  Transcription)法、逆転写酵素のＲＮａｓｅ活性を用いてＲＮＡをトリミングしてＲＮＡを得るＴＲＣ(Transcription  Reverse   transcription  Concerted  amplification)法、ＲＮＡポリメラ−ゼを用いてＲＮＡプロモーターが組み込まれたｄｓＤＮＡからＲＮＡを得るＮＡＳＢＡ(Nucleic  Acid  Sequence-Based  Amplification)法、ＲＮＡとＤＮＡのキメラ構造からなるプライマーを利用し、ＲＮＡからｓｓＤＮＡを得るＳＰＩＡ法、ＤＮＡのループ形成を利用し、一定の温度でＤＮＡをＲＮＡからｄｓＤＮＡを得るＬＡＭＰ(Loop-Mediated  Isothermal  Amplification)法、複数の酵素を組み合わせて一塩基多型（ＳＮＰ(Single  Nucleotide  Polymorphism)）を識別しながらｄｓＤＮＡを得るＳＭＡＰ(SMart   Amplification  Process)法、ＤＮＡとＲＮＡが結合したキメラプライマーを用いてｄｓＤＮＡを得るＩＣＡＮ法(Isothermal  and  Chimeric  primer-initiated  Amplification)法などが挙げられる。
【０１００】
また上述の実施の形態では、リアルタイムＰＣＲ装置１として、いわゆる透過型のものが適用された。しかしながら、これに代えて、例えば、図１との対応部分に同一符号を付した図８に示すように、いわゆる反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用するようにしてもよい。
【０１０１】
このリアルタイムＰＣＲ装置１００における反応基板１１１には、側壁の底面がＲ状に形成された複数のウェルＵＬが形成され、これらウェルＵＬに対応させて受光素子ＬＤＡが一面に配される。各光源素子ＬＳから照射される励起光は、励起光透過基板１５を介して反応基板１１１に形成される対応するウェルＵＬに導光される。各ウェルＵＬでは、励起光によって励起される蛍光物の蛍光はウェルＵＬの壁面で反射し、反応基板１１１の一面に受光素子ＬＤＡに入射する。
【０１０２】
このような反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用した場合であっても、上述の実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０３】
なお、リアルタイムＰＣＲ装置１又は１００の構成要素は図示した場合に限らず、適宜設計変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、遺伝子解析、遺伝子診断又は医薬の創製などのバイオ産業上において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】リアルタイムＰＣＲ装置の概略構造を示す断面図である。
【図２】キャリブレーション期間の説明に供する略線図である。
【図３】発熱基板の構成を示す概略図である。
【図４】発熱回路及び温度センシング回路の構成を示す図である。
【図５】発光基板の構成を示す概略図である。
【図６】発光回路の構成を示す図である。
【図７】調整処理手順を示すフローチャートである。
【図８】他の実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置の概略構造を示す断面図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１，１００……リアルタイムＰＣＲ装置、１１，１１１……反応基板、１２……発熱基板、１３……発熱補助基板、１４……発光基板、１５……励起光透過基板、１６……蛍光透過基板、３０……発熱回路、４０……温度センシング回路、５０，８０……走査駆動部、６０……温度制御部、７０……発光回路、７１……ＬＥＤ、７２……コンデンサ、９０……調整部、Ｔ１０，Ｔ１１……トランジスタ、ＶＤＤ……電源電圧。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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