(57)【要約】【課題】  本発明は、乳酸菌の有する膵リパーゼ阻害作用を有する乳酸菌を提供することを目的とした。また、これらの乳酸菌を用いた食品を提供することを目的とする。【解決手段】  種々の分離源からスクリーニングした乳酸菌について検討を行い、一部の乳酸菌に強い膵リパーゼ阻害活性を有することを見出した。すなわち、リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌を利用する。また、前記乳酸菌としてラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）を利用することができる。さらに膵リパーゼ阻害活性におけるＩＣ５０（酵素の５０％阻害活性に必要な乳酸菌の濃度）が１２００μｇ／ｍＬ以下の乳酸菌を利用するのが好ましい。また、これらの乳酸菌を含有する食品も採用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌。
【請求項２】
前記乳酸菌がラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）である請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
前記乳酸菌の膵リパーゼ阻害活性におけるＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬ以下である請求項１又は２に記載の乳酸菌。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の乳酸菌を含有する食品。
【請求項５】
前記食品が発酵乳又は乳酸菌飲料である請求項４に記載の食品。
【請求項６】
前記食品が粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、又は錠剤等の健康食品である請求項４記載の食品。
【請求項７】
請求項１乃至３のいずれかに記載の乳酸菌を含有する膵リパーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌に関する。更に本発明は、当該乳酸菌を含有する食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は動脈硬化や心筋梗塞の疾患を促進させる生活習慣病として知られている。肥満の主要な原因の一つとして食事由来の過剰な脂肪（主に中性脂肪）が消化・吸収され、体内に蓄積することが挙げられる。この消化・吸収においては生体内の消化酵素である膵リパーゼが関与している。具体的には、摂取された食物に含まれる脂肪は膵臓から分泌される膵リパーゼによって脂肪酸とグリセリンに分解され、分解された脂肪酸は小腸粘膜に吸収される。小腸粘膜に吸収された脂肪酸は再度、中性脂肪に合成された後、血中に放出され、体内に吸収される。そして、吸収された中性脂肪で余剰なものは脂肪組織に蓄えられることで肥満に繋がる。
【０００３】
そのため、膵リパーゼを阻害し、食事由来脂肪の消化・吸収を抑えることで肥満を抑制する方法が開発・検討されている。例えば、放線菌類が産生するリプスタチンやこれから発展したオルリスタットは膵リパーゼを阻害する抗肥満薬として知られている。
また、食品中の特定の成分が膵リパーゼを阻害して抗肥満に有効であることが示されている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
一方、本発明者らは、従来より、乳酸菌の有する機能に着目し種々の研究を行っているが、乳酸菌については膵リパーゼ阻害能を有することはいまだに報告されていない。そこで、膵リパーゼ阻害能を有する乳酸菌を検討すべく、本発明にかかる研究を開始した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】奥田拓道：食品に含まれる機能物質と肥満に関する研究．日本栄養・食糧学会誌，５４（１）：３５−４０，２０００．
【非特許文献２】奥田拓道：生活習慣病と食品の機能性．臨床栄養，９７（７）：８１２−８２３，２０００．
【非特許文献３】榮  昭博，関崎悦子：茶およびにがりが膵リパーゼ活性に及ぼす影響．桐生短期大学起要．１６：１３−１７．２００５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、乳酸菌の有する膵リパーゼ阻害作用を有する乳酸菌を提供することを目的とした。また、これらの乳酸菌を用いた食品を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、糞便や各種発酵食品を分離源として、膵リパーゼ阻害作用を有する乳酸菌について検討を行った。その結果、一部の乳酸菌に強い膵リパーゼ阻害活性を有することを見出し、また、前記乳酸菌を実験動物に投与することにより、血中中性脂肪の上昇を効果的に抑制することを見出し、本発明を完成するに至ったのである。
【０００８】
すなわち、本発明は、
膵リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌、である。
【０００９】
さらに本乳酸菌は、ラクトバチルス ガセリ（Lactobacillus gasseri）であることが好ましい。すなわち、本発明は、
前記乳酸菌がラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）である請求項１に記載の乳酸菌、も意図する。
【００１０】
次に、膵リパーゼ阻害活性におけるＩＣ５０（酵素の５０％阻害活性に必要な乳酸菌の濃度）が１２００μｇ／ｍＬ以下であれば、動物実験より有意に血中中性脂肪の上昇を抑制することを見出した。すなわち、本発明は、
膵リパーゼ阻害活性におけるＩＣ５０（酵素の５０％阻害活性に必要な乳酸菌の濃度）が１２００μｇ／ｍＬ以下である請求項１又は２に記載の乳酸菌、も意図する。
【００１１】
次に、これらの乳酸菌を含有させた食品を用いればこれを喫食する際に、同時に生体内の膵リパーゼ活性を阻害し、脂肪酸への分解を抑制することができる。
すなわち、本発明は、
請求項１乃至３のいずれかに記載の乳酸菌を含有する食品、も意図する。
【００１２】
次に、本食品は乳酸菌飲料であることが好ましい。
すなわち、本発明は、
前記食品が発酵乳又は乳酸菌飲料である請求項４に記載の食品、も意図する。
【００１３】
また、本食品は粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、又は錠剤等の健康食品であってもよい。
すなわち、本発明は、
前記食品が粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、又は錠剤等の健康食品である請求項４記載の食品、も意図する。
【００１４】
さらに、本発明の乳酸菌を用いて膵リパーゼ阻害剤を製造することも可能である。
すなわち、本発明は、
請求項１乃至３のいずれかに記載の乳酸菌を含有する膵リパーゼ阻害剤、も意図する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の乳酸菌を摂取することで生体の酵素膵リパーゼを阻害することできる。これによって脂肪の吸収量を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各乳酸菌を投与した場合のラット血中中性脂肪濃度の比較を示した図である。
【図２】各乳酸菌を投与した場合のラット血中中性脂肪濃度上昇に与える影響を示した図である
【図３】NLB367を投与した場合のラットの時間経過ごとの血中中性脂肪濃度を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
乳酸菌
本発明の乳酸菌は、膵リパーゼ阻害活性を有する。特に、その属は、ラクトバチルス ガセリであることが好ましい。特にラクトバチルス  ガセリに属する乳酸菌のうち、ラクトバチルス  ガセリＮＬＢ３６７株及びＮＬＢ３６５株を選択することができた。尚、本発明にいうＮＬＢ及び ＮＬＢSの記号は日清食品ホールディングス株式会社で独自に各菌株に付与した番号である。
【００１８】
尚、ラクトバチルス  ガセリＮＬＢ３６７株及びＮＬＢ３６５株は、平成２１年５月２１日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにＮＬＢ３６７株がNITE AP-763として、また、ＮＬＢ３６５株がNITE AP-762として寄託されている。
また、これらのラクトバチルス  ガセリＮＬＢ３６７株（NITE AP-763）及びＮＬＢ３６５株（NITE AP-762）の菌株的性質は以下の表１及び２に示す通りである。これらの菌学的性質は、Bergey’s manual of systematic bacteriology Vol.2(1986)に記載の方法に
【００１９】
【表１】
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【００２０】
【表２】
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【００２１】
２．膵リパーゼ阻害活性
本発明にいう膵リパーゼの阻害活性の測定は、アラビアガムを用いてトリオレインをエマルジョン化し、膵リパーゼと反応させ、生成されるオレイン酸量を銅試薬で定量する方法（Tujita T etal, Eur.J.Biochem.,133(1),215-221）を用いた。
【００２２】
具体的には以下の方法で測定する。各菌体をＭＲＳ液体培地で３２℃、１８時間培養した。次いで、培養後の菌体を凍結乾燥処理し、凍結乾燥菌体を得た。本凍結乾燥菌体に０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を加えて１ｇ/ｍＬの一定濃度とした被験資料１００μＬに、基質液１００μＬ（８．９ｍｇ／ｍｌ  トレオレイン／アラビアガム（終濃度０．５％））及びブタ膵臓リパーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）５０μＬを添加・混合した後、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、クロロホルム：ｎ−ヘプタン（１：１）／２％（ｖ／ｖ）メタノールを３ｍＬ添加・混合し、遠心分離した後、水層を除去した。これに銅試薬（０．１２１ｇ／mＬ  Ｃｕ（ＮＯ３）２、１００ｍｏｌ  トリエタノールアミン、６０ｍｍｏｌ  ＮａＯＨ、０．３３ｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ）を１ｍＬ添加・混合し、遠心分離した後、上層である有機層０．５ｍＬに対して発色試薬０．５ｍＬ（０．１％バソクプロイン、０．０５％  ＢＨＡ／クロロホルム）を添加し、吸光度(４８０ｎｍ)を測定した。オレイン酸で作製した検量線から、遊離した脂肪酸濃度を求めた。本方法において、膵リパーゼ阻害活性は以下の式より求めた。
【００２３】
膵リパーゼ阻害活性（％）＝  （１−（（Ｔ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００
Ｔ：膵リパーゼ添加・被験試料添加区の遊離脂肪酸濃度
Ｃ：膵リパーゼ添加・被験試料無添加区の遊離脂肪酸濃度
Ｂ：膵リパーゼ無添加・被験試料無添加区の遊離脂肪酸濃度
【００２４】
本発明の乳酸菌は、上記膵リパーゼ阻害活性が３０％以上であることが好ましい。また、４０％以上であればさらに好ましい。
【００２５】
次に、これらの測定方法を用いたＩＣ５０の測定は以下のように行った。上述の測定方法においてそれぞれの菌株に対して、３００、１，０００、３，０００、１０，０００ｍｇ／mＬの濃度に調製した乳酸菌液を用いて各濃度における膵リパーゼ阻害活性を求め、最小二乗法により上述の試験系における膵リパーゼの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００２６】
尚、上記の測定条件でその求めたＩＣ５０が１２００μｇ/mＬ以下であることが好ましい。また、１１００μｇ/mＬ以下であればさらに好ましい。また、８００μｇ/mＬ以下であればさらに好ましい。
【００２７】
３．食品
本発明の乳酸菌は食品に含有せしめて使用することができる。本発明にいう食品とは飲料も含むものとするが、例えば、発酵乳及び乳酸菌飲料が考えられる。必要な菌数については特に限定されないが、発酵乳であれば乳中でよく増殖する乳酸菌では１０８〜９ｃｆｕ／ｍＬまで増殖するものもあり、乳中で本程度まで増殖するものであれば、１００ｍＬ程度を食後に摂取すればよい。
【００２８】
また、発酵乳及び乳酸菌飲料以外にも、バター等の乳製品；マヨネーズ等の卵加工品；バターケーキ等の菓子パン類等にも利用することができる。また、上記の他、本発明の食品は、前記乳酸菌と共に、必要に応じて適当な担体及び添加剤を添加して製剤化された形態（例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等）であってもよい。
【００２９】
通常、脂肪含量が高い食品については、その食品の摂取によって血中中性脂肪含量が上昇する傾向がみられるが、前記乳酸菌を含むことによって、血中中性脂肪の上昇を抑制することができる。
尚、本発明の食品は、一般の食品以外に、特定保健用食品、栄養補助食品等としても有用である。
【００３０】
４．膵リパーゼ阻害剤
前記乳酸菌は、血中中性脂肪低減のために膵リパーゼ阻害剤の有効成分として製剤化されて使用することもできる。当該膵リパーゼ阻害剤は、血中中性脂肪低減に繋がり、抗肥満のための治療剤としても有用である。本発明の膵リパーゼ阻害剤は、前記乳酸菌とともに必要に応じて製剤製造上許容される担体や添加剤を適宜配合して調製される。添加される担体や添加剤の種類及び配合割合については、製剤の形態や投与形態に応じて適宜選択される。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の乳酸菌は膵リパーゼを阻害する活性を有しており、これによって小腸内での脂質の消化・吸収を抑制することができ、過剰な脂質の摂取を抑制し、血中中性脂肪を抑制して抗肥満に繋げることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞乳酸菌株の膵リパーゼ阻害活性の測定
日清食品ホールディングス株式会社が保有する、発酵食品、ヒト糞便等の様々な分離源から分離した乳酸菌及び市販の乳酸菌を用いて膵リパーゼ阻害活性を測定し、スクリーニングを行った。測定方法は以下に示す。被験菌株をＭＲＳ液体培地で３２℃、１８時間培養した。
【００３３】
次いで、培養後の菌体を滅菌純水にて洗浄後、凍結乾燥処理し、凍結乾燥菌体を得た。本凍結乾燥菌体に０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を加えて１ｇ／ｍＬの一定濃度とした被験試料１００μＬに、基質液１００μＬ（８．９ｍｇ／ｍｌ  トレオレイン／アラビアガム（終濃度０．５％））及びブタ膵臓リパーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）５０μＬを添加・混合した後、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、クロロホルム：ｎ−ヘプタン（１：１）／２％（ｖ／ｖ）メタノールを３ｍＬ添加・混合し、遠心分離した後、水層を除去した。これに銅試薬（０．１２１ｇ／mＬ  Ｃｕ（ＮＯ３）２、１００ｍｏｌ  トリエタノールアミン、６０ｍｍｏｌ  ＮａＯＨ、０．３３ｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ）を１ｍＬ添加・混合し、遠心分離した後、上層である有機層０．５ｍＬに対して発色試薬０．５ｍＬ（０．１％バソクプロイン、０．０５％  ＢＨＡ／クロロホルム）を添加し、吸光度(４８０ｎｍ)を測定した。オレイン酸で作製した検量線から、遊離した脂肪酸濃度を求めた。本方法において、膵リパーゼ阻害活性は以下の式より求めた。
【００３４】
膵リパーゼ阻害活性（％）＝  （１−（（Ｔ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００
Ｔ：膵リパーゼ添加・被験試料添加区の遊離脂肪酸濃度
Ｃ：膵リパーゼ添加・被験試料無添加区の遊離脂肪酸濃度
Ｂ：膵リパーゼ無添加・被験試料無添加区の遊離脂肪酸濃度
阻害活性の高かった菌株に及び他の一般的な菌株についての抜粋を表３に示す。
【００３５】
【表３】
2010284123.tif 000005
【００３６】
ほとんどの乳酸菌においては、高い膵リパーゼ阻害活性はみられなかったが、一部の乳酸菌のみに高い膵リパーゼ阻害活性が見られた。膵リパーゼ阻害活性を有する特異的な菌株を見つけることに成功した。尚、ＮＬＢ３６７、３６５、３５５はいずれも、ヒト糞より単離したものである。
【００３７】
さらに膵リパーゼ阻害活性の高かった各乳酸菌に対して、上述の膵リパーゼ阻害活性測定において、被験菌体として本凍結乾燥菌体に０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を加えて３００、１，０００、３，０００、１０，０００ｍｇ／ｍＬとした乳酸菌液を調製して測定し、最小二乗法により上述の試験系におけるブタ膵臓リパーゼの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。尚、比較対象としてはシグマ社製のオリルスタットを用いた。結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
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＜実施例２＞膵リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌の脂肪負荷ラットの血中中性脂肪上昇抑制効果
【００３９】
ＳＤ系雄ラット（使用時週令９〜、日本クレアより購入）を１週間検疫、馴化飼育した後、一晩絶食し、脂肪負荷試験を行った。脂肪懸濁液としてイントラリポス（大塚製薬工場）を用い、７ｍＬ／kg（ラット重量）となるように投与した。また、これと同時に投与した乳酸菌は、各菌株をＭＲＳ培地で培養し、集菌・洗浄後、凍結乾燥したものを用い、１ｇ／ｋｇ（ラット重量）となるように投与した。また、対照群には溶媒の水を投与し、比較対照にオルリスタット  ５ｍｇ／ｋｇ投与群を用意した。投与前、投与後２．５時間に尾静脈より採血、遠心分離により血漿を調製し、中性脂肪濃度をラボアッセイ  トリグリセライドキット（和光純薬）を用いて測定した。脂肪負荷２．５時間後の各乳酸菌株投与群の血中中性脂肪濃度を比較結果を図１に示す。
【００４０】
対照群、オルリスタット群、ＮＬＢ３６７群、ＮＬＢ３６５群、ＮＬＢ３５５群、ＮＬＢＳ０５５群、ＮＬＢ３５７群、ＮＬＢ３６４群、ＮＬＢ３４９群、ＮＬＢ３５０群、ＮＬＢＳ０１２群、ＮＬＢＳ００１群についての結果を図１に示す。
【００４１】
図１に示したように膵リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌株の中でも特に強い膵リパーゼ阻害活性（ＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬ以下）を示したＮＬＢ３６７（ＩＣ５０＝７４５μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３６５（ＩＣ５０＝７８５μｇ／ｍＬ）及びＮＬＢ３５５（ＩＣ５０＝１１０６μｇ／ｍＬ）は有効な血中中性脂肪濃度の上昇抑制を示した。一方、膵リパーゼ阻害活性を示したが、ＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬを超えていたＮＬＢＳ０５５（ＩＣ５０＝１２０１μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３５７群（ＩＣ５０＝１２２４μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３６４群（ＩＣ５０＝１２２７μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３４９群（ＩＣ５０＝１３１１μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３５０群（ＩＣ５０＝１３８５μｇ／ｍＬ）については対照群と比較して血中中性脂肪の低下を示さなかった。ＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬ以下の乳酸菌を用いた場合に血中中性脂肪濃度の低下効果がみられた。
さらに、血中中性脂肪濃度上昇に与える影響について調べた。結果を図２に示す。
【００４２】
図２に示したように、図１の場合と同様に、膵リパーゼ阻害活性を有する乳酸菌株の中でも特に強い膵リパーゼ阻害活性（ＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬ以下）を示したＮＬＢ３６７（ＩＣ５０＝７４５μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３６５（ＩＣ５０＝７８５μｇ／ｍＬ）及びＮＬＢ３５５（ＩＣ５０＝１１０６μｇ／ｍＬ）は有効な血中中性脂肪濃度の上昇抑制を示した。一方、膵リパーゼ阻害活性を示したが、ＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬを超えていたＮＬＢＳ０５５（ＩＣ５０＝１２０１μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３５７群（ＩＣ５０＝１２２４μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３６４群（ＩＣ５０＝１２２７μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３４９群（ＩＣ５０＝１３１１μｇ／ｍＬ）、ＮＬＢ３５０群（ＩＣ５０＝１３８５μｇ／ｍＬ）については対照群と比較して血中中性脂肪濃度の上昇抑制効果を示さなかった。ＩＣ５０が１２００μｇ／ｍＬ以下の乳酸菌を用いた場合に血中中性脂肪濃度の上昇抑制の効果がみられた。
【００４３】
＜実施例３＞ＮＬＢ３６７の血中中性脂肪上昇抑制効果
上述の菌株の中で特に活性の高かったＮＬＢ３６７株について時間ごとの血中中性脂肪濃度を測定した。結果を図３に示す。図３に示したようにＮＬＢ３６７を投与した場合、投与量依存的に血中中性脂肪の上昇が抑制された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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