(57)【要約】      （修正有）【課題】神経系におけるMeis2遺伝子の発現を増強するエンハンサーの提供。【解決手段】以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなるエンハンサー。(a)ヒト由来の特定の塩基配列からなるDNA(b)ヒト由来の特定の塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA。(c)ヒト由来の特定の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなるエンハンサー。
(a)  配列番号１〜８のいずれかに表される塩基配列からなるDNA
(b)  配列番号１〜８のいずれかに表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
(c)  配列番号１〜８のいずれかに表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
【請求項２】
以下の(d)、(e)又は(f)のDNAからなる請求項１記載のエンハンサー。
(d)  配列番号３に表される塩基配列からなるDNA
(e)  配列番号３に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
(f)  配列番号３に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前脳におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
【請求項３】
以下の(g)、(h)又は(i)のDNAからなる請求項１記載のエンハンサー。
(g)  配列番号８に表される塩基配列からなるDNA
(h)  配列番号８に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
(i)  配列番号８に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前脳におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のエンハンサーを含むベクター。
【請求項５】
さらに、プロモーター及びコード領域を含む遺伝子を含む請求項４記載のベクター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項７】
請求項４又は５に記載のベクターを含むトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項２又は３に記載のエンハンサーからなる神経幹細胞検出用マーカー。
【請求項９】
請求項２又は３に記載のエンハンサーの、神経幹細胞検出用マーカーとしての使用。
【請求項１０】
請求項２又は３に記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を検定することを含む、請求項２又は３に記載のエンハンサーをマーカーとして用い、神経幹細胞を同定する方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のエンハンサーの制御下で、目的の遺伝子の発現効率を向上させることを含む遺伝子発現の調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経系におけるMeis2遺伝子の発現を増強するエンハンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物Meis2遺伝子（myeloid ecotropic viral insertion 2）はショウジョウバエhomothorax(hth)の相同遺伝子である（非特許文献１を参照）。Meis/hthはHox遺伝子群のコファクターであり、TALE(three amino acid loop extention)ホメオボックスを有する転写制御因子である。脊椎動物においてMeis2の遺伝子コーディング領域はMeis1、ショウジョウバエにおけるhthと同様ゲノム上で巨大な染色体領域を占有している（図１）。Meis2の場合、そのコーディング領域は200kb以上にも及ぶ。また、そのマウス11日胚における発現はHox遺伝子のコファクターとして期待される、脊髄、体節等の領域に見出されると同時に、発生時にHox遺伝子群の機能支配の基には存在していない、前脳、中脳での発現が観察される（図２）（非特許文献２及び３を参照）。特に前脳においては線条体、皮質内層等の神経幹細胞の多く存在する部位での発現が大人においても維持される（非特許文献４を参照）。Meis1のマウス11日胚での発現はMeis2に相似しており、前脳においても同様な発現が見出されるが、大人のマウスにおいての発現はMeis2が有意に存在していると考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】Moens, C. B. et al. (2006). Dev. Biol. 291, 193-206.
【非特許文献２】Oulad-Abdelghani et al. (1997). Dev. Dyn. 210, 173-183.
【非特許文献３】Cecconi, F. et al., (1997). Dev. Dyn. 210, 184-190.
【非特許文献４】Pennartz, S. et al., (2004). Mol. Cell. Neurosci. 25, 692-706.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、神経系におけるMeis2遺伝子の発現を増強するエンハンサーの提供を目的とする。本発明は、また該エンハンサーを含むベクター、細胞、トランスジェニック動物の提供を目的とする。本発明は、さらに該エンハンサーからなる神経幹細胞のマーカーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
神経幹細胞において特異的に発現をもたらすエンハンサーは幹細胞治療等の場面において、神経幹細胞の同定、神経幹細胞の作製の際に大変有用であると考えられる。そこで、Meis2において、特に大脳線条体における発現をもたらすエンハンサーの探索を行うため、Meis2遺伝子領域のエンハンサー解析を行った。
【０００６】
エンハンサーの位置の策定を行うために幾つかの方法が有るが、今回は進化的な保存性を利用したコンピューター解析を用いたエンハンサー候補領域の決定を行った。生物の進化において、機能上重要なDNA領域はその塩基配列がより保存されていると考えられている。すなわち、遺伝子のエクソンを形成するDNA配列以外においても、遺伝子の発現調節等に重要なDNA領域はより保存性が高いと考えられている。遺伝子のタンパク質のコーディング領域以外の配列において、DNA配列の保存性がより高い部分にはエンハンサーが含まれている可能性が高いと考えられている。そこで、幾つかの脊椎動物のゲノムから、Meis2コーディング領域周辺を取り出し、ヒトMeis2周辺領域との相同性を検討することで、進化上保存されているDNA領域を決定し、そのDNA領域のエンハンサー活性をトランスジェニックマウスで検討するという方法を採った。
【０００７】
ヒト(Homo sapiens)ゲノムにおけるMeis2周辺領域約500kbに対するDNAを指標にして、その相同領域を幾つかの脊椎動物のゲノムから探索し、ヒトのゲノムに対する保存性を基準にしたDNAの保存性のマップをGenomeVISTA（http://genome.ucsc.edu/）のサイトを用いて作製した。ここで用いたゲノムは、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、フグ(Fugu rubripes)、カエル(Xenopus tropicalis)、ニワトリ(Gallus gallus)、マウス(Mus musculus)の5種である（図３）。このゲノム間の比較により、8個の約2kbにわたる相同領域をマウスゲノムから単離した。これらの相同領域をMeis2の5’側から順番にa、b、c、d、e、f、g、hと名付けた（図３、図５−１及び図５−２）。
【０００８】
単離した相同領域はエンハンサーの候補であり、そのエンハンサー活性を検討するためにトランスジェニックマウス技術を用い、解析を行った。プロモーターはhsp68プロモーターを用い、インディケーター遺伝子には大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼの遺伝子を用いた（図４）（Sasaki, H. et al. (1997). Development 124, 1313-1322）。マウス11日胚における発現ではbおよびeには特異的な発現を見出すことができなかった。しかしながら、aは運動神経、感覚神経及びdorsal root gangliaでの発現をもたらし、以下、cは前脳、dは中脳、三叉神経、fは脊髄、gは体節、hは前脳での発現を主としてもたらすと考えられた（図４、図５−１及び図５−２）。cとhにおいて見られる前脳の発現は非常に似ており、区別はつかない。両方共に前脳での発現を調節するものであることが予測される。これらの発現の総和はほぼin situで見出すことのできるMeis2の発現領域を再現していると考えられた。
【０００９】
上記検討の結果、新たにMeis2遺伝子のエンハンサーa〜ｈを同定した。
【００１０】
即ち、本発明は以下のとおりである。
[１]  以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなるエンハンサー。
(a)  配列番号１〜８のいずれかに表される塩基配列からなるDNA
(b)  配列番号１〜８のいずれかに表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
(c)  配列番号１〜８のいずれかに表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
[２]  以下の(d)、(e)又は(f)のDNAからなる[１]のエンハンサー。
(d)  配列番号３に表される塩基配列からなるDNA
(e)  配列番号３に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
(f)  配列番号３に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前脳におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
[３]  以下の(g)、(h)又は(i)のDNAからなる[１]のエンハンサー。
(g)  配列番号８に表される塩基配列からなるDNA
(h)  配列番号８に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
(i)  配列番号８に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前脳におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
[４]  [１]〜[３]のいずれかのエンハンサーを含むベクター。
[５]  さらに、プロモーター及びコード領域を含む遺伝子を含む[４]のベクター。
[６]  [４]又は[５]のベクターを含む細胞。
[７]  [４]又は[５]のベクターを含むトランスジェニック動物。
[８]  [２]又は[３]のエンハンサーからなる神経幹細胞検出用マーカー。
[９]  [２]又は[３]のエンハンサーの、神経幹細胞検出用マーカーとしての使用。
[１０]  [２]又は[３]のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を検定することを含む、[２]又は[３]のエンハンサーをマーカーとして用い、神経幹細胞を同定する方法。
[１１]  [１]〜[３]のいずれかのエンハンサーの制御下で、目的の遺伝子の発現効率を向上させることを含む遺伝子発現の調節方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、神経系細胞において遺伝子の発現効率を増強させる新規なエンハンサーが提供される。さらに、このうち配列番号３又は８の塩基配列からなるエンハンサーは神経幹細胞のマーカーとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のエンハンサーは、配列番号１〜８に表される塩基配列からなる。該エンハンサーは、ヒトMeis2遺伝子のエンハンサーである。配列番号１〜８に表される塩基配列からなるエンハンサーをそれぞれ、エンハンサーa〜エンハンサーｈと呼ぶ。それぞれのエンハンサーの染色体上のMeis2遺伝子領域における位置を図３に示す。本発明のエンハンサーは、神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める。
【００１４】
本発明のエンハンサーa〜ｈは、それぞれ特定の部位における発現効率を高める。エンハンサーaは主に運動神経、感覚神経及びdorsal root gangliaにおいて発現効率を高め、エンハンサーcは主に前脳、特に前脳の線条体、エンハンサーdは主に中脳及び三叉神経、エンハンサーfは主に脊髄、エンハンサーgは主に体節、エンハンサーhは主に前脳、特に前脳の線条体での発現効率を高める。
【００１５】
本発明のエンハンサーは、配列番号１〜８に表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなり、神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーを包含する。
【００１６】
このようなエンハンサーとして、配列番号１〜８に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列からなり、神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーが挙げられる。ここで、１以上の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列とは、例えば、１〜３０塩基、好ましくは１〜２０塩基、さらに好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１又は数個、さらに好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１若しくは２個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を意味する。このような、１以上の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列は、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作製することが可能である。
【００１７】
本発明のエンハンサーは、さらに配列番号１〜８に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなり、神経系におけるMeis2遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーを包含する。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るとは、ストリンジェントな条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことを意味する。例えば、配列同一性が高い塩基配列同士、すなわち同一性が60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い場合はハイブリダイズしないことを意味する。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％  SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％  SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％  SDS、65℃」程度の条件である。前記のSSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記又はは他の要素（例えば、DNA濃度、DNAの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することができる。ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法に従って行なうことができる。
【００１８】
本発明のエンハンサーは、さらに配列番号１〜８に表される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の同一性を有している塩基配列からなるエンハンサーを包含する。
【００１９】
本発明のエンハンサーは、それぞれのエンハンサーが特異的に発現する組織又は細胞のマーカーとして用いることができる。特に、エンハンサーc又はhは線条体をはじめとした大脳（前脳）部での発現を供与する。神経幹細胞は、大脳線条体の側脳室に上衣細胞として存在し、その後線条体由来の細胞が嗅球等に移動し、ニューロンやグリア細胞へ分化する。この分化能と自己複製能を有する幹細胞を神経幹細胞という。この線条体での発現をエンハンサーc又はhが担っているため、エンハンサーc又はhは神経幹細胞のマーカーとして用いることができる。本発明において神経幹細胞には、ニューロンやグリア細胞に至るまでの神経前駆細胞、幼若神経細胞、グリア前駆細胞をも含む。エンハンサーc又はhを神経幹細胞のマーカーとして用いることにより、神経幹細胞を検出することができ、さらに神経幹細胞を単離することができる。
【００２０】
例えば、本発明のエンハンサーc又はh、プロモーター並びにレポーター遺伝子（インディケーター遺伝子）を含むベクター等の核酸構築物を細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を検定し、レポーター遺伝子の発現が増強されている場合、該細胞が神経幹細胞であると判断することができる。また、ES細胞等から神経幹細胞を分化誘導する場合において、本エンハンサー支配下で起動するGFP等のマーカーをES細胞に導入し、その発現開始をモニターすることで、神経幹細胞を細胞培養条件下で単離することも可能になる。具体的には、エンハンサーc又はhをhsp68あるいはtk等のエンハンサーを持たないプロモーターと組み合わせ、GFP等の蛍光タンパク質をその支配下で発現可能な人工的な遺伝子を作製する。その人工遺伝子を細胞に導入し、これをマーカーとする。また、神経誘導の際の分化方向性を決定するための機能因子(Pax6、Islet1等)をこの人工プロモーターの支配下で発現させることで、神経幹細胞から神経への分化に方向性を付与することも可能である。
【００２１】
また、エンハンサーaは、運動神経で特異的に機能するので、脊髄損傷時の神経細胞の分化のマーカーとして用いることができ、例えば、脊髄損傷後の治療効果の判定に用いることができる。
【００２２】
本発明は、さらに上記エンハンサーa〜hのそれぞれを含むベクターを包含する。ベクターとしては、例えば、pBluscript、adenovirus vector、lentivirus vector等を用いることができる。該ベクターは、さらにプロモーター、コード領域を含む外来遺伝子を有する。
【００２３】
用いるプロモーターは限定されないが、例えばhsp68、tk、SV0、SV242(SV40由来のエンハンサーを持たないプロモーター)等を用いることができる。コード領域を含む外来遺伝子は、Meis2遺伝子の位置に例えば相同組換えにより導入してもよい。
【００２４】
外来遺伝子は、本発明のエンハンサーを利用して発現を増大させようとする遺伝子を用いることができる。該外来遺伝子は、エンハンサー及びプロモーターの下流に連結すればよい。また、レポーター遺伝子を用いてもよい。レポーター遺伝子としては、β-ガラクトシダーゼ（lacZ)遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、GFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子等を用いることができる。
【００２５】
さらに、本発明は前記ベクターを含む細胞、トランスジェニック動物をも包含する。細胞へのベクターの導入は、エレクトロポレーション等公知の方法で行うことができる。また、トランスジェニック動物の作製も公知の方法で行うことができる。
【００２６】
本発明は、上記のエンハンサーa〜hのいずれかのエンハンサーの制御下で、目的の遺伝子の発現効率を向上させることを含む遺伝子発現の調節の方法を包含する。
【実施例】
【００２７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２８】
ゲノム領域の比較
GenomeVISTAのサイトhttp://genome.ucsc.edu/においてヒトMeis2の配列を入力し、ヒトMeis2遺伝子領域を呼び出した。サイトのズーム機能を利用し、比較配列の範囲を決定した。比較対象種をゼブラフィッシュ(Danio rerio)、フグ(Fugu rubripes)、カエル(Xenopus tropicalis)、ニワトリ(Gallus gallus)、マウス(Mus musculus)に設定し、相同性の高い領域を決定した。図３にMeis2周辺ゲノム領域の保存性を例示する。図３においては、マウス、ニワトリ、フグのゲノムを例にとり、ヒトMeis2周辺ゲノム領域約1000kbとの保存性の比較を行い、aからfまでの保存性の高い領域を同定し、トランスジェニック解析のために、その染色体領域の配列をPCRでマウスDNAから増幅し、クローニングした。
【００２９】
エンハンサー候補配列aのクローニング
プライマー
EnA-f: CAGCTGCATCTGTAAGCCATTGGG（配列番号９）
EnA-r: GTAAGGGAGTTTCGGGCAAGGGTC（配列番号１０）
を用い、マウスC57BL6/Jゲノムを基質としてPCRにてクローニングした。
【００３０】
エンハンサー候補配列bのクローニング
プライマー
EnB-f: CTATAAGCATCAGGGTAAGGAGAGGGTCAGCTGG（配列番号１１）
EnB-r: CTCCCAGGTTGGGTAGTGGCAGTACTGTGATGAG（配列番号１２）
を用い、マウスC57BL6/Jゲノムを基質としてPCRにて増幅し、その増幅DNA断片より2.8 kbのHindIII断片をクローニングした。
【００３１】
エンハンサー候補配列cのクローニング
３つのDNA断片に分割してPCRにてC57BL6/Jを基質として増幅し、クローニングを行った。
最初の断片は、プライマー
EnC-f1: ACTCCACGCCTGTGTGCTTAATAG（配列番号１３）
EnC-r1: CTGTAGTGCAGGAGAGGAGAAATG（配列番号１４）
の組合せで、
２番目は、プライマー
EnC-f2: GTGCCGCGAGGATTTCAGTCTATG（配列番号１５）
EnC-r2: GATGAGCCCGAGGAAGAAAATCTGG（配列番号１６）
の組合せで、
３番目は、プライマー
EnC-f3: TGGGCTACTGTAACACACCTCTTG（配列番号１７）
EnC-r3: CCTAGGCTCTTACCTTTAACTGCC（配列番号１８）
の組み合わせで増幅した。断片1と断片2はEcoRIサイトでつなぎ、断片２と断片３はAseIサイトで接続し、クローニングを行った。
【００３２】
エンハンサー候補配列dのクローニング
プライマー
EnD-f: CCTCCAGACAACAACAGTGGTAGCAGCCTAAGGG（配列番号１９）
EnD-r: CCATCTCTGTAGATCTGTCCACTCTGCAGCTGCC（配列番号２０）
を用い、C57BL6/Jゲノムから増幅した断片から2.4 kb SalI-EcoRV断片をクローニングした。
【００３３】
エンハンサー候補配列eのクローニング
プライマー
EnE-f: CATGTAGCCTGATAGGGCATCAGG（配列番号２１）
EnE-r: GGATCCGAACTTCTGTACGTTCCG（配列番号２２）
を用い、マウスC57BL6/Jゲノムを基質としてPCRにてクローニングした。
【００３４】
エンハンサー候補配列fのクローニング
2つのDNA断片に分割してPCRにてC57BL6/Jを基質として増幅し、クローニングを行った。
最初の断片は、プライマー
EnF-f1: GAGTGTGTGTACGCACGCAATG（配列番号２３）
EnF-r1: GAGCTCCTACAAGGCTTACTGTGG（配列番号２４）
の組合せで、
断片２は、プライマー
EnF-f2: ACCTTGTAGGAGGGACAGAGTGAC（配列番号２５）
EnF-r2: ACAGAGGAGGCTGACTGGAGAGAG（配列番号２６）
の組み合わせで増幅した。断片１と断片２をNsiIサイトでつなぎ、クローニングを行った。
【００３５】
エンハンサー候補配列Gのクローニング
２つのDNA断片に分割してPCRにてC57BL6/Jを基質として増幅し、クローニングを行った。
最初の断片は、プライマー
EnG-f1: GCTGTTATTCCATGTCCCACTCAG（配列番号２７）
EnG-r1: TGCCCTCATTCACAGCTACTTCTC（配列番号２８）
の組合せで、
断片２は、プライマー
EnG-f2: CTTGACCTCCACCAACGTCTCGAA（配列番号２９）
EnG-r2: TGGCACGCTACTGTTTCACGGTTC（配列番号３０）
の組み合わせで増幅した。断片１と断片２をHindIIIサイトでつなぎ、クローニングを行った。
【００３６】
エンハンサー候補配列Hのクローニング。
２つのDNA断片に分割してPCRにてC57BL6/Jを基質として増幅し、クローニングを行った。
最初の断片は、プライマー
EnH-f1: CTGTGAAGTGCATGGTGAGTACAGG（配列番号３１）
EnH-r1: AGGATGCAGCAGATGCTGCAGCTAG（配列番号３２）
の組合せで、
断片2は、プライマー
EnH-f2: TAGCTGCAGCATCTGCTGCATCCTG（配列番号３３）
EnH-r2: GTCCACAACTCCACAGTTCTCATGC（配列番号３４）
の組み合わせで増幅した。断片1と断片2をPstIサイトでつなぎ、クローニングを行った。
【００３７】
トランスジェニックマウス
８種のクローニングした配列をhsp68-lacZマーカープラスミドにそれぞれつなぎ、８種のトランスジーンを作製した（Sasaki, H. et al. (1997). Development 124, 1313-1322）。トランスジーンの作製に用いたベクターの構造を図４に示す。Hsp68のコアプロモーターを大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼにつなぎ、hsp68プロモーターの上流に検討すべきDNAの試験断片を挿入し、β-ガラクトシダーゼの活性でプロモーターに対する誘導活性を検討した。具体的には、これらのトランスジーンをマウス受精卵の雄性前核に注入した後、一晩HTF培地あるいはM16培地にて培養した。２細胞期になったマウス胚を偽妊娠雌卵管に移植し、移植後11日目にマウス胚を摘出し、4％PFAで固定し、X-galを用いて、β-ガラクトシダーゼ(lacZ)の活性染色を行った。図５-１にエンハンサーa〜hによる発現の代表的な例を示し、図５-２にエンハンサーa〜hによる発現パターンと回収された胎児の数を示す。例えば、エンハンサーaの場合、１２体の胎児においてトランスジーンが確認され、そのうち５体においてβ-ガラクトシダーゼの発現パターンが観察され、共通に見出されるパターンを再現パターンとして決定した。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster) homothorax遺伝子並びにマウス(Mus musculus) Meis1及びMeis2の染色体構造の比較を示す図である。これらの遺伝子はショウジョウバエにおいてもマウスにおいても100kbを超える大きな染色体領域を占有している。
【図２】マウスMeis2遺伝子の11日胚における発現を示す図である。マウス11日胚において、Meis2遺伝子は前脳腹側の一部、体節、脊髄等に発現が見られる。
【図３】Meis2ゲノム領域の保存性を示す図である。
【図４】トランスジーンに用いるベクターの構造を示す図である。
【図５−１】エンハンサー配列のエンハンサー機能解析の結果を示す図であり、エンハンサーa〜hによる発現の代表的な例を示す図である。
【図５−２】エンハンサー配列のエンハンサー機能解析の結果を示す図であり、エンハンサーa〜hによる発現パターンと回収された胎児の数を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号９〜３４  プライマー
【図１】
2010022241.tif 000002
【図２】
2010022241.tif 000003
【図３】
2010022241.tif 000004
【図４】
2010022241.tif 000005
【図５−１】
2010022241.tif 000006
【図５−２】
2010022241.tif 000007
【配列表】
2010022241000001.app