(57)【要約】【課題】測定対象物の周囲に存在するバッファー等の液中において生じる背景光を、測定対象物に影響を与えることなく、また容器が小径であっても効果的に低減し、さらにバッファーの置換を不要とする、背景光低減部材および光測定方法を提供する。【解決手段】背景光低減部材１は、有底の容器４０内のバッファーＢ中に配置された測定対象物Ｓが蛍光性または発光性の物質を取り込むことで発する光を容器４０の底部を介して測定する際に、測定対象物Ｓの周囲のバッファーＢにおいて生じる背景光を低減する為に用いられる部材であって、容器４０内に挿入されてバッファーＢと接触するとともに、該挿入方向に沿った所定軸線Ｃを囲むように配置された疎水性の接触部１０を有し、容器４０内のバッファーＢと接触部１０との上記接触に因って背景光を低減する。【選択図】図２
2010190796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有底容器内の液中に配置された測定対象物が蛍光性または発光性の物質を取り込むことで発する光を前記有底容器の底部を介して測定する際に、前記測定対象物の周囲の液中において生じる背景光を低減する為に用いられる部材であって、
前記有底容器内に挿入されて前記有底容器内の液と接触するとともに、該挿入方向に沿った所定軸線を囲むように配置された疎水性の接触部を有し、
前記有底容器内の液と前記接触部との上記接触に因って前記背景光を低減することを特徴とする、背景光低減部材。
【請求項２】
前記有底容器としての複数のウェルを有するマイクロプレートを使用する際に用いられ、
前記複数のウェルに対応する複数の前記接触部を有することを特徴とする、請求項１に記載の背景光低減部材。
【請求項３】
前記所定軸線と交差する平面内での前記接触部の形状が、前記有底容器の内側面に沿った形状であることを特徴とする、請求項１または２に記載の背景光低減部材。
【請求項４】
前記接触部の形状が、前記所定軸線の方向に延びる筒状であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の背景光低減部材。
【請求項５】
前記接触部が、相互に間隔をあけて前記所定軸線の周囲に配列された複数の疎水性部分から成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の背景光低減部材。
【請求項６】
有底容器内の液中に配置された測定対象物が蛍光性または発光性の物質を取り込むことで発する光を前記有底容器の底部を介して測定する方法であって、
所定軸線を囲むように配置された疎水性の接触部を有する部材の前記接触部を前記所定軸線に沿って前記有底容器内に挿入して前記有底容器内の液と接触させることに因って、前記測定対象物の周囲の液中において生じる背景光を低減することを特徴とする、光測定方法。
【請求項７】
前記有底容器としての複数のウェルを有するマイクロプレートを使用すると共に、
前記部材が、前記複数のウェルに対応する複数の前記接触部を有することを特徴とする、請求項６に記載の光測定方法。
【請求項８】
前記所定軸線と交差する平面内での前記接触部の形状が、前記有底容器の内側面に沿った形状であることを特徴とする、請求項６または７に記載の光測定方法。
【請求項９】
前記接触部の形状が、前記所定軸線の方向に延びる筒状であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の光測定方法。
【請求項１０】
前記接触部が、相互に間隔をあけて前記所定軸線の周囲に配列された複数の疎水性部分から成ることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、背景光低減部材および光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、創薬における化合物ライブラリーのスクリーニングのため、蛍光測定が用いられる。このような蛍光測定では、まずシャーレ、バイエル瓶等の透明な有底容器の底部に、細胞等の測定対象物を培養して配置する。そして、蛍光指示薬を含むバッファー（緩衝液、外液）を追加注入する。このままでは、細胞等に吸収されなかった蛍光指示薬の蛍光が背景光となり、容器底部において測定対象物からの蛍光を識別して測定することが困難となるため、このような過剰の蛍光指示薬を含むバッファーを吸引除去し、蛍光指示薬を含まないバッファーを追加することを繰り返す洗浄（バッファー置換、ウォッシュアウト）が行われる。その後、スクリーニングを行いたい化合物（試薬）等を投入し、容器底部を介して測定対象物の蛍光状態を測定することにより、スクリーニングを行うことができる。
【０００３】
上記のような蛍光測定において、スクリーニングを行いたい化合物には自家蛍光を持つものが多い。自家蛍光を有する化合物を分注して試験する場合、計測される蛍光値が細胞等の測定対象物に由来するものなのか、バッファー中の化合物の自家蛍光（すなわち背景光）に由来するものなのか判断することが困難である。その結果、偽陽性が増大するという問題が生じる。特に、高スループットな化合物のスクリーニングにおいては、検出精度低下、さらにはスループット低下の原因となる。
【０００４】
このような化合物の自家蛍光の問題を解決するため、例えば、黒色色素あるいは様々な種類の色素をバッファー中に混ぜて化合物の自家蛍光による影響を低減する方法が実用化されている（例えば、特許文献１の図２参照）。あるいは、ポリマーラテックスビーズ、無機粒子等をバッファー中に添加し、測定対象物上に供して積層させて光学的な分離層を形成することにより、測定対象物を上から覆い、それにより分離層より上のバッファー由来の背景蛍光を遮光する方法も提案されている（例えば、特許文献１の図６参照）。
【０００５】
また、特許文献２には、細胞等の測定対象物が収容された透明容器内に蛍光指示薬を含むバッファーを加えたのち、遮光性および液体透過性を有するマスキング部材を透明容器内の測定対象物上部に配置することにより、測定対象物上部のバッファーから透明容器の底部へ進もうとする背景光を遮光する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３４５２０６８号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０９５９２９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載された方法のうち、黒色色素等をバッファー中に混ぜる方法では、この黒色色素等自体が、測定対象物である細胞の機能に影響を及ぼして各種反応の阻害を引き起こす場合があり、全ての測定系に対応することが難しい。また、色素での消光の場合、波長ごとに吸収帯域が異なるので、蛍光指示薬の種類や測定系により最適な色素の選択が不可欠となる。
【０００８】
一方、ポリマーラテックスビーズ等をバッファー中に添加し、測定対象物上に供して積層させて光学的な分離層を形成する方法では、ポリマーラテックスビーズ等の粒子が測定対象物である細胞に直接接触することにより、細胞への悪影響が生じるおそれがある。また、ポリマーラテックスビーズ等により分離層が形成された後に、さらに試薬を分注すると、ピペットの吐出圧等によって分離層にクレーターが生じて分離層が乱れ、分離層の厚さにばらつきが生じる。その結果、細胞等に由来する蛍光の高分解能な検出ができなくなるおそれもある。
【０００９】
また、引用文献２に記載された方法に関する本発明者の研究によれば、透明容器の内径が比較的大きい場合には顕著な効果が得られるが、透明容器の内径が小さくなるほど効果が漸減することが判明した。考えられる原因は次の通りである。通常、透明容器内において測定対象物が配置される箇所は親水性である必要があるので、透明容器の内面には親水処理が施されている。このため、透明容器内の液面は、表面張力に起因する凹状の歪み（メニスカス）が形成される。バッファー等の液中において生じた蛍光等は、この凹状の歪みにおいて反射・散乱し、その一部は透明容器の底部へ進むこととなる。そして、透明容器の内径が小さいほど、透明容器内の液面の歪みが顕著となり、容器底部における背景光量が増大する。
【００１０】
なお、従来のバッファー置換を行う方法は、手間がかかりスループット低下の原因となる。また、容器内のバッファーの置換を繰り返すことによって、細胞等の測定対象物が容器の底から剥離してしまう問題もある。
【００１１】
本発明は、上記した問題点に鑑みてなされたものであり、測定対象物の周囲に存在するバッファー等の液中において生じる背景光を、測定対象物に影響を与えることなく、また容器が小径であっても効果的に低減し、さらにバッファーの置換を不要とする、背景光低減部材および光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するために、本発明による背景光低減部材は、有底容器内の液中に配置された測定対象物が蛍光性または発光性の物質を取り込むことで発する光を有底容器の底部を介して測定する際に、測定対象物の周囲の液中において生じる背景光を低減する為に用いられる部材であって、有底容器内に挿入されて有底容器内の液と接触するとともに、該挿入方向に沿った所定軸線を囲むように配置された疎水性の接触部を有し、有底容器内の液と接触部との上記接触に因って背景光を低減することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明による光測定方法は、有底容器内の液中に配置された測定対象物が蛍光性または発光性の物質を取り込むことで発する光を有底容器の底部を介して測定する方法であって、所定軸線を囲むように配置された疎水性の接触部を有する部材の接触部を所定軸線に沿って有底容器内に挿入して有底容器内の液と接触させることに因って、測定対象物の周囲の液中において生じる背景光を低減することを特徴とする。
【００１４】
前述したように、有底容器の内面には親水処理が施されているため、有底容器に注入されたバッファー等の表面張力によって液面が凹状に歪み、その液面における蛍光等の反射・散乱作用によって容器底部での背景光量が増大すると考えられる。このような現象に対し、本発明者は、有底容器内の液面に疎水性の部材を接触させることにより、その液面の形状を改善し得ることを見出した。そして、この部材を或る特定の形状、すなわち有底容器内に挿入する際の挿入方向に沿った所定軸線を囲むように配置された形状とすることにより、有底容器の底部に達する背景光を効果的に低減できることを見出した。これは、上記形状を有する疎水性の部材を液面に接触させることによって、有底容器内の液面の歪みが平坦または凸状となり、液中において生じた蛍光等が液面を透過して外部へ放出されるためと考えられる。
【００１５】
このように、上記した背景光低減部材および光測定方法によれば、有底容器の内径が小さい場合であっても、背景光を効果的に低減することができる。また、当該部材自体が細胞等の測定対象物に接触することなく背景光を効果的に低減できるので、細胞等の測定対象物に影響を与えることなく、背景光の影響を排除した高感度な測定が可能となる。そして、蛍光指示薬の種類（蛍光波長）や測定系を選ばず、どのような測定にも対応できる。また、有底容器内に上記した背景光低減部材を挿入するだけで、液中の過剰な蛍光指示薬に起因する背景光も低減することができるので、バッファーの置換が不要となり、スループットの向上を図ることができる。
【００１６】
上記した背景光低減部材は、有底容器としての複数のウェルを有するマイクロプレートを使用する際に用いられ、複数のウェルに対応する複数の接触部を有することを特徴としてもよい。また、上記した光測定方法は、有底容器としての複数のウェルを有するマイクロプレートを使用すると共に、部材が、複数のウェルに対応する複数の接触部を有することを特徴としてもよい。これにより、マイクロプレートの複数のウェルに測定対象物を配置し、複数の測定を同時に行う場合においても、一括して各ウェルの背景光を低減することができ、スループットをさらに向上させることができる。
【００１７】
また、上記した背景光低減部材および光測定方法は、所定軸線と交差する平面内での接触部の形状が、有底容器の内側面に沿った形状であることを特徴としてもよい。接触部がこのような形状を有することによって、有底容器内の液面の形状を広範囲にわたって改善し、背景光をより効果的に低減することができる。
【００１８】
また、上記した背景光低減部材および光測定方法は、接触部の形状が、所定軸線の方向に延びる筒状であることを特徴としてもよい。或いは、接触部が、相互に間隔をあけて所定軸線の周囲に配列された複数の疎水性部分から成ることを特徴としてもよい。接触部がこれらのうち何れの形状を有しても、上記した効果を好適に得ることができる。
【００１９】
なお、上記した背景光低減部材および光測定方法において、疎水性の接触部が有底容器内の液と接触するとは、（１）疎水性である接触部の先端が液面と接触している（接触部自体が液の内部に入っていない）場合と、（２）接触部を含む部分が液内に挿入されており、当該部分における液面と接触する部位が疎水性（すなわち接触部）である場合とを含むものとする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による背景光低減部材および光測定方法によれば、測定対象物の周囲に存在するバッファー等の液中において生じる背景光を、測定対象物に影響を与えることなく効果的に低減し、さらにバッファーの置換を不要にできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）本発明の第１実施形態に係る背景光低減部材の斜視図である。（ｂ）背景光低減部材の縦断面図である。
【図２】背景光低減部材１の使用状態を示す縦断面図である。
【図３】背景光低減部材１の作用について説明するための図であり、背景光低減部材１を使用しない状態での容器内の様子を概念的に示している。
【図４】背景光低減部材１の作用について説明するための図であり、容器内に背景光低減部材１を挿入した場合の液面の変化の様子を概念的に示している。
【図５】背景光低減部材１による効果を示す写真である。（ａ）背景光低減部材１を使用しない場合における容器４０の底部の写真である。（ｂ）背景光低減部材１を使用した場合における容器４０の底部の写真である。
【図６】（ａ）本発明の第２実施形態に係る背景光低減部材の全体斜視図である。（ｂ）背景光低減部材の拡大図である。（ｃ）接触部周辺の拡大図である。（ｄ）使用状態を示す縦断面図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）第２実施形態に係る光測定方法を示した説明図である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）第２実施形態に係る別の光測定方法を示す説明図である。
【図９】背景光低減部材２による効果を示す写真である。（ａ）背景光低減部材２を使用しない場合のマイクロプレート５０の底部の写真である。（ｂ）領域Ｆに含まれる各ウェル５５に対して背景光低減部材２を使用した場合のマイクロプレート５０の底部の写真である。
【図１０】ウェル５５の底部を介して検出された蛍光強度の時間変化（レスポンス）を示すグラフである。
【図１１】（ａ）〜（ｄ）接触部の平面形状（所定軸線Ｃに垂直な平面における接触部の断面形状）の例を示す図である。
【図１２】図１１（ａ）に示した形状の接触部を使用した場合における（ａ）使用前、（ｂ）使用中それぞれの蛍光の様子を示す写真である。
【図１３】図１１（ｂ）に示した形状の接触部を使用した場合における（ａ）使用前、（ｂ）使用中それぞれの蛍光の様子を示す写真である。
【図１４】図１１（ｃ）に示した形状の接触部を使用した場合における（ａ）使用前、（ｂ）使用中それぞれの蛍光の様子を示す写真である。
【図１５】（ａ）〜（ｃ）接触部の平面形状の他の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、添付図面を参照しながら本発明による背景光低減部材および光測定方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００２３】
（第１の実施の形態）
図１（ａ）は本発明の一実施形態に係る背景光低減部材の斜視図であり、図１（ｂ）はその縦断面図である。本実施形態の背景光低減部材１は、接触部１０を備えている。接触部１０は、後述する有底の容器に挿入され、該容器内の液（バッファー）と接触される部分である。接触部１０は、容器への挿入方向（図中の矢印Ａ）に沿った所定軸線Ｃを囲むように壁面が配置された枠のような形状をしており、本実施形態では所定軸線Ｃの方向に延びる円筒状を呈している。また、所定軸線Ｃと交差する平面内での接触部１０の形状は、容器の内側面に沿った形状をしており、好ましくは容器の内側面に嵌合できるような形状である。接触部１０は疎水性・非吸収性を有しており、材質としてはポリスチレンやポリプロピレン、ポリエチレンが好ましい。また、遮光および消光をするため、背景光低減部材１は黒色であることが好ましい。
【００２４】
図２は、背景光低減部材１の使用状態を示す縦断面図である。図２に示すように、底部が透明な容器４０の底部には、培養された細胞やコーティングされた抗体等の測定対象物Ｓが配置される。容器４０には、蛍光指示薬といった蛍光性または発光性の物質を含む液（バッファー）Ｂが入れられ、測定対象物ＳはバッファーＢ中の上記物質（蛍光指示薬）を取り込む。そして、反射鏡４３を介して励起光Ｅが照射されると、この励起光Ｅによって測定対象物Ｓ中の蛍光指示薬が励起され、所定波長の蛍光Ｌを発する。また、バッファーＢ中には、スクリーニングを行いたい化合物（試薬）Ｄも投入される。そして、容器４０には、本実施形態に係る背景光低減部材１の接触部１０が挿入される。この状態で、測定対象物Ｓから発する蛍光Ｌは、容器４０の透明な底部を通過した後に、反射鏡４３を透過し反射鏡４３の下部に配置された撮像装置(不図示)によって撮像されることにより測定される。
【００２５】
ここで、図３及び図４を参照して、本実施形態の背景光低減部材１の作用について説明する。図３は、背景光低減部材１を使用しない状態での容器内の様子を概念的に示しており、図４は、容器内に背景光低減部材１を挿入した場合の液面の変化の様子を概念的に示している。
【００２６】
通常、容器４０の内面において、測定対象物Ｓが配置される箇所は親水性である必要があるので、容器４０の内面には親水処理が施されている。したがって、図３に示すように、容器４０内のバッファーＢの液面には、表面張力に起因する凹状の歪み（メニスカス）が形成される。
【００２７】
一方、測定対象物Ｓに取り込まれなかった蛍光指示薬から発した蛍光は、この凹状の液面において反射・散乱し、その多くが容器４０の底部へ進む。また、スクリーニングの対象である化合物（試薬）Ｄには自家蛍光を持つものが多く、このような自家蛍光を有する化合物を分注して試験する場合、該化合物Ｄからの蛍光もまたバッファーＢの液面において反射・散乱し、その多くが容器４０の底部へ進む。したがって、これらの光が背景光となり、容器４０の底部を介して出力されることとなる。なお、容器４０の内径が小さいほど容器４０内の液面の歪みが顕著となるので、このような現象が顕著に現れる。
【００２８】
これに対し、図４に示すように、疎水性の接触部１０をバッファーＢの液面に接触させると、バッファーＢの液面の歪みが平坦または凸状となる。このような作用は、本実施形態に係る背景光低減部材１の接触部１０の形状、すなわち所定軸線Ｃを囲むように壁面が配置された枠のような形状に起因するものと考えられる。このような作用により、バッファーＢの液中において生じた蛍光、すなわち測定対象物Ｓに取り込まれなかった蛍光指示薬から発した蛍光や化合物Ｄの自家蛍光は、バッファーＢの液面を透過して外部へ放出されることとなる。このため、容器４０の底部に達する蛍光が少なくなり、背景光が効果的に低減される。
【００２９】
このような効果は、容器４０の内径が小さい場合により顕著となる。上述した表面張力に起因するバッファーＢ液面の凹状の歪みは、容器４０の内側面とバッファーＢの液面とが相互に接触する付近に形成されるので、容器４０の内径が小さいほど、測定領域である容器中央付近における液面の凹みが顕著となるからである。
【００３０】
このように、本実施形態の背景光低減部材１、およびこれを用いた光測定方法によれば、容器４０の内径が小さい場合であっても、背景光を効果的に低減することができる。したがって、容器４０の底部を介した蛍光測定において、背景光に邪魔されることなく、測定対象物Ｓからの蛍光Ｌのみを測定することができ、偽陽性の少ない高精度な蛍光測定が可能となる。また、背景光低減部材１を測定対象物Ｓに接触させずに済むので、測定対象物Ｓに影響を及ぼすことなく、背景光の影響を排除した高感度な測定が可能となる。そして、蛍光指示薬の種類（蛍光波長）や測定系を選ばず、どのような測定にも対応できる。また、容器４０内に背景光低減部材１の接触部１０を挿入するだけで、バッファーＢ液中の過剰な蛍光指示薬に起因する背景光も低減することができるので、バッファーＢの置換が不要となり、スループットの向上を図ることができる。
【００３１】
図５は、本実施形態の背景光低減部材１による効果を示す写真である。図５（ａ）は、背景光低減部材１を使用しない場合（図３を参照）における容器４０の底部の写真であり、図５（ｂ）は、背景光低減部材１を使用した場合（図４を参照）における容器４０の底部の写真である。なお、これらの写真は、容器４０の底部に測定対象物ＳとしてＣＨＯ細胞を配置し、これをＦｌｕｏ４（Ｃａイオン蛍光指示薬）にて染色し、バッファーＢとして１μＭのＦＩＴＣ（Fluorescein Isothiocyanate）を使用することにより背景光を多くしたものである。
【００３２】
図５（ａ）に示すように、背景光低減部材１を使用しない場合には、背景光によって底部全体が明るくなり、ＣＨＯ細胞からの蛍光を見分けることが困難となっている。対して、図５（ｂ）に示すように、背景光低減部材１をＦＩＴＣの液面に接触させると、ＦＩＴＣからの背景光のみを除去してＣＨＯ細胞からの蛍光をクリアに観察可能となる。
【００３３】
なお、前述したように、所定軸線Ｃと交差する平面内での接触部１０の形状は、容器４０の内側面に沿った形状であることが好ましい。接触部１０がこのような形状を有することによって、バッファーＢの液面の形状を広範囲にわたって改善し、背景光をより効果的に低減することができる。
【００３４】
（第２の実施の形態）
図６（ａ）は本発明の第２実施形態に係る背景光低減部材の全体斜視図であり、図６（ｂ）はその拡大図であり、図６（ｃ）は接触部周辺の拡大図であり、図６（ｄ）は使用状態を示す縦断面図である。
【００３５】
この第２実施形態の背景光低減部材が第１実施形態と異なる点は、有底容器としての複数のウェルを備えるマイクロプレートに使用されることにある。
【００３６】
図６（ａ）〜図６（ｃ）に示すように、本実施形態の背景光低減部材２は、測定対象物を収容する複数のウェルを備えるマイクロプレートに使用されるものであり、そのマイクロプレートの複数のウェルに対応した複数の接触部１０を備えている。これら複数の接触部１０は、マイクロプレートの上面を覆う一体構造のシート状部２１によって支持されており、マイクロプレートの上面形状と嵌合して、マイクロプレートの各ウェル内にそれぞれ挿入される。
【００３７】
図６（ｄ）に示すように、本実施形態の背景光低減部材２の使用状態において、マイクロプレート５０に設けられたウェル５５の透明な底部には、培養された細胞等の測定対象物Ｓが配置される。各ウェル５５内には、蛍光指示薬といった蛍光性または発光性の物質を含む液（バッファー）Ｂが投入され、測定対象物ＳはバッファーＢ中の上記物質（蛍光指示薬）を取り込む。そして、図示しない反射鏡を介して励起光が照射されると、この励起光によって測定対象物Ｓ中の蛍光指示薬が励起され、所定波長の蛍光Ｌを発する。バッファーＢ中には、スクリーニングを行いたい化合物（試薬）も投入される。そして、マイクロプレート５０には背景光低減部材２が、各接触部１０と各ウェル５５とが相互に嵌合するように挿入される。一体構造のシート状部２１がマイクロプレート５０の上部を覆うようにして嵌合することにより、接触部１０はウェル５５内の所定の位置に位置決めされる。
【００３８】
次に、背景光低減部材２を使用した光測定方法について具体的に説明する。図７（ａ）〜（ｄ）は、本実施形態に係る光測定方法を示した説明図である。この方法では、まず第１ステップとして、マイクロプレート５０の各ウェル５５の透明な底部に、培養した細胞またはコーティングされた抗体等の形で測定対象物Ｓを配置する（図７（ａ））。次に第２ステップとして、各ウェル５５内に、蛍光指示薬を含んだバッファーＢを加える（図７（ｂ））。このとき、バッファーＢの液面には、表面張力に起因する凹状の歪みが生じる。そして第３ステップとして、蛍光指示薬を含んだバッファーＢを除去することなく（洗浄を行うことなく）、背景光低減部材２をマイクロプレート５０に挿入・嵌合して、各接触部１０を各ウェル５５へ挿入する（図７（ｃ））。これにより、各接触部１０がバッファーＢの液面に接触し、液面の形状が制御されて、バッファーＢから発する蛍光が液面から放出される。その後、第４ステップとして、測定対象物Ｓからの蛍光Ｌを各ウェル５５の底部を介して観察する（図７（ｄ））。なお、スクリーニングの対象である試薬等は、適宜バッファーＢへ投入することができる。
【００３９】
図８（ａ）〜（ｄ）は、本実施形態に係る別の光測定方法を示す説明図である。この方法では、第１ステップとして、測定対象物Ｓをマイクロプレート５０の各ウェル５５に配置する（図８（ａ））。第２ステップとして、背景光低減部材２をマイクロプレート５０に挿入・嵌合して、各接触部１０を各ウェル５５へ挿入する（図８（ｂ））。そして第３ステップとして、蛍光指示薬を含んだバッファーＢを各ウェル５５中に加える（図８（ｃ））。その後、第４ステップとして、蛍光指示薬を含んだバッファーＢを除去することなく（洗浄を行うことなく）、測定対象物Ｓからの蛍光Ｌを各ウェル５５の底部を介して観察する（図８（ｄ））。
【００４０】
本実施形態においても第１実施形態と同様に、各ウェル５５中の測定対象物Ｓからの蛍光Ｌを、ウェル５５の透明な底部を介して測定することができる。そして、疎水性の接触部１０をバッファーＢの液面に接触させると、バッファーＢの液面の歪みが平坦または凸状となる。したがって、バッファーＢの液中において生じた蛍光は、バッファーＢの液面を透過して外部へ放出されることとなる。このため、ウェル５５の底部に達する蛍光が少なくなり、背景光が効果的に低減される。
【００４１】
このように、本実施形態の背景光低減部材２、及びこれを用いた光測定方法によれば、背景光を効果的に低減することができる。したがって、ウェル５５の底部を介した蛍光測定において、背景光に邪魔されることなく、測定対象物Ｓからの蛍光Ｌのみを測定することができ、偽陽性の少ない高精度な蛍光測定が可能となる。また、背景光低減部材２を測定対象物Ｓに接触させずに済むので、測定対象物Ｓに影響を及ぼすことなく、背景光の影響を排除した高感度な測定が可能となる。そして、蛍光指示薬の種類（蛍光波長）や測定系を選ばず、どのような測定にも対応できる。また、ウェル５５内に接触部１０を挿入するだけで、バッファーＢ液中の過剰な蛍光指示薬に起因する背景光も低減することができるので、バッファーＢの置換が不要となり、スループットの向上を図ることができる。
【００４２】
なお、本実施形態において使用されるマイクロプレート５０としては、例えば、ウェル５５が８×１２の格子状に並んだ９６ウェルタイプ、この９６ウェルタイプの半分のサイズのウェル５５が１６×２４の格子状に並んだ３８４ウェルタイプ、並びに、３８４ウェルタイプの更に半分のサイズのウェルが３２×４８の格子状に並んだ１５３６ウェルタイプがある。近年、測定効率の向上のため、より多くのウェル５５を備えた（すなわちウェルサイズが小さい）マイクロプレート５０が用いられる傾向がある。
【００４３】
特に、３８４ウェルタイプのマイクロプレートを使用する場合には、ウェルサイズが３．５ｍｍ以下と小さくなり、従来の方法では液面の歪みの影響が大きくなるので、本実施形態に係る背景光低減部材２、及びこれを用いた光測定方法の効果がより顕著となる。
【００４４】
図９は、本実施形態の背景光低減部材２による効果を示す写真である。図９（ａ）は、背景光低減部材２を使用しない場合のマイクロプレート５０の底部の写真であり、図９（ｂ）は、領域Ｆに含まれる各ウェル５５に対して背景光低減部材２を使用した場合のマイクロプレート５０の底部の写真である。なお、これらの写真は、マイクロプレート５０として３８４ウェルタイプを使用し、ウェル５５の底部に測定対象物ＳとしてＣＨＯ細胞を配置し、これをＦｌｕｏ４にて染色し、バッファーＢとして１μＭのＦＩＴＣを使用したものである。
【００４５】
図９（ａ）に示すように、背景光低減部材２を使用しない場合には、背景光によって底部全体が明るくなり、ＣＨＯ細胞からの蛍光を見分けることが困難となっている。対して、図９（ｂ）の領域Ｆに示されるように、背景光低減部材２をＦＩＴＣの液面に接触させると、ＦＩＴＣからの背景光を効果的に低減できる。
【００４６】
図１０は、ウェル５５の底部を介して検出された蛍光強度の時間変化（レスポンス）を示すグラフである。このグラフの縦軸は光強度の相対値を示しており、横軸は時間である。また、図１０において、グラフ群Ｇは背景光低減部材２をマイクロプレート５０に挿入する前のグラフであり、グラフ群Ｈは背景光低減部材２をマイクロプレート５０に挿入した後のグラフである。グラフ群Ｇに示されるように、背景光低減部材２を使用しない場合には、背景光が主に検出されてＣＨＯ細胞からの蛍光強度を測定することができない。これに対し、グラフ群Ｈに示されるように、背景光低減部材２を使用すると、背景光が低減されてＣＨＯ細胞からの蛍光強度の時間変化を明確に検出できている。
【００４７】
（変形例）
上記各実施形態において、接触部１０の形状は、所定軸線Ｃを囲むように壁面が配置された枠のような形状であればよく、様々な変形が可能である。図１１は、接触部の平面形状（所定軸線Ｃに垂直な平面における接触部の断面形状）の例を示す図である。また、図１２〜１４は、図１１に示した各形状の接触部を使用した場合における（ａ）使用前、（ｂ）使用中それぞれの蛍光の様子を示す写真である。
【００４８】
図１１（ａ）は、上記実施形態の接触部１０と同様に、所定軸線Ｃに沿って延びる円筒形状を示している。このような形状は、金型を用いて接触部を作成する場合に最も作成が容易な形状である。このような接触部１０を使用した場合には、図１２（ａ）と図１２（ｂ）との比較からわかるように、十分に背景光が低減されており、その低減効果は他の形状と比較して最も高い。また、分注器を使用して試薬を分注した際に、測定対象物Ｓに試薬が均一に注がれるという利点もある。
【００４９】
図１１（ｂ）は、円筒形状のうち対向する二つの部分に所定軸線Ｃに沿った切り欠きが入った形状の接触部１１を示している。この接触部１１は、相互に間隔をあけて所定軸線Ｃの周囲に配列された２つの円弧型の疎水性部分１１ａ，１１ｂから成る。このような接触部１１を使用した場合においても、図１３（ａ）と図１３（ｂ）との比較からわかるように、十分に背景光が低減されており、その低減効果は図１１（ａ）の形状と殆ど変わらない。但し、分注器を使用して試薬を分注した際に、２つの疎水性部分１１ａ，１１ｂの隙間から試薬が漏れ出すので、測定対象物Ｓに注がれる試薬にムラが生じるおそれがある。
【００５０】
図１１（ｃ）は、円筒形状のうち三つの部分に所定軸線Ｃに沿った切り欠きが入った形状の接触部１２を示している。この接触部１２は、相互に間隔をあけて所定軸線Ｃの周囲に配列された３つの円弧型の疎水性部分１２ａ〜１２ｃから成る。このような接触部１２を使用した場合においても、図１４（ａ）と図１４（ｂ）との比較からわかるように、十分に背景光が低減されており、その低減効果は図１１（ａ）の形状と殆ど変わらない。但し、図１１（ｂ）に示した接触部１１より隙間が多いため、測定対象物Ｓに注がれる試薬のムラがより大きくなるおそれがある。
【００５１】
図１１（ｄ）は、円筒形状のうち四つの部分に所定軸線Ｃに沿った切り欠きが入った形状の接触部１３を示している。この接触部１３は、相互に間隔をあけて所定軸線Ｃの周囲に配列された４つの円弧型の疎水性部分１３ａ〜１３ｄから成る。このような接触部１３を使用した場合においても、図１２〜図１４の結果から、十分に背景光が低減され、その低減効果は図１１（ａ）の形状と殆ど変わらないものと推測される。
【００５２】
図１５は、接触部の平面形状の他の例を示す図である。図１５（ａ）に示す接触部１４は、矩形枠状といった平面形状を有しており、所定軸線Ｃに沿って延びる角筒状を呈している。また、図１５（ｂ）に示す接触部１５は、図１５（ａ）に示した形状において対向する二辺に所定軸線Ｃに沿った切り欠きが入った形状を有しており、相互に間隔をあけて所定軸線Ｃの周囲に配列された２つのコの字型の疎水性部分１５ａ，１５ｂから成る。また、図１５（ｃ）に示す接触部１６は、図１５（ａ）に示した形状において四辺の全てに所定軸線Ｃに沿った切り欠きが入った形状を有しており、相互に間隔をあけて所定軸線Ｃの周囲に配列された４つのくの字型の疎水性部分１６ａ〜１６ｄから成る。
【００５３】
本発明における接触部は、例えば図１５（ａ）〜図１５（ｃ）に示したような形状であっても、上記実施形態と同様の効果を好適に奏することができる。
【００５４】
本発明による背景光低減部材および光測定方法は、上記した実施形態に限られるものではなく、他に様々な変形が可能である。例えば、上記実施形態に記載された化合物（試薬）とは、（１）測定対象物の内部に取り込まれるもの、（２）測定対象物と直接結合するもの、（３）測定対象物とリガンドなどを介して間接的に結合するものの何れであってもよい。
【符号の説明】
【００５５】
１，２…背景光低減部材、１０〜１６…接触部、２１…シート状部、４０…容器、５０…マイクロプレート、５５…ウェル、Ｂ…バッファー、Ｃ…所定軸線、Ｄ…化合物（試薬）、Ｅ…励起光、Ｌ…蛍光、Ｓ…測定対象物。
【図１】
2010190796.tif 000003
【図２】
2010190796.tif 000004
【図３】
2010190796.tif 000005
【図４】
2010190796.tif 000006
【図６】
2010190796.tif 000007
【図７】
2010190796.tif 000008
【図８】
2010190796.tif 000009
【図１１】
2010190796.tif 000010
【図１５】
2010190796.tif 000011
【図５】
2010190796.tif 000012
【図９】
2010190796.tif 000013
【図１０】
2010190796.tif 000014
【図１２】
2010190796.tif 000015
【図１３】
2010190796.tif 000016
【図１４】
2010190796.tif 000017