(57)【要約】【課題】極めて高感度に光信号を検出可能な光信号検出方法および装置を得る。【解決手段】誘電体プレート11および該プレート11の一面の所定領域に設けられた金属層12を備えたセンサ部14を有するセンサチップ10を用意し、該センサチップ10のセンサ部に試料Sを接触させることにより、該センサ部14に被検出物質の量に応じた量の光応答性標識物質Fを結合させ、所定領域に対して励起光Ｌ0を照射し、該励起光の照射により金属層12上に生じた電場増強場内において生じる光応答性標識物質Fからの光を検出することにより、被検出物質の量を求める光信号検出方法において、光応答性標識物質Fとして、光応答物質15を、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料16により、該光応答物質15が金属層12に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いる。【選択図】図１
2010190880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートおよび、該プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップを用意し、
該センサチップの前記センサ部に試料を接触させることにより、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質が付与された結合物質を結合させ、
前記所定領域に対して励起光を照射し、該励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出することにより、前記被検出物質の量を求める光信号検出方法において、
前記光応答性標識物質として、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いたことを特徴とする光信号検出方法。
【請求項２】
前記光の検出を、異なる複数の時刻に行い、該光の強度の時間変化に基づいて、前記被検出物質の量を求めることを特徴とする請求項１記載の光信号検出方法。
【請求項３】
前記光応答性標識物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１または２記載の光信号検出方法。
【請求項４】
前記光応答性標識物質の粒径が、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることを特徴とする請求項１または２記載の光信号検出方法。
【請求項５】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、９０ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項１または２記載の光信号検出方法。
【請求項６】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項１または２記載の光信号検出方法。
【請求項７】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の表面に前記光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項１から６いずれか１項記載の光信号検出方法。
【請求項８】
誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップと、
前記所定領域に対して励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記センサ部に試料を接触させた際に、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質が付与された結合物質が結合された場合に、前記センサチップへの前記励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出する光検出手段とを備え、
前記光応答標識が、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように包含されてなるものであることを特徴とする光信号検出装置。
【請求項９】
光応答性標識物質から生じる光を検出する光信号検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、
前記金属層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記流路内の、前記センサチップ部より上流側に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質とを備えてなることを特徴とする光信号検出用試料セル。
【請求項１０】
前記光応答性標識物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９記載の光信号検出用試料セル。
【請求項１１】
前記光応答性標識物質の粒径が、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることを特徴とする請求項９記載の光信号検出用試料セル。
【請求項１２】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、９０ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項９記載の光信号検出用試料セル。
【請求項１３】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項９記載の光信号検出用試料セル。
【請求項１４】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の表面に前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項９から１３いずれか１項記載の光信号検出用試料セル。
【請求項１５】
光応答性標識物質から生じる光を検出する光検出法に使用される光信号検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、前記金属層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
光信号検出を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする光信号検出用キット。
【請求項１６】
前記光応答性標識物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１５記載の光信号検出用キット。
【請求項１７】
前記光応答性標識物質の粒径が、７０ｎｍ〜９００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１５記載の光信号検出用キット。
【請求項１８】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、９０ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項１５記載の光信号検出用キット。
【請求項１９】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項１５記載の光信号検出用キット。
【請求項２０】
前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の表面に前記光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項１５から１９いずれか１項記載の光信号検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光を検出することにより試料中の特定物質を検出する蛍光検出法を含む、標識からの光信号を検出することにより試料中の特定物質を検出する光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
また、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。これは、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを備え、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００４】
ところが、表面プラズモン増強蛍光検出装置においては、非特許文献１に示されているように、試料中の蛍光色素と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光色素内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。
【０００５】
そこで、非特許文献１では、金属膜上にカルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜を作製して距離を離す方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）76(2004)  p.6765
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、金属膜上にＣＭＤ膜を形成する場合、金膜上にＳＡＭ（自己組織化膜）を付けてからさらにＣＭＤ膜を作製する必要があることから、金属消光を防止するための手立てに時間と工数がかかる。さらに、蛍光標識された物質をＣＭＤ膜のどの位置につけるかの制御は難しく、蛍光標識と金属膜との距離を厳密に制御するのが困難という欠点がある。蛍光標識と金属膜との距離がずれてしまうと、蛍光信号の強度に大きな影響が及び信号の信頼性が低下するという問題がある。
【０００９】
この金属消光およびそれに付随する問題は、蛍光標識に限らず、光に対して何らかの応答性を有する光応答性物質を標識として用いた場合にも同様に生じる問題である。
【００１０】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、簡便な方法で金属消光を効果的に防止すると共に、安定して光信号を検出することが可能な光信号検出方法および装置を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は光信号検出方法に用いられる試料セルおよび試料キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の光信号検出方法は、誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップを用意し、
該センサチップの前記センサ部に試料を接触させることにより、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の光応答性標識物質が付与された結合物質を結合させ、
前記所定領域に対して励起光を照射し、該励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出することにより、前記被検出物質の量を求める光信号検出方法において、
前記光応答性標識物質として、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いたことを特徴とするものである。
【００１３】
なお、ここで「結合物質」は被検出物質を介してセンサ部に結合する物質であってもよいし、被検出物質と競合してセンサ部に結合する競合物質であってもよい。例えば、抗原抗体反応を検出する光信号検出方法において、抗原が被検出物質であるとき、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、固定層は該抗原と特異的に結合する第１の抗体（固定化抗体）から構成され、結合物質は、抗原と特異的に結合する第２の抗体から構成される。また、競合法によるアッセイを行う場合には、結合物質は、抗原と競合して固定化抗体と結合する競合抗原から構成される。このように、本発明の光信号検出方法は、サンドイッチ法、競合法のいずれの方法によるアッセイにも対応可能である。
【００１４】
「被検出物質の量を求める」とは被検出物質の存在の有無を含み、被検出物質の量とは、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
【００１５】
光応答性標識物質は、粒子状の光透過材料中に複数の光応答物質が存在するものであるが、複数の光応答物質のうち、一部が光透過材料の外部に露出していてもよい。また、光透過材料中における光応答物質の分布状態はどのようであってもよく、均一に分布していてもよいし、均一に分布していなくてもよい。さらに、粒子状の光応答物質の中心部においては、光応答物質が存在しない領域が存在してもよい。
【００１６】
ここで、「光応答物質」は、励起光に対し光応答性を有するものであればよく、励起光の照射により蛍光を生じる蛍光色素分子、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）のみならず、励起光の照射により散乱光を生じる金属微粒子などであってもよい。従って、「光応答物質からの光」とは、励起光が照射されて光応答物質から生じる光（蛍光、燐光）、あるいは、励起光が照射されて光応答物質により散乱された光（散乱光）をいう。
【００１７】
本発明の光信号検出方法においては、前記結合を開始してから所定時間経過後に前記光の検出を１度だけ行い、その光の強度に基づいて前記被検出物質の量を求めてもよいが、前記結合を開始してから、前記光の検出を異なる複数の時刻に行い、該光の強度の時間変化に基づいて、前記被検出物質の量を求めることがより好ましい。
ここで、「異なる複数の時刻」とは、一定時間間隔の複数の時刻であってもよいし、異なる時間間隔の複数の時刻であってもよく、連続的であってもよい。複数の時刻は２以上の時刻であればよいが、測定精度向上の点からは、より多くの時刻で検出を行うことが好ましい。
【００１８】
ここで、前記光応答性標識物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることがより好ましい。また、前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものである場合には、さらに９０ｎｍ〜７００ｎｍがより好ましく、さらには１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることが特に好ましい。なお、本明細書において、光応答性標識物質の粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
また、前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものである場合、前記光応答性標識物質の表面に前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
【００１９】
本発明の光信号検出装置は、誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップと、
前記所定領域に対して励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記センサ部に試料を接触させた際に、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質が付与された結合物質が結合された場合に、前記センサチップへの前記励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出する蛍光信号検出手段とを備え、
前記光応答性標識物質が、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように包含されてなるものであることを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の光信号検出用試料セルは、光応答性標識物質から生じる光を検出する光信号検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、
前記金属層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記流路内の、前記センサチップ部より上流側に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えてなることを特徴とするものである。
【００２１】
なお、本発明の試料セルは第２の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２２】
本発明の光信号検出用キットは、光応答性標識物質からの光を検出する光信号検出法に使用される光信号検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、前記金属層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
光信号検出を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とするものである。
【００２３】
なお、本発明の光信号検出用キットは、第２の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２４】
なお、本発明の光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キットにおける「（第２または第３の）結合物質が修飾された光応答性標識物質」は、本発明の光信号検出方法および装置における「光応答性標識物質が付与された結合物質」とは、いずれも光応答性標識物質と結合物質とが一体となった物質を指すものである。
【００２５】
また、本発明の光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キットにおける「光応答性標識物質」は、上記光信号検出方法および装置における「光応答性標識物質」と同一であり、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように包含されてなるものである。
【００２６】
ここで、光応答性標識物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることがさらに好ましい。また、前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものである場合には、さらに９０ｎｍ〜７００ｎｍがより好ましく、さらには１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることが特に好ましい。
また、前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものである場合、光応答性標識物質の表面に前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
【００２７】
さらにここで、誘電体プレートに設けられる前記金属層は、励起光の照射により表面プラズモンあるいは局在プラズモンを生じさせるものであればよく、金属膜により構成されていてもよいし、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体により構成されていてもよい。さらには、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成されていてもよい。なお、金属層の材料としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の光信号検出方法および装置は、光応答性標識物質として、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いているため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と光応答物質との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して光信号を検出することができる。
【００２９】
本発明の試料セルは、流路内の、センサチップ部より上流側に固定された、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えており、光応答性標識物質は光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、光透過材料で覆われているものであるため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と光応答物質との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して光信号を検出することができる。
【００３０】
本発明の試料キットは、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、流路内に流下される、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された光応答性標識物質を含む標識用溶液を備えており、光応答性標識物質は光応答物質が、前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように光透過材料で覆われているものであるため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と光応答物質との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して光信号を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の第１実施形態による光信号検出方法に用いられる装置を示す概略構成図
【図２】本発明の第２実施形態による光信号検出方法に用いられる装置を示す概略構成図
【図３Ａ】本発明の１実施形態の試料セルを示す平面図
【図３Ｂ】図３Ａに示す試料セルの側断面図
【図４】本発明の第２実施形態による光信号検出装置におけるアッセイ手順を示す図
【図５Ａ】金属膜上に固定される抗体Ｂ１のその他の固定例（その１）
【図５Ｂ】金属膜上に固定される抗体Ｂ１のその他の固定例（その２）
【図６】光応答性標識物質粒径に対しする拡散時間を示すグラフ
【図７Ａ】金属膜上に水溶媒層がある場合の電場Ｅを示す模式図
【図７Ｂ】金属膜上に光応答性標識物質がある場合の電場Ｅを示す模式図
【図８】図７Ａおよび図７Ｂの場合の入射角度と反射率との関係を示すグラフ
【図９】光応答性標識物質の粒径と蛍光量との関係のシミュレーション図
【図１０】光応答性標識物質からの光信号強度の金属膜からの距離依存性を示すシミュレーション図
【図１１】光量の粒径依存性および物質固定量の粒径依存性のシミュレーション図
【図１２】１ｍｍ2に固定された光応答性標識物質からの全光量の粒径依存性を示す図
【図１３】ＳＰＦ法および落射蛍光法による蛍光量の測定結果を示す図
【図１４】ＣＶ値の標識物質個数依存性を示す図
【図１５】蛍光標識物質の検量線データを示す図
【図１６Ａ】本発明の第３実施形態の光信号検出方法に用いられる光信号検出用キットの試料セルを示す平面図
【図１６Ｂ】図１６Ａの試料セルの側断面図および標識用溶液を示す図
【図１７】光信号検出用キットを用いた場合のアッセイ手順を示す図
【図１８】本発明の第４実施形態による光信号検出装置を示す概略構成図
【図１９Ａ】第４実施形態に用いられるセンサチップの第１の具体例の一部を示す斜視図
【図１９Ｂ】第４実施形態に用いられるセンサチップの第２の具体例の一部を示す斜視図
【図１９Ｃ】第４実施形態に用いられるセンサチップの第３の具体例の一部を示す図
【図２０】本発明の第５実施形態による光信号検出方法に用いられる装置を示す概略構成図
【図２１】金属被膜を有する蛍光標識物質（光応答性標識物質）を示す模式図
【図２２】励起光照射光学系の他の例を示す図
【図２３】競合法の原理を説明するための模式図
【図２４】本発明の他の実施形態の試料セルを用いたアッセイ（競合法）手順を示す図
【図２５】本発明の第６の実施形態による光信号検出方法において測定される信号の時間変化を示す図
【図２６】光信号の時間変化対濃度（検量線）を示す図
【発明を実施するための形態】
【００３２】
＜第１の実施形態＞
図面を参照して、本発明の第１実施形態に係る光信号検出方法およびそれに用いられる光信号検出装置について説明する。図１は装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００３３】
図１に示す光信号検出装置１は、誘電体プレート１１の一面の所定領域に設けられた金属膜１２を備えたセンサ部１４を有するセンサチップ１０、励起光Ｌ0を誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件となる入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の面側から励起光Ｌ0を照射する励起光照射光学系２０と、金属膜１２に接触している試料中に光応答性標識物質Ｆが付与された結合物質Ｂ2が存在する場合に、光応答性標識物質Ｆからの光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【００３４】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌ0を出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌ0が全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌ0を導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面１０ａで励起光Ｌ0が全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌ0は、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
【００３５】
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されている。なお、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部を備えない態様であってもよい。
【００３６】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属層として金属膜１２が成膜されたものである。金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属薄膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００３７】
図１に示す実施形態の光信号検出装置を蛍光検出装置として用いるものとし、光信号検出方法として蛍光検出方法について説明する。以下においては、光応答性標識物質Ｆとして蛍光標識物質を用い、光信号として蛍光を検出するものとする。
【００３８】
蛍光検出装置（光信号検出装置）１を用いた蛍光検出の原理について説明する。
励起光照射光学系２０により励起光Ｌ0が誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波Ｅｗが滲み出し、このエバネッセント波Ｅｗによって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。このとき、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域において光応答性標識物質である蛍光標識物質Ｆが存在する場合、その蛍光標識物質Ｆが励起されて蛍光が発生する。ここで、エバネッセント波の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。なお、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域外の蛍光標識物質Ｆは励起されず蛍光を発しない。光検出器（特にここでは、蛍光検出器）３０は、この増強された蛍光を検出する。
【００３９】
本実施形態の蛍光検出方法では、蛍光標識物質Ｆとして、光応答物質である蛍光色素分子１５と、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように該蛍光色素分子１５を内包する光透過材料１６とからなる、金属消光防止性を有する蛍光標識物質を用いている。蛍光標識物質Ｆは蛍光色素分子が光透過材料１６で覆われているため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度を離間させることができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。なお、光応答物質として蛍光色素分子に代えて、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）、あるいは金属微粒子を備えてもよい。金属微粒子を備える場合には、光応答性標識物質は励起光の照射により蛍光ではなく、散乱光を生じるものとなるが、蛍光色素分子を備えた場合と同様に、散乱光の金属消光を防止すると共に、安定して散乱光による信号を検出することができる。
【００４０】
また、本実施形態では、蛍光標識物質Ｆは、複数の蛍光色素分子１５を内包するものであり、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【００４１】
なお、蛍光標識物質（光応答性標識物質）Ｆは粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。光透過材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などの誘電体が挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、該蛍光色素分子１５からの蛍光を透過させて外部に放出でき、蛍光色素分子１５の金属消光を防止できるものであれば特に制限されない。
【００４２】
さて、既述の通り、試料中の蛍光色素分子などの光応答物質が金属膜に接近しすぎると、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属膜１２と光応答物質との間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。
一方、光応答物質は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起される。エバネッセント波の到達範囲（金属膜表面からの距離）は励起光の波長λ程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。光応答物質を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と光応答物質との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。
本実施形態の蛍光標識物質Ｆを用いれば、蛍光色素分子１５は光透過材料１６で覆われていることから直接金属膜に触れることはなく、また、蛍光標識物質中には複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から１０〜１００ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができ、金属消光を防止するための既述のＳＡＭ膜およびＣＭＤ膜などを設ける複雑な作業を行う必要がない。
【００４３】
上記構成の光信号検出装置１を用いた蛍光検出方法を用いたセンシングについて説明する。
まず、センサチップ１０の金属膜１２を備えたセンサ部１４に検査対象となる試料Ｓを接触させる。ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被測定物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾されている。試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２が表面に修飾された蛍光標識物質Ｆが流される。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光標識物質Ｆに表面修飾される２次抗体Ｂ２とは、被検出物質である抗体Ａに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０から励起光Ｌ0が照射され、蛍光検出器３０により蛍光検出がなされる。このとき、蛍光検出器３０によって所定の蛍光が検出されたなら、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち試料中における抗原Ａの存在を確認できることになる。
【００４４】
なお、被検出物質（抗原Ａ）の標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識物質を添加しておいてもよい。
【００４５】
本実施形態で用いられる蛍光標識物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ―ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、金属消光を防止する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光標識物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光標識物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００４６】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態の光信号検出方法および装置を図２から図４を参照して説明する。ここでは、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図２に示す蛍光信号検出装置２は、該光検出装置２における光信号検出方法に使用される本発明の一実施形態の試料セル５０と、試料セル５０の所定領域に励起光Ｌ0を照射させる励起光照射光学２０と、光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【００４７】
図３（Ａ）は、試料セル５０の構成を示す平面図、同図（Ｂ）は試料セル５０の側断面図である。
試料セル５０は、基台５１と、該基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とを備えている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ５３により構成された流路を上部に有する基台５１は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。
【００４８】
試料セル５０の基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２が表面修飾された光応答性標識物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原とは結合せず標識２次抗体Ｂ２と特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。この第１の測定エリア５８がセンサ部に相当し、第２の測定エリア５９はリファレンス部に相当する。なお、図２中においては、試料が注入されて抗体が標識２次抗体と結合して流れた後の試料セル５０を示しているために標識２次抗体吸着エリア５６はもはや存在していない。本例では、センサチップ部にセンサ部とリファレンス部の２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、センサ部のみであってもよい。
【００４９】
第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９の、基台５１上にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された光応答性標識物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる光応答性標識物質であってもよい。さらには金属微粒子など他の光応答性標識物質であってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｂ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的・方法によって適宜定めればよい。
【００５０】
試料セル５０は、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５８からの光信号検出測定の後、第２の測定エリア５９を光信号検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの光信号検出を行うように構成されている。
【００５１】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌ0を出力する半導体レーザ（ＬＤ）からなる光源２１と、誘電体プレート１０に一面が接触するように配置されたプリズム２２とに加え、光源２１から出射された励起光Ｌ0を集光し、プリズム２２の一面から入射させるレンズ２４およびミラー２５からなる導光部材と半導体レーザ光源２１を駆動するドライバ２８とを備えている。
【００５２】
上記構成の光信号検出装置２を用いた光信号検出方法（蛍光検出方法）の原理は第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても第１の実施形態の場合と同様の光応答性標識物質用いているから、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で非常に精度の高い測定を行うことができる。
【００５３】
さらに、この第２の実施形態の光信号検出装置２および蛍光検出方法を利用した、センシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図４を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図４中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図４中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光標識物質Ｆとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Ａが２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった２次抗体Ｂ２の一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった２次抗体が修飾されている蛍光標識物質Ｆが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着しているものを洗い流す。
【００５４】
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正することができる。
【００５５】
図２〜４では、測定エリア５８に固定されている１次抗体Ｂ１は、金属層５９ａ表面に二次元的に設けられているが、図５Ａに示すように、金属層５８ａ上のメンブレンの３次元的に広がった領域に抗体Ｂ１が固定化されていてもよいし、図５Ｂに示すように、金属層５８ａ表面に、表面積を広げるための構造７０を設けてその上に抗体Ｂ１が３次元的に固定化されていてもよい。
【００５６】
構造７０はポリスチレン、ガラスなどの透光性物質であればなんでもよいが、後述する表面プラズモンの擾乱を起こさないように、屈折率が低く、構造体の大きさ（厚さ）が小さいものが好ましい。作製方法は蒸着法、スパッタ法、スピンコートなどの方法で薄膜を作り、その後、プラズマ処理や溶剤処理によって表面をランダムに粗くする方法、あるいは直径１０〜５００ｎｍ程度のポリスチレン微粒子を金膜表面に物理吸着や化学結合により固定化させる方法がある。
【００５７】
さて、第２の実施形態で示したような、マイクロ流路中で流路壁面（のせンサ部）に蛍光標識物質すなわち光応答性標識物質を抗原や抗体を介して固定化するアッセイを行うとき、流路内の光応答性標識物質の運動は拡散が支配的になる。光応答性標識物質の拡散時間はその粒径によって顕著な違いが現れることから、光応答性標識物質の粒径の好ましい範囲を以下のように導出した。なお、以下においては、光応答性標識物質が球状であるとして粒径の範囲を導出した。
【００５８】
光応答性標識物質の拡散時間τは、式（１）で表される。
τ＝ｈ2／Ｄ          ・・・（１）
ここで、ｈ：拡散距離、Ｄ：拡散定数である。
【００５９】
アインシュタイン−ストークスの式（２）を用いると、光応答性標識物質の流体力学半径ｄから拡散定数Ｄが求まるので、サンドイッチ形成に必要な１次抗体までの距離（拡散距離）ｈだけ拡散するのに要する拡散時間τが得られる。拡散距離ｈは流路内の２次元平面上にサンドイッチを形成する場合は流路の高さを表し、メンブレンなどの３次元構造内にサンドイッチを形成する場合は３次元構造上に固定されている１次抗体までの距離を表す。
【００６０】
Ｄ＝ＫBＴ／３πηｄ      ・・・（２）
ここで、ＫB：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒の粘性、ｄ：流体力学半径である。
【００６１】
図６は、サンドイッチ形成に必要な一次抗体までの距離ｈを３０μｍとし、光応答性標識物質の直径φに対する、該光応答性標識物質が距離３０μｍ拡散するのに要する時間を図示したものである。一般に、診断レベルで実用的なアッセイ時間は１０分以下である。図６から、３０μｍの高さのマイクロ流路で１０分以下のアッセイ時間を達成するためには、光応答性標識物質の粒径はφ５３００ｎｍ以下が有効であるといえる。このことから、マイクロ流路での反応においては、光応答性標識物質の粒径がφ５３００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００６２】
また、表面プラズモン励起による電場増強効果を利用した光信号の検出にあたり、光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱を考慮する必要がある。
既述のように、光応答性標識物質の光透過材料には水溶媒より屈折率の高いポリスチレンやガラスを用いている。例えばポリスチレンの屈折率ｎ＝１．５９〜１．６である。このような高屈折率の光応答性標識物質が金属膜近傍に位置することによって表面プラズモンの発生が阻害されうる。この現象をプリズム層１０１、金属膜１０２、溶媒層１０３の三層に分けた多層膜近似で考察した。図７Ａは金属層１０２上に水溶媒層のみである場合、図７Ｂは金属膜１０２にポリスチレンの光応答性標識物質１０４が存在する場合に、プリズム層１０１側から光ビームを入射させた場合に金属膜表面に生じる電場Ｅを模式的に示している。
【００６３】
プリズム層１０１、溶媒層１０３（１０３’）は十分な膜厚があり、プリズム層１０１の屈折率、金属膜１０２の屈折率、膜厚がすでに決まっていると仮定すると、金属膜表面上に誘起されるプラズモンの状態は金属膜上の溶媒屈折率によって決まる。図８は、金属膜１０２上に水溶媒層のみである場合（実線で示す）と、金属層上にポリスチレン層が存在する場合（破線で示す）について、励起光の界面への入射角度と反射率との関係をシミュレーションにより求めたグラフである。このグラフから溶媒側に水溶媒層(屈折率ｎ＝１．３３）がある場合には、表面プラズモンが発生する共鳴角が存在するが、ポリスチレン層（屈折率ｎ＝１．５９）がある場合には表面プラズモンが発生しない（共鳴角が現れない）ことがわかる。すなわち、図７Ｂに示すように光応答性標識物質１０４により点線で示す領域１０５の電場が乱されている。このことから、屈折率の高い光応答性標識物質(ポリスチレンやガラス製)を用いてアッセイを行い、金属膜近傍に光応答性標識物質が固定されると、表面プラズモンが阻害されて低減してしまい、電場増強が得られなくなると推察される。
このような、光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱を考慮に入れ、光応答性標識物質の粒径と標識物質からの光量との関係をシミュレーションした結果を図９に示す。粒径が大きくなれば内包される光応答物質が増えるので、粒径が４００ｎｍまでは光量は粒径の増加に伴い増大するが、粒径５００ｎｍを超えると急激に光量が減少していくことが分かった。これは、粒径５００ｎｍを超えると上述の光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱が大きくなってくるためである。図９から、光応答性標識物質の径の増加による光量の増加と光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱とを考慮し、光量が最大ピークを示した粒径３００ｎｍの光量から１桁程度以上光量が落ちないようにするためには、光応答性標識物質の粒径を７０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲とすることが望ましい。
【００６４】
さらに、光応答性標識物質が蛍光標識物質である場合について、光応答物質の光信号強度分布、流路免疫反応の観点からさらに好ましい粒径範囲を以下のようにして見出した。なお、以下において光応答物質として蛍光色素分子を備えた蛍光標識物質用い、金属膜として金膜を用いた場合について考察を行ったが、蛍光色素分子以外の蛍光を生じる光応答物質についても、絶対値の大小はあるが、同様の傾向が得られ、同様に適用可能である。
【００６５】
図１０は、光応答物質として蛍光色素分子を用い、金属膜として金膜を用いた場合の、励起された光応答性標識物質からの光信号強度の、該光応答性標識物質の金属膜からの距離依存性を示す光信号強度分布のシミュレーション図である。光応答性標識物質からの光信号は金属膜極近傍では金属消光が起こりゼロであるが、金属膜から距離３０ｎｍ程度まで急激に大きくなり、その後、距離が離れるにつれて指数関数的に減衰する。このように光信号は、非常に複雑な強度分布となるため、ビーズ径のコントロールは重要である。
【００６６】
図１１は、光量の粒径依存性および物質固定量の粒径依存性をシミュレーションにより求めた図である。
【００６７】
図１１における右縦軸は、光応答性標識物質がプリズム上の金属膜表面に直接接した状態で、励起光が照射された場合の光応答性標識物質一個全体から生じる光量を示す。光応答性標識物質内には蛍光色素分子が十分多くかつ均一に内包され、蛍光の場合、量子収率は１と仮定し、プリズム表面からの距離とその距離に存在する粒子の体積を掛け合わせて粒子直径の長さ積分して算出した。図１１に示されるように、粒子径が大きくなるほど標識物質からの光量は大きくなった。これは粒子径が大きくなるにつれて、金属膜表面から離れて励起光強度が弱くなる領域の蛍光色素は多くなるが、同時に金属膜近傍の光強度が強い領域にも蛍光色素が多くなるために、結果として標識物質全体から生じる光量が大きくなるためである。
【００６８】
次に、流路免疫反応の観点から最適な粒子径を算出した。免疫反応に用いた式はLangmuirの吸着式と拡散方程式であり、これに、流路内の流速、粒子の立体障害を加味してシミュレーションを行った。ただし、現実的なコストの観点から、粒径が変わったときでも粒子の重量％は一定、すべての粒子表面に修飾されている免疫反応物質の総量は一定と仮定した。図１１における左縦軸は、ｈＣＧサンドイッチアッセイを行ったときのｈＣＧ抗原濃度１０ｐＭ時の光応答性標識物質固定量を示す。図１１に示すように、粒子固定量は単位面積あたりの粒子数で表される。粒子径が小さくなるほど粒子固定量が増大することがわかる。
【００６９】
上記、二つの因子（１つの標識物質からの光量と標識物質の固定量）をあわせると、１ｍｍ2あたりに固定された標識物質からの光量が得られる。図１２は、固定量と光量との積をとり、１ｍｍ2あたりに固定された標識物質を励起したときの全光量の粒径依存性を示した図である。縦軸は全光量を最大値で規格化して信号量として示している。
【００７０】
図１２から、光量７０％以上とすると９０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の粒子径が有効であることが分かった。
【００７１】
なお、ここで光量７０％以上とした根拠は以下の通りである。
【００７２】
同一の蛍光標識物質（同一性能の蛍光標識物質）を用いた場合、表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」という。）は落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」という。）に対して信号増強度が約１０倍得られ、高感度に測定することができる。金膜を使ったＳＰＦ法ではプラズモンを励起するため、励起波長600ｎｍ以上とする必要がある一方、蛍光標識物質は一般的に蛍光波長が短波長のものほど蛍光量が大きく、性能が高い。すなわち、落射蛍光法では、性能の高い蛍光標識物質を用いることが可能であるが、ＳＰＦ法では、性能の劣る、波長の長い蛍光標識を用いざるを得ない。蛍光発光量の典型的な値として、ほぼ同じ粒径のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製蛍光微粒子、蛍光微粒子（Ｉ）（品番Ｆ８８１０、直径０．２ｕｍ、励起波長５８０ｎｍ、蛍光波長６０５ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と蛍光微粒子（ＩＩ）（品番Ｆ８８０７、直径０．２ｕｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の水溶媒希釈液を蛍光分光光度計（品番Ｆ−７０００、日立社製）で測定した測定値を図１３に示した。図１３に示すように、蛍光波長が６０５ｎｍの蛍光粒子（Ｉ）は蛍光粒子（II）より約４．４倍光量が大きく、性能が良い。ＳＰＦ法では６００ｎｍ以上の励起波長を用いる必要があるため、蛍光微粒子（II）を、一方、落射蛍光法は、励起波長に制限がないため、蛍光微粒子（Ｉ）を用いることができる。このように、性能の異なる蛍光標識物質を用いることにより、同一の蛍光標識物質を用いた場合におけるＳＰＦ法の、落射蛍光法に対する優位性は、減じられる。
具体的には、ＳＰＦ法と蛍光微粒子（II）との組合せでは、ＳＰＦ増強度１０×蛍光粒子（II）の光量１＝１０が得られ、一方、落射蛍光法と蛍光微粒子（I）との組合せでは、増強度１×蛍光微粒子（Ｉ）の光量４．４＝４．４が得られる。この場合、蛍光微粒子の性能の差を含めたＳＰＦ法の落射蛍光法に対する信号増強効果は１０／４．４＝２．３となる。このように、使用可能な蛍光微粒子の性能を含めるとＳＰＦ法としての信号増強効果は、同一の性能の蛍光微粒子を用いる場合より減じられる。
さて、図１２の光信号量において、その最大値はすなわちＳＰＦ法における落射蛍光法に対する増強度が約１０倍となる値である。従って、図１２において最大値からずれた場合、増強度自体が小さくなることを意味する。ＳＰＦ法による信号増強効果としては、少なくとも落射蛍光法に対し１．６倍程度以上を得ることが望まれる。増強度Ａ／蛍光性能差（４．４）≧１．６とすると、増強度Ａ≧１．６×４．４≒７．０となる。従って、ＳＰＦ法としての増強度Ａが７倍以上であれば、すなわち、図１２において最大値の７０％以上であれば、落射蛍光法に対して１．６倍以上の蛍光信号量を得ることができる。
【００７３】
さらに、測定の定量性の観点から固定量による統計ばらつきに指標となるＣＶ値を一定以下とするための観点から好ましい粒子径について考察した。統計理論から固定量Ｎ時の取得信号は√Nの統計ばらつき（ショットノイズ）の影響を受ける。このときのＣＶ値 √N/N＝１／√N％の標識物質個数依存性は図１４の通りである。
【００７４】
図１４から示されるように、標識物質個数による統計ばらつきをＣＶ＝５％以下にするためには、固定量は４００個以上必要であり、ＣＶ＝３％以下にしようとすると、固定量は１１１１個以上必要である。
【００７５】
固定エリアの面積を１ｍｍ２とすると、ＣＶ＝５％のとき、４００個／ｍｍ２、ＣＶ＝３％のとき１１１１個／ｍｍ２である。ｈＣＧ抗原濃度１０ｐＭで上記のＣＶを達成しようとすると、図１１の固定量から粒径の範囲を求めることができ、ＣＶ＝５％のとき、粒径５５９ｎｍ以下、ＣＶ＝３％のとき粒径３３３ｎｍ以下と得られる。なお、統計ばらつきは標識物質個数が多いほど小さく、すなわち粒径が小さいほど小さい。
【００７６】
前述した落射蛍光法に対する優位性を保ち、かつＣＶ値が下記の値以下の定量性を達成する粒子径は、ＣＶ＝５％以下とするためには、粒径９０〜５５８ｎｍ、ＣＶ＝３％以下とするためには、粒径９０〜３３３ｎｍ以下であることが分かった。
なお、この統計ばらつきの観点から定められるＣＶが５％、より好ましくはＣＶが３％以下とした場合の５５８ｎｍ以下、より好ましくは３３３ｎｍ以下という粒径の好ましい範囲については、光応答物質が、蛍光を生じるものでない場合も同様に適用可能である。
【００７７】
さらに、流路内で１次抗体を固定するための３次元構造を作成する手間を省き、簡素化した２次元平面上でアッセイを行うとき、光応答性標識物質の粒径の好ましい範囲を以下のように導出した。ここでも、光応答性標識物質として、蛍光色素分子を備えた蛍光標識物質を用いて考察したが、他の蛍光を生じる光応答性物質を用いた場合にも同様に適用可能である。
一般的な診断用途において、検出限界の抗原濃度として１ｐＭ（ピコモーラー：×１０-12ｍｏｌ／ｌ）程度は必要であるといわれている。そこで、この１ｐＭ以下の抗原濃度を検出し、ダイナミックレンジ２桁、すなわち、１００ｐＭまで検出できる感度特性を目標値として蛍光標識物質の好ましい粒径を導出した。
【００７８】
１ｐＭの抗原濃度の検体について、アッセイ時の条件を検出領域の直径を１ｍｍ（面積３．１ｍｍ2）、流路を流下する検体量を３０μｌ（この検体量は一般的な簡易血液診断装置において、流路に流す前の前処理後、あるいはメンブレンフィルターによって血球分離された後の標準的な値である。）、抗原捕捉率を０．２％（一般的に抗原捕捉率は、０．２％〜２％程度であることから、ここでは、捕捉率が最低であった場合でも検出可能とするため、０．２％に設定した。）とすると、１．２×１０4個／ｍｍ2の抗原を検出領域に固定し検出できればよい。ここで、１．２×１０4個／ｍｍ2を目標固定量とする。一方、落射蛍光検出装置（ＬＡＳ−４０００、落射蛍光式、富士フイルム社製）を用いて測定した、前述の手順で作製した蛍光標識物質（直径３００ｎｍ、励起波長５４２ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍ）の検量線データを図１５に示す。ここでは中心波長５２０ｎｍの緑色ＬＥＤの励起光を用い、緑色蛍光用フィルタを通して蛍光を検出した結果を示している。このときの検出限界密度はエラーバーが蛍光検出装置のバックグラウンド値の３σ(σは標準偏差)と交わった１.０×１０3個／ｍｍ2であった。
【００７９】
この結果、φ３００ｎｍの蛍光標識物質を用いると目標固定量（１．２×１０4個／ｍｍ2）の１２分の１の固定量で検出可能であるといえ、１ｐＭ以下の抗原濃度で抗原検出が可能となる高感度化が達成できていることが明らかとなった。また、この結果から、蛍光標識物質の粒径を３００ｎｍより小さくしても１ｐＭの検体について測定可能であることが明らかである。同一密度で蛍光色素分子が内包されている場合、蛍光標識物質１個あたりの蛍光発光量は蛍光標識物質半径の三乗（ｒ3）に比例する。従って、φ１３０ｎｍの蛍光標識物質を用いた場合、１個あたりの蛍光量はφ３００ｎｍの蛍光標識物質の１／１２倍になるが１ｐＭの抗原濃度での検出が十分可能であるといえる。ここから、１ｐＭの抗原濃度での検出を行うための蛍光標識物質粒径の下限値はφ１３０ｎｍ程度と定められる。なお、ここでは、蛍光標識物質中の蛍光色素分子密度が略一定であると想定している。
【００８０】
一方、蛍光標識物質の粒径を大きくすると内包される蛍光色素分子量が増加するため蛍光信号量も増大し検出光量の点で有利になるが、二次元平面上の一定面積に固定できる蛍光標識物質の個数は立体障害の観点から固定量に限界がある。ダイナミックレンジ２桁として１００ｐＭを検出上限濃度とすると、固定量は１．２×１０6個／ｍｍ2となる。このとき、１つの抗原に対し１つの蛍光標識物質が結合するとして最密充填となる大きさは、φ５００ｎｍである。このことから目標固定量を実現できる蛍光標識物質の上限サイズはφ５００ｎｍである。
【００８１】
以上の観点から、蛍光標識物質のさらに好ましい粒径は１３０ｎｍ〜５００ｎｍである。
なお、上記においては、光応答性標識物質が球状であるとみなして好ましい粒径範囲を求めたが、光応答性標識物質は球状でなくてもよく、球状でない場合には、粒子の最大幅と最小幅との平均の長さを粒径とする球状で近似することができる。
【００８２】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の光信号検出方法として、本発明の一実施形態の光信号検出用キットを用いた方法について図１６Ａ、１６Ｂおよび１７を参照して説明する。図１６Ａ、１６Ｂおよび１７において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００８３】
図１６Ａは光信号検出用キット６０の試料セル６１の構成を示す平面図、同図Ｂは試料セルの側断面図および標識用溶液入りアンプル６２を示す図である。
【００８４】
検出用キット６０は、試料セル６１と、光信号検出を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質として２次抗体Ｂ２が修飾された光応答性標識物質Ｆを含む標識用溶液６３とを備えている。
【００８５】
試料セル６１は、試料セル内に２次抗体が表面修飾された光応答性標識物質を物理吸着した物理吸着エリアを備えない点でのみ上述の第２の実施形態の試料セル５０と異なり、その他は試料セル５０と略同一の構成である。
【００８６】
光信号検出装置としては図２に示した第２の実施形態のものを同様に用いることができ、本実施形態の光信号検出用キット６０を用いれば、第２の実施形態の場合と同様に被検出物質に光応答性標識物質による標識がなされるため、同様に精度の高い測定を行うことができる。
【００８７】
さらに、この光信号検出用キット６０を用いた場合の光信号検出装置２におけるセンシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図１７を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１７中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光標識物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光標識物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：蛍光標識物質Ｆは徐々に下流側に流れ、蛍光標識物質Ｆに修飾されている２次抗体が抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００８８】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル６１をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正してもよい。
【００８９】
蛍光標識物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した蛍光標識物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長５０２ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光標識物質への抗体の修飾がなされる。
【００９０】
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により蛍光標識物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光標識物質を再分散させて標識用溶液とする。
【００９１】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態である光信号検出方法およびそれに用いられる光信号検出装置について図１８を参照して説明する。図１８は装置の全体図であり、図中において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。なおここでは、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００９２】
図１８に示す光信号検出装置４は、センサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の光信号検出装置１とは異なる。
【００９３】
センサチップ１０’は誘電体プレート１１上に設けられる金属層１２’として、励起光の照射を受けて、所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌ0の波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えている。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はなく、ここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート上方から励起光Ｌ0を照射するよう構成されている。
【００９４】
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌ0を出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌ0を反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌ0を反射し、光応答性標識物質からの光（蛍光もしくは散乱光等）Ｌｆを透過するものである。
【００９５】
センサチップ１０’の具体例を図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃ（Ａ）〜（Ｃ）に斜視図で示し説明する。
図１９Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌ0の波長よりも小さく設計される。
【００９６】
図１９Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌ0の波長よりも小さく設計される。
【００９７】
図１９Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。
図１９Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
【００９８】
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００９９】
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
【０１００】
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【０１０１】
上記構成の光信号検出装置４を用いた蛍光検出方法について説明する。
光源２１から出射された励起光Ｌ0はハーフミラー２３により反射されてセンサチップ１０’の試料接触面上に入射される。この励起光Ｌ0の照射により、金属層１２’の表面で局在プラズモンが励起される。この局在プラズモンにより金属層１２’上には、電界分布Ｄが生じ、電場増強領域が形成される。一方、試料Ｓ中の励起光Ｌ0が照射された領域においては蛍光標識物質Ｆが励起されて蛍光が発生する。このとき、電場増強領域にある蛍光標識物質Ｆ1からの蛍光Ｌｆ1の強度は増強されるが、電場増強領域外にある蛍光標識Ｆ2からの蛍光Ｌｆ2強度は増強されない。検出器３０においては、図示しない集光レンズにより蛍光を集光し、光検出器により蛍光検出を行う。この際には電場増強領域を含む広範囲の蛍光標識からの蛍光が集光され得るが、例えば、該蛍光を減衰させるフィルタを集光レンズと光検出器との間に備えることにより、蛍光強度が増強された強度の大きいもののみを検出することが可能となる。
【０１０２】
本実施形態の蛍光検出方法においても、被検出物質Ａに、蛍光標識Ｆとして蛍光標識物質を付与してセンシングを行う。蛍光標識物質Ｆは、複数の蛍光色素分子１５と、該複数の蛍光色素分子１５を内包し、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止する光透過材料１６とからなる。蛍光色素分子１５は光透過材料１６で覆われていることから直接金属膜に触れることはなく、また、蛍光標識物質中には複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から１０〜１００ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができ、金属消光を防止するための既述のＳＡＭ膜およびＣＭＤ膜などを設ける複雑な作業を行う必要がない。さらに、蛍光標識物質Ｆは複数の蛍光色素分子１５を備えていることから、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【０１０３】
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の光信号検出方法および装置５を図２０を参照して説明する。ここでは、第２実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【０１０４】
図１１に示す光信号検出装置５は、誘電体プレートからなる基台の所定領域（測定エリア５８、５９）に金属層として金属微細構造体５８ｂ、５９ｂが設けられている試料セル５０’と、測定エリア５８、５９の下方から励起光Ｌ0を透過光として測定エリア５８、５９に照射する励起光照射光学系２０”とを備えている。蛍光検出装置５では、金属微細構造体５８ｂに励起光が照射されることにより生じた局在プラズモンにより電場増強場が生じ、該増強場において増強された蛍光を測定する。
【０１０５】
光信号検出方法（蛍光検出方法）やアッセイ方法については第２の実施形態の場合と同様であり、本実施形態においても、被検出物質Ａに、蛍光標識物質Ｆを付与してセンシングを行う。蛍光標識物質Ｆは、複数の蛍光色素分子１５と、該複数の蛍光色素分子１５を内包し、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属層と近接した場合に生じる金属消光を防止する光透過材料１６とからなる。蛍光色素分子１５は光透過材料１６で覆われていることから直接金属膜に触れることはなく、また、蛍光標識物質中には複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から１０〜１００ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができ、金属消光を防止するための既述のＳＡＭ膜およびＣＭＤ膜などを設ける複雑な作業を行う必要がない。さらに、蛍光標識物質Ｆは複数の蛍光色素分子１５を備えていることから、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【０１０６】
上述の各実施形態においては蛍光標識物質Ｆとして、多数の蛍光色素分子１５と該蛍光色素分子１５を金属消光を防止するように内包する光透過材料１６とからなるものを用いる形態について説明したが、図２１に示すように、さらに、蛍光標識物質Ｆの表面に蛍光を透過する厚みの金属皮膜１９が設けられていてもよい。金属被膜１９は、光透過材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部光透過材料１６が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。
【０１０７】
蛍光標識物質（光応答性標識物質）Ｆの表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０、１０’の金属層１２、１２’に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが蛍光標識物質Ｆの金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光標識物質Ｆ内の蛍光色素分子１５をさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光標識物質のような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
【０１０８】
この金属被膜された蛍光標識物質（光応答性標識物質）Ｆ’は、例えば、この金属被膜１９上に、被検出対象物質（抗原）Ａと特異的に結合する第２結合物質（２次抗体）Ｂ２を修飾し、上述の第１実施形態から第５実施形態における蛍光標識物質Ｆと同様にして利用することができる。
【０１０９】
蛍光標識物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により蛍光標識物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩにＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本店)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【０１１０】
さて、上述の各実施形態においては励起光Ｌ0として、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図２２に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図２２に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【０１１１】
また、上記各実施形態においては、全て非競合法であるサンドイッチ法によるアッセイについて説明したが、本発明の光信号検出方法および装置、試料セルおよび測定キットはサンドイッチ法のみならず、競合法によるアッセイの場合にも適用することができる。
【０１１２】
図２３を参照して、競合法について簡単に説明する。
図２３（Ａ）に示すように、被検出物質（例えば、抗原）Ａと同一の免疫反応を示す第３の結合物質Ｃ３を蛍光標識物質Ｆに修飾させておく。金属膜１２上には、被検出物質Ａおよび第３の結合物質Ｃ３といずれとも特異的に結合する第１の結合物質Ｃ１（例えば、１次抗体）を固定化しておく。第３の結合物質Ｃ３（例えば、競合抗原）が修飾された蛍光標識物質Ｆを所定濃度で、被検出物質Ａと混合し、金属膜１２上に固定化された第１の結合物質Ｃ１に競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。抗原と蛍光標識物質との混合時における蛍光標識物質の濃度は既知である。
【０１１３】
競合法では、図２３（Ｂ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属膜１２上蛍光標識物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、図２３（Ｃ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の蛍光標識物質の数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【０１１４】
図２４は、本発明の他の実施形態の試料セル５０’を用いた競合法によるアッセイ手順を示す図である。試料セル５０’は、第２の実施形態の蛍光検出装置２において、試料セル５０に換えて用いることができる。試料セル５０とは、流路内に備えられている抗体が異なり、本試料セル５０’は競合法によるアッセイに適用されるものである。
【０１１５】
試料セル５０’においては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａと競合して、後述の１次抗体と特異的に結合する競合抗原Ｃ３（第３の結合物質）が表面修飾された蛍光標識物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび競合抗原Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア（センサ部）５８’、被検出物質である抗原Ａおよび、競合抗原Ｃ３とは特異的に結合せず、異なる免疫反応物質対の一方を構成する物質Ｄ１が固定された第２の測定エリア（リファレンス部）５９’が順に設けられている。
競合法の場合は、信号較正に用いられる第２の測定エリア５９’には、抗原Ｃ３、一次抗体Ｃ１とは特異結合を持たない免疫反応物質対の一方を構成する物質Ｄ１を固定する必要があり、その免疫反応物質対の他方を構成する物質Ｄ２が、競合抗原Ｃ３と共に蛍光標識物質Ｆの表面に修飾されている。物質Ｄ１、Ｄ２の組合せとしては、例えばアビジンービオチンを用いることができる。
【０１１６】
試料セル５０’においては、第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上に上述の物質Ｄ1が固定されている。互いに異なる物質が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと競合抗原Ｃ３とは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている物質Ｄ1は抗原Ａおよび競合抗原Ｃ３とは結合せず、競合抗原Ｃ３と共に蛍光標識物質Ｆの表面に修飾されている物質Ｄ2と特異的に結合するものである。これにより、流路を流れた競合抗原の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには物質Ｄ1ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光標識物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光標識物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９’に物質Ｄ1、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的・方法によって適宜、選択することができる。
【０１１７】
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図２４中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図２４中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと競合抗原Ｃ３が付与された蛍光標識物質Ｆとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと競合抗原Ｃ３とが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった競合抗原Ｃ３が修飾されている蛍光標識物質Ｆの一部は、その蛍光標識物質Ｆに表面修飾されている物質Ｄ２が第２の測定エリア５９’上に固定されている物質Ｄ１と結合し、測定エリア５９’上に固定される。さらに１次抗体Ｃ１または物質Ｄ１と、競合抗原Ｃ3または物質Ｄ２を介して結合していない蛍光標識物質が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していたものを洗い流す。
【０１１８】
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび競合抗原Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの蛍光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を求めることができる。
【０１１９】
本実施形態の試料セルを用いた蛍光検出方法においても蛍光標識物質Ｆを用いているから、上記各実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で精度の高い測定を行うことができる。
【０１２０】
なお、各実施形態においては、検出された信号に基づいて濃度が求められる。具体的には、センサ部への、光応答性標識物質が付与された結合物質の結合を開始してから所定時間経過後に光信号（上記では蛍光）を検出し、その光信号値（光信号の強度）に基づいて、光信号の強度対濃度について予め求められている検量線から被検出物質の濃度（被検出物質の量）を求めることができる。なお、センサ部へ結合物質を結合させ始めた時点（結合を開始した時点）とは、センサチップ上に光応答性標識物質と試料液とが混合された反応液を流し始めた時点、あるいは、試料液を先にセンサチップ上に流した後に、光応答性標識物質を含む溶液を流す場合には、光応答性標識物質を含む溶液を流し始めた時点、などである。
【０１２１】
被検出物質の量を、よりＳ／Ｎ良く定量するためには、センサ部への、光応答性標識物質が付与された結合物質の結合を開始した時点から、異なる複数の時刻に光信号を検出し、その光信号値の時間変化に基づいて、光信号の時間変化対濃度について予め求められている検量線から濃度を求めることが好ましい。検出される光信号には、装置ノイズなどの時間的に変化しないノイズ成分が含まれているが、光信号の時間変化（傾き）にはこのようなノイズ成分は含まれない。また、複数の時刻に信号を取得することにより、測定ばらつきの影響も低減することができ、従って、所定時間経過後に１回だけ光信号検出を行う方法と比較して、定量精度を向上させることができる。
【０１２２】
ここで、光信号の検出を異なる複数の時刻に行い、該光の強度の時間変化に基づいて、被検出物質の量（濃度）を求める方法に用いられる、光信号強度の時間変化対濃度の検量線測定の実施例を説明する。
【０１２３】
「抗ｈＣＧ抗体結合蛍光標識物質溶液の作製」
２％蛍光標識物質の溶液２５０μＬに、２ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製＃100006）、５０ｍＭのＭＥＳバッファー(ｐＨ６．０）溶液２５０μＬを加え室温で１５分間攪拌した。１０ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ水溶液を２５μＬ添加し、３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）にて、蛍光標識物質を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光標識物質を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光標識物質を再分散させることで、抗ｈＣＧ抗体結合蛍光標識物質の１％（ｗ／ｖ）溶液を得た。
【０１２４】
「抗ｈＣＧ抗体結合測定エリアの作製」
上板をセンサチップの流路に付ける前に、センサチップの測定エリアに、１０μｇ／ｍＬに調製した抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製＃100066）の１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間静置した。抗体溶液を除去し、予め調製した洗浄用バッファー（０．０５％(ｗ／ｖ) Tween-20を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））で洗浄した（３００μＬ／回、３回）。洗浄終了後、抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１％カゼインを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用バッファーで洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ＡＢＩ社製）を３００μＬずつ各ウェルに添加し、室温で３０分間放置後、溶液を除去し乾燥機中で水分を完全に取り除いた。抗ｈＣＧ抗体結合処理後に、蓋材を用いてセンサチップの流路を封入し、流路型センサチップを作製する。流路の封入には超音波溶着などの方法を用いることができる。
【０１２５】
「抗ｈＣＧ抗体結合蛍光標識物質によるｈＣＧ抗原測定」
精製ｈＣＧ抗原をそれぞれ、０ｐ、０．９ｐＭ、９ｐＭ、９０ｐＭ添加した１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）を調製し、試料溶液とした。濃度０ｐは１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液そのものである。
各試料溶液５００μＬに、上述の手順で調製した１％抗ｈＣＧ抗体結合蛍光標識物質溶液を５μＬずつ添加し混合させ反応液とした。図３Ａおよび図３Ｂに示した試料セルと同様の試料セルを用い、反応液を、測定エリア上を流下させつつ、測定エリアからの蛍光信号を、異なる複数の時刻で測定した。この際、なお、試料セルの空気孔にポンプを接続し、一定流速（線速度１．４ｍｍ／ｓ）となるようにポンプ吸引を行い、反応液のうち３００μＬを測定エリア上に送液しつつ、測定を行った。
このようにして、各濃度の反応液毎に蛍光信号強度の時間変化を測定した結果を図２５に示す。図２５に示す測定結果から、各ｈＣＧ濃度での蛍光量の時間変化（傾きａ）を求めることができる。具体的には図２５に示すように、それぞれの濃度毎に直線フィッティングを行い、その関係式ｙ＝ａｘ＋ｂを求めた。
図２５で求めた蛍光量の時間変化（傾きａ）をｙ軸、濃度をｘ軸としてプロットして、図２６に示すような蛍光量の時間変化対濃度の検量線を取得した。なおここでは、ｈＣＧ抗原濃度（ｘ）と蛍光量の時間変化（ｙ）との関係を、ｙ＝０．０４３ｘ0.9で表すことができた。例えば、未知の濃度のｈＣＧ抗原を含む試料について、蛍光量の時間変化を測定し、その時間変化（傾き）が0.2であった場合、図２６において、ｙ＝０．０４３ｘ0.9がｙ＝０．２と交わった点における濃度（５．５ｐＭ）であると特定することができる。
【０１２６】
光信号検出のシステムとしては、取得された、光信号の時間変化と被検出物質（上記例ではｈＣＧ抗原）の濃度とについての検量線を、被検出物質毎に取得して、所定の記憶部に保持しておくことが望ましい。それにより、被検出物質毎に対応する検量線に基づいて、試料液中の被検出物質量（濃度）を特定することができる。具体的には、試料液中の被検出物質量（濃度）を特定する場合、上記各実施形態において説明したセンシング方法を用い、センサ部（測定エリア）へ結合物質を結合させ始めた時点から、異なる複数の時刻において光信号を検出して、光信号強度の時間変化を取得し、取得された光信号強度の時間変化について、該被検出物質に応じた検量線を参照して、その光信号の時間変化と一致する濃度を特定すればよい。
【０１２７】
なお、上記検量線測定の実施例においては、蛍光量の時間変化（傾き）を求めるのに一次関数を用いた直線フィッティングを行ったが、指数関数など他の関数を用いた式でフィッティングを行っても良い。但し、未知の濃度の被検出物質についての濃度特定を行う場合、参照する検量線の取得時に用いられたものと同じ関数を用いる。
【０１２８】
なお、表面プラズモン増強蛍光検出装置においては、「背景技術」の項で述べたとおり、蛍光分子が金属表面で金属消光を生じるという問題があったために、製品化は容易ではなかった。しかし、金属消光防止構造が付与された蛍光標識物質を作製し標識として用いることにより、金属消光の問題を解消することができた。さらに、金属消光を防止するように光透過材料により蛍光色素分子が内包されていることから、蛍光色素の退色を促進する空気中のオゾンや消光効果を持つ溶媒中のクエンチャから蛍光色素を隔離することができ、これにより色素の安定性が増すという予期せざる効果を得ることができた。これらの効果により、表面プラズモン増強蛍光検出装置の製品化への障壁を乗り越えることができ、製品化を実現可能とした。
【符号の説明】
【０１２９】
１、２、４、５    光信号検出装置
１０、１０’    センサチップ
１１    誘電体プレート
１２    金属層（金属膜）
１２’    金属層（金属微細構造体）
１４    センサ部
１５    光応答物質
１６    光透過材料
１９    金属被膜
２０、２０’    励起光照射光学系
２１    光源
２２    プリズム
３０    光検出器
５０、６１    試料セル
５１    誘電体プレート
５２    流路
５３    スペーサ
５４    上板
５７    光応答性標識物質吸着エリア
５８、５９    測定エリア
Ａ    抗原（被検出物質）
Ｂ１    １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２    ２次抗体（第２の結合物質）
Ｆ    光応答性標識物質
Ｌ0    励起光
Ｌｆ    蛍光
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2010190880.tif 000020
【図１６Ａ】
2010190880.tif 000021
【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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