(57)【要約】【課題】  ステビアからの熱水抽出液の発酵を、従来よりも短時間で実施すること及び安定した品質の発酵液を製造すること。【解決手段】  ステビアの茎と葉又は茎の乾燥粉末を熱水抽出に供する工程、熱水抽出液を滅菌する工程、滅菌後の熱水抽出液に、８種のラクトバチルス属の菌及び１種のミクロバクテリウム属の菌からなる群から選択される少なくとも１種の菌を接種し、雑菌による汚染を排除した状態で発酵させる工程を備えてなることを特徴とするステビア発酵液の製造方法を採用する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビアの茎と葉又は茎の乾燥粉末を熱水抽出に供する工程、熱水抽出液を滅菌する工程、滅菌後の熱水抽出液に、それぞれ下記の性質を有する８種のラクトバチルス属の菌及び１種のミクロバクテリウム属の菌からなる群から選択される少なくとも１種の菌を接種し、雑菌による汚染を排除した状態で発酵させる工程を備えてなることを特徴とするステビア発酵液の製造方法：
［ラクトバチルス属の菌Ａ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．２〜０．３×５．０〜７．２μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。クリーム色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  わずかに酸性化
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  炭酸ガスを発生する。
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース資化性あり。アラビノース、マルトース、スクロース、ラフィノース資化性なし。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．５で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｂ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．４〜０．６×１５．０〜１７．０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  酸性化、黄変、凝固
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース資化性あり。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜９．０で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｃ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．４〜０．６×１４．０〜１７．０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  酸性化、ヨーグルト臭
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  セルビオース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、トレハロース、タガトース資化性あり。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜５．０で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｄ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．２４×約６．１μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボースの資化性はややあり。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．０で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｅ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．３０×約５．９μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  ２０〜４５℃で生育する。１５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．０で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｆ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．４９×約１６．６μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、フラクトース、キシロース、アラビノースの資化性があり、リボースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜７．５で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｇ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．６６×約２．１０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜７．５で生育する；
［ラクトバチルス属の菌Ｈ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．３５×約７．２５μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地表面で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ４．０〜７．５で生育する；及び
［ミクロバクテリウム属の菌Ｉ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．２〜０．３×４．０〜６．０μｍ
運動性：  あり
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地表面で生育する。光沢あり。クリーム色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育しない。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陽性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、黄変、凝固
ゼラチン液化試験：  陽性
糖類資化性：  アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース資化性あり。
生育ｐＨ：  ｐＨ８．０〜９．０でよく生育。ｐＨ４．０以下では生育せず。
【請求項２】
ラクトバチルス属の菌Ａは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号１の塩基配列のものであり、ラクトバチルス属の菌Ｂは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号２の塩基配列のものであり、ラクトバチルス属の菌Cは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号３の塩基配列のものであり、ミクロバクテリウム属の菌Ｉは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号４の塩基配列のものである、請求項１に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項３】
ラクトバチルス属の菌Ａが、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２０である菌、ラクトバチルス属の菌Ｂが、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２１である菌及びミクロバクテリウム属の菌Ｉが受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１６１９である菌である、請求項１又は２に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項４】
滅菌後の熱水抽出液に接種される菌が、ラクトバチルス属の菌Ａ、ラクトバチルス属の菌Ｂ及びミクロバクテリウム属の菌Ｉからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項５】
滅菌後の熱水抽出液にミクロバクテリウム属の菌Ｉを接種して発酵させた後、少なくとも１種のラクトバチルス属の菌を接種して発酵させる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項６】
滅菌後の熱水抽出液に接種される菌が、ラクトバチルス属の菌Ｃ、ラクトバチルス属の菌Ｄ、ラクトバチルス属の菌Ｅ、ラクトバチルス属の菌Ｆ、ラクトバチルス属の菌Ｇ及びラクトバチルス属の菌Ｈからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項７】
発酵時の温度が２０〜４０℃である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項８】
固形分濃度が７〜３０重量％の熱水抽出液を発酵させる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項９】
原料であるステビア粉末中の茎の割合が６０重量％以上である、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項１０】
熱水抽出液を得た後に濃縮工程を実施し、濃縮された熱水抽出液を滅菌する、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のステビア発酵液の製造方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法で製造されたステビア発酵液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビアの茎又は茎及び葉の粉末からの熱水抽出液を発酵させてステビア発酵液を製造する方法であって、熱水抽出液を滅菌した後、特定の菌を接種して雑菌の混入を排除して発酵させる方法及びそのような方法で製造されたステビア発酵液に関する。本発明によれば、従来の自然発酵法と比べて、品質管理が容易であり且つより短期間でステビア発酵液を製造することができる。
【背景技術】
【０００２】
南米、パラグァイ原産の菊科植物、ステビアは、学名をステビア  レバゥディアナ  ベルトニー（Stevia Rebaudiana Bertoni）という。ステビアの葉はステビオサイト等のステビオール配糖体を含有し、これらステビオール配糖体は砂糖の約３００倍の甘味を有し、しかも低カロリーである。そのため、砂糖代替甘味料として各種食品に使用されている。
【０００３】
一方、特許文献１には、ステビアの茎と葉の粉砕物から煮沸抽出を行って抽出液を得、これを濃縮し、その後に発酵させて得られるステビア濃縮発酵液を、園芸用肥料として使用することが開示されている。このようなステビア濃縮発酵液の製造に際しては、ステビアの葉及び茎を乾燥して微粉砕し、得られた粉末を熱水中で長時間煮沸して抽出液を得ている。得られた抽出液はそのまま放置すると腐敗するため、濃縮し、２０〜２５℃で自然に発酵させ、これ以上発酵しなくなった時点で市販している。本発明者らの知見によれば、発酵温度は２５℃以下であることが好ましく、３０℃を越えると腐敗菌が繁殖して好ましい発酵液を得ることができない。発酵の終了までには少なくとも６か月、通常は１年を要している。
【０００４】
特許文献１で得られたステビア濃縮発酵液を５００〜１５００倍に希釈して、植物に葉面散布或いは土壌灌水すると、農作物の糖度が高まり且つ収量が増加する。特許文献１には、適用作物として、メロン、スイカ、カボチャ、イチゴ、トマト、キュウリ、トウモロコシ、ピーマン、ナス、キャベツ、白菜等、更に、サツマイモ、ジャガイモ、里芋、大根、落花生、ミカン、ナシ、ブドウ、柿、桃、栗、キューイフルーツ、サトウキビ、マンゴ、パイナップル、お茶等が列挙されている。
【０００５】
特許文献２には、上記同様のステビア濃縮発酵液を散布することにより、モンパ菌の感染を予防できることと、ステビア濃縮発酵液を既にモンパ菌に感染した土壌に施すことにより、モンパ菌を駆除することができる旨が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、ステビア濃縮発酵液が、インドール酢酸を始めとするオーキシン作用を有する物質との相乗効果により、植物の発芽、発根を促進する旨が開示されている。ステビア濃縮発酵液を使用することにより、発芽率の低い種子、或いは長期間保存したために発芽率が低下している種子であっても、良好な発芽率が得られる。更に、成長した植物の枝を切取り、切り口をステビア濃縮発酵液に浸漬した後に挿し木すると高い定植率が得られるため、ステビア濃縮発酵液を使用することにより、良好な植物個体の枝を挿し木によって効率よく増やしていくこともできる。
【０００７】
特許文献４には、ステビア濃縮発酵液を植物に散布することにより、果実の生育途中における果樹からの落下を防止し、農作物の根張りを促進し、日持ちを向上させる技術が開示されている。更に、特許文献５には、ステビア濃縮発酵液が、農作物の栽培にあたって農薬を使用した結果、農作物に残留した農薬を分解或いは資化する乳酸菌を含有している旨が開示されている。これらの乳酸菌は、有機塩素系、有機リン系、合成ピレスロイド系、カーバメイト系の農薬に対して耐性を有するのみならず、農薬の存在下で増殖率が向上する菌もあった。更に、本発明者らの知見によれば、ステビア濃縮発酵液は、植物の硝酸態窒素を減少させることも判明している。
【０００８】
ステビア濃縮発酵液は、植物に限らず、動物、人体にとっても有効である。特許文献６には、ステビア濃縮発酵液を内服液として服用すると、消化器系疾患、特に食欲不振、消化不良等に有効であることが開示されている。更に、ステビア濃縮発酵液は、茶葉の３倍の抗酸化活性を有し、II型糖尿病、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ＨＩＶウイルス、眼疾患等にも顕著な効果を示すことが判明している。
【０００９】
特許文献７には、ステビア濃縮発酵液由来の配糖体及びその類縁化合物が、標的細胞中のインスリン・リセプター・サブストレイト（Insulin receptor substrate）の総数を増加させ、チロシンリン酸化を促進し、インスリン・シグナルを上流から下流に向かって迅速に伝達し、インスリンの作用を大幅に向上させる旨が開示されている。
【００１０】
更に、ステビア濃縮発酵液を動物の飼料に配合することにより、動物の成長が早まり、食肉の味を低下させることなく脂肪分を低下させることができることも知られている。ステビア濃縮発酵液を魚類の養殖に使用すれば、魚類の食欲を増進させるため、養殖期間を短縮でき、しかも魚肉の味が向上する。また、魚類に与える飼料にヒスタミンが混入している場合には、ヒスタミンが魚類に与える悪影響を緩和することができる。
【００１１】
このように、ステビアの茎と葉の煮沸抽出物の濃縮発酵液は、人体用のサプリメント、農業用資材、飼料配合物として普及している。更に、ステビア濃縮発酵液を使用して栽培すると、農作物の収量が増すだけでなく、植物本来の味が保たれており、糖度が高く、日持ちがよく、硝酸態窒素も少ない優れた農作物が得られる。ステビア濃縮発酵液を飼料に配合すると、動物や魚類の発育が増進されるのみならず、得られた肉は脂肪が少なく、柔らかく、且つ優れた味である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平０３−２２０１０９号公報
【特許文献２】特開２００２−２０５９０７号公報
【特許文献３】特開２００４−１４３０４８号公報
【特許文献４】特開２０００−０５３５１５号公報
【特許文献５】特開２００８−２７３８４３号公報
【特許文献６】特開平０５−０３２５５５号公報
【特許文献７】特開２００６−２６５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献１に示されるように、ステビアの茎と葉の煮沸抽出液を得ても、このままでは商品にすることができない。すなわち、ステビア煮沸抽出液には微生物の栄養源が含有されているため、腐敗菌が増殖し、商品にすることができない。腐敗菌の増殖を抑えて好ましい菌を増殖させるために、ステビア煮沸抽出液を濃縮した上で、２０〜２５℃の低温で自然発酵させた。これにより、乳酸菌が増殖し、腐敗菌の繁殖を抑制することができた。ステビア煮沸抽出液には糖分が含まれ、これらの糖の殆どすべてが分解された時点で発酵は終了する。これが熟成の完了である。熟成したステビア煮沸抽出液は、安定であり、放置しても腐敗することはない。発酵温度は２０〜２５℃であるため、乳酸菌の増殖も遅く、発酵の終了、即ち熟成には、半年から１年、通常は約１年の期間が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、発酵初期のステビア煮沸抽出液中に存在する微生物に着目し、それらの微生物を使用して、ステビア煮沸抽出液の発酵期間を短縮できないかと考えた。そして、発酵初期のステビア煮沸抽出液中に存在する微生物を単離し、得られた各単離菌を滅菌されたステビア煮沸抽出液に接種し、培養し、発酵液を得た。得られた発酵液を味と香りで評価し、良好な発酵液が得られる菌を選別した。そして、選別した菌を使用してステビア発酵液を製造する方法に到達した。
【００１５】
即ち本発明は、ステビアの茎と葉又は茎の乾燥粉末を熱水抽出に供する工程、熱水抽出液を滅菌する工程、滅菌後の熱水抽出液に、それぞれ下記の性質を有する８種のラクトバチルス属の菌及び１種のミクロバクテリウム属の菌からなる群から選択される少なくとも１種の菌を接種し、雑菌による汚染を排除した状態で発酵させる工程を備えてなることを特徴とするステビア発酵液の製造方法に関する：
【００１６】
［ラクトバチルス属の菌Ａ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．２〜０．３×５．０〜７．２μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。クリーム色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  わずかに酸性化
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  炭酸ガスを発生する。
糖類資化：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース資化性あり。アラビノース、マルトース、スクロース、ラフィノース資化性なし。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．５で生育する；
【００１７】
［ラクトバチルス属の菌Ｂ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．４〜０．６×１５．０〜１７．０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  酸性化、黄変、凝固
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース資化性あり。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜９．０で生育する；
【００１８】
［ラクトバチルス属の菌Ｃ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．４〜０．６×１４．０〜１７．０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  酸性化、ヨーグルト臭
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  セルビオース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、トレハロース、タガトース資化性あり。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜５．０で生育する；
【００１９】
［ラクトバチルス属の菌Ｄ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．２４×約６．１μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、
フラクトース、キシロースの資化性があり、リボースの資化性はややあり。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．０で生育する；
【００２０】
［ラクトバチルス属の菌Ｅ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．３０×約５．９μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  ２０〜４５℃で生育する。１５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．０で生育する；
【００２１】
［ラクトバチルス属の菌Ｆ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．４９×約１６．６μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロース、アラビノースの資化性があり、リボースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜７．５で生育する；
【００２２】
［ラクトバチルス属の菌Ｇ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．６６×約２．１０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜７．５で生育する；
【００２３】
［ラクトバチルス属の菌Ｈ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．３５×約７．２５μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ４．０〜７．５で生育する；及び
【００２４】
［ミクロバクテリウム属の菌Ｉ］
（形態的性質）
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．２〜０．３×４．０〜６．０μｍ
運動性：  あり
胞子形成：  なし
（生育状況）
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地表面で生育する。光沢あり。クリーム色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育しない。
（生理学的性質）
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陽性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、黄変、凝固
ゼラチン液化試験：  陽性
糖類資化性：  アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース資化性あり。
生育ｐＨ：  ｐＨ８．０〜９．０でよく生育する。ｐＨ４．０以下では生育せず。
【００２５】
上記の本発明のステビア発酵液の製造方法において使用されるラクトバチルス属の菌Ａは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号１の塩基配列のものであることができ、ラクトバチルス属の菌Ｂは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号２の塩基配列のものであることができ、ラクトバチルス属の菌Cは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号３の塩基配列のものであることができ、ミクロバクテリウム属の菌Ｉは、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号４の塩基配列のものであることができる。
【００２６】
上記の本発明のステビア発酵液の製造方法において使用されるラクトバチルス属の菌Ａは、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２０である菌であることができ、ラクトバチルス属の菌Ｂは受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２１である菌であることができ、ミクロバクテリウム属の菌Ｉは受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１６１９である菌であることができる。
【００２７】
上記の本発明のステビア発酵液の製造方法において、滅菌後の熱水抽出液に接種される菌は、ラクトバチルス属の菌Ａ、ラクトバチルス属の菌Ｂ及びミクロバクテリウム属の菌Ｉからなる群から選択される少なくとも１種であることができる。
【００２８】
上記の本発明のステビア発酵液の製造方法には、滅菌後の熱水抽出液にミクロバクテリウム属の菌Ｉを接種して発酵させた後、少なくとも１種のラクトバチルス属の菌を接種して発酵させる方法が包含される。
【００２９】
上記の本発明のステビア発酵液の製造方法において、滅菌後の熱水抽出液に接種される菌は、ラクトバチルス属の菌Ｃ、ラクトバチルス属の菌Ｄ、ラクトバチルス属の菌Ｅ、ラクトバチルス属の菌Ｆ、ラクトバチルス属の菌Ｇ及びラクトバチルス属の菌Ｈからなる群から選択される少なくとも１種であることができる。
【００３０】
発酵時の温度は、２０〜４０℃であることが好ましい。
【００３１】
固形分濃度が７〜３０重量％の熱水抽出液を発酵させることが好ましい。
【００３２】
原料であるステビア粉末中の茎の割合が６０重量％以上であることが好ましい。
【００３３】
熱水抽出液を得た後に濃縮工程を実施し、濃縮された熱水抽出液を滅菌してもよい。
【００３４】
また、本発明は、上記の本発明のステビア発酵液の製造方法で製造されたステビア発酵液に関する。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、ステビアからの熱水抽出液の発酵を、１乃至２ヶ月に短縮することが可能となる。また、管理された、安定した品質のステビア発酵液を製造することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
１．  ステビア熱水抽出液の製造
ステビアは蕾を持つ直前に刈り取る。次いで、乾燥させ、茎と葉をそれぞれ製粉装置で粉砕してステビア粉末を得、所定の重量比で配合する。両者の重量比率は、好ましくは茎１００〜６０：葉０〜４０、さらに好ましくは茎９５〜７０：葉５〜３０である。一般に茎の配合量が多いと作用効果が増大する傾向があるが、一方、発酵液の収率が低下する傾向もある。
【００３７】
熱水にステビア粉末を入れ、有効成分を抽出する。熱水の温度は、９０〜１００℃であることが好ましく、煮沸しながら及び／又は攪拌しながら抽出することがさらに好ましい。ステビア粉末に対する水の割合は、粉末１重量部に対し、水が好ましくは２〜１５重量部、さらに好ましくは４〜１０重量部である。
【００３８】
第１回の熱水抽出を行った残渣に、新しい水を加えて第２回の熱水抽出を行い、さらに第２回の抽出後の残渣に新しい水を加えて第３回の熱水抽出を行うというように、新しい水を用いて複数回の抽出を行ってもよい。あるいは、第１回の熱水抽出で得られた抽出液を、新しい粉末の抽出溶媒として用いてもよい。後者の方法によれば、少量の水で更なる濃縮の必要のない濃厚な抽出液を得ることができる。抽出により、原料ステビア粉末１ｋｇから、通常は０．５〜２ｋｇ、好ましくは０．６〜１．８ｋｇの抽出液が得られる。
【００３９】
２．  ステビア熱水抽出液の濃縮  
得られた熱水抽出液は、後工程において滅菌された後には雑菌による汚染を排除した状態で菌が接種され、発酵工程に供されるので、この工程以降での腐敗防止を目的として濃縮を行う必要はない。しかし、ステビア熱水抽出液の濃度が低い場合には、この工程で、即ち滅菌前の熱水抽出液を濃縮してもよい。なお、濃縮は、発酵工程の後に行ってもよい。濃縮方法は特に限定されず、水溶液の濃縮に適用されている公知の方法、例えば、加熱や減圧下で水分を蒸発させる方法によればよい。
【００４０】
発酵させるに適したステビア熱水抽出液の固形分濃度は、好ましくは３〜３０重量％、さらに好ましくは７〜２５重量％である。あまりに希薄な溶液は、発酵に大きな容積を要するため、産業上好ましくない。一方、固形分濃度が３０重量％を超えると、ステビア熱水抽出液に粘りが生じ、取り扱い難くなり、最終商品としても好ましくない。なお、ステビア熱水抽出液の固形分濃度が高すぎる場合には、適宜希釈して発酵に供すればよい。
【００４１】
３．  ステビア熱水抽出液又はその濃縮液（以下、両者を特に区別せず、「ステビア熱水抽出液」という）の滅菌
本発明では、後工程で植菌する特定の菌以外の微生物が実質的に存在しない状況下において、ステビア熱水抽出液の発酵を行う。従って、菌の接種工程の前に、滅菌を行う。滅菌方法は特に限定されないが、例えば、培養タンクにステビア熱水抽出液を投入後、加圧蒸気を吹き込むか又はジャケットに加熱蒸気を流すことによって回分殺菌を行う方法、あるいはプレート型熱交換器を用いてステビア熱水抽出液を殺菌しながら培養槽に投入する連続殺菌を行う方法がある。
【００４２】
４．  菌の接種
本発明では、滅菌後のステビア熱水抽出液に、ラクトバチルス属の菌Ａ乃至Ｈとミクロバクテリウム属の菌Ｉからなる群から選択される少なくとも一種を接種する。菌の接種の際の菌の濃度は特に限定されないが、３千万〜２億個／ｍｌであることが好ましく、５千万〜１．５億個／ｍｌであることがさらに好ましい。
【００４３】
菌の接種までの工程は、例えば次のようにして行う。まず種菌培養として、２５０ｍｌ容フラスコに１００ｍｌのＧＹＰ液体培地を入れ、１２０℃で２０分間殺菌し、放冷する。このＧＹＰ液体培地に、斜面培養した菌を１白金耳接種し、３５℃で７日間培養する。次に、前前培養として、例えば、１Ｌ容フラスコ２個にそれぞれ５００ｍｌの適切な液体培地（例えばステビア熱水抽出液）を入れ、１２０℃で２０分間殺菌し、放冷する。この液体培地に種菌培養で得た液をそれぞれ５０ｍｌずつ加え、３５℃で３０時間培養する。更に、前培養として、２０Ｌ容小型通気攪拌培養槽（ジャー・ファーメンタ）により、ステビア熱水抽出液を用いて、３５℃で３０時間培養する。この前培養によって得られた液を、本培養の種培養液とする。本培養、即ち発酵のための菌の接種は、例えば、８００Ｌのステビア熱水抽出液を１ｋL容の通気攪拌培養タンクにて加熱殺菌し、放冷後、これに種培養液１０Ｌを添加することによって行う。
【００４４】
ここで、上記９種の菌は、１種のみを使用してもよいし、２種以上を使用してもよい。２種以上を使用する場合には、同時に接種してもよいし、順次、即ち、ある菌を使用して発酵をスタートさせ、時間差を付けて他の菌を接種してもよい。特に、ミクロバクテリウム属の菌Ｉを使用する場合には、初めにミクロバクテリウム属の菌Ｉを接種して発酵をスタートさせ、その後、ラクトバチルス属の菌のいずれかを接種することが好ましい。なお、使用する菌の詳細については、後記する。
【００４５】
５．  発酵
菌を接種後のステビア熱水抽出液を、雑菌の混入がない条件下において、好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは３０〜４０℃、さらにより好ましくは３３〜３８℃に保持し、発酵を行わせる。また、発酵中のステビア熱水抽出液のｐＨは、３．５〜９．０であることが好ましい。なお、ラクトバチルス属の菌を接種した場合には、ｐＨ３．５〜８．５が好ましく、ｐＨ４．０〜７．５がさらに好ましい。また、ミクロバクテリウム属の菌Ｉを接種した場合には、ｐＨ４．０〜９．０が好ましく、ｐＨ７．０〜９．０がさらに好ましい。
【００４６】
ステビア熱水抽出液は、攪拌してもしなくてもよいが、培養液が均一に混じり合う程度に攪拌することが望ましい。ラクトバチルス属の菌を接種した場合には、発酵は、好気的雰囲気で行っても嫌気的雰囲気で行ってもよい。ミクロバクテリウム属の菌Ｉを接種した場合には、発酵は好気的雰囲気で行う。この場合、培養液は発泡しやすいので、機械的消泡装置で泡を排除すると同時に発泡状態に応じて通気速度をコントロールする。また、発酵時間は、好ましくは、１ヶ月以上、さらに好ましくは２ヶ月以上であり、２〜４ヶ月が特に好ましい。グルコースを分解して炭酸ガスを発生する菌Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＨを使用した場合には、炭酸ガスの発生の終了により、発酵が終了したことがわかる。
【００４７】
雑菌による汚染を排除した状態で発酵させるための方法は、特に限定されない。発酵中に発酵槽に雑菌が混入しないような装置、設備を使用すればよい。例えば、その内部を密閉状態とすることができる通常の通気攪拌槽を使用する。この培養槽において、攪拌軸からの雑菌の侵入を防ぐため、例えばメカニカル・シールを採用し、通気を行う場合には、空気の除菌を行うための通常の方法（例えばエア・フィルターの使用）を採用すればよい。
【００４８】
６．  ラクトバチルス属の菌Ａ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ａは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ａは、グルコースを分解する際に炭酸ガス及び乳酸以外の有機酸（例えば酢酸）を産生することから、ヘテロの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するヘテロの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ａとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉに属する菌を使用することが好ましく、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有するラクトバチルス属の菌を使用することがさらに好ましく、配列番号１の塩基配列において、第２９３番の塩基がｔである及び／又は第１０３５番の塩基がｔであるラクトバチルス属の菌を使用することがさらにより好ましく、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２０である菌を使用することが特に好ましい。なお、菌Ａに属するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＳＩＩＤ５８２６−０２は、平成２０年７月２４日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２０として寄託された。
【００４９】
７．  ラクトバチルス属の菌Ｂ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｂは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｂは、グルコースを分解する際に炭酸ガスを発生しないことから、ホモの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するホモの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ｂとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍに属する菌を使用することが好ましく、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号２の塩基配列を有するラクトバチルス属の菌を使用することがさらに好ましく、配列番号２の塩基配列において、（１）第１５０番の塩基がａである、（２）第２４０番の塩基がｃである、（３）第２７４番の塩基がａである、からなる選択されるいずれか一つ以上を充足するラクトバチルス属の菌を使用することがさらにより好ましく、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２１である菌を使用することが特に好ましい。なお、菌Ｂに属するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＳＩＩＤ５８２６−０３は、平成２０年７月２４日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２１として寄託された。
【００５０】
８．  ラクトバチルス属の菌Ｃ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｃは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｃは、グルコースを分解する際に炭酸ガスを発生しないことから、ホモの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するホモの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｔｈｅｒｉｓに属する菌を使用することが好ましく、菌Ｃとして、配列番号３（１６Ｓ  ｒＤＮＡの一部（５５８ｂｐ））に示す塩基配列を有するラクトバチルス属の菌を使用することがさらに好ましい。
【００５１】
９．  ラクトバチルス属の菌Ｄ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｄは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｄは、グルコースを分解する際に炭酸ガス及び乳酸以外の有機酸（例えば酢酸）を産生することから、ヘテロの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するヘテロの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ｄとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓに属する菌を使用することが好ましい。
【００５２】
１０．  ラクトバチルス属の菌Ｅ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｅは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｅは、グルコースを分解する際に炭酸ガス及び乳酸以外の有機酸（例えば酢酸）を産生することから、ヘテロの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するヘテロの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ｅとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍに属する菌を使用することが好ましい。
【００５３】
１１．  ラクトバチルス属の菌Ｆ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｆは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｆは、グルコースを分解する際に炭酸ガスを発生しないことから、ホモの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するホモの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ｆとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍに属する菌を使用することが好ましい。
【００５４】
１２．  ラクトバチルス属の菌Ｇ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｇは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｇは、グルコースを分解する際に炭酸ガス及び乳酸以外の有機酸（例えば酢酸）を産生することから、ヘテロの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するヘテロの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ｇとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓに属する菌を使用することが好ましい。
【００５５】
１３．  ラクトバチルス属の菌Ｈ
本発明で使用するラクトバチルス属の菌Ｈは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。菌Ｈは、グルコースを分解する際に炭酸ガス及び乳酸以外の有機酸（例えば酢酸）を産生することから、ヘテロの乳酸菌である。本発明では、前記した性質を有するヘテロの乳酸菌のいずれをも使用することができるが、菌Ｈとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓに属する菌を使用することが好ましい。
【００５６】
１４．  ミクロバクテリウム属の菌Ｉ
本発明で使用するミクロバクテリウム属の菌Ｉは、前記した形態的性質、生育状況、及び生理学的性質を有するものである。本発明では、前記した性質を有するミクロバクテリウム属の菌のいずれをも使用することができるが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓに属する菌を使用することが好ましく、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号４の塩基配列を有するミクロバクテリウム属の菌を使用することがさらに好ましく、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６１９である菌を使用することが特に好ましい。なお、菌Ｉに属するＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＩＩＤ５８２６−０１は、平成２０年７月２４日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６１９として寄託された。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を挙げて説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１（ステビア熱水抽出液の製造）
刈り取ったステビア草を茎と葉に分けて乾燥した。次いで、乾燥された茎と葉をそれぞれ製粉装置で５０〜７０タイラーメッシュの大きさとなるように粉砕した。茎８０重量部に対し、葉２０重量部の割合で配合した混合粉末１ｋｇに対し、水７リットルを加え、得られた混合物をニーダーで混ぜながら加熱し、煮沸抽出を行った。遠心分離機を用いて熱水抽出液と残渣とに分離した。真空濃縮機を使用し、熱水抽出液をその容量が約１／６となるまで濃縮した。濃縮後のステビア熱水抽出液のブリックス糖度は１９．１、固形分濃度は２０％であった。この熱水抽出液をオートクレーブに入れ、１２０℃で２０分間滅菌した。これを冷蔵保存し、実験用ステビア熱水抽出液とした。
【００５９】
実施例２（菌の分離、選択）
別に、従来の方法でステビア濃縮発酵液を製造している工場から、培養０日目、１０日目、１６日目、１７日目及び４２日目のステビア熱水抽出液（発酵途中のもの）を入手した。これらの液から、希釈平板法を用いて菌を分離した。その際、ＧＹＰ白亜寒天培地、グルコース・酵母エキス寒天培地、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地及びＹＭ寒天培地を用い、３０℃で３〜７日培養した。得られたコロニーを更に分離培養する操作を繰返し、各菌を分離した。なお、用いた培地の組成は、以下に示すとおりである。
【００６０】
ＧＹＰ白亜寒天培地（ｐＨ６．８）
グルコース                  ４．０ｇ
ペプトン                    ２．０ｇ
イースト・エキストラクト    ２．０ｇ
塩溶液＊１                   １．０ｍｌ
ＣａＣＯ３                   ２．０ｇ
寒天                        ３．０ｇ
水                          ２００ｍｌ
【００６１】
＊１：  塩溶液の配合
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ８．０ｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
ＮａＣｌ                    ０．４ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
濃塩酸                      ０．１ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００６２】
グルコース・酵母エキス寒天培地（ｐＨ無調整）
グルコース                  ４．０ｇ
イースト・エキストラクト    １．０ｇ
ペプトン                    ２．０ｇ
寒天                        ４．０ｍｌ
水
【００６３】
ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（ｐＨ６．８）
グルコース                  ０．２ｇ
イースト・エキストラクト    ０．５ｇ
ペプトン                    １．０ｇ
Ｌ−システイン              ０．０２ｇ
ＢＣＰ                      ０．００８ｍｌ
ツィーン８０溶液            ０．２ｍｌ
寒天                        ４．０ｇ
水                          ２００ｍｌ
【００６４】
ＹＭ寒天培地（ｐＨ６．２）
グルコース                  ２．０ｇ
ペプトン                    １．０ｇ
イースト・エキストラクト    ０．６ｇ
マルト・エキストラクト      ０．６ｍｌ
寒天                        ４．０ｇ
水                          ２００ｍｌ
【００６５】
実施例２で分離した菌の各々を、予め、以下に処方を示すＧＹＰ液体培地で増殖させた。液体培地を遠心分離に供し、増殖後の菌を沈澱させた。沈澱した菌を実施例１で調製した実験用ステビア熱水抽出液で洗浄し、洗浄後の菌を、実施例１で調製した実験用ステビア熱水抽出液に分散させて懸濁液とした。この懸濁液を、菌数２０億個／３０ｍｌになるように実施例１で調製した実験用ステビア熱水抽出液に接種し、ジャー・ファーメンタ内で培養した。培養温度は約３５℃、培養期間は２ヶ月であった。
【００６６】
ＧＹＰ液体培地
グルコース                  ４．０ｇ
ペプトン                    ２．０ｇ
イースト・エキストラクト    ２．０ｇ
塩溶液＊１                    １．０ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００６７】
＊１：  塩溶液の配合
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ８．０ｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
ＮａＣｌ                    ０．４ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
濃塩酸                      ０．１ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００６８】
従来の方法でステビア濃縮発酵液を製造している工場のベテラン勤務者をパネリストとして、培養後の発酵液の一部について、官能試験を行った。その結果は次の通りであった。
【００６９】
本発明菌Ａを使用した発酵液……味、香り共従来品とほぼ同じである。
本発明菌Ｂを使用した発酵液……従来品にやや劣るが、味、香り共に問題なし。
本発明菌Ｉを使用した発酵液……味、香り共に従来品と異なるが、味はよい。
【００７０】
実施例３（生化学的試験による菌Ａ乃至Ｉの同定）
選択した菌について、生化学的同定試験を行った。細胞形態の観察（直接検鏡法、運動性試験等）、生育状況の観察（コロニーの形態や生育温度等）、生理学的性質（グラム染色性試験、カタラーゼ試験、硝酸還元試験、リトマスミルク試験、ゼラチン液化試験、糖類発酵性試験、最適ｐＨ試験等）を行った。試験方法は、次の通りであった。
【００７１】
（１）細胞形態の観察
（１−１）細胞の形態及び大きさ
菌をＧＹＰ白亜寒天培地に生育させ（３０℃、７日間）、直接検鏡法で、細胞の形態を観察した。即ち、６００倍で検鏡（ＵＳ−３，ケニス）した。また、ミクロメーターを用いて、細胞の大きさを測定した。
【００７２】
（１−２）運動性
ＧＹＰ白亜寒天培地に生育した菌を、下記の運動性試験培地に穿刺し、３０℃で２〜３日間培養後、穿刺ラインから外に向かって拡散して生育していたら運動性あり、穿刺ラインに沿って生育していたら運動性なしと判定した。
【００７３】
運動性試験培地（ｐＨ６．８）
グルコース                  ４．０ｇ
ペプトン                    ２．０ｇ
イースト・エキストラクト    ２．０ｇ
寒天                        ０．３ｇ
水                          ２００ｍｌ
【００７４】
（１−３）胞子形成
菌をＧＹＰ培地５ｍｌにて十分に生育させ（接種後２０〜２４時間）、遠心分離により菌体を沈め、上澄みを捨てた。菌体の上に、下記の胞子形成試験培地５ｍｌをよく攪拌してから注ぎ入れた。胞子形成試験培地にて、３７℃で７日間培養した。
【００７５】
胞子形成試験培地（ｐH６．８）
ミートエキス                ０．５ｇ
イーストエキス              ０．１ｇ
α−メチルグルコシド        ０．５ｇ
トマトジュース上澄液        ２０ｍｌ
硫安                        １．０ｇ
水                          ８０ｍｌ
【００７６】
胞子の検出は、８０℃ヒート・ショック法にて行った。培養後の胞子形成試験培地２ｍｌを試験管にとり、これを正確に８０℃に沸かした湯浴中に浸し、１０分間保持した。対照として、同じ菌を生育培地（ＧＹＰ培地など）で生育させ、培養２０時間後の細胞についても、同時にヒート・ショック処理を行った。この目的はヒート・ショックの完全性を調べるためである。ヒート・ショック処理に供されたものと未処理のものにつき、１０倍希釈を数回繰り返した。各段希釈液１ｍｌにつき、ＧＹＰ白亜寒天培地を用いて平板培地を作製した。これらの平板培地を培養してコロニーを形成させた。ヒート・ショック処理をしたものと未処理のものとでコロニーの出現数を比較し、胞子の形成率を算出した。
【００７７】
（２）生育状況の観察
（２−１）コロニーの形態
菌をＧＹＰ白亜寒天培地で生育させ（３０℃、７日間）、培地中での生育場所（表面か、内部か）と、色調を観察した。
【００７８】
（２−２）生育温度
菌をＧＹＰ白亜寒天培地に接種し、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃及び４５℃で７日間培養し、生育の有無を観察した。
【００７９】
（２−３）嫌気下での生育性
菌をＧＹＰ白亜寒天培地に接種し、酸素を窒素で置換した環境下において、３０℃で７日間培養し、生育の有無を観察した。
【００８０】
（３）生理学的性質
（３−１）グラム染色性試験
ＧＹＰ白亜寒天培地に生育した菌を、１白金耳量採取し、スライドガラスに塗布した。グラム染色液ｎｅｏ−Ｂ＆Ｍワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて菌を染色した。青く染色された菌をグラム陽性、赤く染色された菌をグラム陰性とした。
【００８１】
（３−２）カタラーゼ試験
ＧＹＰ白亜寒天培地に生育した菌を、１白金耳量採取し、スライドガラスに塗布した。３％過酸化水素水１滴を滴下し、発泡の有無を観察した。
【００８２】
（３−３）硝酸還元試験
継代培養液（培地はＧＹＰ液体培地）３滴を、下記の硝酸還元試験培地に接種し、３０℃で５日間培養した。培養終了後、培地に、ＮＯ２−検出用試薬のＡ液（Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−ナフチルアミン０．１ｍｌを蒸留水２０ｍｌと混和し、ろ過し、そのろ液に３０％酢酸水溶液１８０ｍｌを加えたもの）とＢ液（スルファニル酸０．５ｇを３０％酢酸水溶液１５０ｍｌも溶解したもの）を各１ｍｌ添加し、３０分間静置後、判定を行った。変化なしを陰性、赤色に変色した場合を陽性と判定した。
【００８３】
硝酸還元試験培地（ｐＨ無調整）
ペプトン                    １．０ｇ
ＮａＣｌ                    １．０ｇ
ＫＮＯ３                    ０．１ｇ
水                          １００ｍｌ
【００８４】
（３−４）リトマスミルク試験
継代培養液（培地はＧＹＰ液体培地）２滴を、下記のリトマスミルク培地に接種し、３０℃で５〜７日間培養した。培養終了後、培地色が赤色に変色している場合を酸性化、培地色が白色乃至は透明に変色している場合を脱色、ミルクがヨーグルト状に凝固している場合を凝固、ミルクが溶けて黄褐色に変色している場合を液化と判定した。
【００８５】
リトマスミルク試験培地（ｐＨ６．８〜７．０）
スキムミルク                １０ｇ
リトマス溶液                １ｍｌ
水                          １００ｍｌ
１１０℃にて１０分間滅菌した。
【００８６】
（３−５）ゼラチン液化試験
ＧＹＰ白亜寒天培地に生育した菌を、白金耳にて下記のゼラチン液化試験培地に線を引くように接種（画線培養）し、３０℃で１０〜１５日間培養を行った。培養終了後、試験培地を冷蔵庫で冷却し、その後、シャーレを傾けた際の挙動を観察した。
【００８７】
ゼラチン液化試験培地（ｐＨ６．８）
グルコース                  ４．０ｇ
ペプトン                    ２．０ｇ
イースト・エキストラクト    ２．０ｇ
塩溶液＊１                    １．０ｍｌ
ゼラチン                    ４０ｇ
水                          ２００ｍｌ
【００８８】
＊１：  塩溶液の配合
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ８．０ｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
ＮａＣｌ                    ０．４ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
濃塩酸                      ０．１ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００８９】
（３−６）糖類資化性試験
継代培養液（培地はＧＹＰ液体培地）１滴を、下記の糖類発酵性試験培地に接種し、３０℃で３日間培養した。培養終了後、目視にて、その生育度を判定した。
【００９０】
糖類発酵性試験培地（ｐＨ６．８〜７．０）
糖                          １．０ｇ
イースト・エキストラクト    ０．５ｇ
ペプトン                    ０．５ｇ
塩溶液＊１                    ０．５ｍｌ
水                          １００ｍｌ  
【００９１】
＊１：  塩溶液の配合
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ８．０ｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
ＮａＣｌ                    ０．４ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
濃塩酸                      ０．１ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００９２】
糖としてアラビノースを使用した場合のみ、滅菌フィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ、アドバンテック社）を用いてろ過滅菌を行った。
【００９３】
（３−７）耐塩性
基本的には、供試菌毎に、その生育に最適の培地を基本培地として用いた。基本培地（例えばＧＹＰ液体培地）に食塩を加えて培地を調製した。培地の食塩濃度は、０％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、６．５％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１２．５％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、１８％（ｗ／ｖ）及び２０％（ｗ／ｖ）の１０通りとした。
【００９４】
十分に生育した前培養液（基本培地で、菌の接種後２０〜２４時間培養したもの）１滴を、上記の培地５ｍｌに接種した。これを、供試菌の至適温度で３〜１０日間培養した。
【００９５】
培養後の各培地について、濁度（ＯＤ７００）を測定し、食塩無添加の培地で生育した培養液の濁度に対するそれぞれの食塩濃度で生育した培養液の濁度の比を用いて０．７      以上を生育と判定した。供試菌が生育した上限の食塩濃度をとって、ｘ％食塩耐性と表現した。
【００９６】
（３−８）生育ｐＨ
ＧＹＰ液体培地を、最終ｐＨが３．０、３．５、４．０、８．０、８．５、９．０となるように調製した。即ち、滅菌した２倍濃度のＧＹＰ液体培地（下記の通り）に、別に滅菌しておいた水酸化ナトリウム水溶液（０．０３〜０．０８Ｎ）又は塩酸（０．０２５〜０．０８Ｎ）と等量混合し、上記ｐＨに近い６種類を試験に供した。継代培養液１滴を各試験培地に接種後、３０℃で３日間培養した。培養終了後、目視にて、その生育度を判定した。
【００９７】
２倍濃度のＧＹＰ液体培地
グルコース                  ８．０ｇ
ペプトン                    ４．０ｇ
イースト・エキストラクト    ４．０ｇ
塩溶液＊１                    ２．０ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００９８】
＊１：  塩溶液の配合
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ８．０ｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
ＮａＣｌ                    ０．４ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ０．４ｇ
濃塩酸                      ０．１ｍｌ
水                          ２００ｍｌ
【００９９】
結果を以下に示す。
【０１００】
（Ｉ）菌Ａ
（Ｉ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．２〜０．３×５．０〜７．２μｍ
運動性：  なし
胞子形成：なし
【０１０１】
（Ｉ−２）生育状態
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーン形成。クリーム色を呈する。
生育温度：１５〜４０℃で生育する。４５℃で生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１０２】
（Ｉ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  変化なし
ゼラチン液化試験：  陰性  
グルコースからのガスの発生：  ガス発生あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース資化性あり。アラビノース、マルトース、スクロース、ラフィノース資化性なし。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．５で生育する。
【０１０３】
（ＩＩ）菌Ｂ
（ＩＩ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．４〜０．６×１５．０〜１７．０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１０４】
（ＩＩ−２）生育状態
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーン形成。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃で生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１０５】
（ＩＩ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  酸性化、凝固
ゼラチン液化試験：  陰性  
グルコースからのガスの発生：  なし
糖類資化性：アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース資化性あり。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．０〜９．０で生育する。
【０１０６】
（ＩＩＩ）菌Ｃ
（ＩＩＩ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．４〜０．６×１４．０〜１７．０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１０７】
（ＩＩＩ−２）生育状況
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１０８】
（ＩＩＩ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  酸性化、ヨーグルト臭
ゼラチン液化試験：  陰性
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  セルビオース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、トレハロース、タガトース資化性あり。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜５．０で生育する。
【０１０９】
（ＩＶ）菌Ｄ
（ＩＶ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．２４×約６．１μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１１０】
（ＩＶ−２）生育状況
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１１１】
（ＩＶ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、
フラクトース、キシロースの資化性があり、リボースの資化性はややあり。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．０で生育する。
【０１１２】
（Ｖ）菌Ｅ
（Ｖ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．３０×約５．９μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１１３】
（Ｖ−２）生育状況
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  ２０〜４５℃で生育する。１５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１１４】
（Ｖ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
耐塩性：  ５％食塩耐性
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜８．０で生育する。
【０１１５】
（ＶＩ）菌Ｆ
（ＶＩ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．４９×約１６．６μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１１６】
（ＶＩ−２）生育状況
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１１７】
（ＶＩ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
ゼラチン液化試験：  ±
グルコースからのガス発生：  なし
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロース、アラビノースの資化性があり、リボースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜７．５で生育する。
【０１１８】
（ＶＩＩ）菌Ｇ
（ＶＩＩ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．６６×約２．１０μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１１９】
（ＶＩＩ−２）生育状況
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１２０】
（ＶＩＩ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ３．５〜７．５で生育する。
【０１２１】
（ＶＩＩＩ）菌Ｈ
（ＶＩＩＩ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  約０．３５×約７．２５μｍ
運動性：  なし
胞子形成：  なし
【０１２２】
（ＶＩＩＩ−２）生育状況
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地で生育し、クリアゾーンを形成する。白色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃では生育しない。
嫌気下での生育性：  生育する。
【０１２３】
（ＶＩＩＩ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陰性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、酸性化
グルコースからのガス発生：  あり
糖類資化性：  グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、
スクロース、フラクトース、キシロースの資化性があり、リボース及びアラビノースの資化性はややある。
乳酸生成能：  有
生育ｐＨ：  ｐＨ４．０〜７．５で生育する。
【０１２４】
（ＩＸ）菌Ｉ
（ＩＸ−１）形態的性質
細胞の形態：  桿菌
細胞の大きさ：  ０．２〜０．３×４．０〜６．０μｍ
運動性：  あり
胞子形成：  なし
【０１２５】
（ＩＩＩ−２）生育状態
コロニーの形態：  ＧＹＰ白亜寒天培地表面で生育する。クリーム色を呈する。
生育温度：  １５〜４０℃で生育する。４５℃で生育しない。
嫌気下での生育性：  生育しない。
【０１２６】
（ＩＩＩ−３）生理学的性質
グラム染色性：  陽性
カタラーゼ試験：  陽性
硝酸還元試験：  陰性
リトマスミルク試験：  脱色、凝固
ゼラチン液化試験：  陽性  
糖類資化性：  アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース資化性あり。
生育ｐＨ：  ｐＨ８．０〜９．０で生育する、ｐＨ４．０以下では生育せず。
【０１２７】
実施例４（菌Ａ、Ｂ、Ｃ及びＩの属、種の同定）
菌Ａ乃至Ｃ及びＩのそれぞれについて、常法によって菌を増殖させ、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った後、１６Ｓ  ｒＤＮＡの解析を行った。具体的には、次のような操作を行った。
【０１２８】
（１）培養条件
（１−１）培地
菌Ａ乃至Ｃ：  ＭＲＳ寒天培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）
菌Ｉ：  標準寒天培地（日水製薬株式会社製）
（１−２）培養温度  ３０℃
（１−３）培養時間  ４日間
（１−４）その他の条件  好気培養
【０１２９】
（２）ＤＮＡの抽出から配列決定まで
（２−１）ＤＮＡ抽出  ＩｎｓｔａＧｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ  ＲＡＤ，ＣＡ，ＵＳＡ）
（２−２）ＰＣＲ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）
（２−３）サイクルシークエンス  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
（２−４）使用プライマー  ９Ｆ，３３９Ｆ，７８５Ｆ，１０９９Ｆ，５３６Ｒ，８０２Ｒ，１２４２Ｒ，１５１０Ｒ
（２−５）シークエンス  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
（２−６）配列決定  ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ  １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．，Ｔｅｗａｎｔｉｎ，ＡＵＳ）
【０１３０】
（３）結果
菌Ａの１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号１に記載のとおりであり、菌Ｂの１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号２に記載のとおりであり、菌Ｃの１６Ｓ  ｒＤＮＡ（一部）は配列番号３に記載のとおりであり、菌Ｉの１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号３に記載のとおりであった。
【０１３１】
また、上記４種の菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡを、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）ＢＬＡＳＴ検索及びアポロンＤＢ−ＢＡ  ４．０（株式会社テクノスルガ・ラボ）ＢＬＡＳＴ検索に供したところ、以下の結果となった。
【０１３２】
菌Ａ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ（相同率：９９．７％以上）
菌Ｂ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ（相同率：９９．７％以上）又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（相同率：９９．７％以上）
菌Ｃ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｈｅｒｉｓ（相同率：９９．８％以上）
菌Ｉ：  Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ  ｏｘｙｄａｎｓ（相同率：９９．８％以上）
【０１３３】
実施例５（菌Ｄ乃至Ｈの属、種の同定）
菌Ｄ乃至Ｈのそれぞれについて、乳酸菌用細菌同定検査キットのアピ５０ＣＨＬ（日本ビオメリュー株式会社製）を用い、そのプロトコールに従って同定を行った。結果は次のとおりであった。
【０１３４】
菌Ｄ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ（７５．５％）又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（３０．０％）
菌Ｅ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（８０．５％）
菌Ｆ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（７０．５％）
菌Ｇ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（８５．５％）
菌Ｈ：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ（６０．５％）又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（３８．０％以上）
【０１３５】
実施例６（ステビア発酵液１の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌ＡであるＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２０を、実施例１で調製した実験用ステビア熱水抽出液に接種し、３リットル容量のジャー・ファーメンタにて、培養温度３５℃にて２ヶ月間培養した。グルコース等からの乳酸及び酢酸の生成に伴って、ｐＨは急速に低下した。培養終了後、培地中のグルコース及びフラクトースは資化され、菌体細胞と乳酸と酢酸に変化していた。また、ステビア粉末に含有されていたステビオシドやレバウディオシドのグルコース残基の一部が加水分解されたために、ステビオシドやステビオールなどの濃度も変化していた。得られた発酵液を、ステビア発酵液１とした。この発酵液は、従来の方法で低温で自然発酵して得られた発酵液と極めて類似していた。
【０１３６】
実施例７（ステビア発酵液２の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌ＢであるＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２１を用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液２を製造した。
【０１３７】
実施例８（ステビア発酵液３の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌Ｃであって、配列表の配列３に示す遺伝子配列を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液３を製造した。
【０１３８】
実施例９（ステビア発酵液４の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌Ｄを用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液４を製造した。
【０１３９】
実施例１０（ステビア発酵液５の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌Ｅを用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液５を製造した。
【０１４０】
実施例１１（ステビア発酵液６の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌Ｆを用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液６を製造した。
【０１４１】
実施例１２（ステビア発酵液７の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌Ｇを用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液７を製造した。
【０１４２】
実施例１３（ステビア発酵液８の製造）
微生物としてラクトバチルス属の菌Ｈを用いた以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液８を製造した。
【０１４３】
実施例１４（ステビア発酵液９の製造）
微生物としてミクロバクテリウム属の菌ＩであるＦＥＲＭ  Ｐ−２１６１９を用い、緩やかに酸素供給しながら培養したこと以外は、実施例６と同様にしてステビア発酵液９を製造した。菌Ｉは、ラクトバチルス属の菌と比べて発酵中の乳酸の生成量が少ないため、発酵中におけるｐＨの低下は穏やかであった。
【０１４４】
実施例１５（小松菜の栽培試験）
実施例６、７、８、１０、１２、１３及び１４で得られたステビア発酵液１、２、３、５、７、８及び９の、農作物の成長に及ぼす影響を観察した。ステビア発酵液４は使用した菌Ｄが菌Ｈと近似しているため、ステビア発酵液６は使用した菌Ｆが菌Ｂと近似しているため、それぞれ割愛した。
【０１４５】
植物の成長に及ぼす土壌の影響を排除するために、水耕栽培を行った。栽培用水槽は横４００ｍｍ、縦３００ｍｍ、高さ５０ｍｍのプラスチック製容器であった。この容器に含水させたスポンジを敷き詰め、小松菜種子を播種した。発芽後、長さ５ｃｍの苗を選び、１区画１０本を定植した。
【０１４６】
定植は、次のようにして行った。横４００ｍｍ、縦３００ｍｍ、高さ５０ｍｍのプラスチック製容器に、液肥１リットルを注入した。次いで、そのプラスチック製容器内に嵌入容易なサイズのメッシュ状容器（横３８０ｍｍ、縦２８０ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に市販のバーミキュライトを１０ｍｍ厚に敷き、その上に発芽した小松菜をスポンジ培地ごと載せ、これを１区画とした。
【０１４７】
各試験区では、異なるステビア発酵液を添加した液肥を使用した。試験区１は、市販の家庭用水耕栽培液ハイポニカ（商標名、協和社製、濃縮液体肥料）の希釈液のみで栽培を行った。この希釈液は、Ａ液６ｍｌ及びＢ液６ｍｌに水を加えて全量３リットルとしたもの（Ａ液及びＢ液の各々が５００倍希釈）である。
【０１４８】
試験区２〜８は、上記のハイポニカの希釈液に、実施例６、７、８、１０、１２、１３及び１４で得られたステビア発酵液のいずれかを添加したものである。また、試験区９（参考）には、市販のステビア抽出発酵液、「ファームＡ」（商品、株式会社ビーアンドエル製）を用いた。実施例６、７、８、１０、１２、１３及び１４で得られたステビア発酵液は「ファームＡ」より高濃度であったため、固形分濃度を指標として「ファームＡ」と同一濃度になるように水道水で希釈して用いた。各試験区の液肥の条件をまとめると、次の通りである。
【０１４９】
試験区１：  ハイポニカの希釈液のみを使用した。
試験区２：  濃度調節した本発明ステビア発酵液１を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区３：  濃度調節した本発明ステビア発酵液２を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区４：  濃度調節した本発明ステビア発酵液３を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区５：  濃度調節した本発明ステビア発酵液５を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区６：  濃度調節した本発明ステビア発酵液７を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区７：  濃度調節した本発明ステビア発酵液８を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区８：  濃度調節した本発明ステビア発酵液９を、ハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
試験区９：  「ファームＡ」をハイポニカの希釈液１リットルに対して１ｍｌ添加したものを使用した。
【０１５０】
上記の方法で栽培を開始した。栽培は３〜４月に行った。気温が低かったため、発育が遅かった。定植から５０日後に茎の付け根より切断して収穫した。収穫後の地上部重量、個体長さ、個体葉数を測定し、１０株の平均値を表１に記載した。成長中の観察では、ステビア発酵液を添加した試験区は、試験区１（対照区）と比して明らかに生育がよく、丈も高く、葉の勢いもよく、逞しい印象であった。
【０１５１】
【表１】
2010284100.tif 000002
【０１５２】
実施例１６（血糖値低下作用）
４週齢の実験用マウス４０匹を購入した。１群８匹として、５群に分け、購入直後から全マウスに市販の実験用高脂肪食（オリエンタル酵母工業株式会社製）を与えて飼育した。第１群を除く第２〜５群には、飼育１週間後にストレプトゾトシンとニコチナミドを与えてII型糖尿病マウスを得た。投与量は膵臓のランゲルハンス島の細胞を大量に破壊するが、なお、インスリン生成機能を有する程度の量である。これらのマウスに高脂肪食を与えながら、さらに３週間飼育した。
【０１５３】
飼育５週目に入った日から、第３群には、実施例６で製造したステビア発酵液１を水道水で１０倍に希釈したものを、０．１ｍｌ／１０ｇ体重／回の量で１日２回、７日間、ゾンデを用いて強制経口投与した。第４群には、実施例８で製造したステビア発酵液３を水道水で１０倍に希釈したものを、０．１ｍｌ／１０ｇ体重／回の量で１日２回、７日間、ゾンデを用いて強制経口投与した。第５群には市販のステビア発酵濃縮エキス「ステビアの恵」（商標名、株式会社ビーアンドエル製）を同じく水道水で１０倍に希釈したものを、０．１ｍｌ／１０ｇ体重／回の量を１日２回、７日間、ゾンデを用いて強制経口投与した。マウスに与えるストレスを同等とするため、第１群と第２群には、水道水を、０．１ｍｌ／１０ｇ体重／回の量で１日２回、７日間、ゾンデを用いて強制経口投与した。各群のマウスに施した処置をまとめると、次の通りである。
【０１５４】
第１群……高脂肪食
第２群……高脂肪食＋II型糖尿病化処置
第３群……高脂肪食＋II型糖尿病化処置＋本発明方法で製造したステビア発酵液１を投与        第４群……高脂肪食＋II型糖尿病化処置＋本発明方法で製造したステビア発酵液３を投与
第５群……高脂肪食＋II型糖尿病化処置＋市販のステビア濃縮発酵液を投与
【０１５５】
７日後に全群のマウスにグルコース１ｇ／ｋｇ体重をゾンデを用いて強制経口投与し、投与後、１５分、３０分、６０分、１２０分後の血糖値を測定し、各群８匹の平均値を表２に示す。表２より、本発明方法で製造されたステビア発酵液１及びステビア発酵液３を投与されたマウスでは、市販のステビア発酵濃縮エキス「ステビアの恵」を投与されたマウスと同様に、グルコース投与３０分後と６０分後との間で血糖値の低下率が高く、これらがII型糖尿病マウスに対して有効であることが判明した。
【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
実施例１７（ブロイラー雛の飼育）
孵化した雛の消化器系は生後５日以内に形成されるといわれている。そこで、生後１週間まで飲料水にステビア発酵液を添加し、以後は添加することなくブロイラーを育成した。安全な鶏肉を年間１０万羽生産している養鶏場で試験を行った。この養鶏場では孵化１０週間後に出荷している。
【０１５８】
各試験区は、オス、メス各１０羽、合計２０羽とし、対照区では飼育場と同様の飼料、飲み水を与えて飼育した。試験区１では、孵化後１週間のみ、実施例６で製造したステビア発酵液１の原液を０．１％濃度で含有する希釈水を飲み水として与えた以外は、対照区と同様にして飼育した。試験区２では、孵化後１週間のみ、実施例８で製造したステビア発酵液３の原液を０．１％濃度で含有する希釈水を飲み水として与えた以外は、対照区と同様にして飼育した。参考区では、孵化後１週間のみ、市販のステビア濃縮発酵エキス「ファームＡ」（商品名、株式会社ビーアンドエル製）を０．１％濃度で含有する希釈水を飲み水として与えた以外は、対照区と同様にして飼育した。なお、ステビア発酵液１及び３の原液とは、実施例１５の方法に従って、固形分濃度が「ファームＡ」と同等となるように希釈したものである。
【０１５９】
孵化後、１週間毎に各雛の体重を測定し、各区毎の体重の平均値を表３に示した。表３より、本発明の方法で製造したステビア発酵液１及び３は、鶏の飼育にも有効であることが判明した。
【０１６０】
【表３】
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【受託番号】
【０１６１】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６１９
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２０
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６２１
【配列表】
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