(57)【要約】【課題】細胞等の生物学的試料に対して侵襲性の低いダイセクション装置およびダイセクション方法を提供すること。【解決手段】平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離すための超音波ダイセクション装置であって、超音波発生手段と、超音波発生手段により発生させた超音波を目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部に収束させるための超音波収束手段と、超音波収束手段により収束された超音波が目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生するように超音波発生手段を制御するためのコントローラとを備えた超音波ダイセクション装置。【選択図】図１
2010022226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離すための超音波ダイセクション装置であって、
超音波発生手段と、
超音波発生手段により発生させた超音波を目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部に収束させるための超音波収束手段と、
超音波収束手段により収束された超音波が目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生するように超音波発生手段を制御するためのコントローラと
を備えた超音波ダイセクション装置。
【請求項２】
前記コントローラは、超音波発生手段により発生させる超音波の周波数ｆ、超音波収束手段のＮＡ、及び水中超音波音速ｃｗの関係、並びに超音波の出力に基づき、超音波の継続時間を制御することを特徴とする、請求項１に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項３】
前記超音波の継続時間は、10μｓよりも長いことを特徴とする、請求項２に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項４】
生物学的対象を照明するための照明手段を更に備えた、請求項１に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項５】
前記照明手段が、生物学的対象を直接照明するように配置されていることを特徴とする、請求項４に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項６】
前記照明手段が、超音波収束手段を照明し、その散乱光により生物学的対象を照明するように配置されていることを特徴とする、請求項４に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項７】
生物学的対象を観察するための観察手段を更に備えた、請求項１または４に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項８】
前記観察手段が、生物学的試料を間に挟んで、超音波収束手段と向かい合うように配置されていることを特徴とする、請求項７に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項９】
生物学的対象を観察するための観察手段を所定の位置に配置するための手段を更に備えた、請求項１または４に記載の超音波ダイセクション装置。
【請求項１０】
平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離すための超音波ダイセクション方法であって、
目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部に超音波を収束させる工程と、
収束超音波により、生物学的対象を含む溶液中に目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生させ、目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離す工程
を含む方法。
【請求項１１】
複数の生物学的対象から目的の生物学的対象を切り離した後、それ以外の生物学的対象を担体上から排除し、目的の生物学的対象のみを担体上に残す工程を更に含む、請求項１０に記載の超音波ダイセクション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平坦な担体上に配置された複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより複数の生物学的対象から目的の生物学的対象を切り離すための超音波ダイセクション装置および超音波ダイセクション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一又は少数の細胞、あるいは微小な生体組織を採取して、その中の遺伝子を解析する研究が近年盛んになっている。例えば、癌組織中の細胞をマイクロダイセクションにより採取し、癌細胞のみの遺伝子発現を解析したり、隣り合う神経細胞の個々における遺伝子発現レベルを解析したりする研究がなされている。とりわけ、癌細胞、神経細胞、胚細胞、幹細胞などにおいて、単一細胞レベルで解析を行うことが重要となってきており、単一細胞や微小な生体組織等の生体試料を採取する技術は、その後の解析の精度を左右する重要な技術である。
【０００３】
細胞群のなかから必要な細胞を切り出すダイセクション技術として、これまでに、UVレーザーによるカッティング（特許文献１および２）、IRレーザーによる熱で、細胞に接触させた接着剤の面に接着する方法(特許文献３）、振動を与えた細い棒で細胞を切る方法（特許文献４）等が知られている。しかし、UVレーザーによる方法は生細胞に対する光毒性の問題があり、IRレーザーによる方法は発熱の問題があり、生細胞に適用するのは難しい。また、振動を与えた細い棒を用いる方法は生細胞に適用可能であるが必要な細胞を正確に取り出す精度に欠けている。また、この方法は、マニピュレータでの操作のため、高度な手技が必要である。
【０００４】
また、収束超音波により水中に音響流を発生させることができることは知られているが（非特許文献１）、これが細胞ダイセクションに利用可能であることは知られていない。
【特許文献１】特開２００２−１５６３１６号公報
【特許文献２】米国特許第５９９８１２９号明細書
【特許文献３】特許第３７８６７１１号公報
【特許文献４】特開２００４−３０５４４１号公報
【非特許文献１】社団法人電子情報通信学会  信学技報  UE93-93，EA93-93（1994-01）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞等の生物学的試料に対して侵襲性の低いダイセクション装置およびダイセクション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、収束超音波により液体中に発生させた音響流が、細胞のダイセクションを引き起こすことができることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、一つの側面によれば、
平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離すための超音波ダイセクション装置であって、
超音波発生手段と、
超音波発生手段により発生させた超音波を目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部に収束させるための超音波収束手段と、
超音波収束手段により収束された超音波が目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生するように超音波発生手段を制御するためのコントローラと
を備えた超音波ダイセクション装置である。
【０００８】
別の側面によれば、本発明は、
平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離すための超音波ダイセクション方法であって、
目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部に超音波を収束させる工程と、
収束超音波により細胞培養液中に目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生させ、目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離す工程
を含む方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細胞に対して侵襲性の低い新規ダイセクション装置および方法が提供される。本発明の装置は、高度な手技を必要とすることなく、正確に細胞の切り出しが可能であり、一細胞レベルで目的の細胞のダイセクションを行うことが可能であるという点で優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、「ダイセクション」とは、平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象から目的の生物学的対象を切り離すことを意味し、ここで切り離される生物学的対象は、一つであってもよいし、複数であってもよい。本発明において「生物学的対象」は、平坦な担体上に広がった任意の生物学的試料であり、たとえば、平坦な担体上に単層に広がった任意の細胞であり、これは、細胞を平坦な担体上で平面上に増殖させることにより得ることができる。あるいは、「生物学的対象」は、生体組織より切除され、平坦な担体上に置かれた組織切片であってもよい。「担体」は、生物学的対象を含む溶液を保持する平坦な担体であり、たとえば、生物学的対象を含む溶液を保持する平板状の基板（たとえばAmpliGrid （Advalytix社製））であってもよいし、底面が平坦であって、かつ可視光を透過させる透明な面からなる任意の容器、たとえばシャーレ等であってもよい。
【００１１】
１．超音波ダイセクション装置
［第１の実施の形態］
以下、本発明の第１の実施の形態に係る超音波ダイセクション装置について、図１を参照して説明する。なお、以下の説明は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するためのものではない。
【００１２】
図１に示すように、本実施の形態の超音波ダイセクション装置は、下記の構成を具備する：
超音波発生手段１；
超音波発生手段１により発生させた超音波を収束させるための超音波収束手段２；
超音波収束手段２により収束された超音波が音響流を発生するように超音波発生手段を制御するためのコントローラ３；
超音波収束手段２を駆動するための駆動部４；
生物学的対象を含む溶液を保持する担体を載せる試料台５；
生物学的対象を照明するための照明手段６；
生物学的対象を観察するための観察手段７。
【００１３】
以下、第一の実施の形態に係る装置の各構成および動作について、先に挙げた構成の順に説明する。
【００１４】
超音波発生手段１は、超音波を発生させる。図１において超音波発生手段１は、所定周波数の高周波信号（電気信号）を発生、送信する信号発生・送信機１ａと、この電気信号を音波に変換するトランスデューサ（電気−音響変換素子）１ｂとから構成される。信号発生・送信機１ａは、図５に示されるとおり、電気信号の発生を行う信号発生機１１ａ−１と、任意波形発生器１３からの出力波形に基づいて電気信号の長短を制御するＲＦスイッチ１１ａ−２と、出力（パワー）の増幅を行うパワーアンプ１１ａ−３と、パワーアンプ１１ａ−３とその後段のトランスデューサ１ｂをつなぐコネクタ１１ａ−４とから構成される。トランスデューサ１ｂは、高周波信号（電気信号）に対応した音波を、超音波伝搬媒体（サファイア等）を介して、超音波収束手段２に伝播する。トランスデューサ１ｂには、ＺｎＯやＬｉＮｂＯ3などがスパッタまたは接着されている。
【００１５】
超音波収束手段２は、超音波発生手段１により発生させた超音波を収束させる。超音波収束手段２は、音響レンズであり、その超音波出射端面が四球面を形成している。超音波収束手段２は、トランスデューサ１ｂからの超音波（ＵＷ）を、所定の焦点位置（目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部）で収束するように偏向し、出射させる。なお、ここでいう境界部は、目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象の境界線上だけでなく、境界線近傍（主に目的の生物学的対象の外側）も含んでいる。
【００１６】
超音波発生手段と超音波収束手段の一例を図２に示す。図２において超音波発生手段は、電気信号を発生、送信する信号発生・送信機１１ａと、発生させた電気信号を音波に変換するＺｎＯ薄膜トランスデューサ１１ｂと、音波を音響レンズへと伝播する超音波伝搬媒体（サファイアロッド）１１ｃから構成される。信号発生・送信機１１ａは、信号発生機１１ａ−１と、ＲＦスイッチ１１ａ−２と、パワーアンプ１１ａ−３と、コネクタ１１ａ−４とから構成される。トランスデューサ１１ｂは、好ましくは、音響レンズの反対面に音響レンズと同程度のサイズに形成される。図２において超音波収束手段は、その超音波出射端面が凹球面で、SiO2 ARコートされている音響レンズ１２である。ダイセクションされる細胞１９は、ディッシュ１８内の細胞培養液２０中で増殖させることにより調製し、試料台１５上に置かれる。図２は、音響レンズ１２により収束された超音波を、目的の細胞とそれ以外の細胞との境界部上に照射した様子を示す。
【００１７】
コントローラ３は、超音波収束手段２により収束された超音波が目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生するように超音波発生手段１を制御するための手段である。本発明のダイセクションにおいてかかる音響流の発生は必須であるため、コントローラ３は重要である。
【００１８】
「音響流」とは、収束超音波により液体中に発生する細い液体の流れを意味する。「目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流」は、「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」である。かかる音響流は、超音波の非線形効果により発生する液体の流れであり、その収束スポット径（生物学的対象に作用する部分でとった断面における外径）は個々の生物学的対象のサイズより小さいサイズ（20μｍ以下、好ましくは5μｍ程度）を有し、生物学的対象を互いに切り離す圧力を有する流れである。
【００１９】
コントローラ３は、「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」を発生する超音波を射出するように電気信号を制御する。音響流を発生する超音波を射出するための電気信号は、所定の時間持続される単一周波数の電気信号（バースト波）である。具体的には、コントローラ３は、電気信号を制御し、これにより超音波の周波数、射出時間、および出力（パワー）等の制御を行う。たとえば、コントローラは、超音波発生手段１により発生させる超音波の周波数ｆ、超音波収束手段２のＮＡ、及び水中超音波音速ｃｗの関係、並びに超音波の出力に基づき、超音波の継続時間を制御する。図５において、コントローラである任意波形発生器１３は、図６に示す信号をＲＦスイッチ１１ａ−２に印加することにより、任意の継続時間のバースト波を発生させることができる。すなわち、任意波形発生器１３は、射出時間のコントローラとして機能する。なお、任意波形発生器１３のかわりに電気信号の制御プログラムと制御信号発生手段を備えたコンピュータと、このコンピュータによる制御が可能な電気信号発生・送信機により、超音波の周波数、射出時間、および出力（パワー）等を制御してもよい。
【００２０】
駆動部４は、超音波収束手段２をＸＹＺ軸方向に駆動する。駆動部４は、超音波を生物学的対象の所望の位置（目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部）に照射するために超音波収束手段２をＸＹ軸方向（水平方向）に駆動するとともに、超音波が生物学的対象上の適切な高さで収束されるように超音波収束手段２をＺ軸方向（音波軸方向）に駆動する。なお、超音波を生物学的対象の所望の位置で収束させるために、本実施の形態では超音波収束手段をＸＹＺ軸方向に駆動するが、後述の試料台５を駆動させてもよい。
【００２１】
試料台５は、生物学的対象を含む溶液を保持する担体を載せるための平らなステージである。試料台５は、その下方から細胞を観察可能なように倒立顕微鏡のステージと同じ構成を有していることが好ましい。
【００２２】
照明手段６は、生物学的対象を明瞭に観察するために生物学的対象を照明する。照明手段は、具体的には光源である。後述の観察手段（顕微鏡）のコンデンサレンズのNAは、超音波収束手段（音響レンズ）のNAより小さく、試料を照明することは難しいため、観察手段（顕微鏡）を備えている場合であっても、本発明のダイセクション装置は照明手段を別途備えていることが好ましい。照明手段は、生物学的対象を一方向から照明する一つの光源から構成されていてもよいし、生物学的対象を種々の方向から照明するように環状に配置された複数の光源から構成されていてもよい。また、照明手段は、図３に示すとおり、生物学的対象を直接照明するように配置されていてもよいし、図４に示すとおり、超音波収束手段である音響レンズの超音波出射端面を照明し、その散乱光により生物学的対象を照明するように配置されていてもよい。
【００２３】
観察手段７は、生物学的対象を観察するための手段であり、具体的には光学顕微鏡対物レンズであり、好ましくは倒立顕微鏡対物レンズである。観察手段７は、対物レンズ以外の光学顕微鏡の構成（たとえば撮像装置）を備えていてもよい。本発明のダイセクション装置は、観察手段を備えていてもよいし、観察手段を備えていない場合、既存の観察手段を所定の位置に配置し組み合わせるための手段を設けてもよい。本発明の装置が観察手段を備えていない場合、既存の観察手段と組合せて使用することができるよう、音響レンズの音軸上の超音波放射方向に観察手段の少なくとも一部（対物レンズなど）を配置するためのスペース、治具等を有していることが望ましい。
【００２４】
２．超音波ダイセクション方法
本発明の超音波ダイセクション方法は、平坦な担体上に広がった複数の生物学的対象を含む溶液に対して、収束超音波により音響流を発生させ、これにより複数の生物学的対象から目的の生物学的対象を切り離すための方法であって、
（１）目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部（境界線上だけでなく、境界線近傍（主に目的の生物学的対象の外側）も含む）に超音波を収束させる工程と、
（２）収束超音波により、生物学的対象を含む溶液中に目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流を発生させ、目的の生物学的対象とその他の生物学的対象とを相対的に切り離す工程
を含む。
【００２５】
上記方法は、本発明の超音波ダイセクション装置を用いて行うことができる。以下、工程順に説明する。
【００２６】
（１）超音波を収束させる工程
超音波ダイセクション装置の超音波発生手段により発生させた超音波（ＵＷ）を、超音波収束手段である音響レンズにより、所定の焦点位置（目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部）で収束させる。所定の焦点位置で超音波を収束させるためには、音響レンズを所定の位置に配置する。この位置決めは、観察手段で生物学的対象を観察しながら、音響レンズ自体をＸＹＺ軸方向に駆動するか、もしくは試料台をＸＹＺ軸方向に駆動することにより行うことができる。
【００２７】
音響レンズのＺ軸方向（音波軸方向）における位置調整は、収束超音波を試料溶液に照射し、「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」を試料溶液中で発生させるために重要である。すなわち、音響レンズとダイセクションされる生物学的対象との間の距離は、音響レンズの焦点距離に制御される必要がある。たとえばその距離は、5ｍｍより短い距離、数ミリメートル、たとえば0.5 ｍｍに制御される。このとき音響レンズの一部（少なくとも超音波出射端面を含む部分）は、生物学的対象を含む溶液中に浸漬されている。
【００２８】
収束させた超音波の収束スポット径（生物学的対象に作用する部分でとった断面における外径）は、目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な大きさ、すなわち個々の生物学的対象のサイズより小さいサイズ（20μｍ以下、好ましくは5μｍ程度）である。
【００２９】
（２）音響流を発生させる工程
収束させた超音波から「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」、すなわち「目的の生物学的対象の相対的な切り離しに有効な収束スポット径をもつ音響流」を発生させるためには、上述のとおり、超音波の周波数、射出時間、および出力（パワー）等に関して適切に設定する必要がある。
【００３０】
超音波の周波数は、「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」を発生させるように当業者により適宜設定されるが、非特許文献１（社団法人電子情報通信学会  信学技報 US93-93，EA93-93（1994-01)）に音響流を発生させる周波数として記載される値「5ＭＨｚ」または「10ＭＨｚ」より高く設定することが好ましい。周波数は、たとえば数百ＭＨｚであり、後述の実施例では300ＭＨｚを使用したが、これに限定されない。
【００３１】
超音波の射出時間（以下、継続時間ともいう）は、「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」を発生させるように当業者により適宜設定されるが、一般的には、音響流を生成させるための時間が必要であり、これは、超音波顕微鏡で使用される数μｓ（たとえば約0.5μｓ）より長く、本発明の場合10μｓ以上の時間が必要である。後述の実施例にある通り、細胞の切り離しに必要な最低の継続時間は、出力（パワー）によって異なるが、出力（パワー）の増大に伴い際限なく継続時間が短くなるのではなく、10μｓ程度に漸近することが本発明者らにより見出されている。ただし、音響流を発生させた後、必要以上に超音波を射出しつづけると、音響流の流れの幅が拡大し、生物学的対象を切り離すことが可能な狭小な幅の音響流ではなくなるため、射出時間を長くしすぎるのは好ましくない。射出時間は、たとえば数百μｓ〜数百ｍｓであり、後述の実施例では400μｓまたは300μｓを使用したが、これに限定されない。
【００３２】
超音波の出力（パワー）は、「生物学的対象のダイセクションを行うことが可能な音響流」を発生させるように当業者により適宜設定されるが、一般的には、上述の音響流を発生させる高パワー、すなわち超音波の非線形効果を生じさせる高パワーが必要である。上述の音響流を発生させるために、本発明において超音波は好ましくは高パワーで用いられる。後述の実施例では、電気信号のパワーとして、0.4〜1.0Ｗのパワーを使用したが、これに限定されない。ただし、技術的に、0.4〜1.0Ｗのすべてが音響流の発生に利用されるわけではない。すなわち、超音波発生手段により発生させた電気信号は、そのすべてが音波に変換されず、一部は失われる。また、音響レンズにより収束された超音波は、反射等のため一部は失われ、そのすべてが音響流の発生に利用されるわけではない。
【００３３】
本発明において、超音波発生手段の周波数（ｆ）、超音波収束手段（音響レンズ）の開口数（ＮＡ）、水中超音波音速ｃｗ＝1500ｍ／ｓについて、ｃｗ／２（ｆＮＡ）＜20μｍ＊の関係式を満たすとともに、（＊Sparrowの定義の分解能）、超音波を継続時間10μｓ以上かけることが好ましい。
【００３４】
目的の生物学的対象をその他の生物学的対象から相対的に切り離すために、必要であれば、目的の生物学的対象とそれ以外の生物学的対象との境界部に複数回〈たとえば、目的の生物学的対象の切り離しが確認できるまで）超音波照射を行う。
【００３５】
複数の生物学的対象から目的の生物学的対象を切り離した後、それ以外の生物学的対象を、より射出時間の長い超音波照射により広範囲にわたって音響流を発生させて担体上から排除し、目的の生物学的対象のみを担体上に残してもよい。目的以外の生物学的対象は、超音波のパワーを上げたり、照射時間を増加させたりすることにより排除効率を高めることができる。
【実施例】
【００３６】
実施例１
図５に示される超音波ダイセクション装置を用いて細胞のダイセクションを行った例を以下に記す。
【００３７】
図５のダイセクション装置は、電気信号を発生する信号発生機１１ａ−１と、先に説明したように射出時間を制御可能な任意波形発生器１３と、ＲＦスイッチ１１ａ−２と、電気信号を増幅するパワーアンプ１１ａ−３と、発生させた電気信号を音波に変換するＺｎＯ薄膜トランスデューサ１１ｂと、音波を音響レンズへと伝播するサファイアロッド１１ｃと、音波を収束する音響レンズ１２と、音響レンズ１２を駆動するための駆動部１４と、細胞１９を含む細胞培養液２０を収容するディッシュ１８を載せる試料台１５と、細胞を観察するための倒立型顕微鏡の対物レンズ１７とから構成される。
【００３８】
図６は、図５のダイセクション装置において、信号発生機により発生させた電気信号からバースト波が形成される様子を示す。すなわち、図６は、信号発生機により発生させた単一周波数の電気信号が、任意波形発生器により所定の継続時間のみ出力されるように制御され、バースト波が形成されることを示す。
【００３９】
以下、実験手順の詳細を記す。
【００４０】
倒立型顕微鏡の対物レンズ１７を細胞位置から、ＷＤ（作動距離）分上昇させた。この操作により音波は細胞位置で焦点距離を結ぶことになる。次いで対物レンズを音響レンズ最深部に合焦して、合焦位置が観察面中心位置になるように水平位置調整した。
【００４１】
細胞に合焦し直し、周波数300ＭＨｚ、継続時間400μｓの信号を介して1Ｗ弱で試し打ちを行い、さらに位置調整を行った。具体的には、信号発生機１１ａ−１から周波数300ＭＨｚの信号を出し、任意波形発生器１３によりＲＦスイッチ１１ａ−２の入力フォーマットに従った信号を与えることで300ＭＨｚの信号を所定の継続時間（＝射出時間）のバースト波にした。バースト波は、パワーアンプ１１ａ−３で増幅されてトランスデューサ１１ｂで音波平面波に変換された。この平面波は、音響レンズ１２を通って細胞培養液２０中で収束音波になり、細胞１９付近で収束された。ここで周波数、継続時間、パワーが適切であれば、音響レンズ直下の１個の細胞に作用する細い音響流を形成することができる。本実施例では、300ＭＨｚの周波数、400μｓの継続時間、0.4〜1.0Ｗの入射パワーを使用した。このパワーは、電気信号のパワーであり、トランスデューサでのロス、音響レンズでのロスは考慮に入れていない。
【００４２】
調整終了後、目的の細胞（群）を選択して、目的の細胞と隣接する細胞との境界部を、細胞ごとに数回超音波照射することにより、目的の細胞と隣接する細胞を切り離した。目的の細胞から離れた領域の細胞については、パワーを上げる、音響レンズを細胞から離す方向にデフォーカスする、継続時間を増加させる等の方法により、広い領域の細胞群を一括で除去し、これにより目的の細胞以外の細胞を除去した。除去された細胞は細胞培養液に浮遊しているため液交換により取り除いた。以上の手順により、目的細胞のみを担体上に残すことに成功した。
【００４３】
この実験結果を図７に示す。図７の上の写真は、ダイセクション前の細胞を示し、下の写真はダイセクション直後の細胞を示す。図７は、目的の細胞が隣接する細胞と切り離されたことを示す。なお、本実施例では、複数の目的の細胞をそれ以外の細胞と切り離しているが、下記実施例２に示すとおり、本発明の方法に従って、単一の目的の細胞をそれ以外の細胞と切り離すことも可能である。
【００４４】
実施例２
本実施例では、本方法で目的の細胞１個をその他の細胞と切り離したときに、本方法による細胞に対するダメージが少ないことを確認する実験を行った。
【００４５】
上記実施例１と同じ実験配置で、実施例１と同様の手順に従って細胞ダイセクションを行った。実験パラメータは300MHz、2.5W、継続時間300μsである。ダイセクション後、細胞は、そのまま容器内に翌日まで保存した。
【００４６】
結果を図８に示す。図８は上から順に、超音波ダイセクション前、直後、１日後の画像である。ダイセクション１日後には、細胞は１回の分裂を行ったことが観察され、ダイセクションによるダメージが少ないことが実証された。
【００４７】
実施例３
本実施例では、目的の細胞をその他の細胞と切り離すために必要な超音波の最小継続時間を、電気信号の出力を変化させて調べた。本実施例も、上記実施例１と同じ実験配置で、同様の手順に従って行った。
【００４８】
継続時間は音響流を十分成長させるのに重要なパラメータである。ある程度以下の継続時間では、音響流を十分に成長させられず、音響流は細胞を切り離し可能な速度に到達しないと考えられる。この最小継続時間を調べるために、入力パワーを変化させたときの、細胞を切り離し可能な最低の継続時間を調べた。
【００４９】
結果を図９に示す。グラフは10μsに漸近しており、10μsが最小継続時間であることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る超音波ダイセクション装置を示す図。
【図２】超音波発生手段と超音波収束手段の一例を示す図。
【図３】生物学的対象を直接照明するように配置された照明手段を備えた超音波ダイセクション装置を示す図。
【図４】音響レンズの超音波出射端面を照明するように配置された照明手段を備えた超音波ダイセクション装置を示す図。
【図５】実施例で使用した超音波ダイセクション装置を示す図。
【図６】信号発生機により発生させた電気信号、任意信号発生器の信号と、それによりＲＦスイッチから出力される信号のタイムチャート。
【図７】超音波ダイセクションの結果を示す写真。
【図８】超音波ダイセクションの結果を示す写真。
【図９】超音波の継続時間に関する実験結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００５１】
１…超音波発生手段、１ａ…信号発生・送信機、１ｂ…トランスデューサ、２…超音波収束手段、３…コントローラ、４…駆動部、５…試料台、６…照明手段、７…観察手段、
１１ａ…信号発生・送信機、１１ａ−１…信号発生機、１１ａ−２…ＲＦスイッチ、１１ａ−３…パワーアンプ、１１ａ−４…コネクタ、１１ｂ…ＺｎＯ薄膜トランスデューサ、１１ｃ…サファイアロッド、１２…音響レンズ、１３…任意波形発生器、１４…駆動部、１５…試料台、１７…対物レンズ、１８…ディッシュ、１９…細胞、２０…細胞培養液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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