(57)【要約】【課題】  乳癌患者に対して有効な治療を行うための乳癌サブタイプを検出する方法を提供すること、および該乳癌サブタイプに有効な医薬を提供することをその主な課題とする。【解決手段】  被験者由来の癌細胞において、染色体１ｐ１３．２領域、染色体の１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以上の増加、あるいは染色体１２ｑ１５領域、および染色体１６ｐ１１．２領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以下の減少を指標として選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することにより、ＥＲ、ＰｇＲの状態を推定し、乳癌サブタイプの検出方法を提供する。さらに、予後不良の乳癌サブタイプに有効な医薬品として、ＩＮＦγを提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の癌細胞において、染色体１ｐ１３．２領域、染色体の１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、染色体１２ｑ１５領域、染色体１６ｐ１１．２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することを特徴とする、乳癌サブタイプの検出方法。
【請求項２】
被験者由来の癌細胞において、染色体１ｐ１３．２領域、染色体の１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以上の増加、あるいは染色体１２ｑ１５領域、および染色体１６ｐ１１．２領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以下の減少を指標として選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
被験者由来の癌細胞において、下記のいずれかの状態を推定することを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
ａ）染色体の１６ｐ１３．３領域のＤＮＡコピー数増加が、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋；
ｂ）染色体１ｐ１３．２領域、染色体１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、および染色体１０ｐ１１．２２領域の何れかの領域におけるＤＮＡコピー数増加、および／または染色体１６ｐ１１．２領域のコピー数減少が、ＥＲ−／ＰｇＲ−；および、
ｃ）染色体１２ｑ１５領域におけるＤＮＡコピー数の減少が、ＥＲ−／ＰｇＲ−、かつＨＥＲ２遺伝子発現増幅が陰性。
【請求項４】
被験者由来の癌細胞において、染色体１２ｑ１５領域におけるＤＮＡコピー数の減少が、インターフェロンγ遺伝子のＤＮＡコピー数の減少を推定することを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
被験者由来の癌細胞が、ＥＲ−／ＰｇＲ−であり、かつＨＥＲ２遺伝子発現増幅が陰性である乳癌サブタイプのための治療薬であって、インターフェロンγを含有する医薬品。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、乳癌サブタイプの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌のサブタイプの検出方法に関し、詳しくは、特定の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の増減によるホルモンレセプターの発現状態を指標として、乳癌のサブタイプおよび薬剤治療適応性を検出する方法、該方法の指標となる染色体領域の検出方法、および該サブタイプに有効な医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、先進国女性の死亡者数において大きな割合を示している。一般的に、癌は遺伝子を含むゲノムの異常の蓄積によって生じると考えられている。癌の発生や進展との関係についての概要は一部の癌では明らかとなっているものの、乳癌の生物学的特性とゲノムの異常との関係についての情報は依然として極めて乏しいのが現状である。
【０００３】
乳癌は、特に早期に検出されなければ死亡率が顕著に高まる癌種である。死亡率を減少させるために、早期発見と適切な処置が必須である。それには困難を伴うが、個々の患者に最適な治療法を決定することが重要である。現在、乳癌の検診では、エストロゲンレセプター（ＥＲ）やプロゲストロンレセプター（ＰｇＲ）の状態を従来の組織学的診断で検査し、一般的にエストロゲンレセプターが発現している状態（ＥＲ＋）の腫瘍は、タモキシフェンなどのエストロゲン拮抗物質や、レトロゾールなどのアロマターゼ阻害物質で治療を行っている。生物学的特性は、ホルモンレセプターの発現状態と一致しない腫瘍もあるが（例えば、非特許文献１、２参照。）、乳癌の生物学的特性には、ホルモンレセプターの発現状態が影響している（例えば、非特許文献３、４参照。）。
【０００４】
ＥＲの発現状態が明らかになっている腫瘍について、２つの異なる方法により初期の発癌状況を決定した報告では、エストロゲンレセプターとプロゲストロンレセプターが発現している状態（ＥＲ＋／ＰｇＲ＋）の腫瘍と比較して、エストロゲンレセプターとプロゲストロンレセプターが発現していない状態（ＥＲ−／ＰｇＲ−）の腫瘍が、一般的に高い再発と、予後不良が認められることを確認している（例えば、非特許文献５参照。）。癌の生物学的特性は、主に癌細胞のゲノムの変異によるが、ホルモンレセプター発現状態に関連したゲノム異常の同定は、生物学的特性とホルモンレセプター状態との関係の一致が重要である。このため、ゲノム異常の網羅的分析が、乳癌のサブタイプ確認に必要とされている。
【０００５】
ＥＲ−は予後のマーカーではないとされている（例えば、非特許文献５、６参照。）。特許文献１では、乳癌患者の染色体数を測定することにより、染色体不安定性（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ：ＣＩＮ）を検出し、悪性度の高い乳癌ではＣＩＮが高いと報告しているが、ＥＲとの関連性は明確には出ていない。しかしながら、ＥＲ＋は一般的に予後のマーカーと考えられる。ＥＲの発現状態は、アジュバント  タモキシフェン処理のようなホルモン療法の予測のためにも有用であり、さらに、ＥＲと同様にＰｇＲも、ホルモン療法への機能的なマーカーである。しかしながら、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍は、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋腫瘍に比較して有効な治療法に乏しいのが現状である（例えば、非特許文献７参照。）。
【０００６】
近年、特に乳癌の予後ならびに治療効果を予測する重要な因子として注目を集めているのが、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）である。ＨＥＲ２は、チロシンキナーゼ受容体であり、正常細胞において細胞の増殖、分化などの調節に関与しているが、何らかの理由でこのタンパクをコードするＨＥＲ２遺伝子の増幅や遺伝子変異が起こると、細胞の増殖・分化の制御ができなくなり、細胞は悪性化する。乳癌においては、ＨＥＲ２遺伝子が高い頻度で過剰発現していることが認められ、ＨＥＲ２遺伝子の過剰発現は、乳癌の予後ならびに治療効果を予測する重要な指標として認識されている。
【０００７】
ゲノム異常の網羅的解析に関する技術として、アレイ化した比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａＣＧＨ）が有力である。全ての癌細胞のゲノムについて、ａＣＧＨを用い、ＤＮＡコピー数の異常について高度な解析をした報告もあり（例えば、非特許文献８，９参照。）、特別な表現型の特徴と結びつけて、ゲノム異常の同定を容易にするという報告がある（例えば、非特許文献９，１０参照。）。本発明者らは、先に、ａＣＧＨを用いて染色体異常を検出することにより、悪性上皮腫瘍（ＡＣＣ）における悪性度を検出して、薬剤適応性を判定する方法、該判定の指標となる染色体領域および遺伝子の検出方法を報告した（特許文献２参照。）。乳癌の悪性度と染色体異常については、すでに報告があり、増幅したＲＮＡから調整したｃＤＮＡのマイクロアレイを用い、ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性の乳癌患者から遺伝子異常を見出し、異常遺伝子を乳癌のタイプを決定する方法（例えば、特許文献３参照。）、ＥＲ、ＰｇＲ状態を明らかにした胸癌患者の２０ｑ１３．２領域内における染色体異常を検出する方法（例えば、特許文献４参照。）が報告されている。しかし、これらの報告では、染色体異常と、ＥＲ状態、ＰｇＲ状態、およびゲノム異常との関係による判定については明らかにされていない。
【０００８】
乳腺細胞中のインターフェロンγ（ＩＮＦγ）は、乳癌細胞を含む細胞株の生育を阻害する（例えば、非特許文献１１参照。）。そのため内在性のＩＮＦγの欠如は、乳癌細胞の成長を促すことになると報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）。しかしながら、ホルモンレセプター状態とＩＮＦγの関係は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−８８８４６号公報(表１)
【特許文献２】特開２００６−１１５８４４号公報(表１、表２)
【特許文献３】特開２００５−２７００９３号公報(図１)
【特許文献４】特開２００８−２８３９７０号公報(表４)
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｉｃｈｔｎｅｒ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ.４０：８４５−８５１，２００４
【非特許文献２】Ｊｏｒｄａｎ  ＶＣ，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０：５５３−５６２，２００６
【非特許文献３】Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２１６：３９４−３９８，２００８
【非特許文献４】Ｐｏｌｙａｋ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：３１５５−３１６３，２００７
【非特許文献５】Ｐｕｔｔｉ  ＴＣ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１８：２６−３５，２００５
【非特許文献６】Ｔｓｕｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：１２１−１３２，２００８
【非特許文献７】Ｗｉｎｅｒ  ＥＰ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ.８：１６０９−ａ−１６１０，２００５
【非特許文献８】Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＤＧ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１２（２）：Ｒ１４５−１５２，２００３
【非特許文献９】Ｐｏｌｌａｃｋ  Ｊ．Ｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２１６：３９４−３９８，２００８
【非特許文献１０】Ｓｈｉｎａｗｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．１３：７６０−７７０，２００８
【非特許文献１１】Ｇａｒｃｉａ−ｔｕｎｏｎ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．７：１５８，２００７
【非特許文献１２】Ｄｏｈｅｒｔｙ  ＧＭ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ．２３３：６２３−６２９，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、乳癌患者に対して有効な治療を行うための乳癌サブタイプを検出する方法を提供すること、および該乳癌サブタイプに有効な医薬を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、乳癌患者の細胞組織を材料として、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）法により、特定染色体領域のＤＮＡコピー数の増減を検出し、免疫組織化学的手法で確認したＥＲ及びＰｇＲの発現状態や、ＨＥＲ２遺伝子の発現状態との関連から、予後不良タイプの乳癌で特徴的に異常を示す染色体領域を見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【００１４】
（１）被験者由来の癌細胞において、染色体１ｐ１３．２領域、染色体１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、染色体１２ｑ１５領域、染色体１６ｐ１１．２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することを特徴とする、乳癌サブタイプの検出方法。
【００１５】
（２）被験者由来の癌細胞において、染色体１ｐ１３．２領域、染色体の１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以上の増加、あるいは染色体１２ｑ１５領域、および染色体１６ｐ１１．２領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以下の減少を指標として選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することを特徴とする、上記（１）に記載の検出方法。
【００１６】
（３）被験者由来の癌細胞において、下記いずれかの状態を推定することを特徴とする、上記（２）に記載の検出方法。
ａ）染色体の１６ｐ１３．３領域のＤＮＡコピー数増加が、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋；
ｂ）染色体１ｐ１３．２領域、染色体１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、および染色体１０ｐ１１．２２領域の何れかの領域におけるＤＮＡコピー数増加、および／または染色体１６ｐ１１．２領域のコピー数減少が、ＥＲ−／ＰｇＲ−；および、
ｃ)染色体１２ｑ１５領域におけるＤＮＡコピー数の減少が、ＥＲ−／ＰｇＲ−、かつＨＥＲ２遺伝子発現増幅の陰性。
【００１７】
（４）被験者由来の癌細胞において、染色体１２ｑ１５領域におけるＤＮＡコピー数の減少が、インターフェロンγ遺伝子のＤＮＡコピー数の減少を推定することを特徴とする、上記（２）に記載の検出方法。
【００１８】
（５）被験者由来の癌細胞が、ＥＲ−／ＰｇＲ−であり、かつＨＥＲ２遺伝子発現増幅が陰性である乳癌サブタイプのための治療薬であって、インターフェロンγを含有する医薬品。
【００１９】
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、乳癌サブタイプの検出用キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、特定の染色体領域のＤＮＡコピー数の増加や減少から、ホルモンレセプターの発現状態や特定の遺伝子の発現状態を推定できるため、乳癌のサブクラスを把握でき、該乳癌サブクラスに有効な治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】個々の染色体領域におけるＤＮＡコピー数変化の頻度を示した図である。
【図２】乳癌患者におけるホルモンレセプターの状態と、個々の染色体領域のＤＮＡコピー数変化を示した図である（Ａ：２８例のＰｇＲ＋腫瘍、Ｂ：１８例のＰｇＲ−腫瘍）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
癌患者において、予後良好とは、最初の診断から５年以内に転移が起こらない癌の状態であり、予後不良とは、５年以内に転移が起こる、もしくは、すでに転移している末期癌の状態を示す。通常の乳癌における抗癌剤の有効性は、ホルモンレセプターの有無に左右され、ホルモンレセプターが存在する場合は、抗癌剤の有用性が高い場合が多く、一般的には予後良好となる。さらに、ＨＥＲ２遺伝子の発現状態の有無を確認することにより、抗ＨＥＲ２薬剤の乳癌治療への効果を推定することができる。
【００２３】
乳癌における抗癌剤の有効性を左右するホルモンレセプターとは、エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびプロゲストロンレセプター（ＰｇＲ）をあげることができる。乳癌患者の癌細胞は、免疫組織化学的に評価することによって、エストロゲンレセプターが発現している状態（ＥＲ＋）、エストロゲンレセプターが発現していない状態（ＥＲ−）、プロゲストロンレセプターが発現している状態（ＰｇＲ＋）、プロゲストロンレセプターが発現していない状態（ＰｇＲ−）を確認することができ、癌細胞のタイプは、２つのホルモンレセプターの発現状態から、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋（エストロゲン・プロゲストロンレセプターがともに発現している状態）、ＥＲ＋／ＰｇＲ−（エストロゲンレセプターが発現し、プロゲストロンレセプターが発現していない状態）、ＥＲ−／ＰｇＲ＋（エストロゲンレセプターが発現せず、プロゲストロンレセプターが発現している状態）、およびＥＲ−／ＰｇＲ−（エストロゲン・プロゲストロンレセプターがともに発現していない状態）に分類することが出来る。本発明の乳癌サブタイプとは、上記４種のホルモンレセプターの状態を示す乳癌のタイプをいう。ＨＥＲ２遺伝子発現状態の有無は、乳癌サブタイプでの抗ＨＥＲ２薬剤の効果を推定するためのマーカーと捉えることができる。
【００２４】
ＥＲが多い患者ほど，予後は良好とされ、乳癌治療を受けている患者の約７０％はＥＲ＋で、このうち約６０％にホルモン療法が有効であるが、ＥＲ−腫瘍の場合では、有効率は低い。ＰｇＲもＥＲと同程度に予後因子、予測因子として重要であると考えられており、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋の患者には、ホルモン療法の高い効果が認められている。対して、ＥＲ−／ＰｇＲ−の患者には、ホルモン療法の効果が認められないことが知られている。
【００２５】
乳癌のサブタイプに分類されるＥＲとＰｇＲの状態を検出する方法としては、免疫組織化学的手法が好ましい手法である。免疫組織化学的手法は、抗原−抗体反応という特異的な結合反応を利用して、目的とする蛋白質の細胞内外および組織内の局在を検出する手法であり、抗原に対する特異的抗体である一次抗体に酵素や蛍光物質を直接結合させて検出する方法や、一次抗体に対する抗体である二次抗体を用いて可視化する方法等がある。本発明は、上記のどちらの手法を用いることもできる。また、ここで用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良い。抗体には、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）等の蛍光物質や、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施すことにより、精度良く効率的な検出を行うことができる。これらの標識された抗体は、市販のキットを用いることもできる。
【００２６】
免疫組織化学的手法により、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋、ＥＲ＋／ＰｇＲ−、ＥＲ−／ＰｇＲ＋、ＥＲ−／ＰｇＲ−のサブタイプに分類した乳癌の組織について、各組織の染色体不安定性（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＣＩＮ）や、ＤＮＡ量のインデックス（ＤＩ）としてのＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ（染色体分析）を測定し、関連を解析することにより、該組織の悪性度を、各ホルモンレセプター状態と関連させて確認することができる。
【００２７】
本発明は、各ホルモンレセプター状態を有する乳癌の組織について、初めに染色体ＤＮＡコピー数の増減を測定することにより、各ホルモンレセプターの状態を推定して、乳癌におけるサブタイプを検出するものである。
【００２８】
乳癌は、遺伝型―表現型の関係が研究されているため感度良く検査されている。本発明における染色体ＤＮＡコピー数の異常は、染色体上の遺伝子の異常も推定することができる。
【００２９】
乳癌組織のＣＩＮや、ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙを測定するためには、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法やＬＳＣ（Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）法を用いることができる。また被験者由来の癌細胞の染色体ＤＮＡのコピー数の増減は、染色体ＣＧＨ（ｃＣＧＨ）、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンを使用したアレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）等の方法を用いることができる。
【００３０】
ＦＩＳＨ法は、各染色体に存在する特異的な塩基配列に相補的なＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、蛍光染色によって可視化する方法である。ＣＩＮの有無は、核の間のＦＩＳＨスポットの数の変化の割合により判断することが出来る。この方法は、乳癌の予後因子とされるＨＥＲ２遺伝子を検出する方法としても有用である。ＦＩＳＨ法によるＨＥＲ２遺伝子のコピー数異常を測定する方法は、ＨＥＲ２遺伝子が存在するとされている１７番染色体について、正常細胞の１７番染色体のセントロメア部分（ＣＥＰ１７）とＨＥＲ２遺伝子の比を求めることによって、増幅の有無を判断することが出来る。ＨＥＲ２遺伝子コピー数が細胞平均２．０倍以上であるとき増幅あり、として、ＨＥＲ２遺伝子発現増幅は陽性、ＨＥＲ２遺伝子コピー数が細胞平均２．０倍未満であるとき増幅なし、として、ＨＥＲ２遺伝子発現増幅は陰性とする。
【００３１】
前記プローブはゲノムＤＮＡ断片、オリゴマー、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えば、遺伝子とハイブリダイズするよう設計させたプローブは、ポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、それらの変異体、それらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、或いは１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片からなる群から選択することができる。
【００３２】
ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙの決定は、癌細胞のＤＮＡ量をＬＳＣ法により測定し、ＤＮＡヒストグラムを作成しＤＩを算出することができる。０≦Ｄ１＜１．２の場合をｄｉｐｌｏｉｄ、Ｄ１≧１．２の場合をａｎｅｕｐｌｏｉｄ腫瘍として分類することができる。
【００３３】
ｃＣＧＨ分析法では、染色体のゲノム−ワイドの細かいスキャンで、がん細胞における多くの染色体コピー数異常、例えば１０Ｍｂの低いコピー数や、２Ｍｂの高いコピー数増幅など、ＤＮＡ配列のコピー数異常（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ：ＤＳＣＮＡ）について幅広い分析を行うことができる。
【００３４】
ａＣＧＨ法は、Ｐｉｎｋｅｌら（Ｐｉｎｋｅｌ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０：２０８−２１１，１９９８）により報告された方法で、ＣＧＨアレイ上のＢＡＣクローンを用いることにより、精度の高い分析が可能になる方法である。ａＣＧＨ法による分析は、ＢＡＣクローンをスポットした市販のものを入手して利用することも可能である。例えば、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣ  Ａｒｒａｙ（登録商標）、ＳＰＥＣＴＲＡＬ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ社のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐ（登録商標）等がある。ＭＡＣ  Ａｒｒａｙ（登録商標）の場合、アレイスライド上には全染色体を網羅する４０３０個のＢＡＣクローンがスポットされている。ＢＡＣのチップ情報は、以下のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏ．ｋｒ／ｅｎｇ／ｂｉｏｃｈｉｐ／ｋａｒｙｏ_sｕｍｍａｒｙ．ｊｓｐ）から入手することができる。
これは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ’ｓ  ＫＯＧＥＮＯＭＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔで作成されたＤＮＡ断片からなるＢＡＣクローンを、スライドガラス上にスポットしたアレイを用いて行うもので、ＢＡＣクローンとのハイブリダイゼーションにより発生した蛍光について、癌／正常の蛍光強度比を測定するものである。
【００３５】
ＢＡＣクローンと反応させる試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡは、ランダムプライム法などで標識するが、このような方法で蛍光標識する場合、癌細胞、正常細胞はそれぞれ別の色素による標識を行う。癌細胞由来の試験用ＤＮＡは、Ｃｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（Ｃｙ５：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で、正常細胞由来の対照ＤＮＡはＣｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（Ｃｙ３：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で標識することができる。試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ由来の蛍光による画像は、レーザースキャナーや、ＣＣＤカメラなどの定量的検出装置により取得し、ＣＧＨ解析用ソフトウエアにより画像解析を行うことができる。
【００３６】
ＤＮＡコピー数増減の判定においては、試験用ＤＮＡの蛍光強度を分子、対照ＤＮＡの蛍光強度を分母とする、すなわちＣｙ５／Ｃｙ３値を、対数ｌｏｇ２で表した数値を用いる。癌細胞が正常の場合は、比が１であり、数値は０となる。癌細胞で増加している場合は、比は１より大きくなりｌｏｇ２の値は正の数を示し、減少している場合は、比は１より小さくなりｌｏｇ２の値は負の数を示す。ＤＮＡコピー数の増加の判定基準は、閾値を０．２５とし、０．２５以上の場合をＤＮＡコピー数増加とすることが一般的であり、０．５以上の高レベルの増加の場合は、より精度の高い判定が可能になる。また、ＤＮＡコピー数の減少の判定基準は、−０．２５以下とすることが一般的である。
【００３７】
正常細胞と腫瘍組織の間でのクローンのコピー数の比較は、一般的にｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ（χ乗検定）で決定することができる。また、変化や頻度の総数での違いは、ｔ検定、Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ検定、ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕテストで行うことが望ましい。そこでの違いは、Ｐ値（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）として算出する。Ｐ値とは、帰無仮説が正しい場合の偶然性の確率を表し、P値が1の場合は１００％がそのようになる確率であり、Ｐ値が０．０１の場合は、偶然にそのようになる確率は１％である、という事を表す。通常の統計解析ではＰ値が０．０５より低い場合、２つの間では相違があると判定することができる。
【００３８】
本発明は、ａＣＧＨ法を用いて、染色体１ｐ１３．２領域、染色体１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の増加、あるいは染色体１２ｑ１５領域、および染色体１６ｐ１１．２領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の減少を検出し、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することにより、閾値±０．２５より大きなコピー数の異常を検出した場合、新しいタイプの乳癌と判断するものである。
【００３９】
染色体のＤＮＡコピー数の異常は、染色体上に存在する遺伝子にも異常が起こっていると推定される。異常が起きた染色体上に存在する遺伝子の情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）のデーターベースから得ることができる。
【００４０】
染色体１ｐ１３．２領域には、ＣＡＰＺＡ１遺伝子（ｃａｐｐｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）ｍｕｓｃｌｅ  Ｚ−ｌｉｎｅ，ａｌｐｈａ  １）、ＭＯＶ１０遺伝子（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  １０）、ＲＨＯＣ遺伝子（ｒａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  Ｃ）、ＰＰＭ１Ｊ遺伝子（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １Ｊ）が存在しており、ＤＮＡコピー数増加により、ＣＡＰＺＡ１遺伝子、ＭＯＶ１０遺伝子、ＲＨＯＣ遺伝子、ＰＰＭ１Ｊ遺伝子の過剰発現が起こることが推定される。ＣＡＰＺＡ１遺伝子は、筋繊維の成長をコントロールするタンパク質をコードする遺伝子であり、ＲＨＯＣ遺伝子は、細胞の運動に関係し、癌細胞の増殖や転移でこの遺伝子の過剰発現が見られている。ＰＰＭ１Ｊ遺伝子は、セリン・スレオニンリン酸化酵素をコードする遺伝子である。
【００４１】
染色体１ｐ３２．１領域には、ＭＹＳＭ１遺伝子（Ｍｙｂ−ｌｉｋｅ，ＳＷＩＲＭ  ａｎｄ  ＭＰＮ  ｄｏｍａｉｎｓ  １）が存在しており、ＤＮＡコピー数増加により、ＭＹＳＭ１遺伝子の過剰発現が起こることが推定される。
【００４２】
染色体２ｐ２５．３領域には、ＴＰＯ遺伝子（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が存在しており、ＤＮＡコピー数増加により、ＴＰＯ遺伝子の過剰発現が起こることが推定される。ＴＰＯ遺伝子は、膜結合グリコプロテインをコードする遺伝子であって、チロシン残基のヨード化など甲状腺機能では中心的に働くタンパクをコードする遺伝子である。この遺伝子の変異は、甲状腺ホルモン生成に異常をきたすとされている。
【００４３】
染色体１０ｐ１１．２２領域には、ＮＲＰ１遺伝子（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）が存在しており、ＤＮＡコピー数増加により、ＮＲＰ１遺伝子の過剰発現が起こることが推定される。ＮＲＰ１遺伝子は、血管内皮成長因子に関与するチロシンキナーゼ受容体への膜結合副受容体である。ＮＲＰ１遺伝子は、脈管形成や神経網の発達、細胞生存、細胞の遊走、細胞の浸入に対し、鋭敏なルールによる働きをすることが知られている。
【００４４】
上記ＭＹＳＭ１遺伝子、ＴＰＯ遺伝子、ＮＲＰ１遺伝子は、一般的に細胞の増殖や分化に関わるとされており、ＮＲＰ１遺伝子の高い発現レベルはいろいろな種類の癌で観察され、癌細胞の未分化の表現型を維持していると報告されている（Ｃａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：８６６７−８６７２，２００８）。
【００４５】
染色体１６ｐ１３．３領域には、ＳＯＸ８をコードする遺伝子が存在しており、ＤＮＡコピー数増加により、ＳＯＸ８遺伝子の過剰発現が起こることが推定される。ＳＯＸ８遺伝子は、胚生育の制御や細胞死の決定に関与する転写因子のペプチドをコードする遺伝子である。
【００４６】
染色体１２ｑ１５領域には、ＩＮＦγ遺伝子が存在しており、ＤＮＡコピー数減少により、ＩＮＦγ遺伝子の発現低下が起こることが推定される。ＩＮＦγ遺伝子は、タイプＩＩのインターフェロンで、ウイルスや細胞内細菌感染、あるいは癌の先天的あるいは後天的免疫制御のためのサイトカインである。ＩＮＦγ遺伝子の増殖による染色体異常は、自己炎症性症候群や自己免疫疾患で見られる。ＩＮＦγ遺伝子の重要性は、ウイルス防御における免疫システムもあるが、より重要な点は、免疫賦活や免疫抑制効果である。ＩＮＦγ遺伝子は、主にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞やナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞で生産される。
【００４７】
ヒトＨＥＲ２をコードする遺伝子は、ゲノム配列上１７番染色体長腕（１７ｑ１１．２−ｑ１２、１７ｑ２１．１）に存在する。ＨＥＲ２遺伝子を過剰発現する乳癌・卵巣癌は、予後不良であるとされている。そのため、ＨＥＲ２を標的として開発された分子標的治療薬のトラスツズマブは、ＨＥＲ２遺伝子の増幅が確認された乳癌患者に対し有効とされている。本発明は、トラスツズマブを処方できない乳癌患者を検出し、新たな処置を行うための方法である。
【００４８】
本発明のＩＮＦγを含む医薬品は、治療すべき患者の健康および治療に対する反応、乳癌組織の形態、重症度および経過について判断することによって、最も有効な投与形態および投与量が決められる。本発明のＩＮＦγを含む医薬品による乳癌治療に有効な量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）とすることができ、より好ましい投与量は、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）とすることができる。
【００４９】
本発明はまた、染色体１ｐ１３．２領域、染色体１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、および染色体１６ｐ１３．３領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の増加、あるいは染色体１２ｑ１５領域、および染色体１６ｐ１１．２領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の減少を検出するためのキットであって、このキットを用いて乳癌サブタイプを検出することができる。
【００５０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００５１】
＜乳癌組織と組織切片作成＞
山口大学病院外科から得られた、４６人の初期潜侵乳癌患者を被検体とした。全ての癌は散在性と考えられた。３１才から７５才までの患者の平均年齢は５７．６才であった。被検体の患者は外科での化学療法も放射線治療も受けていなかった。山口大学医学部倫理委員会にて承認され、全ての患者からインフォームドコンセントが得られた。癌組織から外科的に取り除いた標本部分を固定する前にタッチ−スメア標本を作製した。その後、癌組織を１０％ホルマリンに１日で固定し、免疫組織化学的手法を含む組織学的な検査を行った。タッチ−スメア標本は、ＦＩＳＨやＬＳＣでの分析用に供した。
【００５２】
＜免疫組織化学的手法＞
ＥＲとＰｇＲの発現状態は、先に報告した方法（Ｉｋｅｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｊｐｎ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｃｙｔｏｌ  ４６：３３２−３３７，２００７）に準じて行った。すなわち、ＥＲ、ＰｇＲの抗体と、ＥＲ（１Ｄ５：Ｄａｋｏ社製）、ＰｇＲ（ＰＲ８８：ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製）とをホルマリン固定、パラフイン封埋した後、協和ステインキット(協和メデックス社製)を用いた免疫組織化学的手法により評価した。「日本乳癌学会」の臨床的判定（Ｕｍｅｍｕｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １３：２３２−２３５，２００６）により、１０％以上の陽性細胞がみられる症例をそれぞれＥＲ（＋），ＰｇＲ（＋）とし、各ホルモンレセプターが発現しているとした。
【００５３】
＜結果＞
ＥＲとＰＧＲの発現は、各々３７例（８０．４％）と２８例（６０．９％）であった。この中で２５例（５４．３％）では、両方の発現があった。しかし６例（１３．０％）では、ＥＲ、ＰｇＲの発現が無かった（表１)。ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍は組織学的にＨＩＧＨ−ＧＲＡＤＥタイプに分類された。
【実施例２】
【００５４】
＜ＤＮＡｐｌｏｉｄｙとＣＩＮの決定＞
実施例１で調整した標本を用い、染色体不安定性（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＣＩＮ）とＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙを決定した。
【００５５】
＜ＦＩＳＨ法を用いたＣＩＮとＨＥＲ２遺伝子の測定＞
ＣＩＮは、以前報告された文献（Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：５２８３−５２８５，１９９９、Ｆｕｒｕｙａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：２８１５−２８２０，２０００、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：２７５２−２７５８，２００６）に準じて行った。すなわち、４６例中３６例のタッチ−スメア標本に、７番、１１番、１７番、１８番の４つの染色体の各セントロメア部分用のプローブ（Ｄ７Ｚ１，Ｄ１１Ｚ１，Ｄ１７Ｚ１，Ｄ１８Ｚ１：Ａｂｂｏｔｔ社製）の混合液を添加し、７３℃２分間変性処理を行った。ハイブリダイゼーションは３７℃で１２時間行った。０．４ｘＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０で７３℃２分間処理後、０．４ｘＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０で洗浄した。対比染色は、ＤＡＰＩ−ＩＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ−ＩＩ：Ａｂｂｏｔｔ社製）で染色し、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で、各標本の１００個以上発光した癌細胞を観察し、それぞれのプローブにおけるシグナル数をカウントした。ＣＩＮの有無は、細胞での各プローブのシグナル数の細胞間較差により決定した。シグナル数より、各細胞における染色体が、上記４つの染色体の通常７５％以下であるとき、ＣＩＮは陽性と考えた。
【００５６】
また、ＨＥＲ２遺伝子のコピー数の検出は、上記タッチ−スメア標本を用いて、ＨＥＲ２ＤＮＡプローブキット（Ａｂｂｏｔｔ社製）を利用したＦＩＳＨ法で行った。１７番染色体上のセントロメア部位の遺伝子コピー数と比較して、ＨＥＲ２遺伝子コピー数が細胞平均２．０倍以上であるとき増幅あり（ＨＥＲ２＋）と判定した。
【００５７】
＜ＬＳＣによるＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙの決定＞
ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙの決定は、ＬＳＣを用いて行った。サンプルの調整やＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙの決定は先の論文の方法（Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：５２８３−５２８５，１９９９、Ｆｕｒｕｙａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：２８１５−２８２０，２０００）に準じた。すなわち、７０％のエタノールで固定されたタッチ−スメア標本を、０．１％ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むヨウ化プロピジウム溶液（ＰＢＳに２５μｇ／ｍｌ）に浸した。ＤＮＡ量はＬＳＣ１０１（オリンパス社製）で測定した。通常個々の標本には、５０００個以上の細胞を存在させた。ＤＮＡヒストグラムを作成し、ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ（染色体コピー数）を決定した。ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙはＤＮＡ  ｉｎｄｅｘ（ＤＩ）で表し、１．０≦ＤＩ＜１．２の場合をｄｉｐｌｏｉｄ、ＤＩ≧１．２の場合をａｎｅｕｐｌｏｉｄ腫瘍として分類した。
【００５８】
＜結果＞
ＤＮＡヒストグラムから、ｄｉｐｌｏｉｄとａｎｅｕｐｌｏｉｄのカテゴリーに分類し、１５例（３２．６％）がｄｉｐｌｏｉｄで、３１例（６７．４％）がａｎｅｕｐｌｏｉｄ腫瘍であった。ＣＩＮはＦＩＳＨにより２４例で評価した。その結果、１０例（２７．８％）はｄｉｐｌｏｉｄ／ＣＩＮ陰性であったが、２３例（６４．９％）は、ａｎｅｕｐｌｏｉｄ／ＣＩＮ陽性であった。ｄｉｐｌｏｉｄ／ＣＩＮ陽性腫瘍、ａｎｅｕｐｌｏｉｄ／ＣＩＮ陰性腫瘍はまれであった。Ｄｉｐｌｏｉｄ腫瘍はＥＲ及び／またはＰｇＲを発現し、特に全てのＤｉｐｌｏｉｄ腫瘍はＥＲ＋であった。全てのＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍は、ａｎｅｕｐｌｏｉｄ／ＣＩＮ陽性であった。表１にホルモンレセプター状態と、Ｐｌｏｉｄｙ，染色体不安定性、ＨＥＲ２遺伝子増殖との関係を被検体数で示した。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
上記表において、ＣＩＮ＋は染色体不安定性有り、ＣＩＮ−は染色体不安定性無し、を表し、ＨＥＲ２＋は増幅有り、ＨＥＲ２−は増幅無し、を表した。
【実施例３】
【００６１】
＜ａＣＧＨ法によるＤＮＡコピー数異常の検出＞
ａＣＧＨは、実施例１と同じ４６人の癌患者の組織を用いた。組織切片にヘマトキシリン・エオジン染色を行い、顕微鏡下にて注射針（２６Ｇ）を用いて選択的に癌細胞のみ採取する手法（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を用いて、先の文献（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ４０：１６１−１６６，２０００）に従い、ａＣＧＨによる解析のために通常組織のサンプルの混じりを減じた。結果として、サンプルの通常細胞の混じりは可能な限り縮小し、１０％以下になった。高分子重量のＤＮＡは、各ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  腫瘍標本からＤＮＡ抽出キット（ＳｅｐａＧｅｎｅ，三光純薬社製）を用いて、前記Ｈａｓｈｉｍｏｔｏらの方法に記載の実験に従い抽出した。この研究に使った、ＢＡＣ  ＤＮＡ  アレイ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社製）は、４０３０個のヒト由来大腸菌の人工的な染色体クローンで、全ゲノムに対して、ほぼ０．８３Ｍｂｐ毎に１クローン存在しており、そのうちの３５６個は癌関連遺伝子を含む。実験は、先の文献（Ｏｈｇｕｃｒｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ５９：９７８−９８３，２００６，Ｃｈｏｃｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１７：６７７−６８４，２００９，Ｆｕｒｕｙａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：３９３，２００８，Ｎａｋａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １８１：７０−７６，２００９）に準じて行った。すなわち、５００ｎｇの腫瘍ＤＮＡと性一致対照ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）は、ランダムにプライマーを標識したキット（ＢｉｏＰｒｉｎｅ（登録商標）ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を各々標識した。融合のために、標識ＤＮＡは５０ｍｇ  のＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）と混合し、７５℃で変性させたプローブ混合物をアレイへ供した。
【００６２】
＜蛍光スキャナーによる読み取り＞
３７℃にて７２時間ハイブリダイゼーションを行ったマイクロアレイを４５℃の５０％ホルムアミド溶液、２ｘＳＳＣ溶液で洗浄し、常温でリン酸緩衝液、２ｘＳＳＣ溶液でさらに洗浄を行った。なお、マイクロアレイのバックグランドが高いときにはエタノール洗浄を行った。マイクロアレイを完全に乾燥させた後に、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）でスキャンし、１６ビットＴＩＦＦイメージをＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ５．０  ソフトウエアでとらえた。蛍光イメージは、アレイの分析のために可視化して、ＭＡＣ  Ｖｉｅｗｅｒ（登録商標）ソフトウエア（マクロゲン社製）で解析した。蛍光スポットは自動的に決定した。各クローンの赤／緑の割合はｌｏｇ２Ｒａｔｉｏとして算出した。まったく変化がない場合の割合は、ｌｏｇ２１＝０となる。割合は少なくとも±０．２５より大きい場合は、コピー数の増加や減少が考えられる。ｌｏｇ２値が1以上を増幅とした。このｌｏｇ２の値が閾値より大きくなった場合に、ＤＮＡコピー数の異常を判断した。
【００６３】
＜統計解析＞
クローンのコピー数の比較は、正常細胞と腫瘍組織の間で行った。２つのグループ間での増加や減少の違いは、一般的なｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ（χ乗検定）で決定した。変化や頻度の総数での違いは、ｔ検定、Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ検定、ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕテストで行った。違いはＰ値として算出し、Ｐ値が０．０５より低い場合に違いを認めるものとした。
【００６４】
＜ＤＮＡコピー数異常の頻度＞
ＤＮＡコピー数の増加及び減少の平均数値は、各々４０５±２１１と、４９５±３０３であった。ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍は増加と減少の高い数値を有する傾向があり、６例のＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍で、５４１．７と６４３．２であったのに対し、他は各々３７５．５と４６１．２であった。染色体１ｑと染色体８ｑのコピー数増加と、染色体８ｐ、染色体１６ｑ、染色体１７ｐのコピー数減少を腫瘍の５０％で確認した（図１）。マップ化されたクローンでは、染色体１ｑ２３−１ｑ４４の広い領域でコピー数増加が高い頻度で見られ、表２に示すように、特に染色体１ｑ３２．１領域（クローンＮｏ．２８９３）のコピー数増加は、４６例の７８．３％で頻度を確認した。染色体８ｑ２３．３領域（クローンＮｏ．１３９４）のコピー数増加は３０例（６６．７％）で確認し、染色体８ｐ２３．１領域（クローンＮｏ．４５８９）のコピー数減少は３７例（８０．４％）で、染色体８ｐ２３．３領域（クローンＮｏ．５５７９と９２３）のコピー数減少は２８例（６０．９％）で確認した。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
＜DNAの増幅＞
ＤＮＡの増幅、ＤＮＡの高度増加（ｌｏｇ２＞１．０）はまれであるが、例外的に染色体１７ｑ１２領域に位置するＢＡＣクローンの２２４，２２６１，２２７で確認した。ＢＡＣクローンの２２４はＤＮＡ増幅の頻度が最も高く見られ、9例（１９．６％）で確認し、ＢＡＣクローンの２２６１のＥＲＢＢ２を含むＤＮＡの増幅は、８例（１７．４％）で確認した（表３）。ＢＡＣクローンの２２６１には、ＨＥＲ２遺伝子が存在しているので、乳癌患者におけるＨＥＲ２遺伝子の増幅との関連が確認された。他の染色体部位の増幅は不確定に見られた。ＤＮＡコピー数の確実な減少（ｌｏｇ２＜−１．０）は、コピー数の減少を８例で確認した染色体８ｐ２３領域を例外として、乳癌でまれにしか起こらなかった。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
＜ＤＮＡコピー数異常とＥＲとＰｇＲの発現状態＞
ＤＮＡコピー数が増加したクローンと、ＥＲとＰｇＲの発現状態との関連を表４に示した。
【００６９】
染色体１０ｐ１１．２２領域（クローンＮｏ．１２７６、ＮＲＰ１遺伝子を含む）の頻繁なコピー数増加は８例で確認した。ＥＲとＰｇＲの発現状態との関わりでは、ＥＲ＋とＥＲ−腫瘍の間で  ２／３７ｖｓ６／９，ｐ＝１．３７×１０−５、ＰｇＲ＋とＰｇＲ−腫瘍の間で１／２８ｖｓ７／１８，ｐ＝０．００１１２、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍と他腫瘍の間で６／６ｖｓ２／４０，ｐ＝１．０３×１０−８と確かな違いを示した。
【００７０】
染色体１ｐ３２領域におけるクローンのコピー数増加は、しばしばＥＲ−腫瘍で確認したが、ＥＲ＋腫瘍では確認できなかった。特に染色体１ｐ３２．１領域（クローンＮｏ．２１６１、ＭＹＳＭ１遺伝子を含む）のコピー数増加の頻度は、ＥＲ＋とＥＲ−腫瘍の間で０／３７ｖｓ４／９，Ｐ＝２．２×１０−５、ＰｇＲ＋とＰｇＲ−腫瘍の間で０／２８ｖｓ４／１８，Ｐ＝０．００６２６、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋腫瘍と他の腫瘍の間で０／２５ｖｓ４／２１，Ｐ＝０．０２２４、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍と他の腫瘍の間で４／６ｖｓ０／４０，Ｐ＝６．５１×１０−８と顕著であった。
【００７１】
染色体１ｐ１３．２領域（クローンＮｏ．２１３４）のコピー数増加は、ＥＲ−とＰｇＲ−腫瘍の4例のみで確認し、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍と他の腫瘍の間でＰ＝６．５１×１０−８であった。
【００７２】
染色体２ｐ２５．３領域（クローンＮｏ．２０６９  ＴＰＯ遺伝子を含む）のコピー数増加は１０例で確認した。それは、ＥＲ＋とＥＲ−腫瘍の間で４／３７ｖｓ６／９，Ｐ＝２．６９×１０−５、ＰｇＲ＋とＰｇＲ−腫瘍の間で０／２８ｖｓ１０／１８，Ｐ＝３．０３×１０−６、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋腫瘍と他の腫瘍の間で０／２５ｖｓ１０／２１，Ｐ＝９．６１×１０−５、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍と他の腫瘍の間で６／６ｖｓ４／４０，Ｐ＝６．２３×１０−７と強い違いがあった。
【００７３】
染色体１６ｐ１３．３領域（クローンＮｏ．５８８５）のコピー数増加はＥＲ＋／ＰｇＲ＋腫瘍で顕著に見られた（１２／２５ｖｓ１／２１，Ｐ＝０．００１１８）。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
染色体５ｐ２１．３−ｐ２２．１領域（クローンＮｏ．４１０３）のコピー数減少の頻度は、ＥＲ＋とＥＲ−腫瘍の間で特に顕著であった（１／３７ｖｓ６／９，Ｐ＝１．６５×１０−６）。染色体８ｐ２３．２領域（クローンＮｏ．８０９）のコピー数減少の頻度は、１７例（４０．０％）で確認し、特にＰｇＲ＋とＰｇＲ−腫瘍の間で顕著な違いがあった（４／２９ｖｓ１３／１７，ｐ＝２．１２×１０−５）。７例で確認した染色体１６ｐ１１．２領域（クローンＮｏ．２５９１）のコピー数減少は、ホルモンレセプターの状態と緊密に関連し、その頻度はＥＲ＋とＥＲ−腫瘍の間で２／３７ｖｓ５／９，Ｐ＝０．０００１７２、ＰｇＲ＋とＰｇＲ−腫瘍の間で０／２８ｖｓ７／１８，Ｐ＝０．０００１７４、ＥＲ＋／ＰｇＲ＋腫瘍と他の腫瘍の間で０／２５ｖｓ７／２１，Ｐ＝０．００１７２、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍と他の腫瘍の間で５／６ｖｓ２／４０，Ｐ＝６．１３×１０−７であり、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍と他の腫瘍の間で顕著な違いがあった。
【００７６】
＜ＤＮＡコピー数異常と、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍、ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙおよびＣＩＮの関連＞
染色体２ｐ２５．３領域でコピー数増加があり、かつ、ＰｇＲ−腫瘍の１０例のケースについて、ＤＮＡコピー数の異常、ホルモンレセプターの状態、ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ、ＣＩＮ、ＨＥＲ２発現状態との関連結果を表５に示した。この中に、６例の染色体２ｐ２５．３領域と、染色体１０ｐ１１．２２領域の両方でコピー数増加を示すＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍があった。さらに、染色体１２ｑ１５領域（クローンＮｏ．２７６４  ＩＦＮγ遺伝子を含む）のコピー数減少は、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍の３例のみで見られ、他では見られなかった（３／３ｖｓ０／４２，Ｐ＝１．９７×１０−１１）。これらＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍の３例は、ＨＥＲ２増幅無しで、かつ染色体１２ｑ１５領域のコピー数減少の腫瘍であった。そのため、これらを、いわゆる‘トリプルネガティブ’腫瘍に分類した。染色体１２ｑ１５領域のコピー数減少以外のＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍はＨＥＲ２の増幅を示した。染色体２ｐ２５．３領域でコピー数増加があり、かつ、ＰｇＲ−腫瘍の１０例のケースは、全てＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ  が、ａｎｅｕｐｌｏｉｄで、ＣＩＮが染色体不安定性ありと確認された。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
上記表において、染色体領域については、↑はコピー数増加、−は変化無し、↓はコピー数減少を表した。ＥＲとＰｇＲについて、＋は発現有り、−は発現無し、を表し、ＨＥＲ２について、＋は増幅有り、−は増幅無し、を表し、ＣＩＮについて、＋は染色体不安定性有り、−は染色体不安定性無し、を表した。Ｐｌｏｉｄｙについては、Ａがａｎｅｕｐｌｏｉｄｙを表し、ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２について、↓はコピー数減少を、−は変化無し、を表した。
【００７９】
＜乳癌悪性度の判断＞
染色体１ｐ１３．２領域、染色体１ｐ３２．１領域、染色体２ｐ２５．３領域、染色体１０ｐ１１．２２領域、１６ｐ１３．３のコピー数増加と、染色体１２ｑ１５領域のコピー数減少は、図２に示したようにＥＲ、ＰｇＲの状態と高い関連性を持った。これらのコピー数の異常は、ＥＲ―／ＰｇＲ−の腫瘍で特異的に確認された。染色体２ｐ２５．３領域のコピー数増加は、ＰｇＲ−腫瘍の５５．６％と、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍の全てで確認した。ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍では、染色体１０ｐ１１．２２領域の増加が見られ、さらに、染色体１６ｐ１１．２領域のコピー数減少、染色体１ｐ１３．２領域および染色体１ｐ３２．１領域のコピー数増加が頻繁に見られた。ＥＲ−／ＰｇＲ−とＨＥＲ２増幅の欠如した腫瘍、いわゆる‘トリプルネガティブ’腫瘍は、遺伝子ＩＦＮＧを含む染色体１２ｑ１５領域のコピー数減少というゲノム変化を伴うことが明らかになった。ゲノム変異と、ＥＲ−／ＰｇＲ−腫瘍を含むグループとの間に明らかな関係があることから、乳癌の表現型や遺伝子型に関し、ゲノム変化に基づいた新たな分類を考慮する必要性があることが分った。乳癌の一般的な治療が困難な特別のタイプである、いわゆる‘トリプルネガティブ’腫瘍への処置の手がかりとして、染色体１２ｑ１５領域に存在するＩＦＮγ遺伝子のコピー数減少から、ＩＮＦγが効果的であると推察された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の乳癌サブクラスの検出法により、分子標的治療薬のトラスツズマブでは効果のない乳癌患者を見出すことができ、該サブクラスに効果的な治療方法を処置することができる。また、ＩＦＮγを含む医薬品は、該サブクラスの乳癌患者に効果的であると推定され、重要な医薬品となる可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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