(57)【要約】      （修正有）【課題】高活性かつ立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼタンパク質を多数発現し、触媒能力を増大させた形質転換体などを提供する。【解決手段】立体選択性を持った特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子より成るニトリルヒドラターゼの遺伝子を菌体内に多数存在させることで従来の微生物に比して飛躍的に触媒能力を増大させた形質転換体が提供される。この形質転換体またはその培養物を使用することで、ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、例えばベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物から生じるラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体から、効率的に光学活性なS-(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を製造できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)のタンパク質と(b)のタンパク質とを含むニトリルヒドラターゼタンパク質。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b) 配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニット機能を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼβサブユニット機能を有するタンパク質。
【請求項５】
請求項４記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項３記載の遺伝子及び／又は請求項５記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換ベクターを有する形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、培養物中からニトリルヒドラターゼタンパク質を回収する、ニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項７記載の形質転換体の培養物又はその処理物をニトリル化合物と接触させ、アミド化合物を回収する、アミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体のニトリル基を立体特異的に水和し、光学活性なS-(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を生成する能力を有するニトリルヒドラターゼ及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミドは、医薬品、農薬の合成原料として、また光学活性カルボン酸の製造原料として有用な化合物である。
【０００３】
光学活性アミドの製造方法としては、不斉触媒を使用して製造する方法や、立体選択性を有する酵素、例えば立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼを使用して製造する方法が知られている。
【０００４】
立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、これまで、Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540（非特許文献１）Rhodococcus  sp.AJ270（非特許文献２）、Pseudomonas putida NRRL-18668（特許文献１）などが知られており、本発明者らもラセミ体のマンデロニトリル及びその誘導体、例えばベンズアルデヒド及びその誘導体と青酸の混合物から生じるラセミ体のマンデロニトリル及びその誘導体から、高い光学純度でS-(+)-マンデルアミドおよびその誘導体を生成するRhodococcus  sp.HT40-6株を見出している（特許文献2）。
【０００５】
【特許文献１】特表平11-513255
【特許文献２】特開平4-222591
【非特許文献１】Biotechol.j.2006,1,596-573
【非特許文献２】Tetrahedron:Asymmetry 11(2000)1123-1135
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
工業的に光学活性アミドを製造する場合、コスト面から触媒能力が高い微生物が求められる。しかしながら、従来の微生物では触媒活性の点で十分ではなかった。
上述した実状に鑑み、本発明は、高活性かつ立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼの提供、その酵素を多数発現し触媒能力を増大させた形質転換体、及びそれを使用したアミドの製造方法などを提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼを生産するRhodococcus  sp.HT40-6株のニトリルヒドラターゼ遺伝子を同定し、その遺伝子を菌体内に多数存在させることで、飛躍的に触媒能力が増大した形質転換体を提供できること、等の知見を見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次のものである。
(1)以下の(a)のタンパク質と(b)のタンパク質とを含むニトリルヒドラターゼタンパク質。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b) 配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニット機能を有するタンパク質。
(3)上記（２）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(4)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼβサブユニット機能を有するタンパク質。
(5)上記（４）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(6)上記（３）記載の遺伝子及び／又は上記（５）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
(7)上記（６）記載の組換ベクターを有する形質転換体。
(8)上記（７）記載の形質転換体を培養し、培養物中からニトリルヒドラターゼタンパク質を回収する、ニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法。
(9)上記（７）記載の形質転換体の培養物又はその処理物をニトリル化合物と接触させ、アミド化合物を回収する、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の好ましい態様によれば、遺伝子組換の方法でクローン化された立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼの遺伝子を菌体内に多数存在させることで従来の微生物に比して飛躍的に触媒能力を増大させた形質転換体が提供される。この形質転換体またはその培養物を使用することで、ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、例えばベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物から生じるラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体から、効率的に光学活性なS-(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１１】
１．ニトリルヒドラターゼ
ニトリルヒドラターゼとは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
【００１２】
【化１】
2010022334.tif 000002
（ここで、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を意味する。）
【００１３】
「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、上記の通りニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。ニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の1つであるマンデロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、例えば、本発明の形質転換体あるいはその培養物中から精製したタンパク質などをマンデロニトリルに接触させ、生成するマンデルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、マンデロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。
【００１４】
本発明のニトリルヒドラターゼは、αサブユニットタンパク質（以下、「ニトリルヒドラターゼαサブユニットタンパク質」という）とβサブユニットタンパク質（以下、「ニトリルヒドラターゼβサブユニットタンパク質」という）とを含む複合体(以下、「ニトリルヒドラターゼタンパク質」という場合がある)で構成されている。
【００１５】
本発明のニトリルヒドラターゼタンパク質は以下の(a)のタンパク質と(b)のタンパク質とを含むニトリルヒドラターゼタンパク質である。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b) 配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１６】
また、本発明は、以下の(a)のタンパク質を提供する。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
さらに、本発明は、以下の(b)のタンパク質を提供する。
(b) 配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１７】
本発明の好ましい態様に係るニトリルヒドラターゼタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（αサブユニット）および配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（βサブユニット）を含むタンパク質である。本発明の好ましい態様によれば、ニトリルヒドラターゼは、ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、例えばベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物から生じるラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体から効率的に光学活性なS-(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を立体選択的に水和することができる。このようなニトリルヒドラターゼ活性により、本発明の好ましい態様に係るニトリルヒドラターゼタンパク質は、ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、またはベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物に作用させることにより、光学活性なS-(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を製造することができる。
【００１８】
ここで、上記マンデロニトリルまたはその誘導体、ベンズアルデヒドおよびその誘導体、およびマンデルアミドまたはその誘導体としては、例えば下記式（１）〜（３）の化合物をそれぞれ挙げることができる。
【００１９】
【化２】
2010022334.tif 000003
（ここで、Ｘは水素原子、メチル基、メトキシ基、ヒドロキシル基又はハロゲンを表す。）
【００２０】
ハロゲンとしては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を挙げることができる。
【００２１】
さらに、本発明の形質転換体で発現させたニトリルヒドラターゼタンパク質が立体選択性を持ったニトリルヒドラターゼの活性（立体選択的ニトリルヒドラターゼ活性）を有するか否かは、例えば、マンデロニトリルを用いて活性を測定する方法により確認することができる。この方法では、基質であるマンデロニトリルまたはその誘導体をラセミ化するために反応系を中性付近ないし塩基性に保つのが良く、例えばpH4〜11、好ましくはpH6〜10に調整する。基質の濃度はベンズアルデヒドや青酸に対する酵素の感受性により一概に特定し得ないが、通常、反応液中のマンデロニトリルおよびその誘導体は、例えば0.1〜10重量％、好ましくは0.2〜5.0重量％であり、ベンズアルデヒドまたはその誘導体は、例えば0.1〜10重量％、好ましくは0.2〜5.0重量％であり、青酸は、例えば0.1〜1.0重量％、好ましくは0.1〜0.5重量％である。原料となる基質に対する微生物等の使用量は乾燥菌体として例えば0.01〜5.0重量％、反応温度は例えば0〜50℃、好ましくは10〜30℃、反応時間は例えば0.1〜24時間程度である。
【００２２】
本発明者らは、微生物ロドコッカス（Rhodococcus） sp.  HT40-6株（以下、単にHT40-6株ということがある。）から、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を同定した。その結果、αサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列であった。一方、βサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示される塩基配列であった。また、αサブユニット及びβサブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列であった。
【００２３】
なお、HT40-6株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に寄託番号FERM BP-5231で寄託されている。
【００２４】
２．遺伝子
本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニットタンパク質をコードする遺伝子は、以下の(a)のタンパク質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）である。
(a) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２５】
上記(a)に記載のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニットタンパク質をコードする遺伝子(以下、「ニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子」という)である。
【００２６】
本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子は、上述したHT40-6株から単離することができる。例えば、HT40-6株由来の染色体DNAを鋳型として、他の微生物等に由来する既知のニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子において相同性が高い領域に対応するアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーを用いたPCRにより、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を単離することができる。あるいは、得られたPCR産物が、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子の一部である場合には、HT40-6株由来の染色体DNAを用いて、染色体DNA断片を組み込んだ組換えプラスミド（組換えベクター）などの組換え体DNAライブラリーを作製する。組換え体DNAを大腸菌などに導入し、形質転換体を作製する。次いで、形質転換体に対して上述したPCR産物をプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーション法により、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を含む形質転換体を選別する。そして、選別した形質転換体から本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を単離する。
【００２７】
本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子の塩基配列としては、遺伝コードの縮重の点から限定されるものではないが、例えば、配列番号１に記載の塩基配列が挙げられる。
【００２８】
配列番号１で表される塩基配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子と他の微生物由来のニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子とのアミノ酸レベルでの相同性分析の結果を表１に示す。相同性分析は、Genetyx ver6（株式会社 ゼネティクス）を用いて行った。
【００２９】
なお、ロドコッカス・ロドクロウス J1（L型）、ロドコッカス sp.、アースロバクター・アウレッセンス TC1、シュードノカルディア・サーモフィラ、コマモナス・テストステロニ 5-MGAM-4D、およびメソリゾビウム sp. F28由来のニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子の塩基配列及びその対応するアミノ酸配列は、それぞれ以下の表２に示す登録番号で登録されている。
【００３０】
【表１】
2010022334.tif 000004
【００３１】
【表２】
2010022334.tif 000005
【００３２】
表１に示すように、配列番号１で表される塩基配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子は、ロドコッカス・ロドクロウスJ1（L型）由来の既知ニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子とアミノ酸配列レベルで90％以上の相同性を有している。
【００３３】
一方、ニトリルヒドラターゼは、活性中心に補欠分子として非ヘム鉄原子又は非コリン核コバルト原子を有していることが既に知られている。非ヘム鉄原子を有するニトリルヒドラターゼは、鉄型ニトリルヒドラターゼと呼ばれ、また非コリン核コバルト原子を有するニトリルヒドラターゼは、コバルト型ニトリルヒドラターゼと呼ばれている。コバルト型ニトリルヒドラターゼは、システインクラスター（Cys Thr Leu Cys Ser Cys）と呼ばれる活性部位を有する(Eur. J. Biochem. 271,429-438 (2004))。本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニットタンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号２においては、当該システインクラスターが109-114番目に認められる。
【００３４】
以上から、配列番号１で表される塩基配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子は、新規なニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子であると特定できる。
【００３５】
一方、本発明に係るニトリルヒドラターゼβサブユニットタンパク質をコードする遺伝子は、以下の(b)のタンパク質をコードする遺伝子である。
(b) 配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００３６】
上記(b)に記載のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼβサブユニットタンパク質をコードするニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子である。
【００３７】
本発明に係るニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子は、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝と同様に、例えば微生物HT40-6株から単離することができる。単離方法は、他の微生物等に由来する既知のニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子において相同性が高い領域に対応するアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーを用いる以外には、上述したニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を単離する方法と同様である。
【００３８】
本発明に係るニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子の塩基配列としては、遺伝コードの縮重の点から限定されるものではないが、例えば、配列番号３に記載の塩基配列が挙げられる。
【００３９】
配列番号３で表される塩基配列からなるニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子と他の微生物由来のニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子とのアミノ酸レベルでの相同性分析の結果を表３に示す。相同性分析は、Genetyx ver6（株式会社 ゼネティイクス）を用いて行った。
【００４０】
なお、ロドコッカス・ロドクロウス J1（L型）、メソリゾビウム sp. F28、シュードノカルディア・サーモフィラ、アースロバクター・アウレッセンス TC1、ロドコッカス sp.、およびコマモナス・テストステロニ 5-MGAM-4D由来のニトリルヒドラターゼβサブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ表４に示す登録番号で登録されている。
【００４１】
【表３】
2010022334.tif 000006
【００４２】
【表４】
2010022334.tif 000007
【００４３】
表３に示すように、配列番号３で表される塩基配列からなるニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子は、ロドコッカス・ロドクロウスJ1（L型）由来の既知ニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子とアミノ酸配列レベルで90％以上の相同性を有している。
【００４４】
なお、以下では本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子とニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子とを合わせて、「本発明に係る遺伝子」という場合がある。
【００４５】
一旦、本発明の好ましい態様に係る遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は、例えば、化学合成によって、又はクローニングされたクローンを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る遺伝子を得ることができる。
【００４６】
３．ベクター
本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）は、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子及び/又は本発明に係るニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子を含有する組換えプラスミド（組換えベクター）である。適当なベクターに本発明に係る遺伝子を挿入することにより、本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）を得ることが出来る。本発明に係る遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中に導入可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA及び人工染色体DNAなどが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入することなどによって複製可能となるDNA断片であってもよい。
【００４７】
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET30bなどのpET系、pBR322およびpBR325などのpBR系、pUC118、pUC119、pUC18およびpUC19などのpUC系、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13などのYEp系、YCp50などのYCp系等）、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来のプラスミド（pRC001、pRC002、pRC003、pRC004等）などが挙げられる。プラスミド pRC004は、各々ロドコッカス ・ロドクロウス（Rhodococus rhodochrous） ATCC 4276、ATCC 14349、ATCC 14348、IFO 3338株由来のプラスミドであり、特開平2-84198 号公報、特開平4-148685号公報、特開平5-64589号公報、特開平5-68566 号公報に記載されている。
またファージDNAとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、カリフラワーモザイクウイルスなどの植物ウイルス、またはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４８】
本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）を導入する宿主が大腸菌である場合には、大腸菌において発現効率の高いベクター、例えば、trcプロモーターを有する発現ベクターpKK233-2(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/Amplicon Express社製)又はpTrc99A(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/Amplicon Express社)を用いることが好ましい。
【００４９】
また、宿主がロドコッカス属細菌である場合には、ロドコッカス属細菌内で複製増殖可能なDNA領域を含む組換えベクター、pSJ020およびｐSJ034等が挙げられる。好ましいベクターは、ｐSJ034である。
【００５０】
なお、ｐSJ034はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。なお、pSJ023は形質転換体ATCC12674/pSJ023（FERM BP-６２３２）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成9年3月4日付け寄託されている。
【００５１】
pSJ034は、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococus erythropolys） SK92-B1株由来のニトリラーゼ発現調節遺伝子により組換え遺伝子を発現するベクターであり、マルチクローニング部位に酵素遺伝子を導入すると数残基のアミノ酸がN末端に結合した融合タンパク質として発現する。
【００５２】
ベクターに本発明に係る遺伝子を挿入するには、まず適当な制限酵素で本発明に係る遺伝子のcDNAを切断し、次いで適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が用いられる。またベクターと本発明に係る遺伝子のcDNAのそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、PCRなどを用いたin vitro法または酵母などを用いたin vivo法によって両者を連結する方法であってもよい。
【００５３】
また本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）は、本発明に係る遺伝子の他に、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル及びリボソーム結合配列(SD配列)などの遺伝子制御配列並びに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、限定されるものでないが、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。遺伝子制御配列や選択マーカーの挿入方法は、ベクターに本発明に係る遺伝子を導入する方法と同様であってよく、遺伝子制御配列及び選択マーカーが宿主内で機能しうるようにベクターに連結する。
【００５４】
４．形質転換体、およびニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を含有する組換えプラスミド（組換えベクター）と本発明に係るニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子を含有する組換えプラスミド（組換えベクター）とを同一の宿主中に導入することにより得ることができる。また、本発明に係るニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子とニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子とを含有する組換えプラスミド（組換えベクター）を宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明に係る遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、細菌が挙げられる。細菌としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア(Escherichia)属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス(Bacillus)属、並びに受託番号ATCC12674、ATCC17895及びATCC19140として特定されるロドコッカス・ロドクロウスの菌株等のロドコッカス(Rhodococcus)属に属する細菌が挙げられる。
【００５５】
細菌への本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）の導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法及びエレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００５６】
本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）を、上記細菌宿主に導入するのみならず、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）等の動物細胞、Sf9等の昆虫細胞、あるいはアブラナ科等に属する植物などに導入して形質転換体を得ることもできる。
【００５７】
酵母への本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）の導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、YIp系などのベクターあるいは染色体中の任意の領域と相同なDNA配列を用いた染色体への置換・挿入型の酵母の形質転換法であってもよい。
【００５８】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、CHO細胞、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５９】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６０】
植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞などが用いられる。植物への本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法およびPEG法等が挙げられる。
【００６１】
酵母への本発明の組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入することの出来る方法であれば良く、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられる。
【００６２】
本発明に係る遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、本発明に係る遺伝子に特異的なプライマーを設計してPCRを行う。その後は、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そしてPCR産物を検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相にPCR産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等によりPCR産物を確認する方法も採用してもよい。
【００６３】
一方、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法においては、本発明に係る微生物又は形質転換体を培養し、培養物中からニトリルヒドラターゼタンパク質を回収することにより、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質を得ることができる。ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００６４】
本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法において、本発明に係る微生物を培養する方法は、上記で示した方法と同様である。一方、本発明に係る形質転換体を培養する方法は、本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）を導入した宿主の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００６５】
細菌や酵母等の微生物を宿主として得られた本発明に係る形質転換体では、培養に使用する培地は、本発明に係る形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地又は合成培地のいずれであってもよい。また、培地は、本発明に係る形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有することができる。炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース及びデンプン等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。また、窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス及びコーンスティープリカー等が挙げられる。さらに、無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００６６】
また、本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）が有する選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６７】
プロモーターとして誘導性プロモーターを有する本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）で形質転換した宿主を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）で形質転換した微生物を培養する際には、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを有する本発明に係る組換えプラスミド（組換えベクター）で形質転換した微生物を培養する際には、IAA等を培地に添加することができる。
【００６８】
さらに、ニトリルヒドラターゼ誘導剤を培地に添加することで、本発明に係る形質転換体が生産するニトリルヒドラターゼの酵素量を高めることができる。ニトリルヒドラターゼ誘導剤としては、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、バレロニトリル及びベンゾニトリル等のニトリル化合物、並びに、尿素、アセトアミド及びプロピオンアミド等のアミド化合物が挙げられる。
【００６９】
細菌や酵母等の微生物を宿主として得られた本発明に係る形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20℃〜40℃、好ましくは30℃〜37℃で行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、pH5.0〜9.0、好ましくはpH6.5〜7.5に設定すればよい。
【００７０】
一方、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法において、培養物からのニトリルヒドラターゼタンパク質の回収は、まず、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理又は磨砕処理等により菌体又は細胞を破壊する。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。得られた粗タンパク質溶液を、塩析、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動等に単独で又は適宜組み合わせて適用することで、単離・精製することができる。
【００７１】
また、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、培養上清を得る。その後、タンパク質の単離・精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて、得られた培養上清に適用することにより、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質を単離・精製することができる。
【００７２】
また、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造は、上述したような形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を採用して行うこともできる。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でニトリルヒドラターゼタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。この場合、使用する細胞抽出液の由来は前述の宿主細胞であることが好ましい。なお、細胞抽出液は、濃縮されたものでも希釈されたものでも良く、あるいはそのままでも良く、限定はされない。細胞抽出液は、例えば、限外ろ過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって得ることができる。このような無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、試薬キットPROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTMSystem(プロメガ)、合成装置のPG-MetaTM(東洋紡)、RTS(ロシュ・ダイアグノスティクス)等が挙げられる。無細胞タンパク質合成系によって産生されたニトリルヒドラターゼタンパク質は、前述したようなクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して精製することができる。
【００７３】
５．アミド化合物の製造方法
本発明に係るアミド化合物の製造方法においては、本発明に係る形質転換体の培養物又はその処理物をニトリル化合物と接触させることで、該ニトリル化合物から変換したアミド化合物を得ることができる。本発明に係る形質転換体の培養方法に関しては、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法において上記で説明した方法と同様である。また、「培養物」は、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法において上記で説明した定義と同様である。一方、「処理物」とは、培養物を、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質を単離・精製するように1以上の処理工程に供して得られたものを意味する。処理物としては、例えば、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の製造方法により得られたものが挙げられる。
【００７４】
培養物又はその処理物は、適当な担体に保持し、固定化酵素としてニトリル化合物に接触させてもよい。
【００７５】
基質として使用するニトリル化合物は、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質が当該ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させることができるものであればいずれのものでもよい。基質として使用するニトリル化合物としては、限定されるものではないが、マンデロニトリルが好ましい。特に、本発明に係るニトリルヒドラターゼは、マンデロニトリルおよびその誘導体、例えばベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物から生じるマンデロニトリルおよびその誘導体について、中性または塩基性の極性媒体中で、ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体のニトリル基を立体特異的に水和し、光学活性なS-(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を生成することができる。
【００７６】
本発明に係るアミド化合物の製造方法では、培養物又はその処理物をニトリル化合物と、アミド化合物が生成されるように接触させる。ここで「接触」した状態としては、培養物又はその処理物中の本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質が酵素として機能し、且つ当該ニトリルヒドラターゼタンパク質とニトリル化合物とが酵素反応する状態であればよい。「接触」には、例えば、分離精製したニトリルヒドラターゼとニトリル化合物とを混合すること、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現する細胞の培養容器にニトリル化合物を添加すること、当該細胞をニトリル化合物の存在下で培養すること、当該細胞の抽出液をニトリル化合物と混合することなどが含まれる。本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質が酵素として機能する条件は、例えば、pH5.0〜9.0、好ましくはpH6.5〜7.5、温度は0℃〜40℃、好ましくは10℃〜30℃であることに起因して、本条件下で、本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質とニトリル化合物とを接触させることが好ましい。
【００７７】
本発明に係るアミド化合物の製造方法においては、反応液中のニトリル化合物濃度としては、特に限定されないが、例えば、0.1〜5重量％、好ましくは0.5〜2.0重量％が挙げられる。上記ニトリル化合物濃度に対して接触させる培養物又はその処理物中の本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質濃度は、酵素反応が生じる濃度であれば、特に限定されない。また、酵素反応は、基質と酵素の濃度にも依存することから、基質であるニトリル化合物と酵素である本発明に係るニトリルヒドラターゼタンパク質の濃度を最適化することで、酵素反応を効率的に進めることができる。
【００７８】
本発明に係るアミド化合物の製造方法において、アミド化合物の回収は、培養物又はその処理物とニトリル化合物との混合物が菌体又は細胞を含む場合には、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、次いで、濾過、濃縮、各種クロマトグラフィー、抽出、活性炭処理及び蒸留などの通常の方法に単独で又は適宜組み合わせて適用することで、回収・精製することができる。あるいは、混合物を、濾過、濃縮、各種クロマトグラフィー、抽出、活性炭処理及び蒸留などの通常の方法に単独で又は適宜組み合わせて直接適用することで、回収・精製してもよい。
【００７９】
以上のように、本発明に係るアミド化合物の製造方法によれば、ニトリル化合物からアミド化合物を効率よく製造することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。
【００８１】
［実施例1］ニトリルヒドラターゼ遺伝子の同定
（1）HT40-6株由来の染色体DNAの調整
ロドコッカス（Rhodococcus）sp. HT40-6（FERM BP-5231）をMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、1％グルコース、0.2%K2HPO4及び0.2％KH2PO4、pH7.0）100ml中、30℃で72時間振盪培養した。
培養後、菌体を集菌し、Saline-EDTA溶液（0.1M EDTA及び0.15M NaCl（pH8.0））4mlに懸濁した。次いで、懸濁液にリゾチーム8mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
【００８２】
次に、凍結した懸濁液に、Tris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl及び0.1M Tris-HCl(pH9.0)）10mlを穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）（最終濃度0.1mg）を加えて37℃で1時間振盪し混合液を得た。
【００８３】
次いで、混合液に等量のTE飽和フェノール（TE：10mM Tris-HCl及び1mM EDTA(pH8.0)）を加えて撹拌した後、遠心した。遠心後、上層を回収し、2倍量のエタノールを加え、析出したDNAをガラス棒で巻きとり、90％、80％、70％のエタノールの順にすすぎ、残存するフェノールを取り除いた。
【００８４】
得られたDNAをTE緩衝液3mlに溶解させた。次いで、溶液にリボヌクレアーゼA溶液（100℃、15分間の加熱処理済）を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。その後プロテイナーゼKを加え、37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノール（TE：10mM Tris-HCl及び1mM EDTA(pH8.0)）を加えて遠心し、上層と下層とに分離させた。
得られた上層に等量のTE飽和フェノール（TE：10mM Tris-HCl及び1mM EDTA(pH8.0)）を加えてから上層と下層とに分離させるまでの操作を2回繰り返した後、得られた上層に等量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心し、上層と下層とに分離させた(以下、上記操作を「フェノール処理」という)。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻き取り、回収し、染色体DNAを得た。
【００８５】
(2) ニトリルヒドラターゼ遺伝子のプローブの調製
上記(1)で得られた染色体DNAを鋳型として使用し、以下の表５に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００８６】
【表５】
2010022334.tif 000008
【００８７】
プライマーNH-01及びNH-02は、いずれも公知なニトリルヒドラターゼ遺伝子において相同性が高い領域のアミノ酸配列を参考にして作製した。なお、NH-01(配列番号5)において、sはg又はcを表し(存在位置：6及び15)、rはg又はaを表す(存在位置：9、12及び18)。また、wはa又はtを表す(存在位置：17)。さらに、NH-02(配列番号6)において、sはg又はcを表し(存在位置：3、6及び12)、rはg又はaを表す(存在位置：9及び16)。また、kはg又はtを表し(存在位置：10)、nはイノシンを表す(存在位置：18)。
【００８８】
反応液を調製した後、1サイクルが93℃：30秒、55℃：30秒及び72℃：3分である反応を、30サイクル行った。PCR終了後、GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を使用して、増幅されたDNAを回収した。回収したDNAを、0.7％アガロースゲル電気泳動により分離した後、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部をコードすると考えられる約200bpのDNA断片を得た。こうして得られたDNA断片を、DIG DNA Labeling Kit（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて標識し、プローブとした。
【００８９】
(3) DNAライブラリーの作製
HT40-6株由来の染色体DNA200μlに、10倍濃度制限酵素緩衝液40μl、滅菌水145μl及び制限酵素Sau3AI 15μlを加え、37℃にて6時間反応させた後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。次いで、回収したDNAをアガロース電気泳動に供し、7kb付近のDNA断片をゲルから切り出し、GFX DNA回収キット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて回収した。このDNA断片を、ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて大腸菌ベクターpUC18のBamHI部位に挿入し、組換え体DNAライブラリーを作製した。なお、ライゲーションに用いた大腸菌ベクターpUC18は、タカラバイオから購入した。
【００９０】
(4) 形質転換体の作製および組換え体DNAの選別
大腸菌JM109株を、LB培地（1％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキス及び0.5％NaCl）1mlに接種し、37℃で5時間、前培養した。前培養後、培養物100μlを、SOB培地（2％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO4及び1mM MgCl2）50mlに加え、18℃で20時間培養した。培養後、大腸菌を遠心により集菌した後、冷TF溶液（20mM PIPES-KOH(pH6.0)、200mM KCl、10mM CaCl2及び40mM MnCl2）13mlを加え、0℃で10分間放置した後、再度遠心した。上澄を除いた後、沈澱した大腸菌を冷TF溶液3.2mlに懸濁し、さらにジメチルスルホキシド0.22mlを加えて、0℃で10分間放置した。こうして作製したコンピテントセル200μlに、上記(3)で作製したHT40-6株由来のDNA断片を含む組換え体プラスミドを含有する溶液（DNAライブラリー）10μlを加え、0℃で30分間放置した。次いで、混合液を、42℃で30秒間のヒートショックに供し、0℃で2分間冷却した後、SOC培地(2％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキス、20mMグルコース、10mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO4及び1mM MgCl2)0.8mlを加えて、37℃にて60分間振盪培養した。振盪培養後、培養液を200μlずつアンピシリン100μg/ml含有のLB寒天培地にプレーティングし、37℃で18時間培養した。
【００９１】
寒天培地上に生育した形質転換体コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーション法を用いてHT40-6株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を持つ形質転換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメンブレン（バイオダインA：日本ポール株式会社製）上に移し、菌体を溶かしてDNAを固定した後、ナイロンメンブレンを上記(2)で作製したプローブ（約200kb断片）で処理し、DIG Luminescent Detection Kit （ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて、目的の組換え体DNAを含むコロニーを選択した。
【００９２】
(5) 組換え体プラスミドの調製
上記(4)で選択した形質転換体を、LB培地100mlにて37℃で一晩培養し、FlexiPrep Kit(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いてプラスミドを抽出した。こうして得られた組換え体プラスミドをpMS057と名付けた。図１は、組換え体プラスミドpMS057構造を示す模式図である。図１において、「NHaseα」はニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を意味し、そして「NHaseβ」はニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子を意味する。
【００９３】
(6) 塩基配列の決定
組換え体プラスミドpMS057の塩基配列を、CEQ2000XL(ベックマンコールター社製)を用いて決定した。その結果、配列番号7に示される塩基配列が得られた。配列番号7に示される塩基配列には、配列番号2または配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼαサブユニットタンパク質、と配列番号4または配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼβサブユニットタンパク質およびアクティベータ領域（配列番号１０）をコードするオープンリーディングフレームが見出された。
【００９４】
得られた株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列と既知の微生物由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列との比較を、以下の表６に示す。
【００９５】
【表６】
2010022334.tif 000009
【００９６】
表６に示すように、HT40-6株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ1（L型）由来の既知のニトリルヒドラターゼとアミノ酸配列レベルでαサブユニット及びβサブユニットのいずれも90%以上の相同性を有していることから、得られたHT40-6株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子が新規なニトリルヒドラターゼ遺伝子であることが分かった。
【００９７】
［実施例2］ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌形質転換体の作製
実施例1で得られたプラスミドpMS057を鋳型として使用し、以下の表に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００９８】
【表７】
2010022334.tif 000010
【００９９】
PCRは、Thermalcycler personal(宝酒造社製)を用いて、1サイクルが94℃:30秒、65℃：30秒及び72℃：3分である反応を30サイクル行った。
【０１００】
PCR終了後、反応液5μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、3kbのPCR産物の検出を行った。
【０１０１】
PCR産物が検出されることを確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製し、制限酵素XbaIとSse8387Iで切断した。制限酵素処理を行ったPCR産物を、0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、3Kb付近のバンドを回収した。回収したPCR産物を、Ligation Kit(宝酒造社製)を用いてベクターpSJ034のXbaI-Sse8387I部位に連結し、組換え体プラスミドを作製した。得られた組換え体プラスミドを、pSMJ057と名付けた。図２は、組換え体プラスミドpSMJ057の構造を示す模式図である。図２において、「NHaseα」はニトリルヒドラターゼαサブユニット遺伝子を意味し、そして「NHaseβ」はニトリルヒドラターゼβサブユニット遺伝子を意味する。また、SK92-B1ニトリラーゼレギュレーターは、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)SK92-B1株由来ニトリラーゼ遺伝子の制御遺伝子を意味する。
【０１０２】
上記ベクターpSJ034は、ロドコッカス菌においてニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現させることができることが既に知られているプラスミドである。ベクターpSJ034は、特開平10-337185号公報に示される方法に従い、ベクターpSJ023から作製することが可能である。    pSJ023は、形質転換体ATCC12674/pSJ023（FERM BP-6232）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に寄託されている。
【０１０３】
組換え体プラスミドpSMJ057に挿入された遺伝子の塩基配列を確認し、HT40-6菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子であることを確認した。
【０１０４】
（２）ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous） ATCC 12674 株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。（１）で調製したプラスミド（pSMJ057）各 1μｌと菌体懸濁液各10μｌを混合し、各々氷冷した。キュベットに各プラスミドと各菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser (BIO RAD)により2.0ＫＶ、200 ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショクを行った。その後、キュベットにＭＹＫ培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％Ｋ２ＨＰＯ4 、0.2％ ＫＨ２ＰＯ４ ）500μl を加え、30℃、5時間静置した後、50μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。得られたコロニーのプラスミドを確認し、2種の形質転換体（ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous） ATCC12674／pSMJ057）を得た。
【０１０５】
[実施例３]ニトリルヒドラターゼ活性の測定
実施例２で得られたロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous） ATCC12674／pSMJ057をGGPK培地（1.5％グルコース、1％グルタミン酸ナトリウム、0.1％バクトイーストエキス、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％ MgSO4・7H2O、カナマイシン 50μg／ml、pH7.2）100mlに植菌し、30℃で72時間振盪培養した。
【０１０６】
また、比較例としてロドコッカス sp. HT40-6を下記培地に接種し30℃で96時間、好気的に培養を行った。
培地（pH7.4）
グルコース 27ｇ
ポリペプトン 4ｇ
酵母エキス 2ｇ
硫酸アンモニウム 0.2ｇ
硝酸アンモニウム 2ｇ
MgCl2 0.2ｇ
CaCl2 40mg
MnSO4 ・4H2 O     4mg
FeCl3 ・7H2 O     0.7mg
ZnSO4 ・7H2 O     0.1mg
ε−カプロラクタム     4ｇ
CoCl2 ・6H2 O     30mg
30mMりん酸緩衝液（ｐＨ7.4） 1000ml
【０１０７】
遠心分離により各々の菌体を20mMりん酸緩衝液（ｐＨ7.5）で３回洗浄した。沈殿菌体を20mMマンデロニトリルを含む1.5mlの上記緩衝液に懸濁し、30℃で30分振盪しながら反応を行った。反応終了後、各々の反応液を遠心分離し菌体を除去した後、上清中のマンデルアミド含量を液体クロマトグラフィー（カラム；SHODEX ODSF511A，キャリヤ；0.2MH3 PO4 ：アセトニトリル＝4：1，モニター；208nm）で分析した。また生成したマンデルアミドの光学純度は光学分割用カラム（CHIRALCEL CA−1，ダイセル化学工業、キャリヤ；100％エタノール）を用いて測定した。結果を表８に示した。
活性（U）は1分間に1μmolの生成物を生成する酵素量とし、乾燥菌体（DC）当たりの比活性として記した。
【０１０８】
【表８】
2010022334.tif 000011
【０１０９】
以上実施例にしめしたように、形質転換体ATCC12674/pSMJ057は触媒能力が極めて高いので、この形質転換体を用いることでマンデロニトリルから効率的に光学活性なS-(+)-マンデルアミドを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】プラスミドpMS057の構成図である。
【図２】プラスミドpSMJ057の構成図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：pMS057（実施例１）
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
【図１】
2010022334.tif 000012
【図２】
2010022334.tif 000013
【配列表】
2010022334000001.app