(57)【要約】【課題】インビトロにおいて不死化哺乳細胞のメロゾイトを増殖すること。【解決手段】本発明は、発生の無性生殖期におけるＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱の偏性細胞内原虫の連続培養のための方法を提供することによって、課題を解決する。本発明の方法は、以下の工程を含む：Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種を増殖するのに適した不死化宿主細胞を含む細胞培養系を提供する工程、宿主細胞の感染について有効な条件下で、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種の感染段階で宿主細胞を接触する工程、宿主細胞（ここで、この宿主細胞は、食作用によって原虫を取り込み得る）にメロゾイトの増殖をもたす工程、を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本方法は、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱およびその属およびそれらの種の、スポロシスト形成原虫の連続培養のための培養系および方法に関する。本発明はまた、ワクチンの使用、アッセイおよび他の用途のために、本発明の培養系および方法によって産生された、メロゾイトおよびオーシストならびに関連したＳｐｏｒａｚｏｅａのライフステージ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫は、スポロシスト形成原虫を含み、これらの多くは、世界中の動物および人々の無数の疾患の病因である。特に民間の関心事は、Ｃｏｃｃｉｄｉａ亜綱、Ｅｕｃｏｃｃｉｄｉｉｄａ目およびＥｉｍｅｒｉｉｎａ亜目のＳｐｏｒｏｚｏｅａ、ならびにＣｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｅｉｍｅｒｉａ属、Ｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｎｅｏｓｐｏｒａ属、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｙｚｚｅｒｉａ属およびＷｅｎｙｏｎｅｌｌａ属のスポロシスト形成原虫によって引き起こされた疾患である。
【０００３】
特に、コクシジウム症は動物の腸の疾患であり、Ｃｏｃｃｉｄｉａ亜綱（Ｅｉｍｅｒｉａ属）の原虫寄生体によって引き起こされた家畜（例えば、家禽）を含む。これらは主として、腸管上皮で複製する偏性細胞内原虫寄生体である。これらの寄生体は、単宿主性のライフサイクルを持ち、高い割合で宿主種特異性および組織特異性を示す。全体的に、コクシジウム症に起因する損害および予防投薬の費用の組み合わせは、産業に影響を及ぼす有意な年間経済の損失を生じる。
【０００４】
家畜のコクシジウム症感染症の経済影響は、養鶏業（ここでは、トリの集中的な家屋（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｏｕｓｉｎｇ）が疾患の蔓延となる）で特に厳しい。家禽（ｆｏｗｌ）（例えば、家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）および他の家畜のトリ）に関しては、Ｃｏｃｃｉｄｉａ感染症は、発育阻害および皮膚変色から経済的打撃を生じる。さらに、多数のＥｉｍｅｒｉａ種は、環境からの感染性粒子の経口経路を介しておよび／または吸入によって、単一の宿主に感染し得る。一旦摂取すると、寄生体は、腸壁の粘膜層に侵入し、損傷し、その結果、急性罹患を引き起こす（例えば、感染したトリにおいて、発育減少および飼料利用の減少をもたらす）。
【０００５】
Ｅｉｍｅｒｉａ属、Ｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ属またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の原虫は、代表的に、これらのライフサイクルを完成するために、単一の宿主を必要とするだけである。自然条件下において、このライフサイクルは、この状況から胞子形成化オーシストの摂取で始まる。摂取された胞子形成化オーシストの細胞壁は、砂嚢の機械的な破壊によって壊され、そして／または腸の酵素によって消化される。スポロシスト内はスポロゾイト（これは、生物体の感染段階にある）である。スポロゾイトは、腸粘膜または他の位置の上皮細胞に侵入する。感染部位は、含まれる種の特性である。
【０００６】
宿主動物の細胞内では、スポロゾイトはまた、分裂小体と呼ばれる多核巨細胞メロントに進化する。各々のメロント核は、メロゾイトと呼ばれる感染体へと発生を行い、新しい細胞に入り、このプロセスを繰り返す。可変数の無性世代の後に、メロゾイトは、小配偶子または大配偶子のいずれかへと発生する。小配偶子は、順番に、大配偶子と受精する多数の小配偶子に発生する。生じた接合体は、強硬な外被を形成することによって被包し、次いで、オーシスト（糞の中で胞子形成をしない）と呼ばれる。適切な環境条件下では、このオーシストは、胞子形成し、感染性になる。次いで、感受性のある動物による摂取によって、このサイクルを繰り返される。
【０００７】
Ｃｏｃｃｉｄｉａの感染は、種特異な免疫を誘発する。例えば、ニワトリに感染するＣｏｃｃｉｄｉａ種が７つ知られており、これらのうち６つは、中等度の病原性を重度の病原性にすると考えられている。
【０００８】
従って、家禽（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｖｉａｎ）において、以前に曝露していないトリが、疾患の発生（別の種のＣｏｃｃｉｄｉａの導入もしくは新しい種のＣｏｃｃｉｄｉａの導入）をもたらし得る。オーシストは、（実験室方式でそれらを壊し得るが、）ｐＨ、界面活性剤、タンパク質分解酵素、糖分解酵素および脂肪分解酵素、機械的な破壊ならびに薬品（例えば、次亜塩素酸ナトリウムおよびニクロム酸カリウム）に対して極度の耐性があり、何週間も宿主の外で生存する。例えば、ニワトリに感染するＣｏｃｃｉｄｉａ種が７つ知られており、これらのうち６つは、中等度の病原性を重度の病原性にすると考えられている。
【０００９】
多数の方法が、Ｃｏｃｃｉｄｉａに対して家禽を免疫するために開発されている。市販で成功している全ての方法は、生きている被嚢原虫（しばしば、弱毒化株）の投与に基づく。他の経路が使用されているが、最も一般的な接種経路は経口である。Ｅｄｇａｒ（特許文献１）は、生存可能なＥ．ｔｅｎｅｌｌａの胞子形成化したオーシストの経口投与によって、ニワトリのワクチン接種を与える。Ｄａｖｉｓら，特許文献２は、抗Ｃｏｃｃｉｄｉａｌ薬の同時投与の有無にかかわらず、少数の胞子形成化オーシストの連続投与によって、ワクチン接種の方法を与える。
【００１０】
弱毒化は、ニワトリの連続継代によって達成され得る。オーシストの初期形成を示すＣｏｃｃｉｄｉａ株の選択、および弱毒化は、特許文献３（本明細書中においてその全体が参考として援用される）によって記載されている。
【００１１】
弱毒化スポロシスト株の経口投与はまた、コクシジウム症に対する免疫を与えるために利用されている（特許文献４；ＭｃＤｏｎａｌｄ，特許文献３；およびＳｃｈｍａｔｚら，特許文献５）。弱毒化への代替手段は、非特許文献１に開示され、これは、卵片発生を予防するために、γ放射線で処置されているスポロゾイトの経口投与を与える。
【００１２】
ワクチン接種の非経口的な経路は、脱嚢スポロゾイトの皮下投与または腹腔内投与（Ｂｈｏｇａｌ，特許文献６；Ｂｈｏｇａｌら，特許文献７）、およびオーシストまたはスポロシストのいずれかの卵内（ｉｎｔｒａ−ｏｖｏ）投与（Ｅｖａｎｓら，特許文献８；非特許文献２）を含む。Ｔｈａｘｔｏｎ（特許文献９）は、卵黄嚢注射によって新たに孵化したニワトリへ、オーシストまたはスポロゾイトの投与により、Ｃｏｃｃｉｄｉａに対するワクチン接種の方法を与える。
【００１３】
ワクチン接種のための生存可能な原虫の必要性は、現在のワクチン接種の方法の全てにおける共通因子である。生存不能な原虫または原虫からの抗原は、臨床的な感染症に対する予防として必要とされる、高水準の免疫を与えることに失敗している。
【００１４】
これまで、生存可能で、生きている原虫（例えば、オーシスト）は、生きていて、インタクトに感染したトリから以前に収集されている。しかし、ワクチン生産について生存可能なＣｏｃｃｉｄｉａ細胞を産生するために、生きた動物またはいくつかのＣｏｃｃｉｄｉａ種（ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）の卵）の使用は、高価でありかつ効率が悪い。
【００１５】
ワクチン生産、および他の目的での使用において、必要な数量のＣｏｃｃｉｄｉａを産生するための経済的で効率的な代替法は、長い間、探求されている。インビトロのＣｏｃｃｉｄｉａの増殖（Ｐｒｏｐｏｇａｔｉｏｎ）が試みられているが、成功は限られている。Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＢＫ）細胞は、インビトロにおいてＥｉｍｅｒｉａの増殖を支持すると報告されているが、この発生は、無性発生の１回の複製サイクルに限定される（非特許文献３）。Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（非特許文献４）およびＥ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ（非特許文献５）ならびにＥ  ｂｏｖｉｓ（Ｓｐｅｅｒら，Ｚ．Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ，（１９７３））からのＥｉｍｅｒｉａオーシストは、初期の宿主誘導性メロゾイトが種菌として使用されている場合に獲得された。しかし、上記に述べたように、感染動物組織由来のメロゾイトを使用する必要性は、これらのアプローチの有用性を限定する。
【００１６】
特許文献１０は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａおよびＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘの増殖を支持する（しかし、複製はわずか７２時間だけに認められた）異常な胚組織由来のニワトリ細胞株を記載する。別の欠点は、ニワトリ由来の不死化細胞株が、生ワクチンを作製するために使用される場合、腫瘍形成能をニワトリに伝える危険性を与えるいうことである。
【００１７】
メロゾイトの限定された継代は、公知である。例えば、特許文献１１は、スポロゾイトは、非特許文献６に記載される方法の改変を使用して、細胞凝集物として培養中に増殖する原始ニワトリ腎臓細胞（ＰＣＫ）に感染する。しかし、この方法によって産生されたメロゾイトが一旦放出されると、この培養は終結する。これは、Ｅｉｍｅｒｉａ属は同調した増殖を示し、従って、オーシストの放出において、比較的短い期間の後に、メロゾイトの不死化細胞株（すなわち、終結しないメロゾイトの細胞株）を産生するために誘導され得ないという、最新のドグマである。
【００１８】
従って、ワクチン生産および他の試み（ｅｎｄｅａｖｅｒ）の使用において、十分なＣｏｃｃｉｄｉａ細胞を獲得するための経済的で効率的な方法のための長年の探求（ｌｏｎｇｆｅｌｔ）および長年の必要性が依然として引き続いている。インビトロにおける不死化哺乳細胞のメロゾイトの増殖が所望である。しかし、上記に述べたように、適切な宿主細胞を提供するインビトロ培養系は、必要の場合のみ誘導され得る感染段階への転換を伴い、Ｃｏｃｃｉｄｉａの無性生殖期（すなわち、メロゾイト）の無期限増殖を可能にするという点で、以前は利用可能でなかった。
【００１９】
本明細書中の任意の参考文献の引用も、これらの参考文献が、本願に対して「先行技術」として利用可能であるという承認として解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第３，１４７，１８６号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５４４，５４８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，０５５，２９２号明細書
【特許文献４】米国特許第４，４３８，０９７号明細書
【特許文献５】国際公開第９４／１６７２５号パンフレット
【特許文献６】米国特許第４，８０８，４０４号明細書
【特許文献７】米国特許第５，０６８，１０４号明細書
【特許文献８】国際公開第９６／４０２３３号パンフレット
【特許文献９】米国特許第５，３１１，８４１号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，８４６，５２７号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，５００，４３８号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，３７（１）：７４−８２（１９９３）
【非特許文献２】Ｗａｔｋｉｎｓら，Ｐｏｕｌ．Ｓｃｉ．，４（１０）：１５９７−６０２（１９９５）
【非特許文献３】Ｄ．Ｍ．Ｓｃｈｍａｔｚ，Ａｄｖ，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，５：２４１（１９８７）
【非特許文献４】Ｍ．Ｎａｃｒｉ−Ｂｏｎｔｅｍｐｓ，Ａｎｎ．ｒｅｃｈ．Ｖｅｔ．，７：２２３（１９７６）
【非特許文献５】Ａｕｇｕｓｔｉｎら，Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，２５：８２，（１９７８）
【非特許文献６】Ｄ．Ｊ．Ｄｏｒａｎ，Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．５７：８９１−９００，（１９７１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、発生の無性生殖期におけるＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱の偏性細胞内原虫の連続培養のための方法を提供することによって、他の問題と同様に上記で同定された問題を解決する。本発明の方法は、以下の工程を含む：Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種を増殖するのに適した不死化宿主細胞を含む細胞培養系を提供する工程、宿主細胞の感染について有効な条件下で、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種の感染段階で宿主細胞を接触する工程、宿主細胞（ここで、この宿主細胞は、食作用によって原虫を取り込み得る）にメロゾイトの増殖をもたす工程、を包含する。
【００２３】
本明細書に提供された本発明の方法および培養系は、これまで入手不可能な量のオーシスト、メロゾイトおよび／または他のライフステージのＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫の産生を可能にさせる。このような量のこれらの細胞の利用能は、生ワクチン中の生存可能なＳｐｏｒｏｚｏｅａ細胞封入体を動物に提供する工程（経済的な量のＳｐｏｒｏｚｏｅａタンパク質および／またはＳｐｏｒｏｚｏｅａ核酸が、任意の有用な目的（例えば、診断、タンパク質ベースのワクチン、生物体の分子生物学および／もしくは遺伝学の研究など）のために、容易に獲得される）を包含する、種々の有用性を可能にする。
【００２４】
細胞培養系は、培養における宿主細胞およびＳｐｏｒｏｚｏｅａ種の生物体を維持するのに適切な培地を含む。選択された宿主細胞株に適した任意の培地も、使用され得る。
【００２５】
好ましい実施形態において、培地は、還元剤（例えば、生殖が無性生殖である生活環段階における無期限培養において、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種生物体を維持するのに有効な濃度）を含む。培養系と互換性をもつ任意の還元剤が、例えば、機能上同等な、約０．０１〜約０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの濃度で、使用され得る。
【００２６】
好ましい宿主細胞は、哺乳類網様内皮細胞由来の食作用活性を保持する不死化細胞（例えば、単球細胞株由来の不死化細胞株）である。
【００２７】
本発明の方法および培養系を用いて培養される好ましい生物体は、単一型の宿主細胞だけを自然に感染させて、以前に工業規模で無期限細胞培養が首尾よく保たれてない、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫である。これらは、トリに感染させる、例えば、Ｃｏｃｃｉｄｉａならびに／または例えば、Ｅｉｍｅｒｉａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍおよびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに好ましくは、Ｅｉｍｅｒｉａ種のメンバーである。
【００２８】
一般に、２つのタイプの宿主細胞を自然に感染させるＳｐｏｒｏｚｏｅａ（例えば、Ｎｅｏｓｐｏｒａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｆｒｅａｎｋｅｌｉａ、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ、ＨａｍｍｏｎｄｉａおよびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）は、長期培養に対して感受性が高く、それらは本発明の細胞培養系で増殖し得るが、これらのＳｐｏｒｏｚｏｅａは、これらの方法による増殖のために好ましい生物体ではない。
【００２９】
本発明はまた、本発明方法によって産生されたＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫、およびこのような原虫を含む抗原虫ワクチンを提供する。Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱のそのような原虫に対して、トリにワクチン接種する方法もまた、提供する。
【００３０】
本発明の培養系および方法によって産生された生物体を含むワクチン組成物はまた、例えば、薬学的に受容可能なアジュバントおよび当該分野で公知の保存薬、着色剤などを含む。必要に応じて、本発明のワクチンは、経口投与のために飲料水、食料になる穀類またはペレットで混合され得る。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の方法および細胞培養系によって産生された生物体を用いてワクチン接種された鳥類を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、スクリーニングされる因子との接触の有無に関わらず、上記に記載されるように、目的のＳｐｏｒｏｚｏｅａ種を培養する工程、および目的の因子の非存在下で、増殖または増殖に関する生存度の阻害を検出する工程を包含する、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫の増殖を破壊するかまたは阻害する因子をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、好ましい実施形態によれば、以下の方法などが提供される：
（項目１）
無性発生段階におけるＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱の偏性細胞内原虫の連続培養のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種を増殖するのに適した不死化哺乳類宿主細胞を含む細胞培養系を提供する工程であって、ここで、偏性細胞内原虫は、トリに感染し得る、工程；および
（ｂ）該宿主細胞においてメロゾイトの増殖を生じる、該宿主細胞の感染に有効な条件下において、感染段階のＳｐｏｒｏｚｏｅａ種と宿主細胞とを接触させる工程、を包含する、方法。
（項目２）
前記細胞培養系が、前記宿主細胞および前記Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種生物を維持するのに適した増殖培地を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記増殖培地が、還元剤を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記還元剤は、生殖が無性生殖であるライフサイクル段階において、無限培養でＳｐｏｒｏｚｏｅａ種生物を維持するのに有効な濃度で存在する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記還元剤が、β−メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミン、２，３−ジメルカプトコハク酸、ペニシラミン、β−ラクタム、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルベート、グルタチオンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記還元剤が、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭにわたる濃度のβ−メルカプトエタノールである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記宿主細胞が、哺乳類網様内皮細胞由来の食作用活性を保持する不死化細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記網様内皮細胞が、単球である、項目７に記載の方法。
（項目９）
Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される属に帰属する種である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ種である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘおよびＥｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａまたはＥｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目１に記載の方法によって産生された、生存可能なＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫。
（項目１４）
Ｅｉｍｅｒｉａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ、ＦｒｅｎｋｅｌｉａおよびＢｅｓｎｏｉｔｉａからなる群から選択される属に帰属する種である、項目１３に記載の原虫。
（項目１５）
項目１３に記載の原虫を含む、抗原虫ワクチン組成物。
（項目１６）
保護性の抗原虫免疫を誘発するために、トリにワクチン接種する方法であって、該方法が、項目１の方法によって産生された生存可能な生物を、それを必要とするトリに投与する工程を包含し、ここで、生存可能な生物の数がトリに保護免疫を誘発するのに有効である、方法。
（項目１７）
前記トリが家畜のトリであり、前記原虫がＣｏｃｃｉｄｉｏｓｉａである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記トリが、Ａｎａｔｉｄａ、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａ、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅおよびそれらの種からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記トリが、シチメンチョウまたはニワトリである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記生存可能な生物の数が、メロゾイトまたはオーシストまたはそれらの混合物を含み、該生存可能な生物の数が１０〜１０６個にわたる、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記生存可能な生物の数が１０２〜１０５個のメロゾイトまたはオーシストを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記生存可能な生物が、経口投与、羽の粉付けもしくは噴霧、インオボ注射およびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって投与される、メロゾイトまたはオーシストを含む、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
細胞培養系であって、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種を増殖するのに適した不死化食宿主細胞、および還元剤なしで培養されたＳｐｏｒｏｚｏｅａ種の生存と比較して無期限細胞培養において、ライフステージを無性生殖的に生殖するＳｐｏｒｏｚｏｅａ種の生存を増強するのに有効な量の還元剤を含む細胞培地を含む、細胞培養系。
（項目２４）
薬学的に受容可能なアジュバントを含む、項目１５に記載のワクチン組成物。
（項目２５）
項目２４のワクチン組成物と共に混合された食品組成物を含む、ワクチン。
（項目２６）
スクリーニングされる因子との接触が有りおよび無しで、項目１に記載の方法によって、目的のＳｐｏｒｏｚｏｅａ種を培養する工程、および目的の因子の非存在下において増殖の阻害または増殖に関する生存度を検出する工程を包含する、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱の原虫の増殖を破壊するかまたは阻害する因子をスクリーニングする方法。
（項目２７）
無性発生段階における偏性細胞内原虫の連続培養のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）不死化ウシ単球を含む細胞培養系を提供する工程であって、ここで、該不死化ウシ単球細胞は、食作用によって原虫を取り込み得；
ここで、該細胞培養系は、不死化ウシ単球の増殖に適切な培地および約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭにわたる濃度のβ−メルカプトエタノールを含む、工程；および、
（ｂ）宿主細胞においてメロゾイトの増殖を生じる、宿主細胞の感染に有効な条件下で、感染段階の原虫と宿主細胞を接触させる工程であって；
ここで、該原虫は、トリに感染するＥｉｍｅｒｉａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される属の種である、工程
、を包含する、方法。
（項目２８）
前記原虫は、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘおよびＥｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥｉｍｅｒｉａ種である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記方法はさらに、増殖が少なくとも８０％のコンフルーエンシーに達する時はいつでも、前記培養系における宿主細胞の濃度を減少させる工程を包含する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
原虫の一つ以上のＥｉｍｅｒｉａ種からニワトリまたはシチメンチョウを免疫するためのワクチンであって、トリＥｉｍｅｒｉａ種のメロゾイト；メロゾイトから発生したオーシスト、またはそれらの混合物を含み；ここで、該メロゾイトは、不死化哺乳類食細胞の連続培養で増殖された、ワクチン。
（項目３１）
前記哺乳類食細胞が単球である、項目３０に記載のワクチン。
（項目３２）
前記単球がウシ単球である、項目３１に記載のワクチン。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（本発明の詳細な説明）
従って、本発明は、宿主細胞を含む培養系およびＳｐｏｒｏｚｏｅａ綱のスポロシスト形成原虫のインビトロ連続培養のための方法を提供する。本発明の培養系によって産生される原虫細胞（例えば、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａメロゾイトおよび／またはオーシストもしくは他の抗原物質）もまた提供する。このような物質は、例えば、ヒト、鳥類および家畜（家禽を含む）を感染するＳｐｏｒｏｚｏｅａからの予防を必要とする動物のワクチン接種のために、抗Ｓｐｏｒｏｚｏｅａワクチンの生産に使用され得る。
【００３４】
従って、本発明は、このような細胞の経済的で効率的な産生を可能にするために、インビトロにおいて、無期限または十分に長期間維持されるＳｐｏｒｏｚｏｅａ細胞の無性生殖期を可能にする細胞培養系および方法を提供する。
【００３５】
本発明の培養系および方法は、生存可能なそして有毒な（すなわち、感染性）スポロシスト形成原虫の培養集団の産生をもたらす。一般に、これらの方法は、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱、特にＣｏｃｃｉｄｉａ亜綱、特にＥｕｃｏｃｃｉｄｉｉｄａ目、そして特にＥｉｍｅｒｉｉｎａ亜目の任意のスポロシスト形成原虫、ならびにＣｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｅｉｍｅｒｉａ属、Ｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｎｅｏｓｐｏｒａ属、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｙｚｚｅｒｉａ属およびＷｅｎｙｏｎｅｌｌａ属のスポロシスト形成原虫にも適用可能である。
【００３６】
本明細書に提供された方法は、全てのＳｐｏｒｏｚｏｅａ培養に対して、そして特にＣｏｃｃｉｄｉａｌオーシストの培養（例えば、Ｅｉｍｅｒｉａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ、ＦｒｅｎｋｅｌｉａおよびＢｅｓｎｏｉｔｉａの全てのトリの感染性種）に対して有用であると考えられる。インビトロで培養する方法は、生きている動物の使用および／もしくは提示された寄生虫を宿主にする種でのアッセイを、置換し、そして／または補充し得る。
【００３７】
特に好ましい実施形態において、本発明は、例えば、Ｅｉｍｅｒｉａ属、Ｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ属またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の原虫および類似する単一宿主細胞の必要条件を満たす他の原虫のインビトロ培養にとって有用であると考えられる。これらの原虫は、それらの好ましい宿主細胞に対する特異的な受容体を有し、代表的に、これらの細胞を培養する困難性に加えて、他の細胞に感染しない。上記に記載しているように、これらの原虫は、代表的に、それらのライフサイクルを完成するために単一の宿主を必要とする。
【００３８】
対照的に、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ綱の他の属は、それらのライフサイクルを完成するために二つの宿主を必要とする。例えば、Ｎｅｏｓｐｏｒａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｆｒｅａｎｋｅｌｉａ、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ、ＨａｍｍｏｎｄｉａおよびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓは、それらのライフサイクルを完成するために二つの宿主を必要とし、そしてこれらは、不死化細胞培養で維持することがそれほど難しくないことを証明した（例えば、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｎｅｕｒｏｎａの培養を記載する、Ｄａｍｅら，米国特許出願第２００２／０１１５８２８Ａ１号を参照のこと。この開示は、本明細書中においてその全体が援用される。）。
【００３９】
非常に特異的な単一型の宿主を必要とする原虫（特に、Ｅｉｍｅｒｉａ属、Ｉｓｏｓｐｏｒａ属、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ属またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属および単一な宿主だけを必要とする他のＳｐｏｒｏｚｏｅａ  ｓｐ．）が、インビトロでの長期培養において、これまで厄介な問題であったことを証明した。本発明の方法は、この問題を解決し、これらの生物の長期培養のための方法および細胞培養系を提供する。
【００４０】
（定義）
本発明の範囲および本質をより一層評価するために、以下の用語が定義される。
【００４１】
用語「宿主細胞」とは、本発明の培養系で使用された任意の哺乳類種の不死化細胞をいう。好ましくは、これらは、食作用のプロセスによって原虫を取り込む「食細胞」（すなわち、これらの細胞が培養系で維持することが望まれる原虫を飲み込み、その結果、この原虫は、食胞に取り込まれる）である。例えば、本発明は、インビトロ培養に適応され、目的の原虫を維持する任意の食細胞株を使用すると考えられている。これらとしては、例えば、単球に由来する細胞株およびそれらの子孫由来の細胞株（例えば、マクロファージ、ならびにリンパ節、脾臓、および骨髄の細網細胞、組織球（例えば、中枢神経系の小膠細胞、肺胞マクロファージ、肝臓のクッパー細胞など））が挙げられる。不死化細胞は、必要に応じて、ウシ、ブタ、イヌ、サル、ネコ、ヒト、ウマ、ヒツジ、マウスおよび／またはオオカミの供給源（名前にかかわらず、このようないくつかの動物起源において）からの起源から選択される。不死化細胞は、インビトロで無期限に増殖するという点で、いわゆる「初代」細胞株と区別されるが、初代細胞株は、インビボでのように振る舞い、インビトロで無期限に複製しない。
【００４２】
用語「培養」とは、必要に応じて、宿主細胞上へのオーシストまたはメロゾイトの配置、および新しい宿主細胞への継代を意味する。好ましくは、代表的な培養系の原虫細胞の数は１０６個以上であるか、または他の実施形態において、これらの数は変化し得るが、１０９個以上の細胞である。本明細書で使用される場合、用語「連続培養」とは、別の方法で示されない限り、無期限に繁殖する細胞培養を意味する。好ましくは、Ｅｉｍｅｒｉａの培養について、１８日間またはそれ以上長い間、培養において、無性生殖期の増殖を繁殖または継続する株は、連続培養物である。より好ましくは、連続培養物は、１５０日間と同じくらい長い間、またはそれ以上の間、無性生殖期で増殖および維持し続け、そして、低温または凍結によって容易に保存され、続いて適切な宿主へ再導入後に無性増殖を再開する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「家畜のトリ（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ｂｉｒｄ）」としては、別の方法で示されない限り、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、猟トリ（ウズラ、キジおよびガチョウが挙げられるがこれらに限定されない）および平胸類（ダチョウが挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。
【００４４】
用語「被包」とは、原虫寄生体のオーシスト段階を意味する。
【００４５】
用語「スポロシスト」とは、オーシストのスポロゾイトを封入するカプセルをいう。胞子形成化オーシストの摂取から糞内のオーシスト出現までの時間は、検出潜伏時間という。これは、種々のＥｉｍｅｒｉａ種間で異なる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「Ｅｉｍｅｒｉａ」とは、別の方法で示されない限り、家畜のトリを感染させる一つ以上のＥｉｍｅｒｉａ属の種を意味する。Ｅｉｍｅｒｉａ種としては、ニワトリで見出された種（例えば、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘおよびＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉが挙げられる）、ならびにシチメンチョウで見出された種（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａおよびＥ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａが挙げられる）、ならびに上記で定義されるような他の家畜のトリを感染させるＥｉｍｅｒｉａ属種もまた挙げられる。用語「Ｅｉｍｅｒｉａ」はまた、前述のＥｉｍｅｒｉａの種の全ての株が挙げられ、これらとしては早熟性株および弱毒性株（株が完全に発生できないように放射線照射された株または別の方法で処置された株が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。用語Ｅｉｍｅｒｉａはまた、上記で定義されるように、新たに発見された任意の株または家畜のトリを感染させるＥｉｍｅｒｉａ種を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「オーシスト」および「メロゾイト」とは、別の方法で示されない限り、生存可能な（すなわち、生存する）（例えば、環境、動物および本発明に従う不死化培養物から得られるような）ＥｉｍｅｒｉａオーシストおよびＥｉｍｅｒｉａメロゾイトを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「免疫化」および「ワクチン接種」は、同義語であり、交換可能で使用される。本明細書で使用される場合、用語「有効な免疫用量」とは、別の方法で示されない限り、オーシストおよびメロゾイトの数を意味するか、あるいは混合された場合には、ワクチン接種された際にトリにおける免疫応答（例えば、抗Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．抗体力価および／または細胞媒介性免疫の活性の上昇）を誘発するのに十分な、オーシストおよびメロゾイトの数を意味する。好ましくは、誘発された免疫反応は、ワクチン接種された（有毒な用量のトリ特異的Ｅｉｍｅｒｉａ種でチャレンジされる）トリにおける臨床疾患の徴候、体重減少、罹病率および／または死亡率を制限するかまたは減少させる、予防免疫を提供する。
【００４９】
（Ｓｐｏｒａｚｏｅａの供給源）
本発明の培養系によって培養されたＳｐｏｒｏｚｏｅａは、既知のサンプル、感染動物（例えば、血液、糞、組織）から獲得されるか、または汚染された環境物質から獲得される。サンプルに存在する集団（例えば、土壌サンプルまたは糞便サンプル）が主としてスポロシスト段階にある場合、集団のサンプルは本明細書に記載されるように簡潔に培養される。この集団が主としてオーシスト段階にある場合、この集団は環境のマネジメントのために、周知の方法で胞子形成を受けることを誘導され得るか、または集団からのサンプルは、周知の実験室的方法を使用することで胞子形成を受けることを誘導され得る。この集団またはサンプルが主として胞子形成化オーシスト段階にある場合、当該分野で周知の方法、例えば、ガラスビーズを用いた機械的な破壊によって、スポロシストは容易に獲得され得る。
【００５０】
（オーシストの供給源）
オーシストは、感染動物の糞または組織；汚染した飼料もしくは水；土壌；貯蔵わらもしくは床敷き；または、他の種々の供給源、から入手可能である。スポロシストの単離方法は公知である。オーシストを分離するのに使用される正確な手段は、オーシストが獲得される物質で異なり、当業者に容易に明らかである。
【００５１】
以下は、未精製の環境サンプルから生物を単離するための、一つの利用可能なアプローチを要約する。要するに、初期工程は、異物からのオーシストの分離である。一般に、土壌または排泄物は、飽和食塩水を用いてスラリーを形成して、スラリーからスポロシストを分離することによって処理される。例えば、処理されるべき物質は、スラリーを形成するために、最小量の２倍量（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ飽和水溶液と混合される。必要ならば、均質の硬度が達成されるまで、このスラリーは、ミキサーまたはブレンダーで処理され得る。このスラリーは、４℃で１０分間、約８００×ｇで遠心分離される。２４×２４ウィーブチーズ・クロス（ｗｅａｖｅ  ｃｈｅｅｓｅ  ｃｌｏｔｈ）の二重層を通して注ぐことによって、上清が回収される。一般的に使用されるサンプルからオーシストを精製する他の方法としては、Ｓｈｅａｔｈｅｒのスクロース浮上法およびＺｉｎｃ硫酸塩浮上法（例えば、ＬＲ  ＡｓｈおよびＴＣ  Ｏｒｉｈｅｌ，Ｐａｒａｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ（著作権）１９９１、本明細書中において参考として援用される）が挙げられる。
【００５２】
フィルターにかけた上清を、２倍量の飲料水で希釈し、４℃で１０分間、約１６００×ｇで遠心分離する。ペレット化されたオーシストを、水で洗浄し、上述のようにさらに３回、遠心分離によってペレット化する。次いで、オーシストを、水洗浄で使用したのと同じ手順を用いて、２．５％の重クロム酸カリウムで３回洗浄する。最終的な洗浄後に、オーシストは、４℃で２．５％重クロム酸カリウムに保存され得るか、または胞子形成のために容器に移され得る。
【００５３】
あるいは、連続した濾過は、サイズに基づいたオーシストを単離するために使用され得る。濾過が使用される場合、オーシストは前に記載されるように、水および２．５％重クロム酸カリウムで洗浄される。
【００５４】
（胞子形成）
当該分野で公知の方法によって、オーシストの胞子形成を誘導することが可能である。例えば、２．５％重クロム酸カリウム溶液の入った容器にオーシストを入れ、そして、開口部に綿またはフォームラバープラグをとりつけることによって、胞子形成を達成し得る。この容器を、２８〜３０℃で４８〜７２時間、２５０ｒｐｍの軌道振盪機上で攪拌する。あるいは、空気を溶液を介して１時間あたり約２５〜７５立方フィートで泡立てる間、オーシストを含む溶液を、絶えず攪拌し得る。胞子形成プロセスの間、スポロシストを含むか否かを決定するために、サンプルを、一定の間隔を置いて回収し、オーシストの顕微鏡検査によって胞子形成を試験する。
【００５５】
あるいは、サンプルが環境（例えば、床の塵）から獲得される場合、この塵が天然の胞子形成を引き起こすために、適切な湿気条件および温度条件を提供するように対処され得る。
【００５６】
胞子形成に続いて、胞子形成化オーシストは、濾過、遠心分離または当業者に公知の他の許容可能な濃縮手段によって回収される。例えば、胞子形成化オーシストは、４℃で１０分間、約１６００×ｇの遠心分離によって濃縮され得、そして、この上清は捨てられ得る。濃縮後に、胞子形成化オーシストは、４℃で１０分間、５．２５％次亜塩素酸ナトリウムの懸濁によって殺菌され得る。殺菌後、この胞子形成化オーシストは、４℃で１０分間、１６００×ｇの遠心分離または他の許容可能な手段によって、次亜塩素酸ナトリウムから除去される。次いで、胞子形成化オーシストは、４〜６回、滅菌水で洗浄される。洗浄後に、胞子形成化オーシストは、２．５％ニクロム酸カリウム、３０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または他の許容可能な消毒薬中で保存され得る。
【００５７】
胞子形成化オーシストは、当該分野で公知の方法（例えば、外被膜の機械的な破壊および／またはタンパク質分解性消化）によって、外被膜を含まないスポロシストを獲得するために破壊され得る。１つの便宜的な方法は以下の通りである。要するに、胞子形成化オーシスト（例えば、上記に記載されるように、必要に応じて、環境物質（土壌または糞）から分離された胞子形成化オーシスト）は、ＰＢＳ中に約２×１０６／ｍｌの濃度に希釈される。このＰＢＳの１ｍｌアリコートは、０．５ｍｍガラスビーズを１２５μｌ含む１．５ｍｌ微量遠心管に添加される。次いで、このチューブは、５分間、高速でボルテックスされ、次いで氷上で冷蔵保存される。ボルテックス後、この上清は除去され、そして保存される。次いで、このガラスビーズはＰＢＳで洗浄され、そして上清が保存され、そしてボルテックスした後に獲得された上清と混合される。次いで、上清は、約２〜３分間、約９００×ｇで遠心分離され、そして上清は捨てられる。スポロシストを有するペレットは、０．２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁される。次いで、１ｍｌあたりのスポロシストの濃度が、血球計算板または他の細胞数決定法を用いて決定される。
【００５８】
（インビトロにおける宿主細胞株のＳｐｏｒａｚｏｅａの培養）
記載の便宜のために、本培養系はバッチ培養系の点で記載される。当業者は、培養系および関連方法が、バッチで与えた培養系（ｂａｔｃｈ−ｆｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）および連続培養系を包含する培養において、細胞を増殖するために、他の当該分野で公知の方法に容易に適応されることを理解する。インビトロにおいて動物細胞を増殖するための当該分野で公知の多数の方法の詳述は、例えば、Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（著作権）２０００（本明細書中においてその全体が参考として援用される）に記載される。
【００５９】
本発明の培養系について、開始集団は、天然に存在する集団あるいは実験室で維持されるもののいずれかであり得る。この集団が主としてオーシストまたは胞子形成化オーシストを含む場合、食細胞の細胞株が宿主細胞として使用される（食胞融解小体に放出を達成する）場合、本発明に従った寄生生物を脱嚢する必要はない。
【００６０】
サンプル中のスポロシストは、胞子形成／脱嚢およびメロゾイトの増殖を可能にさせる間、宿主細胞と共に培養され、各宿主細胞内で増幅される。この時間は、異なる宿主細胞およびメロゾイト（ｍｅｒｏｚｕｉｔｅ）の種で変化するが、代表的に、Ｅｉｍｅｒｉａ
ｓｐについては約７２時間である。
【００６１】
維持培地（例えば、本明細書に定義されるような培養培地）は、取り換えられないというより、むしろ新しい培地が３日間毎に添加される。培養されたメロゾイトは、オーシストまたはスポロシストを成熟し、産生することを可能にさせる。インキュベーション時間は、代表的に、約４〜約３０日間にわたる。例えば、培養においてメロゾイトを産生する代表的な時間は約１０日間であり、オーシストを産生する代表的な時間は１８日間である。
【００６２】
特に、培養が分割されず、密度を増やすことを可能にさせる場合、約１８日間に、オーシストまたはスポロシストが培養液に放出される。そうでなければ、培養の適切な分割の状態では（すなわち、細胞密度の周期的な低減）、この培養は、メロゾイトを産生し続ける。
【００６３】
スポロシストは、遠心分離によって維持培地から収集され、冷凍保存、凍結保存または凍結乾燥のいずれかによって保存される。メロゾイトは、一般に、感染宿主細胞の培養容積の約１／２０に制限される、培養細胞のアリコートを除去することによって収集される。次いで、このアリコートは、新たにトリプシン処理された宿主細胞の副集密層（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）に挿入される。実験室スケールの生産において、そして／または培養系がスケーリングされる場合、メロゾイトの移動の最適な頻度は、これが特定の宿主細胞株（Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種）でいくらか変化するが、代表的に、約１０日間ごとである。メロゾイトが、増強された病原性または新しい宿主株に対する病原性を達成するために、２つの細胞株の間で通過される場合、移動の最適な時間は好ましくは４日間であるが、これに限定されない。次いで、宿主細胞の感染は、染色された原虫（例えば、ギムザ染色）を染色し検出するのに適切な、任意の手段を用いて決定される。相関によって、元の集団における原虫の生存度は、サンプル中の原虫の染色の程度に基づいて見積もられ得る。力価試験は、生きたトリのアッセイによる生存度と関連され得る。この生きたトリのアッセイは、ワクチンを調製するためのインビトロの力価試験を確認し得る。
【００６４】
一つの好ましい実施形態において、本発明は、増殖および脱嚢を支持し得る培養系（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐの連続培養）を提供する。必要とされる限り、この培養系は無性生殖の分裂形態において、メロゾイト集団を維持し、そして、必要とされる場合、この培養系は包嚢に包むために（すなわち、ワクチン、または他の用途のためのオーシストとして、メロゾイトを終結するために）メロゾイトを含み得る。本発明の培養系の宿主細胞は、本発明の方法に経済的に適応され得る、任意の適切な不死化哺乳類細胞株である。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐの脱嚢および増殖を支持する不死化食細胞から選択され、そして、例えば、哺乳類網様内皮細胞由来の例えば不死化細胞の連続培養で繁栄し得る不死化食細胞から選択される。これらは、例えば、単球およびそれらの子孫（例えば、マクロファージ、ならびにリンパ節、脾臓、および骨髄の細網細胞、組織球、中枢神経系の小膠細胞、肺胞マクロファージ、肝臓のクッパー細胞など）が挙げられる。不死化細胞は、必要に応じて、ウシ、ブタ、イヌ（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３８９）、サル、ネコ、ヒト（例えば、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ２０２）、ウマ、ヒツジ、マウス（例えば、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ６１）および／またはオオカミの供給源（このような供給源としていくつか挙げると）から選択される。
【００６６】
本発明がどのように作動するかに関して、任意の理論または仮説によっても制限されることはないが、寄生生物細胞を細胞内の貪食空胞に吸収する能力に起因して、食細胞は、一部分において、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ生物体を培養するために適していると考えられる。
【００６７】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明はまた、培養系の使用について、適切な宿主細胞を同定するためのスクリーニング系を提供する。要するに、適切な宿主細胞は、以下に示されるように、本発明の培養系を使用することによって同定され、これらの例のウシ単球細胞株のかわりに候補宿主細胞を用い、ウシ単球細胞を用いて達成される寿命および増殖に関して、置換された培養系におけるメロゾイトの寿命および増殖を決定する（全ての他のパラメーターは同じであるかまたは類似である）。適切な宿主細胞（例えば、食細胞）は、無性生殖状態において、このような生物体の長期培養に有用である（例えば、少なくともＥｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．および関連生物において例示されたウシ単球細胞と同じくらい首尾よい）Ｓｐｏｒｏｚｏａｅａ生物体の寿命および増殖を提供する。
【００６８】
さらなる好ましい実施形態において、宿主細胞は、選択された宿主細胞の長期培養のために適切であり、かつ還元剤（例えば、約０．０１〜約０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノールの機能的同等物である還元活性を有する濃度の還元剤）を含む培地で培養される。適切な還元剤は、長期培養において、Ｓｐｏｒｏｚｏａｅａ生物体（例えば、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐを含む）の寿命を高める任意の還元剤である。
【００６９】
１つの特定の任意の実施形態において、ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）は、本発明に従って好ましい還元剤から除去される。
【００７０】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、培養系での使用に適切な還元剤を同定するためのスクリーニング系を提供する。要するに、適切な還元剤は、以下に示すように、本発明の培養系を使用し、これらの例のβ−メルカプトエタノールのかわりに候補還元剤を用い、そして、例えば、類似のレベルの還元活性で（β−メルカプトエタノールについて首尾よく使用されたものに関連して）、β−メルカプトエタノールの有無での達成に関する、置換された培養系におけるメロゾイトの寿命および増殖を決定することによって同定される。適切な還元剤は、無性生殖状態におけるこのような生物体の長期培養に有用である（例えば、少なくともＥｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．および関連生物においてβ−メルカプトエタノールと同じくらい首尾よい）Ｓｐｏｒｏｚｏａｅａ生物体のための寿命および増殖を提供する。
【００７１】
単に一例として、好ましい還元剤は、ジスルフィド結合を還元する因子であり、β−メルカプトエタノール、メルカプトエチラミン、２，３−ダイマーカプトコハク酸、ペニシラミン、β−ラクタム、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸ならびにそれらの同等物および／またはその組み合わせが挙げられる。
【００７２】
当業者は、最適な培養生産力および寿命を決定するために、選択された還元剤の濃度を変え、他のパラメーターを一定に保つ一方で、示された細胞培養系をルーチンに使用することによって、適切な還元剤の濃縮を最適化し得る。例えば、目的の還元剤について、増加するレベルの濃度は、利益がもはや増加された濃度と共に改善しないレベル、または任意の還元剤のネガティブな効果が培養の生産性および寿命の利益を上回るレベルを決定するために試験され得る。
【００７３】
最も好ましくは、還元剤は、細胞培養液において、約０．０１ｍＭから約０．５ｍＭまで、またはそれ以上にわたる濃度のβ−メルカプトエタノールであり、より好ましくは、約０．０５５ｍＭの濃度のβ−メルカプトエタノールである。本発明がどのように作動するかに関して、任意の理論または仮説によっても制限されることはないが、使用された濃度において、一般に１ｍＭ未満であり、そして好ましくは０．１ｍＭ未満であり、還元剤は選択的に、宿主細胞ならびに／または寄生虫性分化に関する寄生虫シグナルおよび／もしくは放出シグナルの減少に介入すると考えられている。
【００７４】
本発明がどのように作動するかに関して、任意の理論または仮説によっても制限されることはないが、一つの代替的な実施形態において、還元剤は、宿主細胞貪食空胞への取り込まれた、消化または傷害する原虫から、食細胞宿主細胞を阻害し、従って、食細胞宿主細胞の細胞株内の培養において、生存可能な原虫寄生体に有効に寄与すると仮定される。
【００７５】
さらなる実施形態において、宿主細胞培養系は、例えば、上記の濃度範囲で（例えば、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．生物体の連続培養の間）、食細胞の不死化細胞株および適切な還元剤（例えば、β−メルカプトエタノールまたはその機能的な同等物）を含む培養液の両方を使用する。
【００７６】
最も好ましい実施形態において、宿主細胞は、本明細書中においてその全体が参考として援用される（Ｄｒ．Ｓｐｅｅｒ，：Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）、Ｓｐｅｅｒら，１９８５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５０：５６６−５７１からのウシ単球細胞（時々ＢＭ６１７という）である。ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ６０１７およびＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ６０５７から得られるウシ単球もまた、示される。
【００７７】
本発明の培養系は、選択された宿主細胞が適切な場合、培地、密度、任意の増殖基質もしくは表面、温度および気圧を使用する。必要に応じて、宿主細胞は、フラスコを攪拌または回転しながら懸濁液中で増殖する。あるいは、例えば、固体基質を必要とする宿主細胞に関して、この細胞は、フラスコ表面上で、増殖培地で浸したスライド上で、ペトリ皿の中で、および／または増殖培地で懸濁されたマイクロビーズ（必要に応じて、磁気）の表面上で、または任意の選択された宿主細胞に適切な、当該分野で公知の任意の他の細胞増殖支持体上で増殖する。  
【００７８】
例えば、本明細書で示され、上記に記載されたウシ単球細胞を使用する場合、この細胞は、好ましくは、培養での使用のために、８０％コンフルエンシー未満の密度で、約１５０ｃｍ２組織培養フラスコに播種される。好ましくは、この宿主細胞は、抗菌剤（例えば、ペニシリン／ストレプトマイシン）および静真菌剤を補充された標準細胞培地（例えば、ＧｉｂｃｏのＲＰＭＩ）で増殖する（５％  ＣＯ２、３７℃）。実験室スケールにおいて、宿主細胞の培養フラスコが、最大密度（例えば、８０％〜１００％コンフルエンシー）に達する場合、このフラスコは、細胞濃度を減少させるために、分割（ｄｉｖｉｄｅ）されるかまたは「分割（ｓｐｌｉｔ）」される（例えば、１／６のコンフルエント密度まで）。もちろん、ワクチンまたは他の目的のために、原虫物質の量産のためにスケーリングされる場合、このプロセスは変動することを当業者は理解する。
【００７９】
この培養系は、選択された宿主細胞株のために、適切な温度で処理される。好ましくは、インキュベーションは、約２５℃〜約４５℃にわたる温度で処理され、さらに好ましくは、約３７℃〜約４１℃にわたる温度である。
【００８０】
（ワクチンおよび培養されたＥｉｍｅｒｉａ  ｓｐを用いたトリへのワクチン接種）
生物体は生きた動物または卵の供給源から獲得されるが、Ｅｉｍｅｒｉａ種ワクチンは公知である。詳細は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄら，米国特許第５，０５５，２９２号によって示される（本明細書中においてその全体が参考として援用される）。
【００８１】
培養系によって獲得されたメロゾイトの精製は、当該分野で公知の任意の方法によって達成される。単に一例として、かつ限定されることなく、オーシストは培養液に放出され得、そして／または、培養された細胞は、メロゾイトを収集するために、当該分野で公知の方法によって破裂され得る。この細胞破片は、例えば、Ｊ．Ａ．Ｏｌｓｏｎ，１９９０，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１４３５−１４３９に記載されるように、除去され得る。要するに、放出されたメロゾイトを含む培養液を回収する工程を包含するＯｌｓｏｎの方法は、メロゾイトを濃縮するために、１０分間、４５０×ｇで回収され、回転される。メロゾイトおよび宿主細胞破片を含むペレットは、０．１Ｍ  ＮａＣｌ−０．０５Ｍ  ＫＣ１−２０％ウシ血清アルブミン中に懸濁されて、７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−８６ｍＭ  ＮａＣｌ−１００ｍＭグルコースに平衡化されたＤＥ−５２陰イオン交換カラム（ｐＨ８．２）に適用される。メロゾイトは、カラムを通って流れる。Ａ．Ｋｉｌｅｊｉａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４６５０−４６５５，（１９７４）に記載されるように、カラムから回収されたメロゾイトは、電子顕微鏡によって純度を試験され得る。
【００８２】
トリに対するワクチンとして使用される場合、スポロゾイトもしくはメロゾイト、またはそれらの混合物は、好ましくはインオボ（ｉｎ  ｏｖｏ）に投与されるか、または生理学的に適切な任意の培地でニワトリへの注射によって投与される。好ましくは、それらは生理学的にバランスの取れた生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁される。選択された培地は、必要に応じて、一つ以上の懸濁剤を含み得、これらは、生理学的に適切なゲル、ゼラチン、ヒドロゾル、セルロースまたは多糖ゴムが挙げられる。
【００８３】
一つの好ましい実施形態において、このような生存可能な生物体（例えば、メロゾイトおよび／またはスポロゾイトを含む）は、好ましくは、インオボに投与されるかまたは以下の経路による注射または接種によってニワトリに投与される：アジュバントおよび／または免疫エンハンサーもしくは免疫刺激剤（同時投与するかまたは、例えば、ワクチン接種前またはワクチン接種後に連続的に投与する）の任意の組み合わせにおいて、任意の適した非経口投与、皮下投与、乱刺投与および／または筋肉内投与（当該分野で公知の形態（例えば、適応する緩衝液および／または生理学的に受容可能な生理食塩水））。
【００８４】
適切な免疫刺激剤は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、リンパ球の細胞培養からの上清、単球、リンパ器官由来の細胞、細胞調製物または細胞抽出物（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはリポ多糖調製物）、マイトジェンまたは低分子量の医薬品を含むアジュバントを含むが、これらに限定されない。免疫刺激剤は、インキュベーションの間の任意の時間にインオボに投与され得る。好ましくは、免疫刺激剤は、Ｅｉｍｅｒｉａスポロゾイト、Ｅｉｍｅｒｉａメロゾイト、またはそれらの混合物の用量を含む培地において、インオボに投与される。
【００８５】
経口的に投与されたワクチン／ワクチン接種方法について、当該分野で公知の任意の生理学的に適切な緩衝液または懸濁化剤が、容易に使用される。さらに、この組成物は、穀粒または他の穀物などに取り込まれ得るか（例えば、飲料水の中に混ぜるかまたは食物ペレット上に噴霧される）、まぶされ得るか、または噴霧され得る。
【００８６】
ワクチン接種の目的について、投薬量または種菌は、メロゾイト、オーシストおよび／またはその組み合わせ（２つ以上のＥｉｍｅｒｉａ種）の生存細胞および活性細胞を含む。
【００８７】
ワクチン接種について、本発明の方法によって培養されたＥｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．細胞の好ましい用量は、約１０〜約１０６個の範囲のオーシストまたはメロゾイトまたはそれらの混合物である（ここで、オーシストおよびメロゾイトの総数は、約１０〜１０５個の範囲である）。投与された細胞は、適切な宿主細胞を介した継代によって、照射によって、組換え変異によって、そして／または当該分野で公知の他の方法によって、必要に応じて弱毒化される。
【００８８】
より好ましい用量は、約１０２〜１０５個の範囲のオーシストまたはメロゾイトまたはそれらの混合物である（ここで、オーシストおよびメロゾイトの総数は、約１０３〜１０５個の範囲である）。
【００８９】
さらに好ましい用量は、約１０２〜１０５個の範囲のオーシストまたはメロゾイトまたはそれらの混合物である（ここで、前記オーシストおよびメロゾイトの総数は、約１０２〜１０５個の範囲である）。
【００９０】
ワクチン接種を必要とする家畜のトリを含む任意のトリは、この処置を受けることが企図される。好ましくは、このようなワクチン接種を受けるトリは、商業的な鳥類飼養または非営業的な鳥類飼養に関連するトリである（例えば、Ｃｏｃｃｉｄｉａｌ感染が起こり得、そしてＣｏｃｃｉｄｉａｌ感染が望ましくない条件下において、多数増加したトリ）。これらは、例えば、Ａｎａｔｉｄａｅ（例えば、ハクチョウ、ガチョウおよびアヒル）、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ（例えば、家畜のハトのようなハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ））、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ（例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ）、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ（例えば、家畜のニワトリ）、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ（例えば、ペットの市場または収集家の市場で飼育された、例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム）が挙げられる。狩猟鳥および平胸類の鳥は、本発明の培養方法によって産生された原虫細胞または他の誘導体と共に、ワクチン接種されることもまた検討される。ワクチン接種のために投与されたＥｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．生物体の好ましいレシピエントは、ニワトリである。
【００９１】
当該分野で公知の任意の投与経路またはワクチン接種は、容易に使用される。従って、用量は、必要に応じて、ニワトリの卵にインオボに投与される。用量はまた、必要に応じて、若い羽（例えば、初生ひな）とワクチン生物体とを接触することによって投与されるか、あるいは食物中におよび／または噴霧もしくは点滴によって経口投与される。経口送達は、口に直接的（飲料水の中に）に用量を適用することによって、そして／または羽上にこの用量を噴霧することによって、達成される（洗顔動作を介して経口送達を提供する）。用量はまた、必要に応じて、ニワトリによって摂取されるペレットまたはゲルに生物体を適用するか、または混合することによって、経口的に投与される。
【００９２】
ニワトリ卵または初生ひなにインオボに投与される好ましい用量は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘおよびＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉからなる群から選択された２つ以上のＥｉｍｅｒｉａ種の、オーシストまたはメロゾイト、またはそれらの混合物を含む。
【００９３】
シチメンチョウ卵または初生ひなにインオボに投与される好ましい用量は、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａおよびＥ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａからなる群から選択された２つ以上のＥｉｍｅｒｉａ種の、オーシストまたはメロゾイト、またはそれらの混合物を含む。この用量は、好ましくは１０〜１０６個のオーシストまたはメロゾイトまたはそれらの混合物を含む（この用量に含まれる各種について）。
【００９４】
必要に応じて、このワクチンは、本発明の培養系によって産生されたＥｉｍｅｒｉａ  ｓｐ．を用いたワクチン接種前および／またはワクチン接種後に、当該分野で公知の任意の適切な抗Ｃｏｃｃｉｄｉａｌ化学療法剤またはワクチン接種の効果を弱めるのに有効な用量域における化学療法剤因子を用いて、ワクチン接種された動物における予防免疫応答の形成を損なわないで、同時投与（例えば、同時に）される。化学療法剤は、任意の有効な抗原虫薬剤（例えば、殺菌薬のような抗原虫化合物、抗生物質、抗Ｃｏｃｃｉｄｉａｌ抗体を含む組成物（例えば、モノクローナル抗体）および／またはそのフラグメントもしくはその組換え誘導体）を含むが、これに限定されない。
【００９５】
本発明に従った組み合わせの処置はまた、ワクチン接種前におよび／または任意の他の時間に、当該分野で公知の任意の免疫刺激剤を投与する工程および／または同時投与する工程を包含する。
【００９６】
免疫刺激剤を投与する工程の好ましい方法は、孵化の最後の四半期の間または初生ひなへの、適用量のオーシストもしくはメロゾイト、もしくは前記オーシストおよびメロゾイトの混合物の同時のインオボ投与である。
【００９７】
本発明の別の局面は、冷蔵すること、凍結することまたは凍結乾燥することによる、オーシストまたはメロゾイト、または前記オーシストおよびメロゾイトの混合物の保存である。例えば、本発明の培養方法および培養系によって産生された生存可能な生物体を凍結する場合、当該分野で公知の凍結保存が必要に応じて使用される。これらは、単に例として、グリセロールなどの浸透保護剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、糖（例えば、グルコース、ガラクトース、ラフィノース）、タンパク質（例えば、血清および／もしくはアルブミンならびに他の血清成分）、尿素、またはアミノ酸組成物（例えば、Ｎ−Ｚ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）Ａ（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｏｆｆｍａｎ
Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩｌｌｉｎｏｉｓからのＩＰＬ：５Ｘ５９０２７）のようなカゼイン加水分解物）が挙げられる。
【００９８】
（抗原虫剤のスクリーニング）
本発明の培養系はまた、抗原虫剤、特に抗Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐ因子をスクリーニングして同定するのに有効で有用な方法を提供する。スクリーニングされる因子は、潜在的予防薬剤または治療薬剤（例えば、薬物または抗体）などを含む。
【００９９】
要するに、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種は培養され、この培養は分割される。予防法を試験するために、試験因子は、単層細胞によるオーシストの脱嚢前に培地に導入される。治療効果を試験するために、第１分裂は、正常な維持培地の培養系で増殖される。両方の方法において、無性生殖で生殖する原虫の段階を傷害するかまたは抑制する可能性を評価させるために、第２分裂は、目的の因子を補充された（溶液中に提示するかまたはテストストリップまたはテストディスクへ薬品を塗る）維持培地の培養系で増殖される。
【０１００】
公知の薬剤耐性特性を有する薬剤感受性原虫または生物体は、代替的な治療薬物をスクリーニングするために、必要に応じて使用される。
【０１０１】
代替的な戦略において、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種は培養され、この培養は分割される。第１分裂は、正常な維持培地の培養系で増殖される。無性生殖で生殖する原虫の段階を傷害するかまたは抑制する可能性を評価させるために、第２分裂は、目的の因子を補充された（溶液中に提示するかまたはテストストリップまたはテストディスクへ薬品を塗る）維持培地の培養系で増殖される。薬剤感受性原虫または公知の薬剤耐性特性を有する生物体はまた、代替的な治療薬物をスクリーニングするために、培養系で使用されると考えられる。
【０１０２】
（ワクチンでの使用のための弱毒性Ｅｉｍｅｒｉａ株の開発）
ワクチンの調製のためにウイルスを弱毒化する周知の方法は、高い継代レベルまで組織培養中で継代されることである。長期培養を通じて、生物体は培養条件に適応する特性を集積する傾向があり、病原力特性を失い得る。本明細書に記載される培養系は、生ワクチンとして使用されるために、非毒性株を開発する目的のために、Ｅｉｍｅｒｉａの長期増殖に使用される。この技術は、５０以上の継代のために、実施例２に記載されるように、メロゾイト培養の継代を使用する。
【０１０３】
あるいは、ウシ単球における増殖に適応したメロゾイトは、種々の種（例えば、イヌ、ネコ、ウシまたは他のもの）由来の腎臓細胞などの代替の細胞株で増殖する能力のために選択され得る。種々の継代レベルにおいて、これらの連続培養から得られたメロゾイトまたはオーシストは、実施例４に記載されるように、初生ひなまたは孵化卵の中への接種によって、病原性について試験され得た。培養で複製するそれらの能力を保有した高い継代株は、宿主細胞において減少した病原力を示すが、ワクチン開発のために選択された。
【実施例】
【０１０４】
（実施例）
以下の特定の実施例は、例示の目的のために含まれ、別の方法で示されない限り、本発明の範囲に限定されることを意図しない。
【０１０５】
（実施例１）
（ワクチン接種のための連続培養系の調製）
以下のように、連続培養系を調製した。
【０１０６】
不死化ウシ単球宿主細胞株を７６回継代し、マイコプラズマがないことを見出した。ウシ単球細胞株は、Ｓｐｅｅｒら，Ｉｄ（前出）に従った細胞の誘導体である。
【０１０７】
ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシン（２．５μｇ／ｍｌ）、β−メルカプトエタノール（０．０５５ｍＭ）および１０％ウマ血清もしくはウシ血清（維持培地）で補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）に、宿主細胞を維持した。
【０１０８】
１５０ｃｍ２組織培養フラスコに、１フラスコあたり１５ｍｌ（約６×１０４細胞／ｍｌ）で宿主細胞を播種し、その結果、８０％コンフルエンシー〜１００％コンフルエンシーの密度で単層を生じた。細胞を定置フラスコでインキュベートした（３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター）。３日ごとに１５ｍＬの新しい維持培地を細胞に与え、７日ごとに分割した。０．２５％のトリプシンを用いて単層を破壊することによって、培養物を分割し、同じ培地条件および同じインキュベーション条件を用いて、６回の培養のうち１回、各々の新しい１５０ｃｍ２フラスコへプレートした。
【０１０９】
（実施例２）
（Ｅｉｍｅｒｉａ種原虫の培養）
感染したニワトリの糞からのＥｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストのサンプルを、以下のように、培養のために調製した。糞のスラリーは、糞１に対して水１０を添加することによって作製し、オーシストは糖浮上法の手段によって精製した（ＬＲ  ＡｓｈおよびＴＣ  Ｏｒｉｈｅｌ，Ｐａｒａｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ（著作権）１９９１，３４−３５頁に記載されるように、Ｓｈｅａｔｈｅｒの糖浮上法と同様（本明細書中においてその全体が参考として援用される））。オーシストを遠心分離によって濃縮し、２．５％のニクロム酸カリウムで再懸濁し、そして、胞子形成を容易にするために、２４時間〜７２時間、室温で空気にさらした。使用するまで、スポロシストを４℃で保存した。コンタミした細菌を傷害するために、胞子形成オーシストを、クロロヘキシジングルコン酸溶液（ＰｅｒｉｏｇｕａｒｄＴＭ）に、２５℃で１分間、懸濁した。洗浄によって、クロロヘキシジングルコン酸を除去した。遠心（６分間、８００×ｇ）によってオーシストをペレット化し、上清を捨て（上清を捨てる場合、１回ペレットを懸濁する）、次いで、実施例１に記載された、１００分量の抗生物質／静真菌性の維持培地にペレットを懸濁することによって、洗浄を実施した。遠心分離および再懸濁をさらに２回繰り返した。
【０１１０】
実施例１で調製されたウシ単球のフラスコは、８０％未満のコンフルエンシーで、トリプシン処理後すぐに使用した。次いで、新たに調製した各々のフラスコは、上記に記載されるように調製した、１５ｍＬの維持培地の中に、約１０００個のオーシストを接種した（１０−３個の寄生虫／宿主細胞の宿主細胞になるようなスポロシスト／オーシストの密度）。約３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで、培養物を定置フラスコの中でインキュベートした。
【０１１１】
３日ごとに新しい培地（１５ｍｌ）を添加し、１０日間、オーシストをウシ単球細胞と共にインキュベートした。１０日後に、単層を培養液へ断片化することによって、培養上清および感染細胞を回収し、実施例１に記載されるように、２０回の培養のうち１回は、８０％未満のコンフルエンシーで、（感染していない）新しいウシ単球の単層にワクチン接種した。分裂体について培養を日々観察し、宿主細胞から放出し、浮遊したスポロシスト／オーシストを観察した。上清培養液をデカントすることによって、生存可能なスポロシスト／オーシストを回収し、その後、寄生虫を濃縮するために、６分間、８００×ｇの遠心分離を行った。スポロシスト／オーシストは、すぐに使用するか、またはさらなる実験に使用するまで、２〜７℃で、培地の中に保存した。合計１８０日間、メロゾイトに感染した細胞を継代し、この培養における継続的な複製能力を維持した。
【０１１２】
（実施例３）
（スポロシスト形成生物体の保存）
本発明はまた、インビトロ培養において、そしてトリの接種の必要がない状態で、感染力を観察することによって、保存されたＥｉｍｅｒｉａオーシスト／スポロシストの生存度を評価する方法を提供する。
【０１１３】
測定法を用いたスクロース浮上法によって、ニワトリの糞からＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａのオーシスト／スポロシストを獲得したか、または実施例２に記載されるような培養からＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａのオーシスト／スポロシストを誘導し得た。
【０１１４】
このオーシスト／スポロシストを５つの同等のアリコートに分割した。凍結保存薬剤（例えば、Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ＭｅｄｉａＴＭ，Ｇｉｂｃｏ）を用いて、４つのアリコートを−２０℃で凍結し、そして、５番目のアリコートを−２７℃で保存した。
【０１１５】
ウシ単球における感染力との比較によって、この培養から誘導された４つ凍結サンプルの生存度を、冷凍保存した５番目のサンプルの生存度と比較した。
【０１１６】
以下のように、生存度の比較を実施した。
【０１１７】
簡単に、実施例１の方法を用いた寄生虫接種（ワクチン接種する場合、８０％コンフルエンシー未満）の直前に、無菌カバーガラスを含む２４ウェルのプレートに、１ウェルあたりの約１×１０５〜２×１０５個の細胞密度で、ウシ単球を植えつけた。試験サンプルの系列希釈（例えば、１０−１〜１０−４の希釈系列）を維持培地で作製し（実施例１から）、０．１ｍｌは二連のウェルの２４ウェルプレートに播種した。プレートを約３７℃でインキュベートした（１〜４日間、３〜５％ＣＯ２）。顕微鏡検査によって、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａの感染段階の存在について、ウェルを調べた。あるいは、カバーガラスをこのウェルから除去し、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ寄生虫の観察を容易にするために、ギムザ染色した。５０％感染力を示す最も高い希釈として、各サンプルの力価を計算した。サンプルを相対的な感染価に基づく生存度について比較した。
【０１１８】
（実施例４）
（培養からのメロゾイトの収集）
培養物（実施例１および実施例２を参照のこと）が活発に複製される（例えば、一般に最後の分割（継代培養）の１０日以内に）場合、メロゾイトを収集した。感染細胞および培養上清を、細胞スクレーパを用いて収集した。機械的手段（シリンジの２７ゲージ針を介した吸引）によって宿主細胞を溶解した。次いで、メロゾイトを遠心分離（１０分間、４５０×ｇ）によって濃縮し、維持培地で再懸濁した。次いで、試験動物にワクチン接種するために、生じた懸濁液を使用した。
【０１１９】
（実施例５）
（培養からのオーシストの収集）
多くのオーシストを集積させるために、１８日間もしくはそれ以上長い間、分割しないで実施し得る培養（実施例１および実施例２を参照のこと）から、オーシストを収集した。培養上清を収集し、そして、Ｓｈｅａｔｈｅｒの浮上方法を用いて、細胞破片からオーシストを精製した（前出で検討）。次いで、遠心分離（１０分間、４０５×ｇ）によって、オーシストを濃縮した。ペレットにされたオーシストを維持培地に再懸濁し、すぐに使用した。
【０１２０】
（実施例６）
（ニワトリのワクチン接種）
本実施例は、予防ワクチンとして（前出）、実施例２の培養方法で増殖したＥｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストおよびメロゾイトならびにＥｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａオーシストおよびメロゾイトを使用する可能性を示す。
【０１２１】
（実験Ａ：Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａおよびＥ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストを用いたニワトリへのワクチン接種）
（方法）
１９日間の培養物からの培養上清をデカントすることによって、培養されたウシ単球から誘導されたＥ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストおよびＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストを収集した。オーシストを遠心分離によって濃縮し、１ｍｌあたり１００，０００個のオーシストの濃度で培地に再懸濁し、すぐに使用した。
【０１２２】
本試験は、３群のＲｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｒｅｄ初生ひなを使用した。実験グループ１は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（ｎ＝３）について組織培養誘導性オーシストを受けたニワトリであった；実験グループ２は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ（ｎ＝３）について組織培養誘導性オーシストを受けたニワトリであった；そして、実験グループ３は、コントロールのニワトリであった（オーシストなし（ｎ＝２））。グループ１およびグループ２各々の強制飼養（各ニワトリ１００〜１０００羽）によって、オーシストを経口的に投与した。
【０１２３】
（結果）
９日後に、グループ１のニワトリの糞にオーシストを観察し、そして１２日後に、グループ１のニワトリおよびグループ２のニワトリの両方の糞にオーシストを観察した。これらのデータは、培養誘導性オーシストが実施可能であり、これらの種について予想される正常な検出時間で、宿主において複製されるということを確認する。
【０１２４】
オーシストを与えなかったグループ３のコントロールのニワトリは、それらの糞の中にオーシストを落とさなかった。これらのデータは、試験トリまたは家庭内のトリの条件において、Ｅｉｍｅｒｉａを有する環境汚染の証拠はなかったことを確認した。従って、グループ１およびグループ２におけるオーシストの脱粒は、培養種菌の結果と考えられ得る。
【０１２５】
（組織病理学）
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストを与えた１羽のニワトリは、重度の下痢で死亡した。
【０１２６】
死亡したニワトリからの腸の組織切片の顕微鏡検査にて、コクシジウム症と確定診断した。これらのデータは、ウシ単球培養から誘導されたオーシストが、トリ宿主においてそれらの病原性を維持し得ることを示す。
【０１２７】
（実験Ｂ：Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａおよびＥ．ｔｅｎｅｌｌａを用いたニワトリにおける負荷試験）
（生物体の培養および継代）
予備実験において、上記のパートＡで使用した多くのオーシストからのオーシストのアリコートを、メロゾイトの連続培養を産生するために、実施例２（前出）に記載されるように培養した。一つの１５０ｃｍ２フラスコ（ウシ単球細胞含有）に、１００個のオーシストの種菌を用いた。実施例２に記載されるように、非脱嚢オーシストが培養中に存在しないことを確実にするために、２回継代した。
【０１２８】
（ワクチン接種）
経口接種によって、初生ひな（半分Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  ＲｅｄもしくはＢａｒｒｅｄ  ＲｏｃｋおよびＡｍｅｒｉｃａｎａ）に培養したメロゾイトを接種をした。上記で調製した１００，０００個の培養誘導性Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａメロゾイトまたはＥ．ｔｅｎｅｌｌａメロゾイトを受けたトリは下痢を示し、一方、１０００個、５０００個および１０，０００個のメロゾイトの用量を受けた初生ひなは下痢を示さなかった。
【０１２９】
培養したメロゾイトを用いた接種の１４日後、１０００個、５０００個および１０，０００個のメロゾイトを与えたニワトリならびに１羽の接種されていないコントロールのニワトリを、パートＡ（前出）からオーシストを落としたニワトリによって占められた以前の環境へ移した。この汚染している環境に置いた場合、メロゾイトを受けなかった初生ひなは、コクシジア感染症で死亡した。しかし、前もって低レベルのメロゾイトでワクチン接種をしたニワトリは、臨床的には健康なままであった。これらのデータは、無症状用量のメロゾイトが、トリにおいて誘導免疫（致死量のＥｉｍｅｒｉａを用いた後の負荷試験からそれらを保護した）を可能にしたこと示す。
【０１３０】
【表１】
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（実験Ｃ：１０日齢胚へのＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａおよびＥ．ｔｅｎｅｌｌａの接種）
１０日齢の胚を含有したニワトリ卵に、１０００個のＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａおよびＥ．ｔｅｎｅｌｌａのウシ単球培養誘導性メロゾイト（実施例２により）の尿膜経路によるインオボ接種は、どのメロゾイト種においても胚死をもたらした。組織におけるオーシスト形成の証拠はなかった。これらのデータは、Ｅｉｍｅｒｉａの両種が、ウシ単球の培養後に胚に対して病原性を保持したことを示す。
【０１３１】
（実施例７）
（抗原虫因子のスクリーニング）
Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種に対して提案された抗原虫因子の有効性は、実施例１および実施例２の系を用いて評価した。
【０１３２】
（Ａ．Ｄｉｃｌａｚｕｒｉｌについてのスクリーニング）
ＴｈｅｒｍｏｎａｘＴＭ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）含有２４ウェル組織培養プレートを使用し、ウシ単球細胞を播種し、そして実施例１の方法を用いて、維持培地に＜８０％コンフルエンスまで培養した。その後、各ウェルにＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａおよびＥ．ｔｅｎｅｌｌａを播種した。各１０個の試験ウェルの培地の中に、抗コクシジア因子ｄｉｃｌａｚｕｒｉｌを導入する一方で、他の１０個のウェルをコントロールとして保持した。試験した薬剤の抗原虫活性を評価するために、培養２４時間、４８時間および７２時間において、増員生殖の存在をコントロールのウェルと試験ウェルとの間で比較した。寄生虫の増殖についての観察は、顕微鏡試験およびギムザ染色したカバーガラスで行った。薬物処置を評価するために、増員生殖の存在およびコントロールウェルからの減少パーセントを使用した。
【０１３３】
（Ｂ．他の薬剤についてのスクリーニング）
２４ウェル組織培養プレートを使用し、宿主細胞に対して適切な維持培地で、温度でそして適切な雰囲気下で、宿主細胞を＜８０％コンフルエンスまで増殖し、次いで、目的のＳｐｏｒｏｚｏｅａ種を各ウェルに播種する。試験するために、各１０個の試験ウェルの培地に一つの薬剤または複数の薬剤を導入する一方で、他の１０個のウェルをコントロールとして保持する。試験した薬剤の抗原虫活性を評価するために、培養約１〜１０日後の増殖をコントロールのウェルと処理したウェルとの間で比較した。
【０１３４】
寄生虫の増殖についての観察は、顕微鏡試験またはギムザ染色あるいは寄生虫を観察するための適切な染色したカバーガラスの使用であり得る。
【０１３５】
（実施例８）
（コントロール原虫のための評価方法）
家畜の原虫感染を減少させる一つの方法は、例えば、Ｃｏｃｃｉｄｉａのような生物体を家内の動物へ感染させ得る物質を除去するために設計された、取り扱い方法（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を実施することである。
【０１３６】
このような取り扱い方法は、培養系ならびに実施例１および実施例２の方法をそれぞれ用いて、容易に評価される。
【０１３７】
規格化サンプル（例えば、同腹のサンプル）を目的の領域から取り、そして、存在し得るオーシストを単離するためにプロセスする。実施例２に記載されるように、これらを培養系へ播種し、５〜１０日後の増殖を、測定し多数の公知の生物体を有するサンプルと関連付け、開始サンプルの範囲に関連する増殖レベルを決定する。
【０１３８】
次いで、新しい取り扱い方法を実施し、その後、取り扱い方法の変更前に要した位置および量で、規格化サンプルを収集する。次いで、新しいサンプルを培養し、目的の環境領域における任意の生存可能な原虫の減少を決定するために、５〜１０日目の増殖を、取り扱い前のサンプルの増殖と比較した。