(57)【要約】【課題】患者における移植拒絶、特に、心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法を提供することを、本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより、患者における移植拒絶、特に、心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法を提供することによって解決された。移植拒絶、特に心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするための診断オリゴヌクレオチド、およびこれらを含むキットまたはシステムもまた記載される。１つの実施形態において、個体の免疫状態を評価する方法であって、該個体における造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布に依存して異なったレベルで発現される１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のインビトロでの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、米国仮特許出願第１０／１３１，８３１号（２００２年４月２４日出願）および同第１０／３２５，８９９号（２００２年１２月２０日出願）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
この出願は、臓器移植後の発現プロファイリングの分野にある。
【０００３】
（発明の背景）
疾患の診断、予後、重症度分類、および治療における現在の欠点の多くに対して、疾患の基礎を成す分子機構の同定、ならびに疾患状態の発生または進行を発現パターンにより予測するか、または特定の治療的介入に対する患者の反応を予測するヌクレオチド配列（またはヌクレオチド配列の集合）の発見を介して、取り組みがなされ得る。特に、容易にアクセス可能な細胞および組織からの、予測値によるヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列集合の同定は、非常に価値がある。例えば、末梢血は、全ての患者から得られ得、そして低コストかつ多くの時点で容易に採取することができる。このことは、容易に入手できないか、もしくは侵襲的で有害な手順を介してのみ入手可能な大部分の他の細胞型および組織型に対して、望ましい対照である。また、所望する場合、遺伝子発現分析に先立って血液試料中の多くの細胞型を容易に分離し得るため、循環血液中に存在する種々の細胞型は、発現プロファイリング実験にとって理想的である。発現プロファイリング技術を用いた疾患の研究にとって、そして診断技術の開発および治療標的の同定にとって、血液が非常に魅力的な基質を提供する一方で、血液試料中の発現プロファイリングの値は、それらの細胞型における遺伝子発現の変化が、疾患に対する予兆、ならびに疾患の病因および進行に関連する程度に依存する。
【０００４】
造血は、血液の全ての細胞型の発生および成熟である。これらとしては、赤血球、血小板および白血球が挙げられる。白血球は、さらに、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）および単核細胞（モノサイト、リンパ球）に分類される。これらの細胞は、循環プールを満たすため、そしてこの系の損傷およびチャレンジに応答するために前駆細胞から発生および成熟される。これは骨髄、脾臓、胸腺、肝臓、リンパ節、粘膜結合リンパ組織（ＭＡＬＴ）および末梢血において生じる。
【０００５】
前駆細胞は、各系統の未成熟形態に分化し、そしてこれらの未成熟細胞は、成熟細胞にさらに発達する。このプロセスは、造血成長因子の影響および指向下で生じる。造血が刺激される場合、末梢血には多くの未成熟な細胞が存在し、いくつかの場合、前駆細胞は増加した頻度で見出される。例えば、ＣＤ３４＋細胞（造血幹細胞）は、免疫系に対する損傷を有する末梢血において頻度が増加し得る。好中球については、「バンド」形状が増加し、赤血球については、網状赤血球、または有核赤血球が認められる。リンパ球は、リンパ芽球（未成熟リンパ球）に先行する。
【０００６】
種々の系統の赤血球の生成速度を測定することは、重要な臨床目的であり得る。種々の血球の生成に関連する造血障害は、薬理学的に処置され得る。例えば、貧血（低赤血球）は、エリスロポイエチン（造血増殖因子）で処置され得、そしてこの治療に対する応答は、ＲＢＣ生成速度を測定することによって評価され得る。低好中球数は、Ｇ−ＣＳＦの投与によって処置され得、そしてこの治療は、好中球生成速度を測定することによってモニタリングされ得る。あるいは、赤血球障害の診断は、系統特異的生成速度の決定によって非常に促進される。例えば、貧血（低ＲＢＣ）は、減少された細胞生成または増加した細胞の破壊によって引き起こされ得る。後者の場合、細胞生成速度は、減少されるよりもむしろ増加され、そして治療の影響は非常に異なる。赤血球生成速度の測定の臨床的用途のさらなる議論を、以下にする。
【０００７】
赤血球生成速度の評価は、診断および非血液病障害について有用であり得る。特に、急性同種移植拒絶の診断およびモニタリングは、このようなアプローチにより有益であり得る。急性同種移植拒絶の現在の診断およびモニタリングは、侵襲性同種移植生検および生検病歴の評価によって達成される。このアプローチは、患者の手順の経費、費用、疼痛および不快感、熟練した臨床医の必要性、手順の合併症の危険性、免疫系機能に対する洞察力の欠如、ならびに病理学的評価の変動に起因して、最適とは言えない。さらに、生検は、同種移植片に重大な細胞侵襲が生じた後にのみ、急性同種拒絶を診断し得る。この時点で、このプロセスはすでに、同種移植に損傷を引き起こしている。これらの全ての理由のために、プロセスにおける初期段階での急性拒絶を診断およびモニタリングし得る単純な血液試験が必要とされる。同種拒絶は、免疫系の機能細胞の存在に依存する。さらに、拒絶のプロセスは造血の活性化を引き起こし得る。最後に、急性拒絶を処置または予防するのに効果的な免疫抑制治療は、造血を抑制し得る。これらの理由のために、造血細胞生成速度の評価は、急性拒絶の診断およびモニタリングにおいて有用であり得る。
【０００８】
細胞の発達および生成速度を測定する現在の技術は不適切である。最も一般的なアプローチは、長期にわたって目的の系統の成熟細胞の数を測定するものである。例えば、患者が貧血（低赤血球数）について処置されている場合、臨床医は血球数を測定して循環の赤血球（ＲＢＣ）数を評価する。これが効果的であるために、臨床医は長期にわたって細胞数を測定しなければならず、そして治療に対する応答を評価できるまで２〜４週間待たなければならない。同じ制限が、血液の全ての細胞系統の評価に当てはまる。
【０００９】
代替的なアプローチは、顕微鏡下でこれらの細胞を計数することによって末梢血における未成熟細胞数を計数することである。これは、細胞生成速度のより迅速な評価を可能にし得るが、熟練した血液学者による評価の必要性、観察者による変動および形態学だけに基づいて全ての前駆細胞を識別できないことによって制限される。
【００１０】
骨髄生検は、細胞生成速度の評価について貴重な基準である。熟練した臨床医の必要性、読み手の変動および形態学だけによる感度の欠如の制限に加えて、この技術はまた、費用、患者の不快感および病院に長期間通院する必要性によって限定される。従って、患者における造血速度を測定するための、信頼性のある迅速な手段が必要とされる。
【００１１】
造血と疾患プロセスの多様性との間の関係に加えて、心臓血管性疾患、炎症、自己免疫疾患およびリウマチ様疾患、感染性疾患、移植拒絶、癌および悪性腫瘍、ならびに内分泌疾患のような広範なクラスを含む広範な疾患プロセスにおいて、白血球（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、単球および顆粒球（好中球を含む））の役割を指示する多数の文献が存在する。例えば、アロテーム性動脈硬化症、再狭窄、移植血管病変（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ）および急性冠状症候群のような疾患を一般に生じるような多くの心臓血管性疾患は、全て重大なＴ細胞の関与を実証する（非特許文献１〜３）。これらの疾患は、慢性炎症性障害の兆候として現在認識され、動脈系図（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｒｅｅ）における傷害プロセスに対して継続応答を生じる（Ｒｏｓｓら（１９９９）Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６７：１４２８−３３）。リンパ球、単球および好中球の遺伝子およびそれらの生成物の差示的発現は、文献において明確に実証されている。特に興味深いのは、免疫系の循環細胞における差示的発現の例示であり、これは、他の炎症性疾患または例えば、静止冠状疾患よりむしろ不安定なアンギナに一般的に関連するのとは対照的に、特定の疾患（例えば、アロテーム性動脈硬化症）についての特異性を実証する。
【００１２】
多くの個々の遺伝子、例えば、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｋａｓｓｉｒｅｒら（１９９９）Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １３８：５５５−９）；白血球エラスターゼ（Ａｍａｒｏら（１９９５）Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １６：６１５−２２；およびＣＤ４０Ｌ（Ａｕｋｒｕｓｔら（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：６１４−２０）は、種々の血管疾患のマーカーとしてのある程度の感度および特異性を実証する。さらに、種々のインビトロの実例において操作された単球の精製された集団から単離された、差示的に発現された標的遺伝子およびフィンガープリント遺伝子の同定は、心臓血管疾患の範囲を診断およびモニタリングするために提案されている（例えば、Ｆａｌｂに対する米国特許番号第６，０４８，７０９号；同第６，０８７，４７７号；同第６，０９９，８２３号；および同第６，１２４，４３３号「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＡＮＤ  ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ  ＯＦ  ＣＡＲＤＩＯＶＡＳＣＵＬＡＲ  ＤＩＳＥＡＳＥ」（ＷＯ  ９７／３００６５もまた参照のこと）を参照のこと）。Ｌｏｃｋｈａｒｔ，米国特許番号第６，０３３，８６０号「ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＦＩＬＥＳ  ＩＮ  ＡＤＵＬＴ  ＡＮＤ  ＦＥＴＡＬ  ＯＲＧＡＮＳ」は、組織サンプルにおける同定された遺伝子のセブセットについての発現プロファイルの使用、および薬物効果のモニタリングを提案する。
【００１３】
疾患の診断、予後、およびモニタリングのための発現プロフィルに基づく技術の精度は、もし問題の疾患に対してある程度の特異性をそれぞれ有する数多くの差次的発現ヌクレオチド配列が、協調した様式で同定およびアッセイされ得る場合、激的に高まる。診断用途に多数の遺伝子（遺伝子セット）の発現を用いることは、アッセイおよび集団のばらつきの克服を助ける。ＷｏｈｌｇｅｍｕｔｈのＰＣＴ出願ＷＯ  ０２／０５７４１４「ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＦＩＬＩＮＧ」は、差次的発現ヌクレオチドのセットを同定している。
【００１４】
この改善された正確性を達成するために、一旦同定されたヌクレオチド配列のセットは、疾患の診断、予後およびモニタリングにとって最も有用な所定のセットにおいて差示的に発現されたヌクレオチドを同定するために変動される必要がある。本発明は、これらおよび他の必要性を説明し、かつ移植拒絶および末梢血の遺伝子、または他のヌクレオチド配列の差示的な調節が示され得る造血速度の決定に適用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈ−Ｎｏｒｏｗｉｔｚら（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９３：１６８−１７５
【非特許文献２】Ｊｕｄｅら（１９９４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：１６６２−８
【非特許文献３】Ｂｅｌｃｈら（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５：２０２７−３１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
個体の免疫状態を評価する方法であって、該個体における造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布に依存して異なったレベルで発現される１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
（項目２）
請求項１に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子が、以下：
【化１】
2010022375.tif 000002
【化２】
2010022375.tif 000003
【化３】
2010022375.tif 000004
からなる群より選択されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含む、方法。
（項目３）
前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現されるＲＮＡレベルを測定することによって決定される、請求項２に記載の方法。
（項目４）
前記ＲＮＡレベルをＰＣＲによって検出する、請求項３に記載の方法。
（項目５）
前記ＲＮＡレベルが、ハイブリダイゼーションによって検出される、請求項３に記載の方法。
（項目６）
前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
（項目７）
個体における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、造血速度を検出する工程を包含する、方法。
（項目８）
前記検出が、個体に直接適用される、請求項７に記載の方法。
（項目９）
前記検出が、個体から単離されたサンプルに適用される、請求項７に記載の方法。
（項目１０）
請求項７に記載の方法であって、前記検出が、ＲＮＡプロファイリングアッセイ、イムノアッセイ、蛍光活性細胞ソーティング、タンパク質アッセイ、ＭＲＩ画像化、骨髄吸引、および核画像化からなる群より選択される、方法。
（項目１１）
前記ＲＮＡプロファイルアッセイが、ＰＣＲベースのアッセイである、請求項１０に記載
の方法。
（項目１２）
前記ＲＮＡプロファイルアッセイが、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである、請求項１０に記載の方法。
（項目１３）
請求項１０に記載の方法であって、前記ＲＮＡプロファイルアッセイが、前記個体における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程をさらに包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、以下：
【化４】
2010022375.tif 000005
【化５】
2010022375.tif 000006
【化６】
2010022375.tif 000007
【化７】
2010022375.tif 000008
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目１４）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植片拒絶、および機械的器官置換拒絶からなる群より選択される、方法。
（項目１５）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植である、方法。
（項目１６）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、肝臓移植である、方法。
（項目１７）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、腎臓移植である、方法。
（項目１８）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、骨髄移植である、方法。
（項目１９）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、膵島移植である、方法。
（項目２０）
請求項７に記載の方法であって、前記移植拒絶が、幹細胞移植である、方法。
（項目２１）
個体における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布を検出する工程を包含し、ここで、該検出が、ＲＮＡプロファイリングアッセイ、イムノアッセイ、蛍光活性細胞ソーティング、タンパク質アッセイ、ＭＲＩ画像化、骨髄吸引、および核画像化からなる群より選択される、方法。
（項目２２）
前記ＲＮＡプロファイルアッセイが、ＰＣＲベースのアッセイである、請求項２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＲＮＡプロファイルアッセイが、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである、請求項２１に記載の方法。
（項目２４）
請求項２１に記載の方法であって、前記ＲＮＡプロファイルアッセイが、前記個体における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程をさらに包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、以下：
【化８】
2010022375.tif 000009
【化９】
2010022375.tif 000010
【化１０】
2010022375.tif 000011
【化１１】
2010022375.tif 000012
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目２５）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植片拒絶、および機械的器官置換拒絶からなる群より選択される、方法。
（項目２６）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植である、方法。
（項目２７）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、肝臓移植である、方法。
（項目２８）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、腎臓移植である、方法。
（項目２９）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、骨髄移植である、方法。
（項目３０）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、膵島移植である、方法。
（項目３１）
請求項２１に記載の方法であって、前記移植拒絶が、幹細胞移植である、方法。
（項目３２）
患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、以下：
【化１２】
2010022375.tif 000013
【化１３】
2010022375.tif 000014
【化１４】
2010022375.tif 000015
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３３）
請求項３２に記載の方法であって、前記患者において１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程をさらに包含し、ここで、該１つ以上のさらなる遺伝子が、以下：
【化１５】
2010022375.tif 000016
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３４）
患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、前記患者において１つ以上の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、配列番号３６、８７、９４、１０７、お
よび９１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３５）
請求項３４に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３６である、方法。
（項目３６）
請求項３４に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号８７である、方法。
（項目３７）
請求項３４に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号９４である、方法。
（項目３８）
請求項３４に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０７である、方法。
（項目３９）
請求項３４に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号９１である、方法。
（項目４０）
患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、以下：
【化１６】
2010022375.tif 000017
【化１７】
2010022375.tif 000018
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目４１）
請求項４０に記載の方法であって、前記患者において１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする工程をさらに包含し、ここで、該１つ以上のさらなる遺伝子が、以下：
【化１８】
2010022375.tif 000019
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目４２）
患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における腎臓移植拒絶を診断またはモ
ニタリングする工程を包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、以下：
【化１９】
2010022375.tif 000020
【化２０】
2010022375.tif 000021
【化２１】
2010022375.tif 000022
【化２２】
2010022375.tif 000023
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目４３）
請求項４２に記載の方法であって、前記患者において１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする工程をさらに包含し、ここで、該１つ以上のさらなる遺伝子が、以下：
【化２３】
2010022375.tif 000024
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目４４）
請求項３２に記載の方法であって、前記遺伝子の少なくとも２個の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
（項目４５）
請求項３２に記載の方法であって、前記遺伝子の少なくとも１０個の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
（項目４６）
請求項３２に記載の方法であって、前記遺伝子の少なくとも１００個の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
（項目４７）
請求項３２に記載の方法であって、前記遺伝子の全ての発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
（項目４８）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植片拒絶、および機械的器官置換拒絶からなる群より選択される、方法。
（項目４９）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶である、方法。
（項目５０）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、肝臓移植拒絶である、方法。
（項目５１）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、腎臓移植拒絶である、方法。
（項目５２）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、骨髄移植拒絶である、方法。
（項目５３）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、膵島移植拒絶である、方法。
（項目５４）
請求項３２に記載の方法であって、前記移植拒絶が、幹細胞移植拒絶である、方法。
（項目５５）
請求項３２に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現されるＲＮＡレベルを測定することによって決定される、方法。
（項目５６）
請求項５５に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子によって発現される前記ＲＮＡレベルを検出する前に、前記患者からＲＮＡを単離する工程をさらに包含する、方法。
（項目５７）
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡレベルが、ＰＣＲによって検出される、方法。
（項目５８）
請求項５７に記載の方法であって、前記ＰＣＲが、以下：
【化２４】
2010022375.tif 000025
【化２５】
2010022375.tif 000026
【化２６】
2010022375.tif 000027
【化２７】
2010022375.tif 000028
【化２８】
2010022375.tif 000029
【化２９】
2010022375.tif 000030
【化３０】
2010022375.tif 000031
【化３１】
2010022375.tif 000032
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるプライマーを使用する、方法。
（項目５９）
請求項５８に記載の方法であって、前記ＰＣＲが、以下：
【化３２】
2010022375.tif 000033
【化３３】
2010022375.tif 000034
【化３４】
2010022375.tif 000035
【化３５】
2010022375.tif 000036
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる対応するプローブを使用する、方法。
（項目６０）
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡレベルが、ハイブリダイゼーションによって検出される、方法。
（項目６１）
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡレベルが、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出される、方法。
（項目６２）
請求項６１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、以下：
【化３６】
2010022375.tif 000037
【化３７】
2010022375.tif 000038
【化３８】
2010022375.tif 000039
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、方法。
（項目６３）
請求項６１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドを含む、方法。
（項目６４）
請求項３２に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
（項目６５）
請求項６４に記載の方法であって、前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化３９】
2010022375.tif 000040
【化４０】
2010022375.tif 000041
【化４１】
2010022375.tif 000042
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目６６）
請求項３３に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記１つ以上のさらなる遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
（項目６７）
請求項６６に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化４２】
2010022375.tif 000043
【化４３】
2010022375.tif 000044
【化４４−１】
2010022375.tif 000045
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして前記１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化４４−２】
2010022375.tif 000046
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目６８）
請求項４０に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
（項目６９）
請求項６８に記載の方法であって、前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化４５】
2010022375.tif 000047
【化４６】
2010022375.tif 000048
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目７０）
請求項４１に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記１つ以上のさらなる遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上のさらなる遺伝子
によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
（項目７１）
請求項７０に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化４７】
2010022375.tif 000049
【化４８】
2010022375.tif 000050
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして前記１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化４９】
2010022375.tif 000051
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目７２）
請求項４２に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
（項目７３）
請求項７２に記載の方法であって、前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化５０】
2010022375.tif 000052
【化５１】
2010022375.tif 000053
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目７４）
請求項４３に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記１つ以上のさらなる遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
（項目７５）
請求項７４に記載の方法であって、前記１つ以上の遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化５２】
2010022375.tif 000054
【化５３】
2010022375.tif 000055
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして前記１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、以下：
【化５４】
2010022375.tif 000056
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目７６）
請求項６４に記載の方法であって、前記測定が、血清を測定する工程を包含する、方法。
（項目７７）
請求項６４に記載の方法であって、前記タンパク質が、細胞表面タンパク質である、方法。
（項目７８）
請求項６４に記載の方法であって、前記測定が、蛍光活性細胞選別機を使用する工程を包含する、方法。
（項目７９）
実質的に精製されたオリゴヌクレオチドであって、［配列番号Ｘ＋Ｙ−新規遺伝子配列＋文献配列］からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチド。
（項目８０）
実質的に精製されたオリゴヌクレオチドであって、以下［これらが正しい配列であることを確実にするためにチェックする］：
【化５５】
2010022375.tif 000057
【化５６】
2010022375.tif 000058
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチド。
（項目８１）
請求項７９に記載のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目８２）
請求項８０に記載のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目８３）
請求項７９に記載のオリゴヌクレオチドに対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目８４）
請求項８０に記載のオリゴヌクレオチドに対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目８５）
請求項７９に記載の診断オリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
（項目８６）
請求項３２に記載の方法であって、検出される前記発現レベルが、患者の体液中の発現レベルである、方法。
（項目８７）
請求項８６に記載の方法であって、前記体液が、末梢血である、方法。
（項目８８）
患者において移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における４つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該４つ以上の遺伝子が、以下：
【化５７】
2010022375.tif 000059
【化５８】
2010022375.tif 000060
【化５９】
2010022375.tif 000061
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目８９）
患者において腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者の体液中の１つ以上のタンパク質を検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該１つ以上の遺伝子が、以下：
【化６０】
2010022375.tif 000062
からなる群より選択されるタンパク質配列を含む、方法。
（項目９０）
少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含む体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムであって、ここで、該単離されたポリヌクレオチドが、遺伝子の発現を検出し、ここで、該遺伝子が、以下：
【化６１】
2010022375.tif 000063
【化６２】
2010022375.tif 000064
【化６３】
2010022375.tif 000065
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、そして該遺伝子が、移植される器官を拒絶しない個体における白血球中の遺伝子の発現と比較して、移植される器官を拒絶する個体中の体液で差示的に発現される、システム。
（項目９１）
少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含む体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムであって、ここで、該単離されたポリヌクレオチドが、遺伝子の発現を検出し、ここで、該遺伝子が、以下：
【化６４】
2010022375.tif 000066
【化６５】
2010022375.tif 000067
【化６６】
2010022375.tif 000068
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、そして該遺伝子の発現が、造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布に関連する、システム。
（発明の要旨）
これらの要求に応えるために、本発明は、差示的な遺伝子発現を検出するためのシステムに関する。１つの形式において、方法によって、個体の成熟経路に沿う造血速度または造血細胞の分布に依存して異なるレベルで発現された１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程による個体の免疫状態の評価が提供される。１つ以上の遺伝子は、
【００１７】
【化６７】
2010022375.tif 000069
【００１８】
【化６８】
2010022375.tif 000070
【００１９】
【化６９】
2010022375.tif 000071
【００２０】
から選択されたヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチドを含む。発現レベルは、１つ以上の遺伝子によって発現されたＲＮＡレベルを測定することによって検出され得る。１つのバリエーションにおいて、このＲＮＡレベルはＰＣＲによって検出される。別のバリエーションにおいて、このＲＮＡレベルは、ハイブリダイゼーションによって検出される。この発現レベルはまた、１つ以上の遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質を測定することによって検出され得る。
【００２１】
本発明はさらに、造血速度の検出によって個体における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関する。この検出は、個体に直接適用され得るか、または個体から単離されたサンプルに適用され得る。検出は、ＲＮＡプロファイリングアッセイ、免疫アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティング、タンパク質アッセイ、末梢血細胞学アッセイ、ＭＲＩ画像化、骨髄吸引、および／または核画像化によって達成され得る。１つのバリエーションにおいて、ＲＮＡプロファイルアッセイはＰＣＰベースのアッセイである。別のバリエーションにおいて、このＲＮＡプロファイルアッセイは、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである。このＲＮＡプロファイルアッセイは、１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程をさらに包含し、ここで、１つ以上の遺伝子は、
【００２２】
【化７０】
2010022375.tif 000072
【００２３】
【化７１】
2010022375.tif 000073
【００２４】
【化７２】
2010022375.tif 000074
【００２５】
から選択されたヌクレオチド配列を含む。移植拒絶としては、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵臓小島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植拒絶および人工組織置換拒絶の１つ以上が挙げられ得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここでこの１つ以上の遺伝子は、
【００２７】
【化７３】
2010022375.tif 000075
【００２８】
【化７４】
2010022375.tif 000076
【００２９】
【化７５】
2010022375.tif 000077
【００３０】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。１つにバリエーションにおいて、本発明はさらに、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、患者における１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出することに関し、ここで、１つ以上のさらなる遺伝子は、
【００３１】
【化７６】
2010022375.tif 000078
【００３２】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
さらなるバリエーションにおいて、本発明は、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この１つ以上の遺伝子は、
【００３４】
【化７７】
2010022375.tif 000079
【００３５】
【化７８】
2010022375.tif 000080
【００３６】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。１つのバリエーションにおいて、この方法は、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、ここで、１つ以上のさらなる遺伝子は、
【００３７】
【化７９】
2010022375.tif 000081
【００３８】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
本発明はまた、患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによってこの患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この１つ以上の遺伝子は、
【００４０】
【化８０】
2010022375.tif 000082
【００４１】
【化８１】
2010022375.tif 000083
【００４２】
【化８２】
2010022375.tif 000084
【００４３】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。１つのバリエーションにおいて、この方法はさらに、患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、ここで、１つ以上のさらなる遺伝子は、
【００４４】
【化８３】
2010022375.tif 000085
【００４５】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
別の局面において、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。別のバリエーションにおいて、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、少なくとも１０個の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。さらなるバリエーションにおいて、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、少なくとも１００個の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。な
おさらなるバリエーションにおいて、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、列挙された全ての遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。
【００４７】
別のバリエーションにおいて、移植拒絶は、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵臓小島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植拒絶および人工器官置換拒絶から選択され得る。
【００４８】
別の局面において、移植拒絶を検出する方法は、１つ以上の遺伝子によって発現されるＲＮＡレベルを測定することにより発現レベルを検出する工程を包含する。この方法はさらに、１つ以上の遺伝子によって発現されたＲＮＡレベルを検出する前に、患者からＲＮＡを単離する工程を包含する。
【００４９】
１つのバリエーションにおいて、このＲＮＡレベルはＰＣＲによって検出される。なおさらなるバリエーションにおいて、このＰＣＲは、
【００５０】
【化８４】
2010022375.tif 000086
【００５１】
【化８５】
2010022375.tif 000087
【００５２】
【化８６】
2010022375.tif 000088
【００５３】
【化８７】
2010022375.tif 000089
【００５４】
【化８８】
2010022375.tif 000090
【００５５】
【化８９】
2010022375.tif 000091
【００５６】
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるプライマーを使用する。あるいは、このＰＣＲは、
【００５７】
【化９０】
2010022375.tif 000092
【００５８】
【化９１】
2010022375.tif 000093
【００５９】
【化９２】
2010022375.tif 000094
【００６０】
【化９３】
2010022375.tif 000095
【００６１】
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる対応するプローブを使用する。このＲＮＡレベルは、このプローブへのハイブリダイゼーションによって検出され得る。さらなるバリエーションにおいて、このＲＮＡレベルは、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって検出される。オリゴヌクレオチドの例としては、
【００６２】
【化９４】
2010022375.tif 000096
【００６３】
【化９５】
2010022375.tif 000097
【００６４】
【化９６】
2010022375.tif 000098
【００６５】
から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：（配列番号）３６を有する。さらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７を有する。なおさらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４を有する。さらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：９１からなるヌクレオチド配列を有する。別のバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７からなるヌクレオチド配列を有する。
このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドであり得る。
【００６６】
別の局面において、移植拒絶を検出する方法は、１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって発現レベルを検出する工程を包含する。１つのバリエーションにおいて、この１つ以上のタンパク質は、
【００６７】
【化９７】
2010022375.tif 000099
【００６８】
【化９８】
2010022375.tif 000100
【００６９】
から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなるバリエーションにおいて、この方法は、
【００７０】
【化９９】
2010022375.tif 000101
【００７１】
によって発現される１つ以上のさらなるタンパク質を検出する工程を包含する。なお別のバリエーションにおいて、１つ以上のタンパク質は、
【００７２】
【化１００】
2010022375.tif 000102
【００７３】
【化１０１】
2010022375.tif 000103
【００７４】
【化１０２】
2010022375.tif 000104
【００７５】
から選択され得、そして１つ以上のタンパク質は、
【００７６】
【化１０３】
2010022375.tif 000105
【００７７】
から選択され得る。
【００７８】
別の局面において、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測定することによって、この患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。１つ以上のタンパク質は、
【００７９】
【化１０４】
2010022375.tif 000106
【００８０】
【化１０５】
2010022375.tif 000107
【００８１】
から選択されるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、１つ以上の遺伝子の発現レベルは、１つ以上の遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質、および１つ以上のさらなる遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質を測定することによって検出され得る。１つのバリエーションにおいて、１つ以上の遺伝子によって発現されたこの１つ以上のタンパク質は、
【００８２】
【化１０６】
2010022375.tif 000108
【００８３】
【化１０７】
2010022375.tif 000109
【００８４】
から選択されたアミノ酸配列を含み、そして１つ以上のさらなる遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質は、
【００８５】
【化１０８】
2010022375.tif 000110
【００８６】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８７】
別の局面において、患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、この患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、１つ以上の遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質を測定することによって、患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。１つのバリエーションにおいて、この１つ以上のタンパク質は、
【００８８】
【化１０９】
2010022375.tif 000111
【００８９】
【化１１０】
2010022375.tif 000112
【００９０】
【化１１１】
2010022375.tif 000113
【００９１】
から選択されるアミノ酸配列を含む。別のバリエーションにおいて、この方法は、１つ以上のさらなる遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質を測定することによって１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。１つ以上の遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質は、
【００９２】
【化１１２】
2010022375.tif 000114
【００９３】
【化１１３】
2010022375.tif 000115
【００９４】
から選択されるアミノ酸配列を含み、そして１つ以上のさらなる遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質は、
【００９５】
【化１１４】
2010022375.tif 000116
【００９６】
から選択されたアミノ酸配列を含み得る。
【００９７】
タンパク質検出は、血清を測定することによって達成され得る。別のバリエーションにおいて、タンパク質は、細胞表面タンパク質である。さらなるバリエーションにおいて、この測定は、蛍光活性化細胞ソーターを用いることを包含する。
【００９８】
別の局面において、本発明は、
【００９９】
【化１１５】
2010022375.tif 000117
【０１００】
【化１１６】
2010022375.tif 000118
【０１０１】
【化１１７】
2010022375.tif 000119
【０１０２】
から選択されるヌクレオチド配列を有する実質的に精製されたオリゴヌクレオチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３３−６６４から選択されるヌクレオチド配列を有する実質的に精製されたオリゴヌクレオチド、および
【０１０３】
【化１１８】
2010022375.tif 000120
【０１０４】
【化１１９】
2010022375.tif 000121
【０１０５】
【化１２０】
2010022375.tif 000122
【０１０６】
から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに少なくとも９０％配列同一性を有する実質的に精製されたオリゴヌクレオチドに関する。さらなる局面において、本発明は、
【０１０７】
【化１２１】
2010022375.tif 000123
【０１０８】
【化１２２】
2010022375.tif 000124
【０１０９】
【化１２３】
2010022375.tif 000125
【０１１０】
から選択されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに、高ストリンジェンシーでハイブリダイズする実質的に精製されたオリゴヌクレオチドに関する。これらの配列は、移植拒絶および／または心臓移植拒絶のための診断的オリゴヌクレオチドとして使用され得る。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有し得る。
【０１１１】
別の局面において、本発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この患者の体液中の１つ以上の遺伝子の発現レベルが検出される。さらなるバリエーションにおいて、この体液は、末梢血である。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、この方法は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における４つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、ここで、この４つ以上の遺伝子は、
【０１１３】
【化１２４】
2010022375.tif 000126
【０１１４】
【化１２５】
2010022375.tif 000127
【０１１５】
【化１２６】
2010022375.tif 000128
【０１１６】
から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１１７】
別の局面において、この発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者の体液中の１つ以上のタンパク質を検出することによって、この患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この１つ以上のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７００、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９３から選択されるタンパク質配列を有する。
【０１１８】
さらなる局面において、本発明はまた、少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチド
を含む、体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムに関し、ここで単離されたポリヌクレオチドは遺伝子発現を検出し、この遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２，
【０１１９】
【化１２７】
2010022375.tif 000129
【０１２０】
【化１２８】
2010022375.tif 000130
【０１２１】
から選択されるヌクレオチド配列を含み、そして、この遺伝子は、移植された器官を拒絶しない個体の白血球における遺伝子発現と比較して、移植された器官が拒絶される個体の体液中で差示的に発現される。
【０１２２】
別の局面において、本発明は、少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含む、体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムに関し、ここで、この単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の発現を検出し、ここで、この遺伝子は、
【０１２３】
【化１２９】
2010022375.tif 000131
【０１２４】
【化１３０】
2010022375.tif 000132
【０１２５】
【化１３１】
2010022375.tif 000133
【０１２６】
から選択されるヌクレオチド配列を含み、そしてこの遺伝子発現は、造血速度またはその成熟経路に沿う造血細胞の分布に関する。
【０１２７】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３０１６−３１１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３１０８−３１１７から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、この方法は、ＣＭＶ感染の検出において有用である。
【０１２８】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１〜３３２は、同種移植片拒絶および他の障害の診断およびモニタリングのための遺伝子発現マーカーに対応する５０マーオリゴヌクレオチドである。
【０１２９】
配列番号３３３〜６６４は、プローブ１〜３３２によって同定される遺伝子に対する参照ｍＲＮＡ配列である。
【０１３０】
配列番号６６５〜９９５は、遺伝子１〜３３２についての左方向ＰＣＲプライマーの第１のセットである。
【０１３１】
配列番号９９６−１３２６は、遺伝子１〜３３２についての右方向ＰＣＲプライマーの第１のセットである。
【０１３２】
配列番号１３２７−１６５７は、遺伝子１〜３３２についての第１のセットＰＣＲプライマーに対するＴａｑｍａｎプローブである。
【０１３３】
配列番号１６５８−１９０３は、選択された遺伝子１〜３３２についての左方向ＰＣＲプライマーの第２の代替のセットである。
【０１３４】
配列番号１９０４−２１５１は、選択された遺伝子１〜３３２についての右方向ＰＣＲプライマーの第２の代替のセットである。
【０１３５】
配列番号２１５２−２３９９は、選択された遺伝子１〜３３２についての第２の代替のセットＰＣＲプライマーに対するＴａｑｍａｎプローブである。
【０１３６】
配列番号２４００−２６２６は、１〜３３２において同定される遺伝子由来のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質である。
【０１３７】
配列番号２６２７−２７９５は、図７ならびに表６および表８において、遺伝子を同定するために使用される５０マーオリゴヌクレオチドアレイプローブである。
【０１３８】
配列番号２７９６−２９２４は、腎移植および拒絶において変化した発現を示す、表８中の遺伝子に対する参照ｍＲＮＡ配列である。
【０１３９】
配列番号２９２５−３０１５は、表８において変化した発現を示す遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【０１４０】
配列番号３０１６−３０８１は、５０マーオリゴヌクレオチドアレイプローブであり、実施例における遺伝子を同定するために使用される。
【０１４１】
配列番号３０８２−３１０７は、実施例において論じられる遺伝子およびプライマーである。
【０１４２】
配列番号３１０８−３１１７は、ヒト遺伝子由来のｍＲＮＡであり、ここで、調節はＣＭＶ感染の際に変化される。
【０１４３】
（表の簡単な説明）
表１：表１は、白血球プロファリングによる研究に対して感受性のある疾患または状態を列挙する。
【０１４４】
表２：移植マーカー
Ａ．移植遺伝子：同種移植片拒絶のモニタリングに有用な遺伝子がここに列挙される。遺伝子記号および名称が与えられる。配列番号５０マーは、遺伝子に特異的な５０マーオリゴヌクレオチドの配列番号である。（Ｂｕｉｌｄ  １６０、２００３年２月１６日）からのＮＣＢＩ  Ｕｎｉｇｅｎｅ番号（ＨＳ）は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡについて、（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３５、２００３年４月１５日）からの受託番号として与えられ、遺伝子に対応するＧｅｎｂａｎｋ番号である。ＡＣＣによって同定される配列は、配列表（配列番号ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）にある。
【０１４５】
Ｂ．マイクロアレイデータ：配列番号５０マー、遺伝子、遺伝子名称、ＡＣＣおよび配列番号ＲＮＡ／ｃＤＮＡは、Ａ（上記）のように各遺伝子について与えられる。同定された各遺伝子は、データのノンパラメトリック分析から与えられるＮＲにおいてノンパラメトリックスコアおよび中間値ランクを有する。これらの遺伝子は、最高から最低へとランキングされる。ダウンレギュレートされた遺伝子は、この欄において１として記される。
【０１４６】
Ｃ．ＰＣＲプライマー：各遺伝子についてのリアルタイムＰＣＲに対するプライマーおよびプローブは、それらの配列番号により与えられる。各遺伝子は、１または２セットの順方向および逆方向のＰＣＲプライマーならびにＴａｑｍａｎまたは類似のアッセイにおける検出のためのハリブリダイゼーションプローブを有する。
【０１４７】
Ｄ．ＰＣＲデータ：リアルタイムＰＣＲデータをテキストに記載されるように、ｓｙｂｒ緑色技術を使用して移植サンプルのセットに対して作成する。各遺伝子について、この分析に使用されるサンプル数（ｎ）が与えられる。Ｆｉｓｈｅｒ検定およびｔ−検定についてのオッズ比およびｐ値が与えられて、急性拒絶サンプルの比較が与えられる（テキストを参照のこと）。
【０１４８】
Ｅ．移植タンパク質：各遺伝子について、ＲｅｆＳｅｑデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ
Ｒｅｌｅａｓｅ  １３５、２００３年４月１８日）において対応するタンパク質は、配列表についてのそのタンパク質に対する配列番号により与えられる（ＲｅｆＳｅｑペプチド受託番号）。
【０１４９】
表３：アレイのためのウイルス遺伝子。ウイルスゲノムを使用して、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドを設計した。使用されるウイルスゲノムについての受託番号は、オリゴヌクレオチド設計に使用される領域の遺伝子名および位置により与えられる。
【０１５０】
表４．心臓同種移植片拒絶の遺伝子発現マーカーの発見のための従属変数
安定なグレード０は、続く生検に対する拒絶を経験しない患者におけるグレード０生検である。ＨＧまたは最高のグレードは、中心部の病理学者および局所的な病理学者からのより高い生検グレードを従属変数の決定に使用したことを意味する。
【０１５１】
表５．リアルタイムＰＣＲアッセイレポーターおよびクエンチャー色素。レポーターおよびクエンチャー色素の種々の組み合わせは、リアルタイムＰＣＲに有用である。レポーターおよびクエンチャー色素は、必要に応じて、前出に規定される特定の組み合わせで作動する。各レポーターについて、クエンチャー色素に対する適切な選択が与えられる。
【０１５２】
表６．拒絶マーカーＰＣＲアッセイ結果
リアルタイムＰＣＲアッセイの結果を、拒絶のないサンプルに対する拒絶サンプルの比較について列挙する。倍率変化は、各遺伝子拒絶および／または拒絶のないサンプルの発現について与えられる。拒絶クラスおよび拒絶のないクラスを比較するｔ−検定についてのｐ値が与えられる。
【０１５３】
表７．アレイ拒絶有意差分析のまとめの結果。マイクロアレイについての有意差分析（ＳＡＭ）を使用する、急性拒絶に対する白血球遺伝子発現の相関分析についてのまとめの結果が与えられる。５つの分析を記載する。拒絶クラスおよび拒絶のないクラスを規定するために使用されたＩＳＨＬＴグレードが与えられる。各場合において、３つの病理学の読み取りからの最高のグレードを分析のために取った。全てのサンプルは２つの分析のために使用される。他の分析は、患者あたり１つのサンプルのみを使用することによる（「非冗長性」）か、または所定のクラス内の患者あたり１つのサンプルのみを使用することによる（「クラス内の非冗長性」）分析において使用される患者の冗長性を減少する。分析に使用されるサンプルの数が与えられて、達成される最低の偽検出率（ＦＤＲ）が記される。
【０１５４】
表８．腎臓組織拒絶アレイ有意差分析。コントロールに対して急性拒絶を有する腎臓組織に対するマイクロアレイを使用して、アップレギュレートされたと同定された遺伝子を列挙する。マイクロアレイについての有意差分析（ＳＡＭ）を使用して、各遺伝子に対する偽検出率（ＦＤＲ）を決定した。白血球において公知の発現を有する遺伝子を表に記す。
【０１５５】
表９．拒絶マーカー配列分析。表２に列挙される６３個の同種移植片拒絶マーカーについて、遺伝子配列分析を実施した。これらの遺伝子およびタンパク質を受託番号によって同定する。各遺伝子の細胞局在化を、分泌された、核、ミトコンドリア、細胞質または細胞膜のいずれかとして記載する。遺伝子の機能もまた、記載する。
【０１５６】
表１０．種々の系統の未成熟細胞に対する遺伝子発現マーカーが、例として表１０に与えられる。
【０１５７】
表１１．造血速度の変化は、多くの疾患状態および他の病理学に相関している。このような状態の例を表１１に列挙する。
【０１５８】
表１２．この表は、ＣＭＶ感染の診断およびモニタリングについての値を有すると同定
されたオリゴヌクレオチドおよび関連する遺伝子を列挙する。最初の列は、配列表のオリゴヌクレオチドに対応する配列番号を与える。ｕｎｉｇｅｎｅ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号およびＧＩ番号もまた、公知の場合は各配列について与えられる。受託番号に関連する遺伝子名が、与えられる。この鎖は、−１または１として記され、これは、このプローブが配列（−１）の相補鎖から設計されたか、または配列（１）から直接設計されたことを意味する。次に、各プローブのヌクレオチド配列がまた、与えられる。各遺伝子について、実施例７に記載される有意差分析からの偽検出率（ＦＤＲ）は、適用可能である場合に与えられる。ＷＢＣは白血球計数である。ＷＰＴは、移植後の週数である。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、新規なヌクレオチド配列のヌクレオチド配列および／または予測されるタンパク質配列の特徴についての模式的な指示セットを示す模式的なフローチャートである。
【図２】図２は、自動化ＲＮＡ調製機の構成要素を示す。
【図３】図３は、グラフに示されたミニアレイに対する６つのハイブリダイゼーションの結果を示す（各列についてｎ＝６）。エラーバーはＳＥＭである。この実験は、ＡＰ調製ＲＮＡからの平均シグナルがＣｙ３およびＣｙ５の両方についてのＧＳ調製ＲＮＡからの平均シグナルの４７％であることを示す。
【図４】図４は、ミニアレイに上での９つの白血球特異的遺伝子の各々について、平均バックグランドを差し引いたシグナルを示す。この平均は、各遺伝子について３〜６個の上記のハイブリダイゼーションに対するものである。エラーバーは、ＳＥＭである。
【図５】図５は、多くの遺伝子についてのＣｙ５シグナルに対するＣｙ３の比を示す。正規化後、この比をハイブリダイゼーションの間の変数に対して補正し、異なる時間において実施した実験間の比較を可能にする。この比は、Ｃｙ５バックグランドを差し引いたシグナルでＣｙ３バックグランドを差し引いたシグナルを除したものとして計算される。各バーは、３〜６のハイブリダイゼーションについての平均である。エラーバーはＳＥＭである。
【図６】図６は、ミニアレイを使用するコントロールＲＮＡについてのデータ中央値Ｃｙ３バックグランド減算シグナルを示す。
【図７−１】図７：心臓同種移植片拒絶診断遺伝子Ａ．５つのマーカー遺伝子についての拒絶サンプル発現データおよび拒絶のないサンプル発現データの例。各サンプルについて、関連する拒絶グレードは、５つの差次的に発現される遺伝子についての発現比であることが示される。これらの遺伝子は、オリゴヌクレオチドに対する配列番号によって同定される。グレード０サンプルとグレード３Ａサンプルとの間の平均倍率の差は、下部で計算される。Ｂ．ＣＡＲＴ分類モデル。心臓拒絶の診断のための３つの遺伝子分類モデルについての決定ツリー。第１のステップにおいて、遺伝子２２３の発現を使用して、患者を２つの枝に分ける。次いで、各枝の残りのサンプルを１つの残りの遺伝子によってさらに分ける。サンプルを拒絶または拒絶がないのいずれかとして分類する。１つの拒絶のないサンプルは、拒絶サンプルとして誤って分類される。Ｃ．ＣＡＲＴ分類モデルに対する代理物。実施例に記載されるＣＡＲＴ拒絶モデルにおける３つのスプリッター遺伝子の各々について、ＣＡＲＴアルゴリズムによって同定された５つの上部代理遺伝子を列挙する。
【図７−２】図７：心臓同種移植片拒絶診断遺伝子Ａ．５つのマーカー遺伝子についての拒絶サンプル発現データおよび拒絶のないサンプル発現データの例。各サンプルについて、関連する拒絶グレードは、５つの差次的に発現される遺伝子についての発現比であることが示される。これらの遺伝子は、オリゴヌクレオチドに対する配列番号によって同定される。グレード０サンプルとグレード３Ａサンプルとの間の平均倍率の差は、下部で計算される。Ｂ．ＣＡＲＴ分類モデル。心臓拒絶の診断のための３つの遺伝子分類モデルについての決定ツリー。第１のステップにおいて、遺伝子２２３の発現を使用して、患者を２つの枝に分ける。次いで、各枝の残りのサンプルを１つの残りの遺伝子によってさらに分ける。サンプルを拒絶または拒絶がないのいずれかとして分類する。１つの拒絶のないサンプルは、拒絶サンプルとして誤って分類される。Ｃ．ＣＡＲＴ分類モデルに対する代理物。実施例に記載されるＣＡＲＴ拒絶モデルにおける３つのスプリッター遺伝子の各々について、ＣＡＲＴアルゴリズムによって同定された５つの上部代理遺伝子を列挙する。
【図８Ａ】図８ＡリアルタイムＰＣＲを使用するマイクロアレイを使用して発見された遺伝子の差次的発現の検証。複数のアッセイに対する各患者サンプルについてのＣｔをＲ５０コントロールＲＮＡにおけるＣｔと共に示す。三角形は、ＲＴ（逆転写）コントロールを表す。
【図８Ｂ】図８ＢリアルタイムＰＣＲを使用するマイクロアレイを使用して発見された遺伝子の差次的発現の検証。グランザイムＢの発現とアクチン参照との間の倍率の差をＣＭＶ疾患に罹患する患者および罹患していない患者由来の３サンプルについて示す。
【図９】ＰＣＲプライマーのエンドポイント試験。電気泳動およびミクロ流体学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの産物を評価する。β−ＧＵＳ画像。レーン３は、プライマーＦ１７８およびＲ２４２についての画像である。レーン２およびレーン１は、それぞれ非テンプレートコントロールおよびＲＴコントロールに対応する。β−ＧＵＳプライマーＦ１７８およびＲ２４２の電気泳動図、ゲル画像からのレーン３のグラフ図。β−アクチンゲル画像。レーン３は、プライマーＦ７５およびＲ１７８についての画像である。レーン２およびレーン１は、それぞれ非テンプレートコントロールおよびＲＴコントロールに対応する。β−アクチンプライマーＦ７５およびＲ１７８の電気泳動図、ゲル画像からのレーン３のグラフ図。
【図１０】図１０：ＰＣＲプライマー効率試験。出発ＲＮＡ量のｌｏｇに対するＣｔの標準曲線を２つの遺伝子について示す。
【図１１】図１１：リアルタイムＰＣＲコントロール遺伝子分析１１の候補コントロール遺伝子を６つの全血サンプル（ＰＡＸ）に対するリアルタイムＰＣＲを使用して、同じ患者由来の６つの単核サンプル（ＣＰＴ）と対で試験した。各サンプルを２回試験した。各遺伝子について、サンプル間での遺伝子の変動性を垂直軸（上部グラフ）上に示す。各遺伝子についての平均Ｃｔ値もまた示す（下部グラフ）。２μｇのＲＮＡをＰＡＸサンプルに対して使用し、０．５μｇの総ＲＮＡを単核サンプル（ＣＰＴ）に対して使用した。
【図１２】図１２：確立されたマーカーとの同時発現による拒絶マーカーの発見マイクロアレイを使用して、２４０人の移植レシピエント由来のサンプル中の遺伝子配列番号８５および遺伝子配列番号３０２の発現を測定した。各サンプルについて、遺伝子配列番号８５についての発現測定値を遺伝子配列番号３０２に対してプロットする。
【図１３】図１３：拒絶の診断のための３−遺伝子ＰＣＲアッセイについてのＲＯＣ（レシーバーオペレーター特性）曲線（例１７を参照のこと）。各試験のカットオフについての感受性および擬陽性率を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６０】
（発明の詳細な説明）
（定義）
他に規定しない限り、すべての科学用語および技術用語を、それらの用語が関連する技術分野で慣用されている意味と同様の意味を有するものとして理解する。本発明の目的のために、以下の用語を下記のように定義する。
【０１６１】
本発明の脈絡の中では、用語「遺伝子発現系（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」は、遺伝子発現を検出するための任意の系、装置（デバイス）、または手段のことを意味し、診断薬、候補ライブラリー・オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド・セット、またはプローブ等が含まれる。
【０１６２】
用語「モニタリング（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）」は、本明細書では、個人または個人の健康もしくは疾患状態についての有用な状態を提供するために遺伝子セットを使用することの説明に用いられる。「モニタリング」として、予後の決定、重症度分類、薬物療法の選択、進行中の薬物療法の評価、結果の予測、治療に対する応答測定、疾患または疾患合併症、時間とともに疾患の進行を追うことまたは患者健康状態に関して任意の情報を提供すること、投薬が標識を持つ必要がない疾患の小さなサブユニットにとって重要であると思われる既知の作用分子機構である実験的治療から得られる利益を得そうな患者を選択すること、より侵襲的／高価な試験、例えば非侵襲的血液試験からより侵襲的なオプション（例えば生検）に至る検査のカスケードを決定する手助けするために、患者集団をスクリーニングすること、または別の適応症を治療するために用いられる薬物の副作用を評価する検査が挙げられる。
【０１６３】
用語「診断用オリゴヌクレオチド・セット（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｔ）」は、２個以上のオリゴヌクレオチドからなるセットを意味し、差次的発現について評価した際に、それらのオリゴヌクレオチドに対応した遺伝子は、予測的データを集合的に生成する。そのような予測データは、概して診断、予後、治療結果のモニタリング等に関する。一般に、診断用オリゴヌクレオチド・セットの構成要素は、予測値を与えるＤＮＡ配列の突然変異または多型よりはむしろ、診断用オリゴヌクレオチド・セットの構成要素の発現パターンであるという点で、疾患等の特定の形質または表現型と相関することから、個人の遺伝子型を直接決定するためにＤＮＡ分析によって評価されるオリゴヌクレオチド配列と区別される。診断用オリゴヌクレオチド・セットの特定の構成要素（または成分）が、場合によっては、種々の周知分析法（例えばサザンブロット法、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＳＣＰ、およびＳＮＰ）のいずれかによる直接的な遺伝子タイピングに従う一つ以上の突然変異または多型を示すこともできると理解される。    
【０１６４】
「疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」  は、疾患または疾患群に対する治療標的であるポリぺプチド、最も一般的にはタンパク質、あるいは治療マ
ルチサブユニット・タンパク質の一サブユニットをコードする遺伝子または他のオリゴヌクレオチドである。
【０１６５】
「候補ライブラリー（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）」または「候補オリゴヌクレオチド・ライブラリー（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）」は、一つ以上の基準によって特定の疾患または疾患群と関連している可能性が高い複数のオリゴヌクレオチド配列（または遺伝子配列）からなる集合を意味する。上記基準は、例えば、疾患状態での差次的発現パターンまたは科学的もしくは技術的文献で報告されたような生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での活性化または休止している白血球での差次的発現パターン、配列データベースで報告されているような組織て特異的発現、あるいは目的とする組織もしくは細胞型での差次的発現である。一般に、候補ライブラリーは、少なくとも２つの成分または構成要素、より一般的にはライブラリーは、約１０以上、または約１００、または約１，０００、またはそれ以上の成分または構成要素を有する。
【０１６６】
用語「疾患基準（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）」は、本明細書では疾患の指標を示すために用いられ、該指標として、例えば、診断因子、予後因子、病歴または家族歴によって示される因子、遺伝的要因、または症候、同様に、上記リストから選択されるようないくつかの指標に関連した疾患の明白な、または確かな診断が挙げられる。疾患基準として、過去にさかのぼる健康データまたは将来の健康データ（例えば、患者の病歴、臨床検査結果、診断試験結果、臨床イベント、投薬、リスト、治療に対する反応、および危険因子）を含む患者の健康状態を記述したデータが挙げられる。
【０１６７】
用語「分子署名（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」または「発現プロフィル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」は、候補ライブラリーを構成する複数の成分（例えば、少なくとも２、多くの場合約１０、約１００，約１，０００、もしくはそれ以上）に対する発現値の集合を意味する。多くの場合、分子署名は、候補もしくは診断用ヌクレオチド配列または遺伝子のライブラリーまたはアレイのヌクレオチド配列全てに対する発現パターンを表す。あるいは、上記分子署名は、候補ライブラリーの１つ以上のサブセットの発現パターンを表す。用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、２つ以上のヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは、天然または合成のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【０１６８】
本明細書で用いられる用語「健康な個人（ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、特定の疾患または疾患基準に関連している。すなわち、個人は特定の疾患基準を示すものではなく、また特定の疾患と診断されるものではない。問題となっている個人は、もちろん、症状を示すことができるか、もしくは別の疾患に対する種々の指標因子を持つことができることがわかるだろう。
【０１６９】
同様に、「疾患と診断された個人（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ）」は、特定の疾患（または疾患基準）と診断された個人を意味する。そのような個人は、別の疾患（関連または非関連疾患）に関連した、または該疾患と診断された疾患基準も示す。
【０１７０】
「アレイ（ａｒｒａｙ）」は、空間的または論理的に組織化された集まり、例えばオリゴヌクレオチドによってコードされたＲＮＡまたはタンパク質等のオリゴヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列産物である。いくつかの実施形態では、アレイは候補ライブラリーの産物に特異的な抗体または他の結合試薬を含む。
【０１７１】
発現パターンに言及する場合、遺伝子発現での「質的（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ）」な
違いは、相対値が割り当てられない違いを意味する。すなわち、そのような違いは、「全か無の（ａｌｌ  ｏｒ  ｎｏｔｈｉｎｇ）」の評価によって示される。そのような全か無の評価は、例えば発現が検出閾値を上回るか、または下まわるか（発現のオン／オフ／パターン）であることができる。あるいは、質的違いは発現産物の異なる種類、例えば異なる対立遺伝子（突然変異または多形対立遺伝子等）および変異体（配列変異体および翻訳後修飾変異体を含む）を意味する。
【０１７２】
一方、遺伝子発現のパターンについて言及する場合、「量的（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）」違いは、段階的なスケールで値を割り当てることができる発現の違いを意味する（例えば、０〜５または１〜１０スケール、＋〜＋＋＋スケール、または１等級〜５等級スケール；説明のために選択される数が完全に任意なものであり、発明を制限するために解釈されるべきものではないと理解される）。
【０１７３】
（本発明の遺伝子発現システム）
本発明は、配列表に示したオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するヌクレオチド配列を持つ１つ以上のＤＮＡ分子を持つ遺伝子発現系による遺伝子発現の検出方法を目的とする。一態様では、オリゴヌクレオチドは、白血球で差次的発現する遺伝子の発現を検出する。上記遺伝子発現系は、候補ライブラリー、診断薬、診断用オリゴヌクレオチド・セット、または診断用プローブ・セットであってもよい。上記ＤＮＡ分子分子は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、ｃＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書で教示した処置に続いて、白血球での遺伝子発現を分析するために目的とする配列を同定することができる。そのような配列は疾患状態を予測することが可能である。
【０１７４】
（本発明の診断用オリゴヌクレオチド）
本発明は、相関が個人の健康状態とヌクレオチド配列に対応するＲＮＡまたはタンパク質産物の個人での発現とのあいだに存在する、表２、表８および配列表に記した白血球候補ライブラリーの成分を含む診断用オリゴヌクレオチドおよび診断用オリゴヌクレオチド・セットに関する。場合によっては、そのような検出に必要なオリゴヌクレオチドは１つだけである。診断用オリゴヌクレオチド・セットの成分を、ＲＮＡまたはタンパク質産物の発現を検出することが可能な任意の手段によって同定することができ、該手段として、限定されるものではないが、差次的発現スクリーニング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、高性能配列解読装置、マイクロアレイ、液体または他のアレイ、タンパク質をベースとした方法（例えば、ウェスタンブロット法、プロテオミクス、および本明細書に記載した他の方法）、ならびに、本明細書でさらに記載されるように、データ・マイニング法が挙げられる。
【０１７５】
一実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド・セットは、少なくとも１つの疾患基準なしで個人での発現に関連して少なくとも１つの白血球が関与する疾患に対する少なくとも１つの疾患基準で、個人の白血球で差次的に発現される表２、表８または配列表に記された少なくとも２つのオリゴヌクレオチド配列を含み、２つ以上のヌクレオチドの発現が、以下に述べるように、少なくとも１つの疾患基準と相関している。
【０１７６】
別の実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド・セットは、差次的に発現され、かつ差次的発現／相関がこれまでは記述されていなかった表２または配列表に記されたオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド・セットは、アレイ上に固定される。
【０１７７】
別の実施形態では、診断用ヌクレオチド（またはヌクレオチド・セット）は、表２、表８または配列表に記された白血球候補ライブラリーの成分に関連しており、それに対して
相関が個人の健康状態（または疾患基準）のあいだに存在する。診断用ヌクレオチドは、表２、表８、および配列表に記された候補ライブラリーの成分の完全長遺伝子配列（または予測された完全長遺伝子配列）に部分的または全体的に含まれる（または由来する）。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチド配列は、ＥＳＴ、または染色体配列から設計され、これらは、公のデータベース由来である。これらの場合において、全長遺伝子配列は、知られていなくても良い。いくつかの場合での全長配列は、遺伝子予測アルゴリズムを使用して予測され得る。あるいは、全長が、クローニングにより決定され得、標準的分子生物学的アプローチを使用する目的の配列を含む全長遺伝子または遺伝子の配列決定が、本明細書中に記載される。ｃＤＮＡが公開データベースのどの配列とも一致しない、ｃＤＮＡライブラリの発明者らの配列決定から設計されるオリゴヌクレオチドについても、同じことがいえる。
【０１７８】
上記診断用ヌクレオチドはまた、相関配列または完全長遺伝子と共発現する他の遺伝子に由来するものであってもよい。複数の遺伝子は、複数の発現パターンを共有することができる。なぜなら、それらは同一の分子経路で調節されるからである。発現に類似性があることから、行動遺伝子が診断用遺伝子セットにおける診断用遺伝子の代わりとなりうる点で、該行動遺伝子が代理物として同定される。実施例４は、上記データからの代理物の発見を明示する。代理配列表は、候補診断遺伝子の代理の配列を同定する。
【０１７９】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子クラスター」または「クラスター」は、発現パターンによって関連づけられた遺伝子からなる群を意味する。すなわち、遺伝子のクラスターは、異なる条件（例えば、移植片の非拒絶または移植片拒絶）でも同様の調節がなされた遺伝子からなる遺伝子クラスターである。１つのクラスター内の各々の遺伝子の発現プロファイルは、そのクラスター内の少なくとも１つの他の遺伝子の発現プロファイルと相関させるべきである。相関の評価は、種々の統計学的方法を用いておこなってもよい。この明細書で用いられるように、用語「代理物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）」は、診断分析で診断用遺伝子の代わりとして用いることが可能な発現プロファイルを持つ遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、しばしば診断用遺伝子としての同一遺伝子クラスターのメンバーである。そのような診断用遺伝子セットの各成分に対して、以下に説明するような類似の発現パターンを持つ遺伝子の同定を介して、潜在的な代理物のセットを同定することができる。
【０１８０】
多くの統計解析は、相関係数を発生することで、２つの遺伝子発現パターン間の相関性を記述する。相関係数が０．８以上の場合、パターンは相関していると考えてもよい。好ましい実施形態では、相関係数は０．８５、０．９、または０．９５を超えなければならない。他の統計学的方法は、一定量の相互情報を生成して、２つの遺伝子発現パターン間の相関性を記述する。標準化相互情報値が０．７以上の場合、パターンは相関していると考えられる。好ましい実施形態では、標準化相互情報値は、０．８、０．９、または０．９５を超えなければならない。パターンが遺伝子発現データの階層的クラスタリングに密接に集まる場合、該パターンも同様に考えることができる（Ｅｉｓｅｎら、１９９８）。類似パターンは、階層的クラスタリングで最も近い１、２、５、１０、２０、５０、または１００の隣り合うものの中にあるか、あるいは類似度（Ｅｉｓｅｎら、１９９８）  が０．５、０．７、０．８、０．９、０．９５、または０．９９を上回る遺伝子である可能性がある。類似パターンを、ＣＡＲＴ（Ｂｒｅｎｎａｎら、１９９４）による分類木の中で代理物であるとわかる遺伝子として同定することも可能である。しばしば、しかし常にではないが、遺伝子クラスターの成分は、類似の遺伝子発現パターンに加えて、類似の生物学的機能を持っている。
【０１８１】
本発明の診断用遺伝子に対して、相関している遺伝因子、クラスター、および代理物が同定されている。これらの代理物を、アッセイの際に、代理物として診断用遺伝子の代わ
りに、または該診断用遺伝子に加えて用いることが可能である。
【０１８２】
本発明も、診断用プローブ・セットを提供する。プローブが、限定されるものではないが、増幅ＤＮＡ、増幅ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、部分的または完全長核酸配列を含む診断用ヌクレオチド・セットのヌクレオチド配列を特異的に同定することが可能な任意の試薬を含むものであると理解される。また、プローブは、診断ヌクレオチド配列のタンパク質産物（例えば、抗体および他の親和性試薬）を識別することが可能である。
【０１８３】
また、各々のプローブが１つの遺伝子に対応、複数のプローブが１つの遺伝子に対応、もしくはその両方、または１つのプローブが２つ以上のプローブに対応すると理解される。
【０１８４】
開示された核酸分子の相同体と変異体とを本発明で用いてもよい。標準の方法を使用して整列配置する場合、これらの核酸分子の相同体および変異体は配列同一性が比較的高い。本発明に包含される配列は、本明細書で開示した配列に対して、配列同一性が少なくとも４０〜５０、５０〜６０、７０〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、または９５〜１００％である。
【０１８５】
発現プロファイリングに関して、開示された配列での変異が依然として遺伝子発現の検出を可能とすることが理解される。遺伝子発現検出に求められる配列同一性の程度は、オリゴマーの長さに依存して変化する。６０ｍｅｒでは、６０ｍｅｒ中での６〜８のランダム突然変異または６〜８のランダム欠失は、遺伝子発現検出に影響を及ぼさない。Ｈｕｇｈｅｓ，  ＴＲ，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｋ  ｊｅｔ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９：３４３−３４７（２００１）。ＤＮＡ配列の長さが増加するにつれて、まだ遺伝子発現検出が可能なあいだ、許容される突然変異数または欠失数が増加する。
【０１８６】
当業者によって認められるように、本発明の配列はシーケンシング・エラーを含む可能性がある。すなわち、誤ったヌクレオチド、フレームシフト、未知のヌクレオチドまたはシーケンシング・エラーの他の型が配列のいずれかにある可能性がある。しかし、正しい配列は本明細書では相同体およびストリンジェンシーの定義に入る。
【０１８７】
ヒトゲノムでの特異的ハイブリダイゼーションのために必要なオリゴヌクレオチドプローブの最小長は、２通りの方法を使用して推定されることができる。第１の方法は、プローブが偶然にヒトゲノムにおいてユニークであるという統計議論を使用する。手短に言うと、複雑さＣのゲノムで長さＬのオリゴヌクレオチドに対して予想される独立完全一致（Ｐｏ）の数は、以下の等式によって求めることができる（Ｌａｉｒｄ  ＣＤ，  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  ３２：３７８  （１９７１）。すなわち、
Ｐｏ＝（１／４）Ｌ  ＊  ２Ｃ  
哺乳類ゲノムの場合、２Ｃ＝〜３．６ｘ１０９であり、１４〜１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドはゲノムで一度だけ見られると思われる。しかし、哺乳類のゲノムのコード配列中のヌクレオチドの配分は無作為でなく（Ｌａｔｈｅ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８３：１  （１９８５）  ）、より長いオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの特異性の増加にとって好ましいと思われる。実際的な条件では、このことは長さが１９〜４０ヌクレオチドのプローブでうまくいく（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、以下）。特異的プローブの長さを推定する第２の方法は、選択された条件下でハイブリダイズするのに十分な長さのプローブを用いることで、またその配列をサーチしてヒトゲノム
中の配列に一致させたり、ユニークな一致を選択するコンピュータを使用することである。プローブ配列は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｉｎｆｒａの第１１章で記述されるように、所望のハイブリダイゼーション特性に基づいて選択される。プライマー３プログラムは、これらのプローブを設計することに役立つ（（Ｓ．  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ  １９９６，１９９７；  プライマー３コードはウェブサイト（ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／プライマー３．ｈｔｍｌ）で入手可能である。これらのプローブの配列は、ＢＬＡＳＴまたはＭＥＧＡＢＬＡＳＴのようなプログラムを使用しているヒトの正真正銘の配列のデータベースに対して、ペアワイズに比較される（Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１−１４１）。大部分のヒト・ゲノムが現在データベースに含まれるので、一致する数が測定される。所望のターゲット配列に対してユニークであるプローブ配列が選択される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、診断用ヌクレオチド  プローブセットは、アレイ上に固定される。このアレイは、任意に、一つ以上のチップ・アレイ、プレート・アレイ、ビーズ・アレイ、ピン・アレイ、膜アレイ、固体表面アレイ、液体アレイ、オリゴヌクレオチド・アレイ、ポリヌクレオチド・アレイもしくはｃＤＮＡアレイ、マイクロタイター・プレート、ピン・アレイ、ビーズ・アレイ、膜、またはチップを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、上記白血球関連疾患は、表１に記された疾患から選択される。別の実施形態では、いくつかの実施形態では、上記疾患はアテローム性動脈硬化症または心臓同種移植片拒絶である。別の実施形態において、疾患は、うっ血性心不全、アンギナ、および心筋梗塞である。
【０１９０】
いくつかの実施形態で、本発明の診断用オリゴヌクレオチドは、疾患状態に関連していることがしられている遺伝子（「既知のマーカー」）と組み合わせて診断用遺伝子セットとして用いられる。既知のマーカーを診断用ヌクレオチドと組み合わせて用いることで、既知マーカー単独では得られない情報を提供することができる。既知マーカーとして、提供した従来の表によって同定されたものが挙げられる。
【０１９１】
（造血）
本発明はまた、本発明の診断用オリゴヌクレオチドを使用する造血速度の測定の方法およびモニタリングおよび移植拒絶反応の診断のための方法として、任意の方法による造血速度の方法に向けられる。前駆体細胞および未成熟細胞はしばしば、細胞特異的表現型マーカーを有する。これらは、未成熟の細胞または前駆体細胞において制限された様式で発現される遺伝子および／またはタンパク質である。この発現は、成熟と共に減少する。種々の系統の未成熟細胞についての遺伝子発現マーカーが、例として以下の表１０に与えられる。
【０１９２】
（表１０：）
【０１９３】
【化１３２】
2010022375.tif 000134
【０１９４】
末梢血液サンプル中のこれらの遺伝子および他の遺伝子のレベルを測定することにより、未成熟細胞または前駆体細胞の数および割合の評価が、行われ得る。赤血球および血小板におけるＲＮＡ定量が、特に使用される。これらの細胞は、その成熟形態において無核化される。発達の間、血小板を巨核球から切り取り、核なしの相補性的なＲＮＡを採取する。ＲＮＡは、血小板により迅速に消費される。赤血球は、核のある細胞として開始するが、核は、成熟プロセスの最後に向かって押し出される。これらの細胞は、細胞の１２０日の寿命の最初の２日以内で迅速に消費される。
【０１９５】
これらの無核化細胞型について、遺伝子発現マーカーは、細胞株のみに対して特異的であり（未成熟形態に対しては特異的でなく）、細胞生成速度の測定に有用でなければならない。他の血液細胞型に対する系統に特異的な遺伝子は、ＲＮＡレベルについて測定される場合、細胞生成速度のマーカーとして働く。これは、ＲＮＡが、これらの場合に未成熟形態に対して特異的であるためである。例えば、ヘモグロビンは、赤血球に対して特異的であるが、ヘモグロビンＲＮＡは、新たに産生された赤血球に特異的である。従って、赤血球の産生速度が増加する場合、系統特異的ＲＮＡ（例えば、ヘモグロビン）のレベルもまた、増加される。
【０１９６】
造血成長因子およびサイトカインは、不完全な系統特異性を有する。Ｇ−ＣＳＦは、低い顆粒白血球数を患者に投与し、そしてその効果は、全ての系統（顆粒白血球、赤血球、血小板など）の刺激である。溶血性貧血は、複数の細胞系統の産生を増加するよう導くが、増大した需要における唯一の系統が、赤血球である。造血応答の特異性の欠如のために、赤血球および血小板産生速度が、リンパ球系統の増加した産生の代理物として働き得る。リンパ球系統のための代理物としてＲＢＣおよび血小板産生速度を使用することは、これらの細胞における核の欠如および系統特異的ＲＮＡレベルを単純に測定することにより細胞産生速度を測定する容易さのために、有用であり得る。
【０１９７】
造血速度は、末梢血の遺伝子発現プロファイルを使用して測定され得る。ＲＢＣおよび血小板特異的遺伝子は、核の欠如および速度論のために、測定のための独特の機会を提供する。新しい細胞＝抹消血中の細胞型由来の新しい／はるかに多くのＲＮＡ。未成熟リンパ球は、免疫活性化および免疫拒絶反応についてさらにより特異的であり得る。リンパ球前駆体の細胞特異的マーカーが、同定される（リンパ芽球としても知られる）。以下を参照のこと。顆粒白血球前駆体および巨核球のマーカーまたは任意の血液細胞の未成熟形態が、この点において有用であり得る。
【０１９８】
（造血速度を測定するための適用）
造血速度の変化が、多くの疾患状態および他の病理に関連付けられてきた。このような状態の例を、表１１に列挙する。当業者は、他のこのような条件に気付く。さらに、本発明の１つの局面は、造血速度の変化の間の関連の同定である。従って、造血速度の測定に向けられる本発明の方法は、多くの疾患状態および他の病理の診断およびモニタリングに適用され得る。さらに、これらの方法は、患者のための適切な治療を決定するのに有益であり得る。
【０１９９】
【化１３３】
2010022375.tif 000135
【０２００】
本発明の方法はまた、造血速度の変化に相関される疾患および他の病理の治療レジメンをモニタリングするのに有用である。さらに、この方法が使用されて、造血速度に影響する薬物での処置をモニタリングし得る。当業者は、多くのこのような薬剤を知っている。以下の薬剤は、このような例である。
【０２０１】
エリトロポイエチンは、減少した赤血球生成に起因する種々の貧血を処置するのに使用される成長因子である。遺伝子発現または他の手段による赤血球生成をモニタリングすることは、投薬を改善し得、そしてこの高価な薬剤を使用する治療への応答のより早い評価のための手順を提供する。
【０２０２】
ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｇ−ＣＳＦ）が、免疫抑制または化学療法に通常関する低い好中球量（好中球減少）の処置のために使用される。遺伝子発現試験または他の手段により好中球産生をモニタリングすることは、投薬、患者の選択、短縮された治療の持続時間を改善し得る。
【０２０３】
プレドニゾン／免疫抑制−免疫抑制の最も一般的な副作用の１つは、造血の抑制である。これは、あらゆる細胞系統で生じ得る。遺伝子発現モニタリングまたは造血速度の他の測定法が使用されて、特定の細胞株の血球減少について通常モニタリングし得、そして投薬を改変し、治療を改変し、または特定の造血成長因子を加えるためにその情報が使用され得る。以下の細胞数自体は、あまり感受性でなく、所定の投薬量で延長された治験の必要性が生じ、その後効力および毒性が評価され得る。
【０２０４】
化学療法剤をモニタリングすると−ほとんどの化学療法剤は、いくらかまたは全ての系統について骨髄を抑制する。遺伝子発現試験または造血速度を評価する他の手段が使用されて、特定の細胞株における血球減少について通常モニタリングし得、そして情報を使用して投薬を改変し得、治療を改変し得、または特定の増殖成長因子を加え得る。
【０２０５】
（一般分子生物学レファレンス）
本発明の文脈のなかで、核酸および／またはタンパク質は、周知の分子生物学的技術によって操作される。そのような数々の方法についての詳細なプロトコールは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２０００年を通して増補）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （”Ａｕｓｕｂｅｌ”）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”），および  Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （”Ｂｅｒｇｅｒ”）に記載されている。
【０２０６】
上記レファレンスに加えて、例えば本発明のｃＤＮＡプローブの増幅に有用な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑレプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）のＲＮＡポリメラーゼのプロトコールは、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）    Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）  （”Ｉｎｎｓ”）；  Ａｒｎｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  （１９９０）  Ｃ＆ＥＮ  ３６；  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９１）  ３：８１；  Ｋｗｏｈら（１９８９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，１１７３；  Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４；  Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３５：１８２６；  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７；  Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ４：  ５６０；  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７，  およびＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ  （１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３に見いだされる。本発明の文脈で核酸のクローニングに有用なさらなる方法として、Ｗａｌ
ｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４２６，０３９号が挙げられる。ＰＣＲによる大きな核酸を増幅する改善された方法が、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４およびそこに挙げられたレファレンスにまとめられている。
【０２０７】
本発明の特定のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、モノヌクレオチドおよび／またはトリヌクレオチドに基づくホスホラミダイト・カップリング化学を含む種々の固相戦略を利用して合成することができる。例えば、核酸配列は、活性モノマーおよび／またはトリマーを、伸びているポリヌクレオチド鎖へ連続的に追加することによって合成することができる。例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｍ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１１：３を参照のこと。
【０２０８】
所望の配列を合成する代わりに、本質的にどのような核酸であっても種々の商業的供給元に特別注文することが可能である。そのような供給元として、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，  Ｉｎｃ．、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、その他多くがある。
【０２０９】
同様に、核酸およびタンパク質マイクロアレイの商業的供給元が利用可能であり、例えばＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡなどが挙げられる。
【０２１０】
本発明に関連した一領域は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションである。当業者は、ハイブリダイゼーションの厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に基づくハイブリダイゼーション条件を区別する。例えば、厳密性の高い（高ストリンジェント）条件として、０．５  Ｍ  ＮａＨＰＯ４，  ７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、  および１  ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションをおこない、６８℃で０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することを含むことも可能である（（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，
およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ａｔ  ｐ．  ２．１０．３）。中程度のストリンジェント条件として、例えば、０．２ＸＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、４２℃での洗浄が含むことも可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９，  上掲）。
【０２１１】
本発明は、本発明のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、そのことから該ＤＮＡ配列の相補体でもある核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、上記したように、厳密性の高いものであっても、厳密性がやや劣るものであってもよい。例えば、核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ（ｏｌｉｇｏ）」である場合、高ストリンジェント条件は、例えばピロリン酸ナトリウム、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチド用）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチド用）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチド用）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチド用）で６ｘＳＳＣ／０．０５％ナトリウムピロホスフェート中で洗浄することを意味することができる。これらの核酸分子は、標的ヌクレオチド配列アンチセンス分子として作用することができ、該分子は標的ヌクレオチド配列調節で、および／または標的ヌクレオチド配列核酸配列の増幅反応でのアンチセンス・プライマーとして、有用である。さらに、そのような配列は、リボザイムの一部として、および／または三重らせん配列にとっても有用であると思われ、また標的ヌクレオチド配列制御にも有用である。またさらに、そのような分子を、疾
患を生ずる対立遺伝子の存在が検出可能である診断方法の構成要素として用いることができる。    
【０２１２】
（診断用ヌクレオチドセットの同定）
（候補ライブラリー（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ））
白血球で差次的に発現される候補遺伝子のライブリーは、診断用オリゴヌクレオチド・セットと疾患特異的標的ヌクレオチド配列の同定および評価用の基質である。
【０２１３】
白血球という用語は、一般的に、有核赤血球ではない任意の有核血液細胞のことをいう。より具体的には、白血球は大まかに２つのクラスに分離される。第１のクラスは顆粒球、最も広く行き渡って、例えば好中球が含まれ、同様に低い頻度で好酸球および好塩基球が含まれる。第２のクラスは、非顆粒または無核の白血球であり、単球およびリンパ球（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が含まれる。第２のクラス（非顆粒状であるか単核白血球）は、単球とリンパ球（例えばＴ細胞とＢ細胞）を含む。炎症性およびリウマチ性疾患、神経変性疾患（例えば、例えばアルツハイマーの痴呆）、心血管疾患、内分泌疾患、移植拒絶、悪性腫瘍、および感染疾患、ならびに表１に示す他の疾患等の多種多様な疾患プロセスにおける白血球（例えば、好中球、単球、およびリンパ球）に関連した詳細な従来文献がある。単核球は、慢性免疫応答に関与する一方、顆粒球は、白血球のほぼ６０％を占めており、急性炎症性刺激に対する非特異的で型にはまった反応を示し、しばしば生存期間はわずか２４時間である。
【０２１４】
多数の疾患関連プロセスでのそれらの広範囲にわたる関与および／または影響に加えて、白血球は種々の理由から、臨床的および実験的な評価にとって特に魅力的な基質である。最も重要なことは、それらが本質的にあらゆる潜在的被検者から低コストで容易に利用されることである。採取は、最小限に侵襲的でほとんど痛みがなく、障害も少なく、あるいは回復時間も最小限である。採取は、種々の臨床および非臨床的設定で、著しい技術的支出なしに、最小限に訓練された人員（例えば採血者、医療技術者等）によって行うことができる。また、白血球は再生可能であり、一人の被験者に対して複数の時間点で利用可能である。
【０２１５】
（初期候補ライブラリーのアセンブリー）
初期候補ライブラリーは、「調査している（ｍｉｎｉｎｇ）」刊行物および配列データベースと差次的発現ライブラリーの構築とから組み立てられた。ライブラリー内の候補オリゴヌクレオチド配列は、完全長または部分的な核酸配列、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、合成オリゴヌクレオチド配列等であってもよい。核酸配列は、長さが少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、またはそれ以上の長さのものとすることができる。あるいは、候補ヌクレオチド配列のタンパク質産物は、以下にさらに記載されるような標準的方法を使用する候補ライブラリにおいて表され得る。診断用オリゴヌクレオチドの選択および確認では、長さが５０ヌクレオチドの核酸配列を使用して、８，０３１の候補オリゴヌクレオチド配列からなる初期ライブラリーを、以下に記載されるように構築した。
【０２１６】
（候補ヌクレオチド・ライブラリー）
本発明者らは、活性化白血球と休止白血球で差次的に発現される初期候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分を同定した。その初期候補ヌクレオチド・ライブラリーから、候補のプールを、表２、表８、および配列表に列挙されるように選択した。したがって、本発明は表２、表８および配列表に示されるヌクレオチド配列を含む候補白血球ヌクレオチド・ライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は表２、表８および配列表に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む候補ライブラリーを提供する。別の実施
形態では、本発明は表２、表８および配列表に示される少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む候補ライブラリーを提供する。もう一つの実施形態では、少なくとも２つのヌクレオチド配列は、長さが１９ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、または少なくとも１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、リボ核酸（ＲＮＡ）配列、合成オリゴヌクレオチド配列、またはゲノムＤＮＡ配列を含む。ヌクレオチド配列が各々１つの遺伝子と一致する可能性があり、あるいはいくつかのヌクレオチド配列が１つの遺伝因子と一致する可能性があるいはその両方の可能性がある。
【０２１７】
本発明は、候補ヌクレオチド・ライブラリーに対するプローブも提供する。本発明の一実施形態では、プローブは表２、表８または配列表でリストされる少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。これらのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの白血球関連疾患のための少なくとも１つの疾患基準を持つ個人の白血球および少なくとも１つの疾患基準を持たない個人の白血球で差次的に発現される。２つ以上のヌクレオチド配列の発現は、少なくとも１つの疾患基準と相関している。プローブが候補ヌクレオチド・ライブラリーのＲＮＡ発現またはタンパク質発現を検出する可能性があると理解される。代わりに、またはそれに加えて、プローブは、さらに後述するように、候補ヌクレオチド配列に関連した遺伝子型を検出することができる。別の実施形態では、候補ヌクレオチド・ライブラリーのプローブがアレイの上で固定される。
【０２１８】
本発明の候補ヌクレオチド・ライブラリーは、本発明の診断用ヌクレオチド・セットを同定することに有用であり、それ自身が、後述するように、本発明の診断用ヌクレオチド・セットである。候補ヌクレオチド配列を、さらに特徴づけることが可能であり、また疾患標的ヌクレオチド配列および／または新規ヌクレオチド配列として、後述するように、同定してもよい。後述するように、候補ヌクレオチド配列は、像形成（イメージング）試薬としての用途にも適していると思われる。
【０２１９】
（非白血球発現遺伝子の検出）
血液サンプル中の遺伝子発現レベルを測定する際に、白血球から得られていないＲＮＡが、測定され得る。例は、ウイルス遺伝子、損傷された非白血球細胞型から放出された遊離ＲＮＡまたは循環非白血球細胞型由来のＲＮＡである。例えば、急性同種移植片拒絶反応の過程において、組織損傷が、同種移植片細胞または同種移植片細胞由来のＲＮＡの循環への放出を、生じ得る。候補同種移植片の場合において、このような転写は、筋肉（ミオグロビン）または心筋（トロポニンＩ、トロポニン（ｔｏｐｏｎｉｎ）Ｔ、ＣＫ−ＭＢ）に対して特異的であり得る。末梢血中の心臓特異的ｍＲＮＡの存在は、進行中の心臓細胞損傷または最近の心臓細胞損傷（急性の拒絶反応から生じる）を示し得る。従って、このような遺伝子は、同種移植片拒絶反応についての非常にすぐれた診断用マーカーであり得る。
【０２２０】
（発現パターンの生成）
（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質試料の獲得）
差次的に発現された候補ヌクレオチド配列のライブラリーの同定または構築の後で、候補ライブラリーの複数成分に対応した白血球発現プロフィールが得られる。一人以上の被検者からの白血球試料が標準的な方法によって得られる。最も一般的に、これらの方法では、末梢血を経皮−静脈経由で採血する。末梢血管系から全血の循環白血球を採取することが最も単純で、侵襲が最小であり、さらに最も低コストの選択肢である一方で、多数の他の採取法があり、ある状況下では好ましく用いられることはいうまでもない。実際、例えば、中心ライン（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅ）、中心動脈、または実際に心臓カテーテル、あるいは中央血管系に接近する外科的手技の際に得られる末梢血管系から採取された白血球間には、関連する差異が存在しない。また、少なくとも部分的に白血球から構成さ
れる他の体液または組織も所望の白血球試料である。例えば、気管支鏡検査法の間、肺から得られる流体試料は、白血球が豊富であり、かつ本発明の文脈中で発現プロファイリング、（例えば診断、予後のため）または肺移植拒絶、炎症性肺疾患、もしくは感染肺疾患のモニターがやりやすい。他の組織の流体試料、例えば結腸、洞、食道、胃、小腸、膵管、胆道系、膀胱、尿管、膣、頸部または子宮、その他の内視鏡検査によって得たものも好適である。試料を、白血球を含む他の源、例えば尿、胆汁、髄液、大便、胃または腸管の分泌物、精液、または固形の器官もしくは関節生検から得てもよい。
【０２２１】
最も高い頻度で、白血球の混合集団（例えば全血で見いだされたもの）を本発明の方法で利用する。粗分離（例えば赤血球からの混合白血球の粗分離）および／または濃縮化（例えばショ糖、パーコール、もしくはフィコール勾配上での濃縮化）または他の公知方法を用いて、十分な量でＲＮＡおよびタンパク質の発現産物の回収を促進し、また非特異的バックグラウンドを減少させることができる。いくつかの例では、白血球の亜母集団を精製することが求められ、それを行う方法、例えば密度または親和性勾配、フロー・サイトメトリー、蛍光活性化セル・ソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫磁気分離、「パニング」等が入手可能な文献および下記に説明されている。
【０２２２】
（発現プロファイリングのためのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質試料の入手）
発現パターンは、ＤＮＡ、またはＲＮＡまたはタンパク質生成物のレベルにて評価され得る。例えば、種々の技術は、全血からＲＮＡの単離に利用できる。細胞（リボソームＲＮＡとｔＲＮＡの存在または非存在下で）からのｍＲＮＡの単離を可能にするいかなる技術でも、利用することができる。手短に言えば、後に続く遺伝子発現分析に好適な信頼性が高い全ＲＮＡ単離を可能にする１つの方法を以下に説明する。被験者から末梢血（静脈または動脈のいずれか）を抗凝固剤（例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩、またはヘパリン）の入った１本以上の滅菌された内毒素無しの試験管に取る。一般に、上記試料は少なくとも２つの部分に分けられる。１つの部分は、ＤＮＡまたはタンパク質等の将来の分析のために例えば５〜８ｍｌの全血を凍らせて保存しておく。第２の部分は、例えば約８ｍｌの全血であり、Ｓａｍｂｏｏｋ，  Ａｕｓｕｂｅｌ、下記、および米国特許第５，７２８，８２２号および第４，８４３，１５５号等に記載されたような種々の技術のいずれかによる全ＲＮＡの単離用に処理される。
【０２２３】
代表的に、約８ｍｌの全血（ほとんどの状況下で直ちに成人被験者から入手可能な量）から得られる単核白血球の被験者試料から、全ＲＮＡが５〜２０μｇ得られる。この量は、例えば、少なくとも２つのプローブ・アレイに対して標識およびハイブリダイゼーションを行う上で十分な量である。候補ライブラリーのヌクレオチドの発現パターンを分析するための標識プローブを、標準的な方法を用いて被験者のＲＮＡ試料から調製する。多くの場合、ｃＤＮＡはポリＴプライマーと、標識（例えば放射性または蛍光）ヌクレオチドとを用いて、全ＲＮＡから合成される。次に、結果として生じる標識ｃＤＮＡを、候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分に対応するプローブとハイブリダイズさせ、ライブラリーの各ヌクレオチド配列に対して、発現データを得る。被験者試料（例えば、他の生物学的流体および試料から得た白血球または末梢血白血球）から単離したＲＮＡを候補ライブラリーのヌクレオチドの発現パターンの分析のために用いる。
【０２２４】
しかし、場合によっては、白血球試料から抽出されるＲＮＡの量が制限されるので、ＲＮＡから合成を増幅することが望ましい。増幅は、プローブ標識の効率を増加させることによって、または標識前にＲＮＡ試料を増幅することによって達成可能である。増幅プロセスのあいだ、いかなるバイアス（遺伝子発現レベルに関して）も導入しない増幅方法を選択するために、注意を払わなければならないと考えられる。
【０２２５】
いくつかの方法は利用可能であり、これらの方法は、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（ガラス
蛍光標識キット（Ｇｌａｓｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｍｔｉｎｇ  Ｋｉｔ））もしくはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（フェアプレイ・マイクロアッセイ標識キット（Ｆａｉｒｐｌａｙ  Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ））、またはマイクロマックス・キット（Ｍｉｃｒｏｍａｘ  ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，  Ｉｎｃ．）を用いて、限定量のＲＮＡからのシグナルを増やす。あるいは、標識がない状態でＴ７−ポリＴプライマーを用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  （３ＤＮＡ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏ）由来のＤＮＡデンドリマーをプライマー上でポリＴ配列とハイブリダイズさせるか、もしくは蛍光標識配列に対して相補的な「キャプチャー配列（ｃａａｐｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とハイブリダイズさせる。各々の３ＤＮＡ分子は２５０個の蛍光分子を持つので、各ｃＤＮＡを強く標識することができる。
【０２２６】
あるいは、ＲＮＡ試料を標識に先立って増幅する。例えば、米国特許第６，１３２，９９７号で述べられるように、線形増幅をおこなってもよい。Ｔ７−ｐｏｌｙＴプライマーを用いてＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成する。つぎに、第２のＤＮＡ鎖を作って増幅のための基質を完成させる。プライマーに組み込まれたＴ７プロモーターを用いて、オリジナルＲＮＡのアンチセンス・コピーを多数作る。蛍光色素標識したヌクレオチドを、直接ＲＮＡに組み込む。あるいは、アミノ・アリル（ａｍｉｎｏ  ａｌｌｙｌ）標識ヌクレオチドをＲＮＡに取り込み、Ｈｕｇｈｅｓの記載にしたがって、つぎに蛍光色素をアミノ・アリル基に化学的に結合させる。増幅のための他の典型的な方法は以下に記載する。      
【０２２７】
単離ＲＮＡが白血球由来のＲＮＡを含まなければならないが、程度の差はあっても他の細胞型のＲＮＡを含む可能性があると考えられる。その上、単離ＲＮＡは、先に述べたように白血球（例えば単球および／またはＴリンパ球）のサブセットに由来する可能性がある。ＲＮＡ誘導のために使用される細胞型のそのような考慮は、使用される発現プロファイリングの方法に依存する。白血球のサブセットは、蛍光活性化セル・ソーター（ＦＡＣＳ）、微量流体法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）細胞分離システム、または種々の他の方法によって得られることができる。細胞の選別（セル・ソーティング）は、診断用遺伝子セットの発見のために産物としての遺伝子セットの実現のため、またはその両方のために、必要と思われる。セル・ソーティングは、種々の技術（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｃａｎｔｏｒら、１９７５参照、またＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡの技術を参考）で、達成できる。
【０２２８】
ＤＮＡ試料は、ＤＮＡ突然変異、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、または他の多型の存在について分析するために得るとよい。ＤＮＡの単離は、標準の技術（例えばＭａｎｉａｔｕｓ、上掲）を用いておこなう。
【０２２９】
候補ヌクレオチド産物の発現もプロテオミクスを使用して評価可能である。タンパク質は、患者血清または白血球細胞由来のタンパク質試料で検出される。血清の調製は、標準の方法を用いて全血の遠心によっておこなう。血清中に存在するタンパク質は、種々の白血球と非白血球細胞のいずれかから産生されると考えられ、白血球から分泌されたタンパク質を含む可能性がある。あるいは、白血球または白血球の亜母集団の調製は、先に述べたようおこなう。細胞タンパク質の調製は、周知の方法によって白血球サンプルからおこなう（例えばＴｒｉｚｏｌ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ｃａｔ  ＃  １５５９６１０８；  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．  （１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２，  １５６；  Ｓｉｍｍｓ，  Ｄ．，  Ｃｉｚｄｚｉｅｌ，  Ｐ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  （１９９３）  Ｆｏｃｕｓ（登録商標）  １５，  ９９；  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．，  Ｂｏｗｅｒｓ−Ｆｉｎｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓａｂａｔ
ｉｎｉ，  Ｌ．  （１９８７）  Ｊ．  ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓ．  ６，  ８３；  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  （１９９３）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５，５３２；  Ｂｒａｃｅｔｅ，  Ａ．Ｍ．，  Ｆｏｘ，  Ｄ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｓ，  Ｄ．  （１９９８）  Ｆｏｃｕｓ  ２０，  ８２；  Ｓｅｗａｌｌ，  Ａ．  ａｎｄ  ＭｃＲａｅ，  Ｓ．  （１９９８）  Ｆｏｃｕｓ  ２０，３６；  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８４  Ａｐｒ；１３８（ｌ）：  １４１−３、Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ；  Ｗｅｓｓｅｌ  Ｄ，  Ｆｌｕｇｇｅ  ＵＩ．  （１９８４）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８４  Ａｐｒ；１３８（１）：  １４１−１４３）。            
【０２３０】
測定法自体は、タンパク質マーカーの細胞表面での発現にもとづいて細胞が選別および／または計数されるセル・ソーティング・アッセイであってもよい（Ｃａｎｔｏｒら、１９７５，Ｇａｌｂｒａｉｔｈら、１９９９を参照のこと）。
【０２３１】
（発現パターンの入手）
次いで、候補ライブラリーの成分に対応する複数のヌクレオチドの発現パターンまたはプロファイルを、一つ以上の試料の白血球で評価する。一般的に、白血球は患者末梢血試料に由来するが、すでに示したように、多くの他の試料供給源もまた好適である。これらの発現パターンは、いくつかのＲＮＡまたはタンパク質産物に対する相対的または絶対的発現値のセットを構成するもので、該産物は複数の評価ヌクレオチド配列に対応し、本明細書ではそれをそれらのヌクレオチド配列に対する患者の「発現プロファイル」と称する。候補ライブラリーのわずか１つの独立成分のための発現パターンが得られる一方で、一般に、より多くのヌクレオチド配列（例えば約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、またはそれ以上）に対応している発現パターンを得ることが好ましい。ライブラリーにある差次的発現した各々の発現構成要素の発現パターンは、診断、予後、モニタリングなどの予測値に関して限られた特異性および感度を与える。
【０２３２】
（臨床研究、データ、患者グループ）
議論を目的として、被験者または被検者白血球試料はという用語は、健康および／または疾患状態に関係なく個人を意味する。被検者は、患者、試験参加候補者、コントロール被験者、スクリーニング被検者または白血球試料が得られる他のいかなるクラスの個人とすることができる。本発明の前後関係で評価され、かつ本明細書の文脈のなかで評価される個人の他のいかなる種類でもありえる。したがって、被験者は、疾患で診断可能であり、疾患の症状、または疾病素質、例えば疾患に対する家族（遺伝的）歴または病歴（医学的）因子、その他を１つ以上持つことができる。あるいは、被験者は、上記因子または基準のいずれかに関して健康でありえる。本明細書で用いられる用語「健康な（ｈｅａｌｔｈｙ）」は、特定の疾患または疾患因子もしくは疾患基準に関係するもので、任意の絶対的評価または状態に対応するように定義することはできないことは、いうまでもない。したがって、任意の特定の疾患または疾患基準に関連して健康であると判断された個人は、実際のところ、他の１つ以上の疾患があるか、もしくは他の１つ以上の疾患基準を示し得る。
【０２３３】
さらに、本発明の議論が集中し、かつヒト配列および試料を用いて例証される一方で、実験動物（例えばマウス、ラット、モルモット、およびウサギ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびトリ）、ならびにペット（例えば、イヌおよびネコ）のようなヒト以外の動物に対して、適切な候補ライブラリーの構成または選択を通して、本発明が等しく適用される。
【０２３４】
（発現データを得るための方法）
発現データを得る多数の方法は公知であり、これらの技術の任意の一つ以上を単独または組合わせたものが、本発明の文脈で発現プロファイルを決定する上で好適である。例えば、発現パターンは、ノーザン分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑ  Ｍａｎ分析、またはＦＲＥＴ検出によって評価可能であり、一つ以上の分子ビーコンのモニタリング、オリゴヌクレオチド・アレイに対するハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイに対するハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチド・アレイに対するハイブリダイゼーション、液状マイクロアレイに対するハイブリダイゼーション、マイクロエレクトリック・アレイに対するハイブリダイゼーション、分子ビーコン、ｃＤＮＡシーケンシング、クローン・ハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡフラグメント・フィンガープリンティング、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、ディファレンシャル・ディスプレイおよび／またはディファレンシャル・スクリーニング（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：８２７−８３６，およびその文献で引用した文献を参照）でおこなう。
【０２３５】
例えば、特異的ＰＣＲプライマーは、候補ヌクレオチドライブラリーのメンバーに対して設計される。ポリｄＴオリゴヌクレオチド・プライマーからの逆転写によって被験者試料ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲにかける。二重鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲ産物の逆転写に好適なプライマーを用いて調製可能であり、続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いてｃＤＮＡの増幅がおこなわれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の産物は、候補ライブラリーのオリジナル成分に対応するセンスＲＮＡである。ＰＣＲ産物を当該技術分野で公知のいくつかの方法で評価してもよい。そのような方法として、ＴａｑＭａｎまたは分子ビーコン・プローブ等の標識プライマーの検出を用いたリアル・タイム・アセスメントが挙げられる。ＰＣＲ産物の分析に好適な技術プラットフォームとして、ＡＢＩ  ７７００、５７００または７０００の配列決定システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、ＭＪリサーチ・オプティコン（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｔｉｃｏｎ）（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）、ロッシュ・ライト・サイクラー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ４０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、バイオ・ラッド・サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ）  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）が挙げられる。あるいは、分子ビーコンを用いてＲＮＡまたはＤＮＡ試料中の核酸配列の存在を検出し、もしくは続いて任意の方法、例えばＩＶＴ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）またはＮＡＳＢＡ（核酸配列にもとづいた増幅）を用いて配列の増幅をおこなう。分子ビーコンは、候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分に対する配列相補性により設計され、蛍光標識が結合している。各々のプローブは、非オーバーラップ発光波長で異なる蛍光ラベルを持っている。例えば、１０個の遺伝子の発現は、１０種類の異なる配列特異的分子ビーコンを使用して評価可能である。
【０２３６】
あるいはまたは加えて、分子ビーコンは、一度に複数のヌクレオチド配列の発現を評価するのに用いられる。診断用ヌクレオチド・セットの成分に相補的な配列を有する分子ビーコンを設計して蛍光標識を結合させる。使用される各々の蛍光標識は、非オーバーラップ発光波長を持たなければならない。例えば、１０個のヌクレオチド配列の評価は、増幅ＲＮＡもしくは非増幅ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料に１０個の配列特異的分子ビーコン（各々に対して異なる蛍光分子による標識がなされている）をハイブリダイズさせることによっておこなうことができる。そのようなアッセイは、試料標識方法の必要を回避する。
【０２３７】
あるいはまたは加えて、ビーズ・アレイを用いて、一度に複数の配列の発現を評価する
ことができる（例えば、ＬａｂＭＡＰ  １００，  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘａｓを参照）。代わりにまたは加えて、エレクトリック・アレイは、Ｍｏｔｏｒｏｌａ  （Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＩＩ．）  のｅ−センサー（ｅ−Ｓｅｎｓｏｒ）技術またはＮａｎｏｇｅｎ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．）のナノチップ（Ｎａｎｏｃｈｉｐ）技術として例示される。
【０２３８】
もちろん、選択された特定の方法は回収ＲＮＡ量、開業医の好み、利用可能な試薬および装置、検出器等のような因子に依存する。一般的に、しかし、選択された方法は、目的とする試料およびプローブの数を処理することに好適である。高スループット発現分析方法については、以下で考察する。
【０２３９】
あるいは、遺伝子発現のタンパク質産物レベルで発現が実行される。例えば、白血球試料では、タンパク質発現は、ウェスタン分析、二次元ゲル分析、クロマトグラフィ分離、質量分析検出、タンパク質融合レポーター構成体、比色アッセイ、タンパク質アレイへの結合、およびポリソームｍＲＮＡの特徴のあいだから選択される１つ以上の方法によって評価することができる。特に好ましいアプローチの一つとして、候補ライブラリーの成分に特異的な抗体のアレイに対して標識タンパク質発現産物を結合させることが含まれる。抗体を産生および評価する方法は、当該技術分野で広範囲にわたる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（上掲）；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８９）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （”Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ”）。候補ヌクレオチド配列の産物に対して特異的な抗体試薬の選択によって、本発明に対して適用可能な種々の免疫学的方法および免疫アッセイ方法に関するさらに詳しい説明は、例えばＳｔｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒ  （ｅｄｓ．）（１９９１）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ７ｔｈ  ｅｄ．、および  Ｐａｕｌ  （上掲）に見いだすことができる。別のアプローチは、脱着分光測定を実行するためのシステムを用いる。商業的に入手可能なシステムは、例えばＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）から入手可能なものが、特にタンパク質発現の定量分析にかなり適している。実際、脱着分光測定によるアプローチにおいて使用されるタンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ（登録商標））アレイ（例えば、ウェブサイト、ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ．ｃｏｍ参照のこと）は、タンパク質発現検出用のアレイを提供する。あるいは、タンパク質産物のエピトープを認識する親和性試薬（例えば、抗体、小分子など）を開発する。親和性アッセイは、タンパク質アレイ・アッセイで用いられ、例えば特定のタンパク質の有無を検出する。あるいは、上記方法により親和性試薬を用いて発現の検出をおこなう。白血球の細胞表面で発現されたタンパク質の場合、標識結合性試薬は白血球の集団に結合し、蛍光活性化セル・ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてタンパク質を発現する白血球を同定かつ計数する。
【０２４０】
本発明で議論される発現評価の方法もまた、診断用ヌクレオチド・セットの発見の文脈のなかで議論されるけれども、例えば以下にさらに議論するように、疾患を診断するために診断用ヌクレオチド・セットを用いた場合の発現評価に等しく適用可能であることが認められる。
【０２４１】
（高スループット発現アッセイ）
多くの適切な高スループット・フォーマットが、遺伝子発現を評価するために存在する。一般的に、高スループットという用語は、１日あたり、少なくとも約１００のアッセイまたは少なくとも約５００のアッセイでまたは約１０００のアッセイまたは少なくとも約５０００のアッセイで実行するフォーマット、あるいは少なくとも約約１０，０００のアッセイ、またはそれ以上のアッセイを実行するフォーマットをいう。アッセイを数える場合、評価した候補ヌクレオチド配列の数または試料の数を考慮することができる。例え
ば、候補ヌクレオチド配列に対応した単一プローブを用いたグリッド・アレイ（ドット・ブロット等）で実行された約１００個の試料等のノーザン分析が高スループット分析であると考えられる。しかし、より一般的には、そのようなアッセイは一連の二連のブロットとして実行され、各々が候補ライブラリーの異なる成分に対応した異なったプローブによって評価される。あるいは、１つ以上の試料で、または多数の試料で約１００以上の候補ヌクレオチドの発現を同時に評価する方法が高スループットと考えられる。
【０２４２】
高スループット発現分析を実施するための多数の技術的プラットフォームが公知である。一般的に、そのような方法は、被験者試料または候補ライブラリーのいずれか、またはその両方の論理的または物理的アレイを含む。一般のアレイ・フォーマットは、液状アレイおよび固相アレイの両方が含まれる。例えば、核酸のハイブリダイゼーション、抗体もしくは他の受容体のリガンドへの結合等、液相アレイを用いたアッセイを、マルチウェルまたはマイクロタイター・プレートで実施することができる。９６ウェル、３８４ウェル、または１，５３６ウェルのマイクロタイター・プレートが幅広く利用されており、より多くのウェル数（例えば３，４５６および９，６００）であっても使用することができる。一般に、マイクロタイター・プレートの選択は、方法および設備（例えばロボット操作およびローディング・システム）によって測定され、試料調製および分析に使われる。典型的なシステムとして、例えばＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．  （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）のＯＲＣＡＴＭシステムおよびＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ）のＺｙｍａｔｅシステムが挙げられる。
【０２４３】
あるいは、種々の固相アレイを、本発明の文脈中で発現パターンを決定するために好適に用いることができる。典型的なフォーマットとして、膜またはフィルター・アレイ（例えば、ニトロセルロース、ナイロン）、ピン・アレイ、およびビーズ・アレイ（例えば、液体「スラリー」中で）が挙げられる。一般的に、候補ライブラリーの成分に対応する発現産物と特異的に相互作用（例えば、ハイブリダイズまたは結合する）核酸またはタンパク質試薬に対応するプローブを、固形支持体上に、例えば直接または間接的に架橋することによって固定する。本質的に、特定の発現アッセイを実行する必要のある条件や試薬に耐えることが可能な固形支持体を用いることができる。例えば、官能化ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、修飾シリコン、種々のポリマーのいずれか、例えば（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組み合わせのすべてを固相アレイに対する基質として用いることができる。  
【０２４４】
好ましい実施形態で、アレイは、例えば、上記した特定の材料のうちの１つから構成される「チップ（ｃｈｉｐ）」である。ポリヌクレオチド・プローブ，（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）合成オリゴヌクレオチド等、または候補ライブラリーの個々の成分の発現産物と特異的に相互作用する抗体等の結合タンパク質が、論理的順番で、すなわちアレイ内でチップに固定される。また、マーカー・ヌクレオチド配列（試料の標識の設計に依存）のセンスまたはアンチ・センス配列のいずれかに対して特異的親和性を持つ任意の分子を、マーカーに対する特異的親和性を失うことなくアレイ表面に固定することができ、さらに、アレイ生産のために得ることができ、かつ生産することができ、例えば、マーカーの特異的核酸配列を特異的に認識するタンパク質、リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または特異的親和性を有する他の化学物質もしくは分子である。
【０２４５】
核酸およびタンパク質をチップ基質に結合させる方法についての詳細な議論は、Ｐｉｒｒｕｎｇらの米国特許第５，１４３，８５４号（“Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”）（１９９２年９月１日発行）、Ｃｈｅｅ他の米国特許第５，８３７，８３２号（Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ  Ｃｈｉｐｓ”）（１９９８年１１月１７日発行）、Ｄａｌｅの米国特許第６，０８７，１１２号（Ａｒｒａｙｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”）（２０００年７月１１日発行）、Ｂａｈｌ他の米国特許第５，２１５，８８２号（”Ｍｅｔｈｏｄ  Ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｏｎ  Ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ  Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ”）（１９９３年６月１日発行）、Ｋａｔｏの米国特許第５，７０７，８０７号（  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｅｘｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”（１９９８年１月１３日発行）、Ｂｒｏｗｎ他の米国特許第５，８０７，５２２号（  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ”）（１９９８年９月１５日発行）、Ｇａｍｂｌｅ他の米国特許第５，９５８，３４２号（  ”Ｊｅｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｅｖｉｃｅ”）（１９９９年９月２８日発行）、Ｃｈｅｎｃｈｉｋ他の米国特許第５，９９４，０７６号（  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  差次的発現”）（１９９９年１１月３０日発行）、Ｗａｎｇの米国特許第６，００４，７５５号（  ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ”）  （１９９９年１２月２１日発行）、Ｂｒａｄｌｅｙ他の米国特許第．  ６，０４８，６９５号（”Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｏ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ”）（２０００年４月１１日発行）、Ｋａｍｂ他の米国特許第６，０６０，２４０号（”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｍｏｕｎｔｓ  Ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｉｎ  Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ”）（２０００年５月９日発行）、Ｋａｔｏの米国特許第６，０９０，５５６号（  ”Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｇｅｎｅ”）（２０００年７月１８日発行）、およびＬｏｃｋｈａｒｔ他の米国特許第６，０４０，１３８号（”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂａｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ    Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ”  ）（２０００年３月２１日発行）に見いだされ、本明細書ではそれらの各々の全体を援用する。  
【０２４６】
例えば、標準的ＴＡクローニング・ベクターにある候補ヌクレオチド配列に対応するｃＤＮＡインサートを、約３０〜４０サイクルにわたってポリメラーゼ鎖反応により増幅する。増幅ＰＣＲ産物を、米国特許第５，１４３，８５４号に記載されたＶＳＬＩＰＳＴＭ技術等の種々の周知技術のいずれかによってガラス支持体上に配列する。被験者試料から単離されたＲＮＡ、またはＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、蛍光タグ等で標識し、ＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を含む溶液を、ハイブリダイゼーションにとって好適な条件下で「プローブ」チップとともにインキュベートする。インキュベーションし、かつ非特異的ハイブリダイゼーションを除去するために洗浄した後、チップに結合した標識核酸を定性的または定量的に検出し、さらに結果として生じた対応の候補ヌクレオチド配列の発現プロファイルを記録する。診断目的のために使用されるプローブが診断用ヌクレオチド配列の発見および検証の間、使用されるプローブと同一である可能性があると認められる。あるいは、プローブ配列は診断用ヌクレオチド配列の発見および検証に使用される配列とは異なる可能性がある。オーバーラップしない、または部分的にオーバーラップするヌクレオチド配列からの複数のｃＤＮＡを使用することができる。
【０２４７】
別のアプローチでは、候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分に対応するオリゴヌクレオチドを合成してアレイ上にスポットする。あるいは、オリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の方法（例えば、Ｈｕｇｈｅｓら、上掲）を用いて合成する。オリゴヌクレオチド
は、候補ヌクレオチド配列の任意の部分に対する相補性を持つように設計される。また、診断用オリゴヌクレオチド・セットの診断用途等のための発現分析の文脈のなかで、以下にさらに記載するように、オリゴヌクレオチドが特定のハイブリダイゼーション特性または特定の特性および／または感度を示すように、設計することができる。
【０２４８】
ハイブリダイゼーション・シグナルを、当該分野で公知の方法を用いて増幅することが可能であり、また本明細書に記載したように、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈキット（ガラス蛍光標識キット）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅキット（ＦａｉｒＰｌａｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）、Ｍｉｃｒｏｍａｘキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，  Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅキット（３ＤＮＡ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏ）、線形増幅（例えば米国特許第６，１３２，９９７号またはＨｕｇｈｅｓ，  ＴＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９：３４３−３４７  （２００１）  および／または  Ｗｅｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：１９９−２０４に記載）が挙げられる。
【０２４９】
あるいは、蛍光標識されたｃＤＮＡは、公知の方法を用いてマイクロアレイに直接ハイブリダイズされる。例えば、標識ｃＤＮＡの生成は、Ｃｙ−３およびＣｙ−５結合デオキシリボヌクレオチドを用いた逆転写によりおこなわれ、反応産物は、Ｃｙ−５標準の方法を使用して純化される。診断用ヌクレオチド・セットの同定に有用な発現データのシグナル増幅方法もまた、診断目的のための発現データの増幅に有用である。
【０２５０】
マイクロ・アレイ発現は、種々のレーザーまたはＣＣＤをベースとしたスキャナーによってマイク・アレイを走査し、多数のソフトウェア・パッケージ、例えばＩｍａｇｅｎｅ
（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｓｃａｎａｌｙｚｅ（（Ｅｉｓｅｎ，  Ｍ．  １９９９．ＳＣＡＮＡＬＹＺＥ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．，  Ｓｔａｎｆｏｒｄ，  ＣＡ．  Ｖｅｒ  ２．３２．）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により特徴を抽出することで検出可能である。
【０２５１】
別のアプローチでは、マイクロエレクトリック・アレイに対するハイブリダイゼーションを、例えばＵｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｊ  Ｍｏｔ  Ｄｉａｇｎ．  ３：７４−８４の記載通りに実行する。親和性プローブ（例えば、ＤＮＡ）を金属表面に付着する。各々のプローブの基礎をなしている金属面は、金属導線および電気シグナル検出システムに接続している。非標識ＲＮＡもしくはｃＤＮＡをアレイにハイブリダイズさせるか、またはＲＮＡもしくはｃＤＮＡ試料をハイブリダイゼーション前に、例えばＰＣＲ等によって増幅させる。試料ＲＮＡまたはｃＤＮＡの特異的ハイブリダイゼーションは、検出器に送られる電気シグナルの生成をもたらす。Ｗｅｓｔｉｎ  （２０００）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：１９９−２０４  （マイクロエレクトロニック・チップ・アレイのアンカー複合増幅（ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を記載）；  Ｅｄｍａｎ  （１９９７）  ＮＡＲ  ２５：４９０７−１４；  Ｖｉｇｎａｌｉ  （２０００）  Ｊ  Ｉｒｍｎｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２４３−５５を参照のこと。
【０２５２】
別のアプローチでは、微量流体チップをＲＮＡ試料調製および分析に用いる。このアプローチによって、試料調製および分析が簡素化されるため、効率が高まる。手短に言うと、微量流体法を用いることで、ＲＮＡ調製および分析の前に特異的白血球亜母集団をソートすることが可能である。例えば、微量流体チップはＲＮＡ（逆転写、ＲＴ−ＰＣＲ）を必要とするＲＮＡ調製および反応に役立つ。手短に言えば、小量の抗凝固剤添加全血を微量流体チップ、例えばＣａｌｉｐｅｒ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）またはＮａｎｏｇｅｎ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．）から入手可能なチップ上に載せる。微量
流体チップは、細胞が移動し、かつ反応が行われるチャンネルおよびリザーバーを含むものであってもよい。細胞を移動させて試薬にさらすために、機械、電気、磁気、重力、遠心、その他の力を利用する。例えば、全血の細胞を低張性塩類液を含むチャンバーに入れて、インキュベーション２０分後に赤血球の選択的溶解をおこなう。次に、残留細胞（白血球）を洗浄液チャンバーに入れ、最終的にグアニジン・イソチオシネートのような溶解緩衝液を含むことはチャンバーに持ち込まれる。白血球細胞可溶化物は、チップの中のＲＮＡ単離のために更に処理されるか、またはさらにプロセッシング（例えば標準の方法によるＲＮＡ単離）のために除去される。あるいは、微量流体法チップは、フィコールまたは他の密度試薬を含む環状のディスクである。血液試料を上記ディスクの中央に注入し、該ディスクに対して単核球の密度勾配分離に適した遠心力を生じる速度で回転され、さらなる分析または処理のために分離単核細胞を集める。
【０２５３】
上記発現評価の方法は、診断用ヌクレオチド・セットの発見の文脈のなかで議論したけれども、診断用ヌクレオチド・セットを疾患の診断等に用いることで、さらに以下に記載するように、発現評価にも適用可能であることが理解される。
【０２５４】
（発現パターンの評価）
発現パターンの評価は、質的なおよび／または量的測定尺度によっておこなうことができる。遺伝子発現（ＲＮＡまたはタンパク質産物として）を評価するための一定の上記技術が事実上、主に質的であるデータを与える。すなわち、上記方法は、発現の量的側面に関して有意情報を提供することなく異なったモードに発現を分類する発現での差異を検出する。例えば、それが候補ヌクレオチド配列の発現の有無（すなわち発現のオン／オフ・パターン）を検出する場合、技術は質的な技術と説明することができる。あるいは、遺伝子産物の異なる対立遺伝子または変異体の存在（および／または不在）を質的な技術が測定する。
【０２５５】
対照的に、いくつかの方法は、量的方法において発現を特徴づけるデータを提供する。すなわち、方法は数値尺度での発現に関係するもので、例えば数値尺度を０〜５のスケール、１〜１０のスケール、＋〜＋＋＋のスケール、グレード１からグレード５、ａ〜ｚのグレードなどとする。数値およびシンボルの例は任意のものであり、いかなる段階的なスケール（または段階的なスケールの任意な象徴的表現）を本発明の文脈において用いることで、ヌクレオチド配列発現での量的違いを説明することができる。代表的に、このような方法は、相対的な発現の増加または減少に対応する情報を得る。
【０２５６】
量的または質的発現データのいずれかを生成する方法は、被験者の白血球試料での候補ヌクレオチド配列の発現を評価するのに好適である。場合によっては、多数の方法を用いて複数の候補ヌクレオチドに対する発現パターンの決定する場合、ヌクレオチド配列の回収データ（例えば発現プロファイル）は定量的データと定性的データとの組み合わせである。
【０２５７】
いくつかの用途では、複数の候補ヌクレオチド配列の発現を順番に評価する。このことは、概して低スループットから中等度のスループットとして特徴づけることができる。それとはコントロール的に、選ばれたアッセイのスループットが増加するので、一つの白血球試料または複数の白血球試料での複数の候補ヌクレオチド配列に対する発現のアッセイが同時におこなわれる。また、上記方法（およびスループット）は一人の従事者によって主に決定されるが、一般に、迅速な、例えば時間節約および費用効果の尺度で自動化もしくは部分的自動化された調製および検出を許容する方法を用いることが好ましい。
【０２５８】
先行する考察が候補ライブラリー成分の発現評価をめざす一方で、以下にさらに説明するように、診断用ヌクレオチド・セットの成分の発現を評価することにも適用されること
が理解される。
【０２５９】
（遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
発現プロファイルおよび臨床データの相関に加えて、またはこれと結合して、発現パターンを１つ以上の遺伝子座にて被験体の遺伝子型と相関させることが、しばしば望ましい。例えば、選択された遺伝子座は、候補ライブラリーの１つ以上の成分に対応する染色体座、マーカーの遺伝子座に対する多形対立形質、または疾患（または疾患基準）に関係していると推定される代わりとなる疾患関連遺伝子座（候補ライブラリーには貢献せず）とすることができる。実際、ある遺伝子座での（多型）対立遺伝子座が疾患（または疾患に対する疾病素質）に関連している場合、対立形質の存在は、それ自身が疾患基準となる。
【０２６０】
個人の遺伝子型を評価する多くの周知方法が存在し、この方法としては、多くの他の有用な方法の中でも、サザン分析、制限フラグメント長多型（ＰＦＬＰ）分析、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、増幅長多型（ＡＦＬＰ）分析、および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析（例えば、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎまたは分子ビーコン）が挙げられる。多くのそのような方法を高スループットおよび／または自動化（もしくは半自動化）試料調製および分析方法に、適用可能である。ほとんどは、発現プロファイリング用の材料を生じたものと同様の白血球試料から単純な方法を介して回収された核酸試料上で実行することができる。典型的な技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（上掲）に記載されている。
【０２６１】
（本発明の診断用ヌクレオチドセットの同定）
診断用ヌクレオチド・セットおよび疾患特異的標的ヌクレオチド配列の同定は、白血球発現プロファイルと患者の健康状態に関するデータとの相関によって進行し、「分子署名」と称されるデータ・セットを生成する。患者の健康状態（「疾患基準」ともいう）に関するデータの例を、後述の「選択された疾患」と題したセクションで説明する。相関分析に有用な方法を本明細書の別の場所にさらに記載する。
【０２６２】
通常、被験体の健康状態に関する関連データとしては、例えば被験体の病歴というかたちで被験体、内科医、または第三者によって提供される遡及的または潜在的な健康データ（例えば、さらに以下に記載される医学的診断、臨床検査結果、診断検査結果、臨床イベントまたは投薬リスト）が挙げられる。そのようなデータは、処置および／または特定の投薬に対する患者の反応に関する情報と既に特徴づけられた「危険因子（ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ）」の存在に関するデータとを含むものであってもよい。例えば、タバコ喫煙および肥満が心臓疾患に関して事前に同定された危険因子である。疾患および疾患基準を含む健康状態の情報のさらなる例が、以下の選択された疾患と題したセクションに記載されている。
【０２６３】
代表的に、データは先のイベントと評価（すなわち遡及的なデータ）を記述する。しかし、サンプリングに続いて収集されたデータ（すなわち、予測データ）もまた発現プロファイルに相関すると思われる。サンプリングした組織、例えば末梢血、気管支洗浄（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｌａｖａｇｅ）等を１つ以上の複数の時点で得ることができ、被験体データが試料獲得の時間に関して遡及的または潜在的であると考えられる。
【０２６４】
複数時点で収集したデータ（「時系列データ（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｄａｔａ）」と呼ぶ）は、しばしば有用であることから、本発明は異なる時点で同一患者から収集した患者データの分析を包含する。対試料（一人の患者から異なる時点で採取した試料等）の分析は、患者に対して特異的な遺伝的変異性が比較によって制御されることから、疾患状態に対して特異的に関連する差異の同定を可能とする。また、患者間に存在する他の変数（例えば炎症疾患（例えば、慢性間接リウマチ）の有無、白血球遺伝子発現に影響する
と考えられる薬物療法の使用、および共病的状態（ｃｏ−ｍｏｒｂｉｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の有無など）をこのように制御することができる。対試料の分析方法を、以下にさらに詳細に示す。さらに、複数の発現プロファイルを収集することによって生成した発現プロファイルのパターンを分析することで、時間とともに変化する発現レベルの変化に関連した情報が得られる。それによって、変化率、軌跡、または発現曲線の決定を可能とし得る。２つの時系列（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）試料は、時間とともに変化する遺伝子発現に関する情報を提供する一方で、３つの時系列試料が遺伝子発現の「軌跡（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）」を決定するのに必要であり得る。そのような情報は、疾患の診断に関連するものであってもよい。例えば、遺伝子の発現は個体間で変動しうるものであるが、臨床イベント（例えば心臓発作）は、発現のレベルを各々の患者において２倍にする可能性がある。この例では、各個体での発現の絶対レベルに対して、臨床的に関心のある情報は、発現レベルの変化から収集される。
【０２６５】
単一の患者試料を得る場合、その試料の発現プロファイルをいくつかの参照発現プロファイルと比較することが望ましいと思われる。この場合、患者試料と、その患者および問題となっている医学的状態にとって適切な参照発現プロファイルとの間での発現の変化を決定することができる。例えば、参照発現プロファイルを、問題となっている疾患基準なしに、類似の特性（年齢、性別、人種、診断等）を持つすべての患者について決定することができる。
【０２６６】
通常、２０〜１００の小サイズのサンプルを使用して、診断用ヌクレオチドセットの同定をおこなう。以下にさらに記載するように、多種多様な大規模の患者母集団で使用する診断用ヌクレオチドセットの検証では、より大きな試料サイズが一般に求められる。例えば、様々な人種集団、人口統計学的群、国、民族または人種に対する遺伝子発現相関の拡大は、目的とする人口の発現相関実験を必要とするかもしれない。
【０２６７】
（発現参照標準）
患者（すなわち、疾患と診断された被験体、該疾患の症状を呈する被験体、疾患基準を示す被験体、または疾患に対して医師によるケアを受けている被験体サンプル）由来の発現プロファイルを、コントロールまたは標準発現ＲＮＡと比較して、互いに関連した一群の患者から得た発現プロファイル（例えば、候補ヌクレオチドセットのもの）との比較（すなわち、この群の患者とこの群の他の患者または別の群の患者との比較）を促す。
【０２６８】
使用する参照ＲＮＡは、低コストかつ大規模生産が簡単であるという所望の特徴を持たなければならない。また、参照ＲＮＡは、可能な限り候補ライブラリーの遺伝子と同じほどの測定可能な量を含まなければならない。
【０２６９】
例えば、診断用ヌクレオチドセットを同定する一つのアプローチでは、患者試料由来の発現プロファイルを発現参照「標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）」と比較する。発現参照標準を、例えば、休止培養白血球由来のＲＮＡまたは市販の参照ＲＮＡ（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）とすることができる。Ｎａｔｕｒｅ，Ｖ４０６，８−１７−００，ｐ．７４７−７５２を参照のこと。例えば、アレイ、およびある種の他の用途（例えば、定性ＰＣＲ、ＰＴ−ＰＣＲ等）で大量のヌクレオチド配列の発現をアッセイする場合、さらに／あるいは、大量の発現プロファイル（例えば、患者母集団）を比較しようとする場合、発現参照標準の使用が特に有用であり、試料プロファイルと標準プロファイルとを比較することが求められている。概して、発現参照標準は大量に利用可能でなければならず、増幅および標識反応にとって良好な基質でなければならず、さらに適当な発現プロファイリング技術を用いて候補核酸のかなりの割合を検出する能力を持たなければならない。
【０２７０】
代わりに、または加えて、患者試料に由来する発現プロファイルを、内部参照コントロール遺伝子（例えばβアクチンまたはＣＤ４）の発現と比較する。プロファイリングされた遺伝子と内部参照コントロール遺伝子との相対的発現（同一個体間）が得られる。内部参照コントロールは、参照ＲＮＡとともに使用する場合もある。例えば、「遺伝子１」の発現プロファイルおよびＣＤ４をコードする遺伝子とを患者試料中および参照ＲＮＡ中で決定することができる。各遺伝子の発現は、参照ＲＮＡにおける遺伝子の発現と比較した、患者サンプルの遺伝子の発現の「相対的」比として表現され得る。遺伝子１の発現比率（試料／参照）をＣＤ４の発現比率（試料／参照）で割ってもよく、それによってＣＤ４に対する遺伝子１の相対的発現が得られる。
【０２７１】
本発明はまた、発現プロファイリングで有用なバッフィーコートコントロールＲＮＡおよびバッフィーコート細胞の集団（全血を遠心することで得られた白血球細胞層）から産生されたコントロールＲＮＡを用いる方法とを提供する。バッフィーコートは、顆粒球、単核球、および血小板を含むすべての白血球細胞を含有する。本発明は、白血球の発現プロファイル分析に使用するために、バッフィーコート細胞からコントロールＲＮＡを調製する方法も提供する。バッフィーコート分画は、例えば、血液バンクから、または直接個体から得られ、好ましくは多くの個体から得ることで、個体試料からの偏りを避けてＲＮＡ試料が健康的な集団の平均的な発現を示すようにする。約５０もしくは約１００、あるいはそれ以上の個体から得たバッフィーコート分画が好ましい。各々の個体から得たバッフィーコート１０ｍｌを使用する。バッフィーコート試料を赤血球溶解緩衝液で処理し、赤血球を選択的に取り除く。バッフィーコート層の白血球を遠心によって回収する。あるいは、特定の白血球亜母集団、例えば単核球またはＴリンパ球などを得るために、バッフィー細胞試料をさらにエンリッチすることができる。単核球についてエンリッチするために、上記バッフィー細胞ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、密度を１．０７７＋／−０．００１ｇ／ｍｌに合わせたポリスクロースおよびジアトリゾア酸ナトリウム溶液を含む非ポリスチレンチューブに充填する。Ｔリンパ球についてエンリッチするために、全血４５ｍｌをＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、室温で２０分間インキュベートする。混合物を、等量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳで希釈して転倒混合する。希釈混合物３０ｍｌをＤＭＬ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１５ｍｌの最上部に積層する。チューブを１，２００×ｇで遠心し、血漿：培地境界面にあるエンリッチされた細胞層を除去し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗い、さらに細胞を１，２００×ｇで遠心して回収する。氷上で、細胞ペレットを５ｍｌの赤血球溶解緩衝液（ＥＬ緩衝液、Ｑｉａｇｅｎ）によって１０分間処理し、エンリッチされたＴリンパ球を遠心により回収する。
【０２７２】
加えて、または代わりに、バッフィー細胞（バッフィーコートまたは亜母集団全体、例えば単核分画）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、サイトカインまたは活性化試薬（例えば、ホルボールエステルまたはイオノマイシン）によって刺激することができる。そのような刺激によって、活性化免疫細胞で発現するヌクレオチド配列の発現を増加させることが可能であり、白血球発現プロファイリング実験にとって目的のものであり得る。
【０２７３】
先に述べたように亜母集団選択および／またはさらなる処理（例えば上記したような刺激）を施した後で、ＲＮＡの調製を標準的方法を用いておこなう。例えば、細胞をペレット状にし、フェノール／グアニジンチオシアネートで溶解することで、ＲＮＡを調製する。ＲＮＡはまた、シリカゲル系精製カラムを用いて単離することもでき、また該カラム法をフェノール／グアニジンチオシアネート法によって単離したＲＮＡに使用することができる。個体バッフィーコート試料由来のＲＮＡをこのプロセスの過程でプールすることができ、結果として生じる参照ＲＮＡが多くの個体のＲＮＡを表し、また個体の偏りが最小化または取り除かれる。また、前述または後述の発現プロフィールを回収し、比較する方法を使用して、バッフィーコート参照ＲＮＡの新たなバッチを最後のバッチと直接比較す
ることで、１つのバッチからもう一方のバッチで発現パターンの類似性が確実となる。１つ以上の発現参照コントロールを実験で用いる。例えば、以下の供給元の１つ以上に由来するＲＮＡは実験のコントロールとして使用することができる。すなわち、刺激されたか刺激されていない全バフィーコート、刺激されたか刺激されていない末梢単核球、もしくは刺激されたか刺激されていないＴリンパ球である。
【０２７４】
あるいは、発現参照標準を任意の被験体由来とすることができ、または被験体のクラスとして、健康な被験体または同一もしくは異なる疾患または疾患基準で診断された被験体が含まれる。２つ以上の異なるクラスの被験体から得た発現プロファイルを比較して、さらに後述するように、候補ライブラリーのヌクレオチド配列のどのサブセットが２つの被験体クラス間を最も区別することができるかについて決定する。本文脈では「異なるクラス（ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌａｓｓｅｓ）」という用語は、目的とする疾患に関連した少なくとも１つの識別可能な基準（「疾患基準」）に関連することがわかる。上記クラスは、もちろん、他の疾患基準に関して、または疾患診断、予後、またはその他に関して有意な重複（または同一性）を示すことができる。発見のモードは、例えば、異なる被験体クラスの分子的特徴を互いに比較するか（例えば、管理すべき患者、第２の疾患を有する患者に対する第１の診断を有する患者）、または異なる時間点を取った単一個体の分子的特徴を比較することが含まれる。本発明は、これまでまたは以下にさらに説明するように、幅広い範囲の疾患、疾患基準、状態、ならびに他の臨床および／または疫学的問題に適用することができる。
【０２７５】
本議論が発現参照コントロールの使用に関係する間、診断用ヌクレオチドセットを同定する間、発現参照コントロールもまた、さらに後述するように、診断用ヌクレオチドセット（例えば疾患診断のために診断用ヌクレオチドセットの使用）の使用の際に役立つと認められる。
【０２７６】
（発現プロファイルの分析）
容易なアクセスを促すために、例えば、比較、再検討、回収、および／または修飾のため、分子的特徴／発現プロファイルが代表的にデータベースに記録される。最も代表的に、データベースはコンピュータ装置でアクセス可能なリレーショナルデータベースではあるが、他のフォーマット、例えば写真、アナログもしくはデジタル画像処理読み出し、スプレッドシート、その他として発現プロファイルのインデックスファイルに手動でアクセス可能なフォーマットも使用することができる。好ましい実施形態に関するさらなる詳細を以下に示す。初めに記録される発現パターンが事実上、アナログであるかもしくはデジタルであるかにかかわらず、さらに／またはそれらが発現での質的もしくは量的な違いを表すかどうかにかかわらず、発現パターン、発現プロファイル（集合的発現パターン）および分子的特徴（相関発現パターン）がデジタル的に保存され、かつデータベースを介してアクセスされる。代表的に、データベースは、局所的および／または遠隔的に利用可能であるアクセスにより、中央の施設で編集され、かつ維持される。
【０２７７】
追加試料を得て、それらの発現プロファイルを決定して関連被験体データと相関させることで、確定的な分子的特徴が同様にしてデータベースに記録される。しかし、本質的に受動的なやり方で追加される各々の次の追加よりもむしろ、一つの試料からのデータは第２（先行または後に続く）試料に由来するデータにほとんど関係なく、アルゴリズムは任意かつさらに、既存のデータベースに対して追加試料を照会し、分子的特徴と疾患基準とのあいだの関連をさらに改善する。さらに、１つ（または複数）の分子的特徴を含むデータセットは、追加または他の疾患基準の拡張セットに対して、任意に照会される。統合システムおよびウェブ（Ｗｅｂ）実施形態におけるデータベースの使用をさらに後述する。
【０２７８】
（アレイ由来の発現プロファイルデータの分析）
発現データは、当該分野で周知の方法（Ｉｍａｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍａｒｉｎａ  ｄｅｌ  Ｒｅｙ，ＣＡ）、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、およびＳｃａｎａｌｙｚｅ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が挙げられる）を用いて分析される。以下の議論において、「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」はアレイ上でＤＮＡの独立したスポットをいう。各遺伝子は、１つ以上の特徴によって表され得る。例えば、ハイブリダイズしたマイクロアレイを、ＧｅｎｅＰｉｘ３．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのスキャナーで走査および分析する。ＧｅｎｅＰｉｘによって抽出されたデータを、全ての下流品質管理（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）および発現評価のために用いる。このデータは、以下のようにして得る。ソフトウェアによって「未検出（ｎｏｔ  ｆｏｕｎｄ）」というフラッグがたてられたすべての特徴についてのデータを個々のハイブリダイゼーションについてのデータセットから除去する。ＧｅｎｅＰｉｘによる「未検出」フラッグは、ソフトウェアが上記特徴をバックグラウンドと区別することができなかったことを示す。各特徴を調べ、そのシグナルの値を決定する。特徴の中央値ピクセル強度（Ｆｎ）からバックグラウンドの中央値ピクセル強度（Ｂｎ）を引いて、バックグラウンド減数シグナル（以下、「ＢＧＳＳ」とする）を生成する。バックグランドピクセルの標準偏差によってＢＧＳＳを割ることで、シグナル対ノイズ比（以下、「Ｓ／Ｎ」とする）を得る。Ｃｙ３チャンネル（試料ＲＮＡに対応）およびＣｙ５チャンネル（参照ＲＮＡに対応）の両方で３以上のＳ／Ｎ値を持つ特徴を用い、さらなる分析をおこなう（以下、「利用可能な特徴（ｕｓｅａｂｌｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）」という）。あるいは、異なるＳ／Ｎ値を、分析のための発現データ選択に用いる。例えば、３より大きいシグナル対ノイズ比（＞３）を有する発現データのみを分析に用い得る。あるいは、３未満のＳ／Ｎ値（＜３）を有する特徴がそのようにフラッグが立てられ、分析に含まれ得る。そのようなフラッグが立てられたデータセットは、より多くの値を含み、さもなければ見落としてしまうかもしれない発現マーカーの発見を可能にし得る。しかし、そのようなデータセットは、フィルタにかけたデータよりも高い可変性を有し得、所見（ｆｉｎｄｉｎｇｓ）の有意性または相関統計のパフォーマンスを減少させ得る。
【０２７９】
各々の使用可能な特徴（ｉ）について、発現レベル（ｅ）は、Ｃｙ５チャンネル（参照ＲＮＡ）に対するＢＧＳＳによって割られたＣｙ３（試料ＲＮＡ）チャンネルに対するバックグランド減数シグナル（以下、ＢＧＳＳという）の対数比（Ｒ）として、表わされる。この「対数比」の値は、他の実験との比較のために使用される。
【０２８０】
【化１３４】
2010022375.tif 000136
【０２８１】
ハイブリダイゼーション中のシグナルの変動は、ハイブリダイゼーション、ＤＮＡスポッティング、洗浄条件、および標識効率に影響を及ぼす多くの因子によって生じ得る。
【０２８２】
単一の参照ＲＮＡを実験的なＲＮＡ全てに使用し得、独立した比較に加えて多重比較を可能にする。試料ＲＮＡを同じ参照と比較することによって、各試料からの遺伝子発現レベルがアレイ全体で比較され、それによって本発明者らの実験的な比率に対して、一貫した分母の使用を可能にする。
【０２８３】
データを分析する代替法は、（１）参照チャンネルによる基準化なしに試料チャンネルを用いること、（２）参照チャンネルにおけるシグナルが大きい場合に、より大きな相関を与える参照に基づいた強度依存基準化（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いること、（３）バックグラウンド減算なしのデータを用いるか、もしくはバックグラウンド自体よりもむしろバックグラウンド強度の実験的派生関数を減じることを、含む。
【０２８４】
（スケーリング）
実験の範囲内で標識およびハイブリダイゼーションの可変性について、データのスケーリング（基準化）を公知の方法を用いて行って、制御し得る。スケーリングは、異なる実験、患者等などの間でデータの比較を促すので、好ましい。一般に、ＢＧＳＳを、因数（例えば中央値（ｍｅｄｉａｎ）、平均、標本削除平均、および百分位数）にスケーリングする。追加のスケーリング方法として、０と１との間でスケーリングすること、平均値を引くこと、または中央値を引くことが挙げられる。
【０２８５】
スケーリングは、より詳細に上で記載したように、共通の参照ＲＮＡを用いて得た発現パターンとの比較によってもおこなわれる。他のスケーリング方法を用い、参照ＲＮＡは、発現データの多重比較（例えば、患者間、試料間など）を容易にする。参照ＲＮＡの使用は、実験的な比率に対して一貫した分母を与える。
【０２８６】
参照ＲＮＡの使用に加えて、独立した発現レベルを調節して、異なるハイブリダイゼーション実験間での標識効率の違いを正し、例えば、異なる全体的なシグナル強度を有する実験間での直接的な比較を可能にし得る。スケーリング因子（ａ）を、個々の発現レベルを以下のように調節するために用い得る。スケーリング因子（ａ）の中央値（例えばＢＧＳＳ）は、３を上回るＳ／Ｎ値を有する全ての特徴のセットに対して、決定される。次に、ＢＧＳＳｉ（各特徴「ｉ」についてのＢＧＳＳ）を全ての特徴（ａ）に対する中央値によって割ることで、スケール比率が生ずる。スケール比率は、特徴（ｅｉ）に対する発現値または対数比を決定するために用いられる。
【０２８７】
【化１３５】
2010022375.tif 000137
【０２８８】
さらに、またはあるいは、コントロールの特徴は、実験の範囲内で標識およびハイブリダイゼーションの可変性のためにデータを基準化するために用いられる。コントロールの特徴は、植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の遺伝子に対するｃＤＮＡであり得、ミニアレイをスポッティングする際に含まれる。コントロールｃＤＮＡに対して相補的である等量のＲＮＡを、それらが標識される前に試料の各々に添加する。これらコントロール遺伝子由来のシグナルを用いて、基準化定数（Ｌ）が以下の式に従って決定される：
【０２８９】
【化１３６】
2010022375.tif 000138
【０２９０】
ここで、ＢＧＳＳｉは、特定の特徴に対するシグナルであり、ＮはＡ．ｔｈａｌｉａｎａコントロール特徴の数、Ｋはハイブリダイゼーションの数、およびＬｊは各々の独立したハイブリダイゼーションに対する基準化定数である。
【０２９１】
上記式を用いて、特定のハイブリダイゼーションおよび色素（例えば、Ｃｙ３）についての全てのコントロール特徴に対する平均値を計算する。全てのＣｙ３ハイブリダイゼーションについてのコントロール特徴平均値が平均され、ハイブリダイゼーションにおけるコントロール特徴平均を全てのハイブリダイゼーションの平均で割って、等式（０．３）においてａとして用いられる特定のＣｙ３ハイブリダイゼーション（Ｌｊ）に対する基準化定数を生じる。同一の基準化ステップは、Ｃｙ３値およびＣｙ５値について実行され得る。
【０２９２】
代替スケーリング方法もまた、用いられ得る。緑／赤比の対数（ｌｏｇ）を、全ての特徴について決定する。全ての特徴に対する中央値ｌｏｇ比の値を決定する。次に、以下の式を用いて特徴値のスケーリングを行う：Ｌｏｇスケーリングした特徴比＝Ｌｏｇ特徴比−中央値Ｌｏｇ比
基準化のための多くのさらなる方法が存在し、データに適用され得る。一つの方法において、Ｃｙ３ＢＧＳＳ／Ｃｙ５ＢＧＳＳの平均比が、一つのアレイ上の全ての特徴に対して決定される。この比は、次に何らかの任意の数（例えば１、または何らかの別の数）にスケーリングされる。つぎに、平均比を選択されたレベルに持っていくために必要とされるスケーリング因子によって、各プローブに対する比が乗じられる。これは、分析において、各アレイについて、実行される。あるいは、上記比率を、分析における全てのアレイにまたがる平均比に基準化させる。基準化の他の方法は、標準分布で、または最も極端な場合、アレイ上の他のオリゴヌクレオチドに関連する各オリゴヌクレオチドのシグナルのランクを用いて、それらを数多くの一定のポイント（四分位数または十分位数等）に移すことで、種々のアレイのシグナル強度の分布をよりいっそう一致させることを含む。
【０２９３】
遺伝子配列またはオリゴヌクレオチドごとに複数の特徴を用いる場合、それらの繰り返しを各遺伝子に対する平均的発現値を誘導するために使用し得る。複製特徴のいくつかが質に劣り、分析の必要条件に合致しない場合、残りの特徴を遺伝子または遺伝子配列を表すために使用し得る。
【０２９４】
（相関分析）
相関分析は、どのアレイプローブが、特定の臨床状態を表す試料群に近いマーカーを最もよく識別する発現挙動であるか、またはマーカーとして最もよく寄与する発現挙動を有するかを決定するために実行される。相関分析、すなわち異なる疾患基準（例えば、臨床状態）を表す複数の試料の間での比較は、標準統計学的方法を用いて実行される。多数のアルゴリズムは、発現データの相関分析に有用であり、アルゴリズムの選択は、実行されるべきデータ分析に部分的に依存している。例えば、アルゴリズムは、試料を確実に分類
する発現挙動を備えた最も有益な１つの遺伝子を同定するか、あるいは試料を分類するのに有益な遺伝子全てを同定するのに使用され得る。あるいは、アルゴリズムは、２つまたはそれ以上の遺伝子のどのセットが試料を正確に分類する集団的発現挙動を有するかの決定を適用し得る。診断用の複数の発現マーカーの使用は、個体間の遺伝子の発現における可変性を克服し得るか、あるいはアッセイ固有の可変性を克服し得る。複数の発現マーカーは、２つまたはそれ以上の遺伝子あるいはプローブが診断に関する同一の情報を提供し得る点で、重複しているマーカー（代理物）を含み得る。これは、例えば２つまたはそれ以上の遺伝子あるいは遺伝子プローブが強調的に発現される場合に生じ得る。診断用途のために、アッセイにおいて、遺伝子および１つまたはそれ以上のその代理物を利用することが適切であり得る。この重複性は、試料を識別する１つのマーカーの不具合（技術的あるいは生物学的）を克服し得る。あるいは、１つまたはそれ以上の代理物は、発現レベルのより高いベースライン、より良い細胞特異性、ＰＣＲプライマーあるいは相補的プローブの設計についての試料群またはより特異的な配列間のより高い倍変化のような、アッセイ開発にとって一層相応しい特性を有し得る。上記議論は、ＲＮＡ発現プロファイルの分析に関するものであるが、その議論は、ＲＮＡ発現プロフィールの分析にふさわしいか、その議論は等しくタンパク質あるいは他の分子マーカーのプロファイルの分析に同様に適用可能であることが、理解され得る。
【０２９５】
分析前に、発現プロファイルデータは、当該分野において公知の方法を用いて、分析のために初期化あるいは作製され得る。例えば、アレイプローブごとに対数比で目盛られた発現データは、しばしば以下の式を用いて算出される：
ｌｏｇ（Ｃｙ３  ＢＧＳＳ／Ｃｙ５  ＧＳＳ）ここで、Ｃｙ３シグナルは、臨床試料における遺伝子の発現に対応し、Ｃｙ５シグナルは、参照ＲＮＡにおける遺伝子の発現に対応する。
【０２９６】
データは、以下に述べられるように処理されるべき特異的分析に依存して、さらにフィルタに通され得る。例えば、フィルタリングは、ある一定レベル以上の発現を備えた試料のみ、あるいは試料セット間のある一定レベル以上の可変性を有するプローブを選択することを意図され得る。
【０２９７】
次の非限定的な議論は、当該分野において公知の数種の統計学的方法を考慮する。簡単に言うと、ｔ−検定およびＡＮＯＶＡは、それぞれ集団間あるいは集団内の発現差で１つの遺伝子を同定するために使用される。多変量解析方法は、いかなる１つの遺伝子の発現よりも特異的な２つの疾患状態の間を識別する発現について、２つまたはそれ以上の遺伝子のセットを同定するために使用される。
【０２９８】
（ｔ−検定）
２つの群の間の差の最も簡単な測定法はスチューデントのｔ−検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）である。例えば、Ｗｅｌｓｈら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１７６−８１（卵巣癌試料とコントロール組織試料における差次的遺伝子発現の発見のための不対のスチューデントのｔ−検定の使用を示す）を参照のこと。このｔ−検定は、等しい偏差および正規分布データを仮定する。この検定は、２つの試料群間で１つの遺伝子の発現に差がある確率を同定する。統計学的有意性を達成するために必要な各群内の試料数は、各群内の試料間のばらつきに依存する。ｔ−検定の標準式は；
【０２９９】
【化１３７】
2010022375.tif 000139
【０３００】
であり、ここで、
【０３０１】
【化１３８】
2010022375.tif 000140
【０３０２】
は、ｃ群とｔ群との間の遺伝子ｉの平均発現レベルの差であり、ｓｉ，ｃは、ｃ群の遺伝子ｘの偏差であり、ｓｉ，はｔ群の遺伝子ｘの偏差であり、ｎｃおよびｎｔはｃ群およびｔ群における試料数である。
【０３０３】
ｔ統計値と自由度［ｍｉｎ（ｎｔ，ｎｃ）−１］との組み合わせは、意味のない仮説を排除する確率であるｐ値を与える。平均発現レベルが２つの群間の差である確率９９％であること（平均発現レベルが実際のところ差ではなく、統計学的確率によって生じたと観察される差であるような１％の確率）を示す０．０１以下のｐ値は、しばしば許容し得ると考えられる。
【０３０４】
大きなスケールで、例えば約８０００個の遺伝子の大きなデータセット上で検定を実行する場合、実行されている個々の検定の数を調節するための補正因子が含まれなければならない。最も一般的で簡単な補正は、検定実施数でｐ値を割る複数検定用のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正である。８０００個のデータセット上でこの検定を使用することは、２つの検定条件間の正確な差となるらしい遺伝子を同定するために０．０００００１２５以下のｐ値が必要とされることを示す。
【０３０５】
（マイクロアレイに関する有意性分析（ＳＡＭ））
マイクロアレイに関する有意性分析（ＳＡＭ）（Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１）は、発現値と応答ベクターとの間の補正を備えた遺伝子が統計学的に発見されかつ統計学的有意性を割り当てられた方法である。有意な遺伝子に対する誤った有意性の割合は、疑似発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）である。これは、閾値ごとに、有意であると呼ばれる遺伝子のセットが存在し、ＦＤＲがこの要求に対する信頼レベルを与えることを意味する。仮にある遺伝子が５％のＦＤＲで、ＳＡＭにより２つのクラス間で差次的に発現されるといわれる場合、上記遺伝子が上記クラス間で実際に差次的に発現される確率が９５％存在する。ＳＡＭは、マイクロアレイの可変性および多数の変数を考慮に入れる。ＳＡＭは、上記クラス間で最も包括的に差次的に発現される遺伝子を同定する。したがって、異常値の試料または患者を同定し、かつ分類するための重要な遺伝子は、ＳＡＭにより同定され得ない。
【０３０６】
（非パラメータ検定）
Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き検定法は、非パラメータ検定の一例であり、一対比較検定に利用されている。例えば、ＳｏｋａｌおよびＲｏｈｌｆ（１９８７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  第２版，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋを参照のこと。この統計を適用するには少なくとも６対が必要である。この検定は対の発現データ（例えば、２つの場合における心臓移植生検を有し、そして１つの場
合においてグレード０を別の場合においてグレード３Ａを有する患者のセット）の分析に有用である。閾値を有するＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定は、使用され得る他の非パラメータ検定である。
【０３０７】
（ＡＮＯＶＡ）
多数の関連した群にわたる遺伝子発現の差は、当該分野において周知の方法である、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）（ＭｉｃｈｅｌｓｏｎおよびＳｃｈｏｆｉｅｌｄ，１９９６）を用いて評価され得る。
【０３０８】
（多変量解析）
多変量解析に適した多くのアルゴリズムは当該分野で公知である。一般に、発現がいかなる１つの遺伝子の発現よりも特異的な２つの疾患状態間を識別する２つまたはそれ以上の遺伝子セットは、識別基準（例えば、遺伝子Ｘの発現は通常から３００％増加すべきであるが、一方、遺伝子ＹおよびＺの発現は通常から７５％減少するべきである）を用いて遺伝子の可能性のある組み合わせを検索することによって同定される。通常、検索は１つの遺伝子で開始し、その後に、検索ステップごとに次の最も適した遺伝子を加える。あるいは、検索は遺伝子全てで開始し、識別を支援しない遺伝子が段階的に排除される。
【０３０９】
（対の試料）
対の試料、すなわち同一の患者から異なる時点で採取された試料は、上述したように、しばしば有用である。例えば、対の試料の使用は、個体間の遺伝的ばらつきに起因するばらつきの低減を可能にする。さらに、対の試料の使用は、対の試料由来のデータが減少したばらつきを認識する異なった様式で算出され得る点で、統計学的な有意性を有する。例えば、対の試料に関するｔ−検定のための式は、
【０３１０】
【化１３９】
2010022375.tif 000141
【０３１１】
であり、ここで、Ｄは対の各試料セット間の差であり、ｂは試料対の数である。
【０３１２】
【化１４０】
2010022375.tif 000142
【０３１３】
は上記対のメンバー間の差の平均である。この検定では、対の試料間の差のみが検討され、その後に、一緒にまとめられている（通常のｔ−検定の場合、群間の可能な全ての差を取得するのに対して）。対のデータを有する有用なさらなる統計学的検定、例えばＡＮＯＶＡおよびＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付き検定は上記で議論されている。
【０３１４】
（診断分類）
一旦遺伝子の識別用セットが同定されたら、診断用分類子（発現データに基づく診断分類に試料を割り当てる数学的関数）を未知の試料発現レベルに適用する。
【０３１５】
この分析に用いられ得る方法としては、以下の非制限的なリストが挙げられる：
ＣＬＥＡＶＥＲは、有用な発現プロファイルデータの分類のために用いられるアルゴリズムである。Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１８９−１９３を参照のこと。ＣＬＥＡＶＥＲは、正の訓練試料（例えば特定の患者または試料診断分類、疾患、あるいは疾患基準に由来することが既知の試料からの発現プロフィール）、負の訓練試料（例えば特定の患者または試料診断分類、疾患、あるいは疾患基準に由来しないことが既知の試料からの発現プロフィール）、および検査試料（例えば患者から得た発現プロフィール）を使用して、検査試料が特定の疾患または疾患基準に相関するかあるいは特定の疾患または疾患基準に相関しないかを決定する。ＣＬＥＡＶＥＲはまた、分類のための２０の大部分の予測遺伝子のリストも生成する。
【０３１６】
人工ニューラルネットワーク（以下、「ＡＮＮ」）を用いて、複合データセットにおけるパターンを認識し得、かつＡＮＮは、試料を２より多い群に分類する発現基準を発見し得る。オリゴヌクレオチド発現マイクロアレイによって生成される発現データを用いて癌に対する遺伝子発現診断を発見するための人工神経ネットワークの使用は、Ｋｈａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：６７３−９によって実証される。Ｋｈａｎは、９６の遺伝子が腫瘍分類での０％誤り率を提供することを見出した。その後、各遺伝子の発現における変化への分類の感度を測定することによって、分類用のこれらの遺伝子の最も重要なものを決定した。９６の遺伝子を用いた階層的クラスタリングによって、癌の診断分類への正しいグループ化をもたらす。
【０３１７】
Ｇｏｌｕｂは、ｃＤＮＡマイクロアレイおよび識別算出を用いて、骨髄性白血病およびリンパ性白血病を区別する発現挙動を有する遺伝子を同定する。Ｇｏｌｕｂら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−７を参照のこと。新規クラス発見のために、自己組織マップを用いた。「１つ除外（ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｏｕｔ）」分析を用いて、交差検定（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行った。５０の遺伝子を有用なマーカーとして同定した。これは、等価診断正確度でわずか１０の遺伝子まで減少した。
【０３１８】
臨床試料のサブセット（例えば、移植拒絶グレードを有する臨床試験のサブセット）に相関する遺伝子群を同定するために、階層的クラスタリング方法および非階層的クラスタリング方法もまた、有用である。Ａｌｉｚａｄｅｈは、遺伝子発現プロファイルデータに基づき、異なる種類のびまん性Ｂ細胞リンパ腫を識別する主要ツールとして階層的クラスタリングを使用した。Ａｌｉｚａｄｅｈら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１を参照のこと。Ａｌｉｚａｄｅｈは、遺伝子発現プロファイルデータに基づいて異なる種類のびまん性Ｂ細胞リンパ腫を識別する主要ツールとして階層的クラスタリングを使用した。１７８５６のプローブを保持するｃＤＮＡアレイをこれらの実験のために用いて、９６の試料を１２８のアレイ上で評価して、３８０の遺伝子のセットを試料分類に有用であるとして同定した。
【０３１９】
Ｐｅｒｏｕは、発現プロファイルデータに基づいた乳癌試料の分子分類に対する階層的クラスタリングの使用を実証する。Ｐｅｒｏｕら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７４７−５２を参照のこと。この研究において、８１０２の遺伝子プローブを保持するｃＤＮＡアレイを用いた。これらの遺伝子の１７５３が乳癌間で高い可変性を有することが見出され、分析用に用いられた。
【０３２０】
Ｈａｓｔｉｅは、発現マーカーの発見に対する遺伝子主成分分析（ｇｅｎｅ  ｓｈａｖｉｎｇ）の使用について記載する。Ｈａｓｔｉｅら，（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１（２）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ０００３．１−０００３．２１。遺伝子主成分分析アルゴリズムは、類似または整合している発現パターンを有するが、条件（ＲＮＡ試料、試料クラス、患者クラス）にわたってより大きな可変性を有する遺伝子のセットを同定する。この手法において、移植拒絶グレード内で密接な発現パターンを有するが、また、拒絶
グレードにわたって高い可変性を有する遺伝子も、一緒にグループ化する。アルゴリズムは、１つのグループ化ステップで両方の特性の利点を利用する。例えば、遺伝子主成分分析（ｇｅｎｅ  ｓｈａｖｉｎｇ）は、共調節発現を有する有用なマーカー遺伝子を同定し得る。有用なマーカー遺伝子のセットを、分類におけるいくらかの非重複値を提供する各遺伝子を用いて、より少ないセットに減少させ得る。Ａｌｉｚａｄｅｈら（上掲）が記載するデータセット上で、このアルゴリズムを用いて、３８０の有益な遺伝子マーカーのセットを、２３４まで減少させた。
【０３２１】
発現木の管理回収（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ）（Ｈａｓｔｉｅ  ２００１）は、データセット上の他のもの全てから１つのクラスを最もよく区別する遺伝子またはクラスターを同定する。該方法を用いて、互いから、２つ以上のクラスまたは全てのクラスを含むデータセットに対して１つのクラス対他の全てを、最もよく分離し得る遺伝子／クラスターを同定する。診断用遺伝子セットの発見または検査のために、このアルゴリズムを用い得る。
【０３２２】
ＣＡＲＴは、決定木分類アルゴリズム（Ｂｒｅｉｍａｎ  １９８４）である。遺伝子発現および／または他のデータから、ＣＡＲＴは、試料分類に対する決定木を開発し得る。決定木上の各ノードは、１つ以上の遺伝子の発現レベルまたは変数についての検索要求を含む。閾値より上にある試料は、決定木の１つの枝を下回り、そうでない試料は、他の枝を下回る。分類分析におけるその使用の更なる記載および診断用遺伝子セットを発見および実行する上でのその有用性の例については、実施例４を参照のこと。ＣＡＲＴは、各スプリッターに対する代理物（分類で有用な遺伝子に対する次に良い代替である遺伝子）を同定する。
【０３２３】
群を識別するために決定木を構築する分類アルゴリズムであるという点で、多重相加的回帰木（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ＪＨ  １９９９，ＭＡＲＴ）はＣＡＲＴと類似している。ＭＡＲＴは、任意の分類問題について多数の木を構築して、得られたモデルは多数の木の組み合わせを含む。ＭＡＲＴは、モデルを構築するため、８０００の遺伝子マイクロアレイに由来するような、大量のデータセットに用いられ得るので、変数を選択し得る。ＭＡＲＴが多くの木の組み合わせを用いて、任意の１本の木からはあまり多くの情報をとらないので、訓練に耐える。ＭＡＲＴは、分類子として使うための遺伝子のセットおよびアルゴリズムを同定する。
【０３２４】
Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら（２００２）に記載される方法によって、ニアレストシュランクンセントロイドクラシファイア（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｓｈｒｕｎｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）をマイクロアレイまたは他のデータセットに適用し得る。このアルゴリズムもまた、分類のために遺伝子セットを同定し、試料の各クラスに対して、それらの１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）誤り率を決定する。アルゴリズムは、セット中の１つの遺伝子から全ての遺伝子まで、どんなサイズのモデルに対する誤り率でも決定する。特定数の遺伝子が用いられる場合、どちらかのまたは両方の試料クラスに対する誤り率が最小化され得る。この遺伝子数が決定される場合、選択した遺伝子と関連するアルゴリズムが同定され得、将来の試料の上で分類子として使用され得る。
【０３２５】
一旦遺伝子のセットおよびそれらの遺伝子に対する発現基準を分類のために構築したら、交差検定（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行う。１０分割交差検定（１０  ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）分析を含む多くの手法が存在し、この際、訓練試料の１０％を分析外として、分類アルゴリズムを残りの９０％で構築する。１０％は、その後、アルゴリズムに対する検査セットとして用いられる。試料の１０％を各回の
検査セットとして残したまま、この過程を１０回繰り返す。この分析を介して、予測（検査）試料で用いるアルゴリズムの強力さを推定するために役立つ交差検定（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）誤りを導き出し得る。
【０３２６】
発現分析のために用いられる全ての患者試料に対して臨床データを集める。臨床変数は、定量的または非定量的でありうる。定量的である臨床変数を、有意性または分類分析用の変数として用い得る。患者の性別のような非定量的臨床変数も、いくつかの統計学的ツールとともに、有意性分析または分類分析において用いられ得る。条件に対して最も有用な診断用遺伝子セットは、１つ以上の予測臨床変数とともに考慮される場合、最適であると認識される。臨床データは、相関分析用の監視ベクトルとしても用いられうる。すなわち、各試料に関連する臨床データを用いて、分析に対して意味のある診断分類に試料を分け得る。例えば、いくつかの診断基準（ａ）の存在または非存在に基づいて、２つ以上の群に試料を分け得る。さらに、臨床データを利用して、相関分析のために患者を選択すること、あるいはいくつかの望ましくない特性（例えば、進行中の感染、医薬品、または任意の他の案件）に基づいて患者を除外し得る。臨床データはまた、結果の検査前の可能性を評価するためにも用いられ得る。例えば、女性患者は、男性患者よりも全身性紅斑性狼瘡に羅患していると診断される可能性が非常に大きい。
【０３２７】
一旦、試料を許容可能な精度で分類する遺伝子セットを同定する。遺伝子セットを発見するために使用されなかった新規試料を用いて、これらの遺伝子をセットとして検証する。これらの試料は、発見臨床研究からの凍結保管庫（ｆｒｏｚｅｎ  ａｒｃｈｉｅｖｅｓ）から、または将来の新規患者から入手され得る。マイクロアレイとともに遺伝子セットの発現プロファイリングを用いて、または検査セット試料上の各遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲを用いて、試料の「検査セット」を用いた検証が行われ得る。あるいは、異なる発現プロファイリング技術が、用いられ得る。
【０３２８】
（免疫モニタリング）
白血球遺伝子発現を用いて、免疫系をモニタリングすることができる。免疫モニタリングは、所定の細胞型中の遺伝子セット対するおよび細胞型選択的方法で発現する遺伝子に対する遺伝子発現レベルを試験する。遺伝子発現モニタリングも、新規細胞型、前駆細胞、細胞分化等の有無を検出する。遺伝子発現パターンは、疾患状態への応答性を担う免疫系の細胞の活性化または静止状態に関連する可能性がある。例えば、移植拒絶のプロセスでは、免疫系の細胞は、外部組織の存在によって活性化される。この過程をモニタリングおよび診断する遺伝子および遺伝子セットは、免疫系活性化のレベルおよび種類の尺度を提供している。免疫系をモニタリングする上で有用な遺伝子および遺伝子セットは、免疫系に関与する全ての疾患の診断およびモニタリングのために有用であり得る。いくつかの例としては、移植拒絶、慢性関節リウマチ、狼瘡、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ならびにウイルス性、細菌性および真菌性感染がある。本明細書に開示される全ての障害および疾患を考慮する。免疫活性化をモニタリングする遺伝子および遺伝子セットは、免疫活性化を減少させるために用いられる免疫抑制薬物療法に対する応答をモニタリングするために有用である。遺伝子は、いくつかの他の検査によって決定されたように、試料中の免疫活性化または静止状態の既知の存在に対する発現パターンの相関によって、免疫活性化に相関すると判明した。
【０３２９】
（選択した疾患）
基本的には、ヌクレオチド配列の少なくとも１つのサブセットが、疾患基準または疾患を有する１つ以上の個体および疾患基準または疾患を持たない１つ以上の個体に由来する試料中で差次的に発現する限り、本発明の診断用ヌクレオチドセットを開発して、任意の疾患または疾患基準に本質的に適用することが可能であり、この際、該個体は、異なる時間点でサンプリングされた同一個体であるか、または該個体は、異なる個体（又は個体集
団）であってもよい。例えば、ヌクレオチド配列のサブセットは、疾患または疾患基準を持たない被験体（例えば疾患を持たない患者（コントロール患者）と比べて、疾患または疾患基準を持つ被験体（例えば疾患または疾患基準を持つ患者）のサンプリングされた組織で差次的に発現し得る。代替として、または追加的に、ヌクレオチド配列のサブセットは、例えば異なる時間点、異なる疾患段階、治療前および後、危険因子の存在または非存在下等で、同一患者から得た異なる試料で差次的に発現し得る。
【０３３０】
診断には相関しないが、疾患の特定の局面に相関するヌクレオチド配列のセットに対応する発現プロファイルを用いて、本発明の診断用ヌクレオチドセットおよび疾患特異的標的ヌクレオチド配列を同定することもできる。例えば、このような局面または疾患基準は、被験体の病歴、家系、例えば、小児期の疾患、親または他の親類の死亡原因、過去の外科的処置または他の処置、投薬、症状（症状の開始および／または継続期間を含む）等に関連し得る。あるいは、疾患基準は、診断（例えば、高血圧、糖尿病、アテローム性硬化症）、または予後（例えば、特徴の診断、事象または合併症の予測）（例えば、急性心筋梗塞、血管形成術後の再狭窄、再灌流障害、同種移植片拒絶、慢性関節リウマチまたは全身性エリテマトーデス病活性など）に関連し得る。他の場合では、疾患基準は、治療結果、例えば移植拒絶、バイパス手術または投薬に対する応答、ステント移植後の再狭窄、治療的新脈管形成治療に起因する側副血管増殖、血管再生に起因する減少した狭心症、多数の治療に関連する症状の回復などに対応する。また、疾患基準は、先行して同定されたまたは古典的な危険因子に一致し、予後または将来の疾患診断に対応することが可能である。上記に示したように、疾患基準は、１つ以上の遺伝子座に対する遺伝子型にも対応し得る。異なる時間点での同一患者から、異なる患者から、疾患（基準）を有する患者およびコントロール集団を代表する患者間等から、疾患基準（患者データを含む）を採取（および比較）することが可能である。時系列データ、すなわち個体（または個体群）から異なる時間点で採取されたデータを、異なる時間点で個体（個体群）から得た試料の比較のために用いて、疾患状態と特に関連する差の同定を可能にすることと、時間経過での発現の変化率または軌道を含む時間経過での発現の変化に関連する情報を得ることとが可能である。「本発明の診断用ヌクレオチドセットの同定」と表題した本セクションで時系列データの有用性をさらに論じる。
【０３３１】
現行の診断手段がない状態を診断する際用いるために、診断用ヌクレオチドセットを開発することが可能であることがさらに理解される。例えば、慢性関節リウマチでは、多くの場合、患者が状態の徴候を経験する前に関節破壊が進行している。患者が症状を提示することに部分的に依存する現行の診断手段を用いることができるときよりも早い段階で、リウマチ関節破壊を診断する診断用ヌクレオチドセットを開発することが可能である。診断用ヌクレオチドセットを開発して、現行の診断手段を置換または増強することが可能である。例えば、心臓同種移植拒絶を診断するための診断用ヌクレオチドセットの使用は、現行の診断検査および移植片生検を置換することが可能である。
【０３３２】
疾患の以下の考察は、例示的かつ非制限的であることが理解され、通常、上記に論じた一般的基準、例えば家族の病歴を下記に論じる特定の疾患に適用可能であることがさらに理解される。
【０３３３】
白血球に加えて、全体を通して記載されるように、一般的方法が、組織または細胞型の試料を採取および評価することによって、任意の被験体組織または細胞型で差次的に発現するヌクレオチド配列に適用可能である。しかし、多くの場合は、このような試料の採取は、現状の技術に与えられた有意な技術または医療問題を提示する。
【０３３４】
（器官移植拒絶および成功）
器官移植の頻繁な合併症は、拒絶を生じる免疫系による外来としての移植された器官の
認識である。診断ヌクレオチドセットは、器官移植の成功、拒絶および処置をモニタリングするために同定および検査され得る。現在、免疫系を抑制し、それによって、拒絶の比率および重篤度を減少させる投薬が存在する。しかし、これらの薬物はまた、生理学的免疫応答を抑制し、患者を、幅広い種類の日和見感染および癌に対して感受性にする。現在、移植拒絶を診断する、簡単に信頼できる方法はない。器官生検は、好ましい方法であるが、これは、高価で、痛みを伴い、そして有意な危険と関連し、そして局所的な拒絶に対する不適切な感受性を有する。
【０３３５】
本発明の診断ヌクレオチドセットは、移植拒絶および成功についての診断試験として使用するために開発および確証され得る。診断ヌクレオチドセットを同定する方法は、任意の器官移植集団に適用可能であることが理解される。例えば、診断ヌクレオチドセットは、心臓同種移植片拒絶および成功について開発された。
【０３３６】
いくつかの場合において、疾患の基準は、器官生検に基づく急性段階拒絶診断に対応し、そしてＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（「ＩＳＨＬＴ」）基準を使用して、評価付けられた。この評価付けシステムは、グレード０、１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、３Ｂ、または４として組織学レベルについて心内膜心筋生検を分類する。グレード０生検は、拒絶の有意な証拠を有さず、一方、各連続したグレードは、白血球浸潤および／または移植片心筋細胞に対する損傷の増加した重篤度を有する。医療センターと病理学者との間、および同じ病理学者の異なる時間での繰り返した読みの間の評価付けシステムにおける可変性が存在することを認識する。白血球遺伝子発現相関分析についての疾患基準としての生検のグレードを使用する場合、この疾患基準の可変性を決定するために、全ての生検スライドについて単一の病理学者が読むこと、または全てのスライドを複数の病理学者が読むことが望ましい。一部可変性に起因して、心臓生検が、急性拒絶の診断について、１００％感受性でない、または１００％特異性でないことが理解される。心臓生検グレードを診断遺伝子セットの発見のための疾患基準として心臓生検グレードを使用する場合、患者サンプルをグレードに基づく診断カテゴリーに分割することが望ましくあり得る。このような分類の例は、以下を有する患者である：グレード０対グレード１Ａ−４、グレード０対グレード１Ｂ−４、グレード０対グレード２−４、グレード０−１対グレード２−４、グレード０−１対グレード３Ａ−４、またはグレード０対グレード３Ａ−４。
【０３３７】
他の疾患基準は、心臓生検の結果および他の基準（例えば、心エコー検査による心臓機能試験の結果、心臓カテーテル挿入による血行力学評価、ＣＭＶ感染、移植後の週、医薬レジメン、人口統計学および／または他の診断試験の結果）に対応する。
【０３３８】
他の疾患基準は、患者の病歴からの情報および器官ドナーに関する情報に対応する。あるいは、疾患基準としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染、心臓機能の生理学的試験によって測定される同種移植片機能不全（例えば、カテーテル挿入または心エコー検査からの血行力学的測定）、および他の感染の症状の存在または非存在が挙げられる。あるいは、疾患基準は、治療の結果（例えば、移植失敗、再移植、死、入院、静脈内免疫抑制の必要、移植片脈管障害、免疫抑制投薬に対する応答などに対応する。疾患基準は、少なくとも中程度の組織学的なグレードの拒絶エピソード（これは、さらなるコルチコステロイド、抗Ｔ細胞抗体、または全体的なリンパ照射を用いる患者の処置を生じる）；組織学的グレード２以上を有する拒絶；２未満の組織学的グレードを有する拒絶；組織学的拒絶無しおよび正常または変化のない同種移植片の機能（カテーテル挿入または心エコー検査データからの血行力学的測定に基づく）；重篤な同種移植片機能不全の存在または研究期間の間の同種移植片機能不全を悪くすること（カテーテル挿入または心エコー検査データからの血行力学的測定に基づく）；培養、組織学、またはＰＣＲによる記載されたＣＭＶ感染、および感染の少なくとも１つの臨
床的徴候または症状；特異的移植生検拒絶グレード；患者の慢性免疫抑制レジメンの増強を促進する穏やか〜中程度の組織学的重篤度の拒絶；プラスマフェレーシスまたは「体液性」拒絶の診断を促進する同種移植片機能不全を有する穏やか〜中程度重篤の拒絶；ＣＭＶ以外の感染（特に、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の感染）；リンパ増殖障害（移植後リンパ腫とも呼ばれる）；脈管内超音波（ＩＶＵＳ）、血管造影、または急性心筋梗塞での増加する初期厚みによって診断される移植脈管障害；移植失敗または再移植；および全ての死因に対応する。診断基準として有用な診断データの例は、実施例３に提供される。
【０３３９】
別の例において、診断ヌクレオチドセットは、腎臓同種移植片レシピエントの診断およびモニタリングにおける使用のために開発および確証される。疾患基準は、例えば、腎臓同種移植片拒絶の生検分析の結果、血清作製レベル、クレアチンクリアランス、腎臓についての放射線学的画像化の結果、および尿検査に対応する。別の疾患基準は、血液透析、再移植、死または他の腎臓置換療法についての必要性に対応する。診断ヌクレオチドセットは、骨髄移植および肝臓移植患者それぞれの診断および処置における使用のために開発および確証される。骨髄移植についての疾患の基準は、移植片拒絶および／または対宿主移植片病、癌の再発、免疫抑制に起因する合併症、血液学的異常、感染、入院ならびに／あるいは、死に対応する。肝臓移植拒絶についての疾患基準としては、肝臓損傷および肝臓機能のレベル（例えば、ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＡｌＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、アルカリホスファターゼ、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）、Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ、ＡｌｂｕｍｉｎおよびＰｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ時間）が挙げられる。さらなる疾患基準は、肝性脳症、投薬使用、腹水、移植失敗、再移植、入院、免疫抑制の合併症、診断試験の結果、放射線試験の結果、死ならびに移植片生検についての組織学的拒絶に対応する。さらに、尿は、腎臓移植をプロファイルするための標的組織のために使用され得、一方、胆管および腸の分泌物および糞便は、肝性または腸の器官の同種移植片拒絶について有利に使用され得る。診断ヌクレオチドセットはまた、慢性腎臓同種移植片拒絶の診断およびモニタリングについて発見および開発され得る。
【０３４０】
腎臓同種移植片の場合、タンパク質を分泌する遺伝子発現マーカーが同定され得る。これらのタンパク質は、標準的な免疫アッセイを使用して同種移植片レシピエントにおいて検出され得る。タンパク質は、低分子量である場合、尿中に存在し得る。低分子量タンパク質は、糸球膜を通って尿中へと通るようである。
【０３４１】
別の例において、診断ヌクレオチドセットは、異種移植片患者の診断および処置における使用のために開発および確証される。これは、非ヒト動物からヒトまたは非ヒト動物間での任意の器官の移植を含み得る。これは、診断および治療の発見および適用、ならびにヒト間の同種移植片移植についての考察は、ヒト間の同種移植片についての考察と実質的に類似する。
【０３４２】
別の例において、診断ヌクレオチドセットは、人工器官レシピエントの診断および処置における使用のために開発および確証される。これは、機械式循環の支持体、人工心、左室補助装置、腎臓補充療法、器官人工器官などを含むが、これに限定されるものではない。疾患基準は、血栓症（血餅）、感染、死、入院および器官機能（例えば血流動態、クレアチニン、肝機能テスト、腎機能テスト、機能的な容量）の悪化している計測である。
【０３４３】
別の例において、診断ヌクレオチドセットは、適切なレシピエントにドナー器官を一致させる際に使用するための開発および確証される。診断遺伝子セットは、ドナー器官とレシピエントの首尾良い一致と相関して発見され得る。疾患基準としては、移植失敗、急性および慢性拒絶、死、入院、免疫抑制剤使用、および免疫抑制の合併症が挙げられる。遺
伝子セットは、ドナーまたはレシピエントの末梢血、器官組織、またはいくつかの他の組織からアッセイされ得る。
【０３４４】
別の例において、診断ヌクレオチドセットは、患者の免疫耐性（宿主免疫系による同種移植片拒絶の減少）の診断および誘導における使用のために開発および確証される。疾患基準としては、拒絶、免疫活性のアッセイ、免疫抑制の必要性、および各器官の移植についての上記全ての疾患基準が挙げられる。
【０３４５】
（ウイルス疾患）
診断白血球ヌクレオチドセットは、ウイルス疾患の診断および移植拒絶の診断およびモニタリングについて開発および確証され得る。別の局面において、ウイルスヌクレオチド配列は、ウイルス疾患の診断または移植拒絶の診断およびモニタリングにおいて使用するための白血球ヌクレオチドセットに添加される。あるいは、ウイルスヌクレオチドセットおよび白血球ヌクレオドセットは、連続的に使用され得る。
【０３４６】
（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））
ＥＢＶは、種々の疾患（例えば単核細胞症、Ｂ細胞リンパ腫および咽頭癌）を引き起こす。それは単核細胞を感染させ、そして、循環異型リンパ球は感染の共通徴候である。末梢白血球遺伝子形質発現は、感染によって変えられる。免疫抑制される移植レシピエントおよび患者は、ＥＢＶ関連リンパ腫についての増加した危険にある。
【０３４７】
診断ヌクレオチドセットは、ＥＢＶの診断およびモニタリングについて、ならびに移植拒絶の診断およびモニタリングについて開発および確証され得る。１つの局面において、診断ヌクレオチドセットは、白血球セットである。あるいは、ＥＢＶヌクレオチド配列は、ＥＢＶの診断における使用のための白血球ヌクレオチドに添加される。疾患基準は、ＥＢＶの診断と対応し、特に、ＥＢＶ−血清−陽性、ＥＢＶ関連疾患の存在（または予測的な存在）（例えば、単核細胞症）、およびＥＢＶ関連リンパ腫と対応する。診断ヌクレオチドセットは、ＥＢＶの診断、およびＥＢＶ関連疾患の存在の予測に有用である。
【０３４８】
（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））
サイトメガロウイルスは、大部分の任意の組織、特に、結腸、肺、骨髄および網膜の炎症および疾患を引き起こし、そして免疫抑制患者（例えば移植、癌、エイズ）の疾患の非常に重要な原因である。多くの患者は、ＣＭＶに感染するか、またはＣＭＶに曝露されているが、全ての患者が、ウイルスからの臨床疾患を発症した。また、ＣＭＶ陽性ドナー由来の同種移植片のＣＭＶ陰性レシピエントは、ＣＭＶ感染について高いリスクにある。免疫抑制薬が開発および使用される場合、現在または差し迫った臨床的ＣＭＶ疾患を有する患者を同定することがますます重要である。なぜなら、免疫抑制治療の潜在的な利益は、臨床的ＣＭＶ感染および免疫治療の使用から生じ得る疾患の増加する速度とバランスをとらなければならない。ＣＭＶはまた、アテローム性動脈硬化症または血管形成術後の再狭窄の存在においてある役割を果たし得る。ＣＭＶ発現はまた、移植拒絶と相関し、そして移植拒絶の診断およびモニタリングにおいて有用である。
【０３４９】
診断ヌクレオチドセットは、ＣＭＶ感染またはＣＭＶ感染に再活性化の診断およびモニタリングにおける使用のために開発される。１つの局面において、診断ヌクレオチドセットは、白血球ヌクレオチドセットである。別の局面において、ＣＭＶヌクレオチド配列は、ＣＭＶ診断における使用のために白血球ヌクレオチドセットに添加される。疾患基準は、ＣＭＶ（例えば、血清陽性状態）の診断および臨床的に活性なＣＭＶの存在に対応する。疾患基準はまた、予想されるデータ（例えば、ＣＭＶが臨床的に活性または差し迫ったＣＭＶ感染になる可能性）に対応する。抗ウイルス投薬が利用可能であり、診断ヌクレオチドセットは、初期の処置、慢性抑制またはＣＭＶ活性の予防について患者を選択するた
めに使用され得る。
【０３５０】
（Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）
これらの慢性ウイルス感染は、米国ではそれぞれ約１２５万人および約２７０万人の患者に及んでいる。多数の患者が感染するが、臨床症状は被らない。感染した数人の患者が、慢性肝臓障害、肝硬変および肝癌を被り続ける。
【０３５１】
診断ヌクレオチドセットは、ＨＢＶまたはＨＣＶ感染の診断およびモニタリングに使用するために開発される。一つの局面では、診断ヌクレオチドセットは、白血球ヌクレオチドセットである。別の局面では、白血球ヌクレオチドセットにウイルスヌクレオチド配列が添加され、ウイルス診断および肝臓疾患の進行のモニタリングに使用される。疾患基準は、ウイルスの診断（例えば、血清陽性状態または他の疾患症状）に対応する。あるいは、疾患基準は、肝臓障害（例えば、アルカリホスファターゼの増加、ＡＬＴ、ＡＳＴまたは肝生検における進行中の肝臓障害の証拠）に対応する。あるいは、疾患基準は、入院に必要であるかまたは肝臓移植に対して必要である、血清肝臓試験（ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、ＰＴ、ビリルビン）、肝生検、肝臓超音波、血清ＰＣＲによるウイルス負荷、肝硬変、肝癌に対応する。診断ヌクレオチドセットは、ＨＢＶおよびＨＣＶを診断するために使用され、疾患進行の可能性を予測するために使用される。抗ウイルス治療用法（例えば、インターフェロンγおよびリバビリン）もまた、疾患基準であり得る。
【０３５２】
（ＨＩＶ）
ＨＩＶは、Ｔ細胞に感染し、白血球発現に確実に変化をもたらす。診断ヌクレオチドセットは、ＨＩＶの診断およびモニタリングのために開発される。一つの局面では、診断ヌクレオチドセットは、白血球ヌクレオチドセットである。別の局面では、白血球ヌクレオチドセットにウイルスヌクレオチド配列が添加され、ウイルス診断に使用される。疾患基準は、ウイルスの診断（例えば、血清陽性状態）に対応する。さらに、疾患基準は、ウイルス負荷、ＣＤ４  Ｔ細胞数、日和見性感染、抗レトロウイルス治療に対する反応、ＡＩＤＳに対する進行、ＨＩＶ関連転帰（例えば、悪性腫瘍、ＣＮＳ障害）の進行および発生の速度に対応する。抗レトロウイルスに対する反応も疾患基準であり得る。
【０３５３】
（薬理ゲノム学）
薬理ゲノム学は、特定薬剤療法（複数の療法の組み合わせ）に反応する個体の傾向の研究である。この文脈では、反応とは、特定薬物が特定の患者、例えば１つの薬剤に反応するが他の薬剤に反応しない何人かの患者に作用するか否かを指す場合がある。反応は、治療の成功の可能性あるいは治療における進捗状況の評価を指す場合もある。また、この記述においては、特定患者への薬物の滴定療法も含まれ、例えば異なる患者は、所定の薬剤の異なる用量に反応する場合がある。この局面は、副作用を有する薬物あるいは他の薬物療法との相互作用が企図される場合に重要となる可能性がある。
【０３５４】
診断用ヌクレオチドセットは、患者が特定の療法に反応するか否かの評価用および／または患者の薬物療法（複数の療法）に対する反応性のモニタリング用として開発されかつ実証されている。疾患の基準は、臨床的な徴候あるいは臨床的な終点の有無、副作用の存在、あるいは他の薬物（複数の薬物）との相互作用が該当する。診断用ヌクレオチドセットはさらに、活動状態の疾患に対する薬剤療法の標的あるいはマーカーであるヌクレオチド配列をさらに含めてもよい。
【０３５５】
（診断用ヌクレオチドセットの検証および正確度）
本発明の診断用プローブセットの広範な適用の前に、プローブセットの予測的な価値が検証される。診断用プローブセットが、発現解析に基づくマイクロアレイによって開発さ
れる場合、遺伝子メンバーの差次的発現が、より少ない可変性かつより多量でかつ正確な技術（例えば、リアルタイムＰＣＲ）により確認され得る。実験のこの型では、増幅産物は、ＰＣＲ反応の間に測定される。このことは、研究者が、いずれかの試薬が、増幅に対して律速になる前に、観察することを可能にする。動力学的ＰＣＲでは、測定は、ＣＴ（サイクル閾値）またはＣＰ（横断点（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ））の測定である。この測定（ＣＴ＝ＣＰ）は、増幅曲線が、蛍光閾値を横断する点である。閾値は、全ての反応が、増幅の直線相にある領域内にある点に設定する。ＣＴを測定する場合、より低いＣＴ値は、初期のサイクル回数は、閾値がより迅速に横断することを意味するので、より多い量の出発物質を示す。
【０３５６】
複数の蛍光方法論は、リアルタイムＰＣＲで増幅産物を測定するために利用できる。Ｔａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、プローブが配列特異的結合およびＴａｑ  ３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解されるまで、プローブからのシグナルを阻害するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）もＦＲＥＴ技術を使用し、それによって、ヘアピン構造が増幅ＤＮＡに結合する特異的プローブによって緩和される場合、蛍光が測定される。第３の一般に使用される化学は、ＤＮＡ結合色素であるＳｙｂｒグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。産生される増幅産物が多いほど、シグナルが高くなる。Ｓｙｂｒグリーン方法は、非特異的な増幅産物に高感度であり、プライマー設計および選択の重要性を増加させる。他の検出化学物質（例えば、臭化エチジウムまたは他のＤＮＡ結合色素および蛍光色素／クエンチャー色素Ｔａｑｍａｎ化学物質）もまた使用され得る。
【０３５７】
リアルタイムＰＣＲ検証を実施例１２のように行うことができる。
【０３５８】
代表的には、例えばオリゴヌクレオチド特異的プライマーを用いたＤＮＡ配列決定によって、各プローブのオリゴヌクレオチド配列を確認する。得られた部分的配列は、一般に、オリゴヌクレオチドプローブの同一性を確認するのに十分である。また、相補的ポリヌクレオチドを蛍光標識して、アレイにまたはオリゴヌクレオチドプローブの再合成型を含有する異なるアレイにハイブリダイズさせて、正確なプローブの検出を確認する。
【０３５９】
代表的には、診断用プローブセットに対する分子署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）と選択した指標との間の対応性の正確度を統計学的に評価することによって、検証を実行する。例えば、２つの被験体クラス間のヌクレオチド配列で差次的な発現を相対的発現の単一比として表すことができる。以下の方程式で記載されるように、選択した指標を有する被験体中のヌクレオチド配列の発現を、選択した指標を有さない被験体中のそのヌクレオチド配列の発現と比較することができる。
ΣＥＸａｉ／Ｎ＝ＥＸＡ  群Ａのメンバーでのヌクレオチド配列ｘの平均発現
ΣＥＸｂｉ／Ｍ＝ＥＸＢ  群Ｂのメンバーでのヌクレオチド配列ｘの平均発現
ＥＸＡ／ＥＸＢ＝ΔＥＸＡＢ  群ＡおよびＢ間のヌクレオチド配列ｘの平均差次的発現：であり、式中、Σは、和を表し、ＥＸは、標準に対するヌクレオチド配列ｘの発現であり、ａｉは、群Ａの個々のメンバーであり、群Ａは、Ｎ個の成分を有し、ｂｉは、群Ｂの個々の成分であり、群ＢはＭ個の成分を有する。
【０３６０】
少なくとも２個のヌクレオチド配列（例えば、ヌクレオチド配列Ｘおよびヌクレオチド配列Ｙ）の発現を、群Ａ（例えば、疾患を有する）および群Ｂ（例えば、疾患を有さない）の少なくとも１つの被験体における標準と比較して測定する。理想的には、確認の目的のために、指示薬は、発現パターンから独立している（すなわち、発現パターンに基づいて割り当てられていない）。あるいは、遺伝子発現の核酸配列ＸおよびＹに対する最低限
の閾値は、標準と比較して、群Ａに対する代入を表している。ヌクレオチド配列ｘについては、この閾値は、ΔＥｘと名付けられ、ヌクレオチド配列ｙについては、その閾値はΔＥｙと名付けられる。
【０３６１】
以下の式は、以下の計算で使用される：
感受性＝（真陽性／真陽性＋偽陰性）
感受性＝（真陰性／真陰性＋偽陽性）
例えば、閾値を上回るヌクレオチド配列ｘの発現：ｘ＞ΔＥｘが、群Ａの８０／１００の被験体に観察され、群Ｂの１０／１００の被験体に観察される場合、所定の発現閾値ΔＥｘにおけるヌクレオチド配列ｘの群Ａへの代入に対する感受性は、８０％であり、そして特異性は９０％である。
【０３６２】
群Ａの８０／１００の被験体でヌクレオチド配列ｙの発現が、ΔＥｙより大きい場合、そして、群Ｂの１０／１００の被験体でヌクレオチド配列ｙの発現が、ΔＥｙより大きい場合、所定の閾値ΔＥｙで群Ａへの代入に対して、ヌクレオチド配列ｙの感受性は、同様に８０％であり、特異性は９０％である。さらに、ヌクレオチド配列ｙに対する発現閾値に達した群Ａにおける８０の被験体の内の６０はまた、発現閾値ΔＥｘに達し、ヌクレオチド配列ｙに対する発現閾値に達した群Ｂにおける１０の被験体の内の５は、発現閾値ΔＥｘに達し、被験体の群Ａへの代入に対する試験の感受性（ｘ＞ΔＥｘおよびｙ＞ΔＥｙ）は６０％であり、その特異性は９５％である。
【０３６３】
あるいは、群Ａに対する代入の基準が次のように変化する場合：ｘの発現＞ΔＥｘまたはｙの発現＞ΔＥｙ、その感受性は、１００％に到達し、その特異性は８５％である。
【０３６４】
明らかに、任意の治療プローブセットの予測的な正確さは、選択された最低発現閾値に依存する。ヌクレオチド配列Ｘの発現（標準と比較して）は、群Ａ（疾患あり）および群Ｂ（疾患なし）の被験体で測定される。ｘに対するヌクレオチド配列発現の最低限の閾値は、群Ａに対する代入を必要とし、ΔＥｘ１と呼ばれる。
【０３６５】
群Ａの９０／１００の患者が、ヌクレオチド配列ｘ＞ΔＥｘ１の発現を有し、群Ｂの２０／１００の患者が、ヌクレオチド配列ｘ＞ΔＥｘ１の発現を有する場合、ヌクレオチド配列ｘの発現の、群Ａに対する患者の代入に対する感受性（最低限の発現閾値としてΔＥｘ１を使用する）は９０％であり、特異性は８０％である。
【０３６６】
最低限の発現閾値を変化することにより、問題のヌクレオチド配列の特異性および感受性における変化を生じる。例えば、群Ａの１００／１００の被験体および群Ｂの４０／１００の被験体が閾値に達するように、群Ａへの被験体の代入に対して、ヌクレオチド配列ｘの最小発現閾値がΔＥｘ２を下回る場合、群Ａへの被験体の代入に対する試験の感受性は、１００％であり、特異性は６０％である。
【０３６７】
従って、２つのヌクレオチド配列ＸおよびＹについて：ヌクレオチド配列ｘおよびヌクレオチド配列ｙの発現（標準と比較して）は、群Ａに属する被験体（疾患を有する）および群Ｂに属する被験体（疾患を有さない）中で測定される。ヌクレオチド配列ＸおよびＹに対するヌクレオチド配列発現の最低限の閾値（共通の標準と比較した）は、群Ａに対する代入を表す。ヌクレオチド配列ｘについては、この閾値は、ΔＥｘ１と呼ばれ、ヌクレオチド配列ｙについては、この閾値は、ΔＥｙ１と呼ばれる。
【０３６８】
群Ａにおいて、９０／１００の患者は、ΔＥｘ１およびΔＥｙ１の発現に最低限必要な量に達し、群Ｂにおいて、１０／１００の被験体は、ΔＥｘ１およびΔＥｙ１の発現に最低限必要な最低限必要な量に達する場合、群Ａへの被験体の代入に対するその試験の感受
性は、９０％であり、特異性は９０％である。
【０３６９】
ＸおよびＹのΔＥｘ２およびΔＥｙ２に対する最小発現閾値の増加することにより、群Ａにおいて、７０／１００の被験体が、発現ΔＥｘ２およびΔＥｙ２の最低限必要な量に到達し、群Ｂにおいて、３／１００の被験体が、発現ΔＥｘ２およびΔＥｙ２の最低限必要な量に到達する。群Ａへの被験体の代入に対するその試験の感受性は、７０％であり、特異性は９７％である。
【０３７０】
群Ａへの代入に対する基準が、問題の被験者が、ΔＥｘ２またはΔＥｙ２のどちらかの閾値に達し、群Ａにおける１００／１００の被験体が基準を満たし、そして群Ｂの２０／１００の被験体が基準を満たす場合、群Ａへの代入に対するその試験の感受性は、１００％であり、特異性は８０％である。
【０３７１】
診断プローブセットそれぞれの個々の構成要素は、被験体群間で区別される定義された感受性および特異性を有する。このような個々のヌクレオチド配列は、合わせて、評価の感受性および特異性を増加するための診断プローブセットとして使用され得る。分子の特徴のデータベースは、被験者群間で最も高い平均差示的発現を有するヌクレオチド配列のセットを同定するためのアルゴリズム（すなわち、プローブセットの一員に対応する）によって照会される。代表的には、診断プローブセット中のヌクレオチド配列の数が増加するにつれて、予測される値、すなわちプローブセットの感受性および特異性も増加する。プローブセットが定義される場合、それらは、診断のためおよび以下に議論するように患者をモニタリングするために使用され得る。定義された使用のためのプローブセットの診断感受性および診断特異性は、上に示したように特定の発現レベルを有する所定のプローブセットに対して決定され得る。診断用として、各ヌクレオチド配列の使用のために必要な発現の閾値を変化させることにより、プローブセットの感受性および特異性は、熟練者によって変えられ得る。例えば、セット中の各ヌクレオチド配列に対する発現の異なる閾値の大きさを小さくすることにより、試験に対する感受性は増加するが、特異性は減少する。前述の議論から明らかなように、感受性および特異性は、反比例していて、そしてプローブセットの予測される正確さは、継続的であり、各ヌクレオチド配列の示す発現閾値に依存する。発現閾値が変化する場合、感受性および特異性は、反比例の関係を有する傾向があるが、予測される値を有するヌクレオチド配列が診断ヌクレオチドセットに付加されるにつれて、パラメーターは両方とも増加され得る。さらに、１つのマーカーまたはいくつかのマーカーは、患者の集団全体にわたって、確実な発現マーカーではあり得ない。これは、発現の可変性および測定間、個体間および個体の時間の経過に存在する発現の測定の可変性のためである。診断ヌクレオチドセットにおける多数の候補ヌクレオチド配列または多数のヌクレオチド配列の算入は、全てのヌクレオチド配列が、診断のための閾値を満たす必要はないので、この可変性を可能にする。一般に、単一のマーカーより、より多数のマーカーが良い。診断するために、多数のマーカーが使用される場合、全ての発現マーカーが無作為な可変性に基づいていくつかの閾値を満たさない可能性は低く、従って、試験は、偽陰性をほとんど生じない。
【０３７２】
所望の診断感受性および診断ヌクレオチドセットの特異性は、セットの意図的な使用に依存して変化し得る。例えば、特定の使用の場合、高特異性および高感受性が所望される。例えば、患者集団が受ける副作用を予測するための診断ヌクレオチドセットは、このような患者の処置を避けるために高感受性を必要とし得る。他の設定では、高感受性が所望されるのに対して、特異性の低下も許容され得る。例えば、多少の副作用を伴なう有益な処置の場合、薬物に反応する多数の患者を可能（高感受性）と同定することが重要であり得、そして、反応しない患者の処置は、許容される。他の設定では、高特異性が所望され、低感受性が許容され得る。例えば、初期臨床試験で患者を同定する場合、特定の処理に反応し得る患者を同定することが重要である。この設定では、感受性が、単にこの研究に
登録する患者の減少を生じ、より多くの登録のための患者のスクリーニングを必要とするのでより低い感受性が許容される。
【０３７３】
（診断ヌクレオチドセットを使用する方法）
本発明はまた、以下のための診断ヌクレオチドセットを使用する方法を提供する：疾患の診断；疾患の重篤度の評価；疾患の将来の発生の予測；疾患の将来の合併症の予測；疾患予後の決定；患者の危険度の評価または患者の群の「階層化」；現在の薬物治療に対する反応の評価；現在の非薬学的治療に対する反応の評価；患者に対する最も適切な薬剤または処置の決定；患者が特定の薬物に反応するか否かの予測；患者に対する最も適切なさらなる診断試験の決定、特に臨床的におよび疫学的に適切な適用。
【０３７４】
本発明のヌクレオチドセットは、医師、医療関係労働者、病院、研究所、患者、企業および他の公共団体により種々の目的で使用され得る。前に示したように、本質的に任意の疾患、条件または少なくとも１つのヌクレオチド配列が白血球母集団（または亜母集団）中で、差次的に発現するような状態が、本発明の診断ヌクレオチドセットおよび方法を使用して、評価（例えば、診断、モニタリングなど）され得る。個体レベルにおける診断状態の評価に加えて、本発明の診断ヌクレオチドセットは、「集団レベル」（例えば、疫学的な研究または状態もしくは疾患に対する集団のスクリーニング）での被験体の評価に適している。
【０３７５】
（サンプルの収集および調製）
ＲＮＡ、タンパク質および／またはＤＮＡは、当該分野で周知で、さらに本明細書に記載される方法を使用して調製される。本発明の方法に使用するために回収された被験体サンプルは一般に、臨床状況で回収されることが理解され、ここで、遅延は、ＲＮＡサンプルが被験体サンプルの全血から調製される前に持ち込まれ得、例えば、血液サンプルは、さらなるプロセシングのために、臨床研究室には、迅速には送達され得ない。多数のサンプルが一般に所定の時間にプロセスされる臨床研究室状況で、さらなる遅延が持ち込まれ得る。この理由のために、インタクトな白血球の室温での非常に長いインキュベーションを特徴とする方法は、この延長された時間の間に、白血球の発現特性が変化し得るために、好ましくない。例えば、ＲＮＡは、フェノール／グアニジンイソチオシアネート試薬を用いて全血から単離され得るかまたは別の直接全血溶解方法（例えば、米国特許第５，３４６，９９４号および同４，８４３，１５５号に記載される）を用いて単離され得る。この方法は、特定の状況下ではあまり好ましくない。というのは、赤血球の数が白血球を１０００：１で上回るので、全血ＲＮＡ抽出物から回収したＲＮＡの大部分は、赤血球に由来するためである。赤血球ＲＮＡおよびタンパク質の存在がＲＮＡ発現特性データに偏りを持ち込まないこと、またはプローブの不適切な感受性もしくは特異性を持ち込まないことを保証するために注意を払わなければならない。
【０３７６】
あるいは、インタクトな白血球は、赤血球を選択的に溶解するが白血球は溶解しない溶解緩衝液（例えば、米国特許第５，９７３，１３７号および同６，０２０，１８６号に記載される）を使用して全血から回収され得る。次いで、インタクトな白血球は、本明細書に記載されるように、遠心分離により回収され、そして、白血球ＲＮＡは、標準的プロトコルを使用して単離される。しかし、この方法は、白血球の部分集団（例えば、所望の場合、単核細胞）を単離し得ない。さらに発現特性は、溶解緩衝液中での長期のインキュベーションの間に変化し得、特に、多数のサンプルが、所定の時間に調製される多忙な臨床研究室ではそうである。
【０３７７】
あるいは、特定の白血球細胞型は、密度勾配試薬を使用して分離され得る（Ｂｏｙｕｍ、Ａ、１９６８）。例えば、単核細胞は、密度勾配遠心分離を使用して（例えば、米国特許第４，１９０，５３５号、同４，３５０，５９３号、同４，７５１，００１号、同４，
８１８，４１８号および同５，０５３，１３４号に記載されるように）全血から分離され得る。血液を、抗凝血剤および密度試薬（例えば、フィコールまたはパーコール）を含む管に直接入れる。この管を遠心し、血液を赤血球および顆粒球層、単核細胞懸濁液および細胞質層に分離する。単核細胞相を容易に除去し、そして細胞を遠心、溶解および凍結により回収し得る。凍結サンプルは、ＲＮＡが単離され得るまで安定である。しかし、密度遠心分離は室温で行なわなければならない。そして、処理が過度に長い場合（例えば、多忙な臨床研究室における場合）、発現特性は変化し得る。
【０３７８】
あるいは、細胞は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）または、細胞を、遺伝子発現またはタンパク質発現に基づいて部分集合にわける他のいくつかの技術を使用して分離され得る。この技術は、目的の細胞に関して、サンプルを濃縮するためには好ましいが、また、細胞操作および時間の遅れを持ち込み、遺伝子発現特性の変化を生じる（Ｃａｎｔｏｒら、１９７５；Ｇａｌｂｒａｉｔｈら、１９９９）。
【０３７９】
各臨床ＲＮＡサンプルの質および量を、配列ハイブリダイゼーションのために増幅および標識する前に、当該分野で公知の方法を使用して点検することが好ましい。例えば、１μＬの各サンプルをＲＮＡ  ６０００ナノＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ．ＵＳＡ）を使用して、生物分析機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ．ＵＳＡ）により分析し得る。分解されたＲＮＡを２８Ｓ対１８ＳリボソームＲＮＡの比の減少および／または２５〜１００ヌクレオチドの範囲の大量のＲＮＡの存在により同定する。
【０３８０】
診断ヌクレオチドセットとともに使用するためのＲＮＡサンプルが、診断ヌクレオチドセットを同定するために使用するように、同一のまたは異なる細胞集団、部分集団および／または細胞型から産生され得ることが理解される。例えば、単核細胞から抽出されたＲＮＡを使用して同定された診断ヌクレオチドセットは、診断ヌクレオチドセットの一部の特定の特性に依存して、全血または単核細胞から抽出されたＲＮＡの分析に適している場合がある。診断遺伝子セットを得る場合に使用されたものに比べて、種々の細胞集団、部分集団または細胞型に由来するＲＮＡとともに使用された場合、一般に、診断ヌクレオチドセットは、試験され、検査されなければならない。例えば、診断ヌクレオチドセットの一部の細胞特異的遺伝子発現、診断ヌクレオチドセットの一部により提供される情報の重複性、診断ヌクレオチドセットの一部の発現レベルおよび診断ヌクレオチドセットの一部の発現の細胞特異的変化のような因子は、診断ヌクレオチドセットの一部を同定するために使用される場合と比較して、種々のＲＮＡ源の使用の有用性に寄与する。全血に由来するＲＮＡをアッセイすることで、血液から特定の細胞型を単離する必要性を取り除くことが好ましいことが理解される。
【０３８１】
（臨床状況における発現特性のための高品質のＲＮＡの産生に適したＲＮＡ抽出の迅速な方法）
臨床状況では、発現特性に適した高品質のＲＮＡ調製物を、白血球の所望の集団から入手することは、いくつかの技術的課題を提示し、それらは、以下：臨床状況におけるサンプルの迅速な高処理処置に対する能力の欠如および処理における遅れ（多忙な研究室または臨床状況において）が、ＲＮＡ品質に逆に影響し得る可能性（例えば、特定のヌクレオチド配列の発現特性の移動を可能にすることによって）を含む。また、毒性試薬および高価な試薬（例えばフェノール）の使用は、臨床状況においては、そのような試薬の輸送および取扱いに関連して費用を増加させるために、好ましくない。
【０３８２】
白血球発現特性に関するＲＮＡ単離の有用な方法は、時宜を得た様式で、単球ＲＮＡおよびリンパ球ＲＮＡの単離を可能にするが、細胞の発現特性の保存および再生可能な高品質のＲＮＡサンプルの安価な産生は可能ではない。従って、本発明は、発現特性が「凍結
（ｆｒｏｚｅｎ）」になり、ＲＮＡ分解が減少するように、ＲＮＡ転写のインヒビターおよび／またはタンパク質合成のインヒビターを添加する方法を提供する。所望の白血球集団または部分集団が次いで、単離され、そのサンプルは凍結され得、またはＲＮＡを抽出するさらなる処理の前に、溶解され得る。血液は、被験体集団から取り出され、転写を阻害するために、アクチノマイシンＤ（１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで）に曝露され、タンパク質合成を阻害するために、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで）に曝露される。血液が取り出されるとすぐに、インヒビターは、血液回収管に液体形態で注入されるか、または管は、凍結乾燥したインヒビターまたは抗凝血剤を含む溶液中に存在するインヒビターのどちらかを含むように製造され得る。この時点で、血液サンプルは、他のところで記載したように、所望の白血球集団またはまたは部分集団が単離されるまで室温で保存され得る。標準的方法（例えば、上に記載したように）を使用してＲＮＡは単離され、または細胞ペレットもしくは細胞抽出物は、さらなるＲＮＡのプロセシングが好都合になるまで凍結され得る。
【０３８３】
本発明はまた、所望の白血球サンプルの分離に関して、低温密度勾配を使用する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、低温密度勾配の使用ならびに転写および／またはタンパク質合成インヒビターの使用の組合せを提供する。所望の白血球集団は、細胞の分離のために必要な密度および粘度を０〜４℃で維持する細胞分離のための密度勾配溶液を使用して分離される。低温が細胞のプロセスを遅くし、発現特性の変化を最小限にするので、血液は、この溶液を含む管に入れられ、処理の前までおよび処理の間、冷却される。標準的方法を使用して、白血球が分離され、ＲＮＡが単離される。あるいは、細胞ペレットまたは抽出物は、ＲＮＡのさらなるプロセシングが好都合になるまで、凍結される。さらなる工程の間、サンプルを再度暖めることを避けるように注意を払うべきである。
【０３８４】
あるいは、本発明は、上に記載するように、アクチノマイシンＡおよびシクロヘキシミドの使用と組み合わせた低温密度勾配分離を使用する方法を提供する。
【０３８５】
（診断薬に対する発現の評価）
被験体サンプル中の診断ヌクレオチド配列のセットに対する発現特性は、各成分ヌクレオチド配列の発現を決定する任意の技術により評価され得る。発現分析に適切な方法は、当該分野で公知であり、上記の「発現データを得る方法」および「高処理発現アッセイ」と題された節で議論される。
【０３８６】
多くの場合、発現特性の評価は、最も効率的であり、コスト効率が良く、ＲＮＡ発現の分析により実施される。あるいは、診断ヌクレオチドセットの各成分によりコードされるタンパク質は、タンパク質発現を決定し得る任意の技術（例えば、上に記載した）により診断目的で検出され得る。発現特性は、診断ヌクレオチドセットを同定し、確認するために使用された技術と同一の技術または異なる技術を使用して、被験体白血球サンプル内で評価され得る。例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイ上で配列の部分集合として同定された診断ヌクレオチドセットは、それらが同定された同一アレイ上で、診断目的（または予測目的もしくはモニタリング目的など）で使用され得る。あるいは、所定の疾患または条件のための診断ヌクレオチドセットは、示した目的で使用される部分アレイ上に組織化され得る。診断ヌクレオチドセットが、１つの技術（例えば、ＲＮＡ発現特性）を使用して発見され、しかし別の技術（例えば、タンパク質発現特性）を使用して診断に適用される場合、ヌクレオチドセットは、一般に新規の技術を用いて診断目的を確認されなけらばならないことに留意することが重要である。さらに、単一の用途のために開発される診断ヌクレオチドセット（例えば、特定の疾患を診断するため）は、後に、異なる適用（例えば、特定の疾患が生じる可能性を予測すること）に有用であることが見出され得ることも理解される。一般に、診断ヌクレオチドセットは、第２の状況で使用するために確認される必要がある。本明細書で考察したように、診断ヌクレオチドセットの一員の配列は、当該分野
で公知の方法を使用して、ＲＮＡまたはｃＤＮＡから増幅され得、そのヌクレオチド配列の特定の増幅物を提供する。
【０３８７】
（一般的なタンパク質方法）
本発明のヌクレオチド配列のタンパク質産物としては、機能的に等価な遺伝子産物を表すタンパク質を挙げることが可能である。このような等価な遺伝子産物は、上述のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含むことが可能であるが、これはサイレントな変化を生じるため、機能的に等価なヌクレオチド配列産物を生成する。関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性での類似性に基づいて、アミノ酸置換を行うことが可能である。
【０３８８】
例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性アミノ酸としては、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびとヒスチジンが挙げられる。負電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書で使用するように、「機能的に等価な」とは、本明細書に記載されるヌクレオチドにコードされる内在遺伝子産物と実質的に類似のインビボ活性を示すことができるタンパク質を指す。
【０３８９】
当技術で周知の技術を用いた組み換えＤＮＡ技術によって、遺伝子産物（ヌクレオチド配列のタンパク質産物）を生成することが可能である。当業者には周知の方法を用いて、新規なヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。このような方法としては、例えばインビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えが挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９，前出に記載される技術を参照せよ。また、例えば合成機を用いて、新規なヌクレオチド配列タンパク質配列をコードすることができるＲＮＡを化学的に合成することが可能である。例えば「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，１９８４，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載される技術を参照のこと。これは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９０】
種々の宿主−発現ベクター系を用いて、本発明のヌクレオチド配列コーディング配列を発現することが可能である。このような宿主−発現系は、対象コーディング配列を産生し、続いて単離することを可能にする媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）を表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換またはトランスフェクションされるときに、インサイチュで本発明のヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を提示し得る細胞も表す。そのようなものとしては、限定はされないが、ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えばサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピシア（Ｐｉｃｈｉａ））；ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させたか、またはヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来のプロモ
ーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられる。
【０３９１】
細菌系では、発現させるヌクレオチド配列タンパク質の使用目的によって、多数の発現ベクターを有利に選択することが可能である。例えば、多量の該タンパク質を生産するとき、抗体の生成のためにまたはペプチドライブラリーをスクリーニングするためには、例えば容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましくあり得る。そのようなベクターとしては、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら，１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１；）が挙げられ、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃ  Ｚコーディング領域とともにインフレームで、ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を該ベクターに個々にライゲートすることが可能である；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３；−５５０９）およびｐＧＥＸベクターなどを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させることも可能である。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着後に、遊離グルタチオンの存在下で溶離することによって溶解細胞から容易に精製することができる。トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むようにｐＧＥＸを設計するため、クローニングした標的ヌクレオチド配列タンパク質をＧＳＴ部分から分離することができる。本発明に有用な他の系としては、ＦＬＡＧエピトープまたは６−ＨＩＳ系の使用が挙げられる。
【０３９２】
昆虫系では、オートグラファ核多角体ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ））をベクターとして用いて、外来ヌクレオチド配列を発現させる。該ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。ヌクレオチド配列コーディング配列を、該ウイルスの非必須領域（例えば多角体遺伝子）中に個々にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多角体プロモーター）の制御下に置くことが可能である。ヌクレオチド配列コーディング配列の挿入が成功することによって、多角体遺伝子の不活性化および非閉塞組み換えウイルス（すなわち、多角体遺伝子にコードされるタンパク様外被を持たないウイルス）の産生を生じる。その後、これらの組み換えウイルスを用いて、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に感染させて、  該細胞内で、挿入ヌクレオチド配列が発現する（例えばＳｍｉｔｈら，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ、米国特許第４，２１５，０５１号を参照せよ）。
【０３９３】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスを用いる発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列に、対象ヌクレオチド配列コーディング配列をライゲートすることが可能である。その後、インビトロまたはインビボ組み換えによって、このキメラヌクレオチド配列をアデノウイルスゲノムに挿入することが可能である。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）内の挿入によって、感染宿主内で生存可能であり、かつヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を発現することができる組み換えウイルスを生じる（例えばＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９を参照せよ）。挿入ヌクレオチド配列コーディング配列の効率的な翻訳のには、特定の開始シグナルも必要となりうる。これらシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ヌクレオチド配
列を適当な発現ベクターに挿入する場合、付加的な翻訳制御シグナルが必要とされない可能正がある。しかし、ヌクレオチド配列コーディング配列の部分のみを挿入する場合、恐らくＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルを設けなければならない。さらに、開始コドンは、完全な挿入の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、すなわち天然および合成でありうる。適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを内包することによって、発現効率を高めることが可能である（Ｂｉｔｔｎｅｒら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照せよ）。
【０３９４】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式でヌクレオチド配列産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することが可能である。タンパク質産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、そのタンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に対して特有かつ特定のメカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現させる外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にすることができる。このためには、１次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化に対する細胞内機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を有する真核宿主細胞を用いることが可能である。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられる。
【０３９５】
組み換えタンパク質の長期間かつ高収率の生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を安定して発現する細胞系を操作することが可能である。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いる代わりに、適当な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を濃縮培地で１〜２日間増殖させることができ、その後、選択培地に切り換える。組み換えプラスミド内の選択可能なマーカーは、選択に耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に取り込み増殖して、次に細胞系にクローニングおよび増殖され得る細胞増殖巣を形成することを可能にする。この方法を有利に用いて、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を発現する細胞系を操作することが可能である。このような操作した細胞系は、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の内在性の活性に作用する化合物をスクリーニングおよび評価する上で特に有用である。
【０３９６】
多数の選択系を用いることができ、該選択系としては、限定はされないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ら，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３；）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６；）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７；）遺伝子が挙げられ、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞系で用いることができる。メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，ら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７；）、マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２；）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，
ら，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７；１４７）遺伝子用の選択基準として代謝拮抗物質耐性を用いることもできる。
【０３９７】
代替の融合タンパク質系によって、ヒト細胞系で発現する非変性融合タンパク質の容易な精製が可能になる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７６）。この系では、対象ヌクレオチド配列を、６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグにこのヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームが翻訳的に融合されるようにワクシニア組み換えプラスミドにサブクローニングする。組み換えワクシニアウイルスに感染させた細胞からの抽出物を、Ｎｉ２＋−ニトリロ酢酸−アガロースカラムにかけて、イミダゾール含有緩衝液によってヒスチジンタグタンパク質を選択的に溶出する。
【０３９８】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、該アッセイ系用のヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を生産する場合、標識、固定化、および／または検出を容易にすることができる融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【０３９９】
（抗体）
間接標識には、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質に特異的に結合する標識抗体などのタンパク質の使用を伴う。そのような抗体としては、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラッグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラッグメントが挙げられる。
【０４００】
本発明は、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質に対する抗体も提供する。１つ以上のヌクレオチド配列エピトープを特異的に認識することができる抗体の生産方法を本明細書に記載する。そのような抗体としては、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラッグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラッグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラッグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記の任意のもののエピトープ結合フラッグメントを挙げることが可能である。例えば生物学的試料中のヌクレオチド配列の検出で、または代わりに、異常性遺伝子活性の阻害用の方法として、下記さらに記載するように例えば疾患標的ヌクレオチド配列の阻害で、このような抗体を用いることが可能である。従って、このような抗体を、心血管または他の疾患治療方法の一環として利用することが可能であり、かつ／あるいは診断技術の一環として利用することが可能である。該診断技術によって、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の異常レベルに関してまたはこのようなタンパク質の異常形態の存在に関して患者を試験することが可能である。
【０４０１】
ヌクレオチド配列に対する抗体の生産のために、ヌクレオチド配列またはその部分にコードされるタンパク質を用いた注入によって、種々の宿主動物を免疫化することが可能である。そのような宿主動物としては、限定はされないが、少数ではあるが例を挙げるとすれば、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられ得る。宿主種に応じた種々のアジュバントを用いて、免疫学的応答を増大させることが可能であり、該アジュバントとしては、限定はされないが、フロイントの（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレチシンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
【０４０２】
ポリクローナル抗体は、遺伝子産物などの抗原またはその抗原的機能性誘導体で免疫化した動物の血清由来の抗体分子の異種の集まり、である。ポリクローナル抗体の生産のために、上述のアジュバントを補充した遺伝子産物の注入によって、上述したような宿主細胞を免疫化することが可能である。
【０４０３】
培養で継続的細胞系による抗体分子の産生を与える任意の技術によって、特定の抗原に対する抗体の同種の集まりであるモノクローナル抗体を得ることが可能である。このようなものとしては、限定はされないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｌｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンのクラスのものでありうる。この発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することが可能である。
【０４０４】
さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）を用いることができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０４０５】
あるいは、一本鎖抗体を産生するために記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を適合させて、ヌクレオチド配列−一本鎖抗体を生産することができる。アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラッグメントを結合させ、一本鎖ポリペプチドを生じることによって、一本鎖抗体を形成する。
【０４０６】
公知の技術によって、特異的エピトープを認識する抗体フラッグメントを生成することが可能である。例えば、そのようなフラッグメントとしては、限定はされないが、抗体分子のペプシン消化によって生産することができるＦ（ａｂ’）２フラッグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラッグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂフラッグメントが挙げられる。また、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラッグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【０４０７】
（疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列）
本発明は、疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列および疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列セットも提供する。上述のように同定する診断用オリゴヌクレオチドセット、そのサブセット、新規なオリゴヌクレオチド配列、および診断用オリゴヌクレオチドセットの個々の成分も疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列である。具体的には、差次的に調節されるか、あるいは疾患または疾患基準に強く相関する予測値を有する個々のオリゴ
ヌクレオチド配列が疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列として得に有利である。共調節される遺伝子セットも疾患特異的標的オリゴヌクレオチドセットとして同定することが可能である。そのようなオリゴヌクレオチド配列および／またはオリゴヌクレオチド配列産物は、種々の薬剤および技術による調節に対する標的である。例えば標的特異的モノクローナル抗体または小分子インヒビター、あるいは患者へのオリゴヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチド配列遺伝子産物の送達によって、例えば疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列（あるいは該オリゴヌクレオチド配列の産物または疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列のセット）を阻害または活性化することができる。種々の薬剤および技術によって、遺伝子セットも阻害または活性化することができる。標的オリゴヌクレオチド配列の特定の有用性は、標的オリゴヌクレオチド配列が発見された被験体集団と、標的オリゴヌクレオチドが相関する疾患または疾患基準とに依存する。
【０４０８】
（画像化）
本発明はまた、画像化試薬を提供する。差示的に発現される白血球ヌクレオチド配列、診断用ヌクレオチドセット、またはそれらの部分、および本発明の新規のヌクレオチド配列は、疾患を有するかまたは有さない細胞において発現されるヌクレオチド配列である。疾患状態において差示的に発現されるヌクレオチド配列を発現する白血球は、身体内で、画像化の目的のために、目的の部位に局在し得る。例えば、アテローム性動脈硬化症を有する個体において差示的に発現されるヌクレオチド配列を発現する白血球は、アテローム性動脈硬化性プラークの部位で、局在するかまたは蓄積し得る。このような白血球は、標識された場合、標識された白血球が、例えば、アテローム性動脈硬化症の場合、アテローム性動脈硬化性プラークに蓄積するかまたは局在する身体の領域を画像化する際に使用するための検出試薬を提供し得る。例えば、白血球が、被験体から収集され、インビトロで標識され、そして被験体に再導入される。あるいは、標識された試薬が、被験体個体に導入され、そして白血球の標識が、この患者において生じる。
【０４０９】
本発明の画像化標的を検出する画像化剤は、周知の分子法および免疫学的方法で生成される（例示的なプロトコールについては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）を参照のこと）。
【０４１０】
例えば、全長核酸配列、あるいは免疫原性ペプチドフラグメントまたはポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子フラグメントが、簡便な発現ベクター（例えば、インフレームエピトープ、または後の精製を容易にするための基質結合タグをを含むベクター）中にクローニングされる。次いで、タンパク質が、このクローニングされたｃＤＮＡ配列から発現され、そして画像化標的タンパク質の１つ以上の抗原に対する抗体または他の特異的結合分子を作製するために使用される。あるいは、発現された画像化標的を特異的に結合する（またはこれに特異的に結合している)低分子天然もしくは合成のポリペプチド（
もしくはペプチド）、またはが、十分に確立された技術によって同定され得る（例えば、Ｍｅｎｄｅｌら（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １５：２９−４１；Ｗｉｌｓｏｎ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７：７３−９８；ＨａｍｂｙおよびＳｈａｗｗａｌｔｅｒ（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８２：１６９−９３；およびＳｈｉｍａｚａｗａら（１９９８）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ
Ｂｉｏｌ  ８：４５１−８を参照のこと）。結合分子（例えば、抗体、低分子リガンドなど）は、造影剤または他の検出可能な標識（例えば、ガドリニウム、ヨウ素またはγ放射源）で標識される。白血球に関連する疾患プロセスのインビボにおける画像化のために、標識された抗体は、被験体（例えば、ヒト患者または動物被験体）に注入され、そしてこの抗体が標的細胞に結合するのを可能にするのに十分な時間おかれる。次いで、この被験体は、適切な技術（例えば、ＭＲＩ（この標識がガドリニウムである場合））を用いて、またはγカウンター（この標識がγ放射体である場合）を用いて画像化される。
【０４１１】
（白血球接着に関与するヌクレオチド配列の同定）
本発明には、白血球接着に関与するヌクレオチド配列の同定方法も包括される。内皮細胞と白血球との間の相互作用は、全ての炎症性障害の根本をなすメカニズムであり、該炎症性障害としては、表３に列記した疾患が挙げられる。例えば、アテローム性動脈硬化症の第１の明白な異常は、内皮への接着および単核細胞（例えばＴ細胞および単球）の血管外遊出である。内皮への侵襲（例えば、サイトカイン、タバコ、糖尿病、高血圧、および他の多くのもの）によって、内皮細胞活性化を生じる。その後、内皮は、単核細胞に対するカウンターレセプターを有する接着分子を発現する。白血球レセプターが内皮接着分子に結合したら、該白血球レセプターは、内皮に接着し、短距離を回転移動（ｒｏｌｌ）して停止し、内皮外へと遊走（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）する。急性および慢性炎症両方で、類似の接着事象が起こる。白血球が内皮接着分子に、あるいは内皮または他の細胞によって分泌される可溶性サイトカインに結合するとき、遺伝子発現プログラムが白血球内で活性化される。この発現プログラムによって、白血球回転移動（ｒｏｌｌｉｎｇ）、強固な接着、および血管壁または実質組織への遊走（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を生じる。この過程の阻害は、抗炎症薬剤開発で非常に望まれる目標である。さらに、この過程で差次的に発現する白血球ヌクレオチド配列および上皮細胞ヌクレオチド配列は、疾患特異的標的ヌクレオチド配列でありうる。
【０４１２】
標準的方法を用いて、例えばヒト冠状動脈、ヒト大動脈、ヒト肺動脈、ヒト臍静脈、または微小血管内皮細胞に由来するヒト内皮細胞をコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な単層として培養する。その後、サイトカインまたは酸化ＬＤＬ、高血糖、剪断応力、または低酸素などの別の活性化刺激に内皮細胞のいくつかをさらす（Ｍｏｓｅｒら，１９９２）。いくつかの内皮細胞は、そのような刺激にさらさず、コントロールとして機能させる。例えば、ヒト組み換えＩＬ−１α  ５Ｕ／ｍｌまたはＴＮＦ（腫瘍壊死因子）１０ｎｇ／ｍｌを含有する培養培地を用いて、内皮細胞単層を数分から一晩インキュベートする。培養培地組成を変更して、またはフラスコを密封して低酸素を誘引する。さらに、組織培養プレートを回転させて、剪断応力を誘発する。
【０４１３】
クロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）製のＬＧＭ−３倍地を用いて、ヒトＴ細胞および／または単球を組織培養フラスコまたはプレートで培養する。３７℃で、５％ＣＯ２、および９５％湿度で、細胞をインキュベートする。これらの白血球を、内皮細胞単層上に白血球の懸濁液を添加することによって活性化またはコントロール内皮層にさらす。組織培養処理プレート／フラスコ上、または微孔性膜上で、内皮細胞単層を培養する。暴露の可変させる継続期間後、全ての細胞をトリプシンで処理して、ＰＥＣＡＭ−１等の内皮細胞特異的マーカーに対する磁気親和試薬による白血球から内皮細胞を選別することによって内皮細胞および白血球を別々に回収する（幹細胞技術）。標準的技術によって、ＲＮＡを単離細胞から抽出する。白血球ＲＮＡを上述のように標識し、白血球候補ヌクレオチドライブラリーにハイブリダイズする。上皮細胞ＲＮＡも標識して、白血球候補ヌクレオチドライブラリーにハイブリダイズする。また、白血球候補ライブラリーに対して上述した方法に従って調製して、上皮細胞ＲＮＡを上皮細胞候補ヌクレオチドにハイブリダイズする。
【０４１４】
候補ヌクレオチドライブラリーへのハイブリダイゼーションによって、接着を受ける白血球および／または上皮細胞中で上方調節または下方調節されるヌクレオチド配列が明らかになる。差次的に調節されるヌクレオチド配列は、上述のように、例えば完全長配列を単離および配列決定すること、ＤＮＡおよび予測タンパク質配列の分析、およびヌクレオチド配列のタンパク質産物の機能的特徴付けによってさらに特徴付けられる。更なる特徴付けによって、炎症過程の調節に対する候補標的でありうる白血球接着特異的標的ヌクレオチド配列の同定を生じる。小分子または抗体インヒビターを開発して、標的ヌクレオチド配列機能を阻害することができる。このようなインヒビターを、白血球接着を阻害する
それらの能力に対して、上述の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験で試験する。
【０４１５】
（集積システム）
発現プロファイルおよび分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の収集および分析と、その編集、本発明のデータベースの保存およびアクセスとに対するの集積システムとしては、配列検索および分析に対する命令セットを含むソフトウエアと、任意でハイスループット流体管理ソフトウエア、画像分析ソフトウエア、データ判読ソフトウエア、デジタルコンピューターに操作可能に接続したソースから目的地（検出装置等の）に解を移すためのロボット的コントロールアーマチュア、デジタルコンピューターに被験体データを入力するため、または分析操作もしくはロボット的コントロールアーマチュアによるハイスループット試料移動を制御するための入力装置（例えばコンピューターキーボード）を有するデジタルコンピューターが挙げられる。任意で、集積システムは、標識アッセイ構成要素、例えば候補ライブラリーマイクロアレイにハイブリダイズした標識核酸からの標識シグナルをデジタル化するための画像スキャナをさらに有する。画像スキャナを画像分析装置と接続して、ハイブリダイズした標識の存在または強度の測定、すなわちオン／オフ発現パターンあるいは発現での増加または減少の指標を提供することができる。
【０４１６】
標準的オペレーティングシステムを用いた容易に入手できるコンピューターハードウエアリソースが十分に適しており、例えばＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ適合ＤＯＳ（登録商標）、ＯＳ２（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＮＴ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９８（登録商標）、ＬＩＮＵＸ（登録商標）、あるいはＭａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）、Ｓｕｎ、またはＰＣでも十分である）が本発明の集積システムで使用される。本明細書で上述したように、設計、例えばオープンアーキテクチャオブジェクト指向発見的アルゴリズム、または発現分析用の命令セットの設計に対して、ソフトウエア技術での現在の技術が同様に適している（すなわち、多数の成熟段階のプログラミング言語およびソースコードサプライヤー）。例えば、本明細書の方法に従って、Ｖｉｓｕａｌ  ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）等の標準的プログラミング言語を用いる技術を有する者によって、分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）をアラインメントまたは操作するためのソフトウエアを構築することができる
様々な方法と、遺伝的アルゴリズムおよびニューラルネットワークを含むアルゴリズムとを用いて、データ収集、相関、および保存機能とともに、本明細書で上述したような他の望ましい機能を実行することができる。さらに、デジタルまたはアナログコンピューターシステム等のデジタルまたはアナログシステムは、ディスプレイならびに／または入力および出力ファイルの制御等の様々な他の機能を制御することができる。
【０４１７】
例えば発現パターンまたはプロファイル、被験体医療または背景データ、分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）等に対応する１つ以上の文字列を、デジタルシステムのメモリにロードしたソフトウエアに入力して、命令セットで示されるオペレーションを実行することによって、例えば文書処理ソフトウエア（例えばＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ(
登録商標)またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ(登録商標)）およびデータベースソフト
ウエア（例えばＣｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ(登録商標)、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ(登録商標)等の表計算ソフトウエアあるいはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ(登録商標)またはＰａｒａｄｏｘ(登録商標)等のデータベースプログラム）等の標準的デスクトップ用途を本発明に適合させることができる。例えば、システムには、例えばＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）、またはＬＩＮＵＸシステム等の標準的オペレーティングシステムと併用するユーザーインターフェースと組み合わせて用いる適当な文字列情報を有する前述のソフトエアを含むことができる。例えば、必要なオペレーションをアプリケーションにプログラミングすることによって、またはユーザーによる手操作で実行される必要なオペレーションを用いて（あるいはその両方で）、
文字列を操作するための命令セットである。例えば、ＰＩＬＥＵＰまたはＢＬＡＳＴ等の特殊配列アラインメントプログラムも、例えば核酸またはタンパク質（あるいは対応する文字列）のアラインメント用に本発明のシステムに組み込むことができる。
【０４１８】
上述の統計学的方法のプログラミングされた実施形態等の、例えば発現プロファイルと診断用ヌクレオチドライブラリー成分のサブセットとの間の相関を決定するために、本発明に必要な統計学的方法を実行するためのソフトウエアも本発明のコンピューターシステムに包含される。また、主成分分析（ＰＣＡ）または最小二乗解析等の方法を実行するためのプログラミング要素も該デジタルシステムに包含して、データ間の関係を同定することができる。このような方法に典型的なソフトウエアは、Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒ，Ｍｅ；ウエブサイトｐａｒｔｅｋ．ｃｏｍで提供される。
【０４１９】
任意のコントローラまたはコンピューターは、必要に応じてモニターを含み、該モニターとしては、平面型ディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶表示装置、液晶表示装置）、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、または例えば予測的データを出力するためにユーザーインターフェースとして機能する別の表示装置が挙げられる。マイクロプロセッサー、メモリ、インターフェース回路等の多数の集積回路チップを含むコンピューター回路は、多くの場合、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、書き込み可能ＣＤ−ＲＯＭ等の高容量挿抜可能ドライブ、および他の通常の周辺構成部品を必要に応じて備えるケーシングまたはボックスに置かれる。
【０４２０】
キーボード、マウス、タッチスクリーン等の入力装置は、任意で、例えば比較すべきまたは関連コンピューターシステムで操作すべき配列またはデータセットのユーザーの入力およびユーザー選択を提供する。コンピューターは、通常、セットパラメータまたはデータフィールドへのユーザー入力形態で、またはプログラミングされた命令、例えば種々の異なる特定のオペレーションに対してプログラミングされた命令形態で、ユーザー命令を受け取るための適当なソフトウエアを含む。その後、ソフトウエアは、システムに命令して任意の所望のオペレーションを実行するための適当な言語にこれらの命令を変換する。
【０４２１】
集積システムを特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはプログラム可能倫理回路（ＰＬＤ）回路内に組み入れることも可能である。このような場合、ＡＳＩＣまたはＰＬＤを作製するために用いることができるコンピューター読み取り可能記述子言語に本発明を組み込む。ＰＤＡ、ラップトップ型コンピューターシステム、ディスプレイ、画像編集装置等の種々の他のデジタル装置の回路または倫理プロセッサ内に集積システムを組み込むこともできる。
【０４２２】
デジタルシステムは、発現プロファイルおよび関連被験体データを物理的アッセイと組み合わせてコンパイルまたはモニターする、かつ相関、例えば疾患に対する予測値を用いた分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を確立または改良する学習構成要素を含むことができる。組み合わせの成功および不成功をデータベース中に記録しておき、特定の疾患または状態に対する高予測精度で、診断用ヌクレオチドセットのユーザーまたはデジタルシステムに基づく選択用の位置揃え／基本設定を提供する。
【０４２３】
集積システムは、自動化ワークステーションを含むこともできる。例えば、そのようなワークステーションは、ヒト血液試料由来のＲＮＡを調製することと、同位体標識または非同位体標識でＲＮＡを標識することと、候補ライブラリーの全てまたは部分を有する少なくとも１つのアレイに標識ＲＮＡをハイブリダイズさせることと、ハイブリダイゼーションパターンを検出することとを含む事象の配列を実行することによって、白血球ＲＮＡ試料を調製および分析することができる。ハイブリダイゼーションパターンを適当なデータベースにデジタル化および記録する。
【０４２４】
（自動化ＲＮＡ調製ツール）
本発明は、全血試料由来の単核細胞の調製および単核細胞由来のＲＮＡの調製用の自動化ＲＮＡ調製ツールも含む。好ましい実施形態では、ＲＮＡ調製ツールの使用を完全に自動化するため、細胞分離およびＲＮＡ単離には、人による操作が不要である。完全自動化は、延滞を最小にし、かつ異なるライブラリーにわたって試料調製を規格化するので有利である。この規格化によって、結果の再現精度が増加させる。
【０４２５】
図２は、本発明のＲＮＡ調製ツールによって実施されるプロセスを示す。装置の主要構成要素は、遠心機である（Ａ）。密度勾配溶液、転写／翻訳インヒビター、および遠心後に単核細胞および血清から赤血球を分離するゲル障壁を含有する全血のチューブを、遠心機に入れる（Ｂ）。該障壁は、遠心中に赤血球および顆粒球を透過できるが、単核細胞を通過させない（またはこの障壁物質は、遠心中に単核細胞が障壁のレベルを超えて残るような密度を有する）。遠心後、赤血球および顆粒球を障壁の下でトラップして、単核細胞および血清層の単離を促進する。メカニカルアームがチューブを取り出し、反転させて、単核細胞層および血清を混和する（Ｃ）。次に、このアームは、上清を新しいチューブに注ぐ（Ｄ）一方で、赤血球および顆粒球は障壁の下に残る。または、ニードルを用いて、上清を吸引して、新しいチューブに移す。該装置のメカニカルアームは、蓋の開閉をし、ＰＢＳを分配し、遠心による単核細胞の収集補助を促進して、遠心機の内外にチューブを移動させる。遠心に続いて、上清をこぼすかまたは真空装置によって除去して（Ｅ）、単離単核細胞ペレットを残す。この細胞からのＲＮＡの精製を自動的に実行するとともに、遠心ステップの前および後に、溶解緩衝液および他の精製溶液を自動的に分配および除去する（Ｅ）。その結果、精製ＲＮＡ溶液が生じる。別の実施形態では、カラムまたはフィルター方法を用いて、ＲＮＡ単離を実行する。さらに別の実施形態では、本発明は、細胞溶解で使用するための内蔵ホモジナイザーを含む。
【０４２６】
（他の自動化システム）
固相または液相でのハイスループット試料の調製および評価用の自動化および／または半自動化方法が利用可能であり、市販の装置によってサポートされる。例えば候補ライブラリーの生産および特徴付けを容易にするための細菌コロニーからの核酸の調製用のロボット装置は、例えば１０，０００／４時間までの異なるクローンを同定、サンプリング、および９６ウエルマイクロタイター皿に植菌することができる自動化コロニーピッカー（例えばＱ−ｂｏｔ，Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｕ．Ｋ．）を含む。代替としてまたは追加として、液体取り扱い用のロボット的システムが種々の供給源から利用可能であり、例えばＴａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）が開発した自動合成装置等の自動化ワークステーションと、科学者が実行する手操作を模倣するロボットアームを利用した多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））がある。上記の装置の任意のものが、本発明とともに使用するために、例えばライブラリー構成要素または被験体白血球試料のハイスループット分析に適している。本明細書に記載されるように操作することができるようなこれらの装置に対する変更の性質および実施は、（もしある場合は）当業者には自明である。
【０４２７】
関連アッセイに適当な全手順、例えば試料および試薬ピペッティング、液体分配、時間的インキュベーション、および検出装置のマイクロプレートの最終読み取りを自動化するハイスループットスクリーニングシステムが市販されている。（例えばＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，
ＭＡ等を参照せよ）。これらの設定変更可能なシステムは、高度の柔軟性およびカスタマイゼーションとともに、ハイスループットおよび迅速な起動を提供する。同様に、アレイおよびアレイ読み取り装置は、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、および他のところから入手可能である。
【０４２８】
このようなシステムの製造元は、詳細なプロトコルに様々なハイスループットを提供している。従って、例えばＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合等の調節を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術公報を提供している。
【０４２９】
例えば光学および蛍光検出装置、光学および蛍光顕微鏡、プレート読み取り装置、ＣＣＤアレイ、  ホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）、シンチレーションカウンター、光電管、フォトダイオード等を含む様々な市販の周辺装置およびソフトウエアを、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６またはｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ適合ＤＯＳ(登録商標)、ＯＳ２(登録商標)ＷＩＮＤＯＷＳ(登録商標)、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）
ＮＴ(登録商標)あるいは、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５(登録商標)を用いた機器）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ(登録商標)、またはＵＮＩＸ（登録商標）を用いた（例えばＳＵＮ(登録商標)ワークステーション）コンピューターを用いてデジタル画像あるいはデジタル光学アッセイまたは他のアッセイ結果をデジタル化、保存、および分析するために利用することができる。
【０４３０】
（ウエブサイトでの実施形態）
現地化または分散化コンピューター環境で、上述の方法を実施することができる。例えば、現地化コンピューター環境を用いる場合、候補ヌクレオチドライブラリーまたは診断用ヌクレオチドセットを含むアレイを検出装置に近接して構成し、該検出装置は、今度は、ユーザー入出力機能を備えたコンピューター装置に連結する。
【０４３１】
分散化コンピューター環境では、複数のプロセッサを有する単一コンピューター上、または複数のコンピューター上で、該方法を実施することができる。例えば共有バスを介して、該コンピューターを連結することもできるが、通常は、該コンピューターは、ネットワーク上のノードである。該ネットワークを現地レベルで一般化または公共使用化すること、あるいは広範な地理的領域にわたって分散させることができる。特定の実施形態では、該コンピューターは、イントロネットまたはインターネットの構成要素である。
【０４３２】
被験体分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）（例えば発現プロファイル、または関連診断、予後、またはモニタリング結果）に対応する予測的データを種々の関係者（ｐａｒｔｙ）によって共有することができる。具体的には、このような情報は、被験体、被験体の医療開業医または提供者、会社または他の機関、あるいは科学者によって利用されうる。コンピューター読み取り媒体に記録された個々の被験体データ、データベースサブセット、または全データベースに、任意の通信手段によって、ユーザーが直接アクセスすることができ、該通信手段としては、限定はされないが、インターネットが挙げられる。適当なコンピューター装置、集積システム、通信ネットワークを用いて、遠隔地にいるユーザーと、近くにいるユーザーとが、例えば同様の物理的容易さで、記録された情報にアクセスすることができる。任意で、データサブセットにアクセスすることを可能にする重複しない英数字パスワードを用いて、データベースへのアクセスを制御することができる。このような規定を用いて、例えばプライバシー、匿名性等を確実にすることができる。
【０４３３】
代表的には、クライアント（例えば患者、開業医、提供者、科学者等）は、ウエブブラウザを動作して、ウエブサーバーを動作するサーバーコンピューターにリンクする。ウエブブラウザは、例えばＩＢＭ’ｓ  Ｗｅｂ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ、ＮｅｔＳｃａｐｅ、またはＭｏｓａｉｃ等のプログラムである。ウエブサ
ーバーは、必ずしもそうではないが通常、ＩＢＭ’ｓ  ＨＴＴＰ  Ｄａｅｍｏｎまたは他のＷ  Ｗ  Ｗ  ｄａｅｍｏｎ（例えばＬＩＮＵＸを用いたプログラム形態）である。クライアントのコンピューターは、回線上でまたはワイヤレスシステムを解してサーバーコンピューターに双方向的に連結する。今度は、サーバーコンピューターは、この発明の方法を実施するソフトウエアへのアクセスを提供するウエブサイト（ウエブサイトのホストとして働くサーバー）と双方向的に連結する。
【０４３４】
インターネットに接続したクライアントのユーザーまたはインターネットによって、クライアントは本明細書に記載される方法の実施を提供するアプリケーションのホストとして働くウエブサイトの部分であるリソースを要求することが可能である。その後、サーバープログラムは、要求を処理して、特定のリソースを返す（それらが現在も利用可能であると仮定して）。Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌｏｃａｔｏｒ（「ＵＲＬ」）として知られる標準的な表記法が採用されている。この方法は、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（「ｈｔｔｐ」）、Ｆｉｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（「ｆｔｐ」）、ｇｏｐｈｅｒ、およびＷｉｄｅ  Ａｒｅａ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（「ＷＡＩＳ」）等のサブクラスを現在含んでいる複数種類のロケーション名を包括する。リソースをダウンロードするとき、付加的な離そーツのＵＲＬも含むことが可能である。従って、クライアントのユーザーは、該ユーザーが特定的に要求した新規リソースの存在を容易に知ることができる。
【０４３５】
イントラネットを実施する方法ならびに／あるいはコンピューターおよび／またはデータアクセス過程のイントラネット実施形態は、当業者に周知であり、例えばＡＣＭ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３８３−３９２；ＩＳＯ−ＡＮＳＩ，Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｒａｆｔ，”Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ＳＱＬ”，Ｊｉｍ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊｕｌ．１９９２；ＩＳＯ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｒａｆｔ，”Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ＳＱＬ−Ｐａｒｔ  ２：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＳＱＬ／Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）”，ＣＤ９０７５−２：１９９．ｃｈｉ．ＳＱＬ，Ｓｅｐ．１１，１９９７；およびＣｌｕｅｒら，（１９９２）Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｑｕｅｒｉｅｓ，Ｐｒｏｃ  ＳＩＧＭＯＤ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄａｔａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｊｕｎ．２−５，１９９２，ＳＩＧＭＯＤ  Ｒｅｃｏｒｄ，ｖｏｌ．２１，Ｉｓｓｕｅ  ２，Ｊｕｎ．，１９９２；Ｓｔｏｎｅｂｒａｋｅｒ，Ｍ．，Ｅｄｉｔｏｒに記載されている。他のリソースは、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ、ＩＢＭ、Ｓｕｎ、および他のソフトウエア開発会社から入手可能である。
【０４３６】
上述のツール用いて、発見または診断ツールとしての試薬、方法、およびデータベースのユーザーは、発現および被験体データを用いて、中心部データベースに質問することができる。データの各登録を、データベース中の発現および被験体情報の全体に付加する。データを付加するので、付加した臨床および発現データを組み込んだ新規の相関統計分析が自動的に実行される。従って、予測精度および記録分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の相関種類が増加するにつれて、データベースが増加する。
【０４３７】
例えば、患者等の被験体は、彼らの白血球試料の発現分析の結果と、患者が属する任意の特定の診断（または予後、またはモニタリング、またはリスク集団）の見込みに関する任意の蓄積知識、すなわち彼らの発現プロファイルおよび／または分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）とにアクセスすることができる。任意で、被験体は、診断、試験結果、発現
プロファイリング時から生じている臨床または他の関連事象に付加的な情報を与えることによって、データベースの予測精度を増すことができる。任意の通信形態を介して、そのような情報をデータベースに与えることができ、該通信形態としては、限定はされないが、インターネットが挙げられる。そのようなデータを用いて、診断集団を連続的に定義（および再定義）することができる。例えば、１０００人の患者が、彼らの発現プロファイリングから５年にわたって心筋梗塞の発生に関するデータを提出し、これら患者のうち３００人が心筋梗塞を経験したと報告しかつ７００人が経験していないと報告する場合、該３００人の患者は、新規の「集団Ａ」と定義される。アルゴリズムを用いて、データベースに連続的に質問および改訂をするので、集団ＡおよびＢ（すなわち、５年期間内で心筋梗塞であったか、またはなかった）を区別する新規の診断用ヌクレオチドセットを同定する。その後、この新規に定義されるヌクレオチドセットを、５年期間にわたる心筋梗塞の発生を予測する判断材料として用いる（上述の方法で）。患者による直接的な提出を上記に例示したが、関連データを提出するアクセスおよび権限を有する任意の個体、例えば患者の開業医、研究技術者、医療または研究執行者等がそのようにすることもできる。
【０４３８】
上記の例から明らかであるように、インターネットを介した（またはイントラネットを介した）情報の送信は、必要に応じて双方向である。すなわち、例えば、通信システムを介して、発現プロファイル、被験体データ等に関するデータをデータベースに送信する一方で、分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）、予測分析等に関する情報がデータベースからユーザーに送信される。例えば、診断用ヌクレオチドセットを有するマイクロアレイを含む集積システムの適当な構成を用いて、コンピューター装置に連結した検出装置は、本発明の方法に従った分析用の中央データーベースに、発現プロファイルおよび対応する個々の識別子を直接送信（現地的に、またはかなりの距離の遠隔ワークステーションから、例えばデータベースから数百または数千マイル離れて）することができる。例えば上述のアルゴリズムに従って、個々の識別子を１つ以上の診断（または予後、またはモニタリング等）分類に割り当てる。その後、例えば同様の通信モードを介して、同じまたは異なるインターネット（またはイントラネット）アドレスにいる受取人この分類結果を中継する。
【０４３９】
（キット）
本発明をユーザーにキットとして、任意に提供する。一般的に、キットには本発明の一つ以上の診断用ヌクレオチドセットが含まれる。あるいは、キットには本発明の候補であるヌクレオチドライブラリが含まれる。ほとんどの場合、診断用ヌクレオチドプローブセット、または他の候補ライブラリの部分セット（例えば、いづれかの発現プロファイリング技術を用いて診断用遺伝子セットを試験するためのｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または抗体マイクロアレイ、もしくは試薬など）が適切な容器に収められている。さらに、このキットは、一つ以上の付加試薬（例えば、発現産物を標識するための基質、ラベル、プライマー）、チューブおよび／または他の付属品、採血試料、緩衝液（例えば、赤血球溶解緩衝液、白血球溶解緩衝液）、ハイブリダイゼーションチェンバー、カバーガラス等、ならびにソフトウェアパッケージ（例えば、本発明の統計学的方法を含めて、すなわち上記のとおり、編集されたデータベースにアクセスするためのパスワードおよび／またはアカウント番号）を含む。さらに、キットには、本発明の方法において診断用ヌクレオチドセットを使用する好ましい方法を詳述している取扱説明書一式、またはユーザー向けマニュアルを任意に含めることができる。１つの実施形態において、マイクロアレイを使用して診断用ヌクレオチドセットを発見するのに有用な内容物を含めても良い。キットには、エンドトキシン、およびＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を含まない無菌の血液採取チューブを含めることができる。キットにはまた、アルコール消毒綿、止血帯、血液採取セット、および／またはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；実施例８の方法を単核細胞由来のＲＮＡに使用する場合に必要とされる）を含めることができる。キットにはまた、細胞溶解緩衝液を含めてもよい。キットは、ＲＮＡ単離キット、ＲＮＡを標識するための基質（さまざまな発現プロファイリング技術用に変えることができる）を含むことができる。キット
はまた、以下の一つ以上を含む蛍光マイクロアレイ発現プロファイリング用の材料を含むことができる。：すなわち、逆転写酵素および１０×ＲＴ緩衝液、Ｔ７（ｄＴ）２４プライマー（５’末端にＴ７プロモーターを有するプライマー）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、デオキシヌクレオチド、任意にそれぞれ１００ｍＭ、ＲＮａｓｅ抑制薬、二番目の鎖ｃＤＮＡ緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼリボヌクレオチド、インビトロ転写緩衝液、および／またはＣｙ３およびＣｙ５標識されたリボヌクレオチド。キットはまた、候補の遺伝子ライブラリ、スライド用カバーガラスおよび／またはハイブリダイゼーションチェンバーを含むマイクロアレイを含み得る。さらに、キットは、データから診断用遺伝子セットを同定するためのソフトウェアパッケージを含み得、これは統計学的方法を含み、および／または所望の遺伝子セットの感度および特異性において交換可能である。ソフトウェアは更に、中央に位置するデータベースサーバによるアクセスとデータ分析を容易にし得る。ソフトウェアは更に、中央のデータベースサーバにアクセスするためにパスワードとアカウント番号を含み得る。加えて、キットはユーザー向けキットマニュアルを含むことができる。
【０４４０】
もう一つの実施形態で、キットには、マイクロアレイを用いて診断用ヌクレオチドセットを適用するのに有用な内容物を含み得る。キットには、エンドトキシンおよび／またはＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を含まない無菌の血液採取チューブを含み得る。キットはまた、アルコール消毒綿、止血帯および／または血液採取セットを含み得る。キットは、更にＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水；実施例２の方法を単核ＲＮＡを誘導するために使用する場合に必要とされる）、細胞溶解緩衝液、および／またはＲＮＡ単離キットを含み得る。加えて、キットは、ＲＮＡを標識するための基質（さまざまな発現プロファイリング技術用に変え得る）を含み得る。蛍光マイクロアレイ発現プロファイリング用に、構成材料には、逆転写酵素および１０×ＲＴ緩衝液、Ｔ７（ｄＴ）２４プライマー（５’末端にＴ７プロモーターを有するプライマー）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、デオキシヌクレオチド（任意にそれぞれ１００ｍＭ）、ＲＮａｓｅ抑制薬、第２の鎖ｃＤＮＡ緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写緩衝液、および／またはＣｙ３およびＣｙ５標識されたリボヌクレオチドを含むことができる。キットには更に、候補遺伝子ライブラリを含むマイクロアレイを含めることができる。キットは、また、スライド用カバーガラスおよび／またはハイブリダイゼーションチェンバーを含むことができる。キットは、データから診断用遺伝子セットを同定するためのソフトウェアパッケージを含むことができる。ソフトウェアパッケージは、統計学的方法を含み、所望の遺伝子セットの感度および特異性において交換可能であり、および／または中央に位置するデータベースサーバによるアクセスとデータ分析を容易にすることができる。ソフトウェアパッケージは、中央のデータベースサーバにアクセスするためのパスワードとアカウント番号を含み得る。加えて、キットは、ユーザー向けキットマニュアルを含むことができる。
【０４４１】
もう一つの実施形態で、キットは、リアルタイムＰＣＲを使用して診断用ヌクレオチドセットを適用するのに有用な内容物を含み得る。このキットには、エンドトキシン、および／またはＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を含まない無菌の血液採取チューブを含み得る。キットは更に、アルコール消毒綿、止血帯および／または血液採取セットを含むことができる。キットはまた、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水；実施例２の方法を単核ＲＮＡを誘導するために使用する場合に必要とされる）を含み得る。加えて、キットは、細胞溶解緩衝液および／またはＲＮＡ単離キットを含み得る。キットはまた、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）用基質を含みえ、これはポリｄＴプライマー、ランダムな六量体プライマー、逆転写酵素とＲＴ緩衝液、ＤＴＴ、デオキシヌクレオチド１００ｍＭ、Ｒｎａｓｅ  Ｈ、診断用および制御用遺伝子セットに対するプライマー一組、１０×ＰＣＲ反応緩衝液、および／またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含めて、様々なリアルタイムＰＣＲ技術によって変わる。キットはまた、診断用および制御用遺
伝子セットのための蛍光プローブ（あるいは、二重鎖ＤＮＡだけと結合する蛍光色素）を含み得る。更に、キットは、試料同定用バーコード、セット全体の１つのバーコード、またはプレートの反応チューブごとの個々のバーコードを有する９６穴プレート、試料追跡用バーコードの有無にかかわらず反応チューブを含むことができる。キットはまた、データから診断用遺伝子セットを同定するためのソフトウェアパッケージ、および／または統計学的方法を含むことができる。ソフトウェアパッケージは、所望の遺伝子セットの感度および特異性において交換可能にすることができ、および／または中央に位置するデータベースサーバによるアクセスとデータ分析を容易にすることができる。キットは、中央のデータベースサーバにアクセスするためにパスワードとアカウント番号を含むことができる。最後に、キットはユーザー向けキットマニュアルを含むことができる。
【０４４２】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによってさらに良く理解されるであろう。
【実施例】
【０４４３】
（実施例の表題リスト）
実施例１：候補遺伝子ライブラリを含む白血球ｃＤＮＡアレイの調製
実施例２：発現プロファイリングのための単核細胞からのＲＮＡの調製
実施例３：白血球発現プロファイリングにおいて使用するためのユミバーサルコントロールＲＮＡの調製。
実施例４：ＲＮＡの標識および候補ヌクレオチド配列の白血球ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション。
実施例５：候補同種移植拒絶の診断および処置において有用な診断用遺伝子セットの同定のための臨床研究。
実施例６：腎臓および肝臓の同種移植拒絶のための診断用ヌクレオチドキットの同定。
実施例７：サイトメガロウイルスの診断のための診断用ヌクレオチドセットの同定：
実施例８：オリゴヌクレオチドプローブの設計：
実施例９：８，０００スポットの５０マーオリゴヌクレオチドのアレイの生成。
実施例１０：マイクロアレイを使用する心臓同種移植拒絶の診断のための診断用ヌクレオチドセットの同定。
実施例１１：総ＲＮＡの増幅、標識およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション。
実施例１２：アレイ発現結果のリアルタイムＰＣＲ評価。
実施例１３：急性同種移植拒絶のリアルタイムＰＣＲ発現マーカー。
実施例１４：マイクロアレイを使用する心臓同種移植拒絶の診断のための診断用ヌクレオチドセットの同定。
実施例１５：相関および分類分析。
実施例１６：急性同種移植拒絶：生検組織発現プロファイリング。
実施例１７：急性同種移植拒絶の診断およびモニタリングのためのマイクロアレイおよびＰＣＲ遺伝子発現。
実施例１８：アレイサンプルの調製。
実施例１９：同種移植拒絶診断用遺伝子配列分析。
実施例２０：診断用遺伝子配列によって発現されるタンパク質の検出。
実施例２１：造血速度の変化の検出。
【０４４４】
（実施例１：候補遺伝子ライブラリを含む白血球ｃＤＮＡアレイの調製）
白血球発現プロファイリングのための候補遺伝子および遺伝子配列を、本明細書中の他の箇所に記載される方法によって同定する。候補遺伝子を使用して、種々の方法における末梢白血球発現プロファイリングのためのプローブを得るかまたは設計する。
【０４４５】
３８４個のプローブを有するｃＤＮＡマイクロアレイを、初期候補ライブラリから選択される配列を使用して構築した。ｃＤＮＡを、Ｔ細胞ライブラリ、ＰＢＭＣライブラリおよび軟膜ライブラリから選択する。
【０４４６】
（９６ウェルＰＣＲ）
プラスミドを９６ウェル様式で単離し、そしてＰＣＲを９６ウェル様式で実施した。反応緩衝液、ｄＮＴＰ、順方向プライマーおよび逆方向プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むマスター混合物を作製する。９９μｌのマスター混合物を、９６ウェルプレートに分割した。プラスミドの１μｌのプラスミド（１〜２ｎｇ／μｌ）をこのプレートに添加した。この反応物の最終濃度は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、３．５ｍＭ
ＭｇＣｌ２、２５  ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．４μＭ  Ｍ１３順方向プライマー、０．４Ｍ  １３逆方向プライマー、および１０ＵのＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：
工程１：９５℃で１０分間
工程２：９５℃で１５秒間
工程３：５６℃で３０秒間
工程４：７２℃で２分１５秒間
工程５：工程２を３９回
工程６：７２℃で１０秒間
工程７：４℃で最後まで。
【０４４７】
（ＰＣＲ精製）
ＰＣＲ精製を、９６ウェル様式で実施する。ＡｒｒａｙＩｔ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）のＰＣＲ精製キットを使用し、そして、提供されるプロトコールに、変更なしで従った。サンプルを乾固するまでエバポレートする前に、ＰＣＲ産物の濃度を分光計を使用して決定した。エバポレーションの後、このサンプルを１×Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＡｒｒａｙＩｔ）に再懸濁し、このサンプルの大部分が、０．２〜１．０μｇ／μｌの間にあるようにした。
【０４４８】
（アレイの製造）
次いで、スポット化ｃＤＮＡマイクロアレイを、ＡｒｒａｙＩｔによるＰＣＲ産物から、そのプロトコール（これはＡｒｒａｙＩｔウエブサイトで見出され得る）を使用して作製する。各フラグメントを各アレイに３回スポットした。白血球発現プロファイリングのための候補遺伝子および遺伝子配列を、本明細書中の他の箇所に記載される方法によって同定する。これらの候補遺伝子を、末梢白血球発現プロファイリングのために使用する。候補ライブラリを使用して、種々の様式で、発現プロファイリングのためのプローブを得るかまたは設計し得る。
【０４４９】
オリゴヌクレオチドプローブを、表２、表８および配列表の遺伝子配列を使用して調製する。オリゴプローブを、種々の会社（例えば、Ｃｏｍｐｕｇｅｎ、Ｍｅｒｇｅｎ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）による契約条件に基づいて設計するか、またはＭＩＴウェブサイト位置してに示されるような種々のパラメータおよびアルゴリズムを使用して、候補配列から設計する。簡単に述べると、合成されるオリゴヌクレオチドの長さが決定され、好ましくは、１８ヌクレオチドより大きく、一般的には、１８〜２４ヌクレオチド、２４〜７０ヌクレオチドであり、いくつかの場合において、７０ヌクレオチドより大きい。上記の配列分析アルゴリズムおよびツールを、この配列に適用して、反復エレメント、ベクター配列および低複雑性配列をマスクする。（遺伝子配列データベース（例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＵｎｉＧｅｎｅ、ｄｂＥＳＴまたはＮＣＢＩの非縮重データベース）に対する、研究中のオリゴヌクレオチド配列のＢｌａｓ
ｔ  ｎ検索に基づいて）候補ヌクレオチド配列に対して特異的であり、かつ＜５０％  Ｇ含有量および２５〜７０％のＧ＋Ｃ含有量を有するオリゴヌクレオチドを選択する。所望のオリゴヌクレオチドを、周知の方法および装置を使用して合成するか、または会社（例えば、Ｓｉｇｍａ）に注文する。オリゴヌクレオチドをマイクロアレイにスポットする。あるいは、オリゴヌクレオチドを、種々の技術（Ｈｕｇｈｅｓら、２００１、Ｙｅｒｓｈｏｖら、１９９６，Ｌｏｃｋｈａｒｔら、１９９６）を使用して、アレイ表面上で直接合成する。
【０４５０】
（実施例２：発現プロファイリングのための単核細胞からのＲＮＡの調製）
以下の方法を使用して、白血球発現プロファイリングのために、被験体から血液を単離した。患者毎に２つのチューブを用いた。標準的末梢静脈血抽出物から、あるいは大腿動脈、大腿静脈、鎖骨下静脈、または内頚静脈に挿入した大量の動脈内または静脈内カテーテルから直接、血液を抽出した。ヘパリンが後のＲＮＡ反応物に干渉し得るので、血管内カテーテルからのヘパリンによる試料汚染を避けるたように注意を払った。
【０４５１】
各チューブに対して、全血８ｍｌを、抗凝固剤である作用クエン酸塩と、２５℃密度勾配溶液（例えばＦｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ）と、遠心するとＲＢＣおよび顆粒球は透過するが単核細胞は透過しないポリエステルゲル障壁とを含有するチューブ（ＣＰＴ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  注文番号３６２７５３）に採血した。チューブを数回反転して抗凝血剤と血液を混和した。スイングアウトローター中で、室温で２０分間、チューブを１７５０×ｇで遠心した。遠心機からチューブを取り出して、５〜１０回反転して、単核細胞と血漿を混和した一方で、ゲル障壁の下でＲＢＣと顆粒球をトラップした。血漿／単核細胞混合物をｌ５ｍｌチューブにデカントして、リン酸緩化生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍｌを添加する。１５ｍ１チューブを１７５０×ｇで５分間回転させ、細胞をペレットにした。上清を破棄して、ＲＬＴ溶解緩衝液１．８ｍｌを単核細胞ペレットに添加する。緩衝液と細胞を上下にピペッティングして、ペレットの完全な溶解を確実にした。全ＲＮＡの単離を進めることが都合よくなるまで、細胞溶解物を凍結保存した。
【０４５２】
ホモジナイゼーション（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム）およびオンカラムＤＮａｓｅ処理を含む全ＲＮＡ単離のために製造元（１０／９９バージョン）が指示するように、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、溶解単核細胞から全ＲＮＡを精製した。精製ＲＮＡを水５０ｕｌ中で溶出した。この方法によって調製されたＲＮＡのさらなる使用は、実施例１０および１１に記載される。いくつかのサンプルを、異なるプロトコールによって、以下のようにして調製した：
抗凝固剤（クエン酸塩）と、２５℃密度勾配溶液（Ｆｉｃｏｌｌ）と、遠心するとＲＢＣおよび顆粒球は透過するが単核細胞は透過しないポリエステルゲル障壁とを含有するチューブ（ＣＰＴ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、注文番号３６２７５３）に、末梢静脈から２つの８ｍｌ血液試料を採血した。単核細胞および血漿が障壁上に残存する一方で、ＲＢＣおよび顆粒球を下にトラップした。チューブを数回反転させて、抗凝固剤と血液を混和して、２０分間室温で、スイングアウトローター中でこのチューブを１７５０×ｇで遠心にかけた。チューブを遠心機から取り出して、濁った単核細胞層より上にある透明な血漿層を吸引および破棄した。濁った単核細胞層を吸引して、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて、ゲル障壁の表面から、単核細胞の全てを注意してすすいだ。単核細胞懸濁物約２ｍｌを、２ｍｌ微量遠心用チューブに移し、微量遠心機中で１６，０００ｒｐｍで３分間遠心して、細胞をペレットにした。上清を破棄して、細胞を溶解してＲＮａｓｅを不活性化するＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）１．８ｍｌを単核細胞ペレットに添加した。細胞および溶解緩衝液を上下にピペッティングして、ペレットの完全な溶解を確実にした。全ＲＮＡの単離を進めることが都合よくなるまで、細胞溶解物を凍結保存した。
【０４５３】
ＲＮＡ試料を８ｍＬ全血から単離した。収量は、８ｍＬ血液に対して、２μｇから２０μｇ全ＲＮＡの範囲であった。Ａ２６０／Ａ２８０分光光度比は、１．６と２．０との間であり、これは試料の純度を示した。臭化エチジウム存在下で、各試料の２μ１をアガロースゲル上で泳動させた。ＲＮＡ試料の分解およびＤＮＡ混入は、見られなかった。
【０４５４】
いくつかの場合では、単核細胞の特定のサブセットをヒト被験体の末梢血から単離した。これを行った際、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）製のＳｔｅｍＳｅｐ細胞分離キット（マニュアルバージョン６．０．０）を用いた。この同じプロトコールを、Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、および他の細胞の単離に適用することができる。抗体による負の選択を用いる細胞型の単離は、抗体による標的細胞の活性化を避けることが所望され得る。
【０４５５】
（実施例３：白血球発現プロファイリングで使用するための一般的なコントロールＲＮＡの調製）
軟膜由来の全ＲＮＡおよび／または軟膜から単離した濃縮単核細胞由来の全ＲＮＡを用いて、イオノマイシンおよびＰＭＡによる刺激を伴うおよび伴わないの両方で、コントロールＲＮＡを調製した。以下のコントロールＲＮＡを調製した。すなわち、
コントロール１：軟膜全ＲＮＡ
コントロール２：単核細胞全ＲＮＡ
コントロール３：刺激軟膜全ＲＮＡ
コントロール４：刺激単核全ＲＮＡ
コントロール５：５０％軟膜全ＲＮＡ／５０％刺激軟膜全ＲＮＡ
コントロール６：５０％単核細胞全ＲＮＡ／５０％刺激単核全ＲＮＡである。
【０４５６】
以下のプロトコールを用いて、複数の試料を調製した。すなわち、３８個体由来の軟膜を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。各軟膜は、１つの個体から得た約３５０ｍＬまでの全血に由来する。１０ｍｌ軟膜を袋から取り出して、５０ｍｌチューブに入れた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａｇｅｎ）４０ｍｌを添加し、チューブを混合して、氷上に１５分間置き、その後４℃で１０分間、２０００×ｇで遠心することによって細胞をペレットにした。上清をデカントし、細胞ペレットをＱｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ  １０ｍｌ中に再懸濁した。その後、４℃で１０分間、チューブを２０００×ｇで遠心した。その後、１つの軟膜試料につきＴＲＩＺＯＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）２０ｍｌ中で細胞ペレットを再懸濁して、回転ホモジナイザーを用いて混合物を破砕し、その後、ＲＮＡ単離に進む前に、溶解物を−８０℃で凍結した。
【０４５７】
他のコントロールＲＮＡを、軟膜から調製した濃縮単核細胞から調製した。上述したように、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから軟膜を得た。５０ｍｌポリプロピレンチューブに軟膜１０ｍｌを添加し、リン酸塩緩衝液塩類（ＰＢＳ）１０ｍｌを各チューブに添加した。希釈試料に対して等容積の１．０７７＋／−０．０００１ｇ／ｍｌ密度溶液であるポリスクロース（５．７ｇ／ｄＬ）およびジアトリゾア酸ナトリウム（９．０ｇ／ｄＬ）溶液を調製した（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７，Ｓｉｇｍａカタログ番号１０７７−１）。このステップおよびその後のステップ全てを室温で実行した。５０ｍｌチューブ中のｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液１５ｍｌの上に、希釈軟膜／ＰＢＳ  １５ｍｌを層状にした。室温で３０分間、チューブを４００×ｇで遠心した。遠心後、単核細胞を含んでいる不透明な中間面の０．５ｃｍ以内に対する溶液の上層を破棄した。不透明な中間層を新たな遠心チューブに移した。等容積のＰＢＳを各チューブに添加して、室温で１０分間、３５０×ｇで遠心した。上清を破棄した。Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａｇｅｎ）５ｍｌを用いて、残留細胞ペレットを再懸濁して、室温で１０分間、チューブを２０００×ｇで遠心した。上清を破棄した。処理済みの個々の軟膜のそれぞれに対して、ＴＲＩＺＯＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）２０ｍｌ中でペレットを再懸濁した。試料を、回転ホモジナイ
ザーを用いて均質化して、ＲＮＡを単離するまで−８０℃で凍結した。
【０４５８】
以下のように、冷凍溶解軟膜試料からＲＮＡを単離した。すなわち、凍結試料を解凍して、クロロホルム４ｍｌを各軟膜試料に添加した。ボルテックスによって試料を混合して、５分間２０００×ｇで遠心した。水層を新しいチューブへ移し、その後、ＲＮｅａｓｙ
Ｍａｘｉ  ＲＮＡクリーンアップキットを、製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ（ＰＮ  ７５１６２））に従って使用して再精製した。収量、純度、および完全性を、分光光度計とゲル電気泳動法とによって評価した。  
【０４５９】
以下のように、複数の試料を、異なるプロトコールによって調製した。このプロトコールを用いて調製したＲＮＡの更なる使用については、実施例１１に記載する。  
【０４６０】
５０個の全血試料を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｂｌｏｏｄ
Ｃｅｎｔｅｒで、同意した血液ドナーからランダムに選択した。約３５０ｍｌの個体の提供血液から各軟膜試料を生産した。室温で８分間、全血試料を約４，４００×ｇで遠心すると、３つの異なる層が生じた。すなわち、血漿の上層、軟膜の第２の層、および赤血球の第３の層である。軟膜画分２５ｍｌを得て、等容積のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で希釈した。５０ｍＬプラスチックチューブ中で、１．０７７＋／−０．００１  ｇ／ｍｌの密度に調節したジアトリゾア酸ナトリウム溶液（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（Ｓｉｇｍａ））１５ｍｌ上で希釈軟膜３０ｍｌを層状にした。室温で１０分間、チューブを８００ｇで回転した。チューブの３０ｍｌ印まで、血漿層を取り出し、単核細胞層を新たなチューブに移して、等容積のＰＢＳを用いて洗浄して、室温で１０分間、２０００ｇで遠心することによって回収した。ボルテックスによって、Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａｇｅｎ）１０ｍｌ中に細胞ペレットを再懸濁し、１０分間氷上でインキュベートして、いかなる残存赤血球も除去した。４℃で１０分間、単核細胞を２０００ｇで回転した。フェノール／チオシアン酸グアニジニウム溶液（ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５ｍｌ中で細胞ペレットを溶解した。ＰｏｗｅｒＧｅｎｅ５回転式ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＯｍｉｎｉ使い捨てジェネレータプローブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、試料を均質にした。Ｔｒｉｚｏｌ溶解物を、次のステップまで−８０℃で凍結した。
【０４６１】
試料を解凍して、５分間室温でインキュベートした。クロロホルム５ｍｌを、各試料に添加して、ボルテックスによって混合して、３分間室温でインキュベートした。水層を、新しい５０ｍｌチューブへ移した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（ＰＮ
７５１６２）を用いて、製造元のプロトコール（１９９９年１０月）に従って、全ＲＮＡを含有する水層をさらに精製した。各回転前の１分間にインキュベーションして、ＲＮａｓｅ非含有水１ｍｌを用いてカラムを２回溶出した。標準的方法を用いて、ＲＮＡの量および質を評価した。一般に、１０個の軟膜のバッチから一度にＲＮＡを単離した。軟膜１つ当たりの平均収量８７０μｇおよび推定全収量  ４３．５ｍｇ全ＲＮＡであり、２６０／２８０比  １．５６および２８Ｓ／１８Ｓ比  １．７８であった。
【０４６２】
ＲＮＡ  ６０００マイクロフルイディクスチップを用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＮＡの質を試験した。５つの異なるバッチに対するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒから得た電気泳動図の分析によって、バッチ間の質での再現性が実証された。
【０４６３】
５つ全てのバッチから得た全ＲＮＡを組み合わせ、５０ｍｌチューブ中で混合して、その後、以下のようにアリコートした。すなわち、１５ｍｌチューブ中の２×１０ｍｌのアリコートと、１．５ｍｌ微量遠心チューブ中の１００μｌアリコート中の残りとである。これらのアリコートによって、ＲＮＡ純度、大きさ、および完全性に関する高度に再生可
能な結果を得た。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０４６４】
（参照ＲＮＡの試験ハイブリダイゼーション）
ＢＣ３８および刺激単核参照試料を比較した場合、図３に示す他の参照試料より良好でない場合は、Ｒ５０を同様に実行した。ハイブリダイゼーション分析では、本明細書に記載される方法を用いて、Ｒ５０標的をＣｙ−５で蛍光的に標識し、実施例９で記載するオリゴヌクレオチドアレイに、増幅および標識ａＲＮＡをハイブリダイズした（実施例１１の通りに）。Ｒ５０は、３より大きいシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）にてプローブの９７．３％を、そして１より大きいＳ／Ｎにてプローブの９９．９％を、検出した。
【０４６５】
（実施例４：ＲＮＡ標識、および候補ヌクレオチド配列の白血球ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション）
（グアニン−ケイ素精製と酸−フェノール精製との比較）
これらのデータを、２つの異なるＲＮＡ精製方法からのシグナル強度間の差異を同定するために設計された、１２個のハイブリダイゼーションの組から得る。使用した２つのＲＮＡ法は、グアニジン−シリカ（ＧＳ，Ｑｉａｇｅｎ）および酸−フェノール（ＡＰ、Ｔｒｉｚｏｌ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）であった。２つを、ＡＰ調製のために使用し、他の８つを、ＧＳ調製のために使用した。このＡＰ技術およびＧＳ技術を使用する白血球ＲＮＡ調製のためのプロトコルを、本明細書中に記載されるように完了させた。
【０４６６】
（グアニジン−シリカ（ＧＳ）法）
各チューブについて、８ｍｌの血液を、抗凝固剤であるクエン酸と、２５℃密度勾配溶液と、遠心分離の際にＲＢＳおよび顆粒球に対しては透過性であるが単核細胞に対しては不透過性であるポリエステルゲル障壁とを含むチューブ中に、引き込んだ。単核細胞および血漿は、障壁上に残ったが、ＲＢＣおよび顆粒球は、下に捕捉された。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（＃３６２７５３）からのＣＰＴチューブを、この目的のために使用した。このチューブを数回反転させて、血液と抗凝固剤とを混合させた。そのチューブをすぐに、スイングバケットローターにおいて１７５０×ｇにて室温で２０分間遠心分離した。そのチューブを、遠心機から取り出し、５〜１０回反転させた。これにより、血漿と単核細胞とが混合されたが、ＲＢＣと顆粒球とは、ゲル障壁の下に捕捉されたままであった。この血漿／単核細胞混合物を、１５ｍｌチューブ中にデカントし、５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を添加した。１５ｍｌチューブを、１７５０×ｇにて５分間遠心分離して、細胞をペレットにした。上清を廃棄し、１．８ｍＬのＲＬＴ溶解緩衝液（グアニジンイソチオシアネート）を単球細胞ペレットに添加した。この緩衝液および細胞をピペッティングし、ペレットを完全に溶解させた。次いで、細胞溶解物を、総ＲＮＡ単離のためにＱｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットプロトコル（１０／９９バージョン）に記載されるように正確に処理した（均一化（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム）のための工程およびオンラインＤＮａｓｅｓｙ処理を含む）。精製したＲＮＡを、水５０μｌ中に溶出した。
【０４６７】
（酸−フェノール（ＡＰ）法）
各チューブについて、８ｍｌの血液を、抗凝固剤であるクエン酸と、２５℃密度勾配溶液と、遠心分離の際にＲＢＳおよび顆粒球に対しては透過性であるが単核細胞に対しては不透過性であるポリエステルゲル障壁とを含むチューブ中に、引き込んだ。単核細胞および血漿は、障壁上に残ったが、ＲＢＣおよび顆粒球は、下に捕捉された。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（＃３６２７５３）からのＣＰＴチューブを、この目的のために使用した。このチューブを数回反転させて、血液と抗凝固剤とを混合させた。そのチューブをすぐに、スイングバケットローターにおいて１７５０×ｇにて室温で２０分間遠心分離した。そのチューブを、遠心機から取り出し、５〜１０回反転させた。これにより、血漿と単核細胞とが混合されたが、ＲＢＣと顆粒球とは、ゲル障壁の下に捕捉されたままであっ
た。この血漿／単核細胞混合物を、１５ｍｌチューブ中にデカントし、５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を添加した。１５ｍｌチューブを、１７５０×ｇにて５分間遠心分離して、細胞をペレットにした。上清を廃棄し、細胞ペレットを、０．６ｍＬフェノール／グアニジンイソチオシアネート（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して溶解した。その後の全ＲＮＡ単離を、製造業者のプロトコルを使用して進行した。
【０４６８】
各人由来のＲＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５のいずれかで標識し、その後、対にしてミニアレイにハイブリダイズさせた。例えば、第１アレイに、第１のヒト由来のＧＳ  ＲＮＡ（Ｃｙ３）および第２のヒト由来のＧＳ  ＲＮＡ（Ｃｙ５）をハイブリダイズさせた。
【０４６９】
本明細書中に考察されるすべての実験のための標識技術およびハイブリダイゼーション技術を、上記の詳説するように完了した。アレイを、実施例１に記載したように調製した。
【０４７０】
被験体試料から単離したＲＮＡまたはコントロール軟膜ＲＮＡを、ｃＤＮＡアレイに対するハイブリダイゼーションのために標識した。全ＲＮＡ（１００μｇまで）を、２μｌの１００μＭ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）溶液と合わせ、７０℃まで１０分間加熱して、氷上に配置した。反応緩衝液をチューブに、最終濃度の１×ＲＴ緩衝液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、０．１ｍＭ非標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ、ならびに０．０２５ｍＭ非標識ｄＣＴＰ、２００ｐｇのＣＡＢ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ光化学系Ｉクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質）、２００ｐｇのＲＣＡ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＲＵＢＩＳＣＯアクチベーゼ）、０．２５ｍＭのＣｙ−３  ｄＣＴＰもしくはＣｙ−５  ｄＣＴＰ、および４００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に添加した。
【０４７１】
標識反応の各成分の体積は、以下の通りであった：２０μｌの５×ＲＴ緩衝液；１０μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ；１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＣＴＰを含まない）；０．５μｌの５ｍＭ  ＣＴＰ；１３μｌのＨ２Ｏ；０．０２μｌの１０ｎｇ／μｌ  ＣＡＢおよびＲＣＡ；１μｌの４０単位／μｌのＲＮＡｓｅＯＵＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；２．５μｌの１．０ｍＭ  Ｃｙ−３  ｄＣＴＰもしくはＣｙ−５  ｄＣＴＰ；ならびに２．０μｌの２００単位／μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ。サンプルをボルテックスして遠心分離した。サンプルを、第１鎖ｃＤＮＡ合成のために４℃にて１時間インキュベートし、その後、７０℃にて１０分間加熱して、酵素活性をクエンチした。１μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａを添加してＲＮＡ鎖を分解し、サンプルを、３７℃にて３０分間インキュベートした。次に、Ｃｙ−３  ｃＤＮＡサンプルおよびＣｙ−５  ｃＤＮＡサンプルを１つのチューブに合わせた。組み込まれていないヌクレオチドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者に指示される通りに使用して除去した。サンプルをエバポレートして乾燥させ、５μｌの水中に再懸濁した。サンプルを、５×ＳＳＣと０．２％  ＳＤＳと２ｍｇ／ｍｌのＣｏｔ−１  ＤＮＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と、１ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と、１．６ｎｇ／μｌのポリｄＡ４０−６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とを含むハイブリダイゼーション緩衝液と、混合した。この混合物を、マイクロアレイ表面上に配置し、カバーガラススリップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、このアレイ上に配置した。このマイクロアレイスライドガラスを、ハイブリダイゼーションチャンバー（ＡｒｒａｙＩｔ）中に配置した。その後、このチャンバーを、６２℃の水浴中に一晩浸漬した。そのマイクロアレイを、カセットから取り出し、そのマイクロアレイを１×ＳＳＣと０．１％  ＳＤＳとを含む洗浄緩衝液に反復して浸漬することによって、カバースリップを取り除いた。このマイクロアレイスライドを、１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で５分間洗浄した。その後、このスライドを、０．１％  ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ中で５分間洗浄した。このスライドを、最後に、０．１×ＳＳＣ中で２分間洗浄した。このスライドを、１０００ｒｐｍにて２分間遠心分離してスライドを乾燥させ、その後、マイクロアレイスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にてスキャンした。
【０４７２】
２０μｇのＲＮＡを用いる６つのハイブリダイゼーションを、各型のＲＮＡ調製物（ＧＳまたはＡＰ）について実施した。Ｃｙ３標識ＲＮＡおよびＣｙ５標識ＲＮＡの両方が試験調製物に由来するので、各々のＧＳ調製したＣｙ３標識ＲＮＡについて６つのデータ点が存在し、各々のＧＳ調製したＣｙ５標識ＲＮＡについて６つのデータ点が存在する。このミニアレイハイブリダイゼーションを、ＧｅｎＰｉｘ３．０ソフトウェアを使用してＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓスキャナーにてスキャンした。示されるデータは、以下の通り誘導した。第１に、このソフトウェアにより「見出されない」と合図されたすべての特徴を、個々のハイブリダイゼーションについてデータベースから取り除いた。これらの特徴は、通常は、高い局所的バックグラウンドまたは他の処理アーティファクトに起因する。第２に、中央値蛍光強度−バックグラウンド蛍光強度を使用して、各ハイブリダイゼーションについて各色素についての平均バックグラウンド差引きシグナルを計算した。図３において、６つ全てのハイブリダイゼーションにわたるこれらの平均の平均を、グラフ化した（各列についてｎ＝６）。エラーバーは、平均値標準誤差（ＳＥＭ）である。この実験は、ＡＰ調製されたＲＮＡからの平均シグナルは、Ｃｙ３およびＣｙ５の両方について、ＧＳ調製されたＲＮＡからの平均シグナルの４７％である。
【０４７３】
（末梢白血球サンプル由来の白血球遺伝子についての発現データの作成）
６つのハイブリダイゼーションを、上記で与えられるプロトコルを使用して、ヒト血液白血球から精製したＲＮＡを用いて実施した。この６つのうちの４つは、上記ＧＳ法を用いて調製し、２つは、上記ＡＰ法を用いて調製した。白血球ＲＮＡの各調製物を、Ｃｙ３で標識し、１０μｇをミニアレイにハイブリダイズさせた。コントロールＲＮＡを、Ｃｙ５でバッチ標識し、１０μを、Ｃｙ３標識した実験ＲＮＡとともに各ミニアレイにハイブリダイズさせた。
【０４７４】
これらの実験に使用したコントロールＲＮＡは、上記のようなコントロール１（軟膜ＲＮＡ）であった。このＲＮＡの調製のためのプロトコルは、本明細書中に再現される。
【０４７５】
（軟膜ＲＮＡ単離）
軟膜を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから得た（全３８個の個々の軟膜を使用した）。各軟膜は、１人の個体由来の約３５０ｍＬ全血に由来する。１０ｍｌ軟膜を得て５０ｍｌチューブに入れた。４０ｍｌの次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）溶液（Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａｇｅｎ））を添加した。このチューブを混合して、氷上に１５分間置いた。その後、このチューブを４℃で１０分間、２０００×ｇで遠心分離した。その上清をデカントし、細胞ペレットを次亜塩素酸溶液（Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ）１０ｍｌ中に再懸濁した。その後、４℃で１０分間、チューブを２０００×ｇで遠心した。その後、処理した各々の個々の軟膜について２０ｍｌのフェノール／グアニジンチオシアネート溶液（ＴＲＩＺＯＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））中で細胞ペレットを再懸濁した。その後、この混合物を、回転ホモジナイザーを用いて破砕した。その後、ＲＮＡ単離に進む前に、溶解物を−８０℃で凍結した。
【０４７６】
その後、このアッセイを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ３．０ソフトウェアを使用してＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓスキャナーにてスキャンして分析した。示すデータは以下の様にして得た。第１に、このソフトウェアにより「見出されない」と合図されたすべての特徴を、個々のハイブリダイゼーションについてデータベースから取り除いた。第２に、コントロール特徴を使用して、実験中での標識およびハイブリダイゼーション変動についてデ
ータを正規化した。コントロール特徴は、植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子についてのｃＤＮＡであり、これは、ミニアレイをスポットする場合に含めた。これらのｃＤＮＡのうちの２つに対して相補的な等量のＲＮＡを、標識する前にサンプル各々に添加した。第３は、予備標識し、等量を、ハイブリダイゼーション前に各ハイブリダイゼーション溶液に添加した。これらの遺伝子からのシグナルを使用して、本発明者らは、以下の式
【０４７７】
【化１４１】
2010022375.tif 000143
【０４７８】
に従って正規化定数（Ｌｊ）を誘導した。この式において、ＢＧＳＳｉは、特定の特徴について中央値バックグラウンド差引きシグナルとしてＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアにおいて同定されたその特定の特徴についてシグナルであり、Ｎは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａコントロール特徴の数であり、Ｋは、ハイブリダイゼーションの数であり、Ｌは、各個々のハイブリダイゼーションについての正規化定数である。上記の式を使用して、特定のハイブリダイゼーションおよび色素（例えば、Ｃｙ３）のすべてのコントロール特徴に対する平均を、計算した。すべてのＣｙ３ハイブリダイゼーションについてのこれらのコントロール特徴平均の、平均を取った。すべてのハイブリダイゼーションの平均によって誘導された１つのハイブリダイゼーションにおけるコントロール特徴平均は、特定のＣｙ３ハイブリダイゼーションについての正規化定数を与える。
【０４７９】
同じ正規化工程を、Ｃｙ３値およびＣｙ５値について、蛍光およびバックグラウンドの両方を実施した。一旦正規化すると、バックグラウンドＣｙ３蛍光を、各特長についてのＣｙ３蛍光から差引いた。１００未満の値を、さらなる計算から排除した。なぜなら、低い値は、偽の結果を引き起こした。
【０４８０】
図４は、ミニアレイにおけるミニ白血球特異的遺伝子の各々についての平均バックグラウンド差引きシグナルを示す。この平均は、各遺伝子についての上記ハイブリダイゼーションのうちの３〜６についてである。エラーバーは、平均値標準誤差（ＳＥＭ）である。
【０４８１】
Ｃｙ３シグナル対Ｃｙ５シグナルの比が、多数の遺伝子について示される。これらの比は、ハイブリダイゼーション間の変動について補正し、種々の時点において行った実験の間の比較を可能にする。この比は、Ｃｙ５バックグラウンド差引きシグナルによって除算した、Ｃｙ３バックグラウンドシグナルとして計算した。エラーバーは、平均値標準誤差（ＳＥＭ）。
【０４８２】
まとめると、これらの結果は、本発明者らが、白血球の部分集団において特異的に発現される遺伝子についての発現レベルを測定し得ることを示す。これらの発現測定を、逆転写によって直接標識した白血球全ＲＮＡを１０μｇだけ用いて行った。そのシグナル強度は、出発ＲＮＡまたはシグナル蛍光のいずれかを増幅する改善された標識技術によって、増加され得る。さらに、より高感度のスキャニング技術を、使用し得る。
【０４８３】
（図４および図５における遺伝子）
【０４８４】
【化１４２】
2010022375.tif 000144
【０４８５】
（実施例５：心臓同種移植片の診断および処置において有用な診断遺伝子を同定するための臨床研究）
実測研究を、行った。この研究において、心臓移植レシピエントの予想コホートを、臨床事象または拒絶グレードと、白血球候補ヌクレオチド配列ライブラリーの発現との間の関係について分析した。患者を、4つの心臓移植センターにおいて、移植待機リストにて
、またはそのルーティング移植後ケアの間に、同定した。研究期間の間または研究期間開始３ヶ月以内にその研究センターにて器官を受けたすべての生体心臓移植レシピエント（新規移植または再移植）が、適任者であった。移植後第１年目は、最も急性の拒絶が生じる時間であり、従って、この期間の間の患者を研究することが重要である。患者は、研究手順の前にインフォームドコンセントを与えた。
【０４８６】
末梢血白血球サンプルを、以下の時点においてすべての患者から得た：移植手術の前（可能な場合）、慣用的スケジュールのスクリーニング生検と同じ日、疑われる急性拒絶についての評価の際（急性生検）、移植もしくは免疫抑制の急性合併症についての入院の際、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染が疑われるかもしくは確認された際。サンプルは、標準的末梢静脈血採血を通してか、または患者の看護の間に配置されたカテーテル（例えば、心臓内生検のために配置された中心静脈カテーテル）を通して、得た。血液を静脈ラインから得た場合、サンプルとともにヘパリンを得ることを回避するために注意を払った。なぜなら、ヘパリンは、ＲＮＡを含む下流反応を妨害し得るからである。単核細胞を、実施例２に記載されるような全血サンプルから調製した。サンプルを、血液採血の２時間以内に処理し、ＲＮＡに加えて、ＤＮＡおよび血清を、保存した。サンプルを、−８０℃でかまたはドライアイス上で保存し、十分なドライアイスを含む密封容器中のＲＮＡ調製部位に送った。ＲＮＡを、実施例２に記載されるように被験体サンプルから単離し、実施例９〜１０にさらに記載されるように、差次的に発現される白血球ヌクレオチド配列の候補ライブラリーにハイブリダイズさせた。増幅、標識、ハイブリダイゼーションおよびスキャニングのために使用される方法は、実施例１１に記載される。マイクロアレイにハイブリダイズされた人移植患者単核細胞ＲＮＡの分析および診断遺伝子セットの同定が、実施例１０に示される。
【０４８７】
各患者について、臨床情報を、以下の時点において得た：移植手術の前（入手可能な場合）、慣用的スケジュールのスクリーニング生検と同じ日、疑われる急性拒絶についての評価の際（例えば、急性生検）、移植もしくは免疫抑制の急性合併症についての入院の際、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染が疑われるかもしくは確認された場合。データを、患者から直接、患者の医療記録から、診断試験報告から、またはコンピュータ化病院データベースから、得た。研究臨床相関（患者の事象を診断し、どの発現データが相関しているかを述べる）および交絡変数（患者の事象を診断し、変化した白血球遺伝子発現を生じ得ることを述べる）に関する情報をすべて収集することは、重要であった。収集する臨床データの例は、患者の性別、誕生日、移植日、人種、予想クロスマッチの要件、移植前診断および合併症の発生、移植についての徴候、心臓疾患の重篤度および方、左心室補助デバイスの歴史、すべての既知の医療診断、血液型、ＨＬＡ型、ウイルス血清（ＣＭＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、ＨＩＶなど）、血清化学、白血球および赤血球の数および差、ＣＭＶ感染（臨床徴候および診断法）、新しい癌の発症、右心もしくは左心のカテーテル挿入により測定した血流力学パラメーター（移植物機能の尺度）、心エコー検査の結果、冠動脈造影図、血管内超音波検査の結果（移植物血管症の診断）、投薬、投薬の変化、拒絶についての処理、および投薬レベルである。器官ドナーに関する情報（人工統計学、血液型、ＨＬＡ型、スクリーニング培養の結果、ウイルス血清学の結果、脳死の主要原因、変力支持体の必要性、および器官冷却虚血時間を含む）もまた、収集した。
【０４８８】
各訪問時の患者各々についての心臓内生検の結果の収集は、非常に重要であった。生検結果は、下記に記載される、国際心肺移植学会（ＩＳＨＬＴ）の基準を使用して、すべて解釈しそして記録した。生検病理学的グレードを、各センターにて経験を積んだ病理学者が決定した。
【０４８９】
【化１４３】
2010022375.tif 000145
【０４９０】
ＩＳＨＬＴグレードの割当てに変動が存在するので、１人の病理学者による生検スライドの集中的かつ盲検的な読取りを行うことが、重要であった。これは、この分析におけるサンプルに関係するすべての生検スライドについて取り計らった。その後、１人の病理学者によるグレードを、研究センターの病理学者から誘導されたもとのグレードと比較した。
生検グレードに対する白血球遺伝子発現の相関分析のために、集中的読み取り情報を、種々の様式で使用した（より詳細については実施例１０を参照のこと）。いくつかの分析において、もとの読取りのみを、結果として使用した。他の分析においては、集中読取り者からの結果を、結果として使用した。他の分析においては、２つのグレードのうちの最も高いグレードを、使用した。例えば、もとの割当てグレードが０であり、集中読取り者が１Ａを割当てた場合、１Ａが、結果として使用されたグレードであった。いくつかの分析において、最高のグレードを使用し、その後、グレード１Ａ読取りに関連するサンプルを、この分析から排除した。いくつかの分析において、２つの読取りの間の相違がないグレードのみを、相関分析についての結果として使用した。臨床データを、データベース中に入力して保存した。このデータベースを照会して、望ましい基準を満たすべての患者および患者の訪問を同定した（例えば、グレードＩＩを超える生検結果、ＣＭＶ感染なし、移植からの時間１２週間未満を有する患者）。
【０４９１】
収集した臨床データ（疾患基準）を使用して、発現データの相関について患者グループまたはサンプルグループを規定する。患者グループを、例えば、（有用もしくは興味深い臨床特徴を保有する患者グループ）対（その特徴を有さない患者グループ）の比較のために同定する。収集した臨床データに基づいて行い得る有用かつ興味深い患者の特徴の例が、ここで列挙される：
１．  少なくとも中程度の組織学的グレードの拒絶エピソードであり、これは、さらなるコルチコステロイドおよびＴ細胞抗体または全リンパ系照射による患者の処置を生じる。２．  ２以上の組織学的グレードを有する拒絶
３．  ２未満の組織学的グレードを有する拒絶
４．  組織学的拒絶および正常もしくは不変の同種移植片機能の不在（カテーテル挿入からの血流力学測定または心エコーデータに基づく）
５．  重篤な同種移植機能不全の存在または研究期間の間の同種移植片機能不全の悪化（カテーテル挿入からの血流力学測定または心エコーデータに基づく）
６．  培養、組織学的またはＰＣＲにより文書化されたＣＭＶ感染、および少なくとも１つの感染の臨床的徴候もしくは症状
７．  特定の移植片生検拒絶グレード
８．  患者の慢性免疫抑制レジメンの増強を促進する軽度〜中程度の組織学的重篤度の拒絶
９．  血漿瀉血または「体液性」拒絶の診断を促進する同種移植片機能不全を有する、軽度〜中程度の重篤度の拒絶
１０．ＣＭＶ以外（特に、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））の感染
１１．リンパ増殖性障害（移植後リンパ腫とも呼ばれる）
１２．血管内超音波（ＩＶＵＳ）、血管造影、または急性心筋梗塞における内膜厚の増加によって診断される、移植片血管症
１３．移植失敗または再移植
１４．死亡を引き起こすすべて
１５．初期生検読取りにより規定されるグレード１Ａ以上の拒絶
１６．初期生検読取りにより規定されるグレード１Ｂ以上の拒絶
１７．集中生検読取りにより規定されるグレード１Ａ以上の拒絶
１８．集中生検読取りにより規定されるグレード１Ｂ以上の拒絶
１９．初期および集中生検読取りにより規定されるグレード１Ａ以上の拒絶
２０．初期および集中生検読取りにより規定されるグレード１Ａ以上の拒絶
２１．移植後の経過のあらゆる時点で患者において生じるグレード２を超えるあらゆる拒絶。
【０４９２】
被験体サンプルの発現プロフィールを、例えば、上記および下記の方法によって、患者グループ間で差次的な発現を有するヌクレオチド配列のセットを発見する。種々の診断ヌ
クレオチドセットの発見のために得る患者白血球サンプルの非限定的例は、以下の通りである：
生検を避けるため、または生検を選択するための白血球セット：
サンプル：グレード０対グレード１〜４
治療反応のモニターをするための白血球セット：
成功する薬物処置  対  不成功の薬物処置を調べる
サンプル：
成功：時間１：拒絶有り、時間２：薬物治療  時間３：拒絶無し
不成功：時間１：拒絶有り、時間２：薬物治療；時間３：拒絶
後に起こる急性拒絶反応を予測するための白血球セット：
生検は、拒絶無しと示され得るが、この患者が、その後すぐに拒絶を発生し得る。後に拒絶を発生する患者および拒絶を発生しない患者のプロフィール参照。
【０４９３】
サンプル：
群１（後に拒絶有り）：時間１：グレード０；時間２：グレード＞０
群２（後に拒絶無し）：時間１：グレード０；時間２：グレード０
局部的な拒絶が、生検によって見落とされ得る。これが起こると、患者はグレード０を有し得るが、実際には拒絶を有し得る。これらの患者は、移植などに損傷を有し得る。
【０４９４】
サンプル：
拒絶無しのもの：時間のある一定期間にわたって、拒絶無し
拒絶有りのもの：同じ期間にわたって、拒絶の症状有り
後または現在の移植手術の失敗を診断するための白血球セット：
サンプル：
ある時間にわたる悪化している機能を規定し、プロフィールに関連づけるための心エコー検査またはカテーテル法のデータ。
【０４９５】
差し迫る活性ＣＭＶを診断するための白血球セット：
サンプル：
ＣＭＶ  ＩｇＧ陽性の患者を参照。後に（サンプルに対して）臨床的なＣＭＶ感染の有る患者  対  後に臨床的なＣＭＶ感染の無い患者を比較する。
【０４９６】
現在の活性ＣＭＶを診断するための白血球セット：
サンプル：
ＣＭＶ  ＩｇＧ陽性の患者を分析する。現在の臨床的な活性ＣＭＶ感染が有る患者  対
現在の活性ＣＭＶ感染が無い患者を比較する。
【０４９７】
高精度に患者の群を区別する１つのヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列のセットの同定の際に、１つのヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列のセットは、診断テストとして、確認され、実行される。この試験の使用は、ヌクレオチドセットを見つけるために使用される患者の群に依存する。例えば、組織学的な拒絶反応または移植機能障害の無い患者を全ての他の患者から正確に区別する、集合的な発現の挙動を有する、ヌクレオチド配列のセットが、見つかれば、生検を必要とする患者をスクリーニングするために用いる診断は、発展する。拒絶反応が無いと同定された患者は、生検を必要とせず、一方、その他の患者は、疾患の程度をさらに規定するために、生検を必要とする。別の実施例において、筋細胞の壊死（＞グレードＩ）に関した、継続する移植拒絶反応を決定する診断のヌクレオチドセットは、患者が、現在の治療レジメンの下で、適切な治療を受けていないことを決定するために使用される。増加した免疫抑制剤の治療または、変更した免疫抑制剤の治療の後、継続する移植拒絶反応が進行しているかどうかを決定するために、診断プロフィールの作成を行う。なお別の例において、患者の拒絶反応の状態を決定し、サイト
メガロウイルスの感染を診断する診断ヌクレオチドセットが、免疫抑制剤治療および抗ウイルス剤治療を釣り合わせるために、使用され得る。
【０４９８】
この実施例の方法はまた、心臓異種移植のモニタリングに適用可能である。
【０４９９】
（実施例６：腎臓および肝臓の同種移植拒絶のための診断ヌクレオチドセットの同定）
拒絶反応の診断試験は、移植された腎臓または肝臓の拒絶に関連した分子サインを同定するために、患者の白血球発現プロフィールを用いて、同定される。血液、または他の白血球供給源のサンプルは、腎臓または肝臓の生検に次いで、それぞれ、腎臓または肝臓の移植を行った患者から得られる。その結果は、組織学的グレード（つまり、同種移植拒絶の状態および重篤さ）を表わす。発現プロフィールは、上に記載したようにサンプルから得られ、その発現プロフィールを、生検の結果と関連づける。腎臓の拒絶反応の場合、尿排泄、クレアチンクリアランスレベルおよび血清クレアチンレベル（および腎機能の他のマーカー）に対応する臨床データが集められる。肝臓の損傷および機能の血清マーカー（例えば、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、アルカリフォスファターゼ、ＧＧＴ、ビリルビン、アルブミンおよびプロトロンビン時間）の生化学的特徴化を含む、臨床データが、肝臓移植拒絶反応をモニタリングするために集められた。白血球ヌクレオチド配列発現プロフィールが、集められ、重要な臨床状態および腎臓または肝臓移植の結果と関連づけられる。有用な臨床関連の実施例をここに挙げる：
１．少なくとも中程度の組織学的グレードの拒絶エピソード（さらなるコンドロイチン、抗Ｔ細胞抗体、またはリンパ照射全体を用いる患者の処置を生じる）
２．組織学的拒絶および通常であるか不変の異型移植機能（上で一覧を示す腎臓または肝臓機能の試験に基づく）の欠如。
３．研究期間の間の重篤な同種移植片機能不全または悪化している同種移植機能不全（上で一覧を示す腎臓機能および肝臓の機能の試験に基づく）の存在。
４．培養組織、組織学またはＰＣＲによる文書化されたＣＭＶ感染症、および、少なくとも一つの臨床徴候または感染の症状。
５．特定の移植片生検拒絶グレード
６．患者の慢性の免疫抑制性レジメンの組織学的重篤度を促している拡大に対する穏やか〜中程度の拒絶。
７．ＣＭＶ以外の感染症（特に、エプシュタインバーウイルス（ＥＢＶ）
８．リンパ増殖障害（また、移植後のリンパ腫と呼ばれる）
９．移植失敗または再移植。
１０．血液透析または腎臓移植患者のための他の腎臓補充療法の必要。
１１．肝臓移植レシピエントのための肝性脳症。
１２．全ての原因死亡率
上記手順（腎臓または肝臓同種移植片拒絶についての予測および／または診断的な価値を有する）によれば、候補ライブラリー（または前に同定された診断的なヌクレオチドのセット）のサブセットは、同定される。
【０５００】
（実施例７：サイトメガロウイルスの診断のための診断ヌクレオチドセットの同定）
サイトメガロウイルスは、免疫無防備状態の患者（例えば、移植患者、癌患者、およびＡＩＤＳ患者）における疾患の主な原因である。ウイルスは、ほとんど任意の組織（特に、結腸、肺、骨髄および網膜）において炎症および疾患を引き起こし得る。例えば、移植拒絶を予防するために、現在または差し迫ってＣＭＶ疾患を有する患者（特に、免疫抑制訳が患者において使用される場合）を同定することがますます重要である。白血球を、活性ＣＭＶ、差し迫ったＣＭＶ、またはＣＭＶなしの患者においてプロファイルする。活性ＣＭＶまたは差し迫ったＣＭＶと相関する発現プロフィールを同定する。候補ライブラリー（または先に同定された診断ヌクレオチドセット）のサブセットを、活性ＣＭＶまたは差し迫ったＣＭＶの診断のための予測的価値を有する上記手順に従って、同定する。活性
または差し迫ったＣＭＶの診断のための予測的価値を同定した診断ヌクレオチドセットは、心臓、肝臓、および／または腎臓の同種移植片関連診断遺伝子セット（実施例６および１０に記載される）と組み合わされ得るかまたはともに使用され得る。
【０５０１】
さらに、または代替として、ＣＭＶヌクレオチド配列を得、そして診断ヌクレオチドセットを、ＣＭＶヌクレオチド配列を使用して設計する。生物の配列全体は、公知であり、そして全てのＣＭＶヌクレオチド配列が、単離され、そして配列情報および以下に記載されるアプローチを使用してライブラリーに添加する。公知の発現遺伝子が好ましい。あるいは、ヌクレオチド配列は、同等に発現されるＣＭＶ遺伝子の群（極初期遺伝子、初期遺伝子および後期遺伝子）を表すために選択される（Ｓｐｅｃｔｏｒら、１９９０、Ｓｔａｍｍｉｎｇｅｒら、１９９０）。
【０５０２】
オリゴヌクレオチドは、実施例８のオリゴ設計手順を使用して、ＣＭＶ遺伝子について設計された。プローブは、本明細書で示される１４の遺伝子配列を使用して設計されて、実施例９に記載されている配列に含まれた：
【０５０３】
【化１４４】
2010022375.tif 000146
【０５０４】
ＣＭＶ遺伝子の発現のための診断ヌクレオチドセットは、他の状態（例えば、器官同種移植片拒絶）の診断のための診断白血球ヌクレオチドセットとともに使用される。
【０５０５】
実施例２に記載される技術を使用して、１８０個の心臓移植レシピエント（実施例５に記載される研究において登録される）からの単核サンプルを、白血球アレイを用いる発現プロフィールのために使用した。これらのサンプルの中で、１５個は、培養、ＰＣＲまたは任意の特定の診断試験によって作られる一次または再活性化ＣＭＶの診断があった患者と関係していた。
【０５０６】
ＲＮＡ調製後、増幅、標識化、ハイブリダイゼーション、スキャン、特徴摘出およびデータ処理は、実施例９に記載されているオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用している実施例１１にて説明したように、行われた。
【０５０７】
Ｃｙ３（患者サンプル）／Ｃｙ５（Ｒ５０参照ＲＮＡ）の発現の得られるｌｏｇ比を分析に使用した。マイクロアレイ（ＳＡＭ、Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１、実施例１５を参照のこと）のための重要性分析は、どの遺伝子がこれらの１５人ＣＭＶ患者と１６５人の非ＣＭＶ患者との間で最も有意に差示的に発現されたかについて決定するために適用された（表１２）。１２個の遺伝子は、０％ＦＤＲを有すると同定され、そして６個の遺伝子は、０．１％のＦＤＲを有すると同定され、表２に列挙した。いくつかの遺伝子は、アレイに
１つより多くのオリゴヌクレオチドによって表され、２個の遺伝子について、同じ遺伝子に由来する複数のオリゴヌクレオチドが、有意と呼ばれる（配列番号３０６１，３０６４：エオメソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ  ）および３０３１、３０４０、１０４、２７３６：小さい誘導性のサイトカインＡ４）。
【０５０８】
臨床変数はまた、重要性分析において含まれた。例えば、白血球数および移植後の週の数（患者について、サンプルが得られた時点における）は、１８０サンプルの大部分について入手可能であった。これらの変数のｌｏｇが取られ、次いで、変数は、遺伝子発現データを用いて上記重要性分析において使用された。白血球数（０．１％ＦＤＲ）および移植後の週（０％ＦＤＲ）は、ＣＭＶ状態と相関したようであった。ＣＭＶ患者は、より後の移植後データおよび下部の白血球数と関連する検体がありそうだった。
【０５０９】
これらの遺伝子および変数は、単独で使用されることができるかまたは他の遺伝子または変数に関連してまたは診断的な遺伝子セットを構築するための他の遺伝子または本願明細書において記載されている方法を用いた分類法アルゴリズムとともに使用され得る。
【０５１０】
リアルタイムＰＣＲ確証のためのプライマーは、実施例１３にて説明したように、これらの遺伝子のいくらかのために設計され、表２Ｃおよび配列表に列挙された。実施例１３に記載されている方法を用いて、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのためのプライマーは、アレイから発現所見を確証するために設計され、用いられた。６個のサンプルは、試験された（ＣＭＶ患者からの３個およびＣＭＶのない患者からの３個）。この遺伝子が、ＣＭＶをもつ患者とＣＭＶのない患者の間で差示的に発現されるとわかった（完全な記載について実施例１３を参照）。この同じアプローチは、リアルタイムＰＣＲによって他の診断的な遺伝子を確証するために用いることができる。診断的なヌクレオチドセットはまた、この同じ方法を使用して、種々の他のウイルス疾患のために同定され得る（表１）。
【０５１１】
ｃＤＮＡマイクロアレイは、ウイルス発現をモニターするために用いてもよい。さらに、これらの方法は、他のウイルス（例えばエプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペス１および小胞性口内炎ウイルス）をモニターするために用いてもよい。
【０５１２】
（実施例８：オリゴヌクレオチドプローブの設計）
例証として、このセクションは、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた４つのオリゴヌクレオチドプローブの設計を記載する。この過程での主なステップを初めに示す。
【０５１３】
ＧｅｎＢａｎｋから、ｍＲＮＡの最良の潜在的配列を得る。完全長配列参照配列が利用できない場合、５’末端よりも３’末端を優先して、部分配列を用いる。配列がアンチセンス鎖を表すことが既知であるとき、配列の逆相補体をプローブ設計のために用いる。プローブ設計時にＧｅｎＢａｎｋで有意のマッチがない減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）白血球発現ライブラリーで表される配列に対して、本発明の配列を用いる。
【０５１４】
ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ等のアルゴリズムを用いて、配列中の低複雑領域および反復エレメントをマスキングする。
【０５１５】
Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１等のプローブ設計ソフトウエアを用いて、特異的な物理的および化学的特性を有する５０残基の配列を選択する。３’末端に最も近い５０残基は検索フレームを構成する。それが含む残基を適合性について試験する。それらが特定の基準を満たさない場合、検索フレームを５’末端側に近づいて１残基分移動して、ここでそれが含む５０残基を試験する。適切な５０マーが見つかるまで
、この過程を繰り返す。
【０５１６】
そのような５０マーが配列内に存在しない場合、適切な５０マーが見つかるまで、物理的および化学的基準を調整する。
【０５１７】
ＮＣＢＩでＢＬＡＳＴｎ検索ツールを用いて、プローブをｄｂＥＳＴ、ＵｎｉＧｅｎｅクラスターセット、および集まったヒトゲノムと比較して、関連する同定情報を得て、プローが１つより多い遺伝子に有意な類似性を持たないことを確認する。
【０５１８】
（クローン４０Ｈ１２）
クローン４０Ｈ１２を配列決定して、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩでｎｒ、ｄｂＥＳＴ、およびＵｎｉＧｅｎｅデータベースと比較する。配列は、登録番号ＮＭ＿００２３１０、すなわちゼロのＥ値が報告されている白血球阻害因子レセプター（ＬＩＦＲ）ｍＲＮＡをコードする’ｃｕｒａｔｅｄ  ＲｅｆＳｅｑ  ｐｒｏｊｅｃｔ’配列（Ｐｒｕｉｔｔら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：４４−４７を参照せよ）にマッチした。ゼロのＥ値は、全ての実用目的のために、配列の長さと、データベースの組成およびサイズとに基づいて、類似性がランダムである可能性がないということを示す。登録番号ＮＭ＿００２３１０として登録されるこの配列は、クローン４０Ｈ１２の配列よりもかなり長く、ポリＡテールを有する。これによって、登録番号ＮＭ＿００２３１０として登録されるこの配列がセンス鎖であり、特に３’末端でクローン４０Ｈ１２配列よりもｍＲＮＡのより完全な表現であることが示された。登録番号「ＮＭ＿００２３１０」は、センス鎖ｍＲＮＡを表す登録番号のテキストファイルに包括され、Ｂａｔｃｈ  Ｅｎｔｒｅｚウエブインターフェースを用いたＥｎｔｒｅｚ検索問合せとして所望の登録番号を含有するテキストファイルをアップロードし、かつＦＡＳＴＡファイルとして局所的な結果を保存することによって、センス鎖ｍＲＮＡに対する配列を得た。以下の配列を得て、クローン４０Ｈ１２のアラインメントの領域を概説する。
【０５１９】
【化１４５】
2010022375.tif 000147
【０５２０】
【化１４６】
2010022375.tif 000148
【０５２１】
【化１４７】
2010022375.tif 000149
【０５２２】
。
【０５２３】
ＮＭ＿００２３１０の配列を含むＦＡＳＴＡファイルを、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒウェブインターフェース（Ｓｍｉｔ，ＡＦＡ＆Ｇｒｅｅｎ，Ｐ  ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｈｔｍｌ，ＳｍｉｔおよびＧｒｅｅｎ））を用いてマスキングした。具体的には、マスキングの間、配列の以下の種類を、「Ｎ」：ＳＩＮＥ／ＭＩＲ＆ＬＩＮＥ／Ｌ２、ＬＩＮＥ／Ｌ１、ＬＴＲ／ＭａＬＲ、ＬＴＲ／Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ、Ａｌｕ、および単純反復等の他の低情報量配列と置換した。下記は、マスキング後の配列である。
【０５２４】
【化１４８】
2010022375.tif 000150
【０５２５】
【化１４９】
2010022375.tif 000151
【０５２６】
【化１５０】
2010022375.tif 000152
【０５２７】
。
【０５２８】
バッチ、自動化コンピューター方法、ならびに配列を用いて、この配列の長さを測定し、センス鎖、その長さ、ｍＲＮＡの３’末端に近いプローブ配列の所望の位置を、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にサブミットした。検索の質を１００％で設定して、最良プローブ数を１、長さ範囲を５０塩基対、標的  Ｔｍを７５℃＋／−５℃、ヘアピン最大ΔＧを６．０−ｋｃａｌ／ｍｏｌ、自己ダイマー最大ΔＧを６．０−ｋｃａｌ／ｍｏｌ、実行／反復（ジヌクレオチド）最大長を５、Ｐｒｏｂｅ部位最小オーバーラップを１で設定した。４９の潜在的プローブのうち基準を満たすものがなかったとき、プローブ部位を配列の５’末端により近い５０塩基対に移動して、分析のためにＡｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒに再サブミットする。基準を満たす潜在的なプローブがなかったとき、プローブ配列が生成されるように、融解温度の変動を＋／−８℃まで上げ、実行での同一塩基対数を６まで増加させた。
【０５２９】
上記の配列で、上記に示した基準を用いて、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１は、以下の配列のオリゴヌクレオチド番号３０３７に対するプローブを設計する（上記の配列中、下線で示す）。それは、６８．４℃の融解温度と、６ヌクレオチドの最大実行とを有し、ｍＲＮＡの３’末端に近いオリゴヌクレオチドを得るために、Ａｒｒａｙ
Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１でのプローブ設計の基準を緩和する一症例を表す（低融解温度を許容した）。
【０５３０】
（クローン４６３Ｄ１２）
クローン４６３ＤＩ２を配列決定して、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩでｎｒ、ｄｂＥＳＴ、およびＵｎｉＧｅｎｅデータベースと比較した。配列は、登録番号ＡＩ１８４５５３、すなわち定義ライン「ｇｂ：Ｍ２９５５０  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥ  ２Ｂ  ＣＡＴＡＬＹＴＩＣ  ＳＵＢＵＮＩＴ  １（ＨＵＭＡＮ）；，ｍＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」に類似するｑｄ６０ａ０５．ｘ１  Ｓｏａｒｅｓ＿ｔｅｓｔｉｓ＿ＮＨＴ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ；１７３３８４０  ３’」を有するＥＳＴ配列とマッチした。アラインメントのＥ値が１．００×１０−１１８であった。ＧｅｎＢａｎｋ配列は、ポリＴ領域で始まって、それがアンチセンス鎖であり、５’から３’方向へ読み取ることが示唆された。この配列の開始は、ｍＲＮＡセンス鎖の３’末端に相補的である。この配列の登録番号は、アンチセンス配列を表す登録番号のテキストファイルに包括された。Ｂａｔｃｈ  Ｅｎｔｒｅｚウエブインターフェースを用いたＥｎｔｒｅｚ検索問合せとして所望の登録番号を含むテキストファイルをアップロードし、かつＦＡＳＴＡファイルとして局所的な結果を保存することによって、アンチセンス鎖ｍＲＮＡの配列を得た。以下の配列を得て、クローン４６３Ｄ１２のアラインメント領域を概説する。
【０５３１】
【化１５１】
2010022375.tif 000153
【０５３２】
【化１５２】
2010022375.tif 000154
【０５３３】
。
【０５３４】
ＡＡ１８４５５３の配列を含むＦＡＳＴＡファイルを、その後、以下に示すように、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒウェブインターフェースを用いてマスキングした。クローン４６３Ｄ１２のアラインメントの領域を概説する。
【０５３５】
【化１５３】
2010022375.tif 000155
【０５３６】
。
【０５３７】
配列を上述のようにＡｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒにサブミットしたが、プローブの所望の位置を塩基対５０で示し、基準を満たすプローブがない場合は、３’方向へ移動した。元の配列はアンチセンスであったので、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒから得た相補配
列を用いた。Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒによって設計されたオリゴヌクレオチドは、リゴヌクレオチド番号３０５４に対応し、上記の下線部の配列に相補的である。このプローブは、７２．７℃の融解温度と、４ヌクレオチドの最大実行を有する。
【０５３８】
（クローン７２Ｄ４）
クローン７２Ｄ４を配列決定して、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩでｎｒ、ｄｂＥＳＴ、およびＵｎｉＧｅｎｅデータベースと比較した。これらのデータベースのいずれにも、有意なマッチは見出されなかった。ヒトゲノムドラフトと比較したとき、下記に示す参照配列ＮＴ＿００８０６０の３つの連続した領域に有意なアラインメントを見出し、挿入配列が、非同定遺伝子の３つのスプライシングされたエキソンを含むことを示唆した。
【０５３９】
（マッチング残基上の残基数）
クローン７２Ｄ４配列        ＮＴ＿００８０６０上の番号
１〜１９８              ４７８６４６〜４７８８４３
１９７〜４８９              ４７９８７６〜４８０１６８
４９１〜５８５              ４８９２７１〜４８９３６５
参照配列がイントロンを含有し、この遺伝子に対するコーディング鎖または非コーディング鎖のいずれかを表し得るので、ＢｉｏＣａｒｄｉａ自体の配列ファイルを用いて、オリゴヌクレオチドを設計した。２つの相補的なプローブを設計して、センス鎖が表されることを確実にした。クローン７２Ｄ４中の挿入配列を、３つの推定エキソンを概説して以下に示す。
【０５４０】
【化１５４】
2010022375.tif 000156
【０５４１】
。
【０５４２】
配列をＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにサブミットしたが、反復配列は見出されなかった。上記に示した配列を用いて、上述のようにＡｒｒａｙ  Ｄｓｉｇｎｅｒを用いて２つの５０マープローブを設計したプローブを以下の配列中に太字で示す。配列中のプローブは、オリゴヌクレオチド番号３０２０（配列番号３０２０）であり、そして相補プローブは、オリゴヌクレオチド番号３１８（配列番号３１８）である。標的タンパク質の一部を以下に列挙する（配列番号３１０６）
【０５４３】
【化１５５】
2010022375.tif 000157
【０５４４】
（プローブ配列の確認）
プローブ設計後、ＮＣＢＩでＢＬＡＳＴｎを用いて、ｄｂＥＳＴ，ＵｎｉＧｅｎｅクラスターセット、および集まったヒトゲノムに対して配列を比較することによって、各プローブ配列を確認した。アラインメント、登録番号、ｇｉ番号、ＵｎｉＧｅｎｅクラスター番号、および名称を検査して、最も一般的な配列をプローブとして用いた。
【０５４５】
（実施例９：８０００スポット５０マーオリゴヌクレオチドのアレイの生産）
本発明者らは、初期候補５０マーオリゴヌクレオチドを８０００スポットしたアレイを生産した。実施例８によって、このアレイ用のプローブの設計および選択を例証する。
【０５４６】
Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）によって、標準的ホスホラミダイト化学を用いて、０．０５μｍｏｌｅの合成の開始スケールで、非修飾５０マーのオリゴヌクレオチドを合成した（例えばＲ．Ｍｅｙｅｒｓ編（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅを参照せよ）。簡潔に言うと、合成を開始するために、５’末端にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を有する３’ヒドロキシルヌクレオシドを固相支持体に結合させた。結合反応のために５’ヒドロキシルを遊離させるために、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて、ＤＭＴ基を除去した。次に、テトラゾールおよび次のヌクレオチドのホスホラミダイト誘導体を添加した。テトラゾールはホスホラミダイトの窒素をプロトン化して、それが求核攻撃を受けやすいようにする。ヒドロキシル基の５’末端のＤＭＴ基は、過度のヌクレオチドのさらなる添加をブロックする。次に、酸素ドナーとして酸化剤および水を用いた酸化ステップで、ヌクレオチド間結合をホスホトリエステル結合に変換する。過剰なヌクレオチドをろ過して、次のヌクレオチドのためのサイクルをＤＭＴ保護基の除去によって始めた。合成後、オリゴを固相支持体から切断した。オリゴヌクレオチドを脱塩し、１００または２００μＭの濃度で水中で再懸濁して、９６ディープウエル形式に入れた。オリゴヌクレオチドをＷｈａｔｍａｎ  Ｕｎｉｐｌａｔｅ  ３８４ウエルポリプロピレンＶ底プレートに再アレイした。１×Ｍｉｃｒｏ
Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｌｕｓ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ、ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）中で、オリゴヌクレオチドを全量１５μｌで最終濃度３０μＭに希釈した。全体で、８，０３１のオリゴヌクレオチドを、２１個の３８４ウエルプレートへアレイした。
【０５４７】
Ｔｅｌｅｃｈｅｍ／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ  Ｓｕｐｅｒアミンガラス基板（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ）上でアレイを生産し、これは、２５×７６×０．９６ｍｍの正確な寸法を有する０．１ｍｍのフィルタをかけたクリーンルームで製造した。アレイは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  ４８ピンＭｉｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ＰｒｉｎｔｈｅａｄとともにＶｉｒｔｅｋ  Ｃｈｉｐｗｒｉｔｅｒを用いてプリントした。Ｐｒｉｎｔｈｅａｄは、４８  Ｓｔｅａｌｔｈ  ＳＭＰ３Ｂ  ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｐｉｎを積載しており、これを、直径１１０−１１５ミクロンのスポットサイズを有するスライド上にオリゴヌクレオチドをプリントするために用いた。
【０５４８】
（実施例１０：心臓同種移植片拒絶反応の診断のための診断ヌクレオチドセットの同定）
心臓同種移植片拒絶反応の診断およびモニタリングに有用な発現パターンを有する遺伝子が同定された。さらに、同種移植片拒絶のための診断アルゴリズムと一緒に働く遺伝子のセットを同定した。以下のマーカーの発見において使用される患者、患者の臨床データおよび患者サンプルは、実施例５に記載されている臨床研究から誘導された。収集した臨床データは、発現データの相互関係のための患者またはサンプルグループを規定するために用いる。患者グループは、比較（例えば有用なまたは興味深い臨床差異を有する患者グループ  対  差異を所有しない患者グループ）について識別される。心臓同種移植片拒絶反応の測定は、患者（そして、患者サンプル）を、いくらかの期間にわたるかまたはある時点で、より高いおよびより低い拒絶活性をもつグループに分けるために上記した臨床データから導かれる。このようなデータは、心臓生検の病理学者の読み値および末端器官損害の進行を測定するデータ（抑圧された左室機能不全（減少した心臓血液拍出量、減少した駆出分画、低い心臓血液拍出量の臨床徴候）およびイオントロピック（ｉｏｎｔｒｏｐｉｃ）因子（Ｋｏｂａｓｈｉｇａｗａ１９９８）の使用法を含む）から決定されるような拒絶グレードである。
【０５４９】
同種移植片拒絶の発生と相関している発現プロフィール（末端器官損害および末端器官損害の進行に対応する発現プロフィールを含む）は、識別される。発現プロフィールは、同種移植片拒絶反応、および処置への反応または処置に対する反応の可能性を予測するように、識別される。候補ライブラリー（または先に識別された診断的なヌクレオチドセット）のサブセットは、識別され、これは、同種移植片拒絶の存在または同種異系移植片拒絶反応または器官損傷の予測のための予測値を有する。
【０５５０】
単核のＲＮＡサンプルは、実施例２に記載されているプロトコルを使用して、心臓同種移植片移植を最近受けた患者から集められた。サンプルコレクションのときの同種移植片拒絶状況は、実施例５にて説明したように、心臓生検の検査で決定された。
【０５５１】
１８０の試料を、分析に含めた。各患者試料は、試料の時点で収集した生検および臨床データに関連した。心臓生検は、地方局（ｌｏｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）の病理学者および４つ全ての地方局からの生検スライドを目隠し様式で解読した中央局の病理学者（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ）によって類別された。生検の等級は、０、１Ａ、１Ｂ、２、３Ａおよび３Ｂを含んだ。第４等級の拒絶は、同定されなかった。これらの等級に従い、地方局病理学解読または２つの解読（地方局もしくは中央局）の高い方のどちらかを用いて、従属変数を構築した。遺伝子発現プロフィールの心臓同種移植拒絶との相関のために使用された従属変数を、表４に示す。従属変数は、拒絶の存在または非存在に対応する試料のクラスを生成するために使用される。
【０５５２】
臨床データはまた、分析に試料を含めるための基準を決定するために使用された。試料が細菌またはウイルス感染を有さない患者由来であることを必要とする最も厳密な包含基準は、心臓移植の少なくとも２週間後であり、そして現在入院していないことであった。
第２の包含基準（包含２）は、移植後基準を１週間に減少し、そして入院基準を撤廃した。
【０５５３】
ＲＮＡの調製後（実施例２）、増幅、標識、ハイブリダイゼーション、スキャニング、特徴抽出およびデータ処理を、実施例９に記載のオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、実施例１１に記載のように行った。生じたＣｙ３発現（患者試料）／Ｃｙ５（Ｒ５０参照ＲＮＡ）のｌｏｇ比率を、分析に用いた。このデータセットを、「統計」データと呼ぶ。参照されるデータセットの第２の型は、第１に由来する。これらのデータセットは、以下の式を用いて、各試料における遺伝子発現ｌｏｇ比率を、同一患者由来のベースライン試料と比較した：
参照ｌｏｇ比率＝（ｌｏｇ比試料）−（ｌｏｇ比ベースライン）
２つの参照データセットを使用し、「０  ＨＧ」および「最良０（Ｂｅｓｔ  ０）」と名付けた。０  ＨＧについてのベースラインは、試料と同一患者由来の第０等級試料であり、中央局病理学者と地方局病理学者との間の最良の等級を用いた試料であった。最良０についてのベースラインは、試料と同一患者由来の第０等級試料であり、地方局解読生検等級データおよび中央局解読等級データの両方を用いた試料であった。可能ならば、試料前の第０等級が、両参照データセットにおけるベースラインとして使用された。
【０５５４】
また、データセットを、サブセットに分配し、ざっとデータの半分の２つのサブセット間を比較した。構築したサブセットの型は、以下であった。第１（前半分）サブセット／第２（後半分）サブセットは、試料番号によって並べられたデータセットからの試料の第１の半分および試料の第２の半分であった。奇数サブセット／偶数サブセットは、同一の供給源（試料番号によって並べられたデータセット）を使用したが、奇数サブセットは、第１試料から始まる２つおきの全ての試料で構成され、そして偶数サブセットは、第２試料から始まる２つおきの全ての試料で構成された。第１４局サブセット／他のサブセットは、移植病院によって分割された同一のデータセットであった。第１４局サブセットは、第１４局における患者由来の全ての試料で構成され、一方、他のサブセットは、他の３つの局（第１２局、第１３局、および第１５局）由来の全ての試料で構成された。
【０５５５】
まず、マイクロアレイについての有意性分析（ＳＡＭ，Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１，実施例１５）を使用し、拒絶群と非拒絶群との間で差次的に発現した遺伝子を発見した。従属変数、包含基準、統計／参照、およびデータサブセットの９６の異なった組み合わせを、ＳＡＭ分析において使用し、拒絶と非拒絶との間で有意に差次的に発現する、遺伝子の第１リストを構築した。これらの遺伝子のうち最も顕著な遺伝子を、以下の基準に基づいて選択した。列１の遺伝子は、２つの独立したサブセット内の同じ分析において、２０％未満のＦＤＲと共に出現した遺伝子であった。列２の遺伝子は、ＦＤＲ２０％未満のリストにおける上位２０位以内に存在し、包含基準および統計／参照定数を有する全ての従属変数にわたり、５０％を上回る時間で出現した遺伝子であった。列３の遺伝子は、２０％未満のＦＤＲ、包含基準および統計／参照定数を有する全ての従属変数にわたり５０％を上回る時間を有する５０％を上回る時間で出現した遺伝子であった。分析によって拒絶と非拒絶との間で統計的に差次的に発現すると同定された遺伝子を、表２に示す。
【０５５６】
ＳＡＭは、群の間の相違の大きさおよび各群における試料間の変動の大きさに基づき、有意に異なるとして遺伝子を選択する。９個の遺伝子について、幾つかの第０等級試料と幾つかの第３Ａ等級試料との間の相違の例を、図７Ａにおいて示す。
【０５５７】
さらに、これらの同一の組み合わせの多くが、発現木の管理回収（Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）（ＳＨＥＴ、Ｈａｓｔｉｅら，２００１）アルゴリズム（実施例１５参照）において使用され、アルゴリズムが、拒絶クラスと非拒絶クラスとの間を識別するために最も良いと選択するマーカーを
、０．０１の偏因子（ｂｉａｓ  ｆａｃｔｏｒ）を用いて同定する。上位２０項目または上位３０項目を、ＳＨＥＴ出力から得、そして統計データまたは参照データのどちらかにおける全ての比較の中で、データをグループ化した。分析の５０％を超える項目中の上位５項目から見出された任意の遺伝子を、選択し、群Ｂ１（表２）とした。各遺伝子の出現率を、全ての（統計データまたは参照データのいずれかについての）ＳＨＥＴ分析にわたって表にし、最も高く出現した１０の遺伝子を選択し、群Ｂ２とした（表２）。
【０５５８】
使用されるさらなる分類方法は、ＣＡＲＴ（Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、実施例１５）であった。統計データセットまたは参照データセットのどちらかを、発現値（ｌｏｇ比率）が、試料の少なくとも８０％で存在する遺伝子のみに減少した。これらのデータを、デフォルト設定（対称性Ｇｉｎｉアルゴリズム（Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｇｉｎｉ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用する）で、ＣＡＲＴにおいて使用した。各従属変数を、完全試料セットおよび厳密な包含基準の両方を用いて、使用した。遺伝子の２つの群を同定した。群Ｃ１は、最初のスプリッター（第１の決定ノード）である遺伝子であった。群Ｃ２は、これらの分析全体にわたって最も頻繁なスプリッターとして生じた１０の遺伝子であった。
【０５５９】
２つの他の分類モデルを開発し、そしてこれらの最良遺伝子を、心臓同種移植拒絶のマーカーとして同定した。群Ｄ遺伝子を、５９の試料のセット、参照データ、地方局生検解読等級から、ロジスティック回帰を用いて、同定した。群Ｅ遺伝子を、第１統計データセットから、Ｋ最近傍分類アルゴリズム（Ｋ−ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、同定した。
【０５６０】
階級的クラスタリング（Ｅｉｓｅｎら  １９９８）およびＣＡＲＴの両方を使用して、各同定されたマーカーについての代替物を同定した。階級的クラスタリング代替物は、これらにおいて共発現される遺伝子であり、系統樹の最も近い分岐から選択された。ＣＡＲＴ代替物は、決定ノードにおいて第１スプリッターとして選択された遺伝子についての代替物として、ＣＡＲＴによって同定された。
【０５６１】
実時間ＰＣＲ確認のためのプライマーを、各マーカー遺伝子について、実施例１３に記載のように設計した。
【０５６２】
ＣＡＲＴを、試料をアレイからの遺伝子発現データを用いて拒絶または非拒絶として分類するための決定木を構築するために使用した。分析は、心臓同種移植患者に由来する試料を正確に同定するために、共に使用し得る遺伝子のセットを同定した。決定木のための遺伝子のセットおよび同定された閾値発現レベルを、「モデル」と呼ぶ。このモデルは、未知の試料の拒絶状態を予測するために使用され得る。入力データは、本発明者らの上位１３９のマーカー遺伝子についての、統計的発現データ（ｌｏｇ比率）および参照発現データ（中央局または地方局のどちらかから得られる最高の第０等級を参照したｌｏｇ比率）であった。これらの発現データの２つの型を、独立した変数として、ＣＡＲＴソフトウェアに入力した。
【０５６３】
従属変数は、拒絶状態であり、このモデルについて、非拒絶＝第０等級および拒絶＝第３Ａ等級として、規定した。試料を、これらが、細菌感染もしくはウイルス感染を有する患者由来であるか、または移植後２週間未満の患者由来である場合、訓練セット中の考慮から除外した。使用した方法は、対称性Ｇｉｎｉであり、独立した変数の線形組み合わせを許容する。コストは、偽陰性および偽陽性の両方について１に設定され、２つの状態について優先が同等に設定される。欠失データについてペナルティは評価しないが、しかし、選択されたマーカー遺伝子は、データセットにわたって強い表現を有した。１０倍の交差検定を使用し、モデルを試験した。特定化されない設定は、初期値のままにした。
【０５６４】
図７Ｂに示したモデルは、３つのノード（それぞれ異なったマーカー遺伝子）における発現値についての決定に基づく。このモデルについて割り当てられたコストは、同等である優先、各型のエラーについて１に設定したコスト、および１０倍交差検定からの結果に基づき、０．２９２であった。
【０５６５】
訓練セットにおいて、誤分類された拒絶試料はなく（感度＝１００％）、そして１つの非拒絶試料だけが誤分類された（特異性＝９４．４％）。１０倍交差検定後、２つの拒絶試料が誤分類され（感度＝８７．５％）、そして３つの非拒絶試料が誤分類された（特異性＝８３．３％）。ＣＡＲＴソフトウェアは、各決定ノードについて代替物マーカーを割り当てた。
【０５６６】
これらの遺伝子を単独であるいは他の遺伝子または変数と組み合わせて用いて、診断用遺伝子セットまたは分類アルゴリズムを構築し得る。これらの遺伝子を拒絶用の既知の遺伝子マーカー（先行技術で同定されたもの等）と併せて用いて、診断用アルゴリズムを提供し得る。
【０５６７】
（実施例１１：全ＲＮＡの増幅、標識、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション）
（増幅、標識、ハイブリダイゼーション、およびスキャニング）
インタクトな全ＲＮＡの少なくとも０．５から２μｇからなる試料を、アレイハイブリダイゼーション用にさらに処理した。利用可能であるときは、インタクトな全ＲＮＡ２μｇを増幅のために用いる。３つの連続した酵素反応で、全ＲＮＡ試料の増幅および標識を実施した。第１に、ＲＮＡの一本鎖ＤＮＡコピーを作製した（以下、本明細書中で「ｓｓ−ｃＤＮＡ」）。第２に、ｓｓ−ｃＤＮＡを相補ＤＮＡ鎖に対するテンプレートとして用いて、二本鎖のｃＤＮＡ（以下、本明細書中で「ｄｓ−ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ」）を生成した。第３に、細菌Ｔ７プロモーターからインビトロ転写によって線形増幅を実行した。この工程の間、蛍光連結ヌクレオチドを、増幅ＲＮＡ（以下、本明細書中で「ａＲＮＡ」）に組み込んだ。
【０５６８】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを生成した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２（１×  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２００Ｕ  逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１８０６４０１４）、１５Ｕ  ＲＮａｓｅインヒビター（ＲＮＡＧｕａｒｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，＃２７−０８１５−０１）、５μＭ  Ｔ７Ｔ２４プライマー（５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号３１０５）、および０．５〜２μｇの選択した試料全ＲＮＡで構成される反応で、第１の鎖ｃＤＮＡを生成した。植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の幾つかの精製組み換えコントロールｍＲＮＡを、反応混合物：２〜２０ｐｇの以下の遺伝子、すなわちＣＡＢ、ＲＣＡ、ＬＴＰ４、ＮＡＣ１、ＲＣＰ１、ＸＣＰ２、ＲＢＣＬ、ＬＴＰ６、ＴＩＭ、およびＰＲＫａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，それぞれ＃２５２２０１、＃２５２２０２、＃２５２２０４、＃２５２２０８、＃２５２２０７、＃２５２２０６、＃２５２２０３、＃２５２２０５、＃２５２２０９、＃２５２２１０）に添加した。これらの各植物遺伝子に対応するセンスオリゴヌクレオチドプローブがマイクロアレイ上に存在するため、コントロールＲＮＡによって、臨床試料中の個々のｍＲＮＡに対するコピー数の推定が可能になる。２０μｌの最終反応容積を、９０分間４２℃でインキュベートした。
【０５６９】
第２ｃＤＮＡ鎖の合成のために、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅを先の反応に添加して、最終量を１５０μｌにした。先の内容物を希釈して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．０）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ  ＃ＢＰ  １７５６−１００）、９０ｍＭ  ＫＣｌ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ，＃０３１３−５００）、４．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ，＃０３０４−５００）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃Ａ７０２−５００）（１×  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２６６ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２６６ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２６６ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２６６ｍＭ  ｄＣＴＰ、４０  Ｕ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１８０１０−０２５）、および２Ｕ  ＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１８０２１−０１４）の最終濃度に新たな基質を添加した。第２鎖合成を１５０分間１６℃で行った。
【０５７０】
第２鎖合成後、増幅に進む前に、フェノール−クロロホルム抽出を用いて、酵素、ｄＮＴＰ、および緩衝液からｄｓ−ｃＤＮＡを精製して、その後、グリコーゲン存在下でｃＤＮＡのエタノール沈殿を行った。
【０５７１】
あるいは、シリカゲルカラムを用いて、ｃＤＮＡを精製する（例えばＱｉａｇｅｎ製のＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲクリーンアップ、＃２８１０４）。グリコーゲン存在下で、エタノール沈殿によって、カラム精製ｃＤＮＡの容積を減らして、ここで、＞１０，０００×ｇで３０分間の遠心によってｃＤＮＡを回収し、上清を吸引して、７０％エタノール、３０％水１５０μｌを添加して、ＤＮＡペレットを洗浄した。遠心の後で、上清を除去し、残留エタノールを室温で蒸発させた。あるいは、真空蒸発装置中で、カラム精製ｃＤＮＡの容積を減らし、上清を最終容積７．４μｌに減らす。
【０５７２】
ｃＤＮＡのインビトロ転写によってｃＤＮＡの線形増幅を実行した。上述の工程から得たｃＤＮＡペレットを水７．４μｌ中に再懸濁して、７．５ｍＭ  ＧＴＰ、７．５ｍＭ  ＡＴＰ、７．５ｍＭ  ＴＴＰ、２．２５ｍＭ  ＣＴＰ、１．０２５ｍＭ  Ｃｙ３連結ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，＃ＮＥＬ−５８０）、１×反応緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸおよび＃１３３４）、および１％Ｔ７ポリメラーゼ酵素混合物（Ａｍｂｉｏｎ，Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ
Ｋｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸおよび＃１３３４）を含有する最終容積２０μｌにインビトロ転写反応緩衝液を添加した。この反応物を一晩３７℃でインキュベートした。インビトロ転写後、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；＃  ７４１０６）を用いて、販売元のプロトコールに記載されるように、酵素、緩衝液、および過剰ＮＴＰからＲＮＡを精製した。第２の溶出工程を実行し、２つの溶出液を合わせて、最終容積６０μｌにした。ＲＮＡ  ６０００ナノＬａｂＣｈｉｐとともにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いて、ＲＮＡを定量する。
【０５７３】
Ｃｙ３ＣＴＰの代わりにＣｙ５−ＣＴＰを組み込んだことを除いて、参照ＲＮＡを上述のように調製した。５つの反応物由来の参照ＲＮＡ（各反応は、全ＲＮＡ２μｇで開始した）を一緒にプールして、上述のように定量化した。
【０５７４】
（アレイへのハイブリダイゼーション）
以下のように、ハイブリダイゼーション用にＲＮＡを調製した。すなわち、ｌ８ｍｍ×５５ｍｍアレイに対して、増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）２０μｇを、参照ａＲＮＡ２０μｇと組み合わせた。真空蒸発器中で、１０μｌまで水を蒸発させることによって、組み合わせた試料および参照ａＲＮＡを濃縮した。試料を９５℃で３０分間加熱して、ＲＮＡを５０〜２００ｂｐ断片に細分することによって、試料を断片化した。または、真空蒸発器中で
、５μｌまで水を蒸発させることによって、組み合わせた試料および参照ａＲＮＡを濃縮した。２０ｍＭ酢酸亜鉛５μｌをａＲＮＡに添加して、混合物を６０℃で１０分間インキュベートした。断片化後、ハイブリダイゼーション緩衝液４０μｌを添加して、競合相手ＤＮＡとしてＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．１μｇ／ｕｌを有する５×ＳＳＣおよび０．２０％ＳＤＳの最終濃度を達成した。最終ハイブリダイゼーション混合物を９８℃まで加熱して、その後１秒につき０．１℃で、５０℃に低下させた。
【０５７５】
あるいは、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に含め、ハイブリダイゼーション温度を低下させる。
【０５７６】
ハイブリダイゼーション混合物を、ガラスカバースリップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃２９３５−２４６）で覆った６５℃予熱マイクロアレイ表面に適用して、６５℃で予熱したハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ．ＡＨＣ−１０）に入れた。５×ＳＳＣの１５μｌをハイブリダイゼーションチャンバー中の貯蔵器それぞれに入れて、チャンバーを密封して、６２℃の水浴中に一晩（１６〜２０時間）置いた。インキュベーション後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、スライドを３０℃で５分間洗浄し、その後２×ＳＳＣ中で、３０℃で５分間、その後２×ＳＳＣ中で、３０℃で更に５分間、その後０．２×ＳＳＣ中で、室温で２分間洗浄した。アレイを２分間１０００×ｇで回転させ、乾燥させた。乾燥したマイクロアレイを、その後上述の方法によってスキャニングする。
【０５７７】
Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）スキャナーＧ２５６５ＡＡでマイクロアレイを画像化した。Ａｇｉｌｅｎｔソフトウエアを用いたスキャン設定は、次の通りであった。すなわち、ＰＭＴ感度（１００％赤色および１００％緑色）、スキャン解像度（１０ミクロン）、赤色および緑色色素チャネル、円形コンベアー中の全てのスライドに対してデフォルトスキャン領域を使用すること、最大スキャン領域を使用すること、機器ＩＤに対するスキャンの日付、およびスライドＩＤに対するバーコードに対してである。Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーによって生成される完全像を反転および回転させ、ＴＩＦＦＳｐｌｉｔｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて２つの画像（各シグナルチャネルに対し１つ）に分割した。２つのチャネルは、５３２ｎｍ（Ｃｙ３標識試料）および６３３ｎｍ（Ｃｙ５標識Ｒ５０）での出力である。個々の画像を特徴摘出のためのＧｅｎｅＰｉｘ  ３．０（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にロードして、開いたファイルに一致する励起波長（赤色は６３３ｎｍに、緑色は５３２ｎｍに等しい）に各画像を割り当てた。設定ファイル（ガル）を開き、格子での各点が特徴の＞５０％で重複するように、格子を画像上に重ねた。その後、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウエアを用いて、特徴に対する最小閾値を設定することなく特徴を見出した。低シグナル強度を有する特徴に対しては、ＧｅｎｅＰｉｘは「見つからない（ｎｏｔ  ｆｏｕｎｄ）」と報告する。全ての特徴に対しては、直径設定を必要に応じて特徴だけを含むように調整した。
【０５７８】
ＧｅｎｅＰｉｘソフトウエアによって、両方のチャネルで、各特徴に対する中央画素強度（Ｆｉ）および各特徴に対するローカルバックグラウンドの中央画素強度（Ｂｉ）を決定した。それぞれに対する標準偏差（ＳＤＦｉおよびＳＤＢｉ）も決定する。ＧｅｎｅＰｉｘがバックグラウンドから特徴を区別することができなかった特徴は、後述するように「フラッグが立てられた（ｆｌａｇｇｅｄ）」。
【０５７９】
「．ｇｐｒ」ファイルへの特徴摘出の後で、．ｇｐｒファイルのヘッダー情報を変更して、データベースに正確な情報を伝えた。Ｅｘｃｅｌマクロは、以下の情報を含むために書き込まれた。すなわち、元の．ｔｉｆ画像ファイルの名称、スライドＩＤ、特徴摘出ソフトウエアのバージョン、ＧｅｎｅＰｉｘアレイリストファイル、ＧｅｎｅＰｉｘ設定ファイル、スキャンＩＤ、スライドをスキャニングした者の名称、緑色ＰＭＴ設定、赤色Ｐ
ＭＴ設定、摘出ＩＤ（．ｇｐｒファイルを作成した日付、ｙｙｙｙ．ｍｍ．ｄｄ−ｈｈ．ｍｍ．ｓｓとしてフォーマットする）、結果ファイル名称（．ｇｐｒファイル名称と同じ））、保存ＣＤ、および摘出コメントである。
【０５８０】
（Ｅｘｃｅｌテンプレートによる前処理）
画像分析およびデータ取り出し後に、各ハイブリダイゼーションから得たデータを前処理して、データベースに入力され、かつその後分析用に用いられるデータを取り出した。ＧｅｎｅＰｉｘでの特徴摘出によって生成された完全なＧＰＲファイルをエクセルファイル前処理テンプレートにインポートするか、またはＡＷＫスクリプトを用いて処理した。両プログラムは、同じ処理論理を用いて、同一の結果を生む。同じエクセルテンプレートまたはＡＷＫスクリプトを用いて、各ＧＰＲファイルを処理した。テンプレートは、データ上で一連の計算を行い、正確でない特徴を他のものから区別し、かつ各プローブに対する単一のデータ点に二重または三重の特徴データを組み合わせる。
【０５８１】
前処理において使用されるデータカラムは、以下の通りであった。すなわちオリゴＩＤ、Ｆ６３３  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ５色素に対する特徴での全ての画素からの中央値）、Ｂ６３３  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ５に対する選択した特徴のローカルバックグラウンドでの全ての画素の中央値）、Ｂ６３３  ＳＤ（Ｃｙ５に対する選択した特徴のローカルバックグラウンドでの画素に対する値の標準偏差）、Ｆ５３２  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ３色素に対する特徴での全ての画素からの中央値）、Ｂ５３２  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ３色素に対する選択した特徴のローカルバックグラウンドでの全ての画素の中央値）、Ｂ５３２  ＳＤ（Ｃｙ３に対する選択した特徴のローカルバックグラウンドでの画素に対する値の標準偏差）、およびＦｌａｇｓである。ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｆｌａｇｓカラムは、特徴摘出の間、フラッグセットを含む。「−７５」は、その位置でアレイにプリントされる特徴がなかったことを示し、「−５０」は、ＧｅｎｅＰｉｘが特徴シグナルをローカルバックグラウンドと区別することができなかったことを示し、「−１００」は、ユーザが特徴を劣っていると評価したことを示す。
【０５８２】
一旦インポートされたら、−７５フラッグを持つ特徴に関連するデータを用いなかった。その後、Ｂ６３３  ＳＤおよびＢ５３２  ＳＤの中央値を、「０」のフラッグ値を有する全ての特徴にわたって算出した。Ｂ６３３  ＭｅｄｉａｎおよびＢ５３２  Ｍｅｄｉａｎの最小値を同定し、「０」のフラッグ値に関連する値のみを考慮した。各特徴に対して、蛍光シグナルからローカルバックグラウンド（ＢＧＳＳ）を引いて、それをローカルバックグラウンドの標準偏差によって割ることによって、両色素に対してシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を算出した。すなわち、
【０５８３】
【化１５６】
2010022375.tif 000158
【０５８４】
である。
Ｓ／Ｎが３未満の場合、調整バックグランド減算シグナルを、スライドの上の最小ローカルバックグラウンドを引いた蛍光として算出した。その後、そのチャネルに対する全ての特徴に関する中央ノイズによって割った調整バックグラウンド減算シグナルとして、調整Ｓ／Ｎを算出した。調整Ｓ／Ｎが３より大きく、元のＳ／Ｎが３未満であった場合、２５のフラッグをＣｙ５チャネルに対して設定して、２３のフラッグをＣｙ３チャネルに対して設定し、両方がこれらの基準を満たした場合は、２８のフラッグを設定した。調整Ｓ／
Ｎおよび元のＳ／Ｎ両方が３未満であった場合、６５のフラッグをＣｙ５に対して設定して、６３をＣｙ３に対して設定して、両色素チャネルが３未満の調整Ｓ／Ｎを有する場合は６８を設定した。全てのシグナル対ノイズ算出、調整バックグラウンド減算シグナル、および調整Ｓ／Ｎを各色素チャネルに対して算出した。ＢＧＳＳ値が６４０００以上であった場合、フラッグを設定して（Ｃｙ５に対して５５、Ｃｙ３に対して５３、両方に対して５８）、飽和を示した。
【０５８５】
元のＳ／Ｎが３以上であった場合、更なる算出用に用いたＢＧＳＳは元のＢＧＳＳであった。元のＳ／Ｎ比が３未満かつ調整Ｓ／Ｎが３以上であった場合、調整ＢＧＳＳを用いた。調整Ｓ／Ｎ比が３未満の場合、フラッグ状態の認識を有する調整ＢＧＳＳを用いた。
【０５８６】
アレイ間の比較を容易にするために、Ｃｙ３およびＣｙ５データをスケール変更した。緑／赤の比のログ値を全ての特徴に対して決定した。良好な特徴（Ｆｌａｇ  ０、２３、２５、２８、６３）に対する中央ログ比値を測定した。特徴値は、以下の公式を用いてスケール変更した。すなわち、Ｌｏｇ＿Ｓｃａｌｅｄ＿Ｆｅａｔｕｒｅ＿Ｒａｔｉｏ＝Ｌｏｇ＿Ｆｅａｔｕｒｅ＿Ｒａｔｉｏ−Ｍｅｄｉａｎ＿Ｌｏｇ＿Ｒａｔｉｏである。
【０５８７】
各特徴に対するフラッグ設定を用いて、各プローブに対する発現比、１つ、２つ、または３つの特徴の選択を決定した。全ての特徴が同じカテゴリー（ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ＝ｎｅｇａｔｉｖｅｓ、０対２８、５３−５８、および６３−６８）でフラッグ設定を有する場合、３つのスケール変更した逆対数特徴比の平均を算出した。３つの特徴が同じカテゴリーでフラッグを有さない場合、最良質のフラッグを有する特徴を用いた（０＞２５＞２３＞２８＞５５＞５３＞５８＞６５＞６３＞６８）。負のフラッグを有する特徴は全く用いなかった。最良のフラッグが同じカテゴリーの中の２または３つの特徴であったとき、逆対数平均を用いた。単一特徴が他の２つより良いフラッグカテゴリーを有する場合、その特徴比の逆対数を用いた。
【０５８８】
一旦プローブ発現比が１、２、または３つの特徴から算出されたら、スケール変更した平均値の比を後述するように得て、データを分析する際使用するために保存した。どの特徴を用いて、プローブ値を算出する場合でも、それらの特徴から得たフラッグを取り出して、そのプローブに対するフラッグ値として保存した。２つの異なるデータセットを、分析のために用い得る。フラッグを立てたデータは、フラッグを有するものを含む全ての値を用いる。分析前にフラッグを立てたデータをセットから除去することによって、選別したデータセットを作製する。
【０５８９】
（実施例１２：アレイ発現結果の実時間ＰＣＲ検証）
白血球マイクロアレイ遺伝子発現を用いて、発現マーカーおよび臨床結果に対する診断用遺伝子セットを発見した。実時間ＰＣＲ等のより高感度かつ定量的な技術を用いて、各遺伝子に対する遺伝子発現結果を検証することが望ましい。さらに、診断用ヌクレオチドセットが実時間ＰＣＲパネルとして診断試験として実行されることが可能である。または実時間ＰＣＲ検証によって提供される定量的情報を利用して、任意の代替の定量的または半定量的遺伝子発現技術を用いた診断試験を設計することができる。
【０５９０】
マイクロアレイ実験の結果を検証するために、本発明者らは実時間、すなわちキネティックＰＣＲを用いた。この種の実験では、増幅産物がＰＣＲ反応の間測定される。これによって、任意の試薬が増幅に対する律速になる前に、研究者が増幅を観察することが可能になる。キネティックＰＣＲでは、測定は、ＣＴ（閾値サイクル）またはＣｐ（交差点）である。この測定（ＣＴ＝Ｃｐ）は、増幅曲線が閾値蛍光値と交差する点である。反応の全てが増幅のそれらの線形位相に存在した領域の内の点に閾値を設定する。ＣＴを測定するとき、以前のサイクル数は、閾値がより急速に越えられたことを意味するため、より低
いＣＴ値は、より高量の開始材料を表す。
【０５９１】
幾つかの蛍光方法論は、実時間ＰＣＲでの増幅産物を測定するために利用できる。Ｔａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、プローブが配列特異的結合およびＴａｇ  ３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解されるまでの、プローブからのシグナルを阻害するために、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）もまた、ＦＲＥＴ技術を使用し、それによって、ヘアピン構造が増幅ＤＮＡに結合する特異的プローブによって緩和されるとき、蛍光が測定される。第３の一般に使用される化学は、ＤＮＡ結合色素であるＳｙｂｒグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。産生される増幅産物が多いほど、シグナルが高くなる。Ｓｙｂｒ  グリーン方法は、非特異的な増幅産物に高感度であり、プライマー設計と選択の重要性を増加させる。臭化エチジウムまたは他のＤＮＡ結合色素および蛍光色素／クエンチャー色素Ｔａｑｍａｎ化学の多くの修飾等の他の検出化学もまた、用いられ得る。
【０５９２】
（試料調製およびｃＤＮＡ合成）
実時間ＰＣＲ反応のための入力は、遺伝子特異的プライマー、特定の患者試料由来のｃＤＮＡ、および標準試薬である。ｃＤＮＡは、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８４１８−０１２）およびｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４８１９０−０１１）を用いた逆転写によって、それぞれ０．５ｎｇ／μｌおよび３ｎｇ／μｌの最終濃度で、単核ＲＮＡ（実施例２のとおりに調製）または全血ＲＮＡから生成した。第１鎖反応混合物に対して、単核全ＲＮＡ０．５μｇまたは全血ＲＮＡ２μｇおよびＯｌｉｇｏ  ｄＴ／Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ混合物１μｌを水に添加して、１１．５μｌの最終容積にした。試料混合物は、その後１０分間７０℃で配置した。７０℃インキュベーションの後で、試料を氷上で冷やし、スピンダウンして、第１鎖緩衝液混合物８８．５μｌを反応チューブに分配した。最終的な第１鎖緩衝液混合物は、１×第１の鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｙ００１４６，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｙ００１４７）、０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４０Ｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４２Ｓ）、０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４３Ｓ）、０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４１Ｓ）、２００Ｕ  逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０６４−０１４）、および１８Ｕ  ＲＮａｓｅインヒビター（ＲＮＡＧａｕｒｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−０８１５−０１，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の最終濃度を生成した。反応物を９０分間４２℃でインキュベートした。インキュベーションの後、酵素を１５分間７０℃で熱不活化し、ＲＮＡｓｅ  Ｈを２Ｕ反応チューブに添加して、２０分間３７℃でインキュベートした。
【０５９３】
（プライマー設計）
２つの方法を用いて、プライマーを設計した。第一は、ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭおよびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に提供されるＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが与えるプライマー設計に対する推奨を使用した。プライマー設計のために用いた第２の方法は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのウェブサイトにおいて、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手し得るＰＲＩＭＥＲ３  ｖｅｒ  ０．９プログラムであった。該プログラムは、Ｍａｓｓｅｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙウェブサイトにおけるウェブサイトで、Ｗｏｒｌｄ
Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂにおいてもまた、アクセスすることができる。プライマーおよびＴａｑｍａｎ／ハイブリダイゼーションプローブを両方のプログラムを用いて後述するように
設計した。
【０５９４】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ文献には、プライマーは、融解温度５８℃と６０℃との間で設計すべきであると説明される一方で、Ｔａｑｍａｎプローブに対しては、供給された試薬の塩条件下で、６８〜７０℃の融解温度を有するべきである。塩濃度は、ソフトウエアで固定する。プライマーは、１５塩基対長と３０塩基対長との間であるべきである。プライマーは、５０塩基対と１５０塩基対との間のサイズの単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）生成し、２０％と８０％との間のＣ−Ｇ含有量を有し、互いに隣り合う４を超えない同一塩基対を有し、３’末端の最後の５塩基中の２を超えないＣおよびＧを有するべきである。プローブは、５’末端上にＧを持つことができず、最少のＧを有する鎖をプローブとして用いるべきである。
【０５９５】
Ｐｒｉｍｅｒ３は、多数のパラメータを有する。融解温度以外の全てに対してデフォルトを用いて、単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の最適サイズを１００塩基に設定する。最大基準の１つは、プローブおよびプライマーの融解温度に影響することから、塩濃度である。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓに相当する融解温度を有するプライマーおよびプローブを生成するために、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓによって設計される多数のプライマーおよびプローブを、ＰＲＩＭＥＲ３を用いて試験した。５０ｍＭの塩濃度を用いることによって、これらのプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓの予測よりも３．７℃高い平均融解温度を有した。ＰＲＩＭＥＲ３を用いて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓと同等の融解温度を有するプライマーおよびプローブを設計するために、６２．７℃＋／−１．０℃の融解温度をプライマーに対するＰＲＩＭＥＲ３で用いて、７２．７℃＋／−１．０℃を５０ｍＭの塩濃度を有するプローブに対して用いた。
【０５９６】
Ｐｒｉｍｅｒ３に対するＣソースコードをダウンロードして、ＧＣＣコンパイラを用いてＳｕｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ２５０サーバー上でコンパイルした。その後、プログラムは、ソフトウエアに伴われるヘルプファイルによって記載されるような入力パラメータとともに、プライマーおよびプローブを設計したい配列を含有する入力ファイルを用いたコマンドラインから使用された。スクリプトを用いて、多数の配列を入力して、多数の可能プローブおよびプライマーを自動的に生成することを可能にした。
【０５９７】
β−アクチン（β  アクチン，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ：ＮＭ＿００１１０１）およびβ−ＧＵＳ：グルクロニダーゼβ（ＧＵＳＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ：ＮＭ＿０００１８１）に対するプライマー、２つの参照遺伝子を、両方の方法を用いて設計して、例としてここで示す。
【０５９８】
すなわち、第１の工程は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒウェブサイト（Ｓｍｉｔ，Ａ．Ｆ．Ａ．およびＧｒｅｅｎ，Ｐ．）のウェブサイトでアクセス可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを用いてｍＲＮＡ配列中で見いだされる反復配列をマスクアウトすることであった。
【０５９９】
その後、マスキングした配列の最後の３’末端上の最後の５００塩基対を、以下の典型的な入力配列を用いてＰＲＩＭＥＲ３に送信した。すなわち、
【０６００】
【化１５７】
2010022375.tif 000159
【０６０１】
ＰＲＩＭＥＲ３を実行した後、プライマーおよびプローブの１００セットをＡＣＴＢおよびＧＵＳＢに対して生成した。このセットから、左のプライマー両方が右のプライマー両方と対になり得るかどうかに基づいて、重なり（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを選択し、単一のＴａｑｍａｎプローブを正しいサイズの挿入配列に対して用いることができた。多くの経験から、本発明者らは、プライマー選択に対して混合および適合手法を用いずに予測プライマーの上の対の幾つかだけを用いることに決定した。
【０６０２】
ＡＣＴＢに対しては、これが判明した。すなわち、
【０６０３】
【化１５８】
2010022375.tif 000160
【０６０４】
試験したところ、Ｆ７５およびＲ１７８の対が最良に機能した。
【０６０５】
ＧＵＳＢに対して、以下のプライマーを選択した。すなわち、
【０６０６】
【化１５９】
2010022375.tif 000161
【０６０７】
これらのＧＵＳＢ対の組み合わせで、よく機能するものはなかった。
【０６０８】
上記のプライマー対に加えて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓは、ＧＵＳＢに対して以下のプライマーを予測した。すなわち、
順方向１７８  ＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣ（配列番号３０９３）および逆方向  ２４２  ＧＡＧＧＣＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号３０９４）である。プライマーのこの対が機能して、ＧＵＳＢｍＲＮＡを増幅した。
【０６０９】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓでこれらのプライマーを予測するために用いたパラメー
タは、以下の通りであった。すなわち、
プライマー  Ｔｍ：最小５８、最大＝６０、最適  ５９、最大差＝２度
プライマー  ＧＣ：最小２０％、最大＝８０％、３’Ｇ／Ｃクランプなし
プライマー：長さ：最小＝９、最大＝４０、最適＝２０
単位複製配列：最小Ｔｍ＝０、最大Ｔｍ＝８５
最小＝５０ｂｐ  最大＝１５０ｂｐ
プローブ：Ｔｍ１０度＞プライマー、５’末端上のＧで開始しない
その他：最大塩基対反復＝３
不明瞭残基の最大数＝０
２次的構造：最大連続ｂｐ＝４、最小総ｂｐ＝８
Ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ：最大連続マッチ＝９
最大％マッチ＝７５
最大３’連続マッチ＝７。
【０６１０】
グランザイムＢは、移植拒絶のマーカーである。
【０６１１】
グランザイムＢに対して、以下の配列（ＮＭ＿００４１３１）（配列番号３０９６）をＰｒｉｍｅｒ３に対する入力として用いた。すなわち、
【０６１２】
【化１６０】
2010022375.tif 000162
【０６１３】
グランザイムＢに対して、以下のプライマーを試験用に選択した。すなわち、
【０６１４】
【化１６１】
2010022375.tif 000163
【０６１５】
試験によって、Ｆ８１およびＲ１７８がよく機能することが実証された。
【０６１６】
この手法を用いて、同種移植拒絶に相関する発現パターンを有することが示された全ての遺伝子に対してプライマーを設計した。これらのプライマー対を、表２、表８に示し、そして配列表に追加する。この手法を用いて、標的遺伝子の任意の領域からプライマーを設計することができる。
【０６１７】
（プライマーエンドポイント試験）
プライマーを初めに検査して、それが非特異的な増幅なしで正確なサイズの産物を生成するかどうか調べた。ＲｏｘおよびＳｙｂｒグリーン色素なしで、標準の実時間ＰＣＲプロトコールを用いた。実施例３（Ｒ５０）で記載したように、５０の個体から産生された汎用単核白血球参照ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの上で各プライマー対を検査した。  
【０６１８】
ＰＣＲ反応は、１×実時間ＰＣＲ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｂ０２９５３）、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ（ＮＥＢ）、０．６２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ゴールド（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、使用する各プライマー（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）０．３μＭ、Ｒ５０逆転写反応物５μｌ、および水からなり、最終容積１９μｌであった。
【０６１９】
４０サイクルのＰＣＲの後で、１：７２，０００の最終希釈率で、各産物１０マイクロリットルをＳｙｂｒグリーンと組み合わせた。ＡＢＩ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で、各ＰＣＲ産物に対する溶融曲線を測定し、１つの明瞭なピークを有する産物を生成するプライマー対を更なる分析用に選択した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  １０００チップ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）でのアガロースゲル電気泳動法によって、これらのプライマー対由来の産物の１マイクロリットルを調べた。２つの遺伝子に対する結果を図９に示す。プライマー設計および標的遺伝子の配列から、増幅ＤＮＡ産物の予測サイズを算出し得る。所望の産物の増幅および夾雑物の最少増幅を有するプライマー対のみを実時間ＰＣＲに対して用いた。異なるサイズの多数の産物を生成したプライマーは、対象遺伝子に特異的ではないと考えられ、多数の遺伝子または染色体遺伝子座を増幅し得る。
【０６２０】
（プライマー最適化／効率）
一旦プライマーがエンドポイントＰＣＲを通過したら、該プライマーを検査して、実時間ＰＣＲ反応での反応効率を測定した。上述のように、開始全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。Ｒ５０逆転写ｃＤＮＡの５連続希釈のセット（上述のように）を水で作製する。すなわち、１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、および１：１６０である。
【０６２１】
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｎ８０８−０２２８）を用いて、Ｓｙｂｒグリーン実時間ＰＣＲ反応を実施した。プライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬からなるマスター混合物を作製した。反応での全ての成分の最終濃度は、１×Ｔａｑｍａｎ緩衝液Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＡＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＣＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＧＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、４００μＭ  ｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、１：４００，０００希釈Ｓｙｂｒグリーン色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑゴールド（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）であった。ＰＣＲマスター混合物を、２つの耐光性チューブに分配した。各β−アクチンプライマーＦ７５およびＲ１７８（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）をＰＣＲマスター混合物の１つのチューブに添加し、各β−ＧＵＳプライマーＦ１７８およびＲ２４２（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）をＰＣＲマスター混合物のもう一方のチューブに添加して、３００ｎＭの最終プライマー濃度にした。β−アクチンまたはβ−ＧＵＳマスター混合物４５μｌを９６ウエルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）のウエル中に分配した。テンプレート希釈系列の５μｌを各プライマーに対して３つのウエルに分配した。ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で、以下の条件で反応を実行した。すなわち、９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル；その後５０℃で始まり９５℃で終わる解離曲線である。
【０６２２】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２．０ソフトウエアを用いて、各ウエルからの蛍光シグナルを分析した。高エンドのベースラインを８〜２０サイクルに調整して、任意のデータ曲線への影響を低減させたが、ベースラインドリフトを低減させるためにできるだけ高くした。増幅の線形位相の間、大部分の増幅曲線が閾値を越え
ることできるように閾値を選択した。各ウエルに対する解離曲線を、そのマーカーに対する他のウエルと比較した。この比較によって、「劣った」ウエル、すなわち増幅しなかったか、間違ったサイズの産物を増幅したか、または多数の産物を増幅したものの同定を可能にした。各増幅曲線が閾値（ＣＴ）を越えたサイクル数は記録し、そのファイルを更なる分析のためにＭＳ  Ｅｘｃｅｌに転送した。三組のウエルに対するＣＴ値を平均化した。算出したＲＮＡ開始濃度のログ１０の関数として、データをプロットした。ＲＴ反応で用いたＲＮＡの元の量、ＲＴ反応の希釈率、および実時間ＰＣＲ反応で用いた量（５μｌ）を基にして、各ｃＤＮＡ希釈に対する開始ＲＮＡ濃度を決定した。各遺伝子に対して、線形回帰直線を、希釈系列点の全てを介してプロットした。線の傾斜を利用して、下記の方程式を用いて各プライマーセットに対する反応効率を算出した。すなわち、
【０６２３】
【化１６２】
2010022375.tif 000164
【０６２４】
この方程式（Ｐｆａｆｆｌ  ２００１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）用いた、これらのβ−アクチンプライマーに対する効率は、１．２８であり、これらのβ−ＧＵＳプライマーに対する効率は、１．１４である（図１０）。多数の遺伝子および多数の試料間で発現レベルを比較したとき、この効率を用いた。この同法を用いて、検査した各遺伝子のためのプライマー対に対する反応効率を算出した。効率が再現的に０．７〜２．４の間であると決定される場合、プライマー対が成功したとみなした。
【０６２５】
（ＳＹＢＲグリーンアッセイ）
一旦マーカーがＰｒｉｍｅｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＱＰＣＲに合格したら（上述の通り）、それを実時間ＰＣＲアッセイで用いた。患者ＲＮＡ試料は、ｃＤＮＡに対して逆転写され（上記のように）、１：１０希釈物を水で作製した。患者試料に加えて、テンプレート非含有コントロール（ＮＴＣ）および上記のプールした参照ＲＮＡ（実施例３参照）を全てのプレートに包含した。
【０６２６】
Ｔａｑｍａｎ  Ｃｏｒｅ  ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｎ８０８−０２２８）を用いて、Ｓｙｂｒグリーン実時間ＰＣＲ反応を実施した。プライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬からなるマスター混合物を作製した。反応での全ての成分の最終濃度は、１×Ｔａｑｍａｎ緩衝液Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＡＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＣＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＧＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、４００μＭ  ｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、１：４００，０００希釈Ｓｙｂｒグリーン色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑゴールド（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）であった。ＰＣＲマスター混合物を８つの耐光チューブにアリコートした（１つが試料セットにわたって調べる各マーカーに対する）。各マーカーに対して最適化したプライマー対を、その後、ＰＣＲマスター混合物に添加して、３００ｎＭの最終プライマー濃度にした。各マーカーマスター混合物１８μｌを、３８４ウエルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）のウエルに分配した。２μｌの１：１０希釈コントロールまたは患者ｃＤＮＡ試料を、各プライマー対に対して３組のウエルに
分配した。上記のサイクル条件を用いて、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で反応を実行した。
【０６２７】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２，０ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各ウエルからの蛍光シグナルを分析した。高エンドのベースラインを８〜２０サイクルに調整して、任意のデータ曲線への影響を低減させるが、ベースラインドリフトを低減させるためにできるだけ高くする。増幅の線形位相の間、大部分の増幅曲線が閾値を越えることできるように閾値を選択した。各ウエルに対する解離曲線を、そのマーカーに対する他のウエルと比較した。この比較によって、「劣った」ウエル、すなわち増幅しなかったか、間違ったサイズの産物を増幅したか、または多数の産物を増幅したものの同定を可能にした。各増幅曲線が閾値（ＣＴ）を越えたサイクル数は記録し、そのファイルを更なる分析のためにＭＳ  Ｅｘｃｅｌに転送した。解離曲線の分析によって劣っているとして同定された任意のウエルを表すＣＴ値を削除した。３組のウエルに対するＣＴ値を平均化した。標準偏差（Ｓｔｄｅｖ）および変動係数（ＣＶ）を３組のウエルに対して算出した。ＣＶが２より大きかった場合、３つのウエル間の域外値を同定および削除した。その後、平均を再算出した。各プレートで、コントロール（β−アクチンまたはβ−ＧＵＳ）の平均ＣＴから標的マーカーの平均ＣＴを引くことによって、各マーカー−コントロール組み合わせに対するΔＣＴを算出した。２の、標的マーカーのΔＣＴの羃乗を与えることによって、コントロールマーカーに対する発現を算出した。たとえば、β−アクチンに対する発現を以下の方程式によって算出する。すなわち、
【０６２８】
【化１６３】
2010022375.tif 000165
【０６２９】
全てのプレートを二重に行い、同様の方法で分析した。第１のプレートに対するＲＥから第２のプレートに対するＲＥ値の絶対値を引いて、平均によってそれを割ることによって、各試料−マーカー組み合わせ（相対発現）に対するパーセント値変動を測定した。２５％より多いプレート上の変動算出が５０％より多い場合、第３のプレートを実行した。
【０６３０】
（ＴＡＱＭＡＮプロトコール）
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ化学を用いて、実時間ＰＣＲアッセイも実行した。
【０６３１】
Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，＃４３２４０１８）を用いて、Ｔａｑｍａｎ実時間ＰＣＲ反応を実施した。マスター混合物を８つの耐光性チューブにアリコートした（１つが各マーカーに対する）。各マーカーに対して最適化したプライマー対を、その後、ＰＣＲマスター混合物の正確にラベル付けしたチューブに添加した。ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡデュアル標識Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｖｏｔｏ、ＣＡ、ＤＬＯ−ＦＴ−２）を、その後、ＰＣＲマスター混合物の正確にラベル付けしたチューブに添加した。あるいは、表５に示すように、クエンチャーのための吸光波長はレポーターの発光波長に合致するような蛍光レポーター色素およびクエンチャーの異なる組み合わせを用いることができる。各マーカーマスター混合物１８μｌを３８４ウエルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）に分配した。テンプレート試料の２μｌを、各プライマー対に対して３組のウエルに分配した。各試薬の最終濃度は、１×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、３００ｎＭ各プライマー、０．２５ｎＭプローブ、２μ１  １：１０希釈テンプレ
ートであった。標準条件（９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル）を用いて、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で反応を実行した。
【０６３２】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｖ２．０ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）は、各ウェルから蛍光シグナルを分析するのに用いられた。高エンドのベースラインを８〜２０サイクルに調整して、任意のデータ曲線への影響を低減させたが、ベースラインドリフトを低減させるためにできるだけ高くした。増幅の線形位相の間、大部分の増幅曲線が閾値を越えることできるように閾値を選択した。各増幅曲線が閾値（ＣＴ）を越えたサイクル数は記録し、そのファイルを更なる分析のためにＭＳ  Ｅｘｃｅｌに転送した。３組のウエルに対するＣＴ値を平均化した。標準偏差（Ｓｔｄｅｖ）および変動係数（ＣＶ）を３組のウエルに対して算出した。ＣＶが２より大きかった場合、３つのウエル間の域外値を同定および削除した。その後、平均を再算出した。各プレートで、コントロール（β−アクチンまたはβ−ＧＵＳ）の平均ＣＴから標的マーカーの平均ＣＴを引くことによって、各マーカー−コントロール組み合わせに対するΔＣＴを算出した。２の、標的マーカーのΔＣＴの羃乗を与えることによって、コントロールマーカーに対する発現を算出した。全てのプレートを二重に行い、同様の方法で分析した。第１のプレートに対するＲＥから第２のプレートに対するＲＥ値の絶対値を引いて、平均によってそれを割ることによって、各試料−マーカー組み合わせ（相対発現）に対するパーセント値変動を測定した。２５％より多いプレート上の変動算出が５０％より多い場合、第３のプレートを実行した。
【０６３３】
（ＢＩ−ＰＬＥＸＩＮＧ）
実時間ＰＣＲアッセイの変動は、反応の間でのＲＮＡ開始材料の等しくない量から生じる可能性がある。いくつかのアッセイでは、変動を減らすために、コントロール遺伝子増幅を標的遺伝子と同じ反応ウエルに含めた。２つの遺伝子からのシグナルを区別するために、異なる蛍光色素をコントロール遺伝子に対して用いた。β−アクチンをコントロール遺伝子として用い、使用するＴａｑＭａｎプローブ遺伝子を、蛍光色素ＶＩＣおよびクエンチャーＴＡＭＲＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｖｏｔｏ、ＣＡ、ＤＬＯ−ＦＴ−２）で標識した。あるいは、コントロール遺伝子に対するレポーターの発光波長が、標的に対して用いるレポーター色素の波長と十分に異なる限り、蛍光レポーター色素およびクエンチャーの他の組み合わせ（表５）を用いることができる。反応での制限的な濃度（１５０ｎＭプライマーおよび０．１２５ｎＭプローブ）で、コントロール遺伝子プライマーおよびプローブを用いて、標的マーカーを増幅するための十分な試薬が存在することを確実にした。同じプロトコール下でプレートを実行して、同方法でデータを分析するが、ＶＩＣシグナルに対して異なるベースラインおよび閾値を用いる。ＦＡＭおよびＶＩＣシグナルチャネル両方から、域外値を上記のように除去した。コントロール遺伝子からのＶＩＣシグナルを用いて、上述のように、コントロールに対する発現を算出した。
【０６３４】
（絶対定量）
参照マーカーに対する発現を算出する代わりに、実時間ＰＣＲを用いて、絶対定量を実施し得る。各マーカーの絶対量を測定するために、プレート上の各マーカーに対する既知量のテンプレートから得た希釈系列を用いて、標準曲線を構築する。細菌から精製したクローン遺伝子を用いて、または合成相補オリゴヌクレオチドを用いて、標準曲線を作製し得る。いずれにせよ、予測発現範囲を網羅する希釈系列を、プレート中の一連のウエルでテンプレートとして用いる。これらの既知量のテンプレートに対する平均ＣＴ値から、標準曲線をプロットし得る。この曲線から、未知のものに対するＣＴ値を用いて、ｃＤＮＡの開始濃度を同定する。これらの絶対量を疾患クラス（すなわち拒絶対非拒絶）間で比較し得るか、またはコントロール遺伝子に対する発現として考慮し得、試料収集、ＲＮＡ精
製および定量、ｃＤＮＡ合成、ならびにＰＣＲ増幅での試料間の変動を修正し得る。
【０６３５】
（細胞型特異的発現）
いくつかのマーカーは、特異的な細胞型のみで発現する。これらのマーカーは、非拒絶試料からの拒絶試料の区別のために有用なマーカーであり得るか、または単一の細胞型で他のマーカーの差次的発現を同定するために用いられ得る。細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＤ８等）に対する特異的マーカーを用いて、試料中の細胞集団の差を同定し得る。この細胞型で発現することが既知である他のマーカーを、ＣＤ８のレベルと比較して、ＣＤ８Ｔ細胞内の差次的遺伝子発現を示し得る。
【０６３６】
（ＰＣＲ用のコントロール遺伝子）
上記のように、標準曲線を用いた遺伝子発現の絶対定量として、またはコントロール遺伝子と比較される対象遺伝子の相対的発現として、ＰＣＲ発現測定を行い得る。後者の場合は、対象遺伝子およびコントロール遺伝子を同じ試料で測定する。これは、異なる反応または同じ反応（ｂｉｐｌｅｘ形式、上記参照）で行い得る。いずれにせよ、遺伝子発現に対する最終的な測定は、コントロール遺伝子発現に対する遺伝子発現の比率として表される。コントロール遺伝子にとって、対象標的組織内で構成的に発現することおよび個体間または個体に由来する試料間での細胞毎の基準に関する発現での最小の変動を有することが重要である。遺伝子が、この種の発現挙動を持つ場合、相対発現比は、アッセイで用いる試料ＲＮＡの量での可変性を修正するために役立つ。さらに、理想的なコントロール遺伝子は、アッセイする遺伝子と比較して、対象試料での高レベルの発現を有する。これは、対象遺伝子およびコントロール遺伝子をｂｉｐｌｅｘ形式で用いる場合重要である。コントロール遺伝子がその閾値Ｃｔに早期に達するように該アッセイを設定して、対象遺伝子と制限的な試薬について競合しないようにプライマーによってその増幅を制限する。
【０６３７】
アッセイ用の理想的なコントロール遺伝子を同定するために、上述のように、ＲＮＡ調達および調製方法ならびに実時間ＰＣＲアッセイを用いて、試料間の可変性と、単核ＲＮＡ試料および全血ＲＮＡ試料両方での発現とに対して多数の遺伝子を検査した。移植レシピエントに由来する６つの全血および６つの単核ＲＮＡ試料を検査した。両方の試料型で、二重実験での各遺伝子の強度レベルおよび可変性を図１１に示す。
【０６３８】
試料にわたる低可変性および高発現の基準に基づいて、β−アクチン、１８ｓ、ＧＡＰＤＨ、ｂ２ミクログロブリンは、ＰＡＸ試料に対するコントロール遺伝子の良い例であるということが判明した。内部ｂｉｐｌｅｘコントロールがアッセイであるので、単一のコントロール遺伝子を組み込み得る。
【０６３９】
（リアルタイムＰＣＲでの変動に対する管理）
試薬、実験者、および調製方法での相違、ならびにピペッティングステップでの可変性が原因で、リアルタイムＰＣＲ実験では、有意のプレート毎での変動がある。自動化（可変性および間違いを低減するために）、試薬ロット品質管理、および最適データ取り扱いによって、この変動を低減することができる。しかし、複製のプレート上の結果は、異なる時間で、機器中で実行することから、依然として異なる可能性がある。
【０６４０】
変動をデータ摘出および分析に入れることもできる。蛍光強度（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳ  ｖ２．１  ソフトウエアでのΔＲｎ）がユーザ決定閾値（ＣＴ）を越える時間（ＰＣＲサイクルで測定）として、リアルタイムＰＣＲ結果を測定する。相対定量を実行するとき、標的遺伝子に対するＣＴ値を、コントロール遺伝子に対するＣＴ値から引く。この差（ΔＣＴと呼ばれている）は、試料間で相違があるかどうかを決定するための実験中で比較される値である。閾値を設定する上での変動によって、追加的な間違い導かれ得る。これは特に、標的遺伝子およびコントロール遺伝子両方が同じ反応
チューブで測定されるデュプレクス実験形式では事実である。２つの遺伝子のそれぞれに特異的な色素を用いて、デュプレキシングを実行する。２つの異なる蛍光色素をプレート上で用いるので、２つの異なる閾値が設定される。これらの閾値の両方とも、各ΔＣＴに寄与する。１つのプレートから次のプレートまでの各色素の閾値設定でのわずかな差（他の色素に対する）が、ΔＣＴに大きく影響を及ぼす可能性がある。
【０６４１】
ＰＣＲプレートに対して閾値を設定する方法がいくつかある。以前のバージョンのＳＤＳソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、プレートに対する平均基線蛍光および基線の標準偏差を決定する。閾値は、基線の標準偏差×１０に設定する。ＳＤＳ  ２．０では、ユーザは、自身で基線を決めなければならない。他の機械製造元からのソフトウエアでは、ユーザ自身が閾値を設定するか、または異なるアルゴリズムを使用することが必要になる。ＳＤＳソフトウエアの最新版（ＳＤＳ  ２．１）は、自動的な基線および閾値設定を含む。ソフトウエアは、検出可能なレベルに先立つサイクルで、ΔＲｎを用いて、プレートの上の各ウエルに対して、基線を別々に設定する。プレートの間での変動性は、再現性のある閾値設定に依存する。このことは、数学的データまたは実験データにより駆動される閾値設定プロトコルを必要とする。標準的な式に従って、閾値を再現可能に設定することにより、閾値設定プロセスに導入され得る変動性が最小にされる。さらに、プレートの間に、実験的変動が存在し得、これは、データの成分に対して閾値を設定することによって、減少され得る。本発明者らは、各プレートに対する反応のセットを使用するシステムを開発した。このシステムは、閾値較正器（ＴＣｂ）と称される。ＴＣｂウェルは、全てのプレートに対して閾値を設定するために、使用される。
【０６４２】
１．ＴＣｂウエルは、実験内の全てのプレート間で共通のテンプレート、プライマー、およびプローブを含有する。
【０６４３】
２．上記で決定した最小閾値および最高閾値内で閾値を設定する。
【０６４４】
３．ＴＣｂウエルに対して平均ＣＴ値を生じるこの範囲内の値が全てのプレートで同様であるように閾値を設定する。
【０６４５】
これらの方法を使用して、表２Ｃに示されるプライマーを誘導した。
【０６４６】
（実施例１３：急性同種移植片拒絶のリアルタイムＰＣＲ発現マーカー）
実施例１４および１６において、マイクロアレイを使用して、遺伝子は、心臓および腎臓の同種移植片拒絶の有用なマーカーであると同定された。これらの研究を介して同定されたいくつかの遺伝子は、表２に列挙されている。これらの知見を確証し、発現レベルのさらに正確な測定を得、そして診断試験のためのＰＣＲ試薬を開発する目的で、同種移植片レシピエント由来の試料に対して、同定された遺伝子についてのプライマーを使用して、リアルタイムＰＣＲアッセイが実施された。いくつかの遺伝子特異的ＰＣＲプライマーが開発され、そして実施例１２に記載されるように、表２Ａにおける全ての遺伝子について、試験された。いくつかのプライマーは、表２Ｃおよび配列表に列挙されている。これらのプライマーを使用して、β−アクチンまたはβ−ｇｕｓに対する遺伝子の発現を、心臓同種移植片レシピエントから得た６９個の単核ＲＮＡ試料において、Ｓｙｂｒ緑色リアルタイムＰＣＲアッセイを、実施例１２に記載されるように使用して測定した。各試料をＩＳＨＬＴ心臓拒絶生検等級で評価した。試料を、２期で試験した。第Ｉ期において、１４の等級０の試料、１つの等級１Ａの試料、３つの等級２の試料、および９つの等級３Ａの試料を試験した。ＩＩ期において、１９の等級２の試料、４つの等級１Ｂの試料、４つの等級２の試料、および１５の等級３Ａの試料を試験した。データを、各期について個々に、および組み合わせたＩ期＋ＩＩ期の試料セットについて分析した。これらのデータを、表６にまとめる。
【０６４７】
拒絶した試料（３Ａ）と拒絶なしの試料（０）との間での発現の、平均倍数変化を計算した。ｔ試験を実施して、各遺伝子が、拒絶と拒絶なしとの間で異なって発現される有意性を決定し、そしてｐ値を計算した。高い平均倍数変化および低いｐ値を有する遺伝子を、拒絶マーカーとしてのさらなる開発のための最良の候補とみなす。しかし、低い平均倍数変化および高いｐ値を有する遺伝子が、依然として、いくらかの患者における拒絶についての有用なマーカーであり得、そして拒絶を診断するための遺伝子発現パネルの一部として働き得ることに注意することが、重要である。これらの同じＰＣＲデータを使用して、実施例１７に議論されるような急性拒絶の診断のための、ＰＣＲ遺伝子発現パネルを作製した。
【０６４８】
Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定のような非パラメータ検定は、有用なマーカーを選択するために有用である。これらは、マーカーが、異なるクラスの間を区別する能力およびそれらの有意性を評価する。例えば、全ての試料（拒絶なしの試料と拒絶する試料との両方を含む）の中央値を閾値として使用し得、そしてＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ検定を、閾値より上および閾値より下の拒絶および拒絶なしの数に対して適用し得る。
【０６４９】
これらの方法を使用して、表２Ｄにおけるデータを作成した。
【０６５０】
（実施例１４：心臓同種移植拒絶の、マイクロアレイを使用する診断についての、診断ヌクレオチドセットの同定）
急性心臓同種移植拒絶の診断およびモニタリングのために有用な発現パターンを有する遺伝子を同定した。さらに、同種移植拒絶に対する診断アルゴリズムにおいて一緒に作用する遺伝子のセットを同定した。急性同種移植拒絶は、全ての固体器官（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、膵臓島細胞、腸管などが挙げられる）の移植において起こるプロセスである。急性心臓拒絶の遺伝子発現マーカーは、全ての同種移植レシピエントの診断およびモニタリングのために有用であり得る。以下のマーカーの発見において使用される患者、患者の臨床データ、および患者試料は、実施例５に記載される臨床試験に由来した。
【０６５１】
収集された臨床データを使用して、発現データの修正のための患者群または試料群を規定した。患者群を、比較のために同定した。例えば、有用かまたは興味深い臨床的特徴を保有する患者群対その特徴を保有しない患者群。心臓同種移植拒絶の測定は、臨床データから誘導され、患者（および患者試料）を、いくらかの期間にわたって、または任意の１つの時点で、より高いかまたはより低い拒絶活性を有する群に分割した。このようなデータは、病理学者による心臓生検標本の組織学的読取り、および終末器損傷（抑制された左心室機能不全（減少した心拍出量、減少した駆出率、低い心拍出量の臨床的兆候）および強心薬の使用）の進行を測定するデータから決定されるような拒絶等級であった（Ｋｏｂａｓｈｉｇａｗａ，１９９８）。
【０６５２】
単核ＲＮＡ試料を、心臓同種移植片移植を最近受けた患者から、実施例２に記載されるプロトコルを使用して収集し、そして調製した。試料収集の時点での同種移植拒絶状態を、実施例５に記載されるように、そして本明細書に要約されるように、心臓生検の試験によって決定した。
【０６５３】
３００の患者試料を、分析に含めた。各患者試料は、試料の時点で収集された生検および他の臨床データに関連した。心臓生検が、地方センターの病理学者によって、そして４つの全ての地方センターからの生検スライドを読み取った３人の中央病理学者によって、盲検の様式で等級付けられた。生検等級には、０、１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、および３Ｂが含まれた。等級４の拒絶は、同定されなかった。独立変数を、これらの等級に基づいて、
地方センター病理学読取り、中央の盲検病理学者の読取り、読取りの最高値、全ての病理学的読取りから誘導された地方または中央の一致した等級を使用して展開した。試料を、以下の様式で、拒絶なしまたは拒絶に分類した：等級０対等級１〜４、等級０および１Ａ対等級１Ｂ〜４、等級０対等級３Ａ、等級０対等級１Ｂ〜４、ならびに等級０対等級１Ｂおよび３Ａ〜４。等級０の試料を選択し、その結果、これらには、同じ患者における急性拒絶のエピソードがすぐには後に続かなかった。等級０の試料を等級３Ａの試料と比較することによって、平均的な、拒絶群と拒絶なしの群との間の最も大きい差異が与えられる。
【０６５４】
全ての病理学者の読み取りの最高値をとることは、異議のない等級０であった拒絶なしの群から、任意の試料を除去する効果を有する。これはまた、病理学者が拒絶の特徴を見た場合に、その読み取りが正しいようであり、そして他の病理学者は見出し損なっているかもしれないと仮定した場合に、分析において使用される拒絶試料の数の増加を生じる。多くの有力な心臓病理学者および臨床医は、ＩＳＨＬＴ等級２の拒絶が、有意な急性拒絶を表さないと考える。従って、補正分析について、等級２の試料の排除が正当にされ得る。臨床データをまた使用して、試料を分析に含めるための基準を決定した。例えば、急性拒絶を有する患者、または初期の移植後期間にある（外科的炎症を起こしている）患者は、拒絶とは無関係の免疫活性化を有し得、従って、拒絶を有さない患者として同定することが困難であり得る。最も拘束的な包含基準は、試料が、細菌感染もウイルス感染も有さない、心臓移植後少なくとも２週間であり、無症候性であり、そして現在入院していない患者由来であることを必要とした。
【０６５５】
ＲＮＡの調製後（実施例２）、増幅、標識、ハイブリダイゼーション、走査、特徴抽出およびデータ処理を、実施例９に記載のオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、実施例１１に記載のように行った。生じたＣｙ３発現（患者試料）／Ｃｙ５（Ｒ５０参照ＲＮＡ）のｌｏｇ比を、分析に用いた。
【０６５６】
マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ，Ｔｕｓｈｅｒら，２００１、実施例１５）を用いて、拒絶群と拒絶なしの群との間で差次的に発現する遺伝子を同定した。独立変数、包含基準、統計学／参照、およびデータサブセットの多くの異なる組み合わせが、ＳＡＭ分析において使用されて、拒絶と拒絶なしとの間で有意に異なって発現される遺伝子の主要なリストを作成した。実施例１５に記載されるように、ＳＡＭは、誤った検出の割合を、異なって発現すると同定される各遺伝子に割り当てる。これらの遺伝子の最も有意なものが、同定された。例示的な分析は、ＳＡＭを使用する、等級０の試料の、等級３Ａ〜４の試料に対する比較であった。全ての病理学的読み取り由来のデータを使用して、一致した等級０の試料および等級３Ａ以上の少なくとも１つの読み取りを有する試料を同定した。この拒絶および拒絶なしの定義を使用して、拒絶試料由来の発現プロフィールを、ＳＡＭを使用して、拒絶なしの試料と比較した。この分析は、１％のＦＤＲを有する７つの遺伝子、１．４％における１５の遺伝子、３．９％における３５の遺伝子を同定した。さらにより多くの遺伝子が、より高いＦＤＲレベルにおいて同定された。
【０６５７】
表７において、多くのＳＡＭ分析が要約される。各場合において、３人の病理学者からの最も高い等級が、分析のために採用された。拒絶および拒絶クラスは、規定されていない。試料は、患者に関する冗長性にかかわらず使用されるか、または１人の患者もしくは１つのクラスあたりの１人の患者あたり１つのみの試料が使用されることが要求されるかの、いずれかである。分析において使用される試料の数が与えられ、そして達成される最も低いＦＤＲが記録される。
【０６５８】
ＳＡＭによって、候補拒絶マーカーとして同定される遺伝子のいくつかが、表２ＡおよびＢに記録される。ＳＡＭは、群間の差異、および各群内の試料間の変動の規模に基づい
て、有意に異なるとして遺伝子を選択する。ＳＡＭによって、拒絶と拒絶なしとの間で異なって発現されると同定されない遺伝子は、依然として、有用な拒絶マーカーであり得ることに注目することが重要である。なぜなら、１．マイクロアレイ技術は、低レベルで発現される全ての遺伝子を検出するほど十分には感受性ではないから。２．遺伝子は、患者のサブセットにおいてのみ有用な拒絶マーカーである点で、遺伝子発現パネルの有用なメンバーであり得るから。この遺伝子は、全ての拒絶試料と拒絶なしの試料との間で、有意には異なって発現されないかもしれない。
【０６５９】
結果の交差検定の目的で、データベースをまた、サブセットに分割して、データの大まかに半分である２つのサブセットの間の分析を比較した。構築されるサブセットの型は、以下の通りであった。第一の半分／第二の半分のサブセットは、試料の数によって順番になったデータセットからの、試料の第一の半分および試料の第二の半分であった。奇数／偶数のサブセットは、同じ供給源（試料の数によって順番になったデータセット）を使用したが、奇数のサブセットは、最初のもので開始する２番目ごとの試料からなり、そして偶数のサブセットは、第二の試料で開始する２番目ごとの試料からなり、中央の１４／他のサブセットは、同じデータセットであり、移植病院によって分割される。中央の１４のサブセットは、中央１４における患者由来の全ての試料からなり、一方で、他のサブセットは、他の３つの中央（１２、１３および１５）由来の全ての試料からなった。遺伝子が、両方のデータのセットにおいて有意に異なって発現されることが見出された場合、高い優先度が、診断試験の開発のためにその遺伝子に置かれた。このことは、「アレイスコア」値（表２Ｂ）に反映され、これはまた、遺伝子についての誤った検出の割合、および分類モデルにおける遺伝子の重要性を考慮した（実施例１７を参照のこと）。
【０６６０】
あるいは、試料を、１０の等しい部分に分け、そしてＳＡＭの結果の１０分割交差検定を行い得る。
【０６６１】
マイクロアレイデータをまた使用して、実施例１７に記載されるように、拒絶の診断のための分類モデルを作成した。分類モデルを介して、拒絶の診断において有用であると同定される遺伝子は、表２Ｂにおいて、「モデル」欄に記載される。
【０６６２】
遺伝子が、マイクロアレイ有意性分析、分類モデル、ＰＣＲ分析、または従来技術の検索によって、有用な拒絶マーカーであると同定される場合、種々のアプローチが使用されて、目的の遺伝子と類似の発現挙動（同時発現）を有する遺伝子が発見された。遺伝子が、有用な拒絶マーカーである場合、類似の発現挙動を有すると同定される遺伝子もまた、おそらく、有用な拒絶マーカーである。階層クラスター化（Ｅｉｓｅｎら、１９９８、実施例１５を参照のこと）を使用して、確立された拒絶マーカーについての同時発現される遺伝子を同定した。遺伝子を、クラスター化系統樹の最も近い枝から同定された。移植レシピエント由来の２４０の試料から作製された遺伝子発現プロフィールを、上記のように作成した。階層クラスター化を実施し、そして拒絶マーカーの同時発現される遺伝子を同定した。一例が、図１２に示される。配列番号８５は、マイクロアレイとＰＣＲとの両方を使用して、拒絶と拒絶なしとの間で有意に異なって発現されることが示された。遺伝子配列番号３０２０は、階層クラスター化によって、配列番号８５と密接に同時発現されるとして同定された。表２Ｂにおいて、確立されたマーカーと同時発現すると同定された遺伝子は、「クラスター」と標識される欄内のものと同時発現される配列番号を列挙することによって、そのように同定される。
【０６６３】
リアルタイムＰＣＲ検定のためのプライマーのいくつかは、実施例１２に記載されるようなマーカー遺伝子の各々について設計され、そして表２Ｃおよび配列表に列挙される。これらのプライマーを使用するＰＣＲ発現測定を使用して、アレイ知見を検定し、差次的遺伝子発現をより正確に測定し、そして拒絶の診断のためのＰＣＲ遺伝子発現パネルを、
実施例１７に記載されるように作成した。
【０６６４】
データを分析する代替の方法は、以下を包含し得る：１）参照チャネルによる標準化なしで、試料チャネルを使用すること、２）参照に基づいて、強度依存性の標準化を使用することであって、これは、参照チャネルにおけるシグナルが大きい場合、より大きい補正を提供する、３）バックグラウンドの減算なしで、またはバックグラウンド自体ではなく、バックグラウンド強度の実験的導関数を減算することなく、データを使用すること。
【０６６５】
これらの方法を使用して、表２Ｂに列挙される遺伝子を同定した。
【０６６６】
（実施例１５：相関および分類分析）
実施例１１で記載したように、マイクロアレイから得た発現データセットの生成および処理後、大部分のその後の分析のためにログ比を用いる。これは、試料および汎用レフェレンス間の各遺伝子に対する発現比の対数である。この処理アルゴリズムは、多数のフラッグを、低シグナル対ノイズの、飽和シグナルの、あるいは低いまたは不確かな質の他の方法でのデータに割り当てる。全てのデータ（フラッグを立てたデータを含む）を用いて相関分析を進めることができるか、またはフラッグを立てたデータがデータから除去される選別データセット上で行うことができる。選別データは、より少ない可変性およびノイズを持ち、より有意なまたは予測の結果を生じることが可能である。フラッグを立てたデータは、利用可能な全てのデータを含有し、選別データセットでは見逃した遺伝子の発見を可能にする。
【０６６７】
上記および実施例１１の質に対するデータを選別した後、欠けているデータは、マイクロアレイデータセットで共通である。いくつかのアルゴリズムは、完全なデータセットを必要とせず、このように欠けている値を許容することができる。他のアルゴリズムは、欠けているデータの入力値で最適となるか、または該値を必要とする。分析での全ての試料にわたって欠けている値を５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％または他の％より多く有する分析から全ての遺伝子を選別することによって、欠けている値を有するデータセットの分析を進めることができる。列平均、カラム平均、最も近接のまたは他の算出数値を用いるような種々の方法によって、欠けている値に対するデータの帰属を実行することができる。明記した場合を除き、選別および帰属に対するデフォルト設定を用いて、全ての分析用ソフトウエアパッケージに対するデータを調製した。
【０６６８】
発現データに加えて、臨床データが分析に含まれる。連続変数、例えば超音波心臓検査で測定される心臓の駆出分画または白血球数が、相関分析のために使われることができる。研究被験体上で集められる臨床データの任意の断片を、相関または分類分析で用いることができる。場合によっては、分析の前に値の対数を得ることが望ましい。これらの変数を遺伝子発現値とともに分析に含むことができ、その場合には、それらは別の「遺伝子」として処理される。患者の状態を診断するために機能するマーカーセットを発見することができ、これらには、遺伝子および臨床パラメータを含むことができる。男性または女性等の分類変数も相関分析用の変数として用いることができる。例えば、患者の性別は、分類木のための重要なスプリッターでありうる。
【０６６９】
発現データの有意性または分類分析に対する監視ベクトル（従属変数）として臨床データを用いる。この場合、試料と関連する臨床データを用いて、相関または分類分析のために試料を臨床的に意味がある診断カテゴリーに分ける。例えば、腎生検からの病理的検体を用いて、狼瘡患者を腎臓疾患持つおよび持たない群に分けることができる。第３のまたはより多いカテゴリーも含むことができる（例えば「未知」または「未報告」）。監視ベクトルの発現データおよび定義の生成後に、相関、有意性、および分類分析を用いて、どの遺伝子セットが患者および患者試料の診断および分類に最も適当であるかを決定する。
発現データ分析の２つの主要な種類を通常、異なる結果および目的で、発現データ上で実行する。第一は、有意性分析または差の分析である。この場合、分析の目標は、試料群間で差次的発現する遺伝子を同定すること、および統計学的信頼を同定されるそれらの遺伝子に割り当てることである。これらの遺伝子は、問題となっている疾患過程のマーカーでありえ、さらに指標のための診断ツールとして研究および開発される。分析の第２の主要なタイプは、分類分析である。有意性分析が試料群間で差次的に発現する個々の遺伝子を同定する一方で、分類分析は、試料（患者）群を最適に識別する遺伝子発現値に対する遺伝子セットおよびアルゴリズムを同定する。結果として生じる遺伝子発現パネルおよびアルゴリズムを用いて、診断検査を作製および実行することができる。遺伝子のセットおよび診断ツールとしてのそれらを用いるためのアルゴリズムは、本明細書でしばしば「モデル」と言及される。個々のマーカーを用いても、遺伝子発現診断モデルを作製することができる。しかし、多数の遺伝子（または遺伝子セット）が多くの場合より有用かつ正確な診断ツールである。
【０６７０】
（マイクロアレイに対する有意性分析（ＳＡＭ））
マイクロアレイに対する有意性分析（ＳＡＭ）（Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１）は、それらの発現値および応答ベクトル間の相関を持つ遺伝子が統計学的に発見され、統計学的有意性を割り当てることを介した方法である。有意遺伝子に対する偽有意性の比率は、Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）である。これは、各閾値に対して、有意であると言われる複数の遺伝子があり、ＦＤＲによって、この主張に対する信頼レベルを与えられることを意味する。ＳＡＭによって遺伝子が２つのクラス間で差次的に発現すると称する場合、５％のＦＤＲとともに、遺伝子がクラスの間で実際に差次的に発現する９５％の可能性がある。ＳＡＭは、該クラス間で差次的に発現する遺伝子を同定する。このアルゴリズムは、クラスにおける低い変動性、およびクラスの間における大きい変動性を有する遺伝子を選択する。アルゴリズムは、分類に有用ではあるが、多くの試料中で差次的に発現しない遺伝子を同定しないかもしれない。例えば、男性でなく女性にある疾患に有用なマーカーである遺伝子は、ＳＡＭ分析では、非常に有意なマーカーではないかもしれないが、多遺伝子アルゴリズムの診断用の遺伝子セットの部分としては有用でありうる。
【０６７１】
監視ベクトルとして臨床データを用いて、患者試料から得たデータおよび分類定義を生成した後、ＳＡＭを用いて、グループ分けの中で差次的に発現する可能性がある遺伝子を検出する。ここで述べるように、最も高い有意性を持つ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ（実施例１３）によって検証することができるか、分類アルゴリズムを構築するために用いることができる。
【０６７２】
（分類）
分類アルゴリズムを用いて、遺伝子セットと、診断および疾患モニタリング検査として適用することができるそれらの遺伝子の発現レベルの公式を同定する。同じ分類アルゴリズムを、マイクロアレイおよびＰＣＲを用いた発現データを含む全ての種類の発現およびプロテオミクスのデータに適用することができる。分類モデルの例は、実施例１７に与えられる。下記の考察は、使用するアルゴリズムおよび使用方法について記載する。
【０６７３】
分類および回帰樹（ＣＡＲＴ）は、決定木分類アルゴリズムである（Ｂｒｅｉｍａｎ  １９８４）。遺伝子発現からおよび／または他のデータに対して、ＣＡＲＴは、試料分類のための決定木を呈することができる。決定木の各ノードは、１つ以上の遺伝子または変数の発現レベルについての質問を伴う。閾値より上にある試料は、決定木の１つの枝を下がり、閾値より上にはない試料は他の枝を下がる。発現データセット由来の遺伝子は、ＳＡＭ分析（または他の有意性検査）での有意な差次的発現、監督した木−収穫分析による検定、試料群との間の高い倍変化、またはターゲット疾患の分類への既知の関連によって
ＣＡＲＴで分類法建設のために選択されることができる。さらに、臨床問題に対する既知の重要性であるか、多変量解析または他のいくらかの技術による有意な予測値であるとわかるＣＡＲＴについての独立変数として臨床データを用いることができる。ＣＡＲＴは、分類（診断）に対する予測変数とそれらの関連する決定法則を同定する。ＣＡＲＴは、各スプリッター（分類での有用な遺伝子のための次善の代用である遺伝子）に対する代理物も同定する。アッセイの所望のパフォーマンスを最適化するために誤分類コストを増加させることによって、分析をＣＡＲＴで実行する。例えば、所定の診断に対する検査の感度が９０％より大きいことは、最も重要であり得る。１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）またはｖ−分割交差検定（後述参照）を用いてＣＡＲＴモデルを構築および検査することができる。ＣＡＲＴは、変数（５〜５０）のより少ない数で、最もよく作用する。
【０６７４】
群を識別するために決定木を構築する分類アルゴリズムであるという点で、多変量加法回帰木（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ＪＨ  １９９９，ＭＡＲＴ）はＣＡＲＴと類似している。ＭＡＲＴは、任意の分類問題のために対して多数の木を構築して、得られたモデルは多数の木の組み合わせを含む。ＭＡＲＴは、モデル構築に際して、変数を選択することができ、８０００の遺伝子マイクロアレイに由来するものなどの、大量のデータセットに用いられることができる。ＭＡＲＴが多くの木の組み合わせを用いて、任意の１本の木からはあまり多くの情報をとらないので、訓練に耐える。ＭＡＲＴは、分類子として使うための遺伝子セットおよびアルゴリズムを同定する。
【０６７５】
Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，２００２に記載される方法によって、ニアレストシュランクンセントロイドクラシファイア（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｓｈｒｕｎｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）をマイクロアレイまたは他のデータセットに適用することができる。このアルゴリズムも分類のために遺伝子セットを同定し、試料の各クラスに対して、それらの１０分割交差検定誤り率を決定する。アルゴリズムは、セット中の１つの遺伝子から全ての遺伝子に至るまで、どんなサイズのモデルに対する誤り率でも決定する。特定数の遺伝子が用いられるとき、どちらかのまたは両方の試料クラスに対する誤り率が最小化され得る。この遺伝子数が測定されるとき、選択した遺伝子と関連するアルゴリズムが同定され、将来の試料に対する分類子として使用され得る。
【０６７６】
各分類アルゴリズムに対して、かつ有意性分析に対して、構築される遺伝子セットおよび診断アルゴリズムは、交差検定と予測検定（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）によって試験される。これらの手段でのアルゴリズムの検証は、標的集団に対するアルゴリズムの予測値の推定を産む。１０分割交差検定分析（訓練試料の１０％を分析外として、分類アルゴリズムを残りの９０％で構築する）を含む多くの手法が存在する。１０％は、その後、アルゴリズムに対する検査セットとして用いられる。試料の１０％を各回の検査セットとして残したまま、この過程を１０回繰り返す。この分析を介して、予測（検査）試料で用いるアルゴリズムの強力さを推定するために役立つ交差検定誤りを導き出すことができる。試料の任意の％を、交差検定（ｖ−分割交差検定（ＬＯＯＣＶ））のために残しておくことができる。許容される交差検定誤りを持つ診断に対して遺伝子セットを構築するとき、初期分析には含まれない試料（検査試料）を用いて、遺伝子のこのセットを試験する。これらの試料を、臨床試験の間に発生するアーカイブから取り出すことが可能である。また、試料を入手して、遺伝子セットを用いて、患者診断を予測する場合、新規の予測臨床試験を開始することができる。
【０６７７】
（実施例１６：急性同種移植拒絶：生検組織遺伝子発現プロファイリング）
急性同種移植拒絶は、レシピエントの白血球の活性化、および拒絶する器官内への浸潤を包含する。例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ４  Ｔ細胞によって活性化され、そして同種移植片に入り、ここで、移植片組織を破壊する。これらの活性化された、移植片に関連
する白血球は、移植片内に存在し得、死滅するかまたはその移植片を出る。出る場合、これらの細胞は、これらが尿または血液（腎臓同種移植片の場合）、胆汁または血液（肝臓移植片の場合）、あるいは血液（心臓同種移植片の場合）に入る道を見出し得る。これらの活性化された細胞は、特異的な遺伝子発現パターンを有し、これは、マイクロアレイ、ＰＣＲ、または他の方法を使用して測定され得る。これらの遺伝子発現パターンは、移植片組織（移植片関連白血球）、血液白血球、尿白血球、または糞便／胆汁白血球において測定され得る。従って、移植片関連白血球の遺伝子発現パターンは、診断試験のために移植片の外側で測定され得る、活性化された白血球のマーカーを発見するために使用される。
【０６７８】
腎臓生検組織試験片および心臓生検組織試験片を、遺伝子発現プロファイルについて取得する。
【０６７９】
これらの試験片を、同種移植生検のときに取得して、標準的なアプローチを用いて液体窒素中で急速凍結するか、または製造業者の推奨（ＲＮＡｌａｔｅｒ，  Ｑｉａｇｅｎ，
Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従いＲＮＡ安定試薬に浸漬することによって、保存した。また、この生検同種移植片の生理学的評価を得て、そしてサンプルを、心臓に関する場合、特定のＩＳＨＬＴ拒絶等級（ＩＳＨＬＴ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｇｒａｄｅ）を有するか、または、腎臓に関する場合、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、急性管部壊死（ａｃｕｔｅ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を有するかもしくは疾患を有さないとして、分類した。
【０６８０】
２８の腎臓生検組織サンプルを、ＲＬＴ緩衝液に移して、ホモジョナイズし、そして、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して調製した。平均的なＲＮＡ総量は、１．３μｇである。サンプルを、カラム上で、ＤＮＡｓｅ消化に供した。１８サンプルは、進行中の急性同種移植片拒絶反応を有する患者に由来して、１０のサンプルは、慢性拒絶反応または急性腎不全を有するコントロールに由来する。
【０６８１】
サンプルからのＲＮＡを、増幅について使用され、標識および白血球アレイに対するハイブリダイゼーションについて使用した（実施例１１）。「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ，  Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１，実施例１５）を、その急性拒絶反応サンプルとコントロールとの間で差次的に発現した遺伝子を同定するために、使用した。移植に関連する急性拒絶反応の白血球マーカーは、活性化した白血球においてあるレベルで発現している遺伝子でなければならない。白血球は、急性拒絶反応に関連して、いくらかの頻度を伴って移植組織中に存在するので、拒絶反応と関連する白血球は、その実験において、急性拒絶反応においてアップレギュレートされるとしてＳＡＭにより同定される。３５の遺伝子が、５％未満の偽検出を伴うＳＡＭによって急性拒絶反応においてアップレギュレートされたとして同定され、そして、１３９の遺伝子を、＜  １０．０％  ＦＤＲで検出した。この分析の結果を、表８に示す。
【０６８２】
これらの遺伝子の各々に対して、５０マーのオリゴヌクレオチド配列を使用して、ＮＣＢＩデータベース（ＵｎｉｇｅｎｅおよびＯＭＩＭを含む）を検索した。配列分析により、公知の白血球特異的マーカーであるか、公知の白血球発現性マーカーであるか、白血球発現性ではないことが公知であるか、または未知の発現であるかのいずれかであるとして、遺伝子を同定した。この情報は、アップレギュレーションされている全ての遺伝子から候補白血球マーカーを選択することを補助する。このことは、アップレギュレーションされている遺伝子のいくつかは腎臓組織により発現されているかも知れないので、必須である。白血球特異的または白血球発現性であるこれらの遺伝子を、急性同種移植拒絶（心臓
および腎臓）を有する患者および有さない患者に由来する尿サンプルおよび血液サンプル中においてＰＣＲにより評価するために選択した。これらの遺伝子は、同種移植組織検体における急性拒絶の有用な発現マーカーであり、循環白血球、または尿中白血球における処理のための有用な遺伝子発現マーカーでもあり得る。白血球で発現することが知られている遺伝子を表８に示す。さらに、この分析に由来する白血球発現性遺伝子のいくつかを、ＰＣＲによる確認および急性心臓拒絶の診断のための開発のために選択した。これらを表２に記載する。
【０６８３】
腎臓生検検体において、リアルタイムＰＣＲを使用して、末梢血液中の５つの心臓拒絶マーカーをアッセイした。急性拒絶（ｎ＝６）とコントロール（ｎ＝６）との間でのこれらの遺伝子についての平均変化倍率を下で与える。実験は、試験するサンプルの数および結果の有意性を増大させるために継続中である。
【０６８４】
（腎臓同種移植組織における心臓拒絶末梢血液マーカーのＰＣＲアッセイ。Ｒ＝拒絶、ＮＲ＝拒絶なし）
【０６８５】
【化１６４】
2010022375.tif 000166
【０６８６】
細胞から分泌される腎臓拒絶のマーカーは、患者の尿または血清において、拒絶に対する診断またはスクリーニングアッセイとして測定し得る。より低い分子量を有する遺伝子が、この方法において測定される尿中に濾過されて入る可能性が最も高い。標準的な免疫アッセイが、これらのタンパク質を測定するために使用され得る。表８に分泌されることが公知である遺伝子を示す。
【０６８７】
（実施例１７：急性同種移植拒絶の診断およびモニタリングについてのマイクロアレイおよびＰＣＲによる遺伝子発現パネル（ｐａｎｅｌ））
（アレイパネル／分類モデル）
本発明の方法を使用して、急性同種移植拒絶のスクリーニングおよび診断についての遺伝子発現パネルを発見した。遺伝子発現パネルは、種々の技術（マイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない）の任意の１つを使用する診断試験のために実行され得る。
【０６８８】
実施例２および５に記載したように心臓同種移植レシピエントから収集および調製した末梢血液単核細胞ＲＮＡを用いて、実施例１１、１３、および１５に記載したようにマイクロアレイを使用して白血球の遺伝子発現プロフィールの作成および分析を行った。３００サンプルを分析した。ＩＳＨＬＴ拒絶グレードを用いて、患者を拒絶を有するクラスおよび拒絶を有さないクラスとに分けた。Ｍｕｌｔｉｐｒｅ  Ａｄｄｉｃｔｉｖｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ（ＭＡＲＴ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ＪＨ  １９９９，実施例１５）を使用して、高感度で拒絶を診断するための遺伝子発現パネルおよびアルゴリズムを構築した。示す場合を除いて、ＴｒｅｅＮｅｔ１．０（Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれる、ＭＡＲＴの実施のためのデフォルトの設定を使用した。
【０６８９】
８２個のグレード０（拒絶）サンプルおよび７６個のグレード１Ｂ−４（拒絶なし）サンプルを訓練集合（各クラスの８０％）および試験集合（各クラスの２０％）に分けた。次いで、ＭＡＲＴアルゴリズムを、訓練集合について開発し、拒絶を拒絶なしとする分類ミスについて１．０２：１のコスト（ｃｏｓｔ）で、拒絶サンプルを拒絶なしサンプルと区別した。次いで、得られたアルゴリズムを使用して、試験サンプルを分類した。このアルゴリズムは、訓練集合中の拒絶なしサンプルの５１／６６（７７％）および試験集合中の拒絶なしサンプルの９／１６（５６％）を正確に分類した。拒絶サンプルについては、訓練集合においては６４／６４（１００％）が正確に分類され、試験集合おいては１２／１２が正確に分類された。このアルゴリズムは３７個の遺伝子を使用した。ＭＡＲＴは、このモデルにおける重要性の順序により遺伝子に序列をつける。３７個の遺伝子は、順に、配列番号：３０５８、３０３０、３０３４、３０６９、３０８１、３０７２、３０４１、３０５２、３０４８、３０４５、３０５９、３０７５、３０２４、２７９、３０２３、３０５３、３０２２、３０６７、３０２０、３０４７、３０３３、３０６８、３０６０、３０６３、３０２８、３０３２、３０２５、３０４６、３０６５、３０８０、３０３９、３０５５、４９、３０８０、３０３８、３０７１であった。
【０６９０】
移植後１ヶ月の患者および公知のＣＭＶ感染を有する患者に由来するサンプルを除外することにより、別のＭＡＲＴモデルを構築した。２０個のグレード０（拒絶）サンプルおよび２５個のグレード１Ｂ−４（拒絶なし）サンプルを訓練集合（各クラスの８０％）および試験集合（各クラスの２０％）に分けた。次いで、ＭＡＲＴアルゴリズムを、訓練集合について開発し、デフォルトの設定を用いて拒絶サンプルを拒絶なしサンプルと区別した。次いで、得られたアルゴリズムを使用して、試験集合を分類した。このアルゴリズムは、訓練集合および試験集合の両方のクラスのサンプルの１００％を正確に区別した。しかし、このモデルは、１６９個の遺伝子を必要とした。このサンプル分析は、アルゴリズムの全てのデシジョンツリーが２つのノード（ｎｏｄｅ）（１つの決定、「スタンプ（ｓｔｕｍｐ）モデル」）からなるという要求性がある点でのみ異なる２回目の実施を行った。この場合、訓練集合においては１５／１６の拒絶なしサンプルが正確に同定され、試験集合においては４／４の拒絶なしサンプルが正確に分類された。拒絶サンプルについて、訓練集合においては１７／１９が正確に同定され、試験集合においては５／６が正確に分類された。このモデルは、２３個の遺伝子を必要とした。それらは、重要性の順に、配列番号：３０４２、２７８３、３０７６、３０２９、３０２６、２７５１、３０３６、３０７３、３０３５、３０５０、３０５１、３０２７、３０７４、３０６２、３０４４、３０７７、２７７２、３０４９、３０４３、３０７９、３０７０、３０５７、３０７８であった。
【０６９１】
（リアルタイムＰＣＲパネル／分類モデル）
最良の拒絶マーカーについてのＰＣＲプライマーを開発し、実施例１２および１３に記載したように移植患者サンプルに対するリアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。このデータを使用して、拒絶の診断のためのＰＣＲ遺伝子発現パネルを構築した。ＭＡＲＴ（実施例１５）を使用して、拒絶を診断するために、１２個の拒絶なしサンプル（グレード０）および１０個の拒絶サンプル（グレード３Ａ）を用いて、１０回（１０−ｆｏｌｄ）相互確認したモデルを作成した。拒絶を拒絶なしとする分類ミスに対して１．０２：１のコストを割り当てたこと、および全てのデシジョンツリーが２つのノードに限定される（「ｓｔｕｍｐ  ｍｏｄｅｌ」）という要求性を除いて、デフォルトの設定を使用した。２０個の遺伝子をこのモデルにおいて使用した。これらの遺伝子としては、配列番号１０１、３０２１、１０２、２７８１、７８、８７、８６、３６、７７、２７６６、３０１８、８０、３０１９、２７５２、７９、９９、３０１６、２７９０、３０２０、３０５６、８８が挙げられる。この１０回相互確認した拒絶についての感度は１００％であり、特異性は８５％であった。遺伝子についてのいくつかのＰＣＲプライマーを表２Ｃおよび配列表に列挙してある。
【０６９２】
ｎｅａｒｅｓｔ  ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら  ２００２；ＰＡＭ  バージョン１．０１，実施例１５を参照のこと）を使用して、ＰＣＲデータについての異なる分析を行った。拒絶を診断するために、１３の拒絶なしサンプル（グレード０）および１０個の拒絶サンプル（グレード３Ａ）を用いて、１０回相互確認したモデルを作成した。（０．５、０．５）の先行確率（ｐｒｉｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）設定を使用したこと以外は、デフォルトの設定を使用した。このアルゴリズムは、任意の数の遺伝子を用いるアルゴリズムを導出した。３遺伝子モデルは、拒絶についての１０回相互確認した感度が９０％であり、特異性が８５％であり、高度に正確であった。
【０６９３】
このモデルで使用された３つの遺伝子は、配列番号：２７８４、７９、および２７９４であった。使用したＰＣＲプライマーのいくつかを表２Ｃおよび配列表に示した。ＲＯＣ曲線をこの３遺伝子モデルについてプロットした。それを図１３に示す。
【０６９４】
（実施例１８：アッセイサンプルの調製）
ＸＤｘの白血球特異的マーカーが全血において検出され得ることを示すために、本発明者らは、ＰＡＸｇｅｎｅ全血収集、安定化、およびＲＮＡ単離キット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）を使用して、全血ＲＮＡを収集した。種々の量の全血ＲＮＡを、初期ＲＴ反応に使用し（１、２、４および８μｇ）、そして、異なるＲＴ反応物の種々の希釈物を試験した（１：５、１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０）。本発明者らは、ＸＤｘマーカーに特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、全血中のこれらのマーカーを容易に検出し得ることを示した。
【０６９５】
移植レシピエント由来の１４個の全血サンプル（ＰＡＸｇｅｎｅ、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）と対をなす１４個の単核サンプル（ＣＰＴ、ＢＤ）から、全ＲＮＡを調製した。出発物質として２μｇの全ＲＮＡを使用して、各サンプルからｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを１：１０に希釈して、Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
【０６９６】
リアルタイムＰＣＲについて、各遺伝子に対して１５〜３０のＣｔ値が望ましい。遺伝子のＣｔ値が３０よりもはるかに大きい場合、結果は、可変性であり、非線形であり得る。ＰＡＸサンプルについて、標的ＲＮＡは、ＣＰＴサンプルよりもより希釈される。ｃＤＮＡの希釈は、Ｃｔ値が３０未満であるために適切でなければならない。この方法により試験した最初の５遺伝子のついてのＣｔ値を、全血ＲＮＡ（ＰＡＸ）および単核ＲＮＡ（ＣＰＴ）の両方について下表に示す。
【０６９７】
【化１６５】
2010022375.tif 000167
【０６９８】
１つの例外を除いて、遺伝子は全血においてより高いＣｔ値を有していた。このプロトコルを使用して、全ての遺伝子を＜３５のＣｔで検出し得る。標的サンプルにおいて３０よりも大きいＣｔ値を有することが見出された遺伝子については、ｃＤＮＡの希釈を弱める必要があり得る。
【０６９９】
（実施例１９：同種移植拒絶の診断的遺伝子配列分析）
細胞から分泌されるか、または表面タンパク質として発現される遺伝子産物は、特に診断上の利用性があり、血漿または血清中のタンパク質の相対量を検出するためのアッセイを開発され得る。分泌タンパク質もまた、尿（腎臓同種移植における拒絶の検出のために有用なサンプルであり得る）中に検出可能であり得る。細胞表面マーカーは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原特異的抗体を用いることによって、またはフローソーティング技術（例えば、ＦＡＣＳ）を使用することによって、検出され得る。
【０７００】
１つの患者の集団において異なって調節されていることが見出されている遺伝子の各々は、いくつかの潜在的な適用を有している。各遺伝子は、新しい薬剤の標的、状態の診断用マーカー、薬物送達および薬物クリアランスを滴定するための指標であり得、または新規の薬剤についての低分子のスクリーニングにおいて使用され得る。これらの適用のいずれも、インビボでの遺伝子産物の生理学的機能および局在性を理解すること、ならびにそれらの機能を公知の疾患および障害と関連付けることによって、改良され得る。各候補遺伝子の基本的な機能の同定は、その遺伝子が一部を構成するシグナル伝達経路または代謝経路を同定するための助けとなり、薬物開発を行うものにとって興味深い潜在的な診断用マーカーまたは標的として、それらの経路の他のメンバーを調査するようになる。
【０７０１】
表２のマーカーのそれぞれについて、本発明者らは、その遺伝子の基本的な機能および細胞内局在性を同定することを試みた。これらの結果を表９にまとめる。最初のＤＮＡ配列決定および処理、配列分析、ならびに新規のクローンの分析に加えて、以下の公開供給源から情報を得た：ＮＣＢＩにおけるＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ、ＮＣＢＩにおけるＬｏｃｕｓＬｉｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース、およびウェブ上のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ。ＲｅｆＳｅｑ計画に由来する決定した（ｃｕｒａｔｅｄ）参照ｍＲＮＡにより示される各マーカーについて、対応する参照タンパク質の寄託番号を列挙した。決定した配列とは、ＮＣＢＩのスタッフにより、転写される場合にそのｍＲＮＡを最も良好に推定できるように、手動で処理されている配列であり、その処理は、ドラフトＤＮＡ配列、予測される開始部位、終結部位およびスプライシング部位、ならびにＥＳＴおよび完全長ｍＲＮＡの学術団体からの提出物をアラインメントに基づいて行われる。
【０７０２】
これらの方法を使用して、表２Ｅのデータを得た。
【０７０３】
（実施例２０：診断用遺伝子配列によって発現されるタンパク質の検出）
当業者は、タンパク質検出の多くの可能な方法を認識している。以下の例は、１つの可能な方法を例示する。
【０７０４】
配列の示されたコード領域を、ＰＣＲにより、サブクローニングのためにいずれかの末端にアダプター配列を有するように増幅する。タンパク質の精製および／または検出を容易にするために、エピトープまたは他のアフィニティ「タグ」（例えば、「Ｈｉｓ−タグ」）が添加され得る。この増幅した配列を適切な発現ベクター、最も代表的には、細菌（最も代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉ）および発現のために選択される生体／細胞（例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞）のいずれかにおいて複製し得るシャトルベクターに挿入する。このようなシャトルベクターは、代表的には、細菌のための複製起点および細菌における選択のための抗生物質耐性マーカー、ならびに最終的な発現細胞型への形質転換／トラ
ンスフェクションのために適切な複製配列および選択配列を含む。さらに、目的の配列が、転写に必要なシグナル（プロモーター）および翻訳に必要なシグナルとコード領域と作動可能に連結されるように、このベクターに挿入される。この発現は、細菌細胞、真菌細胞、または哺乳動物細胞において達成され得るか、またはインビトロ翻訳によって達成され得る。
【０７０５】
次いで、代表的には、発現用ベクターを使用して細菌を形質転換し、クローンを分析して、適切な配列が発現に対して生産的な配向で発現ベクターに挿入されたことを確認する。次いで、この確認した発現ベクターを宿主細胞内にトランスフェクションし、種々の方法（抗生物質耐性または栄養素要求性マーカーの栄養的相補が挙げられる）により形質転換体を選択する。次いで、この形質転換細胞を目的のタンパク質の発現を誘導する条件下で増殖させ、この細胞および馴化培地を収穫し、そして最も豊富な供給源（細胞ペレットまたは培地のいずれか）から目的のタンパク質を単離する。
【０７０６】
次いで、クロマトグラフィーまたは他の方法（親和性「タグ」配列を使用する免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられる）、または他の方法（細胞分別、イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー、または選択的沈降が挙げられる）の標準技術により、タンパク質を単離する。次いで、この単離・精製したタンパク質を特異的抗体を作成するために抗原として使用する。これは、標準的な方法（異種へのアジュバントを伴った注入、マウスからのモノクローナル抗体の単離、またはバクテリオファージ提示抗体ライブラリーからの抗体のインビボでの選択が挙げられる）により達成される。次いで、これらの抗体を使用して、標準的な方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ）を使用して、複雑な体液中の示される目的のタンパク質の存在を検出する。
【０７０７】
（実施例２１：造血速度の変化の検出）
本明細書の他の実施例に記載するように、マイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲを使用して、心臓同種移植のレシピエント由来の血液細胞の遺伝子発現プロフィーリングを行った。
【０７０８】
マイクロアレイおよびＰＣＲの両方において、急性心臓移植拒絶と最も相関していた遺伝子のうちの２つは、ヘモグロビンβおよび２，３ＤＰＧＭであった。これらの遺伝子は、赤血球系列の特異的マーカーであることが周知である。精製した末梢単核細胞および全血ＲＮＡ調製物の両方を使用して、この相関を見出した。
【０７０９】
拒絶と最も強く相関していたＰＣＲデータに由来する５個の遺伝子を分析することにより、それらの発現レベルが互いに極めて高く相関する（Ｒ２＞０．８５）ことが示された。
【０７１０】
【化１６６】
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【０７１１】
このことは、それらの遺伝子の全てが、１つの応答またはプロセスの部分として上昇していることを示す。マイクロアレイデータを使用して、これらの遺伝子を、各々およびマイクロアレイ上の他の遺伝子と関連付けた場合に、これらの５個の遺伝子は、互いおよび
それらと密接に関連する他のアレイ遺伝子と適切に関連しており、その上位４０のうちの４つは血小板関連遺伝子であったことを見出した。さらに、これらの遺伝子の多くが、ＣＤ３４と密接に関連していた。ＣＤ３４は、造血幹細胞のマーカーであり、造血の増加に伴って末梢血において見られる。
【０７１２】
ＣＤ３４、血小板ＲＮＡおよび赤血球ＲＮＡは全て、未成熟な血液細胞または前駆血液細胞を標識し、急性拒絶についてのこれらのマーカーは協調的な造血反応の一部であることは明らかである。ＲＢＣおよび血小板の産生速度が少し増大することにより、ＲＮＡレベルの大きな変化が生じ得る。急性拒絶による免疫活性化により、骨髄部位および非骨髄部位において造血の増大が誘導され得る。骨髄反応は完全な特異性を欠くので、これにより多くの系列の増大が誘導される。あるいは、感染（ウイルスまたはその他）、アレルギーまたは系に対する他の刺激に起因して、造血の増大が移植レシピエントにおいて起こり得る。これにより、細胞、すなわち拒絶を引き起こし得る免疫細胞の大量生産が生じる。このシナリオにおいて、免疫活性化のマーカーについてのモニタリングは、早期の診断の機会を提供する。
【０７１３】
【表１】
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【０７１４】
【表２−１】
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【０７１５】
【表２−２】
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【０７１６】
【表２−３】
2010022375.tif 000172
【０７１７】
【表２−４】
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【０７１８】
【表２−５】
2010022375.tif 000174
【０７１９】
【表２−６】
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【０７２０】
【表２−７】
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【０７２１】
【表２−８】
2010022375.tif 000177
【０７２２】
【表２−９】
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【０７２３】
【表２−１０】
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【０７２４】
【表２−１１】
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【０７２５】
【表２−１２】
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【０７２６】
【表２−１３】
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【０７２７】
【表２−１４】
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【０７２８】
【表２−１５】
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【０７２９】
【表２−１６】
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【０７３０】
【表２−１７】
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【０７３１】
【表２−１８】
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【０７３２】
【表２−１９】
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【０７３３】
【表２−２０】
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【０７３４】
【表２−２１】
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【０７３５】
【表２−２２】
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【０７３６】
【表２−２３】
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【０７３７】
【表２−２４】
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【０７３８】
【表２−２５】
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【０７３９】
【表２−２６】
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【０７４０】
【表２−２７】
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【０７４１】
【表２−２８】
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【０７４２】
【表２−２９】
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【０７４３】
【表２−３０】
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【０７４４】
【表２−３１】
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【０７４５】
【表２−３２】
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【０７４６】
【表３】
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【０７４７】
【表４】
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【０７４８】
【表５】
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【０７４９】
【表６−１】
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【０７５０】
【表６−２】
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【０７５１】
【表７】
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【０７５２】
【表８−１】
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【０７５３】
【表８−２】
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【０７５４】
【表８−３】
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【０７５５】
【表９−１】
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【０７５６】
【表９−２】
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【０７５７】
【表９−３】
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【０７５８】
【表９−４】
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【０７５９】
【表９−５】
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【０７６０】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
2010022375.tif 000224
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
2010022375.tif 000227
【図１０】
2010022375.tif 000228
【図１１】
2010022375.tif 000229
【図１３】
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【図１２】
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【配列表】
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