(57)【要約】【課題】生体組織から採取した細胞の生体外培養において、生体内により近い環境下で、三次元的な細胞凝集体を簡易に形成することができ、かつ、培養面積当たりの培養細胞数を増加させることができる細胞培養担体を提供する。【解決手段】基材表面２に、幅が１０μｍ以上１００００μｍ以下、深さが１０μｍ以上１００００μｍ以下であり、端部が閉じられた、凹曲面状の溝１が、平行ライン状に複数形成されている細胞培養担体を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に、平行ライン状に、端部が閉じられた溝が複数形成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
基材表面に、網目状に、端部が閉じられた溝が複数形成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項３】
前記溝が凹曲面状であることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記溝は、幅が１０μｍ以上１００００μｍ以下、深さが１０μｍ以上１００００μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項５】
前記溝は、底部より深い凹部が等間隔に形成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項６】
前記基材が、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、シリカおよびイットリアのうちの少なくともいずれか１種のセラミックス、または、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂、アガロース、コラーゲン、ゼラチンもしくはポリ乳酸のうちの少なくともいずれか１種の高分子からなることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外で、三次元的な細胞凝集体を形成し、細胞の機能や寿命を維持して増殖させるための細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＥＳ細胞の樹立や、生体組織から採取した幹細胞や組織細胞を選別する技術の発達等により、これらの細胞を生体外で培養し、細胞治療への応用や、薬剤の生理活性・毒性等を調べる薬物シミュレータに応用する研究が盛んに行われている。
【０００３】
一般に、生体内では、細胞が組織化する際に、細胞の機能の維持向上を図る上で重要なファクターである細胞外マトリックスや内部圧力等について、細胞同士間での情報伝達を活発に行うための環境が整っている。
しかしながら、生体外では、このような生体内と同様の環境を作ることが難しいため、生体から採取した細胞の生体外培養は、非常に困難である。
このため、生体外培養において、できる限り生体内に近い環境下で、細胞を培養する技術の開発が求められている。
【０００４】
これに対して、細胞培養技術の発達に伴い、最近では、生体組織から採取した細胞を、その細胞に適した細胞外マトリックスをコーティングしたディッシュ上で維持する技術が知られている。
しかしながら、ディッシュ上で増殖した細胞は、二次元的にしか増殖することができないため、細胞の寿命や物質生産能力等が、生体内とは異なっていることが多い。
【０００５】
このため、細胞間相互作用の維持の観点から、多数の細胞から三次元的な凝集体を作製するスフェロイド（球状細胞凝集体）培養法が注目されている。
例えば、その一つとして、細胞非接着性材料からなる基板表面に、一定の間隔で、直径数十〜数百μｍの細胞接着性を有する半球状のマイクロウェルを配列させた培養担体を用い、このウェル（凹部）内に接着依存性細胞を大量に撒種することにより、ウェル内で凝集した細胞同士が接着し、細胞凝集体が形成されるという培養方法が知られている（例えば、特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７５９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記のような従来の培養担体を用いた場合、培養面積当たりのスフェロイド形成効率は十分ではない。また、各マイクロウェル同士は連結していないため、マイクロウェル内で形成された細胞凝集体同士の情報伝達はなされず、培養細胞のための環境が、人工臓器や薬物シミュレータへの応用に適しているとは言い難い。
【０００８】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、生体組織から採取した細胞の生体外培養において、生体内により近い環境下で、三次元的な細胞凝集体を簡易に形成することができ、かつ、培養面積当たりの細胞数を増加させることができる細胞培養担体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞培養担体は、基材表面に、平行ライン状に、端部が閉じられた溝が複数形成されていることを特徴とする。
このような培養担体を用いることにより、一つの溝内で、複数の細胞同士間での情報伝達が可能となり、生体内に近い環境下で、三次元状の細胞凝集体を大量に培養することができる。
【００１０】
また、本発明に係る他の態様の細胞培養担体は、基材表面に、網目状に、端部が閉じられた溝が複数形成されていることを特徴とする。
このような培養担体を用いれば、溝内での、複数の細胞同士間での情報伝達がさらに密になり、より生体内に近い環境が得られる。
【００１１】
前記溝は、培養担体に撒種した細胞を凝集させてスフェロイド化させる観点から、凹曲面状であることが好ましい。
【００１２】
また、前記溝は、培養された三次元状の細胞凝集体の取り扱い容易等の観点から、幅が１０μｍ以上１００００μｍ以下、深さが１０μｍ以上１００００μｍ以下であることが好ましい。
【００１３】
さらに、前記溝は、撒種する細胞の位置を固定させる観点から、底部より深い凹部が等間隔に形成されていることが好ましい。
【００１４】
また、前記基材は、細胞の接着性や増殖効率等に応じて選択され、具体的には、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、シリカおよびイットリアのうちの少なくともいずれか１種のセラミックス、または、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂、アガロース、コラーゲン、ゼラチンもしくはポリ乳酸のうちの少なくともいずれか１種の高分子からなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る細胞培養担体を用いれば、生体組織から採取した細胞の生体外培養において、細胞の機能や寿命を維持した三次元的な細胞凝集体を簡易に形成し、かつ、培養面積当たりの培養細胞数を増加させることができる。
したがって、本発明に係る細胞培養担体によれば、生体外培養で、人工臓器や薬物シミュレータへの応用にも適した培養細胞を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について、図面を参照して、より詳細に説明する。
図１に、本発明に係る細胞培養担体の一態様の上面図を、図２に、その顕微鏡写真を、また、図３に、その部分斜視図を示す。
この細胞培養担体は、円板状の基材表面２に、平行ライン状に、溝１が複数形成されている。各溝１は、端部が閉じられた状態であり、上面から見ると、細長い長方形状である。
このような形状の培養担体を用いて、一つの溝１内に間隔をあけて複数の細胞を撒種することにより、従来のマイクロウェルが形成された培養担体よりも広面積である溝１内において、三次元状の細胞凝集体を大量に培養することができる。
また、一つの溝１で、複数の細胞の培養が行われることにより、細胞同士間での情報伝達が可能となり、独立したウェル毎に細胞が培養される場合よりも、生体内に近い環境を形成することができるため、細胞の寿命や物質生産能力の向上を図ることができる。
【００１７】
培養させる三次元状の細胞凝集体の大きさの制御は、端部が閉じられた溝１の長手方向（ライン方向）の長さを制御することにより行うことができる。
前記各溝１の端部が閉じられていない場合、細胞の播種時に、細胞が端部より流れ落ちるため、培養させる三次元状の細胞凝集体の大きさを制御することができない。
【００１８】
前記溝１は、図３に示すように、凹曲面状（Ｕ字状）であることが好ましい。また、断面が半円状であることがより好ましい。
該溝１内に撒種された細胞を凝集させてスフェロイド化させる観点から、このように、溝１は角部を有しない形状が適している。
【００１９】
また、前記溝１のサイズは、培養する細胞の大きさに応じて、適宜設計することができるが、培養された三次元状の細胞凝集体の取り扱い容易等の観点から、幅および深さは１０μｍ以上１００００μｍ以下であることが好ましい。
【００２０】
なお、前記溝１の間隔、すなわち、溝１同士の間に露出している基板表面（凸部）２の幅は、５μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
凸部は、細胞非接着部分であり、培養担体上での培養面積を広げる観点から、できる限り面積が小さいことが好ましいが、培養担体の強度を考慮して、上記範囲内の幅とすることが好ましい。凸部２の幅は、より好ましくは、５０μｍ程度である。
【００２１】
図４に、本発明に係る細胞培養担体の他の態様の部分斜視図を示す。また、図５に、図４のＡ−Ａ断面図を示す。
図４は、細胞培養担体全体は、上記図１示したものと同様に、円板状の基材表面２に、平行ライン状に、端部が閉じられた状態で、溝１が複数形成されているものである。上記の態様とは、溝１の形状のみが異なっている。
【００２２】
本態様は、図４，５に示したように、溝１のライン方向において、溝１の底部より深い凹部３が等間隔に形成されているものである。前記凹部３の深さ（溝１の底部からの深さ）は、前記撒種させる細胞の大きさよりも小さく構成されている。
このように、凹部３を予め溝１の底部に形成し、その位置に細胞を撒種させることにより、撒種させた直後の細胞の位置ずれを防止することができる。これにより、撒種直後の細胞同士の衝突を防止することができ、細胞へのダメージを防止することができる。
前記凹部３の深さが、前記撒種させる細胞の大きさよりも大きい場合、前記凹部３内のみで細胞が培養される可能性があり、上述した効果が十分に得られない。
この凹部３も、図５に示すように、上述した溝１の形状と同様に、細胞のスフェロイド化の観点から、角部を有しないように、凹曲面状に形成されていることが好ましい。
【００２３】
また、図６に、本発明に係る細胞培養担体の他の態様を示す。図６に示す培養担体は、上記の図１に示した培養担体における溝１が、基板表面２に、平行ライン状のみならず、直交ライン状にも複数形成されているものである。すなわち、端部が閉じられた溝１が、網目状に形成されているものである。
各溝１の形状、サイズ等は、上記図１に示した培養担体と同様であるため、説明を省略する。
このように、網目状に溝１を形成することにより、溝１内に撒種された細胞同士間での情報伝達がさらに密になり、より生体内に近い環境を形成することができる。
【００２４】
上記図６に示したような網目状の溝１も、図４，５に示すような底部がより深い凹部を等間隔に形成しておいてもよい。この場合、前記凹部は、直交する溝１の各交点の位置に形成されることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る細胞培養担体の基材の材質は、細胞の接着性や増殖効率等に応じて、従来から培養担体に用いられている材料のうちから、適宜選択することが好ましい。具体的には、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、シリカおよびイットリアのうちの少なくともいずれか１種のセラミックス、または、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂、アガロース、コラーゲン、ゼラチンもしくはポリ乳酸のうちの少なくともいずれか１種の高分子からなることが好ましい。
【００２６】
なお、前記溝１の内表面は、細胞を効率的に接着させる観点から、多孔体であることが好ましい。ここでいう多孔体とは、例えば、気孔率が３０〜９５％である。
ただし、培養担体に対する接着性が強い細胞を培養する場合は、逆に、接着性を抑制する必要があるため、前記溝１の内表面は緻密体であることが好ましい。ここでいう緻密体とは、例えば、気孔率が９５％以上である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
直径１３ｍｍのハイドロキシアパタイトの円板状の基材表面に、平行ライン状に、幅１８０μｍ、深さ４０μｍの溝を、５０μｍ間隔で形成した図１に示すような細胞培養担体を作製した。この細胞培養担体を２４ウェルプレートの穴に入れ、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝ガン細胞）を１．０×１０4個撒種し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を混合したＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で培養した。
【００２８】
７日間経過後、培養担体上で増殖したＨｅｐ−Ｇ２を、トリプシン処理により剥離し、血球計算板により、細胞数を計測したところ、５．０×１０5個であった。
また、増殖した細胞を、グルタルアルデヒドで固定処理し、ＳＥＭ観察したところ、ライン状に配列している凹部内で、Ｈｅｐ−Ｇ２が細胞凝集体を形成していることが認められた。
図７−１および図７−２に、このＨｅｐ−Ｇ２の顕微鏡写真を示す。図７−１は倍率４００倍、図７−２は倍率２５００倍である。
さらに、上記において増殖したＨｅｐ−Ｇ２について、免疫測定法により、細胞１．０×１０6個当たりのアルブミン量を算出したところ、４００μｇ／日であり、ゼラチンコートディッシュにおいて増殖したＨｅｐ−Ｇ２と比較して、約６倍の物質生産能力を有していることが認められた。
【００２９】
［比較例１］
直径１３ｍｍのハイドロキシアパタイトの平らな円板状の細胞培養担体を用いて、実施例１と同様にして、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝ガン細胞）を培養した。
７日間経過後、培養担体上で増殖したＨｅｐ−Ｇ２を、トリプシン処理により剥離し、血球計算板により、細胞数を計測したところ、１．０×１０5個であった。
また、平板上で増殖した細胞を、グルタルアルデヒドで固定処理し、ＳＥＭ観察したところ、凝集体を形成せずに、扁平状に増殖していることが認められた。
図８−１および図８−２に、このＨｅｐ−Ｇ２の顕微鏡写真を示す。図８−１は倍率５００倍、図８−２は倍率２５００倍である。
さらに、上記において増殖したＨｅｐ−Ｇ２について、免疫測定法により、細胞１．０×１０6個当たりのアルブミン量を算出したところ、４０μｇ／日であり、ゼラチンコートディッシュにおいて増殖したＨｅｐ−Ｇ２と比較して、物質生産能力は同等程度であることが認められた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係る細胞培養担体の一態様の上面図である。
【図２】図１に示す細胞培養担体を部分拡大した顕微鏡写真である。
【図３】図１に示す細胞培養担体の部分拡大斜視図である。
【図４】本発明に係る細胞培養担体の他の態様の部分拡大斜視図である。
【図５】図４のＡ−Ａ断面図である。
【図６】本発明に係る細胞培養担体の他の態様の上面図である。
【図７−１】実施例１において増殖したＨｅｐ−Ｇ２の顕微鏡写真（×４００）である。
【図７−２】実施例１において増殖したＨｅｐ−Ｇ２の顕微鏡写真（×２５００）である。
【図８−１】比較例１において増殖したＨｅｐ−Ｇ２の顕微鏡写真（×５００）である。
【図８−２】比較例１において増殖したＨｅｐ−Ｇ２の顕微鏡写真（×２５００）である。
【符号の説明】
【００３１】
１  溝
２  基板表面（凸部）
３  凹部
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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