(57)【要約】【課題】  生体内で重要な働きをしているにもかかわらず、未だ発見されていない新規なタンパク質を提供する。【解決手段】  細胞分化及びガン化に関与する新規タンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、そのタンパク質を認識する抗体、そのタンパク質を利用したガンの予防又は治療薬のスクリーニング方法、及びそのタンパク質を利用したガンの診断のためのデータを収集する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すタンパク質、
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、幹細胞分化時に発現量が減少するタンパク質、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、幹細胞分化時に発現量が減少するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質を認識する抗体。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質と被験物質とを接触させ、請求項１に記載のタンパク質と結合する被験物質を選択することを特徴とするガンの予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
ヒトから採取した生体試料中に含まれる請求項１に記載のタンパク質の量を測定することを特徴とするガンの診断のためのデータを収集する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分化及びガン化に関与する新規タンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、そのタンパク質を認識する抗体、そのタンパク質を利用したガンの予防又は治療薬のスクリーニング方法、及びそのタンパク質を利用したガンの診断のためのデータを収集する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、Pibouinらは、大腸ガン細胞株において過剰発現する新規なcDNAを見つけ、このcDNAに対応する遺伝子をOCC-1遺伝子と名づけた（非特許文献１）。Pibouinらは、非特許文献１中で、１）OCC-1遺伝子は２種類の長さの異なるmRNAとして転写され、長いmRNA中は５個のORFを含み、短いmRNA中は３個のORFを含んでいた、２）これらのORFがコードするペプチドをin vitro translationで合成すると、9 kDa以下の小さいペプチドが得られた、３）これらのORFとハイブリダイズするマウスのゲノムDNAやマウス組織由来のRNAは見つからなかった、４）前述した小さなペプチドしか得られなかった点及びマウスのゲノムDNA等とハイブリダイズできない点を考慮すると、OCC-1遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子ではなく、腫瘍化プロセスに関与する遺伝子を制御するRNA遺伝子である可能性が高い、と報告している。
【０００３】
【非特許文献１】L. Pibouin et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, Volume 133, (2002), Pages 55-60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ゲノム配列解読時代に突入し、非常に多くのタンパク質が公共データベースに登録されている今日、新規なタンパク質を発見することは非常に稀である。しかし、生体内で重要な働きをしているにもかかわらず、未だ発見されていないタンパク質も多数存在すると考えられる。本発明は、このような背景の下、新規なタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、PibouinらがRNA遺伝子であると推測していたOCC-1遺伝子が実はタンパク質をコードする遺伝子であることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００６】
OCC-1遺伝子がコードするタンパク質（以下、このタンパク質を「Pep63」という場合がある。）は、Pibouinらの論文（非特許文献１）のFig. 1Aに示される6.9 kDaのORFがコードするタンパク質である。Pibouinらは、in vitro translationにより、このORFの翻訳産物の合成を試みているが、対応するタンパク質を得ていない（57頁左欄5行〜右欄2行、Fig 1C）。従って、Pep63は、本願の出願前に生体内から単離されたり、人為的に合成されたりしたことのない全く新規なタンパク質である。
【０００７】
また、Pibouinらは、Fig. 1Aに示される各ORFはタンパク質をコードしていないと推測している（59頁右欄5行〜60頁左欄3行）。従って、Fig. 1Aに示されるORFの翻訳産物であるPep63が生体内に存在することは全く予想外のことであった。
【０００８】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すタンパク質、
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、幹細胞分化時に発現量が減少するタンパク質、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、幹細胞分化時に発現量が減少するタンパク質。
（２）（１）に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）（１）に記載のタンパク質を認識する抗体。
（４）（１）に記載のタンパク質と被験物質とを接触させ、（１）に記載のタンパク質と結合する被験物質を選択することを特徴とするガンの予防又は治療薬のスクリーニング方法。
（５）ヒトから採取した生体試料中に含まれる（１）に記載のタンパク質の量を測定することを特徴とするガンの診断のためのデータを収集する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、新規なタンパク質を提供する。このタンパク質のコード領域を含むmRNAは、ガン細胞において高発現していることから、このタンパク質はガン化と密接に関連すると考えられる。従って、ガンの予防又は治療薬のスクリーニング方法やガンの診断に利用できる。
【００１１】
また、このタンパク質は、幹細胞の分化時に発現量が減少することから、幹細胞の分化と密接に関連すると考えられる。従って、幹細胞の分化を促進する物質や抑制する物質のスクリーニングにも利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のタンパク質は、（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、幹細胞分化時に発現量が減少するタンパク質、（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、幹細胞分化時に発現量が減少するタンパク質、を含む。
【００１４】
（ａ）のタンパク質は、前述したPep63であり、Pibouinらによって名付けられたOCC-1遺伝子の翻訳産物である。
【００１５】
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質に、（ａ）のタンパク質の機能を失わせない程度の変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の個数は、前記した機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、数個程度であることが好ましい。（ａ）のタンパク質の機能を失っていないかどうかは、（ａ）のタンパク質と同様に、幹細胞分化時に発現量が減少するかどうかを調べればよい。
【００１６】
（ｃ）のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる（ａ）のタンパク質と同様の機能を持つタンパク質である。（ｃ）のタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、75％以上の相同性、好ましくは90％以上の相同性を指す。
【００１７】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも含み、上述した本発明のタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として公知の方法によって製造することができる。このようにして作られた抗体は、本発明のタンパク質の検出や測定に利用できる。
【００１８】
本発明のガンの予防又は治療薬のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質と被験物質とを接触させ、本発明のタンパク質と結合する被験物質を選択することを特徴とするものである。本発明のタンパク質は、ガン化と密接と関連すると考えられるので、本発明のタンパク質と結合するタンパク質は、ガンの予防又は治療薬の候補となる。本発明のタンパク質と被験物質が結合するかどうかは、物質間の相互作用を検出するために用いられる一般的な方法によって確認することができる。このような方法としては、例えば、two-hybrid法、pull down法などを例示できる。
【００１９】
本発明のガンの診断のためのデータを収集する方法は、ヒトから採取した生体試料中に含まれる本発明のタンパク質の量を測定することを特徴とするものである。本発明のタンパク質の測定値は、医師によるガンの診断のためのデータとして利用される。生体試料としては、血液、尿、皮膚、毛髪、細胞、組織などを例示できる。本発明のタンパク質の測定はどのような方法で行ってもよいが、前述した本発明の抗体を用いることが好ましい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２１】
〔実施例１〕  スクロース勾配カラムによる非変性細胞抽出液の超遠心分画
5% CO2、37℃で培養しているヒト間葉系幹細胞（Cambrex社より購入）をトリプシン処理により回収後、遠心分離（500xg、室温、５分）により細胞沈殿物を得た。この細胞沈殿物をLysis buffer (10 mM Tris-HCl(pH8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % NP-40, 1 mM  DTT, 100 U/ml RNAsin[Promega], Protease inhibitor cocktail[Roche])に懸濁し、数回のピペティングにより攪拌した後、遠心分離（4800rpm, 4℃, 3分）により細胞質画分である上清を回収した。
【００２２】
上清を10-50％のスクロース勾配カラムにて、冷却後、超遠心分離（25,000 rpm, 4℃, 90分）を行い、５つの分画を回収した。
【００２３】
各分画からRNeasy mini kit（Qiagen社）により細胞から全ＲＮＡを抽出した。
【００２４】
QuantiTect Reverse Transcription kit（Qiagen社）によりcDNAを作成し、SYBER Premix EX Taq（Takara社）により定量ＰＣＲを行い、コントロールである18S rRNAとPep63 mRNAを定量した。各分画に含まれる18S rRNA量とPep63 mRNA量を図１に示す。図１に示すように、各分画に含まれるRNAの量比は、18S rRNAとPep63 mRNAでほぼ一致していた。このことから、Pep63 mRNAとリボソームとの結合が示唆される。
【００２５】
〔実施例２〕  抗Pep63抗体の作製
（１）エピトープペプチド調製
以下の３種類のペプチドをFmoc固相合成法により合成したのち、HPLCおよび質量分析によって88%以上の純度であることを確認した。
Peptide 1: CGNSTATSAGAGQGP（配列番号３）
Peptide 2: CTEDDKRRNYGGVYV（配列番号４）
Peptide 3: CVNMVSSQTKTVRKN（配列番号５）
（２）ペプチド架橋
Pierce社のImject Maleimide Activated mcKLHに含まれる試薬および緩衝溶液を使用した。
(a)上記３種類のエピトープペプチド3 mgをMaleimide Conjugate Buffer （0.1M リン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、pH7.2）500 μlに溶解した。
(b)Maleimide KLH 4 mgをH2O 500 μlに溶解した。
(c)(a)および(b)の両溶液を室温で混合し、さらに室温で２時間放置した。
(d)100 μlずつに１０等分に分注した。
（３）免疫
3種類のペプチド架橋後溶液各100 μl、合計300 μlを生理食塩水で1 mLに調整した抗原溶液と等量の完全フロイトアジュバンド（Thermo Scientific, #77140）と共に、２羽のウサギの背部皮下に免疫した（カクテル免疫）。免疫はELISA力価測定の情報に従い、初回免疫１週間後から２週間毎週（合計３回）追加免疫を行った。さらに、その１週間後に全採血をした。血液の遠心分離により血清を回収し、−８０度で保存した。
【００２６】
〔実施例３〕  特異的抗体による新規タンパク質Pep63の検出
間葉系幹細胞におけるPep63の発現を、抗Pep63抗体を含む全採血の血清を用いてウエスタンブロティング法にて検討した。
【００２７】
5% CO2、37℃で培養しているヒト間葉系幹細胞（Cambrex社より購入）にLysis buffer (50 mM Tris-HCl(pH8.0), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 1 mM PMSF, Protease inhibitor cocktail [Roche])を加えることで得られる細胞溶解液10 μlに、SDS buffer (0.125 mM Tris-HCl(pH6.8), 20 % Glycerol, 4 % SDS, 2 % β-mercaptoethanol, BPB)  10μlを混ぜ、15％ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。
【００２８】
一次抗体として上述の２羽のウサギから得られた血清２種類をそれぞれ用いる場合だけでなく、それら血清溶液に免疫に試用した３種類のペプチドをそれぞれあらかじめ加えた６種類の溶液も用いた。
【００２９】
二次抗体には抗ウサギIgG（Amersham社）を用い、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE社)により化学発光後、LAS-3000 (FUJIFILM社)により感光した。
【００３０】
ウエスタンブロットの結果を図２に示す。図２に示すように、エピトープペプチドの添加によって消失する２つのバンドが検出された。Pep63の予想される分子量から10 kDa付近に検出されたバンドがPep63であると考えられる。なお、20 kDa付近に検出されたバンドについては現在解析中であるが、糖鎖が付加したPep63、あるいは二量体のPep63である可能性が推測される。
【００３１】
〔実施例４〕  転写レベルの経時的測定の実験方法
ヒト間葉系幹細胞（Cambrex社より購入）を、5% CO2、37℃でほぼ１００％コンフルエントまで培養したのち、脂肪分化誘導キット（Cambrex;B3004）にて脂肪細胞へ分化させた。
【００３２】
分化誘導後、０，１，３，７日目で、RNeasy mini kit（Qiagen社）により細胞から全ＲＮＡを抽出した。
【００３３】
QuantiTect Reverse Transcription kit（Qiagen社）によりcDNAを作成し、SYBER Premix EX Taq（Ｔａｋａｒａ社）により定量ＰＣＲを行い、Pep63 mRNAを定量した。この結果を図３に示す。図３に示すように、Pep63 mRNA量は、分化誘導後に顕著に減少した。このことは、Pep63が未分化幹細胞機能への深い関与を示唆する。
【００３４】
〔実施例５〕  翻訳レベルの経時的測定の実験方法
ヒト間葉系幹細胞（Cambrex社より購入）を、5% CO2、37℃でほぼ１００％コンフルエントまで培養したのち、脂肪分化誘導キット（Cambrex;B3004）にて脂肪細胞へ分化させた。
【００３５】
分化誘導後、０および７日目で、Lysis buffer (50 mM Tris-HCl(pH8.0), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 1 mM PMSF, Protease inhibitor cocktail [Roche])を加えることで得られる細胞溶解液10 μlに、SDS buffer (0.125 mM Tris-HCl(pH6.8), 20 % Glycerol, 4 % SDS, 2 % β-mercaptoethanol, BPB)10μlを混ぜ、15％ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。
【００３６】
一次抗体として実施例２のウサギから得られた血清１種類を、二次抗体には抗ウサギIgG（Amersham社）をそれぞれ用い、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE社)により化学発光後、LAS-3000 (FUJIFILM社)により感光した。ウエスタンブロットの結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】非変性細胞抽出液の超遠心分画に含まれる18S rRNA量とPep63 mRNA量を示す図。
【図２】抗Pep63抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図。
【図３】分化誘導後のヒト間葉系幹細胞中のPep63 mRNA量の経時的変化を示す図。
【図４】分化誘導後のヒト間葉系幹細胞中のPep63量の変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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