(57)【要約】【課題】 この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の生成物による植物への活性付与及びその促進を目的としたものである。【解決手段】 この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を固体培地で培養して、その生成物を抽出し、又は前記菌の分生胞子を施用することにより、植物の活性付与及びその促進の目的を達成することができた。この発明は、このような特性を有する植物の活性付与剤の製造方法、活性付与方法及び活性促進剤並びに活性促進剤の施用方法に関する。【選択図】図１
2010000078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を固体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で７日〜１５日間静置培養した後、生成物を抽出して下記の物質を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量１９２
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量２０６
Ｃ成分：
【化１】
2010000078.tif 000019
．．．であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-．．．であって分子量１５４又は２２０
【請求項２】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を液体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で４日〜１０日間振盪培養した後、生成物を抽出して下記の物質を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量１９２
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量２０６
Ｃ成分：
【化２】
2010000078.tif 000020
．．．であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-．．．であって分子量１５４又は２２０
【請求項３】
植物栽培に際し、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を植物の種子へ付着処理し、覆土と分生胞子とを混和し、又は分生胞子の適量を散布して、潅水又は埋設して、下記の物質を生産させることを特徴とした植物の活性付与方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量１９２
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量２０６
Ｃ成分：
【化３】
2010000078.tif 000021
．．．であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-．．．であって分子量１５４又は２２０
【請求項４】
植物栽培に際し、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を植物の種子へ付着処理し、覆土と分生胞子とを混和し、又は分生胞子の適量を散布して、潅水又は埋設して、下記の物質を生産させると共に、前記分生胞子のおかれた土壌温度を１５℃〜３０℃とし、水分を３０％以上とし、かつ土壌に増殖可能な通気性又は含気性を付与することを特徴とした植物の活性付与方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量１９２
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量２０６
Ｃ成分：
【化４】
2010000078.tif 000022
．．．であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-．．．であって分子量１５４又は２２０
【請求項５】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を培養して、下記の活性付与剤を生成させた後、これを培地と共に適量宛分離し、無菌の多孔質粒子及び栄養分よりなる増量材と混合した後、所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量１９２
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量２０６
Ｃ成分：
【化５】
2010000078.tif 000023
．．．であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-．．．であって分子量１５４又は２２０
【請求項６】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を液体培地で増殖させて、下記の活性付与剤を生成させた後、所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量１９２
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-．．．であって分子量２０６
Ｃ成分：
【化６】
2010000078.tif 000024
．．．であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-．．．であって分子量１５４又は２２０
【請求項７】
請求項５又は６の何れか１項記載の植物の活性促進剤を、育苗土壌に混入し、又は育苗時に、土壌に散布、或いは圃場に散布することを特徴とした植物の活性促進剤の施用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５（Trichoderuma hurzianum SK-5-5）菌の培地から抽出した糸状菌及び細菌に抗菌性を有する物質を得ることを目的とした植物の活性付与剤の製造方法に関する。また他の発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子の生成する物質によって植物の根、茎、葉等に病原菌に対する抵抗性を付与することを目的とした植物の活性付与方法及び植物の活性促進剤並びにその施用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリコデルマ菌は、微生物農薬として病害防除に実用化されている糸状菌であり、Trichoderuma lignourum がタバコの白絹病の防除用農薬として登録されている（農薬登録 No.7023）。また英国、フランスでもTrichoderuma hurzianumを有効成分とする野菜の立枯病、苗腐病に有効な微生物農薬（F-ｓtop）が登録されている。
【０００３】
近来減農薬・生態系保全型の病害防除の必要性が強く唱えられ、特に生物防除方法は環境負荷の影響が少ないと考えられるので、精力的に研究が進められている。植物の根や根圏から分離される細菌や、菌類の中には植物の生育を促進するものがあり、それぞれ植物生育促進根圏（plant growth-promoting rhizobacteria：ＰＧＰＲ)、植物生育促進菌類（plant growth-promoting fungi：ＰＧＰＦ)と呼ばれている。
【０００４】
前記有用根圏微生物であるＰＧＰＲ、ＰＧＰＦは植物の生育を促進するのみならず、各種の土壌病害を抑制することも知られている。また最近では、土壌病害のみならず、地上病害も抑制する事実も明らかにされ、前記ＰＧＰＲ、ＰＧＰＦは、植物の全身抵抗性の誘導が関わっていることが見出されたと紹介されている（１９９９年６月号、今月の農業誌）。
【０００５】
またコウライシバから分離選抜したPhoma，Trichoderma, Fusarium，Penicillium，Sterileなどの菌が、キュウリにおける炭そ病に対し、誘導抵抗性を示すことが報告されている（１９９９年６月号、今月の農業誌）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−１９２０２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】１９９９年６月号、「今月の農業」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この発明は、植物病原菌に抗菌性を有する物質を得ることを課題として研究しており、北海道十勝地方の土壌からTrichoderuma hurzianum ＳＫ−５−５(トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５)菌を分離した。この菌は、植物病原菌の８０％を占めるとされる土壌伝染性病原糸状菌に対して広く拮抗性を示す菌であり、現在芝のブラウンバッチ、ラージバッチなどの Rhizoctonia類に微生物農薬（生菌製剤）として開発中のものである。前記トリコデルマ ハルジアナムＳＫ−５−５菌の拮抗作用は、相手菌糸に接触し、コイリングをする事により、細胞質凝集を促し死滅させるものである。その外観的観察経過より見てペニシリアム（Penicillium sp）等が生産する抗生物質のような培地上で阻止円を示すほど活性が高いものではなく、菌糸同志の接触により発現するものと推定される。
【０００９】
前記細胞質凝集作用が、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の生産する何らかの物質によってもたらされると考えられ、これを究明することを第一の課題としたものである。
なお、この発明で用いるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌は、日本国内工業技術院微生物工業研究所に受託番号「微工研菌寄第１３３２７号」として寄託されている。微工研は、当該原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求を行ない、受託番号ＢＰ−４３４６が付与されている。
【００１０】
前記従来のＰＧＰＲ、ＰＧＰＦは、特定植物（例えばキュウリ）に対し、炭そ病についての有効性を示すもので、今後研究の結果、その使用方法の改善などにより、他の植物、病原菌に対して有効なことが判明する可能性はあるとしても、未だ具体的植物、病原菌に対しては今後の課題とされている。
然し乍ら単に病原菌を殺菌するという従来の生物農薬の思考形態が、植物の根茎に亘り抵抗性を付与する方向に変りつつあることは、今後の植物栽培上重要な示唆を含むものである。
【００１１】
この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ-５−５菌について、各種実験を重ねている間に、前記生物農薬の将来性と合致することに想到し、更に使用方法、対象植物等を選定、研究の結果、この発明を完成したのである。将来の植物栽培に多大の影響を与えるものとして、この発明はきわめて有望であり、将来の農業等を支える重要な手段の１つとなることに疑はない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の生産する物質により、細胞凝集作用（抗菌性）がもたらされるものと推定し、前記菌を培養、精製、同定した所、糸状菌又は細菌に抗菌性を有する物質を得たのである。
【００１３】
また他の発明は、植物栽培に際し、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を覆土中に共存させて増殖させることにより、その生成物質により、各種植物の根茎活性を付与し、耐菌性を向上させることが判明し、前記従来の問題点を発展的に改善させて、実用性を確立したものである。
【００１４】
即ち活性付与剤の発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を固体培地で培養し、抽出した物質であって、糸状菌に抗菌力を有することを特徴とした植物の活性付与剤である。また他の発明は、トリコデルマ ハルジアナムＳＫ−５−５菌を液体培地で培養し、抽出した物質であって、細菌の一種（Staphylococcus aureus 209p）に抗菌力を有することを特徴とした植物の活性付与剤である。
【００１５】
次に製造方法の発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を固体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で７日〜１５日間静置培養した後、抽出して、前記の活性付与剤を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法であり、またトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を液体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で４日〜１０日間振盪培養した後、抽出して、前記の活性付与剤を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法である。
【００１６】
この発明において、使用する固体培地として、米培地を用いた。米培地は、米１００％、大豆かす３％、滅菌水１０％よりなる固定培地であって、培養中に培地の表面が乾燥しないよう、滅菌水を添加した。
【００１７】
この発明において、使用する液体培地は、グルコース３．０％〜５．０％、ポリペプトン０．５％、Ｎａｃｌ０．８％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム１．０％である。
【００１８】
前記のように固定培地と、液体培地によれば、夫々の特性により、異なる物質を生成することが明らかとなった。このような結果についてのメカニズムは明らかでないが、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌に対する刺激その他の作用の相違、かつ培地構成物質に関する特性により、異なる物質を生成するものであって、前記米培地及び液体培地以外の成分の培地であっても同様の物質を生成することは十分考えられ、かつ生成効率向上等今後の研究課題は多大である。
【００１９】
次に活性付与方法の発明は、植物栽培に際し、トリコデルマ ハルジアナムＳＫ−５−５菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する覆土中に共存させることを特徴とした植物の活性付与方法であり、植物栽培に際し、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する覆土中に共存させて増殖させ、糸条菌に抗菌力を有する物質の生産を持続させることを特徴とした植物の活性付与方法である。また植物栽培に際し、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する覆土中に共存させると共に、前記分生胞子の増殖促進条件を付与することを特徴とした植物の活性付与方法であり、分生胞子の施用手段は、植物の種子処理、覆土と分生胞子との混和、分生胞子の散布、潅水又は埋設したものである。更に増殖促進条件は、土壌温度を１５℃〜３０℃とし、水分を３０％以上としたものであり、他の増殖促進条件は、土壌に増殖可能な通気性又は含気性を付与するものである。
【００２０】
次に他の発明は、多孔性セラミックス粒子その他の担体に、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を付着させたことを特徴とする植物の活性促進剤であり、無菌処理した無機質粒子に、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を混合し、又はトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を付着させ、前記無機質粒子と他の粒子とを混合したことを特徴とする植物の活性促進剤である。またトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を培養し、これを培地と共に適量宛分離し、無菌の多孔質粒子に栄養分（例えばキトサン）と共に付着させた後、所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤であり、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を液体培地で増殖させ、これを無菌の多孔質粒子に栄養分と共に付着させた後、多孔質粒子を所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤である。
【００２１】
また他の発明は、前記記載の植物の活性促進剤を、育苗土壌に混入し、又は育苗時に土壌に散布或いは舗場に散布することを特徴とした植物の活性促進剤の施用方法である。この場合の活性促進剤の使用量は、トリコデルマ ハルジアナムＳＫ−５−５菌５×１０４／ｇ〜５×１０９／ｇを１ｍ２当り５ｇ〜１００ｇ散布又は栽培土１ｍ３当り５ｇ〜１００ｇ混入するものである。前記発明における植物は、てん菜、メロン、トウモロコシ、水稲、キャベツ及びタマネギなどであり、根、茎、葉及び実を採取する植物について、何れも有効であることが確認され、その効果も収量増加、糖度増加その他の有為性が明確になった。
【００２２】
前記の発明におけるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を培養し、その単離精製物を検討した所、ＵＶ吸収スペクトラム、質量分析及びＮＭＲ測定結果より、Aib（α-Aminoisobutyric acid）を含むPolypeptideの、Peptibols系と判断した。Peptibols系抗 生物質はアミノ酸配列の中に α-Aminoisobutyric acid（Aib）を含んでおり、 Ｎ末端がAcetyl基で、Ｃ末端が Amino alcohol結合であることが特徴である（多くは Phenylalaniol基でおわる）。なお今回の精製物、Ａ成分、Ｂ成分、Ｄ成分は質量分析より一部のアミノ酸配列を下記のように推定し、その部分構造を既存のPeptibols のアミノ酸配列と検索した結果、一致する物が無く、新規 Peptibols系であると推定した。Ｅはアミノ酸配列の推定が困難であるため判断できなかった。
【００２３】
ＵＶ吸収波長：４成分とも末端吸収
Ａ成分＝１９３３
Ｂ成分＝１９４９または１９６４
Ｄ成分＝１８１０
Ｅ成分＝１８２９
推定構造：
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-.....
前記のように生成物質は新規配列のアミノ酸と認められるが、植物の根より吸収されて、茎及び葉に至り、ついで消失する。従って収穫時の植物には、根、茎、葉共に残留の有無は不明であるけれども、当初（発芽以後の幼茎等）植物に吸収された段階で、植物のＤＮＡに何等かの変化を与えるものか、残留するものと推定される。何故ならば、一旦抗菌性を取得した植物は、根茎等の分裂生成に拘らず抗菌性の持続が認められるからである。従って免疫性付与（活性付与）と類似であり、育苗時又は比較的若い植物（実質的に植物の増殖時）に施用すれば、再使用の必要性が認められないのは、一旦活性ができると、その植物の一生に亘り効力が持続されるからである。
【００２４】
この発明のトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子は、植物の苗の時、又は播種時に覆土中に混入すると、前記分生胞子の増殖に伴って生成物質も増加し、これが根から吸収されて茎葉に至り、全体に活性が付与されるので（恰も免疫性付与の如く）、植物が生長して根又は実などを採取する時期（例えば播種後１ヶ月〜６ヶ月後）になっても、前記抗菌性は保たれることが確認された。従って多くの植物は、一回の処理（散布その他の手段）によって活性が付与されてその目的を十分達成することができた。
【００２５】
この発明における分生胞子の担体は、多孔質セラミックス粒子（例えば麦飯石の粒子）であって、これをキトサン液に浸漬し、水分を蒸発したものである。前記粒子の大きさについて特定はないが、取扱いの容易性から直径０．５ｍｍ〜５ｍｍ位が好ましい。前記担体は、多孔質セラミックス粒子（天然又は人工）に限定されることなく、分生胞子に悪影響がない物は使用することができる。
【００２６】
前記セラミックス粒子に予め培養したトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を５×１０４／ｇ〜５×１０９／ｇ宛付着させ、これを１ｍ２当り５ｇ〜１００ｇ宛散布する。この場合に、水と共に散布する場合もあるが、潅水するのは、水分付与を目的とする場合と、分生胞子を均等に浸透させて、土壌中に均等に分布させる為に用いる場合とがある。
【００２７】
前記トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の量を５×１０４／ｇ未満にした場合に、前記菌の繁殖が阻害されなければ、増殖されるが、何等かの理由により増殖しない場合があるので、一応の目途とした。然し乍ら菌の増殖は環境によって著しく相違するので、施用後の環境整備によっては更に少量（例えば５ｇ未満）の菌でも植物の生育に合せて増殖し、必要量の生産物質を得ることは可能と考えられる。
【００２８】
一方菌量の上限を５×１０９／ｇ以下としたのは、前記生産物質の関係から不必要と考えたからである。菌の増殖条件が悪い場合には、比較的高濃度の施用を要するが、５×１０９／ｇを越える必要はないと考えられる。この発明におけるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌は通常分生胞子として与えるが、施用時の環境が厳しい場合（例えば高温時、寒冷時）には厚膜胞子として与える方が好ましい場合もある。
【００２９】
前記発明において、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を固体培地又は液体培地又はその他の培地で培養し、その生成物を抽出して、これを植物の活性付与剤として施用する場合には、例えば０．１〜１ｇ／ｍ２必要となる。
【００３０】
また分生胞子を散布する場合には、当該分生胞子の増殖下限菌数（例えば５×１０９／ｇ）が必要である。
【００３１】
この発明の植物の活性付与剤は、菌の時に１回施用するだけで、爾後収穫まで施用する必要はない。この点は一般農薬と異なり、そのメカニズムは不明であるが、植物のＤＮＡに何等かの影響を与え、又は生成物質が植物の根、茎、葉に微量残留して、前記特性を発揮するものと推定される。
【００３２】
前記において、分生胞子を施用する場合には、舗場などで、分生胞子が十分増殖し、飽和に達したならば、分生胞子は急速に活力を失い、遂には消滅することが確認された。尤も一部分分生胞子が残留していることも考えられ、増殖条件が良好になれば再び増殖する場合も有り得る。
【００３３】
前記発明においては、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５を固体培地又は液体培地で培養し、その生成物質中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ成分について単離精製したが、活性物質は、新規アミノ酸配列をもつ新規物質で、その分子量は、Ａ成分＝１９２，Ｂ成分＝２０６，Ｃ成分＝１６８，Ｄ１＝１５４，Ｄ２＝２２０であって、当該アミノ酸又はその周辺物が植物の活性化に有効であろうと推定される。
【００３４】
そこでトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を所定濃度（例えば１ｇ中５×１０５以上）以上で施用（土壌に混用、又は根物の根圏に散布）することにより、所期の目的を達成することが確認されている。恐らく、植物により最適の成分又は混用比があるに違いない。
【００３５】
そこで前記トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を従来法によって多量培養し、その生成物質を抽出精製して植物の活性付与剤を得ることができる。前記生成物質は、前記Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分、Ｄ成分及びＥ成分が判明している。
【００３６】
前記発明は、各種植物について有効であるが、実験の結果（実験中も含む）によれば、水稲、トウモロコシ、てん菜、メロン、馬鈴薯、さつまいも、いちご、玉ねぎ、キャベツなどに有効なことが確認された。
【発明の効果】
【００３７】
この発明によれば、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を固形培地に培養した場合には、表２のように、糸状菌について抗菌性を示すことが認められた。
またトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を液体培地で培養した場合には表２のようにバクテリアに有効であるものと認められた。
この発明によれば、植物の生育初期に、床土等にトリコデルマ ハルジアナムＳＫ−５−５菌を適量宛混入することにより、又は生育時の散布など根圏に施用することにより、植物を活性化してその根・茎・葉を改善し、罹病防止、病原菌に対する耐性を付与することができる。これにより生育時の発病を激減させるのみならず、植物の生育を促進し、増収を図り、糖度を向上させるなどの諸効果がある。
然して前記効果は、前記トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子の生成物質（例えば新規アミノ酸）によるものと推定されるが、前記分生胞子は増殖後、また前記生成物質は、植物の成長終期には何れも消失するものと認められるので、如何なる意味の影響もなく、かつ連続使用についても何等の悪影響も見られない効果がある。更に前記生成物質は新規アミノ酸及びその周辺物質と認められるから、植物の葉、茎などに微量残留しても無害である。
【００３８】
またこの発明のトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌は、土壌中で増殖するので、環境条件が増殖に適する場合には、当初の散布濃度が不十分の場合であっても、増殖により必要量の生成物質を補給し、所期の目的を達成した後、自然消滅する特性が認められ、人体への影響はもとより、土壌、植物その他環境破壊などのおそれは皆無である。更に連作不良の作物についても、連作の不利は解消されるものと推定された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】この発明の菌のＡ培地培養におけるＨＰＬＣ分析グラフ。
【図２】同じく図１の拡大グラフ。
【図３】同じくＡ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図４】同じくＡ成分の１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）を示すグラフ。
【図５】（ａ）、（ｂ）同じくＡ成分の質量分析測定のグラフ。
【図６】同じくＢ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図７】同じくＢ成分の１Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図８】（ａ）、（ｂ）同じくＢ成分の質量分析測定のグラフ。
【図９】同じくＤ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１０】同じくＤ成分の１Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図１１】（ａ）、（ｂ）同じくＤ成分の質量分析測定のグラフ。
【図１２】同じくＥ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１３】同じくＥ成分の１Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図１４】（ａ）、（ｂ）同じくＥ成分の質量分析測定のグラフ。
【図１５】同じくＡ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１６】同じくＡ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図１７】同じく図１６の検出されたＡピークの質量分析のグラフ。
【図１８】同じくＢ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１９】同じくＢ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図２０】同じく図１９の検出されたＡピークの質量分析のグラフ。
【図２１】同じくＣ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図２２】同じくＣ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図２３】同じく図２２の検出されたＡピークの質量分析のグラフ。
【図２４】同じくＣ成分の質量分析グラフ。
【図２５】同じくＣ成分のピークの１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）を示すグラフ。
【図２６】同じくＣ成分の構造図。
【図２７】同じくＤ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図２８】同じくＤ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図２９】（ａ）同じくＵＶλ２３０ｎｍで検出されたＤ１成分を示すグラフ。（ｂ）同じくＵＶが末端吸収でＤ１成分とＲＴ０．６差で検出されたＤ２成分を示すグラフ。
【図３０】（ａ）同じく図２９で検出されたＤ１成分の質量分析を示すグラフ。（ｂ）同じく図２９で検出されたＤ２成分の質量分析を示すグラフ。
【図３１】同じく米培地の培養抽出物精製経過の系統図。
【図３２】同じくＢ培地Ｉの培養抽出物精製経過の系統図。
【図３３】同じく新規物質（ＭＷ：１９８）１、２、３の誘導体の構造図。
【図３４】同じくたまねぎに施用した際、越冬前の生育調査部の説明図。
【図３５】同じくたまねぎのバルブ径と葉面積の相関図。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を固体培地又は液体培地で培養して抗生物質を生成することを特徴とした植物の活性付与剤である。また製造方法の発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌を米培地などの固体培地又は液体培地に植菌し、所定温度（例えば２５℃〜３０℃）で、所定時間（例えば４日〜３０日）間培養した後、精製、抽出することを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法である。
【００４１】
また活性付与方法の発明はトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の分生胞子を根圏付近の覆土中に共存させるものである。この場合に前記分生胞子は多孔性セラミックス粒子を担体とする。このようにすれば、散布の容易性と、十分な酸素の補給性を確保することができるので好ましく、前記多孔性セラミックス粒子にキトサンその他、分生胞子の増殖時に必要な栄養分を補給することが一層好ましい。前記のようにすれば、分生胞子の増殖を円滑かつ確実にすることができるので、必然的に有用物質の単離生成物も多くなる。
【００４２】
次に活性付与剤の発明は、土壌中の増殖環境を良好にする為に、土壌温度を１５℃〜３０℃とし、水分を３０％以上とするが、その他の雑菌処理については必要性がない場合もある。更に施用方法の発明は、種子への付着、散布、土壌との混和、散布潅水による浸透などがある。
【実施例１】
【００４３】
（供試菌名称）
Trichoderuma hurzianum SK-5-5（トリコテ゛ルマ ハルシ゛アナム SK-5-5）
供試菌は97年1月北海道グリーン興産より寒天培地のスラント1本を受領した。供試菌は下記の斜面培地に植菌し、２８℃で５日間培養後、冷蔵にて保存した。
【００４４】
寒天斜面培地組成
オートミール ５．０％
シュクロース ５．０％
寒天 １．０％
２８℃、５日間培養後冷蔵保存
【００４５】
（培養）
培養は５００ｍｌ三角フラスコを用い、米培地（Ａ培地）と液体培地（Ｂ培地Ｉ）の２種類で行った。Ａ培地の条件は、２８℃で静置培養（培養途中に滅菌水１０ｍｌを添加）とし、Ｂ培地Ｉの培養は、２８℃で270rpmの振盪培養をした。
培地組成：Ａ培地
米       １００％
大豆かす     ３％
滅菌水     １０％
培地組成：Ｂ培地Ｉ
グルコース      ５．０％
ポリペプトン    ０．５％
ＮａＣｌ        ０．８％
酵母エキス      ０．２％
炭酸カルシウム  １．０％
【００４６】
（検定法）
検定は、すべてペーパーディスク平板法によるin vitroで行い、供試菌には下記の菌を用いた。
【００４７】
(1) Rhizoctonia solani（AG-1IA）
検定用培地にはＰＤＡ（Nissui）1.3%、Chloramphenicol 0.002%の組成からなる培地を用いた。Rhizoctonia の菌糸の先端をコルクボーラーで抜いたものを平板培地の中央にのせ、ブロスを染み込ませたペーパーディスクを置き菌糸の伸長の様子を観察した。
【００４８】
(2) Botrytis cinerea
検定用培地にはPotato-extract 20.0%、Sucrose 2.0%、寒天1.5%の組成からなる培地を用いた。検定はペーパーディスクに試料をのせ風乾後シャーレにのせた。シャーレをインキュベーターに入れて培養し、ペーパーディスクの周りに阻止円が形成されているか否かを観察した。
【００４９】
(3) 抗菌スペクトラム検定菌
抗菌スペクトラムを下記の検定菌を用いて測定した。
Bacillus subtilis ATCC6633
Micrococcus luters ATCC6633
Staphylococcus aureus 209P
Escherichia coli NIHJ
Saccharomyces cerevisiae SHY3
Candida albicans M9001
Candida pseudotropicalis M9035
Cryptococcus neoformans M9010
Debaryomyces hansenii M9011
Trigonopsis variabilis M9031
Schizosaccharomyces pombe M9025
Hansenula schneggi IAM4269
【００５０】
（培養法）
(1) Ａ培地培養法
Rhizoctonia solani（AG-1IA） 活性成物
糸状菌Rhizoctonia solani（AG-1IA）に対するＡ培地の培養抽出液活性物の単離精製。
Ａ培地（米培地１kg）５００ｍｌの三角フラスコ１本に米１００ｇと大豆かす３ｇを加え、同じ条件のもの１０本分の培地を調製した。滅菌後エーゼで植菌して、２８℃１０日間（菌がよく増殖するように途中何度かフラスコを振る。また培地の表面が乾いてきたら滅菌水を添加する。）静置培養後、５０％アセトン水を２リットル加え抽出をした。ここで培養物５０％アセトン抽出液２リットルを得た。
【００５１】
(2) Ｂ培地培養法
Staphylococcus aureus 209P 活性成物
細菌Staphylococcus aureus 209Pに対するＢ培地培養抽出液中活性物の単離精製。
【００５２】
【表１】
2010000078.tif 000003
【００５３】
液体培地であるＢ培地Ｉの抗細菌活性成分をより多く生産する目的で培地組成の窒素源と炭素源の割合が異なるＩ〜ＩＶの４種を比較検討した。各培地５００ｍｌ三角フラスコ２本を用い、培養５日間後培養液を５倍濃縮に調製し、検定に用いた。
【００５４】
(3) Ｂ培地Ｉ培養法培地
検討の結果よりＢ培地Ｉで精製用培養を行ったＢ培地（グルコース ５．０％、ポリペプトン ０．５％、ＮａＣｌ ０．８％、酵母エキス ０．２％、炭酸カルシウム １．０％）５００ｍｌ三角フラスコに、１００ｍｌの培地を調製した。滅菌後植菌し、２８℃、５日間、振盪培養を行った。計１．５リットルの培養液と等量のアセトンを加え、５０％アセトン抽出液３リットルを得た。
【００５５】
（精製法）
(1) Ａ培地培養抽出物精製法Ａ培地培養５０％アセトン抽出液２リットルのアセトン留去後、１リットルをＨＰ−２０−Sephadex カラム（60.0cm×4.5cm φ）に全量を通過吸着させた。等量の水で洗浄後、等量の５０％アセトン、次いで等量の１００％アセトンで溶離させた。それぞれの分画を検定菌Rhizoctonia solani（AG-1IA）で検定後、活性物質が１００％アセトン溶離部に溶離されていることを確認した。続いて１００％アセトン溶離部１リットルを濃縮し、1098mgの粗精製物を得て、その中の１００ｍｇを展開溶媒メタノール系のＬＨ−２０カラムにかけた（100.0cm×2.0cmφ）。分画をアッセイし、活性分画を確認した。これら活性分画を回収後シリカゲルＴＬＣ（酢酸エチル：酢酸：水＝５：１：１）で展開し、モリブデン硫酸呈色反応をしたところ、Ｒｆ＝０．３付近にスポットが検出された。同時に不活性分画の展開部にはこれらのスポットは検出されなかった。このことから活性物はＲｆ＝０．３付近に検出されるスポットと推定し、さらに精製を進めた。シリカゲルＰＴＬＣ展開（酢酸エチル：酢酸：水＝５：１：１）、かき取りメタノール抽出後、ＨＰＬＣを用いて単離精製をした。単離精製物は器機分析を実施し同定をした（図３１）。
【００５６】
(2) Ｂ培地Ｉ培養抽出物精製法
Ｂ培地培養５０％アセトン抽出液３リットルのアセトン留去後（１．５リットル）、活性炭吸着カラム（60.0cm×2.0cm φ）に全量１．５リットルを通過、吸着させた。等量の水で洗浄後、等量の５０％アセトン、続いて等量の１００％アセトンで溶離させた。各分画を検定菌Staphylococcus aureus 209Pを用いて検定した結果、１００％アセトン溶離部に活性物質が溶離されていることが確認された。１００％アセトン溶離部１．５リットルを濃縮し、酢酸エチルで分配抽出を行い、次いでメタノールを展開溶媒とするＬＨ−２０を実施し、ＨＰＬＣで単離精製を行った。単離精製物は機器分析を実施し同定をした（図３２）。
【００５７】
（単離精製物生物活性法）
(1) Ａ培地単離精製物評価法
４成分の生物評価法
検定用培地にはＰＤＡ（Nissui） 1.3%、Choloramphenicol 0.002%の組成からなる培地を用いた。Rhizoctonia solani（AG-1IA）の菌糸の先端をコルクボーラーで抜いたものを平板培地の中央に乗せ、サイドに調製した単離物質を染み込ませたペーパーディスクを置き菌糸の伸長の様子を観察した。
【００５８】
(2) Ｂ培地Ｉ単離精製物評価物
Ｃ成分の生物評価（ＭＷ１６８）
単離精製したＣ成分（MW:168）は新規物であり、きわめて単純な構造を保持している。母核としての興味が持たれた為生物評価を拡大して実施した。
【００５９】
(3) バクテリア属の評価
Bioassay
試験菌を加えた寒天培地をシャーレに入れ固める。その上に試料を含むペーパーディスクをのせ、37℃で18時間培養した後、発育阻止円の形成を確認する。
【００６０】
(a) 使用菌株
Staphylococcus aureus 209P、Pseudomonas syringal（タバコ野火病菌）、Xanthomonoas Campestris pv.citri（カンキツかいよう病）、Erwinia sp（ウメかいよう病）の４菌株を用いた。
【００６１】
(b) 使用培地
前培養にはブイヨン培地 （DIFCO）を用い、一晩培養後、×１０２ に希釈し、これを上層の培地０．５％に混ぜ、菌測定培地には MYCIN AGAR （ミクニ化学）を用いた。
上層 − MYCIN AGAR 1.5%（ミクニ化学）＋ブイヨン２％培地 （DIFCO）
にて一晩培養した培養液×102 に希釈したものを０．５％加える。
下層 − MYCIN AGAR 2.0%（ミクニ化学）
【００６２】
(c) 抗菌測定
ペーパーディスクに1000pppm,500ppm,250ppmに調製した単離精製物を染み込ませ、風乾後シャーレに乗せ、37℃で18時間培養し、発育阻止円の形成の有無を観察した。
【００６３】
(4) ブドウ球菌に対する抗菌力（ＭＩＣ）の測定
(a) 使用菌株
S.aureusu 209P JC−1，第１Ｇ保存の臨床分離黄色ブドウ球菌２０株（ＭＳＳＡ，ＭＲＳＡ 各１０株）及び基準菌株である E.coli NIHJ JC−2の計２２株を用いた。
【００６４】
(b) 使用抗菌薬
MW:168、methicllin（DMPPC，注射用スタフシリン、Lot.No.FSB 19,900μg/mg、萬有製薬）、vancomycin （VCM,Lot.No.41H0457,10750SIGMA）
【００６５】
(c) 使用培地
抗菌力測定にはMueller-Hinton agar （MIA:Difco）を用い前培養には、Mueller Hinton broth（MHB:Difco）を用いた。
【００６６】
(d) 抗菌力測定
使用菌株に対する各薬剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は日本化学療法学会標準法に準拠し、寒天平板希釈法にて測定した。菌株はＭＨＡに塗抹し、３７℃で一晩培養して生育したコロニーをＭＨＢにて３７℃で一晩培養し、その菌液を１００倍希釈（E.Coliのみ１０００倍希釈）したものを接種菌液とした。
【００６７】
（結果）
(1) 検定菌の結果Ａ培地とＢ培地Ｉの培養液活性は表２の通りである。
抗菌スペクトラムを下記の検定菌を用いて測定した。
【００６８】
【表２】
2010000078.tif 000004
【００６９】
Ａ培地の培養抽出液中の検定の結果、Rhizoctonia solani（AG-1IA）の菌糸がＡ培地培養抽出物のペーパーディスクを避けている様子が観察された。本菌が生産するＡ培地培養液中の活性物が、菌糸の成長を妨げる物質を生産していると推察した。このためＡ培地培養液中より、Rhizoctonia solani（AG-1IA）に阻害活性を示す物質を指標に単離精製を試みた。
【００７０】
またＢ培地Ｉの培養抽出液中の検定の結果、Botrytis cinerea、Rhizoctoniasolaniに活性は確認されず、バクテリアにのみ発育阻止円の形成が確認された。このことは、本菌は拮抗作用以外の抗菌力があると見られ、抗生物質を生産している可能性が考えられた。特にStaphylococcus aureus 209Pに形成された発育阻止円はクリアーであった為、Ｂ培地ＩではバクテリアStaphylococcus aureus 209Pに対する活性物質を指標に単離精製を実施することにした。Ａ培地培養物とＢ培地Ｉ培養物の抗菌スペクトラムは異なっており、それぞれ系統の異なるものを生産していると思われた。それぞれの活性物を単離精製することとした。
【００７１】
(2) 培養の結果
(a) Ａ培地培養結果
Ａ培地（米培地 １kg）５００ｍｌの三角フラスコ１０本分を２８℃で１０日間、静置培養し、培養物５０％アセトン抽出液２リットルを得た。
【００７２】
(b) Ｂ培地検討と培養結果
表１に表したＢ培地ＩとＢ培地ＩＩに活性が認められ、Ｂ培地Ｉにより強い活性が認められた本菌は、窒素源が少ない条件で活性物を生産することが確認された。この結果よりＢ培地Ｉを用いて２８℃で５日間、振盪培養をした。
【００７３】
(3) 精製結果
(a) Ａ培地培養精製結果
シリカゲルＰＴＬＣ処理後の活性分画を粗精製物として、ＨＰＬＣ（0.05%TFA含 ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）で純度の確認を行った。分析では０分から３０分にかけてメタノール０％から１００％のグラジエントをかけ、さらに３０分から１００％メタノールで流速１ml/minで分析したところ、ＲＴ（リテションタイム）32.5分（Fr65）で検出された（図１）。一見、単一物質のピークが検出されたかのように思われたが、拡大することにより複数ピークの存在が明らかとなった（図２）。ＲＴの速い方からＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅと称し（図２）、そのうちの４成分を単離精製した。単離精製物の成分と量は、Ａ成分 7.2mg，Ｂ成分12.1mg，Ｄ成分 3.5mg，Ｅ成分 4.5mgであった。ピークＣは量が少量であり、精製は断念した。
【００７４】
(b) Ｂ培地Ｉ培養精製結果
それぞれの分画のアッセイより活性Fr41〜54に活性があることを確認し回収した。ＨＰＬＣ（0.05%TFA含ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）分取、分析を行い検出されたピークのＲＴの速い方からＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅと数え、５成分の存在を確認した。このうちＣ成分 8.1mg単離精製することが出来た。
【００７５】
(4) 機器分析の結果
(a) Ａ培地単離精製物ＵＶ吸収スペクトラム、質量分析及びＮＭＲ測定結果（図３〜１４）より、Aib（α-Aminoisobutyric acid）を含むPolypeptideの、Peptibols系と判断した。Peptibols系抗生物質はアミノ酸配列の中に α-Aminoisobutyric acid（Aib）を含んでおり、Ｎ末端がAcetyl基で、Ｃ末端が Amino alcohol結合であることが特徴である（多くは Phenylalaniol基でおわる）。なお今回の精製物、Ａ成分、Ｂ成分、Ｄ成分は質量分析より一部のアミノ酸配列を下記のように推定し、その部分構造を既存のPeptibols のアミノ酸配列と検索した結果、一致する物が無く、新規 Peptibols系であると推定した。Ｅはアミノ酸配列の推定が困難であるため判断できなかった。
【００７６】
ＵＶ吸収波長：４成分とも末端吸収（図３、図６、図９、図１２）
Ａ成分＝１９３３（図５）
Ｂ成分＝１９４９または１９６４（図８）
Ｄ成分＝１８１０（図１１）
Ｅ成分＝１８２９（図１４）
推定構造
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-...
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-... 
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-...
【００７７】
(b) Ｂ培地Ｉ（液体培地）活性物
機器分析の結果Ｃ成分は、分子量１６８（Ｃ８Ｈ８Ｏ４）の新規物質であることが推定された。他の成分について単離精製は非常に困難であり、不可能と判断したが、LC/MS を実施した。Ａ成分のＵＶ吸収波長は末端であった（図１５）。ＨＰＬＣの条件はカラムCapcel pac C18 UG120 （2×150mm）を用い、１％酢酸：アセトニトリル＝９８：２、流速0.2ml/min、温室の条件で分析した。Ａ成分は、ＲＴ７．４８分に検出された（図１６）。Ａ成分が検出された分画の質量分析の結果、分子量は１９２であることを推定した（図１７）。同じくＢ成分についても同様の分析をしたところＢ成分もＵＶ吸収波長が末端（図１８）で、ＨＰＬＣのＲＴ １２、４５分に検出された（図１９）。質量分析の結果、分子量は２０６であることを推定した（図２０）。Ｃ成分は単離精製が可能であった分画である。Ｃ成分のＵＶ吸収波長は２７０ｎｍ（図２１）で、ＨＰＬＣのＲＴは１５．９２分に検出された（図２２）。質量分析の結果、分子量は１６８であることを推定した（図２３、２４）。また溶媒ＣＤ３ＯＤで溶解し、ＮＭＲを測定（図２５）、解析したところ五員環を含み、共役結合をもつ新規物質であることが推定された。推定構造を図２６に示した。Ｄ成分はＵＶ吸収波長が２３０ｎｍ付近にあり（図２７）、ＨＰＬＣのＲＴは３０．２８分に検出された（図２８）。しかし再度ＨＰＬＣを実施し、ＵＶスペクトラム検出器の波長を末端と２３０ｎｍで分析した結果、ＲＴ０．６分の差で２成分（Ｄ１，Ｄ２）存在していることが確認された（図２９）。それぞれの質量分析の結果、ＲＴの速いＵＶ吸収が２３０ｎｍのものは分子量１５４であった（Ｄ１）。たまＲＴが０．６分遅れて検出される成分の分子量は２２０であることを推定した（Ｄ２）（図３０）。これらの分子量の明らかとなった成分を分子量の少ない順にならべると１５４（Ｄ１），１６８（Ｃ），１９２（Ａ），２０６（Ｂ），２２０（Ｄ２）であることが確認された。
【００７８】
(5) 生物評価結果
(a) Ａ培地培養単離精製物生物評価結果
４成分の生物評価結果
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ成分について5000ppmから希釈し、5000ppm，2500ppm，1250ppm，625ppmで検定した。結果Ａ成分、Ｅ成分は1250ppmまで Rhizoctonia solaniの菌糸の伸長を阻害しおり、Ｂ成分、Ｄ成分は625ppmまでRhizoctonia solaniの菌糸の伸長を阻害しているのが確認された。
【００７９】
(b) Ｂ培地Ｉ培養単離精製物生物評価結果
(イ) バクテリア属の評価結果
Ｂ培養物（MW168） のバクテリアに対する生物活性は発育阻止円が形成されていなかったことから抗菌力は無いか、弱いものと考えられた。
【００８０】
(ロ) ブドウ球菌に対する抗菌力（ＭＩＣ）の測定結果は表３の通りである。
【００８１】
表３に示したようにＢ培養物（MW168） は今回測定した濃度において抗菌力を示さず、ブドウ球菌に対する抗菌力は無いか極めて弱いものと考えられた。
【００８２】
【表３】
2010000078.tif 000005
【００８３】
考察Ａ培地培養物より単離精製した成分からは、Ａｉｂ（α-Aminoisobutyric acid）を含むPeptibols系のもの４成分を単離することが出来た。Trichodermaが生産する Peptibols系のものは幾つかすでに報告されているが、今回単離精製したものは、それらのものとは一致しなかった。また、それぞれの成分のアミノ酸配列の結果、３成分が新規の配列であることが推定された。（Ｅ成分のみ配列を測定するのが不可能だった）さらにin vitro試験ではRhizoctonia solani（AG-1IA）の菌糸を阻害している様子が観察された。この結果から本菌の米培養抽出物中にRhizoctonia solani（AG-1IA）に対する菌糸伸長阻害物質が生産されていることが明らかとなった。本菌の拮抗作用である相手菌糸との接触により発現する細胞質凝集を促し死滅させる物質そのものであるという断言はまだ出来ないが、本菌の米培養抽出物中に菌糸成長伸長抑制物が生産されていることは明らかである。
【００８４】
またＢ培地Ｉ培養より単離精製した成分はMW:168の新規（3(3-hydroxy-cyclopropene 5-one-2yl)2-propenoic asid）であり、Bioassay を幾つか実施したが活性は無いか、きわめて弱いものと判断した。おそらく活性本体はMW:168周辺化合物であり、MW:168は活性物の副成物であると推測している。またMW:168周辺化合物の分子量はMW:154、MW:192、MW:206、MW:220であり、分子量の差がそれぞれ１４であることがわかる。これはメチル基一個分と同量であり、メチル基の増減による活性の違いも考えられる。またMW:168は新規な構造を保持しているが、構造検索より類似していた化合物が幾つか報告されていた。その中でMW:168に一番近い構造であったもの（図３３）は、鳥取大学のＰＧＲ活性スクリーニングで見出されたものであり、糸状菌Penicillium valiabile SOPPより代謝され単離精製されたと報告され、Ｃ8Ｈ8Ｏ5 （MW:198）の組成式で表されている新規物質であるが、活性は弱いものと報告されている。
【実施例２】
【００８５】
この発明の植物の活性促進剤をぎんがメロンについて農地で施用した所、次の結果を得た。
【００８６】
実施場所  北海道常呂郡訓子府町弥生
田川農園
実施期間  平成１１年４月２３日〜同年７月２９日
実施条件  アグロミックＳＫ−１０（トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の商標、以下同じ）を５０ｇ／ｍ２の割合でメロン床土に散布した。
直径１〜２ｍｍの麦飯石に、５×１０７／ｇの分生胞子を付着させてあった。試験区、対照区共に２００ｍ２で、両区の相違は、アグロミックＳＫ−１０の散布の有無だけであった。農薬、追肥は一切しなかった。
【００８７】
前記アグロミックＳＫ−１０を平成１１年４月２３日散布、平成１１年４月２６日定植、平成１１年７月２９日収穫を開始した。ぎんがメロンの平均重量と糖度は表４の通りである。
【００８８】
【表４】
2010000078.tif 000006
【００８９】
調査経過の特徴
(1) 初期段階の特徴として、根の活着が顕著で葉形が大きく茎が太い上に花めが大きい。
(2) 中間階段の特徴は、つる（ヘタ）の状態がガッチリして対照区と大きな格差があり、勿論農薬の使用は一切無く苗の立枯れ、つる割れ病、つる枯れ病の兆候も無かった。
(3) 収穫時の特徴としては、果実が大きく形が揃っており、ネットは太くて、張りは抜群であった。
(4) 食味検査について、果実全体に糖度が等しく、外皮ぎりぎりまで果肉が柔らかく、糖分が高く、しかもさらっとして上品な味覚である（対照区のメロンとは確実に格差を生じた）。
(5) 果実がしまっており、収穫後相当長期（対照区の１．５倍以上）の保存が可能であった。
【実施例３】
【００９０】
実施場所  明治製菓株式会社生物科学研究所
実施期間  平成１１年４月〜同年８月
実施条件  ４月６日播種
４月８日〜２２日発芽、育苗
５月７日定植、アグロミックＳＫ−１０の散布
２×１０７／ｇ、３０〜４０ｇ／ｍ２
６月４日〜７日交配
７月１２日〜２３日収穫
前記中適宜施肥、潅水した。前記実施により、表５の結果を得た。
【００９１】
【表５】
2010000078.tif 000007
【００９２】
結果
糖度は施用区の方が１．５％高かった。ＳＫ−１０施用によりショ糖量が上昇し、ブドウ糖、果糖が抑制された。ＳＫ−１０の一度の施用により糖度が向上したことは、根圏における相互作用により光合成産物の転流その他活性が付与された結果である。
【実施例４】
【００９３】
この発明の植物の活性促進剤をてん菜について施用した所、次の結果を得た。
【００９４】
実施場所  北海道斜里町朱丹
実施期間  平成１１年３月１２日〜同年１０月７日
実施条件  ポット上部土約３０ｋｇに対し、アグロミックＳＫ−５５（トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５菌の商標）相当量を混和処理した。分生胞子は２×１０８／ｇ以上であった。覆土に対し殺菌処理なし。菌定着の為に３月下旬〜４月中旬、週一回程度潅水を実施した。７月３０日アグロミックＳＫ−５５の１００倍液を株元と葉面に２リットル／ｍ２噴霧散布した。処理区と対照区との相違は、殺菌処理しないことと、アグロミックＳＫ−５５の処理をしないことであり、施肥量、施肥方法その他一切同一とした。
【００９５】
結果
上記実施について、平成１０年７月２９日収穫した所、表６の実数、表７の比率の結果を得た。
【００９６】
【表６】
2010000078.tif 000008
【００９７】
【表７】
2010000078.tif 000009
【００９８】
前記実施例によれば、根重が３２％増加し、糖量が４０％増加している。従って同一面積で４０％増収したことになり、大変な成果である。
【００９９】
前記実施例によれば、発芽時の混和と、７月３０日にアグロミック ＳＫ−５５の散布で、収量の著しい増加が認められたことは、アグロミック ＳＫ−５５により、てん菜の根茎を活性化し、これにより養分吸収その他が合理的、かつ強力になり、細胞分裂も順調になったものと推定される。
【０１００】
てん菜の場合にも種子の処理、土壌混和、中間散布など、今後は施用量と時機を研究することにより、更なる利点が浮上する可能性がある。
【実施例５】
【０１０１】
この発明の植物の活性促進剤を水稲について施用した所、次の結果を得た。
【０１０２】
実施場所  北海道札幌市清田（佐々木農園）
北海道夕張郡田仁町（樋山農園）
北海道雨竜郡北竜町（高橋農園）
実施期間  平成１１年５月６日〜同年９月１６日
実施条件  品種名 ほしのゆめ、きらら３９７
アグロミックＳＫ−１０（トリコデルマ ハルジアナム  ＳＫ−５−５菌の商標）散布量
Ａ… ５０ｇ／ｍ２、分生子２×１０８／ｇ
Ｂ…１００ｇ／ｍ２、分生子２×１０８／ｇ
対照区には、タチガレンエース液を散布し、追肥した（従来法）以外は同一である。
【０１０３】
前記の条件で、水稲栽培した所、表８（佐々木農園）、表９（樋山農園）、表１０（高橋農園）の結果を得た。
【０１０４】
【表８】
2010000078.tif 000010
【０１０５】
【表９】
2010000078.tif 000011
【０１０６】
【表１０】
2010000078.tif 000012
【０１０７】
前記実施例によれば、きらら３９７の場合に、蛋白質で、慣行区に比べて４〜６ポイント下がり、アミロースで１〜３ポイントの差が確認された（１ポイントは０．５とされる）。
【０１０８】
そこで味度を測定した所、平均９１．０であった。一方市販の味が良いと言われる米について測定した所、８８．０が最高であったから、現時点で最高の味度を示したものということができる。
【０１０９】
前記結果より判断するに、水稲の活性化により、病原菌、害虫を忌避した低農薬有機農法であり、植物本来の力を引出して味覚を改善するのみならず収穫量も増加（２０〜５０％）するなどの特徴が確認された。
【実施例６】
【０１１０】
この発明の植物の活性促進剤をトウモロコシについて施用した所、次の結果を得た。
【０１１１】
実施場所  明治製菓株式会社生物科学研究所
実施期間  平成１１年４月〜同年８月３０日
使用菌：アグロミックＳＫ−１０（２×１０７／ｇ）
施用法：発芽第２週目に、土壌散布、潅水１５０ｍｌ／ｐｏｔ
施用説明  前記条件のもとに、表１１の施用設計に基づき施用した。
【０１１２】
【表１１】
2010000078.tif 000013
【０１１３】
前記により栽培し、収穫した所、表１２の結果を得た。
【０１１４】
【表１２】
2010000078.tif 000014
【０１１５】
前記のように、果実の肥大効果と、糖度の向上が認められた。施用量の多少による有為差は殆ど認められなかった。即ち２０ｇ／ｍ２の施用量と、２００ｇ／ｍ２の施用量との間に差がないということになり、トウモロコシの場合には、発芽後１回の施用で活性付与が行われることにより収穫まで継続するものと推定される。
【０１１６】
従ってアグロミックＳＫ−１０により、生成される新アミノ酸の量が活性を付与するのに十分であるならば、施用量は２０ｇ／ｍ２以下でも十分効力を発揮し得ることになる。
【０１１７】
前記理由により、土壌がアグロミックＳＫ−１０の増殖に必要な条件を有する場合には、２０ｇ／ｍ２以下でも十分効力を有するものと認められる。恐らく増殖可能な条件の下限によって定まるであろう。そこで発芽後一定期間、アグロミックＳＫ−１０の増殖条件のもとにトウモロコシを育成する方法も考えられる。
【実施例７】
【０１１８】
アグロミックＳＫ−１０（トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５の商標）をたまねぎ育苗床土に施用し、その苗及び定植後の生育促進効果を以下のように調査した。
【０１１９】
(1) 試験材料：
(a) 供試種子：スーパーハイゴールドの薬剤処理していない種子
(b) 供試資材：アグロミックＳＫ−１０（Trichoderma harzianum ＳＫ−５−５の５×１０８ＣＦＵの生菌剤、北海道グリーン興産株式会社提供）
(c) 供試場所：千葉県木更津市下郡今間
(2) 試験方法：
(a) 苗床の準備：育苗床は千葉県下の山砂土で、前作はスイートコーンを栽培した圃場を用いた。ｐHは６．０前後の弱酸性土壌であったので、ｐHの調整を兼ねて消石灰１ｍ２あたり５０ｇ、完熟堆肥（牛糞主体のモミガラ入り堆肥）１ｋｇ、ＣＤＵ２０ｇをアグロミックＳＫ−１０散布施用１５日前に施肥し、耕耘した。
【０１２０】
(b) アグロミックＳＫ−１０施用および方法：
施用日：平成１１年９月１１日
準備した育苗床に、供試資材アグロミックＳＫ−１０粒剤を播種４日前に１ｍ２あたり５０ｇ散布し、表層３−５ｃｍの深さによく混和し、水道水を用いて、土壌水分が多湿にならないように（手で握りしめて団子になる程度の湿り程度、即ち糸状菌を増殖培養のための最適湿度条件）に留意して散水を行なった。
【０１２１】
(c) 播種およびアグロミックＳＫ−１０の施用後の管理：
播種日：平成１１年９月１５日
残暑の厳しい、高温・乾燥であるので、トリコデルマ菌が育苗床土に増殖・定着を良くし、たまねぎの出芽を良くするために、できるだけ地温を２０℃〜２５℃程度に保ち、且つ水分条件の安定を図るように、両区ともライ麦ワラを２〜３ｃｍの厚さに敷き、その上に寒冷紗をかけた。
【０１２２】
たまねぎの種子は、すじまきで５０ｃｍ間に７０粒程度を播種し、覆土後、適度の散水を行なって、出芽が始まるまで、上記方法で被覆した。
【０１２３】
出芽後は敷きワラを除去し、寒冷紗トンネル被覆を１ヶ月程度行なった。定植に備えるために、前記トンネル被覆を取り除き、堆肥と混合したＣＤＵ化成肥料を１ｍ２あたり２０ｇ程度、条間に浅く中耕して施肥した。苗の大きさは径０．５〜０．６ｃｍ×葉丈５〜６ｃｍ程度の充熟した苗を作ることを目標にして育苗した。
【０１２４】
(d) 定植：
定植日：平成１１年１１月７日（播種後５３日目）
本圃の土壌は沖積土、ｐHは６．０程度の弱酸性土壌で、さつまいもの後作。消石灰１０ａあたり６０ｋｇ、完熟堆肥５００ｋｇ、骨粉６０ｋｇ、米粕６０ｋｇを堆肥とよく混和して施用し、耕耘した。一週間後に畦幅１ｍ・３条植の畦を作り、ＣＤＵ２０ｋｇと過燐酸石灰１０ｋｇを完熟堆肥３００ｋｇによく混和して、溝施肥した。苗は大きさの順に株間１５ｃｍに施肥溝に定植した。
【０１２５】
(3) 調査結果：
(a) 出芽および生育状況：出芽では無処理区、処理区とも、ほとんど差は無かったが、一週間後にわずかながら無処理区で苗立ち枯れが発生した。その後の生育では、２５日目ごろまで差は認められなかったが、トンネル除去・追肥後（播種後３５日目）より、処理区で葉色が濃くなり、目視でも生育が旺盛となり、差が認められるようになった。
【０１２６】
(b) 苗の生育調査：
(イ) 定植前の苗の生育状況：調査日平成１１年１１月７日（播種後５３日目）詳細なデータは表１３に示した。
【０１２７】
良苗（大および中苗本数）は処理区７８％で、無処理区では６５％であった。アグロミックＳＫ−１０の施用によって良苗比率が１３％増加した。苗径が０．７ｍｍ以上の苗はなかった。促進効果について、表１３で示すとおり、アグロミックＳＫ−１０処理区では生育指数が大きくなり、生育が旺盛で、根量も多くなった。生育促進率を比較すると、ＳＫ−１０処理区は、無処理区より２７％の生育増加が認められた。
【０１２８】
(ロ) 定植後の生育調査：越冬前の生育状況について調査した。
【０１２９】
調査方法：図３４の方法で調査した。
【０１３０】
結果：詳細な結果は表１４のとおりである。
【０１３１】
アグロミックＳＫ−１０処理区は、無処理区と比較して、出葉枚数で０．４枚多く、生育促進率は１５２．５％、バルブ径１５４．７％の増加率となった。目視による観察でも、明らかに生育促進効果が認められた。アグロミックＳＫ−１０処理区は、無処理区と比較して、根量が多く、根張りも良く、根に良く土が付着し、根毛も多かった。またアグロミックＳＫ−１０処理区において、葉面積とバルブ径は相関関係が認められた（図３５、表１５、表１６）。
【０１３２】
【表１３】
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【０１３３】
【表１４】
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【０１３４】
【表１５】
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【０１３５】
【表１６】
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【実施例８】
【０１３６】
アグロミックＳＫ−１０をキャベツ育苗床土に施用し、その苗及び定植後の生育促進効果を以下のように調査した。
【０１３７】
(1) 使用材料：
(a) 供試種子：薬剤処理していない種子
(b) 供試資材：アグロミックＳＫ−１０（トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５−５の５×１０８ＣＦＵ、北海道グリーン興産株式会社提供）
(2) 実施場所：千葉県成田市吉田農園
(3) 施用概要：
(a）施用日：平成１１年９月１５日
(b) 播種日：平成１１年９月１９日
(c) 床 土：ｐH６．０前後の砂壌土を中性に調整する為、消石灰を１ｍ２あたり５０ｇ位散布した。これに完熟堆肥を１ｍ２当り１ｋｇ、２週間前に施肥し、耕耘した。
【０１３８】
播種前にアグロミックＳＫ−１０を、１ｍ２あたり５０ｇ位散布した。ついで表層５ｃｍ位を土壌混和させ、１ｍ２あたり３リットル位散水したが、土壌水分は多湿にならない程度とした（手で握りしめて団子になる程度）。
【０１３９】
(4) 調査日：平成１１年１２月２３日（播種後９４日）
前記調査日において、処理区は葉色濃く、厚葉でしまりがよく、結球性が速いことが認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月25日(2009.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を固体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で７日〜１５日間静置培養した後、生成物を抽出して下記の物質を得ることを特徴とした新規アミノ酸の製造方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９４９又は１９６４
Ｃ成分：C８H８O４であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１８１０
【請求項２】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を液体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で４日〜１０日間振盪培養した後、生成物を抽出して下記の物質を得ることを特徴とした新規アミノ酸の製造方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９４９又は１９６４
Ｃ成分：C８H８O４であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１８１０
【請求項３】
植物栽培に際し、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を植物の種子へ付着処理し、覆土と分生胞子とを混和し、又は分生胞子の適量を散布して、潅水又は埋設して、下記の物質を生産させることを特徴とした新規アミノ酸の製造方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９４９又は１９６４
Ｃ成分：C８H８O４であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１８１０
【請求項４】
植物栽培に際し、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を植物の種子へ付着処理し、覆土と分生胞子とを混和し、又は分生胞子の適量を散布して、潅水又は埋設して、下記の物質を生産させると共に、前記分生胞子のおかれた土壌温度を１５℃〜３０℃とし、水分を３０％以上とし、かつ土壌に通気性又は含気性を付与することを特徴とした植物に付与する新規アミノ酸の生成方法。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９４９又は１９６４
Ｃ成分：C８H８O４であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１８１０
【請求項５】
トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌の分生胞子を液体培地で増殖させて、下記の新規アミノ酸を生成させた後、所定量宛包装したことを特徴とする包装アミノ酸。
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１９４９又は１９６４
Ｃ成分：C８H８O４であって分子量１６８
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-の部分構造を有し、分子量１８１０