(57)【要約】【課題】  標的微生物のゲノムの多くを他の易培養性の微生物のゲノムとともに組み込んだ形質転換体を製造する方法及び該方法に用いられる材料を提供すること。【解決手段】  ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセル生産菌を、核酸切断条件下で培養して、核酸切断処理されたミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程；前記培養物からミニセルを分離する工程；及び接合伝達の方向が時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から反時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ａのゲノムの少なくとも一部と、接合伝達の方向が反時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部とを、最少培地において前記ミニセルに接合伝達させて、増殖能を有する接合伝達形質転換体を得る工程を含む、前記接合伝達形質転換体を製造する方法、並びに前記ミニセル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセル生産菌を、核酸切断条件下で培養して、核酸切断処理されたミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程；
前記培養物からミニセルを分離する工程；及び
接合伝達の方向が時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から反時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ａのゲノムの少なくとも一部と、
接合伝達の方向が反時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部とを、
最少培地において前記ミニセルに接合伝達させて、増殖能を有する接合伝達形質転換体を得る工程
を含む、前記接合伝達形質転換体を製造する方法。
【請求項２】
前記ミニセル生産菌がＦ-細胞であり、かつ前記供与体Ａ及び前記供与体ＢがＨｆｒ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミニセル生産菌が、大腸菌、サルモネラ属細菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、又はカンピロバクター属細菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記供与体Ａ及び前記供与体Ｂが、それぞれ独立して、大腸菌、サルモネラ属細菌、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌又はプロピオニバクテリウム属細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸切断条件下での培養が、核酸切断剤の存在下での培養、紫外線照射下での培養、及び放射線照射下での培養からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸切断剤が、マイトマイシンＣ、ナルジキシン酸、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチン・スチマラマー及び塩酸イダルビシンからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記供与体Ａは接合伝達の導入部がゼロ点から反時計回り方向に５分以内の位置にある供与体であり、かつ前記供与体Ｂは接合伝達の導入部がゼロ点から時計回り方向に５分以内の位置にある供与体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記供与体Ａのゲノムの少なくとも一部又は前記供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部が、ファージＤＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
核酸切断処理されたミニセル生産菌に由来する、ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種の供与体のゲノムの少なくとも一部を接合により受容体に伝達することを含む、増殖能を有する接合伝達形質転換体を製造する方法及び該方法に用いられるミニセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は自然界及び生体内で様々な役割を担っている。例えば、腸内細菌は、宿主が摂取した難分解性多糖類を短鎖脂肪酸に転換して宿主にエネルギー源を供給することや、外部から侵入した病原細菌を殺傷して腸内での増殖を妨げることなどにより、宿主の恒常性維持に役立っている。ヒトの腸内細菌は、５００種類以上いると推定されており、腸内で共生して生物叢（腸内フローラ）を形成している。しかし、腸内フローラに常在する細菌のうち、現在培養可能な細菌は２０〜３０％程度であり、残りの難培養性の細菌の特性や役割については未だ詳細に解明されていない。腸内細菌以外にも、極限環境微生物、海洋性微生物、地殻内休眠微生物（ドーマント）などの微生物は、地上の微生物と異なる分子メカニズムを有していると目されており、未知の酵素の発現を期待されているが、それらのほとんどが難培養性である。
【０００３】
自然界において、人体に対して有毒な微生物も存在する。有毒性微生物として、例えば、サルモネラ菌Salmonella thyphi株や大腸菌Ｏ−１５７株が挙げられる。特に、大腸菌Ｏ−１５７株による食中毒は毎年頻発している。抵抗力の弱い幼児、小児及び老年者が大腸菌Ｏ−１５７株に感染すると死に至る場合もある。そこで、大腸菌Ｏ−１５７株などの有毒性微生物による感染症に対して、即効性のある予防薬及び治療薬の開発が望まれている。しかし、有毒性微生物を培養することのできる研究施設は限られており、有毒性微生物に対する感染症予防薬及び治療薬の開発が進んでいないというのが現状である。
【０００４】
これまで、難培養性微生物をその役割が観察できる程度に増殖させること、及び有毒性微生物を無毒化した状態で増殖させることは、既存の培養法を改変することにより試みられていた。しかし、上記試みは、培地組成が複雑であり、培養条件も多数のパラメータからなるために、多大な時間と労力を要していた。そこで、難培養性微生物及び有毒性微生物を直接培養するのではなく、発現ベクターを用いた遺伝子組換え法、易培養性微生物若しくは無毒性微生物を用いた相同組換え法、又は接合伝達法などにより、これらのゲノムの一部を他の微生物に組み込んだ形質転換体を利用して、難培養性微生物及び有毒性微生物の構造や機能等を研究することが試みられている（例えば、特許文献１〜４を参照）。
【特許文献１】特開平１０−７５７９３号公報
【特許文献２】特開平６−３０７８１号公報
【特許文献３】特開平９−７０２９２号公報
【特許文献４】特表２００８−５１０７９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、難培養性微生物や有毒性微生物などの由来微生物のオペロンが長大である場合や由来微生物の遺伝子がゲノム上の多座に渡っている場合などでは、遺伝子を分割するか、又は遺伝子ごとに、種々の形質転換体を作成しなければならず、形質転換体一種あたりの形質転換範囲が限られる。さらに、従来の相同組換え法や接合伝達法は、多遺伝子の交雑の頻度が低く効率が悪い。上記状況を鑑みて、本発明者らは、従来の形質転換体を利用する方法について、多数の生化学反応が関わる系において中間生成物や分岐生成物の合成が期待できないことから、個々の微生物の分子メカニズムを解明することが困難であろうと考えた。
【０００６】
したがって、本発明は、標的微生物の分子メカニズムを解明するために、標的微生物のゲノムを他の易培養性の微生物のゲノムとともに組み込んだ形質転換体を製造する方法及び該方法に用いられる材料を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、種々検討した結果、核酸切断剤の存在下で培養されたミニセル生産菌からミニセルを分離し、次いで、接合伝達の方向及び導入部が特定の関係にある２種の供与体のゲノムの一部を該ミニセルに接合伝達させることにより、供与体の多くの遺伝子が伝達された、増殖能を有する接合伝達形質転換体を製造することに成功した。さらに、本発明者らは、該接合伝達形質転換体の遺伝的特徴が、ミニセルではなく、ゲノムの伝達元である２種の供与体に由来することを確かめた。また、本発明者らは、２種の供与体のゲノムの一方にファージＤＮＡを含めることにより、他方の供与体のゲノムを多く持つ接合伝達形質転換体を選択的に製造することに成功した。本発明は以上の知見に基づいて完成された発明である。
【０００８】
したがって、本発明によれば、ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセル生産菌を、核酸切断条件下で培養して、核酸切断処理されたミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程；
前記培養物からミニセルを分離する工程；及び
接合伝達の方向が時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から反時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ａのゲノムの少なくとも一部と、
接合伝達の方向が反時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部とを、
最少培地において前記ミニセルに接合伝達させて、増殖能を有する接合伝達形質転換体を得る工程
を含む、前記接合伝達形質転換体を製造する方法が提供される。
【０００９】
本発明の好ましい態様は、前記ミニセル生産菌がＦ-細胞であり、かつ前記供与体Ａ及び前記供与体ＢがＨｆｒ細胞である。
【００１０】
本発明の好ましい態様は、前記ミニセル生産菌が、大腸菌、サルモネラ属細菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、又はカンピロバクター属細菌である。
【００１１】
本発明の好ましい態様は、前記供与体Ａ及び前記供与体Ｂが、それぞれ独立して、大腸菌、サルモネラ属細菌、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌又はプロピオニバクテリウム属細菌である。
【００１２】
本発明の好ましい態様は、前記核酸切断条件下での培養が、核酸切断剤の存在下での培養、紫外線照射下での培養、及び放射線照射下での培養からなる群から選ばれる少なくとも一種である。
【００１３】
本発明の好ましい態様は、前記核酸切断剤が、マイトマイシンＣ、ナルジキシン酸、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチン・スチマラマー及び塩酸イダルビシンからなる群から選ばれる少なくとも一種である。
【００１４】
本発明の好ましい態様は、前記供与体Ａは接合伝達の導入部がゼロ点から反時計回り方向に５分以内の位置にある供与体であり、かつ前記供与体Ｂは接合伝達の導入部がゼロ点から時計回り方向に５分以内の位置にある供与体である。
【００１５】
本発明の好ましい態様は、前記供与体Ａのゲノムの少なくとも一部又は前記供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部が、ファージＤＮＡを含む。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、核酸切断処理されたミニセル生産菌に由来する、ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセルが提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の製造方法によれば、接合伝達により２種の供与体のゲノムの一部をミニセルに伝達して増殖能を有する接合伝達形質転換体を製造することができる。さらに、本発明の製造方法によって、難培養性微生物及び有毒性微生物などの微生物のゲノムの一部を含む接合伝達形質転換体を選択的に製造することにより、該微生物が産生する中間代謝物や分岐代謝物を調査することが可能となり、さらには該微生物の分子メカニズムをも解明し得る。すなわち、本発明の製造方法によれば、自然界や生体内に常在している微生物の常在環境における役割や機能を解明することが可能となる。
【００１８】
本発明の製造方法によれば、例えば、大腸菌Ｏ１５７株と別の大腸菌株とを供与体として用いることにより、Ｏ１５７株の形質を有し、かつＯ１５７抗原を有さない新たな接合伝達形質転換体を製造することができる。該接合伝達形質転換体は、Ｏ１５７抗原の合成経路に関わる遺伝子が欠損しており、増殖を重ねてもＯ１５７抗原を合成することがなく、かつＯ１５７抗原の中間生成物を生産し得る可能性がある。さらに、該接合伝達形質転換体は、Ｏ１５７抗原の中間生成物を分解又はその他の物質に転換する可能性がある。したがって、Ｏ１５７抗原の生化学的な合成経路や分解若しくは分岐メカニズムは、Ｏ１５７抗原の解毒化に対して重要な情報であることから、本発明の製造方法によって上記した接合伝達形質転換体を製造して研究する意義は非常に高い。
【００１９】
生体の腸内細菌群から本発明の製造方法によって接合伝達形質転換体を製造し、次いで、再び該接合伝達形質転換体を生体内に戻して定着させて、腸内フローラに外的変化を意図的に与えることも可能である。定着した接合伝達形質転換体は、ヒト又は家畜等の腸内フローラにおける役割及び機能を拡大することができ、腸内フローラのバランス維持及び改善等に貢献し得る。特に、従来のプラスミドを利用した形質転換法であれば、形質転換を維持するために抗生物質が必要であり、実験室環境でしか使用できなかった。さらに、従来の形質転換法によって製造された形質転換体を腸内フローラに導入したとしても、腸内フローラに元々存在していなかったことから、腸内フローラを乱すことになり、形質転換体の排出又は腸内フローラの破壊につながり、重篤な疾病を引き起こす可能性もある。それに対して、本発明の製造方法によって製造された接合伝達形質転換体は、腸内フローラに存在した野生株の多くの遺伝子を含むことから、腸内フローラにおいて定着する可能性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の接合伝達形質転換体を製造する方法は、以下の工程を含む方法である：
ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセル生産菌を、核酸切断条件下で培養して、核酸切断処理されたミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程；
前記培養物からミニセルを分離する工程；及び
接合伝達の方向が時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から反時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ａのゲノムの少なくとも一部と、
接合伝達の方向が反時計回りであって、接合伝達の導入部がゼロ点から時計回り方向に１０分以内の位置にある供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部とを、
最少培地において前記ミニセルに接合伝達させて、増殖能を有する接合伝達形質転換体を得る工程。
【００２１】
（１）ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程
ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程（以下、「第一の工程」と呼ぶこともある）は、ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセル生産菌を核酸切断条件下で培養することによって、ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得る工程である。
【００２２】
本明細書でいう「ミニセル生産菌」とはミニセルの生産を誘導する発現系を有する菌株を意味し、「ミニセル」とはゲノムＤＮＡの大部分を持たず、自己増殖能のない小型の細胞を意味する。ミニセルの生産を誘導する発現系に関与する遺伝子として、例えば、ｍｉｎＡ遺伝子及びｍｉｎＢ遺伝子を挙げることができる。ミニセル生産菌は、野生型のｍｉｎＡ遺伝子、ｍｉｎＢ遺伝子及びこれら以外のミニセルの生産を誘導する発現系に関与する遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子に変異が生じることにより作製され得る。ミニセル生産菌としては、例えば、ＭＥ８０７７株、χ１４１１、P６７８-５４株などの大腸菌（Escherichia coli）、χ１３１３株などのサルモネラ属細菌（Salmonella sp.）、CU403 divIV-B1株などのバチルス属細菌（Bacillus sp.）、Lactobacilli higardii LHC11株及びLactobacilli higardii LHC12株などのラクトバチルス属細菌（lactobacilli sp.）、Campylobacter jejuni MDUWO1210 株などのカンピロバクター属細菌（Propionibacterium sp.）などを挙げることができる。本発明の方法において、大腸菌のミニセル生産菌としてはＥ．ｃｏｌｉ  ＭＥ８０７７株が好ましく用いられる。ミニセル生産菌からミニセルを生産させるためには、ミニセル生産菌が通常増殖できる条件で培養すればよく、例えば、ミニセル生産菌が大腸菌である場合には、ミニセル生産菌をＬＢ液体培地中で培養することにより、ミニセル生産菌にミニセルを生産させることができる。生産されたミニセルは、顕微鏡観察により体長の相違によって、ミニセル生産菌と区別して確認することができる。例えば、ミニセルの長軸は、ミニセル生産菌に対して、０．２〜０．３倍の長さである。体長以外にも、例えば、ＤＡＰＩ〔4',6-diamino-2-phenylindole〕などの核酸染色剤を用いることにより、ミニセルは、核酸染色剤によって染色されない細胞小体として、核酸が染色されるミニセル生産菌と区別して確認することができる。
【００２３】
第一の工程において、ミニセル生産菌は、ＲＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩなどのＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有する。ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターは、ＲＮＡポリメラーゼが接着し、かつ自立的に複製することが可能な発現ベクターである。ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡと接着することは、例えば、Shepherd N, Dennis P, Bremer H. Cytoplasmic RNA Polymerase in Escherichia coli. J Bacteriol. 2001 183(8):2527-34の文献によって報告されている。したがって、ＲＮＡポリメラーゼとベクターとの接着の様式及び条件は特に限定されるものではなく、例えば、ミニセル生産菌の増殖に応じて、ミニセル生産菌から発現されたＲＮＡポリメラーゼは、ベクターと接触し、固定され得る。
【００２４】
ベクターの具体例としては、ｐＴＳＭｂ１、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＣＲ２．１、ｐＬＥＸ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＢＢＲ１２２（サルモネラ属細菌）等のプラスミドベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させる場合には、ｐＴＳＭｂ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８などが好ましく用いられる。例えば、ｐＴＳＭｂ１ベクターは、複製開始点としてｐ１５Ａを持ち、１細胞当たり１０〜１５コピー存在する。ｐＴＳＭｂ１ベクター上には、カナマイシン耐性遺伝子、ＬａｃＩ遺伝子、ｃＩ８５７遺伝子、蛍光蛋白質ＧＦＰ遺伝子が存在する。ｐＴＳＭｂ１ベクターにおいて、ＬａｃＩ遺伝子の発現は、Ｐｓ１−ｃｏｎプロモータで制御され、ｃＩ８５７蛋白質で抑制される。ｐＴＳＭｂ１ベクターにおいて、ｃＩ８５７遺伝子及びｇｆｐ遺伝子の発現は、Ｐｔｒｃプロモータで制御され、ＬａｃＩ蛋白質で抑制される。ｐＴＳＭｂ１ベクターでは、ＬａｃＩとｃＩ８５７遺伝子がトグルスイッチの状態で配置されているので、染色体上のＬａｃＩやｃＩ遺伝子の存在を感知して、ｇｆｐ遺伝子の発現が調節される。
【００２５】
ベクターは、選択マーカーを含有してもよい。特に、ミニセル生産菌におけるベクターの存在を確認する指標として、選択マーカーが使用され得る。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等の如きその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンなどの薬剤に対する耐性遺伝子を挙げることができる。ベクターは、プロモータ、所望により、ターミネータ、エンハンサーなどを連結してなり、これらをベクターに挿入する方法は当業者に通常知られる方法（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、バイオ実験イラストレイテッド、第１巻〜第７巻、秀潤社、などに記載の方法）によりすることができる。
【００２６】
第一の工程において、ミニセル生産菌は、核酸切断条件下で培養される。核酸切断条件下での培養とは、例えば、核酸切断剤の存在下、紫外線照射下若しくは放射線照射下、又はこれらを組み合わせた培養であって、ミニセル生産菌のゲノムＤＮＡが損傷することによりミニセル生産菌のＤＮＡ修復系が誘導された培養である。
【００２７】
ＤＮＡ修復系として、例えば、大腸菌のＳＯＳカスケード（応答）が挙げられる。ＳＯＳカスケードは、ＤＮＡ損傷で生じる一本鎖ＤＮＡが最初のシグナルとなって大腸菌のＲｅｃＡタンパク質が活性化されることから始まる。一本鎖ＤＮＡにＲｅｃＡタンパク質が結合すると、ＳＯＳボックス（オペレータ部位）に結合しているＬｅｘＡリプレッサータンパク質が不活性化される。その結果として、ＳＯＳ遺伝子の転写が開始されてＤＮＡポリメラーゼＶとＲｅｃＡタンパク質が生成されて、ＤＮＡ損傷部位を修復する。ＳＯＳカスケードは、ＤＮＡ損傷部位に適当な塩基を入れて修復する系であり、error-prone repairであると言われている。
【００２８】
核酸切断剤とは、二本鎖ＤＮＡへの架橋形成を介するなどしてＤＮＡを損傷させる薬剤である。したがって、第一の工程において、ミニセル生産菌を所定の濃度の核酸切断剤の存在下で培養すると、ミニセル生産菌のゲノムＤＮＡは核酸切断剤の作用により切断され、ゲノムＤＮＡの一部が一本鎖及び二本鎖に断片化するなどの損傷を受ける。この場合、ミニセル生産菌において、損傷を被ったゲノムＤＮＡを修復するために、ＤＮＡ修復に関与する１以上の酵素が発現するなどして、ＤＮＡ修復系が活性化する。すなわち、第一の工程において、ミニセル生産菌を所定の濃度の核酸切断剤の存在下で培養すると、一本鎖及び二本鎖に断片化されたゲノムＤＮＡを有し、かつＤＮＡ修復系を活性化したミニセル生産菌が得られる。
【００２９】
核酸切断剤は、上記した通りに、ゲノムＤＮＡの一部を断片化し、かつＤＮＡ修復系を活性化する薬剤であれば特に制限されないが、例えば、マイトマイシンＣ、ナルジキシン酸、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチン・スチマラマー、塩酸イダルビシンなどを挙げることができ、これらの単独又は組み合わせが含まれ得る。大腸菌のＳＯＳカスケードを誘導する薬剤としてはマイトマイシンＣが好ましく用いられる。核酸切断剤の濃度は、ミニセル生産菌に対して致死量ではなく、かつゲノムＤＮＡを断片化してＤＮＡ修復系を活性化し得る濃度であれば当業者により適宜設定できる。例えば、核酸切断剤としてマイトマイシンＣを用いる場合は、マイトマイシンＣの濃度は、５〜１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、１０〜５０ｎｇ／ｍｌがより好ましく、１５〜３０ｎｇ／ｍｌがさらに好ましく、２０±５ｎｇ／ｍｌがなおさらに好ましい。ミニセル生産菌の培養において、核酸切断剤を培養当初から培地に含有させてもよいし、培養開始から所定の時間に別途核酸切断剤を添加してもよい。
【００３０】
ミニセル生産菌は、ミニセル生産菌の菌種に応じて、通常知られる培地、培養法及び培養条件で培養することができる。ミニセル生産菌の培養に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、及び菌種に応じて微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３１】
培地の炭素源としては、ミニセル生産菌が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、デキストリン、糖蜜などの糖質、クエン酸及びコハク酸などの有機酸、グリセリンなどの脂肪酸を挙げることができる。
【００３２】
培地の窒素源としては、各種有機及び無機の含窒素化合物、並びに各種の無機塩を挙げることができ、例えば、コーンスチープリカ、大豆粕、大豆粉、ペプトン、ポリペプトン、バクトペプトンなどの各種ペプトン類などの有機窒素源、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウムなどの無機窒素源を挙げることができる。グルタミン酸などのアミノ酸及び尿素などの有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。さらに、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も窒素源として使用できる。
【００３３】
培地の無機物としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。さらに、必要に応じて、アミノ酸並びにビオチン及びチアミンなどの微量栄養素ビタミンなども適宜用いられる。
【００３４】
培養法としては、例えば、固体培地などを用いる固体培養法、並びに通気、振とう、撹拌及びこれらを組み合わせて用いる液体培養法などを挙げることができる。液体培養法を用いる場合は、回分培養、流加培養、連続培養、灌流培養のいずれを用いてもよい。培養温度とｐＨは、ミニセル生産菌の増殖に適した条件を適宜選べばよい。例えば、ミニセル生産菌が大腸菌の場合の培養は、温度は好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃、さらに好ましくは３７℃±１℃であり、ｐＨは好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８、さらに好ましくは７．２±０．２であり、これらの温度及びｐＨから選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間はミニセル生産菌が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは８〜１２０時間であり、さらに好ましくはミニセルが最大に生成する時間までである。ミニセル生産菌の増殖を確認する方法は特に制限されないが、例えば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。さらに、培養中の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。ミニセル生産菌が嫌気性微生物である場合は、空気や酸素に変えて窒素などを培地に加えて培養すればよい。
【００３５】
ミニセル生産菌の培養において、ベクターに選択マーカーを含有させている場合などでは、選択マーカーに対応した栄養素や抗生物質を培養当初又は培養中に培地に加えることができる。例えば、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含有する場合は、適当な濃度に調製したカナマイシン溶液を培地に加えることができる。
【００３６】
ミニセル生産菌を培養することにより、ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を得ることができる。ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物とは、ミニセル生産菌を培養して生じる培養物であり、増殖したミニセル生産菌、ミニセル生産菌から生産されたミニセル、ミニセル生産菌が生産する副生産物、培地の不溶成分などの固形成分、該固形成分を除いた液体成分などからなる。ただし、ミニセル生産菌を培養して生じる培養物から液体成分を除いた固形成分をミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物と呼ぶ場合もある。
【００３７】
（２）ミニセルを分離する工程
ミニセルを分離する工程（以下、「第二の工程」と呼ぶこともある）は、ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物から、通常知られる方法により、ミニセルを分離する工程である。ミニセルを分離する方法としては、例えば、密度勾配遠心法及びろ過法を挙げることができ、ろ過法が好ましく用いられる。ろ過法によるミニセルを分離する方法としては、ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物からミニセルを分離できる方法であれば特に制限されないが、例えば、ミニセルを透過し、かつミニセル生産菌を透過しない細孔径のろ過膜にミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物を適用する方法が挙げられる。この場合、ミニセルはろ液として回収される。ろ過法によりミニセルを分離する方法では、２以上のろ過膜を用いることもできる。例えば、ミニセル生産菌及びミニセルを含む培養物をミニセル生産菌及びミニセルを透過することができる細孔径（例えば、２〜１０μｍ）のろ過膜でろ過し、次いで、ろ過して得られたろ液を、ミニセルを透過し、かつミニセル生産菌を透過しない細孔径（例えば、０．５〜１μｍ）のろ過膜でろ過することにより、ろ液中にミニセルを分離回収することができる。
【００３８】
ろ液中に回収されたミニセルは、例えば、回転数、時間、温度などを適宜設定した遠心分離法によって沈殿物として回収することができる。沈殿回収されたミニセルは、例えば、後述する接合で用いられる最少培地で１回以上洗浄することもできる。該洗浄後は、再び、遠心分離法などによりミニセルは回収され得る。
【００３９】
回収されたミニセルにミニセル生産菌が含まれないことを確認する方法として、例えば、回収されたミニセルを最少培地内に懸濁し、得られたミニセル懸濁培地の一部をミニセル生産菌が増殖し得る寒天培地上に塗末して培養し、次いで、コロニーが存在しないことを確認する方法を挙げることができる。
【００４０】
（３）接合伝達形質転換体を得る工程
接合伝達形質転換体を得る工程（以下、「第三の工程」と呼ぶこともある）は、接合伝達の方向及び導入部が所定の関係にある供与体Ａ及び供与体Ｂのゲノムの一部を、上記ミニセルに所定の培地上で接合伝達させて、増殖能を有する接合伝達形質転換体を得る工程である。
【００４１】
本明細書にいう「接合伝達」とは、細胞間の接触を介して、一方の細胞（供与体）から他方の細胞（受容体）にゲノムＤＮＡ及び／又はプラスミドＤＮＡが伝達されることを意味する。典型的な接合伝達として、例えば、伝達性遺伝子であるＦ因子を有する供与体とＦ因子を有さない受容体（Ｆ-細胞）の間で行われる接合伝達が挙げらる。Ｆ因子を有する供与体としては、例えば、Ｆ因子をベクター内に有する供与体（Ｆ+細胞）、Ｆ因子をゲノム内に有する供与体（Ｈｆｒ細胞）、Ｆ因子がゲノム内に組み込まれた後に再びベクター内に組み込まれた供与体（Ｆ’細胞）などを挙げることができる。第三の工程に用いられる供与体Ａ及び供与体ＢはＨｆｒ細胞であることが好ましく、それぞれ独立して大腸菌、サルモネラ属細菌、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌、プロピオニバクテリウム属細菌などのＨｆｒ細菌がより好ましい。第三の工程に用いられるミニセルはＦ-細胞であるミニセル生産菌から生産されたものである。通常、Ｆ因子は細菌の属及び種によって異なることが知られている。しかし、Ｆ因子は、細菌の属及び種間で相互に組換え可能である。したがって、例えば、ミニセル生産菌を大腸菌Ｆ-細胞とする場合、供与体Ａ及び供与体Ｂをそれぞれ大腸菌のＦ因子が組み込まれたＨｆｒ細胞であるサルモネラ属細菌及びバチルス属細菌とすることができる。これまでにも、大腸菌のＦ因子をサルモネラ属細菌のゲノムＤＮＡに挿入して、サルモネラ属細菌のゲノムＤＮＡを大腸菌に挿入した例（Johnson EM, Easterling SB, Baron LS., (1970), J Bacteriol. 104:668-73）や該サルモネラ属細菌の代わりに植物病原菌のエルウィニア属細菌を用いた例（Kotoujansky A, Lemattre M, Boistard P., (1982), J Bacteriol. 150:122-31、Pugashetti BK, Chatterjee AK, Starr MP., (1978), Can J Microbiol. 24:448-54）やバチルス属細菌を用いた例（Aquino de Muro M, Priest FG., (2000), Res Microbiol. 151:547-55）が報告されている。
【００４２】
供与体Ａ及び供与体Ｂは、互いに接合伝達の方向及び導入部が所定の関係にある。本明細書にいう「接合伝達の方向」とは、供与体のゲノムが受容体に伝達される方向を意味し、これはＦ因子が供与体のゲノムのどちらの方向に組み込まれているかで決まると推測されている。接合伝達の方向は、ゲノム上で所定のゼロ点（ゼロ分ともいう）を基準に時計回りと反時計回りの２種に分けられる。例えば、大腸菌であれば、ゼロ点はthrA座位である。通常、Ｈｆｒ細胞のうち、ＨｆｒＨ型である細胞の遺伝子伝達方向が時計回りと規定される。
【００４３】
本明細書にいう「接合伝達の導入部」とは、供与体のゲノム上の伝達開始部位を意味し、これは供与体のゲノムにおけるＦ因子が組み込まれた部位により決定されると推測されている。接合伝達の導入部は、ゼロ点を基準として“分”や“ｋｂｐ（塩基対）”などで表される。例えば、大腸菌の場合、通常３７℃での接合において、供与体のゲノム全部が受容体に伝達されるまで約１００分かかると言われている。そこで、大腸菌においては、ゼロ点を基準として接合伝達中に受容体に進入する時間の相対値（０〜１００分）を遺伝子の座位として表すことができる。接合に関する一般的な事項について、「微生物学  入門編、Ｒ．Ｙ．スタニエら著、高橋甫ら訳、（１９８０）、培風館、ｐｐ．１７３−１８３」を参照することができる。
【００４４】
第三の工程に用いられる供与体Ａと供与体Ｂの接合伝達の方向は、互いに反対の関係にあり、例えば、供与体Ａの接合伝達の方向が時計回りである場合、供与体Ｂの接合伝達の方向は反時計回りである。さらに、供与体Ａの接合伝達の方向が時計回りである場合、供与体Ａの接合伝達の導入部はゼロ点から反時計回り方向に好ましくは１０分以内、より好ましくは５分以内の位置にある。すなわちこれは、供与体Ａが大腸菌である場合は、供与体Ａの接合伝達の導入部は、好ましくは９０〜１００分、より好ましくは９５〜１００分の間に位置することを意味する。供与体Ｂの接合伝達の方向が反時計回りである場合、接合伝達の導入部は０点から時計回り方向に好ましくは１０分以内、より好ましくは５分以内の位置にある。すなわちこれは、供与体Ｂが大腸菌である場合は、供与体Ｂの接合伝達の導入部は、好ましくは０〜１０分、より好ましくは０〜５分の間に位置することを意味する。具体例として、供与体Ａには接合伝達の方向が時計回りで接合伝達の導入部が９６．８分の位置にある大腸菌ＲＣ３０株を挙げることができ、供与体Ｂには接合伝達の方向が反時計回りで接合伝達の導入部が２．７分の位置にある大腸菌ＭＥ８１６２株を挙げることができる。なお、大腸菌のゲノムＤＮＡのサイズは約４．３Ｍｂｐであることから、大腸菌のゼロ点から時計回り方向に２．７分、５分、１０分、９５分、９６．８分の位置とは、大腸菌のゼロ点から時計回り方向に約１１６ｋｂｐ、約２１５ｋｂｐ、約４３０ｋｂｐ、約４０８５ｋｂｐ、約４１６２ｋｂｐの位置にそれぞれ対応する。
【００４５】
供与体Ａ及び供与体Ｂは、微生物寄託機関や自然界からのスクリーニングにより得ることもできるし、例えば、図１２における（ａ）〜（ｆ）に示した通り、（ａ）Ｆプラスミドを単離し、（ｂ）Ｆプラスミドに所望の外来遺伝子配列を通常の遺伝子操作で挿入し、（ｃ）組換えＦプラスミド上の外来遺伝子配列と一定の距離に抗生物質耐性遺伝子を組み込み、（ｄ）組換えＦプラスミド上の外来遺伝子配列の中央付近を制限酵素で切断して一本鎖組換えＦプラスミドを得て、（ｅ）Ｆ-株と一本鎖組換えＦプラスミドを一本鎖の状態で混合し、及び（ｆ）相同組換えにより一本鎖組換えＦプラスミドが組み込まれたＦ-株を上記抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質で選択することにより、遺伝子工学的に作製することもできる。
【００４６】
第三の工程では、供与体Ａ及び供与体Ｂとミニセルとを、最少培地、好ましくは液体の最少培地において接触させることにより、供与体Ａ及び供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部をミニセル内に接合伝達する。本明細書にいう「供与体Ａ（又は供与体Ｂ）のゲノムの少なくとも一部」とは、供与体Ａ（又は供与体Ｂ）のゼロ点付近の遺伝子（例えば、大腸菌であればthrA遺伝子）を含み、かつ供与体Ａ（又は供与体Ｂ）の全ゲノムの好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、なおさらに好ましくは少なくとも５０％のＤＮＡをいう。ただし、ミニセルに伝達される供与体Ａのゲノムと供与体Ｂのゲノムとの合計は、ミニセル生産菌のゲノムサイズと同程度であることが望ましい。例えば、供与体Ａ及び供与体Ｂがそれぞれ大腸菌ＲＣ３０株及び大腸菌ＭＥ８１６２株である場合、電気泳動の結果（図９を参照）から、大腸菌８０７７株由来のミニセルであるＲ１及びＲ２株のゲノムＤＮＡは、２４％がＲＣ３０に由来し、１０％がＭＥ８１６２株に由来し、共通部分（ＲＣ３０株及びＭＥ８１６２株間の由来の区別がつかない部分）が６５％であり；Ｒ３株のゲノムＤＮＡは、２２％がＲＣ３０に由来し、１３％がＭＥ８１６２株に由来し、６５％が共通部分であり；Ｒ４株は、２１％がＲＣ３０に由来し、１５％がＭＥ８１６２株に由来し、６４％が共通部分である。なお、後述する通り、ＭＥ８１６２株にはλファージＤＮＡが含まれているため、Ｒ１〜Ｒ４株のいずれの株のゲノムＤＮＡも、ＭＥ８１６２株よりＲＣ３０株に由来するゲノムＤＮＡが大半を占めていると考えられる。さらに、Ｒ１〜Ｒ４株の全ゲノムＤＮＡ量は、上記電気泳動結果から、ミニセル生産菌と同程度の約４．６Ｍｂｐである。
【００４７】
本明細書にいう「最少培地」とは、通常用いられている意味と同様のものであり、ミニセル生産菌が増殖できる最も簡単な組成をもつ合成培地をいう。最少培地は、通常、グルコース、塩化ナトリウム、無機リン酸、無機窒素及び金属を少なくとも含み、ミニセル生産菌の生育要求性に応じてビタミン類、アルカリ土類金属（第２族元素）化合物、アミノ酸などをさらに含むことができる。ミニセル生産菌が大腸菌の場合に用いられる最少培地として、例えば、Ｍ９最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊらの文献（１９８９）に記載の方法で調製することができ、通常、グルコース、塩化ナトリウム、Ｎａ2ＨＰＯ4．７Ｈ2Ｏ、ＫＨ2ＰＯ4、ＮＨ4Ｃｌ、ＭｇＳＯ4を含むことが好ましく、ＣａＣｌ2及びＴｈｉａｍｉｎｅをさらに含むことがより好ましい。Ｍ９最少培地の具体例として、実施例に記載の培地組成からなるＭ９最少培地を挙げることができる。最少培地の各成分の濃度及びｐＨは、ミニセル生産菌の生育条件に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
接合伝達における温度及び時間は、接合に適した温度及び時間であれば特に制限されないが、温度は上記したミニセル生産菌の培養温度に設定することが好ましく、接合時間は５時間以上が好ましい。
【００４９】
接合伝達により得た接合伝達形質転換体は、供与体Ａ及び供与体Ｂのゲノムの少なくとも一部を接合伝達により導入されたミニセル形質転換体である。接合伝達形質転換体の増殖能は、例えば、最小寒天平板培地に塗末して培養することにより、コロニーとして確認できる。
【００５０】
接合伝達形質転換体が、供与体Ａ、供与体Ｂ及びミニセル生産菌並びにこれらの突然変異体でないことを確認する方法としては、例えば、実施例に記載のある通りに、ゲノムＤＮＡを電気泳動で比較する方法や蛍光タンパク質の発現を確認する方法を挙げることができる。
【００５１】
第三の工程において、例えば、接合伝達されるべき供与体Ａ（又は供与体Ｂ）のゲノムサイズに制限を設けたければ、供与体Ａ（又は供与体Ｂ）の制限すべきサイズ付近にファージＤＮＡを溶原化させておくことができる。例えば、供与体Ａのゼロ点から２０分の位置にファージＤＮＡを溶原化させておき、次いで、供与体ＡのゲノムにおけるファージＤＮＡがミニセルに接合伝達されると、ファージが溶菌過程に入り、製造された接合伝達形質転換体が溶菌して死滅する可能性が高くなる。すなわち、ファージＤＮＡを有する接合伝達形質転換体は製造されず、供与体Ａのゼロ点から２０分未満のゲノムがミニセルに接合伝達された接合伝達形質転換体のみが得られる傾向にある。したがって、この場合、供与体Ｂのゲノムの多くが接合伝達された接合伝達形質転換体を選択的に製造することが可能となる。
【００５２】
ファージは、供与体の種類によって適宜選択でき、特に制限されない。例えば、供与体が大腸菌である場合は、ラムダ（λ）ファージが好ましく用いられる。その他のファージとしては、供与体の種類に応じて、例えば、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、並びにＭ１３ファージ及びｆｄファージなどの繊維状ファージなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
本発明の別の側面によれば、本発明のミニセルは、本発明の接合伝達形質転換体を製造する方法に用いられるミニセルであって、核酸切断処理されたミニセル生産菌に由来する、ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクターを有するミニセルである。よって、本発明のミニセルは、ＲＮＡポリメラーゼが接着したベクター、並びにミニセル生産菌の断片化した一本鎖のゲノムＤＮＡ及びミニセル生産菌からのＤＮＡ修復系の酵素を少なくとも含む。
【００５４】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
１．材料及び方法
（１）プラスミド、増殖条件、及び化合物
大腸菌ＭＥ８０７７株（ｍｉｎＡ、ｍｉｎＢ、ｔｈｒ−１、ｌｅｕＢ６、ａｚｉ、ｌａｃＹ１、ｔｓｘ、ａｒａ−１３、ｇａｌ−６、ｍａｌＡ１、ｔｈｉ−１、ｘｙｌ−７、ｒｐｓＬ、ｍｔｌ−２、ｔｏｎＡ２、ｓｕｐＥ４４）は、ミニセル製造細胞として使用された（J. W. Szostakら, Nature, 409, 387-390 (2001)）。大腸菌ＭＥ８１６７株（ｌａｃ、ｇａｌ、ｘｙｌ、ｍｔｌ、ｍａｌＡ、ｔｈｉ、（ｌａｍｂｄａ）+）及び大腸菌ＲＣ３０株（ＣＧＳＣ＃６５９９）（ｌａｃＺ５８（ｄｅｌ）（Ｍ１５）、ｌａｃＩ２２、ｅ１４−、ｒｅｌＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１）はゲノム供与体として使用され、ＨｆｒＲ５（ｌｅｕＡ−＞ｔｏｎＡ）及びＨｆｒＨ（ｖａｌＳ＜−ａｔｔＰ４）を有していた（D. S. Tawfikら, Nature Biotechnol., 16, 652-656 (1998)、T. Oberholzerら, Chem. Biol., 2, 677-682 (1995)）。指標プラスミドであるｐＴＳＭｂ１は、ｌａｃ−ｃＩトグルスイッチ、ｐ１５オリジン及びカナマイシン耐性遺伝子を有していた（T. Oberholzerら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 238-241 (1999)）。他に記載がない限り、大腸菌株は３７℃でＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）において好気的に増殖された。Ｍ９最少培地は、大腸菌の遺伝学的標識の確認だけでなく、ミニセル及びＨｆｒ株の接合に使用された。カナマイシン及び糖類は和光ケミカル株式会社から購入された。マイトマイシンＣは協和醗酵工業株式会社から購入された。
【００５６】
（２）ミニセルの単離及び精製
大腸菌ＭＥ８０７７はｐＴＳＭｂ１で形質転換され、１２時間、３７℃で１００μｇ／ｍｌ  カナマイシン及び２０ｎｇ／ｍｌ  マイトマイシンＣを含む、４０ｍｌのＬＢ液体培地中でインキュベートされた。培養物は濾過膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＳＶ、ミリポア；細孔径５．０μｍ）でろ過された。濾液はまた、正常細胞を除去するために濾過膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＡＡ、ミリポア；細孔径０．８μｍ）で２度ろ過された。ミニセルは、濾液の遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、４℃）によって回収され、Ｍ９最少培地で洗浄され、２０μｌのＭ９最少培地（１２．８ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4．７Ｈ2Ｏ、３ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ  ＮａＣｌ、１ｇ  ＮＨ4Ｃｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．４％  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．００５％  Ｔｈｉａｍｉｎｅ、Ｈ2Ｏ  １Ｌ、ｐＨ７．０）中で懸濁された。この１０μｌのミニセル・フラクションをＬＢ寒天平板培地上に塗末して、コロニーの存在又は不存在によって正常細胞のコンタミネーションをチェックした。
【００５７】
（３）接合条件
ＭＥ８１６２株とＲＣ３０株は、３７℃でＬＢ液体培地中で好気的にインキュベートされた。培養物の６６０ｎｍ（ＯＤ660）の光学濃度が０．１に達した時、培養細胞は遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１分、４℃）によって回収され、同容量のＭ９最少培地で洗浄され、次いで、同容量のＭ９最少培地中に懸濁された。５μｌのミニセル・フラクション及び１μｌの各細胞懸濁液が、３７℃で５時間混合され、及びインキュベートされた。その後、混合物は１００μｌのＭ９最少培地に加えられ、及び３−５分間ボルテックス・ミキサーで攪拌された。その混合物はＭ９寒天平板最少培地上に塗末して、３７℃で培養された。
【００５８】
（４）１６Ｓ  ｒＤＮＡ及び緑蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅はＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ社）を使用して、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００（アプライドバイオシステム社）で実施された。プライマー２７Ｆ（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）及び１４９２Ｒ（GGTTACCTTGTTACGACTT）は１６Ｓ  ｒＤＮＡの増幅に使用された。プライマーｇｆｐ−ｆ（ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT）及びｇｆｐ−ｒ（TTATTTGTATAGTTCATCCATGC）はＧＦＰ遺伝子の増幅に使用された。
【００５９】
（５）ＧＦＰ発現の分析
細胞は遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１分、４℃）により回収され、ＰＢＳバッファー（７５ｍＭ  リン酸ナトリウム及び６７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄され、ＧＦＰを測定するためにＰＢＳバッファー中で懸濁された。ＧＦＰ発現データすべては、ベクトン・ディキンソンＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロー血球計を使用することにより回収された。遺伝子発現の各蛍光測定は、３０，０００個の細胞から得られた。
【００６０】
（６）大腸菌ゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）
大腸菌ゲノムＤＮＡはＷａｌｄｅらの方法（P. Walde, et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 7541-7547 (1994)）で準備された。大腸菌株は３７℃で１２時間、１ｍｌのＬＢ培地で増殖された。細胞は遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１分、４℃）によって回収され、同容量のＰＩＶバッファー（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス＝ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６））で洗浄され、半容量のＰＩＶバッファー中で懸濁された。細胞懸濁液は、予め５０℃で熱せられた、同容量の１．６％  パルスフィールド公認（ＰＦＣ）のアガロース（バイオラド社）溶液と混合され、及び直ぐにプラグ鋳型（バイオラド社）に注がれた。プラグ鋳型はアガロースが硬化することを可能にするために、４℃で維持された。アガロースゲル・ブロックはプラグ鋳型から取り除かれ、１ｍｌのＥＣバッファー（６ｍＭ  トリス＝ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ポリオキシエチレン（２０）セチル・エーテル（Ｂｒｉｊ−５８）、０．２％  デオキシコール酸塩、０．５％  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）に浸された。その後、ＥＣ溶液におけるアガロース・ブロックは、室温で１５分間、ゆっくりと振とうされた。アガロース・ブロックは、１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム及び２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを含む、１ｍｌのＥＣバッファーに移され、３７℃、一晩優しく振とうされた。その後、ブロックされたアガロースは、１ｍｌのＥＳバッファー（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ９．０）、０．５％  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）へ移されて、室温で１５分間、優しく振とうされた。アガロース・ブロックは、５０μｇ／ｍｌ  プロテナーゼＫ（和光）を含む１．５ｍｌのＥＳバッファーへ移されて、５０℃、３６時間インキュベートされた。アガロースゲル・ブロックは、１．５ｍｌのＴＥバッファーで２度洗浄され、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む１．５ｍｌのＴＥバッファーへ移し、室温で１時間インキュベートされた。アガロースゲル・ブロックは、ＴＥバッファーで２度洗浄され、ＴＥバッファー中でゲノムＤＮＡゲル・ブロックとして４℃で維持された。アガロースゲル・ブロックは、ＡｓｃＩ又はＰｍｅＩの制限酵素用の適切なバッファーで洗浄された。その後、アガロースゲル・ブロック中のゲノムＤＮＡは３７°Ｃで２４時間、３０ＵのＡｓｃＩ又はＰｍｅＩで切断された。アガロースゲル・ブロックは、酵素反応後にＴＥバッファーで２度洗浄された。アガロースゲル・ブロックは、ＰＦＧＥのために、１％  ＰＦＣアガロースゲルの細胞にロードされた。ＰＦＧＥは、指示に従って、１４℃において０．５Ｘ  ＴＢＥバッファー中でＣＨＥＦ  ＭＡＰＰＥＲシステム（バイオラド社）を使用して実行された。２００ｋｂ〜１０ｋｂまでの断片の分離のために、パラメータが０．４７−１７．３３秒のパルス時間、−１．３５７のランピングファクター、６Ｖｃｍ−１の電圧、及び２０．３時間のランタイムに調整された。ラムダラダー（７２７．５−４８．５ｋｂ）のＤＮＡサイズマーカー及び低範囲（１９４−２．０３ｋｂ）のＰＦＧマーカーは、ニューイングランドバイオ社（ＭＡ、米国）から購入された。
【００６１】
２．結果
ミニセルは、細菌細胞の一部分であって、細胞分裂に関する遺伝子の突然変異を持ついくつかのバクテリアによって生産されるものである（H. I. Adlerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 57:321-326 (1967)、J. N. Reeve, et al., J Bacteriol. 114:860-73. (1973)、R. J. Sheehyら, J Bacteriol. 114:439-42. (1973)）。ミニセルは、細胞膜でエネルギーを得るための電子伝達系とタンパク質合成のためのシステムを有し、ゲノムＤＮＡに関連した生化学反応を除いて、生きている細胞と同じ生命活動を示す（H. F. Dvorakら, J Bacteriol. 104:543-8. (1970)、K. J. Roozenら, J Bacteriol. 107:21-33. (1971)、N. H. Mendelsonら, J Bacteriol. 117:1312-9. (1974)）。大腸菌にはＦ-とＨｆｒ株間の接合システムによりゲノムを挿入することが出来ることから、大腸菌のミニセルを使った系を構築した（図１）（E. A. Birgeら, Bacterial and bacteriophage genetics. 4th Ed. Camper 11.(1981)、J. T. Ouら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72:3721-5 (1975)）。Ｈｆｒ株は接合中に、ゲノムに組み込まれたＦプラスミドのｏｒｉＴから、ゲノムＤＮＡのループをＦ-株に挿入する。
【００６２】
ｍｉｎＡ変異及びｍｉｎＢ変異を持つ大腸菌のＭＥ８０７７はミニセルを生産する。ミニセルの大きさは、通常の細胞のおよそ４分の１である。大腸菌ＭＥ８０７７はプラスミドｐＴＳＭｂ１によって形質転換され、ＲＮＡポリメラーゼ濃度を高度に保つことができる（N. Shepherdら, J Bacteriol. 183:2527-34 (2001)）。さらに、ｐＴＳＭｂ１は、接合によりゲノム挿入の後、成育された細菌がミニセル由来か否かを識別する上で役立つ（H. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:8414-8419 (2004)）。当初、遠心分離することによって、培養液からミニセルの精製を試みた（C. M. Koppelman et al., J Bacteriol. 183:6144-7. (2001)）。しかし、時間がかかる上、ミニセルを通常の細胞から完全分離することができなかった。そこで、適切なメンブレンフィルターでろ過を繰り返すことにより、３０分以内にミニセルを精製することが可能となった。
【００６３】
ＭＥ８０７７は低濃度のマイトマイシンＣを加えて培養した。マイトマイシンＣは大腸菌にＳＯＳカスケードを活性化する抗生物質の１つである。Ｈｆｒからミニセルに挿入されるゲノムが直線状であるため、環状ゲノムを完成させるために修復する必要があると考えた。ＳＯＳカスケードにおけるすべての酵素はゲノムを再構築するためにＤＮＡの修復を促進する。また、マイトマイシンＣの作用によって生産される短い一本鎖ＤＮＡは、ミニセル内でのＤＮＡ合成に際してプライマーとして働いた。最終的に、ＭＥ８０７７のミニセルは、ｐＴＳＭｂ１、多少のＳＯＳカスケードタンパク質及び短い一本鎖ＤＮＡを保持している状態に調製された。なお、ｐＴＳＭｂ１に由来するｃＩ８５７タンパク質は、ＲｅｃＡタンパク質によって分解されない。ＭＥ８０７７培養液４０ｍｌを濾過した後、ミニセルを遠心分離により集め、２０μｌのＭ９最少培地に懸濁した。ミニセル懸濁液１０μｌをＬＢ寒天プレートに塗布したとき、コロニーは形成されなかった（非掲載データ）。
【００６４】
ゲノム提供株としてＨｆｒ株ＭＥ８１６２とＲＣ３０（それぞれ２．７１分（ＨｆｒＲ５）から反時計回り、９６．８分から時計回りに（ＨｆｒＨ）ゲノムを挿入する）を適用した（図２）。接合は、２つのＨｆｒ株からゲノムすべてを挿入するために３７°Ｃで５ｈ、炭素源として０．４％のグルコースを含むＭ９最少培地で実行された。ゲノム上の１６ＳｒＤＮＡとプラスミド上の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のＰＣＲ増幅によって、大腸菌ゲノムとｐＴＳＭｂ１の存在を確認した（図３）。ミニセル生産株ＭＥ８０７７はゲノムＤＮＡとｐＴＳＭｂ１を保持しています。そして、１６ＳのｒＤＮＡとＧＦＰ遺伝子の両方がＰＣＲによって確認できました。精製されたミニセル懸濁液はｐＴＳＭｂ１だけが存在します。そして、ＧＦＰ遺伝子だけが確認できました。ＰＣＲの結果も、ミニセルが濾過によって完全に精製され、ｐＴＳＭｂ１だけを持つミニセルであることを示した。１６ｓｒＤＮＡとｇｆｐ遺伝子は、ＭＥ８１２６とＲＣ３０との接合後、濾過精製されたミニセル懸濁液で確認できた。これらの結果から、Ｆ-株とＨｆｒ株の接合を利用したミニセルへのゲノム挿入が成功していることがわかった。
【００６５】
接合体は、４−５日の間３７°Ｃで０．４％のグルコースと１００ｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭ９最少培地寒天プレート（Ｍ９ＧＫ）の上で培養した。ＭＥ８０７７株はアミノ酸要求性であり、並びにＭＥ８１６２及びＲＣ３０株はカナマイシン感受性であることから、これらの菌株はＭ９ＧＫの上で成長することができない。１０回の実験から４つのコロニーを得て、これら４株をＲ１からＲ４と名付けた。ミニセルとＭＥ８１６２またはＲＣ３０どちらか一方と接合したとき、Ｍ９ＧＫ寒天プレート上で生育するコロニーはなかった。図４は、ＭＥ８０７７、精製されたミニセル、Ｒ株の最初の培養菌とＲ株の安定した培養菌の顕微鏡観察結果を示す。ＭＥ８０７７の生産するミニセルは、およそ直径１μｍの球状の形態をしていた。最初の段階で、Ｒ１〜４株の細胞形は、短桿菌（２−３×２−４μｍ）だった。しかし、Ｒ株は非常に不安定で、時々長い形態を示して、非常にゆっくり成長した（データなし）。Ｒ株の形と特性を安定させるために２、３回培養を行い、次いで、Ｒ株がＭＥ８０７７のミニセルを起源としているかどうか、ＭＥ８１６２やＲＣ３０のゲノムを持っているかどうかについて調査した。
【００６６】
Ｒ株の由来には、ミニセルからの大腸菌細胞の合成を除いて、３つの可能性が考えられる。一つ目は、トレオニンとロイシンの非要求性となったＭＥ８０７７の自然突然変異株又はカナマイシン耐性を得たＭＥ８１６２（若しくはＲＣ３０）株である。二つ目は、ミニセル懸濁液に残った少数のＦ−細胞とＨｆｒ株との間の単純な接合組み換え体である。三つ目は、接合の間に起きたｐＴＳＭｂ１によるＭＥ８１６２又はＲＣ３０株の形質転換体である。Ｒ株の由来を確認するために、生化学的特性とゲノムについて調べた。
【００６７】
ＭＥ８０７７に形質転換したプラスミドｐＴＳＭｂ１には、カナマイシン耐性遺伝子、ｌａｃ−ｃＩ遺伝子トグルスイッチとｐ１５  ｏｒｉがある。遺伝子トグルスイッチは、ゲノムＤＮＡ上のｌａｃＩとｃＩ遺伝子により、ＧＦＰ遺伝子の発現は二つの安定状態を示す。ＭＥ８０７７のゲノムにはｌａｃＩ遺伝子があり、ｃＩ遺伝子が無いため、ＧＦＰを発現できない（オフ状態）。それに対して、ＭＥ８１６２とＲＣ３０のゲノムには、ｃＩ遺伝子があり、ｌａｃＩ遺伝子が無いため、ＧＦＰが発現する（オン状態；図５及び６）。Ｒ１からＲ４のすべての株は、ＧＦＰ表現（オン状態）を示し、ｐＴＳＭｂ１プラスミド（図１１）を保持していた。さらに、Ｒ株にはミニセル生産能がなかった。これらの結果は、Ｒ株がアミノ酸非要求性となったＭＥ８０７７の自然突然変異株ではないことを示唆した。Ｒ株のＧＦＰ発現量は、ＭＥ８１６２やＲＣ３０よりわずかに低かった。
【００６８】
ＭＥ８０７７株にある遺伝子マーカー（ガラクトース、キシロース、マンニトール、マルトースとアラビノース資化能、アミノ酸要求性とストレプトマイシン耐性）について、Ｒ株を調べた（図７）。Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、ＲＣ３０と同じ遺伝マーカーを示した。Ｒ１は、マルトース資化能以外、ＭＥ８１６２と同じ遺伝マーカーを示した。接合実験に用いるミニセル懸濁液において、混入したＭＥ８０７７の通常細胞の数を確認することは、非常に難しい。しかし、ミニセル懸濁液を接合せずにＬＢ寒天プレートの上に塗布した場合、又はＭＥ８１６７若しくはＲＣ３０株のどちらか片方で接合実験を行った後で塗布した場合、成育するコロニーは認められなかった。したがって、通常細胞が混入したとしても２、３個以下であると考えられる。そこで、ＭＥ８０７７株と２つのＨｆｒ株を用いて、同じ条件下で接合実験を行い、Ｒ株と同じ遺伝マーカーの接合体の取得を試みた。その結果、Ｍ９ＧＫ寒天培地上に成育した２４３の接合組み換え体の中で、ＧＦＰとミニセル生産性を含め、Ｒ株と同じ遺伝子マーカーを示す組み換え体はなかった（表１）。
【表１】
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【００６９】
さらに、遺伝子マーカーが変化した２つの組み換え体でも８つの遺伝マーカーのうち最高で５つしか変わらなかった。既報と同様に、単純な接合実験では、Ｆ-とＨｆｒの間における複数の遺伝マーカーの移行は２％未満であった（R.G. Lioydら, Genetics. 139: 1123-1148 (1995)）。したがって、Ｒ株は生化学的性質からＭＥ８０７７及びＭＥ８１６２若しくはＲＣ３０間における接合組み換え体から得ることができなかった。
【００７０】
３７℃における、Ｒ１〜４株の成長曲線をＭＥ８０７７、ＭＥ８１６２及びＲＣ３０と比較した（図８）。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の倍加時間は、それぞれ０．５９、０．５７、０．５７及び０．４５ｈであった。対数増殖期のＲ株の倍加時間は、大腸菌の通常範囲内であった。しかし、定常期の６６０ｎｍにおける濁度は１．５を示した。定常期の濁度はＭＥ８１６２、ＲＣ３０及びＭＥ８０７７と比べて約１／３であった。Ｒ株は、材料となった菌株とは異なる成長特性を示した。
【００７１】
Ｒ株、ＭＥ８０７７、ＭＥ８１６２とＲＣ３０のゲノムについて調べた。各株のゲノムはＰｍｅＩ又はＡｓｃＩの制限酵素を用いて分解後、パルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）によって分離した（図９）。ＰｍｅＩとＡｓｃＩによるＭＥ８０７７、ＭＥ８１６２とＲＣ３０のゲノム分解パターンは、各々全く異なっていた。例えば、ＰｍｅＩで分解した場合、１９４ｋｂｐ以上の３つのバンドが、ＭＥ８０７７株にはなかったが、ＭＥ８１６２とＲＣ３０株には２つのバンド（太いバンドと細いバンド）しかなかった。ＰｍｅＩに比べてＡｓｃＩによる分解パターンでは、ＭＥ８０７７、ＭＥ８１６２及びＲＣ３０の間の違いが明らかであった。ＭＥ８０７７は、特に９．４２ｋｂｐ及び２００ｋｂｐにおいて他の２つのＨｆｒ株と大きく異なっていた。ＰｍｅＩ又はＡｓｃＩによるＲ株のゲノムの分解パターンは、ＭＥ８０７７ではなくＭＥ８１６２とＲＣ３０が混成したパターンを示した。Ｒ株間においても、ゲノムの消化パターンにいくつかの違いがあった。ゲノムのＰｍｅＩ分解では、すべてのＲ株の２２０から１２５ｋｂｐまでがＲＣ３０株と同じパターンを示した。しかし、Ｒ３とＲ４株は９７から７０ｋｂｐ、１２５から８０ｋｂｐまでにおいて、ＭＥ８１６２株のＰｍｅＩ分解と同じパターンを示した。一方、Ｒ１とＲ２株は、上記領域においてＲＣ３０株と同じ分解パターンを示した。すべてのＲ株のゲノムは、ＡｓｃＩによる分解において、ほとんど同じ分解パターンを示した。最も大きい１９０ｋｂｐと１６５ｋｂｐの二本のバンドは、ＲＣ３０株と同じだった。１０５ｋｂｐから９３ｋｂｐまでのＲ株の分解パターンは、ＭＥ８１６２株と同様だったが、９３ｋｂｐから７２ｋｂｐまで、そして２３ｋｂｐから７．７ｋｂｐまではＲＣ３０と同様だった。４つのＲ株のゲノムは、ＰＦＧＥの結果からＭＥ８１６２よりＲＣ３０に近いことがわかった。ＭＥ８１６２株は、ゲノムにラムダファージの溶原因子を持っている。ミニセルには活性化ＲｅｃＡが存在するため、溶源化ファージが溶菌サイクルへ変化する。その結果、ＭＥ８１６２のゲノムを多く含むミニセルはファージにより溶菌する可能性が高いと考えられる。以上の結果から、Ｒ株のゲノムがＭＥ８１６２及びＲＣ３０株の両方のゲノムが混在して構成されていることがわかった。Ｒ株は、ＭＥ８１６２又はＲＣ３０株の自然突然変異株、若しくはｐＴＳＭｂ１の組み換え体ではないことがわかった。Ｒ株はＭＥ８０７７から分離されたミニセルを起源として、ＭＥ８１６２とＲＣ３０の新しい複合ゲノムを持っていた。
【００７２】
（比較例１）
他のミニセル生産株（χ１４１１（ＣＧＳＣ６３９７）株）の利用を実施例と同じ方法により試みた。しかし、χ１４１１株のミニセル並びにＭＥ８１６２及びＲＣ３０との接合によって、合成細菌のコロニーを得ることができなかった。χ１４１１のミニセルは、顕微鏡観察の結果、ＭＥ８０７７のミニセルよりわずかに小さいことがわかった。ミニセルの大きさは、大腸菌の再生のための重要な要因の１つであるかもしれない。
【００７３】
（比較例２）
ゲノム供与体として他の７種の大腸菌Ｈｆｒ株（ＣＧＳＣ３１２、ＣＧＳＣ５７７８、ＣＧＳＣ２４３７、ＣＧＳＣ５８１６、ＣＧＳＣ５１３２、ＣＧＳＣ５３５０、ＣＧＳＣ４８９５）について検討した。接合実験を行ったＨｆｒ株の組み合わせは、（１）ＣＧＳＣ３１２＋ＣＧＳＣ５７７８、（２）ＣＧＳＣ２４３７＋ＣＧＳＣ５８１６、（３）ＣＧＳＣ３１２＋ＣＧＳＣ５７７８＋ＣＧＳＣ２４３７＋ＣＧＳＣ５８１６、（４）ＣＧＳＣ２４３７＋ＣＧＳＣ５１３２＋ＣＧＳＣ５３５０＋ＣＧＳＣ４８９５、（５）ＣＧＳＣ４８９５＋ＣＧＳＣ５１３２、（６）ＲＣ３０＋ＣＧＳＣ５３５０である。大腸菌のゲノム地図における上記７株の遺伝子挿入位置を図１０とした。図１０において、円の外周の数値は遺伝子の位置（分）を、内周の数値は菌株番号をそれぞれ示す。菌株番号が数値だけの菌株はCGSC 番号を示している。ゲノム遺伝子地図に対して時計回りを黒矢印で、反時計回りを赤矢印で示した。
【００７４】
図１０を見ればわかる通り、７株のＨｆｒ株はゲノムを挿入する地点も方向もＭＥ８１６２とＲＣ３０とは異なっていた。しかし、ミニセルからの大腸菌の再生は、ＭＥ８１６２とＲＣ３０以外のＨｆｒ株では成功しなかった。さらに、ＭＥ８１６２とＲＣ３０を含む３つ以上のＨｆｒ株と接合した場合もまた、再生株を得ることができなかった。接合時、ＨｆｒからＦ-株へのゲノム挿入の頻度は、各々のＨｆｒ株の特性に依存する。さらにまた、本実験では接合時間が５時間と長いためにＨｆｒ株が増殖し、致死接合の問題が生じる（R. A. Skurrayら, J Bacteriol. 113:58-70. (1973).）。接合の状態は、ミニセルから大腸菌細胞への再生に影響を及ぼすのかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ミニセルから接合伝達形質転換体を製造する方法の概略図であり、Ｆ-株及びＨｆｒ株の接合を介したＭＥ８１６７株及びＲＣ３０株のゲノム伝達による精製された大腸菌ＭＥ８０７７株のミニセルからの接合伝達形質転換体の製造方法を示す。
【図２】図２は、接合中のＭＥ８１６７株及びＲＣ３０株のゲノム伝達の方向及びＰＯポイント（導入部）を示す。
【図３】図３は、Ｈｆｒ株との接合後の、ｐＴＳＭｂ１、精製ミニセル、及びミニセルを持つＭＥ８１６２株のｇｆｐ遺伝子及び１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅結果を示す。
【図４】図４は、ＭＥ８０７７株、ミニセル及び接合伝達形質転換体の細胞の形態を示す。実施例に記載の通りに、ミニセル（指示矢）はＭＥ８０７７株から精製され、すべての株は３７℃でＬＢ培地でインキュベートされた。バーは５μｍを示す。
【図５】図５は、指標プラスミドであるｐＴＳＭｂ１を示す。ＭＥ８１６２株とＲＣ３０株のゲノムのｃＩ遺伝子は、ｐＴＳＭｂ１のｌａｃＩの発現を抑制し、及びｇｆｐの発現をもたらし、ＭＥ８０７７株のゲノムのｌａｃＩ遺伝子は、ｃＩ及びｇｆｐの発現を抑制する。
【図６】図６は、接合伝達形質転換体及び親株のｇｆｐの発現結果を示す。
【図７】図７は、接合伝達形質転換体と親株の遺伝子マーカーを示す。すべての株は、抗生物質を含むＬＢ培地又は炭素源として各糖類を含むＭ９最少培地上でストリークされた。
【図８】図８は、接合伝達形質転換体及び親株の生育を示す。すべての株は、３７℃で好気的にインキュベートされた。生育は６６０ｎｍの光学濃度で測定された。
【図９】図９は、大腸菌ゲノムのＰｍｅＩ及びＡｓｃＩのＰＦＧＥ結果を示す。Ｍ１及びＭ２はそれぞれ低レンジ範囲のＰＦＧマーカー及びラムダラダーマーカーである。
【図１０】図１０は、大腸菌の染色体地図における各Ｈｆｒ  株の遺伝子挿入位置を示す。図中、円の外周の数値は遺伝子の位置（分）を、内周の数値は菌株番号を、菌株番号が数値だけの菌株はＣＧＳＣ  番号をそれぞれ示す。ゲノム遺伝子地図に対して時計回りを黒矢印で、反時計回りを赤矢印で示した。
【図１１】図１１は、ｐＴＳＭｂ１及び接合伝達形質転換体のプラスミドの電気泳動結果を示す。プラスミドはミニプレップキット（キアゲン、ＭＤ）を用いてオーバーナイトで増殖した培養物  ６ｍｌから単離された。プラスミドはＮｈｅＩ又はＡｇｅＩで切断され、及び電気泳動で分離された。
【図１２】図１２は、供与体Ａ及び供与体Ｂの遺伝子工学手法を利用した作製方法の概要を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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