(57)【要約】【課題】簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続培養法による化学品の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明は、培養装置と培養装置外部の分離膜を有する膜分離装置を接続し、両装置間に培養液を循環させながら、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、かつ、原料を前記の培養液に追加する連続培養による化学品の製造方法において、回収率を１０．０％以下になるように循環液量および濾過フラックスを制御し運転することで、安定に長期間の連続培養運連を実施することができ、発酵による化学品の生産効率を著しく向上させることが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養装置と培養装置外部の分離膜を有する膜分離装置を接続し、両装置間に培養液を循環させながら、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、かつ、培養原料を前記の培養液に追加する連続培養による化学品の製造方法であって、循環液量あたりの濾過液量の回収率を１０．０％以下になるように調節することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法。
【請求項２】
前記回収率を調節する方法が、循環液量、濾過フラックスおよび濾過液量から選択されるいずれか１つ以上を制御することを特徴とする請求項１記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項３】
連続培養の希釈率が１．８から９．０（１／ｄａｙ）であることを特徴とする請求項１または２記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項４】
前記培養液を分離膜で濾過する際の濾過フラックスが０．７００ｍ／ｄａｙ以下であることを特徴とする請求項１から３に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項５】
培養液体積あたりの前記分離膜の面積が１．５ｍ２／ｍ３以上９０ｍ２／ｍ３以下であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項６】
前記分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜であることを特徴とする請求項１から５に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項７】
前記多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であることを特徴とする請求項６に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項８】
前記多孔性膜の膜表面粗さが０．１μｍ以下であることを特徴とする請求項６から７のいずれかに記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項９】
膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いることを特徴とする請求項１から８に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項１０】
前記膜分離装置が、中空糸膜の分離膜からなる膜分離装置であることを特徴とする請求項１から９に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項１１】
前記化学品が、乳酸であることを特徴とする請求項１から１０に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続培養による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法のひとつである発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続培養法に分類することができる。
【０００３】
回分および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
連続培養法は、培養装置内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの発酵について連続培養法が開示されている（非特許文献１）。しかし、これらの例では、培養液へ培養原料の連続的な供給を行うとともに、微生物や培養細胞を含んだ培養液を抜き出すために、培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
連続培養法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることで、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されており、例えば、簡便な操作条件で長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続培養技術が開示されている（特許文献１）。しかしながら連続培養時間が３００時間程度であり、さらなる連続培養時間の長期化が当然ながら望まれていた。
【０００６】
また、膜を用いた水処理の技術領域では、濾過抵抗が大きくないため、逆洗水などを利用することで回収率（ただしこの場合の回収率の定義は、濾過液量／膜供給液量である）９０％以上の処理できるような工夫がされている（特許文献２）。しかしながら、特許文献２のような膜利用技術として確立されている水処理運転技術を連続培養法において適用すると膜が簡単に閉塞すると考えられ、連続培養時間の長期化のための解決手段が望まれていた。
【特許文献１】特開２００７−２５２３６７号公報
【特許文献２】特許３９８６３７０号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al. （ヒラオ・トシヒコ  ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド  マイクロバイアル  アンド  マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の目的は、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続培養法による化学品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、濾過液の回収率を制御することで長期間にわたり、膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった長期連続培養を安定的に維持できることを可能とし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、培養装置と培養装置外部の分離膜を有する膜分離装置を接続し、両装置間に培養液を循環させながら、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、かつ、培養原料を前記の培養液に追加する連続培養による化学品の製造方法であって、循環液量あたりの濾過液量の回収率を１０．０％以下になるように調節することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法である。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、前記循環液量あたりの濾過液量の回収率を調節する方法が、循環液量濾過フラックスおよび濾過液量から選択される１つ以上を制御することである。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、連続培養の希釈率が１．８から９．０（１／ｄａｙ）である。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、前記培養液を分離膜で濾過する際の濾過フラックスが０．７００ｍ／ｄａｙ以下である。
【００１３】
本発明の好ましい態様によれば、培養液体積あたりの前記分離膜の面積が１．５ｍ２／ｍ３以上９０ｍ２／ｍ３以下である。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、前記分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜である。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、前記多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いている。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、前記膜分離装置が、中空糸膜の分離膜からなる膜分離装置である。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、前記化学品が、乳酸である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡便な操作条件で、従来以上の長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続培養が可能となり、連続培養によって化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、培養装置と培養装置外部の分離膜を有する膜分離装置を接続し、両装置間に培養液を循環させながら、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、かつ、培養原料を前記の培養液に追加する連続培養による化学品の製造方法であって、循環液量あたりの濾過液量の回収率を１０．０％以下になるように循環液量および濾過フラックスを制御し運転することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法である。
【００２１】
本発明において培養装置とは、培養液の撹拌、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、液量などを設定することができ、培養にとって好適な条件に維持することができる装置である。
【００２２】
また本発明において膜分離装置とは、分離膜を濾過に適するように設置した装置のことである。例えば、膜分離装置下部より気体を供給することで膜面を洗浄することができるものが好ましい。それら供給した気体を抜き取るためのラインがあることが好ましい。また、膜を逆洗浄できることが好ましい。また膜分離装置は複数接続する場合、直列に接続してもよいし、並列に接続してもよい。
【００２３】
培養装置と培養装置外部の分離膜を有する膜分離装置の間を、培養液を循環させる手段としては例えばポンプによる手段が挙げられる。ポンプには例えば渦巻きポンプ、チューブポンプ、ダイヤフラムポンプなど様々な種類があるが、本発明においてポンプの種類としては、ポンプの出力設定により循環液量が算出できるものが好ましい。好ましくはダイヤフラムポンプが挙げられる。
【００２４】
本発明においての循環液量あたりの濾過液量の回収率（以下、回収率と称することがある）について説明する。循環液量あたりの濾過液量の回収率とは単位時間あたりに循環された培養液量（循環液量）に対して、一日あたりに濾過された培養液量（濾過液量）の割合であり、下記の（式１）により算出する。ただし、膜分離装置が複数接続されている場合は、それぞれの膜分離装置での濾過液量および循環液量から算出する。また濾過液量は、膜分離装置に使用している分離膜面積と、運転制御可能である濾過フラックスから（式１）は下記の（式２）に変換できる。
【００２５】
循環液量あたりの濾過液量の回収率（％）
＝濾過液量（m3／ｄａｙ）／循環液量（m3／ｄａｙ）×１００・・・（式１）
＝分離膜面積（ｍ２）×濾過フラックス（ｍ／ｄａｙ）／循環液量（m3／ｄａｙ）×１００・・・（式２）。
【００２６】
本発明において、循環液量あたりの濾過液量の回収率を１０．０％以下になるように制御し運転するとは、具体的には循環ラインおよび濾過ラインに流量計を設けることでその時々の循環液量および濾過液量をモニタリングすることで、（式１）から回収率を算出し回収率を１０．０％以下になるように循環ポンプもしくは濾過ポンプの出力を制御しながら運転することである。例えば、循環液量を一定に保ちながら、濾過フラックスのみを制御する運転も可能である。その逆の濾過フラックスを一定に保ちながら、循環液量を制御する運転も可能である。また、回収率は１０．０％以下、好ましくは５．０％以下になるように制御することが重要であり、そうすることで分離膜の詰まりがなくなり、長期連続培養を安定的に維持できることが可能となる。回収率の下限としては液を循環するためにはエネルギーが必要であるため可能な限り回収率を高めたいが、少なくとも０．０１％以上が好ましい。
【００２７】
本発明においては、循環液量、濾過フラックスおよび濾過液量から選択される１つ以上を制御することで回収率を制御調整することが好ましい。循環液量を制御するためには、前記のような循環手段の出力を調節することが好ましい。また、濾過フラックスもしくは濾過液量を制御する手段としては例えばポンプ、水頭差圧、液体や気体等による吸引、あるいは膜分離装置内を加圧するなどの手段が挙げられ、好ましくはポンプを使用する。ポンプには例えば渦巻きポンプ、チューブポンプ、ダイヤフラムポンプなど様々な種類があるが、本発明においてポンプの種類としては、ポンプの出力設定により濾過液量が算出つまり濾過フラックスを制御できるものが好ましく、具体例としてダイヤフラムポンプが挙げられる。
【００２８】
次に、本発明においての連続培養の希釈率について説明する。連続培養の希釈率とは下記の（式３）により算出することができる。
【００２９】
希釈率＝濾過液量の体積（m3／ｄａｙ）／培養液体積（m3）・・・（式３）。
【００３０】
ここでの培養液体積とは、培養装置および膜分離装置に存在する液体積を意味している。例えば培養装置内に３Ｌの培養液があり、膜分離装置に１Ｌの培養液がある場合、培養液体積は４Ｌである。つまり連続培養の希釈率とは培養液の何倍が一日にろ過されるかを表す指標である。本発明においては、連続培養の希釈率が１．８から９．０（１／ｄａｙ）であることが好ましい。連続培養の希釈率が１．８未満であると連続培養での生産速度を高める効果が十分に得られない場合があり、連続培養の希釈率が９．０以上であると微生物もしくは培養細胞の培養原料の消費が間に合わず、未利用の培養原料が濾過されてしまう場合がある。
【００３１】
次に、本発明においての濾過フラックスについて説明する。濾過フラックスとは下記の（式４）により算出することができる。
【００３２】
濾過フラックス＝濾過液量の体積（m3／ｄａｙ）／分離膜面積（m２）・・・（式４）。
【００３３】
装置に使用している膜面積は任意に設定できるため明らかである。濾過液量の体積（m3／ｄａｙ）は１ｄａｙかけて濾過液量の体積を測定することが好ましいが、１時間程度の濾過液量の体積を測定することで１ｄａｙの濾過液量の体積を概算することもできる。本発明において、濾過フラックスが０．５００ｍ／ｄａｙ以下が好ましく、０．０５０ｍ／ｄａｙ以上０．４００ｍ／ｄａｙがより好ましい。濾過フラックスが０．５００ｍ／ｄａｙを超えると回収率での制御によって連続培養を安定に制御することが難しくなる場合がある。また、濾過フラックスが０．０５０ｍ／ｄａｙ未満であると分離膜面積が大きくなりすぎ経済的な観点から工業化が難しくなる。
【００３４】
次に、本発明においての培養液体積あたりの分離膜面積について説明する。培養液体積あたりの分離膜面積とは下記の（式５）により算出することができる。
【００３５】
培養液体積あたりの分離膜面積（１／ｍ）＝分離膜面積（ｍ２）／培養液体積（ｍ３）・・・（式５）。
【００３６】
ここでいう培養液体積とは、例えば、培養装置内に３Ｌの培養液があり、膜分離装置に１Ｌの培養液がある場合、培養液体積は４Ｌである。その装置に分離膜面積として２００ｃｍ２を設置した場合は５ｍ２／ｍ３となる。本発明においては培養液体積あたりの前記分離膜の面積は１．５ｍ２／ｍ３以上９０ｍ２／ｍ３以下が好ましい。培養液体積あたりの前記分離膜の面積が１．５ｍ２／ｍ３未満であると膜分離装置の体積が大きくなりすぎ、培養の制御が困難になる場合がある。培養液体積あたりの前記分離膜の面積が９０ｍ２／ｍ３を超えると膜分離装置内に菌体が堆積しやすくなり、培養液の循環が困難になる場合がある。
【００３７】
本発明において用いられる分離膜について説明する。分離膜としては微生物もしくは培養細胞の培養液から微生物もしくは培養細胞のみを濾別することができ、かつ分離膜自体が滅菌操作（例えば１２０℃で３０分）に耐えうるものであればどのような分離膜でも良い。そのような分離膜として、例えば、高分子膜としては、均質膜や多孔性膜、非対称膜、荷電膜、照射-エッチング膜、モザイク荷電膜、バイポーラ(両極)膜、液膜、イオン交換膜およびそれらを組み合わせた複合膜などが挙げられる。無機膜としては、セラミック膜、ダイナミック膜、ゼオライト膜、炭素膜、金属膜などが挙げられる。好ましくは、セラミック膜および多孔性膜であり、より好ましくは多孔性膜である。
【００３８】
次に、本発明において分離膜として好ましく用いられる多孔性膜について説明する。
【００３９】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
【００４０】
多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
【００４１】
多孔質樹脂層を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００４２】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００４３】
また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００４４】
本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが好ましい。多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、発酵に使用される微生物による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。また、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物あるいは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【００４５】
微生物もしくは培養細胞の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は、１μｍ未満であることが好ましいが、多孔性膜の平均細孔径は、微生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましく、微生物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい酵母や細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０．４μｍ以下がより好ましく、０．２μｍ以下であれば、さらに好適に実施することができる。
【００４６】
また、微生物もしくは培養細胞が目的とする化学品以外の物質、例えば、タンパク質、多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することで細胞の破砕物が生成する場合があり、これら物質によって多孔性膜の閉塞することから回避するために、平均細孔径が０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
【００４７】
以上のことから、本発明の多孔性膜の平均細孔径は、多孔性膜の平均細孔径は、０.４μｍ以下がより好ましく、０．２μｍ以下がさらに好ましく、０．１μｍ以下が、最も好ましい。また、平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上であることが好ましいが、より好ましくは、０．０２μｍ以上であり、０．０４μｍ以上であることが更に好適である。
【００４８】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。あるいは、平均細孔径は、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０，０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
【００４９】
本発明に用いる多孔性膜の細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が好ましいが、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差は細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式６）により算出される。
【００５０】
【数１】
2010022321.tif 000002
【００５１】
本発明で用いられる多孔性膜においては、培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００５２】
また、本発明で用いられる多孔性膜においては、膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。ここでいう膜表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは小さければ小さいほど好ましいが、０．１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれやすい。また、多孔性膜の膜表面粗さを、０．１μｍ以下とすることにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物もしくは培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に、可能になる。さらに、多孔性膜の膜表面粗さを、０．１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続培養が実施可能であり、膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。
【００５３】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
【００５４】
装置    原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
条件    
探針    SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード  コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲    １０μｍ、２５μｍ 四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ 四方（水中測定）
走査解像度  ５１２×５１２
試料調製  測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。
【００５５】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記、原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式７）により算出することができる。
【００５６】
なお、多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満、多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上、かつ多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下の膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることが実施例において明らかになっている。
【００５７】
【数２】
2010022321.tif 000003
【００５８】
本発明で用いられる分離膜の形状については特に限定はなく、具体的には平膜や中空糸膜が挙げられる。
【００５９】
本発明で用いられる多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは好ましくは、２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
【００６０】
本発明で用いられる多孔性膜の形状が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは、２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは、２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００６１】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００６２】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。本発明で使用される多孔性膜の平膜としては、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有しているもの好ましく採用される。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して多孔性膜全体に強度を与える。また、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良いが、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透させた膜が好ましく採用され、多孔質基材の表面に、多孔性樹脂層を構成する樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原液を多孔質基材に含浸させ、その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成することで得られる。
【００６３】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは、５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００６４】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ−ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を好ましく用いることができる。これらを単独で用いても良いし、２種類以上を混合して用いても良い。
【００６５】
例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、グリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノール、およびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましい。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００６６】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することで、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００６７】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出するとともに、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００６８】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることで調整できる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性、細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製できる。積層される樹脂の材質は、例えば、上述多孔性樹脂層の材質と同様のものが好ましく用いることができる。また、積層の方法は特に限定されず、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることで積層量を調整することもできる。
【００６９】
本発明で用いられる多孔性膜は、樹脂などの部材を用いて中空糸膜の中空部を接着・封止し、平膜を支持体に設置することによって分離膜エレメントとすることができる。なお、本発明においては体積あたりの膜面積の設置が有利であるという観点から中空糸膜を用いることが好ましい。
【００７０】
本発明で用いられる膜分離装置は、上記のような分離膜エレメントを複数設置することが可能である装置であり、培養液の循環液入り口と循環液出口があることが好ましい。
【００７１】
本発明の化学品の製造方法においては、微生物または培養細胞を培養することにより化学品を製造する。本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、工業的によく使用される酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。これらの微生物や培養細胞のうち、目的とする化学品の生産能力が高いものを選択して用いることが好ましい。なお、本発明においては微生物の培養を「発酵」または「発酵培養」と称することがある。
【００７２】
培養原料としては、培養する微生物または培養細胞の生育を促し、目的とする化学品を良好に生産させうるものであればよい。培養原料の具体例としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００７３】
本発明に使用する微生物または培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤を必要に応じて使用する。本発明において、培養液とは、原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の原料組成から適宜変更しても良い。
【００７４】
本発明では、培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されるのが好ましい。培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持することが好ましい理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。
【００７５】
微生物または培養細胞の培養は、通常、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４−８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００７６】
本発明の化学品の製造方法では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、微生物濃度を高くした後に、連続培養（引き抜き）を開始しても良い。本発明の化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から培養原料の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。培養原料供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、培養原料の供給と培養液引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００７７】
培養原料には微生物または培養細胞の増殖に必要な栄養素を添加し、微生物または培養細胞の増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００７８】
本発明の化学品の製造方法では、必要に応じて培養装置内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、培養装置内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、引き抜くことで、閉塞から回避することができる。また、培養装置内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００７９】
本発明の化学品の製造方法では、微生物または培養細胞を増殖しつつ化学品を生成する連続培養法であれば、培養装置の数は問わない。本発明の化学品の製造方法では、連続培養操作は、通常、単一の培養装置で行うのが、管理上好ましいが、培養装置の容量が小さい等の理由から、複数の培養装置を用いることも可能である。この場合、複数の培養装置を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００８０】
本発明の化学品の製造方法で製造される化学品としては、前記微生物または培養細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はなく、培養する微生物または培養細胞によって適宜選択されうる。本発明の化学品の製造方法で製造される化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
【００８１】
次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物または培養細胞について、具体的な化学品を例示しながら説明する。
【００８２】
本発明の化学品の製造方法において、乳酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては特に制限はないが、好ましくは乳酸菌を用いることができる。ここでいう乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属またはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を適宜選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。
【００８３】
本発明の化学品の製造方法においては、更に、乳酸の内でも、Ｌ―乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈａｒｐｅａｅ）、ペディオコッカス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）またはラクトバシラス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００８４】
本発明の化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としてはＤ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば制限はない。Ｄ−乳酸生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞は、例えば、野生型株では、Ｄ−乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｄ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００８５】
また、本発明の化学品の製造方法でＬ−乳酸またはＤ−乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強する方法は、従来知られている薬剤変異による方法であってもよいが、例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ＬＤＨと言うことがある）またはＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｄ−ＬＤＨと言うことがある）を導入して、微生物または培養細胞にＬ−乳酸またはＤ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強することが好ましく、より好ましくは、微生物にＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸またはＤ−乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
【００８６】
前記組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００８７】
本発明で使用するＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＬ−乳酸またはＤ−ＬＤＨに変換する活性を持つタンパク質であるＬ−乳酸脱水素酵素またはＤ−乳酸脱水素酵素をコードしていれば限定されない。このうちＬ−ＬＤＨとしてはホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来またはカエル由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。カエル由来の中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）またはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、より好ましくはバシラス・ラエボラクティカス由来の遺伝子である。
【００８８】
本発明に用いられるＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨには、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。また、本発明で使用するＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨは、Ｌ−乳酸脱水素酵素またはＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。  
【００８９】
本発明の化学品の製造方法でＬ―乳酸を製造する場合、製造された濾過・分離発酵液に含まれるＬ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｌ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｌ−乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むＬ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＬ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＬ−乳酸を得ることもできる。
【００９０】
本発明の化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。本発明の化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。
【００９１】
本発明の化学品の製造方法でエタノールを製造する場合、エタノールの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては特に制限はないが、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母を用いることができる。このうちサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を好適に用いることができる。また、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌も好ましく用いることができる。このうち、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）を好適に用いることができる。
【００９２】
本発明におけるエタノールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよく、具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一部性質が改変されたものの一例としては、リゾパス属に属するカビのグルコアミラーゼ遺伝子を組み込み、生でんぷんの資化能力を獲得した酵母を挙げることができる（微生物、３：５５５−５６４（１９８７））。また、本発明の製造方法により製造された濾過・分離発酵液に含まれるエタノールの分離・精製は、例えば、蒸留法による精製法や、ＮＦ、ＲＯ膜、あるいはゼオライト製の分離膜を用いた濃縮・精製法を好適に用いることができる。
【００９３】
本発明の化学品の製造方法でピルビン酸を製造する場合、ピルビン酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては特に制限はないが、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌を好ましく用いることができる。さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌を用いることができる。
【００９４】
本発明におけるピルビン酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は人為的にピルビン酸生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよく、これら微生物あるいは培養細胞を突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を変異、または欠失させた細菌も好ましく用いられる。またカビ、酵母なども好ましく用いることができる。例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属またはシゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属に属するカビまたは酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）などのカビまたは酵母を用いてピルビン酸を製造することが出来る。
【００９５】
本発明の化学品の製造方法でピルビン酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるピルビン酸の分離・精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平６−３４５６８３に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００９６】
本発明の化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、具体例としては、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属やアクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）やJames B. Mckinlay （ジェームズ Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド  マイクロバイアル  アンド  マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６ （２００５）。また、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属やブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などのコリネ型細菌および大腸菌なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）などが好適である。
【００９７】
本発明におけるコハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよく、具体例として、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）や、非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸・ギ酸開裂酵素と乳酸脱水素酵素の欠損株である大腸菌ＡＦＰ１１１株などを使用することができる。
【００９８】
本発明の化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の分離・精製は、通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開２００５−３３３８８６号公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮・晶析を組み合わせた精製法を好適に用いることができる。
【００９９】
本発明の化学品の製造方法でイタコン酸を製造する場合、イタコン酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はなく、具体例としては、カビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、あるいはウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属に属するカビ、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する酵母を用いたイタコン酸の生産が挙げられる。中でも、アスペルギルス  テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス  イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、ウスティラゴ  メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ  シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、およびウスティラゴ  ラベンホルスティナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉｎａ）のカビ、あるいはカンジダ  アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を、イタコン酸の生産に好ましく用いることができる。
【０１００】
本発明の化学品の製造方法でイタコン酸を製造する場合、イタコン酸の分離・精製は、好ましくは、限外濾過や電気透析を用いて行うことができる。例えば、特公昭−５０９５８号公報に示される限外濾過、および塩型カチオン交換樹脂膜を用いた電気透析による精製法を好適に用いることができる。
【０１０１】
本発明の化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、１，３−プロパンジオールの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、具体例としては、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【０１０２】
本発明の化学品の製造方法でグリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する場合、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で１，３−プロパンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
【０１０３】
組換え微生物で１，３−プロパンジオールを製造する場合、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）属及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属より成る群から選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエッシェリシア  コリである。
【０１０４】
本発明の化学品の製造方法でグルコースから１，３−プロパンジオールを製造する場合、組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましく。 更にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが更に好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが更に好ましい。
【０１０５】
本発明の化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析させて行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
【０１０６】
本発明の化学品の製造方法でカダベリンを製造する場合、カダベリンの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、具体例としては、微生物が有するリジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性が増強された微生物が好ましい。更に好ましくは、微生物がリジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、組換え微生物がリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が、１または２種類以上組み込まれている微生物が挙げられる。
【０１０７】
組換え微生物でカダベリンを製造する場合、大腸菌またはコリネ型細菌を宿主とする組換え微生物が好ましく、より好ましくは、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌である。また、コリネ型細菌の中でもコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属から選ばれることがより好ましく、コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が更に好ましい。更に微生物はホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく、遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることがより好ましい。
【０１０８】
本発明の化学品の製造方法でカダベリンを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるカダベリンの分離・精製は、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方法を組み合わせて行うことができる。例えば、特開２００４−２２２５６９号公報に示される晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。本発明では、連続培養の際に用いられる酸によって様々なポリマー原料にすることができ、好純度が求められるポリマー原料用途では晶析による精製方法が好ましく用いられる。塩酸により培養液のｐＨを維持すると、その濾過液から晶析工程によりカダベリン二塩酸塩を回収することができる。更に好ましくは、連続培養の際にジカルボン酸により培養液のｐＨを維持し、そのろ過液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することが挙げられる。更に好ましくは、そのジカルボン酸は、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸である。更に好ましくは、該ジカルボン酸として、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかを挙げることができる。
【０１０９】
本発明の化学品の製造方法で核酸を製造する場合、核酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はなく、核酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞は、元来核酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた原核微生物であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【０１１０】
ここで、前記一部性質の改変に関して説明する。核酸を効率よく生産するためには、核酸を生合成して蓄積し、生体外に放出する必要がある。そのため、核酸の生合成系路に関与する酵素の増強、核酸の分解路に関与する酵素活性低下、また核酸を生体外放出に関わるタンパク質、あるいは生体膜組成等の改変など、微生物あるいは培養細胞の性質を変えることによって効率的に核酸を生産する微生物あるいは培養細胞を作出することができる。
【０１１１】
具体的には、一部性質の内、イノシンを生産する場合には、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。グアノシンを生産する場合には、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、グアニル酸レダクターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオチダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。ウリジンを生産する場合には、ウリジンホスホリラーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。シチジンを生産する場合には、シジチンデアミナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましく、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【０１１２】
本発明の化学品の製造方法で核酸を製造する場合、その微生物あるいは培養細胞としてコリネ型細菌または枯草菌を好ましく用いることができる。例えば、イノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられ、コリネバクテリウム属の中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グアノファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）またはコリネバクテリウム・ペトロフィリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｉｕｍ）が好ましく用いられる。また、枯草菌として、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌が挙げられ、中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはバチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。また、グアノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられ、中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましく、枯草菌としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌が挙げられ、中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはバチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。また、ウリジンまたはシチジンを生産する場合には、枯草菌として中でもバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌が好ましく用いられ、中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。
【０１１３】
本発明の化学品の製造方法で核酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれる核酸の分離・精製は、好ましくは、イオン交換樹脂処理法、濃縮冷却晶析法、膜分離法およびその他の方法を組み合わせることにより行なわれる。不純物を除くためには、常法の活性炭吸着法および再結法を用いて精製してもよい。
【０１１４】
本発明の化学品の製造方法でアミノ酸を製造する場合、アミノ酸の製造に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としてはアミノ酸を生産することが可能な微生物であれば制限はない。アミノ酸の製造に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞は、元来アミノ酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。
【０１１５】
本発明の化学品の製造方法でアミノ酸を製造する場合、アミノ酸は、好ましくは、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ―フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、メチオニン、セリン、バリン、ロイシンが挙げられる。
【０１１６】
次に、具体的なアミノ酸を例示しながら、アミノ酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞について説明する。
【０１１７】
本発明の化学品の製造方法でＬ−スレオニンを製造する場合、Ｌ−スレオニンの製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する細菌を用いることができる。そのうちで、特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【０１１８】
本発明の化学品の製造方法でＬ−リジンまたはＬ−グルタミン酸を製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）が好ましい。
【０１１９】
本発明の化学品の製造方法でＬ−トリプトファンを製造する場合、Ｌ−トリプトファンの製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）またはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
【０１２０】
本発明の化学品の製造方法でＬ−イソロイシンを製造する場合、Ｌ−イソロイシンの製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。
【０１２１】
本発明の化学品の製造方法でＬ−グルタミンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはフラボバクテリウム・リゲンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｇｅｎｓｅ）が好ましい。
【０１２２】
本発明の化学品の製造方法でＬ−アルギニンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
【０１２３】
本発明の化学品の製造方法でＬ−アラニンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）またはアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）が好ましい。
【０１２４】
本発明の化学品の製造方法でＬ−ヒスチジンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはストレプトマイセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が好ましい。
【０１２５】
本発明の化学品の製造方法でＬ−プロリンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、カルチア・カテナフォルマ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｃａｔｅｎａｆｏｒｍａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）またはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
【０１２６】
本発明の化学品の製造方法でＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
【０１２７】
本発明の化学品の製造方法でＬ−アスパラギン酸を製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。
【０１２８】
本発明の化学品の製造方法でメチオニンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましい。
【０１２９】
本発明の化学品の製造方法でセリンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）が好ましい。
【０１３０】
本発明の化学品の製造方法でバリンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）またはクレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が好ましい。
【０１３１】
本発明の化学品の製造方法でロイシンを製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。
【０１３２】
本発明の化学品の製造方法でアミノ酸を製造する場合、アミノ酸の製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、例示した微生物あるいは培養細胞に対して、人為的に生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一部性質が改変されたアミノ酸の製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞の一例としては、特開平２−２１９５８２に記載されているＬ−スレオニン生産性の向上したプロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）や、特表平３−５００４８６に記載されているＬ−アラニン生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などがある。
【０１３３】
本発明の化学品の製造方法に従って、連続培養をおこなった場合、従来の回分発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここでいう、連続培養における生産速度は、次の式（８）で計算される。
【０１３４】
【数３】
2010022321.tif 000004
【０１３５】
また、回分培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【０１３６】
次に、本発明の化学品の製造方法で用いられる連続培養装置の好ましい態様について、図を用いて説明する。図１は、本発明の化学品の製造方法で用いられる連続培養装置の例を説明するための概要側面図である。
【０１３７】
図１において、連続培養装置は、培養装置１と膜分離装置２と循環ポンプ３と濾過ポンプ４および分離膜エレメント５で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント５には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜、および分離膜エレメントを使用することが好適である。また、膜分離装置２は、循環ポンプ３を介して培養装置１に接続されている。
【０１３８】
図１において、培地供給ポンプ６によって培地を培養装置１に投入し、必要に応じて、攪拌機７で培養装置１内の培養液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置８によって必要とする気体を供給することができる。この時、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置８で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ１０によって発酵液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１１によって培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、培養装置内の培養液は、循環ポンプ３によって培養装置１と膜分離装置２の間を循環する。生産物を含む培養液は、分離膜エレメント５によって微生物と生産物に濾過・分離され、装置系外に取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることで装置系内の微生物濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。また、レベルセンサー１２によって、培養装置内の液面を一定にするために培地供給ポンプ６を制御する。
【０１３９】
必要に応じて、気体供給装置１３によって必要とする気体を膜分離装置２内に供給することができる。この時、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置１３で供給することができる。分離膜エレメント５による濾過・分離は、濾過ポンプ４によって行う。循環ポンプ３および濾過ポンプ４の先にある流量計１４および１５によって循環液量および濾過液量を回収率モニタリング装置１６に取り込み、回収率を常時計算し、必要に応じて循環ポンプまたは濾過ポンプの出力を変更し、回収率を１０．０％以下に制御する。
【０１４０】
本発明の化学品の製造方法で用いられる連続培養装置で、好ましく用いられる分離膜エレメントについて、説明する。
【０１４１】
図２示す分離膜エレメントについて説明する。本発明の化学品の製造方法で用いられる連続培養装置では、好ましくは、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを用いることができる。分離膜エレメントは、図２に示すように、剛性を有する支持板１７の両面に、流路材１８と前記の分離膜１９をこの順序で配し構成されている。支持板１７は、両面に凹部２０を有している。分離膜１９は、培養液を濾過する。流路材１８は、分離膜１９でろ過された透過水を効率よく支持板１７に流すためのものである。支持板１７に流れた透過水は、支持板１７の凹部２０を通り、集水パイプ２１を介して膜分離装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１４２】
次に、図３に示す分離膜エレメントについて説明する。分離膜エレメントは、図３に示すように、中空糸膜で構成された分離膜束２２と上部樹脂封止層２３、下部樹脂封止層２４によって主に構成される。分離膜束は上部樹脂封止層２３、および下部樹脂封止層２４よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層による接着・固定化は中空糸膜の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層２３は中空糸膜の内孔を封止しておらず、集水パイプ２５に透過水が流れる構造となっている。分離膜束２２によって濾過された透過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２５を介して膜分離装置２６の外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１４３】
本発明の化学品の製造方法で用いられる連続培養装置の膜分離装置を構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。培養装置内が滅菌可能であれば、連続培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき、より安定した連続培養が可能となる。膜分離装置を構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【実施例】
【０１４４】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、上記化学品の例として、Ｌ−乳酸を選定し、Ｌ−乳酸を生産する能力のある微生物による図１の概要図に示す装置を用いた連続培養の具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。
【０１４５】
参考例１  Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。ヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【０１４６】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【０１４７】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりヒトＬ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することによりヒトＬ−ＬＤＨ遺伝子（配列番号３：アクセッションナンバーＡＹ００９１０８）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたヒトＬ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒトＬ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ＬＤＨ５を得た。なお、ヒト由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ＬＤＨ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【０１４８】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ＬＤＨ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【０１４９】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＹＥＡＳＴ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ２０００  ＥＤＩＴＩＯＮ、  ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【０１５０】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０１５１】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１５２】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。
【０１５３】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【０１５４】
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１５５】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【０１５６】
参考例２  多孔性膜の作製（その１）
樹脂として、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドをそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【０１５７】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８７．０重量％。
【０１５８】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質樹脂層が形成された多孔質基材を得た。
【０１５９】
水 ：３０．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：７０．０重量％。
【０１６０】
この多孔質基材をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。
【０１６１】
多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、０．１μｍであった。
【０１６２】
次に、上記分離膜について、純水透過係数を評価した。５０×１０−9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【０１６３】
また、細孔径の標準偏差 は、０．０３５μｍ、膜表面粗さは０．０６μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は、本発明に好適に用いることができた。
【０１６４】
実施例１  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１の連続培養装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｌ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用いた。実施例１における運転条件は以下のとおりである。
【０１６５】
培養装置液量：２０（Ｌ）
膜分離装置液量：５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養装置通気量：２．０（Ｌ／ｍｉｎ）
膜分離装置通気量：なし
反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
培地供給速度：培養装置内の液面レベルセンサーにて可変制御
循環ポンプによる循環液量：６．０２（Ｌ／ｍｉｎ）
濾過フラックス：０．３２５ｍ／ｄａｙ
回収率：１．５％。
【０１６６】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０１６７】
【表１】
2010022321.tif 000005
【０１６８】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１０００ｍｌに植菌し、３０００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前培養）。前培養液を、図１に示す連続培養装置の２０Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養装置を付属の攪拌機によって攪拌し、通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、４８時間培養を行った後に、濾過ポンプを稼働させ０．３２５ｍ／ｄａｙの濾過フラックスで濾過し連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。この時の回収率は式１から計算すると１．５％である。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。膜の閉塞が発生すると濾過フラックスが低下してくるため、濾過フラックスを経時的に計測した。
【０１６９】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。運転開始から１０００時間に渡って濾過フラックスが安定し、回収率１．５％での運転によって、長時間安定したＬ−乳酸の連続培養による製造が可能となった。連続培養結果を表２に示す。
【０１７０】
実施例２  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その２）
回収率を３．０％で運転を行った。実施例１の運転条件との変更点は下記のみで、その他は実施例１と同様におこなった。
【０１７１】
循環ポンプによる循環液量：３．０１（Ｌ／ｍｉｎ）
回収率：３．０％。
【０１７２】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。８００時間に渡って濾過フラックスが安定し、回収率３．０％での運転でも長時間安定したＬ−乳酸の連続培養による製造が可能となった。連続培養結果を表２に示す。
【０１７３】
実施例３  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その３）
回収率を１．５％での運転であるが、実施例１の運転条件と下記条件を変更し行った。
【０１７４】
循環ポンプによる循環液量：３．０１（Ｌ／ｍｉｎ）
濾過フラックス：０．１６２ｍ／ｄａｙ
回収率：１．５％。
【０１７５】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。９００時間に渡って濾過フラックスが安定し、実施例１と循環液量および濾過フラックスの条件が異なろうとも、回収率１．５％での運転にすることで、安定したＬ−乳酸の連続培養による製造が可能であった。連続培養結果を表２に示す。
【０１７６】
実施例４  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その４）
回収率を１．５％での運転であるが、実施例１の運転条件と下記条件を変更し行った。
【０１７７】
膜分離装置液量：２．５（Ｌ）
膜分離エレメント有効濾過面積：２０００平方ｃｍ
濾過フラックス：０．６５０ｍ／ｄａｙ
回収率：１．５％。
【０１７８】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。１０５０時間に渡って濾過フラックスが安定し、実施例１より膜面積が小さく高い濾過フラックスであっても、回収率１．５％での運転にすることで、安定したＬ−乳酸の連続培養による製造が可能であった。連続培養結果を表２に示す。
【０１７９】
実施例５  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その５）
回収率を９．９％での運転であるが、実施例１の運転条件と下記条件を変更し行った。
【０１８０】
膜分離エレメント有効濾過面積：５０００平方ｃｍ
濾過フラックス：０．１００ｍ／ｄａｙ
循環ポンプによる循環液量：０．３５（Ｌ／ｍｉｎ）
回収率：９．９％。
【０１８１】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。５５０時間に渡って濾過フラックスが安定し、実施例１より膜面積が小さく高い濾過フラックスであっても、回収率９．９％での運転にすることで、安定したＬ−乳酸の連続培養による製造が可能であった。連続培養結果を表２に示す。
【０１８２】
比較例１  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その６）
回収率を１２．０％で運転を行った。実施例１の運転条件との変更点は下記のみで、その他は実施例１と同様におこなった。
【０１８３】
循環ポンプによる循環液量：１．１６（Ｌ／ｍｉｎ）
濾過フラックス：０．５００ｍ／ｄａｙ
回収率：１２．０％。
【０１８４】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。１００時間で濾過フラックスが低下し、回収率１２．０％では急速に濾過フラックスが低下し、安定したＬ−乳酸の連続培養による製造が困難であった。連続培養結果を表２に示す。
【０１８５】
参考例２  多孔性膜の作製（外圧式中空糸）（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１８６】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を中空糸膜表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた中空糸膜を製作した。得られた中空糸膜は被処理水側表面の平均孔径が０．０５μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０−9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【０１８７】
実施例６  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その７）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が４０００平方ｃｍの図３に示す分離膜エレメントを用い、実施例２の運転条件との変更点は下記のみで、その他は実施例２と同様におこなった。
【０１８８】
膜分離装置液量：０．９（Ｌ）
回収率：３．０％
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。１０００時間に渡って濾過フラックスが安定し、分離膜の形状には関係なく回収率を１０．０％以下で運転することが連続培養の運転条件において重要であることがわかった。連続培養結果を表２に示す。
【０１８９】
実施例７  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その８）
分離膜として塩素化ポリエチレンである液中膜５１０型（クボタ社製）を使用して実施例５と同様のＬ−乳酸連続培養試験を行った。本分離膜の多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、０．４μｍであった。次に、上記分離膜について、純水透過係数を評価したところ３０×１０−9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【０１９０】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。５００時間に渡って濾過フラックスが安定し、分離膜の素材には関係なく回収率を１０．０％以下で運転することが連続培養の運転条件において重要であることがわかった。連続培養結果を表２に示す。
【０１９１】
実施例８  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その９）
分離膜として内圧式中空糸であるＵＭＰ−１５３（旭化成社製）を使用してＬ−乳酸連続培養試験を行った。本分離膜の多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、０．２μｍであった。実施例８における運転条件は以下のとおりである。
【０１９２】
培養装置液量：２０（Ｌ）
膜分離装置液量：２．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養装置通気量：２．０（Ｌ／ｍｉｎ）
膜分離装置通気量：なし
反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
培地供給速度：培養装置内の液面レベルセンサーにて可変制御
循環ポンプによる循環液量：４．８（Ｌ／ｍｉｎ）
濾過フラックス：０．２００ｍ／ｄａｙ
回収率：１．２％。
【０１９３】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。７００時間に渡って濾過フラックスが安定し、中空糸の外圧式、内圧式には関係なく回収率を１０．０％以下で運転することが連続培養の運転条件において重要であることがわかった。連続培養結果を表２に示す。
【０１９４】
実施例９  酵母を用いた連続培養によるＬ−乳酸の製造（その１０）
分離膜として内圧式中空糸であるＵＬＰ−１４３（旭化成社製）を使用してＬ−乳酸連続培養試験を行った。本分離膜の多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、０．４５μｍであった。実施例８の運転条件と下記条件を変更し行った。
【０１９５】
循環ポンプによる循環液量：２．４（Ｌ／ｍｉｎ）
回収率：２．３％。
【０１９６】
図４に測定した濾過フラックスの推移を示す。８００時間に渡って濾過フラックスが安定し、中空糸の外圧式、内圧式には関係なく回収率を１０．０％以下で運転することが連続培養の運転条件において重要であることがわかった。連続培養結果を表２に示す。
【０１９７】
【表２】
2010022321.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続培養法による化学品の製造方法である。本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続培養が可能となり、化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、本発明で用いられる連続培養装置の例を説明するための概要側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの例を説明するための概略斜視図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる中空糸膜による分離膜エレメントを設置した膜分離装置の例を説明するための断面説明図である。
【図４】図４は、連続培養の時間経過における濾過フラックスの推移を示している図である。
【符号の説明】
【０２００】
１  培養装置
２  膜分離装置
３  循環ポンプ
４  濾過ポンプ
５  分離膜エレメント
６  培地供給ポンプ
７  攪拌機
８  気体供給装置
９  ｐＨセンサ・制御装置
１０  ｐＨ調整溶液供給ポンプ
１１  温度調節器
１２  レベルセンサー
１３  気体供給装置
１４  流量計
１５  流量計
１６  回収率モニタリング装置
１７  支持板
１８  流路材
１９  分離膜
２０  凹部
２１  集水パイプ
２２  分離膜束
２３  上部樹脂封止層
２４  下部樹脂封止層
２５  集水パイプ
２６  膜分離装置
【図１】
2010022321.tif 000007
【図２】
2010022321.tif 000008
【図３】
2010022321.tif 000009
【図４】
2010022321.tif 000010
【配列表】
2010022321000001.app