(57)【要約】【課題】酵母を利用した生産性の高いグルコシルセラミドの製造方法を提供する。【解決手段】キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法。前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物は、キャンディダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＪＰＣＣＹ０００４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５７０）であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法。
【請求項２】
前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物が、キャンディダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＪＰＣＣＹ０００４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５７０）である請求項１に記載のグルコシルセラミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を利用するグルコシルセラミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴイド塩基（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ  ｂａｓｅ）を基本骨格として脂肪酸と糖鎖とが結合したものであり、哺乳類、植物、微生物に存在し（非特許文献１参照）、糖鎖や脂肪酸の炭素数、並びに二重結合や水酸基の有無などの違いに基づく種々の構造が報告されている（非特許文献２参照）。
スフィンゴ糖脂質の構成成分であるセラミド（Ｃｅｒ）は、ヒトの角質層の細胞間脂質の主成分として４０〜６０％を占めており、その親水性部分に水分子を保持することで水分の蒸発を抑えると共に、細菌などの体外刺激物が体内へ侵入することを防止する役割を担っていると考えられている。そして、セラミドは加齢に伴い減少し、しわ、肌荒れの原因となることが報告されている。セラミドや、セラミドにグルコースが付加した構造のグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）は、ヒトの乾燥落屑性皮膚への塗布による水分保持機能改善効果、経口摂取による経皮水分蒸発量の低減効果を有するが報告されており、化粧品や健康食品の原料として注目されている。例えば、セラミドやグルコシルセラミドの日本国内の市場規模は、グルコシルセラミド５％含有の粗抽出物として２００５年では５．８トン、金額にすると約１３．５億円であり、毎年約２０％の伸びが見込まれている。
【０００３】
従来は、スフィンゴ糖脂質の原料として、セラミドとガラクトースとが結合した構造を有するガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）が使用され、これを豊富に含む牛脳が抽出源として利用されてきた。しかし、２００１年の狂牛病の大流行を受け、牛脳由来物質に関する安全性評価の確立が未だ不十分であることから、抽出源として他の生物を利用することが求められるようになってきた。化学合成品は、安全性の観点から食品素材としての利用が制限されるからである。このような背景から、現在では米糠や小麦胚芽などの植物が、グルコシルセラミドの主な抽出源として利用されている。
【０００４】
しかし、植物の乾燥単位質量あたりから抽出可能なグルコシルセラミドの量は非常に少なく、例えば、精米からは０．００２５質量％、小麦からは０．０２１質量％程度にとどまる（非特許文献３参照）。したがって、抽出・精製工程に多大なコストと労力を要する。そのため、グルコシルセラミドの市場価格は、３％含有品で２００〜３００円／ｇ、すなわち、グルコシルセラミド純品に換算して６７００〜１００００円／ｇとなっており、非常に高価である。そこで、安価なグルコシルセラミドの製造技術の開発が強く望まれている。
【０００５】
このような中、生育速度が速く、大量培養による物質の大量生産が可能な微生物の利用が注目されている。そして、グルコシルセラミド生産能を有する微生物の探索も開始されており（非特許文献４参照）、これまでに、例えば、クルブロマイセス  ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、デバリオマイセス  ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉ）等、いくつかの酵母がグルコシルセラミド生産能を有していることが報告されている。これら酵母は、培養時間が２４〜４８時間程度と短いこと、植物と比較してグルコシルセラミドの抽出が容易であること、消費者に好印象で捉えられていること、等の理由から、グルコシルセラミドの抽出源として期待される。
【非特許文献１】Ｄ．Ｗａｒｎｅｃｋｅ  ａｎｄ  Ｅ．Ｈｅｉｎｚ（２００３）  Ｒｅｃｅｎｔｌｙ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｇｉ．ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０，９１９−９４１．
【非特許文献２】Ｒ．Ｘ．Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｃｈｅｎ（２００３）  Ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｐ．２０：５０９−３４．
【非特許文献３】Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｔ．（１９９９）  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｂｌｅ  ｐｌａｎｔ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌｉｐｉｄｓ，３４：１２３１−１２３７．
【非特許文献４】Ｍａｓａｈｉｋｏ  Ｔａｍｕｒａ，Ｏｓａｍｕ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｎａｏｙａ  Ｔａｋａｋｕｗａ，Ｙｕｊｉ  Ｏｄａ，Ｍａｓａｏ  Ｏｈｎｉｓｈｉ（２００５）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｂｅｅｔ  Ｍｏｌａｓｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：９５−１０５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、グルコシルセラミド生産能を有する酵母は、まだ十分に探索されているとは言えず、より生産性の高いグルコシルセラミドの製造方法の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、酵母を利用した生産性の高いグルコシルセラミドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法である。
請求項２に記載の発明は、前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物が、キャンディダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＪＰＣＣＹ０００４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５７０）である請求項１に記載のグルコシルセラミドの製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高品質のグルコシルセラミドを簡便且つ大量に製造できる。その結果、安価なグルコシルセラミドを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳しく説明する。
なお、以下において、「キャンディダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＪＰＣＣＹ０００４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５７０）」のことを「ＪＰＣＣＹ０００４」と略記することがある。
また、本発明において「グルコシルセラミド」とは、例えば、下記式（１）で表されるように、スフィンゴシン骨格（ａ）中のアミノ基と、脂肪酸骨格（ｂ）中のカルボキシ基とがアミド結合を形成した構造を有するセラミド骨格（ａ＋ｂ）中のうち、前記スフィンゴシン骨格（ａ）の分子末端の１級水酸基に相当する水酸基が、グルコースの１位の炭素原子に結合した構造を有する化合物の総称を指すものとする。したがって、「グルコシルセラミド」には、前記スフィンゴシン骨格（ａ）に由来する炭化水素基の種類や、前記脂肪酸骨格（ｂ）に由来する炭化水素基の種類、あるいは構造式中のいずれかの基の立体配置等が異なる複数の化合物を含む。
【００１０】
【化１】
2010022217.tif 000002
【００１１】
＜ＪＰＣＣＹ０００４の獲得＞
ＪＰＣＣＹ０００４は、以下の手順に従って獲得した。
まず、下記手順で分離培地を作製した。
分離培地：酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、人工海水３７ｇ、クロラムフェニコール０．３ｇ、ストレプトマイシン０．１５ｇ、アンピシリン０．１ｇ、粉末寒天１２ｇを純水１Ｌに添加し、１２１℃で１０分間滅菌処理した後、適量を滅菌済み平板に分取して、寒天平板を作製した。
次いで、発酵食品（テンペ）を１００倍量（質量比）の生理食塩水で激しく撹拌し、上澄みを前記分離培地に塗布し、２５℃でインキュベーションを行なった。植菌後３日目に確認できたコロニーを滅菌済み爪楊枝で釣菌し、新たな酵母培地に植菌し、生育を繰り返すことで単菌化を行った。
【００１２】
＜ＪＰＣＣＹ０００４の同定＞
ＪＰＣＣＹ０００４の同定は、株式会社テクノスルガに委託して実施した。そして取得した検体を用いて、「簡易形態観察」、「生理・生化学的性状試験（以下、生理性状試験と略記する）」、「２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の同定」を行った。なお、供試菌体としては、下記条件で培養した菌株を使用した。
［培養条件］
培地；Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ−ｍａｌｔ  ａｇａｒ（ＹＭ  ａｇａｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
培養温度；温度耐性試験を除き２５℃
培養期間；１週間〜１ヶ月間
その他の培養条件；好気培養
【００１３】
［簡易形態観察］
以下のものを使用して観察を行なった。
顕微鏡；光学顕微鏡ＢＸ５１（オリンパス株式会社製）（微分干渉観察）
マウント液；滅菌蒸留水
（１） 巨視的観察（コロニー観察）
ＹＭ平板培地上で２５℃の温度条件下、培養７日間でコロニーは表１に示す性状を示した。
【００１４】
【表１】
2010022217.tif 000003
【００１５】
（２） 微視的観察（形態性状観察）
ＹＭ平板培地上で２５℃の温度条件下、培養開始１０日目に、栄養細胞は楕円形であり、増殖は多極出芽によることが確認された。培養開始から１ヶ月経過した平板で、有性生殖器官の形成は認められなかった。
【００１６】
［生理性状試験］
試験方法は、Ｂａｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌ（１９９８）に準拠し、培養は温度耐性試験を除き２５℃で行った。結果を表２〜６に示す。なお、表中、「＋」は反応が陽性であることを、「−」は反応が陰性であることをそれぞれ示す。また、「Ｓ（ｓｌｏｗ）」は試験開始後に２週間から３週間以上かけて徐々に陽性反応が認められたことを、「Ｌ（ｌａｔｅｎｔ）」は試験開始２週間以降に急速に陽性反応が認められたことをそれぞれ示す。
【００１７】
【表２】
2010022217.tif 000004
【００１８】
【表３】
2010022217.tif 000005
【００１９】
【表４】
2010022217.tif 000006
【００２０】
【表５】
2010022217.tif 000007
【００２１】
【表６】
2010022217.tif 000008
【００２２】
［２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の同定］
ＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの各操作は、下記の各プロトコールに基づいて行った。
ＤＮＡ抽出；物理的破壊及びＭａｒｍｕｒ（１９６１）の改変法
ＰＣＲ；ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
サイクルシークエンス；ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
プライマー；ＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ３及びＮＬ４（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３）
シークエンス；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
配列決定；ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ  １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）
相同性検索及び簡易分子系統解析；アポロン２．０（ソフトウェア、テクノスルガ・ラボ）、アポロンＤＢ−ＦＵ２．０（データベース、テクノスルガ・ラボ）、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）
【００２３】
ＪＰＣＣＹ０００４の２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列を同定した結果、配列番号１に示す塩基配列であることが判った。
【００２４】
アポロンＤＢ−ＦＵ２．０に対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、ＪＰＣＣＹ０００４の２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌系アナモルフ（無性時代）酵母の一種であるキャンディダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の基準株ＮＲＲＬＹ−１２９６８Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５７４９）と１００％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ等の国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果でも、ＪＰＣＣＹ０００４の２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、多数のキャンディダ  トロピカリスの塩基配列に対し１００％の相同率を示した。図１は、アポロンＤＢ−ＦＵ２．０に対する相同性検索で得られた上位１３塩基配列を基に作成した系統樹であり、ＪＰＣＣＹ０００４は、キャンディダ  トロピカリス  ＮＲＲＬＹ−１２９６８Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５７４９）と同一の系統枝を形成し、さらにこの系統枝の信頼性を表すブートストラップ値は１００％で支持された。以上より、２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ０００４はキャンディダ  トロピカリスに帰属する菌種であると推定された。
【００２５】
また、簡易形態観察の結果、ＪＰＣＣＹ０００４は、栄養細胞が楕円形であり、栄養増殖は多極出芽によることが確認され、キャンディダ  トロピカリスの形態学的特徴と一致した。
２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ０００４が帰属すると推定したキャンディダ属には、「Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ第４版（Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌ，１９９８）」において１６３種が記載されており、これら１６３種は生理性状に基づき１２のグループに分けられている。生理性状試験の結果、ＪＰＣＣＹ０００４は、炭素源としてイノシトール及びエリスリトールを資化せず、窒素源として硝酸塩を資化せず、４０℃の温度条件下での生育を示すことから、「キャンディダ属生理性状グループＶＩ（Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌ，１９９８）」に分類される推定された。一方、２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ０００４が帰属すると推定したキャンディダ  トロピカリスもまた、「キャンディダ属生理性状グループＶＩ」に分類されている。さらに、「キャンディダ属生理性状グループＶＩ」に分類されている２０菌種の区別に有効とされる生理・生化学的特徴において、ＪＰＣＣＹ０００４はキャンディダ  トロピカリスと良く一致した。具体的には、グルコースの発酵性、並びにガラクトース、マルトース、セロビオース、トレハロース、ラフィノース、可溶性デンプン及びＬ−アラビノースの資化性において、ＪＰＣＣＹ０００４はキャンディダ  トロピカリスと一致する特徴を示した。さらに、「Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ第４版（Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌ，１９９８）」及び「ＹＥＡＳＴＳ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ第３版（Ｂａｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）」を参考に、ＪＰＣＣＹ０００４とキャンディダ  トロピカリスの他の生理・生化学的特徴についても比較したところ、ほぼ類似した特徴を示した。したがって、本同定試験において決定したＪＰＣＣＹ０００４の生理・生化学的特徴は、キャンディダ  トロピカリスとほぼ類似することが明らかとなり、これは、２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果を支持するものであった。
【００２６】
以上より、「簡易形態観察」、「生理性状試験」及び「２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析」の結果から、ＪＰＣＣＹ０００４はキャンディダ  トロピカリスに帰属すると推定された。そして、Ｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に基づく分類学的位置から、ＪＰＣＣＹ０００４は、子嚢菌系アナモルフ（無性時代）酵母であるキャンディダ  トロピカリス  （キャステル）  ベルカウト（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  （Ｃａｓｔｅｌｌ．）  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ）であると推定された。
【００２７】
ＪＰＣＣＹ０００４は、平成２０年５月１４日付けで受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５７０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
【００２８】
本発明のグルコシルセラミドの製造方法は、キャンディダ属に属する微生物を培養する工程を有するものである。本発明は、グルコシルセラミド生産能を有する、キャンディダ属に属する微生物を初めて見出したことにより為されたものである。
そして、前記キャンディダ属に属する微生物は、ＪＰＣＣＹ０００４であることが好ましい。
【００２９】
上記微生物を培養して得られる培養物中には、該微生物により生産されたグルコシルセラミドが含有される。該培養物は、そのまま目的の用途に使用しても良いし、適宜任意の精製操作を行ってから使用しても良い。
ＪＰＣＣＹ０００４等のキャンディダ属に属する微生物は、公知の手法で培養すれば良い。ＪＰＣＣＹ０００４であれば、例えば、上記の獲得手順に記載した分離培地や、酵母エキス、バクト  トリプトン（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ）、グルコース等を含有する培地を使用すると良い。なかでも糖類としては、前記の資化性を有するものであればいずれも使用し得るが、グルコースが特に好ましい。
【００３０】
また、培地中には、所定濃度の塩類を含有させることが好ましく、該塩類としては塩化ナトリウムが好ましい。塩類の濃度は０．１〜３質量％であることが好ましく、０．３〜２．５質量％であることがより好ましく、２質量％程度であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、グルコシルセラミドの生産性が一層向上する。
【００３１】
培地は中性〜弱アルカリ性であることが好ましい。具体的には、培地のｐＨは６．５〜１０．５であることが好ましく、７．０〜１０．３であることがより好ましく、１０程度であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、グルコシルセラミドの生産性が一層向上する。
【００３２】
培地は固形培地及び液体培地のいずれでも良い。
培養時の温度は、１８〜４０℃であることが好ましく、２３〜３５℃であることがより好ましい。
培養時間は、培養温度にもよるが、１２時間以上であることが好ましく、２０時間以上であることがより好ましい。培養時間の上限は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良いが、通常は、５０時間程度で十分である。
培養方法は、静置培養、振とう培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すれば良い。そして、好気培養することが好ましい。
【００３３】
生産されたグルコシルセラミドは、公知の手法で培養物から分離すれば良い。例えば、培養物から遠心分離等の手法でＪＰＣＣＹ０００４等の菌体を回収し、必要に応じて洗浄後、凍結乾燥等の手法で乾燥菌体を得る。そして、得られた乾燥菌体をホモジナイズし、次いで、有機溶媒／水の混合溶媒を使用して、有機溶媒中にグルコシルセラミドを抽出する。さらに、溶媒を除去することでグルコシルセラミドが得られる。ホモジナイズは、クロロホルム／メタノール混合溶媒等の有機溶媒とアルカリ性水溶液とを併用して行うことが好ましく、抽出時の有機溶媒も同様のものを使用することが好ましい。
【００３４】
従来の微生物のうち、例えば、クルブロマイセス  ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）  ＮＢＲＣ  １０９０株は、高いグルコシルセラミド生産性を有することが知られている。そして、ＪＰＣＣＹ０００４は、クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株よりもさらに高いグルコシルセラミド生産性を有する。これは、ＪＰＣＣＹ０００４が、クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株同等以上の、一菌体あたりのグルコシルセラミド生産性を有し、さらに、クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株よりも増殖能に優れることが理由であると推測される。
【００３５】
ＪＰＣＣＹ０００４は種々のグルコシルセラミドを生産する。そのうち生産量が多い代表的なものとして、下記式（１）で表されるものが例示できる。
そして、ＪＰＣＣＹ０００４が生産するその他のグルコシルセラミドとしては、下記式（１）中のスフィンゴシン骨格に由来する炭化水素基の種類が異なるもの、脂肪酸骨格に由来する炭化水素基の種類が異なるもの、あるいは構造式中のいずれかの基の立体配置が異なるものが例示できる。ここで、「炭化水素基の種類が異なる」とは、例えば、炭素数、側鎖の有無、側鎖の位置、二重結合の有無、二重結合の位置等が異なることを指す。
クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株も、同様のグルコシルセラミドを生産することが知られている。
【００３６】
【化２】
2010022217.tif 000009
【００３７】
ＪＰＣＣＹ０００４は、酵母の一種であり、容易に大量培養でき、しかもグルコシルセラミドの生産性が高い。また、生産されたグルコシルセラミドの分離も容易である。したがって、本発明によれば、高品質のグルコシルセラミドを簡便且つ大量に製造でき、安価なグルコシルセラミドを提供できる。
【実施例】
【００３８】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００３９】
＜ＪＰＣＣＹ０００４を使用したグルコシルセラミドの製造＞
［実施例１］
（グルコシルセラミドの定量）
酵母エキス１質量％、バクト  ペプトン（Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ）２質量％、グルコース２質量％、バクト  アガー（Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）１質量％を含有する固形培地を使用して２日間、試料を静置培養し、コロニー形成が確認された酵母（アルカリ耐性株）１８株を選別した。これらの中には、ＪＰＣＣＹ０００４が含まれていた。
次いで、酵母エキス１質量％、バクト  トリプトン（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ）２質量％、グルコース２質量％、塩化ナトリウム２質量％を含有し、ｐＨを１０に調整した液体培地５０ｍｌを使用して、５００ｍｌの坂口フラスコ中で上記１８株の酵母を３０℃、１２０ｒｐｍの条件で４８時間振とう培養した。振とう培養後、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで菌体を回収し、さらに蒸留水で２回洗浄した。得られた菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体の質量を測定した。
得られた乾燥菌体１００ｍｇに対して、クロロホルム／メタノール（１／１， ｖ／ｖ） １ｍｌと、０．８Ｍ水酸化カリウム水溶液１ｍｌを加え、５分間超音波によりホモジナイズした後、４２℃で３０分間インキュベートした。次いで、クロロホルム２．５ｍｌと水１．１２ｍｌを加えて混合した後、有機層を分取し、エバポレーターを使用して４０℃で減圧乾固後、凍結乾燥した。得られたサンプルをクロロホルム／メタノール（２／１， ｖ／ｖ）１００μｌに溶解させ、そのうち１０μｌをＴＬＣ分析し、オルシノール硫酸試薬（硫酸／水／エタノール（５／１３／２７，ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶液４５ｍｌにオルシノール０．１ｇを溶解させた試薬）を噴霧後、ホットプレートを使用して１１０℃で５分間加熱し、呈色させた。この時、ＴＬＣの展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／水（６５／１６／２，ｖ／ｖ／ｖ）を使用した。さらに、グルコシルセラミドの標準物質として、下記式（２）で表される大豆由来の粉末グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ）をクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）に溶解させたものを使用した。また、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅを使用してスポットの大きさとその呈色の平均強度を求め、これらを掛け合わせてスポットの呈色強度を算出することで、検量線を作成した。そして、この検量線を使用して、乾燥菌体１ｇあたりから抽出可能なグルコシルセラミドを定量した。
【００４０】
【化３】
2010022217.tif 000010
【００４１】
定量結果より、ＪＰＣＣＹ０００４の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり７．５ｇであり、ＪＰＣＣＹ０００４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．４６ｍｇであることが確認された。以上より、ＪＰＣＣＹ０００４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり３．５ｍｇであることが確認された。
【００４２】
（グルコシルセラミドの同定）
得られたグルコシルセラミドの構造を、下記二種類の手法で決定した。
（１）ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
グルコシルセラミドの標準物質として、前記式（２）で表される大豆由来の粉末グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ）を使用し、検出条件を最適化した。
具体的には、前記大豆由来グルコシルセラミドをクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）に溶解させ、濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調整し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、正イオンモードの条件で、ＥＳＩ−ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析では、衝突エネルギーを３０％から７０％まで５％間隔で増大させ、そのスペクトルパターンから、グルコシルセラミドの構造を最も正確に反映したスペクトルが得られるエネルギーを決定することで、検出条件を最適化した。
【００４３】
（２）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
上記グルコシルセラミド定量時に調製したサンプル２０μｌを使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。分析には、前記大豆由来のグルコシルセラミドと、下記式（３）で表されるグルコシルセラミドＣ１２β−Ｄ−ＧｌｕｃｏｓｙｌＣｅｒａｍｉｄｅ（Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ）の化学合成品を使用した。カラムとしてはＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｏｎｄｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩ．Ｄ×２５０ｍｍＬ）を使用した。また、移動層Ａとして５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル／メタノール／酢酸（９７／２／１，ｖ／ｖ／ｖ）、移動層Ｂとして５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノール／酢酸（９９／１，ｖ／ｖ／ｖ）を使用し、下記グラジエント条件（Ａ．Ｈ．Ｍｅｒｒｉｌｌ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００５参照）で、移動層の流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとし、正イオンモードで検出を行った。
グラジエント条件：０％Ｂ（０分）−０％Ｂ（５分）−１０％Ｂ（７．５分）−１０％Ｂ（１２分）−１８％Ｂ（１６分）−１８％Ｂ（２２分）−１００％Ｂ（２６分）−停止（２６．０１分）。「％」はいずれも「容量％」を示す。
ＭＳ／ＭＳ分析の親イオンとしてはナトリウム付加物のイオンを選択し、衝突エネルギーを４０％に設定した。そして、最適化した検出条件に基づいて対象酵母由来の脂質を含むサンプル２０μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
【００４４】
［実施例２］
液体培地中の塩化ナトリウムの含有量を０．５質量％としたこと以外は、実施例１と同様に、グルコシルセラミドを製造した。
その結果、ＪＰＣＣＹ０００４の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり８．４ｇであり、ＪＰＣＣＹ０００４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．３９ｍｇであることが確認された。以上より、ＪＰＣＣＹ０００４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり３．３ｍｇであることが確認された。
【００４５】
［実施例３］
液体培地中の塩化ナトリウムの含有量を１質量％としたこと以外は、実施例１と同様に、グルコシルセラミドを製造した。
その結果、ＪＰＣＣＹ０００４の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり８．０ｇであり、ＪＰＣＣＹ０００４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．３９ｍｇであることが確認された。以上より、ＪＰＣＣＹ０００４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり３．１ｍｇであることが確認された。
【００４６】
［実施例４］
液体培地中の塩化ナトリウムの含有量を１．５質量％としたこと以外は、実施例１と同様に、グルコシルセラミドを製造した。
その結果、ＪＰＣＣＹ０００４の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり７．５ｇであり、ＪＰＣＣＹ０００４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．４０ｍｇであることが確認された。以上より、ＪＰＣＣＹ０００４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり３．０ｍｇであることが確認された。
【００４７】
［実施例５〜８］
塩化ナトリウムを含有させず、ｐＨを所定の値に調整した液体培地を１０ｍｌ使用し、３０℃、１３５ｒｐｍの条件で４８時間振とう培養したこと以外は、実施例１と同様に、グルコシルセラミドを製造した。前記液体培地のｐＨは、それぞれ７（実施例５）、８（実施例６）、９（実施例７）及び１０（実施例８）とした。そして、培養液１ＬあたりのＪＰＣＣＹ０００４の乾燥菌体量、ＪＰＣＣＹ０００４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量、及びＪＰＣＣＹ０００４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性について、いずれも実施例５を１００％とした場合の相対値を求めた。結果を表７に示す。
【００４８】
表７から明らかなように、液体培地のｐＨを１０とした場合に、培養液１Ｌあたりのグルコシルセラミドの生産性が最も高かった。一方、液体培地のｐＨを９とした場合に、培養液１Ｌあたりの乾燥菌体量が最も高く、当該ｐＨがＪＰＣＣＹ０００４の生育に最も適していることが確認された。
【００４９】
【表７】
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【００５０】
［比較例１］
＜クルブロマイセス  ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）  ＮＢＲＣ  １０９０株を使用したグルコシルセラミドの製造＞
ＪＰＣＣＹ０００４の代わりに、クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株を使用したこと以外は、実施例１と同様にグルコシルセラミドを製造し、得られたグルコシルセラミドの構造を確認した。クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した。
その結果、本菌株の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり４．８ｇであり、本菌株の乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．４２ｍｇであることが確認された。以上より、本菌株の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり２．０ｍｇであることが確認された。
【００５１】
上記結果より、ＪＰＣＣＹ０００４は、クルブロマイセス  ラクチス  ＮＢＲＣ  １０９０株よりもグルコシルセラミドの生産性が高いことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、化粧品や健康食品の製造に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＪＰＣＣＹ０００４の２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を使用して得られた分子系統樹を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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