(57)【要約】【課題】ミクロ粒子に標識付けされた蛍光物質を検出するための方法及び装置を開示する。【解決手段】本装置は、ミクロ粒子を移送して選択された箇所を通すための単一の毛管流搬送システムと、ミクロ粒子に標識付けされた蛍光物質を照射するための電磁照射のソースと、選択された箇所で蛍光物質から発光する蛍光性の光を計測するための検出機器とから成る。本方法は、ミクロ粒子を選択された箇所まで移送する段階と、ミクロ粒子に対して標識付けされた蛍光物質を照射する段階と、選択された箇所で前記蛍光物質から発光される蛍光性の光を測定する段階とから成る。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中のミクロ粒子を検出するための装置であって、ミクロ粒子は蛍光基質で標識付けされ、蛍光物質は電磁照射に曝されると蛍光性の光を放射する、そのような装置において、毛管室と、前記ミクロ粒子と流体を前記毛管室へ導入可能な、前記毛管室に連結された流体送出システムと、前記蛍光物質を電磁照射にさらすために前記毛管室の近傍に配置された電磁照射のソースと、前記ミクロ粒子が毛管室にあるときに前記蛍光物質から発光する蛍光性の光を計測するように構成されている検出機器とから成ることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記ミクロ粒子が、微生物であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ミクロ粒子が、細菌、ウィルス、又は寄生虫であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記ミクロ粒子が、ＣＤ４細胞であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記ミクロ粒子が蛍光球体であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記蛍光球体が、フィルトロフィーダーにより摂取されていることを特徴とする、上記請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記フィルトロフィーダーが、流体サンプル中の毒性レベルに感応する捕食速度を有していることを特徴とする、上記請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記蛍光物質が染色接合抗体であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記蛍光物質がＤＮＡ着色剤であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記蛍光物質が磁荷を有することを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記毛管の周囲にあるように配置された、蛍光物質をはねつける磁荷を有する磁気要素を更に含んでいることを特徴とする、上記請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記流体送出システムが、注入器ポンプに連結された注入器であることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記流体送出システムが、ぜん動式のポンプであることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記電磁照射のソースが少なくとも１個のレーザーであることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記検出機器が、検出器のアレーであることを特徴とする、上記請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
ミクロ粒子に対して標識付けされた蛍光物質を検出するための装置において、前記ミクロ粒子を移送して選択された箇所を通すための単一の毛管流搬送システムと、前記ミクロ粒子に対して標識付けされた物質を照射するための電磁放射のソースと、前記選択された箇所で前記物質から発光される蛍光性の光を測定するための検出システムとから成ることを特徴とする装置。
【請求項１７】
前記電磁放射のソースが、光のソースから成ることを特徴とする、上記請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記光のソースが、レーザーから成ることを特徴とする、上記請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
複数のミクロ粒子が、実質的に均一な速度で、独立して移送され選択された箇所を過ぎることを特徴とする、上記請求項１６に記載の装置。
【請求項２０】
前記ミクロ粒子が生物であることを特徴とする、上記請求項１６に記載の装置。
【請求項２１】
前記ミクロ粒子が蛍光球体であることを特徴とする、上記請求項１６に記載の装置。
【請求項２２】
前記蛍光球体が、フィルトロフィーダーにより摂取されることを特徴とする、上記請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記フィルトロフィーダーを毒性物体に曝すためのデバイスを更に含んでいることを特徴とする、上記請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記蛍光物質がフィルトロフィーダーにより摂取され、フィルトロフィーダーを毒性物質に暴露することが、フィルトロフィーダーによる蛍光物質の摂取の速度に影響を及ぼすことを特徴とする、上記請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記摂取速度を、選択された箇所における前記蛍光物質から発光される蛍光性の光の量の関数として計算するための手段を更に含んでいることを特徴とする、上記請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記蛍光物質が磁荷を有することを特徴とする、上記請求項１６に記載の装置。
【請求項２７】
前記選択された箇所の周囲にあるように配置された、蛍光物質をはねつける磁荷を有する磁気要素を更に含んでいることを特徴とする、上記請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
蛍光物質の標識を付けられたミクロ粒子を検出するための方法において、前記ミクロ粒子を選択された箇所まで移送する段階と、前記ミクロ粒子に対して標識付けされた蛍光物質を照射する段階と、前記選択された箇所で前記蛍光物質から発光される蛍光性の光を測定する段階とから成ることを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記ミクロ粒子が、細菌であることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ミクロ粒子が、ウイルスであることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ミクロ粒子が、寄生虫シストであることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ミクロ粒子が、ＤＣ４細胞であることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ミクロ粒子が、蛍光球体であることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記蛍光球体が、フィルトロフィーダーにより摂取されていることを特徴とする、上記請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フィルトロフィーダーが、流体サンプル中の毒性レベルに感応する捕食速度を有していることを特徴とする、上記請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記蛍光物質が、染色接合抗体であることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光物質が、磁荷を有していることを特徴とする、上記請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体サンプル中のミクロ粒子を検出するための方法及び装置に関する。より厳密には、本発明は、流体送出システムとレーザー蛍光検出システムを使って、流体サンプル中にある濃度の低い蛍光標識付けされたミクロ粒子を検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
流体中に低濃度で存在する微生物を検出することは、患者の疾病をより良好に処置したり、致命的疾病の突発的流行を予防したり、食物、飲み物、及び医薬品の製造工場での品質管理処理をより良好に遂行したり、科学者に分析研究器具を強力に且つ容易に使用できるようにさせるに当たり、微生物汚染に対する回答をより速やかに提供するための決定的な要素である。
【０００３】
結核菌、膣トリコモナス、カンピロバクター、サルモネラ菌、大腸菌、及びサイクロスボラ等の微生物に関する検査方法には、増殖培養法、ＰＣＲ法、蛍光強化顕微鏡的視覚化、ＡＴＰ生物発光技術、及びバクトメータが含まれる。これらの方法は、時間がかかり高価な上検出能力に限界があることがしばしばである。
【０００４】
検査機器には、エピ蛍光顕微鏡、蛍光測定器、及びフローサイトメーターが含まれる。エピ蛍光顕微鏡を冷却されたＣＣＤ高解像度カメラに連結すると、顕微鏡的微粒子のエピ蛍光顕微鏡的視覚化ができるようになる。蛍光測定器は、検出能力に限界があり、また多くの生物個体群のスペクトル識別が必要とされるときにはあまり適さない。生対死の生物識別が必要とされる事例がしばしばある。フローサイトメーターは、免疫蛍光検査法で死んだ粒子又は生きている粒子を検出し識別するに際しては非常に正確である。しかしながら、フローサイトメーターは高価であり、熟練した技術者または科学者がそれを操作してデータを解釈することが必要である。
【０００５】
クリプトスポリジウムオーシスト及びジアルジアシストは、免疫蛍光検査分析（ＩＦＡ）手法を使って検出することができる。この方法ではポリクロナール抗体を使ってシストを着色し、そのシストを次にエピ蛍光鏡検法により検出する。この方法は、熟練技術者により多数の粒子をエピ蛍光鏡検法で検査しなければならないことを考えると、極端に労働集約的である。フローサイトメーターを使用してもよいが、非常に高価であり、操作に当たっては経験を積み十分に訓練された技術者を必要とする。更に、フローサイトメーターは、オーシスト識別には依然として鏡検法による確認を必要とする。
【０００６】
水質モニタリングは、農業用、工業用、及び人間が消費するための非汚染水の供給管理に絶対に必要である。水質モニタリングには、真水毒性のインジケータとして、例えばファットヘッドミノウ、ピメフェイルプロメラス、枝角類セリオダフニアドゥビア、及び緑藻類セレナストラムカプリコルヌイアム等の検査生物を使って行ってもよい。検査生物は標準条件下で培養され、ある期間中毒性に曝される。対照生物に対する検査生物の生存及び繁殖速度を比較すれば、水の毒性が表示できる。細菌酵素活性は、裂けると蛍光状態になる特別に設計された酵素基質を用いて水質を推定するのに使用される。この基質は細菌の酵素により裂かれ、特定の波長の光に曝されると蛍光性の光を放つ。酵素活性の速度は、蛍光測定器を用いて計測され、細菌上の毒性侵襲レベルの間接的な測定値を示す。
【０００７】
動物プランクトンの捕食習性も水質を評価するために使用することができる。
【０００８】
広範にわたる急性毒性研究が、概括的にはプランクトンを使って、厳密には様々なワムシを使って行われてきた。ワムシの捕食と繁殖速度は高速毒性評価ツールとして使うことができる。淡水に関してはワムシ、ブラキオナスカリシフローラスの捕食と繁殖速度について、海水に関してはブラキオナスプリカチリスの捕食と繁殖速度について、キシレン、カドミウム、銅、水銀、及びジアザノンを始めとして広範囲の化学物質の影響がもっぱら研究されてきた。捕食速度法では、ワムシは毒物を含んだ水に対して数分間曝され、次に蛍光的に印の付けられたビーズ上で捕食できる状態にさせられる。ワムシは、それから麻酔をかけられ、洗浄されて、顕微鏡スライドに移されて、蛍光顕微鏡を使って個別に検査される。捕食速度は、個々のワムシの消化管中の摂取されたビーズの蛍光輝度を画像技術を駆使して計量することにより推定される。この方法は熟練作業者と、カメラと、蛍光顕微鏡を必要とし、時間の掛かる高価なものとなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
必要とされているものは、有害微生物のようなミクロ粒子を検出して水質を評価するための、迅速、敏感で、再現性があり、実質上自動的で、且つ費用効率の良い方法と装置である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ミクロ粒子に対して標識付けされた蛍光物質を検出するための装置を提供する。本装置は、選択された場所を通ってミクロ粒子を移送するための単一の毛管流搬送システムと、ミクロ粒子に対して標識付けされた物質を照射するための電磁放射のソースと、選択された場所で物質から放射される蛍光性の光を測定するための検出システムとから成る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、サンプル準備システムを示す。
【図２Ａ】流れ搬送システムを示す。
【図２Ｂ】毛管の２通りの実施例の詳細図である。
【図２Ｃ】毛管の２通りの実施例の詳細図である。
【図３Ａ】レーザー蛍光測定装置の１実施例を示す。
【図３Ｂ】レーザー蛍光測定装置の別の実施例を示す。
【図３Ｃ】レーザー蛍光測定装置の更に別の実施例を示す。
【図４Ａ】デジタル処理ユニットのサンプル出力を示す。
【図４Ｂ】デジタル処理ユニットの別のサンプル出力を示す。
【図５Ａ】ミクロ粒子に標識付けするために使用される様々な蛍光シアン化合物染料に関する発光スペクトルを示す。
【図５Ｂ】他の蛍光で印を付けられたミクロ粒子が存在する場合に、Ｃｙ５標識を付けられたミクロ粒子を検出するための信号処理戦略のフローチャートを示す。
【図６Ａ】本発明の装置を使用して、既知量２μｍの蛍光球体が混入された水のサンプルから得られるキャリブレーションカーブを示す。
【図６Ｂ】粒子濃度の粒子到着速度分布（ポアッソン統計モデル）への依存度のグラフを示す。
【図６Ｃ】積分された検出蛍光信号対ＳＹＴＯTM６０大腸菌濃度の展開のグラフを示す。
【図７Ａ】３種類の異なる生物濃度についての分析的モデルによる、正規化されたビード濃度対捕食時間を示す。
【図７Ｂ】５００ワムシ／ｍｌのワムシ濃度を使用して、１ｐｐｍのジアザノンを含有する試験サンプルと対照サンプルについての、正規化された蛍光球体濃度対捕食時間を示す。
【図７Ｃ】６００ワムシ／ｍｌのワムシ濃度を使用して、1ｐｐｍのジアザノンを含有する試験サンプルと対照サンプルについての、正規化された蛍光球体濃度対捕食時間を示す。
【図７Ｄ】６００ワムシ／ｍｌのサンプルと、１０００ワムシ／ｍｌのサンプルについての、正規化された蛍光球体濃度対捕食時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１は、サンプル準備システム１００を示す。サンプル準備システム１００はミクロ粒子１０４を含有している疑いのある流体サンプル１０２を含む。流体サンプル１０２は、フィルタ又はトラップを通して不要物もしくは顕微鏡的粒子状物体を取り除く。検査するサンプルを準備するために、蛍光物体１０６を流体サンプル１０２及びミクロ粒子１０４と反応させる。蛍光物体１０６は、着色したり、標識付けしたり、またそうでなければミクロ粒子１０４に取り付くようになっている、１つ又はそれ以上の蛍光着色剤、染料、又は試薬であってもよい。試験サンプル１０８は、流体サンプル１０２から遊離残留蛍光物体を濾過分離することにより得られる。試験サンプル１０８は、こうして、流体サンプル１０２とミクロ粒子１０４に付着した蛍光物体１０６を含有する。
【００１３】
流体サンプル１０２は、水サンプル、尿サンプル、血液サンプル、食料品サンプルでもよいし、又は検査されるものなら他のどんな流体であってもよい。流体サンプル１０２は、ＨＩＶのようなウイルス検出用にＰＣＲ増幅されたサンプルを含有していてもよい。ミクロ粒子１０４は、結核菌、膣トリコモナス、カンピロバクター、サルモネラ菌、大腸菌、サイクロスポラ、クリプトスポリジウムオーシスト、ジアルジアシスト又は標識付けが可能な他の何れの細菌、ウイルス、真菌、微生物であってよい。ミクロ粒子１０４は又、ＡＩＤＳ患者をモニターするためのＣＤ４又はＣＤ８細胞であってもよい。異なる型の微生物を検出し互いに区別できるようにするためには、異なる蛍光物体１０６を用いてもよい。例えば、細菌に関しては、蛍光物体１０６は標準ＤＮＡ又は表面ラベル試薬着色剤でもよい。クリプトスポリジウムオーシスト又はジアルジアシストに関しては、蛍光物体１０６は、それぞれ抗クリプトスポリジウム抗体又は抗ギアルジア抗体と接合した蛍光染料でもよい。蛍光物体１０６は、磁界により影響を受けるように磁荷を帯びていてもよい。
【００１４】
ミクロ粒子１０４は、蛍光物体１０６を含有する顕微鏡的ビーズでもよい。流体サンプル１０２中の毒物濃度を測定するためには、ワムシ又は動物プランクトンなどのフィルトロフィーダ微生物をサンプル１０２に既知の量だけ加えてもよい。このようなフィルトロフィーダ微生物は、毒物濃度の既知の関数である捕食速度を有する。既知の培養期間の後、ミクロ粒子１０４は流体サンプル１０２に加えられる。ミクロ粒子１０４は、オレゴン州、ユージンのモレキュラプローブ社から入手可能な蛍光染料を含有しているラテックスビーズのような、フィルトロフィーダ微生物が摂取することのできる蛍光球体であってもよい。蛍光球体は２μｍの均一直径であってもよいし、サイズが非均一でもよい。それらは、最大吸収波長が６２４ｎｍで最大発光波長が６４５ｎｍの均一な分光光度特性を有していてもよいし、多様な分光光度特性を有していてもよい。試験サンプル１０８は、既知の時間間隔でサンプル準備システム１００から引き出される。試験サンプル１０８は、流体サンプル１０２から摂取されなかったミクロ粒子１０４を濾過分離することにより得られる。試験サンプル１０８は、このように水サンプル１０２と消化管にミクロ粒子１０４が付いた微生物１０４とを含んでいる。
【００１５】
図２Ａは、流れ搬送システム２００を示す。流れ搬送システム２００は、試験サンプル１０８を毛管２０２に導入する流体送出システムである。毛管２０２は非常に薄い壁と優れた光学特性を有している。毛管２０２は、微生物１０４が１度に１個ずつ入るように作られた内径を有する。毛管２０２の断面は試験容積２０４を規定する。毛管２０２は、少なくとも一部が、毛管をその場に保持する役目を負う光学テーブル２０６に連結されている。処理量を増やすため、多数の毛管２０２を並列に配置してもよい。
【００１６】
流れ搬送システム２００は、毛管２０２に連結されたポンプシステム２１６を含んでいてもよい。ポンプシステム２１６は、試験サンプル１０８を含む注入器２０８であってもよく、試験サンプル１０８を毛管２０２と試験容積２０４を通るように注入する。毛管２０２を通過した後、サンプル１０８はダンプ２１２に入る。この方法で、試験サンプル１０２中のミクロ粒子１０４は１度に１個ずつ毛管２０２を通過する。ポンプシステム２１６は、注入器２０８に連結された注入器ポンプ２１４を更に含んでいてもよい。注入器ポンプ２１４は、試験サンプル１０８が毛管２０２中を通る流量を精密に制御するように作られている。ポンプシステム２１６は、ぜん動型ポンプであってもよい。
【００１７】
図２Ｂと２Ｃは、毛管２０２の２通りの実施例の詳細図を示す。図２Ｂは、毛管２０２を通って試験容積２０４に向かって流れるミクロ粒子１０４を示す。図２Ｃは、磁気要素２２０が毛管２０２周りに同軸に配置された状態の毛管２０２を示す。磁気要素２２０は、連続リングであってもよいし、又は１個またはそれ以上の別々の要素から成ってもよい。磁気要素２２０は磁荷を帯びたミクロ粒子１０４及び蛍光物体１０６と結びつけて使用してもよい。この構成により、蛍光物体１０６で標識付けされたミクロ粒子１０４は、試験容積２０４を流れ抜ける際に毛管２０２の中心に実質的に集束されるので、こうしてミクロ粒子１０４の検出性が向上する。
【００１８】
図３Ａは、レーザー蛍光測定装置３００を示す。レーザー３０２は、レーザー光線３０４を生成する。レーザー光線３０４は、１個又はそれ以上のレンズ３０６を介して試験容積２０４上に集束される。レーザー３０２の波長と光束サイズは、蛍光物体１０６の吸収波長と毛管２０２のサイズに従って選択される。
【００１９】
試験サンプル１０８が試験容積２０４を通過するとき、試験サンプル１０８中に存在する蛍光物体１０６は何れもレーザー光線３０２に曝される。代わりに毛管２０２中の定在試験サンプル１０８をレーザー光線３０２に対して移動させ、試験サンプル１０８を曝すようにしてもよい。集合レンズ３１０は、蛍光物体１０６により発光される蛍光性の光を光電子増倍管３１２上に集めて像を映す。蛍光性の光から共振光を濾過分離するために、干渉フィルタのセット３１４を光電子増倍管３１２の前に置いてもよい。その共振光を集めるために、試験室３０８の反対側にフォトダイオード３１６を置いてもよい。光電子増倍管３１２からの出力は、蛍光のピークを分析するために第１デジタル処理ユニット３１８に送られる。フォトダイオード３１６からの出力は、ミー散乱ピークを分析するために第２デジタル処理ユニット３２０に送られる。
【００２０】
図３Ｂは、もう１つのレーザー蛍光測定装置３００を示す。この場合には、蛍光発光は回折格子３１３を通り抜けて、多重検出器アレー３１５上に像を結ぶ。集合レンズ３１０の焦点距離と口径、格子３１３の分散特質、及びアレー状の多重検出器３１５のサイズと分離は、共振光の他にも蛍光物体１０６の発光スペクトルに特有の少なくとも２個又は３個の蛍光発光帯を検出するために最適化される。干渉フィルタのセット３１７は、ミクロ粒子１０４を標識付けするため使われる蛍光物体１０６の蛍光発光を選抜するために用いることもできる。特定の伝送特性を有する多重干渉フィルタ３１７を使用して、多数のスペクトル箇所で蛍光発光を読み取ることにより、使用される特定の蛍光物体１０６を検出、識別することができる。各検出器への総蛍光信号の寄与により、特定の蛍光物体１０６を標識付けされていない粒子の蛍光発光と区別するために必要なデータが提供される。多重検出器アレー３１５からの出力はデジタル処理ユニット３１８に供給され、このユニットは多重検出器アレー３１５により送出された多数の信号を処理してデジタル化する。
【００２１】
図３Ｃは、レーザー蛍光測定装置３００のもう１つの実施例を示す。複数のレーザー３０２が複数のレーザー光線３０４を生成する。レーザー光線３０４は１個又はそれ以上のレンズ３０６を介して試験容積２０４上に集束される。レーザー光線３０４のサイズは、毛管２０２のサイズに整合している。レーザー３０２の波長は、蛍光物体１０６に特有の吸収帯と同調している。この多数レーザー及び検出器システムは、単一のレーザーシステムに付きまとう間違った正及び負の結果を減少させるのを支援する。
【００２２】
図４Ａは、デジタル処理ユニット３１８からのサンプル出力を示す。光電子増倍管３１２から出てくる電圧信号は、デジタル化されコンピュータに送信され、そこで操作と分析が行われる。電圧信号は、３０００Ｈｚまでの周波数で８ビット精度でデジタル化される。
【００２３】
蛍光物体１０６が試験容積２０４を通過する度毎に、蛍光ピーク４０２が現れる。閾値４０４はベースライン信号レベルとその分散に従って選択される。電圧スパイクのサイズと共に閾値を超えて検出された蛍光ピーク４０２の数により、蛍光物体１０６の量の測定が行われる。毒物濃度の場合は、このデータを汚染されていない基準サンプルについてのデータと比較すれば、水サンプル１０２中の毒物濃度を求めることができる。
【００２４】
図４Ｂはデジタル処理ユニット３１８からのもう１つのサンプル出力を示す。蛍光物体１０６により標識付けされたミクロ粒子１０４が試験容積２０４を通過するとき、時間シグネチャ４０６とスペクトルシグネチャ４０８付きの蛍光性の光のバーストを生成する。時間シグネチャ４０６及びスペクトルシグネチャ４０８は、次にデジタル信号処理ユニット３１８により処理され、検出されるべきミクロ粒子１０４及び蛍光物体１０６の予測される時間及びスペクトルシグネチャと比較される。
【００２５】
広範囲の粒子と微生物は、生来的に、広範囲の波長で蛍光性があるので、ミクロ粒子をスペクトルで区別して確実にそれを検出するのは至難の業である。多数のレーザーソースと検出器は、検出の標的にされたミクロ粒子に付着した染料の蛍光パターンのスペクトル的ピンポイントに近い近似波長で使用してもよい。電子信号分析技術は、検出に先立ち、標的ミクロ粒子の事前に定義された形状とスペクトル特性の理解に合わせた特別仕様にすることができる。
【００２６】
多数の信号を使用すれば正規化が行えるし、選択度が改善される。２個以上の蛍光発光波長及び／又は２個以上の励起波長で計測すれば、異なる染料源を区別することができるスペクトル選択度が得られる。免疫蛍光のために使われる染料は、バックグラウンドの蛍光源に比較すると比較的狭い発光ピークを有するのが普通であるので、オンピーク時信号対オフピーク時信号の割合によって、染料で印された粒子を同じ絶対蛍光度がバックグラウンドで起きてもそれらと正確に区別できる。
【００２７】
バックグラウンド粒子信号は、電子フィルタリングの使用を介して排除され、これにより持続性のある非常に早いデータサンプリング速度が可能になる。電子フィルタリングには数器の検出器の使用が伴い、粒子の光分散シグネチャの特異性と少なくとも２個の蛍光波長シグネチャの存在により実現される。検出されたログ増幅信号の各々の差分信号解析に基づき、標識付けされたミクロ粒子を５０ｋＨｚまでのデータ周波数速度で選抜する能力が実現される。
【００２８】
図５Ａは、ミクロ粒子１０４を標識付けするために使うことのできる様々な蛍光シアン化合物着色剤の発光スペクトルを示しており、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７はそれぞれ最大吸収ピークが６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７４３ｎｍである。多重検出器アレー３１８は、最初に特定染料の蛍光スペクトルを記録するのに使うことができる。サンプル中の標識付けされたミクロ粒子１０４により発光される蛍光スペクトルは、次に染料の記録された蛍光スペクトルと比較される。このやり方では、標識付けされたミクロ粒子１０４は、識別されて、他の蛍光的に標識付けされたミクロ粒子１０４から区別される。更に、流量が制御されるので、追跡信号の幅は試験容積２０４を横切るミクロ粒子１０４の直径に比例すると考えられる。
【００２９】
図５Ｂは、他の蛍光印の付いたミクロ粒子が存在する状況でＣｙ５標識付けされたミクロ粒子１０４を検出するための信号処理戦略のフローチャートを示す。４器の検出器が使用されている。検出器Ｄ１は共振レーザー励起に中心合わせされており、この事例では６３５ｎｍである。検出器Ｄ２、Ｄ３及びＤ４は、Ｃｙ５蛍光発光の特性に対応して、６５０ｎｍ、６７０ｎｍ、及び６９０ｎｍで中心合わせされている。
【００３０】
ミクロ粒子１０４が試験容積２０４で検出されると、まず、検出器Ｄ１により検出された信号の時間履歴が分析され（ブロック５０２）、信号強度Ｓ１及びパルス幅Ｗ１が、試験容積内の特定のミクロ粒子の経路により生成される予測時間履歴（Ｓｃ，Ｗｃ）と比較される（ステップ５０４）。検出された信号がこの判定基準に合致しなければ、そのデータは排除される（ステップ５０６）。検出された信号がこの第一試験を通過すれば、検出器Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４の蛍光輝度比率が分析される（ブロック５０８）。Ｓ２／Ｓ３及びＳ２／Ｓ４の蛍光比率が、Ｃｙ５蛍光スペクトルＳｃａ及びＳｃｂそれぞれに対応する予測蛍光比率と比較される（ブロック５１０）。これら２通りの試験が肯定的であれば、ミクロ粒子が家運とされ（ブロック５１２）、試験の結果が否定的であればデータは排除される（ブロック５１４）。
【００３１】
事例１
フロー搬送システムシステム１００を既知の蛍光濃度を持った水サンプルを使用して較正した。３ｘ１０9ビーズ／ｍｌの基準溶剤を１０００倍に希釈した。次に、０、３、５００、７０００、１４０００、２８０００ビーズ／ｍｌを含有する水サンプルを、２０μｌマイクロピペットを使って１０％の信頼度で準備した。これらの水サンプルを装置に通した。図６Ａは、検出された蛍光ピーク計数対較正サンプルの予想計数を示す。優れた相関関係が一貫して入手できた。
【００３２】
１０7大腸菌ＳＹＴＯTM６０ＤＮＡ着色済みの基準サンプルを、最初に７０％のイソプロパノールを用いて１時間曝して細菌を死滅させ、次に滅菌洗浄を３回行うことによって準備した。大腸菌の細菌個体群を次に５μｍｏｌ濃度のＳＹＴＯTM６０着色剤により着色した。ＳＹＴＯTM６０着色剤のスペクトル特性（Ａｂｓ＝６５０ｎｍ、Ｅｍ＝６７８ｍｎ）は、本発明のレーザーをベースにしたシステムに非常によく適合する。
【００３３】
ｍｌ当たり１０7から０までの着色された大腸菌の５等級に分けられた濃度サンプルを、２μｌマイクロピペット及び２μｌ濾過済み非イオン化水を使って準備した。サンプル毎に１００μｌ溶液を、１ｍｌ注入器を使って抜き取った。注入器を注入器ポンプ上に置き、溶液を１０μｌ／分の流量で７０μｍの単一毛管内に試験容積に向かって注入した。蛍光試験容積は、６３５ｎｍ、５ｍＷレーザーダイオードと単一の１０ｍｎ焦点レンズを使って２０μｍの集束されたレーザー光線により規定された。試験容積は、４０倍の対物顕微鏡を使って３ｍｍｘ３ｍｍのスリット上に結像された。光検出器信号は、３０００Ｈｚ、８バイトのダイナミックレンジでデジタル化された。デジタル化された信号は、単一のシリアルケーブルを介してラップトップコンピュータへと送信された。信号は、専有のソフトウェアを使ってウインドウスクリーン上にオンラインで表示された。各サンプルを１０μｌ／分の流量で３０分間注入するのに対応するデータが時系列に記録された。サンプル毎に三重の反復実験が行われたが、これは９０分間の注入に相当する。流量、注入時間、及び予想濃度を制御することにより、予想蛍光ピーク計数が計算され、実測計数と比較された。サンプル毎に、平均ピーク滞留時間、ピーク輝度、及びピークパワー（ピーク積分）も計算された。
【００３４】
粒子が試験容積を横切って到着するプロセスはランダム到着プロセスに従い、従ってポアッソンプロセスに従うものと仮定された。予想計数の数は、粒子がレーザー光線を横切る通過時間に匹敵する時間中に２個以上の粒子が試験容積に到着する可能性を考慮に入れるために、一つの検出計数が２個以上の粒子に帰するはずであるという事実を考えに入れそれに従って修正された。
【００３５】
図６Ｂは、調査された生物濃度についての試験容積への粒子到着速度分布を表している。１０μｌ／分の流量で１０5ｐ／ｍｌより濃度が高い場合には、ポアッソンの統計的修正が必要である。特に、ｍｌ当たり１０7個の大腸菌濃度ではその期間の８０％は試験容積を横切っている大腸菌が２個以上ある。
【００３６】
図６Ｃは、予想濃度と、着色された個々の大腸菌のレーザー試験容積を通る通路に対応する積分された検出蛍光信号との間の相関を表す。積分された信号は、ポアッソン統計学により修正された検出ピークの数と平均ピークパワー（V／ｍｓ）の積として計算された。相関は高く、傾斜９８％である。しかしながら、サンプル中に大腸菌が存在しない時には、３０秒毎に４ピークの積分されたバックグラウンドノイズが検出された。これらのバックグラウンドは、光線反射を光検出器スリットに偏向させるバブルに属する所、もしくは自然蛍光性粒子に属する所でピークとなる。多数の波長検出アレーと光散乱検出器を使用することによりこれらの間違った正の計数を排除できる。
【００３７】
事例２
ワムシを使った水質モニタリングを、内径７０μｍの毛管で、６３５ｎｍの狭帯域を使い、３ｍＷダイオードレーザーで光束直径を４０μｍとして実行した。干渉フィルタは、６７０ｎｍ（２０ｎｍＦＷＭ）で１２％を、そして他の全ての波長では１０―6を透過させるように選択した。
【００３８】
方法
１．フロリダの水産養殖所から、生きているＢプリカチリスワムシ培養物を入手した。このワムシは、飼育が簡単で、捕食、繁殖及び死滅速度への毒性サンプルの影響が広い範囲に亘り研究されていることから選んだ。１００ｍｌバイアル内のワムシの平均濃度は、５個の２０μｌサンプルを５０倍の顕微鏡で検査して数えた。２０μｌサンプル毎に平均１０匹のワムシが計測され、これは５００ワムシ／ｍｌという勘定になる。
２．捕食速度計測を行うために各８ｍｌのサンプル２個を用いた。基準サンプルと試験サンプルである。これら２個のバイアルに５００ワムシ／ｍｌのワムシ溶液を満たした。
３．ｐＨ、Ｏ2、アルカリ度、塩度、及び温度等の水質パラメータをできる限り一定に維持するために、ワムシ媒体溶液を使って２０００ｐｐｍジアザノン溶液を準備した。２０μｌ量のジアザノン溶液を試験サンプルに加えた。
４．５分間定温放置した後、深紅色の蛍光球体の４０ｘ１０6ビーズ／ｍｌ溶液２０μｌを、基準サンプルと試験サンプル両方に加えた。このときの時間をｔ＝０とした。
５．ルアーユニオンで、２０μｍプランクトンフィルタが末端に付く１００μｍ片のナイロンチューブに連結された２個の同じ注入器を使って、５０μｌのサンプルを基準サンプルと試験サンプルとから抽出した。両方共に、生物はビード溶液から濾過分離した。
６．基準サンプルと試験サンプルは、注入器ポンプを使って流量１５μｌ／分で試験室を連続的に通した。手に入れたデータは後の分析に備えて保存した。
７．ステップ５と６を、ｔ＝５、１０、１５、及び２０分で繰り返した。
【００３９】
データ分析
各データファイルは、ＴＯＸＡＮＡTM、即ち時系列データ分析ソフトウェアプログラムを使って検索した。このプログラムは、データファイル毎に０−５Ｖのスケールでデジタル化された光電子増倍管追跡信号の視覚化ができるようになっている。信号のベースライン平均及び分散値の評価を（ピークが検出されない所で）ファイル毎に行った。この測定から、ピーク検出閾値、Ｔdは以下のように算出した。
2010017188.tif 000003
平均ピーク輝度、平均ピーク幅、及び平均ピーク面積の他にも、輝度がＴdを上回るピークの数をファイル毎に算出した。
【００４０】
分析モデル
平均移動度Ωを持つ生物に対するすきま容積ＶC1とすきま直径ｄは次のように仮定できる。
2010017188.tif 000004
（式１）
単位時間当たりのすきま容積に存在するビーズの数は以下のようになる。
2010017188.tif 000005
（式２）
容積Ｖは平均移動度Ωを持つ生物を含有するものと仮定する。この容積内では食物粒子もしくはビーズはＣb（ｔ）である。
単位時間当たりのビード濃度変化は、
2010017188.tif 000006
（式３）
のように変化する。
（１）と（２）を（３）に代入すると、時間経過と共にビード濃度が変化する速度は、以下の微分方程式で表される。
2010017188.tif 000007
（式４）
定数ｋを次のように定義する。
2010017188.tif 000008
（式５）
そうすると、ｌ／ｋは、ビード濃度が下がる速度を反映する時定数である。従って（５）は次のようになる。
2010017188.tif 000009
（式６）
（６）を積分すると次のようになる。
2010017188.tif 000010
（式７）
ｔ＝０で、ＣN＝（ｔ＝０）＝ＣB0のとき（７）は次のようになる。
2010017188.tif 000011
（式８）
捕食速度は、生物毎に単位時間当たりに摂取されるビーズの数と定義され、以下の式で表される。
2010017188.tif 000012
（式９）
（８）と（９）を組み合わせると、Ｆは以下のようになる。
2010017188.tif 000013
（式１０）
ｄ（Ｃd）／ｄｔがＣb（ｔ）に比べて小さいと仮定すれば、Ｆは定数となり以下のように表される。
2010017188.tif 000014
（式１１）
【００４１】
図７Ａは、３通りの異なる生物濃度、即ち１００ワムシ／ｍｌ、２５０ワムシ／ｍｌ、及び１０００ワムシ／ｍｌにつき、数式８で求められたモデルによる、正規化されたビード濃度対捕食時間を示す。この場合捕食速度（ＦＲ）をモデル化するために使用された分析値は１２．７ビーズ／分である。
【００４２】
この値は、以下の仮定、即ち生物がワムシであり、そのすきま割合は移動度１５ｃｍ／秒で１５０μｍ直径の断面に比例するという仮定に基づき計算された。技術の感応度は生物濃度に強く依存しているということに留意することが肝心である。
【００４３】
結果
図７Ｂは、１ｐｐｍのジアザノンを含有している試験サンプルと対照サンプルにつき、正規化された蛍光球体濃度と捕食時間の関係を示している。モデルに対して実験結果を比較するために、５００ワムシ／ｍｌの濃度を使用した。
この対照サンプルに関しては、モデルと実験の間の相関は最初の６００秒に関してはすばらしい。この領域では、平均捕食速度は２９ｘ１０-3ビーズ／秒である。９００秒後にモデルから実験が逸れるのには２つの要因がある。第１に、モデルはＣbの変動がＣbに比較して小さいままで、従って捕食速度は一定であると仮定していることである。実際には、捕食速度は食料濃度に依存しており、９００秒後には５０％下がった。この変動は無視できない。第２に、ワムシは平均消化経過時間が１２００秒だということである。蛍光球体はワムシによって代謝されないので、１０００秒後にはワムシによりサンプル中に吐き戻されてしまい、このことがビード濃度の増加に寄与することになる。
【００４４】
試験サンプルについては、蛍光球体の濃度は、生物当たりの消化速度１０-3ビーズ／秒に比例した傾斜でわずかに下がっている。ここでは、捕食速度は、１ｐｐｍのジアザノンへの暴露から３０係数分下がった。
【００４５】
図７Ｃは、１ｐｐｍのジアザノンを含有している試験サンプルと対照サンプルにつき、正規化された蛍光球体濃度と捕食時間の関係を示している。生物の濃度は、今度は６００ワムシ／ｍｌである。
ここでもまた、対照サンプルに関し、モデルと実験とは最初の６００秒に関してはすばらしい一致を示している。捕食速度は、先に入手した生物当たり１．７ビーズ／分という値と比べ、生物当たり３ビーズ／分である。試験サンプルに関しては、ビーズの濃度は時間が経過してもほとんど変化のないままで、捕食速度は０．０５ビーズ／分未満を指している。この計測は、先の実験と一致する。
【００４６】
図７Ｄは、６００ワムシ／ｍｌサンプルと１０００ワムシ／ｍｌサンプルにつき、正規化された蛍光球体濃度と捕食時間の関係を示している。２個のサンプルを、濃縮された２μｍ蛍光球体に１７００秒間曝した。蛍光球体濃度は、継続してモニターされ、正規化された濃度は報告されて先に述べた隙間割合モデルと比較された。モデルと実験の一致度は、生物当たりの平均捕食速度に対して最適であり、４．８ビーズ／分に等しい。
質量の項で捕食速度を表すと、以下の数式が使え、
2010017188.tif 000015
（数式１２）
ここにＦＲ、ρ、及びＶfluoはそれぞれ、個々のワムシ当たりの平均捕食速度、蛍光球体密度、及び個々の蛍光球体容積である。ここで、捕食速度が４．８ビーズ／分、球形状の蛍光球の密度が１．０５５ｇ／ｍｌで直径が２μｍという場合は、生物当たりＭ−ｄｏｔ＝２１ｘ１０―12ｇ／分である。
【００４７】
本発明に関しこれまで述べてきたのは説明のためである。余すところ無く記したり、本発明を開示された形態に寸分違わず限定することは意図していない。多くの修正や変更が行えることは当業者には自明であろう。本発明の範囲は以下の請求項並びにそれと等価なものによって定義されるものである。
【図１】
2010017188.tif 000016
【図２Ａ】
2010017188.tif 000017
【図２Ｂ】
2010017188.tif 000018
【図２Ｃ】
2010017188.tif 000019
【図３Ａ】
2010017188.tif 000020
【図３Ｂ】
2010017188.tif 000021
【図３Ｃ】
2010017188.tif 000022
【図４Ａ】
2010017188.tif 000023
【図４Ｂ】
2010017188.tif 000024
【図５Ａ】
2010017188.tif 000025
【図５Ｂ】
2010017188.tif 000026
【図６Ａ】
2010017188.tif 000027
【図６Ｂ】
2010017188.tif 000028
【図６Ｃ】
2010017188.tif 000029
【図７Ａ】
2010017188.tif 000030
【図７Ｂ】
2010017188.tif 000031
【図７Ｃ】
2010017188.tif 000032
【図７Ｄ】
2010017188.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月9日(2009.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中のミクロ粒子を検出するための装置であって、ミクロ粒子は電磁照射に曝されると蛍光性の光を放射する蛍光物質で標識付けされる、そのような装置であって、
実質的に一定の壁の厚さ及び実質的に一定の内部断面領域を有する毛管チューブと、
前記ミクロ粒子を含む流体を、前記毛管チューブを介して流すことが可能な、前記毛管チューブに連結された流体送出システムと、
前記毛管チューブの試験容積部を定義し、該試験容積部において前記蛍光物質を電磁照射にさらすために前記毛管チューブを介して電磁波照射のビームを放出する電磁照射のソースであって、ミクロ粒子を含む前記流体が使用時に前記毛管チューブの前記試験容積部を満たす電磁照射のソースと、
前記ミクロ粒子が前記試験容積部を通って流れるときに前記蛍光物質から発光する蛍光性の光を計測するように構成されている検出機器と備えている装置。
【請求項２】
前記毛管チューブが、前記ミクロ粒子を一度に実質的に１つ収容するように構成された内部断面領域を有する請求項１に記載の装置。
【請求項３】
毛管の内部断面領域の大きさに対するミクロ粒子の直径の比率は、約０．００７から約０．０３である請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記ミクロ粒子が、微生物を含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記ミクロ粒子が、細菌、ウイルス又は寄生虫のいずれかである請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ミクロ粒子が、ＣＤ４細胞を含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記ミクロ粒子が、蛍光球体を含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記蛍光物質が染色接合抗体を含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記蛍光物質がＤＮＡ着色剤を含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記流体送出システムが、注入器ポンプに連結された注入器を含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記流体送出システムが、ぜん動式のポンプである請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記電磁照射のソースが少なくとも１個のレーザーを含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記検出機器が、検出器のアレーを含んでいる請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
蛍光物質の標識を付けられたミクロ粒子を検出するための方法であって、
毛管チューブにおいて前記ミクロ粒子を含む流体を選択された箇所まで実質的に一定の速度で移送する段階であって、前記ミクロ粒子を含む前記流体が前記選択された箇所で前記毛管チューブを満たしており、前記毛管チューブは実質的に一定の壁の厚さ及び実質的に一定の内部断面領域を有している、前記移送する段階と、
前記選択された箇所において前記ミクロ粒子に対して標識付けされた蛍光物質を照射する段階と、
前記選択された箇所で前記蛍光物質から発光される蛍光性の光を測定する段階とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ミクロ粒子は、実質的に一度に１つが前記毛管チューブの前記選択された箇所に移送される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ミクロ粒子が、微生物を含んでいる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光物質は、色接合抗体を含んでいる請求項１４に記載の方法。