(57)【要約】【課題】ＬＡＬ試薬、あるいは、生物由来の生理活性物質に汚染されたＬＡＬ試薬等におけるコアギュロゲンの機能を維持したまま凝固酵素活性を不可逆的に不活性化し、試薬に利用可能なコアギュロゲン原料を取得する技術を提供する。【解決手段】ＬＡＬ試薬をある所定温度で所定時間に亘って加熱処理することにより、ＬＡＬ試薬中の酵素活性のみを不可逆的に失活させる。その際、活性化した凝固酵素により加水分解されコアギュリンとなってゲル化や凝集反応を惹起するという、コアギュロゲン本来の活性は維持させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の酵素群とコアギュロゲンとを含んだカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬと、生物由来の所定の生理活性物質とを反応させ、前記生理活性物質によって前記酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによってコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されることを利用して、前記生理活性物質を検出または前記生理活性物質の濃度を測定する際に使用される、コアギュロゲン原料の製造方法であって、
ＬＡＬを所定温度で所定時間に亘り加熱処理することで、該ＬＡＬ中の前記酵素群の少なくとも一部を失活させるとともにコアギュロゲンの活性は維持させることを特徴とするコアギュロゲン原料の製造方法。
【請求項２】
前記ＬＡＬは、溶液として供給され、
前記所定温度は６０℃以上であることと特徴とする請求項１に記載のコアギュロゲン原料の製造方法。
【請求項３】
前記ＬＡＬは、溶液として供給され、
前記所定温度は８０℃以下であることと特徴とする請求項１または２に記載のコアギュロゲン原料の製造方法。
【請求項４】
前記ＬＡＬは、溶液として供給され、
前記所定時間は１０分以上８時間以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のコアギュロゲン原料の製造方法。
【請求項５】
前記ＬＡＬは、凍結乾燥体として供給され、
前記所定温度は１００℃以上２５０℃以下であることを特徴とする請求項１に記載のコアギュロゲン原料の製造方法。
【請求項６】
前記ＬＡＬは、凍結乾燥体として供給され、
前記所定時間は３００分以上であることを特徴とする請求項１または５に記載のコアギュロゲン原料の製造方法。
【請求項７】
所定の酵素群とコアギュロゲンとを含んだカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬと、生物由来の所定の生理活性物質とを反応させ、前記生理活性物質によって前記酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによってコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されることを利用して、前記生理活性物質を検出または前記生理活性物質の濃度を測定する際に使用される、コアギュロゲン原料であって、
ＬＡＬを所定温度で所定時間に亘り加熱処理することで、前記ＬＡＬ中の前記酵素群の少なくとも一部を失活させたことを特徴とするコアギュロゲン原料。
【請求項８】
前記ＬＡＬは、溶液として供給され、
前記所定温度は６０℃以上であることと特徴とする請求項７に記載のコアギュロゲン原料。
【請求項９】
前記ＬＡＬは、溶液として供給され、
前記所定温度は８０℃以下であることと特徴とする請求項７または８に記載のコアギュロゲン原料。
【請求項１０】
前記ＬＡＬは、溶液として供給され、
前記所定時間は１０分以上８時間以下であることを特徴とする請求項７から９のいずれか一項に記載のコアギュロゲン原料。
【請求項１１】
前記ＬＡＬは、凍結乾燥体として供給され、
前記所定温度は１００℃以上２５０℃以下であることを特徴とする請求項７に記載のコアギュロゲン原料。
【請求項１２】
前記ＬＡＬは、凍結乾燥体として供給され、
前記所定時間は３００分以上であることを特徴とする請求項７または１１に記載のコアギュロゲン原料。
【請求項１３】
請求項７から１２のいずれか一項に記載のコアギュロゲン原料と、加熱処理されていないＬＡＬとを混合することで、前記加熱処理されていないＬＡＬにおけるコアギュロゲン濃度を高めたことを特徴とする、前記生理活性物質の検出または前記生理活性物質の濃度測定に使用されるＬＡＬ試薬。
【請求項１４】
請求項７から１２のいずれか一項に記載のコアギュロゲン原料におけるコアギュロゲンを、該コアギュロゲンより大径の多数の微粒子の表面に結合または吸着させて調製されたことを特徴とするエンドトキシンの測定用のコアギュロゲン結合マイクロビーズ。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＬＡＬ試薬と、前記所定の生理活性物質を含む試料とを混和させることで、
前記所定の生理活性物質によって前記ＬＡＬ試薬中の酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによって、濃度が高められた前記コアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されることを利用して、前記所定の生理活性物質を検出または前記所定の生理活性物質の濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載のコアギュロゲン結合マイクロビーズと、加熱処理されていないＬＡＬと、前記所定の生理活性物質を含む試料とを混和させることで、
前記所定の生理活性物質によって前記加熱処理されていないＬＡＬにおける酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによって前記微粒子の表面に結合または吸着したコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解され、前記微粒子同士が架橋されることを利用して、前記所定の生理活性物質を検出または前記所定の生理活性物質の濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載のコアギュロゲン結合マイクロビーズと、加熱処理されていないＬＡＬと、前記所定の生理活性物質を含む試料との混和液を光の入射可能に保持し、前記混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から取得される前記混和液の透過率より前記試料中の前記生理活性物質の濃度を導出する導出手段と、
を備えることを特徴とする攪拌比濁測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの生物由来の生理活性物質の検出または濃度測定を、迅速または高感度に計測するための試薬、その製造法、ならびにそれを用いた測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。
【０００３】
ところで、カブトガニの血球抽出物(以下、「ＬＡＬ : Limulus amoebocyte lysate」ともいう。)の中には、エンドトキシンによって活性化される酵素であるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＬＡＬとエンドトキシンとが反応する際には、エンドトキシンの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＬＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＬＡＬの特性を用いて、エンドトキシンを高感度に検出することが可能である。
【０００４】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
【０００５】
β−Ｄ−グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ−Ｄ−グルカンによって凝固（ゲル凝固）する特性を利用して、β−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。
【０００６】
このエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、カブトガニの血球抽出成分によって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う方法としては、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＬＡＬを元に製造された試薬（ＬＡＬ試薬）とを混和した混和液を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無によりゲル化したかどうかを判定し、試料に一定濃度以上のエンドトキシンが含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。また、ＬＡＬ試薬と所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法や、酵素カスケードにより加水分解されて発色する合成基質を用いる比色法などがある。
【０００７】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セルに測定試料とＬＡＬ試薬との混和液を生成させる。そして、混和液のゲル化を外部から光学的に測定する。しかしながら、比濁法においては特に所定生理活性物質の濃度が低い試料において混和液がゲル化するまでに非常に多くの時間を要する場合がある。これに対し、所定生理活性物質の短時間測定が可能な方法が求められている。測定試料とＬＡＬ試薬との混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル微粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の強度、あるいは、混和液を透過す
る光の強度から、試料中の所定生理活性物質の存在を短時間で測定できるレーザー散乱粒子計測法等が提案されている。
【０００８】
ＬＡＬ試薬はカブトガニの血球抽出物を主原料として製造される。このため、製造上ある確率でエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンが混入してしまい、試薬として利用できない廃棄物となる可能性がある。また、エンドトキシン、あるいは、β−Ｄ−グルカンのいずれの測定法も、測定試薬の原料が有限資源であるカブトガニの血球抽出物であるため、試薬の使用量を減少させ、あるいは、試薬製造上のロスを低減させるといった取り組みが必要になる。
【０００９】
試薬の使用量を減少させる試みとしては、単純に試料容量を減少させることはもちろん、測定感度を高めて結果的に測定回数を低減することも効果的である。一方、製造上のロスを減らすにはエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンによる汚染をいかに抑制するかということが重要である。さらに、製造中に試薬として使用できなくなった原料からエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを除去して再利用したり、補助的な試薬の添加物として利用したりすることなども考えねばならない。補助的な試薬の添加物として利用する場合、試薬の粘性の調整剤としての役割や、ゲル化・凝集での中心的役割を担うコアギュロゲン原料としての利用などが考えられる。
【００１０】
しかしながら、例えばエンドトキシンに汚染されて使用できなくなった原料中のエンドトキシンを除去するだけでは既に活性化してしまった酵素群を除去することは不可能である。原料中の酵素活性のみを不活性化してコアギュロゲンの機能、すなわち、活性化された凝固酵素により加水分解されてコアギュリンとなり、ゲル化・凝集反応を生じさせる機能を維持した原料の製造方法は報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第２６６７６９５号公報
【特許文献２】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献３】特開平１０−２９３１２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、ＬＡＬ試薬、あるいは、生物由来の生理活性物質に汚染されたＬＡＬ試薬等におけるコアギュロゲンの機能を維持したまま凝固酵素活性を不可逆的に不活性化し、試薬に利用可能なコアギュロゲン原料を取得する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するための本発明は、若干の所定生理活性物質の混入を許容するＬＡＬ試薬をある温度条件下において加熱処理することにより、ＬＡＬ試薬中の酵素活性のみを不可逆的に失活させたことを最大の特徴とする。本発明においては、その際、活性化した凝固酵素により加水分解されコアギュリンとなってゲル化・凝集反応を惹起するという、コアギュロゲン本来の活性は維持させる。
【００１４】
より詳しくは、本発明は、所定の酵素群とコアギュロゲンとを含んだカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬと、生物由来の所定の生理活性物質とを反応させ、前記生理活性物質によって前記酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによってコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されることを利用して、前記生理活性物質を検出または前記生理活性物質の濃度を測定する際に使用される、コアギュロゲン原料の製造方法であって、
ＬＡＬを所定温度で所定時間に亘り加熱処理することで、該ＬＡＬ中の前記酵素群の少なくとも一部を失活させるとともにコアギュロゲンの活性は維持させることを特徴とする。
【００１５】
これによれば、ＬＡＬ中の酵素カスケードを構成する酵素群の少なくとも一部を失活させることで酵素カスケードの発生を抑止し、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの汚染によっても加水分解してコアギュリンになりづらいコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【００１６】
また、これによれば、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの汚染により使用不可となったＬＡＬ試薬のコアギュロゲンを、機能を維持したまま取得することができるので、カブトガニの血球から得られる有限の資源をより有効に活用することが可能となる。
【００１７】
ここで、所定の酵素群とは例えばＬＡＬ中のＣ因子、Ｂ因子、Ｇ因子、凝固酵素前駆体など、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどにより酵素カスケードを生じ最終的にコアギュロゲンを加水分解する凝固酵素を生じる原因となる酵素類を意味している。すなわち、ＬＡＬ中の全ての酵素を失活させずとも、少なくとも一部の酵素が失活し、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどによっても、最終的にコアギュロゲンを加水分解する凝固酵素が生じないようになれば本発明の目的は達成できる。
【００１８】
また、上記において生物由来の所定の生理活性物質とは、ＬＡＬ中の所定の酵素群を活性化させ酵素カスケードを生じせしめ、最終的にコアギュロゲンを加水分解する凝固酵素を生じせしめる特性を有する生理活性物質を意味しており、例としては上述のとおり、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンが挙げられる。但し、同等の特性を有する他の生理活性物質をも含む趣旨であり、上述の２物質に限定するものではない。
【００１９】
なお、上記においてＬＡＬが溶液として供給される場合には、所定温度は６０℃以上としてもよい。ここで、発明者の鋭意研究により、溶液としてのＬＡＬ試薬を６０℃以上に加熱処理することで、セリンプロテアーゼ等の酵素群の酵素活性を略完全に失活させることができることが分かってきた。従って、ＬＡＬが溶液として供給される場合に所定温度を６０℃以上とすることで、より確実に、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどに汚染されても加水分解してコアギュリンにならないコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【００２０】
また、上記においてＬＡＬが溶液として供給される場合には、所定温度は８０℃以下としてもよい。ここで、発明者の鋭意研究により、ＬＡＬ試薬を８０℃より高い温度まで加熱処理して酵素活性を失活させた場合には、ＬＡＬ中の蛋白質の変性により試薬が白濁してしまうことが分かってきた。そうすると、所定生理活性物質の検出や濃度測定を、試薬の透過光や散乱光によって光学的な手法によって行う目的には適さなくなってしまうおそれがある。従って本発明においては、ＬＡＬが溶液として供給される場合には所定温度を８０℃以下とすることで、光学的な測定にも適した、より利用価値の高いコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【００２１】
さらに、上記においてＬＡＬが溶液として供給される場合には、所定時間は１０分以上８時間以下としてもよい。ここで、溶液としてのＬＡＬ試薬を６０℃以上に加熱処理した場合、加熱時間は１０分程度で、セリンプロテアーゼ等の酵素群の酵素活性を略完全に失活させることができることが分かってきた。従って、所定時間を１０分以上とすることで、広い範囲の加熱温度でセリンプロテアーゼ等の酵素群の酵素活性を略完全に失活させることができる。また、加熱時間があまりに長い場合には、低温でもＬＡＬ中の蛋白質が変性して白濁が生じるおそれがある。従って本発明では、所定時間を１０分以上８時間以下
とすることで、より確実に、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどに汚染されても加水分解してコアギュリンにならず、光学的な測定に適したコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【００２２】
さらに、上記においてＬＡＬが凍結乾燥体として供給される場合には、所定温度は１００℃以上２５０℃以下としてもよい。ここで、ＬＡＬが凍結乾燥体として供給される場合には、溶液として供給される場合と比較してより高い温度で加熱処理する必要があることが分かってきた。この場合には、ＬＡＬ試薬を１００℃以上２５０℃以下とすることで、より確実に、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどに汚染されても加水分解してコアギュリンにならず、光学的な測定にも適した、より利用価値の高いコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【００２３】
また、この場合には、所定時間は３００分以上としてもよい。ここで、ＬＡＬが凍結乾燥体として供給される場合には、ＬＡＬ試薬を１２０℃で３００分に亘って加熱することで、セリンプロテアーゼ等の酵素群の酵素活性を略完全に失活させることができることが分かってきた。従って、所定時間を３００分以上とすることで、より広い範囲の加熱温度でより確実に、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの汚染によっても加水分解してコアギュリンにならないコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【００２４】
また、本発明は、所定の酵素群とコアギュロゲンとを含んだカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬと、生物由来の所定の生理活性物質とを反応させ、前記生理活性物質によって前記酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによってコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されることを利用して、前記生理活性物質を検出または前記生理活性物質の濃度を測定する際に使用される、コアギュロゲン原料であって、
ＬＡＬを所定温度で所定時間に亘り加熱処理することで、前記ＬＡＬ中の前記酵素群の少なくとも一部を失活させたことを特徴とするコアギュロゲン原料であってもよい。
【００２５】
このコアギュロゲン原料においては、所定生理活性物質との反応で酵素カスケードを生じる酵素群が失活されているので、少量の所定生理活性物質による汚染によりコアギュロゲンが加水分解されてコアギュリンとなることを抑止でき、よりハンドリングの良いコアギュロゲン原料を得ることができる。なお、この場合においても、ＬＡＬが溶液として供給される場合には、所定温度は６０℃以上としてもよい。また、８０℃以下としてもよい。さらに、所定時間は１０分以上８時間以下としてもよい。一方、ＬＡＬが凍結乾燥体として供給される場合には、所定温度は１００℃以上２５０℃以下としてもよい。また、所定時間は３００分以上としてもよい。
【００２６】
また、本発明においては、上記で得られたコアギュロゲン原料と、加熱処理されていないＬＡＬとを混合することで、前記加熱処理されていないＬＡＬにおけるコアギュロゲン濃度を高めたことを特徴とする、前記生理活性物質の検出または前記生理活性物質の濃度測定に使用されるＬＡＬ試薬としてもよい。
【００２７】
すなわち、所定の酵素群を失活させたコアギュリン原料を、熱処理をしていないＬＡＬに加えることで、通常よりコアギュロゲンの濃度の高いＬＡＬ試薬を調製することができる。これにより、所定生理活性物質との反応により活性化された酵素群によって加水分解されコアギュリンとなるコアギュロゲンの量を相対的に増加させることができる。従って、所定生理活性物質によるＬＡＬ試薬のゲル化をより顕著にすることができ、所定生理活性物質の測定をより高感度にすることができる。
【００２８】
また、本発明においては、上記で得られたコアギュロゲン原料におけるコアギュロゲンを、該コアギュロゲンより大径の多数の微粒子の表面に結合または吸着させて調製された
ことを特徴とするエンドトキシンの測定用のコアギュロゲン結合マイクロビーズとしてもよい。
【００２９】
ここで、コアギュロゲンを例えば樹脂製の微粒子の上に結合または吸着させた状態のＬＡＬにエンドトキシンなどの所定生理活性物質を作用させると、ＬＡＬ単体に所定生理活性物質を作用させた場合と比較して、より大きな凝集塊を早期に生成することが分かってきた。これは、微粒子上のコアギュロゲンがＬＡＬ中の酵素カスケードにより加水分解されコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させることによる。また、この凝集反応は試料の濁りや色の影響を受けづらいこと、さらには、この凝集反応はＬＡＬ単体で惹起される凝集反応よりも、非常に強大であることも明確になってきている。
【００３０】
本発明においては、この現象を利用し、ＬＡＬ中の酵素群を失活させて得られたコアギュロゲン原料を微粒子の上に結合または吸着させた試薬（以下、「コアギュロゲン結合マイクロビーズ」ともいう。）を調製した。このコアギュロゲン結合マイクロビーズとＬＡＬとを混合させた試薬にエンドトキシンを含む試料を作用させることで、ＬＡＬ中にもともと存在したコアギュロゲンがコアギュリンとなり凝集するとともに、微粒子の上に結合または吸着されたコアギュロゲンがコアギュリンとなり微粒子同士を会合させてより大きな凝集塊を早期に生成させる。これによれば、ＬＡＬ試薬と試料との混和液におけるゲル粒子の生成を大幅に促進することができる。その結果、所定生理活性物質の検出または濃度の測定を、より迅速且つ、高感度にすることができる。
【００３１】
なお、ＬＡＬ中に含まれるコアギュロゲンを微粒子の上に結合または吸着させる際には、まず、蛋白質を結合、吸着することが可能な官能基を微粒子の表面に存在せしめる。そして、従来の方法によれば、その状態でＬＡＬを作用させて、コアギュロゲンを微粒子表面に化学的に結合させるか、静電的、親水的、疎水的に吸着させる。その際のＬＡＬ中のは長時間に及ぶため、従来の方法では、微粒子や使用する試薬類、水などに微量に混在する所定生理活性物質が蛋白質における酵素群と反応し、コアギュロゲンをコアギュリンに加水分解して、コアギュロゲンと微粒子の結合・吸着反応中に微粒子の凝集が開始してしまうことが考えられる。そしてこの場合には、酵素の活性化によって試薬中のコアギュロゲンが加水分解されて消費されてしまうおそれがある。
【００３２】
このような不都合に対し、従来は、コアギュロゲンを微粒子の表面に結合または吸着させる際には、ＬＡＬ試薬と微粒子の懸濁液とを混合するとともに、ＬＡＬ中の酵素群と所定生理活性物質との反応を抑制する抑制剤を添加する必要があり、コアギュロゲンを微粒子の表面に結合または吸着させる作業が複雑でコスト的にも不利な状況であった。これに対し本発明では、コアギュロゲン原料の調製過程でＬＡＬ中の酵素群を失活させるため、抑制剤を添加する工程を省略することが可能である。これにより、より簡単にまたはより低廉なコストで、コアギュロゲンを微粒子の上に結合または吸着させた試薬を調製することが可能である。
【００３３】
また、本発明は、上記のコアギュロゲン原料と、加熱処理されていないＬＡＬとを混合することによって、前記加熱処理されていないＬＡＬにおけるコアギュロゲン濃度を高めたＬＡＬ試薬と、前記所定の生理活性物質を含む試料とを混和させ、
前記所定の生理活性物質によって前記ＬＡＬ試薬中の酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによって濃度が高められた前記コアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されることを利用して、前記所定の生理活性物質を検出または前記所定の生理活性物質の濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法であってもよい。
【００３４】
この生物由来の生理活性物質の測定方法によれば、より高い濃度のコアギュロゲンを用いて、所定生理活性物質の測定を行うことができる。従って、所定生理活性物質とＬＡＬ
との反応によるゲル化をより顕著にすることができ、所定生理活性物質の測定をより高感度にすることができる。
【００３５】
また、本発明は、上記のコアギュロゲン結合マイクロビーズと、加熱処理されていないＬＡＬと、前記所定の生理活性物質を含む試料とを混和させることで、
前記所定の生理活性物質によって前記加熱処理されていないＬＡＬにおける酵素群が活性化されて生じる酵素カスケードによって前記微粒子の表面に結合または吸着したコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解され、前記微粒子同士が架橋されることを利用して、前記所定の生理活性物質を検出または前記所定の生理活性物質の濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法であってもよい。
【００３６】
この所定生理活性物質の測定方法によれば、ＬＡＬ中の酵素群を失活させて得られたコアギュロゲン原料を微粒子の上に結合または吸着させたコアギュロゲン結合マイクロビーズと加熱処理されていないＬＡＬとを混合させた試薬にエンドトキシンを含む試料を作用させる。このことで、ＬＡＬ中にもともと存在したコアギュロゲンがコアギュリンとなり凝集するとともに、微粒子の上に結合または吸着されたコアギュロゲンがコアギュリンとなり微粒子同士を会合させてより大きな凝集塊を早期に生成させる。これによれば、ＬＡＬ試薬と試料との混和液におけるゲル粒子の生成を大幅に促進することができる。その結果、所定生理活性物質の検出または濃度の測定を、より迅速且つ、高感度にすることができる。
【００３７】
また、本発明は、上記のコアギュロゲン結合マイクロビーズと、加熱処理されていないＬＡＬと、前記所定の生理活性物質を含む試料との混和液を光の入射可能に保持し、前記混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から取得される前記混和液の透過率より前記試料中の前記生理活性物質の濃度を導出する導出手段と、
を備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の攪拌比濁測定装置であってもよい。
【００３８】
本発明においては、ＬＡＬ中の酵素群を失活させて得られたコアギュロゲン原料を微粒子の上に結合または吸着させたコアギュロゲン結合マイクロビーズと、加熱処理されていないＬＡＬと、所定生理活性物質を含む試料とを混和させ混和液保持手段に入れる。そして、この混和液を攪拌手段により攪拌することで、所定生理活性物質で活性化された凝固酵素によるコアギュロゲンの加水分解及び、加水分解で得られたコアギュリンによる微粒子の会合を促進する。
【００３９】
そして、光入射手段から入射された光のうち、上記混和液を透過して受光素子に届いた光の強度を測定する。さらに、導出手段においては上記混和液の透過率より所定生理活性物質の濃度が導出される。
【００４０】
ここにおいて、微粒子の上に結合または吸着されたコアギュロゲンの加水分解が進みコアギュリンが生成されると、コアギュリンが微粒子同士を会合させてより大きな凝集塊を早期に生成させる。ここで、コアギュロゲン結合マイクロビーズと加熱処理されていないＬＡＬと所定生理活性物質を含む試料との混和液は、混和時点では、多量のマイクロビーズの微粒子が分散しているために強く濁っている。そして、コアギュリンの生成による微粒子の会合が進行すると微粒子の濃度が急激に減少するために混和液の透過率が急激に上昇する。
【００４１】
本発明における攪拌比濁測定装置では、通常の比濁法に係る測定装置と異なり、コアギュリンの生成に伴う微粒子の会合に起因する透過率の急激な上昇を測定するため、混和液を攪拌することによる反応の促進効果と相まって、測定時間を大幅に短縮できるとともに、非常に高感度に所定生理活性物質の測定を行うことができる。
【００４２】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明にあっては、ＬＡＬ試薬、あるいは、生物由来の生理活性物質に汚染されたＬＡＬ試薬等におけるコアギュロゲンの機能を維持したまま凝固酵素活性を不可逆的に不活性化し、試薬に利用可能なコアギュロゲン原料を取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の実施例におけるＬＡＬ試薬水溶液の加熱温度と残存凝固酵素比活性との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例におけるＬＡＬ試薬凍結乾燥体の加熱時間と残存凝固酵素比活性との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図４】活性型凝固酵素によるコアギュロゲンのゲル化・凝集過程とコアギュロゲン結合マイクロビーズの凝集過程とを説明するための図である。
【図５】コアギュロゲン結合マイクロビーズ法と比濁法におけるエンドトキシン用量反応を比較したグラフである。
【図６】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＬＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ＬＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。すなわち、図６に示すように、エンドトキシンがＬＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となる、活性型Ｃ因子はＬＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＬＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＬＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００４６】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＬＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＬＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００４７】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＬＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００４８】
所定生理活性物質を定量することが可能な測定法としては前述のように比濁法、ならびに、レーザー光散乱粒子計測法が挙げられる。これらの測定法はこのＬＡＬの酵素カスケ
ード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００４９】
特にレーザー光散乱粒子計測法では、系内に生成されたゲルの微粒子を直接測定するため、比濁法よりも高感度であり、且つ、一般的にＬＡＬと検体からなる試料を強制的に攪拌するので、比濁法と比較して短時間でゲルの生成を検出できる。
【００５０】
また、エンドトキシンの別の測定法として比色法がある。これは図６に示すように、ＬＡＬの酵素カスケード反応を利用しつつも、コアギュリンゲルによる試料の濁りを測定するのではなく、凝固酵素により加水分解を受け発色する合成基質を利用して、合成基質を含んだＬＡＬと検体とを反応させ、その吸光度変化を測定する方法である。この比色法においては、系内に生成されていく発色物質の濃度を測定するので、試料におけるゲルの生成を測定する比濁法やレーザー光散乱粒子計測法と比較すると、短時間で低濃度の所定生理活性物質を測定することができる。
【００５１】
ところで、上記した各々の測定法でエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを測定するためのＬＡＬ試薬を製造する過程でエンドトキシン、あるいは、β−Ｄ−グルカンが混入すると、混入した物質の量にもよるが、試薬の製造途中で原料がゲル化してしまって試薬として使用不可能となる場合がある。その際の混入量がたとえ僅かであっても、既に述べたようにＬＡＬ試薬は酵素のカスケードによる増幅作用を持つため、試薬の調製に長時間を要する場合には、試薬全体がゲル化してしまうこともあり得る。
【００５２】
エンドトキシンに関してはポリミキシンＢやポリリジンなどの吸着物質が知られており、ＬＡＬ試薬に適用することにより混入したエンドトキシンを除去することも可能である。しかしながら、既に活性化してしまったＣ因子、Ｂ因子、ならびに、凝固酵素は酵素カスケードの最下流のコアギュロゲンを加水分解する方向に働き続けるため、エンドトキシンを除去するだけではＬＡＬ試薬のゲル化を防止できない。このことはβ−Ｄ−グルカンについても同様である。
【００５３】
以下に、エンドトキシン、あるいは、β−Ｄ−グルカンがごく微量混入しても、製造途中でゲル化することを抑制できるＬＡＬ試薬、あるいは、ＬＡＬを素材としたコアギュロゲン原料の製造法の例を示す。しかしながら本発明のＬＡＬ試薬及び、コアギュロゲン原料の製造法は、以下の例に限定されるものではない。
【００５４】
本発明に係るコアギュロゲン原料の素材としてはカブトガニの血球抽出物、それを用いて製造されたＬＡＬ試薬、ならびに、それらにごく微量のエンドトキシン、あるいは、β−Ｄ−グルカンが混入したために試薬として利用できなくなった廃棄物などを用いることができる。しかし、本発明の目的が機能を持ったコアギュロゲン原料の製造にあることから、既にコアギュロゲンの大多数がコアギュリンとなりゲル化してしまったものは除外する。これらの素材に対して必要に応じてエンドトキシンを吸着する物質、β−Ｄ−グルカンを吸着する物質、エンドトキシンの作用を失活させる物質、β−Ｄ−グルカンの作用を失活させる物質の少なくとも一つ以上を添加してもよい。
【００５５】
エンドトキシンを吸着する物質としてはポリミキシンＢ、ポリリジン、ポリオルチニン、ポリエチレンイミンなど、あるいは、Ｃ因子自体やＣ因子がエンドトキシンを結合する部位を含む蛋白質やポリペプチド、エンドトキシンを結合する抗体などを例示できる。エンドトキシンを失活させる物質としては、鉄イオン、アルミニウムイオン、クロムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、マンガンイオンを含む水溶液、ならびに、これらを供給する金属片などを例示できる。
【００５６】
同様に、β−Ｄ−グルカンと結合する物質としてはレクチン、あるいは、Ｇ因子自体あるいはＧ因子がβ−Ｄ−グルカンを結合する部位を含む蛋白質やポリペプチド、β−Ｄ−グルカンを結合する抗体などを例示できる。また、β−Ｄ−グルカンを不活性化するためには、素材の水素イオン濃度を下げることにより、β−Ｄ−グルカンの溶解性を下げて析出させてしまうことも考えられる。
【００５７】
このように必要に応じて最適な添加物を混合させた素材に対して、次に加熱処理を行う。この加熱処理を適当な加熱温度、加熱時間で行うことにより、素材中の所定の酵素群であるＣ因子、活性型Ｃ因子、Ｂ因子、活性型Ｂ因子、Ｇ因子、活性型Ｇ因子、凝固酵素前駆体、凝固酵素の少なくとも一部を不可逆的に不活性化させる。そして、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンとの反応によって凝固酵素が生じないようにする。そうすれば、たとえエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンに汚染されても、加水分解してコアギュリンとなってゲル化することのないコアギュロゲン原料を得ることができる。
【００５８】
この場合の加熱処理は素材の状態により、加熱温度と加熱時間を適宜調整すればよい。例えば、素材が溶液の場合、反応させる温度が４０℃以上１４０℃以下であることが好ましく、６０℃以上１００℃以下であることがさらに好ましい。好ましい加熱時間は加熱温度によって大きく異なるが、３０秒以上７２時間以下であることが好ましく、１０分以上８時間以下であることがさらに好ましい。
【００５９】
加熱温度を高くしすぎたり、加熱時間を長くしすぎたりすると、ＬＡＬ試薬あるいは、ＬＡＬ中の蛋白質が変性して白濁してしまい、試料の濁りを測定する方法には使用が困難になったり、コアギュロゲンが変性して機能を失ってしまったりする可能性があるので注意を要する。
【００６０】
一方、素材が、既に凍結乾燥体となっているＬＡＬ試薬である場合には、素材が溶液の場合と異なり、より高い加熱温度とより長い加熱時間が必要となる。加熱温度は８０℃以上３００℃以下が好ましく、１００℃以上２５０℃以下がさらに好ましい。好ましい加熱時間は水溶液の場合と同様に加熱温度により異なるが、３０秒以上７２時間以下が好ましく、１０分以上８時間以下がさらに好ましい。
【００６１】
このように加熱処理した素材は必要に応じて種々の金属塩あるいはアンモニウム塩、酸、アルカリ、さらには、緩衝液などによりｐＨを調整したり、必要に応じて界面活性剤や糖類などを添加しても良い。
【００６２】
このように製造したコアギュロゲン原料はそのままではエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを作用させてもゲル化、あるいは、凝集反応を起こすことはない。しかしながら、活性化した凝固酵素を作用させるか、あるいは、加熱処理していないＬＡＬ試薬と混和後にエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを作用させることにより速やかにコアギュリンへと加水分解されゲル化、あるいは、凝集反応が惹起される。
【００６３】
また、本発明により製造したコアギュロゲン原料はエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンの測定感度の向上、測定時間の短縮、測定利便性の向上などに役立てることが可能である。すなわち、本発明のコアギュロゲン原料を、加熱処理していないＬＡＬ試薬と混和することにより、通常よりもコアギュロゲン濃度の高いＬＡＬ試薬を調製することが可能である。このＬＡＬ試薬にエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを作用させることによって、より迅速で高感度な測定が可能となる。
【００６４】
また、例えば、本発明によるコアギュロゲン原料をポリスチレンラテックスの微小な粒子の表面に結合または吸着させた状態のＬＡＬ試薬を調製することにより、従来の比濁法
によるエンドトキシン測定よりも大幅な時間短縮が可能な測定法が実現できる。
【００６５】
すなわち、コアギュロゲン原料をポリスチレンラテックスの微粒子（以下、ビーズともいう）の表面に結合または吸着させたＬＡＬ試薬に、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンによって活性化された凝固酵素を作用させると、コアギュロゲンが酵素カスケードにより加水分解されコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させる。従って、本発明により取得されたコアギュロゲン原料におけるコアギュロゲンを微粒子に結合または吸着しておくことで、より効率的に微粒子同士を会合させることが可能となり、より早期に凝集塊を生成させることが可能となる。
【００６６】
本発明のコアギュロゲン原料におけるコアギュロゲンをビーズに結合させるには、ビーズが持つ電荷で吸着させる方法、ビーズのイオン的性質を利用する方法、ビーズ表面にコアギュロゲン原料中の蛋白質と反応可能な官能基を形成し、その官能基と蛋白質中のアミノ基、あるいは、カルボキシル基を利用して化学的に結合させる方法などが考えられるが、どのような方法を用いても良い。
【００６７】
ところで、従来、ＬＡＬの素材を改変してこのようにビーズに結合または吸着させるような操作をすると、製造にかかる時間が数時間以上という長期に及ぶため、他の素材中に微量に混入したエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンが影響したり、あるいは、作業中にそれらの生理活性物質が微量に混入したりして、原料がゲル化してしまい、そのままでは目的の物質を得ることができない場合があった。
【００６８】
これに対して、従来は、原料に対して各種の酵素阻害剤を添加する対策が考えられた。この酵素阻害剤としては、Diisopropylfluorophosphate、Benzamidine、Phenylmethanesulfonyl fluoride、4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride、6-Amidino-2-naphthyl-4-guanidinobenzoatedimethanesulfonate、p-Amidinophenylmethylsulfonyl fluoride、Aprotinin、Antipain、Leupeptin、Ecotin、PPACK(Phe-Pro-Arg-chloromethylketone)、α2-Macroglobulin、Trypsin inhibitorなどを例示することができる。
【００６９】
しかしながら、本発明のコアギュロゲン原料を用いた場合は、ＬＡＬ中の酵素機能のみが不可逆的に不活性化されているとともにコアギュロゲン活性は維持されている。従って、上記のような酵素阻害剤を添加するまでもなく、ビーズへの結合または吸着操作中に素材中に混入したエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンによる、原料のゲル化を防止することができる。
【００７０】
以下に、本発明のコアギュロゲン原料の製造方法の詳細について示す。製造例は製造方法の一例を示したものであって、本発明に係る製造方法は以下の製造例の条件に限定されるものではない。
【００７１】
〔製造例１〕
ＬＡＬ試薬の凍結乾燥体（リムルスＥＳ−ＩＩシングルテストワコー、和光純薬製、以下ＥＳ−ＩＩと略す。）に所定量（０．１５ｍＬ）の注射用蒸留水（大塚製薬製）を加えてボルテックスミキサーで混和した。その後、予め所定温度（後述）に加熱しておいたアルミブロックヒーター（ＨＤＢ−１Ｎ、アズワン製、以下特に断らない限りアルミブロックヒーターとしてこの機種を使用する。）にセットして所定時間（後述）の加熱を行った。加熱後すぐに氷中で冷却しコアギュロゲン原料の水溶液を得た。
【００７２】
〔製造例２〕
ＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）の凍結乾燥体をそのまま、予め１２０℃に加熱しておいたアルミブロックヒーターにセットして所定時間（後述）の加熱を行った。加熱後すぐに氷中
で冷却しコアギュロゲン原料の凍結乾燥体を得た。
【００７３】
〔製造例３〕
製造例１、ならびに製造例２で得られたコアギュロゲン原料の酵素活性の不可逆的な失活とコアギュロゲン機能の維持とを、エンドトキシンの定量が可能なレーザー散乱粒子計測法を用いて評価した。レーザー散乱粒子計測法においては、φ７ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス製で内部に試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ１ｍｍ、長さ５ｍｍ）を内在した専用のガラス容器を使用した。この容器をエンドトキシンフリーにするために、容器の開口部をアルミ箔で覆い、さらに、２０本ずつアルミ箔で小分けに梱包したものを鉄製の乾熱処理缶に詰め、２５０℃で３時間加熱処理して、エンドトキシンを熱分解した。このように乾熱処理によりエンドトキシンフリーにした測定容器を製造し試験に使用した。
【００７４】
〔製造例４〕
本発明によるコアギュロゲン原料のコアギュロゲン機能、すなわち、活性化した凝固酵素によりコアギュロゲンが加水分解されてゲル化するか、あるいは、凝集反応を示すかを調べるために、凝固酵素の活性化物を以下のようにして得た。すなわち、加熱処理していないＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）に１．０ＥＵ／ｍＬの濃度のエンドトキシン水溶液２００μＬを作用させて、製造例３により製造した測定容器にＬＡＬ試薬とエンドトキシン水溶液の混合物を移注し、３７℃に保温しながら容器内部のステンレス攪拌子を容器底面方向に配置した攪拌器により回転して反応を進行させた。
【００７５】
レーザー光散乱粒子計測法では、エンドトキシンによりゲル化したＬＡＬ試薬が攪拌により微小な凝集塊として出現し、その凝集塊の出現時間と試料中のエンドトキシンの濃度は両対数プロットで直線に乗ることが知られている。この条件の場合、約６分で凝集が検出されたが、凝集検出後も攪拌を続け、測定開始から２０分の時点で容器を装置から取り出し、容器内部のゲル凝集物を全量回収し、エンドトキシンフリーのディスポーザブル遠心管に移注して、１５０００ｒｐｍ（ローター半径７ｃｍ）で２分間遠心して、コアギュリンポリマーが主成分であるゲル成分を沈殿させた。別の方法により、遠心上清にはコアギュロゲンが含まれていないことを確認した。この製造法により、エンドトキシンによって活性化した凝固酵素を調製した。
【００７６】
〔製造例５〕
ＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）に所定濃度（後述）のエンドトキシン水溶液０．２ｍＬを加えてボルテックスミキサーで混和した後、予め、１００℃に加熱しておいたアルミブロックヒーターにセットして２０分間の加熱を行った。加熱後すぐに氷中で冷却しエンドトキシンが混入したコアギュロゲン原料の水溶液を得た。
【００７７】
〔製造例６〕
表面がカルボキシル化されたポリスチレンラテックス微粒子（Polybeads Carboxylate Microspheres、０．４５μｍ、固形分２．６３％、Polysciences Inc．製、以下、カルボキシルビーズと略す。）の懸濁液０．５ｍＬをエンドトキシンフリーのスクリューキャップ付き遠心管（容量２．０ｍＬ）にて１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを除去した。次いで、注射用蒸留水を加えて２．０ｍＬにし、懸濁させた後に再び遠心して上澄みを除去した。この遠心操作による上澄み除去をもう一度繰り返した後、注射用蒸留水１ｍＬに再懸濁した後、エンドトキシンフリーのスクリューキャップ付き遠心管（容量１５ｍＬ）に移注した。さらに、４ｍＬの注射用蒸留水を加えた後にオートクレーブ（１２１℃、２０分）を掛け、ビーズに混入するエンドトキシンを不活性化ならびに除去した。
【００７８】
オートクレーブ後のカルボキシルビーズを容量２ｍＬのスクリューキャップ付き遠心管
に移注し、上述した要領で遠心と上澄み除去、さらに、注射用蒸留水への再懸濁をセットとする洗浄操作を合計２回行った。次に、注射用蒸留水で溶解し、濃度が２０ｍｇ／ｍＬになるように調製した水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ、同仁化学製）水溶液１０ｍＬに０．１Ｍ酢酸バッファ（ｐＨ４．９８）２ｍＬを混合し、これを孔径φ０．２μｍの滅菌用フィルタ（ミリポア製）に通し、このうちの０．５ｍＬに上記のカルボキシルビーズの沈殿物を再懸濁させた。
【００７９】
また、ＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）の凍結乾燥体に注射用蒸留水（大塚製薬製）０．５ｍＬを加えて溶解し、６０℃で１０分間加熱をおこなった。この加熱処理により得られた本発明のコアギュロゲン原料０．５ｍＬと上述の方法で調製したカルボキシルビーズ懸濁液０．５ｍＬ、さらに、１．０％になるように調製した非イオン性界面活性剤であるTriton
Ｘ−１００水溶液（注射用蒸留水で調製後、孔径φ０．２μｍの滅菌用フィルタで濾過）を１０μＬ混合し、室温で２時間反応させた。
【００８０】
この反応により、カルボキシルビーズのカルボキシル基がカルボジイミドで活性化された後、コアギュロゲンのアミノ基とアミド結合を起こして、ビーズ表面にコアギュロゲンが化学的に結合される。反応後、上記のように遠心、上澄み除去、注射用蒸留水による再懸濁を２回おこなって反応物を洗浄した。次いで、０．２５Ｍのアミノエタノール水溶液（注射用蒸留水で調製後、孔径φ０．２μｍの滅菌用フィルタで濾過）を１００μＬ加えて、室温で２０分間攪拌して、カルボキシルビーズ上の活性化したカルボキシル基のうち未反応のものを不活性化させた。その後、同様に注射用蒸留水で合計３回洗浄し、５ｍＬの注射用蒸留水に再懸濁させ、上述の１．０％のTriton Ｘ−１００水溶液と２％のアジ化ナトリウム水溶液（注射用蒸留水で調製後、孔径φ０．２μｍの滅菌用フィルタで濾過）をそれぞれ５０μＬずつ加えてコアギュロゲン結合マイクロビーズを得た。
【００８１】
以下に、本発明の実施例について説明する。
【００８２】
〔実施例１〕
製造例１において、アルミブロックヒーターの指示温度を４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、１００℃、ならびに、１２０℃のいずれかの条件において、加熱時間を１０分にして製造したコアギュロゲン原料から１００μＬをとり、製造例３で製造した測定容器に入れた。そこに、２．０ＥＵ／ｍＬの濃度のエンドトキシン水溶液１００μＬを加えて作用させ、レーザー散乱粒子計測装置（ＰＡ−２００、興和製、以下ＰＡ−２００と略す。）で測定を行った。加熱処理なしの場合の測定濃度（Ｃ＝１．０ＥＵ／ｍＬ）と、加熱したＬＡＬ試薬での測定濃度（Ｓ）から、加熱された後に残存する酵素活性である残存凝固酵素比活性（Ａ）を以下の式で定義して導出した。
Ａ＝Ｓ／Ｃ×１００（％）・・・・・（１）
【００８３】
図１には、得られた残存凝固酵素比活性（Ａ）とＬＡＬ試薬水溶液の加熱温度との関係を示す。図１に示したように、加熱時間を１０分とした場合には、加熱温度が６０℃以上になると酵素活性が完全に消失することが分かった。また、図示しないが、加熱温度が高いほど製造後のコアギュロゲン原料水溶液は白濁する現象が観察された。例えば、１２０℃で加熱してコアギュロゲン原料水溶液を製造した場合、かなりの部分が熱変性によるものと見られる白濁と不溶物に変化してしまっており、実使用には適さないことが判った。
【００８４】
〔実施例２〕
製造例１において、アルミブロックヒーターの指示温度を４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、１００℃、ならびに、１２０℃のいずれかの条件において、加熱時間を１０分にして製造したコアギュロゲン原料（１５０μＬ）に、製造例４で得られた活性化した凝固酵素水溶液５０μＬを加えて作用させ、ボルテックスミキサーで５秒間混和させた
。その試料を製造例３で製造した測定容器に移注し、レーザー散乱粒子計測装置（ＰＡ−２００）で凝集開始時間の測定を行った。
【００８５】
表１にそれぞれの加熱温度に対する凝集開始時間を示したが、いずれの加熱温度においても活性化した凝固酵素水溶液を添加してから３分程度で凝集が開始しており、コアギュロゲンの機能は加熱による影響を殆ど受けていないことが示された。また、１２０℃という高温で処理した場合には、ＬＡＬ試薬中の大部分の蛋白質は熱変性して凝固してしまうものの、その中に残存するコアギュロゲン自体は機能を維持しており、活性化した凝固酵素水溶液の添加から４分程度で凝集が開始した。このことから、コアギュロゲンは非常に加熱に強いことが示された。また、表１から分かるように、ＬＡＬ試薬を８０℃以下で加熱処理して酵素活性を失活させた場合には、ＬＡＬ試薬に白濁は殆ど見られなかった。従って、ＬＡＬ試薬を８０℃以下で加熱処理して酵素活性を失活させることで、光学的な測定にも適した、より利用価値の高いコアギュロゲン原料を取得することが可能となることが分かった。
【００８６】
【表１】
2010190801.tif 000003
【００８７】
〔実施例３〕
製造例２において、加熱時間を１０分、３０分、６０分、１２０分、ならびに、３００分のいずれかの時間にして、ＬＡＬ試薬（リムルスＥＳ−ＩＩシングルテストワコー、和光純薬製）を開封せずにそのまま加熱処理したコアギュロゲン原料の凍結乾燥体に１．０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン水溶液（２００μＬ）を添加した。そして、ボルテックスミキサーで５秒間混和した後、製造例３により製造した測定容器に移注して、レーザー光散乱粒子計測装置（ＰＡ−２００）にて、加熱処理の後に残存する酵素の活性を調べた。そして、上述の式（１）で定義される残存凝固酵素比活性（％）を算出した。
【００８８】
図２には本実施例で得られた残存凝固酵素比活性と、ＬＡＬ試薬凍結乾燥体の加熱処理時間との関係を示す。図２に示したように、実施例１の場合と比較して、高温下で長時間の加熱処理を行っても、なかなか、酵素活性が完全に消失しないことが分かる。しかしながら、１２０℃で３００分の加熱処理により、残存凝固酵素比活性は０．２％程度に減少した。このように製造したコアギュロゲン原料では、原料を水に溶解させたときの水溶液の色がやや黄変する傾向が見られたが、白濁や凝固不溶物の発生はなく、水に速やかに溶解した。
【００８９】
〔実施例４〕
実施例４においては、予めエンドトキシンが混入した状態でＬＡＬ試薬を加熱処理した場合の、混入したエンドトキシンの濃度と加熱処理による酵素の不活性化の程度との関係を調べた。製造例５において、予め混入させておくエンドトキシン水溶液のエンドトキシン濃度１０、１、０．１ＥＵ／ｍＬとして、それぞれの濃度のエンドトキシンが混入したコアギュロゲン原料を得た。
【００９０】
次に、本実施例においては、上記のエンドトキシンが混入したコアギュロゲン原料と比較するためのコントロールコアギュロゲン原料を、エンドトキシンを含まない注射用蒸留水（大塚製薬製）０．２ｍＬで溶解したＬＡＬ試薬を製造例５に示した手順で加熱することで調製した。さらに、エンドトキシン水溶液の希釈系列を作り、それぞれ２００μＬを加熱処理していないＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）に入れてボルテックスミキサーで５秒間攪拌した後、それぞれの試料から１００μＬを取り、上記のコントロールコアギュロゲン原料１００μＬと混和し、レーザー光散乱粒子計測装置（ＰＡ−２００）にてエンドトキシン濃度の検量線を得た。
【００９１】
次に、加熱処理していないＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）を注射用蒸留水（大塚製薬製）２００μＬで溶解し、そのうちの１００μＬを上記の予めエンドトキシンが混入したそれぞれのコアギュロゲン原料１００μＬとボルテックスミキサーで５秒間混和させた。そして、レーザー光散乱粒子計測装置（ＰＡ−２００）でエンドトキシン濃度を上記で得られた検量線に照らし合わせて算出した。得られた結果を表２に示した。表２に示すように、いずれの試料においても測定されたエンドトキシン濃度は、実際に混入したエンドトキシン濃度より低かった。そして、表中の加熱後の活性残存率が示すように、得られたエンドトキシン濃度の実際の値からの低下の度合は、混入させたエンドトキシンの濃度が低いほど大きかった。このように、予め混入させたエンドトキシンの濃度が低いほど加熱処理による酵素の不活性化の効果が大きいことが示された。
【００９２】
【表２】
2010190801.tif 000004
【００９３】
〔実施例５〕
製造例６により製造されたコアギュロゲン結合マイクロビーズを用いてエンドトキシン水溶液の希釈系列中のエンドトキシン濃度を攪拌比濁法を用いて測定した（以下、この測定法をコアギュロゲン結合マクロビーズ法とする。）。攪拌比濁法は従来法の比濁法と異なり、試料を攪拌しつつ、試料の透過率の変化の度合からエンドトキシンの濃度を測定する。
【００９４】
図３には、本実施例の攪拌比濁測定装置としての比濁計測装置１の概略構成を示す。本実施例の攪拌比濁法においては、試料は混和液保持手段としての専用のガラス製容器２に移注する。ガラス製容器２の周囲を囲うように保温器５が設けられている。この保温器５の内部には図示しない電熱線が備えられており、この電熱線に通電されることにより、ガラス製容器２を約３７℃に保温するようになっている。このガラス製容器２の中にはステンレス製の攪拌子３が備えられている。この攪拌子３は、ガラス製容器２の下部に設置された攪拌器４の作用によってガラス製容器２の中で回転する。すなわち、攪拌器４はモータ４ａとモータ４ａの出力軸に設けられた永久磁石４ｂとからなっている。そして、モータ４ａに通電されることで永久磁石４ｂが回転する。この永久磁石４ｂからの磁界が回転するために、ステンレス製の攪拌子３が回転磁界の作用で回転する。この攪拌子３と攪拌器４とは攪拌手段に相当する。
【００９５】
なお、比濁計測装置１には光入射手段としての光源６と受光手段としての受光素子９が
設置されている。光源６から出射した光はアパーチャ７を通過した後、保温器５に設けられた入射孔５ａを通過してガラス製容器２中の試料に入射される。ガラス製容器２中の試料を透過した光は保温器５に設けられた出射孔５ｂから出射され、アパーチャ８を通過して受光素子９に照射される。受光素子９では、受光した光の強度に応じた光電信号を出力する。この光電信号の出力より、導出手段としての演算装置１０において試料の透過率が算出される。
【００９６】
熱処理していないＬＡＬ試薬（ＥＳ−ＩＩ）２本を２００μＬの注射用蒸留水に溶解させ、そこに、製造例６で製造したコアギュロゲン結合マイクロビーズ５０μＬを入れてボルテックスミキサーで５秒間攪拌しコアギュロゲン結合マイクロビーズ−ＬＡＬ試薬混合物を得た。エンドトキシン水溶液の希釈系列、すなわち、２、０．２、０．０２、０．００２ＥＵ／ｍＬのいずれか５０μＬと上記のコアギュロゲン結合マイクロビーズ−ＬＡＬ試薬混合物５０μＬを上記の製造例３に準じて製造したガラス製容器２に入れて比濁計測装置１にて測定を行った。
【００９７】
コアギュロゲン結合マイクロビーズ法では、作用させたエンドトキシンによりＬＡＬ試薬中の凝固酵素が活性化されると、同じくＬＡＬ試薬中に含まれるコアギュロゲンがコアギュリンとなり、同時に、コアギュロゲン結合マイクロビーズ上のコアギュロゲンも加水分解されてコアギュリンとなるが、ビーズがこれらのコアギュリンにより架橋されて大きな凝集塊を形成する。試料には、当初、多量の単体ビーズが含まれており強く濁っているが、凝集により単体のビーズ濃度が急激に減少するため、試料の光透過率が上昇する。コアギュロゲン結合マイクロビーズ法ではこの光の透過率の急激な上昇により凝集塊の発生開始時間を決定する。
【００９８】
図４には、従来の活性型凝固酵素によるコアギュロゲンのゲル化・凝集過程と、コアギュロゲン結合マイクロビーズ法におけるコアギュロゲンのゲル化・凝集過程とを示す。図４（Ａ）に示したのは従来の活性型凝固酵素によるコアギュロゲンのゲル化・凝集過程である。図に示すように、粒径にして数ｎｍ程度のコアギュロゲン１００が活性型凝固酵素によって加水分解されてコアギュリン１０１となる。これらのコアギュリン１０１は凝集して多量体となり攪拌比濁法においてはゲル粒子を形成する。その後、時間の経過とともにコアギュリン１０１の凝集はさらに進行しゲル粒子の粒径は徐々に大きくなる。そして、比較的長いラグタイムが経過した時点で測定可能な数μｍ〜数十μｍの粒径のゲル粒子１０２となる。
【００９９】
これに対し、コアギュロゲン結合マイクロビーズ法では、図４（Ｂ）に示すように、ビーズ１０３上に結合したコアギュロゲン１００に活性型凝固酵素が作用すると、ビーズ１０３上のコアギュロゲン１００が酵素カスケードによって加水分解されてコアギュリン１０１となり、コアギュリン１０１が凝集する過程ではコアギュリン１０１がビーズ１０３同士を会合させる。このことにより、コアギュリン１０１とビーズ１０３を主成分とする粒子の径が早急に大きくなり、短時間のラグタイムにおいて測定可能な粒径を得ることとなる。なお、この凝集反応はＬＡＬ単体で惹起される凝集反応よりも、非常に強大であることも明確になってきている。
【０１００】
また、本実施例においては、コアギュロゲン結合マイクロビーズ法を用いた場合と比較するために比濁法によってもエンドトキシン濃度測定を行った。比濁法では、熱処理していないＬＡＬ試薬に注射用水１００μＬ、エンドトキシン水溶液希釈系列のいずれかの濃度の試料を１００μＬ入れて比濁法装置（トキシノメータＥＴ−２０００、和光純薬製）で測定を行った。コアギュロゲン結合マイクロビーズ法と比濁法の比較結果を図５に示したが、両測定法とも横軸にエンドトキシン濃度、縦軸に検出時間を取ると、その両軸対数プロットは直線に近似された。近似曲線はコアギュロゲン結合マイクロビーズ法がＹ＝−
０．１９０Ｘ＋０．７３８、比濁法ではＹ＝−０．３４９Ｘ＋０．８６９であることから、コアギュロゲン結合マイクロビーズ法が比濁法に比べて大幅に測定時間を短縮可能であること、作用させるエンドトキシンの濃度が低いほど測定に要する時間の差が大きく開いてくることが示された。測定に要する実時間などを表３にまとめた。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
本実施例において、ビーズ１０３の素材は特に限定されるものではないが、ポリスチレンラテックス樹脂の他、シリカ、シリコン樹脂、セルロース樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ハイドロキシアパタイトなどが例示でき、ポリスチレンラテックス樹脂、シリカ、セルロース樹脂が望ましい。
【０１０３】
また、ビーズ１０３の大きさは、凝集により早期に光学的に検出可能となる条件と、調製時のハンドリングの容易さ、系内への分散のし易さなどから、０．０５μｍから５０μｍの範囲であるものが用いられる。ビーズ１０３の表面にコアギュロゲンを結合させるには、静電的、親水的、あるいは、疎水的にコアギュロゲンを吸着させる方法と、化学的に結合させる方法とが考えられる。
【符号の説明】
【０１０４】
１・・・比濁計測装置
２・・・ガラス製容器
３・・・攪拌子
４・・・攪拌器
４ａ・・・モータ
４ｂ・・・磁石
５・・・保温器
５ａ・・・入射孔
５ｂ・・・出射孔
６・・・光源
７・・・アパーチャ
８・・・アパーチャ
９・・・受光素子
１０・・・演算装置
１００・・・コアギュロゲン
１０１・・・コアギュリン
１０２・・・凝集粒子
１０３・・・ビーズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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