(57)【要約】【課題】  サイトケラチン１９のｍＲＮＡを迅速に増幅・検出すること。【解決手段】  サイトケラチン１９  ｍＲＮＡ中の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、相補的な配列を有する第二のプライマー（第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブで経時的に測定することで前記課題を解決する。【選択図】  図１
2010124770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサイトケラチン１９（以降ＣＫ１９と表記）ｍＲＮＡの測定方法において、
前記測定方法が、ＣＫ１９  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いた、
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる測定方法であり、かつ、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号５で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号７で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１９から２２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２９から３２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２３あるいは２４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２５あるいは２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号２７あるいは２８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１あるいは２に記載のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、測定方法。
【請求項４】
前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４６に示されるいずれかの塩基配列中、あるいは当該相補配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
請求項１から５に記載のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＣＫ１９  ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、
（ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、および当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、
および、
（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、
を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、測定方法。
【請求項７】
前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９から１８で示されたいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
ＣＫ１９  ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１から８、または配列番号３９から４６に示されたいずれかの塩基配列中または当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅法を利用したサイトケラチン１９  ｍＲＮＡの測定方法に関する。より正確には、本発明は一定温度（４０から６０℃。好ましくは４３℃）でのｍＲＮＡの増幅、検出に適したオリゴヌクレオチドを提供し、本発明によって試料中のサイトケラチン１９  ｍＲＮＡを簡便・迅速に測定することができる。また、本発明はサイトケラチン１９  ｍＲＮＡ測定のための試薬も提供し、分子生物学、生化学、医学分野などにおける研究・診療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
サイトケラチンは細胞骨格を形成する中間径フィラメントタンパク質で、上皮組織に特徴的に存在する。現在までに２０種以上のサイトケラチンが同定され、また、そのタンパク質の電荷に基づき、酸性のタイプＩと、中性から塩基性のタイプＩＩに分類される。サイトケラチンは種類によって発現部位が異なっており、サイトケラチン８、１８、１９は主として上皮細胞に発現しており、サイトケラチン５、１４は基底細胞に、サイトケラチン２、６、１０、１１は基底上組織にそれぞれ局在していることが知られている。
【０００３】
サイトケラチンが医療などの分野で広く認識されているのは、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色が多用されていることが一因である。多くの場合、癌の診断は病理学的に行なわれ、癌が疑われる組織や細胞をヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した標本を用いるのが一般的である。しかしながら、ＨＥ染色では癌細胞と正常細胞の区別がつきにくいことがあり、癌細胞の発見を見落とすことがある。そこで、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫組織染色が多用されている。上皮組織以外の検体を抗サイトケラチン抗体を用いて免疫組織染色した結果、陽性反応が見られた場合、その組織に本来は上皮組織でしか発現していないはずのサイトケラチンが発現していることとなり、組織学的に異常、つまりは病理学的に癌である判断される。
【０００４】
サイトケラチン１９（以降ＣＫ１９と表記）は、主として上皮組織に発現するだけでなく、他の正常組織においても少量発現していることが知られているが、種々の癌でその発現が亢進している事が明らかとなっている。前述の抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色においても、ＣＫ１９を抗原として認識する抗体を使用することが多い。ＣＫ１９のこのような発現特性は、腫瘍マーカーとしての条件を満たすものであり、実際に腫瘍マーカーとして広く使用されている。ＣＫ１９は、種々の癌で発現が亢進することから適用される癌種も多く、使用法も癌の早期診断、転移診断、治療効果のモニタリングなど多岐に亘っており、非常に有用な腫瘍マーカーといえる。
【０００５】
前述のように病理診断による癌の診断は、ゴールドスタンダードとして広く汎用されているが、病理医の高い技術が必要とされ、使用する検体によっては癌細胞の見落としがあることが指摘されている。近年、こういった見落としの軽減、また各病院などで均一な診断が行えるように遺伝子検査（核酸増幅法）の使用が提案、あるいは一部実用化がなされている。核酸増幅法が高感度であることはすでに知られており、特定の遺伝子を増幅するため高い特異性を得ることができ、また、測定法によっては試料中の特定遺伝子の定量を行なうことも可能である。つまりは、特定遺伝子の発現量の大小に関する情報も提供することができる。
【０００６】
一般に、核酸増幅法を利用した腫瘍マーカー遺伝子ｍＲＮＡの検出の際には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が核酸増幅法として広く用いられており、ＣＫ１９  ｍＲＮＡに対する適用も報告されている（非特許文献１から８、特許文献１から４参照）。当該増幅法は、例えば、腫瘍組織からＲＮＡを抽出後、
（ａ）抽出したＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、および、
（ｂ）当該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し検出する工程、
と二段階の工程（場合によってはさらに検出工程を別個に実施する必要がある）が必要であるため、操作の煩雑性や二次汚染の危険性が示唆される。また、前記二段階の工程を実施するのに通常２時間以上が必要であり、複数の工程の実施による再現性不良、多数検体処理や検査コストの低減の点で問題があった。反応時間短縮のため、前記二段階の工程を同時に行なうＯｎｅＳＴＥＰ  ＲＴ−ＰＣＲ法も開発されているが、各工程を別個に行なうＲＴ−ＰＣＲ法に比べて検出感度の低下や非特異的な増幅産物が産生されやすいことなどが指摘されている。さらに、ＰＣＲ法による増幅は２本鎖ＤＮＡを増幅するため、混入する染色体ＤＮＡも増幅する可能性が懸念されるため、厳密にｍＲＮＡ発現を解析するためにはＤＮａｓｅなどによる消化を行ない染色体ＤＮＡを完全に除く必要があった。このため、操作の更なる煩雑化や再現性不良を招いていた。さらに、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００７】
また、別の核酸増幅法である、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を利用したＣＫ１９  ｍＲＮＡの増幅、検出も報告されている（非特許文献９、１０、特許文献５参照）。これは、２種類のインナープライマー、２種類のアウタープライマー、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を混合し、一定温度（６５℃前後）で保温することにより、目的とする核酸を増幅する方法である。しかしながら、前記増幅法は、プライマー設計数が多く、かつ個々のプライマー設計において多くの制約があるため設計が非常に複雑である。例えば、標的遺伝子に対して、３’末端、５’末端においてそれぞれ３つの領域を選定（この際、各領域間の距離などが重要とされている）した上で、各領域の相同的あるいは相補的な配列を組み合わせて長さの異なるプライマーを設計する必要がある。当然ながら、この際各プライマーのＴｍ値やＧＣ含量などが反応性に関連することから、プライマーを設計できる領域はかなり限定される。さらには、反応速度を増加させるためにＬｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒの使用が可能（Ｌｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒの使用で検出時間は３０分程度に短縮される）であるが、さらに２つのプライマーを設計する必要がある。このように多数のプライマーを設計するには困難が伴うだけでなく、製造コストの面で不利となる。さらにはＬＡＭＰ法では、増幅産物を直接的に検出するのではなく、反応溶液の濁度を検出することで、相対的に増幅産物の量を推定している。濁度を検出する方法は、直接的に増幅核酸を検出しているわけではないため、非特異的な増幅産物が産生される場合は定量的な検出が行なえないばかりでなく、測定結果から非特異的な増幅産物が産生されたのかどうかが分からない。また、多数のプライマーが反応に関与するＬＡＭＰ法では非特異的な増幅産物の産生を完全に抑制することは困難である。したがって、ＰＣＲ法において一部報告がなされているマルチプレックスＰＣＲのような、複数の腫瘍マーカーを同時に増幅検出するのは不向きといえる。濁度検出法ではどの腫瘍マーカーを増幅検出したのか判断できないからである。また、ＬＡＭＰ法もＲＴ−ＰＣＲ法と同様、２本鎖ＤＮＡを鋳型として増幅を行なうため、染色体ＤＮＡを増幅する可能性がある。他にも、ＬＡＭＰ法による増幅時の温度は６５℃の一定であるが、一般的には反応前後で高温処理を必要とし、これは反応装置の省力化・低コスト化の障害となっている。
【０００８】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、ＮＡＳＢＡ法（特許文献６および７参照）、およびＴＭＡ法（特許文献８参照）などが報告されている。前記ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生成し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【０００９】
前記ＲＮＡ増幅法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。また、結果が出るまでに通常、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法ともに９０分以上必要であり、迅速な結果を得るに至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に予備加温（例えば、６５℃）の必要があり、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
【００１０】
簡便にＲＮＡを増幅・測定する方法としては、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（特許文献９および非特許文献１１参照）があげられる。前記方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変更するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を、同時かつ迅速、簡便に実施することが可能である。この方法では、増幅された核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、増幅された核酸を直接的に検出でき、また、複数のインターカレーター性蛍光色素を使用することで、複数の核酸を増幅後、個々の増幅産物を検出することができる。より具体的な態様としては、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定塩基配列に対して、
（１）当該特定塩基配列の３’末端側に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、
（２）（１）の逆転写反応によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡを生成させ、
（３）（２）で生成した１本鎖ＤＮＡの３’末端に相補的で、かつ、それ自身がその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、
（４）（３）で生成した２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定塩基配列のＲＮＡ）を生成させる方法である。
そして、（４）で生成したＲＮＡ転写産物は特定塩基配列に由来するＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）の反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（１）から（４）の反応が進行することでＲＮＡ増幅の連鎖反応が起きる。
【００１１】
当該核酸増幅法の特徴は、ＰＣＲ法のように反応液の温度を昇降させる必要がなく、またＲＮＡの逆転写と、その後のＤＮＡ増幅反応を分けて実施することがない、という点にある。さらに、増幅されたＲＮＡ転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させ、特定塩基配列または当該塩基配列に相補的な配列の増幅と同時に、当該増幅の様子を直接的に検出（モニタリング）することができる。したがって、通常のＲＮＡ増幅法のように、別個にハイブリダイゼーション検出などを行なう必要がないため、結果を得るまでの時間を大幅に短縮可能である。
【００１２】
しかしながら、当該核酸増幅法に適したＣＫ１９  ｍＲＮＡ増幅用プライマー配列およびその組み合わせ、さらには検出用のオリゴヌクレオチドプローブ配列については知られていない。これは、反応の開始時に一度反応温度よりも高温にし、標的となるＲＮＡの高次構造を変性させる工程を必要とするＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などの核酸増幅法と異なり、当該核酸増幅法が、増幅反応を通じて、比較的低温の一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で標的とするｍＲＮＡの増幅検出を行なうことに由来する。つまり、一般にｍＲＮＡのような１本鎖ＲＮＡは高次構造を形成しやすいことが知られており、当該核酸増幅法のような反応条件下では、標的となるｍＲＮＡが高次構造を形成し、プライマーおよびプローブの結合を阻害すると考えられるため、最適なプライマーおよびプローブは高次構造フリー領域に設計する必要がある。ＲＮＡ高次構造の指標として、塩基配列から二次構造を二次構造解析ソフトウェアにより計算・推定することは可能だが、計算上の二次構造から実際の高次構造を推定することは極めて困難である。
【００１３】
また、当該核酸増幅法のように比較的低温で核酸増幅を実施する場合、高温で実施されるＰＣＲ法に比較してプライマーダイマーといった非特異産物が生産しやすく、非特異産物生成を低減させるためにはプライマーの組み合わせも厳密に選定する必要がある。しかしながら、一般に用いられるプライマーの設計法は、高温で変性する工程を含むこと（例えばＰＣＲ法）を前提としているため、既存のプライマー設計技術では、当該核酸増幅法に適したプライマーを設計することは困難である。よって、前記一定温度ＲＮＡ増幅・測定法による迅速、簡便、高感度なＣＫ１９  ｍＲＮＡ測定を実現するためには、一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下においても結合効率が低下せず、かつＣＫ１９  ｍＲＮＡの増幅、検出が可能なオリゴヌクレオチドおよびその組み合わせが必要であった。
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０２００８１号
【特許文献２】特表２００３−５２７０９８号公報
【特許文献３】特表２００５−５２２２３１号公報
【特許文献４】特表２００８−５０２３３０号公報
【特許文献５】特開２００４−８９１８０号公報
【特許文献６】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献７】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献８】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献９】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献１】Ａｎｎｅ−Ｍａｒｉｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７７，２１３−２２０（１９９７）．
【非特許文献２】Ｔａｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９４，１１６４−１１６９（２００６）．
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，１６，６４３−６４８（２００６）．
【非特許文献４】Ｗｅｉｇｇｅｌｔ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９０，１５３１−１５３７（２００４）．
【非特許文献５】Ｋａｍｉｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１４９，９９８−１００５（２００３）．
【非特許文献６】Ｍａｋｉｎｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，５０，１４０７−１４１０（２００３）．
【非特許文献７】Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，７９，１８１３−１８２０（１９９９）．
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，９，３０８−３１４（２００６）．
【非特許文献９】Ｔｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４８０７−４８１６（２００７）．
【非特許文献１０】Ｍｉｋｅ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１２２，２５６２−２５６７（２００８）．
【非特許文献１１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，１２４７−１２５２（２００３）．
【非特許文献１２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ヒト細胞や組織などから得られた試料に対し、サイトケラチン１９  ｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、サイトケラチン１９（以降ＣＫ１９と表記）ｍＲＮＡを特異的かつ迅速に測定する方法を構築するに至った。
【００１７】
第一の発明は、試料中のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、
前記測定方法が、ＣＫ１９  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いた、
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる測定方法であり、かつ、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法である：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号５で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号７で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド。
【００１８】
第二の発明は、第一の発明に記載のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法である：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１９から２２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２９から３２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２３あるいは２４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２５あるいは２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号２７あるいは２８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド。
【００１９】
第三の発明は、第一あるいは第二の発明に記載のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、測定方法である。
【００２０】
第四の発明は、前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、第三の発明に記載の測定方法である。
【００２１】
第五の発明は、前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４６に示されるいずれかの塩基配列中、あるいは当該相補配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、第四の発明に記載の測定方法である。
【００２２】
第六の発明は、第一から第五の発明に記載のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法において、前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＣＫ１９  ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、
（ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、および当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、
および、
（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、
を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、測定方法である。
【００２３】
第七の発明は、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９から１８で示されたいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、第六の発明に記載の測定方法である。
【００２４】
第八の発明は、ＣＫ１９  ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１から８、または配列番号３９から４６に示されたいずれかの塩基配列中または当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドである。
【００２５】
第九の発明は、第八の発明に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定試薬である。
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明中の試料とは、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明は、ヒト細胞、ヒト組織、体液、血液、尿、便、リンパ液、乳管液、あるいは腹腔や胸腔の洗浄液等を材料として、例えば特開平７−５９５７２号などに記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、当該試料を直接的に測定することで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織などに含まれるＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定を行なうものである。
【００２８】
本発明中の特定塩基配列とは、ＣＫ１９  ｍＲＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、ＣＫ１９  ｍＲＮＡ上で、第一のプライマーは特定塩基配列の５’末端から３’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相同的であり、第二のプライマーは特定塩基配列の３’末端から５’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相補的である。よって、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、当該部位は切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
【００２９】
本発明中のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位である。種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が知られており、本発明の使用において特にプロモーターを限定するものではないが、分子生物学的実験などで通常用いられている、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターが好ましい。また前記配列に転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明中の相補的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。高ストリンジェントな条件の一例として、本発明の実施例に記載の核酸増幅反応液組成をあげることができる。また、本発明中の相同的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列の完全相補配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう相補的あるいは相同的な配列は、高ストリンジェントな条件においてハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能であることはいうまでもない。さらに、ハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲で、１から数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いてもよい。
【００３１】
本発明中のヌクレオチドもしくは核酸とは、天然に存在する塩基、糖および糖間結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシド（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）およびポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本発明中のヌクレオチドあるいは核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子、および放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマーまたはポリマーなども含む。
【００３２】
本発明中のプライマーとは、核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいい、核酸増幅反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法（特許文献９および非特許文献１１参照）といった核酸増幅反応により、鎖長あるいは配列において特異的な生成物が得られるように、好ましくはプライマー自身がその鋳型に特異的な配列を含むよう設計される。
【００３３】
プライマーの長さは、通常１５から１００塩基、好ましくは１５から３５塩基の鎖長を有するように設計されるが、当該鎖長に限られるものではない。よって、本発明の第一および第二のプライマーは、本願発明に記載する塩基配列の範囲内で、少なくとも連続する１５塩基以上の任意の配列の中から選定することができる。すなわち、本発明におけるＣＫ１９  ｍＲＮＡ検出のための第一および第二のプライマーは、
（ｉ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号１に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号５に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号２に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号３に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号７に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
または、
（ｉｖ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
である。
【００３４】
本発明におけるＣＫ１９  ｍＲＮＡ検出のための第一および第二のプライマーのより好ましい態様は、
（ｉ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号１９から２２に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号２９から３２に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号２３あるいは２４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３３あるいは３４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号２５あるいは２６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３５あるいは３６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
または、
（ｉｖ）第一のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号２７あるいは２８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３７あるいは３８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
である。
【００３５】
本発明におけるＣＫ１９  ｍＲＮＡ検出のための第一および第二のプライマーの好ましい一態様として、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１９から２２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２９から３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２３あるいは２４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号２５あるいは２６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号２７あるいは２８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
があげられる。
【００３６】
さらに本発明の一態様として、ＣＫ１９  ｍＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の前記５’末端部位で切断される。特定核酸配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ＣＫ１９  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。
【００３７】
本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、ＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号９から１８に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００３８】
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的、または相同的な配列となる。本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとして、ＣＫ１９  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３９から４６に記載の配列に対して相同的、または相補的な配列の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブがあげられる。
【００３９】
本発明におけるＣＫ１９  ｍＲＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドの組み合わせの一態様として、
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９から１２に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号１に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号９から１２に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号５に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４１に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１３あるいは１４に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号２に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１３あるいは１４に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４２あるいは４３に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１５あるいは１６に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号３に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１５あるいは１６の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号７に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４４あるいは４５に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７あるいは１８に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１７あるいは１８の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
があげられる。なお、（ｉ）において、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列および第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する必要がある。
【００４０】
本発明におけるＣＫ１９  ｍＲＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドの組み合わせのより好ましい態様として、
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９あるいは４０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９あるいは４０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｖｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０あるいは４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０あるいは４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４２あるいは４３に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４２あるいは４３に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４４あるいは４５に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４４あるいは４５に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
があげられる。
【００４１】
本発明のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法では、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するのみだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加してもよい。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験などで汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体を例示できる。
【００４２】
本発明の一態様では、試料中のＣＫ１９  ｍＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一および第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＣＫ１９  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行なわれる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖は前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で、かつ５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００４３】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加してもよい。
【００４４】
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から６０℃の範囲で設定することがより好ましく、さらに好ましい態様は反応温度が４３℃である。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
【００４５】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。前記測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などがあげられる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるのが好ましい。該オリゴヌクレオチドプローブとしてモレキュラービーコンといったＦＲＥＴを利用した既知のプローブを使用することができるが、プローブ設計やプローブ合成の容易性から、より好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献９および非特許文献１１参照）。
【００４６】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが知られている。前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献９および非特許文献１１参照）。
【００４７】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献９および非特許文献１１参照）。また、前記官能基の導入方法としては、市販されているＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いても可能である。
【００４８】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４７）を有する第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、切断用オリゴヌクレオチド、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度４０から６０℃（好ましくは４３℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
【００４９】
前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００５０】
本発明の一態様として、前記試料中のＣＫ１９  ｍＲＮＡを測定し、得られた蛍光強度比の情報と、既知の濃度のＣＫ１９  ＲＮＡを測定した際の蛍光強度比の情報を比較することで、試料中に存在した特定塩基配列の量（対象となったＲＮＡコピー数）を算出することが可能である。特定塩基配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行なった反応液に対して、特定塩基配列に対して相補的に結合し得る固定化および標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定塩基配列に特異的に結合する、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する方法が好ましい。また、このプローブは前記ＲＮＡ増幅反応を阻害しないため、その存在下で前記特定塩基配列の増幅を実施して、特定塩基配列の増幅の様子をモニタリングする方法が特に好ましい。なお、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定塩基配列の増幅を行なう場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加するなどするのが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが特定塩基配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出器によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、特定塩基配列の存在の有無の確認、または増幅された特定塩基配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定核酸配列の量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。
【００５１】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＣＫ１９  ｍＲＮＡを測定することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいればよく、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションを防止する上で特に好ましい。
【００５２】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりＣＫ１９  ｍＲＮＡの高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度かつ一段階の直接的増幅・検出が可能となった。
【発明の効果】
【００５３】
本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）ＲＮＡを１段階の操作で特異的で、かつ迅速・高感度に増幅し、また増幅産物を直接的に検出することができる。
【００５４】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（ＣＫ１９遺伝子のｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を５’末端を有する２本鎖ＤＮＡが合成され、前記ＤＮＡを鋳型に多量の１本鎖ＲＮＡが生成され、さらに生成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することにより蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便、かつ迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。本発明のＣＫ１９  ｍＲＮＡ測定方法は、核酸増幅および測定の時間が３０分以内であり、これは既存のＲＴ−ＰＣＲ法（通常２時間以上）、ＮＡＳＢＡ法（９０分以上）、ＴＭＡ法（９０分以上）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法（通常３０から６０分程度）による測定よりも同等以上の迅速性を有する。
【００５５】
さらに、１段階操作でＣＫ１９遺伝子のｍＲＮＡを増幅・検出するためのオリゴヌクレオチドを提供すること、すなわちＣＫ１９  ｍＲＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチド、およびＣＫ１９  ｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＣＫ１９  ｍＲＮＡ発現細胞の測定方法、ならびに定量試薬を生化学・分子生物学・医療分野などに提供することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００５７】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したＣＫ１９  ＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で行なった。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＫ１９の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２２７６、１４９０塩基）のうち、１６０から１３５３番目の塩基（１１９４塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００５８】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。配列番号３９に記載の配列の５’末端から９番目のＴ、配列番号４０に記載の配列の５’末端から１２番目のＴ、配列番号４１に記載の配列の５’末端から１３番目のＡ、配列番号４２に記載の配列の５’末端から１３番目のＣ、配列番号４３に記載の配列の５’末端から７番目のＴ、配列番号４４に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号４５に記載の配列の５’末端から１０番目のＣ、配列番号４６に記載の配列の５’末端から９番目のＧの位置にＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基にインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３９から４６）を調製した（非特許文献１２参照）。
【００５９】
実施例３  ＣＫ１９  ＲＮＡの測定（その１）
表１に示す組み合わせのうち［１］から［２８］に示す、切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（以降ＩＮＡＦプローブと表記）を用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお表１のうち、配列番号１９から２２は配列番号１の部分配列、配列番号２３および２４は配列番号２の部分配列、配列番号２５および２６は配列番号３の部分配列、配列番号２７および２８は配列番号４の部分配列、配列番号２９から３２は配列番号５の部分配列、配列番号３３および３４は配列番号６の部分配列、配列番号３５および３６は配列番号７の部分配列、配列番号３７および３８は配列番号８の部分配列である。
【００６０】
【表１】
2010124770.tif 000003
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い、１０３コピー／５μＬになるように希釈し、これをＲＮＡ試料として使用した。
（２）以下の組成の反応液２０．０μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＰＣＲ  ｔｕｂｅ  ｗｉｔｈ  ｄｏｍｅ  ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００６１】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１．０ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
１．０μＭ  第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４７）が付加されている。）
１．０μＭ  第二のプライマー
０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（当該オリゴヌクレオチドの３’末端の
水酸基はアミノ化されている。）
２０．０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ
６．０Ｕ  リボヌクレアーゼ  インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μＬを添加した。
【００６２】
酵素液の組成（反応時（３０μＬ中）の最終濃度）
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス社製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００６３】
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、その時の時間を検出時間とした結果を表２に示した。
【００６４】
【表２】
2010124770.tif 000004
表１の組み合わせのうち、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号５の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［１］から［８］）、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号６の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［９］から［１６］）、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号３の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号７の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［１７］から［２４］）、
および、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号４の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号８の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［２５］から［２８］）、
いずれも１０３コピー／５μＬの標準ＲＮＡを２０分以内に検出した。なお、コントロール試験区（標準ＲＮＡの代わりにＲＮＡ希釈液を反応液に添加して測定）では、反応開始から３０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。
当該結果より、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号５に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号６に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号３に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号７に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
または、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号４に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号８に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
のいずれかを用いてＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、従来技術で最も汎用されるＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＫ１９  ｍＲＮＡの検出方法（通常２時間以上）と比較してＣＫ１９  ＲＮＡを迅速に検出することが示された。
【００６５】
実施例４  ＣＫ１９  ＲＮＡの測定（その２）
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、実施例３よりも低濃度の標準ＲＮＡを測定した。
【００６６】
（１）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で実施した。
【００６７】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［５］から［８］、［１０］、
［１２］、［１４］、［１６］、［２０］から［２２］、［２４］、［２７］から
［３０］を使用。
【００６８】
ＲＮＡ試料：
実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、
５０コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、および１０３コピー／５μＬに希釈
したものを使用。
【００６９】
（２）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３に示す。
【００７０】
【表３】
2010124770.tif 000005
今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、５０コピー／５μＬの標準ＲＮＡを２０分以内に検出した。以上より、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてＣＫ１９  ＲＮＡを増幅させることで、５０コピー／５μＬといった低濃度のＣＫ１９  ＲＮＡであっても迅速に検出できることが示された。
【００７１】
実施例５  特異性評価
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＣＫ１９  ＲＮＡの増幅検出系における、他のサイトケラチンＲＮＡに対する交差反応性について検討した。
【００７２】
（１）サイトケラチン１８（以降ＣＫ１８と表記）ＲＮＡ、およびサイトケラチン２０（以降ＣＫ２０と表記）ＲＮＡの調製
（１−１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＫ１８の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００２２４、１４８５塩基）のうち１１０から１４３４番目の塩基（１３２５塩基）、およびＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＫ２０の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１９０１０、１８１７塩基）のうち、４０から１７１０番目の塩基（１６７１塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（１−２）（１−１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
（１−３）（１−２）で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い、１０１０コピー／５μＬになるように希釈した。
【００７３】
（２）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で実施した。
【００７４】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［８］、［１０］、［２１］、［２８］
を使用。
【００７５】
なお、
組み合わせ［８］は、第一のプライマーが配列番号１の部分配列からなり、第二の
プライマーが配列番号５の部分配列からなる組み合わせ、
組み合わせ［１０］は、第一のプライマーが配列番号２の部分配列からなり、第二
のプライマーが配列番号６の部分配列からなる組み合わせ、
組み合わせ［２１］は、第一のプライマーが配列番号３の部分配列からなり、第二
のプライマーが配列番号７の部分配列からなる組み合わせ、
組み合わせ［２８］は、第一のプライマーが配列番号４の部分配列からなり、第二
のプライマーが配列番号８の部分配列からなる組み合わせ、
にそれぞれ相当。
【００７６】
ＲＮＡ試料：
ＲＮＡ試料のうち、ＣＫ１９は実施例３で使用した試料、ＣＫ１８およびＣＫ２０
は本実施例の（１）で調製した試料を使用。
【００７７】
（３）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表４に示す。なお、表４においてＮ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。
【００７８】
【表４】
2010124770.tif 000006
今回検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせはいずれも、ＣＫ１９  ＲＮＡのみを検出し、一方、ＣＫ１８およびＣＫ２０は１０１０コピー／５μＬという非常に多量のＲＮＡ試料であっても検出しなかった。以上の結果より、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＣＫ１９  ＲＮＡの増幅検出系は、サイトケラチンのうちＣＫ１９を特異的に検出することが示された。
【００７９】
実施例６  ＣＫ１９  ＲＮＡの測定（その３）
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、様々な濃度の標準ＲＮＡを測定し、検出時間と初期標準ＲＮＡとの関係を確認した。
【００８０】
（１）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で測定した。
【００８１】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、［８］、［１０］、および［３０］を使用。
【００８２】
ＲＮＡ試料：
実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、
１０２コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬ、１０４コピー／５μＬ、および
１０５コピー／５μＬに希釈したものを使用。
【００８３】
（２）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表５に、表５の結果を基に検量線を作成した結果を図１に示す。また、１０２コピー／５μＬのＲＮＡ試料を測定したときの反応開始後２０分後における蛍光強度比も合わせて表５に記載した。
【００８４】
【表５】
2010124770.tif 000007
今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、酵素添加後１５分以内に測定した全ての濃度の標準ＲＮＡを検出した。また、検出時間を縦軸に、初期の標準ＲＮＡ濃度量（コピー数をｌｏｇで表したもの）を横軸にしてプロットしたところ、今回検討した全ての組み合わせにおいて、１０２コピーの低コピー領域から検出時間は初期ＲＮＡ量依存的であり、検量線は線形一次曲線で近似することができた。すなわち、未知試料について、本発明のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定を行ない、得られた検出時間を図１に示す検量線に当てはめることで、未知試料に含まれるＣＫ１９  ｍＲＮＡの量を推測可能であることが示された。
【００８５】
実施例７  ＣＫ１９  ＲＮＡの測定（その４）
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ヒトの肺腺癌由来の培養細胞抽出物中のＣＫ１９  ｍＲＮＡの定量を行なった。
【００８６】
（１）培養細胞の入手
ヒト肺腺癌由来培養細胞（ＰＣ−３）は、Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）より入手した（ＨＳＲＲＢ  Ｎｏ．ＪＣＲＢ００７７）。
【００８７】
（２）培養細胞の培養
ＰＣ−３細胞の培養は、ＨＳＲＲＢのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｅｌｌｄａｔａ／ｊｃｒｂ００７７．ｈｔｍ）に記載の培地、培養条件に従い培養した。
【００８８】
（３）リンパ球の単離
健常人の血液（全血）を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、付属のマニュアルに従いリンパ球の単離を行なった。
【００８９】
（４）ＲＮＡの抽出
培養したＰＣ−３細胞は、細胞数を計測し、５ｃｅｌｌｓ、５０ｃｅｌｌｓ、５×１０２ｃｅｌｌｓ、５×１０３ｃｅｌｌｓになるように調製し、前記細胞のみ、あるいは前記細胞を５×１０６Ｃｅｌｌｓのリンパ球と混合した試料を作製し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて、キット付属のマニュアルに従い、ＲＮＡの抽出を行なった。なお、ＲＮＡ抽出試料の量は５０μＬである。
【００９０】
（５）ＣＫ１９  ＲＮＡの測定
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
【００９１】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［１０］を使用。
【００９２】
ＲＮＡ試料：
本実施例の（４）に記載のＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）記載のＲＮＡ希釈液
を用いて１０倍希釈後、そのうちの５μＬを使用。
【００９３】
（６）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表６（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）および７（ＰＣ−３細胞とリンパ球との混合物からのＲＮＡ抽出試料）に、また表６および７の検出時間と、実施例６で得られた検量線（図１（ｂ））を基に各ＲＮＡ試料中に含まれるＣＫ１９  ＲＮＡ量を計算した結果を表８（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）および９（ＰＣ−３細胞とリンパ球との混合物からのＲＮＡ抽出試料）に示す。
【００９４】
【表６】
2010124770.tif 000008
【００９５】
【表７】
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【００９６】
【表８】
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【００９７】
【表９】
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培養ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料、および前記細胞とリンパ球との混合物からのＲＮＡ抽出試料、いずれの試料も、検量線から求められた各ＲＮＡ試料中のＣＫ１９  ｍＲＮＡ量は、使用した培養ＰＣ−３細胞の細胞数にほぼ比例しており、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＣＫ１９  ＲＮＡの増幅検出法が濃度依存的であることが示された。
【００９８】
実施例８  ＣＫ１９  ＲＮＡ増幅産物の塩基配列解析
実施例７で得られた核酸増幅反応後の試料に含まれる２本鎖ＤＮＡの塩基配列解析を実施した。塩基配列解析の結果、全ての試料において、使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせによってＣＫ１９  ｍＲＮＡの増幅が起きたときに相当する塩基配列を確認した。
【００９９】
つまり、本発明において増幅検出しているのはＣＫ１９  ＲＮＡであり、他の非特異的なＲＮＡは増幅検出していないことを示している。実施例７に示したＲＮＡ抽出物には、ＣＫ１９  ＲＮＡの他に雑多なＲＮＡが混入しているが、本発明の測定方法はＣＫ１９  ＲＮＡのみを増幅検出しており、非常に特異性が高いといえる。また、多量の夾雑物（ＣＫ１９  ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ）存在下でも、使用した培養細胞の数に依存的、かつ非常に少量の培養細胞（５Ｃｅｌｌｓ）からの抽出物でも測定可能であり、非常に高感度、かつ正確性に優れた測定方法といえる。
【０１００】
以上より、本発明のＣＫ１９  ｍＲＮＡの測定方法は、未知試料中に含まれるＣＫ１９  ｍＲＮＡを特異的に、かつ迅速、高感度に測定可能であり、さらには、検量線を用いることで、定量を行なうことも可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ＣＫ１９  ＲＮＡの検量線。縦軸は蛍光強度比が１．２を超えた時間（検出時間、分）であり、横軸は測定に用いた初期の標準ＲＮＡ量（コピー数）をｌｏｇで表したものである。また、各点から求めた線形一次曲線の式およびＲ２の値を記載してある。
【図１】
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【配列表】
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