(57)【要約】【課題】多重様式における目的のポリヌクレオチド配列を増幅するための方法、試薬およびキットを提供すること。【解決手段】本発明は、ポリヌクレオチドまたはサンプルを分析するのに適切な種々のアッセイを実施するための方法、試薬およびキットを提供する。この種々のアッセイとしては、多重様式で実施される増幅工程が含まれる。また増幅の効率を分析するおよび改善するための方法ならびに遺伝子発現の分析を実施するための方法も提供される。本発明の方法の一つによると、一以上のポリヌクレオチドは、複数の増幅プライマー対またはセットを使用して増幅され、これら複数の増幅プライマー対またはセットの各々は、別々の目的のポリヌクレオチド配列を増幅するのに適し、または作用する。【選択図】図２
2010000092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．関連する同時係属出願に対する相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、出願番号第６０／４３１，１５６号（２
００２年１２月４日出願）および出願番号＿＿＿＿＿（「ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ  ＡＭＰＬ
ＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」と題され、２００３年１
１月２５日出願）（代理人整理番号Ｐ−７１９０２−１）についての優先権の利益を主張
し、これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（２．発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に関連し、そして特に多重様式で目的のポリヌクレオチド
配列を増幅するための方法、試薬およびキットを提供する。一旦増幅されると、この多重
増幅産物は、さらなる精製または操作を伴わず下流の分析に使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
（３．発明の背景）
ポリメラーゼ連鎖反応を使用する核酸の増幅のための一般的な原則および条件は、当該分野において周知である（例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３）。組織サンプル由来の核酸の増幅は、疾患の状態を診断および予後の決定の両方についての貴重な情報供給源、ならびに遺伝的な障害（一塩基多型（ＳＮＰ）、異常遺伝子の発現、染色体および遺伝子の再配列、転座および／または選択的スプライシング、ならびに染色体の重複／除去を含む）と関連付ける能力を示す。しかし、従来のポリメラーゼ連鎖反応の方法は、ＰＣＲ反応（例えば、一重ＰＣＲ）ごとに単一のＤＮＡ標的種のみの増幅を可能とする。例えば、目的の１０，０００個の標的配列の増幅は、代表的に従来のＰＣＲ手順に基づいて１０，０００個の別々のポリメラーゼ連鎖反応を必要とする。この従来のアプローチは、時間を消費することおよび費用がかかることが判明している。従って、サンプルに由来する標的配列を増幅する改善された方法に対する必要性が当該分野において存在し、ここで任意の複数の標的配列は、多重様式において同一の反応条件の下で同時に増幅され得る。
さらに、特定の下流のアッセイ（例えば、アレイベースのアッセイおよび定量的ＰＣＲ
アッセイ）は、適切な分析を実施するためのかなり大量の標的核酸の開始サンプルを必要
とする。限られた量の開始サンプルのみが、使用に利用可能である場合において、一また
は少数の下流分析のみが、サンプルが使い果たされる前に実施され得る。従って、実施さ
れるべき種々の下流アッセイを可能にするために、必要に応じて同時に、比較的短時間で
目的のサンプルについての種々の情報を提供するために、開始物質の量を増幅する、また
は有意に増加する方法に対する必要性が当該分野において存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（４．発明の要旨）
種々の実施形態において、本発明は、多重様式における目的のポリヌクレオチド配列を
増幅するための方法、試薬およびキットを提供する。本発明の方法の一つの実施形態によ
ると、一以上のポリヌクレオチドは、複数の増幅プライマー対またはセットを使用して増
幅され（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反
応（「ＲＴ−ＰＣＲ」により）、これら複数の増幅プライマー対またはセットの各々は、
別々の目的のポリヌクレオチド配列を増幅するのに適し、または作用する。増幅プライマ
ーの一対またはセットを用いて実施され、そのため単一の増幅された配列（「アンプリコ
ン」）を産生する従来の増幅反応とは異なり、本発明の多重増幅方法は、複数の増幅プラ
イマーの対またはセットを利用する利点により、単一の反応において複数の別々の目的の
配列の同時増幅を可能とする。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
サンプル内の目的の標的遺伝子配列の発現を定量するための方法であって、該方法は、以
下：
（ｉ）目的の標的遺伝子配列を増幅するのに適した複数の増幅プライマーセットの存在
下において、および増幅した標的遺伝子配列の領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌ
クレオチドプローブの存在下において、ポリメラーゼ連鎖反応によるサンプルに由来する
一以上のｃＤＮＡ分子を増幅する工程であって、該少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
プローブは、必要に応じて時間の関数として該増幅反応をモニタするのに適した標識系に
より標識される工程、ならびに
（ｉｉ）工程（ｉ）において増幅された該標的遺伝子配列を定量する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記工程（ｉ）の増幅はさらに、前記ポリメラーゼ連鎖
反応が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応であるように、逆転写酵素の存在下において実施さ
れ、そして前記一以上のｃＤＮＡ分子は、前記サンプルに由来するｍＲＮＡから得られる
、方法。
（項目３）
項目１に記載の方法であって、前記一以上のｃＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡライブラリーを
含む、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、前記定量する工程は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反
応増幅法、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション分析法、電気泳動法およびクロ
マトグラフィー法からなる群の少なくとも一つより選択される方法による分析を包含する
、方法。
（項目５）
項目１に記載の方法であって、前記工程（ｉ）のポリメラーゼ連鎖反応は、前記増幅が
、直線的な範囲にあり続けるように複数のサイクルで実施される、方法。
（項目６）
項目１に記載の方法であって、前記工程（ｉ）における増幅は、熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼにより達成される、方法。
（項目７）
項目１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブは、
検出可能なシグナルを産生することが可能な部分により標識される、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、前記標識は、フルオロフォアである、方法。
（項目９）
項目７に記載の方法であって、前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブは、
５’−エキソヌクレアーゼプローブ、ステム−ループ状ビーコンプローブおよびステムレ
ス状ビーコンプローブからなる群より選択される、方法。
（項目１０）
項目１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブは、
複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該複数のオリゴヌクレオチドプローブの各々
は、別々の増幅された目的の標的遺伝子配列の領域に相補的である、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、前記工程（ｉ）の生成物は、複数のアリコートに分配
され、そして前記工程（ｉｉ）における定量する工程は、該アリコートで実施される、方
法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記アリコートの数は、多重増幅に使用されるプライ
マー対の数と等しい、方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、工程（ｉｉ）は、複数の前記標的配列の一つを増幅す
るのに適した増幅プライマーセットの存在下においてポリメラーゼ連鎖反応により各アリ
コートにおける前記生成物を増幅する工程を包含する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、前記工程（ｉｉ）における増幅工程はさらに、異なる
増幅された目的の標的遺伝子配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下
において実施され、ここで工程（ｉｉ）における各プローブは、工程（ｉ）における一つ
の該オリゴヌクレオチドプローブを含む、方法。
（項目１５）
項目１２に記載の方法であって、前記工程（ｉ）の増幅プライマーセットの前記配列は
、前記工程（ｉｉ）の増幅プライマーセットの前記配列と同一である、方法。
（項目１６）
項目１１に記載の方法であって、前記工程（ｉｉ）における増幅工程はさらに、分子の
存在下において実施され、該分子は、二本鎖ポリヌクレオチドに結合する場合、時間の関
数として前記増幅反応をモニタするのに適した検出可能なシグナルを産生する、方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、前記分子は、インターカレートする色素および小さい
方の溝に結合する色素からなる群より選択される、方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、前記分子は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよび
エチジウムブロマイドからなる群より選択される、方法。
（項目１９）
サンプル内の遺伝子発現のプロフィールを決定するための方法であって、該方法は、以下
：
（ｉ）該サンプルに由来する一以上のｃＤＮＡ分子を、目的の標的遺伝子配列を増幅す
るのに適した複数の増幅プライマーセットの存在下においてポリメラーゼ連鎖反応により
増幅させる工程；
（ｉｉ）選択したレベルよりも大きな観察された増幅効率を有する増幅した標的遺伝子
配列を同定；および
（ｉｉｉ）遺伝子発現プロフィールを得るために、工程（ｉｉ）において同定された該
標的遺伝子配列を定量する工程、
の工程を包含する、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、前記工程（ｉ）の増幅はさらに、前記ポリメラーゼ連
鎖反応が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応であるように、逆転写酵素の存在下において実施
され、そしてここで前記一以上のｃＤＮＡ分子は、前記サンプルに由来するｍＲＮＡから
得られる、方法。
（項目２１）
項目１９に記載の方法であって、前記一以上のｃＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡライブラリー
を含む、方法。
（項目２２）
項目１９に記載の方法であって、前記選択したレベルは、７０％である、方法。
（項目２３）
項目１９に記載の方法であって、前記選択したレベルは、９０％である、方法。
（項目２４）
項目１９に記載の方法であって、前記定量する工程は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖
反応増幅法、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション分析法、電気泳動法およびク
ロマトグラフィー法からなる群の少なくとも一つより選択される方法による分析法を包含
する、方法。
（項目２５）
項目１９に記載の方法であって、前記工程（ｉ）における増幅工程はさらに、増幅した
目的の標的遺伝子配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下において実
施され、該プローブは、時間の関数として工程（ｉ）における該増幅反応をモニタするの
に適切な標識系により標識される、方法。
（項目２６）
項目１９に記載の方法であって、前記工程（ｉ）の生成物は、複数のアリコートに分配
され、そして前記工程（ｉｉ）における定量工程は、該アリコートで実施される、方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法であって、工程（ｉｉ）は、複数の前記標的配列の一つを増幅す
るのに適した増幅プライマーセットの存在下において、ポリメラーゼ連鎖反応により一以
上に分けたアリコートにおいて前記生成物を増幅する工程を包含する、方法。
（項目２８）
項目２７に記載の方法であって、前記工程（ｉ）の増幅プライマーセットの配列は、前
記工程（ｉｉ）の増幅プライマーセットの配列と同一である、方法。
（項目２９）
項目２７に記載の方法であって、前記工程（ｉｉ）における増幅する工程はさらに、分
子の存在下において実施され、該分子は、二本鎖ポリヌクレオチドに結合する場合、時間
の関数として前記増幅反応をモニタするのに適した検出可能なシグナルを産生する、方法
。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、前記分子は、インターカレートする色素および小さい
方の溝に結合する色素からなる群より選択される、方法。
（項目３１）
項目３０に記載の方法であって、前記分子は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよび
エチジウムブロマイドからなる群より選択される、方法。
（項目３２）
項目２７に記載の方法であって、前記工程（ｉ）のポリメラーゼ連鎖反応は、前記増幅
が、直線的な範囲にあり続けるように複数のサイクルで実施される、方法。
（項目３３）
目的の複数の標的配列を生成する方法であって、該方法は、以下：
目的の標的配列を増幅するのに適した複数の増幅プライマーの存在下において、および
増幅した目的の標的配列の領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ
の存在下において、一以上の標的ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応により増幅す
る工程であって、該オリゴヌクレオチドプローブは必要に応じて、時間の関数として増幅
反応をモニタするのに適した標識系により必要に応じて標識される、工程
を包含する、方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法であって、前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブは
、複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該複数のオリゴヌクレオチドプローブの各
々は、増幅した目的の標的配列の領域に相補的である、方法。
（項目３５）
項目３３に記載の方法であって、前記増幅の生成物はさらに、単一のポリヌクレオチド
の多形成分析、遺伝子型分析、遺伝子発現分析、フィンガープリント分析、遺伝子診断の
ための遺伝子変異の分析、細胞において稀に発現される遺伝子の分析、核酸の配列決定、
核酸のミニ配列決定、および遺伝子発現分析からなる群より選択される少なくとも一つの
アッセイに供される、方法。
（項目３６）
項目３３に記載の方法であって、前記増幅の生成物はさらに、クロマトグラフィー法、
電気泳動法および色素またはハイブリダイゼーションプローブを用いた染色法からなる群
より選択される少なくとも一つのアッセイに供される、方法。
（項目３７）
項目３３に記載の方法であって、前記増幅の前記生成物は、複数のアリコートへ分配さ
れる、方法。
（項目３８）
項目３５に記載の方法であって、前記増幅の前記生成物は、複数のアリコートへ分配さ
れ、そしてここで前記少なくとも一つのアッセイは、少なくとも一つの該アリコートで実
施される、方法。
（項目３９）
項目３８に記載の方法であって、前記アリコートの数は、前記増幅する工程において使
用されるプライマー対の数と等しい、方法。
（項目４０）
目的の複数の異なる標的配列を産生する方法であって、該方法は、以下：
目的の標的配列を増幅するのに適した複数の増幅プライマーの存在下において、および
二重鎖ポリヌクレオチドに結合した場合、検出可能なシグナルを産生する分子の存在下に
おいて、一以上の標的ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する工程であ
って、該分子は、時間の関数として該増幅反応をモニタするのに適し、それによって複数
の標的配列を生成する、工程を包含する、方法。
（項目４１）
項目４０に記載の方法であって、前記分子は、インターカレートする色素および小さい
方の溝に結合する色素からなる群より選択される、方法。
（項目４２）
項目４１に記載の方法であって、前記分子は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよび
エチジウムブロマイドからなる群より選択される、方法。
（項目４３）
項目１、１９、３３および４０のいずれか一項に記載の方法であって、前記増幅は、ウ
ラシルＮ−グリコシラーゼの存在下において実施される、方法。
【０００６】
以下に、より詳細に議論されるように、複数の別々の配列が、単一の反応において同時
に増幅されるので、この多重増幅を、種々の状況において使用し、下流分析および／また
はアッセイに利用可能なサンプルの濃度または量を効率的に増加し得る。一旦このサンプ
ルが、本明細書中に記載される方法に従って多重増幅されると、後分析のために、前希釈
を伴ってかまたは伴わずに、アリコートへ分配され得る。その増加された濃度および量に
起因して、その本来のサンプルを用いて実施する場合に比べて、有意により多くの分析ま
たはアッセイが、多重増幅サンプルを用いて実施され得る。多くの実施形態において、多
重増幅はさらに、本来利用可能であるよりも多くのサンプルもしくは高濃度のサンプルを
必要とするアッセイまたは分析を実施する能力を可能にする。例えば、１０００倍の多重
増幅後、次いでその後のアッセイは、１０００倍よりも少ないサンプル容量で実施され得
る。多重増幅による濃縮はまた、本来のサンプル中に存在し得る増幅インヒビターを希釈
するために使用され得る。
【０００７】
多重増幅反応は、従来のＰＣＲ試薬、反応条件ならびにサイクル温度およびサイクル時
間を用いて実施され得るが、多重増幅反応において生成された種々のアンプリコンの量は
、使用したＤＮＡポリメラーゼの量もしくは濃度、および／またはサイクルあたりのプラ
イマー伸長反応の時間もしくは持続時間の長さを増加させることによって、増加され得る
ことが発見された。
【０００８】
多重増幅産物の生成における特定の実施形態において、増幅の間に生成された種々のア
ンプリコンの相対濃度は、使用したＤＮＡポリメラーゼの量または濃度を増加することに
よって、そして／またはサイクルあたりのプライマー伸長反応の時間もしくは持続時間の
長さを増加させることによる相対濃度における変化を検出するために十分に維持され得る
。
【０００９】
さらに、従来のプライマー濃度が使用され得る一方で、驚くべきことに、非常に低濃度
の増幅プライマーの存在下で、高度の効率で増幅が進行することが発見された。比較する
ために、従来の一重の（「一重の（ｓｉｍｐｌｅｘ）」）ＰＣＲ増幅を３００〜９００ｎ
Ｍの各プライマーの存在下で行うのに対して、高効率の多重反応を、各プライマーわずか
４５ｎＭを用いて達成した。
【００１０】
ＤＮＡ標的ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ標的ポリヌクレオチドは両方ともこのような
低濃度のプライマーを使用して多重増幅され得る。具体的には、逆転写、およびＤＮＡポ
リメラーゼを用いて生じたｃＤＮＡのその後の多重増幅を介したＲＮＡのｃＤＮＡへの逆
転写は、低濃度（例えば、各プライマーについて、４５ｎＭ）でプライマーを使用して達
成され得る。従って、本発明は、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）それぞれの原理を用いて、多重様式でのＤＮＡ標的
ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ標的ポリヌクレオチド両方の増幅を可能にする。
【００１１】
さらに、個々のプライマー濃度は、最適化される必要はなく；約等モル濃度での全ての
プライマーの使用が、良好な結果をもたらすことが発見された。さらに、本発明の特定の
実施形態において、低濃度のプライマーの使用は、非特異的なプライマー相互作用（例え
ば、プライマー二量体化）の可能性を低減させ、それによって最適化に対する必要物を除
去することが示された。本発明の種々の実施形態に記載されるプライマーの濃度（例えば
、各プライマー４５ｎＭ）は、標的配列の多重増幅を可能にするのに十分高いが、相互に
非特異的にプライマーが相互作用することを防止するまたは回避するために十分低いこと
が示された。従って、配列の実質的に任意の組合せの多重増幅が、時間を要する最適化工
程を伴なわずに、迅速に達成され得る。
【００１２】
多重増幅におけるオリゴヌクレオチドプローブの存在は、顕著に増幅反応を妨害しない
ことも発見された。従って、多重増幅は、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、定量Ｐ
ＣＲ分析またはリアルタイムＰＣＲ分析のために設計された非プライム化オリゴヌクレオ
チドプローブ（ｎｏｎ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ））の存在下
で、効率的に実施され得る。多重増幅に存在し得るプローブの型の非限定的な例としては
、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（例えば、米国特許第５，５３８，８４８号を参照
のこと）、ステムループすなわちヘアピンＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例
えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号ならびにＴｙａ
ｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４
：３０３−３０８）、ステムレスすなわち直鎖ビーコン（例えば、ＷＯ９９／２１８８１
を参照のこと）、ＰＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（例えば、米国特許第６，
３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照のこと）、直鎖ＰＮＡビーコン
（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａら、２００１、ＳＰＩＥ  ４２６４：５３−５８を参照のこと
）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓ
ｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６
，５４８，２５０号）、ステムループかつ二本鎖ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌ
ｉｎａｓら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．２９：Ｅ９６および米国
特許第６，５８９，７４３号）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１
号）、擬似ノットプローブ（ｐｓｅｕｄｏ  ｋｎｏｔ  ｐｒｏｂｅ）（米国特許第６，５
４８，２５０号）、サイクリコン（ｃｙｃｌｉｃｏｎ）（米国特許第６，３８３，７５２
号）、ＭＧＢ  ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、
ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライト
アッププローブ、自己組織化ナノ粒子プローブ、およびフェロセン改変プローブが挙げら
れる。
【００１３】
この発見は、重要である。なぜなら、既製の市販試薬（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｓｉｎｅｓｓ；Ｆｏ
ｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって、商品名Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍｅｎｄ（登録
商標）で販売される遺伝子発現試薬およびＳＮＰ試薬）を使用して多重増幅反応を実施す
ることが可能になるからである。これに関連して、増幅プライマーおよびプローブを含む
既製の試薬は、一緒にプールされ得、そして、前もってプローブを除去することなく、多
重増幅反応に使用され得る。多重増幅が、このようなオリゴヌクレオチドプローブの非存
在下で実施されるのと同様に、このようなオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施さ
れる多重増幅は、さらなる精製または操作を伴わずにその後の分析をするために、前希釈
を伴ってか、または伴わずに、アリコートに分配される。
【００１４】
多重様式で増幅されたサンプルは、さらなる精製または操作を伴わずに、実質的に、任
意の後の分析またはアッセイに使用され得る。例えば、多重増幅の産物は、単一ポリヌク
レオチド多形分析、遺伝子型分析、遺伝子発現分析、フィンガープリント分析、遺伝的診
断のための遺伝子突然変異の分析、細胞における発現が稀な遺伝子の分析、核酸配列決定
（例えば、米国特許第６，４２８，９８６号）、核酸ミニ配列決定（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ）（例えば、米国特許第６，４７９，２４２号）、およびアレイに対するハ
イブリダイゼーション（例えば、米国特許第６，４８５，９４４号）のために使用され得
る。多重増幅産物は、さらなる増幅分析（例えば、定量ＰＣＲ増幅またはリアルタイムＰ
ＣＲ増幅を介した分析）にさえも適している。この後者の実施形態において、後の定量Ｐ
ＣＲ分析またはリアルタイムＰＣＲ分析のために使用されるプライマーの配列は、最初の
多重増幅に使用されるプライマーの配列と同一であってもよいし、また、異なっていても
よい。多重増幅産物は、アリコートに分配され得、そのそれぞれは、後の一重のまたは多
重アッセイまたは分析に供され得る。あるいは、多重増幅産物は、アリコートに分割され
る必要はなく、種々のアッセイおよび分析が、その産物に直接実施され得る。
【００１５】
意義深いことに、このような後の分析またはアッセイは、プールされたオリゴヌクレオ
チドプローブおよび／またはプライマーを最初に除去することなく、多重増幅産物に直接
行われ得る。後の分析またはアッセイに持ち越されたいずれのプローブおよび／またはプ
ライマーも分析またはアッセイを妨害しない。
【００１６】
なお別の実施形態において、本発明は、一つ以上の目的のポリヌクレオチド配列の存在
についてのサンプル分析の二工程方法を提供する。一番目の工程では、サンプル（または
複数の異なるサンプル）に由来する一つ以上のポリヌクレオチドが、上記のように、複数
の異なる増幅プライマー対またはプライマーセットの存在下で多重増幅される。一実施形
態において、二番目の工程では、多重増幅産物は、目的の配列を増幅するために作動する
、または適した一組の増幅プライマーの存在下でのポリメラーゼ連鎖反応によって単一に
増幅され、その一重増幅反応は、増幅産物の蓄積に関してモニタされる。別の実施形態で
は、二番目の工程において多重増幅産物は、複数の反応容器に分配され、各容器中の産物
は、目的の配列を増幅するために作動する、または適した一組の増幅プライマーの存在下
で一重増幅され、その一重増幅産物は、増幅産物の蓄積に関してモニタされる。いずれか
の実施形態において、一重増幅産物の蓄積は、そのサンプルが、それぞれの目的のポリヌ
クレオチドを含んでいることを示す。
【００１７】
一重増幅産物の蓄積は、従来の手段（例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、染色、
配列特異的ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、蛍光標識されたプローブ）の使用
）によって、反応の終点でモニタされ得る。あるいは、一重増幅産物の蓄積は、周知の方
法（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドに結合した際に検出可能シグナルを生成し得る一種
以上の色素または標識（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩまたはＳＹＢＲ（
登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、エチジウムブロマイドま
たはＹＯ−ＰＲＯ−１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ま
たは適した標識系で標識したプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ま
たは種々の異なる型の上記の例示的なプローブの内の一つ）の存在下で一重増幅を実施す
る）を用いて、時間の関数としてモニタされ得る。
【００１８】
本発明はまた、多重増幅および任意のそれ以降の分析を実施するために適した試薬およ
びキットを提供する。一実施形態において、このキットは、単一の容器中にパッケージン
グされた多重増幅を実施するのに適した複数の増幅プライマーセットを備える。このキッ
トは、必要に応じて、さらなる一種以上の増幅を実施するための試薬（例えば、ＤＮＡポ
リメラーゼ酵素、逆転写酵素および／または、テンプレート依存性ＤＮＡ合成を介したプ
ライマーの伸長に適したヌクレオチド３リン酸（「ｄＮＴＰ」）の混合物）を備える。キ
ットに含まれる任意のポリメラーゼの量は、多重増幅反応の効率を最適化するのに適した
ものであり得る。最大限の利便性のために、種々の試薬が、組合せ中にパッケージングさ
れ得、従来のＰＣＲ反応および／またはＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を実施するための市販され
ている試薬（例えば、（２×）ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉ
ｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
ｂｕｓｉｎｅｓｓから入手可能））の組合せ後に作製され得る。このキットはさらに、
多重増幅産物とともに下流のアッセイまたは分析を実施するために有用な試薬を備える。
例えば、このキットはさらに、ＳＮＰ検出またはＳＮＰ分析、オリゴヌクレオチドマイク
ロアレイ（例えば、遺伝子発現またはＳＮＰ分析に適したマイクロアレイ）および／また
はユニバーサル増幅、検出および／または精製のための「テール（ｔａｉｌｅｄ）」プラ
イマー（例えば、Ｂｅｎｇｒａら、２００２、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：２１３１〜２
１４０；Ｍｙａｋｉｓｈｅｖら、２００１、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１６３〜１６
９；および米国特許第６，３９５，４８６号を参照のこと）に有用なオリゴヌクレオチド
プローブを備え得る。一実施形態において、このキットはさらに、複数の一重定量増幅反
応またはリアルタイム増幅反応を実施するために適した試薬を備える。このような試薬は
代表的に、一組の定量増幅プライマーまたはリアルタイム増幅プライマー、定量的リアル
タイム増幅反応のモニタに適した標識系を用いて標識したオリゴヌクレオチドプローブ、
一重増幅に適した濃度のＤＮＡポリメラーゼおよび／またはテンプレート依存性ＤＮＡ合
成に適したｄＮＴＰの混合物を含む。このキットは、これらのさらなる試薬の任意のもの
を一つ以上備え得る。
本発明の多重増幅方法、試薬およびキットの種々の実施形態は、当該技術の状態に顕著
な利点を提供する。例えば、複数の増幅プライマーの使用によって、多重増幅のいくつか
の実施形態は、限られた量またはコピー数のポリヌクレオチドサンプルの増幅を最初に可
能とし、それによって、他の方法では、サンプル量の制限に起因して極端に困難で、時間
を要し、不正確であるかまたは実現不可能である一以上の下流の分析を行なうことを可能
とする。特定の実施形態において、多重増幅はまた、標的ポリヌクレオチドサンプルを濃
縮させることが可能であり、さらに、当初のサンプルが複数の標的ポリヌクレオチドの希
釈プールを含む例においても可能である。この方法におけるサンプルの濃縮は、高濃度の
サンプルを必要とする下流の分析およびアッセイを実施を可能にし、さらに、当初のサン
プルが希釈されすぎた例においても可能である。さらなる実施形態において、多重増幅は
、予めパッケージングされた市販の試薬を用いて、単一の管中で実施され得、実質的に任
意の型のサンプル由来の実質的に任意の型の標的ポリヌクレオチド配列の増幅を可能にし
、ここで、試薬および反応条件は、特定のサンプル中の特定の標的配列の増幅を調整する
ために最適化される必要はない。多くの実施形態において、本明細書中に記載される多重
増幅は、高度の効率で実施されることが見出されている。従って、多重増幅産物は、下流
分析に使用され得、そこで、開始サンプル中のコピー数の相対的または絶対的な量が、例
えば、発現プロフィール分析で評価される。本発明の種々の実施形態の他の利点は、本開
示の総説で明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明に基づいた多重増幅の実施形態の一般的な原理を図示する漫画を提供する。
【図２】図２は、多重増幅が複数の下流の一重（一重「ｓｉｍｐｌｅｘ」）定量ＰＣＲ分析またはリアルタイムＰＣＲ分析と結びついた、本発明に基づいた二工程アッセイの実施形態を図示する漫画を提供する。
【図３】図３は、本発明の９５重増幅反応の実施形態の増幅効率を、ＤＮＡポリメラーゼ濃度の関数として図示するグラフを提供する。
【図４】図４は、合計１００ｎｇのｃＤＮＡ（ｃＤＮＡライブラリー由来）および６Ｕ／２０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）を用いて、合計１０サイクル（サイクル時間は、約１分間／サイクル）実施した本発明の９５重増幅反応の実施形態の観察された増幅効率を図示するグラフを提供する。
【図５】図５は、例示的な下流の一重アッセイの間に、複数の増幅プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブの存在が、決定的にはアッセイの性能に影響しないことを示すグラフを提供する。
【図６】図６は、多重増幅中のサンプルポリヌクレオチドの量と下流の個々のリアルタイムＰＣＲ増幅の間に観察されたＣｔ値との間の直線的な関係を示すグラフを提供する。
【図７】図７は、種々の多重増幅後に観察された下流の一重アッセイ増幅の増幅効率を示す棒グラフを提供する。
【図８】図８は、下流の一重アッセイ増幅の観察された増幅効率に対する多重増幅中のＵＮＧの効果を示す棒グラフを提供する。
【図９】図９は、下流の一重アッセイ増幅のＣｔ値に対する多重増幅のＰＣＲサイクルの数の増加の効果を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（６．詳細な説明）
特定の実施形態において、本発明は、目的のポリヌクレオチド配列を多重様式で増幅す
るための方法、試薬およびキットを提供する。多重増幅は、周知の原理、およびポリメラ
ーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）そ
れぞれによるＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの増幅のための試薬
を、一つの重要な相違を伴なって使用する。多重増幅は、単一のセットまたは一対の増幅
プライマーを使用するのではなく、複数の異なる増幅プライマー対またはセットを単一の
反応で使用し、単一の反応で複数のポリヌクレオチド配列の同時増幅を可能にする。従っ
て、多重増幅は、単一増幅産物すなわち「アンプリコン」を生成するのではなく、単一の
反応で、複数の異なるアンプリコンを生成する。以下でより詳細に記載するように、多重
様式で増幅され得るポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ
核酸（ＲＮＡ）の両方を含む。増幅されるべきポリヌクレオチド（「標的ポリヌクレオチ
ド」）がＲＮＡである場合、ＲＮＡは最初に逆転写されｃＤＮＡを生成し、それは次いで
、多重様式で増幅され得る。あるいは、標的ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲの原理を用いて複数
の増幅プライマー対の存在下で直接多重増幅され得る。従って、多重増幅の文脈で使用さ
れる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」は、多重ＰＣＲおよび多重ＲＴ−ＰＣＲの両方を含
むことを意味する。
【００２１】
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の原理およびＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ増幅の原理は、周知で
あり、無数の参考文献に記載され、その文献としては、米国特許第４，６８３，１９５号
；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；
同第５，３３８，６７１号；同第５，３４０，７２８号；同第５，４０５，７７４号；同
第５，４３６，１４９号；同第５，５１２，４６２号；同第５，６１８，７０３号；同第
６，０３７，１２９号；同第６，３００，０７３号；および同第６，４０６，８９１号；
ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ中のＩｎｎｉ
ｓら、１９９０、；およびＳｃｈｌｅｓｓｅｒら、１９９１、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：５５３〜５５６が挙げられ、これらの開示
は、本明細書中に参考として援用される。本明細書中に記載される多重増幅の違いおよび
利点の理解を容易にするために、これらの増幅方法の短い要約が提供される。従来のＰＣ
Ｒは、少なくとも二つのプライマー、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを必要と
し、これらは、増幅されるべき二本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
ＰＣＲにおいて、増幅されるべき配列を含む二本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドは、二つ
の増幅プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ合成に適した２’−デオキシリボヌ
クレオチド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）の混合物の存在下でインキュベートされる。増幅を
開始するために、二本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドは変性され、一つのプライマーが、
変性した標的の各鎖にアニーリングされる。プライマーは、互いから離れた部位で、標的
ＤＮＡポリヌクレオチドに、一つのプライマーの伸長産物が、その相補体から分離された
場合に、もう一方のプライマーにハイブリダイズし得るような向きでアニーリングする。
一旦、所定のプライマーがそのそれぞれの標的ＤＮＡポリヌクレオチド鎖にハイブリダイ
ズすると、そのプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される。伸長産物は
次いで、標的配列から変性され、その後そのプロセスが繰り返される。ＰＣＲ周期（すな
わち、温度サイクル）は代表的に、変性工程、アニーリング工程および伸長工程を含む。
【００２２】
このプロセスの連続サイクルにおいて、前のサイクルにおいて生成されたその伸長生成
物は、その後のＤＮＡ合成のためのテンプレートとして働く。第２のサイクルの始めに、
その増幅の生成物は、対数増殖速度で蓄積し始める。その最終増幅生成物、すなわち「ア
ンプリコン」は、第１のプライマーの配列、続いて目的の配列、続いて第２のプライマー
の配列に相補的な配列を含む第１鎖、および（ｉｉ）第１鎖に相補的な第２鎖からなる別
個の二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００２３】
従来のＲＴ−ＰＣＲは、標的ＲＮＡポリヌクレオチド配列の増幅を可能にする。ＲＴ−
ＰＣＲにおいて、増幅されるべき配列（例えば、ｍＲＮＡ）を含む一本鎖ＲＮＡ標的は、
逆転写酵素、２つの増幅プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ合成に適切なｄＮ
ＴＰの混合物の存在下でインキュベートされる。増幅プライマーのうちの一方は、ＲＮＡ
標的に対してアニールされ、その逆転写酵素の作用によって伸長され、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ
二本鎖ハイブリッドを生じる。このハイブリッドは、次いで、変性され、その他方のプラ
イマーは、その変性されたｃＤＮＡ鎖にアニールされる。一旦ハイブリダイズされると、
そのプライマーは、そのＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長され、二本鎖ｃＤＮＡを
生じ、次いで、この二本鎖ｃＤＮＡは、上記のように、二本鎖テンプレート、または従来
のＰＣＲを介するさらなる増幅のための標的として働く。従って、従来のＰＣＲとＲＴ−
ＰＣＲとの間の主な差異は、その後者の反応混合物中に逆転写酵素が存在することである
。逆転写の後に、そのＲＮＡは、その後のＰＣＲ増幅の間にその反応混合物に残り得るか
、またはそのＲＮＡは、その後のＰＣＲ増幅の前に周知の方法によって必要に応じて変性
され得る。
【００２４】
ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲ増幅は、当該分野で記載されるように、種々の改善
のうちの１以上を組み込み得る。このような改善の非限定的例としては、「ホットスター
ト（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）」ＰＣＲ技術（Ｄ’Ａｑｕｉｌａら，１９９１，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３７４９）、「タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）」ＰＣＲ
技術（Ｄｏｎら，１９９１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４００８）、ポリメ
ラーゼ増強因子の使用（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＡｒｃｈａｅＭａ
ｘｘＴＭ；米国特許第６，４４４，４２８号もまた参照のこと）、およびウラシルＮ−グ
リコシラーゼ（ＵＮＧ）による処理（本明細書中の実施例６に記載され、米国特許第５，
０３５，９９６号を参照のこと）を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを使用すること
）が挙げられる。これらの改善および／またはＰＣＲ増幅および／またはＲＴ−ＰＣＲ増
幅を行うための他の改善のうちのいずれかは、本明細書中に記載の種々の方法に関連して
使用され得る。
【００２５】
本発明の特定の実施形態の全体像は、図１に提供される。図１を参照すると、サンプル
に由来する１以上の標的ポリヌクレオチド（これは、１以上のＲＮＡまたはＤＮＡであり
得る）が、複数の増幅プライマー対（その各々は、異なる目的の標的配列を増幅するため
に適切である）の存在下で、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって増幅される。いくつかの
実施形態において、プライマー対の数は、少なくとも１００、３００、５００、１０００
、１００００または３００００であり得る。例示されるように、そのサンプルまたは標的
ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、その第１のｃＤＮＡ鎖は、当該分野で周知である
ように、必要に応じて、ランダムＲＴ−プライマー（例えば、ランダムヘキサマーまたは
オリゴ（ｄＴ）プライマー）または配列特異的ＲＴプライマーのいずれかを使用する多重
増幅の前に、合成され得る。あるいは、その標的ＲＮＡは、その複数の増幅プライマー対
の存在下で、ＲＴ−ＰＣＲによって直接、多重増幅され得る。その複数の増幅プライマー
対が存在するので、その多重増幅の生成物は、アンプリコン１および３によって示される
ように、複数の異なるアンプリコンである。
【００２６】
当業者に理解されるように、多重増幅に適した標的ポリヌクレオチドは、本質的に、Ｄ
ＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくは
ｒＲＮＡ）のいずれかであり得、実質的に任意のサンプルまたは供給源から誘導され得る
かまたは獲得され得る（ここでそのサンプルは、必要に応じて、少量または制限された量
であり得る）。例えば、そのサンプルは、犯罪現場から回収された１個もしくは数個の細
胞、または生検を介して回収された少量の組織であり得る。
【００２７】
限定ではなく例示によって、その標的ポリヌクレオチドは、染色体もしくは遺伝子また
はそれらの一部もしくはフラグメント、調節ポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡに由来する
制限フラグメント（例えば、プラスミドまたは染色体ＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、
構築物もしくは構築物のライブラリー（例えば、ＹＡＣ、ＢＡＣもしくはＰＡＣのライブ
ラリー）に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、またはｃＤＮＡも
しくはｃＤＮＡライブラリーであり得る。その標的ポリヌクレオチドは、単一のポリヌク
レオチド（これから、複数の異なる目的の配列が増幅され得るか、または複数の異なるポ
リヌクレオチド（これから、１以上の異なる目的の配列が増幅され得る）を含み得る。当
業者によって認識されるように、そのサンプルまたは標的ポリヌクレオチドはまた、多重
増幅反応において増幅されない１以上のポリヌクレオチドを含み得る。
【００２８】
本明細書中に記載される多重増幅の重要な実施例は、サンプルポリヌクレオチドの高度
に複雑な混合物からポリヌクレオチド配列を増幅する能力である。確かに、多くの実施形
態は、数十、数百、数千もしくは数万、数十万または数百万すらのポリヌクレオチド分子
を含む標的ポリヌクレオチドサンプルの多重増幅に適切である。特定の実施形態において
、その多重増幅方法は、ｃＤＮＡライブラリーを含むサンプルに由来する複数の配列また
は生物学的サンプル（例えば、組織および／もしくは細胞）から単離もしくは得られた総
ｍＲＮＡを増幅するために使用され得る。ここでそのｃＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡのライ
ブラリーは、極めて大きい可能性がある。例えば、いくつかの生物から、またはいくつか
の異なる型の組織もしくは器官から構築されたｃＤＮＡライブラリーまたはｍＲＮＡライ
ブラリーは、本明細書中に記載の方法に従って多重増幅され得る。具体的例として、いく
つかの異なる組織もしくは器官から構築されたｃＤＮＡの極めて複雑なライブラリーから
の多重増幅は、良好な結果をもって達成された（例えば、実施例４を参照のこと）。この
特定のｃＤＮＡライブラリーは、１０，０００〜２０，０００個のｃＤＮＡの範囲で含ま
れていたと考えられる。
【００２９】
増幅される標的ポリヌクレオチドの量は、広く変化し得る。多くの実施形態において、
従来のＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲに適切な量が使用され得る。例えば、その標的
ポリヌクレオチドは、当該分野で周知であるように、単一の細胞から、数十個の細胞から
、数百個またはさらにそれを超える数の細胞から単離され得る。多くの実施形態について
、その標的ポリヌクレオチドが複雑なｃＤＮＡライブラリーである実施形態を含め、合計
の標的ポリヌクレオチドは、約１ｐｇ〜１００ｎｇの範囲であり得る。
【００３０】
当業者は、いくつかの利点は、一般に、および特定の多重増幅において、複雑な標的ポ
リヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリー）で行われた多
重増幅から生まれてくることを理解する。第１に、低コピー数で存在する標的ポリヌクレ
オチドを含むサンプルは、量が効率的に増大され得、その能力により、多重増幅なしで可
能であった有意により多い下流の分析またはアッセイを行うことが可能になる。第２に、
その多重増幅は、その能力により、その限定された量に起因して、本来のサンプルを用い
て可能ではないかもしれない下流の分析もしくはアッセイを行うことが可能になる。第３
に、大きな希釈プールもしくはサンプル内の標的ポリヌクレオチドは濃縮され得、その能
力により、高度に濃縮されたサンプルを要する下流の分析もしくはアッセイを行うことが
可能になる。さらに、特定の実施形態に関連して以下に詳細に記載されるように、その多
重増幅は、高度な効率で進むので、サンプル中の種々の標的配列の相対濃度は、その能力
により、下流分析における（例えば、下流の遺伝子発現プロファイリング分析における）
相対濃度を評価または定量することが可能になるように十分に保たれる。
【００３１】
増幅されるべき標的ポリヌクレオチドは、使用される増幅反応の型に適した従来のサン
プル調製技術を使用して、多重増幅のために調製され得る。例えば、そのポリヌクレオチ
ドは、当該分野で周知であるように、クロマトグラフィー、沈澱、電気泳動を介してそれ
らの供給源から単離され得る。あるいは、そのポリヌクレオチドは、細胞から、またはそ
の標的ポリヌクレオチドを含む組織もしくは細胞の溶解物から直接増幅され得る。いくつ
かの実施形態において、増幅されるそのポリヌクレオチドは、メチル化シトシン残基を検
出するために、従来の亜硫酸水素ナトリウム処理、またはその等価な処理に供され得る（
例えば、米国特許第６，５９６，４８８号を参照のこと）。
【００３２】
多重増幅によって、増幅され得る配列の数、すなわち、別の方法でいえば、生成され得
るアンプリコンの数は、主に、その多重増幅の間に使用される異なる増幅プライマー対の
数によって、規定される。本発明の特定の実施形態に従って、各増幅プライマー対は、２
つの増幅プライマーを含み、当該分野で周知であるように、その一方は、正方向増幅プラ
イマーであり、もう一方は、逆方向増幅プライマーである。増幅プライマー対は、配列特
異的であり得、増幅されるべき目的の配列に隣接する配列にハイブリダイズするように設
計され得る。従って、各プライマー対の実際のヌクレオチド配列は、増幅されるべき目的
の配列に依存し得、当業者に明らかである。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを介する目的の特
定の配列を増幅するために適したプライマー対を設計するための方法は、周知である。例
えば、Ｅｃｋｅｒｔら（１９９１）ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ
，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕｉｒｋｅ，ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２２５−２４４；ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖ
ｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｓｉｎｅｓｓ，カタ
ログ番号４３０４４４９  Ｒｅｖ．Ｃから入手可能）；Ｒｏｚｅｎら，２０００，Ｂｉｏ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏ
ｗａ，ＮＪ，ｐｐ３６５−３８６；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｗｉｂｒ／２／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｒｅｌ
ｄｏｃｓ／ｔａｑｍａｎｐｒ．ｐｄｆ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｋｌ．ｕｎｉ−ｆｒｅｉｂｕｒｇ．ｄｅ／ｃｏｒｅ−ｆａｃｉ
ｌｉｔｙ／ｔａｑｍａｎ／ｔａｑｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ／ｏｌｉｇｏｓ／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｐｈｐ
；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒ
ｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；および
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍ
を参照のこと（これらは、特定のプライマー対がどのように設計され得るかを示す例を提
供する）。
【００３３】
一般に、各増幅プライマーは、増幅反応の条件下でのその標的配列の温度指向性合成を
プライムするには十分長くなければならない。そのプライマーの正確な長さは、多くの要
因に依存し得、それらの要因としては、そのプライマーとテンプレートポリヌクレオチド
との間の所望のハイブリダイゼーション温度および増幅されるべき異なる標的ポリヌクレ
オチド配列の複雑性が挙げられるが、これらに限定されない。特定の適用に適したプライ
マーの長さおよび配列を選択する能力は、当業者の能力範囲内である。特定の実施形態に
おいて、そのプライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチドを含み得るが、そのプライマー
は、より少ないヌクレオチドを含み得る。短いプライマー分子は、一般に、十分に安定し
たテンプレートとのハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度しか必要としない
。一般に、その増幅プライマーは、約５５〜７５℃の範囲における融解温度（Ｔｍ）を有
するように設計されるべきである。この範囲における融解温度は、そのプライマーは、プ
ライマー伸長の開始時にその標的ポリヌクレオチドにアニールされたままであるかまたは
ハイブリダイズされたままであることを確実にする傾向がある。プライマー伸長反応に使
用される実際の温度は、他の要因の中でも、多重アッセイにおいて使用されるプライマー
の濃度に依存し得る。熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を
用いて行われる増幅のために、その増幅プライマーは、約６０〜約７８℃の範囲における
Ｔｍを有するように設計され得る。異なる増幅プライマーの融解温度は、異なり得る；し
かし、好ましくは、これらの温度は、全て、ほぼ同じであるべきである。
【００３４】
Ｔｍは、紫外線淡色性（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｉｓｍ）に基づ
いて、例えば、２６０ｎｍでのスペクトルをモニタすることによって、いくつかの標準的
な手順を用いて経験的に決定され得る（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−−Ｔｈｅ  
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ，第２版，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎ
ｃ．，１９７０，ｐｐ．８７６−７に記載される）。Ｔｍ値を決定するための種々の方法
は、同じＤＮＡ分子に対してわずかに異なる値を生じ得るが、それらの値は、代表的には
、約２℃〜３℃を超えるほどには、互いに変動しない。
【００３５】
他の実施形態において、そのＴｍ値は、オリゴヌクレオチド融解温度を推定するための
公知の方法を用いて計算され得る（例えば、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６０−１４６５；Ｆｒｉｅｒら，１
９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；
Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３
：３７４６−３７５０；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒ
ｅｓ．１７：８５４３−８５５１；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃ
ｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６４０９−６４１２；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７−２５９；Ｏｓｂｏｒｎｅ，１９
９１，ＣＡＢＩＯＳ  ８：８３；Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔら，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ  ３６：１１９−１２８を参照のこと）。
【００３６】
従来のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲのための増幅プライマーのように、多重増幅に有用な
増幅プライマー対の配列は、増幅されるべき目的の配列に隣接する標的ポリヌクレオチド
の領域に実質的に相補的であるように設計される。「実質的に相補的」とは、そのプライ
マーの配列が、多重増幅反応において使用される温度および条件下で標的ポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするために十分な相補性を含むことを意味する。
【００３７】
多くの場合において、そのプライマーの配列は、テンプレートポリヌクレオチドに完全
に相補的であり得るが、ある場合には、当該分野で周知であるように、ミスマッチまたは
非相補性の領域を含むことが望ましいこともある。具体的例として、非相補性領域は、そ
れらのプライマーのうちの１以上の５’末端において含まれ得、それらのプライマー配列
の残りは、それらそれぞれの標的ポリヌクレオチド配列に完全に相補性である。別の具体
的例として、非相補性塩基または非相補性のより長い領域が、プライマー全体を通して散
在し得るが、ただし、そのプライマーは、多重増幅に使用される温度および反応条件下で
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするように十分に相補性を有する。
【００３８】
それらのプライマーのうちの１以上は、標識（例えば、５’末端において）を含み得る
。用語「標識」とは、化合物（例えば、ポリヌクレオチド）に結合され、このような化合
物を公知の検出手段（例えば、分光光学的手段、光化学的手段、放射活性手段、生化学的
手段、免疫化学的手段、酵素的手段または化学的手段）を用いて検出可能にする任意の部
分をいう。例示的な標識としては、発蛍光団、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素
標識、赤外線標識、および化学発光標識が挙げられるが、これらに限定されない。標識の
他の例としては、従来の結合対のメンバー（例えば、ビオチン）が挙げられ、これらは、
アビジンとともに捕捉方法において、またはサンプルをさらに濃縮するために使用され得
る。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；
同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同
第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号
が挙げられる。このような標識を検出する方法は、当業者に周知である。
【００３９】
特定の実施形態において、プライマーはまた、ユニバーサル増幅（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、検出および／または精製のために５’「テイル」を含
み得る（例えば、Ｂｅｎｇｒａら，２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：２１３１−２
１４０およびＭｙａｋｉｓｈｅｖら，２００１，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１６３−
１６９を参照のこと）。いくつかの実施形態において、プライマーは、移動度改変物質（
ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）のタグ相補部分に結合するためのタグ部分を含み
得る（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎの米国特許第６，３９５，４８６号を参照のこと）。例
示的なタグおよび／またはタグ相補体としては、抗体と関連抗原もしくはハプテン、レセ
プターと関連リガンド、アビジン（もしくはストレプトアビジン）とビオチン、およびポ
リヌクレオチド配列とそれらの相補的配列が挙げられるが、これらに限定されない。移動
度改変物質はまた、代表的には、特定の移動度の移動度依存性分析技術を行うためのテイ
ル部分（例えば、ポリマー）を含む。
【００４０】
増幅プライマーの化学的組成は、本明細書中に記載される多重増幅の成功にとって重要
ではない。多重増幅反応において使用されるＤＮＡポリメラーゼが、標的ポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズされる場合、プライマーを伸長させ得ることのみが、必要条件である
。テンプレート依存性プライマー伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長され
得る種々のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知である。これらのオリゴヌクレオチド
の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡオリゴヌクレオチド、またはこれら
の種々の組み合わせおよび／もしくはキメラが挙げられるが、これらに限定されない。例
えば、キメラオリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡの領域に融合
されたＤＮＡの領域を含み得る。具体的例として、キメラ増幅プライマーは、２’−デオ
キシリボヌクレオチドまたはＤＮＡ領域（例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ調製に関する方
法および組成物について国際公開番号ＷＯ／９６４０７０９（本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）によって連結される２つのＰＮＡの領域を含み得る。その増幅
プライマーは、その標準的な遺伝子コード核酸塩基（例えば、シチジン、アデニン、グア
ニン、チミンおよびウラシル）から完全に構成され得るか、または代わりにその増幅プラ
イマーは、プライマーに含まれる場合、標準的な核酸塩基と塩基対を形成し、かつポリメ
ラーゼにより伸長可能である、当業者に公知の改変核酸塩基を含み得る。このような改変
核酸塩基の具体的例としては、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンが挙げられ
るが、これらに限定されない。他の適切な改変核酸塩基もしくは非標準的核酸塩基は、当
業者に明らかである。
【００４１】
さらに、その増幅プライマーは、当該分野で周知であるように、１以上のインターリン
ケージ（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）（例えば、１以上のホスホロチオエート連結または
ホスホロジチオエート連結）を含み得る。
【００４２】
これらの型の種々のオリゴヌクレオチドの全て、またはこのようなオリゴヌクレオチド
の混合物は、本明細書中に記載される種々の多重増幅において増幅プライマーとして用い
られ得る。１つの実施形態では、多重増幅反応において用いられるプライマーの全ては、
ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
多重増幅において利用される異なる増幅プライマー対の数は重大ではなく、２程度の少
数から、数十、数百、数千またはさらにはそれより多くまでの範囲に及び得る。従って、
特定の適用および条件に依存して、多重増幅は、２程度の少数から、数十、数百、数千ま
たはさらにはそれより多くまでの目的のポリヌクレオチド配列の同時増幅を許容する。
【００４４】
以下でより詳細に記載されるように、多重増幅の生成物は、種々の異なる下流アッセイ
および／または分析において用いられ得る。以下でさらに考察される特定の実施形態では
、多重増幅反応の生成物は、その後の複数の単一（「一重（ｓｉｍｐｌｅｘ）」）の、定
量的ＰＣＲ増幅反応またはリアルタイムＰＣＲ増幅反応（例えば、遺伝子発現分析のため
に慣用的に用いられ、そして当該分野において５’−エキソヌクレアーゼアッセイまたは
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとして通常公知である（例えば、例えば、米国特許第
５，６９１，１４６号）、定量的増幅またはリアルタイム増幅）において用いられ得る。
多重増幅反応の生成物が、このような様式で用いられるべきである場合、多重増幅反応に
おいて利用される増幅プライマー対の数および／または配列は、実施され得る下流の一重
の定量的増幅反応の数に対応するように相関され得る。例えば、９６個の下流の一重５’
−エキソヌクレアーゼ増幅アッセイが所望されるならば、この多重増幅は、９６個の異な
るセットの増幅プライマーまたは対のプールを用いて実施され得る。増幅プライマー対の
数と、その後の一重の定量的増幅反応の数との相関は、各々のその後の一重定量的増幅反
応が、多重増幅反応において用いられる対のうちの一方と配列が同一の増幅プライマーの
対を用いて実施される実施形態において、特に便利または有利である。
【００４５】
多重増幅反応について用いられる増幅プライマー対の数および／または配列は、この多
重増幅反応の生成物を用いて実施され得る他の下流のアッセイまたは分析に対して、類似
の様式で相関され得る。例えば、多重増幅反応の生成物が、（例えば、オリゴヌクレオチ
ドアレイでの）遺伝子発現分析について用いられる実施形態では、この多重増幅プライマ
ー対は、マイクロアレイによって評価されるポリヌクレオチド配列を特異的に増幅するよ
うに設計され得る。
【００４６】
特定の所望のその後の分析および／またはアッセイにおける使用に適切な多重増幅生成
物を作製するために適切な多重プライマー対の配列は、当業者に明らかである。
【００４７】
上記で考察したように、増幅されるべきサンプルポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡま
たはＤＮＡ）の性質に依存して、多重増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）また
は逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって達成され得る。従って、標的ポリヌクレオチド
がＤＮＡである多重増幅は、上記で考察した複数の増幅プライマー対またはセットに加え
て、必須成分として、テンプレート依存性ＤＮＡ合成（例えば、プライマー伸長）に適切
な２’−デオキシリボヌクレオシド（２’−ｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）三
リン酸とＤＮＡポリメラーゼとの混合物を代表的に含む。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ
である多重増幅は、さらに、逆転写酵素を代表的に含む。以下に記載の特定のパラメータ
ー、ならびに上記の一対の代わりに複数の増幅プライマー対を使用することを除いて、多
重増幅反応は、このような従来のＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応において従来用いら
れる試薬、試薬濃度および反応条件を用いて実施され得る。例えば、本明細書中に注記さ
れる通りのことを除いて、従来のＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応において用いられる
、種々の異なるプライマー濃度、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素）
、酵素濃度、ｄＮＴＰ混合物（ならびにそれらの絶対濃度および／または相対濃度）、総
標的ポリヌクレオチド濃度、緩衝剤、緩衝剤濃度、ｐＨ範囲、サイクリング時間およびサ
イクリング温度は、本明細書中に記載される多重増幅反応に用いられ得る。適切な反応条
件を選択するためのガイダンスは、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，
６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；同第５，５
６１，０５８号；同第５，６１８，７０３号；同第５，６９３，５１７号；同第５，８７
６，９７８号；同第６，０８７，０９８号；同第６，４３６，６７７号；および同第６，
４８５，９１７号、ならびにＰＣＲ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ，Ｊ．Ｗ．Ｗｉｌｅ
ｙ  ＆  Ｓｏｎｓ編，Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ，１９９５、およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（
Ｉｎｎｉｓ，Ｍ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ．
編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）（これらの全て
は、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。ＰＣＲ増幅プライマーおよび
ＲＴ−ＰＣＲ増幅プライマーを設計するための種々のツール、ならびに種々の異なる型の
ＰＣＲ反応（従来のＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応が挙げられる）を実施するための
無数のプロトコル、反応条件および技術もまた、オンラインで入手可能である（例えば、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ／Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ＿Ｂｉｏｌｏｇｙ／ＰＣＲ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと）。これらの
種々のツールおよびプロトコルの全ては、本明細書中に記載される多重増幅反応に関連し
て用いられ得る。
【００４８】
従来のＰＣＲ増幅反応およびＲＴ−ＰＣＲ増幅反応と同様に、多重増幅反応は、種々の
異なるＤＮＡポリメラーゼ（またはＤＮＡポリメラーゼの混合物）を用いて実施され得る
が、好ましくは、１以上の耐熱性ポリメラーゼの存在下で実施される。適切な耐熱性ポリ
メラーゼとしては、ＴａｑおよびＴｔｈ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事
業の１つであるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販される）が挙げられるが
これらに限定されない。さらに、従来のＲＴ−ＰＣＲ増幅反応と同様に、多重ＲＴ−ＰＣ
Ｒ増幅反応は、種々の異なる逆転写酵素（または逆転写酵素の混合物）を用いて実施され
得るが、いくつかの実施形態では、耐熱性逆転写が好ましい。適切な耐熱性逆転写酵素と
しては、逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ、およびＴｔｈ逆転写酵素）
が挙げられるがこれらに限定されない。これらのポリメラーゼおよび逆転写酵素を用いて
種々の変性反応、アニーリング反応およびプライマー伸長反応を実施するために適切な温
度は、当該分野で周知である。従来のＰＣＲ増幅反応およびＲＴ−ＰＣＲ増幅反応におい
て通常用いられる任意の試薬（例えば、ＰＣＲを増強するため、Ｔｍを改変するため、ま
たはプライマー二量体形成を減少させるために設計される試薬）もまた、この多重増幅反
応において用いられ得る（例えば、全てが、本明細書中に参考として援用される、特許第
６，４１０，２３１号；同第６，４８２，５８８号；同第６，４８５，９０３号；および
同第６，４８５，９４４号を参照のこと）。特定の実施形態では、この多重増幅は、市販
の増幅試薬（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  
Ｍｉｘ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＴ
ａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒ
ａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（これらの全ては、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
の事業の１つであるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販される）を用いて実
施され得る。
【００４９】
従来の試薬および反応条件を用いて適切な結果が達成され得るが、多くの実施形態では
、多重増幅の性能または観察された効率は、反応の特定のパラメーターおよび／または条
件を調節することによって改善され得る。
【００５０】
表現「観察される性能」および「観察される効率」および文法上のその等価物とは、多
重増幅に関連して用いられる場合、多重増幅において作製される個々のアンプリコンの量
をいう。増幅の性能または効率は、多重増幅一般に対応し得るか、または多重増幅内の特
定のアンプリコンに対応し得る。多重増幅は、多重増幅において作製された、特定のアン
プリコンの量が、同じ標的ポリヌクレオチドを用いて一重の従来のＰＣＲ反応またはＲＴ
−ＰＣＲ反応で生成される量と同一である場合、この目的の特定のアンプリコンに関して
１００％の効率である。多重反応は、多重増幅において生成されるアンプリコンの各々の
量が、同じ標的ポリヌクレオチドを用いて個々の一重の従来のＰＣＲ反応またはＲＴ−Ｐ
ＣＲ反応において生成されるそれぞれのアンプリコンの量と同一である場合、一般に１０
０％効率的である。多重増幅は、多重反応において作製された特定のアンプリコンの量が
、一重の従来のＰＣＲ反応またはＲＴ−ＰＣＲ反応において作製された量の約９０％以上
である場合、この特定のアンプリコンに関して「非常に効率的」と考えられる。
【００５１】
一般的かまたは特定の標的配列に関してのいずれかでの、多重増幅反応の観察された効
率は、リアルタイムＰＣＲ法を用いて評価され得る。１つの実施形態では、特定の標的配
列の増幅の観察される効率は、複数のプライマーセット（その各々は、目的の異なる標的
配列を増幅するために適切である）を用いて多重ＰＣＲ増幅反応において複数のポリヌク
レオチド（これは、特異的標的を包含する）を増幅することによって決定され得る。この
多重増幅は、Ｎ回のサーマルサイクル工程に関して実施され、ここで、Ｎは、使用者によ
って選択され得る。次いで、第１アリコートの多重増幅生成物は、目的の標的配列を増幅
するための適切な増幅プライマー対またはセット、およびリアルタイムで増幅反応をモニ
タするために有用な試薬（例えば、インターカレート色素または配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ））の存在下で、一重ＰＣＲ増幅反応に
おいて増幅される。サーマルサイクリングに供していない「偽」（コントロール）多重増
幅から得た第２アリコートは、同様に、一重増幅される。Ｃｔアッセイ値は、第１アリコ
ートから得られ、そしてＣｔコントロール値は、第２アリコートから得られる。１つの実
施形態では、多重増幅において特定の標的配列の増幅の観察された効率は、以下の式から
算出され得る：
観察された効率％＝１００×（Ｃｔコントロール値−Ｃｔアッセイ値）／Ｎ。
【００５２】
多重増幅における任意の数の特異的標的配列は、同様に分析され得る。使用者は、観察
された効率についての選択基準（すなわち、「カットオフ」値）（例えば、５０％、７０
％、８０％、９０％、９５％または９９％）を選択し得る。所望される場合、多重増幅に
おける各プライマーセットについての観察された効率が決定され得、そしてそれらの観察
された効率が、選択基準に等しいかまたはそれを超えるかに依存して、プライマーがグル
ープ分けされ得る。選択基準を満たさず、選択基準を超えもしないプライマーセットは、
一重増幅において個々に分析され得るか、またはさらなる分析のために１以上の別個のプ
ールのプライマーセットに再度グループ分けされ得る。
【００５３】
別の実施形態では、多重増幅における標的配列の全ての増幅の観察された効率の平均が
分析され得る。上記で考察した実施形態と同様に、多重増幅は、Ｎ回のサーマルサイクル
について実施され得、その正確な数は、使用者によって選択され得る。多重増幅の生成物
は、複数のアリコートに（代表的には、多重増幅において用いられるプライマー対の数に
等しいアリコートの数に）分割される。各アリコートは、多重増幅において用いられるプ
ライマー対のセットのうちの１つ、および一重増幅をリアルタイムでモニタするために適
切な試薬またはプローブの存在下で一重増幅される。Ｃｔアッセイ値は、各一重増幅につ
いて決定され、そして平均Ｃｔアッセイ値は、そこから算出され得る。Ｃｔコントロール
値および平均Ｃｔコントロール値は、サーマルサイクリングに供していない「偽」（コン
トロール）多重増幅反応の一重増幅から同様に得られ得る。１つの実施形態では、多重増
幅の平均効率は、以下の式を用いて算出され得る：
平均効率％＝１００×（平均Ｃｔコントロール値−平均Ｃｔアッセイ値）／Ｎ。
【００５４】
当業者によって認識されるように、多重増幅一般についての特定の程度の効率または特
定の配列についての特定の程度の効率は、成功のために必要とされない。必要とされるの
は、多重増幅が、特定の適用に適切な様式で実施されることだけである。上記で考察した
通り、多くの実施形態では、適切に効率的な多重増幅は、従来のＰＣＲ反応条件またはＲ
Ｔ−ＰＣＲ反応条件を用いて達成される。しかし、特定の反応条件または反応パラメータ
ー（例えば、用いるＤＮＡポリメラーゼの量）を改変することにより、多重増幅の効率が
、従来のＰＣＲ反応条件またはＲＴ−ＰＣＲ反応条件を用いて達成される効率を超えて改
善され得ることが見出されている。
【００５５】
代表的に、従来のＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、０．０５Ｕ／μＬのＤＮＡポ
リメラーゼを用いて実施される。１Ｕ／２０μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業の１つである、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施される１０サイクルの９５重増幅について
は、さらに１〜８Ｕ／２０μＬを添加することによって、多重増幅の効率が向上すること
が見出されている。実施例の節にさらに詳細に記載されているように、さらに１〜５Ｕ／
２０ＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、効率における有意
な向上が観察された。向上はまた、さらに６〜１５Ｕ／２０μＬを用いて観察されたが、
これらは、おそらく、５０％グリセロール中に保存されたＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）
Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼで反応混合物をスパイクすることの結果として反応混合物
に添加されるさらなるグリセロールに起因して、それほど明確でなかった（例えば、図３
を参照のこと）。効率における同様の増加もまた、他のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ
ａｑＩポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、ＳＥＱＵＥＮ
ＡＳＥ  １．０およびＳＥＱＵＥＮＡＳＥ  ２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）
、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼならびにＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）について期待さ
れる。従って、１つの実施形態では、多重増幅は、２０μＬの反応体積毎に約２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６単位のＤＮＡポ
リメラーゼの存在下で実施される。
【００５６】
多重増幅反応の効率はまた、プライマー伸長反応について、単独で、または上記で考察
した増加した量のＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせのいずれかで、従来のＰＣＲまたは
ＲＴ−ＰＣＲにおいて代表的に用いられるよりも長い持続時間を用いることによって向上
し得る。従来のＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応では、プライマー伸長反応は代表的に
、１増幅サイクルあたり約１分間実施される。任意の特定の作動理論に束縛されることを
意図しないが、プライマー伸長反応の持続時間が１分間から、例えば、約２分間、約３分
間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、また
はそれよりも長期に増大することにより、多重増幅の性能または効率が改善され得ると考
えられる。従って、１つの実施形態では、１サイクルにつき約２分〜約１５分の範囲とい
うプライマー伸長反応についての持続時間を用いて、多重増幅が実施される。１回の反応
サイクルを構成する他の区間について用いられる持続時間は、従来用いられる持続時間で
あり得る。１つの実施形態では、多重増幅は、９５°Ｃにて１５秒間という第１変性工程
および６０℃にて１〜１５分間という第２アニーリング／伸長工程を含む２工程のサイク
ルを用いて実施され得る。
【００５７】
従来のＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲは、各プライマーについて約３００ｎＭ〜９００ｎＭ
の範囲の増幅プライマー濃度を用いる。この範囲のプライマー濃度が多重増幅において用
いられ得るが、多重増幅が、かなり低い増幅プライマー濃度を用いて実施され得ることが
見出されている。極めて驚くべきことに、１０分間／サイクルのプライマー伸長反応時間
を用いて１０サイクル実施される９５重増幅において、非常に効率的な多重増幅が、各プ
ライマーについて４５ｎＭ程度の低いプライマー濃度を用いて達成された。特定の実施形
態では、各プライマーについて約３０ｎＭ〜４５ｎＭの範囲のプライマー濃度が用いられ
得る。
【００５８】
さらに、個々のプライマー対の濃度を最適化する必要がないことが見出された。増幅さ
れる配列にかかわらず、それゆえ、プライマーの配列にかかわらず、これらの増幅プライ
マーは、各プライマーについて約３０ｎＭ〜９００ｎＭの範囲の濃度で用いられ得る。異
なる増幅プライマー対は、この範囲内の異なる濃度で存在し得るか、あるいは、増幅プラ
イマーのいくつかまたは全ては、この範囲内でほぼ等モル濃度で存在し得る。１つの実施
形態では、これらの増幅プライマーの少なくともいくつか（例えば、約１０％、２５％、
３５％、５０％、６０％またはそれより多く）が、各プライマーについて約３０ｎＭ〜約
１００ｎＭの範囲でほぼ等モル濃度で存在する。別の実施形態では、これらの増幅プライ
マーの全てが、各プライマーについて３０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲でほぼ等モル濃度で存
在する。特定の実施形態では、これらの増幅プライマーの全ては、各プライマーについて
３０ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、
１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎ
Ｍ、８００ｎＭまたは９００ｎＭの濃度で存在する。なお別の実施形態では、増幅プライ
マーのいくつかまたは全ては、各プライマーについて約４５ｎＭの濃度で存在する。上記
で考察した増幅プライマー濃度は、多重増幅される標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである
かまたはＤＮＡであるかにかかわらず用いられ得る。多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅の逆転写反応
は、言及したプライマー濃度において良好に作動する。
【００５９】
当業者によって認識されるように、ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下の３つ
の段階へと分解され得る：アンプリコンの量がサイクルごとに対数的に蓄積する（すなわ
ち、サイクルごとに倍加する）、対数期；アンプリコンの量がサイクルごと変動率で蓄積
する（すなわち、反応は遅くなり始める）、直線期；ならびに反応が停止してアンプリコ
ンは生成されず、十分長期間放置するとアンプリコンが分解し始める、プラトー期。
【００６０】
対数期において、達成される増幅の程度は、使用される増幅サイクルの数に対数的に比
例する。例えば、１０サイクルの増幅により、増幅された配列の量が１０２４倍増加する
。別の例として、１５サイクルの増幅により、３２，２８６倍増加する。別の例において
、２０サイクルの増幅により、１，０４８，５７６倍増加する。
【００６１】
多重増幅とともに実施される増幅サイクルの数は、とりわけ、望ましい増幅の程度に依
存し得る。次に、望ましい増幅の程度は、増幅されるべきポリヌクレオチドサンプルの量
、および／または多重増幅産物の意図する下流の用途などの要因に依存し得る。従って、
多重増幅において使用されるサイクルの数は、種々の適用のために変化し、それは問う業
者にとって明らかである。ほとんどの適用について、１０増幅サイクルの間実行される反
応は、分析を実施するために必要なサンプルの量に関わらず、サンプルが１個〜数個の細
胞に由来する場合でさえ、サンプルが非常に低コピー数で存在する場合でさえ、かつ／ま
たはシングルコピーとしてのみ存在する場合でさえ、数百回の下流での分析のために十分
な多重増幅産物を生じることが期待される。しかし、より多いかまたはより少ない増幅サ
イクルが、使用され得る。特定の実施形態において、多重増幅は、１０回、１１回、１２
回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、またはそれ以
上程度の多さのサイクルの間、実行される。具体的実施形態において、多重増幅が、２〜
１２サイクル（５〜１１サイクルを含む）または１４サイクルまで実行される（例えば、
実施例７参照）。多サイクル数が、多量の下流アッセイが実施されるべき特定の適用にお
いて、必要であり得る。
【００６２】
多くの実施形態において、対数期または直線期を過ぎて多重増幅を進行させ続けること
が、望ましくあり得る。実際、多くの実施形態において、多重増幅を、対数期または直線
期において反応を維持するために適切なサイクル数の間実行することが、望ましくあり得
る。
【００６３】
多重増幅反応パラメーター（例えば、プライマー対もしくはプライマーセットの濃度、
ＤＮＡポリメラーゼの濃度、所要期間およびアリーリング工程、プライマー伸長工程、お
よび／もしくは変性工程、熱サイクル数、Ｍｇ２＋濃度、アジュバント濃度（例えば、Ｄ
ＭＳＯ、グリセロール、ＢＳＡまたは尿素）は、例えば、複数の多重増幅を実行すること
、これらのパラメーターのうちの１つ（またはそれ以上）を変化すること、および得られ
る多重増幅の効率を、例えば上記の方法を使用して評価することによって、経験的に最適
化され得る。このような最適化反応の例（ＤＮＡポリメラーゼの量が変化される）は、下
記の実施例１において記載される。
【００６４】
一旦増幅されると、多重増幅産物は、さらなる精製も操作もせずにその後の無数の種々
のアッセイまたは分析において使用され得る。そのような後のアッセイまたは分析のため
に、多重増幅の生成物は、複数の種々のアッセイまたは分析の間で、事前希釈をしてかま
たは事前希釈をせずにかのどちらかで、分割され得る。任意の必要に応じた希釈の程度は
、望まれる後の分析の数およびそのような分析各々のために必要なサンプルの量などの要
因に依存し得、それは当業者にとって明らかである。多重増幅産物を用いて実行され得る
その後のアッセイおよび分析の例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、遺伝子型分析、
遺伝子発現分析（例えば、定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲまたはオリゴヌクレオチドマ
イクロアッセイ上でのハイブリダイゼーション）、フィンガープリント分析、核酸配列決
定（例えば、米国特許第６，４２８，９８６号）、核酸ミニ配列決定（例えば、米国特許
第６，４７９，２４２号）、および／または遺伝子発現プロファイリングにおいて使用さ
れ得るアレイへのハイブリダイゼーション（例えば、米国特許第６，４８５，９４４号）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
特定の実施形態において、多重増幅の産物は、複数の種々のアッセイまたは分析の間で
分割されない。例えば、１種以上の増幅プライマー、プローブ、色素、および／または他
の試薬が、さらなる増幅を実行するために増幅産物に直接添加され得る。種々の他の実施
形態において、多重増幅の産物は、複数のアリコートへと分割され、これらのアリコート
のうちの１つ以上が、多重アッセイまたは多重分析に供され得る。それらのアッセイまた
は分析の例としては、多重増幅および多重ＳＮＰ検出が挙げられる。
【００６６】
１つの具体的実施形態において、多重増幅の産物は、その後の増幅反応（例えば、遺伝
子発現分析のために一般的に使用される定量的増幅アッセイまたはリアルタイム増幅アッ
セイ）において使用され得る。そのような定量的増幅アッセイまたはリアルタイム増幅ア
ッセイの具体的例において、サンプル由来の全ＲＮＡが、目的の特殊な遺伝子配列を特異
的に増幅するために適切な増幅プライマーと、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ増幅において使用さ
れるＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性を介して、増幅反応において蓄
積するアンプリコンの量のリアルタイムモニタを可能にする標識化系で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブとの存在下で、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅される。そのような定量的
ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応において得られるサイクル閾値（Ｃｔ値）は、元の全ｍＲＮＡサン
プル中に存在する遺伝子コピー数と関連付けられ得る。そのような定量的ＲＴ−ＰＣＲ反
応またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応、ならびに増幅をリアルタイムでモニタするため
に有用な種々の型の試薬および／または標識オリゴヌクレオチドプローブは、当該分野で
周知である。増幅を時間の関数としてモニタするために５’−エキソヌクレアーゼアッセ
イを利用する具体的アッセイは、５’−エキソヌクレアーゼ遺伝子定量アッセイと呼ばれ
る（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号、ならび
にＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１４：３０３〜３０８を参照のこと）。別の具体的アッセイが、米国特許第５
，９９４，０５６号に記載されており、これは、増幅を時間の関数としてモニタするため
にインターカレート色素または他の色素を利用する。
【００６７】
強力ではあるが、５’−エキソヌクレアーゼ遺伝子定量アッセイ（ならびに他の遺伝子
定量アッセイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上で実施される定量アッセイ））は、比較
的大量の出発ＲＮＡ（例えば、１〜１０μｇ）を必要とする。この大量のサンプルが必要
なことに起因して、５’エキソヌクレアーゼ遺伝子定量アッセイおよび他の遺伝子定量ア
ッセイは、低コピー数で発現される遺伝子を検出するため、または限定量のサンプルしか
（例えば、臨床生検などから）入手可能ではない場合においては、適切ではなかった。
【００６８】
サンプル中の複数のポリヌクレオチド配列を同時に増幅する能力によって、本明細書中
に記載される多重増幅反応は、そのような下流の遺伝子発現分析（例えば、５’エキソヌ
クレアーゼ遺伝子定量アッセイ）と組み合わせて使用するために、理想的である。非常に
低コピー数でサンプル中に存在するポリヌクレオチド、および／または少数の細胞もしく
は１個の細胞から得られるサンプル中に存在するポリヌクレオチドは、数十回、数百回、
または数千回〜数十万回の定量的増幅アッセイまたはリアルタイム増幅アッセイのために
適切な量のサンプルを提供するように、多重増幅され得る。従って、本発明の一実施形態
において、多重増幅反応の産物は、事前に希釈してかまたは事前希釈することなく、複数
回の一重定量増幅反応または一重リアルタイム増幅反応の間で分割される。各一重定量増
幅反応または一重リアルタイム増幅反応は、１組の増幅プライマーおよび適切なプローブ
を用いて従来の様式で実行される。一重定量増幅または一重リアルタイム増幅のために使
用される増幅プライマーの対または組は、多重増幅反応において使用されるプライマーの
対または組のうちの１つと同じであり得る。重要なことに、多重増幅産物は、このような
後の一重増幅において、さらなる精製も操作も行うことなく直接使用され得る。種々の酵
素、ｄＮＴＰ、増幅プライマーおよび多重増幅から持ち越された他の必要に応じた試薬は
、後の定量的増幅アッセイの精度にもリアルタイム増幅アッセイの精度にも干渉しない。
【００６９】
本発明者らは、驚くべきことに、特定の実施形態においては、多重増幅は、おそらく高
い増幅効率に起因してコピー数比を実質的に維持し、その結果、元のサンプルのコピー数
または発現レベルは、多重増幅されたサンプルから確認され得ることを、発見した。従っ
て、いくつかの実施形態において、元のサンプルからのコピー数は決定され得、例えば、
種々の下流適用（例えば、遺伝子発現研究）において使用され得る。
【００７０】
多重様式で増幅されるサンプルは、さらなる精製も操作もせずに広範な種類の後の分析
またはアッセイにおいて使用され得る。例えば、多重増幅の産物は、一塩基多型（ＳＮＰ
）分析、遺伝子型決定分析、遺伝子発現分析、フィンガープリント分析、遺伝子診断のた
めの遺伝子変異分析、細胞中で稀にしか発現されない遺伝子の分析、核酸配列決定（例え
ば、米国特許第６，４２８，９８６号）、および核酸ミニ配列決定（例えば、米国特許第
６，４７９，２４２号）のために、使用され得る。
【００７１】
遺伝子発現研究を実施する際、例えば、多重増幅されたサンプル中のポリヌクレオチド
産物を定量するための種々の方法が、使用され得る。用語「定量する」とは、遺伝子の転
写レベルを定量する文脈において使用される場合、絶対的定量または相対的定量を指し得
る。絶対的定量は、既知の濃度の１種以上の標的核酸（例えば、コントロール核酸）を含
め（または既知量の標的核酸自体を用い）、未知物の検出されたシグナルを（例えば、標
準曲線の作成を介して）その既知の標的核酸と参照することによって、達成され得る。あ
るいは、相対的定量化は、２種以上の遺伝子間または２種以上の処理間で検出されたシグ
ナルを比較して、検出されるシグナル値の変化を（暗に転写レベルを）定量することによ
って、達成され得る。検出されるシグナルは、利用される具体的方法に依存する。例えば
、リアルタイムＰＣＲを使用する場合、検出されるシグナルは、蛍光強度に関連付けられ
得る。増幅産物は、分離され得、そして当業者に公知の種々の技術のいずれかによって検
出され得る（例えば、米国特許第６，６１８，６７９号を参照のこと）。検出から得られ
るデータは、保存され、そして分析されて、１組の遺伝子発現データが得られ得る。微小
作製ＤＮＡアレイを使用する場合、検出されるシグナルは、ハイブリダイゼーション強度
であり得る。
【００７２】
具体的実施形態において、多重増幅の産物は、差次的に発現される遺伝子のついてのポ
リヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体に、適用され得る。ポ
リヌクレオチドが（直接的にか間接的に、共有結合的にか非共有結合的に）結合され得る
任意の固体表面が、使用され得る。そのような支持体の非限定的例としては、フィルター
、ポリビニルクロリドディッシュ、ビーズ、スライドガラスなどが挙げられる。固体支持
体の具体的例は、高密度アレイまたはＤＮＡチップである。これらは、そのアレイ上の所
定の位置に特定のハイブリダイゼーションプローブを含む。いくつかの実施形態において
、各所定の位置は、１つより多くのそのプローブを含み得るが、その所定の位置内の各分
子は、同じ配列を有する。そのような所定の位置は、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）と呼ばれる
。例えば、１つの固体支持体上に、２個、１０個、１００個、１０００個から、１０，０
００個、１００，０００個、または４００，０００個までのそのような特徴が存在し得る
。それらのプローブが付着している固体支持体または領域は、ほぼ１ｃｍ２であり得る。
発現モニタのためのハイブリダイゼーションアレイは、当該分野で公知の任意の技術に従
って作製および使用され得る（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９６、Ｎａ
ｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６７５〜１６８０；ＭｃＧａｌｌ，Ｇ
．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３５５５〜１
３４６０；および米国特許第６，０３３，８６０号、同第６，３０９，８２２号；同第６
，４８５，９４４号；および同第６，５４８，２５７号参照）。
【００７３】
本発明者らは、驚くべきことに、従来濃度のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５
’−エキソヌクレアーゼプローブ）の存在は、多重増幅反応においては、多重増幅の実施
にも効率にも干渉しないことを発見した。そのようなプローブの存在は、多重増幅産物を
用いて実行される下流の分析（例えば、一重定量的増幅アッセイもしくは一重リアルタイ
ム増幅アッセイまたは他の分析）にも干渉しない。この発見により、市販されている在庫
品の定量的増幅試薬またはリアルタイム増幅試薬（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業）から市販されているＡｓ
ｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ試薬）を使用して実行することが可能になる。
【００７４】
市販のＡｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  ５’−エキソヌクレアーゼ試薬（または他
の市販の試薬）を用いて多重増幅を実行する能力によって、その後の一重５’−エキソヌ
クレアーゼアッセイと理想的に相関または一致する多重増幅反応の生成が可能になる。「
相関する」または「一致する」とは、多重増幅工程において使用されるプライマーまたは
プライマー対の同じ組が、下流分析アッセイにおいて使用され得ることを意味する。しか
し、いくつかの実施形態において、下流アッセイにおいて使用されるプライマーまたはプ
ライマー対は、上流多重の多重増幅において使用されるプライマー対とは異なり得る。特
定の実施形態において、下流アッセイにおいて使用されるプライマーは、ネスト化（ｎｅ
ｓｔｅｄ）プライマーであっても、そうではなくてもよい。
【００７５】
極めて有利なことに、多重増幅を実行し、その後、複数の一重定量増幅アッセイまたは
一重リアルタイム増幅アッセイを実行するために適切なキットは、市販の５’−エキソヌ
クレアーゼ試薬から、さらに操作することも精製することもなく、容易に生成され得る。
多重増幅を実施するためのプライマーは、一対の増幅プライマーと５’−エキソヌクレア
ーゼプローブとを含む、５’−エキソヌクレアーゼ試薬をプールすることによって、生成
され得る。上記のように、多重増幅反応および後の一重５’−エキソヌクレアーゼ増幅ア
ッセイにおいて、５’−エキソヌクレアーゼプローブが存在することは、いずれの増幅に
も干渉しない。
【００７６】
一致または相関している多工程アッセイの実施形態（これは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＡｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）サービス
（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｄｅｔａｉｌ．ｃｆｍ？ｐｒｏｄ＿ｉｄ＝１１０１参照）
を使用して作製され得る）が、図２に示される。図２を参照すると、複数の５’−エキソ
ヌクレアーゼ増幅プライマー／プローブセットが、使用者によって選択され、そして一緒
にプールされて、多重増幅のために適切な複数の増幅プライマーの対または組が生じる（
このプールは、複数の５’−エキソヌクレアーゼプローブを含む）。選択された５’−エ
キソヌクレアーゼ増幅プライマー／プローブのセットの各々の個別のアリコートは、個々
の反応容器（例えば、マルチウェルプレートのウェル）に、１つの容器またはウェルにつ
いて、１つのプライマー／プローブの組で分配される。第１工程において、目的のサンプ
ル由来の標的ポリヌクレオチドが、プールされた増幅５’−エキソヌクレアーゼプライマ
ー／プローブの存在下で、多重増幅される。その後、多重増幅の生成物が、マルチウェル
プレートのウェルへと分注され、一重５’−エキソヌクレアーゼ増幅アッセイが、従来の
方法を使用して実行される。ある特に簡便な実施形態において、５’−エキソヌクレアー
ゼプライマー／プローブのセットは、定量的増幅分析またはリアルタイム増幅分析のため
に設計された機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｒｅｌａ  
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業）から入手可能なＡＢ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ機器
）にて直接使用され得る微小流体カードのウェルの間に供給され得る。適切なマイクロカ
ードの例は、米国特許第６，１２６，８９９号に記載され、商業的実施形態は、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｒｅｌａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業）から
入手可能な７９００ＨＴ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃカードである。
【００７７】
多重増幅において存在し得るオリゴヌクレオチドプローブは、５’−エキソヌクレアー
ゼプローブには限定されない。一実施形態において、増幅された標的配列のすべてまたは
一部に対して相補的な任意の標識または非標識の一本さオリゴヌクレオチドが、多重増幅
において存在し得る。
【００７８】
上記で考察したプライマーと同様に、そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはそれらの１種以上の組み合わせから構成されるキメ
ラであり得る。そのオリゴヌクレオチドは、標準的または非標準的な核酸塩基またはその
混合物から構成され得、増幅プライマーと組み合わせて上記されたような、１つ以上の改
変型インターリンケージ（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）を含み得る。これらのオリゴヌク
レオチドプローブは、種々の目的（例えば、生成したアンプリコンの量をモニタするため
、一塩基多型を検出するため、または当該分野で周知である他の適用）のために適切であ
り得る。
【００７９】
一実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、特定のアンプリコンの少なく
とも一領域に対して相補的である。上記プローブは、その特定のアンプリコンの領域に対
して完全に相補的であり得るか、またはその特定のアンプリコンに対して実質的に相補的
（少なくとも１５〜７５ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約６５％相補的
）であり得る。他の実施形態において、上記プローブは、そのアンプリコンの領域に対し
て少なくとも約７５％、８５％、９０％、または９５％相補的である。Ｋａｎｅｈｉｓａ
，Ｍ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（本明細書中に
参考として援用される）を参照のこと。特定のオリゴヌクレオチドプローブとアンプリコ
ンとの間の相補性の正確な程度は、そのプローブにとって望ましい適用に依存し、それは
当業者にとって明らかである。
【００８０】
このようなオリゴヌクレオチドプローブの長さは、広範に変化し得、そしていくつかの
実施形態において、プローブが設計される特定の適用に依存して、わずか２ヌクレオチド
〜数十ヌクレオチドまたは数百ヌクレオチドもの範囲であり得る。１つの特定の実施形態
において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約１５ヌクレオチド〜３５ヌクレオチ
ドの範囲である。別の特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが
約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの範囲である。なお別の特定の実施形態において
、オリゴヌクレオチドプローブは、２５ヌクレオチド〜７５ヌクレオチドの範囲である。
他の実施形態において、プローブは、長さが約６ヌクレオチド〜７５ヌクレオチド、また
は約１２ヌクレオチド〜２２ヌクレオチドの範囲である。オリゴヌクレオチドプローブは
、（例えば、米国特許第６，３９５，４８６号に記載されるような）移動度改変因子（ｍ
ｏｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）と結合するための５’タグ部分を含み得る。
【００８１】
１つの特定の実施形態において、多重増幅において存在するオリゴヌクレオチドプロー
ブは、生成されるアンプリコンの量を時間の関数としてモニタするのに適切である。この
ようなオリゴヌクレオチドプローブとしては、上記の５’−エキソヌクレアーゼアッセイ
（ＴａｑＭａｎ（登録商標））プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号もまた参照の
こと）、種々のステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号、
および５，９２５，５１７号、ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６、Ｎａ
ｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８を参照のこと）、ステム
のないビーコンもしくは直鎖状ビーコン（例えば、ＷＯ９９／２１８８１を参照のこと）
、ＰＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例えば、米国特許第６，３５５，
４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照のこと）、直鎖状ＰＮＡビーコン、（例
えば、Ｋｕｂｉｓｔａら、２００１、ＳＰＩＥ  ４２６４：５３−５８を参照のこと）、
非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎ
ｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５
４８，２５０号）、ステムループおよび二重鎖のＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌ
ｉｎａｓら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．２９：Ｅ９６および米国
特許第６，５８９，７４３号）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１
号）、偽ノット（ｐｓｅｕｄｏ  ｋｎｏｔ）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号
）、サイクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ  ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプ
ローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５
９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）点灯プローブ、自己集合ナノ粒子プローブ、
ならびに、例えば米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａら、２００１、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ  ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋら、２０００、Ａｎａｌ  
Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ  ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉら、２００２、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇら、２００２
、Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌら、２００２、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅら、２００２、Ｔｒｅｎ
ｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇら，２００２，Ｃｈｅｍ
．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；およびＹｕら、２００１、Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４：１１１５５−１１１６１（これらのすべてが本明細書中で参
考として援用される）に記載されるフェロセン修飾プローブが挙げられるが、これらに限
定されない。
【００８２】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、当該分野で周知であるような
一塩基多型を検出するのに適切である。このようなプローブの特定の例としては、１つの
ヌクレオチド位置を除いて配列が同一である、一組の４つのオリゴヌクレオチドプローブ
が挙げられる。この４つのプローブの各々は、この位置に異なるヌクレオチド（Ａ、Ｇ、
ＣおよびＴ／Ｕ）を含む。プローブは、スペクトル的に分解可能な異なる波長で光を放出
し得る異なる発蛍光団（例えば、４種の異なる色の発蛍光団）のように、お互いを区別可
能な、検出可能な異なるシグナルを生成し得る標識で標識され得る。このような標識プロ
ーブは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第６，１４０，０５４号およびＳａｉ
ｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６に記載される。
【００８３】
これらの種々のオリゴヌクレオチドプローブの存在下で多重増幅を実施することは、多
重増幅のための一組の増幅プライマーを設計または作製することにおいて、多大な柔軟性
を可能にする。このようなオリゴヌクレオチドプローブを含む市販のプライマーセットは
、オリゴヌクレオチドの事前除去を行わずに、単純に一緒にプールされ得、そしてさらな
る操作を行わずに多重増幅に使用され得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、多重増幅の前に、プー
ルされたプライマーセットから除去され得る。このような除去は、一対の特定の結合分子
（例えば、ビオチン／アビジンまたは抗体／抗原）を使用してもたらされ得る。例えば、
ビオチン標識したオリゴヌクレオチドプローブは、アビジン結合によって除去され得る。
他の実施形態において、標識ヌクレオチドプローブは、レーザーまたは他の光源を使用し
て光退色され得る。
【００８５】
多重増幅はまた、例えば、増幅の終わりおよび／または増幅の間に、増幅産物の蓄積を
時間の関数としてモニタするのに適切な色素分子の存在下で行われ得る。１つの実施形態
において、このような色素としては、二重鎖ポリヌクレオチドに結合した場合に検出可能
なシグナル（例えば、蛍光）を生成する色素が挙げられる。適切な色素の非限定的な例と
しては、当該分野で周知であるような、一般的な核酸染色剤（例えば、インターカレート
色素および副溝結合色素）が挙げられる。特定の実施形態において、色素は、ＳＹＢＲ（
登録商標）ＧｒｅｅｎＩもしくはＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、エチジウムブロ
マイド、またはＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、
ＯＲから入手可能）である。このような色素は、当該分野で一般に使用される通常濃度で
使用され得る（例えば、米国特許第５，９９４，０５６号を参照のこと）。
【００８６】
このような色素分子の存在下、または適切なオリゴヌクレオチドプローブの存在下で多
重増幅を行うことにおいて、本出願人らは、プールされたプライマーセットを特徴付ける
ための一般的な方法を発見した。この方法において、増幅は、リアルタイムでモニタされ
、そしてサイクル閾値（「Ｃｔプール」）が得られる。これは、アンプリコンすべての総
和によって生成される加法的シグナルである。オリゴヌクレオチドプローブがリアルタイ
ム多重増幅のために使用される実施形態において、別個のプローブが、増幅される各標的
配列に対して存在し、そしてプローブすべてが同じシグナル伝達系を使用する。この方法
は、予め最適化された既製のキットにて提供され得るプール試薬の高速かつ簡便な試験を
提供することにおいて、特に有用である。このような試薬のプールは、本明細書中でさら
に記載されるように、市販のプライマーセット（例えば、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａ
ｎｄＴＭ遺伝子発現産物）、またはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ遺伝子発現アッセイ（Ｑｉａｇ
ｅｎ）で入手可能なプライマーセットを混合することによって調製され得る。
【００８７】
本明細書中に記載される方法の特定の適用において、サンプル中の種々のポリヌクレオ
チドの相対レベルが決定され得、参照配列と比較され得る（すなわち、正規化され得る）
。用語「参照配列」とは、アッセイのためのコントロールを提供するサンプルにおいて、
増幅の標的としての役割を果たす核酸配列をいう。参照は、サンプル源に対して内部（ま
たは内因性）であっても、サンプルに対して外部から付加されても（または外因性であっ
ても）よい。参照配列は、代表的には、多重増幅の間に増幅される。例えば、遺伝子発現
分析を行う場合、サンプルに対して内因性である多重セットにおける少なくとも１つの増
幅標的が、参照配列として選択され得る。この参照は、非常に定常な発現レベルを示すこ
とが独立して示された標的（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子）であり得る。このよ
うなハウスキーピング遺伝子としては、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、１８Ｓ  ＲＮＡおよ
びサイクロフィリンが挙げられる。以下に示されるように、内因性の参照配列に由来する
Ｃｔ値は、他の標的配列のＣｔ値を相対発現レベルに変換するためのコントロールを提供
し得る。必要に応じて、比較的定常な発現レベルを有する複数のコントロール標的／参照
配列が、互いにコントロールとしての役割を果たすように、多重増幅に含まれ得る。ある
いは、参照配列は、外部の参照配列であり得る。例えば、外部の参照配列は、逆転写の前
にサンプルに添加される規定量のＲＮＡ、または多重増幅の前に添加される規定量のＤＮ
Ａ（例えば、ｃＤＮＡ）のいずれかであり得る。
【００８８】
参照配列の使用の例において、サンプル（例えば、ＲＮＡサンプルまたはｃＤＮＡサン
プル）を増幅するために、多重ポリメラーゼ連鎖反応増幅が、標的配列を増幅するための
複数のプライマーセットを使用し、かつ参照配列を増幅するためのプライマーセットを含
んで行われる。リアルタイム一重増幅において、Ｃｔ標的値が、各標的配列について得ら
れ、そしてＣｔ参照値が、参照配列について得られる。Ｃｔ標的値を正規化するために、
Ｃｔ参照値が、各Ｃｔ標的値から減算されて、各標的配列についてのΔＣｔ標的値が得ら
れる。特定の実施形態において、（上記のような）Ｃｔプール値が、参照値として使用さ
れ得る。例えば、Ｃｔプール値が得られ得、そして各Ｃｔ標的値から減算されて（すなわ
ち、Ｃｔプール値がＣｔ参照値の代わりに使用される）、各Ｃｔ標的値が得られる。
【００８９】
本方法の特定の適用は、処理された細胞、細胞株、組織または生物から得られるサンプ
ルを分析することに関する。例えば、特定の遺伝子のアップレギュレーションまたはダウ
ンレギュレーションが分析され得る。用語「処理」とは、１以上の細胞、細胞株、組織、
または生物を、その細胞、細胞株、組織、または生物が、その遺伝子発現プロフィールを
変えるようにさせ得る条件、物質、または薬剤（あるいはそれらの組み合わせ）に供する
プロセスをいう。処理としては、一定範囲の化学濃縮および曝露時間が挙げられ得、そし
て複製サンプルが生成され得る。用語「未処理のコントロール」とは、処理に曝されてい
ない細胞、細胞株、組織、または生物から得られるサンプルをいう。未処理のコントロー
ルに由来するｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）は、多重増幅において、処理した細胞、細胞株
、組織または生物に由来するサンプルと同じ様式で増幅され得る。処理したサンプルおよ
び未処理のサンプルの両方から得られるサイクル閾値は、上記のように正規化され得る。
例えば、未処理のコントロールについてのサイクル閾値（「Ｃｔ未処理」）は、未処理の
コントロールサンプル中の各標的配列について得られ得、そしてＣｔ参照は、上記のよう
に、各参照配列について得られ得る。Ｃｔ参照が各Ｃｔ未処理値から減算されて、ΔＣｔ
未処理値が得られる。同様に、処理した細胞、細胞株、組織または生物に由来するサンプ
ルに由来するｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）についてのサイクル閾値（Ｃｔ処理）が得られ
得、そして正規化されてΔＣｔ処理値が得られ得る。内因性の参照に対して正規化された
、処理したサンプルに由来する標的配列の量、正規化された未処理のコントロールに対す
る標的配列の量が、以下の式：
２−ΔΔＣｔ
によって与えられることが示され得、ここで、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ処理−ΔＣｔ未処理であ
る。ΔΔＣｔ値は、標的配列の発現レベルにおける処理の効果の分析において使用され得
る。
【００９０】
実際には、本明細書中に記載される任意の多重増幅または一重増幅のいずれかを行うこ
とにおいて、望まれる場合、蛍光シグナルにおけるＰＣＲと無関係の変動について正規化
するために、蛍光色素（例えば、ＲＯＸ）を有する受動参照（ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ）が含まれ得る。
【００９１】
また、本明細書中で、複数の異なる目的の標的配列を増幅するのに適切な、複数の増幅
プライマーセットを特徴付けするための方法が開示される。１つの実施形態において、プ
ライマーセットがプールされ、そしてこのプライマーセットが、増幅を時間の関数として
モニタするのに適切な試薬の存在下で、多重増幅に使用される。このような試薬の例とし
ては、オリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。他の例としては、色素分子（例えば、
インターカレート色素および副溝結合色素）が挙げられる。
【００９２】
また、本明細書中で、多重増幅および種々の二工程反応ならびに／あるいは本明細書中
に記載されるアッセイを行うのに適切な試薬およびキットが提供される。このような試薬
およびキットは、本明細書中で記載されるように、単一の増幅プライマーセットの代わり
に試薬および／またはキットが単一の容器に包装された複数の増幅プライマーを含む（こ
こで、この単一の容器は、１以上のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得る）こと
を除いて、従来のＰＣＲ増幅反応およびＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を行うのに適切な試薬およ
びキットを模倣し得る。特定の試薬の例としては、Ａｓｓａｙｓ−ｂｙ−ＤｅｓｉｇｎＴ
Ｍに含まれる試薬、遺伝子発現用のＰｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇ
ｅｎｔｓ（ＰＤＡＲ）、対立遺伝子区別用のＰＤＡＲおよびＡｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍ
ａｎｄ（登録商標）用のＰＤＡＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｅ
ｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業）にて市販されている試薬が挙げられるが、これら
に限定されない。キットは、必要に応じて、多重増幅産物の下流またはその後の分析のた
めに包装された試薬を備え得る。１つの実施形態において、キットは、複数の増幅プライ
マーの対またはセットを含む容器、および複数の反応容器を備え、これらの増幅プライマ
ーの各々は、異なる目的の配列を増幅するのに適切であり、そしてこれらの反応容器の各
々は、目的の配列を増幅するのに適切な単一の増幅プライマーセットを含む。個々の反応
容器に含まれるプライマーは、互いに独立して、複数の多重増幅プライマーを含むプライ
マーセットと同じであっても異なっていてもよい。特定の実施形態において、容器および
複数の反応容器の両方は、キットが図２に示される多工程アッセイを行うのに適切である
ように、５’−エキソヌクレアーゼプローブをさらに含む。１つの実施形態において、複
数の反応容器は、マルチウェルプレートである。
【００９３】
記載されてきた本発明は、以下の実施例において本発明の種々の特徴および利点が示さ
れ、この実施例は、例示的かつ非限定的であることが意図される。
【実施例】
【００９４】
（７．実施例）
（７．１  実施例１：多重増幅効率は、ＤＮＡポリメラーゼの濃度を増加させることに
よって増加する）
多重増幅を行うためのＤＮＡポリメラーゼの最適量を決定するために、９５重（９５−
ｐｌｅｘ）増幅をＤＮＡポリメラーゼ濃度の関数として行った。９５重増幅用の増幅プラ
イマーミックスを、ランダムに選択した９５個の異なる２０Ｘ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄ
ｅｍａｎｄＴＭ遺伝子発現産物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒ
ａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業、カタログ番号
【００９５】
【化１】
2010000092.tif 000003
）から、１０μＬをプールすることによって調製した。各々の２０Ｘ  Ａｓｓａｙｓ−ｏ
ｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭ遺伝子発現産物は、２つの非標識増幅プライマー（各プライマー１
８μＭ）と、１つのＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（５μＭ）とを
含んでいた。９５重増幅を、この増幅プライマーセットを用いて、２０μＬの反応容積当
たり１ユニット（１Ｕ／２０μＬ）〜１７Ｕ／２０μＬの範囲にわたるＤＮＡポリメラー
ゼ濃度を使用して行った。１Ｕ／２０μＬのＤＮＡポリメラーゼを用いて行った９５重増
幅について、５μＬのプールプライマーミックス、１０μＬの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録
商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（「２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍ
ｉｘ」；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｎｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎの事業、カタログ番号４３０４４３７）および５μＬのテンプレートｃＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡライブラリーに由来する；１００ｎｇの全ｃＤＮＡ）を、反応チューブに加えた。
２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメ
ラーゼ（０．１Ｕ／μＬ）、ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ、ｄＵＴＰを含むｄＮ
ＴＰ、受動参照（ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）および最適緩衝成分を含む。よ
り高いＤＮＡポリメラーゼ濃度で行った９５重増幅を、適切な量のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇ
ｏｌｄ（登録商標）（５Ｕ／μｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号
Ｎ８０８０２４）を用いて反応をスパイクすることによって調製した。すべての９５重反
応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業）で、最初に加熱（９５℃で１
０分間）し、その後、合計１０サイクル（９５℃で１５秒間の融解；６０℃で１分間のア
ニーリング／伸長）行った。
【００９６】
９５重増幅各々の産物を、水で２００μｌまで（１０倍）希釈し、９５個の一重リアル
タイム増幅反応用に分けた。各一重増幅は、上記の２０Ｘ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍ
ａｎｄＴＭ遺伝子増幅産物のうちの１つをプライマー／プローブとして、１回の反応につ
いて１つの異なるプライマーセットと共に使用した。以下の量の試薬を、一重リアルタイ
ム増幅のために使用して２０μＬの反応容積を得た：２μＬの希釈した９５重増幅産物、
１μＬの２０Ｘ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭ遺伝子増幅産物、１０μＬの２
Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび水。すべての一重増幅を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商
標）７７００または７９００機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅ
ｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業）で、合計４０サイクル（上記のサイクル条件と同
じ条件を使用する）行った。アンプリコンの蓄積を、リアルタイムでモニタした。これら
の増幅が、「アッセイ増幅」である。
【００９７】
９５種の対応する一重コントロール増幅を、同様の様式で、多重予備増幅に供されてい
ないテンプレートｃＤＮＡを用いて行った。ＤＮＡポリメラーゼの各濃度について、９５
個のアッセイ増幅のサイクル閾値（Ｃｔ値）を得、そして平均化して、各ＤＮＡポリメラ
ーゼ濃度についての平均アッセイＣｔ値（Ｃｔアッセイ）を得た。９５種のコントロール
増幅についてのＣｔ値もまた平均化して、平均コントロールＣｔ値（Ｃｔコントロール）
を得た。平均Ｃｔアッセイ値と平均Ｃｔコントロール値との差（ΔＣｔ値）を、各ＤＮＡ
ポリメラーゼ濃度について得、そしてプロットした（図３）。本実験において、特定の標
的配列について（産生したアンプリコンの量に関して）一重増幅と同じことを行う多重増
幅は、ΔＣｔ値１０を生じた。ΔＣｔ値が１０に近いほど、１０サイクルの多重増幅の効
率が良くなる。
【００９８】
図３から明らかなように、９５重増幅の効率は、１〜５Ｕ／２０μＬの反応容積の範囲
にわたって、ＤＮＡポリメラーゼ濃度が増加するにつれて増大し、この濃度にて効率は、
わずかに減少する前にプラトーであった。本実験から、上記の反応条件を使用して多重増
幅を行うための最適にスパイクされたＤＮＡポリメラーゼ濃度が、２０μＬの反応容積当
たり４〜６ユニットの範囲であることが決定された。より高いレベルのスパイクされたＤ
ＮＡポリメラーゼで観察された効率の低下は、多重増幅反応における酵素保存緩衝液の極
めて高濃度の成分（例えば、グリセロール）によって引き起こされていると考えられる。
【００９９】
（７．２  実施例２：多重増幅は、非常に低いプライマー濃度で効率的であり、最適化
を必要としない）
多重増幅の無数の利点のうちの２つは、非常に低いプライマー濃度を用い、かつプライ
マーの濃度を個々に最適化する必要がなく、１回において複数の配列を効率的に増幅する
能力である。これらの点を実証するため、１００ｎｇ  ｃＤＮＡを、６Ｕ／２０μＬ  Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、実施例１に記載されるように、９５重（９５−ｐｌｅｘ）増
幅において０サイクルまたは１０サイクル多重増幅した。各多重増幅物を分割し、そして
９５の個々の一重（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘ）反応を、実施例１に記載のように実施した
。各一重反応についてのΔＣｔ値（Ｃｔ０サイクル−Ｃｔ１０サイクル）を得、そして視
覚的比較のため棒グラフにプロットした（図４）。実施例１についてのように、特定の反
応についての最適ΔＣｔは、１０である。図４から見られ得るように、９５アッセイのう
ちの９０アッセイは、無作為選択多重増幅においてうまく実施された。
【０１００】
注目すべきことに、いずれのプライマー濃度も９５重増幅工程のために最適化されなか
った。市販の２０×Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ試薬を、さらなる操作無しに単に
共にプールした。その上、多重増幅のプライマー濃度は非常に低く、各プライマーにつき
４５ｎＭでしか存在しない。対照的に、一重増幅のために用いられたプライマー濃度は、
各プライマーにつき９００ｎＭであった。
【０１０１】
（７．３  実施例３：多重増幅は、オリゴヌクレオチドプローブの存在下で実行され得
る）
多重増幅の別の重要な利点は、多重増幅の間にも、多重増幅産物について行われる下流
増幅の間に有意な干渉なしに、オリゴヌクレオチドプローブ存在下で反応を実行する能力
である。この前者の利点は、実施例２（前出）から明白である。実施例２において、多重
増幅工程において効率的な増幅が達成され、これは、反応物中のＴａｑＭａｎ（登録商標
）ＭＧＢオリゴヌクレオチドプローブを含め、Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭ試
薬を利用して、多重プライマープールを作製したおかげである。
【０１０２】
後者の利点を実証するために、実施例１に記載されるように、５×濃度の９５重プライ
マー／プローブプール（ＲＮＡ−ｃＤＮＡ特異的）の存在下または非存在下で、１ｎｇの
ゲノムＤＮＡを用いて、一重ＲＮａｓｅ  Ｐアッセイ（ＤＮＡ特異的）を実行した。５×
濃度の９５重プライマー／プローブプールを、一重ＲＮａｓｅアッセイに対しいかなる影
響を有するかを決定するために、添加した。２反応の平均Ｃｔ値を、図５に図示する。図
５から明らかなように、９５重プライマー／プローブプールの存在は、ＲＮａｓｅ  Ｐア
ンプリコンのＣｔ値に影響せず、一重ＲＮａｓｅ  Ｐアッセイが、最初に多重プライマー
および／またはプローブを除去する必要がなく、多重増幅反応の産物を用いて実施され得
ることを実証した。多重プライマーおよび／またはプローブの存在は、一重ＲＮａｓｅ  
Ｐアッセイの遂行に悪影響を及ぼさない。
【０１０３】
（７．４  実施例４：多重増幅は、非常に少量のサンプルの下流分析を可能にする）
多重増幅が、所望の型および／または数の分析のために、他の方法では少なすぎる量の
サンプルの下流分析を可能にすることを実証するため、多重増幅を、種々の濃度（１００
ｎｇ〜１００ｐｇの範囲（５細胞のサンプルサイズとほぼ等価））のサンプルｃＤＮＡを
用いて実行した。各濃度のｃＤＮＡを９５重増幅に供し、その後、９５の個々の実時間増
幅分析を、実施例１に記載のように実施した。サンプルｃＤＮＡ濃度の関数としての９５
重増幅の平均Ｃｔ値を、図６に提供する。図６に図示されるように、サンプルｃＤＮＡ濃
度と平均Ｃｔ値との間に線形相関が存在し、これは、大きな百分率（約９７％）の標的配
列を、これらが多重様式で同時に増幅されてもなお、効率よく増幅したことを実証する。
達成した感度のレベルは、僅か１〜２細胞からのサンプルを、多重増幅後の実時間ＰＣＲ
によって分析し得ることを実証する。その上、多重増幅は、多数の下流実時間ＰＣＲアッ
セイのために十分な量の、増幅サンプルを生じる。
【０１０４】
（７．５  実施例５：増大した多重化における多重増幅）
多重増幅が非常に高いレベルの複雑さで実行され得ることを実証するため、１８６重、
３６９重、７３８重および１０１３重の増幅を、４つの個々の多重増幅反応において実行
した。各増幅についての増幅プライマー混合物を、等容量の１８６、３６９、７３８また
は１０１３の異なった無作為に選択した２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭ遺
伝子発現産物を、４つの別々の微小遠心チューブにプールすることにより、それぞれ調製
した。４本のチューブの各々について、プールした溶液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標
）濃縮機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を用いて乾燥させた
。残渣を、１×作業増幅プライマー濃度（４５ｎＭ）に対し、多重増幅プライマーが４×
ストック濃度（各１８０ｎＭプライマー）になるように、脱イオン水中に再懸濁した。１
０１３重プール混合物について、合わせたプライマーは、４５．６μＭの濃度にて再懸濁
物中に存在し、そしてＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブは、１０．１μＭで存在
した。１８６重増幅について、２つのプレート（ＩＡＰおよびＩＡＯと名付けられる）の
各々からの９２プライマーセットを、２つの参照遺伝子（グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびシクロフィリン）についての等容量のプライマーセッ
トと共にプールした。この実施例において記載される実験を設定する上で、便宜上、液体
移動において、上記の無作為選択した２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ遺伝子発
現産物のそれぞれを、一連の９６ウェルプレート（アルファベット順にプレートＩＡＡ〜
ＩＡＯと名付けた）に分配した。各２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ遺伝子発現
産物は、２種の未標識増幅プライマー（各プライマーにつき１８μＭ）および１種のＦＡ
Ｍ標識化ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（５μＭ）を含んだ。
【０１０５】
各増幅（１８６重、３６９重、７３８重、または１０１３重のプールしたプライマー混
合物から）を、５０μＬの最終容量で、以下の構成成分を用いて実施した：４×のプール
し再懸濁したプライマー混合物（１２．５μＬ）、２５μＬの２×ＴａｑＭａｎ（登録商
標）ユニバーサルＰＣＲマスター混合物（「２×マスター混合物」；カタログ番号４３２
４０１６、ＵＮＧ酵素非含有）、１０μＬテンプレートｃＤＮＡ（ｃＤＮＡライブラリー
から；２５ｎｇの全ｃＤＮＡ）および２．５μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）。２×マスター混合物は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇ
ｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（０．１Ｕ／μＬ）、ｄＮＴＰ、受動的参照およ
び最適化緩衝液成分を含んでいた。４つの反応の各々を、計１０サイクル（１５秒間、９
５℃で融解；４分間、６０℃でアニール／増幅）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７
００装置で実施した。
【０１０６】
各増幅の産物を、水で希釈し、そして一重分析のために分取した。１８６重および３６
９重反応の場合、一重アッセイを設定する前に、産物を１：５に希釈した。７３８重およ
び１０１３重増幅について、一重アッセイを設定する前に、産物を１：１０に希釈した。
これらの一重増幅の各々を、上述の多重増幅において使用される２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏ
ｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭ遺伝子発現産物のプライマー／プローブの１つとして使用し、そし
て一連の９６ウェルプレートに、液体移動の便宜をはかるために分配した（アルファベッ
ト順に、プレートＩＡＡ〜ＩＡＯと名付けた）。プライマー／プローブの異なったセット
を、各一重反応について使用した。以下の容量の試薬を、一重（「アッセイ」）増幅のた
めに使用した：２．５μＬの希釈した１８６重、３６９重、７３８重または１０１３重の
増幅産物、０．５μＬの２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ遺伝子発現産物、５μ
Ｌの２×マスター混合物および反応物容量を１０μＬにするまでの水。全てのアッセイ増
幅を、計４０サイクル（１５秒間、９５℃で融解；１分間、６０℃でアニール／伸長）で
、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００装置で実施した。アンプリコンの蓄積を、実
時間でモニタした。
【０１０７】
多重コントロールに対応し、１８６重、３６９重、７３８重および１０１３重コントロ
ール増幅物を、上述のように調製したが、これらのコントロール多重増幅物を、サーマル
サイクリングに供さなかった（すなわち、この反応物を、多重増幅に供さなかった）。こ
れらの「擬似」増幅混合物を、希釈し、そして一重「コントロール」増幅で、上述のよう
にアッセイした。各アッセイ増幅について、プレートＩＡＯおよびプレートＩＡＰからの
標的のＣｔ値を得て平均化し、平均アッセイＣｔ値を生じた。平均ΔＣｔ値を、実施例１
に記載のように計算した。ΔＣｔ値を、図７におけるΔＣｔ値の上昇によって選別する。
【０１０８】
以下の表は、種々のアッセイ増幅からの結果を要約する：
【０１０９】
【表１】
2010000092.tif 000004
この結果は、多重増幅を非常に高いレベルの複雑性で実行した際の性能の悪化がなかっ
たことを実証する。
【０１１０】
（７．６  実施例６：多重ＰＣＲ増幅は、ウラシルＮ−グリコしたーゼ（ＵＮＧ）の存
在において実施され得る）
ＰＣＲにおける「持ち越し」夾雑を防ぐ方法としては、ＰＣＲ混合物中でｄＴＴＰの代
わりにｄＵＴＰを使用し、その後、全ての生じたＰＣＲ混合物をウラシルＮグリコシラー
ゼ（ＵＮＧ）で処理することが挙げられる（米国特許第５，０３５，９９６号）。この実
施例におけるこの実験を、多重増幅の効率に対するＵＮＧの存在の影響を評価するために
実施した。
【０１１１】
最初の１８６重増幅（ＵＮＧ（−））を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルマス
ター混合物、ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧなし（カタログ番号４３２４０１８）
をユニバーサルマスター混合物（カタログ番号４３０４４３７）の代わりに用いたこと以
外は、実施例５に記載のように行った。多重増幅を、実施例５において１０サイクルの代
わりに、１４サイクルに延長した。このサンプルを、増幅後氷上で冷却し、次いで、実施
例５に記載のように、一重ＰＣＲに供した。
【０１１２】
別の１８６重増幅（ＵＮＧ（＋））を、ユニバーサルマスター混合物（カタログ番号４
３０４４３７）（ＵＮＧ含有）を用いて、１８６重増幅を１４サイクルに延長した以外は
、実施例５に記載のように行い、サンプルを氷上で４時間冷却した。このサンプルを、実
施例５に記載のように、一重ＰＣＲに供した。
【０１１３】
これらの２つのプロトコールの各々について、対応するコントロール多重増幅を設定し
たが、これらのコントロール反応物を、サーマルサイクリングに供さなかった。「ＵＮＧ
（−）」プロトコール由来および「ＵＮＧ（＋）」プロトコール由来の一重増幅について
のΔＣｔ値を得、棒グラフ上にプロットした（図８）。以下の表は、２つのプロトコール
の結果を要約する：
【０１１４】
【表２】
2010000092.tif 000005
この実施例において、実施例５に記載される手順と類似した手順で実行した多重増幅に
おけるＵＮＧの存在の影響を、評価した。多重増幅におけるＵＮＧの存在は、ＵＮＧ（−
）サンプルと比較して、一重増幅工程における増幅の効率に、本質的に影響を有さなかっ
た。
【０１１５】
（７．７  実施例７：多重増幅のサイクルの増加の影響）
実施例５において、多重増幅を、１０サイクル行った。本実施例において、多重増幅を
、１０サイクル、１２サイクルおよび１４サイクル行った。より高いサイクル数は、増幅
産物の濃度を増加させ得、これは、より多数の下流アッセイ（例えば、より多数の一重増
幅）を行うことを可能にする。
【０１１６】
３種の１８６重増幅を、ユニバーサルマスター混合物（カタログ番号４３２４０１８）
（ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧなし）を用いて、実施例５に記載のように実施し
、そして多重増幅を、１０、１２または１４増幅サイクルによって延長した。各３つのプ
ロトコールに対するΔＣｔ値を図９に示し、以下の表に要約する：
【０１１７】
【表３】
2010000092.tif 000006
平均ΔＣｔ値は、サーマルサイクル数が増加するに従って増大した。標準偏差は、本質
的に変化しなかった。これらの結果は、１０から１４までのサイクル数で行われる際の性
能において減少がないことを示す。増幅が１００％の効率である場合、増幅反応物と「擬
似」反応物との間のΔＣｔは、１０サイクルの増幅で１０であり、１２サイクルで１２で
あり、１４サイクルで１４である。この実施例において、平均ΔＣｔ値は、それぞれ１０
（９．９９）、１２（１１．８）、および１４（１４．１３）に近似した。
【０１１８】
（７．８  実施例８：ＲＴ−ＰＣＲ多重増幅によるヒト血漿中のｍＲＮＡの定量）
血漿中を循環するＲＮＡの検出は、癌、冠状動脈不全および自己免疫機能不全のような
疾患状態の早期検出を可能にし得、そしてまた、その後の遺伝子発現による投薬処置レジ
メンの成功を、モニタするためにも使用され得る。
【０１１９】
この実施例は、ｍＲＮＡのサンプルからのｃＤＮＡの産生、その後の１つの反応混合物
内における複数の選択されたＰＣＲプライマーの存在下でのｃＤＮＡの多重ＰＣＲ増幅、
その後の各選択されたＰＣＲプライマーの存在下での一重実時間ＰＣＲを実証する。
【０１２０】
全血を、健康なドナーから得、そして２０００×ｇで２０分間遠心分離した。無細胞上
清をデカントし、そして０．２μｍフィルターを通して濾過した。回収率（容量約１０ｍ
ｌ）は、全血容量の約５０％であった。ＲＮＡを抽出し、エタノール沈殿に供した。ＲＮ
Ａペレットを、２００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１２１】
１０８の選択された２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ遺伝子発現産物の等容量
（各１０μｌ）をプールし、そしてＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）濃縮機（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓａｖａｎｔ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を用いて乾燥させた。残渣を、脱イオン水中
に再懸濁し、各プライマーにつき１８０ｎＭのプライマー濃度を得た。１０８のＡｓｓａ
ｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄプライマーは、固体組織および白血球特異的アンプリコンに対応
した。これらの例としては、以下が挙げられた：ピニン（ｐｉｎｉｎ）、ヘキソキナーゼ
−１、ＶＥＧＦβ、ＰＲＫＣＢ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、シクロフィリンＡ、ＧＡＳ２Ｌ１
、ＤＤＸ１、ＴＥＲＴ、ＢＭＰＲ２、ＬＡＮＣＬ１およびＣＣＬ５。
【０１２２】
逆転写酵素（ＲＴ）および多重増幅インキュベーションは、以下を含んだ：１工程ＲＴ
−ＰＣＲのための１２５μｌの２×ユニバーサルマスター混合物（ＴａｑＭａｎ（登録商
標）１工程マスター混合物試薬キット、ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧなし、カタ
ログ番号４３０９１６９）；１２．５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（５Ｕ／μｌ＝
２０μｌ多重増幅容量につき５単位過剰）；６．２５μｌの逆転写酵素／ＲＮａｓｅイン
ヒビター；１０６．２５μｌの血漿ＲＮＡ（２４０ｎｇ）；および６２．５μｌのプール
し再懸濁した１０８のＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ産物。終容量は２５０μｌ（２４
０ｎｇ血漿ＲＮＡ）であり、そして５０μｌを、９６ウェルプレートの別々のウェルにア
リコートに分けた。
【０１２３】
逆転写反応を、３０分間４８℃で実施し、その後、９５℃で１０分間の変性を行った。
多重増幅を、計１４サイクル（各サイクル：９５℃で１５秒間；６０℃で４分間アニール
／伸長）行った。これらの反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００装置で行っ
た。
【０１２４】
逆転写酵素反応物を含むが１４サイクルのＰＣＲ多重増幅は省略した「擬似」多重増幅
物では、特定のアンプリコンが検出され得ることに起因するシグナルがなかった。以下の
表は、選択された標的についての結果を要約する：
【０１２５】
【表４】
2010000092.tif 000007
結果は、ヒト血漿ＲＮＡの逆転写から得、複数のプライマー対の存在下で多重増幅に供
したＤＮＡは、その後、同じプライマー対を最適化なしで用いて、一重増幅され得ること
を示す。
【０１２６】
他で述べない限り、本明細書中で使用されたかまたは企図された技術は、当業者に周知
の標準的方法論である。材料、方法および実施例は、例示のみであり、限定ではない。
【０１２７】
上記は本発明の特定の実施形態を示したが、これらの実施形態は、例証として示されて
いるに過ぎないことが理解されるべきである。上記と異なるが、本明細書中で記載され、
特許請求される本発明の精神および範囲から逸脱しないバリエーションが他者により認知
され、実践されることが予測される。本明細書中で挙げた全ての特許出願、特許、および
参考文献は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【図１】
2010000092.tif 000008
【図２】
2010000092.tif 000009
【図３】
2010000092.tif 000010
【図４】
2010000092.tif 000011
【図５】
2010000092.tif 000012
【図６】
2010000092.tif 000013
【図７】
2010000092.tif 000014
【図８】
2010000092.tif 000015
【図９】
2010000092.tif 000016