(57)【要約】      （修正有）【課題】高レベルの組み換え蛋白を発現する安定な哺乳動物細胞系を迅速に得ることに有用な方法を提供する。【解決手段】レシピエント哺乳動物細胞系において安定に発現されるキメラトランスアクチベーター構築物により活性化される強力な転写エレメントを利用したベクターおよび細胞系。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１記載のｐＨＴｏｐのＤＮＡ配列を含む、組み換えＤＮＡ配列。
【請求項２】
（ａ）イー・コリ（E. coli）テトラサイクリンリプレッサーと単純ヘルペスウイルス１６の転写アクチベータードメインとの融合物を含むキメラ転写因子；および
（ｂ）複数のｔｅｔオペレーター配列が前にある最小プロモーター、ならびに目的蛋白をコードする第１のＤＮＡおよび選択可能マーカー遺伝子をコードする第２のＤＮＡ配列を含むポリシストロン性メッセージを含むベクター
を含む、組み換えＤＮＡ発現系。
【請求項３】
安定な組み換え哺乳動物細胞系を得る方法であって、前記方法が、
（Ａ）プラスミドベクターを用いてレシピエント哺乳動物細胞系をトランスフェクションして、トランスフェクションされたレシピエント哺乳動物細胞系を得て；
（１）該プラスミドベクターが：
（ａ）複数のｔｅｔオペレーターが前にある最小プロモーター；
（ｂ）ポリシストロン性メッセージの効果的な発現を指令しうるリーダー配列；および
（ｃ）目的蛋白をコードする第１のＤＮＡおよび選択可能マーカー遺伝子をコードする第２のＤＮＡ配列を含むポリシストロン性メッセージ
を含むものであり；
（２）該レシピエント哺乳動物細胞系が、イー・コリテトラサイクリンリプレッサーと単純ヘルペスウイルス１６の転写アクチベータードメインとの融合物を含むキメラ転写因子を含むものであり；
（Ｂ）ついで、該トランスフェクションされたレシピエント哺乳動物細胞系を単離し、所望により培養すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高レベルの組み換え蛋白を産生する安定な哺乳動物細胞系を得る方法、ならびにかかる方法における使用に適した細胞系およびベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系のごとき哺乳動物細胞系は、しばしば、組み換え蛋白の製造に使用される。かかる方法においては、安定な細胞系を得て、比較的短時間のうちにかかる高生産性安定細胞系を形成できることが望ましい。かかる細胞系の形成により、生物学的評価および商業的生産の目的に使用する大量の蛋白の大規模な製造が可能になる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、比較的短時間のうちに、好ましくは約４週間程度で高レベルの分泌組み換え蛋白および膜結合組み換え蛋白を産生する安定な哺乳動物細胞系を確立するとこが可能な新規哺乳動物発現ベクターに関する。本発明の好ましい具体例において、哺乳動物細胞系はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）起源のものである。
【０００４】
１の具体例において、本発明は、安定な細胞系の形成に有用な組み換えＤＮＡ配列および遺伝子発現プラスミドを包含する。好ましい具体例は、遺伝子発現プラスミドｐＨＴＯＰまたはｐＨＴＯＰ６の組み換えＤＮＡ配列を含む。他の具体例において、本発明は、キメラ転写因子［ｔＴＡ］をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡベクターを包含し、ｔＴＡはイー・コリ（E. coli）テトラサイクリンリプレッサー蛋白と単純ヘルペスウイルス１６（ＶＰ１６）の転写活性化ドメインとの融合物を含んでいてもよく、ベクターは複数のｔｅｔオペレーター［ｔｅｔＯ］配列が前にある最小プロモーターを含んでいる。
【０００５】
ｐＨＴｏｐベクターは、ＣＨＯ／Ａ２細胞系中にトランスフェクションされた場合、同じポリシストロン性メッセージ上に存在するＤＨＦＲ発現のみならず、その中に組み込まれた遺伝子の非常に効果的な発現を導く。ストリンジェントなＭＴＸ選択プロトコールを用いて、高発現クローンを単離し、１カ月以内に増幅することができる。試験した５種の遺伝子については、発現レベルはＣＯＳ一時的発現レベルよりも高い。ＭＴＸ濃度を増加させつつ細胞を増殖させることにより発現レベルを増大させることができる。発現の安定性は選択圧がない場合でも少なくとも３週間維持されうることが示された。
【０００６】
１工程選択プロトコールにより達成される発現レベルは遺伝子により異なる。１〜１４μｇ／ｍｌの範囲の分泌蛋白レベルが観察された。一般的には、ストリンジェントなＭＴＸ選択は、均一なレベルの蛋白を発現するクローンを生じ、多数のクローンをスクリーニングする必要性がない。ｐＨＴｏｐベクターを用いると、分泌蛋白および膜蛋白の両方が高レベルで発現されうる。
【０００７】
本明細書記載のＣＨＯ安定細胞系を確立するためのストリームライン化されたプロトコールを、大規模ＣＯＳトランスフェクションのための別法として用いてもよい。ＣＨＯ細胞は無血清培地で十分に増殖し、容易にならし培地が得られ、新規蛋白を精製することができる。例えば、かかるプロトコールは機能検索における安定な細胞系の形成を加速しうる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はGossenおよびBujardにより特徴づけられた調節可能な発現系のダイヤグラムである。この発現系は２つのエレメントに基づく。それらは、イー・コリテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純ヘルペスウイルス１６の転写ドメインとの間の融合物であるキメラ転写因子（ｔＴＡ）；ならびに１のベクター（複数のｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列がＴＡＴＡボックスを提供する最小プロモーターの前にある）である。キメラトランスアクチベーターが発現される場合、そのｔｅｔＲドメインがｔｅｔＯ配列に結合する。次いで、これが強力な活性化ドメインＶＰ１６を基底転写複合体の近くに置き、それを活性化させる。この相互作用はテトラサイクリンの作用により逆転させられうる。それゆえ、テトラサイクリンは転写を「オフ」にするスイッチとして使用できる。テトラサイクリン不存在下において、発現は「オン」になる。
【図２】図２Ａは、発現系における最小プロモーターとの基底開始複合体を示すダイヤグラムである。図２Ｂは活性化された開始複合体を示す。
【図３】図３はｐＥＤ６のプラスミドダイヤグラムである。ｐＥＤ６は５３３４塩基対のプラスミドであり、ＥＭＣリーダーとＤＨＦＲ配列との間にジャンクションを含んでいる。
【図４】図４は、最小ＡｄＭＬＰ発現プラスミド［ｐＥＤ６ｍｉｎ］の構築を示すプラスミドダイヤグラムである。ＳＶ４０複製開始点およびエンハンサーならびにＴＡＴＡボックスから８塩基対までのアデノウイルス主要後期プロモーターがｐＥＤ６からループアウトされ、５７５塩基対が欠失している。ユニークなＸｈｏＩ部位が挿入されてｔｅｔＯの挿入が可能となっている。
【図５】図５は、ｐＥＤ６からのｐＨＴｏｐの構築を示すダイヤグラムである。ｐＥＤ６ｍｉｎを構築した後、６個のｔｅｔＯ配列をＸｈｏＩ部位中に連結してｐＴＯＰ６を得る。次に、ＨＢＶポリＡ配列をｔｅｔＯ配列の上流に挿入する。
【図６】図６はｐＨＴＯＰのプラスミドダイヤグラムである。ｐＨＴＯＰは５６３９塩基対のプラスミドであり、その中で、ｐＨＴＯＰ６のＥＭＣリーダー／ＤＨＦＲジャンクションが変化させられており、上流遺伝子の発現レベルに影響せずにＤＨＦＲ翻訳が起らないようになっている。このことにより、高レベルのメトトレキセート［ＭＴＸ］を使用することなくストリンジェントな選択が維持できる。
【図７】図７はｐＺｔＴＡのプラスミドダイヤグラムである。ｐＺｔＴＡは６４２０塩基対のプラスミドであり、トランスアクチベーターＣＨＯ細胞系の構築に使用される。かかる細胞系を構築するために、ｐＺｔＴＡをＣＨＯ細胞中にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、１μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下において２４個のクローンを選択する。ついで、選択用のＣＡＴ遺伝子を含有するｐＴＯＰ６［ｐＴＯＰ６ＣＡＴ］中にこれら２４個のクローンを一時的にトランスフェクションする。トランスフェクションされたクローンをＣＡＴ活性についてアッセイする。活性のレベルを、ｐＴＯＰ６ＣＡＴおよびｐＥＤｔＴＡをＣＨＯ細胞中にトランスフェクションすることにより得られた活性のレベルと比較する。
【図８】図８は、上記図７の説明にて説明した、ｔＴＡを発現するＣＨＯ細胞系ＣＨＯ／Ａ２の誘導を示す。
【図９】図９は、２種の細胞系ｐＥＤＳＥＡＰおよびｐＨＴＯＰＳＥＡＰにおけるリポーター遺伝子分泌アルカリ性ホスファターゼの一時的発現を示すグラフである。非常に高感度な化学発光アッセイを用いてＳＥＡ発現をモニターする。０．０５、０．１および０．２μｇのｐＥＤＳＥＡＰおよびｐＨＴＯＰＳＥＡＰをそれぞれＣＨＯ／２Ａ細胞系中にリポフェクションした。ＳＥＡ活性を１秒あたりのカウント数［ＣＰＳ］として測定し、それはグラフに示す範囲においてＳＥＡ活性に比例する。図９に示す一時的トランスフェクション実験において、ｔｅｔ調節可能プロモーターはアデノウイルス主要後期プロモーターよりも約５倍強力であることが示される。
【図１０】図１０は、アデノウイルスを用いてｐＥＤ６ＳＥＡＰおよびｐＨＴＯＰ６ＳＥＡＰでトランスフェクションさせた細胞、ならびにドキシサイクリン（テトラサイクリンアナログ）存在下にてｐＨＴＯＰ６ＳＥＡＰをトランスフェクションさせた細胞におけるＳＥＡの一時的発現を示すグラフである。さらに、ＳＥＡは、ｐＨＴＯＰ６の調節下において、ｐＥＤ６調節下よりも約６倍強力に発現されることが示される。Ｄｏｘの添加は、ｔｅｔプロモーターによるＤＮＡ発現を完全に阻害する。
【図１１】図１１は、ｐＥＤ６ＳＥＡＰおよびｐＨＴＯＰ６ＳＥＡＰでトランスフェクションされたＣＨＯ／Ａ２細胞系におけるＳＥＡの安定な発現のレベルを比較するグラフである。各ベクターに関して可能な最高濃度のＭＴＸ存在下においてクローンを拾った（ＣＨＯ／ＥＤ６ＳＥＡＰについては０．１μＭ ＭＴＸ；ＣＨＯＡ２／ＨＴＯＰ６ＳＥＡＰについては０．５μＭ ＭＴＸ）。ＭＴＸを用いた場合に観察された発現レベルは、アルファ培地（ＭＴＸ不含）にて拾ったクローンと比較して約３０倍であった。ｐＨＴＯＰＳＥＡＰにおける発現レベルはｐＥＤ６ＳＥＡＰよりも約３倍高かった。これらのクローンにおける発現レベルはＣＨＯ細胞系の場合非常に高く、ＣＯＳ−１一時的発現において得られるものと同程度である。
【図１２】図１２は、ｐＨＴＯＰベクターおよびＣＨＯ／Ａ２トランスアクチベーター細胞系を用いる１工程ＣＨＯ細胞系選択のためのストリームライン化されたプロトコールのダイヤグラムである。
【図１３】ｈＧＤＦ−９を安定に発現しているＣＨＯ細胞のウェスタンブロット分析であり、該ＣＨＯ細胞はｐＨＴＯＰベクターを用いるトランスフェクションにより確立された。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を撒いて、０．０２および０．１μＭ ＭＴＸ存在下でコロニー形成させた。２週間後、各ＭＴＸ濃度からコロニーを拾った。細胞を増殖させて集密とし、２４時間培養した無血清ならし培地を集め、ＧＤＦ−９特異的ポリクローナル抗体、次いで化学発光検出を用いるウェスタン分析を行った。  ０．１μＭ ＭＴＸにて選択したクローン（レーン１１〜１６）は、０．０２μＭ ＭＴＸにて選択したクローン（レーン１〜１０）よりも高いレベルのＧＤＦ−９を発現した。低いＭＴＸ濃度で選択されたクローンは広範囲の発現を示した。しかしながら、ＧＤＦ−９発現レベルは、０．１μＭ ＭＴＸで選択されたクローンについては非常に均一であった。よって、メトトレキセート濃度を増加させていくことによるストリンジェント選択により、高レベルの蛋白を均一に発現するクローンが得られる。
【図１４】図１４は、１工程選択を用いて得られる発現レベルは遺伝子により異なることを示すグラフである。分泌型のｍＣＤ２８、ｍＢ７．２またはｍＣＴＬ４（すべてｍＩｇＧ２ａ融合蛋白）を安定に発現するＣＨＯ細胞を、ｐＨＴＯＰベクターを用いて確立した。０．０５μＭ ＭＴＸにてクローンを選択し、集密まで増殖させ、２４時間培養した無血清ならし培地を集めてｍＩｇＧ２ａ ＥＬＩＳＡを行った。発現された３種の遺伝子に関して、ｍＣＴＬＡ４クローンは最高レベルの蛋白（１３μｇ／ｍｌ）を産生した（その次はｍＣＤ２８（８μｇ／ｍｌ）およびｍＢ７．２（３μｇ／ｍｌ）であった）。
【図１５】図１５は、哺乳動物発現系の比較を示すウェスタンブロット分析である。レーン１ないし９は、ｐＥＤＢＭＰ−２で安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のステップワイズ増幅の効果を示す。レーン１０ないし１６は、ｐＨＴＯＰＢＭＰ−２で安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の１工程選択の効果を示す。レーン１７および１８は、ｐＥＤＢＭＰ−２で一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞および模擬トランスフェクションの結果を示す。
【図１６】図１６は、２種の効果的な発現ベクターを示す。ｐＥＤはアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）を転写開始のために使用する。それはＣＯＳ細胞における一時的発現のためのＳＶ４０複製開始点を含む。ハイブリッドイントロンの後にｃＤＮＡ挿入のためのユニークなクローニング部位が続いている。選択可能マーカーＤＨＦＲの前にある内部リボソーム開始部位（ＥＭＣＶリーダー）は、ＤＨＦＲマーカーがユニークなポリシストロン性メッセージから独立して翻訳されるのを可能にする。ｐＨＴｏｐを作成するために、ＳＶ４０およびＡｄＭＬＰプロモーターエンハンサーエレメントが除去され、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位から３５塩基対上流の部分のみが残るようにベクターｐＥＤを修飾した（ｐＥＤｍｉｎ）。除去したところに６リピートのｔｅｔオペレーター配列を挿入した。このベクター（ｐＴＯＰ）は、ｔｅｔリプレッサーとｔｅｔオペレーターとの間の相互作用を介してトランスアクチベーター（ｔＴＡ）により制御されるものとなり、テトラサイクリンを用いて転写をオン／オフすることができる。さらに、プラスミド骨格中の潜在的なプロモーターに対する妨害を防止するために、肝炎ポリアデニル化部位がｔｅｔオペレーター配列の上流に挿入された。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明ベクターは、レシピエント哺乳動物細胞系において安定に発現されるキメラトランスアクチベーター構築物により活性化される強力な転写エレメントを利用する。好ましい具体例において、強力な転写エレメントは、最小哺乳動物ＴＡＴＡ配列の上流に近接した複数コピーのｔｅｔオペレーターを含む。このキメラは強力な哺乳動物プロモーターを形成する。さらなる好ましい具体例において、この強力なプロモーターはポリシストロン性メッセージの合成を指令し、ジヒドロ葉酸耐性遺伝子（ＤＨＦＲ）のごとき耐性マーカーの発現が目的遺伝子の発現とリンクされ、非常に発現力のあるクローンの選択が可能となる。好ましい具体例において、ＥＭＣウイルス（ＥＭＣＶ）リーダーのごとき適当なリーダー配列の一部分を、このポリシストロン性メッセージの効果的な機能発揮のために使用してもよい。ＥＭＣＶリーダー配列を、例えば、ｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１から得てもよい（S. K. Jung, et al., J. Virol. 63: 1651-1660 (1989)）。この文献の開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。選択可能な耐性マーカーとともにポリシストロン性メッセージを生じるこの強力なキメラプロモーターと、キメラトランスアクチベーターを発現する宿主細胞との組み合わせ使用により、１工程で高レベルの組み換え蛋白を産生する細胞系を迅速に選択することができる。
【００１０】
この１工程選択方法を用いて約５０μｇ／ｍｌまでの分泌蛋白レベルが観察された。高レベルのメトトレキセート（ＭＴＸ）存在下でストリンジェントに選択されたクローンは均一なレベルの蛋白を産生し、多数のクローンをスクリーニングする必要がない。最初の選択工程で得られる産生レベルは遺伝子により異なるが、ＭＴＸ濃度を増加させていくことによりレベルを増大させることができる。さらに、産生レベルは選択圧の存在下で安定であり、選択圧を除去した場合でも少なくとも３週間安定である。
【００１１】
本発明の系は、通常のステップワイズ増幅を用いる従来の系よりもずっと迅速に安定な細胞系を発生させるという利点を有する（従来の系では約４カ月、本発明の系では約１カ月）。さらに、この系を用いると、ＣＯＳ細胞における一時的な発現よりも高い産生レベルが得られる。したがって、本発明は、高発現細胞系を迅速かつ簡単に得る方法を提供するものであり、ＣＯＳ細胞における一時的発現（迅速であるが蛋白の大規模生産には労力が必要）とステップワイズ増幅による安定な発現（遅くて労力が必要）との間のかかる系に対する以前からの必要性を満たすものである。
【００１２】
本発明発現系は２個のエレメントの組み合わせ使用に基づく。２個のエレメントとは、イー・コリテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純ヘルペスウイルス１６の転写ドメインとの間の融合物であるキメラ転写因子（ｔＴＡ）、ならびにＴＡＴＡボックスを提供する最小プロモーターの前に複数のｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列が存在するベクターである。これらのオペレーターはＶＰ１６の強力な活性化ドメインを基底転写複合体の近くに置いて、それを活性化する。この相互作用はテトラサイクリンを用いることにより逆転させることができ、それゆえ、テトラサイクリンは転写を「オフ」にするスイッチとして使用できる。テトラサイクリン不存在下において、発現は「オン」である。しかしながら、本発明方法はこの調節を使用することを要しない。かくして、１の具体例において、本発明は、最小プロモーターがリーダー配列に作動可能に連結されている（リーダー配列はＤＨＦＲ遺伝子に作動可能に連結されている）プラスミドを含む。リーダー配列の上流は、発現される所望蛋白をコードする遺伝子の挿入に適した１個またはそれ以上の制限部位である。好ましい具体例において、プラスミドｐＨＴＯＰ６が用いられ、さらに本明細書で説明するようにｐＨＴＯＰ６はプラスミドｐＥＤから作成されている。プラスミドｐＨＴＯＰも本発明に有用である。ｐＨＴＯＰ中において、ＥＭＣＶリーダーとＤＨＦＲ遺伝子との間のジャンクションが変化されて、上流遺伝子の発現レベルに影響することなくＤＨＦＲの翻訳が起らないようにされた。低レベルのＤＨＦＲ発現が予想される大型蛋白の製造には、ｐＨＴＯＰ６は好ましいベクターであるかもしれない。本発明方法は分泌蛋白および膜蛋白の両方の製造に有用である。本発明方法を、大規模ＣＯＳトランスフェクションを行うための別法として用いることができる。ＣＨＯ細胞を使用する好ましい具体例において、蛋白精製のために細胞は無血清培地にて増殖させられる。
【００１３】
レシピエント哺乳動物細胞系として有用なトランスアクチベーター細胞系を、上記ｔＴＡのごときキメラ転写因子をＣＨＯ細胞系のごとき適当な細胞系中にトランスフェクションすることにより誘導してもよい。好ましい具体例において、ＤＨＦＲを欠き、それゆえ通常はメトトレキセート選択下では生存することのできないＣＨＯ細胞系ＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１を用いる。かかるプロセスのダイヤグラムを図１０および１１に示す。
【００１４】
プラスミドｐＨＴＯＰ−Ｘ（ここにＸは発現される蛋白のコーディング配列である）を作成し、トランスアクチベーター細胞系中にトランスフェクションし、図１５に示すようにスクリーニングする。かくして、１の具体例において、本発明は、ｐＨＴＯＰまたはｐＨＴＯＰ６ＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ配列を含む。他の具体例において、本発明は、安定な哺乳動物細胞系の製造方法を含み、該方法は、（１）レシピエント哺乳動物細胞系をプラスミドベクターでトランスフェクションしてトランスフェクションされたレシピエント哺乳動物細胞系を得て（該プラスミドベクターは、（ａ）複数のｔｅｔオペレーターが前にある最小プロモーター；（ｂ）ポリシストロン性メッセージの効果的な発現を指令しうるリーダー配列；および（ｃ）目的蛋白をコードする第１のＤＮＡおよび選択可能マーカーをコードする第２のＤＮＡ配列を含み；該レシピエント哺乳動物細胞系は、（１）１またはそれ以上のコピーのイー・コリテトラサイクリンリプレッサーの融合物を含むキメラ転写因子；（２）単純ヘルペスウイルス１６の転写ドメイン；および（３）複数のｔｅｔオペレーター配列が前にある最小プロモーターを含むベクターを含む）；ついで、（Ｂ）得られた該トランスフェクションされたレシピエント哺乳動物細胞系を単離することを含む。最適には、トランスフェクションされた細胞系をさらなる使用のために培養してもよい。
【００１５】
下記実施例は本発明の好ましい具体例のいくつかを説明する。
Ａ．ステップワイズ増幅において、ＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞がｐＥＤＢＭＰ−２で安定にトランスフェクションされた。トランスフェクション４８時間後にアルファ培地でのコロニー形成のために細胞をプレートに撒いた。２週間後、クローンを拾い、安定化するまで（４週間）０．０２μＭ ＭＴＸ中で増殖させ、ついで、０．１μＭ ＭＴＸ中に移し、４週間増殖させた。集密細胞による無血清ならし培地（２４時間）を集めてウェスタン分析を行った。
【００１６】
Ｂ．本発明の１工程選択において、ｐＨＴｏｐＢＭＰ−２でＣＨＯ ＤＵＫＸ／Ａ２細胞が安定にトランスフェクションされた。トランスフェクション４８時間後に０．１μＭＭＸＴおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８培地でのコロニー形成のために細胞をプレートに撒いた。２週間後、クローンを拾い、無血清培地ならし培地にて集密になるまで増殖させ、集密細胞によるならし培地を集めてウェスタン分析を行った。
【００１７】
Ｃ．ＣＯＳ一時的トランスフェクションを、ｐＥＤＢＭＰ−２で一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞を用いて行った。トランスフェクションから４８〜７２時間後、無血清ならし培地を集めてウェスタン分析を行った。
【００１８】
ウェスタン分析：
上記プロトコールＡ、Ｂ、Ｃからのならし培地１０μｌを還元的条件下の１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動させ、ウェスタンブロットによりニトロセルロースに移した。ＢＭＰ−２特異的ポリクローナル抗体、ついで、化学発光検出を用いてＢＭＰ−２を検出した。
【００１９】
ｐＥＤベクターを用いるステップワイズ増幅により確立されたクローンは広範なＢＭＰ−２発現を示した。対照的に、ｐＨＴｏｐベクターを用いる１工程選択において拾ったクローンは高く、均一なＢＭＰ−２発現を示した。ＣＯＳ細胞において一時的に発現されたＢＭＰ−２のレベルは、ｐＨＴｏｐクローンにおいて見られるレベルよりもずっと低かった。
【００２０】
１工程選択を用いて確立された安定なＣＨＯ細胞系は、ＣＨＯステップワイズ増幅またはＣＯＳ一時的発現と比較して、一貫して高い発現レベルを示した。さらに、１工程選択を用いて得られた発現レベルはより均一であった。ｐＨＴｏｐベクターを用いるトランスフェクションにより、分泌型のｍＢ７．１−ｍＩｇＧ２ａ融合蛋白を安定に発現するＣＨＯ細胞系が確立された。０．１μＭ ＭＴＸ中で選択されたクローンを、３週間にわたり、選択圧（ＭＴＸおよびＧ４１８）存在下または不存在下で１週間に２回継代した。１、２および３週間目に無血清ならし培地（２４時間）を集密細胞から得て、抗−ｍＩｇＧ２ａ ＨＲＰ抗体を用いるウェスタンブロット、ついで、化学発光検出により分析した。高濃度のメトトレキセートでの選択を行わなかった場合にも、発現レベルは少なくとも３週間は維持された。
【００２１】
ｐＨＴｏｐベクターを用いるトランスフェクションにより、分泌型のｈＣＤ２８−ｈＩｇＧ４融合蛋白を安定に発現するＣＨＯ細胞が確立された。クローンを０．１μＭ ＭＴＸ中で選択し、ついで、０．５μＭ ＭＴＸ中で３週間増殖させた。無血清ならし培地（２４時間）を集密細胞から集め、抗−ｈＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いるウェスタンブロット、ついで、化学発光検出により分析した。各レーンは１０μｌのならし培地または精製ｈＩｇＧ４蛋白（定性用）を示す。３個の最高発現クローンからのならし培地の発現レベル（２、３、５）をｈＩｇＧ４ ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００２２】
０．１μＭ ＭＴＸ中で選択されたクローンは約１〜２μｇ／ｍｌのｈＣＤ２８／ｈＩｇＧ４を発現し、ｈＣＤ２８発現の有為な増加（５〜１０倍）を示したが、２つのクローン（＃１、４０）は中程度の発現増加を示した。高濃度のメトトレキセート中で選択された細胞の発現レベルは、メトトレキセート濃度を増加させることにより増大させることができる。
【００２３】
ｐＨＴｏｐｍｕＦｒｚｂ−１（ネズミフラズルド）でトランスフェクションし、０．０５μＭ ＭＴＸ中でクローンを選択することによりＣＨＯ細胞系が確立された。０．１μＭ ＭＴＸで生存した２つのプールのコロニーも確立された。３５Ｓメチオニン／システインで細胞を６時間標識し、ならし培地を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。各レーンはクローンおよびプールから得たならし培地５０μｌを示す。０．０５μＭ ＭＴＸ中で選択された個々のクローンの発現は均一で、２つのプールからの発現は個々のクローンの発現と同程度であった。
【００２４】
ストリンジェント選択条件下での個々のクローンの発現の均一性のため、発現を犠牲にすることなくコロニーをプールすることができ、それゆえ、安定な細胞系を得る最終工程の迅速化が図られる。
【００２５】
ｐＨＴｏｐベクターを用いるトランスフェクションにより、ＣＣＲ５を安定に発現するＣＨＯ細胞系が確立された。０．０２μＭ ＭＴＸ中で選択されたクローンを、ＦＡＣＳ分析によりＣＣＲ５発現につき分析した。トランスフェクションされたｃ細胞を抗−ＣＣＲ５モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄのクローン４５５３１．１１１）またはネズミＩｇＧ２ａイソタイプ（未トランスフェクション対照細胞用）を用いて染色し、ついで、ＰＥ−抱合抗−ネズミＩｇＧ抗体で染色した。ＣＣＲ５発現につきスクリーニングした１３個のクローンのうち、１１個のクローンがＣＣＲ５を発現しており、未トランスフェクション対照細胞よりも２ｌｏｇの発現増加を示した。バックグラウンド以上のＣＣＲ５発現を示さないクローンはわずか２個であった。
１工程選択系を用いて膜貫通蛋白を発現させることもできる。
【００２６】
実施例および図面は、本発明方法における使用に適した細胞系およびベクター（これらは本発明の一部を構成する）を用いて高レベルの組み換え蛋白を産生する安定な哺乳動物細胞系を得ることにおける本発明の実施を説明するものである。実施例において、本発明は組み換え蛋白の効果的な製造に有効であることが示されている。本明細書および実施例を読めば、当業者には多くの修飾および変更が明らかであろう。かかる修飾および変更は本発明の一部を構成し、実施例は限定的なものではない。
【配列表フリーテキスト】
【００２７】
SEQ ID NO:1: pHTop
【図１】
2010000087.tif 000002
【図２】
2010000087.tif 000003
【図３】
2010000087.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
2010000087.tif 000007
【図７】
2010000087.tif 000008
【図８】
2010000087.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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