(57)【要約】【課題】安全性等の面から使用しやすい、食用キノコが分類される担子菌から、エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質を見出し、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを有する形質転換体、及び、該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、並びに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質及び担子菌の少なくともいずれかを用いた糖の製造方法、該糖の製造方法により得られた糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含有する食品、飼料、洗剤、及びエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いたセルロース含有織物の処理方法の提供。【解決手段】本発明のタンパク質は、担子菌由来のタンパク質であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１８ｋＤａであり、かつ、エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌由来のタンパク質であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１８ｋＤａであり、かつ、エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
担子菌が、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
【請求項４】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｆ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｈ）配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含むことを特徴とするエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質、及び、担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得ることを特徴とする糖の製造方法。
【請求項９】
さらに請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質以外のセルラーゼを用いる、請求項８に記載の糖の製造方法。
【請求項１０】
請求項８〜９のいずれかに記載の糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、エタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜３に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする食品。
【請求項１２】
請求項１〜３に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする飼料。
【請求項１３】
請求項１〜３に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする洗剤。
【請求項１４】
請求項１〜３に記載のタンパク質の少なくともいずれかを用いて、セルロース含有織物を処理することを特徴とするセルロース含有織物の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを有する形質転換体、及び、該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、並びに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質及び担子菌の少なくともいずれかを用いた糖の製造方法、該糖の製造方法により得られた糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含有する食品、飼料、洗剤、及びエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いたセルロース含有織物の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドグルカナーゼ（ＥＧｓ；ＥＣ  ３．２．１．４）は、セルロースを加水分解する酵素の１種である。セルロースを加水分解する酵素には、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨｓ；ＥＣ  ３．４．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬｓ；ＥＣ  ３．２．１．２１）もあり、これらの酵素は、アミノ酸配列の相同性に基づいて、グリコシドヒドロラーゼファミリー（以下、「ＧＨファミリー」と称することがある。）に分類されている。分類の詳細は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺｙｍｅｓ（ＣＡＺｙ）ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）で確認することができる。
【０００３】
セルロースは、グルコース分子がβ−１，４結合でつながっている直鎖上の高分子である。セルロースは、植物細胞壁の主要な構成成分であり、地球上で最も多く存在するバイオポリマーである。したがって、そのセルロースを分子内部から切断するエンドグルカナーゼは、バイオマス原料の処理、洗剤などの分野で利用され、研究がなされてきた（例えば、特許文献１〜２参照）。
【０００４】
これまでに、子嚢菌のカビの一種であるヒポクレア  ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ（不完全世代：トリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）））についてはよく研究されており、ＧＨファミリー６とＧＨファミリー７に属する２種のセロビロヒドロラーゼ（Ｃｅｌ６Ａ（ＣＢＨＩ）、Ｃｅｌ７Ａ（ＣＢＨＩＩ））と、少なくとも５つのエンドグルカナーゼ（Ｃｅｌ７Ｂ（ＥＧＩ）、Ｃｅｌ５Ａ（ＥＧＩＩ）、Ｃｅｌ１２Ａ（ＥＧＩＩＩ）、Ｃｅｌ６１Ａ（ＥＧＩＶ）、Ｃｅｌ４５Ａ（ＥＧＶ））が生産されること、及びこれらの酵素は、協調して、又は相乗的にセルロースを加水分解するために作用することが知られている。
また、子嚢菌がセルロースを分解した培地の濾液は、セルラーゼ混合物として市販されてもいる。
【０００５】
一方、食用キノコが含まれる担子菌では、木材腐朽菌であるファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が、効率的にリグノセルロースを分解することができ、セルロースとヘミセルロースの分解に関連する一連のヒドロラーゼを生産することが知られており、また、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の全ゲノム配列も解明されている。
しかしながら、これまでにＧＨファミリー６と７に属するセロビオヒドロラーゼと（例えば、非特許文献１参照）、ＧＨファミリー５と１２に属する４つのエンドグルカナーゼ（例えば、非特許文献２、３参照）が生産されることが知られているに過ぎず、ＧＨファミリー４５に属するエンドグルカナーゼは見つかっておらず、また、詳細なセルロース分解の仕組みも判明していない。
【０００６】
カビが含まれる子嚢菌と異なり、担子菌には食用キノコが含まれている。そのため、バイオマス原料の処理などにおけるエンドグルカナーゼは、安全性等を考慮すると、担子菌由来のエンドグルカナーゼのほうが使用しやすいという利点がある。したがって、担子菌由来のエンドグルカナーゼの取得が期待されているのが現状である。
【０００７】
【特許文献１】特許第３８７４４０９号公報
【特許文献２】特表２００４−５１９２１２号公報
【非特許文献１】Ｕｚｃａｔｅｇｕｉ，  Ｅ．，  Ａ．  Ｒｕｉｚ，  Ｒ．  Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏ，  Ｇ．  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ．  １９９１．  Ｔｈｅ  １，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ．  Ｉ．  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ．  J．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：２７１−２８５．
【非特許文献２】Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｇ.，  Ａ．  Ｎｕｔｔ，  Ｈ．  Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，  Ｊ．  Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ，  Ｇ．  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ．  １９９９．  Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ２８  （Ｃｅｌ１２Ａ），  ａ  ｎｅｗ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５９：８８−９５．
【非特許文献３】Ｕｚｃａｔｅｇｕｉ，  Ｅ．，  Ｇ．  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ｅｋ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ．  １９９１．  Ｔｈｅ  １，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ．  Ｒｅ−ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：１４３−１５９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性等の面から使用しやすい、食用キノコが分類される担子菌から、エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質を見出し、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを有する形質転換体、及び、該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、並びに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質及び担子菌の少なくともいずれかを用いた糖の製造方法、該糖の製造方法により得られた糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含有する食品、飼料、洗剤、及びエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いたセルロース含有織物の処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者が、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、安全性等の面から使用しやすいという利点がある、食用キノコが分類される担子菌の一種であるファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が、既知のエンドグルカナーゼとは、アミノ酸配列の同一性が低く、触媒残基が異なるにもかかわらず、エンドグルカナーゼ活性を有する新規かつ有用なタンパク質を生産することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  担子菌由来のタンパク質であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１８ｋＤａであり、かつ、エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質である。
＜２＞  担子菌が、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）である前記＜１＞に記載のタンパク質である。
＜３＞  エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質である。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
＜４＞  エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｆ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｈ）配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
＜５＞  前記＜４＞に記載のＤＮＡを含有することを特徴とする組換えベクターである。
＜６＞  前記＜５＞に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。
＜７＞  前記＜６＞に記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含むことを特徴とするエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法である。
＜８＞  前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のタンパク質、及び、担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
＜９＞  さらに前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のタンパク質以外のセルラーゼを用いる、前記＜８＞に記載の糖の製造方法である。
＜１０＞  前記＜８＞〜＜９＞のいずれかに記載の糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、エタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法である。
＜１１＞  前記＜１＞〜＜３＞に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする食品である。
＜１２＞  前記＜１＞〜＜３＞に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする飼料である。
＜１３＞  前記＜１＞〜＜３＞に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする洗剤である。
＜１４＞  前記＜１＞〜＜３＞に記載のタンパク質の少なくともいずれかを用いて、セルロース含有織物を処理することを特徴とするセルロース含有織物の処理方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前記目的を達成することができ、安全性等の面から使用しやすい、食用キノコが分類される担子菌から、エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質を見出し、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを有する形質転換体、及び、該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、並びに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質及び担子菌の少なくともいずれかを用いた糖の製造方法、該糖の製造方法により得られた糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含有する食品、飼料、洗剤、及びエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いたセルロース含有織物の処理方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質）
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、担子菌由来のタンパク質であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１８ｋＤａである。
また、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質や、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。
そして、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質には、配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質や、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。
ここで、「数個のアミノ酸」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される領域としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列や、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列と配列同一性を有するものであってもよい。前記配列同一性としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【００１３】
前記アミノ酸配列の同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、及びＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３）により決定することができる。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌらによって開発されている（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，  １９９０)。これらは、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で利用することができる。  前記アミノ酸配列の同一性を分析するＢＬＡＳＴプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムが挙げられる。前記プログラムを用いて配列同一性を分析のする際のパラメーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デフォルト値を用いることができる。  なお、塩基配列における同一性についても、同様にして配列同一性を決定することができる。
【００１４】
−分子量の測定−
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により測定することができる。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を用いることができる。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるポリアクリルアミドゲルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１２％ポリアクリルアミドゲルなどが挙げられる。
前記電気泳動に用いる装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）などが挙げられる。
【００１５】
−エンドグルカナーゼ活性の測定−
本発明のタンパク質がエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質であることは、前記タンパク質のエンドグルカナーゼ活性を測定することにより確認することができる。
前記エンドグルカナーゼ活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試料と基質を反応させ、得られた生成物を検出することにより、測定することができる。
前記基質としては、エンドグルカナーゼが分解することができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、リケナン、大麦β−グルカン、グルコマンナンなどが挙げられる。
前記反応の温度としては、エンドグルカナーゼが活性を有する温度であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３０℃などが挙げられる。
前記生成物としては、前記基質の分解物であり、例えば、還元糖などが挙げられる。
前記検出の方法としては、前記生成物を検出することができれば、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ＰＨＢＡＨ）法による検出、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による検出、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による検出などが挙げられる。
【００１６】
−アミノ酸配列の決定−
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、公知の方法により決定することができ、例えば、プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  ｃＬｃ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定することができる。
【００１７】
−基質−
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の基質としては、例えば、非晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、リケナン、大麦β−グルカン、グルコマンナンなどが挙げられ、中でもリケナン、大麦β−グルカンが好適である。
前記基質の分解物としては、例えば、単糖から７糖の還元糖が挙げられ、中でも３糖〜５糖の還元糖を好適に得ることができる。
【００１８】
−至適温度−
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いる温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜７０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましく、３０℃〜５０℃が特に好ましい。前記温度が１０℃未満であると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が機能しないことがあり、７０℃を超えると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が失活することがある。一方、前記温度が前記特に好ましい範囲内であると、効率的に基質を分解することができる点で有利である。
【００１９】
−至適ｐＨ−
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いるｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２．０〜８．０が好ましく、３．０〜７．０がより好ましく、４．０〜６．０が特に好ましい。前記ｐＨが２．０未満、又は８．０を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記ｐＨが前記特に好ましい範囲内であると、効率的に基質を分解することができる点で有利である。
【００２０】
−併用−
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、他のセルラーゼと共に用いると、相乗作用により、基質を効率的に分解することができる。前記他のセルラーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のＣｅｌ６Ａなどが挙げられる。
併用する場合の本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質：前記他のセルラーゼのモル比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７５：２５〜２５：７５が好ましく、７５：２５がより好ましい。
【００２１】
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、以下に記載する製造方法により製造することができ、後述する糖の製造方法、該糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、食品、飼料、洗剤、及びセルロース含有織物の処理方法に好適に用いることができる。
【００２２】
（エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法）
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、担子菌の培養物から得ることができ、また、本発明の形質転換体を用いた方法により、好適に製造することもできる。
【００２３】
＜担子菌を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法＞
前記担子菌を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、担子菌を培養する工程（培養工程）と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程（採取工程）とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。この前記製造方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を製造する第１の形態である。
【００２４】
−培養工程−
前記培養工程は、担子菌を培養する工程である。
前記担子菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、担子菌門  ハラタケ亜門に属する担子菌が好ましく、担子菌門  ハラタケ亜門  ハラタケ綱に属する担子菌がより好ましく、担子菌門  ハラタケ亜門  ハラタケ綱  コウヤクタケ目に属する担子菌が更に好ましく、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が特に好ましい。
【００２５】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地を用いた固体培養方法、液体培地を用いた液体培養方法などが挙げられる。中でも、液体培養方法が、タンパク質を多く製造できる点で、好ましい。
前記液体培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルロースを含有するＫｒｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ培地（Ｋｒｅｍｅｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｗｏｏｄ．  １９９２．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ａｎ  Ｆｅ（ＩＩＩ）  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｆｌａｖｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ２．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０５：１３３−１３８．）が挙げられる。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃〜４５℃が好ましく、３０℃〜４０℃がより好ましく、３７℃が特に好ましい。前記培養の温度が２０℃未満であると、担子菌の生育が遅くなることがあり、４５℃を超えると担子菌が成育しないことがある。一方、前記培養の温度が前記特に好ましい範囲であると、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を効率よく製造できる点で有利である。
前記培養の日数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日〜３０日が好ましく、２日〜１４日がより好ましく、３日〜７日が特に好ましい。前記培養の日数が１日未満であると、担子菌数が少なく、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造量が少ないことがあり、３０日を超えると、死菌となる担子菌数が多くなったり、製造されたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が分解されてしまうことがある。一方、前記培養の日数が前記特に好ましい範囲であると、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を効率よく製造できる点で有利である。
【００２６】
−採取工程−
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、菌体内または菌体表面に生産された場合は、培養物から菌体を分離し、その菌体を超音波破砕などの公知の処理をすることにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。また、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、培養液中に生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。
上記採取したエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、精製することが好ましい。前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられる。
【００２７】
−その他の工程−
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を保存するために凍結乾燥する工程、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の濃度を上げるために濃縮する工程などが挙げられる。
【００２８】
＜形質転換体を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法＞
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、後述する本発明の形質転換体を培養する工程（培養工程）と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程（採取工程）とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。この前記製造方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を製造する第２の形態である。
【００２９】
−培養工程−
前記培養工程は、後述する本発明の形質転換体を培養する工程である。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地を用いた固体培養方法、液体培地を用いた液体培養方法などが挙げられる。中でも、液体培養方法が、タンパク質を多く製造できる点で、好ましい。
【００３０】
前記形質転換体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエなどの酵母や、大腸菌などが挙げられる。中でも、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が活性を有する酵素の生産量が多い点で好ましい。
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、用いる形質転換体に応じて選択することが好ましい。例えば、前記形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がアルコール酸化酵素プロモータであるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いる場合、前記培地としては、例えば、酵母エキスとペプトンとメタノールを含む培地を用いることが好ましい。また、例えば、形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がＧＡＬ１プロモータであるサッカロミセス・セルビシエ用いる場合、前記培地としては、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地を前培養の培地として用い、その後の培養の培地としては、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地を用いることが好ましい。また、例えば、形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がｌａｃプロモータである大腸菌を用いる場合、前記培地としては、例えば、ＩＰＴＧを含有する液体培地を用いることが好ましい。
【００３１】
−採取工程−
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、菌体内または菌体表面に生産された場合は、培養物から菌体を分離し、その菌体を超音波破砕などの公知の処理をすることにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。また、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、培養液中に生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。
上記採取したエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、精製することが好ましい。前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられ、また、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質に精製用のタグ配列が付加してある場合には、付加されたタグに対応する精製の方法を用いることもできる。前記付加されたタグに対応する精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、付加されたタグが、ヒスチジン６残基の配列の場合、ニッケルカラムを用いた精製の方法を用いることができる。
【００３２】
−その他の工程−
前記その他の工程としては、本発明の効果を害しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、上述の＜担子菌を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法＞に記載した工程などが挙げられる。
【００３３】
（エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ）
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡである。
また、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の２７位〜２０６位のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで、「数個のアミノ酸」とは、上述と同様に、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される領域としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
さらに、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。
なお、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡや、配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列を含むＤＮＡと配列同一性を有するものであってもよい。前記塩基配列の同一性としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記塩基配列の同一性は、上述したアミノ酸配列の同一性と同様にして決定することができる。前記塩基配列の同一性を分析するプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂｌａｓｔｎプログラムが挙げられる。前記プログラムを用いて配列同一性を分析のする際のパラメーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デフォルト値を用いることができる。
【００３４】
前記ＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７．）を用いる方法、前記ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）により変異を導入する方法などが挙げられる。
なお、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。一方、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合もある。本発明のＤＮＡには、このような人工的に調製されたＤＮＡ、又は天然の変異ＤＮＡが含まれる。
【００３５】
前記ＤＮＡの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどが挙げられる。
前記ゲノムＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、配列番号：２に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製する方法が挙げられる。また、配列番号：２に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。
前記ｃＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、配列番号：２に記載の塩基配列情報を基に作成したプローブやプライマーを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製する方法が挙げられる。
このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：２に示される塩基配列を含むＤＮＡ、あるいは前記ＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズするＤＮＡもまた、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００３６】
前記ハイブリダイゼーション技術を用いる場合の反応条件としては、上記のＤＮＡを単離することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ストリンジェントな条件が好ましい。
前記ストリンジェントな条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ナトリウム濃度が２５ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、２５ｍＭ〜３００ｍＭがより好ましく、温度が４２℃〜６８℃が好ましく、４２〜６５℃がより好ましい。例えば、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ  ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、温度４２℃が挙げられる。
こうして単離されたＤＮＡは、配列番号２に記載の塩基配列又は、配列番号：２で示される塩基配列の７９位〜６２１位の塩基配列と高い配列同一性を有すると考えられる。高い配列同一性とは、塩基配列全体で、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。このような塩基配列は、本発明のエンドグルカナーゼと実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしていると考えられる。
【００３７】
なお、上記のような塩基配列の配列同一性や、コードするタンパク質のアミノ酸配列の配列同一性を示すようなＤＮＡは、上述のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群や公共データベースの中から、例えば、前述のＢＬＡＳＴプログラムを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００３８】
このようにして得られたＤＮＡがエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養し、得られたタンパク質について、上述したようにエンドグルカナーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【００３９】
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを少なくとも含有し、必要に応じてさらにその他のＤＮＡを含有する。
【００４０】
前記ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。これらの具体的な例としては、酵母由来のプラスミド、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、λファージ、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターが挙げられる。
また、前記ベクターは、本発明のＤＮＡを発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
【００４１】
前記その他のＤＮＡとしては、本発明の効果を害しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マーカー遺伝子、制御配列、精製用配列などが挙げられる。
前記マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのように宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリン、カナマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
前記制御配列としては、例えば、プロモータ配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが挙げられる。前記プロモータ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、天然状態において本発明のＤＮＡの発現を制御している固有のプロモータ以外のプロモータも用いることができる。
前記精製用配列としては、例えば、ヒスチジンをコードする塩基配列などが挙げられる。
【００４２】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のＤＮＡや、必要に応じてさらにその他のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。
ベクターに上記ＤＮＡを挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。
【００４３】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明のベクター（発現ベクター）を宿主中に導入することにより得ることができる。
【００４４】
前記宿主としては、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を発現しうるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、Ｓｆ９等の昆虫細胞などが挙げられる。中でも、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が活性型の酵素を大量に生産する点で好ましい。
【００４５】
前記ベクターを宿主中に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
酵母へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられる。
細菌へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
動物細胞へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。
昆虫細胞へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４６】
本発明の組換えベクターが宿主に導入されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
前記ＰＣＲ法としては、例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、組換えベクターが宿主に導入されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認することもできる。
【００４７】
前記形質転換体は、上述したように本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造に用いることができ、得られたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、以下の糖の製造方法、該糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、食品、飼料、洗剤、及びセルロース含有織物の処理方法に好適に用いることができる。
【００４８】
（糖の製造方法）
本発明の糖の製造方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、及び担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得ること（糖取得工程）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００４９】
−糖取得工程−
前記糖取得工程は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、及び担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得る工程であり、必要に応じて更に本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質以外のセルラーゼを用いることができる。
【００５０】
前記バイオマス原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、農業や林業等の生産活動に伴う残渣として得られる「廃棄物系バイオマス」や、エネルギー等を得る目的で意図的に栽培して得られる「資源作物系バイオマス」などを使用することができる。前記「廃棄物系バイオマス」としては、例えば、廃建材、間伐材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガス、サトウキビ搾りかすなどが挙げられ、また、前記「資源作物系バイオマス」としては、例えば、サトウキビ、トウモロコシ等の糖質系作物などが挙げられる。また、バイオマス原料は、木を原料とした「木質バイオマス」、草を原料とした「草本バイオマス」などにも分類される。
また、前記バイオマス原料は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５１】
前記担子菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、担子菌門  ハラタケ亜門に属する担子菌が好ましく、担子菌門  ハラタケ亜門  ハラタケ綱に属する担子菌がより好ましく、担子菌門  ハラタケ亜門  ハラタケ綱  コウヤクタケ目に属する担子菌が更に好ましく、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が特に好ましい。
【００５２】
前記セルラーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のＣｅｌ６Ａなどが挙げられる。
【００５３】
前記糖取得工程における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記バイオマス原料１ｇに対して、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましく、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇがより好ましく、０．１ｍｇ〜１ｍｇが特に好ましい。前記タンパク質の使用量が、前記バイオマス原料１ｇに対して、０．００１ｍｇ未満であると、糖化が不十分となることがあり、１００ｍｇを超えると、糖化阻害が起こることがある。一方、前記タンパク質の使用量が、前記特に好ましい範囲内であると、酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で、有利である。
また、前記担子菌の使用量としては、特に制限はなく、担子菌が生産するエンドグルカナーゼの量などを考慮して適宜選択することができる。
なお、前記セルラーゼをさらに使用する場合、該セルラーゼの使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができるが、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質：前記セルラーゼのモル比が、７５：２５〜２５：７５が好ましく、７５：２５がより好ましい。
【００５４】
前記糖取得工程における温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０℃〜７０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましく、３０℃〜５０℃が特に好ましい。前記温度が、１０℃未満であると、糖化ができないことがあり、７０℃を超えると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が失活することがある。一方、前記温度が、前記特に好ましい範囲内であると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の使用量に対して得られる糖の量が多い点で、有利である。
【００５５】
前記糖取得工程におけるｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、２．０〜８．０が好ましく、３．０〜７．０がより好ましく、４．０〜６．０が特に好ましい。前記ｐＨが、２．０未満、又は８．０を超えると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が失活することがある。一方、前記ｐＨが、前記特に好ましい範囲内であると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の使用量に対して得られる糖の量が多い点で、有利である。
【００５６】
前記糖取得工程により、例えば、セルロース由来の糖であるグルコースを含む糖液を得ることができる。また、前記糖取得工程により得られた糖液は、好ましくは、ヘミセルロース由来の糖をも含む。へミセルロース由来の糖としては、例えば、キシロース、アラビノースといった五炭糖や、グルコース、ガラクトース、マンノースといった六炭糖が挙げられる。
前記糖液は、例えば、そのまま後述する本発明のエタノールの製造方法に供してもよいし、以下のようなその他の工程を経て、後述する本発明のエタノールの製造方法に供してもよい。
【００５７】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記糖液を、後述する発酵工程に適切となるようなｐＨに調整する工程などが挙げられる。
【００５８】
（エタノールの製造方法）
本発明のエタノールの製造方法は、前記糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、エタノールを得ること（発酵工程）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００５９】
−発酵工程−
前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記糖を含む溶液に酵母等のアルコール発酵微生物を添加して、アルコール発酵を行わせる方法が、特に好ましい。前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス属酵母などが挙げられる。なお、前記酵母は、天然酵母であってもよいし、遺伝子組み換え酵母であってもよい。
【００６０】
前記発酵の際の、前記酵母の使用量、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等については、特に制限はなく、例えば、アルコール発酵に供する糖の量、使用する酵母の種類等に応じて、適宜選択することができる。
【００６１】
−その他の工程−
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記発酵工程により得られたエタノールを分離精製する工程などが挙げられる。前記分離精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蒸留などが挙げられる。
【００６２】
前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノールなどとして好適に利用可能である。前記エタノールはバイオマス原料から得ることができるので、バイオマス原料がある限りは再生産が可能であり、また、バイオマス原料となる植物は栽培時に大気中の二酸化炭素を吸収するため、前記エタノールを燃焼させて二酸化炭素が発生したとしても、大気中の二酸化炭素濃度を増加させることにはならない。したがって、前記エタノールは、地球温暖化防止に望ましいエネルギー源ということができる。また、このようなエタノールは、近年特に、ガソリンに混合し、環境に優しい自動車燃料として使用することが期待されている。
【００６３】
（食品、及び飼料）
本発明の食品、及び飼料は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含んでなる。
前記食品、及び飼料における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記食品、及び飼料の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記食品、及び飼料は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含むため、例えば、食品、及び飼料に含まれるセルロースなどを分解することができ、消化を効率よくすることができる。
【００６４】
（洗剤）
本発明の洗剤は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含んでなる。
前記洗剤における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記洗剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記洗剤は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含むため、例えば、洗浄対象物のセルロース繊維に詰まった汚れを効率よく取り除くことができる。
【００６５】
（セルロース含有織物の処理方法）
本発明のセルロース含有織物の処理方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の少なくともいずれかを用いて、セルロース含有織物を処理すること（処理工程）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記セルロース含有織物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジーンズが挙げられる。
また、前記処理工程における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の使用量、温度、時間などは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、本発明のセルロース含有織物の処理方法で、前記ジーンズを処理することで、例えば、ストーンウォッシング加工などを行うことができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６７】
（エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質の遺伝子の探索）
エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質の遺伝子を得るために、まず、担子菌のファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｋ−３株（Ｊｏｈｎｓｒｕｄ，  Ｓ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｅ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ．  １９８５．  Ｃｒｏｓｓ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏf  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｈｏｍｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  Ｋ−３  −  Ｎｅｗ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｄｅｇｒａｄｅ  ｌｉｇｎｉｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：３２０−３２７．）が生産するタンパク質を、以下のようにして調べた。
上記ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｋ−３株を、２％セルロース（ＣＦ１１；Ｗｈａｔｍａｎ社製）を含有するＫｒｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ培地（Ｋｒｅｍｅｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｗｏｏｄ．  １９９２．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ａｎ  Ｆｅ（ＩＩＩ）  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｆｌａｖｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ２．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０５：１３４）で、Ｈａｂｕ，  Ｎ．，  Ｋ．  Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ｍ．  Ｓａｍｅｊｉｍａ，  Ｂ．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｅ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ．  １９９７．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６：９８の記載に基づいて、３日間培養した。
前記培養後の培養液をろ過し、ガラス繊維濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ（登録商標）  ＧＡ−１００；東洋濾紙（株）製）を用いて菌糸体を分離した。そして、分離した菌糸体は液体窒素で凍結し、後述する全ＲＮＡの抽出に用いた。
培養液のろ液５００μＬを遠心ろ過装置（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−０．５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮し、その濃縮液（未精製のタンパク質約１００μｇ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の装置（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ）を用いて、１２％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｋ−３株は、図１に示すようなタンパク質を生産していることがわかった。なお、図１において、「矢印」は、後述するＮ末端アミノ酸配列の決定を行ったタンパク質を示す。
【００６８】
上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の装置（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｃｅｌｌ）を用いて、１８ｋＤａのタンパク質（図１の矢印、以下、「ＰｃＣｅｌ４５Ａ」と称することがある。）をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。
その後、前記転写したＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  ｃＬｃ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、決定した。その結果、ＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端アミノ酸配列は、ＡＴＧＧＹＶＱＱＡＴであった。
【００６９】
前記ＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端アミノ酸配列の配列同一性検索行うことにより、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａの配列と同一性を有する配列を調べた。
前記配列同一性検索は、ＢＬＡＳＴプログラムとして、ｔｂｌａｓｔｎを用い、データベースとして、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のゲノムデータベースｖ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｈｃｈｒ１／Ｐｈｃｈｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。ｔｂｌａｓｔｎの設定は、「ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ」を「１ｅ−１」、「ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ」を「ＰＡＭ３０」とした以外は、デフォルト値とした。
その結果、前記ＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端アミノ酸配列は、機能が知られていないファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の「Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ６、１７９８２６３−１７９８２３４」と一致することがわかった。
【００７０】
（ＰｃＣｅｌ４５ＡのｃＤＮＡのクローニング）
次に、前記ＰｃＣｅｌ４５ＡのｃＤＮＡのクローニングを以下のようにして行った。
まず、上述した、凍結した菌糸体から、ＩＳＯＧＥＮ（（株）ニッポンジーン製）を用いて、製造者のマニュアルに基づいて、全ＲＮＡを約２００ｍｇ抽出した。
前記抽出された全ＲＮＡ１μｇからＯｌｉｇｏｔｅｘ（ＴＭ）−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（タカラバイオ（株）製）を用いてｍＲＮＡを精製した。
そして、前記ｍＲＮＡから、逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ；東洋紡績（株）製）と、３’ＲＡＣＥアダプタープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを用いて、製造者のマニュアルに基づいて、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。
その後、前記Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを用いて、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａをコードする領域と３’非翻訳領域をＰＣＲによって増幅した（９４℃２分を１サイクル、９８℃１０秒・６８℃３０秒を２５サイクル、４℃で終了）。ＰＣＲは、ポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ２；東洋紡績（株）製）を用い、プライマーとして、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のゲノム配列に基づいて設計したプライマー（Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ１、Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ２）と、リバースプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを用いて、製造者のマニュアルに基づいて行った。
プライマー：
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ１：ＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＴＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧ
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ２：ＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧ
リバースプライマー：Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）
【００７１】
また、５’非翻訳領域の塩基配列は、ＧｎｅｎｅＲａｃｅｒ（トレードマーク）  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、以下の遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した（９４℃２分を１サイクル、９８℃１０秒・７０℃３０秒を５サイクル、９８℃１０秒・６８℃３０秒を５サイクル、９８℃１０秒・６６℃３０秒・６８℃３０秒を２０サイクル、４℃で終了）。
プライマー：
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−５’−Ｒ１：ＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣ
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−５’−Ｒ２：ＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴ
上記で得られたＰＣＲ産物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）  ＴＯＰＯ（登録商標）  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）を用いてクローン化した。
そして、前記ＰＣＲ産物の塩基配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＳＱ５５００Ｅ（（株）日立ハイテクノロジーズ製）を用いて調べた。
【００７２】
その結果、前記ｃＤＮＡは７１８ｂｐからなり、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のゲノム上では、２つのイントロンで３つのエキソンに分けられている２０６アミノ酸をコードする翻訳領域を含むことがわかった。結果を図２、及び図３に示す。
なお、図２中、灰色の反転表示（ＫＲ）は、Ｋｅｘ２プロテアーゼのプロセシング部位を示し、これまでのセクレトーム研究で見つかっている配列は、ボールド文字で示す。
【００７３】
（ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列分析）
−シグナルペプチド分析−
シグナルペプチドについては、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓのＳｉｇｎａｌＰ  ３．０サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて調べた。
その結果、上述のＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端アミノ酸配列（図２の二重下線部で示す。）と異なる最初の１９アミノ酸（図２の一重下線部で示す。）がシグナルペプチドであることが示唆された。
【００７４】
−糖鎖付加部位分析−
Ｎ型糖鎖付加部位については、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓのＮｅｔＮＧｌｙｃ  １．０サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）を用いて調べた。
その結果、１つのＮ型糖鎖付加部位が予測された（図２の反転表示部（ＮＹＴ）で示す）。
【００７５】
Ｏ型糖鎖付加部位については、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓのＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）を用いて調べた。
その結果、４つのＯ型糖鎖付加部位が予測された（図２の囲み部で示す）。
【００７６】
−配列同一性分析−
前記ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴプログラムとして、ｂｌａｓｔｐを用い、データベースとして、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、配列同一性検索を行った。なお、ｂｌａｓｔｐの設定は、デフォルト値とした。
その結果、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列は、真菌のＧＨファミリー４５（ＥＧＶ）に属するエンドグルカナーゼに対して、低い配列同一性を有しているのみであり、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａは、新規のタンパク質であることがわかった。
前記ＰｃＣｅｌ４５Ａと最も配列同一性が高かったのは、仮説のタンパク質を除くと、ヒポクレア  ジェコリナ（Ｈ．ｊeｃｏｒｉｎａ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））のＥＧＶであり、２２％だった。また、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａには、真菌のＧＨファミリー４５（ＥＧＶ）に属するエンドグルカナーゼに保存されている推定ドメインが含まれていないこともわかった。
【００７７】
次に前記ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ検索の結果、配列の関連性が認められた以下の５つのタンパク質のアミノ酸配列とを、Ｅ−ＩＮＳ−ｉアルゴリズムのＭＡＦＦＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６；ｈｔｔｐ：／／ａｌｉｇｎ．ｂｍｒ．ｋｙｕｓｈｕ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｍａｆｆｔ／ｏｎｌｉｎｅ／ｓｅｒｖｅｒ／）プログラムにより、マルチプルアライメントを行った。結果を図４に示す。なお、図４は、ＢＯＸＳＨＡＤＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて作成した。
５つのタンパク質
・コプリノプシス  シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）の仮説のタンパク質（以下、「ＣｃＨＰ」と称することがある。）。
・ウスティラゴ  メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）の仮説のタンパク質（以下、「ＵｍＨＰ」と称することがある。）。
・アスペルギルス  ニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）の仮説のタンパク質（以下、「ＡｎＨＰ」と称することがある。）。
・アスペルギルス  フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の仮説のタンパク質（以下、「ＡｆＨＰ」と称することがある。）。
・ヒポクレア  ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）のＣｅｌ４５Ａ（以下、「ＨｊＣｅｌ４５Ａ」と称することがある。）。なお、仮説のタンパク質を除くと、前記ＨｊＣｅｌ４５Ａが、上述の１８ｋＤａのタンパク質のアミノ酸配列と最も配列同一性が高かったものである。
【００７８】
図４に示したＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列と、ＨｊＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列との比較から、ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列のＡｓｐ１４０（図４中の矢印部分）は、触媒残基のうちの１つであると考えられる。しかしながら、他の触媒残基の可能性があるアミノ酸（ＨｊＣｅｌ４５ＡのＡｓｐ２７）は、ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列には見つからなかった。そのため、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、既知の酵素とは反応の仕組みが異なることが考えられる。
【００７９】
−系統学的分析−
次にＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列と、ｂｌａｓｔｐ検索において関連性を示した、真菌ＧＨファミリー４５のエンドグルカナーゼのサブファミリーＢ（以下、「Ｃｅｌ４５−ｓｕｂＢ」と称することがある。）に属する酵素と、植物のエクスパンシン（Ｅｘｐａｎｓｉｎ）と、ＣＡＺｙ  ｓｅｒｖｅｒ上で真菌ＧＨファミリー４５のサブファミリーＡ（以下、「Ｃｅｌ４５−ｓｕｂＡ」と称することがある。）に属する酵素と、真菌のスウォレニン（Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ）とを系統学的に分析した結果を図５に示す。
図５の系統樹は、最小距離法（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ）により、ＭＡＦＦＴサーバー上のマルチプルアライメントの結果から作成し、ＦｉｇＴｒｅｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．１．２；  ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）を用いて作成した。
【００８０】
ＢＬＡＳＴ検索の結果から考えると、アミノ酸配列の点からは、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＧＨファミリー４５のサブファミリーＢとはやや似ているが、ＧＨファミリー４５のサブファミリーＡとは、明らかに異なっていた。
また、図５に示すように、ＰｃＣｅｌ４５Ａが含まれる分岐群は、担子菌の中でコプリノプシス  シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ（ＥＡＵ９１０５６））、ウスティラゴ  メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ（ＸＰ＿７６１６８６））由来の仮説のタンパク質のみを含んでいた。
以上から、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＧＨファミリー４５の新たなサブファミリーに分類される新規のタンパク質であることがわかった。以下に、ＰｃＣｅｌ４５Ａの製造方法の一例を挙げる。
【００８１】
（酵母を用いたＰｃＣｅｌ４５Ａの製造）
−組換えベクター（発現ベクター）の作製−
ＰｃＣｅｌ４５Ａの成熟体の塩基配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
オリゴヌクレオチドプライマー
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−ＸｈｏＩ−Ｆ：ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧ
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−ＮｏｔＩ−Ｒ：ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＧＴＴ
ＰｃＣｅｌ４５Ａ遺伝子を含むベクターを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドプライマーと、ポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ２；東洋紡績（株）製）を用いて、ＰＣＲを行い（９４℃２分を１サイクル、９８℃１０秒・６８℃３０秒を２０サイクル、４℃で終了）、発現ベクターに挿入するＤＮＡ断片を増幅した。
前記増幅したＤＮＡ断片を酵母（Ｐｉｃｈｉａ）の発現ベクターｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位に挿入し、組換えベクター（発現ベクター）を得た。
【００８２】
−形質転換体の作製−
上記で得られた発現ベクター約５μｇをＢｐｕ１１０２Ｉ（タカラバイオ（株）製）を用いて、直鎖化した。そして、エレクトロポレーションにより、酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１Ｈ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ、前記直鎖化した組換えベクターを導入した後、形質転換体の選別を行った。前記エレクトロポレーション、及び形質転換体の選別は、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（トレードマーク）  Ｐｉｃｈｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマニュアルに基づいて行った。これにより、前記発現ベクターにより形質転換された形質転換体を得た。
【００８３】
−形質転換酵母の培養、及びＰｃＣｅｌ４５Ａの製造及び精製−
上述の形質転換体を２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含むＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、１％グリセロール）１０ｍＬで３０℃、３００ｒｐｍで往復振とう培養器で２４時間培養し、２００ｍＬのＹＰＧ培地の入った三角フラスコに接種した後、回転振とう培養器（３０℃、１５０ｒｐｍ）でさらに２４時間培養した。遠心分離（３，０００ｇ、１０分）によって菌体を回収した後、５０ｍＬのＹＰＭ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、１％メタノール）に菌体を移し、２４時間ごとに終濃度１％になるようにメタノールを加えながら、さらに回転振とう培養器（３０℃、１５０ｒｐｍ）で９６時間培養した。
前記培養液を遠心分離（３０分、５，０００×ｇ）し、得られた培養上清を粗酵素液とした。前記粗酵素液に、最終濃度が１Ｍとなるように硫酸アンモニウムと、最終濃度が２０ｍＭとなるように酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）とを加えた。
１Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓカラム（２６ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）を用いて、前記溶液を分画した。ＰｃＣｅｌ４５Ａは、３００ｍＬの逆勾配で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）へ溶出した。
その後、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａを含む分画を集め、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して平衡化した。そして、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ  カラム（９ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）に前記平衡化したＰｃＣｅｌ４５Ａを含む溶液を加えた。ＰｃＣｅｌ４５Ａは、０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウム１００ｍＬの直線勾配でカラムから溶出した。
得られたＰｃＣｅｌ４５Ａの精製度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミドゲル）で分析した。また、得られたＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  ｃＬｃ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により確認した。その結果、形質転換酵母で得られたＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端アミノ酸配列は、ＡＴＧＧＹＶＱＱＡＴであり、担子菌ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）で得られた天然のものと同じであることがわかった。
次に、上記で得られたＰｃＣｅｌ４５Ａがエンドグルカナーゼ活性を有するか否かを以下の酵素試験により確認した。
【００８４】
（酵素試験）
−各種基質に対する加水分解活性−
上記で得られたＰｃＣｅｌ４５Ａ  １．０μＭと、０．５％の以下の各基質とを５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中、３０℃で１２０時間まで反応させた。
基質：
・結晶性セルロース（Ｆｕｎａｃｅｌ  ＩＩ、フナコシ（株）製。以下、「ＭＣＣ」と称することがある。）
・非晶性セルロース（リン酸膨潤セルロース、結晶性セルロースから、Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｍ．１９８８．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ，  ａｍｏｒｐｈｏｕｓ，  ａｎｄ  ｄｙｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：１９−２５に記載の方法により調製した。以下、「ＰＡＳＣ」と称することがある。）
・カルボキシメチルセルロース（７ＬＦＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製。以下、「ＣＭＣ」と称することがある。）
・リケナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・大麦β−グルカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・グルコマンナン（和光純薬工業（株）製）
・キシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
【００８５】
−−生成した還元糖量の測定−−
前記反応を１時間行った後、等体積量の１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え、反応を止めた。そして、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ＰＨＢＡＨ）法（Ｌｅｖｅｒ，  Ｍ．  １９７２．  Ａ  ｎｅｗ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４７：２７３−２７９．）により、標準としてグルコース（和光純薬工業（株）製）を用いて還元糖量を測定した。結果を表１に示す。
【００８６】
【表１】
2010022242.tif 000002
表１中、「ｎ．ｄ．」は、反応を１２０時間行った後に還元糖の生成が検出されなかったことを示す。
【００８７】
表１の結果から、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＰＡＳＣ、ＣＭＣ、リケナン、大麦β−グルカン、及びグルコマンナンを加水分解することができ、エンドグルカナーゼ活性を有していることがわかった。
一方、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＭＣＣ、及びキシランに対しては、加水分解活性を有していないことがわかった。
また、ＰｃＣｅｌ４５Ａのβ−１，３／１，４−グルカン（リケナン、大麦β−グルカン）に対する初速度（活性）は、β−１，４−グルカン（ＰＡＳＣ、カルボキシメチルセルロース）より高いことがわかった。
【００８８】
−加水分解産物の分析−
−−薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析−−
ＰｃＣｅｌ４５Ａと、各基質とを以下のように反応させた後に得られるオリゴ糖（加水分解産物）について、ＴＬＣにより分析した。
ＰｃＣｅｌ４５Ａ  １．０μＭと、０．５％の各基質（ＭＣＣ、ＰＡＳＣ、ＣＭＣ、リケナン、大麦β−グルカン、グルコマンナン、キシラン）とを５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中、３０℃で１時間、又は１２０時間反応させた。
前記反応液を５分間煮沸することにより反応を止め、該反応液を遠心分離し（×１５，０００ｇ）、得られた上澄みをｐｒｅ−ｃｏａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  ＴＬＣ  ｐｌａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）にアプライした。展開溶媒として、ＥｔＯＡｃ／ＣＨ３ＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ（３／２／１  体積比）を用いて展開した後、Ｋａｗａｉ，  Ｒ．，  Ｋ．  Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ｍ．  Ｋｉｔａｏｋａ，  Ｔ．  Ｉｓｈｉｉ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｓａｍｅｊｉｍａ．  ２００４．  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３  ｇｌｕｃａｎ  （１−＞３）−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｗｈｉｔｅ−ｒｏｔ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ.  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ３３９：２８５２−２８５３．に記載の方法でオルシノール試薬により還元糖を検出した。結果を図６、図７に示す。
【００８９】
図６は、反応時間１時間の場合の加水分解産物における可溶性産物のＴＬＣ分析の結果を示し、図７は、反応時間１２０時間の場合の加水分解産物における可溶性産物のＴＬＣ分析の結果を示す。
図６、及び図７中、「１」は基質が「ＭＣＣ」の場合を示し、「２」は基質が「ＰＡＳＣ」の場合を示し、「３」は基質が「ＣＭＣ」の場合を示し、「４」は基質が「リケナン」の場合を示し、「５」は基質が「大麦β−グルカン」の場合を示し、「６」は基質が「グルコマンナン」の場合を示し、「７」は基質が「キシラン」の場合を示す。また、「＋」は、「ＰｃＣｅｌ４５Ａ有り」の場合を示し、「−」は、「ＰｃＣｅｌ４５Ａ無し」の場合を示す。
図６、及び図７から、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、基質がβ−１，４−グルカン（ＰＡＳＣ、ＣＭＣ）の場合にオリゴ糖を生成することがわかった。
【００９０】
−−高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析−−
ＰｃＣｅｌ４５Ａと、基質としてＰＡＳＣとを以下のように反応させた後に得られる単糖〜７糖までのそれぞれの糖の量について、ＨＰＬＣにより分析した。
ＰｃＣｅｌ４５Ａ  １．０μＭと、０．５％のＰＡＳＣとを５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中、３０℃で３０分間、６０分間、１２０分間、１８０分間、２４０分間のそれぞれの時間反応させた。そして、各反応液を５分間煮沸した後、遠心分離（×１５，０００ｇ）した。得られた上澄みをアセトニトリル／Ｈ２Ｏ（６０／４０から５０／５０、体積／体積）の直線勾配で、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（昭和電工（株）製）で分離した。前記分離されたものの量は、ポリマー化度（ＤＰ）＝２〜７のセロオリゴ糖（生化学工業（株））を標準として用いて定量した。
なお、ＨＰＬＣの装置は、Ｃｏｒｏｎａ（トレードマーク）  Ｃｈａｇｅｄ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（トレードマーク）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＬＣ−２０００（日本分光（株）製）を使用した。結果を図８に示す。
【００９１】
図８中、「■」は単糖を示し、「●」は２糖を示し、「▲」は３糖を示し、「◆」は４糖を示し、「□」は５糖を示し、「○」は６糖を示し、「△」は７糖を示す。
図８の結果から、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＰＡＳＣを基質とした場合に、ポリマー化度（ＤＰ）＝３〜５のセロオリゴ糖（３糖〜５糖）を多く生成することがわかった。一方、２糖（ＤＰ＝２）や単糖（ＤＰ＝１）はわずかしか生成されなかった。なお、ＤＰ＝６〜７のセロオリゴ糖（６糖〜７糖）の生成も少なかったが、これらは可溶性が低かったためだと思われる。
【００９２】
−ＰｃＣｅｌ４５Ａの相乗効果−
酵素として、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させた組換えファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｃｅｌ６Ａ（以下、「Ｃｅｌ６Ａ」と称することがある。）とを用い、基質として、ＰＡＳＣを用いた場合の、基質の加水分解産物について調べ、ＰｃＣｅｌ４５Ａの相乗効果を以下のようにして試験した。
【００９３】
−−組換えＣｅｌ６Ａの製造−−
−−−Ｃｅｌ６Ａ遺伝子のクローニング−−−
ＮＣＢＩデータベース上にあるファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）由来Ｃｅｌ６Ａ遺伝子（ＡＡＢ３２９４２）をもとに、以下のプライマーを設計した。
プライマー：
ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ：ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＣＧＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列中、「ＧＡＡＴＴＣＣ」は制限酵素ＥｃｏＲＩ切断配列）
ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＮｏｔＩ−Ｒ：ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＣ（配列中、「ＧＣＧＧＣＣＧＣ」は制限酵素ＮｏｔＩ切断配列）
上記プライマーを用い、ＰｃＣｅｌ４５Ａと同様に調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い（９４℃２分を１サイクル、９８℃１０秒・６８℃１分３０秒を２５サイクル、４℃で終了）、ＰｃＣｅｌ６Ａの成熟体タンパク質をコードする部分（２１番アミノ酸以降）を得た。
上記で得られたＰＣＲ産物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）  ＴＯＰＯ（登録商標）  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）を用いてクローン化した。
【００９４】
−−−組換えベクター（発現ベクター）の作製−−−
ミニプレップを行って調製されたＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子を含むベクター、及び酵母発現用ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＮｏｔＩ（タカラバイオ（株）製）によって切断し、得られたフラグメントをアガロース電気泳動で分離したのちゲル抽出によって得た。
制限酵素処理されたｐＰＩＣＺαＡとＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子それぞれ２０ｎｇをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ（株）製）によってライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）を用いてクローン化した。ミニプレップを行って調製されたＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子を含む酵母発現用ベクターｐＰＩＣＺαＡ（以下、「ｐＰＩＣＺαＡ／ＰｃＣｅｌ６Ａ」と称することがある。）からＳｔｅ１３シグナル切断サイトを切除するために、以下のプライマーを設計し、ｐＰＩＣＺαＡ／ＰｃＣｅｌ６Ａを鋳型としてＰＣＲを行った（９４℃２分を１サイクル、９８℃１０秒・６８℃１分３０秒を１５サイクル、４℃で終了）。
プライマー：
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｋｅｘ２−Ｆ：ＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧ
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｋｅｘ２−Ｒ：ＣＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＣ
増幅された遺伝子断片を制限酵素ＤｐｎＩによって処理し、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）を用いてクローン化した。
【００９５】
−−−形質転換体の作製−−−
ミニプレップを行って得られた、Ｓｔｅ１３シグナル切断サイトを切除したｐＰＩＣＺαＡ／ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓｔｅ（−）を制限酵素ＢｓｔＸＩ（タカラバイオ（株）製）によって直鎖化し、エレクトロポーレーション法によって酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）  ＫＭ−７１Ｈ株に導入した。形質転換体の選抜は抗生物質（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性を指標に行った。
【００９６】
−−−形質転換酵母の培養、及びＣｅｌ６Ａの製造及び精製−−−
上述の形質転換体を２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含むＹＰＧ培地（１％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２％Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、１％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）１０ｍＬで３０℃、３００ｒｐｍで往復振とう培養器で２４時間培養し、２００ｍＬのＹＰＧ培地の入った三角フラスコに接種した後、回転振とう培養器（３０℃、１５０ｒｐｍ）でさらに２４時間培養した。遠心分離（３，０００ｇ、１０分）によって菌体を回収した後、５０ｍＬのＹＰＭ培地（１％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２％Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、１％Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に菌体を移し、２４時間ごとに終濃度１％になるようにＭｅｔｈａｎｏｌを加えながら、さらに回転振とう培養器（３０℃、１５０ｒｐｍ）で９６時間培養した。遠心分離（３，０００ｇ、１０分）によって得られた培養上清を粗酵素液とした。
上述のようにして得られた粗酵素液に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、遠心分離（１５，０００ｇ、３０分）によって沈殿を回収した。前記沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させた。
１Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓカラム（２６ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）を用いて、前記溶液を分画した。ＰｃＣｅｌ６Ａは、３００ｍＬの逆勾配で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）へ溶出した。
その後、前記ＰｃＣｅｌ６Ａを含む分画を集め、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して平衡化した。そして、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ  カラム（９ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）に前記平衡化したＰｃＣｅｌ６Ａを含む溶液を加えた。ＰｃＣｅｌ６Ａは、０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウム１００ｍＬの直線勾配でカラムから溶出した。
得られたＰｃＣｅｌ６Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミドゲル）で単一のバンドを与えた。また、得られたＰｃＣｅｌ６ＡのＮ末端のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  ｃＬｃ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により確認した。その結果、形質転換酵母で得られたＰｃＣｅｌ６ＡのＮ末端アミノ酸配列は、ＱＡＳＥＷＧＱＣＧＧＩＧであり、担子菌ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）由来のＣｅｌ６Ａと同じであることがわかった。
【００９７】
−−相乗効果試験−−
ＰｃＣｅｌ４５Ａと、Ｃｅｌ６Ａとの全酵素濃度を１．０μＭとし、両者の割合をモル比１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、０：１００として、０．５％のＰＡＳＣと、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中、３０℃で６０分間、１２０分間、１８０分間、２４０分間の各時間反応させた。そして、反応液を５分間煮沸した後、遠心分離（×１５，０００ｇ）した。
得られた上澄みに含まれるセロオリゴ糖を、上述のＨＰＬＣ分析と同様にして分析した。結果を図９、及び図１０に示す。
【００９８】
図９中、実線は、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、Ｃｅｌ６Ａとのモル比が１００：０の場合を示し、点線はＰｃＣｅｌ４５Ａと、Ｃｅｌ６Ａとのモル比が５０：５０の場合を示し、破線はＰｃＣｅｌ４５Ａと、Ｃｅｌ６Ａとのモル比が０：１００の場合を示す。
図９の結果から、ＰｃＣｅｌ６Ａによって、ＰＡＳＣから生成される主産物はセロビオース（ＤＰ＝２）であることがわかった。また、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰｃＣｅｌ６Ａとを共に用いた場合でも、ＰＡＳＣから生成される主産物は、同様にセロビオース（ＤＰ＝２）であることがわかった。
【００９９】
図１０中、「■」は反応時間が６０分の場合を示し、「●」は反応時間が１２０分の場合を示し、「▲」は反応時間が１８０分の場合を示し、「◆」は反応時間が２４０分の場合を示す。また、点線は、各酵素単独で基質と反応させた場合における加水分解産物の量を合計した値を示す。
図１０の結果から、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰｃＣｅｌ６Ａとを共に用いると、両者を単独で用いた場合の合計値よりも、加水分解産物（セロオリゴ糖）が多く得られることがわかった。反応時間１２０分、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰｃＣｅｌ６Ａとのモル比が７５：２５では、加水分解産物の量は、計算値（図１０の点線）より３．６倍高くなり、反応時間１２０分、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰｃＣｅｌ６Ａとのモル比が５０：５０では、加水分解産物の量は、計算値（図１０の点線）より２．７倍高くなっていた。
この結果から、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、他のセルラーゼと併用すると相乗効果を有することがわかった。また、ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＰｃＣｅｌ６Ａの活性を増強すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、例えば、バイオマス原料からの糖の製造方法、該糖を用いたエタノールの製造方法、さらに、食品、飼料、洗剤、及びセルロース含有織物の処理方法に好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）を培養した後の培養液の濾過物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】図２は、ＰｃＣｅｌ４５ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列と前記ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、ＰｃＣｅｌ４５Ａのファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のゲノム上での位置を示す図である。
【図４】図４は、ＰｃＣｅｌ４５Ａのアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列のマルチプルアライメントの結果を示す図である。
【図５】図５は、ＰｃＣｅｌ４５Ａの系統樹を示す図である。
【図６】図６は、ＰｃＣｅｌ４５Ａと各基質とを１時間反応させた後の反応液中の加水分解産物のＴＬＣ分析の結果を示す図である。
【図７】図７は、ＰｃＣｅｌ４５Ａと各基質とを１２０時間反応させた後の反応液中の加水分解産物のＴＬＣ分析の結果を示す図である。
【図８】図８は、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰＡＳＣとを反応させた後の反応液中のセロオリゴ糖の生成の経時変化を示した図である。
【図９】図９は、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰｃＣｅｌ６ＡとをＰＡＳＣと反応させた場合に生成されたセロオリゴ糖をＨＰＬＣによって調べた図である。
【図１０】図１０は、ＰｃＣｅｌ４５Ａと、ＰｃＣｅｌ６Ａとを、ＰＡＳＣと反応させた場合の相乗効果を調べた図である。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
2010022242.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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