(57)【要約】【課題】自己免疫疾患の病因細胞の分離方法および自己免疫疾患の診断補助方法ならびにＨＡＭの病因細胞の分離方法および診断補助方法を提供すること。【解決手段】自己免疫疾患の病因細胞の分離方法であって、被験者から採取された生体試料から、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞を分離するステップを含む。本方法によって分離された細胞を用いれば、自己免疫疾患の診断補助、重症度の判定、治療効果の評価などを迅速かつ容易におこなうことができる。また、本方法によって分離された細胞を用いれば、自己免疫疾患の根本的治療方法を開発することも可能である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生体試料から、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞を分離するステップを含む、自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
【請求項２】
前記細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、請求項１に記載の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
【請求項３】
前記サイトカインはインターフェロンγであり、
前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、
請求項２に記載の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
【請求項４】
前記生体試料は末梢血単核球である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
【請求項５】
被験者から採取された生体試料を準備するステップ、
前記生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞の割合を測定するステップ、および
前記細胞の割合を指標として、前記被験者が自己免疫疾患を発病している可能性を判断するステップ、を含む自己免疫疾患の診断補助方法。
【請求項６】
前記細胞は、生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、請求項５に記載の自己免疫疾患の診断補助方法。
【請求項７】
前記サイトカインはインターフェロンγであり、
前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、
請求項６に記載の自己免疫疾患の診断補助方法。
【請求項８】
自己免疫疾患患者から採取された生体試料を準備するステップ、
前記生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞の割合を測定するステップ、および
前記細胞の割合を指標として、自己免疫疾患の重症度を判断するステップ、を含む自己免疫疾患の重症度を判断する方法。
【請求項９】
前記細胞は、生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、請求項８に記載の自己免疫疾患の重症度を判断する方法。
【請求項１０】
前記サイトカインはインターフェロンγであり、
前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、
請求項９に記載の自己免疫疾患の重症度を判断する方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患患者から採取された生体試料を培養するステップ、
前記培養された生体試料に自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与するステップ、
前記生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞の割合を指標として、前記治療薬候補物質を評価するステップを含む、自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記細胞は、生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、請求項１１に記載の自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記サイトカインはインターフェロンγであり、
前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、
請求項１２に記載の自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患患者から採取された生体試料から分離されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋を含む、自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の病因細胞の分離方法および自己免疫疾患の診断補助方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患の病態は「過剰な免疫応答」であるが、その過剰免疫応答の主原因となっている細胞はまだ不明である。自己免疫疾患の根本的な治療法を開発するためには、その病因細胞を明らかにすることが必要であるが、自己免疫疾患の病因細胞を特定することはこれまで困難であった。
【０００３】
また、自己免疫疾患は「自己免疫寛容」が低い状態で発症する。自己免疫寛容には、Ｔ細胞の一種であり、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＦｏｘＰ３＋を指標として特定される「制御性Ｔ細胞」が寄与しているとの報告がなされている。さらに、実験動物から制御性Ｔ細胞を除去すると、各種の臓器で自己免疫疾患が発症することが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、自己免疫疾患の一つとしてＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（以下、「ＨＡＭ」とも呼ぶ）が知られている。ＨＡＭは、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞が脊髄の中に浸潤することによって惹起される慢性脊髄炎の病理像を呈する難治性神経疾患である（非特許文献２参照）。この疾患の原因となるウイルスは、ＨＴＬＶ−Ｉというレトロウイルスであり、垂直感染（特に、授乳感染）、血液感染、性感染などによって感染する。ＨＡＭの症状は、胸髄の側索を走行する錐体路が侵されることによる、歩行障害、排尿障害などである。
【非特許文献１】Mitchell Kronenberg and Alexander Rudensky, "Regulation of immunity by self-reactive T cells,"  Nature, 2 June 2005, 435, p.598-604.
【非特許文献２】Shibayama K. et al., "Interferon-alpha treatment in HTLV-I-associated myelopathy: Studies of clinical and immunological aspects," J Neurol Sci, 1991, 106, p.186-192.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでの報告からＨＴＬＶ−ＩはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋のＴ細胞に選択的に感染することが知られている。しかし、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋のＴ細胞集団のうち、どの細胞がＨＡＭの病因細胞となっているかは明らかになっていなかった。
またＨＡＭも自己免疫疾患であることから、ＨＡＭの病因細胞と自己免疫疾患の病因細胞とは共通のグループに属する可能性がある。したがって、ＨＡＭの病因細胞を特定することで、自己免疫疾患全般の病因細胞を特定できる可能性がある。
【０００６】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、自己免疫疾患の病因細胞の分離方法および自己免疫疾患の診断補助方法、特にＨＡＭの病因細胞の分離方法および診断補助方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ＨＡＭを自己免疫疾患のモデルとして研究することで、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋）のうちＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞が自己免疫疾患の病因細胞であることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の第１は、以下に示す自己免疫疾患の病因細胞の分離方法である。
［１］  被験者から採取された生体試料から、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞を分離するステップを含む、自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
［２］  前記細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、［１］に記載の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
［３］  前記サイトカインはインターフェロンγであり、前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、［２］に記載の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
［４］  前記生体試料は末梢血単核球である、［１］〜［３］のいずれかに記載の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法。
【０００９】
本発明の第２は、以下に示す自己免疫疾患の診断補助方法である。
［５］  被験者から採取された生体試料を準備するステップ、前記生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞の割合を測定するステップ、および前記細胞の割合を指標として、前記被験者が自己免疫疾患を発病している可能性を判断するステップ、を含む自己免疫疾患の診断補助方法。
［６］  前記細胞は、生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、［５］に記載の自己免疫疾患の診断補助方法。
［７］  前記サイトカインはインターフェロンγであり、前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、［６］に記載の自己免疫疾患の診断補助方法。
【００１０】
本発明の第３は、以下に示す自己免疫疾患の重症度の判断方法である。
［８］  自己免疫疾患患者から採取された生体試料を準備するステップ、前記生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞の割合を測定するステップ、および前記細胞の割合を指標として、自己免疫疾患の重症度を判断するステップ、を含む自己免疫疾患の重症度を判断する方法。
［９］  前記細胞は、生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、［８］に記載の自己免疫疾患の重症度を判断する方法。
［１０］  前記サイトカインはインターフェロンγであり、前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、［９］に記載の自己免疫疾患の重症度を判断する方法。
【００１１】
本発明の第４は、以下に示す自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法である。
［１１］  自己免疫疾患患者から採取された生体試料を培養するステップ、前記培養された生体試料に自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与するステップ、前記生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞の割合を指標として、前記治療薬候補物質を評価するステップを含む、自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［１２］  前記細胞は、生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞のうち、サイトカインを産生する細胞である、［１１］に記載の自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［１３］  前記サイトカインはインターフェロンγであり、前記自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症である、［１２］に記載の自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【００１２】
本発明の第５は、以下に示す自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング用キットである。
［１４］  自己免疫疾患患者から採取された生体試料から分離されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞であって、ＦｏｘＰ３ｌｏｗまたはＣＤ１２７＋の細胞を含む、自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、自己免疫疾患、特にＨＡＭの診断補助、重症度の判定、治療効果の評価などを迅速かつ容易におこなうことができる。したがって、本発明によれば、ＨＡＭの診断および治療をより早期に行うことが可能となり、患者のＱＯＬを向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．本発明の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法
本発明の自己免疫疾患の病因細胞の分離方法は、被験者から採取された生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞（以下、「病因細胞」という）を分離するステップを含むことを特徴とする。
【００１５】
生体試料は、少なくともＴ細胞集団を含む試料である。このような生体試料の例には、被験者から採取した血液や、血液に含まれる血球、末梢血単核球などが含まれる。好ましい生体試料は、末梢血単核球である。末梢血単核球を分離する方法は、当業者に公知の技術（例えば比重法など）を用いることができる。
【００１６】
準備した生体試料から病因細胞を分離する。生体試料から病因細胞を分離する方法は、当業者にとって公知の方法を用いることができる。細胞を分離する方法の例には、ソーテイング機能を有したフローサイトメーターを用いた分離方法や、磁気ビーズを用いた分離方法などが含まれる。
また、病因細胞を生体試料から分離するステップの数は、１であってもよいし２以上であってもよい。つまり、生体試料から、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞を１ステップで分離してもよいし、生体試料から、まずＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団を分離し、ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団のなかからＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞を分離することで、病因細胞を分離してもよい。
【００１７】
ＣＤ４＋とは、例えば、末梢血単核球におけるＣＤ４の発現量をフローサイトメトリーで解析したときに確認される、ＣＤ４の発現量が高い細胞集団と同程度のＣＤ４の発現量を有することを意味する。
ＣＤ２５＋とは、例えば末梢血単核球におけるＣＤ２５の発現量をフローサイトメトリーで解析したときに確認される、ＣＤ２５の発現量が高い細胞集団と同程度のＣＤ２５の発現量を有することを意味する。
ＣＣＲ４＋とは、例えば、末梢血単核球におけるＣＣＲ４の発現量をフローサイトメトリーで解析したときに確認される、ＣＣＲ４の発現量が高い細胞集団と同程度のＣＣＲ４の発現量を有することを意味する。
【００１８】
一方、ＦｏｘＰ３ｌｏｗとは、転写制御因子であるＦｏｘＰ３は発現しているがその発現量が少ないことを意味する。ＦｏｘＰ３の発現量が少ないとは、ＦｏｘＰ３の発現量が、末梢血単核球におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＤ４５ＲＯ−の細胞のＦｏｘＰ３の発現量と同程度であることを意味する（実施例１、図１Ａ参照）。すなわち本発明の病因細胞のＦｏｘＰ３の発現量は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＤ４５ＲＯ−の細胞のＦｏｘＰ３の発現量と同程度である。
また、ＣＤ４５ＲＯ−とは、例えば、末梢血単核球におけるＣＤ４５ＲＯの発現量をフローサイトメトリーで解析したときに確認される、ＣＤ４５ＲＯの発現量が低い細胞集団と同程度のＣＤ４５ＲＯの発現量を有することを意味する。
【００１９】
本発明ではＦｏｘＰ３ｌｏｗに代えてＦｏｘＰ３と発現量が反比例するＣＤ１２７を指標として用いることができる。すなわちＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＣＤ１２７＋を指標として分離した細胞も「病因細胞」である。
また、ＦｏｘＰ３は細胞内タンパク質であるのに対し、ＣＤ１２７は、細胞表面抗原であることからＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＣＤ１２７＋を指標として細胞を分離することで、病因細胞を生きたままで分離することができる。
【００２０】
本発明の分離方法によって分離した細胞は、自己免疫疾患の病因細胞を含むことから（実施例２参照）、自己免疫疾患の指標となりうる。例えば、被験者から採取した生体試料（例えば末梢血単核球）内における病因細胞の割合を測定することで、被験者が自己免疫疾患を発病している可能性を判定できる。また、自己免疫疾患患者から本発明によって分離された病因細胞を用いて自己免疫疾患の治療薬をスクリーニングすることもできる。
【００２１】
さらに、本発明によって分離された病因細胞はサイトカインを産生する。また、病因細胞が産生するサイトカインの種類は自己免疫疾患の種類によって異なる。したがって、病因細胞が産生するサイトカインの種類に基づいて自己免疫疾患の種類を特定することもできる。例えば、病因細胞が産生するサイトカインの種類がインターフェロンγである場合、発病しているおそれまたは発病するおそれがある自己免疫疾患はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ）である。
一方、病因細胞が産生するサイトカインの種類がインターロイキン１７である場合、発病しているおそれまたは発病するおそれがある自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【００２２】
このように本発明の分離方法によって分離された病因細胞を用いれば、自己免疫疾患の診断を補助することができる。また、本発明の分離方法によって分離された病因細胞を用いれば、自己免疫疾患の根本的治療方法を研究することができる。
【００２３】
２．自己免疫疾患の診断補助方法
本発明のＨＡＭの診断補助方法は、１）被験者から採取された生体試料を準備する第１ステップ、２）生体試料内における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗ、の細胞（病因細胞）の割合を測定する第２ステップ、３）生体試料内における病因細胞の割合を指標に、被験者が自己免疫疾患を発病している可能性を判断する第３ステップ、を含む。
【００２４】
１）第１ステップでは、被験者から採取された生体試料を準備する。準備する生体試料とは、例えば被験者の血液から分離した末梢血単核球である。
【００２５】
２）第２ステップでは、生体試料内における病因細胞の割合を測定する。生体試料内における病因細胞の割合を測定するには、例えばフローサイトメトリーを用いてもよい。またＦｏｘＰ３ｌｏｗに代えてＣＤ１２７＋を指標とし、病因細胞の割合を測定してもよい。
【００２６】
３）第３ステップでは、生体試料内における病因細胞の割合を指標として、被験者が自己免疫疾患を発病している可能性を判断する。具体的には、第２ステップにおいて測定した病因細胞の生体試料内における割合が健常者のそれと比較して高いまたは低いとき、被験者が自己免疫疾患を発病している可能性が高いと判断する。
【００２７】
上述のように病因細胞は自己免疫疾患の種類ごとに異なるサイトカインを産生する。したがって、第２ステップにおいて病因細胞の指標に特定のサイトカインを加えることで、特定の種類の自己免疫疾患の診断を補助することができる。
【００２８】
例えば第２ステップでＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋、インターフェロンγ＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗ（以下「ＨＡＭ病因細胞」という）の細胞の割合を測定することで、本発明の方法によってＨＡＭの診断を補助することができる。ここで、インターフェロンγ＋とはインターフェロンγを産生していることを意味する。
【００２９】
図４Ａは、生体試料（末梢血単核球）内におけるＨＡＭ病因細胞の割合をプロットしたグラフである。図４Ａに示されるように、ＨＡＭ患者から採取された生体試料内のＨＡＭ病因細胞の割合は健常者および成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者のそれと比較して特異的に高い。したがって、生体試料内におけるＨＡＭ病因細胞の割合を測定することで、ＨＡＭの診断を補助することができる。具体的には、生体試料内におけるＨＡＭ病因細胞の割合が１％以上であったとき、被験者はＨＡＭを発病している可能性が高いと判断される。
【００３０】
一方、例えば第２ステップでＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋、ＦｏｘＰ３ｌｏｗおよびインターロイキン１７＋の細胞（以下「多発性硬化症病因細胞」という）の割合を測定することで、本発明の方法によって多発性硬化症の診断を補助することができる。ここで、インターロイキン１７＋とはインターロイキン１７を産生していることを意味する。
【００３１】
このように、本発明の診断補助方法によれば、従来は判別が困難であった、初期段階におけるＨＡＭと多発性硬化症とを容易に判別することができる。
【００３２】
３．自己免疫疾患の重症度の判断方法
生体試料における病因細胞の割合と、自己免疫疾患の臨床的重症度（運動障害）との間には相関があることから（図４Ｂ参照）、病因細胞の割合を測定することで、自己免疫疾患の免疫学的重症度を判断または疾患の予後を予測することができる。
【００３３】
本発明の自己免疫疾患の重症度の判断方法は、１）自己免疫疾患患者から採取された生体試料を準備する第１ステップ、２）生体試料内におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗ、の細胞（病因細胞）の割合を測定する第２ステップ、３）病因細胞の割合を指標として自己免疫疾患の免疫学的重症度を判断する第３ステップ、を含む。
【００３４】
第１ステップおよび第２ステップは、上述した自己免疫疾患の診断補助方法における第１ステップおよび第２ステップと同じであってよい。
【００３５】
第３ステップでは、病因細胞の割合を指標として自己免疫疾患の免疫学的重症度を判断する。また、予め作成された検量線を用いて、病因細胞の割合から自己免疫疾患の臨床的重症度を求めることもできる。
【００３６】
また治療前と治療後との生体試料内における病因細胞の割合を比較することで、自己免疫疾患の治療効果を評価することもできる。例えば、治療後の病因細胞の割合が治療前の病因細胞の割合よりも低い場合、治療は効果的と評価され、一方、治療後のＨＡＭ病因細胞の割合が治療前のＨＡＭ病因細胞の割合と同じまたはそれよりも高い場合、治療効果は十分でないと評価される。
【００３７】
上述のように病因細胞は自己免疫疾患の種類ごとに異なるサイトカインを産生する。したがって、第２ステップにおいて病因細胞の指標に特定のサイトカインを加えることで、特定の種類の自己免疫疾患の重症度を測定することができる。
【００３８】
例えば、第１ステップでＨＡＭ患者から採取した生体試料を準備し、第２ステップでＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗ、インターフェロンγ＋の細胞（ＨＡＭ病因細胞）の割合を測定することで、本発明の方法によってＨＡＭの重症度を測定することができる（実施例４参照）。
【００３９】
また、例えば第１ステップで多発性硬化症患者から採取した生体試料を準備し、第２ステップでＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋、ＦｏｘＰ３ｌｏｗおよびインターロイキン１７＋の細胞（多発性硬化症病因細胞）の割合を測定することで、本発明の方法によって多発性硬化症の免疫学的重症度を判断することもできる。
【００４０】
このように本発明の免疫学的重症度の判断方法によれば、自己免疫疾患の予後の予測および治療効果の評価を容易に行うことができる。
【００４１】
４．自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明のＨＡＭの治療薬のスクリーニング方法は、１）自己免疫疾患患者から採取された生体試料を準備するステップ、２）生体試料に自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与する第２ステップ、３）生体試料を指標として、自己免疫疾患の治療薬をスクリーニングする第３ステップを含む。
【００４２】
１）第１ステップでは、自己免疫疾患患者から採取された生体試料を準備する。準備される生体試料は、例えば自己免疫疾患患者の血液から分離した末梢血単核球である。準備された末梢血単核球は培養されてもよい。培養はプレート（シャーレ）上で当業者に公知の方法によって行えばよい。また末梢血単核球は免疫不全動物（例えば、ヌードマウスやスキッドマウスなど）内で培養されてもよい。
また、自己免疫疾患の治療薬候補物質の投与前に、予め生体試料内における病因細胞の割合を測定してもよい。治療薬候補物質の投与後の病因細胞の割合と治療薬候補物質の投与前の病因細胞の割合とを比較することで、自己免疫疾患の治療薬候補物質の評価をすることができる。
【００４３】
２）第２ステップでは、準備した生体試料に自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与する。生体試料に自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与する方法は当業者に公知の方法を用いればよい。例えば、細胞がプレート上で培養されている場合、治療薬候補物質を当該プレート上に滴下することで、治療薬候補物質を投与してもよい。また、例えば細胞が免疫不全動物内で培養されている場合、治療薬候補物質を当該動物に注射することで、治療薬候補物質を投与してもよい。
【００４４】
３）第３ステップでは生体試料を指標として、治療薬候補物質を評価する。生体試料を指標とするとは、例えば、生体試料（末梢血単核球）内における病因細胞の割合を指標とすることを意味する。この場合、自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与した後、所定の時間経過後の病因細胞の割合を測定し、投与後の値と投与前の値とを比較する。投与後の値が投与前の値よりも低かった場合、治療薬候補物質は自己免疫疾患の治療薬として効果的であると評価される。
また生体試料を指標とするとは、培養している生体試料の増殖を指標とすることを意味してもよい。この場合、自己免疫疾患の治療薬候補物質を投与した後、生体試料（末梢血単核球）の増殖率を計測し、投与後の増殖率と投与前の増殖率とを比較する。投与後の増殖率が投与前の増殖率よりも減少した場合、治療薬候補物質は自己免疫疾患の治療薬として効果的であると評価される。
【００４５】
上述のように病因細胞は自己免疫疾患の種類ごとに異なるサイトカインを産生する。したがって、第２ステップにおいて病因細胞の指標に特定のサイトカインを加えることで、特定の種類の自己免疫疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００４６】
例えば第１ステップでＨＡＭ患者から採取された生体試料を準備し、第２ステップで当該生体試料を指標とすることで、本発明のスクリーニング方法によってＨＡＭの治療薬をスクリーニングすることができる。
【００４７】
また、第１ステップで多発性硬化症患者から採取された生体試料を準備し、第２ステップで当該生体試料を指標とすることで、本発明のスクリーニング方法によって多発性硬化症の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００４８】
このように本発明のスクリーニング方法を用いれば自己免疫疾患の病因細胞を指標として治療薬をスクリーニングすることができるので、自己免疫疾患の根本的治療薬をスクリーニングすることができる。
【００４９】
５．本発明の自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、自己免疫疾患患者から本発明の分離方法によって分離された病因細胞を有することを特徴とする。前述の治療薬のスクリーニング方法は、本発明のスクリーニング用キットを用いて実施することができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング用キットは、病因細胞以外の細胞を含んでいてもよい。具体的には、自己免疫疾患患者の末梢血単核球を含んでいてもよい。
【００５１】
病因細胞はプレート上に培養されていてもよく、免疫不全動物内で培養されていてもよい。すなわち本発明のスクリーニング用キットは病因細胞が培養されたプレートを有していてもよく、病因細胞を含む免疫不全動物を有していてもよい。
【００５２】
また、病因細胞をＨＡＭ病因細胞に置き換えることで、本発明のスクリーニング用キットを用いてＨＡＭの治療薬をスクリーニングすることができる。また、病因細胞を多発性硬化症病因細胞に置き換えることで、本発明のスクリーニング用キットを用いて多発性硬化症の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００５３】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００５４】
［実施例１］
本実施例では、ＦｏｘＰ３の発現量（ｎｅｇａｔｉｖｅ（−）、ｌｏｗ、ｈｉｇｈ）によって細胞集団の種類が異なること示すため、末梢血単核球由来のＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団におけるＦｏｘＰ３の発現パターンを解析した。
【００５５】
１．生体試料の調製
ＨＡＭ患者の血液からフィコール（Ｆｉｃｏｌ）遠心比重法により末梢血単核球（生体試料）を分離した。また比較例として、健常者の血液から同様に末梢血単核球を分離した。
ＨＡＭ患者および健常者それぞれから採取した末梢血単核球からＣＤ４＋の細胞集団を磁気ビーズを含むキット（ＣＤ４＋Ｔ ＣｅｌｌアイソレーションキットII；ミルテニーバイオテク社製）を用いて分離した。そして、ＣＤ４＋細胞集団中のＣＤ２５＋の細胞集団をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分離した。抗ＣＤ２５抗体にはＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。
【００５６】
２．ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞におけるＦｏｘＰ３の発現パターンの解析
準備されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞におけるＣＤ４５ＲＯおよびＦｏｘＰ３の発現パターンをフローサイトメーターを用いて解析した。抗ＣＤ４５ＲＯ抗体にはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＯ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を、抗ＦｏｘＰ３抗体にはＰＥ標識ラット抗ヒトＦｏｘＰ３抗体（ｅバイオサイエンス社製）を用いた。解析結果を図１Ａに示す。縦軸はＦｏｘＰ３の発現量を示し、横軸はＣＤ４５ＲＯの発現量を示す。
【００５７】
図１ＡはＨＡＭ患者および健常者のＣＤ４＋およびＣＤ２５＋細胞集団におけるＣＤ４５ＲＯおよびＦｏｘＰ３の発現パターンを示した２パラメータドットプロットである。
【００５８】
図１Ａが示すようにＣＤ４５ＲＯ−の細胞集団６では、ＦｏｘＰ３の発現量の分布は、ＣＤ４５ＲＯ＋の細胞集団の発現量の分布よりも狭い。また、ＣＤ４５ＲＯ−細胞集団６のＦｏｘＰ３の発現量は、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＦｏｘＰ３の発現量の高い（ｈｉｇｈ）細胞集団４のそれよりも低く、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＦｏｘＰ３のｎｅｇａｔｉｖｅ（−）細胞集団５のそれよりも高い。すなわちＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＤ４５ＲＯ−の細胞集団６ではＦｏｘＰ３はｎｅｇａｔｉｖｅ（−）ではないが、発現量は低い（ｌｏｗ）。
【００５９】
このようにＦｏｘＰ３の発現量はｈｉｇｈ（図１におけるグループ１）、ｌｏｗ（図１におけるグループ２）、ｎｅｇａｔｉｖｅ（−）（図１におけるグループ３）の３つのグループに分けられることがわかる。そして、上述したように、本発明ではＣＤ４５ＲＯ−の細胞集団６のＦｏｘＰ３の発現量と同程度のＦｏｘＰ３の発現量をＦｏｘＰ３ｌｏｗとして定義する。
また、ＣＤ４５ＲＯ−の細胞集団には制御性Ｔ細胞はほとんど（基本的に）含まれないことが知られている。したがって、図１Ａに示されたＣＤ４５ＲＯ−およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団６は制御性Ｔ細胞以外の細胞集団であることが考えられる。
【００６０】
次に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞集団におけるサイトカインおよびＦｏｘＰ３の発現パターンを解析した。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋を指標として用いたのは、ＨＴＶＬ−ＩウイルスがＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞に特異的に感染すると知られているからである。その結果、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団２がインターフェロンγ（ＩＦＮγ）やインターロイキン２（ＩＬ２）などのサイトカインを産生することが示された。一方、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団１ならびにＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３−の細胞集団３ではサイトカインを産生する細胞はきわめて少なかった（図１Ｂおよび図１Ｃ参照）。
【００６１】
これらの結果は、ＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団内にはＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団とは異なる性質の細胞集団が存在することを示す。
【００６２】
［実施例２］
本実施例では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団に自己免疫疾患の病因細胞が含まれることを示すため、自己免疫疾患患者から採取した、ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団におけるＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現パターンを、健常者および成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者から採取したＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団におけるＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現パターンと比較した。
【００６３】
ＡＴＬとは、ＨＴＬＶ−Ｉウイルスによって引き起こされる白血病である。つまりＨＡＭとＡＴＬとでは病因ウイルスが同一であるが症状が異なる。
また、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋を指標として用いたのは、上述のようにＨＴＶＬ−ＩウイルスがＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞に特異的に感染することが知られているからである。
【００６４】
１．生体試料の調製
ＨＡＭ患者の血液からフィコール遠心比重法により末梢血単核球（生体試料）を分離した。また比較例として、健常者およびＡＴＬ患者の血液から同様に末梢血単核球を分離した。
ＨＡＭ患者、健常者およびＡＴＬ患者のそれぞれから採取した末梢血単核球からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋の細胞をフローサイトメーターを用いて分離した。抗ＣＤ４抗体にはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ｅバイオサイエンス社製）を用いた。抗ＣＤ２５抗体には、実施例１と同じ抗体を用いた。
【００６５】
２．ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団におけるＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現パターンの解析
準備されたＣＤ４＋およびＣＤ２５＋細胞集団におけるＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現パターンをフローサイトメーターを用いて解析した。抗ＣＣＲ４抗体にはＰＥ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＣＲ４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。抗ＦｏｘＰ３抗体には、実施例１と同じ抗体を用いた。解析結果を図２に示す。縦軸はＦｏｘＰ３の発現量を示し、横軸はＣＣＲ４の発現量を示す。
【００６６】
図２には健常者におけるＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団のＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現量の分布を示す２パターンドットプロット（図２Ａ）、ＨＡＭ患者におけるＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団のＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現量の分布を示す２パターンドットプロット（図２Ｂ）、そしてＡＴＬ患者におけるＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団のＣＣＲ４およびＦｏｘＰ３の発現量の分布を示す２パターンドットプロット（図２Ｃ）が示される。
【００６７】
また図２に示された２パターンドットプロットでは、ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋細胞集団をＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団７と、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団８と、ＣＣＲ４−およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団９とに分けた。
【００６８】
図２に示されるように、ＨＡＭ患者のＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団７は、健常者およびＨＡＭ患者のＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団７よりも増加している。一方、ＨＡＭ患者のＣＣＲ４−およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団９ならびにＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団８は、健常者およびＨＡＭ患者のＣＣＲ４−およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団９ならびにＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団８と比較して減少している。
【００６９】
このようにＨＡＭ患者では、健常者と比較してＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団の割合が増加していることが示された。また、ＨＡＭとＡＴＬとは同じＨＴＬＶ−Ｉウイルスによって引き起こされるにもかかわらず、ＨＡＭ患者ではＡＴＬの患者と比較しても、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞の割合が増加した。
したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞にはＨＡＭの病因細胞が含まれると考えられる。また、ＨＡＭの病因細胞と自己免疫疾患の病因細胞は同じグループに属する可能性が高いと考えられることから、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞には自己免疫疾患の病因細胞が含まれると考えられる。
【００７０】
［実施例３］
本実施例では、ＨＡＭ患者の生体試料から採取したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞が特異的にインターフェロンγを産生することを示すため、ＨＡＭ患者の生体試料から採取したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団のうちインターフェロンγを産生する細胞の割合を測定し、健常者およびＡＴＬ患者から採取したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団のうちインターフェロンγを産生する細胞の割合と比較した。
【００７１】
１．生体試料の調製
ＨＡＭ患者の血液からフィコール遠心比重法により末梢血単核球（生体試料）を分離した。また比較例として、健常者およびＡＴＬ患者の血液から同様に末梢血単核球を分離した。
ＨＡＭ患者、健常者およびＡＴＬ患者のそれぞれから採取した末梢血単核球からＣＤ４＋の細胞集団を磁気ビーズを含むキット（ＣＤ４＋Ｔ ＣｅｌｌアイソレーションキットII；ミルテニーバイオテク社製）を用いて分離した。さらに分離したＣＤ４＋の細胞集団からＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞をフローサイトメーターを用いて分離した。抗ＣＤ２５抗体および抗ＣＣＲ４抗体には、実施例２と同じ抗体を用いた。
【００７２】
２．ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団におけるインターフェロンγ＋（ＨＡＭ病因細胞）の発現パターンの解析
準備されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団のＦｏｘＰ３およびインターフェロンγの発現パターンをフローサイトメトリーを用いて解析した。抗ＦｏｘＰ３抗体には実施例１と同じ抗体を用いた。抗インターフェロンγ抗体にはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトインターフェロンγ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。解析結果を図３に示す。縦軸はＦｏｘＰ３の発現量を示し、横軸はインターフェロンγの発現量を示す。
【００７３】
図３Ａは健常者から採取したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋細胞集団のＦｏｘＰ３およびインターフェロンγの発現パターンを示す２パターンドットプロットである。図３ＢはＨＡＭ患者から採取したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋細胞集団のＦｏｘＰ３およびインターフェロンγの発現パターンを示す２パターンドットプロットであり、そして図３ＣはＡＴＬ患者から採取したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋細胞集団のＦｏｘＰ３およびインターフェロンγの発現パターンを示す２パターンドットプロットである。
図３に示されるようにＨＡＭ患者のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞集団ではインターフェロンγを産生する細胞の割合は、３２．１８％であった。これは健常者の値２．５２％およびＡＴＬ患者の値０．８２％と比較して、顕著に高い。またＨＡＭ患者ではＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＣＲ４＋の細胞集団のうちインターフェロンγを産生する細胞集団のほとんどはＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団であった。
【００７４】
このようにＨＡＭ患者ではＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団内にインターフェロンγの産生する細胞が特異的に観察された。したがってＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋、ＦｏｘＰ３ｌｏｗおよびインターフェロンγ＋の細胞がＨＡＭの病因細胞であることが示された。
【００７５】
このように、病因細胞中におけるインターフェロンγを産生する細胞（ＨＡＭ病因細胞）の割合を測定することで、ＨＡＭを発病している可能性を判断することができる。これにより従来は困難であった、初期段階における多発性硬化症とＨＡＭとを区別することが容易になる。
【００７６】
［実施例４］
本実施例では、生体試料内におけるＨＡＭ病因細胞の割合と、ＨＡＭの重症度との間に相関があることを示すため、ＨＡＭ患者の重症度と生体試料内におけるＨＡＭ病因細胞の割合との関係を求めた。
【００７７】
１．ＨＡＭ病因細胞の割合の測定
ＨＡＭ患者の血液からフィコール遠心比重法により末梢血単核球（生体試料）を分離した。次に、ＨＡＭ患者の末梢血単核球におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋およびインターフェロンγ＋を指標としてＨＡＭ病因細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて測定した。
インターフェロンγはＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞が特異的に産生することから、インターフェロンγを指標とした場合、ＦｏｘＰ３ｌｏｗを指標とする必要がなくなる。したがって本実施例ではＦｏｘＰ３を指標から省いた（図３Ｂ参照）。
【００７８】
２．ＨＡＭの臨床的重症度の測定
ＨＡＭ患者の臨床的重症度（運動障害）は、Osame's Motor Disability Score （ＯＭＤＳ）によって判別した。ＯＭＤＳによるＨＡＭ患者の運動障害の程度を判別する方法は、例えば以下の文献を参照すればよい。
Izumo S, Goto I, Itoyama Y, Okajima T, Watanabe S, Kuroda Y, Araki S, Mori M, Nagataki S, Matsukura S, et al., "Interferon-alpha is effective in HTLV-I-associated myelopathy: a multicenter, randomized, double-blind, controlled trial," Neurology, 1996, 46, p.1016-1021.
【００７９】
図４Ａは、ＨＡＭ患者から採取した生体試料内のＨＡＭ病因細胞の割合と、健常者およびＡＴＬ患者のそれとを比較したグラフである。図４Ａに示すように、健常者およびＡＴＬ患者ではＨＡＭ病因細胞はほとんど確認されないのに対し、ＨＡＭ患者ではＨＡＭ病因細胞の割合が高かった。
【００８０】
図４Ｂは患者の臨床的重症度と生体試料内のＨＡＭ病因細胞の割合との関係を示したグラフである。縦軸はＨＡＭ病因細胞の割合を％で示し、横軸は、ＨＡＭ患者の臨床的重症度を示す。図４Ｂに示すように、ＨＡＭ患者の臨床的重症度とＨＡＭ病因細胞との割合との間には正の相関が確認された。
【００８１】
このように、ＨＡＭ患者の生体試料（末梢血単核球）内のＨＡＭ病因細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＣＲ４＋、ＦｏｘＰ３ｌｏｗおよびインターフェロンγ＋細胞）の割合を求めることで、ＨＡＭ患者の重症度を判断したり、ＨＡＭ患者の予後を予測したりすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によれば、自己免疫疾患（特にＨＡＭ）の病因細胞の分離方法、診断補助、重症度の判断方法、治療効果の評価などを迅速かつ容易におこなうことができる。したがって、本発明によれば、自己免疫疾患の診断および治療をより早期に行うことが可能となり、患者のＱＯＬを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明の実施例１の結果を示す２パラメータドットプロット。
【図２】本発明の実施例２の結果を示す２パラメータドットプロット。
【図３】本発明の実施例３の結果を示す２パラメータドットプロット。
【図４】本発明の実施例４の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００８４】
１  ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団におけるＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団
２  ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団におけるＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団
３  ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の細胞集団のおけるＦｏｘＰ３−の細胞集団
４  ＣＤ４５ＲＯ＋およびＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団
５  ＣＤ４５ＲＯ＋およびＦｏｘＰ３−の細胞集団
６  ＣＤ４５ＲＯ−およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団
７  ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団
８  ＣＣＲ４＋およびＦｏｘＰ３ｈｉｇｈの細胞集団
９  ＣＣＲ４−およびＦｏｘＰ３ｌｏｗの細胞集団
【図１】
2010017130.tif 000003
【図２】
2010017130.tif 000004
【図３】
2010017130.tif 000005
【図４】
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