(57)【要約】【課題】  経口投与組成物として好適な、生体内に於ける酸化ストレス防御及び解毒機能を向上せしめるためのグルタチオン産生促進作用を有する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】  アセチル化トリテルペン酸にグルタチオン産生促進作用が存すること、更には３-アセチルウルソール酸及び／又は３-アセチルオレアノール酸がバラ科アロニア属、バラ科リンゴ属、バラ科ナシ属、ツツジ科クマコケモモ属、ツツジ科スノキ属、フトモモ科フトモモ属、リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物に含有されることを見いだした。アセチル化トリテルペン酸を含有する経口投与組成物として好適な、グルタチオン産生促進作用を有する組成物を提供する。【選択図】図４
2010105937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択される成分を有効成分として含有することを特徴とする、グルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項２】
前記トリテルペン酸は、ウルソール酸又はオレアノール酸であることを特徴とする、請求項１に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項３】
前記誘導体は３位アシル化体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項４】
前記トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択される成分の起源が、バラ科アロニア属（Aronia sp.）、バラ科リンゴ属（Malus sp.）、バラ科ナシ属（Pyrus sp.）、ツツジ科クマコケモモ属（Arctostaphylos sp.）、ツツジ科スノキ属（Vaccinium sp.）、フトモモ科フトモモ属（Syzygium sp.）、リンドウ科センブリ属（Swertia sp.）の植物体の抽出物から選ばれることを特徴とする、請求項１〜３何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項５】
バラ科アロニア属（Aronia sp.）の植物がアロニア・メラノカルパ（Aronia melanocarpa）、バラ科リンゴ属（Malus sp.）の植物がリンゴ（Malus pumila var. domestica）、バラ科ナシ属（Pyrus sp.）の植物がセイヨウナシ（Pyrus communis）、ツツジ科クマコケモモ属（Arctostaphylos sp.）の植物がウワウルシ（Arctostaphylos uva-ursi）、ツツジ科スノキ属（Vaccinium sp.）の植物がツルコケモモ（Vaccinium oxycoccus）、フトモモ科フトモモ属（Syzygium sp.）の植物がチョウジ（Syzygium aromaticum）、リンドウ科センブリ属（Swertia sp.）の植物がセンブリ（Swertia japonica）であることを特徴とする、請求項４に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項６】
前記グルタチオンの産生促進に於いて、γ-グルタミルシステイン合成酵素の発現の促進を機作に含むことを特徴とする、請求項１〜５何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項７】
経口投与組成物であることを特徴とする、請求項１〜６何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項８】
デトックスを目的とする組成物であることを特徴とする、請求項１〜７何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
【請求項９】
前記デトックスの目的は、次に示す疾患予防及び／又は改善効果であることを特徴とする、請求項８に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
（疾患）しみ、にきび、アトピー性皮膚炎、動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、妊娠中毒、白内障、慢性肝疾患、腎疾患、肺疾患
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリテルペン酸乃至はその誘導体を有効成分として含有する、グルタチオン産生促進用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン（γ-Ｌ-グルタミル-Ｌ-システイニルグリシン）は酸性のトリペプチドで、細菌、植物、動物に広く存在する最も代表的な低分子チオール化合物である。その役割としては、グルタチオントランスフェラーゼの補酵素として発がん物質等をシステイン抱合体へと誘導する形で、その解毒作用に関与し、又グルタチオンペルオキシダーゼの補酵素として活性酸素種の不活性化に関与する。その活性本体はグルタチオンに含まれるＳＨ基であり、２分子の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が酸化されてＧＳＳＧとなることにより、相手分子の毒性、攻撃性を低減する効果を有する。又、タンパク質分子のＳＨ基を維持することによりその立体構造並びに生理活性を保持させる作用も有する。通常グルタチオンは酸化型の形で生体内に保持され、必要時にグルタチオン還元酵素により還元体へと還元されて利用される。ここに於いて、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの総量であるトータルグルタチオンレベルを高く保持することの重要性が存する。しかしながらシステイン抱合体形成に使用されたグルタチオンは、ＭＲＰ１等のトランスポーターを介して生体外に排出されてしまうことから、過剰な活性酸素種による酸化ストレスや異物の付加により、生体内のトータルグルタチオンレベルが低下してしまう現象が少なからず存した。この様な現象は、紫外線暴露等による皮膚の炎症（ニキビ、アトピー性皮膚炎含む）・黒色化（シミ、ソバカス含む）、動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、妊娠中毒、白内障、慢性肝疾患、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、免疫疾患、腎臓病、肺疾患、癌等あらゆる疾患を引き起こしたり、重篤化させたりする他、生理的な加齢に伴う老化の要因のひとつともなっている。即ち、生体内に於いてトータルグルタチオンレベルを上昇させる手段の開発が望まれていたと言える。
【０００３】
そのためグルタチオンそのものは医薬品として日本薬局方に収載されており、例えばグルタチオンそのものあるいはその前駆体を白内障や肺疾患の治療に用いたり、美白化粧料に用いたりすることは知られていた（例えば、特許文献１〜３を参照）。
【０００４】
あるいは、生体内に於いてグルタチオン産生を促進する方策も考えられ、この様な作用を有する植物も知られている（例えば、特許文献４、５を参照）。しかしながら、これらについては有効成分の特定がなされておらず、グルタチオン産生促進作用を常に一定に発現させるのには困難があった。更に、トリテルペン酸乃至はその誘導体にグルタチオン産生促進作用が存することも全く知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平０２−４５４２０号公報
【特許文献２】特開平０５−３０１８１１号公報
【特許文献３】特開平０８−３１９２４２号公報
【特許文献４】特開２００６−３４８０５２号公報
【特許文献５】特開２００６−３４７９３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、明確な化学物質を有効成分とする、グルタチオン産生促進用の組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは有効成分の構造が明確なグルタチオン産生促進作用を有する物質を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、トリテルペン酸及びその誘導体にその様な作用を見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択される成分を有効成分として含有することを特徴とする、グルタチオン産生促進用の組成物。
＜２＞前記トリテルペン酸は、ウルソール酸又はオレアノール酸であることを特徴とする、＜１＞に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜３＞前記誘導体は３位アシル化体でであることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜４＞前記トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択される成分の起源が、バラ科アロニア属（Aronia sp.）、バラ科リンゴ属（Malus sp.）、バラ科ナシ属（Pyrus sp.）、ツツジ科クマコケモモ属（Arctostaphylos sp.）、ツツジ科スノキ属（Vaccinium sp.）、フトモモ科フトモモ属（Syzygium sp.）、リンドウ科センブリ属（Swertia sp.）の植物体の抽出物から選ばれることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜５＞バラ科アロニア属（Aronia sp.）の植物がアロニア・メラノカルパ（Aronia melanocarpa）、バラ科リンゴ属（Malus sp.）の植物がリンゴ（Malus pumila var. domestica）、バラ科ナシ属（Pyrus sp.）の植物がセイヨウナシ（Pyrus communis）、ツツジ科クマコケモモ属（Arctostaphylos sp.）の植物がウワウルシ（Arctostaphylos uva-ursi）、ツツジ科スノキ属（Vaccinium sp.）の植物がツルコケモモ（Vaccinium oxycoccus）、フトモモ科フトモモ属（Syzygium sp.）の植物がチョウジ（Syzygium aromaticum）、リンドウ科センブリ属（Swertia sp.）の植物がセンブリ（Swertia japonica）であることを特徴とする、＜４＞に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜６＞前記グルタチオンの産生促進に於いて、γ-グルタミルシステイン合成酵素の発現の促進を機作に含むことを特徴とする、＜１＞〜＜５＞何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜７＞経口投与組成物であることを特徴とする、＜１＞〜＜６＞何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜８＞デトックスを目的とする組成物であることを特徴とする、＜１＞〜＜７＞何れか１項に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
＜９＞前記デットクスの目的は、次に示す疾患予防及び／又は改善効果であることを特徴とする、＜８＞に記載のグルタチオン産生促進用の組成物。
（疾患）しみ、にきび、アトピー性皮膚炎、動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、妊娠中毒、白内障、慢性肝疾患、腎疾患、肺疾患
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、明確な化学物質を有効成分とする、グルタチオン産生促進用の組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
＜１＞本発明のグルタチオン産生促進用の組成物の必須成分であるトリテルペン酸類
本発明のグルタチオン産生促進用の組成物は、トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択される成分を有効成分として含有することを特徴とする。前記トリテルペン酸としては、例えば、ウルソール酸、オレアノール酸、アジア酸、ベツリン酸などが好適に例示でき、中でも３位に水酸基を有する、ウルソール酸、オレアノール酸がより好ましい。これらは、トリテルペン酸のまま使用することもできるが、誘導体などに構造変換して使用することもできる。誘導体としては、水酸基をアセチル化、オクタノイル化、ラウロイル化、オレオイル化、ステアロイル化、イソステアロイル化などの等アシル化したアシル誘導体、メトキシ化、エトキシ化、ブチルオキシ化等のアルコキシ化したアルコキシ誘導体、カルボキシル基をアミド化したアミド誘導体、カルボキシル基をアルキル化、アルケニル化、アリル化、ホスホリル化したエステル類等が好適に例示でき、アシル化誘導体が特に好ましい。具体的には、例えば、３-アセチルウルソール酸、３-アセチルオレアノール酸、３-アセチルアジア酸などが好適に例示でき、中でも、３-アセチルウルソール酸、３-アセチルオレアノール酸が特に好適に例示できる。これらは、更にアルカリで処理して塩としても使用でき、塩としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩等の有機アミン塩、アルギニン塩、リシン塩等の塩基性アミノ酸塩等が好適に例示できる。を好ましく用いることができる。
【００１０】
この様なトリテルペン酸乃至はその誘導体は、天然にも存していることから、天然物より抽出し、精製を行い得ることもできる。この様な場合には、トリテルペン酸乃至はアセチル化トリテルペン酸などのトリテルペン酸誘導体の含有量を指標にすることができる。かかる指標物質が多く含まれるように抽出物を精製分画して用いることが好ましい。アセチル化トリテルペン酸であれば、例えばバラ科アロニア属（Aronia sp.）、バラ科リンゴ属（Malus sp.）、バラ科ナシ属（Pyrus sp.）、ツツジ科クマコケモモ属（Arctostaphylos sp.）、ツツジ科スノキ属（Vaccinium sp.）、フトモモ科フトモモ属（Syzygium sp.）、リンドウ科センブリ属（Swertia sp.）の植物体の抽出物に含有される。前記バラ科アロニア属の植物としてはアロニア・メラノカルパ（Aronia melanocarpa）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、果実部が好適に例示できる。前記バラ科リンゴ属の植物としてはリンゴ（Malus pumila var. domestica）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、果実部が好適に例示できる。前記バラ科ナシ属の植物としてはセイヨウナシ（Pyrus communis）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、葉部が好適に例示できる。前記ツツジ科クマコケモモ属の植物としてはウワウルシ（Arctostaphylos uva-ursi）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、果実部及び／又は葉部が好適に例示できる。前記ツツジ科スノキ属の植物としてはツルコケモモ（Vaccinium oxycoccus）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、果実部が好適に例示できる。前記フトモモ科フトモモ属の植物としてはチョウジ（Syzygium aromaticum）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、花蕾部が好適に例示できる。前記リンドウ科センブリ属の植物としてはセンブリ（Swertia japonica）が好適に例示でき、抽出物の作製に用いる植物部位としては、地上部が好適に例示できる。抽出に際して、植物体乃至はその乾燥物は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物は、植物体乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬することにより製造できる。前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ル等のアルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフラン等のエ−テル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示でき、３０〜８０％、より好ましくは７０％含有エタノ−ルが特に好適に例示できる。浸漬後は室温まで冷却し、析出した不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮等により除去することができる。しかる後に、水と酢酸エチル、水とブタノ−ル等の液液抽出や、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ−等で分画精製し、本発明の抽出物を得ることができる。この様に、アセチル化トリテルペン酸を含有する植物の抽出物で、生体内のグルタチオン合成酵素の発現を促進することによりグルタチオン産生を促進し、活性酸素種の関与する多様な疾患に対する治療効果をもたらすことが期待される。又、斯くの如く抽出物をトリテルペン���乃至はその誘導体の基源とする場合は、後記のヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２を用いた試験に於いて、被験体を加えないコントロールに対して、グルタチオンの産生量が少なくとも４０％増加させる作用を有するものを選択して使用することが好ましい。
【００１１】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、かかる実施例にのみ、限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００１２】
＜製造例１＞
１）日本新薬株式会社より供与されたバラ科アロニア・メラノカルパの果実の乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液に酢酸エチル１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、アロニア・メラノカルパの抽出物２．４ｇを得た。
【００１３】
製造例１に記載のアロニア・メラノカルパの抽出物を以下の条件に従って高速液体クロマトグラフィー分析に供した。
使用カラム：野村科学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ−３０−ＵＧ５ (５μｍｘ２５０ｍｍ）
移動相溶媒：９０％アセトニトリル
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ 波長２１０-４００ｎｍ
分析結果を図１に示すが、製造例１に記載のアロニア・メラノカルパの抽出物にはオレアノール酸、ウルソール酸、３-アセチルオレアノール酸及び３-アセチルウルソール酸が含まれていることが示されている。
【００１４】
＜製造例２＞
１）バラ科リンゴの果実を購入し、凍結乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液に酢酸エチル１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、リンゴの抽出物１．５ｇを得た。
【００１５】
＜製造例３＞
１）バラ科セイヨウナシの葉を樹木より採取し、凍結乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液にノルマルブタノ−ル１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、セイヨウナシの抽出物１．９ｇを得た。
【００１６】
＜製造例４＞
１）「ウワウルシ」の名称でウチダ和漢薬より販売されているツツジ科ウワウルシの果実の乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液に酢酸エチル１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、ウワウルシの抽出物２．９ｇを得た。
【００１７】
＜製造例５＞
１）ツツジ科ツルコケモモの果実の乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液にノルマルブタノール１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、ツルコケモモの抽出物２．１ｇを得た。
【００１８】
＜製造例６＞
１）「チョウジM」の名称でウチダ和漢薬より販売されているフトモモ科チョウジの花蕾の乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液に酢酸エチル１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、チョウジの抽出物３．４ｇを得た。
【００１９】
＜製造例７＞
１）「せんぶり」の名称でウチダ和漢薬より販売されているリンドウ科センブリの地上部の乾燥物を２００ｇ秤取り、４ｌの７０％含水エタノ−ル水溶液を加え、ホモジナイザ−でホモジナイズ処理を行い、室温で２時間浸漬し、不溶物を濾過で取り除いた後、減圧濃縮し、約１ｌの水溶液とした。
２）この様にして得た水溶液に酢酸エチル１ｌを加え、液液抽出を行った。同様の抽出操作を、さらに２回行った。各溶媒相を合わせ、減圧濃縮し、センブリの抽出物２．８ｇを得た。
【００２０】
＜２＞本発明のグルタチオン産生促進用の経口投与組成物
本発明のグルタチオン産生促進用の組成物は、生体内に於いてグルタチオンの産生を高める目的で経口投与組成物として投与するもの、皮膚内のグルタチオン産生量を高める目的で経皮的に投与されるものが存する。この様な本発明の組成物に於いて、前記トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこらの塩は、グルタチオン産生促進剤として作用する。
経口投与組成物としては、、例えば、菓子やパン、麺等の一般食品、カプセル剤や、錠剤の形態を取る、健康増進の目的を有する食品群（例えば、特定保健用食品等）、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤や、錠剤の形態を取る、経口投与医薬等が例示でき、それぞれの製剤で許容される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、食品であれば、塩、砂糖、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、酢等の調味成分、着色成分、フレーバー等の矯臭成分、増粘剤、乳化・分散剤、保存料、安定剤等が好適に例示でき、健康増進の目的を有する食品群や医薬であれば、結晶セルロース、乳糖等の賦形剤、アラビヤガムやヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、クロスカルメロースナトリウム、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、矯味、矯臭剤、着色剤等が好ましく例示できる。これらを常法に従って処理することにより、本発明の経口投与組成物は製造することができる。この時、前記トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩は、総量で、組成物全量に対して、１〜５０質量、より好ましくは５〜３０質量％含有されることが好ましい。
【００２１】
斯くして得られた、本発明の経口投与組成物は、それを飲用することにより、生体内のグルタチオン量を増加させる作用に優れる。この様な作用を発揮させるためには、前記植物の抽出物を総量で、１日あたり、１０〜１０００ｍｇを１回乃至は数回に分けて飲用することが好ましい。
【００２２】
＜３＞グルタチオン産生促進活性試験
（１）グルタチオン産生量測定試験
ヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ-１１９９７）を用いてグルタチオン産生量の測定試験を実施した。１０容量％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）に細胞を懸濁し、培養プレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、ジメチルスルホキシドにて懸濁した各抽出物を乾燥固形物量として培地中に２０μｇ／ｍｌの濃度で含む試料添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。
細胞を回収し、その後−３０℃で凍結、融解することで細胞を破砕し、細胞内のグルタチオンを溶出させた。１０００ｘｇで１５分間、２０℃で遠心し、上清を測定試料とした。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ−４１２キット（ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてグルタチオン量を測定した。即ち、グルタチオン標準品、ブランク、測定試料２００μlを、各々のキュベットへ入れ、キット付属のクロモジェン２００μlと酵素液２００μlを各キュベットに加え、室温で５分間インキュベートした。その後各キュベットにキット付属のＮＡＤＰＨ液２００μlを添加し、４１２ｎｍの吸光度の変化を３分間測定した。グルタチオン量は、同時に設定したグルタチオン標準品にて作成した検量線から計算した。これらを元に、グルタチオン産生促進値（検体存在下のグルタチオン産生量／検体非存在下のグルタチオン産生量）を求めた。この値が１．４以上の場合（４０％促進）、その検体はグルタチオン産生促進作用を有すると判断した。
【００２３】
（２）γ-グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）遺伝子の定量試験
上記（１）と同様の方法でＨｅｐＧ２を培養し、ジメチルスルホキシドにて懸濁した各抽出物を乾燥固形物量として培地中に２０μｇ／ｍｌの濃度で含む試料添加培地に交換し、さらに６時間培養した。その後細胞を回収し、ＲＮＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを用いて、以下に示すようにリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ法によりγ-グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）遺伝子の定量試験を実施した。即ち、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、ＧＣＳ合成プライマー（ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ社製）及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応を行った。逆転写反応によって得られたＧＣＳのｃＤＮＡを滅菌水にて１００倍希釈し、鋳型ｃＤＮＡとした。Ｅｘ  Ｔａｑ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った後に電気泳動を行った。得られたバンドは画像ソフトを用いて画像として取り込み、ＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製）を用いてバンドの濃淡を数値化した。ＧＣＳ遺伝子の発現量は、β-アクチン遺伝子についても同様に検討した発現量（合成プライマーはＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ社製）の相対値として表した。設計した合成プライマーの塩基配列及びＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
【００２４】
ＧＣＳの合成プライマー
2010105937.tif 000003
【００２５】
β-アクチンの合成プライマー
2010105937.tif 000004
【００２６】
ＰＣＲ反応条件
2010105937.tif 000005
【００２７】
＜結果１＞
図２にトリテルペン酸及びアセチル化トリテルペン酸を添加したときのヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２のグルタチオン産生量を示す。いずれもグルタチオンの産生を促進していることが判る。グルタチオン産生量は、ジメチルスルホキシドのみ添加したコントロールに於けるグルタチオン量に対する比で示した。３-アセチルウルソール酸及び３-アセチルオレアノール酸は、コントロールに比べて３倍以上も高いグルタチオン産生促進作用を有し、その効果はウルソール酸及びオレアノール酸よりも高いものであった。即ち、トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択されるものの内、アシル化誘導体が好ましく、中でも、アセチル化誘導体が特に好ましいことが判る。
【００２８】
＜結果２＞
図３に製造例１〜７に記載の植物抽出物を添加したときのヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２のグルタチオン産生量を示す。グルタチオン産生量は、ジメチルスルホキシドのみ添加したコントロールに於けるグルタチオン量に対する比で示した。製造例１〜７の植物抽出物はいずれもコントロールに比べて高いグルタチオン産生促進作用を有した。これより、トリテルペン酸、トリテルペン酸の誘導体及びこれらの塩から選択されるものの基源として、植物の抽出物を利用することができることが判る。
【００２９】
＜結果３＞
図４に製造例１〜７に記載の植物抽出物を添加したときのヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２のＧＣＳ遺伝子の発現量を示す。製造例１〜７の植物抽出物はいずれもコントロールに比べて高いＧＣＳ遺伝子発現促進作用を有した。以上の結果より、本発明の組成物はグルタチオン合成酵素の発現を促進することを機作の一つしており、新規な作用機序に則ったグルタチオン産生促進作用を有することが判る。
【００３０】
下記表１〜７に示す処方に従って、本発明の経口投与組成物である、錠剤状の食品を作製した。即ち、１０％エタノール１０質量部を噴霧しながら、処方成分１００質量部をニューマルメライザー（不二パウダル株式会社製）で造粒し、４０℃で３時間送風乾燥した後、１５０ｍｇ錠に打錠し、本発明の食品１〜７を得た。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、機能性食品等の食品に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】製造例１に記載のアロニア・メラノカルパ抽出物の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】トリテルペン酸及びアセチル化トリテルペン酸を添加したときのヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２のグルタチオン産生量を示す図である。
【図３】製造例１〜７に記載の植物抽出物を添加したときのヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２のグルタチオン産生量を示す図である。
【図４】製造例１〜７に記載の植物抽出物を添加したときのヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２のγ-グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）遺伝子の発現量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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