(57)【要約】【課題】新規なニトリラーゼを使用してニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物などからカルボン酸、例えば光学活性なヒドロキシカルボン酸を製造する方法を提供する。【解決手段】ニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物に、ニトリラーゼを産生するジベレラ（Gibberella）属に属する微生物又はその処理物を接触させることを含むカルボン酸の製造方法である。ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物として、好ましくは、Gibberalla acuminata が使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物に、ニトリラーゼを産生するジベレラ（Gibberella）属に属する微生物又はその処理物を接触させることを含むカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物が、Gibberalla acuminata である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ニトリルが、ラクトニトリルである請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリラーゼを産生するジベレラ（Gibberella）属に属する微生物又はその処理物を用いたカルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリラーゼはニトリルを対応するカルボン酸に変換する酵素であり、Ｒ−マンデル酸などの工業的に有用なカルボン酸の製造に利用される酵素である。
【０００３】
上記ニトリラーゼ活性を有する酵素をもつ微生物として、カゼオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ）属、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属等に属する微生物が知られている（特許文献１〜７、非特許文献１）。
【０００４】
また、最近では土壌からＤＮＡを採取し、ニトリラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を取得することもと報告されている（非特許文献２、特許文献８）。よって、種々の性能を有するニトリラーゼが求められている。
【０００５】
一方、ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物においては、ニトリルとして、フェニルアセトニトリルや３−シアノピリジンが、それら対応するアミドを経由してカルボン酸に分解されることが知られている。よって、ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物には、ニトリルをアミドに変換するニトリルヒドラターゼ及びアミドをカルボン酸に変換するアミダーゼの２種類が存在するものと予想されている。しかし、ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物が、ニトリルを1段階でカルボン酸に変換するニトリラーゼを産生することは明らかにはされていない（非特許文献３）。
【特許文献１】特公昭６３−２５９６号公報
【特許文献２】特開平４−４０８９８号公報
【特許文献３】特開平８−１７３１５２号公報
【特許文献４】特開平８−１７３１７５号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ９６−０９４０３号公報
【特許文献６】国際公開９７−３２０３０号公報
【特許文献７】特許第３００９４２１号公報
【特許文献８】特表２００６−５１１１９５号公報
【非特許文献１】Biotech.Appl.Biochem.(1989)11,581-601
【非特許文献２】Appl.Environ.Microbiol.(2004)70,2429-2436
【非特許文献３】Appl.Environ.Microbiol.(2000)66,2290-2296
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新規なニトリラーゼを使用してニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物などからカルボン酸、例えば光学活性なヒドロキシカルボン酸を製造することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明者は、ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物由来の新たなニトリラーゼを見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下を包含する。
【０００９】
（１）ニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物に、ニトリラーゼを産生するジベレラ（Gibberella）属に属する微生物又はその処理物を接触させることを含むカルボン酸の製造方法。
【００１０】
（２）ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物が、Gibberalla acuminata である上記（１）の製造方法。
【００１１】
（３）ニトリルが、ラクトニトリルである上記（１）又は（２）の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規なニトリラーゼを使用して、ニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物などからカルボン酸を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１４】
本発明は、「ニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物に、ニトリラーゼを産生するジベレラ（Gibberella）属に属する微生物又はその処理物を接触させることを含むカルボン酸の製造方法」である。
【００１５】
本発明において、「ニトリラーゼ」とは、ニトリルからカルボン酸を生成する反応を触媒する酵素をいう。より具体的には、ニトリルのニトリル基に作用し、ニトリル基をカルボキシル基とアンモニアに加水分解する反応を触媒する酵素をいう。好ましくは、下記式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシニトリルに対して鏡像選択的加水分解を行い、下記式（ＩＩ）で示される光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を生成を触媒する酵素である。
【化１】
2010022314.tif 000002
【化２】
2010022314.tif 000003
【００１６】
なお、式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシニトリルは、反応媒体中では下記式（ＩＩＩ）に示すようにアルデヒドとシアンに可逆的に分解されるため、アルデヒド及びシアンの混合物との間で平衡状態にある。
【化３】
2010022314.tif 000004
【００１７】
よって、ニトリラーゼは、上記式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシニトリルの代わりに上記式（ＩＩＩ）で示されるアルデヒドとシアンとの混合物から、式（ＩＩ）で示される光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を生成することもできる。勿論、２−ヒドロキシニトリルとアルデヒドとシアンの混合物から式（ＩＩ）で示される光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を生成することもできる。
【００１８】
「ニトリル」とは、ニトリラーゼの基質として使用できる化合物であれば特に限定されるものではなく、例えば、飽和又は不飽和脂肪族ニトリル、ハロゲン、複素環又は芳香族で置換された脂肪族ニトリル、及びジニトリル等を挙げることができる。好ましくは、本発明のニトリラーゼの基質となるニトリルは、ラクトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、アクリロニトリル、２、３、４−シアノピリジン、ベンゾニトリル、バレロニトリル、ヘキサンニトリル、オクタンニトリル、イソバレロニトリル、ペラグロニトリル、イソブチロニトリル、２−メタクリロニトリル、ヒドロキシアセトニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸エチルエステル、アジポニトリル、クロトノニトリル、メタクリロニトリル、エチレンシアンヒドリン、o、m-シアノフェノール、m、p―トルニトリル、ｍ、p−アミノベンゾニトリル、ベンジルシアニド、マンデロニトリル、シアノピリジン、２−ピリジンアセトニトリル、２−チオフェンアセトニトリル及び２−ヒドロキシ−4―メチルチオブチロニトリルである。より好ましくは、ラクトニトリルである。  また前記ニトリルが可逆的に分解された際に生じるアルデヒドとシアンとの混合物も基質として使用できる。
【００１９】
「ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物」とは、例えば、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ＮＢＲＣ６６０５、ＮＢＲＣ３０３０７、ＮＢＲＣ５２６８、ＮＢＲＣ７１８８、ＮＢＲＣ７７０４、ＮＢＲＣ７７０５及びＮＢＲＣ４４７４、ジベレラ・アキュミナタ（Ｇｉｂｅｒｅｌｌａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ  ＮＢＲＣ３０３０７）等である。好ましくは、ジベレラ・アキュミナタ（Ｇｉｂｅｒｅｌｌａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ  ＮＢＲＣ３０３０７）である。これらの微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手することができる。
【００２０】
前記微生物は、公知の培養方法に準じて培養することができる。使用する培地には、一般微生物の栄養源として公知のものを利用することができ、グリセリン、クエン酸、酢酸及びグルタミン酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス及びペプトン等の有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄及びコバルト等の無機栄養源、並びにビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。微生物のニトリラーゼの量を増大させるため、培地には、さらにｎ−ブチロニトリル等のニトリル又はε−カプロラクタム等のアミドを添加するのが好ましい。培地のｐＨは例えばｐＨ５〜１０の範囲であり、培養温度は例えば１０〜３８℃、好ましくは２５〜３２℃である。培養日数を例えば１〜５日の範囲とし、菌体中の目的のニトリラーゼの含量が最大になるまで微生物を培養することが好ましい。培養終了後、遠心分離等により培養菌体を収集する。
【００２１】
「処理物」とは、前記培養終了後に収集された微生物菌体、その菌体を洗浄した洗浄菌体、微生物菌体又は洗浄菌体を破砕した粗酵素液、粗酵素液を精製した精製酵素、菌体又は酵素を固定化した固定化酵素等をいう。
【００２２】
前記の微生物又はその処理物は、ニトリル及び／又はアルデヒドとシアンとの混合物に接触させることにより、カルボン酸を製造する。
【００２３】
「接触」とは、ニトリラーゼを産生するジベレラ（Gibberella）属に属する微生物又はその処理物とニトリルを、同一の反応系に存在させることを意味する。例えば、微生物菌体又はその処理物とニトリルを混合すること、ジベレラ属に属する微生物の培養容器にニトリルを添加すること及びジベレラ属に属する微生物をニトリルの存在下で培養すること等をいう。
【００２４】
接触条件としては、反応系のｐＨを例えばｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０に調整する。また、ニトリル、アルデヒド及びシアンに対するニトリラーゼの感受性に依存して変わるが、通常、反応液中のニトリルの濃度は、例えば０．１〜２．０重量％、好ましくは０．５〜１．０重量％である。アルデヒドの濃度は、例えば０．１〜１．０重量％、好ましくは０．１〜０．５重量％であり、シアンの濃度は、例えば０．１〜０．５重量％、好ましくは０．１〜０．２重量％である。また、反応温度は、例えば０〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃である。さらに、反応時間は、例えば０．１〜２４時間である。
【００２５】
生成したカルボン酸は公知の方法により取得することができる。例えば遠心分離により微生物を除き、さらに必要であれば限外ろ過などにより顆粒成分と蛋白、多糖成分の除去を行う。また必要であれば活性炭処理を施した後、減圧濃縮、または酸性下での有機溶媒による抽出を行い、酢酸エチルエステルなどを用いて再結晶をくり返すことにより高純度結晶を得ることができる。
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００２７】
（１）ジベレラ・アキュミナタ（Gibberalla acuminata）NBRC30307の培養
ジベレラ・アキュミナタ（Gibberalla acuminata）NBRC30307は独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）から入手した。ジベレラ・アキュミナタ（Gibberalla acuminata）NBRC30307株を、以下の組成の培地を用いて２８℃、１２５ｒｐｍで４日間振とう培養した。
【００２８】
（培地組成：１Ｌ中）
クエン酸ナトリウム          ５ｇ
コーンスティープリカー      ２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                ７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                ３ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．１ｇ
酵母エキス              ０．２ｇ
ε−カプロラクタム          ４ｇ
培地のｐＨ            ｐＨ６．０
４日間の培養後、培養液を遠心分離にかけて菌体を集菌し、集菌した菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させることで、休止菌体を調製した。
【００２９】
（２）ラクトニトリルからＬ−乳酸の生成
（１）で調製した休止菌体を使用し、以下の組成の反応液を用いてラクトニトリルからＬ−乳酸を製造した。
【００３０】
（反応液組成）
ラクトニトリル      １００ｍＭ
リン酸緩衝液        １００ｍＭ
休止菌体            ０．５ｍｇ−ＤＣ（ｄｒｙ  ｃｅｌｌ）
１ｍｌ反応液
反応は２０℃で行い、反応開始から１０分間に生成するアンモニアをインドフェノール法によって定量した。そして、測定したアンモニアの量から、次のようにして、比活性（U/mg-DC）を求めた。
【００３１】
乳酸の分析値は１．５ｍＭであり、ニトリラーゼの比活性は1.5μmol/10min/0.5mgcell=0.3units/mg-DCとなる。
【００３２】
また、各鏡像体の生成量は以下のＨＰＬＣ分析条件で測定した。
【００３３】
（乳酸の光学分割条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（＋）
移動相：２ｍＭ  ＣｕＳＯ４
検出：２５４ｎｍ
【表１】
2010022314.tif 000005
【００３４】
表１に示すように、分析の結果、ジベレラ・アキュミナタ（Gibberalla acuminata）  NBRC30307の休止菌体により、ラクトニトリルからＬ−乳酸が選択的に製造できることが確認できた。