(57)【要約】【課題】本発明は、対照との比較によって得られた標的核酸の相対比が検出対象ゲノムのコピー数の絶対値を確実に反映する、標的核酸のコピー数の定量方法を提供することを目的とする。【解決手段】標的核酸含有ＤＮＡ及び既知のコピー数を有する対照ＤＮＡを制限酵素によって切断し、前記切断後の標的核酸含有ＤＮＡ及び前記切断後の対照ＤＮＡにそれぞれアダプター配列を付加し、前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、第１の定量的ＰＣＲによって前記標的核酸含有ＤＮＡと前記対照ＤＮＡとの分子数比を算出し、前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、前記標的核酸の少なくとも一部の領域を核酸増幅して第２の定量的ＰＣＲを行い、その増幅産物の比から前記標的核酸のコピー数を求める。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸のコピー数が判明している対照ＤＮＡを用いて、生物のゲノム中における標的核酸のコピー数を検出する方法であって、
（１）標的核酸含有ＤＮＡ及び前記対照ＤＮＡを制限酵素によって切断する工程と、
（２）前記切断後の標的核酸含有ＤＮＡ及び前記切断後の対照ＤＮＡにそれぞれアダプター配列を付加し、アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及びアダプター付加対照ＤＮＡとする工程と、
（３）前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、それぞれ前記アダプター配列の少なくとも一部を含む領域を核酸増幅して第１の定量的ＰＣＲを行い、前記標的核酸含有ＤＮＡと前記対照ＤＮＡとの分子数比を算出する工程と、
（４）前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、前記標的核酸の少なくとも一部の領域を核酸増幅して第２の定量的ＰＣＲを行い、その増幅産物の比から前記標的核酸のコピー数を求める工程と、
を有することを特徴とする標的核酸のコピー数検出方法。
【請求項２】
前記対照ＤＮＡがプラスミドＤＮＡまたはファージに由来するＤＮＡである請求項１に記載の標的核酸のコピー数検出方法
【請求項３】
前記プラスミドＤＮＡが所望のＢＡＣクローンを含むプラスミドである請求項２に記載の標的核酸のコピー数検出方法。
【請求項４】
前記ゲノムＤＮＡが真核生物、もしくは原核生物由来のゲノムＤＮＡである、請求項１乃至３のいずれかに記載の標的核酸のコピー数検出方法。
【請求項５】
前記第１の定量的ＰＣＲは、前記アダプター配列及び前記標的核酸の直前配列を基に設計されたプライマーを用いる請求項１乃至４のいずれかに記載の標的核酸のコピー数検出方法。
【請求項６】
前記アダプター配列が前記生物のゲノム中に存在しない配列である請求項１乃至５のいずれかに記載の標的核酸のコピー数検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物のゲノム配列中に存在する標的核酸配列のコピー数を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのゲノム塩基配列が解明され、遺伝子と疾患の研究が進められたことにより、ゲノム中の遺伝子のコピー数変化が疾患に影響することがわかってきた。非特許文献１にコピー数の変化を検出する方法として、検出対象の組織または細胞由来のゲノムＤＮＡと、対照とする組織または細胞由来のゲノムＤＮＡとを比較するＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）法が開示されている。ＣＧＨ法は、染色体レベルの物理サイズで起きたコピー数の減少（ｌｏｓｓ）、過剰（ｇａｉｎ）を決定することができる。
【０００３】
一方、近年、ＤＮＡ断片を基板となる固体に均等間隔にスポットしたＤＮＡマイクロアレイが実用化され、一度に数百〜数万種類の遺伝子の発現動態を検出するツールとして用いられている。そして、このＤＮＡマイクロアレイとＣＧＨ法を組み合わせ、増幅や欠失などのゲノム異常をハイスループットに解析する方法が開発されている。このアレイＣＧＨと呼ばれる解析方法は、新しい増幅領域の探索には非常に優れた方法であり、癌関連遺伝子の同定に積極的に用いられている。
【非特許文献１】Ａ Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ、ＯＰ Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ、Ｄ Ｓｕｄａｒ、Ｄ Ｒｕｔｏｖｉｔｚ、ＪＷ Ｇｒａｙ、Ｆ Ｗａｌｄｍａｎ, ａｎｄ Ｄ Ｐｉｎｋｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ 、３０ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９２、２５８：８１８−８２１．
【０００４】
しかし、アレイＣＧＨの場合、ゲノム中の標的核酸の増幅および欠失は同定できるが、コピー数の変化を正確に定量することは困難である。
【０００５】
コピー数を精度良く求める方法として、特許文献１の段落番号［００１５］には、異なる個体由来のゲノムＤＮＡに共通のアダプター配列を付加し、アダプタープライマーと各個体の配列特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅後、その増幅量比を測定することでゲノムＤＮＡの量比を検出する方法が開示されている。
【０００６】
また、特許文献２の段落番号［０００６］には、定量的ＰＣＲ方法を用いて標的核酸のコピー数比を求める方法が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、いずれの方法も、異なる個体または組織由来のゲノムＤＮＡを対照としてコピー数の相対比を求める方法であり、検出対象ゲノム内に存在するコピー数の絶対値を定量することは困難である。異なる個体または組織由来のゲノムＤＮＡを対照として相対比を求める方法の場合、算出される値は対照組織または細胞に依存するからである。通常のヒト細胞において、標的核酸は各相同染色体に１ずつ存在し、細胞全体ではコピー数は２となる。対照組織または細胞におけるゲノムにおいて、標的核酸のコピー数が通常どおり２であった場合、ＰＣＲ後の増幅産物の相対比は測定対象ゲノムのコピー数を反映する。しかし、対照の一倍体のゲノムにおいて標的核酸のコピー数が０（欠失）または３以上であった場合、相対比は検出対象ゲノムのコピー数の絶対値を反映しない。対照として用いるゲノムにおいて、標的核酸のコピー数がすべて２であることは必ずしも保証されないため、得られた相対比が検出対象ゲノムのコピー数の絶対値を必ずしも反映しないため定量できないという課題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、対照との比較によって得られた標的核酸の相対比が検出対象ゲノムのコピー数の絶対値を確実に反映する、標的核酸のコピー数の定量方法を提供することを目的とする。
【特許文献１】特開２００１−３３３８００号公報
【特許文献２】特開２００２−０００２７５号公報
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る標的核酸のコピー数検出方法は、
標的核酸のコピー数が判明している対照ＤＮＡを用いて、生物のゲノム中における標的核酸のコピー数を検出する方法であって、
（１）標的核酸含有ＤＮＡ及び前記対照ＤＮＡを制限酵素によって切断する工程と、
（２）前記切断後の標的核酸含有ＤＮＡ及び前記切断後の対照ＤＮＡにそれぞれアダプター配列を付加し、アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及びアダプター付加対照ＤＮＡとする工程と、
（３）前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、それぞれ前記アダプター配列の少なくとも一部を含む領域を核酸増幅して第１の定量的ＰＣＲを行い、前記標的核酸含有ＤＮＡと前記対照ＤＮＡとの分子数比を算出する工程と、
（４）前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、前記標的核酸の少なくとも一部の領域を核酸増幅して第２の定量的ＰＣＲを行い、その増幅産物の比から前記標的核酸のコピー数を求める工程と、
を有することを特徴とする標的核酸のコピー数検出方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
標的核酸のコピー数が判明している対照ＤＮＡを用いて、生物のゲノム中における標的核酸のコピー数を検出する方法であって、
（１）標的核酸含有ＤＮＡ及び前記対照ＤＮＡを制限酵素によって切断する工程と、
（２）前記切断後の標的核酸含有ＤＮＡ及び前記切断後の対照ＤＮＡにそれぞれアダプター配列を付加し、アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及びアダプター付加対照ＤＮＡとする工程と、
（３）前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、それぞれ前記アダプター配列の少なくとも一部を含む領域を核酸増幅して第１の定量的ＰＣＲを行い、前記標的核酸含有ＤＮＡと前記対照ＤＮＡとの分子数比を算出する工程と、
（４）前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、前記標的核酸の少なくとも一部の領域を核酸増幅して第２の定量的ＰＣＲを行い、その増幅産物の比から前記標的核酸のコピー数を求める工程と、
を有することを特徴とする標的核酸のコピー数検出方法。
【００１１】
（コピー数の検出方法）
本発明は、標的核酸のコピー数の検出方法に関し、標的核酸のコピー数が判明している対照核酸を用いて、生物のゲノム中における標的核酸のコピー数を検出する方法である。
【００１２】
ゲノムとは、ある生物のＤＮＡにコードされていて、その生物が有する遺伝情報を意味する。例えばヒトゲノムとは、２２対の常染色体と性染色体のＸＸまたはＸＹ、計４６本に含まれる遺伝情報全体を指す。ゲノム配列と記述した場合、遺伝情報を担う塩基配列の情報を意味し、ゲノムＤＮＡと記述した場合、ゲノム配列に即した核酸を意味する。
【００１３】
標的核酸とは、コピー数の検出対象となる核酸であり、例えばゲノム中に含まれている多数の遺伝子領域の中で特に検出対象とする遺伝子領域を意味する。
【００１４】
対照ＤＮＡとは、対照ＤＮＡは標的核酸を少なくとも１つ有し、そのコピー数が判明している核酸断片である。塩基配列も判明しているものが好ましく用いられる。対照ＤＮＡとして、例えば、標的核酸を少なくとも１つ有するプラスミドＤＮＡやファージを好ましく用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
コピー数とは、ゲノム中に含まれる標的核酸の個数を意味する。例えばＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｉｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：上皮細胞成長因子受容体）を標的核酸とした場合、正常細胞の一倍体のヒトゲノムにおけるＥＧＦＲ領域の個数、つまりコピー数は１である。しかし、癌などの疾患ではこのＥＧＦＲ領域が増加し、多い場合はゲノム中に数十個にまでなる場合もある。
【００１６】
また、ゲノムは所望の生物に由来するゲノムを用いることができる。その際の生物は原核生物由来、真核生物由来のもののどちらを用いても良い。ゲノムは１つ又は複数のＤＮＡ鎖を含む。また、標的核酸含有ＤＮＡとは、標的核酸を有するＤＮＡ鎖のことである。
【００１７】
（工程（１）；制限酵素処理）
本発明では、まず、標的核酸含有ＤＮＡ及び前記対照ＤＮＡを制限酵素によって切断する。
【００１８】
検出対象となる標的核酸や標的核酸含有ＤＮＡに応じて、所望の制限酵素を使用できる。具体的には、標的核酸内に切断サイトをしない制限酵素で処理することが好ましい。また、標的核酸の直前領域に切断サイトがある制限酵素で処理することが好ましい。制限酵素としては、例えばＭｂｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＴａｑＩ等がある。
【００１９】
（工程（２）；アダプター付加）
次に、前記切断後の標的核酸含有ＤＮＡ及び前記切断後の対照ＤＮＡにそれぞれアダプター配列を付加し、アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及びアダプター付加対照ＤＮＡとする。つまり、前記工程（１）で、特定の制限酵素を用いて、標的核酸含有ＤＮＡを含む試料Ａ及び対照ＤＮＡを含む試料Ｂ中のＤＮＡをそれぞれ切断した後、当該切断部位にアダプターを付加する。
【００２０】
アダプターとは、後の工程（３）における第１の定量ＰＣＲにおいて、アダプター用プライマーがアニールする部位となる。アダプター配列は、真核生物のゲノム配列由来、もしくは原核生物のゲノム配列由来、もしくはいずれの生物にも由来しない配列を用いることができる。また、例えば、化学合成により得ることができる。ただし、検出対象となるゲノムＤＮＡが有する配列をアダプター配列として用いることは避けた方が好ましい。
【００２１】
（工程（３）；第１の定量ＰＣＲ）
次に、前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、それぞれ前記アダプター配列の少なくとも一部を含む領域を核酸増幅して第１の定量ＰＣＲを行い、前記標的核酸含有ＤＮＡと前記対照ＤＮＡとの分子数比を算出する。つまり、まず、前記工程（２）で調製したアダプター付加標的核酸含有ＤＮＡを含む試料及びアダプター付加対照ＤＮＡを含む試料について、第１の定量ＰＣＲを行う。この際、標的核酸含有ＤＮＡと対照ＤＮＡとの分子数比を算出できるようなプライマーを設計し用いる。
【００２２】
定量的ＰＣＲ方法とは核酸中における標的遺伝子の存在量を、プライマーやプローブを用いたＰＣＲを行って測定もしくは検出する方法である。ＰＣＲとはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）のことであり、現在の分子生物学、遺伝子工学などで常用されている反応である。定量的ＰＣＲ方法としては、分子生物学、遺伝子工学で定常的に用いられている公知の方法を用いることができる。例えば、一組の特異的なプライマーセットを用い、指数増幅している途中のサイクルで止め、増幅産物の量を測定、比較する方法を用いることができる。また、特に高い定量性を有する市販のキット（アプライドバイオシステム社など）を用いることができる。この場合一組の特異的なプライマーセットと特異的なプローブを用いて定量を行う。前記プローブは配列の一端が蛍光色素、反対側の一端が消光剤で標識されており、ＰＣＲのテンプレートに結合した後ＰＣＲの進行ととともに分解されて蛍光を発するように設計されている蛍光プローブを用いることができる。また、ＰＣＲ増幅により得られる産物の検出は公知の方法により行うことができる。定量的ＰＣＲ方法は、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法がより好ましく用いられる。プローブは、増幅核酸の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされたものを用いることができる。定量的ＰＣＲ方法に使用するものを指し、特に指定がない限り長さは制限されない。
【００２３】
分子数比とは、標的核酸含有ＤＮＡの本数と対照ＤＮＡの本数との比のことである。例えば、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲによる場合、その増幅曲線が一致すればそれらの本数は等しいということになる。
【００２４】
プライマーは、第１の定量ＰＣＲにおいて、標的核酸含有ＤＮＡと対照ＤＮＡとの分子数比を算出できるようなプライマーであればよい。例えば、以下のアダプター特異的プライマーと測定対象ＤＮＡ特異的プライマーを用いることができる。
【００２５】
アダプター特異的プライマーとは、前記設計されたアダプターの配列と相補的な配列を有し、かつハイブリダイズすることができるプライマーである。
【００２６】
測定対象ＤＮＡ特異的プライマーとは、例えば、標的核酸の直前領域のＤＮＡ配列（直前配列）を基に作製することができる。
【００２７】
（工程（４）；第２の定量ＰＣＲ）
前記アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡ及び前記アダプター付加対照ＤＮＡについて、前記標的核酸の領域を核酸増幅して第２の定量ＰＣＲを行い、その増幅産物の比から前記標的核酸のコピー数を求める。
【００２８】
前記工程（３）より、アダプター付加標的核酸含有ＤＮＡの試料中に含まれる標的核酸含有ＤＮＡと、アダプター付加対照ＤＮＡの試料中に含まれる対照ＤＮＡとの分子数比は把握される。したがって、これらの試料を用いて、標的核酸の領域を核酸増幅して第２の定量ＰＣＲを行うことにより、その増幅産物の比から標的核酸のコピー数を求めることができる。
【００２９】
第２の定量ＰＣＲとしては、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法がより好ましく用いられる。
【００３０】
第２の定量ＰＣＲに用いるプライマーとしては、標的核酸の少なくとも一部の領域を特異的に増幅することができるプライマーを用いる。例えば、標的核酸の一部の領域と相補的な配列を有し、当該領域にハイブリダイズすることができるようにプライマーを設計する。また、標的核酸の両末端に基づいてプライマーを設計することもできる。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
＜実施例１＞
測定対象となるゲノムとしてヒト舌癌細胞株ＮＡ由来ゲノム、対照ＤＮＡとしてＢＡＣクローンＤＮＡ、標的核酸としてＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｉｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：上皮細胞成長因子受容体）を選択した。そして、本発明に係るコピー数の検出方法により、ＮＡ細胞由来ゲノム中で増加しているＥＧＦＲのコピー数を定量した。
【００３３】
Ｉ．ＥＧＦＲを含む核酸の調製
（１）ＥＧＦＲを含むヒトゲノムＤＮＡの抽出
ヒト舌癌細胞株ＮＡ（大日本製薬社製）から、ゲノムＤＮＡ抽出精製キット（商品名：ＤＮＥａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ；キアゲン社製）を用いて、キット添付の使用説明書の方法に従って、ゲノムＤＮＡを抽出、精製した。まず、ヒト類表皮癌標準細胞ＮＡの懸濁液（２×１０6個／２００μｌ）に、上記キットに含まれているＡＴＬ緩衝液を１８０μｌ加え、１５秒間攪拌した。次に、この懸濁液に、上記キットに含まれているＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を２０μｌ加え、攪拌した後、５５℃で３０分間加温した。次に、上記キットに含まれるＡＬ緩衝液を４００μｌ加え、３０秒間攪拌後、７０℃で１０分間加熱した。次に、エタノールを４００μｌ加えて１５秒間攪拌後、まずその混合溶液６００μｌをカラムに添加した。そして、８，０００ｒｐｍで１分間遠心後、廃液を捨ててから残りの混合溶液をカラムに添加し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心し、ゲノムＤＮＡをカラムに吸着させた。廃液を捨てた後、カラムに上記キットに含まれるＡＷ１緩衝液を５００μｌ添加し、８，０００ｒｐｍで１５秒間遠心、さらに上記キット中のＡＷ２緩衝液を５００μｌを加えて１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。次に、廃液を捨て、何も添加せずに１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。次に、新しいチューブに上記カラムをセットし、超純水を５０μｌ加えて１分間静置後、８，０００ｒｐｍで１分間遠心し、ゲノムＤＮＡを溶出した。ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジー社製）を用いてこのゲノムＤＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、２５０ｎｇ／μｌだった。
【００３４】
（２）ＥＧＦＲを含むＢＡＣ ＤＮＡの抽出
Ｈｕｍａｎ ＢＡＣ ｃｌｏｎｅ ＲＰＣＩ−１１−８１５Ｋ２４（インビトロジェン社製）から（１）と同様の手法でＢＡＣ ＤＮＡを抽出、精製した。このＤＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、３００ｎｇ／μｌだった。なお、ＢＡＣクローンＤＮＡはＥＧＦＲを１コピー含む。
【００３５】
ＩＩ．制限酵素による切断とアダプター配列付加
（１）制限酵素の選択
ヒトゲノムにおいてＥＧＦＲ領域の直前に切断サイトがあり、かつ適当な長さ（平均６５００ｂｐ程度）にゲノムを断片化する制限酵素としてＢｓｓ ＳＩ（第一化学薬品株式会社製）を選択した。
【００３６】
（２）アダプター配列の選択と合成
ヒトゲノムが有しない配列として、原核生物Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムの一部を選択し、制限酵素Ｂｓｓ ＳＩの切断サイトを加えた配列をアダプター配列として用いた。また、アダプター配列（ベックス社にて合成）を以下に示す。
【００３７】
5' GCAGGCGGTTAGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTTAACCATAGTAGGCTTTGGAA     3'
3' CGTCCGCCAATCTATTCAGACTTCAATTTCCGACACCGAATTGGTATCATCCGAAACCTTTGCT 5'
（３）制限酵素による切断
（３−１）ヒトゲノムＤＮＡの断片化
上記（Ｉ−１）で得たＮＡ由来のヒトゲノムＤＮＡについて、Ｂｓｓ ＳＩによる断片化を以下の手順で行った。表１の混合液を３７℃で１時間インキュベートした後、８０℃で２０分間加熱して酵素を不活性化した。
【００３８】
【表１】
2010000003.tif 000002
ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３は制限酵素の付属品を使用した。
【００３９】
また、断片化した上記ゲノムＤＮＡについて、ＤＮＡ精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＤＮＥａｓｙ；キアゲン社）を用いて精製した。
【００４０】
こうして得た検体を、断片化測定用ＤＮＡ（又は検体１−１）と称する。
【００４１】
（３−２）ＢＡＣクローンＤＮＡの断片化
上記（Ｉ−２）で得たＢＡＣクローンＤＮＡについて、上記（３−１）と同様にＢｓｓ ＳＩによる断片化を以下の手順で行った。表２の混合液を３７℃で１時間インキュベートした後、８０℃で２０分間加熱して酵素を不活性化した。
【００４２】
【表２】
2010000003.tif 000003
ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３は制限酵素の付属品を使用した。
【００４３】
また、断片化した上記ゲノムＤＮＡについて、ＤＮＡ精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＤＮＥａｓｙ；キアゲン社）を用いて精製した。こうして得た検体を、断片化対照ＤＮＡ（又は検体２−１）と称する。
【００４４】
（４）アダプター配列の付加
（４−１）ヒトゲノムＤＮＡへのアダプター配列の付加
ＩＩ−（２）で得たアダプター配列とＩＩ−（３−１）で得た断片化標的核酸含有ＤＮＡとを表３の組成で混合し、１６℃で１時間静置して結合させた。その後、精製を行った。
【００４５】
【表３】
2010000003.tif 000004
ＤＮＡ リガーゼ、１０×リガーゼ緩衝液はともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
【００４６】
こうして得た検体を、アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ（又は検体１−２）と称する。
【００４７】
（４−２）ＢＡＣクローンＤＮＡへのアダプター配列の付加
ＩＩ−（２）で得たアダプター配列と（３−２）で得た断片化対照ＤＮＡ（又は検体２−１）とを表３の組成で混合し、１６℃で１時間静置して結合させて結合させた。その後、精製を行った。こうして得た検体を、アダプタ付加対照ＤＮＡ（又は検体２−２）と称する。
【００４８】
ＩＩＩ．定量的ＰＣＲ方法によるコピー数の定量
（１）アダプター配列用のプライマー、プローブの設定
Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲ法（アプライドバイオシステム社）のキットを用いて、定量的ＰＣＲ方法を行うためアダプター配列用プライマーセットとプローブを設計した。プライマーの一方はアダプター配列上に、もう一方は７番染色体上でＥＧＦＲ直前の特異的な配列上に設計し、２本鎖の増幅産物が一種類のみ得られるように工夫した。また、蛍光色素と消光剤とＭＧＢで標識されたアダプター用プローブは、アダプター配列とＥＧＦＲの結合部位をカバーするように設計した。これらの配列を以下の表４に示す。尚、プライマーとプローブはアプライドバイオシステム社に依頼して合成した。
【００４９】
【表４】
2010000003.tif 000005
【００５０】
（２）ＥＧＦＲ用のプライマー、プローブの設定
ＩＩＩ−（１）と同様に、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲ法（アプライドバイオシステム社）のキットを用いて定量的ＰＣＲ法を行うため、ＥＧＦＲ用プライマーセットとプローブを設計した。プライマーセットとプローブはいずれもＥＧＦＲのイントロン１の配列上に設計した。これらの配列を以下の表５に示す。尚、プライマーとプローブはアプライドバイオシステム社に依頼して合成した。
【００５１】
【表５】
2010000003.tif 000006
【００５２】
（３）定量的ＰＣＲ方法によるアダプター配列の定量
定量的ＰＣＲ方法により、検体１−２（アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ）と検体２−２（アダプタ付加対照ＤＮＡ）とで、アダプター配列とＥＧＦＲを含む断片の分子数をそろえる。アダプター配列用プライマーセットとプローブ（以下、アダプター配列用プライマーミックス）を用い、２種類のチューブについてそれぞれ定量的ＰＣＲ方法を行った時に増幅曲線が一致すれば、２種類のチューブはＥＧＦＲ領域直前に結合したアダプター配列を同量含有していることになる。前記アダプター配列用プライマーミックスとキット（商品名：Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて、表６の従ってＰＣＲ溶液を調製した（例数ｎ＝２）。
【００５３】
【表６】
2010000003.tif 000007
マスターミックス（商品名：Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ；アプライドバイオシステムズ社）
【００５４】
表６で調製したＰＣＲ溶液を装置（商品名：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム；アプライドバイオシステムズ社）にセットし、定量的ＰＣＲ方法を行った。ＰＣＲのサイクル条件は５０℃ ２分→９５℃ １０分→（９５℃ １５秒→６０℃ １分を４０回）である。この結果からアダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡとアダプタ付加対照ＤＮＡについてアダプター配列の増幅曲線が一致した。このときの増幅曲線を図１に示す。図１の結果から、アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ（検体１−２）とアダプタ付加対照ＤＮＡ（検体２−２）とで、アダプター配列とＥＧＦＲを含む断片の分子量が同量存在することが確認された。
【００５５】
（４）定量的ＰＣＲ方法によるＥＧＦＲの定量
次に、各検体（検体１−２と検体２−２）に含まれるＥＧＦＲのコピー数を定量的ＰＣＲ方法により定量した。ＥＧＦＲ用プライマーセットとプローブ（以下、ＥＧＦＲ用プライマーミックス）を用いて定量的ＰＣＲ方法を行った場合、アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ（検体１−２）とアダプタ付加対照ＤＮＡ（検体２−２）から得られる増幅曲線の差が各検体中のＥＧＦＲのコピー数の差を反映する。したがって、本実施例では、アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡとアダプタ付加対照ＤＮＡにおける増幅曲線の比が、標的核酸含有ＤＮＡ中のＥＧＦＲのコピー数を表すことになる。
【００５６】
前記ＥＧＦＲ用プライマーミックス（商品名：Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて、表６に従ってＰＣＲ溶液を調製し、ＩＩＩ−（３）と同様の条件で定量的ＰＣＲ方法を行った（例数ｎ＝２）。このときの増幅曲線を図２に示す。ＢＡＣクローンＤＮＡはＥＧＦＲを１コピーのみ含むことがわかっている。アプライドバイオシステムズ社のソフト７５００  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて増幅曲線を解析した結果、ＥＧＦＲのコピー数は、アダプタ付加対照ＤＮＡ（検体２−２）に対してアダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ（検体１−２）が１７倍であった。
【００５７】
（５）まとめ及び考察
ゲノムを制限酵素で切断後、アダプター配列を付加することで、ゲノム中に複数の配列が多数存在することになる。しかし、アダプター側に結合するプライマーからはＰＣＲが進むが、反対側のプライマーが結合できるのはＥＧＦＲ直前領域なので、効率よくＰＣＲが行われるのはある特定の領域だけである。さらに、定量的ＰＣＲに最も大きな意味をもつ標識プローブであるが、これはアダプター配列とＥＧＦＲ直前領域との連結部分にのみ結合する。Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲ方法の原理上、プライマーで挟まれた領域にプローブが結合しないと定量できない。よって、両側から効率よくＰＣＲが進み、かつ標識プローブが結合するアダプター配列−ＥＧＦＲ直前領域のみが定量されると考えられる。増幅領域となるテンプレート量が等しければ増幅曲線が同一になることを利用し、アダプタ付加対照ＤＮＡとアダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡについてそれぞれの増幅曲線が等しくなるような量を把握した。アダプタ付加対照ＤＮＡとアダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡにおいて、アダプターが付加されたＥＧＦＲ領域の双方の量をそろえた後に、ＥＧＦＲ領域に特異的なプライマーミックスで定量した。ＢＡＣクローンＤＮＡ中の標的核酸のコピー数は１とわかっているので、ゲノムＤＮＡと比較した時に得られた値（１７倍）は、ゲノムＤＮＡ中の標的核酸のコピー数の絶対値を反映していると考えられる。  ＜実施例２＞
ゲノムとしてヒト肺癌細胞株Ａ４３１由来ゲノムＤＮＡ、対照ＤＮＡとしてＢＡＣクローンＤＮＡ、標的核酸としてＥＧＦＲを用い、本発明に係るコピー数の検出方法により、Ａ４３１細胞由来ゲノムＤＮＡ中で増加しているＥＧＦＲのコピー数を定量した。Ａ４３１細胞では、エクソン１５の前後の領域で増加しているＥＧＦＲが異なることが報告されている（参考文献１；MOL． Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ. Ｊｕｌｙ １９８５， ｐ１７２２−１７３４  参考文献２；Ｊｐｎ. Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. （Ｇａｎｎ）， ７９， １１７４−１１８３; Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， １９８８）。Ａ４３１細胞においてＥＧＦＲのコピー数は全体的に増加しているが、特にエクソン１５より前の一部の領域が多く増加していると言われている。そこで、イントロン１とエクソン１９を同時に定量し、各領域のコピー数の絶対値を求めた。
【００５８】
Ｉ．ＥＧＦＲを含む核酸の調製
ヒト類表皮癌標準細胞Ａ４３１(大日本製薬社製)から、ゲノムＤＮＡ抽出精製キット（商品名：ＤＮＥａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ；キアゲン社製）を用いて、実施例１のＩ−（１）に従って、ゲノムＤＮＡを抽出、精製した。ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジー社製）を用いてこのゲノムＤＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、２００ｎｇ／μｌだった。ＥＧＦＲを含むＢＡＣクローンＤＮＡは実施例１と同様のＲＰＣＩ−１１−８１５Ｋ２４（インビトロジェン社製）を用いた。
【００５９】
ＩＩ．制限酵素による切断とアダプター配列付加
制限酵素とアダプター配列の選択、およびＤＮＡに対する制限酵素処理とアダプター配列付加は実施例１と同様に行った。こうして得られた、Ａ４３１細胞由来のゲノムＤＮＡを制限酵素処理したものを断片化標的核酸含有ＤＮＡ２（検体３−１）と称する。さらに、断片化測定用ＤＮＡ２（検体３−１）にアダプター配列を付加した検体を、アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ２（検体３−２）と称する。ＢＡＣクローンＤＮＡについては実施例１と同様に、制限酵素処理されたＢＡＣクローンＤＮＡを断片化対照ＤＮＡ（検体２−１）、さらにアダプター配列が付加された検体をアダプタ付加対照ＤＮＡ（検体２−２）と称する。
【００６０】
ＩＩＩ．定量的ＰＣＲ方法によるコピー数の定量
（１）定量ＰＣＲ用のプライマー、プローブの設定
アダプター配列用プライマーミックスは実施例１と同様のものを使用した。ＥＧＦＲ用プライマーミックスで、イントロン１を検出するものは実施例１と同様の配列を用い、ＥＧＦＲ用プライマーミックス−１と称する（配列は表７参照）。さらに、エクソン１９を検出するプライマーミックスを設計し、ＥＧＦＲ用プライマーミックス−１９と称する（配列は表７参照）。尚、プライマーとプローブはアプライドバイオシステムズ社に依頼して合成した。
【００６１】
【表７】
2010000003.tif 000008
【００６２】
（３）定量的ＰＣＲ方法によるコピー数の定量
定量的ＰＣＲ方法によりアダプタ付加対照ＤＮＡ（検体２−２）と、アダプタ付加標的核酸含有ＤＮＡ２（検体３−２）でアダプター配列とＥＧＦＲを含む断片の分子数をそろえた（例数ｎ＝３）。このときの増幅曲線を図３に示す。試薬や手順は実施例１−ＩＩＩ−（３）に従い、検体１−１と同様に行った。その後、各検体に含まれるＥＧＦＲのイントロン１とエクソン１９のコピー数を定量的ＰＣＲ方法により定量した（例数ｎ＝３）。前記ＥＧＦＲ用プライマーミックス１および１９（商品名：Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて、表６に従ってＰＣＲ溶液を調製し、実施例１−ＩＩＩ−（３）と同様の条件で定量的ＰＣＲ方法を行った。このときの増幅曲線を図４に示す。アプライドバイオシステムズ社のソフト７５００  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて増幅曲線を解析した結果、検体２−２に対する検体３−２ＥＧＦＲのコピー数は、イントロン１で約３４倍、エクソン１９で約１６倍であった。
【００６３】
（４）考察
実施例１と同様、両側から効率よくＰＣＲが進み、かつ標識プローブが結合するアダプター配列−ＥＧＦＲ直前領域のみが定量されると考えられる。増幅曲線をもとにＢＡＣクローンＤＮＡとゲノムＤＮＡの量をそろえた後、ＥＧＦＲの２箇所についてそれぞれ定量ＰＣＲ方法を行ったところイントロン１とエクソン１９ではコピー数の絶対値が異なっていた。非特許文献３によると、Ａ４３１細胞由来のＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションした結果、ＥＧＦＲ領域は約２０倍に増加しているとの報告がある。さらに非特許文献２によると、Ａ４３１細胞ではＥＧＦＲは全体的に重複しているが、すべてのＥＧＦＲ領域が均一に重複しているとは限らず、エクソン１５より前の部分のみが重複している部分もある。つまり、サザンハイブリダイゼーションによって得られたコピー数はこれら不均一な重複も含め平均した数値である。本手法で得られた結果は、これら不均一な重複部位のコピー数をも個別に検出していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例１における第１の定量的ＰＣＲを行った際の増幅曲線である。
【図２】実施例１における第２の定量的ＰＣＲを行った際の増幅曲線である。
【図３】実施例２における第１の定量的ＰＣＲを行った際の増幅曲線である。
【図４】実施例２における第２の定量的ＰＣＲを行った際の増幅曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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