(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療用の、トランスフェリン−薬剤複合体組成物、トランスフェリン−薬剤複合物などの癌治療に使用される分子複合体を形成する方法、および、そのために用いる中間化合物の提供。【解決手段】式（Ｉ）を有する分子複合体を提供する。式中、ｎは複合数であり、Ｐはタンパク質などの担体分子の部分であり、Ｒ１は生物学的活性分子又はその類似体、誘導体、塩若しくは第二級アミンの部分であり、Ｚは−Ｏ−又はＮＨ−であり、Ｙは、任意に１個又は複数のフェニルで置換され、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、任意に１個又は複数のアルキル又はフェニルで置換されたシクロアルキル基、或いは任意に１個又は複数のアルキル、電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基である。分子複合体を適切な投与量で患者に投与することを含む、患者の目的とする標的細胞に生物学的活性分子を集中させる方法。2010254696.tif 000081【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の構造を有する分子複合体、
【化１】
2010254696.tif 000048
［式中、
（ａ）ｎは、前記分子複合体の複合数であり、
（ｂ）Ｐは、少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有する分子の脱アミノ部分であり、
（ｃ）Ｒ１は、
（１）（ｉ）式Ｒ１−ＯＨで表される、ヒドロキシル基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体の脱ヒドロキシル部分、並びに
（２）（ｉ）式Ｒ１−ＮＨ２で表される、アミノ基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体あるいはこれらの塩又は第二級アミンの脱アミノ部分、から選択され、
（ｄ）Ｚは、Ｒ１が前記の脱ヒドロキシル部分である場合には−Ｏ−、Ｒ１が前記の脱アミノ部分である場合には−ＮＨ−であり、
（ｅ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個又は複数のアルキル、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項２】
Ｐがタンパク質である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項３】
前記タンパク質がトランスフェリンである、請求項２に記載の分子複合体。
【請求項４】
ｎが１から５の整数である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項５】
前記生物学的活性分子が癌治療に有効な薬剤である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項６】
前記薬剤が天然物癌治療薬である、請求項５に記載の分子複合体。
【請求項７】
前記薬剤が、タキサン、カンプトテシン、エポシロン、ククルビタシン、クアシノイド、アントラサイクリン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項５に記載の分子複合体。
【請求項８】
Ｒ１部分が、７−デヒドロキシルパクリタキセル、１０−デヒドロキシルパクリタキセル、２’−デヒドロキシルパクリタキセル、３’−デ−ベンズアミドパクリタキセル、３−デヒドロキシルコレステロール、及び２０−デヒドロキシルカンプトテシン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項９】
Ｙが−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは３から７の整数）である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項１０】
Ｒ１が、７−デヒドロキシルパクリタキセル部分であり、Ｚが−Ｏ−であり、Ｙが−（ＣＨ２）３−である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項１１】
Ｐがトランスフェリンであり、ｎが３である、請求項１０に記載の分子複合体。
【請求項１２】
Ｒ１が２’−デヒドロキシルパクリタキセル部分であり、Ｚが−Ｏ−であり、Ｙが−（ＣＨ２）４−である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項１３】
Ｐがトランスフェリンであり、ｎが１及び２から選択される、請求項１２に記載の分子複合体。
【請求項１４】
分子複合体の形成に有用な、次式の構造を有する化合物。
【化２】
2010254696.tif 000049
［式中、
（ａ）Ｒ１は、
（１）（ｉ）式Ｒ１−ＯＨで表される、ヒドロキシル基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体の脱ヒドロキシル部分、並びに
（２）（ｉ）式Ｒ１−ＮＨ２で表される、アミノ基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体あるいはこれらの塩又は第二級アミンの脱アミノ部分、から選択され、
（ｃ）Ｚは、Ｒ１が前記の脱ヒドロキシル部分である場合には−Ｏ−であり、Ｒ１が前記の脱アミノ部分である場合には−ＮＨ−であり、
（ｄ）Ｒ２は、−ＣＨ＝ＣＨ（Ｗ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）Ｗ、及び−Ｃ（Ｏ）Ｈから選択され、
（ｅ）Ｗは、
（１）水素、
（２）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（４）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択され、
（ｆ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項１５】
Ｒ２が、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）、及び−Ｃ（Ｏ）Ｈから選択される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記生物学的活性分子が癌治療に有効な薬剤である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
前記薬剤が天然物癌治療薬である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記薬剤が、タキサン、カンプトテシン、エポシロン、ククルビタシン、クアシノイド、アントラサイクリン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１部分が、７−デヒドロキシルパクリタキセル、１０−デヒドロキシルパクリタキセル、２’−デヒドロキシルパクリタキセル、３’−デ−ベンズアミドパクリタキセル、３−デヒドロキシルコレステロール、及び２０−デヒドロキシルカンプトテシン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｙが、−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは３から７の整数）である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１が、７−デヒドロキシルパクリタキセル部分であり、Ｚが−Ｏ−であり、Ｙが−（ＣＨ２）３−である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１が、２’−デヒドロキシルパクリタキセル部分であり、Ｚが−Ｏ−であり、Ｙが−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは４から７の整数）である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１が、７−デヒドロキシル２’−保護パクリタキセル部分であり、Ｒ２が、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から選択される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１が、７−デヒドロキシル−２’−ヒドロキシルパクリタキセル部分であり、Ｒ２が、−Ｃ（Ｏ）Ｈである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２５】
（Ａ）
（１）式Ｒ１−ＯＨで表される、ヒドロキシル基を有する生物学的活性分子、並びにその類似体及び誘導体、及び、
（２）式Ｒ１−ＮＨ２で表される、アミノ基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体、あるいはそれらの塩又は第二級アミン
から選択される第一化合物を、次式
【化３】
2010254696.tif 000050
から選択される第二化合物と反応させて次式の第三化合物を生成する段階と、
【化４】
2010254696.tif 000051
（Ｂ）前記第三化合物を、次式の第四化合物に変換する段階と、
【化５】
2010254696.tif 000052
（Ｃ）前記第四化合物を、少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有する分子と複合させて次式の分子複合体を形成させる段階、
とを含む、分子複合体の製造方法。
【化６】
2010254696.tif 000053
［上記各式で、
（ａ）Ｘはハロゲンであり、
（ｂ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択され、
（ｃ）Ｗは、
（１）水素、
（２）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（４）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択され、
（ｄ）Ｒ１は、前記第一化合物の脱ヒドロキシ部分であり、Ｚは、前記第一化合物が前記のヒドロキシル基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体である場合には、−Ｏ−であり、
（ｅ）Ｒ１は、前記第一化合物の脱アミノ部分であり、Ｚは、前記第一化合物が前記のアミノ基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体、あるいはそれらの塩又は第二級アミンである場合には、−ＮＨ−であり、
（ｆ）ｎは、前記の分子複合体の複合数であり、及び
（ｇ）Ｐは、少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有する前記分子である。］
【請求項２６】
Ｗが水素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｐがタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質がトランスフェリンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｎが１から５の整数である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記の生物学的活性分子が癌治療に有効な薬剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が天然物癌治療薬である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、タキサン、カンプトテシン、エポシロン、ククルビタシン、クアシノイド、アントラサイクリン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１部分が、７−デヒドロキシルパクリタキセル、１０−デヒドロキシルパクリタキセル、２’−デヒドロキシルパクリタキセル、３’−デ−ベンズアミドパクリタキセル、３−デヒドロキシルコレステロール、及び２０−デヒドロキシルカンプトテシン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
Ｙが−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは３から７の整数）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記第三化合物を前記第四化合物に変換する段階が、前記第三化合物を次式
【化７】
2010254696.tif 000054
のジオールに酸化し、その後に前記ジオールを前記第四化合物に酸化することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有する前記分子がトランスフェリンタンパク質であり、前記第四化合物を前記分子と複合させる段階が、第四化合物、ＤＭＳＯ及びトランスフェリンＰＢＳ緩衝液を混合して分子複合体を含有する混合物を形成することを含む、請求範囲２５に記載の方法。
【請求項３７】
分子複合体を含有する前記混合物に反応停止剤を添加する段階を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応停止剤がエタノールアミンＰＢＳ溶液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１が３−デヒドロキシルコレステロール部分であり、前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、コレステロール、塩化メチレン、５−ヘキセン酸、ＤＣＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１が、３−デヒドロキシルコレステロール部分であり、前記第三化合物を前記第四化合物に変換する段階が、窒素雰囲気下で、前記第三化合物、ＴＨＦ、ｔ−ＢｕＯＨ、水、ＮＭＯ、ＮａＩＯ４、及びＯｓＯ４を混合することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１が、２０−デヒドロキシルカンプトテシン部分であり、前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、カンプトテシン、５−ヘキセン酸、ＤＭＦ、ＤＩＰＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ１が、２０−デヒドロキシルカンプトテシン部分であり、前記第三化合物を前記第四化合物に変換する段階が、窒素雰囲気下で、前記第三化合物、ＴＨＦ、アセトン、ＡＣＮ、水、Ｔ−ＢｕＯＨ、ＮＭＯ、ＮａＩＯ４及びＯｓＯ４を混合することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
（Ａ）パクリタキセルの２’−ヒドロキシル位を保護して、次式の第一化合物を形成する段階と、
【化８】
2010254696.tif 000055
（Ｂ）前記第一化合物を次式から選択される第二化合物と反応させて、
【化９】
2010254696.tif 000056
次式の第三化合物を形成する段階と、
【化１０】
2010254696.tif 000057
（Ｃ）前記第三化合物を、次式の第四化合物に変換する段階と、
【化１１】
2010254696.tif 000058
（Ｄ）前記第四化合物の２’位を脱保護して、次式の第五化合物を形成する段階と、
【化１２】
2010254696.tif 000059
（Ｅ）前記第五化合物をトランスフェリンと複合させて、次式の構造を有する分子複合体を形成する段階と
【化１３】
2010254696.tif 000060
を含む、癌治療に使用するためのトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の製造方法。
［上記各式で、
（ａ）ｎは１から５の整数であり、
（ｂ）Ｐ１はヒドロキシル保護基であり、
（ｃ）Ｘはハロゲンであり、
（ｄ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直線は分岐状アルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項４４】
前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第一化合物、塩化メチレン、５−ヘキセン酸、ＤＩＰＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第三化合物を前記第四化合物に変換させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第三化合物、ＡＣＮ、ＴＨＦ、水、ＮＭＯ、ＮａＩＯ４、ＯｓＯ４及びｔ−ＢｕＯＨを混合することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第四化合物を脱保護する段階が、窒素雰囲気下で、前記第四化合物、ＴＢＡＦ及びＴＨＦを混合することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記第五化合物をトランスフェリンと複合させる段階が、前記第五化合物、ＤＭＳＯ及びトランスフェリンＰＢＳ緩衝液／ＤＭＳＯ溶液を混合することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
（Ａ）次式の第一化合物を、
【化１４】
2010254696.tif 000061
次式から選択される第二化合物と反応させて、
【化１５】
2010254696.tif 000062
次式の第三化合物を形成する段階と、
【化１６】
2010254696.tif 000063
（Ｂ）前記第三化合物を次式の第四化合物に変換する段階と、
【化１７】
2010254696.tif 000064
（Ｃ）前記第四化合物をトランスフェリンと複合させて、次式の構造を有する分子複合体を形成する段階と
【化１８】
2010254696.tif 000065
を含む、癌治療に使用するためのトランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体の製造方法。
「上記各式で、
（ａ）ｎは１から５の整数であり
（ｂ）Ｘはハロゲンであり
（ｃ）Ｗは
（１）水素
（２）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（４）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択され、
（ｄ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。」
【請求項４９】
前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第一化合物、塩化メチレン、５−ヘプテン酸、ＤＩＰＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第一化合物、塩化メチレン、オレイン酸、ＤＩＰＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第三化合物を前記第四化合物に変換させる段階が、窒素雰囲気下で前記第三化合物、アセトン、水、ＮＭＯ、ＮａＩＯ４、ＯｓＯ４及びｔ−ＢｕＯＨを混合することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記第四化合物をトランスフェリンと複合させる段階が、前記第四化合物、ＤＭＳＯ及びトランスフェリンＰＢＳ緩衝液／ＤＭＳＯ溶液を混合することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
（Ａ）次式の第一化合物を、
【化１９】
2010254696.tif 000066
次式から選択される第二化合物と反応させて、
【化２０】
2010254696.tif 000067
次式の第三化合物を形成する段階と、
【化２１】
2010254696.tif 000068
（Ｂ）前記第三化合物を次式の第四化合物に変換する段階と、
【化２２】
2010254696.tif 000069
（Ｃ）前記第四化合物をトランスフェリンと複合させて、次式の構造を有する分子複合体を形成する段階と
【化２３】
2010254696.tif 000070
を含む、癌治療に使用するためのトランスフェリン−３’−パクリタキセル複合体の製造方法。
［上記各式で、
（ａ）ｎは１から５の整数であり、
（ｂ）Ｒ３は、
（１）ＮＨ２、及び
（２）ＮＨ２ＨＡ（ここでＨＡは（ｉ）有機酸及び（ｉｉ）鉱酸から選択される）から選択され、
（ｃ）Ｘはハロゲンであり、
（ｄ）Ｗは、
（１）水素、
（２）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（４）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択され、
（ｅ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項５４】
前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第一化合物、塩化メチレン、５−ヘプテン酸、ＤＣＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、最初に、前記第一化合物を、対応するアミンに遊離させることを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記第三化合物を前記第四化合物に変換させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第三化合物、ＡＣＮ、水、ＮＭＯ、ＮａＩＯ４、ＯｓＯ４及びＴＨＦを混合することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記第四化合物をトランスフェリンと複合させる段階が、前記第四化合物、ＤＭＳＯ及びトランスフェリンＰＢＳ緩衝液／ＤＭＳＯ溶液を混合することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
（Ａ）次式の第一化合物を、
【化２４】
2010254696.tif 000071
次式から選択される第二化合物と反応させて、
【化２５】
2010254696.tif 000072
次式の第三化合物を形成する段階と、
【化２６】
2010254696.tif 000073
（Ｂ）前記第三化合物を次式の第四化合物に変換する段階と、
【化２７】
2010254696.tif 000074
（Ｃ）前記第四化合物をトランスフェリンと複合させて、次式の構造を有する分子複合体を形成する段階と
【化２８】
2010254696.tif 000075
を含む、癌治療に使用するためのトランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体の製造方法。
［上記各式で、
（ａ）ｎは１から５の整数であり、
（ｂ）Ｘはハロゲンであり、
（ｃ）Ｗは、
（１）水素、
（２）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（４）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又は電子吸引若しくは電子供与の基で置換された芳香族基から選択され、
（ｄ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項５９】
前記第一化合物を前記第二化合物と反応させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第一化合物、５−ヘキセン酸、ＤＭＦ、ＤＩＰＣ及び４−ＰＰを混合することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第三化合物を前記第四化合物に変換させる段階が、窒素雰囲気下で、前記第三化合物、アセトン、ＡＣＮ、ＴＨＦ、水、ＮＭＯ、ＮａＩＯ４、ＯｓＯ４及びｔ−ＢｕＯＨを混合することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記第四化合物をトランスフェリンと複合させる段階が、前記第四化合物、ＤＭＳＯ及びトランスフェリンＰＢＳ緩衝液／ＤＭＳＯ溶液を混合することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
トランスフェリン−ローダミン１２３複合体を形成するのに有用な、次式の構造を有する化合物。
【化２９】
2010254696.tif 000076
［上式で、Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項６３】
Ｙが−（ＣＨ２）３−である、請求項６２に記載の化合物。
【請求項６４】
次式のアルデヒドを、
【化３０】
2010254696.tif 000077
トランスフェリン及び次式のローダミン１２３を含む溶液に添加して、
【化３１】
2010254696.tif 000078
次式のトランスフェリン−ローダミン１２３複合体を形成する
ことを含む、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体の製造方法。
【化３２】
2010254696.tif 000079
［上記各式で
（ａ）ｎは１から５の整数であり、
（ｂ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項６５】
トランスフェリン、Ｈｅｐｅｓ緩衝塩、ローダミン１２３及びグルタルアルデヒドを混合して前記トランスフェリン−ローダミン１２３複合体を形成する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記溶液を反応停止剤で停止させることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記反応停止剤がエタノールアミンＨＢＳ溶液である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
次式の構造を有する分子複合体の選択された量を患者に投与することを含む、患者の標的細胞に選択的に生物学的活性分子を集中させる方法。
【化３３】
2010254696.tif 000080
［式中、
（ａ）ｎは前記分子複合体の複合数であり、
（ｂ）Ｐは少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有し前記選択される標的細胞を攻撃する分子の脱アミノ部分であり、
（ｃ）Ｒ１は、
（１）（ｉ）式Ｒ１−ＯＨで表される、ヒドロキシル基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体の脱ヒドロキシル部分、並びに
（２）（ｉ）式Ｒ１−ＮＨ２で表される、アミノ基を有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体、あるいはこれらの塩又は第二級アミンの脱アミノ部分から選択され、
（ｄ）Ｚは、Ｒ１が前記の脱ヒドロキシル部分から選択される場合には−Ｏ−であり、Ｒ１が前記の脱アミノ部分から選択される場合には−ＮＨ−であり、
（ｅ）Ｙは、
（１）任意に、１個又は複数のフェニル基で置換され、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、
（２）任意に、１個若しくは複数のアルキル基又はフェニル基で置換されたシクロアルキル基、及び
（３）任意に、１個若しくは複数のアルキル基、電子吸引基又は電子供与基で置換された芳香族基から選択される。］
【請求項６９】
Ｐがタンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記タンパク質がトランスフェリンである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ｎが１から５の整数である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記生物学的活性分子が癌治療に有効な薬剤である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記薬剤が天然物癌治療剤である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記薬剤がタキサン、カンプトテシン、エポシロン、ククルビタシン、クアシノイド、アントラサイクリン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
Ｒ１部分が、７−デヒドロキシルパクリタキセル、１０−デヒドロキシルパクリタキセル、２’−デヒドロキシルパクリタキセル、３’−デ−ベンズアミドパクリタキセル、３−デヒドロキシルコレステロール、及び２０−デヒドロキシルカンプトテシン、並びにこれらの類似体及び誘導体から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
Ｙが−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは３から７の整数）である、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本出願は、２００１年３月２３日提出の米国仮出願第６０／２７８，２４３号の利益を請求する。【０００２】  本発明は、一般に、患者の治療に使用する化合物及び方法に関する。より詳細には、本発明は癌治療用分子複合体に関する。特に、本発明は、トランスフェリン−薬剤複合体、その形成に有用な方法及び中間体、並びにその複合体を使用して患者を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】  現在、数多くの抗癌剤が、様々な癌の治療において臨床的に使用されている。例えば、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びタキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）は、乳癌及び卵巣癌の治療に使用される２つの有望な抗癌剤であるが、皮膚、肺、頭部及び頚部の癌腫など他の癌の治療においても有望視されている。この他にも、これらの癌及び他の癌を治療するために有望な化学療法剤が開発され、試験されている。パクリタキセル、タキソテール、並びに他のタキサン類（ｔａｘａｎｅｓ）、カンプトテシン類（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）類、エポシロン類（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）及びクアシノイド類（ｑｕａｓｓｉｎｏｉｄｓ）などの化合物、更に癌治療で有効性を示すその他の化合物が大きな関心を呼んでいる。特に、インビトロ及びインビボで抗癌活性を示す天然物薬剤が大きな関心を呼んでいる。このような化合物は、例えば、潜在的に再生可能な資源から入手できるという点で望ましいものである。【０００４】  しかし、確認されている多くの抗癌性化合物には、化学療法で使用する上での幾つかの問題点がある。その特有の問題の一つは、多くの抗癌性化合物が水に不溶であること関し、それが、化学療法に役立つ適切な医薬製剤を開発する上で大きな問題が生じさせていることである。これらの薬剤の水溶性を増大させる試みにおいて、これら薬剤は、しばしば、様々な担体化合物と共に製剤されている。しかし、これらの担体化合物は、その製剤を使用して治療した患者に、様々な副作用を引き起こすことがある。例えば、パクリタキセル、カンプトテシン及びこれらの類似体は、一般に、ポリエトキシレートひまし油およびエタノールの混合物と製剤されるが、これらの混合物は、臨床試験において好中球減少症、粘膜性、心性及び神経性の毒性、過敏症、ヒスタミン放出及び重症アレルギー反応を含む副作用をもたらすことが報告されている。【０００５】  癌治療でこれらの化学療法剤を使用する際のもう一つの問題は、正常健常細胞に有害な影響を及ぼさないで、癌細胞を攻撃することの難しさである。例えば、パクリタキセルは、正常細胞よりも癌細胞でより頻度が高い、有糸分裂及び細胞分裂過程を妨害することによってその抗癌活性を発揮する。しかし、化学療法を受けている患者は、正常健常細胞内での有糸分裂の妨害に関連する様々な副作用を体験することがある。【０００６】  従って、癌の治療法において、化学療法剤で癌細胞を直接的に攻撃するための化合物及びその使用法の開発が、極めて望まれている。これが可能になれば、担体化合物による有毒な副作用の軽減又は排除、薬剤の標的部位への効率的な送達、並びに投与薬剤の投与量の削減、及びその結果としての、健常細胞に対する毒性や化学療法における投与費用の低減に繋げることができる。【０００７】  その興味ある具体的手法の一つとして、腫瘍認識分子と複合させた抗癌剤部分を利用する方法がある。例えば、米国特許第６，１９１，２９０号（Ｓａｆａｖｙ）には、腫瘍細胞表面の受容体と結合できる受容体リガンドペプチドと複合させたタキサン部分の形成及びその使用について考察がなされている。Ｓａｆａｖｙは特に、このような受容体リガンドペプチドを、ＢＢＮ／ＧＲＰ受��体認識ペプチド、ソマトスタチン受容体認識ペプチド、表皮成長因子受容体認識ペプチド、モノクローナル抗体又は受容体認識炭水化物とすることができることを指摘している。【０００８】  特に興味ある腫瘍認識分子の一つとしては、ヒトのタンパク質であるトランスフェリンがある。トランスフェリンは、分子量が約７９５５０の血清糖タンパク質であり、ヘモグロビン合成のために成熟途上の赤血球に対する鉄の輸送に関与している。トランスフェリンは、鉄イオンに対する結合親和性が極めて高く、それによって、血漿中には、鉄の強毒性形態である遊離の鉄イオンが、本質的に存在しない。さらに、成熟過程にある細胞に必要な鉄分は、ジフェリック・トランスフェリン（各タンパク質分子が特異的に２個のＦｅ３＋イオンと結合してサーモンピンク色の錯体を形成したもの）によって供給される。すなわち、鉄が結合したトランスフェリンは、細胞膜上の受容体と結合し、そのトランスフェリン−受容体複合体が細胞膜内に取込まれ、次いで細胞質に鉄が放出されて、アポトランスフェリン−受容体複合体は細胞表面に戻り、アポトランスフェリンが受容体から放出されることになる。成熟過程にある細胞は、その細胞表面にトランスフェリン受容体を有しているが、静止期にある細胞ではトランスフェリン受容体が存在しないか、あっても極少数であることが明らかになっている。さらに、癌細胞には多くのトランスフェリン受容体が存在し、興味いことには、薬剤耐性癌細胞にはさらに多くのトランスフェリン受容体が存在することが明らかにされている。癌細胞上にはトランスフェリン受容体が存在し、正常細胞上には存在しないと言うことは、トランスフェリン複合体が癌細胞に対する標的薬剤としての一つの選択肢となり得る可能性を示唆している。例えば、Ｙｅｈ他の論文「Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ」、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３２巻、１−１１頁（１９８４年）、及びＳｉｚｅｎｓｋｙ他の論文「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７巻、１６３−１６６頁（１９９２年）で報告されているように、癌治療におけるトランスフェリン−アドリアマイシン複合体の治療指数はフリーのアドリアマイシンよりも大きい。【０００９】  その他の研究でも、ドコルビシン（Ｄｏｃｏｒｕｂｉｃｉｎ）（Ｋｒａｔｚ他の論文「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｄｏｃｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｕｐｔａｋｅ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、８７巻、３３８−３４６頁（１９９８年））及びマイトマイシン（Ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ（Ｔａｎａｋａ他の論文「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｅｒ−��ｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９巻、７７４−７７７頁（１９９６年））などの各種化学療法剤と複合させたトランスフェリンを利用する、癌治療に対する有望な方法が提案されている。【００１０】  有効なトランスフェリン−パクリタキセル複合体を目指した試みが、Ｂｉｃａｍｕｍｐａｋａらの論文「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｎ  Ｈ６９  Ｃｅｌｌｓ」、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、５巻、１３８１−１３８３頁（１９９８年）で報告されている。特に、Ｂｉｃａｍｕｍｐａｋａらは、２’−グルタリル−ヘキサンジアミンパクリタキセルを合成し、次いで、それを、グルタルアルデヒドリンカーを使用して、２’−グルタリル−ヘキサンジアミン基のアミンにより、トランスフェリンと結合させた。しかし、Ｂｉｃａｍｕｍｐａｋａは、得られたトランスフェリン−パクリタキセル複合体におけるＨ６９細胞の増殖を阻止する能力が、元のパクリタキセル薬剤の５．４分の１未満であったと報告している。【００１１】  従って、トランスフェリン、Ｓａｆａｖｙが認知した受容体リガンドペプチド、又は他のタンパク質、抗体、レクチン、或いは細胞表面に付着できるその他の物質などの各種分子に、化学療法剤を結合するための、新規な化合物を提供することに対する要求が理解されよう。また、そのような化合物の形成方法を提供することに対する要求も理解される。さらに、癌治療に使用するための新規な分子複合体、特に、新規なトランスフェリン−薬剤複合体に対する要求も理解される。最後に、改善されたトランスフェリン−薬剤複合体などの分子複合体の使用などによって、患者に化学療法用薬剤製剤を投与する、癌治療法用の新規な方法に対する要求も理解される。本発明は、これらの要求に応じるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，１９１，２９０号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｙｅｈ等、「Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ」、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３２巻、１−１１頁（１９８４年）
【非特許文献２】Ｓｉｚｅｎｓｋｙ等、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７巻、１６３−１６６頁（１９９２年）
【非特許文献３】Ｋｒａｔｚ等、「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｄｏｃｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｕｐｔａｋｅ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、８７巻、３３８−３４６頁（１９９８年）
【非特許文献４】マイトマイシン（Ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ（Ｔａｎａｋａ等、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｅｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９巻、７７４−７７７頁（１９９６年）
【非特許文献５】Ｂｉｃａｍｕｍｐａｋａ等、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｎ  Ｈ６９  Ｃｅｌｌｓ」、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、５巻、１３８１−１３８３頁（１９９８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】  本発明の目的は、ヒドロキシル基又はアミノ基を有する薬剤の新規かつ有用な分子複合体組成物を提供することである。【００１５】  本発明のさらなる目的は、癌治療用の、トランスフェリン−薬剤複合体組成物を提供することである。【００１６】  本発明の他の目的は、トランスフェリン−薬剤複合物などの、癌治療に使用される分子複合体を形成するために用いる中間化合物を提供することである。【００１７】  本発明の他の目的は、分子複合体、特にトランスフェリン−薬剤複合体を形成する効率的な方法を提供することである。【００１８】  本発明の更に他の目的は、癌患者が従来経験していた副作用を軽減又は排除する、患者に新規かつ有用な化学療法剤を投与する方法を提供することである。【００１９】  本発明の更に他の目的は、患者の癌細胞に化学療法剤を効率的に集中させるための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】  本発明によれば、次の式を有する分子複合体が得られる。【００２１】
【化１】
2010254696.tif 000002
「式中、ｎは分子複合体の複合数（例えば１〜５の整数）であり、Ｐはトランスフェリンタンパク質などの、少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有する分子の脱アミノ部分であり、Ｒ１はヒドロキシル基又はアミノ基を有する生物学的活性分子又はその類似体もしくは誘導体の、それぞれ、脱ヒドロキシル又は脱アミノの部分であり、Ｚはそれぞれ−Ｏ−又はＮＨ−であり、Ｙは、任意に１個又は複数のフェニルで置換された、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル基、任意に１個又は複数のアルキル又はフェニルで置換されたシクロアルキル基、或いは任意に１個又は複数のアルキル基、電子吸引基もしくは電子供与基で置換された芳香族基である。」
Ｐは、好ましくはトランスフェリンなどのタンパク質であり、そのタンパク質は、生物学的活性分子と結合構造を通じて結合している。生物学的活性分子は、癌治療に有用であるような天然物薬剤でよく、各種タキサン類、カンプトテシン類、エポシロン類、ククルビタシン類、クアシノイド類、アントラサイクリン類、並びにその類似体及び誘導体などが挙げられる。【００２２】  本発明はまた、トランスフェリン−薬剤複合体などの分子複合体の形成に有用な化合物に関する。その化合物は次の一般式を有している。【００２３】
【化２】
2010254696.tif 000003
「式中、Ｒ１、Ｙ及びＺは前記と同様であり、Ｒ２は−ＣＨ＝ＣＨ（Ｗ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）Ｗ、又は−Ｃ（Ｏ）Ｈである｛Ｗは水素、任意に１個又は複数のフェニルで置換される１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキル、任意に１個又は複数のアルキル又はフェニルで置換されたシクロアルキル、又は任意に１個又は複数のアルキル基、電子吸引基もしくは電子供与基で置換された芳香族基である。｝。」【００２４】  本発明はさらに、本発明による分子複合体の製造方法、特に癌治療に使用するためのトランスフェリン−薬剤複合体の製造方法に関する。この方法は、ヒドロキシル基又はアミノ基のいずれかを有する生物学的活性分子並びにその類似体及び誘導体（及び塩又は第二級アミン）からなる第１化合物を、次式の何れかの第２化合物と反応させて、【００２５】
【化３】
2010254696.tif 000004
次式の第３化合物を形成する段階と、【００２６】
【化４】
2010254696.tif 000005
第３化合物を次式の第４化合物に変換する段階と、【００２７】
【化５】
2010254696.tif 000006
第４化合物を少なくともｎ個の接近可能なアミノ官能基を有する分子と結合させて、次式の分子複合体を形成する段階とを含んでいる。【００２８】
【化６】
2010254696.tif 000007
「上記各式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ１、Ｚ、Ｗ、Ｙ、ｎ及びＰは前記と同様である。」
Ｗは、好ましくは水素であり、その結果第２化合物は末端オレフィンを有する。
第３化合物を第４化合物へ転換する段階は、第３化合物の酸化によって対応する次式のジオール中間体を介し、【００２９】
【化７】
2010254696.tif 000008
その後に、当該ジオールを酸化して第４化合物にすることによって行われる。【００３０】  本発明はさらに、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体、トランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体、トランスフェリン−３’−パクリタキセル複合体、及びトランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体の製造方法を提供する。本発明はまた、トランスフェリン−ローダミン１２３化合物、並びにその製造に用いる中間体及び方法を提供する。【００３１】  最後に、本発明は、本発明の複合化合物を利用して患者の選択された標的細胞に生物学的活性分子を、選択的に集中させる方法に関し、特に、トランスフェリン−薬剤複合体など本発明による分子複合体を、投与量を精選して、患者に投与することを含む方法に関するものである。【００３２】  本発明のこれらの目的及び他の目的については、本発明の例示的実施形態に関する以下の詳細な説明を添付の図面と併せ検討することによって容易に把握し、理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の形成で使用される７−アシル−ペンタナールパクリタキセルリンカー化合物を形成するための化学反応式を示す図である。
【図２】３−アシル−ペンタナールコレステロールリンカー化合物をトランスフェリンと結合させ、トランスフェリン−３−コレステロール複合体を形成するための化学反応式を示す図である。
【図３】２０−アシル−ペンタナールカンプトテシンリンカー化合物をトランスフェリンと結合させ、トランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体を形成するための化学反応式を示す図である。
【図４（ａ）】トランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体の形成で使用される２’−アシル−ペンタナールパクリタキセルリンカー化合物を形成するための化学反応式を示す図である。
【図４（ｂ）】トランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体の形成で使用される２’−アシル−ヘキサナールパクリタキセルリンカー化合物を形成するための化学反応式を示す図である。
【図４（ｃ）】トランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体の形成で使用される２’−アシル−ノナナールパクリタキセルリンカー化合物を形成するための化学反応式を示す図である。
【図５】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−３−コレステロール複合体のＫＢ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図６】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体のＫＢ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図７】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のＫＢ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図８】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−３−コレステロール複合体のＬｕ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図９】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体のＬｕ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１０】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のＬｕ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１１】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−３−コレステロール複合体のｈＴＥＲＴ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１２】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体のｈＴＥＲＴ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１３】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のｈＴＥＲＴ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１４】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のＫＢ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１５】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のＬｕ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１６】プロトコルＡにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のｈＴＥＲＴ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１７】プロトコルＢにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のＫＢ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１８】プロトコルＢにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のＬｕ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図１９】プロトコルＢにおける異なる濃度での、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体のｈＴＥＲＴ細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】  本発明は、新規な分子複合体、特に患者の癌治療で使用する新規なトランスフェリン−薬剤複合体を提供する。さらに、本発明は生物学的活性分子をトランスフェリン又はその他の分子などの担体分子と結合するために用いる新規な中間体化合物に関するものである。特に、本発明は、癌治療薬並びにその類似体及び誘導体、並びにその前駆体など、それぞれ、ヒドロキシル基及びアミノ基を有する生物学的活性分子のアルデヒドエステル誘導体及びアルデヒドアミド誘導体を提供する。これらの誘導体は、そのエステル結合又はアミド結合しているアルデヒド官能基とトランスフェリン分子又は他のタンパク質の各種アミノ官能基との間でシッフ塩基を形成することによって、ヒト・トランスフェリンタンパク質などの担体分子と結合することができる。
【００３５】  本発明はまた、ヒドロキシル基又はアミノ基を有する様々な生物学的活性化合物のトランスフェリン複合体、又は他の分子複合体、並びにその中間体の効率的な合成プロトコルを提供する。一般化した方法では、ヒドロキシル基又はアミノ基を含有する生物学的活性分子と、二重結合好ましくは末端オレフィンを有するカルボン酸又は酸ハロゲン化物などの適当なアシル化剤とを結合させることを含む。四酸化オスミウム触媒を用いて末端オレフィン部位を迅速かつ高効率で酸化し、次いで、得られたジオールを開裂してアルデヒドにすることによって、トランスフェリン複合体又は他の分子複合体の合成に適した前駆体が得られる。これら付加生成物の合成経路における最終段階は、アルデヒドを血液タンパク質であるトランスフェリンなどの担体分子と処理し、トランスフェリン単量体に生物学的活性分子を生成させることである。これらの生物学的活性分子では生物学的活性が増大していることが見出されている。本発明は、本明細書で開示するように、担体分子には、トランスフェリンの他、生物学的活性分子のエステルリンカー化合物及びアミドリンカー化合物のアルデヒド官能基と、シッフ塩基を形成することができる、少なくとも１個の接近可能なアミノ官能基を有する任意の分子を含めるように広く想定している。
【００３６】  また、本発明において、用語「生物学的活性分子」は、細胞、組織、脈管内などでの１種又は複数の生物学的過程に一般的に影響を与え、又は関与する任意の分子を含むものとして、広く解釈して理解されるべきである。このような生物学的活性分子には、薬剤、抗体、抗原、レクチン、色素、染料、トレーサ又は他の類似分子が含まれる。特に、本発明での使用を企図しているヒドロキシル基含有分子又はアミノ基含有分子には、パクリタキセル、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）及び他のタキサン類、コレステロール、ローダミン１２３、カンプトテシン類、エポシロンＢなどのエポシロン類、ククルビタシン類、グローカルボロン（ｇｌａｕｃａｒｕｂｏｌｏｎｅ）、ブルサトール（ｂｒｕｓａｔｏｌ）及びブルシアンチン（ｂｒｕｃｅａｎｔｉｎ）などのクアシノイド類、アドリアマイシン、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）などのアントラサイクリン類、並びにこれらの類似体及び誘導体、並びにその他の化合物が含まれる。
用語「分子複合体」は、例えば本明細書で開示されるエステル及びアミドのシッフ塩基結合を通して本発明の担体分子に結合している生物学的活性分子を含む任意の化合物を広く包含するものとして理解されるべきである。
【００３７】  本研究の中心は癌治療であるが、本願がさらに、各種のタンパク質又はその他の担体分子を、本発明により、他の応用分野を対象とした生物学的活性分子と複合させることを企図していることを理解されるべきである。
【００３８】（Ｉ．トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体）
本発明によってトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体を形成することができる。図１に示すように、先ず、パクリタキセルを様々な中間化合物を経由して７−パクリタキセルアルデヒドエステルに変換する。次いで、このアルデヒドエステルをトランスフェリンと結合させてトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体を形成する。
【００３９】Ａ．２’ＴＢＤＭＳパクリタキセルの調製
【００４０】
【化８】
2010254696.tif 000009
【００４１】  先ず、パクリタキセルの２’−ヒドロキシル基をＴＢＤＭＳで保護して２’−ＴＢＤＭＳパクリタキセルを形成する。反応例としてはＴＢＤＭＳを示したが、ＴＢＤＭＳの代わりにＴＲＯＣ，ＢＯＭ，ＣＢＺ，ベンジル、ＴＥＳ，ＥＥなど他の保護基も使用可能であることを認識されたい。
【００４２】  この材料は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５巻、８９３１−８９３４頁，１９９４年でＰｒｏｆ  Ｇｕｎｄａ  Ｇｅｏｒｇ他が述べている方法によって調製され、それに従って特徴付けられる。
【００４３】  パクリタキセル（２０．０ｇ、２３．４５ｍＭ）のジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下でイミダゾール（２３．９５ｇ、３５１．７ｍＭ）を添加し、続いてＴＢＤＭＳＣｌ（４９．５ｇ、３２８．３ｍＭ）を添加した。得られた溶液を、窒素雰囲気下、周囲温度で１６時間攪拌した。この段階でＴＬＣ分析を行い、出発物質が完全に消費されていることを確認し、水（２００ｍＬ）及び酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加して反応を終了した。有機層を分離し、水（１００ｍＬ×２回）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後濾過、留去して残渣を取り出し、真空オーブン中で乾燥し、さらに精製することなしに次の反応に使用した。
【００４４】Ｂ．２’保護パクリタキセルの７−ヘキセン酸エステルの調製
【００４５】
【化９】
2010254696.tif 000010
【００４６】  次に、好ましくは末端オレフィンを有する酸と反応させて、２’−保護パクリタキセルの７−ヘキセン酸エステルを形成した。本明細書の実施例では、５−ヘキセン酸を使用するが、本発明は、鎖末端から離れた位置にある二重結合を有するオレフィンアシル化剤をも想定していることを理解されたい。もっとも、好ましくは末端オレフィンを有する他の適当なアシル化剤を企図する。
例えば、本発明は次式の酸、
【００４７】
【化１０】
2010254696.tif 000011
又は次式の酸ハロゲン化物の使用を企図する。
【００４８】
【化１１】
2010254696.tif 000012
「上記各式中、Ｘはハロゲンであり、Ｙは、任意に１個若しくは複数のフェニル基で置換され１から２０個の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状のアルキル基、任意に１個若しくは複数のアルキル基またはフェニル基で置換されたシクロアルキル基、あるいは任意に１個若しくは複数のアルキル、電子吸引基または電子供与基で置換された芳香族基である。Ｗは、水素、任意に１個若しくは複数のフェニル基で置換され１から２０個の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状のアルキル基、任意に１個若しくは複数のアルキル基またはフェニル基で置換されたシクロアルキル基、あるいは任意に１個若しくは複数のアルキル、電子吸引基または電子供与基で置換された芳香族基である。」
【００４９】  ２’ＴＢＤＭＳパクリタキセル（２．０ｇ、２．０７ｍＭ）塩化メチレン（３０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下で、５−ヘキセン酸（０．４９ｍＬ、４．１４ｍＭ）を添加し、その後更にＤＩＰＣ（０．８１ｍＬ、５．１８ｍＭ）及び４−ＰＰ（０．０９５ｇ、０．６４ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を、４時間攪拌し、ＴＬＣ分析により完全に反応していることを判断した。水（５０ｍＬ）及び酢酸エチル（９０ｍＬ）を添加して反応を終了させ、有機層を分離し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。得られた生成物を濾過し、溶媒を留去して残渣を取り出し、精製すること無しに次の反応に供した。
【００５０】Ｃ．２’保護パクリタキセルの７−アルデヒド誘導体の調製
【００５１】
【化１２】
2010254696.tif 000013
【００５２】  末端オレフィン部位を酸化してジオールに変え、続いて末端炭素を開裂するとパクリタキセルの７−アルデヒド２’保護誘導体が得られる。二重結合が前に考察したように鎖末端から移動している（すなわち、前記式中のＷが水素でない）アシル化剤を使用する場合には、この反応中に起こる二重結合の開裂によって、二重結合を越えた鎖の部分が除去されることを理解されたい。また、例示した工程では単一段階として示されているが、次式のジオール、
【００５３】
【化１３】
2010254696.tif 000014
（及び、本明細書に記載された化合物に対応するジオール）は、ＮａＩＯ４無しでこの段階を実行することによって単離可能であることを認識されたい。ＮａＩＯ４で処理してこのジオールを酸化開裂すると末端アルデヒドが得られる。
【００５４】  ７−ヘキセノイル、２’ＴＢＤＭＳパクリタキセル（２．２ｇ、２．０７ｍＭ）のＡＣＮとＴＨＦ（各２０ｍＬ）の混合溶媒溶液に、水（２０ｍＬ）を加え、続いて窒素雰囲気下で、ＮＭＯ（０．４９ｇ、４．１４ｍＭ）、ＮａＩＯ４（０．８９ｇ、４．１４ｍＭ）及びＯｓＯ４（１３．１５ｍｇ、０．０５２ｍＭ）のｔ−ＢｕＯＨ溶液を添加した。得られた反応混合物を周囲温度で２時間攪拌し、酢酸エチル及び水（各１００ｍＬ）を加え反応終了とした。分離した有機層を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム及びハイドロサルファイトナトリウムを通して濾過した。濾液を蒸発乾固して、粗生成物を精製すること無しに脱シリル化反応に供した。
【００５５】Ｄ．パクリタキセルの７−アルデヒド誘導体の調製
【００５６】
【化１４】
2010254696.tif 000015
【００５７】  ２’位を次のように脱保護した。２’保護したパクリタキセルの７−アルデヒド誘導体（２．２５ｇ、２．０７ｍＭ）ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、周囲温度でＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（１．０Ｍ溶液を３．１１ｍＬ、３．１１ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を２時間攪拌した。ＴＬＣ分析によればこの時点で出発物質はなかった。酢酸エチル（２００ｍＬ）及び０．５ＮＨＣｌ（１００ｍＬ）を加え混合物の反応を終了し、分離した有機層を水（２００ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。有機層を濾過、蒸発乾固し、次いで酢酸エチル及びヘプタンを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製し、６０％の総収率で精製物質を得た。化合物はＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲによって解析した。
【００５８】Ｅ．トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の調製
次にアルデヒドエステル誘導体をトランスフェリンと結合させて、複合数ｎ（トランスフェリン１分子当たりのパクリタキセルの分子数）を有するトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体を形成させることができる。複合数は３であったが、条件を変更すると複合数ｎが１から５のトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体が生成する可能性も考えられる。本発明は、トランスフェリンの代わりに、接近可能なアミノ官能基を有する他のタンパク質などの担体分子を使用することが可能であり、得られる分子複合体の複合数もそれに応じて変動可能であることを当然考慮に入れている。
【００５９】
【化１５】
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【００６０】  ８０ｍｇ（１μｍｏｌ）のトランスフェリンを含むＰＢＳ緩衝液／ＤＭＳＯ溶液に、１９．０４ｍｇ（２０μｍｏｌ）の７−アシル−ペンタナルパクリタキセルを含むＤＭＳＯ溶液２ｍｌを滴下した。トランスフェリンＰＢＳ緩衝液／ＤＭＳＯ溶液は、トランスフェリンを４ｍｌのＰＢＳ（５０ｍｍｏｌ、ｐＨ８．０）に溶解し、さらにそのトランスフェリンＰＢＳ溶液に、０℃で、２ｍｌのＤＭＳＯを加えて調製した。反応混合物を、Ｃ２４振とう恒温器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｌａｓｓｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ、Ｅｄｉｓｏｎ、アメリカ）を使用して、３７℃で８時間振とうした。反応混合物を５．０μｍの濾過装置で濾過し、澄明な濾液を、ｓｕｐｅｒｄｅｘＨＲ２００カラム（２．０×３０ｃｍ）に２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．５ｍｌ／分の流速で流すＦＰＬＣによって精製した。トランスフェリンに対応する分画を集めて凍結乾燥した。
【００６１】  本明細書では例示しないが、７−パクリタキセル複合体と同様に１０−デアセチルパクリタキセルの分子複合体が形成されることを理解されたい。例えば、出発化合物として次式の１０−デアセチルパクリタキセルを用い、
【００６２】
【化１６】
2010254696.tif 000017
アシル化剤として６−ヘプテン酸を用い、上述の方法と同様にしてトランスフェリン−１０−アシル−ヘキサナールパクリタキセル複合体が形成される。当技術分野で知られているように、２’位及び７位の適切な保護及び脱保護を利用することができる。
【００６３】（ＩＩ．トランスフェリン−３−コレステロール複合体）
トランスフェリンに非細胞毒性分子を結合した場合の結果を調べるためにトランスフェリン−３−コレステロール複合体を調製した。以下で考察するように、これらの結果は、本発明による癌治療用トランスフェリン−薬剤複合体は、インビトロ又はインビボで細胞毒性活性を示す癌治療剤を使用して形成されるべきことを示唆する。例えば癌治療用分子以外の分野での応用を研究するために、３−コレステロールと別のタンパク質との様々な複合体を同様にして調製して、そのようなタンパク質の複合物と他の生物学的活性化合物と比較することが可能であろう。
【００６４】  図２に示すように、先ず、コレステロールを、各種中間化合物を経由して３−コレステロールアルデヒドエステルに変換し、次いで、それをトランスフェリンと結合させトランスフェリン−３−コレステロール複合体を形成する。前に考察したように、本明細書の実施例で使用する５−ヘキセン酸を、前に述べたようなその他各種アシル化剤で代替することができる。
【００６５】Ａ．３−ヘキセノイルコレステロールの調製
【００６６】
【化１７】
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【００６７】  コレステロ−ル（２．０ｇ、５．１７ｍＭ）塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液に、５−ヘキセン酸（０．６８ｍＬ、５．６９ｍＭ）を添加し、続いて窒素雰囲気下で、ＤＣＣ（１．６０ｇ、７．７６ｍＭ）及び４−ＰＰ（０．１１５ｇ、０．７８ｍＭ）を加えた。得られた反応混合物を、周囲温度で１時間攪拌し、メチルｔ−ブチルエーテル（６０ｍＬ）を加え反応終了とした。尿素を濾過により除去し、生成物を分液ロートに移し、１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及び塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。生成物をＭｇＳＯ４上で乾燥後、濾過し、溶媒を留去して残渣を得た。９５％以上の収率で得られた生成物を１Ｈ  ＮＭＲで解析した。
【００６８】Ｂ．コレステロールの３−アシル−ペンタナールエステルの調製
【００６９】
【化１８】
2010254696.tif 000019
【００７０】  コレステロール３−ヘキセン酸エステル（２．０ｇ、４．１４ｍＭ）のＴＨＦとｔ−ＢｕＯＨの混合溶媒（各１０ｍＬ）溶液に、水（５ｍＬ）を加え、引き続き窒素雰囲気下で、ＮＭＯ（０．９７ｇ、８．３ｍＭ）、ＮａＩＯ４（１．７８ｇ、８．３ｍＭ）及びＯｓＯ４（２１．３ｍｇ、０．０８３ｍＭ）のｔ−ＢｕＯＨ溶液を添加した。得られた反応混合物を、ＴＬＣ分析で調べて変換が完全になるまで１６時間攪拌した。反応混合物に珪藻土（１．６ｇ）を加えて濾過した。フィルタケーキを酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄し、濾液を分液ロートに移し、１Ｎ  ＨＣｌ（１５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）及び塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４上で乾燥した。濾過した溶液を蒸発乾固し、続いてカラムクロマトグラフィーで精製して８５％の収率で生成物を得た。生成物を１Ｈ  ＮＭＲで解析した。ＮＭＲ分析によればコレステロール系の内部二重結合は酸化条件でも変化していないことがわかった。
【００７１】Ｃ．トランスフェリン−３−コレステロール複合体の調製
次に、アルデヒドエステル誘導体をトランスフェリンと結合させ、複合数がｎであるトランスフェリン−３−コレステロール複合体を形成できる。
【００７２】
【化１９】
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【００７３】  ２０ｍｇ（０．５μｍｏｌ）のトランスフェリンを含むＰＢＳ−緩衝液（５０ｍｍｏｌ、ｐＨ７．０）２ｍＬに、１．２１ｍｇ（２．５μｍｏｌ）の３−アシル−ペンタナールコレステロールを含むＤＭＳＯ溶液１ｍＬを滴加した。反応混合物を、Ｃ２４振とう恒温器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｌａｓｓｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ、Ｅｄｉｓｏｎ、アメリカ）を用いて、３７℃で３０分間振とうした。この混合物に反応停止剤として１．５２７ｍｇ（２５ｍｍｏｌ）のエタノールアミンを含むＰＢＳ溶液０．５ｍＬを添加して反応を停止させた。次に、濁った混合物を４℃、１０００ｇで１０分遠沈し、上澄み液を、ｓｕｐｅｒｄｅｘＨＲ２００カラム（２．０×３０ｃｍ）を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．５ｍｌ／分の流速で流すＦＰＬＣで精製した。トランスフェリンに対応する分画を集め、凍結乾燥した。
【００７４】ＩＩＩ．トランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体
図３に示すように、先ず、カンプトテシンを様々な中間化合物を経由して２０−カンプトテシンアルデヒドエステルに変換し、次いで、それをトランスフェリンと結合させて、トランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体を形成する。本発明においては、トランスフェリンを、接近可能なアミノ官能基を有する他のタンパク質などの担体分子で代替可能であり、５−ヘキセン酸を、前に述べたような他のアシル化剤で代替可能である。
【００７５】Ａ．２０−ヘキセノイルカンプトテシンの調製
【００７６】
【化２０】
2010254696.tif 000021
【００７７】  ＤＭＦ（４０ｍＬ）中にカンプトテシン（２．０ｇ，５．７４ｍＭ）及び５−ヘキセン酸（０．７５ｍＬ、６．３１ｍＭ）を含む混合物に、窒素雰囲気下で、ＤＩＰＣ（０．９９ｍｌ，６，３１ｍＭ）及び４−ＰＰ（０．１３ｇ、０．８６ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を、周囲温度で２４時間攪拌した。ＴＬＣ分析でカンプトテシンが完全に消費されていることを確認した後、塩化メチレン及び水（各２００ｍＬ）を用いながら反応混合物を分液ロートに移した。分離した有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して蒸発乾固した。固体残渣を塩化メチレン及び酢酸エチルを用いて結晶化した。結晶を濾過して純度９８％以上の材料を７０％の収率で得た。結晶をＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲデータで解析した。
【００７８】Ｂ．カンプトテシンの２０−アシル−ペンタナールエステルの調製
【００７９】
【化２１】
2010254696.tif 000022
【００８０】  カンプトテシン２０−ヘキセン酸エステル（１．０ｇ、２．２５ｍＭ）のＴＨＦ、アセトン及びＡＣＮ混合溶媒（各１５ｍＬ）溶液に、水（１５ｍＬ）を加え、引き続き窒素雰囲気下で、ＮＭＯ（０．５３ｇ、４．５ｍＭ）、ＮａＩＯ４（０．９６ｇ、４．５ｍＭ）及びＯｓＯ４（１５．３ｍｇ、０．０６ｍＭ）のｔ−ＢｕＯＨ溶液を添加した。得られた反応混合物を、周囲温度で４時間攪拌し、ヘキセン酸エステルからカンプトテシンペンタナール誘導体への変換を完結させた。反応混合物を、塩化メチレン及び水（各２００ｍＬ）に分配させた。有機層を分離し、１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過後、蒸発乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、精製物をＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲデータにより解析した。
【００８１】Ｃ．トランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体の調製
次に、アルデヒドエステル誘導体をトランスフェリンと結合させ、複合数がｎであるトランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体を形成する。
【００８２】
【化２２】
2010254696.tif 000023
【００８３】  トランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体を形成する方法は、先に述べた、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体及びトランスフェリン−３−コレステロール複合体を形成する方法と同様であり、ＤＭＳＯ及びトランスフェリンＰＢＳ溶液を利用する。得られたトランスフェリン−２０−カンプトテシンのマススペクトル分析によれば、結合比はトランスフェリン１分子に対してカンプトテシンが３分子であった（すなわち、ｎ＝３）。トランスフェリンとトランスフェリン−２０−カンプトテシン複合体の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルが相違しており、全体としての立体配座が変化したことを示唆する。
【００８４】（ＩＶ．トランスフェリン−ローダミン１２３複合体）
検出及び視覚化のためにローダミン１２３の蛍光を利用する目的で、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体を調製した。ローダミン１２３及びトランスフェリンのそれぞれの遊離アミノ基の間を繋ぐリンカーとしてグルタルアルデヒドを用いて、１段階でトランスフェリン−ローダミン１２３複合体を調製した。この反応では中間体として次式の活性アルデヒド化合物が形成されると考えられる。
【００８５】
【化２３】
2010254696.tif 000024
【００８６】Ａ．トランスフェリン−ローダミン１２３複合体の調整
【００８７】
【化２４】
2010254696.tif 000025
【００８８】  トランスフェリン４０ｍｇ（０．５μｍｏｌ）を含むＨｅｐｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ、１５０ｍｍｏｌＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｓ、ｐＨ７．４）溶液１ｍｌを、１ｍｌのローダミン１２３（５μｍｏｌ）と４分間かき混ぜて混合した。１ｍｌのグルタルアルデヒド（１２．５ｍｍｏｌ、ＨＢＳ溶液）を、室温でかき混ぜながら４分間で滴加した。反応停止剤として０．５ｍｌの２５ｍｍｏｌエタノールアミンＨＢＳ溶液を添加し、４分間攪拌して結合反応を停止させた。混合物を透析チューブに移し、暗黒下に４℃で８時間、１ＬのＨＢＳに対して透析した。次に、濁った混合物を４℃で１０分間、１０００ｇで遠沈し、澄明上澄み液に対して、ｓｕｐｅｒｄｅｘＨＲ２００カラム（２．０×３０ｃｍ）を用い０．５ｍｌ／分の流速で２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を流してクロマトグラフを行った。トランスフェリンに対応する分画を集めて凍結乾燥した。
【００８９】（Ｖ．２’−パクリタキセル化合物）
図４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）に示すように、各種２’−パクリタキセル中間化合物を形成したが、アルキル鎖の短いアルデヒド誘導体（図４（ａ）に示した方法で５−ヘキセン酸を使用した場合など）では、トランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体の形成に問題があった。おそらく、２’位が半球状タキサン骨格のＣ−１３の周囲にある凹状領域に位置することに由来する障害によるものであろう。従って、この結果から、ヘキセン酸よりも鎖が長い結合用化合物を用いて形成したアルデヒド誘導体など、より長いアルキル鎖をもったアルデヒド誘導体を利用して、本発明によるトランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体を形成できると考えられる。さらなる実験により、それぞれ図４（ｂ）及び４（ｃ）に示すように、同様な化学的方法を使用して２’−ヘプタナール  トランスフェリン複合体及び２’−ノナナールトランスフェリン複合体をより容易に形成できることがわかった。２’−ノナナールパクリタキセル化合物の形成には、図４（ｃ）に示すようにオレイン酸（９，１０位に二重結合を有する１８炭素鎖の酸）を使用したことに留意されたい。さらに、トランスフェリンが比較的大きなタンパクであることを考えれば、この結果から、前に述べたＳａｆａｖｙによって確認されたタンパク質などのより小さな担体分子は、パクリタキセルの凹状構造による障害が少なく、前記のアシル化剤の式においてＹ＜４であるようなアルキル鎖の短い２’−パクリタキセルアルデヒド誘導体とより容易に複合体を形成できると考えられる。
【００９０】Ａ．パクリタキセル２’−ヘキセン酸エステルの調製
【００９１】
【化２５】
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【００９２】  パクリタキセル（２．０ｇ、２．３４ｍＭ）及び５−ヘキセン酸（０．３１ｍＬ、２．５８ｍＭ）の塩化メチレン（２５ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、０℃でＤＣＣ（０．７２ｇ、３．５１ｍＭ）を添加し、更にその後４−ＰＰ（０．１７ｇ、０．５ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を２時間攪拌し、その間に、反応混合物の温度は周囲温度に戻した。ＴＬＣで反応を調べ、２時間後に反応が完結していることを確認した。水及び酢酸エチルを各３０ｍＬ添加して反応を終えた。混合物を分液ロートに移し、有機層を１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及び塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。乾燥した濾液を蒸発乾固し、メチルｔ−ブチルエーテルで結晶化した。得られた化合物について、ＨＰＬＣにより純度９５％以上であることを確認した。また、１Ｈ  ＮＭＲ分析によりパクリタキセルの７位のヒドロキシル基には影響がなく２位のヒドロキシル基でエステル化されていることを確認した。収率は９８％であった。
【００９３】Ｂ．パクリタキセル２’アルデヒド誘導体の調製
【００９４】
【化２６】
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【００９５】  パクリタキセル２’−ヘキセン酸エステル（０．４７５ｇ、０．５ｍＭ）のｔ−ＢｕＯＨ、アセトン及び水（各２ｍＬ）の混合溶液に、窒素雰囲気下で、ＮＭＯ（０．１１８ｇ、１ｍＭ）ＮａＩＯ４（０．２１４ｇ、１ｍＭ）及びＯｓＯ４（２．５４ｍｇ、０．０１ｍＭ）のｔ−ＢｕＯＨ溶液を添加した。得られた混合物を周囲温度で２時間攪拌した。ＴＬＣによればこの時点で反応は完結していた。混合物に水及び酢酸エチル（各２０ｍＬ）を添加して反応を終え、有機層を分離し、１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）及び塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム及びハイドロサルファイトナトリウムを通して濾過し、蒸発乾固した。粗化合物を酢酸エチル及びヘプタンを使用したカラムクロマトグラフィーで精製し、ＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲで解析した。収率８５％。
【００９６】Ｃ．パクリタキセル２’ジオール誘導体の調製
図４（ａ）に示したように、上記反応でＮａＩＯ４を使用しない場合には、次のようにジオールが単離される。
【００９７】
【化２７】
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【００９８】  パクリタキセル２’−ヘキセン酸エステル（９．０ｇ、９．４７ｍＭ）アセトン（１３５ｍＬ）溶液に、水（５０ｍＬ）を添加した。得られた溶液に、窒素雰囲気下で、ＮＭＯ（２．２２ｇ、１８．９４ｍＭ）を添加し、続いてＯｓＯ４（４８．２ｍｇ、０．１９ｍＭ）ｔ−ＢｕＯＨ溶液を添加して１６時間攪拌を続けた。ＴＬＣで変換の完結を確認した後、反応混合物に珪藻土（１５ｇ）を加えて濾過した。濾液をロータリー蒸留器でアセトンが無くなるまで濃縮し、引き続き水層を固形食塩で飽和させた後、酢酸エチル（２００ｍＬ）による抽出操作に付した。得られた有機層を水（１０ｍＬ）、１Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）、水（１０ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４を通して濾過した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率６５％で純粋なジオールを得た。先に考察した７−パクリタキセル誘導体の対応するジオールの場合と同様、ジオールをＮａＩＯ４で処理する酸化的開裂によって末端アルデヒドが得られる。
【００９９】Ｄ．トランスフェリン−２’−アシル−ヘキサナルパクリタキセル複合体の調製
図４（ｂ）に示すように、まず、パクリタキセルを、各種中間体を経由して２’−アシル−ヘキサナールパクリタキセル化合物に変換した。２’−アシル−ヘキサナールパクリタキセルアルデヒドエステル誘導体を形成するための化学過程は、５−ヘキセン酸の代わりに６−ヘプテン酸を使用すること以外は２’−アシル−ペンタナールパクリタキセル誘導体の形成について既に述べた化学過程と同様である。
【０１００】  次に、アルデヒドエステルをトランスフェリンに結合させ、以下に示すような複合数がｎであるトランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体を形成する。
【０１０１】
【化２８】
2010254696.tif 000029
この手順は、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の調製について既に述べたものと同様である。マススペクトルによれば、各トランスフェリンに２分子のパクリタキセルが複合したもの（すなわち、ｎ＝２）も検出されたが、主なトランスフェリン−２’−パクリタキセル複合生成物の結合比はトランスフェリン１分子に対しパクリタキセル１分子（すなわち、ｎ＝１）であった。遠紫外領域でのトランスフェリンとトランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体との円偏光二色性スペクトルが相違しており、２’−パクリタキセル複合体の全体としての立体配座の変化が示唆される。
【０１０２】Ｅ．トランスフェリン−２’−アシル−ノナナールパクリタキセル複合体の調製
図４（ｃ）に示すように、パクリタキセルを、各種中間体を経由して先ず２’−アシル−ノナナールパクリタキセルアルデヒドエステル化合物に変換することによって、２’−パクリタキセルのトランスフェリン複合体を形成した。化学過程は２’−アシル−ペンタナールパクリタキセル誘導体について既に述べたものとやはり同様であるが、図４（ｃ）で示したように、アシル化剤としてオレイン酸（ｃｉｓ−９−オクタデセン酸、ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯ２Ｈ）を使用したことに留意されたい。従って、鎖を開裂してアルデヒドを形成させるに際しては、９，１０位の二重結合を越えて延びている鎖の部分が除去される。
【０１０３】  ２’−アシル−ノナナールパクリタキセルとトランスフェリンを複合させて次式のトランスフェリン−２’−パクリタキセル複合体を形成させることは、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体について既に述べた複合の場合と同様である。
【０１０４】
【化２９】
2010254696.tif 000030
【０１０５】（ＶＩ．アミド誘導体）
本発明はまた、アミノ基含有化合物のアミド誘導体の形成をも想定している。例えば、次式
【０１０６】
【化３０】
2010254696.tif 000031
のパクリタキセル類似体を、適切なアシル化剤、好ましくは末端オレフィンを有するアシル化剤と結合させ、その末端オレフィンによって、トランスフェリン又はその他の担体分子／タンパク質と共に使用する、アルデヒドリンカーに変換可能なパクリタキセルアミド誘導体を形成することができる。
上記のアミノ基含有パクリタキセル類似体をヘキセン酸と結合させることによって形成される中間体の例を次式に示す。
【０１０７】
【化３１】
2010254696.tif 000032
このような中間体は、例えば７−パクリタキセル及び２−パクリタキセル誘導体について既に開示した方法によって、対応するジオール、
【０１０８】
【化３２】
2010254696.tif 000033
及びアルデヒド
【０１０９】
【化３３】
2010254696.tif 000034
に変換することができる。従って、次式のトランスフェリン複合体を企図する。
【０１１０】
【化３４】
2010254696.tif 000035
半球状タキサン骨格のＣ−１３位周囲の凹状領域に側鎖が存在することに由来する障害に基づく、トランスフェリン複合体を形成する困難さに対処するためには、ヘキセン酸よりも鎖長がより長い結合用化合物を使用することが考えられる。例えば、ヘプテン酸を使用すると次式のトランスフェリン複合体が形成される。
【０１１１】
【化３５】
2010254696.tif 000036
ここでは、保護したタキサンを、先ず、次のように対応するアミン−塩酸塩に変換する。
【０１１２】
【化３６】
2010254696.tif 000037
上式で示した７−Ｏ，３’−Ｎ−ジ−（ＣＢＺ）−２’−Ｏ−ＢＯＭパクリタキセルなどの保護されたタキサンの形成は、当技術分野で周知であり、例えば米国特許第５，７５０，７３７号、５，９７３，１７０号、６，１３３，４６２号、６，０６６，７４９号、６，０４８，９９０号、６，１３６，９９９号、及び６，１４３，９０２号に開示されており、その教示を参照として本明細書に組込む。上記反応式に示したアミン−塩酸塩の形成は、米国特許出願第０９／８４３，２８４号により完全に記載されており、その教示を参照として本明細書に組込む。
【０１１３】  例えば、反応例を挙げれば、５．０５ｇの７−Ｏ，３’−ジ−（ＣＢＺ）−２’−Ｏ−ＢＯＭパクリタキセルを、磁気攪拌子を備えた０．５Ｌ丸底フラスコ内の９０．０ｍＬのＴＨＦに溶解し、フラスコに６．０１ｍＬの３．６２Ｍ塩酸（２２．０８ｍｍｏｌ）及び８．１０ｇ（湿分５０％）の１０％Ｐｄ／Ｃを添加した。反応容器を窒素で３回、水素で２回流洗し、反応混合物を、水素を充填したバルーンから供給される水素雰囲気下、室温下で、約１時間激しく攪拌した。この操作により上記反応式に示したアミン塩酸塩が生成した。上記の工程で使用した塩酸に代わって、他の鉱酸並びに有機酸を使用できることを認識されたい。
【０１１４】  その他にもタクサンのアンモニウム塩を形成する方法が知られている。例えば、トリフルオロ酢酸を使用して対応するアンモニウムトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩を形成する方法が、例えば米国特許第５，６７５，０２５号、５，６８４，１７５号、５，７７０，７４５号、５，９３９，５６６号、５，９４８，９１９号、６，０４８，９９０号、６，０６６，７４９号、６，０７２，０６０号、６，１３６，９９９号、６，１４３，９０２号、６，２６２，２８１号、及び６，３０７，０８８号に開示されており、その教示を参照として本明細書に組込む。
【０１１５】  アミン−塩酸塩を形成したら、次に、以下に示すように、その塩酸塩をヘプテン酸と反応させて、対応するヘプテン酸エステルを形成する。
【０１１６】
【化３７】
2010254696.tif 000038
この反応は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えて、アミン塩を対応する遊離のアミンに解離させていることを理解すべき以外は、７−パクリタキセル誘導体又は２’−パクリタキセル誘導体に関して既に開示している反応とほぼ同様である。次に、以下に示すように、得られたヘプテン酸エステルを対応する３’−アミドヘキサナールパクリタキセルに変換した。
【０１１７】
【化３８】
2010254696.tif 000039
この反応もやはり前に他の誘導体に関して述べた反応と同様である。次に、得られたアルデヒドを、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の形成について前に述べた方法と同様の方法を用いて、トランスフェリンと結合させ、トランスフェリン−３’−アミド−ヘキサナールパクリタキセル複合体を得た。トランスフェリンとトランスフェリン−３’−アミド−ヘキサナールパクリタキセル複合体の円偏光二色性スペクトルは類似しており、双方の全体的立体配座が類似していることを示す。
【０１１８】  前述したことから、アミン塩の代わりに対応する遊離のアミンそれ自体を使用できることを認識されたい。タキサンの遊離アミンの形成は、例えば米国特許第５，６８８，９７７号、５，７７０，７４５号、５，９３９，５６６号、６，０４８，９９０号、６，０６６，７４９号、６，０７２，０６０号、６，１０７，４９７号、６，２６２，２８１号、及び６，３０７，０８８号に開示されており、その教示を参照として本明細書に組込む。
従って、本発明は、上述の実施例のアミン塩酸塩を、次の一般式で表される化合物並びにその類似体及び誘導体で代替することを企図する。
【０１１９】
【化３９】
2010254696.tif 000040
（式中、Ｒ３はＮＨ２又はＮＨ２ＨＡでよくＨＡは有機酸又は鉱酸である）
【０１２０】（ＶＩＩ．一般的方法及び化合物）
これまでの考察から明らかなように、本発明は、タンパク質−薬剤複合体を形成するための一般的方法を提供するものである。先ず、ヒドロキシル基又はアミノ基を有する、式Ｒ１−ＮＨ２又はＲ１−ＯＨで表される生物学的活性化合物、あるいはその類似体又は誘導体を準備するが、場合によっては、それらの化合物の別の位置を、当技術分野で周知の範囲で１種又は複数の保護基で保護することができる。また、本発明がアミノ基を有する生物学的活性分子の第二級アミン（すなわち、Ｒ４が当技術分野で周知の適当なラジカルである式Ｒ１Ｒ４ＮＨで表される分子）も想定していることを認識されたい。
【０１２１】  生物学的活性化合物を、次式（Ｗ、Ｘ及びＹは前記と同様である）
【０１２２】
【化４０】
2010254696.tif 000041
から選択される化合物と反応させることによって、次式の構造を有する化合物を形成する。
【０１２３】
【化４１】
2010254696.tif 000042
「式中、Ｚは、生物学的活性化合物が式Ｒ１−ＯＨを有する場合には−Ｏ−、生物学的活性化合物が式Ｒ１−ＮＨ２を有する場合には−ＮＨ−であり、Ｗ及びＹは前記と同様である。」
この化合物を酸化して次式のアルデヒドにする。
【０１２４】
【化４２】
2010254696.tif 000043
別法としては、中間体として次式の対応するジオールを形成し、それを開裂してアルデヒドとすることもできる。
【０１２５】
【化４３】
2010254696.tif 000044
アルデヒドを、接近可能なアミノ官能基を含有するタンパク質又は他の担体分子、例えば式中、ｍが整数、Ｐがタンパク質又は他の担体分子、（ＮＨ２）ｍがその接近可能なアミノ官能基である次の一般式を有する化合物などと結合させて、
【０１２６】
【化４４】
2010254696.tif 000045
次式の複合体を形成する。
【０１２７】
【化４５】
2010254696.tif 000046
「式中、ｎは分子複合体の複合数であり、単一の担体分子に結合している特定の薬剤の分子数を表し、反応条件や特定の薬剤をトランスフェリンタンパク質などの担体分子に結合させるために使用される基礎となる中間化合物によって異なる。
【０１２８】  本発明で使用を想定している担体分子には、トランスフェリンなどのタンパク質、Ｓａｆａｖｙによって明らかにされた受容体リガンドペプチド、又はその他のタンパク質、抗体、レクチン又は細胞表面に付着できるその他の物質が含まれる。
【０１２９】  本発明の一般的方法は、次の一般式で表されるオレフィン、ジオール、及びアルデヒドなど、各種中間化合物の形成を想定していることを認識されたい。
【０１３０】
【化４６】
2010254696.tif 000047
「式中、Ｒ１、Ｚ、及びＹは前記と同様であり、Ｒ２は−ＣＨ＝ＣＨ（Ｗ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）Ｗ、又は−Ｃ（Ｏ）Ｈであり、Ｗは前記と同様である。」
Ｒ１には、必要であれば、例えばパクリタキセルの場合であればＴＢＤＭＳ、ＴＲＯＣ、ＢＯＭ、ベンジル、ＴＥＳ、又はＥＥなどの１個又は複数の保護基を含めることができる。その場合必要であれば、本発明の方法に１個又は複数の保護基でＲ１を保護する段階及び脱保護する段階を含めることができる。例えば、パクリタキセルをアシル化剤と結合させる段階に先立って、パクリタキセルの２’位をＴＢＤＭＳ、ＴＲＯＣ、ＢＯＭ、ベンジル、ＴＥＳ、又はＥＥなどで保護し、その後、その化合物を対応するアルデヒドに変換する段階の後に２’位を脱保護することができる。
【０１３１】（ＶＩＩＩ．分析／解析）
上記の方法で形成されたトランスフェリン−薬剤複合生成物を、マススペクトル及びＦＰＬＣで解析した。２００ｎｍから８００ｎｍのＵＶスペクトルを測定した。トランスフェリン／トランスフェリン複合体の測定濃度は０．５ｍｇ／ｍｌとした。測定サンプルはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）で調製した。円偏光二色性の測定は、光路長１ｍｍの円筒状水晶セルを用い、２４０ｎｍから１９０ｎｍまでのスペクトルを測定した。トランスフェリン／トランスフェリン複合体の測定濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。測定サンプルは水又はＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）で調製した。
【０１３２】  蛍光分光光度計を用いてトランスフェリン、ローダミン１２３、及びトランスフェリン−ローダミン１２３複合体の蛍光を測定した。トランスフェリン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、ローダミン１２３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びトランスフェリン−ローダミン１２３複合体（０．２５ｍｇ／ｍｌ）は、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解した。励起波長はトランスフェリン及びトランスフェリン−ローダミン１２３複合体では２８０ｎｍ、ローダミン１２３では５００ｎｍとし、３００から７００ｎｍの範囲の発光スペクトルを記録した。
【０１３３】  Ｌａｅｍｍｌｉゲル電気泳動法（「Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｄ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４」、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０−６８５頁（１９７０年））を用いて、トランスフェリン複合体の純度を評価した。１２％のアクリルアミドからなる垂直スラブゲル（ＮｕＰＡＧＥ電気泳動装置、ＮＯＶＥＸ（登録商標））及びＥ１９００−ＸＣＥＬＬ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ装置（Ｎｏｖｅｘ、サンジエゴ、カリフォルニア州）を用いて、複合体カラム分画のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。サンプルを調製し、１００℃で３分間加熱後、ゲル上に載せた。トランスフェリン複合体（２０μｌ）を、ゲル上に約０．０３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で添加した。電気泳動が終了した後、ゲルをクマシーブルー染色液で３０分間染色し、次いで５〜１２時間脱色した。トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体については、２−メルカプトエタノールの存在下（１μｌ、還元剤）及び非存在下でサンプルを分析した。
【０１３４】  既知量のパクリタキセルを注入し、そのピーク面積をパクリタキセル濃度に対してプロットすることにより、ＨＰＬＣによるパクリタキセルの検量線を作成した。サンプルは、Ｃ−４カラム（５μｍ、３００Å、２５ｃｍ×４．６ｍｍ内径、流速１ｍｌ／分）を用い、溶媒Ａ（８０％水、２０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（８０％ＡＣＮ、２０％水、０．１％ＴＦＡ）とのグラジエントで溶離する分析用逆相ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ分析に要する時間は全部で２４分であった。分析用ＨＰＬＣに用いたグラジエント法では、溶媒Ｂを０％から始めて、２０分間で１００％まで増やし、次いで溶媒Ｂ１００％で２分間溶離し、最後に２分間で溶媒Ｂを０％に徐々に戻した。
【０１３５】  パクリタキセルの原液（１ｍｇ／ｍｌ）は、パクリタキセルを酢酸エチルに溶解して調製した。パクリタキセルの最終濃度は、２５、５０、７５、１００μｇ／ｍｌとした。各濃度について、サンプルをＨＰＬＣに注入し、２回繰返して得られたピーク面積の平均を、パクリタキセルの濃度に対してプロットし、パクリタキセルの検量線を作成した。
【０１３６】  トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の結合比は、複合体を酸加水解し、続いてＨＰＬＣでパクリタキセルの量を測定した後に判断した。１ｍｇのトランスフェリン−パクリタキセルを、０．４ｍｌのＰＢＳ緩衝液に溶解し、酢酸を加えてｐＨを４に調整後、反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合物に酢酸エチルを０．２ｍｌ添加して２分間かき混ぜ、パクリタキセルを単離した。次に濁った混合物を、４℃で１０分間、１０００ｇで遠沈し、パクリタキセルを含む澄明な上澄液２０μｌをＨＰＬＣに注入した。パクリタキセルの検量線によれば、結合比はトランスフェリン１個に対しパクリタキセルが３個であった。
【０１３７】（ＩＸ．トランスフェリン複合体の安定性）
Ａ．熱安定性
トランスフェリン及びトランスフェリン複合体を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０、０．０５モル）に溶解（１ｍｇ／ｍｌ）して、トランスフェリン及びトランスフェリン複合体の貯蔵液を調製した。封管中に０．１ｍｌずつ等分し、３７℃に保った。適当な時間間隔で３本の封管を取り出し、直ちにドライアイスで凍結してＣＤ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による分析を行うまで−７０℃で保存した。分析直前に該当するサンプルを急速解凍した。
【０１３８】Ｂ．ｐＨ依存安定性
トランスフェリン及びトランスフェリン複合体を、水に溶解してそれぞれの貯蔵液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。さらに、貯蔵液を様々なｐＨの緩衝液（０．０５モル）で希釈して最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌとした。このサンプルを、室温に２時間、又は３７℃に２時間保ち、ＣＤ、蛍光及びＵＶ分光法で分析した。
【０１３９】（Ｘ．細胞毒性データ）
哺乳動物の培養細胞を用いて、トランスフェリン−３−コレステロール複合体、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体及びトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の増殖抑制能を調べた。以下で考察するように、ローダミン１２３及びコレステロールのトランスフェリン複合体は、腫瘍細胞及び正常細胞のいずれに対しても大きな有害作用を示さなかった。このことから、物質をトランスフェリンに複合させること自体が細胞の増殖に大きな影響を及ぼしている訳ではないことがわかる。しかし、パクリタキセルの複合体は、癌に対して有効性を示す化合物であり、正常細胞に有害な影響を与えないで癌細胞を攻撃できる可能性のあることがわかった。従って、本発明は、できれば最適投与量下で正常細胞を傷害することなしに、癌治療で効果を示す化合物で癌細胞を特異的に攻撃するための有望な方法を提案するものである。
【０１４０】  細胞系としては、ＫＢ（ヒト口腔類表皮癌種、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１７）、Ｌｕ−１（ヒト肺癌細胞系、イリノイ大学医学部、腫瘍外科部門より入手）、及びｈＴＥＲＴ（テロメラーゼ−不朽化正常上皮細胞系、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃Ｃ４０００−１）を選択した。二つの治療プロトコルで、化合物の投与量を変えて評価した。プロトコルＡでは、ＫＢ、Ｌｕ、及びｈＴＥＲＴ細胞の各培養物を、培養日以降、３種の複合化合物の投与量を様々に変えて処理した。プロトコルＢでは、ＫＢ、Ｌｕ、及びｈＴＥＲＴ細胞の各培養物を集密するまで（９日間）増殖させ、次いで、試験の期間中、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体の様々な投与量で処理した。
【０１４１】  ＫＢは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（ＰＳＦ）（ＧＩＢＣＯ）及び１％可欠アミノ酸（ＮＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）を追加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。Ｌｕは、１０％ＦＢＳ、ＰＳＦ、及び１％ＮＡＡを追加したＭＥＭＥ（ＧＩＢＣＯ）中に保持した。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１は、１０％ＦＢＳ＋ＰＳＦを追加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＧＩＢＣＯ）中に保持した。すべての細胞系を空気中５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃、湿度１００％で培養した。
【０１４２】  全般的な手順は、Ｓｋｅｈａｎ他による論文「Ｎｅｗ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ−ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｂ２、１１０７−１１１２頁、１９９０年、及びＬｉｋｈｉｔｗｉｔａｙａｗｕｉｄ他による論文「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ｂｉｓｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｐｈａｎｉａ  ｅｒｅｃｔａ」、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、５６巻３０−３８頁１９９３年、に記載されているものに従った。典型的には細胞を６０％から７０％集密するまで増殖させ、培地を交換し、１日後にその細胞を試験に供した。最初に試験サンプルを滅菌したＰＢＳに溶解した。ＰＢＳ溶媒を用いて順次希釈して、その１０μｌを３つのウェルに添加した。対照群にはＰＢＳ（１０μｌ）を添加した。プレートを調製した後、トリプシンで処理して組織培養フラスコから細胞を取り出し、計数し，新鮮培地で希釈した。ＫＢ細胞（３×１０４細胞／ｍｌ）、Ｌｕ細胞（５×１０４細胞／ｍｌ）及びｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞（４×１０４細胞／ｍｌ）（培地１９０μｌ）を９６穴プレートに添加した。プレートを５％ＣＯ２存在下で３７℃で培養し、２０％冷トリクロロ酢酸１００μｌを添加して細胞を固定し、４℃に３０分間保った。プレートを水道水で洗浄（３回）し、一夜乾燥した。１％酢酸に溶かした０．４％（ｗ／ｖ）スルホローダミンＢを１００μｌ添加して固定した細胞を３０分間染色した。プレートを１％酢酸で洗浄（３回）し、乾燥させた。１０ｍＭ非緩衝Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ１０）を添加（２００μｌ／ウェル）して結合している染料を可溶化した。プレートを５分間シェイカー上に保持し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５１５ｎｍでの吸収を測定した。いずれの場合も、９６穴プレートの幾つかのウェルに同数の細胞を添加し、３７℃で３０分間培養して零日対照とした。次いで、トリクロロ酢酸で細胞を固定し、上記同様に処理した。
【０１４３】  始めに、プロトコルＡに従って、トランスフェリン−３−コレステロール複合体、トランスフェリン−ローダミン１２３複合体及びトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体を用いて一連の実験を行った。プロトコルＡでは、プレート作製日に試験化合物を６２．５〜２５０μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で添加し、３日毎に培地を補充し、試験化合物の濃度を同一に維持した。時間に対する吸光度のプロットで示されるように、トランスフェリン−３−コレステロール複合体及びトランスフェリン−ローダミン１２３複合体はいずれの細胞系に対しても活性を示さなかった（図５、６、８、９、１１、１２）。これに対してトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体では、試験したその全ての濃度で細胞増殖の完全な抑制が観察された（図７、１０、１３）。
【０１４４】  そこで、さらに低濃度のトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体を使用して再度試験した。図１４に示すように、ＫＢ細胞をプロトコルＡで試験してみると、５又は５０μｇ／ｍｌの濃度では完全な増殖抑制が観察されたが、０．５μｇ／ｍｌの濃度では増殖に対する影響は認められなかった。それぞれ図１５及び１６に示すように、Ｌｕ及びｈＴＥＲＴ細胞についても同様な応答が観察された。
【０１４５】  プロトコルＢによるＫＢ細胞についての試験でも類似の結果が観察された。プロトコルＢでは、９日目まで培地を取り替えることなしに細胞を増殖させ、９日目に様々な濃度の試験化合物を添加し、次いで、３日毎に化合物及び培地を補充した。５０又は５μｇ／ｍｌの濃度では細胞数のかなりの減少が観察されたが、０．５μｇ／ｍｌの濃度では細胞数は対照と同程度であった（図１７）。
【０１４６】  Ｌｕ細胞は抵抗性が若干大であった。５０μｇ／ｍｌでは細胞数のかなりの減少が観察されたが、５μｇ／ｍｌの濃度ではその減少の程度が小さくなり、０．５μｇ／ｍｌの濃度では細胞数が減少しなかった（図１８）。
【０１４７】  ｈＴＥＲＴ細胞に対しては効果が最も小さかった。対照培養物及び０．５又は５μｇ／ｍｌのトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体で処理した培養物で細胞増殖のわずかな増加が観察された。細胞を５０μｇ／ｍｌで処理した場合、この増殖は減少したが、それでも１６日目で細胞数は９日目とほぼ同じであった（図１９）。これらの結果は、トランスフェリン−７−パクリタキセル複合体が、主として癌細胞（ＫＢ及びＬｕ）を攻撃し、正常細胞（ｈＴＥＲＴ）にはあまり影響を与えないことを示唆しており、本発明によるトランスフェリン−７−パクリタキセル複合体及び他のタンパク質−薬剤複合体によって、癌治療に対する有望な方法が得られることを示している。
【０１４８】  以上、本発明の例示的実施形態に則して本発明をある程度詳細に説明してきた。しかしながら、本発明は、先行技術を考慮して解釈される特許請求の範囲で定義されるものであって、本発明の例示的実施形態に、本明細書に含まれる発明の概念から逸脱することなしに修正又は変更を加えることができることを認識されたい。
【図１】
2010254696.tif 000082
【図２】
2010254696.tif 000083
【図３】
2010254696.tif 000084
【図４（ａ）】
2010254696.tif 000085
【図４（ｂ）】
2010254696.tif 000086
【図４（ｃ）】
2010254696.tif 000087
【図５】
2010254696.tif 000088
【図６】
2010254696.tif 000089
【図７】
2010254696.tif 000090
【図８】
2010254696.tif 000091
【図９】
2010254696.tif 000092
【図１０】
2010254696.tif 000093
【図１１】
2010254696.tif 000094
【図１２】
2010254696.tif 000095
【図１３】
2010254696.tif 000096
【図１４】
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【図１５】
2010254696.tif 000098
【図１６】
2010254696.tif 000099
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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