(57)【要約】【課題】血管内皮細胞で発現しているLOX-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつLOX-1を介した酸化LDLの細胞内への取り込み抑制能を有するアンタゴニスト作用を有し、かつ安全性が高いLOX-1アンタゴニスト作用剤又はこれを有する食品及び医薬組成物、ならびにLOX-1以外の他のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込み抑制能も有する、安全性が高いアンタゴニスト作用剤及びこれを有する食品又は医薬組成物を提供すること。【解決手段】ふともも科バンジロウに属するグァバ葉の植物抽出物を有効成分として含有してなる、LOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤、該LOX-1アンタゴニスト作用剤を含有する食品組成物及び医薬品組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ふともも科バンジロウに属するグァバ葉の植物抽出物を有効成分として含有してなる、LOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤。
【請求項２】
LOX-1以外のスカベンジャーレセプターを介した細胞への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する請求項１記載のLOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤。
【請求項３】
前記抽出物が、合成吸着剤を使用し、水及び／又は有機溶媒により有効成分を分画して得られたものである請求項１又は２記載のLOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載のLOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤を含有する食品組成物。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか記載のLOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤を含有する医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、LOX-1アンタゴニスト作用剤、及びこれを含む食品組成物、又はこれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症発症の原因には高血圧、高脂血症、糖尿病、加齢、喫煙等様々なものが挙げられる。その中の一つである高脂血症は過食、高脂肪食、運動不足等の非健康的生活習慣やそれによる肥満が原因で生じる。動脈硬化症の進行は、高血圧の悪化や腎臓病、さらには、狭心症や心筋梗塞等の心臓病、脳出血や脳梗塞、脳卒中等の血管疾患発症の一因となることもある。
【０００３】
日本国厚生労働省の人口動態統計によると、日本における疾患別死亡者の死因は１位悪性新生物(腫瘍及び癌)（３２９，３１４人)、２位心疾患（１７３，０２４人)、３位脳血管疾患(１２８，２６８人)である。これらの中で動脈硬化症と関連の強い疾患である２位心疾患と３位脳血管疾患を合わせた死亡総数に占める割合は２７．８％であり、これは悪性新生物の死亡者割合である３０．４%にほぼ匹敵する(平成１８年)。これより、動脈硬化症は現代社会における生活習慣病問題の代表の一つと言える。
【０００４】
動脈硬化症の原因の一つである高脂血症の治療は食事療法や運動を含む生活習慣の改善と薬物療法が基本であるが、２０００年より導入された「健康日本２１（２１世紀における国民健康づくり運動)」でも奨められているように、まずは生活習慣の改善から行うことが好ましい。「健康日本２１」は近年の日本人死亡原因の多くを含む生活習慣病の発症や進行に関わる基礎疾患、更には生活習慣を改善することにより生活習慣病の危険因子を減らす健康づくりを目的としており、生活習慣病の一次予防を推進している。この一次予防とは適正な食事や運動不足の解消、禁煙や節酒、ストレスコントロール等の生活習慣づくり及び、予防接種や環境改善、外傷の予防等の特殊予防を意味する。つまり、心疾患や脳血管疾患の原因である動脈硬化症においては基礎疾患である肥満、高血圧や高脂血症を生活習慣の改善により予防することが推奨されている。さらに、動脈硬化症は自己による病状進行感覚がなく、異変を感じ検査を行う時点ではすでに症状が深刻化していることが多い。以上より、動脈硬化症予防及び治療においては生活習慣の改善に繋がるものが好ましく、これより食品からの予防学的なアプローチ、さらには日常的に摂取可能な形態を用いる対処方法が望ましいと考えられる。
【０００５】
動脈硬化症発症メカニズムは酸化LDL(low density lipoprotein:低密度リポ蛋白質)等の酸化脂質や免疫反応により受ける血管内皮細胞の機能障害より始まる。機能障害を受けた血管内皮細胞では単球接着分子が発現し、血液中の単球が血管内皮細胞に接着、内膜へ遊走、その後マクロファージへ分化する。マクロファージは酸化LDLを取り込み泡沫化し、脂肪線条を作る。この脂肪線条ができると、平滑筋細胞が中膜より内膜へ遊走し、脂肪線条を取り囲むように増殖、コラーゲン等の線維が分泌され線維性肥厚が形成され、これの石灰化が進行することによって動脈硬化症は昂進する。動脈硬化症の発症メカニズムは進行するほど様々な物質がリクルートされることを考慮すると、メカニズムの初期段階を止めるようなアプローチが適切であると考えられる(非特許文献１)。そこで、我々はメカニズム初期段階である血管内皮細胞の機能障害に注目し、これを回避するようなアプローチを目標とした。酸化LDLに大量に含まれているリゾホスファチジルコリンをヒト血管内皮細胞と共培養すると内皮細胞が活性化され、単球接着分子の発現が誘導されること(非特許文献２)から、血管内皮細胞の機能障害は酸化LDLと血管内皮細胞間の反応に起因することが原因の一つと考えられる。この反応の詳細としては、血管内皮細胞に発現している6種類のスカベンジャーレセプターが変性LDLである酸化LDLやアセチル化LDL、又はアポトーシス細胞や炎症細胞を認識し、取り込むことにより、内皮細胞が活性化されることが明らかにされている(非特許文献３)。受容体(レセプター)は特異的に物質(リガンド)を認識し結合する、又は細胞内へリガンドを取り込むという特徴を持つ。
【０００６】
血管内皮細胞に発現しているスカベンジャーレセプターの中でもLOX-1(レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体：lectin-like oxidized LDL recptor-1)は、血管内皮細胞において酸化LDL等の取り込みを行う受容体であり(非特許文献４)、内皮細胞だけではなく血管平滑筋細胞や炎症細胞等のさまざまな細胞種に発現を認め、その発現もさまざまな条件下で調節されている(非特許文献５)。また、LOX-1は酸化LDLだけではなく老化赤血球やアポトーシス細胞、炎症細胞等を認識すること等もすでに明らかにされている(非特許文献６)。LOX-1トランスジェニックマウス(LOXtg)と遺伝的高脂血症モデルApoE(Apolipoprotein E:アポリポ蛋白質E)欠損マウス(ApoE KOマウス)を交配させたLOXtg/ApoE KOマウスとApoE KOマウスを比較したところ、血中脂質プロファイルに差はないが、ApoE KOマウスと比較してLOXtg/ApoE マウスでは心筋内細動脈において酸化LDLの集約が認められており、さらに高脂肪食を負荷することにより心筋内細動脈に脂肪沈着を伴う血管病変の形成を認めたことが報告されている（非特許文献７)。これより、LOX-1を介した酸化ストレスの増大が血管内皮障害成因、動脈硬化の進展に重要な働きを果たしていることが示唆された。このLOX-1をターゲットとした薬物については、高脂血症治療剤であるプラバスタチン（pravastatin）が血管平滑筋細胞やマクロファージのLOX-1発現を遺伝子レベルで抑制することが明らかにされている。例えばプラバスタチンを投与したWHHR(Watanabe Heritable Hyperlipidemic Rabbits:遺伝性高脂血症ウサギ)と投与しないコントロールのWHHRを比較すると、動脈硬化症状のある血管領域においてLOX-1蛋白質およびmRNA(メッセンジャーＲＮＡ)発現が抑制される。さらにプラバスタチンを投与したWHHRではコントロールのWHHRよりもIMT(intima-media thickness:中膜複合体厚)が52%低いという結果が得られている(非特許文献８)。また、LOX-1欠損マウス(LOX-1  KOマウス)と動脈硬化モデルマウスであるLDLR欠損マウス(LDLR  KOマウス)を交配し作製したダブルKOマウスを用いた実験では、LDLR  KOマウスでは血管内で多く観察された脂質微細顆粒の沈着や膜肥厚がダブルKOマウスでは抑えられており、またLDLR KOマウスでの動脈硬化症の進行に関わる蛋白質の発現量変化がダブルKOマウスでは抑制されていることが明らかになった(非特許文献９)。これらの結果は動脈硬化症発症においてLOX-1は非常に重要な役割を担っており、LOX-1蛋白質及びmRNA発現阻害は動脈硬化症治療に繋がることをインビトロ（in vitro）、インビボ（in vivo）の両者において示唆している。
【０００７】
ところで、ふともも科バンジロウに属するシジュウム  グァバ(Psidium guajava L.)は、熱帯アメリカ地方より世界の熱帯及び亜熱帯地方に広められ、日本では沖縄、鹿児島地方の一部にて栽培され、グァバと呼ばれている。この植物の果実や葉は古くから日本の沖縄県や台湾等で果実、根、葉が糖尿病、下痢、歯痛、口内炎、胃潰瘍に効果があるとされ、乾燥葉を焙煎したものは健康茶として愛飲されている。この植物のグァバ茶ポリフェノールは糖の吸収を穏やかにする効果を持ち、特定保健用食品として許可されている。この植物の葉を水もしくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られるエキスに生体内外における過酸化脂質の生成を抑制する抗酸化活性が含まれていること(特許文献１０)や、この植物の葉を５０％エタノール水溶液により抽出して得られるエキスにリパーゼ阻害効果(特許文献１１)が報告されている。しかしながら、この植物を抽出して得られるエキスがLOX-1アンタゴニスト作用を有することは知られていない。
【非特許文献１】Chen X. et al. Cardiovascular Drug Reviews (2007); 25:146-61
【非特許文献２】Kume N. et al. J. Clin. Invest. (1994); 93:907-11
【非特許文献３】Murphy JE. et al. Athrtosclerosis (2005); 182:1-15
【非特許文献４】Moriwaki H. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (1998); 18:1541-7
【非特許文献５】Mehta JL et al. Can J Cardiol (2004); 20:32B-36B
【非特許文献６】Kataoka H et al. Circulation (1999); 99:3110-7
【非特許文献７】Inoue K. et al. Circ Rec. (2005); 97:176-84
【非特許文献８】Hofnagel O. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (2006); 26:604-10
【非特許文献９】Mehta JL. Et al. Circ Res. (2007); 100:1634-42
【特許文献１】特開平１１−７５７７０号公報
【特許文献２】特開２０００−１０３７４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記観点からなされたものであり、血管内皮細胞で発現しているLOX-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつLOX-1を介した酸化LDLの細胞内への取り込み抑制能を有するアンタゴニスト作用を有し、かつ安全性が高いLOX-1アンタゴニスト作用剤又はこれを有する食品及び医薬組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、LOX-1以外の他のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込み抑制能も有する、安全性が高いアンタゴニスト作用剤及びこれを有する食品又は医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、スカベンジャーレセプターの中でもLOX-1に着目し、スクリーニングによって、このＬＯＸ-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつLOX-1を介した酸化LDLの細胞内への取り込みを阻害するアンタゴニスト作用のある成分を有する茶葉を鋭意探索した。その結果、ふともも科バンジロウに属するグァバ葉の抽出物に、優れたLOX-1アンタゴニスト作用、さらには細胞での酸化LDL取り込み抑制能を有し、かつ細胞への安全性が高い成分が存在することを見出した。また、LOX-1以外のスカベンジャー受容体も発現している血管内皮細胞の酸化LDL結合・取り込み阻害を検証したところ、グァバ葉より抽出される成分は抗LOX-1抗体よりも酸化LDL結合・取り込み阻害率がより高いことが明らかになった。
【００１０】
すなわち、本発明者らは、日本で愛飲されている茶葉や健康茶の原料を多数スクリーニングしたところ、驚くべきことに、グァバ葉より抽出される成分にはLOX-1以外のスカベンジャー受容体に対して拮抗作用、あるいは取り込み過程での抑制作用を有することを初めて見出した。さらには、グァバ葉より抽出される成分はスカベンジャー受容体の一つであるSR-Aと変性LDLに含まれるアセチル化LDLとの結合を阻害する作用を有することも明らかにした。これらの事実より、グァバ葉より抽出される成分は血管内皮細胞に発現しているSR-A、又はSR-A以外のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込み阻害機能を有している可能性が示唆され、グァバ葉より抽出される成分はLOX-1を含む数種類のスカベンジャー受容体に対するアンタゴニスト効果を持ち、相乗的・相加的に酸化LDLの取り込み阻害機能を有する可能性があることが示唆される。以上より、アンタゴニスト作用剤としての本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕ふともも科バンジロウに属するグァバ葉の植物抽出物を有効成分として含有してなる、LOX-1（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニスト作用剤、
〔２〕LOX-1以外のスカベンジャーレセプターを介した細胞への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する前記〔１〕記載のLOX-1アンタゴニスト作用剤、
〔３〕前記抽出物が、合成吸着剤を使用し、水及び／又は有機溶媒により有効成分を分画して得られたものである前記〔１〕又は〔２〕記載のLOX-1アンタゴニスト作用剤、
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載のLOX-1アンタゴニスト作用剤を含有する食品組成物、
〔５〕前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載のLOX-1アンタゴニスト作用剤を含有する医薬品組成物
に関する。
なお、本発明においてアンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載の方法で評価した場合に、LOX-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつ酸化LDLの細胞内への取り込みを阻害することを意味する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤を用いることで、動脈硬化症の初期段階に関わりの深い血管内皮細胞のLOX-1を介した酸化LDL取り込みを阻害することができ、結果として動脈硬化症の発症を抑制するという効果が奏される。また、SR-Aと変性LDLとの結合阻害に加え、血管内皮細胞においてLOX-1以外のスカベンジャー受容体による酸化LDLの取り込みも阻害できるという事実より、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤は動脈硬化症の発症をより顕著に抑制できるという効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
グァバは、ふともも科バンジロウ属に分類され、学名はシジュウム  グァバ(Psidium guajava L.)であり、グァバ、バンカ、バンザクロ、バンジロウ、バンセキリュウ等の名で呼ばれている。熱帯アメリカ原産のグァバは、現在では世界の熱帯及び亜熱帯地域で栽培されており、日本では沖縄、鹿児島地方の一部で栽培されている。この植物の葉を抽出して作るグァバ茶は、糖の吸収を穏やかにする効果を持つことから健康茶として日本や台湾等で認知されている。本発明者らはスクリーニングを重ねた結果、数多くある茶葉の中からグァバ葉より得られる抽出物に本目的の活性を初めて発見して本発明を完成させた。これらより、グァバは本発明において好ましい原料である。
【００１４】
グァバ葉は、酸化LDL受容体(LOX-1)アンタゴニスト作用を有する成分を含有するのみならず、LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込みについても抑制する成分を含有しており、結果として、動脈硬化症発症初期段階である血管内皮細胞の機能障害に対する抑制効果あるいは抗動脈硬化作用が期待できる。よって、グァバ葉から得られる抽出物は上記成分を含むため、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤の有効成分として用いることができる。
【００１５】
ここで植物抽出物とは、葉由来抽出物、またこの抽出物を何らかの方法によって分画した物、この抽出物を濃縮した物、さらにはこれらを混合した物等、グァバ葉由来抽出物から得られた物を示し、この限りではない。また、抽出に用いた溶媒を乾燥させて乾固した固体状物、この固体状物を水等の何らかの溶媒に溶解させた物も含む。なお、植物体の粉砕物を取り除かず、混合した状態の物も植物抽出物として使用できる。
【００１６】
グァバ葉から得られる抽出物とは、グァバ葉を溶媒に接触させ、溶媒中に溶出される成分から得られる植物抽出物を示す。この抽出には様々な方法を用いることができる。グァバ葉はそのまま、乾燥状態、焙煎後、又はこれらの混合でもよく、グァバ葉はカット状の物や、ミキサー等により粉砕した物でもよい。抽出処理においては連続式、還流式、バッチ式、浸漬式、超音波処理式等を用いることが可能である。また、抽出処理を行う時間及び温度も抽出処理方法と任意に組み合わせることができる。抽出条件の例としては、６０℃のインキュベーター内であらかじめ容器及び水を６０℃に温め、粉砕済みの乾燥グァバ葉を加え、１時間インキュベーター内に静置し、抽出物を得ることができる。抽出した物の沈殿物を除去せずにそのまま用いることもできるが、濾紙や０．２２μｍや０．４５μｍ等のフィルターメンブレンにより固形分を除去し、濾液を抽出物として得ることもできる。この抽出物はそのまま用いることもできるが、溶媒を蒸発させた乾燥状態の固体を用いることも、さらには水やその他有機溶媒等に溶解して用いることも可能である。この場合の蒸発は凍結乾燥や減圧乾燥を用いることができる。
【００１７】
抽出を行う溶媒は水及び／又は有機溶媒の両者において可能である。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン等が挙げられ、これらは単独又は２種類以上を混合して用いてもよく、またこれらと水の混合溶媒としてもよい。中でも、LOX-1アンタゴニスト作用を有する成分を含む抽出物を効率よく得ることができるという観点から、水で抽出処理することが好ましい。
【００１８】
グァバ葉から得られる抽出物は、そのまま製剤化に用いることも可能であるが、活性の高い画分を効率よく得られる観点から、抽出物を合成吸着剤などで分画し、LOX-1アンタゴニスト作用を有する成分を分画し、製剤化に用いることが好ましい。
【００１９】
前記合成吸着剤とは、例えば、スチレンージビニルベンゼン系合成吸着剤のダイヤイオン(登録商標)HP10、ダイヤイオンHP20、ダイヤイオンHP21、ダイヤイオンHP30、ダイヤイオンHP40、ダイヤイオンHP50、SEPABEADS(登録商標) SP800、SEPABEADS SP825、SEPABEADS SP850、SEPABEADS SP875、SEPABEADS SP205、SEPABEADS SP206、SEPABEADS SP207(以上、三菱化学株式会社製)、アクリル系合成吸着剤のダイヤイオンHP1MG、ダイヤイオンHP2MG、(以上、三菱化学株式会社製)、アンバーライト(登録商標) XAD４、アンバーライトXAD16(以上、オルガノ株式会社製)、アクリル系合成吸着剤のダイヤイオンHP1MG、ダイヤイオンHP2MG(以上、三菱化学株式会社製)、アンバーライトXAD4(オルガノ株式会社製)、デキストラン系のセファデックス(登録商標)LH-20(アマシャム  ファルマシア株式会社製)、オクタデシルシリル基を持つCOSMOSIL(登録商標)C18OPN（ナカライテスク株式会社製）などが挙げられる。
【００２０】
前記合成吸着剤からの溶出は低級アルコール水溶液による濃度勾配溶出が好ましく、溶出条件は使用するアルコール及び吸着剤の種類によるものである。グァバ葉から得られる抽出物から酸化LDL受容体(LOX-1)アンタゴニスト作用を有する成分を分類する際も、使用する吸着剤や溶出アルコールによって条件は変動するが、上記のような吸着剤を利用することにより効率的に目的成分を溶出することが可能である。
【００２１】
さらに、抽出物からのLOX-1アンタゴニスト作用成分を有する画分の分画は、上記のような合成吸着剤を用いた吸着クロマトグラフィ法に限らず、抽出物からLOX-1アンタゴニスト作用の少ない成分を効率よく除去できる方法であればよい。例えば、液液抽出法、分配クロマトグラフィ法、吸着クロマトグラフィ法、分子排斥クロマトグラフィ法、イオン交換クロマトグラフィ法などが挙げられる。上記のような吸着剤のうち、例えばダイヤイオンSP700を用いて溶出すると効率的に目的成分を溶出することが可能である。
【００２２】
グァバ葉から得られる抽出物から酸化LDL受容体(LOX-1)アンタゴニスト作用成分を含む画分を分画する方法としては、使用する合成吸着剤や溶出アルコールによって条件は変動するが、例えばダイヤイオンSP700を用いた場合は２０〜５０％メタノール水溶液で溶出すると効率的に目的成分を溶出することが可能である。この方法は、カラムクロマトグラフィーはもちろんバッチ法でも行うことは可能であり、また溶出に用いる溶媒はメタノールに限らず、その他のアルコールを用いこともできる。さらには、抽出物をセップパックＣ18カラムやフェニルカラムなどに負荷して活性画分は吸着し、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、アセトンなどで溶出させることによって活性画分を濃縮・精製することができる。
これらのようにして得られた目的成分を含む画分はそのまま使用することもできるが、濃縮・精製したもの、乾固したもの、乾固物を水または有機溶媒で溶解したものなど、いずれの状態でも使用することが可能である。
【００２３】
以上のようにして得られる前記グァバ葉の植物抽出物を、本発明ではLOX-1アンタゴニスト作用剤として用いることができる。本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤における前記植物抽出物の含有量としては、アンタゴニスト作用、脂質取り込み抑制作用、あるいは抗動脈硬化作用を示す量であれば、特に限定はない。よって、前記グァバ葉の植物抽出物又は分画物を有効成分として含有してなる、LOX-1アンタゴニスト作用を有する組成物として用いることができる。
【００２４】
本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤は、LOX-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつ酸化LDLの細胞内への取り込みを阻害するというLOX-1アンタゴニスト作用を有することに特徴がある。かかる特徴を有することで、動脈硬化症の発症に影響を与える血管内皮細胞への、LOX-1を介する酸化LDLの細胞内への取り込みを抑えることにより、動脈硬化症の発症を抑えることを可能にする。
【００２５】
また、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤としては、動脈硬化抑制効果がより向上するという観点から、前記LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化LDLの結合及び取り込みを抑制する作用も有するものが好ましい。ここで、LOX-1以外のスカベンジャー受容体とは、血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、血小板等に存在するLOX-1以外の受容体であってLDLと結合して前記細胞内へ取り込むことができる受容体である。このようなスカベンジャー受容体としては、例えば、SR-AＩ／II、SR-B1、CD36、MARCO、CD68、SRECs、SR-PSOX、FEEL-1等のタイプA、B、C、D、E、F、G、Hに大別されているが、特に限定はない。
本発明では、後述の実施例に記載のように、抗LOX-1抗体を用いた結合及び取り込み阻害活性量をスカベンジャー受容体中のLOX-1の割合を換算し、細胞内への酸化LDLの結合及び取り込み阻害活性量より換算されるスカベンジャー受容体の阻害効果の割合がLOX-1の割合よりも多ければ、LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化LDLの結合及び取り込みが阻害されているとする。
【００２６】
また、本発明のLOX-1アンタゴニスト剤は、食品・医薬品等の組成物に、公知の技術を用いて配合することができる。この場合、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤をそのまま用いてもよいが、各種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなく、適時設置すればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンク等の経口投与基材が、食品等に簡易には配合できる点から望ましい。
【００２７】
また、食品としては、一般食品として、種々の食品原料に前記抽出物の所望量を加え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、前記抽出物、分画物をそのまま、あるいは食べやすい状態にして使用することができる。
【００２８】
また、医薬品としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤等が挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤と共に通常の方法に従って製剤すればよい。
【００２９】
これらの食品又は医薬品組成物における、上記LOX-1アンタゴニスト剤の１日あたりの投与量は症状、身長、体重、年齢等により異なるが、成人１人あたりの摂取量が、１〜２５ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは２．５〜８．５ｍｇ／ｋｇ・日となるように、あるいは２%で茶葉を使用するとしてグァバ茶１００〜５００ｍＬ／日を１回ないし数回に分けて被検体に投与するのがよい。
【００３０】
なお、ふともも科バンジロウに属するグァバは、日本や台湾において古くから健康茶として愛飲されており、安全性に関して問題はない。
【００３１】
また、本発明において標的としているLOX-1は血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞にも存在することから、それぞれの細胞に酸化LDLが取り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。さらにLOX-1を介した酸化LDLの結合及び取り込みのみならず、他のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの結合及び取り込みも抑制可能である。さらに本発明者は、スカベンジャー受容体に含まれるSR-Aと変性LDLであるアセチル化LDLとの結合を阻害する効果を持つことを確認した。これはさらなるLOX-1以外のスカベンジャー受容体の酸化LDL又はその他変性LDLとの結合を阻害する効果をも共有している可能性を示唆している。したがって、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤は、血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞等の動脈硬化症に関与する複数の細胞群において酸化LDLの結合及び取り込みを顕著に阻害する作用を有するという、従来の動脈硬化抑制剤にはない機構で動脈硬化症の発症を抑制することができるため、従来品と比べて、顕著かつ安全にヒトや非ヒト動物(例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の哺乳動物)における動脈硬化症を予防／治療することが期待できる。
【００３２】
以上、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
なお、実施例で用いた試料は以下のようにして調整した。
１．bLOX-1のcDNA
前記bLOX-1のcDNAのクローニングは、非特許文献(Sawamura T. et al. Nature (1997); 386: 73-7)に記載の方法に準じて行った。
即ち、bLOX-1については、血管内皮細胞のcDNAライブラリーより各独立したクローンを発現ベクターに組み込み、アフリカミドリザル腎臓由来(COS-7)細胞での一過性発現を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート(DiI)(invitrogen社製)で標識した酸化LDL、DiI-OxLDLとの共培養後にセルソーターによるDiIポジティブの分離を行い、プラスミドを回収した。このスクリーニング方法を３回繰り返し、シングルクローンを単離した。
【００３４】
２．抗LOX-1抗体
抗LOX-1抗体は非特許文献４に記載の方法に準じて製造した。
即ち、bLOX-1を発現しているチャイニーズハムスター卵巣由来(CHO)細胞を５mM  EDTA-PBSで処理(室温、５分間)した後、プロテアーゼ阻害剤含有緩衝液(２５mMのHEPES(ｐＨ７．４))、１０mMの塩化マグネシウム、０．２５Ｍのシュークロース、及びプロテアーゼ阻害剤（１０Ｕ／ｍＬのアプロチニン（Aprotinine）、２μｇ／ｍＬのペプスタチン（Pepstatin）、５０μｇ／ｍＬのロイペプチン（Leupeptin）及び０．３５ｍｇ／ｍＬのAPMSF)中に懸濁し、ポッター式ホモゲナイザーで破砕し、低速遠心(１５００ｒｐｍ、１０分、４℃)した。次いで、上清を回収し、超遠心(１００，０００ｇ、１時間、４℃)し、沈殿した膜画分を回収しリン酸緩衝液中に懸濁し−２０℃で保存した。この懸濁液をウシあるいはヒト抗体の作製(免疫源)として用いた。
得られた細胞膜画分を正常マウスに免疫し、ウシLOX-1に対するマウスモノクローナル抗体を調製した。
前記モノクローナル抗体の調製は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック(黒木登志夫ら編集、羊土社発行、p66-74、1992年)及び単クローン抗体実験操作入門(安東民衛ら著作、講談社発行、1991年)に記載される一般的方法に従って行った。
なお、抗LOX-1抗体とは、LOX-1を抗原とした特異抗体であり、抗原抗体反応によりLOX-1アンタゴニストとして作用するものをいう。
【００３５】
３．PBSバッファー
PBSバッファーについては、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム十二水和物、１．８ｍＭリン酸二水素カリウムを精製水に混合し、適量の塩酸でｐＨを７．４とした。
【００３６】
４．酸化LDL
酸化LDLの調製は下記の通りに行った。健常人の血漿を遠心チューブに入れ、臭化ナトリウムを加えて、比重を１．０１９に調整した後に、超遠心機「L-80」（商品名、Beckman製）で遠心し(２０時間、５８０００ｒｐｍ）、下層を別のチューブに回収した。回収した液量を測定し、臭化カリウムを加えて比重を１．０６３に調整した。次いで、超遠心機「L-80」で遠心し（２０時間、５８０００ｒｐｍ）、上層を別のチューブに回収した。回収した画分をリン酸緩衝液（外液を２回以上交換）で透析し、精製ヒトLDLを得た。
得られた精製LDLから酸化LDLを調整するために、精製ヒトLDL及び硫酸銅の濃度が、各々３ｍｇ／ｍＬ及び７５μＭとなるように調整した溶液を、ＣＯ2インキュベーター内で２０時間インキュベートした。次いで、EDTAを含有する０．１５μＭの塩化ナトリウム溶液にて透析し（外液を２回以上交換)、ヒト酸化LDLを得た。
【００３７】
（実施例１）
乾燥したグァバ葉を適当な大きさに細かくカットした。このカット葉２ｋｇに対して５０倍量の精製水を加え、６０℃にて１時間静置、抽出した。この抽出液を減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮した。これらの操作により２００ｇの油状のグァバ抽出物を得た。得られた抽出物をLOX-1アンタゴニスト作用剤として用いた。
【００３８】
（実施例２）
上記実験例１で得られたLOX-1アンタゴニスト作用剤のLOX-1アンタゴニスト活性に関して、LOX-1に対する酸化LDL結合率を蛋白質bLOX-Fcを用いて評価を行った。
【００３９】
蛋白質bLOX-Fcは、ウシ由来LOX-1(bLOX-1)の細胞外ドメインとヒトIgG1 Fcドメインの融合蛋白質である。この融合配列をpCd5lneg1ベクターに導入し、これをCHO細胞に形質転換し、安定発現株を作成した。bLOX-Fcを発現したCHO細胞を経代し、培養上清に分泌されたbLOX-Fcを得た。ヒトIgG1 Fcドメインを認識するプロテインＡアガロース（Protein A-agarose）(Bio-Rad社製)を用いて培養上清からbLOX-Fcを単離・精製した。このようにして得られた蛋白質bLOX-Fcは酸化LDLに対する結合能力を有し、以下のELISAによる試験用LOX-1標品として用いることにした。
【００４０】
ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay:酵素免疫測定法)は、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、NUNC製)を用いて行った。上記のように精製した蛋白質bLOX-Fcを１０μｇ／ｍＬとなるようにPBSバッファーで調整し、5０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で２晩静置後、PBSバッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２５％ブロックエース(大日本住友製薬社製)を含むPBSバッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、PBSバッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSバッファーで適当な希釈倍率となるように調整した各精製サンプルを１００μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、PBSバッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、５μｇ／ｍＬとなるようにPBSバッファーで調整した酸化LDLを各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、PBSバッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインB抗体(The Binding Site社製)をPBSバッファーで１０００倍希釈し、１００μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で２時間の静置後、PBSバッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン(TMB)ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定(EIA)-基質-キット試薬(Bio-rad社製)を１００μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を５０μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、LOX-1アンタゴニスト活性(LOX-1に対する酸化LDL結合阻害率)を定量した。
【００４１】
図1は実施例2で行った、蛋白質bLOX-Fcを用いたELISAより得られた結果であり、蛋白質bLOX-Fcと酸化LDLの結合阻害率を示している。LOX-1アンタゴニスト作用剤は実施例1より得たものを用いており(図中「グァバ」)、また、「X」はLOX-1アンタゴニスト作用を持たない茶葉エキス（大麦若葉、なたね豆、桑の葉、ウコン、アロエ、クマ笹、クミスクチン、メグスリノキ、イチョウ、煎茶、黄金桂などの一般的な茶葉）を示しており、実施例1と同様に抽出処理を行った。LOX-1アンタゴニスト作用剤は濃度依存的に結合阻害効果を有していることが明らかである。
【００４２】
（実施例３）
実施例１で得られたLOX-1アンタゴニスト作用剤は吸着剤を用いることによりLOX-1アンタゴニスト効果を有する成分を分画することが可能である。例えば吸着剤ＳＰ７００を用いた場合では、実施例１の方法で得られたグァバ抽出物にＳＰ７００を付し、水、２０％メタノール、５０％メタノール、メタノールで順次溶出した。得られた溶出物から溶媒を濃縮した。
【００４３】
（実施例４）
実施例３から得られた溶出物についてLOX-1に対する酸化ＬＤＬ結合率を蛋白質bLOX-FCを用いて評価を行った。ELISAは実施例２と同様の方法で行った。
図２は実施例４で行った、蛋白質bLOX-Fcを用いたELISAより得られた結果であり、蛋白質bLOX-Fcと酸化LDLの結合阻害率を示している。本試験の阻害剤は、実施例３より得られた溶出物を一度乾固させ、１０μｇ／ｍＬに調整したものを使用した。LOX-1アンタゴニスト作用剤はSP700を用いることによりメタノール濃度に依存しアンタゴニスト活性を有する成分を分画することが可能である。
【００４４】
（実施例５）
実施例１より得られる抽出物（ＳＰ７００使用前）と実施例Ｂから得られた５０％メタノール画分（ＳＰ７００使用後）についてLOX-1に対する酸化ＬＤＬ結合率を蛋白質bLOX-FCを用いて評価を行った。ELISAは実施例２と同様の方法で行った。
図３は実施例５で行った、蛋白質bLOX-Fcを用いたELISAより得られた結果であり、蛋白質bLOX-Fcと酸化LDLの結合阻害率を示している。本試験は各阻害剤を１０μｇ／ｍＬに調整したものを使用した。LOX-1アンタゴニスト作用剤はSP700を用い活性成分を分画することにより、蛋白質bLOX-FCと酸化LDLの結合阻害率は約７倍程度に効果を高めることが可能である。
【００４５】
なお、以降の実施例では、実施例１より得られた抽出物、及び実施例３から得られた５０％メタノール画分をLOX-1アンタゴニスト作用剤として随時使用した。
【００４６】
（実施例６）
LOX-1アンタゴニスト作用剤について、bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞を用い、細胞に発現している蛋白質bLOX-1に対するアンタゴニスト効果の検出を行った。LOX-1アンタゴニスト作用剤による、bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞への蛍光標識酸化LDLの結合抑制能を評価した。
【００４７】
bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞は、既知の方法に従って経代・維持を行った(Nature,Vol.385,p73-77,1997)。この細胞を用いたアッセイは、次のように行った。９６ウェルブラックプレート(nunc社製)に１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各ウェルに１００μＬずつ１０％牛胎児血清(FBS、ただしテトラサイクリンを含まない)含有「HamF12培地」(GIBCO社製)のもとで細胞を播種し、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後結合阻害の評価を行った。以降の操作は氷上で行い、反応・静置の際は４℃にてインキュベートを行った。プレートを４℃でプレインキュベートを３０分間行った後、培養上清を除去し、各抽出液を適当な希釈倍率で含むHEPESバッファー(１０ｍＭのHEPES、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2を含み、ｐＨ７．４に調整したバッファー）を１００μＬずつ各ウェルに添加後、４℃環境下で３０分間静置した。抽出液を含む新しい培養液を添加した後に、３０分間の前処理を上記環境下で行うことにより、LOX-1への抽出物の結合反応を行った。その後、DiI-OxLDLを５μｇ／ｍＬ、牛胎児血清を１０％となるように各ウェルにアプライし、上記環境下で１．５時間静置した。蛍光標識をした酸化LDLを添加した後に、上記環境下で１．５時間の反応を行うことにより、CHO細胞への蛍光標識酸化LDLの結合処理を行った。これらの処理を行った後に、各ウェルをHEPESバッファーで３回洗浄し、ホルマリン１００μＬをアプライし、室温で１５分間反応させ、細胞を固定した。その後、DAPI(４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール)を精製水で１０００倍希釈し、これを１００μＬアプライした。DAPIは死細胞の核を染色するため、これにより細胞数をカウントすることが可能である。DiIを指標に結合した酸化LDLとDAPIの検出を行った。蛍光測定機器は、GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製の「IN Cell Analyzer」を用いた。また、１ウェル当たり４視野を測定し、その平均値を用い結合率の算出を行った。
【００４８】
図４は実施例６で行った、bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞の酸化LDLの結合阻害率を示している。抗LOX-1抗体はCHO細胞への酸化LDLの結合を約９５%阻害していることより、CHO細胞への酸化LDLの結合はほぼCHO細胞に発現しているbLOX-1を介した結合であることが示唆される。図４の結果より、LOX-1アンタゴニスト作用を持たない茶葉エキス(図中「X」)はCHO細胞への酸化LDLの結合を阻害していない。これに対して、LOX-1アンタゴニスト作用剤(図中「グァバ」)は濃度依存的に、CHO細胞への酸化LDLの結合を阻害する効果を有していることが明らかである。
【００４９】
(実施例７)
LOX-1アンタゴニスト作用剤について、bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞を用いた、細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み抑制能を評価した。
【００５０】
bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞を９６ウェルブラックプレートに１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各ウェルに１００μＬずつ１０％牛胎児血清含有HamF12培地のもとで細胞を播種し、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後取り込み阻害の評価を行った。培養上清を５０μＬ除去し、各抽出液を適当な希釈倍率で含む新しい培養液を５０μＬずつ各ウェルに添加後、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で３０分間静置した。抽出液を含む新しい培養液を添加した後に、３０分間の前処理を上記環境下で行うことにより、LOX-1への抽出物の結合反応を行った。その後、DiI-OxLDLを５μｇ／ｍＬとなるように各ウェルにアプライし、上記環境下で６時間静置した。蛍光標識をした酸化LDLを添加した後に、上記環境下で6時間の反応を行うことにより、CHO細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、各ウェルをPBSバッファーで３回洗浄し、ホルマリン１００μＬをアプライし、室温で１５分間反応させ、細胞を固定した。その後、DAPIを精製水で１０００倍希釈し、これを１００μＬアプライした。DAPIは死細胞の核を染色するため、これにより細胞数をカウントすることが可能である。DiIを指標に取り込まれた酸化LDLとDAPIの検出を行った。蛍光測定機器は、GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製の「IN Cell Analyzer」を用いた。また、１ウェル当たり４視野を測定し、その平均値を用い結合率の算出を行った。
【００５１】
図５は実施例７で行った、bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞の酸化LDLの取り込み阻害率を示している。抗LOX-1抗体はCHO細胞への酸化LDLの取り込みを約95%阻害していることより、CHO細胞への酸化LDLの取り込みはほぼCHO細胞に発現しているbLOX-1を介した取り込みであることが示唆される。この結果より、LOX-1アンタゴニスト作用を持たない茶葉エキス(図中「X」)はCHO細胞への酸化LDLの取り込みを阻害していないのに対して、LOX-1アンタゴニスト作用剤(図中「グァバ」)の効果は、濃度依存的に、CHO細胞内への酸化LDLの取り込みを阻害する効果を有していることが明らかである。
【００５２】
(実施例８)
実施例７のようにbLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み抑制能の評価の際、同時にLOX-1アンタゴニスト作用剤のCHO細胞に対する毒性評価を行った。
【００５３】
LOX-1アンタゴニスト作用剤による細胞毒性を検証するために以下のように生細胞数を測定した。生細胞数を測定する方法としては、乳酸脱水素酵素(LDH: Lactate Dehydrogenase)の放出量を測定する方法を用いた。LDHとは全ての細胞に存在する安定な原形質酵素であり、細胞の細胞膜の損傷により細胞内から細胞外へ、つまり培養上清に速やかに放出される。培養上清に放出されたLDHを検出するため細胞障害性検出キット(Cytotoxicity Detection Kit plus(LDH))(Roche社製)を用いて検出を行った。具体的には96 ウェルプレート(ファルコン社製)の半面ずつに前記同様に１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各ウェルに１００μＬずつ１０％牛胎児血清含有HamF12培地のもとでCHO細胞及び細胞を含まない培養液(これをネガティブコントロールとする)を播種し、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後、培養上清を５０μＬ除去し、各抽出液を適当な希釈倍率で含む新しい培養液を５０μＬずつ各ウェルに添加後、上記環境下で６時間静置した。抽出液を含む新しい培養液を添加した後に、６０分間の前処理を上記環境下で行うことにより、細胞に対する抽出物による毒性効果を検討した。６時間の反応を終える１５分前に、抽出物を含まないコントロールのウェルに「溶解液（Lysis solution）」(細胞障害性検出キット付属品)を５μＬ加え、さらに３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で１５ｍｉｎインキュベートした。上記溶解液と接触した細胞は細胞膜障害を受け細胞外の培地へLDHを速やかに放出するため、これをポジティブコントロールとした。反応終了後、４９０ｎｍ、５９５ｎｍの吸光度を測定し、培地内のLDH量を検出することにより、各エキスによる毒性効果を検出した。
【００５４】
図６は実施例８で行った、bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞に対するLOX-1アンタゴニスト作用剤（図中「グァバ」）の毒性試験におけるCHO細胞の生存率を示している。本試験はLOX-1アンタゴニスト作用剤及びLOX-1アンタゴニスト作用を持たない茶葉エキス（図中「X」）を１ｍｇ／ｍＬで行っている。LOX-1アンタゴニスト作用剤は１００μｇ／ｍＬで９０％以上の酸化LDL取り込み阻害効果を持つ事実（図２)と、その１０倍量である１mｇ／ｍＬで安全性が確認できるという結果を考慮すると、本発明のLOX-1アンタゴニスト剤は毒性効果の低い濃度において、充分なアンタゴニスト効果を有することが示唆される。
【００５５】
(実施例９)
LOX-1アンタゴニスト作用剤について、正常大動脈内皮細胞(BAEC:Cell Applications Inc.社製)を用い、細胞内への蛍光標識酸化LDLの結合抑制能を評価した。BAECの経代・維持は１０％牛胎児血清含有DMEM培地(SIGMA社製)を用いて既知の方法で行った。９６ウェルブラックプレートに１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各ウェルに１００μＬずつ細胞を播種し、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で１日間培養した。１日間の培養後、滅菌PBSバッファーにより１ｍｇ／ｍＬに調整した腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α;Tumor necrosis factor-alpha Wako社製)を各ウェル１μＬずつ添加し、さらに３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で１日間培養した。上記環境下で１日間培養することにより、BAECへの炎症作用によりLOX-1の発現が誘導される。1 日間の培養後、酸化LDL結合阻害の評価を行った。また、細胞内への蛍光標識酸化LDLの結合抑制能評価について、培地は上記のものを用い、その他方法は(実施例６)と同様に行った。結果を図７に示す。
【００５６】
(実施例１０)
LOX-1アンタゴニスト作用剤について、BAECを用い、細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み抑制能を評価した。培地は１０％牛胎児血清含有DMEM培地を用いた。プレートへの播種およびTNF-αを用いた刺激処理の方法は(実施例９)と同様に行い、その後の酸化LDLの取り込み抑制能評価の方法は(実施例７)と同様に行った。
【００５７】
図７は実施例９で行ったBAECの酸化LDLの結合阻害率と、実施例１０で行ったBAECの酸化LDL取り込み阻害率を示している。本試験は抗LOX-1抗体を３０μｇ／ｍＬ、LOX-1アンタゴニスト作用剤（図中、「グァバ」）及びLOX-1アンタゴニスト作用を持たない茶葉エキス（図中「X」）を３００μｇ／ｍＬで行っている。この結果より、LOX-1アンタゴニスト作用剤はBAECの細胞内への酸化LDLの取り込みを阻害する効果を有していることが明らかである。またLOX-1アンタゴニスト効果を有する抗LOX-1抗体を用いた結果と比較すると、LOX-1アンタゴニスト作用剤は抗LOX-1抗体よりも高い酸化LDL結合阻害効果及び取り込み阻害効果を有することが明らかになった。これより、LOX-1アンタゴニスト作用剤はLOX-1に加え、LOX-1以外のスカベンジャーに対するアンタゴニスト効果を有していることが示唆された。
【００５８】
（実施例１１）
実施例１０のBAECを用いた細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み抑制能の評価の際、同時にLOX-1アンタゴニスト作用剤の細胞に対する毒性評価を行った。毒性評価試験方法について、培地は１０％牛胎児血清含有DMEM培地を用いて行い、その他方法は(実施例８)と同様に行った。
【００５９】
図８は実施例１１で行った、BAECに対するLOX-1アンタゴニスト作用剤の毒性試験における細胞の生存率を示している。本試験はLOX-1アンタゴニスト作用剤（図中、「グァバ」）及びLOX-1アンタゴニスト作用を持たない茶葉エキス（図中「X」）を５００μｇ／ｍＬで行っている。LOX-1アンタゴニスト作用剤は３００μｇ／ｍＬで８０％以上の酸化LDL結合阻害効果及び９０％以上の取り込み阻害効果を持つ事実（図７）と、さらに濃い濃度である５００μｇ／ｍＬで安全性が確認できるという結果を考慮すると、本発明のLOX-1アンタゴニスト剤は毒性効果の低い濃度において、充分なアンタゴニスト効果を有することが示唆される。
【００６０】
(実施例１２)
LOX-1アンタゴニスト作用剤のLOX-1以外のスカベンジャー受容体に対するアンタゴニスト作用に関して、SR-AIIに対する変性LDLであるアセチル化LDL結合率をSR-A蛋白質を用いて評価を行った。
【００６１】
スカベンジャーレセプターに含まれるSR-AIIに関してはヒト脾臓由来のcDNAライブラリーをテンプレートとして、膜貫通領域を除く配列を取得するため、以下の２段階のプライマーを用いてnested PCRを行った。このように増幅したPCR産物とpSecTag2/Hygroベクター(invitrogen社製)をHindIII及びNotIを用いて制限酵素処理を行った後、これらをライゲーションすることによりプラスミドを完成させた。その後、ベクターへ正しくSR-AIIの配列が挿入されているかを確認するためシーケンスを行った。正しい配列が確認されたプラスミドについては、FreeStyle 293-F 細胞(invitrogen社製)に形質転換し、定法に従い分泌蛋白質として培地から回収した。この培地より得られたSR-AII蛋白質を、Ni-NTAアガロースカラム(Qiagen社製)を用いて精製した。
1段階目のプライマー
FW：5' tccttcaaagctgcactg 3'（配列表の配列番号1）
RV： 5' agagggccctgccctaatatg 3'（配列表の配列番号２）
2段階目のプライマー
FW： 5' aaccaagcttatgctgaagtgggaaacg 3'（配列表の配列番号３）
RV： 5' ataagaatgcggccgcagagggccctgccctaatatg 3'（配列表の配列番号４）
【００６２】
ELISAはSR-A蛋白質を用い、変性LDLはアセチル化LDL(AbD Serotec 社製)を用いて行った。またその他の方法は(実施例２)と同様に行った。
【００６３】
図９は、図１の結果と実施例１２で行った、SR-A蛋白質を用いたELISAより得られた結果を比較したものであり、蛋白質bLOX-Fcと酸化LDL（図中、左側）及びSR-A蛋白質とアセチル化LDL（図中、右側）の結合阻害率を示している。LOX-1アンタゴニスト作用剤（図中「グァバ」）は両スカベンジャー受容体に対して変性LDLである酸化LDL又はアセチル化LDLとの結合を阻害する効果を有していることが明らかである。なお、図中の「Ｘ」はアンタゴニスト作用を持たない茶葉エキスを示す。
【００６４】
以上の結果から、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤は、以下３点の特徴を有することがわかる。
（１）LOX-1を介した細胞内への酸化LDL取り込み阻害効果に優れ、かつ安全性が高い。
（２）細胞内へのLOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した酸化LDL取り込み阻害効果も有しており、かつ安全性が高い。
（３）LOX-1と酸化LDL間に加え、SR-Aと変性LDL間の結合を阻害する。
このような特徴を有する本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤は、多面的な阻害剤の効果を有しており、よって動脈硬化症の初期段階で起きる血管内皮細胞の変性LDLの取り込み及び炎症に対する予防効果が期待できる。
【００６５】
上記のLOX-1アンタゴニスト作用剤の食品組成物、医薬組成物中への添加量は、前記組成物１００ｇあたり固形分で２５０ｍｇ以下が好ましく、具体的には一日あたり５０〜５００ｍｇ摂取することにより、安全性と有効性が両立できる。例えば、食品組成物、医薬組成物の配合例としては、以下のものが挙げられる。
【００６６】
(実施例１３)
キャンディへの配合例
砂糖６４ｇ、水飴３５ｇを１５０℃で加熱溶解し、１２０℃に冷却後、クエン酸１ｇ、LOX-1アンタゴニスト作用剤５０〜５００ｍｇを添加、攪拌後、均一としたものを成型し、冷却してキャンディを得た。
【００６７】
(実施例１４)
グミへの配合例
砂糖４５ｇ、水飴５０ｇを１１０℃で加熱溶解し、別途膨潤溶解させたゼラチン８ｇを添加し、さらにクエン酸２ｇ、LOX-1アンタゴニスト作用剤５０〜５００ｍｇを添加混合し、型に流し込み、一昼夜静置後、型からはずして、グミを得た。
【００６８】
(実施例１５)
錠剤への配合例
デキストリン２０ｇ、乳糖１０ｇ、パラチノース１５ｇ、バレイショデンプン４０ｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｇ、LOX-1アンタゴニスト作用剤５０〜５００ｍｇを均一に混合し、得られた組成物を流動法で造粒してから乾燥し、さらに打錠機にて打錠して錠剤を得た。
【００６９】
(実施例１６)
カプセル剤への配合例
スクワレン２０ｇ、リノレン酸トリグリセリド２０ｇ、小麦胚芽油１０ｇ、精製イワシ油２０ｇ、トコフェノール０．２ｇを混合攪拌し、均一な組成物とした。この組成物に脱脂大豆粉末３９．８ｇとLOX-1アンタゴニスト作用剤５０〜５００ｍｇを加えてニーダにより十分に混練した。得られた混練物をカプセル充填機によりカプセル化してカプセル剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤は、LOX-1への酸化LDLの結合を阻害するアンタゴニスト作用、LOX-1及びLOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した脂質取り込み抑制作用、あるいは動脈硬化抑制作用に優れており、かつ安全性が非常に高い。よって本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤はヒトあるいは非ヒト動物が継続して摂取しても副作用等の心配がない。また、継続的な摂取により、血管内皮細胞等の動脈硬化症に関連する細胞への酸化LDLの取り込みが継続的に阻害され、結果としてヒトあるいは非ヒト動物における動脈硬化症の発症を抑えたり、また症状を緩和することが期待できる。
例えば、茶は植物の乾燥葉を湯で抽出することにより得られ、その調整は日本の一般家庭において日常的に行われており、簡便であることから、本発明のLOX-1アンタゴニスト作用剤を含む飲料組成物を摂取することで、日常から手軽に行う動脈硬化症予防及び治療を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は実施例２の実験、蛋白質bLOX-Fcを用いたELISAから得られた解析結果を示すグラフである。酸化LDLを５μｇ／ｍＬの濃度で添加したときの各々のABS４５０nmの値を１００％として換算した値を結合率とした。縦軸は１００％から結合率を差し引いた値を結合阻害率として示した。なお、全てのABS４５０ｎｍの値については、酸化LDLを添加しなかったネガティブコントロールの値を差し引いた。
【図２】図２は実施例４の実験結果を示すグラフである。蛋白質bLOX-Fcを用いたELISAから得られた解析結果を示すグラフである。酸化ＬＤＬを５μｇ／ｍＬの濃度で添加したときの各々のＡＢＳ  ４５０ｎｍの値を１００％として換算した値を結合率とした。縦軸は１００％から結合率を差し引いた値を結合阻害率として示した。なお、全てのＡＢＳ  ４５０ｎｍの値については、酸化ＬＤＬを添加しなかったネガティブコントロールの値を差し引いた。
【図３】図３は実施例５の実験結果を示すグラフである。蛋白質bLOX-Fcを用いたELISAから得られた解析結果を示すグラフである。酸化ＬＤＬを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加したときの各々のＡＢＳ  ４５０ｎｍの値を１００％として換算した値を結合率とした。縦軸は１００％から結合率を差し引いた値を結合阻害率として示した。なお、全てのＡＢＳ  ４５０ｎｍの値については、酸化ＬＤＬを添加しなかったネガティブコントロールの値を差し引いた。
【図４】図４は実施例６の実験、bLOX-1を発現したCHO細胞の酸化LDL結合実験から得られた解析結果を示すグラフである。細胞に結合した酸化LDL量を示す蛍光量については、全ての処理区において阻害剤及び蛍光標識した酸化LDLを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。阻害剤を含まない蛍光量を上記のように処理し、細胞数で除したコントロールの値を１００％として換算した値を酸化LDL結合率とした。縦軸は１００％から酸化LDL結合率を差し引いた値を酸化LDL結合阻害率として示した。
【図５】図５は実施例７の実験、bLOX-1を発現したCHO細胞の酸化LDL取り込み実験から得られた解析結果を示すグラフである。細胞内へ取り込まれた酸化LDL量を示す蛍光量については、全ての処理区において阻害剤及び蛍光標識した酸化LDLを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。阻害剤を含まない蛍光量を上記のように処理し、細胞数で除したコントロールの値を１００％として換算した値を酸化LDL取り込み率とした。縦軸は１００％から酸化LDL取り込み率を差し引いた値を酸化LDL取り込み阻害率として示した。
【図６】図６は実施例８の実験、bLOX-1を発現したCHO細胞の毒性試験から得られた解析結果を示すグラフである。各々の阻害剤についてABS４９０nmの値からABS５９５nmの値を差し引き培地のバックグラウンドを除いた。さらに、細胞を含むウェルの値から細胞を含まないウェルの値を差し引き、細胞溶解液を加えたポジティブコントロールの値を１００％として換算した値を毒性とした。縦軸は１００％から毒性を差し引いた値を生存率として示した。
【図７】図７は実施例９の実験、BAECの酸化LDL結合実験と実施例１０の実験、BAECの酸化LDL取り込み実験から得られた解析結果を示すグラフである。細胞に結合した酸化LDL量及び細胞内へ取り込まれた酸化LDL量を示す蛍光量については、全ての処理区において阻害剤及び蛍光標識した酸化LDLを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。阻害剤を含まない蛍光量を上記のように処理し、細胞数で除したコントロールの値を１００％として換算した値を酸化LDL結合率及び酸化LDL取り込み率とした。縦軸は１００％から酸化結合率又は酸化LDL取り込み率を差し引いた値を酸化LDL結合阻害率又は酸化LDL取り込み阻害率として示した。
【図８】図８は実施例１１の実験、BAECの毒性試験から得られた解析結果を示すグラフである。各々の阻害剤についてABS４９０ｎｍの値からABS５９５ｎｍの値を差し引き培地のバックグラウンドを除いた。さらに、細胞を含むウェルの値から細胞を含まないウェルの値を差し引き、細胞溶解液を加えたポジティブコントロールの値を１００％として換算した値を毒性とした。縦軸は１００％から毒性を差し引いた値を生存率として示した
【図９】図９は実施例１２の実験、蛋白質SR-Aを用いたELISAから得られた解析結果を図７の蛋白質bLOX-Fcを用いた解析結果と共に示すグラフである。蛋白質SR-Aについては、アセチル化LDLを５μｇ／ｍＬの濃度で添加したときの各々のABS４５０ｎｍの値を１００％として換算した値を結合率とした。縦軸は１００％から結合率を差し引いた値を結合阻害率として示した。なお、全ての４５０ｎｍの値については、アセチル化LDLを添加しなかったネガティブコントロールの値を差し引いた。蛋白質bLOX-Fc及び蛋白質SR-AのELISAについて各阻害剤１０μｇ／ｍＬを添加した場合の解析結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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