(57)【要約】【課題】改良された治療インデックスと抗癌剤に特有の副作用の減弱を得ることができる、腫瘍の治療に有用な医薬品を提供すること。【解決手段】式（Ｉ）のアルカノイルＬ−カルニチン（式中、ＲおよびＸ−は明細書中で定義された通りである）を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。2010254717.tif 000025            （Ｉ）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2010254717.tif 000024
（Ｉ）
［式中、Ｒはアセチル基であり、Ｘ−は医薬上許容される塩のアニオンを示す］
の化合物を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物、ここで、該医薬組成物は該腫瘍の転移を減少させることに特徴付けられる。
【請求項２】
腫瘍が肺腫瘍である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
タクソールまたはブレオマイシンから選択される抗癌剤をさらに含む請求項１または２に記載の医薬組成物、ここで、該医薬組成物は実質的に該抗癌剤に固有の副作用が無いことに特徴付けられる。
【請求項４】
抗癌剤がタクソールである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗癌剤がブレオマイシンである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
副作用が好中球減少症である、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
副作用が抹消神経障害である、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
副作用が肺損傷である、請求項３または５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
タクソールまたはブレオマイシン、およびアセチルＬ−カルニチンを含み、Ｌ−カルニチンをさらに含んでいてもよい、組み合わせ物。
【請求項１０】
請求項９記載の組み合わせ物を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物、ここで、該医薬組成物は、実質的に副作用が無いかまたは限定された副作用のみを生じることに特徴付けられる。
【請求項１１】
請求項９記載の組み合わせ物を、医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
治療有効量のタクソールまたはブレオマイシンを、保護有効量のアセチルＬ−カルニチンと共に、医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ａ）治療有効量のタクソールまたはブレオマイシンを含有する医薬組成物；
ｂ）該タクソールまたはブレオマイシンの副作用に対して実質的な保護作用を示すのに有効な量の、少なくとも１の請求項１の化合物を含有する医薬組成物
を含む、キット。
【請求項１４】
活性成分として、タクソールまたはブレオマイシンから選択される抗癌剤の治療有効量、および少なくとも１の請求項１の化合物またはその医薬上許容される塩の解毒有効量を含有する、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１の化合物の医薬上許容される塩がクロライド、ブロミド、オロテート、酸アスパルテート、酸シトレート、酸ホスエフェート、フマラート、酸フマラート、マレエート、酸マレエート、酸オキサレート、酸スルフェート、グルコースホスフェート、タートレートおよび酸タートレートからなる群から選択される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
タクソールまたはブレオマイシンから選択される抗癌剤の治療有効量を含有する医薬組成物、およびアセチルＬ−カルニチンもしくはその医薬上許容される塩の、該抗癌剤により誘導される毒性を減弱するが、同時に該抗癌剤の抗癌作用を維持する解毒量を含有する医薬組成物、を含むキット。
【請求項１７】
連続投与のための、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
抗癌剤およびアセチルＬ−カルニチンもしくはその医薬上許容される塩の投与を実質的に同時に行うための、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
請求項１〜８、１０〜１２、１４および１５のいずれかに記載の医薬組成物を含有し、各医薬組成物の同時併用摂取または予め定められた用法に基づく摂取を指示する説明書が添付された製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−カルニチンおよびアルカノイルＬ−カルニチンの、腫瘍治療のための医薬の製造における使用、特に該物質の腫瘍治療のための抗癌剤と組み合わせての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ヒトに抗癌剤を使用すると、様々な毒性作用や副作用を生じ、これが患者の生活をおびやかすことは良く知られている。実際に、抗癌剤に起因する合併症のために抗癌剤の投与量を減らしたり、治療自体を中断するようなことがある。
【０００３】
投与量の減少または治療の中断は、再発を促し、多くの場合各患者の一般症状を悪化させることとなり、時には患者を死に至らしめる。
病院のスタッフや、腫瘍患者の家族などの間での、非常に重要でまた切実に望まれていることは、治療されている患者の「生活の質の向上」である。
癌治療のために日常的に多重化学療法が施されている患者の体重がかなり減ることもまた、良く知られている。
【０００４】
ヒトを治療するための抗癌剤の数及びその重要性が増加しているにもかかわらず、その使用を制限する主要因は毒性副作用であることは、この問題が未だに懸念されている課題であることを意味する。
【０００５】
すなわち、新規な剤もしくは複数の剤の適当な組み合わせであって、ヒト治療に用いられる抗癌剤に起因する毒性もしくは副作用を実質的に減弱させるものを見出すことは、強く望まれている。
【０００６】
Ｌ−カルニチンと抗癌剤と組み合わせて使用することはすでに公知である。
実験動物モデルにおいて、ドキソルビシン単独を投与したラットにおける体重減少は、同じ物質をＬ−カルニチンと組合せて投与したラットの体重減少より大きかった〔Senekowitsch R, Lohninger A, Kriegel H．， Staniek H．， Krieglsteiner HP．， Kaiser E．「心臓毒性のあるアドリアマイシンに対するＬ−カルニチンの保護作用」    Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｏｎ  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｈｅａｒｔ．  Ｉｎ：  Ｋａｉｓｅｒ  Ｅ．，  Ｌｏｈｎｉｎｇｅｒ  Ａ．，  （ｅｄｓ．）．  「カルニチン、その肺および心臓疾患における役割。」(Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ：  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ〕：  １２６−１３７．  Ｋａｒｇｅｒ，  ＢａｓｅＬ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７）。
【０００７】
米国特許第4,713,370号はカルニチンを細胞増殖抑制剤、例えばダウノマイシン、Ｎ−アセチルダウノマイシンおよびダウノマイシンオキシム、と組み合わせて用いて、これらの化合物の心臓毒性を減弱させることを開示している。米国特許第4,267,163号はカルニチンを細胞増殖抑制剤、例えばアドリアマイシン、アドリアマイシン−14−オクタノエート、4'−エピ−アドリアマイシン、アドリアマイシンベータアノマーおよび4'−エピ−アドリアマイシンガンマ−アノマーと共に用いて、これらの化合物の心臓毒性を減弱させることを開示する。米国特許第4,751,242号はアセチルＬ−カルニチンを抹消神経障害の治療に用いることを開示する。
【０００８】
アントラサイクリン誘導性心臓毒性に対するカルニチンの効果を評価した報告もある（Neri B., Comparini T., Milani A., Torcia M., Clin. Trial J． 20， 98-103， 1983； De Leonardis V．， De Scalzi M．， Neri B．， et al． Int． J． Clin． Pharm． Res． 70， 307−311， 1987）。
【０００９】
上に引用した参考特許および書籍には、抗癌剤の毒性もしくは副作用を減弱させるために多くの努力がなされたことが示されているのであるが、この重大な問題は満足のゆく状態で解決されてはいない。
【００１０】
カルボプラチンは、シスプラチンの構造異性体である。カルボプラチンによる腎毒性は決して無視できるわけではないがシスプラチンの腎毒性より低い。
ビンクリスチンは良く知られた抗癌剤であるが、毒性を有しており、特に免疫系レベルに影響を与える。
タクソールはTaxus brevifolia の樹皮から最初に分離された天然抽出物であり、抗癌作用を有するがヒトに対して神経毒性および骨髄毒性を有することが示されている。タクソールは、プラチナ療法に耐性を示す腫瘍の処置に用いられるが、末梢神経系により大きな累積的毒性を引き起こす。タクソールによる処置を受けた患者に好中球減少が認められることもまた、報告されている（Rowinsky e al．； Semin． Oncol． （1993， Aug. 20 （4 suppl 3）， 1−15； Onetto e al． J． Natl． Cancer Inst． Monogr． （1993）； （15）：131−9）。
【００１１】
ブレオマイシンは、典型的には精巣癌、リンパ腫及び他の種類の腫瘍に罹患している若年の患者の処置に用いられる。ブレオマイシンの肺毒性は、肺胞上皮バリアの崩壊と、その結果として生じる肺胞内の繊維芽細胞の増殖および細胞該マトリックス成分の沈着に特徴付けられる（Karam H et ＡＬＣell Biol． Toxicol（1998 Feb）；14（1）：13−22）。２型肺細胞は損傷されたまたは消失した上皮を修復することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
薬剤療法による一般的問題のひとつは、薬剤の治療インデックスである。これは、治療有効用量の毒性用量、またはいずれにしても副作用を生じる用量に対する比率である。
【００１３】
医療界では、患者が処置に対して立ち向かうことができるような治療管理をすること、および同時に、抗癌化学療法においては非常に困難であるが、許容できる生活の質を守ることが必要であると認識されている。このような認識は、動物の治療、例えばペットと呼ばれる動物の治療にもあてはまることである。
【００１４】
用量を下げようという自然な流れ、およびそれゆえ患者の薬の服用頻度を多くしすぎることなく、治療に有効な投与を行うのに適した製剤形態を使用することと、各抗癌剤の最少有効量とは相容れない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
驚くべきことに、抗癌剤とＬ−カルニチンまたは以下に定義するアルカノイルＬ−カルニチンとの併用使用は、抗癌剤の活性に対して予期されなかった相乗作用を示した。なお、「併用使用」については以下に詳細に定義する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において、全く予期しなかったのであるが抗癌剤、特にタクソール、カルボプラチン、ブレオマイシンおよびビンクリスチンの治療有効量と、Ｌ−カルニチンまたはアルカノイル基が炭素原子２−８の直鎖もしくは分岐鎖状であるアルカノイルＬ−カルニチン、またはその医薬上許容される塩の一つの、解毒有効量との併用使用により、抗癌剤の効果を減ずることなく毒性及び副作用に対する強い保護作用が得られる。このことから、治療対象がヒトであれ動物であれ、他の効果に加えて生活の質の顕著な改善と、治療対象の生命それ自体の延長がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
さらに、上記のごとき併用使用が、腫瘍の転移に対する抑制作用を有することもまた、見出された。
従って、本発明の一つの目的は式（I)の化合物：
【化１】
2010254717.tif 000002
［式中、Ｒは水素または２から８炭素原子のアルカノイル基であり、Ｘ−は医薬上許容される塩のアニオンを示す］
の、抗癌剤を含有する医薬品の製造への使用であって、該化合物は抗癌剤の活性に対して相乗効果を示すことに特徴付けられる。
【００１８】
本発明の別の目的は、抗癌剤の副作用を実質的に減弱する、式（Ｉ）の化合物の併用使用を提供することである。
本発明の更なる目的は、式（Ｉ）の化合物を、転移抑制のために有用な医薬品の製造に使用することである。
本発明の更に別の目的は、式（Ｉ）の化合物と抗癌剤との組み合わせ物および関連する医薬組成物である。
【００１９】
アルカノイルＬ−カルニチンには良く知られているように毒性の副作用が無い。このためアルカノイルＬ−カルニチン類は長期間の治療においても、毒性または副作用の予防や治療、例えば体重減少、心臓、腎臓および中枢神経系の損傷、特にタクソールによる神経障害または好中球減少、もしくはブレオマイシンに誘導される肺損傷、のためであっても安全に使用される。
【００２０】
本発明の実施はまた、治療される患者の生活の質の向上にも寄与する。例えば、抹消神経障害、好中球減少、呼吸不全または体重減少に起因する衰弱など、これらの剤により惹起される物理的苦しみを少し考えれば理解されるであろう。
【００２１】
本発明の上記及び他の目的を、本発明の態様および実施例により詳細に開示する。
本明細書において、「抗腫瘍性」「抗癌」および「抗増殖性」という用語は、本質的に同じ意味であると理解されるべきである。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明において、上述化合物の「併用使用」が意味するのは（i)共同投与、つまり実質的に同時にもしくは連続的に、Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンもしくはその医薬上許容される塩と、抗癌剤を投与すること、もしくは（ii)上記活性成分を組み合わせ物として、任意に医薬上許容される賦形剤および／またはビヒクルとの混合物として含有する組成物を投与することの両方である。
【００２３】
本発明は従って、式（I)のＬ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンもしくはその医薬上許容される塩、および抗癌剤の共同投与；および経口投与、非経口投与または鼻内投与により投与することのできる医薬組成物であって、上記２つの活性成分を混合して含有する、叙放性製剤を含む医薬組成物の両方に及ぶ。好ましくは、アルカノイルＬ−カルニチンはアセチルＬ−カルニチン（以下、ＡＬＣまたはＡＬＣａｒと略す）、プロピオニルＬ−カルニチン(以下、ＰＬＣと略す）、ブチリルＬ−カルニチン、バレリルＬ−カルニチンおよびイソバレリルＬ−カルニチンまたはこれらの医薬上許容される塩を含む。これらのうちで好ましいのは、アセチルＬ−カルニチン、プロピオニルＬ−カルニチン、およびブチリルＬ−カルニチンである。
【００２４】
以下の詳細な説明から明白ではあるが、タクソール、アセチルＬ−カルニチンとプロピオニルＬ−カルニチン、またはブレオマイシンとアセチルＬ−カルニチン、またさらには、Ｌ−カルニチンカルニチンとタクソールまたはカルボプラチンもしくはビンクリスチンのごとき、抗癌剤との併用使用もまた、可能であると考えられる。これら全ての態様において、Ｌ−カルニチンを併用使用に用いることができる。
【００２５】
共同投与はまた、別個の投与製剤であるＬ−カルニチンまたは上記アルカノイルＬ−カルニチン類の一つ、もしくはこれらの医薬上許容される塩と、抗癌剤とを含有するパッケージもしくは製品であって、活性成分を同時もしくは決められた時間どおりに、患者の症状に基づき担当医が定めた処方により投与するよう、説明書が添付されたものもまた、含む。
【００２６】
Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンの、「医薬上許容される塩」の語は、後者と毒性もしくは副作用をもたらさないいずれかの酸との塩を含む意味である。このような酸は薬理学者および医薬品工業に従事する者に良く知られている。
【００２７】
Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンの医薬上許容される塩の例は、以下のものに限定されるわけではないが、クロライド、ブロミド、ヨーダイド、アスパルテート、酸アスパルテート、シトレート、酸シトレート、タートレート、酸タートレート、ホスフェート、酸ホスエフェート、フマラート、酸フマラート、グリセロホスフェート、グルコースホスフェート、ラクテート、マレエート、酸マレエート、ムカート、オロテート、オキサレート、酸オキサレート、スルフェート、酸スルフェート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メタンスルホネート、パモエートおよび酸パモエートが含まれる。
【００２８】
Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンを臨床で用いる場合の、好ましい毎日投与用の処方のひとつは、Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチン、好ましくはアセチルまたはプロピオニルＬ−カルニチンを０.１から３ｇ、より好ましくは０.５から３ｇを含有するものである。
【００２９】
本発明は、上述の抗癌剤に起因する体重減少、心臓、腎臓および中枢神経系の損傷、抹消神経系損傷および肺損傷などの、毒性または副作用を予防もしくは治療するのに有利である。
【００３０】
「実質的保護作用」の語は、副作用の予防、減弱もしくは除去が、統計的に有意な程度であることを意味する。
本発明はまた、禁忌による治療の中止を余儀なくされることなく、予定された処置プロトコルを維持すること、または化学療法剤の投与量を増加させることができることから、治療の効果が上がり、患者の癒し効果および生命の寿命の延長に寄与することができる。
【００３１】
本発明により得られる他の有利な点は、処置される患者の生活の質に関するものである。上記に述べたように、抹消神経障害や体重減少による衰弱による肉体的苦痛の減弱もしくは除去は、患者自身の満足度の向上に役立つ。経済的な観点からも、病院施設や家族が患者の世話をするために発生するコストについて、節約することができるのは明らかである。
【００３２】
骨髄抑制は、様々な腫瘍、例えば乳癌、子宮癌、肺癌（小細胞及びその他の肺癌）、頭および頚部の治療のために用いられる化学療法剤である、タクソールの投与の結果に生じる副作用である（Slichenmeyer and Von Hoff: J. Clin. Pharmacol. （1990）, 30, 770-778）。タクソールに用いられているビヒクルは、市販の医薬処方（登録商標タクソール  ブリストルマイヤーズスクイブ）でも用いられている、ひまし油のポリエトキシル化誘導体である、登録商標クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬとして知られているものである。これがヒスタミン遊離およびアナフィラトキシー反応をイヌおよびヒトにおいて誘導し得ることが開示されている（Ｓｌｉｃｈｅｎｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ：ｉｂｉｄ；Ｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｌｌｅｒｇｙ  （１９９２），４７，６２４−６２９；Ｈｅｒｓｈｋｏｖｉｚ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９４），５６，４９５−５０１；Ｉｎｏｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．（１９９４），５６，４５−４９）。市販されている薬のビヒクルが登録商標クレモフォアＥＬであるという事実に鑑みれば、治療に用いられる製剤に関する骨髄毒性の問題に迫ることができる。
【００３３】
増殖性疾患の治療における最も重要な問題のひとつは、腫瘍の転移性拡散である。これによって時に最初の腫瘍の治療が意味のないものとなるまでに進行し、そしてそれ自身が死亡原因となる。
【００３４】
本発明の第１の好ましい態様においては、Ｌ−カルニチンと、タクソール、カルボプラチンまたはビンクリスチンのごとき抗癌剤とを組み合わせると、処置をした患者の生存期間が確実に延長される。
本発明の第２の態様において、アセチルＬ−カルニチンはタクソールにより誘導される副作用、例えば神経障害、骨髄抑制および体重減少、に対する予期されなかった保護作用を示す。
【００３５】
本発明の第３の態様において、アセチルＬ−カルニチンはタクソールと共に投与した場合、驚くべき抗転移活性を特に肺癌に関して示すというものである。
【００３６】
他の好ましい態様によれば、プロピオニルＬ−カルニチンがタクソールとの組み合わせで驚くべき相乗作用を示した。
タクソールは重篤な好中球減少を示し、好中球量は第3から4回目の投与で最低となった。
【００３７】
本発明において、ＡＬＣには抗癌剤の抗癌作用を妨害する作用は認められなかった。
ＡＬＣは簡便には経口投与する。だからといって当業者が適用してよいとする他の投与経路が本願から除かれるわけではなく、特に注射により、例えば抗癌剤と同じ点滴バイアル中に添加して、あるいは抗癌剤に続いて投与してもよい。
【００３８】
同様に、プロピオニルＬ−カルニチン（ＰＬＣ）はタクソールの治療効果と相乗効果を示した。
従って、保護作用剤としてのアセチルＬ−カルニチン、相乗作用剤としてのプロピオニルＬ−カルニチン、およびタクソールの３つの組み合わせが有利であることは明らかであり、これはまた別々の製剤でも、上と同様に組み合わせたものであってもよい。この組み合わせは、相乗作用を示すか、または本発明の組み合わせにより実質的に減弱された副作用を誘導する他の抗癌剤を含有していてもよい。Ｌ−カルニチンを上述の組み合わせに追加することも好ましい。
【００３９】
本発明の特別な目的の一つは、治療有効量のタクソールを、保護有効量のアセチルＬ−カルニチンおよび相乗効果有効量のプロピオニルＬ−カルニチンと共に、医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する医薬組成物を提供することである。
【００４０】
本発明の別の態様においては、これもまた有用である、保護成分としてのアセチルＬ−カルニチンとブレオマイシンとの二成分の組み合わせ物を提供する。
【００４１】
本発明をどのように適用するかという観点からすれば、本発明の態様のうちのひとつとしてはａ）治療有効量の抗癌剤を含有する医薬組成物；ｂ）少なくとも１の、上に定義したアルカノイルＬ−カルニチンの、該抗癌剤に対する相乗作用を示す量を含有する医薬組成物、およびｃ）少なくとも１の上に定義したアルカノイルＬ−カルニチンおよび／またはＬ−カルニチンの、該抗癌剤の副作用に対する実質的な保護作用を示す量を含有する、医薬組み合わせ物、を含有するキットが含まれる。本発明のこのキットは、ａ）治療有効量の抗癌剤を含有する医薬組成物；ｂ）少なくとも１つの上に定義したアルカノイルＬ−カルニチンの該抗癌剤との相乗作用を示すのに有効な量を含有する医薬組成物、からなる態様であってもよい。または、本発明のキットはａ）治療有効量の抗癌剤を含有する医薬組成物；およびｂ）少なくとも１の上に定義したアルカノイルＬ−カルニチンおよび／またはＬ−カルニチンの、該抗癌剤の副作用に対する実質的な保護作用を示す量含有する医薬組み合わせ物、からなる態様であってもよい。
【００４２】
上記キットの特別な例としては、カルボプラチン、ビンクリスチン、タクソール、およびブレオマイシンを抗癌剤として用いたものが挙げられる。
【００４３】
以下、本発明を実施するための方法を、タクソールを抗癌剤とし、アセチルＬ−カルニチンを実質的保護剤として、そしてプロピオニルＬ−カルニチンを実質的相乗作用剤として用いる好ましい態様を例として、説明する。
【００４４】
本分野の専門家が、必要な場合には恐らく周辺の知識も動因して、自身が従事する分野における自身の一般的な知識に基づき、実験プロトコルを完成させ得るとは当然である。
【００４５】
本発明の実施態様：
（１）抗癌剤を含有する医薬品を製造するための、式（Ｉ）
【化２】
2010254717.tif 000003
（Ｉ）
［式中、Ｒは水素または２から８炭素原子のアルカノイル基であり、Ｘ−は医薬上許容される塩のアニオンを示す］の化合物の使用、該化合物は抗癌剤の活性に対して相乗効果を示すことに特徴付けられる。
（２）Ｒがプロピオニルである、（１）記載の使用。
（３）抗癌剤がタクソールである、（１）または（２）記載の使用。
（４）抗癌剤がブレオマイシンである、（１）または（２）記載の使用。
（５）腫瘍の転移を減少させるのに有用な医薬品を製造するための、式（Ｉ）
【化３】
2010254717.tif 000004
（Ｉ）
［式中、Ｒは水素または２から８炭素原子のアルカノイル基であり、Ｘ−は医薬上許容される塩のアニオンを示す］の化合物の使用。
（６）治療される腫瘍が肺腫瘍である、（５）記載の使用。
（７）Ｒがアセチル基である、（５）または（６）記載の使用。
（８）タクソール、カルボプラチン、ブレオマイシン及びビンクリスチンからなる群から選択される抗癌剤を含有する医薬品を製造するための、（１）記載の化合物、特にアセチルＬ−カルニチンまたはその医薬上許容される塩の一つの使用、該医薬品には実質的に該抗癌剤に固有の副作用が無いことに特徴付けられる。
（９）抗癌剤がタクソールである、（８）記載の使用。
（１０）抗癌剤がブレオマイシンである、（８）記載の使用。
（１１）副作用が好中球減少症である、（８）または（９）記載の使用。
（１２）副作用が抹消神経障害である、（８）または（９）記載の使用。
（１３）副作用が肺損傷である、（８）または（９）記載の使用。
（１４）タクソール、アセチルＬ−カルニチンおよびプロピオニルＬ−カルニチンを含み、任意にＬ−カルニチンを含有する組み合わせ物。
（１５）（１４）記載の組み合わせ物の、抗癌作用を有する医薬品の製造のための使用、該医薬品は相乗作用を示し、実質的に副作用が無いかまたは限定された副作用のみを生じることに特徴付けられる。
（１６）（１４）記載の組み合わせ物を、医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する、医薬組成物。
（１７）治療有効量のタクソールを、保護有効量のアセチルＬ−カルニチン、および相乗効果を発揮する量のプロピオニルＬ−カルニチン、および任意にＬ−カルニチンと共に、を医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する、（１６）記載の医薬組成物。
（１８）ブレオマイシン、アセチルＬ−カルニチンおよび任意にＬ−カルニチンを含有する、組み合わせ物。
（１９）（１８）記載の組み合わせ物の、抗癌作用を有する医薬品の製造のための使用、実質的に副作用が無いかまたは限定された副作用のみを生じることに特徴付けられる。
（２０）（１８）記載の組み合わせ物を、医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する、医薬組成物。
（２１）治療有効量のブレオマイシンを、保護有効量のアセチルＬ−カルニチンと共に、医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤との混合物として含有する、（１６）記載の医薬組成物。
（２２）ａ）治療有効量の抗癌剤を含有する医薬組成物；
ｂ）少なくとも１の（１）の化合物の、該抗癌剤と相乗効果を発揮するのに有効な量を含有する医薬組成物；
ｃ）少なくとも１の（１）の化合物の、該抗癌剤の副作用に対して実質的な保護作用を示すのに有効な量を含有する医薬組成物
を含む、キット。
（２３）ａ）治療有効量の抗癌剤を含有する医薬組成物；
ｂ）少なくとも１の（１）の化合物の、該抗癌剤と相乗効果を発揮するのに有効な量を含有する医薬組成物
を含む、キット。
（２４）ａ）治療有効量の抗癌剤を含有する医薬組成物；
ｂ）少なくとも１の（１）の化合物の、該抗癌剤の副作用に対して実質的な保護作用を示すのに有効な量を含有する医薬組成物
を含む、キット。
（２５）活性成分として、タクソール、カルボプラチンおよびビンクリスチンからなる群から選択される抗癌剤の治療有効量、および少なくとも１の（１）の化合物またはその医薬上許容される塩の解毒有効量を含有する、医薬組成物。
（２６）アルカノイルＬ−カルニチンがアセチルＬ−カルニチン、プロピオニルＬ−カルニチン、ブチリルＬ−カルニチン、バレリルＬ−カルニチンおよびイソバレリルＬ−カルニチンからなる群から選択される、（２５）記載の組成物。
（２７）Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンの医薬上許容される塩がクロライド、ブロミド、オロテート、酸アスパルテート、酸シトレート、酸ホスエフェート、フマラート、酸フマラート、マレエート、酸マレエート、酸オキサレート、酸スルフェート、グルコースホスフェート、タートレートおよび酸タートレートからなる群から選択される、（２５）記載の組成物。
（２８）タクソール、ブレオマイシン、カルボプラチンおよびビンクリスチンからなる群から選択される抗癌剤の治療有効量、およびＬ−カルニチンまたは炭素原子数２〜８の直鎖または分岐鎖アルカノイル基を有するアルカノイルＬ−カルニチンもしくはこれらの医薬上許容される塩の、該抗癌剤により誘導される毒性を減弱するが、同時に該抗癌作用を維持する解毒量、の併用使用。
（２９）投与を連続的に行う、（２８）記載の使用。
（３０）抗癌剤およびＬ−カルニチンもしくはアルカノイルＬ−カルニチンの投与を実質的に同時に行う、（２９）記載の使用。
（３１）（１６）、（１７）、（２０）、（２１）、（２２）、（２５）、（２６）または（２７）のいずれかに記載の医薬組成物を含有し、各剤の同時併用摂取または予め定められた用法に基づく摂取を指示する説明書が添付された製品。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明のＬ−カルニチンまたはその誘導体と上記抗癌剤との予期し得ぬそして驚くべき保護作用を示すのに適した実施例のうち顕著な例を示す。
実施例１
抗癌剤で処置したラットの生存期間の相違
本実施例の目的は、ネズミ実験モデルにおいてＬ−カルニチンにより誘導される保護作用を生存期間の延長を指標として証明および評価することである。
一群10匹の雄性、３月齢のウイスターラット（チャールズリバー）を用い、２２±２℃、５０±１５％相対湿度、１２時間明／暗サイクルの条件下で、食餌および水を自由に、無制限に摂取できる状態で飼育した。
用いた物質はＬ−カルニチン、タクソール、カルボプラチンおよびビンクリスチンである。
各抗癌剤のＬＤ３０、ＬＤ５０およびＬＤ８０値に該当する用量をラットへ静脈内（i.v.)投与した。
Ｌ−カルニチン、２００ｍｇ／ｋｇによる処置は、抗癌剤の投与の8日前から、1日1回、皮下投与にて行い、さらに14日間続けた。
【００４７】
処置の直前に各ラットの尾部に番号を付し、これに基づいてラットの致死率を抗癌剤の投与から14日間モニターした。実験データはウイルコクソン（Wilcoxon)およびログ−ランク(Log-Rank)検定により解析し、生データの解析により得られた統計的有意性を以下の表１にまとめた。
【００４８】
【表１】
2010254717.tif 000005
【００４９】
有意性は、組み合わせ投与と、各コントロール（同じ用量の抗癌剤単独）とを比較した場合の値である。
【００５０】
表1に示す得られた結果は、Ｌ−カルニチンと抗癌剤で処置した群の有意な生存期間の延長を示す。
表1に示す統計的分析の結果は、二つの「ｐ」値を含んでいる。第1のｐはウイルコクソン検定を用いて計算したものであり、第2のｐ、即ち括弧内のｐ値はログ−ランク検定を用いて計算した値である。
【００５１】
これら２つの検定、ウイルコクソンおよびログ−ランク検定の結果の相違は、前者が生存曲線の第1部分の相違を検出するのに威力を発揮するのに対し、後者は第２部分の相違を検出するのに威力があることからくるものである。
行った実験において、生存期間の相違は、主に曲線の第1部分において認められた。
低い容量で比較した場合に、統計的有意性が無いことは、死亡率が低いためであり、この用量での群間の相違を検査するにはこのモデルは特に好ましいわけではない。
【００５２】
実施例２
タクソール誘導性抹消神経障害の実験モデルにおける、アセチルＬ−カルニチンの保護作用
本実施例の目的は、タクソール投与（１６ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）の1週間前にアセチルＬ−カルニチンを投与した場合のその保護作用を、知覚神経伝達速度（sensory nerve conduction velocity （SNCV））を、尾部を用いたＨ反射によって測定して評価することである。
【００５３】
雌性、３月齢のウイスターラットを用いた。２２±２℃、５０±１５％相対湿度、１２時間明／暗サイクルの条件下で飼育した。ラットは処置の直前に尾部へ番号をつけ、食餌および水を自由に、無制限に摂取できる状態においた。
用いた剤はアセチルＬ−カルニチンとタクソールである。
【００５４】
試験群は以下の通りである
１.  コントロール
２.  シャム（タクソール溶液の溶媒のみを投与した群）
３.  タクソール１６ｍｇ／ｋｇ
４.  アセチルＬ−カルニチン＋タクソール１６ｍｇ／ｋｇ
５.  タクソール８ｍｇ／ｋｇ
６.  アセチルＬ−カルニチン＋タクソール８ｍｇ／ｋｇ
【００５５】
以下の処置スケジュールを用いた：シャム動物には、タクソール溶液の溶媒（クレモフォア(cremophor)／エタノール）のみを、腹腔内投与(ｉ.ｐ.)した。タクソールは週に１回、５週間にわたって、ｉ.ｐ.投与した。Ｌ−カルニチン200ｍｇ／ｋｇは、胃内管を用いた経口投与(ｏ.ｓ.)により、最初のタクソールの投与の1週間前からはじめ、さらに4週間（全５週間）、毎日１回投与した。
【００５６】
以下の方法を用いた：被検動物は、０.４５ハロタン、窒素初級酸化物および酸素の気体状混合物にて麻酔し、刺激部位を除毛し、手術台に載せた。記録および知覚応答の刺激はOte Biomedica Phasis II electrographを用いて行った。動物の体温に対する神経伝達速度の文献開示事項によれば、体温を実験全体において一定に保つことが必要であり、体温は直腸内で、ＢＭ 70002型動物用体温調節器(Biomedica Mangoni)により測定した。
【００５７】
知覚神経伝達速度の測定は、尻尾上で、スチールリングタイプの刺激と、長さ４６ｃｍの測定電極を用い、刺激強度を閾値と等しい値とし、刺激長さを100マイクロ秒として行った。
平均３００応答を、陽性とした。
知覚神経伝達速度はｍｓにて表示され、これは２つの刺激部位間の距離（ｍｍで表示）の、中心（最も近接した）および遠方（背部脊椎より最も遠い）刺激により生じる波の潜伏期間の差に対する比として計算される。
全ての群の動物において、基底条件（何らかの物質を投与する前）と処置5週間後の二回、速度を測定した。
結果を平均±標準偏差で示し、有意性を片側および両側の両方のｔ−検定を用いて評価し、ｐ＜０.０５を統計学的に有意であるとした。
尾部神経で測定した知覚神経伝達速度データを以下の表2に示す。
【００５８】
【表２】
2010254717.tif 000006
基底状態において、全ての群の動物は、良く似た神経伝達値を示した。
【００５９】
5週間後の測定において、基底状態と比べて知覚神経伝導速度の統計学的に有意な（ｐ＜０.０１）増加が全ての群において認められた。
【００６０】
タクソールの溶媒で処置した群(シャム群）は、コントロール群に対して神経伝達速度を変化させなかった。タクソール投与群では、神経伝達速度がコントロール群に対して統計学的に有意に減少していることが認められた。この減少は用量依存性であった。１６ｍｇ／ｋｇ投与群では−１７％、８ｍｇ／ｋｇ投与群では−９％の減少であった。
【００６１】
アセチルＬ−カルニチンによる処置は、両方の群において有意（ｐ＜０.０１）にこの神経伝達速度を増加させた；１６ｍｇ／ｋｇのタクソール投与群と比して９％、８ｍｇ／ｋｇのタクソール投与群と比して５％の増加であった。
この得られた結果に基づいて、アセチルＬ−カルニチンはタクソール誘導性神経毒性に対して統計的に有意な保護作用を示すことがわかる。
【００６２】
実施例３
アセチルＬ−カルニチンのタクソール誘導性体重減少に対する保護作用
前の実施モデルで用いた動物の体重を処置前に測定し（基底値）、そして処置終了時にも測定した。
データを表3に示した。データによれば、タクソール処置による体重減少に対し、実質的な、そして予期し得なかった効果が、アセチルＬ−カルニチンにより、もたらされたことがわかる。
【００６３】
【表３】
2010254717.tif 000007
【００６４】
実施例４
アセチルＬ−カルニチンのタクソール誘導性好中球減少症に対する保護作用
本発明の発明者らによって、タクソールによる好中球減少作用により、３回目から４回目の投与の後に最下点となることが確認されている。
循環好中球量および腫瘍成長の両方に対する、ＡＬＣのタクソールと組み合わせた際の作用を評価するため、タクソールのみを投与した群、およびネズミ乳癌（Ｌ−MM3)を接種した動物についてＡＬＣ−誘導性保護作用の程度を測定した。ＡＬＣおよびタクソールもしくはＡＬＣ単独にて処置した動物における腫瘍の成長を観察した。タクソール処置は多形核球の有意な減少をもたらした。アセチルＬ−カルニチンの経口投与をタクソール処置と組み合わせると、抗癌剤により誘導される好中顆粒球の減少を有意に抑制することがわかった。腫瘍の成長に関して、タクソールを、好中顆粒球の評価の際と同じ投与スケジュールで投与して観察したところ、Ｌ−ＭＭ３の成長を有意に抑制することが認められた。この観察は腫瘍が約２ｃｍの大きさとなるまで続けた。14日間のタクソールとＡＬＣの組み合わせ処置は、タクソールの抗癌作用に影響を及ぼさなかった。
【００６５】
結論として、この腫瘍モデルにおいても、タクソールは重篤な好中球減少症を誘導し、ＡＬＣはこの種の骨髄毒性が生じる期間中投与することによって、タクソール誘導性多形核球減少を防止することが示された。一方、ＡＬＣはタクソールの抗癌作用には影響を及ぼさなかった。
【００６６】
実施例５
アセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ)のタクソールｉ.ｐ.投与との組み合わせ投与による、マウス好中球減少症に対する効果
アセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ）を、タクソールと組み合わせて投与した場合の、タクソール誘導性好中球減少症に対する効果を評価すべく、優良実験室規範（ＧＬＰ）に基づいた試験を行った。被検動物に対し、ＡＬＣ＋タクソール、およびタクソールもしくはＡＬＣを単独で投与した。このモデルにおいて、循環好中球量を測定した。
【００６７】
タクソールの3回目の投与後6時間以内に、好中顆粒球の有意な減少が認められ、そして第3回−第４回投与後において最低値となるような好中球減少が認められた。
【００６８】
アセチルＬ−カルニチン内部塩（滅菌アンプル）、を注射用水へ溶解させて、これを用いた。各アンプルのＡＬＣを４ｍｌの注射用水に溶解させた（溶液O）。この溶液Ｏの２ｍｌを滅菌PBSにて２５ｍｌとし、これを用いて１０ｍｇ／ｍｌとして皮下投与（１００ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）を行った；０.８ｍｌの溶液OをPBSにて50ｍｌとして、２ｍｇ／ｍｌとして経口投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／５０ｍｌ）。
【００６９】
タクソール（パシタクセルpacitaxel)（INDENA)を秤量し、先に調製した特別のビヒクルへ溶解し（クレモフォア（登録商標）EL(BASF)、１：１でエタノールにより希釈）、＋４℃にて光を避けて保存した。使用時に１２ｍｇ／ｍｌの溶液をリン酸緩衝食塩水（PBS、SIGMA)にて１：４となるように希釈し、ｉ.ｐ.投与（３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）した。
【００７０】
試験の主な概要は以下の通りである：
動物：雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、体重１８−２０ｇ（Hａｒｌａｎ）
動物飼育条件：１ケージあたり4−5匹；温度２２±２℃；相対湿度５５±１５％；空気交換１５−２０／ｈ；１２時間明／暗サイクル（午前７時−午後7時、明）；マクロロンケージ(makrolon cages) (26.7×20.7×14cm)、ステンレススチールのアミカバーつき；脱埃;、滅菌、コーン型敷き。
食餌：４ＲＦ２１給餌（会社：Mucedola)、餌および水は自由に無制限に摂取させた。
【００７１】
無作為化は動物ブロック毎に略式で行った。即ち動物飼育施設職員がマウスを箱からケージへ移動させ、一度に１ケージを満たした。第2段階で、職員は先にマウスにしるしを付け、体重を量り、その体重が群間で有意に相違する場合にはマウスを１のケージから別のケージへ移動させ、ケージ毎の動物数を変えずにケージ間の体重を類似したものとするようにした。各ケージには群の番号、処置の種類（物質および／または複数の物質、用量、投与経路）を付したカードを添付した。各動物には、尾部に消えないインクで１から５の番号を付した。
【００７２】
動物の体重：処置開始前および５または７および１１日目にマウスの体重を測定した。
マウスは、１から１０日まで処置を行った：タクソールまたはそのビヒクルを、隔日、５、７、９及び１１日目に投与した。
各群は、１）ブランク；２）ビヒクル＋PBS；３）タクソール；４）タクソール＋ＡＬＣ；５）ＡＬＣ;6）ＡＬＣ＋ビヒクルである。各動物は最後のタクソール投与後６時間後に屠殺した。
【００７３】
血液および骨髄試料を最後のタクソールもしくはビヒクル投与から６時間後に採取した。マウスをCO2で麻酔し、血液を眼窩静脈叢から採取（０.５ｍｌの血液／マウス）、これを１０μlのビスターへパリン(Vister Heparin)(5000U/ml)を添加したエッペンドルフ試験管に投入した。動物は頚椎脱臼により屠殺した。その後、骨髄試料を採取した。
マウス一匹あたり１の血液試料および１の骨髄試料を、様々な時間に採取した。
【００７４】
血液細胞カウント
ＷＢＣ（白血球）数のカウントを開始する前に、装置をデルコン(Delcon)のエマチェック(EMACHECK)血液試料パラメーター(ヒト用）にてチェックする。
装置は、その取扱説明書に記載に従って用いた。血液（２５μｌ）を取り、ビーカー中にて等張液(PLTA 生理的食塩水, Delcon)にて希釈して１０ｍｌの体積とした（希釈１:４００）（溶液Ａ）。溶液Ａから１００μｌを取り、別のビーカー内でこれを希釈して１０ｍｌとした（希釈１：１００）（溶液Ｂ）。溶液Ａへ３滴の溶解剤(Emosol, Delcon)を添加し、これを手動でかき混ぜた後約２分間おいて反応させ、赤血球を溶血させてＨＧＢ（ヘモグロビン）が放出されるようにした。溶解剤を含有する溶液ＡをＷＢＣおよびヘモグロビン（ＨＧＢ）測定に用いた。溶液BはＲＢＣおよび血小板（PLT)に用いた。
各資料につき二重測定を実施し、１の試料と次の試料の測定の間に装置を等張液にて洗浄した。
【００７５】
スーパーフロストプラス(Superfrost plus)スライド(25×75×1mm)（MenseＬ−Glaser)のすぐ使える製品を用いた。血液（８μl）をスライドの右側部分へ載せた；別のスライドを、該血液の左側へ４５度の角度に置き、後ろへ引いて血液滴と接触させ、これによって二つのスライド間の接触線に沿って血液試料が迅速に広がるようにした；スライドを次いで前方へ、滑らかな、すばやい動きで動かし、血液の薄いフィルムを得た。スライドを空気中に置いて乾燥させ、Diff-Quick(DADE)染料で、説明書に従って染色し、空気中で再度乾燥させた。
【００７６】
スライドをヒストレモン（Hisotolemon）溶液（CarloErba）に２秒間浸漬した；合成マウント(synthetic mountant) (Shandon)を１滴スライド上にたらし、カバースライドをその上に載せて全血液スメアを覆うようにした。二つのスライドの間に泡が入らないよう、気をつける。スライドを乾燥させ、次いでシダーオイルをスライド上に１滴たらした後、ＷＢＣカウントを１００まで、光学顕微鏡を用いて行った。
【００７７】
ＷＢＣ/mlの値は、ヘマトサイトメーターを用いて測定した。これに白血球組成中の好中顆粒球の割合のパーセンテージを乗じた。このパラメーターを１００で除したものは好中球／ｍｍ３血液の値となる。
【００７８】
以下が正常なパラメーター値である：ＷＢＣは、ヘマトサイトメーターで計測して、１８０００／ｍｍ３までの値；好中球のパーセンテージとしては、スライド上で１８％までの値；好中球の絶対数は、１８００までの値。
【００７９】
データは平均±ＳＥで示した。各群の好中顆粒球の値の比較はＡＮＯＶＡを用いて行った。異常値はＤｉｘｏｎ検定に供した。
【００８０】
タクソール処置（30ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｐ.、２日毎、全４回）により、最後の投与から６時間後に有意な好中球の減少を招いた（ブランクと比べて、−９０％の好中顆粒球、ｐ＜０.００１）。アセチルＬ−カルニチン（１００ｍｇ／ｋｇ）の経口または皮下投与は、多形核球をタクソール誘導性ダメージから８−４３％（皮下）；−２３（経口）保護した（表４）
【００８１】
別の試験において、タクソール単独投与では９８％の好中球減少であったところ、ＡＬＣ＋タクソールの組み合わせでは７３％の好中球の減少が認められた。ＡＬＣまたはビヒクル+ＡＬＣの投与では、ビヒクル単独投与もしくは無処置動物（ブランク）と比べて好中球の変化は無かった（表４）
【００８２】
最後のタクソール投与から３日後、好中顆粒球は回復しはじめる（−６４％対ビヒクル）が、その効果はＡＬＣ＋タクソールを組み合わせた投与後のほうがより強力であった（−２６％対ビヒクル）。また、ＡＬＣまたはビヒクル+ＡＬＣ処置によっては、ビヒクル単独もしくは無処置動物（ブランク）と比して好中球数に変化は誘導されなかった。
【００８３】
【表４】
2010254717.tif 000008
【００８４】
【表５】
2010254717.tif 000009
【００８５】
タクソールを1日おきに4回投与すると、重篤な好中球減少が生じる。ＡＬＣの経口投与は、このタクソールの副作用を有意に保護することができる。
【００８６】
実施例６
タクソールのｉ.ｖ.投与と組み合わせた場合の、マウスにおける好中球減少に対するアセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ）投与の効果
タクソールの投与経路をここでは静脈内としたこと以外は、本質的に実施例５と同じ試験を行った。これは、いわば臨床と同じ投与条件である。
試験条件および測定は前実施例と同じである。
結果を表６および表７に示す。
【００８７】
【表６】
2010254717.tif 000010
【００８８】
【表７】
2010254717.tif 000011
【００８９】
上記結果は、ＡＬＣ経口投与による保護効果を確認するものである。
実施例７
Ｌ−MM3乳癌移植マウスに対してタクソールと組み合わせて投与した場合の、アセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ)の好中球減少に対する効果、および抗癌剤の評価
試験は優良実験室規範（ＧＬＰ）に則って行った。アセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ)を、タクソールと組み合わせた場合の、腫瘍成長に対する効果を調べるため、Ｂａｌｂ／ｃマウスにネズミ乳癌（Ｌ−MM3)を接種し、動物をＡＬＣ＋タクソールおよびタクソールまたはＡＬＣ単独投与により処置した。さらに、この腫瘍モデルにおいて、循環好中球も測定した。
【００９０】
アセチルＬ−カルニチン内部塩（滅菌アンプル）を水に溶解した注射剤を用いた。ＡＬＣの各アンプルを４ｍｌの注射用滅菌水に溶解した（溶液Ｏ）。０.８ｍｌの溶液OをPBSにて50ｍｌとして、経口投与剤とした（１００ｍｇ／ｋｇ／５０ｍｌ）。
【００９１】
タクソール（パシタクセルpacitaxel)（INDENA)を秤量し、先に調製した特別のビヒクルへ溶解し（クレモフォア（登録商標）EL(BASF)、１：１でエタノールにより希釈）、＋４℃にて光を避けて保存した。使用時に１２ｍｇ／ｍｌの溶液をリン酸緩衝食塩水（PBS、SIGMA)にて１：４となるように希釈し、ｉ.ｐ.投与（３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）した。
【００９２】
試験の主な概要は以下の通りである：
動物：120匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、体重１８−２０ｇ（Hａｒｌａｎ）
動物飼育条件：１ケージあたり5匹；温度２２±２℃；相対湿度５５±１５％；空気交換１５−２０／ｈ；１２時間明／暗サイクル（午前７時−午後7時、明）；マクロロンケージ(makrolon cages) (26.7×20.7×14cm)、ステンレススチールのアミカバーつき；脱埃;、滅菌、コーン型敷き。
食餌：４ＲＦ２１給餌（会社：Mucedola)、餌および水は自由に無制限に摂取させた。
【００９３】
無作為化は動物ブロック毎に略式で行った。即ち動物飼育施設職員がマウスを箱からケージへ移動させ、一度に１ケージを満たした。第2段階で、職員は先にマウスにしるしを付け、体重を量り、その体重が群間で有意に相違する場合にはマウスを１のケージから別のケージへ移動させ、ケージ毎の動物数を変えずにケージ間の体重を類似したものとするようにした。各ケージには群の番号、処置の種類（１および／または複数の物質、用量、投与経路）を付したカードを添付した。各動物には、尾部に消えないインクで１から５の番号を付した。
【００９４】
動物の体重：処置開始前および最終タクソール投与日にマウスの体重を測定した。
投与スケジュール１：Ｂａｌｂ／ｃ由来移植可能ネズミ乳癌細胞（Ｌ−MM3)は３７℃にてプラスチック製フラスコ内で、５％CO2、加湿インキュベーター中、５％熱非動化ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン２ｍMおよびゲンタマイシン８０μｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭ培地にて増殖させた。接種時には、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにて剥がし、ＰＢＳを含まない同じ培地にて洗浄した。
【００９５】
麻酔した雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスわき腹へ、４×１０５細胞（０.２ｍｌＤＭＥＭ中）を皮下接種した。
腫瘍接種４日後、マウスへ以下の要領で各物質を投与して、好中球減少を調べた。
【００９６】
【数１】
2010254717.tif 000012
【００９７】
ＡＬＣは１０日間、投与した。動物を６時間後に屠殺した。
実験群は其々１５匹からなる。
群                    ケージ番号
腫瘍 + ビヒクル          1, 2, 3
腫瘍 + タクソール + ＡＬＣ  4, 5, 6
腫瘍 + タクソール        7, 8, 9
腫瘍 + ビヒクル + ＡＬＣ    10, 11, 12
【００９８】
処置スケジュール２：上記と同じ実験群で、各群15匹（別のケージ）を以下の通り処置して生存および腫瘍サイズを測定した。
【００９９】
【数２】
2010254717.tif 000013
【０１００】
ＡＬＣ投与は14日間続けた（16、17、18群）。腫瘍のサイズを、約２ｃｍとなるまで計測した。被検動物は100日間生存させた。
各試験群の構成は以下の通りである：
群                    ケージ番号
- 腫瘍 + ビヒクル            13, 14, 15
- 腫瘍 + タクソール + ＡＬＣ   16, 17, 18
- 腫瘍 + タクソール          19, 20, 21
- 腫瘍 + ビヒクル + ＡＬＣ     22, 23, 24
【０１０１】
処置および屠殺のスケジュール
日数      ケージ
1  接種: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22
2  接種: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23
3  接種: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24
4  ＡＬＣ: 4, 16, 10, 22
5  ＡＬＣ: 4, 5, 16, 17, 10, 22, 11, 23
6  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11,23,12, 24
7  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11,23,12, 24
8  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24
ビヒクル: 1, 13, 10, 22
タクソール: 4, 7, 16, 19       
9   ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11,23, 12, 24
ビヒクル: 2, 14, 11, 23
タクソール: 5, 8, 17, 20
10  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11,23,12, 24
ビヒクル: 1, 3, 13, 15, 10, 22, 12, 24
タクソール: 4, 6, 7, 9, 16, 18, 19, 21
11  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11,23,12, 24
ビヒクル: 2, 14, 11, 23
タクソール: 5, 8, 17, 20 
12  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11,23, 12, 24
ビヒクル: 1, 3, 13, 15, 10, 22, 12, 24
タクソール: 4, 6, 7, 9, 16, 18, 19, 21
13  ＡＬＣ: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12,24
ビヒクル: 2, 14, 11, 23
タクソール: 5, 8, 17, 20
14  ＡＬＣ: 5, 6, 17, 18, 11, 23, 12, 24,16,22
ビヒクル: 1, 3, 13, 15, 10, 22, 12, 24
タクソール: 4, 6, 7, 9, 16, 18, 19, 21
最後のタクソール投与から6時間後、屠殺:１, 4, 7, 10 + 3匹のブランクマウス
15  ＡＬＣ: 6, 18, 12, 24, 16, 22, 17, 23
ビヒクル: 2, 14, 11, 23
タクソール: 5, 8, 17, 20
最後のタクソール投与から6時間後、屠殺:2, 5, 8, 11 + 3匹のブランクマウス
16  ＡＬＣ: 16, 22, 17, 23, 18, 24
タクソール: 6, 9, 18, 21
ビヒクル: 3, 15, 12, 24
最後のタクソール投与から6時間後、屠殺:3, 6, 9, 12 + 4匹のブランクマウス
17  ＡＬＣ:16, 22, 17, 23, 18, 24
18  ＡＬＣ: 17, 23, 18, 24
19  ＡＬＣ: 18, 24
【０１０２】
腫瘍のサイズ（長さ及び幅）は、腫瘍が測定可能な大きさとなったときから1週間に2回、キャリパーで測定した。腫瘍サイズはｃｍで示し、下式にて評価した：（長さ×幅）
【０１０３】
腫瘍計測スケジュール
接種後日数    ケージ（各5匹のマウスを飼育）
22          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
23          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
28          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
30          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
35          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
3６          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
42          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
44          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
49          13, 16, 19, 22
14, 17, 20, 23
15, 18, 21, 24
【０１０４】
血液および骨髄試料は第1のスケジュールで処置した動物より採取した。屠殺時にマウスをＣＯ２で麻酔し、血液は眼窩静脈叢より（0.5ｍｌの血液/マウス）採取し、これを１０μlのビスターへパリン(Vister Heparin)(5000U/ml)を添加したエッペンドルフ試験管に投入した。動物は頚椎脱臼により屠殺した。その後、骨髄試料を採取した。
1匹のマウスにつき１の血液試料および１の骨髄試料を様々な時間に採取した。
【０１０５】
血液細胞カウント
ＷＢＣ（白血球）数のカウントを開始する前に、装置をデルコン(Delcon)のエマチェック(EMACHECK)血液試料パラメーター(ヒト用）にてチェックした。
装置は、その取扱説明書に記載に従って用いた。血液（２５μｌ）を取り、ビーカー中にて等張液(PLTA 生理的食塩水, Delcon)にて希釈して１０ｍｌの体積とした（希釈１:４００）（溶液Ａ）。溶液Ａから１００μｌを取り、別のビーカー内でこれを希釈して１０ｍｌとした（希釈１：１００）（溶液Ｂ）。溶液Ａへ３滴の溶解剤(Emosol, Delcon)を添加し、これを手動でかき混ぜた後約２分間おいて反応させ、赤血球を溶血させてＨＧＢ（ヘモグロビン）が放出されるようにした。溶解剤を含有する溶液ＡをＷＢＣおよびヘモグロビン（ＨＧＢ）測定に用いた。溶液BはＲＢＣおよび血小板（PLT)に用いた。
各資料につき二重測定を実施し、１の試料と次の試料の測定の間に装置を等張液にて洗浄した。
【０１０６】
スーパーフロストプラス(Superfrost plus)スライド(25×75×1mm)（MenseＬ−Glaser)のすぐ使える製品を用いた。血液（８μl）をスライドの右側部分へ載せた；別のスライドを、該血液の左側へ４５度の角度に置き、後ろへ引いて血液滴と接触させ、二つのスライド間の接触線に沿って血液試料が迅速に広がるようにした；スライドを次いで前方へ、滑らかな、すばやい動きで動かし、血液の薄いフィルムを得た。スライドを空気中に置いて乾燥させ、Diff-Quick(DADE)染料で、説明書に従って染色し、空気中で再度乾燥させる。
【０１０７】
スライドをヒストレモン（Hisotolemon）溶液（CarloErba）に２秒間浸漬した；合成マウント(Shandon)を１滴スライド上にたらし、カバースライドをその上に載せて全血液スメアを覆うようにした。二つのスライドの間に泡が入らないよう、気をつける。スライドを乾燥させ、次いでシダーオイルをスライド上に１滴たらした後、ＷＢＣカウントを１００まで、光学顕微鏡を用いて行った。
【０１０８】
ＷＢＣ/mlの値は、ヘマトサイトメーターを用いて測定した。これに白血球組成中の好中顆粒球の割合のパーセンテージを乗じた。このパラメーターを１００で除したものは好中球／ｍｍ３血液の値となる。
【０１０９】
データは平均±ＳＥで示した。各群の好中顆粒球の値の比較はＡＮＯＶＡを用いて行った。腫瘍サイズの比較はノンパラメトリックデータのためのマンホイットニー片側検定を用いて行った。
【０１１０】
Ｌ−ＭＭ３を移植したマウスにおいてタクソール処置（30ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｐ.、２日毎、全４回）により、有意な多形核球の減少を招いた（−９３％対ブランク、ｐ＜０.０００１）。アセチルＬ−カルニチン（１００ｍｇ／ｋｇ、1日1回、10日間）の経口投与を、タクソール治療と同時に行った群では、タクソールによる好中顆粒球の減少に対して有意な保護作用を示し得た（３３５／ｍｍ３対６５／ｍｍ３、ｐ＜０.０１）（表８）
【０１１１】
好中顆粒球の評価を行った時と同じ投与スケジュールでタクソールを投与した（30ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｐ.、２日毎、全４回）ところ、Ｌ−ＭＭ３腫瘍成長を有意に抑制することが見出された。腫瘍は、コントロール群において腫瘍のサイズが約２ｃｍとなるまで観察した（０.５６ｃｍ対１.８ｃｍ，ｐ＜０.０００１）。同時にＡＬＣの経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ、毎日1回）を14日間（+タクソール（30ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｐ.、２日毎、全４回））を行ったが、抗癌作用には影響を及ぼさなかった。
【０１１２】
結論として、この腫瘍モデルにおいてもまた、タクソールは重篤な好中球減少を招き、ＡＬＣをこの種の骨髄毒性が生じる期間中投与することによってこのタクソール誘導性多形核球減少を抑制することができた。同時に、ＡＬＣの作用はタクソールの抗癌作用には影響を及ぼさなかった。
【０１１３】
【表８】
2010254717.tif 000014
【０１１４】
タクソールのＭ１０９ネズミ肺癌に対する抗癌作用に対する、アセチルＬ−カルニチンの影響の評価
タクソールは、子宮癌、乳癌、肺癌およびその他の癌の治療に有用であることが証明されている(Rowinsky, E.K., and R.C. Donehower, (1991); Pharmacol. Ther. 52:35.)。この化合物の抗癌作用は主に該化合物の、チューブリンモノマー内の微小管の脱重合化を抑制する能力に由来している(Schiff, P. B., J. Fant, and S.B. Horwitz. 1979. Nature)。この効果は細胞の増殖を細胞サイクルのＧ２／Ｍ相、即ちＤＮＡ合成が完了し、続く細胞分裂もしくは有糸分裂期に入る中間期の最終ステージにおいて抑制し、そしてこれによって細胞内でアポトーシスのカスケードが開始される。タクソールには他の化学療法剤と同様、これに加えて、神経障害および骨髄抑制のごとき副作用がある。
【０１１５】
ビヒクル単独で処置された動物と、タクソールとアセチルＬ−カルニチンの経口投与を組み合わせて処置された動物の各群から得られた統計的データを比較したところ、後者では全観察時において統計学的に有意な腫瘍重量の縮小が認められた。これとは対照的に、ビヒクル単独処置群とビヒクルとアセチルＬ−カルニチン投与の組み合わせ処置群とを比較したところ、腫瘍塊成長の統計学的な有意差はいつ観察しても認められなかった。タクソール処置群と、タクソールとアセチルＬ−カルニチン併用処置群のデータを分析したところ、両者の腫瘍重量に有意差はなかった。転移数を分析したところ、タクソール処置群、タクソールとアセチルＬ−カルニチンの併用処置群およびビヒクルとアセチルＬ−カルニチンの併用処置群において、ビヒクル単独処置群と比較した場合、転移数が有意に減少した。さらに、タクソール処置またはタクソールとアセチルＬ−カルニチン併用処置マウスでは、ビヒクル単独処置群またはビヒクルとアセチルＬ−カルニチン併用処置群と比較した場合、転移腫瘍の直径の有意な減少を示した。以下のデータの分析に基づいて、我々はアセチルＬ−カルニチンは、タクソールの抗癌作用を腫瘍重量の抑制に関しては妨害しないということができる。さらに、アセチルＬ−カルニチンは肺転移に対して有意な抑制作用を示した。
以下は、本発明の更なる態様を示す実施例である。
【０１１６】
実施例８
タクソールのＭ１０９ネズミ肺癌に対する抗癌作用に対する、アセチルＬ−カルニチンの影響の評価
試験は優良実験室規範（ＧＬＰ）に則って行った。アセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ)を、タクソールと組み合わせた場合の、腫瘍成長に対する効果を調べるため、Ｂａｌｂ／ｃマウスにネズミ肺癌（Ｍ１０９)を接種し、動物をＡＬＣ＋タクソールおよびタクソールまたはＡＬＣ単独投与により処置した。さらに、この腫瘍モデルにおいて、循環好中球も測定した。
【０１１７】
アセチルＬ−カルニチン内部塩（滅菌アンプル、０.５ｇ）を注射剤用水に溶解した製剤を用いた。
ＡＬＣの各アンプルを４ｍｌのこの溶媒中へ溶解した（溶液Ｏ）。正確に、１.６ｍｌの溶液Oをリン酸緩衝塩水（PBS, Sigma P-4417）にて40ｍｌとして、経口投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／２０ｍｌ）。
【０１１８】
タクソール（パシタクセルpacitaxel)（INDENA)を秤量し、先に調製した特別のビヒクルへ溶解し（クレモフォア（登録商標）EL(BASF)、１：１でエタノールにより希釈）、＋４℃にて光を避けて保存した。使用時に１２ｍｇ／ｍｌの溶液をリン酸緩衝食塩水（PBS、SIGMA)にて１：４となるように希釈し、ｉ.ｐ.投与（３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）した。
【０１１９】
動物：６０匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、体重１８ｇ（Hａｒｌａｎ）
動物飼育条件：１ケージあたり5匹；温度２２±２℃；相対湿度５５±１５％；空気交換１５−２０／ｈ；１２時間明／暗サイクル（午前７時−午後7時、明）；マクロロンケージ(makrolon cages) (26.7×20.7×14cm)、ステンレススチールのアミカバーつき；脱埃;、滅菌、コーン型敷き。
食餌：４ＲＦ２１給餌（会社：Mucedola)、餌および水は自由に無制限に摂取させた。
無作為化：略式、動物のブロック毎
動物の体重：処置開始前および試験終了まで週に1度マウスの体重を測定した。
【０１２０】
Ｍ１０９腫瘍細胞は固形癌から単離した。
Kedar E., B. Ikejiri, G.D. Bannard and R.B. Herberman (Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18; 991: 1982)に記載の方法の変法を用いた。一匹のＢａｌｂ／ｃマウス（ドナー）を頚椎脱臼により屠殺し、背中を変性アルコールで清拭した後背面皮膚を長方形に2枚切りだし、これを腫瘍塊を除去するために分離した。皮膚片を滅菌ガーゼ上に置き、結合組織を除き、また壊死部分および出血部分を除いた。被検組織をＣａ＋＋Ｍｇ＋＋含有ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）ｐＨ７.２、へ投入し、冷却し、2-3ｍｍの小片へと崩し、２ｍｇ／ｍｌトリプシン（タイプIII、１０００U/ｍｇタンパク質、Sigma-Aldrich)、2ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ(タイプI-S 180U/ｍｇ、固体) 、0.2ｍｇ／ｍｌ DNAse(タイプI  １５４８U/ｍｇタンパク質、Sigma）および25μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（シグマ）を含有する、Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７.２ｍ）中へ再懸濁（15ml溶液／g腫瘍）し、一定の撹拌下で37℃にて15分間インキュベートした。細胞懸濁液を次いでポッター(B.Braun)を用いて2分間ホモゲナイズし、37℃にて10分間インキュベートし、No.２１の針をつけたシリンジで何度もやさしく吸引した。３０ｍｌの10％ＦＢＳ(Eurobio)添加ＲＰＭＩ−１６４０（Eurobio)を添加した後、4℃に保ち、細胞懸濁液を滅菌ガーゼに通し、次いで７００ｇにて10分間遠心分離をした。細胞のペレットを10％ＦＢＳおよび0.2ｍｇ／ｍｌDNAse（Sigma）添加ＲＰＭＩ−１６４０中へ優しく再懸濁し、次いで７００ｇにて10分間遠心分離をした。ペレットを引き続きＲＰＭＩ−１６４０で二回洗浄し、最後の洗浄の終了時にペレットをＲＰＭＩ−１６４０中へ優しく再懸濁し、細胞数を数えて細胞濃度を調節した。
【０１２１】
細胞数は顕微鏡下で数えた。細胞計数はトリパン−ブルー生細胞染色排除法を用いて行った。腫瘍細胞を０.４％トリパン−ブルー(Sigma)にて適当に希釈した。生染色法により、生細胞と死細胞を区別することができる。細胞を含有する希釈物をゆっくり撹拌し、そのうち１０μlを取りブーカーチャンバー（Burker chamber）へセットした。3つの3重線で区切られている正方形の格子を用いた。これは、それぞれが二重線で区切られている16個（4×4）の小さな正方形を含む。生細胞（半透明に見える）と死細胞（染料が入って青く見える）の両方の細胞が、メジアン線と３重線で形成された正方形内または線そのものの上に認められる。この操作を別の３つの正方形でも行い、各正方形内の細胞数の合計を計算し、その算術平均をこの４つの正方形の計測数とした。生細胞数の算術平均へ用いた希釈率を乗じ、測定に用いたチャンバーに特有の率（１０４）をかけて、1ミリリットルあたりに含まれる生細胞数を算出する。生細胞数の算術平均の全細胞数の算術平均に対する比に100を乗じれば、細胞の生存率が算出される。
【０１２２】
接種条件：60匹の無麻酔Ｂａｌｂ／ｃマウス、体重約１８ｇ（Harlan）へ３×１０５のＭ１０９癌細胞を0.1ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)へ希釈したものを右後足へｉ.ｍ.投与した。
処置スケジュール：試験群の腫瘍サイズを評価するため、各群15匹のＢａｌｂ／ｃマウスへ、３×１０５個のＭ１０９肺癌細胞を接種し、被検成分をスケジュール通投与した。ＡＬＣは１００ｍｇ／ｋｇ（経口）の用量にて、4日目から17日目まで投与した。母液を１：４にＰＢＳにて希釈したビヒクルは、8、10、12及び14日目にｉ.ｐ.投与した。タクソールは30ｍｇ／ｋｇ（ｉ.ｐ.）の用量を、８、１０、１２および１４日目に投与した。以下に示すようなスケジュールである。
【０１２３】
【数３】
2010254717.tif 000015
【０１２４】
マウスはＭ１０９ネズミ肺癌細胞接種後22日まで観察を続け、その後屠殺して肺を取り出し、転移数を数えた。各実験群は15匹のマウスを含み、以下の通りである：
【０１２５】
群                    ケージ番号
- 腫瘍 + ビヒクル + ＡＬＣ     1,2,3
- 腫瘍 + タクソール + ＡＬＣ   4,5,6
- 腫瘍 + タクソール            7,8,9
- 腫瘍 + ビヒクル              10,11,12
【０１２６】
処置条件
日数      処置        ケージ番号
1      細胞接種           1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,
2        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
3        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
4        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
5        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
6        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
タクソノール        4,5,6,7,8,9
ビヒクル            1,2,3,10,11,12,
7        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
8        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
タクソノール        4,5,6,7,8,9
ビヒクル            1,2,3,10,11,12,
9        ＡＬＣ           1,2,3,4,5,6
10      ＡＬＣ            1,2,3,4,5,6
タクソノール        4,5,6,7,8,9
ビヒクル            1,2,3,10,11,12,
11      ＡＬＣ            1,2,3,4,5,6
12      ＡＬＣ            1,2,3,4,5,6
タクソノール        4,5,6,7,8,9
ビヒクル            1,2,3,10,11,12,
13      ＡＬＣ            1,2,3,4,5,6
14      ＡＬＣ            1,2,3,4,5,6
15      ＡＬＣ            1,2,3,4,5,6
【０１２７】
腫瘍計測スケジュール:
接種後の日数              ケージ番号
4        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
8        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
11        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
13        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
15        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
18        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
20        1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
【０１２８】
腫瘍計測：腫瘍は週に３回、計測可能になり次第キャリパを用いて計測した。腫瘍重量は2次元（長さおよび幅）の測定結果に基づき以下の式により算出し、ｍｍで表示した。
【数４】
2010254717.tif 000016
【０１２９】
簡便にするために腫瘍密度を１であるとすると、mm3で示された腫瘍体積は腫瘍の重量（ｍｇ）と等しいこととなる。
【０１３０】
肺転移数の測定：Ｍ１０９ネズミ肺癌を移植後22日目に実験動物を頚椎脱臼により屠殺した。肺を取り出し、約５から7日の間ボウイン液（Bouin's solution)に浸けた。ボウイン液は以下の組成である：７１％の飽和ピクリン酸溶液(Merck)および２４％の10％ホルムアルデヒド溶液(Fluka)。肺転移が明らかに認められる場合にその数を数えた。
【０１３１】
腫瘍サイズおよび肺転移数のデータの統計分析は、ノンパラメトリックデータのためのマン−ホイットニー片側検定を用いて行った。
各実験動物群のデータを分析したところ、３０ｍｇ／ｋｇのタクソールをｉ.ｐ.投与した群は、ビヒクル単独で処置したものと比して腫瘍塊成長の抑制が認められた（表９）。この現象はタクソールの1回目の投与後にすでに認められ、タクソール処置群とビヒクル単独処置群の腫瘍重量の差はｐ＜０.０１
で有意であった。第２回目の投与後、観察された腫瘍重量の減少は維持され、ビヒクル単独投与の場合と比べて統計学的にも有意であり（ｐ＜０.０００１）、この腫瘍重量の抑制は続く投与の後でも有意であった。タクソール30ｍｇ／ｋｇのｉ.ｐ.投与とアセチルＬ−カルニチン100ｍｇ／ｋｇの経口投与との組み合わせ処置群では、第一回目の投与の後腫瘍重量の減少が認められ、ビヒクル単独投与群と比べてｐ＜０.０５で有意であった。この傾向はその後の投与においても維持された。分析を行った全ての日において、ビヒクルおよびアセチルＬ−カルニチンの組み合わせ処置群は腫瘍塊成長においてビヒクル単独処置群と有意な差を示さなかった。さらに、タクソール単独処置群とタクソールプラスアセチルＬ−カルニチン併用処置群を比べた場合にも、腫瘍塊のサイズに関しては観察した全日程に渡って両者の間に有意差は認められなかった。以下のデータの分析に基づき、我々はアセチルＬ−カルニチンはタクソールの腫瘍塊成長抑制作用を妨げないということができる。
【０１３２】
試験終了時の転移数を分析した。タクソール処置群、タクソールとアセチルＬ−カルニチン併用処置群およびビヒクルとアセチルＬ−カルニチンの併用処置群において、ビヒクル単独処置群と比べて統計学的に有意な転移数の減少が認められた。さらに、タクソール単独またはタクソールとアセチルＬ−カルニチン併用処置をされたマウスにおいては、ビヒクル単独処置群またはビヒクルプラスアセチルＬ−カルニチン併用処置群と比較して有意に、転移腫瘍直径の減少が認められた（表１０参照）。得られたデータの分析に基づき、アセチルＬ−カルニチンは肺転移の形成にゆるやかな抑制作用を有することが示唆される。
【０１３３】
【表９】
2010254717.tif 000017
【０１３４】
【表１０】
2010254717.tif 000018
【０１３５】
ＡＬＣはタクソールの治療効果を妨害しなかった。この点について、以下に開示するようにヒトの腫瘍モデルを用いて試験した。
【０１３６】
実施例９
ヒト腫瘍モデルにおける、アセチルＬ−カルニチン処置のタクソール抗癌活性に及ぼす影響。
LOVOヒト直腸癌の細胞培養物を、ヘアレスマウスへ移植したものを用いた。
腫瘍は固形状片としてマウスの両わき腹へ移植した（0日目）。
接種した腫瘍をキャリパーにて測定し、腫瘍の重量が100ｍｇに達したときにマウスを各5匹の4群に分け、以下の処置を行った。
第1群：コントロール
第2群：タクソール
第3群：ＡＬＣ
第4群：タクソール + ＡＬＣ
【０１３７】
同日に、ＡＬＣ処置を開始し、これを18日間連続して続けた（ｑｄｘ１８）（第３および４群）。ＡＬＣは100ｍｇ／ｋｇの用量を、投与体積25ml/kgとなるよう、投与した。
タクソール(54ｍｇ／ｋｇ/15ml/kg)は、i.v.投与を4日の間隔を置いて全4回行うというスケジュール（q4dx4  10、14、18、22日目）にて投与した（第2及び4群）。
【０１３８】
処置中および続く3週間、隔週で腫瘍を計測し、各処置による腫瘍体積の抑制率を計算したＴＶＩ％;計算式は［100―（処置腫瘍の平均重量／コントロール腫瘍の平均重量）×１００）］である。
【０１３９】
タクソール処置は腫瘍増殖を抑制した（ＴＶＩ=88％)。ＡＬＣ処置ではコントロール群と同じ腫瘍増殖を示し、腫瘍増殖に何も影響しなかった。タクソールとＡＬＣの併用処置は、タクソール単独で得られたものとほとんど同じ抗癌有効性（ＴＶＩ=90％)を示した。このことにより、ＡＬＣがタクソールの細胞障害活性を妨害しないことが確認される。
【０１４０】
実施例１０
ブレオマイシン誘導性肺毒性に及ぼすアセチルＬ−カルニチンの効果
体重120gのハムスターへ、ブレオマイシン（1ユニット）または同じ体積の生理的食塩水を気管内経路(IT)にて投与した。これに加えて、ＡＬＣ(200ｍｇ／ｋｇ)または生理的食塩水をブレオマイシン投与の直前に腹腔内投与する予備処置を行い、続く1週間、毎日投与を行った。ハムスターはの組織試料を採取するまで、3週間回復期間を置いた。組織試料を採取した時点（22日目）において、各動物の一方の肺について病理検査を行い、もう一方の肺をヒドロキシプロリン量の測定に供した。
【０１４１】
各試験群は以下の通りである：
１.  生理的食塩水前処置/生理的食塩水 IT
２.  生理的食塩水前処置/ブレオマイシン IT
３.  ＡＬＣ前処置/生理的食塩水 IT
４.  ＡＬＣ前処置/ブレオマイシン IT
【０１４２】
3回の試験を行い、41匹の動物を用いた。
肺はエキソビボで、ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液（ｐＨ７）を用い、２０ｃｍＨ２Ｏエキソビボのガス注入にて固定化し、パラフィンに包埋し、切片を作成し、ハエマトキシリン／エオシンにて染色した。切片は同じ方向で作成した：肺葉の上部、中部及び下部のそれぞれの切片を作成し、それぞれについて炎症性浸潤、浮腫、および間質性および肺胞内繊維症の有無及び程度を観察した。
【０１４３】
生理的食塩水を投与した、またはＡＬＣ前処置／生理的食塩水ＩＴ群の肺は正常の肺胞構造であった。ブレオマイシンＩＴ処置群または生理的食塩水のみで前処置／ブレオマイシンＩＴ処置群の動物は、高密度な繊維症と肺胞無気肺および浮腫が認められた。ＡＬＣで前処置した動物においては、いくつかの繊維症領域が認められたものの、明らかに薄く、また崩壊部分の密度も低かった。
【０１４４】
ヒドロキシプロリン含量（コラーゲンの主要構成成分のひとつである）は、公知のWoessner法を用いて測定した。肺試料をホモゲナイズし、ＮａＯＨにて加水分解し、しばらく置いて酸化させ、次いでErlihアルデヒド試薬を添加する。各試料につき2連のアリコートを分光光度計にてアッセイし、生成ヒドロキシプロリンで作成した標準キャリブレーションカーブによりその濃度を調べた。ヒドロキシプロリン含量（HYP)はｍｇ／肺で示す。
【０１４５】
無処置ハムスターまたはＡＬＣ単独処置群では得られたＨＹＰレベルは正常の許容できる値であった。ブレオマイシン処置動物ではHYPの増加が認められ、これは繊維形成過程におけるコラーゲンの蓄積に一致する。しかしながら、ＡＬＣで処置した動物ではブレオマイシン処置群と比してHYPの減少が認められ、繊維形成の抑制と合致する。
【０１４６】
【表１１】
2010254717.tif 000019
ＡＬＣはブレオマイシン処置動物の繊維形成作用を弱める。
【０１４７】
実施例１１
プロピオニルＬ−カルニチン（ＰＬＣ)によるタクソールインビボ抗癌作用の増強
細胞培養および腫瘍接種条件：
Ｌ−MM3ネズミ乳癌細胞の培養細胞を用いた。細胞はプラスチックフラスコ中、37℃、加湿、５％CO2の環境下で培養したものである。細胞は、２ｍMＬ−グルタミンおよび80μg/mlのゲンタマイシンを添加した10％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ内で増殖させた。サブコンフルエントとなった細胞を、トリプシン-ＥＤＴＡを用いて対数増殖期の間に回収し、ＤＭＥＭに再懸濁した。これらを雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（体重20g）の皮下へ、4×１０５個接種した。
【０１４８】
腫瘍計測法
腫瘍はキャリパーを用いて週に３回、計測可能となり次第計測した。腫瘍重量は２次元の計測値（長さ及び幅）（ｍｍで表示）に基づき以下の式で計算した：
（長さ×幅２）／２＝腫瘍体積（ｍｍ３）
【０１４９】
簡便にするために腫瘍密度を１であるとすると、mm3で示された腫瘍体積は腫瘍の重量（ｍｇ）と等しいこととなる。
【０１５０】
タクソール調製法
使用剤：タクソール（パシタクセルpacitaxel)（INDENA)。この剤を秤量し、特別のビヒクルへ溶解し（１２ｍｇ／ｍｌ）＋４℃にて光を避けて保存した。使用時に溶液をリン酸緩衝食塩水（PBS、SIGMA)にて１：４となるように希釈し、注射した。
【０１５１】
使用剤のビヒクル：クレモフォアEL(BASF)
クレモフォアをエタノールで１：１に希釈し、光を避けて保存した。処置の日にPBSにて１：４に希釈した。
動物は上記実施例に記載のごとく選択および処置した。
【０１５２】
処置条件
スケジュールＡ  以下のスケジュールに従い、３０ｍｇ／ｋｇのタクソールをｉ.ｐ.で、100ｍｇ／ｋｇのＰＬＣをｓ.ｃ.で各マウスに投与した。
A)
日数                処置
0        400,000 細胞/mouse  の接種
12          100 ｍｇ／ｋｇ ｓ.ｃ. ＰＬＣ  の投与
13          ＰＬＣ
14          ＰＬＣ
15          ＰＬＣ + タクソール (30 ｍｇ／ｋｇ)
16          ＰＬＣ
17          ＰＬＣ + タクソール
18          ＰＬＣ
19          ＰＬＣ + タクソール
20          ＰＬＣ
21          ＰＬＣ + タクソール
22          ＰＬＣ
23          ＰＬＣ
24          ＰＬＣ
【０１５３】
B)
日数                処置
0              400,000 細胞/mouse  の接種
４          100 ｍｇ／ｋｇ s.c. ＰＬＣ  の投与
5          ＰＬＣ
6          ＰＬＣ
7          ＰＬＣ
8          ＰＬＣ + タクソール 30 ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｐ.
9          ＰＬＣ
10          ＰＬＣ + タクソール
11          ＰＬＣ
12          ＰＬＣ + タクソール
13          ＰＬＣ
14          ＰＬＣ + タクソール
15          ＰＬＣ
連続
59          ＰＬＣ
【０１５４】
両方の処置スケジュールにおいて、コントロール、タクソールおよびＰＬＣの各群に同じ数の細胞を接種した。
タクソールは、タクソール単独処置群とタクソールおよびＰＬＣの併用処置群の両方へ、同時に投与した。
【０１５５】
ＰＬＣ処置は、単独の場合、タクソールと組み合わせた場合のいずれにおいても、処置スケジュールA)では腫瘍接種12日目から開始し、24日目で終了した；処置スケジュールＢ）では腫瘍接種5日目から開始し、試験終了日である59日目まで投与した。
【０１５６】
結果
試験Ａ）
【表１２】
2010254717.tif 000020
【０１５７】
腫瘍サイズ
【表１３】
2010254717.tif 000021
【０１５８】
ノンパラメトリックデータのためのマン−ホイットニー片側検定を適用したところ、全ての観察時点においてタクソール＋ＰＬＣ処置群は、コントロール群に対してｐ＜０.００３の統計的有意性を持って相違しており、少なくとも観察時点においては（46日目）、有意差のレベルはｐ＜０.０３４まで落ちた。タクソール群の46日目の値は、コントロール群の値と有意差が無いことに注目すべきである。
【０１５９】
試験Ｂ）
腫瘍の認められた動物／全動物
【表１４】
2010254717.tif 000022
【０１６０】
腫瘍サイズ
【表１５】
2010254717.tif 000023
【０１６１】
ウイルコクソン統計学的検定を用いて分析したところ、コントロール群のみがタクソール＋ＰＬＣ群と、p<0.05で有意差があった。