(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株、およびＬ−メチオニン前駆体を生産する方法の提供。【解決手段】ａ）コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性が増進され、あるいはｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性が増進され、あるいはｃ）前記ａ）およびｂ）の特性を全て有する、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株。【選択図】図２
2010000075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．３１）が導入および増進され、あるいは
ｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進され、あるいは
ｃ）前記ａ）およびｂ）の特性を全て有する、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株。
【請求項２】
前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミカム(corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナスエレギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、またはマイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)から選択された菌株。
【請求項３】
前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、Unipro database No. Q9RVZ8, NP_249081またはYP_886028から選択された遺伝子でエンコーディングされた、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
前記アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドは、アミノ酸３４５番の位置に突然変異を持っている、請求項１に記載の菌株。
【請求項５】
前記アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項６】
前記菌株は、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−リシンを生産する菌株に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項７】
前記菌株は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ.）である、請求項１に記載の菌株。
【請求項８】
前記菌株は、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼが弱化または非活性化されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項９】
前記菌株はホモセリンキナーゼが弱化または非活性されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項１０】
前記菌株は、メチオニン合成経路の転写調節因子が弱化または非活性化されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項１１】
前記菌株は、Ｌ−メチオニン−依存性から自由なトレオニン生産菌株である大腸菌ＭＦ００１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１、寄託番号ＫＣＣＭ１０５６８）に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項１２】
前記菌株は、トレオニン生産菌株である大腸菌ＦＴＲ２５３３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＴＲ２５３３、寄託番号ＫＣＣＭ１０５４１）に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項１３】
前記菌株は Ｏ−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine) 生産菌株であるEscherichia coli CJM-X(pthrA(M)-CL) (ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ)である、請求項１に記載の菌株。
【請求項１４】
前記菌株は Ｏ−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine) 生産菌株であるEscherichia coli CJM2-X(pthrA(M)-CL) (ＫＣＣＭ１０９２５Ｐ) である、請求項１に記載の菌株。
【請求項１５】
１）請求項１〜１４のいずれか１項による菌株を発酵させる段階と、２）培地または菌株内でＯ−アセチルホモセリンを培養する段階と、３）Ｏ−アセチルホモセリンを分離する段階とを含む、Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体(Methionine Precursor)であるＯ−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine)を生産する菌株、およびこの菌株を用いてＬ−メチオニン前駆体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニンは、ヒトに必要な必須アミノ酸の一つであって、飼料および飲食物添加剤だけでなく、医学溶剤および医学補充剤の合成原料としても広く使われる。メチオニンは、コリン（レシチン）およびクレアチンのような合成物の前駆体としての役割を果たすと同時に、システインおよびタウリンの合成原料としても使われる。また、メチオニンは硫黄(sulfur)を提供する役割を果たす。Ｓ−アデノシル−メチオニン(S-adenosyl-methionine)は、Ｌ−メチオニンに由来し、生体内メチル基を提供する役割を果たし、脳における様々な神経伝達物質の合成に関与する。メチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）は、生体内で肝と動脈の脂肪蓄積を抑制し、うつ病、炎症、肝疾患および筋肉痛を緩和させるなどの様々な役割を果たす。
今まで知られているメチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−メチオニンの生体内(in vivo)機能は、次のとおりである。
１）脂肪代謝を促進する肝と動脈における脂肪蓄積を抑制し、脳、心臓および腎臓の血液循環を向上させる（非特許文献１）。
２）消化作用、毒性物質の解毒または排出、および鉛（Ｐｂ）などの重金属の排出を増進させる。
３）１日当たり８００〜１６００ｍｇの投与量で抗うつ剤として投与できる（非特許文献２）。
４）肝機能を増進させ（非特許文献３）、特に、アルコールによって引き起こされる肝疾患に効果的である（非特許文献４）。
５）骨関節疾患に対する抗炎症効果を示し、関節回復を促進する（非特許文献５）。
６）毛髪の必須栄養素である。毛髪に栄養を供給することにより、脱毛を防ぐ（非特許文献６）。
【０００３】
メチオニンは、動物飼料や食品、医薬品などに適用するために、化学的または生物学的に合成できる。
化学的な合成は、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）−ヒダントイン(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)の加水分解反応によってメチオニンを生産する。ところが、このように化学的に合成されたメチオニンは、Ｌ型とＤ型の混合形態で生産されるという欠点を持っている。
生物学的な合成は、メチオニンの合成に関与するタンパク質を使用する方法である。Ｌ−メチオニンは、大腸菌(E.coli)においてｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥおよびｍｅｔＨなどの遺伝子から発現する酵素の作用によってホモセリンから生合成される。特に、ｍｅｔＡは、メチオニン生合成の一番目の酵素であるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ(succinyltransferase)をコードする遺伝子であって、ホモセリンをＯ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン(O-succinylhomoserine)に転換する機能を行う。ｍｅｔＢ遺伝子によってコードされるＯ−スクシニルホモセリンリアーゼ(O-succinylhomoserine lyase)またはシスタチオニンガンマシンターゼ(cystathionine gamma synthase)は、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンをシスタチオニンに転換する。ｍｅｔＣによってコードされるシスタチオニンベータリアーゼは、シスタチオニンをＬ−ホモシステインに転換する機能を行う。ｍｅｔＥによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-independent methionine synthase)と、ｍｅｔＨによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-dependent methionine synthase)は、Ｌ−ホモシステインをＬ−メチオニンに転換する。ここに加えて、ｍｅｔＦによってコードされる５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)と、ｇｌｙＡによってコードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼとは一緒に作用し、Ｌ−メチオニンの合成に必須的なメチル基を提供するＮ（５）−メチルテトラヒドロ葉酸(N(5)-methyltetrahydrofolate)を合成する機能を行う。
【０００４】
Ｌ−メチオニンは、前記酵素による連鎖的な有機反応によって合成され、前記タンパク質、または前記タンパク質に影響するタンパク質に遺伝的な操作を加える場合、Ｌ−メチオニンの合成を増加させることができる。例えば、特許文献１は、エシェリキア属(Escherichia sp.)に属するゲノム上に、ｔｈｒＢＣとｍｅｔＪを除去してｍｅｔＢＬを過発現させ、ｍｅｔＫをリーキー型に製作してＬ−メチオニンを生産する方法を開示している。また、特許文献２は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)に属し、ｍｅｔＤ（Ｌ−メチオニン合成阻害剤）遺伝子をノックアウト(Knock-out)した菌株を使用する方法を開示している。特許文献３は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔＦ）の発現を増加させてＬ−メチオニンの生産を増加させる方法を開示している。
また、生物学的方法によって生産されるメチオニンは、Ｌ型であるという利点があるが、その量は極めて微量である。これはメチオニン生合成経路が非常によく調節されるフィードバック体系を持っているためである。メチオニンが一定の水準以上に合成されると、最終産物としてのメチオニンがメチオニン生合成を開始する初期タンパク質をコードするｍｅｔＡ遺伝子の転写をフィードバックで抑制する。ｍｅｔＡ遺伝子は、転写段階ではメチオニンによって阻害され、翻訳段階では細胞内プロテアーゼによって分解されるメカニズムでメチオニンの量を調節するので、ｍｅｔＡ遺伝子の高発現のみではメチオニンの量を一定の水準以上に増加させることができない（非特許文献７）。したがって、以前の多くの特許らは、フィードバック調節体系からｍｅｔＡ遺伝子のフィードバックを解除する研究に集中している（特許文献４および特許文献５）。
【０００５】
特許文献６は、硫黄の源泉としてシステインを使用せず、直接メチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）または硫化水素（Ｈ２Ｓ）を使用するように変形されたシスタチオニンシンターゼ（Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ）によってホモシステインまたはメチオニンを合成する方法について開示している。ところが、シスタチオニンシンターゼは、細胞で様々なメチオニン前駆体と結合することができ、それにより高い水準の副産物を生産することができると知られている。例えば、シスタチオニンシンターゼは、Ｏ−スクシニルホモセリンとホモシステインの付随反応によって高い水準のホモランチオニン(homolanthionin)を蓄積すると報告された（非特許文献８）。したがって、シスタチオニンシンターゼの過発現は、付随反応の増加に起因した細胞内反応の効率性を減少させることができる。また、この方法では、細胞内のメチオニン代謝経路を用いるため、酵素の反応過程が非効率的であり、細胞に激しい毒性を持つＨ-２ＳまたはＣＨ３ＳＨを使用するという点で実効性が低下し、メチオニン合成経路のフィードバック調節によって十分な量のメチオニンを合成することができないという問題がある。
【０００６】
このような問題を解決するために、本発明者らは、２段階、（１）大腸菌(E.coli)の発酵によってＬ−メチオニン前駆体を生産する段階と、（２）酵素反応によってＬ−メチオニン前駆体をＬ−メチオニンに転換する段階とを含む過程を開発したことがある（特許文献７）。前記２段階の過程による場合、硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとＳＡＭｅによる菌株のフィードバック調節問題、細胞内酵素（例えば、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ、およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ）による中間産物の分解活性問題を全て解決することができる。しかも、Ｄ−メチオニンとＬ−メチオニンとの混合形態を生産する化学的な合成方法に比べ、前記２段階の過程はＬ−メチオニンのみを選択的に生産するのに非常に効果的である。
前記２段階の過程で、メチオニン前駆体の生産量はメチオニン生産量増加の核心要素の一つである。メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンの合成量を増加させるために、強力なアスパルトキナーゼ、ホモセリントランスフェラーゼおよびＯ−アセチルホモセリントランスフェラーゼの組み合わせが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本特開２０００−１３９４７１号公報
【特許文献２】米国特許公開第２００３／００９２０２６号明細書
【特許文献３】米国特許公開第２００２／００４９３０５号明細書
【特許文献４】国際特許公開第２００５／１０８５６１号パンフレット
【特許文献５】国際特許公開第２００５／１４０３８１３号パンフレット
【特許文献６】米国特許公開第２００５／００５４０６０号明細書
【特許文献７】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３６５０明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401
【非特許文献２】Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S
【非特許文献３】FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26
【非特許文献４】Cochrane Database Syst Rev., Rambal A., 2001; (4): CD002235
【非特許文献５】ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30
【非特許文献６】Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266
【非特許文献７】Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443
【非特許文献８】J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景の下に、本発明者らは、ａ）コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．３１）が導入および増進され、あるいはｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進され、あるいはｃ）前記ａ）およびｂ）の特性を全て有する、Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株を開発した。
本発明の目的は、ａ）コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．３１）が導入および増進され、あるいはｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進され、あるいはｃ）前記ａ）およびｂ）の特性を全て有する、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてＬ−メチオニン前駆体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一つの様態において、本発明は、ａ）コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．３１）が導入および増進され、あるいはｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進され、あるいはｃ）前記ａ）およびｂ）の特性を全て有する、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供する。
本願で使用される用語「Ｌ−メチオニン前駆体」とは、メチオニン特化代謝経路の一部分である代謝物質、またはこの代謝物質から派生した物質をいう。特に、本願におけるＬ−メチオニン前駆体とはＯ−アセチルホモセリンを意味する。
本願で使用される用語「Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株」とは、Ｌ−メチオニン前駆体を生物体内で生産することが可能な原核または眞核微生物菌株であって、本発明に係る操作によってＬ−メチオニン前駆体を蓄積することが可能な菌株をいう。例えば、菌株はエシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属 (Leptospira)、サルモネラ属(Salmonellar sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)、ヒポモナス属(Hypomonas sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacteria sp.)、およびノカルジア属(Nocardia)、またはカビ類(fungi)または酵母類(yeast)に属する微生物菌株を含むことができる。好ましくは、エシェリキア属、コリネバクテリウム属およびレプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。さらに好ましくはエシェリキア属の微生物菌株であり、最も好ましくは大腸菌(E.coli)である。
【００１１】
様々な具体例として、本発明は、前記菌株から完全なＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの分解に関与する遺伝子を欠損または弱化させ、Ｏ−アセチルホモセリンの合成に関与する遺伝子を導入または増強させた菌株をＬ−メチオニン前駆体の生産菌株として提供する。また、本発明は、Ｏ−アセチルホモセリンの生産を増強させるために、トレオニン生合成経路を遮断または弱化させた菌株を提供する。また、本発明は、フィードバック調節体系から自由なＯ−アセチルホモセリントランスフェラーゼを導入、過発現または活性増強させた菌株を提供する。また、本発明は、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼが過発現し或いは活性増強された菌株を提供する。また、本発明は、フィードバック調節体系から自由なホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの導入、過発現または活性増強されると同時に、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼが過発現または活性増強された菌株を提供する。
さらに詳しくは、本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体の分解に関与するｍｅｔＢ遺伝子、トレオニン生合成経路に関与するｔｈｒＢ遺伝子、およびＬ−メチオニン前駆体生産遺伝子の転写を調節するｍｅｔＪ遺伝子を欠損させたＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、メチオニン前駆体の合成に関与する本来のｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子をノックアウトし、フィードバックが解除された外部のｍｅｔＸ遺伝子を導入したＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされる活性を増強させたＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。
より望ましくは, 本発明はまた L-メチオニン前駆体合成に関与する本来の metA または metX 遺伝子をノックアウッさせて, フィードバックが解除された外部 metX 遺伝子を取り入れて, thrA 遺伝子によってコーディングされる活性を増強させた L-メチオニン前駆体生産菌株を提供する.
【００１２】
本願で使用される用語「非活性」とは、遺伝子の減衰または欠失をいう。遺伝子の欠失は、遺伝子を切断しあるいは染色体上に特定の遺伝子配列を挿入してタンパク質の配列を変形させることにより行われる。ここで、「減衰(attenuation)」または「弱化(weakening)」という用語は、微生物菌株において相応するＤＮＡによってコードされる少なくとも一つの酵素に対する細胞内活性を除去または減少させることを意味する。例えば、遺伝子のプロモーター部位および５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を弱化させるか、あるいは当該遺伝子のＯＲＦ部位に突然変異を導入することによりタンパク質の活性を弱化させることができる。減衰の測定によれば、相応するタンパク質の濃度または活性は一般に野生型(wild-type)または初期微生物菌株の濃度または活性に比べて０〜７５％、０〜５０％、０〜２５％、０〜１０％または０〜５％に減少する。
減衰を成すために、例えば、遺伝子の発現または酵素タンパク質の触媒活性を減少または除去することができ、前記２つの方法を選択的に組み合わせることができる。
適切な培養によって、あるいは遺伝子発現の信号構造の変形によって、あるいはアンチセンス−ＲＮＡ技術によって遺伝子発現を減少させることができる。例えば、遺伝子発現の信号構造は、例えばリプレッサー(repressor)、アクチベータ(activator)、オペレーター(operator)、プロモーター、アテニュエーター(attenuator)、リボソーム結合部位、開始コドン(codon)およびターミネーター(terminator)である。これに関連し、ＪｅｎｓｅｎおよびＨａｍｍｅｒ(Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)) 、ＣａｒｒｉｅｒおよびＫｅａｓｌｉｎｇ(Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)) 、ＦｒａｎｃｈおよびＧｅｒｄｅｓ(Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)) 、並びに遺伝学科分子生物学の公知の教科書であるＫｎｉｐｐｅｒｓ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)またはＷｉｎｎａｃｋｅｒ("Genes and Clones", 1990)などを参考することができる。
【００１３】
酵素タンパク質の触媒活性の変化または減少を誘導する突然変異は、当業界によく知られている。例えば、ＱｉｕおよびＧｏｏｄｍａｎ(Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997))、Ｙａｎｏ等(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998))、並びにＷｅｎｔｅおよびＳｃｈａｃｈａｍａｎｎ(Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991)の論文、またはＨａｇｅｍａｎｎ("General Genetics", 1986)などを参考することができる。
できる限り、突然変異は転移(transitions)、転換(transversions)、挿入(insertions)および欠失(deletions)による突然変異である。酵素活性に関わるアミノ酸配列の変化有無に応じてミスセンス(missense)突然変異またはノンセンス(nonsense)突然変異に区分することができる。遺伝子の少なくとも一つの塩基対において、この突然変異は間違ったアミノ酸を導入し、翻訳が速やかな中断を誘導する。もし停止コドンが突然変異の結果としてコーディング地域に形成されると、これも翻訳の未成熟終了(termination)を誘導する。典型的に多数のコドンが欠失されると、酵素活性が完全に損失してしまう。このような突然変異の発生に関する具体的な内容は、Ｋｎｉｐｐｅｒｓ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ ("Genes and Clones", , 1990)またはＨａｇｅｍａｎｎ("General Genetics", 1986)などの著名な遺伝学および分子生物学教科書を参考することができる。
【００１４】
本願で使用される用語「増進(enhancement)」とは、相応するＤＮＡによってコードされる酵素の細胞内活性の増加をいう。酵素の細胞内活性の増進は遺伝子の過発現によってなされ得る。目的遺伝子の過発現は、前記遺伝子のプロモーター地域または５’−ＵＴＲ地域の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を増進させることができ、目的の遺伝子を染色体上に追加導入することにより発現を強化させることができ、目的の遺伝子をベクター上に自己プロモーターまたは強化された別個のプロモーターと共に導入して菌株に形質転換させることによりタンパク質の発現量を強化させることができる。また、酵素の細胞内活性の増進は、目的遺伝子のＯＲＦ(open reading frame)地域に突然変異を導入することによりなされ得る。増進の測定によれば、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型タンパク質または初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として、一般に最少１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加することが分かる。
本発明の具体的な実施様態において、Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株を準備する方法は次のとおりである。
第１段階として、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンなどのＬ−メチオニン前駆体を蓄積するために、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼなどのタンパク質をコードする遺伝子を菌株において欠損または弱化させる。
【００１５】
シスタチオニンガンマシンターゼをコードする遺伝子を通称「ｍｅｔＢ」と表示し、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼをコードする遺伝子を通称「ｍｅｔＺ」と表示し、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼをコードする遺伝子を通称「ｍｅｔＹ」と表示する。前述した活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、大腸菌(Escherichai coli.)における公知のｍｅｔＢである。この遺伝子のゲノム塩基配列は以前の文献「Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997)」によって公開されたＥ．ｃｏｌｉのゲノム塩基配列（ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５８７６）から得ることができる。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、DNA Data Bank Japan）から得ることができる。この他にも、同じ活性を持つ遺伝子として、コリネバクテリウムのｍｅｔＢとｍｅｔＹ、シュードモナス(Pseudomonas.)由来のｍｅｔＺなどを例示することができる。
シスタチオニンガンマシンターゼまたはＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼは、次の反応式に示すように、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをシスタチオニンまたはホモシステインに転換する能力を持っている。よって、この活性を持つ遺伝子を弱化させる場合、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンが培養液に過量蓄積される。
Ｌ−システイン＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン⇔スクシネート＋シスタチオニン
Ｌ−システイン＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔アセテート＋シスタチオニン
ＨＳ−＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン⇔スクシネート＋ホモシステイン
ＨＳ−＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔アセテート＋ホモシステイン
【００１６】
第２段階として、第１段階で準備された菌株にホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子を除去または弱化させる。ＴｈｒＢ遺伝子はホモセリンからＯ−ホスホホモセリン(phosphohomoserine)の合成を随伴し、次いでｔｈｒＣ遺伝子によってトレオニンに転換される。合成されたホモセリンが全量メチオニンの前駆体合成に利用できるようにするために、ｔｈｒＢ遺伝子を欠損または弱化させる。
第３段階として、メチオニン合成経路の転写調節因子を欠損または弱化させる。メチオニン合成を随伴するｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥおよびｍｅｔＦ遺伝子は、フィードバック調節体系によって抑制される。ｍｅｔＪ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉにおける典型的な転写調節因子である。メチオニン前駆体を合成するためにｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子を過発現させなければならず、このためにｍｅｔＪの除去が必要である。よって、Ｅ．ｃｏｌｉからｍｅｔＪを除去すると、ｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子の発現が常に促進された状態となり、Ｌ−メチオニン前駆体を大量生産することができる。
前記第２段階と前記第３段階は、前駆体生産菌株によって異なり、前駆体生産菌株を製作するために必須的ではない。より好ましくは、エシェリキア属の微生物における前駆体生産経路を強化するために行うことができる。
【００１７】
第４段階として、Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンの合成を増加させるために、メチオニン生合成経路の第１過程を媒介する酵素としてのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＸ遺伝子の発現を増進させる。ｍｅｔＸは
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の通称であり、新規の外部のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは様々な微生物種から得られる。例えば、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来する遺伝子によってコードされる。好ましくは、前記ホモセリＯ−アセチルトランスフェラーゼはコリネバクテリウムグルタミカム(corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナスエレギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、またはマイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)から選ばれた菌株に由来する遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼはＵｎｉｐｒｏデータベース登録番号Ｑ９ＲＶＺ８（配列番号３２）、ＮＰ＿２４９０８１（配列番号３３）またはＹＰ＿８８６０２８（配列番号３４）のアミノ酸配列を有する。レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)に由来したｍｅｔＸ遺伝子は、フィードバック抵抗性(J Bacteriol. 1998 Jan;180(2):250-5. Belfaiza J et al.)があるものと知られている。様々なホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、以前、本発明者らの研究からフィードバック抵抗性が確認された。
【００１８】
ｍｅｔＸ遺伝子の導入および増進は、遺伝子の導入によって、または５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列と遺伝子のプロモーター地域の変形によって、または目的遺伝子のＯＲＦ地域への突然変異導入によってなされ得る。ｍｅｔＸ遺伝子発現の増進によって結局メチオニン前駆体合成が増加する。
第５段階として、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの前駆体であるホモセリンの合成を増加させるために、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を増進させる。ｔｈｒＡは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を持つペプチドをコードする遺伝子の通称である。好ましくは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏデータベース登録番号ＡＰ＿０００６６６の遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２７に示されたが、アミノ酸位置３４５に突然変異を持っている。ＴｈｒＡ活性の増進は、ｔｈｒＡ遺伝子への突然変異導入によって染色体上に目標の遺伝子をさらに導入し、過程処理されたプラスミドをさらに導入することによりなされ得る。
Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンは、前記第１段階〜第５段階の全体過程または一部分を用いることにより菌株に蓄積できる。
【００１９】
Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株は、Ｌ−リシン(lysine)、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン(isoleusine)を生産する菌株を用いて製造することができる。好ましくは、Ｌ−トレオニンを生産する菌株を使用することにより製造する。この場合には、既にホモセリンまでの合成が円滑に行われた菌株であって、さらに多くのメチオニン前駆体を合成することができる。したがって、トレオニン生産菌株を用いて、トレオニン生合成経路に関与する遺伝子、およびｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＺを欠損または弱化させることにより、メチオニン前駆体を蓄積することができる。また、ｍｅｔＸ遺伝子発現を増進させてより多量のメチオニン前駆体を合成することができる。
本願で使用される用語「Ｌ−トレオニン生産菌株」とは、生体内でＬ−トレオニンを生産することが可能な原核または眞核微生物菌株をいう。例えば、エシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、またはブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)に属するＬ−トレオニン生産微生物菌株が含まれ得る。これらの中でも、エシェリキア属(Escherichia sp.)が好ましく、大腸菌(Escherichia coli)がさらに好ましい。
【００２０】
本発明の好適な具体例において、Ｌ−トレオニンを生産するＥ．ｃｏｌｉ突然変異菌株であるＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）から形質転換されたＬ−トレオニン生産および独立菌株としてのＣＪＭ００２を使用した。ＴＦ４０７６は、メチオニン要求性、メチオニン類似体（例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、ＡＨＶ）、リシン類似体（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例えば、α−アミノ酪酸）に対する耐性などの特徴を持つ。ＴＦ４０７６はメチオニン要求性菌株であって、細胞内でメチオニンは合成できない。本発明者らはこのようなメチオニン要求性を解除してメチオニン生産菌株として用いるために、ＮＴＧを使用した人工的な突然変異法を用いて、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２を製造した。前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１と命名し、２００４年４月９日にＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５６８で寄託した。
本発明において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２菌株のｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ、ｍｅｔＪおよびｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた後、ｍｅｔＡ位置にｍｅｔＸを導入した。このように製造された最終的なＬ−メチオニン前駆体生産菌株はＣＪＭ−Ｘと命名した。ＣＪＭ−Ｘ菌株のｍｅｔＸ遺伝子はＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓに由来した。ＣＪＭ−Ｘ菌株をｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させ、これをＣＪＭ−Ｘ（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）＿ＣＬ）と命名した。前記方法によって製造されたＯ−アセチルホモセリン生産菌株Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ ＣＪＭ−Ｘ（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）は２００８年１月２３日に寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐで寄託した。
【００２１】
本発明の好適な具体例において、ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３４４で開示されたＬ−トレオニン生産菌株ＦＴＲ２５３３を使用することができる。ＦＴＲ２５３３は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６から派生したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＦＲ７６２４に由来した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＦ４０７６に由来した。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６は、ＰＥＰからオキサロ酢酸(oxaloacetate)形成の触媒として作用するｐｐｃ遺伝子とアスパラギン酸塩からトレオニンを生合成するために必要な酵素、例えばｔｈｒＡ：アスパルトキナーゼ１−ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ｔｈｒＢ：ホモセリンキナーゼ、ｔｈｒＣ：トレオニンシンターゼを高水準で発現するので、Ｌ−トレオニンの生産を増加させることができる。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＴＲ７６２４（ＫＣＣＭ１０５３８）はＬ−トレオニン生合成のために必要なｔｙｒＢ遺伝子の発現を抑制する非活性ｔｒｙＲ遺伝子を持っている。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＴＲ２５３３（ＫＣＣＭ１０５４１）は、非活性化されたｇａｌＲ遺伝子を持つＬ−トレオニン生産菌株であると同時に、Ｌ−トレオニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異菌株である。
本発明の具体的な実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＴＲ２５３３菌株のｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ、ｍｅｔＪおよびｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた後、ｍｅｔＡの位置にｍｅｔＸ遺伝子を導入した。このように製造された最終的なＬ−メチオニン前駆体はＣＪＭ２−Ｘと命名した。ＣＪＭ２−Ｘ菌株のｍｅｔＸ遺伝子はＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓに由来した。ＣＪＭ２−Ｘ菌株をｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させ、これをＣＪＭ２−Ｘ（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）と命名した。前記方法によって製造したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ２−Ｘ（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）は、２００８年２月１２日に寄託番号ＫＣＣＭ１０９２５Ｐで寄託した。
【００２２】
別の様態において、本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体を生産する方法に関するものである。具体的には、本発明は、ａ）前記微生物菌株を発酵させる段階と、ｂ）培地または菌株内でＯ−アセチルホモセリンを培養する段階、およびｃ）Ｏ−アセチルホモセリンを分離する段階を含んでなる、Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法に関する。
前記で製造されたＬ−メチオニン前駆体生産菌株の培養は、当業界における公知の適切な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法は、例えば回分式、連続式および流加式培養を含むが、これに限定されない。このような様々な培養方法は、例えば、文献「"Biochemical Engineering"by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.」に開示されている。
培養に使用される培地は、特定菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。様々な微生物培養培地は、例えば、文献「"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.」に開示されている。これらの培地は多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。炭素源は、例えば、グルコース(glucose)、ラクトース(lactose)、スクロース(sucrose)、フルクトース(fructose)、マルトース(maltose)、スターチ(starch)およびセルロース(cellulose)などの炭水化物；大豆油(soybean oil)、ヒマワリ油(sunflower oil)、ヒマシ油(castor oil)またはココナツオイル(coconut oil)などの脂肪；パルミチン酸(palmitic acid)、ステアリン酸(stearic acid)およびリノール酸(linoleic acid)などの脂肪酸；グリセロール(glycerol)およびエタノール(ethanol)などのアルコールと酢酸(acetic acid)などの有機酸(organic acid)を含む。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。窒素源としては、ペプトン(peptone)、酵母抽出液(yeast extract)、肉汁(gravy)、麦牙抽出液(malt extract)、コーンスティープリカー(corn steep liquor（ＣＳＬ）)およびベスン粉(bean flour)などの有機窒素源および尿素(urea)、硫酸アンモニウム(ammonium sulfate)、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含む。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。前記培地には、リン酸源としてさらにリン酸二水素カリウム(potassium dihydrogen phosphate)、リン酸水素二カリウム(dipotassium hydrogen phosphate)および相応するナトリウム含有塩(sodium-containing salts)を含むことができる。また、培地は硫酸マグネシウム(magnesium sulfate)または硫酸鉄(iron sulfate)などの金属を含むことができる。また、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが添加できる。これらの培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加できる。
【００２３】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することにより培養する間に気泡の生成を抑えることができる。また、培養液の好気性条件を保つために、培養液内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）が注入できる。培養物の温度は一般に２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養の期間はＬ−メチオニン前駆体の生産が所望の水準に到達するまで続くことができ、好ましい培養時間は１０〜１６０時間である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のメチオニン前駆体生産菌株を使用する場合、メチオニンは、典型的な化学的メチオニン合成方法より環境親和的に生産することができる。また、本発明に係る菌株から生産されたＯ−アセチルホモセリンから転換されたＬ−メチオニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤の生産に広く使用できる。
本発明のメチオニン前駆体生産菌株を使用する場合、メチオニンは、典型的な化学的メチオニン合成方法より環境親和的に生産することができる。また、本発明に係る菌株から生産されたＯ−アセチルホモセリンから転換されたＬ−メチオニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤の生産に広く使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】メチオニン前駆体生産菌株の遺伝的操作を説明する図である。
【図２】メチオニン生産のための２段階過程の化学的な構造を説明した図である。
【図３】ｍｅｔＸ遺伝子発現のためのｐＣＪ−ＭｅｔＸ−ＣＬの開裂地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。但し、これらの実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
実施例１：メチオニン前駆体生産菌株の製造
<１−１>ｍｅｔＢ遺伝子の欠損
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株においてシスタチオニンシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させるために、ＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）。配列番号１および配列番号２のプライマーを用いてｐＫＤ３ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）を鋳型としてＰＣＲ反応によって欠損カセットを構成した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒の変性過程(denaturation)、５５℃で３０秒のアニーリング過程(annealing)および７２℃で１分の伸長過程を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返すことにより行った。
【００２７】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片はｐＫＤ４６ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）を予め形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、ｐＫＤ４６で形質転換されたＷ３１１０菌株は、１００μｇ／Ｌアンピシリンと５ｍＭ Ｌ−アラビノースが含まれたＬＢ培地を用いて、ＯＤ６００が０．６に到達するまで３０℃で培養した。滅菌蒸留水で２回、１０％グリセロールで１回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは２５００Ｖで加えた。回収された菌株を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコール(chloramphenicol)を含んだＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００２８】
選別された菌株は、菌株を鋳型として同一のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．２Ｋｂと観察されることを確認することにより、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）で形質転換させてＬＢ培地で培養した。その後、再び同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をＷ３−Ｂと命名した。
【００２９】
<１−２>ｔｈｒＢ遺伝子の欠損
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子としてのｔｈｒＢ遺伝子を欠損させることにより、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特にトレオニン生産菌株を用いる場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいため、この遺伝子の欠損が必ず必要である。前記製作されたＷ３−Ｂ菌株からｔｈｒＢ遺伝子を欠損させるために、ｍｅｔＢ遺伝子欠損時と同一のＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を使用した。
ｔｈｒＢ欠損カセットを製作するために、ｐＫＤ４ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ１９７：Ｐ６６４０〜６６４５）を鋳型として、配列番号３、４のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で１分の延長段階を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．６ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−Ｂ菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、５０μｇ／Ｌのカナマイシンを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００３０】
選別された菌株は菌株を直接鋳型として配列番号３、４のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Ｋｂと確認される菌株を選別することにより、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクターで形質転換させてＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０ｂｐに小さくなった最終ｔｈｒＢ遺伝子欠損菌株を製作し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株はＷ３−ＢＴ菌株と命名した。
【００３１】
<１−３>ｍｅｔＪ遺伝子の欠損
メチオニン前駆体の合成に関与するｍｅｔＡ遺伝子の調節遺伝子であるｍｅｔＪ遺伝子を欠損させるために、ｍｅｔＢ遺伝子欠損時と同一のＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を使用した。ｍｅｔＪ遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号５、６のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性(denaturation)段階、５５℃で３０秒のアニーリング(annealing)段階および７２℃で１分の延長(extension)段階を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−ＢＴ菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００３２】
選別された菌株を直接鋳型として配列番号７、８のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Ｋｂに変化することを確認することにより、ｍｅｔＪ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが６００ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＪ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をＷ３−ＢＴＪと命名した。
【００３３】
<１−４>ｍｅｔＡ遺伝子の欠損
Ｏ−アセチルホモセリンの生産を増加させるために、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ遺伝子をＷ３−ＢＴＪ菌株から除去した。ｍｅｔＸ遺伝子挿入がＯ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンの蓄積をもたらすという発見に基づき、ｍｅｔＡ遺伝子欠損がＯ−アセチルホモセリンの蓄積を誘導するものと期待された（表３）。ｍｅｔＡ遺伝子を除去するために、ＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った。
ｍｅｔＡ遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号９、１０のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で１分の延長段階を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−ＢＴ菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００３４】
選別された菌株を直接鋳型として配列番号９、１０のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．１Ｋｂｐに変化することを確認することにより、ｍｅｔＡ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１００ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＡ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をＷ３−ＢＴＪＡと命名した。
【００３５】
<１−５>ｍｅｔＸ遺伝子の過発現
Ｏ−アセチルホモセリンの合成のために、メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリン合成遺伝子、すなわちホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ(homoserine O-acetyl transferase)をコードするｍｅｔＸ遺伝子を過発現させようとした。
このために、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)のクロモソーム(chromosome)を鋳型として配列番号２８、２９番のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で２分の延長段階を１サイクルとして、これを２５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＣＬ１９２０ベクターにＣＪ１プロモーターとＥｃｏＲＶ制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをｐＣＪ１−ＭｅｔＸｌｍｅ−ＣＬと命名した。前記ベクターでＷ３−ＢＴＪ菌株を形質転換させて製作された菌株をＷ３−ＢＴＪ／ｐＣＪ−ＭｅｔＸｌｍｅ−ＣＬと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
【００３６】
ｍｅｔＸ遺伝子を過発現させるための他の方法として、コリネバクテリウムグルタミカム(corynebacterium glutamicum)のクロモソーム(chromosome)を鋳型として配列番号３０、３１番のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で２分の延長段階を１サイクルとして、これを２５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＣＬ１９２０ベクターにＣＪ１プロモーターとＥｃｏＲＶ制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをｐＣＪ１−ＭｅｔＸｃｇｌ−ＣＬと命名した。前記ベクターでＷ３−ＢＴＪ菌株を形質転換させて製作された菌株をＷ３−ＢＴＪ／ｐＣＪ−ＭｅｔＸｃｇｌ−ＣＬと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
【００３７】
ｍｅｔＸ遺伝子を過発現させるための別の方法として、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)を鋳型として配列番号１１、１２番のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で２分の延長段階を１サイクルとして、これを２５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＣＬ１９２０ベクターにＣＪ１プロモーターとＥｃｏＲＶ制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをｐＣＪ１−ＭｅｔＸｄｒａ−ＣＬと命名した。前記ベクターでＷ３−ＢＴＪ菌株を形質転換させて製作された菌株をＷ３−ＢＴＪ／ｐＣＪ−ＭｅｔＸｄｒａ−ＣＬと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
ｍｅｔＸ遺伝子を過発現させるための別の方法として、マイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)を鋳型として配列番号１３、１４番のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で２分の延長段階を１サイクルとして、これを２５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００３８】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＣＬ１９２０ベクターにＣＪ１プロモーターとＥｃｏＲＶ制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをｐＣＪ１−ＭｅｔＸｍｓｍ−ＣＬと命名した。前記ベクターでＷ３−ＢＴＪ菌株を形質転換させて製作された菌株をＷ３−ＢＴＪ／ｐＣＪ−ＭｅｔＸｍｓｍ−ＣＬと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
ｍｅｔＸ遺伝子を過発現させるための別の方法として、シュードモナスエレギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)を鋳型として配列番号１５、１６番のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で２分の延長段階を１サイクルとして、これを２５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００３９】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＣＬ１９２０ベクターにＣＪ１プロモーターとＥｃｏＲＶ制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをｐＣＪ１−ＭｅｔＸｐａｅ−ＣＬと命名した。前記ベクターでＷ３−ＢＴＪ菌株を形質転換させて製作された菌株をＷ３−ＢＴＪ／ｐＣＪ−ＭｅｔＸｐａｅ−ＣＬと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
このように製造されたベクターをＷ３−ＢＴＪＡ菌株にそれぞれエレクトロポレーションし、菌株の生産能力を実施例２−１で説明されたようにフラスコ培養を用いて検定した。各菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能力は、コリネバクテリウムグルタミカムに由来したｍｅｔＸベクターを導入した菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能力（ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３６５０）を１００％としてそれぞれ測定した。その結果、Ｏ−アセチルホモセリン生産能力はベクターｐＣＪ−ＭｅｔＸｄｒａ−ＣＬ、ｐＣＪ−ＭｅｔＸｍｓｍ−ＣＬおよびｐＣＪ−ＭｅｔＸｌｍｅ−ＣＬでそれぞれ形質転換された菌株において著しく増加した。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
前述した３つの中でも最も効果的な生産を示すデイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)（ｍｅｔＸ（ｄｒａ）由来のｍｅｔＸ遺伝子の安定的な発現のために、前記ｍｅｔＸ（ｄｒａ）遺伝子をＥ．ｃｏｌｉの染色体に挿入した。ｍｅｔＸ（ｄｒａ）挿入菌株を構成するために、ｐＳＧベクター体系を使用した(Appl. Environ. Microbiol. 1993 V59. p.3485-3487, villaverde. A et. al)。
まず、配列番号１７、１８のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからｍｅｔＡの上流(upstream)地域の６００ｂｐを増幅し、配列番号１９、２０のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからｍｅｔＡの下流(downstream)地域の６００ｂｐを増幅した。次に、配列番号２１、２２のプライマーを用いてｍｅｔＸ（ｄｒａ）を増幅した。その結果として得られたＰＣＲ産物はゲル抽出によって分離し、断片の混合物は配列番号２３、２４をプライマーとしてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡは、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＳＧ７６Ｃベクターにクローニング(cloning)した。前記で構成されたベクターでＷ３−ＢＴＪＡ菌株を形質転換させ、クロラムフェニルコール抵抗性菌株を選別し、ｍｅｔＸ ｄｒａ遺伝子が成功的にクローニングされたことを確認した。選別された菌株のマーカーを除去するために、ｐｌｓｃｅｌベクターで形質転換させ、再び選別した。前記菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能力を確認した結果、ｍｅｔＸ（ｄｒａ）遺伝子が導入された菌株の生産はｐＣＬ−ｍｅｔＸｄｒａプラスミドを含有した菌株の生産と類似の生産能を示した。
【００４２】
<１−６>ｔｈｒＡ遺伝子の過発現
Ｏ−アセチルホモセリンの生産をさらに効果的に増加させるために、ｔｈｒＡ遺伝子を過発現させた。
このために、Ｌ−トレオニン生産菌株であるＥ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２（ＫＣＣＭ１０５６８）の染色体を鋳型として配列番号２５、２６のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル−抽出によって分離し、制限酵素ＥｃｏＲＶを用いてｐＣＬ１９２０ベクターのＣＪ１プロモーターに連結した。連結されたベクターはｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬと命名した。このベクターで、実施例１−１〜１−５の方法により製造された菌株を形質転換させた。ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２７に示され、アミノ酸位置３４５に突然変異を持っている。
【００４３】
<１−７>Ｌ−トレオニン生産菌株の転換
メチオニン要求性が解除されたＬ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＣＪＭ００２（ＫＣＣＭ−１０５６８号）を用いて、前記１−１〜１−５と同様の方法でＯ−アセチルホモセリン生産菌株を製作してＣＪＭ−Ｘと命名した。ＣＪＭ−Ｘ菌株の染色体は、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)由来のｍｅｔＸ遺伝子を持っている。また、ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３４４に記載されたＬ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＦＴＲ２５３３（ＫＣＣＭ１０５４１）を用いて、前記１−１〜１−５と同様の方法でメチオニン前駆体生産菌株を製作し、これをＣＪＭ−２Ｘと命名した。ＣＪＭ−２Ｘ菌株の染色体は、デイノコッカスラジオデュランス由来のｍｅｔＸ遺伝子を持っている。また、それぞれの菌株は実施例１−６に説明されたようにｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させ、メチオニン前駆体生産量を測定した。
【００４４】
実施例２：Ｌ−メチオニン前駆体の生産のための発酵
<２−１>フラスコ培養実験
実施例１で製作された菌株のメチオニン前駆体生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。平板ＬＢ培地にｍｅｔＸ発現ベクターおよびＣＪＭ−Ｘ、ＣＪＭ２−Ｘ、ＣＪＭ２−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬで形質転換させたＣＪＭ２−ＢＴＪＡ菌株を接種して３１℃で一晩培養した。Ｏ−アセチルホモセリン前駆体生産菌株である大腸菌ＣＪＭ−ＢＴＪＡ（ｐＣＪ−ＭｅｔＸ−ＣＬ）はＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３６５０に記載されており、２００７年７月５日に寄託番号ＫＣＣＭ−１０８７３で寄託した。
単一コロニーをスペクチノマイシンの含まれた３ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３１℃で５時間培養し、さらに２５ｍＬのメチオニン前駆体生産培地を含んだ２５０ｍＬの三角フラスコに２００倍希釈して３１℃の２００ｒｐｍで６４時間培養し、ＨＰＬＣ分析によってメチオニン前駆体生産量を比較した（表２および表３）。その結果、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株を用いて製作されたメチオニン前駆体生産菌株の場合において、メチオニン前駆体生産量が著しい増加したことが分かった。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
【表３】
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【００４７】
<２−２>大容量発酵
Ｏ−アセチルホモセリンを大量生産するために、Ｏ−アセチルホモセリン生産能力を示す幾つかの菌株を選択して５Ｌの発酵槽で培養した。それぞれの菌株を、抗生剤スペクチノマイシンの含有された平板ＬＢ培地に接種して３１℃で一晩培養した。その後、単一コロニーを、スペクチノマイシンを含有するＬＢ培地１０ｍＬに接種した後、３１℃で５時間培養した。培養液は、２００ｍＬのメチオニン前駆体シード培地を含有する１０００ｍＬの三角フラスコに１００倍希釈して３１℃、２００ｒｐｍで３〜１０時間培養した後、５Ｌの発酵槽に接種して流加式(Fed batch)培養発酵法で２０〜１００時間培養した。このように培養した発酵液でメチオニン前駆体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果は、表５のとおりであった。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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１．Ａｂｓｔｒａｃｔ
The present invention relates to a microorganism producing L-methionine precursor, O-acetylhomoserine, and a method of producing L-methionine precursor using   the microorganism.
２．Ｒｅｐｒｅｓｅｎａｔｉｖｅ  Ｄｒａｗｉｎｇ
Figure 1
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