(57)【要約】      （修正有）【課題】高い分解能を備えつつ、高速でデータ取得が可能な共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】集光レンズ１６が集光した蛍光のうち、集光点からの光束のみを透過するピンホール１８と、ピンホール１８を透過した蛍光の光強度を検出する光検出器１９と、光検出器１９により検出された光強度と２次元スキャナ１３によるレーザ光の照射位置の情報とを対応づけて、蛍光試料１５の観測画像を形成するとともに、前記観測画像と所定の点像分布関数とを用いて蛍光試料１５の実構造を推定するためのデコンボリューションを行うコンピュータ２０と、コンピュータ２０による演算結果を表示するモニタ２０とを備えた共焦点顕微鏡１において、レーザ光源１０は蛍光試料１５が吸収飽和するまでの光強度を有し、コンピュータ２０は光検出器１９により検出された線形成分および非線形成分の蛍光強度を用いて前記観測画像を形成する。【選択図】図１
2010039323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光束を射出する光源と、
前記照明光束を蛍光試料上で２次元走査する光走査手段と、
前記光走査手段を介した前記照明光束を前記蛍光試料上に集光する対物レンズと、
前記照明光束を受けて前記蛍光試料が発した蛍光光束を集光する集光レンズと、
前記蛍光試料上の集光点と共役関係となる位置に設けられ、前記集光レンズが集光した前記蛍光光束のうち、前記集光点からの光束のみを透過する光分離部材と、
前記光分離部材を透過した前記蛍光光束の光強度を検出する光検出手段と、
前記光検出手段により検出された光強度と、前記光走査手段による前記照明光束の照射位置の情報とを対応づけて、前記蛍光試料の観測画像を形成する画像形成手段と、
前記画像形成手段により形成された前記観測画像と所定の点像分布関数とを用いて、前記蛍光試料の構造を推定するためのデコンボリューションを行う演算手段と、
前記演算手段による演算結果を表示する表示手段とを備えた共焦点顕微鏡において、
前記光源は、前記蛍光試料が吸収飽和するまでの光強度を有し、
前記画像形成手段は、前記光検出手段により検出された線形成分および非線形成分の蛍光強度を用いて前記観測画像を形成することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記光源にパルスレーザを用いることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、微小な試料の形状を高精度で測定できる装置として、共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。共焦点顕微鏡は、対物レンズの後ろ側焦点位置にピンホールを置くことにより、焦点近傍以外から出る光を除去してコントラストの高い画像が得られるようにしたものであり、焦点を試料に対して水平方向に一定量ずつ相対移動させて試料の走査画像（断面画像データ）を取得すれば、焦点面と一致した部分だけが明るくなる画像が高さごとに得られ、さらに断面像を高さを変えながら得ることにより、精度の高い３次元画像が得られる。
【０００３】
ところで、上記のような共焦点顕微鏡において、空間分解能を向上させるために、蛍光の飽和を利用したものが提案されている（例えば、特許文献２を参照）。この顕微鏡では、レーザ光の強度が強い時に、吸収飽和が生じることによってレーザ光強度と試料から発せられた蛍光の強度との関係が非線形になるように、レーザ光の強度を変調させて試料に照射し、試料で発生した蛍光を検出し、検出された蛍光から、蛍光の飽和成分、より具体的にはレーザ光の変調周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行う。
【特許文献１】特開２００７−２７９０８５号公報
【特許文献２】国際公開番号ＷＯ２００６／０６１９４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の共焦点顕微鏡においては、試料上の１点ごとに、レーザ光の周波数に対する高調波成分をロックイン検出して取り出している。このため、２次元の観察領域全体をスキャンするためには検出時間が長くなり、リアルタイムでの観測が難しい。
【０００５】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、高い分解能を備えつつ、高速でデータ取得が可能な共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的を達成するため、本発明を例示する第一の態様に従えば、照明光束を射出する光源と、前記照明光束を蛍光試料上で２次元走査する光走査手段と、前記光走査手段を介した前記照明光束を前記蛍光試料上に集光する対物レンズと、前記照明光束を受けて前記蛍光試料が発した蛍光光束を集光する集光レンズと、前記蛍光試料上の集光点と共役関係となる位置に設けられ、前記集光レンズが集光した前記蛍光光束のうち、前記集光点からの光束のみを透過する光分離部材と、前記光分離部材を透過した前記蛍光光束の光強度を検出する光検出手段と、前記光検出手段により検出された光強度と、前記光走査手段による前記照明光束の照射位置の情報とを対応づけて、前記蛍光試料の観測画像を形成する画像形成手段と、前記画像形成手段により形成された前記観測画像と所定の点像分布関数とを用いて、前記蛍光試料の構造を推定するためのデコンボリューションを行う演算手段と、前記演算手段による演算結果を表示する表示手段とを備えた共焦点顕微鏡において、前記光源は、前記蛍光試料が吸収飽和するまでの光強度を有し、前記画像形成手段は、前記光検出手段により検出された線形成分および非線形成分の蛍光強度を用いて前記観測画像を形成することを特徴とする共焦点顕微鏡が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
以上説明したように、本発明によれば、高い分解能を備えつつ、高速でデータ取得が可能な共焦点顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態に係る共焦点顕微鏡１の概略構成図を示す。
【０００９】
図１において、レーザ光源１０から射出されたレーザ光（照明光束）は、照明用レンズ１１を通り、ダイクロイックミラー１２で対物レンズ１４の方向に反射され、試料１５上を２次元に走査する２次元スキャナ１３に入射する。なお、２次元スキャナ１３としては、照明光束であるレーザ光の光路に挿入したガルバノミラーを駆動させたり、ピエゾ素子を駆動機構として用いたステージを利用したりする等、様々な方法が利用可能である。２次元スキャナ１３で２次元走査されたレーザ光は対物レンズ１４に入射し、ステージ（ＸＹＺ方向に移動するステージ）１６に載置された試料１５に集光される。試料１５上で集光されたレーザ光は試料１５に予め含まれている蛍光色素を励起し、蛍光が試料１５から発せられる。なお、対物レンズ１４とステージ１６とは相対的に光軸方向に移動できれば、どちらが駆動されても良い。
【００１０】
試料１５で発せられた蛍光は、対物レンズ１４で集光され、２次元スキャナ１３でデスキャンされてダイクロイックミラー１２に入射する。ダイクロイックミラー１２に入射した蛍光は、該ミラー１２を透過し、集光レンズ１７を通り、試料１５と共役な位置に配設されたピンホール１８に入射する。ピンホール１８は対物レンズ１４の焦点位置と共役な位置に配設されているため、光軸上の位置として、集光されたレーザ光の焦点位置より手前あるいは奥の位置で励起された蛍光を通さず、焦点位置で励起された蛍光のみを通過させる。
【００１１】
ピンホール１８を通過した蛍光は、光検出器１９に入射する。光検出器１９は光電子倍増管などのポイントセンサであり、受光した光強度を電気信号に変換し、コンピュータ２０に送出する。コンピュータ２０は、受信した電気信号をＡ／Ｄ変換しデジタルデータにする。このデジタルデータを２次元スキャナ１３の走査に同期して２次元に配置することで、コンピュータ２０内に焦点位置のみの情報を持った２次元画像データを取得することができる。
【００１２】
コンピュータ２０は、上記のように２次元画像データを取得した後、ステージ１６に光軸方向に一定量移動する命令を伝達する。この命令を受けてステージ１６は、光軸方向に一定量移動する。そして、この移動が完了後、２次元画像データ取得を行うことで焦点位置の異なる２次元画像データを取得することができる。
【００１３】
このように「ステージ１６を光軸方向に一定量移動する」、「２次元画像データ取得を行う」という操作を繰り返すことで、焦点位置の異なる複数の２次元画像データを取得することができる。対物レンズ１４から射出したレーザ光の焦点位置は不変であり、ステージ１６の光軸位置が変化すると相対的に試料１５上での焦点位置が変化する。この結果、取得されたそれぞれの２次元画像データは、それぞれの試料１５の位置に対応した焦点位置の情報を持つ２次元画像データとなり、コンピュータ２０のメモリに記憶される。また、メモリに記憶された２次元画像データをコンピュータ２０で処理し、モニタ２０に２次元画像表示、あるいは３次元画像表示して蛍光像を観察することができる。
【００１４】
ところで、顕微鏡などの光学機器により試料を観察した場合、顕微鏡の観察画像は、元の物体に比べて光学機器のボケ分だけ劣化することが知られている。そこで、本実施形態では、コンピュータ２０において、劣化した画像を本来の画像に復元する処理、いわゆるデコンボリューション処理を行っている。
【００１５】
すなわち、光検出器１９により検出された光強度のデータは、コンピュータ２０に送出されて、各観察点の蛍光強度分布として逐次記録され、所定の観察領域の２次元マッピングに対応する観測画像データが形成される。そして、全ての観測点での蛍光強度分布データの取りこみが終了した時点でデコンボリューション処理を行い、該処理後の回復画像データを基に試料１５の全体の回復画像を再構成し、表示画像データを算出し、試料１５の２次元像を再生させている。
【００１６】
ここで、デコンボリューション処理の一例を示す。観測点の座標を（ｘ，ｙ）とすると、試料１５から得られる共焦点顕微鏡１の観測画像ｇ（ｘ，ｙ）は、回復画像（真の試料画像）ｆ（ｘ，ｙ）と本顕微鏡１の点像分布関数（ＰＳＦ）ｈの畳込み（convolution）にノイズｎ（ｘ，ｙ）が加わったものとして、次式（１）で表現することができる（以下、＊は畳み込み積分（コンボリューション）を表す）。但し、顕微鏡１の点像分布関数（ＰＳＦ）は、蛍光マイクロビーズなどを用いて、予め正確に調べられているものとする。
【００１７】
ｇ(x,y)＝∬ｈ(x−x’,y−y’)ｆ(x’,y’)dx’dy’＋ｎ(x,y)  …（１）
＝ｈ(x−x’,y−y’)＊ｆ(x’,y’)＋ｎ(x,y)
【００１８】
また、ｆ(x,y)、ｇ(x,y)、ｈ(x,y)、ｎ(x,y)のフーリエ変換をそれぞれＦ(u,v)、Ｇ(u,v)、Ｈ(u,v)、Ｎ(u,v)としたとき（但し、（u,v）を空間周波数）、これらは次式（２）の関係にある。
【００１９】
Ｇ(u,v)＝Ｈ(u,v)Ｆ(u,v)＋Ｎ(u,v)…（２）。
【００２０】
ここで、式（２）を変形すると、次式（３）が得られる。
【００２１】
Ｆ(u,v)＝Ｇ(u,v)／Ｈ(u,v)−Ｎ(u,v)／Ｈ(u,v)…（３）
【００２２】
このＦ(u,v)を逆フーリエ変換することにより、高解像度の回復画像を得ることが可能である。
【００２３】
さらに、本実施形態においては、レーザ光源１０が、試料１５が吸収飽和するまでの光強度を有する。一般に、励起光であるレーザ光の強度が大きくなると、吸収飽和が発生する。すると、レーザ光の強度と蛍光の強度との関係が非線形となる。このような飽和現象は、励起光の強度が大きいほど発生し易く、また飽和の度合いも大きくなる。従って、レーザ光の強度が最も強いスポット中心部ほど、蛍光の飽和が発生し易く、また飽和の度合いが大きくなる。吸収飽和が起こった場合、蛍光強度は、入射光強度の１乗に比例する部分（１次成分）と、１次成分より小さい寄与を持つ入射光強度の２乗に比例する部分（２次成分）と、２次成分より小さい寄与を持つ入射光強度の３乗に比例する部分（３次成分）と、…の和に展開できる。すなわち、図２に示すように、レーザ光のスポット中心部と対応する試料１５の部位から発生する蛍光に、線形である１次成分の他に、２次、３次、…と高次成分（非線形成分）が表れる。本実施形態では、これら高次成分が含まれた蛍光（１次成分と全ての高次成分とが足し合わされた光）を光検出器１９により検出することで、スポット中心部のみの情報を取り出すことが可能となる。また、ロックイン検出をすることなく、光検出器１９により検出された光（１次成分（線形成分）と高次成分（非線形成分）とが足し合わされた光）を画像形成にそのまま用いるため、より高速でのデータ処理が可能となる。
【００２４】
図３は、高次成分を検出した場合の空間分解能について、光学的伝達関数ＯＴＦの遮断周波数を用いて示したものであり、横軸はＺ方向の空間周波数、縦軸はｙ方向の空間周波数を示す（なお、ｘ方向は紙面垂直方向）。光学的伝達関数ＯＴＦとは、物体のフーリエ成分（グレーディング）の振幅と像のフーリエ成分（グレーディング）の振幅の比（コントラスト）を表すものであり、点像分布関数ｈ(x,y)のフーリエ変換を表すＨ(u,v)で与えられる。図３に示すように、より高次成分になるほど、遮断周波数が高くなり、これを得るための空間周波数が高くなることを意味し、ひいては実質的には空間分解能が高い観察が可能であることが分かる。
【００２５】
なお、取得可能な高次成分の最高次数は、励起光の強度と本顕微鏡装置のＳ／Ｎ比に応じて決定され、これに応じて光学的伝達関数ＯＴＦの遮断周波数が決まる。但し、実際は蛍光分子が褪色するため、励起光の強度には上限が存在し、従って取得できる高周波成分の次数にも上限がある。従来の１次の周波数成分を検出していた場合と比べ、２次の高調波成分を検出することにより１．５倍の遮断周波数を与えることができ、３次の高調波成分を検出することにより２倍の遮断周波数を与えることができる。このように、本実施形態においては、２次、３次…の高調波成分を検出することにより、回折限界を超え、従来の顕微鏡よりもより高分解能で検出することができる。
【００２６】
本実施形態では、蛍光の飽和の度合いが大きいほど、飽和を検出し易くなり、分解能を向上することができる。しかしながら、蛍光の飽和の度合いを大きくするために、レーザ光の強度を強くすると、試料の損傷や蛍光の褪色が発生するおそれがあるため、本実施形態においては、レーザ光源１０にパルスレーザ光源を用いることが好ましい。
【００２７】
以上のように、本実施形態の共焦点顕微鏡１においては、共焦点法により焦点面に入る余分な光を排除し、デコンボリューション処理により本顕微鏡装置に係るボケを除去し、蛍光の飽和を利用して空間分解能を上げることにより、より細かく、より早く、より明るい試料の画像を取得することができる。
【００２８】
以上、本発明を分かりやすくするために、実施形態の構成要件を付して説明したが、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の概略構成図を示す。
【図２】スポット中心部からの距離と、検出可能な周波数成分との関係図を示す。
【図３】高次の周波数成分を検出した場合の空間分解能について、光学的伝達関数の遮断周波数を用いて示した模式図を示す。
【符号の説明】
【００３０】
１  共焦点顕微鏡
１０  レーザ光源
１１  照明用レンズ
１２  ダイクロイックミラー
１３  ２次元スキャナ（光走査手段）
１４  対物レンズ
１５  試料（蛍光試料）
１６  ステージ
１７  集光レンズ
１８  ピンホール（光分離部材）
１９  光検出器
２０  コンピュータ（画像形成手段および演算手段）
２１  モニタ（表示手段）
【図１】
2010039323.tif 000003
【図２】
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【図３】
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