(57)【要約】      （修正有）【課題】従前の方法と比べて、迅速、簡便かつ高感度で、被験試料におけるＢ群連鎖球菌の存在の有無を確認することができる方法及び該方法を実施するための材料の提供。【解決手段】Ｂ群連鎖球菌に特有のＣＡＭＰファクター遺伝子の特定領域を増幅することができるＬＡＭＰ用プライマーのセットを作製することに成功。また、このプライマーセットを用いることによって、ＬＡＭＰ法により上記特定領域を高感度で特異的に増幅することができ、結果として従前の方法と比べて迅速、簡便かつ高感度でＢ群連鎖球菌を検出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域をＬＡＭＰ法により増幅し得る、Ｂ群連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）を検出するためのプライマーセット。
【請求項２】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域内の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３について、
Ｆ２ｃに対して相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同一の配列を含むインナープライマーフォワード（ＩＰＦ）、
Ｆ３ｃに対して相補的な配列Ｆ３を含むアウタープライマーフォワード（ＯＰＦ）、
Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側にＲ１に対して相補的な配列Ｒ１ｃを含むインナープライマーリバース（ＩＰＲ）、並びに
Ｒ３と同一の配列を含むアウタープライマーリバース（ＯＰＲ）
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
ＩＰＦ及びＩＰＲの少なくとも１種は、３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
ＯＰＦ及びＯＰＲの少なくとも１種は、Ｔｍ値が５９〜６１℃である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域におけるダンベル構造の一本鎖ループ部の配列及び／又は該一本鎖ループ部の配列に対して相補的な配列を含むループプライマーをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項６】
ループプライマーの少なくとも１種は、Ｔｍ値が６４〜６６℃である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の第１３０位〜第５４０位の間にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
ＩＰＦが以下の（ａ）又は（ａ’）の配列を含み；ＯＰＦが以下の（ｂ）又は（ｂ’）の配列を含み；ＩＰＲが以下の（ｃ）又は（ｃ’）の配列を含み；及び、ＯＰＲが以下の（ｄ）又は（ｄ’）の配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセット。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の配列
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の配列
（ｃ）配列表の配列番号４に記載の配列
（ｄ）配列表の配列番号５に記載の配列
（ａ’）配列表の配列番号２に記載の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である配列
（ｂ’）配列表の配列番号３に記載の配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が５９〜６１℃である配列
（ｃ’）配列表の配列番号４に記載の配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である配列
（ｄ’）配列表の配列番号５に記載の配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が５９〜６１℃である配列
【請求項９】
ループプライマーがフォワードとリバースからなり、ループプライマーのフォワードが以下の（ｅ）又は（ｅ’）の配列を含み、及びループプライマーのリバースが以下の（ｆ）又は（ｆ’）の配列を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載のプライマーセット。
（ｅ）配列表の配列番号６に記載の配列
（ｅ’）配列表の配列番号６に記載の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が６４〜６６℃である配列
（ｆ）配列表の配列番号７に記載の配列
（ｆ’）配列表の配列番号７に記載の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が６４〜６６℃である配列
【請求項１０】
ＩＰＦ、ＯＰＦ、ＩＰＲ、ＯＰＲ及びループプライマーの少なくとも１種は、ＧＣ含量が４０〜６５％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより被験試料中のＣＡＭＰファクター遺伝子の有無を検出することを含む、Ｂ群連鎖球菌の検出方法。
【請求項１２】
増幅操作後の溶液の濁度により増幅されたＤＮＡの存在を確認する、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
被験試料が、ヒト由来の試料である、請求項１１又は１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
ヒト由来の試料が、膣スワブ、喀痰、膿又は滲出液である、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載に検出方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ群連鎖球菌を検出するためのプライマーセットに関する。さらに本発明は、該プライマーセットを用いたＢ群連鎖球菌の検出方法及び該検出方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ群連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）は、新生児の敗血症や髄膜炎の筆頭起因菌種である。出産時の母子間の垂直感染を防止するために、Ｂ群連鎖球菌を保菌する妊婦に対して分娩時にペニシリンを予防的に投与することが、米国ＣＤＣや欧州で推奨されている。日本でも、最近、このような予防投薬処置が広く行なわれはじめた。Ｂ群連鎖球菌は、新生児の敗血症や髄膜炎の起因菌としてのみならず、成人においても肺炎などの起因菌として問題となることも知られている。
【０００３】
Ｂ群連鎖球菌には、これまでペニシリン等のβ−ラクタム薬が奏効し、第一選択薬はペニシリン系やセファロスポリン系の抗菌薬であった。しかし、近年、Ｂ群連鎖球菌の中には、ペニシリン結合蛋白に変異を獲得し、β−ラクタム薬に抵抗性を示す株が散見されている。例えば、本発明者らは、ペニシリンの抵抗性を獲得したＢ群連鎖球菌について報告している（非特許文献１）。
【０００４】
そこで、新生児や成人における上記疾患の治療に際しては、臨床検体中でのＢ群連鎖球菌の存在の有無を確認した上で、該Ｂ群連鎖球菌がβ−ラクタム薬に対して耐性があるか否かを検査することが求められている。これまでのＢ群連鎖球菌の存在の確認は、膣スワブなどの生体由来の被験試料からＢ群連鎖球菌の同定キット（例えば、三菱化学メディエンス、Streptococcus agalactiae用同定キット「ストレプテクス」）を用いるなどによって実施されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】木村幸司ら、Antimocrobial Agents and Chemothery、(2008), 第52号(8), pp.2890-2897．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記したＢ群連鎖球菌の同定キットを用いたＢ群連鎖球菌の検出方法は、培養と同定という二段階の操作が必要であることから、少なくとも２日の期間を要し、さらに培養及び同定について異なる２種の手技を要する。さらに上記方法は、一定数の増殖活性のあるＢ群連鎖球菌を必要とする方法である。このような方法は緊急分娩時の検査などに対応することが困難であることから、臨床的な応用性を考えれば、迅速、簡便かつ高感度のＢ群連鎖球菌の検出方法の開発が望まれる。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、従前の方法と比べて、迅速、簡便かつ高感度で、被験試料におけるＢ群連鎖球菌の存在の有無を確認することができる方法及び該方法を実施するための材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｂ群連鎖球菌に特有のＣＡＭＰファクター遺伝子の特定領域を増幅することができるＬＡＭＰ用プライマーのセットを作製することに成功した。また、このプライマーセットを用いることによって、ＬＡＭＰ法により上記特定領域を高感度で特異的に増幅することができ、結果として従前の方法と比べて迅速、簡便かつ高感度でＢ群連鎖球菌を検出できた。本発明は、これらの知見に基づいて完成された発明である。
【０００９】
したがって、本発明は以下の構成からなる。
［１]
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域をＬＡＭＰ法により増幅し得る、Ｂ群連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）を検出するためのプライマーセット。
［２］
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域内の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３について、
Ｆ２ｃに対して相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同一の配列を含むインナープライマーフォワード（ＩＰＦ）、
Ｆ３ｃに対して相補的な配列Ｆ３を含むアウタープライマーフォワード（ＯＰＦ）、
Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側にＲ１に対して相補的な配列Ｒ１ｃを含むインナープライマーリバース（ＩＰＲ）、並びに
Ｒ３と同一の配列を含むアウタープライマーリバース（ＯＰＲ）
を含む、［１］に記載のプライマーセット。
［３］
ＩＰＦ及びＩＰＲの少なくとも１種は、３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［４］
ＯＰＦ及びＯＰＲの少なくとも１種は、Ｔｍ値が５９〜６１℃である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［５］
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域におけるダンベル構造の一本鎖ループ部の配列及び／又は該一本鎖ループ部の配列に対して相補的な配列を含むループプライマーをさらに含む、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［６］
ループプライマーの少なくとも１種は、Ｔｍ値が６４〜６６℃である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［７］
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の第１３０位〜第５４０位の間にある、［１］〜［６］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［８］
ＩＰＦが以下の（ａ）又は（ａ’）の配列を含み；ＯＰＦが以下の（ｂ）又は（ｂ’）の配列を含み；ＩＰＲが以下の（ｃ）又は（ｃ’）の配列を含み；及び、ＯＰＲが以下の（ｄ）又は（ｄ’）の配列を含む、［１］〜［７］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の配列
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の配列
（ｃ）配列表の配列番号４に記載の配列
（ｄ）配列表の配列番号５に記載の配列
（ａ’）配列表の配列番号２に記載の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である配列
（ｂ’）配列表の配列番号３に記載の配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が５９〜６１℃である配列
（ｃ’）配列表の配列番号４に記載の配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である配列
（ｄ’）配列表の配列番号５に記載の配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が５９〜６１℃である配列
［９］
ループプライマーがフォワードとリバースからなり、ループプライマーのフォワードが以下の（ｅ）又は（ｅ’）の配列を含み、及びループプライマーのリバースが以下の（ｆ）又は（ｆ’）の配列を含む、［５］〜［８］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
（ｅ）配列表の配列番号６に記載の配列
（ｅ’）配列表の配列番号６に記載の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が６４〜６６℃である配列
（ｆ）配列表の配列番号７に記載の配列
（ｆ’）配列表の配列番号７に記載の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ
Ｔｍ値が６４〜６６℃である配列
［１０］
ＩＰＦ、ＯＰＦ、ＩＰＲ、ＯＰＲ及びループプライマーの少なくとも１種は、ＧＣ含量が４０〜６５％である、［１］〜［９］のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［１１］
［１］〜［１０］のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより被験試料中のＣＡＭＰファクター遺伝子の有無を検出することを含む、Ｂ群連鎖球菌の検出方法。
［１２］
増幅操作後の溶液の濁度により増幅されたＤＮＡの存在を確認する、［１１］に記載の検出方法。
［１３］
被験試料が、ヒト由来の試料である、［１１］又は［１２］に記載の検出方法。
［１４］
ヒト由来の試料が、膣スワブ、喀痰、膿又は滲出液である、［１３］に記載の検出方法。
［１５］
［１］〜［１０］のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、［１１］〜［１４］のいずれか１項に記載に検出方法を実施するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプライマーセットを用いたＢ群連鎖球菌の検出方法によれば、従前の同定キットを用いたＢ群連鎖球菌の検出方法と比べて迅速、簡便かつ高感度でＢ群連鎖球菌を検出することができる。本発明のプライマーセットはＬＡＭＰ法に用いられるものである。ＬＡＭＰ法はＰＣＲで必要とされるような特殊な装置を要しないことから、本発明のプライマーセットは、通常の施設、例えば、病院などの臨床施設において汎用的にＢ群連鎖球菌を検出するために使用することができる。
【００１１】
本発明のプライマーセットは、Ｂ群連鎖球菌のみを検出し、同じグラム陽性球菌属であるＡ群連鎖球菌、肺炎球菌、腸球菌などを検出せず、Ｂ群連鎖球菌に対して高い特異性を示す。さらに、本発明のプライマーセットを用いた検出方法は、理論上は１μlあたり4個程度のＢ群連鎖球菌を検出することができることから、高感度の検査として期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のプライマーセットの一態様を用いたＬＡＭＰ法の検出感度を調べた結果をグラフ化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について詳細に説明する。
［プライマーセット］
本発明のプライマーセットは、ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域をＬＡＭＰ法により増幅し得る、Ｂ群連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）を検出するために用いられる。本発明のプライマーセットは、例えば、ＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフト（PrimerExplorer Ver.4、栄研化学）を使用して設計し、設計されたプライマーセットの中から候補となり得るプライマーセットを合成して、各プライマーセットについて、Ｂ群連鎖球菌から精製したＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ法を試行することにより、検出感度と特異性を基準として、本発明のプライマーセットを用意することができる。
【００１４】
ＣＡＭＰファクター遺伝子（Christie-Atkins-Munch-Peterson factor gene）は、ほとんどのＢ群連鎖球菌が保有し、かつＢ群連鎖球菌に特異的である。これは、メナードらの文献（Ke D, Menard C, Picard FJ, Boissinot M, Ouellette M, Roy PH, Bergeron MG., Clin Chem. 2000 Mar;46(3):324-31）によって報告されている。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、このＣＡＭＰファクター遺伝子を検出対象遺伝子とし、さらにＬＡＭＰ法を利用することにより、ＰＣＲ装置などの特殊な装置を用いることなしに、例えば、病院の細菌検査室等でＢ群連鎖球菌を簡便かつ迅速に検出することに成功した。ＣＡＭＰファクター遺伝子の具体例は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列である。ＣＡＭＰファクター遺伝子としては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基の欠失、置換、付加及び／又は挿入を有する塩基配列からなり、配列番号１に記載の塩基配列からなるＣＡＭＰファクターと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
【００１５】
ＬＡＭＰとは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略であり、環状型等温増幅反応又はループ媒介等温増幅法ともいい、詳細は国際公開第００／２８０８２号公報を参照することができる。
【００１６】
ＬＡＭＰ法は、鋳型となるヌクレオチド（例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域）に自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。
【００１７】
ＬＡＭＰ法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能にしている。
【００１８】
本発明のプライマーセットの具体的態様の一つは、ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域内の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３について、
Ｆ２ｃに対して相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同一の配列を含むインナープライマーフォワード（ＩＰＦ）、
Ｆ３ｃに対して相補的な配列Ｆ３を含むアウタープライマーフォワード（ＯＰＦ）、
Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側にＲ１に対して相補的な配列Ｒ１ｃを含むインナープライマーリバース（ＩＰＲ）、並びに
Ｒ３と同一の配列を含むアウタープライマーリバース（ＯＰＲ）
を含む。
【００１９】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域に含まれる任意の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーフォワード（ＩＰＦ）及びインナープライマーリバース（ＩＰＲ）、並びにアウタープライマーフォワード（ＯＰＦ）及びアウタープライマーリバース（ＯＰＲ）と呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補的な塩基配列をＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補的な塩基配列をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃとそれぞれ呼ぶ。
【００２０】
インナープライマーとは、標的領域上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーフォワード（以下ＩＰＦ）、そして「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーリバース（以下ＩＰＲ）と呼ぶ。インナープライマーは、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」と「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」の間、あるいは「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」の間に、塩基数０〜５０の任意の塩基配列を持っても良い。
【００２１】
アウタープライマーとは、標的領域上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーフォワード（以下ＯＰＦ）、「Ｒ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーリバース（以下ＯＰＲ）と呼ぶ。
【００２２】
ここで、各プライマーにおけるフォワードとは、標的領域のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方リバースとは、標的領域のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２３】
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって、ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域及び該標的領域と相補的な領域を増幅することができる。
【００２４】
本発明のプライマーセットにおいて、ＩＰＦ、ＯＰＦ、ＩＰＲ及びＯＰＲは、上記配列を含むプライマーであれば特に制限されない。これらのうちＩＰＦ及びＩＰＲの好ましい具体例は、３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である。
【００２５】
各プライマーの３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの計算は、Nearest-Neigbor法を用いて計算することができる。例えば、ＩＰＦ及びＩＰＲの３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーは、栄研化学ＨＰ（ＵＲＬ：
https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html）を参照し、上記ＨＰ上で提供されているPrimerExplorer、具体的にはPrimerExplorer V4を利用することにより、Ｆ１ｃ及びＲ１ｃの５’末端とＦ２及びＲ２の３’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーとして計算することができる。また、PrimerExplorer V4を利用すれば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列等の情報を記入し操作することにより、３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である一連のプライマーを得ることができる。この中から好ましいＩＰＦ及びＩＰＲを選ぶことができる。
【００２６】
ＯＰＦ及びＯＰＲの好ましい具体例は、融解温度の値、すなわちＴｍ値が５９〜６１℃である。Ｔｍ値は、例えば、Nearest-Neigbor法を用い、オリゴ濃度0.1μM、ナトリウムイオン濃度50mM、マグネシウムイオン濃度4mMで算出することができ、上記のPrimerExplorer V4を利用することもできる。Ｔｍ値は、Ｆ１ｃ及びＲ１ｃでは６４〜６６℃、Ｆ２、Ｒ２、Ｆ３及びＲ３では５９〜６１℃であることが好ましい。さらに、ＩＰＦ、ＯＰＦ、ＩＰＲ及びＯＰＲの各プライマーのＧＣ含量は、４０〜６５％程度であることがより好ましい。
【００２７】
ＬＡＭＰの核酸増幅においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いることができる。ループプライマー（Ｌｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒ）は、ダンベル構造のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（詳しくは、国際公開第０２／２４９０２号公報を参照）。
【００２８】
ループプライマーの塩基配列は、上記のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば特に制限はなく、標的領域の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれることが好ましいが、ループ構造はダンベル構造の５’末端側にあることがより好ましい。また、ループプライマーは上記のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な配列を有するフォワードと、上記のループ構造の一本鎖部分の塩基配列を有するリバースとからなることがさらに好ましい。
【００２９】
ループプライマーは、Ｔｍが６４〜６６℃であることが好ましい。ループプライマーの３’末端の６塩基の自由エネルギーの合計は−4 kcal/mol以下であることがより好ましいが、必ずしもこの条件を満たさなくともよい。ループプライマーのＧＣ含量は、４０〜６５％程度であることがさらに好ましい。
【００３０】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域は、上記のＩＰＦ、ＩＰＲ、ＯＰＦ及びＯＰＲ、並びにループプライマーを設計できる領域であれば特に制限されないが、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の第１３０位〜第５４０位が好ましく、２００位〜５４０位がより好ましく、２５０位〜５４０位がさらに好ましく、３００位〜５４０位がなおさらに好ましく、３２０位〜５３０位が特に好ましい。
【００３１】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の３２０位〜５３０位である場合のＩＰＦ、ＩＰＲ、ＯＰＦ及びＯＰＲの具体例は、それぞれ配列表の配列番号２、３、４及び５に記載の配列を挙げることができるが、本発明のプライマーセットに含まれるＩＰＦ、ＩＰＲ、ＯＰＦ及びＯＰＲはこれらに限定されるものではない。また、ＩＰＦ及びＩＰＲの具体例として、配列表の配列番号２及び４の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下である配列を挙げることができる。さらに、ＯＰＦ及びＯＰＲの具体例として、配列表の配列番号３及び５の配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつＴｍ値が５９〜６１℃である配列を挙げることができる。
【００３２】
ＣＡＭＰファクター遺伝子における標的領域が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の３２０位〜５３０位である場合のループプライマーの具体例は、配列表の配列番号６及び７に記載の配列、並びにこれらの配列において１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつＴｍ値が６４〜６６℃である配列を挙げることができるが、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーセットはこれらに限定されるものではない。
【００３３】
本明細書において、「１から複数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異」における「１から複数個」の範囲は、プライマーの種類に応じて、３’末端及び５’末端のそれぞれの６塩基の自由エネルギーの合計が−4 kcal/mol以下になる配列やＴｍ値が５９〜６１℃又は６４〜６６℃になる配列である限りにおいて限定されるものではなく、例えば、１から１０個、好ましくは１から８個、より好ましくは１から６個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から４個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、「塩基の欠失」とは配列中の塩基の欠落もしくは消失を意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていること、「塩基の逆位」とは隣り合う２以上の塩基の位置が逆になっていること、「塩基の付加」とは塩基が付け加えられていること、「塩基の挿入」とは配列中の塩基の間に別の塩基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００３４】
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、上記した配列を含めば、ＣＡＭＰファクター遺伝子、特に配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＣＡＭＰファクター遺伝子の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に通常知られる任意の方法で作製することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって合成することができる。
【００３５】
［検出方法］
本発明の別の側面によれば、本発明のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより被験試料中のＣＡＭＰファクター遺伝子の有無を検出することを含む、Ｂ群連鎖球菌の検出方法が提供される。本発明の検出方法の一態様は、例えば、本発明のプライマーセット及び被験試料又は被験試料から得たＤＮＡを含む溶液をＬＡＭＰ法による核酸増幅操作に供すること、及び核酸増幅操作後の溶液において増幅されたＤＮＡの存在を確認することを含む。さらに、本発明の検出方法の別の一態様は、例えば、本発明のプライマーセットを用意すること、前記プライマーセット及び被験試料又は被験試料から得たＤＮＡを含む溶液をＬＡＭＰ法による核酸増幅操作に供すること、及び核酸増幅操作後の溶液において増幅されたＤＮＡの存在を確認することを含む。
【００３６】
本発明のプライマーセットについては、上記［プライマーセット］の記載を参照できる。
【００３７】
本発明の方法では、本発明のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより被験試料中のＣＡＭＰファクター遺伝子の有無を検出する。具体的には、まず、本発明のプライマーセット及び被験試料又は被験試料から得たＤＮＡを含む溶液をＬＡＭＰ法による核酸増幅操作に供する。
【００３８】
被験試料は、例えば、分離培養した発育コロニー、培養液あるいは患者カテーテル拭き取り検体、膣スワブ、喀痰、膿汁、滲出液などが挙げられるが、これらはヒト由来であることが好ましく、ヒト由来の膣スワブ、喀痰、膿又は滲出液がより好ましい。被験試料は、例えば、被験試料そのものでもよく、被験試料を適当な緩衝液、生理食塩水、水などで希釈したものであってもよい。
【００３９】
被験試料からＤＮＡを得る方法としては、被験試料を分離培養した発育コロニー、培養液あるいは患者カテーテル拭き取り検体、膣スワブ、喀痰、膿汁、滲出液などとする場合には、タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後、フェノール及びクロロホルムを用いた方法などの公知のＤＮＡ抽出・精製法の他、市販抽出キットを用いる方法などを利用することができる。また、迅速な検出のため、未精製の状態のままの試料処理液も利用できる。
【００４０】
具体的には、分離培養した発育コロニーからＤＮＡを得る方法としては、発育コロニーをGeneReleaser（フナコシ）などのＤＮＡ抽出試薬を用いて説明書に従って処理する方法を挙げることができる。発育コロニーを接種して培養した液体培地からＤＮＡを得る方法としては、例えば、後述する実施例に示す方法を用いることができる。
【００４１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰｓ、プライマーセット、蒸留水）を混合し、反応チューブに分注した後に被験試料、被験試料から得たＤＮＡ又は被験試料から得たＤＮＡを含む溶液を加える。上記試薬としては、例えば、栄研化学のloopamp DNA増幅試薬キットを利用することが好ましい。次いで、酵素活性に適した温度、例えば、６０〜７０℃、好ましくは６５℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅が完了するのに十分な時間、例えば、３０分〜１２０分、好ましくは６０〜９０分の範囲に設定できる。
【００４２】
核酸増幅操作後の溶液において増幅されたＤＮＡの存在を確認する。被験試料中にＢ群連鎖球菌が含まれている場合、核酸増幅操作によりＣＡＭＰファクター遺伝子に相当するＤＮＡが増幅される。逆に、被験試料中にＢ群連鎖球菌が含まれていなければ、核酸増幅操作によっても増幅されるＤＮＡはない。
【００４３】
核酸増幅操作後の溶液において増幅されたＤＮＡ、すなわちＣＡＭＰファクター遺伝子の有無は、これまでに知られている技術によって制限なく確認することができ、例えば、該溶液の濁度を測定することや蛍光目視検出などで確認することの他に、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター（特許文献特開２００１−２４２１６９号公報）を用いる方法、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかける方法などによって確認することができる。アガロースゲル電気泳動では、増幅されたＤＮＡは、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
【００４４】
ＬＡＭＰ法ではＤＮＡの合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼で確認できる程度に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば６５０ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することも可能である（特許文献国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、ＵＶランプを当てることにより目視で反応液の蛍光発色を観察することで行うことができる。
【００４５】
簡便性及び汎用性の観点から、核酸増幅操作後の溶液において増幅されたＤＮＡの存在は、濁度測定により確認することが好ましい。増幅ＤＮＡの濁度の測定は、例えば、以下のように行うことができる。リアルタイム濁度測定装置により経時的に、あるいは濁度測定装置により最終増幅産物の濁度を測定する。濁度を検出する際の波長は、６５０ｎｍであることが好ましい。
【００４６】
具体的には、栄研化学のリアルタイム濁度測定装置LA-320Cを用いて、濁度が０．１以上になったものを増幅されたＤＮＡが存在する、と判定することができる。
【００４７】
本発明の別の側面によれば、本発明のプライマーセットを含む、本発明の検出方法を実施するためのキットも包含する。本発明のキットは、本発明のプライマーセットを含めば特に制限されないが、例えば、以下の物を含めることができる。
1. 鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素
2.反応バッファー
3.dNTPs
4.プライマーセット(本発明のプライマー)
5.コントロールDNA（陽性コントロール）
6.反応チューブ
7.説明書
【００４８】
前述のように、本発明の方法では、ＤＮＡの増副産物の有無を濁度測定又は蛍光目視検出により行うことができる。蛍光目視で検出する場合は、上記キットに蛍光目視試薬を含めることができる。濁度測定装置を使用する場合には、キットには蛍光目視検出試薬は含めない。
【００４９】
本発明のキットに含める酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００５０】
反応バッファーとしては、ＬＡＭＰ法の反応に適した試薬を混合したものであれば特に制限されないが、例えば、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤を混合したものを利用できる。本発明のキットは、必要に応じて増幅ＤＮＡの確認に必要な試薬類を含めることができる。
【００５１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
１  Ｂ群連鎖球菌を検出するための、ＬＡＭＰ用プライマーセットの設計
Ｂ群連鎖球菌ATCC12403(NEM316)株のCAMP factor gene (cfb)の全長配列（配列表の配列番号１）をもとに、Primer Explorer V4を用いて表１の通りに設計した。表１に記載のプライマーは、シグマアルドリッチジャパン社に合成及び精製を委託した。
【表１】
2010284090.tif 000002
【００５３】
２  LAMP法の感度
B群連鎖球菌ATCC BAA-611(2603V/R)から精製したchromosomal DNA(Promega Wizard genomic DNA purification kitで精製、加熱処理なし)を鋳型とし、栄研化学のloopamp DNA増幅試薬キットを用いて、テンプレートの量を表２に示す通りに変えて、表３の反応ミックスにより、65 ℃、 90分間のLAMP法を実施した。増幅は、濁度を測定して確認した。結果を図１に示す。図１が示す通り、10fgまで濁度の上昇が認められ、検出が可能であった。
【表２】
2010284090.tif 000003
【表３】
2010284090.tif 000004
【００５４】
３  LAMP法の特異度
以下の種々の細菌からchromosomal DNAを精製（Promega Wizard genomic DNA purification kitで精製、加熱処理なし）し、1ngを鋳型として、上記２と同じ条件でLAMP法を行い、増幅の有無を濁度測定で判定した。結果を、表４にて、「＋」を増幅ありとし、「-」を増幅なしとして示した。表４に示す通り、Streptococcus agalactiae においてのみ増幅を認め、他菌種では増幅を認めなかった。
【表４】
2010284090.tif 000005
【００５５】
配列表は以下の記載に基づく。
配列番号１  CAMP factor gene：
atgaacgttaaacatatgatgtatctatctggaactctagtggctggtgcattgttattttcaccagctgtattagaagtacatgctgatcaagtgacaactccacaagtggtaaatcatgtaaacagtaataatcaagcccagcaaatggctcaaaagcttgatcaagatagcattcagttgagaaatatcaaagataatgttcagggaacagattatgaaaaaacggttaatgaggctattactagtgttgaaaaattaaagacttcattgcgtgccaaccctgagacagtttatgatttgaattctattggtagtcgtgtagaagccttaacagatgtgattgaagcaatcactttttcaactcaacatttagcaaataaggttagtcaagcaaatattgatatgggatttgggataactaagctggttattcgcattttagatccatttgcttcagttgattcaattaaagctcaagttaacgatgtaaaggcattagaacaaaaggttttaacttatcctgatttaaaaccaactgatagagctaccatctatacaaaatcaaaacttgataaggaaatctggaatacacgctttactagagataaaaaagtacttaacgtcaaagaatttaaagtttacaatactttaaataaagcaatcacacatgctgttggagttcagttgaatccaaatgttacggtacaacaagttgatcaagagattgtaacattacaagcagcacttcaaacagcattaaaataa
配列番号２  ＩＰＦ(NEM316FIP)： CAG CTT AGT TAT CCC AAA TCC CAT A GAA GCA ATC ACT TTT TCA ACT CA
配列番号３  ＯＰＦ(NEM316F3)：AGA AGC CTT AAC AGA TGT GA
配列番号４  ＩＰＲ(NEM316BIP)： ATT CGC ATT TTA GAT CCA TTT GCT T GCC TTT ACA TCG TTA ACT TGA G
配列番号５  ＯＰＲ(NEM316B3)： CAG GAT AAG TTA AAA CCT TTT GTT C
配列番号６  ＬＰＦ(LF2)： TGC TTG ACT AAC CTT ATT TGC
配列番号７  ＬＰＲ(LB)： CAG TTG ATT CAA TTA AAG
【図１】
2010284090.tif 000006
【配列表】
2010284090000001.app