(57)【要約】【課題】  マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体に対する特異性や捕捉性の高いマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチド、およびこれを用いた、マウス肝炎ウイルス感染を高感度で検出することができるマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法を提供する。【解決手段】  マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列および／またはこれにおいて１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合するポリペプチド。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなり、かつマウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合するポリペプチド：
（ａ）マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が配列番号３〜１１に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のいずれかのポリペプチドを含む、マウス肝炎ウイルス感染検査キット。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のいずれかのポリペプチドとマウスから採取した被検体とを接触させて抗原抗体反応の有無を判定する、マウス肝炎ウイルス感染の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列および／またはこれらアミノ酸配列との同一性が高いアミノ酸配列からなる、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合するマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチド、およびこれを用いたマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス肝炎ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＭＨＶ）とは、コロナウイルス科コロナウイルス属に属するＲＮＡウイルスであり、自然宿主はマウスである。不顕性感染である場合がほとんどであり、肝臓や腸管で増殖する。免疫抑制状態や若齢によっては肝壊死斑が肝臓全体に広がり、急性死亡する場合がある。また、マウス肝炎ウイルスのいくつかの株が、多発性硬化症のモデルマウスに対して進行性脱髄性脳炎を引き起こすことが知られている。そのため、繁殖を一時中断することにより繁殖コロニーからマウス肝炎ウイルスを排除する試みがなされている（非特許文献１）。
【０００３】
マウス肝炎ウイルスはマウスにおいて感受性が高く、また、実験動物の感染症は実験データの再現性を損ねることから、実験動物マウスに対するマウス肝炎ウイルス感染症の定期的な検査が不可欠であり、検査のための抗体検出の方法や装置、キットなどが開発されている。
【０００４】
例えば、Ｔ．Ｓ．Ｇｏｌｄｉｎｇらにより、ＲＴ−ＰＣＲを利用してマウス排泄物からマウス肝炎ウイルスを検出する方法が提案されている（非特許文献２）。また、特開２０００−１３１３１９号公報には、被検抗体を捕捉できる物質（病原微生物抗原）を支持体に固定したイムノクロマトグラフィ法に、病原微生物抗原に特異的な鶏卵卵黄抗体の着色粒子標識物を組み合わせて用いた抗体検査方法および検査用キット（商品名：モニライザ（Ｒ））が開示されており（特許文献１）、特表２００７−５３２９０５号公報には、複数のウイルス抗原あるいは抗ウイルス抗体を捕捉することができる複数のサブアレイを含むマイクロアレイシステムに生物学的サンプルを接触させて複合体を形成させ、これにタンパク質マイクロアレイシステムを接触させることにより、捕捉されたウイルス抗原あるいは抗ウイルス抗体を検出する方法、マイクロアレイシステムおよびキットが開示されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１３１３１９号公報
【特許文献２】特表２００７−５３２９０５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗ．Ｅ．Ｇｉｄｄｅｎｓら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３７（４）巻、第４４２〜４４８頁、１９８７年
【非特許文献２】第４５回アメリカ実験動物学会総会公演要旨集（１９９４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献２において提案されているＲＴ−ＰＣＲを用いた方法では、マウス肝炎ウイルス遺伝子の抽出作業や標的遺伝子の増幅作業などの手間が掛かってしまい、マウス肝炎ウイルス感染を短時間で検出することが困難である。また、特許文献１および特許文献２において開示されている検出方法やキットなどにおいては、マウス肝炎ウイルスそのものが抗原として用いられていることから、製品ごとに精度が異なること、製造コストがかかること、擬陽性が多いことなどの問題がある。
【０００８】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体に対する特異性や捕捉性の高いマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチド、およびこれを用いた、マウス肝炎ウイルス感染を高感度で検出することができるマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープとイムノアッセイ法とを用いることにより、従来のマウス肝炎ウイルス感染検査キットと比較してマウス肝炎ウイルス感染を高感度で検出することができることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなり、かつマウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合するポリペプチド：
（ａ）マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【００１１】
（２）マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が配列番号３〜１１に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列である、（１）に記載のポリペプチド。
【００１２】
（３）（１）または（２）に記載のいずれかのポリペプチドを含む、マウス肝炎ウイルス感染検査キット。
【００１３】
（４）（１）または（２）に記載のいずれかのポリペプチドとマウスから採取した被検体とを接触させて抗原抗体反応の有無を判定することにより行う、マウス肝炎ウイルス感染の検出方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチドおよびこれを用いたマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法によれば、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体に対する特異性や捕捉性を高めることができ、従来のマウス肝炎ウイルス感染検査キットと比較してマウス肝炎ウイルス感染を高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】４５５アミノ酸からなるマウス肝炎ウイルス核タンパク質のアミノ酸配列から選択した計４４６種類のポリペプチドをＳＰＯＴ合成法に従って作製し、これらを用いて作製したペプチドアレイを示す模式図である。
【図２】実施例（１）で作製したマウス肝炎ウイルスペプチドアレイを用いて、マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの血清をイムノクロマトグラフィにより化学発光させ、各スポットの発光強度とバックグラウンドとの比の平均値をプロットしたグラフである。縦軸は発光強度の比の平均値を示し、横軸はマウス肝炎ウイルス核タンパク質アミノ酸配列のＮ末端からの順番を示す。
【図３】血清の濃度を変化させた血清（正常マウス血清および感染マウス血清）についての抗体の検出を、配列番号４および配列番号１１のペプチドを用いてＥＬＩＳＡ法により行い、その結果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍ吸光度（ＯＤ４５０）の値を示し、横軸は検体である血清の希釈倍率を示す。
【図４】マウス肝炎ウイルス核タンパク質のアミノ酸配列と、ラット唾液腺涙腺炎ウイルス核タンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係るマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチドおよびこれを用いたマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法について詳細に説明する。本発明に係るポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなり、かつマウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合する：
（ａ）マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【００１７】
本発明におけるマウス肝炎ウイルス核タンパク質から選択されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープは、マウス肝炎ウイルス核タンパク質のアミノ酸配列により提示される、直鎖のアミノ酸で構成されるものと、一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造を組むことによって生じるものとがある。
【００１８】
ここで、本発明における「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原上の部位の通常の意味を有し、「抗原決定基」と交換可能に用いることができる。本発明におけるエピトープは、典型的には、全タンパク質の小さな部分であるアミノ酸のセグメントであり、一次的すなわち連続的である場合のみならず、立体配座的すなわち不連続的である場合がある。すなわち、タンパク質のフォールディングによって並べられた一次配列の隣接部分または非隣接部分によってコードされるアミノ酸から形成されるものである。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、少なくとも１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸の長さの配列が必要である。
【００１９】
また、エピトープは、これに結合する抗体の結合部位すなわちパラトープと水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合により非共有的に結合する。この結合が成立するためには、エピトープ上の当該作用する部位とパラトープ上の当該作用する部位とが一定の空間配置を取る必要があるが、本発明におけるエピトープの鎖長を伸長させることにより、あるいはアミノ酸を付加させることにより、パラトープに結合可能な立体構造（高次構造）を取ることができ、エピトープとして機能する場合がある。
【００２０】
本発明において、エピトープの同定は特に限定されず、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定することができる。例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ法（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，第１０２巻、第２５９〜２７４頁、１９８７年）やＳＰＯＴ合成法（Ｒ．Ｆｒａｎｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２年、第４８巻、第９２１７頁，Ｗ．Ｒ．Ｇ．Ｄｏｓｔｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、１４７７２頁）に従い、ペプチドを化学合成あるいは遺伝子工学的に合成してペプチドアレイを作製し、イムノアッセイにより同定することができる。
【００２１】
本発明において用いることができるイムノアッセイは、当業者によって適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降測定法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどを挙げることができる。
【００２２】
また、これらイムノアッセイに用いられる二次抗体についても、当業者によって適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントなどを挙げることができる。また、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントには、マウス肝炎ウイルス抗原に対する結合活性が保持されている完全な抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント）、抗体の抗原結合部位を含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および他の合成タンパク質が含まれる（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、第４２３〜４２６頁、１９８８）。
【００２３】
なお、本発明に係るエピトープをコードするポリヌクレオチドを選択し、あるいは、Ｓｔｕｍｐｐ Ｍ．Ｔ．らの方法（Ｓｔｕｍｐｐ Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３３２（２）巻、第４７１〜４８７頁、２００３）に従って得られた完全長ｃＤＮＡからポリヌクレオチドを合成して、ファージディスプレイ法、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法等を用いて同定することもできる。
【００２４】
マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列のうち、ＳＰＯＴ合成法に従い、ペプチドを化学合成してペプチドアレイを作製し、イムノクロマトグラフィにより同定することのできるアミノ酸配列としては、配列番号３〜１１に示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２５】
本発明において「抗原」とは、脊椎動物にこれを投与することにより免疫応答を導き出すことができ、それによってこれと特異的に結合する抗体の産生、放出を促進させるものをいい、１または２以上のエピトープを有している。本発明における抗原は、「免疫原」と交換可能に用いることができ、サブユニット抗原や、抗体と結合した状態の複合体も本発明における抗原に含まれる。また、抗原としては、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、核酸、多糖類、リポ多糖類、脂質などを挙げることができるが、本発明においては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質であることが好ましく、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質であることがより好ましい。
【００２６】
本発明において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」という場合の、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列を有するポリペプチドが、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合する限り特に限定されないが、例えば１〜１９個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列をコードするのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００２７】
すなわち、本発明においては、マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎ウイルス抗原エピトープを構成するアミノ酸配列の全部または少なくともシグナル配列を除いた部分を含む一部と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつマウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合するペプチドが含まれる。ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２８】
本発明におけるマウスもまた、特に限定されないが、例えば、Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、ＢＤＦ１、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、ＩＣＲなどの、一般に動物実験に使用される各種系統のマウスを挙げることができる。
【００２９】
なお、コロナウイルス科コロナウイルス属に属するＲＮＡウイルスであって、マウス肝炎ウイルスの近縁であるものとしてラット唾液腺涙腺炎ウイルス（Ｒａｔ ｓｉａｌｏｄａｃｒｙｏａｄｅｎｉｔｉｓ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ；ＳＤＡＶ）を挙げることができる。ラット唾液腺涙腺炎ウイルスはマウス肝炎ウイルスと形態のみならず抗原性が類似しているため、マウス肝炎ウイルス核タンパク質により提示されるマウス肝炎抗原エピトープは、抗マウス肝炎ウイルス抗体のみならず、抗ラット唾液腺涙腺炎ウイルス抗体も認識する。すなわち、本発明に係るマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチドは、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体と特異的に結合する他、ラット唾液腺涙腺炎ウイルスに感染したラットが産生する抗ラット唾液腺涙腺炎ウイルス抗体と特異的に結合することから、ラット唾液腺涙腺炎ウイルス感染の検出にも有効である。
【００３０】
次に、本発明は、本発明に係るポリペプチドを含むキットを提供する。本発明に係るキットは、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質または緩衝液など、マウス肝炎ウイルス感染の検出手段の実施に有用な物質などをキットの構成物として含んでいてもよい。
【００３１】
さらに本発明は、本発明に係るポリペプチドとマウスから採取した被検体とを接触させて抗原抗体反応の有無を判定することにより行う、マウス肝炎ウイルス感染の検出方法を提供する。本発明に係るマウス肝炎ウイルス感染の検出方法には、本発明に係るマウス肝炎ウイルス感染の検出方法を損なわない限り、インキュベート工程や洗浄工程などを含んでいてもよい。
【００３２】
本発明に係るポリペプチドを含むキットおよびマウス肝炎ウイルス感染の検出方法は、実験動物マウスに対するマウス肝炎ウイルス感染症の定期的な検査に用いることができる他、例えば、従来のマウス肝炎ウイルス感染検査キットやマウス肝炎ウイルス感染検査方法によって擬陽性とされたマウスに対する検査に用いることなどが可能である。
【００３３】
以下、本発明に係るマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチドおよびこれを用いたマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３４】
＜実施例１＞マウス肝炎ウイルスペプチドアレイを用いたマウス肝炎ウイルスエピトープの同定
（１）マウス肝炎ウイルスペプチドアレイの作製
４５５アミノ酸からなるマウス肝炎ウイルス核タンパク質（マウス肝炎ウイルスＮＰ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ００９９０；配列番号１および配列番号２）のアミノ酸配列から、１０残基ポリペプチドを１残基ずつシフトさせることによって選択した計４４６種類のポリペプチドを、ＳＰＯＴ合成法（Ｒ．Ｆｒａｎｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２年、第４８巻、第９２１７頁，Ｗ．Ｒ．Ｇ．Ｄｏｓｔｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、１４７７２頁）に従い、Ａｕｔｏ Ｓｐｏｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ＡＳＰ−２２２（Ｉｎｔａｖｉｓ社）を用いてセルロース膜上に合成することにより、マウス肝炎ウイルスＮＰアミノ酸配列のＮ末端から１〜１０番目（スポットＮｏ．１）、２〜１１番目（スポットＮｏ．２）、３〜１２番目（スポットＮｏ．３）と続いて４４６〜４５５番目（スポットＮｏ．４４６）までの、計４４６種類の１０残基ポリペプチド鎖がセルロース膜上に順番に並んだマウス肝炎ウイルスペプチドアレイを作製した。これを図１に示す。
【００３５】
（２）各種マウスにおけるマウス肝炎ウイルスエピトープの同定
本実施例（１）で作製したマウス肝炎ウイルスペプチドアレイ、各種マウスの血清およびｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を用い、マウス肝炎ウイルスペプチドアレイに特異的に結合するＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧをＥＬＩＳＡ法で検出することにより、エピトープを同定した。
【００３６】
［２−１］１％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳ溶液および１％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳスキムミルク溶液の調製
それぞれの最終濃度が、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＫＣｌ、８１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４となるように調製したＨｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）溶液１Ｌにつき、１０ｍＬの割合でＴｗｅｅｎ−２０を加えることにより、１％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳ溶液（１％ＰＢＳＴ）を調製した。さらに、この１％ＰＢＳＴに重量比５％となるようスキムミルクを加えて溶解することにより、１％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳスキムミルク溶液（１％ＰＢＳＴ−ＳＭ）を調製した。
【００３７】
［２−２］感染マウスの血清の調製
マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの集団から、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キット（モニライザＭＨＶ；わかもと製薬社）にて陽性を示した７個体を得、それらの血清を採取した。それぞれ採取した血清を、１％ＰＢＳＴ−ＳＭにて１０００倍に希釈することにより、１％ＰＢＳＴ−ＳＭ希釈血清を調製した。
【００３８】
［２−３］マウス肝炎ウイルスペプチドアレイによるエピトープの探索
本実施例（１）で作製したマウス肝炎ウイルスペプチドアレイを、本実施例（２）［２−１］で調製した１％ＰＢＳＴ−ＳＭ５０ｍＬに浸漬させ、４℃下で一晩インキュベートした後、さらに本実施例（２）［２−１］で調製した１％ＰＢＳＴ２０ｍＬに浸漬させて、室温下で１分間振盪することにより洗浄した。この洗浄したマウス肝炎ウイルスペプチドアレイをプラスチックフィルム上に置き、１％ＰＢＳＴ−ＳＭ希釈血清をそれぞれ５ｍＬずつ乗せ、これをプラスチックフィルムで覆い、室温下で２時間インキュベートした。
【００３９】
インキュベート後にプラスチックフィルムを取り除いたマウス肝炎ウイルスペプチドアレイを本実施例（２）［２−１］で調製した１％ＰＢＳＴ２０ｍＬに浸漬させ、室温下で１５分×３回振盪することにより洗浄し、再度プラスチックフィルム上に置いた後、本実施例（２）［２−１］で調製した１％ＰＢＳＴ−ＳＭで１００００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をそれぞれ５ｍＬずつ乗せ、再度プラスチックフィルムで覆い、さらに室温下で２時間インキュベートした。その後、プラスチックフィルムを取り除き、本実施例（２）［２−１］で調製した１％ＰＢＳＴ２０ｍＬに浸漬させ、１５分×３回振盪することにより洗浄した。
【００４０】
ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを反応させたマウス肝炎ウイルスペプチドアレイを、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて化学発光させた後、さらにＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ社）を用いて、化学発光が確認された各スポット（各ポリペプチド）の検出、画像化および発光強度の数値化を行うことにより、マウス肝炎ウイルスペプチドアレイに特異的に結合したＩｇＧ抗体を検出して定量化した。
【００４１】
マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの血清の、各スポットの発光強度とバックグラウンドとの比の平均値をプロットしたものを図２に示し、マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの血清のうち、発光が確認されたスポットを抽出して得られたアミノ酸配列と、それらの配列番号とを表１に示す。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
図１および表１に示すように、マウス肝炎ウイルスＮＰアミノ酸配列のＮ末端から１〜１４番目（配列番号３）、同２４〜３９番目（配列番号４）、同４９〜６４番目（配列番号５）、同６９〜８２番目（配列番号６）、同２４０〜２５３番目（配列番号７）、同３０７〜３２５番目（配列番号８）、同３５４〜３７３番目（配列番号９）および同３８１〜３９３番目（配列番号１０）に相当する各スポットの発光強度が、これらのバックグラウンドの発光強度との比で大きいことが確認された。また、このうち、マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウス７個体すべてにおいて、バックグラウンドの発光強度との比が２以上であるスポットのアミノ酸配列は、Ｎ末端から２４〜３９番目（配列番号４）、３０７〜３２５番目（配列番号８）および３５４〜３７３番目（配列番号９）であることが確認された。
【００４４】
＜実施例２＞マウス肝炎ウイルスＮＰエピトープペプチドの感染マウス特異性の確認
実施例１（２）［２−３］で同定したマウス肝炎ウイルスＮＰエピトープの感染マウス特異性を確認するため、マウス肝炎ウイルスＮＰアミノ酸配列のＮ末端から２４〜３９番目（配列番号４）およびＮ末端から３５７〜３７２番目（ＲＦＤＳＴＬＰＧＦＥＴＩＭＫＶＬ（Ｒはアルギニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｇはグリシン、Ｅはグルタミン酸、Ｉはイソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｋはリシン、Ｖはバリンを示す）：配列番号１１）のペプチドを化学合成し、ＥＬＩＳＡ法により、これらに結合する抗体の検出を行った。
【００４５】
（１）０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳ溶液およびブロッキング溶液の調製
それぞれの最終濃度が、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＫＣｌ、８１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４となるように調製したＰＢＳ溶液１Ｌにつき、５ｍＬの割合でＴｗｅｅｎ−２０を加えることにより、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳ溶液（０．５％ＰＢＳＴ）を調製した。さらに、この０．５％ＰＢＳＴに重量比０．５％となるようウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて溶解することにより、ブロッキング液を調製した。
【００４６】
（２）感染マウスの血清の調製
マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの集団から、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キット（モニライザＭＨＶ；わかもと製薬社）にて陽性を示した１４個体を得、それらの血清（感染マウス血清）と、マウス肝炎ウイルスに感染していない８個体の血清（正常マウス血清）とを採取した。それぞれ採取した血清を本実施例（１）で調製したブロッキング液にて、それぞれ５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１６００倍、３２００倍および６４００倍に希釈することにより、各濃度のブロッキング液希釈血清を調製した。
【００４７】
（３）ＥＬＩＳＡ法による抗体の検出
配列番号４および配列番号１１のペプチドを０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に溶解し、０．５μＭに調製した。これを９６ウェル平底プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に２００μＬずつ加え、４℃下で一晩インキュベートした後、本実施例（１）で調製した０．５％ＰＢＳＴ ２００μＬで各ウェルを３回洗浄し、本実施例（１）で調製したブロッキング液２００μＬを各ウェルに加え、さらに３７℃下で１時間インキュベートした。次いで、各ウェルを本実施例（１）で調製した０．５％ＰＢＳＴ ２００μＬで３回洗浄し、本実施例２（２）で調製した血清を２００μＬずつ加え、３７℃下で１時間インキュベートした後、再び各ウェルを本実施例２（１）で調製した０．５％ＰＢＳＴ ２００μＬで３回洗浄した。本実施例２（１）で調製したブロッキング液を用いて１００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を各ウェルに２００μＬずつ加え、３７℃下で１時間インキュベートした後、各ウェルを本実施例２（１）で調製した０．５％ＰＢＳＴ ２００μＬで３回洗浄し、１．５ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミン・２塩酸（ＯＰＤ）溶液を２００μＬずつ加え、３７℃下で１０分間インキュベートした。各ウェルに３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ加えて発色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（モデル６８０マイクロプレートリーダー；バイオ・ラッド  ラボラトリーズ社）で４５０ｎｍ吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。その結果を図３に示す。
【００４８】
図３に示すように、配列番号４および配列番号１１のいずれのペプチドを抗原として用いた場合でも、正常マウス血清のＯＤ値は濃度にかかわらずほぼ一定の値であるのに対し、感染マウス血清のＯＤ値は濃度の低下に伴い低下することが確認された。以上の結果より、配列番号４および配列番号１１のペプチドは、マウス肝炎ウイルス感染マウスの血清に含まれる抗体に特異的に結合することが示された。
【００４９】
＜実施例３＞マウス肝炎ウイルスＮＰエピトープペプチドによるウイルス感染の検出
実施例１（２）［２−３］で同定し、実施例２（３）で確認されたマウス肝炎ウイルスＮＰエピトープを用いて、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キットで感染陽性と判定された実験感染マウスについて、マウス肝炎ウイルス感染の検出が可能かどうかを検討した。また、マウス肝炎ウイルス感染の判定の感度について、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キット（モニライザＭＨＶ；わかもと製薬社）との比較を行った。
【００５０】
（１）マウスの血清の調製
マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの集団から得られた１４個体の血清と、マウス肝炎ウイルスに感染していない８個体の血清を採取した。それぞれ採取した血清を実施例２（１）で調製したブロッキング液を用いて、それぞれ５０倍に希釈することによりブロッキング液希釈血清を調製した。
【００５１】
（２）ＥＬＩＳＡ法による検出
実施例２（３）で用いた配列番号４および配列番号１１のペプチドと、本実施例（１）で調製したブロッキング液希釈血清とを用いて、実施例２（３）と同様の手法で４５０ｎｍ吸光度（ＯＤ４５０）を測定することにより抗体を検出した。その結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
表２に示すように、正常マウス８個体については、配列番号４および配列番号１１のいずれのペプチドを用いた場合でも、８個体すべてにおいて陰性と判定された。また、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キット（モニライザＭＨＶ；わかもと製薬社）を用いた場合でも、正常マウス８個体すべてにおいて陰性と判定された。一方、マウス肝炎ウイルスに自然感染したマウスの集団から得られた１４個体については、いずれのペプチドを用いた場合でも、１０個体が陽性と判定され、残り４個体が陰性と判定されたが、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キット（モニライザＭＨＶ；わかもと製薬社）を用いた場合では、８個体が陽性と判定され、残り６個体が陰性と判定された。配列番号４および配列番号１１のいずれのペプチドを用いた場合に陽性と判定された１０個体のうちの８個体は、市販のマウス肝炎ウイルス感染判定キット（モニライザＭＨＶ；わかもと製薬社）で陽性と判定された８個体と一致した。以上の結果より、配列番号４および配列番号１１のペプチドは従来のマウス肝炎ウイルス感染判定キットよりも高感度にマウス肝炎ウイルス感染の判定を行うことができることが示された。
【００５４】
＜比較例＞マウス肝炎ウイルス核タンパク質アミノ酸配列とラット唾液腺涙腺炎ウイルス核タンパク質アミノ酸配列との比較
ラット唾液腺涙腺炎ウイルス核タンパク質（ラット唾液腺涙腺炎ウイルスＮＰ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ１０７６０；配列番号１２および１３）は４５４アミノ酸からなる。ここで、マウス肝炎ウイルスＮＰのアミノ酸配列（４５５アミノ酸、配列番号２）と、このラット唾液腺涙腺炎ウイルスＮＰのアミノ酸配列（配列番号１３）とのアラインメントを図４に示す。
【００５５】
図４に示すように、マウス肝炎ウイルスＮＰとラット唾液腺涙腺炎ウイルスＮＰとのアミノ酸配列の相同性は９３．４％であることが分かる。特に、ラット唾液腺涙腺炎ウイルスＮＰのアミノ酸配列と配列番号３〜１１に示されるアミノ酸配列とを比較すると、ラット唾液腺涙腺炎ウイルスＮＰのＮ末端から３８番目のグルタミンが配列番号４においてはロイシンであること、同５９番目のトレオニンが配列番号５においてはセリンであること、同３２１番目のプロリンが配列番号８においてはアラニンであること、同３８３番目のアラニンが配列番号１０においてはアスパラギン酸あることのみ相違していることが分かる。このことから、配列番号３〜１１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウス肝炎ウイルス抗体）のみならず、抗ラット唾液腺涙腺炎ウイルス抗体を認識することが示された。
【００５６】
以上のような本実施例によれば、マウス肝炎ウイルスに感染したマウスが産生する抗マウス肝炎ウイルス抗体に対する特異性や捕捉性の高いペプチドを作製することができ、かつ、マウス肝炎ウイルス感染を簡便かつ高感度で検出することができる。
【００５７】
なお、本発明に係るマウス肝炎ウイルス由来ポリペプチドおよびこれを用いたマウス肝炎ウイルス感染検査キットならびにマウス肝炎ウイルス感染の検出方法は、前述した実施形態に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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