(57)【要約】      （修正有）【課題】イミダゾリノンなどの除草剤に対する耐性または抵抗性レベルの上昇したトランスジェニック植物を提供する。【解決手段】真核生物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードする、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列並びに植物発現ベクターを使用して、植物を形質転換する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物アセトヒドロキシ酸シンテターゼ、すなわちＡＨＡＳの小サブユニットタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示される請求項１のＤＮＡ配列。
【請求項３】
配列表の配列番号３に示される請求項１のＤＮＡ配列。
【請求項４】
植物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードする請求項１のＤＮＡ配列。
【請求項５】
双子葉植物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードする請求項４のＤＮＡ配列。
【請求項６】
アラビドプシス由来のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードする請求項５のＤＮＡ配列。
【請求項７】
単子葉植物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードする請求項４のＤＮＡ配列。
【請求項８】
コメまたはメイズ由来のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードする請求項７のＤＮＡ配列。
【請求項９】
植物細胞で発現可能なプロモーターと、真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含む植物発現ベクター。
【請求項１０】
プロモーターは、高い発現レベルの植物プロモーターである請求項９の発現ベクター。
【請求項１１】
プロモーターは、アラビドプシスのＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターである請求項９の植物発現ベクター。
【請求項１２】
ＤＮＡ配列は、アラビドプシスの小サブユニットタンパク質をコードする請求項１１の植物発現ベクター。
【請求項１３】
植物細胞で発現可能な第二のプロモーターと、真核生物ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とをさらに含む請求項９の植物発現ベクター。
【請求項１４】
大サブユニットプロモーターと、真核生物ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とが、双子葉植物に由来する請求項１３の植物発現ベクター。
【請求項１５】
双子葉植物は、アラビドプシスである請求項１４の植物発現ベクター。
【請求項１６】
ＤＮＡ配列は、除草剤に抵抗性である変異体ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードする請求項１３の植物発現ベクター。
【請求項１７】
アラビドプシスＤＮＡ配列は、イミダゾリノン除草剤に抵抗性である変異体アラビドプシスのＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードする請求項１６の植物発現ベクター。
【請求項１８】
プロモーターおよびＤＮＡ配列は、双子葉植物に由来する請求項１３の植物発現ベクター。
【請求項１９】
プロモーターおよびＤＮＡ配列は、単子葉植物に由来する請求項１３の植物発現ベクター。
【請求項２０】
ＤＮＡ配列は、コメまたはメイズに由来する請求項１９の植物発現ベクター。
【請求項２１】
プロモーターと、ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含んでなる、植物においてＡＨＡＳ遺伝子を発現させるための植物発現ベクター。
【請求項２２】
ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列は、真核生物に由来する請求項２１の植物発現ベクター。
【請求項２３】
プロモーターおよびＤＮＡ配列は、アラビドプシスに由来する請求項２２の植物発現ベクター。
【請求項２４】
植物細胞で発現可能なプロモーターと、移行ＡＨＡＳ大サブユニットポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、リンカーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、真核生物ＡＨＡＳ小サブニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、植物ターミネーター配列とを連続して含む植物発現ベクター。
【請求項２５】
植物細胞で発現可能なプロモーターと、移行ＡＨＡＳ小サブユニットポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、リンカーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＡＨＡＳ大サブユニットポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、植物ターミネーターとを連続して含む植物発現ベクター。
【請求項２６】
プロモーターと、移行ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とが、双子葉植物に由来する請求項２４または２５の植物発現ベクター。
【請求項２７】
プロモーターと、移行ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とが、アラビドプシスに由来する請求項２４または２５の植物発現ベクター。
【請求項２８】
プロモーターと、移行ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とが、単子葉植物に由来する請求項２４または２５の植物発現ベクター。
【請求項２９】
プロモーターと、移行ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とが、コメまたはメイズに由来する請求項２４または２５の植物発現ベクター。
【請求項３０】
単離された真核生物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質。
【請求項３１】
配列表の配列番号２に対応するアミノ酸配列を有する請求項３０のタンパク質。
【請求項３２】
精製された真核生物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質を含む組成物。
【請求項３３】
ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質は、アラビドプシスのＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質である請求項３２の組成物。
【請求項３４】
除草剤に抵抗性であるトランスジェニック植物を作成する方法であって、真核生物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む植物発現ベクターにより、植物を形質転換することを含む方法。
【請求項３５】
発現ベクターは、高い発現レベルの植物プロモーターと、真核生物のＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とをさらに含む請求項３４の方法。
【請求項３６】
プロモーターは、真核生物のＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターであり、大サブユニットＤＮＡ配列は、真核生物のＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質の除草剤抵抗性変異体をコードする請求項３５の方法。
【請求項３７】
プロモーターと、ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列とが、アラビドプシスに由来する請求項３６の方法。
【請求項３８】
植物細胞に除草剤抵抗性を付与する方法であって、第一の植物発現プロモーター、およびＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む第一の植物発現ベクターと、第二の植物発現プロモーター、および真核生物ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む第二の植物発現ベクターとにより、植物細胞を同時形質転換することを含む方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法により産生された植物細胞。
【請求項４０】
ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニック植物の除草剤抵抗性を増強する方法であって、真核生物の小サブユニットＡＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列によりトランスジェニック植物を形質転換することを含む方法。
【請求項４１】
請求項４０の方法により産生されたトランスジェニック植物。
【請求項４２】
請求項４０の方法により産生されたトランスジェニック植物であって、前記植物は、他のＡＨＡＳ阻害除草剤と比較してイミダゾリノン除草剤に高い抵抗性を示すトランスジェニック植物。
【請求項４３】
他のＡＨＡＳ阻害除草剤は、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、ピリミジル−オキシ−安息香酸、スルファモイル尿素およびスルホニルカルボキシアミドからなる群から選択される請求項４２のトランスジェニック植物。
【請求項４４】
植物の子孫植物における除草剤抵抗性を増強する方法であって、遺伝的相補体が真核生物のＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットの除草剤抵抗性変異体をコードする配列、および真核生物ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物と、植物とを交雑させるステップと、除草剤抵抗性を示す子孫植物を選択するステップとを含む方法。
【請求項４５】
植物とトランスジェニック植物との交雑は、有性生殖により達成される請求項４４の方法。
【請求項４６】
請求項４４の方法により産生された子孫植物。
【請求項４７】
遺伝的相補体は、真核生物小サブユニットＡＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む請求項４４の子孫植物。
【請求項４８】
遺伝的相補体が、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットの除草剤抵抗性変異体をコードするＤＮＡ配列と、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列とを含む請求項４４の植物の除草剤抵抗性派生的植物。
【請求項４９】
請求項４８の植物の派生物であり、イミダゾリノン除草剤に耐性を示す植物。
【請求項５０】
遺伝的相補体は、植物において発現するためのプロモーターと、真核生物のＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、植物細胞で機能するターミネーター配列とを含む、植物において発現可能な遺伝子を含むトランスジェニック植物。
【請求項５１】
遺伝的相補体は、真核生物の小サブユニットＡＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む請求項４９の植物の植物派生物。
【請求項５２】
双子葉植物である請求項４６または４７のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
単子葉植物である請求項４６または４７のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
除草剤に抵抗性を付与する植物ＡＨＡＳ遺伝子の変異を同定する方法であって、ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質遺伝子を含む異種ベクターを有する生物を、除草化合物に曝露することを含む方法。
【請求項５５】
ベクターは、ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質遺伝子をさらに含む請求項５４の方法。
【請求項５６】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子は、アラビドプシスに由来するＤＮＡ配列を有する請求項５４の方法。
【請求項５７】
ＡＨＡＳ酵素活性に影響を及ぼす除草剤を同定するためのスクリーニング法であって、ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質遺伝子を含む異種発現ベクターを有する生物を、化合物に曝露するステップと、除草剤の効果を決定するステップとを含む方法。
【請求項５８】
ＡＨＡＳ酵素のアロステリックフィードバック阻害を変化させる変異を同定するためのスクリーニング法であって、
ＡＨＡＳ酵素活性の欠損した微生物株を、変異植物ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むプラスミド発現ベクターにより形質転換するステップと、
１または２つの分枝鎖アミノ酸の存在下で、最小培地中で微生物株をスクリーニングするステップと、
前記培地中で増殖する微生物株を同定するステップとを含む方法。
【請求項５９】
配列番号３のヌクレオチド配列１〜７５７番目を含む単離されたＤＮＡ配列。
【請求項６０】
請求項５９の単離されたＤＮＡ配列を含む異種植物発現ベクター。
【請求項６１】
異種ＤＮＡ配列を含む請求項６０に記載の植物発現ベクター。
【請求項６２】
請求項６１の発現ベクターにより植物細胞を形質転換することを含む植物細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現させる方法。
【請求項６３】
請求項５９のＤＮＡ配列を含む組換え植物細胞。
【請求項６４】
請求項６２の組換え植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項下で、１９９８年１０月２９日に提出された、米国仮特許出願番号第６０／１０６，２３９号の特典を請求する。
【０００２】
発明の背景
除草剤は、雑草および他の望ましくない植物の制御に、農学上汎用されている。その植物毒性から、除草剤は、望ましい植物の成長および収量をも死滅またはかなり阻害する。
【０００３】
いくつかの植物は、例えばアラビドプシス（シロイヌナズナ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、特定の除草剤に対する抵抗性を本来有するか、または、同じ作用機序をもつ除草剤に繰返し曝露されると、抵抗性を発達させる。除草剤に抵抗性を付与する植物遺伝子を同定、単離およびクローニングし、これらの遺伝子を使用して、穀物などの望ましい植物を形質転換して、それらを除草剤抵抗性とすることが、植物生物工学研究者の目標である。
【０００４】
植物の除草剤抵抗性を作成または同定する数個の方法が知られている。例えば、米国特許第５，７１９，０４６号、第５，６３３，４４４号および第５，５９７，７１７号は、植物スルホンアミド抵抗性遺伝子、並びに、増殖がスルホンアミドにより阻害される植物細胞を、この遺伝子を含むベクターで形質転換する方法を開示する。
【０００５】
米国特許第５，４０５，７６５号は、トランスジェニック小麦植物の産生法を開示する。この方法は、異種ＤＮＡを、懸濁培養液中のＣ型胚小麦カルスに、パーティクル銃法により送達することを含む。
【０００６】
米国特許第５，５３９，０９２号は、ラン藻および植物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを開示する。この特許は、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化触媒能を有する、除草剤抵抗性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子で、植物を形質転換することを含む、単子葉植物の除草剤抵抗性を増加させるプロセスを開示する。この特許は、産生されたトランスジェニック植物が、アリールフェノキシプロピオネートおよびシクロヘキサンジオンなどの除草剤に抵抗性であることをさらに開示する。
【０００７】
米国特許第５，３０４，７３２号は、除草剤抵抗性植物の単離法を開示する。この特許は、イミダゾリノンおよびスルホンアミドなどの除草剤に抵抗性である植物細胞系を単離するための、in vitroでの細胞培養法の使用を記載する。
【０００８】
特異的除草剤抵抗性の形質は、特定の酵素に関連することが最も多い。植物への除草剤抵抗性の付与に関連して関心を集めている１つのかかる酵素は、アセトヒドロキシ−酸シンターゼ（「ＡＨＡＳ(acetohydroxy-acid synthase)」）であり、これはアセトラクテートシンターゼ（「ＡＬＳ(acetolactate synthase)」、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）としても知られる。それは植物および多くの微生物に必須の酵素であり、大半の植物においてこの酵素は除草剤に感受性である。ＡＨＡＳ酵素は、分枝鎖アミノ酸、イソロイシン、ロイシン、およびバリンの生合成の第一段階を触媒し、その活性は、これらのアミノ酸によりアロステリックに阻害される。ＡＨＡＳ活性はまた、イミダゾリノン化合物、例えば、ｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒ（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）、アメリカン・シアナミッド、Ｐ
ａｒｓｉｐａｎｎｙ、ＮＪ）；スルホニル尿素をベースとした化合物、例えば、スルホメツロンメチル（ＯＵＳＴ（登録商標）、Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ウィルミントン、ＤＥ）；トリアゾロピリミジンスルホンアミド（Ｂｒｏａｄｓｔｒｉｋｅ（登録商標）Ｄｏｗ  Ｅｌａｎｃｏ；Ｇｅｒｗｉｃｋら、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２９：３５７〜３６４、１９９０参照）；スルファモイル尿素（Ｒｏｄａｗａｙら、水稲、小麦および大麦における、Ａｃ３２２，１４０の選択的機序、Ｐｒｏｃ．Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃ．Ｃｏｎｆ．、Ｗｅｅｄｓ、１９９３）；ピリミジル−オキシ−安息香酸（ＳＴＡＢＬＥ（登録商標）、Ｋｕｍｉａｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．、Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、およびスルホニルカルボキシアミド（Ａｌｖａｒａｄｏら、米国特許第４，８８３，９１４号）を含む、数種類の除草剤により阻害される。ＡＨＡＳ活性の阻害により、植物は分枝アミノ酸を作成できなくなったり、または毒性代謝物が蓄積し、それ故植物が死滅することがある。
【０００９】
ＡＨＡＳ酵素をコードする遺伝子は、大腸菌を含む腸内細菌、およびネズミチフス菌から単離されている。米国特許第５，６４３，７７９号は、ラクトコッカス属に由来するα−ＡＨＡＳ酵素をコードする核酸配列、および、微生物を形質転換するためのそれを含むベクターを開示する。トランスジェニック微生物は、増大量のＡＨＡＳ酵素を産生する。
【００１０】
特開平８−２１４８８２号公報は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のＡＨＡＳの大および小サブユニットの核酸配列を開示する。遺伝子配列を使用して、光合成微生物を形質転換し、アミノ酸の合成のためにＡＨＡＳ酵素の産生を向上させる。
【００１１】
真核生物では、細菌ＡＨＡＳ酵素の大サブユニットに相同なポリペプチドをコードする遺伝子が、酵母サッカロミセス・セルビシエで同定されている。様々な植物に由来するＡＨＡＳの変異大サブユニットをコードする遺伝子も単離され、クローニングされ、除草剤に抵抗性のトランスジェニック植物を作成するのに使用されている。
【００１２】
米国特許第５，６０５，０１１号、第５，０１３，６５９号、第５，１４１，８７０号および第５，３７８，８２４号は、除草剤抵抗性に関連した、変異植物ＡＬＳタンパク質をコードする核酸断片を開示する。変異ＡＬＳ大サブユニットタンパク質は、植物に、スルホニル尿素化合物に対する除草剤抵抗性を付与する。この変異大サブユニットタンパク質をコードする核酸断片は、通常スルホニル尿素除草剤に感受性である植物を形質転換するために、ベクター中に使用される。かかる形質転換から生じるトランスジェニック植物は、スルホニル尿素除草剤に抵抗する。
【００１３】
米国特許第５，６３３，４３７号は、オナモミのＸａｎｔｈｉｕｍ属から単離された大サブユニット遺伝子および酵素を開示し、これは、植物、植物組織および種子に、数個の構造的に関連していない種類の除草剤に抵抗性を付与する。この特許は、ＡＨＡＳ活性を普通に阻害する除草剤を開示する。
【００１４】
除草剤抵抗性ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子もまた、合理的に設計されている。ＷＯ第９６／３３２７０号、米国特許第５，８５３，９７３号および第５，９２８，９３７号は、イミダゾリンなどの除草剤およびＡＨＡＳ阻害除草剤に対して、選択的に増加した抵抗性を示すものを含む、ＡＨＡＳ変異体の調製のための、構造をベースとしたモデリング法を開示する。この文書は、かかる変異体をコードする単離ＤＮＡ、これらのＤＮＡを含むベクター、変異体ポリペプチドの産生法、および特異的ＡＨＡＳ遺伝子変異を含む除草剤抵抗性植物を開示する。
【００１５】
原核生物ＡＨＡＳ酵素は、２つの別個であるが、物理的に会合したタンパク質サブユニットとして存在する。原核生物では、２つのポリペプチドである「大サブユニット」および「小サブユニット」は、別々の遺伝子から発現される。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩと称される、全て大および小サブユニットをもつ、３つの主要なＡＨＡＳ酵素が、腸内細菌において同定されている。原核生物では、ＡＨＡＳ酵素は、分枝アミノ酸生合成経路の調節酵素であることが示されており（Ｍｉｆｌｉｎ，Ｂ．Ｊ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４６：５４２〜５５０、１９７１）、大サブユニットのみが、触媒活性を有することが観察されている。微生物系に由来するＡＨＡＳ酵素の研究から、２つの役割が小サブユニットについて記載されている。１）小サブユニットは、イソロイシン、ロイシンまたはバリンまたはその組合せの存在下にある場合に、触媒大サブユニットのアロステリックフィードバック阻害に関与する。２）小サブユニットは、イソロイシン、ロイシンまたはバリンの非存在下で、大サブユニットの活性を増強する。小サブユニットはまた、大サブユニットの活性コンフォメーションの安定性を増加させることが示されている（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５５６０〜５５６６、１９９２）。小サブユニットの発現はまた、大腸菌に由来するＡＨＡＳＩに見られるように、大サブユニットの発現も増加できる（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５５６０〜５５６６、１９９２）。
【００１６】
これらの微生物系では、大サブユニットのみが、in vitroで、アミノ酸イソロイシン、ロイシンまたはバリンによりフィードバック阻害できない、基底活性レベルを示す。小サブユニットが、大サブユニットを含む同反応混合物に添加されると、大サブユニットの比活性は増加する。
【００１７】
大ＡＨＡＳサブユニットタンパク質は、植物において同定され、単離され、植物の形質転換に使用されている。５５７位のトリプトファンがロイシンで置換された、ＡＨＡＳ３大サブユニットタンパク質のＡＨＡＳ変異対立遺伝子イソタイプは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ細胞系に見出されている（Ｈａｔｔｏｒｉら、Ｍｏｌ．＆Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９〜４２５、１９９５）。この遺伝子の変異タンパク質産物は、スルホニル尿素、イミダゾリノン、およびトリアゾロピリジン抵抗性を細胞系に付与する。この変異対立遺伝子はまた、トランスジェニック植物に発現されると、これらの除草剤に対する抵抗性を付与する。
【００１８】
シロイナズナの大サブユニットの、ＡＨＡＳ除草剤抵抗性の二重変異対立遺伝子も同定されている（Ｐｌａｎｔａ  １９６：６４〜６８、１９９５）。遺伝子のｃｓｒ１−４は、クロロスルフロン、イマザピル、およびトリアゾロピリミジンに抵抗性である、動態学の変化したＡＨＡＳ酵素をコードする。ｃｓｒ１−４遺伝子は、植物で発現されると、添加されたＬ−バリンおよびＬ−ロイシンに応答して、植物の生長に影響を及ぼす。
【００１９】
最近まで、ＡＨＡＳの小サブユニットタンパク質が真核生物にも存在する、直接的な証拠が全くなかった。近年、他のグループが、発現配列タグ（ＥＳＴ;expressed sequence tag）の使用により、真核生物である植物アラビドプシスにおいて、微生物ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子に相同的な配列を同定した。彼らは、無作為に単離したアラビドプシスｃＤＮＡ配列が、微生物系に由来するＡＨＡＳ小サブユニット配列と、配列相同性を有することを示した。それ以来、酵母および紅藻などの他の真核生物に由来する、小サブユニットからのＥＳＴが記載されている（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ１９９７、Ｇｅｎｅ  １９０：２４５）。Ｄｕｇｇｌｅｂｙは、既知の原核生物小サブユニット遺伝子配列に相同性を有する、３つのＥＳＴ配列（２つはアラビドプシスから、１つはコメから）を開示する。
【００２０】
より近年に、国際公開ＷＯ９８／３７２０６号は、ホロ酵素を阻害する除草剤をスクリーニングするための、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ由来のＡＬＳ小サブユニットｃＤＮＡ配列の使用を開示する。しかし、本発明以前には、真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質の遺伝子の完全なゲノム配列は決定されておらず、また、真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質も、アラビドプシスから産生または単離されていなかった。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、生物学的に機能的な真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質およびその機能的変異体をコードする、ＤＮＡ配列を提供する。本発明により、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子がクローニングされ、配列決定された。真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターが、植物の形質転換用に提供される。ＡＨＡＳタンパク質またはタンパク質群の大および小サブユニットの両方をコードする遺伝子を含む、発現ベクターも提供される。ベクターは、小麦、大麦、コメ、サトウキビ、綿花、トウモロコシ(corn)、大豆、砂糖大根、カノーラ等を含む、単子葉および双子葉植物などの、所望のトランスジェニック植物の産生法に使用され得る。かくして産生されたトランスジェニック植物は、イミダゾリノンなどの特定の除草剤に対して耐性レベルが上昇する。
【００２２】
本発明はまた、ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質の遺伝子を含むプラスミドを含む、ＤＮＡベクターの構築法に関する。本発明のベクターは、広範囲の植物の形質転換に適切であり、また、ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むように操作し得る。
【００２３】
相補的な真核生物小サブユニットタンパク質遺伝子、例えば、アラビドプシスまたはメイズ(トウモロコシ; maiz)に由来する遺伝子を含むベクターを使用して、イミダゾリノン耐性植物を形質転換して、第二機序による除草剤抵抗性を増強できる。
【００２４】
本発明の特定の実施形態において、大および小ＡＨＡＳサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列、並びに、植物において協調的に調節される発現系としての、ＡＨＡＳの大および小サブユニットのプロモーターを含む、発現ベクターが提供される。
【００２５】
特定の単子葉穀物については、コメまたはメイズに由来するものなどの、単子葉ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子およびプロモーターを使用することが好ましくあり得る。これらの遺伝子は、イミダゾリノンまたは他のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する除草剤抵抗性を示す、トランスジェニック単子葉植物の開発を含む適用に有用である。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明は、イミダゾリノン除草剤に対して、高レベルの耐性または抵抗性を示す、トランスジェニック穀物植物の創製法に関する。この方法は、ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子およびＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の除草剤抵抗性変異体を含むプラスミドベクターなどのＤＮＡ構築物を、イミダゾリノンに対して通常感受性であるかまたは部分的に抵抗性である植物に導入することを含む。一旦ベクターが、植物組織に導入されると、ベクターは植物の内在性機序を使用して、大および小サブユニットタンパク質を発現する。外来性のＡＨＡＳ酵素の大サブユニットおよび小サブユニットの産生の増加により、植物に、増強したイミダゾリノン抵抗性が付与される。このイミダゾリノン抵抗性の増加は、触媒活性、安定性、分解に対する抵抗性、または、植物中の増加量の
小サブユニットタンパク質の存在下での、大サブユニットタンパク質の阻害に対する抵抗性の増加の結果である。
【００２７】
好ましい実施形態において、ＡＨＡＳ酵素の大サブユニットおよび小サブユニット遺伝子は、単一のプラスミド上に存在し、これは、一体として、形質転換植物のゲノムに組込まれ、除草剤抵抗性穀物のより簡単な育種のために単一の遺伝子座として分離する。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、ＤＮＡ構築物またはベクターは、単一のプロモーターに作動可能に連結され、それから発現される、単一の遺伝子に融合された、除草剤抵抗性大ＡＨＡＳサブユニット遺伝子および小ＡＨＡＳサブユニットタンパク質遺伝子を含む。
【００２９】
本発明のベクターにより産生されたＡＨＡＳの小サブユニットタンパク質は、除草剤の新規標的部位として使用したり、または、大サブユニットと組合せて使用して、大サブユニットの推定的阻害剤をスクリーニングすることができる。
【００３０】
本発明は、植物に除草剤抵抗性を付与する、ＡＨＡＳ酵素の変異を同定するための、スクリーニング手段として、小サブユニットＤＮＡ配列を利用する方法にも関する。本発明のこの態様において、ＡＨＡＳの大および小サブユニットを同時に発現する生物を、植物に除草剤に対する抵抗性を付与する変異についてスクリーニングする。変異遺伝子産物を、単離して、イミダゾリノンを含む除草剤の効果についてin vivoで試験する。次いで、変異除草剤抵抗型を単離する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明のアラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットゲノムＤＮＡ配列を含む、ｐＵＣプラスミド植物発現ベクター構築物を示す。
【図２】図２は、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子地図を示す。
【図３】図３は、最初の３つのコドンを有さない、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含む、本発明のプラスミド発現ベクターｐＨＵＷＥ８２を示す。
【図４】図４は、最初の９８アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を差し引いた、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含む、本発明のプラスミド発現ベクターｐＨＵＷＥ８３を示す。
【図５】図５は、リン酸緩衝食塩水（ＭＴＰＢＳ）およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、アラビドプシスＡＨＡＳ酵素の大ＡＨＡＳサブユニットタンパク質のin vitro活性および安定性を示す、棒グラフである。
【図６】図６は、リン酸緩衝食塩水（ＭＴＰＢＳ）の存在下で、アラビドプシスＡＨＡＳ酵素の大サブユニットタンパク質のin vitro活性を示す、棒グラフである。
【図７】図７は、漸増量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下での、アラビドプシスＡＨＡＳ酵素の大サブユニットタンパク質のin vitro活性を示すグラフである。
【図８】図８は、漸増量のアラビドプシス小サブユニットタンパク質中の、ＡＨＡＳ酵素の野生型大サブユニットタンパク質のin vitro活性を示すグラフである。
【図９】図９は、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質の存在下での、除草剤抵抗性変異体（Ｍｅｔ１２４Ｈｉｓ）大サブユニットアラビドプシスＡＨＡＳタンパク質のin vitro活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＡＨＡＳ小サブユニットゲノムＤＮＡを含む、５．６ｋｂのＤＮＡ断片を含む、本発明の植物形質転換ベクターｐＨＵＷＥ６７である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、本発明の植物形質転換（発現）ベクターを示す。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、アラビドプシスのＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質の遺伝子のクローニングおよび配列決定に関する。配列表の配列番号１は、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含む。コードされたＡＨＡＳ小サブユニットポリペプチドの対応するアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示す。アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列表の配列番号３に示す。
【００３３】
本発明はまた、真核生物アセトヒドロキシ酸シンターゼ、すなわちＡＨＡＳの小サブユニットタンパク質をコードする、単離ＤＮＡ配列に関する。特に、本発明は、アラビドプシスなどの双子葉植物、或いはライスまたはメイズなどの単子葉植物から得ることができる、植物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。
【００３４】
クローニングされたアラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列は、ＤＮＡベクター構築物に使用して、イミダゾリノンなどの除草剤に通常感受性であるかまたは部分的に抵抗性である、穀物植物を形質転換できる。形質転換後に得られたトランスジェニック植物は、イミダゾリノンなどのＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性の増加を示す。
【００３５】
本発明の発現ベクター系は、適切な条件下で使用して、実質的に全ての植物細胞を形質転換できる。形質転換細胞は完全な植物体へと再生でき、よって、遺伝子が無傷植物に発現されると、トランスジェニック植物に除草剤抵抗性を付与する。
【００３６】
ＡＨＡＳ小サブユニットをコードするＤＮＡ配列をベクターに使用して、植物を形質転換し得、これにより創製された植物は、除草剤、特にイミダゾリノンに対して増強した抵抗性を有する。ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、植物への除草剤抵抗性の付与において、単独で、またはＡＨＡＳ酵素の大サブユニットをコードするＤＮＡ配列と組合せて、ベクター中に使用し得る。
【００３７】
本発明は、真核生物プロモーター、並びに、真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、植物発現ベクターに関する。発現ベクターに使用する真核生物プロモーターは、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターなどの、高発現レベルの植物プロモーターとする。発現ベクターに好ましくは使用するＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列は、アラビドプシス小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【００３８】
別の実施形態において、植物発現ベクターは、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットのプロモーター；真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットをコードするＤＮＡ配列；ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットのプロモーター；および真核生物ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００３９】
さらに別の実施形態において、植物で異種ＡＨＡＳ遺伝子を発現するための植物発現ベクターは、植物プロモーター、並びに、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４０】
１つの実施形態において、植物発現ベクターは、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットプロモーター、および、アラビドプシス小サブユニットＡＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４１】
別の実施形態において、植物発現ベクターは、植物細胞で発現可能なプロモーター；トランジットＡＨＡＳ大サブユニットポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；野生型の成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質または変異体をコードするＤＮＡ配列；リンカーポリペプチド転写物をコードするＤＮＡ配列；成熟真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列；および植物ターミネーター配列を連続的に含む。この実施形態において、プロモーター、移行(transit)ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および、成熟ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、双子葉植物、特にアラビドプシスに由来する。別に、プロモーター、移行ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および、成熟ＡＨＡＳ
大サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み得る、植物発現ベクターは、メイズなどの単子葉植物から得られる。
【００４２】
別の実施形態において、植物発現ベクターは、植物での発現に適したプロモーター、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４３】
別の実施形態において、植物発現ベクターは、イントロンおよびリーダー配列などの、遺伝子発現を増強するためのＤＮＡ配列を含む。本発明のこの態様において、植物発現ベクターは、ＡＨＡＳ遺伝子発現を調節するためのＤＮＡ配列を含む。イントロン配列はまた、メイズＡｄｈ１イントロンおよびｓｈｒｕｎｋｅｎｔ−１遺伝子座由来の第一イントロンなどのイントロン由来の異種イントロン配列であり得る。さらに、遺伝子発現を増強するためのＤＮＡ配列は、タバコモザイクウイルス由来のＷ配列などのリーダー配列であり得る。
【００４４】
本発明はまた、単離された真核生物のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質に関する。ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質は、配列表の配列番号２に対応するアミノ酸配列を有する。このタンパク質は、例えば、アラビドプシスから精製でき、組成物中に使用し得る。また、この遺伝子を使用して、大腸菌などの微生物中でアラビドプシス小サブユニットタンパク質を発現でき、大腸菌の抽出物から精製できる。
【００４５】
本発明はまた、植物を、真核生物ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む植物発現ベクターで形質転換することを含む、除草剤に抵抗性のトランスジェニック植物を創製する方法に関する。
【００４６】
本発明はまた、植物細胞を、第一の植物発現プロモーターおよびＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む、第一植物発現ベクター、並びに、第二植物発現プロモーターおよび真核生物ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む第二植物発現ベクターで同時形質転換することを含む、植物細胞に、除草剤抵抗性を付与する方法に関する。
【００４７】
本発明はさらに、トランスジェニック植物を、真核生物小サブユニットＡＨＡＳタンパク質またはその変異体または変異体をコードするＤＮＡ配列で形質転換することを含む、ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質またはその変異体または変異体をコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック植物の除草剤抵抗性を増強する方法に関する。
【００４８】
本発明はまた、体細胞的にまたは有性的に、遺伝的相補体が、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットの除草剤抵抗性変異体をコードする配列、並びに真核生物ＡＨＡＳタンパク質の小サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物と植物とを交雑させ；除草剤抵抗性を示す子孫植物を選択することを含む、植物の子孫植物の除草剤抵抗性を増強する方法に関する。
【００４９】
本発明はまた、本発明の方法により産生されたトランスジェニック植物および子孫に関し、この植物は、イミダゾリノンおよび他の除草剤に対する抵抗性の上昇を示す。
【００５０】
本発明はまた、遺伝的相補体が、植物で発現するためのプロモーター、真核生物ＡＨＡＳタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、並びに植物細胞で機能するターミネーター配列を含む、植物で発現可能な遺伝子を含む、トランスジェニック植物に関する。
【００５１】
本発明はまた、除草剤に抵抗性を付与する、植物ＡＨＡＳ遺伝子の変異を同定する方法であって、生物を除草化合物に曝露することを含み、この生物は、ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質遺伝子を含む異種ベクターを有する。この実施形態の別の態様において、異種ベクターは、ＡＨＡＳ大および小サブユニット遺伝子を含み得る。この方法は、変異形のＡＨＡＳ酵素に対する、除草剤の効果を試験するためのスクリーニング系としても有用である。
【００５２】
本発明はまた、酵素のアロステリックフィードバック阻害特徴を変化させる、植物ＡＨＡＳ遺伝子（群）中の変異を同定する方法にも関する。ＡＨＡＳ大または小サブユニット遺伝子における、酵素のフィードバック特徴を変化させる変異を使用して、植物中のアミノ酸レベル、特に分枝鎖アミノ酸レベルを変化させる。この方法は、ＡＨＡＳ酵素活性の欠損した微生物株を、変異植物ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むプラスミド発現ベクターで形質転換することを含む。ＡＨＡＳ活性の欠失した適切な微生物株は、大腸菌ＭＩ２６２である。変異ＡＨＡＳ大および小サブユニット遺伝子は、無作為に作成できるか、または、以前に記載された方法を使用して（Ｏｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９〜３６８、１９９６）、タンパク質構造モデルから合理的に設計できる。一旦微生
物株が形質転換されると、１または２つで、３つではない分枝鎖アミノ酸の存在下で、最小培地中でスクリーニングし、次いで、最小培地中で増殖する微生物株を同定する。
【００５３】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むベクターを、慣用的な組換えＤＮＡ技術を使用して、植物または細菌細胞に取込むことができる。植物を形質転換された植物細胞から成長させ、第二世代植物を、トランスジェニック植物の種子から得ることができる。別に、植物の形質転換用のベクターは、発現可能なＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質遺伝子を含む、組換え植物ウイルスベクターであり得る。この実施形態において、ウイルスベクターは、標的穀物植物を全体的に感染でき、宿主のゲノムを破壊することなく、宿主植物中でＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質を発現できる。
【００５４】
本発明はまた、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子プロモーターＤＮＡ配列に関する。本発明のこの態様において、ＡＨＡＳ小サブユニットプロモーター配列を使用して、異種ポリペプチドを発現できる。別に、ＡＨＡＳ小および大サブユニットプロモーターはまた、協調的に調節された遺伝子系として使用して、異種マルチサブユニットタンパク質を発現、または単一遺伝子を過剰発現できる。
【００５５】
ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質遺伝子の同定、クローニングおよび配列決定
ＧｅｎＢａｎｋでＰ＿１２１９７と称される、推定シロイナズナ(Arabidopsis thaliana)の小サブユニットタンパク質のＥＳＴ配列を使用して、完全なＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子をクローニングした。合成ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたＡＨＡＳ小サブユニットＥＳＴ配列に対応する、アラビドプシスの推定ＡＨＡＳ小サブユニットＤＮＡ配列に対応するように特別に設計した。プライマーは、標準的な技法を使用して合成した（米国特許第４，６８３，２０２号；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング第２版、コールドスプリングハーバー）。
【００５６】
逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲを、アラビドプシスから単離した全ＲＮＡに実施した。ＥＳＴ配列から設計したプライマーは、アラビドプシスｃＤＮＡ断片を増幅できた。この断片を、標準的な技法を使用して、インビトロゲンＴＡベクター（インビトロゲン製造番号Ｋ２０００−０１）にクローニングした。このクローンは、ｐＤＧＲ１０２と命名され、ＥＳＴ配列の一部を含む４５０塩基対断片に相当した。
【００５７】
同じＰＣＲプライマーを使用して、アラビドプシスλ：ｙｅｓｃＤＮＡライブラリーから断片を増幅した。これにより、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子がライブラリーに存在することが確認された。ｐＤＧＲ１０２内に特異的な正鎖プライマー、およびλ：ｙｅｓファージミドベクターにハイブリッドする逆プライマーを使用して、小サブユニット遺伝子の３’ハーフを示す断片を、鋳型源としてアラビドプシス全ｃＤＮＡライブラリーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。この約８００塩基の産物を、インビトロゲンＴＡベクター（インビトロゲン、製造番号Ｋ２０００−０１）にクローニングし、クローンｐＤＧＲ１０６と命名した。クローンｐＤＧＲ１０６も配列決定され、その翻訳されたアミノ酸配列により、断片は、既知の原核生物小サブユニット遺伝子配列に対する相同性により、小サブユニット遺伝子の３’半分を示すことが確認された。この断片は、停止コドンおよび３’フランキングポリＡ尾部を含んだ。
【００５８】
ｐＤＧＲ１０２およびｐＤＧＲ１０６に含まれるＰＣＲ断片は、小サブユニット遺伝子の５’領域および３’ハーフをそれぞれ示すことが判明し、そのＤＮＡ配列は、約１８８ｂｐ重複した。重複領域に位置する独特なＳｓｐＩ制限酵素部位を使用して、切断し、共に断片を結合し、ほぼ全長のＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を再構築した（Ｎ末端遺伝子の一部は依然として欠失していた）。得られたクローンはｐＤＧＲ１１５とラベルした。
【００５９】
５’ｃＤＮＡ末端を迅速に増幅して（５’ＲＡＣＥ、ギブコ／ＢＲＬ、製造番号１８３７４−０５８）、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の５’末端のシークエンスを完了した。ｐＤＧＲ１１５配列から設計されたプライマーを使用して、小サブユニット遺伝子をクローニングし、その５’末端まで配列を伸長した。アラビドプシス実生から抽出した全ＲＮＡを鋳型として使用した。配列は、６５０塩基対伸長され、Ｎ末端メチオニン残基の推定開始コドンを同定した。確立された全長配列を使用して、全長ｃＤＮＡクローンを作成した。
【００６０】
アラビドプシス小サブユニット遺伝子のゲノムクローンは、クロンテックアラビドプシスゲノムλライブラリーのスクリーニングにより得られた。ライブラリーをスクリーニングするために、３８０ｂｐのプローブを、５’領域の小サブユニットｃＤＮＡ位配列のＰＣＲ増幅により作成した。ＰＣＲ産物は、プライマー；５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＴＴＧＡ−３’（配列表の配列番号４）および５’−ＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＣＧＡＴＧＴＡＣ−３’（配列表の配列番号５）の使用により得られた。３８０塩基対のＰＣＲ産物を、インビトロゲンＴＡクローニングベクターにクローニングした。プローブを標識するために、ＰＣＲ挿入断片を、ＥｃｏＲＩで切出し、ランダムにプライムすることにより、α−32ＰｄＣＴＰで標識した。ライブラリーのスクリーニングは、慣
用的な方法により、ナイロン膜上で実施した。プローブにハイブリッドしたλファージを同定および単離した。λファージＤＮＡを抽出し、ＳａｌＩで消化し、断片をｐＵＣ１９にクローニングした。小サブユニットｃＤＮＡ配列に特異的なプライマーを、様々なクローニングＳａｌＩゲノム断片と共に、シークエンス反応に使用し、小サブユニット遺伝子を含むクローンを同定した。５．６ｋｂのＳａｌＩ断片内にＡＨＡＳ小サブユニット配列を含むクローンを同定し、これは、図１のｐＭＳｇ６プラスミド内に示す。プロモーター領域、移行配列、小サブユニット遺伝子の成熟コード配列、イントロン、および、翻訳ターミネーターを、４．９ｋｂのゲノム断片を配列決定することにより同定した。
【００６１】
ゲノムとｃＤＮＡ配列を比較して、Ｎ末端メチオニンの開始コドンを同定した。小サブユニット遺伝子のｃＤＮＡは、４９１アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【００６２】
図２は、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子のゲノムＤＮＡ配列の地図である。図２に示したように、および配列表の配列番号３を参照すると、この遺伝子は、ヌクレオチド番号１〜ヌクレオチド７５７番目におよぶプロモーターを含む。遺伝子の開始コドンは、ヌクレオチド７５８〜７６０番目に対応する。遺伝子は、１１のイントロンおよび１２のエキソンを含む。エキソン１は、ヌクレオチド７５８〜ヌクレオチド１００６番目におよぶ。イントロン１は、ヌクレオチド１００７〜ヌクレオチド１０８４番目におよぶ。エキソン２は、ヌクレオチド１０８５〜ヌクレオチド１３００番目におよぶ。イントロン２は、ヌクレオチド１３０１〜ヌクレオチド１４５５番目におよぶ。エキソン３は、ヌクレオチド１４５６〜ヌクレオチド１５３４番目におよぶ。イントロン３は、ヌクレオ
チド１５３５〜ヌクレオチド１６５９番目におよぶ。エキソン４は、ヌクレオチド１６６０〜ヌクレオチド１７３１番目におよぶ。イントロン４は、ヌクレオチド１７３２〜ヌクレオチド２２３６番目におよぶ。エキソン５は、ヌクレオチド２２３７〜ヌクレオチド２３２０番目におよぶ。イントロン５は、ヌクレオチド２３２１〜ヌクレオチド２４８６番目におよぶ。エキソン６は、ヌクレオチド２４８７〜ヌクレオチド２６４０番目におよぶ。イントロン６は、ヌクレオチド２６４１〜ヌクレオチド２９１０番目におよぶ。エキソン７は、ヌクレオチド２９１１〜ヌクレオチド２９９８番目におよぶ。イントロン７は、ヌクレオチド２９９９〜ヌクレオチド３２８４番目におよぶ。エキソン８は、ヌクレオチド３２８５〜ヌクレオチド３３８９番目におよぶ。イントロン８は、ヌクレオチド３３９０〜ヌクレオチド３４７０番目におよぶ。エキソン９は、ヌクレオチド３４７１〜ヌクレオチド３５９２番目におよぶ。イントロン９は、ヌクレオチド３５９３
〜ヌクレオチド３８９１番目におよぶ。エキソン１０は、ヌクレオチド３８９２〜ヌクレオチド４０４２番目におよぶ。イントロン１０は、ヌクレオチド４０４３〜ヌクレオチド４２８５番目におよぶ。エキソン１１は、ヌクレオチド４２８６〜ヌクレオチド４３５１番目におよぶ。イントロン１１は、ヌクレオチド４３５２〜ヌクレオチド４６４７番目におよぶ。エキソン１２は、ヌクレオチド４６４８から、ヌクレオチド４７３７番目の停止コドンにおよぶ。転写ターミネーターは、ヌクレオチド４７３７番目の停止コドンとヌクレオチド４８９５の間のＤＮＡ区分に位置する。
【００６３】
上記のＤＮＡ配列によりコードされた、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質のアミノ酸配列は、原核生物由来のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質のアミノ酸配列に高い相同性を有する。相同性は、原核生物のＡＨＡＳ小サブユニット配列の保存領域において特に高い。例として、本発明のアラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列は、枯草菌の小サブユニット遺伝子の配列に対して、４２．５％の配列同一性を示した。これにより、ゲノムクローンのＤＮＡ配列は、アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットの配列であることが示された。
【００６４】
図２はまた、寄託番号Ｐ＿１２１９７およびＰ＿２１８５６をもつ、２つのＧｅｎｂａｎｋＥＳＴ配列の位置を示す。両方のＥＳＴ配列が、以前に、微生物ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子に対して相同性を有すると同定され、これにより、アラビドプシスに２つのイソ酵素が存在することが示唆された。Ｐ＿１２１９７からのＥＳＴ配列を使用して、本発明のＡＨＡＳ小サブユニットｃＤＮＡおよびゲノムクローンをクローニングした。完了したＡＨＡＳ配列の解析により、この遺伝子は、既知のＡＨＡＳ小サブユニットに相同性を有する、２つの反復アミノ酸配列をコードすることが示された。ＡＨＡＳ遺伝子配列は、単一のポリペプチド内に直列に並んでいる。ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列を、元の２つのＥＳＴと比較した後に、２つのＥＳＴは、同じ遺伝子の一部であり、各々が、各反復配列内の類似領域に対応すると決定された。
【００６５】
いくつかの具体的な材料および方法を、ゲノム小サブユニット遺伝子のクローニングに使用した。アラビドプシスゲノムライブラリー−アラビドプシスゲノムライブラリーは、クロンテックから得た。
【００６６】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むプラスミドの構築
配列表の配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含む、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むＤＮＡ分子を、適切な向きでおよび正しい読み枠内の適切な異種発現ベクター系に挿入できる。プラスミド、バクテリオファージウイルスおよび他の修飾ウイルスなどの数多くのベクター系を、本発明の実践に使用できる。適切なプラスミドベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＩ１２２、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１およびＴＡクローニングベクターを含むがこれに限定されない。λｇｔ１０、λｇｔ１１およびシャロン４などのウイルスベクターも使用できる。
【００６７】
Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、ｐＨＵＷＥ８２、およびｐＨＵＷＥ８３プラスミド発現ベクターの構築
本発明において、ＡＨＡＳ小サブユニットｃＤＮＡ配列を、ファルマシアから得た、ｐＧＥＸ−２ＴまたはｐＧＥＸ−４Ｔ−２大腸菌発現ベクターに挿入した。ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列を含む、５つの異なるＤＮＡ断片を、ｐＧＥＸ−２ＴまたはｐＧＥＸ−４Ｔ−２発現ベクターにクローニングした。これらのクローンを、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、ｐＨＵＷＥ８２、およびｐＨＵＷＥ８３と称し、これらは全て、発現ベクター内に含まれるコード配列の量が異なる。プラスミドＦ１、Ｆ２およびＦ３は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２大腸菌発現ベクターにＡＨＡＳ小サブユニットｃＤＮＡを含み、以下の例２により詳細に記載する。プラスミドｐＨＵＷＥ８２およびｐＨＵＷＥ８３中のＡＨＡＳ小サブユニットｃＤＮＡは、ｐＧＥＸ−２Ｒ大腸菌発現ベクターにクローニングした。ｐＨＵＷＥ８２ベク
ターは、ほぼ全長のアラビドプシスＡＳＡＳ小サブユニット遺伝子を含んだ（最初の３つのアミノ酸は含まない）。ｐＨＵＷＥ８３は、推定トランジット配列を含まない小サブユニット遺伝子を発現するように操作した（最初の９８のアミノ酸は含まない）。プラスミドｐＨＵＷＥ８２およびｐＨＵＷＥ８３の地図は、それぞれ図３および４に示す。小サブユニット遺伝子の変形が、グルタチオントランスフェラーゼ／ＡＨＡＳ小サブユニット融合タンパク質として大腸菌に発現される。融合タンパク質をアフィニティー精製した後、それぞれのタンパク質をトロンビンで切断する。５つのアミノ酸のトロンビン切断部位、すなわち、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列表の配列番号６）の取込み、および、プロテアーゼ開裂位置のために、追加のグリシンおよびセリン残基が
、小サブユニットタンパク質のＮ末端上に維持される。得られたｐＨＵＷＥ８２由来のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質は、Ｎ末端配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（配列表の配列番号７；最初の３つのアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａは、ベクターに取込まれなかった）を有し、ｐＨＵＷＥ８３由来のタンパク質は、Ｎ末端配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ（配列表の配列番号８；最初の９８のアミノ酸は、ベクターに取込まれなかった）を有する。ｐＨＵＷＥ８２およびｐＨＵＷＥ８３の両方において、Ｎ末端配列アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−は、トロンビン開裂部位の残りである。
【００６８】
植物形質転換／発現ベクターの構築
数多くの植物形質転換ベクターおよび植物形質転換法が利用できる（Ａｎ，Ｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、８１：３０１〜３０５、１９８６；Ｆｒｙ，Ｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．６：３２１〜３２５、１９８７；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７〜７７４、１９８８；Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．２０３２１２．２０３〜２１２、１９９０；Ｃｏｕｓｉｎｓら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１〜４９４、１９９１；Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．およびＳｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．Ｇｅｎｅ．１１８：２５５〜２６０、１９９２；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９〜２４６、１９９２；Ｄ'Ｈａｌｌｕｉｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９〜３１４、１９９２；Ｄｈｉｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１〜８８、１９９２；Ｃａｓａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１２１２〜１１２１６、１９９３；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ、Ｉｎ  Ｖ
ｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９〜１２４、１９９３；Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２：１８０〜１８３、１９９３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｚ．およびＭｃｈｕｇｈｅｎ，Ａ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．９１：１３９〜１４８、１９９３；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．およびＴｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７、１９９３；Ｇｏｌｏｖｋｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．９１：４１〜５２、１９９３；Ｇｕｏ  Ｃｈｉｎ  Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２〜２０７８、１９９３；Ａｓａｎｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１３、１９９４；Ａｙｅｒｅｓ  Ｎ．Ｍ．およびＰａｒｋ，Ｗ．Ｄ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９〜２３９、１９９４；Ｂａｒｃｅｌｏら、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３〜５９２、１９９４；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９〜３０７、１９９４；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａら、Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａ
ｎｔ．１６：２２５〜２３０、１９９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ  Ｔｅｃｈ．５：１７〜２７、１９９４；Ｅａｐｅｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１３：５８２〜５８６、１９９４；Ｈａｒｔｍａｎら、Ｂｉｄ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９１９９２３、１９９４；Ｒｉｔａｌａら、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７〜３２５、１９９４；Ｗａｎ，Ｙ．Ｃ．およびＬｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８、１９９４；Ｗｅｅｋｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ：１０４、１９９４）。ＡＨＡＳ小サブユニットＤＮＡ配列を、標準的な技法を使用して任意のベクターに挿入する。ベクターの選択は、好ましい形質転換技法および形質転換する標的植物種に依存する。好ましい実施形態において、ＡＨＡＳ
小サブユニット遺伝子は、高発現レベルの植物プロモーターの後にクローニングでき、次いで、この構築物を、すでにトランスジェニックである植物に、または、大サブユニットタンパク質の除草剤抵抗性変異対立遺伝子で形質転換すべき植物に導入できる。このように、除草剤抵抗性遺伝子の効力は、大サブユニットタンパク質の安定化または活性化により増強し得る。この方法は、任意の植物種に適用し得るが、重要な穀物に適用された場合に最も利点がある。
【００６９】
植物発現カセットを構築し、外来ＤＮＡを植物に導入する方法論は、一般に当分野に記載されている。例えば、外来ＤＮＡを、腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミドベクターを使用して植物に導入できる。外来ＤＮＡ送達に利用される他の方法は、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、電気穿孔法、マイクロインジェクションホイスカー、および直接的ＤＮＡ取込みのための微粒子銃すなわちマイクロプロジェクタイル衝撃の使用を含む。前記方法は当分野で公知である。（Ｖａｓｉｌらの米国特許第５，４０５，７６５号；Ｂｉｌａｎｇら（１９９１）Ｇｅｎｅ１００：２４７〜２５０；Ｓｃｈｅｉｄら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２２８：１０４〜１１２；Ｇｕｅｒｃｈｅら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ５２：１１１〜１１６；Ｎｅｕｈａｕｓｅら（１９８７）Ｔｈｅｏｒ
．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：３０〜３６；Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０〜７３；Ｈｏｗｅｌｌら（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２０８：１２６５；Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９〜１２３１；ＤｅＢｌｏｃｋら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ９１：６９４〜７０１；植物分子生物学の方法（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ出版社（１９８８）および植物分子生物学の方法（ＳｃｈｕｌｅｒおよびＺｉｅｌｉｎｓｋｉ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ出版社（１９８９）。形質転換法は、形質転換すべき植物細胞、使用するベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベルおよび他のパラメータに依存する。
【００７０】
発現カセットの成分は、挿入遺伝子の発現を増加させるために修飾し得る。例えば、切断短縮配列、ヌクレオチド置換または他の修飾を使用し得る。遺伝子発現を増強させるためのＤＮＡ配列は、植物発現ベクターにも使用し得る。これらは、メイズＡｄｈ１のイントロン、イントロン１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３〜１２００、１９８７）、およびリーダー配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）由来の（Ｗ−配列）、メイズＣｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅウイルスおよびアルファルファモザイクウイルスを含む（Ｇａｌｌｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：８６９３〜８７１１、１９８７およびＳｋｕｚｅｓｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１５：６５〜７９、１９９０）。メイズのｓｈｒｕｎｋｅ
ｎｔ−１遺伝子座からの第一イントロンが、キメラ遺伝子構築物における遺伝子の発現を増加させることが示された。米国特許第５，４２４，４１２号および第５，５９３，８７４号は、遺伝子発現構築物における特定のイントロンの使用を開示し、Ｇａｌｌｉｅら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９〜９３９、１９９４）はまた、イントロンが、組織特異的な遺伝子発現の調節に有用であることを示した。ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子発現をさらに増強または最適化するために、本発明の植物発現ベクターはまた、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を含むＤＮＡ配列も含み得る。次いで、かかる修飾発現系で形質転換された植物細胞は、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の過剰発現または構成的発現を示し得る。
【００７１】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子および本発明の他の遺伝子を効率的に発現するためには、プロモーターが発現ベクター中に存在しなければならない。使用する宿主細胞系に応じて、多くの適切なプロモーターのいずれか１つを使用できる。適切なプロモーターは、ユビキチン、ｎｏｓプロモーター、小サブユニットリブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、小サブユニットクロロフィルＡ／Ｂ結合ポリペプチドプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ＡＨＡＳ大および小サブユニットプロモーター、（ＯＣＳ）３ＭＡＳ、並びに植物および植物ウイルスから単離されたプロモーターを含む、高発現レベルの植物プロモーターとする。Ｃ．Ｅ．Ｖａｌｌｅｊｏｓら、「RＲＮＡ（４５Ｓ）に相同的な配列を含むＤＮＡ制限断片、主要なクロロフィルA/B結合ポリペプチドおよびリブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の、トマト
ゲノムにおける位置」Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１２：９３〜１０５（１９８６）。植物の形質転換に適切な別のプロモーターは、アクチンプロモーターである。本発明の好ましいプロモーターは、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列と共に使用するためのＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターである。次いで、発現ベクターを使用して植物細胞を形質転換できる。形質転換に適した他の植物組織は、葉組織、根組織、分裂組織、カルスなどの培養植物細胞、およびプロトプラストを含む。
【００７２】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子プロモーターの使用：好ましい実施形態において、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の転写に使用するプロモーターは、強力な植物プロモーターとする。植物中のＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の天然プロモーターを、トランスジェニック植物におけるＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質遺伝子の発現に使用し得る。小サブユニット遺伝子プロモーターはまた、異種遺伝子を発現するためにベクターで使用できる。ＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターは、ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子のプロモーターと共にベクターで使用できる。これらのプロモーターは、単一の多量体タンパク質の２つのサブユニットをコードする２つの遺伝子の転写を駆動するが、これは、協調的に調節されたプロモーターとして使用し得る。例えば、両方のプロモーターが、特定の時間または
分裂組織などの特定の組織で同時にアップレギュレートされ得る。２つの異なるが、同時に活性であるプロモーターの利点は、それらが同時抑制されにくいことである。同時抑制は、類似した配列をもつ２つの遺伝子が、形質転換生物内に存在する場合に起こり得る。同時抑制は、同レベルの遺伝子の発現のサイレンシングを引き起こす。
【００７３】
さらに、同じプロモーター配列で調節される２つの遺伝子を含む形質転換ベクターは、類似配列間の組換えを受け得、よって一方または両方の遺伝子が不活性化される。同時調節される異なるプロモーターの使用により、組換えの問題なく、２つの遺伝子の発現が可能となり得、多量体タンパク質の発現が容易となり得る。
【００７４】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子のプロモーターは、さらなる目的のために使用できる。第一に、大および小サブユニット遺伝子は、互いに協奏的に物理的に接触して作用するポリペプチドをコードし、２つの遺伝子は、発現時に協調的に調節され得る。大および小サブユニットプロモーターの両方を有することにより、他の多量体タンパク質の発現、または２つの異なるプロモーターからの同じ遺伝子の過剰発現が可能となり得る。これは、同じプロモーターで２つの遺伝子を発現することにより、相同的プロモーター配列の組換えに起因する問題が引き起こされ得ることから、有利である。２つの異なる遺伝子を使用する場合、多量体タンパク質の遺伝子は、同時にまたは同じ組織で発現されないだろう。協調的に調節されているが、異種であるプロモーターは、これらの問題を克服する。
【００７５】
第二に、大および小サブユニットプロモーターの両方を有することで、遺伝子調節を解明する手段が提供される。これらのプロモーターは、レベルの協調、組織特異性、サブユニット遺伝子の協調の決定について試験するために、リポーター遺伝子にライゲートできる。
【００７６】
第三に、除草剤抵抗性を増強するのに最も効果があるように適切な時間および組織で発現されるように、小サブユニット遺伝子をそれ自体のプロモーター上で発現することが有利である。
【００７７】
最後に、協調的に調節され得る２つのプロモーターを有することで、我々に、各プロモーターに共通であり得る調節因子を解析および単離する手段が提供される。前記因子は、ＡＨＡＳ大および小サブユニットプロモーターの両方からの発現を調節する、転写因子を含む。プロモーター配列はまた、２つの遺伝子の協調的調節に関与し得る、共通のモチーフを有し得る。さらに、小サブユニットゲノムクローンでのイントロンの役割は、２つのプロモーターの同時調節に関与し得る。２つのプロモーターおよびイントロンは、我々に、プロモーターの協調的調節の機序を解明する手段を提供する。
【００７８】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子のイントロンの使用
ゲノムクローンは、遺伝子発現の調節に使用され得る、数個のイントロンを有する。イントロンは、遺伝子発現を調節することが示されている。例えば、メイズＡｄｈ１イントロン１は、メイズにおいて、リポーター遺伝子の発現を有意に増加させる（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３〜１２００、コールドスプリングハーバーラボラトリーによる、ＩＳＳＮ０８９０〜９３６９／８７）。メイズのｓｈｒｕｎｋｅｎｔ−１遺伝子座の第一イントロンも、キメラ遺伝子構築物において発現を増加させることが示されている。米国特許第５，４２４，４１２号および第５，５９３，８７４号は、遺伝子発現の調節における特定のイントロンの使用を開示する。
【００７９】
イントロンはまた、組織特異的に発現レベルを調節することが示されている。Ｇａｌｌｉｅら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９〜９３９）は、イントロンによる遺伝子発現の増強は細胞型に依存することを示した。それ故、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子イントロンを使用して、特定の組織型に特に重点的に遺伝子を発現できる。
【００８０】
また、除草剤抵抗性の増強に最も効果のあるように、適切な時間および組織で発現されるように、小サブユニット遺伝子をその全てのイントロンと共に発現することが有利である。
【００８１】
発現ベクターにおけるＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の使用
繋がれた酵素。本発明のこの実施形態において、ＡＨＡＳ小サブユニットは、ポリグリシン（ポリＧｌｙ）などのリンカーポリペプチドをコードする転写物を介して、大サブユニットに翻訳的に連結している。リンカーポリペプチドの繋ぎの長さは変化する。リンカーポリペプチドの繋ぎに関する２つのＡＨＡＳサブユニットの位置は、大サブユニット転移配列、次いで、大サブユニット成熟コード配列、リンカーポリペプチド転写物、および小サブユニット成熟コード配列である。選択的位置づけは、大および小サブユニットの成熟コード配列を、小サブユニットトランジット配列を用いて、リンカーポリペプチド転写物の回りでスイッチすることを含む。
【００８２】
活性および除草剤抵抗性を増強するための繋がれた酵素。大および小サブユニット間の会合が緩いことが大腸菌酵素を用いて示された。大腸菌において、各サブユニットについて１０-7Ｍの濃度で、大サブユニットはα2β2活性ホロ酵素として半分しか会合していないと推定された（Ｓｅｌｌａら、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７５：５３３９〜５３４３）。最大の活性は、モル過剰のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質で達成される。ＡＨＡＳ酵素は、両方のサブユニットが会合した場合に、最も安定で活性であると決定されたので（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋら、１９９２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７４：５５６０〜５５６６、Ｓｅｌｌａら、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７５：５３３９〜５３４３）、高度に活性で安定な酵素を、２つのサブユニットを１つのポリペプチドに融合することにより作成し得る。繋がれたポリペプチドは、適切に機能することが示されている。Ｇｉｌｂｅｒｔらは、大腸菌において２つの繋がれたオリゴ糖合成酵素を発現させ、機能的で、in vitroで安定で、可溶性である酵素を製造した（Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：７６９〜７７２、１９９８）。
【００８３】
単一の遺伝子由来の単一ポリペプチドとしての、ＡＨＡＳの大および小サブユニットの両方の発現はまた、トランスジェニック除草剤抵抗性穀物の産生に利点を有する。単一の遺伝子を使用して、植物を形質転換し、育種して穀物系を得ることは、２つ以上の遺伝子を使用する場合よりも簡単でより利点がある。
【００８４】
融合酵素対。本発明のこの態様において、ＡＨＡＳ小サブユニットは、単一のプロモーターの指令下で、大サブユニットの直ぐ下流の植物ベクターに位置する。別に、ＡＨＡＳの小および大サブユニット遺伝子を分離して、単一の構築物内の異なるプロモーターの指令下に置くことができる。
【００８５】
２つの遺伝子、１つの構築物。本発明の別の態様において、この発現ベクターにおいて、ＡＨＡＳの大および小サブユニットの両方が、単一のプラスミド構築物中の、別々のプロモーターの制御下に配置される。これにより、別々の実体として両方の遺伝子を発現できるが、直列型は、植物子孫においては単一遺伝子座として作動する。
【００８６】
２つの遺伝子、１つのプロモーター。メイズ条斑病ウイルスプロモーターは、２方向に遺伝子を発現できる、二官能性プロモーターである。このプロモーターを使用すると、遺伝子転写は、ベクターの他方の鎖にコードされた遺伝子上でおよび逆方向に開始できる。それ故、ＡＨＡＳの大および小サブユニット遺伝子は、単一のプロモーターから発現できる。
【００８７】
２つの遺伝子、２つの構築物。別のアプローチにおいて、２つの別々のベクター構築物が作成され、各々、異なるプロモーターの指令下の、大または小サブユニットを含む。このアプローチは植物が二重に形質転換されることを必要とする。
【００８８】
植物発現ベクターは、遺伝子配列の下流に、適切な転写ターミネーター配列も含むべきである。遺伝子転写の正しい終結および転写物のポリアデニル化のために、植物発現カセットに使用される様々な転写ターミネーターが知られている。本発明に使用する転写因子は、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウｂｃｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ＡＨＡＳ大および小サブユニットターミネーターを含む。これらのターミネーターは、単子葉植物および双子葉植物形質転換の両方に使用するためのベクターに使用できる。
【００８９】
本発明の遺伝子産物はまた、葉緑体に標的化し得る。これは、シグナル配列（これは遺伝子に融合でき、従って発現ベクターに融合できる）を導入することにより達成される。遺伝子産物のアミノ末端に対応するシグナル配列（Ｃｏｍａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１０４〜１５１０９、１９８８参照）を、遺伝子の５’末端上流に融合する。本発明のＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質は、シグナル配列を有することが判明し、それ故、このシグナル配列は、本発明のベクターに使用できる。本発明に使用する他のシグナル配列も既知であり、例えば、ＡＨＡＳ大または小サブユニット、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ、ＧＳ２タンパク質等由来のｃＤＮＡの５’末端からのものである（Ｃｈｅｎｇ＆Ｊｏｇｅｎｄｏｒｆ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３６３〜
２３６７、１９９３）。
【００９０】
アグロバクテリウム属の細菌は、外来ＤＮＡを導入し、植物細胞を形質転換するのに使用できる。前記細菌の適切な種は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む。アグロバクテリウム・チュメファシエンス（例えば、ＬＢＡ４４０４またはＥＨＡ１０５株）は、植物の形質転換能が公知であるため、特に有用である。
【００９１】
異種遺伝子で植物細胞を形質転換する別のアプローチは、不活性または生物学的に活性な粒子を、植物組織および細胞に推進することを含む。米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；および第５，１００，７９２号（これは全て、Ｓａｎｆｏｒｄら）は、この技法を開示する。要約すると、この手順は、不活性または生物学的に活性な粒子を、細胞に、細胞の外表面を通過するに効果的な条件下で推進して、ベクターを細胞の内部に取込むことを含む。不活性粒子を使用する場合、粒子を、所望の遺伝子を含むベクターでコーティングすることによりベクターを細胞に導入できる。別法として、ベクターが、粒子の後に細胞に運ばれるように、標的細胞をベクターで囲むことができる。乾燥酵母細胞、乾燥細菌、またはバクテリオファージを含む、他の生物学的に活性な粒子は（各々所望のＤＮＡを含む）、植物細胞組織に推進できる。さらに、本発明のベクターは、標準的な技法を使用して、色素体形質転換法への使用に適するように構築できる。
【００９２】
本発明の単離ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子は、単子葉植物および双子葉植物を含む、多種多様な植物細胞に除草剤抵抗性を付与するのに使用できる。遺伝子は、これらの広い分類内に該当する任意の植物細胞に挿入できるが、コメ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、人参、サトウキビ、タバコ、豆、エンドウ、大豆、砂糖大根、およびカノーラなどの、穀物植物細胞に特に有用である。
【００９３】
本発明の発現系は、適切な条件下で、実質的に全ての穀物植物細胞の形質転換に使用できる。形質転換細胞は完全な植物体へと再生でき、よって、ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子は、無傷トランスジェニック植物に除草剤抵抗性を付与または増強する。上記に示したように、発現系は、除草剤抵抗性遺伝子が、連続的または構成的に発現されるように修飾できる。
【００９４】
植物において除草剤抵抗性を増強するためのＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の使用：ＡＨＡＳ大および小サブユニットの両方の遺伝子を含むプラスミドを構築できる。このように、２つの遺伝子は、単一の遺伝子座として分離し、除草剤抵抗性穀物の育種はより簡単になる。別に、大および小サブユニットを、単一プロモーターから発現される単一遺伝子に融合できる。融合タンパク質は、上昇したレベルの活性および除草剤抵抗性を有する。ＡＨＡＳの大サブユニットは、野生型配列であるか（抵抗性が、独立または融合した小サブユニットの存在下で付与される場合）、または変異大サブユニットであり得、それ自体に除草剤に対する幾らかの抵抗性レベルを有する。小サブユニットの存在は、１）大サブユニットの活性を増強し、２）大サブユニットの除草剤抵抗性を増強し、３）in vivoで
発現されると、酵素の安定性を増加させ、そして、４）大サブユニットの分解に対する抵抗性を増加させる。小サブユニットは、このように、イミダゾリノンまたは他の除草剤に対する植物／穀物の抵抗性を上昇させる。抵抗性の上昇により、形質転換植物／穀物に対する植物毒性を引き起こすことなく、除草剤を適用し、および／またはその雑草制御安全率を増加することができる。理想的には、付与された抵抗性は、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン等の他のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性を増加させることなく、またはより低い程度で増加させることにより、イミダゾリノンおよび他の種類の除草剤に対する抵抗性を上昇させる。
【００９５】
除草剤抵抗形の大サブユニット遺伝子を発現する植物に、小サブユニット遺伝子を添加することにより、除草剤抵抗性を増強することに関する追加の態様
多くの場合において、タンパク質の変異は、不安定性を引き起こし得、活性を減少させ得、分解する傾向が高いことが示されている。除草剤抵抗性ＡＨＡＳ遺伝子、特に植物に由来するものは、一般に、除草剤による阻害に対する抵抗性を付与する変異を含む。これは、これらのタンパク質の安定化、活性の維持、分解に対する抵抗性において、重要度が高い。小サブユニット遺伝子が大サブユニット遺伝子に伴うことにより、これらの感受性領域を補助し得る。
【００９６】
相補的サブユニットの非存在下または非化学量論的レベルの存在下で存在する、マルチサブユニットタンパク質のサブユニットは、優先的に分解し得る。これは、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの大および小サブユニットで示されている（Ｓｐｒｅｉｔｚｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５４６０〜５４６４）。ＡＨＡＳの大サブユニット遺伝子が形質転換され、相補的小サブユニットを有さない穀物で発現されるか、または小サブユニット遺伝子の発現レベルを超えた高いレベルで発現される場合、大サブユニットタンパク質は、不安定で優先的に分解し得る。これにより、除草剤抵抗性レベルは低くなる。
【００９７】
大および小サブユニットの会合は、高度に特異的のようである。大腸菌は、３つの大サブユニットのイソ酵素および３つの小サブユニットのイソ酵素を有する。各大サブユニットのイソ酵素は、特異的に、唯１つの小サブユニットイソ酵素と会合するが、全てのサブユニットが同じ生物で発現される（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋら、１９９２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７４：５５６０〜５５６６）。この特異性により、大サブユニットが、小サブユニットのとは異なる生物またはイソ酵素対に由来する場合、内在性ＡＨＡＳ小サブユニットタンパク質は、導入されたＡＨＡＳ大サブユニットの活性を安定化または増強することができないことが示唆される。これは、除草剤抵抗性の目的において、同じ生物およびイソ酵素対に由来する大および小サブユニット遺伝子の両方の導入における重要性
を与える。小サブユニット遺伝子の発現は、これらの問題を改良し得る。
【００９８】
ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子は、ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子と組合せて、形質転換植物細胞および組織の選択マーカーとしても使用できる。任意の目的の遺伝子を、ＡＨＡＳ大および小サブユニット遺伝子を含むベクターに取込むことができる。ベクターを、ＡＨＡＳ阻害除草剤に感受性の植物細胞または組織に導入できる。これらのベクターを含む形質転換体は、標準的な技法を使用して、除草剤の存在下で選択できる。
【００９９】
例１
ＤＮＡおよびλＤＮＡ単離：ＤＮＡ単離は、製造業者により提供されたＱＩＡｇｅｎスピンミニプレップキット（５０）（ＱＩＡｇｅｎ製造番号２７１０４）および標準的な手順を使用して実施した。λＤＮＡ単離のために、ＱＩＡｇｅｎλミジキット（２５）（ＱＩＡｇｅｎ製造番号１２５４３）を製造業者のプロトコルに従って使用した。ＴＡクローニングにおいて、インビトロゲンオリジナルＴＡクローニングキット（インビトロゲン製造番号Ｋ２０００−０１）を使用し、標準的なプロトコルを実施した。
【０１００】
サブクローニング：λＤＮＡを、適切な制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したｐＵＣ１９と混合した。フェノールで抽出した後、挿入断片を、１μｌのＤＮＡリガーゼ（４単位／ｍＬ）の添加によりｐＵＣ１９とライゲートし、１７℃で一晩インキュベートした。
【０１０１】
５’ＲＡＣＥ：実験に使用した５’ＲＡＣＥは、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅用の５’ＲＡＣＥ系であり、ギブコ／ＢＲＬ（製造番号１８３７４−０５８）から得た。反応は、製造業者により提供された標準的な手順に従って実施した。
【０１０２】
スクリーニングライブラリー：クロンテックアラビドプシスλゲノムライブラリーを、製造業者により供給されたプロトコルに記載された、３０，０００プラーク／１５０ｍｍプレートの密度で塗布した。アマシャム核酸転写膜ハイボンド（登録商標）Ｎ＋（ディスク：０．１３７直径、除去等級：０．４５μｍ）を使用した。ナイロン転写膜を、注意してプレート表面に置き、膜および寒天に、無菌針を使用して印をつけた。第一膜を３分後に除去し、二重膜を、プレート表面に置き、８分後に除去した。膜を、コロニー面を上にして、変性緩衝液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｎ  ＮａＣｌ）中に浸漬した吸着ろ紙のパッド上に５分間置き、次いで、各膜を、コロニー面を上にして、中和溶液（１ＭトリスＨＣｌ、１．５Ｎ  ＮａＣｌ）に浸漬した吸着ろ紙のパッド上に５分間置いた。膜を簡潔
に、２×ＳＳＣ中で洗浄し、乾燥ろ紙に転写した。サンプルをＵＶ架橋により膜に固定し、８０℃で１時間真空で焼き固めた。次いで、膜を、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、５×デンハード溶液、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０５ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．０５％ＮａＰＰｉを含む緩衝液中で、４２℃で、２時間、プレハイブリダイズした。ＤＮＡを制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上で分画した。ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（５０）（ＱＩＡｇｅｎ製造番号２８７０４）を使用して精製した。ギブコ／ＢＲＬライフテクノロジーズランダムプライマーＤＮＡ標識システム（製造番号１８１８７−０１３）を使用して、以下の修飾を行いＤＮＡを標識した。１２５ｎｇのプローブＤＮＡを、マイクロ遠心チューブ中の５５μｌの蒸留水に溶かし、沸騰水浴中で５分間加熱することにより変性させ、氷上で直ちに冷却した。次いで、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰおよびクレノウ酵素を、変性ＤＮＡに加え、混合物を２５℃で１時間インキュベートした。１容量のホルムアミドを混合物に加え、反応液を６５℃で３０分間加熱した。標識ＤＮＡを含む反応液を、プレハイブリダイゼーション溶液に加え、膜を、４２℃で２０時間、ゆっくりと振盪しながらハイブリッドさせた。ハイブリダイゼーション後、膜を、２回、０．１％ＳＤＳを含む０．４×ＳＳＣ緩衝液中で室温で１０分間洗浄し、次いで、１回、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ緩衝液中で６５℃で３０分間洗浄した。膜をＸ線フィルムに一晩露光させた。二重膜上のＤＮＡプローブにハイブリッドしたＤＮＡを含むプラークは陽性の結果を示し、これらのプラークを単離した。手順は、単一の単離物が回収されるまで二回繰返した。
【０１０３】
配列決定：シークエンス反応は、提供されたＡＢＩプロトコルに従って、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＤＮＡシークエンスキットを使用して実施した。エタノール沈降後、ＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ鋳型抑制試薬に溶かし、９０℃で５分間変性させた。次いで、サンプルをＡＢＩ３１０シークエンサーにのせた。
【０１０４】
例２
ＡＨＡＳ大サブユニットタンパク質遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの調製
アラビドプシス由来の野生型（ｐＡＣ７７４）およびＭｅｔ９２Ｈｉｓ変異体（ｐＡＣ７８６）ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子を、ファルマシアの大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２に構築した。グルタチオントランスフェラーゼ／ＡＨＡＳ大サブユニット融合タンパク質を発現するように遺伝子を、上記したプラスミドｐＨＵＷＥ８２およびｐＨＵＷＥ８３について記載したのと同じように構築して、精製を補助した。５アミノ酸プロテアーゼ開裂部位が、２つのタンパク質の接合部にコードされ、よって精製後にそれらを切断して分離できる。アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子のｃＤＮＡ配列を含む、３つのベクター構築物を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２発現ベクターを使用して作成した。これらは、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３と称され、３つ全てが、遺伝子内に含まれるペプチド配列の量が異なっていた。Ｆ１プラスミドのＡＨＡＳｃＤＮＡによりコードされるペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（配列表の配列番号９）である。プラスミドＦ２のＡＨＡＳｃＤＮＡによりコードされるペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−（配列表の配列番号１０）である。Ｆ３プラスミドのＡＨＡＳｃＤＮＡによりコードされるペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（配列表の配列番号１１）である。全３つのペプチドのＮ末端Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−は、トロンビン開裂の残りである。
【０１０５】
ＡＨＡＳのアラビドプシス大および小サブユニットタンパク質の発現
ＤＨ５α−コンピテント細胞（ギブコＢＲＬ）を、大サブユニットプラスミドｐＡＣ７７４およびｐＡＣ７８６、並びに、小サブユニットプラスミドＦ１、Ｆ２およびＦ３で形質転換した。細胞を氷上で解凍した。１μｌの１：５希釈のプラスミドＤＮＡを、７５μｌの細胞に加え、次いで、氷上に３０分間置いた。細胞に４２℃の水浴中で９０秒間熱ショックを与え、次いで、氷上に２分間置いた。８００μｌのルリア−ベルタニ培地（ＬＢ）を、形質転換細胞を含む各チューブに加え、次いで、これを３７℃の振盪器中で１時間増殖させた。細胞を２分間遠心分離にかけ、過剰の培地を吸引した。細胞ペレットを、１００μｌのＬＢに再懸濁し、１００μｇのカルベニシリンを含むＬＢ上に一晩３７℃で塗布した。単一のコロニーを、３７５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地中に接種し、一晩３７℃の振盪器中で増殖させた。７００μｌのアリコートを取り出し、３００μｌの５０％グリセロール中に加え、次いで、液体窒素中で凍結させ、細胞ストック用に−８０℃で維持した。
【０１０６】
大サブユニットＡＨＡＳ遺伝子の精製
ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中に大サブユニット遺伝子を有する形質転換大腸菌の５０ｍｌの一晩培養液を、２％グルコース、３７５μｇ／ｍｌカルベニシリンと共に、１リットルの２×ＹＴに接種した。細胞を、５時間、３７℃の振盪器／インキュベーター中で増殖させ、次いで、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、次いで、さらに２．５時間３０℃の振盪器に入れた。細胞を、ＪＡ１０ローター中で８０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離により収集した。細胞を精製まで−２０℃でペレットとして保存した。
【０１０７】
１リットルの細胞培養液の細胞ペレットを、１０ｍｌのＭＴＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4）、ｐＨ７．３に再懸濁し（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ６７：３１〜４０、１９９８）、１００μｇ／ｍｌのリゾザイムを加えた。懸濁液を、５ｍＭジチオトレイトールに調整した。トリトンＸ−１００を、２０％トリトンＸ−１００のＭＴＰＢＳ溶液の添加により、最終濃度１％となるまで加えた。細胞を穏やかに３０℃で１５分間振盪させ、次いで、４℃まで氷上で冷却し、マイクロチッププローブ、負荷サイクル７０％、マイクロチップパルサーの最大のアウトプットコントロールを使用して、８〜１０秒間超音波処理した。超音波処理したものを、２回、Ｊ２０ローター中で、１７，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間で遠心分離し、
不溶性物質を除去した。溶解液を１５０ｍｇ（乾燥重量）のグルタチオンアガロース（ＭＴＰＢＳ中で平衡化し水和した）に加え、３０分間４℃で逆にした。アガロースを５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により静置させ、洗浄液のＡ280が、ＭＴＰＢＳのそれと一致するまで、遠心分離サイクルを反復することにより氷冷ＭＴＰＢＳで洗浄した。アガロースを、溶出のために適切なカラムに移した。融合タンパク質を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ還元グルタチオンで溶出し、１ｍｌ画分とした。各画分のＡ280をタンパク質含量について調べ、適切な画分（Ａ280＞０．１００）をプールした。プールしたサンプルに、タンパク質溶液１ｍｌあたり５単位のウシトロンビンを加えた。サンプルをＭＴＰＢＳ、３ｍＭジチオトレイトールに対して１５時間室温で透析し、融合タンパク質のタンパク質分解的開裂およびトリス−ＨＣｌおよび還元グルタチオンの除去を可能とした。透析したサンプルを、さらに２回、平衡化グルタチオンアガロースに通過させて、開裂ＧＳＴタンパク質を除去し、非切断融合タンパク質を除去した。精製サンプルを、０．０２％アジ化ナトリウムの存在下または非存在下、４℃で保存した。
【０１０８】
ＡＨＡＳの小サブユニットタンパク質の精製
形質転換されたＤＨ５細胞を培養し、ＡＨＡＳの大サブユニットを発現する細胞を集めるために使用したのと同じような方法で収集した。１リットルの培養液からの細胞ペレットを、１０ｍｌのＳＴＥ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、次いで、１００μｇ／ｍｌのリゾザイムを加えた。これを１５分間氷上に置いた。ジチオトレイトールを５ｍＭまで加え、Ｎ−ラウロイルサルコシンを、ＳＴＥの１０％ストック液から最終濃度１．５％となるまで加えた。細胞に１０秒間ボルテックスをかけた。溶解液を氷上で８〜１０秒間、マイクロチッププローブ、負荷サイクル７０％、マイクロチップパルサーの最大のアウトプットコントロールを使用して、８〜１０秒間超音波処理した。超音波処理したものを、２回、ＪＡ２０ローター中で、４℃で、１７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不溶性物質を除去した。上清を２００ｍｇ（乾燥重量）のグルタチオンアガロース（ＭＴＰＢＳ中で平衡化し水和した）に加え、２０分間４℃で逆にした。アガロースを、５００ｒｐｍで５分間遠心分離して静置させ、上清を吸引した。アガロースを、洗浄液のＡ280が、ＭＴＰＢＳのそれと等しくなるまで、遠心分離サイクルを反復することにより氷冷ＭＴＰＢＳで洗浄した。アガロースを、溶出のために適切なカラムに移した。融合タンパク質を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ還元グルタチオン、５ｍＭジチオトレイトール、および２％Ｎ−オクチルグルコシドで溶出し、１ｍｌ画分を集めた。各画分の２８０ｎｍの吸光度を調べ、適切な画分（Ａ280＞０．１００）をプールした。サンプルを、ＭＴＰＢＳ、３ｍＭジチオトレイトールに対して１５時間４℃で透析し、還元グルタチオン、トリス−ＨＣｌ、およびＮ−オクチルグルコシドを除去した。ＳＤＳを、１％のＨ2Ｏ中ストック溶液から０．００５％となるまで加えた。タンパク質溶液１ｍｌあたり５単位のウシトロンビンを加え、サンプルを、室温で３０〜４５分間穏やかに振盪し、融合タンパク質のタンパク質分解的開裂を可能にした。次いで、サンプルを直ちに、Ｅｔｒａｃｔｉゲル−Ｄ洗浄アフィニティーカラム（ピアス）に通過させ、ＳＤＳを除去した。切断サンプルを４℃で貯蔵するか、または２回、再平衡グルタチオンアガロースを通過させて、ＧＳＴおよび非切断融合タンパク質を除去した。精製サンプルを４℃で保存した。
【０１０９】
タンパク質濃度の決定
タンパク質溶液のアリコートを、５％トリクロロ酢酸に調整し、氷上に２０分間置き、タンパク質を沈降させた。次いで、アリコートを１０分間４℃で高速遠心分離し、沈降物をペレット化した。ペレットを等量の３％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム、０．１Ｎ  ＮａＯＨに再懸濁した。ピアスＢＣＡタンパク質アッセイを使用して、タンパク質溶液の濃度を決定した。ウシ血清アルブミンを、３％炭酸ナトリウム、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で調製した。
【０１１０】
ＡＨＡＳアッセイ。ＡＨＡＳアッセイは、Ｓｉｎｇｈら（Ｓｉｎｇｈら、１９８８）に記載されたものを僅かに修飾して実施した。ＡＨＡＳ活性を、１×ＡＨＡＳアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭピルベート、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＴＰＰ、および５０μＭ  ＦＡＤ）中でアッセイした。１×アッセイ緩衝液の最終濃度は、２×アッセイ緩衝液中に抽出された酵素の希釈により、または、酵素を添加して、最終濃度１×ＡＨＡＳアッセイ緩衝液を作成することにより得られた。ｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒおよび関連した対照を含む全アッセイは、５０％ＤＭＳＯ溶液として混合物をアッセイするために、ｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒの添加により、最終濃度５％のＤＭＳＯを含んだ。アッセイは、２５０μＬの最終容量で３７℃でマイクロタイタープレート中
で実施した。
【０１１１】
例３
ジチオトレイトールの効果。リン酸緩衝食塩水（ＭＴＰＢＳ）中のジチオトレイトール（ＤＴＴ）の、ＡＨＡＳ大サブユニット酵素活性に対する効果を測定した。実験は、３ｍＭ  ＤＴＴの存在下または非存在下で、大サブユニットの精製タンパク質溶液中で実施した。アッセイは上記のように実施した。結果は図５および６に示す。図５から分かるように、図６と比較して、ＡＨＡＳ大サブユニットの触媒活性は、ＤＴＴにより劇的に増強される。さらに、ＤＴＴの非存在下で、大サブユニット活性は、４日間の期間におよび分解した（図６）。アラビドプシス大サブユニットは、３ｍＭ  ＤＴＴの存在下で、１ヶ月の期間、４℃で貯蔵した場合に非常に安定であることが判明した。
【０１１２】
他のスルフヒドリル還元体も試験したが、ＤＴＴが、還元グルタチオンおよびβ−メルカプトエタノールよりも良好に、酵素を、安定化および活性化するようであった。ＤＴＴによる酵素の活性化のために、小サブユニット酵素によるＡＨＡＳ大サブユニット酵素の活性化を検討する全ての実験は、ＤＴＴまたは他のスルフヒドリル還元剤の非存在下で、または３ｍＭの一定濃度のＤＴＴで実施した。
【０１１３】
ウシ血清アルブミンの効果。大サブユニットの増強が、小サブユニットに特異的であるかを決定するために、ウシ血清アルブミンの効果を試験する、別の非特異的な対照も実施した。一定量の大サブユニットに、漸増量の０．２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を加えた。結果は図７に示す。図７から分かるように、ＢＳＡの試験サンプルへの添加により、ＡＨＡＳの大サブユニットタンパク質の触媒活性の、有意でははないが、僅かな、プラトー増加が引き起こされた。
【０１１４】
例４
以下の実験は、上記の例２に記載したように精製した小サブユニットおよび大サブユニットタンパク質を使用した。アラビドプシスに由来するＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子を含むプラスミドＦ１を、大腸菌で発現させ、部分的に精製した。サンプルのタンパク質濃度を決定し、漸増濃度のアリコートを一定量の精製アラビドプシス大サブユニットに加えた。
【０１１５】
図８は、アラビドプシス小サブユニットタンパク質の添加による、野生型アラビドプシスＡＨＡＳ大サブユニットの活性化を示す。ＡＨＡＳアッセイは、上記のように実施し、図８に示した結果は、小サブユニットタンパク質が、触媒大サブユニットの酵素活性のレベルを増強することを示す。ＡＨＡＳの大サブユニットタンパク質の活性化は、野生型大サブユニットおよび大サブユニットの除草剤抵抗性変異体の両方で示される。
【０１１６】
別の実験において、大サブユニット酵素の除草剤抵抗性変異体（１２４位での置換変異、メチオニンをヒスチジンにより置換）を使用した。図９に示した結果は、大サブユニットの除草剤抵抗形の酵素活性も増強されることを示す。
【０１１７】
例５
アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニットゲノムＤＮＡを含む、図１０に示した、植物形質転換ベクターｐＨＵＷＥ６７を以下のように構築した。アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子（ｐＭＳｇ６）の５．６ｋｂゲノム断片を含む、図１に示したｐＵＣ１９ベクターをＳａｌＩで切断した。プロモーターおよびイントロンを含む、全アラビドプシスＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子（図２参照）を含む５．６ｋｂ断片を、アガロースゲル電気泳動によりベクターから分離した。断片をアガロースゲルから切出し、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（製造番号２８７０６）を使用して、製造業者により提供された手順に従って精製した。アグロバクテリウムをベースとした形質転換ベクターのｐＢＩＮ１９をＳａｌＩで切断した。ベクターを、フェノール：クロロホルム抽出により精製した。精製
したベクターを、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して脱リン酸化し、フェノール：クロロホルムで再抽出した。ベクターおよびゲノム挿入断片をライゲートし、構築物を含むライゲート混液を使用して、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。大腸菌をカナマイシンプレート上で選択し、プラスミドを、形質転換大腸菌から抽出した。ベクター構築物を、ＰＣＲ産物を作成し、産物を、例１に記載したシークエンス手順を使用してシークエンスすることにより確認した。従って、ｐＨＵＷＥ６７（図１０）と称されるベクターは、ｐＢＩＮ１９プラスミドに融合した、ＡＨＡＳプロモーター、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および３’−ターミネーターを含む、ＡＨＡＳゲノムＤＮＡを含む、５．６ｋｂ断片を含む。このベクター構築物は、標準的な技法を使用して、アグロバクテリウムをベースとした植物の形質転換に使用する。
【０１１８】
図１１Ａ〜１１Ｅに示した植物形質転換ベクターは、標準的なクローニング手順に従って、上記のベクターｐＨＵＷＥ６７と同じように構築する。図１１Ａ〜１１Ｅにおいて、ベクターは、ＡＨＡＳ小サブユニットｃＤＮＡ、断片、ゲノム断片または変異体を含み得る。図１１Ｂにおいて、ベクターはさらに、遺伝子挿入断片の上流に作動可能に連結されたＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターを含む。この実施形態において、アラビドプシス小サブユニット遺伝子はターミネーターを含む。
【０１１９】
図１１Ｃにおいて、ベクター構築物は、直列的にＡＨＡＳ小および大サブユニット遺伝子を含み、大サブユニット遺伝子は、小サブユニット遺伝子の下流にある。両方の遺伝子が、遺伝子挿入断片の上流に位置する、ＡＨＡＳ小サブユニットプロモーターにより調節される。ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子は、除草剤抵抗性変異対立遺伝子である。
【０１２０】
図１１Ｄにおいて、植物発現ベクターは、それ自体のプロモーターの制御下に
、大および小サブユニット遺伝子を含む。転写終結シグナルは、ＡＨＡＳ小サブユニットターミネーターにより提供される。ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子は、イミダゾリノンなどの除草剤に対する抵抗性を付与する。
【０１２１】
図１１Ｅのベクターは、図１１Ｃに示したベクターに類似している。しかし、このベクターには、ＡＨＡＳ大および小サブユニット遺伝子は、構築物中で位置が逆である。この例でのＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子は、小サブユニット遺伝子の上流にある。ＡＨＡＳ大サブユニット遺伝子は、除草剤抵抗性変異対立遺伝子である。
【０１２２】
本発明の技法に基づき、および以下の厳密なＤＮＡハイブリダイゼーション技法に従って、相同的ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列を、コメ、メイズ、小麦、大麦等の様々な植物種から得ることができる。それ故、これらのＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子配列はまた、植物を形質転換するための本発明のベクターおよび方法にも有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ．１１Ｂ】
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【図１１Ｃ．１１Ｄ．１１Ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月21日(2010.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物アセトヒドロキシ酸シンテターゼ、すなわちＡＨＡＳの小サブユニットタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列。
【外国語明細書】
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