(57)【要約】【課題】  マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ正確に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供する。【解決手段】  搬送媒体とともに卵子１３を搬送する卵子搬送流路１２と、この卵子搬送流路１２に接続され卵子１３を係留するためのＶ字形状を有する卵子捕捉流路１６と、卵子捕捉流路１６に接続され卵子捕捉流路１６に係留された卵子１３にカップリングするためのドナー細胞１５を搬送媒体とともに搬送するドナー搬送流路１４と、カップリング後の卵子１３及びドナー細胞１５を搬送媒体とともに搬送する搬出搬送流１８とを設ける。卵子捕捉流路１６は、Ｖ字形状の両端がそれぞれ卵子搬送流路１２と搬出搬送流１８とに接続されるとともにＶ字形状の中央の屈曲部１６ｃがＶ字形状の両端より幅が狭くなっており、ドナー搬送流路１４は、卵子捕捉流路１６の卵子１３が係留される部分に接続されている。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路内の搬送媒体中で第１の細胞と第２の細胞とのカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、
前記搬送媒体とともに前記第１の細胞を搬送する第１の搬送流路と、
該第１の搬送流路に接続され前記第１の細胞を係留するためのＶ字形状を有する捕捉流路と、
該捕捉流路に接続され前記捕捉流路に係留された前記第１の細胞にカップリングするための前記第２の細胞を搬送媒体とともに搬送する第２の搬送流路と、
カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を搬送媒体とともに搬送する第３の搬送流路と
を備え、
前記捕捉流路は、Ｖ字形状の両端がそれぞれ第１の搬送流路と第３の搬送流路とに接続されるとともにＶ字形状の中央の屈曲部がＶ字形状の両端より幅が狭くなっており、前記第２の搬送流路は、前記捕捉流路の前記第１の細胞が係留される部分に接続されていることを特徴とする細胞カップリングモジュール。
【請求項２】
前記捕捉流路は、Ｖ字形状の前記第１の搬送流路に接続された端部からＶ字形状の中央の屈曲部に向かって次第に幅が狭くなるテーパー状である請求項１記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項３】
前記第１の細胞の直径をｄとした場合に、前記捕捉流路のＶ字形状の中央部の幅Ｂが、０．７ｄ≦Ｂ＜ｄの範囲である請求項１又は２記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項４】
前記第１の搬送流路、前記捕捉流路、前記第２の搬送流路及び前記第３の搬送流路は、それぞれ断面が矩形である請求項１乃至３の何れかに記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項５】
前記第１の細胞が卵子であり、前記第２の細胞がドナー細胞である請求項１乃至４の何れかに記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れかに記載の細胞カップリングモジュールと、
前記第１の搬送流路に前記第１の細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記第２の搬送流路に前記第２の細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第２の送液ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。
【請求項７】
前記捕捉流路における画像を撮像する画像センサと、
該画像センサで撮像された画像に基づいて、前記第１の送液ポンプ及び前記第２の送液ポンプの送液をコントロールするコントローラと
を更に備えたことを特徴とする請求項６記載の細胞カップリング装置。
【請求項８】
請求項１乃至５の何れかに記載の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、
前記第１の搬送流路に前記搬送媒体を送出して前記捕捉流路内に前記第１の細胞を搬送し、
前記第１の細胞が前記捕捉流路のＶ字形状中央の屈曲部に到達して係留された時点で前記第１の搬送流路からの前記搬送媒体の送出を低減又は停止し、
前記第２の搬送流路に前記搬送媒体を送出して前記第２の細胞を前記捕捉流路に係留されている前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記第１の搬送流路及び／又は前記第２の搬送流路から前記搬送媒体を送出してカップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を第３の搬送流路に搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関し、更に詳細には、クローン胚の作出、細胞融合などに際して、簡便にしかも確実に細胞同士をカップリングさせることができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学の分野を中心に微小流路をガラス基板やプラスチック基板に形成し、その微小閉空間内で化学反応を起こすマイクロ（化学）チップが開発されている。特にDNAのPCR（Polymerase Chain Reaction）法の応用として従来技術と比較し、数倍〜十数倍の高速分離検出が可能となり、多くの製品開発がされている（例えば、非特許文献１参照。）。現在その応用先は生化学反応を中心とした応用であり、細胞の分離や加工といった細胞単体の個別搬送、個別加工といった技術は、確立されていない。
【０００３】
ところで、クローン技術の確立は今後の医療・化学産業を革新的に変化させると期待される技術である。ファンクショナルジェノミクスの分野では、遺伝子影響を調べるために特定の遺伝子を持ったマウス（ＫＯマウス）を作成し、様々な創薬や治療の研究に使われている。ＫＯマウスの作成方法では主に、ＥＳ細胞からキメラマウスを作り、その子孫からＫＯマウスを作成する方法が取られているが、安定したクローン技術により、ＥＳ細胞から直接クローン技術でＫＯマウスを作る方法や、体細胞で遺伝子をＫＯしクローンマウスを作る方法が有用となってくる。特に、ＥＳ細胞が樹立されていない動物種やマウスの系統では体細胞からのクローン体の作成は非常に有効である。一方で、現状のクローニングにおける核移植作業は、移植工程中に多くの手作業が含まれており（例えば、非特許文献２参照。）、研究の効率化、妥当な評価の障害になっている。例えば、移植後の卵細胞に対し、添加薬品の効果を比較する場合、手作業による卵子の損傷のばらつきが大きいと薬品の効果を正確に評価することができない。
【０００４】
このように自動化による研究の省力化と実験条件の安定化はファンクショナルジェノミクスの技術発展に必要不可欠であり、また、今後の産業化を考慮する上でも作業の自動化は重要であることに鑑み、種々の検討が行われている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００６−３２５４２９号公報
【非特許文献１】ANDREW J.DEMELLO, “Microfluidics: DNA amplification moves on”, Nature 422, 28-29 (06March 2003); doi:10.1038/422028a.
【非特許文献２】T. WAKAYAMA,A. C. F. PERRY, M. ZUCCOTTI, K. R. JOHNSON, R. YANAGIMACHI, “Full-termdevelopment of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei”,Nature 394, 369-374 (23 July 1998); doi:10.1038/28615.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ正確に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞カップリングモジュールは、マイクロ流路内の搬送媒体中で第１の細胞と第２の細胞とのカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、前記搬送媒体とともに前記第１の細胞を搬送する第１の搬送流路と、該第１の搬送流路に接続され前記第１の細胞を係留するためのＶ字形状を有する捕捉流路と、該捕捉流路に接続され前記捕捉流路に係留された前記第１の細胞にカップリングするための前記第２の細胞を搬送媒体とともに搬送する第２の搬送流路と、カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を搬送媒体とともに搬送する第３の搬送流路とを備え、前記捕捉流路は、Ｖ字形状の両端がそれぞれ第１の搬送流路と第３の搬送流路とに接続されるとともにＶ字形状の中央の屈曲部がＶ字形状の両端より幅が狭くなっており、前記第２の搬送流路は、前記捕捉流路の前記第１の細胞が係留される部分に接続されていることを特徴とする。
【０００７】
細胞はある程度変形させてもその機能に障害になく元に戻るという復元性があるため、本発明ではその特性を利用して、Ｖ字形状を有する捕捉流路の中央の屈曲部で第１の細胞を係留し、第２の搬送流路から第２の細胞を搬送することにより、第１の細胞に第２の細胞を容易にカップリングさせることができる。
【０００８】
ここで、前記捕捉流路は、Ｖ字形状の前記第１の搬送流路に接続された端部からＶ字形状の中央の屈曲部に向かって次第に幅が狭くなるテーパー状であることが好ましい。
【０００９】
また、前記第１の細胞の直径をｄとした場合に、前記捕捉流路のＶ字形状の中央部の幅Ｂが、０．７ｄ≦Ｂ＜ｄの範囲であることが好ましく、０．８ｄ≦Ｂ≦０．９５ｄの範囲であることがより好ましい。
【００１０】
前記第１の搬送流路、前記捕捉流路、前記第２の搬送流路及び前記第３の搬送流路は、それぞれ断面が矩形とすることができる。これにより、例えばリソグラフィーなどにより容易にマイクロ流路を形成することができる。また、捕捉流路の断面が矩形であれば、ほぼ球形の細胞を係止する場合にも矩形の角の部分から搬送媒体が流れることが可能であるため、第１の細胞によって完全に捕捉流路が閉塞されてしてしまうことを防止することができる。
【００１１】
本発明の細胞カップリングモジュールは、前記第１の細胞が卵子であり、前記第２の細胞がドナー細胞である場合に好適である。
【００１２】
本発明の細胞カップリング装置は、上記の細胞カップリングモジュールと、前記第１の搬送流路に前記第１の細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、前記第２の搬送流路に前記第２の細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第２の送液ポンプとを備えたことを特徴とする。
【００１３】
第１の送液ポンプの送液を調節することにより、第１の細胞の移動、停止等の制御が可能となる。また、第２の送液ポンプの送液を調節することにより、第２の細胞の移動、第１の細胞とのカップリング、停止等の制御が可能となる。
【００１４】
また、本発明の細胞カップリング装置は、前記捕捉流路における画像を撮像する画像センサと、該画像センサで撮像された画像に基づいて、前記第１の送液ポンプ及び前記第２の送液ポンプの送液をコントロールするコントローラとを更に備えた構成とすることが可能である。
【００１５】
このように、画像センサとコントローラとを備えた構成により、細胞のカップリングを自動化することが可能となる。
【００１６】
本発明の細胞カップリング方法は、上記の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、前記第１の搬送流路に前記搬送媒体を送出して前記捕捉流路内に前記第１の細胞を搬送し、前記第１の細胞が前記捕捉流路のＶ字形状中央の屈曲部に到達して係留された時点で前記第１の搬送流路からの前記搬送媒体の送出を低減又は停止し、前記第２の搬送流路に前記搬送媒体を送出して前記第２の細胞を前記捕捉流路に係留されている前記第１の細胞にカップリングさせ、前記第１の搬送流路及び／又は前記第２の搬送流路から前記搬送媒体を送出してカップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を第３の搬送流路に搬送することを特徴とする。
【００１７】
このように、第１の搬送流路における搬送媒体の送出を調節して第１の細胞の移動、係留等を行い、第２の搬送流路における搬送媒体の送出を調節して第２の細胞を係留されている第１の細胞にカップリングさせることができるので、複雑な機構を設けることなく、細胞のカップリングを容易に行うことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を使用すれば、複雑な機構を設けることなく、第１の搬送流路における搬送媒体の送出を調節することにより第１の細胞を確実に捕捉流路の中央の屈曲部に係留することができる。続いて、第２の搬送流路における搬送媒体の送出を調節することにより、第２の細胞を第１の細胞に確実かつ簡便にカップリングさせることができる。これにより、簡便かつ確実に細胞カップリングを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本実施形態では、卵子からクローン胚を作出する際の操作を例として説明する。クローン胚の作出に際しては、卵子の透明帯が除去された後、卵子が二分割され、分割されたうちの核の無い方にドナー細胞がカップリングされる。
【００２０】
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。本実施形態の細胞カップリング装置は、マイクロ流路１１を形成した細胞カップリングモジュール１０と、培地、生理食塩水などの搬送媒体を送出する卵子用送液ポンプ２０及びドナー用送液ポンプ２２と、卵子用送液ポンプ２０及びドナー用送液ポンプ２２の送液量（速度）を制御するコントローラ２４と、マイクロ流路１１の画像を撮像する画像センサ２８と、マイクロ流路１１の画像の監視と装置全体の運転状況を表示及び監視するためのモニタ２６とを備えている。
【００２１】
本実施形態における細胞カップリングモジュール１０の詳細を図２に示す。本実施形態の細胞カップリングモジュール１０には、図１及び図２に示すように、卵子１３（二分割された卵子のうちの核の無い方をいう。以下同様。）を搬送媒体とともに搬送する卵子搬送流路１２（第１の搬送流路）と、卵子搬送流路１２に続くＶ字形状を有する卵子捕捉流路１６と、卵子にカップリングするためのドナー細胞を搬送媒体とともに搬送するドナー搬送流路１４（第２の搬送流路）と、カップリング後の卵子及びドナー細胞を搬送媒体とともに搬出する搬出搬送流路１８（第３の搬送流路）とを有している。本実施形態では、卵子捕捉流路１６は、Ｖ字形状の卵子搬送流路１２に接続された端部からＶ字形状の中央の屈曲部１６ｃに向かって次第に幅が狭くなるテーパー状に形成されているとともに、Ｖ字形状の搬出搬送流路１８に接続された端部からＶ字形状の中央の屈曲部１６ｃに向かって次第に幅が狭くなるテーパー状に形成されている。本実施形態では、マイクロ流路１１は、卵子搬送流路１２、卵子捕捉流路１６、ドナー搬送流路１４及び搬出搬送流路１８によって構成されている。
【００２２】
本実施形態におけるマイクロ流路１１は、以下のようにして作成される。まず、基板上にリソグラフィー用の光硬化剤（レジスト）の塗膜を形成し、次に、フォトマスクを用いてマイクロ流路１１の形状の部分に光照射して硬化させる。更に、未照射の部分を除去することにより、マイクロ流路１１の形状の凸状パターンを基板上に形成する。次に、このパターンを覆って基板上にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を塗布し、これを硬化させた後に基板から取り外することにより、凹状のマイクロ流路１１が形成された細胞カップリングモジュール１０が得られる。このようにして作成したマイクロ流路１１の断面形状はほぼ矩形であり、例えば０．０５ｍｍ×０．０５ｍｍ〜０．２ｍｍ×０．２ｍｍの形状である。
【００２３】
本実施形態におけるマイクロ流路１１の形状について、図２を参照しながら説明する。通常、卵子１３の径（ｄ）は、通常約８０〜約１２０μｍであるが、本実施形態ではｄ＝１００μｍの卵子を用いた。卵子搬送流路１２の幅（Ｗ）は、卵子１３の移動を妨げる大きさでなければ特に制限はないが、本実施形態ではＷ＝２００μｍ（＝２ｄ）とした。また、卵子捕捉流路１６の卵子搬送流路１２の側面からの突出長さ（Ａ）は、Ａ＝１００μｍ（＝ｄ＝１／２Ｗ）である。また、Ｖ字形状の一方の幅（Ｃ1又はＣ2）は、Ｃ1＝Ｃ2＝２００μｍ（＝Ｗ）とした。更に、卵子捕捉流路１６の屈曲部１６ｃのＶ字形状の中央部の幅（Ｂ）は、Ｂ＝９０μｍ（０．９ｄ）とした。また、ドナー搬送流路１４は卵子捕捉流路１６の凸側の側面１６ｂに対して直角に設けられ、卵子捕捉流路１６の凹側の頂部１６ａから側面１６ｂに対して直角に降ろした線の距離Ｄが最小となる位置に設けられている。
【００２４】
本実施形態では、図１に示すように、卵子搬送流路１２には卵子用送液ポンプ２０から搬送媒体が送出される。卵子用送液ポンプ２０からの搬送媒体の送出量は、０．５〜１μｌ／分である。また、ドナー搬送流路１４にはドナー用送液ポンプ２２から搬送媒体が送出される。ドナー用送液ポンプ２２からの搬送媒体の送出量は、０．０５〜０．１μｌ／分である。卵子用送液ポンプ２０及びドナー用送液ポンプ２２からの搬送媒体の送出量は、画像センサ２８からの卵子捕捉流路１６の画像に基づいてコントローラ２４により制御されている。
【００２５】
以上の構成を有する装置における細胞カップリング方法について説明する。まず、卵子用送液ポンプ２０及びドナー用送液ポンプ２２から搬送媒体を送出し、マイクロ流路１１のすべてを搬送媒体で満たす。次に、マイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて卵子１３を卵子搬送流路１２に導入する。なお、卵子１３及び後述するドナー細胞１５は、接着性を高めるために予めＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で処理してある。
【００２６】
次に、卵子用送液ポンプ２０からの搬送媒体の送出を開始する。画像センサ２８からの画像により、図３に示すように、卵子１３が卵子捕捉流路１６の中央の屈曲部１６ｃに係止されたことが検出されると、卵子用送液ポンプ２０からの搬送媒体の送出量を低減し又は停止する。ここで、卵子１３はある程度変形させても元に戻るという復元性を有しているので、図３に示すように変形して屈曲部１６ｃに保持されても、機能的に障害が生じることはない。
【００２７】
次に、ドナー搬送流路１４にマイクロピペット、ガラス毛細管などを用いてドナー細胞１５を導入する。続いて、ドナー用送液ポンプ２２からの搬送媒体の送出を開始する。画像センサ２８からの画像により、ドナー細胞１５がドナー搬送流路１４内を移動して卵子１３まで到達した後、ドナー細胞１５が卵子１３に接着したことが確認されると、再び卵子用送液ポンプ２０からの搬送媒体の送出が開始される。これにより、互いに接着した卵子１３及びドナー細胞１５は、搬送媒体の圧力により、変形しつつ搬出搬送流路１８に押し出されることとなる。押し出された卵子１３及びドナー細胞１５は、搬出搬送流路１８からマイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて取り出される。以上により、本実施形態の細胞カップリング装置を用いた卵子１３とドナー細胞１５とのカップリングが完了する。
【００２８】
本実施形態の細胞カップリング装置では、卵子用送液ポンプ２０及びドナー用送液ポンプ２２による搬送媒体の送出量の制御のみによって卵子１３とドナー細胞１５とのカップリングが行われるので、特にメカニカルな機構を用いることなく、簡便かつ確実にカップリング操作を行うことが可能である。また、卵子用送液ポンプ２０及びドナー用送液ポンプ２２として特に送液精度の高いものを使用する必要がないので、安価にカップリング装置を構築することが可能である。
【００２９】
なお、上記で説明した実施形態では、第１の細胞が分割した卵子であり、第２の細胞がドナー細胞である場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、２つの細胞をカップリングする操作について適用することができる。その場合、第１の細胞及び第２の細胞の大きさに応じて、第１の搬送流路、第２の搬送流路、捕捉流路及び第３の搬送流路の幅を変更する必要があることは言うまでもない。
【００３０】
また、本実施形態では、マイクロ流路１１の断面形状が矩形の場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、断面が矩形以外の例えば円形であっても差し支えない。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法は、細胞融合、クローン家畜生産などに有用なので、バイオ産業、畜産業などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。
【図２】図１における細胞カップリングモジュールの平面図である。
【図３】図２の細胞カップリングモジュールにおける細胞のカップリング方法を示す説明図である。
【符号の説明】
【００３３】
１０  細胞カップリングモジュール
１１  マイクロ流路
１２  卵子搬送流路（第１の搬送流路）
１３  卵子（第１の細胞）
１４  ドナー搬送流路（第２の搬送流路）
１５  ドナー細胞（第２の細胞）
１６  卵子捕捉流路（捕捉流路）
１６ｃ  屈曲部
１６ｂ  側面
１６ａ  頂部
１８  搬出搬送流路（第３の搬送流路）
２０  卵子用送液ポンプ
２２  ドナー用送液ポンプ
２４  コントローラ
２８  画像センサ
２６  モニタ
【図１】
2010051176.tif 000003
【図２】
2010051176.tif 000004
【図３】
2010051176.tif 000005