(57)【要約】【課題】安全、迅速、かつ安価なワルファリン投与量の決定を可能にする、ワルファリンの感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法を提供する。【解決手段】薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む、遺伝子型を判定する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、
前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、
前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む、遺伝子型を判定する方法。
【請求項２】
前記固形試験試料が血液を乾燥させたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固形試験試料が毛根である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子を同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
判定された遺伝子型の情報が、抗血液凝固剤ワルファリンの投与量の決定に用いられるものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血液凝固剤ワルファリンに対する感受性に関連する薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を含む固形被検試料から、当該固形被検試料に含まれる遺伝子の遺伝子型を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワルファリン（warfarin）は、経口投与可能な抗血液凝固剤（抗血栓薬）として知られており、脳血栓、脳梗塞、心筋梗塞などの原因となる脳や心臓の血管に血栓ができやすい状態を改善したり、手術後の血栓形成を予防する目的で投与されている。ワルファリンは、下記化学構造式で表わされる化合物であり、Ｓ体とＲ体のラセミ体が存在し、Ｓ体はＲ体の約３倍の抗血液凝固活性を有する。
【０００３】
【化１】
2010200670.tif 000003
【０００４】
薬を投与した際、ヒトは薬物代謝酵素の働きの相互作用により、薬の効能が発揮される。たとえば、日本人の約９６％においては、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ：Cytochrome Pigment）ファミリーに属する薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の働きによって、投与されたワルファリンは、効能が消失する、下記化学構造に代謝され、ワルファリンの血中濃度が期待数値で変動する。
【０００５】
【化２】
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【０００６】
しかしながら、日本人の約４％はこのＣＹＰ２Ｃ９の活性が低く、１％に至ってはこの代謝が１／１０に満たない。なお、このワルファリンの維持量は、人種間でも差があり、白人はアジア人の約１．４倍の維持量であることも知られている。たとえばMajid Moridani et al., "Frequency of CYP2C9 polymorphisms affecting warfarin metabolism in a large anticoagulant clinic cohort", The Canadian Societ of Clinical Chemists, (2006), p.606-612（非特許文献１）では、ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子型のワルファリン代謝への影響に関する研究報告がなされている。また、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１（Vitamin K Epoxide Reductase Complex Subunit 1）の遺伝子型もワルファリンの代謝に影響することが知られており、たとえばKyoko Obayashi et al., "VKORC1 gene variations are the major contributors of vatiation in warfarin dose in Japanese patients", the American Society of Clinical Pharmacology and Therapeutics., (2006), p169-178（非特許文献２）などで報告されている。
【０００７】
このようにワルファリンは、同じ量を投与してもある患者では血栓ができ（効果が得られていない）、また別な患者では血管を破り出血するなどの事故が起こる（効果が強すぎる）というように、効き方に大きな個人差があるため、服薬管理が非常に難しい薬剤である。このような事故を未然に防止するため、従来は、ワルファリン投与後のプロトロンビン時間国際標準化比（ＰＴ−ＩＮＲ：Prothrombin Time−International Normalized Ratio）をモニターし、投与量の調節が行われている。しかし、この方法では、ワルファリンの投与量を決定するまでに頻繁な検査と投与量の調節が必要であり、相当な時間と費用を必要とするものであった。
【０００８】
ところで、生物の個体間では、野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ：Single Nucleotide Polymorphism）が存在し、この遺伝子多型は、個体の基礎代謝、性質、疾患等の差異を生じさせることがしられている。したがって、個体のＤＮＡの特定遺伝子において変異が生じているか否かを検査することについて、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などを利用したさまざまな研究が進められている（たとえば特開２００５−２４５２７２号公報（特許文献１）など参照）。生物における遺伝子多型を検査することは、将来生じうる疾患等を予測することが臨床的にも重要視されている。しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製等が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。
【０００９】
また生体から少量の血液などを採取し、その血液を直接利用して特定遺伝子を増幅して検出するための簡便なＰＣＲ法などなどが開発されている（たとえば特表２００８−５３１０３９号公報（特許文献２）など参照）。
【００１０】
近年、臨床での応用が期待される薬物代謝酵素遺伝子のＳＮＰも多く見出されている。これらの遺伝子にその酵素活性を低下させるようなＳＮＰがあると、薬剤の血中濃度が長時間に渡って高く保たれた結果、効果が強く発現したり、有毒な中間代謝産物が蓄積されたりする副作用がある。また、代謝速度の高い遺伝子多型が見出されたならば、薬剤の血中濃度を維持するために投薬量を増やすなどの処置が必要となる。そこで、投薬前にこのような遺伝子のＳＮＰを検査し、その遺伝子の型から判断して適切な薬剤の投薬量を決定するなどして、副作用を回避し、効率的な治療効果を得ようとする医療、すなわち、「テーラーメイド医療」、「オーダメイド医療」、あるいは「個別化医療」と呼ばれている患者個々の体質に応じたより適切な医療の実現が可能となり、無用な副作用への対処や不適切な投薬を減らすことによって医療費削減への効果も期待できる。このように、ＳＮＰを利用した診断の実用化と普及が大いに期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−２４５２７２号公報
【特許文献２】特表２００８−５３１０３９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Majid Moridani et al., "Frequency of CYP2C9 polymorphisms affecting warfarin metabolism in a large anticoagulant clinic cohort", The Canadian Societ of Clinical Chemists, (2006), p.606-612
【非特許文献２】Kyoko Obayashi et al., "VKORC1 gene variations are the major contributors of vatiation in warfarin dose in Japanese patients", the American Society of Clinical Pharmacology and Therapeutics., (2006), p169-178
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、安全、迅速、かつ安価なワルファリン投与量の決定を可能にする、ワルファリンの感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の遺伝子型判定方法は、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明における固形試験試料は、血液を乾燥させたものであるか、または、毛根であることが望ましい。
【００１６】
本発明の遺伝子型判定方法は、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子を同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定するものであることが、好ましい。
【００１７】
本発明において、判定された遺伝子型の情報が、抗血液凝固剤ワルファリンの投与量の決定に用いられるものであることが、好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、安全、迅速、かつ安価なワルファリン投与量の決定を可能にする、ワルファリンの感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の好ましい一例を模式的に示す図である。
【図２】血液凝固因子とビタミンＫサイクルを模式的に示す図である。
【図３】ワルファリンの維持用量と頻度との関係を示すグラフである。
【図４】実施例１のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を示す電気泳動写真である。
【図５】実施例１のＡＳＰ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、本発明の好ましい一例を模式的に示す図である。本発明は、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む。以下、図１を参照しながら、本発明の方法について詳細に説明する。
【００２１】
図１に示す例では、まず、直接固形被検試料を採取するか、または液状物を乾燥することで、ワルファリンの投与対象となる患者から、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の少なくともいずれかの遺伝子を含む固形被検試料を採取する。
【００２２】
直接固形被検試料を採取する場合、ワルファリンの投与対象となる患者の毛根、口腔粘膜および細胞組織から選ばれる固形物を、固形被検試料として直接次の工程に供する。なお、毛根は、毛髪、眉毛、鼻毛、ひげ、陰毛、腋毛を含む全ての体毛由来のものであれば特に限定されない。毛根は、根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みをともなわない採取が可能であり、口腔粘膜は口中に皮膚を綿棒などで軽くこすることで痛みをともなわず採取することが可能である。また、口腔粘膜は、採取後そのまま室温に置くことで乾燥させた固形状態のものであってもよい。細胞組織については、そのまま用いられる程度に乾燥していることが好ましく、水分含有量は０％以上５０％未満であることが特に好ましい。また、細胞組織については、細かく粉砕されることが好ましい。
【００２３】
また液状物を乾燥されることで固形被検試料を採取する場合、ワルファリンの投与対象となる患者の鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、精液および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで得られる固形物を次の工程に供する。ここで、液状物に含まれる細胞組織は、水分含有量が５０％以上のものを示すものとする。なお、上述した口腔粘膜も、適宜乾燥させた後に用いても良い。
【００２４】
ここで、液状物を乾燥させる方法としては、ろ紙に該液体状の試料をしみこませ、水分を蒸発させる方法や、自然乾燥または凍結乾燥など、公知の乾燥方法を選ぶことができる。ただし、糞便由来の固形被検試料を得るためには、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉し１時間以上保持することが好ましい。植物繊維体とは、紙、綿などの植物性の繊維体をいうものとする。
【００２５】
液状体を乾燥させて固形被検試料とすることで、液状体にもともと含まれるプロテアーゼ、アミラーゼおよびヌクレアーゼなどの酵素活性を阻害することができ、生体組織細胞、微生物およびウイルスを完全に死滅させることなく生命活動を休止させることができる。したがって、固形被検試料の輸送、保存などは室温で行うことができ、より簡便となる利点がある。
【００２６】
本発明の遺伝子型判定方法においては、上述した中でも、採取され得る細胞の数が一定しており、安定した量の鋳型を遺伝子型判定に供することができ、再現性に優れる観点から、固形被検試料が血液を乾燥させたものであるか、または、毛根であることが好ましく、また、上述したように根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みを伴わない採取が可能であることから、固形被検試料が毛根であることが特に好ましい。なお、固形被検試料が血液を乾燥させたものである場合、従来のワルファリン投与量の決定方法と比較すると、血液の採取量が少なくて済むという利点がある。図１には、ワルファリンの投与対象となる患者から、毛根２を含む頭髪１を注意深く引き抜き、固形被検試料として採取した例が示されている。
【００２７】
本発明の遺伝子型判定方法では、次に、上述したようにして採取した固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、固形被検試料に含まれる薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の少なくともいずれかの遺伝子を増幅する。
【００２８】
本工程では、プレート状またはチューブ状の担体上で、上述した遺伝子を増幅することが好ましい。具体的には、まず、プレート状またはチューブ状の担体上に試薬を置く。チューブ状の担体である場合には、その内部に試薬を投入し、プレート状の担体である場合には、その表面に試薬を置く。この試薬は、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液とプライマーＤＮＡとを含有する。そして試薬と固形被検試料とが直接接触するように担体上に固形被検試料を配置し、公知の方法によってポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法で遺伝子を増幅する。なお、担体上に固形被検試料を置き、その後に担体上に試薬を置いてもよい。図１には、チューブ状の担体３の内部にＰＣＲ反応液４を投入し、さらに、担体３に固形被検試料である頭髪１を投入することで、固形被検試料をＰＣＲ反応液と接触させた後、チューブ状の担体３に蓋５をして、ＰＣＲ反応を行う例が示されている。
【００２９】
本工程においては、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼに代表される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのものであれば特に制限されないが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。バッファーは固形被検試料中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質存在下でもＤＮＡ増幅可能なものであれば、特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（島津製作所）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）、ＫＯＤ  ＦＸバッファー（東洋紡績）などを用いることが好ましく、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ用に開発されたＫＯＤ  ＦＸバッファー（東洋紡績）を用いることが特に好ましい。
【００３０】
薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を構成する核酸がＤＮＡの場合においては、直接ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法などを行なうことができる。また、該核酸がＲＮＡ断片の場合においては、ＲＮＡ鎖断片の場合は逆転写反応を行なった後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ：Strand Displacement Amplification）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ（Reverse Transcription）−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：Transcription-Mediated Amplification）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて増幅することができる。なお、ＰＣＲなどの増幅の条件は、特異的な増幅が起こる限り特に制限されず、適宜設定することができる。なお、本発明においては、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子を同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定するようにすることが好ましい。
【００３１】
本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されず、また、適宜公知の方法で設計することができる。なお、簡便な手順で遺伝子型の判定が可能となることから、ＰＣＲ法の中でも、対立遺伝子増幅（ＡＳＰ：Allele Specific Primer）−ＰＣＲ法およびＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型：Restriction Fragment Length Polymorphism）法を利用することが好ましく、そのために設計されたプライマーＤＮＡを用いることが好ましい。
【００３２】
ここで、本発明でいう「不溶性担体」としては、プラスチック、ガラスなどからなるチューブのほか、９６穴ウェルなどを挙げることができる。チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
【００３３】
上述のように、担体表面にはプローブＤＮＡが固定化されていることが特に好ましい。これは、固形被検試料中のＲＮＡの特定遺伝子をチューブ状の担体に固定したオリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を介してハイブリダイゼーションで捕捉して、ＲＴ−ＰＣＲ法にて遺伝子増幅ができ、または、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、同時に、プレート状担体に固定した複数種のプローブＤＮＡで多種の生物の特異的遺伝子を検出したり、遺伝子多型（ＳＮＰ）を網羅的に検出できるという利点があるためである。
【００３４】
そして、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法によって、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子が増幅される。
【００３５】
本発明の遺伝子型判定方法では、次に、上述したようにして増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する。本工程における解析法は、増幅された遺伝子の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法から選ばれるいずれかの方法が挙げられる。ゲル電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行なうことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレショルド値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレショルド値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲの特定遺伝子に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００３６】
ここで、本発明において遺伝子型を判定する対象となる、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子について説明する。まず、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９は、上述したように、下記式
【００３７】
【化３】
2010200670.tif 000005
【００３８】
で表わされる化学構造を有するワルファリンを、投与された患者の体内において、下記式
【００３９】
【化４】
2010200670.tif 000006
【００４０】
で表わされる、効能が消失した化学構造に代謝する働きを有する酵素である。ここで、上述したように、日本人の約９６％は、このＣＹＰ２Ｃ９は正常な活性を有するが、約４％はこのＣＹＰ２Ｃ９の活性が低く、約１％に至っては酵素活性が１／１０に満たない。このＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子としては、たとえば、正常な酵素活性を有する遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１（配列番号１に示す塩基配列）と、約１／１０に低下した酵素活性を有する遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９  ＊３（配列番号２に示す塩基配列）とが知られている。すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９が正常な活性を有する約９６％の日本人は対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１／＊１を有し、ＣＹＰ２Ｃ９の活性が低い約４％の日本人は対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１／＊３を有し、酵素活性が１／１０に満たない約１％の日本人は対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９  ＊３／＊３を有することとなる。
【００４１】
また、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１（Vitamin K Epoxide Reductase Complex Subunit 1）は、血液凝固に関連する酵素である。ここで、図２は、血液凝固因子とビタミンＫサイクルを模式的に示す図である。図２に示されるように、下記式
【００４２】
【化５】
2010200670.tif 000007
【００４３】
で表わされる化学構造を有するビタミンＫは、下記式
【００４４】
【化６】
2010200670.tif 000008
【００４５】
で表わされる化学構造を有する還元型ビタミンＫとなり、この還元型ビタミンＫが血液凝固因子に作用して、血液凝固因子が活性化される。血液凝固因子に作用した後の還元型ビタミンＫは、下記式
【００４６】
【化７】
2010200670.tif 000009
【００４７】
で表わされるビタミンＫエポキシドとなり、これにＶＫＯＲＣ１が作用することで、ビタミンＫエポキシドが還元されてビタミンＫとなる。ワルファリンは、このようなビタミンＫサイクルにおける律速酵素であるＶＫＯＲＣ１の作用を阻害することで、ビタミンＫエポキシドからのビタミンＫの形成を妨げ、抗血液凝固作用を発揮する。このＶＫＯＲＣ１も、個人によって代謝が異なる。このＶＫＯＲＣ１遺伝子としては、たとえば、遺伝子ＶＫＯＲＣ１  Ａ／Ａ（配列番号３に示す塩基配列）と、ワルファリンの維持用量が高い傾向にある遺伝子ＶＫＯＲＣ１  Ｇ／Ａ（配列番号４に示す塩基配列）とが知られている。
【００４８】
ここで、図３は、ワルファリンの維持用量と頻度との関係を示すグラフであり、縦軸は頻度、横軸はワルファリンの維持用量（ｍｇ／日）である。ワルファリンの維持用量と頻度とは、図３に示すグラフのような関係を示す。図３に示すグラフにおいて、正常な範囲といえる領域Ａ、維持用量が低すぎる（ワルファリン感受性が低すぎる）といえる領域Ｂ、維持用量が高すぎる（ワルファリン感受性が高すぎる）といえる領域Ｃの３つの領域に大きく分けることができる。ここで、領域Ｂに属する患者は、上述したような対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９  ＊３／＊３を有する患者であると考えられ、領域Ｃに属する患者は、上述したようなＶＫＯＲＣ１遺伝子ＶＫＯＲＣ１  Ｇ／Ａを有する患者であると考えられる。
【００４９】
なお、本発明における薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子は、その長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５０〜３０００塩基であることが好ましい。
【００５０】
本発明において、判定された遺伝子型の情報は、抗血液凝固剤ワルファリンの投与量の決定に用いられるものであることが、好ましい。本発明の方法によって、上述したようにワルファリンの感受性に関連する遺伝子である薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の遺伝子型を安全、迅速、かつ安価に判定することができる。これによって、従来と比較して格段に安全、迅速、かつ安価にワルファリン投与量を決定することができることが期待される。
【００５１】
具体的には、本発明の方法によって判定された遺伝子型の情報に基づき、たとえば、０点、１点、２点とスコアを算出して各グループに分け、たとえば０点のグループではワルファリンの投与開始量を２ｍｇとし、１点のグループではワルファリンの投与開始量を２．５ｍｇとし、２点のグループではワルファリンの投与開始量を３．５ｍｇにするというようにする。このようにすることで、ワルファリン投与後のプロトロンビン時間国際標準化比をモニターし、投与量を調節する従来の方法と比較して、維持用量到達期間を短縮することができるとともに、出血性副作用の頻度を減少することができると考えられる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１＞
〔１〕ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による遺伝子型の判定
以下の手順で、ワルファリン服用患者４０名および健常人７名それぞれのＶＫＯＲＣ１遺伝子およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の遺伝子型をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により判定した。ワルファリン服用患者４０名および健常人７名の指先からそれぞれ採取した血液（全血）をろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料とした乾燥ろ紙血を採取した。通常行うＤＮＡの抽出・精製する過程を省略し、この乾燥ろ紙血の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。
【００５４】
（ＰＣＲ反応液組成）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：１２．５μＬ
・２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ：２．５μＬ
・Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ：１μＬ
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．５μＬ
・ＤＷ（distilled water）：８．５μＬ
なお、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ用プライマーとしては、以下の４種類の塩基配列のものを用い、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘとしては４種類全てを混合した。また、比較のため、ＣＹＰ２Ｃ９用の２種類のみ、ＶＫＯＲＣ１用の２種類のみでＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを調製したＰＣＲ反応液も調製し、同様にＰＣＲを行った。
【００５５】
・プライマー１（ＣＹＰ２Ｃ９−Ｆ）：５’−ＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣ−３’（配列番号５）
・プライマー２（ＣＹＰ２Ｃ９−Ｒ）：５’−ＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号６）
・プライマー３（ＶＫＯＲＣ１−Ｆ）：５’−ＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣ−３’（配列番号７）
・プライマー４（ＶＫＯＲＣ１−Ｒ）：５’−ＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣ−３’（配列番号８）
チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５６】
（増幅条件）
熱変性：９５℃、３分
９５℃、２０秒→６０℃、２０秒→７２℃、３０秒を３５サイクル
伸長反応：７２℃、５分
得られたＰＣＲ産物は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子については２９８ｂｐ、ＶＫＯＲＣ１遺伝子については６３６ｂｐであった。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液を、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用としては制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ（タカラバイオ（株）製）、ＶＫＯＲＣ１遺伝子としては制限酵素ＮｃｉＩ（東洋紡（株）製）で処理した後、アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。図４は、実施例１のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を示す電気泳動写真である。一番左側のメーカーのレーンを除く６つのレーンのうち、左側の２つはＣＹＰ２Ｃ９用プライマー２種類のみを用いた場合であり、レーン１が遺伝子型ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１／＊１、レーン２が遺伝子型ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１／＊３を示している。また、上記６つのレーンのうち、真ん中の２つはＶＫＯＲＣ１用プライマー２種類のみを用いた場合であり、レーン１が遺伝子型ＶＫＯＲＣ１  Ａ／Ａ、レーン２が遺伝子型ＶＫＯＲＣ１  Ｇ／Ａを示している。さらに、上記６つのレーンのうち、右側の２つは４種類のプライマーを混合して用いた場合であり、レーン１は遺伝子型ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１／＊１、ＶＫＯＲＣ１  Ａ／Ａであり、レーン２は遺伝子型ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１／＊３、ＶＫＯＲＣ１  Ｇ／Ａを示している。遺伝子型ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１の制限酵素処理断片として２８ｂｐ、１５８ｂｐおよび１１２ｂｐのもの、遺伝子型ＣＹＰ２Ｃ９  ＊３の制限酵素処理断片として１８６ｂｐ、１１２ｂｐのもの、遺伝子型ＶＫＯＲＣ１  Ｇ／Ａの制限酵素処理断片として４７２ｂｐ、１１４ｂｐ、５０ｂｐのもの、遺伝子型ＶＫＯＲＣ１  Ａ／Ａの制限酵素処理断片として５２２ｂｐ、１１４ｂｐのものが得られたことが分かる。
【００５７】
〔２〕ＡＳＰ−ＰＣＲ法による遺伝子型の判定
以下の手順で、ワルファリン服用患者４０名および健常人７名それぞれのＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の遺伝子型をＡＳＰ−ＰＣＲ法により判定した。ＡＳＰ−ＰＣＲ用のプライマーとして以下の３種類の塩基配列を用い、Ｐｒｉｍｅｒ  ＭｉｘとしてはＣＹＰ２Ｃ９＿Ｆ＿Ａ＋ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｒ、ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｆ＿Ｃ＋ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｒの２種類を調製し、これを用いたこと以外は上述と同様のＰＣＲ反応溶液に、同様に採取した固形被検試料を投入した。
【００５８】
・プライマー５（ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｆ＿Ａ）：５’−ＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＴ−３’（配列番号９）
・プライマー６（ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｆ＿Ｃ）：５’−ＣＡＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＴ−３’（配列番号１０）
・プライマー７（ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｒ）：５’−ＴＡＧＴＴＴＣＴＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡ−３’（配列番号１１）
以下の増幅条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５９】
（増幅条件）
熱変性：９５℃、２分
９８℃、１０秒→６２．５℃、３０秒→７４℃、３０秒を３５サイクル
伸長反応：７４℃、２分
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。図５は、実施例１のＡＳＰ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。一番左側のメーカーのレーンを除く４つのレーンのうち、左側の２つはＣＹＰ２Ｃ９  ＊１についての結果、右側の２つはＣＹＰ２Ｃ９  ＊３についての結果であり、ＣＹＰ２Ｃ９  ＊１については８２ｂｐ、ＣＹＰ２Ｃ９  ＊３については８０ｂｐであった。
【００６０】
このようにして、ワルファリン服用患者４０名および健常人７名それぞれのＶＫＯＲＣ１遺伝子およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の遺伝子型をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により判定し、また、ＡＳＰ−ＰＣＲ 法を用いてＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の遺伝子型を判定し、その有用性を検討した。さらに、これらの遺伝子型とワルファリン投与量の関連についても考察した。なお、従来なら数日を要していた遺伝子型の判定が、本発明の方法を採用したことによって、採血後３時間で可能になった。
【００６１】
（結果・考察）
ワルファリン服用患者のＶＫＯＲＣ１遺伝子の１６３９位における遺伝子型は、ＡＡが３８名、ＡＧが２名であり、ＡＧ型の患者においてワルファリン投与量が多い傾向にあった。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の遺伝子型は、全員が＊１／＊１であった。健常人におけるＶＫＯＲＣ１遺伝子の遺伝子型は、全員がＡＡであり、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子型は、＊１／＊１が６名、＊１／＊３が１名であり、日本人では数％しか存在しない＊１／＊３が確認された。ＡＳＰ−ＰＣＲ法においても、ＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊１、＊１／＊３の判定が可能であり、判定に要する時間も短縮された。以上よりＡＳＰ−ＰＣＲ法は、採血に関する患者負担を軽減し、より簡便な新しい遺伝子型判定法として有用であると考えられた。
【００６２】
＜実施例２＞
ワルファリン服用患者４０名および健常人７名からそれぞれ採取した毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪を固形被検試料として用いたこと以外は、実施例１と同様にして遺伝子型の判定を行った。結果、毛根を直接ＰＣＲ溶液に浸すことによって、血液採取より簡単な操作で、かつ、血液検査と同様の精度の高さで遺伝子型を判定できることが分かった。
【００６３】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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