(57)【要約】【課題】植物におけるＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制させる方法、当該フコース修飾を減少、抑制した植物形質転換体等を提供する。【解決手段】糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の転写、翻訳を、ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＰＴＧＳ）、ウイルス誘導ジーンサイレンシング（ＶＩＧＳ）、又はｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＴＧＳ）により阻害し、植物細胞内におけるＧＤＰ−フコース量を減少させることにより、糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、オリゴ糖、多糖等を含む糖鎖へのフコース修飾を減少・抑制させる。【効果】アレルゲンとなり得るフコース修飾が除去された糖蛋白質等の生産が可能となり、植物で生産させた医療用糖蛋白質の臨床応用が可能となる。【選択図】図１
2010051297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うこと、あるいは、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物ウイルスベクターを、植物体もしくは植物細胞に感染させることにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子の発現を抑制して、植物における植物型のＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する糖鎖構造の改変方法であって、上記遺伝子断片として、上記酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、当該ＤＮＡ配列の変異体、アレル、バリアント、又はホモログに相当するＤＮＡ配列、あるいは、当該遺伝子と５０％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を用いることを特徴とする糖鎖構造の改変方法。
【請求項２】
上記植物型のＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制が、植物の糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、又は、オリゴ糖もしくは多糖を含む糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を、該遺伝子の転写、翻訳を、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＴＧＳ）、ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＰＴＧＳ）、又はウイルス誘導ジーンサイレンシング（Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）により阻害することにより、ＧＤＰ−フコースの細胞内での合成を阻害し、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＤ）遺伝子、又は、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＥＲ）遺伝子である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物ウイルスベクターを用いる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物形質転換用ベクターを用いる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法で得られた、ＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子発現が抑制され、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
【請求項８】
上記植物形質転換体、植物細胞、又は植物体が、植物細胞、植物体、又はその子孫である、請求項７に記載の植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
【請求項９】
請求項８に記載の植物細胞、植物体、又はその子孫より得られた糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、又は糖鎖。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の植物形質転換体を宿主として、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された糖蛋白質を合成することを特徴とする糖蛋白質の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、オリゴ糖もしくは多糖を含む糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する植物における糖鎖構造の改変方法に関するものであり、更に詳しくは、糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードするＧＭＤ遺伝子又はＧＥＲ遺伝子の相同遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを用いて植物体を形質転換させることにより、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する植物型のＮ−結合型糖鎖構造を改変する方法、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制された糖蛋白質を産生する植物形質転換体、その形質転換植物体を用いてフコース修飾の減少、抑制された糖蛋白質を合成する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、その化学的、物理的特性から、様々な機能を有している。特に、糖蛋白質の糖鎖は、該等蛋白質を構成する蛋白質の安定性に寄与するだけでなく、蛋白質が糖鎖修飾を受けることによって、初めて機能することも知られている。多くの糖蛋白質は、蛋白質のアスパラギン残基に糖鎖が結合した、アスパラギン結合型糖鎖（以下、Ｎ−結合型糖鎖と記載することがある。）による修飾を受けている。
【０００３】
Ｎ−結合型糖鎖は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる共通のトリマンノシルコア構造を有するが、植物に由来する植物型のＮ−結合型糖鎖のコア糖鎖部分には、動物型には認められない植物特有のα−１，３−フコース、β−１，２−キシロース修飾が存在する（図１）。
【０００４】
これらの構造は、動物の生体内に投与した際に、アレルゲンになる可能性が指摘されており（非特許文献１）、血中等に直接投与する医療用糖蛋白質を、遺伝子組換え植物で生産した場合、アレルゲン性を除くために、その除去が必要となる。
【０００５】
植物型の糖鎖修飾は、植物細胞内において合成されたＧＤＰ−フコース及びＵＤＰ−キシロースが、ゴルジ体内において、α−１，３−フコース転移酵素、β−１，２−キシロース遺伝子により、Ｎ−結合型糖鎖へ付加されることで形成される。
【０００６】
これまでに、例えば、抗体組成物含有医薬（特許文献１）、ゲノムが改変された細胞（特許文献２）、抗体組成物を産生する細胞（特許文献３）、抗体組成物の製造方法（特許文献４）、が提案されている。これらの特許文献には、動物型Ｎ−結合型糖鎖のα−１，６−フコース付加を抑制するために、α−１，６−フコース転移酵素及びＧＤＰ−フコース合成に関与する酵素を抑制することが開示されているが、ＧＭＤ遺伝子に関しては、動物細胞からレクチン耐性株を選抜したのみであり、植物における植物型糖鎖についての遺伝子操作による遺伝子抑制は行われていない。
【０００７】
また、これまでに、植物由来Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコース、β−１，２−キシロース修飾抑制について報告されている。シロイヌナズナ（非特許文献２）、コケ（非特許文献３）、ウキクサ（非特許文献４）において、α−１，３−フコース転移酵素、β−１，２−キシロース遺伝子が抑制された植物体が、相同組換えや突然変異体の選抜により得られている。また、タバコにおいて、ＲＮＡｉ法により、各遺伝子が抑制された植物体が得られている（非特許文献５）。
【０００８】
一方、トリマンノシルコア構造に対し、非還元末端側にＮ−アセチルグルコサミンによって糖鎖が伸長した際に、植物においては、Ｎ−アセチルグルコサミンに対して、α−１，４−フコース修飾が頻繁になされる。
【０００９】
動物細胞等においては、当該Ｎ−アセチルグルコサミンに、β−１，４−ガラクトース等の修飾がなされることが多く、植物におけるα−１，４−フコース修飾は、β−１，４−ガラクトース修飾に競合する。そのため、植物において、動物型糖鎖修飾を有する糖蛋白質を生産する際には、α−１，４−フコース修飾も除去されることが望ましいと考えられる。
【００１０】
糖鎖にフコース修飾がなされるのは、ＧＤＰ−フコースを、フコース供与体として、各種フコース転移酵素によって、糖鎖にフコース付加がなされることによる。ＧＤＰ−フコースは、植物細胞内において、ＧＤＰ−マンノースより、ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−４−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＥＲ）により合成される。
【００１１】
ＧＭＤ遺伝子が破壊された植物体では、フコース合成ができなくなること、細胞壁多糖の構成糖が変化すること、また、Ｎ−結合型糖鎖にフコース修飾がなされない、ことが報告されている（非特許文献６、７）。しかし、上記報告は、突然変異体を選抜したものであり、これまで、植物において、ＧＭＤ遺伝子等を標的として、植物体を形質転換させる遺伝子操作により、遺伝子発現の抑制を行った報告は無い。
【００１２】
植物由来Ｎ−結合型糖鎖には、動物型には見られない還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へのα−１，３−フコース修飾（動物型ではα−１，６−フコース修飾）が存在するため、動物型糖鎖のα−１，６−フコース修飾を抑制する方法は、そのまま植物型糖鎖構造に適用することはできない。また、ＧＭＤ遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ細胞株についての報告もなされているが、動物細胞での例が、そのままゲノムが倍数体であることが多い植物に応用できるとは限らない。
【００１３】
現在、様々な医療用蛋白質は、微生物、昆虫細胞、動物細胞等を用いて生産されているが、これらの手法は、毒素等の混入の可能性、また、コスト面から、代替、補完する物質生産システムが求められており、その候補の一つとして、植物による物質生産システムの開発が世界各地で進められている。
【００１４】
植物による物質生産、特に、医療用糖蛋白質の生産においては、植物特有の糖鎖修飾の除去が、そのアレルゲン性から求められている。しかし、これまで報告されている知見は、動物型Ｎ−結合型糖鎖へのフコース付加を抑制するもの、動物細胞を用いたもの、突然変異体を選択したもの等に留まっているのが実情であり、当技術分野においては、植物において、遺伝子を標的としてウイルスベクター法及び形質転換を適用して、実際に、遺伝子発現を抑制した形質転換体により糖鎖へのフコース修飾を抑制する技術を確立することが強く要請されていた。
【００１５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００３／０８４５９６  Ａ１
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００３／０３５７４１  Ａ１
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００２／０３１１４０  Ａ１
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００３／０８５１１８  Ａ１
【非特許文献１】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０  （２００３）  １３２７−１３３７
【非特許文献２】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５６１（２００４）１３２−１３６
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５（２００７）３８９−４０１
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（２００６）１５９１−１５９７
【非特許文献５】Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６（２００８）３９２−４０２
【非特許文献６】Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２（１９９７）３３５−３４５
【非特許文献７】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１１９（１９９９）７２５−７３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、植物において、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子を標的として、植物体を形質転換させることにより、その遺伝子発現の抑制を行うことを目標として鋭意研究を重ねた結果、ＧＥＲ遺伝子又はＧＭＤ遺伝子を標的として、ウイルスベクター法及び形質転換によって、植物において実際にその遺伝子発現を減少、抑制させ、フコース修飾を減少、抑制させた植物形質転換体を創出することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明は、植物における糖蛋白質である植物型のＮ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコース修飾を始めとする、糖鎖へのフコース修飾の抑制・除去の手段を提供することを目的とするものである。また、本発明は、植物における糖蛋白質である植物型のＮ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコース修飾を始めとする、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制させた植物形質転換体を提供することを目的とするものである。尚、ここで上げる糖鎖とは、糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖に限定されず、糖脂質糖鎖や、オリゴ糖、多糖等の糖鎖が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うこと、あるいは、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物ウイルスベクターを、植物体もしくは植物細胞に感染させることにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子の発現を抑制して、植物における植物型のＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する糖鎖構造の改変方法であって、上記遺伝子断片として、上記酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、当該ＤＮＡ配列の変異体、アレル、バリアント、又はホモログに相当するＤＮＡ配列、あるいは、当該遺伝子と５０％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を用いることを特徴とする糖鎖構造の改変方法。
（２）上記植物型のＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制が、植物の糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、又は、オリゴ糖もしくは多糖を含む糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制である、前記（１）に記載の方法。
（３）糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を、該遺伝子の転写、翻訳を、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＴＧＳ）、ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＰＴＧＳ）、又はウイルス誘導ジーンサイレンシング（Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）により阻害することにより、ＧＤＰ−フコースの細胞内での合成を阻害し、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）上記ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＤ）遺伝子、又は、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＥＲ）遺伝子である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物ウイルスベクターを用いる、前記（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物形質転換用ベクターを用いる、前記（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（７）前記（１）から（６）のいずれかに記載の方法で得られた、ＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子発現が抑制され、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
（８）上記植物形質転換体、植物細胞、又は植物体が、植物細胞、植物体、又はその子孫である、前記（７）に記載の植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
（９）前記（８）に記載の植物細胞、植物体、又はその子孫より得られた糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、又は糖鎖。
（１０）前記（７）又は（８）に記載の植物形質転換体を宿主として、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された糖蛋白質を合成することを特徴とする糖蛋白質の合成方法。
【００１９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うこと、あるいは、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物ウイルスベクターを、植物もしくは植物細胞に感染させることにより、ＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子の発現を抑制して、植物における植物型のＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する糖鎖構造の改変方法であって、上記遺伝子断片として、上記酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、当該ＤＮＡ配列の変異体、アレル、バリアント、又はホモログに相当するＤＮＡ配列、あるいは、当該遺伝子と５０％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を用いることを特徴とするものである。
【００２０】
また、本発明は、上記糖鎖構造の改質方法を用いて得られた、ＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子発現が抑制され、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された植物形質転換体、植物細胞、又は植物体の点、また、上記植物細胞、植物体、又はその子孫より得られた糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、又は糖鎖の点、また、上記植物形質転換体を宿主として、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された糖蛋白質を合成する糖蛋白質の合成方法の点、に特徴を有するものである。
【００２１】
本発明では、糖ヌクレオチドの一種であるＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を、該遺伝子の転写、翻訳を、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＴＧＳ）、ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＰＴＧＳ）、又はウイルス誘導ジーンサイレンシング（Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）により阻害することにより、ＧＤＰ−フコースの細胞内での合成を阻害し、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制すること、を好ましい実施の態様としている。
【００２２】
また、本発明では、上記植物型のＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制が、植物の糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、又は、オリゴ糖もしくは多糖を含む糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制であること、また、上記ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＤ）遺伝子、又は、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＥＲ）遺伝子であること、更に、上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物ウイルスベクター又は植物形質転換用ベクターを用いること、を好ましい実施の態様としている。
【００２３】
本発明において、ＧＤＰ−フコース合成に関与する酵素遺伝子の抑制は、ＧＭＤ遺伝子もしくはＧＥＲ遺伝子由来ｍＲＮＡを標的とし破壊すること、当該遺伝子からのｍＲＮＡ合成そのものを抑制すること、それにより、ＧＭＤ蛋白質もしくはＧＥＲ蛋白質の合成を阻害すること、により実施することができる。
【００２４】
植物細胞は、ある遺伝子が過剰に発現すると、その遺伝子の発現が抑制される機構を有しており、ウイルス等に対する防御機構として機能している。この防御機構では、過剰発現したｍＲＮＡを破壊することで、遺伝子発現を抑制している。本発明では、ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＰＴＧＳ）の手法、及びウイルス誘導ジーンサイレンシング（Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）の手法、を用いることができる。
【００２５】
次に、植物ウイルスベクターの一種である、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）を用いたウイルス誘導ジーンサイレンシング（Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）による方法について詳しく説明する。この方法では、タバコの葉試料を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料を精製し、本ＲＮＡ試料及びオリゴｄＴプライマーを用い、１本鎖ｃＤＮＡを合成する。既知のＧＭＤ遺伝子配列を元に設計したプライマーＮｂＭＤ（Ｆ）（配列番号１）及びＮｂＭＤ（Ｒ）（配列番号２）を用いたＰＣＲにより、ＧＭＤ遺伝子の部分配列を単離する。
【００２６】
ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片を調製するために、単離したＧＭＤ遺伝子を鋳型として、制限酵素ＭｌｕＩサイトを有するプライマーＣＭ−ＮｂＭＤ−Ｆ（配列番号３）及びＣＭ−ＮｂＭＤ−Ｒ（配列番号４）を用いて、ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物について、制限酵素ＭｌｕＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子断片バンド部分を切り出し、遠心濾過することで得られる遺伝子断片を含む溶液より、ベクターへ挿入するＧＭＤ遺伝子断片を精製する。
【００２７】
ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターを調製するために、例えば、ＣＭＶベクターとして、３種のプラスミドｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３が用いられる。このうち、ｐＣＹ２（Ｎ）は、遺伝子断片を挿入するためのマルチクローニングサイトを有する。ｐＣＹ２（Ｎ）を、制限酵素ＭｌｕＩで処理後、精製し、更に、ＤＮＡ末端を脱リン酸化する。脱リン酸化物を精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＣＹ２（Ｎ）由来のバンド部分を切り出し、遠心濾過することで得られるｐＣＹ２（Ｎ）を含む溶液より、脱リン酸化ベクターｐＣＹ２（Ｎ）ΔＰを得る。
【００２８】
単離した遺伝子を鋳型として、ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片を脱リン酸化ｐＣＹ２（Ｎ）ΔＰへ挿入する。ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片が挿入されたｐＣＹ２（Ｎ）プラスミド（ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ））は、菌体より精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認し、ＧＭＤ遺伝子断片がｐＣＹ２（Ｎ）へセンス方向に挿入されたもの（ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓ）、アンチセンス方向に挿入されたもの（ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ａ）を得る。
【００２９】
接種用ＣＭＶベクターを調製するために、植物において、ＶＩＧＳを誘導するには、ウイルスを植物体に感染させる必要がある。キュウリモザイクウイルスは、ＲＮＡウイルスであるため、ＲＮＡを、植物体に接種する。ＧＭＤ遺伝子断片が挿入されたＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓ及びｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３を鋳型として、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａへの接種のためのＲＮＡ合成を行う。環状プラスミドであるｐＣＹ１、ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓ、ｐＣＹ３を直鎖化するために、ｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）及びＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓは、ＮｏｔＩ処理、ｐＣＹ３は、ＥｃｏＲＩ処理に供し、直鎖化ＤＮＡを得る。
【００３０】
ＲＮＡ合成は、直鎖化ＤＮＡを鋳型として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。また、Ｒｉｂｏ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を反応溶液中に加えることで、キャップ構造を有するＲＮＡの合成を行う。反応終了後、ＤＮＡ分解酵素処理により、鋳型ＤＮＡを分解し、フェノール処理及びエタノール沈殿により、接種用ＲＮＡを精製する。接種用ＲＮＡは、−８０℃で接種直前まで保存する。
【００３１】
ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターをＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａへ接種するために、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３に由来するＲＮＡの混合溶液に対し、ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）ＳもしくはＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ａに由来するＲＮＡ溶液を混合し、接種用のＲＮＡ溶液を調製する。同様に、ネガティブコントロールとして、ｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３に由来するＲＮＡ溶液を混合し、接種用のＲＮＡ溶液を調製する。
【００３２】
播種後約１ヶ月のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの展開葉に、ＲＮＡ溶液を滴下し、手でＲＮＡ溶液を葉の全面に塗布することで、ＣＭＶベクターを感染させる。接種後３週目に葉試料を採取し、植物型糖鎖修飾抑制効果を検討する。葉試料を用いて、植物由来Ｎ−結合型糖鎖を調製する。糖鎖試料は、超純水に溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に用いる。
【００３３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる植物型糖鎖修飾抑制効果の評価法は、以下の通りである。１μｌの糖鎖試料溶液と０．５μｌの２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｏｉｃ  Ａｃｉｄ（ＤＨＢ）水溶液（５  ｍｇ／ｍｌ）をＭＴＰ  ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐＴＭ  ６００／３８４  Ｔ  Ｆプレート（ブルカーダルトニクス）上のターゲットにおいて混合し、風乾する。測定は、Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（ブルカーダルトニクス、ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎモード、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  モード）で行い、観測された各糖鎖のピーク面積の割合（％）を、「糖鎖Ａのピーク面積の割合（％）＝（糖鎖Ａのピーク面積／全糖鎖ピーク面積）×１００」、の式により算出する。ウイルスベクター未接種及び接種植物体由来糖鎖試料において、各糖鎖の割合を比較し、植物型糖鎖修飾抑制効果を評価する。
【００３４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる植物型糖鎖修飾抑制効果として、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターを接種した植物体において、Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコースの修飾が約７０％から２０％へと低下することが観察される。
【００３５】
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａからＲＮＡ試料を調製するために、ウイルス未接種株、ＣＭＶベクター接種株（抑制用遺伝子の挿入は無し）、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター接種株よりウイルス接種後、３週目に葉試料を採取し、それぞれの葉試料を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製する。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子の発現様式の評価を行うために、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料及びオリゴｄＴプライマーを用い、１本鎖ｃＤＮＡを合成する。本ｃＤＮＡ溶液を試料として、ＰＣＲを行う。ＧＭＤ遺伝子用プライマーとしては、ＮｂＭＤ（Ｆ）（配列番号１）及びＮｂＭＤ（Ｒ）（配列番号２）を用いる。また、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１α（ＥＦ−１α）遺伝子由来ｍＲＮＡを内部標準とし、プライマーＥＦ−１−Ｆ（配列番号５）及びＥＦ−１−Ｒ（配列番号６）を用いて、その部分配列を増幅する。ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター接種株では、未接種株に比べ、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡ量の顕著な減少が認められる。
【００３７】
ｉ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行い、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡ量を概算すると、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター接種株では、未接種株に比べ、１０％以下となり、その顕著な減少が認められる。
【００３８】
これから、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来ＧＭＤ遺伝子を組み込んだＣＭＶベクターよるＶＩＧＳ誘導で、植物由来糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコース修飾が抑制可能であることが分かる。これは、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター感染により誘導されたＶＩＧＳにより、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡが破壊された結果、植物体中でのＧＭＤ蛋白質が減少し、α−１，３−フコース転移酵素へのフコース供与体であるＧＤＰ−フコースの合成が阻害されたためと考えられる。
【００３９】
次に、タバコ植物体を形質転換することでＰＴＧＳを誘導する方法について詳しく説明する。ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片を調製するために、単離したＧＭＤ遺伝子を鋳型として、制限酵素サイトを有するプライマーペアを作製し、Ｎｂ−ｉＭＤ−Ｆ（Ｘｂａ）（配列番号７）及びＮｂ−ｉＭＤ−Ｒ（Ｂａｍ）（配列番号８）、Ｎｂ−ｉＭＤ−Ｆ（Ｓａｃ）（配列番号９）及びＮｂ−ｉＭＤ−Ｒ（Ｓｍａ）（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより、約４００ｂｐの遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘｂａ−Ｂａｍ）及びＮｂｉＭＤ（Ｓｍａ−Ｓａｃ）を得る。
【００４０】
ＮｂｉＭＤ（Ｘｂａ−Ｂａｍ）について、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子断片バンド部分を切り出し、ゲル切片を遠心濾過することで得られる遺伝子断片を含む溶液より、ベクターへ挿入するＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘ−Ｂ）を得る。ＮｂｉＭＤ（Ｓｍａ−Ｓａｃ）について、制限酵素ＳｍａＩ及びＳａｃＩで処理後、ＮｂｉＭＤ（Ｘｂａ−Ｂａｍ）と同様に処理し、ベクターへ挿入するＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｓ−Ｓ）を得る。
【００４１】
イントロン配列を単離するために、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ葉試料より、ＤＮＡ試料を精製する。本ＤＮＡ試料より、既知のβ−１，２−キシロース転移酵素遺伝子配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ１２４９３２）を元に設計したプライマーＡｔＸ（Ｆ）（配列番号１１）及びＡｔＸ（Ｒ）（配列番号１２）を用いたＰＣＲにより、β−１，２−キシロース転移酵素遺伝子を単離する。
【００４２】
単離した遺伝子を鋳型として、ＡｔＸｙｌｔ−ｉｎｔ１（Ｆ）（配列番号１３）及びＡｔＸｙｌｔ−ｉｎｔ１（Ｒ）（配列番号１４）により、イントロン部分を増幅する。増幅したイントロン部分ＤＮＡを、鋳型として、制限酵素サイト付きプライマーＡｔＸＴｉｎｔ１−Ｆ（Ｂａｍ）（配列番号１５）及びＡｔＸＴｉｎｔ１−Ｒ（Ｓｍａ）（配列番号１６）を用い、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａβ−１，２−キシロース転移酵素遺伝子に由来するイントロン配列であるＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂａｍ−Ｓｍａ）を得る。
【００４３】
ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂａｍ−Ｓｍａ）について、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子断片バンド部分を切り出し、ゲル切片を遠心濾過することで得られる遺伝子断片を含む溶液より、ベクターへ挿入するイントロン配列ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂ−Ｓ）を得る。
【００４４】
植物形質転換用ベクターｐＢＥ２１１３からＧＵＳ遺伝子を削除するために、植物形質転換用ベクターであるｐＢＥ２１１３を、制限酵素ＳｍａＩとＳａｃＩで処理後、精製し、更に、ＤＮＡ末端を脱リン酸化する。脱リン酸化物を精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＢＥ２１１３由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片を遠心濾過することで得られるＤＮＡ溶液より、ＧＵＳ遺伝子を削除した遺伝子断片  ｐＢＥ２１１３ΔＧＵＳを得る。
【００４５】
ＧＭＤ遺伝子抑制用植物形質転換用ベクターＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３を調製するために、ｐＢＥ２１１３ΔＧＵＳに対し、ＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｓ−Ｓ）を挿入する。ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片が挿入されたベクターＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３は、菌体より精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認する。
【００４６】
ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３を、制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理後、精製し、更に、ＤＮＡ末端を脱リン酸化する。脱リン酸化物を精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片を遠心濾過することで得られるＤＮＡ溶液より、ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰを精製する。
【００４７】
ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰに対し、イントロン配列ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂ−Ｓ）を挿入する。イントロン配列ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂ−Ｓ）が挿入されたベクターＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３は、菌体より精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認する。
【００４８】
ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３を、制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで処理後、精製し、更に、ＤＮＡ末端を脱リン酸化する。脱リン酸化物を精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片を遠心濾過することで得られるＤＮＡ溶液より、ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰを精製する。
【００４９】
ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰに対し、ＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘ−Ｂ）を挿入する。ＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘ−Ｂ）が挿入されたベクターＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３は、菌体より精製後、挿入遺伝子断片のシーケンス解析し、ＧＭＤ遺伝子断片がイントロン配列をはさみ、逆反復配列を形成していることを確認する。
【００５０】
タバコＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを形質転換するために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株を用い、リーフディスク法により行う。タバコの葉からリーフディスクをコルクポーラーにより切り抜き、ＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ  ＬＢＡ４４０４株の菌液に浸して、ＭＳ寒天培地上で共存培養して、タバコ葉にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを感染させる。
【００５１】
カナマイシンとカルベニシリンを含むＭＳ液体培地でリーフディスクを洗浄することで、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌体を除去する。リーフディスクは、これら抗生物質を加えた再分化用ＭＳ寒天培地上で培養し、形質転換タバコのシュートを得る。シュートは、カナマイシン及びカルベニシリンを含む発根培地において培養し、育成する。
【００５２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、植物型糖鎖修飾抑制効果を評価するために、得られた形質転換植物体より、Ｎ−結合型糖鎖を精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる糖鎖構造解析を行い、フコース修飾抑制の程度を評価する。ＭＤｉ−１１株において、Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコースの修飾が７０％から５％へと低下することが観察される。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲによりＧＭＤ遺伝子の発現様式を評価するために、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料及びオリゴｄＴプライマーを用い、１本鎖ｃＤＮＡを合成する。本ｃＤＮＡ溶液を試料として、ＰＣＲを行う。ＧＭＤ遺伝子用プライマーとしては、ＮｂＭＤ（Ｆ）（配列番号１）及びＮｂＭＤ（Ｒ）（配列番号２）を用いる。また、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１α遺伝子由来ｍＲＮＡを内部標準とし、プライマーＥＦ−１−Ｆ（配列番号５）及びＥＦ−１−Ｒ（配列番号６）を用いて、その部分配列を増幅する。形質転換タバコでは、非形質転換タバコに比べ、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡ量の顕著な減少が認められる。
【００５４】
本発明では、植物の遺伝子発現抑制機構を利用して、遺伝子発現を抑制する手法として、ＰＴＧＳ法、ＶＩＧＳ法を利用することが可能である。抑制したい遺伝子と相同な遺伝子配列を植物細胞内で過剰に発現させることで、特定の遺伝子の抑制が可能となる。ＰＴＧＳ及びＶＩＧＳを誘導する方法は、抑制したい遺伝子と相同な遺伝子配列を植物細胞内で発現可能な方法であれば良く、形質転換やウイルスベクターを利用する等の方法を利用することができる。
【００５５】
本発明では、上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物ウイルスベクター、例えば、ＣＭＶベクター（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，２００７，Ｎｏｖ；５（６）：７７８−９０）、ｔｏｂａｃｃｏ  ｒａｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，Ｍａｙ  １２；２８１（１９）：１３７０８−１６、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）２５（２），２３７−２４５）、Ｐｏｔａｔｏウイルスベクター（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ  ２００４，Ｖｏｌ．１３４，ｐｐ．１３０８）、また、植物形質転換用ベクター、例えば、ｐＢＥ２１１３（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１６０，３４３−３５２，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２）、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，Ａｐｒ．３；８：３６）、ｐＢＥ２１１３及びｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ８（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｖｏｌ．１３９，ｐｐ．１１７５）、ｐＢＩ１２１（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ  ２００１，Ｖｏｌ．１２６，ｐｐ．９６５）、各種形質転換用ベクター（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７，４９（４）：５５６−５６７）、等を用いることができる。本発明において、植物形質転換用ベクター及び植物ウイルスベクターとしては、適宜のプラスミドベクター、ウイスルベクターを使用することが可能である。
【００５６】
植物において、主に、当該遺伝子のプロモーター領域がメチル化される転写抑制型［ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＴＧＳ）］の遺伝子の不活性化も行われる。ＴＧＳにおいては、例えば、抑制したい遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ配列をそのまま、もしくは逆反復配列を形成するように、植物細胞内で過剰に発現させることで、誘導が可能である（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９（２０００）５１９４−５２０１等）。
【００５７】
本発明では、ＧＭＤ遺伝子やＧＥＲ遺伝子を抑制するための遺伝子配列としては、ＧＭＤ蛋白質もしくはＧＥＲ蛋白質そのものをコードする遺伝子配列、例えば、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＧＭＤ遺伝子（部分）配列（ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＮ７４７６４８、ＣＮ７４７７３９、Ｕ８１８０５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ  ｔｈａｌｉａｎｅのＧＭＤ遺伝子配列（ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ８１８０５、ＮＭ １２６０２６、ＮＭ １１４９７６）、等を用いることができる。また、ＧＭＤ蛋白質もしくはＧＥＲ蛋白質に機能的に類似した蛋白質をコードするＤＮＡ配列、例えば、変異体、アレル、バリアント、ホモログ等、また、ＧＭＤ遺伝子やＧＥＲ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と５０％以上の相同性を持つＤＮＡ配列、更に、メチル化されることによって、当該遺伝子の転写を抑制可能なＤＮＡ配列、等を用いることができる。
【発明の効果】
【００５８】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）植物における糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制して植物型糖鎖構造の改変方法を提供することができる。
（２）糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制させた植物形質転換体を調製し、提供することができる。
（３）上記植物形質転換体を宿主として利することにより糖蛋白質の糖鎖構造を改変した糖蛋白質を合成することが可能となる。
（４）本発明の植物形質転換体を利用することで、生体内に投与した際にアレルゲンになる可能性がある植物特有のフコース修飾を減少、抑制した糖蛋白質を生産することが可能となる。
（５）遺伝子組換え植物で、アレルゲン性を低下させた医療用糖蛋白質を生産し、提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、以下の実施例は、本発明の好適な例を示すものであり、植物種や、ＰＴＧＳ、ＶＩＧＳ、及びＴＧＳを誘導する手法等において、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６０】
本実施例では、植物ウイルスベクターの一種である、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）を用いたウイルス誘導ジーンサイレンシング（Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）により、糖鎖へのフコース修飾の抑制を行った。
【００６１】
（１）タバコＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａからのＧＭＤ遺伝子の単離
タバコの一種であるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料を、液体窒素中で磨砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）により、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料を精製した。本ＲＮＡ試料及びオリゴｄＴプライマーを用い、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥヘルスケア）により、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００６２】
既知のＧＭＤ遺伝子配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＣＮ７４７６４８及びＣＮ７４７７３９）を元に設計したプライマーＮｂＭＤ（Ｆ）（配列番号１：５’−ＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣ）及びＮｂＭＤ（Ｒ）（配列番号２：５’−ＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣ）を用いたＰＣＲにより、ＧＭＤ遺伝子の部分配列を単離した。ＰＣＲには、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９４℃で３分処理後、９８℃（３０秒）→５６℃（１５秒）→６８℃（２分）のサイクルを３５回繰り返した。
【００６３】
（２）ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片の調製
単離したＧＭＤ遺伝子を鋳型として、制限酵素ＭｌｕＩサイトを有するプライマーＣＭ−ＮｂＭＤ−Ｆ（配列番号３：５’−ＴＡＧＴＴＡＡＣＧＣＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧ）及びＣＭ−ＮｂＭＤ−Ｒ（配列番号４：５’−ＴＡＧＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣ）を用い、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）によるＰＣＲにより、約２００ｂｐの遺伝子断片を得た。ＰＣＲは、９４℃で３分処理後、９８℃（３０秒）→５６℃（１５秒）→６８℃（１分）のサイクルを３５回繰り返した。
【００６４】
得られたＰＣＲ産物について、制限酵素ＭｌｕＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子断片バンド部分を切り出した。ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、遺伝子断片を含む溶液を得た。本溶液より、ベクターへ挿入するＧＭＤ遺伝子断片を精製した。
【００６５】
（３）ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターの調製
本実施例で用いたＣＭＶベクターは、３種のプラスミドｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３より構成され、このうち、ｐＣＹ２（Ｎ）は、遺伝子断片を挿入するためのマルチクローニングサイトを有する（図２及び特開２００５−０１３１６４号公報）。
【００６６】
ｐＣＹ２（Ｎ）を、制限酵素ＭｌｕＩで処理後、精製し、更に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）により、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。脱リン酸化物を精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＣＹ２（Ｎ）由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、ｐＣＹ２（Ｎ）を含む溶液を得た。本溶液より、脱リン酸化ベクターｐＣＹ２（Ｎ）ΔＰを得た。
【００６７】
単離した遺伝子を鋳型として、ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片の脱リン酸化ｐＣＹ２（Ｎ）ΔＰへの挿入は、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）により行った。ライゲーション反応液は、そのままＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）の形質転換に用いた。
【００６８】
ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片が挿入されたｐＣＹ２（Ｎ）プラスミド（ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ））は、菌体よりＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認し、ＧＭＤ遺伝子断片がｐＣＹ２（Ｎ）へセンス方向に挿入されたもの（ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓ）、及びアンチセンス方向に挿入されたもの（ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ａ）を得た。
【００６９】
（４）接種用ＣＭＶベクターの調製
植物において、ＶＩＧＳを誘導するには、ウイルスを植物体に感染させる必要がある。キュウリモザイクウイルスは、ＲＮＡウイルスであるため、ＲＮＡを植物体に接種することとなる。
【００７０】
ＧＭＤ遺伝子断片が挿入されたＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓ及びｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３を鋳型として、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａへの接種のためのＲＮＡ合成を行った。まず、環状プラスミドであるｐＣＹ１、ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓ、ｐＣＹ３を直鎖化するために、ｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）及びＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ｓは、ＮｏｔＩ処理、ｐＣＹ３は、ＥｃｏＲＩ処理に供し、直鎖化ＤＮＡを得た。
【００７１】
ＲＮＡ合成は、直鎖化ＤＮＡを鋳型として、ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行った。また、Ｒｉｂｏ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を反応溶液中に加えることで、キャップ構造を有するＲＮＡの合成を行った。
【００７２】
反応終了後、ＤＮＡ分解酵素処理により、鋳型ＤＮＡを分解し、フェノール処理及びエタノール沈殿により、接種用ＲＮＡを精製した。接種用ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水に溶解後、−８０℃で接種直前まで保存した。また、ＲＮＡ分解を極力抑えるため、接種用ＲＮＡの合成は、接種当日に行った。
【００７３】
（５）ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターのＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａへの接種
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａへのＲＮＡの接種（ＣＭＶベクターの感染）は、以下のように行った。ｐＣＹ１、ｐＣＹ３に由来するＲＮＡの混合溶液に対し、ＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）ＳもしくはＧＭＤ−ｐＣＹ２（Ｎ）Ａに由来するＲＮＡ溶液を混合し、接種用のＲＮＡ溶液を調製した。同様に、ネガティブコントロールとして、ｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３に由来するＲＮＡ溶液を混合し、接種用のＲＮＡ溶液を調製した。
【００７４】
播種後約１ヶ月のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの展開葉２枚に、少量のカーボランダム（ナカライテスク）を散布し、そこに、ＲＮＡ溶液をピペットマンにより滴下し、ゴム手袋を着用した手で、ＲＮＡ溶液を葉の全面に塗布することで、ＣＭＶベクターを感染させた。接種後３週目に、葉試料を採取し、植物型糖鎖修飾抑制効果を検討した。
【００７５】
（６）植物由来Ｎ−結合型糖鎖の調製法
植物由来Ｎ−結合型糖鎖の調製は、以下のように行った。葉試料５０ｍｇを、乳鉢・乳棒を用い磨砕し、磨砕物を２ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）へ懸濁した。懸濁液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心後、上澄をミニザルトシリンジフィルター（０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過した。
【００７６】
濾液に、６００μｌの５０％トリクロロ酢酸を滴下・混合後、４℃で一晩静置した。試料溶液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで、蛋白質を沈殿させた。沈殿した蛋白質は、９０％アセトン水溶液で３回洗浄後、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおいて、減圧乾固した。乾固した蛋白質は、５０μｌの脱イオン水を加えた後に、１００℃で１０分間処理した。
【００７７】
本溶液に、５０μｌの０．０２Ｍ  ＨＣｌを加え、蛋白質を再懸濁した。懸濁液に、ペプシン（５ｍｇ／ｍｌ（０．０１Ｍ  ＨＣｌ））を２０μｌ加え、３７℃で２時間静置した。その後、更に、前記ペプシン溶液を２０μｌ加え、３７℃で一晩静置した。ペプシン処理液を、１Ｍアンモニア水溶液で中和後、１００℃で１０分間処理によりペプシンを失活させた。
【００７８】
試料溶液を、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄を新たな１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、減圧乾固した。乾固物を４７．５μｌの０．５Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に懸濁後、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解したグリコペプチダーゼＡ（０．０５ｍＵ／２．５μｌ、生化学工業）を加え、３７℃で一晩静置した。
【００７９】
グリコペプチダーゼＡ処理液に、５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ８．０）を加え、１００℃で１０分間処理に供した。試料溶液を１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄をＤｏｗｅｘ５０（Ｈ＋）カラム、Ｄｏｗｅｘ１（ＣＯ３２−）カラム及びカーボグラフカラムで順次処理し、精製・脱塩後、減圧乾固し、糖鎖試料を得た。糖鎖試料は、１０μｌの超純水に溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に用いた。
【００８０】
（７）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる植物型糖鎖修飾抑制効果の評価法
１μｌの糖鎖試料溶液と、０．５μｌの２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｏｉｃ  Ａｃｉｄ（ＤＨＢ）水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を、ＭＴＰ  ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐＴＭ  ６００／３８４  Ｔ  Ｆプレート（ブルカーダルトニクス）上のターゲットにおいて混合し、風乾した。測定は、Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（ブルカーダルトニクス、ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎモード、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  モード）で行い、観測された各糖鎖のピーク面積の割合（％）を以下の式で算出した。
【００８１】
糖鎖Ａのピーク面積の割合（％）＝（糖鎖Ａのピーク面積／全糖鎖ピーク面積）×１００
ウイルスベクター未接種及び接種植物体由来糖鎖試料において、各糖鎖の割合を比較し、植物型糖鎖修飾抑制効果を評価した。
【００８２】
（８）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる植物型糖鎖修飾抑制効果の評価
ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターを接種した植物体において、Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコースの修飾が、約７０％から２０％へと低下することが観察された（図３及び表１）。
【００８３】
【表１】
2010051297.tif 000003
【００８４】
（９）Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａからのＲＮＡ試料の調製
ウイルス未接種株、ＣＭＶベクター接種株（抑制用遺伝子の挿入は無し）、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター接種株より、ウイルス接種後３週目に、葉試料を採取し、それぞれの葉試料を、液体窒素中で磨砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。
【００８５】
（１０）ＲＴ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子の発現様式の評価
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料を５μｇ及びオリゴｄＴプライマーを用い、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥヘルスケア）により、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡ溶液１μｌを試料として、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＴ−ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分処理後、９４℃（３０秒）→５６℃（３０秒）→７２℃（１分３０秒）のサイクルを３５回繰り返した。
【００８６】
ＧＭＤ遺伝子用プライマーとしては、ＮｂＭＤ（Ｆ）（配列番号１：５’−ＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣ）及びＮｂＭＤ（Ｒ）（配列番号２：５’−ＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣ）を用いた。また、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１α（ＥＦ−１α）遺伝子由来ｍＲＮＡを内部標準とし、プライマーＥＦ−１−Ｆ（配列番号５：５’−ＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣ）及びＥＦ−１−Ｒ（配列番号６：５’−ＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＣＡＴＣＴＣ）を用いて、その部分配列を増幅した。その結果、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター接種株では、未接種株に比べ、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡ量の顕著な減少が認められた（図４）。
【００８７】
ｉ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡ量を概算した結果、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター接種株では、未接種株に比べ１０％以下となり、その顕著な減少が認められた（図５）。
【００８８】
以上の結果から、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来ＧＭＤ遺伝子を組み込んだＣＭＶベクターよるＶＩＧＳ誘導で、植物由来糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコース修飾が抑制可能であることが明らかとなった。これは、ＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクター感染により誘導されたＶＩＧＳにより、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡが破壊された結果、植物体中でのＧＭＤ蛋白質が減少し、α−１，３−フコース転移酵素へのフコース供与体であるＧＤＰ−フコースの合成が阻害されたためと推定される。
【実施例２】
【００８９】
本実施例では、タバコ植物体を形質転換することで、ＰＴＧＳを誘導することにより、糖鎖へのフコース修飾の抑制を行った。
（１）ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片の調製
単離したＧＭＤ遺伝子を鋳型として、制限酵素サイトを有するプライマーペアとして、Ｎｂ−ｉＭＤ−Ｆ（Ｘｂａ）（配列番号７：ＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＣＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧＣＧＧ）及びＮｂ−ｉＭＤ−Ｒ（Ｂａｍ）（配列番号８：ＴＡＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣ）、Ｎｂ−ｉＭＤ−Ｆ（Ｓａｃ）（配列番号９：ＴＡＧＴＴＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＴＣＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧＣＧＧ）及びＮｂ−ｉＭＤ−Ｒ（Ｓｍａ）（配列番号１０：ＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣ）を用い、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲにより、約４００ｂｐの遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘｂａ−Ｂａｍ）及びＮｂｉＭＤ（Ｓｍａ−Ｓａｃ）を得た。ＰＣＲは、９４℃で３分処理後、９８℃（３０秒）→５６℃（１５秒）→６８℃（１分３０秒）のサイクルを３５回繰り返した。
【００９０】
ＮｂｉＭＤ（Ｘｂａ−Ｂａｍ）について、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子断片バンド部分を切り出した。ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、遺伝子断片を含む溶液を得た。本溶液より、ベクターへ挿入するＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘ−Ｂ）を得た。
【００９１】
ＮｂｉＭＤ（Ｓｍａ−Ｓａｃ）について、制限酵素ＳｍａＩ及びＳａｃＩで処理後、ＮｂｉＭＤ（Ｘｂａ−Ｂａｍ）と同様に処理し、ベクターへ挿入するＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｓ−Ｓ）を得た。
【００９２】
（２）イントロン配列の単離
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ葉試料より、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）により、ＤＮＡ試料を精製した。本ＤＮＡ試料より、既知のβ−１，２−キシロース転移酵素遺伝子配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ１２４９３２）を元に設計したプライマーＡｔＸ（Ｆ）（配列番号１１：５’−ＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧ）及びＡｔＸ（Ｒ）（配列番号１２：５’−ＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧ）を用いたＰＣＲにより、β−１，２−キシロース転移酵素遺伝子を単離した。ＰＣＲには、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９４℃で３分処理後、９８℃（３０秒）→５６℃（１５秒）→６８℃（２分）のサイクルを３５回繰り返した。
【００９３】
単離した遺伝子を鋳型として、ＡｔＸｙｌｔ−ｉｎｔ１（Ｆ）（配列番号１３：５’−ＧＴ  ＧＡＡＧＡＧＧＴＴＴ  ＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡ  ＣＴＣＡＴＴＧ）及びＡｔＸｙｌｔ−ｉｎｔ１（Ｒ）（配列番号１４：５’−ＴＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧ）により、イントロン部分を増幅した。
【００９４】
増幅したイントロン部分ＤＮＡを鋳型として、制限酵素サイト付きプライマーＡｔＸＴｉｎｔ１−Ｆ（Ｂａｍ）（配列番号１５：５’−ＴＡＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣ  ＧＡＧＧＴＴＴ  ＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡ  ＣＴＣＡＴＴＧＡＴＣ  ＴＧ）及びＡｔＸＴｉｎｔ１−Ｒ（Ｓｍａ）（配列番号１６：５’−ＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＧＧ  ＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣ）を用い、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａβ−１，２−キシロース転移酵素遺伝子に由来するイントロン配列であるＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂａｍ−Ｓｍａ）を得た。
【００９５】
ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂａｍ−Ｓｍａ）について、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子断片バンド部分を切り出した。ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、遺伝子断片を含む溶液を得た。本溶液より、ベクターへ挿入するイントロン配列ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂ−Ｓ）を得た。
【００９６】
（３）植物形質転換用ベクターｐＢＥ２１１３からのＧＵＳ遺伝子の削除
植物形質転換用ベクターであるｐＢＥ２１１３を、制限酵素ＳｍａＩとＳａｃＩで処理後精製し、更に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）により、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。
【００９７】
脱リン酸化物を精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＢＥ２１１３由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、ＤＮＡ溶液を得た。本溶液より、ＧＵＳ遺伝子を削除した遺伝子断片ｐＢＥ２１１３ΔＧＵＳを得た。
【００９８】
（４）ＧＭＤ遺伝子抑制用植物形質転換用ベクターＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３の調製
ｐＢＥ２１１３ΔＧＵＳに対し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）により、ＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｓ−Ｓ）を挿入した。ライゲーション反応液は、そのままＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）の形質転換に用いた。ＧＭＤ遺伝子抑制用遺伝子断片が挿入されたベクターＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３は、菌体より、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認した。
【００９９】
ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３を、制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理後、精製し、更に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）により、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。脱リン酸化物を精製後アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、ＤＮＡ溶液を得た。本溶液より、ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰを精製した。
【０１００】
ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰに対し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）により、イントロン配列ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂ−Ｓ）を挿入した。ライゲーション反応液は、そのままＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）の形質転換に用いた。イントロン配列ＡｔＸＴｉｎｔ１（Ｂ−Ｓ）が挿入されたベクターＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３は、菌体より、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認した。
【０１０１】
ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３を、制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで処理後、精製し、更に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）により、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。脱リン酸化物を、精製後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３由来のバンド部分を切り出し、ゲル切片をウルトラフリーＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、遠心濾過することで（５，０００×ｇ、５分）、ＤＮＡ溶液を得た。本溶液より、ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰを精製した。
【０１０２】
ＩＮＴ−ＧＭＤ−ｐＢＥ２１１３ΔＰに対し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）により、ＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘ−Ｂ）を挿入した。ライゲーション反応液は、そのままＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）の形質転換に用いた。ＧＭＤ遺伝子断片ＮｂｉＭＤ（Ｘ−Ｂ）が挿入されたベクターＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３（図６）は、菌体より、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、精製後、挿入遺伝子断片のシーケンス解析し、ＧＭＤ遺伝子断片がイントロン配列をはさみ、逆反復配列を形成していることを確認した。
【０１０３】
（５）タバコＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの形質転換
タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株を用い、リーフディスク法により行った。殺菌処理を行ったタバコの葉から、直径約１ｃｍのリーフディスクを、コルクポーラーにより切り抜き、ＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ  ＬＢＡ４４０４株の菌液に浸して、２日間ＭＳ寒天培地上で共存培養（２３℃、１６時間照明）して、タバコ葉にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを感染させた。
【０１０４】
３日目に、５ｍｇ／ｌカナマイシンと５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むＭＳ液体培地でリーフディスクを洗浄することで、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌体を除去した。リーフディスクは、これら抗生物質を加えた再分化用ＭＳ寒天培地上で培養し、形質転換タバコのシュートを得た。シュートは、カナマイシン及びカルベニシリンを含む発根培地において培養し、十分に発根後、温室において育成した。
【０１０５】
（６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる植物型糖鎖修飾抑制効果の評価
得られた形質転換植物体より、Ｎ−結合型糖鎖を精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる糖鎖構造解析を行い、フコース修飾抑制の程度を評価した。その結果、ＭＤｉ−１１株において、Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコースの修飾が７０％から５％へと低下することが観察された（図７及び表２）。
【０１０６】
【表２】
2010051297.tif 000004
【０１０７】
（７）ＲＴ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子の発現様式の評価
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料を３μｇ及びオリゴｄＴプライマーを用い、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥヘルスケア）により、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡ溶液１μｌを試料として、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＴ−ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分処理後、９４℃（３０秒）→５６℃（３０秒）→７２℃（１分３０秒）のサイクルを３５回繰り返した。
【０１０８】
ＧＭＤ遺伝子用プライマーとしては、ＮｂＭＤ（Ｆ）（配列番号１：５’−ＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣ）及びＮｂＭＤ（Ｒ）（配列番号２：５’−ＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣ）を用いた。また、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１α遺伝子由来ｍＲＮＡを内部標準とし、プライマーＥＦ−１−Ｆ（配列番号５：５’−ＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣ）及びＥＦ−１−Ｒ（配列番号６：５’−ＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＣＡＴＣＴＣ）を用いて、その部分配列を増幅した。その結果、形質転換タバコでは非形質転換タバコに比べ、ＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡ量の顕著な減少が認められた（図８）。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
以上詳述したように、本発明は、植物における糖鎖構造の改変方法及びその植物体に係るものであり、本発明により、植物における糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制して植物型糖鎖構造の改変方法を提供することができる。糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制させた植物形質転換体を調製し、提供することができる。上記植物形質転換体を宿主として利することにより糖蛋白質の糖鎖構造を改変した糖蛋白質を合成することが可能となる。本発明の植物形質転換体を利用することで、生体内に投与した際にアレルゲンになる可能性がある植物特有のフコース修飾を減少、抑制した糖蛋白質を生産することが可能となる。
【０１１０】
本発明により、植物において、糖鎖へのフコース修飾の抑制・除去が可能となり、植物に特有な糖鎖修飾であり、動物へのアレルゲンとなる可能性がある糖蛋白質Ｎ−結合型糖鎖へのα−１，３−フコース修飾が除去可能であり、植物による医療用糖蛋白質の生産への本発明の応用が可能である。本発明は、遺伝子組換え植物で、アレルゲン性を低下させた医療用糖蛋白質を生産し、提供することを可能とするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】植物型糖鎖と動物型糖鎖における糖蛋白Ｎ−結合型糖鎖修飾の相違点を示す。植物型では、α−１，３−フコース、β−１，２−キシロース修飾が存在する。
【図２】植物型糖鎖修飾抑制に用いるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクターのｐＣＹ１、ｐＣＹ２（Ｎ）、ｐＣＹ３を示す。
【図３】植物体におけるＧＭＤ遺伝子抑制用ＣＭＶベクターによるＮ−結合型糖鎖へのフコース修飾抑制効果を示す。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲによる各ウイルスベクター接種植物体におけるＧＭＤ遺伝子発現様式の解析結果を示す。
【図５】Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子由来ｍＲＮＡの存在比を示す。
【図６】ＧＭＤ遺伝子抑制用に設計した植物形質転換用ベクターＧＭＤｉｎｖ−ｐＢＥ２１１３を示す。
【図７】形質転換体よりＮ−結合型糖鎖を精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる糖鎖構造解析を行いフコース修飾抑制の程度を評価した結果を示す。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子抑制組換え植物体におけるＧＭＤ遺伝子発現様式の解析結果を示す。
【図２】
2010051297.tif 000005
【図３】
2010051297.tif 000006
【図６】
2010051297.tif 000007
【図７】
2010051297.tif 000008
【図１】
2010051297.tif 000009
【図４】
2010051297.tif 000010
【図５】
2010051297.tif 000011
【図８】
2010051297.tif 000012
【配列表】
2010051297000001.app