(57)【要約】【課題】  メダカトランスポゾン様因子にコードされている新規な蛋白質、それをコードするポリヌクレオチドの提供。また、当該蛋白質を用いて細胞、好ましくは脊椎動物の遺伝子構造を改変する方法、それによる細胞機能を改変する方法、及びその細胞の提供。さらに、遺伝子の転移に必要なシスエレメント構造を解明、提供する。【解決手段】   特定のアミノ酸配列、又はその類似アミノ酸配列を有するトランポザーゼ様活性を有する蛋白質、前記の蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素。また、前記の蛋白質をコードする特定の塩基配列を有するＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡにハイブリダイズし得るＤＮＡ、又は対応するＲＮＡ。さらに、当該蛋白質又はこれを産生し得る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の一部を切り出し又は切り出して他の箇所に挿入することからなる遺伝子構造を改変させる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるトランポザーゼ活性を有する蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸を存在させて、細胞内のゲノム中の両端に１対の繰り返し配列を含む遺伝子を切り出す方法。
【請求項２】
切り出された遺伝子が、他の遺伝子に挿入される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法を用いて、細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により機能が改変された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスポザーゼ様活性を有する新規な蛋白質、当該蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素、これを用いた細胞内の遺伝子の遺伝子構造を改変させる方法、この方法による細胞の機能を改変させる方法、この方法による遺伝子の導入方法、このためのプラスミド、及びこの方法により機能が改変された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
メダカ（Oryzias latipes）は東アジアに生息する魚であり、脊椎動物の遺伝の研究に使用されてきた。メダカのｉ遺伝子座の変異は、メラニン欠乏症及び赤目を生じさせる。このｉ遺伝子座はチロシナーゼの遺伝子をコードしていることが知られている。このｉ遺伝子座のアレル変異体のひとつであるｉ４から約４．７ｋｂのＤＮＡがクローニングされ、トランスポゾン様の配列を有しているとされていた。即ち、ショウジョウバエのｈｏｂｏ、トウモロコシの実のＡｃやキンギョソウのＴａｍ３などのｈＡＴファミリーのトランスポゾンのトランスポザーゼ（transposases）に類似したオープンリーディイングフレームや短い逆転した配列の繰り返し（terminal inverted repeats）を有していた。メダカのこのエレメントは、Ｔｏｌ２と命名された。実験室で使用されるメダカは、一倍体（haploid）のゲノム当たり約１０コピー有している。
チロシナーゼの遺伝子座に存在したＴｏｌ２エレメントは、ｉ４変異体の魚では胚発生の間に標的遺伝子座から切り出されることがＰＣＲにより示された（非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）もメダカ（Oryzias latipes）と同様に小型の硬骨魚であり、脊椎動物の遺伝現象及び発生の研究のためのモデル動物として開発されてきた（非特許文献２〜４参照）。ゼブラフィッシュにおいては、大量の化学的突然変異誘発スクリーンが行なわれ（非特許文献５〜６参照）、突然変異した遺伝子のクローニングを容易にするため、シュードタイプ（pseudotyped）のレトロウィルスを用いた挿入突然変異誘発法が開発され実行されてきた（非特許文献７〜９参照）。また、エンハンサートラップ及び遺伝子トラップスクリーンが行なわれるようにするトランスポゾン技術の開発の試みの中で、魚類におけるTcl／marinierファミリーのトランスポゾンの転位が調べられ、明らかにされてきた（非特許文献１０〜１２参照）。これらの結果は励みになるものではあるが、トランスポゾンを用いた非常に効率のよいトランスジェネシス又は挿入突然変異誘発法はまだ開発されていない。
【０００４】
本発明者らは、Ｔｏｌ２因子を用いた新規なトランスポゾン技術の開発に興味をもってきた。この目標に向かう最初のステップとして、本発明者らはゼブラフィッシュ胚を用いて、ゼブラフィッシュの受精卵に、Ｔｏｌ２因子を含んでいるプラスミドＤＮＡを注入する一過性胚エクシジョンアッセイを開発し、注入されたプラスミドからＴｏｌ２因子を切り出すことができることを示し、Ｔｏｌ２因子が自律的なメンバーでありかつゼブラフィッシュにおいても活性があることを示した（非特許文献１３参照）。Ｔｏｌ２因子のＤＮＡ配列はｈＡＴファミリーのトランスポゾンのトランスポザーゼと類似しているが、活性のあるトランスに機能することができる酵素も、切り出し反応に必須なシスエレメントも同定されていない。Ｔｏｌ２因子をトランスジェネシス及び挿入突然変異誘発に有用な道具とするためには、シス及びトランスの必要条件を細かく調べ、特性を明らかにしなければならない。Ｔｏｌ２因子によってコードされている活性のあるトランスポザーゼはまだ同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Koga, et al., Nature, 383, 30 (1996).
【非特許文献２】Takeuchi, Nture, 211, 866-867 (1996).
【非特許文献３】Yamamoto, Genetics, 55, 329-336 (1967).
【非特許文献４】Streisinger, et al., Nature, 291, 293-296 (1981).
【非特許文献５】Driever, et al., Development, 123, 37-46 (1996).
【非特許文献６】Haffter, et al., Development, 123, 1-36 (1996).
【非特許文献７】Lin, et al., Science, 265, 666-669 (1994).
【非特許文献８】Gaiano, et al., Nature, 383, 829-832 (1996).
【非特許文献９】Amsterdam, et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 62, 437-450 (1997).
【非特許文献１０】Ivics, et al., Cell, 91, 501-510 (1997).
【非特許文献１１】Raz, et al., Curr. Biol., 8, 82-88 (1997).
【非特許文献１２】Fadool, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5182-5186 (1998).
【非特許文献１３】Kawakami, et al., Gene, 225, 17-22 (1998).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、第一にゼブラフィッシュ胚に注入されたＴｏｌ２因子から転写されたｍＲＮＡを同定することを目的とする。次いで、この転写物が活性のある酵素をコード化しているかどうかを調べるため、ゼブラフィッシュ受精卵に、Ｔｏｌ２ｃＤＮＡを鋳型として用いて試験管内で合成されたＲＮＡと、トランスポザーゼをコード化している領域に欠失をもつ非自律的Ｔｏｌ２因子を含んでいるプラスミドＤＮＡとをコインジェクトする新規な分析法を開発する。
また、本発明は、ゼブラフィッシュにおけるＴｏｌ２因子の切り出しに機能する、活性のあるトランス因子及び必須なシスエレメントを同定する。
【０００７】
したがって、本発明は、Ｔｏｌ２因子にコードされている新規な蛋白質、それをコードするポリヌクレオチドを提供するものである。また、本発明は、当該蛋白質を用いて細胞、好ましくは脊椎動物の遺伝子構造を改変する方法、遺伝子構造の改変による細胞機能を改変する方法、これらの方法により機能が改変された細胞を提供するものである。さらに、本発明は遺伝子の転移に必要なシスエレメント構造を解明し、これを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸の一部が置換され若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加していてもよいアミノ酸配列を有するトランポザーゼ様活性を有する蛋白質に関する。また、前記の蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素に関する。
また、本発明は、前記の蛋白質をコードする核酸、好ましくは配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡにハイブリダイズし得るＤＮＡ、又は対応するＲＮＡに関する。
【０００９】
本発明は、前記の蛋白質がトランスポゾンを転移させるトランスポザーゼ様活性を有していること明らかにし、当該蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、細胞内、好ましくは脊椎動物の細胞内の遺伝子の一部を切り出し又は切り出して他の箇所に挿入することからなる遺伝子構造を改変させる方法に関する。当該切り出される遺伝子の一部の塩基配列の上流に、少なくとも１回の逆方向反復配列（inverted repeats(Angel エレメント)）を含む塩基配列を有する遺伝子であることが好ましい。
また、本発明は、前記の方法を用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法、及び細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法に関し、さらに本発明は、これらの方法により機能が改変された細胞に関する。
そして、本発明は、これらの方法に使用されるプラスミド、より詳細には塩基配列の上流に、少なくとも１回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有するＤＮＡを含有してなるプラスミドにも関する。
さらに、本発明は、脊椎動物のゲノムＤＮＡ中に、他の遺伝子を挿入する方法において、トランスポザースを用いて自律的に当該挿入を行うことを特徴とする脊椎動物のゲノムＤＮＡ中に他の遺伝子を挿入する方法、好ましくは他の遺伝子がＴｏｌ２エレメントであり、脊椎動物が、魚類である前記方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、遺伝子の転移酵素活性を有する新規な蛋白質及びそれをコードする核酸を提供するものである。
また、本発明は、脊椎細胞において異なるファミリーの遺伝子転移酵素が、遺伝子を転移させ得る活性を発現することができることを開示するものであり、脊椎動物における遺伝子の転移や転移による変異に関する技術の発展に大きく寄与するものである。一方、最近の遺伝子工学が個々の細胞の形質転換から生体の形質転換へと発展していることから、本発明の細胞レベルの遺伝子の転移技術が単に細胞の形質転換のみに制限されるものではなく、生体における形質転換の手段の一つとして、哺乳動物の遺伝子構造や機能を改変するための医学や農学の分野への応用が期待される技術である。とりわけ、遺伝子治療、魚類の品種改良においては有力な手段となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｔｏｌ２プラスミド及びその転写物の構造、及び本発明のｃＤＮＡの構造を示すものである。破線部分はイントロンを示す。一番目のイントロンにある逆方向反復配列（Ａｎｇｅｌエレメント）と、本発明で用いたプライマーの位置とを矢印で示す。
【図２】図２は、本発明のＴｏｌ２及びＡｃトランスポザーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図３】図３は、本発明のコインジェクションによる一過性胚エクシジョンアッセイの概要を示したものである。切り出し産物（ｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒ）の検出に用いたプライマーを矢印で示す。
【図４】図４は、ゼブラフィッシュ胚における本発明の切り出し反応のＰＣＲ分析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、Ｔｏｌ２エレメントをゲノムに転移させるための（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミド、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）及びＴｏｌ２ｃＤＮＡの構造を示す。図５上部の黒線はサザンブロット分析に使用するプローブ部分を示す。
【図６】図６は、Ｔｏｌ２エレメントの存在が確認された親（ｆｆ−１及びｆｆ−７）のそれぞれの子孫Ｆ１のサザンブロット分析の結果（図６のＡ）、及びＰＣＲ分析の結果（図６のＢ）を示す、図面に代わる写真である。
【図７】図７は、ｆｆ−７の子孫Ｆ１のＡ、Ｂ及びＣの３種における、ゲノム中に挿入されたＴｏｌ２エレメントの周囲の塩基配列を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
先に本発明者らは、チロシナーゼ遺伝子座からクローン化したＴｏｌ２因子を含んでいるプラスミドであるＴｏｌ２−ｔｙｒプラスミドをゼブラフィッシュ受精卵に注入し、注入したプラスミドＤＮＡからＴｏｌ２因子を切り出すことができることを示した（Kawakami等、1998）。推定上のトランスポザーゼ活性をコード化している転写物を同定するため、Ｔｏｌ２−ｔｙｒプラスミドを注入した胚から全ＲＮＡを調製した。筆者等はまず、Ｔｏｌ２配列の別の部分とアニールする、重なりのある４対のプライマーを用いて３’ＲＡＣＥを行なった。
3’ＲＡＣＥを行なうために用いられたとなり同士の前向きのプライマーは：
Ｔｏｌ２ｆ２  ；   5' - TTGGTCAGACATGTTCATTG - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ３  ；   5' - ATGTTCATTGGTCCTTTGGA - 3'、
Ｔｏｌ２ｆ４  ；   5' - ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ５  ；   5' - CTGCTCTGATCATGAAACAG - 3'、
Ｔｏｌ２ｆ８  ；   5' - GCTTAATAAAGAAATATCGGCC - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ９  ；   5' - AATATCGGCCTTCAAAAGTTCG - 3'、並びに
Ｔｏｌ２ｆ１２  ； 5' - CTGTAATCAGAGAGTGTATGTGTA - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ１３  ； 5' - ATTGTTACATTTATTGCATACAAT - 3'である。
【００１３】
ポリアデニル化されたｃＤＮＡはＴｏｌ２ｆ８とＴｏｌ２ｆ９、及びＴｏｌ２ｆ４とＴｏｌ２ｆ５を用いた３’ＲＡＣＥではうまく増幅されたが、Ｔｏｌ２ｆ２とＴｏｌ２ｆ３、及びＴｏｌ２ｆ１２とＴｏｌ２ｆ１３を用いた３’ＲＡＣＥではそうではなかった。
次いで、５’ＲＡＣＥを行なうために用いられた重なりのある逆向きの次のプライマー：
Ｔｏｌ２ｒ４  ； 5' - CTCAATATGCTTCCTTAGG - 3'と
Ｔｏｌ２ｒ５  ； 5' - CTTCCTTAGGTTTGATGGCG - 3'
を用いた５’ＲＡＣＥを行ない、２１５６個のヌクレオチドから成る完全な長さのＴｏｌ２転写物を同定した（図１）。
【００１４】
得られたｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
図１は、Ｔｏｌ２プラスミド及びその転写物の構造を示す。図１の最上段は完全な長さのＴｏｌ２因子（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）である。図の破線部分は、イントロンである。一番目のイントロンにある逆向きの反復（Ａｎｇｅｌ因子）と、前記したプライマーの位置とを矢印で示す。その下の段は、３’ＲＡＣＥの結果を示し、その下の段は５’ＲＡＣＥの結果を示す。いずれの場合も、イントロン部分は破線で示されている。
その下の段にこれらの結果から得られた全長のｍＲＮＡの構造を示す。翻訳領域は、配列番号１のｃＤＮＡの塩基配列の８５番目（ＡＴＧ）から２０３２（ＴＡＧ）に相当している。
図１の下から１段目と２段目は、欠失変異株の（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶ及び（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶの構造を示している。
【００１５】
５’ＲＡＣＥ分析では、プラスミド配列からスタートし、Ｔｏｌ２因子の一番目のエクソン内の通常では機能しないスプライスアクセプター(cryptic spliceacceptor）部位へジャンプした異常な転写物も見つかった（データは示さず）。これらの転写物についてはそれ以上は調べなかった。
ｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定によりＴｏｌ２因子のエクソン−イントロン構造（すなわち、４つのエクソンと３つのイントロン）が明らかにされた（図１の最上段参照）。このｃＤＮＡは６４９個のアミノ酸から成るタンパク質をコード化している。この蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
Ｔｏｌ２エレメントがトランスポゾン様配列であることは知られていたが、本発明は、Ｔｏｌ２エレメントが蛋白質をコードし、当該蛋白質の発現による作用であることを初めて確認したものである。即ち、本発明は、Ｔｏｌ２エレメントにおいてコードされている新規な蛋白質を提供するものであり、また、当該蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１６】
図２に本発明の蛋白質のアミノ酸配列及び公知のｈＡＴファミリーのトランスポゾンのトランスポザーゼ類のアミノ酸配列を比較した図を示す。この比較から、これらの蛋白質は特に中央部のアミノ酸配列が類似していることがわかる（図２参照）。しかし、ＮＨ２−及びＣＯＯＨ−末端のアミノ酸配列にはやや多様性があった。
【００１７】
同定された本発明の蛋白質（Ｔｏｌ２転写物）が、活性のある酵素をコード化しているかどうかを決定するため、コインジェクジョンによる新規な一過性の胚エクシジョンアッセイを開発し、これによる酵素活性の確認を行った。
ゼブラフィッシュの受精卵に、配列番号１に示すｃＤＮＡを鋳型として用いて試験管内で合成したｍＲＮＡと、Ｔｏｌ２エレメントのＥｃｏＲＶ切断部位の間の塩基を欠失させた、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶ（図１参照）を含む（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドとをコインジェクトした。コインジェクションの約８時間後、各々の胚よりＤＮＡを抽出し、Ｔｏｌ２エレメントの外側の配列に基づいて調製されたプライマーｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒ
ｔｙｒ−ｅｘ４ｆ  ：  5'-GCTACTACATGGTGCCATTCCT-3'
ｔｙｒ−ｅｘ５ｒ  ：  5'-CACTGCCAGATCTGCTGGGCTT-3'
を用いてＰＣＲ法により分析した。図３にこの方法の概要を示し、図４のＡにこれらのプライマーに一を示す。
【００１８】
（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドからＴｏｌ２エレメントの部分が切り出された場合に生成すると考えられる約２５０ｂｐのＰＣＲ産物が、調べた全ての胚において増幅されていた（５６個中５６個、図４Ｂのレーン１−１０参照）。このＰＣＲ産物は（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドＤＮＡのみを注入した胚からは決して検出されなかった（５０個より多い中で０個、図４Ｂのレーン１１−２０参照）。
６個の異なる胚からのＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定した。それらのうちの３個は、野性型のメダカチロシナーゼ遺伝子の配列（図４Ｃ、切り出し産物ａ）を有し、正確な切り出しを示しており、他の３個は、ｈＡＴファミリーのトランスポゾンの切り出しに特徴的な（Pohlman等、1984 ; Sutton等、1984 ; Koga等、1996 ; Kawakami等、1998）、少数のヌクレオチドが付加したほぼ野性型の配列（図４Ｃ、切り出し産物ｂ及びｃ）を有しており、この実験における切り出しという事象がトランスポザーゼ活性に依存することを示している。
【００１９】
これらの結果、即ち、本発明の配列番号１に示す塩基配列を有するｍＲＮＡと共にインジェクションした場合には、トランスポゾンの切り出しに特徴的なＰＣＲ産物が得られ、これをインジェクションしない場合にはこのようなＰＣＲ産物が得られないということは、本発明の蛋白質（Ｔｏｌ２転写物）が、切り出しを触媒する活性のあるトランスポザーゼをコードしており、しかも（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドは切り出しに必須のシスエレメントの配列を含むことを示している。
【００２０】
図４は、この実験の結果を示すものであり、図４Ａは、この分析に用いたプライマーの位置及び方向を矢印で示している。図４Ｂの上段は、プライマーｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒを用いたＰＣＲ産物を、下段はプライマーＴｏｌ２ｆ１及びＴｏｌ２ｒ３を用いたＰＣＲ産物を示す、図面に代わる写真である。レーン１ー１０はゼブラフィッシュ胚に（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドとＴｏｌ２のｍＲＮＡと共にインジェクションした場合を、レーン１１−２０は（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドのみを単独でインジェクションした場合を、レーンＧ及びＰは５０ｎｇのゼブラフィッシュゲノムＤＮＡと、１０ｐｇの（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドＤＮＡとからのＰＣＲ産物である。図４のＣは、上記の実験で得られた切り出し産物のＤＮＡ配列を示している。Ｔｏｌ２配列を肉太活字で示し、Ｔｏｌ２エレメントの外側の８ｂｐの同方向のプライマーの配列部分に下線をつけてある。
【００２１】
この実験では、切り出し産物は一回のＰＣＲ増幅の後に検出可能であったが、試験管内で調製したｍＲＮＡに代えて全長のＴｏｌ２エレメントを含有するプラスミドＤＮＡを単独で受精卵に注入した分析法では、二回のＰＣＲが必要であったことが注目された。ここで観察された効率のより高い切り出し反応は 、ＤＮＡ注入によって供給されるよりも多くのトランスポザーゼがＲＮＡ注入によって供給されたためとして説明することができる。
【００２２】
Ｔｏｌ２エレメントの一番目のイントロンは約３００ｂｐの大きな逆方向反復配列（inverted repeats）を含んでおり、最近Ａｎｇｅｌエレメントの逆向きの重複として同定された（Izsvak等、1999）（図１参照）。このイントロン部分の配列が切り出しに必要であるかどうかを検討するために、一番目のイントロンの配列をも完全に欠いている（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶ（図１の下段参照）を含有する（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドを構築し、その活性をＴｏｌ２のｍＲＮＡとのコインジェクションにより前記の実験と同様に分析した。この結果を図４のＤに示す。
【００２３】
図４のＤの上段は、プライマーｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒを用いたＰＣＲ産物を、下段はプライマーＴｏｌ２ｆ１及びＴｏｌ２ｒ３を用いたＰＣＲ産物を示す、図面に代わる写真である。レーン１−８はゼブラフィッシュ胚に、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドとＴｏｌ２のｍＲＮＡとをインジェクションした場合を示し、レーン９−１２は（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドとＴｏｌ２のｍＲＮＡとをインジェクションした場合を示し、レーン１３−１６は（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドのみを単独でインジェクションした場合を示す。レーンＰは１０ｐｇの（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。
【００２４】
レーン９−１２は先ほどの実験を対照としておこなったものであり、切り出しを示すＰＣＲ産物を確認することができたが、イントロン部分を欠失させたプラスミドを用いたレーン１−８のものでは、切り出し産物は検出することができず（１６個のうち０個、図４Ｄ、レーン１ー８参照）、一番目のイントロンが切り出しに必須のシスエレメントを含んでいることが示された。
また、ΔＲＶ欠失を修復し、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドとほぼ同じ大きさの（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１、即ちＴｏｌ２エレメントの６４４〜２１６３番目の塩基のみを欠失させたものを含有する（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１プラスミドもコインジェクションアッセイによって調べたが、切り出しを示すＰＣＲ産物は得られなかった（１６個のうち０個、データは示さず）。
【００２５】
切り出しに必須のシスエレメントを正確に特定するためには、一番目のイントロン内のより小さい欠失及び点突然変異を用いたさらなる分析が必要であろうが、これらの結果からイントロン部分が切り出しに必要であり、かつ当該イントロン部分にはＡｎｇｅｌエレメントが逆方向反復配列として含まれていることから、当該逆方向反復配列が本発明の切り出しに必要な配列と考えることもできる。
【００２６】
このように、Ｔｏｌ２エレメントによってコードされていた転写物（本発明の蛋白質）及びこの蛋白質のトランスポザーゼ活性と、転移に必須のシスエレメントとを初めて同定することに成功した。これらの発見は、Ｔｏｌ２トランスポザーゼの生化学的な特徴づけにつながるものであろう。
また、Ｔｃ１／marinerファミリーに属するトランスポゾンのゼブラフィッシュゲノムへの転位が報告されている（Raz等、1997 ; Fadool等、1998）。この報告の実験では、ゼブラフィッシュの一細胞期の胚に、インビトロで転写したトランスポザーゼＲＮＡと必須のシスエレメントをもつトランスポゾンベクターとがコインジェクトされた。
異なるファミリーに属するトランスポゾンが、ゲノムへの組込みに関して異なる特異性及び効率を有するかもしれないが、Ｔｏｌ２エレメントを用いた魚類における新規なトランスポゾン技術を開発した本発明の方法によれば、遺伝子の切り出しが前記したラッツ（Raz）らの方法と同様に行われていることから、Ｔｃ１／marinerファミリーのトランスポゾンにおいて行なわれたものと類似の方法で、Ｔｏｌ２エレメントなどの遺伝子をゲノム内にトランスポーズすることができることになるであろう。
【００２７】
そこで本発明者らは、Ｔｏｌ２エレメントを転位によりゼブラフィッシュのゲノムに導入することができるかどうかを検討した。ゼブラフィッシュのゲノムにはＴｏｌ２エレメントは存在しないことが知られている。
Ｔｏｌ２エレメントがトランスポジションを活性化することができるトランスポゼースをコードしているかどうかを試験するために、ゼブラフィッシュの受精卵に、トランスポゼースをコードしていると考えられるテンプレートとしてのＴｏｌ２ｃＤＮＡを用いてインヴィトロで転写したＲＮＡ、及びトランスポゼースをコードしていると考えられる領域を欠失させている（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶエレメントを有するプラスミドＤＮＡを、コインジェクトした。
これらの（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミド及びＴｏｌ２ＤＮＡの構造を図５に示す。３’及び５’は転写の方向を示す。
【００２８】
インジェクトした卵を成魚に生長させて、インジェクトしていない成魚とつがいにした。そして、その子孫にＴｏｌ２配列が存在するか否かを分析した。
インジェクトした８匹の魚のうちの２匹からの子孫に、Ｔｏｌ２配列を見出すことができた。この２匹の魚をｆｆ−１（founder fish-1）及びｆｆ−７（founder fish-7）と名付けた。
ｆｆ−１からの６８匹のＦ１のうちの２匹がＴｏｌ２配列を持っていた。これらの２匹の魚は、Ｔｏｌ２配列と同様にプラスミド配列も持っていた。また、ｆｆ−７からの５０匹のＦ１のうち２５匹はＴｏｌ２配列を持っていた。これらの２５匹の魚はプラスミド配列をもっておらず、図６のＡに示すサザンブロットの結果からＡ、Ｂ及びＣの３種類に分類された。このうちＡは７匹で、Ｂは３匹で、Ｃは１５匹であった。
図６のＡは、ｆｆ−１、ｆｆ−７からのＦ１の尾ひれから調製したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｖで消化し、これを図５に示すプローブを用いてサザンブロット分析した結果を示す、図面に代わる写真である。ｆｆ−１からの２匹は同じパターンを示したが、ｆｆ−７からのものはＡ、Ｂ及びＣの３種類のパターンを示した。
【００２９】
次に、ｆｆ−１、ｆｆ−７からのＦ１のＰＣＲ分析を行った。図５にＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３として示される位置のプライマーを用いた。対照として、ゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡ（Ｇ）、及びゲノムＤＮＡと（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドＤＮＡ（Ｇ＋Ｐ）を用いた。ｆｆ−７からのＦ１では、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３におけるＰＣＲ産物を増幅することはできなかった。即ち、ｆｆ−７からの子孫は、ｆｆ−１からの子孫とは異なりＴｏｌ２のフランキング配列となるプラスミド配列を持っていなかった。
【００３０】
ｆｆ−７の子孫におけるＴｏｌ２配列を含むＤＮＡフラグメント及びその近傍領域をインバースＰＣＲ（inverse PCR）によりクローニングして、その配列を決定した。Ａ、Ｂ及びＣの３種類のいずれの場合もＴｏｌ２配列はゼブラフィッシュのゲノム配列の中にあり、その両端には８ｂｐの繰り返し配列がみられた。Ｔｏｌ２配列の両端における８ｂｐの繰り返しは、ｈＡＴファミリーのトランスポザースによる挿入に特徴的なものであり、トランポザースによってＴｏｌ２配列の挿入が行われたことを示すものである。
図７にＡ、Ｂ及びＣの３種類の決定された塩基配列を示す。図７中のＴｏｌ２は、Ｔｏｌ２の配列を示している。Ａでは、Ｔｏｌ２配列の両端に「ＣＴＣＡＡＣＴＧ」の繰り返しが、Ｂでは、Ｔｏｌ２配列の両端に「ＴＡＴＡＧＡＧＡ」の繰り返しが、Ｃでは、Ｔｏｌ２配列の両端に「ＧＴＴＴＴＣＡＧ」の繰り返しが見られた。
【００３１】
脊椎動物の培養細胞や生殖細胞において、Ｔｃｌ／マリナー（mariner）ファミリーに属する、人工的に再構築され活性化されたスリーピングビューティー（sleeping beauty）（Ivics,Z., et al., Cell, 91, 501-510 (1997)）、線虫のＴｃ３（Raz,E., et al., Current Biology, 8, 82-88 (1997)）、ショウジョウバエのマリナー因子（mariner）（Fadool,J.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5182-5186 (1998)）についてトランスポジション活性が報告されている。しかし、脊椎動物ゲノムに存在する自律的なトランスポゾン活性は未だ報告されていない。
本発明は、脊椎動物からの自律的なエレメントを同定した最初の報告であり、脊椎動物における機能的なトランスポザース活性を最初に報告するものである。
即ち、本発明は、脊椎動物において自律的に遺伝子を切り出す方法に関するのみならず、遺伝子を切り出し、きりだされた遺伝子をゲノムなどの他の遺伝子の中に挿入する方法にも関するものである。
【００３２】
本発明の蛋白質は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものであるが、必ずしもこの中の全てのアミノ酸を必須とするものではなく、本発明のトランポザーゼ活性又は当該活性と類似する活性（これらを併せて、トランスポザーゼ様活性という。）を有していればよく、その一部のアミノ酸が置換され若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有するものであってもよい。そして、好ましくはＴｏｌ２エレメントに由来するアミノ酸配列を有するものである。また、本発明の蛋白質は、配列表の配列番号１に示される塩基配列に相当する塩基配列を有するｍＲＮＡから産生さることを特徴とするものでもある。
【００３３】
本発明の核酸は、前記した本発明の蛋白質からなるアミノ酸配列をコードするものであり、好ましくは配列表の配列番号１で示される配列を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。本発明の核酸は前記の塩基配列を有するもののみならず、これらの塩基配列にハイブリダイズ、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列も包含される。
【００３４】
本発明の蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の遺伝子構造を改変させる方法としては、細胞に本発明の前記した蛋白質又はそのｍＲＮＡなどの当該蛋白質を産生し得る核酸を導入し、同時に転移させたい遺伝子を含有する遺伝子、例えばプラスミドなどを導入して、本発明の蛋白質による酵素作用により細胞内の遺伝子構造を改変することができる。本発明の改変は、好ましくは自律的な転移を起こすものである。細胞としては、動物細胞が好ましく、より好ましくは脊椎動物の細胞、さらに好ましくは魚類の細胞、具体的にはゼブラフィッシュなどの魚類の細胞などが挙げられる。
前記の転移させたい遺伝子を含有する遺伝子としては、転移させたい外来遺伝子を含有するプラスミドのような天然の細胞内に存在しないものであってもよいが、天然の細胞内に存在する遺伝子であってもよい。この場合に転移に必要なシスエレメントを必要に応じて付加することもできる。転移させたい遺伝子としては、トランスポゾンが好ましいが、場合によっては各種の遺伝子異常による疾患を有する細胞に正常な遺伝子を導入するための遺伝子であってもよい。
また、本発明の改変方法は、導入されたプラスミドなどの細胞内の遺伝子の一部を切り出すことのみからなるものであってもよいが、この方法により切り出された遺伝子の全部又は一部が、他の遺伝子に挿入されることを包含するものであってもよい。
本発明の改変方法における切り出される遺伝子は、その塩基配列の上流に、少なくとも１回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有することが好ましい。このような逆方向反復配列は、遺伝子の転移におけるシスエレメント、又はシスエレメントの一部と考えられるからである。
【００３５】
また、本発明は、前記してきた改変方法を用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法、及び細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法に関する。前記してきた方法によれば、例えば、プラスミド中の外来遺伝子を細胞のゲノム中に転移させることができ、細胞に当該細胞が本来有していない新たな遺伝子を導入することができる。また、このようなあらたに導入された遺伝子を発現させることにより、当該細胞の機能を改変することも可能となる。さらに、本発明はこのような方法により細胞の機能が改変された細胞を提供することができる。この方法における細胞としても、前記した細胞が好ましい。
【００３６】
本発明の塩基配列の上流に、少なくとも１回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有するＤＮＡを含有してなるプラスミドとしては、逆方向反復配列の下流にある遺伝子を転移させるためのものであり、少なくとも１回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する部分とその下流に転移させたい遺伝子を含有し、細胞に容易に導入することができるものであればよい。
【００３７】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明の実験においては、Ｔｅｕｂｉｎｇｅｎ、ＴＬ及びｂｒａｓｓ系統のゼブラフィッシュを用いて注入用の卵を得、以下の実験にはこれを使用した。
【実施例１】
【００３８】
実施例１（ｃＤＮＡのクローニング）
ゼブラフィッシュの受精卵に、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）プラスミドを注入し、注入の９時間後に５０個のゼブラフィッシュ胚より、Ｔｒｉ  Ｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Life Technologies社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、得られた約３μｇの全ＲＮＡを、各々次の３’ＲＡＣＥ法及び５’ＲＡＣＥ法に用いた。
３’ＲＡＣＥを行なうために用いられたとなり同士の前向きのプライマーは：
Ｔｏｌ２ｆ２  ；    5' - TTGGTCAGACATGTTCATTG - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ３  ；    5' - ATGTTCATTGGTCCTTTGGA - 3'、
Ｔｏｌ２ｆ４  ；    5' - ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ５  ；    5' - CTGCTCTGATCATGAAACAG - 3'、
Ｔｏｌ２ｆ８  ；    5' - GCTTAATAAAGAAATATCGGCC - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ９  ；    5' - AATATCGGCCTTCAAAAGTTCG - 3'、及び
Ｔｏｌ２ｆ１２  ；  5' - CTGTAATCAGAGAGTGTATGTGTA - 3'と
Ｔｏｌ２ｆ１３  ；  5' - ATTGTTACATTTATTGCATACAAT - 3'である。
５’ＲＡＣＥを行なうために用いられた重なりのある逆向きのプライマーは：
Ｔｏｌ２ｒ４  ；    5' - CTCAATATGCTTCCTTAGG - 3'と
Ｔｏｌ２ｒ５  ；    5' - CTTCCTTAGGTTTGATGGCG - 3'である。
３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ産物をゲル抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  クローニングキット（Invitrogen社）を用いてクローン化し、さらにABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて配列決定した。
決定された塩基配列を配列表の配列番号１に示し、その翻訳領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
また、その概要を図１に示す。  括弧内の数字は、Ｔｏｌ２エレメントの５’末端からのｂｐである。ｃＤＮＡ配列のＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号はＡＢ０３２２４４である。
【実施例２】
【００３９】
実施例２（（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドの構築）
（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドは、まず（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）プラスミドのＮｒｕ  Ｉ−Ｎｓｐ  Ｖを、ｃＤＮＡのＮｒｕ  Ｉ−Ｎｓｐ  Ｖフラグメントで置換し、さらにその結果得られたプラスミドをＥｃｏＲＶで消化し、自己連結させることによって構築した。
【実施例３】
【００４０】
実施例３（ｍＲＮＡ合成、胚への注入、及びＰＣＲ分析）
推定上のトランスポザーゼのコード領域全体をコード化しているｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Stratagene）においてクローン化し、直鎖化し、プロテイナーゼＫを用いて消化し、さらにフェノール／クロロフォルム抽出した。ｍＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びｍＣＡＰ  ｍＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇキット（Stratagene）を用いた試験管内の転写により生成した。転写物の濃度及び大きさは、アガロースゲル電気泳動で調べた。
ゼブラフィッシュ受精卵に、前記で得られたＤＮＡ溶液の１−２ｎｌ（〜２５ｎｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ）をｍＲＮＡ（〜５ｎｇ／μｌのＴｏｌ２のｍＲＮＡ）と共に、又は単独で注入し、２８℃にて〜８時間インキュベートした。各々の胚を、５０μｌの１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫに浸し、さらに５０℃にて３時間インキュベートした。
【００４１】
次いで、１μｌの溶解した胚を、ｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃３０秒、５５℃３０秒、及び７２℃３０秒を３５サイクル）に使用した（Kawakami等、1998）。ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲル電気泳動にて分析した。結果を図４に示す。
ＤＮＡ配列分析用には、ＰＣＲ産物をゲル抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Invitrogen）を用いてクローン化し、配列決定した。各々のサンプル中の注入されたプラスミドＤＮＡの存在を、Ｔｏｌ２ｆ１（5' -TCCACCCATGCTTCCAGCAGTA - 3'）及びＴｏｌ２ｒ３（5' - CGTTGTGGTTGCAATCCATTCAAC - 3'）プライマーを用いたＰＣＲ（９４℃３０秒，５５℃３０秒、及び７２℃３０秒を２５サイクル）により確かめた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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