(57)【要約】【課題】ＣｐＧ−Ｒの特徴づけおよび同定、同様の免疫応答を導き得る他のタンパク質またはレセプターをＣｐＧ−Ｒと区別すること。【解決手段】本発明は、ＣｐＧレセプター（ＣｐＧ−Ｒ）をコードする核酸分子およびポリペプチドに関する。このＣｐＧ−Ｒは、ＴＨＤを含み、ＭｙＤ８８アダプタータンパク質と相互作用し、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチドに結合し得る。本発明は、ＣｐＧ−Ｒに対する抗体、および免疫応答を調節する方法、およびＣｐＧ−Ｒに結合し、そして／またはＣｐＧ−Ｒを調節する化合物を同定する方法に関する。本発明はまた、ＣｐＧレセプターとしてのポリペプチドの使用に関し、このポリペプチドは、Ｔｏｌｌ相同性ドメインを含み、かつＣｐＧオリゴヌクレオチドに結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、１９９９年１１月２日に出願した出願番号６０／１６３，１５７号および１９９９年１１月２４日に出願した出願番号６０／１６７，３８９号の優先権を主張する。これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、免疫応答、およびタンパク質の同定、および免疫応答をシグナル伝達するための経路、具体的には、ＣｐＧレセプター（ＣｐＧ−Ｒ）の同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物の固有の免疫系は、病原性生物に特徴的な分子特徴を認識し、これに応答する。病原体の種々の部分（例えば、表面タンパク質、特に細胞壁成分および特定のヌクレオチド配列）が認識され得、種々の免疫応答を誘発し得る。細胞が種々のレセプターおよび膜結合タンパク質を有し、これらのレセプターおよび膜結合タンパク質が、外来エレメントを認識し、そして免疫応答として公知のカスケードを誘発することは長い間公知であった。２つの広範なクラスまたは型の応答が周知である：体液性免疫すなわち抗体媒介性免疫；および細胞媒介性免疫。特定の病原体または状態は、主に抗体媒介性反応により効果的に制御され得る一方、他の状態または病原体は、宿主の防御を媒介するために強力な細胞性応答を必要とする。
【０００４】
アジュバントは、固有の免疫応答を増強し得る化合物である。アジュバントは、体液性免疫および細胞性免疫の両方を増強し得る。いくつかの状態または疾患、例えば、ヒト免疫不全ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる状態または疾患に関しては、アジュバントの投与により固有の細胞媒介性免疫応答を増大させることが特に望ましい。
【０００５】
非メチル化ＣＧジヌクレオチド配列（細菌ＤＮＡにおいて一般的に見出されるが、哺乳動物ＤＮＡにおいては見出されない）は、固有の免疫系を刺激することが見出された（Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，６，４９６−５００，Ｃａｒｓｏｎら，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２１−２，およびＫｒｉｅｇら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，６，２３−７に総説されている）。天然のＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドにおける非メチル化ＣＧオリゴヌクレオチドまたはモチーフへの曝露は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞およびマクロファージ（Ｊａｋｏｂら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１，３０４２−９，Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，２８，２０４５−５４，Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，１６７１−９，Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，２１１６−２２，およびＪａｋｏｂら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１１８，４５７−４６１）、ならびにＢ細胞（Ｋｒｉｅｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６−９）を直接活性化する。ＮＫ細胞およびＴ細胞はまた、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドに曝露することにより活性化されるが、これらの効果のうちのいくつかは、他の細胞型により生成されたサイトカインにより間接的に媒介され得る（Ｂｅｎｄｉｇｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，２９，１２０９−１８，Ｓｕｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９８，１８８，２３３５−４２，およびＢａｌｌａｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，１８４０−５）。
【０００６】
実験的ワクチンにおいて、プラスミドＤＮＡへの直接的組み込みまたは合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドをタンパク質抗原とともに同時投与することのいずれかにより、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドをアジュバントとして含めることは、増加した抗体力価（特に、ＩｇＧ２ａサブタイプ）を生じる。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドはまた、細胞溶解性Ｔ細胞活性の強力な刺激因子であることが示されており、この細胞溶解性Ｔ細胞活性は、細胞媒介性免疫応答に特徴的である（Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５５３−８，Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０，８７０−６，Ｄａｖｉｓ  Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９９，６６，８４−９０，およびＭｃＣｌｕｓｋｉｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８．１６１，４４６３−６に総説されている）。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドがＴｈ１サイトカイン（特に、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ））の発現を誘導する能力は、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが多様な抗原（顕著には、Ｂ型肝炎）のアジュバントとして用いられる場合に観察される免疫応答の、強力なＴｈ１への偏りを担うようである。Ｔｈ１細胞媒介性免疫は、現在研究中の多くのワクチン標的（例えば、前述のヒト免疫不全ウイルス）に対する防御に必要であると考えられている。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドはまた、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処置が付随する抗原なしで投与した場合ですらＬｉｓｔｅｒｉａおよびＬｅｉｓｈｍａｎｉａのような病原体に対する防御を付与することが示された（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，３６２７−３０，Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，３４２０−６，およびＷａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，６９７０−６９７５）ので、微生物感染を処置することにおける治療的適用を有し得る。さらに、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処置は、未成熟のＢ細胞をアポトーシスから保護する。さらにＣｐＧオリゴヌクレオチド活性は、不特定の結果であり、そして５’隣接プリンおよび３’隣接ピリミジンを有する非メチル化ＣＧが最も大きな効果を有するという点において特異的なメチル化である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドでの予備処置は、アレルギー性喘息モデルおよびＬＰＳ誘導性喘息モデルにおいて防御効果を有し（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｉｎｍｕｎｏｌ．，１６３，２２４およびＳｕｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，６２８４）、そしてアトピー性患者由来のヒト末梢血単球によるインビトロでのＩｇＥ生成を減少させ得る。
【０００７】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドが細胞レセプターと相互作用し、そして細胞内シグナル伝達を開始することによる機構は、未知である。ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡは、オリゴマーまたはプラスミドＤＮＡの状況において、エンドサイトーシス経路を介して始められ、そしてエンドソームに蓄積される（Ｈａｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８，１７，６２３０−４０，Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１，４４９３−７，Ｙｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，４７５５−６１，およびＭａｃｆａｒｌａｎｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，１１２２−３１）。この取り込みは、ＣｐＧモチーフを欠くＤＮＡにより競合され得る（Ｈａｃｋｅｒら，前出）ので、配列特異的ではないようである。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドに対する応答は、クロロキンおよびエンドソーム成熟の他のブロッカーが、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドに対する細胞応答および分子応答を阻害し得るので、細胞取り込み（Ｋｒｉｅｇら，１９９５，前出）およびエンドソーム酸性化を必要とし得る。この阻害の正確な機構は未解決のままであり、任意のＣｐＧオリゴヌクレオチド関連タンパク質または推定ＣｐＧレセプターの細胞下位置もまた未解決のままである。
【０００８】
細胞がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを認識することによる機構は、これまで記載されていないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、マクロファージおよびＢ細胞において複数の細胞内シグナル伝達経路を活性化することは公知である。具体的には、ストレス活性化ＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫおよびｐ３８、ならびにそれらの転写因子標的であるＡＰ−１およびＡＴＦ−２は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処置に対する応答においてリン酸化される（Ｈａｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８，１７，６２３０−４０，およびＹｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１．４４９３−７）。ＮＦ−κＢの核移行を導く経路（これは、阻害性サブユニットのリン酸化および分解を導くキナーゼカスケードを含む）、ＩκＢ（Ｚａｎｄｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，１９，４５４７−５１を参照のこと）はまた、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドにより活性化される（Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，１２４０−５，およびＹｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８．１６０，４７５５−６１）。
【０００９】
他の免疫刺激性薬剤は、同様の効果を有することが公知である。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）は、Ｔｈ１リンパ球応答を誘導する（Ｕｌｌｒｉｃｈら，Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ａｓ  ａｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｅｄｓ．，１９９５，ｐｐ．４９５−５２３）ことが当業者に公知である。マクロファージにおいて、ＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢ経路は、他の薬剤（顕著には、細菌エンドトキシン、リポポリサッカリド（ＬＰＳ））により活性化される。核のＮＦ−κＢ（しばしば、ＡＰ−１のような他の転写因子と組み合わせて）は、多くの免疫応答遺伝子（同時刺激性分子およびサイトカイン）の転写の誘導に必要とされる（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１４，６４９−８３に総説される）。
【００１０】
マウスにおいて、遺伝子の証拠は、多くのＴｏｌｌ／ＩＬ−１レセプターファミリーである、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）４に対する細菌エンドトキシンに対する免疫応答性に関連する。ヒトＴＬＲを用いた実験は、ＬＰＳ応答におけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４に関する（Ｑｕｒｅｓｈｉら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，１５，２９１−２９４に総説される）。より最近では、さらなる細菌産物（ペプチドグリカンおよびミコバクテリアリポタンパク質を含む）もまた、Ｔｏｌｌレセプターファミリーのメンバーを介して作用することが示されている（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６３，１−５，Ｂｒｉｇｈｔｂｉｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８５，７３２−７３６，Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８５，７３６−７３９，およびＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６３，２３８２−２３８６）。Ｔｏｌｌ関連レセプターは、数百万年もの進化を経て保存されている；昆虫においておよび植物においてすら、Ｔｏｌｌ関連レセプターは、遺伝的に、種々の病原体（細菌、真菌、および少なくとも１つのウイルス）に対する応答と関連する（Ｈｏｆｆｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１３１３−１３１８に総説される）。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが、同様にＴｏｌｌ関連レセプターを介して作用するか否か、または推定ＣｐＧレセプターが、Ｔｏｌｌ相同性ドメイン（ＴＨＤ）を含み得るか否かは未知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これらのＣｐＧオリゴヌクレオチドの種々の免疫応答の刺激因子としての潜在的有用性のために、ＣｐＧ−Ｒの単離、特徴づけ、ならびにＣｐＧ−Ｒの作用機構およびシグナル伝達経路においてかなり興味がもたれている。従って、本発明の目的は、ＣｐＧ−Ｒの特徴づけおよび同定、同様の免疫応答を導き得る他のタンパク質またはレセプターをＣｐＧ−Ｒと区別すること、ならびにより望ましい薬理学的特性を有すると同時に、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を保持し得る新規なＣｐＧ−Ｒリガンドの設計を可能にする有用な方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、一部分、ＣｐＧ−Ｒまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子、ＣｐＧ−Ｒをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、およびＣｐＧ−Ｒまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列に関する。
【００１３】
本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターおよびこのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明はまた、ＣｐＧ−Ｒをコードするポリペプチド、もしくはポリペプチドの複合体、またはこれらのホモログもしくはフラグメントに関する。このようなポリペプチドは、上記の核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入すること、この宿主細胞をこのポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させること、およびこの宿主細胞からこのポリペプチドを単離することにより調製され得る。
【００１５】
本発明はまた、上記の核酸分子またはポリペプチドのいずれか、および受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物に関する。
【００１６】
本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体に関する。
【００１７】
本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチドに結合する抗体、およびコントロール抗体を含むキットに関する。
【００１８】
本発明はまた、ＣｐＧ−Ｒに結合するか、またはＣｐＧ−ＲのＣｐＧ活性化を活性化もしくは阻害する一定量の化合物を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物の免疫応答を調節する方法に関する。
本発明はまた、ＣｐＧ−ＲまたはＣｐＧ−Ｒを発現する細胞と化合物とを接触させること、およびこの化合物がＣｐＧ−Ｒに結合するか否かまたはこの化合物がＣｐＧ−Ｒの活性を調節するか否かを決定することによる、ＣｐＧ−Ｒに結合するか、またはＣｐＧ−Ｒの活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）ＣｐＧレセプターをコードする核酸配列またはそのフラグメントを含む、単離された核酸分子。
（項目２）ＣｐＧレセプターをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目３）ＣｐＧレセプターをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目４）項目１に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
（項目５）項目４に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（項目６）ＣｐＧレセプターをコードするアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。
（項目７）Ｔｏｌｌ相同性ドメインを含む、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）前記ポリペプチドがＭｙＤ８８タンパク質と相互作用する、項目６に記載のポリペプチド。
（項目９）項目６に記載のポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、項目４に記載の組換え発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入する工程、該宿主細胞を該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させる工程、および該宿主細胞から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、方法。
（項目１０）項目１に記載の核酸分子、および受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、組成物。
（項目１１）項目６に記載のポリペプチド、および受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、組成物。
（項目１２）項目６に記載のポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体。
（項目１３）項目１２に記載の抗体、およびコントロール抗体を含む、キット。
（項目１４）哺乳動物において免疫応答を調節する方法であって、該方法は、ＣｐＧレセプターに結合する一定量の化合物を該哺乳動物に投与する工程を包含し、該化合物は該ＣｐＧレセプターを調節する、方法。
（項目１５）ＣｐＧレセプターに結合するか、または、ＣｐＧレセプターの活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、該レセプターまたは該レセプターを発現する細胞を化合物と接触させる工程、および、該化合物が該タンパク質に結合するか否か、または、該化合物が該タンパク質の該活性を調節するか否かを決定する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性化を示す棒グラフである。ここでＲＡＷ  ２６４．７細胞を、κＢで駆動したルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトし、そして２４時間後にインターロイキン−１（ＩＬ−１；２０ｎｇ／ｍｌ）、ＭＰＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチド（４μＭ）で６時間処理した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド誘導性κＢ−ルシフェラーゼ（κＢ−Ｌｕｃ）活性化を示すグラフである。ここで、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、κＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミドで一過性にトランスフェクトし、そして２４時間後に示された濃度の、ＣｐＧモチーフを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（０．２５〜８μＭ）またはコントロールオリゴヌクレオチド（４μＭ）で６時間処理した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはＬＰＳによるκＢ−ルシフェラーゼ活性化の反応速度論を示すグラフである。ここで、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、κＢ−Ｌｕｃで一過性にトランスフェクトし、そして２４時間後に、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（４μＭ；白丸）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ；黒丸）で処理した。
【図２Ａ】図２Ａは、ドミナントネガティブ変異体ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８ｌｐｒ）が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド誘導性κＢ−ルシフェラーゼ活性化を阻害することを示すグラフである。ここで、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、κＢ−Ｌｕｃ（１μｇ）単独（黒棒）またはＭｙＤ８８ｌｐｒをコードするプラスミド（１０：１（灰色棒）もしくは１：１（白棒）の２つの比で）でトランスフェクトした。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＮＦ−κＢの活性化およびＭｙＤ８８ｌｐｒによる阻害が、非メチル化ＣＧ配列に依存することを示す棒グラフである。ここで、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを、κＢ−Ｌｕｃ単独（黒棒）、またはκＢ−ＬｕｃおよびＭｙＤ８８ｌｐｒ（白棒）（１：１のプラスミド比）でトランスフェクトした。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭｙＤ８８ドミナントネガティブ構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の代表的なルシフェラーゼアッセイを示す棒グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＭｙＤ８８ドミナントネガティブ構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトしたＲＡＷ  ２６４．７細胞の代表的なルシフェラーゼアッセイを示す棒グラフである。
【図４】図４は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理に対するＡＰＣ応答についてのＴｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）非依存性を示す棒グラフである。ここで、野生型（Ｂａｌｂ／ｃ；黒棒）およびＴＬＲ４変異マウス（ＣＨ３／ＨｅＪ；白棒）に由来する未成熟骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣＣ）を、上記のようにＧＭ−ＣＳＦ中で6日間増殖させ、次いで、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（５μＭ）、コントロールオリゴヌクレオチド（５μＭ）、またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で一晩処理したか、あるいは刺激しないままにした。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、特異的ＣｐＧレセプター（ＣｐＧ−Ｒ）の正体の驚くべき発見に基づく。これはまた、ＣｐＧ−Ｒまたはそれを含む複合体が、ＴＨＤを含むという驚くべき発見にさらに基づく。このレセプター内のＴＨＤの存在の発見は、ＣｐＧ応答のための既知のＴｏｌｌレセプターの必要性およびＣｐＧ−Ｒのさらなる特徴付けのために試験することを可能にした。本発明は、とりわけ、ＣｐＧ−Ｒに関し、これは、単一のポリペプチド、または複数のポリペプチドの複合体であり得、そして必要に応じて、例えば、多糖類、脂質などのようなさらなる成分を含み得る。このＣｐＧ−Ｒまたはそれを含む複合体は、好ましくは、ＴＨＤを含み、そしてＭｙＤ８８アダプタータンパク質と相互作用する。さらに、ＣｐＧ−Ｒは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに結合し得る。
【００２１】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の慣用的方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、第１巻および第２巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１〜４巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）ならびにＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｖ  （第４版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣｐＧ−Ｒ」とは、ＣｐＧレセプターをいい、これは、単一のポリペプチドまたは複数のポリペプチドの複合体であり得、そして必要に応じて、例えば、多糖類、脂質などのようなさらなる成分を含み得る。ＣｐＧ−Ｒは、ＣｐＧシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質であり得るか、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドを結合するためのレセプターであり得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「活性」とは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの結合またはシグナル伝達（例えば、上記のような）に関連する、任意の活性または活性のカスケードをいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、非限定的に、完全なインタクトな抗体、それらのＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）2フラグメント、およびキメラ抗体をいうことが意味される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、句「少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」または「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、好ましくは、オリゴヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、句「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドと、それに続くグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのメチル化されていないジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「相同」とは、ＣｐＧ−Ｒをコードするヌクレオチド配列全体またはアミノ酸配列全体、あるいはＣｐＧ−Ｒの少なくとも一部に、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％の配列同一性によって特徴付けられる、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。相同なアミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換をコードするアミノ酸配列を含み得る。配列同一性は、例えば、デフォルト設定を使用する、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉ）によって決定され得る。このプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される））を使用する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「約」とは、値が、その値の±１０％で変化することを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」とは、特定の活性またはタンパク質の量または効果の増加または減少を意味する。
【００３０】
本発明の１つの局面は、ＣｐＧ−Ｒをコードする新規ヌクレオチド配列を含む新規核酸分子に関する。核酸分子は、好ましくは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであるが、ＲＮＡおよびＤＮＡのモノマーの両方またはペプチド核酸モノマーを含み得る。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもあり得る。核酸分子のモノマーは、従来のホスホジエステル結合または修飾された結合（例えば、ホスホロチオエート結合など）を介して連結され得る。さらに、モノマーの糖部分は、例えば、２’置換基の付加によって修飾され得、これは、ヌクレアーゼ耐性を付与しおそして／または細胞の取り込みを補助する。核酸分子はまた、ＣｐＧ−Ｒをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、この核酸分子は、その配列全体に相補的なヌクレオチド配列を含むが、その配列全体の一部に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。この核酸分子はまた、ＣｐＧ−Ｒをコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含み得、そして上記のように決定されるように、ＣｐＧ−Ｒをコードする配列全体またはその任意の部分に対して、少なくとも約７０％相同、より好ましくは、少なくとも約８０％相同、より好ましくは、少なくとも約９０％相同、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％相同であり得る。
【００３１】
広範な種々の代替的なクローニング方法およびインビトロ増幅方法は、当業者に周知である。これらの技術の例は、例えば、Ｂｅｒｇｅｒら、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に見い出される。
【００３２】
本発明の別の局面は、上記の任意の核酸分子を含む、ベクターまたは組換え発現ベクターに関する。ベクターは、本明細書中では、ＣｐＧ−ＲをコードするＤＮＡを発現させるために、ＣｐＧ−ＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを増幅するために使用される。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルス、および組み込み可能なＤＮＡフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｐｉｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
好ましい発現ベクターは、ＣｐＧ−ＲをコードするＤＮＡ配列が適切な制御配列に作動可能に連結されている、複製可能なＤＮＡ構築物であり、この制御配列は、適切な宿主または生物においてこのＣｐＧ−Ｒの発現をもたらし得る。ＤＮＡ領域は、その領域が、互いに機能的に配置されている場合に、作動可能に連結されている。制御配列としては、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合配列、および転写／翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
好ましいベクターは、好ましくは、宿主生物によって認識されるプロモーターを含む。本発明のプロモーター配列は、原核生物性、真核生物性またはウイルス性であり得る。適切な原核生物配列の例としては、バクテリオファージλのＰRプロモーターおよびＰLプロモーター（Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｒｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９７３）、およびＬａｍｂｄａ  ＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８０）（これらの各々は、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される））；Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター、ならびにＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９０、３０４−３１０（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される））が挙げられる。さらなるプロモーターとしては、マウス乳腺癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの長末端反復、マロニー（ｍａｌｏｎｅｙ）ウイルス、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、エプスタイン−バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、適切な発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にするマーカーを含み得る。発現ベクターは、標準的な方法によって調製され得る。
【００３５】
本発明の別の局面は、上記の任意の核酸分子を含む発現ベクターを有する、形質転換された宿主細胞に関する。本発明のポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母および真核生物が挙げられるが、これらに限定されない。適切な原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。適切な真核生物細胞としては、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、マウス３Ｔ３線維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な酵母細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはまた、バキュロウイルス発現系を使用して発現され得る（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８、６、４７、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙら（編）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２および米国特許第４，８７９，２３６（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される））。さらに、ＭＡＸＢＡＣＪ完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、例えば、昆虫細胞における産生のために使用され得る。細胞培養物中のこのような細胞の増殖は、例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されるような、慣用的手順である。
【００３６】
本発明の別の局面において、上記の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチドに関する。本発明の好ましい実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＣｐＧ−Ｒをコードするアミノ酸配列を含む。あるいは、このポリペプチドは、ＣｐＧ−Ｒをコードするポリペプチドのフラグメントである。あるいは、このポリペプチドは、ＣｐＧ−Ｒまたはそのフラグメントに相同なアミノ酸配列を含む。ＣｐＧ−Ｒに対して、少なくとも約７０％の配列同一性または相同性（上記のように決定した場合に）、少なくとも約８０％の配列同一性または相同性、好ましくは、約９０％の配列同一性または相同性、より好ましくは、約９５％の配列同一性または相同性、そして最も好ましくは、約９８％の配列同一性または相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが、本発明に含まれることが意図される。好ましい相同なポリペプチドは、ネイティブＣｐＧ−Ｒと比較して、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。他の好ましい相同なポリペプチドは、ネイティブＣｐＧ−Ｒと比較して、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個までの保存的アミノ酸置換を含む。これらのポリペプチドは、異種タンパク質由来の領域を含み得る融合タンパク質として、宿主細胞中で発現され得る。本発明のポリペプチドはまた、同じタンパク質であるが天然に存在するポリペプチドと配列が異なる領域を含み得る。さらに、相同なＣｐＧ−Ｒペプチドは、ＣｐＧ−Ｒと比較して、少なくとも約７０％の機能的相同性、少なくとも約８０％の機能的相同性、好ましくは、約９０％の機能的相同性、より好ましくは、約９５％の機能的相同性、そして最も好ましくは、約９８％の機能的相同性を有するポリペプチド含む。従って、本発明は、ＣｐＧ−Ｒに相同でありかつＣｐＧ−Ｒの生物学的特性と実質的に類似する少なくとも１つの生物学的特性（機能的相同性）を本質的に有するタンパク質を包含する。
【００３７】
ＣｐＧ−Ｒをコードする本発明のポリペプチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを結合する能力について、ＴＨＤドメインを含むことについて、およびＭｙＤ８８アダプタータンパク質と相互作用する能力について、例えば、組換え発現ライブラリーまたは配列データベースなどをスクリーニングすることによって、単離され得る。ＭｙＤ８８アダプタードメインは、多糖類およびリポタンパク質のような産物ならびにインターロイキン−１に対するレセプターからのシグナル伝達について必要とされる。本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、好ましくは、実質的に精製され、そして最も好ましくは、均一に精製される。宿主細胞は、好ましくは溶解され、そしてポリペプチドは、その宿主細胞の溶解物から回収される。あるいは、ポリペプチドは、好ましくは宿主細胞を溶解することなく、宿主細胞からの細胞培養培地を精製することによって回収される。ポリペプチドは、周知の方法（硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む）によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。
【００３８】
本発明の別の局面は、上記の任意の核酸分子またはポリペプチドならびに受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物（薬学的組成物を含む）に関する。好ましくは、キャリアまたは希釈剤は、薬学的に受容可能である。キャリアまたは希釈剤は、当該分野で公知の任意の徐放性材料（例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン）を、単独またはワックスとの混合物で、含み得る。処方物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存剤、甘味剤、濃厚剤または矯味矯臭剤を含み得る。本発明の処方物は、当該分野で周知の手段を使用することによって患者に投与された後に、活性成分の迅速な放出、持続的放出または遅延した放出を提供するように処方され得る。薬学的組成物は、滅菌され、そして所望の場合に、その活性化合物と有害には反応しない、補助剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤および／または着色物質などと混合される。濃厚剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤もまた添加され得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、その本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得、そしてＣｐＧ−ＲまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドの活性を調節する化合物についてスクリーニングするために使用され得る。好ましくは、抗体は、ＣｐＧ−Ｒ内のエピトープに結合する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマおよびその抗体自体は、このポリペプチド単離および精製に有用である。さらに、抗体は、ＣｐＧ−Ｒ活性の特異的インヒビターであり得る。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、天然の供給源からまたは周知技術および容易に入手可能な出発材料を使用する組換え技術を介してこのタンパク質を精製するために使用され得る。抗体を作製する方法は、当業者に公知である。モノクローナル抗体を調製するために技術については、例えば、Ｓｔｉｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）2フラグメントの産生は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．（これは、参考として本明細書中に援用される）に記載される。
【００４０】
本発明はまた、キット（薬学的キットを含む）に関する。キットは、上記の任意の核酸分子、ポリペプチドまたは抗体、ならびに適切なコントロールを備え得る。キットは、好ましくは、さらなる成分（例えば、指示書、固体支持体、定量に補助する試薬など）を備える。
【００４１】
本発明の別の局面は、ある量のＣｐＧ−Ｒ、ＣｐＧ−Ｒに対する抗体、またはＣｐＧ−Ｒに結合する化合物の哺乳動物への投与によって、この哺乳動物における免疫応答を調節する方法に関する。ＣｐＧ−Ｒの量、ＣｐＧ−Ｒに対する抗体、またはＣｐＧ−Ｒに結合する化合物は、動物の種、動物のサイズなどに依存するが、当業者によって決定され得る。投与の経路は、作用の適切な部位または所望の部位に対して活性な化合物を効率的に輸送する任意の経路（例えば、経口経路、経鼻経路、直腸経路、肺経路、経皮経路もしくは非経口経路、皮下経路、静脈経路、尿道内経路、筋肉内経路、経鼻経路、眼科溶液、または軟膏、非経口または経口経路が好ましい）であり得る。
【００４２】
本発明の別の局面は、ＣｐＧ−Ｒをコードする核酸分子またはポリペプチドのいずれかに結合する化合物を同定する方法に関する。この方法は、ＣｐＧ−Ｒまたはこれをコードする核酸分子を、化合物に接触させる工程、およびこの化合物がＣｐＧ−Ｒ、またはこれをコードする核酸分子に結合するか否かを決定する工程を包含する。結合は、当業者に周知の結合アッセイにより決定され得る。このアッセイとしては、ゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット、放射線標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分画、共沈殿、ＥＬＩＳＡなどが挙げられるがこれらに限定されない。これらのアッセイは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体が本明細書において参考として援用される）に記載されている。このような試験で用いられるＣｐＧ−Ｒポリペプチドまたは核酸分子は、溶液中で遊離であるか、固体支持体に結合しているか、細胞表面に結合しているか、または細胞内に局在しているかのいずれかであり得る。
【００４３】
本発明の別の局面は、ＣｐＧ−Ｒのシグナル伝達活性を調節する化合物を同定する方法に関する。この方法は、ＣｐＧ−Ｒを、化合物に接触させる工程、およびこの化合物がＣｐＧ−Ｒの活性を調節するか否かを決定する工程を包含する。試験化合物の存在下での活性を測定し、そして試験化合物の非存在下での活性と比較する。試験化合物を含有するサンプルの活性が、試験化合物を欠くサンプル中の活性よりも高い場合、この化合物は、上昇した活性を有する。試験化合物を含有するサンプルの活性が、試験化合物を欠くサンプル中の活性よりも低い場合、この化合物は、活性が阻害されている。このような試験で用いられるＣｐＧ−Ｒは、適切な基質の存在下の溶液中で遊離であるか、細胞表面に結合しているか、または細胞内に局在しているかのいずれかであり得る。
【００４４】
ＣｐＧ−Ｒに結合するか、および／または調節する化合物は、例えば、細胞媒介性免疫応答を促進するワクチンアジュバント、抗菌剤（例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）感染からの防御）、腫瘍免疫療法、アレルギー処置（例えば、ヒトＰＢＭＣにおいてＩｇＥを抑制し、Ｔｈ２からＴｈ１にシフトする）において、および抗炎症剤として（例えば、嚢胞性線維症、敗血症、心疾患、クラミジア、炎症性腸疾患、喘息、および多発性硬化症における使用のため）の、有用性を有する。
【００４５】
本発明はさらに、本発明を明らかにする意図である、以下の実施例によってさらに例示される。前述の実施例は、本発明を例示する意図であるが、いかなる方法でも本発明を限定するとは解釈されない。当業者は、本発明の精神および範囲内である改変を認識する。本発明において言及される全ての参考文献（特許、出願、および印刷された刊行物の各々を含む）は、その全体が参考として本明細書に援用されることが意図される。
【実施例】
【００４６】
（実施例）
（実施例１：一般的方法論）
（動物および細胞株）
骨髄を、種々の遺伝子型の６〜１２週齢の雌性マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６，Ｂａｌｂ／ｃ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ；またはＣ３Ｈ／Ｈｅｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）から回収した。新鮮な骨髄細胞を用いるか、または１０％ジメチルスルホキシドを含有するウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｓｕｍｍｉｔ）中で凍結させて、−８０℃で保存した。骨髄マクロファージ（ＢＭＭＯ）を、前出のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに記載のとおり、調製した。要するに、新鮮骨髄細胞または凍結骨髄細胞をＲＰＭＩ（１０％熱非働化（５６℃３０分）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリン、５０μＭ  βメルカプトエタノール、および１００Ｕ／ｍｌ組み換えマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））中で培養した。２４時間後、非接着細胞を新しいシャーレに回収して、７日間培養を続けてマクロファージ単層を生成した。Ｍ−ＣＳＦではなくＧＭ−ＣＳＦ（２００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した同じ培地中での培養により、非接着ＢＭＤＤＣを、生成した。ＲＡＷ  ２６４．７マウスマクロファージ細胞株（もともとＢａｌｂ／ｃマウス由来）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、１０％熱不活化ＦＣＳ，Ｌグルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および１μＭピルビン酸ナトリウムとともに、ＤＭＥＭ中で培養する。
【００４７】
（試薬）
以下の試薬を用いて、示されるとおり、細胞培養物を処理した：Ｋ２３５  Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＬＰＳ，精製ゲル濾過（Ｓｉｇｍａ）、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒ５９５由来のモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ；ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）（添加の前に１０分間超音波処理した）。Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃ（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）；ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列、ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ（配列番号１）；コントロール非ＣｐＧオリゴヌクレオチドｔｃｃａｇｇａｃｔｔｃｔｃｔｃａｇｇｔｔ（配列番号２）により；ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドを合成した。同じ実験において、ＲＡＷ２６４．７細胞を刺激するために、組み換えマウスインターロイキン−１β（１Ｌ−１）（Ｅｎｄｏｇｅｎ）およびインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）も用いた。本発明において用いられ得るさらなるＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、例えば、以下のようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない：
【００４８】
【化１】
2010263900.tif 000002
【００４９】
。
【００５０】
（イムノブロッティング）
刺激後、完全Ｊプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｊ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（Ｔｒｉｔｏｎ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）とともに、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，６２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で、ＢＭＭＯまたはＲＡＷ  ２６４．７細胞を溶解した。溶解物を、還元サンプル緩衝液中で煮沸し、ＮｕＰＡＧＥＪ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動システム（Ｎｏｖｅｘ）を用いて、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。製造業者の指示に従って、ＩκＢ−α、リン酸化−ＩκＢ−α（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、または抗ＩＬ−１８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体を用いて、ニトロセルロースメンブレンをプローブして、強化化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、可視化した。
【００５１】
（κＢ−Ｌｕｃアッセイ）
トランスフェクションの２４時間前に、１ウェルあたり、３×１０5細胞の密度で、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。トランスフェクションにおいて用いたプラスミドは、ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＣＲ３．Ｖ６４−Ｍｅｔ−Ｆｌａｇ−ＭｙＤ８８ｌｐｒ（Ｊｕｒｇｅｎ  Ｔｓｃｈｏｐｐより寄贈；Ｂｕｒｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３，１２２０３〜９に記載）であった。空のベクター（ｐＣＭＶＫｍ２、Ｃｈｉｒｏｎ）の添加により、全てのウェルにまたがって、総プラスミド濃度を正規化した。製造業者の指示に従って、１ウェルあたり、１０ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とともに、言及された濃度のＤＮＡ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて細胞をトランスフェクトした。細胞を３７℃で３時間トランスフェクション混合液とともにインキュベートし、次いで、培養培地を置換し、そして細胞を一晩、回収させた。翌日、示された濃度および時間で、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＭＰＬ、ＬＰＳまたはサイトカインを用いて、３７℃、５％ＣＯ2で、培養培地中で、トランスフェクトした細胞を、処理した。冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて細胞を１回洗浄し、そしてＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｊ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶解した。全て、製造業者の指示に従って、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ  ２プレート（Ｄｙｎｅｘ）およびＭＬ  ３０００  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を用いて、溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。ＦＬＡＧ−ＭｙＤ８８ｌｐｒ発現の検出のために、トランスフェクトされたＲＡＷ  ２６４．７細胞由来の可溶性ペレットをＴｒｉｔｏｎ溶解緩衝液中に再懸濁し、そして１０分間超音波処理し、その後、サンプル緩衝液を添加して、煮沸した。分離およびニトロセルロースメンブレンへの転写後、ＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）抗体を用いてメンブレンをイムノブロットした。
【００５２】
（フローサイトメトリー）
ＢＭＤＤＣを、示されたように、アジュバントを用いて一晩処理し、洗浄し、ＦｃＢｌｏｃｋ（０．２５μｇ／１０6細胞；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）含有、冷ＰＢＳ／２％  ＦＢＳ中に再懸濁し、そしてＦＩＴＣ結合体化抗体およびＰＥ結合体化抗体（１μｇ／１０6細胞）を５分後に添加した。細胞を３０分間氷上で抗体とともにインキュベートし、洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）上でフローサイトメトリーによって分析した。この分析には、ＣＤ１１ｃについてポジティブに染色し、かつ生存細胞の前方散乱および側方散乱の特性を有するＢＭＤＤＣ培養物由来の細胞のみが含まれた。アジュバントで処理した生存ＣＤ１１ｃ細胞のＣＤ８６−ＦＩＴＣ染色の幾何平均蛍光が未処理のＢＭＤＤＣ培養の幾何平均ＣＤ８６−ＦＩＴＣ蛍光を正規化することに基づいて、ＣＤ８６発現の変化を、評価する。
【００５３】
（実施例２：ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＫ経路およびＮＦ−κＢを活性化する）
ＣｐＧモチーフを含むかまたは欠くオリゴヌクレオチドに対する、マウスＢＭＭＯおよび樹状細胞ならびにマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ  ２６４．７のいくつかの生化学的反応を比較した。オリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧモチーフの効果についてのモデルとして、１８２６と呼ばれるオリゴヌクレオチド（Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３〜３１）（マウスにおける、その活性は文献中に広範に報告されている）を用いた（Ｂａｃｈｍａｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，１８３，１３３５〜９）。ＣｐＧおよびコントロールオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡの安定性を強化するホスホロチオエート骨格を用いて各２０マーに合成した（Ａｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，７５９５〜９）。
【００５４】
実施例１に記載のように、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの骨髄細胞から、マクロファージを分化し、次いで、Ｍ−ＣＳＦを欠く低血清培地に４時間トランスファーした。培地単独、ホスホロチオエート改変ＣｐＧオリゴヌクレオチド（１μＭ）、ＣＧ配列を欠くコントロールオリゴヌクレオチド（１μＭ）、またはＭＰＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した細胞から、溶解物を調製して、リン酸化ＥＲＫ１を認識する抗体を用いて、イムノブロッティングを実施し、そしてＥＲＫ．２ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）でのさらなる処理とともに１５分間同様に処理して、そしてリン酸化ＥＲＫ１およびＥＲＫ２についてイムノブロッティングした。ＡＰＣまたはＲＡＷ  ２６４．７細胞由来の骨髄からの全細胞抽出物のイムノブロッティングによって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる複数のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路（ＥＲＫ１／２，ＪＮＫおよびｐ３８を含む）の活性化が実証された。３つの細胞型全てにおいて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドでの刺激の１時間以内に、ＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはＪＮＫ基質ｃ−ｊｕｎのリン酸化、およびｐ３８  ＭＡＰＫ基質ＡＴＦ  ２のリン酸化を観察したが、ＣｐＧ配列を欠くコントロールでは観察しなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによるＪＮＫ経路およびｐ３８経路の迅速な活性化を示す。ＲＡＷ  ２６４．７細胞およびＢＭＭＯにおけるＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ活性化についてのポジティブな結果は、別のマウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４における観察に対して対照的であるが、ＥＲＫリン酸化は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理細胞においては検出されなかった。
【００５５】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドを含む、パネルのアジュバントで処理した、ＢＭＭＯおよびＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるＮＦ−κＢ経路の状態をまた試験した。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、ＭＰＬ（１μｇ／ｍｌ）ホスホロチオエート改変ＣｐＧオリゴヌクレオチド（４μＭ）またはコントロールホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（非ＣｐＧ；４μＭ）を用いて、ＢＭＭＯを１．５時間処理した。全細胞溶解物を調製し、そして上記のようにＩκＢαについてイムノブロッティングした。ＬＰＳ、ＭＰＬまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理したＢＭＭＯにおいて、１．５時間内にＮＦ−κＢ阻害性タンパク質ＩκＢαの分解を観察したが、コントロールオリゴヌクレオチドでは観察しなかった（データ示さず）。
【００５６】
また、未処理のＲＡＷ  ２６４．７細胞またはホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチド（４μＭ）で、５分、１０分、２０分および６０分、ならびにＣｐＧモチーフを欠くコントロールオリゴヌクレオチドで６０分間、処理した細胞から、溶解物を調製した。次いで、この溶解物を電気泳動によって分離し、そしてリン酸化ＩκＢαおよび総ＩκＢαに対する抗血清を用いてイムノブロッティングした。ＩκＢαリン酸化およびＲＡＷ  ２６４．７細胞における分解により、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる類似の特異的活性化が示された。この活性化は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド添加の１０分間内にＩκＢαリン酸化のレベルで検出され、そしてＩκＢαの分解は２０分間で顕著であった。ＩκＢαは、１時間内にＣｐＧオリゴヌクレオチド処理ＲＡＷ  ２６４．７細胞中で再合成されたが、ほとんどのＩκＢαはリン酸化され、このことは迅速な分解についての連続的標的化を示唆する（データ示さず）。
【００５７】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはＭＰＬ処理により誘導されたκＢ依存性転写を直接評価するため、κ軽鎖エンハンサー（κＢ−Ｌｕｃ）のマルチコピーの制御下で、ルシフェラーゼをコードするＮＦ−κＢ−誘導性レポータープラスミドを用いて、ＲＡＷ２６４．７マクロファージをトランスフェクトし、そして翌日アジュバントまたはサイトカインを用いて処理した。詳細には、κＢ駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて、ＲＡＷ  ２６４．７細胞をトランスフェクトし、そして２４時間後に、ＩＬ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＭＰＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチド（４μＭ）を用いて６時間処理した。細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を照度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）によって定量し、そして未処理のトランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼシグナルに対してこの結果を正規化した。図１Ａに示されるように、ＲＡＷ  ２６４．７細胞に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加は、ＭＰＬまたはＬＰＳにより誘導されたレベルと類似のレベルまで、κＢ依存性ルシフェラーゼ発現を誘導した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドによるκＢレポーター遺伝子の活性化は、ＭＰＬまたはＬＰＳ（両方ともマクロファージにおいてＮＦ−κＢの強力なアクチベータ）に対する応答において見られる活性化よりもわずかに弱かった。ＩＬ−１は、ＩＬ−１８がそうであるように、ＲＡＷ  ２６４．７細胞（図１Ａ）において、κＢ−Ｌｕｃの弱いアクチベータであった（データ示さず）。
【００５８】
κＢ依存性ルシフェラーゼ発現に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドの効果は、用量依存性および時間依存性であった（図１Ｂおよび図１Ｃを参照のこと）。図１Ｂに関して、κＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミドで一時的にトランスフェクトされたＲＡＷ  ２６４．７細胞を、０．２５μＭ〜８μＭの範囲にわたるホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチド濃度の濃度で、またはコントロールのオリゴヌクレオチド（４μＭ）で２４時間後に６時間にわたって処理した。活性化は、０．２５μＭ程度の低いＣｐＧオリゴヌクレオチド濃度で検出された（図１Ｂ）が、試験した最低濃度（０．０５μＭ）では検出されなかった（データは示さず）。図１Ｂに示すデータは、同じ６ウェル組織培養プレート上の未処理のトランスフェクトしたウェルからの溶解産物におけるルシフェラーゼレベルに対して正規化した、２連のウェルからの溶解産物における平均ルシフェラーゼ活性である。ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理によるレポーター遺伝子の活性化は、８μＭで最大であり（図１Ｂ）、そして１０μＭの用量ではさらには増強されなかった（データは示さず）。図１Ｃに関して、κＢ−Ｌｕｃで一時的にトランスフェクトし、そして２４時間後にＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（４μＭ；白丸）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ；黒丸）で処理したＲＡＷ  ２６４．７細胞。図１Ｃに示す結果は、未処理のトランスフェクトされたウェルに対して正規化された２連のウェルの平均である。ＣｐＧモチーフを欠く類似の濃度のコントロールのオリゴヌクレオチドに対する、κＢ-ＬｕｃでトランスフェクトされたＲＡＷ  ２６４．７細胞の暴露は、ルシフェラーゼ発現の増大を誘導しなかった（図１Ｂおよび図１Ｃ）。ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージにおけるκＢ依存性ルシフェラーゼ発現は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはＬＰＳで処理した細胞において類似の反応速度を示した（図１Ｃ）；両方の処理は、迅速な応答（２時間で、２倍の増大よりも大きい）を誘導し、この応答は、４時間〜６時間でプラトーに達した。
【００５９】
これらの結果は、ＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるＣｐＧオリゴヌクレオチドによるＮＦ−κＢ経路の活性化が、特異的であり、迅速であり、そして用量依存性であることを実証する。サイトカインによって媒介されるＣｐＧオリゴヌクレオチドの間接的効果は、シグナル伝達の反応速度が非常に迅速であることを考慮すると、ありそうもない。ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理ＲＡＷ  ２６４．７細胞からの上清の、κＢ−ＬｕｃトランスフェクトＲＡＷ  ２６４．７マクロファージに対する添加は、ルシフェラーゼ発現をほとんど誘導せず（４時間目で２倍未満）、このことは、κＢ−Ｌｕｃ転写に対するＣｐＧモチーフが直接的な効果を有することを確認した。
【００６０】
（実施例３：ドミナントネガティブＭｙＤ８８の発現は、κＢ依存性レポーター遺伝子のＣｐＧ誘導をブロックする）
種々の細菌由来構造体（ＬＰＳ、ペプチドグリカンおよびリポタンパク質を含む）に応じたＴｏｌｌレセプターの役割を考慮すると、Ｔｏｌｌ関連レセプターは、非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドに応じたシグナル伝達に関与すると考えられる。非メチル化ＣｐＧ配列はまた、病原性の非自己の特徴である。このために、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、κＢ−ルシフェラーゼプラスミドおよびドミナントネガティブ形態のＭｙＤ８８（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプターファミリーのメンバーによるシグナル伝達のために必要とされるアダプタータンパク質）をコードする発現ベクターで同時トランスフェクトした。これらの実験において用いられるドミナントネガティブＭｙＤ８８であるＭｙＤ８８ｌｐｒは、インタクトなＴｏｌｌ相同性ドメインを有するが、細胞死ドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ；ＤＤ）に点変異を含む。ｌｐｒマウスにおけるＦａｓの細胞死ドメインにおける類似の変異は、恐らく、この細胞死ドメインのコンホメーションを変更することによってＦａｓシグナル伝達を無くし、従って、下流のシグナル伝達分子の会合をブロックする。ＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるＭｙＤ８８ｌｐｒの過剰発現は、Ｔｏｌｌ相同性ドメインを含むタンパク質との会合について内因性ＭｙＤ８８と競合することによって、ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達を中断すると予想される。ＭｙＤ８８ｌｐｒのこの効果は、この死ドメイン（ｄｅａｔｈ）における変異が、ＮＦ−κＢの他のアクチベーターと共有され得る下流のシグナル伝達構成要素との会合を妨げるに違いないので、Ｔｏｌｌ関連タンパク質に対して特異的である。
【００６１】
ＦＬＡＧタグ化ＭｙＤ８８ｌｐｒをコードするプラスミドでのＲＡＷ  ２６４．７細胞のトランスフェクションは、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫ブロッティングによって決定した場合、予想された大きさのタンパク質の発現をもたらした（データは示さず）。図２Ａに関して、次いで、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、κＢ−Ｌｕｃ（１μｇ）単独で（黒棒）またはＭｙＤ８８ｌｐｒをコードするプラスミドで、２つの異なる比率（１０：１（灰色の棒）または１：１（白色の棒））でトランスフェクトした。総プラスミドＤＮＡ濃度を、空のベクターの添加によって、全てのウェルにまたがって正規化した。トランスフェクション２４時間後の細胞を、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（４μＭ）、ＣｐＧモチーフを欠くコントロールオリゴヌクレオチド（４μＭ）、ＭＰＬ（１μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で処理した。示した結果は、未刺激のトランスフェクトされたコントロールの平均値（未処理カラム）に対して正規化された２連のウェルの平均＋／−標準偏差であり、そして複数の実験において得られた結果の代表である。ドミナントネガティブなＭｙＤ８８ｌｐｒを発現するＲＡＷ  ２６４．７細胞では、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理、ＭＰＬまたはＬＰＳポジティブコントロール（図２Ａ）によって誘導されたκＢ依存性ルシフェラーゼ活性が阻害された。ドミナントネガティブなＭｙＤ８８によるルシフェラーゼ活性の阻害程度は、トランスフェクションにおいて用いられるＭｙＤ８８ｌｐｒプラスミドの量（図２Ａ）およびＭｙＤ８８ｌｐｒ発現の得られるレベルに依存した（データは示さず）。ＩＬ−１８またはＩＬ−１（これらのレセプターは、シグナル伝達のためにＭｙＤ８８を必要する）の誘導された発現によって媒介されるＣｐＧオリゴヌクレオチドの間接的な効果は、これらの結果を説明し得る。しかし、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを組換えＩＬ−１８で処理した場合に得られたネガティブな結果（上記を参照のこと）に加えて、活性なＩＬ−１８は、それぞれ、免疫ブロッティングまたはＥＬＩＳＡによってＲＡＷ２６４．７細胞の抽出物においても上清においても検出可能ではなかった（データは示さず）。
【００６２】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドにおけるメチル化状態およびＣＧジヌクレオチド配列に対するκＢ−ルシフェラーゼの活性化およびＭｙＤ８８ｌｐｒの阻害の依存性を調べた。ＣＧ配列を置換するＧＣを有するコントロールのオリゴヌクレオチド（ＧＣオリゴ）またはＣではなくメチル−Ｃを用いて合成されたコントロールのオリゴヌクレオチド（メチルＣＧ）を、κＢ−Ｌｕｃ単独で、またはＭｙＤ８８ｌｐｒでトランスフェクトされたＲＡＷ  ２６４．７細胞に添加した。図２Ｂに関して、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを、κＢ−Ｌｕｃ単独（黒棒）またはκＢ−Ｌｕｃ＋ＭｙＤ８８ｌｐｒ（白棒）（１：１のプラスミド比）でトランスフェクトした；総ＤＮＡ濃度を、空のベクタープラスミドの添加によって一定に保った。トランスフェクトした細胞を、非メチル化ＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（４μＭ）、非メチル化ＧＣ（ＧＣ）もしくはＣｐＧモチーフを置換するメチル化ＣＧモチーフ（ｍＣＧ）を有する類似のオリゴヌクレオチド、またはＣＧモチーフを欠く無関係の配列（非ＣｐＧ）で、翌日、６時間にわたって処理した。示した結果は、未刺激のトランスフェクトしたコントロールの平均値（「未処理」カラム）に対して正規化された、２連のウェルの平均＋／−標準偏差であり、そして２つの実験において得られた結果の代表である。図２Ｂに示されるように、ＣＧ配列のメチル化またはＧＣでのそれらの置換は、このオリゴヌクレオチドによるほぼ全てのκＢ−Ｌｕｃの活性化を無くした。ＣｐＧモチーフを欠くオリゴヌクレオチドで処理した細胞における基本的なルシフェラーゼ活性は、ＭｙＤ８８ｌｐｒ発現によって阻害されなかった。これらの結果は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによって活性化されたＭｙＤ８８依存性レセプターが、細菌ＤＮＡを模倣することが意図された非メチル化ＣＧ配列についての予測された特異性を有することを示唆する。
【００６３】
別のセットの実験では、シグナルを伝達する能力を欠く３つのＭｙＤ８８構築物をＰＣＲによって増幅し、そしてＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧベクター、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の構成的制御下に置いた。第１の構築物ＭｙＤ８８ｌｐｒは、細胞死ドメインに点変異Ｆ５６Ｎを含む。第２の構築物ＭｙＤ８８−ΔＤＤは、細胞死ドメインを完全に欠く。第３の構築物ＭｙＤ８８−ＴＨＤは、細胞死ドメインおよび中間ドメインの両方を欠く。ＤＮＡを、カチオン性脂質試薬を用いてＲＡＷ  ２６４．７細胞またはマウスの胚性ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼレポータープラスミドを同時トランスフェクトした。上流のκＢ依存性プロモーターのプロセシング。ルシフェラーゼ転写は、ＮＦ−κＢの放出を当てにする。ＮＦ−κＢの放出は、Ｔｏｌｌシグナル伝達経路における最終的な事象の１つである。次いで、細胞を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびいくつかのコントロールのサイトカインで刺激した。ルシフェラーゼ発現を、ルミノメーターでアッセイして、変異ＭｙＤ８８タンパク質がＣｐＧシグナルに影響を与えたか否かを決定した。制限分析および配列決定の結果は、ＭｙＤ８８構築物の存在を確認した（データは示さず）。ドミナントネガティブなＭｙＤ８８はＣｐＧオリゴヌクレオチド刺激に応じてシグナル伝達を特異的かつ選択的にブロックする（図３Ａおよび３Ｂ）。この構築物は、ＴＮＦ  ＭｙＤ８８依存性経路を経るシグナル伝達に影響を与えなかった（ネガティブコントロール）が、ＭｙＤ８８依存性ＬＰＳシグナル伝達およびＩＬ−１シグナル伝達を阻害した（図３Ａ）。ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメイン単独は、シグナル伝達をブロックするために十分であった。
【００６４】
これらの結果は、ＭｙＤ８８機能が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＭＰＬによるＮＦ−κＢの完全な活性化に必要とされることを実証する。ＭｙＤ８８を必要とする全ての公知のレセプターは、共通の構造的特徴ＴＨＤを共有するので、この知見はまた、推定のＣｐＧレセプターの構成要素がＴＨＤを有することを暗示した。ＴＨＤを有するレセプターの存在およびＣｐＧモチーフによって誘導されるシグナル伝達におけるＴｏｌｌ経路構成要素の関与は、新規である。
【００６５】
この結果は、ＣｐＧレセプター構成要素の同様の構造的特徴において第１の洞察を提供する。非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドに対する免疫応答がＴＨＤを含むレセプターを通して媒介されることを知ることによって、対応する遺伝子を同定する新たなアプローチが提供されることが当業者によって認識される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＭｙＤ８８依存性効果のメチル化依存性および良好な配列特異性、ならびにＡＰＣの他のヌクレオチドベースアクチベーターに対するこれらの知見の関連性の調査が行われ得る。
【００６６】
（実施例４：ＴＬＲ４はＣｐＧシグナル伝達に必要とされない）
ＣｐＧ−Ｒのポリペプチド配列を決定する好ましい方法は、公知のＴＬＲが有望な候補であり得るか否かを試験することである。マウスにおけるＬＰＳに対する応答についてのＴＬＲ４についての必要条件は、ＴＬＲ４に点変異を有するエンドトキシン非応答性系統Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ならびにＴＬＲ４を発現しないＣ５７Ｂｌ／ｌ０ＳｃＣｒマウスおよびＣ５７Ｂｌ／ｌ０ＳｃＮＣｒマウスを用いて実証されている（Ｖｏｇｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６２，５６６６−７０，Ｑｕｒｅｓｈｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１８９，６１５−２５，Ｃｈｏｗら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，１０６８９−９２，Ｈｏｓｈｉｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６２，３７４９−５２およびＰｏｌｔｏｒａｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，２０８５−８）。
【００６７】
インビトロでのＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＭＰＬに対するＡＰＣの応答におけるＴＬＲ４の役割を評価するために、ＬＰＳ応答性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＢＭＤＤＣを、これらのアジュバントとともに一晩培養し、そしてＤＣ活性化／成熟のマーカーのアップレギュレーションをアッセイした。細胞の表面のＣＤ８６発現を、フローサイトメトリーによって定量した。ＣＤ８６は、活性化された樹状細胞およびマクロファージにおいてアップレギュレートされるＮＦ−κＢ標的遺伝子である。これは、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する能力を増強する。図４に関して、野生型（Ｂａｌｂ／ｃ；黒棒）およびＴＬＲ４変異マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ；白棒）由来のＢＭＤＤＣを、上記のように、ＧＭ−ＣＳＦ中で６日間にわたって増殖させ、次いで、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（５μＭ）、コントロールオリゴヌクレオチド（５μＭ）もしくはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で一晩処理したか、または未刺激のままにした。生きたＣＤ１１ｃ陽性細胞上でのＣＤ８６の細胞表面発現を、フローサイトメトリーによってアッセイした。示した結果は、同じ培養物由来の未処理のＢＭＤＤＣの相乗平均蛍光（ＭＦ）に対して正規化した、アジュバントで処理したＢＭＤＤＣのＭＦであり、そして３つの実験において得られた結果の代表である。図４に示すように、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳで処理した野生型ＢＭＤＤＣは、細胞表面ＣＤ８６発現の増加を示した。ＴＬＲ４変異ＢＭＤＤＣでは、ＣＤ８６発現における変化はＭＰＬ処理細胞でもＬＰＳ処理細胞でも観察されず、一方、野生型ＢＭＤＤＣにおいて観察された増加と同様の、ＣＤ８６発現における増加が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理培養物において見られた（図４およびデータは示さず）。従って、ＴＬＲ４は、ＬＰＳおよびＭＰＬによるインビトロでのＡＰＣ活性化に必要とされるが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによるインビトロでのＡＰＣ活性化には必要とされない。
【００６８】
上記の実験に類似したさらなる実験を実施して、ＣｐＧ−Ｒの正確な性質をより良く特徴付けるために他の公知のＴｏｌｌ様レセプターを試験し得る。これを、公知のインタクトなＴＬＲおよびこれらのレセプターを非機能的にする変異を有する任意の匹敵する細胞株において実施し得る。インタクトな場合にＣｐＧによって活性化されるがレセプターが欠損している場合は活性化されないレセプターを有する細胞の同定は、どのＴＬＲが存在するかおよびどの特定のＴＨＤが存在するかを正確に指摘する。
【００６９】
本明細書中に開示される結果はまた、シグナル伝達経路についてアダプタータンパク質ＭｙＤ８８を必要とするレセプターによって媒介される細胞のシグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る化合物を開発するために有用なアプローチを提供することが当業者によって認識される。化合物は、細胞とともにインキュベートされ得、そしてＣｐＧ活性化から続くことが公知の事象のカスケードがもたらされたかを見るためにアッセイされ得る。次いで、細胞は、ＭｙＤ８８ｌｐｒ遺伝子でトランスフェクトされ得る。ＭｙＤ８８ｌｐｒ遺伝子を伴わないコントロールにおいて効果を生じるが、ＭｙＤ８８ｌｐｒ遺伝子が発現した場合に効果を生じない化合物は、ＭｙＤ８８アダプタータンパク質を必要とする経路を経た細胞内シグナル伝達を活性化することが示されている。
【００７０】
（実施例５：ＣｐＧ−Ｒの単離）
多数の異なる手順を利用して、Ｔｏｌｌ関連のＣｐＧ−Ｒ構成要素を同定し得る。第１に、当業者は、公知でかつ新規のＴｏｌｌ様レセプターが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する応答性を非応答性細胞に付与する能力を調べ得る。第２に、当業者は、ＭｙＤ８８を使用して、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによって特異的に活性化され、そして他のＴｏｌｌレセプターリガンド（例えば、ＬＰＳ）によっては活性化されない相互作用タンパク質を精製し得るか、または酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、対応するｃＤＮＡを単離し得る。
【００７１】
マウスＴｏｌｌ様レセプター１〜６（ＴＬＲ１〜６）は、密接に関連したヒトホモログを有する。完全なまたは部分的な配列は、マウスの遺伝子についての公のデータベースにおいて利用可能である。ＴＬＲをコードする発現ベクターは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、κＢ−ルシフェラーゼ）によって活性化されるレポーター遺伝子とともに、ＣｐＧ非応答性細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３）中にトランスフェクトされ得る。同時トランスフェクトされたＴＬＲのいずれかがＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する応答性を付与する場合、これは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドでの処理の際にレポーター遺伝子の発現によって反映される。
【００７２】
類似のアプローチを用いて、新規なＴＬＲを含むＣｐＧシグナル伝達における任意の候補ＣｐＧ−Ｒ構成要素の関与を試験し得る。新規のＴｏｌｌ関連レセプターを同定およびクローニングするためのアプローチとしては、ゲノミックス、配列データベースのスクリーニング、縮重ＰＣＲ、酵母ツーハイブリッドシステムおよびハイブリダイゼーションによるライブラリースクリーニングが挙げられる。活性なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、霊長類ではなく、げっ歯類において最も良く記載されているので、マウスの系において研究して、Ｔｏｌｌ関連ＣｐＧ構成要素を同定し、次いで例えばＰＣＲを用いてヒトのホモログを単離することが好ましい。
【００７３】
ＭｙＤ８８ｌｐｒは、インタクトなＴｏｌｌ相同性ドメインおよび単一の不活化点変異を細胞死ドメイン内に含み、そして細菌または真核生物細胞のいずれかにおいて組換えタンパク質として発現され得る。組換えタンパク質をアフィニティー試薬として用いて、ＣｐＧオリゴヌクレオチド処理細胞（例えば、ＲＡＷ２６４．７）から相互作用タンパク質を単離および精製し得る。ＴＬＲシグナル伝達経路における下流のエフェクター分子（例えば、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６）の結合は、細胞死ドメインにおける「ｌｐｒ」変異によって最少になるかまたは除去されるべきである。従って、ＭｙＤ８８ｌｐｒに特異的に結合するタンパク質は、ＴＨＤおよび／またはＴＨＤを細胞死ドメインに連結する領域と相互作用するタンパク質である。Ｔｏｌｌ相同性ドメインは同質型相互作用を介して会合するので、ＴＨＤを含むＣｐＧ−Ｒ構成要素は、ＭｙＤ８８  ＴＨＤに結合することが予想される。一旦、推定のＣｐＧ−ＲがＭｙＤ８８についてアフィニティー精製されると、対応するｃＤＮＡは、例えば、ペプチド分析およびＰＣＲのような標準的な方法によって単離され得る。
【００７４】
同様に、ＭｙＤ８８ｌｐｒは、酵母ツーハイブリッドシステムにおいてベイトとして用いられて、相互作用タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し得る。次いで、ＣｐＧオリゴヌクレオチド誘導性シグナル伝達に対するこれらのｃＤＮＡの関連性が上記の通りに試験され得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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