(57)【要約】      （修正有）【課題】異種ペプチド、詳細にはＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドを作製する方法を提供する。【解決手段】異種ペプチドをコードするＤＮＡを、Ｌ１ポリペプチドをコードするＤＮＡに導入し、両ペプチドの配列を含むＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させ、ついで該異種ペプチドを含むキメラＬ１ポリペプチドを回収する工程を含む、キメラ・ヒト・ＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドの作製方法。また、該方法に用いるベクター、該ベクターを含む宿主細胞、および該方法に従って作製したキメラＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドを含むワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、
（ｉ）Ｅ−Ｆループ；
（ｉｉ）Ｄ−Ｅループ；
（ｉｉｉ）ｈ４ヘリックスおよびＪ領域の間の領域；
（ｉｖ）ｈ４ヘリックス；および
（ｖ）内部Ｃ−Ｄループ
から選択されるＬ１ポリペプチドの表面領域
でＬ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入し；
Ｌ１ポリペプチドおよびＬ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、中で該ポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞に導入し；
該ポリヌクレオチドを発現させ；ついで
Ｌ２ペプチドを含む得られたキメラＬ１ポリペプチドを回収する
工程を含む、免疫原性ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドを作製する方法。
【請求項２】
該ＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドおよび／または該ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドが、ＨＰＶ−１６のポリペプチドまたはペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドが、以下のアミノ酸配列：
ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ（配列番号：１）または配列番号：１に対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ、ＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができるペプチドをコードする配列を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該Ｌ１ポリヌクレオチドの１またはそれを超えるヌクレオチドが、Ｌ２ポリヌクレオチドの導入の点において欠失している、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該Ｌ１ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、挿入したＬ２ヌクレオチドの数に対応する請求項４記載の方法。
【請求項６】
該ポリペプチドの発現が、原核生物または真核生物の発現系のいずれかにおいてである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該キメラ・ポリペプチドが、図６、８、１０、１２および１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列（配列番号：５、７、９、１１および１３）またはその修飾体を有し、但し、該修飾体は挿入したＬ２ペプチドの修飾体であって配列番号：１の配列に少なくとも８０％同一であり、かつ、該キメラ・ポリペプチドはＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該キメラ・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、図５、７、９、１１および１３のいずれか１に記載のヌクレオチド配列（配列番号：４、６、８、１０および１２）またはその修飾体を有し、但し、該修飾体は挿入したＬ２ポリヌクレオチドの修飾体であって配列番号:１の配列に少なくとも８０％の同一性を有するペプチドをコードし、かつ、該ポリヌクレオチドはＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができるキメラ・ポリペプチドをコードする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該キメラＬ１ポリペプチドが、ウイルス様粒子および／またはキャプソメアに会合することができる請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該ウイルス様粒子またはキャプソメアが免疫原性である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
中に配列番号：１または少なくとも８０％の同一性を有する配列の免疫原性ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
（ｉ）Ｅ−Ｆループ；
（ｉｉ）Ｄ−Ｅループ；
（ｉｉｉ）ｈ４ヘリックスおよびＪ領域の間の領域；
（ｉｖ）ｈ４ヘリックス；および
（ｖ）内部Ｃ−Ｄループ
から選択されるＬ１ポリペプチドの表面領域で挿入されており、かつ、該ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを発現することができる、キメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該Ｌ１ポリヌクレオチドの１またはそれを超えるヌクレオチドが、Ｌ２ポリヌクレオチドの導入の点で欠失している請求項１１記載のＨＰＶ  Ｌ１ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｌ１ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、Ｌ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入したヌクレオチドの数に対応する請求項１２記載のＨＰＶ  Ｌ１ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
図５、７、９、１１および１３のいずれか１に記載のＤＮＡ配列（配列番号：４、６、８、１０および１２）、またはその修飾体であるＤＮＡ配列を有し、但し、その修飾ＤＮＡ配列は配列番号：４、６、８、１０および１２のいずれか１の挿入領域の修飾体であって配列番号:１の配列に少なくとも８０％の同一性を有し、ここに該ＨＰＶポリヌクレオチドは、
（ｉ）Ｅ−Ｆループ；
（ｉｉ）Ｄ−Ｅループ；
（ｉｉｉ）ｈ４ヘリックスおよびＪ領域の間の領域；
（ｉｖ）ｈ４ヘリックス；および
（ｖ）内部Ｃ−Ｄループ
から選択されるＬ１ポリペプチドの表面領域で免疫原性ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを提示するキメラＬ１ペプチドをコードし、該キメラＬ１ペプチドはＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
（ｉ）Ｅ−Ｆループ；
（ｉｉ）Ｄ−Ｅループ；
（ｉｉｉ）ｈ４ヘリックスおよびＪ領域の間の領域；
（ｉｖ）ｈ４ヘリックス；および
（ｖ）内部Ｃ−Ｄループ
から選択されるＬ１ポリペプチドの表面領域に
アミノ酸配列：
ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ（配列番号：１）
を有するペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチド。
【請求項１８】
キメラＨＰＶ  Ｌ１ウイルス様粒子またはキャプソメアである請求項１７記載のポリペプチド。
【請求項１９】
図６、８、１０、１２および１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列（配列番号：５、７、９、１１および１３）、またはその修飾体である配列を有し、但し、その修飾体は配列番号：５、７、９、１１および１３に記載の配列のいずれか１内の配列番号：１の修飾体であって配列番号:１の配列に少なくとも８０％の同一性を有し、ここにＨＰＶポリペプチドは、
（ｉ）Ｅ−Ｆループ；
（ｉｉ）Ｄ−Ｅループ；
（ｉｉｉ）ｈ４ヘリックスおよびＪ領域の間の領域；
（ｉｖ）ｈ４ヘリックス；および
（ｖ）内部Ｃ−Ｄループ
から選択されるＬ１ポリペプチドの表面領域で
免疫原性ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを提示するキメラＬ１ペプチドであり、該キメラＬ１ペプチドはＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）ポリペプチド。
【請求項２０】
異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド位置２４１−２７９、３９１−４２９、５２０−５５８、１２４０−１２７８および１２９１−１３２９（配列番号：１２、６、４、１０および８）のいずれか１のＬ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入し；
該Ｌ１ポリペプチドおよび異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞に導入し；
該ポリヌクレオチドを発現させ；ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラＬ１ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドを作製する方法。
【請求項２１】
該異種ペプチドが、いずれか他のＨＰＶペプチドであるか、またはＢ−細胞もしくはＴ−細胞特異的ないずれかの免疫原性エピトープに由来する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該Ｌ１ポリヌクレオチドの１またはそれを超えるヌクレオチドが、該異種ポリヌクレオチドの導入の点で欠失している請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
該Ｌ１ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、挿入した異種ヌクレオチドの数に対応する請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
免疫原性応答を誘導するための、請求項１７ないし１９のいずれか１に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたは請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の免疫原性応答を誘導するためのポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ＨＰＶ６、１６または１８の処置に使用するための請求項２４記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項２６】
好適な宿主中のＨＰＶおよび／または導入したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項２４または２５に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項２７】
さらに、医薬上の賦形剤および／または補助剤を含む請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ＨＰＶ感染症を予防的または治療的に処理する方法において使用するための薬物を製造する方法における、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２９】
ＨＰＶ感染症がＨＰＶ６、１６または１８である請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
該薬物がＨＰＶおよび／または好適な宿主中の誘導したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
該薬物がさらに医薬上の賦形剤および／または補助剤を含む請求項２８ないし３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
免疫原性応答を誘導するための請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたは請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたは請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む免疫原性調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・パピローマウイルスのポリペプチド、詳細にはウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはキャプソメアを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは、ヒトを含む種々の高等脊椎動物にイボおよび他の障害を誘導する一群の小さなＤＮＡウイルスである。
【０００３】
パピローマウイルス（ＰＶ）は、パポーバウイルス科、パピローマウイルス属のメンバーであり、７,９００塩基対の典型的サイズを有する二本鎖環状ＤＮＡゲノムを含む（非特許文献１)。すべてのＰＶは同様のゲノム組織を有し、それにはＤＮＡ複製および細胞トランスフォーメーションに関与するタンパク質をコードする初期遺伝子領域、およびウイルスキャプシドタンパク質をコードする後期領域が含まれる（図１）。long control region（ＬＣＲ）として知られている非コード領域には、転写および複製に関する制御エレメントが含まれる。
【０００４】
パピローマウイルスは２のウイルス構造タンパク質、Ｌ１およびＬ２をコードしている。ビリオンには７２のキャプソメアとして並んだ３６０のＬ１分子が含まれており、その各キャプソメアは５のＬ１分子からなるペンタマーである（非特許文献２)。Ｌ２分子に対するＬ１分子の比率は、ほぼ３０：１と概算されており（非特許文献３）、これは各ビリオンがほぼ１２のＬ２分子を含むことを示唆している。ビリオン当たりのＬ１分子の数が増えるほど、Ｌ１を"多い方の"キャプシドタンパク質といい、Ｌ２を"少ない方の"キャプシドタンパク質ということになる。
【０００５】
ＨＰＶ−１６  Ｌ１は１.５１８ｋｂの遺伝子によってコードされ、５０４のアミノ酸のタンパク質を生じる。Ｌ１は５５ないし５８ｋＤの分子量を有する（非特許文献４）。Ｌ１のドメインは細胞結合を仲介するようであり、また、ウイルスに対する抗体およびＴ細胞免疫応答を仲介する抗原決定基を含むようである。
【０００６】
生殖器ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）の中には、通常は退行するかまたは悪性腫瘍には進行しない生殖器のイボおよび子宮頸部病変を引き起こす低リスクＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１）、ならびに高い等級の子宮頸部病変およびガンと関連する高リスク（または発ガン性）遺伝子型（例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８）が存在する。ＨＰＶは幾つかの他の肛門性器（anogenital)ガンおよび上部気道消化管ガン（upper aerodigestive tract cancer）における病因因子として関連付けられてもいる（非特許文献５）。臨床的、分子的、実験的および疫学的事実の抵抗しがたい集合は、ある種のＨＰＶ型が子宮頸ガンの主要因であることを確立している（非特許文献６）。
【０００７】
ＨＰＶ１６は子宮頸ガン症例の大部分の症例に存在し、ほぼさらなる３０％の症例においてはさらなる３の型（ＨＰＶ１８、３１および４５）が存在する（非特許文献７）。
【０００８】
子宮頸ガンの発病率は合衆国においては低下しているが、それは、各年に約５００,０００の新たな症例が診断される途上国の女性の最も一般的な悪性腫瘍である。
【０００９】
伝統的に大部分の予防的なワクチンは、生、弱毒ウイルスまたはホルマリン不活化ウイルスからなる。パピローマウイルスのビリオンは免疫原性が非常に高く、全身的に注射した場合は高い力価（＞１０,０００）の中和抗体を誘導する（非特許文献８−１０）。しかしながら、大量のこれらの伝統的なワクチンを作り出すことに含まれる困難および危険性に起因して、ウイルスタンパク質サブユニットまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンを開発することが非常に強調されている。
【００１０】
ＨＰＶに対する予防ワクチン用の最良の候補タンパク質は、ＶＬＰに自己会合する多い方のキャプシドタンパク質Ｌ１である（非特許文献１１）。これらのＶＬＰは非常によく特徴付けられており、全ビリオンと区別し得ないように形態上見える（非特許文献１２;非特許文献１３）。実験動物にＶＬＰを注射すると、中和抗体を誘導し（非特許文献１４）；接種したＶＬＰワクチンの予備的なヒト試験も、これらはよく耐性であり非常に免疫原性が高く、前者の症例においては刺激された強いＢおよびＴ細胞応答も示された（非特許文献１５;非特許文献１６）。
【００１１】
発ガン型の粘膜親和性（mucotropic）ＨＰＶに対する有効で安価な予防ワクチンは、世界のガンの負担、特にＨＰＶ１６に対する負担に対して潜在的にインパクトを有し得るであろう。
【００１２】
ＨＰＶ６型および１６型に共通の中和エピトープは、ＨＰＶ１６の少ない方のキャプシドタンパク質、Ｌ２の領域（ａａ）１０８−１２０に見出されている（非特許文献１７および１８）。エピトープに対応する合成ペプチドで鼻腔免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスは、ＨＰＶ６、１６および１８のＬ１／Ｌ２キャプシドと交差反応するＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を生じる免疫応答を誘起した（非特許文献１９）。ウサギ口腔パピローマウイルス（ＲＯＰＶ）またはウサギ乳頭腫パピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のいずれかからのＬ２配列領域９４−１２２由来の２の重複するペプチドのいずれかでウサギを免疫化すると、精製した同族のＬ２、特に感染細胞中で認識されたＬ２に反応した血清を生じ、これはイン・ビトロ(in vitro)でウイルスを中和した。ＣＲＰＶペプチドで免疫化したウサギは、ＣＲＰＶ攻撃に対して免疫性であった（非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Seedorf, K., G.Krammer, M. Durst, S. SuhaiおよびW. G. Rowekamp. 1985. Virol. 145, 181-185.
【非特許文献２】Baker, T. S., W. W. Newcomb, N. H. Olson, L. M. Cowsert, C. Olson,およびJ. C. Brown. 1991. Biophys. J. 60:1445-1456.
【非特許文献３】Doorbaar, J.およびP. H. Gallimore. 1987. J. Virol. 61: 2793-2799.
【非特許文献４】Browne, H. M., M. J. Churcher, M. A. Stanley, G. L. Smith,およびA. C. Minson. 1988. J. Gen. Virol. 69, 1263-1273.
【非特許文献５】Breitburd, F.およびP. Coursaget. 1999. Cancer Biology 9: 431-445.
【非特許文献６】Lowy, D. R., R. KirnbauerおよびJ. T. Schiller. 1994. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 2436-2440.
【非特許文献７】IARC, World Health Organization. 1999. WHO. Report of a technical meeting, Geneva, 16-18 Feb 1999. 1999. Ref Type : Report
【非特許文献８】Doretzky, I., R. Shober, S. K. ChattopadhyayおよびD. R. Lowy. 1980. Virology 103: 369-375.
【非特許文献９】Kirnbauer, R., F. Booy, N. Cheng, D. R. LowyおよびJ. T. Schiller. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 89, 12180-12184.
【非特許文献１０】Kirnbauer, R., J. Taub, H. Greenstone, R. Roden, M. Durst, L. Gissman, D. R. LowyおよびJ. T. Schiller. 1993. J. Virol. 67, 6929-6936.
【非特許文献１１】Schiller, J. T.およびLowy, D. R. 2001. Expert. Opin. Biol. Ther. 1, 571-581.
【非特許文献１２】Chen, X. S., Casini, G., Harrison, S. C.およびGarcea, R. (2001). Joumal of Molecular Biology 307, 173-182.
【非特許文献１３】Rose, R. C., Bonnez, W., Reichman, R. C.およびGarcea, R. L. 1993. J. Virol. 67, 1936-1944.
【非特許文献１４】Rose, R. C., White, W.I., Li, M., Suzich, J. A., Lane, C.およびGarcea, R. L. 1998. Journal of Virology 72, 6151-6154.
【非特許文献１５】Evans, T. G., Bonnez, W., Rose, R. C., Koenig, S., Demeter, L., Suzich, J. A., O'Brien, D., Campbell, M., White, W.l., Bailey, J.およびReichman, R. C. 2001. J. Infect. Dis. 183, 1485-1493.
【非特許文献１６】Harro, C. D., Pang, Y. Y., Roden, R. B., Hildesheim, A., Wang, Z., Reynolds, M. J., Mast, T. C., Robinson, R., Murphy, B. R., Karron, R. A., Dillner, J., Schiller, J. T.およびLowy, D. R. 2001. J. Natl. Cancer Inst. 93, 284-292.
【非特許文献１７】Kawana, K., Matsumoto, K., Yoshikawa, H., Taketani, Y., Kawana, T., Yoshiike, K.およびKanda, T. 1998. Virology 245,353-359.
【非特許文献１８】Kawana, K., Yoshikawa, H., Takentani, Y., Yoshiike, K.およびKanda, T. (1999). Jouranl of Virology 73, 6188-6190.
【非特許文献１９】Kawana, K., Kawana, Y., Yoshikawa, H., Takentani, Y., Yoshiike, K.およびKanda, T. (2001). Vaccine 19, 1496-1502.
【非特許文献２０】ME Embers, LR Budgeon, M Pickel, ND Christensen. 2002. J. Virol., 76 (19): 9798-9805.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
かくして、本発明者らは、その自身の権利におけるワクチンとして、および他の免疫原性ペプチド配列の提示のためのモデルとして、キメラＬ１  ＶＬＰ上のこのＬ２エピトープの提示をさらに調べることを決心した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の形態によれば、
ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、Ｌ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に導入し；
Ｌ１ポリペプチドおよびＬ２ペプチドの配列を含むＤＮＡ配列を、中で該ＤＮＡ配列を発現し得る宿主細胞に導入し；
該ＤＮＡ配列を発現させ；ついで
Ｌ２ペプチドを含む得られたキメラＬ１ポリペプチドを回収する
工程を含む、ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００１６】
ＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドおよび／またはＨＰＶ  Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ−１６のポリペプチドまたはペプチドとし得る。
【００１７】
ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ（配列番号：１）、またはその修飾体もしくは誘導体である配列を有し得、但し、その修飾配列または誘導配列は、配列番号：１の配列に少なくとも８０％相同性を有し、かつ、ＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起するペプチドをコードする配列である。
【００１８】
Ｌ１  ＤＮＡ配列の１またはそれを超えるヌクレオチドはＬ２  ＤＮＡ配列の導入の点において欠失していてもよく、典型的には、Ｌ１配列から欠失したヌクレオチドの数は挿入したＬ２ヌクレオチドの数と対応するであろう。
【００１９】
タンパク質の発現は、原核生物または真核生物の発現システムのいずれかにおいてとし得る。
【００２０】
キメラ・ポリペプチドは、図６、８、１０、１２および１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列（配列番号：５、７、９、１１および１３）、または配列番号：５、７、９、１１および１３に記載の配列のいずれか１に少なくとも８０％相同であって、かつ、ＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができる配列を有し得る。キメラ・ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、図５、７、９、１１および１３のいずれか１に記載のＤＮＡ配列（配列番号：４、６、８、１０および１２）、またはこれらの配列のいずれか１に少なくとも８０％相同性を有し、かつ、ＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができるポリペプチドをコードする配列を有し得る。
【００２１】
キメラＬ１ポリペプチドは、ウイルス様粒子および／またはキャプソメアに会合し得る。ウイルス様粒子またはキャプソメアは免疫原性であってもよい。
【００２２】
本発明の第２の形態によれば、前記ＨＰＶ  Ｌ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列が挿入されたキメラＨＰＶ  Ｌ１  ＤＮＡ配列を提供し、ここに該得られたＨＰＶ  Ｌ１配列はＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを発現することができる。
【００２３】
Ｌ２  ＤＮＡ配列の導入の点におけるＬ１  ＤＮＡ配列の１またはそれを超えるヌクレオチドは欠失していてもよく、典型的には、Ｌ１配列から欠失したヌクレオチドの数は挿入されたＬ２ヌクレオチドの数に対応するであろう。
【００２４】
キメラ核酸配列は、図５、７、９、１１および１３のいずれか１に記載の配列、またはその修飾体もしくは誘導体であるＤＮＡ配列とし得、但し、その修飾ＤＮＡ配列または誘導ＤＮＡ配列は、配列番号：４、６、８、１０および１２のいずれか１の配列に少なくとも８０％相同性を有し、かつ、ＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができるキメラＬ１ペプチドをコードする。
【００２５】
本発明の第３の形態によれば、前記した核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２６】
本発明の第４の形態によれば、前記したベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明のいまださらなる形態によれば、前記ＨＰＶ  Ｌ２ペプチド（配列番号：１）を含むキメラＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドを提供する。
【００２８】
該キメラ・ポリペプチドは、キメラＨＰＶ  Ｌ１ウイルス様粒子またはキャプソメアとし得る。
【００２９】
本発明のさらなる形態によれば、図６、８、１０、１２および１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列（配列番号：５、７、９、１１および１３）、またはその修飾体または誘導体である配列を有し、その修飾体または誘導体は、配列番号：５、７、９、１１および１３に記載の配列のいずれか１に少なくとも８０％相同であって、かつ、ＨＰＶに対する免疫原性応答を誘起することができる配列であるＨＰＶポリペプチドを提供する。
【００３０】
本発明のもう１の形態によれば、
異種ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、Ｌ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に導入し；
Ｌ１ポリペプチドおよび異種ペプチドの配列を含むＤＮＡ配列を、該ＤＮＡ配列を発現し得る宿主細胞に導入し；
該ＤＮＡ配列を発現させ；ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラＬ１ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００３１】
異種ペプチド配列は、いずれか他のＨＰＶ配列とすることができ、あるいはＢ−細胞またはＴ−細胞特異的ないずれかの抗原エピトープ由来のものとし得る。
【００３２】
異種ＤＮＡ配列の導入の点におけるＬ１  ＤＮＡ配列の１またはそれを超えるヌクレオチドは欠失していてもよく、典型的には、Ｌ１配列から欠失したヌクレオチドの数は挿入された異種ヌクレオチドの数に対応するであろう。
【００３３】
本発明のいまださらなる形態によれば、前記したものと実質的に同じである、キメラＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むワクチンを提供する。該ワクチンは、ＨＰＶ感染症、詳細にはＨＰＶ６、１６および１８の感染症の予防的または治療的処理用とし得る。
【００３４】
好ましくは、ワクチンは、ＨＰＶに対するおよび好適な宿主中の導入されたペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができるであろう。
【００３５】
ワクチンは、さらに、医薬上の賦形剤および／または補助剤を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１はＨＰＶ１６のゲノム構成の概略図を示す。
【図２】図２はＨＰＶ１６  Ｌ１のモノマー構造を示す。
【図３】図３は中にＬ２エピトープが挿入されて図５ないし１４のキメラ構築物を生成するＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子の天然配列のヌクレオチド配列（配列番号：２）を示す。
【図４】図４は図３のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図５】図５はキメラ構築物Ａのヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。
【図６】図６はキメラ構築物Ａのアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【図７】図７はキメラ構築物Ｃのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す。
【図８】図８はキメラ構築物Ｃのアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【図９】図９はキメラ構築物Ｅのヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。
【図１０】図１０はキメラ構築物Ｅのアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【図１１】図１１はキメラ構築物Ｆのヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示す。
【図１２】図１２はキメラ構築物Ｆのアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。
【図１３】図１３はキメラ構築物Ｈのヌクレオチド配列（配列番号：１２）を示す。
【図１４】図１４はキメラ構築物Ｈのアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。
【図１５】図１５はキメラ構築物Ａの概略図を示す。
【図１６】図１６はキメラ構築物Ｃの概略図を示す。
【図１７】図１７はキメラ構築物Ｅの概略図を示す。
【図１８】図１８はキメラ構築物Ｆの概略図を示す。
【図１９】図１９はキメラ構築物Ｈの概略図を示す。
【図２０】図２０は構築物Ａから得たキメラＶＬＰを接種したマウスのエンドポイント力価測定から得たデータを示す。
【図２１】図２１は構築物Ｃから得たキメラＶＬＰを接種したマウスのエンドポイント力価測定から得たデータを示す。
【図２２】図２２は構築物Ｅから得たキメラＶＬＰを接種したマウスのエンドポイント力価測定から得たデータを示す。
【図２３】図２３は構築物Ｆから得たキメラＶＬＰを接種したマウスのエンドポイント力価測定から得たデータを示す。
【図２４】図２４は構築物Ｈから得たキメラＶＬＰを接種したマウスのエンドポイント力価測定から得たデータを示す。
【図２５】図２５は非キメラＨＰＶ１６  Ｌ１（ＳＡ−ｏｐｔ）から得たＶＬＰを接種したマウスのエンドポイント力価測定から得たデータを示す。
【図２６】図２６は最初の免疫化の後の追加免疫に対するマウスの応答を示す。
【図２７】図２７はＬ１配列に挿入したＬ２ペプチドのヌクレオチド配列（配列番号：１４）を示す。
【図２８】図２８はＬ１配列に挿入したＬ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
キメラ構築物の設計
ＨＰＶの少ない方のキャプシドタンパク質、Ｌ２の領域（ａａ）１０８−１２０のＨＰＶ６および１６に対する共通の中和エピトープであるペプチド：
ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ（配列番号：１）
をコードするプライマーを合成した。
【００３８】
Chenら（2000）によって発表されたＨＰＶ１６  Ｌ１のモノマー構造（図２）によれば、種々の表面ループおよび領域がペンタマーおよび高次構造が形成された場合に曝露される。
【００３９】
Ｖ５抗体（Ｌ１に対して作り出された中和抗体）のエピトープマッピングに基づき、Ｌ１  ＶＬＰのＶ５抗体結合領域を維持するように、Ｌ２ペプチドを挿入するための種々の領域／ループを選択した。
【００４０】
Ｌ１分子の多い方の抗原領域（Ｖ５結合領域）は、アミノ酸残基Ａ２６６（表面残基Ｖ２７１の下方に位置するＦ５０と共に）およびＳ２８２でマッピングされている（Rodenら, 1996、Whiteら, 1999)。これらの残基に基づいて、本発明者らは、分子のＢループを変化させないことを決定した。これは抗原領域を変化させ、おそらく活性を有するＬ１エピトープを破壊するであろうからである。
【００４１】
したがって、以下のＬ１領域を、Ｌ２ペプチドを挿入するために選択した：
Ａ：  Ｅ−Ｆループ（配列番号：４および５）
Ｃ：  Ｄ−Ｅループ（配列番号：６および７）
Ｅ：  Ｌ１のｈ４へリックスとＪ領域との間の領域（配列番号：８および９）
Ｆ：  ｈ４へリックス（配列番号：１０および１１）
Ｈ：  内部Ｃ−Ｄループ（配列番号：１２および１３）
【００４２】
キメラ構築物の合成
キメラ構築物は、Ｌ２ペプチドをコードする３'末端を用いて設計したプライマーを用いるＰＣＲによって調製した。ｐＳＫプラスミドベクターにクローン化したＨＰＶ  １６ＳＡ−ｏｐｔＬ１遺伝子（配列番号：３および４）をテンプレートとして用いた。以下のＤＮＡ配列：
【００４３】
５'−ＴＴＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ
ＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡ−３'（配列番号：１４）
【００４４】
を用いてＬ２ペプチドをコードした。
【００４５】
表１に示す領域を置換することによって、Ｌ２ペプチドを遺伝子に挿入した。存在するヌクレオチドを置換するこの方法は、いずれの置換もせずにＬ２ヌクレオチドをＬ１配列に単に挿入するよりも、三次構造の乱れが最小限に維持され、かつ、余分なペプチド"ループ"に起因する近くの配列の立体効果の可能性またはそれに結合する抗体との干渉の可能性が最小限化される点で有利である。
【００４６】
挿入したＬ２エピトープの位置は、キメラ構築物について各々図１５〜１９に図示する。
【００４７】
配列決定したｐＳＫ構築物からのキメラ遺伝子を、ｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター（ＳａｌＩ／ＸｂａＩサイト）にクローン化した。ｐＦａｓｔｂａｃ１クローンからのＤＮＡを用いてＤＨ１０ｂａｃ細胞をトランスフェクトし、ｂａｃｍｉｄクローンを調製した。
【００４８】
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現システム（Life Technologies社）を用いて、昆虫細胞中でキメラ構築物を発現した。
【００４９】
【表１】
2010263899.tif 000002
【００５０】
ｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを、セルフェクチンを用いてｓｆ２１（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞にトランスフェクトした。基本的なＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）プロトコールに従って、組換えウイルスを増幅し、キメラＶＬＰを発現させるためのｓｆ２１昆虫細胞に感染させた。
【００５１】
その後に、基本的なＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰ精製プロトコールを行った。感染した昆虫細胞を３,０００ｒｐｍで沈殿させ、０.５ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。その懸濁液を５秒間隔で４回、超音波処理した。ついで、これを、４０％スクロース・クッション上にオーバーレイし、１００,０００×ｇにて３時間ペレット化した。このペレットをＣｓＣｌ緩衝液（０.４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌを含むＰＢＳ）に再懸濁し、１８および２６ゲージ注射針を通して吸引して再懸濁して超音波の前に粘度を低下させた（５秒間隔で４回）。その懸濁液を１０℃、１００,０００×ｇにて２４時間遠心した。
【００５２】
ＣｓＣｌグラジエント中に明瞭なバンドは観察されなかった。したがって、５００μｌ画分を収集し、コンフォメーション特異的Ｖ５およびＤ９（線状エピトープ）モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡによって解析した。Ｖ５および／またはＤ９抗体と反応することが判明した画分を保存し、ＰＢＳに対して４℃にて一晩透析した。
【００５３】
結果
ウェスタンブロットは、ウサギにおいてペプチドに対して作らせたポリクローナルＬ２抗体（The Jake Gittlen Cancer Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey Pennsylvania, USAのNeil Christensen博士から得た）がキメラＬ１粒子（５５ｋＤ）に結合することを示し、これはＬ２エピトープがキメラ構築物によって発現されていることを示している。
【００５４】
精製したＶＬＰの抗体特徴付けを、Neil Christensen博士によって提供された一連の抗体を用いたＥＬＩＳＡによって行った（Christensenら, 1996, 2001）。表２はかかるデータを要約している。
【００５５】
【表２】
2010263899.tif 000003
【００５６】
抗体およびそれらの結合領域の簡単な説明を以下の表３に示す。
【００５７】
【表３】
2010263899.tif 000004
【００５８】
キメラ粒子の電子顕微鏡観察
電子顕微鏡観察の結果は、キメラ構築物から形成された粒子が野生型ＨＰＶ  Ｌ１遺伝子によって生成されたものと同一でないことを示した。形成された粒子は主として部分的に分解されているかまたは部分的にバラバラになった状態であり、一般的に互いに凝集しているように見える。
【００５９】
キメラ抗原を用いた動物実験
６セットの５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを動物実験に用いて、キメラＶＬＰの接種が免疫応答を誘起するかを判定した。５のキメラ構築物から生成したキメラＶＬＰおよび非キメラＨＰＶ１６  Ｌ１（ＳＡ−ｏｐｔ）から生成したキメラＶＬＰを１００μｇの濃度で２の皮下部位に注射した。０、２および４週目に動物に接種した。血液試料および膣洗液を種々の期間に採取した。
【００６０】
各群からのマウス血清を保存し、組換えバキュロウイルスによって昆虫細胞中に生成したＶＬＰを用いるＥＬＩＳＡによって解析した。各群のマウスのエンドポイント力価測定を行って、応答の程度を決定し、応答のより良好な反映を得た（図２０ないし２６）。
結果は、高い免疫応答が達成されたことを示している。
【００６１】
参考資料
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【配列表フリーテキスト】
【００６２】
SEQ ID NO: 1
HPV L2 peptide
SEQ ID NO: 2
Nucleotide sequence of native HPV16 L1 gene
SEQ ID NO: 3
Amino acid sequence of native HPV 16 L1
SEQ ID NO: 4
Nucleotide Sequence of chimera construct A
SEQ ID NO: 5
Amino acid sequence of chimera construct A
SEQ ID NO: 6
Nucleotide Sequence of chimera construct C
SEQ ID NO: 7
Amino acid sequence of chimera construct C
SEQ ID NO: 8
Nucleotide Sequence of chimera construct E
SEQ ID NO: 9
Amino acid sequence of chimera construct E
SEQ ID NO: 10
Nucleotide Sequence of chimera construct F
SEQ ID NO: 11
Amino acid sequence of chimera construct F
SEQ ID NO: 12
Nucleotide Sequence of chimera construct H
SEQ ID NO: 13
Amino acid sequence of chimera construct H
SEQ ID NO: 14
Nucleotide sequence of L2 inserted to L1 sequence
【図１】
2010263899.tif 000005
【図３】
2010263899.tif 000006
【図４】
2010263899.tif 000007
【図５】
2010263899.tif 000008
【図６】
2010263899.tif 000009
【図７】
2010263899.tif 000010
【図８】
2010263899.tif 000011
【図９】
2010263899.tif 000012
【図１０】
2010263899.tif 000013
【図１１】
2010263899.tif 000014
【図１２】
2010263899.tif 000015
【図１３】
2010263899.tif 000016
【図１４】
2010263899.tif 000017
【図２０】
2010263899.tif 000018
【図２１】
2010263899.tif 000019
【図２２】
2010263899.tif 000020
【図２３】
2010263899.tif 000021
【図２４】
2010263899.tif 000022
【図２５】
2010263899.tif 000023
【図２６】
2010263899.tif 000024
【図２７】
2010263899.tif 000025
【図２８】
2010263899.tif 000026
【図２】
2010263899.tif 000027
【図１５】
2010263899.tif 000028
【図１６】
2010263899.tif 000029
【図１７】
2010263899.tif 000030
【図１８】
2010263899.tif 000031
【図１９】
2010263899.tif 000032
【配列表】
2010263899000001.app