(57)【要約】【課題】種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害性活性あるいはＡＤＣＣ活性を有するＮＫ細胞を、Ｋ５６２等と混合させることなく安全に且つ簡単に増殖させるべく活性化させることができるＮＫ細胞活性化方法、これを用いたＮＫ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びに大量のＮＫ細胞を含む単核球を提供すること。【解決手段】ＮＫ細胞活性化方法では、ＣＤ５２アゴニストによりＴ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球に刺激を与えてＮＫ細胞を活性化させる。ＣＤ５２アゴニストによる単核球の刺激は、サイトカインの存在下で行われる。【選択図】図１
2010239972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ５２アゴニストによりＴ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球に刺激を与えてＮＫ細胞を活性化させるＮＫ細胞活性化方法。
【請求項２】
前記ＣＤ５２アゴニスト及びＣＤ３アゴニストによりＮＫ細胞の増殖がＴ細胞の増殖よりも優位となるように単核球に共刺激を与える請求項１に記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項３】
ＣＤ３アゴニストが０．１μｇ／ｍｌ以下の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与える請求項２に記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項４】
ＣＤ３アゴニストが０．００１μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与える請求項２又は３に記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項５】
ＣＤ５２アゴニストが２０μｇ／ｍｌ以下の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与える請求項１から４のいずれか一項に記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項６】
ＣＤ５２アゴニストが２μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与える請求項１から５のいずれか一項の記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項７】
末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血から採取された単核球に刺激を与える請求項１から６のいずれか一項に記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項８】
ＩＬ−２により単核球に刺激を与える請求項１から７のいずれか一項に記載のＮＫ細胞活性化方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞活性化方法を用いてＮＫ細胞を増殖させるＮＫ細胞増殖方法。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞活性化方法を用いてＮＫ細胞を含む単核球を製造する細胞製造方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球であって、ＣＤ５２アゴニストにより刺激が与えられて二次的に増殖されたＮＫ細胞を５０％以上の割合で含む単核球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）を活性化させるＮＫ細胞活性化方法、当該ＮＫ細胞を用いたＮＫ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにＮＫ細胞を含む単核球に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば特許文献１においては、抗ＣＤ３抗体を用いて癌患者から採取したリンパ球を培養して多くのγδＴ細胞及びＮＫ細胞が含まれるリンパ球を得る方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−３１４１８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生体は、病原体の侵入や悪性腫瘍の発生など、生体にとって好ましくない病態を防ぐために、自然免疫と適応免疫の２つの免疫系によって対応している。自然免疫では侵入した病原体を、すでに存在するＮＫ細胞やマクロファージなどの食細胞、あるいは補体系などが、非特異的な活性化経路で数時間以内に感知し迅速にこれを排除する。適応免疫では、特定の病原体や異常細胞に対し抗原特異的エフェクターＴ細胞が増殖を伴って誘導され、細胞傷害活性を有するＴ細胞となり、また抗原に対応する抗体の産生を促進し、侵入した病原体の排除に４日以上の時間を要する。
【０００５】
自然免疫に重要な役割を果たすＮＫ細胞は、末梢血リンパ球の１０％前後を占め、生体の異常をすばやく察知し対処する免疫学的監視を行っている。ＮＫ細胞は、形態的には特徴的な細胞内顆粒を有する大型のリンパ球であり、細胞傷害性Ｔ細胞のように抗原刺激後の分化を経ることなく細胞傷害活性を発揮する細胞である。そのため、Ｔ細胞のような抗原特異性を持たずに、主要組織適合性遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ、以下、ＭＨＣと称する）が消失したある種のウイルス感染細胞や癌細胞に対して細胞傷害活性を示す。一方、ＮＫ細胞には、正常細胞のようにＭＨＣ−ｃｌａｓｓ  Ｉを発現した細胞に結合する抑制性レセプターがあるため、正常細胞に対しては細胞傷害活性が発揮されない。
【０００６】
ＮＫ細胞は、非特異的細胞傷害活性のほか、特有な機序で標的細胞を傷害することができる。ＮＫ細胞の大多数は、ＩｇＧ分子のＦｃ部に対するレセプター（ＣＤ１６）を細胞表面上に発現している。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６を介して標的細胞の細胞表面に結合したＩｇＧのＦｃ部に結合して活性化し、標的細胞を殺傷する抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を発揮する。
【０００７】
このような細胞傷害活性を有するＮＫ細胞を生体外で増やし、再び生体内に戻す養子免疫療法を、癌やウイルス感染症などの治療法として活用しようという試みは長く行われてきた。また、最近は他人（他家）のＮＫ細胞を投与することにより種々の悪性腫瘍を治療しようという試みもなされている（Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００４，１０４：１７０，Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５，  １７：２１１）。しかし、ＮＫ細胞を、簡便な方法により臨床に使用できるほど大量の細胞数となるまで培養することは困難であった。
【０００８】
これまでに報告されたＮＫ細胞の培養法を以下に挙げる。
１）  末梢血リンパ球または磁気ビーズで単離したＮＫ細胞を、ＩＬ−２あるいはＩＬ−１５によって刺激し、増殖させる。斯かる増殖は、多くの報告によれば１０倍前後であるため、末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと称する）を大量に用意する必要がある（Ｄｕｎｎｅ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，  １６７：３１２９，  Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００４，  ６：１５）。
２）  末梢血リンパ球またはＮＫ細胞とＢリンパ腫細胞株であるＫ５６２またはダウジ（Ｄａｕｄｉ）との混合培養をＩＬ−２存在下で行うことで、ＩＬ−２単独の場合よりも多く増殖し、数１０倍に増えることが報告されている。
３）  プラスチックプレートに接着したＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）細胞（実際はＮＫ細胞）に、ＩＬ−２とフィーダ細胞（ｆｅｅｄｅｒ細胞）としてのＣｏｎ−Ａ刺激末梢血リンパ球またはＥＢウイルス感染リンパ芽球細胞株とを加え、増殖させる（Ｒａｂｉｎｏｗｉｃｈ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１，  １３５：４５４）。しかし、プラスチックプレートに接着するＬＡＫ細胞が少ないため、増殖させても最初に採取したＮＫ細胞の３６倍にとどまる。
４）  ＰＢＭＣ４８時間刺激培養上清
ＰＢＭＣ、ＥＢウイルス感染リンパ芽球細胞株、ＰＭＡ及びＰＨＡとイオノマイシン、ＩＬ−２を加えることで、ＩＬ−２単独刺激よりもＮＫ細胞を９倍に増やす。しかし手技が煩雑なわりに大量に得ることは難しい（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９３，  １５０：１７０５）。
５）  ＰＢＭＣと接着性腫瘍細胞株ＨＦＷＴをＩＬ−２存在下で培養すると、ＮＫ細胞が１０日間から２１日間で５８倍から４０１倍に増殖する（Ｈａｒａｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２，  ９３：３１３）。
６）  ４−１ＢＢ遺伝子及びＩＬ−１５遺伝子を組み込んだＫ５６２とＰＢＭＣとを３週間混合培養する場合には、ＮＫ細胞が平均１０００倍以上に増殖する（Ｉｍａｉ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００５）。
【０００９】
上述したように、ＮＫ細胞を少なくとも数１００倍以上に大量に増殖させるためには、Ｋ５６２やＨＦＷＴなどのヒト腫瘍細胞との混合培養、さらにはそれらの細胞株への遺伝子導入が必要である。これらの細胞株が、腫瘍細胞であること、他人の細胞であること、また遺伝子導入をしていることなどから、その使用には医学的な問題のほか倫理上の問題がある。たとえば、腫瘍細胞株との混合培養を用いる方法では、１個でも生き残った腫瘍細胞が生体に入る虞がある。また、生体への導入遺伝子の影響が未知であることなど、その臨床使用にあたっては慎重にならざるをえない。
【００１０】
ＣＤ５２分子は、ＧＰＩアンカー型糖蛋白質に属する。ＧＰＩアンカー型糖蛋白質に属する分子としては、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＣＤ５９等もある。ＣＤ５２分子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞に発現し、顆粒球には発現しない。Ｔ細胞において、ＣＤ３分子とともにＣＤ５２分子をモノクローナル抗体で刺激すると、ＣＤ３単独刺激の場合に比べ、Ｔ細胞の活性化が顕著に増強され、ＣＤ５２が共刺激分子として機能する（Ｒｏｗａｎ  ＷＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５，７：６９）。ＮＫ細胞は、ＣＤ３分子を発現しないため、Ｔ細胞のようにこれらの分子を介した共刺激効果は見られない。
【００１１】
本発明は、前記諸点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害性活性あるいはＡＤＣＣ活性を有するＮＫ細胞を、Ｋ５６２等と混合させることなく安全に且つ簡単に増殖させるべく活性化させることができるＮＫ細胞活性化方法並びにこれを用いたＮＫ細胞増殖方法及び細胞製造方法を提供することにある。また、本発明の他の目的とするところは、大量のＮＫ細胞を含む単核球を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のＮＫ細胞活性化方法は、ＣＤ５２アゴニストによりＴ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球（単核球群）に刺激を与えてＮＫ細胞を活性化させる。当該ＣＤ５２アゴニストによる単核球の刺激は、サイトカインの存在下、好ましくはＩＬ−２の存在下で行われてもよい。
【００１３】
本発明のＮＫ細胞活性化方法によれば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球にＣＤ５２アゴニストによる刺激を与えるために、ＮＫ細胞をＴ細胞よりも活性化させることができ、ＮＫ細胞をＫ５６２等と混合させることなく安全に且つ簡単に増殖させるべく活性化させることができ、特に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球にＣＤ５２アゴニストによる刺激を、例えばＩＬ−２存在下で与えることで、例えばＩＬ−２単独刺激に比べ、ＮＫ細胞をＴ細胞よりも増殖させることができる。また、本発明のＮＫ細胞活性化方法を用いればＮＫ細胞を１０００倍以上にも増殖させ得る。
【００１４】
本発明のＮＫ細胞活性化方法の好ましい例では、前記ＣＤ５２アゴニスト及びＣＤ３アゴニストによりＮＫ細胞の増殖がＴ細胞の増殖よりも優位となるように単核球に共刺激を与える。尚、ＣＤ３アゴニストの追加によるＮＫ細胞の活性化は、ＮＫ細胞がＣＤ３分子を有していないことから、ＣＤ３アゴニストがＮＫ細胞を直接刺激したのではなく、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによるＴ細胞の活性化を経て生じた二次的効果と考えられる。
【００１５】
本発明のＮＫ細胞活性化方法の好ましい例では、ＣＤ３アゴニストが０．１μｇ／ｍｌ以下の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与えてもよく、ＣＤ３アゴニストが０．００１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．０３μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与えてもよく、ＣＤ５２アゴニストが２０μｇ／ｍｌ以下の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与えてもよく、ＣＤ５２アゴニストが２μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する培地において単核球に刺激を与えてもよく、また、ＣＤ５２アゴニスト及びＣＤ３アゴニストが上記各濃度で存在する培地において単核球に刺激を与えてもよく、より好ましくは、ＣＤ５２アゴニスト２０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３アゴニスト０．１μｇ／ｍｌが存在する培地において単核球に刺激を与える。またＣＤ５２アゴニストの濃度は２０μｇ／ｍｌ以上であってもよい。このような好ましい例によれば、ＮＫ細胞の増殖がＴ細胞の増殖よりも優位となるように単核球に刺激を与えることができる。尚、ＣＤ３アゴニストの濃度がＴ細胞に最大限のＤＮＡ合成を誘導する程度に濃い場合には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が優位となり、ＮＫ細胞の増殖は逆に抑制される。
【００１６】
本発明のＮＫ細胞活性化方法の好ましい例では、末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血から採取された単核球に刺激を与える。斯かる単核球は、より好ましくは末梢血単核球からなる。
【００１７】
本発明のＮＫ細胞活性化方法の好ましい例では、ＩＬ−２により単核球に刺激を与える。ＩＬ−２による刺激は、ＣＤ５２アゴニストやＣＤ３アゴニストによる刺激と同時であってもよく、また、ＣＤ５２アゴニストやＣＤ３アゴニストによる刺激の後であってもよい。ＩＬ−２による刺激は、２日から３日ごとに与えてもよい。
【００１８】
本発明のＮＫ細胞活性化方法を用いれば、大量のＮＫ細胞を製造することができ、５０％以上の割合でＮＫ細胞を含む単核球、７０％から９５％の割合でＮＫ細胞を含む単核球を製造することができる。また、本発明の単核球は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む単核球であって、ＣＤ５２アゴニストにより刺激が与えられて二次的に増殖されたＮＫ細胞を５０％以上の割合で含む。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害性活性あるいはＡＤＣＣ活性を有するＮＫ細胞を、Ｋ５６２等と混合させることなく安全に且つ簡単に増殖させるべく活性化させることができるＮＫ細胞活性化方法並びにこれを用いたＮＫ細胞増殖方法及び細胞製造方法を提供し得る。また、本発明によれば、大量のＮＫ細胞を含む単核球を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例２における実験結果に関する説明図である。
【図２】図２は、実施例３における実験結果に関する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
次に、本発明の実施の形態の例を、図に示す例に基づいて更に詳細に説明する。尚、本発明はこれらの例に何等限定されないのである。
【実施例１】
【００２２】
実施例１では、ＣＤ５２アゴニストの存在下及び非存在下においてＣＤ３アゴニストの濃度を変えた場合のＣＤ１６＋ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の比率の変化を調べる実験を行った。
【００２３】
まず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた密度勾配遠心法により健常人から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。
【００２４】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で０μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌに夫々希釈されたＣＤ３アゴニストとしてのヒトＣＤ３抗体（ＯＲＴＨＯ  ＣＬＯＮＥ  ＯＫＴ３，Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）５００μｌを夫々別々に２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各穴に入れて４℃で一晩処理し、このようにして２４穴プレートにヒトＣＤ３抗体を固相化した。２４穴プレートの各穴は、固相化後にＰＢＳで２回洗浄した。
【００２５】
上記同様にヒトＣＤ３抗体５００μｌを夫々別々に他の２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各穴に入れ、さらに当該各穴に、ＣＤ５２アゴニストとしてヒトＣＤ５２抗体、ここではＰＢＳで濃度１ｍｇ／ｍｌに希釈されたＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂを２０μｇ／ｍｌとなるように添加して４℃で一晩処理し、このようにして他の２４穴プレートにヒトＣＤ３抗体及びヒトＣＤ５２抗体を固相化した。他の２４穴プレートの各穴は、固相化後にＰＢＳで２回洗浄した。
【００２６】
次に、単離したＰＢＭＣをＩＬ−２（１７５Ｕ／ｍｌ）を含むＫＢＭ５４０培地（Ｋｏｈｊｉｎ  Ｂｉｏ）に１×１０６／ｍｌの濃度で浮遊させた培養液１ｍｌを、２４穴プレートの各穴及び他の２４穴プレートの各穴に夫々添加し、ＣＯ２培養器内で３７℃、３日間培養した。
【００２７】
４日目に、２４穴プレートの各穴及び他の２４穴プレートの各穴に培養液１ｍｌを追加し、ＩＬ−２を２００Ｕ／ｍｌ添加した。６日目に、２４穴プレートの各穴の細胞を６穴プレートに移すと共に他の２４穴プレートの各穴の細胞を他の６穴プレートに移し、２日から３日間隔でＩＬ−２を２００Ｕ／ｍｌ加えながら培養を継続した。
【００２８】
培養１３日目に、６穴プレートの各穴及び他の６穴プレートの各穴から３×１０５個の細胞をエッペンドルフチューブに取り、これにＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ４抗体及びＰＣ５標識抗ヒトＣＤ１６抗体を各３μｇ／ｍｌ加え、定法により細胞を染色した。染色した細胞はただちにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで解析し、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ１６＋ＮＫ細胞の比率を求めた。
【００２９】
以上のように実験を行った結果、ヒトＣＤ５２抗体を処理せずにヒトＣＤ３抗体のみを処理して６穴プレートから得た細胞数の割合については次の通りであった。ヒトＣＤ３抗体刺激の強さにかかわらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞は４９％から５６％、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は２４％から３４％と狭い範囲で変化した。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞はヒトＣＤ３抗体刺激が強くなるにしたがって２０％まで増加した。
【００３０】
ヒトＣＤ５２抗体を処理して他の６穴プレートから得た細胞数の割合については次の通りであった。ヒトＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌとヒトＣＤ３抗体０μｇ／ｍｌとを処理（ヒトＣＤ５２抗体のみを処理）した細胞数の割合については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が６６％前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１％よりも低く、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２７％前後であった。ヒトＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌとヒトＣＤ３抗体０．０１μｇ／ｍｌとを処理した細胞数の割合については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が９５％前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１％前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％前後であった。ヒトＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌとヒトＣＤ３抗体０．１μｇ／ｍｌとを処理した細胞数の割合については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が６６％前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が３％前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２９％前後であった。ヒトＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌとヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍｌとを処理した細胞数の割合については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が３５％前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が５％前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が５５％前後であった。ヒトＣＤ５２抗体及びヒトＣＤ３抗体を処理（ＣＤ５２抗体のみを処理した場合を含む）して得たＣＤ１６＋ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とには、ヒトＣＤ３抗体のみを処理して得たＣＤ１６＋ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との比率の変動に比べて、大きな比率の変動が見られた。ヒトＣＤ５２抗体のみを処理した場合でも、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は５０％以上であって６６％と高く、ＣＤ８＋Ｔ細胞は２７％であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞は１％よりも低かった。ヒトＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌとヒトＣＤ３抗体０．０１μｇ／ｍｌとを処理して得たＣＤ１６＋ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との比率の差は上述のように顕著なものとなり、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は９０％以上であって９５％前後となった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は、ヒトＣＤ３抗体の濃度が０．０１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで濃くなるに従って上昇し、ヒトＣＤ３抗体の濃度１μｇ／ｍｌではＣＤ１６＋ＮＫ細胞の比率を超えた。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、ヒトＣＤ３抗体の濃度の如何にかかわらず僅かであった。
【００３１】
以上のように、実施例１では、ＣＤ５２抗体のみで又はＣＤ５２抗体にＣＤ３抗体を加えて単核球を刺激することで、ＮＫ細胞の活性化、増殖が誘導されることが明らかになった。尚、ＮＫ細胞はＣＤ３分子を持たないので、ＮＫ細胞の増殖には、ＣＤ５２抗体による刺激又はＣＤ５２抗体及びＣＤ３抗体による刺激によって活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞等の存在が二次的に関与しているものと思われる。
【実施例２】
【００３２】
実施例２では、スモールスケールでの細胞増殖の抗体濃度依存性に関する実験を行った。
【００３３】
実施例１と同じ手順により、各穴がＣＤ３抗体０μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの濃度で夫々処理され、さらにＣＤ５２抗体０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの濃度で夫々処理された２４穴プレートを用意し、当該２４穴プレートの各穴にＰＢＭＣ１×１０６個を添加して培養した。実施例２における培養１９日目の細胞数を図１に示す。
【００３４】
図１において、培養したＰＢＭＣの細胞数については、ＣＤ５２抗体０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０μｇ／ｍｌで処理した場合には１８×１０６個前後、ＣＤ５２抗体０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．００１μｇ／ｍｌで処理した場合には３２×１０６個前後、ＣＤ５２抗体０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．０１μｇ／ｍｌで処理した場合には３３×１０６個前後、ＣＤ５２抗体０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．１μｇ／ｍｌで処理した場合には２８×１０６個前後、ＣＤ５２抗体０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体１μｇ／ｍｌで処理した場合には４０×１０６個前後であることが示された。
【００３５】
図１において、培養したＰＢＭＣの細胞数については、ＣＤ５２抗体２μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０μｇ／ｍｌで処理した場合には１８×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．００１μｇ／ｍｌで処理した場合には２６×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．０１μｇ／ｍｌで処理した場合には３８×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．１μｇ／ｍｌで処理した場合には４４×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体１μｇ／ｍｌで処理した場合には４０×１０６個前後であることが示された。
【００３６】
図１においては、培養したＰＢＭＣの細胞数については、ＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０μｇ／ｍｌで処理した場合には２０×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．００１μｇ／ｍｌで処理した場合には３４×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．０１μｇ／ｍｌで処理した場合には４０×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体０．１μｇ／ｍｌで処理した場合には４９×１０６個前後、ＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌ及びＣＤ３抗体１μｇ／ｍｌで処理した場合には４３×１０６個前後であることが示された。
【００３７】
図１においては、細胞数は、ＣＤ３抗体０．１μｇ／ｍｌ及びＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌでＰＢＭＣを処理した場合に最も多くなっている。
【実施例３】
【００３８】
実施例３では、上述のようにＣＤ３アゴニストとＣＤ５２アゴニストとを固相化したフラスコを用いて、ＩＬ−２存在下でＰＢＭＣからＮＫ細胞を大量に増殖させる実験を行った。
【００３９】
ＣＤ５２抗体のみでもＮＫ細胞を誘導できるが、実施例２においてＣＤ３抗体０．１μｇ／ｍｌ、ＣＤ５２抗体２０μｇ／ｍｌの場合に最も高い増殖率が見られたので、この条件でＰＢＭＣを刺激培養した。
【００４０】
フラスコへの抗体の固相化は、最終濃度が抗ＣＤ３抗体（ＯＲＴＨＯ  ＣＬＯＮＥ  ＯＫＴ３）０．１μｇ／ｍｌ及び抗ＣＤ５２抗体（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）２０μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ２０ｍｌに添加し、これをフラスコに入れ、４℃で一晩静置して行った。フラスコ使用直前には、当該フラスコをＰＢＳ１０ｍｌで２回洗浄し、洗浄後、ＫＢＭ５４０を９０ｍｌ添加した。
【００４１】
単離したＰＢＭＣ１×１０８個を、ＫＢＭ５４０（１０ｍｌ）に浮遊させ、培養液の入ったフラスコに入れた。ＣＯ２培養器内で３７℃で３日間培養し、４日目にＩＬ−２を２００Ｕ／ｍｌ添加した。
【００４２】
６日目に、上記フラスコ内の細胞浮遊液をＫＢＭ５４０（１０００ｍｌ）が入ったＣＯ２透過性バッグにそのまま移し、２日から３日ごとに、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を追加投与した。
【００４３】
以上のようにして、培養した細胞の細胞数を求め、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１６＋ＮＫ細胞の夫々の比率をフローサイトメトリーで調べ、各細胞群の細胞数を計算した。
【００４４】
図２は、実施例３の実験に係る細胞の増殖に関して時系列で示したものである。図２において、７日間培養した細胞の細胞数については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が０．８×１０９個前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１．２×１０９個前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が１×１０９個前後であることが示され、１１日間培養した細胞の細胞数については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が２．１×１０９個前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１．２×１０９個前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２．１×１０９個前後であることが示され、１３日間培養した細胞の細胞数については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が３．７×１０９個前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１．８×１０９個前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２．６×１０９個前後であることが示され、１５日間培養した細胞の細胞数については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が６．３×１０９個前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１×１０９個前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２．３×１０９個前後であることが示され、１８日間培養した細胞の細胞数については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が６．８×１０９個前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が０．８×１０９個前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２．２×１０９個前後であることが示され、２１日間培養した細胞の細胞数については、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が１１×１０９個前後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が１×１０９個前後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が２．８×１０９個前後であることが示された。
【００４５】
実施例３においては、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は、２１日間の培養で２１００倍にまで増殖したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、培養１１日目以降から増殖がほぼ止まった。
【図１】
2010239972.tif 000003
【図２】
2010239972.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月16日(2010.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血から採取した単核球を予め準備し、準備した単核球を、ＣＤ５２抗体の存在下において培養してＮＫ細胞を増殖させるＮＫ細胞増殖方法。
【請求項２】
末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血から採取した単核球を予め準備し、準備した単核球を、ＣＤ５２抗体及びＣＤ３抗体の存在下において培養してＮＫ細胞を増殖させるＮＫ細胞増殖方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＮＫ細胞増殖方法を用いて増殖させたＮＫ細胞を含む単核球。