(57)【要約】      （修正有）【課題】肝癌（hepatoma）の成長を阻害しうる特定のポリペプチドの提供。【解決手段】ボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤。ボンベシンアンタゴニストペプチドの具体例としてD-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-MTac-NH2、Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2等が例示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）［配列番号：３２］：
【化１】
2010150253.tif 000026
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５である、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【化２】
2010150253.tif 000027
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤。
【請求項２】
前記式（Ｉ）中、Ａ１は、Ｄ−Ｃｐａ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−もしくはＤ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−もしくはＤ−Ｔｐｉ、またはＤ−Ｔｒｐであり、Ａ２は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり、およびＱはＮＨ２である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記式（Ｉ）中、Ａ９は、Ｔａｃである、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記式（Ｉ）中、Ａ９は、ＤＭＴａｃである、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項５】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、水素またはＡｃであり、Ａ１は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−またはＤ−Ｔｐｉであり、およびＡ２は、Ｇｌｎである、請求項１または３に記載の薬剤。
【請求項６】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、水素またはＡｃであり、Ａ１は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−またはＤ−Ｔｐｉであり、およびＡ２は、Ｇｌｎである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項７】
前記式（Ｉ）中、Ａ２は、Ｇｌｎであり、Ａ９は、Ｔａｃであり、およびＱはＮＨ２である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
前記式（Ｉ）中、Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−ＰｈｅおよびＴｒｐからなる群より選択されるＤ−またはＬ−アミノ酸残基である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、以下：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、および
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
からなる群より選択される、請求項３に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり、Ａ１は、Ａ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)へのＸのアシル部分が連結するペプチド結合であり、Ａ２はＧｌｎであり、およびＡ９は、Ｔａｃである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、Ｈｃａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＮＨ２［配列番号：７］である、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、以下：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-MTac-NH2、
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、および
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
からなる群より選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2またはD-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2である、請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
以下の式（ＩＩ）［配列番号：３３］：
【化３】
2010150253.tif 000028
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５であり、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【化４】
2010150253.tif 000029
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、ＣｙｓまたはＰｅｎであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、復員軍人援護局によって認められた、政府の支援によってなされた。アメリカ合衆国政府は、本出願に特定の権利を有している。
【０００２】
本発明は、特定の構造のボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤に関するものであり、特に、ヒトにおける肝細胞癌性の腫瘍の生育に影響を及ぼす新規なペプチドに関するものである。さらに詳しくは、本発明は、Ｃ末端の位置にＴａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃ残基を有する（ψ）プソイドペプチドであるボンベシンアンタゴニストおよびその塩、ならびに当該アンタゴニストまたはその塩を含む肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤組成物、これらのペプチドの合成方法およびこれらのペプチドに関する使用方法に関するものである。これらのペプチドは、ボンベシンまたはボンベシン様ペプチドに対する拮抗特性を有する。
【０００３】
本発明は、ボンベシンもしくはボンベシン様ペプチド（例えば、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＣ等）に対する拮抗特性（本明細書中では、「ボンベシン拮抗特性」とも称する）を有するポリペプチド化合物に関するものであり、これらは、例えば、ヒト等の温血動物における悪性の病気の治療において有用である。本発明は、新規なポリペプチド化合物およびそれらの製造方法；上記ポリペプチド化合物を含む新規な薬剤組成物およびヒト等の温血動物においてボンベシン拮抗作用を得るのに使用するための上記化合物を含む薬剤の製造方法を包含する。
【背景技術】
【０００４】
ボンベシンは、カエル、ボンビナ  ボンビナ(Bombina bombina)の皮膚から初めて単離されたテトラデカペプチドアミドである（例えば、非特許文献１参照）。ボンベシンはマウスのスイス  ３Ｔ３(mouse Swiss 3T3)繊維芽細胞の強力なマイトジェンであることが知られており（例えば、非特許文献２参照）、また、モルモットの膵臓の腺房からのアミラーゼの分泌を刺激することが知られている（例えば、非特許文献３参照）。また、ボンベシン様ペプチドはヒトの肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）細胞によって生産、分泌されることが知られており（例えば、非特許文献４参照）、外因的に加えられたボンベシン様ペプチドはイン  ビトロ(in vitro)でヒトのＳＣＬＣ細胞の生育を刺激できることが知られており（例えば、非特許文献５参照）、さらにボンベシンおよびＧＲＰのＣ末端領域に特異的なモノクローナル抗体は受容体へのＧＲＰの結合を遮断し、イン  ビトロ(in vitro)およびイン  ビボ(in vivo)の両方でヒトのＳＣＬＣ細胞の生育を阻害できることも知られている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００５】
ボンベシン様特性を有するＧＲＰは、ブタの腸から単離された２７アミノ酸を有する広く市販されているペプチドアミドであり（例えば、非特許文献７参照）、この際、Ｃ末端のアミノ酸配列はボンベシンのものとほぼ一致している。ニューロメジンＣは、デカペプチドアミドであり、その構造はＧＲＰのＣ末端領域における最後の１０アミノ酸と一致しており、イヌの小腸から単離された（例えば、非特許文献８参照）。ＧＲＰは、体循環におけるガストリンの放出等の、様々な生物学的反応を刺激する。また、ＧＲＰは、マウスの３Ｔ３繊維芽細胞および肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）細胞の成長因子としても機能する。このため、ＧＲＰは、オートクラインの成長メカニズムによるＳＣＬＣの発達において直接的な病態生理学的な役割を果たしていると報告された。
【０００６】
ボンベシン、ニューロメジンＣおよびＧＲＰのＣ末端ノナペプチドの構造は、以下に示す通りである：
【０００７】
【化１】
2010150253.tif 000002
【０００８】
他の両生類のボンベシン様ペプチドに関する調査によって、リトリン(Litorin)、即ちパプア、ニューギニアのカエルの皮膚内のノナペプチド（ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２  ［配列番号：４］）が単離され、このペプチドは非常に強力なボンベシン類似体であることが分かった（例えば、非特許文献９参照）。ボンベシン類似体に関する研究によって、ボンベシンの６〜１４番目の位置の９アミノ酸残基の最小断片がボンベシン活性の全スペクトルを有することが明らかになった。
【０００９】
様々な種類のボンベシンアンタゴニストの特性が現在知られている。ボンベシンとわずかなアミノ酸配列の相同性を有するサブスタンスＰ(Substance P)（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２［配列番号：５］）はボンベシンおよびボンベシン類ペプチドの結合を阻害しないが、（Ｄ−Ａｒｇ１，Ｄ−Ｐｒｏ２，Ｄ−Ｔｒｐ７，８，Ｌｅｕ１１）サブスタンスＰおよび（Ｄ−Ａｒｇ１，Ｄ−Ｐｈｅ５，Ｄ−Ｔｒｐ７，９，Ｌｅｕ１１）サブスタンスＰ等のいくつかのＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換することによって修飾されたサブスタンスＰの類似体（例えば、非特許文献１０参照）は、膵臓の腺房細胞内のボンベシンの分泌を遮断し、スイス  ３Ｔ３(Swiss 3T3)細胞におけるボンベシンの成長促進効果に拮抗するが分かった。ボンベシン由来の２つのタイプのボンベシンアンタゴニスト、例えば、（Ｄ−Ｐｈｅ６，Ｄ−Ｐｈｅ１２）ボンベシン、および［Ｌｅｕ１３−ψ−Ｌｅｕ１４］のボンベシン［配列番号：６］（例えば、非特許文献１１および１２参照）は、ボンベシン反応のイン  ビトロ(in vitro)およびイン  ビボ(in vivo)における強力な阻害剤であることが分かった。
【００１０】
非特許文献１３によって明らかにされた他のタイプのボンベシンアンタゴニストは、Ｃ末端のメチオニン残基がＧＲＰ（２０−２７）類似体から欠損した、Ｎ−アセチル−ＧＲＰ（２０−２６）およびその類似体である。非特許文献１４では、［Ｄ−Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ１３−ψ−Ｐｈｅ１４］ボンベシン−（６−１４）および［Ｄ−Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ１３−ψ−Ｌｅｕ１４］ボンベシン−（６−１４）等のリトリン(Litorin)配列を基礎とした短鎖のボンベシンアンタゴニストによっては上記に相当する親ペプチド(parent peptide) ［Ｌｅｕ１３−ψ−Ｌｅｕ１４］ボンベシン［配列番号：６］よりかなり強力であることが報告された。
【００１１】
ＧＲＰの直鎖の（環状でない）ボンベシン類似体および必要であればＣＨ2−ＮＨの非ペプチド結合を有する両生類のボンベシンは、特許文献１（および関連した類似公報である特許文献２）に記載されている。これらの類似体は、天然のボンベシンペプチドの阻害剤として作用することが記載され、以下の式を有する。
【００１２】
【化２】
2010150253.tif 000003
【００１３】
ただし、Ｒ１及びＲ２はＨであり；Ａ０は欠損していてもよく；各位置の多くの可能なアミノ酸のうち、Ａ１はＤ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、またはＤ−Ｎａｌであってもよく；Ａ２はＧｌｎであってもよく；Ａ４はＡｌａであってもよく；Ａ５はＶａｌであってもよく；Ａ６はＧｌｙであってもよく；Ａ７はＨｉｓであってもよく；およびＷは以下の式で表わされ、
【００１４】
【化３】
2010150253.tif 000004
【００１５】
ただし、Ｒ４はＣＨ２−ＮＨであり；場合によっては、Ｚ１はＬｅｕと同じ側鎖、つまり−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であってもよく；Ｚ２はＣｙｓもしくはＭｅｔと同一の側鎖、つまり−ＣＨ２−ＳＨもしくは−（ＣＨ２）２−ＳＨ−ＣＨ３であってもよく；ＶはＮ（Ｒ６）Ｒ７［但し、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はＨであってもよく；Ｒ１及びＲ２はＨもしくはＣＯＥ１（但し、Ｅ１はＣ１−２０アルキルであってもよい）であってもよい］である。
【００１６】
また、ボンベシンの直鎖のペプチド類似体は、特許文献３にも記載されている。これらのペプチドはＣ末端のＭｅｔ残基およびＣ末端とその隣接する残基との間に［ＣＨ2−ＮＨ］プソイドペプチド結合を有する。
【００１７】
さらに、当該分野における研究が特許文献４に開示されており、特許文献４は参考で本明細書中に引用されるが、本願において実質的に複製される。上記特許文献では、新規な化合物が特定の哺乳動物の癌、とくに肺癌、結腸癌、胃癌の治療に有用であると、記載される。しかし、他の癌に使用されることは言及されていない。現在まで、肝細胞癌の有効な抑制剤は報告されていない。
【００１８】
特許文献５では、結腸癌、乳癌、または前立腺癌の治療に使用されるボンベシンアンタゴニストが記載されたが、肝癌については何ら言及されていない。特許文献６では、ヘプタおよびノナペプチドボンベシンアンタゴニスト、ならびにこれらが哺乳動物のヘパトーマ（肝癌）の治療に使用されることが記載された。この特許文献６では、Ｎ−（左側）およびＣ−（右側）末端の置換基が特許文献４に開示される本発明に係る置換基とは異なるペプチドが使用されている。特許文献７は、肝臓癌ではなく、ＳＣＬＣや前立腺癌の治療に関する文献である。本発明ではＮ末端の置換基はアルカノイルと一般的に称されるものに分類されると考えられるが、ここで、「アルカノイル」ということばは、厳密な意味で使用されるものと考えられ、アルカノイル鎖の芳香族基置換(aromatic substitution)を考慮してはいないと考えられる。さらに、鎖の他方の末端の置換基へのプソイドペプチド結合のヒントは何ら記載されておらず、ましてやヘテロ環のものは何ら記載されていない(there is no hint of a pseudo peptide linkage to the substituent at the other end of the chain and certainly not a heterocyclic one.)。特許文献８には、新規な抗癌性化合物が開示され、本明細書に開示される特定の化合物について言及されている。しかし、肝臓癌については何ら言及されていない。特許文献９には、本明細書に開示される特定の化合物および肝臓癌が記載されているが、当業者に対して本発明が示唆される程度に並列して記載されていない(not juxtaposed in a manner by might suggest the present invention to one skilled in the art.)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第９０／０３９８０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９１／０２７４６号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第０  ３０９  ２９７号公報
【特許文献４】米国特許第５３６５０９４号明細書
【特許文献５】米国特許第５７３６５１７号明細書
【特許文献６】米国特許第６０８３９１５号明細書
【特許文献７】米国特許第５８３４  ４３３号明細書
【特許文献８】米国特許第６９８９３７１号明細書
【特許文献９】米国特許第７３３８６６０号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ａｎａｓｔａｓｉ，Ｅｒｓｐａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｃｃｉ，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．  １９７１，２２，１６６
【非特許文献２】Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ  ａｎｄ  Ｓｉｎｎｅｔｔ−Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １９８３，８０，２９３６
【非特許文献３】Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｊｏｎｅｓ，Ｆｏｌｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．  １９８４，３０９，６１
【非特許文献４】Ｍｏｏｄｙ，Ｐｅｒｔ，Ｇａｚｄａｒ，Ｃａｒｎｅｙ  ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９８１，２１４．  １２４６
【非特許文献５】Ｃａｒｎｅｙ，Ｃｕｔｔｉｔａ，Ｍｏｏｄｙ  ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９８７，４７，８２１
【非特許文献６】Ｃｕｔｔｉｔａ，Ｃａｒｎｅｙ，Ｍｕｌｓｈｉｎｅ，Ｍｏｏｄｙ，Ｆｅｄｏｒｋｏ，Ｆｉｓｃｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ．  １９８５，３１６．８２３
【非特許文献７】ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊｏｒｎｖａｌｌ，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｖａｇｎｅ，Ｇｈａｔｅｉ，Ｂｌｏｏｍ  ａｎｄ  Ｍｕｔｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｖｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９７９，９０，２２７
【非特許文献８】Ｒｅｅｖｅ，Ｗａｌｓｈ，Ｃｈｅｗ，Ｃｌａｒｋ，Ｈａｗｋｅ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８３，２５８．５５８２
【非特許文献９】Ｙａｓｕｋａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，１９７９，２７，４９２
【非特許文献１０】Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，１９８７，４６，２２０１
【非特許文献１１】Ｃｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８８，２６３．  ５０５６
【非特許文献１２】Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８９，１Ｑ，５８７
【非特許文献１３】Ｈｅｉｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４．  １  １２５８
【非特許文献１４】Ｃｏｙ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４．  １９８９，２５，１４６９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、強力なボンベシンアンタゴニストであり、ヘパトーマ（肝癌；肝細胞癌を含む）の成長／発達を阻害しうる特定のポリペプチド；これらのポリペプチドの合成方法；上記ポリペプチドを含む肝癌（hepatoma）の成長／発達を阻害するための薬剤もしくは薬剤組成物；上記ポリペプチドを含む薬剤組成物の製造におけるこれらの化合物の使用；製薬上活性のある物質としての上記ポリペプチドまたは薬剤組成物の使用；または肝癌（hepatoma）の治療に効果のある上記ポリペプチドの或いは薬剤活性（薬理活性）物質としての薬剤もしくは薬剤組成物の適用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、特定のアミノ酸配列を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩が肝癌（hepatoma）の治療に特に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００２３】
すなわち、本発明は、下記を包含する。
【００２４】
（１）  以下の式（Ｉ）［配列番号：３２］：
【００２５】
【化４】
2010150253.tif 000005
【００２６】
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５である、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【００２７】
【化５】
2010150253.tif 000006
【００２８】
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤。
【００２９】
（２）  前記式（Ｉ）中、Ａ１は、Ｄ−Ｃｐａ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−もしくはＤ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−もしくはＤ−Ｔｐｉ、またはＤ−Ｔｒｐであり、Ａ２は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり、およびＱはＮＨ２である、上記（１）に記載の薬剤。
【００３０】
（３）  前記式（Ｉ）中、Ａ９は、Ｔａｃである、上記（１）または（２）に記載の薬剤。
【００３１】
（４）  上記式（Ｉ）中、Ａ９は、ＤＭＴａｃである、上記（１）または（２）に記載の薬剤。
【００３２】
（５）  前記式（Ｉ）中、Ｘは、ＨまたはＡｃであり、Ａ１は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−またはＤ−Ｔｐｉであり、およびＡ２は、Ｇｌｎである、上記（１）または（３）に記載の薬剤。
【００３３】
（６）  前記式（Ｉ）中、Ｘは、ＨまたはＡｃであり、Ａ１は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−またはＤ−Ｔｐｉであり、およびＡ２は、Ｇｌｎである、上記（１）または（４）に記載の薬剤。
【００３４】
（７）  前記式（Ｉ）中、Ａ２は、Ｇｌｎであり、Ａ９は、Ｔａｃであり、およびＱはＮＨ２である、上記（１）に記載の薬剤。
【００３５】
（８）  前記式（Ｉ）中、Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−ＰｈｅおよびＴｒｐからなる群より選択されるＤ−またはＬ−アミノ酸残基である、上記（１）に記載の薬剤。
【００３６】
（９）  前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、以下：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、および
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
からなる群より選択される、上記（１）または（３）に記載の薬剤。
【００３７】
（１０）  前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2である、上記（１）または（４）に記載の薬剤。
【００３８】
（１１）  前記式（Ｉ）中、Ｘは、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり、Ａ１は、Ａ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)へのＸのアシル部分が連結するペプチド結合であり、Ａ２はＧｌｎであり、およびＡ９は、Ｔａｃである、上記（１）に記載の薬剤。
【００３９】
（１２）  前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、Ｈｃａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＮＨ２［配列番号：７］である、上記（１１）に記載の薬剤。
【００４０】
（１３）  前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、以下：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-MTac-NH2、
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、
D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2、および
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
からなる群より選択される、上記（１）に記載の薬剤。
【００４１】
（１４）  前記ボンベシンアンタゴニストペプチドは、D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2またはD-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2である、上記（１３）に記載の薬剤。
【００４２】
（１５）  以下の式（ＩＩ）［配列番号：３３］：
【００４３】
【化６】
2010150253.tif 000007
【００４４】
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５であり、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【００４５】
【化７】
2010150253.tif 000008
【００４６】
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、ＣｙｓまたはＰｅｎであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤。
【発明の効果】
【００４７】
本発明の特定の式（Ｉ）または（ＩＩ）のボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩は、肝癌（hepatoma）（肝細胞癌を含む）に対して優れた治療効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明のボンベシンアンタゴニストペプチドの治療効果を示すために、表１のデータに基づいた、Ｈｃａ１−Ｇｌｎ２−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ９−ＮＨ２［配列番号：７］およびコントロールを用いた、ヌードマウスにおけるＳＫ−Ｈｅｐ−１ヒト肝細胞性の腫瘍(SK-Hep-1 human hepatocellular carcinoma)の容積（ｍｍ３）を処置日数に対してプロットしたグラフである。
【図２】本発明のボンベシンアンタゴニストペプチドの治療効果を示すために、表２のデータに基づいた、Ｈｃａ１−Ｇｌｎ２−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ９−ＮＨ２［配列番号：７］およびコントロールを用いた、ヌードマウスにおけるＳＫ−Ｈｅｐ−２  ヒト肝細胞性の腫瘍(SK-Hep-2 human hepatocellular carcinoma)（Ｈｅｐ−Ｇ２  ヒト肝癌）の成長速度（増加率（倍））を処置日数に対してプロットしたグラフである。
【図３】本発明のボンベシンアンタゴニストペプチドの治療効果を示すために、表１のデータに基づいた、Ｈｃａ１−Ｇｌｎ２−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ９−ＮＨ２［配列番号：７］およびコントロールを用いた、ヌードマウスにおけるＳＫ−Ｈｅｐ−２ヒト肝細胞性の腫瘍(SK-Hep-2 human hepatocellular carcinoma) （Ｈｅｐ−Ｇ２  ヒト肝癌）の容積（ｍｍ３）を処置日数に対してプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００５０】
Ａ．合成ペプチド
本発明は、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）の強力なボンベシンアンタゴニストであるプソイドペプチド(pseudopeptide)を提供するものである。
【００５１】
すなわち、本発明の第一は、以下の式（Ｉ）［配列番号：３２］：
【００５２】
【化８】
2010150253.tif 000009
【００５３】
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５である、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【００５４】
【化９】
2010150253.tif 000010
【００５５】
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤を提供する。
【００５６】
また、より好ましい実施形態によると、本発明の第一の態様は、以下の式（Ｉ’）［配列番号：３０］：
【００５７】
【化１０】
2010150253.tif 000011
【００５８】
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、またはアミノ酸類似体、例えば、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐもしくはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５である、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【００５９】
【化１１】
2010150253.tif 000012
【００６０】
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤を提供する。
【００６１】
また、本発明の第二は、以下の式（ＩＩ）［配列番号：３３］：
【００６２】
【化１２】
2010150253.tif 000013
【００６３】
ただし、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；
Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−Ｐｈｅ、ｐＧｌｕ、Ｃｐａ、Ｎａｌ、Ｐａｌ、Ｔｐｉ、非置換のＴｒｐまたはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２およびＣ１−３アルキルからなる群より選択される一以上の置換基で置換されたＴｒｐからなる群より選択されるＤ−、Ｌ−またはＤＬ−アミノ酸残基であり、またはＸのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；
Ａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ［−］、Ｇｌｕ（Ｙ）、またはＨｉｓであり、この際、［−］は、Ａ２のγカルボキシル部分もしくは３−プロピオニル部分をＡ１のα−アミノ部分と連結する、単結合であり；
Ｙは、以下のいずれかであり、
ａ）−ＯＲ５であり、この際、Ｒ５は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくはフェニルであり）；または、
ｂ）
【００６４】
【化１３】
2010150253.tif 000014
【００６５】
但し、Ｒ６は、水素もしくはＣ１−３アルキルであり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１−３アルキルもしくは−ＮＨＣＯＮＨ２であり、さらに、
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ａ９は、ＣｙｓまたはＰｅｎであり；
Ｑは、ＮＨ２または−ＯＱ１であり、この際、Ｑ１は、水素、Ｃ１−１０アルキル、フェニルもしくはフェニル−Ｃ１−１０−アルキルである；
を有するボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩を含む、肝癌（hepatoma）を治療するための薬剤を提供する。
【００６６】
上記式（Ｉ）、（Ｉ’）または（ＩＩ）のボンベシンアンタゴニストペプチドまたは製薬上使用できるこれらの酸もしくは塩は、優れた肝癌（hepatoma）（肝細胞癌を含む）治療効果を有するため、肝癌（hepatoma）（肝細胞癌を含む）を治療するための薬剤に好適に使用できる。
【００６７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００６８】
上記したように、本発明は、上記式（Ｉ）、（Ｉ’）または（ＩＩ）の強力なボンベシンアンタゴニストであるプソイドペプチド(pseudopeptide)を提供するものである。
【００６９】
上記式（Ｉ）、（Ｉ’）（以下、特記しない限り、一括して「式（Ｉ）」と称する）では、Ａ９は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、もしくはＤＭＴａｃである。ここで、Ａ９には５員の複素環が存在する。この環は、通常、式（Ｉ）のノナペプチドの合成において所定の位置のＡ９残基の側鎖を、好ましくはホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドで酸化し、側鎖をＡ９のα−アミノ基で環化することによって形成される。このようにして得られた環化されたＡ９残基の性質は、元の酸化されていないＡ９および使用される酸化剤の性質によって変化する。ゆえに、Ｃｙｓ９の−ＣＨ２−ＳＨ基がホルムアルデヒドとの反応におけるＬｅｕ−ψ−プソイドペプチド結合付近のＣｙｓ９のα−アミノ基で環化する際には、得られた環は、以下の式（ＩＩＡ）の構造を有する（式（Ｉ）のノナペプチドの−Ｌｅｕ８−ψ−Ｔａｃ９−ＮＨ２断片として示される）；
【００７０】
【化１４】
2010150253.tif 000015
【００７１】
これらのプソイドペプチドは、Ａ９がＣｙｓまたはＰｅｎである非環状の実施形態より大きな生物学的活性及びより長期間の安定性を有する。しかしながら、Ａ９が環状でない際の式（Ｉ）のペプチドの好ましい実施形態としては、Ｘ、Ａ２、及びＱが上記と同様であり、Ａ９がＣｙｓまたはＰｅｎであり、さらにＡ１がＬ−もしくはＤ−Ｐａｌ、Ｌ−もしくはＤ−ＴｐｉまたはＨｃａからなる群より選ばれた非天然に生成するアミノ酸である。
【００７２】
好ましい実施形態としては、Ｘは、水素、Ａｃ、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり；Ａ１は、Ｘのアシル部分をＡ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)と連結するペプチド結合であり；Ａ２は、Ｇｌｎであり；Ａ９は、Ｔａｃであり；およびＱは、ＮＨ２である。
【００７３】
また、他の好ましい実施形態としては、下記がある。
【００７４】
（ａ）Ａ１は、Ｄ−Ｃｐａ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−もしくはＤ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−もしくはＤ−Ｔｐｉ、またはＤ−Ｔｒｐであり、Ａ２は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり、およびＱはＮＨ２である；
（ｂ）Ａ９は、Ｔａｃである；
（ｃ）Ａ９は、ＤＭＴａｃである；
（ｄ）Ｘは、ＨまたはＡｃであり、Ａ１は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−またはＤ−Ｔｐｉであり、およびＡ２は、Ｇｌｎである；
（ｅ）Ａ２は、Ｇｌｎであり、Ａ９は、Ｔａｃであり、およびＱはＮＨ２である；
（ｆ）Ａ１は、Ｐｈｅ、ｐ−ＨＩ−ＰｈｅおよびＴｒｐからなる群より選択されるＤ−またはＬ−アミノ酸残基である；
（ｇ）Ｘは、Ｈｃａ、Ｈｎａ、Ｈｐｐ、ＭｐｐまたはＮａａであり、Ａ１は、Ａ２のα−アミノ部分(alpha amino moiety)へのＸのアシル部分が連結するペプチド結合であり、Ａ２はＧｌｎであり、およびＡ９は、Ｔａｃである。
【００７５】
Ｂ．合成方法
式（Ｉ）のボンベシンアンタゴニストペプチド（本明細書中では、単に「ボンベシンアンタゴニスト」との称する）は、固相合成(solid phase synthesis)によって合成される。第一のプロトコルとしては、すべてのアミノ酸を、Ｃ末端残基を樹脂支持相に連結した後、順次それぞれ結合していく。全アミノアシル残基を樹脂に連結した直後、プソイドペプチドの５員の複素環を、Ｃ末端残基の側鎖を酸化剤と反応させることによって形成する。次に、プソイドペプチドをＨＦ処理し、樹脂支持相からペプチド部分を外す。この反応によって、側鎖の保護基も除去される。
【００７６】
第二のプロトコルとしては、式（Ｉ）のプソイドペプチドを固相および液相によって構築される２断片として合成する方法がありうる。Ｃ末端を含むトリペプチドをオリゴペプチドと連結し、式（Ｉ）のボンベシンアンタゴニスト全体を形成する。
【００７７】
５員の複素環を、Ａ9の側鎖を酸化剤と反応させることによって形成する。次に、このペプチドをＨＦ処理することによって、すべてのアミノアシル残基の側鎖の保護基を除去し、樹脂からペプチドを切断する。
【００７８】
Ｃ．医療への使用
式（Ｉ）または（ＩＩ）のプソイドペプチドは薬剤組成物中に使用され、製薬用の担体と組み合わせて、有効量のプソイドペプチドまたはこの治療学的に使用できる／製薬上使用できる酸もしくは塩を投与することによって、哺乳動物の肝細胞性の癌（肝癌）および他の症状を治療することができる。これらの化合物は、１日に１ｋｇの体重当たり約１〜１，０００μｇの投与量で治療学的に使用できる／製薬上使用できる担体と共に投与される。このような組成物は、非経口的に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内に、肺用のエアロゾルによってもしくは貯蔵形態(depot form)で投与することができる。
【００７９】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。
【００８０】
好ましい実施形態の説明
Ａ．合成ペプチド
１．命名法
本発明を説明する上で便宜上、アミノ酸、ペプチドおよびこれらの誘導体の従来の略称を、ペプチド分野において通常用いられているようにおよびIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature [European J. Biochem.. 1984, 138 9-37]によって推奨されているように用いる。
【００８１】
個々のアミノ酸残基の略称は、アミノ酸の普通名称をもとにしており、例えば、Ａｌａはアラニン、Ｃｙｓはシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、ｐＧｌｕはピログルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｔｒｐはトリプトファン、及びＶａｌはバリンである。Ｇｌｕはγ−カルボキシル側鎖に連結する官能基を有する：［−］またはＹは上記したのと同様である。Ｄｐａは、２，３−ジアミノプロピオン酸(2,3-diaminopropionic acid)である。アミノ酸残基が異性体を有する際には、アミノ酸の記号の前にＤ−もしくはＤＬ−による記載のない限りＬ−体のアミノ酸を表している。
【００８２】
本発明において用いられる通常使用されないアミノ酸の略称は以下の通りである：
Ｃｐａは、パラ−クロロフェニルアラニンである；
Ｄｐａは、２，３−ジアミノプロピオン酸(2,3-diaminopropionic acid)である；
ｐＧｌｕは、ピログルタミン酸である；
Ｎａｌは、３−（２−ナフチル）−アラニン(3-(2-naphthyl)-alanine)である；
Ｐａｌは、３−（３−ピリジル）−アラニン(3-(3-pyridyl)-alanine)である；
Ｐｅｎは、ペニシラミンで(penicillamine)ある；
Ｔｐｉは、２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド−［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸(2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido-[3,4-b]indole-3-carboxylic acid)である；
Ｔａｃは、チアゾリジン−４−カルボン酸(thiazolidine-4-carboxylic acid)である；
ＭＴａｃは、２−メチル−チアゾリジン−４−カルボン酸(2-Methyl-thiazolidine-4-carboxylic acid)である；さらに、
ＤＭＴａｃは、５，５−ジメチル−チアゾリジン−４−カルボン酸(5,5-Dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid)である。
【００８３】
アミノ酸類似体としては以下のものが挙げられる：
Ｈｃａは、ヒドロ桂皮酸(hydrocinnamic acid)またはデス−アミノ−フェニルアラニン(des-amino-phenylalanine)である；
Ｈｎａは、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸(3-hydroxy-2-naphthoic acid)である；
Ｈｐｐは、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid)である；
Ｍｐｐは、３−（４−メトキシフェニル）プロピオン酸(3-(4-methoxyphenyl)propionic acid)である；
Ｎａａは、ナフチル酢酸である；さらに、
Ｐａａは、フェニル酢酸である。
【００８４】
使用する他の省略事項は、以下の通りである：
ＡＣは、アシルである；
Ａｃは、アセチルである；
ＡｃＯＨは、酢酸である；
ＢＨＡは、ベンジルヒドリルアミンである；
Ｂｏｃは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）２Ｏジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート(tert-butoxycarbonyl (BOC)2O di-tert-butyldicarbonate)である；
Ｂｏｍは、ベンジルオキシメチルである；
Ｂｕｔは、ブチルである； 
Ｂｚｌは、ベンジルである；
ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンである；
ＤＩＣは、  １，３−ジイソプロピルカルボジイミドである；
ＤＭＥＭは、ダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)である；
ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである；
Ｅｔは、エチルである；
ＥＤＴＡは、エチレンジアミンテトラ酢酸である；
ＦＣＢＳは、ウシ胎児血清である；
Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)である；
Ｆｏｒは、ホルミルである；
ＨＩＴＥＳは、１０−８Ｍ  ヒドロコルチゾン、５μｌ／ｍｌ  ウシインスリン、１０μｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリン、１０−８  Ｍ  β−エストラジオール及び３×１０−８Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４を含むＲＰＭＩ  １６  ４Ｄ培地である；
ＨＯＢｔは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである；
ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィーである；
Ｌｅｕ−ψ−は、Ｌｅｕの還元型であり、この際、隣接するＡ８またはＡ９残基のα−アミノ部分との−ＣＨ２−部分の結合がプソイドペプチド結合であるように、ＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ２−に置換される；
Ｍｅは、メチルである；
ＭｅＣＮは、アセトニトリルである；
ＭｅＯＨは、メチルアルコールである；
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水である；
ＴＥＡは、トリエチルアミンである；
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸である；
ペプチド配列は、従来法に従って記載され、Ｎ末端のアミノ酸が左側でＣ末端のアミノ酸が右側にくる。しかしながら、特記されない限り、完全なボンベシンアンタゴニストのテトラデカペプチドにおける相当する位置による断片的なペプチドのアミノ酸残基の番号付けの従来法には基づかないことに注意する。従来法に従うと、本明細書に記載された式（Ｉ）のノナペプチドの残基は６〜１４番目であり、ボンベシンアンタゴニストのＴｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１３）のコアは、Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３と番号付けられる。混乱を防ぐために、ボンベシンアンタゴニストは以下のように番号付けられる：Ｎ末端アミノ酸（またはアミノ酸類似体）残基はＡ１である；Ｃ末端アミノ酸（またはアミノ酸類似体）残基はＡ９である；および間の残基はＡ２（Ｎ末端残基Ａ１の付近）から順次Ａ８（Ｃ末端残基Ａ９の付近）に番号が増加するように番号が付けられる。
【００８５】
２．好ましい実施形態
好ましい実施形態は、以下の式（Ｉ）のボンベシンアンタゴニストペプチドである。
【００８６】
【化１５】
2010150253.tif 000016
【００８７】
上記式（Ｉ）において、Ｘ、Ａ1、Ａ2、Ｌｅｕ−ψ−、Ａ9及びＱは、上記と同様である。
【００８８】
これらのボンベシンアンタゴニストプソイドペプチドは、アミノ酸配列、特にＡ１、Ａ２及びＡ９の残基に特徴を有する；さらに、Ａ８とＡ９との間のプソイドペプチド結合の存在にも特徴を有する；さらに必要であれば、Ａ９における５員の複素環をも特徴とするものである。この環状構造は、Ａ９残基およびこれを酸化するのに使用される化合物の性質や種類によって決定される。したがって、ホルムアルデヒドを用い、Ａ９がＣｙｓである場合には、得られる環は、以下の式（ＩＩＡ）のＴａｃの構造を有する［式（Ｉ）のペプチドの−Ｌｅｕ８−ψ−Ｔａｃ９−Ｑ断片（但し、ＱはＮＨ２である）として示される］：
【００８９】
【化１６】
2010150253.tif 000017
【００９０】
Ｃｙｓがアセトアルデヒドで酸化される場合には、得られた５員の複素環は、以下の式（ＩＩＢ）のＭＴａｃ構造を有する［式（Ｉ）のペプチドの−Ｌｅｕ８−ψ−ＭＴａｃ９−Ｑ断片（但し、ＱはＮＨ２である）として示される］：
【００９１】
【化１７】
2010150253.tif 000018
【００９２】
Ａ９がＰｅｎであり、ホルムアルデヒドで酸化される場合には、得られる環は、以下の式（ＩＩＣ）のＤＭＴａｃ構造を有する［式（Ｉ）のペプチドの−Ｌｅｕ８−ψ−ＤＭＴａｃ９−Ｑ断片（但し、ＱはＮＨ２である）として示される］：
【００９３】
【化１８】
2010150253.tif 000019
【００９４】
これらの好ましい実施形態において、ＸはＨ、Ａｃまたはアミノ酸類似体であり、Ａ２はＧｌｎであり、ＱはＮＨ２であることが望ましい。
【００９５】
本発明において特に好ましいプソイドペプチドのボンベシンアンタゴニストを以下に示す。なお、下記において、左側の番号は、ペプチド番号を表す。
【００９６】
1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2；
2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
7. D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
8. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2（配列番号：１４）
9. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2（配列番号：８）
13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2（配列番号：７）
15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leυ-ψ-DMTac
20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
21. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2（配列番号：９）
22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
23. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2（配列番号：１０）
24. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2
25. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2（配列番号：１１）
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2
27. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2（配列番号：１２）。
【００９７】
Ｂ．合成方法
１．概説
式（Ｉ）のプソイドペプチドは、ペプチド分野における当業者に公知の技術によって調製できる。利用できる技術の要旨は、M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Heidelberg, 1984に記載されている。
【００９８】
すべての式（Ｉ）のプソイドペプチドは、固相合成法によって合成できる。これらのペプチド及びこれらの中間ペプチドの特に好ましい調製方法は固相合成法である。排他的固相合成(exclusively solid-phase synthesis)技術は、J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2nd. ed.)のテキストおよびG. Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739, 1987のレビューに掲載されている。（Ｃ末端のＡ９残基を酸化して、残基の特徴的な側鎖をそのα−アミノ基で環化するさらなる段階は、式（Ｉ）のペプチドの合成の様々な段階で行われうる。）
少なくとも２つの合成プロトコルによって、式（Ｉ）のプソイドペプチドとしてのボンベシンアンタゴニストが製造できる。第一のプロトコルでは、すべてのアミノ酸を、Ｃ末端残基である、Ａ９を樹脂支持相に連結した後、順次それぞれ結合していく。第二のプロトコルでは、トリペプチドを樹脂上に構築する。次に、これを残りのアミノ酸を有するオリゴペプチドに連結することによって、所望のボンベシンアンタゴニストを形成する。これらプロトコルは２つとも、合成がＣ末端のＡ９残基で始まり、アミノ酸残基を順次付加することによってＮ末端残基に向かって成長させる。
【００９９】
１−１．（ａ）第一のプロトコル
プソイドペプチドの固相合成で用いられる樹脂支持相は、特に制限されないが、例えば、ベンズヒドリルアミン(benzhydrylamine)（ＢＨＡ）樹脂またはジビニルベンゼンで１％架橋されたクロロメチル化ポリスチレン樹脂が好ましく使用される。これらの樹脂支持相は両方とも市販されている。Ｃ末端のＡ９残基をカルボキシル基を介して樹脂（樹脂支持相）に結合させる。２残基間の反応は、樹脂に連結する前に各Ａ９残基のα−アミノ基に化学保護基(chemical protecting group)を結合させることによって防げる。Ａ９残基のα−アミノ基、および順次連結されるアミノ酸残基に対する保護基は、特に制限されないが、例えば、９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル(tert-butoxycarbonyl)（Ｂｏｃ）基が好ましく使用される。Ｂｏｃを除去する反応によってＣ末端のＡ９の残基から側鎖の保護基をも除去する可能性があるため、ＦｍｏｃをＣ末端のＡ９からＡ２の残基に連結する(coupling)際に使用することがより好ましい。これらの連結反応の間、アミノ酸残基によっては特徴的な側鎖の官能基を、連結反応の前に化学保護基（Ａ９に対しては好ましくはＢｕｔ）を結合させることによって、望ましくない化学反応が起こらないように保護してもよい。
【０１００】
Ｃ末端のＦｍｏｃ−Ａ９（Ｂｕｔ）残基を支持相に結合させた後、そのα−アミノ基を脱保護し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯをこれに連結して、プソイドペプチド結合を形成する。
【０１０１】
残りの残基、特にＡ５、Ａ４、Ａ３及びＡ２は、Ｆｍｏｃによって保護されるのが好ましく、Ａ１はＢｏｃによって保護されるのが好ましいが、これらを逆の番号順（Ａ７、Ａ６等）で順番に付加し、目的とするプソイドペプチドを構築することが好ましい。
【０１０２】
ＨｉｓまたはＧｌｕがプソイドペプチド中に存在する際には、これらの側鎖は、これらの連結反応中または他の残基の連結反応中に望ましくない化学反応を受けやすい。したがって、連結反応でこれらのアミノ酸を連結する前に、化学保護基をこのような側鎖に結合させてもよい。
【０１０３】
すべてのアミノ酸残基を樹脂支持相（好ましくはＢＨＡ樹脂支持相）に連結させた後は、Ｎ末端のプソイドペプチドのＢｏｃを除去する。Ｔａｃ、ＭＴａｃもしくはＤＭＴａｃの５員の複素環を、Ｃｙｓの暴露した−ＣＨ２−ＳＨ部分（またはＰｅｎの−Ｃ（ＣＨ３）２ＳＨ）およびＡ８及びＡ９残基（即ち、Ａ９のα−アミノ）を結合する還元された結合の第２級アミンとホルムアルデヒドやアセトアルデヒド等の酸化剤との反応によって形成する。中間プソイドペプチドは、側鎖の保護基を有したままだが、ＨＦ処理を行うことによって、樹脂支持相から切断し、さらに側鎖の保護基をも除去する。
【０１０４】
１−２．（ｂ）第二のプロトコル
第二のプロトコルでは、固相合成経路により、トリペプチドを樹脂支持相（好ましくはＢＨＡ樹脂支持相）上に構築し、保護されたトリペプチド樹脂を形成する方法である：
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）７−Ｌｅｕ８−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）９−ＢＨＡ樹脂
以下に、固相合成経路により、トリペプチドをＢＨＡ樹脂支持相上に構築し、保護されたトリペプチド樹脂を形成する方法の好ましい実施形態を詳細に説明するが、本発明は下記方法によって限定されるものではない。
【０１０５】
すなわち、Ｂｏｃ１基及びＢｕｔ基を除去し、Ｃｙｓの−ＣＨ２−ＳＨ部分をＡ８及びＡ９残基を結合する還元された結合の第２級アミンで環化して、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）７−Ｌｅｕ８−ψ−Ｔａｃ９−ＢＨＡ樹脂を得る。ＨＦ処理後、遊離したトリペプチド  Ｈｉｓ７−Ｌｅｕ８−ψ−Ｔａｃ９−ＮＨ２を得る。Ｂｏｃ−Ａ１−Ａ２−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＣＨ２−樹脂を、固相合成の標準方法にしたがってＧｌｙ−ＯＣＨ２−樹脂上に順次構築した後、１％  ＫＣＮを含有する９５％メタノール中で１２時間処理し、Ｂｏｃ−オリゴペプチドを切断する。これら２断片を構築したら、Ｂｏｃ−オリゴペプチドを、ＢＯＰ試薬を用いて遊離したＨｉｓ７−Ｌｅｕ８−ψ−Ｔａｃ９−ＮＨ２のトリペプチドに連結する。次に、Ｂｏｃ基を除去し、目的とするペプチドを得る。
【０１０６】
式（Ｉ）のボンベシンアンタゴニストの合成を詳細に記載する前に、上記プロトコルの１つもしくは両方に共通する様々な合成操作を以下に記載する。
【０１０７】
２．ポリペプチド合成に関する一般的な操作
操作１：特定の合成残基または反応体の形成
ａ）Ｌ−およびＤ−Ｔｐｉ：
２．０４ｇ（１０ｍＭ）のＬ−Ｔｐｉを２．１ｇのクエン酸を含む２５ｍｌの沸騰水に溶解する。０．５ｍｌの４０％ホルムアルデヒド水溶液を加えると、固体が即座に形成し始める。この混合物を氷浴中で冷却し、沈殿物を収集し、冷却水及び空気で洗浄し、さらに室温で乾燥することにより、２．１４ｇもしくは９９％の固体［融点（分解）［m.p.(decomposition)］は約３１０℃］が得られる。Ｄ−体はＤ−Ｔｒｐから同様にして形成され、約３１０℃の融点（分解）を有する。
【０１０８】
ｂ）Ｌ−およびＤ−Ｂｏｃ−Ｔｐｉ：
１０．８ｇ（５０ｍＭ）のＤ−Ｔｐｉを２５０ｍｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ及び７．５ｍｌ  トリエチルアミン中に攪拌・懸濁した溶液に、１０ｇのジ−ｔ−ブチルジカルボネート(di-tert-butyl dicarbonate)を添加し、この混合物を４時間攪拌した後、１０ｇのジカルボネート(dicarbonate)をさらに加え、さらに３時間攪拌した後、１０ｇをさらにまた加えた。この混合物を一晩攪拌し、エーテルで抽出（２×１００ｍｌ）し、エーテルは捨てる。クエン酸をｐＨが３〜５になるまで水層に添加した。固体を収集し、水で洗浄し、一晩風乾した。
【０１０９】
固体を１００ｍｌのテトラヒドロフラン中に懸濁する。ほとんどすべての固体が溶解する。不溶分を濾過によって除き、ＴＨＦを真空下で除去する。残渣をエーテルで粉砕することによって、９．２０ｇもしくは５８％の物質が得られる。この物質は出発材料と同じ融点を有するが、溶解度及び８５：１５：０．５のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃを用いたシリカによるＴＬＣが異なる。
【０１１０】
２．５５ｇのＬ−Ｔｐｉを使用する以外同様の方法を用いるによって、２．２２ｇもしくは５９％のＢｏｃ−Ｔｐｉが得られる。
【０１１１】
ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ：
窒素雰囲気下で乾燥トルエン（２５０ｍｌ）中に溶解したＦｍｏｃ−ロイシン  メチルエステル(Fmoc-Leucine methyl ester)（３５ｇ、１３４ミリモル）を、乾燥氷／アセトンで冷却し、１５０ｍｌの２５％  ジイソブチルアルミニウム水素化物(di-isobutyl-aluminium hydride)のトルエン溶液を３０分かけて加える。ジイソブチルアルミニウム水素化物を添加し終わった後、この混合物を乾燥氷／アセトン浴中で２０分間攪拌し、さらに、メタノール（１５ｍｌ）を注意深く加える。この混合物を１０００ｍｌの氷冷水中に注ぎ、振盪、瀘過する。トルエンを分離し、水相をエーテルで再抽出する（３×３００ｍｌ）。トルエン及びエーテル抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。このようにして得られた油状物を、１５００ｍｌ  １５％ＥｔＯＡｃ／ガソリン中で素早くシリカゲルカラム（３×５０ｃｍ）に通す。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯが固体として得られる（２７．６ｇ）。
【０１１２】
ｄ）合成アミノ酸またはアミノ酸類似体：
ボンベシンアンタゴニストプソイドペプチド中に導入される合成アミノ酸またはアミノ酸類似体は、通常市販されているものである。例えば、Ｈｃａは、Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233より市販される。また、Ｂｏｃ−もしくはＦｍｏｃ−保護アミノ酸は、例えば、Advanced ChemTech, 5609 Fern Valley Road, Louisville, KY 40228; or Bachem California, 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505より市販される。
【０１１３】
操作２：樹脂の調製およびＡ９残基の付加
ＢＨＡ樹脂を、１０％  ＴＥＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液（中和）で各々３分間ずつ２回処理することによって調製し、ＣＨ２Ｃｌ２で６回洗浄する。１．３５ミリモルのＦｍｏｃ−Ａ９（Ｂｕｔ）及び１．５０ミリモルの１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(1-hydroxybenzotriazole)（ＨＯＢｔ）のＤＭＦ溶液を加え、３分間混合することによって、Ｆｍｏｃ−Ａ９（Ｂｕｔ）残基を樹脂に結合させる。２０％  １，３−ジイソプロピル−カルボジイミド(1,3-diisopropyl-carbodiimide)（ＤＩＣ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（１．３ミリモル）を加える。この混合物を室温で６０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ａ９（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２及びメタノールでそれぞれ２回、さらにＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)(Anal. Biochem. 34. 595 (1970))を行った。不完全な連結が行われた場合には、この工程を繰り返す。
【０１１４】
操作３：プソイドペプチド結合の形成
５０％  ピペリジンのＤＭＦ溶液を添加し、３０分間混合し；ＤＭＦで洗浄（６×１分）し；次に、ｉ）１％  ＡｃＯＨを含むＤＭＦに溶解したＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（３当量）を加え；さらに、ｉｉ）ＤＭＦに溶解したＮａＢＨ３ＣＮ（３．５当量）を加え、６０分間振盪することによって、Ｆｍｏｃ基のＡ９からの脱保護を行う。この後、５０％  ＭｅＯＨ（３×１分）；１００％  ＭｅＯＨ（３×１分）；およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
【０１１５】
操作４：アミノ酸の連結およびペプチド結合の形成
Ａ９残基のα−アミノ基、および各々順次連結されるアミノ酸残基に対する保護基は、特に制限されないが、９−フルオルエニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル(tert-butoxycarbonyl)（Ｂｏｃ）基が好ましく使用できる。Ｂｏｃを除去する反応によってＡ９の側鎖の保護基をも除去する可能性があるため、Ｆｍｏｃが、Ａ９からＮ末端のアミノ酸残基付近のアミノ酸残基に向かって連結する(coupling)際には、より好ましい。
【０１１６】
Ａ）Ｆｍｏｃ−アミノ酸を用いる場合
Ｆｍｏｃアミノ酸をＦｍｏｃ−中間ペプチドに導入するために、以下の工程を行う。
【０１１７】
（１）Ｆｍｏｃ−中間ペプチドを脱保護し、中和した後、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１分）およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
【０１１８】
（２）ｉ）ＤＭＦに溶解したＦｍｏｃアミノ酸（３当量）及びＨＯＢｔ（３．３当量）を中間ペプチドに添加（３分）し；ｉｉ）３当量のＤＩＣ（ＣＨ２Ｃｌ２における２０％溶液として）を添加し、この混合物を９０分間振盪することによって、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を上記のようにして脱保護された中間ペプチドに連結する。
【０１１９】
（３）次に、この混合物をエタノール（３×１分）およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
【０１２０】
次の残基を連結するために、新たに連結されたＦｍｏｃ−アミノ酸を、５０％  ピペリジンのＤＭＦ溶液によって３０分間脱保護し、ＤＭＦで洗浄する（６×１分）。ステップ（２）に記載したのと同様にして、他の連結を行う。
【０１２１】
新たなアミノ酸を樹脂またはペプチドに連結するたびに、カイザーテストを行う；連結が不完全である場合には、反応を繰り返す。
【０１２２】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結するためには、上記操作のステップ（２）を以下のように修飾する：すなわち、３当量のＤＩＣ（ＣＨ２Ｃｌ２における２０％溶液として）を、Ｆｍｏｃアミノ酸（３．０当量）及びＨＯＢｔ（３．３当量）の混合ＤＭＦ溶液に０℃で１５分間及び室温で１５分間かけて添加する。この反応混合物をペプチド樹脂に添加し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの場合には１時間振盪し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎの場合には２時間振盪する。
【０１２３】
Ｂ）Ｂｏｃ−アミノ酸を用いる場合
Ｂｏｃ−アミノ酸をＦｍｏｃ−中間ペプチドに導入するために、以下の工程を行う。
【０１２４】
（１）Ｂｏｃ基を、５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液を添加することによって除去する；
（２）５％  メルカプトエタノール及び５％  アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液を２５分間かけて加える；および
（３）ＣＨ２Ｃｌ２（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）、およびＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。
【０１２５】
（４）ＤＭＦに溶解した３当量のＢｏｃ−アミノ酸及び３．３当量のＨＯＢｔを添加し、３分間混合することによって、Ｂｏｃ−アミノ酸残基の連結を行う。次に、３当量の２０％  ジイソプロピルカルボジイミドのＣＨ２Ｃｌ２溶液を加え、９０分間振盪する。その後、この反応混合物を、ＭｅＯＨで洗浄した（３回、１分）後、さらにＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する（３回、１分）。
【０１２６】
（５）５％  メルカプトエタノール（５分）及び５％  アニソール（２５分）を含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液でステップ（５）の生成物を洗浄することによって、Ｂｏｃ基を除去（脱保護）する。さらに、ＣＨ２Ｃｌ２（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）、およびＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。
【０１２７】
Ｂｏｃ基が除去されることによってＡ９の側鎖に適切に連結されたＢｕｔ保護基も除去されることに留意しなければならない。したがって、Ｂｏｃ基の除去は、Ａ９残基の環化直前までは、一般的に行われない。
【０１２８】
操作５：５員の複素環の形成
式（ＩＩＡ）の環構造は、脱保護されたＣｙｓ９を有する中間ペプチドを５０％  ＡｃＯＨ、３．７％  ＨＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１：１：８）中で室温で３分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
【０１２９】
式（ＩＩＢ）の環構造は、脱保護されたＣｙｓ９を有する中間ペプチドを５０％  ＡｃＯＨ、１０％  ＣＨ３ＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１．５：０．５：８）中で室温で１０分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
【０１３０】
式（ＩＩＣ）の環構造は、脱保護されたＰｅｎ９を有する中間ペプチドを５０％  ＡｃＯＨ、３．７％  ＨＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１：１：８）中で室温で１０分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
【０１３１】
操作６：樹脂（樹脂支持相）からのペプチドの脱離(detachment)
すべての目的とするアミノ酸残基を付加した後、中間ペプチド樹脂を、アニソールの存在下で液状ＨＦで処理し、ポリペプチドを支持相から切断する。この反応によって、側鎖の保護基も同様に除去される。ＢＨＡ樹脂を用いる際には、得られた中間ペプチドはＱがＮＨ２である。
【０１３２】
ＸがＨ以外のときには、Ｘ基は、すでにＸ基を有するアミノ酸（例えば、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ）を導入することによって；または中間プソイドペプチドのＮ末端のＡ１における脱保護されたα−アミノ基を適当な試薬と反応させることによって、Ｎ末端に位置させる。このようにして、樹脂支持相から除去された完全なペプチドは、ＫＯＣＮと反応させて、ＸをＮＨ２ＣＯ−とすることが好ましい。
【０１３３】
操作７：ペプチドの精製
式（Ｉ）のプソイドペプチドの精製方法は、特に制限されないが、例えば、式（Ｉ）のプソイドペプチドは、通常、アップル  マッキントッシュ  プラス（商標）  コンピューター(Apple Macintosh PlusTM computer)、レオダイン（商標）  インジェクター(RheodyneTMinjector)及びナウアー（商標）  モデル  ８７  可変波長ＵＶモニター(KnauerTM Model 87 variable wavelength UV monitor)によって制御される３機のライニン  ラッビット  エッチピー  ＨＰＬＣポンプ(Rainin Rabbit HP HPLC pump)から構成されるライニン  ＨＰＬＣ  システム(Rainin HPLC System)(Rainin Inc., Co., Woburn, MA製)で行われる逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製されうる。未精製のペプチド（１０〜４０ｍｇ）を、球状のＣ１８シリカゲル（ポアサイズ：３００Å；粒子サイズ：１２μｍ）(Rainin Inc. Co.製）が充填されたダイナマックス（商標）  マクロ(DynamaxTM Macro)カラム（２１．２×２５０ｍｍ）にのせ、２．０ｍｌ／分の流速で（Ａ）０．１％  ＴＦＡおよび（Ｂ）０．１％  ＴＦＡを含む７０％  アセトニトリル水溶液から構成される溶媒システムを用いて直線的な濃度勾配をつけて溶出する。すべての分画について、以下に記載されるようにして、分析用ＨＰＬＣ(Analytical HPLC)によって純度および保持時間(retention time)を調べる。
【０１３４】
未精製および精製ペプチドの品質および溶出特性は、２２０及び２８０ｎｍにセットされたダイオード捕獲検出器(diode array detector)および逆相４．６×２５０ｍｍダブル−ポレックス（商標）(W-porexTM)Ｃ18カラム（ポアサイズ：３００Å、粒子サイズ：５μｍ）を備えたヒューレット−パッカード（商標）(Hewlett-PackardTM)モデル １０９０液体クロマトグラフィーによる分析用ＨＰＬＣ(Analytical HPLC)によって特定する。上記の溶媒システム（Ａ）及び（Ｂ）の流速を１．２ｍｌ／分に維持し、室温で分離を行った。
【０１３５】
ほとんどの場合、濃度勾配の条件をわずかに変えたのみで同様のカラムによる再クロマトグラフィーによって、プソイドペプチドのボンベシンアンタゴニストをさらに精製した。精製されたペプチドの均質性は、分析用ＨＰＬＣにおいて９７％以上精製されていることが分かった。
【０１３６】
必要であれば、式（Ｉ）のプソイドペプチドのアミノ酸分析を、０．２％  ３−（２−アミノエチル）−インドール(3-(2-aminoethyl)-indole)を含む４Ｍ  メタンスルホン酸(methanesulfonic acid)を用いて真空密閉されたチューブ中で１１０℃、２０時間、加水分解されたサンプルについて、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）６３００アミノ酸分析器で行ってもよい。
【０１３７】
Ｃ．合成中間体
１．側鎖の保護基
固相合成において、様々なアミノ酸部分またはペプチド断片の反応性側鎖の官能基を保護することは一般的に行われている。これらの側鎖の官能基は、望ましくない化学反応が側鎖で起こることを防止するために保護される。したがって、一般的に、適当な残基に連結される側鎖の保護基を有するペプチド鎖において目的とする配列中に位置するそれぞれのアミノアシル残基を含む中間ペプチドを生産する。
【０１３８】
ペプチドの合成に使用される特定の側鎖の保護基を選択する際には、以下のような規則に通常従う：（ａ）保護基は連結条件下で自身の保護特性を維持することが好ましい、（ｂ）保護基は、連結試薬に対して安定でなければならず、各合成段階でα−アミノ保護基を除去するために選択される連結反応条件下で安定であることが好ましい、および（ｃ）側鎖の保護基は、ペプチド鎖が望ましくないように変化しないような反応条件下で、目的とするアミノ酸配列の合成が終了した時点で除去可能でなければならない。
【０１３９】
側鎖の保護基は、当該分野において既知の方法／段階によってアミノ酸残基に結合する。Ｈｉｓに対する適当な側鎖の保護基としてはＢｏｍが好ましく挙げられ；ＧｌｕおよびＣｙｓに対する適当な側鎖の保護基としてはＢｕｔが好ましく挙げられる。
【０１４０】
２．合成中間体
以下の合成段階における中間ペプチドも本発明の概念に含まれると、考えられる。３段階におけるペプチド番号２のペプチド（以降、ペプチド２と称する）の中間ペプチドを以下に詳細に説明する：
段階Ａ：すべてのアミノ酸及び樹脂の連結後：
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１  ／０２／Ａ”）；
段階Ｂ：Ｎ末端のＢｏｃ−基の除去後：
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＢＨＡ樹脂（“１／０２／Ｂ”）；
段階Ｃ：Ａ９の環化後：
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂（“１／０２／Ｃ”）。
【０１４１】
下記実施例２におけるペプチド番号１７の合成例で記載されるように、別の一段階、つまり段階Ｄがあってもよい。段階Ｄの中間体は、樹脂から除去されるが、Ａ２にＡ１を連結する単結合Ｘは持たない。
【０１４２】
医療への使用（医薬用途）
本発明の上記化合物（ボンベシンアンタゴニスト）は、ボンベシン／ＧＲＰレセプターのアンタゴニストであるため、肝癌、特にヒト肝癌の治療に使用できる。
【０１４３】
本発明の式（Ｉ）のボンベシンアンタゴニストは、酸付加塩(acid addition salt)等の、製薬上使用できる非毒性の酸または塩の形態で投与されうる。このような酸付加塩としては、特に制限されないが、具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、タンニン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、琥珀酸塩、アルギン酸塩、パモ酸塩(pamoate)、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。
【０１４４】
これらの薬剤組成物は、式（Ｉ）のプソイドペプチドを既知の製薬上使用できる担体と組み合わせて含むが、この際、生理食塩水が例えば担体として使用できるが、他の既知の担体も使用できる。
【０１４５】
これらの薬剤組成物による被験者の治療は、ＬＨＲＨの他のアゴニストおよびアンタゴニスト、またはソマトスタチン類似体を用いた臨床治療と同様にして行われる。したがって、式（Ｉ）のボンベシンアンタゴニストは、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内にまたは肺用のエアロゾルによってもしくは生分解性の適当なポリマー（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド(DL-lactide-coglycolide)等）から配合された貯蔵された形態(in a depot form)（例えば、マイクロカプセル、マイクロ顆粒(microgranule)もしくはシリンダー状や棒様の移植片）で投与されうる。連続点滴、注入ポンプ及びマイクロカプセル等の徐放性の形態 (time-release mode)などの、他の同様な投与形態もまた本発明の概念に含まれる。
【０１４６】
式（Ｉ）のプソイドペプチドの有効投与量は、特に制限されず、投与形態および処置される哺乳動物の種類などによって変化する。投与量は、非経口投与の場合、１日当たり患者の１ｋｇの体重当たり、約１〜１，０００μｇのペプチドでありうる。上記投与量の範囲は単に好ましいというだけでより高いまたはより低い投与量も場合によっては選択されうる。注入量が約１５〜約３０日またはそれ以上継続するように計算された貯蔵された形態(depot form)である以外は、ペプチドを含有する生理食塩水を１日当たり約０．０１〜０．２０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の投与量になるように投与してもよい。
【実施例】
【０１４７】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【０１４８】
なお、以下の実施例では、３種類のキャラクターコード(character code)を用いて、特定の合成段階における中間ペプチドを特定する。例えば、“１／０１／Ａ”と名付けられたペプチドは、合成の段階Ａが終了した実施例“１”で作製されたペプチド“０１”に対する中間ペプチドを表わす。同様にして、例えば、“２／０８／Ｂ”及び“４／１９／Ｃ”は、それぞれ、合成段階Ｂ及びＣが終了した実施例“２”及び“４”で作製されたペプチド“０８”及び“１９”の中間ペプチドを表わす。
【０１４９】
実施例（１）
ペプチド番号
1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
7. D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
8. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2（配列番号：１５）
9. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2（配列番号：８）
13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2（配列番号：７）
これらのペプチドは、共通の中間体Ｉ−１、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：１６）樹脂から適宜合成される。具体的には、以下のようにして合成される。
【０１５０】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を以下のようにして得る：２．０ｇ  ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ２／ｇ）を、２０ｍｌ  １０％  ＴＥＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液でそれぞれ３分間２回処理（中和）することによって調製し、これを２０ｍｌ  ＣＨ２Ｃｌ２で６回洗浄した；次に、ＤＭＦに溶解された３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）及び３．６ミリモルのＨＯＢｔと３分間混合する。３当量のＤＩＣ（ＣＨ２Ｃｌ２における２０％溶液として）を添加する。この混合物を室温で９０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノールで各２回、さらにＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)を行った。
【０１５１】
プソイドペプチド結合を形成するためのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯの連結を以下のようにして行う。すなわち、Ａ９からのＦｍｏｃ基の脱保護を、１５ｍｌ  ５０％  ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え、３０分間混合し、１５ｍｌ  ＤＭＦで洗浄する（６×１分）ことによって、Ｆｍｏｃ基のＡ９からの脱保護を行う。次に、１％  ＡｃＯＨを含む３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（３当量）のＤＭＦ溶液を添加し、ＤＭＦに溶解したＮａＢＨ３ＣＮ（３．５当量）を添加し、さらに、１時間振盪する。この後、１５ｍｌ  ５０％  ＭｅＯＨ（３×１分）；１５ｍｌ  １００％  ＭｅＯＨ（３×１分）；および１５ｍｌ  ＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
【０１５２】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からのＦｍｏｃ基の除去（脱保護）を操作４Ａと同様にして行う。
【０１５３】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からＦｍｏｃ基を除去し中和した後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）の連結を操作４Ａに記載したようにして行う。
【０１５４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの連結を操作４と同様にして行う。２０％  １，３−ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)（３．３ミリモル）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を、０℃で、３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ及び３．６ミリモルのＨＯＢｔのＤＭＦ溶液に加え、１５分間冷却しながら攪拌し、さらに１５分間室温で攪拌し、沈殿物を瀘別し、樹脂に加え、６０分間振盪した。次のアミノ酸残基、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−ＡｌａおよびＦｍｏｃ−Ｔｒｐを同様にして連結することによって順次導入して、３．８０ｇの中間Ｉ−１、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：１６）樹脂の構造を有する保護されたペプチド樹脂を得た。
【０１５５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−ｐＧｌｕを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／０１／Ａ”）。
【０１５６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／０２／Ａ”）。
【０１５７】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＡｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／０４／Ａ”）。
【０１５８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｃｐａを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／０５／Ａ”）。
【０１５９】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｎａｌを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／０７／Ａ”）。
【０１６０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：１７）樹脂（“１／０８／Ａ”）。
【０１６１】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／０９／Ａ”）。
【０１６２】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／１０／Ａ”）。
【０１６３】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＡｃ−Ｄ−Ｔｒｐを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ａｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／１１／Ａ”）。
【０１６４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：１８）樹脂（“１／１２／Ａ”）。
【０１６５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“１／１３／Ａ”）。
【０１６６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＨｃａを中間ペプチドＩ−１に順次連結することによって以下が得られる：Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：１９）樹脂（“１／１４／Ａ”）。
【０１６７】
次に、中間ペプチド１／０１／ＡのＮ末端のＢｏｃ基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いて１回目は５分間及び２回目は２５分間の計２回処理することによって除去する。次に、この中間ペプチドを、ＣＨ２Ｃｌ２（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）及びＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。これによって、ＣｙｓからＢｕｔ保護基をも除去され、これによって中間ペプチド、Ｄ−ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＢＨＡ樹脂（“１／０１／Ｂ”）が得られる。さらに、これをＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ及びＤＭＦで３回ずつ１分間洗浄する。
【０１６８】
この時点で、中間ペプチド１／０１／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化されて、操作５のように式（ＩＩＡ）中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％  ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加する。この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、中間ペプチド  １／０１／Ｃ、Ｄ−  ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂を得る。
【０１６９】
次に、この中間ペプチド  １／０１／Ｃを操作６と同様にしてＨＦ及びアニソールで処理し、ＨｉｓからＢｏｍ保護基を除去し、同時に樹脂支持相からノナペプチドを切断することによって、Ｃ末端にＮＨ2であるＱ基を形成する。このペプチドを操作７と同様にしてＨＰＬＣで精製する。このようにして、ボンベシンアンタゴニストペプチド番号１が得られる。
【０１７０】
Ｂｏｃ基及びＢｕｔ基の除去および還元された結合の第２級アミンによるＣｙｓの−ＣＨ２−ＳＨ基の環化の段階を、同様にして、中間ペプチド  １／０２／Ａ、１／０５／Ａ、１／０７／１Ａ、１／０８／Ａ、１／０９／Ａ、１／１０／Ａ及び１／１２／Ａについて行い、以下の中間ペプチドを得る：
１／０２／Ｂ  Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／０４／Ｂ  Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／０５／Ｂ  Ｄ−Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／０７／Ｂ  Ｄ−Ｎａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／０８／Ｂ  Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−  Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂（配列番号：２０）
１／０９／Ｂ  Ｄ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／１０／Ｂ  Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／１１／Ｂ  Ａｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／１２／Ｂ  Ｔρｉ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂（配列番号：２１）
１／１３／Ｂ  Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂
１／１４／Ｂ  ＨＣａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂（配列番号：２２）。
【０１７１】
未精製のペプチドをＢＨＡ樹脂から切断した後、操作６及び７と同様にして精製し、精製ペプチド２、４、５、及び７〜１４を得る。
【０１７２】
これらのペプチドの保持時間は以下の通りである。
【０１７３】
【表１】
2010150253.tif 000020
【０１７４】
または、５員の複素環を以下の方法によって溶液中に形成してもよい。
【０１７５】
すなわち、０．８ｍｌの氷酢酸中に固相合成から得られたＬｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＮＨ２の構造を有する中間ペプチド  ２５ｍｇを、１００μｌの１％ホルムアルデヒド（水における重量％溶液）と室温で３０秒間混合した後、２０μｌの５０％酢酸アンモニウム溶液を添加する。この反応混合物を精製して、−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＮＨ２の構造を有する目的とするペプチドを得る。
【０１７６】
実施例（２）
ペプチド番号
15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Tac-NH2
本実施例におけるペプチドは、共通の中間体Ｉ−２、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：１６）樹脂から適宜合成され、０．５ｇ  ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ２／ｇ）上に段階的に構築されうる。中間ペプチドＩ−２を実施例（１）に記載された操作および方法にしたがって調製する。次に、このうち、１５０ｍｇの中間ペプチドＩ−２を３つのアリコートに分け、操作４に記載された方法によってさらに２回連結（カップリング）を行い、最終のノナペプチド樹脂を得る。
【０１７７】
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“２／１５／Ａ”）。
【０１７８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“２／１６／Ａ”）。
【０１７９】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“２／１７／Ａ”）。
【０１８０】
操作４と同様にして、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いて、中間ペプチド２／１５／ＡからＢｏｃ基を除去する。この反応によって、残基Ａ９からＢｕｔ基も除去され、これによって以下の中間ペプチド２／１５／Ｂが得られる：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＢＨＡ樹脂。
【０１８１】
この時点で、中間ペプチド２／１５／ＢのＣｙｓ側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様の操作を行なうことによって、式（ＩＩＡ）中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％  ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加する。この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、以下の中間ペプチド２／１５／Ｃが得られる：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＢＨＡ樹脂。
【０１８２】
次に、中間ペプチド２／１５／Ｃを、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去する。溶媒を真空下で蒸発させ、酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥する。精製後、ボンベシンアンタゴニストペプチド番号１５が得られる。
【０１８３】
Ｎ末端のＢｏｃを除去し、Ｃｙｓ９を環化し、ＢＨＡ樹脂から中間ペプチドを除去し、さらにＨＰＬＣで精製する段階を中間ペプチド２／１６／Ａ及び２／１７／Ａについて同様にして行うことによって、ペプチド番号１６及び以下の中間ペプチド２／１７／Ｄが得られる：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＮＨ２。
【０１８４】
０℃の、１５ｍｇの２／１７／Ｄ、および１５ｍｇ  ＨＯＢｔを含む０．８ｍｌのＤＭＦの混合物を、５０μｌ  ２５％  ジイソプロピルカルボジイミドのＣＨ２Ｃｌ２溶液に添加し、０℃で２時間攪拌する。Ｄ−Ｐｈｅ１のα−アミノとＧｌｕ２の３−プロピオニル部分のγ−カルボキシル部分とを連結するペプチド１７の単結合が形成する：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ［−］−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｔａｃ−ＮＨ２。
【０１８５】
この反応混合物を操作７にしたがってＨＰＬＣによる精製を行う。
【０１８６】
保持時間は以下の通りである。
【０１８７】
【表２】
2010150253.tif 000021
【０１８８】
実施例（３）
ペプチド番号
3. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-MTac-NH2
6. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-MTac-NH2
これらのボンベシンアンタゴニストは、共通の中間体Ｉ−３、即ち、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：２３）樹脂から適宜合成されうる。この中間体は、実施例（１）に従って、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）で始まり、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（ＮａＢＨ３ＣＮによる）；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）等が続くように、実施例（１）に記載されたのと同様の固相合成操作によって順次連結することによって、１．０ｇ  ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモル  ＮＨ２／ｇ）上に構築される。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎを操作４に従ってＮ末端に連結し、中間体Ｉ−３を形成する。中間体Ｉ−３へのＢｏｃ−Ｄ−ＰｈｅまたはＢｏｃ−Ｄ−Ｃｐａの最終的な連結は、操作４における方法に従って行われ、これによって中間ペプチド“３／３／Ａ”または“３／６／Ａ”がそれぞれ形成される。
【０１８９】
Ｂｏｃ基の除去を、操作４と同様にして５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いて行う。
【０１９０】
この時点で、中間ペプチド３／３／ＢのＣｙｓ側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式（ＩＩＢ）中に示される５員の複素環を形成する。５０％  ＡｃＯＨ、１０％  ＣＨ３ＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１．５：０．５：８）を添加する。この反応混合物を室温で１０分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、以下の中間ペプチド３／３／Ｃが得られる：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−ＭＴａｃ−ＢＨＡ樹脂。
【０１９１】
中間ペプチド３／３／Ｃ及び３／６／Ｃを、ＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、操作６と同様にして樹脂から除去する。この工程によって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去され、これによってノナペプチド３及び６が得られる。
【０１９２】
これらのペプチドを操作７と同様にしてＨＰＬＣを用いて精製する；保持時間は以下の通りである。
【０１９３】
【表３】
2010150253.tif 000022
【０１９４】
または、２５ｍｇのＬｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＮＨ２の構造を有する中間ペプチドに０．８ｍｌの氷酢酸を添加し、さらに１００μｌの１％アセトアルデヒドと室温で混合することによって、５員の複素環を溶液中に形成してもよい。なお、この混合は５分間行われる；その後、１００μｌの酢酸アンモニウムを添加する。この反応混合物を精製し、Ｌｅｕ−ψ−ＭＴａｃ−ＮＨ２の構造を有する目的とするペプチドを得る。
【０１９５】
実施例（４）
ペプチド番号
18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leυ-ψ-DMTac
20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
21. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2[配列番号:9]
22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-DMTac-NH2
これらのポリペプチドは、共通の中間体Ｉ−４、即ち、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：２４）樹脂から適宜合成される。
【０１９６】
この中間体は、実施例（１）及び（２）に記載されたのと同様にして固相合成の標準的な方法に従って、ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂上に順次構築される。
【０１９７】
すなわち、１．０ｇ  ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ２／ｇ）を、操作２に従って調製し、１０ｍｌの１０％  ＴＥＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液でそれぞれ３分間２回処理（中和）し、１０ｍｌのＣＨ２  Ｃｌ２で６回洗浄する；次に、ＤＭＦに溶解した１．６ミリモルのＦｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）及び１．８ミリモルの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と３分間混合する。２０％  １，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１．６ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を添加する。この混合物を室温で９０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノールで各２回、さらにＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した後、カイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）を行う。
【０１９８】
Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からのＦｍｏｃ−基の除去（脱保護）を操作４Ａと同様にして行う。
【０１９９】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯの連結を操作３に従って行う。Ａ９（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂をＤＭＦで２回洗浄する。次に、１％  ＡｃＯＨを含む１．６ミリモルのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯのＤＭＦ溶液を加えた後、１．８ミリモルのＮａＢＨ３ＣＮのＤＭＦ溶液を添加する。この反応混合物を６０分間振盪した後、５０％メタノール水溶液で２回、１００％メタノールで２回、及びＣＨ２Ｃｌ２で３回、それぞれ１分間ずつ洗浄する。
【０２００】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からＦｍｏｃ基を除去し中和した後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）の連結を操作４と同様にして行う。
【０２０１】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの連結を操作４と同様にして行う。２０％  １，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１．５ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を、１．５ミリモルのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ及び１．６５ミリモルのＨＯＢｔを含むＤＭＦ溶液に０℃で添加し、冷却しながら１５分間および室温で１５分間攪拌し、沈殿物を瀘別し、樹脂に加え、６０分間振盪する。次に、アミノ酸残基Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ及びＦｍｏｃ−Ｔｒｐを同様にして順次連結することによって導入し、１．９ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：２４）樹脂の構造を有する保護されたペプチドである中間ペプチドＩ−４が得られる。
【０２０２】
０．９１ｇの中間ペプチドＩ−４を５つのアリコート（約２００ｍｇずつ）に分け、これを用いて操作４に記載された方法に従って保護されたポリペプチド樹脂を合成する。
【０２０３】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−４に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“４／１８／Ａ”）。
【０２０４】
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅを順次連結することによって以下が得られる：Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“４／１９／Ａ”）。
【０２０５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−ｐｈｅを中間ペプチドＩ−４に順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“４／２０／Ａ”）。
【０２０６】
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎ、さらにＢｏｃ−Ｔｐｉを順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ（配列番号：２５）樹脂（“４／２１／Ａ”）。
【０２０７】
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎ、さらにＢｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを順次連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“４／２２／Ａ”）。
【０２０８】
さらに、Ｂｏｃ−基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いて中間ペプチド４／１８／Ａから除去することによって、以下の中間ペプチド４／１８／Ｂが得られる：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ−ＢＨＡ樹脂。
【０２０９】
この時点で、中間ペプチド４／１８／ＢのＰｅｎ側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式（ＩＩＣ）中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％  ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加し、反応混合物を形成し、この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって以下の中間ペプチド４／１８／Ｃが得られる：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−ＤＭＴａｃ−ＢＨＡ樹脂。
【０２１０】
次に、中間ペプチド４／１８／Ｃを５ｍｌ  ＣＨ２Ｃｌ２、メタノール及びＣＨ２Ｃｌ２で各３回ずつ洗浄し、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理する。溶媒を真空中で蒸発させ、エーテルもしくは酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥することによって、未精製のノナペプチド樹脂が得られる。この反応混合物を精製して、ボンベシンアンタゴニストペプチド番号１８を得る。
【０２１１】
中間ペプチド４／１９／Ａ、４／２０／Ａ、４／２１／Ａ及び４／２２／Ａについて、同様にして保護基を除去し、脱保護されたＡ９を環化し、さらに中間ペプチドをＢＨＡ樹脂から外すことによって、それぞれペプチド番号１９、２０、２１及び２２が得られる。
【０２１２】
操作７に従って、（Ａ）０．１％  ＴＦＡおよび（Ｂ）１％  ＴＦＡを含む７０％  アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムを用いてＨＰＬＣによって精製を行った。精製されたペプチドは、分析用ＨＰＬＣにおいて９７％を超える純度を有していることが分かった。これらのペプチドの保持時間は以下の通りである。
【０２１３】
【表４】
2010150253.tif 000023
【０２１４】
または、２５ｍｇの−Ｌｅｕ−ψ−Ｐｅｎ−ＮＨ２の構造を有する遊離ペプチドを、１００μｌの１０％ホルムアルデヒドと混合された０．８ｍｌの氷酢酸に溶解された２５ｍｇ  ＨＯＢｔに添加し、０℃で３０分間攪拌することによって、Ａ９残基を溶液中で環化し、５員の環構造  Ｌｅｕ−ψ−ＤＭＴａｃ−ＮＨ２を有するペプチドを得てもよい。
【０２１５】
実施例（５）
ペプチド番号
23. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2[配列番号:10]
24. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2
25. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2[配列番号:11]
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2
27. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Cys-NH2[配列番号:12]
これらのペプチドは、共通の中間体Ｉ−５、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ［配列番号：２３］樹脂から合成される。
【０２１６】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂は以下のようにして得られる：操作２及び３に示された方法によって、１．０ｇＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯを順次連結する。
【０２１７】
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ及びＦｍｏｃ−Ｔｒｐ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎを順次連結することによって、中間ペプチドＩ−５として、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ［配列番号：２３］樹脂が得られる。
【０２１８】
本実施例のすべてのペプチドに共通な上記中間体Ｉ−５の１５０ｍｇのアリコートを操作４に記載された方法によってさらにもう１回連結を行うことによって、最終的なペプチド樹脂が得られる。
【０２１９】
Ｂｏｃ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ［配列番号：１７］樹脂（“５／０８／Ａ”）。
【０２２０】
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“５／０９／Ａ”）。
【０２２１】
Ｂｏｃ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ［配列番号：１８］樹脂（“５／１２／Ａ”）。
【０２２２】
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂（“５／１３／Ａ”）。
【０２２３】
Ｈｃａを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：Ｈｃａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ［配列番号：１９］樹脂（“５／１４／Ａ”）。
【０２２４】
Ｎ−末端のＢｏｃ基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液で第一回目は５分間及び次に２５分間の計２回処理することによって、中間ペプチド５／０１／Ａから除去する。この処理によって、Ｃｙｓから保護基が除去される。次に、このペプチドを、操作４と同様にして、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ及びＤＭＦで洗浄することによって、以下の中間ペプチド５／０８／Ｂが得られる：Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＢＨＡ［配列番号：２６］樹脂。
【０２２５】
さらに、この中間ペプチド５／０８／Ｂを、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基が除去される。溶媒を真空下で蒸発させ、酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥することによって、以下のペプチドが得られる：Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ−ＮＨ２［配列番号：１０］。
【０２２６】
保護基及びＢＨＡ樹脂を中間ペプチド５／０８／Ａ、５／０９／Ａ、５／１１／Ａ、５／１２／Ａ、５／１３／Ａ及び５／１４／Ａから除去し、本実施例の冒頭に列挙されたペプチドを得る。これらのペプチドを操作７にしたがって精製試験(purity test)にかける。
【０２２７】
ペプチド番号２３〜２７（上記参照）。
【０２２８】
または、固相法の標準的な方法にしたがって、Ｃｙｓ９の−ＳＨ基を保護するのにＢｚを用いてＢｏｃで保護されたアミノ酸を有するＢＨＡ樹脂上に、これらのペプチドを適宜順次構築してもよく、これによって以下の中間ペプチドが得られる：
Ｂｏｃ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｚ）−ＢＨＡ［配列番号：２７］樹脂（“５／０８／Ａ”）；
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｚ）−ＢＨＡ樹脂（“５／０９／Ａ”）；
Ｂｏｃ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｚ）−ＢＨＡ［配列番号：２８］樹脂（“５／１２／Ａ”）；
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｚ）−ＢＨＡ樹脂（“５／１３／Ａ”）；および
Ｈｃａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｌｅｕ−ψ−Ｃｙｓ（Ｂｚ）−ＢＨＡ［配列番号：２９］樹脂（“５／１４／Ａ”）。
【０２２９】
５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％  ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液で処理することによって、Ｂｏｃ基を除去し、さらにＨＦ及びアニソールで処理することによって、ペプチドを樹脂から切断し、Ｈｉｓから保護基Ｂｏｍを、およびＣｙｓから保護基Ｂｚを除去し、本実施例の冒頭に列挙されたペプチドを得る。
【０２３０】
実施例（６）：アッセイ法
（Ａ）レセプター結合アッセイ
ヒトのＳＫ−Ｈｅｐ−１癌を、メスのヌードマウスの両脇腹部分に皮下移植した。以下のようにして、移植してから４７日目に処置を開始した。ここで、グループ１を、コントロール群とし、グループ２を、ペプチド１４を２０μｇ／日投与した群とした。なお、各群を８匹の動物とした。物質を０．１％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０％ポリエチレングリコール水溶液で希釈した。これらの溶液を０．１ｍｌ量、毎日１回皮下注射した。コントロール群のマウスには、ベヒクルのみを投与した。毎週、腫瘍の重量及び体重を測定して、腫瘍容積を算出した。１３５日目にこの実験を終了した。
【０２３１】
ＳＫ−Ｈｅｐ−１腫瘍は、成長（増殖）が非常に遅いため、この実験を約６週間続けた。マウスは、長期間の処置を良好に許容し(tolerate)、体重及び器官の重量は、いずれの治療によっても変化しなかった。
【０２３２】
３５日後、ペプチド１４で処置することによって、腫瘍容積が９４％に減少し、また、全体的に退縮した腫瘍もあった。グループ２の平均腫瘍容積は、５０日目から実験終了まで、ずっと初期値を下回っていた。時として、自然退縮が未処置のＳＫ−Ｈｅｐ−１で起こった。各群での全体的に退縮した腫瘍の数を下記表５に示す。
【０２３３】
【表５】
2010150253.tif 000024
【０２３４】
実施例（７）
マウスによっては、腫瘍の成長（増殖）が非常に速いものも、遅いものもあった。このため、５１日目に、各群で最も腫瘍が大きかったマウスを剖検した。腫瘍容積の変化率および腫瘍成長速度を、図１〜３に示す。また、腫瘍容積および腫瘍容積倍増時間を下記表２に示す。動物を様々な時点で剖検したので、腫瘍の重量は比較できなかった。ペプチド１４を毎日１０μｇ投与することによって、Ｈｅｐ−Ｇ２癌の生育を有意に阻害した。体重及び器官の重量は、当該処置によっては変化しなかった。
【０２３５】
【表６】
2010150253.tif 000025
【０２３６】
（結論）
上記表６の結果から、ボンベシンアンタゴニストであるペプチド１４は、１０μｇ／日の投与量で、ヌードマウスにおけるＨｅｐ−Ｇ２ヒト肝細胞癌の生育を有意に阻害したことが分かる。
【図１】
2010150253.tif 000030
【図２】
2010150253.tif 000031
【図３】
2010150253.tif 000032
【配列表】
2010150253000001.app