(57)【要約】【課題】特に自己血糖測定において有用である、測定精度、グルコースに対する反応特異性および電極センサーとしての保存安定性の点で、従来のセンシング技術と比較して格段に優れている、グルコースの測定方法および酵素組成物を提供する。【解決手段】グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。該グルコース脱水素酵素は、５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上、２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
【請求項２】
グルコース脱水素酵素が、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．２未満を示すことを特徴とする請求項１に記載のグルコースの電気化学測定方法。
【請求項３】
グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が５０℃、３０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
【請求項４】
グルコース脱水素酵素が５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上を示すことを特徴とする請求項３に記載の電気化学測定方法。
【請求項５】
グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が７０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
【請求項６】
グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
【請求項７】
グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率が９０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
【請求項８】
グルコース脱水素酵素が３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が８０％以上を示すことを特徴とする請求項７に記載のグルコースの電気化学測定方法。
【請求項９】
グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が９５％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
【請求項１０】
グルコース脱水素酵素が粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が９０％以上を示すことを特徴とする請求項９に記載のグルコースの電気化学測定方法。
【請求項１１】
グルコース脱水素酵素が、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．４未満を示すことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の電気化学測定方法。
【請求項１２】
グルコース脱水素酵素がフラビン化合物を補酵素として必要とすることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の電気化学測定方法。
【請求項１３】
グルコース脱水素酵素が糸状菌由来であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の電気化学測定方法。
【請求項１４】
糸状菌がペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする請求項１３に記載の電気化学測定方法。
【請求項１５】
糸状菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｓａｅ）であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の電気化学測定方法。
【請求項１６】
少なくとも、１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
【請求項１７】
グルコース脱水素酵素が、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．２未満を示すことを特徴とする請求項１６に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項１８】
グルコース脱水素酵素が、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．４未満を示すことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項１９】
少なくとも、５０℃、３０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２０】
グルコース脱水素酵素が５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上を示すことを特徴とする請求項１９に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２１】
少なくとも、２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が７０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２２】
少なくとも、２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２３】
少なくとも、３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率が９０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２４】
グルコース脱水素酵素が３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が８０％以上を示すことを特徴とする請求項２３に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２５】
少なくとも、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が９５％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２６】
グルコース脱水素酵素が粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が９０％以上を示すことを特徴とする請求項２５に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２７】
グルコース脱水素酵素がフラビン化合物を補酵素として必要とすることを特徴とする請求項１６〜２６のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２８】
グルコース脱水素酵素が糸状菌由来であることを特徴とする請求項１６〜２６のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項２９】
糸状菌がペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする請求項２８に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項３０】
糸状菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｓａｅ）であることを特徴とする請求項２８又は２９に記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項３１】
１種以上のメディエーター化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１６〜３０のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物。
【請求項３２】
請求項１６〜３１のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物を用いる、グルコースセンサの作製方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の製造方法で得られたグルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース脱水素酵素を用いる酵素電極法により、溶液中、特に血液中のグルコース濃度を測定する方法に関する。以下、グルコース脱水素酵素をＧＤＨとも記載する。また、フラビンアデニンジヌクレオチドをＦＡＤと記載する。また、ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素をＦＡＤＧＤＨとも記載する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースの迅速測定としては、最も広く知られている目的としては、医療分野において糖尿病患者の血糖値測定が挙げられる。また、一般産業界においても、食品工業などの分野では品質管理などの目的で、グルコース量を迅速かつ簡便に測定する技術が求められている。
【０００３】
近年、糖尿病の発症率は年々増加傾向にあり、更にその予備軍といわれる潜在的な人の数も併せると、日本国内だけでも１０００万人以上の数になるといわれている。また、生活習慣病への関心が非常に高まってきていることもあり、血糖値のきめ細かな自己測定が行われる機会や必要性も多くなっている。こうした時代背景において、血糖自己測定モニター（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）のための技術開発は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖の測定技術に関しては、従来から多くの方法が報告されており、また実用化もなされている。ＳＭＢＧのための基本手法としては、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングによる方法が有利である。
【０００４】
一般的に定着してきている血糖測定のためのセンシングの手法としては、グルコースを基質とする酵素を利用したセンサー技術が多数知られている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサー用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサーにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーター（電子受容体）を介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００５】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱとも記載する。）依存型グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサー用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコース脱水素酵素（以下、ＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（以下、ＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００６】
そこで、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、なおかつ特に基質特異性の点で優れたＧＤＨとして、ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）が注目されてきている。非特許文献１〜４、特許文献１〜３にはアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素について報告されている。また、特許文献４には、アスペルギルス属由来フラビン結合型グルコース脱水素酵素（以下、フラビン結合型グルコース脱水素酵素をＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。また、該ＦＡＤＧＤＨをグラッシーカーボン電極に固定化して、電流測定によりグルコースを測定する方法が開示されている。こうした酵素電極を用いた電気化学的な測定方法は一般的に広く用いられている方法ではあるが、再現性や精度の点で優れたデータを取得することが難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】国際公開２００７／１３９０１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００８／００１９０３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３９（２），２６５−２７６（１９６７年）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３９（２），２７７−２９３（１９６７年）
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４６（２），３１７−３２７（１９６７年）
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４６（２），３２８−３３５（１９６７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、特にフラビン化合物を補酵素として必要とする、グルコース脱水素酵素を用いた電気化学的なセンシング技術により、簡便な操作で、迅速に安定したデータを得ることを可能にした、電気化学的なグルコースの定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、有用なグルコースの電気化学的な測定方法を確立する上で、用いるグルコース脱水素酵素の濁りに対する安定性が極めて重要であり、濁りの生じやすさが一定レベル以下の特性を具備するグルコース脱水素酵素の適用が特に有用であることを見出し、本発明に到達した。また、一定レベル以上の熱安定性もしくはｐＨ安定性を具備するグルコース脱水素酵素の適用が特に有用であることも見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
（２）グルコース脱水素酵素が、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．２未満を示すことを特徴とする（１）に記載のグルコースの電気化学測定方法。
（３）グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が５０℃、３０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
（４）グルコース脱水素酵素が５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上を示すことを特徴とする（３）に記載の電気化学測定方法。
（５）グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が７０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
（６）グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
（７）グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率が９０％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
（８）グルコース脱水素酵素が３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が８０％以上を示すことを特徴とする（７）に記載のグルコースの電気化学測定方法。
（９）グルコース脱水素酵素を含有する酵素電極を用いて、グルコースの作用により生じる電流変化を測定することにより溶液中のグルコース量を測定する方法であって、該グルコース脱水素酵素が粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が９５％以上を示すことを特徴とするグルコースの電気化学測定方法。
（１０）グルコース脱水素酵素が粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が９０％以上を示すことを特徴とする（９）に記載のグルコースの電気化学測定方法。
（１１）グルコース脱水素酵素が、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．４未満を示すことを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載の電気化学測定方法。
（１２）グルコース脱水素酵素がフラビン化合物を補酵素として必要とすることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載の電気化学測定方法。
（１３）グルコース脱水素酵素が糸状菌由来であることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれかに記載の電気化学測定方法。
（１４）糸状菌がペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする（１３に記載の電気化学測定方法。
（１５）糸状菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｓａｅ）であることを特徴とする（１３）又は（１４）に記載の電気化学測定方法。
（１６）少なくとも、１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
（１７）グルコース脱水素酵素が、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．２未満を示すことを特徴とする（１６）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（１８）グルコース脱水素酵素が、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．４未満を示すことを特徴とする（１６）又は（１７）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（１９）少なくとも、５０℃、３０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
（２０）グルコース脱水素酵素が５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上を示すことを特徴とする（１９）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（２１）少なくとも、２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が７０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
（２２）少なくとも、２５℃、１６時間の処理条件において、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
（２３）少なくとも、３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率が９０％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
（２４）グルコース脱水素酵素が３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が８０％以上を示すことを特徴とする（２３）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（２５）少なくとも、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が９５％以上を示すグルコース脱水素酵素および緩衝材を含有してなることを特徴とする電気化学測定用酵素組成物。
（２６）グルコース脱水素酵素が粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が９０％以上を示すことを特徴とする（２５）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（２７）グルコース脱水素酵素がフラビン化合物を補酵素として必要とすることを特徴とする（１６）〜（２６）のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物。
（２８）グルコース脱水素酵素が糸状菌由来であることを特徴とする（１６）〜（２６）のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物。
（２９）糸状菌がペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする（２８）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（３０）糸状菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｓａｅ）であることを特徴とする（２８）又は（２９）に記載の電気化学測定用酵素組成物。
（３１）１種以上のメディエーター化合物をさらに含むことを特徴とする（１６）〜（３０）のいずれかに記載の電気化学測定用酵素組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるグルコースの測定方法および酵素組成物は、測定精度、グルコースに対する反応特異性および電極センサーとしての保存安定性の点で、従来の酵素電極を用いるセンシング技術と比較して格段に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】グルコース脱水素酵素を用いた場合の、グルコースのセンシングに関する化学反応のスキームを示す図である。
【図２】本発明の実施例において用いた、組み換えプラスミドの構築を示す図である。
【図３】本発明の実施例において用いた、グルコース脱水素酵素活性の濁りの変化を測定した結果を示す図である。
【図４】（Ａ）実施例で用いた電極の写真を示す図である。（Ｂ）実施例において、カーボン電極上に溶液をマウントした状態を示す写真である。
【図５】本発明の実施例における酵素電極測定の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例において用いた、グルコース脱水素酵素活性の温度安定性を示す図である。
【図７】本発明の実施例において用いた、グルコース脱水素酵素活性のｐＨ安定性を示す図である。
【図８】本発明の実施例において用いた、グルコース脱水素酵素の活性値に関して、３７℃処理を行った際の安定性を示す図である。
【図９】本発明の実施例において用いた、グルコース脱水素酵素の活性値に関して、２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を繰り返した際の安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において用いられるグルコース脱水素酵素は、特に限定されるものではないが、基質特異性の観点から、フラビン化合物を補酵素として要求されるグルコース脱水素酵素を用いることが好ましい。フラビンは、ジメチルイソアロキサジンの１０位に置換基をもつ一群の誘導体であり、フラビン分子種を補酵素とする酵素であれば特に限定されるものではない。フラビン化合物としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが挙げられるが、ＦＡＤが特に好ましい。
【００１５】
グルコース脱水素酵素は、メディエーター（電子受容体）の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。図１にグルコースのセンシングに関するスキームの一例を示す。ＦＡＤ依存型のグルコース脱水素酵素がグルコースに作用するに、補酵素ＦＡＤはＦＡＤＨ２となるが、メディエーターとしてフェリシアン化物（例えば、「Ｆｅ（ＣＮ）６」３−）を存在させると、ＦＡＤＨ２はこれをフェロシアン化物（この場合、「Ｆｅ（ＣＮ）６」４−）へと変換し、自らはＦＡＤへと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質をメディエーターとすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
【００１６】
本発明において用いられるグルコース脱水素酵素の起源は特に限定されないが、糸状菌由来のものが好ましく、なかでもペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するものが例示される。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に由来するものが特に好ましく、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）などが例示される。なかでも、アスペルギルス・オリゼに由来するものが特に好ましい。グルコース脱水素酵素は天然に由来するものを抽出・精製して得てもよいし、これらの遺伝子情報に基づき、公知の遺伝子工学的な手法により生産されたものであっても構わない。
【００１７】
本発明においては、特に濁りに対する安定性に優れたグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。具体的には、グルコース脱水素酵素が１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満、好ましくは０．０５未満を示すことを特徴とする。より好適には、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．２未満、好ましくは０．１未満を示すものであり、更に好適には、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．４未満、好ましくは０．２未満を示すものが用いられる。
【００１８】
あるいは、本発明においては、特に熱安定性に優れたグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。具体的には、５０℃、３０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すものであり、好ましくは５０℃、３０分間の処理後の残存活性が６０％以上を示すもの、より好ましくは５０℃、３０分間の処理後の残存活性が７０％以上を示すもの、更に好ましくは５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上を示すものが挙げられる。また、５０℃、６０分間の処理後の残存活性が３０％以上を示すもの、より好ましくは５０℃、６０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すもの、更に好ましくは５０℃、６０分間の処理後の残存活性が７０％以上を示すものが挙げられる。更には、５０℃、１８０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すもの、更に好ましくは５０℃、１８０分間の処理後の残存活性が６０％以上を示すものが挙げられる。ここで、残存活性とは、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に１０Ｕ／ｍｌの酵素濃度条件として、５０℃、３０分間インキュベートした後のＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性値の、インキュベーションを行わないＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性値に対する割合をいうものである。
【００１９】
あるいはまた、本発明においては、特にｐＨ安定性に優れたグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。具体的には、２５℃、１６時間の処理を行った際に、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が７０％以上を示すものを用いることを特徴とする。より好ましくは、２５℃、１６時間の処理を行った際に、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すもの、更に好ましくは、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．５の時の活性残存率が５０％以上を示すものが用いられる。また、ｐＨ４．０〜６．０の範囲においては、２５℃、１６時間の処理を行った際の、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、８０％以上を示すものであることが好ましい。ここで、残存活性とは、１００ｍＭ濃度の各種緩衝液中に、５Ｕ／ｍｌの酵素濃度条件で、２５℃、１６時間インキュベートした後のＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性値の、インキュベーションを行わないＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性値に対する割合をいうものである。緩衝液の種類としては、ｐＨ３．５〜５．５の範囲では酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範囲ではリン酸緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０の範囲ではトリス緩衝液を用いるものとする。
【００２０】
あるいはまた、本発明においては、特に保存安定性に優れたグルコース脱水素酵素として、３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上を示すものを用いることを特徴とするものである。より好ましくは、３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が８０％以上、好ましくは９０％以上を示すものが用いられる。あるいは、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が９５％以上、好ましくは９８％以上を示すものを用いることも好ましく、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上を示すものが更に好ましい。ここで、残存活性とは、精製酵素１５ｍｇを蓋付き試験管内に秤量して、蓋をした状態にて所定の時間、所定の温度条件でインキュベートした後のＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性値の、インキュベーション開始前のＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性値に対する割合をいうものである。
【００２１】
なお、上記ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行うものである。
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液  ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ  フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）溶液
２．０ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２０．５ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液５．９ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００２２】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式（Ｉ）に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
【００２３】
活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛１６．８×０．１×１．０｝      ・・・（Ｉ）
【００２４】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００２５】
遺伝子工学的な手法を用いる場合、グルコース脱水素酵素遺伝子を、大腸菌を宿主として発現させて生産する方法により取得することも可能である。しかしながら、その場合、得られる蛋白質であるグルコース脱水素酵素は、非糖鎖結合型の酵素になる。そのため、その安定性、特に熱安定性が十分なものを得ることが困難になることが多くなることが予測される。その際には、アミノ酸配列に適宜変異を加えるなどによる改変することも可能である。グルコース脱水素酵素遺伝子としては、配列番号１に示すような、シグナルペプチド切断型のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の配列が例示される。
【００２６】
また、糖鎖結合型酵素を得る方法として、特に糸状菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を発現させる場合、同じく糸状菌を宿主として用いる方法も好ましい。この場合に得られる酵素は、糖鎖結合による安定性、特に熱安定性において優れるものを得やすいという利点がある。宿主として用いる糸状菌の種類としても、上述したようなものが例示されるが、特に限定されるものではないが、例えばアスペルギルス・オリゼに由来するグルコース脱水素酵素遺伝子をアスペルギルス・オリゼに発現させる、セルフクローニング法が有用である。
【００２７】
本発明における電気化学測定法は、特に限定されるものではないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法を適用することができる。具体的な測定手法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられるが、アンペロメトリーにより、還元されたメディエーターを印加により酸化される際に生ずる電流値を測定する方法が特に好ましい。この場合の印加電圧としては、１０〜７００ｍＶが好ましく、５０〜５００ｍＶがより好ましく、１００〜４００ｍＶが更に好ましい。
【００２８】
測定システムとしては、二電極であっても三電極系であってもよい。作用電極にはカーボン電極を用いてもよいし、白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属電極を用いてもよい。カーボン電極の場合、パイロロティックグラファイトカーボン、グラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト、ＰＦＣ（ｐｌａｓｔｉｃ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）などが挙げられる。金属電極の場合、金が特に好ましい。通常は、作用電極上にグルコース脱水素酵素が担持されてなる。酵素の固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどが挙げられる。あるいはフェリシアン化物、フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする方法である。参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが挙げられる。
【００２９】
グルコース濃度の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００３０】
しかしながら、上述のような方法では、測定に必要な溶液の量が多くなるため、小スケールで簡便に測定するためには、印刷電極を用いる方が好ましい。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【００３１】
電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられるが、円形であることが、固定化する酵素溶液のマウントのしやすさの点から特に好ましい。また、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。酵素溶液の容量としては１〜５μＬ程度で十分であり、２〜３μＬ程度の量で行うのがより好ましい。酵素溶液をマウントした後の固定化反応は、湿潤条件下で静置して行うのが好ましい。
【００３２】
酵素反応に用いる溶液の種類は、特に限定されるものではないが、ＰＢＳのようなリン酸緩衝液、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝液などが例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは６．０〜７．５程度である。また、緩衝液の濃度としては、１〜２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０〜１００ｍＭ程度である。また、添加物として、各種の有機酸、塩、防腐剤などの物質を共存させることも可能である。
【００３３】
酵素反応と電極間の電子移動を仲介するためのメディエーターを用いることも効果的である。適用できるメディエーターの種類は特に限定されるものではないが、キノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等が例示される。より具体的には、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン／フェロシアン化物（カリウムもしくはナトリウム塩）、フェリシニウム／フェロセンなどが挙げられる。フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどを用いてもよい。その他にも、オスミウム、コバルト、ルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。水溶性の低い化合物をメディエーターとして用いる場合、有機溶媒を用いると、酵素自体の安定性を損なったり、酵素活性を失活させたりする可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子により修飾されたものを用いてもよい。反応系におけるメディエーター濃度は、１ｍＭ〜１Ｍ程度の範囲が好ましく、５〜５００ｍＭがより好ましく、１０〜３００ｍＭが更に好ましい。またメディエ−ターについても種々の官能基が導入された修飾体を用いるなどして、酵素とともに電極上に固定化させて用いてもよい。
【００３４】
酵素反応は、所望の容量の反応溶液中に、所望の量の酵素とメディエーターを加えて混合された状態において、基質を含有する試料溶液、例えば血液を所定量加えると同時に測定を開始する。電気化学的な検出とは、特に限定されるものではないが、酵素反応が進行するとメディエーターを介在した電子の移動に伴って生ずる電流の変化をシグナルとして測定することが好ましい。測定に供する試料の種類は特に制約されるものではなく、酵素の基質を成分として含有する化含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、可能な範囲で反応温度を一定にして行ってもよい。また、マイクロ流路デバイス等を用いた微量解析に展開することも可能である。
【００３５】
上述したようなグルコースの電気化学的測定法のために用いられる、本発明における電気化学測定用酵素組成物は、濁りに対する安定性に優れたグルコース脱水素酵素と緩衝材を含むことを特徴とする。具体的にはグルコース脱水素酵素が１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．１未満、好ましくは０．０５未満を示すことを特徴とする。より好適には、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．２未満、好ましくは０．１未満を示すものであり、更に好適には、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値が０．４未満、好ましくは０．２未満を示すもの
が用いられる。
【００３６】
あるいは、上述したようなグルコースの電気化学的測定法のために用いられる、本発明における電気化学測定用酵素組成物は、熱安定性に優れたグルコース脱水素酵素と緩衝材を含むことを特徴とする。該熱安定性に優れたグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。具体的には、５０℃、３０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すものであり、好ましくは５０℃、３０分間の処理後の残存活性が６０％以上を示すもの、より好ましくは５０℃、３０分間の処理後の残存活性が７０％以上を示すもの、更に好ましくは５０℃、３０分間の処理後の残存活性が８０％以上を示すものが挙げられる。また、５０℃、６０分間の処理後の残存活性が３０％以上を示すもの、より好ましくは５０℃、６０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すもの、更に好ましくは５０℃、６０分間の処理後の残存活性が７０％以上を示すものが挙げられる。あるいは、５０℃、１８０分間の処理後の残存活性が５０％以上を示すもの、更に好ましくは５０℃、１８０分間の処理後の残存活性が６０％以上を示すものが挙げられる。
【００３７】
あるいはまた、上述したようなグルコースの電気化学的測定法のために用いられる、本発明における電気化学測定用酵素組成物は、ｐＨ安定性に優れたグルコース脱水素酵素と緩衝材を含むことを特徴とする。該ｐＨ安定性に優れたグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。具体的には、２５℃、１６時間の処理を行った際に、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が７０％以上を示すものを用いることを特徴とする。より好ましくは、２５℃、１６時間の処理を行った際に、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．０の時の活性残存率が７０％以上を示すもの、更に好ましくは、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ８．５の時の活性残存率が５０％以上を示すものが用いられる。また、ｐＨ４．０〜６．０の範囲においては、２５℃、１６時間の処理を行った際の、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、８０％以上を示すものであることが好ましい。
【００３８】
あるいはまた、上述したようなグルコースの電気化学的測定法のために用いられる、本発明における電気化学測定用酵素組成物は、粉末状態において熱安定性に優れたグルコース脱水素酵素と緩衝材を含むことを特徴とする。該熱安定性に優れたグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。具体的には、グルコース脱水素酵素として、３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率が９０％以上を示すものを用いることを特徴とするものである。より好ましくは、３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が８０％以上を示すものが用いられる。あるいは、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が９５％以上を示すものを用いることも好ましく、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が９０％以上を示すものが更に好ましい。
【００３９】
一方、緩衝材としては、リン酸塩のほか、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝材などが例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度に調整されることが好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。更には、上述したようなメディエーターである物質も組成物中に共存して含まれていてもよい。
【００４０】
本発明の電気化学測定用酵素組成物には、さらに、下記に例示する、糖アルコール、カルボキシル基含有化合物、アルカリ金属含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質からなる群より選ばれるいずれか１つ以上の化合物などが含まれていても良い。
【００４１】
添加する化合物として好ましいものとして、マンニトール、イノシトール、アラビトール、アドニトール、ガラクチトール、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イノシトール、グリセリン酸カルシウム、コハク酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、フマル酸、マロン酸、ピメリン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、リジン、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる群より選ばれるいずれか１つ以上を挙げることができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましくは、０．００１〜３０重量％、さらに好ましくは、０．０１〜５％、さらに好ましくは０．０１〜１％である。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末あるいは凍結乾燥物中では、溶液中の場合と比べて、更に低濃度の化合物添加で有効性を発揮する傾向にある。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、ＧＤＨ酵素と共存して保存する時の終濃度である。好ましい組合せとしては、性質が近似する塩化合物中での組合せや、カルボン酸含有化合物同士での組合せなどが挙げられるが、例えば、塩化合物とカルボン酸含有化合物などを組み合わせて、お互いの効果を相補するものが好ましい。
上記形態においてさらに熱安定性を向上させるため、組成物のｐＨをｐＨ７以下の酸性側で保持させることができる。あるいは、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸などのジカルボン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を含有することができる。
このような化合物は、組成物中のＧＤＨの熱安定性を加熱乾燥可能なレベルまで向上しうる。加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が１０％以上存在する状態であり、好ましくは４５％以上の残存活性が得られる状態であり、更に好ましくは、７０％以上の残存活性が得られる状態である。
【００４２】
本発明の電気化学測定用酵素組成物においては、さらに、下記に例示するように、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該組成物のｐＨをｐＨ７以下の酸性側で保持させてもよい。
【００４３】
このような組成物は、該組成物をｐＨ７．３以上にした場合と比べて安定性が向上しており、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、１０％以上のＧＤＨ活性を残存する。あるいは、フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、４５％以上のＧＤＨ活性を残存する。
【００４４】
上記形態においては、組成物中に、１種類以上のジカルボン酸、塩化合物を含有することが好ましい。ジカルボン酸としてはコハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸、塩化合物としては塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。本発明では、これらのうち１種類以上の化合物を含有することができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましくは、１ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは、５ｍＭ〜５Ｍ、さらに好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍである。粉末あるいは凍結乾燥物を作製する場合には、溶液中の場合と同程度の化合物濃度を含有する組成にて乾燥処理を施すことにより同様の効果を持った乾燥標品を取得することができる。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、ＧＤＨ酵素と共存して保存する時の終濃度である。好ましい組合せとしては、性質が近似する塩化合物中での組合せや、カルボン酸含有化合物同士での組合せなどが挙げられるが、例えば、塩化合物とカルボン酸含有化合物などを組み合わせて、お互いの効果を相補するものが好ましい。
上記形態においてさらに熱安定性を向上させるため、糖アルコール、カルボキシル基含有化合物、アルカリ金属含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質、例えば、マンニトール、イノシトール、アラビトール、アドニトール、ガラクチトール、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イノシトール、グリセリン酸カルシウム、コハク酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、フマル酸、マロン酸、ピメリン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、リジン、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などの化合物を含有することができる。
【００４５】
また本発明のＧＤＨを含む電気化学測定用酵素組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはスプレードライ等により粉末化することができる。このとき、ＧＤＨは緩衝液等に溶解したものを用いることができ、さらに賦形剤あるいは安定化剤として本発明で用いる上記化合物以外の糖・糖アルコール類、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等を添加することができる。また、粉末化後さらに造粒することもできる。このような物質の例としては例えばトレハロース・スクロース・ソルビトール・エリスリトール、グリセロール等に代表される糖・糖アルコール類・グルタミン酸・アルギニン等に代表されるアミノ酸、牛血清アルブミン・卵白アルブミンや各種シャペロン等に代表されるタンパク質・ペプチド類等を挙げることができる。
【００４６】
本発明のＧＤＨを含む電気化学測定用酵素組成物に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ５〜８の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
【００４７】
本発明において適用されるグルコース脱水素酵素の一例として、その遺伝子の取得および酵素の製法に関して、以下に実験例として例示する。
【００４８】
配列番号１１は、野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列であって、シグナル配列を含む。配列番号２は、「配列番号１１においてシグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質」の一例を示すものである。配列番号１１と配列番号２の違いは、配列番号４５がＮ末端側にシグナル配列を含むが、配列番号２ではシグナル配列部分の一部または全部が欠失している点であり、配列番号１１の方が２１アミノ酸分長くなっているが、それ以外は同じである。
【００４９】
配列番号１１で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、およびそれらをコードする遺伝子は、以下の方法により入手した。本発明者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩと表記する。）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用いた遺伝子組換え体よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコース脱水素酵素を取得できることを見出した。
【００５０】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、自社保有のアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、本発明者らはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。次いで、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。最終的に、この塩基配列を元に、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定、取得した。その概要を、以下の実験例１および実験例２に示す。
【００５１】
＜実験例１＞、
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素（以下、ＡＯＧＤＨとも記載する。）遺伝子の推定］
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃、１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外濾過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更に、これを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得ることはできなかった。
【００５２】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
【００５３】
［ｃＤＮＡの作製］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（但し、ジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡績製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ  Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡績製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−（東洋紡績製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
【００５４】
［ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定］
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（１．４％グリシン、０．３％トリス、２０％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号３）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号４）であった。この配列を基にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ、１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡績製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ  ＣｌｏｎｅＴＭ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡績製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡績製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
【００５５】
［ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定］
決定した塩基配列を元に、「ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００５６】
＜実験例２＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素遺伝子の取得、大腸菌への導入］
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号５および６に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ）を構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号７）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号８）からなることが明らかとなった。ＲＩＢ４０株から予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸でありＴＩ株  ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。また、ＰＣＲ法を用いて、ＲＩＢ４０株に基づくＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、ＲＩＢ４０株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。
【００５７】
＜実験例３＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素（以下、ＡＯＧＤＨと示す。）遺伝子の大腸菌への導入］
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分伸びた形態となる（以下、Ｓ２と示す。）。配列番号９のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号１０のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。なお、この改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。この形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が増大した。
【００５８】
改変型ＦＡＤＧＤＨを取得する方法は、配列番号２（「配列番号１１においてシグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質」の一例）のアミノ酸配列における上記で示されるいずれか位置においてアミノ酸置換を行うこと、または、配列番号２のアミノ酸配列における上記で示されるいずれか位置においてアミノ酸置換を行うことである。なお、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有するものを含む。例えば、具体的に「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２と高い相同性（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列を有する他のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨとを、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００５９】
なお、「配列番号１１において変異を含むアミノ酸配列」に関し、記載されたアミノ酸配列以外に、次の（１）〜（３）のいずれかの形態をとりうる。また、「配列番号１１において変異を含むアミノ酸配列」に関し、更に、次の（１）〜（３）のいずれかの変異を加えた形態をとりうる。配列番号２においても、上記と同様の形態をとりうる。配列番号２において、これらの変異は、変異箇所の位置をそれぞれ２１ずつ減じた表記により示される。
【００６０】
（１）配列番号１１に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する。
（２）配列番号１１において、１４１位、１８１位、１８３位、１８４位、１８５位、１１８６位、１８７位、１８８位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、２０１位、３５０位、３５２位、３９０位、４９２位及び５７２位からなる群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する。
（３）配列番号１１において、アミノ酸置換が、Ｋ１４１Ｅ、Ｇ１８１Ｅ、Ｇ１８１Ｉ、Ｇ１８１Ｐ、Ｇ１８１Ｓ、Ｇ１８１Ｑ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｃ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｌ、Ｓ１８３Ｐ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｌ、Ｇ１８４Ｒ、Ｓ１８５Ｆ、Ｓ１８５Ｔ、Ｓ１８５Ｙ、Ｌ１８６Ａ、Ｌ１８６Ｉ、Ｌ１８６Ｎ、Ｌ１８６Ｐ、Ｌ１８６Ｖ、Ａ１８７Ｃ、Ａ１８７Ｉ、Ａ１８７Ｋ、Ａ１８７Ｌ、Ａ１８７Ｍ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｓ、Ｓ１８８Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｖ、Ｎ１９０Ｋ、Ｎ１９０Ｐ、Ｎ１９０Ｙ、Ｎ１９０Ｗ、Ｌ１９１Ｃ、Ｌ１９１Ｆ、Ｓ１９２Ｉ、Ｓ１９２Ｋ、Ｓ１９２Ｍ、Ｓ１９２Ｑ、Ｓ１９２Ｖ、Ｖ１９３Ａ、Ｖ１９３Ｃ、Ｖ１９３Ｅ、Ｖ１９３Ｉ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９３Ｓ、Ｖ１９３Ｗ、Ｖ１９３Ｙ、Ａ２０１Ｇ、Ｖ３５０Ｑ、Ａ３５２Ｃ、Ａ３５２Ｄ、Ａ３５２Ｉ、Ａ３５２Ｋ、Ａ３５２Ｌ、Ａ３５２Ｍ、Ｑ３５２Ｖ、Ｋ３９０Ｒ、Ｋ４９２Ｒ、Ｖ５７２Ａ、Ｖ５７２Ｃ、Ｖ５７２Ｔ、Ｖ５７２Ｑ、Ｖ５７２Ｓ、Ｖ５７２Ｙ、（Ｇ１８１Ｅ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８１Ｉ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８１Ｓ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８１Ｑ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ａ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｃ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｄ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｄ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｅ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｆ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｈ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｌ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８４Ｄ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８５Ｆ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８５Ｔ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８５Ｙ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｌ１８６Ａ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｌ１８６Ｉ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｌ１８６Ｐ＋Ｓ１９２Ｋ）、（Ｌ１８６Ｐ＋Ｖ５７２Ｃ）、（Ｌ１８６Ｖ＋Ｖ５７２Ｃ）、（Ａ１８７Ｃ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｉ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｋ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｋ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｍ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｐ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｓ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｐ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｙ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｗ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９１Ｃ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９１Ｆ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｍ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｑ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｖ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ａ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｃ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｅ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｓ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｔ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｗ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｙ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ３５０Ｑ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｃ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｄ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｌ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｍ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｖ）、（Ｇ１８４Ｋ＋Ｖ５７２Ｃ）、（Ｇ１８４Ｒ＋Ｖ５７２Ｃ）のうちのいずれかである。ここで、例えば「Ｋ１４１Ｅ」は、１４１位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００６１】
特に、配列番号２における、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）、配列番号１１におけるＧ１８４Ｌ、Ｇ１８４Ｒ、Ｓ１８８Ｐ、Ｖ５７２Ａ、Ｖ５７２Ｃ、Ｖ５７２Ｑ、Ｖ５７２Ｓ、Ｖ５７２Ｙ、（Ｇ１８１Ｉ＋Ｓ１１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｆ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｙ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９２Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９２Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９２Ｖ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｗ）、（Ｇ１８４Ｋ＋Ｖ５７２Ｃ）（Ｇ１８４Ｒ＋Ｖ５７２Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００６２】
配列番号２、配列番号１１で示されるアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６３】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入される。宿主細胞には、大腸菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な細胞が用いられる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。糸状菌の場合にはプロトプラスト化された細胞等が用いられる。
【００６４】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。アスペルギルス・オリゼ株の場合は、好ましくは２０〜４０℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜７２時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し買い変体朴質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度である。
【００６５】
培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従ってＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６６】
このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。
【００６７】
本発明のＧＤＨを含む電気化学測定用酵素組成物を用いて、グルコースセンサを作製することができ、そのようなセンサの製造方法、および、該製造方法により得られたセンサも本願発明に含まれる。
【００６８】
本発明のグルコースセンサは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００６９】
電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００７０】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００７２】
実施例１：アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素遺伝子のアスペルギルス・オリゼ株への導入
上述のＡＯＧＤＨ組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ）をＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ処理し、ＡＯＧＤＨ遺伝子断片を切り出した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績製）を用いて、該ＤＮＡ断片の末端平滑化を行った。一方、ＡｍｙＢプロモーター、ＡｍｙＢターミネーター、アスペルギルス・ニドランス由来ｓＣ遺伝子を含むｐＵＳＡプラスミド（７．２５ｋｂｐ）をＳｍａＩ処理し、図２に示すように、ＡｍｙＢプロモーター直下流を一箇所切断した後、脱リン酸化処理を実施した。該プラスミドに平滑化した上記ＡＯＧＤＨ遺伝子断片を連結し、組換えプラスミドを構築した（ｐＵＳＡＲ）。組換え宿主にはアスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７年）に記載されているもので、ｐＵＳＡプラスミドとともに（独）酒類総合研究所より分譲いただいたものである。形質転換も、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７年）に記載の方法を参考に実施した。形質転換で得られた形質転換体については、純化を繰り返し、最終株を選抜した。取得した形質転換体を試験管スケールで、５ｍｌ液体培地（１．５％  大豆ペプトン、１％  マルトエキス、０．１％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、２％  グルコース、２％  マルトース）で３０℃、２４時間培養したところ、培養液１ｍｌ当たり５．０ＵのＧＤＨ活性を確認した。
【００７３】
実施例２：アスペルギルス・オリゼ由来改変型グルコース脱水素酵素遺伝子（以下ｒｍｒａＡＯＧＤＨ）のアスペルギルス・オリゼへの導入
上記組換えプラスミドｐＵＳＡＲを鋳型として、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用い、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃの変異導入を実施し、改変型グルコース脱水素酵素を含む組換えプラスミドｐＵＳＡＲＭを作製した。該組換えプラスミドを用いて同様にアスペルギルスＮＳ４株の組換え体を取得し、ＧＤＨ活性を確認したところ培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性を確認した。
【００７４】
実施例３：ｒａｒｍＡＯＧＤＨの取得
ｐＵＳＡＲＭ形質転換体を、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、（１．５％  大豆ペプトン、１％  マルトエキス、０．１％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、２％  グルコース、２％  マルトース（ｐＨ６．５））培地にて、培養温度３０℃で５０時間培養した。培養菌体をろ過した後、硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて狭雑タンパク質を沈殿させ、遠心分離で上清を回収した。上清を濃縮・バッファー置換（５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を行い、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを実施し、酵素精製標品（ｒａｒｍＡＯＧＤＨ）を取得した。
【００７５】
実施例４：濁り特性の評価
実施例３で得た精製標品を用いて、グルコース脱水素酵素が１５ｍｇ／ｍｌ濃度でｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中において２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値の、経時的な変化を図３にグラフ化して示した。本グルコース脱水素酵素は、２５℃で２０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値、２５℃で４０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値、２５℃で９０時間静置した後の、６６０ｎｍにおけるＯＤ測定値のいずれも、０．０１以下のレベルであり、ほとんど濁りが生じていないことを示している。
【００７６】
実施例５：熱安定性特性の評価
実施例３で得た精製標品を用いて、１０Ｕ／ｍｌの濃度になるように、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、５０℃で所定の時間の加熱処理を行った際に、残存するグルコース脱水素酵素活性を測定した。図６に、処理前の活性に対する残存活性の比率をグラフ化して示した。本グルコース脱水素酵素は、５０℃、３０分の熱処理により約９０％、５０℃、６０分の熱処理により約８０％、５０℃、１８０分の熱処理により約６０％の残存活性を示している。
【００７７】
実施例６：ｐＨ安定性特性の評価
実施例３で得た精製標品５Ｕ/mlの濃度で、１００ｍＭ濃度の緩衝液中、２５℃、１６時間の処理を行った。緩衝液の種類としては、ｐＨ３．５〜５．５の範囲では酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範囲ではリン酸緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０の範囲ではトリス緩衝液を、それぞれ用いた。各条件での処理の後、残存するグルコース脱水素酵素活性を測定した。図７に、処理前の活性に対する残存活性の比率をグラフ化して示した。本グルコース脱水素酵素は、２５℃、１６時間の処理を行った際に、ｐＨ６．５の時の残存活性に対して、ｐＨ７．５の時の活性残存率が約９５％、ｐＨ８．０の時の活性残存率が約９０％、ｐＨ８．５の時の活性残存率が６０％を示している。また、ｐＨ４．０〜６．０の範囲において、２５℃、１６時間の処理を行った際の、ｐＨ６．５の時の残存活性は８０％以上のレベルが維持されている。
【００７８】
実施例７：保存安定性特性の評価
実施例３で得た精製標品１５ｍｇを蓋付き試験管内に秤量して、蓋をした状態にて、所定の時間、３７℃でインキュベートした際に、残存するグルコース脱水素酵素活性を測定した。図８に、処理前の活性に対する残存活性の比率をグラフ化して示した。本グルコース脱水素酵素は、３７℃で３日間粉末状態において保存した際の活性残存率はほぼ１００％維持されており、３７℃で７日間粉末状態において保存した際の活性残存率が約９０％を示している。
【００７９】
実施例３で得た精製標品１５ｍｇを蓋付き試験管内に秤量して、蓋をした状態にて、２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を繰り返した際の、残存するグルコース脱水素酵素活性を測定した。図９に処理前の活性に対する残存活性の比率をグラフ化して示した。本グルコース脱水素酵素は、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を５回繰り返した際の活性残存率が約９８％、粉末状態において２５℃、１時間および−２０℃、６時間の凍結融解を１０回繰り返した際の活性残存率が約９５％を示している。
【００８０】
各種の酵素特性に関して、確認された結果を以下に示した。
至適温度      ５０〜５５℃
温度安定性    ５０℃、３０分処理による残存活性が８９％
至適ｐＨ      ７．０
ｐＨ安定性    ４．０〜８．０（２５℃、１６時間）
比活性        約５００Ｕ／ｍｇ
糖含有量      ３０〜５０％
Ｋｍ          ６７．６ｍＭ
【００８１】
また、基質特異性に関して、４ｍＭの基質濃度で対比を行った結果を、表１に示す。グルコースに対する反応性を１００％とした際に、例えばマルトース０．１％、スクロース０％、ガラクトース０．１％、フルクトース０．１％、キシロース１８．２％と非常に良好なものであった。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
実施例８：酵素電極測定による評価
上記のグルコース脱水素酵素を用いた酵素電極による測定を検討した。図４（Ａ）に示したような、カーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（カーボン・丸型・ダム付き；バイオデバイステクノロジー製）上に、ｒａｒｍＡＯＧＤＨ２０Ｕ、フェリシアン化カリウム３６４ｍＭ（終濃度）を、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２μＬに溶解した液を電極上に載せて、３５℃で２０分間静置することにより、酵素の電極上への固定化を行った。酵素電極を水で洗浄した後、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。そして、３００ｍＶの電圧を印加して、所定濃度のグルコース溶液２０μＬを電極上に載せて反応を行い（図４（Ｂ）を参照）、４０秒後の電流値を測定した。
【００８４】
反応させた各グルコース濃度における電流応答値をプロットした結果を、図５に示した。相関係数として、Ｒ２＝０．９２４２であり、非常に良好な検量線を得ることができた。更には、測定の再現性や、保存安定性の点でも優れていた。
【００８５】
更に、酵素電極における基質特異性に関しても検討を行った。対比は、いずれの基質においても、１５ｍＭ濃度で行った。結果は表２に示す通り、グルコース以外の主要な糖類に対してはほとんど反応性を示さなかった。特に輸液成分として含まれることから、実際の医療現場ではしばしば問題となるマルトースの影響をほとんど受けないことから、本発明におけるグルコース測定技術は極めて有用であると考えられた。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明を利用することにより、簡便にかつ再現性においても優れたグルコースの定量を実現することができる。特に、酵素反応の初期速度を高める作用により、近年要求されている迅速な定量を実現させるうえで有用な技術である。したがって、医療現場での血糖値センサーはもとより、食品分野等でのグルコース量の品質管理などの分野における応用展開が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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