(57)【要約】【課題】従来法に比べ、より正確であり、簡便で検出効率の良い遺伝子多型解析が可能とする遺伝子多形解析用試薬を提供する。【課題解決手段】  フラップエンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した変異体を得る。得られた変異体は、３’突出末端を有するＤＮＡ基質のみに実質的に作用し、遺伝子多型解析試薬として使用するのに好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）または（２）に示されるフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる遺伝子多型解析用試薬。
（１）配列表の配列番号２に示されるパイロコッカス・ホリコシ由来のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列において、（Ａ）３３番目のアミノ酸がアラニン又はロイシン、（Ｂ）３５番目のアミノ酸がチロシン、（Ｃ）７９番目のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン、（D）３３番目と７９番目のアミノ酸がともにアラニン、（Ｅ）３３番目と３５番目のアミノ酸がともにアラニン、及び（Ｆ）２７８番目と２７９番目のアミノ酸がともにアラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体
（２）パイロコッカス・ホリコシ以外の生物由来のフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、配列番号２に示されるフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列とのアライメント上の対応部位において、上記（１）の(A)〜（F）と同様のアミノ酸変異のいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変化せしめた新規フラップエンドヌクレアーゼ変異体、及び該変異体を利用した遺伝子の多型解析用試薬に関する。 
【背景技術】
【０００２】
フラップ（Flap）エンドヌクレアーゼはＤＮＡ複製・修復に必須な酵素であり、ＤＮＡの構造を特異的に認識しフラップ鎖を切断する。また、この酵素は、５‘exonuclease活性も有している。この酵素は、結晶構造が明らかにされ、基質認識機構に関して変異体を用いて詳しく調べられている。また、耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼとして、パイロコッカス由来の耐熱性酵素も知られている。 
一方、最近は、このようなフラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を利用して、遺伝子の多型解析に利用されている。 
【０００３】
遺伝子の多型とは、異なる個体間で、遺伝子上の同一箇所の塩基配列が異なることをいい、その頻度により突然変異と区別されるが、遺伝子の多型が直接疾病原因となっていることもあり、また、近年、最も頻度の高い多型である一塩基多型（ＳＮＰ）が複雑に関連し、生活習慣病等の遺伝的要因になっているとも考えられ、そのためＳＮＰの位置及びＳＮＰの塩基に関する膨大なデータが集積されつつある。 
上記Flapエンドヌクレアーゼを使用するＳＮＰ解析としては、インベーダー法が知られている。この方法はターゲット核酸（ゲノム上での一塩基多型を持った領域）に、インベーダープローブとシグナルプローブがアニールすることにより形成される3塩基の重複構造をフラープエンドヌクレア-ゼが認識してフラップ部分を切断するか否かを指標にして、ＳＮＰの有無等を解析するものであるが、現在まで知られているフラップエンドヌクレアーゼは、いずれも基質特異性が比較的広いものであるため、ＳＮＰ以外の、例えば単なるニック（ｎｉｃｋ）等の遺伝子欠陥も検出してしまうため、信頼性において十分ではないものであった。 
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kaiser,M., Lyamicheva, N., Ma, W., Miller, C., Neri, B., Fors, L., and Lyamichev, V.,(1999)  J. Biol. Chem., 274,21387-21394
【非特許文献２】Lyamichev,V., Brow, M.A.D., Varvel, V.E., and Dahlberg, J. E., (1999) Proc. Natl.Acad. Sci., 96, 6143-6148
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変換し、遺伝子の多型解析において、従来法に比べ、より正確であり、検出効率の良い解析手段を提供することである。 
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、フラップ（Flap）エンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した、変異体を作製した。 
野生体のフラップ（Flap）エンドヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖が３’末端突出構造を有して切断されている基質、同３’末端突出構造を持たない基質あるいはニック（ｎｉｃｋ）を有する基質等に作用し、基質特異性が広いのに対して、上記変異体は、２本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖が３’末端突出構造を有して切断され、かつ切断されたＤＮＡ鎖の相補鎖部分は連なって、他方のＤＮＡ鎖に対して欠落部分がない塩基対を形成している基質に作用する。すなわち、本発明の上記変異体は３’末端突出構造を有する基質に作用し、３’末端突出構造を有しない基質は殆ど切断できないという性質を有するが、さらに、３’末端突出構造を有する基質であっても、さらに特定構造のＤＮＡ鎖のみに作用する。 
このような変異体酵素の基質特異性を利用すれば、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみを正確に蛍光検出できる新しい手段を提供できる。 
【０００７】
すなわち、本発明は以下（１）〜（６）に示すとおりである。 
（１）野生型フラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、該野生型エンドヌクレアーゼの基質のうち、２本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖が  ３’末端突出構造を有して切断され、かつ切断された各ＤＮＡ鎖は、他方のＤＮＡ鎖と相補の塩基配列部分を有し、これら相補の塩基配列部分は連らなって、他方のＤＮＡ鎖に対し欠落部分のない塩基対を形成しているＤＮＡ基質に作用し、他の基質に対しては作用しないかあるいは活性が低下していることを特徴とする、フラップエンドヌクレアーゼ変異体。
（２）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、（Ａ）３３番目のアミノ酸がアラニン又はロイシン、（Ｂ）３５番目のアミノ酸がチロシン、（Ｃ）７９番目のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン、(Ｄ）３３番目と７９番目のアミノ酸がともにアラニン、（Ｅ）３３番目と３５番目のアミノ酸がともにアラニン及び（Ｆ）２７８番目及び２７９番目のアミノ酸がともにアラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体。 
（３）上記（２）に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードするＤＮＡ。 
（４）上記（３）に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードするＤＮＡを含有する組み換えベクター。 
（５）上記（４）に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。 
（６）上記（１）または（２）に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる、遺伝子多型解析用試薬。 
【発明の効果】
【０００８】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、３’末端が突出している基質、特に第１図に示す、３’突出末端を有するニック及びダブルフラップ基質のみに作用し、これ以外の野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質は殆ど切断できないという新規な性質を有する。このような基質特異性を有する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を使用することにより、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみを正確に検出でき、しかもその検出が簡便に行えるという効果を奏する。 
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】フラップエンドヌクレアーゼの基質の構造を模式的に示した図である。
【図２】ダブルフラップ、ニック及び５’レセスエンド基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図３】シングルフラップ、シュード−Ｙ基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図４】上記６種の各基質に対する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図５】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の手法を示す模式図である。
【図６】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の他の手法を示す模式図である。
【図７】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の他の手法を示す模式図である。
【図８】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析に使用するために、必要な基質特異性について試験した結果を示す電気泳動図である。
【図９】実施例５の実験に用いた基質の構造を模式的に示した図である。
【図１０】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体（Y33AF79A,Y33AF35A)の各基質に対する活性を示す電気泳動写真である。
【図１１】実施例７において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図１２】実施例７において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す電気泳動写真である。
【図１３】実施例７において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図１４】実施例９において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図１５】実施例９において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図１６】実施例１０において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図１７】実施例１０において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図１８】実施例１１において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図１９】実施例１１において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す電気泳動写真である。
【図２０】本発明の酵素変異体を用いて、解析対象ＤＮＡにおけるＳＮＰの有無及びそのホモ、へテロを判定するための手法を示す模式図である。
【図２１】実施例１２において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図２２】実施例１２において作成した基質に対する、野生株及び本発明の酵素変異体（F79A、F79H)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図２３】実施例１２において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体（Y33A、Y33L、F35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図２４】実施例１２において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体（Y33AF79A、F278AF279A、Y33AF35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図２５】実施例１３において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図２６】実施例１３において作成した基質に本発明の酵素変異体を作用させ、得られた各切断フラップ部分の質量分析結果を示すグラフである。
【図２７】上記質量分析結果に基づく分子量と予想分子量がほぼ同一であることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変更したものである。野生型フラップエンドヌクレアーゼは、ニック（ｎｉｃｋ）、３’突出末端を有するニック（Nick with 3'projection）、５’レセス末端（５’Recess-end）、シングルフラップ（Single flap）、ダブルフラップ(Double flap）及びシュード−Ｙ（Pseudo-Y）と呼ばれる基質に作用し、さらに、合流部にギャップ（隙間）を有するダブルフラップ（Double flap with gap at junction；以下、ギャップを有するダブルフラップという。）と呼ばれる構造を有するＤＮＡ基質にも作用する。これらのＤＮＡ基質の構造は図１に示される。 
これらの基質のうち、ギャップを有するダブルフラップ（Double flap with gap at junction）基質は、２本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖が切断された３’末端突出構造を有するが、切断された各ＤＮＡ鎖は、２本鎖ＤＮＡの他方のＤＮＡ 鎖に対して相補の塩基配列部分をそれぞれ有するが、該相補の塩基配列部分を併せても、他方のＤＮＡ鎖に対して欠落する塩基があり、他方のＤＮＡと連続する塩基対が形成されていないものである。 
【００１１】
すなわち野生型フラップエンドヌクレアーゼは、基質特異性が広く、これら７種の各々構造が異なるＤＮＡ基質に作用する。また、フラップエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ作用とエキソヌクレアーゼ作用とを有し、野生型フラップエンドヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ作用により、上記７種のＤＮＡ基質のうち、ニック（ｎｉｃｋ）、３’突出末端を 有するニック（Nick with 3'projection）、及び５’レセス末端（５’Recess-end）基質における下流側ストランド（Downstream）の５’末端側を削除していく。また、エンドヌクレアーゼ作用により、シングルフラップ（Single flap）、ダブルフラップ(Double flap）、シュード−Ｙ（Pseudo-Y）基質、ギャップを有するダブルフラップ基質（Double  flap  with  gap  at  junction）有するフラップストランド（Flap Strand）の５’末端側フラップを切断するとともに、さらにエキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の５’末端側を削除する。 
【００１２】
これに対して、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、上記野生型エンドヌクレアーゼの基質のうち、３’突出末端を有するニック（Nick with 3'projection）基質とダブルフラップ(Double flap）基質のみに作用する。 
すなわち、３’突出末端を有するニック基質においては、下流側ストランド（Down Strand(C-1)）の５’末端側塩基は、上流側ストランド(Upstream Strand (B-2))のフラップ基部の塩基の直前まで伸びており、下流側ストランド（Down Strand(C-1)）と上流側ストランド(Upstream Strand(B-2）のテンプレートストランドに対する相補鎖部分は、連なって、他方のＤＮＡ鎖（Template Strand（A））に対して欠落部分のない塩基対を形成している。ダブルフラップ基質も、同様に他方のＤＮＡ鎖（Template Strand（A））に対するフラップストランド（Flap strand (C-3))及び上流側ストランド（Upstream Strand(B-2)）の相補配列部分は、連なって、他方のＤＮＡ鎖（Template Strand（A））と欠落部分のない塩基対を形成している。 
【００１３】
しかし、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体は、これら以外の上記５種のＤＮＡ基質に対しては、作用しないかあるいはその活性は極めて低い。 
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用形態自体は、野生型と異ならず、３’突出末端を有するニック（Nick with 3'projection）の下流ストランドの５’末端側を削除し、ダブルフラップ(Double flap）のフラップストランド（Flap Strand）のフラップ部分を切断するとともに、さらにエキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の５’末端側を削除する。 
【００１４】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップヌクレアーゼの基質結合部位のアミノ酸を変異させたものである。この変異体酵素を得るには、配列番号２に示す野生型フラップエンドヌクレアーゼ−１のアミノ酸配列をコードする遺伝子あるいはこれを含むプラスミドを鋳型とし、かつ変異を入れたプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行う部位特異的変異作成法により、変異体遺伝子を得て、該変異遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、この組み換えられた発現ベクターを宿主微生物に導入して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養し、培養物から目的のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を得ることができる。 
【００１５】
本発明においては、この手法により、パイロコツカス、ホリコシ（登録番号JＣＭ９９７４）の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−１の遺伝子（配列表の配列番号１）の変異体遺伝子を得、これを用いて得られた様々な酵素変異体の各基質に対する酵素活性を測定した結果、特定構造の３’突出末端を有するＤＮＡ基質のみに実質的に作用する耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を見いだしているが、これを具体的に例示すると以下のとおりである。 
【００１６】
パイロコッカス  ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−１のアミノ酸配列（配列表の配列番号２）において、 
（Ａ）３３番目のアミノ酸であるチロシンがアラニン又はロイシンに置換された変異体。
（以下、それぞれＹ３３Ａ、Ｙ３３Ｌと表示する場合がある。）  該変異体酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号４及び６に示される。 
（Ｂ）３５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異体。 
（以下、Ｆ３５Ｙと表示する場合がある。）該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８に示される。 
（Ｃ）７９番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン又はヒスチジンに置換された変異体。（以下、それぞれＦ７９Ａ、Ｆ７９Ｈと表示する場合がある。）該変異体酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１０、１２に示される。 
（Ｄ） ３３番目のアミノ酸であるチロシンおよび７９番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換された変異体（以下、Y33AF79Aと表示する場合がある。）該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に示される。 
（Ｅ）３３番目のアミノ酸であるチロシンおよび３５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換さ れた変異体（以下、Y33AF35Aと表示する場合がある。）該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５４に示される。 
（Ｆ)２７８ 番目のアミノ酸であるフェニルアラニンおよび２７９番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換された変異体。 
（以下、Ｆ２７８ＡＦ２７９Ａと表示する場合がある。）該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に示される。 
【００１７】
上記Ｙ３３Ａ、Ｙ３３Ｌ、Ｆ３５Ｙ、Ｆ７９Ａ、Ｆ７９Ｈ、Ｙ３３ＡＦ７９、Ｙ３３ＡＦ３５Ａ、Ｆ２７８ＡＦ２７９Ａの各遺伝子は、これら変異体ペプチドをコードするものであれば、特に制約はないが、これら遺伝子の塩基配列を例示すると、それぞれ順に配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、５３、１５に示す配列が挙げられる。 
以下の表１に、フラップエンドヌクレアーゼ −１（野生型）ファミリーのアミノ酸配列をアライメントして示す。 
【００１８】
【表１】
2010200755.tif 000002
表中の符号は以下のとおりである 
phFEN- 1；Pyrococcus horikoshiiのフラップエンドヌクレアーゼ−１（FEN-1） 
mjFEN- 1；Methanococcus jannaschiiのFEN-1 
spRAD2；Schizosaccharomyces pombのRAD2 
hFEN-1；ヒトの FEN-1 
T5 EXO；T5 エキソヌクレアーゼ 
T7 EXO；T7gene6エキソヌクレアーゼ 
E.coli pol.1；E.coliポリメラーゼ１における５’エキソヌクレアーゼドメイン 
Tag.pol.1；Thermus aguaticusポリメラーゼ１における５’エキソヌクレアーゼドメイン
【００１９】
これによれば、パイロコッカス  ホリコシ由来のフラップエンドヌクレアーゼ−１の基質結合ドメインにおける、変異の対象とした部位のアミノ酸はほぼ共通しており、特に、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）については、ヒトを含めて全く共通している。 
このことは、上記パイロコッカス  ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−１について施した変異を、他の生物由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−１にも施せば、同様な基質特異性変化が起こることを強く示唆する。 
【００２０】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の有する、３’突出末端を有するＤＮＡ基質のみに実質的に作用するという基質特異性は、簡便、正確でかつ全く新しい、遺伝子の多型解析手法を提供する。 
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析用試薬として用いた場合における、遺伝子多型解析手法について以下に説明する。 
【００２１】
解析手法１ 
以下に図５のＳＮＰ解析を例にとり、説明する。 
なお、図５中、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡはそれぞれ蛍光色素を示し、２本線上側の−Ａ−はＳＮＰがなく正常の場合の塩基、−Ｇ−、−Ｃ−、−Ｔ−は、多型の場合の塩基を示す。
（ａ）ＳＮＰ部位を含む試料ＤＮＡと相補の塩基配列を有し、その５’末端がＳＮＰ部位と対応する位置まで伸長し、かつ該５末端が、検体試料ＤＮＡにＳＮＰがない場合の塩基（Ａ）と塩基対を形成する塩基（Ｔ）となるようオリゴヌクレオチドを合成してプローブＡとする。また、ＳＮＰ部位を含む試料ＤＮＡと相補の塩基配列を有し、その３’末端がＳＮＰ部位と対応する位置まで伸長し、かつ該３’末端が、試料ＤＮＡにＳＮＰがない場合の塩基（Ａ）及び該塩基と塩基対を形成する塩基（Ｔ）以外の塩基（Ｃ、Ｇ）となるようにオリゴヌクレオチドを合成してプローブＢとし、プローブＡの５’末端およびプローブＢの３’末端を、近接するとＦＲＥＴ効果を生じて、蛍光が発生しないかあるいは少なくとも発光強度が低下する色素でそれぞれ標識する。
ＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素の組み合わせとしては、ＴＡＭＲＡとＦＡＭ、ＢＨＱ−１とＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭ等がある。例えば、プローブＡの５’末端の標識にＦＡＮを用いた場合、プローブＢの３’末端の標識はＴＡＭＲＡを用いればよい。 
（ｂ）次いで試料ＤＮＡに上記プローブＡ及びプローブＢをアニールさせる。このアニールした場合の２本鎖ＤＮＡの構造は、ＳＮＰがある場合とない場合とでは異なる。
【００２２】
〔ＳＮＰがある場合〕 
３’末端をＣとしたプローブＢを使用したとき、試料ＤＮＡのＳＮＰ部位に多型がある場合、すなわち試料ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基はＧ、ＣまたはＴのいずれかである。 
１）このうちＧの場合には、プローブＢの３’末端の塩基（Ｃ）と相補の関係にあり塩基対を形成するので、３’末端突出構造を形成しない（図５（１）中（Ａ））。
２）Ｃの場合には、プローブＡの５’末端の塩基（Ｔ）及びプローブＢの３’末端の塩基（Ｃ）は、試料ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基（Ｇ）といずれも塩基対を形成せず、プローブＡの５’末端の塩基（Ｔ）及びプローブＢの３’末端の塩基（Ｃ）はいずれも突出構造をとり、プローブＡとプローブＢとにおける、試料ＤＮＡに対する相補の塩基配列部分は、試料ＤＮＡに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じる（図５（１）中（Ｂ））  。 
３）Ｔの場合は、上記２）と同様に、プローブＡの５’末端の塩基（Ｔ）及びプローブＢの３’末端の塩基（Ｃ）は、試料ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基（Ｔ）といずれも塩基対を形成せず、プローブＡの５’末端の塩基（Ｔ）及びプローブＢの３’末端の塩基（Ｃ）はいずれも突出構造をとり、プローブＡとプローブＢとにおける、試料ＤＮＡに対する相補の塩基配列部分は、試料ＤＮＡに対して連続した塩基対を形成しない（図５（１）中（Ｂ’）。 
一方、３’末端塩基を（Ｇ）としたプローブＢを使用したときも、同様で、試料ＤＮＡのＳＮＰ部位に多型がある場合には必ず、図５（１）の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｂ’）のいずれかの構造となる。 
【００２３】
〔ＳＮＰがない場合〕 
これに対して、試料ＤＮＡのＳＮＰ部位に多型がない場合、すなわち試料ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基が（Ａ）である場合は、プローブＡの５’末端はＴであるから塩基対を形成するとともに、プローブＢの３’末端は（Ｃ）または（Ｇ）であるから、試料ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基（Ａ）とは塩基対を形成せず、突出末端となる。すなわち、このときの構造は図１に示される３’突出末端を有するニック構造となり、プローブＡの５’末端と、プローブＢのフラップ部分を除く試料ＤＮＡに対する相補の塩基配列部分は、試料ＤＮＡとともに欠落部分のない連続した塩基対を形成する（図５（１）（Ｃ））。 
【００２４】
（ｃ）次いで、上記プローブＡとＢが試料ＤＮＡとアニールした状態で、本発明の遺伝子多型解析用試薬である、フラップエンドヌクレアーゼ変異体を作用させる。 
試料ＤＮＡにＳＮＰがある場合には、該フラップ エンドヌクレアーゼ変異体は、上記図５（１）の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｂ’）に示される構造のＤＮＡ基質にはいずれも作用しないので、プローブＡの蛍光色素ＴＡＭＲＡとプローブＢの蛍光色素ＦＡＭとは近接位置にあり、ＦＲＥＴ効果により、蛍光は発生しない。 
これに対して、ＳＮＰがない場合には、３’突出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブＡの５末端が切断され、蛍光色素ＴＡＭＲＡが上記ＦＡＭとの近接位置から外れることにより蛍光を生じる。 
したがって、蛍光の有無を検出することによりＳＮＰの有無を判定できる。 
【００２５】
解析手法２ 
解析手法２は、図５（２）に示される。 
なお、この手法は、プローブＡの３’末端及び５’末端をそれぞれ近接によりＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡとＦＡＭ等の組み合わせ）により標識し、また、プローブＢには蛍光標識しない他は、解析手法１と同様である。なお、この場合においてはプローブＡの分子長は、その両端の蛍光色素が近接して、ＦＲＥＴ効果により蛍光強度が低下するように、設計する（例えば、２０ｍｅｒ以下）。 
ＳＮＰがある場合においては、解析手法１と同様に、プローブＢは３’末端突出構造を形成しないか（図５（２）（Ａ））、あるいはプローブＡとプローブＢとにおける、試料ＤＮＡに対する相補の塩基配列部分は、試料ＤＮＡに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じるので（図５（２）中（Ｂ）、（Ｂ’））、試料ＤＮＡにＳＮＰがある場合には、使用したフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、いずれも作用しないので、ＦＲＥＴ効果により、蛍光は強度は低いものとなる。それに対して、ＳＮＰがない場合には、３’突出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブＡの５末端が切断され（図５（２）（Ｃ））、蛍光色
素ＴＡＭＲＡが上記ＦＡＭとの近接位置から外れることにより蛍光強度が増大し、蛍光強度を観察することにより、ＳＮＰの有無を判定できる。 
この蛍 光標識手法によれば、プローブＡの両端にそれぞれ異なる蛍光標識を行い、プローブＢの３’末端に蛍光標識しないので、遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で、３’突出末端を有するニックあるいはダブルフラップを形成した場合、酵素活性が低下せずフラップストランドを切断できるので、感度よく解析することが可能となる。 
遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で３’突出末端を形成した場合、酵素活性が低下せず、感度よく解析することが可能となる。 
【００２６】
解析手法３ 
図５中（３）で示される方法はＳＮＰの塩基を決定する方法である。 
この方法は、プローブＡの５’末端をそれぞれ、例えばＣ、Ｇ、Ａとした３種類のプローブＡ  を用いるもので、該５’末端を標識する蛍光色素を各々異ならせるとともに、該蛍光色素として、プローブＢの３末端を標識した蛍光色素とＦＲＥＴ効果により消光する色素を用いる。  しかし、その他の手法は上記解析手法１と同様である。 
このような３種類のプロープＡを用いた場合、その５’末端の塩基が、試料ＤＮＡのＳＮＰの塩基と相補の場合のみ、３’突出末端を有するニック構造となるから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼを作用させた場合に５’末端は切断され、蛍光を発生する。蛍光波長の種類から、どのプローブＡ由来のものかが分かり、その５’末端塩基からＳＮＰの塩基の種類を特定できる。 
【００２７】
解析手法４ 
図６の方法は、ＳＮＰの塩基がすでに明らかとなっている場合に、簡便に検出する方法である。例えば、ＳＮＰの塩基が（Ａ）であり、ＳＮＰのない場合の塩基が（Ｇ）である場合には、プロ-ブAの5’末端を（A）の相補塩基の（T）とするとともに、その３’末端と５’末端を、例えばＴＡＭＲＡとＦＡＭで標識する。このプローブＡの長さは、上記解析手法１と同様に２０ｍｅｒ以下にすることが好ましい。また、プローブの３’末端塩基はＳＮＰのない場合の塩基 （Ｇ）と相補の塩基（Ｃ）にする。 
試料ＤＮＡにＳＮＰがある場合には、試料ＤＮＡとプローブＡ及びＢをアニールさせたとき、３’末端突出ニック構造を形成するから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼを作用させると、プローブＡの５’末端が切断され、５’末端に標識された蛍光色素（ＦＡＭ）が蛍光を発生する。一方、ＳＮＰがない場合はプローブＢの３末端の塩基（Ｃ）は試料ＤＮＡのＳＮＰのないときの塩基（Ｇ）と塩基対を形成し、３’末端突出構造を有しない（５’シングルフラップ構造）ので切断できない。したがって、プローブＡの両末端に標識された上記蛍光色素は、ＦＲＥＴ効果により消光されている。 
したがって、ＳＮＰの塩基がすでに明らかであれば、上記のように各プローブを構成すれば、一回の試験で、簡便にＳＮＰを解析できる。 
【００２８】
解析手法５ 
図７に示す方法は、ゲノムに存在するSNPを多数同時に解析する方法である。 
例えば、ゲノム上のA, B, Cの位置にSNPが存在する場合、図７Bに示したように、プローブA、Bを作成する。プローブAにはSNPのGに相補するCを接合部に入れる。プロ-ブB の3’末端は、SNP無しの場合の塩基（T）と相補する塩基（A）にする。これらプローブを試料のゲノムＤＮＡとアニールさせた場合、SNPが有る場合は、ダブルフラップ（double flap）構造ができ、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体により、接合部より1塩基中に入った所、１箇所で切断される。一方、SNPが無い場合は、シングルフラップ（singleflap）構造ができ、切断されない。 
この解析手法に用いるプローブＡは、検出する ＳＮＰの部位毎に、５’末端フラップの長さが変わるよう合成し、その５’末端にはビオチンを結合させる。例えば、図７に示される様に、ＳＮＰの部位、A、Ｂ、C毎に順に５’突出末端の長さを2-3塩基ずつ長くなるようにする。このことにより、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体による、５’末端フラップの切断により、長さの異なったDNAフラグメントが得られる。5’末端にビオチンがついているため、アビジンカラムで精製することができ、精製されたDNAフラグメントの分子量は質量分析機（ＭＳ）により検出される。SNPの箇所により、得られるDNAフラグメントの長さが異なるために、検出される分子量により、SNPの箇所が特定できる。MALDI-TOFMSを使用すれば、384検体を解析でき、1検体で、10箇所以上のSNPを同時に解析できる。 
【００２９】
上記手法においては、ＤＮＡフラグメントの精製 のためプローブＡの５’末端にビオチンを結合させるが、ZipTip等のＤＮＡ精製手段を用いれば、ビオチンを用いることなく、ＤＮＡフラグメントを精製でき、以後、上記と同様にして該フラグメントの分子量を測定できる。 
また、ＤＮＡを構成する塩基はその分子量がそれぞれ異なるため、５’末端フラップが同じ長さであっても、該フラップを構成する塩基の組み合わせを変えることにより、フラップ鎖の分子量を変えることができ、切断されたＤＮＡフラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップを特定できる。すなわち、図７Ｃに示されるように、例えば、５’フラップ鎖の長さを同じ１４ｍｅｒにしても、その構成塩基の差異により、一方のフラグメントの分子量は４８６５であり、他方は４９４０とすることが可能であり、両者は識別可能である。したがって、５’フラップ鎖の構成塩基をデザインし、切断ＤＮＡフラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップの特定を行い、これに対応するＳＮＰの位置が明らかになる。 
さらに、フラップ鎖が長くなると、フラップエンドヌクレアーゼ変異体により切断しにくくなるが、塩基の組み合わせと塩基の長さを変えることにより、フラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用の良好なフラップ鎖長さの範囲内において、極めて多種の分子量の異なったフラップ鎖を作成することが可能になる。 
【００３０】
解析手法６ 
遺伝子多型においては、ゲノム遺伝子と対立遺伝 子の間でSNPが同じ場合（ホモ）と異なる場合がある（ヘテロ）、本発明によれば、SNP塩基がすでに明らかな場合において、解析対象遺伝子試料のSNPの有無に加えて、該SNPがホモなのかあるいはヘテロなのかも簡単に見分けることができる。 
この手法を図２０に基づき以下に説明する。例えば、SNPがなく正常な塩基がAで、SNPがGである場合、５’末端の塩基をTとしたプローブＡ（Ｔ）と、ＣとしたプローブＡ（Ｃ）とをそれぞれ合成し、その両末端を異なる蛍光色素で標識する。このとき５’末端の蛍光色素を、例えば、プローブＡ（Ｔ）においてはＦＡＭとし、プローブＡ（Ｃ）ではＴＥＴとするように各々異なるようにする。 
この後、解析対象のＤＮＡに対し、プローブＡ（Ｔ）およびプローブＡ（Ｃ）とプローブＢとをアニーリングし、本発明の酵素変異体を作用させると、ＳＮＰがない場合（Ａの場合）には、プローブＡ（Ｔ）のみが３’突出Ｎｉｃｋ構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、蛍光色素ＦＡＭに由来する蛍光が検出される。 
ＳＮＰがホモ（ともにＧ）の場合、プローブＡ（Ｃ）のみが、３’突出Ｎｉｃｋ構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、蛍光色素ＴＥＴに由来する蛍光が検出される。
一方、ヘテロの場合（ＡとＧ）には、プローブ Ａ（Ｔ）とプローブＡ（Ｃ）は、ともに３’突出ｎｉｃｋ構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、ＴＥＴとＦＡＭ由来の波長の異なる２つの蛍光が検出される。 
なお、これ以外は、ギャップを有するダブルフラップ構造かあるいは３’突出構造を有しないシングルフラップ構造を形成するため。本発明の酵素により切断されない。 
したがって、５’末端塩基が異なる２種のプローブＡを使用し、本発明の酵素変異体を作用させて発生する蛍光波長を検出することによりＳＮＰの有無及びホモ、ヘテロの判定を同時に行うことができる。 
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。 
【実施例】
【００３１】
〔実施例１〕 
変異体の作製 
変異体Y33Aの遺伝子の作成は、以下のように行った。 
以下に示す、共通プライマー及び変異の入ったプライマー（Ｙ３３Ａ作成用プライマー）を合成し、パイロコッカス・ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−１（FEN-1）の遺伝子（配列番号１）を含むPET11aプラスミドを鋳型として、初めに、制限酵素サイト（Nde1）の入ったFEN-Uプライマーと変異の入ったY33A-Rプライマー、それと制限酵素サイト（Xho1）の入ったFEN-Rプライマーと変異の入ったY33A-UでPCR（96度で5分加熱後に、DNA polymeraseを入れた。その後に96度１分、55度２分、70度２分の1サイクルを25回行った。）を行い、変異の入った、２つの断片を作成し、次に、これらの断片を鋳型にし、FEN-UプライマーとFEN-RプライマーでPCR（上記と同様の条件）を行い、変異を導入し、同時に遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。 
フラップエンドヌクレアーゼ変異体Y33Aの構造遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示す。 
他のフラップエンドヌクレアーゼ変異体Y33L、F35Y、F79A、 F79H、Y33AF79A、F278AF279A及びY33AF35Aの各遺伝子も上記と同様に作成した。これら構造遺伝子の塩基配列は、それぞれ順に 配列表の配列番号５、７、９、１１、１３、１５、５３に示される。 
【００３２】
共通に使用するプライマー； 
FEN-U 
5’-GGGAATTCCTGCAGATCGCATATGGGTGTTCCTATCGGTGAC-3’（配列 番号１７） 
FEN-R 
5’-ACGCGTCGACGTCCGCTCGAGCGGTTAGGGTTTCTTTTTAACGAACCAAC-
3’（配列番号１８） 
Ｙ３３Ａ作成用プライマー； 
Y33A-U 
5’-ATAGATGCCCTAAACGCCATCGCGCAGTTTTTATCAACGATACGACAG-
3’（配列番号１９） 
Y33A-R 
5’-CTGTCGTATCGTTGATAAAAACTGCGCGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-
3’（配列番号２０） 
Ｙ３３Ｌ作成用プライマー； 
Y33L-U 
5’-ATAGATGCCCTAAACGCCATCCTGCAGTTTTTATCAACGATACGACAG-
3’（配列番号２１） 
Y33L-R 
5’-
CTGTCGTATCGTTGATAAAAACTGCAGGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-3’（配列番号２２） 
Ｆ３５Ｙ作成用プライマー； 
F35Y-U 
5’-GCCCTAAACGCCATCTATCAGTATTTATCAACGATACGACAGCGTGAT-
3’（配列番号２３） 
F35Y-R 
5’-ATCACGCTGTCGTATCGTTGATAAATACTGATAGATGGCGTTTAGGGC-
3’（配列番号２４） 
Ｆ７９Ａ作成用プライマー； 
F79A-U 
5’-GGTATTAAGCCGGCCTACGTCGCGGATGGAAAGCCTCCGGAATTTAAA-
3’（配列番号２５） 
F79A-R 
5’-TTTAAATTCCGGAGGCTTTCCATCCGCGACGTAGGCCGGCTTAATACC-
3’（配列番号２６） 
Ｆ７９Ｈ作成用プライマー； 
F79H-U 
5’-
GGTATTAAGCCGGCCTACGTCCATGATGGAAAGCCTCCGGAATTTAAA-3’（配列番号２７） 
F79H-R 
5’-
TTTAAATTCCGGAGGCTTTCCATCATGGACGTAGGCCGGCTTAATACC-3’（配列番号２８） 
Ｆ２７８ＡＦ２７９Ａ作成用プライマー； 
F278AF279A-U 
5’-CTTTACGCTATTAAGGAAGCGGCGCTTAACCCTCCTGTCACTAATGAA-
3’（配列番号２９） 
F278AF279A-R 
5’-TTCATTAGTGACAGGAGGGTTAAGCGCCGCTTCCTTAATAGCGTAAAG-
3’（配列番号３０） 
Ｙ３３ＡＦ３５Ａ作成用プライマー； 
Y33AF35A-U 
5'-ATAGATGCCCTAAACGCCATCGCGCAGGCGTTATCAACGATAAGACAGAGG-3'（配列番号３９） 
Y33AF35A-R 
5'-CCTCTGTCTTATCGTTGATAACGCCTGCGCGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-3'（配列番号４０） 
また、Y33AF79A遺伝子については、上記Y33Aの遺伝子（配列番号３）を含有するプラスミドを精製し、これを鋳型にしてF79Aのプライマー（配列番号２５，２６）を用いて作成した（配列番号１３）。 
【００３３】
次いで、ＰETlla(Novagen社製）を制限酵素ＮdeIとＸhoIで切断・精製した後、上記の 各変異遺伝子とＴ４リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部をＥ．colｉ−ＸＬｌ−ＢlueＭＲＦのコンピトセルに導入し各形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをアルカリ法で精製し各発現プラスミドを得た。 
【００３４】
〔実施例２〕 
組換え遺伝子の発現 
大腸菌（Ｅ．coliＢＬ21(DE3)，Novagen社製）のコンピテントセルを融解して、二本のフアルコンチューブに各々0.1mlづつ移し、その中に上記の各発現プラスミド溶液0.005ｍｌを別々に加え氷中に３０分間放置した後４２度でヒートショックを３０秒間行い、ＳＯＣmedium0.9ｍｌを加え、３７度で１時間振とう培養したる。 
その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、３７度で一晩培養し、各形質転換体を得た。 
当該各形質転換体をアンピシリンを含む２ＹＴ培 地（２リットル）で６６０ｎｍの吸収が０.４  に達するまで３７℃で培養した後、IPTG(Isopropy-b-D-thiogalactopyranoside)を１ｍＭになるように加え、３０℃で４時間培養した。培養後遠心分離（6,000ｒｐｍ，２０min）で集菌した。 
【００３５】
〔実施例３〕 
変異酵素の精製 
それぞれ集菌した菌体を−２０度で凍結融解し、菌体の２倍の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を加え懸濁液を得た。得られた各懸濁液について85度で30分加熱後遠心分離（11,000rpm，20min）し、HiTrapSP（フアルマシア社製）カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行い活性 画分を得、Ｙ３３Ａ、Ｙ３３Ｌ、Ｆ３５Ｙ、Ｆ７９Ａ、Ｆ７９Ｈ、Ｆ２７８ＡＦ２７９Ａ、Ｙ３３ＡＦ３５Ａ、及びＹ３３ＡＦ７９Ａの精製酵素溶液とした。 
【００３６】
〔実施例４〕 
酵素反応条件 
（１）合成オリゴヌクレオチド 
以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。なお、全てのオリゴヌクレオチドは北海道システムサイエンス社により合成された。 
Template Strand(A);54-mer,
5’- GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号３１） 
Downstream  Strand(C-1)；28mer，5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'; 
（配列番号３５） 
Upstream  Strand(B-1)；26-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';（配列番号３２） 
Upstream  Strand(B-2)；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号３３） 
Flap  Strand(C-2)；32mer, 5'-
TAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' 
（配列番号３６） 
Flap  Strand(C-3);57-mer,5'-GCATCTGACGGATGTCAAGCAGTCCTAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC- 3'（配列番号３７） 
このうちDownstream  Strand(C-1), Flap
Strand(C-2), Flap Strand(C-3)のオリゴヌクレオタイドは5’末端が蛍光ラベル（ＦＡＭ）された。 
【００３７】
（２）基質の調整 
上記オリゴヌクレオチドを〔(A)+(C-1)+(B-1)、(A)+(C-1)+(B-2)、(A)+(C-1)、(A)+(C-2)+(B- 1)、(A)+(C-3)+(B-2)及び(A)+(C-2)〕のように組み合わせて、それぞれ１５０ｍＭNaClを含む、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ph7.4）の中で煮沸し、溶液の温度を徐々に４度までさげることのよりアニーリングさせ、各々の基質を作製した。基質の名称と構造を図１に示す。 
【００３８】
（３）flap エンドヌクレアーゼ活性 
１０マイクロリットルの50ｍMトリス塩酸緩衝液（ｐH8.0、15mM  MgC12、100mg/ml，牛血清アルブミン）に２pmolesの蛍光ラベル（ＦＡＭ）された各基質に酵素変異体Ｙ33Ａ，Ｙ33Ｌ，Ｆ35Ｙ，Ｆ79Ａ，Ｆ79Ｌ，Ｆ79Ｈ，Ｆ278ＡＦ279Ａをそれぞれ加え、60度で１分から１０分まで反応させ、１分間隔で活性を測定した。次ぎに、１０マイクロリットルの95％ホルムアミド、２０mM  EDTA，１mg/mlキシレンシアノールを加え酵素反応を停止させた。これを100℃加温、氷中急冷後、７Ｍ尿素を含む15％polyacryylamide gel電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad社製）でオートラジオグラフイー化し、反応物の分子種と量を測定した。Kinetics解析を行ない、ＫｍとＫcatを算出した。 
（４）変異体の基質特異性 
上記各変異体の基質特異性の変化を他の変異体及び野生型酵素（ＷＴ）とともに図２、３、４に示す。変異体Ｙ33Ａ，Ｙ33Ｌ，Ｆ35Ｙ，Ｆ79Ａ，Ｆ79Ｌ，Ｆ79Ｈ，Ｆ278ＡＦ279Ａ は、Nick,Recess-end,Sing1e  flap,Pseudo-Y基質に対して、活性が著しく減少した。しかし、Double
flap,Nick  with3’Projection基質に対しては、ＷＴと比べて活性は殆ど変化がなかった。 
５’末端の蛍光ラベルの基質は、野生型フラップエンドヌクレアーゼおよび該変異体のいずれもが切断した。 
【００３９】
〔実施例５〕 
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。このうちりＣ−１及びＣ−４の５’末端は蛍光ラベル（ＦＡＭ）されている。次いでこれらオリゴヌクレオチドを、実施例４と同様にアニーリングし図９に示す構造の基質を作成した。 
Template  Strand (A); 54-mer,
5’-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-3 
（配列番号３１） 
Upstream  Strand (B-3),
26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’（配列番号３４） 
Downstream  Strand(C-1)；28mer，5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'; 
（配列番号３５） 
Downstream  Strand (C-4);
29mer, 5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3’（配列番号３８） 
なお、基質の構造は、5’が1mer突出のsingle flap 構造（図9Ａ）、nick領域に1 mer gapの入ったdouble flap 構造（図9Ｂ）、及びnick with 3’projection 構造（図9Ｃ）の３種である。 
【００４０】
ついで、10 マイクロリットルの50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,
100mg/ml 牛血清アルブミン）に、2pmolesの蛍光ラベル（ＦＡＭ）された各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体F79A, Y33A, F278AF279Aを0.1ngと1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide  gel  電気泳動（PAGE）で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。 
結果を図８に示す。これによれば、基質Ｃに対しては、野生型酵素及び本発明の変異体酵素はともに活性を示すが、基質Ａ、Ｂに対しては野生型酵素が活性を示すのに対し、本発明の変異体酵素は、いずれも活性を示さない。この様な基質特異性は本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体が、上記多型解析手法に用いる試薬として、十分な性能を有することを示す。 
【００４１】
〔実施例６〕 
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,  100mg/ml 牛血清アルブミン）に、実施例４、５において作製された、2pmolesの蛍光ラベル（ＦＡＭ）された合計７種の基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型０.１ngと1ng, 変異体Y33AF35A, Y33AF79A 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide  gel  電気泳動（PAGE）で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。結果を図１０に示す。 
これによれば、野生型酵素は、上記７種の総ての基質に対して、活性を示すが、変異体Y33AF35A, Y33AF79Aは、3'が突出しているF（Nick with3’Projection構造）とG（Double flap構造）のみ活性を示す。しかし、3'が突出 しているが、1mer gapがあるC（ギャップを有するダブルフラップ構造）に対しては活性を示さない。 
【００４２】
〔実施例７〕 
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。 
Template Strand (A); 54mer, 
5'-
GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-3’（配列番号３１） 
Upstream
Strand(B-1)；26-mer,
5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';（配列番号３２） 
Upstream
Strand(B-2)；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号３３） 
Upstream
Strand (B-3), 26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’（配列番号３４） 
Downstream
Strand(C-1-1)；20mer，5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' （配列番号４１） 
Flap Strand
(C-4-1); 20mer, 5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGAC-3'（配列番号４２） 
このうちC-4-１、C-1-1については、5'末端にFAM,3'末端にTAMRAをラベルし、実施例４と同様にアニーリングし図１１に示す構造の基質を作成した。 
【００４３】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml  牛血清アルブミン）に、1pmolesの蛍光ラベルされた上記基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide  gel  電気泳動（PAGE）で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。 
結果を図１２に示す。これによれば、野生型酵素は、図中（Ａ）〜（Ｃ）の総ての基質に対して、活性を示すが、変異体酵素は、3'末端が突出している（C）のみ活性を示す。3'が突出しているが、1mer gapがある（B）、及び（A）に対しては活性を示さないか、又は非常に弱い活性を示す。 
【００４４】
〔実施例 ８〕 
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml  牛血清アルブミン）に、実施例７で作成した、10pmolesの蛍光ラベルされた基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型と変異体 10ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止める。励起光494nm, 蛍光520nmで、フィルタ-500nmを使用して、分光蛍光光度計、FP-７５０（日本分光）で蛍光強度を測定した。 
結果を図１３に示す。なお、図１３の各棒グラフの値は、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引いた値である。 
この結果によれば、野生型酵素は、上記Ａ〜Ｃの総ての基質に対して、活性を示すが、変異体酵素は3'末端が突出している基質Cのみ活性を示す。又3'末端が突出しているが、1mer gapがある基質Bに対しては活性を示さない。 
【００４５】
〔実施例９〕 
以下のオリゴヌクレオチドを合成し、 
Template Strand (A); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号３１） 
Upstream  Strand(B-1)；26-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';（配列番号３２） 
Upstream  Strand(B-2)；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号３３） 
Upstream  Strand (B-3),
26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’（配列番号３４） 
Downstream  Strand(C-1)；28mer，5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'; 
（配列番号３５） 
Flap  Strand(C-4); 29mer,
5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3’（配列番号３８） 
B-１、B-２、B-３の3'末端をTAMRAでラベルし、C-1、C-4の5'末端はFAMでラベルした。次に、これらオリゴヌクレオチドを実施例４と同様にアニーリングし図１４に示す構造の基質を作成した。 
【００４６】
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml  牛血清アルブミン）に、10pmolesの蛍光ラベルされた上記各基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生体50ngと変異体を400ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。 次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止める。励起光494nm,蛍光520nmで、フィルタ-500nmを使用して、分光蛍光光度計、FP-７５０（日本分光）で蛍光強度を測定する。酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引く。これを各サンプルの値とする。 
結果を図１５に示す。 
upstream Strand  B-1, B-2, B-3 の３’末端にTAMRAが結合していると、野生型酵素、変異体酵素共に、３’末端に蛍光ラベルがないものに比べ活性が低くなる。しかし、酵素量を増加する （５０ｎｇ）と、活性が検出された。野生型酵素は、基質A, B, C に高い活性を示したが、変異体酵素は、基質Aのみ高い活性を示した。したがって、このような蛍光標識手法によっても、多型解析が可能である。 
【００４７】
〔実施例１０〕 
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下３種のオリゴヌクレオチドを合成した。 
これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、この位置にＳＮＰがあると想定している。 
Template Strand (G); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号４３） 
Template Strand
(C); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGCCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号４４） 
Template Strand (T); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGTCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号４５） 
【００４８】
一方、プローブＡとして以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、また各々標識する蛍光色素が異なる。 
プロ-ブA(C); 28mer 5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'
（配列番号４６） 
5末端に蛍光（ＴＥＴ）がラベルされている。 
プロ-ブA(G); 28mer 5'-GCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'  （配列番号４７） 
5末端に蛍光（ＨＥＸ）がラベルされている。 
プロ-ブA(A); 28mer  5'-ACTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'  （配列番号４８） 
5末端に蛍光（ＦＡＭ）がラベルされている。 
また、プローブＢとして以下のＤＮＡを合成し、その3'末端にクエンチャ-（BHQ-1）をラベルした。 
プロ- ブB(upstrem strand b-2)；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号３３） 
以上のオリゴヌクレオチドを実施例４の方法と同様にアニーリングし、以下の基質１〜９を作成した。 
このアニーリングにより形成される各基質の構造は図１６の（１）〜（９）に示される。 
【００４９】
基質１   Template Strand (G)+プロ-ブA（C）+プロ-ブB               
基質２  Template Strand (G)+プロ-ブA（G）+プロ-ブB 
基質３  Template Strand (G)+プロ-ブA（Ａ）+プロ-ブB 
基質４  Template Strand (C)+プロ-ブA（C）+プロ-ブB 
基質５  Template Strand (C)+プロ-ブA（Ｇ）+プロ-ブB 
基質６  Template Strand (C)+プロ-ブA（Ａ）+プロ-ブB 
基質７  Template Strand (T)+プロ-ブA（C）+プロ-ブB 
基質８  Template Strand (T)+プロ-ブA（Ｇ）+プロ-ブB 
基質９  Template Strand (T)+プロ-ブA（Ａ）+プロ-ブB 
【００５０】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン）に、40pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体170ngと変異体 400ngをそれぞれ加え、60度で10分反応させた。次に、50mMトリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止めた。蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なる。また、フィルタ-の種類も異なる。 
ＴＥＴ    励起波長    510nm  
蛍光波長    540nm   フィルタ-    520nm 
ＨＥＸ    励起波長    520nm  
蛍光波長    550nm   フィルタ-    540nm 
FAM    励起波長     494nm   蛍光波長    525nm   フィルタ-    500nm 
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭの励起波長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、FP-７５０（日本分光）により蛍光強度を測定した。また、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。 
【００５１】
結果を図1７に示す。 
これによると、野生型は全ての基質に対して活性を示したが、本発明の全ての酵素変異体は、基質1、５、９に対して高い活性を示した。このことは、各Template Strand に対しては、それぞれプロ-ブA（C）、プローブＡ（Ａ）及びプローブＡ（Ｇ）のみが塩基対を形成し、３’突出のNickを形成したことを意味する（図１６）。  したがって例えば、プローブＡ（Ｃ）に由来するＴＥＴの蛍光が検出された場合には、Template StrandのＳＮＰ部位として想定した部位の塩基がＧであることが分かり、本発明の酵素変異体を使用して生ずる蛍光の種類によりＳＮＰの塩基を特定することができる。 
【００５２】
〔実施例１１〕 
以下の実験例は、ＳＮＰの塩基がすでに明らかになっている場合において、解析対象の遺伝子に当該ＳＮＰがある化否か判定するために、本発明の酵素変異体を使用した例である。 
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。 
これらの塩基配列中、下線部のＧは正常な塩基であり、ＡはＳＮＰであると想定している。 
Template Strand (A); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号３１） 
Template Strand (G); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号４３） 
一方、プローブＡとして、ＳＮＰに対応する５’末端がＴである以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドの５’末端にFAM, ３’末端にＴＡＭＲＡをそれぞれラベルした。 
プロ-ブA(T); 20mer，5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3'  （配列番号４９） 
また、プローブＢとして以下のオリゴヌクレオチドを使用した。 
プロ-ブ B  ；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号
３３） 
以上の オリゴヌクレオチドを実施例４の方法と同様にアニーリングした。これにより、図１８に示される２種の構造の基質が形成される（ただし、蛍光色素は図示せず。） 
【００５３】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン）に、1pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体は 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide
gel電気泳動（PAGE）で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad
社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。 
結果を図１９に示す。 
これによれば、野生型酵素は、基質Ａ、Ｂに対して、活性を示すが、本発明の変異体酵素は、いずれも基質Ａのみに活性を示し、基質Bに対して、活性を示さないか叉は極めて弱い活性を示す。すなわち、ＳＮＰの塩基が明らかである場合においては、この塩基と塩基対を形成する塩基を５’末端に 有するプローブＡを使用すれば、３’突 出のNickを形成し、本発明の酵素変異体により、プローブＡの５’末端側は切断され、該末端に結合したＦＡＮ由来の蛍光を生ずる。これに対して、SNPがない場合にはプローブAは切断されず、蛍光を発生しない。したがって、蛍光の有無によりSNPの有無を判定できる（図６参照）。 
【００５４】
〔実施例１２〕 
以下の実験例は、ＳＮＰの塩基がすでに明らかになっている場合において、解析対象の遺伝子のＳＮＰの有無及び該ＳＮＰがホモかヘテロかを判定するために、本発明
の酵素変異体を使用した例である。 
解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。なお、下線部の塩基はＡが正常で、ＧがＳＮＰである。 
Template Strand (A); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号３１） 
Template Strand (G); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号４３） 
プローブＡとして以下のオリゴヌクレオチドを合成、プローブＡ（Ｔ）の５’末端に ＦＡＭ，３’末端にＢＨＱ-1を標識し、また、プローブＡ（Ｃ）の５’末端にTET、３’末端にBHQ-1を標識 した。 
プロ-ブA(T); 20mer，5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-
3'（配列番号４９） 
プロ-ブA(C); 20mer ，5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3'  （配列番号５０） 
プロ-ブ B(upstream strand B-2)；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号３３） 
【００５５】
以上のオリゴヌクレオチドを実施例４の方法と同様にアニーリングし、以下の基質１〜６を作成した。 
基質１Template Strand(A)+プロ-ブ Ａ（Ｔ）+プロ-ブB 
基質２Template Strand(A)+プロ-ブＡ（C）+プロ-ブB 
基質３Template Strand(G)+プロ-ブ Ａ（Ｔ）+プロ-ブB 
基質４Template Strand(G)+プロ-ブＡ（C）+プロ-ブB 
基質５Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブＡ（Ｔ）+プロ-ブB 
基質６Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブＡ（C）+プロ-ブB 
基質１〜６の構造を図２１に示す。 
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン）に、10pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体は10ngをそれぞれ加え、60度で10分反応させた。次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止めた。 
以下のように、蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なり、フィルタ-の種類も異なる。 
ＴＥＴ    励起波長    510nm  
蛍光波長    540nm   フィルタ-    520nm 
FAM    励起波長     494nm   蛍光波長    525nm   フィルタ-    500nm 
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭの励起波長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、FP-７５０（日本分光）により蛍光強度を測定することにより行った。また、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。 
【００５６】
結果を図２２、２３、２４に示す。 
本発明の変異体酵素を使用した場合、Template Strand(A)の場合はFAMが検出され、基質1に対し高い活性を示した。Template Strand（G)の場合はＴＥＴが検出され、基質4に高い活性を示した。Template Strand（Ａ）と（G)の場合は，FAMとＴＥＴが検出され、基質５、６に高い活性を示した。基質１、２は、解析対象遺伝子にＳＮＰがない場合、基質 ３、４は、ＳＮＰがＧでホモの場合、及び基質５、６はＳＮＰがＡとＧヘテロの場合にそれぞれ比定される。これらの場合において、各々異なる蛍光が検出できたことは、本発明の多型解析手法が、ＳＮＰの有無のみならずホモ、ヘテロの判定にも有効であることをします。
これに対して、野生型酵素の場合は、各基質に対して検出されるFAMとTETの蛍光強度の差が明らかでなかった。 
【００５７】
〔実施例 １３〕 
以下の実験例は、ゲノムに存在する複数のSNPを多数同時に解析する場合において、（解析手法５）において、検出されたＳＮＰの位置を、切断される５’フラップ鎖の長さ変えずに、その塩基を変えることにより識別できることを検証するものである。 
以下のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。 Ｆｒａｐ Ｓｔｒａｎｄ（Ｃ−５）及び（Ｃ−６）は、ともに１４ｍｅｒで長さは同じにしたが、フラップ部分の塩基は異なる（Ｃ−５；CCCAAAAAAAAAAA、Ｃ−６；AAAAAAAAAAAAAA） 
Template Strand (A); 54mer, 
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’（配列番号３１） 
Upstream
Strand(B-2)；27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'（配列番号３３） 
Flap Strand (C-5)
43mer; 5'-CCCAAAAAAAAAAATCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'（配列番号５１） 
Flap Strand (C-6) 43mer; 
5'-AAAAAAAAAAAAAATCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'  （配列番号５２） 
【００５８】
以上のオリゴヌクレオチドを実施例４と同様にアニーリングし、以下の基質ＡとＢを形成した。基質ＡとＢの構造は、図２５に示される。 
基質Ａ  Template Strand (A)+ Flap Strand (C-5)+ Upstream Strand(B-2) 
基質Ｂ  Template Strand (Ａ)+ Flap Strand (C-６)+ Upstream Strand(B-2) 
次いで、190 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0、15mMMgCl2,）に、2.5マイクロモル各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体酵素 1.5マイクロモルをそれぞれ加え、60度で60分反応させた。0.2M  ＥＤＴＡを9.5マイクロリットル加え、最終濃度10mMにし、活性を止めた。各基質から得られた５’切断されたフラップ部を含むサンプル溶液を混合した後、以下のａ）〜ｋ）のようにして、ZipTip(Millipore corporation)で精製し、MALDI-TOF/MS分析器により分子量を測定した。この精製及び分子量測定工程以下のａ）〜ｋ）に示す。 
【００５９】
a) ZipTip（Millipore社製C18）をP10ピペットに装着し、50％AcCN中で5回ピペッティング 
b) 0.1M  TEAA溶液中で5回ピペッティング 
c) サンプル（600ul中200ulを採取し乾燥後、20ul滅菌水で溶解したもの）を10回ほどピペッティング 
d) 0.1M  TEAA溶液を吸い取り、別の容器に排出する（5回実施） 
e) 50％アセト二トリルにてDNAサンプルをマイクロチューブで溶出 
f) DOWEX-50W-Hydrogen（SIGMA社製）をアンモニアフォームに置換したビーズをパラフィルム上にうすく撒き、その上に溶出したサンプル 7ulをスポット 
g) 数回ピペッティングの後、乾燥しないように10分間ほど静置 
h) TOF/MS測定用サンプルプレートに、マトリックス（3HPA；東京化成製の飽和水溶液）を1ulスポット 
i) ビーズを吸い取らないように注意しながらサンプルを1ul採取し、マトリックスとプレート上で混合（ピペッティング） 
j) サンプルプレートを風乾 
k) MALDI-TOF/MS分析器において測定 
【００６０】
結果を図２６、２７に示す。 
MASS の結果は、4868、4911にピ-クが検出された。4868は基質ＡのFlap鎖が切断されたオリゴヌクレオタイド  分子量4865Ｄａに相当し、4991は基質BのFlap鎖が切断されたオリゴヌクレオチド  分子量4940Ｄａに相当する。 
他のピ-クは検出されなかった。フラップエンドヌクレア-ゼの切断点は、ジャンクション部分より1mer 中にはいったところの一ケ所であった。 
オリゴヌクレオチドはZipTipで精製された。Flap strand はexonucleaseで分解されて、小さな分子量の所に検出され、サンプルの検出に邪魔にならなかった。Downsteam Strand  Bは、検出されなかった。Template  Strand  AとDownstream  Strand  Bはまだアニールしており、この構造が酵素と結合し、Downstrean Strand  Bが検出されなかったと思われる。 
このように、切断されたオリゴヌクレオチドのみ検出できた。このことから、Flap strandの長さを変え、配列を変えることにより一度に多くの種類のSNP解析ができる。 
【図２】
2010200755.tif 000003
【図３】
2010200755.tif 000004
【図４】
2010200755.tif 000005
【図６】
2010200755.tif 000006
【図９】
2010200755.tif 000007
【図１４】
2010200755.tif 000008
【図１６】
2010200755.tif 000009
【図１８】
2010200755.tif 000010
【図２０】
2010200755.tif 000011
【図２２】
2010200755.tif 000012
【図２３】
2010200755.tif 000013
【図２４】
2010200755.tif 000014
【図２５】
2010200755.tif 000015
【図２６】
2010200755.tif 000016
【図１】
2010200755.tif 000017
【図５】
2010200755.tif 000018
【図７】
2010200755.tif 000019
【図８】
2010200755.tif 000020
【図１０】
2010200755.tif 000021
【図１１】
2010200755.tif 000022
【図１２】
2010200755.tif 000023
【図１３】
2010200755.tif 000024
【図１５】
2010200755.tif 000025
【図１７】
2010200755.tif 000026
【図１９】
2010200755.tif 000027
【図２１】
2010200755.tif 000028
【図２７】
2010200755.tif 000029
【配列表】
2010200755000001.app