(57)【要約】      （修正有）【課題】前駆脂肪細胞に作用して脂肪細胞への分化を促進して降血糖作用を示す組成物および該組成物の製造方法の提供。【解決手段】真正担子菌網ヒダナシタケ目タコウキン科（Polyporaceae）タマチョレイタケ属のタタマチョレイタケ（Polyporus tuberaster）を液体培養して得たタマチョレイタケ菌糸体の乾燥若しくは乾燥粉体を有する組成物、またはタマチョレイタケ菌糸体若しくは該組成物から溶媒を用いて抽出した物を含有する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タマチョレイタケ（Polyporus tuberaster）を液体培養して得られたことを特徴とする前駆脂肪細胞分化促進活性を有する菌糸体。
【請求項２】
請求項１記載のタマチョレイタケ菌糸体を乾燥又は乾燥粉体としたことを特徴とする前駆脂肪細胞の分化促進活性を有する組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタマチョレイタケ菌糸体又は組成物から溶媒を用いて抽出することを特徴とする前駆脂肪細胞の分化促進活性を有する組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載のタマチョレイタケ菌糸体又は組成物から溶媒を用いて抽出物を得ることを特徴とする前駆脂肪細胞の分化促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１に記載の菌糸体又は組成物を含有することを特徴とする前駆脂肪細胞の分化促進活性を有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を持つ組成物及びその製造方法に関し、詳しくは、液体培養したタマチョレイタケ（Polyporus tuberaster）菌糸体に由来する物質を有効成分とし、前駆脂肪細胞に作用して脂肪細胞への分化を促進して降血糖作用を示す組成物とその製造方法ならびにこの組成物を含む飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、食生活の欧米化や飽食化、更には社会生活の変化に伴う運動不足が原因となり、肥満や糖尿病、高血圧、高脂血症に代表される生活習慣病が急激に増加している。生活習慣病は重複して発症しやすく、重複した病態はメタボリックシンドロームと呼ばれ、動脈硬化およびそれに伴って発症する心血管病、脳血管病のリスクファクターである。生活習慣病の一つである糖尿病は、前述のメタボリックシンドロームの原因の一つとなるだけでなく、知覚麻痺、失明、動脈硬化等との合併症を引き起こすことも多く、日常生活に多大な障害をもたらす病気である。
【０００３】
食生活や生活習慣に起因する糖尿病は２型糖尿病と呼ばれ、インスリンの作用不足が原因である。２型糖尿病の原因であるインスリンの作用不足は、抹消組織、特に脂肪組織のインスリンへの反応の低下（インスリン抵抗性の悪化）によるところが大きいと考えられている。
【０００４】
これまでに、インスリン抵抗性の改善に有効であることが知られているのが、チアゾリジン誘導体などのチアゾリジン系薬物である。チアゾリジン系薬物は、前駆脂肪細胞の分化誘導を転写レベルで促進することにより、血中の糖を取り込むことのできる脂肪細胞を増殖させ、血糖値を低下させるといわれている。実際に臨床においてインスリン感受性が高まり、血糖降下作用のあることが知られている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、最近になって肝炎、浮腫、食欲亢進などの副作用が報告されるなど、その使用に当たっては医師の厳格な管理・指導が必要とされ、容易に入手、使用できないのが現状である。このため、人体に対して有害な副作用を生じさせることなく、優れた分化促進効果を発揮する物質の開発が待望されている。
【０００６】
本発明は上記のような従来の問題に鑑みたものであり、その目的は、脂肪細胞の分化を促進する新たな技術を提供するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０５−０８６０５７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「American Journal of Physiology- Cell Physiology  264,                                 C1600-C1608」  著者：Sandouk T. ら.
【非特許文献２】「キノコの栽培方法  ２−１−２８−１  タマチョレイタケ」                        特許庁標準技術集、Ｈ１７年度、ｐ．２０２−２０４
【非特許文献３】「タマチョレイタケの生産技術の向上に関する研究」静岡県林                        業技術センター業務成績報告、２００５年、ｐ．５３−５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、脂肪細胞への分化誘導を促進することにより前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させ、血中の糖を取り込ませることが可能になることにより血糖値の上昇を抑制し、更にインスリン抵抗性糖尿病を改善し、更にはメタボリックシンドロームの発生を予防または改善する作用を有しながらも、日々安全な飲食品として摂取することのできる細胞分化促進活性を有する組成物、およびその製造方法、ならびに細胞分化促進活性を有する飲食品を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進作用を有する担子菌由来の抽出物の検討を鋭意行い、タマチョレイタケ子実体および菌糸体の抽出物、特に液体培養菌糸体の抽出物がマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の分化促進作用を有することを見出した。
【００１１】
タマチョレイタケ（Polyporus tuberaster）は真正担子菌網ヒダナシタケ目タコウキン科タマチョレイタケ属の一種で、通常は地中に形成した菌核から発生する地上生であるが、倒木上生のものも存在する。タマチョレイタケは日本やヨーロッパ、北アメリカに分布し、ヨーロッパや日本では昔から食用にされてきた。しかし、タマチョレイタケは日本において絶滅危惧種I類に指定されている希少種であり、原生するタマチョレイタケを採取することは困難である。
【００１２】
タマチョレイタケ子実体の人工栽培は静岡県林業技術センターで研究されており、試験栽培が行われている。しかし、その栽培方法は従来のビン栽培またはきのこ栽培用袋であり、栽培には湿度、温度、光量を厳密に調節できる室内設備と広い面積が必要である（非特許文献２および非特許文献３参照）。また栽培期間は接種から収穫まで最低６０日かかり、大量に子実体を栽培し提供することは困難な状況である（非特許文献２参照）。
【００１３】
本発明者らはタマチョレイタケを液体培養することにより、短期間で大量にタマチョレイタケ菌糸体が培養でき、また前駆脂肪細胞の分化促進作用が向上することを見出した。
【００１４】
本願の発明は、液体培養により前駆脂肪細胞の分化促進作用が向上したタマチョレイタケ菌糸体の培養方法を要旨とするものである。
【００１５】
本願の別の発明は、液体培養したタマチョレイタケ菌糸体から得られることを特徴とする前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する組成物を要旨とするものである。
【００１６】
本願の更に別の発明は、液体培養したタマチョレイタケ菌糸体から溶媒を用いて抽出物を得ることを特徴とする前記した細胞分化促進活性を有する組成物の製造方法を要旨とするものである。
【００１７】
本願の更に別の発明は、前記した細胞分化促進活性を有する菌糸体又は組成物を含有することを特徴とする前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する飲食品を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１８】
上述のように、本発明は、タマチョレイタケ菌糸体より抽出される成分を含み、細胞の脂肪細胞への分化を促進する組成物を含む。この組成物は、糖尿病や関連疾患の進行防止、あるいはこれら疾患の改善に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例におけるタマチョレイタケのアセトン抽出物の脂肪細胞分化促進効果を示すグラフであり、インスリン存在下における前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進マーカー遺伝子であるａＰ２の相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図２】本発明の実施例におけるタマチョレイタケのエタノール抽出物の脂肪細胞分化促進効果を示すグラフであり、インスリン存在下における前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進マーカー遺伝子であるａＰ２の相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図３】本発明の実施例におけるタマチョレイタケの酢酸エチル抽出物の脂肪細胞分化促進効果を示すグラフであり、インスリン存在下における前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進マーカー遺伝子であるａＰ２の相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明で使用する「タマチョレイタケ」とは、タコウキン科（Polyporaceae）、タマチョレイタケ属（Polyporus）のキノコ：タマチョレイタケ（Polyporus tuberaster）である。
【００２１】
なお、本発明で使用するタマチョレイタケの抽出物とは菌糸体をそのまま又は乾燥したものを溶媒で抽出したもの。又は、そのままあるいは乾燥したものを粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【００２２】
抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、又はプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどが挙げられる。また二酸化炭素などを用いた超臨界抽出も用いることができる。これらの溶媒は単独又は２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができ、また、各々の溶媒抽出物が組み合わされた状態でも使用できる。
【００２３】
抽出温度は使用する溶剤が有機溶媒の場合、その沸点にもよるし、使用する溶剤が亜臨界から超臨界の状態にあるガスの場合、その臨界温度にもよるが、好ましくは０℃から８０℃、更に好ましくは室温程度から６０℃の範囲である。
【００２４】
なお、抽出操作は１回のみの回分操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶剤を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶剤を複数回抽出原料に接触させることも可能である。すなわち、抽出操作としては、回分操作、半連続操作、向流多段接触操作のいずれの方式も使用可能である。
【００２５】
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、濾 過、活性炭等による脱色、脱臭等の処理をして用いても良い。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００２６】
本発明のタマチョレイタケの抽出物は、そのまま前駆脂肪細胞分化誘導活性を有する組成物として利用できるほか、更に飲食品に含有できるが、その含有量としては特に規定するものではないが、組成物又は飲食品の種類、品質、期待される作用の程度によって若干異なるが、通常、全量中、固形分換算して、０．００１重量％以上（以下、％で表わす）、好ましくは０．１から５０．０％が良い。
【００２７】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特に言及しない操作は、当業者が一般的に行う技術を利用して行った。また、各機器および試薬は、特に言及しない場合は、下記に説明したとおりに使用した。
【００２９】
タマチョレイタケ（Polyporus tuberaster）菌糸体の培養は以下のようにして行った。
【００３０】
液体培養には培地１Ｌあたりグルコース５０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４；１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１３３ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ；１０ｍｇを混合した後ｐＨを５．５に調整しオートクレーブ滅菌したものを液体培地１として用いた。寒天プレート上での培養には液体培地１に寒天を１．５％添加して用いた。
【００３１】
冷凍保存した菌糸の一部を寒天プレートに植菌し、２８℃のインキュベーター内で７日〜１０日間成長させ、種培養を行った。
【００３２】
菌糸が広がった寒天プレートに直径５ｍｍのコルクボーラーで穴を１０個開けて菌糸を採取し、３００ｍｌ容のガラス製三角フラスコに調製した１００ｍｌの液体培地１に植菌し、２８℃のインキュベーター内で６日間静置培養を行った。その後、回転数１８０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。
【００３３】
生育した菌糸体を２ｍｌ採取し、３００ｍｌ容積のガラス製三角フラスコに調製した１００ｍｌの液体培地１に植菌し、２８℃のインキュベーター内で回転数１８０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。
【００３４】
生育した菌糸体を全量採取し、１０ｌ容積の培養ジャーに調製した６ｌの液体培地１に植菌し、温度２７℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍの条件で８日間培養を行った。
【００３５】
生育した菌糸体は以下のように回収した。９０ｍｍφのブフナー漏斗に定性濾紙を置き、菌糸体を含む液体培地を漏斗上に移し吸引濾過を行った。得られた菌糸体は蒸留水で３回洗浄して培地由来の成分を除き、最終的に圧搾と吸引により水分を可能な限り除いた。得られた含水菌糸体は−８０℃のディープフリーザー内に置いて十分に凍結させた後、凍結乾燥機で乾燥させて９．６ｇのタマチョレイタケ菌糸体の乾燥品を得た。前述の方法で得られた乾燥品は、小型のラボ用ミルを用いて粉砕し、試料とした。
【００３６】
前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性の測定は、以下のようにして行った。
（A）分化処理（分化誘導処理およぶ分化促進処理）
マウス由来の前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を用いて、以下の操作を行った。
【００３７】
細胞の培養温度は３７℃とし、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を通常培地として用いた。以降、培地への添加物の濃度は全て終濃度で表記する。
【００３８】
通常培地で培養し、コンフルエントに達した細胞に、分化誘導処理を行った。すなわち、通常培地に０．２５μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン、および１０μｇ／ｍｌインスリンを添加した分化誘導培地で２日間培養した。
なお、分化誘導開始日を０日目とする。
【００３９】
分化誘導開始から２日目に分化促進培地に交換し分化促進処理を行った。さらに２日毎に２回培地を交換し、４日間（分化誘導開始から６日目まで）培養した。分化促進培地は、通常培地に５μｇ／ｍｌインスリンを添加したものである。
【００４０】
なお、各種抽出物が細胞の分化に与える影響を調べるために、分化誘導培地および分化促進培地に抽出物濃度が１００ｐｐｍになるように抽出物を添加して０〜６日まで培養した細胞を、下記（Ｂ）の操作に用いた。また、対照として子実体の抽出物を添加した培地で０〜６日目まで培養した細胞を用いて下記（Ｂ）の操作を行った。
（Ｂ）分化促進効果の評価
抽出物による分化促進効果を評価した。
【００４１】
分化誘導から８日目の細胞を回収し、Sepasol-RNA I（登録商標、ナカライテスク（株）製）によって細胞からｍＲＮＡを抽出したあと、oligo dTプライマーを用い逆転写することで、ｃＤＮＡサンプルを得た。このｃＤＮＡサンプル中の目的遺伝子（ａＰ２）をLightCycler（登録商標、Roche社製）にて定量した。ａＰ２は、脂肪細胞の分化マーカーとして一般的に利用される遺伝子である。
【００４２】
（抽出物による分化促進効果）
このようにして測定したａＰ２のｍＲＮＡ量を、分化に関わらず定常的に転写される３６Ｂ４のｍＲＮＡ量に対する比率として、分化促進効果の評価を行った。
【００４３】
実施例１
タマチョレイタケ菌糸体の乾燥破砕物１ｇに対してアセトンを５ｍｌを添加し、室温で３日間静置して抽出処理を行った。この抽出物を濾紙にて濾過を行い、アセトン画分を回収し、アセトン画分を減圧下で乾燥させ、本発明の細胞分化促進活性を有する組成物を３４．７ｍｇ得た。この乾燥物をジメチルスルフオキシド３４７μｌに溶解し、細胞分化促進活性を測定した。
【００４４】
比較対照としてタマチョレイタケ子実体をタマチョレイタケ菌糸体と同様に抽出操作を行い、抽出物を２８．６ｍｇ得た。この乾燥物をジメチルスルフオキシド２８６μｌに溶解し、細胞分化促進活性を測定した。
【００４５】
結果を図１に示した。図１の結果から、タマチョレイタケ菌糸体のアセトン抽出物には強い細胞分化促進活性があった。
【００４６】
実施例２
タマチョレイタケ菌糸体の乾燥破砕物１ｇに対してエタノールを５ｍｌを添加し室温で３日間静置して抽出処理を行った。この抽出物を濾紙にて濾過を行い、エタノール画分を回収し、エタノール画分を減圧下で乾燥させ、本発明の細胞分化促進活性を有する組成物を３９．４ｍｇ得た。この乾燥物をジメチルスルフオキシド３９４μｌに溶解し、細胞分化促進活性を測定した。
【００４７】
比較対照としてタマチョレイタケ子実体をタマチョレイタケ菌糸体と同様に抽出操作を行い、抽出物を３２．９ｍｇ得た。この乾燥物をジメチルスルフオキシド３２９μｌに溶解し、細胞分化促進活性を測定した。
【００４８】
結果を図２に示した。図２の結果から、タマチョレイタケ菌糸体のエタノール抽出物には強い細胞分化促進活性があった。
【００４９】
実施例３
マチョレイタケ菌糸体の乾燥破砕物１ｇに対して酢酸エチルを５ｍｌを添加し、室温で３日間静置して抽出処理を行った。この抽出物を濾紙にて濾過を行い、酢酸エチル画分を回収し、酢酸エチル画分を減圧下で乾燥させ、本発明の細胞分化促進活性を有する組成物を３０．５ｍｇ得た。この乾燥物をジメチルスルフオキシド３０５μｌに溶解し、細胞分化促進活性を測定した。
【００５０】
比較対照としてタマチョレイタケ子実体をタマチョレイタケ菌糸体と同様に抽出操作を行い、抽出物を２７．８ｍｇ得た。この乾燥物をジメチルスルフオキシド２７８μｌに溶解し、細胞分化促進活性を測定した。
【００５１】
結果を図３に示した。図３の結果から、タマチョレイタケ菌糸体の酢酸エチル抽出物には強い細胞分化促進活性が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のタマチョレイタケの粉砕物または抽出物を含有することを特徴とする脂肪細胞分化抑制活性を有する組成物は、前駆脂肪細胞の脂肪蓄積を促進する効果を有するため、飲食品などに配合することにより、糖尿病の予防や改善などに有効で、また飲食物としての利用が可能であり、飲食品の製造分野や医薬分野で利用できる。
【図１】
2010263835.tif 000002
【図２】
2010263835.tif 000003
【図３】
2010263835.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月29日(2010.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タマチョレイタケ菌糸体を液体培養し、この液体培養したタマチョレイタケ菌糸体から溶媒を用いて抽出して得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、糖尿病や関連疾患の進行防止、あるいはこれら疾患の改善に用いることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１記載のタマチョレイタケ菌糸体又はその抽出物からなる組成物を含有し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、糖尿病や関連疾患の進行防止、あるいはこれら疾患の改善に用いることを特徴とする飲食品。
【請求項３】
前記タマチョレイタケの抽出物とは菌糸体をそのまま又は乾燥したものを溶媒で抽出したもの、又は、そのままあるいは乾燥したものを粉砕後、溶媒で抽出したものであることを特徴とする請求項１記載の組成物または請求項２記載の飲食品。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本願の発明は、液体培養により前駆脂肪細胞の分化促進作用が向上したタマチョレイタケ菌糸体の抽出物を要旨とするものであり、本願の別の発明は、液体培養したタマチョレイタケ菌糸体から得られることを特徴とする前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する組成物を要旨とするものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本願の請求項１に係る発明は、タマチョレイタケ菌糸体を液体培養し、この液体培養したタマチョレイタケ菌糸体から溶媒を用いて抽出して得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、糖尿病や関連疾患の進行防止、あるいはこれら疾患の改善に用いる（具体的には、血糖値の上昇の抑制、インスリン抵抗性糖尿病の改善、あるいはメタボリックシンドロームの発生の予防または改善のために用いる）ことを特徴とする組成物である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本願の請求項２に係る発明は、前記タマチョレイタケ菌糸体又はその抽出物である組成物を含有し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、糖尿病や関連疾患の進行防止、あるいはこれら疾患の改善に用いる（いいかえれば、血糖値の上昇の抑制、インスリン抵抗性糖尿病の改善、あるいはメタボリックシンドロームの発生の予防または改善のために用いる）ことを特徴とする飲食品である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
請求項３に記載のように、タマチョレイタケの抽出物とは菌糸体をそのまま又は乾燥したものを溶媒で抽出したもの、又は、そのままあるいは乾燥したものを粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
なお、各種抽出物が細胞の分化に与える影響を調べるために、分化誘導培地および分化促進培地に抽出物濃度が１００ｐｐｍになるように抽出物を添加して０〜６日まで培養した細胞を、下記（B）の操作に用いた。また、比較対照として子実体の抽出物を添加した培地で０〜６日目まで培養した細胞を用いて下記（B）の操作を行った。さらに、コントロールとして濃度が０．１％になるようにジメチルスルフオキシドを添加した培地で０〜６日目まで培養した細胞を用いて下記（B）の操作を行った。