(57)【要約】【課題】キャリアまたは活性化合物、およびこれにグラフトされたグルタチオンまたはグルタチオン誘導体を含むデリバリーシステムを提供すること。【解決手段】ビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体を含む部分（moiety）、これに結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体、および該ポリエチレングリコールまたは該ポリエチレングリコール誘導体に結合されたグルタチオン（ＧＳＨ）またはグルタチオン誘導体を含む化合物。【選択図】図１
2010150264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体を含む部分；
これに結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体；および
前記ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール誘導体に結合されたグルタチオン（ＧＳＨ）またはグルタチオン誘導体を含む化合物。
【請求項２】
前記ビタミンＥ誘導体には、トコフェロール誘導体またはトコトリエノール誘導体が含まれる請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記ビタミンＥ誘導体には、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、α−コハク酸トコフェロール、β−コハク酸トコフェロール、γ−コハク酸トコフェロール、δ−コハク酸トコフェロール、α−コハク酸トコトリエノール、β−コハク酸トコトリエノール、γ−コハク酸トコトリエノール、δ−コハク酸トコトリエノール、α−酢酸トコフェロール、β−酢酸トコフェロール、γ−酢酸トコフェロール、δ−酢酸トコフェロール、α−酢酸トコトリエノール、β−酢酸トコトリエノール、γ−酢酸トコトリエノール、δ−酢酸トコトリエノール、α−ニコチン酸トコフェロール、β−ニコチン酸トコフェロール、γ−ニコチン酸トコフェロール、δ−ニコチン酸トコフェロール、α−ニコチン酸トコトリエノール、β−ニコチン酸トコトリエノール、γ−ニコチン酸トコトリエノール、δ−ニコチン酸トコトリエノール、α−リン酸トコフェロール、β−リン酸トコフェロール、γ−リン酸トコフェロール、δ−リン酸トコフェロール、α−リン酸トコトリエノール、β−リン酸トコトリエノール、γ−リン酸トコトリエノール、またはδ−リン酸トコトリエノールが含まれる請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記リン脂質誘導体が公式（Ｉ）を備える請求項１記載の化合物。
【化１】
2010150264.tif 000011
（式中、Ａ1はスフィンゴシンであり、かつ、Ｒ1はオクタノイルまたはパルミトイルを含む。）
【請求項５】
前記リン脂質誘導体が公式（II）を備える請求項１記載の化合物。
【化２】
2010150264.tif 000012
（式中、Ａ2はホスホエタノアミンであり、かつ、Ｒ2はミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルを含む。）
【請求項６】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または前記ポリエチレングリコール誘導体の重合数（ｎ）が約６〜２１０である請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記部分が前記ビタミンＥ誘導体である場合、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が約３００〜１００００である請求項５記載の化合物。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が約７５０〜５０００である請求項４記載の化合物。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が約３５０〜５０００である請求項５記載の化合物。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコール誘導体には、カルボン酸、マレイミド、ＰＤＰ、アミド、またはビオチンが含まれる請求項１記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体デリバリーシステムに関し、より具体的には、グルタチオンベースデリバリーシステム（glutathione based delivery system）に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、それらの間の密着結合（tight junction）のために例えば毒素などの異物をブロックできる脳内皮細胞からなる。しかし、疎水性または低分子量分子は、受動拡散によりＢＢＢを通過することが可能である。
【０００３】
ところが、例えば脳または神経疾患を治療するための親水性タンパク薬や中枢神経系に作用する鎮痛ペプチド薬などの活性化合物（active compound）は、その大きな分子量または親水性のために脳組織に入ることができずに酵素によって分解されてしまう。
【０００４】
近年の研究では、薬物の疎水性を高めるための構造修飾、正に帯電したキャリアを電荷吸収により通過させる吸着介在型トランスポート（absorption-mediated transport、ＡＭＴ）、例えばＮａ+とＫ+、ジペプチド、トリペプチドまたはグルコースなどの親水性金属イオンをトランスポーターにより通過させる担体介在型トランスサイトーシス（carrier-mediated transcytosis、ＣＭＴ）、および例えばインシュリン、トランスフェリンまたは低密度リポタンパク（ＬＤＬ）などの高分子をトランスサイトーシスにより通過させる受容体介在型トランスサイトーシス（receptor-mediated transcytosis、ＲＭＴ）を含む、活性化合物をＢＢＢに通過させるための各種方法が進められている。
【０００５】
グルタチオン（ＧＳＨ）は内生の抗酸化剤である。その血清中の濃度が不十分であると、例えば慢性疲労症候群（ＣＦＳ）などの神経疾患が引き起こされる可能性がある。
【０００６】
１９８８年、特許文献１においてKiwada Hiroshiは、例えばＮ−パルミトイルグルタチオン（N-palmitoylglutathione）であるＮ−アシルグルタチオン（N-acylglutathione）と例えばホスファチジルコリンであるリン脂質とを含み、ターゲッティングして肝臓疾患を治療する、肝臓に蓄積可能なリポゾームを提示した。
【０００７】
１９９４年にBerislav V.Zlokovicにより、グルタチオン（ＧＳＨ）が例えばＧＳＨ−トランスポーターなどの特殊な経路を介して分解することなくモルモットのＢＢＢに到達し通過するということが示された。
【０００８】
１９９５年にBerislav V.Zlokovicにより、脳星状細胞および内皮細胞中にグルタチオン（ＧＳＨ）がミリモル濃度で存在するということが示された。
【０００９】
１９９５年にRam Kannanにより、ＧＳＨの取り込みがＮａ+の濃度に依存することが示された。Ｎａ+の濃度が低いと、脳内皮細胞のＧＳＨの取り込みが抑制され得る。彼はまた、ＢＢＢの管腔側（luminal side）に位置するＮａ依存型ＧＳＨトランスポーターはＧＳＨの取り込みを担当し、ＢＢＢの管腔側に位置するＮａ非依存型ＧＳＨトランスポーターはＧＳＨの排出を担当するということも示した。さらにKannanは、マウスおよびモルモットの脳を用いてラット肝細管ＧＳＨトランスポーター（rat hepatic canalicular GSH transporter、ＲｃＧＳＨＴ）システムを確立し、ｃＤＮＡフラグメント５、７、および１１を分析した。その結果より、フラグメント７がＮａ依存型ＧＳＨトランスポーターに相当し、フラグメント５および１１がＮａ依存型ＧＳＨトランスポーターに相当するということがわかった。
【００１０】
１９９９年にRam Kannanは、ＢＢＢの状況をシミュレートするマウス脳内皮細胞株（ＭＢＥＣ−４）モデルを作製した。このモデルにより、Ｎａ−依存型ＧＳＨトランスポーターがＭＢＥＣ−４細胞の管腔側に位置することが証明された。
【００１１】
２０００年にRam Kannanによって、ヒト脳血管内皮細胞（ＨＣＥＣ）においてＧＳＨがＮａ−依存型ＧＳＨトランスポーターによりＢＢＢを通過すること、およびＨＣＥＣの管腔原形質膜(luminal plasma membrane)にＮａ−依存型ＧＳＨトランスポーターが存在することが示された。
【００１２】
２００３年、特許文献２においてZhao Zhiyangは、スルホンアミド共有結合によりグルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン（ＧＳＨ）を結合させた制癌プロドラッグであって、特定の癌細胞にターゲティングすると共にスルホンアミド結合切断後に治療作用をあらわす、制癌プロドラッグを提示した。この改質は、薬物のアミノ基を保護し、その溶解性を高め、かつその体内における吸収と分布を変えることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開昭６３−２９２２号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／１０９５５５号明細書
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、キャリアまたは活性化合物、およびこれにグラフトされたグルタチオンまたはグルタチオン誘導体を含むデリバリーシステムを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体を含む部分（moiety）、これに結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体、および該ポリエチレングリコールまたは該ポリエチレングリコール誘導体に結合されたグルタチオン（ＧＳＨ）またはグルタチオン誘導体を含む化合物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のデリバリーシステムを示している。
【図２】本発明の各種ｍｅｔ−エンケファリンキャリアの最大可能効果（ＭＰＥ）を示している。
【図３】本発明の各種ｍｅｔ−エンケファリンキャリアの曲線下面積（ＡＵＣ）を示している。
【図４】本発明の各種ガバペンチンキャリアの最大可能効果（ＭＰＥ）を示している。
【図５】本発明の各種ガバペンチンキャリアの曲線下面積（ＡＵＣ）を示している。
【図６】フリーｍｅｔ−エンケファリンおよびリポゾーム中のｍｅｔ−エンケファリンの血清安定性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
添付の図面を参照にして、実施形態により以下に詳細に説明する。
【００１８】
添付の図面を参照とし以下の詳細な説明および例を読めば、本発明をより理解することができるであろう。
【００１９】
本発明は、キャリアまたは活性化合物、およびこれにグラフトされたグルタチオンまたはグルタチオン誘導体を含むデリバリーシステムを提供する。キャリアには、ナノ粒子、高分子ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、高分子ミセル、リポゾーム、マイクロエマルジョン、または液体ベースナノ粒子が含まれ得る。リポゾームは、少なくとも、例えば大豆レシチン（soy lecithin）であるレシチン、および例えば水素化大豆レシチン（hydrogenated soy lecithin）である水素化レシチンのうちの１種を含む。
【００２０】
リポゾームは、血清耐性または電荷量が高まるように、コレステロール、水溶性ビタミンＥ、またはオクタデシルアミンをさらに含んでいてもよい。リポゾームのモル組成比は、レシチンまたは水素化レシチン０．５〜１００％、コレステロールまたは水溶性ビタミンＥ０．００５〜７５％、オクタデシルアミン０．００１〜２５％とすることができる。
【００２１】
さらに、キャリアは約０．５〜１００％の封入効率で活性化合物を封入させることができる。活性化合物には、例えばガバペンチンである小分子化合物、例えばエンケファリンであるペプチド、タンパク質、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチド、または遺伝子フラグメントが含まれ、かつそのキャリア中におけるモル比は約０．０００５〜９５％とすることができる。
【００２２】
上述の標的指向化キャリアまたは活性化合物は、例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、または血液脳関門などの器官のグルタチオントランスポーターへのターゲティングが可能である。
【００２３】
特に、活性化合物は、標的指向化キャリアによって、例えば脳内皮細胞である血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、かつ、細胞透過率が約０．０１〜１００％になる。
【００２４】
本発明はさらに、ビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体を含む部分（moiety）、これに結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体、および該ポリエチレングリコールまたは該ポリエチレングリコール誘導体に結合されたグルタチオン（ＧＳＨ）またはグルタチオン誘導体を含む化合物を提供する。
【００２５】
ビタミンＥ誘導体には、トコフェロール誘導体またはトコトリエノール誘導体が含まれ、かつ該ビタミンＥ誘導体は、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、α−コハク酸トコフェロール、β−コハク酸トコフェロール、γ−コハク酸トコフェロール、δ−コハク酸トコフェロール、α−コハク酸トコトリエノール、β−コハク酸トコトリエノール、γ−コハク酸トコトリエノール、δ−コハク酸トコトリエノール、α−酢酸トコフェロール、β−酢酸トコフェロール、γ−酢酸トコフェロール、δ−酢酸トコフェロール、α−酢酸トコトリエノール、β−酢酸トコトリエノール、γ−酢酸トコトリエノール、δ−酢酸トコトリエノール、α−ニコチン酸トコフェロール、β−ニコチン酸トコフェロール、γ−ニコチン酸トコフェロール、δ−ニコチン酸トコフェロール、α−ニコチン酸トコトリエノール、β−ニコチン酸トコトリエノール、γ−ニコチン酸トコトリエノール、δ−ニコチン酸トコトリエノール、α−リン酸トコフェロール、β−リン酸トコフェロール、γ−リン酸トコフェロール、δ−リン酸トコフェロール、α−リン酸トコトリエノール、β−リン酸トコトリエノール、γ−リン酸トコトリエノール、またはδ−リン酸トコトリエノールであり得る。
【００２６】
リン脂質誘導体は次の公式を備え得る。
【００２７】
【化１】
2010150264.tif 000003
【００２８】
公式（Ｉ）のうち、Ａ1はスフィンゴシンであり、かつ、Ｒ1はオクタノイルまたはパルミトイルを含む。公式（II）のうち、Ａ2はホスホエタノアミン（phosphoethanoamine）であり、かつ、Ｒ2はミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルを含む。
【００２９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体の重合数（ｎ）は約６〜２１０である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体の分子量は、それぞれ異なるビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体によって変えることができる。例として、ＰＥＧまたはその誘導体がビタミンＥ誘導体に結合する場合、その分子量は約３００〜１００００であり、ＰＥＧまたはその誘導体が公式(Ｉ)で示されるリン脂質誘導体に結合する場合は、その分子量は約７５０〜５０００であり、さらに、ＰＥＧまたはその誘導体が公式（II）で示されるリン脂質誘導体に結合する場合には、その分子量は約３５０〜５０００とすることができる。
【００３０】
ポリエチレングリコール誘導体には、カルボン酸、マレイミド、ＰＤＰ、アミド、またはビオチンが含まれる。
【００３１】
図１を参照すると、本発明のデリバリーシステムが示されている。このデリバリーシステム１０は、リポゾーム２０、およびこれにグラフトされたリガンド３０を備える。リガンド３０は、ビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体を含む部分（moiety）４０、これに結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体５０、および該ポリエチレングリコールまたは該ポリエチレングリコール誘導体に結合されたグルタチオン（ＧＳＨ）またはグルタチオン誘導体６０を備える。
【００３２】
本発明が提供する新規なグルタチオン（ＧＳＨ）リガンドを用いた標的指向化キャリアに運ばれる、例えばタンパク質、ペプチド、または小分子などの活性化合物は、担体介在型トランスサイトーシス（ＣＭＴ）または受容体介在型トランスサイトーシス（ＲＭＴ）によって血液脳関門を有効に通過して、脳または神経疾患を治療することができる。
【００３３】
実施例１
ＴＰＧＳ−グルタチオンの調製
【化２】
2010150264.tif 000004
【００３４】
Ｎ−Ｃｂｚアミノ酸ベンジル（Ｎ−Ｃｂｚグルタミン、１．０当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨｏＳｕ、１．０当量）をＤＭＥ（１５ｍＬ）中にて攪拌し、その溶液を０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＩＣ、１．０当量）を加えてから、この温度で４時間攪拌した。その反応混合物を冷凍室に２時間置いたのち、濾過した。
【００３５】
予期したとおりに、形成されたジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）の濾去および溶剤の蒸発後、純粋な化合物が高い収率（９８％）で得られた。その残留物をＥＴ2Ｏ／ヘキサン中にて粉砕し濾過してから、真空中で乾燥させて白色の固体を得た。
【００３６】
（＋）−Ｓ−トリチルシステインリチウム塩（Ｈ−Ｃｙｓ（ＳＴｒｔ）−ＯＬｉ、１当量）および炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3、５．０当量）を水（１５ｍＬ）中に溶解してから、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）を加えてステップ２の中間産物を得た。その混合物を、ＴＬＣ分析によりステップ２の中間産物の消失が示されるまで、室温で３〜６時間激しく攪拌した。その溶液を水（２×１００ｍＬ）で洗浄してから、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥、濾過し、真空中で濃縮して化合物２を得た。
【００３７】
化合物２およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨｏＳｕ、１．０当量）をＤＭＥ（１５ｍＬ）中にて攪拌し、その溶液を０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＩＣ、１．０当量）を加えてから、この温度で４時間攪拌した。その反応混合物を冷凍室に２時間置いたのち、濾過した。
【００３８】
ＤＣＵおよび溶剤を除去したのち、グリシンリチウム塩（Ｈ−Ｇｌｙ−ＯＬｉ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3、５．０当量）を水（１５ｍＬ）中に溶解し、次いでアセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）を加えてステップ４の中間産物を得た。その混合物を、ＴＬＣ分析によりステップ４の中間産物の消失が示されるまで、室温で３〜６時間激しく攪拌した。その溶液を水（２×１００ｍＬ）で洗浄してから、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥、濾過し、真空中で濃縮して化合物３を得た。
【００３９】
ｄ−アルファコハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００（d-alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate、ＴＰＧＳ−ＯＨ）を、エステル化により化合物３と結合させて化合物４を得た。
【００４０】
メタノール（１００ｍＬ）中の化合物４に、１０％Ｐｄ−Ｃ（保護トリペプチド−ＴＰＧＳの重量の０．２倍）を加えた。その懸濁液を、水素を充満させた風船中で室温下１６時間攪拌した。その懸濁液をセライトで濾過してから蒸発させ、その残留物をエタノールから結晶化させた。これにより化合物５を得た。
【００４１】
ＣＨ2Ｃｌ2の存在下、トリエチルシラン（ＥＴ3ＳｉＨ）およびＴＦＡを用いた化合物５の脱保護を行って化合物６（つまりＧＳＨ−ＴＰＧＳ）を得た。
【００４２】
ｍｅｔ−エンケファリンキャリア溶液の調製
大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）を８３．２％、α−コハク酸トコフェロールＰＥＧ１５００（ＴＰＧＳ）を４．２％、グルタチオン−ＴＰＧＳ（ＧＳＨ−ＴＰＧＳ）を４．２％、およびコレステロールを８．４％含有する脂質０．５ｇを、１２．５ｍＬのＺｒＯ2乳鉢に入れた。適量のｍｅｔ−エンケファリンをｐＨ７．４のリン酸塩溶液１０ｍＭ中に溶解して４％薬物溶液を作った。次に、その乳鉢に薬物溶液０．５ｍＬおよびＺｒＯ2ビーズ（直径１０ｍｍ）５個を加えて５００ｒｐｍで１時間粉砕し、粘性クリーム状物にした。続いて、粘性クリーム状物０．２ｇおよびリン酸塩溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）１．８ｍＬを１０ｍＬフラスコに加え室温下で１時間水和させて、ｍｅｔ−エンケファリン封入リポゾームを含むキャリア溶液を作った。リポゾーム中のｍｅｔ−エンケファリンの濃度は０．５６ｍｇ／ｍＬであった。その封入効率は３３．３％であった。キャリアの平均径は１７３．１ｎｍであり、かつその多分散性指数（polydispersity index、ＰＩ）は０．２４３であった。
【００４３】
実施例２〜６
実施例２〜６の調製手法は実施例１に類似する。これらの間の差違はそれぞれ異なるキャリアの組成にある。表１および２を参照されたい。
【００４４】
【表１】
2010150264.tif 000005
【００４５】
【表２】
2010150264.tif 000006
【００４６】
実施例７
ガバペンチンキャリア溶液の調製
大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）を８３．２％、α−コハク酸トコフェロールＰＥＧ１５００（ＴＰＧＳ）を４．２％、グルタチオン−ＴＰＧＳ（ＧＳＨ−ＴＰＧＳ）を４．２％、およびコレステロールを８．４％含有する脂質０．５ｇを、１２．５ｍＬのＺｒＯ2乳鉢に入れた。適量のガバペンチンをｐＨ７．４のリン酸塩溶液１０ｍＭ中に溶解して１０％薬物溶液を作った。次に、その乳鉢に薬物溶液０．５ｍＬおよびＺｒＯ2ビーズ（直径１０ｍｍ）５個を加えて５００ｒｐｍで１時間粉砕し、粘性クリーム状物にした。続いて、粘性クリーム状物０．２ｇおよびリン酸塩溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）１．８ｍＬを１０ｍＬフラスコに加え、室温下で１時間水和させて、ガバペンチン封入リポゾームを含むキャリア溶液を作った。リポゾーム中のガバペンチンの濃度は１．０８ｍｇ／ｍＬであった。その封入効率は３５．７％であった。キャリアの平均径は１４７．７ｎｍであり、かつその多分散性指数（ＰＩ）は０．１５７であった。
【００４７】
比較例１
ｍｅｔ−エンケファリンキャリア溶液の調製
大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）を８３．２％、α−コハク酸トコフェロールＰＥＧ１５００（ＴＰＧＳ）を８．４％、およびコレステロールを８．４％含有する脂質０．５ｇを、１２．５ｍＬのＺｒＯ2乳鉢に入れた。適量のｍｅｔ−エンケファリンをｐＨ７．４のリン酸塩溶液１０ｍＭ中に溶解して４％薬物溶液を作った。次に、その乳鉢に薬物溶液０．５ｍＬおよびＺｒＯ2ビーズ（直径１０ｍｍ）５個を加えて５００ｒｐｍで１時間粉砕し、粘性クリーム状物にした。続いて、粘性クリーム状物０．２ｇおよびリン酸塩溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）１．８ｍＬを１０ｍＬフラスコに加え室温下で１時間水和させて、ｍｅｔ−エンケファリン封入リポゾームを含むキャリア溶液を作った。リポゾーム中のｍｅｔ−エンケファリンの濃度は０．５７ｍｇ／ｍＬであった。その封入効率は３１．１％であった。キャリアの平均径は１６４．１ｎｍであり、かつその多分散性指数（ＰＩ）は０．２８１であった。
【００４８】
比較例２〜３
比較例２〜３の調製手法は比較例１に類似する。これらの間の差違はそれぞれ異なるキャリアの組成にある。表３および４を参照されたい。
【００４９】
【表３】
2010150264.tif 000007
【００５０】
【表４】
2010150264.tif 000008
【００５１】
比較例４
ガバペンチンキャリア溶液の調製
大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）を８３．２％、α−コハク酸トコフェロールＰＥＧ１５００（ＴＰＧＳ）を８．４％、およびコレステロールを８．４％含有する脂質０．５ｇを、１２．５ｍＬのＺｒＯ2乳鉢に入れた。適量のガバペンチンをｐＨ７．４のリン酸塩溶液１０ｍＭ中に溶解して１０％薬物溶液を作った。次に、その乳鉢に薬物溶液０．５ｍＬおよびＺｒＯ2ビーズ（直径１０ｍｍ）５個を加えて５００ｒｐｍで１時間粉砕し、粘性クリーム状物にした。続いて、粘性クリーム状物０．２ｇおよびリン酸塩溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）１．８ｍＬを１０ｍＬフラスコに加え室温下で１時間水和させて、ガバペンチン封入リポゾームを含むキャリア溶液を作った。リポゾーム中のガバペンチンの濃度は１．１７ｍｇ／ｍＬであった。その封入効率は３８．５％であった。キャリアの平均径は１５５．８ｎｍであり、かつその多分散性指数（ＰＩ）は０．１８６であった。
【００５２】
ｍｅｔ−エンケファリンリポゾームのインビトロ透過率試験１
ＢＢＢの状況をシミュレートしたＲＢＥ４／グリオーマ細胞モデルを用い、ｍｅｔ−エンケファリンの透過率を測定した。実施例１〜２（グルタチオン含有）と比較例１（グルタチオンを含まない）の試験結果を表５において比較する。
【００５３】
【表５】
2010150264.tif 000009
【００５４】
この結果より、実施例１および２の透過率（９．８％）は比較例１（３．４％）の約２．８２倍もあり、明らかに高いということが示された。
【００５５】
ｍｅｔ−エンケファリンリポゾームのインビトロ透過率試験２
ＢＢＢの状況をシミュレートしたＲＢＥ４／グリオーマ細胞モデルを用い、ｍｅｔ−エンケファリンの透過率を測定した。実施例３（グルタチオン含有）と比較例２（グルタチオンを含まない）の試験結果を表６において比較する。
【００５６】
【表６】
2010150264.tif 000010
【００５７】
この結果より、実施例３の透過率（６．９９％）は比較例２（３．５５％）の約１．９６倍もあり、明らかに高いということが示された。また、実施例３を実施するに先立って細胞を３０分間グルタチオンで培養した場合には、かかる付加されたグルタチオンが細胞のグルタチオントランスポーターを占有してキャリアの結合を阻止してしまうことでＢＢＢの薬物透過率が低下するため、その透過率は０．２５％まで低下した。この結果は、本発明により提供されるグルタチオンキャリアが、グルタチオンリガンド／トランスポーターの結合により担体介在型トランスサイトーシス（ＣＭＴ）または受容体介在型トランスサイトーシス（ＲＭＴ）が誘発されることでＢＢＢを通過する、ということを証明している。
【００５８】
ｍｅｔ−エンケファリンリポゾームのホットプレート試験
５５℃のホットプレート上で実験用マウスに静脈注射をしたのち、熱誘発の疼痛に対する鎮痛効果を評価した。図２を参照されたい。グルタチオンを含まないキャリア（比較例３）の場合、注射９０分後、その投与量３０ｍｇ／ｋｇの最大可能効果（maximal possible effect、ＭＰＥ）は１３％であった。グルタチオン含有キャリア（実施例５）の場合は、注射６０分後、その投与量３０ｍｇ／ｋｇの最大可能効果（ＭＰＥ）は３７％であった。図３を参照されたい。曲線下面積（ＡＵＣ）によると、実施例５は、比較例３の３．２倍、そしてｍｅｔ−エンケファリン溶液の１４．７倍の鎮痛効果を実現していた。よって薬物は、グルタチオンリガンドを有するキャリアに安全に運ばれてＢＢＢを通過し、鎮痛効果を発揮することができる。
【００５９】
ガバペンチンリポゾームのホットプレート試験
５５℃のホットプレート上で実験用マウスに静脈注射をしたのち、熱誘発の疼痛に対する鎮痛効果を評価した。図４を参照されたい。グルタチオンを含まないキャリア（比較例４）の場合、注射２７０分後、その投与量１０ｍｇ／ｋｇの最大可能効果（ＭＰＥ）は３．１５％であった。グルタチオン含有キャリア（実施例７）の場合は、注射１８０分後、その投与量１０ｍｇ／ｋｇの最大可能効果（ＭＰＥ）が４．４７％であった。図５を参照されたい。曲線下面積（ＡＵＣ）によると、実施例７は、比較例４（ｐ＜０．００５）の鎮痛効果の１．５４倍、そしてグルタチオン溶液（ｐ＜０．０００５）の２．７６倍であった。よって薬物は、グルタチオンリガンドを有するキャリアに安全に運ばれてＢＢＢを通過し、鎮痛効果を発揮することができる。
【００６０】
ｍｅｔ−エンケファリンリポゾームの血清安定性試験
実施例５で作製したキャリアとウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とを１：１（ｖ／ｖ）で混合して溶液を作った。３７℃の水浴中に０、１、２および４時間それぞれ放置したのちに、その溶液をゲル濾過（Sephrox CL-4B、７５ｍｍ×１２０ｍｍ）によって分析し、次いでリポゾーム中におけるｍｅｔ−エンケファリンの残留濃度を測定した。図６にその結果が示されている。
【００６１】
上記結果から、リポゾーム中のｍｅｔ−エンケファリン濃度は９３％以上を維持していることがわかる。一方、フリーｍｅｔ−エンケファリンの残留濃度は２％まで低下している。本発明により提供されるキャリアが高血清耐性を有することは明らかである。
【００６２】
本発明を実施例により、そして好ましい実施形態の点から説明したが、本発明はこれには限定されないと理解されなければならない。それとは反対に、（当業者には明らかであるような）各種変更や類似のアレンジメントがカバーされるよう意図されている。よって、添付の特許請求の範囲は、かかる変更や類似のアレンジメント全てが含まれるように、最も広い解釈が与えられるべきである。
【符号の説明】
【００６３】
１０  デリバリーシステム
２０  リポゾーム
３０  リガンド
４０  ビタミンＥ誘導体またはリン脂質誘導体を含む部分（moiety）
５０  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール誘導体
６０  グルタチオン（ＧＳＨ）またはグルタチオン誘導体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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