(57)【要約】【課題】植物体の細胞壁の厚みを増大させる。【解決手段】糖ヌクレオチド輸送体１３０をコードする遺伝子を植物体に組み込み、形質転換により、糖ヌクレオチド１４０を細胞質基質からゴルジ体１２０の内腔まで輸送させて、植物体の細胞壁の厚みを増大させる。糖ヌクレオチド１４０は、例えば、ＵＤＰ１４１とガラクトース１４３とを有するＵＤＰ−ガラクトースである。糖ヌクレオチド輸送体１３０はＵＤＰ−ガラクトース輸送体であり、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴ１である。細胞壁の厚みが増大した形質転換植物体は、例えばエタノールを得るためのセルロース系バイオマス資源として有効利用できる。【選択図】図３
2010051252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖ヌクレオチド輸送体をコードする遺伝子を植物体に組み込み、前記植物体を形質転換することにより、糖ヌクレオチドを細胞質基質からゴルジ体の内腔まで輸送させて、前記植物体の細胞壁の厚みを増大させる、
ことを特徴とする、植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項２】
前記糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、及び、ＵＤＰ−グルコースのうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１記載の植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項３】
前記糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ガラクトースであり、
前記糖ヌクレオチド輸送体はＵＤＰ−ガラクトース輸送体である、
ことを特徴とする請求項１記載の植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項４】
前記ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴである、
ことを特徴とする請求項３記載の植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項５】
前記ｈＵＧＴは、ｈＵＧＴ１及びｈＵＧＴ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項４記載の植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項６】
前記植物体は、タバコ植物体である、
ことを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項７】
前記タバコ植物体は、バレー種、黄色種、及び、東洋種のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項６記載の植物体の細胞壁厚み増大方法。
【請求項８】
糖ヌクレオチド輸送体をコードする遺伝子を植物体に組み込み、前記植物体を形質転換することにより、糖ヌクレオチドを細胞質基質からゴルジ体の内腔まで輸送させて、植物体の細胞壁の厚みを増大することのできる形質転換植物体としての植物バイオマスを準備する、植物バイオマス準備工程と、
前記植物バイオマス準備工程で得られた形質転換植物体のセルロース系バイオマス原料を糖化する糖化工程と、
前記糖化工程で得られた糖から、微生物を用いてアルコールを生産する発酵工程と、を有する、
ことを特徴とする、セルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項９】
前記糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、及び、ＵＤＰ−グルコースのうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項８記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１０】
前記糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ガラクトースであり、
前記糖ヌクレオチド輸送体はＵＤＰ−ガラクトース輸送体である、
ことを特徴とする請求項８記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１１】
前記ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴである、
ことを特徴とする請求項１０記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１２】
前記ｈＵＧＴは、ｈＵＧＴ１及びｈＵＧＴ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１１記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１３】
前記植物体は、タバコ植物体である、
ことを特徴とする請求項８乃至１２の何れか１項に記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１４】
前記タバコ植物体は、バレー種、黄色種、及び、東洋種のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１３記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１５】
前記アルコールは、エタノールである、
ことを特徴とする請求項８乃至１４の何れか１項に記載のセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法。
【請求項１６】
糖ヌクレオチド輸送体をコードする遺伝子が組み込まれることにより形質転換され、糖ヌクレオチドが細胞質基質からゴルジ体の内腔まで輸送されることにより、細胞壁の厚みが増大している、
ことを特徴とする形質転換植物体。
【請求項１７】
前記糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、及び、ＵＤＰ−グルコースのうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１６記載の形質転換植物体。
【請求項１８】
前記糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ガラクトースであり、
前記糖ヌクレオチド輸送体はＵＤＰ−ガラクトース輸送体である、
ことを特徴とする請求項１６記載の形質転換植物体。
【請求項１９】
前記ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴである、
ことを特徴とする請求項１８記載の形質転換植物体。
【請求項２０】
前記ｈＵＧＴは、ｈＵＧＴ１及びｈＵＧＴ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１９記載の形質転換植物体。
【請求項２１】
前記形質転換植物体は、タバコ植物体である、
ことを特徴とする請求項１６乃至２０の何れか１項に記載の形質転換植物体。
【請求項２２】
前記タバコ植物体は、バレー種、黄色種、及び、東洋種のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項２１記載の形質転換植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体の細胞壁の厚みを増大させる方法、細胞壁の厚みが増大している形質転換植物体、及び、そのような形質転換植物体を利用したセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスは、光合成生物が太陽光のエネルギーを利用して二酸化炭素と水とから合成した有機物、及びそれらが他の生物によって変換されて生成した有機物の総体である。
【０００３】
バイオマスは、有機物の生成に関与した生物が生育できる環境を維持することにより、繰り返し再生産することができる。
【０００４】
また、バイオマスを燃焼させて熱エネルギーを得る場合でも、発生する二酸化炭素を再び同じ有機物として固定することができるため、地球温暖化の原因とされる大気中の二酸化炭素濃度の上昇を引き起こさない。
【０００５】
近年、植物バイオマスからのエネルギー生産が注目されており、例えば自然界に豊富に存在するセルロース系のバイオマス資源からエタノール等のアルコールに代表されるバイオ燃料を生成する技術開発が進められている。
【０００６】
セルロース系バイオマスとしては、繊維系バイオマス、木質系バイオマス 、又は一般的には食用に適さない植物に由来する材料などがあり、セルロース 、ヘミセルロース、リグニン等から構成される。
【０００７】
特許文献１や特許文献２には、セルロース系バイオマス資源からエタノールを製造するプロセスとして、セルロース系バイオマスを超臨界または亜臨界水処理して糖類を生産し、その後、酵素反応によりエタノールを製造する技術が記載されている。
【０００８】
しかし、このような技術ではバイオ燃料の効率的な抽出は不十分であり、カーボンニュートラルな燃料源としての技術的期待に応えることは困難である。
【０００９】
一方、ヒトのＵＤＰ−ガラクトース輸送体遺伝子を導入したタバコ植物体については、植物高、葉数、葉面積、クロロフィル含有量が増加するうえ、さらに、葉及び茎の物理的強度も増加することが、非特許文献１に記載されているが、植物体の細胞構造については未だ明らかにされていない。
【特許文献１】特開２００３−２１２８８８号公報
【特許文献２】特開２００５−２０６４６８号公報
【非特許文献１】ヒトＵＤＰガラクトース輸送体（ｈＵＧＴ１）で形質転換したタバコ植物体の性状  日本生物工学会平成１８年度大会（大阪）の予稿集  ２００６年９月１２日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、バイオ燃料の効率的な抽出等を可能とする形質転換植物体を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、植物体の細胞壁の厚みを増大させる方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、細胞壁の厚みを増大させた形質転換植物体を利用する、セルロース系バイオマスからのアルコール製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、この発明の第１の観点に係る植物体の細胞壁厚み増大方法は、
糖ヌクレオチド輸送体をコードする遺伝子を植物体に組み込み、前記植物体を形質転換することにより、糖ヌクレオチドを細胞質基質からゴルジ体の内腔まで輸送させて、前記植物体の細胞壁の厚みを増大させる、ことを特徴とする。
【００１２】
また、前記糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、及び、ＵＤＰ−グルコースのうち少なくとも何れか一つとする、ことも可能である。
【００１３】
また、前記糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ガラクトースであり、
前記糖ヌクレオチド輸送体はＵＤＰ−ガラクトース輸送体である、ことも可能である。
【００１４】
また、前記ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴである、ことも可能である。
【００１５】
また、前記ｈＵＧＴは、ｈＵＧＴ１及びｈＵＧＴ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００１６】
また、前記植物体は、タバコ植物体である、ことも可能である。
【００１７】
また、前記タバコ植物体は、バレー種、黄色種、及び、東洋種のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００１８】
上記目的を達成するため、この発明の第２の観点に係るセルロース系バイオマスからのアルコール製造方法は、
糖ヌクレオチド輸送体をコードする遺伝子を植物体に組み込み、前記植物体を形質転換することにより、糖ヌクレオチドを細胞質基質からゴルジ体の内腔まで輸送させて、植物体の細胞壁の厚みを増大することのできる形質転換植物体としての植物バイオマスを準備する、植物バイオマス準備工程と、
前記植物バイオマス準備工程で得られた形質転換植物体のセルロース系バイオマス原料を糖化する糖化工程と、
前記糖化工程で得られた糖から、微生物を用いてアルコールを生産する発酵工程と、を有する、ことを特徴とする。
【００１９】
また、前記糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、及び、ＵＤＰ−グルコースのうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２０】
また、前記糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ガラクトースであり、
前記糖ヌクレオチド輸送体はＵＤＰ−ガラクトース輸送体である、ことも可能である。
【００２１】
また、前記ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴである、ことも可能である。
【００２２】
また、前記ｈＵＧＴは、ｈＵＧＴ１及びｈＵＧＴ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２３】
また、前記植物体は、タバコ植物体である、ことも可能である。
【００２４】
また、前記タバコ植物体は、バレー種、黄色種、及び、東洋種のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２５】
また、前記アルコールは、エタノールである、ことも可能である。
【００２６】
上記目的を達成するため、この発明の第３の観点に係る形質転換植物体は、
糖ヌクレオチド輸送体をコードする遺伝子が組み込まれることにより形質転換され、糖ヌクレオチドが細胞質基質からゴルジ体の内腔まで輸送されることにより、細胞壁の厚みが増大している、ことを特徴とする。
【００２７】
また、前記糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、及び、ＵＤＰ−グルコースのうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２８】
また、前記糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ガラクトースであり、
前記糖ヌクレオチド輸送体はＵＤＰ−ガラクトース輸送体である、ことも可能である。
【００２９】
また、前記ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、ｈＵＧＴである、ことも可能である。
【００３０】
また、前記ｈＵＧＴは、ｈＵＧＴ１及びｈＵＧＴ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００３１】
また、前記形質転換植物体は、タバコ植物体である、ことも可能である。
【００３２】
また、前記タバコ植物体は、バレー種、黄色種、及び、東洋種のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る植物体の細胞壁厚み増大方法において用いられる形質転換植物体は、細胞壁の厚みが従来の植物体と比較して極めて増大しており、細胞壁中のセルロース含有量が多く、植物バイオマスとして優れている。そのため、本発明に係る形質転換植物体を利用すれば、効率的にエタノール等のアルコールが得られ、各種燃料や化学原料等を極めて効率よく製造できる。また、燃料から放出される二酸化炭素は、もともと植物体が光合成により取り込んだものなので、地球温暖化防止に役立ち、さらには、本発明に係る形質転換植物体を植物バイオマスとして利用することにより、サトウキビやとうもろこし等の食用植物の植物バイオマスとしての利用を相対的に減らすことにもなる。このように、本発明から得られる利益は計り知れない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（植物体の細胞壁厚み増大方法及び形質転換植物体）
本実施形態に係る植物体の細胞壁厚み増大方法は、図１に示されるように、糖ヌクレオチド輸送体（Nucleotide-sugar  transporter（ＮＳＴ））１３０をコードする遺伝子を植物体に組み込むことにより、糖ヌクレオチド１４０を細胞質基質（Cytosol）からゴルジ体１２０の内腔まで積極的に輸送させることが可能となる。
【００３５】
本発明者は、糖ヌクレオチド輸送体１３０にて糖ヌクレオチド１４０を、細胞質基質からゴルジ体１２０の内腔まで輸送させた植物体の細胞構造のうち、その細胞壁の厚みが増大しているという新知見に基づいて本発明を完成させた。
【００３６】
糖ヌクレオチド１４０は、例えば、ＵＤＰ（ウリジンジホスフェート）１４１とガラクトース（Gal）１４３とを有するＵＤＰ−ガラクトースである。また、例えば、ＵＤＰ１４１とＮ−アセチルグルコサミン(GlcNAc)１４２とを有するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃである。
【００３７】
また、糖ヌクレオチド１４０は、例えば、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−フコース、ＵＤＰ−アラビノピラノース、ＵＤＰ−アラビノフラノース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−アピオース、若しくは、ＵＤＰ−グルコースとすることも可能である。
【００３８】
糖ヌクレオチド輸送体１３０は、例えばヒトの糖ヌクレオチド輸送体である。
【００３９】
糖ヌクレオチド１４０には種々の分子種が存在するが、それぞれの糖ヌクレオチド１４０に特異的な糖ヌクレオチド輸送体１３０が存在する。なお、ＵＤＰ−グルコースは、例えばＵＤＰ−ガラクトース輸送体により、ゴルジ体の内腔まで輸送されると考えられうる。
【００４０】
糖ヌクレオチド輸送体１３０は、例えばＵＤＰ−ガラクトース輸送体である。また例えばＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体である。
【００４１】
ＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子は、例えば、ｈＵＧＴ１である。ｈＵＧＴ１は、図２に示されるように、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーのモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター）をプロモーターとし、Ｎｏｓｔ（ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター）をターミネーターとする。ＨＡはタグであり、抗体で検出するためのものである。
【００４２】
糖ヌクレオチド１４０は、ゴルジ体膜を透過できない。そのため、糖ヌクレオチド輸送体１３０が、糖ヌクレオチド１４０をゴルジ体１２０の内腔へ運び込む。なお、小胞体１１０の内腔へ運び込むことも可能である。
【００４３】
図３（ａ）に示されるように、ゴルジ体１２０の内腔へ運び込まれた糖ヌクレオチド１４０は、例えばＵＤＰ（ウリジンジホスフェート）１４１とガラクトース（Gal）１４３とに別れ、ガラクトース（Gal）１４３は糖転移酵素によって糖タンパク質、糖脂質、多糖類等の糖鎖合成の糖供与体として使用される。
【００４４】
図３（ｂ）に示されるように、糖ヌクレオチド輸送体１３０は、Ｎ末端とＣ末端とをゴルジ体１２０のゴルジ膜の細胞質基質側に露出させた状態で、糖ヌクレオチド１４０をゴルジ体１２０の内腔へ運び込む役割を果たす。
【００４５】
なお、糖ヌクレオチド輸送体１３０は小胞体１１０の内腔において、グルクロン酸抱合の基質であるＵＤＰ−グルクロン酸を供給している。
【００４６】
ゴルジ体１２０の内腔に運び込まれたＵＤＰ（ウリジンジホスフェート）１４１は、ＵＭＰとしてゴルジ体１２０の内腔外に排出される。
【００４７】
ここで細胞壁とは、植物細胞の外側を取り囲んでいる厚さ数μｍの構造であり、その内側にある細胞膜とは区別されるものである。
【００４８】
細胞壁を増大させる植物体は特に限定されるものではないが、バイオマスの生産において効率が良いため、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ属のタバコ植物体が好適に使用される。
【００４９】
タバコ植物体としては、例えば、バレー種、黄色種、東洋種等を使用することができる。なお、一般には、バレー種のニコチンレベルが最も高く、黄色種、東洋種がこれに続く。
【００５０】
（セルロース系バイオマスからのアルコール製造方法）
本実施形態に係るセルロース系バイオマスからのアルコールの製造方法は、糖ヌクレオチド輸送体１３０をコードする遺伝子を植物体に組み込み、前記植物体を形質転換することにより、糖ヌクレオチド１４０を細胞質基質からゴルジ体１２０の内腔まで輸送させて、植物体の細胞壁の厚みを増大することのできる形質転換植物体としての植物バイオマスを準備する、植物バイオマス準備工程と、植物バイオマス準備工程で得られた形質転換植物体のセルロース系バイオマス原料を糖化する糖化工程と、糖化工程で得られた糖から、微生物を用いてアルコールを生産する発酵工程と、を有する。
【００５１】
まず、植物バイオマス準備工程にて、糖ヌクレオチド輸送体１３０をコードする遺伝子を植物体に組み込み、形質転換することにより、糖ヌクレオチド１４０を細胞質基質からゴルジ体１２０の内腔まで輸送させて、細胞壁の厚みが増大している形質転換植物体としての植物バイオマスを準備する。
【００５２】
形質転換の対象となる植物体は、特に限定されるものではないが、例えばバレー種、黄色種、東洋種等のタバコ植物体を用いることができる。このようなタバコ植物体に、例えばＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードするｈＵＧＴ１を組み込むことにより、ＵＤＰ−ガラクトース等をゴルジ体内腔まで輸送させる。例えばｈＵＧＴ１と呼ばれるＵＤＰガラクトース輸送体をコード化するヒト遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＡＡ９５６１５番）は、ヒト前立腺ｃＤＮＡ（マラソンレディｄＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅される。
【００５３】
こうして植物バイオマス準備工程で得られた植物体の細胞壁にはセルロースが多量に含有されている。糖化工程ではこの植物体の細胞壁に含有されるセルロースを糖化する。
【００５４】
なお、セルロース以外の成分であるヘミセルロースやリグニン等が含まれていても良い。
【００５５】
糖化工程では、特に限定されるものではないが、例えば酵素を使用してセルロースを糖化することができる。酵素としては特に限定されるものではないが、例えばセルラーゼ、セロビアーゼ等を使用することができる。
【００５６】
酵素の使用量は、特に制限はなく、例えば、植物体の細胞壁１ｇに対して、０．０１〜１０ｍｇとすることができる。
【００５７】
酵素糖化の温度は、特に制限はなく、例えば、２０℃〜６０℃とすることができる。
【００５８】
酵素糖化のｐＨとしては、特に制限はなく、例えば、ｐＨ３．５〜ｐＨ７．０とすることができる。
【００５９】
なお、糖化工程では、セルロースを酸で加水分解することにより、糖を生成させることも可能である。
【００６０】
こうして糖化工程では、セルロース由来の糖であるグルコースを含む糖液を得ることができる。また、その他にも得られる糖液は、ヘミセルロース由来の糖を含んでいてもよい。へミセルロース由来の糖は、例えば、キシロース、アラビノースといった五単糖や、グルコース、ガラクトース、マンノースといった六単糖が挙げられる。
【００６１】
発酵工程では、糖化工程で得られた糖を微生物にてアルコールへ発酵させる。
【００６２】
微生物は、特に限定されるものではないが、例えば酵母等のアルコール発酵微生物を使用することができる。
【００６３】
発酵工程における酵母の使用量、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等については、特に制限はなく、例えば、アルコール発酵に供する糖の量、使用する酵母の種類等に応じて、適宜選択することができる。
【００６４】
また、得られるアルコールとしては、エタノールやメタノール等の種々のアルコールを製造することができる。中でもエタノールは、燃料用エタノール 、工業用エタノール等として好適に利用可能である。燃料用エタノールは近年特に、ガソリンに混合し、環境に優しい自動車燃料として使用することが期待されている。
【００６５】
（その他の実施形態）
上述の実施形態において、糖化工程を経由してアルコールを製造したが、このような実施形態に限定されず、バクテリアを用いて、セルロースから直接アルコールを生産することも可能である。バクテリアとしては、例えば好熱性嫌気性菌のクロストリジウム・サーモセラムや、常温嫌気性菌のルミノコッカス・アルブス等を使用することができる。
【００６６】
また、上述の糖化工程にて得られた糖を、発酵させて、乳酸を得ることも可能である。乳酸の製造方法において、前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、例えば、糖液に乳酸菌等の乳酸発酵微生物を添加して、乳酸発酵を行わせることができる。乳酸菌としては、特に制限はなく、例えば、ラクトバチルス・マニホティヴォランス、ラクトバチルス・プランタラム等を使用できる。
【実施例】
【００６７】
〔植物体の細胞壁の増大〕
バイナリープラスミドベクターｐＢＩＮ１９のT-DNAを制限酵素HindIIIとEcoRIで切断し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ−、ｈＵＧＴ１遺伝子、ＨＡタグ、Ｎｏｓｔターミネーターの順で繋いだＤＮＡ断片(35SP-hUGT1-HA-NosT)を挿入して、プラスミドベクターｐＢＩＮ−ｈＵＧＴ１を作製した。このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株に導入した。
【００６８】
１ヶ月間無菌培養したタバコ植物（ニコチアナ・タバカムＳＲ−１品種）の葉から約５ｍｍ角の切片を切り出し、一晩培養したｐＢＩＮ−ｈＵＧＴ１を保有するアグロバクテリウムの培養液につけて接種し、35SP-hUGT1-HA-NosTを含むT-DNAをタバコ細胞の染色体に組み込ませた。
【００６９】
この形質転換細胞を植物ホルモンのサイトカイニンを１ｍｇ／Ｌ、オーキシンを０．１ｍｇ／Ｌ含むムラシゲ・スクーグ培地で１ヶ月間培養して、実施例としてのｈＵＧＴ１形質転換植物体（ｈＵＧＴ１−形質転換植物体）を再生させた。
【００７０】
比較例として35SP-hUGT1-HA-NosT断片を含まないｐＢＩＮ１９で形質転換したタバコ植物体（ｐＢＩＮ１９−形質転換対照植物体）を作製した。
【００７１】
なお、再生された個々の形質転換植物体では、ｈＵＧＴ１が組み込まれた場所により遺伝子の発現量が異なるので、ｈＵＧＴ１による効果が異なる。再生された３０系統以上の形質転換植物体のうち、特にｈＵＧＴ１の効果が顕著であったｈＵＧＴ１−２、ｈＵＧＴ１−４、ｈＵＧＴ１−１４、ｈＵＧＴ１−２３（いずれも再生個体の系統名）を実施例として選択した。
【００７２】
ｐＢＩＮ１９タバコ植物体の葉と、ｈＵＧＴ１にてヒトＵＤＰ−ガラクトースをゴルジ体内腔へ輸送させたタバコ植物体（ｈＵＧＴ１−形質転換植物体）の葉と、をそれぞれ１ｇ切り取り、６０℃の空気中にて２４時間乾燥させて乾燥重量サンプルとし、その重量を測定した。
【００７３】
また、ｐＢＩＮ１９タバコ植物体の葉と、ｈＵＧＴ１−形質転換植物の葉と、をそれぞれ１ｇ採取し、各々のサンプルを冷やした２５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でテフロンホモジナイザー（テフロンは登録商標）を用いて十分に摩砕し、２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離後、沈殿を同じ緩衝液中で再度摩砕し、遠心分離を繰り返して沈殿を得た。さらに、沈殿を冷水に懸濁し、同じ遠心分離を行った。この懸濁と遠心分離を再度繰り返した。
【００７４】
沈殿を１０倍量のメタノールに懸濁し、８０℃で３０分間保温した。その後、２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離後、沈殿を再度メタノールに懸濁し遠心分離を行った。沈殿を冷水に懸濁し、２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離を行い、メタノールを除去した。
【００７５】
沈殿を１０倍量のα−amylase 溶液（０．１ｍｌ  α−amylase  TypeＩ−Ａ〔シグマ−アルドリッチ、A6255-10MG〕を１００ｍｌの６ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液[ｐＨ７．０]に添加）に懸濁し、２８℃で２４時間デンプン消化を行った。２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離のあと、沈殿を２回冷水への懸濁と遠心分離で洗浄し、細胞壁を得た。これを細胞壁ポリマーサンプルとした。
【００７６】
少なくとも３個のサンプルから標準偏差を求めて、比較例に係るタバコ植物体の葉と実施例に係るタバコ植物体の葉とについて、それぞれ乾燥重量と、細胞壁ポリマーとを測定した。この標準偏差（単位は、乾燥後ｍｇ／乾燥前ｇ、細胞壁ポリマーｍｇ／乾燥前ｇ）の結果を表１に示す。なお、有意確率ａＰ＜０．０１である。
【００７７】
【表１】
2010051252.tif 000003
【００７８】
実施例に係るタバコ植物体の葉は、コントロールと比較して、いずれも細胞壁ポリマーの合計が増大しており、細胞壁の厚みが増大していることが実証された。
【００７９】
次に、ｐＢＩＮ１９タバコ植物体の葉と、ｈＵＧＴ１−形質転換植物の葉とのそれぞれについて、細胞壁中に含有される糖の分類解析を行った。
【００８０】
サンプルの細胞壁ポリマーは、ピリジン／メタノールと無水酢酸との混合媒体にてアセチル化をした後、４Ｍのトリフロオロ酢酸溶液中で加水分解を行った。
【００８１】
アセチル化された糖類はＡＢＥＥ（ｐ-Amino  benzoic  ethyl  ester）にてラベル化された。ラベル化された糖類は高速液体クロマトグラフィーにて分析された。条件は、移動相にて、０．２Ｍ臭化カリウムバッファ（ｐＨ８．９）、アセトニトリル溶媒（９３：７，ｖ／ｖ）、フローレイト１．０ｍｌ／ｍｉｎ、励起波長３０５ｎｍ，蛍光波長３６０ｎｍの蛍光検出器であった。標準偏差（単位は、ｍｇ／乾燥前ｇ）の結果を表２に示す。なお、有意確率ａＰ＜０．０５、有意確率ｂＰ＜０．０１である。
【００８２】
【表２】
2010051252.tif 000004
【００８３】
ＧａｌＡはガラクツロン酸、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｇｌｕはグルコース、Ａｒａはアラビノース、Ｘｙｌはキシロース、Ｒｈａはラムノースである。ここで、括弧内の割合は、グルコースを除いた合計に対する割合である。標準偏差は少なくとも３個のサンプルから求めた。
【００８４】
実施例に係るタバコ植物体の葉は、コントロールと比較して、いずれもグルコース含有割合が増大しており、また、その他の糖類においても増大していることが判明した。
【００８５】
次に、ｐＢＩＮ１９タバコ植物体の葉と、ｈＵＧＴ１−形質転換植物体の葉とのそれぞれについて、細胞壁中のペクチンと、ヘミセルロースＩと、ヘミセルロースＩＩと、において、糖の分類解析を行った。
【００８６】
サンプルの細胞壁ポリマーは、ピリジン／メタノールと無水酢酸との混合媒体にてアセチル化をした後、４Ｍのトリフロオロ酢酸溶液中で加水分解を行った。
【００８７】
アセチル化された糖類はＡＢＥＥにてラベル化された。ラベル化された糖類は高速液体クロマトグラフィーにて分析された。条件は、移動相にて、０．２Ｍ臭化カリウムバッファ（ｐＨ８．９）、アセトニトリル溶媒（９３：７，ｖ／ｖ）、フローレイト１．０ｍｌ／ｍｉｎ、励起波長３０５ｎｍ，蛍光波長３６０ｎｍの蛍光検出器であった。標準偏差（％）の結果を表３に示す。なお、有意確率ａＰ＜０．０５である。標準偏差は少なくとも３個のサンプルから求めた。
【００８８】
【表３】
2010051252.tif 000005
【００８９】
ヘミセルロースＩを見ると、実施例に係るタバコ植物体の葉は、コントロールと比較して、いずれもグルコース含有割合が増大していることが判明した。
【００９０】
次に、ｐＢＩＮ１９タバコ植物体の葉の細胞壁と、ｈＵＧＴ１−形質転換植物体の葉の細胞壁とのそれぞれについての光学顕微鏡写真にて比較した。
【００９１】
比較例に係るタバコ植物体及び実施例に係るタバコ植物体は、それぞれ２月間土壌で栽培したものであった。これらのタバコ植物体の茎の第５番目の節間をプラントミクロトーム（日本医科器械社製）で２０μｍの厚さで輪切りにした切片を、β-Ｄ-グルコシル・ヤリブ（glucosyl  Yariv)試薬(Biosupplies Australia,  Pty.Ltd.,  Victoria, Australia)を滴下してアラビノガラクタンを染色した。対照としては、切片をα-Ｄ-ガラクトシル・ヤリブ（galactosyl  Yariv）試薬(Biosupplies  Australia)を用いた。そして、３０％(ｖ/ｖ)グリセリン液を一滴たらして、スライドグラスに載せ、光学顕微鏡下(ニコンDS-L1)で組織染色を観察した。
【００９２】
比較例に係るタバコ植物体（ｐＢＩＮ１９−形質転換対照植物）の葉の細胞壁を、図４（ａ）、（ｃ）、（ｅ）に示す。実施例に係るタバコ植物体（ｈＵＧＴ１−形質転換植物）の葉の細胞壁を、図４（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）に示す。
【００９３】
図４（ａ）、（ｂ）は、α-galactosyl  Yariv試薬による染色されない対照染色である。図４（ｃ）、（ｄ）は、β-glucosyl  Yariv試薬によるアラビノガラクタンタンパク質の赤色染色である。図４（ｅ）、（ｆ）は、β-glucosyl  Yariv試薬によって赤色染色された組織の高倍率観察である。
【００９４】
スケールバーは、図４（ａ）から（ｄ）までは１００μｍであり、図４（ｅ），（ｆ）は５０μｍである。図４中において、ｉｃｐは、inner  cortical  parenchyma（内皮層柔組織)である。ｅｐｐは、externalphloem  arenchyma(外師部組織）である。ｃａは、cambium(形成層）である。ｘｐは、xylem  parenchyma(木部柔組織)である。ｉｐは、internal  phloem(内師部組織)である。
【００９５】
図４から明らかなように、実施例に係るタバコ植物体の葉は、コントロールと比較して、細胞壁の厚みが増大していることが実証された。
【００９６】
次に、ｐＢＩＮ１９タバコ植物体の葉の細胞壁と、ｈＵＧＴ１−形質転換植物体の葉の細胞壁とのそれぞれについて、透過型電子顕微鏡写真にて比較した。
【００９７】
比較例に係るタバコ植物体の葉と、実施例に係るタバコ植物体の葉とをそれぞれ小片に切り、真空ポンプによる減圧下で前固定液(０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、０．０１Ｍ塩化カルシウム、４％[ｖ/ｖ] ホルマリン、５％[ｖ/ｖ]グルタルアルデヒド)につけ、その後一晩放置した。
【００９８】
次に、equently  washed  with１０．５及び１．８％(ｗ/ｖ)のショ糖を含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で順次洗浄した。サンプルは１．５％(ｗ/ｖ)酸化オスミウムを含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中にて氷上で２時間固定し、その後５０、７０、８０、９０、９５、１００％（ｖ/ｖ）に順次つけることによって脱水し、エタノール：酸化プロピレン(1：1、ｖ/ｖ)に一度つけ、Epon８１２樹脂中に６０℃で２４時間つけることで、樹脂包埋した。
【００９９】
ダイアモンドナイフを装着したウルトラミクロトーム（Ultramicrotome  Reichert-Jung,Depew,NY)で切り出した約７０ｎｍの超薄切片を０．２％(ｗ/ｖ) ウーロン茶抽出物で６０分間染色し、クエン酸鉛で５分間処理した後、電子顕微鏡（JEM  1200EX  transmission  electron  microscope[JEOL])で８０ｋＶで電子顕微鏡観察した。
【０１００】
比較例に係るタバコ植物体（ｐＢＩＮ１９−形質転換対照植物）の葉の細胞壁を、図５（ａ）、（ｃ）に示し、実施例に係るタバコ植物体（ｈＵＧＴ１−形質転換植物系統２３）の葉の細胞壁を、図５（ｂ）、（ｄ）に示す。図５（ａ）、（ｂ）は、いずれも葉の表側の表皮細胞である。図５（ａ）において四角で囲んでいる部分の拡大図が図５（ｃ）であり、図５（ｂ）において四角で囲んでいる部分の拡大図が図５（ｄ）である。
【０１０１】
ｃｗは、cellwall(細胞壁)である。ｖは、vacuole(液胞)である。ｃｐは、chloroplast(葉緑体)である。図５（ｃ）、（ｄ）における矢印は細胞壁を示す。
【０１０２】
スケールバーは、図５（ａ）、（ｂ）が２μｍであり、図５（ｃ）、（ｄ）が０．５μｍである。比較例に係るタバコ植物体の葉の細胞壁は、０．２μｍであったが、実施例に係るタバコ植物体の葉の細胞壁は、０．５μｍであった。
【０１０３】
図５から明らかなように、実施例に係るタバコ植物体の葉は、コントロールと比較して、細胞壁の厚みが増大していることが判明した。
【０１０４】
〔セルロース系バイオマス原料からのアルコール生産〕
セルロース系バイオマス原料としては、比較例では、ｐＢＩＮ１９形質転換コントロールタバコ植物の乾燥葉粉末０．２５ｇ（新鮮葉重量５．４７５ｇ）を用いた。実施例では、ｈＵＧＴ１形質転換タバコ植物系統２３の乾燥葉粉末０．２５ｇ（新鮮葉重量１．８７５ｇ）を用いた。
【０１０５】
それぞれのサンプルを冷やした２５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液(ｐＨ７．０)中でテフロンホモジナイザー（テフロンは登録商標）を用いて十分に摩砕し、２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離後、沈殿を同じ緩衝液中で再度摩砕し、遠心分離を繰り返して沈殿を得た。
【０１０６】
さらに、沈殿を冷水に懸濁し、同じ遠心分離を行った。この懸濁と遠心分離を再度繰り返した。沈殿を１０倍量のメタノールに懸濁し、８０℃で３０分間保温した。
【０１０７】
その後、２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離後、沈殿を再度メタノールに懸濁し遠心分離を行った。沈殿を冷水に懸濁し、２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離を行い、メタノールを除去した。
【０１０８】
沈殿を１０倍量のα−amylase 溶液(０．１ｍｌα−amylase  Type  Ｉ−Ａ[シグマ−アルドリッチ、A6255-10MG]を１００ｍｌの６ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液[ｐＨ７．０]に添加)に懸濁し、２８℃で２４時間デンプン消化を行った。
【０１０９】
２０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離のあと、沈殿を２回冷水への懸濁と遠心分離で洗浄し、細胞壁を得た。 
【０１１０】
５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５）を取得した細胞壁に加え、１００℃で４時間処理し、１０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。
【０１１１】
さらに、沈殿を２０ｍＭのＥＤＴＡ溶液 (２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５)に懸濁し、１００℃で４時間処理し、１０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。
【０１１２】
次に、沈殿を５％ＫＯＨ溶液(５％[ｗ/ｗ]ＫＯＨ、１％[ｗ/ｖ]水酸化ホウ素ナトリウム)に懸濁し、２８℃で２４時間処理した１０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。
【０１１３】
さらに、２４％ＫＯＨ溶液(２４％[ｗ/ｗ]ＫＯＨ、１％[ｗ/ｖ]水酸化ホウ素ナトリウム)に懸濁し、２８℃で２４時間処理した１０００×ｇで１０分間の遠心分離を行い、沈殿をセルロース画分とした。
【０１１４】
このセルロース画分の全量を１６０ｍｌのセルラーゼ（セルラーゼオノヅカＲＳ）に懸濁し、５０℃で３日間消化し、グルコースを遊離させた。
【０１１５】
グルコース量は、下記表４に示すようなグルコース分析キット（シグマ−アルドリッチ、GAHK20）で定量した。
【０１１６】
【表４】
2010051252.tif 000006
【０１１７】
次に、この反応液を３５００回転、１０分間の遠心分離で分離後、グルコースを含む酵素液を回収した。この液にドライイースト２ｇを加え、十分に懸濁後、４０℃で２時間発酵させ、エタノールを生産させた。
【０１１８】
エタノール量は、下記表５に示すようなエタノールテストキット（ロシュ）で定量した。
【０１１９】
【表５】
2010051252.tif 000007
【０１２０】
その結果、新鮮なｈＵＧＴ１形質転換タバコ植物の葉からは、新鮮なコントロールのｐＢＩＮ１９形質転換植物の葉の３．６９倍量のグルコースが回収され、３．３７倍量のエタノールが生産できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の形質転換植物体から、バイオエタノール等を抽出し、その抽出物は、燃料、化学原料、芳香剤、化粧品、染色剤等の様々な産業分野で利用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】糖ヌクレオチドをＮＳＴにてゴルジ体内腔へ輸送する様子を説明する図である。
【図２】ｈＵＧＴ１を説明する図である。
【図３】ＮＳＴを介して糖ヌクレオチドがゴルジ体内腔へ侵入した状態を説明する図であり、そのうち（ａ）はゴルジ体内腔を説明する物であり、（ｂ）はゴルジ体膜を説明するものである。
【図４】細胞壁の写真を説明する図であり、そのうち（ａ）、（ｃ）、（ｅ）はコントロールであり、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）は実施例である。
【図５】細胞壁の写真を説明する図であり、そのうち（ａ）、（ｃ）はコントロールであり、（ｂ）、（ｄ）は実施例である。
【符号の説明】
【０１２３】
１１０    小胞体
１２０    ゴルジ体
１３０    糖ヌクレオチド輸送体
１４０    糖ヌクレオチド
１４１    ＵＤＰ
１４２    ＧＬｃＮＡｃ
１４３    ガラクトース
【図２】
2010051252.tif 000008
【図１】
2010051252.tif 000009
【図３】
2010051252.tif 000010
【図４】
2010051252.tif 000011
【図５】
2010051252.tif 000012