(57)【要約】【課題】本発明は、分化多能性を維持した多能性幹細胞を効率的かつ簡便に選択する方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、分化多能性を有するとされる細胞集団から、Ｅ−カドヘリン、あるいは、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの発現を指標にして、分化多能性を維持する細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法である。さらに、本発明は、細胞の大きさ、細胞密度、細胞の自家蛍光及び／又は細胞の生死に基づいて、多能性幹細胞の候補細胞を分取し、該分取した多能性幹細胞の候補細胞から、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの細胞表面上での発現を指標にして、分化多能性を維持する細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団からＥ−カドヘリン陽性及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法。
【請求項２】
前記細胞集団が、細胞の大きさ、細胞密度、細胞の自家蛍光及び／又は細胞の生死を指標にして、多能性幹細胞の候補細胞として分取されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補細胞の分取が、フローサイトメーターにより行われる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分取が、前方散乱光及び側方散乱光にゲートを設定して行われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分取が、蛍光にゲートを設定して行われる請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記分取が、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で細胞を染色して行われる請求項３乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記分取が、５８０ｎｍ〜６４０ｎｍ波長範囲の蛍光にゲートを設定して行われる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ−カドヘリン陽性及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞の選別がＥ−カドヘリンに対する抗体及びｃ−Ｋｉｔに対する抗体を用いて行われる請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が蛍光色素又は酵素を結合したものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記選別が、フローサイトメーターによって行われる請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、固定化可能な担体に担持されて行われる請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞集団が、ＥＳ細胞を含む細胞集団である請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞集団が、ｉＰＳ細胞を含む細胞集団である請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
Ｅ−カドヘリン抗体及びｃ−Ｋｉｔ抗体を含む多能性幹細胞を選別するためのキット。
【請求項１５】
Ｅ−カドヘリン抗体及びｃ−Ｋｉｔ抗体を固定化した担体及び該抗体−担体結合体を固定化する保持部を具備し、該抗体−担体結合体が液体と接触可能な構造を備えた、請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法に使用するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分化多能性を有する細胞は、多能性幹細胞などと称され、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を保持していることから、何らかの疾患で損傷した臓器などを再生する上で極めて有効な手段として期待されている。当初、分化多能性を有する細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）の多能性に着目し、医療分野あるいは基礎研究分野においてその利用性について精力的な研究が行われてきた。しかし、ＥＳ細胞は生命の起源となる胚から取得されるものであるため、その使用上、倫理的な問題に直面することとなった。また、ＥＳ細胞から調製した組織などは、移植の段階で拒絶反応を引き起こすおそれがあり、このような免疫的な問題を克服する必要もあった。そこで、近年、ＥＳ細胞を用いた場合に生じ得る倫理上の問題と免疫学上の問題を解決することができる分化多能性細胞として、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞；ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に多くの期待が寄せられるようになってきた。
マウスのｉＰＳ細胞は、Ｙａｍａｎａｋａらによって、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された。さらに、ヒトのｉＰＳ細胞についても、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、ヒトの線維芽細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８を導入してヒトｉＰＳ細胞を樹立し、また、Ｙａｍａｎａｋａらは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣをヒトの線維芽細胞に導入して、同じくｉＰＳ細胞を樹立した。
【０００３】
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞の持つ倫理的問題と免疫学上の問題を克服した理想的な分化多能性細胞ではあるが、人工的に作り出されている点から、安全性の面（例えば、癌化など）でさらに研究を進める必要がある。ＥＳ細胞については、上記問題を含みつつも、生来の分化多能性を備えた細胞であることから、依然として、研究対象としては重要な位置を占めている。
以上のように、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を研究対象にする機会は益々増えて行くことが予想されている現状において、多能性幹細胞本来の性質を備えている細胞を迅速に簡易な方法で取得することも、重要な課題の一つである。
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などは、一見均一な細胞集団を形成しているように見えるが、例えば、ＥＳ細胞については、膜表面抗原や転写因子の発現量の違いからいくつかの分画に分かれることが示唆されている。また、ｉＰＳ細胞についてもその樹立過程において遺伝子導入後に生じる未分化様コロニーには、不完全な初期化により生じたコロニーも存在することが分かっている。従って、このように不均一な細胞集団から同一の分化多能性を保持した細胞集団を調製することは、今後の研究開発を促進していく上でも、重要なことである。
【０００４】
これまでに、多能性幹細胞の未分化性を識別するマーカーの使用に関し、例えば、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤などから、ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を選択して多能性胎児性幹細胞を調製する方法（特許文献１）、脂肪組織などからｐ７５ＮＴＲ及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を選択して多能性幹細胞を調製する方法（特許文献２）、また、精巣細胞をグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む培地で培養し、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ９、ｃ−Ｋｉｔなどのマーカーの発現を手掛かりにして多能性幹細胞を取得することができること（特許文献３）などが報告されているが、より効率的な多能性幹細胞の調製を可能にするマーカーが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０４２４０５
【特許文献２】特開２００６−２３０２３５
【特許文献３】ＷＯ２００５／１００５４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでに分化多能性を保持する多能性幹細胞として、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の調製方法などが数多く報告されているが、これらの方法で調製された細胞集団の中には、未分化状態をすでに喪失した細胞が少なからず含まれており、効率的な分化誘導を行う上での障害となることがあった。
そこで、本発明は、分化多能性を維持する細胞を選別し、多能性幹細胞を効率的に調製する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの発現を指標にして、分化多能性を維持する細胞を効率的に選別することに成功し、本発明を完成させた。
これまでにも、細胞表面上でのｃ−Ｋｉｔの発現を指標にして分化多能性を維持した細胞を選択する方法が報告されているが、ｃ−Ｋｉｔのみを指標にした場合には、多能性幹細胞以外のｃ−Ｋｉｔ陽性細胞（例えば、生殖細胞、造血細胞など）の混入を防ぐことが難しかった。そこで、発明者らは、ｃ−Ｋｉｔの他にＥ−カドヘリンの細胞表面上での発現を多能性幹細胞の選択の指標に加えることで、混入細胞の除去に成功した。
よって、本発明は、分化多能性を有するとされる細胞の集団から、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの細胞表面上での発現を指標にして、分化多能性を維持する細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法を提供する。
さらに、本発明者らは、細胞の大きさの差異、細胞密度の差異、細胞の自家蛍光の差異及び／又は細胞の生死に基づいて、多能性幹細胞の候補細胞を分取し、分取した多能性幹細胞の候補細胞から、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔを細胞表面上に発現する細胞を選別すれば、多能性幹細胞以外のＥ−カドヘリン又はｃ−Ｋｉｔ発現細胞、及び／又は死細胞を有効に除去することができ、より効率的に多能性幹細胞を調製することができることを見出した。
よって、本発明は、細胞の大きさ、細胞密度、細胞の自家蛍光及び／又は細胞の生死に基づいて、多能性幹細胞の候補細胞を分取し、該分取した多能性幹細胞の候補細胞から、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの細胞表面上での発現を指標にして、分化多能性を維持する細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法を提供する。
また、本発明は、上記本発明の方法を実施するためのキット及び装置を提供する。
【０００８】
すなわち、本発明の以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）本発明の第１の形態は、「細胞集団からＥ−カドヘリン陽性及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法」である。
（２）本発明の第２の形態は、「前記細胞集団が、細胞の大きさ、細胞密度、細胞の自家蛍光及び／又は細胞の生死を指標にして、多能性幹細胞の候補細胞として分取されたものである上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の形態は、「前記候補細胞の分取が、フローサイトメーターにより行われる上記（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の形態は、「前記分取が、前方散乱光及び側方散乱光にゲートを設定して行われる上記（３）に記載の方法」である。
（５）本発明の第５の形態は、「前記分取が、蛍光にゲートを設定して行われる上記（３）又は（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の形態は、「前記分取が、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で細胞を染色して行われる上記（３）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（７）本発明の第７の形態は、「前記分取が、５８０ｎｍ〜６４０ｎｍ波長範囲の蛍光にゲートを設定して行われる、上記（５）又は（６）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の形態は、「前記Ｅ−カドヘリン陽性及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞の選別がＥ−カドヘリンに対する抗体及びｃ−Ｋｉｔに対する抗体を用いて行われる上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の形態は、「前記抗体が蛍光色素又は酵素を結合したものである上記（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の形態は、「前記選別が、フローサイトメーターによって行われる上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の形態は、「前記抗体が、固定化可能な担体に担持されて行われる上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法」である。
（１２）本発明の第１２の形態は、「前記細胞集団が、ＥＳ細胞を含む細胞集団である上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載の方法」である。
（１３）本発明の第１３の形態は、「前記細胞集団が、ｉＰＳ細胞を含む細胞集団である上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載の方法」である。
（１４）本発明の第１４の形態は、「Ｅ−カドヘリン抗体及びｃ−Ｋｉｔ抗体を含む多能性幹細胞を選別するためのキット」である。
（１５）本発明の第１５の形態は、「Ｅ−カドヘリン抗体及びｃ−Ｋｉｔ抗体を固定化した担体及び該抗体−担体結合体を固定化する保持部を具備し、該抗体−担体結合体が液体と接触可能な構造を備えた上記（１）乃至（１３）のいずれかに記載の方法に使用するための装置」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、分化多能性を喪失した細胞を含む細胞集団の中から、分化多能性を維持する細胞を簡便かつ効率的に選別し、完全な分化多能性を維持した多能性幹細胞を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】多能性幹細胞を細胞の大きさ、細胞密度、自家蛍光及び細胞表面抗原を指標にして調製する方法の概念図を示す。
【図２】ゲート設定を行う場合（Ａ）と行わない場合（Ｂ）において得られる多能性幹細胞の均一性の比較を示す。
【図３】Ｅ１４ｔｇ２ａ  ＥＳ細胞株を用いた膜表面抗原の発現解析結果を示す。
【図４】ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ−ＮＶｔＴ細胞株を用いた細胞表面抗原とＮａｎｏｇとの相関関係を示す。Ｍｏ−Ｆｌｏ及びＦｌｏｗ−ｊｏを使用した測定結果を、横軸をＮａｎｏｇの発現レベル、縦軸を各種転写因子（ｃ−Ｋｉｔ、ｓｃａ−１、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９及びＥ−カドヘリン）の発現レベルとして表示した。
【図５】ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋）、ｃ−Ｋｉｔ陰性細胞（ｃ−Ｋｉｔ−）、ＳＳＥＡ陽性細胞（ＳＳＥＡ＋）、ＳＳＥＡ陰性細胞（ＳＳＥＡ−）、Ｅ−カドヘリン陽性細胞（Ｅ−カドヘリン−）中における、分化多能性因子（Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）の発現状況につき、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す。ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞に対して、また、ＤＷは水のみのコントロールに対して、同様の解析を行った結果である。
【図６】フローサイトメーターによりｃ−Ｋｉｔ陽性及びｃ−Ｋｉｔ陰性細胞を分取し、アルカリフォスファターゼ染色により未分化性の評価を行った結果を示す。
【図７】胚盤胞注入法を用いたキメラ形成能の評価方法の概略を示す。
【図８】ｉＰＳ細胞樹立過程におけるｃ−Ｋｉｔ及びＥ−カドヘリンの経時的な発現の変化を示す。３因子は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の導入により作製したｉＰＳ細胞、４因子は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃの導入により作製したｉＰＳ細胞の結果を示す。
【図９】ｉＰＳ細胞樹立過程における細胞形態の変化を位相差顕微鏡により観察像を示す。
【図１０】各分画の培養細胞におけるアルカリフォスファターゼ染色よる未分化性評価を行った結果を示す。Ａは、検出されたコロニー写真であり、Ｂはアルカリフォスファターゼで染色されたコロニーの数と染色された細胞の顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの細胞表面上での発現を指標として、完全な分化多能性を維持する多能性幹細胞（又は、単に幹細胞とも記載する）を調製する方法である。本発明によれば、分化多能性を有するとされ、一見均一な細胞集団の中から、分化多能性を維持する幹細胞と分化多能性を喪失した細胞を区別し、分化多能性を維持する多能性幹細胞を選別することが可能となる。つまり、ある細胞集団中、Ｅ−カドヘリン陽性及びｃ−Ｋｉｔ陽性の細胞を同定し、これらの陽性細胞を完全な分化多能性を維持する幹細胞として選別することができる。このように選別された幹細胞を、定法に従い、分化多能性を保持し、かつ分裂増殖が可能な状態で培養を行えば、完全な分化多能性を維持した幹細胞の集団を調製することができる。
本明細書において、「細胞集団」又は「細胞の集団」とは、当該技術分野において通常理解される意味であり、複数の細胞の集まりのことであるが、例えば、分化多能性を喪失した細胞（分化多能性の一部を喪失した細胞を含む）及び／又は完全な分化多能性を維持した細胞（すなわち、本来の意味における多能性幹細胞又は幹細胞）を含む細胞の集まりのことである。そのような細胞の集まりとしては、特に限定はしないが、例えば、分化多能性を喪失した細胞を含むＥＳ細胞集団、不完全な初期化状態（完全に未分化な状態ではないこと）にある細胞を含むｉＰＳ細胞集団などを挙げることができる。また、インビトロにおける培養状態にある細胞の集団のみならず、生体中に組織又は器官の一部として含まれる細胞の集団をも含む概念である。
「ＥＳ細胞」は、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と共に一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的に「ＥＳ細胞株」として樹立することができる。このように、ＥＳ細胞は、受精卵から取得することが多いが、その他、脂肪組織（特許文献２を参照のこと）、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤（特許文献１を参照のこと）、精巣細胞（特許文献３を参照のこと）など、受精卵以外から取得され、ＥＳ細胞類似の特徴を持ち、分化多能性を有するＥＳ細胞様の細胞も知られており、これらの細胞集団も本発明にかかる「細胞集団」又は「細胞の集団」に含まれる。
【００１２】
また、「ｉＰＳ」細胞とは、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称される分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞（例えば、線維芽細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（以下、ここでは「分化多能性因子」と称する）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞のことである。「分化多能性因子」としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４）、Ｓｏｘファミリー（例えば、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２など）、Ｍｙｃファミリー（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃなど）、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８などを挙げることができる。ｉＰＳ細胞の樹立方法については、多くの文献が発行されているので、それらを参考にすることができる（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ  ２００６，１２６：６６３−６７６；Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４４８：３１３−３１７；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４４８：３１８−３２４；Ｍａｈｅｒａｌｉら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７，１：５５−７０；Ｐａｒｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４５１：１４１−１４６；Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８，２６：１０１−１０６；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００８，１０：１０−１２；Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７，３１８：１９１７−１９２０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ  ２００７，１３１：８６１−８７２；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８  ３２２：９４５−９４９などを参照のこと）。
【００１３】
本明細書中に記載される「細胞」の由来は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり特に限定はされない。また、「多能性幹細胞」又は「幹細胞」とは、当業者によって理解されている意味と異なるものではなく、例えば、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持し、理論上すべての生体中の組織（細胞）に分化することができる細胞のことを意味する。
【００１４】
「Ｅ−カドヘリン」は、クラシック・カドヘリンサブファミリーに分類され、細胞表面に存在して細胞同士を接着する働きを担う糖鎖結合型の膜タンパク質である。クラシック・カドヘリンとして、Ｅ−カドヘリンの他、ＬＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンなど約２０種類近く存在する。クラシック・カドヘリンは、5つのドメイン（ＥＣドメイン）を細胞外に有し、１つの膜貫通セグメントと細胞内ドメインからなる構造を有する。その細胞内ドメインにはカテニンが結合し、細胞骨格との連結を行っている。
また、「ｃ−Ｋｉｔ」は、ＣＤ１１７とも称され、造血幹細胞、生殖細胞などの細胞表面上に発現するチロシンキナーゼ活性を有するサイトカインレセプター（レセプターチロシンキナーゼタイプＩＩＩ）のことである。これまでに、「ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」で始まる一群のタンパク質は、細胞の分化段階の指標として利用されており、ｃ−Ｋｉｔは、骨髄中の特定のタイプの造血細胞前駆体を同定するための細胞表面マーカーとして利用されてきた。ｃ−Ｋｉｔのリガンドとしては、サイトカイン幹細胞因子（ＳＣＦ）が知られており、ｃ−ＫｉｔがＳＣＦと結合すると、二量体を形成し、セカンドメッセンジャーを介して細胞内シグナルを活性化する。
【００１５】
本発明は、細胞表面上にＥ−カドヘリンが発現している細胞（Ｅ−カドヘリン陽性細胞）又はｃ−Ｋｉｔが発現している細胞（ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞）を認識又は識別し、これらの細胞を選別する工程を含む。細胞表面上のＥ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔを認識するための手段としては、特に限定はしないが、これらのタンパク質と特異的に結合する分子、例えば、抗体を利用することができる。Ｅ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔに対する抗体は、市販のものを購入して使用することができる（例えば、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＴＡＫＡＲＡ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから購入可能である）。
【００１６】
また、Ｅ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔに対する抗体は、所望の抗原認識性及び親和性を備えたものを取得するために、自ら調製することも可能である。
本発明で使用可能な抗体には、Ｅ−カドヘリン又はＣ−Ｋｉｔに対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂなど）が含まれる。これらの抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には、Ｅ−カドヘリン又はｃ−Ｋｉｔ、あるいは、これらのタンパク質の部分（例えば、細胞表面上に露出した部分など）を使用することができる。アジュバントとしては、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）などを挙げることができる。
【００１７】
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。あるいは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラット若しくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、定法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
【００１８】
抗体を使用した分化多能性を維持した多能性幹細胞の選別は、限定はしないが、例えば、抗体に蛍光色素などを結合させ、免疫組織化学的手法による観察を行い、該蛍光色素によって標識された細胞をＥ−カドヘリン陽性又はｃ−Ｋｉｔ陽性細胞として同定する方法、抗体に酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）の基質などを結合させ、酵素法により発色させ、Ｅ−カドヘリン陽性又はｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を同定する方法などを使用して行うことができる。
なお、本発明における「抗体」には、該抗体を認識するのに使用される蛍光色素や酵素などの検出分子を結合した抗体も含まれる。
【００１９】
Ｅ−カドヘリン陽性細胞及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞は、Ｅ−カドヘリン抗体及びｃ−Ｋｉｔ抗体を担体に固定化して担持させた該抗体−担体結合体を、多能性幹細胞を含む細胞集団と適当な条件下（例えば、生理的なイオン強度、ｐＨ）にて懸濁、混合し、適当な時間（例えば、１時間から一晩）及び温度（例えば、４℃〜３７℃程度）にてインキュベートすることで、Ｅ−カドヘリン陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陽性細胞と抗体とを結合させ、細胞−抗体−担体複合体を適当な方法で回収し、調製することができる。ここで、抗体を固定化し担持させるための担体は、抗体が固定化されるものであればいかなる形状、組成のものであってもよく、例えば、磁気ビーズ、結合したＰｒｏｔｅｉｎＡやＰｒｏｔｅｉｎＧが結合したアガロース、セファロースなどの樹脂、又は抗体が平面に結合した板状の部材（プレート）、膜、チューブなどが使用可能である。例えば、磁気ビーズを使用する場合には、磁気ビーズを結合させたＥ−カドヘリン抗体又はｃ−Ｋｉｔ抗体（アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの結合を利用する）を、Ｅ−カドヘリン陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陽性細胞に各々結合させ、磁力によりこれらの陽性細胞を特異的に選別し、該細胞をさらに培養等することで調製することができる。あるいは、磁力を利用する方法以外にも、Ｅ−カドヘリン陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陽性細胞に、各々結合したＥ−カドヘリン抗体又はｃ−Ｋｉｔ抗体を、アガロース又はセファロースと結合したＰｒｏｔｅｉｎＡ若しくはＰｒｏｔｅｉｎＧなどを利用して、これらの陽性細胞を選別することも可能である。
【００２０】
さらに、Ｅ−カドヘリン陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陽性細胞の選別は、蛍光色素などを結合させた抗体を使用し、蛍光を指標にして細胞を分離する方法、例えば、フローサイトメトリー法などを利用したセルソーターシステム（ＦＡＣＳなどのフローサイトメーター）など、当該技術分野において周知の手法によっても可能である。フローサイトメーターとしては、いかなるものも利用可能であるが、例えば、ベクトン・ディッキンソン社（FACS Vantage、FACSAria、FACSCaliburなど）、ダコ・ジャパン社（Ｍｏ−Ｆｌｏなど）、ベックマン・コールター社（EPICS ALTRAなど）から購入することができる。さらに、フローサイトメーターにより目的細胞を選択、分取する上でフローサイトメーターの使用に供されるソフトウェアとしては、例えば、Ｆｌｏｗ−ｊｏ（Tree Star社）、ＣｅｌｌＱｕｅｓt（ベクトン・ディッキンソン社）などを、使用する装置に応じて使用することができる。
なお、本明細書においては、「フローサイトメーター」とは、セルソーター（細胞装置）機能を備えたもの及び備えないものの両方を意味する。
【００２１】
さらに、本発明は、細胞の大きさの差異、細胞密度の差異、細胞の自家蛍光の差異及び／又は細胞の生死に基づいて、多能性幹細胞の候補生細胞（多能性幹細胞の生きた候補細胞）を分取し、該分取した多能性幹細胞の候補生細胞から、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの細胞表面上での発現を指標にして、分化多能性を維持する細胞を選別し、多能性幹細胞を調製する方法を提供する。
多能性幹細胞は、その細胞の大きさ、細胞密度、自家蛍光（細胞表面の官能基の種類や量を特徴付ける蛍光）に関し、多能性幹細胞以外の細胞と異なる特徴を有している。従って、多能性幹細胞に特徴的な細胞の大きさ、細胞密度、自家蛍光による選別と、Ｅ−カドヘリン及びｃ−Ｋｉｔの発現を指標した選別を組み合わせることで、さらに、効果的に多能性幹細胞を選別することが可能となる。
また、生細胞と死細胞を区別することができる適当な色素で細胞を染色し、生細胞を分取する手段をさらに組み合わせることで、生きた多能性幹細胞を効率的に選別することが可能となる。
多能性幹細胞に特徴的な細胞の大きさ、細胞密度、自家蛍光を有する細胞を選別する方法は、当該技術分野において公知の方法を当業者が適宜選択して実施することができるが、例えば、フローサイトメーターを用いて実施することができる。フローサイトメーターを使用する場合、限定はしないが、例えば、細胞の大きさによる多能性幹細胞の候補細胞の絞り込みは、前方散乱光（forward scatter:FSC）を基準にし、細胞密度による絞り込みは、側方散乱光（side scatter;SSC）を基準にすることができる。フローサイトメーターによる場合、多能性幹細胞を細胞の大きさ及び細胞密度について、FSC及びSSCにゲートを設定し（図１、左図）、自家蛍光について、ある波長領域蛍光の強度にゲートを設定することで（図１、中央図）、多能性幹細胞候補の絞り込みを行うことができる。このようにして絞り込まれた多能性幹細胞候補について、さらに、ｃ−Ｋｉｔ及びＥ−カドヘリンの発現を指標に多能性幹細胞を選別すると（図１、右図）、夾雑細胞が除かれた均一な多能性幹細胞の集団を調製することができる。例えば、ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）などの混入が予想されるような場合には、FSCを１０１〜１０３程度の範囲に、SSCを１０１〜１０２程度の範囲に、また、自家蛍光につき、例えば、５８０ｎｍ〜６４０ｎｍ（６１０±３０ｎｍ）の蛍光波長範囲において、多能性幹細胞からの蛍光強度はＭＥＦからの蛍光強度よりも弱いので、蛍光強度が１００〜１０１程度の範囲にゲート設定すると、ｃ−Ｋｉｔ及びＥ−カドヘリンによる選別後のＭＥＦの混入（図２Ａ中楕円で囲んだ部分の細胞集団）を防ぐことができる（図２Ａ、下段、ＭＥＦとＥＳ、ｉＰＳを比較のこと）（以上の設定は、例えば、Ｍｏ−Ｆｌｏ及びＦｌｏｗ−ｊｏを使用する場合に利用することができる）。
また、生細胞と死細胞は、細胞の生死によって染色の程度が異なる色素、限定はしないが、例えば、ヨウ化プロピジウム（Propidium iodide;PI)などによって細胞を染色し、細胞からの蛍光強度の差異によって生細胞と死細胞の区別が可能である。
なお、「ゲート」の設定とは、フローサイトメトリー法において用いられる通常の意味と異なるものではなく、目的の細胞集団を分取するために、例えば、FSC、SSC、特定の蛍光波長における蛍光強度などに選択範囲（分画の範囲）を設定することである。
【００２２】
細胞の大きさ、細胞密度に関するゲートは、多能性幹細胞のFSC及びSSCの強度範囲を、使用するフローサイトメーターで予め測定しておくことで、測定した値を指標に容易に設定することができる。
同様に、自家蛍光に関するゲートについても、任意の蛍光波長範囲における多能性幹細胞の自家蛍光の強度範囲と混入が予想される細胞（例えば、ＭＥＦなど）の自家蛍光強度範囲を、使用するフローサイトメーターで予め測定しておくことで、測定した値を指標に、多能性幹細胞のみを分取できるゲートを容易に設定することができる。
また、細胞の生死の区別については、細胞の生死によって染色の程度が異なる色素であればいかなるものであっても使用可能であり、色素の励起蛍光波長に適した波長範囲の蛍光を検出して、その強度の差異により容易に区別することができる。さらに、自家蛍光の差異による区別と細胞の生死による区別は、検出する蛍光の波長範囲を適切に選択することで同時に行うことが可能である。例えば、ＭＥＦの混入が予想され場合に、細胞の生死を区別するには、特定の励起光（例えば、PIの場合、４８８ｎｍ）で励起して得られる特定波長領域の蛍光（例えば、PIの場合、５８０ｎｍ〜６４０ｎｍ（６１０±３０ｎｍ））の強度は、生きた多能性幹細胞、ＭＥＦ、死細胞の順に強くなるので、得られる強度を指標にしてゲート設定が可能である。
【００２３】
また、本発明は、多能性幹細胞を調製するためのキットを提供することができる。このようなキットは、ｃ−Ｋｉｔ抗体及びＥ−カドヘリン抗体（あらかじめ蛍光色素が結合されていてもよい）を含む他、洗浄試薬、蛍光色素、酵素、発色団、磁気ビーズ、プロテインＡ又はプロテインＧ結合担体の他、板状、膜状、チューブ状担体、抗体結合試薬（例えば、ビオチン−アビジン結合などを行うのに必要な試薬）などを含むことができる。キット中に含まれる試薬等は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。
また、キットには使用説明書も添付される。キットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００２４】
さらに、本発明は、本発明の方法の実施に適した装置を提供する。当該装置は、Ｅ−カドヘリン抗体及びｃ−Ｋｉｔ抗体を固定化した担体及び該担体を固定化する保持部を具備し、該抗体−担体結合体と液体が接触可能な構成を備えたものである。ここで、「担体」とは、抗体が固定化されるものであればいかなる形状、組成のものであってもよく、例えば、磁気ビーズ、結合したＰｒｏｔｅｉｎＡやＰｒｏｔｅｉｎＧが結合したアガロース、セファロースなどの樹脂、又は抗体が平面に結合した板状の部材（プレート）、膜、チューブなどが使用可能である。また、「保持部」とは、抗体を結合した担体を保持する機能を備えた部分のことであり、例えば、担体がビーズ状のものであれば、これが充填可能なカラム状の部分のことであり、金属、ガラスなどいかなるものであってもよい。担体が板状の部材（プレートなど）、あるいは、膜状若しくはチューブ状の部材の場合には、該板状又は膜状若しくはチューブ状の部材を直接保持するクランプのようなものであっても、内部に該板状又は膜状若しくはチューブ状部材を収納する容器状ものであってもよい。さらに、「液体が接触可能な構成」とは、目的とするＥ−カドヘリン陽性及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞以外の夾雑物（例えば、フリーな抗体、多能性幹細胞以外の細胞など）を洗浄液などで洗い流すことができ、また、目的の細胞を取得するために液体により回収することが可能な構成であればいかなるものであってもよい。例えば、保持部としてカラムなどを使用する場合には、カラム内部において抗体（又は、抗体−担体結合体）とバッファーなどの液体とが接触可能であればよく、また、プレート又は膜若しくはチューブを担体として使用する場合には、プレート又は膜若しくはチューブ上に固定化された抗体（又は、抗体−担体結合体）と液体が接触可能な容器状の閉じた空間によってプレート又は膜若しくはチューブが覆われていればよい。
さらに、本発明の装置には、担体、試料（細胞など）、バッファーなどの溶液を保持部に充填又は注入するための注入口、保持部から排出又は回収するための排出口を適宜備えていてもよい。
本発明の装置は、本発明のキットの構成要素であってもよい。  
【００２５】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
１．ＥＳ細胞株に関する解析
１−１．ＥＳ  細胞株の培養
フィーダー細胞非依存性マウス胚性幹細胞株（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｍＥＳｃ）のＥ１４ｔｇ２ａ、ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ、ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ−ＮＶｔＴは、ゼラチンコートを施したディッシュにて、Ｇｌａｇｏｗ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトメタノール（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム塩（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１％  Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１，０００Ｕ／ｍｌ  ｌｅｕｋｉｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（Ｆｅｅｄｅｒ−Ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を添加した培地で培養した。
ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ−ＮＶｔＴは、ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ細胞のＮａｎｏｇプロモーター下流に、ＩＲＥＳ配列を介して黄色蛍光遺伝子ＶｅｎｕｓとＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を繋いだ配列をｌｏｘＰにより挟み、その下流にテトラサイクリントランス活性化タンパク質（ｔＴＡ）遺伝子をつなげたベクターをエレクトロポレーション法により導入した細胞である。  
Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞は、１２９／ｏｌａ由来の細胞であり、ＨＰＲＴ陰性のＥＳ細胞株である。
ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ細胞は、丹羽仁史博士（理研発生・再生科学総合研究センター）から供与して頂いたもので、ＥＢ３  ＥＳ細胞株に、ＣＡＧｐ−ＤｓＲｅｄベクターを導入しＤｓＲｅｄを強制発現させた細胞である。ＥＢ３細胞は、Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子座下流に薬剤耐性遺伝子ＢＳＤを、ＩＲＥＳ配列を用いてノックインした細胞である。
【００２７】
１−２．フローサイトメーターを用いたＥＳ細胞の膜表面抗原の発現解析
Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞を、２．０×１０５の濃度で、φ１０ｃｍディッシュにまき、２日間培養した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、トリプシン処理を施し、細胞を縣濁した。細胞懸濁液に、抗体（表１を参照のこと）を、０．０２  μｇ  ／１０６細胞となるように加え、氷上で３０分静置した。３％ＦＢＳを含んだＰＢＳ（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ；ＳＭ）で洗浄後、１μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ；ＰＩ）を含んだＳＭ（ＰＩ／ＳＭ）で再懸濁し、Ｍｏ−Ｆｌｏ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と解析ソフトウェア、Ｆｌｏｗ−ｊｏを使用し解析した。
解析の結果から、多能性幹細胞に固有の細胞の大きさ、細胞密度、自家蛍光量を有する細胞として、FSCが１０１〜１０３程度、SSCが１０１〜１０２程度、また、PI染色によって得られる蛍光（励起波長；４８８ｎｍ、蛍光波長；６１０±３０ｎｍ）が、１００〜１０１程度の細胞を多能性幹細胞の候補細胞とした（図２）。
また、ラット由来の精製抗体（色素標識なし）、又は、ビオチン結合抗体を用いた場合は、ＳＭ  で洗浄後、二次抗体として、精製抗体に対してＡｌｅｘａ  ６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０．２μｇ／１０６細胞、ビオチン結合抗体には、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを０．０４μｇ／１０６細胞となるように加え、氷上で３０分静置した。ＳＭで２度洗浄後、ＰＩ／ＳＭ中に再懸濁し解析した。
【００２８】
【表１】
2010200676.tif 000002
【００２９】
この方法で一次解析を行なった後、染色される抗体に関しては同じ量で、染色の程度が悪い抗体に関しては抗体の量及び反応時間を検討しながらより良い染色条件を決定し二次解析及び三次解析を行なった（表２）。抗体による解析の結果、Ｅ１４ｔｇ２ａ ＥＳ細胞株において染色された細胞の割合をその抗体別に分類し、各抗体に対応する抗原がＥＳ細胞株の表面に発現される頻度について解析を行った（図３）。
【表２】
2010200676.tif 000003
【００３０】
染色条件の検討結果及び各抗体に対する抗原の発現頻度の解析結果に基づき、ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ−ＮＶｔＴ細胞を用いて、未分化細胞において発現の高いとされる転写因子  Ｎａｎｏｇと、本結果から選択されたｃ−Ｋｉｔ、ｓｃａ−１、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｅ−カドヘリンとの相関をＭｏ−Ｆｌｏ、Ｆｌｏｗ−ｊｏを使用し解析した。（図４）。
なお、ＰＩは、細胞内のＤＮＡに結合する色素で、細胞膜透過性が低いため生細胞を染色することができず、細胞膜の透過性が上がった死細胞を染色する。この特性を利用して死細胞の識別、除去を行った。
【００３１】
１−３．細胞の分取とＲＴ−ＰＣＲ
次に、ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋）、ｃ−Ｋｉｔ陰性細胞（ｃ−Ｋｉｔ−）、ＳＳＥＡ陽性細胞（ＳＳＥＡ＋）、ＳＳＥＡ陰性細胞（ＳＳＥＡ−）、Ｅ−カドヘリン陽性細胞（Ｅ−カドヘリン＋）中における、分化多能性因子（Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）の発現状況について検討を行った。
Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞の懸濁液にＲａｔ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）を１μｇ／１０６細胞の割合で加え、氷上で３０分静置した。ＳＭで洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｕｌｕｏｒ  ６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２μｇ／１０６細胞の割合で加え、氷上で３０分静置した。ＳＭで２度洗浄後、ＰＥ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ  ＳＳＥＡ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．１μｇ／１０６細胞とＰＥ−Ｃｙ７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ｃ−Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｙｅｎｃｅ）を０．０６μｇ／１０６細胞の割合で加え、氷上で３０分静置した。ＳＭで洗浄後、１μｇ／ｍｌ  ＰＩ／ＳＭで再懸濁し、Ｍｏ−Ｆｌｏにより、ｃ−Ｋｉｔ陽性・陰性、ＳＳＥＡ１陽性・陰性細胞、Ｅ−カドヘリン陽性細胞を、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ分取した。
フェノール・クロロホルム法により、ＲＮＡを分離、エタノール沈殿で精製後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写しｃＤＮＡを作製した。Ｇａｐｄｈを内部標準とし、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＨＳ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＢ）によりＰＣＲを行った（図５）。この結果、ｃ−Ｋｉｔ陽性ＥＳ細胞は、未分化維持に重要とされる遺伝子の高い発現レベルを示しており、また、Ｅ−カドヘリンについても、ｃ−Ｋｉｔよりは発現レベルが下がるものの、未分化関連遺伝子のなかで特にＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の高い発現が見られた。
【００３２】
ＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーの配列は以下の通りである。
Nanog(Forward):5’-CAGGAGTTTGAGGGTAGCTC-3’（配列番号１） 
Nanog(Reverse):5’-CGGTTCATCATGGTACAGTC-3’（配列番号２）
Rex1(Forward):5’-ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA-3’（配列番号３） 
Rex1(Reverse):5’-TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT-3’（配列番号４）
Oct3/4(Forward):5’-TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC-3’（配列番号５） 
Oct3/4(Reverse):5’-TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC-3’（配列番号６）
sox2(Forward):5’-TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA-3’（配列番号７） 
sox2(Reverse):5’-TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA-3’（配列番号８）
Klf4(Forward):5’-TCGCTTCCTCTTCCTCCGACACA-3’（配列番号９） 
Klf4(Reverse):5’-GCGAACTCACTCACACAGGCGAGAAACC-3’（配列番号１０）
Gapdh(Forward):5’-TGCACCACCAACTGCTTA G-3’（配列番号１１）
Gapdh(Reverse):5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’（配列番号１２）
【００３３】
１−４．ｃ−Ｋｉｔ陽性、陰性細胞の分取及びアルカリフォスファターゼ染色による未分化性の評価
Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞の懸濁液にＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ｃ−Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を０．０６  μｇ／１０６細胞の割合で加え、氷上で３０分静置した。ＳＭで洗浄後、ＰＩ／ＳＭで再懸濁し、ゼラチンコート処理した６ウェルプレートの各ウェルにｃ−Ｋｉｔ陽性、ｃ−Ｋｉｔ陰性細胞を４０００個ずつＭｏ−Ｆｌｏを用いて分取した。翌日培地を換え、３日後にＭｏ−ＦｌｏとＦｌｏｗ−ｊｏを用い、各ウェルのｃ−Ｋｉｔの発現を解析した。また、一部のウェルを１０％  ホルマリンを含むメタノールで固定し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．５）で洗浄後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＶＥＣＴＯＲ）を用いて、１５分間染色処理を施した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）で洗浄後、ＰＢＳに置換し、顕微鏡下で観察した（図６）。この結果、ｃ−Ｋｉｔ陽性ＥＳ細胞は密な未分化様コロニーを形成していることが明らかとなった。
【００３４】
１−５．胚盤胞注入法を用いたキメラ形成能の評価
ＥＢ３−ＤｓＲｅｄ細胞のｃ−Ｋｉｔ陽性、ｃ−Ｋｉｔ陰性、ｃ−Ｋｉｔ陽性及びＳＳＥＡ１陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性及びＳＳＥＡ１陰性、ｃ−Ｋｉｔ陽性及びＳｃａ−１陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性及びＳｃａ−１陰性、Ｅ−カドヘリン陽性細胞を、各々、Ｍｏ−Ｆｌｏを用いて９６ウェルプレートの各ウェルへ分取し、胚盤胞に注入するＥＳ細胞として調製した（図７）。
本実験で使用した胚盤胞は、ホスト胚として凍結保存しておいたＢＤＦ１×Ｃ５７ＢＬ６由来の桑実胚を、ＫＳＯＭ−ＡＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、胚盤胞へと培養（１日間）したものを用いた。
顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて分取したＥＳ細胞を１個の胚盤胞に対して５個の割合で、腔へ注入した。胚の回復を待った後、交配後２．５日目の偽妊娠ＩＣＲ  系統マウスの子宮へと移植し、移植後１１日目（胎齢１３．５日目）に帝王切開し胎仔を取り出した。得られた胎仔を蛍光顕微鏡下で観察しキメラ形成の判定を行った（表３）。
【００３５】
【表３】
2010200676.tif 000004
【００３６】
２．ｉＰＳ細胞株に関する解析
２−１．ｉＰＳ細胞の樹立
遺伝子導入（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ）用のレトロウイルス（Ｙａｍａｎａｋａら，Ｃｅｌｌ  ２００６  １２６：６６３−６７６ 参照）を感染させる２日前、凍結保存してあるマウス胎児線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）をゼラチンコートしたディッシュ上、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨＡＮＡ−ＮＥＳＣＯ  ＢＩＯ  ＣＯＲＰ）、１％  Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＭＥＦ培地）を使用して、凍結保存から起こし培養した。
遺伝子導入は以下のように行った。
ウイルス感染１日前、ＭＥＦ培地を、６ウェルプレートに各ウェル１×１０５細胞ずつ撒きなおした。
０日目（ウイルス感染の日）；感染前にＭＥＦを硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ／ｍｌの割合で添加した培地に交換した。ウイルスストック（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ）各１本ずつ融かし、１ウェルに２５μｌずつ加えた。
１日目；新しいＭＥＦ培地に交換した。
２日目；ウイルスが感染した感染したＭＥＦ培地１ウェル分を、６ウェルプレートの各  ウェルに１２等分して撒きなおした。
３〜２１日目；ＭＥＦ培地から、１５％  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトメタノール（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１％  Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１，０００Ｕ／ｍｌ  ｌｅｕｋｉｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＫＳＲ  ＥＳ培地）に交換した。２日に１回の割合で培地交換を行った。
【００３７】
実験に使用したマウス胎児線維芽細胞は、胎齢１３．５日目のＢ６マウス胎児より調製した。具体的には、１胎児分、φ１０ｃｍディッシュ１枚とし、継代１〜２回目で、φ１５ｃｍディッシュ１枚に植え継ぎ、これを３本分して凍結保存しておいた細胞を使用した。
感染に使用したウイルスは、２９３ＧＰＧ細胞から産生された上清を濃縮して使用した。具体的には、ＭＥＦ培地に１μｇ／ｍｌ  テトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ）、２μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加した培地を使用して、ｐｏｌｙ  Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）コートしたφ１０ｃｍディッシュで培養し、〜８０％コンフルエントになった状態で、ディッシュ４枚に撒きなおし、その後、再び〜８０％  コンフルエントになった段階で、培地をＭＥＦ培地に交換した。培地交換から２日目及び３日目に、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通し、４℃  ６，０００ｇで２４時間超遠心した。上清を除き、５００μｌのＫＳＲ  ＥＳ培地に懸濁し、５０μｌずつ凍結保存した。
【００３８】
２−２．フローサイトメーターによる細胞膜表面抗原の経時的変化の解析とアルカリフォスファターゼ染色による未分化性の評価
調製したｉＰＳ細胞は、７、１４、２１日目にディッシュから剥がし、Ｒａｔ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）を１μｇ／１０６細胞となるように加え、氷上で３０分間静置した。ＳＭで洗い、Ａｌｅｘａ  Ｆｕｌｕｏｒ  ６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２μｇ／１０６細胞となるように加え、氷上で３０分間静置した。ＳＭで２度洗浄後、ＰＥ−Ｃｙ７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ｃ−Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｙｅｎｃｅ）を０．０６μｇ／１０６細胞となるように加え、氷上で３０分間静置した。ＳＭ  で洗い、ＰＩ／ＳＭに再懸濁し、Ｍｏ−Ｆｌｏで解析した（図８）。また、細胞の形態変化を顕微鏡下で観察した（図９）。
１４、２１日目にｃ−Ｋｉｔ陽性及びＥ−カドヘリン陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性及びＥ−カドヘリン陰性、ｃ−Ｋｉｔ陰性及びＥ−カドヘリン陽性、ｃ−Ｋｉｔ陰性及びＥ−カドヘリン陰性細胞、各々、４０００個を、予めフィーダー細胞を培養しておいた２４ウェルプレートに１ウェルずつＭｏ−Ｆｌｏで分取した。５日間、ＫＳＲ  ＥＳ培地で培養し、Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞を染色した場合と同様に、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＶＥＣＴＯＲ）を用いて染色した。顕微鏡下、アルカリフォスファターゼ陽性コロニーの数を数え、染色状態の強弱を強陽性（＋＋）、弱陽性（＋）、陰性（−）に分類し、各分類のコロニー数から未分化様細胞がどの分画でより効率的に分取されたかを評価した（図１０）。
この結果から、２１日目において、ｃ−Ｋｉｔ及びＥ−カドヘリンが共に陽性の細胞から選択的に未分化様細胞のコロニーが生じることが明らかとなった（図１０、ｄａｙ２１）。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、分化多能性を維持する多能性幹細胞を効率的に選別する方法であり、医療分野等において利用される分化多能性細胞の効率的な調製に極めて有効な手段を極めて有効な手段を提供するものである。
【図１】
2010200676.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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