(57)【要約】【課題】  ベシクル内に抗癌剤などの薬物を内包させたり、ベシクル表面上に目的細胞に対する標的物質を固定化せずに、ベシクルそれ自身で目的細胞への特異標的機能、ベシクルの内包物の細胞への導入、およびその細胞の殺傷機能を付与することにある。【解決手段】  本発明は、非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０より調製した、相転移温度が非常に低く（−４０℃近傍）、かつ膜流動性の高い、Ｓｐａｎ８０ベシクルが、癌細胞に対して強い膜融合機能、癌細胞殺傷機能を有することを示し、さらにそれらの機能を利用することにある。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクルが癌細胞に対してのみ特異的に膜融合を起こすこと。
【請求項２】
Ｓｐａｎ８０ベシクルは、正常細胞に対して膜融合は起こさないこと。
【請求項３】
Ｓｐａｎ８０ベシクルは、癌細胞にのみＣａｓｐａｓｅ３経由のアポトーシス誘導機能を有すること。
【請求項４】
Ｓｐａｎ８０ベシクルは、抗癌剤の代わりとして使用できること。
【請求項５】
カチオニックペプチド脂質（ＣＰＬ）を、界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクル膜に添加していくにつれて、請求項３で述べたアポトーシス機能を抑制すること。
【請求項６】
Ｓｐａｎ８０ベシクル内に遺伝子や抗癌剤などの生理活性物質を内包させ、目的癌細胞へその生理活性物質を導入するベクターとして、Ｓｐａｎ８０ベシクルを使用する場合、その導入は請求項１で述べたＳｐａｎ８０ベシクルと癌細胞の膜融合により生じること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、非イオン性界面活性剤ベシクルが癌細胞のみに融合して癌細胞を殺傷する機能を明らかにしようとする技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】薬物送達システム（ＤＤＳ）において、癌細胞などを特異的に殺傷させる目的で、抗癌剤などの薬物をマイクロカプセル（ベシクル）に内包させ、その薬物を目的細胞部位にのみ送達させて癌細胞を特異的に殺傷させる方法がある。従来の方法では、そのベシクル自身では目的細胞に対する上記の標的・攻撃機能が無いために、ベシクル表面上に目的細胞へ選択的に結合する物質を固定化し、さらには目的細胞を殺傷させるための抗癌剤などをベシクルに内包させることが必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許公開２００３−００１０９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】従来、癌治療などのＤＤＳキャリアとして多く用いられるリポソームなどでは、リポソーム表面上に目的癌細胞に対する標的物質を固定化し、さらにそのリポソーム内に抗癌剤などの薬物を内包させることにより、はじめて癌細胞特異標的機能や、癌細胞殺傷機能を付与することができる。このようにリポソームそれ自身では、癌細胞特異標的機能や癌細胞殺傷機能は有しておらず、目的細胞へのリポソーム内包物の導入効率にも問題がある。副作用を軽減させたり、ベシクル内包物を膜融合により効率よく目的細胞に導入できるベシクルを、簡便に調製する技術を開発するためにも、ベシクルに何も固定化しない上記のような機能を有するベシクルの開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明は、非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０より調製した、相転移温度が非常に低く（−４０℃近傍）、かつ膜流動性の高い、Ｓｐａｎ８０ベシクルが、癌細胞に対して強い膜融合機能、癌細胞殺傷機能を有することを示し、さらにそれらの機能を利用することにある。
【発明の効果】
【０００６】この非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクルを人体に投与すると、このベシクルは癌細胞にのみ特異的に結合して正常細胞には結合しない。したがって、抗癌剤を使用することなく、その癌細胞のみを殺傷することができ、抗癌剤を使用しなくても癌治療ができる。これまでのマウス実験でも、そのＳｐａｎ８０ベシクルの体内毒性は無く、さらにこのベシクルの構成成分であるＳｐａｎ８０は、既に薬物安定化剤としての投与例もあり安全であり、今後のヒト癌治療への使用が期待出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】  ［表１］  細胞生存率を測定する時に、細胞に加えるサンプル（ベシクルはリポソーム懸濁液）の組成を示す。
【図１】  癌細胞、正常細胞に対して、リポソームおよびＳｐａｎ８０ベシクルをそれぞれ添加した時のそれらの細胞生存率を示す
【図２】  フローサイトメトリーの二重染色法により測定したドットプロットからＣｏｌｏｎ２６細胞のアポトーシス誘導が明らかになった。
【図３】  蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用した膜融合を評価する原理図
【図４】  癌細胞、正常細胞に対して、リポソームおよびＳｐａｎ８０ベシクルをそれぞれ添加した時のそれらの膜融合の変化を、蛍光共鳴エネルギー移動法により測定した結果：図３−１はＳｐａｎ８０ベシクル、図３−２はＰＯＰＣリポソームの場合を示す。
【図５】  Ｓｐａｎ８０ベシクルとＣｏｌｏｎ２６の融合を示す、位相差・蛍光顕微鏡写真。
【符号の説明】
【０００８】１．使用した癌細胞
ＯＳＴ：ヒト骨肉腫細胞
Ｈｅｌａ：ヒト子宮頸癌細胞
Ｃｏｌｏ２０１：ヒト大腸癌細胞
Ｃｏｌｏｎ２６：マウス結腸腺癌細胞
２．使用した正常細胞
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ヒト正常繊維芽細胞（皮膚由来）
ＥＣＶ３０４：ヒト正常血管内皮細胞
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１：マウス由来の骨芽細胞
３．使用したベシクル：  非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクル
４．使用したリポソーム：  ＰＯＰＣリポソーム
ＰＯＰＣ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，Ｍｗ＝７６０．１，２０ｍｇ／ｍｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｆｒｏｍ  Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）
【発明を実施するための形態】
【０００９】まず、０．２ｍｏｌ％のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、及び０．２ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥの二種の蛍光物質を内包させた、非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクル、およびＰＯＰＣリポソーム（ＰＯＰＣ：１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，Ｍｗ＝７６０．１，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）をそれぞれ調製する。一方数種の癌細胞、正常細胞を培養する。これらの癌細胞、および正常細胞に、上記のベシクルおよびリポソームを所定量混合する。
この時、それらのベシクルやリポソームが細胞と融合した時にのみ、蛍光が低下する
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を内包させた非イオン性界面活性Ｓｐａｎ８０からなるベシクル、およびＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ内包のＰＯＰＣリポソームを調製する。それらのベシクルやリポソームが生細胞と融合すると、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭが細胞内に導入され、エステラーゼにより加水分解されてＣａｌｃｅｉｎに変換され蛍光を発するようになる。この方法により、細胞との融合を蛍光顕微鏡で
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特異的に融合することを確認した。つぎに、上記のベシクルとリポソームの濃度をそれぞれ変化させ、数種の癌細胞、正常細胞に添加して、それらの細胞の生存率に及ぼす影響を調べた。その結果、Ｓｐａｎ８０ベシクルが、癌細胞のみを殺傷する機能を有していることを発見した。さらに、二種の蛍光物質Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥと７ＡＡＤによるフローサイトメーターを使用した二重染色法により、前述のＳｐａｎ８０ベシクルの癌細胞特異的殺傷機能がアポトーシスによるもであることを明らかにした。
【実施例】
【００１０】
【実施例１】Ｓｐａｎ８０ベシクルの調製は次ぎのように行った。本研究ではベシクルの調製にはマイクロホモジナイザーの撹拌による二段階乳化法によって行った。Ｓｐａｎ８０  １３２ｍｇ、レシチン（市販の大豆レシチンを精製）１２ｍｇ、コレステロール６ｍｇを３ｍｌのヘキサンで溶解し、ベシクル内水相となる水溶液３００μｌ（ＰＢＳやＥＳＡ溶液など）をそのヘキサン中に添加しながら、マイクロホモジナイザーを用いて１５０００ｒｐｍで３分間撹拌する（一次乳化）。その一時乳化液をエバポレーションしてヘキサンを除去して、クリーム状のエマルションにする。このエマルションに、親水性の界面活性剤のＴｗｅｅｎ８０  ４８ｍｇを溶解させたＰＢＳ溶液３ｍｌ添加して３０００ｒｐｍで１分間撹拌する（二次乳化）。その二次乳化したベシクル溶液を、超遠心器にかけ遠心管上部に集まった油玉を除去した後、そのベシクル溶液を透析チューブで透析した。【００１１】
【実施例２】以下のような方法でＮＢＤ−ＰＥとＲｈｏ−ＰＥがそれぞれ０．２ｍｏｌ％含むＰＯＰＣ
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たＰＯＰＣを３ｍｌ、クロロホルムに溶解したＮＢＤ−ＰＥを６０μｌ、そしてクロロホルムに
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この溶液をロータリーエバポレーターに移し、相転移温度以上の湯浴中（２８℃）で回転させながらロータリーエバポレーターで４００ｍｂａｒ、３００ｍｂａｒ、２００ｍｂａｒ、１５０ｍｂａｒ、１００ｍｂａｒ、５０ｍｂａｒ、５０ｍｂａｒ以下となるように減圧してナスフラスコ内のクロロホルムを除去し、底に脂質薄膜を作成した。１５０ｍｂａｒ以下の減圧操作は特にゆっくり行
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らはずして、直ちにナスフラスコを真空乾燥機に接続し、真空ポンプで二晩真空状態
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と、内水となるＰＢＳ０．３ｍｌを同時にナスフラスコに加え、そのナスフラスコに１分間目盛り２でホモミキサー処理を行い、フラスコ内の薄膜がすべて剥離して、水相中に
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窒素につけて凍結させた後、再び容器ごと水（室温の水道水）につけて懸濁液を溶かした。この凍結融解操作（凍結３分、融解７分）を５回繰り返した。
【実施例３】用いた癌細胞はマウス結腸腺癌細胞Ｃｏｌｏｎ２６、ヒト大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０１、ヒト子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ。ヒト正常繊維芽細胞（皮膚由来）Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ヒト不死化正常血管内皮細胞ＥＣＶ３０４のそれぞれ２種類を用いた。
【実施例４】癌細胞（ＯＳＴ・Ｃｏｌｏ２０１・Ｈｅｌａ）・正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ・ＥＣＶ３０４）の入ったシャーレを必要量準備する。シャーレの上清を取り除き、トリプシンでピペッティングにより回収する。遠心分離にかけ、上清をアスピレ−ターで吸引し、ＤＭＥＭ培地で懸濁して、血球計算板で細胞数を数える。各ｗｅｌｌに細胞数が２×１０５（ｃｅｌｌｓ／／ｍｌ）になるように細胞密度を調整し、１２穴シャーレに細胞を撒く。シャーレに細胞を接着させるためにインキュベーターに入れて１６時間培養する。培地をアスピレーターで取り除き（接着していない細胞を除き、接着している細胞のみで測定を行うことができる）、それに種々の濃度のサンプル（Ｓｐａｎ８０ベシクルやリポソーム懸濁液）を表１に示したような割合で添加する。（ＣｏｎｔｒｏｌはＰＢＳを添加した。）４８時間後、ベシクルおよびリポソーム（濁度０．２９５）をそれぞれ添加した各濃度（ベシクルおよびリポソームの）の細胞数を血球計算板で数える。この際に４％トリパンブルー／ＰＢＳで１５分間インキュベートして死細胞を染色し、総細胞数と死細胞数を数える。
細胞生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝（総細胞数−死細胞数）／総細胞数となる。【００１２】図１に示すように、種々の癌細胞と正常細胞に対して、それぞれリポソームとＳｐａｎ８０ベシクルを添加して、その生存率を調べた。その結果、Ｓｐａｎ８０ベシクルの添加量に相関して、癌細胞が死滅していくことが明らかになった。一方正常細胞には対してはそのような死滅現象はほとんど見られなかった。またＰＯＰＣリポソーム添加の場合についても、癌細胞、正常細胞ともにそのような死滅現象は見られなかった。結局Ｓｐａｎ８０ベシクルのみが、癌細胞に対して殺傷機能を有していると言える。
【実施例５】二重染色法のフローサイトメトリーは次ぎのように行った。例えば、Ｃｏｌｏｎ２６細胞の入ったシャーレを必要量準備（培養）した。シャーレの上清（培地、血清）を取り除き、０．０２％  ＥＤＴＡ−ＰＢＳでピペッティングにより回収した。遠心分離にかけ、上清をアスピレーターで吸引し、ＤＭＥＭ培地で懸濁して血球計算板で細胞数を数え、細胞数が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞濃度を調製し、１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞をプレーティングした。細胞を接着されるために２０時間インキュベートした。その後、接着していない細胞を除き、接着している細胞のみで測定をするため、培地を交換した。この時使用したものは５％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭである。Ｓｐａｎ８０ベシクル懸濁液（濁度０．２４６）を１００μｌ加えて１２、２４、４８時間培養した。各時間経過後、細胞を０．０２％  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで回収、遠心（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）し、１×Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ溶液１００μｌに懸濁させた。
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Ｖ−ＰＥ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを４００μｌ加えた。Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を用いて測定し、ＷｉｎＭＤＩ（ｆｒｅｅ  ｓｏｆｔ）を用いてアポトーシスの程度を解析した。図２に示すようなドットプロットが得られ、Ｓｐａｎ８０ベシクルの添加によりＣｏｌｏｎ２６細胞にアポトーシスが発現し、それによってＣｏｌｏｎ２６細胞が殺傷されたことが解る。このような現象はＯＳＴ、ＥＲＭ５−１、Ｈｅｌａ細胞など多くの癌細胞で見られた。【００１３】また、カチオニックペプチド脂質（ＣＰＬ）をＳｐａｎ８０ベシクル膜に添加するに連れて、この癌細胞へのアポトーシス誘導機能は減少し、ＣＰＬにアポトーシス抑制機能があることが判明した。
【実施例６】ベシクルあるいはリポソームと生細胞間の膜融合に関しては、以下のような原理の下に行った。ベシクルが融合する際には、まずベシクルの膜を構成する脂質分子の混合が起こり（ｈｅｍｉｆｕｓｉｏｎ）、その後内水相の混合が起こると完全な融合となる（ｆｕｓｉｏｎ）。そこで、ベシクルの融合を評価する方法として膜構成脂質の混合、内水相の混合の二つの観点から評価する必要がある。本実験では膜構成脂質の混合を測定した。
膜構成脂質の混合の評価方法としてよく用いられるのが、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用した方法である。ＦＲＥＴは色素二分子の電子励起状態間の相互作用によって生じ、その効率は両分子間距離の６乗に反比例する。ＦＲＥＴが起きるには、供与体分子と受容体分子が近接していること（１０〜１００Å以内）、受容体分子の吸収スペクトルと供与体分子の蛍光スペクトルが重なっていることが要求され、蛍光物質Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＮＢＤを用いたＦＲＥＴによる分析法が用いられている。本実験ではベシクル膜及びリポソーム膜に、０．２ｍｏｌ％のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、及び０．２ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥを含有させた。
膜構成脂質の混合の程度は、蛍光性脂質Ｒｈｏ−ＰＥ、ＮＢＤ−ＰＥによる蛍光共鳴エネルギー移動を利用して評価した。ベシクルと細胞及びリポソームと細胞の混合は、蛍光物質内包ベシクル及び蛍光物質内包リポソームと、任意の細胞数に調製した細胞懸濁液をそれぞれ等量ずつ加えた。波長４７２ｎｍにより励起した時の５２４、５７２ｎｍの蛍光強度ＦＮＢＤ、ＦＲｈｏを測定した。エネルギー移動効率をＥＴとおいた。
ＥＴ＝ＦＲｈｏ／ＦＮＢＤ【００１４】ここでＥＴ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）とはＦＲｈｏ／ＦＮＢＤのことであり、ＦＮＢＤは励起波長：蛍光波長が（４７２：５２４）ｎｍ、ＦＲｈｏは励起波長：蛍光波長が（４７２：５７２）ｎｍの時の蛍光強度である。ＥＴ（ｔ）とはＲｈｏ−ＰＥとＮＢＤ−ＰＥを各０．２ｍｏｌ％含むベシクルと細胞を混合後、基本的に、０，３０，６０，１２０，１８０分のＥＴである。図３に上記の原理を模式化して説明する。０．２ｍｏｌ％の蛍光物質を内包したベシクル及びリポソームと、細胞懸濁液を等量ずつ混合し融合させる。融合初期ではベシクル上及びリポソーム上の試薬同士の距離が近いため、エネルギー移動がよく起こり、ＮＢＤの値は小さく、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの値は大きくなる。また融合が進み粒径が大きくなることで、試薬同士の距離が離れ、エネルギー移動が生じにくくなり、ＮＢＤの値は大きく、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの値は小さくなる。この変化を融合の進行として測定した。図４に示すように、Ｓｐａｎ８０ベシクルを添加した場合にのみ（図３−１（ａ））、蛍光強度が低下している。このことから、Ｓｐａｎ８０ベシクルは癌細胞にのみ膜融合することが明らかになった。
【実施例７】蛍光試薬内包ベシクルおよびリポソーム内には、蛍光試薬の量がそれぞれ０．２ｍｏｌ％のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、及び０．２ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥを含ませた。０．２ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％になるように仕込み量を調整した。以下のように調製した。調製の際には逐次アルミホイルをかぶせて蛍光試薬が消光するのを防ぐ。調製後はアルミホイルを巻いた試験管に入れ保存した。
【実施例８】細胞調製・サンプル調製法＿滅菌ＰＢＳ中に細胞が１０７ｃｅｌｌｓになるように調製し、細胞懸濁液を作成した。用いた細胞は、癌細胞では、マウス結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０１、ヒト子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａ、正常細胞ではマウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、ヒト線維芽細胞（皮膚由来）、ヒト血管内皮細胞ＥＣＶ３０４のそれぞれ３種類
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述のように調製した蛍光試薬内包ベシクル及び蛍光試薬内包リポソームをそれぞれ１５０
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基本的に０，３０，６０，１２０，１８０分で蛍光分光光度計を用いて測定した。
【実施例９】Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭは、元々親水性のＣａｌｃｅｉｎの４つのＣＯＯＨ基をＡＭエステル基で修飾することで、疎水性の高い、脂溶性非荷電分子にしたものである。脂溶性非荷電物質のＣａｌｃｅｉｎＡＭは、生細胞の細胞膜の選択的透過性によって取り込まれ、細胞内のエステラーゼによって加水分解されて、ＡＭエステル基がカルボキシル基なって、親水性のＣａｌｃｅｉｎに戻る機構で蛍光を発し、細胞外に漏出することなくする生細胞を染色する事ができる。また、ＣａｌｃｅｉｎＡＭを無水ＤＭＳＯで溶解し、１×Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  ＤＷ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解する事で、２μＭ  ＣａｌｃｅｉｎＡＭ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製したが、これは大過剰の蒸留水にＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭが溶解しているので、親水性に限りなく近く、これによりＳｐａｎ８０ベシクルに内包することができた。【００１５】
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マルションの調製：ベシクルの主成分となる６６ｍｇのＳｐａｎ８０にｎ−ヘキサン３ｍｌを加え、ホモミキサー（１５０００ｒｐｍ）で３０秒間撹拌した。その後、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴＲＥＶＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．コードＮｏ．４８９２−０１０−Ｋ）を用いて調製した３３．３μＭの
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移し、恒温槽中約３０℃で、ロータリーエバポレーターで減圧し、ｎ−ヘキサンを除去した。
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に、２４ｍｇのＴｗｅｅｎ  ８０を溶解したＰＢＳ溶液（外水）３ｍｌを添加し、ホモミキサー（３５００ｒｐｍ）で撹拌した。この二段階乳化法により調製されたベシクルは、その構成成分によっては多くが凝集している場合があるため、以下の手順でベシクルの再分散を行った。（ａ）調製したベシクルを、マグネチックスターラーを用いて気泡が出なくなるまで（約３時間）撹拌し、その後、冷蔵庫内で撹拌しながら一昼夜放置した。（ｂ）その懸濁液を遠心分離し，一昼夜透析を行い、内水層から漏出したＣａｌｃｅｉｎ溶液を除去した。
【実施例１０】ＣａｌｃｅｉｎＡＭ内包のＳｐａｎ８０ベシクルと細胞間の融合に関する位相差・蛍光顕微鏡観察の観察は以下のように行った。マウス結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６、ヒト子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａ、ヒト正常線維芽細胞（皮膚由来）、ヒト正常血管内皮細胞株ＥＣＶ３０４を回収し、培地に含まれているフェノールレッドのバックグラウンドを除去するため、またＦＢＳに含まれているエステラーゼを除去するために、脱気した滅菌ＰＢＳに懸濁した。それに細胞懸濁液に対して２０％の量を添加し、インキュベーター内で放置して、１〜３時間経過後に採取して、位相差・蛍光顕微鏡にて観察を行った。
図５に、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ内包のＳｐａｎ８０ベシクルと  Ｃｏｌｏｎ２６細胞の内水相どうしの融合が生じ（図５−ａ）、ベシクル内のＣａｌｃｅｉｎＡＭがＣｏｌｏｎ２６細胞内に導入されて、加水分解されたＣａｌｃｅｉｎが蛍光を発している様子を示す蛍光顕微鏡写真を示す。このような様子は、Ｈｅｌａ細胞などでも観察された。こうして、Ｓｐａｎ８０ベシクルが癌細胞と融合する様子が位相差・蛍光顕微鏡でも観察された。
【表１】
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例えば、ベシクル（あるいはリポソーム）のサンプルを１００μｌに対しては、培地８００μｌ、血清μｌをそれぞれ添加して、合計で１ｍｌとした。以下サンプル量が５０、２５、１２．５、６２．５の場合も同様に合計で１ｍｌとした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−（１）】
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【図４−（２）】
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【図５】
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