(57)【要約】【課題】より精度の高い画像を取得する。【解決手段】照明光学系により光源１４から射出される照明光が試料１２に集光され、結像光学系により試料１２からの観察光が結像される。また、光分離部材２２は、試料１２の集光点と略共役な位置に入射する観察光を、少なくとも試料１２の集光点の近傍領域からの観察光とその周辺領域からの観察光とに分離し、光検出器２６が、光分離部材２２により分離された観察光を検出する。そして、シャッタ２３ａおよび２３ｂは、集光点の近傍領域からの観察光と、周辺領域からの観察光とが、光検出器２６において交互に検出されるように、光検出器２６に入射する観察光を切り替える。本発明は、例えば、共焦点顕微鏡に適用できる。【選択図】図１
2010026063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から射出される照明光を試料に集光する照明光学系と、
前記試料からの観察光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系に関し前記試料の集光点と略共役な位置に入射する前記観察光を、少なくとも前記試料の前記集光点の近傍領域からの観察光とその周辺領域からの観察光とに分離する光分離部材と、
前記光分離部材により分離された観察光を検出する検出手段と、
前記集光点の近傍領域からの観察光と前記周辺領域からの観察光とが前記検出手段において交互に検出されるように、前記検出手段に入射する観察光を切り替える切替手段と
を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光学系は、前記照明光を前記試料の所定の面内で走査する走査手段を有し、
前記切替手段は、前記走査手段による前記照明光の走査と同期したタイミングで、前記検出手段に入射する観察光を切り替える
ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記集光点の近傍領域からの観察光に基づく第１の画像データと、前記周辺領域からの観察光に基づく第２の画像データを用いて、前記第１および第２の画像データとはセクショニング分解能が異なる画像データを作成する演算手段
をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関し、特に、より精度の高い画像を取得することができるようにした共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡では、生体標本などの試料に照明光を集光させるとともに、その照明光が集光するスポット（集光部）を走査させ、スポットから射出する光束を共焦点絞り面に集光させて、その共焦点絞りを通過した光束を光検出器で検出することにより、試料の二次元の画像が取得される。
【０００３】
また、共焦点顕微鏡は、共焦点面にピンホール部材を配置し、そのピンホール（開口）内に集光する光のみを通過させることで、試料の特定の高さから射出した光のみが光検出器に入射し、その高さ以外の部分から射出した光がカットされるよう構成されている。これにより、共焦点顕微鏡では、試料の特定の高さに位置する薄い層にのみ限定（セクショニング）された画像を取得することができる。
【０００４】
そして、共焦点顕微鏡では、ピンホール部材の開口径を変更することにより、セクショニング分解能（観察対象となる層の厚み）を変更することができ、開口径を大きくするとセクショニング分解能を低くすることができ、開口径を小さくするとセクショニング分解能を高くすることができる。
【０００５】
また、例えば、特許文献１に開示されている共焦点顕微鏡では、試料から射出する観察光を分離させて、開口径が異なるピンホールをそれぞれ通過させ、それぞれの光を光検出器で検出することにより、セクショニング分解能の異なる複数の画像が取得される。そして、それらのセクショニング分解能の異なる複数の画像に基づいて、それらの画像とはセクショニング分解能の異なる画像が作成される。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７４５９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、特許文献１に開示されている共焦点顕微鏡では、観察光が通過するピンホールごとに光検出器を設ける必要があり、光検出器ごとの装置誤差によって、作成される画像の精度が低下することがあった。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より精度の高い画像を取得することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の共焦点顕微鏡は、光源から射出される照明光を試料に集光する照明光学系と、前記試料からの観察光を結像する結像光学系と、前記結像光学系に関し前記試料の集光点と略共役な位置に入射する前記観察光を、少なくとも前記試料の前記集光点の近傍領域からの観察光とその周辺領域からの観察光とに分離する光分離部材と、前記光分離部材により分離された観察光を検出する検出手段と、前記集光点の近傍領域からの観察光と前記周辺領域からの観察光とが前記検出手段において交互に検出されるように、前記検出手段に入射する観察光を切り替える切替手段とを備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明の共焦点顕微鏡においては、光源から射出される照明光を試料に集光され、試料からの観察光を結像される。また、試料の集光点と略共役な位置に入射する観察光が、少なくとも試料の集光点の近傍領域からの観察光とその周辺領域からの観察光とに分離され、その分離された観察光が検出される。そして、集光点の近傍領域からの観察光と周辺領域からの観察光とが検出手段において交互に検出されるように、検出手段に入射する観察光が切り替えられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の共焦点顕微鏡によれば、より精度の高い画像を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
図１は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【００１４】
図１において、共焦点顕微鏡１１では、観察の対象となる試料１２がステージ１３に載置されており、試料１２に励起光を照射することにより試料１２に含まれている蛍光成分が励起され、試料１２から発せられる蛍光を検出することで、試料１２の画像データが取得される。
【００１５】
光源１４から射出される光束は、照明用レンズ１５により平行光とされ、励起フィルタ１６によりフィルタリングされることによって試料１２に含まれている蛍光成分を励起させる波長領域の励起光となり、ダイクロイックミラー１７に入射する。
【００１６】
ダイクロイックミラー１７は、所定の波長領域の光のみを反射するとともに、他の波長領域の光を透過することができ、励起フィルタ１６を介して入射する励起光を、光軸Ｌに沿って反射してガルバノミラー１８に入射させる。ガルバノミラー１８は、励起光を反射しつつ回動することで、光軸Ｌに直交する平面で励起光を走査させ、その励起光は、対物レンズ１９により集光されて試料１２上にスポットを形成する。
【００１７】
試料１２では、励起光のスポットが形成された領域から蛍光が射出され、その蛍光は、対物レンズ１９を介してガルバノミラー１８に入射する。ガルバノミラー１８は、試料１２に照射した励起光を走査したときと同様の角度で試料１２からの蛍光を反射することで、その蛍光を平行光束に戻し（デスキャンし）、ダイクロイックミラー１７に入射する。
【００１８】
ダイクロイックミラー１７に入射した蛍光は、励起光とは波長が異なることからダイクロイックミラー１７を透過し、蛍光フィルタ２０を通過することにより、試料１２から発せられた蛍光以外の散乱光などがフィルタリングされて集光レンズ２１に入射する。集光レンズ２１は蛍光フィルタ２０を介して入射する蛍光を集光し、その焦点位置には、即ち、対物レンズ１９の焦点位置とほぼ共役な位置（共焦点位置）には、光分離部材２２が配置されている。
【００１９】
光分離部材２２には、直径がそれぞれ異なる２つのピンホール２２ａおよび２２ｂが設けられており、光分離部材２２は、入射した蛍光を分離し、分離された蛍光はピンホール２２ａおよび２２ｂをそれぞれ通過する。光分離部材２２の詳細な説明は図２を用いて後述する。そして、ピンホール２２ａを通過した蛍光はシャッタ２３ａを介して、ハーフミラー２４により反射されて光検出器２６に入射する。また、ピンホール２２ｂを通過した蛍光はシャッタ２３ｂを介して、ミラー２５により反射され、ハーフミラー２４を透過して光検出器２６に入射する。
【００２０】
ここで、ピンホール２２ａを通過する蛍光は、対物レンズ１９の集光位置近傍領域から発光した蛍光であり、ピンホール２２ｂを通過する蛍光は、対物レンズ１９の集光位置近傍の周辺領域から発生した蛍光である。近傍領域は、対物レンズ１９、ピンホール２２ａの大きさなどによって決まるものである。
【００２１】
シャッタ２３ａおよび２３ｂは、例えば、AOM(Acousto-Optic Modulator：音響光学素子)やAOFT（音響光学可変フィルタ）などの高速シャッタ素子であり、コンピュータ２７の制御に従って、図３を参照して後述するように、それぞれ交互に開閉する。また、コンピュータ２７は、ガルバノミラー１８により励起光が走査されるタイミングと同期して、例えば、ガルバノミラー１８によるスキャンの１ラインごとにシャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉を制御する。このようにシャッタ２３ａおよび２３ｂが交互に開閉することで、光分離部材２２のピンホール２２ａを通過した蛍光と、光分離部材２２のピンホール２２ｂを通過した蛍光とが、交互に光検出器２６に入射する。
【００２２】
光検出器２６は、そこに入射する蛍光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号をコンピュータ２７に供給する。
【００２３】
コンピュータ２７は、シャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉を制御するタイミングに応じて、光検出器２６から出力される検出信号を別々に画像処理する。即ち、コンピュータ２７は、シャッタ２３ａを開放させるとともにシャッタ２３ｂを閉鎖させて、ピンホール２２ａを通過した蛍光が検出された検出信号から画像データを構築する画像処理と、シャッタ２３ｂを開放させるとともにシャッタ２３ａを閉鎖させて、ピンホール２２ｂを通過した蛍光が検出された検出信号から画像データを構築する画像処理とを行う。
【００２４】
そして、コンピュータ２７は、ピンホール２２ａを通過した蛍光に基づく画像データと、ピンホール２２ｂを通過した蛍光に基づく画像データとをそれぞれ構築し、それらの画像をコンピュータ２７のモニタに表示させるとともに、ハードディスクドライブなどの記録部に記録させる。
【００２５】
このように、共焦点顕微鏡１１では、光分離部材２２において試料１２から発せられる蛍光が分離され、直径がそれぞれ異なる２つのピンホール２２ａおよび２２ｂを通過した蛍光に基づいた２つの画像データが取得される。
【００２６】
次に、図２を参照して、光分離部材２２について説明する。
【００２７】
光分離部材２２は、図２に示すような中空の多面体の部材により構成されており、その外壁部に、ピンホール２２ａおよび２２ｂ、並びに、集光レンズ２１により集光される蛍光を入射させるための開口部２２ｃが設けられている。また、光分離部材２２は、ピンホール２２ａおよび２２ｂが集光レンズ２１の焦点深度内に配置されるような光軸Ｌ上の所定位置に配置される。
【００２８】
また、光分離部材２２の内周面は、光を反射する反射部材により構成されており、ピンホール２２ａの周囲の反射面２２ｄにおいて、光軸Ｌに沿って光分離部材２２に入射した蛍光が反射され、その反射された蛍光は、シャッタ２３ａおよび２３ｂが設けられている外壁部と対向する外壁部の反射面２２ｅによりピンホール２２ｂに向かって反射される。
【００２９】
即ち、光分離部材２２は、反射面２２ｄおよび２２ｅが光軸Ｌに対して傾斜するように、光軸Ｌ上に配置されており、ピンホール２２ａの開口径よりも広い範囲の蛍光が反射面２２ｄにより反射されることで、ピンホール２２ａを通過する蛍光と、反射面２２ｅを介してピンホール２２ｂを通過する蛍光とに分離される。
【００３０】
また、ピンホール２２ａの開口径は、ピンホール２２ｂの開口径よりも小さく設定されており、集光レンズ２１により集光されて光分離部材２２に入射する蛍光のうち、その中央部付近の蛍光が（対物レンズ１９の集光位置近傍領域から発生した蛍光）ピンホール２２ａを通過し、ピンホール２２ａの周囲の反射面２２ｄにより反射され、さらに反射面２２ｅにより反射された蛍光が、ピンホール２２ｂを通過する。即ち、ピンホール２２ｂを通過する蛍光は、集光レンズ２１により集光された蛍光のうちの、中央部付近が除かれたリング状の周辺部（ピンホール２２ａの開口径を内径とし、ピンホール２２ｂの開口径を外形とするリング状の領域）の蛍光（対物レンズ１９の集光位置近傍の周辺領域から発生した蛍光）となる。
【００３１】
このように、光分離部材２２が、集光レンズ２１により集光される蛍光を分離することで、ピンホール２２ａを通過した蛍光が、シャッタ２３ａを介して光検出器２６に入射し、ピンホール２２ｂを通過した蛍光が、シャッタ２３ｂを介して光検出器２６に入射する。そして、シャッタ２３ａおよび２３ｂは、ピンホール２２ａを通過した蛍光とピンホール２２ｂを通過した蛍光とが、交互に光検出器２６に入射するようなタイミングで開閉する。
【００３２】
次に、図３に示されているタイミングチャートを参照して、シャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉のタイミングについて説明する。
【００３３】
図３は、縦軸が、シャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉（Open/Close）を制御する制御信号の信号値（1/0）を表しており、横軸が、時刻の経過を表している。例えば、制御信号Ｃ１によりシャッタ２３ａの開閉が制御され、信号値が１であるときシャッタ２３ａが開放され、信号値が０であるときシャッタ２３ａが閉鎖される。同様に、制御信号Ｃ２によりシャッタ２３ｂの開閉が制御され、信号値が１であるときシャッタ２３ｂが開放され、信号値が０であるときシャッタ２３ｂが閉鎖される。
【００３４】
図３に示すように、シャッタ２３ａが開放されているときはシャッタ２３ｂが閉鎖され、シャッタ２３ｂが開放されているときはシャッタ２３ａが閉鎖されるように、シャッタ２３ａおよび２３ｂは、交互に開放して蛍光を通過させるように制御される。
【００３５】
例えば、シャッタ２３ａおよび２３ｂは、ガルバノミラー１８が励起光を走査するタイミングと同期して、ガルバノミラー１８により励起光が走査される１ラインに対応する時間ごとに開閉を繰り返す。また、シャッタ２３ａおよび２３ｂは、ガルバノミラー１８が励起光を走査して発せられる蛍光に基づく画像の１画素に対応する時間ごとに開閉を繰り返す。なお、例えば、シャッタ２３ａおよび２３ｂとして、高速シャッタ素子を用いずに、低速で駆動するシャッタが用いられている場合には、１つの画像を取得するごとに、シャッタ２３ａおよび２３ｂが交互に開閉されるようにしてもよい。
【００３６】
このようなシャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉に応じて、ピンホール２２ａを通過した蛍光と、ピンホール２２ｂを通過した蛍光とが、時分割で光検出器２６に入射される。そして、光検出器２６が、ピンホール２２ａを通過した蛍光とピンホール２２ｂを通過した蛍光とをそれぞれ検出し、コンピュータ２７において、シャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉に応じたタイミングで画像処理を切り替えて行うことで、それぞれの蛍光に基づく２枚の画像データが取得される。
【００３７】
即ち、共焦点顕微鏡１１では、ピンホール２２ａを通過した蛍光から得られるセクショニング分解能が高い（観察対象となる層が薄い）第１の画像データと、ピンホール２２ｂを通過した蛍光から得られるセクショニング分解能が低い（観察対象となる層が厚い）第２の画像データとが、コンピュータ２７の記録部に記録される。
【００３８】
そして、コンピュータ２７は、記録部に記録されているセクショニング分解能が高い第１の画像データと、セクショニング分解能が低い第２の画像データとを用いた演算を行うことで、観察者により指定される任意のセクショニング分解能の画像データを作成し、その画像をモニタに表示させることができる。
【００３９】
例えば、セクショニング分解能が高い第１の画像データをＤａとし、セクショニング分解能が低い第２の画像データをＤｂとすると、任意のセクショニング分解能の画像データＤは、Ｄ＝Ｄａ＋αＤｂで算出される。ここで、αは、重み関数であり、観察者は、−１から＋１の範囲でαを指定することで、第１の画像データのセクショニング分解能および第２の画像データのセクショニング分解能とは異なる任意のセクショニング分解能の画像を作成させることができる。
【００４０】
このように、共焦点顕微鏡１１では、セクショニング分解能が高い第１の画像データとセクショニング分解能が低い第２の画像データとを得て、任意のセクショニング分解能の画像を作成することができる。その際、シャッタ２３ａおよび２３ｂにより、光検出器２６に入射する蛍光が、ピンホール２２ａを通過した蛍光と、ピンホール２２ｂを通過した蛍光とで切り替えられるので、第１の画像データと第２の画像データとは、いずれも光検出器２６により検出された蛍光から取得することができ、これにより、任意のセクショニング分解能の画像の精度を向上させることができる。
【００４１】
即ち、例えば、試料から発せられる蛍光を分離させて開口径の異なるピンホールを通過させ、それぞれのピンホールを通過した蛍光を異なる光検出器で検出して第１の画像データと第２の画像データとを取得するような共焦点顕微鏡では、それぞれの光検出器の特性（ゲインや、オフセット、波長感度など）の校正を行わなければならず、それらの校正を行ったとしても、同一の条件で画像を取得することは困難である。このように、画像を取得する条件が異なるため、それらの画像に基づいてセクショニング分解能の異なる画像を作成したとしても、その精度は低いものであった。
【００４２】
これに対し、共焦点顕微鏡１１では、光検出器２６により、ピンホール２２ａを通過した蛍光と、ピンホール２２ｂを通過した蛍光を検出するので、同一の条件で画像を取得することができ、より精度の高い画像を作成することができる。即ち、同一の条件で取得された２枚の画像を用いて画像を作成するので、異なる条件で取得された２枚の画像を用いる場合よりも、より正しい（実際の測定結果により近い）画像が作成される。
【００４３】
また、複数の光検出器を用いる共焦点顕微鏡では、それぞれの光検出器の置かれている環境や、それぞれの光検出器の計時変化などについても考慮する必要があり、画像の取得が煩雑なものになっていた。これに対し、共焦点顕微鏡１１では、１つの光検出器が用いられるので、それらを考慮する必要はなく、画像の取得を容易に行うことができる。
【００４４】
また、共焦点顕微鏡１１は、複数の光検出器を用いることなく構成されるので、複数の光検出器を用いる共焦点顕微鏡よりも、小型化することができるとともに、構成が複雑化することを回避することができ、ひいては、低コスト化を図ることができる。
【００４５】
さらに、ガルバノミラー１８により励起光が走査されるタイミングと同期して、１ラインまたは１画素ごとにシャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉を制御することで、ピンホール２２ａを通過した蛍光に基づく画像と、ピンホール２２ｂを通過した蛍光に基づく画像とのタイムラグを短縮させることができるので、例えば、試料１２が、生きている生物標本であっても、セクショニングの異なる２枚の画像を、ほぼ同じ構図で取得することができる。
【００４６】
なお、共焦点位置において、試料１２からの蛍光を分離する分離手段は、図２に示したような構成の光分離部材２２に限られるものではなく、例えば、プリズム、ダイクロイックミラー、ハーフミラーなどを利用して蛍光を分離し、それぞれの蛍光を開口径の異なるピンホールを通過させるような構成のものを用いることができる。
【００４７】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【図２】光分離部材２２を説明する図である。
【図３】シャッタ２３ａおよび２３ｂの開閉のタイミングを示すタイミングチャートである。
【符号の説明】
【００４９】
１１  共焦点顕微鏡，  １２  試料，  １３  ステージ，  １４  光源，  １５  照明用レンズ，  １６  励起フィルタ，  １７  ダイクロイックミラー，  １８  ガルバノミラー，  １９  対物レンズ，  ２０  蛍光フィルタ，  ２１  集光レンズ，  ２２  光分離部材，  ２２ａおよび２２ｂ  ピンホール，  ２２ｃ  開口部，  ２２ｄおよび２２ｅ  反射面，  ２３ａおよび２３ｂ  シャッタ，  ２４  ハーフミラー，  ２５  ミラー，  ２６  光検出器，  ２７  コンピュータ
【図１】
2010026063.tif 000003
【図２】
2010026063.tif 000004
【図３】
2010026063.tif 000005