(57)【要約】【課題】線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有する新規物質を提供すること。【解決手段】式(I)：    Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２   (I：配列番号１)(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：    Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３            (II：配列番号２)(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：    Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ                    (III：配列番号３)で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２   (I：配列番号１)
(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３            (II：配列番号２)
(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ                    (III：配列番号３)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
【請求項２】
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ                    (III：配列番号３)
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
【請求項３】
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(配列番号４)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
【請求項４】
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(配列番号５)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
【請求項５】
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(配列番号６)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有してなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、並びにそれらを含有する組成物に関する。本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、線維芽細胞由来エラスターゼの活性を阻害するために、及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰｓ)の活性を阻害するために有益に利用され得る。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物の結合組織には、その主要成分として、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ラミニンなどが含まれていることが分かっている。
【０００３】
エラスチンは、黄色いランダムコイル型の線維状タンパク質から構成され、２倍近い長さに引き伸ばしても緩めると元に戻るという、ゴムのような強力な弾力性を有することで知られている。このエラスチンは、結合組織において、架橋したコラーゲンをバネのようにして支え、伸び縮みの原動力となり、皮膚の弾力やハリなどを保つのに大きな働きをしている。生体内においてエラスチンは、皮膚の真皮、靭帯、腱、血管壁など伸縮性の必要な器官に広く分布しており、これらの器官で弾力性を与えるのに非常に重要な役割を担っている。
【０００４】
しかしエラスチンは、加齢や紫外線、活性酸素、ストレスなどにより徐々にその量が減少してしまうことが知られている。そしてこの減少は、本来あるべき弾力性を徐々に失わせ、皮膚などにおいてシワやたるみを生じさせ、老化の大きな一因となることが分かっている。また、正常エラスチンの欠乏は動脈硬化などの血管系疾患の一因となり得ることも知られている。
【０００５】
エラスチンを分解して減少させるエラスターゼ(エラスチン分解酵素)のうち、皮膚の真皮マトリックスに存在するエラスチンの分解に関与するエラスターゼとしては、好中球由来のエラスターゼと線維芽細胞由来のエラスターゼがよく知られている。その中でも、線維芽細胞由来のエラスターゼは、皮膚の弾力性維持にかかわる弾性繊維を構成するエラスチンを分解することが知られているため、その活性を阻害することにより高い抗シワ効果が得られることとなる。
【０００６】
これまでにも、線維芽細胞由来エラスターゼの活性を阻害する物質についての研究がなされており、例えば、ショウキョウエキスなどの植物又はその抽出物などが用いられ得ることが知られている(例えば、特許文献１参照)。
【０００７】
また近年、皮膚の老化には、マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰｓ)が深く関与していることが指摘されている。ＭＭＰｓは、種々の細胞外マトリックスを基質とするタンパク質分解酵素であり、その基質特異性からコラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロメライシン群、膜型ＭＭＰ群、及びその他の群(例えば、マトリライシン等)に大きく分類される。
【０００８】
コラゲナーゼ群に含まれるＭＭＰｓとしては、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３などが挙げられる。なかでもＭＭＰ−１は、真皮マトリックスの主要構成成分であるタイプＩコラーゲンを含む複数種のコラーゲンなどを分解することで知られ、皮膚の老化に大きな影響を与えるとされている。従って、このＭＭＰ−１の活性を阻害することができる物質は、コラーゲンの分解を抑制でき、皮膚の老化を防止することができる。また近年、紫外線をあびることにより皮膚の線維芽細胞内のＭＭＰ−１発現量が増大することが分かってきており、ＭＭＰ−１は光老化の原因物質としても注目されつつある。従って、ＭＭＰ−１活性を阻害できる物質は、光老化も効果的に防止できると考えられる。また、コラーゲンの減少は角膜潰瘍等の角膜障害、リウマチ、関節炎、変形性関節炎、骨関節炎等の関節障害、炎症性疾患等の様々な疾患を引き起こすことが知られているため、コラーゲンの分解を抑制することは、これらの予防及び／又は治療にも有用とされている。
【０００９】
またゼラチナーゼ群に含まれるＭＭＰｓとしては、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９などが挙げられる。これらＭＭＰ−２やＭＭＰ−９は、細胞外マトリックスの構成成分であるゼラチンや、タイプＩＶコラーゲン、タイプＶコラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチンなどの多数の基底膜構成成分を分解することが知られている。基底膜は表皮の最下層で新しい細胞を次々と生み出す源であるため、基底膜構成成分の減少や変性により生じる基底膜構造の変化は、皮膚の弾力やハリなどに大きな影響を与えることとなる。従って、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９の活性を阻害することができる物質もまた、皮膚の老化防止に大きく役立つこととなる。
【００１０】
これまでにも、ＭＭＰｓ活性に対して阻害作用を有する物質について研究がなされており、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９に対して阻害作用を有する物質として、例えば、種々の植物エキスなどが知られている(例えば、特許文献２〜４参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−１１９１８９号公報
【特許文献２】特開２００３−２０１２２９号公報
【特許文献３】特開２００３−２７７２２３号公報
【特許文献４】特開２００７−２１７３５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、植物エキスなどの従来の線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害剤やＭＭＰｓ活性阻害剤は、皮膚への浸透性の面等から十分な効果を与えるものとは言い難いものである。また植物エキスは、原料となる植物の栽培環境や、植物から抽出する際の抽出条件の相違などで、品質に差が生じる場合があるなど、得られる効果の再現性の面等からも満足な効果が得られるとは言い難い。
【００１３】
本発明の課題は、かかる従来技術の問題に鑑み、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有する、更なる有用な新規物質を提供することである。とりわけ本発明は、生体への吸収性又は皮膚への浸透性の観点から、また安定した品質を提供できるように均質物の製造容易性の観点から、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有する比較的低分子の新規物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチドが、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、本発明は、
〔１〕  式(I)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２   (I：配列番号１)
(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３            (II：配列番号２)
(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ                    (III：配列番号３)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、
〔２〕  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ                    (III：配列番号３)
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、
〔３〕  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(配列番号４)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、
〔４〕  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(配列番号５)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
〔５〕  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(配列番号６)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
〔６〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有してなる組成物
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用を有する新規の有用な物質が提供される。また本発明により、ＭＭＰ−１活性阻害作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、及び／又はＭＭＰ−９活性阻害作用を有する新規の有用な物質が提供される。本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、生体内においてエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分の分解を抑制でき、それにより、シワやたるみなどの皮膚の老化を効果的に予防・改善することができ、若々しい肌を維持するためなどに有益に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害効果の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のペプチドは、式(I)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２   (I：配列番号１)
(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３            (II：配列番号２)
(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ                    (III：配列番号３)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれる。なお、アミノ酸の一文字略号により、配列番号１で表わされるペプチドはＴＷＳＬＰＸ１Ｘ２、配列番号２で表わされるペプチドはＴＷＳＬＰＸ３、配列番号３で表わされるペプチドはＴＷＳＬＰという場合がある。
【００１９】
配列番号１におけるＸａａ１及びＸａａ２(Ｘ１及びＸ２)は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す。該アミノ酸は、好ましくはα−アミノ酸であり、より好ましくは遺伝的にコードされるα−アミノ酸である。好ましくは、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、及びＬｅｕからなる群より選ばれ、なかでも、Ｘａａ１−Ｘａａ２がＴｒｐ−Ｔｙｒである場合(配列番号４：一文字略号ＴＷＳＬＰＷＹ)、Ｖａｌ−Ａｓｐである場合(配列番号５：一文字略号ＴＷＳＬＰＶＤ)、若しくはＬｅｕ−Ｔｙｒである場合(配列番号６：一文字略号ＴＷＳＬＰＬＹ)が好ましい。また上述の他に、本願効果を奏し得る限り限定されるものではないが、配列番号４におけるＴｒｐ−Ｔｙｒ(ＷＹ)、配列番号５におけるＶａｌ−Ａｓｐ(ＶＤ)、又は配列番号６におけるＬｅｕ−Ｔｙｒ(ＬＹ)のアミノ酸配列において１又は２個のアミノ酸を保存的置換したもの、より好ましくは１個のアミノ酸を保存的置換したものも好ましい例として挙げることができる。
【００２０】
配列番号２におけるＸａａ３(Ｘ３)は、任意のアミノ酸を示し、具体的には、上記Ｘａａ１及びＸａａ２と同様のアミノ酸が例示される。なかでも、Ｘａａ３は、配列番号４におけるＴｒｐ−Ｔｙｒ(ＷＹ)、配列番号５におけるＶａｌ−Ａｓｐ(ＶＤ)、又は配列番号６におけるＬｅｕ−Ｔｙｒ(ＬＹ)のアミノ酸配列から１個のアミノ酸を欠失させた残り、即ち、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、及びＬｅｕからなる群より選ばれるものが好ましく、これらのアミノ酸を保存的置換したものも好ましい例として挙げることができる。
【００２１】
本明細書において用語「アミノ酸の保存的置換」とは、以下の表１の各群内におけるアミノ酸間の置換をいう。
【００２２】
【表１】
2010195733.tif 000002
【００２３】
上述のようなペプチドのうち、より確実に高い本願効果を得るためには、本発明のペプチドは、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ(一文字略記：ＴＷＳＬＰ、配列番号３)、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＷＹ、配列番号４)、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＶＤ、配列番号５)、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＬＹ、配列番号６)であることが好ましい。
【００２４】
本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドのアセチル誘導体、パルミトイル誘導体、ミリスチル誘導体、アミド誘導体、アクリル誘導体、ダンシル誘導体、ビオチン誘導体、リン酸誘導体、サクシニル誘導体、アニリド誘導体、ベンジルオキシカルボニル誘導体、ホルミル誘導体、ニトロ誘導体、スルフォン誘導体、アルデヒド誘導体、環状化誘導体、グリコシル誘導体、モノメチル誘導体、ジメチル誘導体、トリメチル誘導体、グアニジル誘導体、アミジン誘導体、マレイル誘導体、トリフルオロアセチル誘導体、カルバミル誘導体、トリニトロフェニル誘導体、ニトロトロポニル誘導体、又はアセトアセチル誘導体が挙げられる。この中でもパルミトイル誘導体は、細胞への浸透性が高くなることが期待されるので好ましく、またＮ末端のアセチル誘導体、Ｃ末端のアミド誘導体、Ｃ末端のメチル誘導体は、末端からペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性を有し、生体中における安定性が高くなることが期待されるので好ましい。
【００２５】
本明細書において、「塩」とは、ペプチド又はその誘導体の薬理学的に許容される任意の塩(無機塩及び有機塩を含む)をいい、例えば、ペプチド又はその誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、有機酸塩(酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等)等が挙げられ、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩及び酢酸塩である。
【００２６】
本発明のペプチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、本発明のペプチドは、化学合成方法(例えば、固相法(例えば、Ｆｍｏｃ法)、液相法等)により合成されてもよく、また遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。なお本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもよいが、好ましくはＬ−体である。
【００２７】
さらに本発明のペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによっても調製することも出来る。また、プロテアーゼ処理後には、当該分野で公知の手段によって精製することにより、目的のペプチドを得てもよい。
【００２８】
本発明のペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、本発明のペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
【００２９】
以上のようにして得られた本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、線維芽細胞由来のエラスターゼ活性を阻害してエラスチンの分解を抑制するために、及び／又はＭＭＰｓ活性を阻害してコラーゲンやその他の基底膜構成成分の分解を抑制するために使用することができる。対象となるＭＭＰｓは、特に限定されないが、好ましくはコラゲナーゼ群及びゼラチナーゼ群に属するＭＭＰｓであり、より好ましくはＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９である。
【００３０】
本発明はまた、前記ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を含むことを特徴とする組成物を提供する。かかる特徴を有することにより、該組成物は例えば、医薬、食品、化粧料又は飼料として、さらに研究試薬や検査試薬として好適に使用され得る。
【００３１】
医薬としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する疾患の予防剤及び／又は治療剤が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、動脈硬化等の血管系疾患用の予防剤及び／又は治療剤として、リウマチ、変形性関節症、骨関節炎等の関節疾患用の予防剤及び／又は治療剤として、角膜潰瘍などの角膜疾患用の予防剤及び／又は治療剤として、紫外線曝露、加齢、活性酸素、ストレス等に因る皮膚のシワ若しくはタルミの予防剤及び／又は治療剤として、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防剤及び／又は治療剤として、好適に使用され得る。
【００３２】
食品としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する状態の予防用及び／又は改善用の食品が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、動脈硬化等の予防用及び／又は改善用の食品として、関節痛等の予防用及び／又は改善用の食品として、肌の美容用の食品として、紫外線曝露、加齢、活性酸素、ストレス等に因る皮膚のシワ若しくはタルミの予防用及び／又は改善用の食品として、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防用及び／又は改善用として、好適に使用され得る。なお、食品としての本発明の組成物、即ち、本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を配合した食品は、上記効用を有する保健機能食品や健康食品として、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する状態の予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、具体的には、動脈硬化等の予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、関節痛等の予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、肌の美容のために用いられるものである旨の表示を付して、皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、提供され得る。ここで、保健機能食品とは、厚生労働省の定める保健機能食品を意味し、栄養機能食品及び特定保健用食品を含む。
【００３３】
化粧料としては、例えば、紫外線曝露、加齢、活性酸素、ストレス等に因る皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のための化粧料、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防及び／又は改善のための化粧料として、好適に使用され得る。
【００３４】
飼料としては、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等の家畜や、イヌ、ネコ等のペット動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する状態の予防用及び／又は改善用の飼料が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、動脈硬化等の血管系疾患用の予防用及び／又は改善用の飼料として、リウマチ、変形性関節症、骨関節炎等の関節疾患用の予防用及び／又は改善用の飼料として、角膜潰瘍などの角膜疾患用の予防用及び／又は改善用の飼料等として、好適に使用され得る。
【００３５】
また本発明の組成物は、エラスターゼやＭＭＰｓの活性に関連する状態などを解明するための実験用研究試薬又は検査試薬などとしても好適に使用され得る。
【００３６】
本組成物中の前記ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩の含有量は、ペプチド等の種類、組成物の剤型等によっても異なるが、一般には、高い線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用とそれに伴う皮膚老化防止効果等を得る観点から、好ましくは0.0001〜70重量％、より好ましくは0.001〜50重量％、さらに好ましくは0.001〜20重量％、さらにより好ましくは0.01〜10重量％である。
【００３７】
本発明の組成物は、前記ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩の他に製剤分野や食品分野等において通常使用される担体、基剤、及び／又は添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合して調製することができる。
【００３８】
担体としては、例えば、糖類(例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等)、セルロース類(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、結晶性セルロース等)、水難溶性ガム類(例えば、アラビアガム、トラガントガム等)、架橋ビニル重合体、脂質類等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
【００３９】
基剤としては、例えば、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
【００４０】
添加剤としては、例えば、界面活性剤、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、ビタミン類、アミノ酸類、着色剤、香料等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
【００４１】
さらに本発明の組成物には、必要に応じて他の有用な作用を付加するために、皮膚に対して有効な作用を有する他の有用成分、例えば、美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、ニキビ改善成分、コラーゲン等の生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等を１種又は２種以上組み合わせて配合されてもよい。
【００４２】
本発明の組成物は、外用剤(医薬及び化粧料を含む)、内服剤(医薬、食品及び飼料を含む)等の任意の剤型であり得、皮膚の老化症状に対してより直接的に高い効果を発揮させるためには、好ましくは外用剤として使用され得る。
【００４３】
外用剤としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状(基材担持)、エアゾール状、スプレー状等の任意の形態で使用され得る。
【００４４】
化粧料としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、オイル、パック等の基礎化粧料、又はファンデーション、頬紅、口紅等のメーキャップ化粧料、さらに洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料、入浴剤等の任意の形態で使用され得る。
【００４５】
内服剤としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤(ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む)、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、ゼリー剤等の任意の形態で使用され得る。
【００４６】
また食品とする場合には、パン、麺、惣菜、食肉加工食品(例えば、ハム、ソーセージなど)、水産加工食品、調味料(例えば、ドレッシングなど)、乳製品、菓子(例えば、ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリームなど)、スープ、ジュースなどの任意の一般の食品形態としても提供され得る。このような形態にする場合、本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、目的とする食品の性質等に依存して、当業者に公知の方法により適宜配合され得る。
【００４７】
飼料としては、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。また、研究試薬や検査試薬としても、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。
【００４８】
本発明の組成物は、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有することにより、皮膚真皮細胞外マトリックスに存在するエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分などの分解を阻害して、生体内における正常なエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分の量が低下するのを防ぎ、皮膚の老化を防止するためなどに有益に使用され得る。
【実施例】
【００４９】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５０】
実施例１(ペプチドの調製)
１−１．ペプチドの合成
(１)  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ(一文字略記：ＴＷＳＬＰ、配列番号３)
(２)  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＷＹ、配列番号４)
(３)  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＶＤ、配列番号５)
(４)  Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＬＹ、配列番号６)
上記４種のペプチドを、ペプチド自動合成装置(Applied Biosystems社製、Peptide Synthesizer, ABI 433A)をその使用説明書に従って使用し、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。次いで、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することにより、被験ペプチドを調製した。
【００５１】
１−２．合成ペプチドの純度検定
得られた精製物を、それぞれ以下の分析条件に従って分析用逆相高速液体クロマトグラフィーに付したところ、ＴＷＳＬＰペプチドについては12.9分、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドについては20.0分、ＴＷＳＬＰＶＤペプチドについては12.4分、ＴＷＳＬＰＬＹペプチドについては21.0分に単一の鋭いピークが示され、純度はいずれも95％以上の高純度であることが確認された。
＜分析条件＞
カラム：Inertsil ODS-3(内径：4.6mm、長さ：250mm)、GL Sciences社製
移動相：溶媒Ａ(0.1％トリフルオロ酢酸水溶液)
溶媒Ｂ(0.1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)
グラジエント〔0分(溶媒Ｂ＝20％)〜40分(溶媒Ｂ＝50％)〕
流速：1.0mL／分
検出法：波長220nmにおける吸光度
【００５２】
実施例２(線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害効果の測定)
正常ヒト線維芽細胞を、0.1％Triton X-100／0.2M Tris-HCl緩衝液中で超音波破砕して、線維芽細胞由来エラスターゼの酵素液を調製した。基質としては5mM N-Suc-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide/N/methyl-pyrrolidoneを用いた。
【００５３】
先ず、所定濃度(0.1、1mg／mLの各濃度)に調製した各被験ペプチド溶液50μL、基質溶液100μL及び酵素液50μLを、96ウェルプレートの各ウェルに添加し、37℃で２時間インキュベートした。反応終了後、405nmの吸光度をプレートリーダーにて測定した。コントロール(ペプチド溶液未添加群)のエラスターゼ活性を100％とし、その比から各ペプチドの各濃度における活性阻害の程度を調べた。
【００５４】
この結果を図１に示す。図１に示されるように、いずれの被験ペプチドも線維芽細胞由来エラスターゼ活性を著しく阻害する効果を有することが明らかとなった。
【００５５】
実施例３(ＭＭＰ−１活性阻害効果の測定)
ＭＭＰ−１ Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery キット(ＢＩＯＭＯＬ社製)を用いて、実施例１にて調製した(１)〜(３)の被験ペプチドのＭＭＰ−１活性阻害効果を評価した。本キットは、発色性基質であるthiopeptolideがＭＭＰ−１による切断を受けた際生じる412nmの吸収を測定し、被検薬が非存在下の状態と比較することにより、被験薬の阻害率を測定するものである。すなわち、所定濃度(1mg／mL)に調製したペプチド溶液20μL、ＭＭＰ−１溶液(765mU／μL)20μL及びAssay buffer50μLを、96ウェルプレートの各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベートした。反応終了後、各ウェルに発色性基質10μLを添加し、予め37℃に保温したプレートリーダーにセットした。その後、１分毎に412nmにおける吸収を計１０分間測定し、単位時間あたりの吸光度の増加率から、1mg／mLのペプチド濃度での反応速度(Ｖ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)を算出した。コントロール(ペプチド未添加群)に関しても、反応速度(Ｖ  ｃｏｎｔｒｏｌ)を算出し、その比を利用して1mg／mLのペプチド濃度における阻害率(％)を、以下の式（ａ）により算出した。
阻害率（％）＝{１−（Ｖ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／Ｖ  ｃｏｎｔｒｏｌ）}×１００
式（ａ）
【００５６】
上記試験の結果、1mg／mL濃度において、ＴＷＳＬＰペプチドは23％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドは73％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＶＤペプチドは26％の阻害率を示すことが明らかとなり、なかでもＴＷＳＬＰＷＹペプチドが著しく高い阻害作用を示すことが認められた。
【００５７】
実施例４(ＭＭＰ−２活性阻害効果の測定)
ＭＭＰ−２ Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery キット(ＢＩＯＭＯＬ社製)を用いて、実施例１にて調製した(１)〜(３)の被験ペプチドのＭＭＰ−２活性阻害効果を、実施例３においてＭＭＰ−１溶液(765mU／μL)20μLを用いる代わりに、ＭＭＰ−２溶液(765mU／μL)20μLを用いて、実施例３と同様にして評価した。
【００５８】
上記試験の結果、1mg／mL濃度において、ＴＷＳＬＰペプチドは17％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドは46％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＶＤペプチドは10％の阻害率を示すことが明らかとなった。以上より、ＭＭＰ−２活性阻害作用についても、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドが特に高い阻害作用を示すことが認められた。
【００５９】
実施例５(ＭＭＰ−９活性阻害効果の測定)
ＭＭＰ−９ Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery キット(ＢＩＯＭＯＬ社製)を用いて、実施例１にて調製した(２)の被験ペプチドのＭＭＰ−９活性阻害効果を、実施例３においてＭＭＰ−１溶液(765mU／μL)20μLを用いる代わりに、ＭＭＰ−９溶液(765mU／μL)20μLを用いて、実施例３と同様にして評価した。
【００６０】
上記試験の結果、1mg／mL濃度において、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドは29％の阻害活性を示すことが明らかとなり、ＭＭＰ−９活性阻害作用をも示し得ることが認められた。
【００６１】
以下に製剤実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
【００６２】
製剤実施例１：乳液
〔組成〕                        〔比率〕
ＴＷＳＬＰペプチド              ０．０１
ＬＥＨＡペプチド＊               ０．０１
加水分解エラスチン              ０．０１
アスコルビン酸グルコシド        ２．０
スクワラン                      ２．０
流動パラフィン                  ５．０
セタノール                      ０．５
モノステアリン酸グリセリル      ２．０
ＰＯＥ（２５）セチルエーテル    ２．０
グリセリン                      ４．０
１,３-ブチレングリコール        ６．０
カルボキシビニルポリマー        ０．２
ｐＨ調整剤                      適量
防腐剤                          適量
香料                            適量
精製水                          適量        
計                        １００．０重量％
＊Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａのアミノ酸配列を有するペプチド。
【００６３】
製剤実施例２：クリーム
〔組成〕                                                  〔比率〕
ＴＷＳＬＰＶＤペプチド                                    ０．０１
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物＊＊                    ０．５
パルミチン酸レチノール                                    ０．１４
ワセリン                                                  １．０
スクワラン                                                ５．０
流動パラフィン                                          １０．０
ステアリン酸                                              １．５
ステアリルアルコール                                      ２．０
モノステアリン酸グリセリル                                ２．０
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル                              ３．０
グリセリン                                                ６．０
１,３-ブチレングリコール                                  ８．０
カルボキシビニルポリマー                                  ０．４
ｐＨ調整剤                                                適量
防腐剤                                                    適量
香料                                                      適量
精製水                                                    適量        
計                                                  １００．０重量％
＊＊ダイズタンパク質をサーモリシン（EC3.4.24.4）で分解した後に得られる多種多様なペプチドを実質的に全て含んだ状態のもの：平均分子量1500（ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）法による測定）。
【００６４】
製剤実施例３：化粧水
〔組成〕                                              〔比率〕
ＴＷＳＬＰＷＹペプチド                                ０．００５
ヒアルロン酸ナトリウム                                ０．１
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノイソステアリン酸エステル  ０．３
コハク酸                                              ０．２
コハク酸ナトリウム                                    ０．５
エデト酸三ナトリウム                                  ０．０５
１,３-ブチレングリコール                              ６．０
防腐剤                                                適量
香料                                                  適量
精製水                                                適量        
計                                              １００．０重量％
【００６５】
製剤実施例４：乳液
〔組成〕                                〔比率〕
ＴＷＳＬＰＷＹペプチド                    ０．０１
加水分解エラスチン                        ０．０１
オトギリソウ抽出物（エラスターゼ阻害剤）  １．０
スクワラン                                ２．０
流動パラフィン                            ５．０
セタノール                                ０．５
モノステアリン酸グリセリル                ２．０
ＰＯＥ（２５）セチルエーテル              ２．０
グリセリン                                ４．０
１，３−ブチレングリコール                ６．０
カルボキシビニルポリマー                  ０．１
キサンタンガム                            ０．２
ｐＨ調整剤                                適量
防腐剤                                    適量
香料                                      適量
精製水                                    適量        
計                                  １００．０重量％
【００６６】
製剤実施例５：飲料
〔組成〕                                              〔比率〕
ＴＷＳＬＰペプチド                                    ０．０１
フィッシュコラーゲンペプチド                          ０．５
ビタミンＢ２                                          ０．００５
ビタミンＣ                                            ０．５
エリスリトール                                      １０．０
酸味料                                                １．０
甘味料                                                １．０
香料                                                  ０．０１
精製水                                                残量        
計                                              １００．０重量％
【００６７】
製剤実施例６：内服用錠剤
〔組成〕                                        〔比率〕
ＴＷＳＬＰＷＹペプチド                          ４．０
全トランスレチノール                            ０．０４
ビタミンＢ１                                    ０．８
ビタミンＢ２                                    ０．４
香料                                            ０．５
甘味料                                          ０．５
ショ糖脂肪酸エステル                            ３．０
マルチトール                                  ９０．７６
計                                        １００．０重量％
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、生体内においてエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分の分解を抑制でき、それにより、シワやたるみなどの皮膚の老化を効果的に予防・改善することができ、若々しい肌を維持すること等のために有益に利用され得る。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列表の配列番号１は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号２は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号３は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号４は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号５は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号６は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
【図１】
2010195733.tif 000003
【配列表】
2010195733000001.app