(57)【要約】      （修正有）【課題】グリフォラ・ガルガル子実体中の破骨細胞形成抑制効果を示す化合物の特定。【解決手段】式（２）で表されるエルゴステロール系化合物を有効成分とする骨疾患の予防又は治療剤の使用。2010195697.tif 000024【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（２）
【化１】
2010195697.tif 000015
で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物。
【請求項２】
式（２）
【化２】
2010195697.tif 000016
で表わされる化合物。
【請求項３】
式（４）
【化３】
2010195697.tif 000017
で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（４）で表わされる化合物を提供する化合物。
【請求項４】
式（４−１）
【化４】
2010195697.tif 000018
で表わされる化合物。  
【請求項５】
式（１）で表される化合物、式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、式（２）で表される化合物、式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物、式（３）で表される化合物、式（３）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（３）で表わされる化合物を提供する化合物、式（４）で表される化合物、式（４）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（４）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上を薬理学的に有効な量で含有することを特徴とする、骨疾患の予防又は治療剤。
【化５】
2010195697.tif 000019
【化６】
2010195697.tif 000020
【化７】
2010195697.tif 000021
【化８】
2010195697.tif 000022
【請求項６】
式（４）で表される化合物が式（４−１）
【化９】
2010195697.tif 000023
で表される化合物である、請求項５に記載の骨疾患の予防又は治療剤。
【請求項７】
骨疾患が骨粗鬆症である、請求項５又は６に記載の骨疾患の予防又は治療剤。
【請求項８】
破骨細胞形成阻害剤である、請求項７に記載の骨疾患の予防又は治療剤。
【請求項９】
式（１）で表される化合物、式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、式（２）で表される化合物、式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物、式（３）で表される化合物、式（３）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（３）で表わされる化合物を提供する化合物、式（４）で表される化合物、式（４）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（４）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上が、グリフォラ・ガルガル（和名：アンニンコウ）の子実体からの抽出物である、請求項５乃至８のいずれか一項に記載の骨疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症等の骨疾患の予防や治療に有用な新規化合物と、当該化合物を有効成分とする骨疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、骨形成と骨吸収とを繰り返している。このような骨のライフ・サイクルは、概略次のとおりである。
【０００３】
即ち、軟骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞が、機能的な分業を行い、各細胞が骨の代謝を制御している。骨の代謝は、（１）軟骨内骨化による骨新生と成長、（２）骨形成と骨吸収のサイクルからなるリモデリングによる質的、量的な維持、及び（３）骨折等の損傷における骨再生の三過程に分類される。そして、骨の代謝は、種々のカルシウム代謝ホルモンやサイトカイン、各種細胞内伝達機構や転写因子等を介して、各細胞系の機能や細胞間の相互作用を調節することによって制御されている。
【０００４】
例えば、休止期にある骨の表面が刺激を受けると、破骨細胞に情報が伝達されて骨の吸収が始まる。骨が吸収されているとき、他方では、骨芽細胞による骨の修復、形成が行なわれている。このように、正常な状態にある生体においては、骨の吸収と骨の形成とが並行して行なわれて、骨は新しく生まれ変わっている。
【０００５】
ところで、近年においては、高齢者の骨粗鬆症が注目を浴びている。骨粗鬆症は、骨のリモデリングにおいて、骨の吸収が骨の形成を上回ることによって招来されるものである。従って、骨粗鬆症の予防、治療には、骨吸収を抑制するか、骨形成を促進することが必要である。
【０００６】
このような状況下、種々の骨粗鬆症治療剤や、骨粗鬆症治療効果が期待される漢方薬や食品に由来する成分が提案されている。前者としては、活性型ビタミンＤや特許文献１に記載されたリベロマイシンＡ誘導体等が挙げられる。また、後者としては、特許文献２に記載された冬虫夏草、特許文献３に記載されたエリンギや五加皮の水抽出物、特許文献４に記載された熟地黄や骨砕補の水抽出物、特許文献５に記載されたマコモタケ抽出物等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３５８９５号公報
【特許文献２】特開２００４−３１５４５４号公報
【特許文献３】特開２００５−３３０２８９号公報
【特許文献４】特開２００５−３３０２９０号公報
【特許文献５】特開２００６−１９３４５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献の発明者等と同様に、本発明者等も、骨粗鬆症の予防・治療効果があり、副作用の問題の少ない化合物を希求して、研究を重ねてきた。そして、学名がグリフォラ・ガルガル（Grifola gargal；和名：アンニンコウ）である茸の子実体からの抽出物が、破骨細胞形成抑制効果を示すことを見出した。しかし、骨粗鬆症等の骨疾患の予防又は治療剤としてヒトに摂取させるには、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物そのものの方が都合がよい。従って、本発明の目的は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定し、当該化合物を骨疾患の予防又は治療剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定するために鋭意研究を重ね、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は、次の式（１）乃至（４）で表される化合物等に関する：
【化１】
2010195697.tif 000002
【００１１】
【化２】
2010195697.tif 000003
【００１２】
【化３】
2010195697.tif 000004
【００１３】
及び
【化４】
2010195697.tif 000005
【００１４】
より具体的には、本発明は、前記式（１）乃至（４）のいずれかで表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって前記式（１）乃至（４）のいずれかで表わされる化合物を提供する化合物に関する。
【００１５】
本発明は、前記式（１）で表される化合物、前記式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって前記式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、前記式（２）で表される化合物、前記式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって前記式（２）で表わされる化合物を提供する化合物、前記式（３）で表される化合物、前記式（３）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって前記式（３）で表わされる化合物を提供する化合物、前記式（４）で表される化合物、前記式（４）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって前記式（４）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上を薬理学的に有効な量で含有することを特徴とする、骨疾患の予防又は治療剤に関する。
【００１６】
前記骨疾患としては、骨粗鬆症が挙げられる。また、前記有効成分は、破骨細胞形成阻害剤として使用されることが好ましい。前記骨疾患の予防又は治療剤において有効成分として使用される化合物は、グリフォラ・ガルガル（和名：アンニンコウ）の子実体からの抽出物であってよい。
【００１７】
なお、前記式（２）及び（４）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩は、新規な化合物である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、安全性が高く、骨粗鬆症等の骨疾患の予防及び治療に有効な骨疾患の予防又は治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行った、コントロールのウェルの顕微鏡写真である。
【図２】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行った、破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真である。
【図３】グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物からの、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順を示す図である。
【図４】図３に示した手順の後に行われた、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順を示す図である。
【図５】化合物４のＸ線結晶解析結果を示す分子模型である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に係る前記式（１）乃至（４）で表わされる化合物は、各々エルゴステロール系化合物である。これらの中、前記式（４）で表される化合物は、その立体配置が、下記式（４−１）で表されるものであることが好ましい。
【００２１】
【化５】
2010195697.tif 000006
【００２２】
前記式（１）乃至（４）で表わされる化合物は、化学構造上、異性体を有することがある。本発明において、「式（ｘ）で表わされる化合物」とは、化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体及び異性体混合物を包含する。但し、前記式（１）及び（３）で表される化合物の立体配置については、各々、それらの式に示されたとおりである。
【００２３】
また、前記式（１）乃至（４）で表わされる化合物に結晶多形が存在する場合、本発明においては、結晶形は限定されず、いずれかの単一結晶形であっても、それらの混合物であってもよい。
【００２４】
これらの化合物の薬理学的に許容される塩とは、例えば、前記式（１）乃至（４）において、水酸基の水素が、ナトリウム、カリウム、カルシウム等で置換されてアルカリ又はアルカリ土類金属塩となっているものやアンモニウム基で置換されてアンモニウム塩となっているもの、塩酸、硫酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、グリシン等のアミノ酸が付加した付加塩をいう。しかし、これらに限定されず、薬理学的に許容されるものであれば、いずれであってもよい。
【００２５】
「加水分解によって式（ｘ）で表わされる化合物を提供する化合物」とは、前記式（１）乃至（４）中の水酸基が、保護基で保護されている、換言すれば、当該水酸基中の水素原子が、何らかの基によって置換されており、加水分解されると水酸基となる化合物をいう。このような「保護基で保護されている水酸基」の例としては、メトキシメチルエーテル基、テトラヒドロピラニルエーテル基、ターシャリーブチルエーテル基、アリルエーテル基、安息香酸エステル基、アセテート基（アセチルオキシ基）、ホルメート基、クロトネート基、ｐ−フェニル安息香酸エステル基、トリメチルアセチルオキシ基、ターシャリーブチルジメチルシリルオキシ基、ターシャリーブチルジフェニルシリルオキシ基、トリチルオキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００２６】
前記式（１）乃至（４）で表わされる化合物は、ステロール類の合成方法を参考にして、有機合成をすることができる。
【００２７】
また、前記式（１）乃至（４）で表わされる化合物は、グリフォラ・ガルガルやカワリハラタケの子実体から抽出によって単離することができる。ここで、グリフォラ・ガルガルは、南米原産のグリフォラ属の茸であり、近年、菌床栽培も可能となったものである。グリフォラ・ガルガルの子実体を得るための菌床栽培方法は、例えば特開２００７−２０５６０に開示されている。また、カワリハラタケは、ハラタケ属の茸である。
【００２８】
前記式（１）乃至（４）で表わされる化合物のグリフォラ・ガルガルの子実体からの抽出は、例えば、次のようにして行う。子実体乾燥物をヘキサン等の有機溶媒や水に入れ、可溶性画分と不溶性画分とに分ける。その後、各画分から酢酸エチル等を用いて抽出を行う。その抽出液をカラム・クロマトグラフィーにかけ、有用成分を保持させた後、適切な条件での流出を行って化合物を分取し、精製すればよい。
【００２９】
本発明に係る骨疾患の予防又は治療剤の有効成分は、式（１）で表される化合物、式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、式（２）で表される化合物、式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物、式（３）で表される化合物、式（３）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（３）で表わされる化合物を提供する化合物、式（４）で表される化合物、式（４）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（４）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上である。
【００３０】
本発明に係る骨疾患の予防又は治療剤の有効成分は、少なくとも破骨細胞の形成を抑制する作用を示す。従って、本発明の骨疾患の予防又は治療剤が有効な疾患には、破骨細胞の過剰な形成や機能亢進を伴って骨量が減少する内因性疾患と、骨折等の外因性疾患とが包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗鬆症、破骨細胞腫、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折等が挙げられる。
【００３１】
本発明に係る骨疾患の予防又は治療剤の剤型、投与方法、投与量等は、使用目的や有効成分の物性を考慮して、適宜決定することができる。剤型の例としては、経口投与を目的として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等が、また、非経口投与を目的として、注射剤、吸入剤、座剤、経皮吸収剤等が挙げられる。有効成分と共に使用される添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶剤等が挙げられる。
【００３２】
投与量は、予防であるか治療であるか、疾患の状態、剤型、投与方法、患者の年齢や体重等の諸条件によって異なるが、成人に経口投与する場合、本発明に係る化合物のいずれを用いる場合も、通常は０．１乃至２００μｇ／体重１ｋｇ/日、好ましくは０．２乃至５０μｇ／体重１ｋｇ/日である。
【実施例】
【００３３】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【００３４】
（実施例１）グリフォラ・ガルガルの子実体からの有効成分の抽出、同定
（１）有効成分の有無の判定方法
抽出液や分画液中の有効成分による活性及び細胞毒性の測定は、次のようにして行なった。
【００３５】
（１−１）共存培養法による細胞の培養
マウス（♀、５乃至７週齢）の脛骨及び大腿骨から採取し、培養した骨髄細胞１．３×１０８個と、頭蓋骨から採取し、培養した骨芽細胞様間質細胞１．０×１０６個とを、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（Minimum Essential Medium α- Medium）７．２ｍｌに懸濁させた。これを、４８穴の破骨細胞活性アッセイ用基質プレートに、１５０μｌ／ウェルで分注した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し（被験試料１００ｍｇ／ｍｌ）、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（希釈系列の作製）５０μｌ／ウェルとを加え、全量２５０μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて７日間培養した。なお、培養３日目には、各ウェル中の上澄み液１００μｌを除去し、代わりに、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：４０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料を培養開始前に使用したものの２倍の濃度で含有する被験試料の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液５０μｌ／ウェルとを添加した。
【００３６】
（１−２）ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定
上記のように、骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞とを、活性ビタミンＤ３の存在下で共存培養を行うと、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）を有する破骨様多核細胞（破骨細胞）に分化する。この細胞は、ＴＲＡＰ染色液で染色される。この染色された細胞の数を計測することにより、破骨細胞の形成が抑制されたか否かが分かる。
【００３７】
ＴＲＡＰ染色液は、次のようにして調製した。先ず、５０ｍＭの酒石酸ナトリウムと０．１Ｍの酢酸ナトリウムとを含むＴＲＡＰ緩衝液（ｐＨ＝５．０）を調製した。次に、用時調製で、１．５ｍｇのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩を、１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させた。これにＴＲＡＰ緩衝液１５ｍｌを加え、次に、９ｍｇのファスト・レッド・バイオレットＬＢ塩を加えて溶解させた。
【００３８】
染色は、次のようにして行った。ウェル中の培養液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、１０％ホルマリン（＝３．７％ホルムアルデヒド）含有ＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ／ウェルで加え、１０分間放置し、細胞をウェルに固定させた。その後、エタノールを０．５ｍｌ／ウェルで加え、１分間放置した。乾燥後、ウェルにＴＲＡＰ染色液０．３ｍｌ／ウェルを加え、室温で３０分間インキュベートさせた。ウェルを蒸留水０．５ｍｌ／ウェルで洗浄し、その後乾燥させた。
【００３９】
顕微鏡下において、ウェル当たりの、ＴＲＡＰ染色液によって染色された核を２個以上有する多核細胞（ＴＲＡＰ陽性多核細胞）の数を数えた。これが、ウェル当たりの破骨細胞数である。
【００４０】
細胞を培養する際に、被験試料をＤＭＳＯに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００４１】
コントロールのウェル中の細胞数を１００として、被験試料を添加したウェル中の細胞数の割合を算出した。値が小さいほど、破骨細胞形成抑制効果が高い。
【００４２】
なお、図１に、コントロールのウェルの顕微鏡写真を、図２に破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真を示す。
【００４３】
（１−３）ＭＴＴアッセイ法による細胞生存率の測定
ＭＴＴとは、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミドを指す。この化合物は、水溶性であり、水溶液は黄色を示すが、脱水素酵素によって、ＭＴＴとＮＡＤＨとの間で酸化還元反応が生じると、ＭＴＴが還元されて青色のフォルマゾンとなる。この脱水素酵素は、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素であるので、細胞の健康状態の指標となる。即ち、細胞が元気であれば、酵素活性が高く、フォルマゾンが多く生成されるが、細胞が死んでしまうと、フォルマゾンは生成されない。よって、波長５７０ｎｍにおける吸光度測定によって、生成されたフォルマゾンの量、ひいては細胞の生存率を計測することができる。
【００４４】
ＭＴＴ溶液は、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液である。共存培養後、培養液を除去せず、１２５μｌ／ウェルの量でＭＴＴ溶液を加えた。次いで、炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて２時間インキュベートした。培養液を除去し、１００μｌ／ウェルの量でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。フォルマゾンをよく溶解させた後、波長５７０ｎｍにおいてＤＭＳＯ溶液の吸光度を測定した。
【００４５】
細胞を培養する際に、被験試料をＤＭＳＯに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００４６】
コントロールの吸光度を１００として、被験試料を添加した場合の吸光度の割合を算出した。値が小さいほど、細胞生存率又は細胞活性が低く、それは、被験試料の細胞毒性が強いことを示している。
【００４７】
（２）原料
菌床栽培において、種菌の植え付けから約１２０日後にグリフォラ・ガルガル子実体を収穫した。これに、４５℃の温風を一昼夜、その後７０℃の温風を１時間あて、乾燥させた。このようにして温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体を、原料として用いた。
【００４８】
（３）有効成分の抽出
抽出方法の概略は、図３及び図４に示すとおりである。具体的には、次のようにして有効成分を抽出した。
【００４９】
（３−１）へキサン抽出
温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体８．７８ｋｇを粉砕した。これをヘキサン５０ｌに入れ、室温にて放置した。濾過により、へキサン溶液と残渣とに分けた。
【００５０】
（３−２）酢酸エチル抽出
残渣に酢酸エチル５０ｌを加え、室温にて放置した。濾過により、酢酸エチル溶液と残渣とに分けた。酢酸エチル溶液には、１０１．５ｇの固形分（酢酸エチル可溶画分）が含まれていた。
【００５１】
（３−３）フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー
（３−２）で得られた酢酸エチル溶液（固形分量で９０．１ｇに相当する量）を、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ；関東化学社製；充填剤重量：３５０ｇ；φ４ｃｍ×６０ｃｍ）に３回に分けて供し、有効成分をカラムに保持させた。次いで、溶出液として、ヘキサン／酢酸エチル（９：１（容量））混液５００ｍｌ、塩化メチレン５００ｍｌ、塩化メチレン／アセトン（８：２（容量））混液５００ｍｌ、アセトン５００ｍｌ及び１００％エタノール１，０００ｍｌをこの順で流した。
【００５２】
溶出液を２０ｍｌずつ分取した。その後、カラムには９０％メタノールを流した。分取した溶液、各々につき、（１−１）及び（１−２）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。
【００５３】
この測定結果を踏まえ、溶出液を２８の群（順に、３ＧＡ−ＥＡ−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−２８）にまとめた。これら２８の群のそれぞれを被験試料として用い、（１−１）、（１−２）及び（１−３）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定とＭＴＴアッセイを行った。破骨細胞形成阻害活性が確認されたのは、３ＧＡ−ＥＡ−１１乃至３ＧＡ−ＥＡ−２７であった。
【００５４】
（３−４）Ｓｅｐ  ｐａｋによる前処理と逆相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−３）に記載の処理によって得られた画分３ＧＡ−ＥＡ−１８（３．５８９２ｇ）をＳｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）プラス  Ｃ１８  カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通した。Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）に保持されずに流出した画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）２．７３５２ｇを取り、これを３ＧＡ−ＥＡ−１８−４と名付けた。
【００５５】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４（２．７３５２ｇ）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続された分取用逆相カラム（野村化学（株）製；ＯＤＳカラム３０Ｃ−ＵＧ−１５／３０）に通し、有効成分を保持させた。９０％メタノールで溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−５７の画分を得た。
【００５６】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−２乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−５７に、破骨細胞阻害活性が確認された。これらの結果を基に、三つの画分、即ち３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４及び３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９につき、さらなる分画及び精製を行った。
【００５７】
（３−５）画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３の分画及び精製−Ｓｅｐ  ｐａｋによる前処理及び順相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー−
画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３（固形分量で４６．５ｍｇに相当する量；クロロホルム溶液）を、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）プラス  シリカ  カートリッジ（ウォーターズ社製；順相）に通した。Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）に保持されずに流出した画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３−１と名付けた。その後、クロロホルムで溶出されなかったもの（吸着物；ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、メタノールで溶出させた。その固形分量は、３４．６ｍｇであった。
【００５８】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３−１（固形分量で１２．６ｍｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続された順相カラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＡＱ  ｓｓ―５２５１；株式会社センシュー科学製）に通し、有効成分を保持させた。その後、メタノールで溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３−１−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３−１−１２の画分を得た。
【００５９】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３−１−７に有効成分が濃縮されていた。溶媒を留し、固形分１．９ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（１）で示される化合物１であった。
【００６０】
（３−６）画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４の分画及び精製−Ｓｅｐ  ｐａｋによる前処理及び順相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー−
画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４（固形分量で５３．４ｍｇに相当する量；酢酸エチル／クロロホルム（１：９（容量））混液に溶解させたもの）を、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）プラス  シリカ  カートリッジ（ウォーターズ社製；順相）に通した。Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）に保持されずに流出した画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４−１と名付けた。その後、酢酸エチル／クロロホルムで溶出されなかったもの（吸着物；ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、メタノールで溶出させた。その固形分量は、１７．１ｍｇであった。
【００６１】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４−１（固形分量で３７．０ｍｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続された順相カラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＡＱ  ｓｓ―５２５１；株式会社センシュー科学製）に通し、有効成分を保持させた。酢酸エチル／クロロホルム（１：９（容量））で溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４−１−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４−１−１３の画分を得た。
【００６２】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４−１−４に有効成分が濃縮されていた。溶媒を留去し、固形分１．０ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（１）で示される化合物１であった。
【００６３】
（３−７）画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９の分画及び精製
（３−７−１）画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９の再結晶
画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９の溶媒を留去し、固形分７５．７ｍｇを得た。これを、クロロホルム（固形分が溶解する溶媒）とメタノール（固形分が溶解しない溶媒）の二溶媒系で再結晶させた。結晶化サンプルと、非晶部（ｏｔｈｅｒｓ）とが得られた。
【００６４】
（３−７−２）結晶化サンプルのＳｅｐ  ｐａｋによる前処理及び順相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー
得られた結晶化サンプル２３．８ｍｇを、酢酸エチル／クロロホルム（１：９（容量））に溶解させた。その溶液を、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）プラス  シリカ  カートリッジ（ウォーターズ社製；順相）に通した。Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）に保持されずに流出した画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１と名付けた。その後、酢酸エチル／クロロホルムで溶出されなかったもの（吸着物；ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、メタノールで溶出させた。その固形分量は、４．４ｍｇであった。
【００６５】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１（固形分量で１７．８ｍｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続された順相カラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＡＱ  ｓｓ−５２５１；株式会社センシュー科学製）に通し、有効成分を保持させた。酢酸エチル／クロロホルム（１：９（容量））で溶出を行った。
【００６６】
各溶出画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果に基づき、有効成分が濃縮されている画分を集めた。それらの画分を三つの群に分け、それぞれ、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−１、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−２、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−ｏｔｈｅｒｓと名付けた。
【００６７】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−１から溶媒を留去し、固形分１３．９ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（２）で示される化合物２であった。
【００６８】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−２から溶媒を留去し、固形分１．０ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（３）で示される化合物３であった。
【００６９】
（３−７−３）画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏのＳｅｐ  ｐａｋによる前処理及び順相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−７−１）で得られた非晶部（ｏｔｈｅｒｓ）と、（３−７−２）で得られた吸着物（ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）及び３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−ｏｔｈｅｒｓをまとめて、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏと名付けた。
【００７０】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ（固形分量５４．１ｍｇに相当する量；酢酸エチル／クロロホルム（１：９（容量））溶液）を、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）プラス  シリカ  カートリッジ（ウォーターズ社製；順相）に通した。Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）に保持されずに流出した（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１と名付けた。その後、酢酸エチル／クロロホルムで溶出されなかったもの（吸着物；ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、メタノールで溶出させた。その固形分量は、３１．２ｍｇであった。
【００７１】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１（固形分量で２２．５ｍｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続された順相カラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＡＱ  ｓｓ−５２５１；株式会社センシュー科学製）に通し、有効成分を保持させた。酢酸エチル／クロロホルム（１：９（容量））で溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−１３の画分を得た。
【００７２】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−４、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−７、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８及び３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−９に有効成分が濃縮されていた。
【００７３】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−４から溶媒を留去し、固形分６．５ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（２）で示される化合物２であった。
【００７４】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−７から溶媒を留去し、固形分２．３ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（４−１）で示される化合物４であった。
【００７５】
（３−７−４）画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８及び３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−９のＳｅｐ  ｐａｋによる前処理及び逆相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー
画分３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８と３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−９とをまとめ、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９と名付けた。これを９０％メタノール溶液にし、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）プラス  Ｃ１８  カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通した。Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）に保持されずに流出した画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１と名付けた。その後、９０％メタノールで溶出されなかったもの（吸着物；ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐａｒｔ）を、メタノールで溶出させた。その固形分量は、０．９ｍｇであった。
【００７６】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１（固形分量で８．５ｍｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続された逆相の分取カラム（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ  Ｗａｔｅｒ；ナカライテスク株式会社製）に通し、有効成分を保持させた。８０％メタノールで溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−１０の画分を得た。
【００７７】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−４及び３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−８に有効成分が濃縮されていた。
【００７８】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−４から溶媒を留去し、固形分１．８ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（３）で示される化合物３であった。
【００７９】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−８から溶媒を留去し、固形分１．７ｍｇを得た。後記するように、この固形分は、式（４−１）で示される化合物４であった。
【００８０】
（４）有効成分の同定
（４−１）化合物１
(３−５)及び（３−６）で得た固形分（３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３３−１−７、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−３４−１−４に含有されていたもの）それぞれを、ＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。結果を表１に示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  ４４１．２７４７６（Δ−２．６ｍｍｕ）  ［Ｍ−Ｈ］−より、この固形分（以下、「化合物１」という）の分子量は４４２であり、分子式はＣ２８Ｈ４２Ｏ４であることが分かった。
【００８１】
【表１】
2010195697.tif 000007
【００８２】
化合物１における水酸基の位置を特定するため、化合物１の水酸基をｐ−ブロモ安息香酸エステル化した化合物を調製し、ＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。この結果から、化合物１の水酸基の位置が３位であることが確認された。即ち、化合物１の化学構造は、前記式（１）で示されることが確認された。
【００８３】
(３−５)及び（３−６）で得た固形分それぞれを、ＣＤＣｌ３に溶解させ、異核多重結合連結度（Ｈｅｔｅｒｏ−ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ（ＨＭＢＣ）スペクトルを得た。このデータからも、この固形分（化合物１）の化学構造は、式（１）に示すとおりであると推定された。
【００８４】
(３−５)及び（３−６）で得た化合物１について、常法により、ＩＲスペクトル、旋光度及び融点を求めた。結果を表２に示す。
【００８５】
【表２】
2010195697.tif 000008
【００８６】
（４−２）化合物２
(３−７−２)及び（３−７−３）で得た固形分（３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−１と３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−４に含有されていたもの）を、それぞれＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。結果を表３に示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  ４２５．３０５６（Δ−２．７ｍｍｕ）  ［Ｍ−Ｈ］−より、この固形分（以下、「化合物２」という）の分子量は４４２であり、分子式はＣ２８Ｈ４２Ｏ４であることが分かった。
【００８７】
【表３】
2010195697.tif 000009
【００８８】
化合物２における水酸基の位置を特定するため、化合物２の水酸基をｐ−ブロモ安息香酸エステル化した化合物を調製し、ＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。この結果から、化合物２の水酸基の位置が３位であることが確認された。即ち、化合物２の化学構造は、前記式（２）で示されることが確認された。
【００８９】
(３−７−２)及び（３−７−３）で得た固形分を、それぞれＣＤＣｌ３に溶解させ、ＨＭＢＣスペクトルを得た。このデータからも、この固形分（化合物２）の化学構造は、式（２）に示すとおりであると推定された。
【００９０】
(３−７−２)及び（３−７−３）で得た化合物２について、常法により、ＩＲスペクトル、旋光度及び融点を求めた。結果を表４に示す。
【００９１】
【表４】
2010195697.tif 000010
【００９２】
（４−３）化合物３
(３−７−２)及び（３−７−４）で得た固形分（３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｃ−１−２と３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−４に含有されていたもの）それぞれをＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。結果を表５に示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  ４１１．３２６３（Δ−２．３ｍｍｕ）  ［Ｍ＋Ｈ］＋より、この固形分（以下、「化合物３」という）の分子量は４２６であり、分子式はＣ２８Ｈ４２Ｏ３であることが分かった。
【００９３】
【表５】
2010195697.tif 000011
【００９４】
化合物３における水酸基の位置を特定するため、化合物３の水酸基をｐ−ブロモ安息香酸エステル化した化合物を調製し、ＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。この結果から、化合物３の水酸基の位置が３位であることが確認された。即ち、化合物３の化学構造は、前記式（３）で示されることが確認された。
【００９５】
(３−７−２)及び（３−７−４）で得た固形分を、それぞれＣＤＣｌ３に溶解させ、ＨＭＢＣスペクトルを得た。このデータからも、この固形分（化合物３）の化学構造は、式（３）に示すとおりであると推定された。
【００９６】
(３−７−２)及び（３−７−４）で得た化合物３について、常法により、ＩＲスペクトル、旋光度及び融点を求めた。結果を表６に示す
【００９７】
【表６】
2010195697.tif 000012
【００９８】
（４−４）化合物４
(３−７−３)及び（３−７−４）で得た固形分（３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−７と３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−４９−ｏ−１−８／９−１−８に含有されていたもの）を、それぞれＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。結果を表７に示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  ４５１．３１８８（Δ−３．３ｍｍｕ）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋より、この固形分（以下、「化合物４」という）の分子量は４２８であり、分子式はＣ２８Ｈ４４Ｏ３であることが分かった。
【００９９】
【表７】
2010195697.tif 000013
【０１００】
化合物４における水酸基の位置を特定するため、化合物４の水酸基をｐ−ブロモ安息香酸エステル化した化合物を調製し、ＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。この結果から、化合物４の水酸基の位置が３位と６位であることが確認された。また、４位と５位に掛けてエポキシ基を有することが確認された。即ち、化合物４の化学構造は、式（４−１）に示すとおりであると推定された。
【０１０１】
(３−７−３)及び（３−７−４）で得た固形分を、それぞれＣＤＣｌ３に溶解させ、ＨＭＢＣスペクトルを得た。このデータからも、この固形分（化合物４）の化学構造は、式（４−１）に示すとおりであると推定された。
【０１０２】
(３−７−３)及び（３−７−４）で得た化合物４について、常法により、ＩＲスペクトル、旋光度及び融点を求めた。結果を表８に示す。
【０１０３】
【表８】
2010195697.tif 000014
【０１０４】
また、化合物４をＸ線結晶解析に供したところ、図５に示す分子構造であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明に係る化合物は、破骨細胞形成阻害作用を有するので、骨粗鬆症等の骨疾患の予防又は治療剤として有用である。
【図３】
2010195697.tif 000025
【図４】
2010195697.tif 000026
【図１】
2010195697.tif 000027
【図２】
2010195697.tif 000028
【図５】
2010195697.tif 000029