(57)【要約】【課題】２４Ｐ４Ｃ１２を発現する種々のガン、特に前立腺癌の管理において有用な診断および治療方法および組成物を提供する。【解決手段】複数の特定の配列からなるポリヌクレオチド、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８までの、特定の配列で示される配列を有するポリヌクレオチドまたは２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチド配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションにそれぞれ受託番号２０７１２９および２０７０８４として寄託されたｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５またはｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９と称されるプラスミドに含まれるｃＤＮＡによりコードされる、ポリヌクレオチドからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載される、前立腺癌において発現される１３回膜貫通タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願番号第６０／１２８，８５８号（１９９９年４月１２日出願）の優先権を主張する。この内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載された発明は、新規な遺伝子およびそのコードされたタンパク質（２４Ｐ４Ｃ１２と称される）に関し、そして２４Ｐ４Ｃ１２を発現する種々のガン、特に前立腺癌の管理において有用な診断および治療方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ガンは、心臓疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）に次いで、第２の主なヒトの死亡原因である。全世界的に、数百万の人々が、毎年癌により死亡している。米国単独では、癌は毎年５０万人をはるかに超える人々の死亡原因であり、毎年１４０万人あまりが新たな症例として診断されている。心臓疾患での死亡は、有意に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加の傾向にある。来世紀の初期には、癌は死亡の主原因になると予測されている。
【０００４】
全世界で、いくつかの癌が主要な死亡原因（ｋｉｌｌｅｒ）として顕著である。特に、肺、前立腺、胸部、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌の主要な死亡原因の代表である。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通する致死的特徴を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命的である。さらに、原発性癌を最初に生き延びた癌患者についてすら、生活が劇的に変化したという共通する経験が示されている。多くの癌患者は、再発または処置の失敗についての可能性があることを承知しているために駆り立てられる、強い不安を経験している。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験している。多くの癌患者は、再発を経験している。
【０００５】
全世界で、前立腺癌は、男性において第４に最も一般的な癌である。北部アメリカおよび北欧では、はるかに、最も一般的な男性の癌であり、そして男性における癌による死亡の第２の主原因である。米国単独では、肺癌に次いで、４０，０００人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の規模にも拘わらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ｈｏｒｍｏｎｅ ａｂｌａｔｉｏｎ）療法、および化学療法は、主要な処置様式であり続けている。不運にも、これらの処置は、多くに対してあまり有効でなく、かつしばしば、所望されない結果と関連する。
【０００６】
診断現場において、初期段階で局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺腫瘍マーカーが存在しないことは、相変わらずこの疾患の管理の大きな限界である。血清ＰＳＡアッセイは非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的利用性は、いくつかの重要な点が欠如していると広く考えられている。
【０００７】
前立腺癌についてのさらなる特異的マーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の異なる段階を反復し得る前立腺癌異種移植片の生成により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける経過を生き延び、かつ疾患進行（アンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行および転移性病変の発生を含む）を模倣する能力を示した前立腺癌異種移植片である（非特許文献１）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（非特許文献２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（非特許文献３）およびＳＴＥＡＰ（非特許文献４）。
【０００８】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断し、そしてこれを処置する取り組みを促進したが、診断および治療をさらに改善するために、前立腺および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２
【非特許文献２】Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２
【非特許文献３】Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５
【非特許文献４】Ｈｕｂｅｒｔら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４５２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、複数の膜貫通領域および前立腺癌における発現により特徴付けられる、遺伝子およびタンパク質の新規なファミリーに関する。より詳細には、本発明は、新規な遺伝子およびタンパク質（２４Ｐ４Ｃ１２と称される）を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子は、１３の膜貫通ドメインを含み、かつ１２の膜貫通ドメインを含むマウスおよびＣ ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子に相同性を有する７１０アミノ酸のタンパク質をコードする。ヒト２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のコード領域全体および部分的非コード領域のヌクレオチド配列、ならびにコードされたアミノ酸配列は、図１Ａ〜１Ｄに示される（配列番号１、２）。ＲＴ−ＰＣＲおよびノザンブロッティング分析により、正常結腸、前立腺、腎臓および肺において、ならびに前立腺癌異種移植片において２４Ｐ４Ｃ１２の発現が示される。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の膜貫通特性は、前立腺癌におけるその発現と合わせると、２４Ｐ４Ｃ１２が、例えば、インビボで２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に結合し得、かつこれを調節し得る抗体および他の低分子を用いた、前立腺癌治療の標的であることを示唆する。さらに、前立腺癌細胞の細胞表面にこれが局在するので、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を検出し得る抗体および他の薬剤は、前立腺癌画像化法において有用であり得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２転写産物を検出し得るポリヌクレオチドプローブおよびプライマーを使用した種々の他の分子検出アッセイはまた、前立腺癌および潜在的な他の癌を診断し、モニターし、予知し、および病期分類する際における使用を見出し得る。
【００１１】
本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子、ｍＲＮＡ、またはそのフラグメント（ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含む）に対応するか、または相補的なポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、種々の生物学的サンプルにおいて２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを用いた前立腺細胞の分子的診断アッセイもまた提供される。このようなアッセイは、前立腺癌の存在および程度に関する診断情報および／または予知情報を提供し得る。本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子、ならびに変異した２４Ｐ４Ｃ１２および他の形態の２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入した細胞、および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系もまた提供される。本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全なヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーで標識された抗体を含む）を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、種々の生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような増殖を調節できないいくらかの形態を有するまたはこのような形態を有することが疑われる組織サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をモニターするための方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、前立腺の癌のような２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するための種々の治療組成物およびストラテジーを提供する。これらの組成物およびストラテジーとしては、２４Ｐ４Ｃ１２の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療、ならびに癌ワクチンが挙げられる。
【００１４】
さらに、本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２に関連する新規な遺伝子およびタンパク質（Ｈ３８０８７と称される）を提供する。Ｈ３８０８７遺伝子は、１１の潜在的な膜貫通ドメインを含む７０４アミノ酸のタンパク質をコードする。ヒトＨ３８０８７遺伝子のコード領域全体および部分的非コード領域のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列は、図７Ａ〜７Ｄに示される（配列番号６、７）。５’非翻訳領域の５８塩基対は、非常にＧＣに富んでおり（８７％）、この遺伝子が翻訳調節エレメントを含み得ることを示している。２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７のアミノ酸配列は、配列全体に対して４４％同一であり、５６％相同である（図８）。発現分析により、Ｈ３８０８７が偏在的に発現されることが示され（図９）、その最も高い発現レベルは、精巣において検出された。試験された種々のＬＡＰＣ異種移植片の各々においても発現が観察された。Ｈ３８０８７は、２４Ｐ４Ｃ１２特異的治療を試験するためのコントロールとして役立ち得るか、または診断および／もしくは治療標的を提供し得る。２４Ｐ４Ｃ１２に選択的に影響を及ぼすが、Ｈ３８０８７には選択的に影響を及ぼさない治療は、正常細胞に対してより毒性が少ない可能性がある。従って、Ｈ３８０８７タンパク質は、２４Ｐ４Ｃ１２に指向される治療様式についての前臨床試験ツールとして有用であり得る。しかし、Ｈ３８０８７タンパク質発現は、そのＲＮＡ発現より偏在的ではない可能性があり、このことは、診断および治療ストラテジーについての標的としてのＨ３８０８７を示唆する。
【００１５】
本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２特異的結合薬剤を同定するための方法を提供する。この方法は、２４Ｐ４Ｃ１２を結合する候補薬剤と、Ｈ３８０８７とを接触させる工程、およびこの候補薬剤がＨ３８０８７を結合するか否かを決定する工程を包含する。この候補薬剤のＨ３８０８７に対する結合の欠如は、２４Ｐ４Ｃ１２特性の指標である。このような結合は、当該分野で公知の従来の結合アッセイ（本明細書中に記載の代表的なアッセイを含む）を使用して検出され得る。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
(項目１） ２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが以下からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）または図１Ｅ（配列番号３）に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ＴがＵでもあり得る、ポリヌクレオチド；
（ｂ）ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８までの、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ＴがＵでもあり得る、ポリヌクレオチド；
（ｃ）２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチド配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションにそれぞれ受託番号２０７１２９および２０７０８４として寄託されたｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５またはｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９と称されるプラスミドに含まれるｃＤＮＡによりコードされる、ポリヌクレオチド；
（ｄ）図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）または図１Ｅ（配列番号４）に示されるアミノ酸配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに十分相補的なポリヌクレオチド。
(項目２） 図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）または図１Ｅ（配列番号４）に示されるアミノ酸配列に対して、その長さ全体にわたり少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目３） ２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド：
【化１】
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(項目４） ２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される膜貫通ドメインを含む、ポリヌクレオチド。
(項目５） 検出可能なマーカーで標識されている、項目１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
(項目６） 項目１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
(項目７） 項目６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目８） 項目７に記載の宿主細胞を２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの生成のために十分な条件下で培養する工程を包含する、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを生成するためのプロセス。
(項目９） 前記のように生成された前記２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを回収する工程をさらに包含する、項目８に記載のプロセス。
(項目１０） 項目８に記載のプロセスにより生成された２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド。
(項目１１） 項目１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド。
(項目１２） 項目１１に記載のポリペプチドの少なくとも１５の連続するアミノ酸を含む、ポリペプチド。
(項目１３） 項目１０〜１２のいずれか１項に記載の２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
(項目１４） モノクローナルである、項目１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
(項目１５） ポリクローナルである、項目１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
(項目１６） 項目１４に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む、組換えタンパク質
(項目１７） 検出可能なマーカーで標識されている、項目１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント、あるいは項目１６に記載の組換えタンパク質。
(項目１８） 項目１７に記載の抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク質であって、前記検出可能なマーカーが、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群より選択される、抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク質。
(項目１９） Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＳｆｖフラグメントである、項目１３に記載の抗体フラグメント。
(項目２０） ヒト抗体である、項目１３〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
(項目２１） 毒素または治療薬剤に結合体化されている、項目１３〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
(項目２２） マウス抗原結合領域残基およびヒト抗体残基を含む、項目１３〜１８のいずれか１項に記載の抗体。
(項目２３） 項目２０に記載のモノクローナル抗体を生成する、トランスジェニック動物。
(項目２４） 項目１４に記載のモノクローナル抗体を生成する、ハイブリドーマ。
(項目２５） 項目１４に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変性ドメインを含む、単鎖モノクローナル抗体。
(項目２６） 項目２５に記載の単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目２７） 生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、該サンプルと、項目１７または１８に記載の抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク質とを接触させる工程、および該抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク質に対する、該サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の結合を検出する工程、を包含する、アッセイ。
(項目２８） 生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、項目１に記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；および
（ｂ）該プローブと該サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドとの該ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程であって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が該サンプル内の２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を示す、工程、
を包含する、アッセイ。
(項目２９） 生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つのプライマーを用いて逆転写することにより、該サンプルからｃＤＮＡを生成する工程；
（ｂ）該サンプル中で２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを増幅するためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを使用して、上記のように生成した該ｃＤＮＡを増幅する工程；
（ｃ）該増幅した２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、
を包含し、
該センスプローブおよびアンチセンスプローブとして使用する該２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションにそれぞれ受託番号２０７１２９および２０７０８４として寄託されたｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５またはｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９と称されるプラスミド内に含まれる２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを増幅し得る、アッセイ。
(項目３０） ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を発現する癌の存在を検出する方法であって、該方法は、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程、および上記のように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現された２４Ｐ４Ｃ１２のレベルと比較する工程を包含し、該試験サンプルにおける、該正常サンプルに対して上昇した２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在が、該個体におけるこのような癌の存在の指標を提供する、方法。
(項目３１） ２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をモニターする方法であって、該方法は、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現された２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を決定する工程、および上記のように決定された該状態を、対応する正常サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態と比較する工程を包含し、該試験サンプルにおける、該正常サンプルに対して異常な２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の存在が該個体内の調節されない細胞増殖の指標を提供する、方法。
(項目３２） 個体における癌の存在を診断する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該個体から得られた試験サンプルにおいて発現された２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡのレベルを決定する工程；および
（ｂ）上記のように決定されたレベルを、既知の類似の正常組織サンプルにおいて発現された２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡのレベルと比較する工程、
を包含し、該試験サンプルにおける、該正常組織サンプルに対して上昇した２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現の存在が癌の存在の指標を提供する、方法。
(項目３３） 個体における癌の存在を診断する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該個体から得られた試験サンプルにおいて発現された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程；および
（ｂ）上記のように決定されたレベルを、既知の類似の正常組織サンプルにおいて発現された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルと比較する工程、
を包含し、該試験サンプルにおける、該正常組織サンプルに対して上昇した２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在が癌の存在の指標を提供する、方法。
(項目３４） 項目３２または３３に記載の方法であって、前記癌が前立腺癌であり、そして前記試験組織サンプルおよび正常組織サンプルが、前立腺組織、骨組織、リンパ組織、血清、血液および精液からなる群より選択される、方法。
(項目３５） ２４Ｐ４Ｃ１２特異的結合薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）２４Ｐ４Ｃ１２を結合する候補薬剤と、Ｈ３８０８７とを接触させる工程；および
（ｂ）該候補薬剤がＨ３８０８７を結合するか否かを決定する工程であって、該候補薬剤のＨ３８０８７に対する結合の欠如が、２４Ｐ４Ｃ１２特異性の指標である、工程、
を包含する、方法。
(項目３６） 項目３５に記載の方法により同定された、２４Ｐ４Ｃ１２特異的結合薬剤。
(項目３７） ２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を有する患者を処置するための組成物を調製するための、項目２６に記載のベクター、項目１に記載のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド、項目１に記載のポリヌクレオチドを切断し得るリボザイム、または項目１３〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク質の使用。
(項目３８） ２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するための組成物の調製のための、項目１０もしくは１１に記載の２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドまたはその免疫原性部分の使用。
(項目３９） 前記癌が前立腺癌である、項目３７または３８に記載の使用。
(項目４０） 薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、項目１０もしくは１１に記載の２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドまたはその免疫原性部分、項目２６に記載のベクター、項目１に記載のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド、項目１に記載のポリヌクレオチドを切断し得るリボザイム、項目１３〜２２のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントまたは組換えタンパク質、あるいは項目３６に記載の２４Ｐ４Ｃ１２特異的結合薬剤、および必要に応じて生理学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
(項目４１） ２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目２６に記載のベクターを該患者に投与する工程を包含し、その結果、該ベクターが、単鎖モノクローナル抗体コード配列を該癌細胞に送達し、そして該コードされた単鎖抗体が、該癌細胞において細胞内で発現される、方法。
(項目４２） ２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目４０に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目４３） ２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するためのワクチン組成物であって、該ワクチンは、２４Ｐ４Ｃ１２の免疫原性部分および生理学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチン組成物。
(項目４４） 患者における２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌の発生または進行を阻害する方法であって、該方法は、項目４３に記載のワクチン組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の完全コード配列（および３’非翻訳領域の一部）のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。この配列は、３つのｃＤＮＡクローン（２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９、２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５、および２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ４と命名された）の重複する配列から生成された（実施例２）。１３の潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。Ｋｏｚａｋ配列および推定開始メチオニンを、太字で示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の完全コード配列（および３’非翻訳領域の一部）のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。この配列は、３つのｃＤＮＡクローン（２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９、２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５、および２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ４と命名された）の重複する配列から生成された（実施例２）。１３の潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。Ｋｏｚａｋ配列および推定開始メチオニンを、太字で示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の完全コード配列（および３’非翻訳領域の一部）のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。この配列は、３つのｃＤＮＡクローン（２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９、２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５、および２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ４と命名された）の重複する配列から生成された（実施例２）。１３の潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。Ｋｏｚａｋ配列および推定開始メチオニンを、太字で示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の完全コード配列（および３’非翻訳領域の一部）のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。この配列は、３つのｃＤＮＡクローン（２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９、２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５、および２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ４と命名された）の重複する配列から生成された（実施例２）。１３の潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。Ｋｏｚａｋ配列および推定開始メチオニンを、太字で示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の最初に単離されたＳＳＨフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号３）およびＯＲＦアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、前立腺癌異種移植片、正常前立腺、ならびに他の組織および細胞株の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、これは、正常前立腺およびＬＡＰＣ前立腺癌異種移植片におけるおよそ等しいレベルの発現を示す。レーンは以下の組織を表す：（１）脳；（２）前立腺；（３）；ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；（４）ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；（５）ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；（６）ＨｅＬａ；（７）マウスｃＤＮＡ；および（８）陰性コントロール。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々の組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、これは、２５サイクルのＰＣＲ増幅後の正常腎臓および肺においてのみ、検出可能な発現を示す。より低い発現は、３０サイクルの増幅後の種々の他の組織において検出可能である。レーンは以下の組織を表す：（１）脳；（２）心臓；（３）腎臓；（４）肝臓；（５）肺；（６）膵臓；（７）胎盤；および（８）骨格筋。
【図２Ｃ】図２Ｃは、種々の組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、これは、２５サイクルのＰＣＲ増幅後の正常結腸および前立腺においてのみ、検出可能な発現を示す。より低い発現は、３０サイクルの増幅後の種々の他の組織において検出可能である。レーンは以下の組織を表す：（１）結腸；（２）卵巣；（３）白血球；（４）前立腺；（５）小腸；（６）脾臓；（７）精巣；および（８）胸腺。
【図３Ａ】図３Ａは、正常ヒト組織のパネルにわたる２４Ｐ４Ｃ１２発現のノーザンブロット分析を示し、腎臓における約３ｋｂ転写物の発現を示す。レーンは以下の組織を表す：（１）心臓；（２）脳；（３）胎盤；（４）肺；（５）肝臓；（６）骨格筋；（７）腎臓；および（８）膵臓。
【図３Ｂ】図３Ｂは、正常ヒト組織のパネルにわたる２４Ｐ４Ｃ１２発現のノーザンブロット分析を示し、前立腺および結腸における約３ｋｂ転写物の発現を示す。レーンは以下の組織を表す：（１）脾臓；（２）胸腺；（３）前立腺；（４）精巣；（５）卵巣；（６）小腸；（７）結腸；および（８）白血球。
【図３Ｃ】図３Ｃは、前立腺癌移植片および前立腺癌細胞株における２４Ｐ４Ｃ１２発現のノーザンブロット分析を示し。レーンは以下の組織を表す：（１）ＰｒＥＣ；（２）ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；（３）ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；（４）ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；（５）ＬＡＰＣ−９ ＡＩ；（６）ＬＮＣａＰ；（７）ＰＣ−３；（８）ＤＵ１４５；（９）ＴｓｕＰｒ１；および（１０）ＬＡＰＣ−４ ＣＬ。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物およびマウスＮＧ２２（配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物およびマウスＮＧ２２（配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図５】図５は、ＬＡＰＣ異種移植片における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。マウス骨内に皮下（ｓｃ）または脛骨内（ｉｔ）で移植したＬＡＰＣ異種移植片からＲＮＡを抽出した。１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを有するノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いて探索（ｐｒｏｂｅ）した。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準物を、側方に示す。レーンは以下の組織を表す：（１）ＬＡＰＣ−４ ＡＤｓｃ；（２）ＬＡＰＣ−４ ＡＤｓｃ；（３）ＬＡＰＣ−４ ＡＤｓｃ；（４）ＬＡＰＣ−４ ＡＤｉｔ；（５）ＬＡＰＣ−４ ＡＤｉｔ；（６）ＬＡＰＣ−４ ＡＤｉｔ；（７）ＬＡＰＣ−４ ＡＤ2；（８）ＬＡＰＣ−９ ＡＤｓｃ；（９）ＬＡＰＣ−９ ＡＤｓｃ；（１０）ＬＡＰＣ−９ ＡＤｉｔ；（１１）ＬＡＰＣ−９ ＡＤｉｔ；（１２）ＬＡＰＣ−９ ＡＤｉｔ；（１３）ＬＡＰＣ−３ ＡＩｓｃ；および（１４）ＬＡＰＣ−３ ＡＩｓｃ。
【図６Ａ】図６Ａは、前立腺癌患者サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。前立腺癌患者由来の前立腺腫瘍およびその正常な隣接組織から、ＲＮＡを抽出した。１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを有するノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いて探索した。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準物を、側方に示す。レーンは以下の組織を表す：（１）患者１、正常隣接組織；（２）患者１、グリーソン７腫瘍；（３）患者２、正常隣接腫瘍；（４）患者２、グリーソン９腫瘍；（５）患者３、正常隣接組織；（６）患者３、グリーソン７腫瘍。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａについて記載されるような前立腺癌患者サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２の発現が、βアクチンと比較されたことを示す。レーンは以下の組織を表す：（１）患者１、正常隣接組織；（２）患者１、グリーソン７腫瘍；（３）患者２、正常隣接腫瘍；（４）患者２、グリーソン９腫瘍；（５）患者３、正常隣接組織；（６）患者３、グリーソン７腫瘍。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、Ｈ３８０８７（クローンＧＴＢ６）のｃＤＮＡ配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。潜在的なＫｏｚａｋ配列および開始メチオニン（太字で表す）の前に５’非翻訳（ＵＴＲ）領域中のＧＣリッチ領域（８７％ＧＣ含量）が示される。潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｄは、Ｈ３８０８７（クローンＧＴＢ６）のｃＤＮＡ配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。潜在的なＫｏｚａｋ配列および開始メチオニン（太字で表す）の前に５’非翻訳（ＵＴＲ）領域中のＧＣリッチ領域（８７％ＧＣ含量）が示される。潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄは、Ｈ３８０８７（クローンＧＴＢ６）のｃＤＮＡ配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。潜在的なＫｏｚａｋ配列および開始メチオニン（太字で表す）の前に５’非翻訳（ＵＴＲ）領域中のＧＣリッチ領域（８７％ＧＣ含量）が示される。潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、Ｈ３８０８７（クローンＧＴＢ６）のｃＤＮＡ配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。潜在的なＫｏｚａｋ配列および開始メチオニン（太字で表す）の前に５’非翻訳（ＵＴＲ）領域中のＧＣリッチ領域（８７％ＧＣ含量）が示される。潜在的な膜貫通ドメインに下線を付し、太字で示す。
【図８】図８は、ＢＬＡＳＴ機能（ＮＣＢＩ）を使用してＨ３８０８７との２４Ｐ４Ｃ１２の相同性アラインメントを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト組織における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。１レーンあたり２μｇのｍＲＮＡを用いる複数の組織のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いて探索した。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準物を、側方に示す。レーンは以下の組織を表す：（１）心臓；（２）脳；（３）胎盤；（４）肺；（５）肝臓；（６）骨格筋；（７）腎臓；および（８）膵臓。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒト組織における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。１レーンあたり２μｇのｍＲＮＡを用いる複数の組織のノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いて探索した。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準物を、側方に示す。レーンは以下の組織を表す：（１）脾臓；（２）胸腺；（３）前立腺；（４）精巣；（５）卵巣；（６）小腸；（７）結腸；および（８）白血球。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ヒト組織における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いるＬＡＰＣ異種移植片のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いて探索した。サイズ標準物（ｋｂ）を、側方に示す。レーンは以下の組織を表す：（１）ＰＣ−３；（２）ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；（３）ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；（４）ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；（５）ＬＡＰＣ−９ ＡＩ。
【図１０Ａ】図１０Ａは、２４Ｐ４Ｃ１２特異的ポリクローナル抗体によって２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中での２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の検出を示す。２９３Ｔ細胞は、空のベクター、または、ｐＣＤＮＡ３．１ ＣＭＶで駆動されたＭＹＣ−ＨｉｓまたはｐＳＲ−αレトロウイルス発現ベクター中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトされた。次いで、サンプル緩衝液中の細胞溶解物を、穏やかな熱変性（７０℃）に供し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてニトロセルロースに転写した。次いで、膜を、２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸１〜１４（ＭＧＧＫＱＲＤＥＤＤＥＡＹＧ）に対して惹起した、アフィニティー精製したウサギ抗ペプチドｐＡｂ ２μｇ／ｍｌを用いてウェスタン分析に供した。抗２４Ｐ４Ｃ１２免疫応答性バンドを、抗ウサギＨＲＰ結合体化二次抗体とともにインキュベーションすることによって可視化し、そして化学発光検出を増強した。結果は、熱変性によって増強された、９０ｋＤの免疫反応性バンド（矢印）および高分子量スメア（＞１３２Ｋｄ）の特異的認識を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、２４Ｐ４Ｃ１２特異的ポリクローナル抗体によって２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中での２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の検出を示す。図１０Ａについてと同様に調製されたトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、サンプル緩衝液中で溶解し、そして強力な熱変性（１００℃）に供した。２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸１〜１４（ＭＧＧＫＱＲＤＥＤＤＥＡＹＧ）に対して惹起した、アフィニティー精製したウサギ抗ペプチドｐＡｂ２μｇ／ｍｌを用いるウェスタン分析を、図１０Ａについてと同様に行った。結果は、熱変性によって増強された、９０ｋＤの免疫反応性バンド（矢印）および高分子量スメア（＞１３２Ｋｄ）の特異的認識を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
他に規定しない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語、表記、および他の科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、共通して理解される意味は、明確さおよび／または迅速な参照のために本明細書中で定義され、そしてこのような定義の本明細書中への包含は、当該分野において一般に理解されることにわたって実質的な相違を表すとは必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載または参照される技術および手順は、一般に、従来の方法論（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において記載されている方法論を広く利用した分子クローニングの方法論）を用いて、当業者によって十分に理解されかつ共通して用いられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、他に注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロトコルおよび／またはパラメーターに従って実行される。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」および「局所的に進行した疾患」とは、前立腺皮膜を通して伸長した前立腺癌を意味し、そして米国泌尿器学会（ＡＵＡ）システムの下でのステージＣ疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔシステムの下でのステージＣ１−Ｃ２疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移）システムの下でのステージＴ３−Ｔ４およびＮ＋疾患を含むことが意味される。一般に、手術は、局所的に進行した疾患を有する患者のためには推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化している（器官に限定されている）前立腺癌を有する患者と比較して、実質的により好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超える硬化の明白な証拠、または前立腺基部上の非対称もしくは硬化によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺皮膜に侵入するかもしくは浸透するか、外科的な境界まで伸長するか、または精嚢に侵入する場合、現在、徹底的な前立腺切除後に生理学的に診断される。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、用語「転移性前立腺癌」および「転移性疾患」は、局所的なリンパ節、または異なる部位に拡がった前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステム下でステージＤ疾患、およびＴＮＭシステム下でステージＴｘＮｘＭ＋を包含することが意味される。局所的に進行した前立腺癌の場合、手術は一般的には転移性疾患を有する患者には示されず、そしてホルモン（アンドロゲン除去）治療が好ましい治療様式である。転移性前立腺癌を有する患者は、最終的に、処置の開始から１２〜１８ヶ月以内にアンドロゲン抵抗性の状態を発症し、そしてこれらの患者のおよそ半数がその後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、結局のところ、特徴として、溶骨性ではなくむしろ造血性である（すなわち、正味の骨の形成を生じる）。骨への転移は、脊椎において最も頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、胸郭、頭蓋、および上腕骨と続く。転移のための他の一般的な部位には、リンパ節、肺、肝臓、および脳が含まれる。転移性の前立腺癌は、代表的には、直視的または腹腔鏡的な骨盤のリンパ節切除術、全身の放射性核種スキャン、骨格のラジオグラフィー、および／または骨損傷生検によって診断される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基または１０塩基対の長さのヌクレオチドのポリマー型を意味し、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変型のいずれかであり、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含むことを意味する。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１０アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの状況において使用される、用語「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズする」「ハイブリダイズする」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％ ホルムアミド、６×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ）をいうことが意味される。ここで、ハイブリダイゼーションのための温度が、３７℃より高い温度であり、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中での洗浄のための５５℃がより高い温度であり、そして最も好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。
【００２３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験による計算である。一般に、より長いプローブは、正しいアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、融解温度より下の環境において、相補鎖が存在する場合、変性したＤＮＡの再アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイズ可能な配列との間の所望される相同性の程度が高いほど、使用され得る相対的な温度が高くなる。結果として、相対的により高い温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度ではそのようなことがより少ない、ということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅrｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００２４】
本明細書中に規定されるように、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の条件によって同定され得る：（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度を使用する条件（例えば、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤（例えば、ホルムアミド）を使用する条件（例えば、５０％ （ｖ／ｖ）ホルムアミドおよび０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ Ｆｉｃｏｌ／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）および７５０ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、４２℃）；または（３）５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％ 硫酸デキストラン、４２℃、さらに以下の洗浄工程、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド、５５℃、続いて、高ストリンジェンシー洗浄（ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる、５５℃）を使用する条件。
【００２５】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ）の使用を含む。これは、上記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下を含む溶液中での３７℃、一晩のインキュベーションである：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡ、続いて約３７℃〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子（例えば、プローブ長などのような因子）を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
【００２６】
アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況においてはまた、用語「相同性」は、ＢＬＡＳＴ分析の保存性アミノ酸の判断基準を使用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。例えば、同一性％の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって生成され得る。アミノ酸置換（これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる）に関するさらなる詳細は以下に提供される。
【００２７】
さらなる定義が、引き続くサブセクションを通して提供される。
【００２８】
本発明は、複数の膜貫通領域および前立腺癌における発現によって特徴付けされた、新規な遺伝子およびタンパク質のファミリーに関する。より詳細には、本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７と命名された、新規な遺伝子およびタンパク質を提供する。本発明は、一部は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびＨ３８０８７遺伝子の同定に基づき、そして、前立腺癌、正常な前立腺、および他の正常ヒト組織における、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７遺伝子の発現パターンの特徴付けに基づく。以下に続く実施例においてより完全に記載されるように、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびＨ３８０８７遺伝子の発現パターンは、以下によって分析された：（１）組織および細胞株のパネルから調製した標的ｃＤＮＡを使用する、ＲＴ−ＰＣＲによる示差的発現分析（正常前立腺、ならびにＬＡＰＣ−４ ＡＤおよびＡＩ、およびＬＡＰＣ−９ ＡＤ異種移植片を含む）（２）１６の正常ヒト組織から調製されたｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによる組織特異性分析、ならびに（３）正常前立腺サンプルおよび前立腺癌異種移植片サンプルのノーザンブロット分析。この組み合わせた発現分析は、ＡＤとＡＩ組織の間、臨床的前立腺癌と正常な前立腺との間、および組織特異的の示差的発現に関する情報を提供するために設計された。さらに、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７の遺伝子産物の最初の生物学的特徴付けが、比較できる配列分析によって行われた。
【００２９】
本明細書中に開示された２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７のｃＤＮＡ配列または遺伝子配列のすべてまたは一部に対応するヌクレオチドプローブが提供され、そして、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７の遺伝子配列のすべてまたは一部をコードする他のｃＤＮＡを単離または同定するために使用され得る。本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびＨ３８０８７遺伝子またはそれらのＲＮＡ転写物を特異的に増幅させ得るプライマー、および２４Ｐ４Ｃ１２分子とＨ３８０８７分子との間を区別するためのプライマーを提供する。本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７の遺伝子産物のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、多数のさらなる用途を有する、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７によってコードされるタンパク質およびペプチドを発現するために使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７の遺伝子プローブおよびプライマーもまた、種々の生物学的サンプルにおいて２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７のｍＲＮＡの存在または非存在を検出するために、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７を発現する前立腺癌細胞および他の細胞を検出するために、および前立腺癌についての分子的診断アッセイおよび予後アッセイにおいて使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子に対応するか、またはそれに相補的なポリヌクレオチドは、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２の生物学的活性を調節するかまたは阻害する際に、前立腺癌を処置するための方法において有用であり得る。
【００３０】
本発明はまた、例えば、抗体を惹起するために使用され得る２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７のタンパク質およびポリペプチドを提供する。２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７のタンパク質およびポリペプチドに特異的に結合し得るか、またはそれらを同定し得る抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７の発現を検出するため、それらの細胞内位置を決定するため、前立腺癌細胞および前立腺腫瘍を検出および画像化するため、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７の生物学的活性を調節および阻害するために使用され得る。本発明のこれらおよび他の局面は、以下のサブセクションにより詳細に記載されている。
【００３１】
（２４Ｐ４Ｃ１２の構造および発現）
以下の実施例においてさらに記載されるように、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびタンパク質が、多数の分析的アプローチを用いて特徴付けられた。例えば、ヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列の分析は、潜在的に関連する分子、ならびに認識可能な構造ドメイン、トポロジー的特徴、および２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡおよびタンパク質構造中の他のエレメントを同定するために行われた。２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロットは、２４Ｐ４Ｃ１２メッセージを発現する正常組織および癌性組織の範囲を確立させるために行われた。
【００３２】
ｃＤＮＡ配列と合わせた、約３ｋｂの２４Ｐ４Ｃ１２のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）は、図１Ａ〜１Ｄに提供される。この２５８７ヌクレオチド配列は、７１０アミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質は、１３の推定膜貫通ドメイン（図１Ａ〜１Ｄ中で下線を付した）を有し、そこに、１０５〜１７３、２６１〜３２９、４３９〜５０６、６７８〜７４６、７６８〜８３６、９２４〜９９２、１０７４〜１１４２、１２４５〜１３１３、１３４４〜１４１２、１５０６〜１５７５、１６９４〜１７６３、１８０３〜１８７１、および１９３５〜２０００として番号付けした。比較配列分析は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列に対して有意な相同性を有する２つの公知の配列（最近同定されたマウスＮＧ２２遺伝子およびＣＥＥＳＢ８２Ｆと名付けられたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子）を同定した。これらの両方の遺伝子は、１２の膜貫通ドメインを含むタンパク質をコードする。マウスＮＧ２２遺伝子（図４Ａ〜４Ｂ；配列番号５）は、マウスゲノム中のＭＨＣクラスＩＩＩを含むゲノムＢＡＣクローン中の多くのＯＲＦのうちの１つとして最近同定された。
【００３３】
１６の正常組織において行われた、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントプローブを使用したノザンブロット分析は、主に、前立腺および結腸における発現を示し、より低い発現が、腎臓において検出され、そして有意により低い発現が、膵臓、肺および胎盤において検出された（図２Ａ〜２Ｃ、３Ａ〜３Ｂ）。癌組織における２４Ｐ４Ｃ１２発現を分析するために、ノザンブロッティングを、ＬＡＰＣ異種移植片、ならびにいくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株由来のＲＮＡにおいて行った。結果は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ、ＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ−４細胞株において、２４Ｐ４Ｃ１２の高い発現レベルを示す（図２Ａ、３Ｃ、５）。非常に高いレベルが、ＬＡＰＣ−３ ＡＩにおいて検出される（図５）。より低いレベルが、ＬＡＰＣ−９ ＡＩにおいて検出される（図３Ｃ）。異種移植片のより詳細な分析は、２４Ｐ４Ｃ１２が、マウスの脛骨内で増殖する場合でさえも、異種移植片において高度に発現されることを示す（図５）。ノザン分析はまた、２４Ｐ４Ｃ１２が、正常前立腺、および前立腺癌患者由来の前立腺腫瘍組織において発現されることを示す（図６Ａ）。これらの結果は、２４Ｐ４Ｃ１２が、前立腺癌において高度に発現される前立腺遺伝子であり、そして前立腺癌における薬物または抗体標的としての有用性を有し得る前立腺遺伝子であることを示唆する。
【００３４】
（Ｈ３８０８７の構造および発現）
Ｈ３８０８７は、ＮＣＢＩにおけるｔｂｌａｓｔｎ手段を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列を用いてｄＢＥＳＴデータベースを検索することによって、２４Ｐ４Ｃ１２のファミリーメンバーとして同定された。相同タンパク質のタンパク質フラグメントをコードするＥＳＴが同定された。これらのうちの１つであるＨ３８０８７は、精巣ライブラリーからクローニングされた。ｃＤＮＡ（クローンＧＴＢ６）は、２７３８ｂｐの大きさ（配列番号６）であり、そして１１の推定膜貫通ドメインを有する（図７Ａ〜７Ｄにおいて、下線を引かれ、そしてその図において、１５２〜２２０、３１１〜３７９、７４３〜８１１、８３０〜８９５、９９５〜１０６０、１１３３〜１２０１、１３９４〜１４５９、１５５６〜１６２４、１６５５〜１７２３、１８５９〜１９２４および１９８８０〜２０５６として番号を付される）７０４のアミノ酸タンパク質（配列番号７）をコードする。５’非翻訳領域の５８の塩基対は、非常にＧＣに富み（８７％）、これは、この遺伝子は、翻訳調節エレメントを含み得ることを示す。２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７のアミノ酸配列は、全体の配列に対して、４４％同一であり、そして５６％相同である（図８）。
【００３５】
発現分析は、Ｈ３８０８７が、偏在して発現されることを示し（図９）、最も高い発現レベルが、精巣において検出される。発現はまた、すべてのＬＡＰＣ異種移植片において見られる。Ｈ３８０８７が、偏在して発現されるので、２４Ｐ４Ｃ１２特異的療法を試験するためのコントロールとして役立ち得る。Ｈ３８０８７の機能に影響を及ぼす２４Ｐ４Ｃ１２特異的療法は、正常細胞に対して毒性であり得る。しかし、２４Ｐ４Ｃ１２に選択的に影響を及ぼすが、Ｈ３８０８７には影響を及ぼさない療法は、正常細胞に対して毒性がより減少され得る。従って、Ｈ３８０８７タンパク質は、２４Ｐ４Ｃ１２に対して指向される治療様式のための前臨床試験手段として有用である。
【００３６】
（ポリヌクレオチド）
本発明の一つの局面は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子、ｍＲＮＡもしくは２４Ｐ４Ｃ１２をコードするポリヌクレオチド（集合的に、「２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド」）にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における）のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載される２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびタンパク質、ならびに他の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および改変体は、一般的に、２４Ｐ４Ｃ１２コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性、そして少なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）、より好ましくは、７０％以上の相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）。
【００３７】
２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの一つの実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示される配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドである。２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドは、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるようなヒト２４Ｐ４Ｃ１２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る）；２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のすべてまたは一部分をコードするポリヌクレオチド；前述のポリヌクレオチドに相補的な配列；あるいは前述のうちのいずれかのポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるような、ヌクレオチド残基数６〜ヌクレオチド残基数２１３８の配列を有するか、または図１Ｅ（配列番号３）に示されるような配列を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る。別の実施形態は、配列が、それぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、指定（Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）番号２０７１２９および２０７０８４として寄託された、ｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５またはｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９と命名されたプラスミドのいずれかに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるヒト２４Ｐ４Ｃ１２ｃＤＮＡ、またはそのポリヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ配列の特定の一部分をコードする２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド（例えば、タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む：図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸１〜およそアミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸２０〜およそアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸３０〜およそアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸４０〜およそアミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸５０〜およそアミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸６０〜およそアミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸７０〜およそアミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸８０〜およそアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸９０〜およそアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。このスキームの後、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸１００〜７１０のアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチド（少なくとも１０アミノ酸の）は、本発明の代表的な実施形態である。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドがまた意図される。例えば、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）〜およそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野に周知の種々の技術によって生成され得る。
【００３９】
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列内に含まれる、１つ以上の生物学的モチーフをコードする２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドフラグメントを含む。一つの実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で開示される１つ以上の膜貫通ドメインをコードし得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、Ｈ３８０８７、ＮＧ２２またはＣＥＥＳＢ８２Ｆとの相同性を示す、２４Ｐ４Ｃ１２の１つ以上の領域をコードし得る。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、以下の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびポリペプチドを議論する主題において、より詳細に開示されるような、１つ以上の以下をコードし得る：２４Ｐ４Ｃ１２ Ｎグリコシル化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、チロシンキナーゼリン酸化部位、Ｎミリストイル化部位またはアミド化部位、あるいはロイシンジッパー型。本発明のなお別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２選択的スプライシング改変体に独特である配列をコードし得る。
【００４０】
前述の段落のポリヌクレオチドは、多くの異なる特定の使用を有する。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２は、前立腺癌において特異的に発現されることが示されるので（図２Ａ、３Ｃ、５、６）、これらのポリヌクレオチドは、正常な組織対癌性組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を評価するための方法において使用され得る。代表的には、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドが使用されて、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の特定の領域（膜貫通ドメインを含むような領域）において、混乱状態（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価し得る。例示的なアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方を含み、これらの両方は、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タンパク質内のこれらの領域を試験する。
【００４１】
同様に、本発明はさらに、Ｈ３８０８７遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは、Ｈ３８０８７タンパク質およびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、Ｈ３８０８７遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＨ３８０８７遺伝子、ｍＲＮＡもしくはＨ３８０８７をコードするポリヌクレオチド（集合的に、「Ｈ３８０８７ポリヌクレオチド」）にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における）のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、Ｈ３８０８７遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載されるＨ３８０８７遺伝子およびタンパク質、ならびに他のＨ３８０８７タンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他のＨ３８０８７タンパク質および改変体は、一般的に、Ｈ３８０８７コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性、そして少なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）、より好ましくは、７０％以上の相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）。
【００４２】
Ｈ３８０８７ポリヌクレオチドの一つの実施形態は、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号６）に示される配列を有するＨ３８０８７ポリヌクレオチドである。Ｈ３８０８７ポリヌクレオチドは、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号６）に示されるようなヒトＨ３８０８７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る）；Ｈ３８０８７タンパク質のすべてまたは一部分をコードするポリヌクレオチド；前述のポリヌクレオチドに相補的な配列；あるいは前述のうちのいずれかのポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号６）に示されるような、ヌクレオチド残基数５９〜ヌクレオチド残基数２１７３（図７Ａ〜７Ｄ；配列番号６に示される番号付けを使用して）の配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図７Ａ〜７Ｄに示されるヒトＨ３８０８７ｃＤＮＡ、またはそのポリヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、Ｈ３８０８７ ｍＲＮＡ配列の特定の一部分をコードするＨ３８０８７ポリヌクレオチド（例えば、タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む：図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸１〜およそアミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸２０〜およそアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸３０〜およそアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸４０〜およそアミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸５０〜およそアミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸６０〜およそアミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸７０〜およそアミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸８０〜およそアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸９０〜およそアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。このスキームの後、Ｈ３８０８７タンパク質のアミノ酸１００〜７０４のアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチド（少なくとも１０アミノ酸の）は、本発明の代表的な実施形態である。Ｈ３８０８７タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドがまた意図される。例えば、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）〜およそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野に周知の種々の技術によって生成され得る。
【００４４】
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、Ｈ３８０８７タンパク質配列内に含まれる、１つ以上の生物学的モチーフをコードするＨ３８０８７ポリヌクレオチドフラグメントを含む。一つの実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で開示される１つ以上の膜貫通ドメインをコードし得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、２４Ｐ４Ｃ１２、ＮＧ２２またはＣＥＥＳＢ８２Ｆとの相同性を示す、Ｈ３８０８７の１つ以上の領域をコードし得る。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、以下のＨ３８０８７タンパク質およびポリペプチドを議論する主題において、より詳細に開示されるような、１つ以上の以下をコードし得る：Ｈ３８０８７ Ｎグリコシル化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、チロシンキナーゼリン酸化部位、またはＮミリストイル化部位、あるいはシグナル配列。本発明のなお別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上のＨ３８０８７選択的スプライシング改変体に独特である配列をコードし得る。
【００４５】
本明細書中で開示される本発明の他の具体的に意図された実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然の供給源または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸分子である。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、あるいは他の分子（ペプチド核酸（ＰＮＡ）または塩基対依存様式でＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的に結合する非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業者は、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７ポリヌクレオチドならびに本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲得し得る。
【００４６】
アンチセンス技術は、細胞内部に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を必然的に伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明の２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＨ３８０８７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原子に置換される。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫酸転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）（これらの開示は、本明細書中で参考として完全に援用される）を参照のこと。
【００４７】
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２ゲノムもしくは対応するｍＲＮＡ、またはＨ３８０８７ゲノムもしくは対応するｍＲＮＡの、最初の１００Ｎ末端コドンまたは最後の１００Ｃ末端コドンに相補的であり、そしてこれらのコドンと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全なコンプリメンタリティー（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）は必要ではないが、高い程度のコンプリメンタリティーが好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはＨ３８０８７ ｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてタンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを不可能にする。好ましくは、本発明の２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはＨ３８０８７ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０ｍｅｒフラグメントである。必要に応じて、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７の、最初の１０のＮ末端コドンおよび最後の１０のＣ末端コドンにおける領域に相補的な３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７発現の阻害において、リボザイムを利用するように改変される。Ｌ．Ａ．ＣｏｕｔｕｒｅおよびＤ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １２：５１０−５１５（１９９６）。
【００４８】
本発明のこの局面のさらなる特異的な実施形態は、プライマーおよびプライマーペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素のような）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーが、サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドまたはＨ３８０８７ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得、そして２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはＨ３８０８７タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用され得る。
【００４９】
このようなプローブの例としては、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるヒト２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチド、あるいは図７Ａ〜７Ｄ（配列番号６）に示されるヒトＨ３８０８７ ｃＤＮＡ配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチドが挙げられる。２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはＨ３８０８７ ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーペアの例はまた、続く実施例において記載される。当業者に理解されるように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはＨ３８０８７ ｍＲＮＡを、有効に増幅および／または検出するために使用され得る。
【００５０】
本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子またはＨ３８０８７遺伝子ではない遺伝子に、対応するかまたは相補的である汚染物質ポリヌクレオチド、あるいは２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物もしくはそのフラグメントまたはＨ３８０８７遺伝子産物もしくはそのフラグメントではないポリペプチドをコードする汚染物質ポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離された」と言われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離された２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドまたは単離されたＨ３８０８７ポリヌクレオチドを獲得し得る。
【００５１】
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７ポリヌクレオチドは、種々の目的に有用である。この目的としては、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子、ｍＲＮＡまたはそのフラグメント、あるいはＨ３８０８７遺伝子、ｍＲＮＡまたはそのフラグメントの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使用；前立腺癌および他の癌の、診断および／または予後のための試薬としての使用；２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドまたはＨ３８０８７ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としての使用；２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子もしくはＨ３８０８７遺伝子の発現および／または２４Ｐ４Ｃ１２転写物もしくはＨ３８０８７転写物の翻訳を、調節または阻害するための手段としての使用；ならびに治療薬としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
（２４Ｐ４Ｃ１２をコードする核酸分子の単離およびＨ３８０８７をコードする核酸分子の単離）
本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列およびＨ３８０８７ ｃＤＮＡ配列は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物またはＨ３８０８７遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７の遺伝子産物ホモログ、選択的にスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物またはＨ３８０８７遺伝子産物の変異体形態をコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子またはＨ３８０８７遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するために利用され得る種々の分子クローニング方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニング系を使用して慣用的に利用され得る（例えば、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子ｃＤＮＡまたはＨ３８０８７遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された２４Ｐ４Ｃ１２ｃＤＮＡまたはそのフラグメント、あるいは標識されたＨ３８０８７ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて調べることにより同定され得る。例えば、一つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２ｃＤＮＡ（図１Ａ〜１Ｄ；配列番号１）またはその一部分が、合成され、そしてプローブとして使用されて、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子に対応する重複するｃＤＮＡおよび２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを回収し得る。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子自体は、２４Ｐ４Ｃ１２ＤＮＡプローブまたはプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などをスクリーニングすることによって単離され得る。
【００５３】
（組換えＤＮＡ分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これには、当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに種々のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれるが、これらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。このような分子を生成するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと）。
【００５４】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において２４Ｐ４Ｃ１２および／またはＨ３８０８７ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス感染可能細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞）））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬｎＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＡＰＣ４、ＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクト可能であるかまたは形質導入可能な前立腺細胞株）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７のコード配列を含むポリヌクレオチドを使用し、当該分野で慣用的に使用され、そして広く知られたかなり多数の宿主−ベクター系を用いて、２４Ｐ４Ｃ１２もしくはＨ３８０８７タンパク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
【００５５】
２４Ｐ４Ｃ１２およびＨ３８０８７タンパク質またはそれらのフラグメントの発現に適切な広範な種々の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（全出）を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現ベクターを使用して、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７は、好ましくは、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ３、ＬＮＣａＰおよびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現させ得る。本発明の宿主−ベクター系は、２４Ｐ４Ｃ１２もしくはＨ３８０８７タンパク質またはそれらのフラグメントの産生のために有用である。このような宿主−ベクター系は、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７および２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７変異の機能的特性を研究するために使用され得る。
【００５６】
組換えヒト２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７タンパク質は、２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７をコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって産生され得る。実施例に記載した例示的な実施形態において、２９３Ｔ細胞は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、この２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、２９３Ｔ細胞において発現され、そして組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、標準的な精製方法（例えば、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用するアフィニティ精製）を使用して単離され得る。本明細書中の実施例において同様に記載される別の実施形態では、２４Ｐ４Ｃ１２コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ中にサブクローン化され、そして種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＰＣ３およびＬｎＣａＰ）に感染するために使用されて、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞株を確立する。当該分野において周知の種々の他の発現系もまた使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドをコードする発現構築物は、組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の分泌形態の産生のために使用され得る。
【００５７】
２４Ｐ４Ｃ１２もしくはＨ３８０８７遺伝子またはそれらのフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体の産生、および２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための方法において。２４Ｐ４Ｃ１２もしくはＨ３８０８７タンパク質またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断および予後アッセイにおいて、そして２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（前立腺の癌を含むが、これに限定されない）の管理における画像化方法において有用であり得る。このような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置する方法において使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７タンパク質の検出のために有用な種々の免疫学的アッセイが意図され、これには、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＦＬＩＦＡ）、免疫細胞学的方法などが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、標識され得、そして２４Ｐ４Ｃ１２またはＨ３８０８７発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として使用され得る（例えば、ラジオシンチグラフィ（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンを生成するにおいて特に有用であり得る。
【００５８】
（２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド）
本発明の別の局面は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質としては、本明細書中で特に同定されたタンパク質、ならびに以下に概説される方法に従って過度な実験を伴わずに単離／生成および特徴付けされ得る対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびホモログが挙げられる。異なる２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントの部分を組合せる融合タンパク質、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。このような２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、集合的に、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質、本発明のタンパク質、または２４Ｐ４Ｃ１２という。本明細書中で使用される場合、用語「２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド」は、少なくとも１０個のアミノ酸（好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸）のポリペプチドフラグメントまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質をいう。
【００５９】
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるようなヒト２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるようなヒト２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸配列において変更を有する改変体ポリペプチドを含む。
【００６０】
一般的に、ヒト２４Ｐ４Ｃ１２の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の同一性）を共有する。代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、または２４Ｐ４Ｃ１２ホモログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を含む。２４Ｐ４Ｃ１２対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定の２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、この配列とは根本的な背反（例えば、非保存的置換、短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。
【００６１】
保存的アミノ酸置換はしばしば、タンパク質のコンフォメーションも機能も変更することなく、タンパク質中で作製され得る。このような変化としては、以下が挙げられる：任意のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）の、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸についての置換；グルタミン酸（Ｅ）に対するアスパラギン酸（Ｄ）、およびその逆の置換；アスパラギン（Ｎ）に対するグルタミン（Ｑ）、およびその逆の置換；ならびに、スレオニン（Ｔ）に対するセリン（Ｓ）、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能であり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であり得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そしてこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置において、交換可能である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る。
【００６２】
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、広範な種々の当該分野で認められた２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の改変体（例えば、アミノ酸の挿入、欠失および置換を有するポリペプチド）を含む。２４Ｐ４Ｃ１２改変体は、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）、およびＰＣＲ変異誘発）を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８７）］、カセット式変異誘発［Ｗｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）］、制限選択的変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）］または他の公知技術を、クローン化されたＤＮＡにおいて実施し、２４Ｐ４Ｃ１２改変体ＤＮＡを産生し得る。走査型アミノ酸分析もまた、連続配列に沿って１以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。とりわけ好ましい走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンが、代表的に、この群の中で好ましい走査アミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素を越えてβ鎖を排除し、そして改変体の主鎖コンフォメーションを変更する可能性が低いからである。アラニンが、代表的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、埋没位置および露出位置の両方において、頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、ＮＹ）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合には、同配体アミノ酸が使用され得る。
【００６３】
上記で考察したように、特許請求された本発明の実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の７１０未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、以下が挙げられる：図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸１個〜約アミノ酸１０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸２０個〜約アミノ酸３０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸３０個〜約アミノ酸４０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸４０個〜約アミノ酸５０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸５０個〜約アミノ酸６０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸６０個〜約アミノ酸７０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸７０個〜約アミノ酸８０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸８０個〜約アミノ酸９０個からなるポリペプチド、および図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸９０個〜約アミノ酸１００個からなるポリペプチドなど。このスキームに従って、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸１００〜７１０のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドが、本発明の代表的な実施形態である。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のより大きな部分からなるポリペプチドもまた意図される。例えば、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸１（または、２０もしくは３０もしくは４０など）個〜約アミノ酸２０（または、３０もしくは４０もしくは５０など）個からなるポリペプチドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。
【００６４】
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、図１Ａ（配列番号２）に示されるような２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドである。１つの実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される１以上の膜貫通領域、またはＨ３８０８７、ＮＧ２２もしくはＣＥＥＳＢ８２Ｆに対して相同性を示す２４Ｐ４Ｃ１２の１以上の領域を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基２９〜３２（図１Ａに示される最初のアミノ酸残基から番号付ける）でＮＲＳＣ（配列番号８）、残基６９〜７２におけるＮＳＴＧ（配列番号９）、残基１５５〜１５８におけるＮＭＴＶ（配列番号１０）、残基１９７〜２００におけるＮＤＴＴ（配列番号１１）、残基２９８〜３０１におけるＮＬＳＡ（配列番号１２）、残基３９３〜３９６におけるＮＩＳＳ（配列番号１３）、残基４０５〜４０８におけるＮＴＳＣ（配列番号１４）、残基４１６〜４１９におけるＮＳＳＣ（配列番号１５）、および／または残基６７８〜６８１におけるＮＧＳＬ（配列番号１６）のような１以上の２４Ｐ４Ｃ１２ Ｎ−グリコシル化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基２２〜２４におけるＳＦＲ、残基２１８〜２２０におけるＳＶＫ、残基４３０〜４３２におけるＳＳＫ、残基４９４〜４９６におけるＴＬＲ、残基５７３〜５７５におけるＳＡＫ、および／または残基６１９〜６２１におけるＳＧＲのような１以上の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質キナーゼＣリン酸化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基３１〜３４でＳＣＴＤ（配列番号１７）、残基１０２〜１０５におけるＳＶＡＥ（配列番号１８）、残基１１９〜１２２におけるＳＣＰＥ（配列番号１９）、残基１３５〜１３８におけるＴＶＧＥ（配列番号２０）、および／または残基３０４〜３０７におけるＳＶＱＥ（配列番号２１）のような１以上の２４Ｐ４Ｃ１２カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基６〜１３におけるＲＤＥＤＤＥＡＹ（配列番号２２）のような１以上のチロシンキナーゼリン酸化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基７２〜７７におけるＧＡＹＣＧＭ（配列番号２３）、残基７６〜８１におけるＧＭＧＥＮＫ（配列番号２４）、残基１５１〜１５６におけるＧＶＰＷＮＭ（配列番号２５）、残基２０７〜２１２におけるＧＬＩＤＳＬ（配列番号２６）、残基２７２〜２７７におけるＧＩＹＹＣＷ（配列番号２７）、残基２８７〜２９２におけるＧＡＳＩＳＱ（配列番号２８）、残基３７９〜３５４におけるＧＱＭＭＳＴ（配列番号２９）、残基４４９〜４５４におけるＧＬＦＷＴＬ（配列番号３０）および／または残基４６７〜４７２におけるＧＡＦＡＳＦ（配列番号３１）のような１以上のＮ−ミリストイル化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基６９５〜６９８におけるＬＧＫＫ（配列番号３２）のような１以上のアミド化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基２４��〜２６６におけるＬＦＩＬＬＬＲＬＶＡＧＰＬＶＬＶＩＬＧＶＬ（配列番号３３）のようなロイシンジッパーパターンを含み得る。これらの本発明の関連した実施形態としては、上記で考察された異なるモチーフの組合せを含むポリペプチドが挙げられ、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフまたは介在配列のいずれにも、挿入も欠失も置換も含んでいないポリペプチドである。
【００６５】
本発明のなお別の実施形態において、代表的なポリペプチドは、１以上の２４Ｐ４Ｃ１２の選択的スプライシング改変体に対して固有のアミノ酸配列を含み得る。２４Ｐ４Ｃ１２の選択的スプライシング改変体のモニタリングは、有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシング改変体における変化は、癌の進行を導く一連の事象における１つの工程として示唆されているからである（例えば、Ｃａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５（２５０：３０５９−３０６５（１９９７）を参照のこと）。結果として、２４Ｐ４Ｃ１２の選択的スプライシング改変体のモニタリングは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における摂動に関連する症候群（例えば、癌）を評価するためのさらなる手段を提供する。
【００６６】
上記で議論された１以上の２４Ｐ４Ｃ１２モチーフからなるポリペプチドは、この上記で議論された２４Ｐ４Ｃ１２モチーフが増殖調節不全に関連するという観察の観点から、そして２４Ｐ４Ｃ１２が癌において過剰発現されるので（図５）、悪性疾患表現型の特異的特性の解明に有用である。例えば、カゼインキナーゼＩＩ、ならびにｃＡＭＰおよびｃＣＭＰ依存性タンパク質キナーゼは、悪性疾患表現型の発生に関連することが公知の酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．，７８（２）：１６５−１７４（１９９８）；Ｇａｉｄｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（１０）：４３３１−４３３８（１９９５）、およびＨａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２４（６）：１１１９−１１２６（１９９６）を参照のこと）。さらに、グリコシル化およびミリスチル化の両方は、癌および癌進行にまた関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３（１）：２１−３４（１９９９）；Ｒａｊｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４（１９９７）を参照のこと）。
【００６７】
前述の段落のポリペプチドは、多くの異なる特異的用途を有する。２４Ｐ４Ｃ１２は、前立腺癌において高度に発現されることが示されるので（図２Ａ、３Ｃ、５、６）、これらのポリペプチドは、正常組織 対 癌性組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を評価するための方法、および悪性疾患表現型を解明するための方法において使用され得る。代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域をコードするポリペプチドは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の特定の領域（例えば、膜貫通ドメインを含む領域）における摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用され得る。例示的アッセイは、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを標的化する抗体を利用して、正常組織 対 癌性組織における、この領域の特性を解明し得る。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドは、２４Ｐ４Ｃ１２のこの領域と相互作用する因子をスクリーニングするために使用され得る。
【００６８】
上記で議論されたように、遺伝コードにおける縮重は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子配列における変更を可能にする。特に、当業者は、特定の宿主種に好ましい特定のコドンを認識し、そして所望の宿主に好ましいように、開示された配列を適応させ得る。例えば、好ましいコドン配列は、代表的に、希少コドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において、約２０％未満の使用頻度を有するコドン）が、高頻度のコドンで置換されている。特定の生物についてのコドンの好ましさは、例えば、以下のアドレスの、ＩＮＴＥＲＮＥＴ上で利用可能なコドン使用表を利用することによって算出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｌｍ。約２０％未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって、特定の宿主種について最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「コドン最適化配列」といわれる。
【００６９】
さらなる配列改変が、細胞宿主におけるタンパク質発現を増強するのに公知である。これらとしては、偽性のポリアデニル化シグナル、エキソン／イントロンスプライシング部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、および／または遺伝子発現に有害であり得る、他のこのような、よく特徴付けられた配列の排除が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所定の細胞宿主について、その宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照して算出されるように、平均レベルに調整され得る。可能な場合、この配列はまた、予測されるヘアピンｍＲＮＡ二次構造を回避するように改変され得る。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載のように、オープンリーディングフレームの開始部位での、翻訳開始コンセンサス配列の付加が挙げられる。コドン最適化に加えて、偽性のポリアデニル化配列の排除、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの排除、トランスポゾン様反復の排除、および／またはＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種における発現を最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で、「発現増強配列」と呼ばれる。
【００７０】
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離された形態で具体化され得る。本明細書中で使用される場合、物理的方法、機械的方法または化学的方法を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に通常関連する細胞成分からこの２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を取り出した場合に、タンパク質が「単離された」といわれる、当業者は、標準的な精製方法を容易に使用して、単離された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を獲得し得る。精製された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質分子は、２４Ｐ４Ｃ１２の抗体または他のリガンドへの結合を損なう、他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の実施形態として、精製された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質、および機能的な可溶性２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質が挙げられる。１つの形態において、このような機能的な可溶性２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドを結合する能力を保持する。
【００７１】
本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント（例えば、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるような２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸配列の部分に対応するポリペプチド）を含む、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを提供する。本発明のこのようなポリペプチドは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特性（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に関連するエピトープを特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力）を示す。
【００７２】
２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒト２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、当該分野において周知の、標準的なペプチド合成技術または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、組換え方法を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を生成し得る、この点において、本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２コード核酸分子は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の規定のフラグメントを生成するために手段を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドは、ドメイン特異的抗体（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の細胞外エピトープおよび細胞内エピトープを認識する抗体）の生成および特徴付け、２４Ｐ４Ｃ１２またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子の同定、および種々の治療状況（癌ワクチンを含むが、これらに限定されない）において、特に有用である。
【００７３】
特定の興味深い構造を含む２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドは、例えば、以下：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を含む、当該分野で周知の種々の分析技術を使用するか、または免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の生成、または２４Ｐ４Ｃ１２に結合する細胞因子の同定において、特に有用である。
【００７４】
以下の実施例に記載される実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２は、市販の発現ベクター（例えば、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを含む、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするＣＭＶ駆動発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｍｖｉｔｒｏｇｅｎ））でトランスフェクトされた細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）において、簡便に発現され得る。細胞において発現されたＨＩＳタグ化２４Ｐ４Ｃ１２は、標準的な技術を使用して、ニッケルカラムを使用して精製され得る。
【００７５】
２４Ｐ４Ｃ１２の改変（例えば、共有結合性改変）は、本発明の範囲内に含まれる。１つの型の共有結合性改変としては、２４Ｐ４Ｃ１２の選択された側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤での、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内の２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの別の型の共有結合性改変としては、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの変更が挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目的に含まれ、ネイティブ配列２４Ｐ４Ｃ１２に見い出される１以上の炭水化物部分の欠失（基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および／または酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって）、および／またはネイティブ配列２４Ｐ４Ｃ１２に存在しない、１以上のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。２４Ｐ４Ｃ１２の別の型の共有結合性改変としては、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるような様式の、種々の非タンパク質様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つへの、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの連結が挙げられる。
【００７６】
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された２４Ｐ４Ｃ１２を含むキメラ分子を形成する様式で、改変され得る。１つの実施形態において、このようなキメラ分子としては、ポリヒスチジンエピトープタグを有する２４Ｐ４Ｃ１２の融合体が挙げられ、このタグは、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。このエピトープタグは、一般に、２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は、２４Ｐ４Ｃ１２の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも呼ばれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態での置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日公布）もまた参照のこと。
【００７７】
（Ｈ３８０８７ポリペプチド）
本発明の別の局面は、Ｈ３８０８７タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のＨ３８０８７タンパク質としては、本明細書中で特異的に同定されたＨ３８０８７タンパク質、ならびに本明細書中に概略される方法に従って過度の実験を伴わずに、単離／生成および特徴付けされ得る、対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびホモログが挙げられる。異なるＨ３８０８７タンパク質またはそのフラグメントの部分を組み合わせた融合タンパク質、ならびにＨ３８０８７タンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質もまた、含まれる。このようなＨ３８０８７タンパク質をまとめて、Ｈ３８０８７タンパク質またはＨ３８０８７と称する。本明細書中で使用される場合、用語「Ｈ３８０８７ポリペプチド」とは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは、少なくとも１５アミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたはＨ３８０８７タンパク質をいう。
【００７８】
上記で議論されたように、本発明の実施形態は、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の７０４アミノ酸の配列未満を含むポリペプチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸１〜約アミノ酸１０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸２０〜約アミノ酸３０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸３０〜約アミノ酸４０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸４０〜約アミノ酸５０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸６０〜約アミノ酸７０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸７０〜約アミノ酸８０からなるポリペプチド、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸８０〜約アミノ酸９０からなるポリペプチド、および図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸９０〜約アミノ酸１００からなるポリペプチドなど、を含む。このスキームに従って、Ｈ３８０８７タンパク質のアミノ酸１００〜７１０のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドは、本発明の代表的な実施形態である。Ｈ３８０８７タンパク質のより大きい部分からなるポリペプチドもまた、意図される。例えば、図７Ａ〜７Ｄ（配列番号７）に示されるＨ３８０８７タンパク質の約アミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）〜約アミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）からなるポリペプチドが、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。
【００７９】
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的実施形態としては、図７（配列番号７）に示されるようなＨ３８０８７ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＨ３８０８７ポリペプチドが挙げられる。１つの実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、図７Ａ〜７Ｄに示される１以上の膜貫通領域、または２４Ｐ４Ｃ１２、ＮＧ２２ ＯＲ ＣＥＥＳＢ８２Ｆに対して相同性を示すＨ３８０８７の１以上の領域を含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、１以上のＨ３８０８７のＮグリコシル化部位（例えば、残基１８５〜１８８（番号は、図７に示されるアミノ酸残基の最初のアミノ酸からの番号）のＮＥＴＴ（配列番号４６）、残基１９８〜２０１のＮＩＴＤ（配列番号４７）、および／または残基６９５〜６９８のＮＫＴＮ（配列番号４８））を含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、１以上のＨ３８０８７タンパク質キナーゼＣリン酸化部位（例えば、残基１９〜２１のＴＦＫ、残基１２６〜１２８のＳＳＲ、残基１９５〜１９７のＳＲＫ、残基４０２〜４０４のＴＡＫ、残基５７４〜５７６のＳＡＲ、残基６２０〜６２２のＴＨＲ、残基６８９〜６９１のＴＬＫ、および／または残基６９７〜６９９のＴＮＫ）を含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、１以上のＨ３８０８７カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、残基５４〜５７のＴＨＧＤ（配列番号４９）、残基６７〜７０のＳＲＧＥ（配列番号５０）、残基７７〜８０のＴＫＮＥ（配列番号５１）、残基１２６〜１２９のＳＳＲＤ（配列番号５２）、残基１８７〜１９０のＴＴＹＥ（配列番号５３）、残基１８８〜１９１のＴＹＥＤ（配列番号５４）、残基２９３〜２９６のＳＬＶＤ（配列番号５５）、残基３２１〜２３４のＳＩＬＥ（配列番号５６）、残基３８５〜３８８のＴＳＮＥ（配列番号５７）、および／または残基４１３〜４１６のＳＳＨＥ（配列番号５８））を含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、１以上のチロシンキナーゼリン酸化部位（例えば、残基１２５〜１３３のＲＳＳＲＤＦＥＹＹ（配列番号５９））を含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、１以上のＮミリスチル化部位（例えば、残基７３〜７８のＧＱＫＧＴＫ（配列番号６０）、残基１８４〜１８９のＧＮＥＴＴＹ（配列番号６１）、残基１９４〜１９９のＧＳＲＫＮＩ（配列番号６２）、残基２０５〜２１０のＧＡＫＫＡＮ（配列番号６３）、残基２１１〜２１６のＧＶＬＥＡＲ（配列番号６４）、残基２３６〜２４１のＧＬＶＩＡＭ（配列番号６５）、残基２７３〜２７８のＧＩＦＨＣＹ（配列番号６６）、残基２８９〜２９４のＧＳＤＶＳＬ（配列番号６７）、残基４３１〜４３６のＧＧＥＳＧＹ（配列番号６８）、残基４６８〜４７３のＧＡＦＡＳＹ（配列番号６９）、および／または残基５６８〜５７３のＧＴＮＦＣＴ（配列番号７０））を含み得る。これらの発明に関連する実施形態は、上記で議論された異なるモチーフの組み合わせを含むポリペプチドを含み、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフまたは介在配列のいずれかの内で、挿入、���失または置換を含まないポリペプチドである。
【００８０】
本発明のＨ３８０８７ポリペプチドは、当業者に公知かつ明らかなように、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドについての上記の様式と類似の様式で、改変、生成および使用され得る。
【００８１】
（２４Ｐ４Ｃ１２抗体）
用語「抗体」は、広い意味で使用され、そして特に、単一の抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）、およびポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特性を有する抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体組成物を含む。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、個々の集団を含む抗体は、少量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いて、同一である）から得られた抗体をいう。
【００８２】
本発明の別の局面は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に特異的に結合し、そして非２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびポリペプチドに結合しない（または、弱く結合する）。特に意図される抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１以上の相補性決定領域を含むフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域（すなわち、抗原結合領域）の少なくとも一部として定義される。
【００８３】
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、前立腺癌の診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに画像化方法において特に有用であり得る。細胞内発現された抗体（例えば、単鎖抗体）は、２４Ｐ４Ｃ１２の発現が関連する癌（例えば、進行性および転移性の前立腺癌）の処置に治療的に有用であり得る。毒素または治療分子の送達のために、２４Ｐ４Ｃ１２機能に干渉するか、または２４Ｐ４Ｃ１２の細胞外領域を標的化する、全身投与された２４Ｐ４Ｃ１２抗体もまた、前立腺癌の処置のための治療方法において有用である。このような毒素または治療分子の送達は、２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはそのフラグメントに対して第２の分子を結合体化させる公知の方法を使用して、達成され得る。同様に、このような抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２が他の型の癌でもまた発現または過剰発現される限り、他の癌の処置、診断および／または予後に有用であり得る。
【００８４】
本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２および変異体２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質およびポリペプチドの、検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、一般に、適切には、２４Ｐ４Ｃ１２または変異体２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を認識および結合し得る、１以上の２４Ｐ４Ｃ１２抗体を含み、そして、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）など。さらに、前立腺癌および２４Ｐ４Ｃ１２を発現する他の癌を検出し得る、免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらには、標識した２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用するラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌（例えば、前立腺癌）の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用であり得る。
【００８５】
２４Ｐ４Ｃ１２抗体はまた、２４Ｐ４Ｃ１２および変異体２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質およびポリペプチドの精製、および２４Ｐ４Ｃ１２ホモログおよび関連分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を精製する方法は、２４Ｐ４Ｃ１２抗体（これは、固体マトリックスに結合されている）を、２４Ｐ４Ｃ１２を含有する溶解物または他の溶液と共に、この２４Ｐ４Ｃ１２抗体が２４Ｐ４Ｃ１２に結合するのを可能にする条件下でインキュベートする工程；固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程；および２４Ｐ４Ｃ１２をその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発明の２４Ｐ４Ｃ１２抗体の他の用途としては、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の生成が挙げられる。
【００８６】
抗体の調製のための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、単離または免疫結合体化された形態の、２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質、ペプチドまたはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ編、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、２４Ｐ４Ｃ１２の融合タンパク質（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ＧＳＴ融合タンパク質）もまた使用され得る。特定の実施形態において、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）のオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全てまたはほとんどを含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され得、そして適切な抗体を生成するための免疫原として使用され得る。別の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドが合成され得、そして免疫原として使用され得る。
【００８７】
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術を（精製２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を伴い、または伴わずに）使用して、そのコードされる免疫原に対する免疫応答を生成し得る（概要については、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
【００８８】
図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるような２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸配列を使用して、抗体を生成するために２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２構造の疎水性領域を同定し得る。免疫原性構造を示す２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方法を使用して容易に同定され得る：：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析。２４Ｐ４Ｃ１２抗体の生成のための方法はさらに、本明細書中に提供される実施例によって例示される。
【００８９】
免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法、およびキャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とのタンパク質の免疫結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体化が使用され得；他の例において、連結試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される連結試薬）が、効果的であり得る。２４Ｐ４Ｃ１２免疫原の投与は一般に、当該分野で一般に理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を伴う注射によって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能力（ａｄｅｑｕａｃｙ）を決定することによって理解され得る。
【００９０】
ポリクローナル２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、当該分野で公知の従来技術を使用して調製され得る。このような抗体の調製のための代表的プロトコルは、以下の実施例に記載される。ポリクローナル抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２に関連する複数のエピトープの高感度の検出に有用であり得る。
【００９１】
２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一般に公知のように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または産生性（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）Ｂ細胞を不死化する改変を使用して調製され得る。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原が２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２フラグメントである免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が同定された場合、これらの細胞を拡大し、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
【００９２】
抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用する、組換え手順によって産生され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体またはＣＤＲ移植化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはヒト２４Ｐ４Ｃ１２抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック法が挙げられる（概要について、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照のこと）。
【００９３】
完全なヒト２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒト２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体はまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年１２月３日提出）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【００９４】
２４Ｐ４Ｃ１２抗体の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質との反応性は、適切には、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質、２４Ｐ４Ｃ１２ペプチド、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞またはその抽出物を使用する、多くの周知の手段（ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含む）によって確証され得る。
【００９５】
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第２の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。２４Ｐ４Ｃ１２抗体への結合体化のための第２の分子は、意図される用途に従って選択され得る。例えば、治療的用途のために、第２の分子は、毒素または治療薬剤であり得る。さらに、２以上の２４Ｐ４Ｃ１２エピトープに特異的な二特異的抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して生成され得る。ホモダイマー性の抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって生成され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
【００９６】
（Ｈ３８０８７抗体）
本発明はまた、Ｈ３８０８７に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）を提供する。これらの抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２抗体について上記に記載された様式と類似の様式で、改変、生成および使用され得る。Ｈ３８０８７の遍在性の発現は、２４Ｐ４Ｃ１２特異的治療剤を試験するコントロールとして、および潜在的に２４Ｐ４Ｃ１２診断適用における比較のために、Ｈ３８０８７を有用なものとする。Ｈ３８０８７機能に影響を及ぼす２４Ｐ４Ｃ１２特異的治療剤は、正常細胞に対して毒性であり得る。しかし、２４Ｐ４Ｃ１２に選択的に影響を及ぼし、Ｈ３８０８７には影響しない治療剤は、正常細胞に対してほとんど毒性がないかもしれない。従って、Ｈ３８０８７タンパク質および抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２に対する治療様式についての前臨床試験ツールとして有用であり得る。
【００９７】
（２４Ｐ４Ｃ１２トランスジェニック動物）
２４Ｐ４Ｃ１２またはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得、これらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に、または出生前（例えば、胚段階）でその動物の祖先に導入される。導入遺伝子は、細胞のゲノム内に組み込まれるＤＮＡであり、トランスジェニック動物は、その細胞から発生する。１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡが、確立された技術に従って、２４Ｐ４Ｃ１２コードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得、そしてそのゲノム配列は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を生成するための方法は、当該分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および４，８７０，００９号に記載される。代表的に、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーと共に２４Ｐ４Ｃ１２導入遺伝子の組み込みのために標的化される。胚段階の動物の生殖系列に導入された、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするＤＮＡの発現の増大の効果を試験し得る。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御を付与することが考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明のこの局面に従って、動物をその試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有する処置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病理学的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
【００９８】
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２の非ヒトホモログを使用して、２４Ｐ４Ｃ１２「ノックアウト」動物を構築し得、この動物は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする内因性遺伝子とその動物の胚細胞に導入された２４Ｐ４Ｃ１２をコードする改変ゲノムＤＮＡと間の相同組換えの結果として、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする欠損性または改変型遺伝子を有する。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡを使用して、確立された技術に従って、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするゲノムＤＮＡをクローニングし得る。２４Ｐ４Ｃ１２をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的に、数キロベースの変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、そのベクターに含まれる［相同組換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えした細胞が、選択される［例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照のこと］。次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に導入し、凝集キメラを形成させる［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、１１３−１５２頁を参照のこと］。次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そしてその胚は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種し得る。ノックアウト動物は、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの非存在に起因する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生について、特徴付けられ得る。
【００９９】
同様に、Ｈ３８０８７トランスジェニック動物が、Ｈ３８０８７をコードする核酸を使用して調製され得る。
【０１００】
（２４Ｐ４Ｃ１２の検出のための方法）
本発明の別の局面は、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびその改変体を検出するための方法、および２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を同定するための方法に関する。２４Ｐ４Ｃ１２は、前立腺癌のリンパ節転移および骨転移に由来するＬＡＰＣ異種移植片において発現されるようであり、そして２４Ｐ４Ｃ１２の発現プロフィールは、それを転移された疾患についての潜在的な診断マーカーにする。この状況において、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態は、進行した状態の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の凝集性を含む、種々の因子を予測するために有用な情報を提供し得る。以下で詳細に議論されるように、患者サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態は、以下を含む周知の種々のプロトコルによって分析され得る：免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーションを含む種々のノーザンブロット技術、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小分析サンプルに対して）、ウエスタンブロット分析および組織アレイ分析。
【０１０１】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中の２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドとしては、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子またはそのフラグメント、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、選択的スプライシング改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、および２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が挙げられる。２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを増幅し、そして／または２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を検出するための多くの方法は、当該分野において周知であり、そして本発明のこの局面の実施に用いられ得る。
【０１０２】
１つの実施形態において、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを産生する工程；その中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを使用して、そのように産生されたｃＤＮＡを増幅する工程；および増幅された２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、増幅された２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。別の実施形態において、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を検出する方法は、サンプルからゲノムＤＮＡを最初に単離する工程；その中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを使用して単離されたゲノムＤＮＡを増幅する工程；および増幅された２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。任意の多くの適切なセンスプローブおよびアンチセンスプローブの組合せが、２４Ｐ４Ｃ１２について提供されるヌクレオチド配列（図１Ａ〜１Ｄ；配列番号１）から設計され、そしてこの目的のために使用され得る。
【０１０３】
本発明はまた、組織または他の生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺、および他の組織、尿、細胞調製物など）中の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、１つの実施形態において、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在を検出する方法は、２４Ｐ４Ｃ１２抗体、その２４Ｐ４Ｃ１２反応性フラグメント、または２４Ｐ４Ｃ１２抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と、サンプルとを最初に接触させる工程；ならびに次いで、それに対するサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
【０１０４】
２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を同定するための方法もまた、提供される。１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの存在を検出するための工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識された２４Ｐ４Ｃ１２リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連技術）ならびに種々の核酸増幅アッセイ（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２に特異的な相補プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどの他の増幅型検出方法）が挙げられる。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の２４Ｐ４Ｃ１２Ｓタンパク質または細胞によって分泌された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質を検出するための種々の方法が、当該分野において周知であり、そして２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞の検出のために用いられ得る。
【０１０５】
２４Ｐ４Ｃ１２発現分析はまた、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現を調節する薬剤を同定かつ評価するためにツールとして有用であり得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２発現は、前立腺癌で有意に上方制御され、そしてまた、他の癌において発現され得る。癌細胞での２４Ｐ４Ｃ１２発現または過剰発現を阻害し得る分子または生物学的薬剤の同定は、治療上の価値があり得る。このような薬剤は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合によって２４Ｐ４Ｃ１２発現を定量するスクリーニングを使用して、同定され得る。
【０１０６】
（２４Ｐ４Ｃ１２およびその産物の状態のモニタリング）
個体における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍潜在性に関する情報を提供し得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡは、正常組織に比べて前立腺癌においてかなり多く発現されるので、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質の相対レベルを評価するアッセイは、２４Ｐ４Ｃ１２調節不全と関連する疾患（例えば、癌）を診断するために使用され得、そして適切な治療オプションを規定するに有用である予後情報を提供し得る。同様に、生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ配列の完全性を評価するアッセイもまた、この状況において使用され得る。
【０１０７】
２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡが前立腺癌においてかなり多く発現され、そして正常組織においてかなり多く発現されないという知見は、この遺伝子が細胞増殖の調節不全に関連するという証拠を提供し、それによってこの遺伝子およびその産物を、当業者が２４Ｐ４Ｃ１２調節不全に関連する疾患を有することが疑われる個体由来の生物学的サンプルを評価するために使用し得る標的として同定する。この状況において、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子およびその産物の発現状態の評価は、組織サンプルに潜在的な疾患に関する情報を得るために使用され得る。この状況における用語「発現状態」は、遺伝子およびその産物の発現、機能および調節（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、発現された遺伝子産物（例えば、核酸およびアミノ酸配列）の完全性、ならびにこれらの分子に対する転写改変および翻訳改変）に関与する種々の因子を広範にいうために使用される。
【０１０８】
２４Ｐ４Ｃ１２の発現状態は、特定の疾患の状態、進行および／または腫瘍攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２発現状態を決定し、そして２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌（例えば、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、骨癌、結腸癌、膵臓癌、精巣癌、頚部癌および卵巣癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。特定のサンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２発現状態は、当該分野で周知の多数の手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉マイクロ精査（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｓｓｅｃｔｅｄ）サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析が挙げられるがこれらに限定されない）によって分析され得る。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および遺伝子産物の発現状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ ２［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，４［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，１５［Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ］および１８［ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ］，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら（編）（１９９５）に見出され得る。
【０１０９】
１つの局面において、本発明は、細胞増殖の調節不全と関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現される２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を決定して、次いでそのように決定された状態を、対応する正常サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態に対して比較することによって２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をモニターための方法であって、正常サンプルと比較して試験サンプルにおける異常な２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の存在は、この個体の細胞において細胞増殖の調節不全の存在を指標を提供する、方法を提供する。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルと比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する。これらの組織における２４Ｐ４Ｃ１２の有意な発現の存在は、癌の発生、存在および／または重篤度を示すために有用であり得る。
【０１１１】
関連する実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２発現状態は、核酸レベルではなくタンパク質レベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現される２４Ｐ４Ｃ１２のレベルに対して比較する工程を包含する。１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して評価される。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質発現を検出し得る２４Ｐ４Ｃ１２抗体または結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ形式において使用され得る。
【０１１２】
他の関連する局面において、これらの分子の構造における混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク質で観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｇｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９〜３７８（１９９９）を参照のこと）。この状況において、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で議論されるノーザン、サザン、ウエスタン、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定プロトコルによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９５２，１７０号を参照のこと）。
【０１１３】
別の関連する実施形態において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルに対して、試験細胞サンプルまたは組織サンプル中に発現される２４Ｐ４Ｃ１２選択的スプライシング改変体における有意な変化を検出する工程を包含する。２４Ｐ４Ｃ１２選択的スプライシング改変体のモニタリングは、有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシングの変化は、癌の進行を引き起こす一連の事象における１つの段階として示唆されるからである（例えば、Ｇａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５（２５０：３０５９〜３０６５（１９９７）を参照のこと）。
【０１１４】
遺伝子増幅は、２４Ｐ４Ｃ１２の状態を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子増幅は、サンプルにおいて、例えば、本明細書中に提供される配列に基づいて、適切な標識プローブを使用して、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１〜５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって直接的に測定され得る。あるいは、特定の二重鎖（例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が、用いられ得る。次いで、この抗体が、標識され得、そしてアッセイ（ここで二重鎖が表面に結合され、その結果、この表面上での二重鎖の形成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る）が、行われ得る。
【０１１５】
上記で議論される組織に加えて、末梢血が、２４Ｐ４Ｃ１２発現を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを使用して、癌細胞（前立腺癌を含むがこれに限定されない）の存在について従来通りにアッセイされ得る。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅可能な２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用について現在評価されている。前立腺癌の分野において、これらは、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３〜３８４：Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５〜２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７〜１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。
【０１１６】
本発明の関連する局面は、個体における癌の発症の感受性の推定に関する。１つの実施形態において、癌に対する感受性を推定するための方法は、組織サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を検出する工程であって、その存在が、癌に対する感受性を示し、ここで存在する２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現の程度が感受性の程度に比例する、工程を提供する。特定の実施形態において、前立腺組織中の２４Ｐ４Ｃ１２の存在が、試験され、ここでこのサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の存在は、前立腺癌の感受性（または前立腺腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここでサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における１以上の混乱の存在が、癌の感受性（または前立腺腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。
【０１１７】
本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍攻撃性を測定するための方法に関する。１つの実施形態において、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から採取された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中に発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで正常サンプルに対する腫瘍サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質発現の程度が、攻撃性の程度を示す、工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺腫瘍の攻撃性は、２４Ｐ４Ｃ１２が腫瘍細胞中に発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで１以上の混乱の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０１１８】
本発明のなお別の関連する局面は、個体の悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法に関する。１つの実施形態において、個体における悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から異なる時間に採取された等価な組織サンプル中に発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍サンプルにおける経時的な２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質発現の程度が、癌の進行に関する情報を提供する、工程を包含する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞における２４Ｐ４Ｃ１２発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、癌の進行を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで１以上の混乱の存在は、癌の進行を示す。
【０１１９】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施形態は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定する手段として、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現（または２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況において、悪性疾患に関連する広範な種々の因子（例えば、そうでなければ悪性疾患と関連する遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭ発現を含む））および肉眼的細胞学的観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら，Ａｎａｌ Ｑｕａｎｔ Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４〜８８（１９８４）；Ｅｐｔｓｅｉｎ，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ．１９９５年２月；２６（２）２２３〜９（１９９５）；Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．１９９８年１月；１１（６）：５４３〜５１；Ｂａｉｓｄｅｎら，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８〜２４（１９９９）を参照のこと）が、利用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現（または２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法が、有用である。なぜなら、例えば、一致する一連のまたは一群の特定の因子の存在は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定するために重要な情報を提供するからである。
【０１２０】
代表的な実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現（または２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法は、組織サンプルにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、組織サンプルにおいてＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現との一致を観察する工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺組織における２４Ｐ４Ｃ１２
ｍＲＮＡおよびＰＳＡ ｍＲＮＡの発現が、試験される。好ましい実施形態において、サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡ過剰発現との一致は、前立腺癌、前立腺癌感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在の指標を提供する。
【０１２１】
２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に開示され、そして標準的な核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術の使用が、当該分野において周知である。２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法としては、標識された２４Ｐ４Ｃ１２リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、２４Ｐ４Ｃ１２に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、ならびに他の増幅型検出方法（例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、以下の実施例に記載されるように、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現を検出および定量するために使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２を増幅し得る任意の数のプライマー（本明細書中に詳細に記載される種々のプライマーセットを含むがこれらに限定されない）が、この目的のために使用され得る。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態において、野生型２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
【０１２２】
（２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列により、当業者は、種々の当該分野で受け入れられるプロトコルのいずれか１つを通じて、この配列と相互作用する分子を同定し得る。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系（「ツーハイブリッドシステム」ともいわれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、相互作用する分子は、転写因子およびレポーター遺伝子の直接的な発現を再構成し、次いで、その発現をアッセイする。代表的な系は、真核生物転写アクチベーターの再構成を通じて、インビボでタンパク質間相互作用を同定し、そして例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５２３号、同第５，８４６，７２２号および同第６，００４，７４６号に開示されている。
【０１２３】
あるいは、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法において、選択されたレセプター分子（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２）に結合するペプチドが、アミノ酸の無作為または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。それによって、広範な種々の使用（例えば、治療用試薬または診断用試薬）を有するペプチドが、予期されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関する任意の予備情報を必要することなく同定され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７７３，７３１号に開示されている。
【０１２４】
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞株が、２４Ｐ４Ｃ１２によって媒介されるタンパク質間相互作用を同定するために使用され得る。この可能性は、他の研究者によって示されるような免疫沈降技術（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２６１：６４６〜５１）を使用して試験され得る。代表的には、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２を発現している前立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓタグに対する抗体が、（例えば、上記のベクターを使用して）２４Ｐ４Ｃ１２を発現するように操作された細胞株において使用され得る。免疫沈降した複合体は、ウエスタンブロッティング、タンパク質の35Ｓ−メチオニン標識、タンパク質微量配列決定、銀染色および２次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の結合に対して試験され得る。
【０１２５】
このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態としては、２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用する低分子を同定するための方法が挙げられる。代表的な方法は、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号に議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法が挙げられる。例示的な実施形態において、このハイブリッドリガンドは、細胞中に導入され、次いでこの細胞は、第１および第２の発現ベクターを含む。各発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結された標的タンパク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。各細胞は、レポーター遺伝子をさらに含み、その発現は、第１および第２のハイブリッドタンパク質の互いに対する近接性の条件下に置かれており、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合のみに、事象が生じる。レポーター遺伝子を発現するそれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が、同定される。
【０１２６】
本発明の代表的な実施形態は、図１Ａ〜１Ｄに示される２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法からなる。この方法は、分子集団と２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列とを接触させる工程、相互作用を促進する条件下で、分子集団と２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列とを相互作用させる工程、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子から２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用しない分子を分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触される。
【０１２７】
（治療方法および組成物）
２４Ｐ４Ｃ１２の前立腺腫瘍関連タンパク質としての同定は、このような癌の処置に対する多くの治療アプローチを開放する。上記で議論されるように、２４Ｐ４Ｃ１２は、増殖シグナルの活性化または調節に関与するレセプターとして機能し、そして治療のために標的とされ得る細胞表面上にエピトープを提示することが可能である。
【０１２８】
２４Ｐ４Ｃ１２の発現プロフィールは、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡを暗示し、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡは、黒色腫および他の癌にてアップレギュレートされる、組織特異的遺伝子である（Ｖａｎ ｄｅ ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｒｅｓ．２７：８１〜８６、１９９７）。癌におけるその組織特異的発現および高レベル発現に起因して、これらの分子は、癌ワクチンについての標的として現在調査されている（Ｄｕｒｒａｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ８：７２７〜７３３、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２：９７２〜９７６、１９９７）。２４Ｐ４Ｃ１２の発現パターンは、２４Ｐ４Ｃ１２が同様に、前立腺癌および他の癌に対する癌ワクチンアプローチのための潜在的標的であるという証拠を提供する。なぜなら、その発現が正常な組織に限定されるからである。潜在的レセプターとしてのその構造的特徴もまた、２４Ｐ４Ｃ１２が、低分子標的であり得ること、ならびに抗体に基づく治療ストラテジーのための標的であり得ることの証拠を提供する。
【０１２９】
従って、２４Ｐ４Ｃ１２の細胞外部分を標的とする治療アプローチまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチが、前立腺癌、精巣癌、および２４Ｐ４Ｃ１２を発現する他の癌に罹患する患者に有用であることが予期される。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチは、一般的に、２つの種類に分類される。１つの種類は、その結合パートナーまたは他のタンパク質との、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の結合または会合を阻害するための、種々の方法を包含する。別の種類は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の転写または２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、種々の方法を包含する。
【０１３０】
（抗体に基づく治療のための細胞表面標的としての２４Ｐ４Ｃ１２）
２４Ｐ４Ｃ１２の構造的特徴は、この分子がおそらく細胞表面抗原であることを示し、抗体に基づく治療ストラテジーのための魅力的な標的を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２は正常な細胞と比較して、癌細胞にて過剰発現されるので、２４Ｐ４Ｃ１２免疫反応性組成物の全身投与は、非標的器官および非標的組織へのその免疫治療分子の結合により引き起こされる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果が最小である、比較的良好な感受性を示すことが予期される。２４Ｐ４Ｃ１２の細胞外ドメインと特異的に反応性である抗体は、毒素または治療薬剤との結合体、あるいは細胞の増殖または機能を阻害し得る裸の抗体のいずれかとして、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を全身的に処置するために有用であり得る。
【０１３１】
２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、癌細胞上の２４Ｐ４Ｃ１２にその抗体が結合しかつ細胞および腫瘍の破壊を媒介し、かつ／または細胞もしくは腫瘍の増殖を阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、２４Ｐ４Ｃ１２の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および／またはアポトーシスを誘導することを包含し得る。２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、毒性薬剤または治療薬剤に結合され得、そして２４Ｐ４Ｃ１２を保有する腫瘍細胞に直接その毒性薬剤または治療薬剤を送達するために使用され得る。毒性薬剤の例としては、カルケマイシン（ｃａｌｃｈｅｍｉｃｉｎ）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、放射性同位体（例えば、131Ｉ、イットリウム、およびビスマス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用する癌免疫治療法は、以下を含むがこれらに限定されない、他の型の癌の処置にて首尾良く使用されている種々のアプローチから生じる技術に従い得る：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９０３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素への裸の抗体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体への131Ｉの結合（例えば、ＲｉｔｕｘａｎTM、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．、裸抗体；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、131Ｉ−ＣＤ２０結合体）を含むが、一方他のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎTM（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）との）同時投与を含む。前立腺癌の処置のために、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２抗体が、照射、化学療法またはホルモン切除と組み合わせて、投与され得る。
【０１３３】
２４Ｐ４Ｃ１２抗体治療は癌のすべての病期について有用であり得るが、抗体治療は、進行性または転移性の癌にて特に適切であり得る。本発明の抗体療法での処置は、以前に１つ以上の化学療法を受けている患者に示され得、一方、化学療法レジメンまたは照射レジメンと本発明の抗体療法を組み合わせることが、化学療法処置を受けていない患者に好ましくあり得る。さらに、抗体療法は、減少した投薬量の同時化学療法の使用を、特に、非常に十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者にとって、可能にし得る。
【０１３４】
好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的２４Ｐ４Ｃ１２画像化、または２４Ｐ４Ｃ１２発現の存在および程度を確かに示し得る他の技術を使用して、何人かの癌患者が２４Ｐ４Ｃ１２発現の存在およびレベルについて評価されることは、好ましくあり得る。腫瘍生検または外科的生検の免疫組織化学分析が、この目的に好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法が、当該分野で周知である。
【０１３５】
前立腺癌および他の癌を処置する際に有用な抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を示し得る抗体、および直接細胞傷害性であり得る抗体が挙げられる。これに関して、抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、エフェクター細胞Ｆｃレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を発揮する抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体が、本発明の実施にて有用である。このような直接細胞傷害性のモノクローナル抗体が作用し得る可能な機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体が抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＳＭＣＣ、補体媒介性細胞溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロアッセイを使用して、評価され得る。
【０１３６】
マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラモノクローナル抗体の使用が、何人かの患者で、中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの場合において、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的２４Ｐ４Ｃ１２抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
【０１３７】
本発明の治療法は、単一の抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体の投与、ならびに異なるモノクローナル抗体の組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなモノクローナル抗体カクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするモノクローナル抗体を含むか、異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するモノクローナル抗体と直接細胞傷害性モノクローナル抗体を組み合わせるのと同じ程度だけ、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなモノクローナル抗体は、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体の投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、および免疫モジュレーター（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と組合され得る。抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体は、その「裸」の形態または非結合形態で投与され得るし、またはそれらに結合した治療薬剤を有し得る。
【０１３８】
抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体処方物は、腫瘍部位にその抗体を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。投与の潜在的に有効な経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的に、受容可能な投与経路（例えば、静脈注射（ＩＶ））を介する、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量での、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体調製物の反復投与を包含する。１０〜５００ｍｇモノクローナル抗体／週の範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
【０１３９】
転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎモノクローナル抗体を用いる臨床実験に基づいて、初回負荷量約４ｍｇ／ｋｇ患者の体重のＩＶに続いての、毎週の用量約２ｍｇ／ｋｇの抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体調製物のＩＶが、受容可能な投薬レジメンを示し得る。好ましくは、この初回負荷量が、９０分以上注入として投与される。周期的維持用量は、３０分以上の注入として投与され得るが、ただし、その初回量が十分に許容された場合に限る。しかし、当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における初回量レジメンに影響する。このような因子としては、例えば、使用される抗体またはモノクローナル抗体の結合親和性および半減期、患者における２４Ｐ４Ｃ１２発現の程度、循環する落ちた（ｓｈｅｄ）２４Ｐ４Ｃ１２抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤の影響が、挙げられ得る。
【０１４０】
必要に応じて、患者は、最も有効な投薬レジメンおよび関連因子の決定を補助するために、血清中の循環する落ちた２４Ｐ４Ｃ１２抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じモニターする目的のために使用され得、そして他のパラメーター（例えば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組み合わせて、治療の成功を判断するために有用であり得る。
【０１４１】
（２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質機能の阻害）
本発明は、その結合パートナーまたはリガンドへの２４Ｐ４Ｃ１２の結合あるいは他のタンパク質との２４Ｐ４Ｃ１２の会合を阻害するための、種々の方法および組成物、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２機能を阻害するための方法を包含する。
【０１４２】
（細胞内抗体を用いる２４Ｐ４Ｃ１２の阻害）
１つのアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞中へと遺伝子移入技術を介して導入され得、その遺伝子移入技術において、そのコードされる単鎖抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体が細胞内発現され、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に結合し、そしてそれにより２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され得、その処置の阻害活性が焦点を合わせる制御を提供する。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、そうしなければ豊富なはずの細胞表面レセプターの発現を事実上除去することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと。
【０１４３】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより結合された、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に結合された単鎖可変領域フラグメントとして発現され得る。周囲の細胞内輸送シグナルが、発現される内部抗体を所望の細胞内区画に正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じてＣ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作され得る。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分が、原形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に結合され得る。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質内部抗体が、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞での終着点に輸送されることを防ぐために、使用され得る。
【０１４４】
このような内部抗体の発現を特定の腫瘍細胞に特異的に向けるために、その内部抗体の転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはプロモーターの調節制御下に配置され得る。前立腺に特異的に内部抗体発現を標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０１４５】
（組換えタンパク質を用いる２４Ｐ４Ｃ１２の阻害）
別のアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２に結合し得、それにより２４Ｐ４Ｃ１２がその結合パートナーに接近／結合することまたは他のタンパク質と会合することを妨げ得る、組換え分子が、２４Ｐ４Ｃ１２機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２特異的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２結合パートナーの２４Ｐ４Ｃ１２結合ドメインが、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つの２４Ｐ４Ｃ１２リガンド結合ドメインを含む、二量体融合タンパク質へと操作され得る。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＧH２ドメインおよびＧH３ドメインならびにヒンジ領域を含み得るが、ＧH１ドメインは含まないかもしれない。このような二量体融合タンパク質は、可溶性形態で、２４Ｐ４Ｃ１２の発現と関係する癌に罹患する患者に投与され得、ここでこの二量体タンパク質は２４Ｐ４Ｃ１２に特異的に結合し、それにより結合パートナーとの２４Ｐ４Ｃ１２の相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質は、公知の抗体連結技術を使用してさらに組み合わされて、多量体タンパク質にされ得る。
【０１４６】
（２４Ｐ４Ｃ１２の転写または翻訳の阻害）
別の種類の治療アプローチにおいて、本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の転写を阻害するための、種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための、方法および組成物も提供する。
【０１４７】
１つのアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の転写を阻害する方法は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２特異的リボザイムが、２４Ｐ４Ｃ１２メッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用され得る。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の調節領域（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ転写を阻害するために使用され得る。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
【０１４８】
２４Ｐ４Ｃ１２転写活性化を妨害することを介して２４Ｐ４Ｃ１２の転写を阻害する他の因子もまた、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌の処置に有用であり得る。同様に、２４Ｐ４Ｃ１２のプロセシングを妨害し得る因子は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内にある。
【０１４９】
（治療ストラテジーについての一般的な考慮）
遺伝子移入および遺伝子治療の技術は、２４Ｐ４Ｃ１２を合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体をコードするポリヌクレオチドおよび他の２４Ｐ４Ｃ１２阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、２４Ｐ４Ｃ１２転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターは、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
【０１５０】
上記の治療アプローチは、広範な種々の化学療法または放射線療法のレジメンのいずれか１つと組み合わされ得る。これらの治療アプローチはまた、特に、化学療法剤の毒性に十分に寛容ではない患者において、化学療法の投薬量の減少、および／またはより頻度の少ない投与の使用を可能にし得る。
【０１５１】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロおよびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療の可能性を評価するためのインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟ゲルアッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへの２４Ｐ４Ｃ１２の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０１５２】
インビボでは、２４Ｐ４Ｃ１２治療用組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、外因性前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌外植片または継代された異種移植組織が、免疫無防備動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）は、前立腺癌に関して適切であり、そして記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８，Ｓａｗｙｅｒｓら（１９９８年４月２３日公開）は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および後期段階疾患の特徴である骨芽細胞性転移の形成を要約し得る、ヒト前立腺癌の種々の異種移植モデルを記載している。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例もまた参照のこと。
【０１５３】
アポトーシスの促進を修飾（ｑｕａｌｉｆｙ）するインビボアッセイもまた、潜在的な治療用組成物の評価において有用であり得る。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス病巣の存在について試験され、そして未処置のコントロール異種移殖片保有マウスに比較される。アポトーシス病巣が処置マウスの腫瘍に見出される程度は、この組成物の治療効力の指標を提供する。
【０１５４】
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と非反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれらに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編，１９８０を参照のこと）。
【０１５５】
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達させ得る任意の経路を通じて投与され得る。潜在的に効果的な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、眼内などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存された静菌水、滅菌非保存水の溶液における治療用組成物を含み、そして／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリビニルクロリドまたはポリエチレンバッグに希釈される。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で貯蔵され得、次いで注射する前に、例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む静菌水中に、または滅菌水中に再構成され得る。
【０１５６】
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方法および標的の癌とともに変動し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の因子に依存する。
【０１５７】
（癌ワクチン）
本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントを含む癌ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンを提供する。好ましくは、このワクチンは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはポリペプチドの免疫原性部分を含む。２４Ｐ４Ｃ１２の組織により制限される発現を考慮すると、２４Ｐ４Ｃ１２癌ワクチンは、非標的組織に対して非特異的効果を生成することなく、２４Ｐ４Ｃ１２を発現している癌の特異的な予防および／または処置に効果的であることが予期される。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトＰＳＭＡおよびげっ歯類ＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１〜２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３〜３１１７）。このような方法は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質もしくはそのフラグメント、または２４Ｐ４Ｃ１２をコードする核酸分子、および２４Ｐ４Ｃ１２免疫原を発現し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施され得る。
【０１５８】
例えば、ウイルス遺伝子送達系は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする核酸分子を送達するために用いられ得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系は、以下を包含するが、これらに限定されない：ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に導入される（例えば筋内で）、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＤＮＡを用いることにより用いられ得る。１つの実施形態では、全長ヒト２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡが用いられ得る。別の実施形態では、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードする２４Ｐ４Ｃ１２核酸分子が用いられ得る。ＣＴＬエピトープは、特定化されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され得る。
【０１５９】
種々のエキソビボストラテジーが、用いられ得る。１つのアプローチは、患者の免疫系に２４Ｐ４Ｃ１２抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７共同刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、およびＩＬ−１２を発現し、そして従って、高度に分化された（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために使用されつつある（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３８０）。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の背景においてＴ細胞に対して２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドを提示するために使用され得る。１つの実施形態では、自己樹状細胞は、ＭＨＣ分子に結合し得る２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドでパルスされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質でパルスされる。さらに別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、および腫瘍由来ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））を用いて樹状細胞における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の過剰発現を操作することを包含する。２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞は、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
【０１６０】
抗イディオタイプ抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体もまた、抗癌療法において、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり、そして２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１６１】
遺伝子免疫法は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌細胞に対する予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡおよび適切な調節配列を含む構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、筋肉または皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされた２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質／免疫原を発現する。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質免疫原の発現は、前立腺癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫技術が使用され得る（検討のために、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
【０１６２】
（キット）
上記で記載または示唆された診断適用および治療適用において使用するために、本発明によって、キットもまた提供される。このようなキットは、１つ以上のコンテナ手段（例えば、バイアル、チューブなど）を厳重に閉じ込めて受容するように区画化されるキャリア手段を備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法において、使用されるべき別々の要素の１つを含む。例えば、コンテナ手段の１つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ２４Ｐ４Ｃ１２（および／またはＨ３８０８７）タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２（および／またはＨ３８０８７）遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが、標的核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含むコンテナ、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識）に結合されるレポーター手段（例えば、ビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を含むコンテナを有し得る。
【０１６３】
本発明のキットは、代表的には、上記コンテナ、および使用説明書と共に、市販および使用者の観点で所望の材料（緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む）を含む１つ以上の他のコンテナを含む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用（例えば、上記の使用）についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
【０１６４】
２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡは、ブダペスト条約の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に、プラスミドｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９およびｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５としてそれぞれ１９９９年２月２日および２６日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号２０７０８４および２０７１２９で承認されている。
【実施例】
【０１６５】
本発明の種々の局面を、以下に続くいくつかの例によってさらに記載および例示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【０１６６】
（実施例１：２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成単離）
（材料および方法）
（ＬＡＰＣ異種移植片）
ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈｅａｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）から入手し、記載のように生成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２−４０８；Ｃｒａｆｔら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：５０３０−５０３６）。アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４ ＡＤおよびＡＩ）をそれぞれインタクトな雄ＳＣＩＤマウスまたは雄去勢マウスにおいて増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ腫瘍から誘導して得た。ＡＩ異種移植片を生成するために、ＬＡＰＣ ＡＤ腫瘍を有する雄マウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間飼育した。ＬＡＰＣ腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄ＳＣＩＤマウスにおいてまたは雌ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。
【０１６７】
（細胞株）
ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中で維持した。
【０１６８】
（ＲＮＡ単離）
腫瘍組織および細胞株を、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０8細胞を用いてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）においてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ ＭｉｎｉキットおよびＭｉｄｉキットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度計分析（Ｏ．Ｄ． ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０１６９】
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
【０１７０】
ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー）：
５’ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴ30３’（配列番号３４）
アダプター１（それぞれ配列番号３５、３６）：
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧ３’
３’ＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴＡＧ５’
アダプター２（それぞれ配列番号３７、３８）：
５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧ３’
３’ＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧ５’
ＰＣＲプライマー１（配列番号３９）：
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’
ネスト化プライマー（ＮＰ）１（配列番号４０）
５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＡ３’
ネスト化プライマー（ＮＰ）２（配列番号４１）：
５’ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＡ３’。
【０１７１】
（抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、前立腺癌で示差的に発現され得る２４Ｐ４Ｃ１２に対応するｃＤＮＡを同定した。ＳＳＨ反応は２つの異なる前立腺組織源からのｃＤＮＡを利用し、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ ｃＤＮＡからＢＰＨ（良性前立腺肥大）ｃＤＮＡを差し引く。ＬＡＰＣ−４
ＡＤ ｃＤＮＡを「テスター」の供給源として使用し、一方、ＢＰＨ ｃＤＮＡを「ドライバー」の供給源として使用した。
【０１７２】
テスターｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡを、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮを使用して、上記のように、関連の異種移植片組織から単離された２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成した。第一鎖および第二鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．ＰＴ１１１７−１、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ１８０４−１）に記載のように実施した。得られたｃＤＮＡをＤｐｎＩＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【０１７３】
ドライバーｃＤＮＡを、１：１比で、関連の異種移植片供給源からのＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡ（上述を参照のこと）を、ヒト良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、ヒト細胞株ＨｅＬａ、２９３、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ２０５、およびマウス肝臓由来の消化ｃＤＮＡの混合物と組み合わせることにより生成した。
【０１７４】
テスターｃＤＮＡを、５μｌの水中に関連の異種移植片供給源（上記を参照のこと）からの１μｌのＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈することにより生成した。次いで、希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、総容量１０μｌで１６℃で一晩、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、別の連結反応中で、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡで、そして７２℃で５分間加熱して終結させた。
【０１７５】
第一のハイブリダイゼーションは、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１連結のおよびアダプター２連結のテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。４μｌの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ サーマルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、次いで、６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌの新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第二のハイブリダイゼーションを、２００μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１７６】
（ＳＳＨから生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、２つのＰＣＲ増幅を行った。第一のＰＣＲ反応において、１μｌの希釈最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量２５μｌの１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで２７サイクルの９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分。５つの別の第一のＰＣＲ反応を各実験について行った。産物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応については、プールし、そして希釈した第一のＰＣＲ反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いたものと同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１７７】
ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを青／白およびアンピシリン選択に供した。白色コロニーを釣り上げ、９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅をＰＣＲ１の条件ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を用いて１ｍｌの細菌培養物において実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１７８】
９６ウェルフォーマットで２０％グリセロール中に細菌クローンを貯蔵した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ、およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０１７９】
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析）
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いるオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングによって１μｇのｍＲＮＡから生成した。製造者プロトコルを使用し、そしてこれは、４２℃で５０分間の逆転写酵素とのインキュベーション、続いて３７℃で２０分間のＲＮＡｓｅ Ｈ処理を包含した。反応を完了した後、この容積を、標準化の前に水で２００μｌに増大させた。１６の異なる正常ヒト組織からの第一鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
【０１８０】
複数の組織からの第一鎖ｃＤＮＡの標準化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号４２）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号４３）を用いてβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）、および１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む総容量５０μｌで増幅した。１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルで、５μｌのＰＣＲ反応物を取り出し、そしてアガロース電気泳動のために使用した。ＰＣＲを、以下の条件下で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを用いて実施した：初期変性は９４℃で１５秒間であり、続いて１８サイクル、２０サイクル、および２２サイクルの９４℃で１５、６５℃で２分、７２℃で５秒。７２℃での最終伸長を２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβアクチンバンドのバンド強度を可視検査によって比較した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいβアクチンバンド強度を生じるように、第一鎖ｃＤＮＡの希釈因数を算定した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいバンド強度を達成するには、３ラウンドの標準化が必要であった。
【０１８１】
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの標準化された第一鎖ｃＤＮＡを、以下のプライマー対を用いる２５、３０、および３５サイクルの増幅を用いるＰＣＲによって分析した。これらプライマーは、（ＭＩＴ；詳細については、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕを参照のこと）の補助により設計した：
５’−ａｇａｔｇａｇｇａｇｇａｇｇａｃａａａｇｇｔｇ−３’（配列番号４４）
５’−ａｃｔｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｔａｃｃｇａｇｔｇ−３’（配列番号４５）
半定量発現分析を、軽度のバンド強度を与えるサイクル数でＰＣＲ産物を比較することにより達成した。
【０１８２】
（結果）
上述の材料および方法に記載のＳＳＨ実験は、多数の候補遺伝子フラグメントクローン（ＳＳＨクローン）の単離に至った。全ての候補クローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体に関する情報を提供し、そして示差的な発現について特定の遺伝子を分析するための決定を導くのを補助するために、主な公的な遺伝子およびＥＳＴデータベース中の全配列に対する相同性分析に供した。一般に、検索したデータベースのいずれかにおいていかなる公知の配列とも相同性を有さず、従って新規な遺伝子を表すと考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析によってディファレンシャル発現分析に供した。
【０１８３】
約１６０ｂｐを含む、ＳＨＨクローンの１つは、５３アミノ酸の推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、そして結腸腫瘍ライブラリー由来のＥＳＴに有意な相同性を示す（図１Ｅ；配列番号３、４）。２４Ｐ４Ｃ１２と称される、このＳＳＨクローンを、種々の組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ発現分析のためのプライマーを設計するために使用した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、２４Ｐ４Ｃ１２が、ＬＡＰＣ異種移植片および正常前立腺の全てにおいて、ほぼ等しいレベルで発現されることを示した（図２Ａ）。１６の正常な組織由来の第一鎖ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、２５サイクルの増幅後に結腸、前立腺、腎臓、および肺において発現を示した（図２Ｂおよび２Ｃ）。プローブとして２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを使用するノーザンブロット分析は、ＬＡＰＧ−９ＡＤ、続いてＬＡＰＣ−４ ＡＤにおけるほぼ３ｋｂの２４Ｐ４Ｃ１２転写物の最も高い発現を示す（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１８４】
（実施例２：全長２４Ｐ４Ｃ１２ｃＤＮＡのクローニング）
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを、正常な前立腺のライブラリーから単離し、そして配列決定した。単離されたクローンの２つ（２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９（２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のコード領域のほとんどを含む）および２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５（２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のコード領域全体を含む）と称する）をそれぞれ、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）に、プラスミドｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ９およびｐ２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ５として、１９９９年２月２日および２６日に寄託し、そしてそれぞれＡＴＣＣ受託番号２０７０８４および２０７１２９で承認されている。これらの２つのクローン、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２コード領域のほとんどをコードする別のクローン２４Ｐ４Ｃ１２−ＧＴＥ４は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるような２４Ｐ４Ｃ１２の完全なコード配列および部分的な非コード配列を生成するように合わせられた重複するヌクレオチド配列を有した。
【０１８５】
図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示された２５８７ｂｐの２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列は、マウス遺伝子ＮＧ２２およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＣＥＥＳＢ８２Ｆに対して有意な相同性を有する７１０アミノ酸のＯＲＦをコードする。図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）のｃＤＮＡによりコードされたヒト２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびマウスＮＧ２２遺伝子産物のアミノ酸配列整列を図４Ａ〜４Ｂに示す。
【０１８６】
ＮＧ２２は、マウスゲノムにおいてＭＨＣクラスＩＩＩを包含するゲノムＢＡＣクローン内の多くのＯＲＦの１つとして、最近同定された。ＮＧ２２およびＣＥＥＳＢ８２Ｆはともに、１２の膜貫通ドメインを含む遺伝子であるようである。図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示される２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列は、１３の可能な膜貫通ドメインを含む。１２回膜貫通輸送タンパク質が公知である（ＫｉｔｔｙおよびＡｍａｒａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６７５−６８２）。２４Ｐ４Ｃ１２の推定二次構造に起因して、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、細胞表面膜ポンプまたは輸送因子として機能すると考えられる。
【０１８７】
（実施例３：２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現分析）
正常ヒト組織における２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現を、プローブとして標識された２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメント（実施例１）を用いる、全部で１６の異なる正常ヒト組織を含む、多重組織ブロットのノーザンブロッティングによって分析した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＲＮＡサンプルを、βアクチンプローブを用いて定量的に標準化した。ノーザンブロット分析は、主に前立腺および結腸において発現を示し、腎臓においてやや低い発現が検出され、そして膵臓、肺および胎盤において顕著により低い発現が検出された。
【０１８８】
癌組織における２４Ｐ４Ｃ１２発現を分析するために、ノーザンブロッティングを、ＬＡＰＣ異種移植片、ならびにいくつかの前立腺および非前立腺癌細胞株由来のＲＮＡにおいて実施した。結果は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ、ＬＮＣａＰ、およびＬＡＰＣ−４細胞株において２４Ｐ４Ｃ１２の高い発現レベルを示す（図３、図５）。非常に高いレベルがＬＡＰＣ−３ ＡＩで検出される（図５）。より低いレベルが、ＬＡＰＣ−９ ＡＩで検出される。異種移植片のより詳細な分析は、２４Ｐ４Ｃ１２が、マウスの脛骨内で増殖する場合でさえ、異種移植片において高度に発現されることを示す（図５）。ノーザン分析はまた、２４Ｐ４Ｃ１２が、正常な前立腺および前立腺癌患者に由来する前立腺腫瘍組織において発現されることを示している（図６Ａ）。これらの結果は、２４Ｐ４Ｃ１２は、前立腺癌において高度に発現される前立腺遺伝子であり、そして前立腺癌における薬物または抗体標的としての有用性を有し得ることを示唆する。
【０１８９】
（実施例４：２４Ｐ４Ｃ１２ポリクローナル抗体の生成）
２４Ｐ４Ｃ１２に対するポリクローナル血清を生成するために、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列のアミノ酸１−１４（ＭＧＧＫＱＲＤＥＤＤＥＡＹＧ；配列番号７１）に対応するペプチドを合成した。このペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップルさせ、そして以下のようにウサギを免疫するために用いた。最初にウサギを完全フロイントのアジュバント中に混合した２００μｇのペプチド−ＫＬＨで免疫した。次いで、不完全フロイントアジュバント中の２００μｇのペプチド−ＫＬＨを２週間毎に注射した。各免疫の後約７−１０日に採血した。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティング分析を用いて免疫ペプチドおよび２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対するウサギ血清の力価および特異性それぞれを測定した。アフィニティー精製した抗−２４Ｐ４Ｃ１２ポリクローナル抗体は、免疫ウサギからの粗血清をＡｆｆｉｇｅｌ １５（ＢｉｏＲａｄ）に共有結合した２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドを含むアファニティーマトリックス上を通過させることにより調製した。ＰＢＳを用いてマトリックスを十分に洗浄した後、２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドに特異的な抗体を、低ｐＨグリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ２．５）で溶出し、そしてＰＢＳに対して透析した。
【０１９０】
次いで、ウェスタンブロット分析を、ＣＭＶで駆動されるＰＣＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはレトロウイルスｐＳＲ−α発現ベクターのいずれか中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抗−２４Ｐ４Ｃ１２ ｐＡｂを用いて実施した。２９３Ｔ細胞は、１０μｇの、空のベクター、またはｐＣＤＮＡ３．１ ＣＭＶ駆動ＭＹＣ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＲ−αレトロウイルス発現ベクターで、ＣａＰＯ4を用いて一過性にトランスフェクトした。４０時間後、トランスフェクション細胞を回収し、そして２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で溶解した。試料緩衝液中の細胞溶解液を、次いで、温和な加熱変性（７０℃）または強熱変性（１００℃）のいずれかを行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてニトロセルロースに転写した。次いでメンブレンを、２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸１−１４（ＭＧＧＫＱＲＤＥＤＤＥＡＹＧ；配列番号７１）に対して惹起されたアフィニティー精製された２μｇ／ｍｌのウサギ抗−ペプチドｐＡｂを用いるウェスタン分析にかけた。抗−２４Ｐ４Ｃ１２免疫反応性バンドを、二次抗体に結合した抗ウサギＨＲＰとのインキュベーションおよび増大化学発光により可視化した。
【０１９１】
ウェスタンブロット分析の結果は、９０ｋＤバンドと、トランスフェクト細胞中の高分子量スメアの特異的認識を示すが、空のベクターでトランスフェクトした細胞にはなかった（図１０Ａ、図１０Ｂ）。アミノ酸配列から算出された２４Ｐ４Ｃ１２の分子量は、７９．２ｋＤである。細胞溶解液のウェスタン分析における９０ｋＤバンドの出現は、２４Ｐ４Ｃ１２が翻訳後改変を含むことを示唆する。実際、このアミノ酸配列から予想される複数の可能なＮ連結グリコシル化部位がある。高分子スメアの比率は、温和な加熱（７０℃）変性に比べ高加熱（１００℃）によって増大し、これは、疎水性配列の熱誘導曝露に際し、この１２の膜貫通タンパク質の凝集を示す。分解産物であり得る複数の低分子量バンドもまた、高度に発現されたｐＣＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクトされた細胞中で検出される。
【０１９２】
（実施例５：哺乳動物系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２の産生）
組換え２４Ｐ４Ｃ１２を発現するために、完全長の２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを、Ｃ末端に６Ｈｉｓタグを提供する発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し得る。これらの構築物は、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされ得る。トランスフェクト２９３Ｔ細胞溶解液は、ウェスタンブロットにおいて実施例４に記載された抗−２４Ｐ４Ｃ１２ポリクローナル血清でプローブされ得る。
【０１９３】
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子はまた、レトロウイルス発現ベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローン化し得、そして以下のように２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞株０確立するために用いた。２４Ｐ４Ｃ１２コード配列（翻訳開始ＡＴＧ〜停止コドンまで）は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡからｄｓ ｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ産物を、ベクター上のＥｃｏＲ１（平滑末端化）およびＸｂａ１制限部位を介してｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローン化し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換する。コロニーを釣り上げ、ｃＤＮＡ上の特有の内部制限部位をもつクローンをスクリーニングする。陽性のクローンは、このｃＤＮＡ挿入片の配列決定により確認する。その後、レトロウイルスを、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ３、およびＬｎＣａｐ細胞を用いる、種々の細胞株の感染および生成のために用いられ得る。
【０１９４】
（実施例６：バキュロウイルス系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２の産生）
バキュロウイルス発現系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を生成するために、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを、Ｎ末端にＨｉｓ−タグを提供する、バキュロウイルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化する。詳細には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−２４Ｐ４Ｃ１２を、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞中に同時トランスフェクトし、組換えバキュロウイルスを生成する（詳細についてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより生成する。
【０１９５】
次いで、組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、精製バキュロウイルスを用いたＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により生成する。組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、抗−２４Ｐ４Ｃ１２抗体を用いて検出され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、精製され、そして種々の細胞を基礎にしたアッセイにおいて、または２４Ｐ４Ｃ１２に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。
【０１９６】
（実施例７：Ｈ３８０８７の同定＆クローニング、２４Ｐ４Ｃ１２のファミリーメンバー）
Ｈ３８０８７を、ＮＣＢＩ中のｔｂｌａｓｔｎツールを用いて２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列を用いｄＢＥＳＴデータベースをサーチすることにより２４Ｐ４Ｃ１２のファミリーメンバーとして同定した。相同性タンパク質のタンパク質フラグメントをコードするＥＳＴを同定した。これらのうちの１つ、Ｈ３８０８７は、精巣ライブラリーからクローン化した。このｃＤＮＡ（クローンＧＴＢ６）は、サイズが２７３８ｂｐであり、そして１１の推定の膜貫通ドメインをもつ７０４アミノ酸タンパク質をコードする（図７Ａ−７Ｄ；配列番号６、７）。５’非翻訳領域の５８塩基対は、非常にＧＣリッチ（８７％）であり、この遺伝子が翻訳調節エレメントを含み得ることを示す（図７Ａ−７Ｄ）。２４Ｐ４Ｃ１２（配列番号２）およびＨ３８０８７（配列番号７）のアミノ酸配列は、完全配列に亘って４４％同一および５６％相同である（図８）。発現分析は、Ｈ３８０８７が遍在的に発現されることを示す（図９）。最高の発現レベルが精巣で検出される。発現はまた、すべてのＬＡＰＣ異種移植片中で観察される。Ｈ３８０８７は、遍在的に発現されるので、２４Ｐ４Ｃ１２−特異的治療剤を試験するためのコントロールとして供し得る。Ｈ３８０８７機能に影響する２４Ｐ４Ｃ１２特異的治療剤は、正常細胞に対して毒性であり得る。しかし、Ｈ３８０８７ではなく、２４Ｐ４Ｃ１２に選択的に影響する治療剤は、正常細胞に対してより少ない毒性であり得る。従って、Ｈ３８０８７タンパク質は、２４Ｐ４Ｃ１２に対する治療様式の前臨床試験ツールとして有用である。
【０１９７】
（実施例８：潜在的なシグナル伝達経路の同定）
２４Ｐ４Ｃ１２が細胞中の既知のシグナル伝達経路を直接的または間接的に活性化するか否かを決定するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を基礎にした転写レポーターアッセイを、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞中で実施する。これらの転写レポーターは、良く特徴付けられたシグナル伝達経路の下流にある、既知の転写因子のためのコンセンサス結合部位を含む。これらのレポーターおよびそれらの関連転写因子、シグナル伝達経路、および活性化刺激物の例を、以下に列挙する。
１．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；成長／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；成長／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；成長／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド類／ＭＡＰＫ；成長／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；成長／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；成長／アポトーシス／ストレス
２４Ｐ４Ｃ１２媒介効果は、ｍＲＮＡ発現を示す細胞中でアッセイされ得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、脂質媒介トランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）により導入され得るルシフェラーゼ活性、相対的転写活性の指標は、細胞抽出物のルシフェリン基質とのインキュベーションにより測定され、そして反応の化学発光がルミノメーター中でモニターされる。
【０１９８】
（実施例９：２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体の生成）
２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体を生成するために、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を合成し、そして免疫原として用いる。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２は、Ｃ末端６ＸＨｉｓおよびＭＹＣタグをもつ２４Ｐ４Ｃ１２をコードするＣＭＶ駆動発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中で首尾良く発現され得る。細胞中で発現されたＨＩＳタグ２４Ｐ４Ｃ１２は、標準的な技法を用いるニッケルカラムを用いて精製され得る。
【０１９９】
Ｂａｌｂ Ｃマウスを、最初、腹腔内に、完全フロイントアジュバント中に交合された、２００μｇのＧＳＴ−２４Ｐ４Ｃ１２融合タンパク質で免疫する。次いで、マウスに、フロイントの不完全アジュバント中に混合された７５μｇの２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質で２週間毎に、合計３回の免疫を行う。完全長２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対する免疫マウスからの血清の反応性を、２９３Ｔ細胞から発現されたＨＩＳタグ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の部分精製された調製物（実施例５）を用いてＥＬＩＳＡによりモニターする。最も強い反応性を示すマウスを３週間休息させ、そしてＰＢＳ中の融合タンパク質の最後の注射をし、次いで４日後に屠殺する。次いで屠殺マウスの脾臓を回収し、そして標準的な手順を用いてＳＰＯ／２ミエローマ細胞に融合する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。ＨＡＴ選択の後、増殖ウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎブロットによりスクリーニングし、２４Ｐ４Ｃ１２特異的抗体産生クローンを同定する。
【０２００】
２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体の結合親和性は、標準的な技術を用いて測定し得る。親和性測定は、エピトープ結合に対する抗体の強さを定量し、そしてどの２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体が診断または治療使用に好適であるかを規定するのを補助するために用いられ得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するための好適な方法である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、生体分子相互作用をリアルタイムでモニターするために、表面プラスモン共鳴を用いる（ＳＰＲ、Ｗｅｌｄｆｏｒｄ Ｋ．１９９１、Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ、１９９８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９５：２６８）。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を首尾良く生成する。
【０２０１】
（実施例１０：２４Ｐ４Ｃ１２機能のインビトロアッセイ）
前立腺およびその他の癌における２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、この遺伝子が腫瘍進行および／または腫瘍開始において機能的役割を有するという証拠を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２が、増殖シグナルを活性化することに関与するレセプターとして機能する可能性がある。２４Ｐ４Ｃ１２機能は、インビトロアプローチを用いて哺乳動物細胞中で評価され得る。哺乳動物発現には、２４Ｐ４Ｃ１２は、ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−タグ（実施例５）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）を含む多くの適切なベクター中にクローン化され得る。このような発現ベクターを用い、２４Ｐ４Ｃ１２は、ＰＣ−３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＬＮＣａＰおよび２９３Ｔを含むいくつかの細胞株で発現され得る。２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、抗−２４Ｐ４Ｃ１２抗体およびノザンブロット分析を用いてモニターされ得る（実施例４および９を参照のこと）。
【０２０２】
２４Ｐ４Ｃ１２を発現する哺乳動物細胞株は、いくつかのインビトロおよびインビボアッセイで試験され得、これには、組織培養中の細胞増殖，アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍形成、および膜侵襲培養系を用いるインビトロ侵襲（ＭＩＣＳ；Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：４４９−４５７）が含まれる。２４Ｐ４Ｃ１２細胞表現型を、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を欠く細胞の表現型と比較する。
【０２０３】
２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞株はまた、マトリゲルでコートされた多孔性膜チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通る細胞の通過を測定することにより、侵襲および遊走性質の改変についてアッセイされ得る。対向する側面への膜を通じる細胞の通過は、カルセイン−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を負荷したインジケーター細胞を用いる蛍光アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃４２８）を用いてモニターされる。分析された細胞株は、親および２４Ｐ４Ｃ１２過剰発現ＰＣ３、ＮＩＨ３Ｔ３ならびにＬＮＣａＰ細胞を含む。２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞が化学誘引物質の性質を有するか否かを決定するために、インジケーター細胞を、コントロール培地に比較して２４Ｐ４Ｃ１２馴化培地のグラジエントに向かう多孔性膜を通じる通過についてモニターする。このアッセイはまた、候補の癌治療組成物による２４Ｐ４Ｃ１２で誘導される効果の特異的中和を定性および定量するために用いられ得る。
【０２０４】
２４Ｐ４Ｃ１２の機能は、上記の種々の機能的アッセイ（例えば、成長、侵襲および移動）と連結された抗アンチセンスＲＮＡ技術を用いて評価され得る。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞中に導入し得、それによって２４Ｐ４Ｃ１２の発現を防ぐ。コントロールおよびアンチセンス含有細胞は、増殖、侵襲、移動、アポトーシスおよび転写能力について分析し得る。２４Ｐ４Ｃ１２発現の損失の局所および全身効果が評価され得る。
【０２０５】
（実施例１１：２４Ｐ４Ｃ１２腫瘍成長促進に対するインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の影響は、腫瘍をもつマウス中の遺伝子過剰発現によりインビボで評価され得る。例えば、ＳＣＩＤマウスに、各脇腹上に、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたは２４Ｐ４Ｃ１２を含む、ＰＣ３、ＴＳＵＰＲ１、またはＤＵ１４５細胞のいずれの１×１０6を皮下し得る。少なくとも以下の２つの戦略が用いられ得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、（アデノウイルス２のような）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリザルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、または例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター（このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で）から得られた構成的プロモーターのようなプロモーターの調節下の、構成的２４Ｐ４Ｃ１２発現、および（２）（このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で）ｅｃｄｙｓｏｎｅ、ｔｅｔなどのような、誘導性ベクター系の制御下の調節発現。次いで、腫瘍容積を、触知可能な腫瘍の出現時にモニターし、そして、経時的に、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞が、より速い速度で成長するか否か、および２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞により生成される腫瘍が、改変された病原性の特徴（例えば、増大した転移、血管形成、化学的治療薬物に対して減少した応答性）を示すか否かを測定する。さらに、マウスに、１×１０5の同じ細胞を同所的に移植し得、２４Ｐ４Ｃ１２が、前立腺における局所成長に対する影響、または特に肺、リンパ節、および骨髄に特異的に転移する細胞の能力に対する影響を有するか否かを決定する。
【０２０６】
このアッセイはまた、（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２内部抗体、２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンス分子およびリボザイムのような）候補治療組成物の２４Ｐ４Ｃ１２阻害効果を決定するために有用である。
【０２０７】
（実施例１２：細胞下画分中の２４Ｐ４Ｃ１２発現のウェスタン分析）
２４Ｐ４Ｃ１２の配列分析は、膜貫通ドメインの存在を示した。２４Ｐ４Ｃ１２の細胞位置は、細胞生物学で広く用いられる細胞下分画技法を用いて評価され得る（Ｓｔｏｒｒｉｅ Ｂら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８２：２０３−２５）。前立腺細胞株は、核、細胞質ゾルおよび膜画分に分離され得る。異なる画分中の２４Ｐ４Ｃ１２発現は、ウェスタンブロッティング技法を用いて試験され得る。
【０２０８】
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２の細胞下局在化を決定するために、２９３Ｔ細胞を、ＨＩＳタグ２４Ｐ４Ｃ１２をコードする発現ベクター（ＰＣＤＮＡ ３．１ ＭＹＣ／ＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトされ得る。このトランスフェクト細胞を回収し、そして先に記載のように（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ、Ｐ．Ａ．ら、１９９７、Ｊ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１６９７−１７０６）、差次的細胞下分画プロトコルに供し得る。このプロトコルは、細胞を、核、重膜（リソソーム、ペルオキシソーム、およびミトコンドリア）、軽膜（原形質膜および小胞体）、および可溶性タンパク質について濃縮された画分に分割する。
【０２０９】
本出願を通じて、種々の刊行物が括弧内に参照されている。これらの刊行物の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【０２１０】
本発明は、本明細書に開示の実施の形態により範囲を限定されるべきではなく、これらは、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に等価である任意のものは、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のこれらに加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変は、先行する記述および教示から当業者に明らかとなり、そして本発明の範囲内に同様に入ることが意図される。このような改変またはその他の実施の形態は、本発明の真の範囲および思想から逸脱することなく実施され得る。これらの改変およびその他の実施の形態は、制限されることなく、２４Ｐ４Ｃ１２と組み合わせて、本明細書に開示の種々の方法、アッセイ、分子および戦略を、Ｈ３８０８７との使用のために適合することを包含する。
【図１Ａ】
2010051321.tif 000003
【図１Ｂ】
2010051321.tif 000004
【図１Ｃ】
2010051321.tif 000005
【図１Ｄ】
2010051321.tif 000006
【図１Ｅ】
2010051321.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010051321.tif 000009
【図２Ｃ】
2010051321.tif 000010
【図３Ａ】
2010051321.tif 000011
【図３Ｂ】
2010051321.tif 000012
【図３Ｃ】
2010051321.tif 000013
【図４Ａ】
2010051321.tif 000014
【図４Ｂ】
2010051321.tif 000015
【図５】
2010051321.tif 000016
【図６Ａ】
2010051321.tif 000017
【図６Ｂ】
2010051321.tif 000018
【図７Ａ】
2010051321.tif 000019
【図７Ｂ】
2010051321.tif 000020
【図７Ｃ】
2010051321.tif 000021
【図７Ｄ】
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【図８】
2010051321.tif 000023
【図９Ａ】
2010051321.tif 000024
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2010051321.tif 000026
【図１０Ａ】
2010051321.tif 000027
【図１０Ｂ】
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【配列表】
2010051321000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月25日(2009.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を発現する癌細胞の増殖または生存を阻害する方法に使用するための薬剤の調製のための、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の細胞外部分に特異的に結合する抗体の少なくとも一つの抗原結合部分を含む部分の使用。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体であって、抗原結合部分が該抗体の一部である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
抗原結合部分がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＦＳＶフラグメントである、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
抗体または抗原結合部分がヒト化抗体または完全なヒト抗体である、請求項１〜３いずれかに記載の使用。
【請求項５】
抗体または抗原結合部分が毒素または治療薬剤に結合体化されている、請求項１〜４いずれかに記載の使用。
【請求項６】
癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１〜５いずれかに記載の使用。