(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニック胚において転位を誘導するための方法の提供。【解決手段】（a）トランスポゾンのコピーの1以上を自身のゲノム内に含む第1成体トランスジェニック生物を作製し、（b）前記トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節しうる配列を含む第2成体トランスジェニック生物を作製し、（c）前記第1成体トランスジェニック生物を前記第2トランスジェニック成体生物と交配させて、（i）前記トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む後代を得る。前記方法を用いれば、トランスポゾンの動員を、ある所定の胚発生段階において有利に誘導することが可能であり、単一の細胞の突然変異遺伝子が後続の細胞分裂で複製され、前記転位遺伝子に関して実質的に均質な細胞群が得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄トランスジェニックマウス後代を作製するための方法であって、
（a）トランスポゾンのコピーの1以上を自身のゲノム内に挿入することにより第1成体トランスジェニックマウスを作製し、
（b）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子のコピーの1以上および前記トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節しうる因子を自身のゲノム内に挿入することにより第2成体トランスジェニックマウスを作製し、
ここで、前記第1および第2成体トランスジェニックマウスは疾患状態になり易いことが知られているバックグラウンドを有するマウス系統に由来するものであり、
（c）前記第1成体トランスジェニックマウスを前記第2トランスジェニック成体マウスと交配させて、（i）前記トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む雄後代を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする少なくともH1t遺伝子調節配列の制御下にあり、
（d）前記後代の生殖細胞において前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を誘導して、前記後代の精子形成過程において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
第1トランスジェニックマウスが、そのゲノム内に、トランスポゾンと同族トランスポザーゼをコードする遺伝子との両方のコピーの1以上を含み、第2トランスジェニックマウスが、精子形成中または卵形成中のいずれかの所定の組織でのトランスポザーゼ発現を可能にするのに必要な調節配列のコピーの1以上を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
トランスポゾンと同族トランスポザーゼをコードする遺伝子とが第1マウスのゲノム内に単一の構築物として与えられ、この場合、トランスポゾンの動員に際して、トランスポザーゼをコードする遺伝子が破壊される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子および／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節する遺伝子が、開いたクロマチン構造において位置するように、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子がクロマチンオープニングエレメント内に位置する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
クロマチンオープニングエレメントが遍在的作用性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）、遺伝子座調節領域（LCR）、CpGアイランドまたはインスレーターである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
調節配列が、ある所定の発生段階において活性化されうる発生調節配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
調節配列が、テトラサイクリン誘導性発現系、エストロゲン誘導性発現系、エクジソン誘導性発現系およびlacオペレーターリプレッサー系を含む群から選ばれる誘導可能な調節配列である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現が、（i）転位の結果としてのトランスポザーゼ遺伝子切除、または（ii）トランスポゾンの動員の後のトランスポザーゼ遺伝子切除により排除される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子が、発現される遺伝子内または発現される遺伝子に隣接して挿入される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
トランスポゾンが2型トランスポゾンである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
トランスポゾンがMinos、mariner、Hermes、piggyBacまたはSleeping Beautyである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
トランスポゾンがMinosである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
トランスポゾンと同種の逆方向末端反復配列に隣接した異種核酸配列を含むようにトランスポゾンが修飾されている、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
トランスポゾンが、選択マーカーをコードする核酸配列を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
選択マーカーが蛍光性または発光性ポリペプチドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
トランスポザーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列が、コドン使用頻度を最適化するために修飾されている、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
トランスポザーゼ遺伝子が、該トランスポザーゼ遺伝子を切除することが可能な酵素により認識可能な配列に隣接している、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記切除酵素および同族の認識配列がCre/loxである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記後代を交配させることにより、すべての細胞がトランスポゾン動員により修飾された遺伝子に関して均質なトランスジェニックマウスを作製する工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記マウスが、疾患状態になり易いことが知られているバックグラウンドを有し、該マウスのすべての細胞がトランスポゾン動員により修飾される遺伝子に関して均質である、請求項１９記載の方法により取得可能なトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
トランスジェニックマウスにおける表現型特徴に相関する遺伝子を単離するための方法であって、
（a）請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法により得られる後代を準備し、
（b）前記トランスジェニック後代において、前記表現型特徴を示す複数の細胞の存在を同定し、
（c）1以上の前記細胞のゲノム内の1以上のトランスポゾン転位事象の位置を検出し、
（d）その挿入を含む遺伝子座をクローニングする工程
を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスポゾンを使用する、生物における遺伝情報の導入方法に関する。特に、本発明は、ある所定の発生段階における細胞の遺伝的修飾を誘導するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイスループットDNA配列決定技術ならびに精巧なデータ収集およびコンピューター解析の発展により、キイロショウジョウバエおよびヒトを含む全ゲノムの配列決定がもたらされた。これにより新規「推定」遺伝子配列は同定されても、機能の原因となる関連生物学については何ら明らかにされていない。機能情報は、どの遺伝子が、ヒトにおける疾患の処置および診断のための治療標的となりうるかということを明らかにするための前提条件である。
【０００３】
個々の遺伝子機能、および遺伝子と病態との機能的関連性の同定は今や、バイオテクノロジーおよび医薬産業における主要関心事となっている。疾患関連遺伝子の同定は新規薬物または薬物発見用標的の開発を可能にし、疾患の診断マーカーまたは予後マーカーを提供し、医師に処方の指針を与える。複雑な遺伝的特徴を有する疾患においては、これらのうちの後者が特に有用であろう。患者間の遺伝的変異が測定可能な場合には、薬物作用に対する患者の明確な応答が確認して、個人別医療計画をたてることが可能である。
【０００４】
遺伝子機能を同定するために多数の方法が用いられているが、それらのほとんどは、健康状態と病的状態とにおける遺伝子構造および遺伝子発現プロフィールの比較分析に基づくものである。このアプローチは不経済で長時間を要し、結果はしばしば主観的であって、遺伝子発現におけるばらつきをin vivoでの機能的疾患関連事象に関連づける確たる証拠を欠く。遺伝子機能の証明は、原因（すなわち、遺伝子配列中の突然変異、欠失または挿入）を、完全動物における測定可能な効果（すなわち、行動、発生、代謝などの効果）に直接的に関連づける動物モデル系における研究を要する。
【０００５】
マウスおよび他の哺乳動物における遺伝子機能研究は現在のところ以下のものに限られている。
【０００６】
A）ウイルス感染によりしばしば導入されるタグ付き遺伝子の1以上を各細胞が含有する胚性幹細胞（ES細胞）のライブラリーから誘導された「ノックアウト」トランスジェニックマウスにおける個々の遺伝子の面倒な突然変異分析。
【０００７】
B）アルキル化剤によるマウス遺伝子のin vivoでのランダム突然変異、およびそれに続く、多数突然変異を同定するための全ゲノム配列分析。
【０００８】
既知機能を有する密接に関連した遺伝子に対する配列相同性に基づき機能が推定されうる場合には、ノックアウトアプローチは有効であるが、このアプローチは長時間を要し、労働集約的である。
【０００９】
アルキル化アプローチは専ら、突然変異部位を同定するための全ゲノム配列決定、ならびに既に確認された行動形質および代謝結果における変化のカタログ化に基づくものである。ついで表現型変化の同定を、標的マウスゲノム中のおそらく100個のアルキル化事象に対して補正しなければならない。このアプローチも長時間を要し、大きなマウスライブラリーの作製および維持を要し、マウスの近交系に限られる（比較のための総説としては、Abuinら, (2002) TIB 20, 36-42を参照されたい）。
【００１０】
突然変異を得るためのもう1つの方法はゲノム内への外因性DNAの導入によるものである。  
トランスポゾンは、ある種のゲノム内の或る位置から別の位置へ跳躍または転位しうる天然遺伝因子である。トランスポゾンの動員（mobilization）は、トランスポゾンDNAに隣接する配列に結合してゲノム内の或る位置からのDNAの切除およびそのゲノム内の別の位置での再挿入をもたらしうるトランスポザーゼ酵素の発現に基づいている。遺伝子配列内への挿入は遺伝子機能の変化を招き、そしてこれは完全生物における測定可能な表現型変化を引き起こしうる。
【００１１】
3つの「古典的」モデル動物であるハエ、線虫およびマウスのうち、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）およびシー・エレガンス（C. elegans）については、効率的なトランスポゾンに基づく挿入方法が開発されている。ショウジョウバエ（Drosophila）におけるP因子媒介性遺伝子導入および挿入型突然変異誘発の採用（Spradling & Rubin (1982) Science 218, 341-347）は、ショウジョウバエの遺伝学を一変させ、他の真核生物における同等の方法を開発するための先例を築いた。しかし、P因子は非常に限定された宿主域を有するため、線虫、植物、哺乳類、魚類、例えばゼブラフィッシュおよび鳥類を含む種々の複雑な真核生物における遺伝子導入および／または突然変異誘発のためのベクターとしては過去10年間においては他の因子が使用されている。
【００１２】
Tc1ファミリー因子のメンバーであり2型トランスポゾンであるMinosはディー・ヒデイ（D. hydei）から単離され、キイロショウジョウバエ、シー・キャピタタ（C. capitata）およびアノフェレス・ステフェンシ（Anopheles stephensi）の生殖系列形質転換に使用されている（Loukeris, T. G.ら (1995) Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 9485-9; Loukeris, T. G.ら (1995) Science, 270, 2002-5, Catteruccia F.ら (2000) Nature 405 959-962）。また、一過性動員（transient mobilisation）アッセイを用いて、それがキイロショウジョウバエ、ネッタイシマ蚊（Aedes aegypti）、アノフェレス・ステフェンシ（Anopheles stephensi）およびカイコ（Bombyx mori）の胚ならびにキイロショウジョウバエ、ネッタイシマ蚊（Aedes aegypti）、アノフェレス・ガンビエ（Anopheles gambiae）およびスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）の細胞系において活性であることも示されている（Catteruccia, F.ら (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 2157-2162., Klinakisら (2000) EMBO Reports 1:416-421; Shimizuら: Insect Mol Biol 2000 Jun;9(3):277-81）。
【００１３】
キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のhobo因子がGelbart WM, Blackman RK, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol (1989);36:37-46に記載されている。  
魚類から再構成されたTc1／mariner様転位因子であるSleeping Beauty（SB）トランスポゾンのようなサケ科型トランスポゾンが、Ivicsら (1997) Cell 91, 501-510およびHorieら (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Issue 16, 9191-9196に記載されている。
【００１４】
marinerは、最初はドロソフィラ・マウリチアナ（Drosophila mauritiana）から単離されたトランスポゾンであるが、現在では、いくつかの無脊椎動物および脊椎動物種で見出されている。生物の形質転換のための、marinerの使用が、国際特許出願WO99/09817に記載されている。
【００１５】
Hermesは一般的なイエバエに由来する。トランスジェニック昆虫の作製におけるその使用が米国特許第5,614,398号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００１６】
PiggyBacは、バキュロウイルス宿主トリクプルシア・ニィ（Trichplusia ni）に由来するトランスポゾンである。チチュウカイミバエ（Medfly）の生殖系列形質転換のためのその使用がHandlerら, (1998) PNAS (USA) 95:7520-5および米国特許第6,218,185号に記載されている。
【００１７】
欧州特許出願0955364（Savakisら）（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、細胞、植物および動物を形質転換するための、Minosの使用を記載している。1以上のMinosの挿入を含むトランスジェニックマウスの作製も記載されている。  
国際特許出願WO99/07871は、シー・エレガンスおよびヒト細胞系の形質転換のための、シー・エレガンス由来のTc1トランスポゾンの使用を記載している。  
エンハンサートラップおよび遺伝子タグ付け（遺伝子タギング）のための、キイロショウジョウバエにおけるショウジョウバエP因子の使用が記載されている。Wilsonら, (1989) Genes dev. 3:1301; Spradlingら, (1999) Genetics 153:135を参照されたい。
【００１８】
先行技術で記載されている技術においては、トランスポゾンの跳躍（または転位）を誘導するための同族（cognate）トランスポザーゼの使用が必要であることが認識されている。トランスジェニック動物は、記載されている場合には、例えばトランスポザーゼ遺伝子でのコトランスフェクションによりシスまたはトランスで付与されるトランスポザーゼを有する。
【００１９】
転位因子媒介性形質転換のための標準的な方法は、2つのプラスミド［一方は、トランスポザーゼを発現するが転位能を有さず（ヘルパー）、もう一方は、該因子の逆方向末端反復配列に隣接した目的とする遺伝子を保持する（ドナー）］の混合物を前胞胚葉胚内に共注入することによるものである。注入された動物の形質転換後代は優性マーカー遺伝子の発現により検出される。
【００２０】
PCT/EP01/03341（WO 01/71019）は、転位因子を使用したトランスジェニック動物の作製を記載している。この方法によれば、トランスジェニック生物（それらのうちの1つはトランスポゾン機能を付与し、他方はトランスポザーゼ機能を付与して、要求される細胞または組織内にトランスポゾンとトランスポザーゼとの両方を含有する生物を与える）の交配によりトランスポザーゼ機能が付与される。組織特異的クロマチンオープニング（chromatin opening）ドメインの使用はトランスポザーゼ活性を組織特異的に導き、複数の独立した転位事象を体細胞組織において引き起こす（Zagoraiouら (2001) P.N.A.S. 98 11474-11478）。
【００２１】
複雑なゲノム内の位置変化を迅速に決定し隣接遺伝子を配列分析により決定することが可能となるよう、転位を「タグ付け」することができる。これは、原因（すなわち、特定の遺伝子または調節エレメントにおける挿入事象）と結果（すなわち、測定可能な変化の表現型）とを直接的に関連づけることを可能にする。しかし、転位により遺伝的修飾を誘導するための従来の方法は、転位が生じた組織が、それぞれが特有の転位を有する個々の細胞のモザイクになるという欠点を伴う。その結果、各転位事象が特有のものとなるため、転位事象の表現型結果の分析の実施が困難となりうる。したがって、多数の細胞において同じ遺伝的修飾が得られるよう転位事象を制御するための方法は当技術分野に重要な貢献をもたらすと認識されうる。
【発明の概要】
【００２２】
発明の概要
本発明の第1の態様においては、トランスジェニック後代を作製し転位を誘導するための方法であって、
（a）トランスポゾンのコピーの1以上を自身のゲノム内に含む第1成体トランスジェニック生物を作製し、
（b）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子のコピーの1以上および／または前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を調節しうる因子を自身のゲノム内に含む第2成体トランスジェニック生物を作製し、
（c）前記第1成体トランスジェニック生物を前記第2トランスジェニック成体生物と交配させて、（i）前記トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む後代を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列の制御下にあり、
（d）前記後代において前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を誘導して、前記後代の組織または細胞の少なくとも一部において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程を含んでなる方法を提供する。
【００２３】
したがって、別の表現をすると、本発明は、トランスポゾンの動員によるトランスジェニック後代の生産方法であって、
（a）（i）トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする1以上の遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む後代を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列の制御下にあり、
（b）前記後代において前記トランスポザーゼの発現を誘導して、前記後代の組織または細胞の少なくとも一部において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程を含んでなる方法を提供する。
【００２４】
適切には、第1成体トランスジェニック生物は、安定に組込まれた「休眠（dormant）」トランスポゾンを含むトランスジェニック系統でありうる。そのようなトランスジェニック系統は、標準的なES細胞技術を用いて作製することができる。休眠トランスポゾンは、第2成体トランスジェニック生物との交配により転位するように誘導することができる。したがって、本発明は、数千の突然変異後代（例えば、マウス突然変異体）の迅速な生産を可能にしうる方法を提供する。
【００２５】
「後代」は、第1トランスジェニック生物と第2トランスジェニック生物との間の生殖の産物を意味する。  
好ましい実施形態においては、トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列は、生殖系列の発生中のトランスポザーゼの特異的発現を可能にする配列である。したがって、後代の生殖細胞は転位事象を有する。
【００２６】
図13は、雌がトランスポゾンおよびトランスポザーゼを供与するin vivo転位を示す概要図である。転位は卵母細胞内で生じる。雄との交配後に突然変異体が得られる。  
したがって、1つの実施形態においては、後代は、前記の第1トランスジェニック生物と第2トランスジェニック生物との間の生殖から生じた雌トランスジェニック生物である。この実施形態においては、トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列は、雌後代における卵形成中のトランスポザーゼの特異的発現を可能にする配列である。したがって、トランスポザーゼの発現は卵形成の際に誘導される。そしてこれは、卵母細胞内で生じる生殖系列転位事象を引き起こして、挿入配列を有する卵母細胞を産生する。
【００２７】
この実施形態においては、トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列は、発生中の卵母細胞において発現される遺伝子の調節配列に由来する。適当な調節配列には、Zp3、Zp1、Zp2、Gdf9、Bmp15、FiglaおよびMater（例えば、Rajkovic and Matzuk, Molecular and Cellular Endocrinology 187(2002), 5-9を参照されたい）のような卵母細胞遺伝子の発現を制御する調節配列が含まれる。他の適当な調節配列は、Oct-4の調節配列に由来するものでありうる。
【００２８】
図14は、雌がトランスポゾンを供与し雄がトランスポザーゼを供与するin vivo転位を示す概要図である。転位は精子内で生じる。  
したがって、もう1つの実施形態においては、後代は、前記の第1トランスジェニック生物と第2トランスジェニック生物との間の生殖から生じた雄トランスジェニック生物である。この実施形態においては、トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列は、雄後代における精子形成中のトランスポザーゼの特異的発現を可能にする配列である。したがって、トランスポザーゼの発現は精子形成の際に誘導される。そしてこれは、精母細胞内で生じる生殖系列転位事象を引き起こして、挿入配列を有する精母細胞を産生する。
【００２９】
この実施形態においては、トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列は、発生中の精母細胞において発現される遺伝子の調節配列に由来する。適当な調節配列には、H1t遺伝子の転写産物（Bartellら Biol Of Reproduction 2000; Aug; 63(2); 409-16）のような精母細胞特異的mRNAの発現を制御する調節配列が含まれる。
【００３０】
適切には、ついで、生殖系列内で生じた転位事象を有する後代同士を交配させて、転位事象が特徴づけられうる後代を得る。生殖系列転位を有する後代を、生殖系列転位を有するようそれ自体で産生した配偶体または正常な配偶体と交配させることが可能である。
【００３１】
本発明のもう1つの実施形態においては、「後代」は胚である。したがって、この実施形態においては、トランスジェニック胚を作製し転位を誘導するための方法であって、
a）トランスポゾンのコピーの1以上を自身のゲノム内に含む第1成体トランスジェニック生物を作製し、
b）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子のコピーの1以上および／または前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を調節しうる1以上の配列を自身のゲノム内に含む第2成体トランスジェニック生物を作製し、
c）前記第1成体トランスジェニック生物を前記第2トランスジェニック成体生物と交配させて、（i）前記トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む胚を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列の制御下にあり、
d）前記胚において前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を誘導して、前記胚の組織または細胞の少なくとも一部において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程を含んでなる方法を提供する。
【００３２】
したがって、別の表現をすると、本発明は、トランスポゾンの動員によるトランスジェニック胚の生産方法であって、
a）（i）トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする1以上の遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む胚を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列の制御下にあり、
b）前記胚において前記トランスポザーゼの発現を誘導して、前記胚の組織または細胞の少なくとも一部において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程を含んでなる方法を提供する。
【００３３】
本明細書に記載の「胚」は、脊椎動物または無脊椎動物の場合には出生または孵化あるいは植物の場合には発芽の時点までの、単一の受精卵または接合体から発生する構造体を意味すると理解されるべきである。したがって、本発明の場合には、「胚」は哺乳動物の胎児をも含むと理解されるべきである。
【００３４】
図15は、雄がトランスポゾンを供与し雌がトランスポザーゼを供与するin vivo転位を示す概要図である。転位は卵または初期胚内で生じる。  
胚の細胞または組織におけるトランスポゾンの動員は、胚発生の任意の時点、例えばある所定の胚発生段階において誘導することが可能である。そのような発生段階において転位を誘導することにより、単一の細胞の突然変異遺伝子が後続の細胞分裂において複製されて、転位遺伝子に関して実質的に均質な細胞群が得られうる。したがって、転位遺伝子は特定の組織または組織群の細胞の幾つかまたは全てに存在しうる。したがって、本発明は、1以上の個々の突然変異に関して均質な細胞のクローン集団の1以上を含むトランスジェニック胚および生物の生産を可能にする。
【００３５】
したがって、本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の方法により、トランスジェニック胚を作製し、それにおいて転位を誘導することを含んでなる、トランスポゾンの動員により修飾された遺伝子に関して均質な複数の細胞または組織を有するトランスジェニック生物の生産方法を提供する。
【００３６】
発生中の種々の時点における転位の調節を可能にすることにより、本発明の方法は、ゲノム全体にわたる転位の可能性を増加させる。なぜなら、転写複合体に接近しうるクロマチンドメイン、そしておそらくは転写事象も、胚発生中、そして更には成体の期間および腫瘍のような異常な増殖状態の種々の時点の細胞組織型に応じて様々となるからである。
【００３７】
ゲノムの特定の領域において転位が達成される可能性は、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を制御するためにクロマチンオープニング（chromatin opening）ドメイン、例えば遍在的作用性クロマチンオープニングエレメント（ubiquitously-acting chromatin opening element）（UCOE）（PCT/GB99/02357（WO 0005393））、遺伝子座調節領域（LCR）（Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol.10, 361-365）、CpGアイランドまたはインスレーター（insulator）を使用することにより増加させることが可能である。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態においては、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子および／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節する配列をクロマチンオープニングドメイン内に組込んで、胚の標的組織において転位が達成される可能性を増加させて、転位事象に関して均質なその組織の細胞集団の生成を可能にさせる。例えば、ある一定の組織における転位を誘導することが望ましい場合には、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子および／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節する配列を、その組織におけるトランスジーンの発現に組織特異的制御をもたらす遺伝子座調節領域内に組込む。特異的LCRが利用できない組織における転位を誘導することが望ましい場合および／または特定の組織における転位の初期誘導を誘導することが望ましい場合には、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子および／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節する配列をUCOE内に組込むことが可能である。本発明の特に好ましい実施形態においては、トランスポゾンとトランスポザーゼをコードする遺伝子との両方をクロマチンオープニングドメイン内に組込む。これは、有利にも、胚発生中のゲノムの全体にわたる特定の遺伝子座における転位の効率を増加させて、特定の転位事象に関して均質な1以上の細胞集団の産生を可能にする。
【００３９】
したがって、本発明は更に、第3の態様において、トランスジェニック胚を作製し転位を誘導するための方法であって、
a）トランスポゾンのコピーの1以上を自身のゲノム内に含む第1成体トランスジェニック生物を作製し、
b）第2成体トランスジェニック生物を作製し、
c）前記第1成体トランスジェニック生物を前記第2トランスジェニック成体生物と交配させて、（i）前記トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む胚を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする1以上の調節配列の制御下にあり、前記トランスポゾンおよび／または前記トランスポザーゼをコードする遺伝子および／または前記トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節する配列はクロマチンオープニングドメイン内に位置し、
d）前記胚において前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を誘導して、前記胚の組織または細胞の少なくとも一部において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程を含んでなる方法を提供する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態においては、トランスポゾンのコピーの1以上を含むトランスジェニック生物である第1生物を、同族トランスポザーゼをコードする調節可能な遺伝子のコピーの1以上を自身のゲノム内に含むトランスジェニック生物である第2生物と交配させることにより、胚を作製する。もう1つの実施形態においては、トランスポゾンと同族トランスポザーゼをコードする遺伝子との両方のコピーの1以上を含むトランスジェニック生物である第1生物を、トランスポザーゼの発現を可能にするのに必要な調節因子のコピーの1以上を含む第2生物と交配させることにより、胚を作製することが可能である。
【００４１】
好ましい実施形態においては、トランスポゾンとトランスポザーゼをコードする遺伝子とが単一の構築物として与えられ、この場合、トランスポゾンが動員されると、トランスポザーゼをコードする遺伝子が破壊されて、トランスポゾンの更なる動員が制限される。これは、トランスポゾンが動員されるとトランスポザーゼ遺伝子が破壊される配向で、トランスポザーゼ遺伝子を遮断するイントロン内にトランスポゾンの逆方向反復配列の1つを配置することにより達成されうる。このベクターは、調節因子、トランスポザーゼ遺伝子およびトランスポゾンを含有するトランスジェニック生物を生産するために単一の交配工程を用いることを可能にする。さらに、転位はトランスポザーゼ源の完全な不活性化を招いて、誘導因子の存在下での新たな挿入事象の安定性をもたらす。図1は、本発明におけるそのようなベクターの使用を図示する。
【００４２】
一次トランスポザーゼ機能を排除するために、Cre/lox機能（その詳細はSauer, Methods of Enzymology; 1993, Vol. 225, 890-900に概説されている）および異なるトランスポゾン／トランスポザーゼ組合せ体の組込みを用いることも可能である。しかし、本発明の他の実施形態においては、トランスポザーゼ遺伝子は転位の際に破壊されず、例えば誘導因子の投与の際に更なるトランスポゾン動員を可能にする。
【００４３】
本発明の方法においては、当業者の公知の任意の系を使用して転位を誘導することが可能である。内因性物質の適用または内因性シグナル（例えば、発生調節シグナル）の作用を介したトランスポザーゼ遺伝子の発現の誘導により、転位を誘導することが可能である。
【００４４】
トランスポザーゼをコードする遺伝子を制御する1以上の調節配列は、誘導可能な調節配列でありうる。例えば、適当な誘導系には、tetに基づく系、lacオペレーター-リプレッサー系、エクジソンに基づく系およびエストロゲンに基づく系が含まれ、それらの詳細については後述する。外因性誘導因子を、任意の簡便な方法、例えば、母動物もしくは胚への注入により、または母動物への食物もしくは水の供給の添加物として、付与することが可能である。転位は胚発生中に1回以上誘導することが可能である。したがって、発生の1以上の段階において1回だけまたは反復して誘導因子を投与することが可能である。
【００４５】
本発明の他の実施形態においては、胚発生の特定の段階で生じた遺伝子調節シグナルに応答して、トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現が誘導されうる。そのような制御は、トランスポザーゼをコードする遺伝子を、発生調節配列またはプロモーター（例えば、一過性発現発生調節タンパク質のような特定の遺伝子調節シグナルに応答する発生調節特異的プロモーター）のような遺伝子調節配列の制御下に配置することにより達成することができる。トランスポザーゼをコードする遺伝子がそのような制御下にある場合には、トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現は、遺伝子調節シグナル（例えば、一過性発現発生調節タンパク質）が産生された場合またはそのようなシグナルタンパク質が例えば注入により胚に若しくは母動物の飼料中に導入された場合にのみ生じる。
【００４６】
本発明の方法を用いて、トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現の時機を制御すること、したがって胚における転位の誘導の時機を制御することが可能である。  
トランスポザーゼ遺伝子の発現の持続時間および効果を厳密に制御し、それにより更には転位の時機を制限することが望ましい実施形態においては、トランスポザーゼをコードする遺伝子をトランスポゾンと同じ構築物内に配置して、トランスポゾンの動員に際して、トランスポザーゼをコードする遺伝子が破壊され、更なるトランスポザーゼの産生が妨げられて、更なる転位が制限されるようにすることが可能である。
【００４７】
このようにして誘導の時間を選択することにより、胚発生の或る所定の段階でトランスポゾンの動員を誘導することができる。例えば、発生の非常に初期の段階、例えば接合体段階、4細胞胚、64細胞胚など、あるいはより後の発生段階において、転位を誘導することができる。
【００４８】
1つの実施形態においては、初期受精卵（例えば、2または4細胞段階）においてトランスポザーゼ遺伝子の発現を駆動する1以上の調節配列の制御下にトランスポザーゼを配置することによる転位の誘導が望ましい。トランスポザーゼの発現をこの段階で制御するための適当な調節配列は、この段階で発現が活性化される遺伝子の調節配列に由来するものでありうる。そのような遺伝子には、ZP3、Oct-4（Kirchofら Biol Reprod 2000, Dec; 63(6):1698-705）ならびに母性効果遺伝子、例えばZp1、Zp2、Gdf9、Bmp15、FiglaおよびMaterが含まれる。他の適当な遺伝子には、hsp70.1（Bevilacquaら Development 2000; Apr; 127(7):1541-51）が含まれる。
【００４９】
発生段階に応じて、転位が生じた細胞は更なる細胞分裂周期において分裂して、初期転位事象に関して均質な細胞集団を与えうる。転位が2回以上誘導された場合には、細胞集団は2以上の転位事象のそれぞれに関して均質でありうる。したがって、発生段階に応じて、1以上の組織、完全な組織または組織群内の細胞集団において挿入事象が存在しうる。挿入事象の厳密な性質は、それが幾つかまたは全ての胚組織および生体組織において機能的遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを決定する。したがって、胚発生中または成体細胞および組織において、修飾遺伝子の遺伝子発現パターンをモニターすることが可能である。
【００５０】
さらに、急速に増殖している成体細胞および幹細胞由来の組織において、典型的には組織の再生中または細胞および組織の維持中に、初期転位事象に関して均質な類似した細胞集団を作製することも可能である。そのような細胞および組織の具体例には、迅速なターンオーバーおよび／または幹細胞からの再生（成体におけるもの）を受ける、腸の裏打ち層、肝臓および血液の細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。同様に、転位事象に関して均質な細胞集団を腫瘍において作製することが可能である。本発明の方法は、そのような成体細胞において初期転位事象に関して均質な細胞集団が得られるように応用することが可能である。
【００５１】
したがって、本発明の他の実施形態においては、胚におけるトランスポザーゼの発現を誘導する代わりにまたは好ましくはそれに加えて、生物の組織または細胞の少なくとも一部におけるトランスポゾンの動員を引き起こさせるために新生児、若い成体または成体の生物におけるトランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を誘導することにより、本発明の第1または第3の態様の工程（d）を修飾することが可能である。したがって、本発明の方法は、新生児、若い成体または成体の生物における或る所定の発生段階において誘導される転位事象に関して均質な細胞集団の生産を可能にする。そのような実施形態においては、トランスポゾンまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、トランスジーンの組織特異的制御を可能にする遺伝子座調節領域の制御下にある。例えば、肝細胞において転位を誘導することが望ましい場合には、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子を、肝細胞内での発現に関連した遺伝子座調節領域の制御下に配置することが可能である。
【００５２】
転位事象を接合体の初期発生において誘導する場合には、転位を有するES細胞系を発生させることが可能である。これらのES細胞系を配列決定し、特徴づけし、将来の使用のために保存することが可能である。
【００５３】
本発明によるトランスポゾン挿入の結果としてのトランスジェニック生物における遺伝的突然変異の生成は生物における新規表現型変異を与えうる。本発明の方法を使用することにより、1以上の細胞塊または組織塊のそれぞれが、異なる転位事象（そのそれぞれは表現型効果を与えるものであっても与えないものであってもよい）に関して均質であるトランスジェニック胚を生産することができる。したがって、本発明の方法を使用することにより、挿入事象が生じていない対応する細胞または組織の表現型と比較した場合の表現型変異をそれぞれが示す1以上の細胞塊または細胞群を含む胚およびそれから発生した成体を生産することが可能である。
【００５４】
トランスジェニック胚の表現型に対する転位事象の効果は、もちろん、転位が生じる発生段階に或る程度は左右される。転位を例えば単一の接合体の段階で誘導する場合には、それから発生した胚の全細胞が挿入事象に関して均質となるであろう。したがって、転位事象、例えば挿入事象が、各細胞にとって致死的である表現型の変化を引き起こす場合には、その胚は発生しないであろう。より後の発生段階において転位事象が誘導された場合には、転位事象が生じた細胞の細胞分裂に由来する細胞塊または組織塊に各挿入事象が存在するであろう。したがって、これは、同じ表現型変異を示す細胞のそれぞれを与えうる。例えば、特定の器官の特定の組織の細胞の幾つかまたは全てが由来する細胞において転位事象が誘導された場合には、挿入事象の表現型上の効果は細胞、特定組織または特定器官に限定されたものとなりうる。特定の器官の特定の組織の細胞の幾つかのみが由来する細胞において転位事象が誘導された場合には、組織の全細胞が転位事象を示す場合に観察されうるものより穏やかな表現型が転位事象から生じうる。転位事象が細胞にとって致死的である場合には、細胞は生存しないであろう。特定の組織または器官を構成する全細胞に挿入事象が存在する場合には、その組織または器官は機能したり発生したりすることができず、胚は生存し得ない。あるいは、転位事象は非致死的な表現型上の効果を有しうる。例えば、転位事象が、影響を受けた細胞における酵素の機能をモジュレーションする効果を有していて、影響を受けていない細胞と比較した場合の代謝における相対的変化を引き起こしうる。したがって、これは、変異表現型の組織の領域が、正常表現型または更には別の変異表現型の同じ組織の領域に隣接して存在する肝臓のような器官を与えうる。したがって、生物内の変異表現型の分布は、転位が誘導された胚発生段階に左右されるであろう。さらに、本発明の幾つかの実施形態においては、「第2ラウンド」の転位の誘導が、因子の切除により引き起こされた表現型の逆転（inversion）、または更に重要なことには、相互作用性遺伝子への新たな挿入により引き起こされた表現型の修飾の検出に有用でありうる。
【００５５】
トランスジェニック生物の細胞、組織または器官における表現型変異は、それらの細胞、組織または器官のゲノム内の転位事象にさかのぼって追跡することが可能である。  
したがって、第4の態様において、本発明は、トランスジェニック生物における遺伝的突然変異を検出し特徴づけるための方法であって、
（a）本発明の第1もしくは第3の態様の方法または本発明の第2の態様のトランスジェニック生物により、トランスジェニック胚を作製し、それにおいて転位を誘導し、
（b）前記トランスジェニック胚またはそれから発生した後代において、変異表現型を示す複数の細胞の存在を同定し、
（c）1以上の前記細胞のゲノム内の1以上のトランスポゾン転位事象の位置を検出し、前記転位事象の位置を、観察された変異表現型と相関させる工程を含んでなり、前記転位事象の位置が、観察された変異表現型に関連した1以上の遺伝子座の位置を示す方法を提供する。
【００５６】
「転位事象」は、トランスポゾンの動員により引き起こされるゲノム配列内の変化であり、挿入事象、切除事象または染色体切断を含む。  
挿入事象は、トランスポゾンの核酸配列をプローブすることによるトランスポゾンの存在に関するスクリーニングにより検出することができる。また、切除は、切除後に残された「署名」配列により同定することができる。
【００５７】
本発明の第5の態様は、トランスジェニック動物の複数の細胞における表現型特徴に相関する遺伝子を単離するための方法であって、
（a）本発明の第1もしくは第3の態様の方法または本発明の第2の態様のトランスジェニック生物により、トランスジェニック胚を作製し、それにおいて転位を誘導し、
（b）前記トランスジェニック胚またはそれから発生した後代において、前記表現型特徴を示す複数の細胞の存在を同定し、
（c）1以上の前記細胞のゲノム内の1以上のトランスポゾン転位事象の位置を検出し、
（d）その挿入を含む遺伝子座をクローニングする工程を含んでなる方法を提供する。
【００５８】
前記修飾の遺伝子座は、厳密には、トランスポゾン挿入を位置決定することにより同定することができる。隣接領域の配列決定は、データベース中の遺伝子座の同定を、遺伝子座を配列決定する必要性を潜在的に伴うことなく可能にする。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、トランスポゾンは天然トランスポゾンでありうる。好ましくは、それはMinosのような2型トランスポゾンである。最も有利には、それはMinosである。他のトランスポゾンには、mariner、Hermes、piggyBac、hoboおよびサケ科型トランスポゾン、例えばSleeping Beautyが含まれる。
【００６０】
1以上の異種コード配列および／または発現制御配列を含む修飾トランスポゾンも本発明において使用することができる。そのようなコード配列には、ゲノム内のトランスポゾンの同定およびトランスポゾンが組込まれている遺伝子座のクローニングを促進しうる選択可能なおよび／または選択可能でないマーカー遺伝子が含まれうる。適当なマーカーには、蛍光性および／または発光性ポリペプチド、例えばGFPおよびその誘導体、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）が含まれる。
【００６１】
そのようなマーカーは、例えば、エンハンサーまたはエキソンの近傍に、発現レベルでモジュレーションされるマーカー遺伝子を含むトランスポゾンを挿入することにより、in vivoエンハンサーまたはサイレンサートラップおよびエキソントラップにおいて使用することができる。エキソンおよびエンハンサートラップにおいて使用する構築物はEP 0955364に記載されている。本発明の方法を使用することにより、転位事象に関して均質な複数の細胞または組織がマーカー遺伝子の発現のモジュレーションを示して、エンハンサーおよび／またはサイレンサーおよび／またはエキソンの効率的なトラップを可能にしうる。さらに、特定の型の細胞または組織の一部のみが転位事象に関して均質である実施形態においては、マーカー遺伝子の発現のモジュレーションは、そのようなモジュレーションを示さない同じトランスジェニック動物における同じ型の細胞または組織との比較により同定することができる。
【００６２】
したがって、本発明は更に、第6の態様において、トランスジェニック動物にけるエンハンサーまたはサイレンサーを単離するための方法であって、
（a）本発明の第1もしくは第3の態様の方法または本発明の第2の態様のトランスジェニック生物により、トランスジェニック胚を作製し、それにおいて転位を誘導し、ここで、トランスポゾンは最小プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含んでいて、それが基底レベルで発現され、
（b）前記トランスジェニック胚またはそれに由来する後代の細胞または組織の1以上における前記レポーター遺伝子の発現のレベルを評価し、
（c）前記基底発現レベルと比較して前記レポーター遺伝子のモジュレーションが上昇または低下している細胞または組織の1以上における遺伝子座を同定しクローニングし、
（d）前記細胞または組織におけるそのクローニングされた遺伝子座を特徴づけする工程を含んでなる方法を提供する。
【００６３】
第7の態様においては、トランスジェニック動物におけるエキソンを単離するための方法であって、
（a）本発明の第1もしくは第3の態様の方法または本発明の第2の態様のトランスジェニック生物により、トランスジェニック胚を作製し、それにおいて転位を誘導し、ここで、トランスポゾンは、翻訳開始配列を欠くがスプライス受容配列を含むレポーター遺伝子を含み、
（b）前記胚またはそれに由来する後代において、前記レポーター遺伝子が発現される1以上の細胞または組織を同定し、
（c）前記細胞または組織から、その発現されるレポーター遺伝子を含む遺伝子座をクローニングする工程を含んでなる方法を提供する。
【００６４】
図2、3および4は、本発明のこれらの態様において使用する胚の作製に使用しうる遺伝子トラップ構築物を図示する。
【００６５】
図2は、誘導性TetOプロモーターの制御下にあるトランスポザーゼ構築物と、最小プロモーターの制御下に自己蛍光タンパク質（AFP）をコードするマーカー遺伝子を含むトランスポゾンとを示す。両方の構築物を含むトランスジェニック胚においては、誘導性TetOプロモーターの活性化によりトランスポザーゼの発現が誘導されることが可能であり、それにより、トランスポゾン構築物の転位が達成されうる。エンハンサー部位またはその近傍におけるゲノム内への組込みがマーカー遺伝子の発現により検出されうる。
【００６６】
図3は、誘導性TetOプロモーターの制御下にあるトランスポザーゼ構築物と、翻訳開始配列を欠くがスプライス供与配列を含むAFP蛍光レポーター遺伝子を含むトランスポゾンとを示す。両方の構築物を含むトランスジェニック胚においては、誘導性TetOプロモーターの活性化によりトランスポザーゼの発現が誘導されることが可能であり、それにより、トランスポゾン構築物の転位が達成されうる。適当な配向でのイントロン内への組込みがマーカー遺伝子の発現により検出されうる。
【００６７】
好ましい実施形態においては、遺伝子の発現をアップレギュレーションするためにトランスポゾンを使用することができる。例えば、エンハンサーまたは他の転写活性化エレメントを含むようにトランスポゾンを修飾することができる。遺伝子の近傍におけるそのようなトランスポゾンの動員および挿入は遺伝子または遺伝子座の発現をアップレギュレーションする。この実施形態は、トランスポゾンの局在化によりクローン腫瘍において同定されうる癌遺伝子の単離における特有の利点を有する。
【００６８】
図4は、本発明のこの態様に使用する胚の作製に使用しうる遺伝子活性化系を示す。図4は、誘導性TetOプロモーターの制御下にあるトランスポザーゼ構築物と、同様に誘導性TetOプロモーターの制御下にAFP蛍光マーカー遺伝子を含むトランスポゾンとを示す。両方の構築物を含むトランスジェニック胚においては、誘導性TetOプロモーターの活性化によりトランスポザーゼの発現が誘導されることが可能であり、それにより、トランスポゾン構築物の転位が達成されうる。さらに、AFPを含む転位構築物が異所性遺伝子の上流に挿入された場合には、遺伝子が活性化されることが可能であり、その表現型効果がTetOプロモーターの誘導の際に観察されうる。
【００６９】
転位により遺伝的修飾を誘導するための従来の方法においては、各細胞が特有の転位誘導性遺伝的修飾を有する細胞のモザイクが生じ、各転位事象の表現型上の効果の研究は困難である。同様に、転位細胞に対する天然刺激および人工的刺激の効果の研究を実施し解釈することは困難である。しかし、これとは対照的に、本発明の方法は、細胞塊または組織塊の1以上が単一の転位事象に関して均質であるトランスジェニック胚および生物の産生を可能にするため、例えば、均質な細胞塊におけるレポーター遺伝子発現を周囲の細胞または組織におけるレポーター遺伝子発現と比較することにより、薬理学的刺激または天然刺激の効果を容易に観察することが可能である。したがって、本発明の方法は、生理的刺激（例えば、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子）のような天然刺激または薬物発見アプローチ、毒物学研究などにおける薬物のような人工的刺激に対する、転位事象が生じた細胞の応答を研究するために使用することができる。それどころか、本発明の方法は、刺激に対する細胞塊または組織塊の応答をリアルタイムで観察することを可能にする。
【００７０】
したがって、本発明の第8の態様においては、トランスジェニック動物における刺激に応答性の遺伝子を同定するための方法であって、
（a）本発明の第1もしくは第3の態様の方法または本発明の第2の態様のトランスジェニック生物により、トランスジェニック胚を作製し、それにおいて転位を誘導し、ここで、トランスポゾンは最小プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含んでいて、それが基底レベルで発現され、
（b）前記刺激の非存在下、前記トランスジェニック胚またはそれに由来する後代の細胞または組織の1以上における前記レポーター遺伝子の発現のレベルを評価し、
（c）前記刺激を与え、
（d）前記基底発現レベルと比較して、前記刺激に応答して前記レポーター遺伝子のモジュレーションが上昇または低下している細胞または組織の1以上における遺伝子座を同定しクローニングする工程を含んでなる方法を提供する。
【００７１】
前記方法は更に、
（e）前記細胞または組織におけるそのクローニングされた遺伝子座を特徴づけする追加的工程を含むことが可能である。
【００７２】
したがって、本発明のこの態様は、分子的介入のための新規標的、例えば、ヒト、植物または動物における疾患の治療、殺虫剤、除草剤、抗真菌剤および抗細菌剤の開発のための標的の同定において使用することができる。
【００７３】
もう1つの用途としては、病理発生（例えば、マウス疾患モデルにおけるもの）の原因遺伝子の発見が挙げられる。遺伝子（例えば、キナーゼまたは受容体）の活性化が疾患の病理発生に関与している場合には、該遺伝子の例えば50％の不活性化は該疾患の表現型の1以上を改善または悪化させ得る。したがって、そのような遺伝子の2つのコピーの一方を不活性化するトランスポゾンが挿入された細胞群は罹患バックグラウンドを有する健常群（healthy clusters）として検出されうるであろう。
【００７４】
トランスポゾンは遺伝子内に挿入されうる。好ましくは、トランスポゾンは、転写される遺伝子内に挿入されて、開いたクロマチンにおける該トランスポゾンの局在化をもたらす。トランスポゾンは、クロマチンオープニングドメインエレメント、例えば、組織特異的発現をもたらす遺伝子座調節領域（Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol.10, 361-365）、または非組織特異的発現を可能にする遍在的作用性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）（例えば、WO 0005393を参照されたい）に隣接することが可能である。本発明の方法において使用しうる他のクロマチンオープニングドメインには、ハウスキーピング遺伝子または組織特異的遺伝子に通常は伴いうるCpGリッチアイランド、またはインスレーターが含まれる。
【００７５】
さらに、トランスポゾン自体は、トランスポゾンの両末端の間に、クロマチンオープニングドメインを含みうる。これは、トランスポゾンが組込まれるクロマチン構造の活性化を引き起こして、誘導性トランスポザーゼが細胞または組織特異的にそれに接近することを促す。  
同様に、トランスポザーゼ構築物は、クロマチンオープニングドメインエレメントを含むことまたはそれに隣接していることが可能である。
【００７６】
胚発生中および成体生存期間中に転位事象を調節しうることは、種々の発生時期に種々の組織に存在する複数のクロマチンドメインにおいて転位事象が生じる可能性を増加させる。
【００７７】
本発明の方法は、ある所定の発生段階においてトランスポゾンの動員により生じた遺伝的修飾に関して均質な細胞集団または組織集団の1以上をそれぞれが有する遺伝的に修飾された生物のライブラリーの作製において使用することができる。したがって、本発明のもう1つの態様においては、トランスポゾンの動員により修飾された遺伝子に関して均質な細胞集団または組織集団の1以上をそれぞれが有するトランスジェニック生物のライブラリーの生産方法であって、本発明の第1または第2または第3の態様の方法によるトランスポゾンの動員により細胞を修飾することを含んでなり、前記の所定の胚発生段階において工程（d）を行う生産方法を提供する。
【００７８】
そのような方法により生産されたトランスジェニック生物のライブラリーは本発明のもう1つの態様を構成する。
本発明は、以下の態様にも関する。
雄トランスジェニックマウス後代を作製するための方法であって、
（a）トランスポゾンのコピーの1以上を自身のゲノム内に挿入することにより第1成体トランスジェニックマウスを作製し、
（b）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子のコピーの1以上および前記トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を調節しうる因子を自身のゲノム内に挿入することにより第2成体トランスジェニックマウスを作製し、
ここで、前記第1および第2成体トランスジェニックマウスは疾患状態になり易いことが知られているバックグラウンドを有するマウス系統に由来するものであり、
（c）前記第1成体トランスジェニックマウスを前記第2トランスジェニック成体マウスと交配させて、（i）前記トランスポゾンのコピーの1以上と（ii）前記トランスポゾンのトランスポザーゼ同族体をコードする遺伝子との両方を自身の1以上の細胞のゲノム内に含む雄後代を得、ここで、前記トランスポザーゼをコードする遺伝子は、前記トランスポザーゼの発現を可能にする少なくともH1t遺伝子調節配列の制御下にあり、
（d）前記後代の生殖細胞において前記トランスポザーゼをコードする前記遺伝子の発現を誘導して、前記後代の精子形成過程において前記トランスポゾンの動員を引き起こさせる工程
を含んでなる、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図1は、本発明の或る実施形態における自己不活性化自律性トランスポゾン構築物の使用を図示する。調節因子構築物を含むゲノムを有する第1トランスジェニック生物（A）を、目的とする遺伝子を含むトランスポゾンを含むゲノムを有する第2トランスジェニック生物（B）と交配させる。トランスポゾンの逆方向反復配列の一方は、トランスポザーゼ遺伝子を遮断するイントロン内に位置している。交配の後代（C）におけるトランスポゾンの動員の誘導に際して、トランスポザーゼ遺伝子が遮断されて、目的とする遺伝子の安定化された転位がもたらされ、この場合、誘導因子の存在下でさえも更なる転位事象は生じない。
【図２】図2は、トランスポザーゼ遺伝子が誘導性TetOプロモーターの制御下にあるトランスポザーゼコード化構築物と、本発明のエンハンサートラップ法において使用する、最小プロモーターの制御下にAFP蛍光マーカー遺伝子を含むトランスポゾンとを図示する。
【図３】図3は、誘導性TetOプロモーターの制御下にあるトランスポザーゼ構築物と、本発明のエキソントラップ法において使用する、翻訳開始配列を欠くがスプライス供与配列を含むAFP蛍光レポーター遺伝子を含むトランスポゾンとを図示する。
【図４】図4は、トランスポザーゼ構築物と、異所性遺伝子を同定するための遺伝子トラップにおいて使用するトランスポゾンとを図示する。
【図５】図5は、Minos由来ベクターpMiCMVGFPを示す。Minos逆方向末端反復配列は、太い黒矢印で示されている。これらの矢印の外側の白い枠は、D. hydeiのゲノム内の元のMinosエレメントに隣接する配列を示す。矢じりは、Minos切除を検出するために使用するプライマーの位置を示す。小さな矢印は、GFPおよびトランスポザーゼ遺伝子の転写の方向を示す。黒い棒線は、プローブとして使用する断片を表す。
【図６】図6は、実施例4に記載の本発明の実施形態において使用しうるMinosトランスポザーゼ発現カセットの構造を示す。6.5kbの5'隣接領域およびZP3遺伝子プロモーターをMinosトランスポザーゼcDNA（ILMi）ならびにヒトβグロビン遺伝子の第2イントロンおよびポリアデニル化部位に連結した。関連制限部位が示されている。
【図７】図7は、RT-PCR分析によるMinosトランスポザーゼ転写の検出を示す。分析した種々の組織が示されている。マウスヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を内部対照として使用した。消化されたpUC 18 DNA MspIをマーカー（M）として使用し、H2Oを陰性対照中で使用した。
【図８】図8は、転位事象を示す種々の後代のサザンブロット分析を示す。すべてのDNAサンプルをBgl IIで消化し、32P標識GFPプローブでプローブした。レーン1は対照（Chr 14上に多コピー体としてGFPトランスポゾンを保持し発生中の卵母細胞においてMinosトランスポザーゼを発現する雌マウス）である。レーン2、5、6、7、8、10および11は、二重トランスジェニック雌とwt雄との後代に対応する。それらはすべて、異なる転位事象を代表するものである。レーン2および5：2つの転位事象を有するマウス。レーン3および4は、挿入の分離（レーン3は第2染色体上、レーン4動原体付近の第14染色体上）を示す、2つの転位事象を有するレーン2のマウスの後代に対応する。レーン9：分離を示す、レーン8に示すマウスの後代。
【図９】図9は、マウス（Mus musculus）ゲノムにおける親のおよび4つの異なるMinos挿入の配列を示す。新たな挿入トランスポゾンに隣接する染色体配列は大文字で、トランスポゾン配列は小文字で、標的部位重複は赤で示されている。Celeraデータベースからの挿入およびスカフォールド数の染色体位置が示されている。
【図１０】図10は、Minos転写事象のFISH分析を示す。染色体を4',6'-ジアミノ-2-フェニルインドールで染色し、GFPプローブでプローブした（実施例4の「材料および方法」に記載のとおり）。パネルA：2つの転位事象（第2染色体上および第14染色体の動原体上；図8のレーン2を参照されたい）を有するマウス8218-01；赤色（矢じりで示されている）：チラミド増殖後に染色（実施例4の「材料および方法」を参照されたい）。パネルB：2つの転位事象（一方は第18染色体上、もう一方は、トランスポゾンコンカテマーの初期位置近傍の第14染色体のテロメア付近）を有するマウス8218-02（図8のレーン5）。緑色（矢じりで示されている）：FITC染色。黄色矢印は転位事象を示す。
【図１１】図11は、精子もしくは卵内でのトランスポザーゼの特異的発現のためのまたは遍在的発現のためのノックイン（A）および通常の構築物（B）を示す。図11Bにおいては、βグロビン3'第2エキソン（赤）、介在配列（緑）および第2エキソン（赤）が加えられている。
【図１２】図12は、トランスジェニックマウス用および／またはレトロウイルスプラスミド内へのクローニング用のトラップ構築物を示す。
【図１３】図13は、雌がトランスポゾンおよびトランスポザーゼを供与するin vivo転位を示す概要図である。転位は卵母細胞内で生じる。
【図１４】図14は、雌がトランスポゾンを供与し雄がトランスポザーゼを供与するin vivo転位を示す概要図である。転位は精子内で生じる。
【図１５】図15は、雄がトランスポゾンを供与し雌がトランスポザーゼを供与するin vivo転位を示す概要図である。転位は受精卵または胚内で生じる。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の技術は概ね、当技術分野でよく知られているが、特にSambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.を参考にすることができる。
【００８１】
[トランスポゾン]
本発明の方法においては、任意のトランスポゾンを使用することができる。好ましくは、トランスポゾンは、2型トランスポゾン、より好ましくは、Minos、mariner、Hermes、piggyBacおよびSleeping Beautyよりなる群から選ばれるものである。有利には、トランスポゾンはMinosである。各トランスポゾンはその天然同族トランスポザーゼと共に有利に使用されるが、修飾および／または改良されたトランスポザーゼの使用も予想される。Minosトランスポゾンおよびそれらの同族トランスポザーゼは、米国特許第5,840,865号および欧州特許出願EP 0955364に詳細に記載されている。
【００８２】
トランスポゾンは、好ましくは、異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。この配列は、トランスポゾンの組込みの際に、トランスポゾンと共に細胞のゲノム内に組込まれる。さらに、再動員の際にトランスポゾンが切除される場合に、該配列はトランスポゾンと共に切除される。好ましい実施形態においては、該異種ポリペプチドは選択マーカーである。これは、組込まれたトランスポゾンを有する細胞が同定され該組込み部位が正確にマッピングされることを可能にする。
【００８３】
[マーカー遺伝子]
好ましいマーカー遺伝子には、蛍光ポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。例えば、生物発光においてエネルギー転移受容体として作用する、刺胞動物のグリーン蛍光タンパク質（「GFP」）を、本発明において使用することができる。本明細書中で用いるグリーン蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を発するタンパク質であり、ブルー蛍光タンパク質は、青い蛍光を発するタンパク質である。GFPは、パシフィック・ノースウエスト（Pacific Northwest）クラゲであるエクオリア・ビクトリア（Aequorea victoria）、ウミシイタケ、レニラ・レニフォルミス（Renilla reniformis）およびフィアリジウム・グレガリウム（Phialidium gregarium）から単離されている（Wardら, 1982, Photochem. Photobiol., 35: 803-808; Levineら, 1982, Comp. Biochem. Physiol.,72B: 77-85）。最近、アントザ（Anthoza）種からも蛍光タンパク質が単離された（アクセッション番号AF168419、AF168420、AF168421、AF168422、AF168423およびAF168424）。
【００８４】
エクオリア・ビクトリア（Aequorea victoria）由来の天然に存在するGFPのアミノ酸配列を修飾することにより、有用な励起および発光スペクトルを有する種々のエクオリア（Aequorea）関連GFPが設計されている（Prasherら, 1992, Gene, 111: 229-233; Heimら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 12501-12504; PCT/US95/14692）。エクオリア（Aequorea）関連蛍光タンパク質には、例えば、野生型（天然）エクオリア・ビクトリア（Aequorea victoria）GFP（そのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列はGenbankアクセッション番号L29345、M62654、M62653など）、エクオリア（Aequorea）関連設計形態のグリーン蛍光タンパク質（そのうちのいくつかは前記で挙げられている）が含まれる。これらのうちのいくつか、すなわち、P4、P4-3、W7およびW2は、野生型よりも顕著に短い波長の蛍光を発する。
【００８５】
使用しうる他のマーカー遺伝子の具体例には、ネオマイシン、ピューロマイシンもしくはヒグロマイシンをコードする遺伝子のような選択マーカー遺伝子、またはシトシンデアミナーゼもしくはニトロレダクターゼの遺伝子のような対抗選択性遺伝子が含まれる。  
使用しうる多数のマーカー遺伝子が当業者に認識されている。適当な任意のマーカー遺伝子を使用することが可能であり、特定の選択は本発明に必須ではないと理解されるべきである。
【００８６】
[挿入および切除事象の同定]
トランスポゾン、およびトランスポゾンが切除され始めた位置は、配列分析により同定することができる。例えば、Minosは、典型的には、TA塩基対において組込まれ、切除の際に、4つのトランスポゾン末端ヌクレオチドに隣接した標的TA配列の重複物を後に残す。この配列または関連配列の存在は、配列決定、PCRおよび／またはハイブリダイゼーションのような技術により検出することができる。  
挿入されたトランスポゾンは、例えば、末端反復配列に相補的なPCRプライマーを使用する同様の技術により同定することができる。
【００８７】
[トランスポザーゼ]
有効なトランスポゾンの動員は、宿主細胞への転位因子自体の効率的な運搬と、トランスポゾンの跳躍を触媒するための該細胞内の有効な同族トランスポザーゼの存在との両方に基づいている。本明細書中で用いる「同族トランスポザーゼ」は、第1組込み部位からのトランスポゾンの切除および／または第2組込み部位におけるトランスポゾンの組込みを含むトランスポゾンの転位を活性化するのに有効な任意のトランスポザーゼである。好ましくは、同族トランスポザーゼは、天然におけるそのin vivo環境でトランスポゾンと天然で関連しているトランスポザーゼである。しかし、本発明は、有利に改良された活性を有しうる修飾トランスポザーゼも本発明の範囲内に包含する。例えば、トランスポザーゼをコードする遺伝子の配列は、コドン使用頻度を最適化して転位頻度を増加させるよう修飾することができる。コドン使用頻度の最適化は、ある与えられた遺伝子の発現レベルを増加させるための、当技術分野においてよく知られた方法である。あるいは、トランスポザーゼは、宿主生物における活性の増強をもたらす、アミノ酸の挿入、置換または欠失の1以上を含みうる。
【００８８】
トランスポザーゼをコードする遺伝子は、本発明の方法において使用する胚を産生させるために、トランスポゾンを自身のゲノム内に含む第1生物と交配される第2生物のゲノム内に配置されうる。もう1つの実施形態においては、胚を産生させるために、誘導性トランスポザーゼ発現を可能にするのに必要な調節エレメントのコピーの1以上を含む第2生物と交配されうる第1生物のゲノム内に、トランスポゾンと同族トランスポザーゼをコードする遺伝子との両方のコピーの1以上を配置する。
【００８９】
宿主細胞のゲノム内に遺伝子を導入するための多数の方法が当技術分野で公知であり、本発明の場合に使用することが可能である。例えば、トランスポザーゼ遺伝子をトランスジェニック技術により宿主細胞ゲノム内に挿入することが可能である。そのような方法については後記で更に詳しく説明する。
【００９０】
[トランスポザーゼ発現の調節]
トランスポザーゼをコードするコード配列は、必要に応じてトランスポザーゼ発現をモジュレーションする調節配列に機能しうる形で連結されていることが可能である。トランスポザーゼをコードする配列に機能しうる形で連結される調節配列には、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルが含まれる。これらの調節配列は、トランスポザーゼの発現が要求される宿主生物に適合するように選択されうる。プロモーターなる語は当技術分野においてよく知られており、サイズおよび複雑さにおいて、最小プロモーターから、上流エレメントおよびエンハンサーを含むプロモーターまで多岐にわたる核酸領域を包含する。
【００９１】
プロモーターは、典型的には、問題の生物と同種の細胞型、またはその生物が属する属、科、目、界もしくは他の分類において機能的であるプロモーターから選択されるが、異種プロモーターも機能することがあり、例えば、いくつかの原核性プロモーターは真核細胞において機能的である。プロモーターは、ウイルスまたは真核生物の遺伝子のプロモーター配列から誘導されうる。例えば、それは、発現が生じることになる細胞のゲノムから誘導されたプロモーターでありうる。真核性プロモーターに関しては、それは、遍在的に機能するプロモーター（例えば、αアクチン、βアクチン、チューブリン）あるいは組織特異的に機能するプロモーター（例えば、ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーター）でありうる。生殖系列の転位事象の生成においては、プロモーターは、配偶子形成（卵形成または精子形成）中に発現が誘導される遺伝子から誘導されうる。あるいは、接合子発生中の転位のような発生的に調節される転位事象の場合には、プロモーターは、発現が発生的に調節される遺伝子から誘導されうる。初期接合子における発現の場合には、母性効果遺伝子由来のプロモーターを使用することができる。また、それらは、特異的刺激に応答するプロモーター、例えば、ステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターでありうる。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復配列（MMLV LTR）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーターを使用することができる。
【００９２】
本発明においては、トランスポザーゼをコードする遺伝子は1以上の調節配列の制御下にあり、このことは、例えばプロモーターを使用して得られる発現レベルが調節されうることを意味する。例えば、調節配列は、誘導可能な調節配列でありうる。遺伝子発現のための誘導系は当技術分野で公知であり、それらにはテトラサイクリン、エクジソンおよびエストロゲン誘導系またはlacオペレーター-リプレッサー系が含まれる。
【００９３】
哺乳類細胞において広範に使用されているこの種の系としては、tetOプロモーター-オペレーターとテトラサイクリン／ドキシサイクリン抑制性転写アクチベーターtTAとの組合せ系（Tet-Off遺伝子発現系とも称される）（Gossen, M. & Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551）またはドキシサイクリン誘導性rtTA転写アクチベーターとの組合せ系（Tet-Onとも称される）（Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. & Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells. Science 268:1766-1769）が挙げられる。
【００９４】
Tet-Off系においては、テトラサイクリン（Tc）またはドキシサイクリン（Dox; Tc誘導体）が培地から除去された場合に遺伝子発現が始動する。これに対して、Tet-On系においては、Doxの添加により発現が始動する。細胞の染色体内に安定に組込まれたTet調節性遺伝子および該転写アクチベーター遺伝子を保持する細胞系を樹立するための方法は既に記載されている。例えば、http://www.clontech.com/techinfo/manuals/PDF/PT3001-1.pdfを参照されたい。例えば、Tet-On系は、トランスジェニック動物におけるMinosトランスポザーゼのテトラサイクリン誘導性発現に使用することができる。
【００９５】
二重トランスジェニック動物は標準的な相同組換えES細胞技術により作製することができる。2つの構築物を使用する。第1の構築物は、rtTA遺伝子を構成プロモーター下に含有する。そのような構築物の一例としては、サイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーターの制御下にrtTAアクチベーターをコードする遺伝子を含有するpTet-Onプラスミド（Clontech）が挙げられる。この構築物によりコードされるrtTA転写アクチベーターは、ドキシサイクリンの存在下でのみ活性である。第2の構築物は、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）の制御下にMinosトランスポザーゼ遺伝子を含有する。TREは、tetオペレーター（tetO）を含有する42bpの配列の7つの直接反復配列よりなり、最小CMVプロモーターの直上流に位置し、それは、CMV前初期プロモーターに通常伴うエンハンサーエレメントを欠く。これらのエンハンサーエレメントが欠けているため、rtTAによる結合の非存在下ではTREからのトランスポザーゼの「漏出（leaky）」発現が生じない。そのような構築物の一例として、pTRE2プラスミド（Clontech）が挙げられ、そのMCS内に、Minosトランスポザーゼをコードする遺伝子が挿入される。それらの2つの構築物で安定に形質転換された細胞においては、rtTAは発現されはするが、ドキシサイクリンがその動物に投与されない限り、rtTAはMinosトランスポザーゼの転写を活性化しない。
【００９６】
したがって、本発明の方法において、pTet-OnおよびpTRE2の両構築物を含むトランスジェニック動物を、トランスポゾンを含むゲノムを有する別の動物と交配させた場合、該トランスポゾンと該トランスポザーゼをコードする遺伝子との両方を自身のゲノム内に含む生じた胚におけるトランスポゾンの動員はドキシサイクリンの非存在下では生じない。したがって、ドキシサイクリンの投与を行って、転位を誘導することができる。
【００９７】
誘導因子、例えばドキシサイクリンは、適当な任意の方法により胚に投与することができる。本発明の好ましい実施形態においては、親生物の食餌または水を介して、トランスポザーゼ発現の誘導因子を投与する。
【００９８】
他の誘導系には、タモキシフェン誘導性トランスポザーゼ［トランスポザーゼと共役した修飾エストロゲン受容体ドメイン（Indraら, Nucl Acid Res. 27, 4324-27, 1999）であり、これは、タモキシフェンが培養に加えられるまではそれを細胞質内に保有する］、RU418誘導性トランスポザーゼ（グルココルチコイド受容体と同じ原理で作動する；Tsujitaら, J. Neuroscience, 19, 10318-23, 1999を参照されたい）またはエクジソン誘導系が含まれる。
【００９９】
エクジソン誘導系は、昆虫ホルモンであるエクジソンおよびその誘導体により誘導される、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づくものである。キイロショウジョウバエの変態中に、形態学的変化のカスケードが、エクジソン受容体を介してステロイドホルモン20-OHエクジソン（「エクジソン」と総称される）により始動される。エクジソン応答性は、最適化されたエクジソン応答性プロモーターを調節する修飾エクジソン受容体の安定な発現により哺乳類細胞に移される。修飾エクジソン受容体を発現するトランスジェニック生物（例えば、マウス）は、ホルモンまたはその誘導体の投与後に、組込まれたエクジソン応答性プロモーターを活性化しうる。該受容体がエクジソン、またはエクジソンの類似体であるムリステロン（muristerone）に結合したら、該受容体はエクジソン応答性プロモーターを活性化して、目的とする遺伝子の、制御された発現をもたらす。エクジソンに基づく誘導系は、テトラサイクリンに基づく系より低い基礎活性およびより高い誘導能を示すと報告されている。エクジソンに基づく誘導系の更なる詳細は、例えば、米国特許第6,245,531号およびNo D, Yao TP, Evans RM Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice, Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 93:3346-51（それらのそれぞれの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）。
【０１００】
lacオペレーター-リプレッサー系は哺乳動物、特にマウスにおいて機能的であることが最近示された。Croninら, Genes and Development, 15, 1506- 1517 (2001)（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）は、コドン使用頻度および構造の両方において典型的哺乳類遺伝子に類似しておりマウスにおいて遍在的に機能的lacリプレッサータンパク質を発現するlacリプレッサートランスジーンの、lacプロモーターの制御下のレポーター遺伝子の発現を制御するための使用を記載している。該レポーター遺伝子の発現は、マウスまたは胚の母親の飲料水中に加えられたラクトース類似体IPTGを使用することにより或いは子マウスに授乳することにより可逆的となる。したがって、lacオペレーター-リプレッサー系は、トランスポザーゼ遺伝子をlacプロモーターの制御下に配置することにより、トランスポザーゼの発現を調節するための用途に適合させることが可能である。
【０１０１】
また、さらなる調節配列（例えば、エンハンサー配列）の付加により、これらのプロモーターのいずれかを修飾することが可能である。前記の2以上の異なるプロモーターに由来する配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用することも可能である。
【０１０２】
遺伝子座調節領域（LCR）の使用も予想される。LCRは、厳密に制御される組織特異的制御をトランスジーンにもたらすことが可能であり、トランスジーンの発現の忠実度を著しく増大させる。多数のLCRが当技術分野で公知である。これらには、βグロビンLCR（Grosveldら, (1987) Cell 51:975-985）、αグロビン（Hattonら, (1990) Blood 76:221-227）およびCD2（Festensteinら, (1996) Science 271:1123-1125）、T細胞特異的CD4（Boyerら J Immunol 1997, 159:3383-3390）およびTCR遺伝子座（Diaz Pら, Immunity 1994, 1:207-217; Ortizら EMBO J 1997,16:5037-5045; Hongら Mol Cell Biol 1997, 17:2151-2157）、B細胞特異的MHCクラスIIEa（Carsonら Nucleic Acids Res 1993,21:2065-2072）、マクロファージ特異的リゾチーム遺伝子（Boniferら EMBO J 1990,9:2843-2848）、ニューロン特異的S100遺伝子（Friendら J Neurosci 1992, 12:4337-4346）、肝臓特異的LAP遺伝子（Talbotら Nucleic Acids Res 1994, 22:756-766）、ヒト成長ホルモン遺伝子座（Jonesら Mol Cell Biol 1995, 15:7010-7021）、さらには免疫グロブリン、筋組織などが含まれる。LCRに関する更なる詳細は、Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol.10, 361-365およびLi, Q., Harju, S. & Peterson, K.R. (1999). Trends Genet.15: 403-408に記載されている。
【０１０３】
あるいは、身体の全細胞において開いていてスイッチが入っていなければならない遺伝子ドメイン、すなわち、生存のために全細胞が必要とするタンパク質（例えば、糖からエネルギーを生成するための酵素）に対応し従って遍在的に発現される遺伝子ドメインを、任意の組織におけるトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼの発現を可能にするために利用することができる。そのような遍在的作用性（ubiquitously-acting）クロマチンオープニングエレメント（UCOE）の具体例には、TBPおよびhnRNPA2として公知のヒト遺伝子が含まれる。そのようなUCOEの使用の更なる詳細は、Antoniou, M.およびGrosveld, F. (1999)（Genetic approaches to therapy for the haemoglobinopathies. in: Blood Cell Biochemistry, Volume 8: Hematopoiesis and Gene Therapy FairbairnおよびTesta編 Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. pp 219-242）およびPCT/GB99/02357（WO 0005393）（それらの両方の内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１０４】
また、トランスポザーゼおよび／またはトランスポゾンの発現の調節はES細胞の使用によっても達成することができる。キメラ胚を構築するために形質転換ES細胞を使用して、自身の組織のいくつかにおいてのみトランスポザーゼ遺伝子またはトランスポゾンエレメントを含有するトランスジェニック生物を生産することが可能である。これはもう1つの調節レベルをもたらしうる。
【０１０５】
[転位の効率の最大化]
前記ならびに例えばWO 01/71019およびWO 02/062991に記載されているとおり、組込まれたトランスポゾンの末端反復配列に対するトランスポザーゼ酵素の作用により転位が達成されて、「宿主」ゲノムにおけるその元の位置からのトランスポゾンの切除、および該ゲノム内の異なる位置におけるトランスポゾンの再挿入がもたらされる。
【０１０６】
ほとんどの生化学的過程の場合と同様に、この過程は、単なる基質濃度の改善、高レベルの末端反復配列、すなわちコピー数の増加および高レベルのトランスポザーゼ酵素により、より効率的なものとなりうる。
【０１０７】
コピー数の増加は、元の挿入部位に多コピー列（multiple copy arrays）を作製することにより達成することができる。例えば、標準的な遺伝子導入によりまたはPACベクターを使用して、10〜100コピーが得られうる。あるいは、ゲノム内の異なる部位に複数の挿入が存在することにより、複数のコピーが作製されうる。
【０１０８】
コドン使用頻度を最適化して転位頻度を増加させるために、トランスポザーゼの配列を修飾することができる。コドン使用頻度の最適化は、ある与えられた遺伝子の発現レベルを増加させるための当技術分野でよく知られた方法である。  
したがって、哺乳類細胞または動物におけるハエトランスポザーゼの効率は、ハエのコドン使用頻度を哺乳類のコドン使用頻度に置換することによるmRNAからの翻訳の効率の改善の結果としてその濃度を増加させることにより増加させることができる。
【０１０９】
トランスポザーゼの効率を測定するためのアッセイには、例えばKlinakisら; Insect Molecular Biology, 9 (3), 269-275, 2000に記載されている標準的な転位アッセイが含まれうる。  
トランスポザーゼmRNAの濃度は、豊富で安定なmRNA（例えば、成長ホルモン、グロビン、アクチンまたはアルブミンをコードするもの）において見出される5'および3'配列をトランスポザーゼmRNA配列内に加えることにより増加させることができる。
【０１１０】
[トランスジェニック生物]
本発明の方法においては、トランスポゾン、同族トランスポザーゼをコードする遺伝子またはそれらの両方がゲノム内に組込まれた1以上のトランスジェニック生物を使用することが可能である。  
トランスポゾンまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子の導入は、形質転換／トランスフェクション、ウイルスまたは非ウイルスベクターによる運搬およびマイクロインジェクションを含む利用可能な任意の技術により達成することができる。これらの技術のそれぞれは当技術分野で公知である。トランスポゾンおよびトランスポザーゼをコードする遺伝子は、同じまたは異なる方法を用いて挿入することが可能である。例えば、ショウジョウバエP因子を使用して、Minosトランスポザーゼ構築物をショウジョウバエ内に導入することが可能である。
【０１１１】
好ましい実施形態においては、例えば、トランスポゾン、同族トランスポザーゼをコードする遺伝子またはそれらの両方を含むトランスジェニック動物を生産するために、遺伝子導入技術により、トランスポゾンまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内に挿入することができる。トランスジェニック動物がトランスポゾンとトランスポザーゼをコードする遺伝子との両方を含む場合には、同じまたは異なる方法を用いて両構築物を挿入することができる。該構築物の運搬がウイルスベクターによるものである場合には、トランスポゾンとトランスポザーゼをコードする遺伝子との両方を調節配列（例えば、Tetオペレーター）の制御下に含む複合ベクターを使用することができる。あるいは、別々のベクターを使用することができる。
【０１１２】
本発明においては、適当な任意のトランスジェニック動物を使用することができる。動物には、刺胞動物門、有櫛動物門、扁形動物門、線形動物門、環形動物門、軟体動物門、鋏角亜門、単肢類、甲殻綱および脊索動物門の動物が含まれる。単肢類には、有翅昆虫のような昆虫を含む六脚上綱亜門が含まれる。脊索動物門には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類および両生類のような脊椎動物群が含まれる。哺乳類の具体例には、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、有蹄類、例えばウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジおよびウマならびにげっ歯類、例えばマウス、ラット、アレチネズミおよびハムスターが含まれる。
【０１１３】
本発明の方法において使用しうるトランスジェニック動物を生産するための技術は当技術分野でよく知られている。この課題に関する有用な一般的テキストとしては、Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use（Harwood Academic, 1997）（トランスジェニック動物を作製するために用いる技術の広範な総説）が挙げられる。
【０１１４】
好ましい実施形態においては、該動物は昆虫である。本発明の方法において使用しうるトランスジェニック昆虫を生産するための方法はよく知られている（例えば、Loukerisら (1995), Science 270 2002-2005を参照されたい）。簡潔に説明すると、目的とする遺伝子を保持する転位因子を例えばマイクロインジェクションにより前胞胚葉胚内に挿入する。好ましくは、新たな遺伝物質を極質（まだ発生初期の昆虫自身の卵または精子細胞となることが運命づけられた卵の区画）に配置する。核物質が多数回分裂した後、そのほとんどは、それが昆虫の体の核となる周辺部に分離する。少数の核が極に移動して、成熟すると卵細胞となる。これらの細胞が該トランスジーンを取り込むと、後代はトランスジェニックとなる。トランスジェニック昆虫の生産についての更なる詳細はLoukerisら (1995), Science 270 2002-2005ならびにO'BrochtaおよびAtkinson (1998) Scientific American 279 60-65に記載されている。
【０１１５】
もう1つの好ましい実施形態においては、該動物は好ましくは哺乳動物である。胚の顕微操作のための技術の進歩は今や、例えば受精哺乳類卵内への異種DNAの導入を可能にしている。例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染または他の手段により全能性または多能性幹細胞を形質転換することが可能であり、ついで形質転換細胞を胚内に導入し、ついで胚はトランスジェニック動物へと発生する。非常に好ましい方法においては、発生中の胚に、所望のDNAを含有するレトロウイルスを感染させ、感染胚からトランスジェニック動物を産生させる。しかし、最も好ましい方法においては、適当なDNAを胚の細胞質または前核内に、好ましくは単細胞段階において共注入し、胚を成熟トランスジェニック動物へと発生させる。それらの技術はよく知られている（哺乳類受精卵内への異種DNAのマイクロインジェクションのための標準的な実験室的方法の総説、例えば、Hoganら, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfortら, Bio/Technology 9:844 (1991); Palmiterら, Cell, 41: 343 (1985); Kraemerら, Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammerら, Nature, 315: 680 (1985); Wagnerら, 米国特許第5,175,385号; Krimpenfortら, 米国特許第5,175,384号を参照されたい（それらのそれぞれの内容を参照により本明細書に組み入れることとする））。
【０１１６】
トランスジェニック動物を生産するためのもう1つの方法は、標準的な方法により前核段階の卵内に核酸をマイクロインジェクションすることを含む。ついで、注入された卵を培養し、ついで偽妊娠レシピエントの卵管内に移す。
【０１１７】
トランスジェニック動物は、Schnieke, A.E.ら, 1997, Science, 278: 2130およびCibelli, J.B.ら, 1998, Science, 280: 1256に記載されている核導入技術によっても生産することができる。この方法を用いて、ドナー動物からの繊維芽細胞を、目的とするポリペプチドのコード配列を調節配列の制御下に含むプラスミドで安定にトランスフェクトする。ついで安定なトランスフェクタントを脱核卵母細胞に融合させ、培養し、雌レシピエント内に移す。
【０１１８】
トランスジェニック配列を含有しうる動物の分析は、典型的には、標準的な方法に従うPCRまたはサザンブロット分析により行われるであろう。  
ウシのようなトランスジェニック哺乳動物の構築のための具体例として、DNA結合性分子をコードする配列を含むヌクレオチド構築物を、哺乳動物から新鮮に摘出された卵巣から得た卵母細胞内に例えば米国特許第4,873,191号に記載の技術を用いてマイクロインジェクションする。卵母細胞を卵胞から吸引し、静置させた後、運動性画分を単離するためにPercoll勾配により前分画されヘパリンで受精能獲得した解凍された凍結精子で受精させる。
【０１１９】
受精した卵母細胞を例えば15,000gで8分間遠心分離して、注入のために前核を可視化し、ついで卵管組織馴らし培地内で接合体から桑実胚または胚盤胞段階まで培養する。この培地は、卵管から擦り取られ培地で希釈された管腔組織を使用することにより調製する。接合体は、マイクロインジェクションの2時間以内に培地内に配置しなければならない。
【０１２０】
ついで、コプロスタノールを投与することにより、意図されるレシピエント哺乳動物（例えば、ウシ）において、発情期を合わせる。2日以内に発情が得られ、発情の5〜7日後に胚をレシピエントに導入する。導入の成功をサザンブロットにより後代において評価することが可能である。
【０１２１】
あるいは、所望の構築物を胚性幹細胞（ES細胞）内に導入し、トランスジーンによる修飾が保証されるよう細胞を培養することが可能である。ついで修飾細胞を胞胚期の胚内に注入し、胞胚を偽妊娠宿主内に移す。生じる後代はESおよび宿主細胞に関するキメラであり、通常の交雑育種により、専らES後代を含む非キメラ系統を得ることができる。この技術は例えばWO91/10741に記載されている。
【０１２２】
宿主動物のゲノム内へのトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼコード化遺伝子の運搬および安定な組込みのための別法には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターのようなウイルスベクターの使用が含まれる。さらに、そのような技術は当技術分野において例えばZhangら（Nucl. Ac. Res., 1998, 26:3687-3693）により記載されている。
【０１２３】
適当なウイルスベクターはレトロウイルスベクターであることが可能であり、適当な任意のレトロウイルスから誘導されうるまたは誘導可能でありうる。多種多様なレトロウイルスが同定されている。具体例には、マウス白血病ウイルス（MLV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サル免疫不全ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス（HTLV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、フジナミ肉腫ウイルス（FuSV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Mo-MLV）、FBRマウス骨肉種ウイルス（FBR MSV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Mo-MSV）、アーベルソンマウス白血病ウイルス（A-MLV）、ニワトリ骨髄球腫症ウイルス-29（MC29）およびニワトリ赤芽球症ウイルス（AEV）が含まれる。レトロウイルスの詳細な一覧は、Coffinら, 1997, “retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に記載されている。
【０１２４】
いくつかのレトロウイルスのゲノム構造に関する詳細が当技術分野において見出されうる。例えば、HIVおよびMo-MLVに関する詳細はNCBI GenBank（それぞれ、ゲノムアクセッション番号AF033819およびAF033811）から見出だされうる。
【０１２５】
レトロウイルスは大雑把に2つの範疇、すなわち、「単純型（simple）」および「複雑型（complex）」に分類することができる。レトロウイルスは更に7つの群に分類することができる。これらの群のうちの5群は、発癌性を有するレトロウイルスを表す。残りの2群はレンチウイルスおよびスプマウイルスである。これらのレトロウイルスの総説はCoffinら, 1997（前掲）に記載されている。
【０１２６】
宿主域および組織指向性はレトロウイルスによって様々である。いくつかの場合には、この特異性は組換えレトロウイルスベクターの形質導入能を制限しうる。このため、多数の遺伝子治療実験ではMLVが使用されている。4070Aと称されるエンベロープタンパク質を有する特定のMLVは両種向性ウイルスとして公知であり、そのエンベロープタンパク質は、ヒトとマウスとの間で保存されているリン酸輸送タンパク質と「ドッキング（dock）」するため、これはヒト細胞にも感染しうる。この輸送体は遍在的であるため、これらのウイルスは多数の細胞型に感染しうる。
【０１２７】
複製欠損型レトロウイルスベクターは、典型的には、例えば、パッケージングまたはヘルパー細胞系と組換えベクターとの組合せ体を使用することにより、後続の形質導入のための適当な力価のレトロウイルスベクターを得るために増殖させる。すなわち、それらの3つのパッケージングタンパク質がトランスで付与されうる。
【０１２８】
「パッケージング細胞系」は、レトロウイルスgag、polおよびenv遺伝子の1以上を含有する。パッケージング細胞系は、レトロウイルスDNAをパッケージングするのに必要なタンパク質を産生するが、それはpsi領域を欠くため包膜を引き起こし得ない。ヘルパータンパク質はpsi陽性組換えベクターをパッケージングして、組換えウイルスストックを産生しうる。このウイルスストックを使用して細胞を形質導入して、ベクターを標的細胞のゲノム内に導入することができる。入手可能なパッケージング系の概要がCoffinら, 1997（前掲）に記載されている。
【０１２９】
レンチウイルス群は「霊長類型（primate）」および「非霊長類型（non-primate）」に分類することができる。霊長類型レンチウイルスの具体例には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）およびサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。非霊長類型レンチウイルス群には、原型「スローウイルス」ビスナ・マエディウイルス（VMV）ならびに関連ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）およびより最近になって記載されたネコ免疫不全ウイルス（FIV）およびウシ免疫不全ウイルス（BIV）が含まれる。例えば、Roviraら, Blood. 2000;96:4111-4117; Reiserら, J Virol. 2000 Nov;74 (Mulder, M.Pら (1995). Hum Genet 96(2):133-141):10589; Laiら, Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Oct 10;97(Southern, E.M. (1975). J. Mol. Biol 98,503-517):11297-302;およびSaulnierら, J Gene Med 2000 Sep-Oct;2(5):317-25を参照されたい。
【０１３０】
レンチウイルス科のレトロウイルスが他の型のレトロウイルスと異なる点は、レンチウイルスが、分裂中の細胞および分裂中でない細胞の両方に感染する能力を有することにある。これに対して、MLVのような他のレトロウイルは、例えば筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成する細胞のような分裂中でない細胞には感染することができない。
【０１３１】
レトロウイルス科レンチウイルス亜科の種々のメンバーに基づく多数のベクターが開発されており、これらの多くは特許出願の対象となっている（WO-A-98/18815; WO-A-97/12622）。好ましいレンチウイルスベクターはHIV、SIVまたはEIAVに基づくものである。HIV-1から構築された最も単純なベクターは、envコード領域の一部の欠失またはnefコード領域の置換以外は完全なHIVゲノムを有する。注目すべきことに、これらのベクターはgag/polおよびすべてのアクセサリー遺伝子を発現し、したがって、感染性ウイルス粒子を産生するためには、エンベロープを必要とするに過ぎない。アクセサリー遺伝子のうち、vif、vpr、vpuおよびnefは必須ではない。
【０１３２】
HIVに基づくレンチウイルスベクターのための1つの好ましい汎用形態は、HIV 5'LTRおよびリーダー、いくつかのgagコード領域配列（パッケージング機能を付与するためのもの）、レポーターカセット、rev応答エレメント（RRE）および3'LTRである。これらのベクターにおいて、gag/pol、アクセサリー遺伝子産物およびエンベロープ機能は単一のプラスミドからまたはコトランスフェクトされる2以上のプラスミドからまたはベクター含有細胞のHIVによる同時感染により供給される。
【０１３３】
アデノウイルスは、RNA中間体を経ない二本鎖直鎖状DNAウイルスである。遺伝子配列相同性に基づき6個の亜群に分類される50個を超える異なるヒト血清型のアデノウイルスが存在し、それらはすべて、比較しうる遺伝子構成を示す。ヒトアデノウイルスC群血清型2および5（95％の配列相同性を有する）はアデノウイルスベクター系において最も一般的に使用されており、通常、若年者の上部気道感染に関連している。
【０１３４】
本発明において使用しうるアデノウイルス／アデノウイルスベクターはヒトまたは動物由来でありうる。ヒト由来のアデノウイルスに関しては、好ましいアデノウイルスは、C群に分類されているもの、特に、2型（Ad2）、5型（Ad5）、7型（Ad7）または12型（Ad12）のアデノウイルスである。動物由来の種々のアデノウイルスのうち、イヌアデノウイルス、マウスアデノウイルスまたはトリアデノウイルス、例えばCELOウイルス（Cottonら, 1993, J Virol 67:3777-3785）を使用しうる。
【０１３５】
HSVベクターは、例えばHSV1もしくはHSV2株またはそれらの誘導体から誘導されうる。弱毒化株、例えば株1716（MacLeanら, 1991, J Gen Virol 72: 632-639）、R3616およびR4009（ChouおよびRoizman, 1992, PNAS 89: 3266-3270）およびR930（Chouら, 1994, J. Virol 68: 8304-8311）（それらはすべて、ICP34.5に突然変異を有する）、ならびにd27-1（RiceおよびKnipe, 1990, J. Virol 64: 1704-1715）（これはICP27に欠失を有する）を使用することができる。あるいは、ICP4、ICP0、ICP22、ICP6、ICP47、vhsまたはgHに関して欠失しておりVMW65に不活性化突然変異を有するまたは前記のいずれかの組合せを有する株も、本発明のHSV株を製造するために使用することができる。
【０１３６】
種々のHSV遺伝子の説明において用いられている用語はCoffinおよびLatchman, 1996. Herpes simplex virus-based vectors. In: Latchman DS (編). Genetic manipulation of the nervous system.  Academic Press: London, pp 99-114に記載されている。
【０１３７】
さらに、バキュロウイルスベクターを本発明において使用することができる。バキュロウイルスであるオートグラファカリフォルニカ多核多角体ウイルス（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus）（AcMNPV）は、ある鱗翅目昆虫の細胞内でのみ複製されうるDNAウイルスであり、昆虫細胞内での組換えタンパク質の発現に広範に使用されている。最近では、種々の哺乳類細胞、例えば肝細胞癌細胞系および初代肝細胞ならびに内皮細胞内に異種DNAを高い効率で導入するために、AcMNPVのようなバキュロウイルスが使用されている（Boyce FM, Bucher NL (1996) Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2348-52; Airenne KJ, Hiltunen MO, Turunen MP, Turunen AM, Laitinen OH, Kulomaa MS, Yla-Herttuala S (2000) Baculovirus-mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery. Gene Ther 7,1499-1504）。さらに、遺伝子導入のためのバキュロウイルスベクター、そのゲノム内への異種DNAの導入方法および昆虫細胞培養内での組換えウイルスの生産方法は商業的に入手・利用可能である。さらに、バキュロウイルスは通常は哺乳類細胞内では複製され得ない。したがって、この用途のためにそれを改変操作する必要がない。
【０１３８】
本発明の方法で使用するベクターの構築においては、通常の連結技術を用いることができる。単離されたウイルスベクター、プラスミドまたはDNA断片を切断し、適合化させ、所望の形態で再連結して、必要なプラスミドを得る。所望により、構築されたベクター中の正しい配列を確認するための分析を公知方法で行う。トランスポゾンの存在および／または動員は細胞内で直接的に、例えば、通常のサザンブロット法、ドットブロット法、PCRまたはin situハイブリダイゼーション（トランスポゾン中に存在する配列に基づきうる適当に標識されたプローブを使用するもの）により測定することができる。当業者は、所望によりこれらの方法が修飾されうると容易に予想するであろう。本発明において有用なベクターには、好ましくは、前記のとおりトランスポゾンの同定および位置決定を容易にするマーカー遺伝子が配置されている。
【０１３９】
[本発明の用途]
本発明の方法は、1以上の個々の突然変異に関して均質な細胞のクローン集団の1以上を含むトランスジェニック胚および生物の作製を可能にする。したがって、一塊の細胞、組織または器官もしくは器官群のそれぞれが同じ遺伝的修飾を共有するトランスジェニック胚および動物を生産することが可能である。多数の細胞、組織または器官内に同じ遺伝的修飾が存在するということは修飾の簡便な表現型および遺伝子型分析を可能にし、さらに、対応する野生型遺伝子と比較される特定の遺伝子修飾または更には同じ生物内の同じ型の細胞、組織または器官内の他の遺伝子修飾の効果の比較を可能にする。
【０１４０】
本発明は更に、胚発生中または成体細胞および組織において、修飾遺伝子の遺伝子発現パターンをモニターするために使用することができる。  
トランスポゾン、およびトランスポゾンが切除され始めた位置は、配列分析により同定することができる。例えば、Minosは、典型的には、TA塩基対において組込まれ、切除の際に、4つのトランスポゾン末端ヌクレオチドに隣接した標的TA配列の重複物よりなる痕跡を後に残す。Minosの配列、その痕跡または関連配列の存在は、配列決定、PCRまたはハイブリダイゼーションのような技術により検出することができる。  
挿入されたトランスポゾンは、例えば、末端反復配列に相補的なPCRプライマーを使用する同様の技術により同定することができる。
【０１４１】
本発明は、ある所定の発生段階における厳密な遺伝子モジュレーションおよびそれに続くトランスポゾンを使用した検出を可能にすることにより、ゲノムの機能的マッピングを可能にする。したがって、本発明は、効率的な細胞内トランスポゾンの動員および生物の1以上の細胞または組織の細胞ゲノム内への挿入をもたらして、発生の初期段階のトランスジェニック生物の細胞におけるエキソントラップ機能をもたらす。そのような胚発生段階でのトランスポゾンの動員の誘導は、転位遺伝子に関して均質な細胞塊または組織塊の作製を可能にする。したがって、これは、表現型の変化の迅速かつ効率的な検出および／または修飾遺伝子の同定を可能にしうる。適当なトラップ構築物の一例を図12に示す。
【０１４２】
本発明は、有利な実施形態においては、遺伝子が細胞群または組織群における機能的遺伝的分析のためにトランスポゾンの挿入により標識されたり、ノックアウトされ、ついで、高い経費と時間のかかる遺伝分析を行わなくても、また、多くの場合には大量の配列決定を行わなくても、遺伝子がトランスポゾン「タグ」により特異的に同定されることを可能にする。
【０１４３】
本発明のもう1つの実施形態は、トランスジェニックマウスのようなトランスジェニック生物のライブラリーの作製を提供する。標的遺伝子を1以上の細胞、組織または器官の表現型により表現型的に同定したり、トランスポゾンの挿入部位の決定により遺伝的に同定することができる。前記のとおり、誘導発現系を使用して、遺伝子の部分的ノックアウトとアンチセンス誘導性完全ノックアウトとの間のスイッチを調節することができる。トランスポゾンの挿入を保持する体細胞を、例えば、標準的な方法により不死細胞系を誘導することによりまたは核移植法によりトランスジェニック動物系統を作製することにより不死化することができる。  
そのようなライブラリーを表現型分析および遺伝子連関の同定に使用することができる。本方法は、現在の方法と比較した場合の利点をもたらす。
【０１４４】
異常ヘモグロビン症、血友病、嚢胞性線維症および筋ジストロフィーのような遺伝病においては、単一の遺伝子またはその調節エレメントにおける十分に明らかにされた突然変異が、不適切な遺伝子発現を引き起こして、罹患個体の生活様式および余命に著しい影響を及ぼす臨床的な結果を招く。
【０１４５】
しかし、他の疾患、特に、加齢に関連した疾患、例えば痴呆および精神病；精神医学的障害、例えば統合失調症および躁うつ病；骨および関節関連炎症状態；肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病および関連血管および心血管病態においては、遺伝的要因はより複雑であり、まだほとんど理解されていない（LanderおよびSchork, Science (1994) 265, 2037-2048を参照されたい）。
【０１４６】
種々の標的における複数の突然変異が疾患の発症（例えば、閉経後インスリン抵抗性）および病態の重症度（例えば、血管疾患および卒中の素因）のような要因を決定する場合には、近交マウス系統のランダムアルキル化に基づく方法、および広範なES細胞ライブラリーにおける単一遺伝子欠失から入念に発生させたトランスジェニックマウスは失敗することが必至であるように思われる。
【０１４７】
本発明は、疾患状態になり易いことが知られており、従って相互関連疾患原因遺伝子における既存の突然変異を有すると考えられるバックグラウンドを有する、ランダムに「タグ付け」されたマウス系統を迅速に作製することを特徴とする、より魅力的な方法を提供する。バックグラウンドは、既知組込み部位に複数の「優性」トランスポゾンを保持する創始（ファウンダー）細胞系を使用することにより選択することができる。調節可能なトランスポザーゼ活性は、種々の疾患モデルを反映する種々の遺伝的バックグラウンドにおけるマウスライブラリーの迅速な作製を可能にするであろう。
【０１４８】
例えば、インスリン受容体内の突然変異は、マウスの遺伝的バックグラウンドに依存した軽度ないし重度の高インスリン血症を引き起こすことが示されており、（Kido (2000) Diabetes 49, 589-596を参照されたい）、このことは、他の遺伝子がインスリン抵抗性に対する素因に関与していることを示している。したがって、「軽度表現型」マウスバックグラウンドにおいてin vivo遺伝子転位技術を用いるタグ付けされたマウスライブラリーの作製は、より重度な表現型を有する動物の選択につながるはずである。ついで、新たな転位事象に隣接するDNAの配列分析は、重度表現型の開始に関与する新規候補疾患原因遺伝子を同定するであろう。
【０１４９】
ついで候補疾患遺伝子は、動物モデルにおけるその厳密な役割の決定およびヒトにおける疾患に関連した役割の証明のための更なる研究の焦点となりうる。  
ヒトにおける標的の確認においては、関連患者および対照群に関するDNAおよび臨床的情報を含有する既存の臨床的および遺伝的データベースを利用することになろう。
【０１５０】
作製されたトランスジェニック生物の表現型分析は、尿、血液、脊髄液または組織中に存在する代謝産物、タンパク質（例えば、インスリン）、脂質または炭水化物（例えば、糖耐性を測定する場合）の変化を含む単純かつ迅速な測定によるものでありうる。体液における測定は、NMR、Elisa、GMSなどによる測定を含む当業者に公知の多数の技術のいずれかにより行うことができる。
【０１５１】
他の表現型特性は、光、音、記憶およびストレス試験のような試験を用いることにより行動パターンまたは外的刺激に対する応答を測定することにより分析することができる。  
他の測定可能な表現型特性には、例えば体重、脂肪含量および成長速度を評価することにより測定されうる成長および加齢パラメーター、腫瘍増殖、肥満などが含まれる。さらに、血圧、心拍数、肺機能などのような他の測定可能な特徴の変化を評価することができる。
【０１５２】
好都合にも、本発明のトランスポゾン技術は、長期にわたる保存を要することなくトランスジェニック動物のライブラリーの作製を可能にする。トランスジェニック動物を作製するための従来の方法は、突然変異を生じさせる化学的突然変異誘発のような方法を含む。これらの方法においては、動物（例えば、マウス）当たり複数の突然変異を使用する。動物を作製したら、それを表現型的に分析し、ついで将来の使用のために保管／保存する必要がある。本発明は、ゲノム内に挿入された種々のトランスポゾンを有する出発細胞系または出発トランスジェニック生物の作製を可能にする。ついで、新たなライブラリーを作製するために、トランスポザーゼを保持するトランスジェニック動物と交配させることにより、これらの細胞系または生物を使用することができる。
【０１５３】
もう1つの実施形態において、ゲノムの全体に分布した種々のトランスポゾン挿入を有するES細胞のライブラリーを作製するために、本発明の方法を使用することができる。これらは、配列決定し特徴づけることが可能である。ES細胞は、将来の使用のために簡便に保存することができる。
【０１５４】
もう1つの実施形態においては、発現が外的刺激によりモジュレーションされる遺伝子を「標識」するために、本発明の方法を使用することができる。したがって、標識トランスポゾンでのトランスポゾン動員にさらされた胚、生物またはいずれかから誘導された組織もしくは細胞を、候補薬物または他の試験物質のような外的刺激での処理に付し、標識（マーカー）の発現のモジュレーションを観察する。標識が過剰発現または過少発現されている細胞は、刺激に応答してアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子内またはその近傍に挿入されたトランスポゾンを有している可能性がある。したがって、本発明は、エンハンサーまたはエキソンに接近していることにより自身の発現レベルにおいてモジュレーションされるマーカー遺伝子を含むトランスポゾンを挿入することによりin vivoエンハンサートラップおよびエキソントラップ機能を付与するために使用することができる。
【０１５５】
このアプローチは、薬物発見アプローチ、毒物学研究などにおける薬物による遺伝子モジュレーションの研究に有用である。さらに、それは、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子のような天然刺激に応答する遺伝子モジュレーションの研究、ならびに分子的介入のための新規標的、例えば、ヒト、植物または動物における疾患の治療、殺虫剤、除草剤、抗真菌剤および抗細菌剤の開発のための標的の同定に適用可能である。
【０１５６】
本発明は、以下の実施例において、例示のために更に詳しく説明される。  
【実施例】
【０１５７】
Ａ：ドキシサイクリンを使用するin vivoでのMinosの活性化
実施例１：トランスポゾン保持マウスおよびトランスポザーゼ保持マウスの作製
2つのトランスジェニックマウス系統を作製する。トランスポゾン保持系統（系統MCG）は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にGFP遺伝子を含有するMinosトランスポゾンを含有する断片の縦列配置を含有する。トランスポゾンを、逆方向反復配列の内部のほとんどすべての配列がCMV/GFPカセットにより置換されるように操作する。このトランスポゾンは、トランスポザーゼコード遺伝子を含有していないため非自律性であり、トランスポザーゼ源が存在する場合にのみ動員されうる。第2のトランスジェニックマウス系統は、誘導プロモーターの制御下で発現されるMinosトランスポザーゼ遺伝子を含有する。
【０１５８】
トランスポゾンMiCMVGFPは以下のとおりに構築した。プラスミドｐMILRTetR（Klinakisら (2000) Ins. Mol. Biol. 9, 269-275 (2000b)）をBamHIで切断し、再連結してMinos末端間のテトラサイクリン耐性遺伝子を除去し、プラスミドpMILRΔBamH1を得た。ディー・ヒデイ（D. hydei）からの元の隣接配列およびMinos逆方向反復配列を含有するpMILRΔBam H1からのAsp718/SacI断片をプラスミドpPolyIII-I-lox（ベクターpPolyIII-I（アクセッション番号M18131）のAsp718部位内へのloxPオリゴ：
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
の挿入により作製されたもの）内にクローニングして、プラスミドppolyMILRΔBamHを得た。トランスジェニックマウスの作製に使用した最終構築物（pMiCMVGFP、図5）は、CMVプロモーターにより駆動されるヒト化GFP遺伝子（ClontechプラスミドpHGFP-S65T由来）ならびにそれに続くSV40介在配列およびポリアデニル化部位を含有する、プラスミドpBluescriptGFPからの2.2kbのSpeI断片を、ppolyMILRΔBamH1のSpe I部位内に挿入することにより作製した。
【０１５９】
トランスポゾン保持MCG系統は、pMiCMVGFPプラスミドからの3.2kbのXhoI断片をFVB×FVB受精卵母細胞内にマイクロインジェクションすることにより構築した。GFP DNAをプローブとして使用する、尾部の生検からのDNAのサザンブロット法により、トランスジェニック動物を同定した。
【０１６０】
トランスポザーゼ発現系統は、標準的な相同組換えES細胞技術による胚性幹細胞内へのトランスポザーゼ遺伝子の導入により作製する。標準的な方法（Manipulating the mouse embryo, Hoganら, Cold Spring Harbor Press, 1994）により、トランスジェニック動物を得るために、ES細胞を胚盤胞内に注入する。2つの構築物を使用する。第1の構築物は、標的細胞内で発現される構成プロモーター下のrtTA遺伝子を含有する。使用する構築物は、サイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーターの制御下にrtTAアクチベーターをコードする遺伝子を含有するpTet-Onプラスミド（Clontech）である。この構築物によりコードされるrtTA転写アクチベーターは、ドキシサイクリンの存在下でのみ活性である。第2の構築物は、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）の制御下にMinosトランスポザーゼ遺伝子を含有する。TREは、tetオペレーター（tetO）を含有する42bpの配列の7つの直接反復配列よりなり、最小CMVプロモーターの直上流に位置し、それは、CMV前初期プロモーターに通常伴うエンハンサーエレメントを欠く。これらのエンハンサーエレメントが欠けているため、rtTAによる結合の非存在下ではTREからのトランスポザーゼの「漏出（leaky）」発現が生じない。使用する第2構築物はpTRE2プラスミド（Clontech）であり、そのマルチクローニング部位内に、Minosトランスポザーゼをコードする遺伝子が挿入される。それらの2つの構築物で安定に形質転換された細胞においては、rtTAは発現されはするが、ドキシサイクリン（0.1〜1μg/ml）が培地に加えられない限り、rtTAはMinosトランスポザーゼの転写を活性化しない。  
トランスポザーゼcDNA断片をプローブとして使用する、尾部の生検からのDNAのサザンブロット法により、トランスジェニック動物を同定する。
【０１６１】
実施例２：in vivoでのMinosの活性化
トランスポゾン保持MCG系統のトランスジェニックマウスをトランスポザーゼ保持系統のトランスジェニックマウスと交配させる。トランスポゾンとトランスポザーゼをコードする遺伝子との両方を自身のゲノム内に含む生じた胚におけるトランスポゾンの動員はドキシサイクリンの存在下でのみ生じるであろう。ドキシサイクリンは、それを母生物の飲み水に含有させて、胚に投与する。転位事象の可能な回数を制限するために、ドキシサイクリンは一定期間（妊娠の第1日〜第2日）だけ投与する。  
出生時に、胚から発生したトランスジェニック後代を単離し、種々の細胞および組織を表現型決定に使用する。
【０１６２】
実施例３：転位の検出
構築物中のMinosトランスポゾンに隣接する不動性ドロソフィラ・ヒデイ（Drosophila hydei）配列にハイブリダイズするプライマーを使用して、マウス組織内のMinosトランスポザーゼによる活性転位を検出するために、トランスポゾンの切除に関するPCRアッセイを行う（Klinakisら (2000) Ins. Mol. Biol. 9, 269-275）。ショウジョウバエ細胞においては、Minosのトランスポザーゼ媒介性切除の後に、特徴的な6塩基対の痕跡を後に残す染色分体の修復が生じる（Arcaら (1997) Genetics 145, 267-279）。PCRアッセイにおいて使用するプライマーの特異的ペアにより、これは特徴的な167bpのPCR断片を与える（Catteruccia F.ら (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97, 2157-2162）。
【０１６３】
DNeasy Tissue-Kit（QIAGEN）を製造業者の指示に従い使用して、種々の組織由来のゲノムDNAを単離する。プライマー11DML：
(5’-AAGTGTAAGTGCTTGAAATGC-3’)
およびGOUM67:
(5’-GCATCAAATTGAGTTTTGCTC-3’)
を使用して、PCR反応を行う。
【０１６４】
PCR条件は以下のとおりである：10 mM Tris-HCl（pH 8.8）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.001％ ゼラチン; 1.2単位 Taq 2000（商標）DNAポリメラーゼ（STRATAGENE）、200 gの鋳型DNAおよび10 pmolの各プライマー（25μlの反応当たり）。94℃で30''、59℃で30''および72℃で30''の43または60サイクルを行った。PCR産物をPCRII TAクローニングベクター（Invitrogen）内にクローニングし、T7プライマーを使用して配列決定する。
【０１６５】
トランスジェニック後代の或る組織には特徴的なバンドが存在する。増幅配列に特異的な標識DNAプローブを使用するサザンブロット分析により、断片の同一性を確認する（データ非表示）。細胞塊は同じ転位遺伝子に関して均質であることが示されている。
【０１６６】
Ｂ：ZP3プロモーターの制御下でトランスポザーゼを使用するMinosの活性化
実施例４
この実施例においては、トランスポザーゼをコードする遺伝子の発現を、ある特定の発生段階で産生される遺伝子調節シグナルの制御下に置くことにより、その胚発生段階において転位が誘導されうることが示されている。この実施例においては、トランスポザーゼをコードする遺伝子をZP3プロモーターの制御下に配置した。したがって、トランスポザーゼは、卵形成の2〜3週の期間の、成長中の卵母細胞内でのみ発現された。成長中の卵母細胞内で発現されたMinosトランスポザーゼは、修飾された非自律性Minosトランスポゾンの切除を触媒し、ゲノム内の新たな部位へのその再組込みを促進した。
【０１６７】
図11は、精子における転位のために内因性精子特異的H1t遺伝子内にトランスポザーゼが挿入される代替的構築物（ノックインおよび通常の遺伝子導入のための構築物）を示す。H1t配列を、Zp3（卵に特異的に発現される）またはhnRNP（遍在的に発現される）遺伝子の開始部位に隣接した同等配列で置換することにより、卵特異的発現または遍在的発現のための代替的構築物を作製する。
【０１６８】
Ｃ：Minos配列における哺乳類コドン使用頻度
実施例５：トランスポザーゼの改良
哺乳類細胞または動物におけるハエトランスポザーゼの効率を改良するための方法の1つは、ハエコドン使用頻度を哺乳類コドン使用頻度に置換することによりmRNAから翻訳の効率を向上させ、それによりハエトランスポザーゼの濃度を増加させることである。この目的のために、本発明者らは、ハエMinosトランスポザーゼのコード配列を以下の配列で置換した。
【０１６９】
-配列  新規: 1026 bp;
組成  321  A; 235  C; 261  G; 209  T; 0 その他
比率:  31%  A; 23%  C; 25%  G; 20%  T; 0% その他
分子量 (kDa): ssDNA: 317.79    dsDNA: 632.5。
【０１７０】
起源
1      ATGGTGCGCG GTAAGCCTAT CTCTAAGGAG ATCAGAGTAC TGATCAGGGA CTATTTTAAG
61     TCTGGGAAGA CACTCACTGA GATAAGCAAG CAGTTAAACT TGCCTAAGAG CTCTGTGCAT
121    GGGGTGATAC AGATTTTCAA GAAAAATGGG AACATTGAGA ATAACATCGC GAATAGAGGC
181    CGAACATCCG CAATAACCCC CCGCGACAAG AGACAGCTGG CCAAAATTGT GAAGGCTGAC
241    CGCCGCCAAT CCCTGAGAAA CTTGGCTTCC AAGTGGTCGC AGACCATTGG CAAGACTGTC
301    AAGCGGGAGT GGACCCGGCA GCAATTAAAG AGTATTGGCT ACGGTTTTTA TAAGGCCAAG
361    GAAAAACCCC TGCTTACGCT TCGGCAAAAA AAGAAGCGTC TGCAATGGGC TCGGGAAAGG
421    ATGTCTTGGA CTCAAAGGCA GTGGGATACC ATCATCTTCA GCGATGAGGC TAAATTTGAT
481    GTGAGTGTCG GCGACACGAG AAAGCGCGTC ATCCGTAAGA GGTCCGAGAC ATACCATAAG
541    GACTGCCTGA AAAGAACAAC CAAGTTTCCT GCAAGCACTA TGGTATGGGG ATGTATGTCT
601    GCCAAAGGAC TCGGAAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATT
661    AACATTCTCC AGGATAGTTT GCTGCCCTCA ATACCAAAAC TATCCGATTG TGGTGAATTC
721    ACTTTTCAGC AGGACGGAGC ATCATCGCAC ACCGCCAAGC GGACCAAAAA CTGGCTGCAG
781    TACAATCAGA TGGAGGTGCT CGATTGGCCC TCAAATAGTC CGGATCTAAG CCCAATCGAA
841    AATATCTGGT GGCTAATGAA AAACCAGCTG CGAAACGAGC CACAGAGGAA CATTTCCGAC
901    TTGAAAATCA AGCTGCAAGA GATGTGGGAC TCAATCTCTC AGGAGCACTG CAAAAACCTG
961    CTCAGCAGCA TGCCTAAACG AGTGAAATGC GTGATGCAGG CCAAGGGCGA CGTTACACAG
1021   TTCTGA
この配列は通常の哺乳類コドン使用頻度に対応し、翻訳後に、ハエトランスポザーゼタンパク質配列と同一のタンパク質配列を与える。3つの部分のオリゴヌクレオチドとして合成された遺伝子（cDNA）（印刷の上側はセンス鎖、下側はアンチセンス鎖）の各部分をクローニングし、ついで1つのcDNAに合体させた。
【化１】
2010263916.tif 000002
【０１７１】
材料および方法
プラスミドの構築
トランスジェニックマウスの作製のために使用した修飾MinosトランスポゾンpMiCMVGFP（図5）の構築は実施例1に記載されている。簡潔に説明すると、CMVプロモーターにより駆動されるヒト化GFP遺伝子ならびにそれに続く介在配列およびSV40 ポリAシグナルを含有する2.2kbの断片をMinos逆方向反復配列間に配置した。必要に応じて、単コピートランスジェニック動物の作製のために、左逆方向反復配列の前にlox P部位を含有させた。
【０１７２】
MinosトランスポザーゼcDNAを1kb ClaI/NotI断片としてベクターPev3（Clare Gooding, Biotechnology Dept, Zeneca, Macclesfield, UK; Pev3はNeedhamら, Nucl. Acids Res., 20, 997-1003, 1992に更に詳しく記載されている）内にクローニングした。得られたプラスミドからの3.8kbのClaI/Asp718断片（MinosトランスポザーゼcDNAならびにそれに続くイントロンおよびヒトβグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを含有する）をpBluescript SK+（Stratagene, La Jolla, Ca, USA）内にクローニングしてプラスミドpBlue/ILMi/3'βを得た。透明体3（ZP3）遺伝子のプロモーターおよび5'フランキング領域を含有するプラスミドZP3/6.5Luc（Lira, S.ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7215-7219）からの6.5kbの平滑Asp718断片をpBlue/ILMi/3'βのEcoRV部位内にクローニングしてプラスミドZP3/ILMi（図6）を得、これを、発生中の卵内でトランスポザーゼを発現するトランスジェニックマウスの作製のために使用した。
【０１７３】
トランスジェニックマウスの作製
Minosトランスポザーゼ発現系統を作製するために、10.3 kbのSmaI/Asp718断片をpZP3/ILMi（図6）から切り出し、ゲル電気泳動（Sambrook, Jら. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)）によりプラスミド配列から分離し、ELUTIP-dカラム（Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, Germany）を使用して精製し濃縮し、4ng/μlで受精卵母細胞（FVB×FVB）内に注入した。注入卵を偽妊娠マウス内に移し、トランスジェニック後代を尾部DNAのサザンブロット分析（Southern, E.M. (1975). J. Mol. Biol 98,503-517）により同定した。  
前記およびZagoraiou, Lら (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  98,11474-11478に記載のとおりにトランスポゾン保持（MCG）系統を作製した。
【０１７４】
RT-PCR
RT-PCR分析のために、Ultraspec RNA単離系（Biotech Laboratories, Houston, TX, USA）を使用してZP3/ILMiトランスジェニックマウスの種々の器官から全RNAを単離した。1μgの全RNAから、Reverse Transcriptase（Super RT; HT Biotechnology, Cambridge, UK）およびオリゴ（dT）プライマーを使用して20μlの反応においてcDNAを合成した。RT反応からの1μlのcDNA、1.5 mM MgCl2、100 ngの各プライマー、0.2 mM dNTPおよび2.5 U Taq DNAポリメラーゼ（Pharmacia）を含有する50μl容量のPCRバッファー（Life Technologies, Paisley, UK）中でPCR反応を行った。94℃で45秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリングおよび72℃で45秒間の伸長の合計25サイクルを行った。PCR産物を2％アガロースゲル上の電気泳動により可視化した。Minosトランスポザーゼ特異的プライマーMinosl：5’-CAGCTTCGAAATGAGCCAC-3’およびβEX：5’-TGGACAGCAAGAAAGCGAG-3’を使用した。マウスヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）に特異的なプライマーは5’-CACAGGACTAGAACACCTGC-3’および5’-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3’であった。
【０１７５】
育種計画
トランスポゾン保持（MCG）雌をZP3/ILMi系統15雄と交配させた。これらの交配から得た二重陽性雌を野生型（WT）雄と交配させ、それらの後代を、可能な転位事象に関してサザンブロット分析により分析した。ゲノムDNAをEcoRVまたはBglIIで消化し、0.7または1％アガロースゲル（Sigma, Steinheim, Germany）上で分離し、ナイロンメンブレン（Hybond-N+, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire England）上にブロットし、pMiCMVGFPからの32P標識 737bp SacI/ NotI GFP断片でプローブした。
【０１７６】
DNA蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）分析
マウス中期スプレッド（spreads）を末梢白血球から常法に従い調製した（Mulder, M.Pら (1995). Hum Genet 96(2):133-141）。pMiCMVGFP構築物からの737-bp SacI/ NotI GFP断片をプローブとして使用した。プローブをビオチン（Boehringer Mannheim）で標識し、FITCで免疫化学的に直接検出するか、またはチラミドに基づく工程を加えてシグナルの検出を向上させた（Raap, A.K.ら (1995) Human Molecular Genetics 4, 529-534）。DNAをDAPIで対比三色した。
【０１７７】
挿入部位のクローニング
新たなMinos挿入部位を有する動物からのマウスDNAをEcoRVまたはBglIIで切断し、0.7％アガロースゲル中で分離した。転位事象を含有するゲル領域を切り出し、DNAを単離した。第1 PCR用のMinosプライマーIMio1（5’-AAGAGAATAAAATTCTCTTTGAGACG-3’）およびネスティッドPCR用のIMio2（5’-GATAATATAGTGTGTTAAACATTGCGC-3’）を使用して、断片のサイズに応じて、自己連結断片上で直接的に逆PCRを行うか（Klinakis, A.G., Zagoraiou, L., Vassilatis, D.K & Savakis, C. (2000) EMBO Reports 11, 416-421）、あるいは得られたEcoRVまたはBglII断片をAluIで更に消化し、ついで環化させた。既に記載されているとおりに（Klinakis, A.G., Zagoraiou, L., Vassilatis, D.K & Savakis, C. (2000) EMBO Reports 11, 416-421）、MinosプライマーIMio1およびIMii1（5’-CAAAAATATGAGTAATTTATTCAAACGG-3’）を使用して逆PCRを行い、ついでプライマーIMio2およびIMii2（5’-GCTTAAGAGATAAGAAAAAAGTGACC-3’）を使用してネスティッドPCRを行った。このようにして、左隣接部分と右隣接部分とを別々に増幅した。PCR断片は直接的にまたはpGEM Tイージーベクター（Promega）もしくはPCRIIベクター（Invitrogen）内へのクローニング後に配列決定した。得られた配列に関して、Celera（www.celera.com）データベースにおいてその時点で入手可能なマウスゲノム配列に対してBLAST検索を行った。
【０１７８】
結果
トランスポゾン保持トランスジェニックマウス系統（MCG）を作製した。それは、マウス第14染色体内に組込まれた6コピーのMinosトランスポゾンMiCMVGFP（図5）を含有する。  
トランスポゾンは非自律性である。すなわち、それはそれ自身では転位し得ない。なぜなら、それはトランスポザーゼ遺伝子を欠くからである。平行して、2つのトランスポザーゼ発現マウス系統を作製した。これらは、ZP3遺伝子の6.5Kbの5'隣接領域およびプロモーターの使用により（図6）、成長中の卵母細胞内で特異的にMinosトランスポザーゼを発現した。Minosトランスポザーゼ（ZP3/ILMi）系統の両方において、トランスジーンは縦列配置で組込まれた。この実施例においては、本発明者らは、より高いコピー数が組込まれているZP3/ILMi系統15を使用した（データ非表示）。予想どおり、この系統におけるトランスポザーゼの発現は卵巣に限局された（図7）。トランスジェニックZP3/ILMi系統の種々の組織からのRNAサンプル上で行ったRT-PCRは、正しくスプライシングされたトランスポザーゼRNAに対応する〜360bpの断片が卵巣に限局していることを示した。混入DNAが類似サイズの断片に増幅されることは、エキソン／イントロン結合部に及ぶプライマー（βグロビンIVSII-図6）を使用することにより妨げられた。
【０１７９】
トランスジーンからのMinosトランスポザーゼの発現はZP3プロモーターにより駆動されるため、それは、卵形成の2〜3週の期間の、成長中の卵母細胞内でのみ発現されるはずである。  
通常、透明帯転写産物は原基卵母細胞（10〜15μm）においては検出することができず、最大レベルは直径50μmの卵母細胞において観察される。卵母細胞が最大サイズ（70〜80μm）に達するにつれて、ZP3転写産物のレベルは減少し始める。排卵された卵は全透明帯転写産物のピークレベルの5％未満を含有する（Millarら (1991) Molecular and Cellular Biology 11,  6197-6204; Liu, Cら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 5431-5436）。いくらかのトランスポザーゼ活性が成熟卵細胞内に残存していて父方供与トランスポゾントランスジーンの転位を媒介するという可能性を排除するために、Zp3/ILMi雄（これはトランスポザーゼを発現しない）を多コピートランスポゾン保持系統MCGの雌と交配させた。両方のトランスジーンに陽性である雌後代を更なる研究のために選択した。本発明者らは、二重陽性雌と野生型雄との307個の後代をサザンブロット分析により分析した。EcoRVおよび／またはBglIIで消化された尾部DNAをブロットし、GFPプローブでハイブリダイズさせた。これらの2つの酵素はいずれも、トランスポゾン内で切断しないため、MCG系統においては、トランスポゾンプローブにハイブリダイズする1つの単一バンドが認められる。転位が生じ、トランスポゾンが、それが最初に存在したゲノムEcoRVまたはBglII断片の外に挿入されると、トランスポゾンプローブへのハイブリダイゼーションの後に新たなバンドが検出されるであろう。307匹のマウスのうち、146匹のマウスがトランスポゾン（GFP）に関して陽性であった。これらの146匹のマウスにおいて、ブロット上に新たな制限断片を与える12の転位事象が観察され、8.2％の転位頻度が得られた。2つのマウスにおいては、2つの独立した転位事象が見出された（図8のレーン2および5）。いくつかの後代はMinos媒介性挿入を保持するがトランスポザーゼトランスジーンを受け継がなかったという観察は、第2減数分裂の前に母親の生殖細胞内で転位が生じたことを強く示唆している。
【０１８０】
観察された転位事象が実際に生殖系列内で生じたことを証明するために、転位事象を有する動物を更に野生型マウスと交配させた。それらの後代の分析は、これらのマウスが再挿入Minos因子を安定に伝達することを示した（図8）。トランスポゾンコンカテマーの分離およびF1世代の2つの異なる系統への新たな挿入は、別の染色体へ転位が生じたという明らかな証拠であった（図8のレーン2対3および4、ならびにレーン8対9）。1つを除く全ての転位事象において、単コピーのトランスポゾンが動員された。
【０１８１】
トランスポゾンのサイズはその転位頻度に影響を及ぼし、より長い因子はより低い頻度で転位する傾向にあることが既に認められており（Lampe, D. J.ら (1998). Genetics 149, 179-187; Fischer, S. E.ら (1999) Mol. Gen. Genet. 262, 268-274）、このことは、トランスポザーゼ結合部位（逆方向反復配列）が互いに接近している場合には、それらはより効率的に認識されることを示唆している。
【０１８２】
Minos転位は、隣接DNAの動員を伴わない因子の厳密な組込みにより特徴づけられる。ショウジョウバエにおいてはおよびHeLa細胞においては、トランスポゾンはTAジヌクレオチド内に挿入されて、挿入に際して標的部位の重複化を引き起こす（17, 29）。マウスゲノム内の挿入物の構造を調べるために、本発明者らは、5つの異なる転位事象からの隣接領域をクローニングした（「材料および方法」に記載のとおり）。ショウジョウバエにおいて観察されるのと同様に、創始マウス系統MCGにおいては、Minos末端は特徴的なTAジヌクレオチドに隣接しており、その後には、因子に隣接する配列には無関係な配列が続いていた（図9）。Celeraマウスゲノムデータベースにおける、得られた配列でのBLAST検索は、新たな隣接配列のうちの全5個（1つの場合には、1つの隣接配列のみが得られた）が、広範に散在するゲノム位置に対応することを示した（図9）。分析した5つの転位事象のうち、1つだけが第14染色体上に存在した。それは、第14染色体の先端部にトランスポゾンコンカテマーの存在を伴わない、動原体領域内に組込まれた単コピーのトランスポゾンである。したがって、この転位事象は、異なる染色体内に生じた（図10を参照されたい）。末梢白血球からの中期スプレッド（spreads）上で行ったDNA蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH分析）は、隣接領域の配列決定から得た結果を証明した（データ非表示）。しかし、サザンブロット分析によっては明らかに検出可能であるが同じ染色体上の元の部位の近傍に位置する転位事象は、FISHによっては同定されないであろう。FISHにより単コピー（3kb）の転位を検出することは実際には非常に困難であり、このことは、用いられる唯一の検出方法がFISHであるT細胞において特異的に発現されるMinosトランスポザーゼおよび同じトランスポゾン含有トランスジェニック系統（MCG）で本発明者らが既に得ていた低い転位頻度（0.61％）（Zagoraiou, L.ら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  98,11474-11478）を部分的に説明しうるものである。少なくともショウジョウバエP因子（Zhang, P.& Sprading, A.C. (1993) Geneti
cs 133, 361-373）およびスリーピングビューティー（Sleeping Beauty）（Luo, Gら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 10769-10773; Fisher, S.E.J.ら, (2001) Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6759-6764）では因子の元の部位の近傍の「局所的挿入」は非常に頻繁に生じるため、これがMinos因子の場合に当てはまらないとは考えにくい。
【０１８３】
EcoRV/BglII隣接領域のサイズを決定するために、本発明者らは、loxP/Cre系を使用してMCG系統から単コピーのトランスポゾン系統を作製した（データ非表示）。サザンブロットのデータに基づけば、EcoRVおよびBglII特徴的消化産物内に、トランスポゾンに隣接する約10kbのゲノム配列が存在する。この領域内に生じる（が突然変異誘発の目的には関心が持たれない）局所的再挿入は検出を逃れ、転位頻度の本発明者らの推定には含まれない。したがって、8.2％の頻度は、実際の転位頻度ではなく「有用」な転位頻度を表す。スリーピングビューティー（Sleeping Beauty）に関してマウス雄生殖系列において報告されている転位頻度は約20％であったが、異なる染色体には僅か2％が転位しているに過ぎなかった（Fisher, S.E.J., Wienholds, E. & Plasterk, R.H.A. (2001) Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6759-6764）。これとは対照的に、本発明者らは、Minosに関して、異なる染色体への約6％の転位を見出しており（146個の後代のうち、分析された11個のうちの8個、1個は不明）、一方、11個の転位のうちの僅か3個だけが同じ染色体へのものであった（例えば、図10）。このことは、Minos系が、異なる染色体への転位を好むことを示唆している（ただし、未検出となった元の部位の近傍に多数の転位は存在しなかった）。しかし、現在までに公開されている異なるトランスポゾン系の直接的な比較はそれほど妥当でないかもしれないことに注目されるべきである。トランスポゾンのサイズ、コピー数および初期染色体位置のすべてが転位効率に影響を及ぼす可能性があり、したがって、これらはいずれも、異なる系において比較されうるものではない。
【０１８４】
最後に、これらの結果は、マウス生殖系列において転位が達成されうること、および誘導の時点を選択することにより、ある所定の胚発生段階においてトランスポゾンの動員が誘導されうることを示している。さらに、これらの結果は、例えばMinosを使用する系が生物（例えば、マウス）における挿入遺伝子不活性化、遺伝子タギング、エンハンサートラップおよびエキソントラップのための優れた手段であることを示している。
【０１８５】
前記の説明において挙げた全ての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載されている方法および系の種々の修飾および変更が当業者に明らかとなろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して説明されているが、特許請求されている本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。それどころか、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されている形態の種々の修飾が、特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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