(57)【要約】【課題】バッチ処理または連続処理法により造血幹細胞を単離、生体外増殖、および回収する効率的で、短時間で簡単に操作可能な方法およびシステムを提供する。【解決手段】（１）２μｍから１００μｍの孔径を有する膜よりなる濾過チャンバー、（２）濾過チャンバーに造血幹細胞源を導入する第１注入口、（３）濾過チャンバーに洗浄液を導入する第２注入口、（４）濾過チャンバーに洗浄液を排出させる第１排出口、よりなる造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収システムおよびこのシステムを用いて、（ａ）第１注入口より造血幹細胞源を濾過チャンバーへ導入、（ｂ）第２注入口より洗浄液を濾過チャンバーへ導入（ｃ）造血幹細胞を増殖させるために、造血幹細胞が保持されている膜を幹細胞培養液中で培養するバッチ処理システムと方法または連続処理システムと方法。【選択図】図１
2010263800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収を行うためのシステムであって、
２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えた濾過チャンバー、
濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第１注入口、
濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、および
濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口
を備えた、前記システム。
【請求項２】
造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させた後、該造血幹細胞源を貯蔵するための貯蔵チャンバーをさらに備えてなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
洗浄液が、無血清培地、血清培地、生理食塩水、緩衝液、ＥＤＴＡ含有生理食塩水、ＥＤＴＡ含有緩衝液、貧血小板血漿のいずれか、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
造血幹細胞源が、臍帯血、骨髄液または末梢血のいずれかである、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
造血幹細胞が、膜に保持されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
膜が、ポリウレタンをベースとしたポリマーまたはポリエチレンテレフタレートをベースとしたポリマーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
ポリエチレンテレフタレートをベースとしたポリマーが、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＡＭＯ）、およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）からなる群から選択される少なくとも１つから作られたポリマーコーティングをさらに含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
システムの操作時間が、約１０分から約３０分である、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
濾過チャンバーへ幹細胞培地を導入する第３注入口、
システムにおいて幹細胞培地を循環させるためのポンプ、および
造血幹細胞を収集する第２排出口
をさらに備えてなる、請求項１記載のシステム。
【請求項１０】
造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させた後、該造血幹細胞源を貯蔵するための貯蔵チャンバーをさらに備えてなる、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
幹細胞培地が、サイトカインをさらに含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
幹細胞培地が、低密度リポタンパク質をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
造血幹細胞が、第２排出口から収集された幹細胞培地から回収される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１４】
造血幹細胞を単離、生体外増殖および回収する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のシステムを提供する工程、
（ｂ）第１注入口より造血幹細胞源を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｃ）第２注入口より洗浄液を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｄ）膜を幹細胞培地で培養し、そこに保持された造血幹細胞を増殖させる工程
の順で含む、前記方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）の後、洗浄液を第１排出口から濾過チャンバーの外へ排出させること（ｃ１）をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
造血幹細胞源が、臍帯血、骨髄液または末梢血のいずれかである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
洗浄液が、無血清培地、血清培地、生理食塩水、緩衝液、ＥＤＴＡ含有生理食塩水、ＥＤＴＡ含有緩衝液、貧血小板血漿のいずれか、またはこれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
膜が、ポリウレタンをベースとしたポリマーまたはポリエチレンテレフタレートをベースとしたポリマーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ポリエチレンテレフタレートをベースとしたポリマーが、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＡＭＯ）、およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）からなる群から選択される少なくとも１つから作られたポリマーコーティングをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
造血幹細胞を単離、生体外増殖および回収する方法であって、
（ａ）請求項９に記載のシステムを提供する工程、
（ｂ）第１注入口より造血幹細胞源を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｃ）第２注入口より洗浄液を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｄ）第３注入口より幹細胞培地を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｅ）システム中に幹細胞培地を循環させるポンプを作動させる工程、
（ｆ）第２排出口より収集した幹細胞培地から造血幹細胞を回収する工程
の順で含む、前記方法。
【請求項２１】
（ｂ１）工程（ｂ）において造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させた後、該造血幹細胞源を貯蔵チャンバーに貯蔵すること、
（ｃ１）工程（ｃ）の後、洗浄液を第１排出口より濾過チャンバーの外へ排出させること、および
（ｅ１）工程（ｅ）の後、幹細胞培地の一部を取り出すことによって、造血幹細胞を第２排出口よりサンプリングすること
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
造血幹細胞源が、臍帯血、骨髄液または末梢血のいずれかである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
洗浄液が、無血清培地、血清培地、生理食塩水、緩衝液、ＥＤＴＡ含有生理食塩水、ＥＤＴＡ含有緩衝液、貧血小板血漿のいずれか、またはこれらの組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
膜が、ポリウレタンをベースとしたポリマーまたはポリエチレンテレフタレートをベースとしたポリマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ポリエチレンテレフタレートをベースとしたポリマーが、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＡＭＯ）、およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）からなる群から選択される少なくとも１つから作られたポリマーコーティングをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、造血幹細胞の単離、生体外増殖（ex vivo expanding）および回収を行うための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、細胞および組織の再生源を提供するので、極めて多くの疾患、症状、障害の治療において、多大な期待が寄せられている。幹細胞の主な供給源は、胚性幹細胞または体性幹細胞である。胚性幹細胞は胚から得られるのに対して、体性幹細胞は通常各組織中に極少数で存在しており、脳、骨髄、末梢血、血管、骨格筋、皮膚、臍帯血、脂肪組織および肝臓を含む様々な組織や臓器において見出されている。疾患の治療に胚性幹細胞を用いることは、胚性幹細胞の生命との密接な関係のために論議の的となっている。対照的に、体性幹細胞は倫理的なジレンマは提起されていない。体性幹細胞の有利な点は、患者自身の細胞を培養し、その患者に注入し得ることにある。さらに、患者自身の体性幹細胞を用いることは、免疫抑制剤を使用せずに免疫系による細胞拒絶を防ぐことができる。
【０００３】
造血幹細胞は、臨床処置において最も汎用的に使用されている体性幹細胞である。しかしながら、これらの細胞は成人組織中には極わずかであり、それらの数を細胞培養で増殖させるのは困難であるため、体性幹細胞の十分な数を実際の臨床目的のために得るために、体性幹細胞を単離し細胞培養で増殖させることが研究されている。特公平８−６９（特許文献１）には、臍帯血から単核球細胞を単離する方法が記載されているが、該方法は開放系であり、バクテリアまたは菌によって汚染される可能性がある。さらに、単核球細胞を体外増殖させる前に、単核球細胞を単離するのに約３時間を要する。労働集約的な方法が特開２００８−２３７１３６（特許文献２）に記載されており、この方法では、ＣＤ３４＋造血幹細胞をＨＥＳ法を用い、引き続き磁気ビーズ法を用いて単離されている。同様に造血ＣＤ３４＋造血幹細胞を体外増殖させる前に、ＣＤ３４＋造血幹細胞を単離するのに約３時間から５時間を要する。特開平１０−８４９５０（特許文献３）は、透過法を提示している。この方法は、親水性共重合体でコーティングした不織布を赤血球は透過し、ＣＤ３４＋造血幹細胞は不織布により保持される。しかしながら、収量はあまりにも低く、実用的に使用することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平８−６９号公報
【特許文献２】特開２００８−２３７１３６号公報
【特許文献３】特開平１０−８４９５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の観点から、当該分野において、骨髄移植を含めた医療処置への利用のために、体性幹細胞、特にヒト造血幹細胞を単離および増殖させる改良された方法への必要性が存在する。
【発明の効果】
【０００６】
本明細書に例示および広範に記載するように、本発明は、造血幹細胞を単離、生体外増殖、および回収するシステムおよび方法を特徴とする。本明細書に記載の該方法およびシステムは、効率的で、簡単に操作することができ、バッチ処理または連続処理法により造血幹細胞を単離、生体外増殖、および回収することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一つの面において、本発明は、造血幹細胞を単離、生体外増殖、および回収するためのシステムを提供する。
一つの態様において、本システムは、バッチ式システムであって、２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えた濾過チャンバー、濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第１注入口、濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、および濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口を備えている。一つの例において、造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させた後、該造血幹細胞源を貯蔵する貯蔵チャンバーをさらに含む。他の例において、造血幹細胞が濾過チャンバーの膜に保持され、造血幹細胞を保持した膜が該チャンバーから取り出され、幹細胞培地中で生体外培養される。
【０００８】
他の態様において、本システムは、連続式システムであって、２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えた濾過チャンバー、濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第１注入口、濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、濾過チャンバーへ幹細胞培地を導入する第３注入口、システムにおいて幹細胞培地を循環させるポンプ、濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口、および造血幹細胞を収集する第２排出口を備えている。一つの例において、システムは、造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させた後、造血幹細胞源を貯蔵する貯蔵チャンバーをさらに含む。他の例において、造血幹細胞が、第２排出口より収集された幹細胞培地から連続的に回収される。
【０００９】
第２の面において、本発明は、本発明のシステムの使用によって、造血幹細胞を単離、生体外増殖、回収する方法を提供する。
一つの態様において、本方法は、バッチ式により、造血幹細胞を単離、生体外増殖、回収する方法であって、該方法は、
（ａ）造血幹細胞を単離、生体外増殖、回収するバッチ式システムを提供する工程であって、該システムは、
２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えた濾過チャンバー、
濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第１注入口、
濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、
濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口を備えており、
（ｂ）第１注入口より造血幹細胞源を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｃ）第２注入口より洗浄液を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｄ）膜を幹細胞培地中で培養し、そこに保持された造血幹細胞を増殖させる工程
の順で含む。
【００１０】
一つの例において、本方法は、工程（ｃ）の後、濾過チャンバーの外へ洗浄液を第１排出口から排出させること（ｃ１）をさらに含む。
【００１１】
第二の態様において、本方法は、連続式に造血幹細胞を単離、生体外増殖、回収する方法に関し、該方法は、
（ａ）造血幹細胞を単離、生体外増殖、回収する連続式システムを提供する工程であって、該システムは、
濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第１注入口、
濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、
濾過チャンバーへ幹細胞培地を導入する第３注入口、
システムにおいて幹細胞培地を循環させるポンプ、
濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口、
造血幹細胞を収集する第２排出口
を備えており、
（ｂ）第１注入口より造血幹細胞源を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｃ）第２注入口より洗浄液を濾過チャンバーへ導入する工程、
（ｄ）第３注入口より濾過チャンバーに幹細胞培地を導入する工程、
（ｅ）システム中に幹細胞培地を循環させるポンプを作動させる工程、
（ｆ）第２排出口より収集した幹細胞培地から造血幹細胞を回収する工程
の順で含む。
【００１２】
一つの例において、本方法は、（ｂ１）工程（ｂ）において造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させた後、該造血幹細胞源を貯蔵チャンバーに貯蔵させる工程、（ｃ１）工程（ｃ）の後、洗浄液を第１排出口より濾過チャンバーの外へ排出させる工程、および、（ｅ１）工程（ｅ）の後、幹細胞培地の一部を取り出すことによって、造血幹細胞を第２排出口よりサンプリングする工程をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のバッチ型システムを示す図である。
【図２】本発明の連続型システムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
より詳細な本発明の１つまたはそれ以上の態様は、下記に続く文章に記載する。本発明の他の特徴や有利な点は、以下の詳細な記載および請求項から明らかになろう。
また、以下に続く一般的な記載と詳細な記載はともに例により、クレームされたものとしての本発明のさらなる説明であることを理解すべきである。
定義
「幹細胞」という用語は、組織や臓器の特定細胞を形成するための無限に再生可能な主細胞である。幹細胞は二つの娘幹細胞または、一つの娘幹細胞と一つの前駆細胞へと分裂可能であり、その前駆細胞は組織の成熟した完全に分化した細胞に増殖する。「幹細胞」という用語は、多能性細胞を意味し、「多能性細胞」は、ある組織または臓器中でほ乳類動物の２つまたはそれ以上の異なった細胞種に成長することが可能な細胞を意味する。「造血幹細胞」とは、成熟した血液細胞に成長する能力を有する多能性細胞である。ここで成熟した血液細胞は、限定はされないが、赤血球、白血球、巨核球細胞、血小板や、Ｔ細胞、Ｂ細胞を含んでいる。
【００１５】
本発明の広範囲を規定する多様な範囲およびパラメーターは概略ではあるが、実施例における数値は可能な限り正確に記述する。しかしながら、測定評価中には、いかなる数値も標準偏差から生ずるある程度の誤差を含んでいる。
ここで用いたようにおよび添付のクレームにおいて、単数形の「a」、「an」および「the」は、明確に示す以外は、複数の対象を含むことに留意すべきである。
【００１６】
本発明の実施において用いることができる方法、手法および／またはプロトコール（まとめて「方法」という）は、明細書と通じて述べられた手順のこれらの特定の例に限定されることはなく、同じ目的のために当該分野において知られた任意の手順をも包含される。さらに、いくつかの方法は、特異的に記述されるが、これらに制限されるものではない。
【００１７】
本発明の概要
本発明の実施について、造血幹細胞の単離、増殖、回収のための方法およびシステムに関し詳細に記載する。
バッチ式造血幹細胞の単離、生体外増殖、回収システムおよび方法
本発明の一つの態様について、バッチ式造血幹細胞の単離、生体外増殖、回収システムは、２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えた濾過チャンバー、濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第１注入口、濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、および濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口を備えている。
【００１８】
図１は、本発明の一つの態様であるバッチ型システム１００を示す。バッチ型システム１００は、濾過チャンバー１０１、第１注入口１０４，第２注入口１０５，第１排出口１０６およびドレイン１０７を備えている。濾過チャンバー１０１は、２μｍから１００μｍ、例えば、２μｍから２５μｍ、３μｍから２０μｍ、または３μｍから１５μｍの孔径を有する膜を備えている、。使用法は、造血幹細胞源１０２を、第１注入口１０４より濾過チャンバー１０１に導入する。次に、洗浄液１０３を第２注入口１０５より濾過チャンバー１０１に導入し、濾過チャンバー１０１より排出された使用済み洗浄液１０３は第１排出口１０６を通ってドレイン１０７に排出される。造血幹細胞は濾過チャンバー１０１中の膜に保持される。さらに、造血幹細胞を保持した膜全体は濾過チャンバー１０１より取り出され、生体外培養用幹細胞培地を含む培養器中に設置する。
【００１９】
本発明に使用できる造血幹細胞の適した供給源としては、臍体血、骨髄液または末梢血であるが、これらに限定されるものでもない。一つの例として、臍体血源は、インフォームドコンセントを得た帝王切開または正常出生をおこなった婦人の切除後の臍帯より収集された臍帯血である。他の例として、造血幹細胞源はインフォームドコンセントを得た適正なドナーより収集された末梢血である。骨髄液または末梢血はシリンジを用いて採取され、クエン酸またはヘパリンのような抗凝固剤が含まれた血液バッグ中に保存される。
【００２０】
また他の例において、造血幹細胞源はインフォームドコンセントを得た適正なドナーより標準骨髄液採取法により採取された骨髄液である。造血幹細胞源１０２を、濾過チャンバー１０１に透過させた後、洗浄液１０３は、システム１００に第２注入口１０５より導入される。洗浄工程は、赤血球等を除去することにより造血幹細胞源を純化させる目的を有している。すなわち、赤血球等は造血幹細胞の増殖を抑制する効果があると考えられているからである。本発明で用いられる適正な洗浄液１０３は、無血清培地、血清培地、生理食塩水、緩衝液、ＥＤＴＡ含有生理食塩水、ＥＤＴＡ含有緩衝液、貧血小板血漿のいずれかまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。貧血小板血漿は、血液を供給源とすればいかなる公知の方法により調製されても良い。一つの例において、臍帯血は適切な速度で遠心分離され、血球細胞を取り除くために、上澄み液を膜フィルター（孔径０．２２μｍ）を用いてろ過させ、貧血小板血漿を調製する。
【００２１】
他の方法において、培地、生理食塩水または緩衝液を洗浄液１０３として使用する。培地は、血清を含む場合と含まない場合が考えられる。緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む場合と含まない場合が考えられる。一つの例として、洗浄液１０３はStemCell Technologies (USA)より直接購入したStemSpan SFEM培地のような無血清培地である。この場合、StemSpan SFEM培地に造血成長因子や他のサイトカインが含まれても含まれなくても良い。他の例において、洗浄液１０３は無血清培地と貧血小板血漿との組み合わせである。造血幹細胞源または洗浄液をシステム中に導入するのに、ペリスターポンプのようなポンプを使用して導入することも可能である。流体である造血幹細胞源１０２または洗浄液１０３は、濾過チャンバー１０１に流速１〜１０ｍＬ／分で透過させる。一つの例において、１ｍＬ／分である。
【００２２】
濾過チャンバー１０１は、その中に２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えている。例えば、孔径は、２μｍから２５μｍ、３μｍから２０μｍまたは３μｍから１５μｍである。様々な手法により膜の平均孔径を測定することが可能である。例えば、電子顕微鏡、液体噴出孔径メーター（liquid extrusion porosimetry）や他の適切な既知な方法である。示した実施例においては、孔径は、液体噴出孔径メーターで概算した。孔径の測定は、測定に用いた特定の手法により異なることに留意すべきである。適正な膜材料は、良好な生体適合性、良好な成形性、良好な滅菌性および細胞に対して低毒性である必要がある。
【００２３】
一般的には、膜は以下で示す合成ポリマーより調製される。すなわち、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミドおよびポリウレタン等であるが、これらに限定されるわけではない。さらには、天然ゴムもこれらの素材として含まれ、さらにはアガロース、セルロース、酢酸セルロース、アルギネート等であるがこれらに限定されるわけではない。また、さらにはヒドロキシアパタイト、アルミナ、チタニア等の無機材料およびステンレス鋼、チタン、アルミニウム等の金属も含まれるがこれらに限定されるわけではない。好ましくは、膜はポリウレタンをベースポリマーまたはポリエチレンテレフタレートをベースポリマー（例えば、不織布）として調製されている。ベースポリマーは、さらにその主鎖および／または側鎖に他の分子をグラフトさせていても良い。この他の分子としては、アミノ酸、ペプチド、グリコサミノグリカンや糖鎖蛋白質であるがこれらに限定されるわけではない。ひとつの例として、特開２００５−３２３５３４に記載されている方法のように、ポリウレタンをベースとしたポリマーは、カルボキシルグループのような官能基をポリマー表面にプラズマ放電法を用いてグラフトされる。
【００２４】
ポリエチレンテレフタレートをベースポリマーとして用いる場合、表面に下記のポリマーをコーティングするのも良い。このコーティング用ポリマーは以下のモノマーを少なくとも一つ選択して作成される；ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＡＭＯ）、およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）。例として、ＢＭＡとＤＭＡより調製されたポリマーをコーティングされたポリエチレンテレフタレートをベースポリマー（不織布）としたものより膜は調製される。
【００２５】
透過後、造血幹細胞は濾過チャンバー１０１にある膜に保持されている。そこで、造血幹細胞を保持した膜は濾過チャンバー１０１より取り出され、直接生体外培養するために適切な幹細胞培地を含む培養容器に注意深く設置される。例として、幹細胞培地はサイトカイン混合物と低密度リポタンパク質（LDL）を添加させたStemSpan SFEM培地である。サイトカイン混合物は、組み換えヒト幹細胞因子（recombinant human stem cell factor）、組み換えヒトスロンボポエチン（recombinant human thrombopoietin）および組み換えヒトFlt-3リガンド（recombinant human Flt-3 ligand）等である。各々のサイトカインは、培養初期には、５ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬの間の濃度であり、１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で用いることが好ましい。場合によっては、ＬＤＬも使用しても良い。この場合、培養初期には通常０．１ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬの量を用い、詳しくは５ｍｇ／ｍＬの濃度が好ましい。ひとつの例として、無血清培地は、濾過チャンバー１０１を透過させる洗浄液１０３として使用される。従って、造血幹細胞を保持した膜は約１０日程度の直接生体外培養を行うことができ、造血幹細胞源から直接幹細胞を単離し、生体外培養中に設置されて増殖した造血幹細胞数はコントロールと比べて少なくとも６３％である。他の例として、貧血小板血が濾過チャンバー１０１を透過させる洗浄液１０３として使用される。この場合、増殖した造血幹細胞数はコントロールと比べて少なくとも２８０％である。
【００２６】
本態様のバッチ型システムは簡単に使用でき造血幹細胞を単離するのに時間効率が良いシステムであり、造血幹細胞源を濾過チャンバーに透過させてから単離した造血幹細胞を培養デッシュに挿入するまでの操作時間は１０分から６０分と比較的短時間である。ひとつの好ましい態様では、操作時間は１８分である。
【００２７】
造血幹細胞単離、生体外増殖、回収のための連続型システムおよび方法
本発明の他の態様について、連続式造血幹細胞の単離、生体外増殖、回収システムは、２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を備えた濾過チャンバー、濾過チャンバーへ造血幹細胞源を導入する第1注入口、濾過チャンバーへ洗浄液を導入する第２注入口、濾過チャンバーに幹細胞培地を導入する第３注入口を有すること、システム内に幹細胞培地を循環させるポンプ、濾過チャンバーの外へ洗浄液を排出させる第１排出口、さらに造血幹細胞を収集させる第２排出口を備えている。
【００２８】
図２は、本発明の一つの態様である連続型システム２００を示す。連続型システム２００は、濾過チャンバー２０１、第１注入口２０４、第２注入口２０５，第１排出口２０６、ドレイン２０７、第２排出口２０８、造血幹細胞収集容器２０９、第３注入口２１１およびポンプ２１３よりなる。本システムは、オプションとして濾過チャンバー２０１に接続した貯蔵チャンバー２１０を有していても良い。濾過チャンバー２０１は、その中に２μｍから１００μｍの孔径を有する膜を有している。
【００２９】
操作において、造血幹細胞源２０２を、第１注入口２０４より濾過チャンバー２０１に導入する。オプションとして、濾過チャンバー２０１を透過した造血幹細胞源２０２は、オプション貯蔵チャンバー２１０中に回収、保存される。次に、洗浄液２０３を第２注入口２０５より濾過チャンバー２０１に導入し、濾過チャンバー２０１より排出された使用済み洗浄液２０３は第１排出口２０６よりドレイン２０７に排出される。引き続き、幹細胞培地２１２は第３注入口２１１より濾過チャンバー２０１に挿入され、ポンプ２１３を用いてシステム２００中に循環させる。幹細胞培地２１２は、たとえば２日おき等のように数日おきに新鮮な培地２１２と交換する。使用済み培地２１２は第１排出口２０６よりドレイン２０７に排出される。一方幹細胞は濾過チャンバー２０１中の培養状態で保持されている。幹細胞培地２１２の少量を、培養中第２排出口２０８より採取し、幹細胞培地２１２中の造血幹細胞２０２の数を分析し、造血幹細胞２０２が十分な数に達したかどうかを確かめることも可能である。試料培地２１２中の造血幹細胞２０２の数が求めている値に達したとき、濾過チャンバー２０１中の培地２１２は第２排出口２０８より排出させ、造血幹細胞収集容器２０９中に挿入し、収集容器２０９中の培地２１２より造血幹細胞２０２は回収される。
【００３０】
他の方法として、収集容器２０９中の培地２１２より造血幹細胞２０２は数日ごとに連続的に回収され、それらはまとめて使用されることも可能である。必要であれば、適切な２方または３方バルブ（図示はしていない）をシステムに設置し、異なった回路を形成することも良い。例えば、培地２１２が第３注入口２１１より導入されるとき、第１注入口２０４、第２注入口２０５，ドレイン２０７、収集容器２０９およびオプションの貯蔵チャンバー２１０に導くラインに取り付けられたバルブはすべて閉じることにより、ポンプ、培地２１２および濾過チャンバー２０１周辺の閉鎖回路が形成される。同様に、培養中に少量の培地２１２を採取したいとき、収集容器２０９に通じるバルブは開けられる一方、第１注入口２０４、第２注入口２０５、ドレイン２０７、およびオプションの貯蔵チャンバー２１０に通じるラインに取り付けられたバルブは閉じられることにより、ポンプ、培地２１２、濾過チャンバー２０１および収集容器２０９周辺の閉鎖回路が形成される。
【００３１】
同様に、本発明に使用される造血幹細胞の適した供給源として、臍体血、骨髄液または末梢血であるが、これらに限定されるものでもない。一つの例として、造血幹細胞源は、インフォームドコンセントを得た帝王切開または正常出生をおこなった婦人の切除後の臍帯より収集された臍帯血である。他の例として、造血幹細胞源はインフォームドコンセントを得た適正なドナーより収集された末梢血である。骨髄液または末梢血はシリンジを用いて採取され、クエン酸またはヘパリンのような抗凝固剤が含まれた血液バッグ中に保存される。また他の例では、造血幹細胞源は、インフォームドコンセントを得た適正なドナーより標準骨髄液採取法により採取された骨髄液である。
【００３２】
造血幹細胞源２０２は、第１注入口２０４を通して濾過チャンバー２０１に透過させる。さらに貯蔵チャンバー２１０に再収集され得る。洗浄液２０３は、システム２００に第２注入口２０５より導入される。導入された洗浄液２０３は、赤血球等を除去することにより造血幹細胞源を純化させる目的を有している。すなわち、赤血球等は造血幹細胞の増殖を抑制する効果があると考えられているからである。
【００３３】
本発明で用いられる適正な洗浄液２０３は、無血清培地、血清培地、生理食塩水、緩衝液、ＥＤＴＡ含有生理食塩水、ＥＤＴＡ含有緩衝液、貧血小板血漿のいずれかまたはこれらの組み合わせよりなることであるが、これらに限定されるものではない。貧血小板血漿は、血液を供給源とすればいかなる公知の方法により調製されても良い。一つの例として、臍帯血は適切な速度で遠心分離され、血球細胞を取り除くために、上澄み液を膜フィルター（孔径０．２２μｍ）を用いてろ過させ、貧血小板血漿を調製する。他の方法において、培地、生理食塩水または緩衝液を洗浄液２０３として使用される。培地は、血清を含む場合と含まない場合が考えられ、緩衝液は４酢酸エチレンジアミン（ＥＤＴＡ）を含む場合と含まない場合が考えられる。
【００３４】
一つの例において、洗浄液２０３はStemCell Technologies (USA)より直接購入したStemSpan SFEM培地のような無血清培地である。この場合、StemSpan SFEM培地に造血成長因子や他のサイトカインが含まれても含まれなくても良い。他の例において、洗浄液２０３は無血清培地と貧血小板血漿との組み合わせである。造血幹細胞源または洗浄液をシステム中に導入するのに、ペリスターポンプのようなポンプ（図示せず）を使用して導入することも可能である。造血幹細胞源２０２または洗浄液２０３のような流体は、濾過チャンバー２０１に流速１〜１０ｍＬ／分で透過させる。
【００３５】
濾過チャンバー２０１は、その中に２μｍから１００μｍの孔径を有する膜よりなる。例えば、孔径は２μｍから２５μｍ、３μｍから２０μｍまたは３μｍから１５μｍである。様々な手法により膜の平均孔径を測定することが可能であり、例えば、電子顕微鏡、液体噴出孔径メーター（liquid extrusion porosimetry）や他の適切な既知な方法である。記述した実施例では、孔径は液体噴出孔径メーター（liquid extrusion porosimetry）により測定された。孔径の測定は測定に用いた特定の手法により異なることを記しておく。適正な膜材料は、良好な成形性、良好な生体適合性、良好な滅菌性および細胞に対して低毒性である必要がある。
【００３６】
一般的には、膜は以下で示す合成ポリマーより調製されるがこれらに限定されるわけではない。すなわち、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミドおよびポリウレタン、さらには以下に示すアガロース、セルロース、酢酸セルロース、アルギネート等の天然ポリマーであるがこれらに限定されるわけではない。また、さらにはヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料およびステンレス鋼、チタン、アルミニウム等の金属も含まれるがこれらに限定されるわけではない。好ましくは、膜はポリウレタンベースポリマーまたはポリエチレンテレフタレートベースポリマー（例えば、不織布）によって調製されている。ベースポリマーは、さらにその主鎖および／または側鎖に他の分子をグラフトさせていても良い。この他の分子としては、アミノ酸、ペプチド、グリコサミノグリカンや糖鎖蛋白質であるがこれらに限定されるわけではない。
【００３７】
ひとつの例として、特開２００５−３２３５３４に記載されている方法のように、ポリウレタンベースポリマーはカルボキシルグループのような官能基をポリマー表面に既知のプラズマ放電法を用いてグラフトされる。ポリエチレンテレフタレートをベースポリマーとして用いる場合、表面に下記のポリマーをコーティングするのも良い。このコーティング用ポリマーは少なくとも以下のモノマー一つより選択して作成される；ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＡＭＯ）、およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）。一つの例として膜は、カルボキシルグループを含むまたは含まないポリウレタンベースポリマーより調製される。他の例として、ＢＭＡとＤＭＡより調製されたポリマーをコーティングしたポリエチレンテレフタレートベースポリマー（不織布）によって膜は調製される。
【００３８】
透過後、造血幹細胞は濾過チャンバー２０１にある膜に保持されている。直接対外培養するために適切な幹細胞培地は第３注入口２１１より濾過チャンバー２０１に導入され、ポンプ２１３を用いて循環させる。好ましくは、ポンプ２１３はペリスターポンプであり、システム２００中、特に濾過チャンバー２０１中の培養培地２１２を循環させる。ポンプ２１３は、システム中の培養培地の循環を閉鎖系にする限り、様々な適切な部分を循環させることができる。ひとつの態様として、第１注入口２０４、第２注入口２０５、オプションである貯蔵チャンバー２１０、ドレイン２０７および第２排出口２０８に通じるラインに設置されたバルブを閉じることにより、ポンプ２１３、培養培地２１２および濾過チャンバー２０１中で閉鎖系が形成される。他の態様として、第１注入口２０４、第２注入口２０５、ドレイン２０７、オプションである貯蔵チャンバー２１０に通じるラインに設置されたバルブを閉じることにより、ポンプ２１３、培養培地２１２、濾過チャンバー２０１および収集容器２０９中で閉鎖系が形成される（データは示していない）。
【００３９】
例として、幹細胞培地はサイトカイン混合物と低密度リポタンパク質（LDL）を添加させたStemSpan SFEM培地である。StemSpan SFEM培地は、StemCell Technologies (USA)より直接購入することができ、造血幹細胞因子や他のサイトカインを含んでも、含まなくても良い。サイトカイン混合物は、組み換えヒト幹細胞因子（recombinant human stem cell factor）、組み換えヒトスロンボポエチン（recombinant human thrombopoietin）および組み換えヒトFlt-3リガンド（recombinant human Flt-3 ligand）等である。各々のサイトカインは、培養初期には、５ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬの間の濃度であり、１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で用いることが好ましい。場合によっては、ＬＤＬも使用する。この場合、培養初期には通常０．１ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬの量を用い、詳しくは５ｍｇ／ｍＬの濃度が好ましい。細胞培地２１２は新鮮な細胞培地２１２と一日ごとに交換され、使用済みの細胞培地２１２の少量は採取され、細胞培地２１２中の造血幹細胞数が決定される。
【００４０】
ひとたび、採取した培地２１２中の造血幹細胞２０２があらかじめ定めていた値に到達したら、濾過チャンバー２１１中の培地２１２は、第２排出口２０８より造血幹細胞収集容器２０９中に排出され、造血幹細胞２０２は収集容器２０９中の培地中に収穫される。他の態様として、造血幹細胞２０２は、収集容器２０９中に収集した培地２１２から数日ごとに連続的に収穫され、以後の使用のために貯蔵することも可能である。ひとつの例として、培地２１２から収穫された造血幹細胞は、生体外培養の後、コントロールと比べて少なくとも１以上である。例えば、臍帯血から単離され、直接生体外培養された幹細胞は、生体外培養後、１０日後には１４から１５倍と高い値に到達することもある。
【００４１】
さらに、本態様の連続システムにより単離し、生体外増殖し、収穫された造血幹細胞はコロニーを形成する能力を有している。ひとつの例として、単離し、生体外増殖された造血幹細胞より形成されたコロニー数は、コントロールの値と同等であり、約１５０コロニー数であった（データは示さず）。
同様に、本態様の連続システムは、造血幹細胞を単離するのに手軽に操作でき、時間効率的である。すなわち、生体外培養に必要な時間を考慮しない場合、造血幹細胞源を単離するために濾過チャンバーに透過を始めてからシステム中で生体外培養するまでの操作時間は、約１０分から６０分と比較的短時間である。本態様では、操作時間は約１８分である。
【００４２】
［実施例］
以下、発明の実施の態様を通じて本発明を説明するが、以下の実施態様は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではなく、また実施態様の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００４３】
実施例１  表面修飾ＰＵ膜の調製
１．１  ＰＵ−ＧＭＡ膜の調製
ＰＵ−ＧＭＡ膜は先の文献、特開２００５−３２３５３４公報記載のプラズマ放電法を用いて調製した。簡潔に記載すると、白血球除去膜（イムガードIII-RC、テルモ社製）から取り出したポリウレタン膜をこの実施例では使用する。アルゴンプラズマを用いて反応容器中のポリウレタン（ＰＵ）膜表面にグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は導入された。アルゴンガス（約２６．６パスカルの圧力）を反応容器中に約３０秒間流し、高周波電源（出力２００Ｗ）供給下において、アルゴンプラズマを発生させた。その後、ＧＭＡとＰＵ膜間でグラフト重合を反応容器中にて５分間、０．６５パスカルの圧力下で行った。引き続き、ＧＭＡ架橋ＰＵ膜は、水とメタノールの混合溶液（１：１体積比）で３０分間振動下で洗浄し、さらに純水で３０分間洗浄した。ＰＵ膜表面に導入されたＧＭＡ架橋率は次式で定義された。
ＧＭＡ導入率（％）＝（Ｘ／Ｙ）×１００
ここでＧＭＡ導入率はプラズマ放電後のＰＵ−ＧＭＡ膜の乾燥重量（Ｘグラム、８０度２４時間真空乾燥）をプラズマ放電前のＰＵ膜の乾燥重量（Ｙグラム、８０度２４時間真空乾燥）で割った比と定義した。この例では、ＧＭＡ導入率は０．６１％であった。
【００４４】
１．２  ＰＵ−ＣＯＯＨ膜の調製
上記記載の操作で調製したＰＵ−ＧＭＡ膜（孔径約５μｍと推定）を直径２５ｍｍの円状に各切断した。３枚のＰＵ−ＧＭＡ膜は、水酸化ナトリウム水溶液含有グリシン溶液中に浸漬させた（２０ｍＬ、０．１Ｍ、水酸化ナトリウム水溶液中のグリシン濃度は０．４Ｍ）。その後、８０度で２４時間培養することによりカルボキシル基導入ＰＵ膜を調製した。反応が終了した後、膜は、超純水中で振とうさせながら、１０分間２５度で洗浄した。洗浄は２回を行い、超純水中に４度にて冷蔵保存した。調製したＰＵ膜は、「ＰＵ−ＣＯＯＨ膜」と命名した。
【００４５】
実施例２  造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収のためのバッチシステム
インフォームドコンセプトに同意されている妊婦より臍帯血を得た。臍帯血は、血液抗凝固剤（クエン酸、デキストロース他）を含有している採血bag（CPDA-1、テルモ株式会社製）中に挿入した。ろ過装置は上記記載の３枚のＰＵ−ＣＯＯＨ膜をフィルタホルダー（MILLIPORE製 ２５ｍｍ）に装着させて組み立てた。６ｍＬの臍帯血を１ｍＬ／ｍｉｎの速度でろ過装置に透過させた。その後、洗浄液（６ｍＬ）を１ｍＬ／ｍｉｎの速度で６分間透過させた。洗浄液として、（ａ）血漿Ａ、または（ｂ）StemSpan SFEM培地を用いた。血漿Ａは、以下の方法により調製した。すなわち、臍帯血を１８００ｒｐｍの速度で遠心して貧血小板血漿を得た。さらに、この貧血小板血漿を、孔径０．２２μｍのフィルター（MiLlex GS, MILLIPORE製)を用いてろ過して、完全に血球細胞を除去した血漿を作成した（血漿Ａ）。StemSpan SFEM培地は販売会社より直接購入した（#09650, StemCell Technologies社製）。
【００４６】
洗浄後、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を膜ホルダーより取り出し、下記に記載する細胞培地中に浸漬させて、１０日間３７度、５％のＣＯ２濃度のＣＯ２培養槽中でＰＵ−ＣＯＯＨ膜に接着している造血幹細胞を培養した。この実施例中、単離した造血幹細胞の生体外培養に用いた培養培地は、StemSpan SFEM培地を基本培地として用い、これにサイトカインカクテルであるStemSpan CC110（#02697，StemCell Technologies社製）と５ｍｇ/ｍＬの低密度リポ蛋白質（LDL）を添加させた培地を本発明では用い、以後ＨＳＣ培地Ａと命名した。臍帯血を膜透過させてから造血幹細胞を培養デッシュに播種するまでの全操作時間は１８分のみと短時間であった。
【００４７】
１０日後に、造血幹細胞数はフローサイトメトリー（Beckman-Coulter社製 EPICSTM XL）を用いて測定した。すなわち、ＣＤ３４＋造血幹細胞の分析は、ISHAGEガイドライン（国際血液療法・移植学会, Keeney M. et al., Cytometry (1998) 34, 61-70）の実験法に基づいて行った。すなわち、サンプル管（Beckman-Coulter社製）をサンプルと同数準備した。２０μＬの抗ＣＤ３４抗体（Beckman-Coulter社製 CD45-FITC／CD34−PE）をサンプル管に添加した。１００μＬの各サンプルを抗ＣＤ３４抗体含有の各サンプル管に加え、よく撹拌した後、細胞生存度測定色素（Beckman-Coulter製 7-ADD Viability Dye）を２０μＬ添加し、室温暗所で１５分間培養した。次いで、５００μＬの溶血剤（OptiLyseC）を各sample管に添加し、よく撹拌した後、室温で１０分間培養した。５００μＬのリン酸緩衝液を各sample管に添加し、よく撹拌して、室温で１０分間培養した。このように調製したサンプルをフローサイトメトリーを用いて分析した。試料として採取した臍帯血に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞数を予め分析しておき、血漿ＡとStemSpan SFEM培地を洗浄液として用いたときの造血幹細胞の生体外増殖効率の比較として用いた。増殖・回収後の培地中に存在するＣＤ３４＋造血幹細胞数を分析した。ＣＤ３４＋造血幹細胞の生体外増殖率は下記式より計算で求められる。
【数１】
2010263800.tif 000003
式中、Ｎ２は、増殖・回収後における培地中のＣＤ３４＋造血幹細胞数であり、Ｎ１は試料として採取した臍帯血中に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞数である。結果を表１に示す。造血幹細胞の生体外増殖率は、洗浄液として、血漿ＡおよびStemSpan SFEM培地を用いたときに、それぞれ２．５倍および０．６３倍であった。
【００４８】
【表１】
2010263800.tif 000004
【００４９】
実施例３  実施例２のバッチシステムにより単離、増殖および回収された造血幹細胞
６ｍＬの臍帯血の代わりに１ｍＬの臍帯血を用い、細胞培養開始後５日目の細胞培養液（ＨＳＣ培地Ａ）の交換または未交換以外は、実施例２に記載の方法により造血幹細胞を単離、増殖、回収した。血漿Ａを本実験では洗浄液として使用した。表２に結果を示す。本実施例に記載の方法を用いた造血幹細胞単離、増殖において、コントロールと比べると２．７倍から６．２倍の増殖率を得た。
なお、臍帯血を膜透過させてから造血幹細胞を培養デッシュに播種するまでの全操作時間は１５分以下と短時間であった。
【００５０】
【表２】
2010263800.tif 000005
【００５１】
実施例４  造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収のための連続システム
臍帯血は上記実施例２記載の方法により採取した。造血幹細胞の単離、生体外増殖、回収の連続システムは図２記載の通り設置した。血液バッグ中の臍帯血２０ｇを６枚のポリウレタン(ＰＵ)膜（イムガードIII-RC、テルモ社製）よりなる２０１部位に２ｍＬ／分の透過速度で透過させた。ＰＵ膜の各シートの平均孔径は、キャピラリーフローポロメーター(Porous Materials Inc.)の測定から５から１２μｍであった。フィルター部位を透過した臍帯血は貯蔵部位２０６に貯蔵された。血漿Ａ（２０ｇ）は、フィルター部位２０１を２ｍＬ／分の透過速度で透過させ、続いてフィルター部位２０１を洗浄するためにStemSpan SFEM培地（６０ｇ）を透過させた。ＨＳＣ培養液Ａ（サイトカインカクテルであるStemSpan CC110（#02697，StemCell Technologies社製）と５ｍｇ/ｍＬの低密度リポ蛋白質（LDL）を添加させたStemSpan SFEM培地）をフィルター部位２０１に透過させ、さらにペリスターポンプを用いて０．５ｍＬ/分の速度で循環させた。新鮮なＨＳＣ培養液Ａ（２０ｇ）は、１日目と５日目にシステムに導入され、使用した古いＨＳＣ培養液Ａは排出口２０６を通して排出し、ドレイン２０７に導入させた。一方、フィルター部位２０１中に保持された造血幹細胞は、培養が引き続き続けられた。１日目と６日目と１０日目にＨＳＣ培養液Ａの少量をドレイン２０７より採取し、細胞培地中の造血幹細胞数を分析した。細胞数は、実施例２記載の方法に従い測定した。表３に結果を示す。
【００５２】
表３に示された結果より、本実施例はコントロール（臍帯血から単離し、通常の培養操作に直接用いられる幹細胞）に比べて少なくとも６．８倍という幹細胞の高い増殖率を与えることが明らかである。さらに、本実施例における連続操作により臍帯血を透過させて、ＨＳＣ培養液Ａをフィルター部位に導入し、連続培養するまでに、３０分とかからず、幹細胞を単離、生体外培養そして回収する連続操作は、通常の幹細胞分離および培養法に比べると比較的簡単である。
【００５３】
【表３】
2010263800.tif 000006
【００５４】
実施例５  実施例４の連続システムにより単離、増殖および回収された造血幹細胞
細胞培養後、２日目、４日目、６日目および８日目に培養培地（ＨＳＣ培養液Ａ）を交換した以外は、実施例４に記載の方法に従い造血幹細胞を、単離、生体外増殖ならびに回収した。連続操作により臍帯血を透過させて、ＨＳＣ培養液Ａをフィルター部位に導入し、連続培養するまでに約３０分しか要しなかった。表４に結果を示す。幹細胞を単離し、本実施例に記載された方法により幹細胞を単離、増殖することにより、コントロールと比べて４６倍もの高い増殖率が得られた。
【００５５】
【表４】
2010263800.tif 000007
【００５６】
実施例６  フィルターとして不織布を用いた実施例４の連続システムにおける造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収
ポリウレタン膜の代わりに不織布(Asahi Medical Co., SepaCell R, R-500B2(3)-1)をフィルター膜として使用し、細胞培養後、２日目、４日目、６日目および８日目に培養培地（ＨＳＣ培養液Ａ）を交換した以外は、実施例４に記載の方法に従い造血幹細胞を単離、生体外増殖ならびに回収した。
表５に結果を示す。本実施例に記載された方法に従い幹細胞を単離、増殖することにより、コントロールと比べて３．７倍の増殖率が得られた。
【００５７】
【表５】
2010263800.tif 000008
【００５８】
実施例７  実施例４の連続システムを用いた末梢血からの造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収
臍帯血の代わりに末梢血を用い、新鮮な培養液（ＨＳＣ培養液Ａ）を細胞培養後、２日目、４日目、６日目および８日目に供給した以外は、実施例４に記載の方法に従い造血幹細胞を、単離、生体外増殖ならびに回収した。本実施例に記載された方法に従い幹細胞を単離、増殖することにより、コントロールと比べて増殖率が増加することが予想される。
【００５９】
実施例８  実施例４の連続システムを用いた骨髄液からの造血幹細胞の単離、生体外増殖および回収
臍帯血の代わりに骨髄液を用い、新鮮な培養液（ＨＳＣ培養液Ａ）を細胞培養後、２日目、４日目、６日目および８日目に供給した以外は、実施例４に記載の方法に従い造血幹細胞を、単離、生体外増殖ならびに回収した。本実施例に記載された方法に従い幹細胞を単離、増殖することにより、コントロールと比べて増殖率が増加することが予想される。
［比較例］
【００６０】
臍帯血から通常のFicoll-Paque比重分離法（例えば、Fotino M., et al., Ann. Clin. Lab. Sci., 1,131-133 (1971)）により単核球を分離した。以下に、操作法を記す。
即ち、臍帯血を２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）入りリン酸緩衝液（以後、リン酸緩衝液Ａと命名）で１：４の割合で希釈した。この希釈臍帯血３５ｍＬを１５ｍＬのFicoll-Paque（Ficoll-Paque, Pharmacia）液上に重層した。４００Ｇ、２０℃で４０分間遠心して比重分離を行なった。遠心後、分離された単核球を注意深く分取した。再度リン酸緩衝液Ａを加えて５０ｍＬとし、軽い転倒混和の後、３００Ｇで１０分間遠心した。
【００６１】
下層０．５ｍＬを残して、上澄みをすべて取り除いた。この造血幹細胞含有溶液中に含まれる赤血球、白血球、血小板、ＩＳＨＡＧＥガイドラインに基づくＣＤ３４＋造血幹細胞数は、５１８１細胞／μＬ、１１,９３５細胞／μＬ、１７１,８１２細胞／μＬ、１８５細胞／μＬであった。上記操作は、３時間の操作時間を有した。
次に、上記記載の方法で純化させたＣＤ３４＋造血幹細胞１０００細胞を造血幹細胞培地（ＨＳＣ培養液Ａ）１ ｍＬ含有２４穴プレート中で培養した。１０日後に、ＣＤ３４＋造血幹細胞を回収し、実施例２の方法で細胞培地中の造血幹細胞の生体外増殖率（ＥＶＥＲ）を分析したところ、生体外増殖率は１４３％であった。
【００６２】
結論として、常法である上記記載のFicoll-Paque法による造血幹細胞を単離する時間は、本発明の実施例２、３、４、５および６に示された方法より操作時間はとても長かった。Ficoll-Paque法により単離されたＣＤ３４＋細胞を用いたＣＤ３４＋造血幹細胞の生体外増殖率は、実施例３、４、５および６に示された本発明の方法の生体外増殖率より低かった。
【００６３】
以上、本発明を実施の態様を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の態様に記載の範囲には限定されない。上記実施の態様に、多様な変更または改良を加えることができることは当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた態様も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【符号の説明】
【００６４】
１００  バッチ型システム
１０１  濾過チャンバー
１０２  造血幹細胞源
１０３  洗浄液
１０４  第１注入口
１０５  第２注入口
１０６  第１排出口
１０７  ドレイン  ２００  連続型システム
２０１  濾過チャンバー
２０２  造血幹細胞源
２０３  洗浄液
２０４  第１注入口
２０５  第２注入口
２０６  第１排出口
２０７  ドレイン
２０８  第２排出口
２０９  収集容器
２１０  貯蔵チャンバー
２１１  第３注入口
２１２  培地
２１３  ポンプ
【図１】
2010263800.tif 000009
【図２】
2010263800.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月25日(2009.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
操作において、造血幹細胞源２０２を、第１注入口２０４より濾過チャンバー２０１に導入する。オプションとして、濾過チャンバー２０１を透過した造血幹細胞源２０２は、オプション貯蔵チャンバー２１０中に回収、保存される。次に、洗浄液２０３を第２注入口２０５より濾過チャンバー２０１に導入し、濾過チャンバー２０１より排出された使用済み洗浄液２０３は第１排出口２０６よりドレイン２０７に排出される。引き続き、幹細胞培地２１２は第３注入口２１１より濾過チャンバー２０１に挿入され、ポンプ２１３を用いてシステム２００中に循環させる。幹細胞培地２１２は、たとえば２日おき等のように数日おきに新鮮な培地２１２と交換する。使用済み培地２１２は第１排出口２０６よりドレイン２０７に排出される。一方幹細胞は濾過チャンバー２０１中の培養状態で保持されている。幹細胞培地２１２の少量を、培養中第２排出口２０８より採取し、幹細胞培地２１２中の造血幹細胞の数を分析し、造血幹細胞が十分な数に達したかどうかを確かめることも可能である。試料培地２１２中の造血幹細胞の数が求めている値に達したとき、濾過チャンバー２０１中の培地２１２は第２排出口２０８より排出させ、造血幹細胞収集容器２０９中に挿入し、収集容器２０９中の培地２１２より造血幹細胞は回収される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
他の方法として、収集容器２０９中の培地２１２より造血幹細胞は数日ごとに連続的に回収され、それらはまとめて使用されることも可能である。必要であれば、適切な２方または３方バルブ（図示はしていない）をシステムに設置し、異なった回路を形成することも良い。例えば、培地２１２が第３注入口２１１より導入されるとき、第１注入口２０４、第２注入口２０５，ドレイン２０７、収集容器２０９およびオプションの貯蔵チャンバー２１０に導くラインに取り付けられたバルブはすべて閉じることにより、ポンプ、培地２１２および濾過チャンバー２０１周辺の閉鎖回路が形成される。同様に、培養中に少量の培地２１２を採取したいとき、収集容器２０９に通じるバルブは開けられる一方、第１注入口２０４、第２注入口２０５、ドレイン２０７、およびオプションの貯蔵チャンバー２１０に通じるラインに取り付けられたバルブは閉じられることにより、ポンプ、培地２１２、濾過チャンバー２０１および収集容器２０９周辺の閉鎖回路が形成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
ひとたび、採取した培地２１２中の造血幹細胞があらかじめ定めていた値に到達したら、濾過チャンバー２１１中の培地２１２は、第２排出口２０８より造血幹細胞収集容器２０９中に排出され、造血幹細胞は収集容器２０９中の培地中に収穫される。他の態様として、造血幹細胞は、収集容器２０９中に収集した培地２１２から数日ごとに連続的に収穫され、以後の使用のために貯蔵することも可能である。ひとつの例として、培地２１２から収穫された造血幹細胞は、生体外培養の後、コントロールと比べて少なくとも１以上である。例えば、臍帯血から単離され、直接生体外培養された幹細胞は、生体外培養後、１０日後には１４から１５倍と高い値に到達することもある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
１．１  ＰＵ−ＧＭＡ膜の調製
ＰＵ−ＧＭＡ膜は先の文献、特開２００５−３２３５３４公報記載のプラズマ放電法を用いて調製した。簡潔に記載すると、白血球除去膜（イムガードIII-RC、テルモ社製）から取り出したポリウレタン膜をこの実施例では使用する。アルゴンプラズマを用いて反応容器中のポリウレタン（ＰＵ）膜表面にグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は導入された。アルゴンガス（約２６．６パスカルの圧力）を反応容器中に約３０秒間流し、高周波電源（出力２００Ｗ）供給下において、アルゴンプラズマを発生させた。その後、ＧＭＡとＰＵ膜間でグラフト重合を反応容器中にて５分間、０．６５パスカルの圧力下で行った。引き続き、ＧＭＡ架橋ＰＵ膜は、水とメタノールの混合溶液（１：１体積比）で３０分間振動下で洗浄し、さらに純水で３０分間洗浄した。ＰＵ膜表面に導入されたＧＭＡ架橋率は次式で定義された。
ＧＭＡ導入率（％）＝（（Ｘ／Ｙ）−１）×１００
ここでＧＭＡ導入率はプラズマ放電後のＰＵ−ＧＭＡ膜の乾燥重量（Ｘグラム、８０度２４時間真空乾燥）をプラズマ放電前のＰＵ膜の乾燥重量（Ｙグラム、８０度２４時間真空乾燥）で割った比と定義した。この例では、ＧＭＡ導入率は０．６１％であった。
【外国語明細書】
2010263800.tif 000011
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