(57)【要約】【課題】骨密度低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す新たな骨粗鬆症モデル動物を提供する。【解決手段】ホモシスチンを含む飼料で飼育され、骨密度が正常個体群と比べて低下しておらず、骨の破断エネルギーが正常個体群の８０％以下である骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモシスチンを含む飼料を与えて得られる、全骨密度が正常個体群と比べて低下しておらず、骨の破断エネルギーが正常個体群の８０％以下である骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類。
【請求項２】
骨の靭性が正常個体群の９０％以下である請求項１に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類。
【請求項３】
骨のコラーゲン架橋量が正常個体群の９０％以下である請求項１または請求項２に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類
【請求項４】
前記非ヒト哺乳類は、ラットまたはマウスである請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類。
【請求項５】
２質量％未満のホモシスチンを含む飼料を与えて得られた請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類。
【請求項６】
ホモシスチンを含む飼料を与えて飼育することを含む請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類を作製する方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に被験物質を投与し、被験物質について骨の破断エネルギーの増加を検定することを含む、骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に被験薬物を投与し、被験薬物について骨の破断エネルギーの増加を検定することを含む、薬物の骨粗鬆症の改善に対する薬効評価方法。
【請求項９】
ホモシスチンを含む飼料で非ヒト哺乳類を飼育することと、前記非ヒト哺乳類に被験物質を投与することと、前記被験物質について前記非ヒト哺乳類の骨の破断エネルギーの変化を検定することとを含む、骨粗鬆症の予防用物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は骨密度の低下により骨の脆弱化し骨折の危険性が増加する疾患と考えられていた。そのため、従来の骨粗鬆症治療薬の多くは骨吸収の抑制による骨密度の増加を作用機序とするものであった。しかし、近年、２型糖尿病患者において骨密度（骨量）低下を示すことなく骨折頻度が増大すること（例えば、非特許文献１参照）や血中ホモシステイン高値が骨密度と独立した骨折の危険因子であること（例えば、非特許文献２参照）が知られるようになり、骨の脆弱性に骨密度以外の関与が示唆されている。
【０００３】
ところで骨基質はミネラル成分とコラーゲンを主成分とする基質たんぱく質から構成されている。そのうちコラーゲンは骨単位体積の約５０％を占めており、隣接するコラーゲン分子同士はコラーゲン架橋によって結合してコラーゲン繊維を構成することが知られている。
【０００４】
また、一般に骨の強度（曲げ強度）は剛性、最大負荷及び破断エネルギーという３つのパラメーターで表わされる。剛性は骨密度や骨塩量等のミネラル成分と強く関連し、破断エネルギーは骨中のコラーゲンと強く関連することが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。特に破断エネルギーは、骨が骨折するまでに吸収できるエネルギーを表すことから、骨折しにくさと直接関連する指標であると考えられるが、これまで破断エネルギーだけが低下しているようなモデル動物は報告されていない。
【０００５】
従来、骨粗鬆症モデル動物として卵巣除去（例えば、非特許文献４参照）やステロイド投与（例えば、非特許文献５参照）等が用いられているがこれらのモデル動物は骨の脆弱化とともに骨密度の低下が認められることが知られている。また、２％のホモシスチンを含有する飼料により飼育したラットを、骨粗鬆症モデル動物として用いることが知られている（例えば、非特許文献６参照）が、該モデル動物も骨密度の低下を伴うものであった。
【非特許文献１】Ann V. Schwartz et al., J Clin Endocrinol Metab 86:32-38, 2001
【非特許文献２】Joyce B.J. van Meurs et al., N Engl J Med 2004;350:2033-41
【非特許文献３】Xiaodu Wang et al., Annals of Biomedical Engineering, 32:123-135, 2004
【非特許文献４】W.S.S. Jee et al., J Musculoskel Neuron Interact 2001;1(3):193-2007
【非特許文献５】Pietra Pennisi et al., J Bone Miner Metab (2005) 23:134-139
【非特許文献６】Herrmann M. et al., Clinical Chemistry. 53:1455-1461, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、全骨密度低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す新たな骨粗鬆症モデル動物を提供すること、およびその製造方法、ならびに該骨粗鬆症モデル動物を用いた骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法、薬物の骨粗鬆症の改善に対する薬効評価方法、および骨粗鬆症の予防用物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、モデル動物を鋭意検討した結果、ホモシスチンを含有する飼料を与えて飼育したラットが、全骨密度の低下を生じることなく骨折頻度が増大することを見出し、本発明を完成した。
すなわち前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
本発明の第１の態様は、ホモシスチンを含む飼料を与えて得られる、全骨密度が正常個体群と比べて低下しておらず、骨の破断エネルギーが正常個体群の８０％以下である骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類である。
前記骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、骨の靭性が正常個体群の９０％以下であることが好ましく、骨のコラーゲン架橋量が正常個体群の９０％以下であることがより好ましい。
また前記骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、ラットまたはマウスであることが好ましく、２質量％未満のホモシスチンを含む飼料を与えて得られることがより好ましい。
【０００８】
本発明の第２の態様は、ホモシスチンを含む飼料を与えて飼育することを含む骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類の作製方法である。前記飼料中のホモシスチン濃度は２質量％未満であることが好ましい。
【０００９】
本発明の第３の態様は、前記骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に被験物質を投与し、被験物質について骨の破断エネルギーの増加を検定する工程を含む、骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法である。
本発明の第４の態様は、前記骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に被験物質を投与し、被験物質について骨の破断エネルギーの増加を検定する工程を含む、薬物の骨粗鬆症の改善に対する薬効評価方法である。
本発明の第５の態様は、ホモシスチンを含む飼料で非ヒト哺乳類を飼育することと、前記非ヒト哺乳類に被験物質を投与することと、前記被験物質について前記ヒト動物の骨の破断エネルギーの変化を検定することとを含む、骨粗鬆症の予防用物質のスクリーニング方法である。前記飼料中のホモシスチン濃度は２質量％未満であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、全骨密度低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す新たな骨粗鬆症モデル動物を提供すること、およびその製造方法、ならびに該骨粗鬆症モデル動物を用いた骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法、薬物の骨粗鬆症の改善に対する薬効評価方法、および骨粗鬆症の予防用物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、ホモシスチンを含む飼料を与えて得られた非ヒト哺乳類である。これにより全骨密度低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す新たな骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類を提供することができる。
本発明において、飼料中のホモシスチンの含有率は全骨密度低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す含有率に調整されるが、２質量％未満であることが好ましく、ホモシスチンの含有率が０．５〜１．５質量％であることが好ましく、０．８〜１．２質量％であることがより好ましい。ホモシスチンの含有率が前記範囲内であることで、骨粗鬆症モデルとしてより好適な骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類を効率よく作製することができる。
【００１２】
本発明においてホモシスチンを含む飼料は、ホモシスチンを含まない飼料に、ホモシスチンを所望量添加することで調製することができる。
またホモシスチン以外の飼料の組成は、飼育する非ヒト哺乳類に応じて適宜選択することができる。
【００１３】
本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類として、具体的には例えば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の通常実験に汎用される哺乳動物を挙げることができる。好ましくはラット、マウス、モルモット、ハムスター等のげっ歯動物であり、より好ましくはラット、マウスである。
また非ヒト哺乳類の雌雄については特に制限はないが、骨代謝に関与する性ホルモンの影響を除去するため、雄であることが好ましい。
【００１４】
本発明において、非ヒト哺乳類にホモシスチンを含む飼料を与えて飼育を開始する時期（例えば、週齢）としては特に制限はなく、飼育する非ヒト哺乳類の種類に応じて適宜選択することができる。本発明においては骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類の作製効率の観点から、非ヒト哺乳類の成長期から飼育を開始することが好ましい。例えば、非ヒト哺乳類としてげっ歯動物（好ましくはラット、マウス）を使用する場合、４週齢〜１０週齢であることが好ましく、５週齢〜９週齢であることがより好ましい。前記時期から飼育を開始することで、骨粗鬆症モデルとしてより好適な骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類を効率よく作製することができる。
【００１５】
また、非ヒト哺乳類にホモシスチンを含む飼料を与えて飼育する期間としては特に制限はなく、飼育する非ヒト哺乳類の種類に応じて適宜選択することができる。本発明においては骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類の作製効率の観点から、非ヒト哺乳類が成熟期に達するまでの期間とすることが好ましい。例えば、非ヒト哺乳類としてげっ歯動物（好ましくはラット、マウス）を用いる場合、１０〜３０週であることが好ましく、１５〜２０週であることがより好ましい。前記飼育期間とすることで、骨粗鬆症モデルとしてより好適な骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類を効率よく作製することができる。
【００１６】
非ヒト哺乳類の飼育条件としては、通常用いられる飼育条件を特に制限はなく用いることができる。具体的には、例えば非ヒト哺乳類としてげっ歯動物（好ましくはラット、マウス）を用いる場合、温度２０〜２６℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間の明暗サイクルの飼育室環境で、飼料の自由摂取、自由摂水条件とすることができる。
【００１７】
本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、全骨密度が正常個体群と比べて有意に低下していないことを特徴とする。
本発明において非ヒト哺乳類の全骨密度は、ＸＣＴ-μｓｃｏｐｅ（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｃ社製）を用いて、ｐＱＣＴ（peripheral Quantitative Computed Tomography）により、非ヒト哺乳類から摘出した大腿骨の骨幹部（骨中央）と遠位骨幹端部のＸ線吸収量をそれぞれ測定し、その測定値から求めた全骨塩量を骨面積で除して算出した値である。
【００１８】
また骨密度は上記の測定方法によって、皮質骨、皮質下骨、海綿骨のそれぞれに分けて測定することもできる。
【００１９】
また正常個体群の全骨密度は、ホモシスチンを含まない飼育飼料を用いた以外は、本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類と同様にして飼育された正常個体群を用いて、上述のようにして全骨密度を測定して得られた全骨密度の平均値を意味する。また以下の正常個体群における各種測定値についても前記正常個体群を用いて測定して得られた各種測定値の平均値を意味する。
本発明において前記骨密度の有意差は、有意水準０．０５以下であることが好ましく、有意水準０．０１以下であることがより好ましい。
【００２０】
本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、骨の破断エネルギーが正常個体群の８０％以下であるが、６０〜８０％であることが好ましい。また本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、全骨密度が正常個体群と比べて有意に低下しておらず、骨の破断エネルギーが正常個体群の６０〜８０％であることが更に好ましい。
かかる骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、全骨密度の低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す新たな骨粗鬆症モデル動物とすることができる。
【００２１】
また本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類においては、骨の最大荷重が正常個体群と比べて有意差がないことが好ましい。ここで骨の最大荷重は後述する骨の破断エネルギーの測定方法において、骨が破断するまでに加えられた力（負荷）の最大値を表す。
さらに本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類においては、骨の剛性が正常個体群と比べて有意差がないこともまた好ましい。ここで骨の剛性は後述する弾性領域における変位に対する力（負荷）の傾きを表す。
【００２２】
前記骨の破断エネルギーは、非ヒト哺乳類から摘出した大腿骨の骨幹部（骨中央）について、骨強度計（ＭＺ-５００Ｓ、株式会社マルトー、東京都）を用いて三点曲げ試験（支点間距離：１６ｍｍ、計測速度：２ｍｍ/ｍｉｎ）で測定した値で、大腿骨の骨幹部が破断するまでに加えられた力の積分値（ｍＪ）として測定することができる。
【００２３】
本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類においては、骨の靭性が正常個体群の９０％以下であることもまた好ましく、６０〜９０％であることがより好ましい。骨の靭性が低下していることによって骨の骨折頻度が上昇する。
また本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、骨の弾性領域靭性が正常個体群の９０％以上であって、骨の可塑性領域靭性が正常個体群の８０％以下であることが好ましく、骨の弾性領域靭性が正常個体群の９０〜１２０％であって、骨の可塑性領域靭性が正常個体群の４０〜８０％であることがより好ましい。骨の弾性領域靭性および骨の可塑性領域靭性が前記範囲であることにより、骨粗鬆症モデル動物としてより好適に用いることができる。
【００２４】
前記骨の弾性領域靭性および骨の可塑性領域靭性は、以下のようにして測定される骨の弾性領域エネルギーおよび骨の可塑性領域エネルギーを、それぞれ骨の形状（例えば、ｐＱＣＴにより求めた断面２次モーメントおよび断面計数）によって補正した値である。具体的な補正の方法は、例えば、Journal of bone and mineral research vol.19 No.6 2004に記載されている通常の補正方法である。
また骨の靭性は、前記弾性領域靭性と可塑性領域靭性の和として定義される。
【００２５】
前記骨の弾性領域エネルギーは、非ヒト哺乳類から摘出した大腿骨の骨幹部（骨中央）について、骨強度計（ＭＺ-５００Ｓ、株式会社マルトー、東京都）を用いて三点曲げ試験（支点間距離：１６ｍｍ、計測速度：２ｍｍ/ｍｉｎ）で測定された値で、大腿骨の骨幹部が加えられた力に抗して変形する領域（弾性領域）において、加えられた力の積分値（ｍＪ）として測定される。
また前記骨の可塑性領域エネルギーは、上記と同様にして測定された値で、大腿骨の骨幹部が加えられた力に抗することなく変形する領域（可塑性領域）において、加えられた力の積分値（ｍＪ）として測定される。
【００２６】
前記弾性領域および可塑性領域について図１を参照して説明する。図１は骨強度計による骨強度測定の１例を示したものであり、横軸は無負荷状態からの変位、縦軸は加えた負荷を示す。図１には、横軸に沿って、変位が増加するに従って必要とされる負荷が直線的に比例して増加する領域（弾性領域）と、変位の増加と必要とされる負荷との直線関係が喪失する領域（可塑性領域）と、そして変位の増加とは無関係に負荷が０になる領域（破断後の領域）とがこの順に連続していることが示されている。また、弾性領域から可塑性領域への変換点を降伏点とする。尚、降伏点には、適宜選択されるオフセットを設けてもよい。
すなわち、前記弾性領域エネルギーとは、変位０から降伏点までに骨に加えられた負荷の積分値を意味し、前記可塑性エネルギーとは降伏点から破断までに骨に加えられた負荷の積分値を意味する。
【００２７】
また、本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類は、骨のコラーゲン架橋量が正常個体群の９０％以下であることが好ましく、骨のコラーゲン架橋量が正常個体群の７０〜９０％であることがより好ましい。骨のコラーゲン架橋量が前記範囲であることにより、骨粗鬆症モデル動物としてより好適に用いることができる。
【００２８】
前記骨のコラーゲン架橋量は、コラーゲン中に存在する架橋部位の量をコラーゲンの単位量当たりに換算した数値を意味する。
骨に含まれるコラーゲン量は、骨を脱灰処理後、加水分解処理して得られるヒドロキシプロリンを定量することで算出される。また、コラーゲン中の架橋量は成熟型架橋量と未熟型架橋量の総和をコラーゲンの単位量あたりに換算することで算出される。
【００２９】
ここで成熟型架橋量は、コラーゲンの成熟型架橋構造に特有な化合物であるピリジノリン、デオキシピリジノリンを定量することで算出することができる。また、未熟型架橋構造に特有なＤＨＬＮＬ、ＨＬＮＬ、ＬＮＬを定量することで未熟型架橋量を算出することができる。
【００３０】
本発明の骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法は、前記骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に被験物質を投与し、被験物質について骨の破断エネルギーの増加を検定する工程を含む。
かかるスクリーニング方法であることによって、骨密度の低下を伴わない骨粗鬆症の治療用物質を効率的に選択することができる。
【００３１】
前記被験物質としては特に制限はなく、低分子化合物、高分子化合物、核酸、アミノ酸、ペプチドまたは蛋白質のいずれであってもよい。また前記被験物質は、天然物から単離されたものであっても、化学的または生化学的に合成されたものであっても、また遺伝子工学的に調製されたものであってもよい。さらに前記被験物質は精製物であっても、また植物、動物または微生物等の抽出物等のように粗精製物であってもよい。
【００３２】
また骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に対する被験物質の投与方法は、特に制限されなく、通常用いられる投与方法を用いることができる。例えば、投与する被験物質の種類に応じて、経口投与または皮下、静脈、局所、経皮若しくは経腸（直腸）などの非経口投与を適宜選択することができる。好ましくは経口投与である。
【００３３】
また骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に対する被験物質の投与期間は、被験物質の種類および投与量に応じて適宜選択することができる。一般的には、例えば、８週以上とすることができる。
【００３４】
また被験物質の骨粗鬆症に対する治療効果は、該被験物質について骨の破断エネルギーの増加を検定することで評価することができる。具体的には被験物質を骨粗鬆症モデル動物に投与し、一定期間飼育した後に、該モデル動物について、骨の破断エネルギーを測定して行うことができる。
尚、骨の破断エネルギーの測定方法は上述した。
【００３５】
前記検定は、被験物質を投与しない対照の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類について、同様に骨の破断エネルギーを測定し、これと被検物質を投与したモデル動物の骨の破断エネルギーを比較することで行うことが好ましい。
【００３６】
本発明の薬物の骨粗鬆症の改善に対する薬効評価方法は、前記骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に被験薬物を投与し、被験薬物について骨の破断エネルギーの増加を検定する工程を含む。
かかる薬効評価方法であることによって、骨密度の低下を伴わない骨粗鬆症に有用な薬物を効率的に選択することができる。
【００３７】
前記被験薬物としては特に制限はなく、前記被験物質と同様のものを用いることができる。
【００３８】
また骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類に対する被験薬物の投与方法、骨の破断エネルギーの増加を検定する方法については、前記骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法と同様である。
【００３９】
本発明の骨粗鬆症の予防用物質のスクリーニング方法は、非ヒト哺乳類にホモシスチンを含む飼料を与えて飼育することと、前記非ヒト哺乳類に被験物質を投与することと、前記被験物質について前記非ヒト哺乳類の骨の破断エネルギーの変化を検定することとを含む。本発明においては飼料中のホモシスチン濃度は、全骨密度低下を伴わずに骨折頻度上昇を示す含有率に調整されるが、２質量％未満であることが好ましい。
かかるスクリーニング方法であることによって、骨密度の低下を伴わない骨粗鬆症の予防用物質を効率的に選択することができる。
【００４０】
本発明において、被験物質の投与開始時期、投与期間については特に制限はなく、被検物質の種類および投与量に応じて適宜選択することができる。
一般的には、例えば、ホモシスチンを含む飼料を与えて飼育を開始する時点またはその前に、被験物質を一度だけ投与することもできるし、ホモシスチンを含む飼料を与える飼育期間中に、被験物質を継続的または断続的に投与してもよい。
【００４１】
ホモシスチンを含む飼料については本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類の項で説明した通りである。
また、被験物質、被検物質の投与方法、骨の破断エネルギーの測定方法については、前記骨粗鬆症の治療用物質のスクリーニング方法の項で説明した通りである。
【００４２】
被験物質の骨粗鬆症に対する予防効果は、該被験物質について前記非ヒト哺乳類骨の破断エネルギーの変化を検定することで評価することができる。具体的には、被験物質を投与した非ヒト哺乳類をホモシスチンを含む飼料で一定期間飼育した後に、該非ヒト哺乳類について、骨の破断エネルギーを測定して行うことができる。
【００４３】
前記検定は、被験物質を投与しない対照の非ヒト哺乳類について、同様に骨の破断エネルギーを測定し、これと被検物質を投与した非ヒト哺乳類の骨の破断エネルギーを比較することで行うことが好ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、「％」は特記しない限り質量基準である。
【００４５】
（実施例１）
−飼料の調製−
ＤＬ−ホモシスチンを含まない対照飼料、及び対照飼料にＤＬ-ホモシスチンを１％（ｗ/ｗ）添加した１％含有飼料を日本クレア（株）にて調製した。表１に飼料の組成を示した。
【００４６】
【表１】
2010051238.tif 000002
【００４７】
−骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類の作製−
１８匹のウィスター系雄ラット（７週齢）を体重が均等となるように９匹ずつ２群に分けた。それぞれの群に対照飼料または１％ホモシスチン含有飼料を自由摂取にて４ヶ月間与えて飼育し、対照群と１％ホモシスチン群を作製した。飼育期間終了後、ペントバルビタール麻酔下全血採取によりと殺し左右大腿骨を採取した。
飼育期間中の体重の変化を図２に示した。図２から両群間に顕著な体重の違いは認められなかったことがわかる。
【００４８】
［骨塩量及び骨密度の測定］
ＸＣＴ-μｓｃｏｐｅ（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｃ社製）を用い、ｐＱＣＴ（peripheral Quantitative Computed Tomography）により左右大腿骨の骨幹部（骨中央）と遠位骨幹端部（成長板より３ｍｍ近位側）における骨塩量及び骨密度を測定した。骨塩量はＸ線の吸収量より求めた。また、骨密度は骨塩量を骨面積で割った値より求めた。１個体につき左右大腿骨の平均値を算出し、その個体の数値とした。
【００４９】
大腿骨骨幹端部の骨塩量及び骨密度を表２に示した。大腿骨骨幹端部の全骨、皮質＋皮質下骨、海綿骨のいずれにおいても対照群に比べて１％ホモシスチン群が骨塩量及び骨密度において有意に低値を示すことはなかった。尚、表中の有意差における＊は有意水準０．０５を意味し、＊＊は有意水準０．０１を意味する。以下同様である。
【００５０】
【表２】
2010051238.tif 000003
【００５１】
大腿骨骨幹部皮質骨の骨塩量及び骨密度を表３に示した。対照群に比べて１％ホモシスチン群が皮質骨の骨塩量及び骨密度において有意に低値を示すことはなかった。
【００５２】
【表３】
2010051238.tif 000004
【００５３】
［骨強度の測定］
骨強度計（ＭＺ-５００Ｓ、株式会社マルトー、東京都）を用いて三点曲げ試験（支点間距離：１６ｍｍ、計測速度：２ｍｍ/ｍｉｎ）により左右大腿骨の骨幹部（骨中央）における骨強度（最大荷重、剛性及び破断エネルギー）を測定した。
具体的な測定の１例を図１に示した。前述した通り、加えられた力に抗して変形する領域を弾性領域、抗することなく変形する領域を可塑性領域、弾性領域から可塑性領域への変換点を降伏点（０．０２％オフセット）とした。破断までに加えられた力の最大値を最大荷重（Ｎ）、直線部分（弾性領域）の傾きを剛性（Ｎ／ｍｍ）、破断するまでに加えられた力の積分値（ｍＪ）を破断エネルギー、降伏点までの破断エネルギーを弾性領域のエネルギー、降伏点以降の破断エネルギーを可塑性領域のエネルギーとした。尚、左右大腿骨の平均値をその個体の数値とした。
【００５４】
大腿骨骨幹部の結果を表４に示した。最大荷重及び剛性は両群間に有意な差は認められなかった。一方で破断エネルギーは対照群に比して１％ホモシスチン群で有意に低値を示した。破断エネルギーを弾性領域と可塑性領域とに分けて算出すると、対照群と比して１％ホモシスチン群は弾性領域エネルギーは有意に高値を、可塑性領域エネルギーでは有意に低値を示した。
【００５５】
【表４】
2010051238.tif 000005
【００５６】
また、上記骨強度を骨の形状（ｐＱＣＴにより求めた断面二次モーメント及び断面計数）により補正して、素材強度（最大応力、弾性率、靭性）を算出した。左右大腿骨の平均値をその個体の数値とした。
大腿骨骨幹部の素材強度を表５に示した。最大応力及び弾性率は対照群に比して１％ホモシスチン群で有意に高値を示した。靭性は対照群に比して１％ホモシスチン群で有意に低値を示した。靭性を弾性領域と可塑性領域に分けて算出すると対照群と比して１％ホモシスチン群は、弾性領域靭性については有意に高値を、可塑性領域靭性については有意に低値を示した。
【００５７】
【表５】
2010051238.tif 000006
【００５８】
［コラーゲン含量及びコラーゲン架橋の測定］
左大腿骨中央骨幹部（骨全長の３分の１）を切り出し骨膜、骨髄等を除いた後凍結粉砕した。得られた骨粉に０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）- Tris buffer (ｐＨ７．４)を添加し４℃下で４８時間攪拌した。その後、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥して脱灰骨粉末を得た。
脱灰骨粉末を６ｍｏｌ／Ｌ塩酸中で、１１０℃２４時間加水分解した後、ＨＰＬＣ法でヒドロキシプロリン量を求め、常法により、コラーゲン量に換算した。
脱灰骨粉末にＮａＢＨ４（１％（ｗ/ｖ）ＮａＢＨ４溶液in ０．０１Ｍ  ＮａＯＨ）を加え３７℃下で１時間反応させた後、酢酸を加えてｐＨ４以下にした。その後、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥して粉末とし、これを６ｍｏｌ／Ｌ塩酸で１１０℃２４時間加水分解した後、ＨＰＬＣ法で未熟型架橋（ＤＨＬＮＬ、ＨＬＮＬ、ＬＮＬ）および成熟型架橋（Pyridinoline, Deoxypridinoline）の量を定量した。得られた定量値を単位コラーゲン量当りに換算し未熟型架橋量および成熟型架橋量とした。結果を表６に示した。
【００５９】
【表６】
2010051238.tif 000007
【００６０】
表６から、コラーゲン架橋量は未熟型架量、成熟型架橋量ともに、対照群に比して１％ホモシスチン群で有意に低値を示したことがわかる。
以上から、本発明の骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳類においては、全骨密度の低下を伴うことなく、骨の破断エネルギーが低下、すなわち骨折頻度が上昇することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の実施例にかかる骨強度測定の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施例にかかる対照群及び１％ホモシスチン群の体重変化を示すグラフである。
【図１】
2010051238.tif 000008
【図２】
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