(57)【要約】【課題】高い特異性を有する核酸のハイブリダイゼーション方法、並びにそれを用い、医療現場等で簡便に実施可能で判定精度の高い一塩基多型の判定方法、一塩基多型判定用反応器及び判定装置を提供する。【解決手段】ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列（ｔ）を有する標的核酸を含む試料を、標的塩基配列（ｔ）と相補的なプローブ塩基配列（ｐ）を有するプロープ核酸と接触させ、標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法であり、標的塩基配列（ｔ）以外の標的核酸中の塩基配列の一部又は全部（ａ及び／又はｂ）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ’及び／又はｂ’）を有するブロック核酸を標的核酸と接触させ、ブロック核酸が、標的核酸とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を含む試料を、前記標的塩基配列と相補的なプローブ塩基配列を有するプロープ核酸と接触させ、前記試料中の前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法において、
前記標的塩基配列よりも５’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を５’末端側に有する５’末端側ブロック核酸及び／又は前記標的塩基配列よりも３’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を３’末端側に有する３’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記５’末端側ブロック核酸及び／又は前記３’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることを特徴とする核酸のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
前記標的核酸中に存在する前記標的塩基配列の３’末端側末端と、前記３’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の５’末端側との間、及び／又は前記標的塩基配列の５’末端側末端と、前記５’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の３’末端側との間に、１から１５塩基分のギャップが存在することを特徴とする請求項１記載の核酸のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
前記プローブ核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１項記載の核酸のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記プローブ塩基配列の塩基数が１０以上２０以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の核酸のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
判定の対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を、前記標的塩基配列に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を含み、相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置された複数のプロープ核酸と接触させ、前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとを特異的にハイブリダイズさせる工程Ａと、
前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する工程Ｂとを有することを特徴とする一塩基多型の判定方法。
【請求項６】
前記工程Ａにおいて、前記標的塩基配列よりも５’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を５’末端側に有する５’末端側ブロック核酸及び／又は前記標的塩基配列よりも３’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を３’末端側に有する３’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記５’末端側ブロック核酸及び／又は前記３’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることを特徴とする請求項５記載の一塩基多型の判定方法。
【請求項７】
前記標的核酸中に存在する前記標的塩基配列の３’末端側末端と、前記３’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の５’末端側、及び／又は前記標的塩基配列の５’末端側末端と、前記５’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の３’末端側との間に、１から１５塩基分のギャップが存在することを特徴とする請求項６記載の一塩基多型の判定方法。
【請求項８】
前記プローブ核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項５から７のいずれか１項記載の一塩基多型の判定方法。
【請求項９】
前記プローブ塩基配列の塩基数が１０以上２０以下であることを特徴とする請求項５から８のいずれか１項記載の一塩基多型の判定方法。
【請求項１０】
前記プローブ核酸の各々において、前記プローブ塩基配列の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれも前記プローブ塩基配列の塩基数の１／３倍よりも大きいことを特徴とする請求項５から９のいずれか１項記載の一塩基多型の判定方法。
【請求項１１】
前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを、表面プラズモン共鳴及び金の異常反射のいずれかにより検出することを特徴とする請求項５から１０のいずれか１項記載の一塩基多型の判定方法。
【請求項１２】
判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、前記標的塩基配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロープ核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が単一の前記容器及び流路のいずれか一方又は双方の内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置されていることを特徴とする一塩基多型判定用反応器。
【請求項１３】
前記プローブ核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項１２記載の一塩基多型判定用反応器。
【請求項１４】
前記プローブ塩基配列の塩基数が１０以上２０以下であることを特徴とする請求項１２及び１３のいずれか１項記載の一塩基多型判定用反応器。
【請求項１５】
前記プローブ核酸の各々において、前記プローブ塩基配列の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれも前記プローブ塩基配列の塩基数の１／３倍よりも大きいことを特徴とする請求項１２から１４のいずれか１項記載の一塩基多型判定用反応器。
【請求項１６】
判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、前記標的塩基配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロープ核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置された反応器と、
前記標的塩基配列を有する標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な該プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する検出手段とを有することを特徴とする一塩基多型の判定装置。
【請求項１７】
前記反応器として請求項１２から１５のいずれか１項記載の一塩基多型判定用反応器を用いることを特徴とする請求項１６記載の一塩基多型判定装置。
【請求項１８】
前記検出手段が、表面プラズモン共鳴及び金の異常反射のいずれかにより特異的なハイブリダイゼーションを検出するものであることを特徴とする請求項１６および１７のいずれか１項記載の一塩基多型判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイゼーション方法、一塩基多型の判定方法、一塩基多型判定用反応器及び判定装置に関し、更に詳細には高い特異性を有する核酸のハイブリダイゼーション方法、並びにそれを用い、医療現場等で簡便に実施可能で判定精度の高い一塩基多型の判定方法、一塩基多型判定用反応器及び判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの全塩基配列には個体差があり、そのうち１塩基レベルの個体差（より厳密には、人口の１％以上の頻度で出現するもの）を一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms：ＳＮＰ）と呼ぶ。ヒトＤＮＡでは、約１０００塩基に１つの頻度でＳＮＰが存在すると考えられている。大多数のＳＮＰは非翻訳領域に存在し、遺伝的な特徴の変化をもたらさないが、遺伝子や制御領域にあるＳＮＰは、遺伝的な個体差を生じさせている可能性がある。遺伝子治療及び診断技術の向上に伴い、薬剤感受性（耐性及び副作用の有無等）、感染症への抵抗性、生活習慣病の環境要因、がん、アルツハイマー病、ペットの遺伝病等の種々の疾患の発症リスク等について、遺伝子の一塩基多型により説明可能な事例が多く発見されている。このことから、ＳＮＰの解析により、個人別のテーラーメイド医療や予測医療への可能性が広がると期待されている。
【０００３】
テーラーメイド医療や予測医療の実現のためには、医療現場において迅速、容易かつ安価に実施可能で、信頼性の高い一塩基多型の判定（タイピング）方法及びシステムの確立が急務である。遺伝子解析の市場は着実に広がりつつあり、多くの遺伝子配列解析技術の手法が開発されている。それらの手法は、ポリ（オリゴ）ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用するもの、核酸の伸長、連結、切断等を行う酵素による特定配列の認識効率を利用するものに大別される（例えば、非特許文献１参照）。また、近年、ＳＮＰのタイピング方法に関する研究の活発化に伴い、それに関連する特許出願も多くなされている。
【０００４】
特許文献１には、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素等を用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸の非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程、ミスマッチ部位切断工程において切断された核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程、核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程を含み、ＤＮＡチップ等に適用可能なＳＮＰ判別方法が開示されている。
【０００５】
特許文献２には、検体中の標的核酸と固相担体上の複数種のプローブをハイブリダイゼーションさせる際に、検体を複数に分割することで、それぞれのプローブ種に複数のストリンジェンシーを与えてハイブリダイゼーションさせると共に、プローブ配列において、標的核酸に対し完全相補的な塩基配列からなるプローブとミスマッチを含む塩基配列を有するプローブを設計し、ハイブリダイゼーション結果を比較することで一塩基差まで検出することができる核酸の塩基配列解析方法が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、各標的核酸に対し標的核酸の少なくとも一部に対する完全及び／又は不完全マッチプローブからなるプローブ群を準備し、複数種の標的核酸を含む試料と各プ
ローブ群とを適宜の条件で接触させ、ハイブリッド体シグナル強度を該完全及び／又は不完全マッチプローブに各々対応して測定し、完全マッチプローブ対応の 第一シグナルデータ、並びに／又は不完全マッチプローブ対応の第二シグナルデータを取得し、各プローブ群の第一及び／又は第二シグナルデータから、プローブ群に関連づけられた最適反応条件でのデータを第一及び／又は第二試験データとして抽出し、第一及び／又は第二試験データにフィルタリング処理を行い、試料核酸における標的核酸の配列を判定し、全種標的核酸の判定結果を統合する核酸配列解析方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１７５０１７号公報
【特許文献２】特開２００７−１７４９８６号公報
【特許文献３】特開２００６−６２２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】関根光雄著「新しいＤＮＡチップの科学と応用」、講談社サイエンティフィック、２００７年７月３０日、ＩＳＢＮ９７８−４−０６−１５３８６４−１、ｐ．１２７−１３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用するＳＮＰのタイピング方法には、ミスマッチを有するポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション（ミスハイブリダイゼーション）に起因するバックグラウンドノイズの発生、ハイブリダイゼーションの条件を厳密に設定する必要があるため条件設定に多大な労力を要する等の問題がある。また、酵素による特定配列の認識効率を利用するＳＮＰのタイピング方法には、特殊な酵素を必要としたり、酵素が効果的に働くための条件が特殊であることが多く、やはり条件設定に多大な労力を必要としたりする等の問題がある。
【００１０】
特許文献１記載のＳＮＰ判別方法では、ミスマッチがあってもハイブリダイズさせる必要があるため、長いプローブ核酸を用意する必要があると共に、高価な制限酵素が必要であり、酵素処理時間のために数時間を必要とするため、迅速な判定が困難であるという問題がある。
【００１１】
特許文献２記載の核酸の塩基配列解析方法では、確実な判定を行うために多量のサンプルが必要となる。また、異なった条件でいくつかのプローブに対する結合の判定をおこない、それを総合的に判断する必要があることから、測定後の決定プロトコルが複雑となる。さらに異なった条件下での結合をそれぞれ測定する必要があることから多大な測定時間が必要であるという問題がある。
【００１２】
特許文献３記載の核酸配列解析方法では、異なった条件で複数のプローブに対するハイブリダイゼーションの判定を行い、得られた結果を総合的に判断する必要があることから、多量のサンプルが必要となる。また、測定後の決定プロトコルが複雑となる。更に、異なる条件下でのハイブリダイゼーションをそれぞれ測定する必要があることから長い測定時間が必要であると共に、高価な測定装置を必要とするという問題がある。
【００１３】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、高い特異性を有する核酸のハイブリダイゼーション方法、並びにそれを用い、医療現場等で簡便に実施可能で判定精度の高い一塩基多型の判定方法、一塩基多型判定用反応器及び判定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を含む試料を、前記標的塩基配列と相補的なプローブ塩基配列を有するプロープ核酸と接触させ、前記試料中の前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法において、前記標的塩基配列よりも５’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を５’末端側に有する５’末端側ブロック核酸及び／又は前記標的塩基配列よりも３’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を３’末端側に有する３’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記５’末端側ブロック核酸及び／又は前記３’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることを特徴とする核酸のハイブリダイゼーション方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１５】
なお、本発明において「Ａ及び／又はＢ」とは、Ａ及びＢのいずれか一方又は双方と同義であり、例えば、「Ａ及び／又はＢの存在下」という表現には、（１）Ａのみの存在下、（２）Ｂのみの存在下、並びに（３）Ａ及びＢの両者の存在下の全てが包含される。
【００１６】
プローブ核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイズさせることにより、標的塩基配列とプローブ塩基配列との間にミスマッチが存在する場合の非特異的なハイブリダイゼーションの効率を低下させると共に、互いに相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上させ、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。そのため、塩基配列中の一塩基のみの相違を高精度に検出する必要のあるＳＮＰのタイピングに好適であると共に、複数の測定条件下で得られた複数の実験データを処理する等の煩雑な手順の実行や、それに要する労力を軽減できる。
【００１７】
また、ハイブリダイゼーションを利用したＳＮＰのタイピングはもとより、特定の塩基配列を有する核酸の検出や分離の効率を向上できる。また、標的塩基配列以外の塩基配列部分において、標的核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は２本鎖を形成する。それにより、標的核酸の高次構造の形成を抑制できるため、プローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
【００１８】
本発明の第１の態様に係る核酸のハイブリダイゼーション方法において、前記標的核酸中に存在する前記標的塩基配列の３’末端側末端と、前記３’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の５’末端側との間、及び／又は前記標的塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端側末端と、前記５’末端側ブロック核酸の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列の３’末端側との間に、１から１５塩基分のギャップが存在することが好ましい。
ギャップの長さ（塩基数）を上記範囲とすることにより、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害することなく、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。
【００１９】
本発明の第１の態様に係る核酸のハイブリダイゼーション方法において、前記プローブ核酸がＤＮＡであることが好ましい。
ＲＮＡ等よりも安定なＤＮＡをプローブ核酸とすることにより、プローブ核酸の耐久性を増大させることができると共に、ハイブリダイゼーションの再現性を向上させることができる。
【００２０】
本発明の第１の態様に係る核酸のハイブリダイゼーション方法において、前記プローブ塩基配列の塩基数が１０以上２０以下であることが好ましい。
プローブ塩基配列の塩基数を上記範囲とすることにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチを有する核酸とのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズを増大させることなく、塩基配列特異性を向上できる。
【００２１】
本発明の第２の態様は、判定の対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を、前記標的塩基配列に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を含み、相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置された複数のプロープ核酸と接触させ、前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとを特異的にハイブリダイズさせる工程Ａと、
前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する工程Ｂとを有することを特徴とする一塩基多型の判定方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
なお、本発明において「反応器」とは、標的核酸を含む溶液を充填する容器又は流通させる流路の（溶液と接触する）内壁面上の所定の位置にプローブ核酸が配置され、標的核酸とプローブ核酸を接触させ、ハイブリダイズさせるよう構成されたものをいう。
【００２２】
単一の容器及び流路のいずれかに全てのプローブ核酸が配置されているため、全ての一塩基多型に対応するプローブ核酸について、同一の条件下でハイブリダイゼーションさせることができる。そのため、ハイブリダイゼーション条件の相違に起因するバックグラウンドノイズの発生を抑制し、一塩基のみの相違を高精度で検出できると共に、条件設定のための労力を低減できる。したがって、複雑な条件設定のために多大な労力や熟練を要することなく、医療現場等において迅速かつ簡便に高精度なＳＮＰのタイピングを行うことが可能となる。
【００２３】
本発明の第２の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記工程Ａにおいて、前記標的塩基配列よりも５’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を５’末端側に有する５’末端側ブロック核酸及び／又は前記標的塩基配列よりも３’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を３’末端側に有する３’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記５’末端側ブロック核酸及び／又は前記３’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることが好ましい。
【００２４】
プローブ核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイズさせることにより、標的塩基配列とプローブ塩基配列との間にミスマッチが存在する場合の非特異的なハイブリダイゼーションの効率を低下させると共に、互いに相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上させ、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。そのため、複数の測定条件下で得られた複数の実験データを処理する等の煩雑な手順の実行や、それに要する労力を軽減できる。また、標的塩基配列以外の塩基配列部分において、標的核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は２本鎖を形成する。それにより、標的核酸の高次構造の形成を抑制できるため、プローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
【００２５】
本発明の第２の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記標的核酸中に存在する前記標的塩基配列の３’末端側末端と、前記３’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の５’末端側、及び／又は前記標的塩基配列の５’末端側末端と、前記５’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の３’末端側との間に、１から１５塩基分のギャップが存在することが好ましい。
ギャップの長さ（塩基数）を上記範囲とすることにより、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害することなく、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。
【００２６】
本発明の第２の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記プローブ核酸がＤＮＡであることが好ましい。
ＲＮＡ等よりも安定なＤＮＡをプローブ核酸とすることにより、プローブ核酸の耐久性を増大させることができると共に、ハイブリダイゼーションの再現性を向上させることができる。
【００２７】
本発明の第２の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記プローブ塩基配列の塩基数が１０以上２０以下であることが好ましい。
プローブ塩基配列の塩基数を上記範囲とすることにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチを有する核酸とのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズを増大させることなく、塩基配列特異性を向上できる。
【００２８】
本発明の第２の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記プローブ塩基配列の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれも前記プローブ塩基配列の塩基数の１／３倍よりも大きいことが好ましい。
一塩基多型に対応する塩基が、各領域の塩基数が（ほぼ）等しくなるようにプローブ塩基配列を３つの領域に分割した場合（具体例については後述する。）における中央部に位置すると、ミスマッチが存在する核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。なお、プローブ塩基配列と相補的な標的塩基配列中の一塩基多型に対応する塩基の位置についても同様である。
【００２９】
本発明の第２の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを、表面プラズモン共鳴及び金の異常反射のいずれかにより検出してもよい。
これらの方法によると、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの検出をリアルタイムに行うことができるため、ＳＮＰのタイピングに要する時間を短縮し、スループットを向上できる。また、プレートリーダー等に比べ安価な装置で位置特異的なハイブリダイゼーションの検出が可能であるため、医療現場等において簡便に一塩基多型のタイピングを行うことができる。
【００３０】
本発明の第３の態様は、判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、前記標的塩基配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロープ核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が単一の前記容器及び流路のいずれか一方又は双方の内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置されていることを特徴とする一塩基多型判定用反応器を提供することにより上記課題を解決するものである。
単一の容器及び流路のいずれかに全てのプローブ核酸が配置されているため、全ての一塩基多型に対応するプローブ核酸について、同一の条件下でハイブリダイゼーションさせることができる。そのため、ハイブリダイゼーション条件の相違に起因するバックグラウンドノイズの発生を抑制できると共に、条件設定のための労力を低減できる。したがって、本態様に係る一塩基多型判定用反応器を用いると、複雑な条件設定のために多大な労力や熟練を要することなく、医療現場等において迅速かつ簡便に高精度なＳＮＰのタイピングを行うことが可能となる。
【００３１】
本発明の第３の態様に係る一塩基多型判定用反応器において、前記プローブ核酸がＤＮＡであることが好ましい。
ＲＮＡ等よりも安定なＤＮＡをプローブ核酸とすることにより、プローブ核酸の耐久性を増大させることができると共に、ハイブリダイゼーションの再現性を向上させることができる。
【００３２】
本発明の第３の態様に係る一塩基多型判定用反応器において、前記プローブ塩基配列の塩基数が１０以上２０以下であることが好ましい。
プローブ塩基配列の塩基数を上記範囲とすることにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチを有する核酸とのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズを増大させることなく、塩基配列特異性を向上できる。
【００３３】
本発明の第３の態様に係る一塩基多型判定用反応器において、前記プローブ塩基配列の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれも前記プローブ塩基配列の塩基数の１／３倍よりも大きいことが好ましい。
一塩基多型に対応する塩基が、各領域の塩基数が（ほぼ）等しくなるようにプローブ塩基配列を３つの領域に分割した場合における中央部に位置すると、ミスマッチが存在する核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。なお、プローブ塩基配列と相補的な標的塩基配列中の一塩基多型に対応する塩基の位置についても同様である。
【００３４】
本発明の第４の態様は、判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、前記標的塩基配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロープ核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置された反応器と、
前記標的塩基配列を有する標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な該プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する検出手段とを有することを特徴とする一塩基多型の判定装置を提供することにより上記課題を解決するものである。
単一の反応器中に全てのプローブ核酸が配置されているため、全ての一塩基多型に対応するプローブ核酸について、同一の条件下でハイブリダイゼーションさせることができる。そのため、ハイブリダイゼーション条件の相違に起因するバックグラウンドノイズの発生を抑制できると共に、条件設定のための労力を低減できる。
【００３５】
本発明の第４の態様に係る一塩基多型判定装置において、前記反応器として本発明の第３の態様に係る一塩基多型判定用反応器を用いてもよい。
【００３６】
本発明の第４の態様に係る一塩基多型判定装置において、前記検出手段が、表面プラズモン共鳴及び金の異常反射のいずれかにより特異的なハイブリダイゼーションを検出するものであってもよい。
これらの方法によると、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの検出をリアルタイムに行うことができるため、ＳＮＰのタイピングに要する時間を短縮し、スループットを向上できる。また、プレートリーダー等に比べ安価な装置で位置特異的なハイブリダイゼーションの検出が可能であるため、医療現場等において簡便に一塩基多型のタイピングを行うことができると共に、装置の小型化及び低コスト化が可能になる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によると、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性が高く、塩基配列中の一塩基のみの相違を高精度に検出する必要のあるＳＮＰのタイピングや、特定の塩基配列を有する核酸の検出や分離の効率及び特異性を向上させ、これらに好適に適用できる核酸のハイブリダイゼーション方法が提供される。
また、本発明によると、複雑な条件設定のために多大な労力や熟練を要することなく、医療現場等において迅速かつ簡便に高精度なＳＮＰのタイピングを行うことが可能な一塩基多型（ＳＮＰ）の判定方法が提供される。
【００３８】
また、本発明によると、上記の一塩基多型の判定方法に好適に用いることができる一塩基多型判定用反応器及びそれを用いた一塩基多型判定装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法及び一塩基多型の判定方法における、標的核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とのハイブリダイゼーションの状態を示す模式図である。
【図２】本発明の第４の実施の形態に係る一塩基多型判定装置のブロックダイアグラムである。
【図３】実施例１における、標的塩基配列の塩基長とハイブリダイゼーション効率との関係を示すグラフである。
【図４】実施例１における、標的塩基配列の塩基長とハイブリダイゼーションの塩基配列特異性との関係を示すグラフである。
【図５】実施例１における、標的塩基配列中のミスマッチの位置とハイブリダイゼーションの塩基配列特異性との関係を示すグラフである。
【図６】実施例１における、３’末端側ブロック核酸がハイブリダイゼーションの塩基配列特異性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】実施例１において一塩基多型の判定に使用した標的核酸、プローブ核酸、リンカー核酸及び３’末端側ブロック核酸の塩基配列を示す図である。
【図８】実施例１における一塩基多型の判定において、各ジェノタイプに対応する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。
【図９】同ハイブリダイゼーションのパターンからジェノタイプを判定するためのアルゴリズムを示す図である。
【図１０】実施例１において、被験者に由来する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。
【図１１】実施例２における一塩基多型の判定において、各ジェノタイプに対応する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。
【図１２】実施例２において、被験者に由来する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターン及び判定結果を示すグラフである。
【図１３】実施例３における一塩基多型の判定において、各ジェノタイプに対応する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。
【図１４】実施例３において、被験者に由来する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターン及び判定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
（Ｉ）核酸のハイブリダイゼーション方法
図１を参照しながら、本発明の第１の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法について説明する。なお、図１において、他の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を白又はハッチングで表し、それ以外の塩基配列を黒で表している。また、以下の説明において、塩基配列の名称の後に付したカッコ入りのアルファベットは、図１においてそれぞれの塩基配列に付したアルファベットに対応している。
本実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法は、ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を含む試料を、標的塩基配列と相補的なプローブ塩基配列を有するプロープ核酸と接触させ、試料中の標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法であり、図１に示すように：
（Ａ）標的塩基配列（ｔ）よりも５’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部又は全部（ａ：図１では標的塩基配列（ｔ）よりも５’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部である場合について例示しているが、５’末端までの塩基配列の全部であってもよい。）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ’）を５’末端側に有する５’末端側ブロック核酸、及び／又は
（Ｂ）標的塩基配列（ｔ）よりも３’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部又は全部（ｂ：図１では標的塩基配列（ｔ）よりも３’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部である場合について例示しているが、３’末端までの塩基配列の全部であってもよい。）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ｂ’）を３’末端側に有する３’末端側ブロック核酸
を標的核酸と接触させ、５’末端側ブロック核酸、及び／又は３’末端側ブロック核酸が、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる。
【００４１】
標的核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は２本鎖を形成するため、標的塩基配列（ｔ）以外の標的核酸中の塩基配列がプローブ塩基配列（ｐ）と非特異的にハイブリダイズすることを抑制できる。また、標的核酸中の異なる位置に存在する塩基配列同士が分子内でハイブリダイズして高次構造を形成するのを抑制できるため、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
【００４２】
（１）標的核酸
ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列（ｔ）を有する標的核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびその誘導体を少なくとも一つ以上含んで構成される任意のポリヌクレオチドである。なお、「ポリヌクレオチド」とは、２以上の任意の数のヌクレオチドが縮合した化合物を意味し、いわゆる「オリゴヌクレオチド」も、本発明における「ポリヌクレオチド」に含まれる。ポリヌクレオチドの具体例としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ：スプライシング前のものであってもスプライシング後のものであってもよい）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、或いはそれらの断片等が挙げられる。また、ポリヌクレオチド或いはそれを含む試料の起源は特に制限されず、生体（動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウィルス等の任意の生命体を意味する）試料由来のもの、生体試料由来の核酸をＰＣＲ法等により増幅及び／又は制限酵素等に（標的塩基配列を途中で切断しないものを選択する必要がある。）より断片化したもの、化学合成されたものであってよく、これらのうち２以上の混合物であってもよい。
【００４３】
標的核酸中に含まれる標的塩基配列（ｔ）の位置は特に制限されず、核酸の分子鎖の中央付近であってもよく、５’末端又は３’末端の近傍であってもよい。標的塩基配列（ｔ）の長さ、すなわち標的塩基配列（ｔ）の塩基数は、後述するプローブ塩基配列（ｐ）の塩基数と等しい。標的核酸塩基配列以外の塩基配列の長さについても特に制限はなく、同様に、標的核酸の総塩基数についても特に制限はない。
【００４４】
標的核酸を含む試料の調製には、核酸を含む試料の調製に通常用いられる任意の溶媒、緩衝剤等の添加物及び調製方法を用いることができ、標的核酸の種類及び起源、プローブ核酸とのハイブリダイゼーションの条件等に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
例えば、ハイブリダイゼーションの対象となる核酸において、少なくとも標的塩基配列近傍の塩基配列が既知である場合、標的塩基配列を含む３０〜１０００塩基からなる塩基配列を選択し、その両端付近にハイブリダイズ可能なプライマーを設計する。プライマーの設計には、任意の公知の方法（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３等のプライマー設計プログラムの使用）を用いることができる。このようにして設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により標的核酸の増幅を行う。なお、非対称ＰＣＲ法を用いて、標的核酸を１本鎖核酸として調製してもよい。
【００４６】
（２）５’末端側及び３’末端側ブロック核酸
標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させるために、下記の（Ａ）に示す５’末端側ブロック核酸、及び／又は下記の（Ｂ）に示す３’末端側ブロック核酸を標的核酸と接触させ、５’末端側ブロック核酸、及び／又は３’末端側ブロック核酸が、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ及び／又はｂ）とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる。
（Ａ）５’末端側ブロック核酸：標的核酸中の塩基配列（ａ）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ’）を５’末端側に含む核酸
（Ｂ）３’末端側ブロック核酸：標的核酸中の塩基配列（ｂ）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ｂ’）を３’末端側に含む核酸
【００４７】
なお、以下において、５’末端側ブロック核酸及び３’末端側ブロック核酸を総称して「ブロック核酸」と略称する場合がある。
【００４８】
前述のように、標的核酸と、５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は２本鎖を形成するため、標的塩基配列（ｔ）以外の標的核酸中の塩基配列がプローブ塩基配列（ｐ）と非特異的にハイブリダイズすることを抑制できる。また、標的核酸中の異なる位置に存在する塩基配列同士が分子内でハイブリダイズして高次構造を形成するのを抑制できるため、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
【００４９】
図１に示すように、標的核酸中の塩基配列（ａ）とハイブリダイズ可能な５’末端側ブロック核酸中の塩基配列（ａ’）は、塩基配列（ａ）と完全に相補的であることが好ましいが、塩基配列（ａ）とハイブリダイズ可能であり、標的塩基配列とプローブ塩基配列とをハイブリダイズさせる条件下でもハイブリダイズした状態を維持できる限りにおいて、１又は複数のミスマッチを含んでいてもよい。同様に、標的核酸中の塩基配列（ｂ）とハイブリダイズ可能な３’末端側ブロック核酸中の塩基配列（ｂ’）は、塩基配列（ｂ）と完全に相補的であることが好ましいが、塩基配列（ｂ）とハイブリダイズ可能であり、標的塩基配列とプローブ塩基配列とをハイブリダイズさせる条件下でもハイブリダイズした状態を維持できる限りにおいて、１又は複数のミスマッチを含んでいてもよい。
【００５０】
ブロック核酸とハイブリダイズ可能な標的核酸中の塩基配列（ａ’及び／又はｂ’）の塩基数に特に制限はなく、勿論、標的塩基配列の塩基数と同一であっても異なっていてもよい。また、標的塩基配列よりも５’末端側及び３’末端側に位置するブロック核酸とハイブリダイズ可能な標的核酸中の塩基配列（ａ及び／又はｂ）の塩基数についても、同一であっても互いに異なっていてもよい。
【００５１】
ブロック核酸は、標的核酸中の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ’及び／又はｂ’）のみからなるものであってもよく、標的核酸とのハイブリダイゼーションを阻害しない限りにおいて、それ以外の塩基配列を含んでいてもよい。
５’末端側ブロック核酸は、塩基配列（ａ）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ’）よりも５’末端側に更に１又は複数の塩基を有していてもよいが、好ましくは、該塩基配列（ａ’）は５’末端に位置しており、５’末端には他の塩基を有しない。
同様に、３’末端側ブロック核酸は、塩基配列（ｂ）とハイブリダイズ可能な塩基配列（ｂ’）よりも３’末端側に更に１又は複数の塩基を有していてもよいが、好ましくは、該塩基配列（ｂ’）は５’末端に位置しており、３’末端には他の塩基を有しない。
【００５２】
標的核酸中に存在する標的塩基配列（ｔ）の３’末端側末端と、３’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列（ｂ）の５’末端側、及び／又は標的塩基配列（ｔ）の５’末端側末端と、５’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ）の３’末端側との間には、１から１５塩基分、好ましくは１から６塩基分のギャップが存在する。ギャップが存在しないと、標的核酸とブロック核酸とがハイブリダイズして形成された２本鎖と標的塩基配列との間隔が小さくなりすぎ、立体障害によりプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下する。一方、ギャップの塩基数が１５よりも大きくなると、標的塩基配列以外の標的核酸中の塩基配列とプローブ塩基配列との非特異的なハイブリダイゼーションにより、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下する。標的塩基配列よりも５’末端側及び３’末端側に存在するギャップの塩基数は同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。
【００５３】
（３）プローブ核酸
プローブ核酸としては、プローブ・ハイブリダイゼーション法で通常用いられる核酸をいずれも好適に使用することができる。使用することができる核酸の具体例としては、標的塩基配列に相補的なプローブ塩基配列を有するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びその誘導体を少なくとも１以上含んで構成されるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５４】
プローブ塩基配列（ｐ）の長さ、すなわちプローブ塩基配列（ｐ）の塩基数は、ハイブリダイゼーションの対象となる標的核酸の塩基配列や塩基長等に依存するため一義的に決定することは困難であるが、一般に１０以上２０以下であり、好ましくは１１以上１５以下である。プローブ塩基配列（ｐ）の塩基数が１０を下回ると、統計上可能なプローブ塩基配列の総数（例えば、プローブ塩基配列の塩基数が９の場合、４９＝２６２１４４）が少なくなりすぎ、特異的にハイブリダイズ可能な核酸の種類が減少する。一方、プローブ塩基配列（ｐ）の塩基数が２０を上回ると、ミスマッチが存在しない標的塩基配列とプローブ塩基配列とのハイブリダイゼーションにより形成される２本鎖核酸と、１つの塩基のみがミスマッチである標的塩基配列とプローブ塩基配列とのハイブリダイゼーションにより形成される２本鎖核酸との間の熱的安定性の差が小さくなり、ハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性が低下する。
【００５５】
プローブ塩基配列（ｐ）は、特に一塩基多型（ＳＮＰ）の判定（タイピング）に使用される場合には、ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列（ｔ）と完全に相補的であることが好ましいが、特定の標的核酸の種類やハイブリダイゼーションの条件において十分な塩基配列特異性を有している場合には、１又は複数のミスマッチを含んでいてもよい。
【００５６】
プローブ塩基配列（ｐ）は、プローブ核酸中の任意の位置に存在していてよいが、好ましくは、５’末端側及び３’末端側のいずれかに存在していることが好ましい。ただし、ハイブリダイゼーションの容易さ（立体障害）等の観点から、固相担体上に固定されている側と反対側の末端側に存在していることがより好ましい。
プローブ塩基配列（ｐ）よりも５’末端側又は３’末端側に更に１又は複数の塩基を有していてもよいが、好ましくは、プローブ塩基配列（ｐ）は５’末端又は３’末端に位置しており、５’末端又は３’末端には他の塩基を有しない。
【００５７】
プローブ核酸としては、ＰＣＲ法等で調製されたもの、化学的に合成されたもの、天然に由来する核酸をそのまま、または加工して使用したもの等どのようなものでも使用することができるが、調製の容易さから化学的に合成されたものを使用するのが好ましい。この場合、合成の容易さからポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を使用するのが好ましいが、合成及び入手の容易さ並びに安定性の観点からＤＮＡが好ましい。
【００５８】
プローブ核酸は、固相担体上でハイブリダイゼーションに使用されるため、ハイブリダイゼーションの前後において固相担体に結合及び吸着し続けるために、ハイブリダイゼーションを阻害しない限り任意の官能基又は分子で修飾されていてもよい。官能基又は分子は、５’末端及び３’末端側のいずれに位置していてもよい。したがって、プローブ核酸は、５’末端側及び３’末端側のいずれで固相担体上に固定されていてもよい。また、官能基又は分子は、固相担体上の表面に存在する官能基又は表面に結合させた官能基若しくは分子と結合する任意の官能基又は分子であってよく、その具体例としては、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、チオール基、スルフィド基、ビニル基、固相担体上に結合したアビジンと特異的に結合するビオチン、固相担体上に結合したポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（標的核酸中の塩基配列及びプローブ塩基配列のいずれにも存在しない塩基配列を有するものであることが好ましく、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、及びＰＮＡ（ペプチド核酸）のいずれかである。）等が挙げられる。
【００５９】
プローブ核酸を化学合成する場合、固相担体上での固相合成法を用いて合成してもよく、液相法等の任意の方法により合成後されたプローブ核酸を固相担体上に固定してもよい。
固相担体の例としては、（１）ガラス、樹脂、セラミックス、金属（バルク材料、薄膜、微粒子等の任意の形態を取りうる）等の材質からなるマイクロタイタープレート、セル、フローセル、マイクロリアクター、チューブ、及び（２）シリカ、ポリスチレン等の材質からなるクロマトグラフィー用担体等が挙げられる。固相担体の表面への標的核酸、プローブ核酸及びブロック核酸の非特異的な吸着を避けるために、固相担体の表面を、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等で被覆（ブロッキング）してもよい。
【００６０】
本実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法では、まず、標的核酸を含む試料に５’末端側ブロック核酸及び／又は３’末端側ブロック核酸を加え、これらを標的核酸と接触させ、５’末端側ブロック核酸、及び／又は３’末端側ブロック核酸を、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ及び／又はｂ）とハイブリダイズさせる。次いで、ブロック核酸とハイブリダイズした標的核酸をプローブ核酸と接触させ、これらをハイブリダイズさせる。標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが、塩基配列特異的な核酸の検出を目的とする場合には、任意の方法を用いてハイブリダイゼーションの検出を行う。また、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが、特定の塩基配列を有する核酸の単離を目的とする場合には、ハイブリダイゼーションしていない（プローブ塩基配列と相補的な塩基配列を有しない）核酸を洗浄除去後、標的核酸をプローブ核酸及びブロック核酸から解離させ、ブロック核酸と分離する。ハイブリダイズした核酸の解離及びブロック核酸の分離は、任意の方法を用いて行うことができる。
【００６１】
（II）一塩基多型（ＳＮＰ）の判定（タイピング）方法
本発明の第２の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法は、判定の対象となる標的塩基配列（ｔ）を有する標的核酸を、標的塩基配列（ｔ）に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列（ｐ）を含み、相異なるプローブ塩基配列（ｐ）を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置された複数のプロープ核酸と接触させ、標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列（ｔ）と相補的なプローブ塩基配列（ｐ）を有するものとを特異的にハイブリダイズさせる工程Ａと、標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列（ｔ）と相補的なプローブ塩基配列（ｐ）を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する工程Ｂとを有している。
【００６２】
なお、本発明において「反応器」とは、標的核酸を含む溶液を充填する容器又は流通させる流路の（溶液と接触する）内壁面上の所定の位置にプローブ核酸が配置され、標的核酸とプローブ核酸を接触させ、ハイブリダイズさせるよう構成されたものをいい、セル、フローセル、マイクロリアクター、チューブ等の任意の形態を取りうる。反応器の材質は特に制限されず、ハイブリダイゼーションの位置特異的な検出に用いる方法等に応じて、ガラス、樹脂、セラミックス、金属等の任意の材質を選択できる。
【００６３】
反応器中の容器又は流路の内壁面上には、標的塩基配列（ｔ）に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列（ｐ）を含む（すなわち互いにプローブ塩基配列中の一塩基のみが異なる）複数種（プローブ塩基配列（ｐ）において一塩基多型に対応する位置の塩基が、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）のうち２〜４）のプローブ核酸が配置されている。ここで、相異なるプローブ塩基配列（ｐ）を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置されている。なお、反応器の内壁面上に配置されるプローブ核酸は、単一の一塩基多型に対応する２〜４種類のもののみであってもよいが、互いにプローブ塩基配列（ｐ）が異なっており、互いに独立してハイブリダイゼーションの検出が可能であれば、複数の一塩基多型に対応するプローブ核酸の組み合わせを単一の反応器の内壁面上に配置してもよい。
【００６４】
標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを単分子レベルで検出するためには、高価な検出装置を必要とするため、通常、個々の一塩基多型（ＳＮＰ）に対応するプローブ核酸をそれぞれ複数用意し、反応器の内壁面上に配置する。この場合において、ＳＮＰの判定（タイピング）を行うためには、それぞれのプローブ核酸に対する特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する必要がある。そのため、同一のプローブ塩基配列を有するプローブ核酸同士を、所定の大きさ及び形状を有する所定の領域内にそれぞれ配置すると共に、それらの領域が互いに所定の距離だけ離れた位置となるように、それぞれのプローブ核酸が配置された状態で、プローブ核酸を内壁面上に固定する。プローブ核酸を内壁面上に固定する方法については、上述の第１の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法に関する説明において述べたとおりであるため、詳しい説明を省略する。また、それぞれの領域の形状、大きさ及び個々の領域間の距離は、反応器の大きさ、ハイブリダイゼーションを検出する手段の空間分解能等に応じて適宜決定することができる。
【００６５】
工程Ａにおいて行われる標的核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させるためには、上述の第１の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法と同様、上記の（Ａ）に示す５’末端側ブロック核酸、及び／又は上記の（Ｂ）に示す３’末端側ブロック核酸を標的核酸と接触させ、５’末端側ブロック核酸、及び／又は３’末端側ブロック核酸が、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列（ａ及び／又はｂ）とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることが好ましい。
【００６６】
工程Ａにおいて用いられる標的核酸及びそれを含む試料、ブロック核酸及びプローブ核酸、並びにハイブリダイゼーションの条件については、上述の第１の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法の場合と同様であるため、詳しい説明を省略する。なお、プローブ核酸において、プローブ塩基配列（ｐ）の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列（ｐ）の塩基数の１／３倍よりも大きいこと、すなわち、各領域の塩基数が（ほぼ）等しくなるようにプローブ塩基配列（ｐ）を３つの領域に分割した場合における中央部に位置していることが好ましく、一塩基多型に対応する塩基がプローブ塩基配列（ｐ）の中央に位置することがより好ましい。
なお、「塩基配列の中央に位置する（塩基）」とは、プローブ塩基配列（ｐ）の塩基数がｎである場合において、
（１）ｎが偶数の場合：５’末端側から（ｎ／２）番目又は（ｎ／２）＋１番目
（２）ｎが奇数の場合：（ｎ＋１）／２番目に位置する塩基をいう。
【００６７】
例えば、プローブ塩基配列（ｐ）の塩基数が１３の場合、「プローブ塩基配列（ｐ）の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列（ｐ）の塩基数の１／３倍よりも大きい」位置とは、プローブ塩基配列の５’末端側から５〜９番目をいう。この場合、プローブ塩基配列は、５’末端側から３’末端側に向かって、塩基数がそれぞれ４、５、４である３つの領域に分割されたことになる。また、この場合におけるプローブ塩基配列（ｐ）の「中央」とは、プローブ塩基配列の５’末端側から７番目をいう。
【００６８】
同様に、プローブ塩基配列（ｐ）の塩基数が１２の場合、「プローブ塩基配列（ｐ）の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列（ｐ）の塩基数の１／３倍よりも大きい」位置とは、プローブ塩基配列の５’末端側から５〜８番目をいい（この場合、プローブ塩基配列は、５’末端側から３’末端側に向かって、塩基数が全て４である３つの領域に分割されたことになる。）、この場合におけるプローブ塩基配列（ｐ）の「中央」とは、プローブ塩基配列の５’末端側から６又は７番目をいう。
【００６９】
また、プローブ塩基配列（ｐ）の塩基数が１４の場合、「プローブ塩基配列（ｐ）の５’末端及び３’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列（ｐ）の塩基数の１／３倍よりも大きい」位置とは、プローブ塩基配列の５’末端側から５〜１０番目をいい（この場合、プローブ塩基配列は、５’末端側から３’末端側に向かって、塩基数がそれぞれ４、６、４である３つの領域に分割されたことになる。）、この場合におけるプローブ塩基配列（ｐ）の「中央」とは、プローブ塩基配列の５’末端側から７又は８番目をいう。
すなわち、プローブ塩基配列（ｐ）を上記のように３つの領域に分割すると、塩基数が３の倍数のときは３つの領域の塩基数は全て等しくなり、３で割ると１又は２余る数のときは中央部の塩基数が両端部のそれよりもそれぞれ１又は２多くなるように分割される。
【００７０】
一塩基多型に対応する塩基がプローブ塩基配列（ｐ）の中央に位置すると、ミスマッチが存在する核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができ、一塩基多型（ＳＮＰ）のタイピングの効率及び信頼性を向上できる。
【００７１】
工程Ａにおけるプローブ塩基配列の長さ、３’末端側ブロック核酸及び／又は５’末端側ブロック核酸の使用の有無については、例えば下記のようにして決定できる。
（１）まず、一塩基多型に対応する塩基が中央に位置し、適当な塩基長（例えば、１３塩基）のプローブ塩基配列を有するプローブ核酸を設計及び合成し、標的核酸とのハイブリダイゼーションを観測する。
（２）いずれのプローブ核酸についても共鳴信号の強度が大きく、十分な塩基配列特異性が観測されない場合は、プローブ塩基配列の塩基長を小さくし、共鳴信号の強度が小さく、ミスマッチを有するプローブ核酸に対するハイブリダイゼーション効率がより大きい等の非特異的なハイブリダイゼーションが観測される場合には、プローブ塩基配列の塩基長を大きくする。
（３）上記のようにプローブ塩基配列の塩基長を変更した結果、塩基配列特異性が改善されたが、なお不十分である場合には、３’末端側ブロック核酸及び５’末端側ブロック核酸のいずれか一方を添加し、改善が見られるか検討する。必要に応じて、他方も添加し同様に検討を行う。
【００７２】
プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを行う反応器中には、例えば、リン酸緩衝液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグット緩衝液、トリス緩衝液等の緩衝液を入れる。緩衝液の塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２等）の濃度を調整することにより、プローブ核酸及び標的核酸の固相担体等への非特異的吸着を防止できる。また、緩衝液として、塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液等を用いた場合も、核酸の非特異的吸着を防止できる。
【００７３】
上記のような緩衝液を入れた反応器中に標的核酸を含む溶液を滴下又は供給し、プローブ核酸と標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる。反応器内の温度は、例えば、ハイブリダイゼーション後、プローブ核酸及びブロック核酸と標的核酸とがハイブリダイズして形成された２本鎖のうち最もＴｍ値の低いものが一本鎖核酸に変性しない温度にする。
【００７４】
工程Ｂでは、標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列（ｔ）と相補的なプローブ塩基配列（ｐ）を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する。ハイブリダイゼーションの検出には、反応器の内壁面上において、同一のプローブ塩基配列（ｐ）を有するプローブ核酸同士が配置された個々の領域間の距離よりも空間分解能の小さな任意の方法を用いることができる。好ましい検出方法としては、ハイブリダイゼーションに伴う信号をリアルタイムかつ高感度で検出可能であり、高価な検出装置を必要としない表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法及び金の異常反射のいずれかが挙げられる。これらの検出法を用いる場合において、光の入射面側が透明であり、金の蒸着膜が形成された反応器が用いられる。この場合、金−チオール結合を介してプローブ核酸を表面に固定することもできる。
【００７５】
或いは、ＣＭＯＳ型ＦＥＴのゲート電極の表面に、金の蒸着膜等の電極を介してプローブ核酸を固定し、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを電気的に読み出すことができるよう構成してもよい。この場合において、増幅器やマルチプレクサを集積化することにより、信号の増幅や一塩基多型の判定等の信号処理も行うことができるよう構成することも可能であり、装置の小型化、低コスト化、操作の簡便性及び信頼性の向上の観点から有利である。
【００７６】
（III）一塩基多形判定用反応器
本発明の第３の実施の形態に係る一塩基多型判定用反応器は、判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、標的塩基配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロープ核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置されている。
【００７７】
反応器の材質及び形態、プローブ核酸の配置については、上述の第２の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法に関する説明において述べたとおりであるため、詳しい説明を省略する。
【００７８】
（IV）一塩基多形判定装置
図２に示すように、本発明の第４の実施の形態に係る一塩基多型判定装置１０は、上述の第２の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法を実施するための装置であり、判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、標的塩基配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロープ核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置された反応器１２と、標的塩基配列を有する標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列と相補的な該プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する検出手段１３とを有している。
【００７９】
反応器１２及び検出手段１３については、上述の第２の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法及び第３の実施の形態に係る一塩基多型判定用反応器に関する説明において述べたとおりであるため、詳しい説明を省略するが、例えば、標的核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションの検出に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる場合には、検出手段１３は、光源（半導体レーザ等）、光学系（集光用レンズ、偏光子、プリズム、ビームスプリッタ等）、検出器（ＣＣＤカメラ、フォトダイオードアレイ等）、電子回路（差動アンプ、Ａ／Ｄコンバータ等）等を有している。
或いは、反応器中１２での標的核酸溶液の添加やハイブリダイゼーション等は手動で行ってもよい。
【００８０】
一塩基多型判定装置１０は、反応器１２及び検出手段１３以外にも、標的核酸を含む試料を反応器１２に供給する試料供給手段（ダイアフラムポンプ等）１１、検出手段１３からの信号を処理し、場合によっては一塩基多型の判定を行うデータ処理手段１４、試料供給手段１１、検出手段１３及びデータ処理手段１４の制御を行う制御手段１５を有している。データ処理手段１４及び制御手段１５は、例えばパーソナルコンピュータであり、ハードディスクドライブ、ＲＯＭ等の記憶装置に保存されたプログラムが中央演算処理装置（ＣＰＵ）に読み込まれることにより、データ処理手段１４及び制御手段１５として機能する。一塩基多型判定装置１０は、その他にも、反応器１２の温度を調節するための図示しないヒータ等を有していてもよい。
【実施例】
【００８１】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。これらの実施例は説明のための例示に過ぎず、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されない。また、本実施例においては、塩基配列の相補性及びミスマッチの有無を確認しやすくするために、標的核酸にハイブリダイズするプローブ核酸、リンカー核酸及びブロック核酸の塩基配列を３’末端→５’末端方向に記載する。
【００８２】
実施例１：モデル系アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ２）によるハイブリダイゼーション検出条件の検討
飲酒により摂取されたエタノールの中間代謝産物であるアセトアルデヒドを酸化し、酢酸に変換するＡＬＤＨ２には遺伝子多型（一塩基多型）が存在し、遺伝子型により活性型であるＡＬＤＨ２＊１型と不活性型であるＡＬＤＨ２＊２型とに分けられる。ＡＬＤＨ２遺伝子の第１２エクソンの１０４番目（５’末端から１０３５番目）の塩基が、前者においてはＧ（グアニン）である（以下、「Ｇ型」という。）のに対し、後者においてはＡ（アデニン）である（以下、「Ａ型」という。）。その結果、ＡＬＤＨ２における４８７番目のアミノ酸が、前者においてはグルタミン酸（ＧＡＡ）、後者においてはリジン（ＡＡＡ）になる。遺伝子型が活性型ホモ接合体（Ｇ／Ｇ）の人は、エタノール及びアセトアルデヒド代謝が速いのに対し、ヘテロ接合体（Ｇ／Ａ）及び不活性型ホモ接合体（Ａ／Ａ）の人は、アセトアルデヒド代謝が遅れるため、これらの人には顔面紅潮や不快症状（フラッシング症状）が現れる。特に後者は、酒に非常に弱く、いわゆる殆ど「飲めない」タイプである。白人や黒人では、Ｇ／Ｇの割合がほぼ１００％であるのに対し、日本人では、Ｇ／Ｇの人が５６％、Ｇ／Ａが３８％、Ａ／Ａが４％となっている。
【００８３】
（１）ハイブリダイゼーション検出系の構築及び表面共鳴プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によるハイブリダイゼーションの検出
標的核酸として、Ｇ型のＡＬＤＨ２遺伝子の第１２エクソンの１０４番目の塩基（下記の塩基配列中太字で示した核酸塩基）を含む３０塩基からなり、下記の配列番号１で表される塩基配列を有する核酸を合成した。
【００８４】
【化１】
2010200701.tif 000003
【００８５】
上記配列番号１で表される塩基配列中、下線を付した２０塩基を標的塩基配列とし、０〜３塩基のミスマッチを有するプローブ塩基配列を有するプローブ核酸として、下記の塩基配列２〜９で表される塩基配列を有する８種類の核酸を設計及び合成した。
【００８６】
【化２】
2010200701.tif 000004
【００８７】
上記配列番号２〜９で表される塩基配列中、太字で示した塩基は、配列番号１において太字で示した核酸塩基Ｇに対応する位置に存在する塩基（Ｃは相補的、Ｔはミスマッチ）であり、下線を付した塩基は、標的塩基配列中の対応する塩基と相補的な塩基である。また、イタリックで示した３’末端側の１５塩基の配列は、後述するリンカー核酸（配列番号１０）の５’末端側の１５塩基の配列と相補的であり、ＳＮＰ判定用チップの表面へのこれらのプローブ核酸の固定のために導入された塩基配列である。
【００８８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）用センサーチップを用意し、その表面にアビジンを固定した。次いで、配列番号１０で表される塩基配列を有し、５’末端側でビオチンと結合した合成ＤＮＡ（リンカー核酸）を含む溶液（リンカー核酸濃度２μＭ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ含有ＨＢＳ、３０μＬ）をインジェクト後、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ含有ＨＢＳ）を１５分間流し（流量５μＬ／分）、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を介してセンサーチップの表面に固定した。その後、５０ｍＭ  ＮａＯＨ  ８μＬ（４分間）を４回、次いで０．０５％ＳＤＳ  ８μＬを１回流し、リンカー核酸を洗浄し、１本鎖とした。
【００８９】
【化３】
2010200701.tif 000005
【００９０】
なお、上記塩基配列中、イタリックで示した塩基配列は、配列番号２〜９で表される塩基配列中のイタリックで示した塩基配列と相補的である。次いで、配列番号２〜９で表される塩基配列を有するプローブ核酸のいずれかを含む溶液（プローブ核酸濃度２μＭ、１Ｍ  ＮａＣｌ含有ＨＢＳ）を１分間流した（流量５μＬ／分）。この操作により、これらのプローブ核酸のいずれかが、リンカー核酸中の配列番号１０で表される塩基配列中の相補的な配列とのハイブリダイゼーションを介して表面に結合固定したセンサーチップを作製した。
【００９１】
上記のようにして、表面にプローブ核酸を固定したセンサーチップに、標的核酸を含む溶液（標的核酸濃度０．５μＭ、０〜２Ｍ  ＮａＣｌ含有ＨＢＳ）をインジェクト後、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を１分間流し（流量５μＬ／分）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションをモニタした。ハイブリダイゼーションの前後における平衡時のセンサグラムの強度変化より、ハイブリダイゼーションによる共鳴角の変化の大きさ（共鳴信号の強度：単位はＲＵ（共鳴単位）で表され、１０００ＲＵ＝０．１°である。）を求めた。次いで５０ｍＭ  ＮａＯＨで洗浄（５μＬ／分、１分間）を流して、標的核酸及びプローブ核酸を洗浄除去した。以上の操作を全てのプローブ核酸について行い、配列番号２〜９で表される塩基配列を有するプローブ核酸について、共鳴信号強度の比較を行った。
【００９２】
標的塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸（配列番号２）において観測された共鳴信号の強度は、ＮａＣｌ濃度の増大に伴い増大する傾向にあった。一方、プローブ塩基配列が標的核酸に完全に相補的である場合とミスマッチを有する場合との信号強度の比は、ＮａＣｌ濃度によらずほぼ一定であり、１塩基のミスマッチを有するもの（配列番号３、５）の約１．１４倍しかなく、３塩基のミスマッチを有するもの（配列番号９）でも約１．５倍に過ぎなかった。以上のように、プローブ塩基配列の塩基長が２０である場合には、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、高い塩基配列特異性が見られなかった。
【００９３】
（２）標的塩基配列の塩基長がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
上の（１）の結果から、ＳＰＲ法により標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを検出できることは確認できたが、標的塩基配列の塩基長が２０である場合には、塩基配列特異性が十分でないため、種々の塩基長を有する標的核酸を用い、核酸塩基配列の塩基長がハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性に及ぼす影響について検討した。使用したプローブ核酸及び標的核酸は、それぞれ下記のとおりである。ここでは、配列番号１１で表される塩基配列を有するプローブ核酸のみを用い、塩基長の異なる標的核酸（配列番号１２〜２０）を用いて検討を行った。
【００９４】
【化４】
2010200701.tif 000006
【００９５】
【化５】
2010200701.tif 000007
【００９６】
上記の配列番号１２〜２０で表される塩基配列を有する標的核酸は、配列番号１１で表される塩基配列を有するプローブ塩基配列において太字で示した核酸塩基Ｃに相補的な核酸塩基Ｇを中央に有し、その両側に、前記プローブ塩基配列と相補的な３〜２０塩基の塩基配列をそれぞれ有している。これらの核酸を用いて上記（１）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
【００９７】
結果を図３に示す。横軸は標的核酸の塩基数、縦軸は共鳴信号強度を塩基数で割ったもの（１塩基当たりの共鳴信号強度）をそれぞれ表す。塩基数が２０の場合には１塩基当たりの共鳴信号強度が最大となっており、ミスマッチの有無によるハイブリダイゼーション効率の変化が現れにくくなっていると考えられる。
【００９８】
そこで、塩基長が２４以下の標的核酸（配列番号１２〜１７）のものについて、配列番号１１で表される塩基配列を有するものに加え、ミスマッチを含む下記の塩基配列（配列番号２１、２２）を有するプローブ核酸について上記（１）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
【００９９】
【化６】
2010200701.tif 000008
【０１００】
配列番号２１及び２２において、下線を付した塩基がミスマッチである。結果を図４に示す。標的塩基配列の塩基長が１１〜１５の場合に、プローブ塩基配列が標的核酸に完全に相補的である場合とミスマッチを有する場合との信号強度の比がＮａＣｌ濃度に依存し、最高（ＮａＣｌ濃度が１Ｍの場合）で５〜１００に増大することが確認された。以上の結果から、標的塩基配列（プローブ塩基配列）の塩基長が１１〜１５であることが好ましいことが確認された。なお、以下の操作において、塩（ＮａＣｌ）濃度は、最も高い塩基配列特異性が観測された濃度である１Ｍとした。
【０１０１】
（３）ミスマッチの位置がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
プローブ核酸として、上記の配列番号１１（完全に相補的）及び２１（１塩基のミスマッチを有するもの）で表される塩基配列を有するものを、標的核酸として下記の塩基配列を有するもの（塩基長はいずれも１１である）をそれぞれ用いて上記（１）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
【０１０２】
【化７】
2010200701.tif 000009
【０１０３】
結果を図５に示す。棒グラフは、配列番号１１（完全に相補的）及び２１（１塩基のミスマッチ）で表される塩基配列を有するプローブ核酸と各標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける共鳴信号の強度を示し、折れ線グラフは、前者に対する後者の比率を％単位で表したものであり、値が小さいほど塩基配列特異性が高いことを示す。図５中の折れ線グラフより明らかなように、ミスマッチ塩基が標的塩基配列（プローブ塩基配列）の中央にある場合に塩基配列特異性が最大になることが確認された。
【０１０４】
（４）ブロック核酸がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
標的核酸として、ＡＬＤＨ２遺伝子の第１２エクソンの１０４番目の塩基を含む５０塩基からなる、下記の配列番号２７及び配列番号２８のいずれかで表される塩基配列を有する核酸を合成した。
【０１０５】
【化８】
2010200701.tif 000010
【０１０６】
配列番号２７及び２８で表される核酸は、それぞれＧ型及びＡ型に対応している。上記配列番号１及び２で表される塩基配列中、下線を付した部分は、一塩基多型に対応する塩基及びその前後の６塩基からなる１３塩基を含んでいる。これらの１３塩基又は両端の１塩基ずつを除いた１１塩基を標的塩基配列とし、これらに相補的な塩基配列をプローブ塩基配列とするプローブ核酸として、下記の配列番号２９〜３２で表される塩基配列を有する核酸を設計し、合成した。これらの核酸を用いて上記（１）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。なお、プローブ塩基配列の塩基長は、配列番号２９及び３１が１３、３０及び３２が１１であり、配列番号２９及び３０ではプローブ塩基配列が標的塩基配列に完全に相補的であり、３１及び３２は、一塩基多型に対応する１塩基がミスマッチである。
【０１０７】
【化９】
2010200701.tif 000011
【０１０８】
併せて、上記標的核酸（配列番号２７、２８）における標的塩基配列よりも５’末端及び３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を有する５’末端側（配列番号３３）及び３’末端側ブロック核酸（配列番号３４）をそれぞれ合成し、これらのうち一方又は双方が標的核酸にハイブリダイズした状態におけるハイブリダイゼーション効率も併せて検討した。ブロック核酸の共存下で実験を行う場合には、標的核酸をインジェクト後、２倍の濃度（１μＭ）のブロック核酸をインジェクトし、９５℃で３分間加熱後室温まで徐冷してからＳＰＲ測定を行った。
【０１０９】
【化１０】
2010200701.tif 000012
【０１１０】
プローブ塩基配列の塩基長が１１の場合（塩基配列３０、３２）における結果を図６に示す。いずれのプローブ核酸を用いた場合にも、３’末端側ブロック核酸を添加したときにミスマッチ／マッチ比が８〜１２％と最小になることが確認された。
なお、プローブ塩基配列の塩基長が１３の場合（塩基配列２９、３１）についても同様の結果が得られた。
【０１１１】
（５）３’末端側ブロック核酸の添加量がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
３’末端側ブロック核酸の添加量がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響についても検討した。結果は示さないが、いずれの標的核酸（配列番号２７及び２８）についても、３’末端側ブロック核酸（配列番号３３）の添加量の増大につれてミスマッチ／マッチ比は低下したが、標的核酸の２倍（モル比）付近で添加効果は飽和した。したがって、３’末端側ブロック核酸は、少なくとも標的核酸の２倍（モル比）添加すれば十分に塩基配列特異性を向上させる効果が得られることが確認された。
【０１１２】
（６）３’末端側ブロック核酸がハイブリダイズな可能な標的核酸中の塩基配列の５’末端側と標的塩基配列の３’末端側とのギャップの長さがハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
標的核酸として配列番号２７、２８で表される塩基配列を有するもの、プローブ核酸として配列番号２９、３１で表される塩基配列を有するもの、３’末端側ブロック核酸として、下記の配列番号３４〜４０で表される塩基配列を有するもの（カッコ内の数字は、３’末端側ブロック核酸がハイブリダイズな可能な標的核酸中の塩基配列の５’末端側と標的塩基配列の３’末端側とのギャップの長さ（以下、「ギャップの長さ」と略称する。）を表す。負の数字は、３’末端側ブロック核酸の３’末端側に存在し、標的塩基配列とオーバーラップする余分な塩基の数を表す。）を用いて、上記（１）及び（４）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
【０１１３】
【化１１】
2010200701.tif 000013
【０１１４】
標的塩基配列と３’末端側ブロック核酸の塩基との間にオーバーラップが存在する場合には、ハイブリダイゼーション効率が低下するがＳＰＲ法による測定は可能であった。ギャップの長さが０の場合には、ハイブリダイゼーション効率は高いものの、ミスマッチが存在する場合にもかなりのハイブリダイゼーションが観測され、最小でも１０％程度のミスマッチ／マッチ比が観測された。ギャップの長さが１〜５の場合、１塩基のミスマッチが存在する場合のハイブリダイゼーションが大幅に抑制され、ミスマッチ／マッチ比は１％以下となった。
【０１１５】
以上の結果から、ＡＬＤＨ２においては、プローブ塩基配列の塩基長を１１〜１３とし、ギャップの長さが１〜５となる３’末端側ブロック核酸を用いることで、ＳＰＲ法によりＳ／Ｎ比（マッチ／ミスマッチ比）１００以上で一塩基多型を判定できることが確認された。
【０１１６】
（７）一塩基多型の判定
標的核酸として配列番号２７で表される塩基配列を有するもののみ（Ｇ／Ｇ型に相当）、配列番号２８で表される塩基配列を有するもののみ（Ａ／Ａ型に相当）、両者を１：１で混合したもの（Ｇ／Ａ型に相当）のいずれか、プローブ核酸として配列番号２９、３１及び４１で表される塩基配列を有するもの、３’末端側ブロック核酸として、配列番号３４で表される塩基配列を有するものをそれぞれ用いて（図７参照：黒の台形はアビジンを、Ｂが書かれた五角形はビオチン分子をそれぞれ表す。）、上記（１）及び（４）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。なお、配列番号２９、３１及び４１で表される塩基配列を有するプローブ核酸は、それぞれ一塩基多型に対応する部位における塩基がＧ、Ａ及びＣである標的核酸に相補的なプローブ塩基配列を有している。
【０１１７】
【化１２】
2010200701.tif 000014
【０１１８】
結果を図８に示す。各標的核酸について、配列番号２９、３１及び４１で表される塩基配列を有する各プローブ核酸に対する共鳴信号強度のパターンから、図９に示すようなアルゴリズムを用いて、一塩基多型の各ジェノタイプ（Ｇ／Ｇ、Ａ／Ａ、Ｇ／Ａ）を判定できると考えられる。
【０１１９】
（８）非対称ＰＣＲ法による毛髪より採取したＤＮＡからの１本鎖核酸の調製
株式会社ニッポンジーン製ＤＮＡ抽出キットＩＳＯＨＡＩＲを用いて、ヒトの毛髪からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをテンプレートとして、５’末端から９０４番目〜１３３２番目の塩基を含む４３０ｂｐＰＣＲ増幅産物を得た。使用したプライマーは、それぞれの末端から２５塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このようにして得られた４３０ｂｐ増幅産物をテンプレートとして、非対称ＰＣＲ法により１１８ｂｐ増幅産物を得た。非対称ＰＣＲ法の条件は下記のとおりである。
【０１２０】
４３０ｂｐ増幅産物：２００ｆｇ
５’末端側テンプレート（９４５〜９６４番目の塩基配列と相補的）：１μＭ
３’末端側テンプレート（１０４２〜１０６２番目の塩基配列と相補的）：２０ｎＭ
サイクル：９５℃５分→（９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃１５秒）×３５サイクル
【０１２１】
サザンハイブリダイゼーション法により、得られた増幅産物が１本鎖ＤＮＡであることを確認した。上記の方法により、ＳＮＰの判定に用いることができる１本鎖ＤＮＡが得られることを確認した。
【０１２２】
（９）非対称ＰＣＲ法による毛髪より採取したＤＮＡからの標的核酸試料の調製
１３名のボランティアより採取した毛髪から上記（８）と同様の方法によりＤＮＡを抽出し、４３０ｂｐＰＣＲ増幅産物を得た。使用したプライマーは、それぞれの末端から２５塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このようにして得られた４３０ｂｐ増幅産物をテンプレートとして、非対称ＰＣＲ法により１３９ｂｐ増幅産物を得た。非対称ＰＣＲ法の条件は下記のとおりである。
【０１２３】
４３０ｂｐ増幅産物：２００ｆｇ
５’末端側テンプレート（９２５〜９４９番目の塩基配列と相補的）：１μＭ
３’末端側テンプレート（１０４４〜１０６３番目の塩基配列と相補的：配列番号３４）：２０ｎＭ
Ｐｒｅｍｉｘ、ＭｉｌｌｉＱ：２５μＬ
サイクル：９５℃５分→（９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃１５秒）×４０サイクル
【０１２４】
このようにして得られた標的核酸試料（１３９ｂｐ増幅産物）をエタノール沈殿後、１４０μＬのＭｉｌｌｉＱに溶解し、３Ｍ  Ｂｕｆｆｅｒ７０μＬを加えた。配列番号３４で表される塩基配列を有する３’末端側ブロック核酸の０．２５μＭ溶液１μＬを加え、加熱後、急冷し、標的核酸にハイブリダイズさせた。
【０１２５】
上記（１）において表面にリンカー核酸を固定したセンサーチップに、配列番号２９、３１及び４１で表される塩基配列を有するプローブ核酸のいずれかを含む溶液（プローブ核酸濃度２００ｎＭ、１Ｍ  ＮａＣｌ含有ＨＢＳ）２５μＬを５分間流した（流量５μＬ／分）。この操作により、これらのプローブ核酸のいずれかが、リンカー核酸中の配列番号１０で表される塩基配列中の相補的な配列とのハイブリダイゼーションを介して表面に結合固定したセンサーチップを作製した。次いで、上で調製した標的核酸を含む溶液を１０分間流し（流量３μＬ／分）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションをモニタした。ハイブリダイゼーションの前後における平衡時のセンサグラムの強度変化より、ハイブリダイゼーションによる共鳴角の変化の大きさ（共鳴信号の強度：単位はＲＵ（共鳴単位）で表され、１０００ＲＵ＝０．１°である。）を求めた。次いで５０ｍＭ  ＮａＯＨで洗浄（５μＬ／分、１分間）を流して、標的核酸及びプローブ核酸を洗浄除去した。以上の操作を全てのプローブ核酸について行い、３種類のプローブ核酸について、共鳴信号強度の比較を行った。
【０１２６】
結果を図１０及び表１に示す。３つのプローブ核酸（配列番号２９、３１、４１）を用いて得られた共鳴信号強度の比より、図９に示すアルゴリズムを用いてジェノタイプを判定し、従来法（ＤＮＡシークエンシング）により得られた結果と比較した。
【０１２７】
【表１】
2010200701.tif 000015
【０１２８】
表１に示すように、本方法により判定されたジェノタイプと従来法により判定されたジェノタイプとは完全に一致していた。
【０１２９】
実施例２：メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の一塩基多型の判定
ＭＴＨＦＲは、葉酸代謝経路の酵素のひとつで、ホモシスチンをメチオニンに変換するプロセスの律速段階を触媒する。ＭＴＨＦＲをコードするＤＮＡ中の６７７番目のＣがＴに変異したことに起因するこの酵素の異常は葉酸欠乏を引き起こし、高ホモシスチン血症を来す原因になるが、葉酸の投与によって改善できる。ただし、葉酸欠乏は胎児の神経管閉鎖障害の発症リスクを高めることが知られており、特に妊娠初期には葉酸の充分な摂取が必要である。したがって、診断によりＴＴホモだった場合は妊娠期に葉酸摂取の充分な管理が必要になる。日本人における各ジェノタイプの出現頻度は、Ｃ／Ｃ型４６％、Ｃ／Ｔ型４４％、Ｔ／Ｔ型１０％である。
【０１３０】
（１）モデル系を用いた最適条件の検討
標的核酸として、ＭＴＨＦＲ遺伝子の第６７７番目の塩基を含む５３塩基からなる、下記の配列番号４２及び配列番号４３のいずれかで表される塩基配列を有する核酸を合成した。プローブ核酸として、配列番号４４〜４７で表される塩基配列を有するもの（一塩基多型に対応する塩基を中央に有している。）、３’末端側ブロック核酸として、配列番号４８で表される塩基配列を有するもの（ギャップの長さは１である。）をそれぞれ設計及び合成した。これらの核酸を用いて実施例１の（１）及び（４）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
【０１３１】
【化１３】
2010200701.tif 000016
【０１３２】
【化１４】
2010200701.tif 000017
【０１３３】
【化１５】
2010200701.tif 000018
【０１３４】
３’末端側ブロック核酸を添加してもミスマッチ／マッチ比が１０〜８０％程度と大きな値となった。これは、プローブ塩基配列の塩基長が大きすぎ、ハイブリダイゼーション効率が大きすぎるためであると考えられたため、プローブ塩基配列の塩基長を１１に減少させた、配列番号４９〜５２で表される塩基配列を有するプローブ核酸を合成した。
【０１３５】
【化１６】
2010200701.tif 000019
【０１３６】
これらのプローブ核酸と、上で用いた標的核酸（配列番号４２、４３、両者の１：１混合物：それぞれＣ／Ｃ型、Ｔ／Ｔ型、Ｃ／Ｔ型に対応する。）及び３’末端側ブロック核酸（配列番号４８）を用いて同様の実験を行った。その結果を図１１に示す。この結果から、４つのプローブ核酸に対し観測された共鳴信号強度の比について、下記の基準によりジェノタイプの判定が可能であると考えられる。
（１）配列番号５０＞配列番号４９ならばＴ／Ｔ型
（２）配列番号４９／配列番号５０＞３ならばＣ／Ｃ型
（３）１≦配列番号４９／配列番号５０≦３ならばＣ／Ｔ型
【０１３７】
（２）被験者の毛髪から採取したＤＮＡを用いた一塩基多型の判定
株式会社ニッポンジーン製ＤＮＡ抽出キットＩＳＯＨＡＩＲを用いて、ヒトの毛髪からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをテンプレートとして、下記の配列番号５３及び５４で表される塩基配列を有するプライマー（前者が５’末端側、後者が３’末端側である。）を用いて、非対称ＰＣＲ法により８６６ｂｐ増幅産物を得た。得られた増幅産物をテンプレートとして、下記の配列番号５５及び５６で表される塩基配列を有するプライマー（前者が５’末端側、後者が３’末端側である。）を用いて、非対称ＰＣＲ法により７２ｂｐ増幅産物を得た。これを標的核酸として用い、上記と同様の実験を行った。
【０１３８】
【化１７】
2010200701.tif 000020
【０１３９】
結果を図１２に示す。３つのプローブ核酸（配列番号２９、３１、４１）を用いて得られた共鳴信号強度の比より、上述した判定基準を用いてジェノタイプを判定し、従来法（ＤＮＡシークエンシング）により得られた結果と比較したところ、すべて一致していた。
【０１４０】
実施例３：アポリポタンパクＥ（ａｐｏ  Ｅ）の一塩基多型の判定
ａｐｏ  Ｅは、血漿中で脂質と結合しリポタンパクとなり、また、リポタンパクが細胞に認識されるときのマーカーとなるタンパク質である。ａｐｏ  Ｅ遺伝子にはε２、ε３、ε４の３つの対立遺伝子（アリル）（タンパク質ではＥ２、Ｅ３、Ｅ４のアイソフォーム）があり、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の違いは、１１２位と１５８位のアミノ酸である。ａｐｏ  Ｅ３では１１２番目がシステインであるが、ａｐｏ  Ｅ４では１１２番目がアルギニンとなっている。ａｐｏ  Ｅ４はアルツハイマー病の危険因子として知られており、「ａｐｏ  Ｅ４ホモ」では３倍、「ａｐｏ  Ｅ４ホモ」かつ「ＡＬＤＨ２が不活性型」は３０倍アルツハイマー病に罹患しやすいとされている。
【０１４１】
（１）モデル系を用いた最適条件の検討
標的核酸として、ａｐｏ  Ｅ遺伝子の３’→５’鎖において上記一塩基多型に対応する塩基を含む５７塩基からなる、下記の配列番号５７及び配列番号５８のいずれかで表される塩基配列を有する核酸を合成した。プローブ核酸として、配列番号５９〜６２で表される塩基配列を有するもの（一塩基多型に対応する塩基を中央に有している。）、３’末端側ブロック核酸として、配列番号６３で表される塩基配列を有するもの（ギャップの長さは１である。）をそれぞれ設計及び合成した。これらの核酸を用いて実施例１の（１）及び（４）と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
【０１４２】
【化１８】
2010200701.tif 000021
【０１４３】
【化１９】
2010200701.tif 000022
【０１４４】
【化２０】
2010200701.tif 000023
【０１４５】
いずれの標的核酸についても、３’末端側ブロック核酸の有無に関わりなく、配列番号５９で表される塩基配列を有するプローブ核酸にのみハイブリダイズし、他のプローブ核酸に対しては、有意にハイブリダイゼーションしないという塩基配列非特異的なハイブリダイゼーションが観測された。これは、プローブ塩基配列の塩基長が小さすぎるためであると考えられたため、プローブ塩基配列の塩基長を１５に増大させた、配列番号６４〜６７で表される塩基配列を有するプローブ核酸及び配列番号６８で表される塩基配列を有する３’末端側ブロック核酸を合成した。これらのプローブ核酸と、上で用いた標的核酸（配列番号５７、５８、両者の１：１混合物：それぞれＡ／Ａ型、Ｇ／Ｇ型、Ａ／Ｇ型に対応する。）及び３’末端側ブロック核酸（配列番号６８）を用いて同様の実験を行った。
【０１４６】
【化２１】
2010200701.tif 000024
【０１４７】
【化２２】
2010200701.tif 000025
【０１４８】
プローブ塩基配列の塩基長を１５に増大させた結果、一塩基多型に対応する塩基がＴであるプローブ核酸（配列番号６４）に対する塩基配列非特異的なハイブリダイゼーションは観測されなくなったが、配列番号５８で表される塩基配列を有する標的核酸については、配列番号６５〜６７で表される塩基配列を有するプローブ核酸との間のハイブリダイゼーション効率が殆ど変わらないという結果が観測された。そこで、下記の配列番号６９で表される塩基配列を有する５’末端側ブロック核酸を設計及び合成し、上記の標的核酸（配列番号５７，５８）、プローブ核酸（配列番号６４〜６７）、及び３’末端側ブロック核酸（配列番号６８）と共に用いて同様の実験を行った。
【０１４９】
【化２３】
2010200701.tif 000026
【０１５０】
得られた結果を図１３に示す。この結果から、４つのプローブ核酸に対し観測された共鳴信号強度の比について、下記の基準によりジェノタイプの判定が可能であると考えられる。
（１）配列番号６５＞配列番号６６ならばＡ／Ａ型
（２）配列番号６６／配列番号６５＞２ならばＧ／Ｇ型
（３）１≦配列番号６６／配列番号６５≦２ならばＡ／Ｇ型
【０１５１】
（２）被験者の毛髪から採取したＤＮＡを用いた一塩基多型の判定
株式会社ニッポンジーン製ＤＮＡ抽出キットＩＳＯＨＡＩＲを用いて、ヒトの毛髪からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをテンプレートとして、下記の配列番号７０及び７１で表される塩基配列を有するプライマー（前者が５’末端側、後者が３’末端側である。）を用いて、非対称ＰＣＲ法により２２８ｂｐ増幅産物を得た。得られた増幅産物をテンプレートとして、下記の配列番号７２及び７３で表される塩基配列を有するプライマー（前者が５’末端側、後者が３’末端側である。）を用いて、非対称ＰＣＲ法により１２５ｂｐ増幅産物を得た。これを標的核酸として用い、上記と同様の実験を行った。
【０１５２】
【化２４】
2010200701.tif 000027
【０１５３】
結果を図１４に示す。なお、被験者１、２は同一の被験者に由来する試料について再現性確認のために２回測定を行ったそれぞれの結果を示している、３つのプローブ核酸（配列番号６０、６１、６２）を用いて得られた共鳴信号強度の比より、上述した判定基準を用いてジェノタイプを判定し、従来法（ＤＮＡシークエンシング）により得られた結果と比較したところ、すべて一致していた。
【符号の説明】
【０１５４】
１０  一塩基多型判定装置
１１  試料供給手段
１２  反応器
１３  検出手段
１４  データ処理手段
１５  制御手段
【図１】
2010200701.tif 000028
【図３】
2010200701.tif 000029
【図４】
2010200701.tif 000030
【図５】
2010200701.tif 000031
【図６】
2010200701.tif 000032
【図７】
2010200701.tif 000033
【図８】
2010200701.tif 000034
【図９】
2010200701.tif 000035
【図１０】
2010200701.tif 000036
【図１１】
2010200701.tif 000037
【図１２】
2010200701.tif 000038
【図１３】
2010200701.tif 000039
【図１４】
2010200701.tif 000040
【図２】
2010200701.tif 000041
【配列表】
2010200701000001.app