(57)【要約】【課題】生物製剤、特にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの送達のためにより有効な標的化薬物送達系を提供すること。【解決手段】本発明は、治療剤の送達のための薬学的組成物および方法に関する。本発明の方法および組成物は、治療物質の部位特異的送達を達成し得、特に必要な治療レベルでの標的化部位に到達する際の問題を提示したオリゴヌクレオチドのような薬剤のためのより低い用量および改善された効力を可能にする。超音波の標的化導入を用いて、治療剤の放出を促進し得る。送達系としては、Ｎ2枯渇またはＮ2を含まない環境下で形成されるタンパク質でカプセル化されたガス充填微小泡が挙げられる。これらの微小泡は、空気の存在下で超音波処理された微小泡よりも小さくかつ安定している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物活性物質の送達のための薬学的組成物および方法に関する。本発明の方法および組成物を使用して、生物学的に活性な物質の部位特異的送達を達成し得る。この特異性は、より低い薬物用量かつ改善された効力を可能にし、標的化された器官における治療濃度の達成の問題に代表的に悩まされるオリゴヌクレオチドのような薬剤について特により低い薬物用量かつ改善された効力を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
薬物送達技術は、薬物利用可能性を増大するために、薬物用量を減少させるために、および結果的に薬物が誘導する副作用を減少させるために薬物治療において用いられる。これらの技術は、身体中の薬物の放出を制御、調節、および標的するように働く。目下の薬物送達の目標は、より少ない頻度の薬物投与、全身性循環もしくは特定の標的器官部位における薬物の一定かつ継続した治療レベルの維持、望ましくない副作用の減少、ならびに所望の治療利益を実現するのに必要な量および用量濃度の減少を含んでいた。最終的には、所望の薬物の標的器官への送達を非侵襲的に標的とした方法が所望される。
【０００３】
今日まで、薬物送達系としては、タンパク質、多糖、合成ポリマー、赤血球、ＤＮＡおよびリポソームに基づく薬物キャリアが挙げられた。新世代の生物製剤（例えば、モノクローナル抗体、遺伝子治療用ベクター、抗癌剤（例えば、タキソール）、ウイルスベースの薬物、およびオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）およびポリヌクレオチド）は、送達に関していくつかの問題を提示している。実際、薬物送達は、これらの薬剤の主流の治療的用途を達成するための主な障害であり得、これらの薬剤の当初の可能性は、無制限であるように見えたが、それらの治療パラメーターは、完全な利益の実現を妨げた。
【０００４】
化学的に改変してヌクレアーゼ耐性を付与された合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用は、薬物治療に対して基本的に異なるアプローチを示す。今日までの最も一般的な適用は、特定の標的化ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有するアンチセンスＯＤＮを使用する。治療へのアンチセンスオリゴヌクレオチドのアプローチは、単純かつ特異的な薬物設計の着想を含み、その着想において、ＯＤＮは、翻訳またはより初期のプロセシング事象の過程において機械的な介入を引き起こす。このアプローチの利点は、遺伝子特異的作用についての能力であり、この作用は、比較的低い用量、そして最小の非標的化副作用に反映されるはずである。しかし、生物学的研究において現在最も一般的に使用されるアナログである、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、タンパク質に対する非特異的結合を頻繁に提示する。一般的に、アンチセンスアプローチの主な潜在的利点（低用量および最小の副作用）は、期待はずれであった。
【０００５】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの薬物送達は、２つの重要なチャレンジに集中していた：細胞中へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションおよびインビボでのオリゴヌクレオチドの分布の変化。トランスフェクションに関して、インビトロでの細胞取り込みを改善するための生物学的アプローチは、リポソームおよびウイルスベクター（例えば、再構成されたウイスルおよび偽ビリオン）のようなビヒクルの使用を含んでいた。体内分布を改善するための方法は、カチオン性脂質のような薬剤に焦点を当てていた。このカチオン性脂質は、大部分の細胞の負に荷電した表面への正に荷電した脂質の引力に起因して、薬物の細胞取り込みを増大させると想定される。
【０００６】
カチオン性リポソームは、カテーテルにより投与される場合、インビボでの脈管細胞中への遺伝子の移入を増強することが報告されている（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５（６）：１０３９〜４９、１９９４）。カチオン性脂質ＤＮＡ複合体もまた、気管投与後マウスの肺への効果的な遺伝子移入をもたらすことが報告されている。アシアログリコプロテインポリ（Ｌ）−リジン複合体は、センダイウイルスコートタンパク質を含有するリポソームとの複合体化と同様に限定された成功を経験した。毒性および体内分布は、重要な問題のままである。
【０００７】
前述より、生物製剤、特にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの送達のためにより有効な標的化薬物送達系は、これらの薬物がそれらの完全な能力を達成するために必要とされることが理解され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、生物学的薬剤を特定の組織部位へ送達するための方法を提供する。この方法は、（ａ）タンパク質でカプセル化され、不溶性ガスを含有する複数の微小泡（ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ）の水性懸濁液を形成する工程であって、ここで、この生物学的薬剤が、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のＮ2分圧よりも低いこの微小泡内のＮ2分圧を生じる条件下で、そのタンパク質と結合体化される、工程；および（ｂ）この懸濁液を動物に投与し、その結果このタンパク質が、タンパク質のバイオプロセシングの部位へとこの微小泡結合体化剤を指向し、そしてこの微小泡の消散の際、この生物学的薬剤を放出する工程、を包含する。好ましくは、この微小泡は、Ｎ2枯渇環境、およびより好ましくはＮ2を含まない環境（例えば、酸素）で形成される。
【０００９】
好ましい実施態様において、微小泡をカプセルするタンパク質は、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼからなる群より選択され、アルブミンが特に好ましい。不溶性ガスは、好ましくはペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、またはペルフルオロペンタン）であり、ペルフルオロプロパンおよびペルフルオロブタンが特に好ましい。組織部位は、例えば、動物の肝臓または腎臓であり得る。
【００１０】
タンパク質と結合体化される好ましい生物学的薬剤としては、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、およびリボザイム、ならびにナプロキセン、ピロキシカム、ワルファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソン、およびミコナゾールが挙げられる。選択された実施態様において、生物学的薬剤は、ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチジーンオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、ベクター、ウイルスベクターまたはプラスミドである。好ましいポリヌクレオチドのクラスは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。
【００１１】
本発明はまた、生物学的薬剤を特定の組織部位に送達するための関連方法を提供し、この方法は、（ａ）タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、ここで、この生物学的薬剤がそのタンパク質に結合体化される、工程；（ｂ）この懸濁液を動物に投与する工程；および（ｃ）その組織部位を超音波に曝露する工程、を包含する。好ましくは、微小泡は、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のＮ2分圧よりも低いこの微小泡内のＮ2分圧を生じる条件下で形成される。従って、この微小泡は、好ましくは、Ｎ2枯渇環境において形成され、そしてより好ましくはＮ2を含まない環境、例えば、酸素中で形成される。
【００１２】
任意のこれらの方法の実践において、微小泡の懸濁液は、好ましくは以下の工程を実行することにより形成される：（ａ）５重量％〜５０重量％、好ましくは約５重量％のデキストロースを含むデキストロース水溶液を用いて、約２重量％〜約１０重量％、好ましくは約５重量％のヒト血清アルブミンを含むアルブミン水溶液を、約２倍〜約８倍、好ましくは約３倍に希釈する工程；（ｂ）この溶液を不溶性ガスで攪拌する工程；および（ｃ）好ましくはＮ2枯渇環境において、この溶液を超音波処理ホーン（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｈｏｒｎ）に曝露し、溶液中で微粒子部位に空洞を作製し、それによって直径約０．１〜１０ミクロンの安定した微小泡を生成する工程。好ましくは、工程（ｂ）のＮ2枯渇環境とは、Ｎ2を含まない環境（例えば、酸素）であり、これは超音波処理ホーン（ｓｏｎｉｃａｔｉｎｇ  ｈｏｒｎ）とこの溶液との間の界面に吹き込まれる。
【００１３】
別の局面において、本発明は、超音波画像化に有用な微小泡組成物を提供し、この組成物は、タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を含み、ここで、その微小泡中のＮ2分圧は、空気中で超音波処理された微小泡のＮ2分圧より低い。関連した局面において、本発明は、生物学的薬剤の標的部位への送達に有用な組成物を提供する。この組成物は、このタンパク質に結合体化された生物学的薬剤を有するような微小泡の水性懸濁液を含む。好ましくは、この微小泡は、Ｎ2なしである。この微小泡の好ましいサイズは、直径０．１〜１０ミクロンである。
【００１４】
これらの組成物において、タンパク質は、好ましくは、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼから選択され、アルブミンが特に好ましい。不溶性ガスは、好ましくはペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタン）であり、ペルフルオロブタンおよびペルフルオロプロパンが特に好ましい。微小泡をカプセル化するタンパク質への結合体化に適切な生物学的薬剤としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびリボザイム、ならびにナプロキセン、ピロキシカム、ワルファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソン、およびミコナゾールが挙げられる。オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
【００１５】
本発明はまた、特に、血管の外傷を受けた動物において頸動脈狭窄形成を防ぐ方法を提供する。この方法は、（ａ）アルブミンでカプセル化された、不溶性ガスを含有する微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、ここで、この微小泡を満たしているガスが、Ｎ2枯渇もしくは、好ましくはＮ2なしであり、そしてこのアルブミンが、平滑筋の増殖を媒介する調節酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸生物学的薬剤に結合体化されている、工程、および（ｂ）この懸濁液を動物に投与する工程、を包含する。好ましい方法としては、（ｃ）外傷部位を超音波に曝露し、生物学的薬剤の放出を促進する工程をさらに包含する。この阻害される遺伝子は、好ましくはｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂである。
【００１６】
上記のように、これらの組成物および方法を用いて、生物学的薬剤の有効な投薬量を有意に減少させ得、治療指標を増大させ、そして生物学的利用能を改善させる。用量におけるこの減少は、同様に薬物の細胞傷害性および副作用を減少させ得る。さらに、本発明は、他の血漿結合薬物（例えば、ヘパリン、ジルチアゼム、リドカイン、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）、シクロスポリン、および血液プール活性化を必要とする化学療法剤）の有効性を増強し得る。例えば、ヘパリンの抗凝固特性は、その薬物を、オロソムコイド標識ペルフルオロカーボンに曝露されて超音波処理されたデキストロース／アルブミンと最初に組合わせ、次いでその組合わせを静脈内に投与することによって、劇的に増強され得ることが本明細書中で示される。
【００１７】
結合体は、水性懸濁液として非経口投与のために設計される。投与後、そして目的の部位で注入されたボーラスの到着と一致するように時間を合わせた後、エネルギーが、音波の形態で投与され得、微小泡の空洞の生成をもたらし得；次いで、薬剤は、放出されそして目的の器官または他の部位へ送達される。アルブミンでカプセル化された微小泡または他のタンパク質でカプセル化された微小泡と生物製剤との結合体化は、生物製剤の特定の組織（タンパク質と伝統的に相互作用する組織を含む）への標的化送達を可能にし得る。
【００１８】
改良されたガス充填微小泡は、Ｎ2枯渇環境またはＮ2を含まない環境の存在下で微小泡を形成することによって達成される。そのような環境は、より小さいが、静脈血および動脈血中でより安定である微小泡を生成する。これらのより小さい微小泡は、心筋においてより大きな診断用超音波のコントラストを生じ、そして治療実施態様において、より大きな効力を有した状態で、薬物をこれらの領域に運び得る。
【００１９】
本発明は、診断超音波画像化において伝統的に使用される薬剤および方法を使用し、そして同様に治療剤の送達のためにその標的部位で治療剤の可視化のための手段を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
生物学的薬剤を特定の組織部位に送達するための方法であって、以下：
（ａ）タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、該生物学的薬剤が、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のＮ2分圧よりも低い該微小泡内のＮ2分圧を生じる条件下で、該タンパク質に結合体化される、工程；ならびに、
（ｂ）該懸濁液を動物に投与し、その結果該タンパク質が、該微小泡が結合体化した薬剤を該タンパク質のバイオプロセシング部位に指向させ、そして該微小泡の消散の際に該薬剤を放出する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記微小泡がＮ2枯渇環境で形成される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記微小泡がＮ2を含まない環境で形成される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記環境が酸素からなる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記タンパク質が、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記タンパク質がアルブミンである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記不溶性ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記組織部位が前記動物の肝臓または腎臓である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記生物学的薬剤が、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボザイム、ナプロキセン、ピロキシカム、ワルファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソンおよびミコナゾールからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記生物学的薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチジーンオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、ベクター、ウイルスベクター、およびプラスミドからなる群より選択されるポリヌクレオチドである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
生物学的薬剤を特定の組織部位へ送達するための方法であって、以下：
（ａ）タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、該生物学的薬剤が、該タンパク質に結合体化される、工程；
（ｂ）該懸濁液を動物に投与する工程、および
（ｃ）該組織部位を超音波に曝露する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
前記微小泡が、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のＮ2分圧よりも低い該微小泡内のＮ2分圧を生じる条件下で形成される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記微小泡がＮ2枯渇環境で形成される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記微小泡がＮ2を含まない環境で形成される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記微小泡が以下：
（ａ）５重量％〜５０重量％のデキストロースを含むデキストロース水溶液を用いて、約２重量％〜約１０重量％のヒト血清アルブミンを含むアルブミン水溶液を、約２倍〜約８倍に希釈する工程；
（ｂ）該溶液を前記不溶性ガスで攪拌する工程；および
（ｃ）Ｎ2枯渇環境において、該溶液を超音波処理ホーンに曝露し、該溶液中で微粒子部位に空洞を作製し、それによって直径約０．１〜１０ミクロンの安定した微小泡を生成する工程、
によって形成される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
工程（ｂ）における前記Ｎ2枯渇環境がＮ2を含まない、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記環境が酸素からなる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記酸素が、前記超音波処理ホーンと前記溶液との間の界面に吹き込まれる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
超音波画像化に有用な微小泡組成物であって、タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する微小泡の水性懸濁液を含み、該微小泡内のＮ2分圧が、空気中で超音波処理された微小泡内のＮ2分圧よりも低い、微小泡組成物。
（項目２０）
生物学的薬剤の標的部位への送達に有用な組成物であって、タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する微小泡と、該タンパク質に結合体化された生物学的薬剤とを含む水性懸濁液を含み、該微小泡内のＮ2分圧が、空気中で超音波処理された微小泡内のＮ2分圧よりも低い、組成物。
（項目２１）
前記微小泡が実質的にＮ2を含まない、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記タンパク質が、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼからなる群より選択される、項目２０に記載の組成物。
（項目２３）
前記タンパク質がアルブミンである、項目２０に記載の組成物。
（項目２４）
前記ガスがペルフルオロカーボンである、項目２０に記載の組成物。
（項目２５）
前記ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンからなる群より選択される、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記生物学的薬剤が、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボザイム、ナプロキセン、ピロキシカム、ワルファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソンおよびミコナゾールからなる群より選択される、項目２０に記載の組成物。
（項目２７）
前記生物学的薬剤がオリゴヌクレオチドである、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記微小泡が直径0.1〜10ミクロンである、項目２０に記載の組成物。
（項目２９）
血管の外傷を受けた動物における頸動脈狭窄形成を防ぐための方法であって、該方法は：
アルブミンでカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、ここで該微小泡を満たすガスがＮ2枯渇状態であり、該微小泡が、平滑筋の増殖を媒介する調節酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドに結合体化される、工程；
該懸濁液を該動物に投与する工程；および
該外傷部位を超音波に曝露する工程
を包含する、方法。
（項目３０）
前記微小泡が実質的にＮ2を含まない、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記遺伝子がｃ−ｍｙｃである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子がｃ−ｍｙｂである、項目２９に記載の方法。
これらおよび他の本発明の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読むと、より完全に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＥＳＤＡ（ペルフルオロカーボンに曝露された超音波処理したデキストロース／アルブミン）微小泡についてのＰＳ−ＯＤＮとの結合データのラインウィーバー−バークプロットである。微小泡への結合についての平衡解離定数Ｋm（二連で行った７つの濃度について算出した；実施例５を参照のこと）は、１．７６×１０-5Ｍであった。配列５’ｄ（ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＴ）−３’；配列番号１を有する１５マーのＰＳ−ＯＤＮの、溶液中のヒト血清アルブミンとの結合について報告されたこの値は、ほとんど３．７〜４．８×１０-5Ｍの範囲内である（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｓ．Ｋ．ら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ，Ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｂｕｍｉｎ」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．５：１３１、１９９５）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．超音波の治療用途）
超音波画像化は、治療手順を補助するための診断ツールとして長く使用されている。これは、音波エネルギーが目的の領域に集束され得、そして反射して画像が生じるという原理に基づく。一般的に、超音波変換器は、画像化される領域の上に横たわる身体の表面上に配置され、そして音波を発生および受容することにより生じる超音波エネルギーが伝達される。超音波エネルギーは、変換器に対して後方へ反射され、ここで超音波エネルギーは超音波画像へと翻訳される。反射されたエネルギーの量および特徴は、組織の音響特性に依存する。好ましくは、エコー源性である造影剤を使用して、目的の領域における超音波エネルギーを生じ、そして受容される画像化を改善する。超音波造影心臓図検査計測器の考察については、ＤｅＪｏｎｇ、「Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ」、Ｃｉｐ−Ｇｅｇｅｖｅｎｓ  Ｋｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ  Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｅｋ、Ｄｅｎｈａｇ（１９９３）、１２０頁（以下参照）を参照のこと。
【００２２】
超音波造影心臓図検査を用いて心臓内の構造の描写、弁の完全性の評価、および心臓内吻合の実証が行われている。心筋超音波造影心臓図検査（ＭＣＥ）を使用して、ヒトにおける冠状動脈の血流予備力を測定している。ＭＣＥは、心筋灌流における相対変化の評価および危険性のある領域の描写に安全でかつ有用な技術であることが見出されている。
【００２３】
超音波振動はまた、種々の薬物の吸収を増大させるために、医療分野において治療レベルで使用されている。例えば、日本国特許公開第５２−１１５５９１号には、薬物の経皮吸収が超音波振動により増強されることが開示されている。米国特許第４，９５３，５４５号および同第５，００７，４３８号はまた、超音波振動の補助による薬物の経皮吸収の技術を開示する。米国特許第５，３１５，９９８号は、薬物の拡散および浸透を可能にするための、超音波エネルギーと組合わせて微小泡を含む薬物治療のためのブースターを開示する。この参考文献は、本発明の特定の実施態様とは対象的に、２０分間までの超音波の治療レベルの使用を開示する。本発明の特定の実施態様は、よりずっと短い時間で曝露する、診断レベルの超音波を使用して、結合体化された生物活性剤の放出を促進する。
【００２４】
本発明に従って、伝統的な診断用超音波治療の造影剤を使用して治療剤を特異的に指定された目的の部位に結合させ、次いでこの治療剤を特異的に指定された目的の部位に放出させ、それによって薬物の分布を変更し得る。この目的は、造影剤を単独で用いて、および任意の診断用超音波の使用なしで達成され得る。そのような造影剤が伝統的な診断超音波治療（例えば、０．１〜３．５ＭＰａの範囲のピーク陰圧、および１．０〜４０ＭＨｚの範囲の送信周波数を含む）と組み合わされて用いられ、目的の部位にて治療剤の放出を促進し得ることもまた本明細書中で実証される。この方法の好ましい実施態様において、低周波数の超音波、すなわち１ＭＨｚ未満の周波数、最も好ましくは約１０ｋＨｚ〜約４０ｋＨｚの周波数が使用される。
【００２５】
（ＩＩ．治療用組成物）
本発明の薬学的組成物は、血液不溶性ガスを含み、好ましくは０．１〜１０ミクロンの直径を有する微小泡の液体懸濁物、好ましくは水性懸濁物を含む。この微小泡は、そのようなガスの微小泡を液体へ包括することによって形成される。この微小泡は、フッ化炭素または六フッ化硫黄ガスのような様々な血液不溶性ガスを含み得る。一般には、体温で非毒性でありかつガス状である任意の不溶性ガスが使用され得る。このガスはまた、この薬学的組成物が、微小泡を形成するように超音波処理される場合、約０．１ミクロンと１０ミクロンとの間の平均サイズの直径を有する、安定な微小泡を形成しなければならない。この範囲の平均直径を有する微小泡は、経肺通過に適切であり、そして静脈内注射後および標的部位への移行の間に、微小泡内でガスの有意な拡散を防止するに十分安定である。
【００２６】
不溶性ガスもまた、窒素または酸素よりも低い拡散係数および血液可溶性を有さなければならず、これは、血管の内部圧で拡散する。有用なガスの例は、フッ化炭素ガスおよび六フッ化硫黄である。一般に、過フッ化炭素ガス（例えば、過フッ化メタン、過フッ化エタン、過フッ化プロパン、過フッ化ブタン、および過フッ化ペンタン）が好ましい。これらのガスの過フッ化プロパンおよび過フッ化ブタンは、ヒトにおける眼内注射のための安全性が実証されているので、特に好ましい（例えば、ＷｏｎｇおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ９５：６０９−６１３を参照のこと）。
【００２７】
ガス状の微小泡は、被膜原性（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ）タンパク質コーティングによって安定化される。適切なタンパク質としては、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼのような天然に存在するタンパク質が挙げられる。本発明は、好ましくは、天然に存在するタンパク質を使用するが、合成タンパク質もまた使用され得る。特に好ましいのは、ヒト血清アルブミンである。このタンパク質は、体内で容易に代謝され、そして造影剤として幅広く使用されている。
【００２８】
薬学的に受容可能な糖類（例えば、デキストロース）の混合物を含む水溶液を、先に記載されたタンパク質と組み合わせて使用することが好ましい。本発明の使用に適した他の糖類の例は、単糖類（式Ｃ6Ｈ12Ｏ6を有するもの（例えば、ヘキソース糖、デキストロース、フルクトース、またはそれらの混合物））、二糖類（式Ｃ12Ｈ22Ｏ11を有するもの（例えば、スクロース、ラクトース、もしくはマルトース、またはそれらの混合物））、または多糖類（例えば、式（Ｃ6Ｈ10Ｏ5）nを有する可溶性デンプン（ここで、ｎは、２０と約２００との間の全ての数である）（例えば、アミラーゼもしくはデキストランまたはそれらの混合物））である。しかし、糖類は、本発明の結果を達成するために必須ではない。
【００２９】
本発明の治療用薬剤は、宿主への末梢投与のために薬学的に有効な投薬量形態で、必要に応じて、超音波治療と組み合わせて処方される。一般に、このような宿主ｓはヒト宿主であるが、他の哺乳動物宿主（例えば、イヌまたはウマ）もまた、この治療に供され得る。
【００３０】
（ＩＩＩ．微小泡組成物の調製）
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、市販のアルブミン（ヒト）、Ｕ．Ｓ．Ｐ．溶液（一般に、５重量％または２０重量％の滅菌水溶液として供給される）、および市販のデキストロース（静脈内投与のためのＵ．Ｓ．Ｐ．）の混合物から処方される。最も好ましい実施態様において、この混合物は、ヒト血清アルブミンの２重量％〜１０重量％の溶液の２倍から８倍の希釈物を、デキストロースの５重量％〜５０重量％溶液とともに含む。
【００３１】
微小泡は、代表的には、超音波処理ホーンを用いて、室温および大気圧にて超音波処理することによって形成される。このような超音波処理は、流体中の粒子状物質またはガスの部位で、デキストロース／アルブミン溶液中に空洞化を引き起こす。これらの空洞化部位は、最終的に共鳴し、そして崩壊しておらずかつ安定な小さな微小泡を生成する。超音波処置の間、この溶液は、不溶性ガス、好ましくは過フッ化炭素ガスで、約８０秒間灌流される。一般的には、約４×１０8Ｍより大きな濃度の約０．１〜１０μｍの間の微小泡および好ましくは、５〜６μｍの直径を生成する超音波処理条件が好ましい。得られた微小泡は、室温にて、少なくとも約１２０±５分間濃縮され、ここで過剰な溶液は、超音波用シリンジ（ｓｏｎｉｃａｔｉｎｇ  ｓｙｒｉｎｇｅ）に納まる。
【００３２】
調製の代替法において、実施例２に記載されるように、１５±２ｍｌの超音波処理したデキストロース／アルブミンは、超音波処理の前に８±２ｍｌの過フッ化炭素ガスとともに手で攪拌される。次いで、超音波処理を、８０±５秒間進行させる。
【００３３】
調製の第３の方法（多くの血漿結合薬物についての微小泡の親和性を改善するように設計された）は、超音波処理の前の、５〜３０ｍｇのオロソムコイド（α−酸糖タンパク質）のアルブミン／デキストロース溶液への添加を含む。
【００３４】
本発明に従って、微小泡は、好ましくは、Ｎ2枯渇、好ましくはＮ2を含まない環境で、代表的にはＮ2枯渇（空気に対する比較において）またはＮ2なしのガスを超音波処理ホーンと溶液との間の境界へと誘導することによって形成される。以下にさらに議論されるように、この方法で形成される微小泡は、空気中で形成される微小泡より有意に小さい。これらのより小さい微小泡はより安定であり、そして治療薬および診断薬の送達の改善をもたらす。
【００３５】
次いで、微小泡は、生物学的に活性な薬剤とともにインキュベートされ、その結果、その医薬は、タンパク質にコートされた微小泡と結合体化する（代表的には、非共有結合により）。オリゴヌクレオチドのアルブミンにコートされた微小泡への結合研究は、実施例４〜７に記載される。これらの研究は、例えば、その結合が飽和可能であり、従って、非特異的相互作用が制限されることを示した（実施例６）。実施例７において、微小泡の形態のフィルム原性タンパク質（造影剤において従来的に使用されるような）は、微小泡が不溶性ガスで満たされる場合、化合物を結合するそれらの能力を保持することが実証される。この発見は、このような微小泡造影剤において、タンパク質球が変成したタンパク質から構成されるという先の報告とは反対である。例えば、米国特許第４，５７２，２０３号、米国特許第４，７１８，４３３号、および米国特許第４，７７４，９５８号を参照のこと。本明細書中で実証されるように、空気よりもむしろ不溶性ガス（例えば、過フッ化炭素）が微小泡のために使用される場合、タンパク質はその結合活性を保持する。この効果は、おそらく、超音波処理エネルギーのほとんどが不溶性ガスによって吸収されるという事実に起因する。従って、タンパク質（例えば、アルブミン）は、生物学的に活性な医薬に結合して、微小泡／薬剤結合体を形成し得る。一方、空気を満たした微小泡は、おそらく、あまりそれらの結合能力を保持しない。
【００３６】
（ＩＶ．治療用薬剤）
本発明に有用な治療用薬剤は、フィルム原性タンパク質と結合するそれらの能力を介して選択され、そして逆もまた同様である。例えば、このフィルム原性タンパク質がアルブミンである場合、この治療薬は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリボザイムを含み得、これらの全てはアルブミンに結合し得、そしてそれ自体、微小泡との結合体を形成し得る。部位１（これは、本発明の組成物および方法においてインタクトなままであることが確認されている）でアルブミンに結合に結合する薬物の一覧表は、以下の通りである：
【００３７】
【化１】
2010095541.tif 000002
オロソムコイドがデキストロース／アルブミンに添加されるならば、増強され得る薬物の列挙としてはまた、以下が挙げられる：エリスロマイシン（抗生物質）、リドカイン（抗不整脈薬）、メペリジン（鎮痛薬）、メサドン（鎮痛薬）、ベラパミルおよびジルチアゼム（抗狭心症薬）、シクロスポリン（免疫抑制剤）、プロパノール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）（抗高血圧薬および抗狭心症薬）、ならびにキニジン（抗不整脈薬）。
【００３８】
アルブミンと、特に部位１で結合する他の薬物もまた、この実施態様において有用であり、そして薬物相互作用および当該分野で標準的な薬学の教科書（例えば、「Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ＡＨＦＳ  １９９９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ）または「Ｄｒｕｇ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ」（Ｂｅｒｎｅｙ  Ｏｌｉｎによって出版され、そして４年ごとに改訂される））を通じて当業者によって確認され得る。適切なタンパク質−生物学的薬剤の組み合わせを決定するためのアッセイが、それらの中に開示され、そして本発明の方法を用いて研究するその能力のついての任意の組み合わせを試験するために使用され得る。
【００３９】
以下に実証されるように、本発明は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド治療について特に関連する。なぜなら、有効なアンチセンス、抗遺伝子、プローブ診断薬またはウイルスもしくはプラスミドヌクレオチド送達を使用する遺伝子療法に対する一次障害物は、治療薬の治療効果を達成するに十分な高濃度で標的部位に到達する能力であるからである。本発明は、遺伝子療法ベクター、診断用ヌクレオチドプローブの形態でヌクレオチド配列の送達に特に有用であるか、あるいはアンチセンスまたは抗遺伝子型のストラテジーでヌクレオチド配列を送達して、最終的に標的細胞における遺伝子発現を変更するかまたは検出するために特に有用である。
【００４０】
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖部分、ヌクレオシド間リン酸結合、またはこれらの部位での改変の組み合わせの１つ以上の改変を含み得る。このヌクレオシド間リン酸結合は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、または（混合骨格で改変されたオリゴヌクレオチドを生成するための）このような類似の結合の組み合わせであり得る。他のオリゴヌクレオチドアナログとしては、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アリルまたは２’−Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチド、およびＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートが挙げられる。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
オリゴヌクレオチド合成のための任意の公知の方法は、オリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。これらは、任意の市販の自動化核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用して、ホスホルアミデート化学を使用して、製造業者のプロトコルに従って、最も都合良く調製される。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＳｔｅｋおよびＺｏｎ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３２６：２６３−２８０）に記載される方法に従って、そして、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｍｏｄｅｌｓ  ３８０Ａ−３８０Ｂ−３８１Ａ−３９１−ＥＰ（１９８９年１２月）において合成されそして精製され得る。ＯＤＮは、当業者に公知の方法によって細胞に導入される。例えば、Ｉｖｅｒｓｅｎ，１９９１，「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｌｏｇｕｅ」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５３１−８を参照のこと。
【００４２】
（Ｖ．送達方法）
本発明の送達療法を実施するための好ましい方法において、本発明の薬学的液体薬剤は、静脈内注射、静脈内的（ｉ．ｖ．注入）、経皮的、または筋肉内的に、好ましくはこの薬剤の活性の標的部位付近で、哺乳動物宿主に導入される。治療部位は、特定の腫瘍の位置、特定の感染の位置、差次的な遺伝子活性化に起因して特定の遺伝子産物を発現する器官、損傷または血栓の部位、治療薬のさらなる進行および分布のための部位のような部位を含み得る。
【００４３】
（Ａ．超音波なし）
本発明の実施態様に従って、タンパク質（例えば、アルブミン）でコートされた、不溶性（例えば、過フッ化炭素）ガスの微小泡は、オリゴヌクレオチドとの安定な結合体を形成することが示された（実施例４〜６を参照のこと）。ＯＤＮ結合体化泡は、動物に導入され、それにより、このタンパク質コーティングは、結合体化薬剤を相互作用部位に指向させ得る。最終的には、泡散逸として、この薬剤は、組織部位で放出される。本発明者らは、超音波の適用が、タンパク質コーティングのバイオプロセシングの部位への生物製剤の標的化送達には必要ではないことを示した。このことは、実施例９に示され、ここでは、ＯＤＮ結合体化微小泡は、肝臓および腎臓に指向され、そしてヘキソバルビタールの代謝を変更するに有効であった。このタンパク質は、微小泡および結合体を、プロセシング部位に通過させ、そして泡散逸として、オリゴヌクレオチドまたは他の生物製剤が放出されてその部位で相互作用し、生物学的薬剤の画分が、従来の投与と比較して、同じ生物学的効果を達成することを可能にする。
【００４４】
一般に、標的部位は、フィルム原性タンパク質のバイオプロセシングに基づいて選択される。例えば、腎臓および肝臓は、アルブミンを取り込み、そしてアルブミン微小泡は、結合体化生体活性薬剤のこれらの領域への投与を特異的に指向させるために使用され得る。この生体分布は、上記のように、実施例９で実証される。他のフィルム原性タンパク質の代謝およびバイオプロセシングは、標準的な薬理学の教科書（例えば、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、第７版、Ｂｅｒｔｒａｍ  Ｇ．Ｋａｔｚｕｎｇ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，１９９７）に記載される。
【００４５】
（Ｂ．超音波あり）
本発明の１つの実施態様において、診断用超音波フィールドは、注射されたボーラスが標的部位に到達するときに導入される。実施例８に実証されるように、ＰＳ−ＯＤＮ標識した過フッ化炭素含有微小泡の診断用超音波への曝露は、ＰＳ−ＯＤＮの強度を変更しないが、そのアルブミン結合からはＯＤＮを放出する。
【００４６】
超音波の適用は、様々な方法によって達成され得る。例えば、超音波変換器は、標的部位の上に直接配置され得る。従来の超音波デバイスは、２０ｋＨｚから数Ｍｈｚの超音波シグナルを供給し得る。このシグナルは、一般的に、診断用超音波のために約３〜約５ＭＨｚ、および治療用超音波のために１ＭＨｚ未満、好ましくは約２０ｋＨｚのレベルで適用される。超音波によって供給されるエネルギーは、微小泡を生じて、治療用部位で、または血液プールに薬剤を放出する。この方法はまた、ボーラスが超音波フィールドに侵入するように、可視化させる。
【００４７】
あるいは、超音波変換器は、血液プール中の部位にわたって配置され得、循環を通過するように、微小泡の一定の曝露を可能にする。この手順は、実施例１３に示されるように、特定の薬物（例えば、ヘパリン）の全身性の効果を増強する。
【００４８】
超音波増強が使用され得る配置部位の例としては、腎臓、心室（ｈｅａｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒ）、大動脈または大静脈が挙げられる。実施例１２は、標識したＯＤＮ結合体化微小泡の送達と組み合わせた、腎臓の標的化超音波処理を記載する。１つの腎臓に限定される超音波処理は、この部位で検出されるＯＤＮにおける有意な増加をもたらした。以下の節ＶＩでさらに記載されるのは、罹患した領域の超音波処理に伴うアンチセンスのｃ−ｍｙｃへの投与による、動脈再狭窄の阻害における標的化超音波処理の使用である。
【００４９】
別の実施態様において、注入物（ｉｎｊｅｃｔａｔｅ）は、標的領域に到達するまで、モニターされるかまたは時間調節され得る。対照の薬剤は単独で使用されて、投与から治療部位への伝達を時間調節する。治療薬の投与後、低周波数（２０ｋＨｚから約２ＭＨｚ）の超音波は、標的部位で、適切な時間間隔後に、適切なドップラーエコーまたは超音波エコー装置を用いて導入され、その結果、超音波のフィールドは、標的部位を包含し、そして医薬は、微小泡から放出される。この時点は、一般的に、目的の器官ならびに注射部位に従って変化する。
【００５０】
（ＶＩ．再狭窄の阻害）
（Ａ．背景）
何人かの研究者が、平滑筋細胞の移動および増殖の結果としての血管バルーン損傷後に新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）過形成が生じることを示した（Ａｕｓｔｉｎ，Ｇ．Ｅ．ら、「Ｉｎｔｉｍａｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｏｎ  Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｓｔｅｎｏｓｉｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ」、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６：３６９−７５，１９８５；Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．ら、「Ａ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ：Ａ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｃａｓｅ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８６：ＩＩＩ４７−ＩＩＩ５２，１９９２；Ｃｌｏｗｅｓ，Ａ．Ｗ．ら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｉｎｊｕｒｅｄ  Ａｒｔｅｒｙ」、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４：Ｓ１２−Ｓ１５，１９８９）。この新内膜形成は、バルーン損傷および血管内ステント挿入（ｓｔｅｎｔｉｎｇ）の両方の後の再狭窄の血管造影観察において、役割を果たす（Ｍｉｎｔｚ，Ｇ．Ｓ．ら、「Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｎｏｓｉｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ」、Ｃａｒｄｉｏｌ．−Ｃｌｉｎ．１５：１：１７−２９，１９９７）。血管平滑筋の増殖を担うプロトオンコジーンの合成を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、冠状動静脈または頸動脈の損傷後の狭窄形成を首尾良く阻害した（Ｓｈｉ，Ｙ．ら、「Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃ−Ｍｙｃ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｂａｌｌｏｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：９４４−５１，１９９４；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．ら、「Ｉｎｔｉｍａｌ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  Ａｆｔｅｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＣＤＫ２  Ｋｉｎａｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１４５８−６４，１９９４）。この時点まで、このような処置は、血管内または外膜周囲（ｐｅｒｉａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ）への直接送達を必要とした。本発明者らは、ＯＤＮ（詳細には、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂへ）が過フッ化炭素を曝露されて超音波処理されたデキストロース／アルブミン（ＰＥＳＤＡ）微小泡に結合することを実証した（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｔ．Ｒ．ら、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−Ｅｘｐｏｓｅｄ  Ｓｏｎｉｃａｔｅｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ」、Ｊ．Ｕｌ���ｒａｓｏｕｎｄ．Ｍｅｄ．１５：５７７−５８４，１９９６）。続く研究は、経皮的低周波数超音波は、音波を作り出さない（ｉｎｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）フィールド内に含まれる血管へのＯＤＮの堆積を増加させることを示した（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｔ．Ｒ．ら、「Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  Ｇａｓ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｗａｌｌ  ｉｎ  Ｐｉｇｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｐｌ．２２４９，１９９７）。実施例１４に記載される研究は、低周波数の超音波およびＰＥＳＤＡ微小泡に結合したｃ−ｍｙｃに静脈内注射されたＯＤＮに伴うこの増強された血管堆積は、頸動脈のバルーン損傷後の新内膜形成を阻害し得るか否かを決定するために行われた。
【００５１】
以前の研究における動脈損傷後の以前のＯＤＮの送達方法は、直接動脈送達または外膜周囲適用のいずれかを必要とした（Ｓｈｉら、１９９４（上記に引用）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．ら、１９９４（上記に引用）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ」、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：２３２６−３２，１９９７）。
【００５２】
（Ｂ．本研究）
実施例１４は、本明細書中に記載される経皮的超音波および静脈内微小泡送達系（ｃ−ｍｙｃプロトオンコジーンに対するアンチセンスを含む）を使用するブタにおける頸動脈新内膜形成の阻害を記載する。右頸動脈にわたる領域は、バルーン拡張直後および３日後の両方に、合計６分間、各注射の前後に音波を作り出さなかった。実施例に実証されるように、ＰＥＳＤＡ微小泡に結合した、静脈投与されたＯＤＮの超音波標的化堆積は、内膜過形成を阻害すること、ならびに管腔直径に対して有意に小さな内膜厚の比を作製することにより、狭窄形成を阻害した。
【００５３】
非侵襲性であることに加えて、超音波標的化アプローチは有利である。なぜなら、損傷後の様々な時間間隔で繰り返され得るからである。ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンスの外膜周囲適用は内側の複製を抑制したが、この抑制は、もはやラットにおける頸動脈損傷の４日後では証拠ではない（Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｍ．Ｒ．ら、１９９７（上記に引用））。本研究において、実施例１２に記載されるように、ＰＥＳＤＡに結合した第２の０．５ミリグラムの用量のＯＤＮは、損傷の３日後に静脈内投与された。減少した内膜過形成およびより大きな血管管腔の両方が、ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡ群において３０日で観察された。より大きな管腔サイズが、ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡ群における血管成長またはコントロール群における収縮に起因するか否かは未知である。なぜなら、バルーン前損傷ＩＶＵＳデータが利用可能ではなかったからである。
【００５４】
血管拡張は、バルーン損傷後の狭窄形成の程度を決定することにおける重要な因子であり、生じる内膜過形成の量よりも重要であることが示されている（Ｋａｋｕｔａ，Ｔ．ら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  Ｖｅｓｓｅｌ  Ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ，Ｎｏｔ  Ｉｎｔｉｍａｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  Ａｆｔｅｒ  Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｍｏｄｅｌ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８９：２８０９−１５、１９９４）。超音波標的化送達で処置した被験体におけるより大きな管腔面積は、ｃ−ｍｙｃに対するＯＤＮの重要な効果が、アテローム性動脈硬化症に応答する不適切な補償拡大（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）を予防することであることを示し得る。ＯＤＮが管腔拡大を生じ得る１つの方法は、培地のｃ−ｍｙｃ媒介性細胞移動を妨害することによってであり、ｃ−ｙｃに対するアンチセンスの直接適用によって阻害されたプロセスである（Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｍ．Ｒ．ら、１９９７（上記に引用）；Ｂｉｒｏ，Ｓら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡ  ｏｎ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６５４−５８，１９９３）。ＯＤＮが血管サイズを変更し得る別の機構は、エンドセリン−１の産生（強力な血管収縮薬およびマイトジェン物質）を刺激するｃ−ｍｙｃの能力を阻害することによる（Ｓｈｉｃｈｉｒｉ．Ｍ．ら、「Ｂｉｐｈａｓｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  Ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｃ−ｍｙｃ」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３８（１１）：４５８４−９０、１９９７）。
【００５５】
この研究は、超音波の存在下で、ＰＥＳＤＡ微小泡に結合したＯＤＮの増強した取り込みが、頸動脈バルーン損傷後の狭窄形成に対する重要な効果を有することを確認し、そして送達系としての超音波および微小泡の生理学的な有効性を実証する。
【００５６】
超音波は、オリゴヌクレオチドがカチオン性リポソームのようなほかのキャリア系に対して送達される場合に、培養したＨｅＬａ細胞における遺伝子発現を増強することが示されている（Ｕｎｇｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、「Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ
Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．３２：７２３−２７、１９９７）。超音波の存在下でのこの増強された細胞取り込みの機構は、細胞膜の空洞化誘導性二重層障害であると仮定されている（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．ら、「Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｏｗ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：４１１−２０、１９９６）。それゆえ、微小泡は、この空洞化の閾値をより低くするその能力のために、他のキャリア系を超える固有の利点を有し得る（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｃ．Ｋ．ら、「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」、Ｊ．Ａｃｏｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．８８：２０５９−６９，１９９０）。空洞化がＯＤＮの増強された取り込みのための機構である場合、微小泡の存在およびこの研究で使用されるより低周波数の超音波（２０ｋＨｚ）の両方は、改善された取り込みを有し得る。
【００５７】
結論として、静脈内ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡおよび経皮的低周波数超音波は、バルーン損傷後の血管壁に対するアンチセンスの直接適用と類似の様式において頸動脈狭窄形成を阻害することが示されている。これらのデータは、超音波およびＯＤＮを含む微小泡送達系が、バルーン血管形成術または血管内ステント挿入後の狭窄形成を阻害するための強力な非侵襲性方法であり得ることを実証する。
【００５８】
（ＶＩＩ．Ｎ2枯渇環境における微小泡調製の利点）
アルブミン殻を含む微小泡は、それらの膜を通過する可溶性ガスの迅速な拡散を可能にする。過フッ化炭素含有微小泡は、より高分子量のガスの拡散の低速度および血中におけるその不溶性に起因して、同じ膜を有する空気含有微小泡よりも長く残存する。
【００５９】
しかし、過フッ化炭素含有微小泡はなお、空気中での超音波処理によって調製される（すなわち、超音波処理環境のいずれの改変も伴わない）場合、空気ガスの有意な量を含み得る。この意味において、「不溶性ガス含有」とは、本明細書中で使用される場合、血液不溶性ガス（例えば、過フッ化炭素）とともに攪拌することによって形成される微小泡をいうが、超音波処理の間に存在する他のガスを含むこともまた意図される。従って、空気で超音波処理された微小泡は、アルブミン膜を通過して存在する濃度勾配によって影響され得る。
【００６０】
数学的モデルは、不溶性のガスを含む微小泡が、組織および血液が窒素を含有する場合により長く持続することを示唆した（Ｂｕｒｋａｒｄ，Ｍ．Ｅ．ら、「Ｏｘｙｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｔｏ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｂｙ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｂｕｂｂｌｅｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８７４−８，１９９４）。血中窒素の非存在下では（すなわち、酸素化された血液）、ＰＣＭＢ中からの窒素は、ＰＣＭＢから拡散し、それらのサイズを減少させることが予測される。
【００６１】
従って、実施例１０に示されるように、１００％酸素化された動脈血に曝されたＰＣＭＢは、空気血に曝されたＰＣＭＢよりもサイズが有意に小さかった（表４、実施例１０を参照のこと）。このインビトロの研究は、窒素が微小泡から酸素化された血液に拡散した場合に、酸素化血液が、正常な血液と比較して過フルオロカーボン含有ＭＢのサイズを減少させたことを確証する。しかし、酸素化された血液は、純粋な空気を含有するアルブミン微小泡を用いて示されたように、微小泡からの可溶性ガスの迅速な拡散に起因して、過フルオロカーボン含有微小泡を完全には破壊しなかった（Ｗｉｂｌｅ  Ｊ．Ｊｒ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｐｉｒｅｄ  Ｇａｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｌｂｕｎｅｘ（登録商標）  ｉｎ  Ｄｏｇｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８（補遺）：１−４０１（１９９３））。
【００６２】
表面張力および吸収圧力は、微小泡の直径が減少するにつれて増加するので、静脈内のＰＣＭＢによって産生される画像強度はまた、微小泡の内側および外側の窒素および酸素濃度における変化によって影響を受けることが仮定された。微小泡酸素含量を増大することによって（従って、微小泡中のＮ2の分圧を下げることによって）、血液中の微小泡の残存が延長され得ることが仮定された。これは、Ｎ2枯渇環境またはＮ2を含まない環境において微小泡を形成することによって達成される。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ2枯渇」または「窒素枯渇」とは、空気のＮ2含量よりも少ないＮ2含量をいい。その結果、このような環境の存在下における超音波処理によって形成されたガスで満ちた微小泡中のＮ2の分圧は、空気の存在下での超音波処理によって達成されたＮ2の分圧よりも低い。（空気は、代表的には、重量で約７５．５％、体積で約７８％の窒素を含む）。代表的には、Ｎ2枯渇環境は、空気の酸素含量よりも高い酸素含量を有する。Ｎ2枯渇環境は、それが実質的にＮ2を含まない場合（例えば、商業的に供給される純粋な酸素）に、「Ｎ2を含まない」。
【００６４】
従って、微小泡は、代表的には、Ｎ2枯渇ガスまたはＮ2を含まないガス（例えば、酸素）を、超音波処理ホーンと溶液との間の界面に吹き付けることによって、Ｎ2枯渇環境またはＮ2を含まない環境において超音波処理される。この場合において、「不溶性ガス含有」微小泡は、不溶性ガス（例えば、過フルオロカーボン）を含有し、そしてＮ2枯渇ガスまたはＮ2を含まないガスのいくらかの量を含有することが予測される。（いくらかの少量の空気が、これらの条件下でさえ微小泡に入り得るが、微小泡に含まれるガスは、実質的にＮ2を含まないと見なされる。）
この改変は、実質的により小さな微小泡を作ることが見出された。この微小泡は、血流中でより安定であり、コントラストおよび薬物送達の改善を生じた。このような効果は、実施例１１において記載される非開胸研究において一貫して観察され、空気の存在下で超音波処理されたＰＣＭＢよりもより大きな心筋のコントラストを生じた。１００ミリ秒までの短いパルス間隔を使用する間欠性の画像化（１０ヘルツ画像化）を用いてでさえ、視覚的に明白な心筋のコントラストは、Ｎ2を含まない環境中で超音波処理した微小泡を用いてもなお達成された。
【００６５】
本発明は、標的化された送達系として、薬学的組成物中のこのような造影剤の使用および超音波の適用を包含する。造影剤の製造におけるＮ2枯渇環境またはＮ2を含まない環境の使用はまた、心筋の画像化における造影剤の効果の改善である。
【実施例】
【００６６】
（実施例）
以下の実施例は、例示目的のみのためであって、いかなる場合においても本発明を限定することを意図しない。多数の他のタンパク質生物活性薬剤の組合せが本発明において使用され得、そして本明細書中で意図されることが当業者によって理解される。例えば、フィルモーゲンタンパク質（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、α１酸  糖タンパク質である場合、生物活性薬剤は、リドカイン、インデラル、またはヘパリンであり得る。
【００６７】
以下のすべての実施例において、すべての部および割合は、別に特定されない限りは重量によるものであり、そしてすべての希釈は容積によるものである。
【００６８】
（実施例１．ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド合成）
鎖伸長合成を、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ３９１  ＤＮＡシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の１μｍｏｌカラム支持体上で実行するか、または、これは、Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）によって提供された。１μｍｏｌ合成は、ＡＢＩユーザーブレティン５８により、シアノエチルホスホルアミダイトおよび二硫化テトラエチルチウラムを用いるイオウ処理を使用した。放射性標識されたオリゴヌクレオチドを、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）による亜リン酸水素原料として合成した。
【００６９】
（実施例２．微小泡懸濁物の調製）
５％ヒト血清アルブミンおよび５％デキストロースを、商業的な供給源より入手した。５％デキストロース溶液の３部および５％ヒト血清アルブミン溶液の１部（総計１６ｍｌ）を、３５ｍｌ  Ｍｏｎｏｊｅｔ（登録商標）シリンジに引き上げた。各々のデキストロース／アルブミンサンプルを、デカフルオロブタンまたは空気のいずれかの８±２ｍｌで、手で攪拌し、次いで、そのサンプルを２０キロヘルツでの８０±５秒間の電気機械的超音波処理に曝した。この様式によって作製された４つの連続した、過フルオロカーボンに曝され超音波処理したデキストロース／アルブミン（ＰＥＳＤＡ）微小泡のサンプルの平均サイズは、血球計数によって測定されるように、４．６±０．４ミクロンであった。そして平均濃度は、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器によって測定されるように、１．４×１０9泡／ｍＬであった。
【００７０】
（実施例３．微小泡／ＯＤＮ結合体の調製）
配列５’−ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＧＧＣ３’（ｃ−ｍｙｂに相補的な２４ｍｅｒ）（配列番号２）および５’ＴＴＡＧＧＧ（配列番号３）を有する、均一に35Ｓ標識されたＰＳ−ＯＤＮ（ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）を、過フルオロカーボンに曝された、超音波処理したデキストロース／アルブミン（ＰＥＳＤＡ）微小泡サンプル溶液と、０．５ｍｌの最終容量中で、３７℃で３０分間インキュベートした。その溶液を、微小泡が上端に生じ得るように立てた；次いで、サンプルを、底の清澄な溶液または微小泡を含む上端層のいずれかから、取り除き得た。
【００７１】
（実施例４．洗浄したかまたは洗浄していないＰＥＳＤＡ微小泡へのホスホロチオエートＯＤＮ結合）
洗浄した微小泡を作製するために、実施例１において調製したような微小泡の溶液を、５％デキストロースの１０００倍過剰容量で洗浄して、微小泡と結合していないアルブミンを除去した。微小泡を４時間発生させた。次いで、低位の溶液を除去し、洗浄した泡を残し、次いで０．９％塩化ナトリウムと共に混合した。洗浄した微小泡中のアルブミンタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．ら、「Ａ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｙｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８，１９７６）によって決定されるように、０．２８±０．０４ｍｇ／ｍｌであった。
【００７２】
放射性標識された２４ｍｅｒ  ＰＳ−ＯＤＮを、洗浄したかまたは洗浄していないＰＥＳＤＡ微小泡の懸濁物に、５ｎＭの濃度で添加した。溶液中の放射能を、液体シンチレーションカウンター（モデルＬＳＣ７５００；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。Ｈｙｄｒｏｃｏｕｎｔ生分解性シンチレーションカクテル（５ｍｌ）を１００μｌサンプルに添加した。サンプルを各実験の後すぐに計数し、次いで２４時間後に、化学発光およびクエンチングの影響を減少させるために再び計数した。
【００７３】
液体シンチレーション計数によって計数された、ＰＳ−ＯＤＮの、ＰＥＳＤＡ微小泡（上端層）、洗浄した低層（アルブミンを含まない）、洗浄していない低層（アルブミンを含む）への分配を表１に示す。表１に報告されている実験における全放射能の回収率は、約９６％であった。
【００７４】
【表１】
2010095541.tif 000003
このデータは、微小泡を伴わない洗浄していない溶液におけるアルブミンが、ＰＳ−ＯＤＮに結合することを示す。微小泡を伴わないアルブミンの除去（洗浄した泡）は、ＰＥＳＤＡ微小泡とのＰＳ−ＯＤＮの分配の増加を生じた（比は、ＴＴＡＧＧＧ  ＰＳ−ＯＤＮについて１．６７、およびｃ−ｍｙｂ  ＰＳ−ＯＤＮについて２．１６である）。
【００７５】
（実施例５．洗浄したアルブミンコート微小泡に対するＯＤＮの結合親和性）
実施例４の洗浄した微小泡に対するＰＳ−ＯＤＮの接合親和性を評価するために、結合部位に対する競合リガンドとして過剰の非放射性ＰＳ−ＯＤＮの増加した量を含む混合物を調製した。配列５’−ｄ（ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣ）−３’（配列番号４）を有する非放射性のＰＳ−ＯＤＮ  ２０ｍｅｒを、一連の増加する濃度（０、３．３、１０、３２．７、９４．５、１６７、および６２６μＭ）の放射性２４ｍｅｒを含むチューブに添加した。各々の泡の懸濁物を、反転することによって混合し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。
【００７６】
観察した結合データをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットとして図１に示す。微小泡に対する結合についての平衡解離定数Ｋm（二連で行った７つの濃度について計算した）は、１．７６×１０-5Ｍであった。
【００７７】
（実施例６．ＯＤＮ−微小泡競合結合研究）
サンプルの３つのグループを以下のように三連で調製し、そして各々のサンプルを室温で２０分間インキュベートした。
【００７８】
グループＡ（コントロール）：１００μｌの微小泡／９００μＬの生理食塩水＋２μＬの非標識２０ｍｅｒ
グループＢ：１００μｌの微小泡／９００μＬの生理食塩水＋２μＬのＦＩＴＣ標識２０ｍｅｒ（最終２０ｍｅｒ濃度＝１５１ｎＭ）
グループＣ：１００μｌの微小泡／８００μＬの生理食塩水＋２μＬのＦＩＴＣ標識２０ｍｅｒ＋１００μＬの非標識２０ｍｅｒ。
【００７９】
フローサイトメトリー分析を、１００ｍＷ空冷アルゴンレーザーおよびＬｙｓｉｓＩＩ収集および分析ソフトウェアを備えたＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行った。最小限１０4の収集した微小泡についてリストモードデータを使用し、そして各々のサンプルについて独立した分析を行った。ＦＩＴＣ標識した微小泡の分布を、表２に提供する。
【００８０】
【表２】
2010095541.tif 000004
ＰＥ＝パーセント事象；ＭＩ＝平均強度；ＳＥ＝標準誤差
1平均はコントロールと有意に異なる；Ｐ＜０．００１
2平均は１５１ｎＭサンプルと有意に異なる；Ｐ＜０．００１。
【００８１】
過剰の非標識ＰＳ−ＯＤＮを含むサンプル中の平均蛍光強度の有意な減少は、微小泡への結合が飽和し得ることを示す。結果として、微小泡表面とのＰＳ−ＯＤＮの非特異的相互作用は制限される。
【００８２】
（実施例７．空気を含む微小泡へのＯＤＮの結合対過フルオロカーボンを含む微小泡へのＯＤＮの結合）
空気を含む超音波処理されたデキストロース／アルブミン微小泡へのＰＳ−ＯＤＮの結合の均一性対過フルオロカーボンを含む超音波処理されたデキストロース／アルブミン微小泡へのＰＳ−ＯＤＮの結合の均一性を、フローサイトメトリーによって測定した。洗浄したＰＥＳＤＡ微小泡に対するＰＳ−ＯＤＮのガウス分布（データは示さず）は、これらの微小泡のアルブミンが、オリゴヌクレオチドについてのその結合部位を保持したことを示した。洗浄したＲＡ−ＳＤＡ微小泡についてのガウス分布の非存在は、これらの微小泡の超音波処理の間に、このオリゴヌクレオチドについてのアルブミン結合部位１の損失が生じたことを示した。（アルブミン結合特性、特にそれらがオリゴヌクレオチドに関する場合については、Ｋｕｍａｒら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ，Ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｂｕｍｉｎ」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．５：１３１−１３９（１９９５）を参照のこと）。
【００８３】
上述から、ＰＳ−ＯＤＮはＰＥＳＤＡ微小泡中のアルブミンに結合することが観察され得、このことは、アルブミン上の結合部位１は、電気機械的な超音波処理によるこれらの泡の産生後、生物学的に活性であることを示す。しかし、この結合部位親和性は、電気機械的な超音波処理が空気のみを用いて行われる場合には失われる。さらに、洗浄によるＰＥＳＤＡ微小泡を伴わないアルブミンの除去は、微小泡を有するＰＳ−ＯＤＮの有意な分配を生じる（表１）。これらの観察は、アルブミンの変性が、空気の存在下での超音波処理で示唆されたように、超音波処理の間に過フルオロカーボン含有デキストロース／アルブミン溶液を用いては起こらないことを実証する。
【００８４】
ＰＥＳＤＡ微小泡中のアルブミンの保持された生物活性（とりわけ、部位１において）を、結合部位についてリガンドと競合するような増加した量の過剰の非放射性ＰＳ−ＯＤＮの存在下で、洗浄したＰＥＳＤＡ微小泡へのＰＳ−ＯＤＮの結合の親和性によって確証した（表２）。過剰の非標識ＰＳ−ＯＤＮを含むサンプル中での平均蛍光強度の有意な減少は、微小泡への結合が飽和し得ることを示す。
【００８５】
（実施例８．結合したオリゴヌクレオチドを有する微小泡の超音波への曝露）
以前に記載されたもの（Ｍｏｒ−Ａｖｉ，Ｖ．ら、「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｕｎｅｘ（登録商標）  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｕｎｄｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ；ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｔｕｄｙ」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ７：Ｓ２９，１９９４）と同様の、可変流ミクロスフェアスキャニングチャンバーを使用した。このシステムは、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ（登録商標）フローシステム（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）に連結された環状のスキャニングチャンバーを含む。このスキャニングチャンバーは、各側を水で満たしたチャンバーで囲まれ、そして各側で音響学的に透明な物質で束縛されている。ＰＳ−ＯＤＮ標識されたＰＥＳＤＡ微小泡（０．１ｍｌ）を、スキャニングチャンバーに対して近位にボーラスとして１秒間にわたって注入し、次いで、水道水を満たしたスキャニングチャンバーに、１００ｍｌ／分の制御された流速でプラスチックチュービングを通して流した。泡がスキャニングチャンバーを通過したときに、スキャナー（２．０ＭＨｚ周波数、１．２ＭＰａピーク陰圧）を、従来的な３０ヘルツフレームレートで超音波を送達するために設定した。超音波が送達されないコントロールランもまた行った。
【００８６】
スキャニングチャンバーの通過後、その溶液は同じサイズのプラスチックチュービングを経由して、メモリ付きシリンダーに通した。最初の１０ｍＬを廃棄した。次の１０ｍＬを収集し、そしてサンプルのより低い部分に存在する任意の遊離のオリゴヌクレオチドから頂部の微小泡を分離するために放置した。
【００８７】
溶出物のより上方操作およびより下方操作の両方からの滴下物を、血球計スライド上に配置し、そして１０倍の拡大率を用いて分析した。これらのスライドの写真を作製し、そして３６平方センチメートルの視野にわたって微小泡の数を手で計数した。溶出物のより高い部分およびより低い部分もまた、ホルムアミドおよびＥＤＴＡの溶液で１５倍（ｖ／ｖ）で混合し、そして９５℃で５分間加熱した。次いで、これらのサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーで、２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて試験した。データをＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いて得て、そして曲線の下の蛍光強度領域を測定し得た。
【００８８】
【表３】
2010095541.tif 000005
a頂部＝超音波処理後の溶出物の頂部の層；底＝超音波処理後の底の層
超音波に対する曝露後の頂部の層において微小泡の有意な損失が存在する（超音波なしで２１９±５４微小泡に対し、診断的な超音波に曝露した場合、溶出液の上部の層において５３±２１微小泡）。この微小泡計数の損失は、上部の泡含有層における初期ＰＳ−ＯＤＮ濃度に関わらず明白であった。泡を含まないより低い層におけるＰＳ−ＯＤＮ濃度は、ゲル電気泳動によって測定され、有意に増加した。このデータは、診断的超音波に対するＰＳ−ＯＤＮ標識ＰＥＳＤＡ微小泡の曝露がＰＳ−ＯＤＮの完全性を変化させないが、そのアルブミン結合から遊離させることを示す。
【００８９】
（実施例９．アンチセンスオリゴの微小泡送達を介する変化した生物分布）
チトクロームＰ４５０  ＩＩＢ１遺伝子配列に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを設計し、ヘキソバルビタールの代謝を変化させた（ＰＢはＣＹＰ  ＩＩＢ１  ｍＲＮＡを刺激し、そして結果として、ヘキソバルビタール（これはＣＹＰ  ＩＩＢ１によって水酸化される）は、より迅速に代謝され、そしてその鎮静的効果が減少する。このアンチセンスオリゴは、この効果と反作用することが期待される）。
【００９０】
オリゴヌクレオチドを、ラットチトクロームＰ４５０  ＩＩＢ１の公知の配列に従って合成し、そしてこのオリゴヌクレオチドは以下の配列を有した：ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  Ｔ（配列番号５）およびＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  Ｇ（配列番号６）。これらのオリゴを、より初期に記載されたように、過フルオロカーボンに曝されて超音波処理されたデキストロース／アルブミン微小泡（ＰＥＳＤＡ）と結合体化し、そしてラットに静脈内送達した。２１０〜２９０グラムの間の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｓａｓｃｏ，Ｏｍａｈａ）をすべての研究のために使用した。これらは、ＡＡＡＬＡＣ認定動物資源設備であるネブラスカ大学医学センターの動物区域で飼育された。これらの動物を、１２時間の光／暗サイクルに曝し、そしてＰｕｒｉｎａラット餌および水道水を自由に利用可能にした。
【００９１】
指定されたグループのラットに、８０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間、腹腔内にフェノバルビタール（ＰＢ）（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を注入した。ＰＢ注入をＯＤＮ微小泡注入と同時に与えた。ホスホロチオエートＯＤＮ注入は、１ｍｇ／ｋｇ／日で２日間であった。最初の注入の４８時間後、睡眠時間を測定した。
【００９２】
各々のラットに、１００ｍｇ／ｋｇのヘキソバルビタール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を、ＰＢおよび／またはＯＤＮでの処理の２日目の最後に腹腔内に注入した。その動物を、背を下にして配置し、それらがなおヘキソバルビタールからの鎮静の下にあることを確実にし；そして睡眠時間を、それらが起きあがるときまでそれらが背中を下にして配置されている時間と規定した。
【００９３】
結果は、オリゴヌクレオチド結合体化微小泡の送達が、薬物の効力を非常に改善したことを示す。コントロールラットは、約２３分間の睡眠時間を有した。ＰＢの投与は、睡眠時間を１１．４±４．５分間まで減少させた。しかし、１／２０用量の微小泡結合体化オリゴを与えられたラットは、５０分間より長い睡眠時間を経験した。比較すると、非微小泡結合体化オリゴは、睡眠時間にあまり変化をもたらさなかった（約１３分間）。
【００９４】
オリゴの生体分布を決定するために、動物を最終的にエチルエーテルを用いて屠殺し、そしてミクロソームをＦｒａｎｋｌｉｎおよびＥｓｔａｂｒｏｏｋ（１９７１）によって記載されたように調製した。肝臓を、門脈を介して１２ｍｌの４％生理食塩水で灌流し、次いで動物から取り除いた。肝臓をみじん切りにし、０．２５Ｍショ糖（Ｓｉｇｍａ）中でホモジナイズし、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ２−Ｂ遠心管（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）中で８０００×ｇ、４℃で、２０分間遠心分離した。上清を回収し、０．２５Ｍショ糖に再懸濁し、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＯＴＤ５５Ｂ超遠心管（Ｄｕｐｏｎｔ）中で、１００，０００×ｇ、４℃で、４５分間遠心分離した。ペレットを１．１５％  ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁し、そして１００，０００×ｇで１時間、４℃にて遠心分離した。最終的なペレットを等量の緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％  グリセロール；Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁し、そして−８０℃で凍結させた。
【００９５】
タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６）によって決定した。ホモジネートのアリコート（８０μｌ）を、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）に添加した。次いで、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（２０μｌ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を添加し、そしてプレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  ＭＮ）上で５９５ｎｍにおいて読みとった。データを、既知のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて生成された標準曲線と比較した。
【００９６】
ＣＹＰ  ＩＩＢ１含量は、ペントキシレゾルフィン（ｐｅｎｔｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）Ｏ−脱アルキル化（ＰＲＯＤ）活性によって決定された（例えば、Ｌｕｂｅｔ，Ｒ．Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３８（１）：４３−８，１９８５）。ミクロソームサンプルについて、１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中の１ｍｇタンパク質、１ｍｌの２μＭ  ５−ペントキシレゾルフィン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、および１７μｌの６０ｍＭ  ＮＡＤＰＨを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、その混合物を、２ｍｌキュベットに添加し、そしてＲＦ５０００Ｕ分光蛍光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）で、５３０ｎｍの励起波長および５８５ｎｍの放射波長を用いて読みとった。未知のサンプルの濃度を、レゾルフィン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の標準曲線から計算した。結果を、ｎｍｏｌ  レゾルフィン／ｍｇ  タンパク質／分で記録した。
【００９７】
ＣＹＰ  ＩＩＢ１タンパク質の直接測定を、ＣＹＰ  ＩＢ１タンパク質を指向する抗体を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（ＳｃｈｕｕｒｓおよびＶａｎ  Ｗｅｅｍａｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８１（１）：１−４０，１９７７）。肝臓サンプル（ウェルあたり５０μｇ）を、９６ウェルｎｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏプレート（ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）上で１００μｌの０．３５％炭酸水素ナトリウム緩衝液中に一晩プレーティングした。ミクロソームを、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で３回洗浄し、そして２００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡを除去し、そして５０μｌのＣＹＰ  ＩＩＢ１抗体（Ｏｘｙｇｅｎｅ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。そのミクロソームを生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ）で５回洗浄し、そして５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。そのミクロソームを、３７℃で１時間インキュベートし、生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で５回洗浄し、そして８５％生理食塩水で２回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（１００μｌ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加し、そしてプレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、１時間、４０５ｎｍで連続して読みとった。結果を、ｍＯＤ／分で、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性として記録した。
【００９８】
結果は、オリゴ結合体化微小泡は、そのオリゴを、フェノバルビタール代謝の部位である肝臓および腎臓に方向付けたことを実証した。
【００９９】
（実施例１０．正常および酸素富化動脈血中での超音波処理後のＰＥＳＤＡ微小泡のサイズおよび濃度）
動脈血を、４匹のイヌおよび３匹の健常なブタから、屠殺する直前に空気吸入条件下で採取した。動物のうちの４匹において、さらなる動脈血を、動物が１００％酸素を最低１０分間にわたって吸入した後に得た。この血液を、６０ｍｌヘパリン処理注射器に収集し、そしてスキャニングチャンバ中に注射するまで温水浴中で３７℃にて保持した。スキャニングチャンバ中への血液の注射の直前に、０．２ｍｌのペルフルオロカーボン含有微小泡（ＰＣＭＢ）を、止め栓を通して６０ｍｌ注射器中の血液に注射し、そしてこの注射器を手で穏やかに反転および回転させることによって混合した。
【０１００】
次いで、このサンプルを、スキャニングチャンバ中に５０ｍｌ／分の流速で注射した。一旦このチャンバが満たされたら、注射のために用いられるプラスチックチュービングへとこのスキャニングチャンバを連結している、閉じられた止め栓を開け、そして超音波曝露（１Ｈｚまたは従来の３０〜４５Ｈｚのフレームレートで断続的）を開始した。超音波曝露の後、流出血液が、スキャニングチャンバから、メスシリンダーへと連結されたチュービングへと流れ出た。最初の１０ｍｌの血液を廃棄し、そして次の１５ｍｌの血液を、３個の５ｍｌアリコートとして、反転させキャップをした注射器中へと採取した。最後の５ｍｌのサンプルの採集の３分後、ツベルクリン注射器を最高レベルの溶出血液中に浸漬し、そして１滴を血球計算板スライドの上に置いた；この長さの時間を選択して、溶出血液中の微小泡が頂部に上昇して収集されることを可能にした。次いで、血球計算板スライドを、４０倍の倍率で光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて検鏡し、そして最大濃度の微小泡を含む視野を血球計算板視野で撮影した。
【０１０１】
後に写真を拡大し、そして２５ｃｍ2視野を選択して、この視野における微小泡の濃度および平均直径を分析した。濃度を、スライド全体の小泡の総数を計数することによって決定した。この技術を用いて測定された微小泡濃度は、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターでの測定値と非常に密接に相関し、そしてこの技術でのサイズの測定値は、公知の５ミクロンスフェア（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｎｏｍｉｎａｌ  ５μｍ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いて較正された。
【０１０２】
（インビトロでのスキャニングチャンバ：）スキャニングチャンバシステムは、蠕動性Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘフローシステム（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）に連結された３５ｍｌ円柱状スキャニングチャンバからなっていた。スキャニングチャンバの両側に封止されているのは、厚さ６．６ミクロンの音響透過性ラテックス材料によって結合された、円柱状生理食塩水充填チャンバである（Ｓａｆｅｓｋｉｎ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。超音波曝露の間のスキャニングチャンバ内の圧力を、スキャニングチャンバの近位に配置された圧力変換器（モデル７８３０４Ａ；Ｈｅｗｌｅｔｔ
Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）によって測定し、全ての試行を通じて平均７±３ｍｍＨｇであった。
【０１０３】
２つの異なる２．０メガヘルツ超音波変換器を、インビトロでの研究のために用いた（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １５００；Ａｎｄｏｖｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；およびＨＤＩ  ３０００，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）。生成されたピークの負の圧力は、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ変換器について１．１ＭＰａであり、そしてＨＤＩ  ３０００スキャナーについて０．９ＭＰａであった。全ての研究についての画像化深度は、８．２センチメートルであり、そして両方の変換器についての焦点は８センチメートルであった。各変換器についてのフレームレートは、従来（３０〜４２Ｈｚ）または断続的（１Ｈｚ）のいずれかであった。スキャニングチャンバからの全ての画像を、高忠実度ビデオテープに記録した。
【０１０４】
（結果：）表３は、動脈血（空気および１００％酸素）中で超音波に曝露した後のＰＣＭＢについての平均微小泡サイズにおける相違を実証する。ＰＣＭＢを、１００％酸素付加動脈血へと曝露した場合、インソネーション（ｉｎｓｏｎａｔｉｏｎ）後の平均微小泡サイズに有意な減少が存在した（ｐ＝０．０１）。より小さな微小泡サイズは、断続的画像化後（７．３±３．７μｍ空気  対  ６．４±３．２μｍ  １００％酸素）および従来の画像化後（７．５±３．５μｍ空気  対  ６．３±３．０μｍ  １００％酸素）の両方で見られた。
【０１０５】
微小泡濃度は、空気動脈血における断続的画像化と比較した場合、従来のフレームレートに曝露した後に有意に減少した（表３）。しかし、従来のフレームレートは、同じ変換器出力では、酸素付加した動脈血中で破壊した場合ほど多くのＰＣＭＢを破壊しなかった。
【０１０６】
【表４】
2010095541.tif 000006
微小泡濃度は、空気動脈血中での断続的画像化と比較した場合、従来のフレームレートに曝露した後に減少した（表４）。しかし、従来のフレームレートは、同じ変換器出力では、酸素付加した動脈血中で破壊した場合ほど多くのＰＣＭＢを破壊しなかった。
【０１０７】
（実施例１１．Ｎ2を含まない環境で形成された微小泡対空気環境で形成された微小泡のインビボ画像化研究）
ペルフルオロカーボン含有微小泡（ＰＣＭＢ）を、実施例１に記載の通りに調製した。１部の５％ヒト血清アルブミンおよび３部の５％デキストロース（計１６ｍｌ）を、８ｍｌのデカフルオロブタンを用いて手動で攪拌した。攪拌後、サンプルに、電気機械的超音波処理を８０±２秒間行った。８０秒間の超音波処理プロセスを、２つの異なる環境で行った：空気（ＲＡ）または１００％酸素（Ｎ2を含まない環境）のいずれかを、超音波処理ホーンとペルフルオロカーボンデキストロース／アルブミン溶液との間の界面に超音波処理の間に吹き込んだ。
【０１０８】
（インビボでの画像化：）タンパク質水溶液に超音波処理をすることによって形成される微小泡が哺乳動物に注射されて、所定の領域の音響特性を変更し、次いでその領域が超音波によってスキャンされて医学的手順における使用のための画像が得られる診断的超音波画像化方法が周知である。例えば、米国特許第４，５７２，２０３号、同第４，７１８，４３３号および同第４，７７４，９５８号を参照のこと。
【０１０９】
超音波処理の間に１００％酸素（Ｏ2  ＰＣＭＢ）または空気（ＲＡ  ＰＣＭＢ）のいずれかに曝露された微小泡サンプルを、イヌに静脈内に注射した。画像化を、１．７ＭＨｚ調波変換器（ＨＤＩ  ３０００；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて行った。変換器出力を、０．３〜０．８ＭＰａに設定し、そして２つの異なる微小泡サンプルからのビデオ強度（ｖｉｄｅｏｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の全ての比較のために一定に保った。バックグラウンドを差し引いた心筋ビデオ強度の比較のためのフレームレートは、４３Ｈｚ（従来）または１０Ｈｚ（断続的）のいずれかであった。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、そしてＰｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅに従った。
【０１１０】
ＲＡ（空気）ＰＣＭＢおよびＯ2  ＰＣＭＢのボーラス注射は、０．００２５ｍｌ／ｋｇまたは０．００５ｍｌ／ｋｇのいずれかであった。サンプル中の微小泡の濃度は、同じであると決定された。ピークの前壁ビデオ強度および後壁ビデオ強度を、Ｔｏｍ−Ｔｅｃｈレビューステーション（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を用いてオフラインで得られた、デジタル化したスーパーＶＨＳビデオテープ画像（Ｍａｘｅｌｌ，Ｊａｐａｎ）から測定した。Ｔｏｍ−Ｔｅｃｈレビューステーションは、１〜２５５のグレースケール範囲にわたってビデオ強度を定量する。目的の領域を、各セグメントの心筋層中央に配置した。
【０１１１】
この定量分析に加えて、短軸視野からの前壁領域、隔膜領域、側壁領域、および後壁領域における局部的心筋コントラスト増強の視覚的評価を、２人の独立した調査者によって行った。各領域に、０（心筋コントラストなし）、１＋（中程度の心筋コントラスト増強）または２＋（腔の強度に近づいた明るい心筋コントラスト増強）を割り当てた。
【０１１２】
Ｏ2  ＰＡＭＢとＲＡ  ＰＣＭＢとの間のピーク心筋ビデオ強度の計６の比較を、３匹のイヌにおいて行った。表５では、注射前に、１００％酸素の存在下で超音波処理したＰＣＭＢが、サイズおよび濃度において、空気の存在下で超音波処理したＰＣＭＢと類似したことがわかり得る。しかし、３匹全てのイヌでは、１０ヘルツフレームレート（断続的画像化）を用いるピークの心筋ビデオ強度は、１００％酸素の存在下で超音波処理したＰＣＭＢについて有意に高かった。
【０１１３】
酸素付加したＰＣＭＢのみが、経胸壁画像化のために用いられる用量で一貫した均質な心筋コントラストを生じた。視覚的心筋コントラストは、ＲＡ  ＰＣＭＢの同じ用量の後で２４のうち９の領域で２＋であったのと比較して、静脈内Ｏ2  ＰＣＭＢ注射後に２４のうち２０の領域で２＋であった（ｐ＝０．００１）。
【０１１４】
【表５】
2010095541.tif 000007
酸素付加したＰＣＭＢのみが、経胸壁画像化のために用いられる用量で一貫した均質な心筋コントラストを生じた。視覚的心筋コントラストは、ＲＡ  ＰＣＭＢの同じ用量の後で２４のうち９の領域で２＋であったのと比較して、静脈内Ｏ2  ＰＣＭＢ注射後に２４のうち２０の領域で２＋であった（ｐ＝０．００１）。
【０１１５】
予測された通り、空気血液中の微小泡濃度は、より高いフレームレートに曝露した場合、有意に減少した。しかし、より迅速なフレームレートによるこの破壊は、ＰＣＭＢが酸素付加血液中にある場合、いくらか弱められた。この相違の理由は明らかではない。１つの可能性は、酸素付加された血液における微小泡からのより迅速な窒素の拡散が、より高い内部濃度のペルフルオロカーボンを生じ、従って不溶性ペルフルオロカーボンについての拡散勾配を増加させたことである。その低い溶解度に起因して、微小泡からのその増強された拡散は、より小さな、カプセル化されていないペルフルオロカーボン微小泡の形成に至る。血球計算の分解能は、カプセル化されていない微小泡とカプセル化された微小泡を区別することができず、従ってそれら両方を計算する。この説明はまた、１００％酸素付加動脈血に曝露したＰＣＭＢについて観察された、より小さな平均微小泡サイズを説明し得る。
【０１１６】
（統計分析：）独立ｔ検定を用いて、超音波処理の間に異なるガスに曝露したＰＣＭＢサンプルの微小泡のサイズおよび濃度を比較した。これをまた用いて、インビボ研究におけるピーク心筋ビデオ強度における差を比較した。データが正規分布していない場合、非パラメトリック検定を行った。静脈内Ｏ2  ＰＣＭＢおよびＲＡ  ＰＣＭＢ後の視覚的心筋コントラスト増強の比較を、分割表（ｃｏｎｔｉｎｅｎｃｙ  ｔａｂｌｅ）（Ｆｉｓｈｅｒの正確検定）を用いて行った。０．０５よりも低いｐ値を、有意とみなした。
【０１１７】
変動係数を用いて、インビトロでの研究における微小泡のサイズおよび濃度の測定における観察者間変動性を測定した。独立した調査者間平均差を用いて、ピーク心筋ビデオ強度における観察者間変動を比較した。
【０１１８】
２人の独立した観察者が、断続的または従来のいずれかの超音波フレームレートに曝露された６つの異なるスライドの微小泡のサイズおよび濃度を測定した。６つの異なるサンプルにおける２人のｓ独立した観察者による微小泡のサイズの測定値についての変動係数は８％（ｒ＝０．９５；ｐ＝０．００４）であり、一方、微小泡濃度の独立した測定値についての変動係数は９％（ｒ＝０．９９；ｐ＜０．００１）であった。経胸壁画像化についての２人の独立した調査者によるピーク心筋ビデオ強度測定値において報告された平均差は、４±４単位（ｒ＝０．９４、ＳＥＥ＝５単位；ｐ＜０．００１；ｎ＝２４比較）であり、これは、Ｏ2  ＰＣＭＢとＲＡ  ＰＣＭＢとの間の前壁ピーク心筋ビデオ強度における１６単位の平均差および後壁ピーク心筋ビデオ強度における１３単位の平均差よりも充分に低い。２人の調査者は、４４のうちの３７の領域（８４％）におけるコントラスト増強の視覚的程度において一致した。５つの不一致は、ＲＡ  ＰＣＭＢ心筋コントラスト増強の視覚的階級付けにおいてであった（２つの領域において０対１、３つの領域において１＋対２＋）。１＋が存在するか２＋が存在するかについての不一致が存在した３つの領域は、統計分析において２＋を割り当てた。
【０１１９】
（実施例１２．微小泡からのＯＤＮの取り込みに対する、標的化された超音波処理の効果）
ＰＳ−ＯＤＮ結合体化微小泡の腎臓取り込みに対する超音波処理の効果のインビボでの研究を、３匹のイヌにおいて行った。蛍光標識したＰＳ−ＯＤＮ  ＰＥＳＤＡ微小泡（０．２ｍｌ）の静脈内注射を、大腿静脈において与えた。同時に、左腎臓を、外部に配置した２．０ＭＨｚ〜２．５ＭＨｚの診断超音波変換器（ピークの負の圧力は１．１ＭＰａ）によってインソニファイ（ｉｎｓｏｎｉｆｙ）した。この腎臓を、注射後、およびこの腎臓における視覚的に明らかなコントラスト出現の間、最低２分間にわたって３０Ｈｚフレームレートを用いてインソニファイした。各イヌでは、左心室動脈圧および肺動脈圧を、左心室および胚動脈にそれぞれ配置した生理食塩水を充填したカテーテルを用いた腎臓注射の前および後でモニタリングした。注射の約４時間後、このイヌを屠殺し、そして両方の腎臓を取り出した。切断切片を、腎皮質から得て、そしてＰＳ−ＯＤＮについてのサンプルとし、上記の遺伝子スキャニング方法（実施例８）を用いて計数した。組織学的切片をまた、糸球体およびネフロンにおいて、蛍光の分析のために得た。
【０１２０】
１匹のイヌでは、標識したＰＥＳＤＡにおける静脈内ＰＳ−ＯＤＮ後の非インソニファイ腎臓と比較して１０倍を超えて大きなＰＳ−ＯＤＮの取り込みが、インソニファイした腎臓において存在した。３匹のうちの２匹のイヌでは、ＰＳ−ＯＤＮ取り込みの、インソニファイした腎臓への分配が明らかであった。第１のイヌでは、非インソニファイ腎臓に対して、インソニファイした腎臓においてＰＳ−ＯＤＮの３倍高い取り込みが存在した。第２のイヌでは、インソニファイした腎臓においてＰＳ−ＯＤＮの９倍を超える高い取り込みが存在した。しかし、第３のイヌでは、２つの腎臓の間でＰＳ−ＯＤＮ取り込みの差は存在しなかった。ＰＳ−ＯＤＮで標識したＰＥＳＤＡ微小泡の静脈内注射後、血行力学的な変化は存在しなかった。死後の腎臓の組織学的検査はまた、診断的超音波によって、いずれの糸球体にも管状細胞にも破壊がないことを示した。
【０１２１】
（実施例１３．微小泡からのヘパリン取り込みに対する超音波処理の効果）
静脈内ヘパリンを、３つの異なる設定で、１５００単位のボーラス用量でイヌ被験体に投与した。設定１では、ヘパリンを、遊離の薬物として与えた。設定２では、１５００単位のヘパリンを、オロソムコイドＰＥＳＤＡに結合させて与えたが、超音波は血液プールに適用しなかった。設定３では、オロソムコイドＰＥＳＤＡに結合させた同じ用量のヘパリン（１５００単位）を与え、そして超音波を血液プールに適用した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）のベースライン測定を測定し、次いで各注射後に５分間の間隔で、最低１５分間にわたって繰り返した。
【０１２２】
設定１では、ＰＴＴは、５分では１０６秒を超えて増加したが、１５分で３０〜６０秒に戻った。設定２では、ＰＴＴは１０分後には１０６秒を超えて到達し、そして１５分で６０〜８０秒に戻った。設定３では、ＰＴＴは、１５分後に１０６秒を超えるままであった；さらなる測定は行わなかった。
【０１２３】
（実施例１４．経皮超音波およびｃ−ｍｙｃプロトオンコジーンに対するアンチセンスを含む静脈内微小泡送達系を用いる頚動脈新生内膜形成の阻害）
全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、そしてＰｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅに従った。２８匹の家畜ブタに、アスピリン（３２５ｍｇ  ＰＯ）を前投薬した。次いで、ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）および補助的なペントバルビタールを用いて全身麻酔を投与した。このブタに挿管し、そして呼吸器の呼吸空気に置いた。Ｓｗａｎ  Ｇａｎｚカテーテルを、肺動脈中へ前進させて肺の圧力をモニタリングした。静脈内ヘパリン（４，０００〜５，０００単位）、アトロピン（０．５〜１．０ｍｇ）、および舌下ニフェジピン（１０〜３０ｍｇ）を与えた。８Ｆガイドカテーテルを、右頚動脈の近位部分に配置した。大きすぎるバルーン（６．０ｍｍ〜１０．５ｍｍ）で血管を平均１０７±３４秒間（９０〜２４０秒間の範囲）拡張することによってこの動脈を傷付けた。この介入を、ブタがその後どの処置を受けるかを知らない実験的介入心臓病専門医（Ｕ．Ｄ．）によって行った。損傷後の血管開存性を、ＨｅｘａｂｒｉｘまたはＲｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ−７６の頚動脈内注射を用いる血管造影によって確認した。
【０１２４】
最初の２０動物を、ランダム化して、バルーン傷害の後に３つのうちの１つの処置を受けさせた：
（ａ）ＰＥＳＤＡに結合したｃ−ｍｙｃに対する静脈内ホスホロチオエートＯＤＮ（０．５ミリグラム；Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡ）；
（ｂ）ｃ−ｍｙｃ単独に対する同じ用量の静脈内アンチセンス（ＯＤＮ単独）；または
（ｃ）注射なし（コントロール）。
【０１２５】
注射を、ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡおよびＯＤＮ単独のブタにおけるバルーン傷害の３日後に繰り返した。全ての動物は、ケトロラク（６０ｍｇ）およびソルメドロール（Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ）（４０ｍｇ）を静脈内で与えられて、微小泡を受けるようにランダム化されたブタにおける肺高血圧反応を予防した。
【０１２６】
最後の８匹のブタは、ｃ−ｍｙｃに対する異なるＯＤＮを受けた（モルホリノ（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）；ＡＶＩ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．；Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）。これらのブタでは、バルーン傷害後、第１の４匹は、ＰＥＳＤＡに結合したＯＤＮを受け、そして最後の４匹は、ＯＤＮ単独（ｎ＝２）または処理無し（ｎ＝２）のいずれかを受けた。
【０１２７】
ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡに対してランダム化された動物では、５０ワット／ｃｍ2の出力で経皮２０キロヘルツ超音波プローブ（Ｍｏｄｅｌ  ＸＬ２０２０；Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって、バルーン拡張の直後および３日目の両方において各注射の前および後に、計６分間、右頚動脈の上の領域にインソニファイした。プローブの加熱に起因する皮膚の刺激を避けるために、１．５〜２．０センチメートルのカップリングゲルを、倒置させた切断１２ミリリットル注射器を用いて皮膚表面とプローブ先端との間に配置した。右頚動脈の位置を、診断用変換器（ＨＤＩ３０００；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて確認した。
【０１２８】
（バルーン傷害３０日後での測定：）バルーン傷害３０日後にて、血管内超音波（ＩＶＵＳ）測定を行った後でブタを屠殺した。２．９または３．１  Ｆ  ３０  Ｍｅｇａｈｅｒｔｚ  ＩＶＵＳカテーテル（ＣＶＩＳ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を蛍光顕微鏡下で遠位頚動脈中へと前進させ、そしてカテーテルの電動化した引き戻しを行った。管腔面積、総血管面積（管腔＋任意の脈管形成斑）、および血管直径のオフライン面積測定を、以前に傷付けた領域における最大の斑および最小の管腔の部位にて行った。次いでこのブタを屠殺し、そして頚動脈の連続切片を、固定後に行った。最大内膜厚さの部位を、デジタル面積測定（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６１；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって測定した。この血管は、灌流固定を受けなかったので、最大内皮厚さの値は、ＩＶＵＳによって測定されたバルーン傷害部位での血管直径を指標付けした。ＩＶＵＳおよび組織学的測定の両方は、このブタがどの処置レジメンを受けるかを知らない調査者（それぞれ、Ｗ．Ｈ．およびＳ．Ｒ．）によって行われた。
【０１２９】
（統計分析：）３つの群における、バルーン傷害部位での総血管面積、管腔面積、および管腔直径のＩＶＵＳ測定における差、ならびに最大内皮厚さの組織学的測定を、分散分析（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌｓ複数比較手順）を用いて比較した。ＩＶＵＳは、ＯＤＮ単独を受けた３匹のブタにおいて行われ得なかったので、ＯＤＮ単独およびコントロールからのデータをまた合わせ、そしてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定によってＯＤＮ−ＰＥＳＤＡと比較した。ＩＶＵＳおよび組織学的測定における観察者間変動を、同じ調査者に異なる時点で測定を繰返し、そして測定値間の差のパーセントを計算をさせることにより計算した。
【０１３０】
（結果：）２匹のブタが、バルーン傷害プロトコルの間に死んだ。５匹のブタ（３匹はＯＤＮ−ＰＥＳＤＡ、１匹はＩＶ  ＯＤＮ単独、および１匹はコントロール）では、傷害の３０日後に傷害または内皮過形成の組織学的証拠は無かった。残りの２１匹のブタのうち、８匹はＯＤＮ−ＰＥＳＤＡを受け、７匹は静脈内ＯＤＮ単独を受け、そして６匹は何も受けなかった。２０キロヘルツの超音波で処置されたブタは、適用した超音波の部位で表面剥離（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ａｂｒａｓｉｏｎ）を有していたが、この表面剥離は、３０日の追跡ではもはや明らかでなかった。
【０１３１】
表１は、３つの群における血管内超音波データおよび組織学的データを含む。血管内超音波は、１６匹のブタにおいて可能であった。ＯＤＮ単独を受けたブタのうち３匹においては、傷害３０日後で血栓閉塞していることから、このことは行われ得ず、そしてＯＤＮ−ＰＥＳＤＡおよびＯＤＮ単独を受けた各々１匹のブタでは、技術的理由から、このことは行われ得なかった。
【０１３２】
ＩＶＵＳで測定した傷害部位での総血管面積および管腔面積は、ＯＤＮ−ＰＥＳＤＡ群において有意に大きかった。組織学での同じ群における有意に小さい最大内皮厚さにもかかわらず、このより大きな血管サイズが見られた。最大内皮厚さの組織学的測定がＩＶＵＳ血管直径を指標付けした場合、３つの群の間に明確な区別が存在した（表１）。
【０１３３】
コントロールブタは、超音波およびＯＤＮ−ＰＥＳＤＡで処置したブタと比較した場合、３０日間よでより小さな血管を有したが、より大きな内膜厚さを有した。観察者間変動は、ＩＶＵＳ測定において３％（ｎ＝１２比較）であり、そして反復組織学的測定について１４％（ｎ＝２５比較）であった。
【０１３４】
【表６】
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【図１】
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