(57)【要約】      （修正有）【課題】高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供する。【解決手段】透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された複数個の金属突起と、該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭ（自己組織化単分子膜）１と、該ＳＡＭ１の、該突起とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンド２とを含むプラズモン励起センサであって、該ＳＡＭ１が、該基板に対して略平行であることを特徴とするプラズモン励起センサ。【選択図】図６
2010256161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明平面基板と、
該基板の一方の表面に形成された複数個の金属突起と、
該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭ（自己組織化単分子膜）と、
該ＳＡＭの、該突起とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドと
を含むことを特徴とするプラズモン励起センサ。
【請求項２】
さらに、誘電体からなる層を含み、
該層が、上記金属突起の先端部近傍を被覆するように形成され、上記透明平面基板に対して略平行であり、
該層の、該突起とは接していないもう一方の表面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）が形成されている請求項１に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項３】
上記金属突起の形状が、１山突起形状である請求項１または２に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項４】
上記金属突起が、アクリル系樹脂もしくはエポキシ系樹脂からなる突起の表面を金属からなる薄膜によって被覆されてなるか、または金属のみからなる請求項１〜３のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項５】
上記金属が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属である請求項１〜４のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項６】
上記金属が、金である請求項５に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項７】
上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含む請求項２〜６のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項８】
上記ＳＡＭ（自己組織化単分子膜）が、シランカップリング剤、またはチオール基もしくはジスルフィド基を有する分子からなる請求項１〜７のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項９】
上記リガンドが、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する抗体である請求項１〜８のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項１０】
下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
工程（ａ）：請求項１〜９のいずれかに記載のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【請求項１１】
上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合する請求項１０に記載のアッセイ法。
【請求項１２】
上記アナライトとは異なるアナライトであって、上記アナライトと競合するアナライトが、上記のプラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドとあらかじめ結合している複合体を、さらに用いる請求項１０または１１に記載のアッセイ法。
【請求項１３】
上記アナライトが、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原である請求項１０〜１２のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項１４】
少なくとも、請求項１〜９のいずれかに記載のプラズモン励起センサを含み、請求項１０〜１３のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とする装置。
【請求項１５】
透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された複数個の金属突起と、該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭ（自己組織化単分子膜）とからなり、請求項１〜９に記載のプラズモン励起センサに用いられるプラズモン励起センサ用基板を、少なくとも含むことを特徴とするアッセイ用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、複数個の金属突起を有する基板を含むプラズモン励起センサ、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）による電場増強効果を利用した該センサを用いたアッセイ法、該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に発生させた粗密波（表面プラズモン）と、誘電率（または屈折率）の差異による影響を受け易いエバネッセント波との波数が一致したとき両者が共鳴して反射光が減衰する現象を言い、通常、金属中の電子は光と相互作用しないが、ナノオーダーレベルの微粒子や針状の突起物の先端部が周期的に並ぶような特殊な構造をとる場合、その微細な領域中で電子と光とが共鳴して、これまでの常識を覆すような極めて高い光出力をもたらすなどの効果を発現する。
【０００３】
ＳＰＲ自体は、金属微粒子が着色する現象として知られている。ガラスの表面に金属微粒子を塗布した着色ガラスは鮮やかな色を呈し、ステンドガラスとして普及している。自動車の着色塗装にも応用されている。
【０００４】
これに対して、近年注目されているのが、光デバイスとして利用するという試みである。そのため、ナノ領域における光の挙動を研究する「ナノフォトニクス」という研究分野も確立されつつある。
【０００５】
光デバイスとして注目されている応用分野の１つが、高い光出力を持つ発光素子である。ＳＰＲにより数百倍〜数千倍もの光強度の増加現象が見られることから、これにより高出力な面発光レーザなどの発光デバイスを開発しようという検討が始まっている。ナノオーダーレベルの微細領域に光を閉じ込めることが可能なことから、ナノ光導波路としても有望視されている。
【０００６】
また、ＳＰＲが起こっている表面の領域は、わずかな分子が結合しただけで敏感に共鳴状態が変化することから、ＤＮＡなどの微小物質を検出するバイオセンサとして使用する検討も進んでいる。
【０００７】
このようなＳＰＲの電場増強効果を利用したバイオセンサまたはバイオチップの例として、特許文献１には、光学基材の一面に、高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０である、多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０〜１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属膜表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に試料中の被測定物質と特異的に結合する抗体が固定されている局在プラズモン増強センサが開示されている。
【０００８】
上記局在プラズモン増強センサは、電場直接励起による強い蛍光シグナルが発せられるものの、依然としてノイズも大きいという問題がある。
【０００９】
また、非特許文献１には、ナノインプリント法により、ガラス基板上にピッチ１８０ｎｍ、高さ６０ｎｍ程度の球体状突起樹脂を形成し、その上に厚み４０ｎｍの金薄膜を形成した局在プラズモンセンサが開示されている。
【００１０】
しかしながら、特異分子のシグナル増幅だけでなく、非特異分子などによるノイズも増幅してしまうことからＳ／Ｎに改善の余地が認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−２４０３６１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】松下智彦、外２名、“局在ＳＰＲバイオセンサーの研究  ハイスループットに作製可能なバイオセンサーチップの実現”、平成１９年９月１４日、平成１９年度マイクロ・ナノ融合加工技術研究会  第１回例会
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
特許文献１に開示されている局在プラズモン増強センサは、センサ表面全体の平均的な電場増強だけを狙っているものであって、被測定物質の配置や位置などには創意工夫がみられず、したがって、電場の強い突起部だけでなく、電場の弱い凹部にも被測定物質が万遍なく配置されるため、シグナルが強いものもあれば弱いものもあり、効率の良いシグナルアップを望めるものではない。また、ノイズの原因となる非特異的な被測定物質が電場増強の強い部分に付着する可能性もあり、ノイズアップに繋がる問題も生じる。
【００１５】
そこで、本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、突起先端の平坦部にのみＳＡＭを設け、そこに被測定物質（アナライト）を結合するリガンドを固定化し、多くの被測定物質を電場の強い突起先端部の近傍のみに配置することによって、効率良く安定にシグナルアップできること、さらに、突起先端部の近傍以外にはリガンドを固定化しないことによって、同時にノイズダウンできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された複数個の金属突起と、該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭ（自己組織化単分子膜）と、該ＳＡＭの、該突起とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドとを含むことを特徴とする。
【００１７】
さらに、誘電体からなる層を含み、該層が、上記金属突起の先端部近傍を被覆するように形成され、上記透明平面基板に対して略平行であり、該層の、該突起とは接していないもう一方の表面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）が形成されていることが好ましい。
【００１８】
上記金属突起の形状は、１山突起形状であることが好ましい。
【００１９】
上記金属突起は、アクリル系樹脂もしくはエポキシ樹脂からなる突起の表面を金属からなる薄膜によって被覆されてなるか、または金属のみからなることが好ましい。
【００２０】
上記金属は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属が好ましく、金がより好ましい。
【００２１】
上記誘電体は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００２２】
上記ＳＡＭ（自己組織化単分子膜）は、シランカップリング剤、またはチオール基もしくはジスルフィド基を有する分子からなることが好ましい。
【００２３】
上記リガンドは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する抗体であってもよい。
【００２４】
また、本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする。
【００２５】
工程（ａ）：上記プラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【００２６】
上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合することができる。
【００２７】
上記アナライトとは異なるアナライトであって、上記アナライトと競合するアナライトが、上記のプラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドとあらかじめ結合している複合体を、さらに用いることもできる。
【００２８】
上記アナライトは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原であってもよい。
【００２９】
本発明の装置は、上記プラズモン励起センサを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明のアッセイ用キットは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された複数個の金属突起と、該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭ（自己組織化単分子膜）とからなり、上記プラズモン励起センサに用いられるプラズモン励起センサ用基板を、少なくとも含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のプラズモン励起センサは、ＳＰＦＳにおいて電場増強が著しく大きい突起を有することによって、該突起の先端部近傍に捕捉された蛍光色素からの発光を主に検出することができ、さらに該突起の先端部近傍以外の非特異的な吸着に由来する蛍光が少ないことから、バックグランドノイズも低減することができる。すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、ＳＰＦＳにおいて、電場増強（Ｓ；シグナル）アップだけでなく同時にノイズ（Ｎ）ダウンも行うことでＳ／Ｎ比アップを図ったものである。
【００３２】
また、本発明のプラズモン励起センサは、ＳＰＲにより電場増強を利用しているものであり、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）に用いることによって、さらなる電場増強が利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明のプラズモン励起センサが有する、１山突起形状の金属突起の斜視図（ａ）および断面図（ｂ）を模式的に示し、さらに（ｃ）は、その先端部近傍を誘電体からなる層２７によって被覆するように形成されている該金属突起の一態様の断面模式図を表す。
【図２】図２は、透明平面基板の一方の表面に複数個有する１山突起タイプの金属突起が、隙間なく整列している態様を模式的に示す。
【図３】図３は、本発明のプラズモン励起センサを製造する方法（製造方法（Ｉ））のうち、センサ基板を製造するまでの工程（ｉ）〜（ｖｉｉ）の一態様を模式的に示す。
【図４】図４は、本発明のプラズモン励起センサを製造する方法（製造方法（ＩＩ））のうち、センサ基板を製造するまでの工程（ｉ）〜（ｉｖ），（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）の一態様を模式的に示す。
【図５】図５は、本発明のプラズモン励起センサを製造する方法（製造方法（ＩＩＩ））のうち、センサ基板を製造するまでの工程（ｘｉｖ）〜（ｘｖｉ）の一態様を模式的に示す。
【図６】図６は、本発明のプラズモン励起センサを用いたアッセイ法を模式的に示したものであって、すなわち、図６は、金属突起の先端部近傍のＳＡＭ１が略平坦になっているプラズモン励起センサ１０に固定化されているリガンド２に結合したアナライト３に、さらにリガンド２と同じであっても異なっていてもよいリガンド４と蛍光色素５とのコンジュゲートが結合している状態で、該センサのリガンド２を固定化していないもう一方の表面から入射光を照射することによって（図示なし）、金属突起の先端部近傍が強電場領域（３次元）となり、蛍光色素５が励起され強い蛍光を発しているため、励起散乱光ノイズ、余分の発光ノイズおよび／またはラマン散乱ノイズによるバックグランドノイズが相対的に弱くなり、Ｓ／Ｎ比が著しく向上していることを模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
次に、本発明のプラズモン励起センサ、アッセイ法およびキットについて具体的に説明する。
【００３５】
＜プラズモン励起センサ＞
本発明のプラズモン励起センサは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された複数個の「金属突起」と、該突起の先端部近傍を被覆するように形成された「ＳＡＭ」（自己組織化単分子膜）と、該ＳＡＭの、該突起とは接していないもう一方の表面に固定化された「リガンド」とを含むことを特徴とするものである。
【００３６】
本発明のプラズモン励起センサは、さらに、「誘電体からなる層」を含むことが好ましく、該層は、上記金属突起の先端部近傍を被覆するように形成され、上記透明平面基板に対して略平行であり、該層の、該突起とは接していないもう一方の表面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）が形成されていることが望ましい。
【００３７】
〔透明平面基板〕
本発明で用いられる透明平面基板としては、石英製やガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３８】
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎｄ〕1.８５）、（株）
住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３９】
透明平面基板は、その表面に金属突起を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００４０】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００４１】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００４２】
〔金属突起〕
本発明で用いられる金属突起は、上記透明平面基板の一方の表面に複数個形成されており、金属突起の形状は、１山突起形状（例えば、図１（ａ）に示す。）が好ましい。
【００４３】
図１（ｂ）に定義されている１山突起形状の金属突起の高さは、１００〜２，０００ｎｍが好ましく、２００〜１，０００ｎｍがより好ましい。また該金属突起の幅は、１００〜２，０００ｎｍが好ましく、２００〜１，０００ｎｍがより好ましい。
【００４４】
このような金属突起のアスペクト比（高さ／幅）は、１〜１０が好ましく、２〜１０がより好ましい。
【００４５】
金属突起の高さ、幅およびアスペクト比が上記範囲内であると、より強い電場増強が利用可能であることから好適である。
【００４６】
複数個の金属突起は、図２に示すように隙間なく整列するように透明平面基板の一方の表面に形成することが好ましい。なお、金属突起同士の間およびその近傍を、以下「谷部」ともいう。
【００４７】
このような１山突起形状の金属突起は、円錐状、または三角錐、四角錐などの角錐状の１山突起形状を有する金属突起であり、例えば、図１（ａ）に示す円錐などが挙げられる。
【００４８】
このような金属突起は、（イ）アクリル系樹脂またはエポキシ系樹脂からなる突起の表面を金属からなる薄膜によって被覆されてなるか、または（ロ）金属のみからなることが好ましい。
【００４９】
上記（イ），（ロ）は、電場増強度の観点から適宜選択することができ、例えば、金属種としてアルミニウムを用いた（ロ）である金属突起より、金属種として金を用いた（イ）である金属突起の方が、電場増強度がより大きいことから（イ）を選択することが好ましく、また例えば、（イ），（ロ）のいずれも用いる金属種が金である場合は、（ロ）を選択することが好ましい。
【００５０】
（金属からなる薄膜）
金属からなる薄膜としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であ
り、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。なお、金属突起が金属のみからなる場合、用いられる金属は、金属からなる薄膜を形成する金属種と同様である。
【００５１】
金属からなる薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法により金属からなる薄膜を形成することが好ましい。
【００５２】
金属からなる薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましい。
【００５３】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましい。金属からなる薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。
【００５４】
透明平面基板の一面に設けられた複数個の金属突起が、照射される光の波長以下の構造物であるため、透明平面基板は明確な全反射角を示すことなく、透明平面基板を透過してきた光はほぼ無反射で金属からなる薄膜上（または金属突起の表面上）の表面電子粗密波と相互作用し、金属膜微細構造に強く局在した増強電場を生じるとともに、唯一の周波数レベルにエネルギーが集中し、強い増強電場が形成される。
【００５５】
これに対して、平面や回折格子のような照射される光の波長よりも大きな構造をもつ透明平面基板上の金属からなる薄膜への光照射では、二次散乱光、三次散乱光、四次散乱光といったものが観測され、表面プラズモンの周波数は、多数のレベルに分散される。
【００５６】
形成された増強電場中に標識物質として蛍光分子を置くと、蛍光分子は電場直接励起により電子励起され、強い蛍光を発する。これは、（１）光吸収による励起とそれに続く蛍光ではなく、（２）増強電場による励起による蛍光である。前者（１）は、照射光強度に対する発光強度の比率が吸光度を上限とするのに対し、後者（２）では吸光度が上限ではない。
【００５７】
したがって、上記突起ような微細構造による配置をＳＰＦＳに利用することにより、蛍光分子を強く発光させることができる。
【００５８】
〔ＳＡＭ〕
ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）は、金属突起の先端部近傍を被覆するように形成されたものであり、透明平面基板に対して略平行であって、好ましくは誘電体からなる層の、金属突起とは接していないもう一方の表面に形成され、略平坦になっていることが望ましい。
【００５９】
本発明において、ＳＡＭは、（１）シランカップリング剤、または（２）チオール基もしくはジスルフィド基を有する分子からなることが好ましい。
【００６０】
（シランカップリング剤）
ＳＡＭとして、シランカップリング剤を用いるのは、誘電体からなる層が金属突起の先端部近傍を被覆するように形成されている場合が望ましく、このようなシランカップリング剤としては、アミノ基またはカルボキシル基を有するシランカップリング剤であれば、
特に限定されずに従来公知のものを用いることができる。
【００６１】
（チオール基またはジスルフィド基を有する分子）
ＳＡＭとしてチオール基またはジスルフィド基を有する分子を用いるのは、金属突起の先端部近傍に誘電体からなる層が形成されずに、直接ＳＡＭを金属突起の先端部近傍を被覆する場合が望ましい。
【００６２】
チオール基を有する分子としては、例えば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能）などが挙げられ、これらのうち、炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールが好ましい。
【００６３】
ジスルフィド基を有する分子として、例えば、５−カルボキシペンチル  ジスルフィド、７−カルボキシヘプチル  ジスルフィド、１０−カルボキシデンシル  ジスルフィドなどが挙げられ、これらのうち、５−カルボキシペンチル  ジスルフィドが好ましい。
【００６４】
チオール基またはジスルフィド基を有する分子のうち、好ましくは炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオール、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールである。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００６５】
金属突起の先端部近傍に形成されているＳＡＭの表面形状が、透明平面基板に対して略平行になっていると、金属突起同士の間（谷部）に固定化されるリガンド濃度より、金属突起の先端近傍に固定化されるリガンド濃度を高くすることができ、これによって金属突起の先端近傍に捕捉される蛍光色素を効率良く励起することができる。
【００６６】
なお、このようなＳＡＭの表面の面積は、１，０００〜４０，０００ｎｍ2、かつ金属
突起の底面積の１／１００〜１／１０であることが好ましい。
【００６７】
ＳＡＭを形成する方法としては、例えば、下記（Ａ）〜（Ｆ）の方法などが挙げられる。
【００６８】
（Ａ）エッチング法（フォトレジスト法）：
方法（Ａ）は、まず、金属突起全面にＳＡＭを形成し、次に、突起の先端部のみをマスクすることができるマスク板により、該先端部をマスクし、次にエッチングを行う方法である。これによって、谷部のＳＡＭが除去される。
【００６９】
（Ｂ）レーザアブレーション法：
方法（Ｂ）は、まず、金属突起全面にＳＡＭを形成し、次に、谷部にエキシマレーザー集光ビームを照射する方法である。これにより、谷部のＳＡＭがアブレーション（蒸発・微粒子化）され、除去される。
【００７０】
（Ｃ）インクジェット法：
方法（Ｃ）は、金属突起の先端部近傍のみにインクジェットによりシランカップリング剤を吹付ける方法である。これによって、金属突起の先端部近傍のみにＳＡＭが形成される。
【００７１】
（Ｄ）斜めから吹付けるか、または蒸着する方法：
方法（Ｄ）は、シランカップリング剤を、金属突起に対して斜め上方向から吹付けるか
、または斜め上方向から蒸着する方法である。これにより、金属突起の先端部近傍のみに選択的にＳＡＭが形成される。
【００７２】
（Ｅ）紫外線照射法：
方法（Ｅ）は、まず、金属突起全面にＳＡＭを形成し、次に、２００〜３００ｎｍの波長域の紫外光を谷部に照射する方法である。これによって、谷部のＳＡＭが除去される。なお、この方法は、詳しくは、特開２００２−０２３３５６号公報に記載されている。
【００７３】
（Ｆ）ナノリソグラフィー法：
方法（Ｆ）は、金属突起の先端部近傍のみにＳＡＭを形成する方法であって、極微細なパターニングを可能にする方法である。また、この方法によれば、金属突起の先端部近傍に形成されるＳＡＭを略平坦とすることができるため好ましい。
【００７４】
なお、詳細は、Beomjoon KIMら，“自己組織化単分子膜のマイクロマシニングへの応用”，
生産研究，５４巻３号（第３８〜４３頁），２００２年、および金長吉，“機能性自己組織化単分子膜を用いたナノパターニング”，生産研究，５５巻６号（第２５〜３０頁），２００３年に記載されている。
【００７５】
〔リガンド〕
リガンドとは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されない。
【００７６】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などの腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する抗体が挙げられるが、本発明では特に制限されるものではない。
【００７７】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
【００７８】
〔誘電体からなる層〕
本発明のプラズモン励起センサは、金属突起による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、金属突起とＳＡＭとの間に、さらに誘電体からなる層を含むことが好ましい。
【００７９】
用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできるが、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００８０】
誘電体からなる層の厚さ（透明平面基板を水平に置いた際、金属突起の先端部から誘電体からなる層の表面までの垂直方向の距離とする。）は、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、３０ｎｍ以下が好ましく、１０〜２０ｎｍがより好ましい。また、電場増強の観点からは、２００ｎｍ〜１ｍｍが好ましく、電場増強効果の安定性の
観点からは、４００〜１,６００ｎｍが好ましい。本発明のプラズモン励起センサが、今
後、大量生産される際、該センサが有する誘電体からなる層の厚さが変動することが想定され、特に４００ｎｍ以上の厚さを有すると共鳴角の変動が一層大きくなる可能性があるため、測定の安定性を確保する目的から、誘電体からなる層の厚さとして、特に１０〜２０ｎｍが好ましい。
【００８１】
＜プラズモン励起センサの製造方法＞
本発明のプラズモン励起センサを製造する方法として、例えば、以下の製造方法（Ｉ）〜（ＩＩＩ）などが挙げられる。ただし、本発明は、これら製造方法に限定されるものではない。
【００８２】
〔製造方法（Ｉ）〕
本発明のプラズモン励起センサの製造方法（Ｉ）は、下記工程（ｉ）〜（ｉｘ）を含むことが好ましい。
【００８３】
工程（ｉ）：シリコン製または石英製の基板の一方の表面にレジスト用樹脂を塗布し、該レジスト用樹脂を光照射することによって、金属突起底面の形状にくりぬいたマスクパターンを形成する工程、
工程（ｉｉ）：該工程（ｉ）で得られたマスクパターンの上からウェットエッチングを施すことによって、金属突起の形状に対応する溝を形成する工程、
工程（ｉｉｉ）：該工程（ｉ）で得られたマスクパターンを除去し、該工程（ｉｉ）で得られた溝にアクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂を満たし、その上から透明平面基板を乗せ、該透明平面基板の上から光照射し、アクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂を硬化させることによって樹脂型を形成する工程、
工程（ｉｖ）：該工程（ｉｉｉ）で得られた樹脂型からシリコン製または石英製の基板を外し、アクリル系樹脂またはエポキシ系樹脂からなる突起の表面に金属からなる薄膜を形成することによって金属突起を有するホットサイト基板を得る工程、
工程（ｖ）：該工程（ｉｖ）で得られたホットサイト基板が有する金属突起の表面に誘電体からなる層を形成する工程、
工程（ｖｉ）：該工程（ｖ）で得られた誘電体からなる層の、金属突起とは接していないもう一方の表面にレジスト用樹脂を塗布し、レジスト用樹脂を光照射することによって、誘電体からなる層の所望する形状にくりぬいたマスクパターンを形成する工程、
工程（ｖｉｉ）：該工程（ｖｉ）で得られたマスクパターンの上からドライエッチングを施すことによって、金属突起の先端部近傍を被覆するように誘電体からなる層を形成したセンサ基板を得る工程、
工程（ｖｉｉｉ）：該工程（ｖｉｉ）で得られたセンサ基板が有する誘電体からなる層の略平坦となっている表面にＳＡＭを形成する工程、および
工程（ｉｘ）：該工程（ｖｉｉｉ）で得られたＳＡＭの表面にリガンドを固定化する工程。
【００８４】
〔製造方法（ＩＩ）〕
本発明のプラズモン励起センサの製造方法（ＩＩ）は、上記工程（ｉ）〜（ｉｖ）、下記工程（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）および上記工程（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）を含むことが好ましい。
【００８５】
工程（ｘ）：上記（ｉｖ）で得られたホットサイト基板の金属突起が形成されている一方の表面に対して、垂直方向を基準として１０〜６０度傾いた方向から誘電体を蒸着することによって、誘電体からなる層を形成する工程、
工程（ｘｉ）：該工程（ｘ）で得られたセンサ基板の、誘電体からなる層の金属突起とは接していないもう一方の表面を、光硬化性樹脂によって被覆し、該樹脂を光照射により
硬化させることによって被覆層を形成する工程、
工程（ｘｉｉ）：該工程（ｘｉ）で得られた被覆層の表面を、ケミカルメカニカルエッチングを施すことによって化学機械研磨（ＣＭＰ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）し、誘電体からなる層を露出させる工程、および
工程（ｘｉｉｉ）：該工程（ｘｉｉ）において誘電体からなる層を露出させたセンサ基板の被覆層のみを除去することによって、金属突起の先端部近傍を被覆するように誘電体からなる層を形成したセンサ基板を得る工程。
【００８６】
〔製造方法（ＩＩＩ）〕
本発明のプラズモン励起センサの製造方法（ＩＩＩ）は、ワイヤグリッド偏光子作製法を利用したものであって、下記工程（ｘｉｖ）〜（ｘｖｉ）および上記工程（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）を含むことが好ましい。
【００８７】
工程（ｘｉｖ）：アルミニウムからなる薄膜の一方の表面に、順に誘電体からなる層およびレジスト用樹脂からなる層を形成する工程、
工程（ｘｖ）：該工程（ｘｉｖ）で得られたレジスト用樹脂からなる膜を光照射することによって、金属突起底面の形状にくりぬいたマスクパターンを形成する工程、および
工程（ｘｖｉ）：該工程（ｘｖ）で得られたマスクパターンの上から、ウェットエッチングまたはドライエッチングを施し、該マスクパターンを除去することによって、センサ基板を得る工程。
【００８８】
これら製造方法（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のうち、金属突起の先端部近傍を被覆するように形成した誘電体からなる層の化学機械研磨（ＣＭＰ）による平坦化が容易なことから、製造方法（ＩＩ）が好ましい。
【００８９】
以下、各工程について図３〜５を用いて詳細に説明する。
【００９０】
（工程（ｉ））
工程（ｉ）とは、図３（２）に示すように「シリコン製または石英製の基板２１」の一方の表面に「レジスト用樹脂」を塗布し、該レジスト用樹脂を光照射する（すなわち、紫外光（ＵＶ光）または電子線を照射する。）ことによって、金属突起底面の形状にくりぬいた「マスクパターン２２」を形成する工程である。
【００９１】
「シリコン製または石英製の基板２１」が特にシリコン製である場合、レジスト用樹脂を塗布する表面は、異方性エッチングする観点から（１，０，０）面が好ましい。
【００９２】
「レジスト用樹脂」としては、例えば、電子線レジストの場合、日本ゼオン（株）製の「ＺＥＰ５２０Ａ」、東京応化工業（株）製の「ＯＥＢＲ１００」などの市販品が好適である。
【００９３】
「マスクパターン２２」を形成する際、紫外光（ＵＶ光）を照射する場合、紫外光を透過しない金属性のマスクであるレクチルを用い、または電子線を照射する場合、スキャニングすることが好ましい。
【００９４】
（工程（ｉｉ））
工程（ｉｉ）とは、図３（３）に示すように、上記工程（ｉ）で得られたマスクパターン２２の上から「ウェットエッチング」を施すことによって、金属突起の形状に対応する溝を形成する工程である。
【００９５】
「ウェットエッチング」は、基板２１がシリコン製である場合、例えば、ＴＭＡＨ（Ｔ
ｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ；水酸化テトラメチルアンモニウム）水溶液など、基板２１が石英製である場合、例えば、ＢＨＦ（バッファードフッ酸）などを用いて行うことができる。
【００９６】
（工程（ｉｉｉ））
工程（ｉｉｉ）とは、上記工程（ｉ）で得られた「マスクパターン２２」を除去し、図３（４）に示すように上記工程（ｉｉ）で得られた溝に「アクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂２３０」を満たし、図３（５）に示すようにその上から「透明平面基板２４」を乗せ、該透明平面基板の上から紫外線（ＵＶ）照射し、アクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂を硬化させることによって樹脂型（図３（５）の２３および２４の複合体）を形成する工程である。
【００９７】
「マスクパターン２２」を除去する方法としては、例えば、ＵＶ照射法、酸素アッシング法、ＵＶオゾン法等のドライプロセス法；各種溶剤用いるウェットプロセス法などが挙げられる。これら方法は、適宜選択することができ、本発明は特に限定されないが、本発明のプラズモン励起センサを量産する場合、大量にバッチ処理することができるウェットプロセス法が好ましく、処理の容易性という観点からは、ドライプロセス法が好適である。
【００９８】
「アクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂２３０」は、紫外線を照射することによって硬化し、アクリル系樹脂またはエポキシ系樹脂２３となるものであって、市販品として、例えば、東洋合成工業（株）製の「ＰＡＫ−０１」などが好適である。
【００９９】
「透明平面基板２４」は、上述したものと同様のものを用いることが望ましい。
【０１００】
（工程（ｉｖ））
工程（ｉｖ）とは、図３（６）に示すように、上記工程（ｉｉｉ）で得られた樹脂型からシリコン製または石英製の基板２１を外し、アクリル系樹脂またはエポキシ系樹脂２３からなる突起の表面に「金属からなる薄膜２５」を形成することによって金属突起を有する「ホットサイト基板２６」を得る工程である。
【０１０１】
「金属からなる薄膜２５」は、上述したものと同様にして形成することができる。
【０１０２】
「ホットサイト基板２６」とは、すなわち、透明平面基板２４と、該基板２４の一方の表面に形成された複数個の突起を有するアクリル系樹脂２３からなる層と、該層の、該基板２４とは接していないもう一方の表面に形成された金属からなる薄膜２５とからなるものであり、金属からなる薄膜２５で被覆された突起を金属突起という。
【０１０３】
（工程（ｖ））
工程（ｖ）とは、図３（７）に示すように、上記工程（ｉｖ）で得られたホットサイト基板が有する金属突起の上に「誘電体からなる層２７」を形成する工程である。
【０１０４】
「誘電体からなる層２７」の誘電体の好ましい態様は上述したものと同様である。
【０１０５】
「誘電体からなる層２７」の形成方法としては、例えば、材料としてメチルシルセスキシオキサン（ＭＳＱ）を用いる有機ＳＯＧ（Ｓｐｉｎ  Ｏｎ  Ｇｌａｓｓ）または無機ＳＯＧにより形成する方法などが挙げられる。
【０１０６】
（工程（ｖｉ））
工程（ｖｉ）とは、図３（８）に示すように、上記工程（ｖ）で得られた誘電体からな
る層２７の、金属突起とは接していないもう一方の表面に「レジスト用樹脂」を塗布し、該レジスト用樹脂を光照射することによって、「誘電体からなる層の所望する形状」にくりぬいたマスクパターン２２を形成する工程である。
【０１０７】
「レジスト用樹脂」は、上述したものと同様のものを用いることができる。
【０１０８】
誘電体からなる層も上述した通りであり、「誘電体からなる層の所望する形状」は、略円形状であっても略正方形状であってもよい。
【０１０９】
（工程（ｖｉｉ））
工程（ｖｉｉ）とは、図３（９）に示すように、上記工程（ｖｉ）で得られたマスクパターン２２の上から「ドライエッチング」を施すことによって、金属突起の先端部近傍を被覆するように誘電体からなる層２７を形成した「センサ基板２８」を得る工程である。
【０１１０】
「ドライエッチング」を施す装置として、例えば、ＲＩＥ（平行平板型）プラズマエッチング装置、ＩＣＰ（誘導結合型）プラズマエッチング装置などが挙げられる。
【０１１１】
これらの装置を用いてＳｉＯ2（誘電体からなる層２７）をドライエッチングする際、
通常フルオロカーボン系（ＣＦ系）のエッチングガスを使用する。このエッチングガスを真空中で分解させることによって生成したイオンがＳｉＯ2と反応し、ＳｉＯ2をエッチングすることができる。なお、イオンの生成と同時にフッ素ラジカルも生成し、フッ素ラジカルもＳｉＯ2をエッチングすることができるが、ＳｉＯ2のみならずマスクパターン２２をもエッチングするおそれがあることから、フッ素ラジカルの生成を抑える（すなわち、イオン／フッ素ラジカルの比を大きくする。）ことが好ましい。
【０１１２】
ＩＣＰプラズマエッチング装置は、バイアス電力制御によってエッチャントイオンを加工対象に引き込むエネルギーを制御できることから、ＲＩＥプラズマエッチング装置よりパラメータの選択性に優れている。ただし、ＩＣＰプラズマエッチング装置は、ＲＩＥプラズマエッチング装置より電子密度が高く（すなわち、解離率（電離率）が高い。）、ＳｉＯ2をドライエッチングする際、必要以上にフッ素ラジカルが発生するおそれがあるこ
とから、ＲＩＥプラズマエッチング装置を用いることが好ましい。
【０１１３】
「センサ基板」とは、すなわち、ホットサイト基板２６と、該ホットサイト基板２６が有する金属突起の先端部近傍を被覆するように形成された誘電体からなる層２７とからなるものである。
【０１１４】
（工程（ｖｉｉｉ））
工程（ｖｉｉｉ）とは、上記工程（ｖｉｉ）で得られたセンサ基板が有する誘電体からなる層の略平坦となっている表面に「ＳＡＭ」を形成する工程である。
【０１１５】
「ＳＡＭ」（自己組織化単分子膜）は、上述した通りである。
【０１１６】
ＳＡＭを形成する方法としては、金属突起同士の間（谷部）には誘電体からなる層が形成されていないことから、上述したＳＡＭの形成方法の（Ｃ）インクジェット法または（Ｄ）斜めから吹付けるか、または蒸着する方法が好ましい。
【０１１７】
（工程（ｉｘ））
工程（ｉｘ）とは、上記工程（ｖｉｉｉ）で得られたＳＡＭの表面に「リガンド」を固定化する工程である。
【０１１８】
「リガンド」は、上述した通りである。
【０１１９】
リガンドの固定化方法としては、例えば、リガンドが有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記「ＳＡＭ」を形成するシランカップリング剤が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
【０１２０】
（工程（ｘ））
工程（ｘ）とは、図３（６）に示すように上記（ｉｖ）で得られたホットサイト基板２６の金属突起が形成されている一方の表面に対して、垂直方向を基準として１０〜６０度傾いた方向（金属突起の形状、大きさ、該突起の配置の粗密などによって所望する角度を選択できる。）から「誘電体」を蒸着することによって、図４（１）に示すような「誘電体からなる層２７」を形成する工程である。
【０１２１】
「誘電体」および「誘電体からなる層２７」は上述した通りであるが、図４（１）に示すように、誘電体からなる層２７は金属突起の先端部および谷部にのみ形成され、図３（７）に示すように、金属突起は誘電体からなる層２７に埋没すような態様とは明らかに異なる。
【０１２２】
（工程（ｘｉ））
工程（ｘｉ）とは、図４（２）に示すように、上記工程（ｘ）で得られたセンサ基板の、誘電体からなる層２７の金属突起とは接していないもう一方の表面を、「光硬化性樹脂」によって被覆し、該樹脂を光照射により硬化させることによって「被覆層２９」を形成する工程である。
【０１２３】
「光硬化性樹脂」は、紫外線などの光によって硬化し、その後容易に除去できるものであれば、特に限定されず、上述のアクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂であってもよい。
【０１２４】
「被覆層」の厚さは、特に限定されるものではなく、誘電体からなる層２７を完全に埋没できる厚さであればよい。
【０１２５】
（工程（ｘｉｉ））
工程（ｘｉｉ）とは、図４（３）に示すように、上記工程（ｘｉ）で得られた被覆層２９の、誘電体からなる層２７とは接していないもう一方の表面を、化学機械研磨（ＣＭＰ）、またはドライエッチングもしくはウェットエッチングを施すことによって「誘電体からなる層２７を露出」させる工程である。
【０１２６】
研磨によって「誘電体からなる層２７を露出」させる程度は、金属突起の先端部近傍に形成された誘電体からなる層２７が露出し始め、露出した誘電体からなる層２７の面積が１，０００〜４０，０００ｎｍ2、かつ金属突起の底面積の１／１００〜１／１０の範囲
を満たすか、または誘電体からなる層２７の厚さが１０〜２０ｎｍとなるときに、研磨を停止することが好ましい
（工程（ｘｉｉｉ））
工程（ｘｉｉｉ）とは、図４（４）に示すように、上記工程（ｘｉｉ）において誘電体からなる層２７を露出させたセンサ基板の「被覆層２９のみを除去」することによって、金属突起の先端部近傍を被覆するように誘電体からなる層２７を形成したセンサ基板３０を得る工程である。
【０１２７】
「被覆層２９のみを除去」する方法として、例えば、（１）メチルエチルケトンで溶解させる、（２）酸素アッシング（ドライエッチング）を施す、（３）ＵＶオゾン洗浄を施すことなどが挙げられる。これらのうち、短時間のバッチ処理が容易なことから、（１）が好適である。
【０１２８】
（工程（ｘｉｖ））
工程（ｘｉｖ）とは、「アルミニウムからなる薄膜」の一方の表面に、順に「誘電体からなる層２７」および「レジスト用樹脂」からなる層を形成する工程である。
【０１２９】
「アルミニウムからなる薄膜」は、アルミニウム以外の金属を用いて薄膜を形成することもできるが、アルミニウム以外の金属よりアルミニウムの方がエッチングにおける腐食性が高いことから、アルミニウムが特に好ましい。ただし、アルミニウムを用いる場合、アルゴンなどの不活性ガスを使用して物理的にエッチングする際、選択比（＝アルミニウムのエッチング量／マスクパターンのエッチング量）が小さいことがあるので、マスクパターンをより厚く形成することが好ましい。
【０１３０】
「誘電体からなる層２７」および「レジスト用樹脂」は、上述した態様と同様である。
【０１３１】
なお、図５（１）に示すように、誘電体からなる層２７とレジスト用樹脂からなる層２２０との間に、クロムからなる層３１を設けてもよい。
【０１３２】
これらの層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりこれらの層を形成することが好ましい。
【０１３３】
それぞれの層の好ましい厚さは、誘電体からなる層２７：１０〜２０ｎｍ、クロムからなる層３１：５０〜５，０００ｎｍ（クロムはエッチング耐性に優れているのでレジスト用樹脂からなる層２２０の半分程度が好ましい。）、およびレジスト用樹脂からなる層２２０：１００〜１０，０００ｎｍ（アルミニウムからなる薄膜と同程度またはそれ以上の厚さを有することが好ましい。）である。
【０１３４】
（工程（ｘｖ））
工程（ｘｖ）とは、上記工程（ｘｉｖ）で得られたレジスト用樹脂からなる膜を光照射することによって、金属突起底面の形状にくりぬいたマスクパターン２２を形成する工程である。
【０１３５】
なお、図５（２）には、工程（ｘｖ）のクロムからなる層３１を設けた態様を示す。
【０１３６】
（工程（ｘｖｉ））
工程（ｘｖｉ）とは、上記工程（ｘｖ）で得られたマスクパターン２２の上から、「ウェットエッチング」または「ドライエッチング」を施し、該マスクパターン２２を除去することによって、センサ基板を得る工程である。
【０１３７】
クロムからなる層３１を設けた場合、工程（ｘｖｉ）は、図５（３）に示すように、上記工程（ｘｖ）で得られたマスクパターン２２の上からドライエッチングを施すことによって、クロムからなる層３１からマスクパターンを形成し、図５（４）に示すように、さらに該マスクパターン２２の上からウェットエッチングドまたはライエッチングを施し、該マスクパターン２２を除去することによって、金属突起３３の先端部近傍を被覆するよ
うに誘電体からなる層２７を有するセンサ基板３４を得る工程である。
【０１３８】
「ウェットエッチング」および「ドライエッチング」は、適宜選択することができるが、ナノレベルの加工の場合、微細加工に有利なドライエッチングが好適である。
【０１３９】
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含み、好ましくはさらに洗浄工程を含むことを特徴とするものである。
【０１４０】
工程（ａ）：上述したプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程。
【０１４１】
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程。
【０１４２】
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。
【０１４３】
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【０１４４】
洗浄工程：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面および／または該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程。
【０１４５】
〔工程（ａ）〕
工程（ａ）とは、上述したプラズモン励起センサに、「検体」を「接触」させる工程である。
【０１４６】
（検体）
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。
【０１４７】
（接触）
「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【０１４８】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる角筒状または円筒（管）状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は円筒（管）状を有することが好ましい。
【０１４９】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【０１５０】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観
点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【０１５１】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【０１５２】
工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、または別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【０１５３】
このような「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１５４】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【０１５５】
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【０１５６】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
【０１５７】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎ
である。
【０１５８】
（洗浄工程）
洗浄工程とは、下記工程（ｂ）の前および／または後に含まれることが好ましく、上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面および／または下記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。
【０１５９】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【０１６０】
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
【０１６１】
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１６２】
〔工程（ｂ）〕
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン
励起センサに、さらに、「該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」を反応させる工程である。
【０１６３】
（蛍光色素）
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【０１６４】
本発明で用いられる「蛍光色素」は、特に限定されず、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【０１６５】
このような「蛍光色素」としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５
６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることがで
きる。
【０１６６】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【０１６７】
【表１】
2010256161.tif 000003
【０１６８】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【０１６９】
（リガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。ただし、本発明のプラズモン励起センサに固定化されているリガンドとして用いる１次抗体抗がポリクローナル抗体である場合、２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【０１７０】
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合するアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
【０１７１】
「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の作製方法としては、リガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【０１７２】
このように作製された「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても
異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.０
０１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００）μｇ／ｍＬがより好ましい。
【０１７３】
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
【０１７４】
〔工程（ｃ）〕
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られた「プラズモン励起センサ」に、上記透明基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１７５】
レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１７６】
「レーザ光」としては、例えば、波長４００〜８４０ｎｍ、入射光量として１ｍＷ程度のＬＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの固体レーザおよびガスレーザなどが挙げられる。これらのうち、小型かつ安価であることからＬＤが好ましい。
【０１７７】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記「透明基板」と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。また、プリズムは、プラスチックなども含む誘電体からなる。
【０１７８】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
【０１７９】
「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１８０】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【０１８１】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１８２】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１８３】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが
、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１８４】
〔工程（ｄ）〕
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
【０１８５】
より具体的には、工程（ｄ）は、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原量もしくは標的抗体）量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１８６】
（アナライト）
「アナライト」としては、上記「ＳＡＭ」に固定化されたリガンドに特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【０１８７】
（アッセイＳ／Ｎ比）
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）の前に測定した“ブランク蛍光シグナル”、上記工程（ｃ）で得られた“アッセイ蛍光シグナル”、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＲを測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる。
【０１８８】
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜／（初期ノイズ）
＜装置＞
本発明の装置は、少なくとも、上記プラズモン励起センサを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とするものである。
【０１８９】
「装置」としては、例えば、レーザ光の光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光（ＳＰＦＳ）検出部を含むものとし、検体液、洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、センサチップと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１９０】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１９１】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
【０１９２】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精
度が高く脈動が少ないが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【０１９３】
＜アッセイ用キット＞
本発明のアッセイ用キットは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された複数個の金属突起と、該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭ（自己組織化単分子膜）とからなり、上記プラズモン励起センサに用いられるプラズモン励起センサ用基板を、少なくとも含むことを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、１次抗体や抗原などのリガンド、検体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１９４】
例えば、本発明のアッセイ用キットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１９５】
このような「アッセイ用キット」としては、具体的に、透明平面基板の一方の表面に複数個の金属突起を形成し、該突起の先端部近傍を被覆するように形成されたＳＡＭからなるプラズモン励起センサ用基板；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。
【０１９６】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１９７】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【０１９８】
［作製例１］
まず、シリコン製基板の一方の表面（（１，０，０）面）に、レジスト用樹脂を塗布し、その上から光照射することによって略円形状にくりぬいたマスクパターンを形成した。マスクパターンの上からウェットエッチングを行い、略円錐形の溝を形成した。このシリコン製基板にアクリル系光硬化性樹脂である「ＰＡＫ−０１」（東洋合成工業（株）製）を満たし、透明平面基板として光学ガラスである「ＢＫ７」（ショット日本（株）製）で蓋をして光硬化により樹脂型を作製した。樹脂型を蒸着装置に入れて５０ｎｍの膜厚で金蒸着を行い１山突起タイプの金属突起を有するホットサイト基板を作製した。
【０１９９】
得られた基板は、１０ｍｍ×１０ｍｍの面積を有し、ガラス厚が０．１ｍｍ、樹脂厚５０μｍ、金薄膜の厚さが５０ｎｍ、金属突起部の直径が２００ｎｍ、アスペクト比２の略円錐が間隔２００ｎｍで前後左右に配列したアレイ構造となっている。
【０２００】
次に、得られた基板にスピンコータで、材料としてメチルシルセスキシオキサン（ＭＳＱ）を用いて、有機ＳＯＧにより金薄膜の上にＳｉＯ2を底面から４１０ｎｍの膜厚で形
成した。フォトレジストで金薄膜の突起部構造に合わせてマスクパターンを形成し、ドライエッチングによりマスクパターン以外の部分をエッチングして基板の金属突起部に略平面の誘電体からなる層を形成することによって、センサ基板を得た。なお、誘電体からなる層の厚さは約０．０１μｍであった。
【０２０１】
続いて、センサ基板の上に、３−アミノプロピルトリエトキシシランを５重量％含む水溶液をスピンコータで塗布し、室温で２時間自然乾燥させた後、５０℃で１０分間加熱してリガンドを固定化するためのＳＡＭを形成することによって、ＳＡＭを有するセンサ基板を作製した。
【０２０２】
［作製例２］
作製例１で得られたホットサイト基板を蒸着装置内で水平面から３０度の角度で傾斜させて固定し、蒸着でＳｉＯ2膜を形成した。得られたＳｉＯ2膜は金属突起部と平坦部とに形成された構造を有する。さらに、アクリル系光硬化性樹脂「ＰＡＫ−０１」（東洋合成工業（株）製）で被覆膜を形成した。この膜厚は５００ｎｍであった。ケミカルメカニカルエッチングにより表面を研磨してＳｉＯ2の最表面を略平坦に加工した。
【０２０３】
被覆膜をメチルエチルケトンで溶解し、金属突起部に略平坦の誘電体からなる層を形成することによってセンサ基板を作製した。
【０２０４】
なお、作製例１および２で得られたセンサ基板が有する誘電体からなる層の平坦性を、走査型プローブ顕微鏡(Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＰＭ)（エスアイアイナノテクノロジー社製「Ｎａｎｏ  Ｎａｖｉ  ステーション」）を用いて以下の基準により評価した。
【０２０５】
○：平坦部の傾き範囲が、０度（水平）〜１５度である。
【０２０６】
△：平坦部の傾きの範囲が、１５度を超え３０度以内である。
【０２０７】
×：平坦部の傾きの範囲が、３０度を超える。
【０２０８】
得られた結果を表２に示す。
【０２０９】
【表２】
2010256161.tif 000004
【０２１０】
［作製例３］
作製例１において、ウェットエッチングにより略円錐形の溝を形成しなかった以外は作製例１と同様にして、ＳＡＭを有するセンサ基板を作製した。
【０２１１】
［作製例４］
作製例１において、ドライエッチングを行わなかった以外は作製例１と同様にして、ＳＡＭを有するセンサ基板を作製した。
【０２１２】
［作製例５］
ビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識ＨｉＬｙｔｅ
Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＮＡＳＰＥＣ，ＩＮＣ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。
【０２１３】
次に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０２１４】
なお、作製例１〜４で得られた、ＳＡＭを有するセンサ基板それぞれを用いて、以下のようにして電場増強度を求めた。
【０２１５】
ＳＡＭを有するセンサ基板に、（縦）２ｍｍ×（横）１０ｍｍの穴を有する、外形が（縦）１０ｍｍ×（横）２０ｍｍ、（厚さ）０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製スペーサを設け、流路を配置した。そして、流路の外側から基板を覆うように厚さ４ｍｍで同外形のポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。超純水をペリスタポンプにより、３０℃、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。ここで、光源として波長６３３ｎｍのレーザ光を照射し、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を用いてフォトン量を調節し、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを通して、流路に固定されたセンサ基板に照射し、フォトダイオードを受光センサとしてＳＰＲの測定を開始した。最大共鳴角に光源と受光センサを固定した後、電場増強度を測定した。電場増強測定に用いた光学系は、カットフィルタとして（日本真空光学社製）、集光レンズとして２０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）、ＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツールメント社製）である。
【０２１６】
表面プラズモンにおける電場増強は、観測できない非伝播光であるから、蛍光色素液を流して観測した。蛍光色素としてＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＮＡＳＰＥＣ，ＩＮＣ社製）１μgを１０ｍｌのＰＢＳバッファーに溶解した溶液をペリスタ
ポンプで流速５０μＬ／ｍｉｎの速度で循環させた。
【０２１７】
電場増強度を測定するにあたり、電場増強がないブランクとして通常の伝播光である励起光を金属表面に照射させて蛍光色素溶液の測定を行った。ＳＰＦＳによる蛍光を検出して下記式により電場増強度を求めた。
【０２１８】
電場増強度＝｛（蛍光色素を流した時の増強非伝播光でのシグナル）−（初期ノイズ）｝/｛（蛍光色素を流した時の伝播光でのシグナル）−（初期ノイズ）｝
なお、蛍光色素を流す前の超純水フロー状態でのシグナルを「初期ノイズ」とした。
【０２１９】
得られた結果を表３に示す。
【０２２０】
【表３】
2010256161.tif 000005
【０２２１】
［実施例１］
作製例１で得られた、ＳＡＭを有するセンサ基板に、送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを３０分間、ペリスタポンプにより、３０℃、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。送液の総量は１５ｍＬである。
【０２２２】
さらに、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ添加し（終濃度はそれぞれＮＨＳ：５０ｍＭ、ＷＳＣ：１００ｍＭ）、２０分間循環させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）４０μＬを２時間循環させて、抗ＡＦＰ抗体をセンサ基板に固定化した。表面プラズモンで共鳴角のシフトを測定し、リガンドの固定化を確認した。固定化量は５ｎｇ／ｍｍ2
であった。また、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異吸着防止処理を行った。
【０２２３】
（アッセイ法の実施）
工程（ａ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。
【０２２４】
洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＰＢＳを送液として、１０分間循環さ
せることによって洗浄した。
【０２２５】
工程（ｂ）：作製例５で得られたＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体を１,０００ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを５ｍＬ添加し、３０分間
循環させた。
【０２２６】
洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＰＢＳを送液として２０分間循環させ
ることによって洗浄した。
【０２２７】
工程（ｃ）：洗浄開始から２０分後のＣＣＤから観察したときのＳＰＦＳシグナル値を計測し「アッセイ蛍光シグナル」とした。なお、金基板に何も修飾していないもう一方の流路をＳＰＦＳに別途設置し、超純水を流しながら表面プラズモン測定を元に共鳴角を再設定し、ＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを「ブランク蛍光シグナル」とした。
【０２２８】
下記式から「アッセイＳ／Ｎ比」を評価した。アッセイＳ／Ｎ比は、抗原量に比例するコンジュゲート量により変化するアッセイ蛍光シグナルの数値の絶対値が大きく、かつブランク蛍光シグナルに対して数値的に充分大きい場合、アッセイシグナルの信頼性が高いことを意味する。なお、蛍光色素を流す前の超純水フロー状態でのシグナルを「初期ノイズ」とした。
【０２２９】
アッセイＳ／Ｎ比＝｛（アッセイ蛍光シグナル）−（初期ノイズ）｝／｛（ブランク蛍光シグナル）-（初期ノイズ）｝
得られた結果を表４に示す。
【０２３０】
［比較例１］
実施例１において、作製例１で得られた、ＳＡＭを有するセンサ基板の代わりに、作製例３で得られた、ＳＡＭを有するセンサ基板を用いた以外は、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。
【０２３１】
得られた結果を表４に示す。
【０２３２】
［比較例２］
実施例１において、作製例１で得られた、ＳＡＭを有するセンサ基板の代わりに、作製例４で得られた、ＳＡＭを有するセンサ基板を用いた以外は、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。
【０２３３】
得られた結果を表４に示す。
【０２３４】
【表４】
2010256161.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０２３５】
本発明のプラズモン励起センサを用いるアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【符号の説明】
【０２３６】
１・・・・・・・・・ＳＡＭ
２・・・・・・・・・リガンド
３・・・・・・・・・アナライト
４・・・・・・・・・リガンド２と同じであっても異なっていてもよいリガンド
５・・・・・・・・・蛍光色素
２１・・・・・・・・・シリコン製または石英製の基板
２２０・・・・・・・・レジスト用樹脂からなる層
２２・・・・・・・・・マスクパターン
２３０・・・・・・・・アクリル系またはエポキシ系の光硬化性樹脂
２３・・・・・・・・・アクリル系樹脂またはエポキシ系樹脂
２４・・・・・・・・・透明平面基板
２５・・・・・・・・・金属からなる薄膜
２６・・・・・・・・・ホットサイト基板
２７・・・・・・・・・誘電体からなる層
２８，３０，３４・・・センサ基板
２９・・・・・・・・・被覆層
３１・・・・・・・・・クロムからなる層
３２・・・・・・・・・アルミニウムからなる薄膜
３３・・・・・・・・・金属突起
【図１】
2010256161.tif 000007
【図２】
2010256161.tif 000008
【図３】
2010256161.tif 000009
【図４】
2010256161.tif 000010
【図５】
2010256161.tif 000011
【図６】
2010256161.tif 000012