(57)【要約】【課題】鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際に有用な新規組成物及び方法を提供する。【解決手段】高分子材料からなる反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれ、試料中の核酸をＤＮＡポリメラーゼと接触させポリメラーゼ連鎖反応により増幅する方法において、増幅試薬にアルブミンおよび／又はＤＭＳＯが含まれていることを特徴とする核酸増幅方法【選択図】  図１
2010200660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子材料からなる反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれ、試料中の核酸をＤＮＡポリメラーゼと接触させポリメラーゼ連鎖反応により増幅する方法において、増幅試薬にアルブミンおよび／又はＤＭＳＯが含まれていることを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
増幅試薬に含まれるＤＭＳＯの濃度が２．５〜１２．５％（ｖ／ｖ）である請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
増幅試薬に含まれるアルブミンの濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）である請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
通気性フィルターが装着されたパーツが、高分子材料からなる反応容器と着脱可能である請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
高分子材料が熱可塑性樹脂である請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
熱可塑性樹脂が、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂または２種以上のポリマーアロイまたは２種以上のポリマーブレンドである請求項５記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
着脱可能なパーツがピペットチップである請求項４記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際に有用な新規組成物及び方法に関する。本発明は、具体的にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な新規組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸類の検出、分析、転写及び増幅は、現代の分子生物学において最も重要な操作法である。ＤＮＡ分析のためにそのような操作法の適用は、遺伝子発現の研究、伝染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）又は遺伝病の診断、ｃＤＮＡの生成及びレトロウイルス類の分析等においてとりわけ重要である。
【０００３】
ＤＮＡの増幅に用いられるＰＣＲは、当分野においては周知の技術である。具体的には、ＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及びＤＮＡ合成酵素の存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４  （６０９３），  １３−１９（１９８６））（非特許文献１）。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅のために好ましい反応条件は、熱循環（ｔｈｅｍｏｃｙｃ１ｉｎｇ）、即ちＰＣＲサイクルの各々のステップを達成させるために、反応混合物の温度を変化させることである。熱循環は、約２３℃〜約１００℃の間、好ましくは約３７℃〜約９５℃の間の温度範囲で行う。核酸変性は、約９０℃〜約１００℃の間、好ましくは約９５℃において通常行う。アニーリングは、約３７℃〜約７５℃の間、好ましくは約６０℃において通常行う。ＤＮＡの伸長は、約５５℃〜約８０℃の間、好ましくは約６５〜７２℃において通常行う。サイクリング数は、所望のＤＮＡ生成物の量により大きく異なる。ＰＣＲサイクルの数は、好ましくは約５〜約９９の範囲であり、より好ましくは約２０サイクルより多く、最も好ましくは約２５〜５０サイクルである。
【０００４】
ＰＣＲ技術ははじめ、大腸菌などの常温菌由来のＤＮＡ合成酵素を用いて行われており、その成功率（実際に目的ＤＮＡが増幅する確率）は低いものであった。やがて、好熱菌由来の耐熱性ＤＮＡ合成酵素が利用されるようになり、自動的に温度サイクリングを行う機器も開発されＰＣＲ成功率が向上した。更に、ＰＣＲ成功率を向上させるため、使用するＤＮＡ合成酵素の改良、反応液組成の改良、サイクル温度条件の改良、温度サイクリング機器の性能向上、試薬の管理状態の改善など、多岐にわたり、ありとあらゆる改善がなされてきた。以上の結果、ＰＣＲ成功率は格段に向上したが、増幅に時間を要する課題が指摘されていた。
増幅時間を短縮する手段として、特許文献１および２には、変性反応などのための温度調整を行なう熱媒に空気などの気体を用いる装置が開示されている。具体的には、ヒーターで加熱した空気をＰＣＲ反応液の周囲に送り込むことで、それぞれの反応温度に調整している。これにより、ヒートブロック等を用いるより迅速に温度調整が可能になるとされている。
核酸増幅容器としては、キャピラリーサンプルチューブが用いられている。キャピラリーサンプルチューブは、ＰＣＲ反応液の貯留部位が極めて細く形成されているため、温度調整の時間を短縮することができる。
また、当該装置では、キャピラリーサンプルチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段も備えている。つまり、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用いれば、リアルタイムにＰＣＲの結果を確認することができる。
特許文献１および２に開示の装置のように、核酸増幅容器としてキャピラリチューブを用いる場合は、別途、遠心機によって試料などを充填する工程が必要となる。つまり、キャピラリチューブは液溜部が細いため、試料などを当該液溜部すなわち核酸増幅反応を行なうための反応部に充填するためには、注入口すなわち試料などを受け入れるための導入部に注いだ上で遠心機にかける工程が必要になり、当該工程を行なった上で、装置に搭載する必要がある。
このとき、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器では反応部の材質としてガラスを使用しているため、当該導入部に注いだ試料などを当該反応部に充填するための遠心の際に生じる遠心力によって核酸増幅容器が破損する可能性がある。遠心時の他にも、持ち運びなど通常の実験操作においても核酸増幅容器が破損する可能性がある。当該充填操作の際に核酸増幅容器が破損すると試料などを失うことになるため、例えば、患者から採取できる検体の量が限られている遺伝子診断の場合には、診断結果を得ることができない。
また、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器は、プラスチック製の導入部とガラス製の反応部を組み合わせた複雑な構造であるため、大量生産することが困難であり安価に供給することができない。
特許文献１および２に開示の装置では、核酸増幅反応の前に、別途、核酸増幅容器であるキャピラリチューブにキャップを装着する必要がある。これは、一旦増幅させた同種の核酸、すなわち増幅核酸断片のコンタミネーションを防止するために、従来、一般的に行なわれている対策であるが、それぞれのキャピラリチューブへのキャップの装着は、特にＰＣＲを行なうサンプルの数が多い場合には、大変煩雑な作業となる。
特許文献３には、蓋が一体的に設けられた検出容器に、試薬と、標的核酸を含むことが疑われる試料とを分注する分注手段と、検出容器への試薬および試料の分注が終了した後に、検出容器の蓋を閉める蓋閉手段と、蓋が閉められた検出容器内の標的核酸を増幅する増幅手段と、蓋が閉められた検出容器内の標的核酸の存在を検出する検出手段とを備えた装置が開示されている。つまり、当該装置では、自動的に、核酸増幅容器へ蓋を装着することができる。
特許文献３に開示の装置では、核酸増幅容器へ蓋を装着する作業を自動的に行なうための手段として、当該装置に、検出容器の蓋を蓋閉位置まで移動させる回動部材と、回動部材を上方向から下方向に押圧することにより蓋に上方向からの押圧力を加えて蓋の蓋閉動作を完了させる押圧部材とを含んでおり、押圧部材による上方向からの押圧力による蓋閉め動作により、検出容器の蓋閉め動作を行う。これは、コンタミネーションを防止するために、従来、一般的に行なわれている対策を自動化したものであるが、装置が大型化、複雑化するという問題を有する。また、特許文献３に開示の装置においても、特許文献１および２に開示の装置と同様に、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションを防止するための対策は開示されていない、すなわち、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、上記検体中に含まれる核酸が飛散する問題が解決されていない。
本課題に対し、特許文献４には、通気性フィルターを備えたピペットチップにて試薬を吸引し、該チップと勘合する容器に直接ピペットチップを装着させ、遠心操作を行うことによって、コンタミネーションを防止しつつ、簡便に溶液を容器内に移行させる方法が報告されている。
特許文献５および６には、ＰＣＲによって得られる二本鎖核酸に結合して蛍光を発する蛍光染料を用いて、当該蛍光を検出することで、迅速にＰＣＲの結果を確認する技術が開示されている。
特許文献７には、ＰＣＲによって得られる二本鎖核酸に結合する化合物と、当該化合物が当該二本鎖核酸に結合したときに発する蛍光が変化する反応分子で標識したプライマーとを用いるＩＦＰ法が開示されている。当該蛍光の変化を検出することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
特許文献８には、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプライマーを用いてＰＣＲを行なうＱ−Ｐｒｏｂｅ法が開示されている。これにより、当該蛍光の変化を確認することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４  （６０９３），  １３−１９（１９８６）
【非特許文献２】Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０００−５１１４３５号公報
【特許文献２】特表２０００−５１２１３８号公報
【特許文献３】特開２００５−９５１３４号公報
【特許文献４】特開２００８−２８９４７３号公報
【特許文献５】特開平５−１８４３９７号公報
【特許文献６】特開平１０−２１０４６４号公報
【特許文献７】特表２００３−５００００１号公報
【特許文献８】特開２００１−２８６３００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献４において、核酸増幅容器に直接、通気性フィルターを備えたピペットチップを装着させ、遠心操作を行うことによって、コンタミネーションを防止しつつ、簡便に溶液を容器内に移行させることができ、また、高分子材料からなるピペットチップを用いることで、容器が破損することなく簡便かつ迅速に遺伝子増幅を行うことが可能と考えられた。しかし、実際にそのような容器を用いた場合は、操作は簡便になるものの、全く増幅されない、あるいは不均一な増幅が観察される場合があることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まずその原因を解明すべく鋭意検討を重ねた結果、プラスチック容器を使用し、その容器上部を通気性フィルターが装着されたピペットチップで塞いだ場合、ディナチャリング（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ、変性）に必要な加熱を行うとＰＣＲ中に容器内で溶液が沸騰し十分な増幅が得られず、加温する温度を低下させると、乖離に必要な温度が得られず、結果として充分な増幅が得られないことを見出した。
【０００９】
次いで、本発明者らは、試薬にアルブミンとＤＭＳＯを添加することによって、高分子材料からなる反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれた核酸増幅容器の材質と形状を変えることなく、増幅性能が得られることを見出し本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下のような構成からなる。
［項１］
高分子材料からなる反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれ、試料中の核酸をＤＮＡポリメラーゼと接触させポリメラーゼ連鎖反応により増幅する方法において、増幅試薬にアルブミンおよび／又はＤＭＳＯが含まれていることを特徴とする核酸増幅方法。
［項２］
増幅試薬に含まれるＤＭＳＯの濃度が２．５〜１２．５％（ｖ／ｖ）である項１記載の核酸増幅方法。
［項３］
増幅試薬に含まれるアルブミンの濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）である項１記載の核酸増幅方法。
［項４］
通気性フィルターが装着されたパーツが、高分子材料からなる反応容器と着脱可能である項１記載の核酸増幅方法。
［項５］
高分子材料が熱可塑性樹脂である項１記載の核酸増幅方法。
［項６］
熱可塑性樹脂が、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂または２種以上のポリマーアロイまたは２種以上のポリマーブレンドである項５記載の核酸増幅方法。
［項７］
着脱可能なパーツがピペットチップである項４記載の核酸増幅方法。
【００１１】
特許３８８１００９号には、増幅試薬にアルブミン、ＤＭＳＯを添加することが記載されているが、いずれもＮＡＳＢＡ法への適用について述べられているに過ぎず、また、ＮＡＳＢＡ法にアルブミン、ＤＭＳＯを添加することにより、増幅反応にどのような影響を及ぼすかについては全く言及されていない。ましてや、ＮＡＳＢＡ法とは全く反応機構の異なるＰＣＲ法への適用、および、それによる影響については何ら言及されておらず、示唆もされていない。
さらに、特許３８８１００９号には、本願発明の高分子材料からなる反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれた核酸増幅容器の材質と形状を変えることなく、ＰＣＲ増幅性能が得られることに関し何ら言及されておらず、示唆もされていない。
【００１２】
特表２００５−５１２５７２号公報にはＤＭＳＯを添加する記載があるが、ソルビトールを添加することが必須とされている。本願ではソルビトールは必須の成分ではなく、また添加されるＤＭＳＯ濃度も本願発明より少なく、アルブミンが必須とされることに関しては何ら言及されておらず、示唆もされていない。さらにこれらの記載は、あくまでＰＣＲを実行するために適した温度コントロール下における反応改善を目的とした場合の例示に過ぎない。
特開２００４−１４１１０５号公報には、陰イオン性物質とＤＭＳＯの組み合わせおよび、反応改善剤としてＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、Ｐ  ＥＧ、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）２０，ＮＰ４０、エクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）、ポリオール類、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ＢＳＡが挙げられているが、あくまでＰＣＲを実行するために適した温度コントロール下における反応改善を目的とした場合の例示に過ぎない。
一方、本願発明は、不十分な温度コントロール条件下であっても、反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれた核酸増幅容器の材質と形状を変えることなく、増幅性能が得られることを目的に完成させたものであって、特開２００４−１４１１０５号公報には、この点に関し何ら言及されておらず、示唆もされていない。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、破損しにくく取り扱いが簡便であり、さらに簡易な構造で安価に大量生産することが可能な核酸増幅容器を用いた迅速かつ簡便な核酸増幅検出方法が提供される。
【００１４】
本発明により、簡易な操作で確実に核酸増幅反応液の飛散を防ぐことができるため、自動化が容易であり、簡易な構造の核酸増幅装置でコンタミネーションを予防することが可能な核酸増幅方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＤＭＳＯおよび牛血清アルブミンの添加による増幅反応への影響
【図２】ＤＭＳＯの添加による増幅反応への影響
【図３】牛血清アルブミンの添加による増幅反応への影響
【図４】ＤＭＳＯおよび牛血清アルブミンの両方を添加しない場合の増幅反応への影響
【図５】ＤＭＳＯ添加濃度の増幅反応への影響
【図６】牛血清アルブミン添加濃度の増幅反応への影響
【図７】他の有機溶媒の増幅反応への影響
【図８】本発明に核酸増幅方法に用いる、上部が通気性フィルターにより塞がれている高分子材料からなる反応容器
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一つの形態は、高分子材料からなる反応容器上部が通気性フィルターにより塞がれ、試料中の核酸をＤＮＡポリメラーゼと接触させポリメラーゼ連鎖反応により増幅する方法において、増幅試薬にアルブミンおよび／又はＤＭＳＯが含まれていることを特徴とする核酸増幅方法である。
【００１７】
本発明の核酸増幅方法は、試料中の核酸をＤＮＡポリメラーゼと接触させてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させる方法であり、種々の公知の方法に基づいて実施することが出来る。
また、本発明は、特許文献１および２に開示の装置など、種々の公知の核酸増幅装置に適用することができる。このような装置として、市販のものではロシュ社のライトサイクラーなどが例示できる。これらの装置においてＰＣＲにおける熱媒体は空気などが例示されるが、特に限定されない。
【００１８】
本発明に核酸増幅方法に用いる、上部が通気性フィルターにより塞がれている高分子材料からなる反応容器としては、特許文献４に記載の容器が例示できる。
【００１９】
当該容器を用いた核酸増幅方法について、さらに具体的に図８を用いて説明する。
図８において、まず、（Ａ）に示すような、通気性フィルター付き容器を用意する。容器と着脱可能なパーツとしてはピペットチップがその用途から好ましい形状である。ピペットチップとしては、化学反応のための溶液を保持させることが可能な性質を有していれば特に限定されないが、入手が容易であるという観点から、ピペットチップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器または自動分注装置に使用するために、市販されているピペットチップであることが好ましい。例えば、レイニン・インスツルメント社、ギルソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプティカ社などから市販されているマイクロピペット用のチップを使用することができる。また、従来公知の成型技術を用いれば、任意の形状のピペットチップを設計および作製することができ、上記ピペットチップとして使用することができる。
本発明で用いる反応容器は、通気性フィルターが装着された部分が着脱可能であっても良い。図８に示すピペットチップは（Ｄ）に示すように反応容器と着脱可能になっている。このピペットチップに、手動分注器または自動分注装置を用いて、（Ｂ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持する。当該ピペットチップを、手動または自動にて、（Ｃ）に示すように、核酸増幅容器まで移動させ、（Ｄ）に示すように、ピペットチップを核酸増幅容器に収納する。次に、ピペットチップを手動分注器または自動分注装置から取り外す。このとき、手動分注器または自動分注装置の分注機構から空気を吐出しながら、当該ピペットチップを取り外す動作を行なうことにより、当該動作の際に生じる圧力によってピペットチップに保持された溶液の位置が変化する現象を回避することもできる。
続いて、ピペットチップを装着した核酸増幅容器を遠心することにより、（Ｅ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる。このとき、遠心の代わりに空気圧を用いることにより、当該溶液を移動させることもできる。空気圧を用いる場合には、例えば、手動分注器または自動分注装置の分注機構を再度ピペットチップに装着し、空気を吐出することにより、ピペットチップに保持された溶液を押し出すことができる。
次に、（Ｅ）の状態のままで核酸増幅反応および増幅核酸断片の検出を行い、（Ｅ）の状態のままでピペットチップおよび核酸増幅容器を廃棄する。
【００２０】
反応容器の素材としては、熱可塑性樹脂が例示されるが融点が１００℃以上であれば特に限定されない。
熱可塑性樹脂としては、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂または２種以上のポリマーアロイまたは２種以上のポリマーブレンドが例示される。
好ましくはポリプロピレン、ポリスチレンが例示される。
【００２１】
ピペットチップが吸引することができる溶液の量は、ピペットチップに化学反応のための溶液を保持させることができれば特に限定されないが、例えば、核酸増幅反応では、０．５マイクロリットル以上１００マイクロリットル以下であることが好ましく、１マイクロリットル以上５０マイクロリットル以下であることがより好ましく、５マイクロリットル以上２０マイクロリットル以下であることがさらに好ましい。また、溶液の量は、ピペットチップが反応容器に収納された際に、当該ピペットチップの先端、すなわち吸入吐出口部位に溶液が接触しない量であることが好ましい。さらに好ましくはピペットチップ内部にコンタミネーションと同時に、反応溶液の蒸散を防止するための通気性フィルターを備えたピペットチップが用いられる。
通気性フィルターは、疎水性フィルターであることが好ましく、飛沫だけでなく、エアゾールの通過をも阻止し得る疎水性フィルターであることがより好ましい。このようなフィルターはとしては、従来公知の方法にて作製することが可能であるが、例えば、ポリエチレン製の基材からなる、フィルター孔の大きさが平均約２０ミクロンのフィルターを用いれば、エアゾールの通過によるコンタミネーションを好適に防止し得る。
【００２２】
本発明の方法に用いられる増幅試薬は、アルブミンまたはＤＭＳＯを含む。
アルブミンの添加濃度は特に限定されないが、好ましい下限０．０５％、より好ましい下限は０．１％である。好ましい上限は５％、より好ましくは２％である。
ＤＭＳＯの添加濃度は特に限定されないが、好ましい下限は２．５％、より好ましい下限は５％である。好ましい上限は１２．５％、より好ましい上限は１０％である。
本発明の方法に用いられる増幅試薬は、アルブミンおよびＤＭＳＯの両方を含んでいてもよい。その場合のそれぞれの添加濃度の組合せは特に限定されないが、上記範囲内の組合せであれば好ましい。
なお、上記において、％（ｖ／ｖ）は容量％、％（ｗ／ｖ）は重量％（１ｍｇ／ｍｌが０．１％）をそれぞれ意味する。
【００２３】
本発明の方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは一般的に核酸増幅反応に使用できるものであればよく、現在知られているＤＮＡポリメラーゼ（単独あるいは組みあわせ）としてのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼや，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ（以上はＰｏｌＩ型酵素），Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標），Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ（以上はα型酵素）などが挙げられる。天然型のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を公知の手段により、１もしくは数個が欠失、置換若しくは付加させたもの（変異体）であっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、もしくは変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。例えば、最も一般的であるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡績製のもの（製品コードＫＯＤ−１０１など）を容易に入手することができる。中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００２４】
本発明の方法に用いられる増幅試薬は、上記のほかに、試料中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅するために必要な組成を備えるものであれば特に限定されない。
増幅試薬には、オリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ塩、ＤＭＳＯ、アルブミンの他、界面活性剤、塩類、糖類が適宜加えられる。
【００２５】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
非イオン界面活性剤としては、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、
ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、
ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、
ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２６】
また、
ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。
ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。
オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。
脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００２７】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２８】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２９】
塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が用いられる。
【００３０】
糖類としては、グルコース、ガラクトース等の単糖類、シュークロース、フルクトース、マルトース等の二糖類、グリセロール、トレハロース等が用いられる。
【００３１】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。
下記実施例は、発明を明確にするための例示に過ぎず、技術的範疇に含まれるものは全て包含されうる。
【実施例１】
【００３２】
［アルブミンおよび／またはＤＭＳＯの添加による増幅の改善試薬組成（実施例１）］
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績製）  ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（配列番号１）  ２５０ｎＭ、
オリゴ２（配列番号２）  １５００ｎＭ、
オリゴ３（配列番号３）（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）（蛍光消光プローブ）  ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液  １μＬ、
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ、
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２Ｕ、
牛血清アルブミン  １０μｇまたは添加無し
ＤＭＳＯ  ７．５％または添加無し
試料液  １μＬ  
実施例として、牛血清アルブミンおよび／またはＤＭＳＯを添加した試薬を調製し検討に使用した。（図１〜３）
比較例として、牛血清アルブミンおよびＤＭＳＯをどちらも添加しない試薬を調製し検討に使用した。（図４）
【００３３】
核酸増幅および検出は以下の順序で実施した。
９４℃・２分
９８℃・０秒、６０℃・５秒（５０サイクル）
９８℃・３０秒
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒。
【００３４】
結果を図１〜図４に示す。  
上記の蛍光検出のデータから蛍光微分値を求め、その極大値を蛍光強度とした。蛍光微分値は一定の温度変化あたりの蛍光値変化量を示す。
各図において、標的核酸が増幅されている場合、プローブがハイブリダイズし蛍光強度の低下が認められ、蛍光微分値はマイナスの値を示す。一方、標的核酸が増幅されていない場合、蛍光強度は変化せず、蛍光微分値の値は零である。
【００３５】
図４に示すように、牛血清アルブミンおよびＤＭＳＯの両方が添加されない組成では、全く増幅されないことが確認された。
図２に示すように、ＤＭＳＯのみを添加した組成では蛍光微分値にピークが得られ増幅されていることが確認された。また、図３に示すように、牛血清アルブミンのみを添加した組成では蛍光微分値にピークが得られ増幅されていることが確認された。これらの結果が示すとおり、核酸増幅効率を向上するためには、牛血清アルブミンまたはＤＭＳＯの添加により十分な増幅効果があることが認められた。
さらに、図１に示すように、牛血清アルブミンおよびＤＭＳＯの両方を添加することにより蛍光微分値のピークがさらに高くなることが確認され、両者を共存させることによる相乗効果があることが認められた。
【実施例２】
【００３６】
［ＤＭＳＯ濃度の増幅への影響（実施例２）］
試薬組成（実施例）
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績製）  ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（配列番号１）  ２５０ｎＭ、
オリゴ２（配列番号２）  １５００ｎＭ、
オリゴ３（配列番号３）  （５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）（蛍光消光プローブ）  ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液  １μＬ、
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ、
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２Ｕ、
牛血清アルブミン  １０μｇ
ＤＭＳＯ  ０、２．５、５．０、７．５、１０．０、１２．５％
試料液  １μＬ  
【００３７】
核酸増幅および検出は以下の順序で実施した。
９４℃・２分
９８℃・０秒、６０℃・５秒（５０サイクル）
９８℃・３０秒
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒。
【００３８】
結果を図５に示す。
図５の縦軸は、蛍光微分値のピークの値からバックグラウンドの蛍光微分値を差し引いた値を蛍光強度の低下の絶対値として示している。したがって図５では蛍光強度の低下の絶対値が高いほど、標的核酸の増幅程度が高いことを示している。
図５に示すように、ＤＭＳＯを添加した組成では蛍光強度の低下が認められた。ＤＭＳＯ濃度を検討した結果、ＤＭＳＯ濃度が２．５％未満および１２．５％を超えると大幅に蛍光強度の低下が少なくなることから、増幅効率が低くなったと考えられる。上記結果より、核酸増幅効率を向上するためには、単にＤＭＳＯが含まれる組成ではなく、２．５〜１２．５％、特に５〜１０％で増幅効率が高くなることが確認された。
【実施例３】
【００３９】
［アルブミンの添加の増幅への影響（実施例３）］
試薬組成（実施例）
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績製）  ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（配列番号１）  ２５０ｎＭ、
オリゴ２（配列番号２）  １５００ｎＭ、
オリゴ３（配列番号３）（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）（蛍光消光プローブ）  ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液  １μＬ、
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ、
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２Ｕ、
牛血清アルブミン  ０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５％
ＤＭＳＯ  ７．５％
試料液  １μＬ  
【００４０】
核酸増幅および検出は以下の順序で実施した。
９４℃・２分
９８℃・０秒、６０℃・５秒（５０サイクル）
９８℃・３０秒
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒。
【００４１】
結果を図６に示す。
図６の縦軸は、蛍光微分値のピークの値からバックグラウンドの蛍光微分値を差し引いた値を蛍光強度の低下の絶対値として示している。したがって図６では蛍光強度の低下の絶対値が高いほど、標的核酸の増幅程度が高いことを示している。
図６に示すように、牛血清アルブミン濃度を検討した結果、核酸増幅効率を向上するためには、単に牛血清アルブミンが含まれる組成ではなく、０．０１〜０．５％、特に０．０２５〜０．０５％で増幅効率が高くなることが確認された。
【実施例４】
【００４２】
［他の有機溶媒の増幅への影響（実施例４）］
試薬組成（実施例）
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績製）  ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（配列番号１）  ２５０ｎＭ、
オリゴ２（配列番号２）  １５００ｎＭ、
オリゴ３（配列番号３）  （５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液  １μＬ、
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ、
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２Ｕ、
牛血清アルブミン  １０μｇ  
エタノール、メタノール、アセトンまたはＤＭＳＯ  ７．５％
試料液  １μＬ  
【００４３】
核酸増幅および検出は以下の順序で実施した。
９４℃・２分
９８℃・０秒、６０℃・５秒（５０サイクル）
９８℃・３０秒
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒。
【００４４】
結果を図７に示す。
上記の蛍光検出のデータから蛍光微分値を求め、その極大値を蛍光強度とした。蛍光微分値は一定の温度変化あたりの蛍光値変化量を示す。
図７において、標的核酸が増幅されている場合、プローブがハイブリダイズし蛍光強度の低下が認められ、蛍光微分値はマイナスの値を示す。一方、標的核酸が増幅されていない場合、蛍光強度は変化せず、蛍光微分値の値は零である。
【００４５】
図７に示すように、エタノール、メタノール、アセトンでは蛍光強度の低下が認められず、増幅されていないことが確認された。一方ＤＭＳＯを添加した組成は蛍光強度の低下が認められたことから、標的核酸の増幅が行われていることが確認された。上記結果よりＤＭＳＯ以外の有機溶媒では増幅が不十分であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本願発明は、遺伝子発現の研究、伝染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）又は遺伝病の診断、ｃＤＮＡの生成及びレトロウイルス類の分析等の産業分野においてきわめて有益なものである。
【図１】
2010200660.tif 000003
【図２】
2010200660.tif 000004
【図３】
2010200660.tif 000005
【図４】
2010200660.tif 000006
【図５】
2010200660.tif 000007
【図６】
2010200660.tif 000008
【図７】
2010200660.tif 000009
【図８】
2010200660.tif 000010
【配列表】
2010200660000001.app