(57)【要約】【課題】  SELEX法用のプライマーを効率良く設計可能な設計方法を提供する。【解決手段】  本発明のプライマー設計方法は、プライマー候補配列を生成する工程(S1)と、予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択する工程(S2)と、前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成する工程(S3)と、前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択する工程(S4)と、前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定する工程(S5)とを、コンピュータを用いて実施することを特徴とする。【選択図】  図２
2010239873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成工程と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択工程と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成工程と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択工程と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定工程とを、コンピュータを用いて実施してSELEX法用のプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法。
【請求項２】
前記プライマー候補配列選択工程の前記基準が、プライマーの二次構造形成能に関する基準であることを特徴とする請求項１記載のプライマー設計方法。
【請求項３】
前記ランダムプール選択工程の前記基準が、前記核酸配列の前記ランダム配列が取り得る二次構造の多様性に関する基準であることを特徴とする請求項１または２記載のプライマー設計方法。
【請求項４】
前記核酸配列が、さらに、ランダム配列に対する固定配列を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマー設計方法。
【請求項５】
プライマー設計工程と、
前記設計工程で設計されたプライマーの配列に基づきプライマーを合成する合成工程とを有し、
前記プライマー設計工程が、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマー設計方法により実施されることを特徴とするSELEX法用のプライマーの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の製造方法により製造されたプライマーを用いたSELEX法によりアプタマーを製造することを特徴とするアプタマーの製造方法。
【請求項７】
データ処理装置、記憶装置、入力装置および出力装置を備え、
前記データ処理装置が、
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成手段と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択手段と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成手段と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択手段と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定手段を含むことを特徴とするSELEX法用のプライマー設計装置。
【請求項８】
前記プライマー候補配列選択工程の前記基準が、プライマーの二次構造形成能に関する基準であることを特徴とする請求項７記載のプライマー設計装置。
【請求項９】
前記ランダムプール選択工程の前記基準が、前記核酸配列の前記ランダム配列が取り得る二次構造の多様性に関する基準であることを特徴とする請求項７または８記載のプライマー設計装置。
【請求項１０】
前記核酸配列が、さらに、ランダム配列に対する固定配列を含むことを特徴とする請求項７から９のいずれか一項に記載のプライマー設計装置。
【請求項１１】
さらに、通信装置を備え、前記通信装置により、装置外の通信回線網を介してサーバーに接続可能であり、前記サーバー内のプログラムにより、前記プライマー候補配列生成手段、前記プライマー候補配列選択手段、前記ランダムプール生成手段、前記ランダムプール選択手段および前記プライマー配列決定手段からなる群の少なくとも一つの手段を実行可能であることを特徴とする請求項７から１０のいずれか一項に記載のプライマー設計装置。
【請求項１２】
前記データ処理装置が、前記サーバー内のプログラムにより実行される手段を含まないことを特徴とする請求項１１記載のプライマー設計装置。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマー設計方法をコンピュータ上で実行可能なことを特徴とするSELEX法用のプライマー設計用コンピュータプログラム。
【請求項１４】
請求項１３記載のSELEX法用のプライマー設計用コンピュータプログラムが格納されたことを特徴とする記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、SELEX法用のプライマーの設計方法、プライマーの製造方法、アプタマーの製造方法、プライマーの設計装置、プライマー設計用コンピュータプログラムおよび記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、標的物質に特異的に結合する核酸リガンドである。アプタマーは、１９９０年に、GOLD等によって初めてその概念が報告され、Systematic  Evolution  of  Ligands  by  Exponential  Enrichment  (SELEX)法によって取得される（特許文献１、非特許文献１）。SELEX法は、標的物質をビーズ等の担体に固定化し、これにDNAやRNA等の核酸ライブラリーを添加し、前記標的物質に結合する核酸を回収し、回収した核酸を増幅し、増幅した核酸を再び前記標的物質に添加するという一連の工程を１０回ほど繰り返して、前記標的物質に対する特異性および結合力が高い核酸を濃縮し、その塩基配列を決定することで、アプタマーを獲得する方法である。アプタマーは、医薬品およびセンサへの応用が期待されており、例えば、アプタマー医薬として、血管新生型加齢黄斑変性症（AMD）の治療薬であるペガプタニブ・ナトリウム注射剤が開発され実用化されている。
【０００３】
SELEX法では、核酸の増幅のために、プライマーを設計する必要がある。PCRを代表とする遺伝子増幅法でもプライマーを設計する必要があり、そのためのプライマー設計を支援するソフトが多数開発されている。しかしながら、SELEX法に使用するプライマーの設計を支援するソフトは無い。また、遺伝子の配列を想定して設計できる遺伝子増幅法のプライマー設計とは異なり、SELEX法でのプライマー設計は、想定できる情報が無く、ゼロの状態から二次構造やTm値等を計算しながら人手による試行錯誤を繰り返する必要がある。しかも、設計したプライマーが、必ずしも希望したように働くとは限らない。このように、SELEX法のプライマー設計には、労力、時間およびコストがかかり、しかも不確実性が伴い、効率が悪いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２７６３９５８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９０）２４９，５０５−５１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、効率良くSELEX法のプライマーを設計可能なプライマーの設計方法、それを用いたプライマーの製造方法、アプタマーの製造方法、プライマーの設計装置、プライマー設計用コンピュータプログラムおよび記録媒体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のSELEX法用のプライマー設計方法は、
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成工程と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択工程と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成工程と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択工程と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定工程とを、コンピュータを用いて実施してSELEX法用のプライマーを設計することを特徴とする。
【０００８】
本発明のSELEX法用のプライマーの製造方法は
プライマー設計工程と、
前記設計工程で設計されたプライマーの配列に基づきプライマーを合成する合成工程とを有し、
前記プライマー設計工程が、前記本発明のプライマー設計方法により実施されることを特徴とする。
【０００９】
本発明のアプタマーの製造方法は、前記本発明のプライマーの製造方法により製造されたプライマーを用いたSELEX法によりアプタマーを製造することを特徴とする。
【００１０】
本発明のSELEX法用のプライマー設計装置は、
データ処理装置、記憶装置、入力装置および出力装置を備え、
前記データ処理装置が、
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成手段と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択手段と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成手段と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択手段と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定手段を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明のSELEX法用のプライマー設計用コンピュータプログラムは、前記本発明のプライマー設計方法をコンピュータ上で実行可能なことを特徴とする。
【００１２】
本発明の記録媒体は、前記本発明のSELEX法用のプライマー設計用コンピュータプログラムが格納されたことを特徴とする
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、実際にプライマーを合成する前に、コンピュータでシュミレーションして目的に合ったプライマーを設計可能であるため、労力、時間およびコストを低減でき、かつ確実性に優れ、効率良くプライマーを設計することが可能となる。さらに、本発明によれば、ランダムプールの核酸の二次構造を制御可能であるため、例えば、アプタマーの構造を制御可能であり、また、既得のアプタマー構造を参考にしたランダムプールの設計も可能となり、目的とするアプタマーの取得効率の向上も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のプライマー設計装置の一例の構成を示す構成図である。
【図２】図２は、本発明のプライマー設計方法の一例を示すフローチャート図である。
【図３】図３は、本発明のプライマー設計装置のその他の構成を示す構成図である。
【図４】図４は、前記その他の例のプライマー設計装置が通信回線網を介してサーバーと接続する状態を示す説明図である。
【図５】図５は、核酸の二次構造の構造クラスの分類図である。
【図６】図６は、本発明の実施例１のランダムプールにおけるランダム領域のみの二次構造の頂点の数の分布を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例１のランダムプールにおける核酸配列全体の二次構造の頂点の数の分布を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例１のランダムプールにおけるランダム領域のみの二次構造のクラスの分布を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例１のランダムプールにおける核酸配列全体の二次構造のクラスの分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
つぎに、本発明について、例をあげて説明する。
【００１６】
（実施形態１）
図１に、本発明のプライマー設計装置の一例の構成を示す。図示のように、本例の装置は、入力装置１１、記憶装置１２、出力装置１３およびデータ処理装置１４を主要構成要素とする。入力装置１１は、データ処理装置１４に情報を入力するためのものであり、例えば、キーボード、キーシート、マウス、USB等の端子、CDやCD-R等のドライブ等があげられる。記憶装置１２は、プライマー設計条件に関する情報、ランダムプールに関する情報、設計されたプライマー配列に関する情報等の各種情報および各種プログラムを記憶するためのものであり、例えば、フラッシュメモリ、RAMおよびROM等を適宜組み合わせて構成される。出力装置は、設計されたプライマー配列情報およびその他の情報を出力するためのものであり、例えば、ディスプレーおよびプリンターがあげられる。データ処理装置１４は、プライマー設計のための一連の処理を行うものであり、例えば、中央演算処理装置（CPU）があげられる。本例のデータ処理装置１４は、プライマー候補配列生成手段１４１、プライマー候補配列選択手段１４２、ランダムプール生成手段１４３、ランダムプール選択手段１４４およびプライマー配列決定手段１４５を備える。本発明において、プライマー設計装置は、一台のコンピュータで構成してもよいし、複数のコンピュータにより構成してもよい。
【００１７】
本例において、前記プライマー設計装置は、例えば、図２に示すフローチャートに従い、つぎに示すようにして、プライマーを設計することができる。
【００１８】
（プライマー候補配列の生成：S1）
まず、プライマー候補配列生成手段により、プライマー候補配列を生成する。プライマー配列は、例えば、A,G,C,T,Uの塩基を組み合わせたものである。配列がDNAの場合は、Tを使用し、RNAの場合は、Uを使用する。プライマー候補配列は、３´末端側および５´末端側の二種類を生成する必要がある。プライマー候補配列の長さ（塩基数）は、特に制限されないが、１０〜１００塩基数であり、好ましくは、１５〜５０塩基数であり、より好ましくは、２０〜３０塩基数である。プライマー候補配列は、例えば、ランダムに配列を生成してもよいし、既知のプライマー配列のデータベースを参照して生成してもよい。また、入力装置１１からプライマー候補配列を入力してもよい。
【００１９】
（プライマー候補配列の選択：S2）
つぎに、生成されたプライマー候補配列を、予め設定された基準に従い評価し、前記基準を満たすプライマー候補配列を選択する。この場合、前記基準を満たすプライマー候補配列でない場合（No）は、再度、プライマー候補配列を生成し、前記基準を満たすプライマー候補配列の場合（Yes）は、次のステップに進む。前記基準は、例えば、プライマーの二次構造形成能、Tm値、ナトリウム濃度、GC含量、GC含量のぶれ幅、核酸濃度、GCにおけるGとCの偏り、ATにおけるAとTの偏り等があげられる。前記プライマーの二次構造形成能は、例えば、Max  free  energy（プライマーの構造として許容する自由エネルギーの閾値）があげられる。プライマー候補配列の評価は、例えば、遺伝子増幅のプライマーを設計するためのソフトウエアを使用することができる。このようなソフトウエアは、市販品を用いてもよいし、インターネットで公開されているサイトにあるものを使用してもよい。また、これらの遺伝子増幅のプライマー設計ソフトウエアは、プライマー配列を生成することもできるものも多く、このようなソフトウエアを使用した場合は、プライマー候補配列の生成（S1）および選択（S2）を同時に実施することも可能である。
【００２０】
（ランダムプールの生成：S3）
前記ランダムプールは、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を、複数含む核酸配列混合物（ライブラリー）である。前記ランダム配列は、アプタマー候補となる配列であり、例えば、A,G,C,およびUまたはTの塩基をランダムに連結した配列である。前記ランダム配列の長さ（塩基数）は、例えば、２０〜１２０塩基数であり、好ましくは、３０〜８０塩基数であり、より好ましくは、３０〜４０塩基数である。前記ランダムプールに含まれる前記核酸配列の種類は、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２種類）であり、好ましくは、４３０〜４６０種類（約１０１８〜１０３６種類）である。
【００２１】
前記ランダムプールに含まれる各核酸配列において、さらに、ランダム配列に対する固定配列を含んでいてもよい。前記固定配列としては、例えば、GまたはCの塩基が連結した配列があげられる。例えば、フォワード（Fw）のプライマー候補配列の末端側にGGGG配列を付加し、リバース（Rv）のプライマー候補配列の先端にCCCC配列を付加してもよい。
【００２２】
（ランダムプールの選択：S4）
次に、生成したランダムプールについて、各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択する。前記構造の予測には、例えば、DNAおよびRNA等の構造を予測する既知のソフトウエアを使用することができる。前記基準としては、二次構造の多様性を使用することができる。二次構造の多様性としては、グラフ構造によるクラス分類を使用することができる（GEVERTZ  J.  et.al.  RNA  2005;11;853-863）。二次構造の前記グラフ構造によるクラス分類を、図５に示す。同図に示すように、前記クラス分類は、ステムを辺（−）として表し、ループを点（・）として表すものである。同図では、点の数が７以下のグラフ構造を示すものである。そして、前記基準を満たさない場合（No）は、再度、ランダムプールの生成ステップに戻り、前記基準を満たす場合（Yes）は、次のステップに進む。
【００２３】
（プライマー配列の決定：S5）
次に、前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列に採用し、前記配列をプライマー配列として決定する。決定されたプライマー配列情報は、ディスプレー等の出力装置から出力される（S6）。その他、決定されたプライマー配列情報は、記憶装置に記憶されてもよい。
【００２４】
（実施形態２）
次に、通信インターフェース（通信装置）を備えたプライマー設計装置の例について説明する。本例の装置の構成を図３に示す。図３において、図１と同一部分には同一符号を付している。図示のように、本例の装置は、前記実施形態１の装置と、通信インターフェースを備えてインターネット等の通信回線網に接続可能な他は、主要構成は同様である。図４に示すように、本例の装置１は、インターネット等の通信回線網２を介して、装置外に設置されたサーバー３に接続可能である。したがって、例えば、プライマー候補配列の生成、プライマー候補配列の評価、ランダムプールの生成、およびランダムプールの各核酸配列の構造予測等の各種の工程を、装置外のサーバーにあるサイトのプログラムにより、実施可能である。したがって、本例の装置は、プライマー候補配列生成手段、プライマー候補配列選択手段、ランダムプール生成手段、ランダムプール選択手段およびプライマー配列決定手段の少なくとも一つを、装置外のサーバーのサイトにあるプログラムで実行することが可能であり、その場合は、本例の装置のデータ処理装置は、装置外のサーバーのプログラムで実行する各前記手段については含まなくてもよい。
【００２５】
（実施形態３）
本実施形態は、前記本発明のプライマー設計方法で設計されたプライマー配列に基づき、プライマーを製造する方法である。プライマーの設計方法は、前述のとおりである。また、プライマーの合成方法は、既知の方法を使用でき、例えば、ＤＮＡ合成装置やＲＮＡ合成装置により、ｄＮＴＰ等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記合成装置としては、市販品を使用してもよい。
【００２６】
（実施形態４）
本実施形態は、前記本発明のプライマー製造方法で製造したプライマーを用い、SELEX法によりアプタマーを製造する方法の一例である。プライマーの製造は、前述のとおりである。下記において、SELEX法について、説明する。
【００２７】
（アプタマー）
本発明において、前記アプタマーとは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子であり、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸や、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。前記核酸アプタマーが、後者の二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造としては、例えば、ステムループ構造があげられる。
【００２８】
本発明において、前記核酸アプタマーは、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよい。合成方法は、何ら制限されず、例えば、ＤＮＡ合成装置やＲＮＡ合成装置により、ｄＮＴＰ等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記核酸アプタマーとしては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等があげられ、また、例えば、ＰＮＡ等のペプチド核酸を含んでもよい。前記核酸アプタマーは、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然核酸（非人工核酸）を含んでもよいし、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等の人工核酸を含んでもよい。
【００２９】
SELEX法による核酸アプタマーの製造は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、複数の核酸を含む核酸プールを準備し、前記核酸ライブラリーと標的物質とを結合（会合）させ、前記核酸プールと前記標的物質との複合体を形成する。そして、前記複合体から、前記複合体の形成に関与した核酸プローブのみを回収することにより、前記標的物質に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製できる。以下に、SELEX法を用いて、前記標的物質に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製する方法を具体的に説明するが、本発明は、これらには何ら制限されない。
【００３０】
前記核酸プールとは、例えば、ランダム配列を有する核酸のライブラリー（混合物）である。前記ライブラリーにおける前記核酸は、例えば、ＲＮＡやＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記ランダム領域とは、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、および、ＵまたはＴの塩基をランダムに連結した領域であり、その長さは、例えば、２０〜１２０ｍｅｒである。前記核酸プールは、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２種類）の核酸を含むことが好ましく、より好ましくは、４３０〜４６０種類（約１０１８〜１０３６種類）である。
【００３１】
前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記ランダム配列の５’末端および３’末端の少なくとも一方に、後述する核酸増幅で利用するプライマー配列、ポリメラーゼが認識するポリメラーゼ認識配列等を有する。前記プライマー配列は、前述のプライマー設計方法により設計された配列である。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、アプタマー調製における後述の核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。前記ＲＮＡプールの具体例としては、例えば、５’末端側から、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー配列（以下、「５’末端側プライマー配列」ともいう）とを、この順序で連結し、前記５’末端側プライマー配列の３’末端側に、前記ランダム配列を連結し、さらに、前記ランダム配列の３’末端側にプライマー配列（以下、「３’末端側プライマー配列」ともいう）を連結した構造があげられる。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー配列とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、さらに、標的物質への結合を補助する領域を有してもよい。また、前記核酸プールに含まれるポリヌクレオチドは、それぞれ、異なるランダム配列を有してもよいし、一部の配列が共通するランダム配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各配列は、例えば、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
【００３２】
前記核酸プールの調製方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＤＮＡを含む初期プールを使用し、前記ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、核酸プールのＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記ＤＮＡを含む初期プールとしては、例えば、前記ＲＮＡプールにおける前記ランダム領域の相補鎖のＵをＴに置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記ランダム領域のＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。この初期プールのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製できる。
【００３３】
また、前記ランダム領域のＵをＴに置換したＤＮＡを含む初期プールを準備し、これを鋳型として、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と、前記５’末端側プライマー配列に相補的な配列とを含むプライマーをアニーリングさせ、核酸増幅を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製することもできる。
【００３４】
そして、前記核酸プールと標的物質とを反応させ、前記核酸と前記標的物質との複合体を形成する。前記核酸プールと前記標的物質との結合形式は、特に制限されず、例えば、水素結合等の分子間力等があげられる。前記核酸プールと前記標的物質との結合処理は、例えば、前記両者を溶媒中で一定期間インキュベートする方法があげられる。前記溶媒としては、特に制限されないが、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、例えば、各種緩衝液があげられる。
【００３５】
続いて、前記核酸プールと標的物質との複合体を回収する。なお、前記複合体形成のために前記両者を反応させた反応液には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない核酸プール（以下、「未反応核酸プール」という）が含まれる。このため、例えば、前記反応液から、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを、分離することが好ましい。前記分離方法としては、特に制限されないが、例えば、前記標的物質と前記核酸プールとの吸着性の違いや、前記複合体と前記核酸プールとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
【００３６】
前者の吸着性の違いを利用する方法としては、例えば、以下の方法が例示できる。すなわち、まず、前記標的物質に吸着性を有する担体と、前記複合体を含む前記反応液とを接触させる。この際、前記未反応核酸プールは、前記担体に吸着せず、他方、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体は、前記担体に吸着する。これによって、前記未反応核酸プールと前記複合体とを分離することができる。そして、前記未反応核酸プールを除去後、前記担体に吸着した前記複合体を回収すればよい。また、前記担体から前記複合体を回収する前に、例えば、前記未反応核酸プールを十分に除去するため、前記担体を洗浄することが好ましい。前記標的物質に吸着性を有する担体としては、特に制限されず、例えば、標的物質の種類に応じて適宜選択できる。前記標的物質が、例えば、抗体等のタンパク質の場合、前記吸着性を有する担体としては、例えば、ニトロセルロース膜等があげられる。
【００３７】
後者の分子量の違いを利用する方法としては、例えば、担体を使用する方法が例示できる。前記担体としては、例えば、前記核酸プールが通過し且つ前記複合体が通過できないようなサイズのポアを有する担体があげられる。このような担体を利用して、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを分離できる。前記分離は、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気的な分離であってもよい。
【００３８】
この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化した標的物質を使用する方法もあげられる。すなわち、前記標的物質を予め担体に固定化し、前記担体と前記核酸プールとを接触させ、前記固定化標的物質と核酸プールとの複合体を形成させる。そして、前記固定化標的物質に結合していない未反応の核酸プールを除去した後、前記担体から、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体を解離させればよい。前記標的物質の担体への固定化方法は、何ら制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、前記標的物質にタグを結合しておき、前記タグとの結合基を有する担体に、前記タグを結合した標的物質を接触させる方法があげられる。前記タグとしては、例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ等があげられ、前記結合基としては、例えば、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）等の金属イオンがあげられる。前記担体の具体例としては、例えば、前記金属イオンをベースとするＮｉ−アガロース、Ｎｉ−セファロース等があげられる。
【００３９】
つぎに、回収した前記複合体から、前記複合体形成に関与した核酸プールを回収する。前記複合体形成に関与した核酸プールは、例えば、前記複合体について、前記標的物質と核酸プールとの結合を解除することによって回収できる。
【００４０】
続いて、回収した前記複合体形成に関与した核酸プールについて、核酸増幅を行う。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、核酸プールの種類に応じて、公知の方法により行うことができる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られた増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの転写を行うことができる。これによって、前述の前記複合体形成に関与したＲＮＡプールの増幅を行うことができる。
【００４１】
前記ＲＮＡプールが、例えば、前述のように、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列、前記５’末端側プライマー配列、前記ランダム配列および前記３’末端側プライマー配列を有する場合、これらの配列を利用する増幅方法があげられる。前記ＲＮＡを鋳型として前記ｃＤＮＡを調製するための逆転写反応では、例えば、プライマーとして、前記ＲＮＡプールの３’末端側プライマー配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、前記ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡの増幅には、例えば、プライマーとして、前記５’末端側プライマー配列を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー配列の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー配列を有することが好ましい。得られたＤＮＡの増幅産物を鋳型とするＲＮＡの増幅には、前記ＤＮＡ増幅産物を鋳型として、前記ＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー配列および３’末端側プライマー配列を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う。この際、プライマーとしては、例えば、前記５’末端側プライマー配列を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー配列の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー配列を有することが好ましい。そして、得られた増幅産物を鋳型として、前記増幅産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写反応を行うことによって、前記複合体形成に関与するＲＮＡプールの核酸増幅を行うことができる。増幅産物のうち、例えば、アンチセンス鎖のＤＮＡは、その３’末端側に、ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を有するため、この領域に前記ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが結合し、前記アンチセンス鎖を鋳型として、前記ＲＮＡを合成できる。前記逆転写反応に使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されないが、例えば、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等が使用できる。
【００４２】
なお、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法や、各種等温増幅法等が採用できる。また、その条件も、特に制限されない。
【００４３】
このように、標的物質と複合体を形成した核酸プールを回収し、さらに、前述と同様にして、標的物質を用いた複合体の形成、複合体の回収、前記複合体形成に関与した核酸プールの分離、前記分離した核酸プールの増幅等を繰り返し行うことで、最終的に、標的物質に結合性を有する核酸アプタマーを得ることができる。
【００４４】
本発明において、前記標的物質としては、特に制限されず、例えば、酵素、抗体、構造タンパク質等のタンパク質、核酸、脂質、有機高分子等があげられる。
【実施例】
【００４５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によって、なんら制限ないし限定されない。
【００４６】
（プライマー候補配列の生成および選択）
プライマー候補配列の生成および選択は、例えば、Oligo  Calculator（http://www.genosys.jp/whatsnew/active/active_manual.html、シグマジェノシス社製）等を使用して行った。主要な評価基準として、二次構造の形成能を採用した。二次構造を形成し易いプライマーセットと形成し難いプライマーセットの差異として、Max  free  energy（プライマーの構造として許容するエネルギーの閾値）のパラメーターを用い、形成し易いものは、-10kcal/molに設定し、形成し難いものは-1kcal/molに設定した。その他の共通のパラメーターは、前記ソフトウエアのデフォルト値に従って以下の通りにした。
【００４７】
（共通パラメーター）
FwTm  limit＝75.0（Fwプライマーのt7配列込みのTm値が75程度）
RvTm  limit＝65.0（RvプライマーのTm値が65程度）
Ct  concentration＝1.0（PCR時の核酸濃度が1.0μmol/L(μM)）
Na+  concentration＝50.0（PCR時のNa+濃度が50.0mmol/L(mM)）
GC%＝0.6（t7配列を除くFwとRvのプライマーのGC%がそれぞれ60%程度）
GC%  range＝0.1（上記GC%のぶれ幅を±10%まで許容。50%〜70%）
Minimum  Na%＝0.4（t7配列を除くFwとRvに含まれるGCにおけるGとC、ATにおけるAとTの偏りを4:6まで許容）
【００４８】
（ランダムプールの生成）
前述のようにして生成したプライマー候補配列を、二次構造を形成し易いセットと形成し難いセットのそれぞれに10000セットずつ用意し、それぞれのプライマーセットに対して100本の塩基数４０のランダム配列を付加し、ランダムプールを生成した。また、生成したプライマーセットのFw側の末端にGGGGを、Rv側の先端にCCCCを付加したプライマーセットを別途生成し、前述と同様にしてランダム配列を付加し、ランダムプールを生成した。
【００４９】
（二次構造予測）
二次構造予測には、ViennaPackageのRNAfold（例えば、文献Hofacker,  I.  L.,  Nucl.  Acids  Res.  2003  31:3429-3431、http://www.tbi.univie.ac.at/RNA/）を用いた。RNAfoldの実行には-noLPオプションを付加し、一つの塩基対のみで形成されるステムを許容しないこととした。また、ランダム配列のみの二次構造を予測するために、RNAfoldの実行により二次構造を得た後、かつ後述の多様性の評価の前に、得られた二次構造のうち、プライマー候補配列で形成されるステムについてはループに置換した。
【００５０】
（二次構造の多様性の評価）
二次構造の多様性の評価は、例えば、論文"GEVERTZ  J.  et.al.  RNA  2005;11:853-863"に基づいて行った。この論文では、二次構造予測結果を入力として、二次構造の構造クラスを判定することが提案されている。二次構造の構造クラスについては、前記論文で採用されているグラフ構造によるクラス分類を採用した。
【００５１】
（評価結果）
図６および図７のグラフに、ランダムプールの二次構造の頂点の数の分布を示す。前記両図において、strは、二次構造を形成しやすいプライマーセットのランダムプールを示し、nstrは、二次構造を形成し難いプライマーセットのランダムプールを示し、str_GCは、二次構造を形成しやすいプライマーセットにGGGG+CCCCを付加したランダムプールを示し、nstr_GCは、二次構造を形成し難いプライマーセットにGGGG+CCCCを付加したランダムプールを示し、これらは、下記の図８および図９も同じである。
【００５２】
図６は、ランダム配列のみの二次構造の頂点の数の分布を示す。同図に示すように、str_GC、nstr_GC、strおよびnstrの順序で、分布が平坦になった。このことは、前記順序で、二次構造の多様性が低くなっていくことを意味する。
【００５３】
図７は、核酸配列全体の二次構造の頂点の数の分布である。同図に示すように、各グラフとも同様の分布を示し、プライマーセットによる多様性に相違は認められなかった。
【００５４】
図８に、ランダム配列のみの二次構造のクラス分布を示す。同図に示すように、頂点の数の分布の通りに、二次構造を形成しやすいプライマーセットを用いたランダムプールは、クラス３〜５あたりに二次構造が集中するのに対し、二次構造を形成し難いプライマーセットを用いたランダムプールは、クラス６と７においても、クラス３〜５と同様に二次構造が出現した。
【００５５】
図９に、核酸配列全体の二次構造のクラス分布を示す。同図に示しように、プライマーセットにより相違は認められなかったが、GGGGおよびCCCCを付加した場合に、直線型の二次構造が出現する確率が高くなった。
【００５６】
（核酸配列全体の二次構造を基準とした場合の選択）
前述のように、GGGGおよびCCCCを付加した場合に、直線型の二次構造が出現する確率が高くなった。このため、取得されるランダムプールの核酸配列の小型化を目的とする場合は、GGGGおよびCCCCを付加したプライマー配列を採用すればよく、逆に、取得されるランダムプールの核酸配列の小型化を目的せず、二次構造の多様化を目的とする場合は、GGGGおよびCCCCを付加しないプライマー配列を採用すればよい。
【００５７】
（ランダム配列のみの二次構造を基準とした場合の選択）
前述のように、str_GC、nstr_GC、strおよびnstrの順序で二次構造の多様性が低くなっているので、二次構造の多様性を目的とする場合は、二次構造を形成し難く、かつGGGG+CCCCを付加しないプライマー配列を採用すればよい。これとは逆に、アプタマー取得後の後加工を容易にするためには、二次構造の多様性は低い方がよいので、この目的のためには、二次構造を形成し易く、かつGGGG+CCCCが付加されたプライマー配列を採用すればよい。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、SELEX法に用いるプライマーを効率良く設計可能であり、これにより、アプタマーの取得効率も向上することが期待できる。したがって、本発明は、例えば、アプタマーを利用した医薬品やセンサの分野等の広い分野に適用できる。
【符号の説明】
【００５９】
１      プライマー設計装置
２      通信回線網
３      サーバー
１１    入力装置
１２    記憶装置
１３    出力装置
１４    データ処理装置
１５    通信インターフェース
１４１    プライマー候補配列生成手段
１４２    プライマー候補配列選択手段
１４３    ランダムプール生成手段
１４４    ランダムプール選択手段
１４５    プライマー配列決定手段
【図１】
2010239873.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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