(57)【要約】【課題】  本発明は、一般的リガンドおよび標的リガンドを使用してポリペプチドのレパートリーを選択する方法に関する。【解決手段】  本発明は、ポリペプチドのレパートリーから、第1結合部位において標的リガンドに及び第2結合部位において一般的リガンド（該一般的リガンドは、標的リガンドの特異性には無関係に該レパートリーの機能的メンバーに結合しうる）に結合する機能的ポリペプチドの集団を選択する方法であって、a）該レパートリーを該一般的リガンドと接触させ、それに結合した機能的ポリペプチドを選択し、b）選択した該機能的ポリペプチドを該標的リガンドと接触させ、該標的リガンドに結合するポリペプチドの集団を選択する工程を含んでなる方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体ポリペプチドのライブラリーであって、全ての機能的メンバーがVHドメインを有し、該ドメインはヒト生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP-47によりコードされる超可変ループH1およびH2の正規構造を有する超可変ループを含む、前記ライブラリー。
【請求項２】
抗体ポリペプチドのライブラリーであって、機能的メンバーがVLドメインを有し、該ドメインはヒト生殖細胞系列VL遺伝子セグメントDPK9によりコードされる超可変ループL1およびL2の正規構造を有する超可変ループを含む、前記ライブラリー。
【請求項３】
１以上の前記超可変ループの１以上の位置が変更され、該位置を占めるアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられ、その結果１以上の前記超可変ループが多様化されている、請求項１または２に記載の合成ライブラリー。
【請求項４】
前記１以上の超可変ループがヒト生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP-47によりコードされるループH1の正規構造を有し、且つ、前記ループは、該ループの１以上の位置が変更されることにより多様化されており、このとき該位置を占めるアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられている、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記１以上の超可変ループがヒト生殖細胞系列VL遺伝子セグメントDPK9によりコードされるループL1の正規構造を有し、且つ、前記ループは、該ループの１以上の位置が変更されることにより多様化されており、このとき該位置を占めるアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられている、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記ループが、H31、H33およびH35からなる群より選択される１以上の位置において変更されることにより多様化されている、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ループが、L30、L31、L32およびL34からなる群より選択される１以上の位置において変更されることにより多様化されている、請求項５に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記１以上の超可変ループがヒト生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP-47によりコードされるループH2の正規構造を有し、且つ、前記ループは、該ループの１以上の位置が変更されることにより多様化されている、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記１以上の超可変ループがヒト生殖細胞系列VL遺伝子セグメントDPK9によりコードされるループL2の正規構造を有し、且つ、前記ループは、該ループの１以上の位置が変更されることにより多様化されている、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記ループが、H50、H52、H52a、H53、H55およびH58からなる群より選択される１以上の位置において変更されることにより多様化されている、請求項８に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記ループが、L50およびL53からなる群より選択される１以上の位置において変更されることにより多様化されている、請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記１以上の超可変ループがヒト生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP-47によりコードされるループH1およびH2の正規構造を有し、且つ、前記ループは、該ループの１以上の位置が変更されることにより多様化されている、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記ループが、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55およびH58からなる群より選択される１以上の位置において変更されることにより多様化されている、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記１以上の超可変ループがヒト生殖細胞系列VL遺伝子セグメントDPK9によりコードされるループL1およびL2の正規構造を有し、且つ、前記ループは、該ループの１以上の位置が変更されることにより多様化されている、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記ループが、L30、L31、L32、L34、L50およびL53からなる群より選択される１以上の位置において変更されることにより多様化されている、請求項１４に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記抗体ポリペプチドが、図２における位置１−１１３のアミノ酸配列を有し、ここでH31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55およびH56からなる群より選択される残基が図２における当該位置の残基と異なる、請求項３、４、６、８、１０、１２、または１３に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記抗体ポリペプチドが、図２における位置１３０−２３７のアミノ酸配列を有し、ここでL30、L31、L32、L34、L50およびL53からなる群より選択される残基が図２における当該位置の残基と異なる、請求項３、５、７、９、１１、１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記抗体ポリペプチドがVLポリペプチド配列をさらに有する、請求項１、３、４、６、８、１０、１２、１３または１６に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記VLポリペプチド配列が、請求項２、３、５、７、９、１１、１４、１５または１７に記載の配列である、請求項６に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記抗体ポリペプチドがVHポリペプチド配列をさらに有する、請求項２、３、５、７、９、１１、１４、１５または１７に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記VHポリペプチド配列が請求項１、３、４、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列である、請求項６に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記ライブラリーのメンバーが一般的リガンドであるプロテインＡに結合する、請求項１、３、４、６、８、１０、１２、１３、１６、１８または１９に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記ライブラリーのメンバーが一般的リガンドであるプロテインＬに結合する、請求項２、３、５、７、９、１１、１４、１５、１７、２０または２１に記載のライブラリー。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチドのライブラリーをコードする核酸ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的（generic）リガンドおよび標的リガンドを使用してポリペプチドのレパートリーを選択するための方法に関する。特に、本発明は、抗体ポリペプチドのレパートリーを一般的リガンドで選択して、それらの機能的サブセットを単離する方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（VH）および軽鎖可変ドメイン（VL：これはVκまたはVλとなりうる）の2つの分離した領域を含む。抗原結合部位自体は、6個のポリペプチドループ（VHドメインからの3個（H1、H2およびH3）およびVLドメインからの3個（L1、L2およびL3））により形成される。VHおよびVLドメインをコードするV遺伝子の多様な一次（primary）レパートリーが、遺伝子セグメントの組合せ再配列により産生される。VH遺伝子は、3個の遺伝子セグメント（VH、DおよびJH）の組換えにより産生される。ヒトにおいては、ハプロタイプに応じて、約51個の機能的VHセグメント（CookおよびTomlinson (1995) Immunol Today, 16:237）、25個の機能的Dセグメント（Corbettら (1997) J. Mol. Biol., 268:69）および6個の機能的JHセグメント（Ravetchら (1981) Cell, 27:583）が存在する。VHセグメントは、VHドメインの第1および第2抗原結合ループ（H1およびH2）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、VH、DおよびJHセグメントは合体してVHドメインの第3抗原結合ループ（H3）を形成する。VL遺伝子は、僅か2個の遺伝子セグメント（VLおよびJL）の組換えにより産生される。ヒトにおいては、ハプロタイプに応じて、約40個の機能的Vκセグメント（SchableおよびZachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374:1001）、31個の機能的Vλセグメント（Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264:220; Kawasakiら (1997) Genome Res., 7:250）、5個の機能的Jκセグメント（Hieterら (1982) J. Biol. Chem., 257:1516）および4個の機能的Jλセグメント（VasicekおよびLeder (1990) J. Exp. Med., 172:609）が存在する。VLセグメントは、VLドメインの第1および第2抗原結合ループ（L1およびL2）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、VLおよびJLセグメントは合体してVLドメインの第3抗原結合ループ（L3）を形成する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中等度の親和性を有するほとんどすべての抗原に結合するのに十分な多様性を有すると考えられる。高親和性抗体は、点突然変異の生成を伴う再配列遺伝子の「親和性の成熟」により産生され、改善された結合に基づいて免疫系により選択される。
【０００３】
抗体の構造および配列の分析は、6個の抗原結合ループのうちの5個（H1、H2、L1、L2、L3）が、一定数の主鎖コンホメーションまたは正規（canonical）構造を有することを示している（ChothiaおよびLesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901; Chothiaら (1989) Nature, 342:877）。主鎖コンホメーションは、（i）抗原結合ループの長さ、および（ii）抗原結合ループおよび抗体フレームワーク内の或る鍵部位における個々の残基または残基のタイプにより決定される。該ループの長さおよび鍵残基の分析は、ヒト抗体配列の大多数にコードされるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションを予測することを可能にした（Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227:799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14:4628; Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264:220）。H3領域は、配列、長さおよび構造の点で、より一層多様であるが（Dセグメントの使用による）、それはまた、該ループおよび該抗体フレームワーク内の鍵部位における個々の残基の長さ及び存在または残基のタイプに左右されるループ長の短い一定数の主鎖コンホメーションを形成する（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263:800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399:1）。
【０００４】
ヒト抗体配列内の側鎖の多様性の同様の分析は、一次レパートリーにおける配列多様性のパターンを、体細胞超突然変異により生じたものから分離することを可能にした。それらの2つのパターンは相補的であることが判明している。つまり、一次レパートリーにおける多様性は抗原結合の中心部に集中しており、一方、体細胞超突然変異は、一次レパートリーにおいて高度に保存されている末梢領域にまで多様性を広げる（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256:813; Ignatovichら (1997) J. Mol. Biol, 268:69）。与えられた任意の時点における選択に一定数のB細胞が利用可能であると仮定すると、この相補性は、配列空間（sequence space）を見出すための有効な戦略として生じたと考えられる。したがって、抗体は、まず、結合部位の中心部の多様性に基づいて一次レパートリーから選択される。ついで体細胞超突然変異が、一次応答中に確立された好ましい相互作用を破壊することなく末梢部の残基を最適なものとする。
【０００５】
ファージ提示技術（Smith (1985) Science, 228:1315; ScottおよびSmith (1990) Science, 249:386; McCaffertyら (1990) Nature, 348:552）が最近出現したことにより、広範囲の標的抗原に対するヒト抗体を「シングル・ポット（single pot）」ライブラリーからin vitroで選択することが可能になった。これらのファージ抗体ライブラリーは、以下の2つの範疇に分類することができる：ヒトB細胞から集められた再配列V遺伝子を使用する天然ライブラリー（Marksら (1991) J. Mol Biol., 222:581; Vaughanら (1996) Nature Biotech., 14:309、あるいは生殖細胞系列V遺伝子セグメントがin vitroで「再配列」されるか（HoogenboomおよびWinter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Nissimら (1994) EMBO J, 13:692; Griffithsら (1994) EMBO J, 13:3245; De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248:97）または合成CDRが単一の再配列V遺伝子中に組込まれる（Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457）合成ライブラリー。合成ライブラリーは、再配列V遺伝子から構築されるファージライブラリーの有効サイズを限定しうる天然レパートリーの固有の偏りを克服するのに有用であるが、それらは、集合したV遺伝子中に塩基対の欠失を頻繁に導入する長い縮重PCRプライマーの使用を必要とする。また、この高度なランダム化は、正しくフォールディングできないため非機能的でもある抗体の生成につながる。さらに、これらのライブラリーから選択された抗体は十分に発現されないことがあり、多くの場合、ヒトにおける療法に用いられた場合に抗体免疫原性をもたらしうるフレームワーク突然変異を含有するであろう。
【０００６】
最近、合成ライブラリーアプローチの延長において、コンセンサスフレームワーク配列を有する「マスター遺伝子」のセットを合成することにより、およびフォールディングおよび発現を改善することが示されているアミノ酸置換を組込むことにより、ヒト抗体フレームワークが予め最適化されうることが示唆された（WO97/08320, Morphosys）。ついでオリゴヌクレオチドを使用して、CDRにおける多様性を組入れる。ヒト免疫系に異物として認識されない人工ヒト抗体を産生させることが望まれるため、ほとんどの場合にいずれの天然フレームワークにも対応しないコンセンサスフレームワークを使用することは、このアプローチの欠点となる。さらに、CDRの多様性はまた、フォールディングおよび／または発現に影響を及ぼす可能性があるため、V遺伝子が完全に集合した後にフォールディングおよび／または発現を最適化する（そしていずれのフレームシフトまたは終結コドンをも除去する）ことが好ましい。この目的には、標的抗原での選択を行なう前に該ライブラリーの非機能的な又は十分にフォールディング／発現されないメンバーを除去しうる選択系があれば望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第97/08320号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】CookおよびTomlinson (1995) Immunol Today, 16:237
【非特許文献２】Corbettら (1997) J. Mol. Biol., 268:69
【非特許文献３】Ravetchら (1981) Cell, 27:583
【非特許文献４】SchableおよびZachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374:1001
【非特許文献５】Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264:220
【非特許文献６】Kawasakiら (1997) Genome Res., 7:250
【非特許文献７】Hieterら (1982) J. Biol. Chem., 257:1516
【非特許文献８】VasicekおよびLeder (1990) J. Exp. Med., 172:609
【非特許文献９】ChothiaおよびLesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901
【非特許文献１０】Chothiaら (1989) Nature, 342:877
【非特許文献１１】Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227:799
【非特許文献１２】Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14:4628
【非特許文献１３】Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263:800
【非特許文献１４】Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399:1
【非特許文献１５】Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256:813
【非特許文献１６】Ignatovichら (1997) J. Mol. Biol, 268:69
【非特許文献１７】Smith (1985) Science, 228:1315
【非特許文献１８】ScottおよびSmith (1990) Science, 249:386
【非特許文献１９】McCaffertyら (1990) Nature, 348:552
【非特許文献２０】Marksら (1991) J. Mol Biol., 222:581
【非特許文献２１】Vaughanら (1996) Nature Biotech., 14:309
【非特許文献２２】HoogenboomおよびWinter (1992) J. Mol. Biol., 227:381
【非特許文献２３】Nissimら (1994) EMBO J, 13:692
【非特許文献２４】Griffithsら (1994) EMBO J, 13:3245
【非特許文献２５】De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248:97
【非特許文献２６】Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
先行技術のライブラリーのもう1つの問題点は、主鎖コンホメーションが不均一であり、適当な高分解能結晶学的データが入手できない可能性があるため、三次元構造のモデル化が困難なことである。これはH3領域に関して特に問題となり、この場合、天然または合成抗体ライブラリーに由来する大多数の抗体は中等度または長いループを有するためモデル化できない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第1の態様においては、ポリペプチドのレパートリーから、第1結合部位において標的リガンドに及び第2結合部位において一般的リガンド（該一般的リガンドは、標的リガンドの特異性には無関係に該レパートリーの機能的メンバーに結合しうる）に結合する機能的ポリペプチドの集団を選択するための方法であって、
a）該レパートリーを該一般的リガンドと接触させ、それに結合した機能的ポリペプチドを選択し、
b）選択した該機能的ポリペプチドを該標的リガンドと接触させ、該標的リガンドに結合するポリペプチドの集団を選択する工程を含んでなる方法を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、一般的リガンドに対する結合能により決定される機能性によりポリペプチドのレパートリーを前選択（preselect）し、ついで、前選択の結果得られたポリペプチドのサブセットを標的リガンドに対する結合能による選択の更なるラウンドに使用する方法を提供する。好ましい実施形態においては、該レパートリーをまず一般的リガンドで選択するが、該レパートリーを逆の順序で該リガンドに接触させる（すなわち、一般的リガンドの前に標的リガンドに接触させる）ことが可能であることは当業者に明らかであろう。
【００１２】
本発明は、当業者が、実質的にいずれの標的リガンドにも結合できない又はそのように考えられる非機能的なポリペプチド（例えば、フレームシフト突然変異、終結コドンの導入によるもの、フォールディング突然変異体または発現突然変異体）を、選択されたポリペプチドのレパートリーから除去するのを可能にする。そのような非機能的突然変異体は、ポリペプチドレパートリーの構築に用いる通常のランダム化および変異操作により作製する。同時に、本発明は、当業者が、機能的であり十分にフォールディングし高度に発現されるポリペプチドに関して、選択されたポリペプチドレパートリーを富化するのを可能にする。
【００１３】
好ましくは、例えば、2以上の一般的リガンドで該レパートリーを前スクリーニングすることにより、または異なる条件下で該レパートリーを一般的リガンドと接触させることにより、本発明の方法により該レパートリーから2以上のポリペプチドサブセットを得る。好ましくは、このようにして得たポリペプチドのサブセットを組み合わせて、もう1つのポリペプチドレパートリーを形成させ、それを標的および／または一般的リガンドと接触させることにより更にスクリーニングすることができる。
【００１４】
好ましくは、本発明のライブラリーは、免疫グロブリンスーパーファミリーのポリペプチド、例えば、抗体ポリペプチドまたはT細胞受容体ポリペプチドを含む。好ましくは、該ライブラリーは、個々の免疫グロブリンドメイン、例えば、抗体のVHまたはVLドメイン、またはT細胞受容体のVβまたはVαドメインを含んでいてもよい。したがって、好ましい実施形態においては、例えばVHおよびVLポリペプチドのレパートリーを、一般的リガンドを使用して個々に前スクリーニングし、ついでそれらを組み合わせて、VHおよびVLポリペプチドを共に含む機能的レパートリーを得ることができる。ついで、VHおよびVLドメインを共に含み所望の結合特異性を有するポリペプチドを単離するために、そのようなレパートリーを標的リガンドでスクリーニングすることができる。
【００１５】
好ましい実施形態においては、免疫グロブリンレパートリーでの使用に選択される一般的リガンドはスーパー抗原である。スーパー抗原は、標的リガンドの特異性には無関係に、特定の主鎖コンホメーションを含む機能的免疫グロブリン分子またはそのサブセットに結合しうる。あるいは、一般的リガンドは、与えられた任意のレパートリーを構成するポリペプチドの一般的構造体（例えば、抗体自体、金属イオンマトリックス、有機化合物（タンパク質またはペプチドを含む）など）に結合しうる任意のリガンドから選択することができる。
【００１６】
第2の態様において、本発明は、該機能的メンバーが一般的リガンドおよび標的リガンドの両方に対する結合部位を有するライブラリーを提供する。この目的のために、例えば、与えられたスーパー抗原に認識される主鎖コンホメーションを有する抗体ライブラリーを構築することにより、または潜在的に機能的なメンバーの実質的にすべてが、抗体リガンドに認識されうる構造を有するようなライブラリーを構築することにより、ライブラリーを特別に設計することができる。
【００１７】
第3の態様において、本発明は、本発明により予め選択されたポリペプチドのレパートリーの1以上のメンバーの検出、固定化、精製または免疫沈降のための方法であって、該メンバーを該一般的リガンドに結合させることを含んでなる方法を提供する。
【００１８】
第4の態様において、本発明は、免疫グロブリンスーパーファミリーのポリペプチドのレパートリーを含んでなるライブラリーであって、該レパートリーのメンバーが既知の主鎖コンホメーションを有するライブラリーを提供する。
【００１９】
第5の態様において、本発明は、所望の一般的および／または標的リガンド結合部位を有するポリペプチドをポリペプチドのレパートリーから選択するための方法であって、
a）本発明の前記態様のライブラリーを発現させ、
b）該ポリペプチドを一般的および／または標的リガンドと接触させ、該一般的および／または標的リガンドに結合するポリペプチドを選択し、
c）所望により、該一般的および／または標的リガンドに結合する選択されたポリペプチドを増幅し、
d）所望により、工程a）〜c）を繰返す工程を含んでなる方法を提供する。
【００２０】
ポリペプチドのレパートリーの作製および維持は共に、核酸ライブラリーの形態で行なうのが好都合である。したがって、第6の態様において、本発明は、そのようなポリペプチドのレパートリーをコードする核酸ライブラリーを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】広範な天然多様性を示し抗原と接触するヒト抗体レパートリーのVHおよびVκ領域内の位置を示す棒グラフ（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256:813を参照されたい）。L3の末端およびH3は、非常に多様性であり抗原と接触するが、この図には示されていない。ヒトλ遺伝子における配列多様性は十分に特徴づけられているが（Ignatovichら (1997) J. Mol. Biol, 268:69を参照されたい）、三次元λ構造に関する抗原接触についてのデータは現在のところ非常に少数しか存在しない。
【図２】本発明のライブラリーの基礎を形成するscFvの配列。現在のところ、該ライブラリーの2つの変形（18個の位置が一様でない「一次」ライブラリー、および12個の位置が一様でない「体細胞」ライブラリー）が存在する。6個のループ領域（H1、H2、H3、L1、L2およびL3）が示されている。Kabat（Kabatら (1991). Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services）が定義しているCDR領域に下線が付されている。
【図３】一般的リガンドであるプロテインAおよびプロテインBでの選択の前および後の本発明のライブラリー内の機能性の分析。この場合、プロテインLをELISAプレート上にコートし、scFv上清をそれに結合させ、scFv結合の検出をプロテインA-HRPで行なう。したがって、プロテインAおよびプロテインLの両方に結合しうるscFvのみが、ELISAシグナルを与える。
【図４−１】ウシユビキチン、ラットBIP、ウシヒストン、NIP-BSA、FITC-BSA、ヒトレプチン、ヒトチログロブリン、BSA、鶏卵リゾチーム、マウスIgGおよびヒトIgGでのパンニングの後に本発明のライブラリーから選択されたクローンの配列。配列内の下線は、それぞれのライブラリー内の一様でない位置を示す。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図５】5a：宿主細胞における未選択および前選択「一次」DVTライブラリーにより得られたscFv濃度の比較。5b：既知標準物から決定されたELISAの標準曲線。
【図６】scFvを保持するファージの割合（％）を測定するために抗ファージpIII抗体でプローブした、前選択および未選択DVT「一次」ライブラリーからのファージのウエスタンブロット。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
レパートリー
レパートリーは、多様な変異体（例えば、ヌクレオチド配列が異なる核酸変異体、またはアミノ酸配列が異なるポリペプチド変異体）の集団である。本発明のライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸のレパートリーを含むであろう。本発明では、ポリペプチドのレパートリーは、一般的リガンドに対する結合部位および標的リガンドに対する結合部位を有するように設計する。それらの結合部位は重複していてもよく、あるいは該分子の同一領域に位置していてもよいが、それらの特異性は異なるであろう。
【００２３】
生物
本発明で用いる「生物」なる語は、あらゆる細胞性生命形態（例えば、原核生物および真核生物）および非細胞性の核酸含有体（例えば、バクテリオファージおよびウイルス）を意味する。
【００２４】
機能的
本発明で用いる「機能的」なる語は、当該タイプの天然産生タンパク質の天然生物活性または特定のいずれかの望ましい活性（例えば、後記で定義するリガンド分子に対するその結合能により判定されるもの）を有するポリペプチドに関して使用する。「機能的」ポリペプチドには、例えば、対応する抗原結合部位を介して抗原と特異的に結合する抗体、対応する特有のリガンドに結合する受容体分子（例えば、T細胞受容体）、および対応する基質に結合する酵素が含まれる。あるポリペプチドが本発明において機能的なものとして分類されるためには、当然のことながら、それは、その全体的な構造的完全性（後記で定義する一般的リガンドに対するその結合能により判定される）を保有するように適切にプロセシングされフォールディングされなければならない。
【００２５】
疑義を避けるために、機能性は、標的リガンドに対する結合能と同意義ではない。例えば、機能的抗CEAモノクローナル抗体は、細菌性LPSなどの標的リガンドに特異的に結合できないであろう。しかしながら、それは標的リガンドに結合しうるため、（すなわち、CEAが標的リガンドである場合、それはCEAに結合するであろう）、それは「機能的」抗体分子として分類され、後記で定義する一般的リガンドに対する結合により選択されうる。典型的には、非機能的抗体分子は、いずれの標的リガンドにも結合できないであろう。
【００２６】
一般的リガンド
一般的リガンドは、与えられたレパートリー内の実質的割合の機能的メンバーに結合するリガンドである。したがって、同じ一般的リガンドは該レパートリーの多数のメンバーに結合することが可能であり、これは、それらの標的リガンド特異性（後記を参照されたい）には無関係である。一般に、機能的な一般的リガンド結合部位の存在は、該レパートリーメンバーが正しく発現されフォールディングされることを示す。したがって、対応する結合部位に対する一般的リガンドの結合は、機能的ポリペプチドをポリペプチドのレパートリーから前選択するための方法を与える。
【００２７】
標的リガンド
標的リガンドは、同定しようとする該レパートリーの特異的結合メンバーに対するリガンドである。該レパートリーのメンバーが抗体分子である場合には、該標的リガンドは抗原であってもよく、該レパートリーのメンバーが酵素である場合には、該標的リガンドは基質であってもよい。標的リガンドに対する結合は、「一般的リガンド」の項で前記したとおりに機能的であるレパートリーのメンバーと、標的リガンドに対する結合部位の厳密な特異性との両方に左右される。
【００２８】
サブセット
サブセットはレパートリーの一部である。本発明の用語においては、多くの場合、該レパートリーのサブセットだけが機能的であり、したがって、機能的な一般的リガンド結合部位を有する。さらに、レパートリーの機能的メンバーの一部だけ（しかしながら、それは、ある与えられた標的リガンドに結合すると予想されるものより有意に多い）が一般的リガンドに結合することも可能である。これらのサブセットも、本発明により選択されうる。
【００２９】
所望の基準に従い前選択された新規レパートリーを得るために、ライブラリーのサブセットを組み合わせたりプールすることができる。組合された又はプールされたレパートリーは、一般的リガンドの結合により前選択されたポリペプチドメンバーの単なる混合物であってもよく、あるいは2つのポリペプチドサブセットが組合されるように操作してもよい。例えば、VHおよびVLポリペプチドを個々に前スクリーニングし、ついで遺伝子レベルで単一ベクター上に組み合わせて、それらが組合せVH-VL二量体（例えば、scFv）として発現されるようにすることが可能である。
【００３０】
ライブラリー
ライブラリーなる語は、不均一なポリペプチドまたは核酸の混合物を意味する。ライブラリーは、単一のポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成される。この範囲においては、ライブラリーはレパートリーと同義である。ライブラリーメンバー間の配列の相違は、ライブラリーに存在する多様性に寄与する。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単なる混合物の形態をとることが可能であり、あるいは核酸のライブラリーで形質転換された生物または細胞の形態（例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞など）であってもよい。好ましくは、各個の生物または細胞は、ライブラリーの唯一のメンバーを含有する。核酸を発現ベクター中に組込んで、該核酸にコードされるポリペプチドの発現が可能となるようにするのが好都合である。したがって、好ましい態様においては、ライブラリーは、宿主生物（各生物は、対応するポリペプチドメンバーを産生するように発現されうる核酸形態をとるライブラリーの単一メンバーを含有する発現ベクターのコピーを1以上含有する）の集団の形態をとりうる。したがって、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有する。
【００３１】
免疫グロブリンスーパーファミリー
これは、2つのβシートと通常は保存ジスルフィド結合とを含有する免疫グロブリン（抗体）分子に特徴的な免疫グロブリンフォールドを保有するポリペプチドのファミリーを意味する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、in vivoにおける細胞性および非細胞性相互作用の多数の側面、例えば、免疫系における広範な役割（例えば、抗体、T細胞受容体分子などの場合）、細胞接着への関与（例えば、ICAM分子の場合）および分子内シグナル伝達（例えば、PDGF受容体などの受容体分子の場合）に関与している。本発明は、あらゆる免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。なぜなら、その場合の変異は同様に達成されるからである。好ましくは、本発明は、免疫グロブリン（抗体）に関する。
【００３２】
主鎖コンホメーション
主鎖コンホメーションは、三次元構造のCαバックボーントレースを意味する。抗体またはTCR分子の個々の超可変ループの場合には、主鎖コンホメーションは正規（canonical）構造と同義である。ChothiaおよびLesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901、およびChothiaら (1989) Nature, 342:877に記載されているとおり、抗体の6個の超可変ループのうちの5個（H1、H2、L1、L2およびL3）に関しては、該ループ自体には相当な側鎖多様性が存在するものの、抗体は一定数の正規構造を示す。示される厳密な正規構造は、ループの長さと、そのパッキングに関与する或る鍵残基の種類とに左右される。第6のループ（H3）は、長さおよび配列の両方において、より一層多様であり、したがって、ある短いループ長にわたる正規構造を示すにすぎない（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263:800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399:1）。本発明においては、6個すべてのループが好ましくは正規構造を有し、したがって抗体分子全体の主鎖コンホメーションが既知である。
【００３３】
抗体ポリペプチド
抗体は、B細胞により産生され脊椎動物における宿主免疫防御系の中核部を形成する免疫グロブリンである。本発明で用いる抗体ポリペプチドは、修飾されている又は修飾されていない抗体または抗体の一部であるポリペプチドである。したがって、抗体ポリペプチドなる語は、重鎖、軽鎖、重鎖-軽鎖二量体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、DabフラグメントまたはFvフラグメント（一本鎖Fv（scFv）など）を含む。そのような抗体分子の構築のための方法は当技術分野でよく知られている。
【００３４】
スーパー抗原
スーパー抗原は、一般には細菌内で発現される毒素の形態の抗原であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相互作用するが、この場合、これらの分子に対する通常のリガンド結合部位以外の部位で相互作用する。ブドウ球菌エンテロトキシンは、T細胞受容体と相互作用し、CD4+ T細胞を刺激する作用を有する。抗体に対するスーパー抗原には、IgGの定常領域に結合するプロテインG（BjorckおよびKronvall (1984) J. Immunol,, 133:969; Reisら (1984) J. Immunol, 132:3091）、IgGの定常領域およびVHドメインに結合するプロテインA（ForsgrenおよびSjoquist (1966) J. Immunol., 97:822）、およびVLドメインに結合するプロテインL（Bjorck (1988) J. Immunol., 140:1994）などの分子が含まれる。
【００３５】
（発明の好ましい実施形態）
本発明は、「標的リガンド」に対する特異性に関する選択を行なう前に、フォールディングし十分に発現している機能的メンバーを富化させつつ、非機能的な又は十分にフォールディング／発現していないポリペプチドライブラリーメンバーを排除する（またはそれらの割合を有意に減少させる）選択系を提供する。関連しているクラスの機能的（例えば、完全なおよび／または正しくフォールディングした）タンパク質のすべてに共通の構造的特徴に対して親和性を有するタンパク質である「一般的リガンド」と、ポリペプチド分子のレパートリーとを接触させる。「リガンド」なる語は、本発明で使用する分子に関して広義に用いられていることに注意されたい。本発明で用いる「リガンド」なる語は、該ポリペプチドライブラリーのメンバーに結合する又はそれに結合される任意の実体を意味する。
【００３６】
初期レパートリー中に存在する欠損タンパク質の大多数は、一般的リガンドに結合しないため排除される。非機能的ポリペプチドをライブラリーからこのように選択的に除去することは、その実際のサイズの著しい減少をもたらすが、一方、その機能的サイズは維持され、それに伴いその質は向上する。一般的リガンドに結合することにより維持されたポリペプチドは、元のレパートリーの「第1選択プール」または「サブセット」を構成する。したがって、この「サブセット」は、機能的で十分にフォールディングし十分に発現される該初期レパートリーのメンバーに富む。
【００３７】
ついで第1選択プールまたはサブセットの該ポリペプチドを、所定の機能的特異性を有するポリペプチドに結合する少なくとも1つの「標的リガンド」と接触させる。そのような標的リガンドには、受容体／リガンドのペア（例えば、ホルモンまたは他の細胞シグナル伝達分子、例えば、神経伝達物質およびその対応受容体）のいずれか一方、細胞接着分子の結合ペアのいずれか、酵素の活性部位が結合するタンパク質基質、個々の抗体に対するタンパク質、ペプチドもしくは小有機化合物または更には抗体自体が含まれるが、これらに限定されるものではない。その結果、そのようなライブラリーの使用は、通常のライブラリーの場合ほど労働集約的ではなく、時間および材料の点でより経済的である。また、一般的リガンドで選択されていないレパートリーと比べて、第1選択プールの場合には、標的リガンドに結合できない分子に対する標的リガンドに結合しうる分子の比率がはるかに高くなるため、「標的リガンド」での選択中のバックグラウンドが有意に減少するであろう。
【００３８】
また、本発明においては組合せ選択方法も意図される。種々の一般的および／または標的リガンドを同時または連続的に使用して、同一初期ポリペプチドレパートリーの選択を複数回行なうことができる。したがって、まず該レパートリーを単一の一般的リガンドで選択し、ついで種々の標的リガンドを使用して同時に選択することができる。ついで、得られたサブセットを別々に使用したり、組み合わせることが可能であり、この場合、該組合せサブセットは、一定範囲の標的リガンド特異性を有するが、単一の一般的リガンド特異性を有することとなる。あるいは、まず該レパートリーを単一の標的リガンドで選択し、ついで種々の一般的リガンドを使用して同時に選択することができる。ついで、得られたサブセットを別々に使用したり、組み合わせることが可能であり、この場合、該組合せサブセットは、一定範囲の一般的リガンド特異性を有するが、単一の標的リガンド特異性を有することとなる。また、より精巧な方法の使用も考えられる。例えば、初期レパートリーを、2つの異なる一般的リガンドを使用する2ラウンドの選択、ついで標的リガンドでの選択に付すことができる。これは、すべてのメンバーが一般的リガンドおよび該標的リガンドの両方に結合するようなサブセットを与える。あるいは、2つの一般的リガンドで初期レパートリーの選択を同時に行ない、得られるサブセットを組み合わせ、ついで標的リガンドで選択する場合には、得られるサブセットは、それらの2つの一般的リガンドおよび標的リガンドの少なくとも1つに結合する。組合された又はプールされたレパートリーは、該サブセットの単なる混合物であってもよく、あるいは該サブセットが物理的に結合するように操作してもよい。例えば、VHポリペプチドおよびVLポリペプチドを、2つの異なる一般的リガンドに結合させることにより別個に同時に選択し、ついで単一のベクター上に遺伝子レベルで組み合わせて、それらが組合せVH-VLとして発現されるようにすることができる。ついでこのレパートリーを標的リガンドに対して選択して、それらの選択されたメンバーが一般的リガンドおよび標的リガンドの両方に結合しうるようにすることができる。
【００３９】
本発明は、前記で広く記載されている方法により選択された又は選択可能な機能的ポリペプチドのライブラリー、およびこれらの方法に従い行なう選択において使用しうるポリペプチド分子（好ましくは、標的リガンドに対する第1結合部位および一般的リガンドに対する第2結合部位を含む分子）をコードする核酸ライブラリーを含む。さらに、本発明は、本発明に従い一般的または標的リガンドを使用して選択された機能的ポリペプチドのレパートリーの1以上のメンバーの検出、固定化、精製または免疫沈降のための方法を提供する。
【００４０】
本発明は、特に、免疫グロブリンスーパーファミリーの分子のライブラリーの富化に適用可能である。これは、機能的であり所望の特異性（診断、治療または予防方法における使用に要求されるもの）を有する抗体およびT細胞受容体の集団の作製に関して特に当てはまる。この目的のために、本発明は、抗体およびT細胞受容体ライブラリーであって、該メンバーのすべてが、既知の主鎖コンホメーションの天然フレームワークおよびループの両方を有することを特徴とするライブラリー、ならびに出発配列の有用な突然変異誘発のための及びそのようにして得た機能的変異体をついで選択するための方法を提供する。そのようなポリペプチドライブラリーはVHもしくはVβドメインを含んでいてもよく、あるいはそれはVLもしくはVαドメイン、または更にはVHもしくはVβドメインとVLもしくはVαドメインとの両方を含んでいてもよい。
【００４１】
当技術分野においては、抗体またはT細胞受容体分子の改良されたライブラリーが非常に必要とされている。例えば、「単一ポット（single pot）」ファージ-抗体ライブラリーの作製における進歩にもかかわらず、依然としていくつかの問題が残されている。ヒトB細胞から集められた再配列V遺伝子を使用する天然ライブラリー（Marksら (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Vaughanら (1996) Nature Biotech., 14:309）は、in vivoにおけるB細胞のポジティブおよびネガティブ選択のせいで非常に偏っている。これは、再配列V遺伝子から構築されるファージライブラリーの有効サイズを限定する可能性がある。また、天然ライブラリー由来のクローンは、ヒトにおける療法で使用した場合に抗体免疫原性をもたらしうるフレームワーク突然変異を一定不変に含有する。合成ライブラリー（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457; Nissimら (1994) EMBO J., 13:692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13:3245; De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248:97）は、偏りの問題を克服しうるが、それらは、集合したV遺伝子中に塩基対の欠失を頻繁に導入する長い縮重PCRプライマーの使用を要する。また、この高度のランダム化は、正しくフォールディングできないため非機能的でもある抗体の生成につながりうる。多くの場合、あるライブラリー中のこれらの非機能的メンバーの数が機能的メンバーの数より多くなると考えられる。コンセンサスフレームワーク配列を有する「マスター遺伝子」のセットを合成することにより、およびフォールディングおよび発現を改善させることが示されているアミノ酸の置換を組込むことにより、該フレームワークがフォールディングおよび／または発現に関して予め最適化されうる場合であっても（WO97/08320, Morphosys）、ほとんどの場合、該コンセンサス配列はいずれの天然フレームワークにも対応しないため、依然として免疫原性の問題が残される。さらに、CDRの多様性はまた、フォールディングおよび／または発現に影響を及ぼす可能性があるため、V遺伝子が完全に集合した後、フォールディングおよび／または発現を最適化する（そしていずれのフレームシフトまたは終結コドンをも除去する）のが好ましい。
【００４２】
既存のライブラリーのもう1つの問題は、主鎖コンホメーションが不均一であり、適当な高分解能結晶学的データが入手できない可能性があるため、三次元構造のモデル化が困難なことである。これはH3領域に関して特に問題となり、この場合、天然または合成抗体ライブラリーに由来する大多数の抗体は中等度または長いループを有するためモデル化できない。
【００４３】
既存のライブラリーのもう1つの問題は、発現された抗体フラグメントを検出するためには、エピトープタグ（例えば、myc、FLAGまたはHISタグ）に頼らざるを得ないことである。これらは、通常、抗体フラグメントのNまたはC末端に位置するため、それらはタンパク質分解切断を受けやすい傾向にある。スーパー抗原（例えば、プロテインAおよびプロテインL）を使用して、フォールディングしたドメイン自体に結合させることにより発現抗体フラグメントを検出することができるが、それらはVHおよびVLファミリーに特異的であるため、いずれかの既存の抗体ライブラリーの比較的少数の割合のメンバーがこれらの試薬の1つに結合するにすぎず、両方に結合するのはより一層少数の割合となるであろう。
【００４４】
この目的のためには、標的抗原に対する選択を行なう前に、フォールディングし十分に発現される機能的メンバー（それらはすべて、スーパー抗原であるプロテインAおよびプロテインLなどの一般的リガンドに結合しうる）を富化させつつ、該ライブラリーの非機能的な又は十分にフォールディング／発現されないメンバーを排除しうる（または少なくともそれらの割合を減少させうる）選択系を得ることができれば望ましいであろう。また、すべてのメンバーが天然フレームワークを有し既知の主鎖コンホメーションのループを有する抗体ライブラリーを構築するのが好都合であろう。
【００４５】
したがって、本発明は、非機能的メンバーが除去されるようにポリペプチドレパートリーを選択することを可能にする方法を提供する。これは、機能的ライブラリーのサイズを減少させることなく実際のライブラリーのサイズの著しい減少（そしてそれに伴うライブラリーの質の向上）をもたらす。本発明はまた、すべての機能的メンバーが所定の一般的リガンドに結合しうる新規ポリペプチドレパートリーの製造方法を提供する。それに続く、該レパートリーの任意の1以上のメンバーの検出、固定化、精製または免疫沈降のために、同じ一般的リガンドを使用することができる。
【００４６】
機能的メンバーを富化させるために、および／または所定の一般的リガンドに結合するメンバーを富化させるために、任意の「ナイーブ」または「免疫」抗体レパートリーを本発明で使用することができる。実際のところ、全ヒト生殖細胞系列VHセグメントのうちのごく一部しかプロテインAに高い親和性で結合せず、全ヒト生殖細胞系列VLセグメントのうちのごく一部しかプロテインLに高い親和性で結合しないため、これらのスーパー抗原での前選択は非常に好都合である。あるいは、エピトープタグを介した前選択は、非機能的変異体が合成ライブラリーから除去されるのを可能にする。前選択に容易に適合しうるライブラリーには、Marksら (1991) J. Mol. Biol., 222:581およびVaughanら (1996) Nature Biotech., 14:309に記載されているタイプのin vivoで再配列されたV遺伝子を含むライブラリー、生殖細胞系列V遺伝子セグメントをin vitroで「再配列」させる（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Nissimら (1994) EMBO J., 13:692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13:3245; De Kruifら (1995) J.Mol. Biol., 248:97）または合成CDRが単一の再配列V遺伝子中（Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457）または複数のマスターフレームワーク中（WO97/08320, Morphosys）に組込まれる合成ライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明によるポリペプチドの選択
ポリペプチドの多様性プールを作製したら、本発明による選択を行なう。2つの広範囲選択方法は、一般的リガンドおよび標的リガンドを適用する順序に基づく。これらの方法に基づくコンビナトリアル法は、ある与えられた選択工程において複数の一般的および／または標的リガンドを使用することを含む。組合せ法を用いる場合には、ポリペプチド分子のプールを、例えば、いくつかの標的リガンドと同時に又はそれぞれ単独で連続して接触させることができる。後者の場合には、得られるポリペプチド選択プールを別々に維持するか、それら自体をプールすることができる。これらの選択方法は以下のとおりに要約することができる。
【００４８】
a．選択方法1：
一般的リガンドを使用する初期ポリペプチド選択
ライブラリーの非機能的メンバーを除去するために、一般的リガンドを選択して、該一般的リガンドが機能的分子にのみ結合するようにする。例えば、一般的リガンドは、金属イオン、抗体（モノクローナル抗体または抗体のポリクローナル混合物）、酵素／リガンド複合体の一方または有機物であってもよい。これらのタイプのいずれのリガンドも、一般的リガンドに加えて又はその代わりに本発明の標的リガンドとして有用であることに注意されたい。抗体産生および金属アフィニティークロマトグラフィーについては、後記で詳しく説明する。理想的には、これらのリガンドは、一定の構造（該構造は、非機能的メンバー中に存在しないか又は改変される傾向にある）または配列を有するライブラリーのメンバー上の部位（例えば、ペプチドタグまたはスーパー抗原結合部位）に結合する。抗体ライブラリーの場合には、この方法は、所定のスーパー抗原またはモノクローナル抗体に対する結合部位を有する機能的メンバーのみをライブラリーから選択するのに有用である。そのようなアプローチは、機能的抗体ポリペプチドを、それらの天然および合成プールから選択するのに有用である。
【００４９】
スーパー抗原であるプロテインAおよび／またはプロテインLは、抗体レパートリーを選択するための一般的リガンドとして本発明において有用である。なぜなら、それらは、標的リガンドに対する結合部位の配列および構造には無関係に、正しくフォールディングしたVHおよびVLドメイン（これらは、あるVHおよびVLファミリーに属する）に結合するからである。また、プロテインAまたはもう1つのスーパー抗原であるプロテインGは、抗体の重鎖定常ドメインに結合させることによりフォールディングおよび／または発現に関して選択するための一般的リガンドとして有用である。また、抗κおよび抗λ抗体は、軽鎖定常ドメインを選択するのにも有用である。抗体の又は他の結合性タンパク質、例えばプロテインAの小さな有機模擬体（Liら (1998) Nature Biotech., 16:190）も有用である。
【００５０】
この選択方法を用いる場合、一般的リガンドは、必然的に、前選択されたレパートリーのすべての機能的メンバーに結合しうる。したがって、この一般的リガンド（または或る種のそのコンジュゲート）を使用して、該レパートリーからのいずれかのメンバーまたはメンバーの集団の検出、固定化、精製または免疫沈降を行なうことができる（後記のとおり、所定の標的リガンドに結合させることにより選択されているか否かには無関係である）。本発明のレパートリーのメンバーポリペプチドの免疫沈降およびイムノアッセイ技術によるタンパク質の検出は、本発明において有用な抗体選択リガンドの試験に関して後記で説明する技術（「ポリペプチド選択においてリガンドとして使用するための抗体」を参照されたい）により行なうことができる。本発明の一般的または標的リガンド〔それら自体、フィルター（例えば、ニトロセルロースまたはナイロンのフィルター）またはクロマトグラフィー支持体（セルロース、ポリマー、樹脂またはシリカ支持体が含まれるが、これらに限定されるものではない）などの固体または半固体支持体に結合している〕に対するレパートリーのポリペプチドメンバーの特異的結合により、固定化を行なうことができる。当業者に公知の多数の化学架橋剤のいずれかを使用して、一般的または標的リガンドに該メンバーポリペプチドを共有結合させることができる。金属アフィニティークロマトグラフィー支持体上の固定化については後記で説明する（「ポリペプチド選択に使用する金属リガンド」を参照されたい）。精製は、これらの技術のいずれか又は組合せ（特に、当技術分野でよく知られた方法による免疫沈降およびクロマトグラフィー）よりなるものであってもよい。
【００５１】
このアプローチを用いて、複数の一般的リガンドでの選択を順次行なって、すべてのメンバーが2以上の一般的リガンドに結合するレパートリーを作製したり、あるいは該選択を別々に同時に行なって該サブセットを後で組み合わせたり（この場合、該前選択レパートリーのメンバーは一般的リガンドの少なくとも1つに結合するであろう）、あるいは該選択を別々に行ない、ついで同一ポリペプチド鎖中への組込みを行ない、それにより、前選択中に使用したすべての一般的リガンドにすべてのメンバーが結合しうる大きな機能的ライブラリーを得ることができる。例えば、抗体分子の重鎖および軽鎖に結合する種々の一般的リガンド（後記を参照されたい）を使用して、1以上のライブラリーからサブセットを選択し、ついでそれらを組み合わせて重鎖／軽鎖ライブラリー（該重鎖および軽鎖が、例えば一本鎖Fvの状況においてVHおよびVLドメインを用いることにより非共有的に会合または共有結合されている）を形成させることができる。
【００５２】
標的リガンドを使用する二次ポリペプチド選択
一般的リガンドでの選択工程の後、標的リガンドに結合するメンバーを同定するために該ライブラリーをスクリーニングする。それは一般的リガンドでの選択の後に機能的ポリペプチドに関して富化されているため、標的リガンドでの選択中の非特異的（「バックグラウンド」）結合における有利な減少が生じるであろう。さらに、一般的リガンドでの選択は、機能的ライブラリーのサイズを減少させることなく実際のライブラリーのサイズの著しい減少（そしてそれに伴うライブラリーの質の向上）をもたらすため、より少数のレパートリーが、より大きな出発レパートリー（これは、十分にフォールディング／発現されない多数の非機能的メンバーを含有していた）と同じ、標的リガンド特異性および親和性の多様性を惹起するはずである。
【００５３】
一般的リガンドを使用して得られた第1選択ポリペプチドプールからポリペプチドを選択するために、1以上の標的リガンドを使用することができる。多数の異なるサブセットを得るために2以上の標的リガンドを使用する場合には、これらのサブセットの2以上を組合せて、より複雑な単一のサブセットを形成させることができる。単一の一般的なリガンドは、得られた組合せサブセットのそれぞれのメンバーに結合しうるが、所定の標的リガンドはライブラリーのメンバーのサブセットのみに結合する。
【００５４】
b．選択方法2：
標的リガンドによるレパートリーメンバーの初期選択
ここでは、一般的リガンドを使用する選択の前に、標的リガンドを使用する選択を行なう。同じセットのポリペプチドが望ましい場合には、それらをいずれかの方法により得ることができることは明らかである。このアプローチを用いて、複数の標的リガンドで同時に、または選択用の標的リガンドを混合することにより選択を行なうことができる。同時に行なう場合には、必要に応じて、得られるサブセットを組合せることができる。
【００５５】
一般的リガンドを使用する二次ポリペプチド選択
ついで1以上の一般的リガンドを使用して、標的リガンド結合サブセットの、後続の選択を行なう。これは機能に関する選択ではないが、標的リガンドに結合しうるレパートリーのメンバーは定義上機能的であるため、それは、種々の一般的リガンドに結合するサブセットの単離を可能にする。したがって、標的リガンドで選択した集団を、1つの一般的リガンドにより、あるいは2以上の一般的リガンドにより選択することができる。この場合、一般的リガンドを順次使用して、すべてのメンバーが標的リガンドおよび2以上の一般的リガンドに結合するレパートリーを作製したり、あるいは一般的リガンドを別々に同時に使用して、標的リガンドおよび種々の一般的リガンドと異なる（しかしながらおそらく重複する）サブセットを作製する。ついでこれらを組合せることができる（この場合、メンバーは一般的リガンドの少なくとも1つに結合するであろう）。
【００５６】
免疫グロブリンファミリーポリペプチドライブラリーメンバーの選択
好ましくは、本発明において選択したレパートリーまたはライブラリーのメンバーは、免疫グロブリンスーパーファミリーの分子、特に抗体ポリペプチド、またはT細胞受容体ポリペプチドに属する。抗体に関しては、本発明の方法は、当技術分野で公知で既存の任意の抗体ライブラリー（天然体または合成体）、または一般的リガンドで前選択されるように特別に設計された抗体ライブラリー（後記を参照されたい）に適用することができると予想される。
【００５７】
本発明のライブラリーの構築
a．主鎖コンホメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、それらのポリペプチド鎖に関して同様のフォールド（fold）を有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関しては非常に多様であるが、予想に反して、抗体の抗原結合ループ6個中5個（H1、H2、L1、L2、L3）は一定数の主鎖コンホメーションまたは正規構造をとることが、配列および結晶構造の比較から示されている（ChothiaおよびLesk (1987) 前掲: Chothiaら (1989) 前掲）。したがって、ループ長および鍵残基の分析は、ヒト抗体の大多数で見出されるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションの予測を可能にした（Chothiaら (1992) 前掲; Tomlinsonら (1995) 前掲; Williamsら (1996) 前掲）。H3領域は、配列、長さおよび構造の点で、より一層多様性があるが（Dセグメントを用いるため）、それはまた、該ループおよび抗体フレームワーク内の鍵部位における特定の残基の存在および長さまたは残基のタイプに左右される短いループ長にわたる一定数の主鎖コンホメーションを形成する（Martinら (1996) 前掲; Shiraiら (1996) 前掲）。
【００５８】
本発明では、メンバーの主鎖コンホメーションが既知であることが保証されるように或るループ長および鍵残基が選択されている抗体ポリペプチドのライブラリーを設計する。前記のとおりそれらが非機能的となる可能性を最小限に抑えるために、これらは、天然で見出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の真のコンホメーションであるのが好都合である。生殖細胞系V遺伝子セグメントは、抗体またはT細胞受容体ライブラリーを構築するための1つの適当な基本的フレームワークとして有用である。他の配列も有用である。少数の機能的メンバーが、その機能に影響を及ぼさない改変された主鎖コンホメーションを有するように、変異が低頻度で生じてもよい。
【００５９】
また、正規構造理論は、抗体にコードされる種々の主鎖コンホメーションの数を評価したり、抗体の配列に基づいて主鎖コンホメーションを予想したり、正規構造に影響を及ぼさない多様化のための残基を選択するために、本発明において有用である。ヒトVκドメインにおいては、L1ループは4つの正規構造のうちの1つをとることが可能であり、L2ループは単一の正規構造を有し、ヒトVκドメインの90％はL3ループの4つまたは5つの正規構造のうちの1つをとることが現在公知であり（Tomlinsonら (1995) 前掲）、したがって、Vκドメイン単独では、種々の正規構造を組合せて一定範囲の種々の主鎖コンホメーションを得ることができる。VλドメインがL1、L2およびL3ループの正規構造の異なる範囲をコードしており、VκおよびVλドメインが、H1およびH2ループのいくつかの正規構造をコードしうる任意のVHドメインとペアになりうると仮定すると、これらの5つのループで認められる正規構造の組合せの数は非常に大きくなる。このことは、主鎖コンホメーションにおける多様性の生成が、広範な結合特異性の生成に必須であるかもしれないことを示唆している。しかしながら、単一の既知の主鎖コンホメーションに基づいて抗体ライブラリーを構築することにより、予想に反して、実質的にすべての抗原を標的化するのに十分な多様性を得るためには主鎖コンホメーションにおける多様性は必ずしも要求されないことが判明した。より一層驚くべきことに、単一の主鎖コンホメーションは、必ずしもコンセンサス構造でなくてもよく、単一の天然に存在するコンホメーションを全ライブラリーの基礎として用いることができる。したがって、好ましい態様において、本発明は、単一の既知主鎖コンホメーションをコードするメンバーを含むライブラリーを提供する。しかしながら、偶発的な変異が生じて少数の機能的メンバーが代替的主鎖コンホメーション（これは未知のものであってもよい）を有することがあると理解されるべきである。
【００６０】
選択する単一の主鎖コンホメーションは、好ましくは、問題の免疫グロブリンスーパーファミリーのタイプの分子の通常のものである。天然に存在する分子の相当数が或るコンホメーションをとることが観察される場合には、コンホメーションは通常のものである。したがって、本発明の好ましい態様においては、免疫グロブリンスーパーファミリー分子の各結合ループの種々の主鎖コンホメーションの自然発生は独立して考慮され、したがって、それらの種々のループの主鎖コンホメーションの所望の組合せを有する天然に存在する免疫グロブリンスーパーファミリー分子を選択する。いずれも利用できない場合には、最も近い等価体を選択することができる。先行技術の免疫グロブリンファミリーポリペプチドライブラリーの欠点は、多数のメンバーが非天然フレームワークを有していたりフレームワーク突然変異（前記を参照されたい）を含有していることにあるため、抗体またはT細胞受容体の場合には、所望の主鎖コンホメーションをコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより、それらの種々のループの主鎖コンホメーションの所望の組合せを得るのが好ましい。選択した生殖細胞系遺伝子セグメントが頻繁に発現されることがより好ましく、それらが最も頻繁に発現されるのが最も好ましい。
【００６１】
したがって、抗体ライブラリーを設計する場合には、6個の各抗原結合ループの種々の主鎖コンホメーションの頻度を別々に検討することが可能である。H1、H2、L1、L2およびL3の場合には、天然に存在する分子の抗原結合ループの20％〜100％がとる所定のコンホメーションを選択する。典型的には、観察されるその頻度は35％以上（すなわち、35％〜100％）、理想的には、50％以上、さらには65％以上である。H3ループの大多数は正規構造を有さないため、正規構造を示すループに一般的な主鎖コンホメーションを選択するのが好ましい。したがって、該ループのそれぞれに関しては、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されるコンホメーションを選択する。ヒト抗体では、各ループの最も一般的な正規構造（canonical structure：CS）は以下のとおりである：H1-CS1（発現したレパートリーの79％）、H2-CS3（46%）、VκのL1-CS2（39%）、L2-CS1（100%）、VκのL3-CS1（36%）（κ:λの比を70：30と仮定して計算している（Hoodら (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48:133））。正規構造を有するH3ループでは、残基94〜残基101の塩橋を有する7残基のCDR3長（Kabatら (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services）が最も一般的であるらしい。EMBLデータのライブラリーには、このコンホメーションを形成するのに必要なH3長および鍵残基を有する少なくとも16個のヒト抗体配列が存在し、該タンパク質データバンクには、抗体のモデル化の基礎として使用することができる少なくとも2個の結晶構造（2cgrおよび1tet）が存在する。正規構造のこの組合せのなかで最も頻繁に発現される生殖細胞系遺伝子セグメントは、VHセグメント3-23（DP-47）、JHセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12（DPK9）およびJκセグメントJκ1である。したがって、所望の単一の主鎖コンホメーションを有するライブラリーを構築するための基礎として、これらのセグメントを組合せて使用することができる。
【００６２】
あるいは、単離の際に結合ループのそれぞれの種々の主鎖コンホメーションの自然発生（natural occurrence）に基づいて単一の主鎖コンホメーションを選択する代わりに、主鎖コンホメーションの組合せの自然発生を、単一の主鎖コンホメーションを選択するための基礎として用いる。例えば、抗体の場合には、抗原結合ループの任意の2、3、4、5または全6個の正規構造の組合せの自然発生が決定されうる。本発明では、選択したコンホメーションが、天然に存在する抗体で一般的なものであることが好ましく、それが天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されることが最も好ましい。したがって、ヒト抗体においては、例えば、5個の抗原結合ループH1、H2、L1、L2およびL3の天然の組合せを検討する場合には、正規構造の最も頻繁な組合せを決定し、ついで、単一の主鎖コンホメーションを選択するための基礎としての、H3ループの最も一般的なコンホメーションと組合せる。
【００６３】
b．正規構造の多様化
いくつかの既知の主鎖コンホメーション、好ましくは、単一の既知の主鎖コンホメーションを選択したら、構造的および／または機能的多様性を有するレパートリーを作製するために分子の結合部位を変異させることにより本発明のライブラリーを構築する。これは、一定範囲の活性を付与するのに十分なそれらの構造および／またはそれらの機能の多様性を有する変異体が作製されることを意味する。例えば、問題のポリペプチドが細胞表面受容体である場合には、それらは標的リガンド結合特異性の多様性を有しうる。
【００６４】
所望の多様性は、典型的には、選択した分子を1以上の位置において変異させることにより作製する。変化させる位置はランダムに選択することが可能であり、好ましく選択される。ついでランダム化により変異を達成することができ、その際、存在するアミノ酸を任意のアミノ酸またはその類似体（天然体または合成体）で置換して非常に多数の変異体を得たり、あるいは存在するアミノ酸を一定のアミノ酸サブセットの1以上で置換することにより、より限定された数の変異体を得る。
【００６５】
そのような多様性を導入するための種々の方法が報告されている。誤りがちなPCR（Hawkinsら (1992) J. Mol. Biol., 226:889）、化学的突然変異誘発（Dengら (1996) J. Mol. Chem., 269:9533）または突然変異誘発細菌株（Lowら (1996) J. Mol. Biol., 260:359）を用いて、該分子をコードする遺伝子内にランダム突然変異を導入することができる。また、選択した位置を突然変異させるための方法は当技術分野でよく知られており、PCRを用いて又は用いずにミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを使用することを含む。例えば、突然変異を抗原結合ループに標的化することにより、いくつかの合成抗体ライブラリーが作製されている。一定範囲の新規結合特異性を得るために、ヒト破傷風トキソイド結合性FabのH3領域がランダム化されている（Barbasら (1992) 前掲）。未突然変異フレームワーク領域を有する大きなライブラリーを得るために、ランダムまたは半ランダムH3およびL3領域が生殖細胞系V遺伝子セグメントに付加されている（HoogenboomおよびWinter (1992) 前掲; Nissimら (1994) 前掲; Griffithsら (1994) 前掲; De Kruifら (1995) 前掲）。そのような多様化は、その他の抗原結合ループの一部または全部を含むように拡張されている（Crameriら (1996) Nature Med., 2:100; Riechmannら (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO97/08320前掲）。
【００６６】
ループのランダム化は、H3単独の場合には約1015個以上の構造体を、そしてその他の5つのループの場合には同様に多数の変異体を与える可能性を有するが、すべての可能な組合せを表現するライブラリーを得ることは、現在の形質転換技術を用いても、さらには無細胞系を用いても不可能である。例えば、現在までに構築されている最大のライブラリーの1つにおいては、6x1010個の異なる抗体が作製されているが、これは、この設計のライブラリーに可能な多様性の一部にすぎない（Griffithsら (1994) 前掲）。
【００６７】
非機能的メンバーの除去および単一の既知主鎖コンホメーションの使用に加えて、本発明は、該分子の所望の機能の生成または修飾に直接関与する残基のみを多様化することにより、これらの制限について検討する。多くの分子の場合、その機能は標的リガンドに結合することであり、したがって該分子の全体的なパッキングまたは選択した主鎖コンホメーションの維持に決定的に重要な残基の変化を回避しつつ、多様性を標的リガンド結合部位に集中させるべきである。したがって、本発明は、変異させる選択される位置が標的リガンドに対する結合部位を構成する位置となりうるライブラリーを提供する。
【００６８】
抗体に適用する場合の正規配列の多様化
抗体ライブラリーの場合には、標的リガンドに対する結合部位は抗原結合部位であることが最も多い。したがって、非常に好ましい態様においては、本発明は、抗原結合部位内の残基のみが変異している抗体ライブラリーを提供する。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいては非常に多様であり、高分解能抗体／抗原複合体において接触することが公知である。例えば、L2では、天然に存在する抗体中の50位および53位が多様であり抗原との接触が認められることが公知である。これに対して、通常のアプローチは、Kabatら (1991, 前掲)が定義している対応する相補性決定領域（CDR1）中のすべての残基（本発明のライブラリーでは多様化されるのはそれらの2残基であるのに対して、この場合は約7残基である）を多様化することであった。これは、一定範囲の抗原結合特異性を得るのに必要な機能的多様性に関する著しい改良の1つである。
【００６９】
実際には、抗体多様性は、ナイーブ一次レパートリー（いわゆる生殖細胞系および結合（junctional）多様性）を与える生殖細胞系V、DおよびJ遺伝子セグメントの体細胞組換えと、生じた再構成V遺伝子の体細胞超突然変異との2つの過程の結果である。一次レパートリーの多様性は抗原結合部位の中心部に集中しており、一方、体細胞超突然変異は、一次レパートリーにおいて高度に保存されている抗原結合部位の末梢領域にまで多様性を広げることが、ヒト抗体の配列の分析から示されている（Tomlinsonら (1996) 前掲を参照されたい）。この相補性は、おそらく、配列空間（sequence space）を見出すための有効な戦略として生じたのであろう。それは、見掛け上は抗体に特有であるが、本発明の他のポリペプチドレパートリーに容易に適用することができる。本発明では、変異させる残基は、標的リガンドに対する結合部位を形成する残基のサブセットである。所望により、標的リガンド結合部位内の異なる（重複を含む）サブセットの残基を、選択中の異なる段階で多様化させる。
【００７０】
抗体レパートリーの場合、本発明の2ステップ工程はヒトの免疫系における抗体の成熟に類似している。抗原結合部位内の残基のいくつか（必ずしもすべてではない）を多様化させる場合には、初期「ナイーブ」レパートリーを作製する。これに関して本明細書中で用いる「ナイーブ」なる語は、予め定められた標的リガンドを有さない抗体分子を意味する。これらの分子は、多種多様な抗原刺激により未だ攻撃されていない免疫系を有する胎児および新生児個体などの免疫多様化を経験していない個体の免疫グロブリン遺伝子にコードされる分子に類似している。ついでこのレパートリーを一定範囲の抗原に対して選択する。ついで必要に応じて、初期レパートリーにおいて多様化された領域以外に、さらなる多様性を導入することができる。この成熟レパートリーは、修飾された機能、特異性または親和性に関して選択することができる。
【００７１】
本発明は、抗原結合部位内の残基の一部または全部が変異している2つの異なる抗体ナイーブレパートリーを提供する。「一次」ライブラリーは天然一次レパートリーを模擬したものであり、その多様性は、生殖細胞系V遺伝子セグメントにおいて多様性である（生殖細胞系多様性）または組換え過程中に多様化される（結合多様性）抗原結合部位の中心部の残基に限局している。多様化される残基には、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96が含まれるが、これらに限定されるものではない。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換え過程中に多様化される残基（結合多様性）に限局しているか、または高度に体細胞突然変異している。多様化される残基には、H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34およびL96が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのライブラリーにおける多様化に適したものとして前記で挙げた残基はすべて、1以上の抗体-抗原複合体において接触することが公知である。どちらのライブラリーにおいても、抗原結合部位内の残基のすべてが変異するわけではないため、所望により、残りの残基を変異させることにより追加的な多様性を選択中に加える。これらの任意の残基（または抗原結合部位を含む追加的な残基）の任意のサブセットを抗原結合部位の初期および／または後続の多様化に用いることができることが、当業者に明らかであろう。
【００７２】
本発明のライブラリーの構築においては、選択した位置の多様化は、典型的には、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を改変して多数の可能なアミノ酸（全20個またはそれらのサブセット）がその位置に組込まれうるようにすることにより、核酸レベルで達成される。IUPACの命名法を用いると、最も汎用的なコドンは、すべてのアミノ酸およびTAG終結コドンをコードするNNKである。NNKコドンは、必要な多様性を導入するために好ましく使用される。同じ目的を達成する他のコドンも有用であり、それらには、追加的な停止コドンTGAおよびTAAの生成をもたらすNNNコドンが含まれる。
【００７３】
ヒト抗体の抗原結合部位における側鎖の多様性の特徴は、ある種のアミノ酸残基を優先する顕著な偏りである。VH、VκおよびVλの各領域内の最も多様性である10個の位置のアミノ酸組成を合計すると、側鎖多様性の76％以上が僅か7個の異なる残基（セリン（24%）、チロシン（14%）、アスパラギン（11%）、グリシン（9%）、アラニン（7%）、アスパラギン酸（6%）およびトレオニン（6%））に由来する。主鎖の柔軟性をもたらしうる小さな残基および親水性残基に対するこの偏りは、おそらく、広範な抗原に結合する傾向を有する表面の生成を反映するものであり、初期レパートリーにおいて必要とされる、抗体の無差別な混合の解明に役立つかもしれない。
【００７４】
このアミノ酸分布を模擬することが好ましいため、本発明は、変異させる位置のアミノ酸分布が抗体の抗原結合部位に見られるアミノ酸分布を模擬しているライブラリーを提供する。一定範囲の標的リガンドに対する或るポリペプチド（抗体ポリペプチドに限らない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、本発明の任意のポリペプチドレパートリーに容易に適用される。変異させる位置のアミノ酸分布を偏らせるためには種々の方法があり（トリヌクレオチド突然変異誘発（WO97/08320, Morphosys 前掲）の使用を含む）、そのなかで好ましい方法としては、合成の容易さのため、通常の縮重コドンの使用が挙げられる。縮重コドンのすべての組合せ（各位置において等しい比率の一重、二重、三重および四重の縮重を有する）にコードされるアミノ酸プロフィールを天然アミノ酸の使用と比較することにより、最も典型的なコドンを計算することが可能である。コドン(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)Cおよび(AGT)(AGC)(CT)（すなわち、IUPACの命名法を用いるとそれぞれDVT、DVCおよびDVY）は、所望のアミノ酸プロフィールに最も近いコドンであり、それらは、22％のセリンおよび11％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニンおよびシステインをコードする。したがって、好ましくは、ライブラリーは、多様化される各位置でDVT、DVCまたはDVYのいずれかのコドンを使用して構築する。
【００７５】
前記のとおり、本発明の抗体ライブラリーを構成するポリペプチドは、全抗体またはそのフラグメント、例えば、Fab、F(ab’)2、FvもしくはscFvフラグメントまたは分離したVHまたはVLドメインであってもよく、それらはいずれも、修飾されていても修飾されていなくてもよい。これらのうち、一本鎖Fvフラグメント、すなわちscFvが特に有用である。scFvフラグメントおよび他の抗体ポリペプチドは、当技術分野でよく知られている抗体操作方法により高い信頼性で得られる。scFvは、適切に設計されたリンカーペプチド（例えば、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3または同等のリンカーペプチド）をコードするオリゴヌクレオチドを使用してVH遺伝子とVL遺伝子とを連結することにより形成させる。該リンカーは、VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHの順序で第1 V領域のC末端と第2 V領域のN末端とを架橋する。原則として、scFvの結合部位は、対応する全抗体の特異性を忠実に再現しうる（その逆も成り立つ）。
【００７６】
Fv、FabおよびF(ab’)2フラグメントならびにキメラ抗体分子の構築のための同様の技術が当技術分野で公知である。Fvフラグメントを発現させる場合には、正しい鎖のフォールディングおよび会合が確保されるように注意すべきである。FabおよびF(ab’)2フラグメントの場合には、VHおよびVLポリペプチドを定常領域セグメントと組合せ、それらを再構成遺伝子、生殖細胞系C遺伝子から単離したり、あるいはV領域セグメントに関する抗体配列データから合成することができる。本発明のライブラリーはVHまたはVLライブラリーであってもよい。したがって、単一のVHおよびVLドメインを含む別々のライブラリーを構築することが可能であり、該ライブラリーは、所望により、Dab分子を生成するそれぞれCHまたはCLドメインを含む。
【００７７】
c．本発明のライブラリーベクター系
本発明のライブラリーは、一般的および／または標的リガンドを使用する直接スクリーニングに使用したり、遺伝的提示パッケージ（genetic display package）を含む選択プロトコールで使用することができる。
【００７８】
バクテリオファージλ発現系は、バクテリオファージプラークとして又は溶原体のコロニーとして、どちらも文献記載（Huseら (1989) Science, 246:1275; CatonおよびKoprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinaxら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8095; Perssonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:2432）のとおりに直接スクリーニングすることが可能であり、本発明において有用である。そのような発現系は、ライブラリーの106個までの異なるメンバーをスクリーニングするのに使用することができるが、それらは実際には、より多数（106個を超えるメンバー）のスクリーニングには適していない。他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリーのメンバーの直接化学合成に基づく。1つの初期の方法は、ピンまたはロッドのセット上でのペプチドの合成（例えば、WO84/03564に記載のもの）を含むものである。ペプチドライブラリーを形成するビーズ上でのペプチド合成（この場合、各ビーズが個々のライブラリーメンバーである）を含む同様の方法が、米国特許第4,631,211号に記載されており、関連方法がWO92/00091に記載されている。ビーズに基づく方法の顕著な改良は、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にする特有の識別タグ（例えば、オリゴヌクレオチド）を各ビーズに付けることを含む。ビーズに基づくこれらの改良方法はWO93/06121に記載されている。
【００７９】
もう1つの化学合成法は、それぞれ異なるライブラリーメンバー（例えば、特有のペプチド配列）を、アレイ内の個別の予め定められた位置に配置する方法により、表面上でペプチド（またはペプチド模擬体）のアレイを合成することを含む。各ライブラリーメンバーの種類は、該アレイ内のその空間的位置により決定される。予め定められた分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリーメンバーとの結合相互作用が生じるアレイ内の位置を決定し、それにより空間的位置に基づき該反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第5,143,854号、WO90/15070およびWO92/10092、Fodorら (1991) Science, 251:767、DowerおよびFodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26:271に記載されている。
【００８０】
本発明のライブラリーの構築において特に有用なのは選択提示系であり、これは、核酸がそれが発現するポリペプチドに関連づけられるのを可能にする。本発明で用いる選択提示系は、適当な提示手段により、一般的および／または標的リガンドに結合させることにより該ライブラリーの個々のメンバーの選択を可能にする系である。
【００８１】
任意の選択提示系を、本発明のライブラリーと共に併せて使用することができる。大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは、当技術分野で公知であり、代表例としてファージ提示技術が挙げられる。そのような系は、多様性ペプチド配列を繊維状バクテリオファージの表面上に提示させるものであり（ScottおよびSmith (1990) 前掲）、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのin vitro選択および増幅のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーの作製に有用であることが判明している。VHおよびVL領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌（E. coli）の細胞周辺腔に導くリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、その結果、生じた抗体フラグメントがバクテリオファージの表面上に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、pIIIまたはpVIII）との融合体として提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージカプシド（ファージボディー（phagebodies））上に外的に提示される。ファージに基づく提示系の利点は、それらが生物学的系であるため、選択したライブラリーメンバーを含有するファージを細菌細胞内で増殖させることにより、選択されたライブラリーメンバーが簡便に増幅されうることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含有されているため、配列決定発現およびそれに続く遺伝子操作は比較的容易である。
【００８２】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は、当技術分野でよく知られている（参照により本明細書に組み入れるMcCaffertyら (1990) 前掲; Kangら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:4363; Clacksonら (1991) Nature, 352:624; Lowmanら (1991) Biochemistry, 30:10832; Burtonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:10134; Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19:4133; Changら (1991) J. Immunol., 147:3610; Breitlingら (1991) Gene, 104:147; Marksら (1991) 前掲; Barbasら (1992) 前掲; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol., 22:867; Marksら 1992, J. Biol. Chem., 267:16007; Lernerら (1992) Science, 258:1313）。
【００８３】
特に有利な1つのアプローチはscFvファージライブラリーの使用である（Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883; Chaudharyら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1066-1070; McCaffertyら (1990) 前掲; Clacksonら (1991) 前掲; Marksら (1991) 前掲; Chiswellら (1992) Trends Biotech., 10:80; Marksら (1992) 前掲）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるscFvライブラリーの種々の実施形態が記載されている。改良されたファージ提示アプローチも公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れるWO96/06213およびWO92/01047（Medical Research Councilら）およびWO97/08320（Morphosys, 前掲）に記載されている。
【００８４】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するための他の系は、該ライブラリーメンバーのin vitro合成用の無細胞酵素装置の使用を含むものである。1つの方法においては、標的リガンドに対する選択とPCR増幅との交互のラウンドによりRNA分子を選択する（TuerkおよびGold (1990) Science, 249:505; EllingtonおよびSzostak (1990) Nature, 346:818）。予め定められたヒト転写因子に結合するDNA配列を同定するために、同様の技術を用いることができる（ThiesenおよびBach (1990) Nucleic Acids Res., 18:3203; BeaudryおよびJoyce (1992) Science, 257:635; WO92/05258およびWO92/14843）。同様にして、大きなライブラリーを作製するための方法としてポリペプチドを合成するために、in vitro翻訳を用いることができる。一般に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法が、さらにWO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058およびWO92/02536に記載されている。ファージに基づくものではないもう1つの提示系（例えば、WO95/22625およびWO95/11922（Affymax）に開示されているもの）は、選択のためにポリペプチドを提示させるためにポリソームを使用する。これら及び前記のすべての文献も、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００８５】
したがって、本発明は、所望の一般的および／または標的リガンド結合部位を有するポリペプチドをポリペプチドのレパートリーから選択するための方法であって、
a）本発明の前記態様のライブラリーを発現させ、
b）該ポリペプチドを該一般的および／または標的リガンドと接触させ、該一般的および／または標的リガンドに結合するポリペプチドを選択し、
c）所望により、該一般的および／または標的リガンドに結合する選択したポリペプチドを増幅し、
d）所望により、工程a）〜c）を繰返す工程を含んでなる方法を提供する。
【００８６】
好ましくは、工程a）〜d）は、ファージ提示系を用いて行なう。
【００８７】
本発明は、一般的リガンドおよび標的リガンドの両方に対する結合部位を有するポリペプチドのライブラリーを提供するため、前記選択方法は、一般的リガンドまたは標的リガンドのいずれかを用いる選択に適用することができる。したがって、一般的リガンドの後で標的リガンドを使用して、あるいは標的リガンドの後で一般的リガンドを使用して、初期ライブラリーを選択することができる。本発明はまた、標的リガンドでの選択の前または後に、異なる一般的リガンドを同時または連続的に使用する複数の選択を提供する。
【００８８】
好ましくは、本発明の方法は更に、選択されたポリペプチドを追加的な変異処理（本明細書中に前記されている）に付し、工程a）〜d）を繰返す工程を含む。
【００８９】
一般的リガンドは、必然的に、一般的リガンドを使用して選択されたすべてのライブラリーメンバーに結合しうるため、本発明の方法は更に、該一般的リガンド（または或る種のそのコンジュゲート）を使用して、該ライブラリーからのいずれかの機能的メンバーまたはメンバー集団の検出、固定化、精製または免疫沈降を行なうことができる（標的リガンドに結合させることにより選択されたか否かには無関係である）。
【００９０】
本発明は、既知の主鎖コンホメーションを有するメンバーを含むライブラリーを提供するため、本発明の方法は更に、該ライブラリーの任意の機能的メンバー（標的リガンドに結合させることにより選択されたか否かには無関係である）の三次元構造モデルの作製を含む。好ましくは、そのようなモデルの構築は、相同性モデリングおよび／または分子置換を含む。主鎖コンホメーションの予備的モデルは、ポリペプチド配列と既知の三次元構造の配列との比較により、あるいは二次構造の予測により、あるいは構造ライブラリーのスクリーニングにより、作製することができる。また、計算ソフトウェアを使用して、ポリペプチドの二次構造を予測することができる。種々の位置の側鎖のコンホメーションを予測するために、側鎖回転異性体ライブラリーを使用することができる。
【００９１】
一般に、本発明の実施に必要な核酸分子およびベクター構築物は、当技術分野において入手可能であり、Sambrookら (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAなどの標準的な実験マニュアルに記載のとおりに構築し操作することができる。
【００９２】
本発明における核酸の操作は、典型的には、組換えベクターにおいて行なう。本発明で用いるベクターは、異種DNAの発現および／または複製のために該異種DNAを細胞内に導入するために使用する分離した要素を意味する。そのようなベクターを選択または構築し、ついで使用するための方法は、当業者によく知られている。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソームベクターを含む多数のベクターが公に入手可能である。簡便なクローニングおよび突然変異誘発のために、そのようなベクターを使用することができる。あるいは、本発明のレパートリー（またはプレレパートリー）のメンバーを担持するベクターの典型例として、遺伝子発現ベクターを使用する。本発明で有用なベクターは、所望のサイズ（典型的には0.25キロベース（kb）〜40kb長）のポリペプチドコード配列を収容するように選択することができる。in vitroでのクローニング操作の後、適当な宿主細胞を該ベクターで形質転換する。各ベクターは、一般にはクローニング（または「ポリリンカー」）部位、複製起点および少なくとも1つ選択マーカー遺伝子を含む種々の機能的成分を含有する。与えられたベクターが発現ベクターである場合、それは更にエンハンサー要素、プロモーター、転写終結およびシグナル配列の1以上を有し、それらはそれぞれ、クローニング部位付近に位置し、本発明のポリペプチドレパートリーメンバーをコードする遺伝子に機能しうる形で連結されている。
【００９３】
一般に、クローニングベクターおよび発現ベクターは共に、選択された1以上の宿主細胞内で該ベクターが複製されるのを可能にする核酸配列を含有する。クローニングベクターにおいては典型的には、この配列は、該ベクターが宿主の染色体DNAから独立して複製されるのを可能にする配列であり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関してよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2ミクロンのプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点（例えば、SV40、アデノウイルス）は哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点は、これらを、高レベルのDNAを複製しうる哺乳類細胞（例えばCOS細胞）内で使用するのでなければ、哺乳類発現ベクターには必ずしも必要でない。
【００９４】
好ましくは、クローニングまたは発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも称される）を含有する。この遺伝子は、選択培地内で増殖させる形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、該培地内で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与したり栄養要求性欠損を補足したり該増殖培地内に存在しない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００９５】
本発明のベクターの複製は大腸菌（E. coli）内で最も簡便に行われるため、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与する大腸菌（E. coli）選択マーカー（例えば、β-ラクタマーゼ遺伝子）が有用である。これらは、大腸菌（E. coli）プラスミド（例えば、pBR322）またはpUCプラスミド（例えば、pUC18またはpUC19）から得ることができる。
【００９６】
発現ベクターは、通常、宿主生物により認識され目的のコード配列に機能しうる形で連結したプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは誘導性であっても構成的であってもよい。「機能しうる形で連結（された）」なる語は、記載されている成分がそれらの意図される様態で機能するのを可能にする関係で該成分が並置されていることを意味する。コード配列に「機能しうる形で連結」された制御配列は、該制御配列に適合した条件下で該コード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００９７】
原核宿主で使用するのに適したプロモーターには、例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターが含まれる。また、細菌系内で使用するプロモーターは、一般には、機能しうる形でコード配列に連結したシャイン・ダルガルノ配列を含有するであろう。
【００９８】
本発明のライブラリーにおいては、好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、一般的および／または標的リガンドでの選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一のクローンの、独立した増殖および発現により、あるいは任意の選択提示系を用いることにより行なうことができる。前記のとおり、好ましい選択提示系はバクテリオファージ提示である。したがって、ファージまたはファージミドベクターを使用することができる。好ましいベクターは、大腸菌（E. coli）複製起点（二本鎖の複製用）、そしてまたファージ複製起点（一本鎖DNAの産生用）を有するファージミドベクターである。そのようなベクターの操作および発現は当技術分野でよく知られている（HoogenboomおよびWinter (1992) 前掲; Nissimら (1994) 前掲）。簡単に説明すると、該ベクターは、ファージミドに選択性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子およびlacプロモーターを発現カセットの上流に含有し、それは、pelBリーダー配列（これは、発現されたポリペプチドを細胞周辺腔に導く）、マルチプルクローニング部位（該ライブラリーメンバーのヌクレオチド形態をクローニングするためのもの）、所望により含まれる1以上のペプチドタグ（検出用）、所望により含まれる1以上のTAG終結コドン、およびファージタンパク質pIIIよりなる（N末端からC末端方向）。したがって、大腸菌（E. coli）の種々のサプレッサーおよび非サプレッサー株を使用し、グルコース、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）またはヘルパーファージ（例えば、VCS M13）を加えることにより、該ベクターは、発現されることなくプラスミドとして複製されて大量の該ポリペプチドライブラリーメンバーのみを産生したり、ポリペプチド-pIII融合体の少なくとも1コピーを表面に含有するファージを含むファージを産生しうる。
【００９９】
本発明のベクターの構築においては、通常の連結技術を用いる。単離したベクターまたはDNA断片を切断し、修飾し、必要なベクターを作製するのに望ましい形態で再連結する。所望により、構築したベクター中に正しい配列が存在することを確認するための分析を公知方法で行なうことができる。発現ベクターを構築し、in vitro転写産物を調製し、DNAを宿主細胞内に導入し、発現および機能の評価のための分析を行なうための適当な方法は当業者に公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在を検出し、またはその増幅および／または発現を常法（例えば、サザンまたはノーザン分析、ウエスタンブロット法、DNA、RNAもしくはタンパク質のドットブロット法、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学または核酸もしくはタンパク質分子の配列分析）により定量する。所望によりこれらの方法が修飾されうることは、当業者に容易に予想されるであろう。
【０１００】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる突然変異誘発
ベクター系を選択し、目的のポリペプチドをコードする1以上の核酸配列を該ライブラリーベクター中にクローニングすれば、発現前に突然変異誘発を行なうことにより該クローン化分子内に多様性を生成させることができる。あるいは、前記のとおりに該コード化タンパク質を発現させ、選択した後に、突然変異誘発と追加的な選択ラウンドを行なうことができる。前記のとおり、構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異誘発は、標準的な分子的方法により行なう。特に有用なのは、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちPCR（参照により本明細書に組み入れるMullisおよびFaloona (1987) Methods Enzymol., 155:335）である。PCRは、対象となる標的配列を増幅するために、耐熱性DNA依存性DNAポリメラーゼの触媒による複数サイクルのDNA複製を用いる方法であり、当技術分野でよく知られている。
【０１０１】
本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸鋳型にハイブリダイズして第2核酸鎖の酵素的合成を開始させる一本鎖DNAまたはRNA分子である。該プライマーは、本発明のアレイのセットの調製に使用する核酸分子のプール中に存在する標的分子の一部に相補的である。そのような分子は化学的または酵素的合成法により調製されると考えられる。あるいは、そのような分子またはその断片は天然に存在し、その天然起源から単離され、あるいは商業的供給業者から購入する。突然変異原性オリゴヌクレオチドプライマーは、15〜100ヌクレオチド長、理想的には20〜40ヌクレオチドであるが、種々の長さのオリゴヌクレオチドが有用である。
【０１０２】
典型的には、2つの核酸配列が実質的に相補的である場合（少なくとも14〜25ヌクレオチドの長さにわたり少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約90％の相補性）に、選択的なハイブリダイゼーションが生じる。参照により本明細書に組み入れるKanehisa (1984) Nucleic Acids Res. 12:203を参照されたい。その結果、開始部位においては或る程度のミスマッチが許容されると予想される。そのようなミスマッチは、モノ、ジまたはトリヌクレオチドなどの小さなものかもしれない。あるいはそれは、ミスマッチとして中断していない一連の4以上のヌクレオチドを含む領域と定義されるヌクレオチドループを含むかもしれない。
【０１０３】
全体的に見て、第2の核酸分子に対するプライマーのハイブリダイゼーションの効率および選択性には5つの要因が影響を及ぼす。これらの要因は、（i）プライマーの長さ、（ii）ヌクレオチドの配列および／または組成、（iii）ハイブリダイゼーション温度、（iv）バッファーの化学的性質、および（v）プライマーがハイブリダイズする必要がある領域内の立体障害の可能性であり、非ランダム開始（プライミング）配列を設計する場合には、重要な考慮事項となる。
【０１０４】
プライマーの長さと、プライマーが標的配列にアニーリングする際の効率および精度との間には、正の相関性があり、より長い配列は、より短い配列より高い融解温度（TM）を有し、与えられた標的配列内で反復している可能性が低いため、無差別なハイブリダイゼーションを最小限に抑制する。高いG-C含量を有する又はパリンドローム配列を含むプライマー配列は、それらの意図される標的配列の場合と同様に、自己ハイブリダイズする傾向がある。なぜなら、溶液中では二分子ハイブリダイゼーション速度論よりも一分子ハイブリダイゼーション速度論が一般に優先されるからである。それと同時に、標的配列と緊密に結合するためには、十分な数のG-Cヌクレオチド対合を含有するプライマーを設計することが重要である。なぜなら、AとTとが塩基対を形成する場合には2個の水素結合が見出されるのに対して、G-Cの各対合は3個の水素結合により結合するからである。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイゼーション混合物中に含まれうる有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度と同様に、プライマーのアニーリング効率に反比例し、一方、塩濃度の増加は結合を促進する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、より長いプローブは、より短いものより効率的にハイブリダイズし、より許容的な条件下では、そのような短いものでも十分である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には約1M未満、通常は約500mM未満、好ましくは約200mM未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、0℃という低温から、22℃以上、約30℃以上、（最も頻繁には）約37℃以上まで及ぶ。より長い断片は、特異的なハイブリダイゼーションのためには、より高いハイブリダイゼーション温度を要するかもしれない。いくつかの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすため、パラメーターの組合せが、いずれか1つだけの絶対的な尺度より重要である。
【０１０５】
これらの点を考慮して、プライマーを設計する。多数の配列の相対的利点の評価は当業者において自ら行うことが可能であるが、これらのいくつかのパラメーターの評価およびプライマー配列の最適化を支援するためのコンピュータープログラムが設計されている。そのようなプログラムとしては、例えば、DNAStar（登録商標）ソフトウェアパッケージ（DNAStar, Inc.; Madison, WI）の「PrimerSelect」およびOLIGO4.0（National Biosciences, Inc.）が挙げられる。設計したら、適当なオリゴヌクレオチドを、適当な方法により、例えば、BeaucageおよびCarruthers (1981) Tetrahedron Lett., 22:1859に記載のホスホロアミジット法、またはMatteucciおよびCaruthers (1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185によるトリエステル法により（それらを共に参照により本明細書に組み入れる）、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置またはVLSIPS（登録商標）技術を用いる他の化学的方法により調製する。
【０１０６】
鋳型DNA（少なくとも1fg、通常は1〜1000ng）および少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRを行なう。プライマーのプールが非常に不均一である場合には、より大量のプライマーを使用するのが有利かもしれない。なぜなら、各配列は該プールの分子のごく一部に相当するにすぎず、後の増幅サイクルにおいて量が制限的になるからである。典型的な反応混合物は、2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10X PCRバッファー1（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、0.4μlの1.25μM dNTP、0.15μl（または2.5 単位）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、および合計容量を25μlにする脱イオン水を含む。ミネラルオイルを重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してPCRを行なう。
【０１０７】
PCRサイクルの各工程の時間および温度ならびにサイクル数は、実際のストリンジェンシー要件に応じて調節する。アニーリングの温度および時機は、プライマーが鋳型にアニーリングすると予想される際の効率および許容されるミスマッチの程度により決定される。核酸分子の増幅と突然変異誘発とを同時に行なう場合には、少なくとも合成の第1ラウンドにおいてミスマッチが要求されるのは明らかである。突然変異原性プライマーの混合プールを使用して分子集団を増幅するためには、低い融解温度においてのみ生じる潜在的突然変異産物の、ストリンジェント（高温）なアニーリング条件下での喪失の方が、標的部位以外の配列に対するプライマーの無差別なアニーリングよりはましである。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化することは、通常の当業者の知見の範囲内に十分に含まれるものである。30℃〜72℃のアニーリング温度を用いる。鋳型分子の最初の変性を、通常、92℃〜99℃で4分間行ない、ついで変性（94〜99℃で15秒〜1分間）、アニーリング（前記のとおりに決定される温度、1〜2分間）および伸長（72℃、増幅産物の長さに応じて1〜5分間）よりなる20〜40サイクルを行なう。最終的な伸長は一般には72℃で4分間であり、ついで無期限（0〜24時間）の工程を4℃で行なってもよい。
【０１０８】
レパートリーメンバーの構造分析
本発明は、既知主鎖コンホメーションのポリペプチドのレパートリーを提供するものであるため、該レパートリーの任意のメンバーの三次元構造モデルが容易に作製される。典型的には、そのようなモデルの構築は、相同性モデリングおよび／または分子置換を必要とする。主鎖コンホメーションの予備的モデルは、該ポリペプチド配列と三次元構造の既知な類似配列との比較により、あるいは二次構造の予測により、あるいは構造ライブラリーのスクリーニングにより、作製することができる。また、分子モデリングコンピューターソフトウェアパッケージが商業的に入手可能であり、それらは、ポリペプチドの二次構造を予測するのに有用である。種々の位置の側鎖のコンホメーションを予測するために、側鎖回転異性体ライブラリーを使用することができる。
【０１０９】
ポリペプチド選択においてリガンドとして使用するための抗体
本発明のポリペプチド選択において使用する一般的または標的リガンドは、それ自体が抗体であってもよい。これは、本発明のレパートリー内に包含されるものに対して選択される機能的ポリペプチドにおいて実質的に保存された構造的特徴に結合する一般的リガンドに特に当てはまる。適当な抗体が公に入手可能でない場合には、それをファージ提示法（前記を参照されたい）により又は以下のとおりに製造することができる。
【０１１０】
当業者によく知られている標準的な技術を用いて抗体を作製するために、組換えタンパク質または天然由来のタンパク質を使用することができる。例えば、該タンパク質（すなわち「免疫原」）を投与して、哺乳動物（例えば、サル、ヤギ、ウサギまたはマウス）をチャレンジする。得られた抗体をポリクローナル血清として集めることができる。あるいは、チャレンジした動物からの抗体産生細胞を不死化させる（例えば、不死化融合相手と融合させてハイブリドーマを産生させることにより）ことが可能であり、この場合、該細胞はモノクローナル抗体を産生する。
【０１１１】
a．ポリクローナル抗体
抗原タンパク質を単独で使用したり、あるいは通常の担体にコンジュゲート化させてその免疫原性を増加させ、該ペプチド-担体コンジュゲートに対する抗血清を前記のように動物体内で産生させる。担体タンパク質に対するペプチドのカップリングおよび免疫は、文献記載（Dymeckiら (1992) J. Biol. Chem., 267:4815）のとおりに行なうことができる。ELISAにより又はドットもしくはスポットブロット法（BoersmaおよびVan Leeuwen (1994) J. Neurosci. Methods, 51:317）により、該血清をタンパク質抗原に対して力価測定する。ELISA（例えば、Greenら (1982) Cell, 28:477の方法に従うもの）により、該血清は適当なペプチドに対して強力に反応することが示される。
【０１１２】
b．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を調製するための技術はよく知られており、モノクローナル抗体は、Arnheiterら (1981) Nature, 294, 278に記載されているとおりに、任意の候補抗原（好ましくは、担体に結合しているもの）を使用して調製することができる。モノクローナル抗体は、典型的には、ハイブリドーマ組織培養物からまたは該ハイブリドーマ組織を導入した動物より得た腹水から得る。そのような場合であっても、モノクローナル抗体は、タンパク質「に対して産生された」または「により誘導された」と記載されうる。
【０１１３】
モノクローナル抗体を産生させた後、それを多数の手段のいずれかにより機能および特異性に関して試験する。また、ファージ提示法または他のin vitro選択技術により産生した組換え抗体を試験するためにも、同様の方法を用いることができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）を、免疫原に対する抗体結合に関してスクリーニングすることもできる。特に好ましい免疫学的試験には、酵素結合イムノアッセイ（ELISA）、免疫ブロット法および免疫沈降（Voller, (1978) Diagnostic Horizons, 2:1, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Vollerら (1978) J. Clin. Pathol., 31:507; 米国再発行特許第31,006号; 英国特許第2,019,408号; Butler (1981) Methods Enzymol., 73:482; Maggio, E. (編), (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FLを参照されたい）またはラジオイムノアッセイ（RIA）（Weintraub, B., Principles of radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986年3月, pp. 1-5, 46-49および68-78）（すべて、抗体を産生させた免疫原に対する該抗体の結合を検出するものである）が含まれる。そのような検出を容易にするためには抗体分子または免疫原を標識しなければならないことは当業者に明らかであろう。抗体分子を標識するための技術は当業者によく知られている（HarlourおよびLane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 1-726）。
【０１１４】
あるいは、他の技術を用いて免疫原に対する結合を検出し、それにより、本発明の一般的抗原または標的抗原として使用しようとする抗体の完全性を確認することが可能である。これらには、クロマトグラフィー法、例えばSDS PAGE、等電点電気泳動、ウエスタンブロット法、HPLCおよびキャピラリー電気泳動が含まれる。
【０１１５】
「抗体」は、本発明においては、そのような抗体および他の抗体修飾体の結合（可変）領域を用いる構造体と定義される。したがって、本発明で有用な抗体は、全抗体、抗体フラグメント、多機能抗体集合体、または一般に、抗体由来の1以上の特異的結合部位を含む任意の物質を含んでいてもよい。該抗体フラグメントは、Fv、FabおよびF(ab’)2フラグメントなどのフラグメント、またはそれらの任意の誘導体（例えば、一本鎖Fvフラグメント）であってもよい。抗体または抗体断片は、非組換え体、組換え体またはヒト化体であってもよい。抗体は、任意の免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、IgG、IgMなど）のものであってもよい。また、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの集合体、重合体、誘導体およびコンジュゲートを適宜使用することができる。
【０１１６】
以下の実施例において本発明を更に説明するが、これらは例示目的で記載されているにすぎない。
【０１１７】
ポリペプチドの選択のためのリガンドとしての金属イオン
前記のとおり、抗体以外のリガンドが本発明のポリペプチドの選択において有用である。リガンドのそのような1つの範疇は、金属イオンの範疇である。例えば、Ni-NTAマトリックスを使用して機能的ヒスチジン（HIS）タグの存在に関してレパートリーを前選択するのが望ましいかもしれない。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC; HubertおよびPorath (1980) J. Chromatography, 98:247）は、多数のタンパク質の露出表面上のヒスチジンおよびシステインアミノ酸残基ならびに他の金属結合物質の金属結合特性を利用するものである。それは、金属イオンと複合体を形成する二座金属キレーター（例えば、イミノ二酢酸、IDA、ジカルボン酸基）を含む樹脂、典型的にはアガロースを利用する。本発明の金属イオン担持樹脂を得るために、アガロース／IDAを金属塩（例えば、CuCl2 2H2O）と混合し、該IDAに該二価陽イオンをキレートさせる。商業的に入手可能な1つのアガロース／IDA調製物として、「CHELATING SEPHAROSE 6B」（Pharmacia Fine Chemicals; Piscataway, NJ）が挙げられる。有用な金属イオンには、二価陽イオンNi2+、Cu2+、Zn2+およびCo2+が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリペプチド分子のプールを、0.1〜1.0Mの濃度の塩（典型的にはNaClまたはKCl）および弱いリガンド（例えば、Trisまたはアンモニア）（後者は、該樹脂の金属イオンに対してアフィニティーを有するが、このアフィニティーは、本発明により選択されるポリペプチドが有するアフィニティーより低い）より実質的になる結合バッファー中で調製する。その弱いリガンドの有用な濃度は、結合バッファー中0.01〜0.1Mである。
【０１１８】
金属結合ドメインを有するポリペプチドが結合しうる条件下（後記を参照されたい）、該ポリペプチドプールを該樹脂と接触させ、不純物を洗浄除去した後、選択したポリペプチドを、前記の弱いリガンドを該結合バッファー中の濃度より高い濃度（特に、前記の弱いリガンドは、該金属イオンに対してより弱い結合アフィニティーを有するが、それが該選択ポリペプチドと置換するのには十分な濃度）で含むバッファーで溶出させる。該溶出バッファー中の前記の弱いリガンドの有用な濃度は、該結合バッファー中の濃度より10〜50倍高い濃度、典型的には、0.1〜0.3Mである。該溶出バッファー中の塩濃度は該結合バッファー中の濃度に等しいことに注意されたい。本発明の方法では、該樹脂の金属イオンは典型的には一般的リガンドとして働くが、それらは標的リガンドとしても使用可能であると意図される。
【０１１９】
IMACは、標準的なクロマトグラフィー装置（カラムからバッファーを重力により抜き出すか、減圧により吸引するか、または加圧により押出す）を使用して行なう。別法として、大バッチ法を用いる。この場合、本発明のレパートリーのメンバーを選択しようとするポリペプチドプールと、スラリー状態の該金属担持樹脂とを混合する。
【０１２０】
IMACによる血清T4タンパク質の部分的精製は、Staplesら 米国特許第5,169,936号に記載されているが、表面に露出した金属結合ドメインを含むタンパク質の範囲は広く、他の可溶性T4タンパク質、ヒト血清タンパク質（例えば、IgG、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Gc-グロブリン、Clq、C3、C4）、ヒトデスモプラスミン、ドリコス・ビフロルス（Dolichos biflorus）レクチン、亜鉛阻害性Tyr(P)ホスファターゼ、フェノラーゼ、カルボキシペプチダーゼイソ酵素、Cu,Znスーパーオキシドジスムターゼ（ヒトおよび他のすべての真核生物のものを含む）、ヌクレオシドジホスファターゼ、白血球インターフェロン、ラクトフェリン、ヒト血漿α2-SH糖タンパク質、β2-マクログロブリン、α1-アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、消化管ポリペプチド、ペプシン、ヒトおよびウシ血清アルブミン、顆粒球由来の顆粒タンパク質、リゾチーム、非ヒストンタンパク質、ヒトフィブリノーゲン、ヒト血清トランスフェリン、ヒトリンホトキシン、カルモジュリン、プロテインA、アビジン、ミオグロビン、ソマトメジン、ヒト成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子、血小板由来増殖因子、α-ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、カルジオジラチンなども含まれる。また、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン配列は、IMACを用いて精製することができる。任意の前記タンパク質またはそれらの金属結合性変異体を含むレパートリーが本発明の方法により製造されうることに注目されたい。
【０１２１】
溶出後、選択したポリペプチドを該金属結合バッファーから取り出し、その後続の使用に適したバッファー中に配置する。本発明の第1選択ポリペプチドプールを得るために金属イオンを使用した場合には、そのプールの分子を、機能的ポリペプチドレパートリーのメンバーの選択に使用する第2リガンドに対する結合に関して最適化されたバッファー中に配置する。その代わりに金属を第2選択工程で使用する場合には、該レパートリーのポリペプチドを、保存に適したバッファー（例えば、0.5％グリシンバッファー）またはそれらの意図される用途に適したバッファーに移す。そのようなバッファーには、水、有機溶媒、水と水混和性有機溶媒との混合物、生理的塩類バッファーおよびタンパク質／核酸またはタンパク質／タンパク質結合バッファーが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、該ポリペプチド分子を脱水（すなわち、凍結乾燥により）したり、固体または半固体支持体、例えばニトロセルロースまたはナイロン濾過膜またはゲルマトリックス（すなわち、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲルマトリックス）上に固定化したり、クロマトグラフィー樹脂に架橋することができる。
【０１２２】
ポリペプチド分子は、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより溶出バッファーから取り出すことができる。該ポリペプチド溶出液は、水またはその他の選択した溶液に対して透析することができる。該ポリペプチドを凍結乾燥する場合には、プロテアーゼインヒビター（例えば、ペプスタチン、アプロチニン、ロイペプチンなど）が既に加えられている水を使用する。あるいは、選択した媒体に再懸濁する前に、サンプルを当技術分野でよく知られた硫安沈殿に付すことができる。
【０１２３】
本発明により選択したポリペプチドの用途
本発明の方法により選択したポリペプチドは、リガンド-ポリペプチド結合が係わる実質的に任意の方法（例えば、in vivoでの治療および予防用途、in vitroおよびin vivoでの診断用途、in vitroでのアッセイおよび試薬用途などを含む）において使用することができる。例えば、抗体の場合には、当業者に公知の方法に従い、抗体に基づくアッセイ技術（例えば、ELISA技術）において抗体分子を使用することができる。
【０１２４】
前記で示唆したとおり、本発明により選択した分子は、診断、予防および治療法において有用である。例えば、これらの方法により作製し選択した酵素変異体を、当技術分野でよく知られた技術を用いてin vitroまたはin vivoにおける活性に関してアッセイすることができる。この場合、それらを候補基質分子と共にインキュベートし、基質から生成物への変換を分析する。選択した細胞表面受容体または接着分子を培養細胞内で発現させ、ついで該細胞を、それが生化学的刺激に応答する能力に関して、または未多様化接着分子が結合すると予想される細胞表面分子を発現する他の細胞型に対するそのアフィニティーに関して、それぞれ試験する。本発明により選択した抗体ポリペプチドは、標準的な免疫組織化学的方法によるウエスタン分析およびin situタンパク質検出において診断的に有用である。これらの用途で使用する場合には、選択したレパートリーの抗体を、当技術分野で公知の技術に従い標識することができる。また、そのような抗体ポリペプチドを、クロマトグラフィー支持体（例えば、樹脂）と複合体形成させる場合には、アフィニティークロマトグラフィー法において予備的に使用することができる。そのようなすべての技術は当業者によく知られている。
【０１２５】
本発明により製造したタンパク質の治療および予防的用途は、本発明により選択したポリペプチドをレシピエントとなる哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。これに関して特に有用なのは、抗体、他の受容体（T細胞受容体を含むが、これに限定されるものではない）、そして一般的または標的リガンドとして抗体または受容体を使用する場合には、それらに結合するタンパク質である。
【０１２６】
哺乳動物に対する投与には、少なくとも90〜95％の均一性の実質的に純粋な抗体またはその結合タンパク質が好ましく、医薬用途には、該哺乳動物がヒトである場合には特に、98〜99％以上の均一性が最も好ましい。選択したポリペプチドは、部分的に又は所望の均一性にまで精製した後、診断用または治療用（体外におけるものを含む）に、あるいはアッセイ法、免疫蛍光染色などの開発および実施に使用することができる（LefkoviteおよびPernis, (1979および1981) Immunological Methods, Volumes IおよびII, Academic Press, NY）。
【０１２７】
本発明の選択された抗体またはその結合タンパク質は、典型的には、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染および自己免疫疾患（I型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が含まれるが、これらに限定されるものではない）の予防、抑制または治療に有用であろう。
【０１２８】
この用途における「予防」なる語は、疾患の誘発前に防御用組成物を投与することを含む。「抑制」は、疾患の誘発事象の後であって疾患の臨床的出現の前に、組成物を投与することを意味する。「治療」は、疾患の徴候が顕著になった後で防御用組成物を投与することを含む。
【０１２９】
疾患に対する防御または疾患の治療における抗体またはその結合性タンパク質の有効性をスクリーニングするために使用しうるモデル動物系が入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）の試験方法が当技術分野で公知である（Knightら (1978) J. Exp. Med., 147:1653; Reinerstenら (1978) New Eng. J. Med., 299:515）。重症筋無力症（MG）は、SJL/J雌マウスにおいて、別の種に由来する可溶性AchRタンパク質で該疾患を誘発させることにより試験する（Lindstromら (1988) Adv. Immunol., 42:233）。関節炎は、II型コラーゲンの注射によりマウスの感受性系統において誘発させる（Stuartら (1984) Ann. Rev. Immunol., 42:233）。マイコバクテリア熱ショックタンパク質の注射により感受性ラットにおいてアジュバント関節炎を誘発させるモデルが記載されている（Van Edenら (1988) Nature, 331:171）。甲状腺炎は、文献記載（Maronら (1980) J. Exp. Med., 152:1115）のとおりにチログロブリンを投与することによりマウスにおいて誘発させる。インスリン依存性糖尿病（IDDM）は自然発生させるか、または或る系統のマウス（例えば、Kanasawaら (1984) Diabetologia, 27:113に記載のもの）において誘発させることが可能である。マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトにおけるMSのモデルとして有用である。このモデルにおいては、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄性疾患を誘発させる（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischerら編, GruneおよびStratton, New York, pp. 179-213; McFarlinら (1973) Science, 179:478: およびSatohら (1987) J. Immunol, 138:179）。
【０１３０】
また、本発明の選択された抗体、受容体（T細胞受容体が含まれるが、これに限定されるものではない）またはそれらの結合タンパク質は、他の抗体、特に、疾患の原因となるヒト細胞上の他のマーカーに反応性のモノクローナル抗体（MAb）と共に使用することができる。例えば、適当なT細胞マーカーには、First International Leukocyte Differentiation Workshop（Bernhardら (1984) Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY）により命名されたいわゆる「クラスター分化（Clusters of Differentiation）」に分類されるものが含まれうる。
【０１３１】
一般に、この選択された抗体、受容体または結合タンパク質は、薬理学的に適した担体と共に、精製形態で使用されるであろう。典型的には、これらの担体には、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液（いずれも、生理的食塩水および／または緩衝化媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液が含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液中に維持することが必要であれば、生理的に許容される適当なアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギナートなどの増粘剤から選択することができる。
【０１３２】
静脈内ビヒクルには、液状の栄養補充剤および電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗生物質、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスが存在していてもよい（Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。
【０１３３】
本発明の選択されたポリペプチドは、別々に投与される組成物として、あるいは他の物質と共に使用することができる。これらには、種々の免疫療法薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチニウムおよびイムノトキシンが含まれうる。医薬組成物には、種々の細胞傷害性剤または他の薬剤と、本発明の選択された抗体、受容体またはそれらの結合タンパク質との「カクテル」、さらには、種々の特異性を有する本発明の選択されたポリペプチド（例えば、種々の標的リガンドを使用して選択されたポリペプチド）（それらは投与前にプールされたか否かには無関係である）の組合せが含まれうる。
【０１３４】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に公知のいずれのものであってもよい。療法（免疫療法が含まれるが、これに限定されるものではない）の場合には、本発明の選択された抗体、受容体またはそれらの結合タンパク質を、標準的な技術に従い任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺経路を含む適当な任意の方式によるものであってもよく、また、適宜、カテーテルによる直接注入によるものであってもよい。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌、および臨床家が考慮すべき他のパラメーターに左右されるであろう。
【０１３５】
本発明の選択されたポリペプチドは、保存用に凍結乾燥し、使用前に適当な担体中で再調製することができる。この技術は通常の免疫グロブリンでは有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再調製技術を用いることができる。凍結乾燥および再調製は様々な度合の抗体活性低下を招くことがあり（例えば、通常の免疫グロブリンの場合、IgM抗体は、IgG抗体より大きな活性低下を受ける傾向がある）、それを補うために使用レベルを上方修正しなければならないことがある、と当業者に理解されるであろう。
【０１３６】
この選択されたポリペプチドまたはそれらのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置用に投与することができる。ある治療用途において、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺細胞または他のいくつかの測定可能なパラメーターを達成するのに適当な量を、「治療的に有効な量」と定義することとする。この用量に達するのに必要な量は、疾患の重症度、患者自身の免疫系の全般的状態に左右されることとなるが、一般には、選択された抗体、受容体（例えば、T細胞受容体）またはそれらの結合タンパク質を体重１kgあたり0.005〜5.0mgであり、１回量ごとでは体重１kgあたり0.05〜2.0mgの投与量がより一般的に用いられる。また、予防的用途には、本発明の選択されたポリペプチドまたはそれらのカクテルを含有する組成物を、同様の又はそれより若干低い投与量で投与することができる。
【０１３７】
本発明の選択されたポリペプチドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、殺細胞または除去を助けるために予防的および治療的状況で使用することができる。また、標的細胞集団を選択的に殺し、枯渇させ、あるいは不均一な細胞集団から有効に除去するために、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはin vitroで使用することができる。標準的な技術に従い、哺乳動物からの血液を、選択された抗体、細胞表面受容体またはそれらの結合タンパク質と体外で一緒にし、それにより望ましくない細胞を殺したり該血液から除去して該血液を該哺乳動物に戻す。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例において本発明を更に説明するが、これらは例示目的で記載されているにすぎない。
【０１３９】
（実施例1）
抗体ライブラリーの設計
A．主鎖コンホメーション
ヒト抗体の6個の抗原結合ループのうちの5個（L1、L2、L3、H1およびH2）においては、一定数の主鎖コンホメーションまたは正規構造が存在する（Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227:799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14:4628; Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264:220）。本発明の単一の既知主鎖コンホメーションを提供するために、これらのループのそれぞれに最も一般的な主鎖コンホメーションを用いる。H1-CS1（発現したレパートリーの79％）、H2-CS3（46%）、VκのL1-CS2（39%）、L2-CS1（100%）、VκのL3-CS１（36%）を用いる。H3ループは、短いループ長の一定数の主鎖コンホメーションを形成する（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263:800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399:1）。すなわち、H3が7残基のCDR3長（Kabatら (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Servicesに定義されている）を有し、H94位にリシン残基またはアルギニン残基を、H101位にアスパラギン酸残基を有する場合には、これらの2つの残基の間に塩橋が形成され、ほとんどの場合、単一の主鎖コンホメーションが産生されると考えられる。EMBLデータのライブラリーには、このコンホメーションを形成するのに必要なH3長および鍵残基を有する少なくとも16個のヒト抗体配列が存在し、該タンパク質データバンクには、抗体モデリングの基礎として使用することができる少なくとも2個の結晶構造（2cgrおよび1tet）が存在する。
【０１４０】
この場合、必要な正規構造の組合せを与えるような、所望のループ長および鍵残基をコードする、最も頻繁に発現される生殖細胞系列遺伝子セグメントは、VHセグメント3-23（DP-47）、JHセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12（DPK9）およびJκセグメントJκ1である。したがって、所望の単一の主鎖コンホメーションを有するライブラリーを構築するための基本材料として、これらのセグメントを組合せて使用することができる。VκセグメントO2/O12（DPK9）はVκ1ファミリーのメンバーであり、したがってスーパー抗原プロテインLに結合するであろう。VHセグメント3-23（DP-47）はVH3ファミリーのメンバーであり、したがって、後に一般的リガンドとして使用可能なスーパー抗原プロテインAに結合するはずである。
【０１４１】
B．変異のための位置の選択
ヒトVHおよびVκ配列の分析は、成熟レパートリー内の最も多様性のある位置が、抗原と最もよく接触する位置であることを示している（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256:813; 図1を参照されたい）。これらの位置は機能的抗原結合部位を形成し、したがって側鎖は多様化する方向で選択される（図2）。H54は鍵残基であり、選択されたH2正規構造3においては抗原結合部位から離れた方向に向いている（この位置に見られる多様性は、H54が該結合部位の方向に向いている正規構造1、2および4によるものである）。この場合には、その代わりにH55（これは該結合部位の方向に向いている）が多様化されている。これらの位置における多様性は、一次レパートリーにおける生殖細胞系列または結合の多様性により、または体細胞超突然変異により生じる（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256:813; 図1）。したがって、抗原結合部位内の残基の2つの異なるサブセットを変異させて、2つの異なるライブラリーフォーマットを作製した。「一次」ライブラリーにおいては、変異のために選択される残基はH2、H3、L2およびL3からのものである（これらのループ内の多様性は主として生殖細胞系列または結合の多様性の結果である）。このライブラリー内の変異した位置は、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96（全部で18残基、図2）である。「体細胞」ライブラリーにおいては、変異のために選択される残基はH1、H3、L1、およびL3の末端のものである（この場合の多様性は主として体細胞超突然変異または結合多様性の結果である）。このライブラリー内の変異した位置は、H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34およびL96である（全部で12残基、図2）。
【０１４２】
C．変異させる位置におけるアミノ酸の使用の選択
コドンNNK（これは、TAG終結コドンを含みTGAおよびTAA終結コドンを含まない全20アミノ酸をコードする）またはコドンDVT（これは、セリン22％、およびチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニンおよびシステイン各11％をコードし、各位置において等しい比率で一重、二重、三重および四重の縮重を用いることで、天然ヒト抗体の抗原結合部位内のアミノ酸残基の分布を最も厳密に模倣している）を組込むことにより、側鎖の多様性を「一次」および「体細胞」ライブラリー内に導入する。
【０１４３】
（実施例2）
ライブラリーの構築および一般的リガンドでの選択
表1に挙げるオリゴヌクレオチドおよび生殖細胞系列V遺伝子セグメントDPK9（Coxら (1994) Eur. J. Immunol., 24:827）およびDP-47（Tomlinsonら (1992) J. Mol. Biol., 227:7768）を使用するPCRにより、「一次」および「体細胞」ライブラリーを構築した。簡単に説明すると、5’（バック）プライマーとNNKまたはDVT 3’（フォワード）プライマーとのペアを、鋳型として用いる対応する生殖細胞系列V遺伝子セグメントと共に使用して（表1を参照されたい）、第1ラウンドの増幅を行なった。これは、NNKおよびDVTライブラリーのそれぞれにつき8種類の別個のDNA断片を与える。ついで表1に示す5’（バック）プライマーおよび3’（フォワード）プライマーを第1ラウンドの増幅に由来する精製断片のうちの２種類と共に使用して、第2ラウンドの増幅を行なった。これは、NNKおよびDVTライブラリーのそれぞれにつき4種類の別個の断片を与える（「一次」VHフラグメント、5A；「一次」Vκフラグメント、6A；「体細胞」VHフラグメント、5B；および「体細胞」Vκフラグメント、6B）。
【０１４４】
これらのフラグメントのそれぞれを切断し、ついでいずれのTAGコドンもペプチドタグも含有しないpHEN1の改変形態内に擬VHおよびVκドメインをそれぞれ含有するpCLEANVH（VHフラグメントの場合）またはpCLEANVK（Vκフラグメントの場合）に連結する（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381）。ついで該連結物を非サプレッサー大腸菌（E. coli）株HB2151中にエレクトロポレーションした。これらのライブラリーのそれぞれからのファージを産生させ、VHおよびVκライブラリーに関してそれぞれ一般的リガンドであるプロテインAおよびプロテインL 10μg/mlでコートしたイムノチューブを使用して別々に選択した。ついで、選択したファージに感染させた大腸菌（E. coli）からのDNAを調製し、擬Vκインサートが対応Vκライブラリーで置換されるように切断した。これらのライブラリーのエレクトロポレーションは以下のインサートライブラリーのサイズを与える：9.21 x 108（「一次」NNK）、5.57 x 108（「一次」DVT）、1.00 x 109（「体細胞」NNK）および2.38 x 108（「体細胞」DVT）。前選択の対照として4つの追加的ライブラリーを作製したが、一般的リガンドであるプロテインAおよびプロテインLでの選択は行なわなかった。これらのライブラリーに関するインサートライブラリーのサイズは、1.29 x 109（「一次」NNK）、2.40 x 108（「一次」DVT）、1.16 x 109（「体細胞」NNK）および2.17 x 108（「体細胞」DVT）であった。
【０１４５】
前選択工程の成功を確認するために、選択された及び未選択の「一次」NNKライブラリーからのDNAを、pUC系発現ベクター中にクローニングし、HB2151中にエレクトロポレーションした。96個のクローンを各再クローン化ライブラリーからランダムに拾い、可溶性scFvフラグメントの発現を誘導した。scFvを捕捉するためにプロテインLを使用し、ついで結合を検出するためにプロテインA-HRPコンジュゲートを使用するELISAにより、機能的scFvの産生をアッセイする。このアッセイを用いた場合には、機能的VHおよびVκドメインを発現するscFv（フレームシフト、終結コドン、フォールディングまたは発現突然変異はいずれも存在しない）だけがシグナルを与えるであろう。各ライブラリー内の機能的抗体（バックグラウンドを超えるELISAシグナル）の数は、未選択の「一次」NNKライブラリーでは5％、その選択された形態では75％であった（図3）。該アッセイで陰性であったクローンは、配列決定によって、フォールディングおよび／または発現を妨げるに違いない、抗原結合部位内の重要なフレームワーク残基およびアミノ酸におけるフレームシフト、終結コドン、PCR突然変異の存在が証明された。
【０１４６】
（実施例3）
標的リガンドに対するライブラリー選択
イムノチューブ上に種々の濃度でコートされた5種類の抗原（ウシユビキチン、ラットBIP、ウシヒストン、NIP-BSAおよび鶏卵リゾチーム）を使用して、「一次」および「体細胞」NNKライブラリー（前選択なし）を別々に選択した。2〜4ラウンドの選択の後、鶏卵リゾチーム以外のすべての抗原に対する高特異性抗体を得た。クローンをランダムに選択して配列決定したところ、各抗原に対する一定範囲の抗体が示された（図4）。
【０１４７】
第2段階では、前選択されたNNKおよびDVTライブラリーからのファージを1：1で混合して、単一の「一次」ライブラリーおよび単一の「体細胞」ライブラリーを得た。ついでイムノチューブ上に種々の濃度でコートされた7種類の抗原（FITC-BSA、ヒトレプチン、ヒトチログロブリン、BSA、鶏卵リゾチーム、マウスIgGおよびヒトIgG）によって、これらのライブラリーを別々に選択した。2〜4ラウンドの選択の後、一般的リガンドを使用した前選択を行っていないライブラリーを使用する前段階の選択においては、陽性体を産生しなかった鶏卵リゾチームを含むすべての抗原に対する高特異性抗体を得た。クローンをランダムに選択して配列決定したところ、各抗原に対する一定範囲の抗体が示された（図4）。
【０１４８】
（実施例4）
scFvを保持するファージのscFvの発現および産生に対する前選択の効果
前選択の結果を更に確認するために、未選択の及び前選択された「一次」DVTライブラリーからのDNAを、pUC系発現ベクター中にクローニングし、HB2151中にエレクトロポレーションし、どちらの場合にも105個のクローンを得る。96個のクローンを各再クローン化ライブラリーからランダムに拾い、可溶性scFvフラグメントの発現を誘導した。scFvを捕捉するためにプロテインLを使用し、ついでscFvとの結合を検出するためにプロテインA-HRPコンジュゲートを使用して、機能的scFvの産生を再度アッセイする。各ライブラリーにおける機能的抗体の割合（％）は35.4％（未選択体）および84.4％（前選択体）であり、このことは、プロテインAおよびプロテインLでの前選択の結果として、機能的メンバーの数が2.4倍増加したことを示している（この増加は、同等のNNKライブラリーの場合ほど顕著ではない。なぜなら、DVTコドンはTAG終結コドンをコードしていないからである。未選択NNKライブラリーにおいては、HB2151などの非サプレッサー株におけるTAG終結コドンの存在は終結を招き、したがって機能的なscFvの発現を妨げることになる。NNKライブラリーの前選択は、TAG終結コドンを含有するクローンを除去して、可溶性scFvを発現するメンバーを高い割合で有するライブラリーを産生する）。
【０１４９】
全体的なscFv発現に対する「一次」DVTライブラリーの前選択の効果を評価するために、該再クローン化未選択および前選択ライブラリー（それぞれ、pUC系発現ベクター中のクローン105個を含有する）を、scFvフラグメントのポリクローナル発現に関して誘導する。ついで上清中の発現したscFvの濃度を測定する。これは、プロテインLでコートされたELISAプレート上での2倍希釈（図5aの第1〜12欄）の該上清のインキュベートと、続くプロテインA-HRPを用いた検出によって行ない、同時に既知濃度のscFvをアッセイして、未選択および前選択DVTライブラリーにおけるscFvの発現レベルを定量する。これらを用いて標準曲線をプロットし（図5b）、これから、該未選択および前選択「一次」DVTライブラリーの発現レベルを、それぞれ12.9μg/mlおよび67.1μg/mlと算出する（すなわち、プロテインAおよびプロテインLでの前選択による、発現の5.2倍の増加である）。
【０１５０】
scFvを保持するファージの量を評価するために、該未選択および前選択「一次」DVTライブラリーを増殖させ、ポリクローナルファージを得る。それらの2つのライブラリーからの等容量のファージを、MES泳動バッファーを含有する4〜12％ Bis-Tris NuPAGEゲル上、変性条件下で泳動する。得られたゲルをウエスタンブロット法に付し、抗pIII抗体を使用してプローブし、X線フィルムにさらす（図6）。各場合の下側のバンドはpIIIタンパク質単独に対応し、上側のバンドはpIII-scFv融合タンパク質を含有する。ソフトウェアパッケージNIHイメージを使用する該バンド強度の定量は、前選択が、該ファージ中に存在する融合タンパク質の量を11.8倍に増加させることを示している。実際のところ、該前選択ファージ中の全pIIIの43％はpIII-scFv融合体として存在し、このことは、多くのファージ粒子が、その表面上に少なくとも1つのscFvを提示していることを示唆している。
【０１５１】
したがって、一般的リガンドを使用する前選択は、レパートリーからの機能的メンバーの富化を可能にするばかりでなく、それはまた、十分に発現し、さらに細菌プロテアーゼにより切断されることなく（必要に応じて）ファージの表面上に高レベルの提示を惹起しうるメンバーの優先的選択をもたらす。
【０１５２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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