(57)【要約】【課題】  親油性被検物質を投与できる量をコントロールできる被検物質評価方法を提供する。【解決手段】  本発明は、親油性被検物質の、ＣＤ包接体を線虫に経口摂取させることで、経口摂取した親油性被検物質の生物機能に対する作用を評価する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性被検物質のシクロデキストリン包接体を含有する培地中で線虫を飼育し、経口摂取した被検物質の生物機能に対する作用を評価する被検物質評価方法。
【請求項２】
前記線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項1に記載の被検物質評価方法。
【請求項３】
被検物質の生物機能に対する作用を、生物学的指標および／または生化学的評価により評価する請求項1または2に記載の被検物質評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫を用いた被検物質評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日莫大な数の化学物質が存在する。これらの化学物質の中には、農薬、重金属、大気汚染ガスなどの毒性物質や、薬剤、生理活性物質、栄養補助食品などの有用物質がある。
【０００３】
化学物質の効果を評価するには、マウス、ラット、イヌ、サルなどの高等動物が用いられている。しかし、高等動物を用いると、多大な労力と時間と費用を要する。一方、バクテリアや培養細胞を用いると、形体形成、器官形成などの高次の生命現象が見られず、代謝系も多細胞生物とのギャップが大きい。
【０００４】
このため、高等動物より簡易に試験が行え、ヒトのような動物の神経系、生殖器官を有し、しかもヒトとの類似度性がある動物を用いることが要求されている。このような動物として、線虫のシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を用いる毒性試験方法が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００５】
薬剤、栄養補助食品などの物質の場合、経口摂取による影響を正確に評価することが重要である。しかし、上記文献に記載の方法では、いずれも培地に被検物質を加え、それが線虫に与える影響を評価する。このため、物質が線虫に影響を与えたのが、経口摂取によるものか、経皮摂取によるものか区別できない。また、培地全体に溶け込ませる方法の場合、多量の被験物質を確保する必要がある。しかし、試験的に得られた天然抽出物などでは極めて少ない量の被験物質で試験を行う必要があり、経口的に確実に摂取させるほうが望ましい。さらに、培地に被検物質を加える方法では、被験物質の分子量や化学的性質により、線虫の体表面から吸収される量が異なると推察され、体内移行量を把握することは容易ではない。
【０００６】
本発明者らは、経口摂取した被検物質が線虫に与える影響を評価できる被検物質評価方法を提供する方法として、被検物質をマイクロカプセルに封入して線虫に経口摂取させる方法を見出した（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特開昭５５−１５３５９９号公報
【特許文献２】特開２００５−１０１１０号公報
【特許文献３】特開２００８−１７０４２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献３に記載の方法では、例えば被検物質が親油性の物である場合にはアラビアガムを用いてマイクロカプセル化し、被検物質が親水性の物である場合にはフォスファチジルコリンなどのリン脂質を用いてリポゾームに水溶液を封入し投与する。
【０００８】
しかし、親油性の被検物質の場合、被検物質を大豆油に溶解し、アラビアガムを用いてマイクロカプセルにする。このため、被検物質の大豆油に対する溶解度により、投与可能な量が制限される。
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、親油性被検物質を投与できる量をコントロールできる被検物質評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、親油性被検物質をシクロデキストリン（以下、「ＣＤ」ということもある）に包接させると、親油性被検物質を任意の濃度で包接できることを見出した。また、親油性被検物質のＣＤ包接体を線虫に経口摂取させることができることを確認した。さらに、経口摂取したＣＤ包接体に包接されている被検物質が線虫で作用するためには、線虫腸管腔内もしくは線虫の細胞内部や体腔内で被検物質がＣＤから解離し、その機能を発揮する必要がある。本発明者は、これらのことを確認し、経口摂取した親油性被検物質の生物機能に対する作用が評価できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
上記線虫は、シノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）であればよい。
【００１２】
被検物質の生物機能に対する作用は、例えば生物学的指標および／または生化学的評価により評価することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の被検物質評価方法を用いると、親油性被検物質が経皮吸収される影響を排除して、経口摂取した親油性被検物質が線虫に与える作用を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
［線虫］
本発明の被検物質評価方法に用いる線虫（シノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ））は、１５００種程度知られている中から選択された体長約１ｍｍの土壌線虫の一種である。この線虫は、飼育が容易で体細胞数が約１０００個と少なく、雌雄同体が自家受精で増殖することができる。線虫は神経系、筋肉、消化器官、生殖器官等および表皮をもち、動物としての基本的体制をもっており、その遺伝子もヒトに近く、また、ヒトと同じ真正後生動物に属する。この線虫は、老化の分子生物学研究の実験動物や、病原微生物の感染モデルとして用いられている。
【００１６】
このような線虫として、例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ株Ｎ２雌雄同体型が挙げられる。この線虫は、例えばＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ、ＵＳＡ．）より入手することができる。
【００１７】
線虫の飼育は、「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」、「線虫ラボマニュアル」記載の方法を一部変更して行う。
【００１８】
［被検物質］
本発明で評価することができる被検物質は、経口摂取してその作用を評価するものであれば特に制限はない。被検物質は、脂溶性であると、シクロデキストリンに包接されやすいので好ましい。なお、本明細書中で「脂溶性」とは、分子全体が脂溶性の物質のほか、分子中に脂溶性の基を含むものをいう。被検物質は、分子全体が脂溶性の物質の場合は、物質全体または一部が、シクロデキストリンに包接される。または、分子中に脂溶性の基を含む場合には、脂溶性の基の部分が、シクロデキストリンに包接される。
【００１９】
なお、本発明で、「被検物質」には、薬剤、栄養補助食品などのヒトや動物に対する有用物質や、毒物、農薬、環境汚染源、突然変異原などのヒトや動物に毒性などの悪影響を与える物質のいずれも含まれる。また、「被検物質の生物機能に対する効果」には、その物質が線虫の寿命を延ばすなどの利益を与える「正の作用」であってもよく、毒性、突然変異性などの生体に悪影響を与える「負の作用」であってもよい。すなわち、本発明にいう「被検物質の生物機能に対する作用」とは、被検物質を線虫に与えることによって生ずる何らかの影響を意味する。
【００２０】
［シクロデキストリン］
シクロデキストリンは数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。グルコースが５個以上結合したものが知られている。本発明のシクロデキストリン包接体の製造に用いるシクロデキストリンとしては、グルコースが６個結合しているαシクロデキストリン（シクロヘキサアミロース）、７個結合しているβシクロデキストリン（シクロヘプタアミロース）、８個結合しているγシクロデキストリン（シクロオクタアミロース）などの天然型シクロデキストリンや、これらの天然型シクロデキストリンをメチル化、ヒドロキシプロピル化、アセチル化、モノクロロトリアジノ化、スルフォブチル化などの化学修飾をした化学修飾型シクロデキストリンやマルトシル化などの酵素修飾型シクロデキストリンなどの修飾型シクロデキストリン、あるいはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。これらのシクロデキストリンのうち、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリンを用いることが好ましく、特にγシクロデキストリンを用いることが好ましい。
【００２１】
シクロデキストリンは、ドーナツあるいは穴の開いたバケツのような環状形状をしている。シクロデキストリンの環状構造の内部は他の比較的小さな分子を包接できる程度の大きさの空孔となっている。空孔の内径はα体で０．４５〜０．６ｎｍ、β体で０．６〜０．８ｎｍ、γ体で０．８〜０．９５ｎｍ程度とされている。シクロデキストリンの空孔の端には、ヒドロキシル基（水酸基）が多くあるため、シクロデキストリンは水に溶ける。一方、空洞の中はエーテル結合の酸素原子と水素原子があるため、疎水的になっている。したがって、疎水性をもつ有機化合物などが化学結合を作ることなく、物理的な引力（分子間力）によって空洞の中に取り込まれる（包接される）。本発明では、これを利用して親油性の物質をシクロデキストリンに包接させる。
【００２２】
本発明では、シクロデキストリンの大きさが重要である。線虫は、通常大腸菌を餌として飼育される。また、酵母サイズ（５μｍより大きく、１０μｍより小さいサイズ）の大きさのものは、線虫が摂取しにくい。したがって、脂溶性物質を包接した後で生じるシクロデキストリンの自然凝集塊の径が、大腸菌の大きさと同じ程度（例えば、１μｍ〜５μｍ程度）であると好ましい。なお、シクロデキストリンの自然凝集塊が腸管腔内に取り込まれた後、凝集体はさらに微細な集合体に分散する。
【００２３】
［評価方法］
被検物質は、シクロデキストリンに包接され、分散した溶液を、線虫育成用寒天平板に塗布する。この状態でしばらく置くと、溶媒が寒天に吸収され、シクロデキストリンが線虫育成用寒天平板上に残る。この寒天平板上で所定期間線虫を飼育する。線虫の寿命を観察することで、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価する。また、薬剤、栄養補助食品などの被検物質を摂取させた後に、病原菌などを摂取させることで、薬剤、栄養補助食品などの効果を評価してもよい。
【００２４】
また、本発明の評価方法では、シクロデキストリンが存在する線虫育成用寒天平板で線虫を飼育する期間を変えることで、摂食した被検物質が線虫に影響を与える時期を正確に評価できる。
【００２５】
［摂取量の測定方法］
本発明で用いるシクロデキストリンに、脂溶性蛍光物質などを被検物質とともに包接しておくと、線虫が被検物質をどの程度の量を摂取したかを容易に測定できる。すなわち、蛍光物質などが包接されたシクロデキストリンを線虫に摂食させる。一定時間経過した後、線虫体内の蛍光物質の分布を蛍光顕微鏡で観察するとともに、線虫をすり潰して回収される蛍光物質の量を測定し、単位時間当たりのシクロデキストリン摂取量を算定する。これからシクロデキストリンおよび包接される被検物質の経口摂取量を求めることができる。また、寒天平板上に塗布するシクロデキストリンの量を調整することで、投与量を調整することも容易である。
【００２６】
本発明において、被検物質の評価方法は、用いる被検物質によって、適宜選択することができる。例えば、線虫の寿命の長短、運動、産卵数、突然変異性などの生物学的指標、過酸化脂質などの生化学的指標を評価するなどである。例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ株Ｎ２雌雄同体型の寿命は、通常、２５日程度である。寿命の評価は、線虫を毎日観察し、線虫を器具で軽く触れて動かなかった個体を死亡したものとして、評価することができる。なお、本明細書中において、２５℃の温度条件下で飼育した場合に、線虫の幼虫期とは孵化後０〜３日齢を、成虫期とは４日齢以降をいう。
【００２７】
本発明の方法によれば、親油性被検物質が経皮吸収される影響を排除して、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を直接評価できる。特に、経口摂取量を正確に測定でき、その効果を評価できる。この結果、薬剤、栄養補助食品などの経口摂取による物質の影響を正確に評価することができる。また、本発明の方法によれば、経口摂取したＣＤ包接体に包接されている被検物質が線虫腸管腔内等でＣＤから解離し、腸管腔内から腸管細胞内へと吸収される。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００２９】
以下の実施例において、線虫、試薬、培養液は以下のものを用いた。
線虫：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ株Ｎ２雌雄同体型(線虫)を用いた。
線虫育成用寒天平板（Ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＮＧＭ  ｐｌａｔｅ）：
ＮａＣｌ（和光純薬工業）１．５ｇ、Ａｇａｒ（和光純薬工業）８．５ｇを４８５ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）滅菌し、６０℃のウォーターバス内で１ｈｒ冷却した後、１Ｍ  ＣａＣｌ２を５００μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４を５００μｌ、エタノール（和光純薬工業）で５ｍｇ／ｍｌに調整したコレステロール（和光純薬工業）を５００ｍｇ／ｍｌ、１Ｍ  ＫＰＯ４を１２．５ml混合し、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１２ｍｌずつ分注したものを用いた。
【００３０】
ＴＲＹＰＴＯＮＥ  ＳＯＹＡ寒天平板（ＴＳＡ）：
ＴＲＹＰＴＯＮＥ  ＳＯＹＡ  ＡＧＡＲ（Ｏｘｏｉｄ）２０ｇを５００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）で滅菌して冷却後、９０ｍｍシャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に約２０mlずつ分注したものを用いた。
【００３１】
Ｍ９  ｂｕｆｆｅｒ：
ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業）１．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬工業）３ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業）２．５ｇを蒸留水５００ｍｌに混合し、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）で滅菌して冷却後１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ５００μｌを加えて混合したものを用いた。
【００３２】
１Ｍアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液：
アジ化ナトリウム（和光純薬工業）０．６５ｇを１０ｍｌのＭ９  ｂｕｆｆｅｒに加えて溶解させ、１Ｍアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を作製した。これを母液として、Ｍ９  ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ希釈を行い、５０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液と１０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を作製した。
【００３３】
（実施例１）
（γＣＤの取り込みの確認）
蛍光物質−γＣＤの作製
γＣＤ（ＣＡＶＡＭＡＸ  Ｗ８  Ｆｏｏｄ：Ｗａｃｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ）  ２ｇを乳鉢に量り取り、脱イオン水を適量加えペーストを調製した。１ｍｌのエタノールに溶解した蛍光物質３、３’−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（ＤｉＯ）（Ｓｉｇｍａ製)  ２ｍｇを加えて、均一になるまで混合した。減圧乾燥によって粉末化し、ＤｉＯ−γＣＤ包接体を得た。
【００３４】
蛍光物質包接γＣＤの線虫への投与
ＴＳＡで一晩培養した餌となるＯＰ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０（以下「ＯＰ」という））１０ｍｇをＭ９  ｂｕｆｆｅｒ５０μｌに懸濁した菌液と、蛍光物質包接γＣＤ溶液５０μｌ（ＤｉＯ換算１４．２５μｇ）をＮＧＭ  ｐｌａｔｅに塗布した（１４．２５μｇ／プレート）。その上に線虫を数匹ワームピッカーを用いて移し、３時間餌を自由摂食させた。
【００３５】
蛍光マイクロカプセルの作製
オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）により滅菌した蒸留水３．５ｇとアラビアガム０．７５ｇを遠心チューブに入れ、よく撹拌し、溶解させた。そこに、孔径０．４５μｍのディスクフィルター（東洋濾紙、東京）で濾過滅菌した、蛍光物質３、３’−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（ＤｉＯ、Ｓｉｇｍａ、  Ｄ４２９２）２．５ｍｇを大豆油（和光純薬工業）１．０ｇに加え不溶分を残して採取した上清０．７５ｇを加え、氷上にて超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー）の最大出力で2分間処理して、粒径1〜５μｍのマイクロカプセルを作製した。
【００３６】
蛍光物質包接γＣＤおよび蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への投与
ＴＳＡで一晩培養した餌となるＯＰ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０（以下「ＯＰ」という））をＭ９  ｂｕｆｆｅｒで２００ｍｇ／ｍｌに調整したもの５０μｌと蛍光物質含有マイクロカプセル５０μｌを撹拌混合した後、ＮＧＭ  ｐｌａｔｅに塗布した（溶解量不明のため投与量不明だが全てのＤｉＯが溶解したと仮定すると約１８μｇ／プレート）。その上に線虫を数匹ワームピッカーを用いて移し、３時間餌を自由摂食させた。
【００３７】
蛍光物質包接γＣＤおよび蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への取り込みの確認
１５ｍｌ容量のチューブに、３ｍｌの１０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液と０．１５ｇのＡｇａｒ（和光純薬工業）を入れ、撹拌した後、チューブの蓋を緩めて電子レンジに数十秒かけて溶かし、５％寒天溶液を作った。５％寒天溶液は、固まらないうちに手早くスライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）の上に滴下し、すぐに上からもう一枚スライドグラスをかぶせて平らなアガーパッドを作製した。アガーパッドが固まったら、上に重ねているスライドグラスをゆっくりと取り外し、アガーパッドの上に５０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を数滴のせて、その中に、ワームピッカーですくった線虫を載せた。その上に円形マイクロカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を被せて、顕微鏡観察用の線虫試料とした。
【００３８】
結果
上記線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した。図１は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。図１（Ａ）は、マイクロカプセルを用いたもの、図１（Ｂ）は、γＣＤを用いたものである。図１から、蛍光物質包接γＣＤを用いた場合のほうが蛍光強度が強く、蛍光物質包接γＣＤを用いると、同一条件で多くγＣＤを摂取していることがわかる。
【００３９】
また、図１（Ｂ）から、ＤｉＯが腸管腔内から腸管細胞内へと吸収され分散している状態が写真から読み取れる。一方、マイクロカプセルを用いた、図１（Ａ）の例では、ＤｉＯは腸管腔内にとどまり、腸管細胞内へと吸収されていないことがわかる。
【００４０】
（実施例２）
［γＣＤの取り込み量の確認］
上記実施例１において、投与量を１／１０にした以外は、実施例１と同様にした（１．４２５μｇ／プレート）。
【００４１】
結果
上記線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した。図２は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。図２から、蛍光物質包接γＣＤにおいて、蛍光物質量が１．４２５μｇ／プレートであっても、γＣＤを摂取していることがわかる。すなわち、γＣＤを用いることで、親油性被検物質を効率よく確実に経口的に摂取させることができることがわかった。
【００４２】
（実施例３）
（蛍光物質含有γＣＤの線虫への取り込み量の測定）
蛍光物質−γＣＤの作製
実施例１と同様の方法で、蛍光物質−γＣＤ包接体を作製した。
【００４３】
使用した線虫
線虫Ｂｒｉｓｔｏｌ株Ｎ２の雌雄同体を実験に供した。線虫飼育用の餌として非病原性の大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０株（ＯＰ）を用いた。湿重量１０ｍｇのＯＰを２５μｌ  のＭ９  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ペプトン未添加の線虫育成用寒天培地（ＮＧＭ）に塗布した。虫卵をＮＧＭに散布し、２５℃のふ卵器内で３日齢まで飼育したものを用いた。
【００４４】
蛍光物質含有γＣＤの線虫への投与
次に示す３種の条件で、ＤｉＯを添加したプレートを作製した。ＤｉＯをＮＧＭに添加または表面に塗布して、ＤｉＯ濃度が、１４．２５μｇ／プレートになるようにした。また、蛍光物質−γＣＤ包接体を用いる場合は、ＮＧＭにＤｉＯ濃度が、１４．２５μｇ／プレートになるようになるように蛍光物質−γＣＤ包接体を塗布した。上記した３日齢の線虫を各プレートに５０匹加え、３時間自由に摂食させた。
【００４５】
上記各条件で３時間飼育した線虫各５０匹を回収し、洗浄した。これをペッスルを用いて、物理的に粉砕した。この粉砕液の蛍光強度を測定し（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ．１０ｓ）、線虫１匹あたりのＤｉＯの取り込み量を逆算して求めた。結果を、図３に示す。図３は、各飼育条件における線虫１匹あたりのＤｉＯの取り込み量（ｎｇ）を示すグラフである。
【００４６】
図３から、ＤｉＯを添加したプレート（Ａ）で飼育した線虫では、ＤｉＯの摂取が認められなかったことがわかる。また、ＤｉＯを寒天表面に塗布したプレート（Ｂ）で飼育した線虫においても、ＤｉＯの摂取が認められなかった。一方、ＤｉＯを包接したγＣＤを表面に含むプレート（Ｃ）で飼育した線虫では、ＤｉＯの摂取（約０．２７（ｎｇ）前後）が認められた。
【００４７】
以上の結果から、本発明にかかるγＣＤ包接体を用いると、少量の被験物質を使用する場合に最も効率的に線虫に被験物質を取り込ませることができることがわかった。経口摂取による被検物質の評価をするには、本発明にかかるγＣＤ包接体を用いる方法が優れていることがわかる。
【００４８】
（実施例４）
［コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）を加えた培地上で飼育する線虫の寿命の評価］
本実施例では、以下の培地を用いた以外は、同じものを用いた。
ＣｏＱ１０添加寒天培地（ＣｏＱ１０寒天）：
ＣｏＱ１０（Ｓｉｇｍａ製）７５ｍｇをエタノール（和光純薬工業）１ｍｌと混合し、さらに１５０ｍｇのＴｗｅｅｎ８０と混和してから蒸留水２４９ｍｌと混合した。通常の２倍濃度に調整し滅菌しておいた×２ＮＧＭ２５０ｍｌと混和し、１０ｍｌずつ直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に分注し固化させることで１５００μｇのＣｏＱ１０を含むプレートを調製した。上記の実験と同様に３日齢の線虫を各プレートに５０匹加え、ＯＰを給餌して飼育し毎日その生死を確認し生存分析を行うことで、ＣｏＱ１０添加ＮＧＭと対照群の間で比較検討した。
【００４９】
寒天培地（対照用寒天）：
シャーレに分注する前の液状のＮＧＭ５００ｍｌを作製した。これを、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１０ｍｌずつ分注したものを用いた。
【００５０】
ＣｏＱ１０−γＣＤ包接体：
γＣＤ（ＣＡＶＡＭＡＸ  Ｗ８  Ｆｏｏｄ：Ｗａｃｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ）  ９３．７ｇとＣｏＱ１０（Ｓｉｇｍａ製）２５．０ｇを１０００ｍＬビーカーに量り取り、軽く混合した。これに脱イオン水を４７０ｍＬ加え、ホモジナイザー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｔ２５：ＩＫＡ）を用い、８，０００−１２，０００ｒｐｍにて３０分間攪拌した。噴霧乾燥によって粉末化し、ＣｏＱ１０−γＣＤ包接体を得た。
【００５１】
また、以下の実施例においては、観察により得られた結果は、４  Ｓｔｅｐｓ  エクセル統計  第２版付属の統計ソフトＳｔａｔｃｅｌ  ２（２０）を用い、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により生存率を計算後、Ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔにより各群間の生存率の差を比較した。
【００５２】
ＣｏＱ１０寒天上で全期間飼育することが線虫の寿命に与える実験
産卵期にある線虫から卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した。予め、ＴＳＡで３７℃一晩培養したＯＰを３日齢まで飼育した後、対照用の寒天上、ＣｏＱ１０寒天上およびＣｏＱ１０−γＣＤ塗布寒天上に、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＶＥ寒天上および対照用寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくＯＰを塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ＣｏＱ１０群の線虫は、全飼育期間をＣｏＱ１０寒天上またはＣｏＱ１０−γＣＤ塗布寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。結果を図４に示す。
【００５３】
図４から、全期間ＣｏＱ１０寒天上で飼育した群（図中「ＣｏＱ１０−ＮＧＭ」）は、寿命が短くなることがわかる。また、ＣｏＱ１０−γＣＤ塗布寒天上で飼育した群（図中「１／１０ＣｏＱ１０−γＣＤ」および「１／１００ＣｏＱ１０−γＣＤ」）は、対照群（図中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」）との間に、寿命の差はみられなかった。このことから、全期間ＣｏＱ１０寒天上で線虫を飼育しても、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００５４】
（実施例５）
［レスベラトロールを加えた培地上で飼育する線虫の寿命の評価］
本実施例では、以下の培地を用いた以外は、同じものを用いた。なお、レスベラトロールは天然に存在する植物性のポリフェノールである。
レスベラトロール添加寒天培地（ＲＥＳ寒天）：
レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ製）１４．３ｍｇをＤＭＳＯ（和光純薬工業）１ｍｌに溶解させたレスベラトロール溶液８０μｌをシャーレに分注する上記液状のＮＧＭ１００ｍｌによく撹拌しながら添加し、５０μＭのレスベラトロール添加ＮＧＭを作製し、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１０ｍｌずつ分注したものを用いた。１００μＭを作製するときは１６０μｌをシャーレに分注するＮＧＭ１００ｍｌによく撹拌しながら添加し同様に調整した。
【００５５】
寒天培地（対照用寒天）：
シャーレに分注する前の液状のＮＧＭ５００ｍｌを作製した。これを、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１０ｍｌずつ分注したものを用いた。
【００５６】
レスベラトロール−γＣＤ包接体：
γＣＤ（ＣＡＶＡＭＡＸ  Ｗ８  Ｆｏｏｄ：Ｗａｃｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ）  １３．５ｇを５０ｍＬビーカーに量り取り、脱イオン水を６０ｍＬ加え軽く混合した。これにレスベラトロール（Ｓｉｇｍａ製）１．５ｇを加え、ホモジナイザー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｔ２５：ＩＫＡ）を用い、６，５００−９，５００ｒｐｍにて１５分間攪拌した。凍結乾燥によって粉末化し、レスベラトロール−γＣＤ包接体を得た。
【００５７】
レスベラトロール寒天上で全期間飼育することが線虫の寿命に与える実験
産卵期にある線虫から卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した。予め、ＴＳＡで３７℃一晩培養したＯＰを３日齢まで飼育した後、対照用の寒天上、レスベラトロール寒天上およびレスベラトロール−γＣＤ塗布寒天上に、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＶＥ寒天上および対照用寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくＯＰを塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、レスベラトロール群の線虫は、全飼育期間をレスベラトロール寒天上またはレスベラトロール−γＣＤ塗布寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。結果を図５に示す。
【００５８】
図５から、全期間レスベラトロール寒天上で飼育した群（図中、「５０μＭＲｅｓ」および「１００μＭＲｅｓ」）およびレスベラトロール−γＣＤ塗布寒天上で飼育した群（図中「５０Ｒｅｓ−γＣＤ」および「１００Ｒｅｓ−γＣＤ」）は、対照群（図中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」）との間に、寿命の差はみられなかった。このことから、全期間レスベラトロール寒天上で線虫を飼育しても、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００５９】
以上から、親油性被検物質を包接したγ−シクロデキストリンを用いることで、線虫の経口摂取による親油性被検物質の評価をすることができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図２】図２は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図３】図３は、各飼育条件における線虫１匹あたりのＤｉＯの取り込み量（ｎｇ）を示すグラフである。
【図４】図４は、全期間ＣｏＱ１０を経口投与した群と、対照となる群との、寿命の差を比較したグラフである。
【図５】図５は、全期間レスベラトロールを経口投与した群と、対照となる群との、寿命の差を比較したグラフである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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