(57)【要約】【課題】ＣＤ２３に特異的な新規のリガンド（抗体）を製造する。【解決手段】  ＩｇＥに対する低親和性受容体であるヒトＣＤ２３（ＦｃｅＲＩＩ／ＣＤ２３）と特異的に結合し、ヒトγ１またはヒトγ３のいずれかの定常ドメインを含むモノクローナル抗体を開示する。本抗体は誘導性ＩｇＥ発現を調節または抑制するのに有用である。したがって、それらは誘導性ＩｇＥ産生の抑制が治療的に望ましい疾病状態、例えばアレルギー症状、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療または予防に有用性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦｃγ受容体と結合し、ＩｇＥ産生を抑制する定常領域を含む抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項２】
霊長類の抗原結合部分を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項３】
齧歯類の抗原結合部分を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項４】
キメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類可変領域及びヒト定常領域を含む抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項５】
張り合わせ(veneering)、フレームワーク置換、ＣＤＲグラフティング、または分子モデリングにより調製された、請求項４に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項６】
可変領域が５Ｅ８または６Ｇ５に由来する、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項７】
抗ヒトＣＤ２３抗体５Ｅ８のＣＤ２３との結合を抑制し得る、請求項６に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項８】
抗ヒトＣＤ２３抗体５Ｅ８または６Ｇ５のＣＤ２３との結合を抑制し得る、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項９】
（ａ）配列番号２のヌクレオチド５８〜４２３によりコードされる６Ｇ５重鎖可変領域または配列番号４のヌクレオチド５８〜４１１によりコードされる５Ｅ８重鎖可変領域に由来する重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５８〜３９０によりコードされる６Ｇ５軽鎖可変領域または配列番号３のヌクレオチド６７〜３８７によりコードされる５Ｅ８軽鎖可変領域に由来する軽鎖可変領域と、
（ｃ）ヒトＦｃγ受容体に結合する定常領域と
を含有する抗体のＣＤ２３への結合を阻害できる抗ヒトＣＤ２３抗体であって、ヒトＣＤ２３に特異的に結合し、ＩｇＥ産生を抑制する抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２のヌクレオチド５８〜４２３によりコードされる重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５８〜３９０によりコードされる軽鎖可変領域と
を含有する、請求項９に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１１】
（ａ）配列番号４のヌクレオチド５８〜４１１によりコードされる重鎖可変領域と配列番号３のヌクレオチド６７〜３８７によりコードされる軽鎖可変領域とを含有する、または、
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド２８９〜２９１によりコードされるアスパラギン残基がリジン残基により置換されている、配列番号４のヌクレオチド５８〜４１１によりコードされる重鎖可変領域と、配列番号３のヌクレオチド６７〜３８７によりコードされる軽鎖可変領域とを含有する、
請求項９に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１２】
（ａ）配列番号２のヌクレオチド１４８〜１６５、２０８〜２５８及び３５５〜３９０によりそれぞれコードされる６Ｇ５抗体の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１２４〜１６５、２１１〜２３１及び３２８〜３５７によりそれぞれコードされる６Ｇ５抗体の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域と、
（ｃ）ヒトＦｃγ受容体に結合する定常領域と
を含有する抗体のＣＤ２３への結合を阻害できる抗ヒトＣＤ２３抗体であって、ヒトＣＤ２３に特異的に結合し、ＩｇＥ産生を抑制する抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号４のヌクレオチド１４８〜１６８、２１１〜２６１及び３５８〜３７８によりそれぞれコードされる５Ｅ８抗体の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１３６〜１６８、２１４〜２３４及び３３１〜３５７によりそれぞれコードされる５Ｅ８抗体の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含有する軽鎖可変領域と、
（ｃ）ヒトＦｃγ受容体に結合する定常領域と
を含有する抗体のＣＤ２３への結合を阻害できる抗ヒトＣＤ２３抗体であって、ヒトＣＤ２３に特異的に結合し、ＩｇＥ産生を抑制する抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１４】
ヒトγ１またはヒトγ３モノクローナル抗体のいずれかである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１５】
ヒトγ１抗体である、請求項１４に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１６】
ヒトγ３抗体である、請求項１４に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１７】
ＩｇＥ産生をin vitroで抑制する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１８】
Ｂ細胞によるＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生をin vitroで抑制する、請求項１７に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項１９】
ＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生をin vivoで抑制する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項２０】
０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の結合親和性を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項２１】
少なくとも５ｎＭのＣＤ２３結合親和性を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項２２】
少なくとも１００ｎＭのＣＤ２３結合親和性を有する、請求項２１に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項２３】
ヒトγ１定常領域を欠いた抗ヒトＣＤ２３抗体より強く、Ｂ細胞によるＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生をin vitroで抑制し、ヒトγ１定常領域を含有する、請求項１８に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体を含有する、患者におけるＩｇＥ産生を抑制するための医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体を含有する、アレルギー性疾患の患者におけるＩｇＥ産生を抑制するための医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体を含有する、自己免疫疾患の患者におけるＩｇＥ産生を抑制するための医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体を含有する、炎症性疾患の患者におけるＩｇＥ産生を抑制するための医薬組成物。
【請求項２８】
ＩｇＥの抑制が治療的または予防的に有益である疾病状態の治療または予防剤であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ヒトＣＤ２３抗体を含む前記剤。
【請求項２９】
疾病状態がアレルギー性疾患である、請求項２８に記載の剤。
【請求項３０】
疾病状態が自己免疫疾患である、請求項２８に記載の剤。
【請求項３１】
疾病状態が炎症性疾患である、請求項２８に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥに対する低親和性受容体であるヒトＣＤ２３（ＦｃｅＲＩＩ／ＣＤ２３）と特異的に結合し、そしてヒトγ１またはヒトγ３のいずれかの定常ドメインを含むモノクローナル抗体、ならびに治療薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＥは、喘息、食物アレルギー、１型過敏症およびありふれた副鼻腔炎症であるアレルギー性鼻炎および結膜炎のようなアレルギー反応に介在し、その結果、一般の人々全体に広範な苦痛を引き起こすイムノグロブリンファミリーの一員である。ＩｇＥは、Ｂ細胞により分泌され、その表面に発現される。Ｂ細胞により合成されるＩｇＥは、成熟ＩｇＥ配列に連結した短い膜貫通ドメインによりＢ細胞膜につなぎ留められる。膜および分泌型のＩｇＥは、ＩｇＥ  ＲＮＡ転写物のディファレンシャルスプライシングにより同一細胞で形成される。
【０００３】
ＩｇＥは、低親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩＩ、以下「ＦＣＥＬ」と呼ぶ）に対するそのＦｃ領域を介してＢ細胞（そしてＴ細胞、単核球、ランゲルハンス細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球および血小板）と、ならびに高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ、以下「ＦＣＥＨ」）に対するそのＦｃ領域を介してマスト細胞および好塩基球と結合し得る。低親和性ＩｇＥ受容体は一般的に、文献中ではＣＤ２３と呼ばれる。
【０００４】
哺乳類がアレルゲンに曝されると、抗原提示細胞は、ヘルパーＴ細胞に提示するために抗原を処理する。これらのヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞がクローン増幅を受け、そしてより多くのアレルゲン特異的ＩｇＥを分泌するのを補助する、ＩＬ−４のようなサイトカインを分泌する。この新たに合成されたＩｇＥは、次いで、それがそれらの細胞表面の高親和性受容体を介してマスト細胞および好塩基球と結合する循環中に放出される。それにより、このようなマスト細胞および好塩基球は特異的アレルゲンに対して感作される。同一アレルゲンに次に曝露されると、マスト細胞および好塩基球の表面上の特異的ＩｇＥへの結合が生じ、それによりこれらの細胞上のＦｃｅＲＩが架橋され、そして臨床的過敏症およびアナフィラキシーに関与するヒスタミンおよびその他の因子の放出が活性化される。
【０００５】
当技術分野では、ＦＣＥＬ（ＣＤ２３）結合ＩｇＥと結合し得るが、しかしＦＣＥＨと結合したＩｇＥとは結合し得ない抗体が報告されている（例えば、ＷＯ８９／００１３８および米国特許第４，９４０，７８２号参照）。これらの抗体は、低親和性受容体（ＦＣＥＬ）に結合したＩｇＥまたは循環ＩｇＥと結合するが、しかし高親和性受容体（ＦＣＥＨ）に結合したＩｇＥとは結合しないために、臨床的に有益であることが開示されている。したがって、これらの抗体は、マスト細胞または好塩基球を活性化しない。
【０００６】
さらに、抗ＣＤ２３抗体は、例えばアレルギー性疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療のための治療薬としての可能性を有すると報告されている。例えば、Bonnefoyら（特許文献１）は、ＣＤ２３に結合するリガンド、例えばモノクローナル抗体は、炎症性、自己免疫およびアレルギー性疾患の治療または予防に有用である、と報告する。
【０００７】
ＩｇＥ作動薬および拮抗薬の両方としての、ＣＤ２３に対するモノクローナル抗体の使用が報告されている。ＩｇＥ拮抗薬は、ＩｇＥ抑制が治療的に望ましい症状または疾病、例えば、アレルギー性鼻炎および結膜炎などのアレルギー性症状、アトピー性皮膚炎ならびに喘息の治療への使用の可能性を有することが報告されている。例えば、Bonnefoyら（
ＷＯ８７０７３０２（１９８７））は、ヒトＣＤ２３に対するモノクローナル抗体を報告し、これは細胞型におけるＩｇＥ受容体の存在をアッセイするのに、そしてＩｇＥの調節が治療的に望ましい疾患の治療薬として有用であると主張している。
【０００８】
治療薬および診断薬としての可能性のために、多くのグループがＣＤ２３に対するモノクローナル抗体の生成を報告している（例えば、Rector et al., Immunol., 55:481-488（1985）; Suemura et al., J. Immunol., 137:1214-1220（1986）; Noro et al., J. Immunol., 137:1258-1263（1986）; Bonnefoy et al., J. Immunol., 138:2970-2978（1987）; Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1046（1993）; Sherr et al., J. Immunol., 142:481-489（1989）およびPene et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:6880-6884（1988）参照）。さらに、前記のように、ＩｇＥ合成がサイトカイン（ＩＬ−４）誘導性である系におけるＩｇＥ産生を特異的に抑制するためのこのような抗体の使用も報告されている（Flores-Romo et al.,（同上）; Sherr et al.,（同上）; Bonnefoy et al.,（WO 8707302）; Bonnefoy et al.,（特許文献１）; 非特許文献１; Sarfati et al., J. Immunol 141:2195-2199（1988）およびWakai et al., Hybridoma 12:25-43（1993））。さらに、Flores-Romoら（同上）は、抗ＣＤ２３抗体から調製されたＦａｂがラットにおける抗原特異的誘導性ＩｇＥ応答をin vivoで抑制することを開示する。しかしながら、報告された事にかかわらず、抗ＣＤ２３抗体がＩｇＥ発現を調節するメカニズム、特にそれらがＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生を抑制する方法は、依然として不明である。
【０００９】
抗ＣＤ２３抗体は、ＩｇＥ分泌Ｂ細胞の表面に存在するＣＤ２３を介してシグナルを送ることによりＩｇＥ産生を抑制する、ということが示唆されている。ＩｇＥ分泌Ｂ細胞でアップレギュレーションされるＣＤ２３の機能はＩｇＥ産生のフィードバック抑制である、ということが提案されている（Yu, et al., Nature 369, 753-756（1994））。これは、ＣＤ２３遺伝子が除去されたマウスは対照に比してＩｇＥ産生が増大し、またＩｇＥ産生が維持されることにより理論付けされている（Yuら）。さらに、ＩｇＥ複合体によるまたは抗ＣＤ２３に対するモノクローナル抗体によるＣＤ２３への結合は、ＩｇＥを構成的に分泌するリンパ芽球様細胞株による進行中のＩｇＥ合成を抑制する、ということが報告されている（Sherrら。同上）。これは、この細胞中の分泌ＩｇＥのＨ鎖のメッセンジャーＲＮＡのダウンレギュレーションによる、と思われる（Saxon et al., J. Immunol., 147:4000-4006（1991））。しかしながら、ＩｇＥ発現が抑制される正確なメカニズムは、ＩｇＥ分泌がＩＬ−４誘導性であるシステムにおいては未だ解明されていない。
【００１０】
ＦｃγＲＩＩとＢ細胞上の表面Ｉｇ（Ｂ細胞受容体）との架橋がＩｇ発現のダウンレギュレーションをもたらす、ということも報告されている（D’Ambrosia et al., Science,
268:293-297（1995））。同様のメカニズムは、同じく細胞表面ＣＤ２３およびＦｃγＲＩＩを有する、ＩｇＥを分泌するＢ細胞に関しても提案され得る。抗原（ＣＤ２３）により細胞に結合され、またＦｃ相互作用を介してＦｃγＲＩＩに結合される抗ヒトＣＤ２３抗体は、シグナルを伝達してＦｃγＲＩＩを介してＩｇＥ分泌を抑制し得る。
【００１１】
膜ＣＤ２３とＩｇＥとの間の相互作用以外の相互作用の阻止を含めた、抗ＣＤ２３抗体によるＩｇＥ抑制に関与するメカニズムが提案されている。これに関連して、Ｃ型レクチンファミリーの一員であるＣＤ２３は、Ｔ細胞および単球を含めた種々の細胞型に存在するＣＤ２１、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃのようないくつかのその他のリガンドと相互作用することが示されている。この情況において、ＣＤ２３は、細胞接着分子と考えられ得る。
【００１２】
したがって、ＣＤ２１−ＣＤ２３相互作用は抗原提示とその後のＩｇＥ産生に関与し得る、ということが提案されている。モデルにより、Ｂ細胞上のＣＤ２１がアトピーの個体に主に存在する活性化Ｔ細胞上のＣＤ２３と結合後にＩｇＥ産生のための活性化シグナル
を送ることが示唆される（Lecoanet et al., Immunol., 88: 35-39 (1996);およびBonnefoy et al., Int. Amer. Allergy Immunol., 107:40-42（1995））。抗ＣＤ２３とのこの相互作用の阻止は、ＩｇＥ産生誘導を阻止し得た（Aubry et al., Nature 358:505-507（1992）およびImmunol., 5:944-949（1993）; Grosjean et al., Curr. Opin. Eur. J. Immunol., 24:2982-2988（1994）; Henchoz-Lecoanet et al., Immunol., 88:35-39（1996）; Nambu et al., Immunol. Lett., 44:163-167（1995）; Bonnefoy et al., Int. Amer. Allergy Immunol., 107:40-42（1995））。抗原提示が、Ｔ細胞上のＣＤ２１に結合している抗原提示Ｂ細胞上のＣＤ２３によりアップレギュレーションされる、という可能性もある。
【００１３】
ＩｇＥ産生に及ぼすＣＤ２３の効力を説明し得る可能性のある、さらに別のメカニズムは、可溶性形態のＣＤ２３を必要とする。ＣＤ２３は、細胞表面から切り離され、いくつかの異なる形態の可溶性ＣＤ２３またはＩｇＥ結合因子を放出するということが報告されている（Sarfati et al., Immunol., 53:197-205（1984））。可溶性ＣＤ２３は、サイトカインで、その報告された活性の１つは、Ｂ細胞からのＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生の増大である（Pene et al., J. Cell Biochem., 39:253-269（1989）; Pene et al., Eur. J. Immunol., 18:929-935（1988）; Sarfati et al., J. Immunol., 141:2195-2197（1988）; Sarfati et al.,（1984）（同上）; Saxon et al., J. Clin. Immunol. Allergy, 86（3 pt 1）333-344（1990））。また、ある形態の可溶性ＣＤ２３がＩｇＥ産生を抑制することも報告されている（Sarfati et al., Immunol., 76:662-667（1992））。したがって、抗ＣＤ２３抗体は、１）可溶性ＣＤ２３のＩｇＥ増大作用を抑制し、および／または２）細胞表面からの可溶性ＣＤ２３のタンパク質分解的放出を阻止することにより、ＩｇＥ産生を阻止する可能性がある。
【００１４】
したがって、前記に基づいて、より特異的なＣＤ２３の機能およびＩｇＥ産生に及ぼす効力に関して、そしてさらにそれに特異的なリガンドがＩｇＥ産生に影響を及ぼす手段に関して、当技術分野ではかなりの複雑さおよび不確かさが存在する、ということは明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ９６／１２７４１
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Bonnefoy et al., Eur. J. Immunol 20:139-144（1990）
【発明の概要】
【００１７】
したがって、ＣＤ２３に特異的な新規のリガンド（抗体）を製造すること、そしてこのような抗体を用いて抗ＣＤ２３抗体がＩｇＥ発現を調節するメカニズムを明らかにすることが本発明の目的である。
【００１８】
誘導性ＩｇＥ発現を抑制する能力の改善された、ＣＤ２３、特にヒトＣＤ２３に結合する新規のリガンド（抗体）を製造することが、本発明の別の目的である。
【００１９】
ヒトγ１またはヒトγ３定常ドメインを含む抗ヒトＣＤ２３抗体を製造することは、本発明のより具体的な目的である。
【００２０】
ＣＤ２３およびＦｃ受容体を架橋する能力の増強によってより有効であり得る多価抗ヒトＣＤ２３抗体を製造することは、本発明の別の目的である。
【００２１】
誘導性ＩｇＥ産生を抑制し得る、ヒトγ１またはγ３定常ドメインを含む抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供することは、本発明の別の目的である。
【００２２】
誘導性ＩｇＥ産生の抑制が治療的に望ましい疾病症状の治療または予防のためにヒトγ１またはヒトγ３定常ドメインを含む抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体を使用することは、本発明の別の目的である。
【００２３】
具体的には、ヒトγ１またはヒトγ３定常ドメインを含む抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体を用いてアレルギー性症状、自己免疫疾患および炎症性疾患を治療または予防することは本発明の一目的である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】マウス抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体（ＭＨＭ６）のin vitroのＩｇＥ抑制活性を、５種類の霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体（５Ｅ８、６Ｇ５、２Ｃ８、Ｂ３Ｂ１１および３Ｇ１２）と比較する。
【図２】霊長類モノクローナル抗体５Ｅ８および６Ｇ５が、市販のマウス抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体ＭＨＭ６とは異なるヒトＣＤ２３上のエピトープと結合し（図２の中段パネル）、そして互いに競合する（図２の下段パネル）ことを示す。霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体２Ｃ８およびＢ３Ｂ１１は、ＭＨＭ６と競合する（図２の上段パネル）。
【図３】特定の霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体５Ｅ８のin vitroのＩｇＥ抑制活性を、前記の霊長類モノクローナル抗体の４つの異なるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)バージョンと比較する。それらの配列を以下に説明する。  ｐ５Ｅ８Ｇ４Ｐ  −  このＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体は、ヒトκＬ鎖定常領域およびＰ変異を含有するヒトγ４定常領域（Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-108（1993））の配列を含有する。  ｐ５Ｅ８Ｇ４ＰＮ  −  このＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体は、ヒトκＬ鎖定常領域およびＰ変異を有するヒトγ４定常領域（Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-108（1993））を含有する。この抗体は、アスパラギン残基（炭水化物結合可能部位）をリジンに変えるＨ鎖可変領域中の変異も含有する。  ｐ５Ｅ８Ｇ１  −  このＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体は、ヒトκＬ鎖定常領域およびヒトγ１定常領域を含有する。  ｐ５Ｅ８Ｇ１Ｎ  −  このＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体は、ヒトκＬ鎖定常領域およびヒトγ１定常領域を含有する。この抗体は、アスパラギン残基（炭水化物結合部位）をリジンに変えるＨ鎖可変領域中の変異も含有する。
【図４】図３に示された抗体の見かけのＫｄ（ｎＭ）を比較し、それらのＩｇＥ抑制活性をまとめた表を示す。
【図５】特定の霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体６Ｇ５のin vitroのＩｇＥ抑制活性を、下記の６Ｇ５の２つの異なるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)バージョンと比較する。  ｐ６Ｇ５Ｇ１    このＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体は、ヒトλＬ鎖定常領域およびヒトγ１定常領域を含有する。  ｐ６Ｇ５Ｇ４Ｐ    このＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体はヒトλＬ鎖定常領域およびＰ変異を有するヒトγ４定常領域（Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-108（1993））を含有する。
【図６】霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体２Ｃ８のin vitroのＩｇＥ抑制活性を、２Ｃ８に由来するＦ（ａｂ’）2と比較する。
【図７】２Ｃ８に由来するＦ（ａｂ’）2が霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体２Ｃ８のin vitroのＩｇＥ活性の抑制に拮抗する、ということを示す。
【図８】ＳＣＩＤ動物モデルにおける特定の霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体５Ｅ８のin vivoのＩｇＥ抑制活性を示す。
【図９】霊長類抗ヒト６Ｇ５およびそのＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)バージョンｐ６Ｇ５Ｇ４Ｐのin vivoの抑制活性を比較する。
【図１０】霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体６Ｇ５およびそのＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)バージョンｐ６Ｇ５Ｇ１のin vivoのＩｇＥ抑制活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本出願中に用いられる用語の定義
キメラ抗体：
２つの異なる抗体、通常は異なる種の抗体、最も典型的には齧歯類可変配列とヒト定常ドメイン配列とからの領域を含有する組換え抗体。
【００２６】
抗ヒトＣＤ２３γ１抗体：
誘導性ＩｇＥ産生を抑制するヒトγ１定常領域または断片あるいはその修飾体を含有するヒトＣＤ２３に特異的に結合する抗体。この例としては、特に、齧歯類または霊長類可変ドメインまたは抗原結合部分を含有する抗体、ヒト化、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)およびヒト抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体が挙げられ、これらは、誘導性ＩｇＥ産生をin vitroで抑制するヒトγ１定常ドメイン、断片またはその修飾体を包含する。
【００２７】
抗ヒトＣＤ２３γ３抗体：
誘導性ＩｇＥ産生を抑制するヒトγ３定常領域または断片あるいはその修飾体を含有するヒトＣＤ２３に特異的に結合する抗体。この例としては、特に、齧歯類または霊長類可変ドメインまたは抗原結合部分を含有する抗体、ヒト化、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)およびヒト抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体が挙げられ、これらは、誘導性ＩｇＥ産生をin vitroで抑制するヒトγ３定常ドメイン、断片またはその修飾体を包含する。
【００２８】
抗体定常ドメインの修飾：
定常領域により媒介される基本的エフェクター機能を変えることなく、効率性のレベル、即ちＦｃＲ結合の所望の変化を作り出し得る定常領域の変異、置換または欠失を有する本発明の抗体。
【００２９】
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体：
霊長類可変配列または抗原結合部分と、ヒト定常ドメイン配列を含有する組換え抗体。
【００３０】
ヒト化抗体：
ヒト抗体可変領域をよりそっくり模倣するように改変され、そしてそれによりヒトに投与された場合に免疫グロブリンの特異性または親和性を犠牲にせずに、潜在的免疫原性を排除するかまたは最小限にする、非ヒト可変領域または抗原結合部分を含有する組換え抗体。表面残基の選択修飾を含む「張り合わせ」、フレームワーク置換（ＣＤＲグラフティング）および分子モデリングを含めたヒト化のいくつかの既知の方法がある。
【００３１】
γ１定常ドメイン：
抗体に特異的エフェクター活性を付与する特定の型の定常ドメイン配列。本出願では、γ１定常ドメインは、抗ＣＤ２３可変ドメイン配列または抗原結合部分と組合わされてγ１エフェクター機能を保持する、ヒトγ１定常ドメイン、断片またはその修飾体を指す。修飾体は、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換または付加を含むヒトγ１定常ドメインを含む。このエフェクター機能は、誘導性ＩｇＥ産生を抑制するこのような定常ドメインを含有する抗体の能力により表出される。
【００３２】
γ３定常ドメイン：
抗体に特異的エフェクター活性を付与する特定の型の定常ドメイン配列。本出願では、γ３定常ドメインは、抗ＣＤ２３可変ドメイン配列または抗原結合部分と組合わさせてγ３エフェクター機能を保持する、ヒトγ３定常ドメイン、断片またはその修飾体を指す。修飾体は、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換または付加を含むヒトγ３定常ドメインを含む。このエフェクター機能は、誘導性ＩｇＥ産生を抑制するこのような定常ドメインを含有する抗体の能力により表出される。
【００３３】
ＣＤ２３：
これは、ＩｇＥに対する低親和性受容体ＦｃｅＲＩＩ／ＣＤ２３を指す。
【００３４】
抗ＣＤ２３抗体：
ＣＤ２３、好ましくはヒトＣＤ２３と特異的に結合する抗体。
【００３５】
発明の詳細な説明
前記のように、多くのグループが抗ＣＤ２３抗体の産生、ならびにＩｇＥ産生を調節するための拮抗薬および作動薬としてのその使用をこれまでに報告しているが、しかしＩＬ−４がＩｇＥ産生を誘導する系においてこのような抗体がＩｇＥ発現を調節する正確なメカニズムは依然として明らかでない。したがって、このような抗体がＩｇＥ発現を調節する手段が明らかにされるか、あるいは少なくともより良好に説明されるとすれば、このような情報は、ＩｇＥ産生の調節が治療的に望まれる疾患の治療のための治療薬を設計するのに有用である可能性があるので、有益であろう。特に、誘導性ＩｇＥ産生を抑制する能力の改良されたＣＤ２３に特異的な改良型抗体が得られるとすれば、ＩｇＥレベルの増大は多数の疾患過程、例えばアレルギー性症状、炎症症状および自己免疫性疾患に関与すると考えられるので、有益であろう。このような疾患としては、例えばアトピー性皮膚炎、湿疹、アレルギー性鼻炎および結膜炎、ジョブ症候群、ならびに喘息が挙げられる。
【００３６】
これに関して、本発明者らは、ヒトγ１定常ドメインを含有する抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体が、他のエフェクター型、例えばヒトγ４定常ドメインを含むもの、あるいはエフェクター機能を全く欠いたＣＤ２３モノクローナル抗体または抗体断片より有意に良好に、ＩＬ−４によりＩｇＥ産生が誘導される系においてＩｇＥ産生を抑制する、ということを意外にも発見した。ヒトγ３定常ドメインはヒトγ１と同一のエフェクター機能を媒介することが示されているため、ヒトγ３定常ドメインを含有する抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体も含まれる。
【００３７】
ＩｇＧ（γ）クラスの抗体に関しては、一般に５つの明確にされたエフェクター機能が存在する。これらの機能のうちの２つ、即ち補体活性化およびＦｃγＲＮ相互作用は本発明に記載したin vitroアッセイでは見出されず、したがって、分子メカニズムに関与しないと思われる。ＩｇＧクラスの抗体と相互作用する他の３つのＦｃγＲ受容体が同定された。すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ（これらには少なくとも６つの異なるタンパク質が存在する）およびＦｃγＲＩＩＩ（これには少なくとも２つの異なるタンパク質が存在する）である。これら３つの受容体はすべて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３と相互作用する。
【００３８】
ＦｃγＲＩは、３つのうち唯一、ＩｇＧに対する明らかな親和性を有する。それは単量体γ１およびγ３の両方と結合し、Ｋａは約５×１０8Ｍ-1である。しかしながら、ヒトγ４に対するその親和性は約１０分の１であり、それはヒトγ２とは全く結合しない（Fries et al., 1982, J. Immunol. 129:1041-1049; Kurlander and Batker, 1982, J. Clin. Invest. 69:1-8; Woof, 1984, G. Mol. Immunol. 21:523-527;そしてBurton and Woof,
1992, Human Antibody Effector Function, Adv. Immunol. 51:1-84も参照）。
【００３９】
ヒトＩｇＧに対するヒトＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩの親和性は一般に非常に低い（Ｋa＜１０7Ｍ-1）が、しかしヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３に対する親和性は、それらが抗原に結合した場合に、有意に増大する（Ｋa＝約２〜５×１０7Ｍ-1）（Karas et
al., 1982, Blood 60:1277-1282）。抗原と結合したヒトＩｇＧ２に対するヒトＦｃγＲＩＩの親和性は、相反する結果を生じた。ヒトＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＩｇＧ２と結合しない。ヒトＦｃγＲＩＩおよびヒトＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＩｇＧ４と結合しない（Van de Winkel and Anderson, 1991, J. Leuk. Biol. 49:511-524; Huizinga et al., 1989, J. Immunol. 142:2359-2364）。
【００４０】
Ｆｃ介在性エフェクター機能は抗体の治療活性にとって時として重要である一方、抗ＣＤ２３抗体のＩｇＥ抑制活性におけるエフェクター機能の役割が従来報告されていなかったために、この発見は抗ＣＤ２３抗体の場合には意外であった。実際、過去の証拠は、誘導性ＩｇＥ産生を抑制する抗ＣＤ２３抗体の能力に対して抗体エフェクター機能は重要でない、ということを示唆していた。例えば、Flores-Romoら（Science, 261:1038-1041（1993））は、ポリクローナル抗ＣＤ２３抗体から調製されたＦａｂはin vivoでの誘導性ＩｇＥ抗原特異的応答を抑制する、と報告した。
【００４１】
抗ＣＤ２３抗体の定常領域を介して媒介されるエフェクター機能が明らかに関与するという発見は、本発明者らが、抗ＩｇＥ抑制活性を有するＣＤ２３に特異的な種々の霊長類抗体を単離し、in vitroおよびin vivoでのＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生を抑制するそれらの能力に関して、これらの抗体をＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)バージョンと比較した後になされた。ヒトγ４定常領域を用いて構築された抗体はin vitroでのＩｇＥ抗原特異的応答を抑制しなかったが、一方、ヒトγ１定常領域を含有する抗体は良く抑制した。
【００４２】
３つの種類のＦｃγＲ受容体、即ちＦｃγＲＩ、 ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ（以上）はγ１ドメインにより媒介される特異的エフェクター機能に関与すると考えられるため、そしてこれらの種類の受容体はγ３ドメインを含有する抗体とも結合するために、γ３ドメインを含有する抗ＣＤ２３抗体もin vitroでＩｇＥ抗原特異的応答を良く抑制する、ということは論理的である。
【００４３】
特に、そして以下にさらに詳細に記載するように、細胞性および可溶性ＣＤ２３の両方と特異的に結合した５種類の霊長類モノクローナル抗体が、同一譲受人の出願第０８／３７９，０７２号（米国特許第5,658,570号）（この記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）に開示された方法により、旧世界サル（マカーク）から単離された。この出願は、旧世界サルにおいて、所望の抗原、即ち望ましいヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するための手段、そして治療薬としての他の種の抗体に関連したそれらの利点、例えば、ヒトと旧世界サルの系統発生的近縁性による、ヒトにおける免疫原性の低減または潜在的欠如を詳細に記載した。実際、これらの種の系統発生的近縁性のために、旧世界サルの免疫グロブリンとヒトの免疫グロブリンを配列の比較から区別することは困難である。
【００４４】
これら５つの霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体のうち４つは、以下に詳述されるin vitroでのＢ細胞アッセイにおけるＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生を抑制することができることが実証され、最も効力のあるものはＳＣＩＤマウス動物モデルにおける（これも以下に詳述）ＩＬ−４誘導性ＩｇＥを抑制することも示された。このＩｇＥ抑制活性、そして予想されるヒトでの低免疫原性に基づいて、このような抗体はＩｇＥ産生の抑制が治療的に望まれる疾患の治療のための治療薬として適している可能性がある。
【００４５】
しかし、さらに免疫原性を低下させるために、米国特許出願第０８／３７９，０７２号（米国特許第5,658,570号）（参照により本明細書中に含まれる）にも記載される方法に
よる２つの霊長類モノクローナル抗体（抗体のキメラ化のタイプ）のＰＲＩＭＡＴＩＺＥ(登録商標)（霊長類化）が選ばれた。ＰＲＩＭＡＴＩＺＡＴＩＯＮ(登録商標)（霊長類化）は、霊長類可変領域およびヒト定常領域を含む、IDEC Pharmaceuticals Corporationにより開発された、組換え抗体の産生を基本的に指す。強いＩｇＥ抑制活性を有する二つの霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体（５Ｅ８及び６Ｇ５）のＰＲＩＭＡＴＩＺＡＴＩＯＮ(登録商標)は、ヒトにおける霊長類定常ドメインによるあらゆる可能な免疫原性を排除するために行われる。
【００４６】
また、Ｆｃエフェクター機能は誘導性ＩｇＥ抑制には必要でないという発表済文献からの本発明者らの初期の予測のために、これらの特定の抗体のヒトγ４バージョンが、初期に産生された。しかしながら、全く意外なことに、これらの霊長類モノクローナル抗体の両方から産生されるγ４バージョンは有効でない、即ちそれらは、in vitroでのアッセイにおいてＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生を抑制するためには霊長類抗体より有意に高い濃度のＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)γ４抗体を必要とする、ということが判明した。
【００４７】
さらに、同じ２つの霊長類抗体がその後（霊長類定常ドメインをヒトγ１定常ドメインで置換することにより）ヒトγ１バージョンに変換された場合、これらのγ１抗体はin vitroでの誘導性ＩｇＥ産生を非常に有効に抑制した、という発見はさらに意外であった。したがって、我々の結果は、Ｆｃエフェクター機能が、誘導性ＩｇＥ産生を抑制する抗ヒトＣＤ２３抗体の能力に明らかに重要である、ということを示唆した。この仮説は、in vitroでＩｇＥ産生を抑制することが本発明者らにより示された第３の霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル、即ち２Ｃ８抗体がＦ（ａｂ’）2に変換されたとき、in vitroで誘導性ＩｇＥ産生を実質的に抑制できないことが判明したことによって確認された。実際、このＦ（ａｂ’）2は、霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体２Ｃ８の誘導性ＩｇＥ阻止活性における抑制効果と拮抗することが判明した。
【００４８】
さらに、抗体の１つ（５Ｅ８）のＨ鎖可変領域のグリコシル化部位の欠失は、抗体のＣＤ２３との結合に（得られたＫｄ値により立証される）、または誘導性ＩｇＥ抑制に全く影響を及ぼさない、ということが判明した。したがって、ＩｇＥ抑制の差は、明らかにグリコシル化の相違に関係しないことが示された。
【００４９】
霊長類６Ｇ５のＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)γ１バージョンはＳＣＩＤマウスにおける誘導性ＩｇＥ発現を抑制する一方、同一濃度の霊長類６Ｇ５またはＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)ｐ６Ｇ５Ｇ４ｐは誘導性ＩｇＥ発現を抑制しない、ということが判明した。したがって、ヒトγ１定常ドメインを含有する抗体は、霊長類モノクローナル抗体よりもin vivoの動物モデルにおいてより有効でさえあることが判明した。さらに、γ１およびγ３定常ドメインは同一クラスのＦｃ受容体に対する親和性を有するため、ヒトγ３定常ドメインを含有する抗ＣＤ２３抗体はγ１定常ドメインを有するものと全く同様に有効であると、本発明者らは予測する。
【００５０】
したがって、これらの結果に基づいて、活性Ｆｃ領域、特にヒトγ１またはヒトγ３の活性Ｆｃ領域は、抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体によるＩＬ−４誘導性ＩｇＥ抑制のメカニズムに有意に関与する、ということが意外にも発見された。この発見は、特に、ポリクローナル抗ＣＤ２３抗体由来のＦａｂが誘導性ＩｇＥ産生を抑制し得るという初期の報告に基づいて、そしてＣＤ２３が誘導性ＩｇＥ発現に影響を及ぼす方法に関する種々の説に基づいては全く予期されない。
【００５１】
したがって、本発明はヒトγ１またはγ３定常ドメインを含有する抗ヒトＣＤ２３抗体に関し、そしてＩｇＥ発現を有効に抑制するそれらの能力に基づく治療薬としてのそれらの使用に関する。
【００５２】
当業者は、キメラ抗体の製造に関して当技術分野で周知の方法により、ヒトγ１またはγ３定常ドメインのいずれかを含有する抗ヒトＣＤ２３抗体を調製し得る。本質的には、このような方法は、所望の宿主中でまたはin vitroで抗ヒトＣＤ２３抗体を産生し、望ましい特徴、例えば適切なＣＤ２３結合親和性を示す抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株をクローニングし、例えば、適切なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記ハイブリドーマまたは細胞株からこのような抗体をコードする核酸配列をクローニングし、そこに含まれる可変ドメインを単離し、このような可変ドメインをヒトγ１またはγ３定常ドメインおよび適切なヒトＬ鎖定常ドメインと組換え、そしてその結果生じるキメラ抗ヒトＣＤ２３γ１またはγ３免疫グロブリンをコードする核酸配列を適切な発現系で発現させる工程から成る。好ましくは、本発明の抗ヒトＣＤ２３抗体は、０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の、さらに好ましくは少なくとも５０ｎＭ、最も好ましくは少なくとも５ｎＭの見かけのＣＤ２３結合親和性を有する。
【００５３】
組換え免疫グロブリンの発現に適した宿主細胞は、当技術分野では周知である。例えば、組換え抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＤＧ４４またはＤＵＸＢ１１；あるいはＣＨＯ細胞ＣＨＯ  Ｋ−１；マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０またはＸ６３−Ａｇ８．６５３またはＮＳＯ；ラット骨髄腫細胞ＹＢ２／０；ハムスター乳仔腎細胞ＢＨＫ；ヒト胚腎臓株２９３；サル腎細胞ＣＶ１；ヒト肺繊維芽細胞ＷＩ３８；ヒト頸部癌細胞ＨＥＬＡ；昆虫細胞、植物細胞、酵母菌または細菌中で発現され得る。さらに、免疫グロブリンの発現に適したベクターも当技術分野では周知であり、市販されている。
【００５４】
特に好ましいベクター系は、米国特許出願第０８／１４７，６９６号（米国特許第5,648,267号）に開示された翻訳的損傷ベクター系で、これは、所望の異種ＤＮＡが挿入されるイントロンを含有する翻訳的に損傷された主要な選択可能マーカー（ｎｅｏ）を含む。このベクター系は、非常に高収率の組換えタンパク質、例えば免疫グロブリンを提供することが判明している。しかしながら、目的の抗ＣＤ２３抗体は、機能性免疫グロブリンの発現に適したあらゆるベクター系で産生され得る。
【００５５】
本発明は、ヒトＣＤ２３に特異的なγ１またはγ３型のヒトモノクローナル抗体も含む。ヒトモノクローナル抗体の単離方法も当技術分野では周知であって、その例としては、in vitroによる方法、例えば組織培養でのヒトＢ細胞のin vitro免疫感作、そしてin vivoによる方法、例えばＳＣＩＤマウスにおけるヒトモノクローナル抗体の合成が挙げられる。その後ＳＣＩＤマウス中に導入されるヒト脾臓細胞のin vitroの初回免疫を組合せるＳＣＩＤマウス中でヒトモノクローナル抗体を産生する好ましい手段は、米国特許出願第０８／４８８，３７６号（米国特許第5,811,524号）（この記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）に開示されている。この方法は、所望の抗原、例えばヒト抗原に対して高親和性を有するモノクローナル抗体の再現性のある回収を提供するので、有利である。
【００５６】
本発明は、ＣＤ２３との結合に関して霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体５Ｅ８および６Ｇ５と競合するヒトモノクローナル抗体も含む。
【実施例】
【００５７】
実施例１
霊長類抗ＣＤ２３抗体の産生
ＣＤ２３に特異的な５つの霊長類モノクローナル抗体を、実質的に米国出願第０８／３７９，０７２号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示された方法によって、マカーク(macaque)から単離した。用いた正確な技法を、以下に詳細に説明する。
【００５８】
抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体の単離および特性評価のための方法
８８６６細胞からの免疫原ｓＣＤ２３の精製
精製中、捕捉体としてマウス抗ＣＤ２３抗体（Binding  Site; カタログ番号ＭＣ１１２）を用いた３段階ＥＬＩＳＡにより、可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）を定量した。３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（JRH Biosciences）および４ｍＭグルタミン（JRH Biosciences；カタログ番号９０１１４）を補足したＲＰＭＩ  １６４０（JRH Biosciences；カタログ番号５６−５０９）を用いて、懸濁液バイオリアクター中に維持された８８６６細胞の培養物から、抗原を部分精製した。二酸化炭素を用いて、ｐＨを７．１に保持した。０．４５μｍ濾過による細胞の除去後、フェニルメチルスルホニルフルオリド（最終濃度０．２ｍＭ、Sigma Chemical Co.; カタログ番号Ｐ−７６２６）およびエチレンジアミン四酢酸（最終濃度３ｍＭ、Sigma Chemical Co.；カタログ番号ＥＤＳ）を上清に加え、溶液を２〜８℃で保存した。周囲温度で、中空繊維限外濾過カートリッジ（A/T Technology; 
カタログ番号ＵＦＰ−１０−Ｃ−９Ａ；１０，０００ｄ  ＭＷＣＯ）または接線流動限外濾過カートリッジ（Filtron Corporation; １０，０００ｄ  ＭＷＣＯ ）を用いて、細胞除去上清を、約１５〜２０倍に濃縮した。濃縮上清を濾過滅菌し、−７０℃で保存した。解凍した濃縮物を、５ｇ／ＬでSM-2 BioBeads（BioRad Industries; カタログ番号１５２−３９２０）を添加し、２〜８℃で一夜攪拌することにより、脱脂質化した。濾過により樹脂を除去し、溶液を２〜８℃で保存した。ｓＣＤ２３のいくつかの調製物に関しては、脱脂質化の前又は後に、硫酸アンモニウム（３５〜７０％（ｗ／ｖ）；Fisher;カタログ番号Ａ７０２−３）を用いて濃縮物を分画した。
【００５９】
２〜８℃でアフィニティークロマトグラフィーを用いて、脱脂質化溶液をその後精製した。ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Sigma Chemical Co.; カタログ番号Ｃ−９１４２）を用いて、マウス抗ＣＤ２３モノクローナル抗体（ＢＵ３８）をセファロースに共有結合させることにより、アフィニティーマトリックスを調製した。プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、腹水から、＞９０％の均質性にＢＵ３８抗体（Binding Site;カタログ番号ＣＵＳ８３０）を精製した。脱脂質化溶液を、１×ＰＢＳ（Gibco BRL;カタログ番号７００１３−０．３２），ｐＨ７．２で平衡化したアフィニティーカラム（１．５×５ｃｍ）にアプライし、カラムを、０．０５％ＮＰ４０（Sigma Chemical Co.）を含有する１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２で洗浄して、非結合タンパク質を除去した。３．５Ｍ  ＭｇＣｌ2（Fisher;カタログ番号Ｍ３３−５００）を用いて可溶性ＣＤ２３を溶出した。ｓＣＤ２３を含有する画分を併合し、２〜８℃で、１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２に対して透析した（Baxter Spectra/Por;カタログ番号Ｄ１６１５−１）。透析後、タンパク質溶液をCentriprep 10スピンフィルター（Amicon Corporation; ＭＷＣＯ１０，０００ｄ）を用いて遠心分離により濃縮し、調製物を−７０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％プレキャストゲル、Novex Corporation）およびクーマシー染色を用いて、ｓＣＤ２３の純度を＞７０％と評価した。
【００６０】
霊長類の免疫感作および免疫細胞の単離
カニクイザル（White Sands Research Center, Alamogordo, New Mexico）を、ヒトＲＰＭＩ  ８８６６細胞（Ｂ細胞リンパ腫、Hassner and Saxon, J. Immunol., 132:2844（1984））の上清から精製された可溶性ＣＤ２３で免疫感作した。各々のサルを、三週目毎に、１６７μｌのテムリタイド(Temuritide)（アジュバントペプチド）（Sigma, St. Louis, MO、カタログ番号Ａ−９５１９）および３３３μｌの３×  ＰＲＯＶＡＸ(登録商標)（IDEC Pharmaceuticals Corporation）と混合した５００μｌのＰＢＳ中の２００μｇの可溶性ＣＤ２３で免疫感作した。免疫感作は、皮内、腹腔内、筋肉内および皮下的に実行した。サルの血清中の抗ＣＤ２３抗体の力価を８８６６細胞に関してＥＬＩＳＡにより測定し、同一サルからの予備採血と比較した。
【００６１】
５０，０００の血清力価を有するサルＰＲＯ９７８を屠殺し、脾臓およびリンパ節を外科的に切除して、氷詰めにしてIDEC Pharmaceuticalsに運搬し、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足した滅菌ＲＰＭＩ−１６４０（Gibco BRL, Gaithersburg, MD、カタログ番号２１８７０−０５０）中に沈めた。到着後すぐに、ガラス乳棒により金属メッシュを通して脾臓をつぶしてホモジナイズした。赤血球は、塩化アンモニウムベースの低張緩衝液中で溶解させ、残ったリンパ球を収集して、ＲＰＭＩ−１６４０中で少なくとも３回洗浄した。リンパ節は、同様にホモジナイズして単一細胞懸濁液とし、収集して、 ＲＰＭＩ−１６４０中で少なくとも３回洗浄した。
【００６２】
ハイブリドーマの作製
最終洗浄後、細胞を計数し、前記で得られた霊長類細胞を、標準的技法（Boerner et al., J. Immunol., 147:86（1991））を用いて、マウス−ヒトヘテロハイブリドーマ細胞株Ｈ６Ｋ６／Ｂ５（Carroll et al., J. Immunol. Methods, 89:61（1986））に体細胞融合させ、ウエル当たり細胞３００，０００個の割合で、９６ウエル皿（脾臓：１７５皿または１４，７００ウエル。リンパ節：１７皿または１３８６ウエル）中にプレーティングした。
【００６３】
この手法は、リンパ球と前記の融合パートナーとの２：１の割合で混合し、細胞を５０％ＰＥＧ１５００（Sigma，カタログ番号Ｐ５４０２）中に１分間、徐々に再懸濁させることを含む。これらの細胞を次に１分間静置した後、さらに、過剰量のＲＰＭＩ−１６４０中に徐々に再懸濁させた。その後、再び細胞を１５分間静置した後、２５０×ｇで軽く遠心した。次に細胞を、２０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足した、１００μＭヒポキサンチン、１６μＭチミジン（BoehringerMannheim, Germany、番号６２３０９１）および５．８μＭのアザセリンAzaserine（Sigma、カタログ番号Ａ１１６４）（ＨＴＡ）を含有するＲＭＰＩ−１６４０増殖培地中に再懸濁した。ＨＴＡは、融合された細胞（ヘテロハイブリドーマ融合パートナーと融合した霊長類リンパ球）を残存させる選択剤である。
【００６４】
約６５％のウエルが増殖を示した（１０，５００ウエル）。次に、３段階細胞ＥＬＩＳＡにより、抗ヒトＣＤ２３抗体の存在に関して、これらのウエルをスクリーニングした。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡの第一段階は、ウエル当たり１０５の８８６６細胞（ＣＤ２３陽性細胞株）で予めコーティングされた９６ウエルプレートの各ウエルへ５０μｌの上清を移すことを含んでいた。これらのプレートは、先ず、２０μｇ／ｍｌのポリＬ−リジン（Sigmaカタログ番号Ｐ１３９９、分子量１５０，０００〜３００，０００）を含有する水性溶液５０μｌで、室温で３０分間、プレートをコーティングすることにより作製された。残りの溶液を除去し（「振り落とし」）、プレートを放置して乾燥させた。乾燥したら、ＰＢＳ中の８８６６細胞５０μｌを移して、６００ｇで５分間回転させた。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％グルタルアルデヒド（Sigmaカタログ番号Ｇ６２５７）５０μｌを１５分間添加することにより、８８６６細胞をプレートに共有結合させた。グルタルアルデヒドを除去し（振り落とし）、プレートを０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の１００ｍＭのグリシン（Sigmaカタログ番号Ｇ−２８７９）１５０μｌでブロッキングした。上清添加後、プレートを３７℃で１〜２時間インキュベートし、水道水で７〜９回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に結合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Southern Biotech, Birmingham, Alabama、カタログ番号２０４０−０５）を、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma,カタログ番号Ｐ１３７９）中の１％ドライスキムミルク（Vons）中で１：２０００に希釈した希釈液を添加した。プレートを３７℃で４５分間イン
キュベートし、再び水道水で７〜９回洗浄した。ＨＲＰＯの存在は、１００μｌ／ウエルのＴＭＢ試薬（Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD、カタログ番号５０−７６−０２および５０−６５−０２）の添加後の発色により検出された。２５μｌの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4を添加することにより、反応を停止させた。分光光度計（Titertek Multiscan）で４７０ｎｍで、光学密度（ＯＤ）を測定した。バックグラウンドの２倍より大きいＯＤ値を陽性と評価した。
【００６６】
ＥＬＩＳＡの第二段階は、第一ＥＬＩＳＡで陽性と評価された上清がＣＤ２３と反応し、いくつかの無関係な抗原とは反応しないということを確認するために、実行された。これは、同一ＥＬＩＳＡ手法を用いて、ＣＤ２３陰性ヒト細胞株であるＳｕｐＴ１細胞（ERC BioServices Corporation, Rockville, MD、カタログ番号１００）に関して上清を試験することにより実行された。両試験で同様に評価された上清は、廃棄した。これらの結果により、増殖を伴う１０，５００ウエルのうちの５６が、異なる時点での２つの別々のスクリーニングにおいて８８６６細胞と結合するがＳｕｐＴ１細胞とは結合しない霊長類モノクローナル抗体の存在を示したということが示された。
【００６７】
最初の２つのＥＬＩＳＡ段階により特定された上清が可溶性ＣＤ２３と反応するか否かを確定するために、ＥＬＩＳＡの第三工程を実行した。この第三ＥＬＩＳＡでは、９６ウエルプレートを、５０ｍＭ重炭酸緩衝液、ｐＨ９．３中、２μｇ／ｍｌの、可溶性ＣＤ２３と結合するが、ＣＤ２３−ＩｇＥ結合を抑制しないマウスモノクローナル抗体であるＢＧ−６（Biosource International, Camarillo, CA、カタログ番号ＣＴ−ＣＤ２３−ＣＦ）で、４℃で一夜コーティングした。コーティング緩衝液を除去後、ＰＢＳ中に所定希釈度にした半精製可溶性ＣＤ２３の５０μｌをプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを水道水で７〜９回洗浄後、選択されたウエルからの上清５０μｌを添加した。プレートを水道水で７〜９回洗浄後、５０μｌの、ウサギ抗ヒトＩｇＧ（マウス吸着）−ＨＲＰＯ（Southern Biotech, カタログ番号６１４５−０５）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中の１％ドライスキムミルクで１：４０００に希釈した希釈液を添加し、３７℃で２時間インキュベートして、水道水で７〜９回洗浄し、前記のようにＴＭＢで発色させた。バックグラウンドの２倍より大きいＯＤ値を有するウエルをここでも陽性と評価した。
【００６８】
８８６６細胞との結合を示した５６ウエルのうちの２１が、ＥＬＩＳＡにおいてｓＣＤ２３とも結合した。これらのウエルを、１細胞／３ウエルの割合で細胞をプレートすることにより、少なくとも２倍に拡大し、サブクローニングした。約３ヶ月後、ＣＤ２３に対する霊長類モノクローナル抗体を産生する５つの安定したハイブリドーマを得た。
【００６９】
プロテインＡ法による抗体精製
本質的に、抗体は、細胞および細胞片を除去するために培養上清を遠心分離することにより、精製される。その結果生じる遠心分離した試料を、次に、０．２μｍフィルターを通して濾過する。その後、プロテインＡセファロースファストフローカラムを準備し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化させた。次に、上清を適切な流速（２ｍｌ／分）でカラムに負荷する。負荷後、洗浄カラムを１０カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄する。次に１ｍｌ／分の流速で溶離緩衝液（０．２Ｍ酢酸、０．１Ｍグリシン，ｐＨ３．５）を用いて抗体をカラムから溶離する。次に、１００μｌのＴｒｉｓを含む試験管（２．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０）当たり分画１ｍｌを回収する。その後、２８０ｎｍで、分光光度計を読み取る。その結果得られる、２８０ｎｍで高吸光度を有し、抗体を含有する分画を次に回収し、ＰＢＳに対して一夜透析する。次に、生成物を０．２２μｍの膜を通して濾過することにより滅菌し、−２０℃で保存する。
【００７０】
これら５つの霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体（Ｂ３Ｂ１１、２Ｃ８、５Ｅ８
および６Ｇ５）のうちの４つは、ＩＬ４−ヒドロコルチゾン誘導性末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）培養によりＩｇＥ産生を測定するin vitroアッセイにおけるＩｇＥ産生を抑制することが実証された。これらの結果を、図１に示す。アッセイ条件は以下に示す。５番目の霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体３Ｇ１２は、本アッセイでは不活性であった。
【００７１】
末梢血単核球細胞によるＩＬ−４刺激性ＩｇＥ産生
前記のように、目的の霊長類抗体およびそのＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)（霊長類化）形態を、ＩＬ−４で刺激された末梢血単核球細胞によるＩｇＥ産生に及ぼすこのような抗体の効果を測定するin vitroアッセイにおいてＩｇＥ産生を抑制する能力に関して評価した。
【００７２】
in vitroでのＩＬ−４  ＩｇＥアッセイのための材料
４８ウエル平底クラスタープレート（Costarカタログ番号３５４８）（１．５百万ＰＢＭＣ／ｍｌ／ウエル（４８ウエルプレート））
ヒト組換えＩＬ−４（Genzymeカタログ番号２１８１−０１；１０μｇ（２．５×１０7）ユニット）
抗ＣＤ２３Ｍａｂ：
マウスＭａｂ（ＭＨＭ６；DAKO.  カタログ番号Ｍ７６３）
霊長類Ｍａｂ（防腐剤非含有）
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)（防腐剤非含有）
ＨＢ１０１基礎培地：（Irvine Scientificカタログ番号Ｔ０００）
ＨＢ１０１サプリメント：（Irvine Scientificカタログ番号Ｔ１５１）
ウシ胎仔血清：（ＦＢＳ；Bio-Whittakerカタログ番号１４−５０１Ｆ）
ジメチルスルホキシド：（ＤＭＳＯ；Fisher Scientificカタログ番号Ｄ１２８−５００）
ヒドロコルチゾン：（Sigmaカタログ番号Ｈ−０８８８）
ピューロマイシン：（Sigmaカタログ番号Ｐ−７２５５）
シクロヘキサミド：（Sigmaカタログ番号Ｃ−７６９８）
ヒストパク(Histopaque)（登録商標）（Sigmaカタログ番号Ｈ−８８８９）
ハンクス緩衝化食塩溶液：（ＨＢＳＳ； Irvine Scientificカタログ番号９２３２）
１％ＦＢＳ添加ＨＢＳＳ
濃縮ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（１０×ＤＰＢＳ；Bio-Whittaker、 カタログ番号１７−５１７Ｑ）
バスクリア殺菌剤（Fisher、カタログ番号１３−６４１−３３４）添加ＤＰＢＳ
溶液：
ピューロマイシン溶液：ＨＢ１０１増殖培地中に４０μｇ／ｍｌ
シクロヘキサミド溶液：ＨＢ１０１増殖培地中に２００μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン溶液：ＤＭＳＯで０．１Ｍ溶液とした。
抗ＣＤ２３マウスＭａｂを十分に透析して、防腐剤を除去した。
ＨＢ１０１増殖培地
ＨＢ１０１基礎培地                                        ５００ｍｌ
１０ｍｌ濾過滅菌蒸留水に溶解したＨＢ１０１サプリメント        ５ｍｌ
ＦＢＳ                                                      １０ｍｌ
ヒドロコルチゾン溶液（最終濃度５μＭ）                  ０．２５ｍｌ
【００７３】
in vitroアッセイ手法
バフィーコート細胞１：４を室温でＨＢＳＳを用いて希釈する。これらの細胞は、全血から、血漿成分、凝固血小板およびフィブリン、ならびにバフィーコート細胞を分割し、分離するために、室温で一夜インキュベーション後に、得られる。
【００７４】
次に、３０μｌの希釈バフィーコートを、５０ｍｌ円錐試験管中の１５μｌのヒストパク上に載せる。これらの試験管を、次に、ブレーキをかけずに、室温において１７００ｒｐｍで２０分間、遠心分離する（ＩＥＣ２１６スウィングバケットローター）。次に、滅菌ピペットを用いて、他の層を乱さないように注意しながら、白色ＰＢＭＣ層を回収する。ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）は、部分的に、ヒストパクHISTOPAQUE(登録商標)密度勾配による遠心分離によって沈降され、はっきり見える白色細胞層を形成するバフィーコート細胞である。これらの細胞をピペットで回収し、ＨＢＳＳで洗浄し、次に血球計を用いて計数する。典型的には、３００〜６００×１０6ＰＢＭＣが、単一の４５０ｍｌバフィーコートパッケージから回収され得る。
【００７５】
次に回収したＰＢＭＣを１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳ中で３回洗浄する。洗浄した細胞を、７℃において１３００ｒｐｍで７分間の遠心分離により回収する。
【００７６】
回収された細胞の数を、次に、血球計を用いて決定する。細胞濃度を、ＨＢ１０１増殖培地１ｍｌ当たり約３百万の細胞に調整する。
【００７７】
約１．５百万の細胞（０．５ｍｌ）を次に４８ウエルプレートの各ウエルに添加する。概して、各実験に関しては、５つの並行試験試料を調製する。各プレートの辺部のウエルは、細胞試料には用いられない。したがって、これらのウエルには、例えば０．５ｍｌの０．０５％バスクリア／ＤＰＢＳが充填される。
【００７８】
所望量のＩＬ−４およびＭａｂを含有するＨＢ１０１増殖培地０．５ｍｌを、次にウエルに添加する。用いられるＩＬ−４は、組換えＤＮＡ由来ヒトインターロイキン４である。アッセイに用いられるＭａｂは、マウス、霊長類またはＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体である。典型的には、ＩＬ−４は１００Ｕ／ｍｌの最終濃度で添加され、そしてＭａｂは０．０１〜３μｇ／ｍｌの最終濃度で付加される。
次に、５％ＣＯ2に設定された高湿度インキュベーター中で３７℃で９〜１１日間、細胞をインキュベートする。インキュベーション後、上清流体を回収し、ＩｇＥ含量を測定する。
【００７９】
ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ
以下にＩｇＥ  ＥＬＩＳＡで用いた物質および溶液を列挙する。
ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡに必要な物質および溶液
硫酸、４Ｍ
コーティング緩衝液：  １０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６
濃縮リン酸緩衝化生理食塩水（１０×ＰＢＳ）ストック溶液：
ＮａＨ2ＰＯ4                                    ２６．６ｇｍ
Ｎａ2ＨＰＯ4                                      ２８９ｇｍ
ＮａＣｌ                                        １０６４ｇｍ
蒸留水                                            １０  Ｌ
ブロッキング緩衝液：  １０％ＦＢＳ／ＰＢＳ
希釈緩衝液：  １％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
洗浄緩衝液：  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
ヤギ抗ヒトＩｇＥ（ε鎖特異的）、非標識化：（Tagoカタログ番号４１０４）
ヒトＩｇＥ標準：（The Binding Site  カタログ番号ＢＰ０９４）
ヤギ抗ヒトＩｇＥ、ＨＲＰ−標識化：（Tagoカタログ番号ＡＨＩ０５０４）
ＴＭＢペルオキシダーゼ基質：（KPLカタログ番号５０−７６−０２）
ペルオキシダーゼ溶液Ｂ：（KPLカタログ番号５０−６５−０２）
作用基質溶液：１：１の割合で基質および溶液Ｂを混合
イムロン(Immulon)ＩＩマイクロタイタープレート（Dynatech Labsカタログ番号０１１−０１０−３４５５）
【００８０】
ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ手法
マイクロタイタープレートの各ウエルを、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＥを含有するコーティング緩衝液１００μｌを用いてコーティングする。
次にコーティングプレートを４℃で一夜、インキュベートする。
インキュベーション後、プレート中の各ウエルをＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ  ２００μｌで３回洗浄する。洗浄後、非特異的結合部位をブロッキング緩衝液２００μｌ／ウエルで３７℃で１時間ブロッキングする。
次に１００μｌの試料または標準を各ウエルに添加し、次にウエルを４℃で一夜インキュベートする。インキュベーション後、希釈して、または希釈せずに、試料を試験する。０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲のＩｇＥのいくつかの希釈液を用いて、各プレートについての標準濃度曲線を作成する。
一夜インキュベーション後、各プレートをＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄する。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化ヤギ抗ヒトＩｇＥを希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した希釈液１００μｌを、ドレインしたウエルの各々に添加する。次に、プレートを３７℃で４時間インキュベートする。
プレートを次にＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回、水で３回洗浄する。
次に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン作用基質溶液１００μｌを各ウエルに添加する。その後、室温において暗所で２５分間、プレートをインキュベートする。インキュベーション後、４Ｍ硫酸５０μｌを添加することにより、進行中の反応を停止させる。
次に４５０および５４０ｎｍで同時に吸光度を読み取る。５４０ｎｍ吸光度値は、バックグラウンドとして差し引かれる。
【００８１】
霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体のＫｄ測定値に関するアッセイ
スキャッチャード分析手法
【００８２】
１．放射能標識法
２ビーズ当たり緩衝液１ｍＬを用いて、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳを１００ｍＮリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で２回洗浄する。次にビーズを濾紙上で乾燥させる。
次に２つのビーズを、約１ｍＣｉのＩを含有する125Ｉ溶液１００μｌに添加し、２００μｌのリン酸緩衝液で希釈して、室温で５分間放置する。
抗体（５０μｇ）を、プレロードしたビーズに添加する。放射能の最大取込みの反応時間は、６分である。
反応容器から放射能標識抗体を除去することにより、反応を停止させる。
次にゲル濾過を行い、放射能標識化抗体溶液から過剰の125Ｉまたは非取込み125Ｉを除去する。これは、１．５ｍＬのセファデックス−Ｇ２５、１．５ｍＬのＤＥＡＥセファデックス−Ａ２５および０．５ｍＬのアンバーライトからなるカラムに放射能標識化抗体を通すことにより行われる。放射能標識化抗体を、約１０μｇ／ｍＬの濃度で、総容量５ｍＬ中に溶離する（溶離緩衝液：１０％ゼラチン、２％アジ化ナトリウムおよび１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ）。
【００８３】
２．最適化アッセイ（直接結合試験）
１μｌの試料を採取し、ガンマカウンターに掛けて、１０μｇ／ｍＬ放射能標識化溶液の比活性を測定する。
【００８４】
例：
・ １×１０5ｃｐｍ／μｌ  ×  １０００μｌ／１０μｇ抗体
１×０5ｃｐｍ／μｇ抗体
１×０4ｃｐｍ／ｎｇ抗体
・ 抗体の分子量  ＝  ７５，０００ｎｇ／ｎｍｏｌｅ
・ 比活性：
１×０4ｃｐｍ／ｎｇ  ×  ７５，０００ｎｇ／ｎｍｏｌｅ
＝７．５×０8ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ
【００８５】
抗原をコートしたプレート（例えば、ｍＢ７．１−ＣＨＯを用いて、非特異的結合を排除するために）、及び、バックグラウンドプレート（即ち、非トランスフェクト化ＣＨＯ）を、２００μｌ／ウエルのブロッキング緩衝液（ブロッキング緩衝液：１０％ゼラチン、２％アジ化ナトリウム、１％ＢＳＡおよび１０％ＦＢＳを含有する１×ＰＢＳ）を用いて、室温で１時間ブロッキングする。
次にプレートを、典型的には水道水を用いて手で１０回、洗浄する。
１０μｇ／ｍＬの放射能標識化抗体（５０μｌ）を次に、マルチチャンネルピペットを用いてプレートを通して、２倍連続希釈により力価測定する。室温で１時間インキュベートする。
２００μｌ／ウエルの洗浄緩衝液（洗浄緩衝液：１０％ゼラチンおよび２％アジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ）を用いて約６〜７回、プレートを再び洗浄する。
次にウエルをガンマカウンターに掛けて、各ウエル中の放射能計数を測定する。
最適放射能標識化抗体濃度は、比計数とバックグラウンド計数との差が最大となる濃度である。
【００８６】
３． 競合アッセイのスキャッチャード分析
１０μｇ／ｍＬ放射能標識化溶液を、「直接結合実験」で確定された最適濃度に希釈する。
抗原をコートしたプレートおよびバックグラウンドプレートを、２００μｌ／ウエルのブロッキング緩衝液を用いて、室温で１時間、ブロッキングする。
次にプレートを、例えば水道水を用いて手で約１０回、洗浄する。
別々のＵ底マイクロタイタープレート中で、２倍希釈により、「コールド」（放射能標識なし）抗体を次に力価測定する。「コールド」抗体の出発濃度は、最適放射能標識化抗体濃度の少なくとも１００倍より高い必要がある。
【００８７】
例：
・ 最適放射能標識化濃度：  ０．５μｇ／ｍＬ
・ 「コールド」抗体濃度：  １００μｇ／ｍＬ（注：最初のウエルでの１：２タイターは、「コールド」抗体濃度を５０μｇ／ｍＬに調整する）。
【００８８】
５０μｌ／ウエルの最適放射能標識化抗体を次に、「コールド」抗体を含有するウエルに添加する。
次に、１００μｌ／ウエルの混合溶液を、抗原をコートしたプレートの対応するウエルに移し、室温で１時間インキュベートする。
また、以下の対照を実施するのも望ましい。
ａ）放射能標識化抗体の、抗原をコートしたプレートとの直接結合（５ウエル）、
ｂ）放射能標識化抗体のバックグラウンドプレートとの直接結合（５ウエル）。
【００８９】
インキュベーション後、プレートを、例えば約６〜７回、２００μｌ／ウエルの洗浄緩衝液を用いて洗浄する。
次に、ウエルをガンマカウンターに掛けて、各ウエル中の放射能を測定する。
抗原をコートしたプレートに結合した計数からバックグラウンド計数を差し引いて、各ウエル中の特異的計数を算出することにより、これらの計算が求められる。
【００９０】
４． スキャッチャード分析のための計算
結合抗体［Ｂ］のモル濃度は、以下のように求められる。
【００９１】
例：５０μｇ／ｍＬの「コールド抗体」
結合した特異的計数：  ４３８２ｃｐｍ
５０μｇ／ｍＬの「コールド」抗体の存在下で結合した計数：  ２１５ｃｐｍ
差：  ４３８２ｃｐｍ−２１５ｃｐｍ＝４１６７ｃｐｍ
比活性（放射能標識化抗体）：５．５４×ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ
４１６７ｃｐｍ÷５．５４×１０9ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ
＝７．５２×１０-7ｎｍｏｌｅ
７．５３×１０-7ｎｍｏｌｅ÷０．０５ｍＬ（試料容量）
＝１．５０×１０-5ｎｍｏｌｅ／ｍＬ
＝１．５０×１０-8μｍｏｌｅ／ｍＬ
［Ｂ］＝１．５０×１０-11ｍｏｌｅ／ｍＬ（Ｍ）
【００９２】
総モル濃度［Ｔ］は、以下のように求められる。
５０μｇ／ｍＬ×１μｍｏｌｅ／７５，０００μｇ
＝６．６７×１０-4μｍｏｌｅ／ｍＬ
＝６．６７×１０-7ｍｍｏｌｅ／ｍＬ（Ｍ）
［Ｔ］＝６６６６７×１０-11ｍｍｏｌｅ／ｍＬ（Ｍ）
遊離抗体［Ｆ］は、以下のようにして求められる。
遊離モル濃度  ＝  総計  −  結合
［Ｆ］        ＝  （６６６６７×１０-11）−（１．５０×１０-11）
＝  ６６６６５．５×１０-11  ｍｍｏｌｅ／ｍＬ（Ｍ）
Ｂ／Ｆを算出
Cricket GraphソフトウエアでＢ対Ｂ／Ｆをプロット
【００９３】
本発明の抗ヒトＣＤ２３抗体の活性および親和性
５つの単離霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体のうちの４つ（Ｂ３Ｂ１１、２Ｃ８、５Ｅ８および６Ｇ５）は、ＩＬ−４ヒドロコルチゾン誘導性末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）培養によりＩｇＥ産生を測定する前記のin vitroアッセイにおけるＩｇＥ産生を抑制することが判明した。これらの結果を、図１に示す。５番目の霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体３Ｇ１２は、このアッセイでは不活性であった。
【００９４】
このin vitroアッセイで活性であることがわかった４つの霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体のうちの２つ（Ｂ３Ｂ１１および２Ｃ８）は、市販のマウス抗ヒトＣＤ２３抗体ＭＨＭ６（CAKO A/S, Glostrup, Denmarkカタログ番号Ｍ７６３）と競合することが判明した（図２、上段パネル）。しかしながら、繰り返したアッセイでは、これらの抗体は、ＭＨＭ６ほど有効なＩｇＥ抑制剤ではなかった（データは示されていない）。対照的に、他の霊長類抗ＣＤ２３モノクローナル抗体（５Ｅ８および６Ｇ５）は互いに競合することが判明したが、ＭＨＭ６とは競合しなかった（図２、中および下段パネル）。さらに、霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体５Ｅ８は、in vitroアッセイにおけるＩＬ−４誘導性ＩｇＥの有効な抑制剤であることが判明した（図１および３参照）。
【００９５】
ヒトＩｇＥ合成のための改変Ｈｕ−ＳＣＩＤ−マウスモデルおよびin vivoでの抗ＣＤ２３抗体によるＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生の抑制の測定
in vivoでの誘導性ヒトＩｇＥ産生に及ぼす目的の抗体の作用を検出するために、改変ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウスモデルも開発された。２つのドナーから得られたＰＢＭＣをin vitroでＩＬ−４とともに２日間培養した。ＰＢＭＣをプールし、抗体を伴って、
または伴わずにＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウスの群を再構築するために用いた。マウスから１４、２１、２８および３５日目に採血し、血清ＩｇＧおよびＩｇＥレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。このin vivoモデルを用いて、ＩｇＥの産生を抑制する能力に関して、ＣＤ２３に対する霊長類抗体ならびにＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体の２つの異なるバージョンをアッセイした。
【００９６】
改変ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒト末梢血単核球細胞（ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤ）を用いて再構築された重症複合型免疫欠損ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウス  Ｃ．Ｂ．−１７（Bosma et al., Nature, 301:527（1983））が有意量のヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生し得る（Mosier et al., Nature, 335:256（1988）; Moiser et al., J. Clin. Immunol., 10:185（1990）; Abedi et al., J. Immunol., 22:823（1992）; およびMazingue et al., Eur. J. Immunol, 21:1763（1991））ということが既知であるために、用いられた。ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウスで産生されるヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）の優勢なアイソタイプは、ＩｇＧである。一般に、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥアイソタイプは、ＰＢＭＣが、ある種の自己免疫またはアレルギー性疾患症状を有するドナーから得られる場合を除いて、非常に低いレベルでまたは非検出可能レベルで見出される。ある種のサイトカインを用いてｈｕ−ＰＢＭＣ  ＳＣＩＤマウスモデルを操作すると、ＩｇＥを含めた非ＩｇＧアイソタイプの有意レベルの生成が提供される、ということも報告されている（Kilchherr et al., Cellular Immunology, 151:241（1993）;Spiegelberg et al., J. Clin. Investigation, 93:711（1994）;およびCarballido et al., J. Immunol., 155:4162（1995））。ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤは抗原特異的Ｉｇを生成するためにも用いられているが、但し、ドナーはin vivoでその抗原に対してプライミングされる。
【００９７】
したがって、本発明者らの目的は、目的の抗ＣＤ２３抗体を含めた、ＩｇＥ関連疾患、例えばアレルギー性疾患の治療のための治療薬の効力を試験するために用い得る適切なヒトＩｇＥ産生ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウスモデルを確立することに集中される。
【００９８】
材料および方法
下記のｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、以下の物質および方法を用いた。
【００９９】
ＳＣＩＤマウス：Ｃ．Ｂ．−１７  ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ免疫欠損マウスをTaconicから入手し（Ｃ．Ｂ．−１７／IcrTac-scidfDF）、IDEC Pharmaceuticals動物施設で維持した。滅菌床敷付き滅菌ミクロバリアユニット中にマウスを収容した。動物試験は、Committee on Care of Laboratory Animal Resources Commission on Life Science-National Research Councilにより定められた「実験室動物の管理および使用のための指針（Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals）」に従って実施した（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. No.（NIH）86-23, Bethesda, MD, NIH, 1985）。
【０１００】
ヒトＰＢＭＣ：メーカー推奨のFicoll-Hypaque（Histopaque-1077）（Sigma Diagnosticsカタログ番号１０７７−１）を用いた遠心分離により、血液銀行から入手したバフィーコートから、ＰＢＭＣを単離した。勾配界面のリンパ球調製物を回収し、ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Bio-Whittakerカタログ番号１０−５２７Ｆ）中で３回洗浄した。各実験のために、ＰＢＭＣを２つの別個のドナーから得て、in vitroで別々に培養した。５％ＦＣＳ＋１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Genzyme, Inc. カタログ番号２１８１−０１）を含有するＨＢ−基本培地＋１％ＨＢ１０１凍結乾燥サプリメント（Irvine Scientificカタログ番号Ｔ０００＆Ｔ１５１）中に、１〜３×１０6細胞／ｍｌの濃度で、ＰＢＭＣを再懸濁し、５％ＣＯ2とともに３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、異なるバフィーコートからの細胞を回収し、プールして、ＳＣＩＤマウスを再
構築するために用いた。
【０１０１】
in vivoアッセイ条件
０日目に、マウスのグループ（４〜５匹／グループ）に２００〜３００μｌ容量のＨＢＳＳ中の５０〜６０×１０6リンパ球を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。抗ＣＤ２３抗体を投与した群に関しては、０日目に、ｉ．ｐ．注射の前にＰＢＭＣを抗ＣＤ２３抗体（２００〜４００μｇ／マウス）と混合し、７日目に二回目の注射を施した。全マウスが、０日目〜５日目に、５０００  ＩＵ／マウスのＩＬ−４を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。抗体を注射されなかった群は、対照群として用いた。マウスの眼窩後静脈から採血し、血清をＩｇＧおよびＩｇＥに関して、１４、２１、２８および３５日目にＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１０２】
図８は、霊長類抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体５Ｅ８が、ＳＣＩＤマウスモデルにおけるin vivoのＩＬ−４誘導性ＩｇＥ産生の抑制に有効であることを示す。
【０１０３】
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体のクローニングおよび発現
霊長類免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするために、メーカーが記載した方法に従って、Micro-FastTrack ｍＲＮＡ単離キット（Invitrogenカタログ番号Ｋ１５２０−０２）を用いることにより、抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体６Ｇ５および５Ｅ８を分泌する霊長類ヘテロハイブリドーマの約２×１０6細胞から、ポリＡ＋  ＲＮＡを別々に単離した。
【０１０４】
従来の方法により、ｃＤＮＡサイクルキット（Invitrogenカタログ番号Ｌ１３１０−０１）を用いて、ｃＤＮＡの第一鎖をポリＡ＋  ＲＮＡから合成した。
次に、６Ｇ５および５Ｅ８のＬおよびＨ鎖可変領域を、ヒト免疫グロブリンの異なるコンセンサスファミリーに基づいて選択されたＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡからＰＣＲにより単離した。ＬおよびＨ可変領域のリーダー配列の開始部に対応する５’プライマーが選択され、そしてＪ領域に対応する３’プライマーが選択された（６Ｇ５のλＬ鎖可変ドメイン、５Ｅ８のκＬ鎖可変ドメイン、ならびに６Ｇ５および５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインをＰＣＲ増幅するために用いられる特異的プライマーは、第１表〜第３表に記載されている）。標準的方法にしたがって、ＰＣＲを実行した（ホットスタート１００試験管（Gibco BRLカタログ番号１０３３２−０１３）中で９４℃で１分、５４℃で１．５分、７２℃で２分を３０回）。鋳型としての８０μｌのｃＤＮＡ（２×１０６細胞から）からの５μｌ、５ｎＭ  ｄＮＴＰ  ２μｌ、Ｔａｑ  ポリメラーゼ１μｌ、 Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液  ５μｌ、５’プライマー（２５ｐｍｏｌｅ／μｌ）２μｌ、３’プライマー（２５ｐｍｏｌｅ／μｌ）２μｌおよび水３６μｌを含有する５０μｌの反応液中で、ＰＣＲを開始させた（Ｔａｑポリメラーゼおよび緩衝液はStratageneカタログ番号６００１３１から、ｄＮＴＰはBoehringer Mannheim カタログ番号１５８１２９５から得た）。
【０１０５】
Ａ）プラスミドＮ５ＬＧ１＋６Ｇ５およびＮ５ＬＧ４Ｐ＋６Ｇ５の構築
１）ＰＣＲによる霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体６Ｇ５のＬ鎖可変ドメインのクローニング
霊長類モノクローナル抗体６Ｇ５のｃＤＮＡからのＬ鎖可変領域の第１のＰＣＲ増幅は、λＬ鎖可変領域とin situで一致するバンドを示した。これらのバンドは、３つの異なる初期リーダー配列プライマーを用いたすべての反応において現れた（第１表〜第３表参照）。しかしながら、プライマー７４５（ファミリー２）を用いて得られるＰＣＲ産物は、ＰＣＲ産物バンドの強度が比較的高いために、より特異的であると考えられた。
【０１０６】
Qiaquickゲル抽出キット（Qiagenカタログ番号２８７０４）を用いて、このＰＣＲ産物
を単離した。精製したＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩおよびＡｖｒＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、同一の制限エンドヌクレアーゼで消化した哺乳類発現ベクターＮ５ＬＧ１にライゲーションした。１５０μｌのＰＣＲ反応液からの精製ＰＣＲ産物、１００ｍｇのＮ５ＬＧ１ベクター、２μｌの１０×ライゲーション緩衝液（ＮＥＢカタログ番号２０２Ｓ）および２μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢカタログ番号２０２Ｓ）を含むライゲーション混合物２０μｌを次に、１４℃で一夜インキュベートした。
【０１０７】
哺乳類発現ベクターＮ５ＬＧ１は、哺乳類細胞中で４つの別々のタンパク質の発現を提供する遺伝子配列（例えば、調節配列、コード配列）を含有する。それらは、
（ｉ）ヒトλＬ鎖定常領域、および、Ｌ鎖可変ドメインを挿入するためのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を有する部分免疫グロブリンＬ鎖と、
（ｉｉ）ヒトγ１鎖定常領域コード配列、および、Ｈ鎖可変ドメインを挿入するためのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を有する部分免疫グロブリンＨ鎖と、
（ｉｉｉ）プラスミドを取り込み、抗生物質ゲネチシン(Geneticin)（Gibco BRLカタログ番号１０１３１−１２０９）に耐性である細胞を選択するために用いられるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子と、
（ｉｖ）メトトレキセート（MTX, Sigmaカタログ番号Ａ−６７７０）の存在下で細胞が培養される場合に、選択およびゲノム増幅を提供するマウスジヒドロホレートレダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）（Reff et al., Blood, 83:433-445（1994））
である。
【０１０８】
ライゲーション後、親Ｎ５ＬＧ１プラスミドを消化するが、しかし６Ｇ５のＬ可変ドメインとライゲーションしたＮ５ＬＧ１プラスミドを消化しないＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて混合物を消化した。消化後、以下のように、混合物でEpicurian coli(登録商標) XL1-Blueコンピテント細胞（Stratageneカタログ番号２００２４９）を形質転換した。
【０１０９】
１００μｌのコンピテント細胞を１０μｌの前記ライゲーション混合物と混合し、氷上に３０分間置いた後、４５℃で３０秒間加熱した。この混合物を氷上に２分間置いて、予め室温に温めておいたＳＯＣ９００μｌを添加した（ＳＯＣは、ＬＢブロス（Gibco BRLカタログ番号１０８５５−０１３）＋０．０２Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．０２Ｍ  ＭｇＳＯ4および０．０２Ｍ  Ｄ−グルコースである）。３７℃で１時間インキュベーション後、混合物を４０００ｇで１分間遠心分離してから、８００μｌの上清を捨てた。残りの混合物を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ、Gibco BRLカタログ番号１３０７５−０１５）を含有するＬＢ寒天（Gibco BRLカタログ番号１２９４５−０４４）皿上にプレートした。Wizard(登録商標) MiniprepＤＮＡ精製システム（Promegaカタログ番号Ａ７５１０）を用いて、Ａｍｐプレート上で増殖した大腸菌の個々のコロニーから、プラスミドＤＮＡを単離した。
【０１１０】
単離したプラスミドＤＮＡを次に、ＢｇｌＩＩおよびＡｖｒＩＩを用いて消化し、その後アガロースゲル電気泳動して、特性評価した。４００ｂｐのエチジウム染色ＤＮＡバンドは、Ｌ鎖可変ドメインがうまくクローニングされた可能性を示した。
【０１１１】
これが免疫グロブリンＬ鎖可変ドメインであることを確認するために、Sequenase７−Deaza−ｄＧＴＰ  ＤＮＡシーケンシングキット（USBカタログ番号７０９９０）をシーケンシングプライマー６０７およびＧＥ１０８とともに用いて、シーケンシングを実施した（第４表のシーケンシングプライマー参照）。
【０１１２】
λＬ鎖ファミリー２の５’プライマー初期リーダー配列（プライマー７４５）および３’Ｊ領域プライマー９２６を用いて、霊長類モノクローナル抗体６Ｇ５のｃＤＮＡからの
Ｌ鎖の第２の独立のＰＣＲ増幅を実行した（第１表〜第３表の６Ｇ５のλＬ鎖可変ドメインのＰＣＲのためのプライマー参照）。オリジナルＴＡクローニングキット（Invitrogenカタログ番号Ｋ２０００−０１）を用いて、単離したＰＣＲ産物（前記技法参照）をＴＡベクター中にクローニングした。ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化後、アガロースゲル電気泳動下で、単離miniprep  ＤＮＡ（前記技法参照）を調べた。ＴＡベクターに含まれる、生じたＰＣＲ産物を次に、Ｓｐ６およびＭ１３（−４０）フォワードプライマー（第４表のシーケンシングプライマー参照）を用いて、シーケンシングした（前記と同様に）。その結果得られたＬ鎖配列は、第１のＰＣＲからのＬ鎖のものと同一であった。霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体６Ｇ５のＬ鎖可変ドメインのこの全配列を以下に示す。
【０１１３】
【表１−１】
2010095526.tif 000002
【０１１４】
【表１−２】
2010095526.tif 000003
【０１１５】
【表１−３】
2010095526.tif 000004
【０１１６】
２）ＰＣＲによる霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体６Ｇ５のＨ鎖可変ドメインのクローニング
前記の初期リーダー配列プライマーおよび３’Ｊ領域プライマーＧＥ２４４の組を用いて、霊長類モノクローナル抗体６Ｇ５のｃＤＮＡからのＨ鎖可変ドメインの第１のＰＣＲ増幅を行った。これらのプライマーは、以下の第１表〜第３表中に示す。この反応は、３５０塩基ＰＣＲ産物をもたらした。第１のＰＣＲ増幅では、この３５０塩基生成物（前記のようにして精製される）をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化し、Ｎ５ＬＧ１にライゲーションし、同一エンドヌクレアーゼで消化した。その結果生じたライゲーション混合物で、Ｌ鎖をクローニングするのと同一の技法を用いて宿主細胞を形質転換した。次に、３５０塩基ＰＣＲ産物を含有するプラスミドＮ５ＬＧ１を単離し、シーケンシングした（シーケンシングプライマー２６６および２６８を用いて）（これらのシーケンシングプライマーを、第４表に示す）。
【０１１７】
シーケンシングにより、ＰＣＲ産物はＨ可変ドメインの一部だけを含有し、そしてそのアミノ末端に欠失を含む（配列は、フレームワーク２、コドン３６で始まる）ということが示された。
【０１１８】
ファミリー１（ＭＢ１５０３）のための５’初期リーダー配列プライマーおよび３’Ｊ領域プライマーＧＥ２４４を用いて、第２の独立のＰＣＲ反応を行い、霊長類モノクローナル抗体６Ｇ５のＨ鎖可変ドメインを増幅し、単離した（これらのプライマーも第１表〜第３表に含まれている）。その結果得られたＰＣＲ産物を次に、前記と同じ技法を用いてＮ５ＬＧ１中にクローニングした。その配列は、第１のＰＣＲ産物と同一であることが判明した。
【０１１９】
したがって、欠けている５’末端を含めた６Ｇ５の全Ｈ可変ドメインをクローニングするために、６Ｇ５ Ｈ可変鎖のＣＤＲ３およびフレームワーク４領域を含む新規の長い３’プライマー（ＭＢ１５３３）を次に、ファミリー１ ５’プライマー（ＭＢ１５０３）とともに第３の独立のＰＣＲ反応に用いた（これらのプライマーも、第１表〜第３表に含まれる）。
【０１２０】
ＰＣＲ後、より大きい４２０塩基ＰＣＲ産物が、アガロースゲル上に観察された。このＰＣＲ産物を前記と同様に単離し、そしてＴＡベクター中にクローニングした。ＴＡベクター中に含有されるその結果生じたＰＣＲ産物を次にシーケンシングした。シーケンシングにより、このＤＮＡは全Ｈ可変ドメインを含有することを、そして３’部は、最初の２回のＰＣＲ反応からの先にクローニングされた部分Ｈ鎖可変ドメインのものと同一である
、ということが示された。
【０１２１】
第３のＰＣＲ増幅と同一のプライマーを用いて、第４の独立のＰＣＲを行った。これにより、前記と同様に単離され、ＴＡベクター中にクローニングされたＰＣＲ産物が得られた。第４の独立のＰＣＲ産物の配列は、第３のＰＣＲ増幅で得られたものと同一であることが判明した。霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体６Ｇ５のＨ鎖可変ドメインを含むこの配列を以下に示す。
【０１２２】
【表２−１】
2010095526.tif 000005
【０１２３】
【表２−２】
2010095526.tif 000006
【０１２４】
【表２−３】
2010095526.tif 000007
【０１２５】
３） 哺乳類発現ベクターの構築
６Ｇ５のクローニングしたＨ鎖可変ドメインを哺乳類発現ベクター中に挿入するために、ＴＡベクター中のＨ鎖可変ドメイン（第３の独立のＰＣＲで得られる）をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化し、これを同一制限酵素で消化した、すでにＬ鎖可変ドメインを含有しているＮ５ＬＧ１ベクター中にクローニングした。その結果生じた哺乳類発現ベクターをＮ５ＬＧ１＋６Ｇ５と命名した。
【０１２６】
Ｎ５ＬＧ４Ｐ＋６Ｇ５ベクターを構築するために、それぞれＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩ、およびＮｈｅＩとＳａｌＩの消化により、ＬおよびＨ鎖可変ドメインの両方をＮ５ＬＧ１＋６Ｇ５から単離した。哺乳類発現ベクターＮ５ＬＧ４Ｐベクターは、免疫グロブリンの安定性を増大し、in vivoの薬物動態を改良するために、ヒトγ１を、ヒンジ部におけるセリンのプロリンへの変異（「Ｐ」変異）を含有するヒトγ４定常領域に置き換えた以外は、前記のＮ５ＬＧ１ベクターと同一である。Ｌ鎖可変ドメインを先ずプラスミド中にクローニングし、Ｈ鎖可変ドメインを、前記の技法を用いてＬ鎖可変ドメインを含有するベクター中にクローニングした。この哺乳類発現ベクターは、Ｎ５ＬＧ４Ｐ＋６Ｇ５と命名された。
【０１２７】
Ｂ．プラスミドＮ５ＫＧ４Ｐ＋５Ｅ８、Ｎ５ＫＧ１＋５Ｅ８、Ｎ５ＫＧ４Ｐ＋５Ｅ８Ｎ−およびＮ５ＫＧ１＋５Ｅ８Ｎ−の構築
１．ＰＣＲによる霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体５Ｅ８のＬ鎖可変ドメインのクローニング
κ初期リーダー配列プライマーおよび３’Ｊ領域プライマーＧＥ２０４の組を用いて、５Ｅ８ｃＤＮＡからのＬ鎖可変ドメインの第１のＰＣＲ反応を行った（第１表〜第３表の５Ｅ８のκＬ鎖可変ドメインのＰＣＲのためのプライマー参照）。４２０塩基ＰＣＲ産物を得た。単離４２０塩基ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、哺乳類発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐ中にクローニングして、ＧＥ１０８および３７７プライマー（これらは第４表に含まれている）を用いてシーケンシングした。哺乳類発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐは、ヒトλＬ鎖定常領域の代わりにヒトκＬ鎖定常領域を含有することを除いてベクターＮ５ＬＧ４Ｐと同一である。この４２０ポリヌクレオチドＤＮＡのシーケンシングにより、それが全κＬ鎖可変ドメインを含有することが示された。
【０１２８】
５’ファミリー１プライマーＧＥ２０１および３’プライマーＧＥ２０４を用いて、Ｌ鎖可変領域の第２の独立のＰＣＲを実施した（第１表〜第３表の５Ｅ８のκＬ鎖可変ドメインのＰＣＲのためのプライマー参照）。単離ＰＣＲ産物を（前記の方法を用いて）ＴＡベクター中にクローニングし、Ｓｐ６およびＴ７プロモータープライマーを用いてシーケンシングした。シーケンシングにより、このＰＣＲ産物は第１のＰＣＲから得られたものと同一であることが示された。霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体５Ｅ８のＬ鎖可変ドメインの全配列を以下に示す。
【０１２９】
【表３−１】
2010095526.tif 000008
【０１３０】
【表３−２】
2010095526.tif 000009
【０１３１】
２）ＰＣＲによる霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインのクローニング
５’初期リーダーＨ鎖配列プライマーおよび３’プライマーＧＥ２１０の組を用いて、５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインの第１のＰＣＲを行った（第１表の６Ｇ５および５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインのＰＣＲのためのプライマー参照）。４２０塩基ＰＣＲ産物は、ファミリー３プライマー反応で現れた。ＰＣＲ産物を精製し、次にＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化して、哺乳類発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐベクター中にクローニングした（前記と同様に）。２６８および９２８プライマーを用いて、ＰＣＲ産物をシーケンシングした（第４表のシーケンシングプライマー参照）。
【０１３２】
ファミリー３ ５’プライマーＧＥ２０７および３’プライマーＧＥ２１０を用いて、５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインの第２の独立のＰＣＲ反応を行った（第１表〜第３表の６Ｇ５および５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインのＰＣＲのためのプライマー参照）。単離ＰＣＲ産物を前記と同じ技法を用いてＴＡベクター中にクローニングし、Ｓｐ６およびＴ７プライマーを用いてシーケンシングした。シーケンシングにより、コドン９１のＴＡＣがＴＧＣに変えられていたことが示された。
【０１３３】
９１位での適切なコドンを決定するために、第２のＰＣＲと同じプライマーを用いて、第３の独立のＰＣＲを実施した（前記参照）。ＰＣＲ産物をＴＡベクター中に再びクローニングし、Ｓｐ６およびＴ７プライマーを用いてシーケンシングした。配列は、第１のＰＣＲで得られたＨ鎖可変配列と同一であることが判明した。したがって、第２の独立のＰＣＲ産物中の位置９１のＴＧＣは、明らかにＰＣＲの間に導入されたエラーの結果である。霊長類モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体５Ｅ８のＨ鎖可変ドメインのこの全配列を以下に示す。
【０１３４】
【表４−１】
2010095526.tif 000010
【０１３５】
【表４−２】
2010095526.tif 000011
【０１３６】
【表４−３】
2010095526.tif 000012
【０１３７】
３）哺乳類発現ベクターの構築
Ｎ５ＫＧ４Ｐ中のＨ鎖可変ドメインをＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化し、精製して、５Ｅ８のＬ鎖可変ドメインを含有するＮ５ＫＧ４Ｐ中にクローニングした。次にこのプラスミドを前記と同様に制限エンドヌクレアーゼで消化した。これにより、５Ｅ８のＬ鎖およびＨ鎖可変ドメインの両方を含有するベクターが生じた。このベクターをＮ５ＫＧ４Ｐ＋５Ｅ８と命名した。 Ｎ５ＫＧ４Ｐ＋５Ｅ８のＨおよびＬ可変ドメインの両方を次に、哺乳類発現ベクターＮ５ＫＧ１に挿入して、 Ｎ５ＫＧ１＋５Ｅ８ベクターを作製した。
【０１３８】
４）部位特異的変異誘発による霊長類モノクローナル抗体５Ｅ８のＨ鎖可変領域におけるアミノ酸の変化および哺乳類発現ベクターの構築
５Ｅ８ Ｈ可変ドメインの配列によれば、アスパラギンコドン７５に免疫グロブリンの潜在的グリコシル化部位が存在する。この潜在的グリコシル化部位は、（Ａｓｎ）−（プロリン以外のあらゆるアミノ酸）−（セリンまたはトレオニン）のトリペプチド配列を有する保存アスパラギン結合グリコシル化モチーフに対応する。したがって、このグリコシル化モチーフの改変のために、この位置でグリコシル化され得ない５Ｅ８のグリコシル化変異体は、アスパラギンコドン７５をリジンに置換することにより生成された（この位置で多数のヒト免疫グロブリンに見出される）。部位特異的変異誘発は、以下の方法により行った。
【０１３９】
鋳型としてのＮ５ＫＧ４Ｐ＋５Ｅ８ならびに３’プライマー（コドン７１〜７９に対応する）で、コドン７５に変異（ＡＡＣがＡＡＧに変化）を含有するプライマーＭＢ１６５４およびリーダー配列の始まりの５’プライマー（プライマーＭＢ１６５０）を用いて、第１のＰＣＲをいった（第５表に記載のＨ鎖可変領域５Ｅ８のグリコシル化変異体の生成のために用いられるＰＣＲプライマー参照）。
【０１４０】
同一変異を含有する５’プライマー（コドン７１〜７９に対応）（プライマーＭＢ１６５３）およびフレームワーク４の末端からの３’プライマー（プライマーＭＢ１６５１）を用いることにより、同一鋳型で、第２のＰＣＲをいった（第５表の５Ｅ８のＨ鎖可変領域のグリコシル化変異体の生成のために用いられるＰＣＲプライマー参照）。
【０１４１】
これら２つのＰＣＲ産物を単離し、等モル比で混合した。次に、第１のＰＣＲで用いられた５’プライマー（ＭＢ１６５０）と第２のＰＣＲで用いられた３’プライマー（ＭＢ１６５１）とともに、鋳型として第１および第２のＰＣＲ産物の混合物を用いることにより、第３の独立のＰＣＲをいった（第５表のＨ鎖可変領域のグリコシル化変異体の生成のために用いられるＰＣＲプライマー参照）。第３のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物は、アスパラギン７５がリジンに変化している５Ｅ８のＨ可変ドメインコード領域を含有すること
が判明した。
【０１４２】
第３のＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＮｈｅＩで消化し、そしてＬ鎖可変ドメインのみを含有するＮ５ＫＧ４Ｐ中にクローニングした。ＰＣＲ産物をシーケンシングして、それが変異Ｈ可変ドメインを含むことを確認した。この哺乳類発現プラスミドは、Ｎ５ＫＧ４Ｐ＋５Ｅ８Ｎ−と命名された。
【０１４３】
Ｎ５ＫＧ１＋５Ｅ８Ｎ−を構築するために、Ｎ５ＫＧ４Ｐ−５Ｅ８Ｎ−からのＬおよびＨ可変ドメインの両方をそれぞれＢｇｌＩＩとＢｓｉＷＩおよびＮｈｅＩとＳａｌＩで消化した。Ｌ可変ドメインを先ずクローニングし、次にＨ可変ドメインを哺乳類発現プラスミドＮ５ＫＧ１に挿入して、プラスミドＮ５ＫＧ１＋５Ｅ８Ｎ−を作製した。
【０１４４】
【表５】
2010095526.tif 000013
【０１４５】
【表６】
2010095526.tif 000014
【０１４６】
【表７】
2010095526.tif 000015
【０１４７】
【表８】
2010095526.tif 000016
【０１４８】
【表９】
2010095526.tif 000017
【０１４９】
Ｃ）γ３ベクターの構築
マウス抗体を、ＨおよびＬ鎖定常領域がヒトバージョンで置換されたか、あるいはＣＤＲ（相補性決定領域）以外はすべてそれらのヒト等価物で置換されたキメラに変換するためには多数の方法がある（King et al., Biochem. J. 281:317, 1992; Queen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86(24):10029-33, 1989; Love et al., Methods Enzymol. 178:515-27, 1989; Hutzell et al., Cancer Res. 51:181, 1991; Chiang et al., Biotechniques 7(4):360-6, 1989; Heinrich et al., J. Immunol. 143:3589, 1989; Hardman et al., Int. J. Cancer 44:424, 1989; Orlandi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86(10):3833-6, 1989参照）。
【０１５０】
さらに、先の記載は特に、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)γ１およびγ４抗体の発現のためのベクターの構築が、ＰＣＲを用いてＬおよびＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを増幅し、そしてこれらの領域を、適切なヒト定常領域ドメインをコードする発現ベクター中にクローニングすることにより達成され得る、ということを実証する。したがって、霊長類抗体からの増幅可変領域ＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位も含有する適切な哺乳類発現ベクターが用いられる限り、他のヒト定常領域ドメインをコードする同様の構築物が作製され得る、ということは明らかであろう。
【０１５１】
可変領域ＤＮＡを増幅するために用いられるＰＣＲプライマーは、用いられるベクターによって種々の制限クローニング部位を含むように設計され得る、ということも明らかである。
【０１５２】
ヒトＩｇＧ３からの定常領域ドメインをコードするベクターは当技術分野で利用可能であり、本発明のＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体を構築するために用い得る。例えば、Coらは、キメラおよびヒト化抗体を構築するためのヒトＬおよびＨ鎖定常領域を発現する別々のベクターを使用し、そしてヒトγ１およびγ３の両方のためのＨ鎖ベクターを提供する。目的の抗体の可変ドメイン領域をこれらのベクター中にクローニングするために、ＸｂａＩ制限部位が、ＬおよびＨ鎖に関してそれぞれ、ＪＫ４およびＪＨ３イントロンセグメントの定常領域の直前に位置することが便利である（Co et al., 1996, Cancer Res. 56:1118-1125; Co et al., 1992, J. Immunol. 148:1149-1154）。
【０１５３】
したがって、ＸｂａＩ制限部位、またはＸｂａＩ制限酵素と同じ一本鎖オーバーハング
（即ち、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ）を作成する部位を組み込むＰＣＲプライマーを設計することにより、霊長類抗体からの可変領域は、Coらが記載したベクターを用いてヒトγ３定常領域ドメインと会合し得る。あるいは、リンカーまたはアダプターを用いてクローニングを助長し得る。
【０１５４】
ＤＮＡ合成法を用いてヒトγ３定常領域のｃＤＮＡバージョンを構築し、本明細書に記載したＮ５ＫＧ１ベクター中に、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩ部位との間のヒトγ１定常領域の代わりに、それを挿入することもできる。いずれの制限部位が目的の特定の可変領域をクローニングするのに最も便利であるかによって、当技術分野で報告された他のγ３ベクターもあり、これらのいずれかを用いて、本発明のγ３抗体を構築し、発現させるのに使用し得る（例えば、Parren et al., 1992, J. Immunol. 148（3）:695-701; Steplewski et
al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4852-4856; および米国特許第４，９７５，３６９号参照）（これらは、参照により本明細書中に含まれる）。
【０１５５】
Ｄ）ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体の変異
本発明は、定常領域の変異、置換または欠失を含有するＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体も含む。このような変異は、当業者には周知の技法である、グリコシル化変異体に関して前述したような部位指定的変異誘発法を用いて構築され得る。
【０１５６】
本発明の変異化抗体は、治療的効率のレベルの、即ちＦｃＲ結合の所望の変化をもたらす目的で設計される。しかしながら、抗体の定常領域のあらゆる変異は、γ１またはγ３定常領域ドメインにより媒介されるような基本的エフェクター機能を変えないはずであることが理解されるべきである。それらがγ１またはγ３ドメインを含有する抗体と同様のエフェクター機能を有するように、変異誘発により他のサブクラスのγ抗体を変えることもできる。このような抗体も、本発明に包含される。
【０１５７】
例えば、ＦｃＲ結合およびＣ１ｑ補体成分との相互作用に関与するＩｇＧ定常領域の領域が特性評価されており、そして結合親和性を増大するか、あるいは低減する変異が同定されている。米国特許第５，６４８，２６０号（これは、参照により本明細書中に含まれる）に開示されているように、ヒトＩｇＧ３定常領域のＬｅｕ２３５をＧｌｕに変えると、ヒトＦｃγＲ１受容体に対する変異体の相互作用が壊される。さらに、ヒンジ結合領域中の隣接または近傍部位の変異（即ち、残基２３４、２３５、２３６または２３７をＡｌａに置換）は、残基２３４、２３５、２３６および２３７の変化が、少なくともＦｃγＲ１受容体に対する親和性に影響を及ぼす、ということを示す。
【０１５８】
同様に、米国特許第５，３４８，８７６号（これも参照により本明細書中に含まれる）では、ヒトＩｇＧ３定常領域のヒンジ領域の長さを減少させ、そしてこの領域のアミノ酸配列を変えることにより、Ｃｌｑ結合、したがって補体媒介性細胞溶解がさらに改良される、ということが示された。実際、変異体は、野生型ＩｇＧ３よりも、そしてＩｇＧ１よりさらに多くＣｌｑと結合した。
【０１５９】
したがって、おそらくはより軽症の医学的症状の治療のために、変異を用いて、ヒトＦｃ受容体に対して低親和性を有する治療的抗体を作製し得る、ということが当技術分野から明らかである。さらに、エフェクター機能活性を増大し、それにより治療的用途のためのより強力なバージョンをもたらす変異が同定され得る。遺伝子配列を操作して、薬剤効率を変化させることが予見されるとともに、それらが十分に本発明の精神および範囲内にあることが認識されるべきである。
【０１６０】
Ｅ）チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体の発現
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体を単離するために、以下のプロトコルを用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で、抗体をコードするベクターを発現させた。
【０１６１】
WIZARD(登録商標) MaxiprepsＤＮＡ精製システム（Promegaカタログ番号Ａ７４２１）を用いて、ラージスケールでプラスミドＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡをＳｓｐＩおよびＢｓｐＬＵ１１Ｉで消化し、エタノールを用いて一旦沈殿させて、滅菌ＴＥ中に再懸濁させた。
【０１６２】
精製したエンドヌクレアーゼ制限プラスミドＤＮＡを、次に、電気穿孔を用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ジヒドロフォレートレダクターゼマイナスＤＧ４４細胞中に導入した。使用した電気穿孔技法を、以下に説明する。
【０１６３】
約１．６×１０8ＣＨＯ細胞を、適切なサイズの滅菌Corning管中で、１０００ｒｐｍで１分間、回転させた。培地を除去し、細胞を１５ｍｌの滅菌氷冷ＳＢＳ（滅菌スクロース緩衝化溶液は、２７２ｍＭのスクロース、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１ｍＭのＭｇＣｌ2である）中で洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。ＳＢＳを除去し、１×１０7細胞／ｍｌの細胞濃度で新鮮な氷冷滅菌ＳＢＳを用いて細胞を懸濁させて、氷上に１５分間放置した。ＢＴＸ６００エレクトロポレーターのスイッチを入れ、予め２３０ボルトに設定し、最大電圧つまみは５００ボルト／キャパシタンス＆抵抗に設定した。キャパシタンスは４００マイクロファラデーに、抵抗は１３オームに設定された（設定Ｒ１）。
【０１６４】
プラスミドＤＮＡ（４μｇのＤＮＡまたは２μｇのＤＮＡ）および０．４ｍｌの細胞（４×１０6細胞）を次に、ＢＴＸ０．４ｍｌキュベット（ＢＴＸカタログ番号６２０）中に入れた。キュベットをＢＴＸ６００スタンド中に入れることにより細胞に衝撃を与え、自動荷電＆パルスボタンを押した。各哺乳類発現プラスミドを用いて、別々に約２０回の電気穿孔を実施した。
【０１６５】
衝撃後、キュベットを周囲温度で１５分間放置した。各キュベットからの細胞およびＤＮＡを、ＨＴサプリメント（１００×サプリメントは１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム、１．６ｍＭチミジンGibco BRLカタログ番号１１０６７−０１４である）を添加した、ヒポキサンチンまたはチミジンを含有しない２０ｍｌのＣＨＯ−ＳＳＦＭＩＩ（Gibco BRLカタログ番号３１０３３−０１２）中に再懸濁した。単一電気穿孔処理キュベットからの細胞を次に９６ウエルプレート（２００μｌ／ウエル）にプレートし、３７℃のＣＯ2インキュベーター中に入れた。培地を４００ｍｇ／ｍｌのGeneticin(登録商標)（G418, Gibco BRLカタログ番号１０１３１−０１９）を添加した前記の培地に変えることにより、２〜３日後に選択が開始された。細胞を３７℃で増殖させ、細胞培地を３〜５日毎に取り換えた。１６日後、Ｇ４１８耐性クローンがウエル中に出現し、ＥＬＩＳＡにより上清を抗体発現に関してアッセイした。次に、最高発現クローンを個別にエキスパンドさせた。モノクローナル抗体を後述するように精製した。
【０１６６】
免疫グロブリンＥＬＩＳＡ
プレート（Immulon 2, Dynatech Laboratories, Inc. カタログ番号０１１−０１０−３４５５）を４℃で一夜、１００μｌ／ウエルで２００ｎｇの非標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でコーティングした。これは、プレート当たり２０ｍｌの非標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ／１０ｍｌのコーティング緩衝液（Boehringer Mannheim Ab  カタログ番号６０５  ４００）（約１ｍｇ／ｍｌストックの１：５００希釈液）を用いて実施する。次に、コーティング緩衝液をプレートから除去し、紙タオルを用いて乾燥させる。ウエル当たり１００μｌの希釈緩衝液を次に付加する。
【０１６７】
抗体溶液および標準液（１００ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｎｇ／ｍｌ）を次に、デュプリケートで１００μｌ／ウエルで希釈緩衝液１００ｍｌに直接添加する。抗体溶液および標準液は、希釈緩衝液中に含有される。その結果生じる溶液を次に、３７℃で少なくとも１時間インキュベートする。
【０１６８】
インキュベーション後、各プレートの内容物を除き、プレートを水道水で５回洗浄する。次にプレートを紙タオル上で乾燥させる。
【０１６９】
プレート乾燥後に、二次抗体を１００μｌ／ウエルで添加する。この二次抗体は、１／１０，０００希釈液で、または１μｌのＡｂ／１０ｍｌの希釈緩衝液／プレートで添加されるヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰＯ（Southern  Biotechnology Associates, Inc.から入手。カタログ番号２０６０−０５）であるか、あるいは１／２０，０００希釈液で、または１μｌのＡｂ／２０ｍｌの希釈緩衝液／２プレートで用いられるヤギ抗ヒトλ−ＨＲＰＯ（Southern Biotechnology Associates, Inc.から入手。カタログ番号２０７０−０５）である。
【０１７０】
抗体とプレートの内容物とを３７℃で１時間インキュベートさせる。インキュベーション後、各プレートの内容物を除く。プレートを再び水道水で５回洗浄し、洗浄したプレートを乾燥させる。次に乾燥したプレートに、ＨＲＰＯ基質（TMB Microwell−２成分）を１００μｌ／ウエルの量で添加する（５ｍｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質＋５ｍｌのペルオキシダーゼ溶液Ｂ／プレート（Kirdgaard and Perry Labs, TMB Microwell２成分試薬、カタログ番号５０−７６−００））。
【０１７１】
最も弱い標準液（２．５ｎｇ／ｍｌ）がバックグラウンド上に目に見えるようになった時に、１００μｌの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を各ウエルに添加することにより、反応を停止させる。次にプレートのウエルの光学密度を、波長を設定した（ＯＤ４５０およびＯＰＴ２（ＯＤ５４０））プレートリーダー、例えばMolecular Devices Emax精密マイクロプレートリーダーを用いて読み取る。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡ緩衝液
コーティング緩衝液
炭酸ナトリウム                                ０．８  ｇ／ｌ
重炭酸ナトリウム                              １．５５ｇ／ｌ
約１ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを９．５に調整
希釈緩衝液
０．５％無脂肪乾燥ミルク（５ｍｇ／Ｌ）のＰＢＳ溶液＋０．０１％ Thimerosal（１００ｍｇ／Ｌ）
【０１７３】
前記のアッセイを用いて得られるＥＬＩＳＡ値の例を以下に記載する。
【０１７４】
標準液          ＯＤ４５０        ＯＤ４５０          平均
100ng/ml          0.805              0.876             0.841
50ng/ml          0.395              0.472             0.434
25ng/ml          0.213              0.252             0.233
10ng/ml          0.089              0.105             0.097
5ng/ml          0.054              0.055             0.055
2.5ng/ml        0.031              0.035             0.033
0ng/ml          0.004              0.006             0.005
【０１７５】
希釈緩衝液中の標準液
１ｍｇ／ｍｌとするためのストックＡＢ（通常生理食塩水中で滅菌濾過。ＯＤによりタンパク質測定）の適切な希釈
【０１７６】
例：
キメラサル／ヒト抗ＣＤ４（ＣＥ９．１）は４．１８ｍｇ／ｍｌ
７６μｌの希釈緩衝液に上記２４μｌを加えると、１ｍｇ／ｍｌ
４５０μｌの希釈緩衝液（Ｄ．Ｂ．）に５０μｌのストックＡｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を加えると１００μｇ／ｍｌ
４５０μｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物５０μｌを加えると１０μｇ／ｍｌ
１．８ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物２００μｌを加えると１μｇ／ｍｌ
９ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物１ｍｌを加えると１００ｎｇ／ｍｌ＊
５ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物５ｍｌを加えると５０ｎｇ／ｍｌ＊
５ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物５ｍｌを加えると２５ｎｇ／ｍｌ＊
６ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物４ｍｌを加えると１０ｎｇ／ｍｌ＊
５ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物５ｍｌを加えると５ｎｇ／ｍｌ＊
５ｍｌのＤ．Ｂ．に上記の混合物５ｍｌを加えると２．５ｎｇ／ｍｌ＊
＊ ＥＬＩＳＡに用いられる標準液
【０１７７】
プロテインＡによる抗体精製
手法
培養上清を遠心分離して、細胞および細胞片を取り除く。次に遠心分離物を０．２μｍフィルターに通して濾過する。その後、プロテインＡセファロースファストフローカラム（組換えプロテインＡセファロースファストフロー）（Pharmacia Biotechカタログ番号７１−５０００−０９）を調製し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて平衡化させる。
【０１７８】
上清を適切な流速（例えば、２ｍｌ／分）でカラムに負荷する。負荷後、カラムを１０カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄する。１ｍｌ／分の流速で溶離緩衝液（０．２Ｍ酢酸、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．５）を用いて、抗体をカラムから溶離する。１００μｌのＴｒｉｓを含有する試験管当たり１ｍｌの分画を回収する。その後、２８０ｎｍで分光光度計吸光度読み取りを実施する。次に抗体画分を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．９）に対して一夜透析する。透析物を次に、０．２２μｍの膜を通して濾過して滅菌し、−２０℃で保存する。
【０１７９】
アッセイ結果
前記のＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)ヒトγ４抗ヒトＣＤ２３抗体を精製し、in vitroでの誘導性ＩｇＥ抑制活性に関してアッセイした。これらの結果は、図３および５に含まれる。これは、前記のin vitroＩＬ−４ ＩｇＥアッセイを用いて行った。
【０１８０】
これらのアッセイ結果は意外にも、両方のヒトγ４抗ヒトＣＤ２３抗体は、対応する霊長類抗ヒトＣＤ２３抗体ほど活性ではない、即ち、それらはin vitroでの誘導性ＩｇＥ産生を有意に抑制しなかった、ということを示した。
【０１８１】
しかしながら、霊長類５Ｅ８およびｐ５Ｅ８Ｇ４ＰはＨ鎖可変領域に潜在的アスパラギン結合グリコシル化部位を有するため、この部位でのグリコシル化の効果を調べた（これらの抗体はともに、この部位にＮ−結合オリゴ糖を含有する、ということが判明した（データは示されていない））。したがって、グリコシル化を抑制するために、グリコシル化部位のアスパラギンをリジンに変えて、炭水化物付加を排除した。この変異化抗体を、ｐ５Ｅ８Ｇ４ＰＮ−と命名した。アッセイ結果は、この抗体がＩＬ−４  ＩｇＥアッセイにおいてｐ５Ｅ８Ｇ４Ｐと同一にふるまい（図３参照）、そしてヒトＣＤ２３に対して同一の見かけの親和性Ｋｄを示す（図４参照）、ということを実証した。したがって、これら
の結果は、５Ｅ８γ４ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体から観察されたＩｇＥ抑制の、霊長類５Ｅ８抗体と比較した場合の差はグリコシル化の差によるものではない、ということを示した。
【０１８２】
次に、３つの霊長類抗体（ｐ５Ｅ８Ｇ４Ｐ、ｐ５Ｅ８Ｇ４ＰＮ−およびｐ６Ｇ５Ｇ４Ｐ）を、実質的に同一の方法を用いて、ヒトγ１バージョンとして発現させた。それぞれｐ５Ｅ８Ｇ１、ｐ５Ｅ８Ｇ１Ｎ−およびｐ６Ｇ５Ｇ１と命名した３つのヒトγ１抗ヒトＣＤ２３抗体はすべて、in vitroでのＩＬ−４／ＩｇＥアッセイにおいて活性であることが判明した（図３および５）。
【０１８３】
ｐ５Ｅ８Ｇ１は、０．３μｇ／ｍｌ（Ｐ［Ｔ，ｔ］片側＋０．００５５）および３μｇ／ｍｌ（ｐ［Ｔ＜ｔ］片側＋０．００１９）の濃度で、ｐ５Ｅ８Ｇ４Ｐよりも統計学的に抑制的である、ということが判明した。さらに、 ｐ５Ｅ８Ｇ１Ｎ−は、０．３μｇ／ｍｌ（Ｐ［Ｔ＜ｔ］片側＋０．０３９２）および３μｇ／ｍｌ（ｐ［Ｔ＜ｔ］片側＋０．０３１０）の両濃度で、ｐ５Ｅ８Ｇ４ＰＮ−より統計学的に抑制的である（図３）。
【０１８４】
同様に、ｐ６Ｇ５Ｇ１は３ｍｇ／ｍｌで誘導性ＩｇＥ産生を完全に抑制し、一方ｐ６Ｇ５Ｇ４Ｐは抑制しなかった（これらの結果を図５に示す）。
【０１８５】
したがって、これらの結果は、活性Ｆｃ領域、特にヒトγ１のものが、抗ヒトＣＤ２３抗体による誘導性ＩｇＥ抑制に関して重要である、ということを示唆した。これらの結果はまた、γ３定常領域はγ１が結合するのと同じＦｃγＲ受容体と結合し、そして同一結果を媒介すると考えられるため、ヒトγ３定常領域を含有するヒト抗ＣＤ２３抗体が誘導性ＩｇＥ抑制に重要である、ということも示唆した。
【０１８６】
実施例２
抗ヒトＣＤ２３抗体のＩｇＥ抑制におけるＦｃエフェクター部分の関与に関して我々の仮説を確証するために、２Ｃ８と命名された、in vitroでＩｇＥを抑制することも示されている第三の霊長類抗体を、Ｆ（ａｂ’）2に変換した。前記と同じＩＬ−４／ＩｇＥアッセイを用いて、ＩｇＥ抑制活性を測定した。
【０１８７】
材料
本実施例では、以下の材料を用いた。
ImmunoPure Ｆ（ａｂ’）2調製キット（Pierceカタログ番号４４８８８）
消化緩衝液：  ２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ４．５
０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．０（ＮａＯＨでｐＨを調整）
０．１％アジ化ナトリウム水溶液
透析チューブ：５０，０００ＭＷカットオフ（Spectra Porカタログ番号１３２  １２８）
３７℃を保持し得る振盪水浴
ポリスチレン培養試験管、１７×１００ｍｍ（Fisherカタログ番号１４−９５６−６Ｂ）
ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierceカタログ番号２３２２４）
Centricon-50濃縮機（Amiconカタログ番号４２２５）。
【０１８８】
固定化ペプシンの平衡化
固定化ペプシンの５０％スラリー０．２５ｍｌを、１７×１００ｍｍ試験管に添加する（０．１２５ｍｌのゲル）。次に４ｍｌの消化緩衝液を添加する。その後、血清分離器を用いて、ペプシンを緩衝液から分離する。次に緩衝液を捨て、別の４ｍｌの緩衝液を用いて洗浄工程を繰り返す。次に、固定化ペプシンを０．５ｍｌの消化緩衝液中に再懸濁する
。
【０１８９】
固定化プロテインＡカラムの調製
プロテインＡ AffinityPak(登録商標)カラムおよびImmunoPure結合および溶離緩衝液を室温にする。
【０１９０】
２Ｃ８  Ｆ（ａｂ’）2断片の調製
抗体の技術分野で周知の方法により、２Ｃ８  Ｆ（ａｂ’）2断片を調製する。本発明者らは、メーカーのプロトコールを用いて、市販のキット  ImmunoPure  Ｆ（ａｂ’）2調製キット（Pierceカタログ番号４４８８８）を使用することを選択した。
【０１９１】
１０ｍｇの凍結乾燥２Ｃ８抗体を１ｍｌの消化緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５）に溶解した。１ｍｌの抗体含有試料を次に、固定化ペプシンを含む試験管に添加した。
【０１９２】
次に抗体および固定化ペプシンを３７℃で高速振盪水浴中（高速で）で４時間、インキュベート中は混合を一定に保持するよう注意しながら、インキュベートした。
【０１９３】
その結果生じた可溶化Ｆ（ａｂ’）2およびＦｃ断片、ならびに未消化ＩｇＧをその後、血清分離器を用いて固定化ペプシンゲルから回収した。次に粗消化物を清浄な試験管に注ぎ移す。
【０１９４】
Ｆ（ａｂ’）2断片の回収を増大するために、次に固定化ペプシンを望ましくは１．５ｍｌのImmunoPureＩｇＧ結合緩衝液で洗浄する。次に、洗浄液を粗消化物に添加する。
【０１９５】
その後、プロテインＡカラムを用いて抗体断片を回収した。これは、固定化プロテインＡカラムを開いて行う。気泡がゲル中に入らないよう注意する。保存溶液（０．０２％アジ化ナトリウムを含有）を捨てる。
【０１９６】
次に、１２ｍｌの結合緩衝液（ImmunoPure調製キット中に含まれる）を用いて、固定化プロテインＡカラムを平衡化させた。次に、キット中に含まれる１７×１００ｍｍ試験管にカラムを移して（標識化「Ｆ（ａｂ’）2」）、溶離液を回収した。
【０１９７】
３ｍｌの粗消化物を次にカラムにアプライし、ゲル中に完全に流した。AffinityPak  カラムの使用は、これらのカラムが、そのレベルがトップフリットに達すると自動的に流動を停止するので、望ましい。
【０１９８】
次に６ｍｌの結合緩衝液を用いてカラムを洗浄する。 Ｆ（ａｂ’）2断片を含有する溶離液を次に回収する。この溶離液は、プロテインＡとは結合し得ない（プロテインＡカラムに結合されない）小Ｆｃ断片も含有する。しかしながら、その実質的部分は、透析により排除された。
【０１９９】
透析は、 Ｆ（ａｂ’）2含有溶離液をとり、小Ｆｃ断片夾雑物を排除するために５０，０００の分子量カットオフを有する透析チューブ（Spectra Pur. カタログ番号１３２  １２８）を用いて、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水に対して溶離液を透析することにより行った。
【０２００】
これにより、０．７０７の２８０ｎｍの光学密度を有するＦ（ａｂ’）2断片が生じた（６ｍｌ）。透析、およびCentricon-50濃縮機（Amiconカタログ番号４２２５）による濃縮後、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierceカタログ番号２３２２４）を用いて、タンパク
質含量に関して２Ｃ８  Ｆ（ａｂ’）2生成物をアッセイした。タンパク質含量は、３．７６ｍｇ／ｍｌであることが判明した。
【０２０１】
２Ｃ８  Ｆ（ａｂ’）2をＩｇＥ抑制活性に関してアッセイし、前記と同じin vitroでのアッセイではＩｇＥ産生の抑制は実質的に不可能である、ということが判明した。これらの結果は、図６に含まれる。実際、 Ｆ（ａｂ’）2は、モノクローナル抗体２Ｃ８による誘導性ＩｇＥの抑制効果と拮抗する、ということが判明した。これらの結果を図７に示す。
【０２０２】
実施例３
霊長類モノクローナル６Ｇ５のＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)γ１およびγ４Ｐバージョンをともに、前記のＳＣＩＤマウスモデルにおけるin vivoでの誘導性ＩｇＥ産生の抑制に及ぼす効果に関して評価した。ｐ５Ｅ８Ｇ１Ｎ−は、誘導性ＩｇＥの抑制において霊長類５Ｅ８と同様に有効であることが判明した（図８および９参照）。霊長類６Ｇ５も霊長類化ｐ６Ｇ５Ｇ４Ｐもin vivoでの誘導性ＩｇＥの抑制では有効でなかったが、一方、霊長類化ｐ６Ｇ５Ｇ１は誘導性ＩｇＥ産生を抑制した（図９および１０参照）。これらの結果は、活性Ｆｃ領域が、誘導性ＩｇＥ産生を有効に抑制する抗ヒトＣＤ２３抗体の能力において重要である、という本発明者らの結論をさらに実証する。
【０２０３】
提案されるメカニズム
本発明の結果は、活性Ｆｃ領域が誘導性ＩｇＥ産生を有効に抑制する抗ヒトＣＤ２３抗体の能力において重要であることを決定的に実証するが、しかし分子メカニズムは明らかにされていない。しかしながら、いくつかの仮説が考えられ得る。
【０２０４】
第一は、本発明の抗ＣＤ２３抗体は、Ｂ細胞受容体を抗ＢＣＲγ１抗体で架橋することにより外見上誘導されるのと同様にシグナル伝達経路を誘導するように機能するというものであろう。この場合の抗原受容体シグナリングのダウンレギュレーションは、同一Ｂ細胞上のＦｃγＲＩＩと表面Ｉｇ（Ｂ細胞受容体）のコライゲーションに起因して、Ｉｇ発現のダウンレギュレーションを生じると仮定されている（D’Ambrosia et al., 1995, Science, 268:293-297; Ono et al., 1997, Cell 90:293-301）。実際、ＣＤ２３はＩｇＥ発現Ｂ細胞の表面でアップレギュレーションされ、したがって、γ１定常領域を介してのＣＤ２３とＦｃγＲＩＩ−Ｂ受容体のコライゲーションは同様のシグナル伝達経路を生じることが可能となる。
【０２０５】
あるいは、誘導性ＩｇＥ発現の抑制が、別の細胞型、即ちキラーＴ細胞上でＦｃ領域が適切なＦｃγＲ受容体と相互作用するのと同時に、Ｂ細胞上での表面ＩｇＥの架橋により起きていて、これは次に、Ｂ細胞がアポトーシスを受けるよう「指示」するか、または何らかの他の方法（即ち食作用）で細胞死をもたらすのかもしれない。例えば、米国特許第５，５４３，１４４号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、抗ＩｇＥ抗体によるＩｇＥ発現Ｂ細胞の抑制に関する同様のメカニズムを提案する。そこに考察されているように、あるＩｇＧのサブクラスの抗体、例えばマウスＩｇＧ２ａならびにヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ある種のＦｃ受容体保有食細胞性白血球により実行されるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）を媒介し得る。例えば、ヒトＴ細胞表面抗原に特異的なマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体であるＯＫＴ３（これは治療薬としての販売に関してＦＤＡに認可された最初のモノクローナル抗体製品であった）は、血液中のＴ細胞の迅速な涸渇を提供するために、そして免疫抑制状態を誘導するために（腎移植のために）、患者に用いられる（Russell, P.S. et  al., Transpl. Proc. 17:39-41（1985））。ＯＫＴ３は、５ｍｇ／日／被験者の用量で、循環Ｔ細胞を完全に涸渇させ得る。米国特許第５，５４３，１４４号に記載されたモノクローナル抗体は、特にマウスγ２ａ抗体あるいはヒトγ１またはγ３鎖を保有するヒトまたはヒト化抗体の形態では、同様の方法で
ＡＤＣＣメカニズムによりＩｇＥ発現Ｂ細胞を涸渇させることが提案される。
【０２０６】
しかし抗ＣＤ２３抗体を用いてＩｇＥ発現を抑制するための実際の分子メカニズムが何であれ、抗ＣＤ２３抗体のＦｃ領域、したがってエフェクター機能が重要な要件であるということは明らかである。前記のように、補体は本発明のin vitroアッセイ中には存在しないため、その現象は１つ以上のＦｃγＲ受容体を必要とすると考えられる。関連分子成分が同定されれば、そしてシグナル伝達経路に関与する分子が細胞に対して内部に含まれれば、誘導性ＩｇＥ発現を抑制するために用い得る他の治療薬を設計することも可能である。
【０２０７】
有用性
ＩｇＥ産生を有効に抑制するそれらの能力のために、ヒトγ１定常ドメインを含む本発明抗ヒトＣＤ２３抗体、そしてγ３を含有して構築され得るものは、ＩｇＥ産生の抑制が治療的に望ましいあらゆる疾患の治療に有効である。このような疾患としては、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患が挙げられる。
【０２０８】
本発明抗ＣＤ２３ヒトγ１／γ３定常ドメイン含有抗体の投与により潜在的に治療可能な特定の症状としては、以下のものが挙げられる。
【０２０９】
アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アレルギー性鼻炎および結膜炎自己免疫溶血性貧血；黒色表皮肥厚症；アレルギー性接触皮膚炎；アジソン病；アトピー性皮膚炎；円形脱毛症；全身性脱毛症；アミロイドーシス；アナフィラキシー様紫斑病；アナフィラキシー様反応；再生不良性貧血；血管性水腫（遺伝性）；血管性水腫（特発性）；強直性脊椎炎；動脈炎（頭蓋）；動脈炎（巨細胞性）；動脈炎（高安）；動脈炎（側頭）；喘息；毛細血管拡張性運動失調；自己免疫卵巣炎；自己免疫精巣炎；自己免疫多発性内分泌腺不全；ベーチェット病；ベルガー病；バージャー病；気管支炎；水疱性天疱瘡；カンジダ症；慢性粘膜皮膚；キャプラン症候群；心筋梗塞後症候群；心嚢切開後症候群；心臓炎；セリアックスプルー；シャーガス病；チェディアック−東症候群；チャーグ−ストラウス病；コーガン症候群；寒冷凝集素病；ＣＲＥＳＴ症候群；クローン病；クリオグロブリン血症；原因不明の繊維化肺胞炎；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；真性糖尿病；ダイアモンド−ブラックファン症候群；ディ・ジョージ症候群；円板状エリテマトーデス；好酸球性筋膜炎；上強膜炎；持久性隆起性紅斑；有縁性紅斑；多形性紅斑；結節性紅斑；家族性地中海熱；フェルティ症候群；肺繊維症；糸球体腎炎（アナフィラキシー様）；糸球体腎炎（自己免疫）；糸球体腎炎（連鎖球菌後）；糸球体腎炎（移植後）；糸球体症（膜性）；グッドパスチャー症候群；対宿主性移植片病；顆粒球減少症（免疫媒介性）；環状肉芽腫；肉芽腫症（アレルギー性）；肉芽腫性筋炎；グレーブズ病；橋本甲状腺炎；新生児溶血性疾患；ヘモクロマトーシス（特発性）；ヘーノホ−シェーンライン紫斑病；肝炎（慢性活動性および慢性進行性）；原因不明性組織球増殖症；好酸球増多症候群；特発性血小板減少性紫斑病；ヨブ症候群；若年性皮膚筋炎；若年性慢性関節リウマチ（若年性慢性関節炎）；川崎病；角膜炎；乾性角結膜炎；ランドリー−ギラン−バレー−ストロール症候群；らい病（らい腫）；レフラー症候群；狼瘡；ライエル症候群；ライム病；リンパ腫様肉芽腫症；肥満細胞症（全身性）；混合型結合組織病；多発性単神経炎；マックル−ウェルズ症候群；皮膚粘膜リンパ節症候群；皮膚粘膜リンパ節症候群；多中心性細網組織球症；多発性硬化症；重症筋無力症；菌状息肉腫；壊死性脈管炎（全身性）；ネフローゼ症候群；オーバーラップ症候群；皮下脂肪組織炎；発作性寒冷血色素尿症；発作性夜間血色素尿症；類天疱瘡；天疱瘡；紅斑性天疱瘡；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；鳩飼育者病；肺炎（過敏性）；結節性多発性動脈炎；リウマチ性多発性筋痛；多発性筋炎；多発性神経炎（特発性）；ポルトガル家族性多発性ニューロパシー；子癇前症／子癇；原発性胆汁性肝硬変；進行性全身性硬化症（強皮症）；乾癬；乾癬性関節炎；肺胞タンパク質症；肺繊維症（レイノー現象／症候群）；リーデル甲状腺炎；ライター症候群、再発性多発性軟骨炎；リウマ
チ熱；慢性関節リウマチ；サルコイドーシス；強膜炎；硬化性胆管炎；血清病；セザリー症候群；シェーグレン症候群；スティーブンズ−ジョンソン症候群；スティル病；亜急性硬化性汎脳炎；交感性眼炎；全身性紅斑性狼瘡；移植片拒否反応；潰瘍性結腸炎；未分化結合組織病；じんま疹（慢性）；じんま疹（寒冷）；ブドウ膜炎；白斑；ウェーバー−クリスチャン病；ヴェーゲナー肉芽腫症；ヴィスコット−オールドリッチ症候群。
【０２１０】
これらのうち、抗ＣＤ２３抗体の投与により治療可能なまたは予防可能な好ましい適応症としては、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アトピー性皮膚炎；湿疹；ヨブ症候群、喘息；アレルギー症状；ならびに慢性炎症性疾患および症状、例えばＣＬＬ慢性リンパ性白血病が挙げられ、これらは典型的には高レベルの膜ＣＤ２３および高循環レベルのｓＣＤ２３を特徴とする（Sarfati et al., Blood 71:94-98（1988））。
【０２１１】
治療効果を生じるのに有用な抗体の量は、当業者に周知の標準技法により決定し得る。抗体は、一般的には製薬上許容可能な緩衝液内で標準技法により提供され、あらゆる所望の経路により投与され得る。現在特許請求されている抗体の効能およびそれらのヒトによる寛容性のために、ヒトの種々の疾患または疾病状態に対抗するために、これらの抗体を反復的に投与することができる。
【０２１２】
当業者は、ルーチン的な実験により、アレルギー性疾患および炎症性症状に効果を及ぼすために有効な抗体の非毒性量を決定し得る。しかしながら、一般に、有効用量は約０．０５〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲であろう。
【０２１３】
本発明の抗体は、治療的または予防的な程度にこのような効果を生じるのに十分な量で前記の治療方法にしたがってヒトまたは他の動物に投与し得る。本発明のこのような抗体は、既知の技術により本発明の抗体を従来の製薬上許容可能な担体または希釈剤と組合せることによって調製される従来の投与形態で、このようなヒトまたは他の動物に投与し得る。製薬上許容可能な担体または希釈剤の形態および特性は、組み合わされる有効成分の量、投与経路およびその他の周知の可変要因により決定される、と当業者には認識されるであろう。
【０２１４】
本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入あるいは局所的であってもよい。非経口という用語は、本明細書中で用いる場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣または腹腔内投与を含む。静脈内形態の非経口投与が、一般に好ましい。
【０２１５】
予防的または治療的に免疫抑制を誘導するために本発明の化合物を用いるための毎日の非経口および経口用量レジメンは、一般的に、約０．０５〜１００、好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲である。
【０２１６】
本発明の抗体は、吸入によっても投与され得る。「吸入」とは、鼻腔内または経口吸入投与を意味する。このような投与のための適切な投与形態、例えばエアロゾル処方物または計量用量吸入器は、従来の技術により調製され得る。用いられる本発明の化合物の好ましい投与量は、一般に、約１０〜１００ｍｇの範囲内である。
【０２１７】
本発明の抗体は、局所的にも投与し得る。局所投与とは非全身性投与を意味し、その例としては、表皮への外部的な、口腔への本発明の抗体（またはその断片）化合物の適用、そして耳、眼および鼻へのこのような抗体の滴注が含まれるが、これらの場合、本発明の抗体は血流中に有意に流入しない。全身性投与とは、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。治療的または予防的効果に必要な抗体の量は、もちろん、選択される抗体、治療される症状の性質および重症度、ならびに治療を受ける動物によって変わり、最終的には医師の裁量である。本発明の抗体の適切な局所用量は、一般に、約１〜１００ｍ
ｇ／体重１ｋｇ／日の範囲である。
【０２１８】
組成物
抗体又はその断片は単独で投与され得るが、しかし製剤組成物として与えるのが好ましい。有効成分は、局所投与に関しては、組成物の０．００１％〜１０％ｗ／ｗ、例えば１〜２重量％を構成し得る。組成物の１０％ｗ／ｗ程度であってもよいが、好ましくは５％ｗ／ｗを超えない量、さらに好ましくは０．１％〜１％ｗ／ｗを構成し得る。
【０２１９】
本発明の局所組成物は有効成分を、そのための１つ以上の担体および任意のあらゆるその他の治療的成分と一緒に含む。担体は、組成物の他の成分と相溶性であり、その受容者に有害であってはならないという意味で「許容可能」でなければならない。
【０２２０】
局所投与に適した組成物としては、皮膚を通して治療が必要な部位に浸透するのに適した液体または半液体調製物、例えばリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、そして眼、耳または鼻に投与するのに適した点滴剤が挙げられる。
【０２２１】
本発明の点滴剤は、滅菌水性または油性の溶液または懸濁液を含み、殺細菌および／または殺真菌剤、および／またはあらゆるその他の適切な防腐剤の、そして好ましくは界面活性剤を含有する適切な水性溶液中に有効成分を溶解することにより調製し得る。その結果生じた溶液を、次に濾過して透明にして、適切な容器に移し、次にこれを密封して、オートクレーブ処理、または９０℃〜１００℃での３０分間の保持により滅菌する。あるいは、溶液を濾過により滅菌し、無菌的技法により容器に移すこともできる。点滴剤中に含めるのに適した殺細菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒としては、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
【０２２２】
本発明のローションとしては、皮膚または眼に適用するのに適したものが挙げられる。眼用ローションは、任意に殺細菌剤を含有する滅菌水性溶液を含み、点滴剤の調製の場合と同様の方法により調製し得る。皮膚に適用するためのローションまたはリニメント剤は、乾燥を促進し、皮膚を冷却するための薬剤、例えばアルコールまたはアセトン、および／またはモイスチャライザー、例えばグリセロール、あるいは油、例えばヒマシ油または落花生油も含む。
【０２２３】
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは、外用のための有効成分の半固体組成物である。それらは、適切な機械の助けを借りて、微細または粉末化形態で、単独で、あるいは水性または非水性流体中の溶液または懸濁液で、有効成分を油脂性または非油脂性基剤と混合することにより製造し得る。基剤は、炭化水素、例えば硬質、軟質または液体パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸；粘漿剤；天然起源の油、例えばアーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油；羊毛脂またはその誘導体、あるいは脂肪酸、例えばステアリン酸またはオレイン酸を、アルコール、例えばプロピレングリコールまたはマクロゲルと一緒に含み得る。組成物は、あらゆる適切な界面活性剤、例えば、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を混入し得る。懸濁剤、例えば天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質、例えば石英シリカ、およびその他の成分、例えばラノリンも含まれ得る。
【０２２４】
本発明の抗体又はその断片の個々の投与の最適量および間隔は、治療される症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、そして治療される特定の動物によって決定され、このような最適条件は従来の技法により決定され得ると、当業者には認識されるであ
ろう。治療の最適経過、即ち定められた日数の間の１日当たりに投与される本発明の抗体またはその断片の投与回数は、治療測定試験の慣用的経過を用いて当業者に確認され得ることも、当業者には理解されるであろう。
【０２２５】
これ以上記述することなく、当業者は、前記の説明を用いて、その最高に十分な程度に本発明を利用し得ると考えられる。したがって、以下に本発明を説明するための実施例を示すが、それらはいかなる点でも本発明の範囲を限定するもではない。
【０２２６】
カプセル組成物
粉末化形態の５０ｍｇの本発明の抗体又はその断片、１００ｍｇのラクトース、３２ｍｇのタルクおよび８ｍｇのステアリン酸マグネシウムを標準的な２片硬質ゼラチンカプセルに充填することにより、カプセル形態の本発明の医薬組成物を調製する。
【０２２７】
注射用非経口組成物
１０ｋの容量のプロピレングリコールおよび水の中で１．５ｋの重量の本発明の抗体又はその断片を攪拌することにより、注射により投与されるのに適した形態の本発明の医薬組成物を調製する。この溶液は濾過により滅菌される。
【０２２８】
軟膏組成物
本発明の抗体又はその断片        １０ｇ
白色軟質パラフィンで全量を１００．０ｇにする。
【０２２９】
本発明の抗体又はその断片を小容量のビヒクル中に分散させて、平滑、均質な物質を生成する。次に折り畳み可能な金属チューブに分散物を充填する。
【０２３０】
局所クリーム組成物
本発明の抗体又はその断片              １．０ｇ
ポラワックス（Polawax）ＧＰ２００   ２０．０ｇ
無水ラノリン                          ２．０ｇ
白色蜜蝋                              ２．５ｇ
メチルヒドロキシベンゾエート          ０．１ｇ
蒸留水                全量を１００．０ｇにする量
【０２３１】
ポラワックス、蜜蝋およびラノリンを一緒に６０℃に加熱する。メチルヒドロキシベンゾエートの溶液を添加し、高速攪拌により均質化する。次に温度をＳＯＯＣに下げる。本発明の抗体またはその断片を次に添加し、全体に分散させて、ゆっくり攪拌しながら組成物を冷却させる。
【０２３２】
局所ローション組成物
本発明の抗体又はその断片                  １．０ｇ
ソルビタンモノラウレート                  ０．６ｇ
ポリソルベート２０                        ０．６ｇ
セトステアリルアルコール                  １．２ｇ
グリセリン                                ６．０ｇ
メチルヒドロキシベンゾエート              ０．２ｇ
精製水B.P.                  全量を１００．００ｍｌとする量
（B.P.= 英国薬局方）
【０２３３】
メチルヒドロキシベンゾエートおよびグリセリンを７５℃で水７０ｍｌに溶解する。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート２０およびセトステアリルアルコールを７５℃
で一緒に溶融させて、水性溶液に添加する。その結果生じるエマルジョンを均質化し、連続攪拌しながら冷却させて、本発明の抗体又はその断片を、残りの水中に入れた懸濁液として添加する。全懸濁液を均質化するまで攪拌する。
【０２３４】
点眼剤組成物
本発明の抗体又はその断片                  ０．５ｇ
メチルヒドロキシベンゾエート              ０．０１ｇ
プロピルヒドロキシベンゾエート            ０．０４ｇ
精製水B.P.                  全量を１００．００ｍｌとする量
【０２３５】
メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエートを７５℃で精製水７０ｍｌに溶解し、その結果生じる溶液を冷却させる。本発明の抗体又はその断片を次に添加し、膜フィルター（孔サイズ０．０２２Ａｍ）を通して濾過により溶液を滅菌し、適切な滅菌容器に無菌的に充填する。
【０２３６】
吸入による投与のための組成物
容量１５〜２０ｍｌのエアロゾル容器用には、本発明の抗体又はその断片１０ｍｇを０．２〜０．５ｋの滑剤、例えばポリソルベート８５またはオレイン酸と混合し、このような混合物を噴射剤、例えばフレオン中に、好ましくは（１，２ジクロロテトラフルオロエタン）およびジフルオロクロロメタンの組合せ中に分散し、鼻腔内または口腔吸入投与に適合する適切なエアロゾル容器中に入れる。容量１５〜２０ｍｌのエアロゾル容器用の吸入投与組成物については、エタノール（６〜８ｍｌ）中に本発明の抗体又はその断片１０ｍｇを溶解し、０．１〜０．２ｋの滑剤、例えばポリソルベート８５またはオレイン酸を添加し、これを噴射剤、例えばフレオン中に、好ましくは（１，２ジクロロテトラフルオロエタン）およびジフルオロクロロメタンの組合せ中に分散し、鼻腔内または口腔吸入投与に適合する適切なエアロゾル容器中に入れる。
【０２３７】
非経口投与可能な抗体組成物
本発明の抗体および医薬組成物は、非経口投与、即ち皮下、筋肉内または静脈内投与に特に有用である。非経口投与用組成物は一般に、許容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解された本発明の抗体又はその混合物の溶液を含む。種々の水性担体、例えば水、緩衝化水、０．４ｋ食塩水（通常生理食塩水）、０．３％グリシンなどが用いられる。通常の生理食塩水の使用が好ましい。これらの溶液は滅菌され、一般に粒状物質を含有しない。これらの溶液は、従来の周知の滅菌法により滅菌し得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤等のような生理学的条件に近づけるのに必要とされるような製薬上許容可能な補助物質を含有し得る。このような医薬組成物中の本発明の抗体又はその断片の濃度は、広範に変わり得る。このような濃度は、選択される特定の投与様式によって、主に、流体容積、粘度などを基礎にして選択される。一般に、適切な静脈内用濃度は、約１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【０２３８】
したがって、静注用の本発明の医薬組成物は、４０〜５０ｍｇの本発明の抗ヒトＣＤ２３抗体を含有する通常の生理食塩水１０ｍＬを含む。非経口投与用組成物の製造方法は周知であり、当業者には明らかであって、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science,
15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）にさらに詳細に記載されている。
【０２３９】
本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で再構成し得る。この技術は従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野で既知の凍結乾燥および再構成技術を用い得る。
【０２４０】
意図される結果によって、本発明の医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。治療的適用では、組成物はすでに病気に罹患している患者に、疾病およびその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与され得る。予防的適用では、本発明の抗体又はその混合物を含有する組成物は、未だ疾病状態にない患者に患者の耐性を増強するために投与される。
【０２４１】
治療する医師によって選択される投与レベルおよびパターンを用いて医薬組成物は１回または多数回投与される。あらゆる場合に、本発明の医薬組成物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の抗ＣＤ２３抗体を提供すべきである。
【０２４２】
本発明の抗体は、抗体と同一の治療に有用であると思われるペプチドまたは非ペプチド化合物（模倣物）のいずれかの設計および合成のために用い得る、ということも留意すべきである（例えば、Saragovi et al., Science, 253:792-795（1991）参照）。
【０２４３】
本発明の特定の実施態様を説明のためにここに記載してきたが、前記から、本発明の範囲を逸脱しない限りは、種々の修正が成され得る、と理解されるであろう。したがって、本発明は添付の請求の範囲に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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