(57)【要約】【課題】本発明は、炭酸ガス吸収材料及びそれを用いる炭酸ガスの吸収方法の提供。【解決手段】２−アルケナールリダクターゼを過剰発現する植物体を含む、炭酸ガス吸収材料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アルケナールリダクターゼを過剰発現する植物体を含む、炭酸ガス吸収材料。
【請求項２】
植物体が、タバコである、請求項１に記載の炭酸ガス吸収材料。
【請求項３】
２−アルケナールリダクターゼがシロイヌナズナに由来する、請求項２に記載の炭酸ガス吸収材料。
【請求項４】
植物体が、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１４又はＰ１＃１８である、請求項３に記載の炭酸ガス吸収材料。
【請求項５】
２−アルケナールリダクターゼを過剰発現する植物体を用いることを含む、炭酸ガスの吸収方法。
【請求項６】
植物体が、タバコである、請求項５に記載の炭酸ガスの吸収方法。
【請求項７】
２−アルケナールリダクターゼがシロイヌナズナに由来する、請求項６に記載の炭酸ガスの吸収方法。
【請求項８】
植物体が、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１４又はＰ１＃１８である、請求項７に記載の炭酸ガスの吸収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭酸ガス吸収材料及びそれを用いる炭酸ガスの吸収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の食糧とバイオ燃料の需要は増大しており、バイオマス生産性の向上は農学にとってますます重要な課題になっている。作物生産は乾燥、高・低温、強光、紫外線などの環境ストレスにより大きく阻害されている。環境ストレス耐性が向上した作物の開発が望まれている。
【０００３】
また、炭酸ガスの増大による弊害とくに地球温暖化の問題が指摘されている。日本の炭酸ガス 排出量は全世界の５％を占めると言われ、毎年膨大な量の炭酸ガスが大気中に排出されている。したがって、炭酸ガスの効率的な吸収方法の開発が待たれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、炭酸ガス吸収材料及びそれを用いる炭酸ガスの吸収方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、酸化的ストレスに対する耐性が向上した２−アルケナールリダクターゼ（2-alkenal reductase: ＡＥＲ）過剰発現植物が、炭酸ガス吸収能力も向上していることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］２−アルケナールリダクターゼを過剰発現する植物体を含む、炭酸ガス吸収材料。
［２］植物体が、タバコである、上記１に記載の炭酸ガス吸収材料。
［３］２−アルケナールリダクターゼがシロイヌナズナに由来する、上記２に記載の炭酸ガス吸収材料。
［４］植物体が、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１４又はＰ１＃１８である、上記３に記載の炭酸ガス吸収材料。
［５］２−アルケナールリダクターゼを過剰発現する植物体を用いることを含む、炭酸ガスの吸収方法。
［６］植物体が、タバコである、上記５に記載の炭酸ガスの吸収方法。
［７］２−アルケナールリダクターゼがシロイヌナズナに由来する、上記６に記載の炭酸ガスの吸収方法。
［８］植物体が、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１４又はＰ１＃１８である、上記７に記載の炭酸ガスの吸収方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の植物材料は、環境中の炭酸ガスを効率的に吸収することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】強光および弱光照射による光合成活性の変化である。強光は、２０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓであり、弱光は、１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓである。
【図１−２】強光および弱光照射による光合成活性の変化である。強光は、１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓであり、弱光は、１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓである。
【図２】ＣＯ２吸収の時間変化である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の２−アルケナールリダクターゼは、以下の特性を有する。国際生化学分子生物学連合の酵素委員会に、ＥＣ１．３．１．７４として登録されている。また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存アルケナール／オンオキシドリダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：２−アルケナールα，β−ヒドロゲナーゼとも呼ばれる。触媒する反応は、ｎ−アルカナール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋＝アルクー２−エナール＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋である。４−ヒドロキシノン−２−エナール及びノン−２−エナールに極めて特異的である。短鎖の２−アルケナールには、親和性が低い。but−３−エン−２−オンやpent−３−エン−２−オンのような２−アルケノンについても高い活性を示す。α，β−不飽和アルデヒド及びケトンの解毒に関与する。
【００１０】
シロイヌナズナの２−アルケナールリダクターゼ（ＡＥＲ）をコードする遺伝子は、シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａエコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ−０の遺伝子Ａｔ５ｇ１６９７０である。この遺伝子の完全長ｃＤＮＡ（クローン番号ＲＡＦＬ−０５−１１−Ｉ０２）は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターで購入できる。
【００１１】
ＡＥＲ完全長ｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、バイナリベクターｐＧＳＶＥ９のＸｂａＩ部位に挿入する。このバイナリベクターのＴ−ＤＮＡ領域には、挿入遺伝子を駆動するため挿入部位上流にカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、および選抜マーカーとなるハイグロマイシン耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼＣＤＳ）とそれを駆動するノパリンシンターゼプロモーターを有する。ＡＥＲ遺伝子を挿入したバイナリベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５１Ｃ１Ｒｉｆｒ（ｐＧＶ２２６０）株に導入し、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５１Ｃ１Ｒｉｆｒ（ｐＧＶ２２６０；ｐ３５ＳＰ１Ｓ）株を得る。タバコＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１株から得たリーフディスクとＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５１Ｃ１Ｒｉｆｒ（ｐＧＶ２２６０；ｐ３５ＳＰ１Ｓ）とを共培養し、Ｔ−ＤＮＡが導入されたタバコカルスを得る。このカルスから再分化させた個体のＲＮＡゲルブロットハイブリダイーションによりＡＥＲ遺伝子の発現レベルの高い個体を選抜する。自家受粉により得られた第二世代から種子を採取し、一部の種子をハイグロマイシンを含む無菌培地で発芽させる。種子がすべてハイグロマイシン耐性を示した第二世代はホモ接合体であり、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１４およびＰ１＃１８の３系統が得られた。これらの種子を採取し、使用する。
【００１２】
植物体Ｐ１＃１８は、平成２１年２月２日付けで、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７６２である。
【実施例】
【００１３】
シロイヌナズナの２−アルケナールリダクターゼ（ＡＥＲ）は、２−アルケナールのα，β不飽和結合を還元する。ＡＥＲ過剰発現タバコは、細胞質でＡＥＲを過剰発現しており、この植物はコントロール株に比べて、酸化的ストレス（強光ストレス、ＭＶストレス、オゾンストレス、ＵＶ−Ｂストレス）の耐性が向上することが分かっている）。
【００１４】
また、ＡＥＲ過剰発現タバコは、強光照射による光化学系II（ＰＳII）の失活が軽微であることから、ＰＳIIの失活または強光による細胞死に、２−アルケナールが関与していると考えられる。
【００１５】
１．強光照射によるＡＥＲ過剰発現タバコ株のＰＳII活性の変化
ＡＥＲ過剰発現タバコ
カリフラワーモザイクウイルスの強力な構成的プロモーター３５ｓの制御下にあるバイナリーベクターｐＧＳＣ１７０５のＮｏｔ１−Ｎｏｔ１フラグメントにシロイヌナズナに由来するＡＥＲのｃＤＮＡを導入した。このベクターは遺伝子マーカーとしてヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を持つ。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５１Ｃ１  ＲｉｆＲ〔ｐＧＶ２２６０〕とＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１の葉を用いた標準的なアグロバクテリウム−リーフディスクトランスフォーメーションを行った。トランスジェニック植物は３０ｍｇ／ＬヒグロマイシンＢを含むＭＳプレートにおけるカルスの形成、生育能力によって選別した。選別後、植物を土に移し生育させた。
【００１６】
＜材料＞
タバコの植物体として、コントロール（ベクターのみ）、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１４、Ｐ１＃１８を用いた。
週齢は、１３週齢であり、明期１２時間及び暗期１２時間の条件下で生育させた。
【００１７】
タバコの栽培条件
バットにバーミキュライトを平らに敷き詰め、端から静かに水を注ぎ、湿った土に均一にタバコを播種した。上からラップをして光（１００−１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）の下で育て、播種後４週目に５００倍希釈したハイポネックス（登録商標）を染み込ませた土を入れたプラスチックポットに植え替えた。
【００１８】
＜方法＞
タバコの植物体に葉がついたままの状態で暗黒下に５分おき、葉の一部をＭＩＮＩ−ＰＡＭでＰＳＨの量子収率（Ｆｖ／Ｆｍ）を測定し、その後、１時間、２０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を照射した。その後暗黒下に５分間置き、ＭＩＮＩ−ＰＡＭで光照射の中心部と弱光（１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）照射部について、それぞれＦｖ／Ｆｍを測定し、再び１時間２０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を照射した。これを繰り返し、３時間後までＦｖ／Ｆｍを測定した（図１−１）。また、強光を１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓに変えて同様の実験を行った（図１−２）。
【００１９】
２０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強光照射後のタバコ葉におけるＰＳＨ活性の時間変化は、いずれの株でも弱光（１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）照射部の活性は低下しなかった。強光照射部では、コントロール株で最も活性が低下し、３時間までは急な低下は見られず、同じ割合で低下が見られた。コントロール株に比べるとＡＥＲ過剰発現タバコのＰＳＨ活性の低下が軽微だった。また、１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強光照射後のタバコ葉におけるＰＳII活性の時間変化は、弱光（１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）照射部の活性は同様にいずれの株でも低下しなかった。強光照射部では、コントロール、Ｐ１＃１４、Ｐ１＃１８は、２０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強光照射とほぼ同様の結果を示したが、光が弱かったために全体的に低下は緩やかで、特に１時間後のＰＳII活性ではあまり差が見られなかった。
【００２０】
またＰ１＃１１は、特に耐性が強くＰＳII活性の低下があまり見られなかった。今回の実験から、１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強光照射でもコントロールとＡＥＲ過剰発現タ
バコのＰＳｌ活性に差が出ることが分かったが、光が弱いために照射１時間の葉ではあまり差が見られない可能性が高いので２０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強光ストレスで実験を行った。
【００２１】
光合成は植物やシアノバクテリアの持つ代謝系で、光エネルギーで水を光分解し酸素を発生する過程で作られるＡＴＰとＮＡＤＰＨを利用して、二酸化炭素をグルコースなどの有機化合物に固定する。光化学反応とカルビン回路に分けられる光合成過程のうち炭酸固定反応を持つのはカルビン回路である。光合成の炭酸固定の律速の原因となっているのは、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）である。この酵素反応の効率の悪さ・およびこの酵素によるオキシゲナーゼ反応から始まる光呼吸（二酸化炭素の放出）が炭酸固定の効率を低下させる。光呼吸とは、Ｒｕｂｉｓｃｏのオキシゲナーゼ作用で生成するホスホグリコール酸の代謝によるグリコール酸回路でのＯ２吸収とＣＯ２発生の現象でＲｕｂｉｓｃｏ周辺にＣＯ２が不足する条件、つまり強光・低ＣＯ２・高Ｏ２・高温下で顕著となる。ＣＯ２が不足したままではカルビン回路が回らず、光化学系で生じた還元力、プロトン勾配、ＡＴＰが消費されず、この条件下では光エネルギーは活性酸素を生成し光合成装置を破壊することになるので、Ｏ２を消費しＣＯ２を発生する光呼吸は活性酸素の過剰な発生を抑制し、光阻害を回避する機能を持つといわれている。
【００２２】
ＡＥＲ過剰発現タバコ株の強光耐性の仕組みを調べるために、ＰＳIIの量子収率を測定した結果から、光の強度が強くなるほどコントロール株に比べてＡＥＲ過剰発現株の電子伝達速度は大きくなった。相物に光が当たると、光エネルギーはＰＳIIで、熱あるいは電子伝達に変換される。前の実験で測定した電子伝達速度とはＰＳIIからＰＳＩに流れる電子、つまり電子を受容するカルビン回路と光呼吸を足したものである。光呼吸は、Ｒｕｂｉｓｃｏ周辺にＣＯ２が不足する条件で顕著となるので、最大電子伝達速度がコントロール株に比べてＡＥＲ過剰発現株のほうが高いという結果が炭酸固定と光呼吸どちらかによるものかを区別するためにＣＯ２濃度を変えて炭酸固定速度の測定を行った。
【００２３】
ＣＯ２濃度３５０ｐｐｍは、ほぼ大気の濃度に等しく、炭酸固定のＣＯ２発生と光呼吸のＣＯ２吸収が合わさって実際よりも低い炭酸固定のＣＯ２吸収速度が測定される。またＣＯ２濃度２０００ｐｐｍでは、光呼吸が抑制されるので炭酸固定のＣＯ２吸収速度のみが測定される。
【００２４】
本実験の目的は、ＡＥＲ過剰発現株において、強光での電子伝達活性が高いのは、カルビン回路での炭酸固定能力または光呼吸活性がコントロール株に比べて高いのではないかという仮説を実証するために、ストレスを与える前のＡＥＲ過剰発現株とコントロール株で２つのＣＯ２濃度条件で、炭酸固定で消費されるＣＯ２吸収速度を比較した。
【００２５】
〈材料〉
タバコの植物体（コントロール、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１８）
１０週齢・光強度１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ・明期１６時間、暗期８時間
炭酸固定の測定装置（ＧＦＳ−３０００ガス交換蛍光システム）
タバコの植物体（コントロール、Ｐ１＃１４）
８、９週齢・光強度１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ・明期１６時間、暗期８時間
炭酸固定の測定装置（ＨＣＭ−１０００ガス交換蛍光システム）
【００２６】
〈方法〉
タバコの葉の気孔を開かせるために、２０％Ｏ２、１０００ｐｐｍＣＯ２、光強度５６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓで３０分置いた。３５０ｐｐｍＣＯ２（大気の濃度にほぼ等しい）に下げ、光強度０にして値が安定するまで５分待ち、光強度０の値を５分間測定し、光強度を４５、９０、１６０、３００、４５０、８５０、１３５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓで５分ごとに上げ、ＣＯ２吸収量を測定した。これと同時に葉のＦｖ／Ｆｍ値、ΔＦ／Ｆｍ’を計測した。同様の実験を、測定する時のＣＯ２濃度を３５０ｐｐｍから２０００ｐｐｍに変えて行った。
コントロール、Ｐ１＃１１、Ｐ１＃１８は、ＧＦＳ−３０００ガス交換蛍光システムで測定し、コントロール、Ｐ１＃１４は、ＨＣＭ−１０００ガス交換蛍光システムで測定した。
【００２７】
その結果、図２に示すように、光強度を上げるとＣＯ２吸収量は増加した。これは、すべての株でほぼ同様の結果が得られた。
【００２８】
全ての株で最大の炭酸固定速度までは、光に依存して吸収速度は高くなり、最大に達すると一定になった。３５０ｐｐｍでは、ＡＥＲ過裂発現株のほうが光飽和時に高いＣＯ２吸収速度を示した。２０００ｐｐｍでは光呼吸のＣＯ２発生分だけコントロール株でもＡＥＲ過剰発現株でもＣＯ２吸収速度が高くなった。しかし、その割合をみてみるとＡＥＲ過剰発現株のほうが光飽和時に１．４〜２．２倍高いＣＯ２吸収速度を示した。
【００２９】
ＣＯ２吸収に対応する気孔伝導度（気孔の開閉度）の差は見られなかった。
【００３０】
葉内ＣＯ２濃度を表すＣｉにも差がなかった。また、ＣＯ２吸収に対応する気孔伝導度に差がないことと、Ｒｕｂｉｓｃｏの周りのＣＯ２濃度にほぼ等しいＣｉに差がないことから、葉緑体に対するＣＯ２供給は同じであることが分かった。したがって、炭酸固定と光呼吸で観測されたコントロール株とＡＥＲ過剰発現株の差は、葉内ＣＯ２濃度の差によるものではなく、カルビン回路、光呼吸におけるＲｕｂｉｓｃｏ活性に差があると考えられた。
【００３１】
コントロール株に比べて、ＡＥＲ過剰発現株では、ＰＳIIの量子収率の低下が少なかった。ＰＳIIの量子収率の低下はカルビン回路の上限を越えて電子を流すことで、ＰＳＩでのスーパーオキシド生成や、ＰＳII反応中心での一重項酸素（１Ｏ２）生成を促進し、これらの活性酸素によって周囲の分子が損傷を受けることを防ぐための制御であると考えられている。つまりカルビン回路の上限がコントロール株に比べてＡＥＲ過剰発現株のほうが高いと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の植物材料は、環境中の炭酸ガス吸収のために有用である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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