(57)【要約】【課題】Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング方法の提供。【解決手段】ＧＰＲ４３の機能を調節する物質をＴｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することを特徴とする、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ４３の機能を調節する物質をＴｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することを特徴とする、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＧＰＲ４３またはそれを含む細胞もしくはその細胞膜画分を被験物質と接触させ、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定し、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質である場合に、その物質をＴｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への被験物質の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被験物質の存在下および被験物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、次いで、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸またはその塩の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
被験物質の非存在下における、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸またはその塩の結合量に対して、被験物質存在下における前記結合量が低下する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験物質の存在下および被検物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を、更に短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
（Ａ）ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への被験物質の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する物質であるかどうかを決定し、
（Ｂ）前記（Ａ）によりＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有すると決定された被験物質の存在下および非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、
請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
（Ａ）において、被験物質の存在下および被験物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、次いで、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸またはその塩の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する物質であるかどうかを決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｂ）において、被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
（Ｂ）において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を、更に短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
細胞刺激活性が、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性および／または細胞内のカルシウム遊離活性である、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞刺激活性が、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性および／またはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性である、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
短鎖脂肪酸が、ブチル酸、プロピオン酸、または酢酸である、請求項４、５、８、１０、または１２に記載の方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患および／またはガンの発症・進展を調節する物質のスクリーニング方法である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＰＲ４３またはそれを含む細胞もしくはその細胞膜画分が齧歯類由来である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
被験物質が、短鎖脂肪酸存在下における細胞刺激活性を低下させる場合に、その物質を齧歯類におけるＴｈ１７細胞分化誘導阻害剤またはその候補あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導促進剤またはその候補であると決定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＰＲ４３またはそれを含む細胞もしくはその細胞膜画分が霊長類由来である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
被験物質が、短鎖脂肪酸存在下における細胞刺激活性を低下させる場合に、その物質を霊長類におけるＴｈ１７細胞分化誘導促進剤またはその候補あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導阻害剤またはその候補であると決定する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を介して、生体の機能を調節している。これらのレセプターの多くは、細胞膜を７回貫通する構造を有しており、細胞内で三量体のＧタンパク質 (guanine nucleotide-binding protein) と共役していることから、Ｇタンパク質共役型受容体 (ＧＰＣＲ： G-protein coupled receptor) と呼ばれている。
【０００３】
ＧＰＣＲは、各種の細胞、臓器、および器官の機能細胞表面に存在し、それらの機能を調節する分子との結合を介してシグナルを細胞内に伝達して、細胞の賦活化や抑制化をする。このため、ＧＰＣＲは各種臓器および器官において重要な役割を担っている。このような生理活性物質とＧＰＣＲとの関係を明らかにすることは、生体の機能を解明し、それと密接に関連した医薬品開発をする上で重要である。医薬品を開発するためには、ＧＰＣＲのアゴニストやアンタゴニストを効率良くスクリーニングして、生体内で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解析し、それらを適当な発現系で発現させる必要がある。
【０００４】
ＧＰＲ４３は、ＧＰＣＲの一つであり、そのリガンドとして短鎖脂肪酸が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。また、ＧＰＲ４３は代謝関連障害と関連していることが報告されている（非特許文献２）。しかし、ＧＰＲ４３の生理学的な機能は依然として不明であった。
【０００５】
ところで、免疫応答細胞であるＴ細胞は、細胞表面に発現されるマーカー分子によりＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）とＣＤ８陽性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）に大別され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は産生するサイトカインにより更に、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、およびＴｒｅｇ細胞に分類される。このうちＴｈ１７細胞は自己免疫による細胞傷害を誘導することが知られている（非特許文献３）。また、Ｔｒｅｇ細胞はレギュラトリーＴ細胞とも呼ばれ、Ｔ細胞の活性を抑制することが知られている（非特許文献４）。しかし、ＧＰＲ４３とこれら免疫応答細胞の分化誘導との関係はこれまでに何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−８３５６４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. J. Brown et al., J.Biol.Chem., 278:11312-1319, 2003
【非特許文献２】Y. H. Hong et al., Endocrinology 146:5092-5099, 2005
【非特許文献３】Bettelli E et al., Nature 453:1051-1057, 2008
【非特許文献４】Allan SE et al., Immunological Reviews 223:391-421, 2008
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、ＧＰＲ４３のリガンドである短鎖脂肪酸によりマウスＴｈ１７細胞の分化誘導が極めて効率よく誘導されるとともに、マウスＴｒｅｇ細胞の分化誘導が抑制され、マウスにおいてＴｈ１７／Ｔｒｅｇ経路が強制的にＴｈ１７に変更されることを見出した。本発明者らは、また、短鎖脂肪酸による刺激がＧＰＲ４３を経由したものであることを確認した。更に本発明者らは、驚くべきことに、ヒトＴｈ１７細胞およびヒトＴｒｅｇ細胞ではマウスの場合と逆の結果が得られること、すなわち、短鎖脂肪酸によりヒトＴｈ１７細胞の分化誘導が抑制されるとともに、ヒトＴｒｅｇ細胞の分化誘導が促進され、Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇ経路が強制的にＴｒｅｇに変更されることを見出した。すなわち、本発明者らは、Ｔｈ１７細胞の分化誘導およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質を、ＧＰＲ４３の機能を指標にしてスクリーニングできることを見出し、本発明を完成させた。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）ＧＰＲ４３の機能を調節する物質をＴｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することを特徴とする、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング方法。
（２）ＧＰＲ４３またはそれを含む細胞もしくはその細胞膜画分を被験物質と接触させ、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定し、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質である場合に、その物質をＴｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することを含んでなる、（１）に記載の方法。
（３）ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への被験物質の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、（２）に記載の方法。
（４）被験物質の存在下および被験物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、次いで、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸またはその塩の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、（２）に記載の方法。
（５）被験物質の非存在下における、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸またはその塩の結合量に対して、被験物質存在下における前記結合量が低下する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、（４）に記載の方法。
（６）被験物質の存在下および被検物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、（２）に記載の方法。
（７）被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、（６）に記載の方法。
（８）ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を、更に短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、（６）に記載の方法。
（９）（Ａ）ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への被験物質の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する物質であるかどうかを決定し、
（Ｂ）前記（Ａ）によりＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有すると決定された被験物質の存在下および非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定する、
（２）に記載の方法。
（１０）（Ａ）において、被験物質の存在下および被験物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、次いで、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸またはその塩の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する物質であるかどうかを決定する、（９）に記載の方法。
（１１）（Ｂ）において、被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、（９）に記載の方法。
（１２）（Ｂ）において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分を、更に短鎖脂肪酸またはその塩と接触させ、被験物質の非存在下における細胞刺激活性に対して、被験物質存在下における細胞刺激活性が変化する場合に、その被験物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定する、（９）に記載の方法。
（１３）細胞刺激活性が、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性および／または細胞内のカルシウム遊離活性である、（６）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１４）細胞刺激活性が、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性および／またはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性である、（６）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１５）短鎖脂肪酸が、ブチル酸、プロピオン酸、または酢酸である、（４）、（５）、（８）、（１０）、または（１２）に記載の方法。
（１６）自己免疫疾患および／またはガンの発症・進展を調節する物質のスクリーニング方法である、（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の方法。
（１７）ＧＰＲ４３またはそれを含む細胞もしくはその細胞膜画分が齧歯類由来である、（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）被験物質が、短鎖脂肪酸存在下における細胞刺激活性を低下させる場合に、その物質を齧歯類におけるＴｈ１７細胞分化誘導阻害剤またはその候補あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導促進剤またはその候補であると決定する、（１７）に記載の方法。
（１９）ＧＰＲ４３またはそれを含む細胞もしくはその細胞膜画分が霊長類由来である、（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（２０）被験物質が、短鎖脂肪酸存在下における細胞刺激活性を低下させる場合に、その物質を霊長類におけるＴｈ１７細胞分化誘導促進剤またはその候補あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導阻害剤またはその候補であると決定する、（１９）に記載の方法。
【００１０】
Ｔｈ１７細胞の分化誘導は自己免疫疾患の発症や進展に関連しており、Ｔｒｅｇ細胞の分化誘導はガンの発症や進展に関連している。従って、化合物をスクリーニングにかけ、Ｔｈ１７細胞の分化誘導を調節する物質やＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質を同定することができる本発明による方法は、自己免疫疾患やガンの発症・進展を調節する物質、特に、これらの疾患の治療剤等の探索や開発に多大な貢献をなすものといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】短鎖脂肪酸存在下で分化誘導培養を行ったＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞のフローサイトメーター解析像を示した図である。
【図２】短鎖脂肪酸存在下で分化誘導培養を行ったＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の絶対数（ウェル中の細胞数）を示した図である。黒丸はＴｒｅｇ細胞数を、白丸はＴｈ１７細胞数を、それぞれ示す。
【図３】ブチル酸存在下で分化誘導培養を行ったＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞のフローサイトメーター解析像（左列）と、Ｔｈ１７細胞（白丸）およびＴｒｅｇ細胞（黒丸）の頻度（中列）および絶対数（右列）を示した図である。
【図４】ＧＰＲ４３ノックアウトマウス（ＧＰＲ４３−／−）、ＧＰＲ４３ヘテロマウス（ＧＰＲ４３＋／−）、およびＧＰＲ４３野生型マウス（ＧＰＲ４３＋／＋）について、ブチル酸ナトリウム塩（ＮａＢ）によるＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞刺激試験を行った結果を示した図である。左列および中列はフローサイトメーター解析像（左列）を示し、右列は培養終了時のＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の細胞数を示す。黒丸はＴｒｅｇ細胞数を、白丸はＴｈ１７細胞数を、それぞれ示す。
【図５】分化を終えたＴｈ１７細胞について、短鎖脂肪酸によるＴｈ１７細胞刺激試験を行った結果を示した図である。培養開始１日後、２日後、３日後のフローサイトメトリー解析像を中列に示し、その結果算定されたＴｈ１７細胞数を最右上段に示した。刺激培養の上清を用いてＴｈ１７細胞から産生されたＩＬ−１７をＥＬＩＳＡ法で定量した結果を最右下段に示した。黒丸は３００μＭブチル酸添加培養を、白丸はブチル酸無添加のコントロール培養を示す。
【図６】短鎖脂肪酸をマウスにインビボ投与した場合の生体内のＴｈ１７細胞頻度を示した図である。左上段および右上段はＴｈ１７細胞の頻度を示し、左下段および右下段はＴｒｅｇ細胞の頻度を示す。また、左列は腸間膜リンパ節における結果を示し、右列は脾臓における結果を示す。
【図７】ブチル酸ナトリウム塩存在下で分化誘導培養を行ったヒトＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞のフローサイトメーター解析像（左列）と、Ｔｈ１７細胞（白丸）およびＴｒｅｇ細胞（黒丸）の頻度（中列）および絶対数（右列）を示した図である。最下段右にＴｈ１７コンディションにおける培養上清中のＩＬ−１７濃度を示した。
【図８】酢酸存在下で分化誘導培養を行ったヒトＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞のフローサイトメーター解析像（左列）と、Ｔｈ１７細胞（白丸）およびＴｒｅｇ細胞（黒丸）の頻度（中列）および絶対数（右列）を示した図である。最下段右にＴｈ１７コンディションにおける培養上清中のＩＬ−１７濃度を示した。
【発明の具体的説明】
【００１２】
［短鎖脂肪酸］
本発明では、ＧＰＲ４３のリガンドとして短鎖脂肪酸を使用できる（特許文献１、非特許文献１）。「短鎖脂肪酸」とは炭素数１〜６の飽和または不飽和の脂肪酸を意味する。短鎖脂肪酸のうち飽和短鎖脂肪酸は、Ｈ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは、１〜６の整数を表す）で表すことができる。本発明によるスクリーニング方法に用いられる短鎖脂肪酸としては、好ましくは、ブチル酸、プロピオン酸、酢酸などの飽和短鎖脂肪酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。短鎖脂肪酸は市販されており、当業者であれば容易に入手することができる。短鎖脂肪酸は、また、短鎖脂肪酸を含む動植物から、常法に従って、抽出または精製の工程を経て調製してもよい。本発明では、短鎖脂肪酸は塩の形態で用いてもよく、そのような塩としては周知の塩が挙げられるが、典型的にはアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）が挙げられる。なお、本明細書において単に「短鎖脂肪酸」と言及した場合にはその塩も含む意味で用いられるものとする。
【００１３】
［ＧＰＲ４３］
本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ４３は、短鎖脂肪酸による活性化作用、あるいは短鎖脂肪酸と結合活性を有し、ＧＰＲ４３発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばＧＰＲ４３を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、ＧＰＲ４３の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば短鎖脂肪酸による活性化作用、あるいは短鎖脂肪酸に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。
【００１４】
具体的には、本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ４３は、ＧＰＲ４３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２９７．１（ヒト型）、ＮＰ＿６６６２９９．１（マウス型）、ＮＰ＿００１００５８７７（ラット型））と称されているポリペプチドである。具体的には、ＧＰＲ４３は、（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ポリペプチド、（ｉｖ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および（ｖ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが含まれる。本発明に使用するＧＰＲ４３としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。
【００１５】
ここで、「機能的に等価な改変ポリペプチド」（以下、「改変ポリペプチド」と称する）とは、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ４３と実質的に同じ活性［例えば、短鎖脂肪酸による活性化作用、あるいは短鎖脂肪酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性など）］を有するポリペプチドを意味する。改変ポリペプチドは、好ましくは、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００１６】
本願明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００１７】
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
【００１８】
改変ポリペプチドの例としては、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ４３もしくはその変異体が挙げられる。具体的には配列番号４で表されるアミノ酸配列（マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）由来）からなるポリペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列（ラット由来）、または配列番号８で表されるアミノ酸配列（マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００１９】
上述の相同ポリペプチドとは、ＧＰＲ４３のアミノ酸配列に関して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、ＧＰＲ４３に関して、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ４３と実質的に同じ活性（例えば短鎖脂肪酸による活性化作用、あるいは短鎖脂肪酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性）を有するポリペプチドを意味する。
【００２０】
本願明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ４３もしくはその変異体が含まれる。具体的には配列番号４、配列番号６、または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２１】
なお、変異体とは、「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００２２】
さらに、本発明に使用するＧＰＲ４３（すなわち、ＧＰＲ４３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ＧＰＲ４３と実質的に同じ活性（例えば短鎖脂肪酸による活性化作用、あるいは短鎖脂肪酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチド）を有する限り使用することができる。この場合、部分ポリヌクレオチドを構成するアミノ酸数は、ＧＰＲ４３のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００２３】
本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。また、配列番号４、配列番号６、または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
［ＧＰＲ４３の調製方法］
これら本発明に使用するＧＰＲ４３（すなわち、ＧＰＲ４３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）およびその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、ＧＰＲ４３またはその部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００２５】
以下、本発明に使用するＧＰＲ４３の調製方法のうち、遺伝子工学的手法について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００２６】
［ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチド］
本発明に使用するＧＰＲ４３（すなわち、ＧＰＲ４３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、ＧＰＲ４３、その改変ポリペプチド、その相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
【００２７】
なお、本願明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド； 
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに関する。
【００２８】
本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００２９】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号１で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ４３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。具体的には配列番号３、配列番号５、または配列番号７で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
本願明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。
【００３１】
本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列（例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列）の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００３２】
本発明に使用するＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドとしては、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が好ましい。本発明では、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ４３またはその変異体をコードする塩基配列を用いることができ、例えば、配列番号３、配列番号５、または配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
［プラスミドおよび形質転換体］
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
【００３４】
また、前記形質転換体も、上記のようなＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＧＰＲ４３を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３６】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００３７】
ＧＰＲ４３を含有する細胞は、ＧＰＲ４３を細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではない。ＧＰＲ４３を元々発現する細胞を、ＧＰＲ４３を含有する細胞として利用することができる。また、前記形質転換体（すなわち、ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＧＰＲ４３の発現が可能な条件下で培養することによりＧＰＲ４３を含有する細胞を得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＧＰＲ４３をコードするＲＮＡを注入し、ＧＰＲ４３の発現が可能な条件下で培養することによりＧＰＲ４３を含有する細胞を得ることもできる。
【００３８】
［細胞膜画分］
また、ＧＰＲ４３を含有する本発明に使用する細胞膜画分は、例えば前記のＧＰＲ４３を発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
【００３９】
［スクリーニング方法］
本発明によるスクリーニング方法では、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかは、ＧＰＲ４３のバインディングアッセイ（第一の態様）、ＧＰＲ４３を介した細胞刺激活性のアッセイ（第二の態様）、およびこれらを組み合わせたアッセイ（第三の態様）のいずれかにより決定することができる。
【００４０】
本発明によるスクリーニング方法の第一の態様によれば、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への被験物質の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定するスクリーニング方法が提供される。被験物質がＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する場合には、その被験物質はＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると決定することができる。ＧＰＲ４３のリガンドとして短鎖脂肪酸を用いて被験物質の結合の程度を測定することができるが、後述するようにリガンドを使用せずに被験物質の結合の程度を直接測定することもできる。
【００４１】
例えば、本発明によるスクリーニング方法の第一の態様によれば、被験物質存在下および被験物質非存在下において、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を短鎖脂肪酸と接触させ、次いで、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸の結合の程度を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定するスクリーニング方法が提供される。
【００４２】
このスクリーニング方法では、ＧＰＲ４３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに被験物質をスクリーニングすることができる。すなわち、このスクリーニング方法では、短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３との相互作用を変化させる物質を、具体的には、短鎖脂肪酸のＧＰＲ４３への結合性を変化させる物質を、ＧＰＲ４３の機能を調節（すなわち、促進もしくは阻害）する能力を有する物質であると、具体的には、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することができる。
【００４３】
例えば、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ４３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識したリガンド（すなわち、短鎖脂肪酸）とを接触させ、前記条件下におけるＧＰＲ４３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＧＰＲ４３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに被験物質をスクリーニングすることができる。すなわち、被験物質非存在下におけるＧＰＲ４３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する場合（例えば、被験物質非存在下の結合量と比較して５％以上あるいは１０％以上減少する場合）には、その被験物質は、短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３との相互作用を変化させる物質（具体的には、ＧＰＲ４３の機能を調節（すなわち、促進もしくは阻害）する能力を有する物質）であるから、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節（すなわち、促進もしくは阻害）する物質であると決定することができる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ４３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介するリガンドの特異的結合量を比較する場合には、標識したリガンドを用いることができる。その標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［１２５Ｉ］、［３５Ｓ］などを用いることができる。酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、リガンドと標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分へのリガンドの結合の程度を測定する装置は、当該結合量が測定可能な装置である限り特に限定されるものではないが、例えば、放射線測定装置、光学測定装置（イメージアナライザー、蛍光検出装置、発光検出装置、共焦点レーザー顕微鏡、共振導波路回折格子を用いた光バイオセンサーなど）、電気抵抗測定装置、およびこれらの組み合わせが挙げられる。これらの装置は市販されており、リガンドの標識の種類や標識の有無に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
本発明では「放射線測定装置」を用いて放射性同位元素で標識されたリガンドの結合量を測定することができる。このような装置としては、液体シンチレーションカウンターが挙げられる。
【００４７】
本発明ではまた、「光学測定装置」を用いて蛍光物質、発光物質などで標識されたリガンドの結合量を測定することができる。このような検出は、ＦＲＥＴ（Fluorescence resonance energy transfer）法に従って行ってもよい。蛍光や発光を測定できる装置としては、イメージアナライザー、蛍光検出装置、発光検出装置が挙げられる。
【００４８】
本発明ではまた、ＧＰＲ４３にリガンドあるいは被験物質が結合したことにより生ずる構造変化を測定することにより、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分へのリガンドあるいは被験物質の結合の程度を直接検出することができる。このような構造変化を検出できるキットは市販されており、例えば、Tango（Invitrogen社）を使用した場合にはＧタンパク質結合受容体にリガンドあるいは被験物質が結合したことによるその受容体の活性化の程度を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検出することができる。構造変化を測定するこの方法によれば、標識を使用せずにＧＲＰ４３とリガンドとの結合の程度を測定できる。また、構造変化を測定するこの方法によれば、リガンドを使用せずにＧＰＲ４３への被験物質の結合の程度を測定できる。
【００４９】
本発明では更に、生体分子間の相互作用を測定できる「電気抵抗測定装置」や「光学測定装置」を用いて、ＧＰＲ４３とリガンドあるいは被験物質との間の相互作用を測定することにより、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分へのリガンドあるいは被験物質の結合の程度を直接検出することができる。このような「電気抵抗測定装置」としては、細胞内外のインピーダンスの変化を測定することができるもの（例えば、Cellkeyシステム、MDS Analytical Technologies社）が挙げられ、また、「光学測定装置」としては、標的物質とそれに結合する物質との相互作用によって生じる微少な屈折率変化を共振導波路回折格子により検出できるもの（例えば、EPICバイオセンサー（コーニング社）が挙げられる。生体分子間の相互作用を測定するこの方法によれば、標識を使用せずにＧＲＰ４３とリガンドとの結合の程度を測定できる。また、生体分子間の相互作用を測定するこの方法によれば、リガンドを使用せずにＧＰＲ４３への被験物質の結合の程度を測定できる。
【００５０】
本発明によるスクリーニング方法の第二の態様によれば、被験物質存在下および被験物質非存在下において、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、被験物質がＧＰＲ４３の機能を調節する物質であるかどうかを決定するスクリーニング方法が提供される。
【００５１】
このスクリーニング法では、ＧＰＲ４３リガンドによりＧＰＲ４３を経由して惹起される細胞刺激活性を変化（促進もしくは阻害）させる物質を、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると、より具体的には、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であると決定することができる。
【００５２】
このスクリーニング法では、また、ＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性を促進または阻害する能力を区別して被験物質をスクリーニングしてもよい。具体的には、被験物質非存在下における細胞刺激活性と、被験物質存在下における細胞刺激活性とを比較し、後者の方が大きい場合（例えば、被験物質非存在下の細胞刺激活性と比較して５％以上あるいは１０％以上増加する場合）には、その被験物質は、ＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性を促進ないし増強する物質であると決定することができる。また、被験物質非存在下における細胞刺激活性と、被験物質存在下における細胞刺激活性とを比較し、後者の方が小さい場合（例えば、被験物質非存在下の細胞刺激活性と比較して５％以上あるいは１０％以上低下する場合）には、その被験物質は、ＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性を阻害ないし低減する物質であると決定することができる。なお、細胞刺激活性の低下を指標としてＧＰＲ４３の機能を阻害する物質をスクリーニングする場合には、適度な細胞刺激活性が得られるよう、スクリーニング系に短鎖脂肪酸を添加してもよい。
【００５３】
本発明によるスクリーニング方法の第三の態様によれば、第一の態様のスクリーニング方法を実施し、ＧＰＲ４３へ結合性を有する物質であると決定された被験物質について第二の態様のスクリーニング方法を実施する、スクリーニング方法が提供される。
【００５４】
このスクリーニング法では、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する物質を絞り込んだ上で、細胞刺激活性の測定を行い、実際にＧＰＲ４３の機能を調節（すなわち、促進もしくは阻害）する被験物質をスクリーニングできる点で有利である。すなわち、第三の態様のスクリーニング方法では、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分へ結合性を有する物質をまず同定し、次いで、同定された物質について細胞刺激活性へ与える影響を評価し、ＧＰＲ４３の細胞刺激活性を変化（促進もしくは阻害）させる物質をＧＰＲ４３の機能を調節する物質であると、より具体的には、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節（すなわち、促進もしくは阻害）する物質であると決定することができる。
【００５５】
具体的には、まず、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への被験物質の結合の程度を測定することにより、ＧＰＲ４３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングする（第一の態様のスクリーニング方法）。この場合、短鎖脂肪酸の存在下でスクリーニングを行うことができる。すなわち、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ４３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を短鎖脂肪酸と接触させ、被験物質非存在下および被験物質存在下におけるＧＰＲ４３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＧＰＲ４３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。次いで、前記スクリーニングにおいて同定されたＧＰＲ４３に結合性を有する被験物質の非存在下および存在下の各条件下において、ＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を比較することにより、実際にＧＰＲ４３の機能を調節（すなわち、促進もしくは阻害）する被験物質をスクリーニングする（第二の態様のスクリーニング方法）。
【００５６】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法では、ＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性を促進もしくは阻害する能力を区別して被験物質をスクリーニングし、その結果に基づいてＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導を促進あるいは阻害する物質であると決定してもよい。
【００５７】
例えば、スクリーニング系が齧歯類（例えば、マウス）のＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分から構成されている場合には、被験物質が短鎖脂肪酸による細胞刺激活性を阻害する物質であると評価されるときに、その被験物質を齧歯類（例えば、マウス）におけるＴｈ１７細胞分化誘導阻害剤またはその候補あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導促進剤またはその候補であると決定することができる。なお、齧歯類の例としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が挙げられる。
【００５８】
また、スクリーニング系が霊長類（例えば、ヒト）のＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分から構成されている場合には、被験物質が短鎖脂肪酸による細胞刺激活性を阻害する物質であると評価されるときに、その被験物質を霊長類（例えば、ヒト）におけるＴｈ１７細胞分化誘導促進剤またはその候補あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導阻害剤またはその候補であると決定することができる。なお、霊長類の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、ゴリラ等が挙げられる。
【００５９】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法では、細胞刺激活性として、細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性などを測定することができ、好ましくは、アデニル酸シクラーゼの活性化の程度や細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測定することができる。
【００６０】
これらの態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰ濃度や、ホスホリパーゼＣの活性化によって上昇する細胞内カルシウム濃度を公知の手法で測定すればよい。
【００６１】
例えば、ＧＰＲ４３の機能を調節する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＧＰＲ４３を介するリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させて細胞内のｃＡＭＰの濃度が変化するか、あるいは細胞内Ｃａ２＋濃度が変化する化合物を選択しても良い。あるいは、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＧＰＲ４３のリガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加し、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、ｃＡＭＰ生成量が変化する化合物を選択しても良い。
【００６２】
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどが挙げられるが、市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
【００６３】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法においては、また、ＧＰＲ４３を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ４３を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＧＰＲ４３の機能を調節する化合物をスクリーニングすることができる。この場合は、前述のｃＡＭＰの生成が増加するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が促進されることを利用している。
【００６４】
以下、細胞内刺激活性の変化を測定する手順について、より具体的に説明する。
【００６５】
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。さらにこのレポーター遺伝子は、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇によるシグナル伝達系によっても発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
【００６６】
被験物質による作用が、ＧＰＲ４３に対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＧＰＲ４３を細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ４３を細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、被験物質による作用が、ＧＰＲ４３に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、被験物質による作用が、ＧＰＲ４３に対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分の細胞刺激活性を測定する装置は、当該細胞刺激活性が直接あるいは間接的に測定可能な装置である限り、特に限定されるものではないが、例えば、放射線測定装置、光学測定装置（蛍光検出装置、発光検出装置、イメージアナライザーなど）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６８】
本発明では「放射線測定装置」を用いて放射性同位元素で標識された細胞内刺激活性の指標となる物質の量を測定することができる。例えば、基質として［３Ｈ］myo-イノシトールを基質として用いてリン酸化イノシチドを測定することによりＧＰＲ４３からのシグナリングの有無を測定することができる。放射線測定装置としては、液体シンチレーションカウンターが挙げられる。また、リン酸化イノシチドの測定は後述するＨＴＲＦ法に従って実施することができる。
【００６９】
本発明では「光学測定装置」を用いて蛍光物質、発光物質、発色物質などの蛍光量、発光量、発色量を測定することにより、細胞内刺激活性の指標となる細胞内カルシウムイオン濃度、細胞内ｃＡＭＰ濃度、細胞内タンパク質のリン酸化の程度などを測定することができる。細胞内カルシウムイオン濃度、細胞内ｃＡＭＰ濃度、細胞内タンパク質のリン酸化の程度などを測定は当業者に周知であり、これらの測定用キットや装置も市販されている。
【００７０】
例えば、カルシウムイオンと結合することにより蛍光強度が変化する蛍光物質を用いて細胞内カルシウム濃度を測定することができ、そのような蛍光物質としてはFluo-3/AM、Fluo-2, Fluo-4、Fura-2、エクオリン、Calcium4などが挙げられる。この場合、Ｇｑキメラタンパク質を利用した検出系を用いて細胞内カルシウム濃度を測定してもよい。蛍光物質を利用した細胞内カルシウム濃度の測定は、例えば、蛍光強度測定プレートリーダー（例えば、FLIPR（Molecular Device社製）、ARVO（PerkinElmer社））や細胞の機能解析装置（FDSS(浜松ホトニクス社製)）などを用いて行うことができる。
【００７１】
また、ｃＡＭＰを認識する抗体を用いて細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することができ、この場合には、ＥＬＩＳＡ法により酵素反応による発色の程度などを検出することにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することができる。また、ｃＡＭＰ生成の際に消費されるＡＴＰの量により発光量が変化する発光物質（例えば、ルシフェラーゼ）を用いて細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することができる。更に、アルファスクリーン法により細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することもでき、この場合、ビオチン化されたｃＡＭＰを介して結合する二種類のビーズのうちレーザー照射によってドナービーズから化学的シグナルが生じ、それによりアクセプタービーズから蛍光シグナルが生じ、この蛍光強度を測定することにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定できる。これらの酵素反応による発色の程度や蛍光強度の変化の測定は、例えば、発光検出装置や蛍光検出装置を用いて行うことができる。また、細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定は後述するＨＴＲＦ法に従って実施することもできる。
【００７２】
また、リン酸化キナーゼ（例えば、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ）を認識する抗体を用いて細胞内タンパク質のリン酸化の程度を測定することができ、この場合、酵素反応による発色の程度などを測定することによりリン酸化されたタンパク質の量を測定することができる。この酵素反応による発色の程度は、例えば、ウェスタンブロット法に基づいてEnhanced ChemiLuminescence法などにより、トータルラボイメージャー(アマシャム社)、ＬＡＳイメージアナライザー（富士フィルム社）などのケミルミネッセンス発光検出装置を用いて測定することができる。
【００７３】
本発明においては、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施するために、蛍光強度の測定をホモジニアスなアッセイ系で実施することができ、例えば、ＨＴＲＦ（Homogeneous Time Resolved Fluorescence）法のようなＴＲ−ＦＲＥＴ（Time Resolved-Fluorescence Resonance Energy Transfer）法を実施することができる。このようなアッセイ系における蛍光強度の測定は、ＨＴＲＦ法試薬（Cisbio社）を用いて、ＨＴＲＦ法専用のマイクロプレートリーダー（PerkinElmer社）で実施することができる。
【００７４】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法では、また、細胞刺激活性として、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性および／またはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性を測定することができる。すなわち、スクリーニング系が齧歯類（例えば、マウス）のＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分から構成されている場合には、短鎖脂肪酸によるＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性の上昇は、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性の上昇（Ｔｈ１７細胞分化誘導阻害活性の低下）あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性の低下（Ｔｒｅｇ細胞分化誘導阻害活性の上昇）を指標とすることができる。また、スクリーニング系が齧歯類の場合において、短鎖脂肪酸によるＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性の低下は、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性の低下（Ｔｈ１７細胞分化誘導阻害活性の上昇）あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性の上昇（Ｔｒｅｇ細胞分化誘導阻害活性の低下）を指標とすることができる。
【００７５】
スクリーニング系が霊長類（例えば、ヒト）のＧＰＲ４３またはＧＰＲ４３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分から構成されている場合には、短鎖脂肪酸によるＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性の上昇は、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性の低下（Ｔｈ１７細胞分化誘導阻害活性の上昇）あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性の上昇（Ｔｒｅｇ細胞分化誘導阻害活性の低下）を指標とすることができる。また、スクリーニング系が霊長類の場合において、短鎖脂肪酸によるＧＰＲ４３を経由した細胞刺激活性の低下は、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性の上昇（Ｔｈ１７細胞分化誘導阻害活性の低下）あるいはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性の低下（Ｔｒｅｇ細胞分化誘導阻害活性の上昇）を指標とすることができる。
【００７６】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法では、細胞刺激活性として、細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性などを測定して被験物質をスクリーニングし、その後、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性および／またはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性を測定して被験物質が実際にＴｈ１７細胞分化誘導活性および／またはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性に影響を及ぼすか否かを確認してもよい。
【００７７】
本明細書において「Ｔｈ１７細胞」とはＩＬ−１７を産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）を意味する。また、「Ｔｈ１７細胞分化誘導活性」とは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１７細胞へ分化誘導させる活性を意味し、Ｔｈ１７細胞の出現頻度および／または細胞数を指標にすることができる。
【００７８】
本明細書において「Ｔｒｅｇ細胞」とはＦｏｘｐ３陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を意味する。また、「Ｔｒｅｇ細胞分化誘導活性」とは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｒｅｇ細胞へ分化誘導させる活性を意味し、Ｔｒｅｇ細胞の出現頻度および／またはＴｒｅｇ細胞の細胞数を指標にすることができる。
【００７９】
これらの態様のスクリーニング方法においては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を培養し、培養後、ＩＬ−１７陽性細胞やＦｏｘｐ３陽性細胞の出現頻度や細胞数をフローサイトメーターなどを用いて測定することができる。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の取得や培養は公知の方法に従って行うことができ、例えば、Cobb B et al. A role for Diver in immune regulation, J Exp Med. 2006, 203: 2519-2527を参照することができる。
【００８０】
ＩＬ−１７陽性細胞の出現頻度や細胞数が上昇する場合にはＴｈ１７細胞の分化誘導が促進されていると判断でき、ＩＬ−１７陽性細胞の出現頻度や細胞数が低下する場合にはＴｈ１７細胞の分化誘導が阻害されていると判断できる。また、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の出現頻度や細胞数が上昇する場合にはＴｒｅｇ細胞の分化誘導が促進されていると判断でき、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の出現頻度や細胞数が低下する場合にはＴｒｅｇ細胞の分化誘導が阻害されていると判断できる。
【００８１】
ＣＤ４陽性細胞を培養してＴｈ１７細胞分化誘導活性および／またはＴｒｅｇ細胞分化誘導活性を測定する場合には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１７細胞誘導条件（Ｔｈ１７コンディション）あるいはＴｒｅｇ細胞誘導条件（Ｔｒｅｇコンディション）で培養し、ＩＬ−１７陽性細胞やＦｏｘｐ３陽性細胞の出現頻度や細胞数を測定してもよい。Ｔｈ１７コンディションやＴｒｅｇコンディションでの培養は公知の方法に従って行うことができ、例えば、Cobb B et al. A role for Diver in immune regulation, J Exp Med. 2006, 203: 2519-2527を参照することができる。
【００８２】
本発明に使用する被験物質はどのような物質であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物並びにその塩および溶媒和物、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチド、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。
【００８３】
Ｔｈ１７細胞の分化誘導は自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチ、乾癬）の発症・進展に関与していることが知られている（多発性硬化症：Lock C et al. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nat Med. 2002 May;8(5):451-453、潰瘍性大腸炎：Arisawa T et al. The influence of polymorphisms of interleukin-17A and interleukin-17F genes on the susceptibility to ulcerative colitis. J Clin Immunol. 2008 Jan;28(1):44-49、クローン病：van Beelen AJ et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007 Oct;27(4):660-669、関節リウマチ：Okamoto H et al. Molecular targets of rheumatoid arthritis.   Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Mar;7(1):53-66、乾癬：Fitch E et al. Pathophysiology of psoriasis: recent advances on IL-23 and Th17 cytokines.   Curr Rheumatol Rep. 2007 Dec;9(6):461-467）。従って、本発明によるスクリーニング方法は、自己免疫疾患の発症・進展を調節する物質の探索、特に、自己免疫疾患治療剤またはその候補の探索にも用いることができる。すなわち、本発明によるスクリーニング方法のうち、Ｔｈ１７細胞の分化誘導阻害剤（またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導促進剤）のスクリーニング方法は、自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法として用いることができる。
【００８４】
また、Ｔｒｅｇ細胞の分化誘導は、ガン（例えば、悪性黒色腫や卵巣癌）の発症・進展に関与していることが知られている（Rasku M. et al., J Trans Med 6:12, 2008; Curiel TJ, et al., Nat Med 10(9):942-9, 2004）。従って、本発明によるスクリーニング方法は、ガンの発症・進展を調節する物質の探索、特に、抗ガン剤またはその候補の探索にも用いることができる。すなわち、本発明によるスクリーニング方法のうち、Ｔｒｅｇ細胞の分化誘導阻害剤（またはＴｈ１７細胞の分化誘導促進剤）のスクリーニング方法は、抗ガン剤のスクリーニング方法として用いることができる。
【００８５】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および／または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の治療を含む：
・疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
・疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
・疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
【００８６】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様によれば、被験物質の存在下および被検物質の非存在下において、齧歯類（例えば、マウス）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を短鎖脂肪酸の存在下で培養し、培養後、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性を測定し、被験物質がＴｈ１７細胞の分化誘導を阻害する物質であるかどうかを決定することを含んでなる、齧歯類（例えば、マウス）におけるＴｈ１７細胞分化誘導阻害剤のスクリーニング方法が提供される。この場合、被験物質の存在下および被検物質の非存在下におけるＴｈ１７細胞の分化誘導活性を比較し、被験物質の存在下でＴｈ１７細胞の分化誘導が阻害される場合にその被験物質を齧歯類（例えば、マウス）Ｔｈ１７細胞分化誘導阻害剤またはその候補と決定することができる。
【００８７】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様によれば、また、被験物質の存在下および被検物質の非存在下において、齧歯類（例えば、マウス）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を短鎖脂肪酸の存在下で培養し、培養後、Ｔｈ１７細胞分化誘導活性を測定し、被験物質がＴｈ１７細胞の分化誘導を阻害する物質であるかどうかを決定することを含んでなる、齧歯類（例えば、マウス）における自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法が提供される。この場合、被験物質の存在下および被検物質の非存在下におけるＴｈ１７細胞の分化誘導活性を比較し、被験物質の存在下でＴｈ１７細胞の分化誘導が阻害される場合にその被験物質を齧歯類（例えば、マウス）における自己免疫疾患治療剤またはその候補と決定することができる。
【００８８】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様によれば、被験物質の存在下および被検物質の非存在下において、霊長類（例えば、ヒト）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を短鎖脂肪酸の存在下で培養し、培養後、Ｔｒｅｇ細胞分化誘導活性を測定し、被験物質がＴｒｅｇ細胞の分化誘導を阻害する物質であるかどうかを決定することを含んでなる、霊長類（例えば、ヒト）におけるＴｒｅｇ細胞分化誘導阻害剤のスクリーニング方法が提供される。この場合、被験物質の存在下および被検物質の非存在下におけるＴｒｅｇ細胞の分化誘導活性を比較し、被験物質の存在下でＴｒｅｇ細胞の分化誘導が阻害される場合にその被験物質を霊長類（例えば、ヒト）におけるＴｒｅｇ細胞分化誘導阻害剤またはその候補と決定することができる。
【００８９】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様によれば、また、被験物質の存在下および被検物質の非存在下において、霊長類（例えば、ヒト）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を短鎖脂肪酸の存在下で培養し、培養後、Ｔｒｅｇ細胞分化誘導活性を測定し、被験物質がＴｒｅｇ細胞の分化誘導を阻害する物質であるかどうかを決定することを含んでなる、霊長類（例えば、ヒト）におけるガン治療剤のスクリーニング方法が提供される。この場合、被験物質の存在下および被検物質の非存在下におけるＴｒｅｇ細胞の分化誘導活性を比較し、被験物質の存在下でＴｒｅｇ細胞の分化誘導が阻害される場合にその被験物質を霊長類（例えば、ヒト）におけるガン治療剤と決定することができる。
【００９０】
本発明によるスクリーニング方法のいずれの好ましい態様も、第一の態様のスクリーニング方法を実施した後に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養下でのスクリーニングを行ってもよい。すなわち、被験物質の存在下および被験物質の非存在下において、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分と、短鎖脂肪酸とを接触させ、次いで、ＧＰＲ４３またはそれを含有する細胞もしくはその細胞膜画分への短鎖脂肪酸の結合量を測定することにより、被験物質がＴｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質であるかどうかを決定して、短鎖脂肪酸のＧＰＲ４３への結合性を変化させる物質を絞り込んだ上で、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養下でのスクリーニングを行ってもよい。
【００９１】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様で用いられるＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＧＰＲ４３を発現しているものが使用される。
【００９２】
［スクリーニング用キット］
本発明によれば、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング用キットが提供される。  本発明のスクリーニング用キットは、リガンド（すなわち、短鎖脂肪酸）と、ＧＰＲ４３または前記細胞（すなわち、ＧＰＲ４３を含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＧＰＲ４３を含有する細胞膜画分）とを少なくとも含んでなる。リガンドは、標識したリガンドであってもよい。本発明によるスクリーニング用キットは、所望により、本発明によるスクリーニング方法を実施するための種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。
【００９３】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、リガンド（すなわち、短鎖脂肪酸）、およびＧＰＲ４３を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ４３を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記リガンドは、標識したリガンドであってもよい。本発明によるスクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばＦＳＫ）、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、本発明によるスクリーニング用キットは、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ４３を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【実施例】
【００９４】
本発明を下記実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００９５】
実施例１：Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導への短鎖脂肪酸の影響
（１）インビトロ実験のための細胞の調製
エーテル麻酔下のマウスより脾臓を摘出したのちに、浮遊細胞を調製し、RBC lysing solution（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA) によって赤血球を破砕することで脾臓細胞を得た。細胞を液体培地で洗浄したのちに、１％ウシ胎児血清（HyClone Utah, USA）と１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Gibco-Invitrogen, California, USA）を添加したＤ−ＰＢＳ（−）培地（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）に浮遊した。本細胞浮遊液から、ＭＡＣＳ磁気ビーズ法を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した（CD4+ T cell isolation kit, Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）。得られたＣＤ４＋Ｔ細胞について、ＡＰＣ標識抗ＣＤ６２Ｌ抗体（ＭＥＬ−１４）、ＦＩＴＣ標識  抗ＣＤ４４抗体（ＩＭ７）、ＰＥ標識抗ＣＤ２５抗体（ＰＣ６１）、ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ７５０標識  抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５）（いずれもeBiosciences、California, USAより購入）で細胞表面標識を行い、FACSAria cell sorter（BD Biosciences, California, USA）を用いてＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋  ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。
【００９６】
（２）インビトロＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養
ナイーブＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋  Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）（11B11, BD Biosciences, California, USA）及び抗ＩＦＮ−γ抗体（１０μｇ／ｍｌ）（XMG1.2, BD Biosciences, California, USA）存在下に、固相化抗ＴＣＲβ抗体（２００ｎｇ／ｍｌ）（H57-597, eBiosciences, California, USA）と抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）（37.51, BD Biosciences, California, USA）によって刺激培養した。Ｔｒｅｇ細胞誘導（Ｔｒｅｇコンディション）では、ヒトＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ，R&D Systems, MN, USA）を培養に添加し、Ｔｈ１７細胞誘導（Ｔｈ１７コンディション）では、ヒトＴＧＦ− β１（１ｎｇ／ｍｌ，R&D Systems, MN, USA）に加えてＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ，R&D Systems, MN, USA）を添加し、９６穴平底プレート（Nalgen Nunc International, NY, USA）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、加湿下のもと５日間培養した。回収した細胞をブレフェルディンＡ（４０μｇ／ｍｌ）（BD GolgiPlug, BD Biosciences, California, USA）およびモネンシン（２μＭ）（BD GolgiStop, BD Biosciences, California, USA）の存在下に、フォルボールミリステートアセテート（６５ｎＭ）（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）およびイオノマイシン（５．３μＭ）（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）を用いて４時間刺激し、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ＲM4-5, eBiosciences, California, USA）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（FJK-16s, eBiosciences, California, USA）ならびにＰＥ標識抗ＩＬ−１７抗体（TC11-18H10.1, BD Biosciences, California, USA）で細胞染色した。ＣＤ４陽性細胞のうち、Ｆｏｘｐ３あるいはＩＬ−１７が陽性である細胞を、フローサイトメーター（FACSAria cell sorterもしくはFACSCanto II、BD Biosciences, California, USA）で検出し、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔｒｅｇ細胞ならびにＴｈ１７細胞を算定した。
【００９７】
（３）短鎖脂肪酸によるＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞刺激試験
前記（２）の手法に従って作製したＴｈ１７細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、マイトマイシンＣ（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA #M4287）処理したマウス脾臓細胞（２×１０５細胞／ウェル）をアクセサリー細胞として、抗ＣＤ３抗体（３μｇ／ｍｌ，145-2c11, BD Biosciences, California, USA）と抗ＣＤ２８抗体（１０μｇ／ｍｌ，37.51, BD Biosciences, California, USA）で、水酸化ナトリウム  （和光純薬工業株式会社、大阪、日本）でｐＨ７付近に調整した酢酸、プロピオン酸、ブチル酸、あるいはブチル酸のナトリウム塩（３００μＭ）（いずれもSigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA #B5887）存在下に、９６穴平底プレート（Nalgen Nunc International, NY, USA）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、加湿下のもと３日間刺激培養を行った。培養開始１日後、２日後、３日後に培養細胞と培養上清を回収し、Ｔｈ１７細胞とＦｏｘｐ３陽性Ｔｒｅｇ細胞の頻度をフローサイトメーターで解析するとともに（前記（２）の手法と同じ）、培養上清中のＩＬ−１７は、DuoSet ELISA Development Kits (R&D Systems, MN, USA, #DY421)を用いて定量を行った。
【００９８】
（４）試験結果Ｉ
７〜１０週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｃｒマウス（Japan SLC. Inc., Shizuoka, Japan）の脾臓よりナイーブＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、ブチル酸）存在下において、Ｔｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養を行った。細胞の調製、分化誘導培養、および刺激試験は前記（１）、（２）、および（３）の手法に従って行った。
【００９９】
結果は図１に示される通りであった。フローサイトメーターの解析像によると、Ｔｒｅｇコンディション（左パネル）では、短鎖脂肪酸の添加はＴｒｅｇ細胞の分化に影響を与えなかった。一方、Ｔｈ１７コンディション（右パネル）では、いずれの短鎖脂肪酸も容量依存的にＴｈ１７細胞の分化を増強した。
【０１００】
また、フローサイトメーターの解析像におけるＴｒｅｇ細胞とＴｈ１７細胞の絶対数は図２に示される通りであった。発現頻度のみならず、絶対数においても短鎖脂肪酸は、Ｔｈ１７細胞の誘導を増強していた。
【０１０１】
このように、短鎖脂肪酸は、マウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞の分化を強力に促進することが明らかとなった。短鎖脂肪酸の受容体がＧＰＲ４３であることから、マウスにおける短鎖脂肪酸によるＴｈ１７誘導増強が、ＧＰＲ４３からのシグナリングによる現象である可能性が強く示唆された。
【０１０２】
（５）試験結果ＩＩ
７〜１０週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Japan SLC. Inc., Shizuoka, Japan）の脾臓よりナイーブＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、ブチル酸ナトリウム塩の存在下に、Ｔｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養を行った。細胞の調製、分化誘導培養、および刺激試験は前記（１）、（２）、および（３）の手法に従って行った。
【０１０３】
結果は図３に示される通りであった。図３から明らかなように、Ｔｒｅｇコンディションでは、ブチル酸ナトリウム塩の容量依存的にＴｒｅｇ細胞の分化が抑制され、これと同時にＴｈ１７細胞が分化誘導された。一方、Ｔｈ１７コンディションでは、ブチル酸ナトリウム塩の容量依存的にＴｈ１７細胞の分化が強力に増強された。
【０１０４】
このことから、ＧＰＲ４３からのシグナリングは、マウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化経路を、強力にＴｈ１７細胞へとシフトさせるものであることが強く示唆された。
【０１０５】
（６）試験結果ＩＩＩ
メスＧＰＲ４３ノックアウトマウス（ＧＰＲ４３−／−）（Ｄｅｌｔａｇｅｎ社より購入、１２９ｓｖ由来のノックアウトマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊに６回バッククロスしたもの）、並びに同世代のＧＰＲ４３へテロマウス（ＧＰＲ４３＋／−）およびＧＰＲ４３野生型マウス（ＧＰＲ４３＋／＋）の脾臓から、ナイーブＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、ブチル酸ナトリウム塩の存在下で、Ｔｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養を行った。細胞の調製、分化誘導培養、および刺激試験は前記（１）、（２）、および（３）の手法に従って行った。
【０１０６】
結果は図４に示される通りであった。図４から明らかなように、ＧＰＲ４３野生型マウスとＧＰＲ４３へテロマウスにおいては、ブチル酸ナトリウム塩の容量依存的にＴｈ１７細胞の誘導増強が見られた（最右列に培養終了時のＴｈ１７細胞ならびにＴｒｅｇ細胞の細胞数を示した）。一方、この効果は、ＧＰＲ４３ノックアウトマウスでは減弱しており（中列最下段）、細胞数算定の結果では、ブチル酸ナトリウム塩の効果がキャンセルされていた（最右列最下段）。
【０１０７】
短鎖脂肪酸によるＴｈ１７細胞誘導増強効果がＧＰＲ４３ノックアウトマウスではキャンセルされたことから、マウスにおけるＧＰＲ４３のシグナリングがＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化経路を強力にＴｈ１７細胞へとシフトさせるものであることが確定的となった。
【０１０８】
（７）試験結果ＩＶ
分化を終えたＴｈ１７細胞の機能の活性化ならびに増殖に短鎖脂肪酸が与える影響について調べた。具体的には、７〜１０週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Japan SLC. Inc., Shizuoka, Japan）のナイーブＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、Ｔｈ１７コンディションにて分化誘導したＴｈ１７細胞（培養４日）を回収し、ＢＡＬＢ／ｃ由来のアクセサリー細胞とともに、３００μＭブチル酸存在下に、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体によって細胞刺激を加えた。細胞の調製、分化誘導培養、および刺激試験は前記（１）、（２）、および（３）の手法に従って行った。
【０１０９】
結果は図５に示される通りであった。ブチル酸の容量依存的にＴｈ１７細胞数が増加するとともに、Ｔｈ１７細胞からのＩＬ１７産生量が増加しており、ブチル酸非存在下のコントロールとの比較によってその効果が明らかに示された。すなわち、短鎖脂肪酸は、分化を終えたマウスのＴｈ１７細胞の機能の活性化ならびに増殖を促進することが明らかとなった。試験結果Ｉ〜ＩＩＩから、マウスにおけるＧＰＲ４３からのシグナリングはＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化経路を強力にＴｈ１７細胞へとシフトさせることが判明したが、試験結果ＩＶから、マウスにおけるＧＰＲ４３からのシグナリングは、分化を終えたＴｈ１７細胞の増殖や機能を増強していることが強く示唆された。
【０１１０】
実施例２：マウスへの短鎖脂肪酸投与試験
Ｄ−ＰＢＳ（−）で希釈したブチル酸ナトリウム塩（１０００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／２５０μｌ  ＰＢＳ／マウス）（Sodium Butyrate、NaB, Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA #B5887）もしくはＤ−ＰＢＳ（−）（２５０μｌ／マウス）を、メスＢＡＬＢ／ｃマウスに、４日間連続で腹腔内投与した。エンドトキシン併用群では、Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解したエンドトキシン（２０μｇ／１２５μｌ  ＰＢＳ／マウス）（Lipopolisaccharaides form E.Coli 055:B5, LPS, Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA #L2637）をブチル酸投与初日に、同時腹腔内投与した。コントロールにはＤ−ＰＢＳ（−）（１２５μｌ／マウス）を用いた。投与開始日を第０日とし、第４日にそれぞれのマウスから、腸間膜リンパ節（mesenteric lymphnode, MLN）、脾臓（Spleen）を摘出し、調製したリンパ球について、フローサイトメーターを用いてＦｏｘｐ３陽性Ｔｒｅｇ細胞ならびにＴｈ１７細胞を検出した。検出は実施例１（２）の手法に従って行った。
【０１１１】
結果は図６に示される通りであった。マウスの腸間膜リンパ節では、ブチル酸ナトリウム塩（ＮａＢ）やエンドトキシン（ＬＰＳ）の単独投与によってはＴｈ１７細胞頻度の上昇は見られなかったが、両者の併用によってその上昇が見られた（図６、左上段）。マウスの脾臓では、ブチル酸ナトリウム塩（ＮａＢ）とエンドトキシン（ＬＰＳ）の併用によるＴｈ１７細胞上昇はより顕著にみられた。いずれの投与群においてもＴｒｅｇ細胞頻度には大きな影響はみられなかった。
【０１１２】
ＬＰＳ投与によってマウス体内では、ＩＬ−６をはじめとする炎症性サイトカインの産生がもたらされており、これはインビトロにおけるＴｈ１７コンディションに近似した環境と考えられる。ここにブチル酸ナトリウム塩が存在していると、Ｔｈ１７細胞頻度が上昇したことから、マウス体内においても短鎖脂肪酸はＴｈ１７細胞の分化や増殖を増強することが示された。
【０１１３】
実施例３：ヒト末梢血由来ナイーブＣＤ４Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導への短鎖脂肪酸の影響
（１）インビトロ実験のための細胞の調製
健常供血者からヘパリン存在下に静脈血を採血し、Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden )による比重遠心法にて末梢血単核球を採取し、細胞を２％ウシ胎児血清（HyClone Utah, USA）を添加したＤ−ＰＢＳ（−）培地（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）に浮遊した。これを、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ALB11, Beckman coulter, CA, USA）、ＰＥ標識  抗ＣＤ２５抗体（B1.49.9, Beckman coulter, CA, USA）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（UCHL1, eBiosciences、CA, USA）、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識  抗ＣＤ４抗体（RPA-T4, eBiosciences、CA, USA）で細胞表面標識を行い、FACSAria cell sorter（BD Biosciences, CA, USA）を用いてＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯｎｅｇＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋  ナイーブＴ細胞を調製した。
【０１１４】
（２）インビトロＴｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養
ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯｎｅｇＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０４細胞／ウェル）を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体結合磁気ビーズ（５×１０４ビーズ）（CD3/CD28 T cell expander, Dynal, CA, USA）によって刺激培養した。Ｔｒｅｇ細胞誘導（Ｔｒｅｇコンディション）では、ヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ，PeproTech, NJ, USA）およびヒトＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ，R&D Systems, MN, USA）を培養に添加し、Ｔｈ１７細胞誘導（Ｔｈ１７コンディション）では、ヒトＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ，R&D Systems, MN, USA）に加えてヒトＩＬ−２３（１００ｎｇ／ｍｌ,eBiosciences、CA, USA），ヒトＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ, R&D Systems, MN, USA），ヒトＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ，BD Biosciences, CA, USA），ヒトＩＬ−２１（２５ｎｇ／ｍｌ, Cell Sciences, MA, USA）およびヒトＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍｌ, PeproTech, NJ, USA，培養第３日より）を添加し、９６穴Ｕ底プレート（Nalgen Nunc International, NY, USA）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、加湿下のもと６日あるいは９日間培養した。コントロール培養では、ヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ，PeproTech, NJ, USA）のみを添加した。培養後に回収した細胞をブレフェルディンＡ（４０μｇ／ｍｌ）（BD GolgiPlug, BD Biosciences, California, USA）およびモネンシン（２μＭ）（BD GolgiStop, BD Biosciences, California, USA）の存在下に、フォルボールミリステートアセテート（５０ｎｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）を用いて５時間刺激した後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（BW264/56, Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany）、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識  抗ＣＤ４抗体（RPA-T4, eBiosciences、CA, USA）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（236A/E7, eBiosciences, CA, USA）ならびにＰＥ標識抗ＩＬ−１７抗体（eBio64DEC17, eBiosciences, CA, USA）で細胞染色した。ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞のうち、Ｆｏｘｐ３あるいはＩＬ−１７が陽性である細胞を、フローサイトメーター（FACSAria cell sorterもしくはFACSCanto II、BD Biosciences, California, USA）で検出し、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔｒｅｇ細胞ならびにＩＬ−１７陽性Ｔｈ１７細胞を算定した。
【０１１５】
また、Ｔｈ１７細胞誘導（Ｔｈ１７コンディション）については、培養後の細胞をフォルボールミリステートアセテート（５０ｎｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）を用いて５時間刺激した後、その培養上清について、ＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（DuoSet ELISA Development System, R&D Systems, MN, USA）。
【０１１６】
（３）試験結果Ｉ
健常供血者から得られた末梢血単核球よりＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯｎｅｇＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４＋  ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、ブチル酸ナトリウム塩の存在下において、Ｔｈ１７細胞／Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養を行った。細胞の調製、分化誘導培養、および刺激試験は前記（１）、（２）の手法に従って行った。
【０１１７】
結果は図７に示される通りであった。フローサイトメーターの解析像によると、通常はわずかなＴｒｅｇ細胞のみしか誘導しえないコントロール培養において、強いＴｒｅｇ細胞誘導をみとめた（最上段パネル）。Ｔｒｅｇ細胞コンディションでは、培養のみにて強いＴｒｅｇ細胞がみられており、ここでは、ブチル酸ナトリウム塩の明瞭な効果は検出できなかった（中段パネル）。Ｔｈ１７細胞コンディションでは、Ｔｈ１７細胞とＴｒｅｇ細胞の誘導効率にはＦＡＣＳ上では明確な傾向を見出せなかったが、培養上清中のＩＬ−１７を測定したところ、ブチル酸ナトリウム塩に対して用量依存的にＩＬ−１７産生の阻害が確認された（最下段最右）。フローサイトメーターの解析像から算定したＴｒｅｇ細胞とＴｈ１７細胞の培養中の発現頻度と絶対数を中列ならびに右列に示した。Ｔｒｅｇ細胞の分化にはＴＧＦ−βが必須とされるが、これを添加していないコントロール培養においてＴｒｅｇ細胞誘導の増強が顕著であった。
【０１１８】
（４）試験結果ＩＩ
ブチル酸ナトリウム塩にかわり、同じ短鎖脂肪酸である酢酸の影響を（１）、（２）の手法に従って検討した。結果を図８に示した。酢酸によっても、コントロール培養でＴｒｅｇ細胞の誘導増強が確認できた（最上段）。また、Ｔｒｅｇ細胞コンディションにおいてはＴｒｅｇ細胞の発現頻度の誘導増強を認めたが、絶対数においては明確ではなかった（中段）。Ｔｈ１７細胞コンディションではフローサイトメーター解析では明確な傾向はみられなかったが（最下段）、培養上清中のＩＬ−１７では、その産生抑制が認められた（最下段最右）。
【０１１９】
このように、短鎖脂肪酸は、ヒトのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴｒｅｇ細胞の分化を強力に促進することが明らかとなった。この効果は、Ｔｒｅｇ細胞の分化に必須であるＴＧＦ−βを添加しないコントロール培養においても明確に認められた。培養上清中のＩＬ−１７の測定から、短鎖脂肪酸はヒトにおけるＴｈ１７誘導においては阻害的に作用することが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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