(57)【要約】【課題】可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって大量に効率よく生産する方法を提供する。【解決手段】甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターをその宿主に感染させ、該酵素の生産のための宿主のインキュベーションを、宿主の至適生育温度よりも８〜１２℃低い温度で実施する。該酵素の宿主内での分解または不活性化が低減され、かつ宿主外へ該酵素が分泌および散逸されないシグナルペプチド配列を使用することで、該酵素は宿主内に高濃度に蓄積され、プロテアーゼ処理によって効率よく回収される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、該核酸分解酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターをその宿主に感染させることにより生産する方法であって，該酵素の生産のための宿主のインキュベーションが、宿主の至適生育温度よりも８〜１２℃低い温度で行われる該酵素の生産方法。
【請求項２】
組換えベクターがバキュロウィルスである請求項１に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項３】
該核酸分解酵素をコードする遺伝子が、甲殻類由来核酸分解酵素自身の、異種遺伝子由来の、または非天然の分泌シグナルペプチド配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子であり、該シグナル配列の存在によって、宿主内での該核酸分解酵素の分解または不活性化が低減される、請求項１または２に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項４】
該分泌シグナルペプチドが宿主内で切断されて、該核酸分解酵素が宿主外へ分泌および散逸されることなく、宿主内に成熟酵素として高濃度に蓄積される、請求項３に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項５】
該宿主が昆虫細胞培養株である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項６】
宿主のインキュベーションが１６℃〜２０℃で行われる、請求項５に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項７】
該核酸分解酵素がプロテアーゼ活性に耐性があり、精製工程がプロテアーゼ処理で目的外のタンパク質を分解させる工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項８】
該プロテアーゼ処理に使用する酵素がｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋである、請求項７に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項９】
該プロテアーゼ処理の工程と他の１つの精製工程からなる、２段階の精製工程によって該核酸分解酵素の精製を行う、請求項７または８に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項１０】
該プロテアーゼ処理の工程とアフィニティ精製の工程からなる、２段階の精製工程によって該核酸分解酵素の精製を行う、請求項９に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項１１】
該核酸分解酵素が十脚目（Ｄｅｃａｐｏｄａ）の肝膵臓由来である、請求項1〜１０のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項１２】
該核酸分解酵素が、Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ  または  Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ  由来の酵素である、請求項１１に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項１３】
該核酸分解酵素が、二本鎖特異的核酸分解酵素（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）  である、請求項1〜１２のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
【請求項１４】
該核酸分解酵素をコードする遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）をコードする遺伝子である請求項1〜１３のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法；
（ａ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入、または置換されたアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって大量に効率よく生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲殻類由来の核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）は、分子生物学分野などにおいて様々な用途がある。例えば、エビやカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）由来のヌクレアーゼの中には、二本鎖核酸に高度に特異的なＤＮａｓｅ活性を示すことからＤＳＮ（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）と呼ばれるものがあり、ＳＮＰ解析や（非特許文献１、特許文献１）、ｃＤＮＡ  ライブラリのノーマライゼーション（非特許文献２）やサブストラクション法（非特許文献３）、テロメアの１本鎖オーバーハング長の解析（非特許文献４）などの応用が示されている。
しかしながら、甲殻類由来の核酸分解酵素は、天然材料の入手困難性に加え、天然材料から単離・精製される収量が少ないため、非常に高価である。
これらの甲殻類由来核酸分解酵素を組換え技術によって生産すると、ほとんどの場合、酵素活性を持たない不活性な不溶化タンパク質が得られる結果となる。
【０００３】
例えば、クルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）の肝膵臓由来のヌクレアーゼ（非特許文献５）や、ヤドカリ下目タラバガニ科Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）の肝膵臓由来のＤＳＮ（非特許文献１）について、大腸菌中での組換え酵素の発現を行ったところ、それらの酵素は不活性な不溶性タンパク質として産生されたことが報告されている。Ａｎｉｓｉｍｏｖａらは、大腸菌内で組換えタラバガニＤＳＮ分子が凝集した封入体から、変性、リフォールディング、活性化を含む工程を通じて、可溶性で酵素活性を有する組換えタラバガニＤＳＮを得たが（非特許文献６）、その工程は多段階にわたる非常に手間のかかるものであった。本発明者らは以前に、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて組換えタラバガニＤＳＮの発現を行ったところ（非特許文献７）、可溶性の組換えタラバガニＤＳＮを発現させることに成功した。しかし、不溶性で不活性な組換えタラバガニＤＳＮも大量に産生され、精製後に得られた可溶性のタラバガニＤＳＮの収量は僅かであった。
【０００４】
甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって可溶性かつ活性を示す酵素として生産することが困難な原因はほとんど分かっていない。理由はいくつもあり得るが、推定される理由の一つに、これらの酵素がアミノ酸配列中に多数のシステインを有しており、その成熟タンパク質は高度なジスルフィドネットワークを形成していることが挙げられる。例えば、クダヒゲエビ科のＳｏｌｅｎｏｃｅｒａ  ｍｅｌａｎｔｈｏ  （ナミクダヒゲエビ）の肝膵臓由来の核酸分解酵素は、３６のＣｙｓ残基による１８のジスルフィド結合によって高度に分子内架橋されている（非特許文献８）。クルマエビ肝膵臓由来のヌクレアーゼは、１１のＣｙｓ  残基を持っており、それらのうちの１０  のＣｙｓ  残基が５つの分子内ジスルフィド結合を形成し、残る１つのＣｙｓ  残基は、分子量５００〜７００  Ｄａと推定されるチオール化合物に結合している（非特許文献５）。タラバガニ肝膵臓由来ＤＳＮは１０のＣｙｓ  残基を有している（非特許文献１）。クルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ  （ブラックタイガーエビ）の肝膵臓由来のヌクレアーゼは１１のＣｙｓ残基を有している（非特許文献９）。クモガニ科Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）は１２のＣｙｓ残基を有している。
このような背景のもと、可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって大量に効率よく生産する方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ０３／０４８３７８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈａｇｉｎ，  Ｄ．  Ａ．ら  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，  １２，  １９３５−１９４２  （２００２）
【非特許文献２】Ｚｈｕｌｉｄｏｖ  Ｐ．  Ａ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３２（３），  e３７  （２００４）
【非特許文献３】Ｐｅｎｇ，  Ｒ．  Ｈ．ら  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ３７２，  １４８−１５５  （２００８）．
【非特許文献４】Ｚｈａｏ，  Ｙ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３６，  ｅ１４  （２００８）
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，  Ｗ．  Ｙ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３４６  Ｐｔ  ３，  ７９９−８０４  （２０００）
【非特許文献６】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，  Ｖ．  Ｅ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ），  ７１，  ５１３−５１９  （２００６）
【非特許文献７】平川雄三，  大磯勲：タラバガニ由来ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  の昆虫細胞−バキュロウイルス系による発現．第１１回マリンバイオテクノロジー学会大会，  Ｐ４−１  （２００８年５月２４〜２５日）
【非特許文献８】Ｃｈｏｕ，  Ｍ．Ｙ．ら  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １０３６，  ９５−１００  （１９９０）
【非特許文献９】Ｍｏｌｔｈａｔｈｏｎｇ  Ｓ．ら  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２２，  ６１７−６２７  （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって大量に効率よく生産する方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターをその宿主に感染させ、該酵素の生産のための宿主のインキュベーションを、宿主の至適生育温度よりも８〜１２℃低い温度で実施することで、可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を大量に効率よく生産し得ることを見出した。また該酵素の宿主内での分解または不活性化が低減され、かつ宿主外へ該酵素が分泌および散逸されないシグナルペプチド配列を使用することで、該酵素は宿主内に高濃度に蓄積され、プロテアーゼ処理によって効率よく回収されることを見出した。そして上記課題を解決しうる発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の＜１＞〜＜１２＞に関する。
＜１＞可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、該核酸分解酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターをその宿主に感染させることにより生産する方法であって、該酵素の生産のための宿主のインキュベーションが、宿主の至適生育温度よりも８〜１２℃低い温度で行われる該酵素の生産方法。
＜２＞組換えベクターがバキュロウィルスである＜１＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜３＞該核酸分解酵素をコードする遺伝子が、甲殻類由来核酸分解酵素自身の、異種遺伝子由来の、または非天然の分泌シグナルペプチド配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子であり、該シグナル配列の存在によって、宿主内での該核酸分解酵素の分解または不活性化が低減される、＜１＞または＜２＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜４＞該分泌シグナルペプチドが宿主内で切断されて、該核酸分解酵素が宿主外へ分泌および散逸されることなく、宿主内に成熟酵素として高濃度に蓄積される、＜３＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜５＞該宿主が昆虫細胞培養株である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜６＞宿主のインキュベーションが１６℃〜２０℃、好ましくは１８℃で行われる、＜５＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜７＞該核酸分解酵素がプロテアーゼ活性に耐性があり、精製工程がプロテアーゼ処理で目的外のタンパク質を分解させる工程を含む、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜８＞該プロテアーゼ処理に使用する酵素がｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋである、＜７＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜９＞該プロテアーゼ処理の工程と他の１つの精製工程からなる、２段階の精製工程によって該核酸分解酵素の精製を行う、＜７＞または＜８＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜１０＞該プロテアーゼ処理の工程とアフィニティ精製の工程からなる、２段階の精製工程によって該核酸分解酵素の精製を行う、＜９＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜１１＞該核酸分解酵素が十脚目（Ｄｅｃａｐｏｄａ）の肝膵臓由来である、＜1＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜１２＞該核酸分解酵素が、Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ  または  Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ  由来の酵素である、＜１１＞に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜１３＞該核酸分解酵素が、二本鎖特異的核酸分解酵素（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）である、＜1＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法。
＜１４＞該核酸分解酵素をコードする遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）をコードする遺伝子である＜1＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の甲殻類由来核酸分解酵素の生産方法；
（ａ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入、または置換されたアミノ酸配列。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によって、可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって大量に効率よく生産することが可能となり、該酵素は、核酸分子の分析、検出、分解、合成、改変などを含む様々な検査技術や、診断技術、遺伝子工学技術に利用できる。また組換え技術による酵素の生産方法は、変異導入などによって機能が改変された酵素の生産にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】単離したタラバガニ二本鎖特異的核酸分解酵素（ＤＳＮ）  ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３）と、既知のタラバガニＤＳＮ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ５２０５９１）との塩基配列の比較を示す図である。
【図２】ＤＳＮ断片の増幅のために行ったＰＣＲに用いられるプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】組換えＤＳＮ発現コンストラクトを示す図である。
【図４】組換えウィルス非感染細胞(Ｓｆ９）培養液および組換えウィルス感染細胞(Ｓｆ９）培養液を遠心分離して得られた各画分のウェスタンブロットによる解析結果を示す図である。
【図５】各コンストラクトで発現した組換えタラバガニＤＳＮの精製工程のウェスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】組換えタラバガニＤＳＮの二本鎖核酸特異的分解活性測定の結果を示すゲル電気泳動図である。
【図７】組換えウィルス感染細胞(Ｓｆ９）のインキュベーション温度の変化による組換えタラバガニＤＳＮの発現量の差を示す図である。
【図８】組換えズワイガニＤＳＮの精製における各溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図９】組換えズワイガニＤＳＮの精製におけるプロテイナーゼＫ処理および熱処理の影響を示すＳＤＳページの結果についての図である。
【図１０】組換えズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的切断活性の結果を示すアガロースゲル電気泳動図である。
【図１１】組換えウィルス感染細胞(Ｓｆ９）および組換えウィルス感染細胞(ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋）  のインキュベーション温度の変化による組換えズワイガニＤＳＮの現量の差を示す図である。
【図１２】ＴＡＬＯＮ精製溶出画分における組換えウィルス感染細胞(Ｓｆ９）および組換えウィルス感染細胞(ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋）のインキュベーション温度の変化による組換えズワイガニＤＳＮの現量の差を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターをその宿主に感染させることにより生産する方法であって、該酵素の生産のための宿主のインキュベーションが、宿主の至適生育温度よりも８〜１２℃低い温度で行われる該酵素の生産方法である。
【００１３】
該甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子は、当業者に公知のクローニング手法等によって調製されたものでよい。該遺伝子は、例えば次のアミノ酸配列をコードする遺伝子であってよい；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢＩ１８９７４  （Ａｍｐｈｉｕｃａ  ｃｒａｓｓｉｐｅｓ由来）、ＡＡＮ８６１４３  （Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ由来）、ＢＡＨ０２８２３  （Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ由来）、ＣＡＢ５５６３５  （Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来）、ＡＢＦ６９９３８  （Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ由来）、ＡＣＬ８１５５８  （Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ由来）、ＡＢＩ１８９７２  （Ｐａｌａｅｍｏｎｉｄａｅ  ｓｐ．由来）。また該遺伝子は、例えば、Ｈｏｍａｒｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｅｔｒｏｌｉｓｔｈｅｓ  ｃｉｎｃｔｉｐｅｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、あるいはＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ  由来のヌクレアーゼをコードする遺伝子であってよい。
【００１４】
該甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子の好ましい例として、Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ  （タラバガニ）  および  Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ  （ズワイガニ）  由来の二本鎖核酸特異的核酸分解酵素  （ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＳＮ）  をコードする遺伝子が挙げられる。該タラバガニＤＳＮの例として、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＤＳＮが挙げられる。該ズワイガニＤＳＮの例として、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＤＳＮが挙げられる。該配列番号１および２の甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子の例として、それぞれ配列番号３および配列番号４に示すＤＮＡが挙げられる。また、これらのＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ二本鎖核酸特異的分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも挙げられる。さらに、配列番号３あるいは配列番号４に記載のＤＮＡにおいて１若しくは複数個の塩基が付加、欠損、若しくは置換された塩基配列であって、かつＤＳＮをコードする塩基配列を有するＤＮＡも、挙げられる。ここで、１若しくは複数個の塩基が付加、欠損、若しくは置換された塩基配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の塩基配列同一性を有する塩基配列をいう。
【００１５】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５  Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５  Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００  ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００１６】
核酸分解酵素をコードする遺伝子は、甲殻類由来核酸分解酵素自身の、異種遺伝子由来の、または非天然の分泌シグナルペプチド配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子であることが好ましい。該シグナルペプチドは後述の宿主細胞内で切断されるペプチドであって、該甲殻類由来核酸分解酵素を、後述の宿主細胞外へと分泌あるいは散逸させないペプチドが好ましい。また、該シグナルペプチドは、宿主内での該核酸分解酵素の分解または不活性化を低減するものであることが好ましい。異種遺伝子由来のシグナルペプチドとしては、例えばリゾチーム由来のシグナルペプチドが挙げられ、例えばヒトリゾチーム、ブタリゾチーム、ニワトリリゾチーム由来のシグナルペプチドが挙げられる。該シグナルペプチドは、好ましくは、甲殻類由来核酸分解酵素自身のシグナルペプチド、またはヒトリゾチーム由来のシグナルペプチドである。
以下にシグナルペプチドのアミノ酸配列の例を示す。
【表１】
2010263812.tif 000003
【００１７】
核酸分解酵素をコードする遺伝子には、後で核酸分解酵素の精製や検出を容易にするために、ＧＳＴタグやヒスチジンタグなどのタグ配列等をコードする配列を付加してもよい（例えば、Ｔｅｒｐｅ，  Ｋ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ６０，  ５２３−５３３，  ２００３）。
核酸分解酵素の活性は、当業者に既知の様々なヌクレアーゼ活性測定法によって測定することができるが、好ましくはＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３３，  ３４９−３６２，  １９５０）  によって測定される。
【００１８】
本発明の方法に使用する宿主は、好ましくは昆虫（例えば、成虫、蛹、幼虫、卵、もしくは昆虫培養細胞株など）であり、さらに好ましくは昆虫細胞培養株である。昆虫培養細胞株は、例えばヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）の細胞であり、例えば、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来の細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞等の細胞株）、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１、及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞等の細胞株）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来の細胞（例えば、ＭＧ１細胞及びＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞等の細胞株）が挙げられる。
本発明の方法では、甲殻類由来核酸分解酵素をコードする遺伝子を好ましくは昆虫細胞に導入し、該核酸分解酵素遺伝子を有する昆虫細胞（即ち、形質転換体）を作製する。
【００１９】
昆虫細胞への導入すべき核酸分解酵素遺伝子の形態は、例えば、核酸分解酵素遺伝子を含むＤＮＡ、又は核酸分解酵素遺伝子を含む発現ベクターであってよい。核酸分解酵素遺伝子を含む発現ベクターは、適当なベクターのマルチクローニングサイト等に核酸分解酵素遺伝子を挿入することで得ることができる。適当なベクターとしては、例えばカイコ由来細胞用にはカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ベクター、ヨトウガ由来細胞用にはＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓベクター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ベクター  などが挙げられる。なお、ベクターには、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御領域が適宜含まれていることが好ましい。
昆虫細胞への核酸分解酵素遺伝子を含むＤＮＡ又は発現ベクターの導入方法は、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２０】
本発明では、次いで得られた形質転換体を培養し、核酸分解酵素遺伝子を発現させ、核酸分解酵素を産生させる。培養温度は、宿主の至適生育温度よりも８〜１２℃低い温度が好ましく、例えば、宿主がヨトウガ由来細胞である場合には、例えば、１６℃〜２０℃の温度である。培地は宿主によって適切に選択され、特に限定されないが、例えば宿主がヨトウガ由来細胞である場合には、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が挙げられる。培地のｐＨは例えば６．０〜７．０であり、好ましくはｐＨ  ６．２〜６．５である。培養時間は、例えば７２時間〜２４０時間であり、好ましくは、９６〜１６８時間である。
【００２１】
次いで、産生させた核酸分解酵素以外のタンパク質を分解させるため、プロテアーゼ処理が行われる。本発明のプロテアーゼ処理は、好ましくはｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋによる処理である。プロテアーゼ処理の好ましい濃度は、例えば、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを用いた場合、５〜２０μｇ／ｍｌの濃度となるようにタンパク質含有液に添加する。好ましい処理条件は、例えば３７℃、３０分間のインキュベーションである。
【００２２】
プロテアーゼ処理後には核酸分解酵素の精製が行われる。精製には、当業者がタンパク質の単離精製に用いる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独あるいは適宜組み合わせて用いることにより、前記酵素溶液から核酸分解酵素を単離精製することができる。核酸分解酵素に、ＧＳＴタグやヒスチジンタグなどのタグ配列等を付加して発現させた場合、このような付加配列は、当該酵素の精製途中あるいは精製後に、当業者が通常行う適当な酵素処理等によって取り除いてもよいし、付加配列によって本発明の核酸分解酵素の活性が損なわれない場合はそのままでもよい。本発明の好ましい実施形態における精製方法の例は、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理と、アフィニティ精製による２ステップ精製である。
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
＜実施例１＞  タラバガニ由来核酸分解酵素（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）の生産
（１）タラバガニＤＳＮ  ｃＤＮＡの単離
北海道釧路町で水揚げされた活タラバガニを購入した。タラバガニを解剖して肝膵臓を採取した。採取した肝膵臓、約１００ｍｇを直ちに１．２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に浸漬し、４℃で１６時間保存した。浸漬した肝膵臓をピンセットで取り出し、新しいエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで−８０℃で保存した。
保存したタラバガニの肝膵臓から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。３０ｍｇの肝膵臓から、６０μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。
【００２４】
前述の手順で取得したタラバガニ肝膵臓  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、タラバガニＤＳＮ遺伝子を増幅させるために、逆転写反応とＰＣＲを行った．これらの操作は、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いて行った。反応組成および操作手順を以下に示した．逆転写反応には以下のプライマーを使用した。
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０  ［５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ−３’］（配列番号５）、および
ＤＳＮ  ｌｏｗｅｒ  ［５’−ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＡＣＣ−３’］（配列番号６）。
ＰＣＲ  には以下のプライマーを使用した。
ＤＳＮ  ｕｐｐｅｒ  ［５’−ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’］（配列番号７）、および
ＤＳＮ  ｌｏｗｅｒ  ［５’−ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＡＣＣ−３’］（配列番号６）。
以下のＰＣＲ反応液（総量５０  μｌ）を用いた。
滅菌ミリＱ水  ３５  μｌ
１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５  μｌ
２５  ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３  μｌ
１０  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １  μｌ
ＤＳＮ  ｕｐｐｅｒ  １．５  μｌ
ＤＳＮ  ｌｏｗｅｒ  １．５  μｌ，ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−  １  μｌ
逆転写サンプル  ２  μｌ
ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃  ２分（９８℃  １０秒、５７℃  ３０秒、６８℃  ９０秒）×３５サイクルとし、４℃で保持した。上述の工程で増幅した断片（両端は平滑末端）とＳｍａＩで消化したｐＶＬ１３９３をライゲーションした。ライゲーション反応液２０μｌをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＪＭ１０９（東洋紡社製）１００μｌに形質転換した。ライゲーションおよび形質転換は、キットに添付のプロトコールに従い行った。ＬＢ＋アンピシリン培地上に形成されたコロニーをピックアップし、コロニーＰＣＲを行い、断片の挿入の有無を確認した。コロニーＰＣＲには以下のプライマーを使用した
５’−ＵＴＲ  ｐｒｉｍｅｒ  ［５’−ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  Ｔ−３’］（配列番号８）、および
３’−ＵＴＲ  ｐｒｉｍｅｒ  ［５’−ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＣＧ−３’］（配列番号９）。
【００２５】
挿入が確認されたクローンについて、シーケンサー（ＬＩＣ−４２００Ｌ−１Ｇ、ＡＬＯＫＡ社製）を用いて、所定の方法によって、挿入断片の塩基配列を解読した。このようにして取得したプラスミドをｐＶＬ１３９３  ＤＳＮとした。得られたクローンの塩基配列（配列番号３）と、既知のタラバガニＤＳＮ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ５２０５９１）との比較を図１に示した。
【００２６】
（２）組換えタラバガニＤＳＮを発現させるための昆虫細胞用ベクターの構築
コンストラクト作製のためにｐＶＬ１３９３  ＤＳＮを鋳型としてＰＣＲを行い、挿入されたＤＳＮ断片を増幅させた。各ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列を図２に示した。増幅した各断片を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＶＬ１３９３に挿入し、以下に記載する各コンストラクト（ａ）〜（ｄ）を作製した。
まず次の３つのコンストラクトを構築した：（ａ）タラバガニＤＳＮ由来のシグナルペプチド配列を含む遺伝子（Ｎａ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）、（ｂ）タラバガニＤＳＮ由来のシグナルペプチド配列をヒトリゾチームシグナルペプチド配列に置換した遺伝子（ＨＬ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）、（ｃ）シグナルペプチド配列を除いた遺伝子（Ｎｓ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）。これらのコンストラクトは、ＤＳＮ遺伝子の３’末端に６×ヒスチジン配列を挿入し、Ｃ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質として発現させた。さらにコンストラクト（ｄ）  として、シグナルペプチド配列を除き、５’末端に６×ヒスチジン配列を付加した遺伝子（Ｎｓ−Ｈｉｓ−ＤＳＮ）も作製し、計４つのコンストラクトを構築した。各コンストラクトの模式図を図３に示した。
【００２７】
（３）バキュロウイルス−昆虫細胞系を用いた組換えタラバガニＤＳＮの発現と局在
Ｓｆ９細胞およびセルフェクチン試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋  細胞は日本農産工業社、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡはＯｒｂｉｇｅｎ社から購入した。
作製した各コンストラクトをＳｆ９細胞内でコトランスフェクションし、各組換えウイルスを作製した。コトランスフェクションは、セルフェクチン試薬を用いて，所定の方法に従い行った。作製した各組換えウイルスのコトランスフェクション液１ｍｌをＴｃフラスコで培養したＳｆ９細胞０．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１５ｍｌ）に添加し、２８℃で５日間、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地中でインキュベートした。
【００２８】
ウイルス感染培養液１５ｍｌをチューブに回収し、５，０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を細胞外画分とした。沈殿した細胞をＰＢＳバッファーで洗浄後、１．５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）に懸濁し、１０秒間の超音波破砕を３回行った。１４，０００  ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清を細胞内画分とした。沈殿は１．５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）に懸濁し、これを細胞破砕沈殿画分とした。
【００２９】
調製した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ヒスチジンタグ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製社）を用いたウエスタンブロットにより解析した結果を図４に示す。図４のにおいて、それぞれ、Ｅｘは細胞外分泌画分を、Ｉｎは細胞破砕上清画分を、Ｐは細胞破砕沈殿画分を示す。また、図４の（Ｂ）において、それぞれ、ＣはＣ末端ヒスチジンタグ付加コンストラクト（Ｎｓ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）、ＮはＮ末端ヒスチジンタグ付加コンストラクト（Ｎｓ−Ｈｉｓ−ＤＳＮ）、ＵＣはＵｎｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ（ウィルス非感染細胞の細胞破砕上清画分）を示す。この結果、バキュロウイルス−昆虫細胞系を用いて発現させた組換えタラバガニＤＳＮは、作製したすべてのコンストラクトで、分子量約４０ｋＤａの位置にヒスチジンタグ抗体と反応するバンドが検出された。組換えタラバガニＤＳＮは、すべてのコンストラクトで、細胞外への分泌は確認されず、細胞破砕上清画分および細胞破砕沈殿画分において発現していた。シグナルペプチドを含むコンストラクト（ＨＬ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ、Ｎａ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）と除いたコンストラクト（Ｎｓ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ、Ｎｓ−Ｈｉｓ−ＤＳＮ）の細胞内画分すなわち、細胞破砕上清画分のバンドを比較すると、シグナルペプチドを含む場合は、約４０ｋＤａの組換えタラバガニＤＳＮと考えられるバンドがメインバンドであるのに対して（図４  ＡのレーンＩｎ）、シグナルペプチドを除いた場合は、組換えタラバガニＤＳＮと考えられるバンドがメインバンドではあるが、それ以外のバンドも多数観察された（図４  ＢのレーンＩｎ）。これらのバンドは、ヒスチジンタグ抗体と反応し、タラバガニＤＳＮの推定分子量よりも小さいサイズのバンドであることから、発現した組換えタラバガニＤＳＮの分解物であると見られる。よってバキュロウイルス−昆虫細胞系を用いて組換えタラバガニＤＳＮを発現させた場合、シグナルペプチド配列を含まない遺伝子を発現させると、細胞内で合成された組換えタラバガニＤＳＮが分解を受けることが示された。
【００３０】
（４）組換えタラバガニＤＳＮの精製
発現した組換えタラバガニＤＳＮを、Ｎｉ担体を用いて精製した。Ｎｉ担体はＱＩＡＧＥＮ社のＮｉ−ＮＴＡを使用した。精製に使用したバッファーは、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ  ７．４（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）および５０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ  ７．４（Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）である。また、細胞の溶解には、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒに最終重量％濃度が１％になるようにＮＰ４０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を添加したバッファー（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用した。
【００３１】
作製した各組換えウイルス１ｍｌをｅｘｐｒｅｓＳＦ＋  細胞（１．０×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，５０  ｍｌ）に感染させ、２８℃で５日間、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地中でインキュベートした。ウイルス感染培養液５０ｍｌをチューブに回収し、５，０００×ｇ、５分間遠心分離した。沈殿した細胞をＰＢＳバッファーで２回洗浄した後、精製工程に供するまで−８０℃で保存した。
前記の方法で保存した細胞から、以下の手順（ａ）〜（ｇ）によって組換えタラバガニＤＳＮの精製を行った。
（ａ）  −８０℃で保存した細胞を４ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。
（ｂ）  氷上で１時間静地後、１０ｓｅｃ×３回の超音波破砕を行い、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（ｃ）  上清を回収し、その上清にＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製社）１ｍｌを添加した。
（ｄ）  ４０ｒｐｍで１時間ロータリーシェイカーを用いて混合した。
（ｅ）  ７００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。
（ｆ）  沈殿したＮｉ−ＮＴＡを１０ｍｌのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。
（ｇ）  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍｌ（自社調製）でＮｉ−ＮＴＡに吸着した組換えタラバガニＤＳＮを溶出させた。
【００３２】
各コンストラクトで発現した組換えタラバガニＤＳＮの精製工程のウエスタンブロット解析結果を図５に示した。図５において、Ｍは分子量マーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、Ｓは細胞破砕上清画分を、ＩＳは細胞破砕沈殿画分を、ＵＢは非結合画分を、Ｗは洗浄画分を、Ｅは溶出画分をそれぞれ示す。
各コンストラクトの溶出画分（図５のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤのＥ１およびＥ２）には、タラバガニＤＳＮの分子量約４０ｋＤａと同等の位置に、ヒスチジンタグ抗体と反応するバンドが検出された。よって、発現した各コンストラクトの組換えタラバガニＤＳＮはＮｉ−ＮＴＡに吸着し、イミダゾールにより溶出したことが示された。ＨＬ−ＤＳＮ−ＨｉｓとＮａ−ＤＳＮ−Ｈｉｓの溶出画分の矢印で示したバンド（図５  ＡとＢのＥ１およびＥ２）の濃淡を比較しても顕著な差は観察されなかった。すなわち、これらのコンストラクト間での組換えタラバガニＤＳＮ発現量はほとんど差が無いと考えられる。よって、組換えタラバガニＤＳＮにおいて、異種シグナルであるヒトリゾチームシグナルペプチドを使用しても、タラバガニ由来のシグナルペプチドと同等の効果が得られることが示された。
【００３３】
（５）組換えタラバガニＤＳＮの核酸分解活性
前記の方法で精製した組換えタラバガニＤＳＮの二本鎖核酸特異的分解活性の測定を行った。二本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）、一本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を使用した。二本鎖核酸特異的分解活性評価の反応液（１０  μｌ）の組成は次の通りである。
タラバガニＤＳＮ酵素溶液１  μｌ
１０×ＤＳＮ  バッファー  １  μｌ
滅菌蒸留水７  μｌ
λ  ＤＮＡ  ０．５  μｌ（１５０  ｎｇ）
Ｍ１３  ＤＮＡ  ０．５  μｌ（５０  ｎｇ）
ここで１０×ＤＳＮ  バッファーは、５００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、  ５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ  より成る。調製した反応液を６５℃で３分間インキュベートし、１％アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後のアガロースゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｌｏｎｚａ社製）で３０分間染色し、泳動像を観察した。
【００３４】
比較のために、タラバガニ肝膵臓から抽出された天然由来ＤＳＮ（ＥＶＲＯＧＥＮ社製）についても同様の試験を行った。また、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの両方を分解する特異性を持たないＤＮＡ分解酵素として、ウシ膵臓由来ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）も比較に用いた。
これらの結果を図６に示す。シグナルペプチド配列を含むコンストラクト（ＨＬ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ、Ｎａ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）の溶出画分（図６  ＨＬ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ、Ｎａ−ＤＳＮ−Ｈｉｓの１および２）は、二本鎖ＤＮＡ基質（λＤＮＡ）のみが分解され、一本鎖ＤＮＡ基質（Ｍ１３  ＤＮＡ）は分解されなかった。すなわち、これらの組換えタラバガニＤＳＮには、二本鎖核酸特異的分解活性が確認された。さらに天然由来ＤＳＮ、すなわちタラバガニ肝膵臓から抽出したＤＳＮによる反応液の電気泳動像が、これらの組換えタラバガニＤＳＮの結果とほぼ同等であることも確認された。一方、シグナルペプチド配列を除いたコンストラクト（Ｎｓ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ、Ｎｓ−Ｈｉｓ−ＤＳＮ）の溶出画分（図６Ｎｓ−Ｈｉｓ−ＤＳＮ，  Ｎｓ−ＤＳＮ−Ｈｉｓの１および２）では、両方の基質ＤＮＡが分解されず、二本鎖核酸特異的分解活性も、ＤＮＡ分解活性も持たないことが示された、比較に用いたウシ膵臓由来ＤＮａｓｅ  Ｉは、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ基質を分解した（図６  ＤＮａｓｅＩ）。
【００３５】
ウエスタンブロット解析結果（図５）では、すべてのコンストラクトの溶出画分に組換えタラバガニＤＳＮと見られるバンドが検出されていたにもかかわらず、二本鎖核酸特異的分解活性を示したのは、シグナルペプチド配列を含むコンストラクト（ＨＬ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ，Ｎａ−ＤＳＮ−Ｈｉｓ）だけであった。このことは、バキュロウイルス−昆虫細胞系による組換えタラバガニＤＳＮの発現において、シグナルペプチド配列の有無が組換えタラバガニＤＳＮの活性に重要であり、活性を有する組換えタラバガニＤＳＮを発現させるためには、異種由来または甲殻類由来核酸分解酵素自身のシグナルペプチド配列が必須であることを示している。
【００３６】
（６）組換えタラバガニＤＳＮの大量生産
前記方法により得られた組換えタラバガニＤＳＮの収量は非常に微量であった。我々は、活性を保持した組換えＤＳＮの発現量を増加させるために、組換えバキュロウイルス感染後のインキュベーション温度に着目した。一般的には、バキュロウイルス系で組換えタンパク質を合成する場合は、昆虫細胞の生育温度である２８℃でインキュベーションを行うが、ここではそれよりも低温の１８℃でインキュベーションすることによって、活性を保持した組換えＤＳＮの発現量が著しく増加することを示す。
【００３７】
昆虫細胞のインキュベーション温度を１８℃とし、他は前記と同様の方法で組換えタラバガニＤＳＮの発現・精製を行った。１００ｍｌの昆虫細胞培養液から得られたＴＡＬＯＮ精製溶出画分に存在する活性を保持した組換えＤＳＮ量は、２８℃で発現を行った場合と比較して、以下に示すとおり、約６０倍増加した。
【表２】
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【００３８】
精製各画分のウエスタンブロット結果（図７）を見ると、可溶性画分に存在する組換えタラバガニＤＳＮ発現量は１８℃と２８℃でほぼ同等に見える。一方、不溶性画分では、２８℃の方が顕著に濃いバンドが観察された。つまり、２８℃インキュベーションでは、不溶化した組換えタラバガニＤＳＮが大量に蓄積されている。この問題を解決するために、組換えウイルス感染後のインキュベーション温度を１８℃にした結果、昆虫細胞内で合成された組換えタラバガニＤＳＮの適切なフォールディング形成が促進され、可溶性の組換えタラバガニＤＳＮ量を劇的に増やすことができた。このようにして大量に産生（発現・精製）された組換えタラバガニＤＳＮは、前記（５）と同様の方法で活性試験を行ったところ、該酵素が二本鎖核酸特異的分解活性を有することが確認された。
【００３９】
＜実施例２＞  ズワイガニ由来核酸分解酵素（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）の生産
（１）ズワイガニＤＳＮ全長遺伝子のクローニング
ズワイガニＤＳＮのｃＤＮＡ配列（配列番号４）に基づきプライマーＭＷＦ１（５’−ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡ−３’）（配列番号１０）およびＭＷＲ１（５’−ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＧＧ−３’）（配列番号１１）を設計し、これによってズワイガニＤＳＮ全長遺伝子をクローニングした。逆転写およびＰＣＲ反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いて行った。まず以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。鳥取県の網代港で水揚げされた活ズワイガニを購入し、採取したズワイガニ肝膵臓からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、５μｌの  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ−３’）（配列番号５）（１０μＭ）および、６．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、６５℃で５分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液（５×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を４μｌ添加した。ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２μｌ、逆転写酵素としてＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社製）を１μｌ、それぞれ添加して反応液（全量２０μｌ）を調製した。反応液を４２℃で６０分間インキュベート後、８５℃で５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この溶液を逆転写ｃＤＮＡ溶液とした。
【００４０】
この逆転写ｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として、反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。前記のプライマーＭＷＦ１およびＭＷＲ１をそれぞれ終濃度０．３  μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約１３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０  μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中（以下  ｐＵＣ１８  ＺＤＳＮと呼ぶ）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてズワイガニＤＳＮ全長遺伝子をクローニングし、その全配列を確認した。ズワイガニＤＳＮのアミノ酸配列は、タラバガニＤＳＮとの間で保存された位置にある１０のＣｙｓ残基と、さらに付加的な２つのＣｙｓ残基があり、合計１２のＣｙｓ残基を有している。
【００４１】
（２）組換えズワイガニＤＳＮ  の発現および精製
前記の方法によって単離されたズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡを用い、バキュロウイルス−昆虫細胞系による組換えズワイガニＤＳＮ酵素の発現と精製を行った。
以下に示すＰＣＲにより、ズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡを増幅させた。ズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するために、プライマーＭＥＰＦ（５’−ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＣＧ−３’）（配列番号１２）およびＭＥＰＲ−Ｈｉｓ（５’−ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣＧ−３’）（配列番号１３）を作製した。ズワイガニＤＳＮをＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として発現させるために、ＭＥＰＲ−Ｈｉｓの５’末端側には、６×ヒスチジンをコードする塩基配列を付加している。
【００４２】
前記のｐＵＣ１８  ＺＤＳＮ  ６ｎｇを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０  Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＫＯＤ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。前記のプライマーＭＥＰＦおよびＭＥＰＲ−Ｈｉｓをそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、約１２５０ｂｐの位置にバンドが確認された。このＰＣＲ増幅産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。精製した増幅産物を、ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）およびＢａｍＨＩ（ニッポンジーン社製）を用いて消化後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。制限酵素で消化した増幅産物を常法に従って、ｐＶＬ１３９３ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ（以下ｐＶＬ１３９３  ＺＤＳＮ−Ｈｉｓと呼ぶ）中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって誤りがないことを確認した。
【００４３】
作製したｐＶＬ１３９３  ＺＤＳＮ−Ｈｉｓ  ２μｇ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｏｒｂｉｇｅｎ社製）  ０．５  μｇおよび無血清培地Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を混合して溶液Ａ（全量５０μｌ）を調製した。また、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ  ４５μｌとセルフェクチン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５μｌを混合して溶液Ｂを調製した。溶液Ａと溶液Ｂを混合して溶液Ｃを調製し、室温で３０分間静地した。φ６０ｍｍ  ｄｉｓｈに０．４×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量４ｍｌ）で準備したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶液Ｃを添加し、２８℃で６時間インキュベートした。培地のみを除去し、新しいＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ  ３  ｍｌを添加して、２８℃で５日間インキュベートした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を１ｓｔ組換えウイルス液とした。次に、組換えウイルスの感染力価を増加させるために、以下の操作を行った。１ｓｔ組換えウイルス液  ５００  μｌを、０．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１５  ｍｌ）で組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地中で、２８℃で５日間インキュベートした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を２ｎｄ組換えウイルス液とした。次に、作製した２ｎｄ  組換えウイルス液  １ｍｌを、１．０×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量５０  ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に添加し、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地中で、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を３ｒｄ組換えウイルス液とした。
【００４４】
以下の手順に従い組換えズワイガニＤＳＮの発現および精製を行った。作製した３ｒｄ  組換えウイルス  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１００ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。同様の条件で、さらに２本の該フラスコ（計３００  ｍｌ）で感染を行った。ウイルス感染培養液（全量３００ｍｌ）を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０  ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２％  ＮＰ４０）２０ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静地した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、７，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清にプロテイナーゼ  Ｋ（タカラバイオ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、上清中に含まれる昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質を分解した。この処理液を７，０００×ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清から、ＴＡＬＯＮ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（クローンテック社製）を用いて、組換えズワイガニＤＳＮを精製した。このとき緩衝液として、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）をＴＡＬＯＮの洗浄に使用し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を溶出に使用した。得られた溶出画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図８に示す。図８中、各レーンは次のサンプルを示す。レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；細胞破砕上清、レーン２；細胞破砕沈殿、レーン３；プロテイナーゼ  Ｋ処理上清、レーン４；プロテイナーゼ  Ｋ処理沈殿、レーン５；ＴＡＬＯＮ非吸着画分、レーン６；ＴＡＬＯＮ洗浄画分１、レーン７；ＴＡＬＯＮ洗浄画分２、レーン８；イミダゾール溶出画分。この結果、ズワイガニＤＳＮの予測分子量に一致する単一のタンパク質バンドが観察されることを確認した（図８レーン８、ズワイガニＤＳＮと考えられるバンドを矢印で示した）。以上のような精製操作により、３００ｍｌのウィルス感染培養液から、約５０μｇの高純度酵素が得られた。
【００４５】
（３）プロテイナーゼＫ処理および熱処理の組換えズワイガニＤＳＮの精製純度に及ぼす効果
組換えズワイガニＤＳＮの精製純度に及ぼすプロテイナーゼＫ処理および熱処理の効果を調査した。以下の手順に従って、精製純度を比較した。前記方法で作製した２ｎｄ  組換えウイルス  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量５０ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞に添加し、２８℃で振とうしながら、、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地中で、４日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液（全量５０  ｍｌ）を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２％  ＮＰ４０）４ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静地した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、７，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清を２ｍｌずつ別の容器に回収した。１つの容器に、プロテイナーゼ  Ｋ（タカラバイオ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベート後、６０℃で１５分間処理した。この処理液を１５，０００×ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収した（処理上清）。もう一方の容器は、これらの処理を行わなかった（未処理上清）。処理上清および未処理上清それぞれから、ＴＡＬＯＮ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（クローンテック社製）を用いて、組換えズワイガニＤＳＮを精製した。このとき緩衝液として、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０  ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）をＴＡＬＯＮの洗浄に使用し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、５００  ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を溶出に使用した。
【００４６】
得られた各溶出画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図９に示した。図９中、各レーンに添加したサンプルは以下の通りである。レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；プロテイナーゼ  Ｋ処理および熱処理を行わなかった場合の溶出画分（１０  μｌ）、レーン２；プロテイナーゼ  Ｋ処理および熱処理を行った場合の溶出画分（１０  μｌ）。レーン１では、矢印で示した位置にズワイガニＤＳＮの予測分子量と一致するバンドは観察されたが、これ以外のバンドが多数存在した。一方、レーン  ２では、ほぼ単一の該ＤＳＮと考えられるバンドが観察された。また、各溶出画分に存在する該ＤＳＮに相当するバンドの濃淡は、レーン１とレーン２で同等であることが観察された。つまり、プロテイナーゼ  Ｋ処理および熱処理は、ズワイガニＤＳＮの精製収量に影響を及ぼさないと考えられる。このことは、該処理により、昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質は、分解または沈殿するが、ズワイガニＤＳＮは分解または沈殿しないことを示唆している。よって、該処理は、昆虫細胞−バキュロウイルス系を用いて発現させたズワイガニＤＳＮの精製ステップとして有効である。またここで示した組換えズワイガニＤＳＮの精製方法は、不溶化した封入体を可溶化・リフォールディングするといった手順を必要とせず、プロテイナーゼ  Ｋ  処理と、アフィニティ精製による２ステップでズワイガニＤＳＮを簡便かつ高純度に取得可能な方法である。
【００４７】
（４）組換えズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
前記方法で取得した組換えズワイガニＤＳＮ精製酵素のＤＮＡ分解活性を測定した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ、  Ｍ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３３，  ３４９−３６２，  １９５０）に従い行った。反応基質溶液は、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、７  ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡ  が終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２５℃で平衡化した。精製酵素  １０μｌを添加し、すばやく攪拌した後に、波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素活性を１Ｕとした。この結果、精製酵素の活性は１３１３Ｕ／ｍｌであることが示された。
【００４８】
次に組換えズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的切断活性を評価した。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡとＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを、終濃度がそれぞれ１０μｇ／ｍｌと２１μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。また、基質ＤＮＡをそれぞれ単独で添加した基質溶液も調製した。基質溶液  ９μｌに組換えズワイガニＤＳＮ精製酵素１μｌ（０．５  Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、緩衝液Ｂを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。調製した反応液を６０℃で３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図１０に示した。図１０中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、酵素を含むサンプルがレーン１〜３（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ＋）、酵素を含まないサンプルがレーン４〜６（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ  −）であり、各レーン番号の上に反応液中に添加した基質ＤＮＡを示した（Ｍ１３、λ、およびＭ１３＋λ）。また図１０中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３  ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。
【００４９】
この結果、酵素を添加した反応液（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ＋；図１０  レーン１、２、３）では、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、１本鎖ＤＮＡ基質であるＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、酵素の代わりに緩衝液Ｂを添加した場合（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ−；図１０  レーン４、５、６）では、両方の基質が分解されなかった。このことから、組換えズワイガニＤＳＮは１本鎖ＤＮＡにはほとんど作用せず、２本鎖ＤＮＡのみを特異的に分解することが示された。
【００５０】
（５）組換えズワイガニＤＳＮの大量生産  
前記方法により得られた組換えズワイガニＤＳＮの発現量を増加させるために、組換えバキュロウイルス感染後のインキュベーション温度を１８℃にした。発現量の増加量を比較するために、インキュベーション温度２８℃でも同様の実験を行った。プラークアッセイにより純化した  組換えウイルス  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１００ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞またはｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞に添加し、２８℃または１８℃で振とうしながら、６日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液（全量１００ｍｌ）を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２％  ＮＰ４０）８ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静地した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、７，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清にプロテイナーゼ  Ｋ（タカラバイオ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、上清中に含まれる昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質を分解した。この処理液を７，０００×ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清から、ＴＡＬＯＮ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（クローンテック社製）を用いて、組換えズワイガニＤＳＮを精製した。このとき緩衝液として、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０  ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）をＴＡＬＯＮの洗浄に使用し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００  ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を溶出に使用した。
【００５１】
得られた溶出画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図１１示した。組換えズワイガニＤＳＮはすべての条件で、ほぼ単一のバンドとして精製された（図１１  矢印）。組換えズワイガニＤＳＮ溶出画分のＤＮＡ分解活性を前記方法によって測定し、その活性から組換えズワイガニＤＳＮ量を算出した。各感染条件での、ＴＡＬＯＮ精製溶出画分に存在する組換えズワイガニＤＳＮ量を図１２に示した。その結果、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞の場合は、インキュベーション温度を２８℃から１８℃に変更することで約４倍、Ｓｆ９細胞の場合は約５倍の組換えズワイガニＤＳＮ量の増加が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本願発明によれば、可溶性かつ酵素活性を有する甲殻類由来核酸分解酵素を、組換え技術によって大量に効率よく生産する方法を提供することができ、得られた甲殻類由来核酸分解酵素をＳＮＰ解析その他に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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