(57)【要約】【課題】細胞培養において、細胞の種類や成長度、目的等の種々の状況に柔軟に対応することができ、かつ、簡易な構成からなり、均一な形状の三次元細胞塊を容易に大量に培養することができる細胞培養担体を提供する。【解決手段】細胞培養担体を、上部材１と下部材２との２段構造とし、前記下部材２は、多孔体からなり、上面に細胞を収容する複数の凹部２１が規則的に配置された板状体であり、前記上部材１は、緻密体からなり、前記下部材２の上面に脱着可能に設けられ、前記凹部２１に対応する位置に貫通孔１１を有する板状体であり、前記貫通孔１１を通して、前記凹部２１内に培養する細胞を収容可能であるような構成とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下部材と上部材との２段構造からなり、
前記下部材は、多孔体からなり、上面に細胞を収容し、培養する複数の凹部が配置された板状体であり、
前記上部材は、緻密体からなり、前記下部材の上面に脱着可能に設けられ、前記凹部に対応する位置に貫通孔を複数有する板状体であり、
前記貫通孔を通して、前記凹部内に培養する細胞を収容可能であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
下部材と上部材との２段構造からなり、
前記下部材は、多孔体からなり、上面に細胞を収容し、培養する複数の凹部が配置された板状体であり、
前記上部材は、前記下部材の上面に脱着可能に設けられ、前記下部材と接する下面の下面部は多孔体からなり、前記下面と対向する上面の上面部は緻密体からなり、前記凹部に対応する位置に貫通孔を複数有する板状体であり、
前記貫通孔を通して、前記凹部内に培養する細胞を収容可能であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項３】
前記下部材及び上部材が、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、ジルコニア、アルミナ及びチタニアのうちいずれか１種類のセラミックスからなることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記多孔体は、孔径５μｍ以下の気孔を有し、気孔率１０％以上７０％以下であることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項５】
前記凹部及び前記貫通孔の幅が１０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の三次元細胞塊を形成するための細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療技術や医薬品の開発等を目的として、動物実験や細胞培養実験が行われている。
細胞培養実験は、費用、労力、実験期間のいずれも、動物実験に比べて大幅に低減させることができ、また、動物実験のような系統差、個体差等の問題がなく、再現性のある実験結果を得ることができる。さらに、動物由来のみならず、ヒト由来の細胞を培養して、目的の作用を直接検討することができるという利点を有している。
このような細胞培養実験においては、ヒトを含む動物の組織細胞を三次元的に培養し、この培養細胞を、人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクタ等に応用したり、生体の器官を再構築しようとする試みが検討されている。
【０００３】
従来、このような細胞培養実験に使用される細胞培養担体としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、ガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられてきた。
【０００４】
また、近年、細胞に対して接着性が異なるように、表面がパターニングされた基材を用いて、この表面で細胞を培養し、細胞の接着性がある加工表面にのみ細胞を接着させて、培養細胞を配列する技術も報告されている（例えば、特許文献１，２参照）。
【０００５】
さらに、ガラス等の無機材料、ステンレス鋼等の金属材料、合成樹脂、ゴム等からなるチップ基板表面上に規則配列させた細胞培養セル内で、種細胞を均一な大きさの細胞塊に培養して、各細胞塊を規則配列させた状態で担持させることができる細胞培養チップが開示されている（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−２４５１８１号公報
【特許文献２】特開平３−７５７６号公報
【特許文献３】特開２００５−２７５９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１、２に記載されているような細胞培養方法は、接着性の異なる部分を有する基材表面で細胞塊を形成した場合は、細胞の形態を制御することが難しく、そのうえサイズや担持位置のバラツキが大きく、均一な球状細胞塊を得ることは困難であった。
【０００８】
したがって、このような細胞塊を、生体機能チェックや、新薬スクリーニング等におけるバイオセンサとして用いた場合、十分な生体反応が得られず、センサとして応答性や信頼性に欠け、適用範囲が限定されるために、汎用性に欠けるという課題を有していた。
【０００９】
また、上記特許文献３に記載されているような細胞培養チップを用いた場合であっても、微小な深さを設定することは難しく、細胞培養セルの深さが浅すぎると、培養された細胞が隣のセルに移動してしまう。一方、細胞培養セルの深さが深すぎると、培養された細胞を回収しにくいという課題を有していた。
すなわち、細胞は、その種類や成長度によって大きさが異なるため、上記のような従来の凹部を有する細胞培養担体で細胞を三次元培養する際は、それぞれの細胞に応じて、その都度、細胞を収容するための凹部の深さを適宜調整する必要があった。
【００１０】
したがって、均一な形状の三次元細胞塊を大量に培養するための担体において、細胞の種類や成長度、目的等の種々の状況に対して、柔軟に対応することができる構成のものが求められていた。
【００１１】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、細胞培養において、細胞の種類や成長度、目的等の種々の状況に柔軟に対応することができ、かつ、簡易な構成からなり、均一な形状の三次元細胞塊を容易に大量に培養することができる細胞培養担体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る細胞培養担体は、下部材と上部材との２段構造からなり、前記下部材は、多孔体からなり、上面に細胞を収容し、培養する複数の凹部が配置された板状体であり、前記上部材は、緻密体からなり、前記下部材の上面に脱着可能に設けられ、前記凹部に対応する位置に貫通孔を複数有する板状体であり、前記貫通孔を通して、前記凹部内に培養する細胞を収容可能であることを特徴とする。
このような構成からなる細胞培養担体によれば、均一な形状の三次元細胞塊を容易に大量に培養することができ、かつ、必要に応じて、上部材を取り外すことができるため、細胞の回収が容易であり、また、細胞培養において、細胞の種類や成長度、目的等の種々の状況に柔軟に対応することができる。
【００１３】
また、本発明に係る細胞培養担体は、下部材と上部材との２段構造からなり、前記下部材は、多孔体からなり、上面に細胞を収容し、培養する複数の凹部が配置された板状体であり、前記上部材は、前記下部材の上面に脱着可能に設けられ、前記下部材と接する下面の下面部は多孔体からなり、前記下面と対向する上面の上面部は緻密体からなり、前記凹部に対応する位置に貫通孔を複数有する板状体であり、前記貫通孔を通して、前記凹部内に培養する細胞を収容可能であることを特徴とする。
このような構成からなる培養担体によれば、均一な形状の三次元細胞塊を容易に大量に培養することができ、かつ、必要に応じて、上部材を取り外すことができるため、細胞の回収が容易であり、また、細胞培養において、細胞の種類や成長度、目的等の種々の状況に柔軟に対応することができ、さらに、上部材の下部材と接する下面の下面部は多孔体で構成されているため、当該下面部から下部材の凹部内に収容された細胞に酸素が供給されやすくなる効果を有する。
【００１４】
前記下部材及び上部材は、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、ジルコニア、アルミナ及びチタニアのうちいずれか１種類のセラミックスからなることが好ましい。
これらのセラミックスは、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞培養担体として好適に用いることができる。
【００１５】
前記多孔体は、孔径５μｍ以下の気孔を有し、気孔率１０％以上７０％以下であることが好ましい。
上記のような多孔体であれば、細胞の接着性が適度であり、かつ、培地の循環が促進され、細胞培養に好適であり、細胞培養担体としての強度も維持することができる。
【００１６】
また、前記凹部及び前記貫通孔の幅が１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
前記凹部及び前記貫通孔の幅が上記範囲内であれば、培養に十分な密度で、当該貫通孔を通して凹部内に細胞を収容することができるため、適度な細胞塊を形成することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る細胞培養担体を用いれば、均一な形状の三次元細胞塊を、容易に大量に培養することができる。
また、本発明に係る細胞培養担体は、目的とする細胞の種類や目的等に柔軟に対応することができ、かつ、簡易な構成からなるため、構成するセラミックスの種類や分化誘導法を適宜選択することにより、ＥＳ細胞を、従来よりも効率的に分化誘導させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る細胞培養担体の一態様を示す斜視図である。
【図２】図１の細胞培養担体の平面図である。
【図３】図２のＡ−Ａ断面図である。
【図４】本発明に係る細胞培養担体の他の一態様に対応する図２のＡ−Ａ断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について、図面を参照して、より詳細に説明する。
図１，２に、本発明に係る細胞培養担体の一態様を示す。
この細胞培養担体は、上部材１と下部材２との脱着可能な２段構造からなる。下部材２は、多孔体からなり、上面に細胞を収容し、培養する複数の凹部２１が配置された板状体である。一方、上部材１は、下部材２の上面に設けられるものであり、緻密体からなり、凹部２１に対応する位置に貫通孔１１を複数有する板状体である。
また、この細胞培養担体は、上部材１を下部材２の上面に配置した際、貫通孔１１を通して、凹部２１内に培養する細胞（種細胞）を収容することができる構成を備えている。
細胞培養担体をこのような形態で構成することにより、各凹部で均一な形状の三次元細胞塊を培養することができ、かつ、必要に応じて、上部材を取り外すことができるため、ピペッティング等による細胞の回収が容易であり、また、細胞培養において、細胞の種類や成長度、目的等の種々の状況に柔軟に対応することができる。
【００２０】
下部材２の複数の凹部（マイクロパターン）２１は、所望の培養細胞塊の径に合わせたサイズで、一定の間隔で規則的に配置されていることが好ましい。
培養する細胞の均一性、細胞培養担体の作製や細胞培養操作の容易性等を考慮して、上記のようなマイクロパターン構成とすることが好ましい。
マイクロパターンの形状は特に限定されるものではないが、上記と同様の点を考慮して、水平断面形状が円形状であることが好ましい。
また、凹部２１の数は、細胞培養担体の形状や大きさにもよるが、直径１３ｍｍの円形板状の担体の場合、１つの担体で数千個の細胞塊を培養することが可能である。
【００２１】
また、貫通孔１１及び凹部２１の幅は、１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
凹部２１及び貫通孔１１の幅が１０μｍ未満の場合、各凹部２１に収容可能な細胞の数が少なくなり、十分な密度での細胞培養が困難となる。
一方、前記幅が１０００μｍを超える場合、培養細胞の多層化が進行し、凹部２１内の細胞への培養液の供給、細胞から排出される老廃物の置換が不十分となる。
【００２２】
一方、上部材１は、下部材２のマイクロパターンに対応する位置に貫通孔１１を有している。
この貫通孔１１の形状は、下部材２のマイクロパターン２１との位置合わせが容易であること、また、作製容易性等を考慮して、便宜上、図１，２においては格子状であるが、特に限定されるものではなく、円形状でも、角形状でもよい。
ただし、貫通孔１１の幅は、前述したように、貫通孔１１を通して、凹部２１内に培養する細胞（種細胞）を収容することができる点や、均一な三次元細胞塊を培養する観点から、凹部２１の幅と同等又はそれ以上であることが好ましい。
各凹部２１内の細胞は、上部材１によって分離され、上部材１に細胞が接触しないようにすることが好ましい。
【００２３】
上部材１と下部材２は、貫通孔１１及び凹部２１が設けられていない箇所に脱着可能な図示しない位置合わせ部（例えば、上部材１が凸部、下部材２が凹部）を備えることが好ましい。
このような位置合わせ部を備えることで、上部材１と下部材２を容易に位置合わせすることが可能である。
【００２４】
細胞培養担体は、上部材１及び下部材２ともに、セラミックスからなることが好ましい。
セラミックスであれば、気孔率の調整が容易であり、所望の気孔率の多孔体又は緻密体からなる細胞培養担体を容易に作製することができる。
セラミックスの中でも、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、ジルコニア、アルミナ及びチタニアのうちのいずれか１種類であることが好ましい。
これらのセラミックスは、いずれも、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場として好適である。これらのうちから、細胞の接着性や増殖効率等に応じて、適宜選択することが好ましい。
【００２５】
下部材２を構成する多孔体は、細胞塊が緩く接着するようにする観点から、孔径５μｍ以下の気孔を有し、気孔率１０％以上７０％以下であることが好ましい。
下部材２を上記のような微小孔を有する多孔体とすることにより、細胞の接着性が適度となり、また、培地の循環を促進され、細胞培養に好適であり、細胞培養担体としての強度も維持することができる。
一方、孔径が５μｍを超える場合、該気孔内に細胞が入り込み、回収しにくくなる。
【００２６】
また、下部材２を構成する多孔体の気孔率が７０％を超える場合、担体としての十分な強度を得ることが難しい。
一方、気孔率が１０％未満の場合、細胞への物質供給が不十分となる。
なお、細胞培養担体への細胞の接着性は、気孔率を１０％以上７０％以下の範囲内で変化させることにより、調整することも可能である。
【００２７】
一方、上部材１は、細胞を播種及び回収する際に、細胞が接着しないことが好ましいことから、緻密体で構成する。具体的には、気孔率１０％未満であることが好ましい。
【００２８】
図３に、図２の細胞培養担体のＡ−Ａ断面図を示す。下部材２の凹部２１の深さａは、細胞のサイズや上部材１の高さｂに応じて適宜調整されるが、１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
深さａが１０μｍ未満の場合、該凹部内で三次元細胞塊を培養することが困難である。
一方、深さａが１０００μｍを超える場合、培養細胞を回収しにくく、該凹部に細胞が残留しやすくなる。
【００２９】
凹部２１は、断面がＵ字状又は半円状であることが好ましい。
凹部２１が角部を有する場合、該角部に細胞が接着しやすくなり、均一な三次元球状塊を得ることが困難となり、また、培養細胞をピペッティング等により回収する際に、細胞が残留しやすくなる。
【００３０】
また、上部材１の高さｂは、細胞のサイズや下部材２の深さａに応じて適宜調整されるが、１０μｍ以上１０００μｍ以下の範囲内であることが好ましい。
高さｂが１０μｍ未満の場合、貫通孔１１ごとに、細胞を分離することが困難となる。
一方、深さｂが１０００μｍを超える場合、培地交換操作等が困難となる。
【００３１】
図４は、本発明に係る細胞培養担体の他の一態様に対応する図２のＡ−Ａ断面図である。
すなわち、上部材１は、図４に示すように、下部材２の上面に脱着可能に設けられ、下部材２と接する下面の下面部１ａは多孔体からなり、下面と対向する上面の上面部１ｂは緻密体から構成されていてもよい。
このような構成からなる培養担体によれば、上述した効果に加え、上部材１の下部材２と接する下面の下面部１ａが多孔体で構成されているため、当該下面部１ａから下部材２の凹部２１内に収容された細胞に酸素が供給されやすくなるため好ましい。
下面部１ａを構成する多孔体においても、前述した下部材２と同様の観点から、孔径５μｍ以下の気孔を有し、気孔率１０％以上７０％以下であることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る培養担体を用いて培養可能な細胞の種類は、特に限定されるものではないが、例えば、ＥＳ細胞、繊維芽細胞、幹細胞等の接着性を有する細胞が挙げられ、特に、三次元細胞塊を得る上で、ＥＳ細胞が好ましい。
本発明に係る培養担体を用いれば、培養担体上にフィーダ細胞（支持細胞）層を形成する必要がなく、培養担体上に、直接、細胞を播種して培養することが可能であり、また、そのようにすることが好ましい。また、培養担体の形状、サイズによって、形成される培養塊の形状やサイズを制御することができる。
【００３３】
また、細胞培養に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞種に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、細胞種に合わせて、種々の物質を添加して使用することが好ましい。例えば、ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）、ＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement）、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor；白血病阻害因子）、非必須アミノ酸、ピルビン酸、インスリン、デキサメタゾン、抗生物質等が挙げられる。
【００３４】
また、担体上で培養した３次元細胞塊を、目的とする細胞に分化誘導するためには、例えば、骨となる骨芽細胞に誘導する場合は、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ−I、ＩＧＦ−II（インスリン様成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＴＧＦ−Ｂ（トランスフォーミング成長因子）、ＢＭＰ−Ｚ（骨誘導タンパク）、ＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）、ヒト由来成長因子の濃縮物等の細胞増殖因子を培地に添加する等、目的とする各細胞に応じた成長因子等を適宜添加することが好ましい。
【００３５】
なお、培養担体上でＥＳ細胞の三次元細胞塊を培養した後、目的の細胞へ分化誘導するためには、胚様体（ＥＢ；embryoid body）を形成する必要がある。
ＥＢ形成の際も、本発明に係る培養担体を用いれば、培養した細胞塊から、担体上でそのままＥＢを形成することができ、あるいはまた、細胞塊をシャーレに移して浮遊培養を行うことにより、大量のＥＢを容易に形成することができる。
【００３６】
さらに、上記により得られたＥＢを分化誘導する際も、担体上にそのまま分化誘導することもでき、あるいはまた、ＥＢをシャーレに移して、シャーレに接着させて分化誘導することもできる。
本発明に係る培養担体上で分化誘導する際、上部材を下部材にセットした状態で静置培養を行えば、分化誘導培地への培地交換や薬物添加等を確実に容易に行うことができる。また、培養担体の下部材の凹部にＥＢを接着させたまま分化誘導する場合は、上部材を下部材に取り付けた状態で、分化誘導培地に交換した後は、上部材を取り外して、静置培養を行ってもよい。
一方、ＥＢをシャーレに移す場合は、ＥＢ培地で数回ピペッティングすることにより、形成された細胞塊をシャーレへ移し、シャーレ内で浮遊培養を行った。ピペッティングするだけで、ＥＢが担体から剥がれ落ち、シャーレ内での接着培養を行うことができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
上部材と下部材の２段構造からなる直径１３ｍｍ、高さ２ｍｍのジルコニアセラミックス製細胞培養担体を作製した。
上部材は、高さ３００μｍ、格子幅２０μｍ、格子間隔２００μｍの格子状の気孔率が１０％未満である緻密体とし、下部材は、直径２００μｍ、深さ１００μｍのマイクロパターン（凹部）が形成された孔径０．１〜０．５μｍの気孔を有する気孔率５０％の多孔体とした。
上部材をセットした状態の担体に、ＥＳ細胞を５×１０4個播種し、ＫＳＲ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、ＬＩＦ、ストレプトマイシン、ペニシリンを含むＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で３日間培養した。培地交換は毎日行った。
【００３８】
その結果、担体の下部材の凹部内で、ＥＳ細胞が隣の凹部へ移動したり、広がったりするようなことなく、ＥＳ細胞の三次元細胞塊が形成されていることが確認された。
また、この三次元細胞塊をアルカリフォスターゼ（ＡＬＰ）染色したところ、青紫色になったことから、ＥＳ細胞が未分化状態を保持したまま、増殖していることが確認された。
【００３９】
その後、ＥＢ培地として、ＦＢＳ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地を用いて、下記の２とおりの方法（ａ）、（ｂ）により、ＥＢの形成を行った。
【００４０】
まず、方法（ａ）においては、上部材をセットしたまま、ＥＢ培地へ培地交換後、担体上に細胞塊を保持した状態のまま、静置培養を行った。
ＥＢ培地へ交換後、３，５，７日目の分化状態をＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法：Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)により評価した。
【００４１】
その結果、５日目には中胚葉系の分化マーカーの発現が見られなかったが、７日目には内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉系すべてのマーカーの発現が確認された。
したがって、担体上に細胞塊を接着させた状態でＥＢの形成が可能であることが認められた。
【００４２】
一方、方法（ｂ）においては、細胞塊を形成後、上部材を取り外し、ＥＢ培地で数回ピペッティングすることにより、形成された細胞塊をシャーレへ移し、シャーレ内で浮遊培養を行った。このとき、上部材は、緻密体であるため、取り外す際に、細胞が付着するようなことがなく、また、多孔体の下部材への細胞塊の接着は緩いため、細胞塊のシャーレへの移動も容易に行うことができた。
【００４３】
そして、上記方法（ａ）と同様に、分化状態の評価を行ったところ、５日目には、三胚葉系すべての分化マーカーの発現が確認された。
したがって、方法（ｂ）によっても、ＥＢの形成が可能であることが認められた。
【００４４】
［比較例１］
直径２００μｍ、深さ１００μｍのマイクロパターン（凹部）が形成された孔径０．１〜１．０μｍの気孔を有する気孔率５０％の多孔体からなる直径１３ｍｍ、高さ２ｍｍの１段のジルコニアセラミックス製細胞培養担体を用いて、それ以外については、実施例１と同様にして、ＥＳ細胞の培養を行った。
【００４５】
その結果、ＥＳ細胞が隣の凹部へ移動したり、広がったりして、凹部以外の部分に接着し、均一な形状の大量の三次元細胞塊を得ることはできなかった。また、ピペッティングによる培養細胞の回収も困難であった。
【００４６】
［比較例２］
直径２００μｍ、深さ４００μｍのマイクロパターン（凹部）が形成された孔径０．１〜１．０μｍの気孔を有する気孔率５０％の多孔体からなる直径１３ｍｍ、高さ２ｍｍの１段のジルコニアセラミックス製細胞培養担体を用いて、それ以外については、実施例１と同様にして、ＥＳ細胞の培養を行った。
【００４７】
その結果、ＥＳ細胞が隣の凹部へ移動したり、広がったりして、凹部以外の部分に接着したりせず、培養３日目で均一な形状の三次元細胞塊の形成は認められたが、ピペッティングによる細胞塊の回収は凹部が深いため、困難であった。
【符号の説明】
【００４８】
１    上部材
２    下部材
１１  貫通孔
２１  凹部（マイクロパターン）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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