(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトに対する移植用細胞、生物製剤において、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の含有量を減らすための方法を提供する。【解決手段】Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）もしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）もしくはその誘導体を培地中に添加して細胞を培養することにより、Ｎ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含量を低下させて抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を細胞から除去する方法、および、これに用いる培地。また、これによりＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が除去された細胞、あるいはそれらの細胞を含む組成物、ならびに、該培養細胞により産生される物質を含むＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を含まない生物製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去する方法であって、該培養細胞をＮ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で培養する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルマンノサミンまたはその誘導体が、式Ｉまたは式Ｉ’：
【化１】
2010200609.tif 000010
［式中、Ｒ２は、−ＮＨ−アセチル、またはＮ３であり、
Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２、および、水酸基が保護されているまたは保護されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択される、
但し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはその誘導体が、式ＩＩまたは式ＩＩ’：
【化２】
2010200609.tif 000011
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体が、培地中に少なくとも１００ｎＭ含まれることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で、少なくとも１時間培養することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去するために用いる培地であって、Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する、前記培地。
【請求項７】
Ｎ−アセチルマンノサミンまたはその誘導体が、式Ｉまたは式Ｉ’：
【化３】
2010200609.tif 000012
［式中、Ｒ２は、−ＮＨ−アセチル、またはＮ３であり、
Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２、および、水酸基が保護されているまたは保護されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択される、
但し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、請求項６に記載の培地。
【請求項８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはその誘導体が、式ＩＩまたは式ＩＩ’：
【化４】
2010200609.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、請求項６に記載の培地。
【請求項９】
Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を、培養時の最終濃度が少なくとも１００ｎＭとなるように含む、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１０】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法により、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去した細胞。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法により、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去した細胞を含む組成物。
【請求項１２】
抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤を製造する方法であって、以下の工程：
（１）生物製剤となる物質を発現する培養細胞を、Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で培養し；そして
（２）工程（１）で得られた培養細胞および／またはその培地から、生物製剤となる物質を抽出および／または精製することにより回収する；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により製造される、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去するための方法に関する。本発明はまた、培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去するために用いる培地に関する。本発明はさらに、本発明の方法によりＮ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖が除去された細胞、その細胞を用いて作成した移植用細胞、またはその細胞を含む組成物、あるいは、その細胞により産生される物質、または該物質を含む生物製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療分野において骨髄細胞移植をはじめとした細胞移植の重要性が増している。近年、様々な細胞に分化させることができる胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞が多数開発され、その医療応用が期待されている。この様な細胞の樹立・維持には、しばしばウシ胎児血清やフィーダー細胞などヒト以外の動物由来材料が使用されるため、それらから何らかの分子の混入で移植用細胞に抗原性をもたらす場合があり、そのまま移植するには問題があった。
【０００３】
糖鎖はデンプンやグリコーゲンのように糖が直鎖状に連なった単純多糖の他に、ポリペプチドや脂質などに結合した状態で存在する複合糖質がある。複合糖質の糖鎖は、構成単糖に数多くの種類があることに加え、多様な結合異性体があるため、非常に複雑な構造を持っており、特定の分子と直接結合したり、他の分子のモジュレーターとして機能したりする。そのため生物機能への重要性から核酸、タンパク質に続く第３の生命鎖とも呼ばれることがある。また血液型の本態をなす抗原は糖鎖である。
【０００４】
糖鎖を構成する単糖の中にノイラミン酸と呼ばれる酸性糖がある。このノイラミン酸には、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ：シアル酸）とＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）があり、多くの哺乳類ではこの両方が糖鎖に含まれている。しかしヒトでは、Ｎｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへ変換する酵素が欠損しているため、Ｎｅｕ５Ｇｃを含む糖鎖は発現していないといわれていた（図１）。しかし、すでに樹立されているヒトＥＳ細胞のうちいくつかはＮｅｕ５Ｇｃを発現しており、その細胞には抗原性を持つことが報告されている（非特許文献１）。そのため、動物由来材料を利用して樹立された既存のヒトＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞をはじめとした未分化細胞を、細胞移植などの医療分野に利用することには問題があった。また培養細胞を用いた生物製剤となる物質の産生においても、たとえ培養細胞において遺伝子組換え等によりＮｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへ変換する酵素（例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ水酸化酵素）を欠損させたとしても、多くの場合ウシ血清をはじめとしたヒト以外の生物材料が細胞の生存および生物製剤となる物質の産生には必須であり、生物製剤にヒト以外の生物由来成分が混入する危険性があった。
【０００５】
ヒトの細胞および遺伝子組換え等によりＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ水酸化酵素などのＮｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへ変換する酵素を欠損させた動物細胞は本来、Ｎｅｕ５Ｇｃを生合成することはできない（図１）。移植用細胞においてＮｅｕ５Ｇｃが発現する原因は、移植用細胞を維持する際に必要なヒト以外の動物材料に含まれるＮｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が細胞に吸収されて細胞の糖鎖生合成に再利用されるためだと考えられる（サルベージ経路：図１）。実際Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖をもつ細胞株をＮｅｕ５Ｇｃが全く含まれない無血清の状態で１週間培養すると、検出限界以下まで減少させることができる一方で、ヒト血清存在下で培養すると、Ｎｅｕ５Ｇｃの量は半分程度しか減少させることができないことが報告されている（非特許文献２）。これはいったん細胞に取り込まれたＮｅｕ５Ｇｃが繰り返しサルベージ経路で再利用されるためであると考えられる。多くの細胞は無血清状態で長期間培養することは困難であり、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞も同様に細胞の形質や生存率を無血清状態で維持しつつＮｅｕ５Ｇｃ含量を減少させることは非常に難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Maria J. Martin, et al., Nature Medicine, 11, 228-232 (2005)
【非特許文献２】Hashii N., et al., J. Chromatogr. A., 1160 (1-2), 263-269 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、ヒトに対する移植用細胞には抗原性のあるＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含有糖鎖が抗原性を発揮しない量まで除去させた細胞を準備する必要がある。また、培養細胞により産生される生物製剤となる物質においても抗原性のあるＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が発現されていることがあり、このＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が抗原性や薬効減弱性をもたらす可能性がある。このような生物製剤においても、抗原性・薬効減弱性を持たせないために生物製剤となる物質においてＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の含有量を減らす必要がある。
【０００８】
本発明は、その条件を満たすような細胞を作成するための方法、その条件を満たすような細胞および該細胞を含む組成物、ならびに該方法に用いる培地を提供することを目的とする。本発明はまたＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を含まない生物製剤を製造する方法、およびＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を含まない生物製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究の結果、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）もしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）もしくはその誘導体を培地中に添加して細胞を培養することにより、細胞が元から持つＮｅｕ５Ａｃのデノボ経路を優位に働かせ、サルベージ経路を相対的に低くさせることで、Ｎ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含量を低下させて抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を細胞から除去できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
［態様１］  培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去する方法であって、該培養細胞をＮ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で培養する工程を含む、前記方法。
【００１１】
［態様２］  Ｎ−アセチルマンノサミンまたはその誘導体が、式Ｉまたは式Ｉ’：
【００１２】
【化１】
2010200609.tif 000002
【００１３】
［式中、Ｒ２は、−ＮＨ−アセチル、またはＮ３であり、
Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２、および、水酸基が保護されているまたは保護されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択される、
但し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、態様１に記載の方法。
【００１４】
［態様３］  Ｎ−アセチルノイラミン酸またはその誘導体が、式ＩＩまたは式ＩＩ’：
【００１５】
【化２】
2010200609.tif 000003
【００１６】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、態様１に記載の方法。
【００１７】
［態様４］  Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体が、培地中に少なくとも１００ｎＭ含まれることを特徴とする、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
［態様５］  Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で、少なくとも１時間培養することを特徴とする、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【００１９】
［態様６］  培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去するために用いる培地であって、Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する、前記培地。
【００２０】
［態様７］  Ｎ−アセチルマンノサミンまたはその誘導体が、式Ｉまたは式Ｉ’：
【００２１】
【化３】
2010200609.tif 000004
【００２２】
［式中、Ｒ２は、−ＮＨ−アセチル、またはＮ３であり、
Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２、および、水酸基が保護されているまたは保護されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択される、
但し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、態様６に記載の培地。
【００２３】
［態様８］  Ｎ−アセチルノイラミン酸またはその誘導体が、式ＩＩまたは式ＩＩ’：
【００２４】
【化４】
2010200609.tif 000005
【００２５】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である、態様６に記載の培地。
【００２６】
［態様９］  Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を、培養時の最終濃度が少なくとも１００ｎＭとなるように含む、態様６ないし８のいずれか１項に記載の培地。
【００２７】
［態様１０］  態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法により、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去した細胞。
【００２８】
［態様１１］  態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法により、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去した細胞を含む組成物。
【００２９】
［態様１２］  抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤を製造する方法であって、以下の工程：
（１）生物製剤となる物質を発現する培養細胞を、Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で培養し；そして
（２）工程（１）で得られた培養細胞および／またはその培地から、生物製剤となる物質を抽出および／または精製することにより回収する；
を含む、前記方法。
【００３０】
［態様１３］  態様１２に記載の方法により製造される、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法により、ヒトに対する移植用細胞として利用可能な、抗原性のあるＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含有糖鎖が抗原性を発揮しない量まで除去させた細胞を調製することが可能となった。本発明は、培養細胞から抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去する方法、該方法に用いる培地、本発明の方法により得られた細胞および該細胞を含む組成物、ならびに該細胞から得られる物質および該物質を含む生物製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ノイラミン酸およびノイラミン酸含有糖鎖生合成経路を示した模式図である。
【図２】図２は、ノイラミン酸のＤＭＢ標識と標識体の構造を示す模式図である。
【図３】図３は、ＤＭＢ標識Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５ＧｃのＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図４】図４は、ＤＭＢ標識Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃについてのマスクロマトグラムである。
【図５】図５は、Ｊｕｒｋａｔｔ細胞由来のＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃについてのマスクロマトグラムである。
【図６】図６は、ＭＯＬＴ４細胞由来のＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃについてのマスクロマトグラムである。
【図７】図７は、ＹＡＣ１細胞由来のＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃについてのマスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明者は、細胞が元から持つＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）のデノボ（de novo）経路を有意に働かせ、サルベージ経路を相対的に低くさせることで、Ｎ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含量を低下させて抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を細胞から除去できると推測した。そしてそのために、Ｎｅｕ５Ａｃのデノボ合成経路にある糖またはその誘導体を細胞に取り込ませることを考えた。
【００３４】
一般に糖は脂溶性が低いため、細胞内へトランスポーター（例えば、グルコーストランスポーターなど）を介して取り込まれる。そのため、その能力を超えて大量に糖を細胞に取り込ませることは困難である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃのデノボ合成経路上にあるＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）は他の糖に比べて比較的大量に細胞内に取り込ませることができることに加え、細胞内における効率の良いノイラミン酸デノボ合成の前駆体である。この点に着目した本発明者は、細胞培養液中にＭａｎＮＡｃを添加することにより、ＭａｎＮＡｃを過剰にノイラミン酸のデノボ合成経路に導入したところ、糖鎖合成におけるＮｅｕ５Ｇｃのサルベージ経路からの供給を相対的に阻害して細胞からＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去できることを見出した。
【００３５】
また、この効果は、Ｎｅｕ５Ａｃのデノボ合成経路上にあるＮｅｕ５Ａｃ生合成前駆体や、細胞内で該前駆体に変換される糖誘導体を細胞内に大量に導入することによっても同様に起こると考えられる。Ｎｅｕ５Ａｃのデノボ合成経路上にあるＮｅｕ５Ａｃ生合成前駆体としては、ＭａｎＮＡｃの他、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−フォスフェート（ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）、Ｎｅｕ５Ａｃが挙げられる。また、当該Ｎｅｕ５Ａｃ生合成前駆体の水酸基を、エステル結合で結合されたアルキル基（例えば、アセチル基）、ベンジル基、または水酸基を保護した単糖、で修飾する等して脂溶性を高めた糖誘導体を使用することにより、細胞へ取り込まれる効率が高くなる。そのように水酸基を修飾している置換基は、細胞内酵素エステラーゼや細胞内の糖加水分解酵素等で切断されるため、当該糖誘導体は細胞内で自然にＮｅｕ５Ａｃ生合成前駆体へと変換される。このようなＮｅｕ５Ａｃのデノボ合成経路上にあるＮｅｕ５Ａｃ生合成前駆体やその誘導体もまた、本発明の方法に用いてもよい。
【００３６】
上記の知見に基づいて、本発明は、培養細胞から抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去する方法、該方法に用いる培地、本発明の方法により得られた細胞および該細胞から調製される移植用細胞、および該細胞を含む組成物、ならびにその細胞により産生される物質または該物質を含む生物製剤を提供する。
【００３７】
培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去する方法
一態様において、本発明は培養細胞から抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去する方法に関する。具体的には、当該方法は、培養細胞をＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体を含有する培地中で培養することを含む。
【００３８】
本発明の方法において使用するＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体を含有する培地は、培養細胞の培養に適した培地である限りにおいて、特に限定されない。例えば、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、またはＭＥＭ培地などが利用可能である。
【００３９】
また、本発明の方法において、培養細胞を培養する温度、ｐＨ、二酸化炭素濃度、湿度等の条件は、ヒト培養細胞の培養に適した条件であれば特に限定されない。培養温度は、例えば、２５℃〜４０℃、３０℃〜４０℃、または３７℃であってよい。培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜８、またはｐＨ７であってよい。培養時の二酸化炭素濃度は、例えば１０％ＣＯ２以下、１〜１０％ＣＯ２、２〜８％ＣＯ２、４〜６％ＣＯ２、または５％ＣＯ２であってよい。培養時の湿度は当業者が適宜選択することができ、例えば１０％以下、５〜９５％、９０〜１００％などであってよい。
【００４０】
本明細書において、ＭａｎＮＡｃまたはその誘導体とは、式Ｉまたは式Ｉ’：
【００４１】
【化５】
2010200609.tif 000006
【００４２】
［式中、Ｒ２は、−ＮＨ−アセチル、またはＮ３であり、
Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２および、水酸基が保護されているまたは保護されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択される、
但し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である。
【００４３】
別の態様において、ＭａｎＮＡｃまたはその誘導体は、式Ｉまたは式Ｉ’において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、およびベンジル、からなる群より選択され；Ｒ２は、−ＮＨ−アセチル、またはＮ３であり；Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２、からなる群より選択される；化合物である。
【００４４】
また別の態様において、ＭａｎＮＡｃまたはその誘導体は、式Ｉまたは式Ｉ’において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、または−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）であり；Ｒ２は−ＮＨ−アセチルであり；そして、Ｒ５は、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、および−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）２からなる群より選択される；化合物である。
【００４５】
さらに別の態様において、ＭａｎＮＡｃまたはその誘導体は、式Ｉまたは式Ｉ’において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、または−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）であり；Ｒ２は−ＮＨ−アセチルであり；そしてＲ５は、Ｈ、または−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）である；化合物である。
【００４６】
また別の態様において、ＭａｎＮＡｃまたはその誘導体は、式Ｉまたは式Ｉ’において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、または−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）であり；そして、Ｒ２は−ＮＨ−アセチルである；化合物である。
【００４７】
さらにまた別の態様において、ＭａｎＮＡｃまたはその誘導体は、式Ｉまたは式Ｉ’において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、またはアセチル基であり；Ｒ２は−ＮＨ−アセチルである；化合物である。
【００４８】
もっとも好ましい態様において、本発明の方法に使用される培地中に含まれるＭａｎＮＡｃまたはその誘導体は、Ｎ−アセチルマンノサミン、すなわち、式Ｉまたは式Ｉ’においてＲ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨであり；Ｒ２が−ＮＨ−アセチルである；化合物である。
【００４９】
本明細書において、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはその誘導体とは、式ＩＩまたは式ＩＩ’：
【００５０】
【化６】
2010200609.tif 000007
【００５１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ベンジル、および、水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース、からなる群より選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のいずれか１つが水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソースである場合は、他の置換基は水酸基が保護基で置換されているまたは置換されていないペントースまたはヘキソース以外の置換基である］
により示される化合物である。但し、ここで、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはその誘導体は、式ＩＩまたは式ＩＩ’の化合物においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はのすべてがＨである場合を除いてもよい。
【００５２】
別の態様において、Ｎｅｕ５Ａｃまたはその誘導体は、式ＩＩまたは式ＩＩ’において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、およびベンジル、からなる群より選択される化合物である。
【００５３】
また別の態様において、Ｎｅｕ５Ａｃまたはその誘導体は、式ＩＩまたは式ＩＩ’において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、または−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である化合物である。
【００５４】
さらにまた別の態様において、Ｎｅｕ５Ａｃまたはその誘導体は、式ＩＩまたは式ＩＩ’において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、またはアセチル基である化合物である。
【００５５】
本明細書において、アルキルとは炭化水素鎖を意味し、そしてそれは直鎖状、分枝鎖状、または環状のいずれであってもよい。本明細書において、Ｃｎアルキルとの表現は、炭素数がｎ個（ｎは整数である）のアルキルを意味する。
【００５６】
本明細書において、ペントースとは５個の炭素原子を含む単糖を意味する。より具体的には、ペントースには、アラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、キシルロースが含まれる。
【００５７】
本明細書において、ヘキソースとは６個の炭素原子を含む単糖を意味する。より具体的には、ガラクトース、グルコース、タロース、マンノース、ソルボース、タガトース、フルクトース、プシコースが含まれる。
【００５８】
本明細書において、水酸基が保護基で置換されているペントースまたはヘキソースとは、ペントースまたはヘキソース中の少なくとも１つの水酸基における水素原子が−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）またはベンジルで置換されていることを意味する。好ましい態様において、水酸基が保護基で置換されているペントースまたはヘキソースとは、ペントースまたはヘキソース中の少なくとも１つの水酸基における水素原子が−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、より好ましくはアセチルで置換されていることを意味する。
【００５９】
本発明の方法において、培地中に含まれるＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体の量は、培養細胞に毒性を与えない限りにおいて、特に限定されない。好ましくは、培地中に含まれるＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体の量は少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、あるいは、少なくとも１００μＭである。
【００６０】
あるいは特に、ＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体としてＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−ＰまたはＮｅｕ５Ａｃを使用する場合、培地中のこれらの糖の量は、少なくとも０．１ｍＭであることが好ましく、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭであってよい。培地中のこれらの糖の量の上限は、特に限定されないが、５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、または１Ｍ以下であってもよい。
【００６１】
あるいはまた、ＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体として、上記式Ｉ、式Ｉ’、式ＩＩまたは式ＩＩ’で示される化合物の内、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−ＰまたはＮｅｕ５Ａｃ以外の糖誘導体を使用する場合、これらの糖誘導体は脂溶性が増すことにより、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−ＰまたはＮｅｕ５Ａｃの場合よりも細胞へ取り込まれる効率が高くなることが期待できるため、より低濃度で本発明の効果を発揮する。従って、培地中のこれらの糖誘導体の量は、少なくとも１００ｎＭであることが好ましく、あるいは少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭであってもよい。また、培地中のこれらの糖誘導体の量の上限は、培養細胞に毒性を与えない限りにおいて特に限定されないが、好ましくは１００μＭ以下、５００μＭ以下、１ｍＭ以下である。
【００６２】
本発明の方法において、培養細胞をＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体を含有する培地中で培養する時間は、特に限定されないが、少なくとも１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２４時間、または４８時間であってもよい。培養時間の上限は、特に限定されない。
【００６３】
本発明の方法により、培養細胞からヒトに対して抗原性を有するＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去することができる。本明細書において、「ヒト培養細胞からＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含有糖鎖を除去する」とは、該糖鎖を完全に除去することを必ずしも意図するのではなく、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を抗原性を発揮しない量まで除去することを意味する。
【００６４】
Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の存在は、当業者に公知のいずれかの手法を利用して検出および／または確認してもよく、例えば実施例に記載した方法により検出することが可能である。具体的には、本発明の方法により培養した細胞を回収した後、４Ｍ酢酸溶液に分散させ、８０℃で４時間処理することでノイラミン酸を遊離させる。遊離ノイラミン酸はＤＭＢ（１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン）との反応により誘導体化して標識（図２）した後、液体クロマトグラフィーに連結した質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）で分析する。ここで、質量分析は通常の質量分析（ＭＳ）であってもよく、あるいはタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）であってもよい。検出精度および特異性を挙げるため、ＭＳ／ＭＳであることが好ましい。
【００６５】
Ｎｅｕ５ＧｃをＭＳ／ＭＳで検出する場合は、ＤＭＢ標識されたＮｅｕ５Ｇｃのｍ／ｚ値である４４２（［Ｍ＋Ｈ］に相当）のイオンを分離後、アルゴンを該イオンに衝突させることにより断片化したｍ／ｚ＝４２４をトレースしてクロマトグラムを得る。
【００６６】
Ｎｅｕ５Ａｃ含有糖鎖の存在についてもＮｅｕ５Ｇｃと同様に検出することができる。細胞から遊離させたＮｅｕ５ＡｃをＭＳ／ＭＳで検出する場合は、ＤＭＢ標識されたＮｅｕ５Ａｃのｍ／ｚ値である４２６（［Ｍ＋Ｈ］に相当）のイオンを分離後、アルゴンを該イオンに衝突させることにより断片化したｍ／ｚ＝４０８をトレースしてクロマトグラムを得る。
【００６７】
本明細書において、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を抗原性を発揮しない量まで除去するとは、上記のＭＳ／ＭＳによる分析において得られたクロマトグラムにおいて、Ｎｅｕ５Ｇｃのピークが認められない程度にまで、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の存在が減少していることを意味する。あるいは、本明細書においてＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を抗原性を発揮しない量まで除去するとは、上記のＭＳ／ＭＳによる分析において得られたクロマトグラムにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃのピーク面積を１００％とした場合に、Ｎｅｕ５Ｇｃのピーク面積が５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．８％以下、０．５％以下、または０．４％以下であることを意味する。
【００６８】
また、本発明の方法において使用する培養細胞は、ヒト由来の細胞、または遺伝子組換え等によりＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ水酸化酵素などのＮｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへ変換する酵素を欠損させたヒト以外に由来する細胞である。本発明の方法において使用する培養細胞の具体的なものとして、例えば、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞、血液細胞、幹細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、骨髄細胞、実験用に樹立されたヒト細胞、などが挙げられる。好ましくは、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞である。
【００６９】
培地
一態様において本発明は、本発明の方法に使用するための培地を提供する。本発明の培地は、ＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体を含有することを特徴とするほか、培養細胞の培養に適した培地である限りにおいて、特に限定されない。例えば、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地またはＭＥＭ培地などに、ＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体を添加したものが利用可能である。ＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体は先に特定したとおりである。
【００７０】
本発明の培地において、培地中に含まれるＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体の量は特に限定されないが、好ましくは培養に用いる場合の最終濃度が少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、あるいは、少なくとも１００μＭとなるように含む。本発明の培地中に含まれるＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃまたはその誘導体の量の上限は、培養細胞に毒性を与えない限りにおいて、特に限定されない。
【００７１】
あるいは特に、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−ＰまたはＮｅｕ５Ａｃが培地に含まれる場合、培地中のこれらの糖の量は、培養に用いる場合の最終濃度が少なくとも０．１ｍＭとなるように含むことが好ましく、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭとなるように含んでいてもよい。培地中のこれらの糖の量の上限は、特に限定されないが、培養に用いる場合の最終濃度が５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、または１Ｍ以下となるように含んでいてもよい。
【００７２】
あるいはまた、ＭａｎＮＡｃもしくはその誘導体またはＮｅｕ５Ａｃもしくはその誘導体として、上記式Ｉ、式Ｉ’、式ＩＩまたは式ＩＩ’で示される化合物のうち、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−ＰまたはＮｅｕ５Ａｃ以外の糖誘導体が培地に含まれる場合、培養に用いる場合の最終濃度が少なくとも１００ｎＭとなるように含むことが好ましく、あるいは少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭとなるように含んでいてもよい。また、培地中に含まれるこれらの糖誘導体の量の上限は、培養細胞に毒性を与えない限りにおいて特に限定されないが、好ましくは培養に用いる場合の最終濃度が１００μＭ以下、５００μＭ以下、１ｍＭ以下となるように含んでいてよい。
【００７３】
Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去した細胞および該細胞を含む組成物
一態様において本発明は、本発明の方法によりヒトに対して抗原性を有するＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去した細胞を提供する。本明細書においてＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去したとは、上述したとおり該糖鎖を完全に除去することを必ずしも意図するのではなく、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を抗原性を発揮しない量まで除去することを意味する。
【００７４】
本発明の方法によりヒトに対して抗原性を有するＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去した細胞は、ヒト由来の細胞、または遺伝子組換え等によりＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ水酸化酵素などのＮｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへ変換する酵素を欠損させたヒト以外に由来する細胞である。より具体的には、例えば、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞、血液細胞、幹細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、骨髄細胞、実験や物質生産用に樹立された細胞、などが挙げられる。好ましくは、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞である。別の好ましい態様において、本発明の細胞は物質生産のために遺伝子組換えを受けた細胞であってもよい。
【００７５】
また、本発明の細胞は、ヒトに対して抗原性を有するＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が抗原性を発揮しない量にまで低減されているため、骨髄細胞移植をはじめとした細胞移植に適している。よって、一態様において、本発明の細胞は移植用細胞である。この場合、移植用細胞はヒト由来の細胞であることが好ましい。本発明の移植用細胞は、本発明の方法を適用して抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去した細胞に対し、さらなる培養や処理を加えた細胞であってもよい。
【００７６】
好ましい態様において、本発明の方法によりヒトに対して抗原性を有するＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去した移植用細胞は、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞である。別の好ましい態様において、本発明の移植用細胞は、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系前駆細胞などの未分化細胞に対し、本発明の方法を適用して抗原性Ｎｅｕ５Ｇｃを除去した後、移植の目的に応じて分化させた細胞である。
【００７７】
別の態様において本発明は、本発明の方法によりヒトに対して抗原性を有するＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去した細胞を含む組成物である。本発明の組成物は当該細胞の他、該細胞を維持するための培地、緩衝液、または生理食塩水などの成分を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の組成物はまた、細胞移植のための当該ヒト細胞を含む移植用組成物であってもよい。移植用組成物には、該細胞を維持するための培地、緩衝液、または生理食塩水等の医薬的に許容可能な担体が含まれていてもよい。
【００７９】
抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤を製造する方法
本発明はまた、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤を製造する方法を提供する。当該方法は、以下の工程：
（１）生物製剤となる物質を発現する培養細胞を、Ｎ−アセチルマンノサミンもしくはその誘導体またはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはその誘導体を含有する培地中で培養し；および
（２）工程（１）で得られた培養細胞および／またはその培地から、生物製剤となる物質を抽出および／または精製することにより回収する；
を含むことを特徴とする。
【００８０】
上記工程（１）は、本明細書において上述した培養細胞から抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去する方法において、培養細胞として生物製剤となる物質を発現する培養細胞を適用したものである。
【００８１】
本発明の方法において、生物製剤となる物質とは、細胞が保持または分泌している糖鎖を含む物質をいう。そのような物質には、例えば、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、糖鎖を含む抗体などの複合糖質、が挙げられる。
【００８２】
本明細書において、生物製剤とは、生物製剤となる物質を含む医薬組成物を意味する。生物製剤は、生物製剤となる物質のほかに、医薬的に許容可能な担体、例えば水、生理食塩水、緩衝剤、賦形剤などを含むことができる。
【００８３】
本発明の方法において、生物製剤となる物質を発現する培養細胞は、生物製剤となる物質を発現するヒト由来の細胞、または遺伝子組換え等によりＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ水酸化酵素などのＮｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへ変換する酵素を欠損させたヒト以外に由来する細胞である。生物製剤となる物質を発現する培養細胞は、生物製剤となる物質を天然に発現する細胞であってもよく、あるいは、生物製剤となる物質を発現するように遺伝子工学的に組換えられた細胞であってもよい。
【００８４】
上記工程（２）において、生物製剤となる物質を上記工程（１）で得られた培養細胞および／またはその培地から抽出および／または精製することにより回収する。培養細胞が生物製剤となる物質をその細胞内に保持している場合は、例えば当業者に公知の手法を利用して細胞を破壊することにより、生物製剤となる物質を遊離させた後、該物質を抽出および／または精製してよい。培養細胞が生物製剤となる物質を分泌している場合は、当該細胞を培養した培地から、生物製剤となる物質を抽出および／または精製することができる。
【００８５】
生物製剤となる物質の抽出および／または精製は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、中圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィー、などの手法を、生物製剤となる物質の性質に応じて、当業者が適宜選択および／または組み合わせて行うことができる。
【００８６】
本明細書において、「抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない」とは、該糖鎖を完全に含まないことを必ずしも意図するのではなく、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の含有量が抗原性を発揮しない程度の量まで低減されていることを意味する。
【００８７】
生物製剤中のＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の存在は、本明細書において上述した手法により検出および／または確認することができる。具体的には、本発明の方法により得られた生物製剤となる物質または生物製剤を、４Ｍ酢酸溶液に分散させ、８０℃で４時間処理することでノイラミン酸を遊離させる。遊離ノイラミン酸はＤＭＢで標識（図２）した後、液体クロマトグラフィーに連結した質量分析計で分析する。
【００８８】
本明細書において、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の含有量が抗原性を発揮しない程度の量まで低減されているとは、上記のＭＳ／ＭＳによる分析において得られたマスクロマトグラムにおいて、Ｎｅｕ５Ｇｃのピークが認められない程度にまで、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の存在が減少していることを意味する。あるいは、本明細書においてＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の含有量が抗原性を発揮しない程度の量まで低減されているとは、上記のＭＳ／ＭＳによる分析において得られたマスクロマトグラムにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃのピーク面積を１００％とした場合に、Ｎｅｕ５Ｇｃのピーク面積が５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．８％以下、０．５％以下、または０．４％以下であることを意味する。
【００８９】
本発明の方法により製造される、抗原性Ｎ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を含まない生物製剤、および該生物製剤となる物質もまた、本発明により提供される。
【実施例】
【００９０】
Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃの検出方法
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）はそれぞれ、シアル酸蛍光標識キット（TAKARA、＃４４００）を用いてシアル酸をＤＭＢ（１，２−ジミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン）で誘導体化して質量分析装置（Bruker Daltonics HCT ultra）で分析した。標準物質としてのＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５ＧｃはNakcalai tesqueより入手した。Hashii N.ら（J. Chromatogr. A., 1160 (1-2), 263-269 (2007)）に記載されるように、このキットで誘導体化するとＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃのｍ／ｚ値はそれぞれ４２６および４４２（［ｍ＋Ｈ］）となる（図２）。
【００９１】
細胞から抽出・標識したＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃの同定には検出精度および特異性を上げるため、ＨＰＬＣ（Agilent 1100 cap system）で分離しつつＭＳ／ＭＳを取ることができるＬＣ／ＭＳを使用した。すなわち、質量分析装置のイオントラップ内でＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃに対応するｍ／ｚ＝４２６および４４２のイオンを分離後、アルゴンを該イオンに衝突させることにより断片化したイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）のうち、それぞれｍ／ｚ＝４０８および４２４をトレースするmultiple reaction monitoring mode（ＭＲＭモード）でクロマトグラムを描かせることにより同定した。Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ標準物質の混合物を誘導体化して以下のＨＰＬＣ分離条件で分離し、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ誘導体のマスクロマトグラムを記載した例を図４に示す。
【００９２】
＜ＨＰＬＣ分離条件＞
カラム：GL Sciences Capillary EX-Nno Inertsil Peptides C18 (0.2 x 150 mm)
カラム温度：４０℃
ポンプ設定：  溶媒Ａ−０．１％ギ酸  Ｈ２Ｏ、溶媒Ｂ−０．１％ギ酸  アセトニトリル；０〜２０分（％Ｂ：５％→１２％）
【００９３】
実施例１：ＭａｎＮＡｃ（５ｍＭ）含有培地での培養
Ｎｅｕ５Ｇｃ生合成能をもたないヒト培養細胞としてＪｕｒｋａｔｔ細胞およびＴ細胞リンパ腫細胞株ＭＯＬＴ４、ならびにＮｅｕ５Ｇｃ生合成能をもつマウス培養細胞として、Ｔ細胞リンパ腫細胞株ＹＡＣ１を使用した。それぞれの細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で維持した。それぞれの細胞を十分にＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、５ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを含む培地で４８時間培養した。細胞を回収後４Ｍ酢酸溶液に分散させ、８０℃で４時間処理することでノイラミン酸を遊離させた。遊離ノイラミン酸はシアル酸蛍光標識キット（ＴＡＫＡＲＡ、＃４４００）で上述したように誘導体化してＬＣ／ＭＳで分析した。
【００９４】
その結果ヒト培養細胞Ｊｕｒｋａｔｔ細胞およびＭＯＬＴ４細胞では、培地に５ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加することで、Ｎｅｕ５Ｇｃに由来するピークが、ピークとして認めることが困難な程度にまで大きく減少した（図５および６）。一方で、Ｎｅｕ５Ｇｃのデノボ経路をもつＹＡＣ１細胞では、ヒト培養細胞に比べてそのような効果は低かった（図７）。これらマスクロマトグラムのピーク面積比を表１にまとめた。
【００９５】
【表１】
2010200609.tif 000008
【００９６】
ＭａｎＮＡｃを培地中に添加することで、マウス細胞ＹＡＣ１ではＮｅｕ５Ａｃのピーク面積に対するＮｅｕ５Ｇｃのピーク面積を１８．５％までしか低下させることができなかった。一方で、Ｊｕｒｋａｔｔでは８．６％であったＮｅｕ５Ａｃに対するＮｅｕ５Ｇｃピーク面積比が０．３％まで、ＭＯＬＴ４では１６．８％であった該ピーク面積比が０．４％まで低下させることが可能であった。
【００９７】
このことは、ヒト培養細胞において、培地中にＭａｎＮＡｃを添加することにより、該細胞からＮ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去できることを示している。
【００９８】
実施例２：ＭａｎＮＡｃ（０．１ｍＭ）含有培地での培養
Ｊｕｒｋａｔｔ細胞およびＭＯＬＴ４細胞について、培養の際に０．１ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを含む培地を用いる以外は実施例１と同様に実験を行った。
【００９９】
その結果、培地に０．１ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを培地に添加した場合においても、Ｊｕｒｋａｔｔ細胞およびＭＯＬＴ４細胞におけるＮｅｕ５Ｇｃに由来するマスクロマトグラムのピークが、ピークとして認めることが困難な程度にまで大きく減少することが確認された。マスクロマトグラムのピーク面積比を表２にまとめた。
【０１００】
【表２】
2010200609.tif 000009
【０１０１】
０．１ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを培地に添加した場合の、Ｎｅｕ５Ａｃに対するＮｅｕ５Ｇｃピーク面積比は、Ｊｕｒｋａｔｔ細胞およびＭＯＬＴ４細胞において、それぞれ０．３％および０．９％となった。このことは、ヒト培養細胞において培地中にＭａｎＮＡｃを０．１ｍＭ添加した場合でも、当該細胞からＮ−グライコリルノイラミン酸含有糖鎖を除去できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
ヒトに対する移植用細胞の樹立・維持には、しばしばウシ胎児血清やフィーダー細胞などヒト以外の動物由来材料が使用されるため、それらからの分子の混入により移植用細胞に抗原性をもたらす場合がある。特に、現在樹立されているヒト培養細胞においては、本来ヒトの細胞が有していない、ヒトに対して抗原性を有するＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含有糖鎖が含まれていることが報告されており、そのまま移植するには問題があった。移植用細胞においては、抗原性のあるＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が抗原性を発揮しない量まで除去させた細胞を準備する必要がある。また、培養細胞により産生される生物製剤となる物質においても抗原性のあるＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が発現されていることがあり、このＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖が生物製剤に抗原性や薬効減弱性をもたらす可能性がある。このような生物製剤においても、抗原性・薬効減弱性を持たせないために生物製剤となる物質においてＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖の含有量を減らす必要がある。
【０１０３】
本発明は、培養細胞において抗原性のあるＮｅｕ５Ｇｃ含有糖鎖を除去する方法、および該方法に用いる培地を提供する。本発明により、ヒトにおける細胞移植に利用可能な細胞や、抗原性や薬効減弱性のない生物製剤を供給することが可能となる。
【図２】
2010200609.tif 000014
【図３】
2010200609.tif 000015
【図４】
2010200609.tif 000016
【図５】
2010200609.tif 000017
【図６】
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【図７】
2010200609.tif 000019
【図１】
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