(57)【要約】【課題】「回復」のための新しい治療的アプローチ、または最低限、急性腎不全の後退を速めるため手段の提供。【解決手段】創傷増殖因子（Ｗｏｕｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＷＧＦ）と称される、新規なマイトジェン性タンパク質のアミノ酸配列を有するものを含むタンパク質およびペプチドのファミリー1、ならびに腎臓上皮細胞の増殖を刺激もするそのＮＨ2末端ペプチド（「ＷＧＦ」は、親分子がマイトジェン活性を有する限り、親分子に由来する種々の長さのペプチドを包含する）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新しい宿主への移植が意図されるドナーヒト腎臓をエキソビボで灌流するための組成物であって、該組成物は、単離されたマイトジェン性タンパク質を含み、該タンパク質は、アミノ酸配列ＹＰＱＧＮＨ（配列番号２）を含み、推定分子量４５ｋＤａまたは２２ｋＤａを有し、該推定は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でＨＰＬＣ精製したタンパク質を電気泳動することにより得られ、該組成物は適切な希釈液中にある、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記タンパク質は、
（ａ）形質転換されていないアフリカミドリザル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−１）を培地で培養する工程；
（ｂ）培養中の該細胞を切屑創傷する工程；および
（ｃ）馴化培地から該タンパク質を得る工程、
を包含する方法によって産生されるものである、組成物。
【請求項３】
新しい宿主への移植が意図されるドナーヒト腎臓をエキソビボで灌流するための組成物であって、該組成物は、マイトジェン性活性を有するペプチドを含み、該ペプチドは、以下；
【数１】
2010150277.tif 000018
【数２】
2010150277.tif 000019
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該組成物は適切な希釈液中にある、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
約２２ｋＤａおよび４５ｋＤａの分子量を有するタンパク質因子由来の新規の増殖ペプチドは、上皮のマイトジェン的な活性を刺激するが、線維芽細胞、特に培養中の腎臓上皮細胞は刺激しない。これらの増殖促進効果はまた、インビボで実証された。
【０００２】
急性の腎不全は、現在「現実の」処置が存在しない高い死亡率を伴う重篤な疾患である。急性の腎不全は、それまで正常であった腎機能の急激な崩壊として規定される。これは、循環不全（ショック）、血管遮断、糸球体腎炎および尿流量の閉塞を含む広範な種々のメカニズムにより起こる。さらに、これは、手術、外傷、敗血症後、または特定の薬品、特に抗生物質および抗癌剤で起こり得る。
【０００３】
１９８５年に、１４０，０００人ものアメリカ人が急性腎不全で入院した（１９９０年のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅ  Ｐｌａｎを参照のこと）。これらの症例に関連する処置の平均コストは、９０００ドルを超えた。過去数年間にわたる疾患の増加および正常な上昇に基づいて、現在、２４０，０００人もの患者が、患者１名あたり１０，０００ドルを超えるコストで、毎年急性腎不全を発症していると推定された。それは、１年あたりほぼ２５億ドルの米国保険制度への総コストの動揺へ転換した。
【０００４】
【表１】
2010150277.tif 000002
１９９０年のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅ  Ｐｌａｎから表１に見られ得るように、腎臓疾患は、米国において主な医療コストに寄与するため、回復の期間を短縮する因子は、社会にとって有益である。
【０００５】
同等に重要なのは、急性腎不全の症例数が１年あたり９％の割合で増加しており（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，１９９５）、そしてこの増加の高い割合は持続すると予測されるという事実である。腎不全の発生数におけるこの上昇について与えられる理由は、腎不全の高い危険性を有する「より病気の（ｓｉｃｋｅｒ）」患者がより長期生存しているということである。
【０００６】
１．高齢患者。急性腎不全の有意により高い発生数を有する高齢患者（例えば、６５歳を越える患者は、４５〜６４歳の患者よりも急性腎不全のために５倍より多く入院しやすい）は、いまや、重篤な医療事象（例えば、心臓発作、脳卒中）ならびに複雑な手術から生存している。より洗練されたモニタリングシステムおよびライフサポートシステムを有する改良された病院の集中治療室はまた、「より病気の」患者の生命保持を助ける。さらに、癌および生命を脅かす感染の処置のための改良された治療剤は、しばしば腎毒性である。
【０００７】
２．新生児。腎不全の極度に高い危険性を有する新生児はまた、より短い期間、および有意により軽い誕生時体重でも生存している。このような幼児は、以前は重篤な肺および心臓の問題を克服することが困難であったが、これらの問題は、現在、改良された薬物および技術で、特に専門化された新生児集中治療室で、首尾よく処置され得る。
【０００８】
処置の様式におけるこのような進歩は、継続しそして加速さえすると予想されるため、急性腎不全の症例数が、おそらくより早い速度でさえ増加し継ける見込みがある。
【０００９】
現時点で、現実の「回復（ｃｕｒｅ）」は、急性腎不全については存在しない。処置の現在の方法は、代謝の不均衡を補正するために透析を実施することにより腎臓を「休息させる」こと、および腎機能が自発的に回復することを待つことである。
【００１０】
透析は、正常には腎臓を通じて排泄される血液からの不純物および毒素を、体外循環およびフィルターを通じて（血液透析）、または腹膜を通じて人工的に除去する技術である。このような不純物を除去することにより、腎不全から生じる生命を脅かす代謝の不均衡は、補正され得、患者は安定化され得る。
【００１１】
急性腎不全を発症している患者での死亡率は、極度に高い。患者の死亡率に対する急性腎不全の効果を分析した近年の試験（Ｌｅｖｙら、１９９６）は、以前に公表された１８の報告に基づいて、この割合を４２％から８８％の範囲であると記している。これらの割合は、１９５０年代初頭から本質的に変化していないままである。１９９６年の試験自体では、急性腎不全を発症した入院患者の死亡率は、腎不全のない同様の患者に比べて５倍高かった（３４％対７％）。
【００１２】
この研究の重要な知見は、「急性腎不全は、死をもたらす重篤な腎以外の合併症を発症させる危険性を上昇させるようであり、そして重症疾病の処置可能な合併症としてみなされるべきではない」ということである。従って、急性腎不全の迅速な改善が、重篤、かつしばしば致死的な腎以外の合併症の発生を防ぐことにより、臨床的な過程をまたしばしば困難にした患者における致死の危険性を有意に減少させ得るようである。
【００１３】
腎臓が、傷害後にそれ自体を修復する能力を有するわずかなヒトの器官のうちの１つであるということは長く知られている。腎臓が不可逆的に傷害を受けた場合、そして腎臓細胞の大規模な壊死が存在する場合でさえ、ある程度、新しい細胞増殖が生じるという強力な証拠が存在する。
【００１４】
増殖因子が、傷害を受けた腎臓において再生過程を刺激または増強し、従って重篤度を軽減し、そして急性腎不全の経過を短縮する治療的なアプローチであることが提唱されている。急性腎不全の処置としての増殖因子の使用は、Ｔｏｂａｃｋ（１９８４）により最初に提唱された。しかし、適切な増殖因子を見出すことは、困難と判明した。このストラテジーのための原理は、いくつかの特定の増殖因子タンパク質が同定された後になって発展された（ＭｏｒｄａｎおよびＴｏｂａｃｋ，１９８４；Ｔｏｂａｃｋ  １９９２；ＭｅｎｄｌｅｙおよびＴｏｂａｃｋ，１９８９；Ｔｏｂａｃｋ  １９９２ａおよび１９９２ｂ）。しかし、ヒトの処置において有用である因子はまだ確認されていない。
【００１５】
腎臓の傷害を受けていない尿細管細胞（ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌ）の増殖および遊走の刺激に、そしておそらくさらに準致死的に傷害を受けた細胞の回復を促進するようにインビボで作用する増殖因子は、有益である。特定の増殖因子は、腎臓問題を有する患者の生存の上昇のために、十分な栄養、熱量および透析治療と組み合わせて用いられ得る。例えば、増殖因子の投与は、以下をなし得る：（１）急性腎不全が拒絶の増加と関連した状況での、死体の腎移植片を有する患者において肯定的な結果を増加させること、（２）急性腎不全の期間を短縮し、患者の生存を上昇させること、および（３）腎不全症候群の間の血液透析処置に必要な日数を短縮すること。
【００１６】
自己分泌増殖因子は、それらが作用する同じ細胞により局所的に産生される。それらは、細胞傷害のような刺激事象に応答して産生されるようである。さらに、それらは、極度にわずかな量で産生され、そしてほんの短い時間だけ、検出可能レベルで存在し得る。従って、それらを単離しそして同定することはかなり困難である。
【００１７】
２つの別の型の増殖因子−パラクリンおよびエンドクリン−その両方は、腎臓細胞の増殖刺激においていくぶん役割を有するようである。パラクリン因子は、（それを産生した細胞でよりも）近接した細胞で作用するが、エンドクリン因子は１つの細胞で産生され、そして別の離れた細胞で作用するように輸送（例えば、血流により）される。代表的にはより大量に産生され、そしていくつかの自己分泌因子よりも長い「半減期」を有するこれらの型の因子のうちのいくつかは、発見され、そしてそれらのｃＤＮＡが同定されている。
【００１８】
（動物試験および臨床試験）
いくつかの増殖因子は、回復の速度を増す際のその効力を決定するために、急性腎不全ラットモデルにおいて試験されている。これらの試験の結果は、増殖因子が腎臓の修復の加速において主な役割を果たし得るという理論に対する支持の助長を与える。これらのうち最も重要な３つは以下である。
【００１９】
１．上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、急性腎不全を有するラットにおいて回復を加速すると報告されている（Ｃｏｉｍｂｒａら、１９９０）。しかし、ＥＧＦはまた、骨由来のカルシウムを動員し、これはヒトにおけるその使用を妨げるようである重篤な副作用であることが注目された。
【００２０】
２．インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）。ラットモデルにおけるいくつかの試験は、この因子が実際に有効であることを確認する。しかし、ヒトＩＧＦ−１の２つの臨床的試験においては、急性腎不全からの患者の回復の速度を増す際に実質的な効果を有するようではなかった。
【００２１】
３．骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）は、骨、軟骨および目の組織の修復におけるヒトでの使用のためにすでに認められた骨増殖因子である。ＯＰ−１は、ヒト腎臓の胚発生において重要な役割を果たし得るが、これが成人の腎臓細胞の修復を補助するためにどのように働くのかは明確ではない。ＯＰ−１および他の自己分泌性の腎臓増殖因子は一緒に、作用の相補的メカニズムを有し得ることは可能である。
【００２２】
（自己分泌性腎臓増殖因子）
以前に同定された増殖因子に関する動物試験の結果は、助長されているが、現在、これらの増殖因子で臨床的に用いられているものはない。特に注目されるのは、上記の３つの増殖因子（ＥＧＦ、ＩＧＦ−ＩおよびＯＰ−１）のための腎臓のメッセンジャーＲＮＡが、急性腎不全の間、腎臓において現実に減少することである。論理的に、増殖因子が、傷害の修復、および急性腎不全の後退において有効である場合、このレベルは、臨床事象の間に、上昇することが期待される。
【００２３】
上記で引用された因子のいくつかは、腎臓上皮細胞により放出され、そして自己分泌様式で細胞の増殖を刺激し得る。例えば、サル腎臓（ＢＳＣ−１）細胞は、「低カリウム増殖因子」を放出することによるカリウム濃度の減少を伴って培養培地へ応答し、そして「低ナトリウム増殖因子」を放出することによりナトリウム濃度を減少させる応答をする（ＭｏｒｄａｎおよびＴｏｂａｃｋ，１９８４；Ｗａｌｓｈ−Ｒｅｉｔｚら，１９８６；Ｔｏｂａｃｋら，１９９２ｂおよび１９９５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
「回復」のための新しい治療的アプローチ、または最低限、急性腎不全の後退を速めるための重要な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明によって以下が提供される：
（項目１）  タンパク質であって、以下の特徴：
ａ）ＨＰＬＣ精製したタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミド上で電気泳動することによって得られる、推定分子量４５ｋＤａ；
ｂ）培養細胞と接触するときに、分裂促進活性を刺激する能力；
を有し、そして、
ｃ）引っかきによる損傷が生じることによって培養物中のＢＳＣ−１細胞により放出された、タンパク質。
（項目２）  ＮＨ２−アラニンーグルタミンープロリンートリプシン／システインープロリンーグルタミンーグリシンーアスパラギンーヒスチジンーグルタミン酸ーＸ−アラニン／セリンーチロシンーグリシンーＣＯＯＨのアミノ末端に部分アミノ酸配列を有する、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）  タンパク質であって、以下の特徴：
ａ）ＨＰＬＣ精製したタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミド上で電気泳動することのよって得られる、推定分子量２２ｋＤａ；
ｂ）培養細胞と接触するときに、分裂促進活性を刺激する能力；
を有し、そして、
ｃ）引っかきによる損傷が生じることによって培養物中のＢＳＣ−１細胞により放出された、タンパク質。
（項目４）  ＮＨ２−アラニンーグルタミンープロリンーチロシン／システインープロリンーグルタミンーグリシンーアスパラギンーヒスチジンーグルタミン酸−アラニンートスレオニン−セリン−セリン−セリン−フェニルアラニン−ＣＯＯＨのアミノ末端に部分アミノ酸配列を有する、項目３に記載のタンパク質。
（項目５）  ＮＨ２−チロシンーシステインープロリンーグルタミンーグリシンーアスパラギンーヒスチジンーＣＯＯＨを含む、ペプチドタンパク質。
（項目６）  ７〜１６アミノ酸長を有する、項目５に記載のペプチド。
（項目７）  以下の群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質：
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳＦ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡＹＧ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡＹ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＳＹ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨ；
ＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
ＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨ；
ＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＰＹ／ＣＰＱＧＮＨ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳＦ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳ；および
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴ。
（項目８）  項目１に記載のタンパク質を含む、組成物。
（項目９）  項目１に記載のタンパク質を含む、組成物。
（項目１０）  項目７に記載のペプチドを含む、組成物。
（項目１１）  ペプチドＹＰＱＧＮＨまたはＣＰＱＧＮＨを含む、タンパク質。
（項目１２）  ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧまたはＡＱＰＣＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧを含む、タンパク質。
（項目１３）  以下の特徴：
ｉ）  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でＨＰＬＣ精製したポリペプチドを電気泳動することにより得られる、推定分子量約４５ｋＤａ；
ｉｉ）  培養細胞と接触するときにマイトジェン活性を刺激する能力；
を有し、かつ
ｉｉｉ）  引っかきによる損傷が生じることより培養中のＢＳＣ−１細胞により放出された、
、タンパク質を作製するための方法であって、
該方法は、以下：
ａ）  培地中で腎臓上皮細胞を培養する工程、
ｂ）  培養中の該細胞を引っかきによる損傷を生じさせる工程、および
ｃ）  馴化培地から該タンパク質を得る工程、
を包含する、方法。
（項目１４）  得られた前記タンパク質が、前記馴化培地から単離され、
そして精製される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）  培養中の前記腎臓上皮細胞が、ＢＳＣ−１アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株由来である、項目１１に記載の方法。
（項目１６）    以下の性質：
ｉ）  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でＨＰＬＣ精製されたポリペプチドを電気泳動することにより得られる、推定分子量約２２ｋＤａ；
ｉｉ）  培養細胞と接触する場合にマイトジェン活性を刺激する能力
を有し、かつ
ｉｉｉ）  引っかきによる損傷が生じることにより培養中のＢＳＣ−１細胞により放出された、
タンパク質を作製するための方法であって、
該方法は、以下：
ａ）  腎臓上皮培養物を得る工程、
ｂ）  培養中の該細胞を引っかきによる損傷を生じさせる工程、および
ｃ）  引っかきによる損傷が生じた細胞が培養される培地を馴化されるようにする工程、
を包含する、方法。
（項目１７）  項目１に記載のタンパク質に対する抗体。
（項目１８）  ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧまたはＡＱＰＣＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧに対する、抗体。
（項目１９）  項目７に記載のペプチドに対する、抗体。
（項目２０）  前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１７に記載の抗体。
（項目２１）  前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目１９に記載の抗体。
（項目２２）  項目１に記載のタンパク質を作製するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）  該タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を得る工程；および
ｂ）  遺伝子発現系において、該タンパク質またはペプチドを作製するために、該ヌクレオチド配列を用いる工程、
を包含する、方法。
（項目２３）    生物学的試料において、ＷＧＦタンパク質またはそからのマイトジェンペプチドの量を測定するための診断キットであって、該キットは
、別々の容器に、以下：
ａ）  該ＷＧＦまたはそれからのマイトジェンペプチドに対する抗体；および
ｂ）  該タンパク質またはマイトジェンペプチドと該抗体との間の特異的複合体を検出する手段、
を含む、キット。
（項目２４）  項目２３に記載の方法であって、前記マイトジェン活性ペプチドが、配列
チロシン／システイン／−プロリンーグルタミンーグリシンーアスパラギン  ヒスチジンを有する、方法。
（項目２５）    急性腎不全を伴うヒトを処置するための方法であって
ａ）薬理学的有効量のネイティブＷＧＦタンパク質またはＷＧＦ誘導ペプチドを適切な希釈液中で調製する工程；および
ｂ）該調製物を該ヒトに投与する工程
を包含する、方法。
（項目２６）    前記ＷＧＦが、腎臓ガンの処置のために細胞溶解性リガンドに連結される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）    前記細胞溶解性リガンドが、腎臓ガンの処置のために毒素を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）    適切な希釈液中の薬理学的有効量のネガティブＷＧＦタンパク質またはＷＧＦ誘導ペプチドを、新しい宿主への移植を意図されるヒトの腎臓にエキソビボで灌流する方法。
（項目２９）    慢性腎疾患を伴うヒトを処置するための方法であって、ａ）適切な希釈液中に薬理学的有効量のネイティブＷＧＦタンパク質またはＷＧＦ誘導ペプチドを調製する工程；および
ｂ）有効量の該調製物を該ヒトに投与する工程
を包含する、方法。
（項目３０）    ＷＧＦ誘導ペプチドの少なくとも１つの多量体を含む組成物であって、該ペプチドは、ヘキサペプチドＮＨ2−Ｙ／ＣＰＱＧＮＨ−ＣＯＯＨ、２２ｋＤａおよび
４５ｋＤａのＷＧＦタンパク質の最初の１０アミノ酸（ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥ）、１４−Ｓｅｒペプチド（ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ）、および他のＷＧＦ配列、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、組成物。
（項目３１）    少なくとも１つのＷＧＦ誘導ペプチドを含む組成物であって、少なくとも１つのアミノ酸が、得られるペプチドがそのマイトジェン活性を保持するように、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然アミノ酸で置換される、組成物。
（項目３２）    少なくとも１つのＷＧＦ誘導ペプチドを含む組成物であって、該ペプチドは、マイトジェン活性を有するＷＧＦ誘導ペプチドとは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入により、異なっているアミノ酸を有する、組成物。
（項目３３）  ＷＧＦ誘導ペプチドまたはタンパク質の構造的なホモログでるペプチドまたはタンパク質を含む組成物であって、該ペプチドまたはタンパク質は、該ＷＧＦ誘導ペプチドまたはタンパク質と少なくとも８０％の相同性を有する、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有し、該組成物は、マイトジェン活性を示す、組成物。
（項目３４）  ＷＧＦ誘導ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つ構造的に改変されたアイソフォームを含む組成物であって、該アイソフォームは、グリコシル化、硫酸化、またはミリスチル化のうちの１つの機構によって翻訳後改変され、かつ
該組成物は、マイトジェン活性を有する、組成物。
（項目３５）    ネイティブＷＧＦタンパク質およびＷＧＦ誘導ペプチドが、マイトジェンシグナル伝達を開始するために結合する細胞表面レセプターを含む、組成物。
（項目３６）    ＷＧＦタンパク質または少なくとも１つのＷＧＦ誘導ペプチドを、他の公知の増殖因子および／または栄養素との組み合わせて含む、組成物。
（項目３７）    急性腎不全または慢性腎疾患を伴うヒトを処置することに使用される、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）    ネイティブＷＧＦタンパク質およびＷＧＦ誘導ペプチドのマイトジェン効果をブロックする、ペンタペプチド。
（項目３９）  ＹＰＱＧＮのアミノ酸配列を有する、項目３８に記載のペンタペプチド。
（項目４０）  ＰＱＧＮＨのアミノ酸配列を有する、項目３８に記載のペンタペプチド。
（発明の要旨）
本発明は、創傷増殖因子（Ｗｏｕｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＷＧＦ）と称される、新規なマイトジェン性タンパク質のアミノ酸配列を有するものを含むタンパク質およびペプチドのファミリー1、ならびに腎臓上皮細胞の増殖を刺激もするそのＮＨ2末端ペプチドを含む。（1：一般に、「タンパク質」は、約５０アミノ酸以上の分子について用いられる用語である。ペプチドはより小さい）。「生物学的に活性なＷＧＦ」は、本明細書において、培養された腎臓細胞におけるマイトジェン活性を刺激する因子として規定され、そして一般に、本明細書において「ＷＧＦ」によって意味されるものである。「ＷＧＦ」は、親分子がマイトジェン活性を有する限り、親分子に由来する種々の長さのペプチドを包含する。適切な「ＷＧＦ由来ペプチド」は、アミノ酸置換、付加または欠失が生じたペプチドであるが、このペプチドはマイトジェン活性を刺激し、そしてその作用がペンタペプチドＹＰＱＧＮまたは活性をブロックする任意の他のペプチドによりブロックされるペプチドである。少なくともペンタペプチドＹＰＱＧＮが細胞のＷＧＦレセプターへの接近をブロックすることが考えられる。好ましいヘキサマー（６マー）配列である、ＮＨ2−チロシン／システイン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−ＣＯＯＨ（Ｙ／ＣＰＱＧＮＨ）は、一般に、このペプチドに含まれる。（１か所でのアミノ酸間のスラッシュは、いずれか１つがそこに存在することを示す）。
【００２６】
本発明は、基礎的な「因子」の培養において産生の様式が存在するために、最初、創傷増殖因子（ＷＧＦ）と名付けられたタンパク質を特徴付けるとして言及された、アミノ酸配列由来の生物学的増殖促進タンパク質およびペプチドに関する。さらなる分析は、最初は以下の２つの分子量の因子を示した：
【００２７】
【化１】
2010150277.tif 000003
ＷＧＦ由来の本発明の新規なペプチドの実施態様は、培養におけるサル腎臓上皮細胞のための強力なマイトジェン因子であり、このペプチドは、１４のアミノ酸配列，ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧを含む。この１４アミノ酸のペプチド（１４マー）は、それが１２位でセリン残基を有することを示すために「１４−Ｓｅｒ」と呼ばれる。他の公知の腎臓増殖因子マイトジェン因子と比較して配列ＹＰＱＧＮＨもしくはＣＰＱＧＮＨを含むこのペプチド、または天然の完全長ＷＧＦは、以下の他の公知の因子に付加的であるか、等価であるか、またはより強力であるかのいずれかであるマイトジェン効果を有する：例えば、上皮性増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、バソプレシン、または仔ウシ血清。
【００２８】
天然に存在する因子（ＷＧＦ）は、腎細胞単層がピペットチップによる機械的な引っかき傷を受けた場合、培養培地中に放出される。これは新しい知見であった。すなわち、増殖因子が引っかき傷をつけられた腎臓上皮細胞から放出され、そして同じ型の細胞の増殖を刺激し得る。従って、それは自己分泌性増殖である。因子を放出する細胞の供給源は、ＢＳＣ−１細胞株（形質転換されていないアフリカミドリザル腎臓上皮細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６／ＢＳ−Ｃ−１）である。これらのペプチドはまた、ペプチド合成および組換え遺伝子技術を含む当業者に周知の技術により合成され得る。
【００２９】
創傷後の増殖促進活性の出現は、ＷＧＦの不活性な前駆体のタンパク質分解活性化により媒介されるようである。これについての証拠は、以下の種々のプロテアーゼインヒビターのそれぞれによる１０分間の細胞のプレインキュベーションが創傷後の増殖促進活性の出現を妨害したことである：アプロチニン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｓｉｇｍａ）（ＰＭＳＦ）、アンチパイン、Ｌ−１−クロロ−３−（４−トシルアミド）−７−アミノ−２−ヘプタノン−ヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）またはα2−マクログロブリン。これらの薬剤のどれも、創傷を受けていない培養物の細胞に加えた場合、細胞の増殖を阻害しなかった。ＷＧＦマイトジェン活性の出現後に、培地に添加された場合、ＰＭＳＦもアプロチニンも、細胞の増殖における増加を阻害しないようであった。ＨＰＬＣで精製したＷＧＦは、プロテアーゼであるようではない。なぜなら、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｇｅｌ  ｔａｂｌｅｔｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてアッセイした場合、このＷＧＦはタンパク質分解活性を示さなかったからである。
【００３０】
本明細書において議論されるように、ＷＧＦは、それがＢＳＣ−１細胞のような引っかき傷をつけられた腎臓上皮細胞の培養培地中に放出された後、増殖促進活性を示す。この増殖促進活性を担う成分の単離および精製は、成分が２２および／または４５キロダルトン（ｋＤａ）の相対的分子量（Ｍr）を有するように、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動上でふるまうことを示した。さらなる分析は、ＷＧＦが３Ｔ３線維芽細胞についてのマイトジェン因子ではなく、サル腎臓ＢＳＣ−１細胞についてのマイトジェン因子であるタンパク質であることを示した。ＷＧＦの放出はまた、元々、相対的に腎臓上皮細胞型特異的であるようである。なぜならＷＧＦは、培養中でＢＳＣ−１細胞の創傷後に出現するが、培養中での線維芽細胞の創傷後には出現しないからである。
【００３１】
従って、本発明の１つの局面は、以下の特徴を有する「ＷＧＦ」と名づけられたタンパク質である：
ａ）約４５ｋＤａおよび／または２２ｋＤａの推定分子量（この推定は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでのＨＰＬＣ精製タンパク質の電気泳動により得られる）；
ｂ）培養された細胞と接触させた場合、マイトジェン性活性を刺激し得ること；および
ｃ）引っかき傷つけにより培養物においてＢＳＣ−１細胞により放出されること。詳細には、天然状態から単離された４５ｋＤａタンパク質は、以下のようにそのアミノ末端で部分的なアミノ酸配列を有する：ＮＨ2−アラニン−グルタミン−プロリン−チロシン／システイン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−グルタミン酸−Ｘ−アラニン／セリン−チロシン−グリシン−ＣＯＯＨ（Ｘ＝未特定のアミノ酸）。
【００３２】
別のＷＧＦタンパク質は、約２２ｋＤａの推定分子量を有し、この推定は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでのＨＰＬＣ精製タンパク質の電気泳動により得られ、そしてこれは以下のようにそのアミノ末端での部分的なアミノ酸配列を得る：ＮＨ2−アラニン−グルタミン−プロリン−チロシン／システイン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−グルタミン酸−アラニン−トレオニン−セリン−セリン−セリン−フェニルアラニン−ＣＯＯＨ。
【００３３】
馴化細胞培養培地からＷＧＦを精製するのに適切なプロトコールは、限界濾過、ヘパリン親和性クロマトグラフィーおよび逆相（ＲＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用する。ＷＧＦタンパク質の収率は、通常、１リットルの馴化培地あたり約５０ｎｇのタンパク質の範囲で非常に低いが、６，４００倍の精製が達成される。
【００３４】
生物活性のＷＧＦのサイズは、標準タンパク質（すなわち、公知のサイズのタンパク質）と平行に、ＳＤＳゲルでＨＰＬＣ精製ＷＧＦを電気泳動すること、ゲルを２ｍｍ幅のゲル画分にスライスすること、緩衝液中でそれぞれの画分を溶出すること、次いでＢＳＣ−１細胞の培養物を用いてマイトジェン活性について抽出物をアッセイすることにより規定された。この実験ストラテジーは、ＷＧＦタンパク質が２２ｋＤａおよび４５ｋＤａの推定Ｍrを有し、そしてマイトジェン性であることを示した。
【００３５】
ＲＰ−ＨＰＬＣにより得られた２１４ｎｍでの物質の吸収の単一の先鋭なピークは、線維芽細胞ではなく、腎臓上皮に対する増殖促進活性を示し、そして銀染色によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上でいくつかのバンドを産生した。
【００３６】
先鋭なピークを形成した物質のアミノ酸組成分析は、ＷＧＦのタンパク質特徴を確認した。微量配列決定は、２２ｋＤａイソ型のアミノＮＨ2末端の最初の１６アミノ酸を示した：ＮＨ2−アラニン−グルタミン−プロリン−チロシン／システイン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−グルタミン酸−アラニン−トレオニン−セリン−セリン−セリン−フェニルアラニン−ＣＯＯＨ。４５ｋＤａイソ型について、アミノ末端での１４のアミノ酸が、同定された：ＮＨ2−アラニン−グルタミン−プロリン−チロシン／システイン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−グルタミン酸−Ｘ−アラニン／セリン−チロシン−グリシン−ＣＯＯＨ。１１位でのアミノ酸の同定は未確定（Ｘ）であり、４位でチロシン（Ｙ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、または１２位でアラニン（Ａ）もしくはセリン（Ｓ）であるか否かを決定することは不可能である。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により取り扱われるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＧＥＮＩＮＦＯ（Ｒ）ＢＬＡＳＴ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｂｌａｓｔｅｒ）の７つのペプチド配列データベースの検索は、このアミノ末端配列が新規なタンパク質のアミノ末端配列であることを示した。
【００３７】
実質的に重要なことは、１６のアミノ酸配列より短いペプチドもまた、強力なマイトジェンの比活性を有しているというさらなる知見であった。この知見は、非常に重大である。なぜならこれらの短いペプチドは：（１）抗原性にはほとんどなりそうにない（すなわち、それらは免疫系に拒絶されることなく、別の動物またはヒトに直接注入され得る）、そして（２）それらは、最初に、完全な２２または４５キロダルトンタンパク質をコードし、次いで組換えタンパク質を発現するするｃＤＮＡクローンを見出す必要なく、ペプチド合成機を用いて、容易に大量に調製され、そして改変され得る、からである。
【００３８】
培養された細胞を傷付けることにより因子を産生させることに加えて、マイトジェン活性を発現する合成ペプチドが産生された。特に興味深いのは、その配列が、２２ｋＤａタンパク質の最初の１１のアミノ酸残基に基づき、そしてマイトジェン活性を示す合成ペプチドである。さらに、因子の短いペプチドドメインである他のポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。ヘキサマーは、マイトジェン活性を維持したままである最小のペプチドであった（ＹＰＱＧＮＨまたはＣＰＱＧＮＨ）。
【００３９】
ＮＨ2−チロシン／システイン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−ＣＯＯＨのアミノ酸配列を含むペプチドは、本発明の実施に適している。一般的に、このペプチドは、７〜１６アミノ酸長を有するが、マイトジェン性機能および／または抗原性機能が保存される場合には、他の長さもまた、適している。
【００４０】
トランスフォーミング増殖因子−β２、および配列ＹＰＱＧＮを有する合成５−アミノ酸ペプチドの両方は、ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧのマイトジェン効果をブロックする。グリコサミノグリカン、ヘパリンおよびケラタン硫酸の各々は、このペプチドのマイトジェン効果を増強する。
【００４１】
腎毒性および虚血性ラットモデルの両方において急性腎不全（ＡＲＦ）の経過を変化させる能力について、配列ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ（１４−Ｓｅｒ）および創傷増殖因子アイソフォームのＮＨ2末端由来の他の関連ペプチドを有するペプチドを、評価した；この症候群は、一般に、ヒトを苦しめる。
【００４２】
皮下（ｓ．ｃ．）で与えられた塩化第二水銀を使用し、ラットでＡＲＦを誘導し、そしてその後の７日間に血清クレアチニン濃度を測定することによって評価される、腎機能の生存を増強し、そして回復を加速する能力について、各々のペプチド溶液を評価した。
【００４３】
塩化第二水銀の投与１時間後の配列ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧを有するペプチド（１００μｇ）のＳ．Ｃ．投与は、２日後の腎機能の回復を有意に改善し、そして３日後の生存を改善した。腎機能の生存および回復におけるこのペプチドの有利な効果はまた、腎毒性ＡＲＦ症候群の誘導の１６．５時間後または２４時間前にそれを投与した場合に観察された。
【００４４】
ラットにおいて４５分間の両側腎茎の締付けによって誘導される虚血性ＡＲＦでは、クランプを除去した一時間後のＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧペプチド（１００μｇ）の投与はまた、腎機能の生存を改善し、そして回復を増強した。
【００４５】
再生している腎臓においてＤＮＡを標識するためにブロモデオキシウリジンを使用することによって、このペプチドが、塩化第二水銀誘導性腎損傷の部位に近接する細胞でのＤＮＡ合成を刺激することにより腎機能の生存および回復を改善するという証拠を得た。このペプチドは、腎損傷の２４時間前に与えられた場合、生存を促進する点では、このモデル系での既知の効力の物質である上皮増殖因子よりも強力であり、そして腎損傷の直後に与えられた場合、等価であった。このペプチドを用いる処置に応答する腎機能の改善した生存およびより迅速な回復は、腎毒性ならびに虚血性ＡＲＦを有するヒトにおいて期待される。
【００４６】
本発明の実施のための適切なペプチドは、以下に示される配列：
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳＦ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡＹＧ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡＹ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＳＹ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＳ；
ＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＡＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨ；
ＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
ＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＱＰＹ／ＣＰＱＧＮＨ；
ＰＹ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡ；
ＰＹ／ＣＰＱＧＮＨ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳＦ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳ；
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴＳ；および
Ｙ／ＣＰＱＧＮＨＥＡＴを含む。
【００４７】
ペプチドＹＰＱＧＮＨまたはＣＰＱＧＮＨ（Ｙ／ＣＰＱＧＮＨ）は各々、タンパク質のマイトジェン性フラグメントである。
【００４８】
種々のＷＧＦ由来ＮＨ2末端ペプチドまたは全長ＷＧＦタンパク質の改変体（アイソフォーム）は、それらのアミノ酸配列において、または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）のような配列の改変を含まない方法において、あるいはその両方において異なり得る。アミノ酸配列の改変体は、ＮＨ2末端ペプチドまたはＷＧＦタンパク質の１つ以上のアミノ酸が、異なる天然に生じるアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然アミノ酸で置換された場合に、生成される。特に好ましい改変体は、代表的には、天然ＷＧＦタンパク質アイソフォーム、天然に生じるＷＧＦタンパク質の生物学的に活性なペプチド、ならびにタンパク質またはペプチドの二次構造および疎水性の性質に最小限の影響を有する１つ以上の保存的アミノ酸置換によって野生型配列とは配列が異なる合成ペプチドを含む。改変体はまた、ＷＧＦペプチドまたは全長タンパク質の生物学的活性、すなわち、マイトジェン活性を破壊しない１つ以上の非保存的アミノ酸の置換、欠失または挿入により異なる配列を有し得る。
【００４９】
機能的に等価なペプチドは、等価なアミノ酸を置換することによって、そして作製された分子が機能的に不活性なコントロールペプチドと比較してＢＳＣ−１１細胞の増殖を１５〜３５％刺激することを実証するマイトジェンアッセイを使用することによって、構築され得る。これらの「等価な」または「保存的な」置換を用いて構築されるペプチドは、腎上皮細胞増殖を刺激し得るか、阻害し得るか、または影響し得ない。「保存的置換」についてのガイドは、表２で示される。置換を有するペプチドの合成は、当業者によって容易に実行され、そしてこのマイトジェンアッセイは、容易に実行される。従って、本発明の範囲内のペプチドは、容易に決定される。
【００５０】
代表的には、保存的変化は、類似の性質を有する別のアミノ酸についての１つのアミノ酸の置換を含む。このような置換は、以下：バリン、グリシン、；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの対または群の範囲内である。非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。この極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正荷電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００５１】
表２は、さらなる保存的置換を要約する；他は、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中のＤａｙｈｏｆｆにより記載されている。
【００５２】
【表２】
2010150277.tif 000004
2010150277.tif 000005
本明細書中で記載されるように、微量配列決定後のクロマトグラムの分析は、ＷＧＦアイソフォームのＮＨ2末端における特定のアミノ酸残基の正体が不明瞭であることを示した。妥当と思われるアミノ酸の各々を使用して特定の合成ペプチドを調製することは、異なるマイトジェン能力を有するＷＧＦ由来の分子の同定を可能にした（表３）。
【００５３】
本明細書中に記載されるタンパク質またはペプチドを含む組成物は、本発明の範囲内である。
【００５４】
本発明のタンパク質またはペプチドを産生するための方法は、以下の工程：
ａ）培地において腎上皮細胞を培養する工程、
ｂ）培養中の細胞を掻き取り創傷する（ｓｃｒａｐｅ−ｗｏｕｎｄｉｎｇ）工程、および
ｃ）馴化培地からタンパク質を得る工程を含む。
得られたタンパク質は馴化培地から単離され、そして精製される。培養中の腎上皮細胞の供給源は、ＢＳＣ−１アフリカミドリザル腎上皮細胞株である。
【００５５】
本発明のタンパク質またはペプチドを作製する組換えＤＮＡ方法は、以下の工程：
ａ）タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を得る工程；および
ｂ）遺伝子発現系において、ヌクレオチド配列を使用し、タンパク質またはペプチドを作製する工程を含む。
本発明のペプチドはまた、細胞または分子生物学的技術によらずに、ペプチド合成機で直接的に調製され得る。
【００５６】
ＷＧＦおよび派生するペプチドに対する抗体は、本発明の局面である。各抗体の利用可能性は、尿、血液および組織における、この因子およびその派生するマイトジェン性ペプチドの量を測定する診断的な道具を提供する。新規な診断的洞察は、感染または悪性疾患の処置の間に腎毒性能力を有する薬物を受けている患者において、および腎損傷または新形成を有する個体において容易にされる。このような抗体はまた、慢性的な腹膜透析および／または血液透析をうけている患者の残りの腎臓において、腎臓癌を検出するために使用され得る。この抗体は、例えば、一般的にＹ／ＣＰＱＧＮＨを含む、タンパク質またはこの活性部位を含むペプチドを指向する。
【００５７】
診断的なキットを使用して、ＷＧＦタンパク質またはそれ由来のマイトジェン性ペプチドの量を測定し、生物学的サンプルにおいては急性腎損傷または腎臓疾患の早期発症を検出し、腎細胞癌の処置をモニターし、または慢性的な透析患者における良性腎嚢胞の癌腫または嚢胞腺癌への転換を認識する。このキットは、別個の容器において以下：
ａ）ＷＧＦに対するかまたはそれ由来のマイトジェン性ペプチドに対する抗体；ならびに
ｂ）ＷＧＦタンパク質またはマイトジェン性ペプチドと、この抗体との間の特異的複合体を検出するための手段を含む。コントロールおよび緩衝液もまた、含まれ得る。
【００５８】
本発明は、腎疾患の医学的処置のための組成物を調製する際のペプチドの使用を含み、前記調製する工程が、ペプチドを入手する工程、そしてそれらを適切なキャリアに加える工程を包含する。このようなキャリアは、当該分野において周知である。
【００５９】
本発明の新規な腎増殖因子タンパク質およびペプチド、ならびにそれらに対する抗体は、臨床医学において多様な用途を有する。このＷＧＦペプチドは、腎細胞増殖を刺激するために有用であり、急性腎不全の処置に対して有用な特徴である。急性腎不全の患者、特に増殖能力が低下した死体の腎移植を受けている急性腎不全の患者において、回復を加速することが特に好ましい。患者へのタンパク質またはペプチドの注入は、急性腎不全エピソードの持続時間を短縮すること（これは、患者の生存を増加させる）、そして腎不全症候群の間の血液透析処置のために必要とされる日数を減少させることに関する。このペプチドはまた、他の候補増殖因子についてインビトロでの比較標準を提供する。１つまたは多数のペプチドが、使用され得る。
【００６０】
ＷＧＦは、確立した腎疾患（例えば、慢性糸球体腎炎または間質性腎炎）の進行を遅くする治療剤としての役割を有することが期待される。ＷＧＦおよびそのレセプターは、腎上皮細胞の表面上に存在するようである。ＷＧＦが、ネフロンに沿った特定の腎上皮細胞型の表面上のレセプターに対するリガンドであることが見出される場合、それは、癌化学療法において考慮されるべきである。それが癌細胞型特異的であることが見出される場合、この増殖因子は、細胞毒素、放射性同位元素、または細胞傷害性抗体と結合体化され、強力な新規の化学療法剤を生じ得る。
【００６１】
急性腎不全を有するヒトを処置する方法は、以下の工程：ａ）適切な希釈剤において薬理学的に有効量の天然ＷＧＦタンパク質またはＷＧＦ由来ペプチドを調製する工程；およびｂ）このヒトにこの調製物を投与する工程を含む。このＷＧＦは、細胞溶解性リガンド（例えば、毒素）に連結され得る。
【００６２】
本発明はまた、本明細書中に記載されるタンパク質またはペプチドを使用して、急性腎不全を有するヒトを処置する際に有用な組成物を得ることに関する。
【００６３】
マルチマーはさらに、例えば、本明細書中に開示される４０マーとして、細胞マイトジェン活性を増加させる際に、より有効であり得る。マルチマーは、同種のペプチド、例えば、ヘキサペプチドＹ／ＣＰＱＧＮＨのマルチマーから形成され得るか、またはＷＧＦからのペプチドの組み合わせであり得る。組成物は、ヘキサペプチドＮＨ2−Ｙ／ＣＰＱＧＮＨ−ＣＯＯＨ、または２２−ｋＤおよび４５−ｋＤのＷＧＦタンパク質の最初の１０アミノ酸（ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥ）、またはこの１４−Ｓｅｒペプチド（ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ）、または他のＷＧＦ配列のマルチマー、あるいは本明細書中に開示される任意のペプチドの組み合わせからなる群の１つから作製されるＷＧＦ由来ペプチドの少なくとも１つのマルチマーを含み得る。
【００６４】
この組成物は少なくとも１つのＷＧＦ由来ペプチドを含み得、ここで、１つ以上のアミノ酸は、生じる改変体がそのマイトジェン活性を保持する限り、天然に生じるアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然アミノ酸で置換され得る。適切なＷＧＦ由来ペプチドは、マイトジェン活性を有する別のＷＧＦ由来ペプチドとは少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって異なるアミノ酸配列を有し得る。
【００６５】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が少なくとも８０％の相同性を有し、そしてマイトジェン活性を示すＷＧＦタンパク質の構造的ホモログを含む組成物はまた、本発明の範囲内である。
【００６６】
以下：グリコシル化、硫酸化、またはミリスチル化の１つによって翻訳後に修飾され、マイトジェン活性を保持するＷＧＦタンパク質の少なくとも１つの構造的に変化したアイソフォームを含む組成物もまた、本発明の範囲内である。
【００６７】
本発明の組成物はまた、天然ＷＧＦタンパク質およびＷＧＦ由来ペプチドが結合し、マイトジェンシグナル伝達を開始する、細胞表面レセプターを含み得る。
【００６８】
組成物は、他の既知の増殖因子および／または栄養素との組み合わせでＷＧＦタンパク質またはＷＧＦ由来ペプチドを含み得る。
【００６９】
本発明の組成物は、ａ）適切な希釈剤において、必要に応じて、他の増殖因子および／または栄養素とともに、薬理学的に有効量の天然ＷＧＦタンパク質またはＷＧＦ由来ペプチドを調製する工程；ならびにｂ）有効量の調製物を腎臓に問題を抱えるヒトに投与する工程によって、腎不全または腎機能不全の処置方法のために有用である。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
（発明の詳細な説明）
（腎細胞培養物からの創傷増殖因子の産生）
コンフルエント単層培養物を、２００μＬのピペットチップ（Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して機械的に掻き取った。顕微鏡下で観察した場合、この掻き取る工程は、この細胞を傷付けず、これらの細胞を互いに分離し、そして収縮を引き起こし、培養ディッシュにおいて肉眼で見られ得る狭い小道を残すのみのようであった。細胞を掻き取るこのプロセスは、「創傷」と呼ばれており、長年、モデル系として眼の角膜剥離の修復を研究するために使用されている（Ｊｏｙｃｅら、１９９０）。実質的に、細胞間接着を破壊するのに十分な圧力を細胞に適用する。腎上皮細胞が、創傷後にオートクライン因子を培地に放出したか否かを決定するために、ＢＳＣ−１細胞の単層を掻き取り創傷（ｓｃｒａｐｅ−ｗｏｕｎｄｉｎｇ）した後に、培養ディシュから馴化した培養培地を取り出した。非創傷性「検出器」培養物（５５ｍｍディッシュ当たり１．２×１０6細胞）において、任意の増殖促進活性についてアリコートをアッセイした。
【００７１】
（因子の増殖促進活性）
４日後に検出器培養物中の細胞数を計数することによって、および非創傷培養物からの培地のアリコートが添加されていたコントロール培養物中の細胞数とその数を比較することによって、馴化培地のアリコートにおける増殖促進活性をアッセイした。このストラテジーは、ＢＳＣ−１株の創傷性腎上皮細胞が最初に「創傷増殖因子」と名付けられた増殖促進活性を放出することを示した。３Ｔ３繊維芽細胞は、同様の効果を生じなかった。
【００７２】
このアッセイについて、トリプシンの溶液を用いてディッシュから細胞を剥がし、そして血球計数板においてアリコートを計数した。このアッセイについては、ＷＧＦに曝露された細胞が２．６×１０6細胞／培養物の細胞数を有するようにコンフルエントな培養物を使用したが、非創傷培養物からの培地のアリコートで処理された細胞は、この添加の４日後に２．０×１０6の細胞数を有した。従って、ＷＧＦは、このアッセイにおいて細胞増殖を３０％刺激した。高密度な静止状態の培養（３×１０6細胞／５５ｍｍディッシュ）を使用し、ＤＮＡへの[3Ｈ]チミジン取り込みを測定することによってマイトジェン活性をアッセイした場合、ＷＧＦは、ＤＮＡの合成を約６０％増強した。ＷＧＦを調製するために、細胞は１日おきに掻き取り創傷され得るが、最大活性は、馴化培地に放出される。ＷＧＦは、ＢＳＣ−１細胞の低密度培養物およびコンフルエント培養物の両方についてマイトジェン性であり、そして４℃〜−４０℃での何週間もの貯蔵で安定である。
【００７３】
（創傷増殖因子マイトジェン活性の特徴付け）
ＢＳＣ−１細胞の切屑創傷培養物の馴化培地における増殖促進活性の検出後、マイトジェン因子のサイズおよび組成を決定する努力が行われた。最初に、異なる分子量カットオフを有するフィルターを利用して、増殖促進活性が、１００ｋＤａのカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  ＹＭ膜を通過するが、３０ｋＤａのカットオフを有するメンブレンにより保持されることを示した。このことは、マイトジェン因子のサイズが、３０ｋＤａよりも大きいが、１００ｋＤａ未満であることを示唆する。これらのメンブレンは、マイトジェン因子のサイズについての非常に粗い評価しか提供しない。
【００７４】
さらなる分析は、この活性が、タンパク質であることを強力に示唆した。なぜなら、この活性は、トリプシン（１００μｇ／ｍｌで３時間）、ジチオトレイトール（６５ｍＭで１時間）、酢酸（１Ｍで５時間）、または熱（７０℃で２０分間）に対する曝露により破壊され得たからである。
【００７５】
異なる電荷を有するＤＥＡＥおよびＣＭセルロースマトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＷＧＦに対する正味の電荷の特徴付けが求められた。結果は、ＷＧＦがカチオン性であることを示した。続いての実験は、ＷＧＦがヘパリンカートリッジ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ）に堅固に結合し、ヘパリンカートリッジからＷＧＦは、０．４〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを用いて溶出され得ることを示した。
【００７６】
酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子のようなヘパリン結合増殖因子の活性をブロックすることが公知であるペントサンポリ硫酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）はまた、ＷＧＦの活性をブロックし、ＷＧＦがカチオン性分子であることを示唆した。Ｃ4逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ）における研究は、ＷＧＦ増殖促進活性をこのカラムから溶出するために５５％アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＨＰＬＣグレード）の濃度が必要とされたので、このタンパク質が著しく疎水性であることを示した。ＷＧＦ活性はまた、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＨＰＬＣグレード）およびイソプロパノール中で安定であった。
【００７７】
Ｃ4逆相ＨＰＬＣカラムから溶出した、マイトジェンとして活性なＷＧＦの特定の画分はまた、コンカナバリンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）に結合し、そしてα−メチルマンノシドにより溶出し、この因子が炭水化物を含有することを示唆する。最大の増殖促進活性を示したＨＰＬＣカラムからの４つの画分（ＷＧＦと称された、５５％アセトニトリルで溶出した画分を含む）は、各々、コンカナバリンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに曝露され、続いてα−メチルマンノシドに曝露された。次いで、この溶出物は、その増殖促進活性についてアッセイされた。コンカナバリンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合した、５５％および４９％アセトニトリルでＨＰＬＣカラムから溶出した画分は、α−メチルマンノシドにより溶出され、そして充分に活性であった。対照的に、４６％もしくは５７％アセトニトリルで溶出した画分、またはコントロールのマイトジェンとして用いた、糖タンパク質ではない、純粋な上皮増殖因子は、コンカナバリンＡに結合しなかった。これらの結果は、ネイティブなＷＧＦが糖タンパク質であることを示唆した。
【００７８】
（ＷＧＦ、ヘパリン、および他の増殖因子）
種々の型の細胞、内皮細胞の切屑創傷は、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）を放出するが、腎臓細胞ＷＧＦの特徴付けは、ＷＧＦがａＦＧＦとは異なることを示した。この証拠は以下の通りである：（１）各成分がＢＳＣ−１細胞に添加された場合に、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）は、ＷＧＦのマイトジェン活性を増強するが、ａＦＧＦを阻害する、（２）ケラタン硫酸（細胞外マトリックスのグリコサミノグリカン成分）は、ＷＧＦのマイトジェン活性を刺激するが、ａＦＧＦの活性に対しては効果を有さない、（３）ＷＧＦおよびａＦＧＦの最大濃度のマイトジェン効果は相加的である、および（４）ＷＧＦのサイズは約４５ｋＤａであるがａＦＧＦのサイズは約１６ｋＤａである。
【００７９】
ＷＧＦはまた、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）とは以下の点で異なる：（１）ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）はヘパリンアフィニティーカラムから１．５〜１．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出するが、ＷＧＦは０．４〜１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出する、および（２）ｂＦＧＦのマイトジェン活性は５５％アセトニトリル／０．１％（ＴＦＡ）により９０％阻害されるが、これはＷＧＦの活性に対しては効果を有さない。さらに、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのｍＲＮＡは、ＢＳＣ−１細胞のノーザンブロッティングにより検出されず、このことは、これらの増殖因子をコードする遺伝子がこの細胞によって発現されないことを示した。
【００８０】
部分精製されたＷＧＦおよび上皮増殖因子（ＥＧＦ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の最大濃度のマイトジェン効果もまた相加的であり、このことは、これらがおそらくそれらのマイトジェン効果を異なるレセプターおよびシグナル伝達経路によって発揮することを示す。
【００８１】
ＢＳＣ−１細胞のコンフルエントな単層の、酵素ヘパリナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）による処理は、培養培地中に細胞からＷＧＦマイトジェン活性を放出させたが、ヘパリナーゼＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）による処理では放出しなかった。しかし、これは、少なくとも一時的にＷＧＦを枯渇したことによるようである。細胞を最初にヘパリナーゼＩで処理し、リンスし、培地を吸引し、次いで単層を切屑創傷した場合、増殖促進活性は馴化培地において検出されない。これらの観察は、ＷＧＦの原形質膜（創傷またはヘパリナーゼＩでの処理の際に原形質膜からＷＧＦが放出される）への会合を媒介するヘパリン様分子（例えば、グリコサミノグリカン）の役割を示唆する。
【００８２】
細胞表面上にＷＧＦが存在するならば、おそらく、そのタンパク質骨格に連結している炭水化物残基によって、および／または原形質膜に接着したグリコサミノグリカン（グリコカリックス）との会合によって、トリプシンによる分解から保護されているようである。この形成に好都合である証拠は、以下の実験から誘導される。細胞単層を、タンパク質分解性酵素であるトリプシン（１または１０μｇ／ｍｌ）に１０分間曝露した。この酵素は以前、ＷＧＦ活性を破壊する能力を有することが示された。次いで、ダイズトリプシンインヒビター（１０μｇ／ｍｌ）を添加してこの酵素を中和した。続いて細胞単層が傷付けられた場合、充分に生物学的に活性なＷＧＦが、培養培地中に放出され、このことから、外因性トリプシンが、この細胞に会合した増殖因子を破壊しなかったことが示された。
【００８３】
ＷＧＦは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中の細胞によって貯蔵されないようである。この結論は、以下の実験に基づく。ＢＳＣ−１細胞のコンフルエントな単層を、ＥＧＴＡ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）の培地への添加によりＥＣＭから脱離し、ＥＣＭのコーティングを培養皿の表面上に残した。新鮮な培地をこの皿に添加し、次いでそのＥＣＭコーティングを切屑創傷に供した。マイトジェン活性は、馴化培地中で検出されず、このことは、この活性が、細胞上または細胞内に存在し、そしてＥＣＭ中には存在しないことを示唆した。
【００８４】
部分精製したＷＧＦのマイトジェン効力は、本明細書中に開示したアッセイを用いて、約５％仔ウシ血清、または２０ｐｇ／ｍｌ  ａＦＧＦ、または２０ｐｇ／ｍｌ塩基性ＦＧＦ、または１５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦのマイトジェン効力に等しい。
【００８５】
（ＷＧＦ由来ペプチドに対する公知の増殖因子の比較；相加的効果）  セリン残基を１２位に有する１４アミノ酸ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ（１４−Ｓｅｒ）のマイトジェン効力を、ＢＳＣ−１株のサル腎臓上皮細胞について、増殖因子および他のマイトジェンシグナルに対して比較した。各増殖促進シグナルの以前に同定された最大のマイトジェン濃度を用い、そして０〜０．５μｇ／ｍｌの濃度でＷＧＦ由来ペプチドと比較した。
【００８６】
以下のペプチドおよびイオン性マイトジェンシグナルを研究した：ＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ；ＩＧＦ−Ｉ、５０ｎｇ／ｍｌ；酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、１００ｐｇ／ｍｌ；塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、１，０００ｐｇ／ｍｌ；バソプレシン、７５ｐｇ／ｍｌ；仔ウシ血清（０〜１％）；高カリウム培地（５ｍＭ添加ＫＣｌ、最終濃度１０．４ｍＭ、高ナトリウム培地（２５ｍＭ添加ＮａＣｌ、最終濃度１８０ｍＭ）。
【００８７】
ＢＳＣ−１株の非形質転換サル腎臓上皮細胞を、３８℃にてＣＯ2インキュベーターにおいて５５ｍｍ培養皿中の１％仔ウシ血清および１．６μＭビオチンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞が１皿あたり約１０6個の密度に達した場合、使用済み培地を除去し、そして０．５％仔ウシ血清および１４アミノ酸ペプチド（０．５μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地で置き換えた。最大濃度での各マイトジェンシグナルの培養培地への添加がなされた。４日後、各培養物中の細胞数を、血球計算板中で計数した。得られた値は、３つの別の培養物の平均であった。仔ウシ血清濃度が０．５％から１．０％へと倍化することによって、ＢＳＣ−１細胞の増殖は有意に変化しなかった。１４−Ｓｅｒペプチド（０．５μｇ／ｍｌ）の添加は、これらの血清濃度の各々で増殖を２５〜３０％刺激した。
【００８８】
（１．ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、バソプレシンとの比較）
「１４−Ｓｅｒペプチド」であるＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧは、４日目で、コントロールと比較して、細胞数を２５〜３０％増加させた。ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）単独では、「１４−Ｓｅｒペプチド」の非存在下で増殖を３１％刺激し、そしてその存在下では６１％刺激し、このことは、２つのマイトジェンが相加的であることを示した。
【００８９】
ＩＧＦ−Ｉ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、増殖を２０％刺激し；これは１４−Ｓｅｒペプチドより効力が低かった。両方を添加した場合、３８％の刺激が観察された。完全に相加的である場合の期待値４５％よりも低いとはいえ、ＩＧＦ−Ｉのマイトジェン効果は、１４−Ｓｅｒペプチドのマイトジェン効果に対して相加的であるようであった。
【００９０】
酸性ＦＧＦ（１００ｐｇ／ｍｌ）、塩基性ＦＧＦ（１，０００ｐｇ／ｍｌ）、およびバソプレシン（７５ｐｇ／ｍｌ）は、細胞数を２５％増加させた１４−Ｓｅｒペプチドと比較して、増殖を、それぞれ、１７％、１８％、および１４％刺激した。これらの公知のペプチド性増殖因子の各々は、１４−Ｓｅｒペプチドと相加的であり；酸性ＦＧＦでは４４％、塩基性ＦＧＦでは４１％；およびバソプレシンでは３６％であった。
【００９１】
要約すると、１４−Ｓｅｒ  ＷＧＦ由来ペプチドは、強力なマイトジェンである。なぜなら、これは、腎臓上皮細胞に対して、５個の公知のペプチド増殖因子の各々と等価であるかまたは各々よりも強力であるからである。さらに、１４−Ｓｅｒペプチドの増殖促進効果は、５個の増殖因子の各々と相加的であり、このことは、１４−Ｓｅｒペプチドが、５個の増殖因子が作用するのとは異なるレセプターおよび／またはシグナル伝達経路により作用することを示唆した。最終的に、この相加的なマイトジェン効果は、１以上の公知の増殖因子と組み合わせた１４−Ｓｅｒペプチドが、急性腎不全の間に損傷した腎臓の修復および再生を加速するようにインビボで作用し得ることを示唆する。
【００９２】
（２．高カリウム培地、高ナトリウム培地）
適切な塩溶液の添加により、カリウム濃度を５．４ｍＭのコントロール値から１０．４ｍＭへと上昇させること、またはナトリウム濃度を１５５ｍＭ（コントロール）から１８０ｍＭへと上昇させることは、腎臓上皮細胞についてのマイトジェンシグナルとして役立つ。
【００９３】
培養培地のカリウム濃度が塩化カリウム溶液の添加により５．４ｍＭから１０．４ｍＭへと上昇した場合、細胞数は１８％増加した。１４−Ｓｅｒペプチドの添加は、増殖を４３％増強することが期待され；３５％の増加が観察された。
【００９４】
培地のナトリウム濃度を塩化ナトリウム溶液の添加により１５５ｍＭから１８０ｍＭへと上昇させることは、増殖を２５％増加させた。１４−Ｓｅｒペプチドを添加した場合、４１％の増殖の増分が観察され、これは期待値５０％よりも少なかった。
【００９５】
要約すると、２つのイオン性マイトジェンシグナルの各々は、１４−Ｓｅｒペプチドマイトジェンと相加的であった。
【００９６】
（３．１４−Ｓｅｒペプチドの増殖促進効果について必要とされる時間）
１４−Ｓｅｒ  ＷＧＦ由来ペプチドの細胞表面に対するアフィニティーについてのさらなる見識を得るために、実験を行って、このリガンドが腎臓細胞と接触して、腎臓細胞を不可逆的に加速した増殖へと移行させるために必要とされる最少量の時間を決定した。
【００９７】
ＢＳＣ−１細胞のコンフルエントな単層は、本明細書に記載の通りに調製され、そして１４−Ｓｅｒペプチド（０．５μｇ／ｍｌ）に種々の時間量で（０〜３０分間）曝露される。規定した曝露期間が終了したら、マイトジェンを含有する培養培地を吸引し、そして単層をリンスして非接着性ペプチドを除去し、そして新鮮な培地を添加した。４日後、培養物中の細胞数を計数した。
【００９８】
１４−Ｓｅｒペプチドへの細胞の２分間の曝露は、細胞を最大の増殖刺激（２９％）に移行させるのに充分であった；最大の半分の刺激は、１分間であった。４０アミノ酸ペプチド（表３を参照のこと）は、同様に挙動した。対照的に、ＥＧＦについての勾留時間（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｔｉｍｅ）は４分間であり、そしてバソプレシンについては２分間であった。従って、１４−Ｓｅｒペプチドは、表面レセプターに不可逆的に結合し、そして細胞を加速した増殖へと移行させるために、著しく短い時間（２分間）を明らかに必要とする。必要とされる時間は、他の公知の腎臓細胞マイトジェンと等価であるかまたはそれらよりも短い（ＥＧＦ、４分間；バソプレシン、２分間；低ナトリウム増殖因子、５分間；高カルシウム培地、６分間；アデノシン一リン酸、１４時間）。
【００９９】
（ＷＧＦの精製）
１リットルのＷＧＦ馴化培地を調製するためのプロトコルは、本明細書中に記載される。ＷＧＦタンパク質の通常の収量は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびアミノ酸組成分析により評価した場合、１リットルあたり約５０ｎｇである。
【０１００】
馴化培地調製：ＢＳＣ−１細胞の１００個の培養物を、１０ｃｍの直径を有するプラスチック組織培養皿（Ｎｕｎｃ）において、２％仔ウシ血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地中でコンフルエント（６〜８×１０6細胞）になるまで増殖させる。培地を吸引し、そして培養物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）溶液でリンスして、培地および血清を除去する。次いで、１０ｍｌのＰＢＳを、創傷に備えて各皿に添加する。細胞単層に対して計５回の創傷を、２００μＬプラスチックピペットチップで縁から縁まで皿の表面を横切って引っ掻くことにより、迅速に作製する。約１０分後（９．５分が好ましい）、馴化緩衝液をプラスチックＮａｌｇｅｎｅビーカーにデカントする。
【０１０１】
ＷＧＦの単離および精製：馴化後、プールした馴化緩衝液を滅菌濾過（ＣｏＳｔａｒ、０．２μｍ孔サイズ）して全ての砕片または脱離細胞をシラン処理した（Ａｑｕａｓｉｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）ガラスビン（Ｗｈｅａｔｏｎ）へと除去した。滅菌馴化緩衝液をダイアフィルトレーションし、脱塩し、そしてＹＭ−３０ディスクメンブレン（Ａｍｉｃｏｎ）を４℃にて用いて濃縮した。次いで、濃縮した物質を、室温にて濾過滅菌（Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＡ、０．４５Ｆｍ）し、凍結乾燥してさらに容量を減少させ、１ｍｌヘパリンアフィニティーカートリッジにロードし、そして１Ｍ  ＮａＣｌの溶液で溶出する。このカートリッジを最初に１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中で０．４Ｍ  ＮａＣｌに曝露して非マイトジェン物質を溶出させ；次いで１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液を用いてカートリッジからマイトジェン活性を溶出させる。溶出物を脱塩し、そしてこの容量を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて遠心分離（７５００ｇで４℃にて２時間）することにより減少させる。濃縮物（３００〜４００μｌ）をＣ4逆相ＨＰＬＣカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）（Ｖｙｄａｃ）にロードし、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、５０分間のトリフルオロ酢酸（０．１％）（ＴＦＡ）中のアセトニトリル勾配（１〜８０％）を用いて溶出する。マイトジェン活性を示す少なくとも５個の異なるタンパク質ピーク（２１４ｎｍの吸光度によりモニタリングされる）が容易に同定され得る。しかし、約５５％アセトニトリルで溶出するピークは、慣用的に、大部分のマイトジェン活性および異なる単離株における再現性を示す。この溶出物を、シラン処理したＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに手動で回収し、Ｃ8カラム（Ｖｙｄａｃ）にロードし、そして上記と同じアセトニトリル／ＴＦＡ勾配を用いて再度クロマトグラフィーにかける。再度、マイトジェン活性は、約５５％アセトニトリルに溶出する。増殖促進活性および総タンパク質含量を、精製プロセスの間に各工程でモニタリングする。処理した馴化緩衝液のリットル数に依存して、２回目にＣ8カラムにかけて目的のピークの分離を最適化することが必要であり得る。次いで、この生物活性物質は、減圧濃縮機（Ｓａｖａｎｔ）を用いて容量が減少され、続いて１２．５％  ＳＤＳゲルに電気泳動分離のためにロードされる。
【０１０２】
ＷＧＦのＭrは、その電気泳動での移動の、既知の分子サイズの標準タンパク質の移動との比較により評価される。ゲルにおける種々のタンパク質は、銀（ＢｉｏＲａｄ）で染色することにより、またはＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロッティングした後にクーマシーブルー色素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）でこのブロットを染色することにより、可視化される。通常、１より多くのバンドが現れる。どのバンドが、マイトジェン形態のＷＧＦを示すかを決定するために、非染色非還元ゲルを電気泳動後に２ｍｍ幅のフラグメントに切断し、そして各々をアセトニトリル（３％）およびウシ血清アルブミン（０．１％）を含有するＰＢＳ中で攪拌しながら室温にて１８時間溶出した。各フラグメントの溶出物を、ＢＳＣ−１細胞の培養物に添加して、細胞増殖を刺激するその能力を決定した。この実験ストラテジーは、活性なＷＧＦタンパク質は、２２および４５ｋＤａのＭrを有することを示した。
【０１０３】
ＷＧＦは、創傷後に細胞から放出されるようである；ＷＧＦは、非創傷培養物の培養培地においては出現しない。この結論を支持する証拠が、以下の実験により得られた。切屑創傷培養物からの馴化緩衝液（１５５０ｍｌ）を上記の通りに得、そして５５％アセトニトリルで溶出し、かつ増殖促進活性を示すＣ8−ＨＰＬＣピークとなり、一方、非創傷培養物に曝露し、同じ精製プロトコルに供した同じ容量（１５５０ｍｌ）の緩衝液は、このタンパク質ピークもマイトジェン活性も示さなかった。
【０１０４】
（創傷増殖因子のＮＨ2末端配列）
ＷＧＦのＮＨ2末端のアミノ酸配列を得るために、２．５μｇのＣ8精製タンパク質を得て、そして１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供した。精製タンパク質の相対電気泳動移動度を、既知の分子サイズの標準タンパク質の相対電気泳動移動度に対して比較した。ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロッティングし、そしてクーマシーブルー染料で染色した後、４５ｋＤａおよび２２ｋＤａのサイズに対応する２本のバンドが見られた。続いてこれらをブロットから切り出し、次いでＡＢＩ微量配列決定機にロードした。微量配列決定の結果を、従来の略号を用いて表し、そしてアミノ酸の記号を以下に列挙する：
【０１０５】
【化２】
2010150277.tif 000006
ＷＧＦのアミノ末端配列の計４回の決定が、異なるバッチの馴化培地について行われた。４５ｋＤａタンパク質の、アミノ末端からカルボキシ末端への方向（ＮＨ2→ＣＯＯＨ）の最初の１４個のアミノ酸を以下に示し、ここで、数字は、最初のアミノ酸を番号１として用いた位置をいう：
【０１０６】
【化３】
2010150277.tif 000007
２２ｋＤａタンパク質の３つの異なる単離物の配列の決定は、以下の通りである：
【０１０７】
【化４】
2010150277.tif 000008
最も長いのは１６アミノ酸である。
【０１０８】
重要なことには、最初の１０アミノ酸は、４回の配列決定の各々において同一であり、このことは、２２ｋＤａタンパク質が４５ｋＤａタンパク質のフラグメントまたは分解産物であり得ることを示唆する。しかし、２２ｋＤａタンパク質と４５ｋＤａタンパク質におけるアミノ酸１２〜１４の異なる配列は、これらが２つのＷＧＦイソ型を表し得ることを示唆する。
【０１０９】
（ＷＧＦのＮＨ2末端ドメインは、腎臓上皮細胞に対してマイトジェン性である）
２２ｋＤａタンパク質の１１個のＮＨ2末端アミノ酸ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡの配列（１１マー）を用いて、分枝状リジンコアに連結した合成ペプチドを調製した。この複数抗原性ペプチド系（ＭＡＰＳ）を用いて動物を免疫して、ＷＧＦを認識するポリクローナル抗体を調製した。ＭＡＰＳタンパク質は、一方の末端が樹脂に結合し、そして他方は４つの分枝を有するポリリジン骨格を有する；各分枝は、１１マーペプチドの１つの分子に連結される。驚くべきことに、増殖促進活性について試験した場合、ＭＡＰＳペプチドは、ＢＳＣ−１株のサル腎臓上皮細胞のＤＮＡ合成および増殖を刺激した。その最大増殖促進効果は、ネイティブなＷＧＦの最大増殖促進効果に類似していた。異なる１１アミノ酸配列から調製したＭＡＰＳタンパク質、および関連の無い１６アミノ酸配列を用いて調製したＭＡＰＳタンパク質と比較した場合、ＷＧＦタンパク質に基づく配列のみがマイトジェン活性を示した。続いての実験では、１１アミノ酸ペプチドが、分枝状リジンコアの非存在下で、精製ＷＧＦタンパク質が刺激したのと同じ程度にこれらの腎臓細胞の増殖を刺激したことが示された。試験した２つの細胞型に基づいて、１１マーＷＧＦペプチドは、腎臓上皮細胞のマイトジェン活性を刺激したが、マウス３Ｔ３線維芽細胞の増殖を刺激しなかった。
【０１１０】
さらに、１１マーのペプチドおよび創傷馴化緩衝液の増殖促進効果は、相加的でなく、その１１マーのペプチドは、インタクトなＷＧＦと同じレセプターおよびシグナル伝達経路により細胞増殖を刺激することを示唆している。これらの予期されなかった結果は、他の増殖促進ドメインが、天然の４５ｋＤａタンパク質（その推定される長さは約４００アミノ酸）に含まれ得るにもかかわらず、そのＮＨ2末端の１１アミノ酸が、ＷＧＦのマイトジェンドメインを表すことを示唆する。
【０１１１】
図１は、天然の（２２ｋＤａ）アミノ末端ＷＧＦを表す合成１１マーペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡの等価的なマイトジェン用量の応答、および本発明の最も活性なヘキサペプチド合成物ＹＰＥＧＮＨ（グルタミン（Ｑ）（電荷＝０）残基のグルタミン酸（Ｅ）（電荷＝−１）での置換により天然ＷＧＦと異なる）を示す。しかし、天然の配列が、好ましい（表３を参照のこと）。「天然」の配列は、培養細胞から得られるような２２または４４ｋＤａのＷＧＦにおいて見出されるものである。そのペプチドは、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配（１−８０％）を使用したＣ18カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し、次いで組織培養培地に溶解した。
【０１１２】
ＢＳＣ−１株の非形質転換のサル腎臓上皮細胞を、１％のウシ血清および１．６μＭのビオチンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地で、ＣＯ2インキュベーターにおいて３８℃でコンフルエントに増殖した。細胞が、１シャーレにつき約１０6の密度に達したとき、使用済の培地を除去し、そして０．５％のウシ血清および異なる量のその２つのペプチドを含む新鮮な培地で置換した。４日後、各培養物中の細胞数をカウントした。各値は、３つの異なる培養物の平均値である。
【０１１３】
（ＷＧＦ由来ペプチドのマイトジェン性）
腎細胞の増殖を刺激し得た最も小さいペプチドの配列を描写するために、異なる長さの合成ペプチドを調製し（下記参照のこと）、そしてＣ18カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。マイトジェン活性を、ＢＳＣ−１細胞の培養物中において、４日間、特定の濃度（０．５〜２０μｇ／ｍｌ）のペプチドに曝露した後の細胞数をカウントすることにより評価し、そして添加したペプチドの非存在下での増殖についての結果と比較した。
【０１１４】
【化５】
2010150277.tif 000009
１１マーのように、各５つのより短いペプチド（６〜９アミノ酸長）は、最大で天然ＷＧＦと同程度（２５〜３０％）まで、腎細胞増殖を刺激した。
【０１１５】
以下のペプチド（４〜６アミノ酸長）は、ライン１の活性な１１マーと比較して、細胞増殖を刺激しないＮＨ2末端ＷＧＦのドメインを表す。
【０１１６】
【化６】
2010150277.tif 000010
その配列がＷＧＦと異なる、以下の６マーおよび７マーのペプチドもまた、細胞増殖を刺激しなかった。
【０１１７】
【化７】
2010150277.tif 000011
上記の結果は、その天然配列に基づくペプチドの最大のマイトジェン活性は、配列がＹＰＱＧＮＨである６マーまたはその等価物内に存在することを示す。なぜなら；
（１）この配列を含む、７、８、９、または１１アミノ酸長であるペプチドは、同程度まで増殖を刺激する、
（２）その６マーのＮＨ2−または−ＣＯＯＨ末端の一方から、１つのアミノ酸を欠失する各々２つの５マーは、同程度までマイトジェン性でない、
（３）ＹＰＱＧＮＨと、単一のアミノ酸でのみ異なる６マー（ＹＰＲＧＮＨ）は、同程度までマイトジェン性でない、
（４）ＹＰＱＧＮＨと、２つのアミノ酸で別の６マー（ＱＰＹＰＱＧ）は、マイトジェン性でない、および
（５）ＷＧＦにその配列が見出される４マー（ＧＮＨＥ）または無関係の配列を有する７マー（ＬＫＹＳＧＱＤ）のいずれも、マイトジェン性でない。
【０１１８】
従って、天然ＷＧＦのＮＨ2−末端は、ヘキサペプチド配列（ＮＨ2−チロシン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−ＣＯＯＨ）を含み、その配列は、ＢＳＣ−１株により例示されたように、腎上皮細胞に対してマイトジェン性である。
【０１１９】
種々の長さのペプチドはまた、そのマイトジェン性六量体配列またはその等価物が含まれる限り、本発明の範囲内である。種々の長さのペプチドはまた、個々に使用され得、または特定の目的のために種々の方法で結合される得る。これらの可能性は、以下を含む（ＮＨ2末端−−−−−＞ＣＯＯＨ末端）：
【０１２０】
【化８】
2010150277.tif 000012
これらのペプチドは、いずれかの末端または両端（ＮＨ2−および−ＣＯＯＨ）で、他のアミノ酸配列に結合され得る。アミノ末端のＹは、システインにより置換され得る。
【０１２１】
（天然および改変ＷＧＦ由来アミノ末端ペプチドの特徴付け）
天然ＷＧＦのアミノ末端におけるアミノ酸の置換が同定され、それはペプチドのマイトジェン活性を変化し得た。この試みの目的は、その症候群の動物モデルにおける急性腎不全の処置での、そのペプチドの効力の研究における使用のための、そのペプチドの増殖促進活性を最大化することであった。そのストラテジーは、構造的に関係するアミノ酸を、天然ＷＧＦ配列に見出されるアミノ酸に対して置換することにより、異なるペプチドを設計し、次いで化学合成することであった。次いで目的のそのペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の１−８０％のアセトニトリル勾配を使用した本明細書に記載の逆相Ｃ18カラムＨＰＬＣで精製した。次いで、その精製ペプチドを、凍結乾燥してアセトニトリルおよびＴＦＡを除去し、そして凍結乾燥粉末を秤量し、緩衝液中に溶解し、そして培養培地に添加して、本明細書に記載のサル腎臓上皮細胞の増殖に対するその効果を測定した。異なるペプチドの相対効力を比較するために、４日後、培養物中で２５〜３０％まで最大に増殖を刺激したそれらの分子のみをさらに、それらの濃度依存性を定義することにより分析した。Ｋ1/2と称する値を使用した。この用語は、本明細書において、その増殖刺激効果が、最大増殖が観察される濃度における２分の１である、ペプチド濃度（マイクロモル（μＭ））として定義される。値が低いほど、そのペプチドのマイトジェン効力がより高い。
【０１２２】
【表３】
2010150277.tif 000013
太字はアミノ酸置換を指すのに対し、大文字で示されるアミノ酸は、天然ＷＧＦにおいて存在するものである。
【０１２３】
表３に要約される結果は、一般に、最も強力なものは、配列ＹＰＱＧＮＨを含む、より長いペプチド（４０マー＞２８マー＞１４マー＞１１マー＞６マー）であることを示す。試験された最も長い、非反復の、最も強力なペプチドは、１４マーのＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧである（すなわち、それは最も小さいＫ1/2である０．１２６μＭを有する）。そのペプチドの添加に先立った、グルコサミノグリカン、硫酸ケラタン（２μｇ／ｍｌ）への、その細胞の５分間の曝露は、その効力を増強し（Ｋ1/2＝０．０６７μＭ）、そしてヘパリン（１μｇ／ｍｌ）は、さらにより効果的である（０．０４０μＭ）ことに注目べきである。ラットの研究において、その１４マーはまた、ＡＲＦが塩化水銀により誘導されたラットの生存を、増強することにおいて効果的である。１２位にセリンを有するその１４マーは、６位にグルタミン酸を有する１１マーより効果的である。
【０１２４】
１４マーＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＡＹＧの長さは、そのペプチドの三次元構造に対する関心を誘発する。円偏光二色性法を実行し、βプリーツシート高次構造と一貫するスペクトルが明らかにされた。
【０１２５】
１１マーペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡ（天然ＷＧＦ配列）の効力が、単一の置換（天然グルタミン（Ｑ）のグルタミン酸（Ｅ）での置換）を有する合成ヘキサペプチドＹＰＥＧＮＨ（Ｋ1/2〜０．３μＭ）と類似することは興味深いことである。従って、いくつかの置換は、少なくとも効果的なマイトジェン活性を有するペプチド産生する。しかし、６マーの配列の特定の保存的改変は、効力の大幅な減少を生じる（チロシン（Ｙ）残基のフェニルアラニン（Ｆ）での置換、アスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）もしくはリジン（Ｋ）での置換、またはカルボキシ末端のアミド化）。
【０１２６】
ＷＧＦおよびそのペプチドが、細胞表面レセプター機構を経て、それらのマイトジェン効果を及ぼすという仮説を支持する証拠を、ヘキサペプチドＹＰＱＧＮＨのいずれかの末端において、１つのアミノ酸を欠失した五量体ペプチドが、インタクトな六量体の増殖効果をブロックすることを示すことにより得た。これらの研究において、五量体ＰＱＧＮＨまたはＹＰＱＧＮを合成し、ＨＰＬＣにより精製し、次いで、増殖促進活性についてアッセイした。いずれもマイトジェン的でなかった。いずれかの五量体を、細胞培養培地に添加した場合、それは、同時にまたは後で添加された六量体ＹＰＱＧＮＨの細胞増殖を刺激する能力をブロックした。これらの観察は、その五量体およびヘキサペプチドは、同じ原形質膜上の結合部位／レセプターに対して競合していることを示唆する。その五量体はマイトジェン性でないため、それらがその部位に結合する場合、増殖は観察されない。五量体がその部位に結合した後に、それらは、ヘキサペプチドが膜に対するアクセスを獲得することを妨げるようである。
【０１２７】
ヘキサペプチドＹＰＱＧＮＨまたはＹＰＥＧＮＨが、腎上皮細胞に対する高い効力を有することのさらなる証拠を、加速された増殖への不可逆的関連のための、ペプチドと細胞との間の相互作用のために必要とされる時間を定義することにより得た。これら実験において、目的のペプチドを含む溶液を、細胞単膜に添加し、次いでその後、培養培地を特定の時間で吸引した。次いで、そのペプチドを含まない新鮮な培地を添加し、そして４日後に細胞数をカウントした。そのペプチドは、早い時間（０．５、１、または１．５分）で、増殖を刺激することなく細胞を完全に洗い落とし得たのに対して、その細胞の、ペプチドＹＰＱＧＮＨでの２分間の接触は、最大の増殖促進活性を生じた。その細胞を、ペプチドを添加する前に、硫酸ケラタン（２μｇ／ｍｌ）に５分間曝露した場合、最大のマイトジェン効果が観察されるために、ただ１分の曝露だけが必要である。同様の結果は、ペプチドＹＰＥＧＮＨを試験した場合に得られた；３分の曝露が、最大の増殖応答を得るために十分であるが、細胞を硫酸ケラタンで前処理した場合は、わずか１．５分である。従って、硫酸ケラタンは、天然ＷＧＦタンパク質のみならずＷＧＦ由来のペプチドのマイトジェン能力も同様に増強する。
【０１２８】
ＮＣＢＩにより操作される、７つのタンパク質配列のデータベース（Ｂｌａｓｔｅｒ）の検索により、ＷＧＦのＮＨ2末端配列が新規であり、そして下記に示すように、最初の位置としてＮＨ2末端の最初のアミノ酸を用いると、２つの公知のマイトジェン性タンパク質、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）およびボンベシンと、限られた相同性を有することが明らかになった。
【０１２９】
【化９】
2010150277.tif 000014
太字のアミノ酸の記号は、異なるタンパク質間の同一性を示す。
【０１３０】
ＷＧＦのＮＨ2末端の１４アミノ酸とボンベシン分子との間のアライメントは、継続的なＧＮ残基（ＷＧＦの１４アミノ酸活性ペプチドにおけるアミノ酸＃７、８；ボンベシンにおける＃５、６）、およびＡ残基（ＷＧＦにおけるアミノ酸＃１１；ボンベシンにおける＃９）に限定される。以前の報告（Ｂｒｏｃｃａｒｄｏら、１９７５；およびＨｅｉｍｂｒｏｏｋら、１９８８）では、ボンベシンおよびＧＲＰの７つのＣＯＯＨ末端アミノ酸は、同一であり（ＷＡＶＧＨＬＭ−アミド）、そしてまたこれら２つのタンパク質におけるマイトジェン活性の座位であることが示されている。アミノ酸のこの配列を含む合成ペプチドは、ＢＳＣ−１細胞に対してマイトジェン性であるが、そのＫ1/2は、〜１０μＭである。重要なことに、これらの７つのＣＯＯＨ末端アミノ酸のマイトジェン配列は、ＷＧＦのＮＨ2末端のマイトジェン性の１６アミノ酸において見出されない。
【０１３１】
ＷＧＦと他の公知の配列との間の機能的差異は、ＧＲＰ由来のヘキサペプチドＹＰＲＧＮＨが、腎上皮細胞に対して、せいぜい境界上のマイトジェン性（１０％の刺激）であり、そして線維芽細胞のマイトジェンの刺激に必要であると報告されていないのに対して、ヘキサペプチドＹＰＱＧＮＨが、腎上皮細胞に対してマイトジェン性であることを含む。
【０１３２】
ＷＧＦのＮＨ2末端に由来するマイトジェン性ヘキサペプチド、ＹＰＱＧＮＨ（ＷＧＦ配列におけるアミノ酸＃４〜９）が、ヒトおよびブタＧＲＰ，ＹＰＲＧＮＨ（アミノ酸＃１５〜２０）のヘキサペプチド配列（マイトジェン性であることが公知でないドメイン）から、ただ単一のアミノ酸（Ｑ−−＞Ｒ）において異なることは興味深いことである（Ｈｅｉｍｂｒｏｏｋら、１９８８）。この位置でのアミノ酸置換を作製することの以前の教示もしくは示唆、ＷＧＦ内の特定の置換を作製することの示唆、または置換がＷＧＦでのマイトジェン性刺激活性を与えるというような任意の示唆は存在しない。
【０１３３】
これらの結果は、ＷＧＦ由来のヘキサペプチドＹＰＱＧＮＨが、腎上皮細胞に対して新規なマイトジェン因子であることを示す。
【０１３４】
（ＷＧＦ由来のヘキサペプチドにおけるチロシンのシステインでの置換はマイトジェン活性を保存する）
マイトジェン活性を有する最も短いペプチドは、配列ＮＨ2−チロシン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−ＣＯＯＨ（ＹＰＱＧＮＨ）を有することが初期に見出された。このヘキサペプチドは、ＷＧＦのアミノ末端の位置＃４〜＃９におけるアミノ酸を表す。ミクロシークエンシングによる、各２つのＷＧＦイソ型の位置＃４において同定されたアミノ酸は、システイン（Ｃ）またはチロシン（Ｙ）残基であり得た。
【０１３５】
ＹＰＱＧＮＨペプチドが、その増殖刺激効果を及ぼす最大半減濃度（Ｋ1/2）は、０．３５μＭである（表３）。別の合成六量体（ＹＰＥＧＮＨ）（グルタミン酸（Ｅ）が、天然ＷＧＦに見出されるグルタミン（Ｑ）に対して置換された）は、わずかにより強力であり、そのＫ1/2は、０．３０μＭである。システインが、マイトジェン性のペプチドにおいてチロシンを置換し得たか否かを決定するために、ヘキサペプチドＣＰＥＧＮＨを合成した。このシステイン含有ペプチドは、実際にマイトジェン性であり、そしてその効力（Ｋ1/2）は、チロシン含有ペプチドのそれと同等であった。この位置のアミノ酸が、最大増殖促進活性のためにチロシンまたはシステインのいずれかであり得るという主張に対する支持を、２つのさらなる実験の結果を分析することにより得た。最初の１つにおいて、ホスホチロシン（Ｐｉ−Ｙ）残基を含む六量体ペプチドを、配列Ｐｉ−ＹＰＱＧＮＨを用いて合成した。第二の実験において、チロシン残基をフェニルアラニン（Ｆ）に置換したペプチドを合成し、ＦＰＥＧＮＨを調製した。重要なことに、フェニルアラニンでのチロシンの置換はそのペプチドのマイトジェン効力を約９分の１に減少した（ＦＰＥＧＮＨに対するＫ1/2＝２．７５μＭ；ＹＰＥＧＮＨに対するＫ1/2＝０．３０μＭ）のに対して、Ｐｉ−ＹＰＱＧＮＨに対するＫ1/2は、ＹＰＱＧＮＨに対するそれ（０．３５μＭ）と同様であった。従って、ペプチドのマイトジェン活性は、チロシンの水酸基をリン酸化した場合には有意に影響されないが、水酸機が存在しない場合（チロシンに対するフェニルアラニンの置換）には劇的に減少する。
【０１３６】
これらの観察は、アミノ酸残基内のチロシンのベンゼン環よりむしろメルカプト基または水酸基が、このヘキサペプチドにマイトジェン性を与えることを示唆する。この分析は、水酸基含有の、天然に存在するアミノ酸であるセリンまたはトレオニンでの、チロシンまたはシステインの置換がまた、増殖促進ヘキサペプチドを産生し得ることを予想する。
【０１３７】
要するに、本明細書に記載される異なる長さ（例えば、６〜４０残基）のＷＧＦ由来の合成ペプチドの、その六量体カセット（Ｙ／ＣＰＱＧＮＨ）におけるチロシンまたはシステイン残基は、腎臓上皮細胞におけるマイトジェン機能を十分に支持し得る。これら２つのアミノ酸または他（表２）のいずれかを含む、等価的な位置での有糸分裂活性を増加する合成ペプチドは、急性腎不全後の生存を改善し、そして機能回復を促進するために産生され、そして使用され得る。
【０１３８】
（創傷増殖因子のＮＨ2末端に由来するマイトジェン性ペプチドのさらなる特徴付け）
前節で議論されたように、切屑創傷されたサル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−１株）の馴化培地からの創傷増殖因子（ＷＧＦ）の精製により、２つのマイトジェン性タンパク質（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上の２２ｋＤａおよび４５ｋＤａ）が明らかになった。これらのタンパク質のＮＨ2末端のミクロシーケンスは、各々の最初の１０アミノ酸が同一であったことから、それらはイソ型であり得ることを示唆した。全部で１６のアミノ酸が、２２ｋＤａイソ型のＮＨ2末端で同定され、そして４５ｋＤａイソ型に対しては、１４のアミノ酸が同定された。しかし、４５ｋＤａイソ型については、１１位でのアミノ酸は同定されず、そして１２位においては、アラニンまたはセリンが同等に指定される。４位においては、チロシンまたはシステインが、同等に指定される。
【０１３９】
【化１０】
2010150277.tif 000015
種々の長さのペプチドは、マイトジェン性六量体配列ＮＨ2−チロシン−プロリン−グルタミン−グリシン−アスパラギン−ヒスチジン−ＣＯＯＨ（ＹＰＱＧＮＨ）が含まれる限り、本発明の範囲内である。
【０１４０】
アミノ酸置換は、天然ＷＧＦのアミノ末端において同定され、そのＷＧＦは、この症候群のラットモデルでの急性腎不全の処置における、その効力の研究においての使用のためのペプチドの増殖促進活性を最大化し得た。そのストラテジーは、構造的に関連するアミノ酸で、天然ＷＧＦ配列に見出されるアミノ酸を置換することにより、様々なペプチドを設計し、さらに化学合成することであった。
【０１４１】
次いで、目的のペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の１−８０％のアセトニトリル勾配を使用した逆相Ｃ18ＨＰＬＣカラムで精製した。次いで、その精製ペプチドを、凍結乾燥して、アセトニトリルおよびＴＦＡを除去し、そしてその凍結乾燥粉末を秤量し、緩衝液中に溶解し、そして組織培養培地に添加して、サル腎臓上皮細胞の増殖に対するその効果を測定した。
【０１４２】
異なるペプチドの相対効力を比較するために、４日後、培養物中で２５〜３０％まで最大に増殖を刺激した分子のみをさらに、それらの濃度依存性を決定することにより分析した。Ｋ1/2と称する値を使用した。この用語は、本明細書において、その増殖刺激効果が、最大増殖が観察される濃度における２分の１である、ペプチド濃度（マイクロモル（μＭ））として定義される。値が低いほど、そのペプチドのマイトジェン効力がより高い。
【０１４３】
表３は、１２位にセリン残基を有する１４アミノ酸ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ（１４−Ｓｅｒ）（Ｋ1/2＝０．１２６μＭ）が、その位置にアラニン残基を有するＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＡＹＧ（Ｋ1/2＝０．１９９μＭ）より、強力なマイトジェン因子であることを示す。グルコサミノグリカン硫酸ケラタンを、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合、１４−Ｓｅｒのマイトジェン効力は増強された。なぜなら、そのＫ1/2は０．０６７μＭに低下したからである。さらに、１μｇ／ｍｌの濃度で添加された、グルコサミノグリカンヘパリンは、さらにより効果的であり、そのＫ1/2を０．０４０μＭまで減少させる。これらの実験において使用される最適なモル濃度、１ペプチド分子：１グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子の分子比で、硫酸ケラタンまたはヘパリンのいずれかについての細胞へ添加した。グルコサミノグリカンの刺激効果は、イオン結合を経たペプチド−ＧＡＧ複合体の形成（ペプチドの陽イオン性ヒスチジンから一方のＧＡＧの陰イオン性硫酸塩）または、水素結合（ペプチドのセリン／チロシンの水酸基からＧＡＧ炭水化物の酸素残基）により媒介される。様々な型の細胞において観察された、ヘパリンによる酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）のマイトジェン効果の増強を説明するために提唱されたように、ペプチド−ＧＡＧ複合体は、ペプチドの、細胞表面上のそのレセプターへの結合を安定化し／容易にさせ得る。６位におけるグルタミン（Ｑ）残基のグルタミン酸残基（Ｅ）での置換は、この置換ストラテジーが、６アミノ酸ペプチドＹＰＱＧＮＨについてのＫ1/2を減少し（Ｋ1/2＝０．３５２μＭからＫ1/2＝０．３０１μＭ）、そして１１アミノ酸ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡついてのＫ1/2（Ｋ1/2＝０．２６０μＭからＫ1/2＝０．２０６μＭ）を減少するにもかかわらず、１４−Ｓｅｒペプチドのマイトジェン効力を変化しなかった（Ｋ1/2＝０．１２８μＭ）。
【０１４４】
１１アミノ酸長のＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡ（Ｋ1/2＝０．２６μＭ）、および６アミノ酸ＹＰＱＧＮＨ（Ｋ1/2＝０．３５μＭ）のようなより短いペプチドは、各々が１４アミノ酸ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ（Ｋ1/2＝０．１２６μＭ）のＳＹＧ末端アミノ酸を欠き、そしてマイトジェン因子としてさほど強力ではない。このＳＹＧ配列を含む１１アミノ酸ペプチドが最大限の有糸分裂誘発に必要とされるかどうかを決定するために、配列ＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧを有する１１マーペプチドを合成、精製し、次いで活性についてアッセイした。興味深いことに、このペプチドのＫ1/2は、ヘパリンの非存在下または存在下で０．１６６μＭであった。このことは、１４アミノ酸完全長は、最大限のマイトジェン因子効果に必要とされることを示している。
【０１４５】
１４−セリンペプチドを伸長することがマイトジェン的な効力を増加するかどうかを決定するために、配列ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ（２８マー）を有するこのペプチドの二量体を合成、精製し、そして増殖促進活性についてアッセイした。２８マーのＫ1/2は、０．０６７μＭであった。このことは、このペプチドは、Ｋ1/2が０．１２６μＭの１４マーの２倍の効力を有することを示している（表３）。グリコサミノグリカンケラタン硫酸塩の存在下での１４セリンのＫ1/2（０．０６７μＭ）（表３）が、２８マーのＫ1/2と同一であるため、ペプチドの長さの増加は、マイトジェン的な効力を増加する機構のみではない。
【０１４６】
最も長い公知のＷＧＦ配列を使用して合成したペプチド（２２ｋＤａの１６アミノ酸のアイソフォーム、ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳＦ）はまた、そのマイトジェン的な活性について試験された（Ｋ1/2＝０．２１８μＭ）。このペプチドは、４５ｋＤａのアイソフォームのＮＨ2末端に由来する１４アミノ酸ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧほど強力ではなかった（表３）。
【０１４７】
最終的に、４０アミノ酸ペプチドを合成した。このペプチドは、ＷＧＦの２２ｋＤａおよび４５ｋＤａアイソフォームにおいて同一な、第１の１０アミノ酸の四量体である。これはまだ同定されていない、最も強力なＷＧＦペプチドで、Ｋ1/2＝０．０１２μＭを有する。増強されたマイトジェン的な強度はおそらく、その相対的に長い長さが、イオン性または疎水性の相互作用、および／または水素結合による細胞表面レセプター部位でのリガンド結合を安定化し得ることに関連する。究極的に、このペプチドは、その強力な効力ゆえに、臨床的条件下で最も効果的なＷＧＦ由来のペプチドを立証し得る。ヘパリンの添加は、４０マーのＫ1/2を０．００５１μＭに減少させ、このことはまだ同定されていない最も効果的なＷＧＦ由来のペプチドを作製することに注目のこと。
【０１４８】
１４アミノ酸ペプチド（１４−セリン）は、高いマイトジェン的な効力および相対的に短い長さであるため、このペプチドを、塩化第二水銀に誘導された急性腎不全を有するラットの処置に使用するために選択した。
【０１４９】
（ＷＧＦに由来するペプチドに対する抗体）
ＷＧＦのＮＨ2末端の１１アミノ酸を使用して、２つの異なる抱合されたペプチド抗原を調製した。１つは上述した、１１マーペプチドが分枝したポリリジンバックボーンに連結されたＭＡＰＳタンパク質で、そして他方は、１１マーがキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に化学的に結合された抱合体であった。ＭＡＰＳタンパク質およびＫＬＨ−抱合体を使用して、ウサギ、ニワトリ、およびヒツジを免疫した。これらのストラテジーに起因するこの抗体は、急性または慢性腎疾患、および腎細胞ガンを有する患者の尿、血清、および組織においてネイティブなＷＧＦタンパク質を検出するために役立つ。この抗体はまた、λｇｔ１１における腎臓上皮細胞ｃＤＮＡライブラリーをイムノスクリーニングすることによって、ＷＧＦをコードするｃＤＮＡクローンを得るために使用され得る。
【０１５０】
ペプチドの免疫原性の欠損は、急性腎不全のような腎疾患の処置においてその臨床的な有用性を支持する。
【０１５１】
（組換え遺伝学的方法によるＷＧＦの産生）
完全長のクローンをコードするヌクレオチド配列のＷＧＦを発現するのに適したベクターは、タンパク質のグリコシル化が、個々のその生物学的効果に必要とされるかどうかに部分的に依存する。ＷＧＦがグリコシル化されない場合、細菌の発現系は適していると証明し得るが、炭水化物が決定的に検出され、そして完全な活性に必要とされることが示された場合、そのときはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物の発現系がより適している。
【０１５２】
合成１４マーペプチド、実際はアミノ末端の六量体さえがマイトジェン的であるため、タンパク質のグリコシル化はマイトジェン的な活性を必要としないと思われる。しかし、グリコシル化は、インビボでタンパク質の代謝回転（半減期）の調節において重要な決定要因であることを提供し得る。これは例えば、エリトロポイエチンの場合である。
【０１５３】
本発明の少なくともマイトジェン的六量体をコードするヌクレオチド配列を、調製し、適切な調節エレメントに連結し、そして発現ベクターに組み入れる。宿主細胞をベクターを使用して形質転換し、そして宿主を発現に適した状態に配置する。組換え宿主におけるＷＧＦ遺伝子または部分的なヌクレオチド配列の発現の後、組換えタンパク質を、ＷＧＦに対する抗体を適切な支持体に結合させることによって調製した抗体−アフィニティーカラムを使用して、培養培地から単離した。この調製的なストラデジーは、大量の組換えタンパク質を産生すべきである。
【０１５４】
あるいは、より簡単には、ＮＨ2末端の１４−セリン、１１アミノ酸ペプチド、ヘキサペプチドＹ／ＣＰＱＧＮＨ、または等価なマイトジェン的な効力を発現する他のペプチドの十分な量を、通常のペプチド合成によって調製し得る。組換えまたは化学合成的ストラデジーによって調製されたペプチドのマイトジェン的な効力は、ＢＳＣ−１細胞の増殖を刺激するための生成物のアリコートの能力を測定することによって評価され得る。予想される反応は、４日後のコンフルエントの培養物中の細胞数とコントロールの培養物中で観察される細胞数とを比較すると２０〜３５％増加する。
【０１５５】
組換え系によってＷＧＦを産生するための詳細な技術は、当業者に公知である。
【０１５６】
（インビトロおよびインビボのモデル）
急性腎不全のインビトロおよびインビボのモデルは、創傷修復の２つの主要な生物学的特徴、細胞移動および細胞増殖を研究するために有用である。これらのモデルは、ＷＧＦおよび本発明のペプチドの効果を分析するのに適している。
【０１５７】
ｉ．インビトロのモデル：損傷を受けた腎臓細尿管上皮を刺激するための腎臓上皮細胞の単層培養物のスクレイプ創傷（ｓｃｒａｐｅ−ｗｏｕｎｄｉｎｇ）。
【０１５８】
このモデルでは、高密度、静止状態のサル腎臓上皮単層培養物（ＢＢＣ−１株）を、細尿管ネクローシス後の細胞損失の効果を刺激するための単層領域に限定される、機械的にこすり取ることによって傷つける。剥皮された領域に移動する細胞の数を測定した（ＫａｒｔｈａおよびＴｏｂａｃｋ、１９９２）。細胞移動は、細胞増殖と無関係であることを見出したが、両方の過程はこの実験的調製において研究され得た。
【０１５９】
このモデルは、腎臓上皮細胞移動の動態学の研究、ならびにその発現が創傷後に誘導または抑制される遺伝子の同定に有用である。ＷＧＦの生物学的特徴および効力は、この系を使用する研究に適している。
【０１６０】
ｉｉ．インビボのモデル：ラットにおける急性腎不全（ＡＲＦ）の塩化第二水銀（腎毒素の）および腎臓茎状クランプ（ｒｅｎａｌ  ｐｅｄｉｃｌｅ  ｃｌａｍｐｉｎｇ）（虚血性の）モデル。
【０１６１】
これらのモデルの系を使用する以前の研究は、ＡＲＦ症候群の臨床的、組織学的、生化学的、および機能的な相関関係を特徴付けてきた。必須アミノ酸および非必須アミノ酸の混合物の注入は、ラット腎臓組織の再生においてホスファチジルコリンおよびタンパク質の合成を刺激し、そして塩化第二水銀の静脈内投与後の腎機能障害レベルを減少させることを実証した（Ｔｏｂａｃｋ、１９８０）。これらの研究は、損傷した腎臓の生化学的および機能的な修復は、未処置の動物において適切ではなく、そしてグルコースを有する外因性アミノ酸の供給は回復を早め得ることを示した。ＡＦＲ後の再生を増強するＷＧＦの能力は、ヒトＡＲＦの腎毒素および虚血性のモデルの両方において研究がなされている。
【０１６２】
異常な腎臓の機能および構造の発症、その過程、および引き続く回復を明確にすることは重要である。ヒトにおいて、ラットにおいてと同様に、ＡＲＦの間の腎機能は、血清クレアチニンおよび血液尿素窒素（ＢＵＮ）の濃度を毎日測定することによってモニターされる。これらの測定は、腎臓の主要な機能の１つである糸球体濾過の推定値を提供する。クレアチニンは、クレアチンリン酸の代謝回転の結果として絶えず放出される筋肉から血清に入るのに対し、ＢＵＮは全身体のタンパク質代謝回転の最終産物である。両方の分子は血液への進路を作製し、そしてそれらは微小なサイズであるため尿中に排出される。従って、ＡＲＦにおいてそれらは血液中に蓄積し、そして排出されない程度は、腎臓障害の評価の指針を提供する。腎臓機能の有意な回復は、血清クレアチン濃度の減少によって示される。
【０１６３】
（慢性腎臓疾患の処置）
糖尿病性腎症、間質性腎炎、および慢性糸球体腎炎における腎臓疾患の進行を媒介する機構は、知られていない。腎臓機能の苛烈な欠損は、この過程を遅延または逆転するための治療的なストラデジーが現時点存在しないため、米国においては、毎年何十億ドルもの費用のかかる長期的な透析処置の必要性を生じている。腎臓疾患過程の初期患者は、増殖因子治療の候補として適している。なぜなら、現在、この状態を処置するのに有用な他の代替方法が存在しないからである。本発明のＷＧＦ組成物の投与目的は、ネフロンに沿った損傷腎臓上皮細胞の回復を早めることにあり、その結果、疾患過程によって媒介される損傷の修復は腎臓機能を維持し、そして透析の必要性を未然に防ぐ。
【０１６４】
（腎臓細胞ガンの処置）
腎臓細胞ガンはしばしば緩やかな増殖状態であり、これは身体内の離れた部位への広範な転移を招き、治療の成功を困難なものにする。放射活性ＷＧＦを使用する研究は、腎細胞のＷＧＦレセプターを同定し、そして単離することを可能にする；次いで、レセプターに対して指向される抗体を調製する。これらの抗体は、ネフロンに沿う特定の型の腎細胞のレセプターを局在化させることに役立つ。ＷＧＦレセプターの細胞型特異性に関するこの情報で武装した、目的の腎細胞型のガンを処置するためのストラデジーは、レセプターへの結合を示すＷＧＦまたは特定のＷＧＦペプチドを含み、その結果、目的の増殖細胞に抗ガン薬剤を送達するために使用され得る。このような抗ガン薬剤は、ＷＧＦ、または特定のＷＧＦペプチド、または毒素に結合されたペプチド、細胞溶解性の抗体、またはラジオアイソトープを含む。主要な腎腫瘍の処置は、器官の外科的な摘出によって実行されることが最良であろうが、ガンの転移の処置、特に小型のガンは、ＷＧＦ構造および機能の知識の使用を定式化するこれらの新規の化学療法的な薬剤の重要な標的で有り得る。
【０１６５】
（患者へのＷＧＦの送達）
患者への送達は一般的に、ガンの化学療法送達、あるいは小型の哺乳動物の実験的処置に類似した静脈内注入による。別の経路は、腎不全においてエリトロポイエチン（ＥＰＯ）を用いた貧血の治療に使用される経路であり、この経路では、ＥＰＯを皮下注射によって数日ごとに送達する。
【０１６６】
例えば、ＡＲＦを有する７０ｋｇの患者に対する１４−セリンペプチドの代表的な容量は、約３５ｍｇ（２００ｇの体重あたり１００μｇ）で、緩やかな静脈内注入により投与される。
【０１６７】
（ＷＧＦに対する抗体の使用による腎細胞損傷の診断）
ネイティブなＷＧＦに対する抗体を本明細書で開示されるようにして調製し、そして尿および血液における増殖因子の濃度を決定するために使用する。ネフロンに沿う異なる型の腎細胞におけるＷＧＦの分布を決定する。血液または尿のいずれか、あるいは両方における増殖因子濃度は、腎臓損傷の結果として増加し得る。増殖因子が上皮増殖因子として尿中に排出された場合、腎臓損傷が新しい因子の尿排出の増加を導くことを決定することが可能であり得る。もしそうならば、ＷＧＦを検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットは、５０％以上の腎機能が失われるまで通常の臨床試験で検出されない糸球体濾過速度の低下より前に、早期腎損傷を迅速に診断するために使用される。これは特に、重篤な感染または悪性腫瘍の処置の間、腎毒性の可能性のある薬剤を受けている患者に役立つ。ＷＧＦに対する抗体は、腎損傷および新形成を有する患者の血液および尿における増殖因子の出現を検出するために設計された、診断的ＥＬＩＳＡキットに組み入れられる。
【０１６８】
（長期血液透析患者における腎臓ガンの検出）
長期血液透析を受けている患者のレムナント腎臓（ｒｅｍｎａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ）において発生する腎腺腫、嚢胞腺腫、または癌腫が、増殖因子を過剰発現し、そして尿中に排出することが見出される場合、ＥＬＩＳＡキットは、これらの障害について新しい早期検出システムを提供し得る。このような診断キットはまた、無症候性であるが危険性は高い個体において使用され得る。腎臓ガンは、腫瘍が有意な大きさに増殖するかまたは広範に転移するまで無症候性である傾向があるため、現在、早期に検出することが困難である。
【０１６９】
（増殖因子の構造および機能の操作）
増殖因子のアナログは、腎上皮細胞レセプターへの特異的な結合を最適化することによって、ＷＧＦの増殖促進効果を最大化するために開発される。細胞表面のレセプターに結合することによって、各因子の生物学的機能を阻害するインヒビターはまた、有用である。このようなインヒビターは，ＹＰＱＧＮおよびＰＱＧＮＨのようなペンタペプチドを含む。分解に対して耐性である合成産物または組換え産物の開発は、インビボでの薬理学的活性を持続する。
【０１７０】
（実施例）
以下の実施例は例示するために提供され、限定のためではない。
【０１７１】
（実施例１：１４−セリンペプチドは、腎毒素の急性腎不全の処置に効果的である）
ラットにおいて実験的に誘導される腎毒素および虚血性の急性腎臓損傷（ＡＲＦ）は、ヒトにおけるこの症候群のモデルとして長期間使用されてきた。１４−セリン（ＷＧＦ由来ＮＨ2末端ペプチド）のマイトジェン的な効果が、ＡＲＦを有する動物において治療的な薬剤として効果的であると判明するかどうか決定するために、急性細尿管ネクローシスを、塩化第二水銀（通常の生理食塩水において）の溶液を、体重１ｋｇあたり２．２５ｍｇの用量をラットの皮下に注入することによって誘導した。雄のラットの体重は実験開始時に２００〜２２５ｇであった。この用量は、予備的な実験で７日後の動物の生存率が、２５〜５０％という結果を示したため使用された。血液を尾静脈から各々の日に得、そして血清中のクレアチニン濃度を定量し、そして腎機能の指標として使用した。損傷を受けた腎臓は内因性のクレアチニンを尿中に排出できず、血液中にクレアチニンを蓄積するため、血清中のクレアチン濃度の増加は腎機能の低下の信号である。
【０１７２】
合成ペプチドＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ（１４−セリン）（滅菌した０．０１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水中に溶解される）を、生存、腎機能の回復、およびＤＮＡ合成の刺激に対するこのペプチドの効果を決定するためにラットに皮下注入した。１４−セリン、ＡＱＰＹＰＥＧＮＨＥＡＳＹＧ（１４−マー）、ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＴＳＳＳＦ（１６−マー）、ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡ（１１−マー）、およびＡＱＰＹＰＥＱＧＮＨＥＡ（１１−マー）を含む多数の異なるペプチドを調査した。異なる濃度および異なる投与時間について試験し、そして比較した。この結果は、１４−セリンが、最も効果的なＷＧＦ由来のペプチドであることを示し；塩化第二水銀誘導ＡＲＦ後の生存、および腎機能の回復を改善した。
【０１７３】
急性細尿管ネクローシスを、塩化第二水銀の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって４４匹のラットに誘導し、そして１４−セリンの単一用量を１時間後に皮下注射によって投与した。異なる量のペプチドを、結果に影響するペプチドの能力を評価するために、投与した。７日後の生存率は、０〜７５μｇペプチド（２９％）を投与したラットよりも、１００〜１５０μｇペプチド（６３％）を投与したラットの方が約２倍高かった（χ二乗、ｐ＝０．０１５）。
【０１７４】
生存および腎機能の回復に対するこのペプチドの効果を決定するために、急性細尿管ネクローシスを５９匹のラットに誘導し；塩化第二水銀の投与１時間後、２９匹に１４−セリン（１００μｇ／ラット）を皮下投与し、そして３０匹に同量の媒体を皮下投与した。塩化第二水銀に誘導された急性細尿管ネクローシスの後にＷＧＦ由来ペプチドを投与されたラットの、増加した生存（図２Ａ）および腎機能の回復（図２Ｂ）を示す。５９匹の各ラットに塩化第二水銀を皮下注射し、そして１時間後に、１００μｇのＷＧＦペプチド（１４−セリン）（ｎ＝２９ラット）あるいは媒体（ｎ＝３０ラット）を投与した。生存率は、塩化第二水銀の投与３日後という早い時期で、媒体を投与したラットよりもペプチドを投与したラットのほうがより高かった。血液を尾静脈から示された日に得て、そして血清クレアチニン濃度を測定した。クレアチニン濃度における同様の増加が、１日目に両方のグループのラットで観察された。このことは、ラットは同程度の腎機能損傷を受けていることを意味する。２、３、および４日目のペプチド処理されたラットのより低いクレアチニン濃度は、腎機能の回復が促進されたことを示している。
【０１７５】
図２Ａは、ＡＲＦ症候群の発病の後３日目にペプチドを与えられたラットの生存がビヒクルを与えられたラットの生存より有意に大きく（χ二乗検定、Ｐ＝０．０３５）、この違いは次の４日間続いたことを示す。７日目までに、ビヒクルを受容したラットは、たった２０％しか生き残らなかったが、一方ペプチドを与えられたラットは４８％生存した（χ二乗検定、Ｐ＝０．０１２）。
【０１７６】
ＡＲＦ症候群の発病中の腎臓機能の評価は、クレアチニン濃度が基底量０．５ｍｇ／ｄＬから２．３ｍｇ／ｄＬに増加した場合、１日目で機能の低下が現れた。これは、このペプチドのみで処置された動物（ｎ＝２９ラット）またはビヒクルのみ（ｎ＝３０）で処置された動物においても同様であった（図２Ｂ）。このことは、腎傷害の程度は、ペプチド処置された動物および非処置の動物両方において等しかったことを示唆する。２日目、ビヒクルを与えられた動物（ｎ＝３０）における血清クレアチニン濃度よりもペプチド処置されたラット（ｎ＝２９）における血清クレアチニン濃度の方が有意に低かった（Ｐ＝０．０３４、スチューデントｔ検定）。このことは、腎臓機能における減退が、塩化第二水銀続いてペプチドを与えられたラットにおいて、あまり重篤ではなかったことを示す。腎臓機能の有意により迅速な回復の証拠はまた、ＡＲＦの発病後３日目および４日目に現れた。血液尿素窒素の濃度が腎臓機能の指標として測定される場合、ペプチド投与の同様の有益な効果が、観察された。これらの結果は、培養における腎臓上皮細胞に対するマイトジェンであるＷＧＦペプチドが、腎臓機能の回復を促進し得、そして腎毒素ＡＲＦを有するラットの生存を高め得ることを示す。
【０１７７】
（実施例２：腎毒素ＡＲＦの誘導１６．５時間後におけるインビボでの１４−Ｓｅｒペプチドの投与）
医師は患者に急性腎不全が起こる時を正確に予測することは不可能であるため、血清クレアチニン濃度が、腎臓機能が危険かどうかを決定するために測定される。腎臓機能不全が検出された後、症状を逆転させるための処置が非常に所望される。従って、ヒトＡＲＦにおいて投与される１４−Ｓｅｒペプチドの有用性は、減退した腎臓機能が検出されている場合、有利に作用することを要求する。このペプチドは、ヒトにおけるこの症候群を擬態する条件下で腎毒素ＡＲＦの発病後ラットへ投与した場合、腎臓機能の回復の速度が増加した。腎傷害を誘導するために、各１６匹のラットに塩化第二水銀を与えた。この投与量は、血清クレアチニンの濃度を０時間での０．５ｍｇ／ｄＬから１６．５時間後には２．０ｍｇ／ｄＬまで４倍に上昇した。次いで、半数の動物にペプチドを皮下に与え（ｎ＝８）、そして残りの半数にビヒクルを皮下に与えた（ｎ＝８）。このビヒクルは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４０）中の滅菌０．０１％ウシ血清アルブミンである。この症候群の発病２日目にこのクレアチニン濃度は、ビヒクルを受容しているラット（３．９ｍｇ／ｄＬ）においてよりも、ペプチド処置したラット（３．０ｍｇ／ｄＬ）においての方が、上昇しなかった（Ｐ＝０．０４９９）。重要なことに、３日目においてクレアチニン濃度は、ペプチドを与えられた動物において２．６ｍｇ／ｄＬと衰えたが、ビヒクルのみを与えられたラットでは４．２ｍｇ／ｄＬまで上昇し続けた（Ｐ＝０．０２０）。７日目に、生存はビヒクルで処置した動物（６３％）よりペプチドで処置した動物（８８％）の方が多く現れた。
【０１７８】
従って、１４−Ｓｅｒペプチドは、腎毒素腎傷害が臨床上検出可能になった後に投与される場合、腎臓機能の回復を促進する。
【０１７９】
実験の別個のセットにおいて、１４−Ｓｅｒ（ｎ＝７）またはビヒクル（ｎ＝９）を、塩化第二水銀誘導性傷害の２４時間前、１６匹のラットに与えた。３日目に、血清クレアチニン濃度を使用して評価した腎臓機能は、ペプチドを与えられたラットにおいて有意に良くなった（Ｐ＝０．０３９）。４日目での生存は、ペプチドで処置されたラットにおいて７１％であったが、ビヒクルを与えられたラットにおいては、たった２２％であった（χ二乗検定、Ｐ＝０．０４９）。塩化第二水銀誘導性傷害の２４時間前の１４−Ｓｅｒペプチドでの処置は、１時間後に与えられた場合より、生存において有益な効果を有するようであった。しかし、この違いは、統計的有意には全く達しなかった。
【０１８０】
生存および腎臓機能に対する１４−Ｓｅｒペプチドの有益な効果がペプチドのマイトジェン作用の結果であるかどうかを決定するために、ＤＮＡ合成を塩化第二水銀が与えられたラットの腎臓において測定した。ＤＮＡへ組み込まれるチミジンの非放射性アナログである、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、核を標識化するために使用した。ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体およびジアミドベジデン（ｄｉａｍｉｄｏｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）染色を、腎組織の組織切片において、ＤＮＡ合成下の核を検出するために使用した。ＢｒｄＵを２０％エタノールに溶解し、そして塩化第二水銀の投与２３時間後に腹腔内に注射した。１時間後、腎臓を、大動脈カテーテルを介してリン酸緩衝化生理食塩水の温かい溶液ですばやく灌流して、器官から赤血球を除去し、そして尿細管の開通性を維持した。被膜を腎臓から取り除き、次いで長手方向に二分し、そしてホルマリン中で４時間固定し、次いで７０％エタノール中で固定した。組織切片は調整され、そしてＢｒｄＵ標識化核は、上記のように検出された。
【０１８１】
塩化第二水銀を与えられていないラットの肝臓のＢｒｄＵ染色は、被膜下皮質および無糸球体（内部）皮質において高出力範囲（Ｘ４００）あたり約３つの標識化された核を示した。塩化第二水銀を与えられたラットの腎臓では、この良く特徴付けられたモデル系において期待されるように、近位ネフロンの末端部分（Ｓ3）の尿細管細胞で広範囲の壊死が観察された。壊死の程度は、ラットからラットでいくらか変化していたが、主に無糸球体皮質に限られた。塩化第二水銀を２４時間早く与えられたラットの無糸球体皮質において、非処置のコントロールラットの細胞においてより、多くの標識化細胞が見られた。また塩化第二水銀の投与の２４時間前に１４−Ｓｅｒ（１００μｇ）を与えられたラットの腎組織を調査した。この動物において、１時間のＢｒｄＵ標識化は、本明細書に記載のように塩化第二水銀投与２４時間後において実行された。顕微鏡試験により、多くのより標識化された核が尿細管細胞壊死帯に隣接して存在したことが示された。この発見は重要である。なぜならば、それは、再生細胞が有糸分裂を行い、次いで壊死帯のネフロンへ移動するよう期待される皮質のこの境界範囲において、腎毒素の傷害により不可逆的に傷ついた細胞を置換するためである。従って、この１４−Ｓｅｒペプチドは、塩化第二水銀が誘導した尿細管壊死後ネフロン再生細胞においてＤＮＡ合成を刺激するようであり、そしてこの機構によって、腎臓機能の回復が促進され、そしてＡＲＦ後の生存が改善し得た。
【０１８２】
（実施例３：虚血性急性腎不全の処置における１４−Ｓｅｒペプチドの有効性）
虚血性急性腎不全はしばしば、激しい出血、流体損失（下痢、嘔吐、利尿）、感染（敗血症）、および心不全（心筋性疾患、不整脈）の状態における低血圧により生じる。これはまた、新しい宿主への移植後、ドナーの腎臓における機能の減退を引き起こし得る。１４−Ｓｅｒペプチドが虚血性ＡＲＦを有する動物に治療的薬剤として適するかどうかを決定するために、本実験の開始時に体重２００〜２２５グラムの雄のラットを使用した。動物は初め、感覚脱失を誘導するためにペントバルビタール（１２．５ｍｇ／ラット１００グラム）を皮下に与えられた。次いで皮膚は剃られ、そして右側腹部、次いで左側腹部が小さく切開され、腎臓が曝された。シュヴァルツ外科手術用鉗子を各腎茎（尿管、動脈、静脈）に配置して腎臓の血流を欠乏させ、急性虚血症腎不全を誘導した。約４５分後、この鉗子を取り除き、傷害の腎臓へ血液が再び流れるようにし、そして金属皮膚クリップを使用して、皮膚の切開を閉じた。これは、本明細書中に記載されるように、確立された実験的ＡＲＦのモデルである。１時間後、この２つの鉗子を取り除き、各ラットはビヒクル（リン酸緩衝化生理食塩水中０．０１％ウシ血清アルブミン）中の１４−Ｓｅｒペプチド（ＡＱＰＹＰＱＧＮＨＥＡＳＹＧ）（１００μｇ）またはビヒクルのみ（これらは首のうなじに皮下注射した）のいずれかを受容した。
【０１８３】
生存および腎臓機能の回復に対するこのペプチドの影響を確認するために、両側の腎動脈クランピングを使用して、２９ラットにおける虚血性ＡＲＦを誘導し得た。ＷＧＦ誘導ペプチド（１４−Ｓｅｒ、１００μｇ）を、１４動物のそれぞれに、４５分間虚血症傷害が終わった１時間後、皮下に投与した。；１５ラットは、等量のビヒクルを受容した。生存は、虚血症ＡＲＦの誘導後６日目に、ビヒクルを受容する動物（６７％）よりも、このペプチドを与えられたラットにおいて（９３％）大きいことを示した（χ二乗検定、Ｐ＝０．０８２）（図３Ａ）。血液は、図に示された日数で尾静脈から得、そして血清クレアチニン濃度を測定した。ペプチド処置したラットの腎臓機能の加速的回復は、ＡＲＦ症候群の１、２、３および４日目により低い血清クレアチニン濃度によって明らかにされた。１日目までに、クレアチニン濃度は、ビヒクルが与えられたラット（ｎ＝１５ラット）においてその基底量０．５ｍｇ／ｄＬから３．８ｍｇ／ｄＬまで上昇したが、ペプチド処置した動物（ｎ＝１４）では、３．４ｍｇ／ｄＬという有意により低い値に達した（Ｐ＝０．０３２、スチューデントｔ検定）（図３Ｂ）。クレアチニン濃度は、２日目（Ｐ＝０．０１５）および３日目（Ｐ＝０．０１４）に、ビヒクルを受容したラットよりペプチド処置をした動物の方が、より低かった。４日目までに、クレアチニン濃度は、ペプチド処置したラットにおいて段々と２．２ｍｇ／ｄＬの値に落ちたが、一方、ビヒクルを与えられた動物において、クレアチニン濃度は、２倍高い値の４．４ｍｇ／ｄＬまで増加した（Ｐ＝０．０１１）。従って、ＡＲＦ症候群の最初の４日間に、腎臓機能はビヒクルを与えられた動物においては、いくらか減少したままであったが、ペプチド処置されたラットは迅速に回復した。
【０１８４】
要約すると、虚血性または腎毒性による腎臓傷害のいずれかを有するラットへ投与した１４−Ｓｅｒ  ＷＧＦ由来ペプチドは、生存を高め、そして急性の腎不全症候群からの回復を促進する。
【０１８５】
（実施例４：腎毒性急性腎不全症候群の１１マーＷＧＦ由来ペプチド処理により達成される生存の向上）
実験的なＡＲＦは、塩化第二水銀の皮下への注射によりラットで誘導された。ＡＱＰＹＰＥＧＮＨＥＡ合成ペプチド（滅菌した０．０１％ウシ血清アルブミンおよびＰＢＳに溶解）は、ＡＲＦ症候群からの生存に対する有利な効果を実証するために、塩化第二水銀を与えてから２時間後にラットに皮下注射された。ある実験において、全てで１７匹のラットに塩化第二水銀の用量を注射し、これらは、上述のようなＡＲＦの誘導を示した。次いで、異なる量のペプチド（培養下において腎臓細胞の成長を刺激することが公知である）を、結果を向上させる能力を評価するために、１時間後に動物に注射した。３日後、生理食塩水のみを与えた５匹中５匹の動物、および５０μｇのペプチドを与えた３匹中３匹のラットが、死亡した。逆に、１００μｇのペプチドを与えた３匹中２匹のラットは生き残り、同様に２００μｇのペプチドを与えた６匹中５匹も生き残った。要約すると、１００〜２００μｇのペプチドを与えた９匹中７匹のラット（７８％）は、生き残ったが、５０μｇまでのペプチドを与えた、８匹全てのラット（０％）が生き残らなかった（カイ２乗、Ｐ＝０．０３２）。従って、１１マーＷＧＦペプチドは、腎毒性ＡＲＦにおける生存を向上させた。
【０１８６】
（実施例５：腎臓修復における特定のＷＧＦ由来ペプチドの効果）
さらに、特定のＷＧＦ由来ペプチドの投与は、腎臓構造の修復を促進する。腎臓の成長生理学および病理学の標準的なアッセイを、ＷＧＦペプチドの成長促進（マイトジェン的な）効果が、組織培養において示されたように、細胞分裂のための調製において、ＤＮＡの合成を行うために増加した腎臓細胞数を刺激することを実証するために用いる。
【０１８７】
最初に、塩化第二水銀誘導ＡＲＦを有するラットから得た腎臓組織の切片を調製し、そしてＷＧＦペプチドを与えられた動物および生理食塩水ビヒクルのみを与えられた動物における、腎傷害および修復の程度を比較するために光学顕微鏡下において、観察した。ＷＧＦの修復に対する効果の別の測定は、腎臓組織の詳細な顕微鏡観察にもとづいた組織病理学的な評価である。ＡＲＦの特有の特徴および修復を等級づける得点付けシステムを、ＷＧＦ処理を行なった、または行なっていないラットからの腎臓組織の評価および比較に用いる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９４）。
【０１８８】
方法論的に考慮すべき事項に依存して、放射活性チミジンを、ＡＲＦ後の腎臓ＤＮＡ合成を刺激するＷＧＦペプチドの能力を測定するために用い得る。これらの実験において放射活性チミジンを、死亡１時間前に腹腔内に注入し、そしてその腎臓ＤＮＡへの組込みを、引き続き組織からのＤＮＡ抽出により決定し、次いで化学的なアッセイによりＤＮＡの量を測定し、そしてシンチレーションによるその放射活性をカウントする。オートラジオグラムもまた調製され得、そして腎臓組織内の細胞に、放射活性チミジンが組込まれたＤＮＡを有することを決定するために用いられ得る。参照した全ての技術は、当業者に公知である（Ｃｏｉｍｂｒａら、１９９０）。
【０１８９】
（実施例６：ＴＧＦ−β２およびＹＰＱＧＮペプチドによるＷＧＦ由来ペプチドマイトジェンの阻害）
腎臓細胞成長制御での１４−Ｓｅｒペプチドの役割をよりよく理解するために、マイトジェン効果を阻害し得る薬剤について研究を行った。
【０１９０】
トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β２は、培養液中で増殖を制限する、ＢＳＣ-1細胞によって分泌される自己分泌増殖インヒビターである。外因性ＴＧＦ−β２を、１４−Ｓｅｒの成長促進効果を阻害するその能力を決定するために培養培地に加えた。１ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−β２は、１４−Ｓｅｒにより誘導される成長への２５％の刺激を無効にするのに十分であった。２ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−β２で、成長が、１４−Ｓｅｒの存在または不在においても３０％阻害され、１０ｎｇ／ｍｌでは、６０％が阻害された。６ｎｇ／ｍｌの濃度のＡＧＦ−β２において、５μｇ／ｍｌまでの外因性の１４−Ｓｅｒは、成長阻害を逆転させない。
【０１９１】
ＴＧＦ−β２は、種々のマイトジェンにより誘導される増殖を阻害するため、より特異的なインヒビターが求められてきた。以前に、５アミノ酸のＷＧＦ由来ペプチドＹＰＱＧＮおよびＰＱＧＮＨの研究が、６アミノ酸ペプチドＹＰＱＧＮＨのマイトジェン効果を阻害することを示した。これらのペンタペプチドは、細胞に加えた場合、成長に変化を起こさなかった。細胞を、ペンタペプチドＹＰＱＧＮと共に、３０分間プレインキュベ−トした。次いで、培養培地を吸引し、単層をリンスし、新鮮な培養培地を加え、そして４日後に、細胞数を数えた。細胞とＹＰＱＧＮのプレインキュベーションは、６アミノ酸ペプチドのマイトジェン効果を阻害した。さらに、ＹＰＱＧＮとの１０分または３０分のプレインキュベーションは、以下のそれぞれのペプチドの増殖促進効果を完全にブロックする：ＣＰＱＧＮＨ、１４−Ｓｅｒ、２８マー（１４−Ｓｅｒ  二量体）、および４０マー（表３）。重要なことには、部分的に精製されたＷｏｕｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｅｒ（ヘパリンアフィニティーカートリッジは通過させたが、ＨＰＬＣカラムはまだ通過させていない）のマイトジェン効果もまた、完全に阻害された。
【０１９２】
これらの観察は、天然のＷＧＦ（部分精製）および本明細書に記載された、Ｙ／ＣＰＱＧＮＨ配列を含む６〜４０アミノ酸長のＷＧＦ由来ペプチドは、ペンタペプチドＹＰＱＧＮに対して高い親和性もまた有する、同じ細胞表面レセプターに結合することを示唆する。
【０１９３】
さらなる実験を、天然のＷＧＦまたは、１４−Ｓｅｒペプチドの増殖促進効果をブロックするためのＹＰＱＧＮの能力が、特異的であるか否かを決定するために、実行した。ＢＳＣ−１の培養細胞を、ＹＰＱＧＮで３０分間プレインキュベートし、次いでその培地を吸引し、そして単層を新鮮な培地で２回リンスした。以下のそれぞれの腎細胞マイトジェンを、このセット条件下において最大となることが公知の濃度において、個々に評価した：ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、インシュリン様成長因子Ｉ（５０ｎｇ／ｍｌ）、バソプレシン（７５ｐｇ／ｍｌ）、酸性腺維芽細胞成長因子（１００ｐｇ／ｍｌ）、および塩基性腺維芽細胞成長因子（１，０００ｐｇ／ｍｌ）。この結果は、それぞれの５つのタンパク質が、細胞のＹＰＱＧＮへのプレ曝露にもかかわらず、十分にマイトジェン的であったことを示した。ＹＰＱＧＮによる前処理はまた、ＴＧＦ−β２（６ｍｇ／ｍｌ）の成長阻害効果を、ブロックしなかった。これらの観察が、ＹＰＱＧＮによる、天然のＷＧＦのマイトジェン阻害が特異的であることを示し、そしてＷＧＦレセプター部位およびシグナル伝達経路が、５つの試験した成長因子のものと異なっていることを示した。
【０１９４】
（ＷＧＦタンパク質およびＷＧＦ由来ペプチドに対する細胞表面レセプターのクローニング）
上記で要約した情報が、天然のＷＧＦおよびＷＧＦ由来ペプチドが結合する細胞表面レセプターを単離およびクローニングするための実験的な戦術を示唆する。ＢＳＣ−１株のサル腎臓上皮細胞の表面上のＷＧＦレセプターを検出するために、４０マーＷＧＦペプチドの高い親和性を利用し、これはヘパリンの存在で、Ｋ1/2＝０．００５１μＭ（５．１ｎＭ）で細胞と結合する。さらに、細胞への結合の特異性、またはプラズマメンブレン画分への結合の特異性は、細胞表面とのペプチドの接着をブロックする、ペンタペプチドＹＰＱＧＮを用いることによりモニターした。放射性ヨウ化４０マーを調製し、次いで、ＢＳＣ−１細胞の培養物に、ヘパリンと共に加えた。レセプターを、ジスクシンイミジルコスベリン酸塩の作用により、［125Ｉ］４０マーと架橋することにより、アフィニティー標識化する（Ｓｅｇａｒｉｎｉら、１９８７）。細胞タンパク質は、可溶性であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。オートラジオグラフィーは、レセプターの可視化、およびその大きさの規定を可能にする。十分な量のレセプタータンパク質を、このゲル精製法により単離した後、アミノ末端およびその内部のアミノ酸配列情報を得、オリゴヌクレオチドプライマーを調製し、そしてポリメラーゼ連鎖反応を、レセプタータンパク質をコードしたｃＤＮＡクローンを得るために用いる。
【０１９５】
（実施例７：急性腎不全後の生存に対する１４−Ｓｅｒ  ＷＧＦ由来ペプチドおよびＥＧＦとの間のインビボでの比較）
塩化第二水銀誘導ＡＲＦにおける新規な治療的な薬剤として１４−Ｓｅｒペプチドの有効性を、この動物モデル系において効果的であることが示されている、第１のペプチド成長因子であるＥＧＦと比較した（Ｃｏｉｍｂｒａら、１９９０）。
【０１９６】
それぞれ３つのグループの８匹のラット（ｎ＝２４）に、それぞれ塩化第二水銀（２．２５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）１時間後に１４−Ｓｅｒ（１００μｇ、ｓ．ｃ．）を与えるか、毒素２時間後にＥＧＦ（２０μｇ、ｓ．ｃ．）を与えるかまたはビヒクルを与え（ｓ．ｃ．）、そして生存しているものをモニターした。４日後、ビヒクルを処理した動物の２５％と比較して、１４−Ｓｅｒペプチドを与えたラットのうち６３％が、生きていた（カイ２乗、Ｐ＝０．０４９９）；ＥＧＦを処理したラットのうち５０％が、生存していた（カイ２乗、Ｐ＝Ｎ．Ｓ．）。５日目では、ビヒクルを与えた動物の１２．５％と比較して、ＥＧＦを与えたラットのうち５０％が生存していた（カイ２乗、Ｐ＝０．０４３６）。６日後では、生存しているラットは、ビヒクルを処置した動物の１２％と比較して、１４−ＳｅｒペプチドまたはＥＧＦを与えたラットで同じであった（３７．５％）。これらの観察により、腎傷害後に与えられた１４−ＳｅｒペプチドおよびＥＧＦは、ＡＲＦ症候群からの生存を向上させるそれらの能力が類似していたことを示す。
【０１９７】
別の実験において、塩化第二水銀を投与する２４時間前にＥＧＦ（２０μｇ、ｓ．ｃ．）をラットに与え、この成長因子の効果を１４−Ｓｅｒペプチドと比較した。驚くべきことに、ＥＧＦ処置が、これらの条件下において１４−Ｓｅｒペプチドは、高い保護であるのに対して、ビヒクルとは異なっていなかった。従って、４日目にＥＧＦを与えたラットの生き残りは、２５％であり、ビヒクルを与えたものは、３１％、そして１４−Ｓｅｒ  ＷＧＦ由来ペプチドを与えたものでは、７３％であった。
【０１９８】
これらの研究は、予防的に（すなわち、腎傷害が発生する前に）投与した場合、１４−Ｓｅｒペプチドは、ＥＧＦよりもより効果的に生存を促進することを示す。ＷＧＦ由来ペプチドの投与は、以下について特に効果的であることを証明し得る：（１）ＡＲＦを発症する高い危険性を有する患者（例えば，高齢者、新生児）への外科的な手順の前、（２）敗血症の処置のための抗生物質または抗悪性腫瘍薬剤のような潜在的腎毒性薬剤を投与した患者において、および（３）新しい宿主への移殖に先だつ、ドナーの腎臓の灌流について。
【０１９９】
水溶液に溶解させた１４−Ｓｅｒまたは天然のＷＧＦのような、ＷＧＦ由来ペプチドは、灌流および保護に用いられ得、そしてヒト受容者への再移殖に続く血液での再灌流に際して起こり得る傷害から、虚血性の「ドナー」腎臓を単離（「エキソビボ」で）し得る。従って、ＷＧＦは、屍体からの腎臓または生存しているドナーから取り出され、そして移殖を行なう予定である腎臓を保存するために用いられる溶液に加えた場合、効果的な保護剤として働き得る。
【０２００】
【表４】
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【０２０１】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】図１は、ＢＳＣ−１細胞の増殖に対する、創傷増殖因子由来ペプチドの増殖促進活性を図示する。
【図２Ａ】図２Ａは、塩化第二水銀誘導性の急性尿細管壊死の後に、ＷＧＦ由来ペプチド（１４−Ｓｅｒ）を与えられたラットの増強された生存を図示す。（Ａ：値は、平均±標準誤差である。＊は、スチューデントｔ検定でＰ＜０．０３４。）（Ｂ：生存％は、生存数および死亡数の計によって除算されたラット生存数として計算される；＊は、カイ２乗、Ｐ＜０．０５０。）
【図２Ｂ】図２Ｂは、塩化第二水銀誘導性の急性尿細管壊死の後に、ＷＧＦ由来ペプチド（１４−Ｓｅｒ）を与えられたラットの腎機能回復を示す。（Ａ：値は、平均±標準誤差である。＊は、スチューデントｔ検定でＰ＜０．０３４。）（Ｂ：生存％は、生存数および死亡数の計によって除算されたラット生存数として計算される；＊は、カイ２乗、Ｐ＜０．０５０。）
【図３Ａ】図３Ａは、両側腎茎の締付けにより誘導された虚血性急性腎不全の後に、ＷＧＦ由来ペプチド（１４−Ｓｅｒ）を与えられたラットの増強された生存を図示す。（生存％は、生存数および死亡数の計によって除算されたラット生存数である。）値は、平均±標準誤差である。＊は、スチューデントｔ検定でＰ＜０．０３２。）
【図３Ｂ】図３Ｂは、両側腎茎の締付けにより誘導された虚血性急性腎不全の後に、ＷＧＦ由来ペプチド（１４−Ｓｅｒ）を与えられたラットの腎機能回復を示す。（生存％は、生存数および死亡数の計によって除算されたラット生存数である。）値は、平均±標準誤差である。＊は、スチューデントｔ検定でＰ＜０．０３２。）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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