(57)【要約】【課題】体内ＳＯＤ活性亢進作用を有する経口摂取用組成物を提供する。【解決手段】ヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるグラム陽性細菌の少なくとも１種以上を有効成分として含んでなり、且つ、体内ＳＯＤ活性亢進作用を有することを特徴とする、経口摂取用組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるグラム陽性細菌の少なくとも１種以上を有効成分として含んでなり、且つ、体内ＳＯＤ活性亢進作用を有することを特徴とする、経口摂取用組成物。
【請求項２】
前記細菌が死菌体である、請求項１に記載の経口摂取用組成物。
【請求項３】
前記細菌が、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、および、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌からなる群より選択される少なくとも１種以上の細菌である、請求項１又は２に記載の経口摂取用組成物。
【請求項４】
前記細菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の経口摂取用組成物。
【請求項５】
慢性炎症性疾患による炎症を抑制する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の経口摂取用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内ＳＯＤ活性亢進作用を有する経口摂取用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンや関節リュウマチ、糖尿病、アトピー性皮膚炎、膠原病などの様々な病気には、体内で過剰に発生する活性酸素が直接的に関与している。
このような活性酸素の生成を阻害する、又は生成した活性酸素を除去する方法としては、これまでにも様々な技術が開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１は、チダケサシ属に属する植物を含有する活性酸素消去剤の技術を開示している。また、特許文献２は、柿蒂抽出物を有効成分とすることを特徴とする活性酸素消去剤の技術を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１７９５９２号公報
【特許文献２】特開２００６−８３０７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１には、該文献に開示された活性酸素消去剤が、美肌用の飲食品としての用途を有していると記載されている。しかし該文献は、動物実験（試験例３）において、外用薬としての効果を示す実験結果のみを開示している。したがって、該文献に開示された活性酸素消去剤が、飲食品や内服薬のように、経口摂取しても効果を発揮できるものであるか否かは、該文献から明らかではない。
特許文献２においても、該文献に開示された活性酸素消去剤が、食品としての用途を有しているとの記載がある。しかし、該文献においては、生体内で行う、いわゆるｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果が開示されていない。したがって、該文献に開示された活性酸素消去剤が、食品として摂取しても活性酸素除去の効果を発揮できるものであるか否かは、該文献からは明らかではない。
【０００６】
本発明は、上記外因性活性酸素消去剤の実状を鑑みて成し遂げられたものであり、内因性スーパーオキシドラジカルスカベンジャーのＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ：スーパーオキシドジスムターゼ）活性亢進作用を有する経口摂取用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の経口摂取用組成物は、ヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるグラム陽性細菌の少なくとも１種以上を有効成分として含んでなり、且つ、体内ＳＯＤ活性亢進作用を有することを特徴とする。
【０００８】
このような構成の経口摂取用組成物は、単なる活性酸素消去剤のような、上述した特許文献に記載された従来技術とは異なり、生体のＳＯＤ活性誘導作用の高い前記細菌を有効成分として含むことにより、生体内のＳＯＤ活性を向上させることができる。また、このような構成の経口摂取用組成物は、前記細菌がヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるものであるため、副作用がなく安全性が高い。
【０００９】
本発明の経口摂取用組成物の一形態としては、前記細菌が死菌体であるという構成をとることができる。
【００１０】
本発明の経口摂取用組成物の一形態としては、前記細菌が、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、および、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌からなる群より選択される少なくとも１種以上の細菌であるという構成をとることができる。
【００１１】
本発明の経口摂取用組成物は、前記細菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）であることが好ましい。
【００１２】
本発明の経口摂取用組成物は、慢性炎症性疾患による炎症を抑制する効果を発揮する。
【００１３】
このような構成の経口摂取用組成物は、特に、慢性関節炎、リウマチ性関節炎、花粉症、アトピー性皮膚炎等によって生じる炎症を抑制する効果を発揮する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、単なる活性酸素消去剤のような、上述した特許文献に記載された従来技術とは異なり、生体のＳＯＤ活性誘導作用の高い前記細菌を有効成分として含むことにより、生体内のＳＯＤ活性を向上させることができる。また、このような構成の経口摂取用組成物は、前記細菌がヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるものであるため、副作用がなく安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＥＣ−１２摂取によるコラーゲン誘発関節炎の炎症抑制効果について、ｐｒｉｍｉｎｇの日を起算日として２１日目からのスコアを示す図である。
【図２】Ｎｏｒｍａｌ群及びＣＩＡ群の各群の総ＳＯＤ活性値を示した棒グラフである。
【図３】Ｎｏｒｍａｌ群及びＣＩＡ群の各群のＭｎ−ＳＯＤ活性値を示した棒グラフである。
【図４】ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群の、平均肝ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示した棒グラフである。
【図５】ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群との、平均肝ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示した棒グラフである。
【図６】ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の、平均肝８−ＯＨｄＧ量をそれぞれ示した棒グラフである。
【図７】ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群、ＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群、ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群、ＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の、平均肝ＧＯＴ濃度（白色の棒グラフ）及び平均肝ＧＰＴ濃度（黒色の棒グラフ）をそれぞれ示した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の経口摂取用組成物は、ヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるグラム陽性細菌の少なくとも１種以上を有効成分として含んでなり、且つ、体内ＳＯＤ活性亢進作用を有することを特徴とする。
【００１７】
生体内においては、生理活動の派生として、或いは、体内に侵入した毒物又は免疫学的異物を分解するなどの様々な目的のために活性酸素（スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、窒素酸化物など）が生成し、生理機能の維持に役立っている。正常な状態では、体内の余分な活性酸素は抗酸化酵素を含む制御系により除去され、過剰になることはない。
しかしながら、外的要因により酵素活性が低下してしまうと、活性酸素が増え、生体内環境は酸化ストレスの状態に傾く。
【００１８】
スーパーオキシドジスムターゼ（以下「ＳＯＤ」と略記する場合がある）は様々な生物の組織に存在する抗酸化酵素であり、生体内で発生した反応性の強い活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカル（以下「Ｏ２−」と略記する場合がある）を分解する。生体内の活性酸素制御系においては、Ｏ２−が発生するとＳＯＤの作用により不均化されて過酸化水素が生じ、過剰の過酸化水素はカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ等の過酸化水素の除去に関連した酵素により分解される。この一連のスキームを以下に示す。
ＳＯＤの作用：  ２Ｏ２−＋２Ｈ＋  →  Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
カタラーゼの作用：  ２Ｈ２Ｏ２  →  Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ
グルタチオンペルオキシダーゼの作用：  ＲＯＯＨ＋２ＧＳＨ  →  ＲＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ＧＳＳＧ
なお、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼの存在量が不十分の場合には、そして特に細胞病変に起因して鉄の存在量が非常に少ない場合には、過酸化水素は以下のスキームによって、毒性がより強いヒドロキシラジカルに転化される（フェントン反応）。
フェントン反応：
Ｏ２−＋Ｆｅ３＋  →  Ｆｅ２＋＋Ｏ２
Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２  →  Ｆｅ３＋＋ＯＨ−＋ＯＨ０
Ｏ２−＋Ｈ２Ｏ２  →  Ｏ２＋ＯＨ−＋ＯＨ０
【００１９】
上記したような活性酸素制御系に関する知見に基づき、生体の酸化ストレス及び活性酸素レベルを正常化するために、ＳＯＤそのものや、ＳＯＤ様作用成分を外部から摂取させることが試みられている。
しかしながら、酵素であるＳＯＤを経口摂取したとしても、体内で消化されることによって、生体内においては必要なだけの活性が必ずしも得られない。また、抗酸化ビタミンやポリフェノール等のＳＯＤ様作用成分は、ＳＯＤとよく似た作用を持つに過ぎず、酵素（生体触媒）としてのＳＯＤ能力には遠く及ばない。
本発明に係る経口摂取用組成物は、免疫調整作用に優れ、生体のＳＯＤ誘導作用の高い菌体を含む。このような、ＳＯＤ誘導作用の高い菌体を含む経口摂取用組成物を経口摂取することにより、生体のＳＯＤ活性を向上させ、種々の難治性疾患の病態を改善することができる。
【００２０】
本発明に係る経口摂取用組成物の有効成分は、ヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるグラム陽性細菌であれば、特に限定されることはない。なお、このように、前記細菌がヒトを含む動物腸内又は発酵食品から分離されるものであるため、本発明に係る経口摂取用組成物は、副作用がなく安全性が高い。なお、前記細菌は、１種類のみでもよく、また、２種類以上を混合して用いてもよい。
発明に係る経口摂取用組成物の有効成分は、上述したグラム陽性細菌であり、且つ、該細菌が体内ＳＯＤ活性亢進作用を有するものであることが好ましい。
【００２１】
本発明の経口摂取用組成物の一形態としては、有効成分である前記細菌が、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、および、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌からなる群より選択される少なくとも１種以上の細菌であるという構成をとることができる。これらの細菌は、代謝により乳酸を産生するグラム陽性細菌であり、一般に乳酸菌と呼ばれる細菌である。
【００２２】
ここで、エンテロコッカス属に属する細菌としては、例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコツカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）等が挙げられる。ビフィドバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・プレーべ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）等が挙げられる。ラクトバシルス属に属する細菌としては、ラクトバシルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等が挙げられる。
【００２３】
また、ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられる。ラクトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）等が挙げられる。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、有効成分として用いられる細菌は、乳酸球菌である。より好ましくは、エンテロコッカス属に属する菌である。最も好ましくは、該細菌は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）である。
【００２５】
エンテロコッカス・フェカリスとしては、例えば、エンテロコッカス・フェカリス・ＥＣ−１２株、ＡＴＣＣ  １９４３３、ＡＴＣＣ  １４５０８、ＡＴＣＣ  ２３６５５、ＩＦＯ  １６８０３、ＩＦＯ  １６８０４等の菌株またはその変異株が例示できる。有効成分として用いられる細菌としては、このうち、前記ＥＣ−１２株が最も好ましい。
なおここで「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
【００２６】
なお、エンテロコッカス・フェカリス・ＥＣ−１２株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＥＣ−１２）は、平成１７年（２００５年）２月２５日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２８４である。
【００２７】
有効成分として用いられる細菌は、生菌及び／又は死菌体を用いることができるが、好ましくは死菌体が用いられ、より好ましくは、前記細菌を公知の加熱処理手段で殺菌して得られる加熱殺菌菌体が用いられる。加熱殺菌菌体は、前記細菌を常法に従って培養して得られた培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の方法により菌体を回収し、水洗後、水等に懸濁して１２０℃以下（好ましくは８０〜１２０℃）、３０分以内（３秒〜３０分間）加熱処理した後、必要に応じて濃縮、乾燥することにより調製できる。また菌体を焼成、蒸煮（例えば１７０℃以下、６０分以内）に付すことによって調製してもよい。なお、前記ＥＣ−１２株の加熱処理による殺菌菌体粉末は、商品名「ＥＣ−１２」（コンビ株式会社製）として市販されている。このため、本発明においては、有効成分として用いられる細菌として、このような市販品を用いてもよい。
【００２８】
上記のようにして得られた細菌は、そのまま本発明の経口摂取用組成物として用いることができる。また、更に賦形剤、甘味料、香料、着色料等を添加して顆粒状、錠剤、カプセル剤等にすることもできる。
【００２９】
本発明の経口摂取用組成物の有効摂取量は、菌体（乾物換算）として１０〜４，０００ｍｇ／１人１日である。したがって、本発明の経口摂取用組成物における上記菌体の含有量は、該菌体を乾物換算で、１日当り１０〜４，０００ｍｇ摂取できるように含むことが好ましく、１０〜２，０００ｍｇ摂取できるように含むことがより好ましい。
【００３０】
本発明の経口摂取用組成物は、経口摂取できるものであれば、特に限定されない。したがって、一般食品、菓子類、ゼリー、グミ、キャンディー、ガム、スナック菓子、焼き菓子、レトルト食品、インスタント食品、栄養補助食品、飲料、シート状食品、チュアブル、ゼリー飲料（チュアパック）、練り製品、おかゆ、佃煮等に加工されたものであってもよい。もっとも、具体例としてはこれらに限定されることはない。
【００３１】
本発明の経口摂取用組成物は、慢性炎症性疾患による炎症を抑制する効果を発揮する。本発明の経口摂取用組成物は、特に、老化や、慢性関節炎、リウマチ性関節炎、花粉症、アトピー性皮膚炎、虚血再かん流、白内障、がん、動脈硬化症など活性酸素が関わる炎症性疾患やアレルギー性疾患の炎症抑制に効果を発揮する。また、後述する実施例において示すように、体内ＳＯＤ活性亢進作用の中でも、特に肝ＳＯＤ活性亢進作用を有する。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例（コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）に対するＥＣ−１２の炎症抑制効果、マウス肝臓中のＳＯＤ活性測定、ＥＣ−１２のマウス肝臓に対する抗酸化作用）を挙げて、本発明を具体的に説明する。なお、実施例の末尾に、本実施例全体の結果についての考察を記載した。
【００３３】
１．コラーゲン誘発関節炎に対するＥＣ−１２の炎症抑制効果
供試動物として、９週齢の雄性ＤＢＡ／１Ｊ（日本クレア株式会社製）マウスを用いた。
また試薬として、ＥＣ−１２株の加熱処理による殺菌菌体粉末としてＥＣ−１２（商品名。コンビ株式会社製）、および、ＩＩ型コラーゲン（ｃｈｉｃｋ  ｓｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ由来、ｓｉｇｍａ社Ｂ製）を用いた。
【００３４】
本実施例において、有効成分の効果の確認試験に使用しているＩＩ型コラーゲンによるコラーゲン誘導関節炎マウスは、マウスにＩＩ型コラーゲンを注射することにより、コラーゲン誘導関節炎を発症させる自己免疫疾患の関節炎の病態モデルマウスである。具体的には、マウスにＩＩ型コラーゲンを注射することにより、ＩＩ型コラーゲンが、関節滑膜細胞およびマクロファージに取り込まれ、その断片が、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって自己抗原として提示される。これにより、自己反応性ヘルパーＴ細胞が、マクロファージおよび滑膜細胞を活性化させ、炎症性サイトカインを放出する。また、自己反応性ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞に抗ＩＩ型コラーゲン抗体を産生させ、この抗ＩＩ型コラーゲン抗体が、自己の関節軟骨のＩＩ型コラーゲンと抗原抗体反応をし、補体が活性化され炎症を起こす。
なおこのような炎症を誘導する経路についてはあくまでも仮定であり、これによって本実施例が限定的に解釈されるものではない。
【００３５】
ＩＩ型コラーゲン／１０ｍＭ酢酸（２ｍｇ／ｍＬ）と完全フロイントアジュバントを等量混合してｗ／ｏエマルジョンを作成し、これをＤＢＡ／１Ｊマウスの尾基部に各０．１ｍＬ皮内投与した（０日目：ｐｒｉｍｉｎｇ）。
２１日目にも同様の操作を行った（ｂｏｏｓｔ）。
試験群は下記のとおりである。
【００３６】
［試験群］
・ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与群（１０頭）
・ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与群（１０頭）
・対照群（１０頭）
【００３７】
ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与群、ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与群については、０．２ｍｇまたは２．０ｍｇのＥＣ−１２を０．５ｍＬの蒸留水にそれぞれ懸濁し、０日目より連日７週間経口投与した。対照群には同量の蒸留水を投与した。
【００３８】
関節炎の症状は２５日から目視により週３回観察し、下記の基準に従ってクリニカルスコアを測定して、数値化した。
クリニカルスコアの判定基準：
０＝正常、
１＝発赤、
２＝軽い腫れ、
３＝中程度の腫れ、
４＝重篤な腫れ、
５＝関節の硬直／機能の消失。
測定の際には、四肢それぞれにスコアを与え、結果は１匹あたりの合計として表した。
【００３９】
図１は、ＥＣ−１２摂取によるコラーゲン誘発関節炎の炎症抑制効果について、ｐｒｉｍｉｎｇの日を起算日として２１日目からのスコアを示す図である。
対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＥＣ−１２投与を行った２群のクリニカルスコアは共に、２１日目以降上昇した。しかし、対照群のピーク時（３５日目）において、ＥＣ−１２投与を行った２群は、対照群と比較して有意に症状を改善した。
【００４０】
なお、コラーゲン誘発関節炎に対するＥＣ−１２の病理組織学的抑制効果（関節軟骨の障害、滑膜増生、炎症細胞浸潤、パンヌスの増生）については、本発明者が既に行った特許出願に係る公開特許公報（特開２００７−２５４３３３）段落５９〜６４を参考にすることができる。
【００４１】
２．マウス肝臓中のＳＯＤ活性測定
２−１．試験群
下記に示すマウス６群について、マウス肝臓中のＳＯＤ活性測定試験を行った。なお、これら６群のうち３群は、ＣＩＡ（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）群であり、残りの３群はＮｏｒｍａｌ群である。
【００４２】
［試験群］
・Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与（１０頭）
・Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与（１０頭）
・Ｎｏｒｍａｌ群  対照（１０頭）
・ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与（２０頭）
・ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与（１９頭）
・ＣＩＡ群  対照（２３頭）
【００４３】
凍結したマウス肝臓を氷上で解凍し、２ｍＬチューブに７００ｍｇ量り取った。等量のショ糖緩衝液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ショ糖、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸緩衝液  ｐＨ  ７．４、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）を添加して、ホモジナイザー（Ｆａｓｔ  ｐｒｅｐ（商品名。フナコシ製））を用いて組織をホモジナイズした（ｓｐｅｅｄ  ４．０×１０秒×２回）。１５ｍＬチューブに肝臓抽出液を移し、最終１０倍希釈となるようにショ糖緩衝液を添加した。遠心分離（４℃、１０００ｒｐｍ、１０分）後、上清を２ｍＬチューブに移し、さらに遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分）を行った。遠心分離後の上清を測定用粗酵素液（１００倍希釈サンプル）とした。
【００４４】
総ＳＯＤ活性値の算出のため、粗酵素液を５００、１００、又は５０倍希釈したものを用意し、ＳＯＤアッセイ装置（ＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（商品名。同仁化学研究所製））を用いてブランク及び標品ＳＯＤ（１０Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ）とともにそれぞれのサンプルの吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。ＳＯＤ阻害活性（阻害率（％））は、以下の計算式により求めた。なお、下記式中のＡは吸光度を示す。
（ＳＯＤ阻害活性（阻害率（％））＝〔（Ａｂｌａｎｋ１−Ａｂｌａｎｋ３）−（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ２）〕/（Ａｂｌａｎｋ１−Ａｂｌａｎｋ３）×１００
１検体（３段階希釈）ごとの検量線から阻害率５０％（ＩＣ５０）の希釈率を算出し、ＩＣ５０の時の希釈倍率のＳＯＤ活性を１Ｕとした。この際、標品ＳＯＤ（活性既知のＳＯＤ）に換算してユニット数を算出した。また、Ｍｎ−ＳＯＤ測定は、粗酵素液に１ｍＭ  ＫＣＮ（最終濃度）処理を行ったものを供し、粗酵素液１検体につき、５００、１００、５０又は１０倍希釈したものをＳＯＤ活性測定に用いた。Ｃｕ/Ｚｎ−ＳＯＤ活性値は、総ＳＯＤ活性値からＭｎ−ＳＯＤ活性値を減算して求めた。算出したユニット数は、総タンパク質量当たりに換算して示した。
【００４５】
図２は、Ｎｏｒｍａｌ群及びＣＩＡ群の各群の総ＳＯＤ活性値を示した棒グラフである。なお、左の棒グラフから、Ｎｏｒｍａｌ群  対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の値、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値、ＣＩＡ群  対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の値、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値を示す。また、表中に示す＊＊（アスタリスク２つ）の記号は、比較している２群間に０．０１％の有意差が認められたことを示している。
まず初めに、Ｎｏｒｍａｌ群間での比較を行った。平均総ＳＯＤ活性値は、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で１１９．７Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で１１７．５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｏｒｍａｌ群  対照で６７．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。これらの結果から、Ｎｏｒｍａｌ群間で比較した時は、平均総ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値を示し、また、ＥＣ−１２を投与した２群において、対照群とそれぞれ有意差が認められた。
次に、ＣＩＡ群間での比較を行った。平均総ＳＯＤ活性値は、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で５０．６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で４２．４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＩＡ群  対照で２８．２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。これらの結果から、ＣＩＡ群間で比較した時も、平均総ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値を示し、また、ＥＣ−１２を投与した２群において、対照群とそれぞれ有意差が認められた。
したがって、Ｎｏｒｍａｌ群、ＣＩＡ群のいずれの群においても、平均総ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値であった。
【００４６】
図３は、Ｎｏｒｍａｌ群及びＣＩＡ群の各群のＭｎ−ＳＯＤ活性値を示した棒グラフである。棒グラフの順番及び表中に示す＊＊（アスタリスク２つ）の記号は、図２と同様である。
まず初めに、Ｎｏｒｍａｌ群間での比較を行った。平均Ｍｎ−ＳＯＤ活性値は、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で８４．２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で９６．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｏｒｍａｌ群  対照で３０．８Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。これらの結果から、Ｎｏｒｍａｌ群間で比較した時は、平均Ｍｎ−ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値を示し、また、ＥＣ−１２を投与した２群において、対照群とそれぞれ有意差が認められた。
次に、ＣＩＡ群間での比較を行った。平均Ｍｎ−ＳＯＤ活性値は、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で２５．０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で２０．９Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＩＡ群  対照で７．８Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。これらの結果から、ＣＩＡ群間で比較した時も、平均Ｍｎ−ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値を示し、また、ＥＣ−１２を投与した２群において、対照群とそれぞれ有意差が認められた。
したがって、Ｎｏｒｍａｌ群、ＣＩＡ群のいずれの群においても、平均Ｍｎ−ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値であった。
【００４７】
３．ＥＣ−１２のマウス肝臓に対する抗酸化作用
３−１．飼育
供試動物としては、ＤＢＡ／１Ｊ  Ｓｅａ系雄マウス（九動株式会社製、８週齢）を１５頭、及びＢＡＬＢ／ｃ  Ｃｒ  Ｓｌｃ系雄マウス（日本エスエルシー株式会社製、８週齢）１５頭をそれぞれ種類ごとに用いた。
２５℃に保たれた実験室にマウスを導入後、各群無作為に群分けし（詳細な試験群は下記に示すとおりである。）、群ごとにマウス飼育ケージに収容した。導入から１週間を馴化期間とし、基礎飼料としてＭＦ（商品名。オリエンタル酵母株式会社製）及び水道水を自由摂取させた。馴化終了時から４週間連日、ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群、及びＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群には、毎朝１０時にＥＣ−１２を所定量（１０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ）生理食塩水に懸濁させて強制経口投与した。ＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群、及びＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群には、生理食塩水を強制経口投与した。
【００４８】
［試験群］
・ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群（８頭）
・ＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群（７頭）
・ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群（８頭）
・ＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群（７頭）
【００４９】
３−２．剖検及び分析・検査等
試験開始後４週間で剖検を行った。麻酔はペントバルビタールＮａ（ソムノペンチル（商品名。シェリング・プラウ  アニマルヘルス株式会社製））で行った。剖検時に、腹部大動脈から血液を採取した。
肝臓の一部を採取して、ＲＮＡｌａｔｅｒに浸漬し、１日間冷蔵後、凍結保存した。肝臓からＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ８１０  ｓｙｓｔｅｍ及びＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＲＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（いずれも商品名。富士フイルム株式会社製）を用いてＲＮＡを抽出した。Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（商品名。ＴＡＫＡＲＡ製）で逆転写後、Ｍｎ−ＳＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ及びＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡ発現量をｔａｑｍａｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いて定量した。Ｍｎ−ＳＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨで補正し、ＧＡＤＰＨ遺伝子に対する相対値を算出した。
採血した血液から血清を分取し、常法によりＧＯＴ濃度及びＧＰＴ濃度を測定した。
肝臓中の８ＯＨ−ｄＧ濃度を測定した。測定方法としては、公知文献（Ｋａｓａｉ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  ２００７；  ２９：  １０７−１１４．）に基づいて、アニオン交換カラム及び逆相カラムを用いた、高速液体クロマトグラフィ‐電気化学検出法（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ：Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を採用した。
【００５０】
３−３．統計学的解析
マウス系統毎の、ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群と無投与対照群の各数値について、Ｆ検定を実施し、等分散性の有無によってＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定もしくはＷｅｌｃｈ’ｓ  ｔ検定を実施した。ｐ＜０．０５を有意差ありと判断した。
【００５１】
３−４．試験結果
図４は、ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群の、平均肝ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示した棒グラフである。左の棒グラフから、無投与対照群の平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、無投与対照群の平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、ＥＣ−１２強制経口投与群の平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、ＥＣ−１２強制経口投与群の平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示す。
ＤＢＡ／１Ｊマウスにおける平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において０．０４０／ＧＡＰＤＨ、無投与対照群において０．０３６／ＧＡＰＤＨであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。
また、ＤＢＡ／１Ｊマウスにおける平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において０．１１２／ＧＡＰＤＨ、無投与対照群において０．０７４／ＧＡＰＤＨであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。
【００５２】
図５は、ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の、平均肝ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示した棒グラフである。左の棒グラフから、無投与対照群の平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、無投与対照群の平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、ＥＣ−１２強制経口投与群の平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、ＥＣ−１２強制経口投与群の平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示す。また、表中に示す＊（アスタリスク１つ）の記号は、２群間に０．０５％の有意差が認められたことを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において０．０４３／ＧＡＰＤＨ、無投与対照群において０．０３２／ＧＡＰＤＨであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示し、有意差も認められた。
また、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において０．２３１／ＧＡＰＤＨ、無投与対照群において０．２００／ＧＡＰＤＨであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。
【００５３】
図６は、ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の、平均肝８−ＯＨｄＧ量をそれぞれ示した棒グラフである。左の棒グラフが無投与対照群の平均肝８−ＯＨｄＧ量を、右の棒グラフがＥＣ−１２強制経口投与群の平均肝８−ＯＨｄＧ量を、それぞれ示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける平均肝８−ＯＨｄＧ量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において２．６８／１０６ｄＧ、無投与対照群において２．５１／１０６ｄＧであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。
【００５４】
図７は、ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群、ＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群、ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群、ＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の、平均肝ＧＯＴ濃度（白色の棒グラフ）及び平均肝ＧＰＴ濃度（黒色の棒グラフ）をそれぞれ示した棒グラフである。左の棒グラフから２つずつ、ＤＢＡ／１Ｊマウス  無投与対照群の値、ＤＢＡ／１Ｊマウス  ＥＣ−１２  強制経口投与群の値、ＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の値、ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  強制経口投与群の値をそれぞれ示す。
【００５５】
ＤＢＡ／１Ｊマウスにおける血清中の平均肝ＧＯＴ濃度は、ＥＣ−１２強制経口投与群において７１．０  ＩＵ／Ｌ、無投与対照群において５６．１  ＩＵ／Ｌであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。
ＤＢＡ／１Ｊマウスにおける血清中の平均肝ＧＰＴ濃度は、ＥＣ−１２強制経口投与群において２９．９  ＩＵ／Ｌ、無投与対照群において２４．４  ＩＵ／Ｌであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。
【００５６】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清中の平均肝ＧＯＴ濃度は、ＥＣ−１２強制経口投与群において４９．５  ＩＵ／Ｌ、無投与対照群において５１．３  ＩＵ／Ｌであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも低値を示したが、有意差は認められなかった。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清中の平均肝ＧＰＴ濃度は、ＥＣ−１２強制経口投与群において２１．９  ＩＵ／Ｌ、無投与対照群において２２．０  ＩＵ／Ｌであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも低値を示したが、有意差は認められなかった。
【００５７】
３−５．ＥＣ−１２のマウス肝臓に対する抗酸化作用のまとめ
本試験においては、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が、対照群に対して、特にＭｎ−ＳＯＤ活性が有意に亢進している（図５）ことが明らかとなった。したがって、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて８−ＯＨｄＧ／１０６ｄＧの値を測定したところ、ＥＣ−１２強制経口投与群及び対照群間において、有意差は認められなかった（図６）。また、血清中の平均ＧＯＴ濃度及び平均ＧＰＴ濃度においても、両群間において有意差は認められなかった（図７）。
以上のことから、ＥＣ−１２投与によって引き起こされるＳＯＤ活性亢進においては、酸化ストレスは伴わず、少なくとも肝機能に障害は与えていないことが明らかとなった。なお、本試験期間中を通して、ＥＣ−１２投与による異常、副作用などは認められなかった。
【００５８】
４．本実施例に関する考察
公知文献（Ｃｈｏｉ，Ｅ−Ｍ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２００７；  ２７：  ４７２−４８１）に記載されているように、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）下においては、ＤＢＡ／１Ｊマウスは、著しいＳＯＤ活性低下を示す。しかし、上記「２．マウス肝臓中のＳＯＤ活性測定」の項で述べたように、ＥＣ−１２の投与によって、ＤＢＡ／１Ｊマウスにおいても、肝ＳＯＤ活性が亢進することが分かった。
ＥＣ−１２投与は免疫系において炎症性サイトカインのＴＮＦ−α産生を亢進させる。また公知文献（Ａｆｏｎｓｏ，Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎ  ７４  （２００７）  ３２４−３２９）に記載されているように、Ｍｎ−ＳＯＤ（ＳＯＤ２）は、ＴＮＦ−αによって活性化する。したがって、ＥＣ−１２の投与は、まず初めにＴＮＦ−α産生を亢進させ、このＴＮＦ−αがＭｎ−ＳＯＤを活性化させるという仮説を立てることができる。一方、ＴＮＦ−α産生亢進が、生体内に酸化ストレスをもたらすことによりＳＯＤが活性化されるのではないかという懸念が生じる。
しかし、「３．ＥＣ−１２のマウス肝臓に対する抗酸化作用」の項で述べたように、本実施例においては、ＥＣ−１２の投与が、上述したようなＴＮＦ−αによる肝の酸化ストレスを伴わず、且つ、肝機能障害を生体に対して与えることなく、肝ＳＯＤ活性を亢進できることが確認できた。
【図１】
2010195700.tif 000003
【図２】
2010195700.tif 000004
【図３】
2010195700.tif 000005
【図４】
2010195700.tif 000006
【図５】
2010195700.tif 000007
【図６】
2010195700.tif 000008
【図７】
2010195700.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月28日(2009.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
図２は、Ｎｏｒｍａｌ群及びＣＩＡ群の各群の総ＳＯＤ活性値を示した棒グラフである。なお、左の棒グラフから、Ｎｏｒｍａｌ群  対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の値、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値、ＣＩＡ群  対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の値、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与の値を示す。また、表中に示す＊＊（アスタリスク２つ）の記号は、比較している２群間に０．０１の有意差が認められたことを示している。
まず初めに、Ｎｏｒｍａｌ群間での比較を行った。平均総ＳＯＤ活性値は、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で１１９．７Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｏｒｍａｌ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で１１７．５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｏｒｍａｌ群  対照で６７．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。これらの結果から、Ｎｏｒｍａｌ群間で比較した時は、平均総ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値を示し、また、ＥＣ−１２を投与した２群において、対照群とそれぞれ有意差が認められた。
次に、ＣＩＡ群間での比較を行った。平均総ＳＯＤ活性値は、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で５０．６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＩＡ群  ＥＣ−１２  ０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与で４２．４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＩＡ群  対照で２８．２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。これらの結果から、ＣＩＡ群間で比較した時も、平均総ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値を示し、また、ＥＣ−１２を投与した２群において、対照群とそれぞれ有意差が認められた。
したがって、Ｎｏｒｍａｌ群、ＣＩＡ群のいずれの群においても、平均総ＳＯＤ活性値は、ＥＣ−１２を投与した２群が対照群よりも高値であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
図５は、ＢＡＬＢ／ｃマウス  ＥＣ−１２  １０ｍｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ強制経口投与群とＢＡＬＢ／ｃマウス  無投与対照群の、平均肝ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示した棒グラフである。左の棒グラフから、無投与対照群の平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、無投与対照群の平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、ＥＣ−１２強制経口投与群の平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量、ＥＣ−１２強制経口投与群の平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示す。また、表中に示す＊（アスタリスク１つ）の記号は、２群間に０．０５の有意差が認められたことを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける平均Ｍｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において０．０４３／ＧＡＰＤＨ、無投与対照群において０．０３２／ＧＡＰＤＨであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示し、有意差も認められた。
また、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける平均Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ  ｍＲＮＡ発現量は、ＥＣ−１２強制経口投与群において０．２３１／ＧＡＰＤＨ、無投与対照群において０．２００／ＧＡＰＤＨであり、ＥＣ−１２強制経口投与群の方が無投与対照群よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。