(57)【要約】【課題】豚繁殖・呼吸障害症候群を引き起こす非典型的ウイルスの実質的な無毒型の提供と、ＰＲＲＳに対して有用なワクチンの提供。【解決手段】ＰＲＲＳの有毒型の細胞培養継代から得られる、豚繁殖・呼吸障害症候群の原因であるウイルスの実質的な無毒型および対応するワクチンが提供される。得られた無毒な非典型的ＰＲＲＳウイルスは、宿主動物に接種することによってＰＲＲＳ特異的な抗体応答が誘導され、それによってＰＲＲＳウイルスの既知株および新規に分離された非典型的ＰＲＲＳウイルス株の両方に対する効果的な免疫を与えるという点で、ワクチンとして有用である。好ましい継代技術は、実質的にプロセスの始めから終わりまでの間、弱毒化を達成するために必要な時間を最小化する対数増殖期をウイルスが維持することを確実にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オープンリーディングフレーム５において、制限酵素Ｍｌｕ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩおよびＳａｃ  ＩＩによる、それぞれ、１−４−２の制限酵素切断パターンを有するウイルス。
【請求項２】
オープンリーディングフレーム５において、Ｍｌｕ  Ｉにより切断されない、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
請求項１に記載のウイルスを含有するワクチン。
【請求項４】
さらに、薬学的に許容しうる担体を含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ワクチンが宿主動物で抗体応答を誘導することができる、請求項３または４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記宿主動物がブタを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記抗体応答が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に特異的である、請求項５または６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ウイルス株が非典型的豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株を含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかに記載のワクチンをブタに投与する工程を含む、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に対してブタを免疫する方法。
【請求項１０】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列と少なくとも６５％の配列同一性を有する、分離されたＤＮＡ配列。
【請求項１１】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する、分離されたＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、１９９９年４月２２日に出願された特許出願Ｓ／Ｎ  ０９／２９８号の部分継続出願である。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ブタに非典型的豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する免疫を与えるために、ブタに投与する弱毒化された弱毒化ＰＲＲＳＶ、およびこれに相当する生ウイルスワクチンに関する。本発明は、またＰＲＲＳＶに対してブタに免疫を与える方法、およびウイルスを弱毒化するために継代する新規で、効率の高い方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
２．従来技術の説明
ＰＲＲＳは、ブタの重大なウイルス疾患として１９８０年代後半に発生した。ＰＲＲＳＶは、妊娠中の雌ブタに重大な生殖不全を生じ、早産の形で顕在化し、死産、ミイラ状態での出産、弱い個体としての出産の数を増加し、分娩率を低下させ、発情期への戻りを遅らせる。さらに、ＰＲＲＳＶに感染したブタの呼吸器は、悪影響を受け、感染したブタの肺への病変の出現として顕在化する。ＰＲＲＳＶ感染に関連する問題を克服するため、現存のＰＲＲＳＶ株への免疫を与えるワクチンが開発されている。
【０００４】
非典型的ＰＲＲＳと呼ばれる重大な、通常見られない形態のＰＲＲＳが、１９９６年の後期に北アメリカで初めて認められた。それらは、以下の点で通常のＰＲＲＳと区別される。
１）病気の徴候がより深刻で、かつより長期に及ぶ。
２）流産の事例が、特に懐胎早期および中期により多い。
３）若い雌ブタおよび成熟した雌ブタの死亡率が高い。
４）流産した胎児、早産したブタおよび生産されたブタから分離されるＰＲＲＳＶがより少ない。おそらく流産が、経胎盤感染よりむしろ深刻な母体の疾病によるためである。
５）影響を受けた若いブタの肺の病変は、より広範囲に及ぶ。
６）商業的に利用可能なワクチンはほとんど防御効果がないか、全く防御効果がない。
【０００５】
総体的に、これらの結果は、より強毒で、抗原が全く異なるＰＲＲＳＶ株の出現および新たなＰＲＲＳワクチンの製造の必要性を示している。
【０００６】
弱毒化された生ワクチンを製造するのに最もよく使用される方法は、ウイルスをワクチンとして使用するのに十分に弱毒化されるまで（すなわち、毒性または疾病発生能が減退化される）、天然の宿主以外の（通常細胞培養）物質中で連続的に継代培養させることである。初代の培養に関して、細胞培養は、選択された接種源に感染させる。ウイルスの複製の明確な証拠が得られた後（例えば、感染された細胞におけるウイルスに誘導された細胞変性効果（ＣＰＥ））、初代培養の細胞培養媒体のアリコット、若しくは感染された細胞、またはその両方を、第２代の細胞培養に感染させるのに使用する。この工程を、ウイルスのゲノムに１回またはそれ以上の突然変異が起こり、ワクチンとして使用するのに十分に弱毒化されるまで繰り返す。弱毒化の程度は、通常天然の宿主に接触させた際に、ウイルスが積極的に移動するレベルにより決定する。
【０００７】
上記の手順は、本質的に安定であり、ヒトおよび家畜類に使用される多数のワクチンの開発に広く使用されている。しかし、突然変異が最もよく起こりやすいウイルス複製の対数段階は、ウイルス複製の証拠が明確に現れる前にしばしば完了している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、近年発見された非典型的ＰＲＲＳＶ株を含んだＰＲＲＳＶ株に対する効果的な免疫を与えるワクチンに関して明白な需要が存在している。また、そのようなワクチンを製造する方法に関する需要も存在している。最後に、必要とされる方法は、これまで可能と考えられていた方法よりもより効果的にウイルスを弱毒化し、得られた弱毒化されたウイルスがブタの体内にＰＲＲＳＶ固有の抗体を誘導し、それによりＰＲＲＳＶに対する効果的な免疫を与えるウイルスの培養方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の簡単な説明
本発明は、上に略述した問題を解決し、新たに発見された非典型的ＰＲＲＳＶ株に対する効果的な免疫を与える弱毒化された非典型的ＰＲＲＳＶ株、およびこれに相当する改善され、改良された生ワクチンを提供する。効果的な免疫とは、非典型的ＰＲＲＳＶ感染を含んだブタのＰＲＲＳＶ感染から、実質的な疾病の臨床兆候に至るのを防止するワクチンの能力を呼ぶ。すなわち、免疫を与えられたＰＲＲＳＶに対して血清学的に陽性であってもなくても、いかなる実質的な病気の徴候を示さない。非典型的ＰＲＲＳＶとは、通常のＰＲＲＳＶ株よりも実質的に強毒なこれら新種のＰＲＲＳＶ株を呼ぶ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
好ましい形態において、本発明のワクチンは、弱毒化された生ウイルスを含む。得られた弱毒化されたウイルスは、毒性が弱く、効果的な免疫を与える。継代培養を通じて弱毒化するのに、特に深刻なＰＲＲ症候群を引き起こし、非典型的ＰＲＲＳＶの主要な株を表す非典型的ＰＲＲＳの特定の強毒株（ＪＡ−１４２と命名されている）を選択した。得られた弱毒化されたウイルスは、メリーランド州ロックビルの米国種培養収集機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））１９９９年２月２日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６３８が与えられた。この弱毒化されたウイルスは、継代培養され、効果的なＰＲＲＳＶワクチンとして開発される好ましい原種ウイルスである。
【００１１】
弱毒化されていないウイルスに与えられた名称ＪＡ−１４２は、制限酵素パターンに由来する。１は、酵素Ｍｌｕ  Ｉのオープンリーディングフレーム５（ＯＲＦ５）でのウイルスの切断不能を表す。４は、ＯＲＦ５の塩基対部１１８および２４９および短連続配列におけるＨｉｎｃ  ＩＩによる切断を表す。
【００１２】
ウイルスの継代培養による弱毒化は、効率を増加させる新規の方法により実現した。具体的には、弱毒化の時間を実質的に短縮するため、複数の細胞培養の継代を通じてウイルスの複製における対数期間を維持した。これは、各細胞において、存在するウイルスに対して、予め感染していない細胞が過剰に存在することを保証することで実現した。したがって、継代時において、少数のウイルスのみを移植させることにより、対数複製を保証した。
【００１３】
実際には、工程は通常、数個の独立した細胞培養に、より少量のウイルスアリコット（すなわち、各培養におけるウイルス数がより少ない）を積極的に接種することにより開始する。例えば、開始時の培養は、２００μｌ、２０μｌおよび２μｌのウイルスアリコットを含む。開始時の短い培養期間（例えば〜２４時間）の後、各細胞培養から同じウイルスアリコット（例では２００μｌ、２０μｌおよび２μｌ）を独立した新しい（予め感染されていない）培養に移植し、その一方で、開始時の培養は、細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるか否かをモニタする。この手順は、各場合において同じウイルスアリコットを用いて、複数の継代に渡って連続して継続し、ＣＰＥ観察用の培養を保存する。選択された培養数が完了した後、連続する培養継代の全てでＣＰＥを示された場合、より大きなウイルスアリコット群を終了させ、より小さなウイルスアリコット（例えば、２μｌ、０．２μｌおよび０．０２μｌ）を実施し、その手順を再度繰り返し、ＣＰＥ観察用の移植した後に細胞培養を保存してもよい。
【００１４】
この連続したより小さなウイルスアリコット培養手順のある段階において、与えられた細胞培養中にＣＰＥが観察されなくなる。この時点で、ＣＰＥが観察されなくなった継代を、１つ上の濃度の、ＣＰＥを示すウイルスアリコットと置き換える。そして次の継代は、先に実施したウイルスアリコットを用いて培養する。
【００１５】
ウイルスが細胞への感染がより効果的になり、また経時的に細胞培養により高い感染価を繰り返す傾向がある限り、一連の移植の際に、感染を維持するのに必要なウイルスアリコットはますます小さくなると了解される。感染を維持するのに最小のアリコットの使用は、ウイルスの複製が手順を通じて対数段階を維持していることを保証するのを補助する。
【００１６】
２０１代継代からの弱毒化継代ウイルスのＤＮＡ配列が、その後、従来の方法により決定された。この弱毒化ウイルスのＤＮＡ配列は、ＭＳＶ  ＪＡ−１４２継代番号２０１と命名され、そのＤＮＡ配列は配列番号１として与えられている。強毒性ウイルスＪＡ−１４２のＤＮＡ配列は、配列番号２として与えられている。
【００１７】
本明細書において、以下の定義を適用する。配列同一とは、公知のように２またはそれ以上のポリペプチド配列間での関係、すなわち、レファレンス配列とレファレンス配列と比較される配列との関係を呼ぶ。配列同一は、配列の類似性の程度が最も高くなるように最適にアラインした後、配列の鎖間での一致を測定することにより決定する。そのようなアラインメントに関して、配列同一は、位置対位置の基準で確認される。そのような位置同一の合計数をレファレンス配列の合計数で割り、配列同一（％）を与える。例えば、配列は、特定の部位でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その部位は同一である。
【００１８】
配列同一は、限定的ではない、以下の文献に記載された公知の方法により容易に計算される。
Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｎ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）
Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｇｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｙｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）
Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）
これらの教示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００１９】
配列同一を決定するための好ましい方法は、試験された配列間で最大の位置を与えることである。配列識別を決定する方法は、与えられた配列間で配列識別を決定するための公衆利用可能なコンピュータプログラムで分類することができる。
【００２０】
そのようなプログラムの具体例は、限定的ではない以下のプログラムを含む。
ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｕｅｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））
ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴマニュアル，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，これらの教示は引用することにより本明細書の一部をなす）から公衆利用可能である。
【００２１】
これらのプログラムは、与えられた配列とレファレンス配列との間での最大レベルの配列同一を得るために、デフォルトギャップウェイトを用いて、配列を最適にアラインする。実例として、レファレンスヌクレオチド配列と、例えば少なくとも９５％の配列同一を有するヌクレオチド配列を持ったポリヌクレオチドでは、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、レファレンスヌクレオチド配列の、各々１００のヌクレオチドにつき、５個所まで突然変異を含んでよいことを除いて、レファレンスヌクレオチドと一致している。言い換えると、レファレンスヌクレオチドに対して少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を持ったポリヌクレオチドにおいて、レファレンスヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが欠失若しくは他のヌクレオチドで置換されていてもよく、またはレファレンスヌクレオチドの全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドがレファレンスヌクレオチドに挿入されていてもよい。これらのレファレンスヌクレオチドの突然変異は、レファレンスヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端、またはこれらの末端の間のいずれかの場所で起こり、レファレンスヌクレオチド中のヌクレオチド類のいずれか、またはレファレンスヌクレオチド内の１またはそれ以上の連続する基を変化させる。
【００２２】
同じく、レファレンスアミノ酸配列と、例えば少なくとも９５％の配列同一を有するアミノ酸配列を持ったポリペプチドでは、ポリペプチドの与えられたアミノ酸配列は、レファレンスアミノ酸配列の各々１００のアミノ酸配列につき、５つまでのアミノ酸の変化を含んでもよい点以外はレファレンスアミノ酸配列と同一である。言い換えると、レファレンスアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを配列を得るためには、レファレンス配列のアミノ酸残基の５％までが欠失若しくは他のアミノ酸で置換されてもよく、またはレファレンス配列の全アミノ酸残基の数の５％までの数のアミノ酸がレファレンス配列に挿入されてもよい。レファレンス配列でのこれらの変化は、レファレンスアミノ酸配列のアミノ末端位置若しくはカルボキシ末端位置、またはこれら末端位置の間のいずれかの場所で起こってよく、レファレンス配列中の残基のうちのいずれか、またはレファレンス配列中の１またはそれ以上の基を変化させる。おそらく、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸の置換により異なる。しかし、保存的な置換は、配列同一を決定する際に一致に含まれない。
【００２３】
同様に、本明細書で使用される配列相同とは、２つの配列の相関を決定するための方法を呼ぶ。配列相同を決定するために、２またはそれ以上の配列は、上記のようにして最適にアラインされ、必要に応じてギャップが導入される。しかし、配列同一とは対照的に、配列相同を決定する際には、保存的なアミノ酸置換は、一致として計算される。言い換えると、レファレンス配列と、９５％の配列相同を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得る為には、レファレンス配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの９５％が一致しているか、または他のアミノ酸若しくはヌクレオチドとの保存的な置換を含む必要があるが、そうであれば保存的な置換を含まないアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの合計数の５％までの数のアミノ酸またはヌクレオチドが、レファレンス配列に挿入されていてもよい。
【００２４】
保存的な置換とは、アミノ酸残基若しくはヌクレオチドを、全体的な機能を実質的に変化させない、大きさ、疎水性等を含んだ特徴または特性が類似した他のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドで置換することを呼ぶ。
【００２５】
分離されたとは、その自然状態から人間の手により変化させられること、すなわち、それが自然に発生した場合に、変化させられるか、もしくは原初の環境から除去されるか、またはその両方を意味する。例えば、生体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で使用する用語では、分離されていない。
【００２６】
好ましくは、配列番号１と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列相同を有する配列は、そのような相同配列を含んだ弱毒化ウイルスで動物をワクチン接種して免疫を与えるのに効果的である。または、配列番号１と、少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一を有する配列は、そのような同一配列を含んだ弱毒化されたワクチンを動物に接種して免疫を与えるのに効果的である。
【００２７】
また、本発明の他の実施の態様は以下の（１）〜（３６）である。
（１）弱毒化が達成されるまで、各個体細胞培養組織でウイルスを接種および複製することによる、上記ウイルスを連続的に複製する工程を含むウイルスを弱毒化するための多段継代方法において、少なくとも上記のある細胞培養組織中で、対数的比率でウイルスが複製され、細胞変性効果の誘発の前に、少なくともある細胞培養組織からウイルスを含む検体を取り出し、および、次の各細胞培養継代組織へ該検体を接種する工程を含む、改良を特徴とする多段継代方法。
（２）上記取り出し工程が、上記細胞培養組織の接種後２４時間で発生する、上記（１）に記載の方法。
（３）細胞の単一層を含む上記継代組織が、７０％コンフルーエント以上である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）さらに、前記後代ウイルスが弱毒化されているかどうかを定期的に試験する工程を含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）さらに、上記取り出し工程後に上記のある細胞培養組織を保持し、および、上記保持された細胞培養組織中に細胞変性効果の誘発がされているか否かを観察する工程を含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記接種が最終的にＣＰＥを引き起こす最少数のウイルスを含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６３８を有するＰＲＲＳウイルス。
（８）ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６３８を有する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により非典型的ＰＲＲＳＶ  ＪＡ−１４２株から弱毒化されたウイルス。
（９）上記ウイルスが、細胞培養組織中で最低２００回継代された、上記（８）に記載のウイルス。
（１０）上記ウイルスが実質的に無毒である、上記（９）に記載のウイルス。
（１１）ブタで抗体応答を誘導することができる、上記（１０）に記載のウイルス。
（１２）上記抗体応答が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に特異的である、上記（１１）に記載のウイルス。
（１３）上記（８）に記載のウイルスを含むワクチン。
（１４）さらに、薬学的に許容しうる担体を含む、上記（１３）に記載のワクチン。
（１５）上記ワクチンが宿主動物で抗体応答を誘導することができる、上記（１３）に記載のワクチン。
（１６）上記宿主動物がブタを含む、上記（１５）に記載のワクチン。
（１７）上記抗体応答誘導が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に特異的である、上記（１５に記載のワクチン。
（１８）上記ウイルス株が、非典型的な豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株を含む、上記（１７）に記載のワクチン。
（１９）配列番号１で表されるＤＮＡ配列と少なくとも６５％の配列同一性を有する、分離されたＤＮＡ配列。
（２０）配列番号１で表されるＤＮＡ配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する、分離されたＤＮＡ配列。
（２１）上記（１９）に記載の配列を含むＰＲＲＳウイルス。
（２２）上記（２０）に記載の配列を含むＰＲＲＳウイルス。
（２３）弱毒化が達成されるまで、各個体細胞培養組織でウイルスを接種および複製することによる、上記ウイルスを連続的に複製する工程を含むウイルスを弱毒化するための多段継代方法において、少なくとも上記のある細胞培養組織中で、対数的比率でウイルスが複製され、細胞変性効果の誘発の前に、少なくともある細胞培養組織からウイルスを含む検体を取り出し、および、次の各細胞培養継代組織へ該検体を接種する工程を含む、改良を特徴とする繰返し継代方法により弱毒化されている、上記（２２）に記載のウイルス。
（２４）上記ウイルスが、細胞培養組織中で最低２００回継代される、上記（２２）に記載のウイルス。
（２５）上記ウイルスが、弱毒化されている、上記（２２）に記載のウイルス。
（２６）上記ウイルスが、実質的に無毒である、上記（２２）に記載のウイルス。
（２７）上記ウイルスがブタで抗体応答を誘導することができる、上記（２２）に記載のウイルス。
（２８）上記抗体応答が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に特異的である、上記（２７）に記載のウイルス。
（２９）上記（２０）に記載のＤＮＡ配列を含むワクチン。
（３０）さらに、薬学的に許容しうる担体を含む、上記（２９）に記載のワクチン。
（３１）上記ワクチンが宿主動物で抗体応答を誘導することができる、上記（２９）に記載のワクチン。
（３２）上記宿主動物がブタを含む、上記（３１）に記載のワクチン。
（３３）上記抗体応答が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に特異的である、上記（３２）に記載のワクチン。
（３４）上記ウイルス株が非典型的豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株を含む、上記（３３）に記載のワクチン。
（３５）上記配列の宿主動物への投与により効果的な免疫を与える、上記（２０）に記載のＤＮＡ配列。
（３６）上記（１３）〜（１８）のいずれかに記載のワクチンをブタに投与する工程を含む、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス株に対してブタを免疫する方法。
【実施例】
【００２８】
発明の好ましい実施態様
以下に示す実施例は、本発明の好ましい態様を示す。しかしながら、これら実施例は説明のためのものであり、これにより何ら本発明の総体的な範囲を限定するものでないと理解されるべきである。
【００２９】
実施例１
材料および方法
この実施例は、ウイルスが好ましくは対数関数的な複製となることを確実にすることによって弱毒化効果を最大限とするウイルス弱毒化の継代方法を記載する。ウイルスを一日おきに継代培養した（すなわち、ウイルスを含む栄養培地、非結合細胞、およびウイルス感染細胞培地由来の細胞壊死組織片を非感染培養の栄養培地に栄養培地に添加した。）。複数の培地を用いて、各インターバル毎にウイルスの添加量を変化させた。たとえば、最初に２００μｌを１つの非感染培地に転移し、第２の非感染培地に２０μｌを、第３の非感染培地に２μｌを添加した。最後に、複製サイクルが次期転移まで継続できる余地のある細胞量となるようにする。細胞がいずれＣＰＥを示せば方法は成功したと考えられる。しかしながら、ＰＲＲＳＶ惹起されたＣＰＥは対数関数的成長状態後となるまで現われないため、最終的にうまくいったかどうかはわからないまま、継代接種した（“ブラインド継代”）。ウイルス惹起ＣＰＥにおける継代の結果は、“獲得（ｔａｋｅ）”といえた。継代が獲得されてなければ、獲得できなかった最後の継代由来の最大希釈液を用いて再び継代を始めた。何代も継代するほど、ウイルスは細胞株中の複製に順応しやすくなり、その起源宿主における疾患症候の産生を低減することができた。これら変化は、複製の間におきるランダムな変異により生じる。
【００３０】
この方法を用い、本発明に係る代表的なウイルス、ＭＳＶ，ＪＡ−１４２を以下の手順により継代した。この菌種を、ＭＡＲＣ−１４５細胞培地で一日おきに継代接種した。プロセスに必要な細胞量および栄養培地量を最小限とし、かつ複合アリコット継代技術を簡素化するために２４ウエルプレートを用いた。細胞および栄養培地を各ウエルに添加し、細胞を集密的単層に形成またはほぼ形成（約７０％より多く）させた。栄養培地は、概略９０％でのアール（Ｅａｒｌｅ）液に調整された塩溶液最小必須培地（ＭＥＭ）、１０％ウシ胎仔血清および０．０５％ｍｇｍ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンからなる。使用した栄養培地の容量は、ほぼ１ｍｌである。通常、転移されるウイルスの各量あたりカラムの３ウエルを使用した。先代由来の栄養培地のアリコットを、カラム中の最初のウエルに細胞培地を調製後、４８または７２時間で転移し、最初のウエル由来の栄養培地を同一カラムの第２のウエルに７２または９６時間で、同一カラムの第３のウエルに９６または１２０時間で転移した。プレートは、ある時には該カラムの第４のウエルを使用し、ある時には使用せず、通常１週あたり２回セットアップした。継代接種の条件は、５％ＣＯ２を含む湿気雰囲気中、３７℃に保持した。
【００３１】
各継代に対し、ウイルス量がＣＰＥを惹起するに足りる量であるかを測定するため、大きさの異なるアリコット（ウイルス含有量の異なる）を試験した。たとえば、別々のアリコット転移（継代）系それぞれ２００μｌ、２０μｌおよび２μｌを最小アリコットが、ＣＰＥを産生する最小のアリコットに転移しうる最終物に一致するＣＰＥを示すまで使用した。各アリコット群の最小アリコット（たとえば０．２μｌ）ＣＰＥの結果に一致するように試験する場合、より少量（たとえば０．２μｌおよび０．０２μｌ）を試験した。ある濃度でＣＰＥを示さない時、その培地系は、その継代でのＣＰＥでは結果のでない量の次に少ない量で再び開始した（すなわち、２５代継代の２μｌ転移がＣＰＥの産生に不充分であるが、２５代継代の２０μｌ転移であれば達成できるのであれば、２μｌ転移液（ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）とともに２０μｌを用いて２６代継代のための再開を繰り返す。）。
【００３２】
この方法を用いて、ＣＰＥを獲得するための転移に必要な最小ウイルス量を決定した。ウイルスは、下記量のウイルス感染栄養培地（ＣＰＥの結果が得られる高希釈を反映し［すなわち最小アリコット］、他の希釈も同様に機能するであろうと考えられるような希釈）を用いることにより一日おきに充分に継代された。
【００３３】
【表１】
2010239973.tif 000002
【００３４】
結果および考察
上記方法で使用したウイルスの継代により、ＰＲＲＳＶ，ＪＡ−１４２は弱毒化した。親代のように、ウイルスは細胞培地中でより順応して複製するようになり、それ故、継代保持のために転移されるウイルス感染栄養培地の要求量はより低減した。極めて少量のウイルス感染栄養培地（たとえば０．２μｌおよび０．０２μｌ）を用いる転移では、別々の希釈液が必要であった。この希釈は、少量のウイルス感染栄養培地を多量の栄養培地に添加することにより成される。たとえば、０．２μｌ、２μｌのウイルス感染栄養培地の転移を獲得するために、２０μｌの栄養培地に添加され、その希釈培地の２μｌを当該系の次ぎの培地に添加する。この試みにより、ＣＰＥ結果の得られる高希釈物が使用され、その時ウイルス継代に必要な最小量が決定する。一日おきの継代により、ウイルスは常に対数関数的に複製されることを保証した。また日毎の継代接種は、ウイルス複製のための充分な細胞数であったことを保証した。
【００３５】
複製の間、弱毒化のみが起きるという結果であるような変異（おそらく累積）により、全ての細胞に感染させ、次世代転移の前に、進行を遅くさせるかまたは停止させることは本質的に利点がない。前記ＰＲＲＳＶの研究に基づけば、複製サイクルは約８時間であり、それゆえ、ウイルス感染栄養培地由来のウイルスの最小量を一日おきに非感染栄養培地に転移すれば、ウイルスは常に複製するに充分な細胞と共存することが分った。
【００３６】
すでに分ったように、この方法を用いた継代では、それ以前には不可能と考えられていたような時間短縮である（すなわち各継代時間の要求する時間は短い。）。このことはウイルス弱毒化に充分な高次継代が求められるとき、特に重要である。従来の方法を用いれば、各継代は３日おきで行われるが、本発明の方法を用いれば、２００代継代に要求される工程に費やすのは４００日より少ない日数であろう。
【００３７】
実施例２
材料および方法
この実施例は、２００代ＰＲＲＳウイルス、ＪＡ−１４２は宿主動物において、６回継代した時、毒性が戻るかを試験した。この研究は、６グループで行なった。グループ１の５頭のブタ（プリンシプルグループ）に、ＰＲＲＭＳＶ、２００代ＪＡー１４２を内鼻腔接種し、一方、グループ１Ａの３頭のブタ（コントロールグループ）に滅菌希釈液を内鼻腔接種した。これら動物には、試験の間、随意に市販飼料および水を与えた。両処理グループのブタを、毎日臨床的に観察した（外観、呼吸、便など）。６日後、動物の体重を測定し、血液採取した。各動物の肺疾患スコアを記録した後、肺洗浄物を収集した。それぞれの戻し継代（Ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）１および１Ａを調製するため、肺洗浄物を凍結し、一度解凍し、血清２．０ｍｌおよびグループの各動物からの肺洗浄物２．０ｍｌを用いてプールを調製した。このプールを用いて、グループ２およびグループ２Ａの動物に試みた（内鼻腔に）。このプロセスは、グループ３および３Ａに対し、６および６Ａを介して繰り返された。各グループの動物は、別々であるが、同一条件の舎で飼育した。
【００３８】
以下のように接種した血液サンプルを収集し、体温を観察した。各動物の直腸温度を、−１ＤＰＥ（暴露後日数）から６ＤＰＥおよび定期的に測定し、同一グループの他動物の温度とともに平均した。各動物の健康状態を試験の間毎日観察した。結果は全部、日別観察形式でスコア記録した。記録内容は以下のとおりである。
【００３９】
１．外観
正常＝０；元気がない＝１；興奮＝２；昏睡／死亡＝３０。
２．呼吸
正常＝０；くしゃみ＝１；咳＝１；速／短＝２；呼吸困難＝３。
３．糞便
正常＝０；乾燥＝１；弛緩＝２；液便＝３。
４．目
正常＝０；涙目＝１；にごり＝２；陥没＝３。
５．鼻孔
正常＝０；水鼻＝１；赤／炎症＝２；潰瘍痂皮＝３。
６．口
正常＝０；よだれ＝２；痂皮＝３。
７．動作
ＮＡ
８．食欲
正常＝０；減退＝１；食欲不振（なし）＝３。
９．他
【００４０】
また動物は、接種および剖検に先だって体重測定した。各グループあたりの平均体重を算出して比較した。試験およびコントロール物質に動物を暴露し、ＰＲＲＳ固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）および血清中和（ＳＮ）検定を行なった。血清試料からＰＲＲＳＶを分離する試みがＭＡ−１０４細胞で成された。ワクチン接種の前および後で、全白血球細胞カウント数を、ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ  ＭＯＤＥＬ  Ｚ１，Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，マイアミ、フロリダ州を用いて測定した。剖検では、各動物の肺スコアを記録した。肺のスコアは、肺を７つの部位に分け、各部位を囲む全肺面積に対するパーセンテージとして肺発症量のパーセンテージ（各部位あたり損傷または発赤として影響のみられる肺面積を、全肺の概略面積分を乗じたパーセンテージ）を求めた。
【００４１】
発症の左肺尖（Apical）ローブ％                  Ｘ    ０．１０  ＝
発症の左噴門（Cardiac ）ローブ％                Ｘ    ０．１０  ＝
発症の横隔膜（Diaphragmatic ）ローブ％          Ｘ    ０．２５  ＝
発症の右肺尖ローブ％                            Ｘ    ０．１０  ＝
発症の右噴門ローブ％                            Ｘ    ０．１０  ＝
発症の横隔膜ローブ％                            Ｘ    ０．２５  ＝
発症の右肺中間ローブ％                          Ｘ    ０．１０  ＝
トータル（最右カラム中全数値の総量）                            ＝
【００４２】
結果および考察
各グループのブタを接種後、６日間観察した。臨床スコアは、すべてのグループで低かった。臨床スコアを表１に示す。
【００４３】
【表２】
2010239973.tif 000003
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
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【００４６】
【表５】
2010239973.tif 000006
【００４７】
直腸温や日々の体重増加には、重要な差異は見られなかった。すべての肺の記録（ｌｕｎｇ  ｓｃｏｒｅ）は陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）であった。
【００４８】
血清学的には、ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比およびＳＮ滴定は、各グループの試験期間を通して、陰性であった。ウイルス分離がすべての血清サンプルおよび肺洗浄について試みられた。６日目までに、ＪＡ−１４２、パッセージ２００および引き続いてのバックパスにより与えられたグループからの血清サンプルの６０−１００％は、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であった。生理食塩水により与えられたグループは、陰性であった。最初の三つのパスにおいて、ウイルスは肺洗浄でブタの２０−４０％のみから回収されたが、最後の三つのパスにおいて、ウイルスはブタの５０−８０％から回収された。
【００４９】
このデータによれば、ＪＡ−１４２パッセージ２００は、ブタを６回通ったときにおいて、毒性に戻らなかった。
【００５０】
実施例３
材料および方法
この実施例は、ＭＳＶ、ＪＡ−１４２、パッセージ２００の安全性の減衰のレベルが、宿主動物（ｈｏｓｔ  ａｎｉｍａｌ）における６回のバックパッセージの間に、大きくは変化しないことを証明した。減衰のレベルまたは安全性の評価は、妊娠している雌ブタモデルを用い、生殖能力への影響をモニタリングすることにより行われた。このモデルは、最も感度の高い試験法であり、毒性テストの主観的要因（ｓｕｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）に依存しない。この実施例は、四つのグループ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）からなり、各グループは七匹の雌ブタを有していた。グループＡは、ＰＲＲＳ  ＭＳＶ、ＪＡ−１４２パッセージ２００を鼻腔内に接種された。グループＢは、ＪＡ−１４２、パッセージ２００、バックパッセージ６を鼻腔内に接種された。グループＣは、正常なコントロールとするために、無菌の希釈剤を鼻腔内に接種された。グループＤは、ＰＲＲＳＶ  ＪＡ−１４２、パッセージ４を鼻腔内に接種された。被験物質（ＪＡ−１４２、パッセージ４での試行）は、約９３日間の妊娠期間において与えられた。雌ブタの体温は、接種後の最初の７日間、モニタリングされた。雌ブタからは、血液サンプルが週に一度および分娩のときに採取された。子ブタからは、誕生時、７日時および１４日時に血液サンプルが採取され、体重が記録された。各動物の健康状態は、調査期間に一致して、および、分娩後１４日間、毎日モニタリングされた。分娩能力は、誕生した子ブタの健康状態を観察することにより評価された。
【００５１】
ＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡ検定（ａｓｓａｙ）は、雌ブタの被験物質への曝露に続いて行われた。ＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡ検定は、分娩後毎週、子ブタの血清についても行われた。被験物質への曝露に続いて、血清サンプルからＰＲＲＳＶを分離する試みが、ＭＡ−１０４セルに対して行われた。直腸温は、０接種後日数（ＤＰＶ）から７ＤＰＶまで測定され、各グループの平均温度が決定された。接種の前および後に、総白血球数が実施例１と同様に決定された。実施例２と同様の雌ブタの臨床観察が、−１ＤＰＶから分娩まで行われた。子ブタの臨床観察が、分娩から誕生後１４日まで行われた。最後に、検死において、各子ブタの肺は、ラングインバルブメント（ｌｕｎｇ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）のパーセントを記録された。
【００５２】
結果
ＥＬＩＳＡの結果は、この調査に用いられた動物がＰＲＲＳＶにナイーブ（ｎａｉｖｅ）であったことを示す。ウイルス接種材料、グループＡ、ＢおよびＤを受けたこれらの動物は、処理後１４日で血清変化した（ｓｅｒｏ−ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）。グループＢの三匹の雌ブタは、処理後１４日において陰性のままであった。分娩の時、グループＢの陰性の雌ブタは、ＰＲＲＳＶの抗体に対して陽性という結果が出た。
【００５３】
ブタのＥＬＩＳＡの結果は、グループＡおよびＢの雌ブタに生まれた子ブタの大多数（ｍａｊｏｒｉｔｙ）は、授乳（ｎｕｒｓｅｄ）後、サンプルとされた。分娩後ゼロ日（０ＤＰＦ）に陰性であったこれらのブタは、７ＤＰＦには陽性という結果が出た。グループＣの雌ブタに生まれたすべてのブタは、調査を通して、血清陰性（ｓｅｒｏ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）という結果が出た。大部分は死産またはひからびた死体（ｍｕｍｍｉｅｓ）のいずれかであったため、グループＤからは、少数のブタのみが試験を受けた。試験されたこれらのブタの半分は、血清陽性（ｓｅｒｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であった。このことは、血清陰性のブタは、授乳前にサンプルとされたか、授乳することができなかったかを示した。グループＤの雌ブタに生まれたすべての子ブタは、７ＤＰＦ前に死亡した。グループＡおよびＢの雌ブタからのＰＲＲＳＶの分離は、散発した。ＥＬＩＳＡ試験の結果が、これらの雌ブタがウイルスの被験物質を成功裡に接種されたことを示したにもかかわらず、多くの場合、血清からのウイルスの分離は陰性のままであった。
【００５４】
グループＡおよびＢの雌ブタに生まれたブタの大部分は、調査の実施の間、ウイルスの分離に対して陽性という結果を示した。グループＡの一匹の雌ブタからの同腹子は、決して陽性という結果を示さず、グループＢの一匹の雌ブタからの同腹子は、八匹の子ブタに対して二匹のみがウイルスの分離に対して陽性という結果を示した。グループＣの雌ブタに生まれた子ブタからは、ウイルスは回収されなかった。グループＤの雌ブタから生まれた子ブタの大部分（７１％）からは、ウイルスが回収された。
【００５５】
処理後の直腸温は、注目すべきものではなかった。ＭＳＶ、バックパッセージ６または無菌の希釈剤のいずれかで処理されたグループは、１０１．７゜Ｆを超えることはなかった。グループＤ、即ち、ＪＡ−１４２、パッセージ４で処理されたものは、（七匹中）四匹の雌ブタが１０２゜Ｆを超え、一匹はある一日１０３．４゜Ｆに届く温度を経験した。グループＡ（ＭＳＶで処理）およびＢ（ＭＳＶ、バックパッセージ６で処理）の雌ブタに生まれた子ブタの体重増加能力は、グループＣのコントロールの雌ブタに生まれたブタのそれよりも優れていた。１４日間の観察期間における平均体重増加は、７．９ポンドであった。グループＡについては７．７ポンドであり、グループＢおよびＣについては６．９ポンドであった。体重増加の差異は、１４日まで残った同腹子の数とは無関係であった。平均の同腹子の数は、１４分娩後日数（ＤＰＦ）において、グループＡについて９、グループＢについて７、グループＣについて１０であった。グループＤの雌ブタに生まれたブタで、３ＤＰＦを超えて生存したものはなかった。
【００５６】
グループＡ、ＢおよびＣの雌ブタについての白血球（ＷＢＣ）数は、比較的一定にとどまっていた。試行前の値の平均パーセンテージは、観察期間の間、９２％以上であった。グループＤの三匹の雌ブタは、ＷＢＣ数が期待される通常の範囲（７−２０×１０６／ｍｌ）より低かった。
【００５７】
接種後の臨床観察は、グループＡおよびＢの雌ブタについては、注目すべきものではなかった。グループＣのいくつかの雌ブタは、臨床上の兆候を数日の期間において経験したことが観察された。観察された臨床上の症状の大部分は、食欲減退、呼吸系の症状および機能低下（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）の範疇に属するものであった。グループＣの一匹の雌ブタは、試験３１日目に慢性細菌性肺炎で死亡した。グループＤの七匹の雌ブタのうち六匹は、臨床上の兆候が観察された。それは主に、種々の程度の食欲の欠如であり、食欲減退から拒食症までの範囲にわたっていた。雌ブタについての臨床観察の結果は、表２に示される。
【００５８】
【表６】
2010239973.tif 000007
【００５９】
【表７】
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【００６０】
【表８】
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【００６１】
【表９】
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【００６２】
【表１０】
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【００６３】
【表１１】
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【００６４】
子豚の臨床的観察は２つの主たるカテゴリー、死と食欲減退に集約される。リッター当たりの平均死亡数（ＤＰＬ）の分野でＡ、Ｂ、Ｃ群の間で大きな違いはなかった。Ａ群は、１．３ＤＰＬの平均値であり、Ｂ群は２．４ＤＰＬの平均値、Ｃ群は２．０ＤＰＬの平均値であった、そしてＤ群からは、分娩後３日を越えて生存する子豚はなかった。子豚の臨床スコアは表３に示される。
【００６５】
【表１２】
2010239973.tif 000013
【００６６】
【表１３】
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【００６７】
【表１４】
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【００６８】
【表１５】
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【００６９】
【表１６】
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【００７０】
【表１７】
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【００７１】
【表１８】
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【００７２】
【表１９】
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【００７３】
【表２０】
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【００７４】
【表２１】
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【００７５】
【表２２】
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【００７６】
【表２３】
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【００７７】
【表２４】
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【００７８】
分娩能力結果は、様々な処置グループ間で最も強烈な相違と類似性を提供した。処置は、同腹子の大きさには影響しないであろうから、分娩結果を比較する最も適した方法は、パーセンテージ値を用いて行うことであろう。グループＡの平均生産率は８５％（ＳＤ＋／−９．６）であった。グループＢの平均生産率は８９％（ＳＤ＋／−１１．６）であった。対照グループ（グループＣ）の平均生産率は８３．４％（ＳＤ＋／−７．９）であった。グループＡ、ＢおよびＣの平均死産率はそれぞれ、８．８（ＳＤ＋／−９．６６）、６．６（ＳＤ＋／−９．７）、１４（ＳＤ＋／−１１．３９）であった。グループＡ、ＢおよびＣの雌豚からの平均ミイラ化出産率はそれぞれ、６．１（ＳＤ＋／−６．０１）、３．９（ＳＤ＋／−４．４５）および２．６（ＳＤ＋／−４．０１）であった。グループＤの平均生産率、平均死産率、雌豚からの平均ミイラ化出産率はそれぞれ、８．７（ＳＤ＋／−８．９２）、１０．７（ＳＤ＋／−１１．３９）および８１．９（ＳＤ＋／−１７．１８）であった。
【００７９】
この実施例の結果は、宿主動物に６回通過させた後のＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２００の安定性を実証していた。ＭＳＶで処置した雌豚群（グループＡ）と、戻し継代（Ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）６ウイルスに暴露した雌豚（グループＢ）との間には、分娩能力、白血球減少、直腸温度、および雌豚または子豚の臨床観察のカテゴリーで大差はなかった。さらに、グループＡとグループＢでのこれらの同じカテゴリーでの結果は、滅菌希釈剤で処置したグループＣにより達成されるものに匹敵していた。最後に、ＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代４の毒性親ウイルスに暴露した雌豚の能力は、明らかに、ＭＳＶの弱毒レベルと、Ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ６、ＪＡ−１４２ウイルスによる毒性転化がないことを示していた。
【００８０】
実施例４
材料および方法
この実施例では、ＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２０１を１０倍濃度で投与した際の安全性と弱毒レベルを評価した。妊娠中の雌豚モデルで調査を実施し、生殖能力についてこの用量の効果を監視した。この調査は、３つのグループＡ、ＣおよびＤからなっていた。グループＡには、ＰＲＲＳ  ＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２００を鼻腔内接種した。グループＣには、正常な対照グループとして作用すべく、滅菌希釈剤を鼻腔内接種した。グループＤには、１０ｘＪＡ−１４２、継代２０１を鼻腔内接種した。全ての接種物は、約９３日の妊娠期間中与えた。接種（ワクチン接種）後の最初の７日間、雌豚の体温を監視した。週に１回、それから分娩時に雌豚から血液試料を採取した。接種の前後に、実施例２と同様に、全白血球量を調べた。分娩前後の１４日間、毎日各動物の健康状態を監視した。−１ＤＰＶから分娩まで、雌豚の臨床観察を行った。生まれた子豚の健康状態を観察することにより、分娩能力を評価した。雌豚を試験製品に暴露した後に、ＰＲＲＳＶ  ＥＬＩＳＡアッセイを行った。試験製品に暴露した後、ＭＡ−１０４細胞で、血清試料からＰＲＲＳＶの分離を試みた。分娩から生後１４日目まで、子豚の臨床観察を行った。出生時、生後７日目および１４日目に子豚から血液試料を採取した。分娩後週１回、子豚の血清でＰＲＲＳＶ  ＥＬＩＳＡアッセイを行った。出生時、分娩から７日目、および検死時に子豚の体重も計量した。検死時に、各子豚の肺を、肺障害パーセントでスコアをつけた。
【００８１】
結果および考察
１０倍用量のＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２０１を与えたグループと、正規用量のＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２００を与えたグループと、滅菌稀釈液を与えたグループとの間で有意の相違は認められなかった。従って、ＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２００の安全性および減衰性、ならびに上記グループ同士の比較結果に有意の相違が認められないことに基づき、１０倍用量のＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２０１は安全で、減衰し、かつＰＲＲＳＶに対する抗体の誘起に有効であることが判明した。
【００８２】
実施例５
材料および方法
この実施例では、ＭＳＶ＋５  を表わすＰＲＲＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２０５を最小ワクチン用量で用いた場合、飼養ブタの呼吸器攻撃実験モデルに効力を発揮することを証明した。ブタを３グループに分けた。グループ１には、ＰＲＲＳ  ＭＳＶ、ＪＡ−１４２、継代２０５を２．０ｌｏｇｓ／用量の力価で筋肉内接種した。グループ２には、滅菌稀釈液を筋肉内接種した。グループ３は正常対照とした。ワクチン接種後２８日目にグループ１および２のブタを、１４４のＲＦＬＰパターンを有するＰＲＲＳＶ分離物で攻撃した。ブタの体温をワクチン接種後最初の７日間、および攻撃後は毎日モニタした。各個体の体重を、ワクチン接種時、攻撃時、研究の間中週１回、および検視時に測定した。血液試料をワクチン接種後週１回、および攻撃後は１日おきに採取した。
各個体の健康状態を研究期間中毎日モニタした。検視時、各個体を殺し、実施例２の場合同様肺を肺関与（ｌｕｎｇ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）のパーセンテージについて評価した。ブタを試験品に暴露し、かつ攻撃してからＰＲＲＳＶ  ＥＬＩＳＡアッセイを行なった。
試験品への暴露後、ＭＡ−１０４細胞において血清試料からのＰＲＲＳＶ分離を試みた。ウイルス分離およびＥＬＩＳＡの結果を、陽性個体のパーセンテージが各グループで同じであるかどうかを検定するカイ二乗分析を用いて分析した。実施例２同様、白血球計数を行なった。
【００８３】
結果および考察
この実施例のあらゆる局面において、グループ１のブタ（ワクチン接種したブタ）はグループ２のブタ（滅菌稀釈液を与えたブタ）より良好であった。臨床評価、直腸温度、および肺関与のパーセンテージではそのいずれにおいても、滅菌稀釈液を与えたブタの方が高値を示した。体重増加および白血球数は滅菌稀釈液を与えたブタの方が少なかった。ワクチンを与えたグループでは、攻撃後４日目からウイルス血症の著しい低減もみられた。攻撃後１０日目および１１日目、ワクチン接種グループではウイルス血症陽性の個体数はさらに減少したが、滅菌稀釈液を与えたグループでは該個体数に変化は無かった。
【００８４】
ＥＬＩＳＡを用いて、ワクチン接種および攻撃の前およびあとの抗ＰＲＲＳＶ血清状態をモニタした。ワクチン接種時、ブタは総て陰性であった（Ｓ／Ｐ比＜０．４）。ワクチン接種した個体を含め、総てのブタが７  ＤＰＶ（ワクチン接種後日数）において陰性であった。７日後、試験の結果、ワクチン接種したブタ２２頭中２１頭がＰＲＲＳＶに対する抗体に関して陽性であると判明した。グループ１のブタのうち２頭は攻撃前の期間中陰性のままで、攻撃後８日目（８  ＤＰＣ）に血清学的に変換された。グループ２のブタは総て、トライアル０日目に陰性で、かつ攻撃前の期間中陰性であり続けた。トライアル３９日目（８  ＤＰＣ）、試験の結果、ワクチン接種せずに攻撃したブタ２２頭（グループ２）中１７頭が血清反応陽性と判明した。グループ３のブタ（正常対照）は総て、研究の間中血清反応陰性のままであった。
【００８５】
血清からのウイルス分離を、ワクチン接種の前およびあとに行なった。ワクチン接種した２２頭のブタのうち、２  ＤＰＶまでに１７頭、４  ＤＰＶまでに１８頭、７  ＤＰＶまでに１９頭が陽性となった。ワクチン接種後、ワクチンウイルスを、１頭のブタからは全く回収せず、その他のブタからは０  ＤＰＣまで回収しなかった。このような結果は、ワクチン接種後観察期間中のこれらのブタの血清反応陰性状態に対応する。攻撃時、ワクチン接種したブタの５５％がウイルス血症陽性であった。攻撃後、このパーセンテージは８２％に上昇し（２  ＤＰＣ時点）、その後漸次低下して１１  ＤＰＣには９％となった。グループ２のブタは、０  ＤＰＣにはいずれも陰性であったが、２  ＤＰＣに陽性が８２％となり、４  ＤＰＣには９１％となった。６  ＤＰＣおよび１０  ＤＰＣにはグループ２の約８２％がウイルス陽性で、１１  ＤＰＣにはこのグループの７３％が陽性であった。グループ３の正常対照は研究の間中陰性のままであった。
【００８６】
グループ２について直腸体温測定した結果、グループ全体が上昇することがわかった。このグループの半分の豚は、１１日間の観察期間のうち２日以上、攻撃前の平均値よりも１°Ｆ超高い体温を示した。これに対し、ワクチン接種を行ったグループは、２２匹のうち４匹のみが攻撃前の平均値よりも１°Ｆ超高い体温を示した。２日以上の体温上昇を示した動物の平均日数は、グループ１では２．２日であり、グループ２では４日であった。グループ３の豚で、攻撃前の平均値よりも１°Ｆ超高い体温を２日以上示した豚はなかった。
【００８７】
体重増加は１１日間観察した。グループ３の豚は平均１．０６ポンド／日、グループ２の豚は平均０．９４ポンド／日、グループ１の豚は平均０．５３ポンド／日の体重増加を示した。したがって、ワクチン接種を行わないで攻撃を行った豚は、ワクチン接種を行った豚と比べて約５７％の体重増加を示し、通常にコントロールされた豚の約５０％の体重増加を示した。
【００８８】
攻撃後に白血球減少（白血球数）を観察した。グループ３の試験日３３（２ＤＰＣ）の平均値は、攻撃前の平均と比べて５％減少した。グループ２では、白血球数は平均４１％減少し、１１ＤＰＣまで攻撃前の水準に戻らなかった。ワクチン接種を行ったグループの試験日３４（３ＤＰＣ）の平均値は、グループ平均で１２％減少した。白血球数は、次の日には攻撃前の水準に戻り、観察期間中、攻撃前の水準を維持していた。
【００８９】
毎日の臨床観察は、試験日２８（−４ＤＰＣ）から試験日４２（１１ＤＰＣ）の間行った。すべての豚は、攻撃前には何ら臨床上の徴候は観察されなかった。グループ３は攻撃後も臨床上の徴候は観察されなかった。グループ２のうち５匹で、攻撃後にいくつか臨床上の徴候が観察された。これらの徴候は、６ＤＰＣには明白となったが、重大なものではないと考えられる。ワクチン接種を行った豚については、攻撃後１１日間の観察期間で１つだけ臨床上の徴候が観察された。
【００９０】
本研究終了時に、観察された肺の損傷について診断した。グループ３の豚の肺は正常であり、グループの平均スコアは０．０２であった。グループ２の個々の豚のスコアは、低いもので３３から高いもので９８まであり、グループの平均スコアは７８．３３であった。ワクチン接種を行ったグループは、３０から９０の範囲であり、グループの平均スコアは５３．２０であった。
【００９１】
本実施例データは、変形した生ワクチンである変種ＰＲＲＳウイルスワクチンの効能を示している。このワクチンは、ＭＳＶ（ＪＡ−１４２、継代２０５）の上の５番目の継代を含み、最小服用量２．０logs／doseで投与される。このワクチンの効能は、肺損傷の顕著な減少、攻撃後の顕著な白血球減少および攻撃後の発熱により示される。また、ワクチン接種を行って攻撃した豚は、通常にコントロールされた豚を攻撃した場合と比較すると、通常の成長速度を維持しており、ワクチン接種を行わずに攻撃した豚よりも著しく良好な成長速度を示した。
【００９２】
実施例６
材料および方法
この実施例では、４つのグループ、それぞれ２０匹の豚からなるグループ１、２および３、および１０匹の豚からなるグループ４を比較する。グループ１には、ＰＲＲＳ  ＭＳＶ，ＪＡ−１４２，継代２０５を、約２．５ｌｏｇｓ／ｄｏｓｅタイターで筋肉摂取（ＩＭ）した。グループ２には、ＰＲＲＳ  ＭＳＶ，ＪＡ−１４２，継代２０５を、約５．０ｌｏｇｓ／ｄｏｓｅタイターで、鼻腔摂取した。グループ３には、滅菌希釈剤を筋肉摂取した。グループ４は、精密にコントロールして行った。豚は、ワクチン摂取後２８日目に、ＲＦＬＰパターン１４４をもつ南ダコタ州立大学（ＳＤＳＵ）から分離したＰＲＲＳＶを用いて攻撃した。豚の体温は攻撃後毎日測定した。各動物は、ワクチン摂取時、攻撃時、研究期間中毎週、および検死時に体重測定を行った。血液サンプルはワクチン摂取後毎週、および攻撃後は２日ごとに採取した。各動物の健康状態は研究期間中毎日観察した。研究終了時に動物を殺し、肺を含む部位を切り取って肺を採取した。
【００９３】
この豚について下記の試験（ｔｅｓｔ  ａｒｔｉｃｌｅｓ）および攻撃を行った後、ＰＰＲＳＶ  ＥＬＩＳＡ試験を行った。血清サンプルからのＰＲＲＳＶの分離は、下記試験を行った後、ＭＡ−１０４細胞についても同様に行った。ＷＢＣ値および臨床観察は、実施例２と同様にワクチン摂取後に行った。
【００９４】
結果および考察
ワクチン摂取後０日目（ＤＰＶ）に、１４ＤＰＶでＳ／Ｐ比＜０．４を示したことから、この実施例に用いたすべての豚はＰＲＲＳＶに対して血清学上ネガティヴを示し、グループ１の豚の７０％およびグループ２の豚の９５％が、抗ＰＲＲＳＶ抗体に対してポジティヴを示した。ワクチン摂取を行ったグループ１の豚のうち１匹だけが、攻撃前期間中血清ネガティヴを示した。この豚は、攻撃後（ＤＰＣ）７日目に血清ポジティヴを示した。グループ３および４の豚すべてが攻撃前期間中血清ネガティヴを示した。９ＤＰＣで、滅菌希釈剤を筋肉摂取したグループ３の豚すべてがＰＲＲＳＶ抗体のＥＬＩＳＡ試験に対してポジティヴを示した。通常にコントロールされたグループ４は、この研究期間中ネガティヴを示した。
【００９５】
このウイルス分離の結果は血清学的結果と非常に高い相関関係を示した。一頭の豚だけが血清からのウイルス分離に対し陰性を保ち、これはワクチン接種後の血清陰性状態と合致した。これらの結果は、ワクチン接種後のウイルス血症とワクチン投与による血清学的転換との関係を示唆する。１４ＤＰＶにおいて、血清陽性が７０％だったグループ１に対して、グループ２は１００％血清陽性であった。多量投与グループ（グループ２）は１４および２１ＤＰＶにおいて、それぞれ８５％ならびに９０％であった。比較として、少量投与グループ（グループ１）は、同一のテスト実施日において５５％ならびに８５％であった。
【００９６】
抗原投与の後、グループ３の動物の８９％が２日間以上にわたり抗原投与前より華氏１度以上高い温度を示した。グループ１では動物の１．７５％が２日間以上にわたり華氏１度以上高い温度を示した。グループ２の動物の４５％だけが高温を示したが、それに対して通常管理グループ（グループ４）の３０％が観察期間１１日間のうち２日以上、高温を示した。
【００９７】
多量投与と少量投与のいずれも、ワクチン接種後の成長に何ら害を与えないと見られる（−３ＤＰＶから２８ＤＰＶ）。グループ１および２の一日の平均増加体重は、それぞれ一日当たり０．７７ポンドならびに０．７６ポンドであった。比較として、グループ３および４はそれぞれ一日当たり０．７７ポンドならびに０．７８ポンドであった。抗原投与の後、ワクチン接種されたグループは希釈殺菌剤のグループを凌ぎ、その差は一日当たり０．０５ポンド（グループ１）ならびに０．１５ポンド（グループ２）だった。通常管理グループはワクチン接種グループに対し、同期間中、一日当たり平均０．４から０．５ポンド劣った。
【００９８】
希釈殺菌剤処置を受けたグループであるグループ３の８４％（１９頭中１６頭）に、抗原投与後１日以上、ＷＢＣに２５％以上の低下が見られた。通常管理のグループは１０頭中３頭（３０％）に同様の低下が見られた。抗原投与後、ワクチン接種グループでは、少量投与（グループ１）および多量投与（グループ２）はそれぞれ２０頭中１１頭（５５％）ならびに２０頭中３頭（１５％）に、１日間以上にわたり２５％の白血球減少症が見られた。
【００９９】
抗原投与前に行われた臨床観察では、これらの豚は良好な健康状態を示した。抗原投与後、抗原投与された豚（グループ１、２、および３）に健康状態レベルの大きな変化は見られなかった。無気力、呼吸器（障害）の兆候、および食欲喪失が観察されたが、これらの症状は軽度であった。グループ２の豚のうち１頭について報告された臨床的兆候は、その豚がかかっていた細菌性肺炎（後述の肺障害に関する検討参照）に起因すると考えられる。通常管理のグループ（グループ４）は、１１日間の観察期間中、特に臨床的徴候は見られなかった。
【０１００】
実験終了時において、これらの豚は殺され、肺の影響を記録しＰＲＲＳ様の棒変について観察された。（肺の）各葉について影響の割合が記録され、肺の総容量に対する割合を乗じて算出された。例えば横隔膜葉について、５０％の肺の影響は肺の総容量の１２．５％に相当させるべく２５％を乗じた。得られる最大スコアは１００である。通常管理（グループ４）のグループ平均スコアはゼロだった。希釈殺菌剤処置グループのグループ平均スコアは７０．０８だった。ワクチン処置グループの平均スコアは、少量投与（グループ１）は４８．８３、大量投与グループ（グループ２）は１７．７６だった。一頭の豚について６２．５というグループ２の中で最も高い肺スコアが記録された。この豚の肺に見つかった病変は、上述の細菌性肺炎に関係があった。
【０１０１】
この実験の結果から、どちらの非典型的ＰＲＲＳ  ＭＳＶワクチン投与レベルでも、ＰＲＲＳＶによって生じる呼吸器系疾患にかかわる臨床的徴候の程度が減少した。多量投与は最少量投与に勝ることが、肺の病変のスコアにおける顕著な減少によって示されている。
【０１０２】
実施例７
材料および方法
本実施例では、弱毒化したＭＳＶである２０１回継代からのＪＡ−１４２および現場分離ウイルスＪＡ−１４２の継代３の配列を決定した。弱毒化ウイルスの分離は、ＰＲＲＳに感染した豚から分離したＰＲＲＳＶのＭＡ−１０４シミアン細胞の２０１回継代を表す原種ストックから取得した。
【０１０３】
このウイルスは、サル肝臓細胞線、またはＭＡ−１０４およびＵＳＵ−１０４とも称される２６２１細胞上で成長させた（Ｇｒａｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１８１  Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１１２−１１９（１９８６）、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，北米における豚不妊・呼吸症候群ウイルス（分離株ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２）の分離およびノトバイオート豚における実験的な疾病の再現、４  Ｊ、Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７−１２６（１９９２））（これらの教示は引例することにより本明細書の一部をなす）。細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良された鷹のＭＥＭ培養液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１０％牛の胎児の血清および５０μｇ／ｍｌのゲンタミシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に入った７５ｃｍ２プラスチック製組織培養フラスコの中で３７℃、湿度５％のＣＯ２雰囲気で培養された。細胞は５〜７日間隔で継代を維持した。細胞はトリプシンｖｅｒｓｅｎｅを用いて表面から取り除かれ、１：４に分割された。細胞を感染させるために、培養液をデカントし、ウイルスの入った細胞の上澄み１ｍｌがおよそ１０５〜１０６の細胞培養感染量（ＴＣＩＤ５０）滴定量で３０分間かけて添加された。４％の胎児の牛の血清を含む新鮮な培養液３０ｍｌを添加された。細胞は上述のように５日間培養され、その時点で培養中の細胞変性効果が現れていた。ウイルスを含む培養液はべックマンＴＪ６遠心分離機により２０００ｒｐｍでペレット状の細胞片に遠心分離された。
【０１０４】
ウイルス性ゲノムＲＮＡは、１１２０μｌの好適なバッファＡＶＬ（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ分離キット、Ｑｉａｇｅｎ）（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）キャリアＲＮＡを、ウイルスを含む培養液サンプル２８０μｌに添加して精製された。その混合液は１０分間常温で攪拌しながら培養された。１１２０μｌのエタノールが加えられ、その混合液は数回置換された。ＲＮＡは、６３０μアリコットを１分間６０００ｘｇで繰り返し遠心分離することにより、ＱＩＡａｍｐスピンカラムのマトリクスに吸収された。このカラムは５００μｌのバッファＡＷにより洗浄され、微量の洗浄液を全て取り除くために遠心分離された。ＲＮＡは、常温でピロ炭酸ジエチル処理された水６０μｌを用いてこのカラムから溶出された。精製されたＲＮＡは−７０℃で保管、またはｃＤＮＡの合成に即時使用された。
【０１０５】
ｃＤＮＡ合成するため、ウイルス性ＲＮＡを６７℃で７分間加熱し、任意のヘキサマーまたはＰＲＲＳＶ特定プライマーによって活性化（好ましい性質を引き出す処理）し、スーパースクリプトＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ逆転写酵素（ＲＴ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて逆転写した。４０μｌの反応混合物は、ＭｇＣｌ２が５  ｍＭ、１Ｘ標準バッファＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ各１ｍＭ、ＲＮａｓｅ抑制剤１ユニット／μｌ、ＲＴが２ユニット、およびＲＮＡ１μｌを含んでいた。反応混合物は、９９℃で５分間、ならびに５℃で５分間培養させた。
【０１０６】
以下の配列を達成するため、得られたＤＮＡフラグメントにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。：ｃＤＮＡ反応混合液の１０μｌ部分を以下の試薬と組み合わせて、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｘ標準バッファＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、０．３μＭの−５’および−３’ＰＲＲＳＶ特定プライマー、そして０．３７５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含んだ２５μｌの反応生成物を得た。反応は、温度循環機の中で９３℃で４分間加熱され、５０〜５９℃で３０秒間、７２℃で３０〜６０秒間、そして９４℃で３０秒間を３５回繰り返された。各反応におけるプライマーのアニーリング温度と増幅物の予想される長さにより、所定時間や温度は異なった。最後の培養は７２℃で１０分間行われ、反応は４℃に置かれた。ＰＣＲ生成物はＭｉｃｒｏｃｏｎ  １００キット（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によって精製された。
【０１０７】
ｃＤＮＡ末端（ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）の急速増幅（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ゲノムのＲＮＡの５′末端配列を得るために、Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．，Ｏｎ  Ｂｅｙｏｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ），４ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｓ４０−Ｓ５８（１９９４）（この文献の教示は、引用することにより本明細書の一部をなす。）の方法に基づいて行われた。ウイルスのＲＮＡは分離され、上述したように、ランダムヘキサマーをプライマーとしてｃＤＮＡに変換された。反応生成物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００カラム（Ａｍｉｃｏｎ）で精製された。ｐｏｌｙ（ｄＡ）  ｔａｉｌは、ｃＤＮＡの１０μｌをＩＸバッファ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、２．５ｍＭのＣｏＣｌ２  、０．５ｍＭのｄＡＴＰおよび２ユニットのターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する２０μｌの反応系において、１５分間３７℃で培養することにより、３′末端に加えられた。反応は５分間６５℃で加熱することにより停止され、その後、水で２００μｌに希釈された。
【０１０８】
ＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄａ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｐｏｌｙ（ｄＡ）−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡ、ＩＸバッファー３、それぞれ０．３５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．６２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０４μＭのＱｔプライマー（Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９４）、０．３μＭのＱ０プライマー（Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９４）、０．３μＭの５′−ＣＧＣＣＣＴＡＡＴＴＧＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣ−３′ならびに混合酵素の０．７５μｌを含有する５０μｌの反応系において、行われた。反応系は、９３℃で２分間サーマルサイクラーの中で加熱され、９３℃１０秒間、６３℃３０秒間および６８℃１２分間からなる各サイクルを２５回、繰り返された。２５回のサイクルの後、反応系は、６８℃で７分間培養され、４℃で維持された。分取された反応系の一部は１００倍に希釈され、希釈物の５μｌが、５０μｌ中に、ＩＸバッファ１、それぞれ０．３５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．３μＭのプライマーＱｉ（Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９４）、０．３μＭの５′−ＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣ−３′ならびに混合酵素の０．７５μｌを含有する第二ＰＣＲ反応系に加えられた。反応系は、９３℃で２分間サーマルサイクラーの中で加熱され、９３℃１０秒間、６３℃３０秒間および６８℃４分間からなる各サイクルを２５回、繰り返された。２５回のサイクルの後、反応系は、６８℃で７分間培養され、４℃で維持された。反応生成物は１％のアガロースゲルの上で電気泳動され、約１５００ｂｐのバンドがＱＩＡｇｅｎ  ＱＸＩＩゲル精製キットを用いて精製された。溶出したＤＮＡは、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に、定法を用いて、クローン化された。個々のクローンは分離され、ＱＩＡｇｅｎプラスミド分離キットを用いて、プラスミドＤＮＡの分離のために成長させられた。
【０１０９】
ＰＣＲ生成物およびプラスミドＤＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋにあり、または、公知の配列に由来する、関係するＰＲＲＳＶ配列に基づく適当なプライマに結合され、ミネソタ大学先進遺伝子分析センター（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）にて、Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネータサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＰＲ２４００Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）による自動シークエンシング反応に供された。
【０１１０】
反応は、応用バイオシステム３７００ＤＮＡ配列上で（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｓｅｄ）電気泳動される。呼び出し読み込まれる配列ベースは、主としてＰｈｒｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）で行われ、フラグメントアセンブリは、主としてＰｈａｒｐ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）で行われた。配列を分析するのに、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＥｕＧｅｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を含む別のコンピュータソフトウェアが用いられた。最終的なウイルスの遺伝子配列は、約１００のＰＣＲ反応と４２８のＤＮＡ配列反応により合成された。
【０１１１】
結果
実施例７の結果は、配列番号１および２として得られ、配列番号１はマスターシードウイルス、ＪＡ−１４２の２０１回継代したＤＮＡ配列を表し、配列番号２は組織から分離された毒性の強いウイルス、ＪＡ−１４２の３回継代後のＤＮＡ配列を表す。
【受託番号】
【０１１２】
ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６３８
【配列表】
2010239973000001.app