(57)【要約】      （修正有）【課題】心筋梗塞の後、損傷した心筋及び／又は心筋細胞を修復する。【解決手段】梗塞部を取り囲む心筋に体性幹細胞を移植すると、損傷領域に移行し、そこで筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞に分化し、次いで増殖し、心筋、冠状動脈、細動脈、及び毛細血管を含む構造を形成し、梗塞部の構造的及び機能的な完全性を回復させる。また、心筋梗塞後に患者にサイトカインを投与すると、患者自身の内部に存在し且つ／又は循環する幹細胞が刺激され、血流に入って梗塞領域に向かう。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離、精製、及び増大された成体心臓幹細胞と、薬学上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２】
心臓幹細胞が、ｃ−キット陽性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
心臓幹細胞が、系統陰性である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
心臓幹細胞が、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞へと分化し得る活性により特徴付けられる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
心臓幹細胞が、ｃ−Ｍｅｔ及び／又はＩＧＦ−１Ｒを発現する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
約２×１０４〜約１×１０5の成人心臓幹細胞を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
心臓幹細胞が、ヒト心臓幹細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
心臓幹細胞が、自己由来である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
心筋内注射用に製剤化された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
心臓へのカテーテルによる送達用に製剤化された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
１又は２以上のサイトカインをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
１又は２以上のサイトカインが、幹細胞増殖因子及び／又はインスリン様増殖因子―１である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年７月３１日に出願された米国特許出願第０９／９１９７３２号の一部継続出願である２００２年６月５日に出願された米国特許出願第１０／１６２７９６号の優先権を主張するものであり、且つ２００１年６月６日に出願された米国仮特許出願第６０／２９５８０７号、第６０／２９５８０６号、第６０／２９５８０５号、第６０／２９５８０４号、及び第６０／２９５８０３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
上記引用した各出願も含め、この本文で引用される出願及び特許のそれぞれ、並びにこれら出願及び特許（各発行特許の審査中は「出願引用文献」を含む）のそれぞれで引用される各文書又は参考文献と、これら出願及び特許のいずれかに対応し且つ／又は優先権を主張するＰＣＴ及び外国出願又は特許のぞれぞれと、これら出願引用文献のそれぞれで引用され又は参照される各文書を、参照により本明細書に特に援用する。より一般には、特許請求の範囲の前にある参考文献リストにおいて又は本文そのものにおいて、様々な文書又は参考文献がこの本文で引用され、これら文書又は参考文献（「本明細書引用文献」）のそれぞれ及びこの本文で引用される文書の全て（同様に「本明細書引用文献」）、並びに本明細書引用文献のそれぞれで引用される各文書又は参考文献（本明細書に記載されまた参照により本明細書に援用する任意の文書に記載される製品に関する、任意の製造業者の仕様書や取扱説明書などを含む）は、参照により本明細書に特に援用する。この本文に引用される様々な文書のいずれも本発明の従来技術であると認められていない。本明細書で発明者と称される一人又は複数の発明者を執筆者とするどの文書も、本明細書の発明部分に関しては他者によらない文書である。また、本明細引用文献及び本明細書引用文献に引用された文書、より一般には参照により本明細書に援用された全ての文書における教示は、本明細書の実施及び利用の際に用いることができる。
【０００３】
本発明は、一般に心臓学の分野に関し、より詳細には、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧症、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心血管欠損、及び動脈炎症と、その他の動脈、細動脈、及び毛細血管の疾患を含むがこれらに限定されない心臓血管疾患に罹っている患者を治療するための方法及び細胞組成物に関する。
【０００４】
さらに本発明は、下記のいずれか１つ又は複数に関する。
【０００５】
治療上有効な量の体性幹細胞を、単独で、或いは幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子−１、スチール（steel）因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、又はインターロイキン−３からなる群から選択されたサイトカイン、或いは幹細胞を刺激し且つ／又は動態化することが可能な任意のサイトカインなどのサイトカインと組み合わせて含む、方法及び／又は医薬組成物。サイトカインは、単独で、或いは幹細胞の刺激及び／又は動態化；早期及び遅発性造血の維持（下記参照）；単球の活性化（下記参照）、マクロファージ／単球の増殖；分化、運動性、及び生存（下記参照）が可能な任意のその他のサイトカイン、及び医薬品として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（これらの組合せも含む）と組み合わせて投与することができる。幹細胞は、造血幹細胞や心臓幹細胞、又はこれらの組合せ、又は心臓幹細胞と任意のその他のタイプの幹細胞との組合せなどの、成体幹細胞であることが有利である。
【０００６】
成体幹細胞、例えば造血幹細胞や心臓幹細胞、又はこれらの組合せ、又は心臓幹細胞（例えば成体心臓幹細胞）と別のタイプの幹細胞（例えば別のタイプの成体幹細胞）との任意の組合せなどの幹細胞を、単独で、或いは幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子−１、スチール因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、又はインターロイキン−３からなる群から選択されたサイトカイン、又は幹細胞の刺激及び／又は動態化を可能にする任意のサイトカインなどのサイトカインと共に、循環組織又は筋組織又は循環筋組織内に、例えば心組織内に、すなわち心臓や、例えば大動脈のように心臓に直接接続され又は取着され又は流入する静脈や動脈などの、心臓に向かい又は心臓から出て来る静脈や動脈などの血管内に移植し、沈着し、投与し、或いは移植又は沈着又は投与を引き起こすこと（「〜サイトカインと共に」は、幹細胞及びサイトカインを順次移植し、沈着し、投与し、或いはそのような移植又は沈着又は投与を引き起こすこと、或いは幹細胞及びサイトカインの共移植、共沈着、共投与、又はそのような共移植、共沈着、共投与を引き起こすこと、すなわち同時移植、沈着、投与、又はそのような移植、沈着、投与を引き起こすことを含んでよい）。この移植、沈着、又は投与、或いは移植、沈着、又は投与を引き起こすことは、グラフトと併せることができる。そのような移植、沈着、又は投与、或いは移植、沈着、又は投与を引き起こすことは、心臓の弱っている領域又は瘢痕化領域の治療や、そのような領域の出現又はさらなる出現の予防、或いはそのような領域を引き起こし又は刺激する状態、例えば心筋梗塞や虚血、又はその他の心臓を弱くし又は瘢痕化する状態、例えば遺伝的な状態の治療など、心臓の状態の治療又は療法又は予防に用いることが有利である（以下に述べる心臓の状態も参照）。
【０００７】
そのような幹細胞を、そのような治療、療法、又は予防のための薬物製剤中に、単独で、又は前記サイトカインと組み合わせて使用すること。
【０００８】
幹細胞及び任意選択でサイトカインを含む、そのような治療、療法、又は予防で使用される薬物。
【０００９】
そのような治療、療法、又は予防で使用される製剤用の幹細胞及び任意選択でサイトカインを含むキット。
【００１０】
そのような幹細胞及び任意選択で少なくとも１種のサイトカインを含む組成物と、そのような組成物を調製するためのキット。
【００１１】
本明細書に記載するキット及び組成物を作製する方法。
【００１２】
幹細胞を移植し又は沈着させ、或いは幹細胞の移植又は沈着を引き起こす方法。
【００１３】
循環組織又は筋組織又は循環筋組織、例えば心組織であって、心臓や、例えば大動脈のように心臓に直接接続され又は取着され又は流入する静脈や動脈などの、心臓に向かい又は心臓から出て来る静脈や動脈などの血管に、心臓幹細胞又は心臓原始細胞の移行及び／又は増殖を引き起こすための、治療上有効な量の１種又は複数のサイトカインを含む方法及び／又は医薬組成物。この移行及び／又は増殖は、心臓の弱っている領域又は瘢痕化領域の治療や、そのような領域の出現又はさらなる出現の予防、或いはそのような領域を引き起こし又は刺激する状態、例えば心筋梗塞や虚血、又はその他の心臓を弱くし又は瘢痕化する状態、例えば遺伝的な状態の治療など、心臓の状態の治療又は療法又は予防に用いることが有利である（以下に述べる心臓の状態も参照）。
【００１４】
２種以上のサイトカインを含む、そのような治療、療法、又は予防のための薬物。
【００１５】
そのような治療、療法、又は予防で使用される製剤用のサイトカインを含むキット。
【００１６】
サイトカインを含む組成物及びそのような組成物を調製するためのキット。
【００１７】
本明細書に記載するキット及び組成物を作製する方法。
【００１８】
循環組織又は筋組織又は循環筋組織、例えば心組織であって、心臓や、例えば大動脈のように心臓に直接接続され又は取着され又は流入する静脈や動脈などの、心臓に向かい又は心臓から出て来る静脈や動脈などの血管に、心臓幹細胞又は心臓原始細胞の移行及び／又は増殖を引き起こすための、治療上有効な量の１種又は複数のサイトカインを、例えばロサルタンやストレプトキナーゼ、ReoPro（アブシキシマブ）、マレイン酸エナラプリル、Rapilysin（レテプラーゼ）、Dilatrend（カルベジロール）、Activase（アルテプラーゼ）などのＡＴ１レセプター遮断薬、及び当業者に知られている同様の用途のその他の薬物など、高血圧症、心筋梗塞、虚血、アンギナ、或いはその他の冠状又は血管性疾患の治療に有用な治療上有効な量の医薬品と併せて含む、方法及び／又は医薬組成物。
【００１９】
上述の医薬組成物を利用して、高血圧症、心筋梗塞、虚血、アンギナ、或いはその他の冠状又は血管性疾患を治療する方法。
【００２０】
１種又は複数のサイトカインを、高血圧症、心筋梗塞、虚血、アンギナ、或いは冠状又は血管性疾患の治療に有用な医薬品と併せて含むキット。
【００２１】
上述のキット及び組成物を作製し使用する方法。
【背景技術】
【００２２】
心臓血管疾患は、産業化された世界における健康上の主なリスクである。最も多く見られる心臓血管疾患、すなわちアテローム性動脈硬化症は、心臓発作、卒中、及び四肢の壊疽の主要な原因であり、それが米国における主な死因となっている。アテローム性動脈硬化症は、多くの細胞型及び分子因子に関係する複雑な疾患である（詳細な概説に関しては、Ross、１９９３、Nature ３６２：８０１〜８０９参照）。
【００２３】
虚血は、不適切な潅流に起因した、器官組織の酸素供給不足を特徴とする状態である。そのような不適切な潅流には、２〜３例を挙げると、アテローム硬化性又は再狭窄性の病変、貧血、又は卒中を含めたいくつかの自然な原因があると考えられる。また、例えばバイパス手術中の血流の中断など、多くの医学的介入によっても虚血は生ずる。虚血は、病的な心臓血管組織によってときどき引き起こされる他、虚血性心疾患のようにときどき心臓血管組織に影響を及ぼす可能性がある。しかし虚血は、酸素供給不足に陥っているどの器官にも生ずる可能性がある。
【００２４】
心臓の虚血の最も一般的な原因は、心臓発作として一般に知られている心筋梗塞（ＭＩ）であり、これは最も良く知られているタイプの心臓血管疾患の１つである。１９９８年の概算では、米国で７３０万人がＭＩに罹患することを示しており、１００万人超が所与の年にＭＩを経験している（米国心臓病協会、２０００）。これらの集団の中で男性の２５％及び女性の３８％が、最初にＭＩが認められた年内に死亡する（米国心臓病協会、２０００）。ＭＩは、心臓の、ある領域への血流が突然及び持続的に欠乏することによって引き起こされ、一般には冠状動脈が狭くなることによって引き起こされる。適正な血液供給がないと、組織は虚血状態になり、筋細胞及び血管構造の死に至る。この壊死組織の領域は梗塞部位と呼ばれ、最終的には瘢痕組織になる。生存は、この梗塞部位のサイズに左右され、梗塞部位が増大するにつれて回復の可能性が低くなる。例えばヒトでは、左心室の４６％以上が梗塞状態になると、不可逆的な心原性ショック及び死のきっかけになる（９９）。
【００２５】
ＭＩの現行の治療は再潅流療法に焦点を当てており、これは、組織がさらに失われないように、病気に冒されている領域に血液を流し始めようとするものである。再潅流療法に関する主な選択肢には、抗血栓溶解剤、又はバルーン血管形成術、又は冠状動脈バイパスグラフト術の使用が含まれる。抗血栓溶解剤は、動脈を遮断する可能性のある血餅を溶解し、一方バルーン血管形成術では、カテーテルが閉塞部位に向かって動脈内を縫うように進み、その閉塞部位でカテーテルの先端が膨張し、動脈を押し広げる。さらにより侵襲的な処置にはバイパス形成が含まれ、外科医が患者から静脈の一部を切除し、それを使用して心臓に新しい動脈を生成し、妨害物を迂回して、病気に冒されている領域への血液供給を継続させる。１９９８年には、推定で５５３０００例の冠状動脈バイパスグラフト術及び５３９０００例の経皮経管冠状動脈形成術が実施された。これらの処置は、平均して患者１人当たりそれぞれ２７，０９１ドル及び８，９８２ドルである（米国心臓協会、２０００）。
【００２６】
これらの治療は、血液供給を再度確立させる場合に首尾良く行うことができるが、再潅流治療を始める前に生じた組織損傷は回復不能と考えられている。このため対象となるＭＩ患者には、梗塞領域が制限されるようにできる限り早く再潅流療法を開始する。
【００２７】
したがってＭＩに関するほとんどの研究は、梗塞部位を小さくすることにも焦点を当てている。心筋細胞又は骨格筋原細胞を移植することによって壊死組織を再生する、２〜３の試みがなされている（Leor他、１９９６；Murray他、１９９６；Taylor他、１９９８；Tomita他、１９９９；Menasche他、２０００）。細胞は移植後に生存することができるが、いずれも機能的且つ構造的に丈夫で健康な心筋及び冠状血管を再構成することができない。
【００２８】
正常な成人の細胞全ては、身体の様々な部分に存在する前駆細胞として生ずる。これらの細胞は、プロジェニター（始原）と呼ばれる非常に未成熟な細胞から得られ、メチルセルロースや寒天などの半固形培地で１〜３週間培養すると近接した細胞コロニーに成長することによって、評価されるものである。始原細胞そのものは、幹細胞と呼ばれる種類の始原細胞から得られる。幹細胞は、分裂すると、自己複製しまたプロゲニターに分化するという両方の能力を持つ。したがって幹細胞の分裂により、追加の原始幹細胞といくらか多く分化した始原細胞の両方が発生する。血液細胞の成長における幹細胞の周知の役割の他に、幹細胞は、肝臓、脳、及び心臓を含むがこれらに限定されないその他の組織に見られる細胞も発生させる。
【００２９】
幹細胞は、無限に分裂する能力、及び特定のタイプの細胞に特化する能力を有する。卵子が受精して分裂を始めた後に存在する全能性幹細胞は、総合的な潜在能力を有し、任意のタイプの細胞になることができる。細胞が胞胚期に到達すると、その細胞の潜在能力は低下し、それでもその細胞は体内の任意の細胞へと成長することができるが、胚の成長に必要な支持組織には成長することができない。細胞は、それでも多くのタイプの細胞に成長することができるので、多能性と考えられる。成長中、これらの細胞はより特化し、特定の機能を備えた細胞の発生に関与する。多分化能と考えられるこれらの細胞は成人に見られ、成体幹細胞と呼ばれる。幹細胞が骨髄内に位置付けられ、血流全体を通して循環する少量の末梢血幹細胞があることが周知である（米国国立保健研究所、２０００）。
【００３０】
幹細胞の修復特性により、この細胞は、組織及び器官の可能性ある設計製作のための未開発の資源と考えられている。心臓の状態に対処する際に幹細胞を使用できることは、一つの進歩と考えられる。
【００３１】
以下の参考文献を挙げる。
【００３２】
生体内又は生体外での網膜幹細胞の網膜細胞への分化に関し、視覚回復のための療法として使用することができる米国特許第６１１７６７５号。
【００３３】
ランゲルハンス幹細胞の島から機能的な島を成長させることに関する米国特許第６００１９３４号。
【００３４】
軟骨修復のための間葉幹細胞の使用、及び靭帯再生のための間葉幹細胞の使用に関する米国特許第５９０６９３４号及び第６１７４３３３号であって、例えば幹細胞をゲル基質に埋め込み、これを収縮させ次いで移植して所望の軟組織に代えるもの。
【００３５】
細胞移植によるグラフト術に関する米国特許第６０９９８３２号及び第６１１０４５９号。
【００３６】
自己由来の骨髄及び間葉幹細胞の心筋内注入に関するＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０８３５３（ＷＯ００／５７９２２）及びＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３２６（ＷＯ００／０６７０１）であるが、本発明のように、特に本発明での造血幹細胞が有利に分離され且つ／又は精製された成体造血幹細胞のように、造血幹細胞の投与、移植、沈着、又は使用について教示も提示もなされていないもの。
【００３７】
さらに、これらのうち少なくともある特許文書は、別の理由で本発明に関する教示も提示もしていない。問題となっている幹細胞の源は、再生が必要とされるタイプの組織の既知の前駆体に限定される。これら特定の細胞を得て精製することは、しばしば所与の組織に幹細胞がほとんどないことから、極めて難しくなる可能性がある。対照的に本発明の利益は、幹細胞の様々な系統が心筋損傷部に向かって適切な細胞型に分化することから得られ、すなわち幹細胞を心筋から直接回復させる必要がなく、再生組織の機能性を損なわずに様々なタイプの幹細胞を使用することのできる手法である。また、これら特許文献のその他のものは、幹細胞を、その増殖能力を利用することなく様々な化学組成物の源として利用するものであり、よって本発明について教示も提示もしていない。
【００３８】
最近の文献だけが、既知の分化ではなく組織の修復を助けるという幹細胞の潜在能力について、調査を開始している。この幹細胞の柔軟性、すなわち胚葉の境界を横断する能力は、その新生期でのみの概念である（Kempermann他、２０００、Temple、２００１）。Kocher他（２００１）は、左心室再造形の代替療法として、梗塞後に新生血管形成を誘発させるための成体骨髄の使用について論じている（Rosenthal及びTsao、２００１に概説されている）。その他の研究は、特定のタイプの幹細胞を心筋細胞にうまく分化させることに焦点を当てており、すなわちMalour他（２００１）に示されるような肝臓幹細胞に焦点を当てている。さらに別の研究は、骨髄由来幹細胞の可能性に焦点を当てている（Krause他、２００１）。
【００３９】
医学における幹細胞の最も古い使用の１つは、癌の治療に関するものである。このような治療では、自身の骨髄が放射線によって破壊されている患者に骨髄を移植し、移植した骨髄中の幹細胞によって新しく健康な白血球を生成させる。
【００４０】
このような治療では、幹細胞が正常に機能し続ける正常な環境に、幹細胞を移植する。最近まで、任意の特定の幹細胞系は、３つ又は４つの細胞型を生成できるだけであり、したがって、その能力が既に証明されている細胞型の１つに幹細胞がなる必要のある治療に、利用できるだけだと考えられていた。研究者は、幹細胞の役割が十分明確にされていない、無数の障害の治療に対するその他の選択肢について調査し始めている。そのような研究の例を、本発明を裏付けるものとして示す。
【００４１】
器官の移植は、病気に罹り機能しなくなった組織と交換するために、広く用いられている。より最近では、宿主組織機能の欠陥を増大させる細胞移植が、可能性ある治療パラダイムとして明らかにされている。この手法の一例は、パーキンソン症候群に罹患した個体に胎児組織を使用するという十分に公表されている用法であり（Tompson、１９９２に概説されている）、移植した細胞からのドーパミン分泌によって、患者の欠陥が緩和される。その他の研究では、影響を受けていない姉妹細胞からの移植筋原細胞がデュシェーヌ病患者の内在筋管と融合し、重要なのは、グラフト化した筋管が野生型ジストロフィンを発現することである（Gussoni他、１９９２）。
【００４２】
他の領域での妥当性にも関わらず、これら初期の研究は、損傷心筋との置換えができることが明らかに臨床上の妥当性を有すると考えられる、心臓に首尾良く適用することが可能ないかなる細胞移植技術についても述べていない。さらに、血管由来因子及び向イオン性ペプチドの長期発現を目標とする心臓内グラフトの使用は、心筋虚血又はうっ血性心不全に罹患した個体にとって、それぞれ治療上価値あるものと考えられる。
【００４３】
この背景に照らし、心臓における心筋再生技術の改善が求められている。そのような技術は、心臓の組織再生をもたらすだけではなく、有用な組成物を心臓に直接送達できるものであることも望ましい。本発明は、これらの要求に対処するものである。
【００４４】
したがって、この開示にあるように且つ本発明に示されるように、これまで幹細胞を単独で、又は少なくとも１種のサイトカインと組み合わせて投与し、移植し、沈着させ、幹細胞の沈着、移植、又は投与を引き起こすこと、並びにそのような幹細胞を単独で、又は前記サイトカインと組み合わせて治療、療法、又は予防用の薬物製剤に使用することは、当技術分野で教示も提示もされておらず、したがって本明細書の方法、組成物、キット、及び使用は、新規であり明らかなものではなく且つ創意に富むものであり、すなわち本発明は、当技術分野で教示も提示されておらず、したがって本発明は新規であり自明なものではなく、創意に富んだものであると考えられる。
【特許文献１】米国特許出願第０９／９１９７３２号
【特許文献２】米国特許出願第１０／１６２７９６号
【特許文献３】米国仮特許出願第６０／２９５８０７号
【特許文献４】米国仮特許出願第６０／２９５８０６号
【特許文献５】米国仮特許出願第６０／２９５８０５号
【特許文献６】米国仮特許出願第６０／２９５８０４号
【特許文献７】米国仮特許出願第６０／２９６８０３号
【特許文献８】米国特許第６１１７６７５号
【特許文献９】米国特許第６００１９３４号
【特許文献１０】米国特許第５９０６９３４号
【特許文献１１】米国特許第６１７４３３３号
【特許文献１２】米国特許第６０９９８３２号
【特許文献１３】米国特許第６１１０４５９号
【特許文献１４】ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０８３５３（ＷＯ００／５７９２２）
【特許文献１５】ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３２６（ＷＯ００／０６７０１）
【特許文献１６】米国特許第６２６５１８９号
【特許文献１７】米国特許第６１３００６６号
【特許文献１８】米国特許第６００４７７７号
【特許文献１９】米国特許第５９９００９１号
【特許文献２０】米国特許第５９４２２３５号
【特許文献２１】米国特許第５８３３９７５号
【特許文献２２】米国特許第６２５５２９２号
【非特許文献１】Ross、１９９３、Nature ３６２：８０１〜８０９
【非特許文献２】米国心臓病協会、２０００
【非特許文献３】Leor他、１９９６
【非特許文献４】Murray他、１９９６
【非特許文献５】Taylor他、１９９８
【非特許文献６】Tomita他、１９９９
【非特許文献７】Menasche他、２０００
【非特許文献８】米国国立保健研究所、２０００
【非特許文献９】Kempermann他、２０００
【非特許文献１０】Temple、２００１
【非特許文献１１】Kocher他（２００１）
【非特許文献１２】Rosenthal及びTsao、２００１
【非特許文献１３】Malour他（２００１）
【非特許文献１４】Krause他、２００１
【非特許文献１５】Tompson、１９９２
【非特許文献１６】Gussoni他、１９９２
【非特許文献１７】Sensebe, L．他、Stem Cells １９９７；１５：１３３〜４３
【非特許文献１８】Wartiovaara, U．他、Thromb Haemost １９９８；８０：１７１〜５
【非特許文献１９】Mohle, R., Proc Natl Acad Sci USA １９９７；９４：６６３〜８
【非特許文献２０】「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」第１７版、１９８５
【非特許文献２１】Bianco他、２００１
【非特許文献２２】Clutterbuck、１９９７
【非特許文献２３】Kronenwett他、２０００
【非特許文献２４】LaIuppa他、１９９７
【非特許文献２５】Patchen他、１９９８
【非特許文献２６】Caceres-Cortes他、２００１
【非特許文献２７】Jo他、２０００
【非特許文献２８】Kim及びBroxmeyer、１９９８
【非特許文献２９】Ikuta他、１９９１
【非特許文献３０】Bautz他、２０００
【非特許文献３１】Janowska-Wieczorek他、２００１
【非特許文献３２】Li他（１９９７）
【非特許文献３３】Scholzen及びGerdes、２０００
【非特許文献３４】Pfeffer及びBraunwald、１９９０
【非特許文献３５】Durocher他、１９９７
【非特許文献３６】Morin他、２０００
【非特許文献３７】Beardsle他、１９９８
【非特許文献３８】Musil他、２０００
【非特許文献３９】Bodine他、１９９４
【非特許文献４０】Orlic他、１９９３
【非特許文献４１】Orlic他、２００１
【非特許文献４２】Li他、１９９９
【非特許文献４３】Pollick他、１９９５
【非特許文献４４】www.pnas.org
【非特許文献４５】Olivetti他、１９９１
【非特許文献４６】Beltrami他、１９９４
【非特許文献４７】Kajstura他、１９９５
【非特許文献４８】Reiss他、１９９６
【非特許文献４９】Kasahara他，１９９８
【非特許文献５０】Kachinsky他、１９９５
【非特許文献５１】Hermann及びAebi、１９９８
【非特許文献５２】Yamaguchi他、１９９３
【非特許文献５３】Breier他、１９９６
【非特許文献５４】Couper他、１９９７
【非特許文献５５】Boyden他、１９６２、J. Exptl. Med. １１５：４５３〜４５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４５】
驚くべきことに、心筋梗塞の後、梗塞部を取り囲む心筋に体性幹細胞を移植すると、損傷領域に移行し、そこで筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞に分化し、次いで増殖し、心筋、冠状動脈、細動脈、及び毛細血管を含む構造を形成し、梗塞部の構造的及び機能的な完全性を回復させることがわかった。
【００４６】
また驚くべきことに、心筋梗塞後に患者にサイトカインを投与すると、患者自身の内部に存在し且つ／又は循環する幹細胞が刺激され、血流に入って梗塞領域に向かうこともわかった。また細胞が梗塞部に向かうと、その細胞が損傷組織へと移行し、筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞に分化し、次いで増殖し、心筋、冠状動脈、細動脈、及び毛細血管を含む構造を形成し、梗塞部の構造的及び機能的な完全性を回復させることもわかった。
【００４７】
驚くべきことに、内在する心臓幹細胞（ＣＳＣ）は、ヒト（８２）及びラット（８３、８４）の心臓内で最近になって確認された。これらの原始細胞は心房に蓄積される傾向があるが（８２）、心室心筋全体にも存在する（８２、８３、８４）。ＣＳＣは、造血及び骨格筋幹細胞で一般的に見られる表面抗原を発現する（８５、８６）。ＣＳＣは、クローン原性で自己再生し且つ多能性であり、全ての心臓系統を生じさせるものである（８４）。ＣＳＣの増殖特性により、損傷した心臓は、それ自体を修復させる能力を持つ。しかしこの可能性は、ＣＳＣのコロニー化、増殖、及び新たに組織された機能する心筋への分化に関する本発明者等の理解が不足しているために、限られたものとなっている（６１、８７）。全く同じ障害が、生体における幹細胞の任意のその他の源にも当てはまる（８８）。
【００４８】
造血及び肝性幹細胞（８９、９０、９１）と、最も重要である付随する骨格筋細胞（９２）でのｃ−Ｍｅｔの同定は、そのリガンド、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）がＣＳＣに対して生物学的作用をもたらすかどうかの決定を促す。ＨＧＦが、梗塞直後に解剖学上の貯蔵領域から損傷部位へのＣＳＣの転移を引き起こし、それを促進させると仮定しよう。ＨＧＦは、基質メタロプロテイナーゼ−２（９４，９５）の発現及び活性化を通して細胞の移行に積極的に影響を及ぼす（９３）。この酵素族は、細胞外基質の障壁を破壊し、それによってＣＳＣの運動の促進、ホーミング、及び組織回復がなされる。
【００４９】
同様にインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、マイトジェン性で抗アポトーシス性であり、神経幹細胞の増殖及び分化に必要である（９６、９７、９８）。匹敵する手法では、ＩＧＦ−１が、その数を増大させその生存能力を保護することによってＣＳＣに影響を及ぼす。ＩＧＦ−１過発現は、成体マウス心臓での筋細胞の増殖を特徴とするが（６５）、この細胞増殖は、ＣＳＣの活性化、分化、及び生存に左右される可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００５０】
その結果、本発明は、損傷を受けたばかりの心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／又は再生するための方法及び／又は組成物を提供し、この方法は、心臓幹細胞又は心臓原始細胞の循環組織又は筋組織又は循環筋組織への移行及び／又は増殖を引き起こすために、有効な量の１種又は複数のサイトカイン、例えばＨＧＦ及びＩＧＦ−１を投与することを含むものである。この移行及び／又は増殖は、心臓の弱っている領域又は瘢痕化領域を治療したり、そのような領域の発生又はさらなる発生を予防したり、そのような領域を引き起こし又は刺激する状態の治療、例えば心筋梗塞や虚血又はその他の状態、例えば心臓に弱い領域や瘢痕をもたらす遺伝的状態を治療するなど、心臓状態の治療又は療法又は予防に用いることが有利である。
【００５１】
本明細書で使用されるプロトコルが、心筋細胞（４２、７９）、骨格筋原細胞（５５、７６）の移植によって或いは将来見込まれる胚性細胞の利用（１００、１０１）によって、壊死し又は瘢痕化した心筋を置き換えるのに用いられる手段よりも優れていることを示すことは、妥当である。これらの試みは、グラフト化細胞の多くを生存させるのに首尾良くなされてきたが、心室壁のスペア部分と構造的且つ機能的に一体化した健康な心筋及び冠状血管の再構成には失敗している。ＣＳＣは、心臓の正常な細胞の代謝回転を調節するように、またストレスの多い条件下で構造的且つ機械的に損傷した心室の回復に寄与するように、プログラムされる（８２、１０２）。
【００５２】
また本発明は、循環組織又は筋組織又は循環筋組織への心臓幹細胞又は心臓原始細胞の移行及び／又は増殖を引き起こすための、治療上有効な量の１種又は複数のサイトカインを含む、方法及び／組成物を提供する。この移行及び／又は増殖は、心臓の弱っている領域又は瘢痕化領域を治療したり、そのような領域の発生又はさらなる発生を予防したり、そのような領域を引き起こし又は刺激する状態の治療、例えば心筋梗塞や虚血又はその他の状態、例えば心臓に弱い領域や瘢痕をもたらす遺伝的状態を治療するなど、心臓状態の治療又は療法又は予防に用いることが有利である。
【００５３】
また本発明は、そのような治療、療法、又は予防に使用される薬物も提供する。
【００５４】
本発明はさらに、そのような治療、療法、又は予防に使用される製剤用の１種又は複数のサイトカインを含むキットを提供する。
【００５５】
本発明はさらに、本明細書に記載するキット及び組成物を作製する方法を提供する。
【００５６】
本発明はさらに、そのような治療、療法、又は予防に使用される製剤用として、１種又は複数のサイトカインを、心臓又は血管状態を治療するための治療薬と組み合わせて含む、組成物及び／又はキットを提供する。
【００５７】
本発明は、損傷したばかりの心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／又は再生するための方法及び／又は組成物であって、体性幹細胞、例えば成体幹細胞又は心臓幹細胞又は造血幹細胞又はこれらの組合せなどであり、例えば成体心臓又は成体造血幹細胞又はこれらの組合せ、或いは心臓幹細胞と別のタイプの幹細胞との組合せなどであり、例えば成体心臓幹細胞と別のタイプの成体幹細胞との組合せなどを投与することを含む方法及び／又は組成物を提供する。
【００５８】
本発明はさらに、少なくとも１種のサイトカインの投与を含む、損傷したばかりの心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／再生するための方法及び／又は組成物を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、少なくとも１種のサイトカインを、心臓又は血管状態の治療に有用な医薬品と組み合わせて投与することを含む、損傷したばかりの心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／再生するための方法及び／又は組成物を提供する。
【００６０】
本発明はさらに、体性幹細胞、例えば成体幹細胞又は心臓幹細胞又は造血幹細胞又はこれらの組合せなどであり、例えば成体心臓又は成体造血幹細胞又はこれらの組合せ、或いは心臓幹細胞と別のタイプの幹細胞との組合せなどであり、例えば成体心臓幹細胞と別のタイプの成体幹細胞とサイトカインとの組合せなどを投与することを含む、損傷したばかりの心筋を修復し且つ／又は再生するための方法及び／又は組成物に関する。
【００６１】
本発明はさらに、前述の又は本明細書に開示する組成物のいずれかを調製するための方法であって、医薬品として許容される担体と体性幹細胞及び／又はサイトカインとを混合することを含む方法を提供する。
【００６２】
また本発明は、損傷したばかりの心筋及び／又は心筋細胞の修復及び／又は再生に使用される医薬組成物を含むキットも提供する。
【００６３】
本発明は、成体幹細胞、例えば造血幹細胞や心臓幹細胞、又はこれらの組合せ、又は心臓幹細胞（例えば成体心臓幹細胞）と別のタイプの幹細胞（例えば別のタイプの成体幹細胞）との任意の組合せなどの幹細胞を、単独で、或いは幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子−１、スチール因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、又はインターロイキン−３からなる群から選択されたサイトカイン、又は幹細胞の刺激及び／又は動態化を可能にする任意のサイトカインなどのサイトカインと共に、循環組織又は筋組織又は循環筋組織内に、例えば心組織内に、すなわち心臓や、例えば大動脈のように心臓に直接接続され又は取着され又は流入する静脈や動脈などの心臓に向かい又は心臓から出て来る静脈や動脈などの血管内に移植し、沈着させ、投与し、或いは移植又は沈着又は投与を引き起こすことを含む方法を提供する（「〜サイトカインと共に」は、幹細胞及びサイトカインを順次移植し、沈着させ、投与し、或いはそのような移植又は沈着又は投与を引き起こすこと、或いは幹細胞及びサイトカインの共移植、共沈着、共投与、又はそのような共移植、共沈着、共投与を引き起こすこと、すなわち同時移植、沈着、投与、又はそのような移植、沈着、投与を引き起こすことを含んでよい）。この移植、沈着、又は投与、或いは移植、沈着、又は投与を引き起こすことは、グラフトと併せて行うことができる。
【００６４】
そのような移植、沈着、又は投与、或いは移植、沈着、又は投与を引き起こすことは、心臓の弱っている領域又は瘢痕化領域の治療や、そのような領域の出現又はさらなる出現の予防、或いはそのような領域を引き起こし又は刺激する状態、例えば心筋梗塞や虚血、又はその他の心臓を弱くし又は瘢痕化する状態、例えば遺伝的な状態の治療など、心臓の状態の治療又は療法又は予防に用いることが有利である（上述の心臓の状態も参照）。
【００６５】
本発明はさらに、そのような幹細胞を、そのような治療、療法、又は予防のための薬物の配合の際に単独で、又は前記サイトカインと組み合わせて使用することを提供する。
【００６６】
したがって本発明は、幹細胞及び任意選択でサイトカインを含む、そのような治療、療法、又は予防で使用される薬物も提供する。
【００６７】
同様に本発明は、そのような治療、療法、又は予防で使用される製剤用の、幹細胞及び任意選択でサイトカインを含むキットを提供する。幹細胞及びサイトカインは、１つのパッケージ内で個別の容器に入れることができ、又は１つのパッケージ内で１つの容器に入れることができ、またキットは任意選択で、投与用機器（例えばシリンジ）、及び／又は投与及び／又は混合のための取扱い説明書を含むことができる。
【００６８】
また本発明は、そのような幹細胞及び任意選択でサイトカインを含む組成物と、そのような組成物を調製するためのキット（例えば幹細胞及び任意選択でサイトカインを含むキット；幹細胞及びサイトカインは１つのパッケージ内で個別の容器に入れることができ、又は１つのパッケージ内で１つの容器に入れることができ；またキットは、投与するための機器（例えばシリンジ）及び／又は投与及び／又は混合するための取扱い説明書を任意選択で含むことができる）、並びに前述の組成物を作製する方法も提供する。
【００６９】
また本発明は、生体外で心筋を発生させ且つ／又は再生する手段であって、体性幹細胞及び心組織を生体外で、任意選択でサイトカインの存在下で培養する手段も提供する。体性幹細胞は、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞に分化し、成体外で増殖し、心筋組織及び／又は細胞を形成する。これらの組織及び細胞を、動脈、細動脈、毛細血管、及び心筋を含めた心構造にアセンブルすることができる。次いで生体外で形成された組織及び／又は細胞を、例えばグラフトを介して患者に移植し、それによって構造的及び機能的な完全性を回復させることができる。
【００７０】
この開示において、「含む（comprises、comprising）」、「含有する（containing）」、及び「有する（having）」などは、米国特許法に基づく意味を持つことができ、「含む（includes、including）」などを意味することができる。また「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」又は「本質的に構成する（consists essentially）」などは、米国特許法に基づく意味を持つ。この用語は自由に解釈され、引用されたもの以上の存在によって引用されたものの基本的又は新規な特徴を変化させない限り、引用されたもの以上を存在させることが可能であるが、従来技術の実施形態は除外する。
【００７１】
これら及びその他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示され、又は以下の詳細な説明から明らかであり、且つ以下の詳細な説明に包含される。
【００７２】
一例として本発明について述べるために与えられ、しかし記述される特定の実施形態に本発明を限定しようとするものではない以下の詳細な説明は、参照により本明細書に組み込んだ添付図面と併せて理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
本発明は、治療上有効な量の体性幹細胞を、単独で、或いは幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子−１、スチール因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、又はインターロイキン−３からなる群から選択されたサイトカイン、或いは幹細胞を刺激し且つ／又は動態化することが可能な任意のサイトカインと組み合わせて含む、方法及び／又は医薬組成物を提供する。サイトカインは、単独で、或いは幹細胞の刺激及び／又は動態化；早期及び遅発性造血の維持（下記参照）；単球の活性化（下記参照）、マクロファージ／単球の増殖；分化、運動性、及び生存（下記参照）；心臓又は血管状態の治療が可能な任意のその他のサイトカイン又は医薬品、及び医薬品として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（これらの組合せも含む）と組み合わせて投与することができる。
【００７４】
また本発明は、循環組織又は筋組織又は循環筋組織内に、例えば心組織内に、すなわち心臓や、例えば大動脈のように心臓に直接接続され又は取着され又は流入する静脈や動脈などの心臓に向かい又は心臓から出て来る静脈や動脈などの血管内に、心臓幹細胞又は心臓原始細胞の移行及び／又は増殖を引き起こすための、治療上有効な量の１種又は複数のサイトカインを含む、方法及び／又は医薬組成物も提供する。
【００７５】
好ましい態様では、医薬組成物を含む方法及び／又は組成物は、有効な量の２種以上のサイトカインを含む。より具体的には、この方法及び／又は組成物は、有効な量の肝細胞増殖因子及びインスリン様増殖因子−１を含むことが好ましい。
【００７６】
本発明の医薬組成物中のサイトカインは、早期及び遅発性造血の維持に関与することが知られている媒介物質を含んでもよく、例えばＩＬ−１α及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、及びＩＬ−１３；コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、ｆｉｔ３リガンド、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α、白血病抑制因子、形質転換増殖因子β１及びβ３；マクロファージ炎症性タンパク質１α）、血管原性因子（線維芽増殖因子１及び２、血管内皮増殖因子）などであり、また、その通常の標的（及び源）が結合組織形成細胞（血小板由来増殖因子Ａ、上皮増殖因子、形質転換因子α及びβ２、オンコスタチンＭ及びインスリン様増殖因子１）又はニューロン細胞（神経増殖因子）（Sensebe, L. 他、Stem Cells １９９７；１５：１３３〜４３）である媒介物質、血小板及び巨核球中に存在するＶＥＧＦポリペプチド（Wartiovaara, U. 他、Thromb Haemost １９９８；８０：１７１〜５；Mohle, R., Proc Natl Acad Sci USA １９９７；９４：６６３〜８）、ＨＩＦ−１、低酸素症への応答に関与するいくつかの遺伝子のプロモーターに結合し刺激する強力な転写因子、内皮ＰＡＳドメインタンパク質１（ＥＰＡＳ１）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）など２次的機能を高める単球由来サイトカインを含んでもよい。
【００７７】
別の好ましい態様では、医薬組成物を含めたこの方法及び／又は組成物が、有効な量の２種以上のサイトカインを、心臓及び／又は血管状態の治療に有用な適切な医薬品と併せて含む。
【００７８】
好ましい態様では、本発明の医薬組成物が注射を介して送達される。これらの投与（送達）経路には、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻内投与を含めた皮下又は非経口経路、並びに髄腔内と輸液技法が含まれるが、これらに限定されない。したがって医薬組成物は、注射に適した形態であることが好ましい。
【００７９】
本発明の治療薬を非経口で投与するときは、一般に、単位用量を注射可能な形（溶液、懸濁液、エマルジョン）で配合することになる。注射に適した医薬品製剤は、滅菌注射溶液又は分散液を再構成するための滅菌水溶液又は分散液と滅菌粉末を含む。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロールやプロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体でよい。
【００８０】
適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを使用することによって、また分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また界面活性剤を使用することによって、維持することができる。綿実油やゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ピーナツ油などの非水性ビヒクルと、ミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを、化合物組成用の溶媒系として使用してもよい。
【００８１】
さらに、抗菌性防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む、組成物の安定性、無菌性、及び等張性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の動作は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベンやクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実に防止することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖や塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい。注射可能な医薬品形態の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどを使用することによって引き起こすことができる。しかし本発明によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、又は添加剤は、化合物に対して相溶性あるものでなければならない。
【００８２】
滅菌注射溶液は、本発明の実施に利用される化合物を、必要に応じてその他の成分を様々な量で含んでいる必要とされる量の適切な溶媒に取り入れることによって、調製することができる。
【００８３】
例えば治療用化合物を含む本発明の医薬組成物は、様々なビヒクルや補助剤、添加剤、希釈剤など任意の相溶性ある担体を含有する注射可能な製剤として患者に投与することができ；或いは本発明で利用される化合物は、モノクローナル抗体やイオン泳動、ポリマーマトリックス、リポソーム、微小球などの徐放性皮下移植又は標的送達系として非経口的に患者に投与することができる。
【００８４】
本発明で利用される医薬組成物は、患者に経口投与することができる。化合物を、錠剤や懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末、シロップなどで投与するような従来の方法が使用可能である。化合物を経口的又は静脈内に送達し、生物活性を保持する既知の技法が好ましい。
【００８５】
一実施形態では、本発明の組成物を最初に投与し、その後、さらに投与することによって維持することができる。例えば本発明の組成物を、あるタイプの組成物として投与し、その後、異なるタイプ又は同じタイプの組成物としてさらに投与することができる。例えば本発明の組成物は、血中濃度が適切なレベルになるように、静脈内注射によって投与することができる。次いで患者のレベルを経口剤形によって維持するが、患者の状態に応じてその他の投与形態を使用することができる。
【００８６】
ヒトは、一般にマウス又はその他の実験動物よりも長く治療され、その治療の長さは、疾患過程及び薬物効力の長さに比例することに留意されたい。用量は、数日間にわたり単回投与又は複数回投与することができるが、単回投与が好ましい。したがって、この開示及びそこに引用されている文書から得た技法と当技術分野での知識によって、必要以上に実験することなく、例えばラットやマウスなどの実験動物からヒトへと規模を拡大することができる。
【００８７】
治療の長さは、一般に疾患過程及び薬物効力の長さ及び治療する患者に比例する。
【００８８】
投与する医薬組成物の量は、治療する患者に応じて異なる。好ましい実施形態では、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞及び１日当たり５０〜５００μｇ／ｋｇのサイトカインを患者に投与した。マウスの心臓とヒトの心臓とではそのサイズに明らかな差があるが、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞がヒトにも同様に十分であると考えることが可能である。しかし、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定は、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、損傷を受けてからの時間を含めた患者固有の要素に基づくと考えられる。したがって投与量は、この開示及び当技術分野の知識から、当業者が容易に確認することができる。そのため当業者は、組成物中の化合物と任意選択の添加剤、ビヒクル、及び／又は担体の量を容易に決定することができ、本発明の方法で投与することができる。典型的な場合、任意の添加剤（活性幹細胞及び／又はサイトカインの他に）は、リン酸緩衝生理食塩水中０．００１〜５０重量％の量で存在し、活性成分は、マイクログラムからミリグラムの単位で存在し、例えば約０．０００１〜約５重量％、好ましくは約０．０００１〜約１重量％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５重量％、又は約０．００１〜約２０重量％、好ましくは約０．０１〜約１０重量％、最も好ましくは約０．０５〜約５重量％である。したがって当然ながら、動物又はヒトに投与される任意の組成物では、また任意の特定の投与方法では、適切な動物モデル、例えばマウスなどのげっ歯類における致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０を決定するなどして毒性を決定し、また、適切な応答を誘発させる、組成物の投与量、そこに含まれる成分の濃度、及び組成物を投与するタイミングを決定することが好ましい。そのような決定は、当業者の知識、この開示、及びそこに引用されている文献から、過度の実験を必要としない。また、逐次投与するための時間も、必要以上に実験することなく確認することができる。
【００８９】
さらに当業者なら、１種又は複数のサイトカインと組み合わせて使用される適切な医薬品を、必要以上に実験することなく確認できるであろうし、また当業者なら、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、及び損傷を受けてからの時間を含めた各患者に固有の要素に基づいて、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定を下すことができるであろう。したがって投与量は、これらの開示及び当技術分野の知識から当業者が容易に確認することができる。
【００９０】
本発明の治療薬を含む組成物の例には、懸濁液やシロップ、エリキシルなどの、開口部、例えば口腔、鼻、肛門、膣、経口、胃内、粘膜（例えば舌下、肺胞、歯肉、嗅粘膜、又は呼吸器粘膜）投与に向けた液体調剤と、滅菌懸濁液又はエマルジョンなどの、経口、皮下、皮内、筋肉内、又は静脈内投与に向けた調剤が含まれる。そのような組成物は、水や生理食塩水、グルコースなどの適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することができる。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、望ましい投与経路及び調剤に応じて、湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は粘度増強用添加剤、防腐剤、芳香剤、着色料などの補助物質を含有することができる。必要以上に実験することなく適切な調剤を調製するために、参照により本明細書に援用する「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」第１７版、１９８５などの標準的なテキストを参照されたい。
【００９１】
本発明の組成物は、選択されたｐＨに緩衝させることができるような、例えば等張水溶液や懸濁液、エマルジョン、粘性組成物などの液体調剤として提供されることが都合良い。消化管吸収が好ましい場合、本発明の組成物は、丸薬や錠剤、カプセル、カプレットなどの「固体」形態にすることができ、これには徐放性の又は液体充填剤を有する「固体」調剤が含まれ、例えばゼラチンで液体を覆ったもの、すなわち腸に送達するためにゼラチンが胃内で溶解するものがある。鼻又は呼吸器（粘膜）投与が望まれる場合、組成物をある形にして、スクイーズスプレイディスペンサ、ポンプディスペンサ、又はエアロゾルディスペンサによって定量吐出することができる。エアロゾエルは、通常、炭化水素を用いた加圧下にある。ポンプディスペンサは、計量済み用量、又は特定の粒度を有する用量を吐出できることが好ましい。
【００９２】
本発明の組成物は、特に経口投与する場合、より魅力あるものにするために、医薬品として許容される香料及び／又は着色料を含有することができる。粘性組成物は、ゲルやローション、軟膏、クリーム（例えば経皮投与の場合）などの形をとることができ、典型的な場合には、粘度が約２５００〜６５００ｃｐｓになるように十分な量の増粘剤を含有することになるが、最大で１００００ｃｐｓものより粘性の高い組成物を使用することができる。粘性組成物は、２５００〜５０００ｃｐｓの粘度であることが好ましく、その範囲を超えると組成物を投与することが難しくなる。しかしその範囲を超えると、この組成物は固体又はゼラチン形態に近付くことができ、それを経口摂取用の嚥下丸薬として容易に投与することができる。
【００９３】
液体調剤は、ゲル、その他の粘性組成物、及び固体組成物よりも、通常は調製するのが容易である。さらに液体組成物は、特に注射によって又は経口的に投与することが幾分好都合である。一方、粘性組成物は、胃の内層や鼻の粘膜などの粘膜と長時間接触することができるように、適切な粘度範囲内で配合することができる。
【００９４】
適切な担体及びその他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形の性質、例えば液体剤形であるか（例えば組成物が、溶液に、懸濁液に、ゲルに、又は別の液体剤形に配合されるのかどうか）又は固体剤形であるか（例えば組成物が、丸薬に、錠剤に、カプセルに、カプレットに、徐放性形態に、又は液体充填形態に配合されるのかどうか）に左右されることが明らかである。
【００９５】
溶液、懸濁液、及びゲルは、通常、活性化合物の他に多量の水（好ましくは精製水）を含有する。ｐＨ調節剤（例えばＮａＯＨなどの塩基）や乳化剤、分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、ゼリー形成剤（例えばメチルセルロース）、着色料、及び／又は香料など、少量のその他の成分を含ませてもよい。組成物には等張性を持たせることができ、すなわち血液及び涙液と同じ浸透圧を有することができる。
【００９６】
本発明の組成物の望ましい等張性は、塩化ナトリウム、或いはデキストロースやホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、又はその他の無機溶質や有機溶質など、その他の医薬品として許容される薬剤を使用して実現することができる。塩化ナトリウムが、ナトリウムイオンを含有する緩衝剤として特に好ましい。
【００９７】
組成物の粘度は、医薬品として許容される増粘剤を使用して、選択したレベルに維持することができる。容易に且つ経済的に入手可能でありまた取扱いが容易であることから、メチルセルロースが好ましい。その他の適切な増粘剤には、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択される薬剤に応じて異なる。重要な点は、選択した粘度が実現される量を用いることである。粘性組成物は、通常、そのような増粘剤を添加することによって溶液から調製される。
【００９８】
医薬品として許容される防腐剤は、組成物の貯蔵寿命を延ばすのに用いることができる。ベンジルアルコールが適切と考えられるが、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムを含めた様々な防腐剤を用いてもよい。防腐剤の適切な濃度は、総重量に対して０．０２％〜２％になるが、選択される薬剤に応じていくらか変えることができる。
【００９９】
当業者なら、組成物の成分を、活性化合物に対して化学的に不活性になるよう選択すべきであることが理解されよう。これは、化学及び医薬の原理を熟知している当業者には何の問題も示さず、或いは数々の問題は、この開示及びそこに引用されている文献から、標準的なテキストを参照することによって又は簡単な実験によって（必要以上に実験をすることなく）、容易に回避することができる。
【０１００】
本発明により創出される組成物は、一般に認められる手順に従って、複数の成分を混合することにより調製する。例えば選択された成分を、ブレンダ内で又はその他の標準的な機器で単に混合して濃縮混合物を生成し、次いでこれを、水又は増粘剤を添加することにより最終濃度及び粘度に調節し、場合によっては緩衝剤を添加してｐＨを制御し、又は追加の溶質を添加して等張性を制御することができる。一般にｐＨは、約３〜７．５でよい。組成物は、特定の患者の年齢や性別、体重、状態などの要素と投与に使用される組成物形態（例えば固体であるか液体であるか）を考慮しつつ、複数の投与量で、また医学又は獣医学の分野の当業者に周知の技法によって投与することができる。ヒト又はその他の動物に対する投与量は、この開示、そこに引用された文献、及び当技術分野における知識から、当業者が必要以上に実験することなく決定することができる。
【０１０１】
初回投与及びさらなる投薬又は逐次投与にも適したレジームは様々であり、初回投与の後に引き続き投与することを含めることができるが、それでもなお当業者は、この開示、そこに引用された文献、及び当技術分野における知識から確認することができる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は、アテローム性動脈硬化症、虚血症、高血圧症、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天的心臓血管欠損、及び動脈性炎症と、その他の動脈、細動脈、及び毛細血管の疾患、又は関連する病訴を含むがこれらに限定されない心臓血管疾患の治療に使用される。したがって本発明は、これらの状態又は心臓の衰弱に関わるその他の状態のいずれか１つ又は複数を治療し又は予防するために、本明細書で論じる幹細胞を単独で、又は本明細書で論じる１種又は複数のサイトカインと組み合わせて投与すること、並びにそのような治療又は予防のための組成物と、そのような組成物を配合するために本明細書で論じる幹細胞を単独で、又は本明細書で論じる１種又は複数のサイトカインと組み合わせて使用すること、さらにそのような組成物を調製するために且つ／又はそのような治療又は予防のために、本明細書で論じる幹細胞を単独で又は本明細書で論じる１種又は複数のサイトカインと組み合わせて含んだキットを含む。また、有利な投与経路には、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻内投与、並びにクモ膜下腔内を含めた皮下又は非経口投与を含むがこれらに限定することのない注射を介した投与や輸液技法など、これらの状態の治療に最も良く適した経路が含まれる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、治療薬として使用することができ、すなわち治療の適用分野で使用することができる。本明細書で使用する「治療」及び「療法」という用語には、治療効果、緩和効果、及び予防効果が含まれる。
【０１０４】
本明細書で使用する「患者」は、ヒト、哺乳類、爬虫類、両生類、及び魚類を含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物を包含することができる。しかし患者は、ヒトなどの哺乳類、又は例えばイヌやネコ、ウマなどの飼い慣らされた哺乳類や、例えばウシやヒツジ、ブタなどの生産用哺乳類などの動物哺乳類であることが有利である。
【０１０５】
本明細書で使用する「体性幹細胞」又は「幹細胞」又は「造血細胞」は、骨髄、抹消血管、又はその他の源から得ることができる、自己由来の又は同種異系の幹細胞を指す。
【０１０６】
本明細書で使用する「成体」幹細胞は、出所が胚性ではなく、胚又は胎児性組織から得られたものでもない幹細胞を指す。
【０１０７】
本明細書で使用する「損傷を受けたばかりの心筋」は、治療開始の１週間以内に損傷を受けた心筋を指す。好ましい実施形態では、心筋は、治療開始の３日以内に損傷を受けている。他の好ましい実施形態では、心筋は、治療開始の１２時間以内に損傷を受けている。幹細胞は、損傷を受けたばかりの心筋に対し、単独で、又は本明細書に開示するサイトカインと組み合わせて用いることが有利である。
【０１０８】
本明細書で使用する「損傷を受けた心筋」は、虚血状態に曝された心筋細胞を指す。このような虚血状態は、心筋梗塞又はその他の心臓血管疾患又は関連する病訴によって引き起こされる可能性がある。酸素が欠乏すると、周囲領域の細胞が死滅し、梗塞部が残り、これが最終的に瘢痕になる。
【０１０９】
本明細書で使用する「向かう（home）」は、体性幹細胞を、損傷した心筋及び／又は心筋細胞に引き付けること及び移動させることを指す。
【０１１０】
本明細書で使用する「アセンブル」は、分化した体性幹細胞を機能的構造に、すなわち心筋及び／又は心筋細胞、冠状動脈、細動脈、及び毛細血管に組み込むことを指す。この組込みによって、分化した心筋及び／又は心筋細胞、冠状動脈、細動脈、及び毛細血管に機能性が与えられる。
【０１１１】
したがって本発明は、体性幹細胞の使用を含む。これらは動物の体内に少量で存在するが、幹細胞を収集する方法は当業者に知られている。
【０１１２】
本発明の別の態様では、幹細胞を系統陰性になるよう選択する。「系統陰性（lineage negative）」という用語は、細胞が特定の細胞系統の抗原特性を発現しないことを意味するとして当業者に知られている。
【０１１３】
系統陰性幹細胞は、ｃ−キット陽性になるよう選択することが有利である。「ｃ−キット」という用語は、幹細胞の表面に存在することがわかっており且つその他の周囲細胞から幹細胞を識別し分離するプロセスに日常的に利用される受容体として、当業者に知られている。
【０１１４】
本発明はさらに、心臓に施用される治療上有効な用量又は量の幹細胞を含む。有効な用量は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回で又は複数回に分けて投与することができる。以下の実施例では、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞をマウスモデルに投与した。マウスとヒトではその心臓のサイズに明らかな差があるが、この範囲の幹細胞がヒトにも同様に十分と考えることは可能である。しかし、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定は、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、及び損傷を受けてからの時間を含めた各患者に固有の要素に基づくと考えられる。当業者、特に内科医又は心臓病専門医なら、必要以上に実験をすることなく、有効な用量が構成される幹細胞の数を決定することができるであろう。
【０１１５】
本発明の別の態様では、幹細胞を心臓に、特に梗塞部の境界領域に送達する。当業者なら気付くように、梗塞領域は全体的に目で見ることができ、この特定の幹細胞の位置付けを可能にする。
【０１１６】
幹細胞は、注射によって、特に心筋内注射によって投与することが有利である。当業者なら気付くように、これは、心臓が機能する筋肉であるので、幹細胞を送達する好ましい方法である。心臓に幹細胞を注射すると、その幹細胞は確実に、心臓の収縮運動によって失われることはない。
【０１１７】
本発明の別の態様では、幹細胞を、経心内膜的に（transendocardially）又は経心外膜的に（transepicardially）注射することによって投与する。この好ましい実施形態では、細胞を心筋内に注射する実施形態で必要とされる、保護周囲膜への幹細胞の浸透が可能になる。
【０１１８】
本発明の好ましい実施形態は、経心内膜注射薬を送達するカテーテルをベースにした手法の使用を含む。カテーテルの使用によって、胸腔の開口が必要とされるより侵襲的な送達方法が除外される。当業者なら気付くように、最適な回復時間は、本明細書に概説されるような、カテーテルによる手法を含めた侵襲性がより低い処置によって可能になる。
【０１１９】
本発明の別の実施形態は、幹細胞を梗塞領域に移行させ、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞に分化させる必要がある。これらのタイプの細胞は、構造的且つ機能的な完全性を回復するために存在しなければならないことが、当技術分野では知られている。梗塞組織又は虚血組織を修復するその他の手法は、米国特許第６１１０４５９号及び第６０９９８３２号に示されるように、これらの細胞を心臓に直接移植し、又は培養グラフトとして移植することを含んでいた。
【０１２０】
本発明の別の実施形態は、分化した細胞の増殖と、細胞を、冠状動脈、細動脈、毛細血管、及び心筋を含めた心臓構造に形成することを含む。当業者なら気付くように、これら構造の全ては、心臓の適正な機能に不可欠である。内皮細胞及び平滑筋細胞を含めた細胞の移植によって、その移植した細胞を梗塞領域内で生存させることが可能になることが文献に示されているが、この細胞は、心臓の十分な機能性を回復可能にするのに必要な構造を形成しない。機能的且つ構造的な完全性を回復できることは、本発明のさらに別の態様である。
【０１２１】
本発明の別の態様は、サイトカインの投与に関する。このサイトカインは、サイトカインの群から選択することができ、又は複数のサイトカインの組合せを含むことができる。幹細胞因子（ＳＣＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、幹細胞の血流への移動を引き起こす刺激因子として当業者に知られている（Bianco他、２００１、Clutterbuck、１９９７、Kronenwett他、２０００、LaIuppa他、１９９７、Patchen他、１９９８）。間質細胞由来因子−Ｉは、走化的に幹細胞の移動を刺激することが示されているが、スチール因子は走化的且つケモキネシス的特性を有する（Caceres-Cortes他、２００１、Jo他、２０００、Kim及びBroxmeyer、１９９８、Ikuta他、１９９１）。血管内皮増殖因子は、移動中に移行を促進させる助けをするパラクリンループに関係するものと推測されている（Bautz他、２０００、Janowska-Wieczorek他、２００１）。マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球−マクロファージ刺激因子は、幹細胞の移動を刺激することにより、ＳＣＦ及びＧ−ＣＳＦと同じ手法で機能することが示されている。インターロイキン−３も、幹細胞の移動を刺激することが示されており、特にその他のサイトカインと組み合わせることによって強力になる。
【０１２２】
サイトカインは、生体内でサイトカインを発現するベクターを介して投与することができる。生体内発現用のベクターは、参照により本明細書に援用する任意の文書で引用されており又は当技術分野で使用されているようなベクター又は細胞又は発現系でよく、例えばアデノウイルスやポックスウイルス（ワクシニアやカナリア痘ウイルス、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣなど）、レンチウイルスなどのウイルスベクター、又はＤＮＡプラスミドベクターなどがあり；またサイトカインも、そのようなベクター又は細胞又は発現系を介し、或いはバキュロウイルス発現系やE. coliなどの細菌ベクター発現系及びＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞のようなその他のものを介した生体外発現からのものでよい。例えば、米国特許第６２６５１８９号、第６１３００６６号、第６００４７７７号、第５９９００９１号、第５９４２２３５号、第５８３３９７５号を参照されたい。サイトカイン組成物は、幹細胞調剤に有利であり又は好ましいと言われている経路以外の経路による投与に役立てることができるが、サイトカイン組成物は、幹細胞調剤に有利であり又は好ましいと言われている経路によって投与することも有利と考えられる。
【０１２３】
本発明の別の態様は、治療上有効な用量又は量のサイトカインの投与を含む。有効な用量は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回に又は複数回に分けて投与することができる。好ましい実施形態で、その用量は、治療開始後約２日間又は３日間にわたって与えられる。しかし、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定は、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、投与されるサイトカイン又は複数のサイトカインの組合せ、損傷を受けてからの時間を含めた患者に固有の要素に基づく。当業者、特に内科医又は心臓病専門医なら、必要以上に実験にかけることなく有効な用量を構成することのできるサイトカインの十分な量を決定することができるであろう。
【０１２４】
また本発明は、特に皮下又は静脈内の注射によって送達される、治療上有効な用量又は量のサイトカインの投与も含む。当業者なら、皮下注射又は静脈内投与が極めて一般的であり、血流内への適時の摂取及び循環を可能にする手法で特定の用量を送達する効果的な方法が提供されることに気付くであろう。
【０１２５】
本発明の別の態様は、患者の幹細胞を刺激し且つ血流への移動を引き起こす、投与されたサイトカインを含む。前述のように、所与のサイトカインは、その前記移動を促進させる能力が当業者に周知である。
【０１２６】
幹細胞が血流に移動したら、その幹細胞は、以下の実施例により明らかにされるように、心臓の損傷領域に向かうことが有利である。
【０１２７】
本発明の別の実施形態は、梗塞領域に移行し、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞に分化する幹細胞を含む。これらのタイプの細胞は、構造的及び機能的な完全性を回復させるために存在しなければならない。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、有効な量の１種又は複数のサイトカインを梗塞領域に投与することを含む。有効な用量は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回又は複数回に分けて投与することができる。しかし、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定は、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、投与されるサイトカイン又はサイトカインの組合せ、及び損傷を受けてからの時間を含めた各患者に固有の要素に基づくと考えられる。当業者、特に内科医又は心臓病専門医なら、必要以上に実験にかけることなく、有効な用量を構成することのできるサイトカインの十分な量を決定することができるであろう。
【０１２９】
本発明のさらに別の実施形態は、注射によって、有効な量の１種又は複数のサイトカインを心臓に投与することを含む。サイトカインは、梗塞領域に又は梗塞領域に接する領域に送達することが好ましい。当業者なら気付くように、梗塞領域はその全体を目で見ることができ、サイトカインの特定の位置付けを可能にする。
【０１３０】
サイトカインは、注射によって、特に心筋内注射によって投与することが有利である。当業者なら気付くように、心臓は機能する筋肉であるので、これはサイトカインを送達する好ましい方法である。サイトカインを心臓に注射すると、それらが心臓の収縮運動によって失われないことが、確かである。
【０１３１】
本発明の別の態様では、サイトカインが、経心内膜的に又は経心外膜的に注射することによって投与される。この好ましい実施形態では、サイトカインが心筋内注射される実施形態で必要とされる、保護周囲膜へのサイトカインの浸透が可能になる。
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態は、経心内膜注射により送達するために、カテーテルをベースにした手法を使用することを含む。カテーテルの使用では、胸腔の開口が必要になるより侵襲性の高い方法が除外される。当業者なら気付くように、最適な回復時間は、本明細書で概説するようなカテーテルによる手法を含めたより侵襲性の低い処置によって、可能になる。
【０１３３】
本発明の別の実施形態は、単回投与によるサイトカインの送達を含む。本発明のさらに別の実施形態は、同じ投薬量のサイトカインを心臓に複数回投与することを含む。本発明のさらに別の実施形態は、勾配が形成されるように、サイトカインの複数回分の用量を心臓に投与することを含む。
【０１３４】
本発明のさらに別の実施形態は、内在する心臓幹細胞の刺激、移行、増殖、及び／又は分化を含む。
【０１３５】
本発明の別の実施形態は、分化した細胞の増殖と、その細胞を、冠状動脈、細動脈、毛細血管、及び心筋を含む心臓構造に形成することを含む。当業者なら気付くように、これら構造の全ては心臓の適正な機能に重要である。内皮細胞及び平滑筋細胞を含めた細胞の移植によって、その移植された細胞を梗塞領域内で生存させることが可能であることが文献に示されているが、それらの細胞は心臓の十分な機能性を回復可能にするのに必要な構造を形成しない。機能的且つ構造的な完全性を回復することができ、又は既に当技術分野で実現されたものよりも機能的且つ構造的な完全性を回復することができることは、本発明のさらに別の態様である。
【０１３６】
本発明の実施に際し、損傷心筋の修復の最も効果的な方法を確実にするために、幹細胞の投与とサイトカインの投与の両方を利用することが好ましい。
【０１３７】
本発明で用いられる幹細胞は、系統陰性になるよう選択することが有利である。「系統陰性」という用語は、特定の細胞系統の特徴を示す抗原を発現しない細胞を意味するものとして、当業者に知られている。また、系統陰性幹細胞は、ｃ−キット陽性になるよう選択することが有利である。「ｃ−キット」という用語は、幹細胞の表面に存在することがわかっており、且つその他の周囲細胞から幹細胞を識別し分離するプロセスで日常的に利用される受容体として、当業者に知られている。
【０１３８】
ある実施形態では、治療上有効な用量の幹細胞を、心臓に施用し、送達し、又は投与し、或いは心臓に移植する。有効な用量又は量は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回又は複数回に分けて投与することができる。以下の実施例では、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞をマウスモデルに投与した。マウスの心臓とヒトの心臓とではそのサイズに明らかな差があるが、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞はヒトにも同様に十分であると考えることができる。しかし、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定は、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、及び損傷を受けてからの時間を含めた各患者に固有の要素に基づくと考えられる。当業者、特に内科医又は心臓病専門医なら、この開示及び当技術分野の知識から、必要以上に実験することなく有効な用量を構成することのできる幹細胞の数及びタイプ（又は複数のタイプ）を決定することができるであろうし、さらに、この点に関しまた一般に製剤の調製及び製剤又はその成分の投与に関しては、実施例における教示を挙げることができ、当業者なら、治療する患者の体重を実施例で用いた任意の動物の体重と比較することによって、投薬量や量などの規模を増減することができる。幹細胞は、骨髄又は心臓幹細胞であることが有利であり、幹細胞は、成体骨髄（造血幹細胞）又は成体心臓幹細胞又はこれらの組合せ又は成体心臓幹細胞などの心臓幹細胞と別のタイプの成体幹細胞など別のタイプの幹細胞との組合せであることが、さらに有利である。
【０１３９】
本発明の別の態様では、幹細胞を心臓に、特に梗塞部の境界領域に送達する。当業者なら気付くように、梗塞領域はその全体を目で見ることができ、この幹細胞の特定の位置付けを可能にする。
【０１４０】
幹細胞は、注射によって、特に心筋内注射によって投与することが有利である。当業者なら気付くように、心臓は機能する筋肉であるので、これは幹細胞を送達する好ましい方法である。幹細胞を心臓に注射すると、それらが心臓の収縮運動によって失われることがないことが、確かである。
【０１４１】
本発明のその他の態様では、幹細胞を、経心内膜的に又は経心外膜的に注射することによって投与する。この好ましい実施形態では、細胞が心筋内に注射される実施形態に必要な、保護周囲膜への幹細胞の浸透が可能になる。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態は、経心内膜注射により送達するための、カテーテルをベースにした手法の使用を含む。カテーテルの使用により、胸腔の開口が必要になるより侵襲性の高い送達方法が除外される。当業者なら気付くように、最適な回復時間は、本明細書に概説するようにカテールを用いた手法を含む、より侵襲性の低い処置によって可能になる。
【０１４３】
本発明の実施形態は、サイトカインの投与を含むことができる。このサイトカインは、サイトカインの群から選択してもよく、又は複数のサイトカインの組合せを含んでもよい。
【０１４４】
本発明の別の態様は、治療上有効な用量のサイトカインの投与を含む。有効な用量又は量は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回又は複数回に分けて投与することができる。好ましい実施形態では、その用量は、治療開始の後、２日間又は３日間にわたって与えられる。しかし、何を有効な用量と見なすかについての精密な決定は、患者の寸法、年齢、梗塞サイズ、投与されるサイトカイン又はサイトカインの組合せ、及び損傷を受けてからの時間を含めた各患者に固有の要素に基づくと考えられる。当業者、特に内科医又は心臓病専門医なら、特に本明細書の開示及び当技術分野の知識に照らし、必要以上に実験にかけることなく有効な用量を構成することのできるサイトカインの十分な量を決定することができるであろう。
【０１４５】
治療上有効な用量の少なくとも１種のサイトカインの投与は、注射によって、特に皮下又は静脈内注射によるものであることが有利である。当業者なら、皮下注射又は静脈内送達が極めて一般的であり、血流への適時の摂取及び循環を可能にする手法で特定の用量を送達する効果的な方法が提供されることに気付くであろう。
【０１４６】
本発明の別の態様は、患者の幹細胞を刺激し且つ血流への移動を引き起こす、投与されたサイトカインを含む。前述のように、所与のサイトカインは、前記移動を促進させることができる点に関して当業者に周知である。この場合も、幹細胞が血流内に移動すると、その幹細胞は心臓の損傷領域へと向かう。このようにある実施形態では、移植した幹細胞と移動した幹細胞の両方が梗塞領域に移行し、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞に分化する。当技術分野では、これらのタイプの細胞が、構造的且つ機能的な完全性を回復させるために存在することが有利である。
【０１４７】
本発明の別の実施形態は、分化した細胞の増殖と、この細胞を冠状動脈、細動脈、毛細血管、及び心筋を含めた心臓構造に形成することを含む。当業者なら気付くように、これらの構造全ては心臓の適正な機能に不可欠である。内皮細胞及び平滑筋細胞を含む細胞の移植によって、その移植された細胞が梗塞領域内で生存可能になることが文献に示されているが、これらの細胞は、心臓が十分な機能性を取り戻すことができるように必要な構造を形成しない。心臓構造を生体外で生成し、次いでそれをグラフトの形で移植することができ；グラフトの移植は、この開示にあるように、単独で、或いは幹細胞と組み合わせて又は幹細胞及び少なくとも１種のサイトカインと組み合わせて行われ、例えば、成体幹細胞又は心臓幹細胞又は造血幹細胞であって成体心臓幹細胞及び／又は成体造血幹細胞など、又は成体心臓幹細胞と別のタイプの幹細胞、例えば別のタイプの成体幹細胞との組合せなどが有利である。心筋を生体外で生成し且つ／又は再生する手段は、任意選択でサイトカインの存在下、生体外で培養された体性幹細胞及び心臓組織を組み込むことができる。体性幹細胞は、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞に分化し、生体外で増殖し、心筋組織及び／又は細胞を形成する。これらの組織及び細胞は、動脈、最動脈、毛細血管、及び心筋を含む心臓構造を構築することができる。次いで生体外で形成された組織及び／又は細胞を、例えばグラフトを介して患者に移植し、それによって構造的及び機能的な完全性を回復させることができる。
【０１４８】
追加として又は代替として、グラフトに用いられる組織の供給源は、心臓のグラフトに使用される組織のその他の供給源から得ることができる。
【０１４９】
心臓組織の機能的且つ構造的な完全性の回復又は若干の回復は、これまでに生じたものよりも有利であり、本発明のさらに別の態様になる。
【０１５０】
したがって本発明は、別の態様において、例えば心臓血管の疾患又は状態或いは心臓の状態を治療するための本発明の方法で使用される、体性幹細胞及び／又は少なくとも１種のサイトカインを含んだ医薬組成物などの組成物を調製するための方法を包含する。
【０１５１】
本発明について、さらに、以下の非限定的な実施例を例に挙げて述べるが、これらは本発明及びその多くの利点をより良く理解するためのものである。
【０１５２】
以下の実施例で言及される材料、試薬、化学物質、アッセイ、サイトカイン、抗体、及び種々の品目の全ては、Genzyme、Invitrogen、Gibco BRL、Clonetics、Fisher Scientific、R & D Systems、MBL International Corporation、CN Biosciences Corporate、Sigma Aldrich、及びCedarLane Laboratories, Limited.を含むがこれらに限定されない商業的な供給元を通して、研究団体が容易に入手可能である。
【０１５３】
例えば、
幹細胞因子は、ＳＣＦという名称で（組換えヒト、組換えマウス、及びそれぞれに対する抗体の、複数の形態）R & D Systems（６１４ McKinley Place N.E., Minneapolis，MN ５５４１３）から入手可能であり；
顆粒球−コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦという名称で（組換えヒト、組換えマウス、及びそれぞれに対する抗体の、複数の形態）R & D Systemsから入手可能であり；
幹細胞抗体−１は、ＳＣＡ−１という名称でMBL International Corporation（２００ Dexter Avenue，Suite D, Watertown, MA ０２４７２）から入手可能であり；
多剤耐性抗体は、抗ＭＤＲという名称でCN Biosciences Corporateから入手可能であり；
ｃ−キット抗体は、ｃ−キット（Ａｂ−１）ポリクローナル抗体という名称でCN Biosciences Corporate（Merck KgaA, Darmstadt、ドイツの系列。本社は１０３９４ Pacific Center Court, San Diego，CA、９２１２１に所在）から入手可能である。
【実施例１】
【０１５４】
梗塞心筋の造血幹細胞（ＨＳＣ）修復
Ａ．造血幹細胞の収集
骨髄を、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するオスのトランスジェニックマウスの大腿骨及び脛骨から収集した。大腿骨及び脛骨の外科的除去後、筋肉を切り離し、骨の上部及び下部の表面に切込みを入れて、集めた緩衝液を骨髄に浸透させた。緩衝液及び細胞を含有する流体を、１．５ｍｌのEpindorf試験管などの試験管に収集した。骨髄細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＰＢＳに懸濁させ、氷上で、以下の造血系統、すなわちＣＤ４及びＣＤ８（Ｔリンパ球）、Ｂ−２２０（Ｂリンパ球）、Ｍａｃ−１（マクロファージ）、ＧＲ−１（顆粒球）（Caltag Laboratories）、及びＴＥＲ−１１９（赤血球）（Pharmingen）に特異的なラット抗マウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで濯ぎ、ヤギ抗ラット免疫グロブリン（Polysciences Inc.）で被覆した磁気ビーズと共に３０分間インキュベートした。系統陽性細胞（Ｌｉｎ＋）をバイオマグネットで除去し、系統陰性細胞（Ｌｉｎ−）をＡＣＫ−４−ビオチン（抗ｃ−キットｍＡｂで染色した。細胞をＰＢＳで濯ぎ、ストレプトアビジン結合フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）（Caltag Labs．）で染色し、FACSVantage機器（Becton Dickinson）を使用する蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）て選別した。ＥＧＦＰ及びＡＣＫ−４−ビオチン−ＳＡ−ＥＰの励起は、波長４８８ｎｍで生じた。Ｌｉｎ−細胞を、ｃ−キット陽性（ｃ−キットＰＯＳ）及びｃ−キット陰性（ｃ−キットＮＥＧ）として選別し、このとき染色強度の差は１〜２ ｌｏｇであった（図１）。ｃ−キットＰＯＳ細胞を、５μｌのＰＢＳ中２×１０４〜１×１０５個の細胞として懸濁させ、ｃ−キットＮＥＧ細胞を、５μｌのＰＢＳ中１×１０５個の濃度で懸濁させた。
【０１５５】
Ｂ．マウスにおける心筋梗塞の誘発
心筋梗塞を、Ｌｉ他（１９９７）により記述されるように、２月齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスで誘発させた。梗塞後３〜５時間でマウスの胸部を再度開き、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を含有するＰＢＳ ２．５μｌを、梗塞部に接する生存可能な心筋の全面及び後面に注射した（図２）。Ｌｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞を注射しないままの又は注射した梗塞マウスと、擬似手術したマウス、すなわち胸腔を開いたが梗塞を誘発していないマウスとを、対照として使用した。全ての動物を、手術後９±２日後に犠牲にした。プロトコルは、機関の審議委員会によって承認された。結果を平均±ＳＤとして示す。２つの測定値同士の有意性はスチューデントｔ検定によって決定し、多数の比較ではボンフェローニ法（Scholzen及びGerdes、２０００）によって評価した。Ｐ＜０．０５は有意であると見なした。
【０１５６】
Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ骨髄細胞を、メスのマウスの梗塞周囲左心室に注射することによって、心筋再生が生じた。梗塞周囲領域は、梗塞部に接する生存可能な心筋領域である。修復は、３０匹のマウスのうち１２匹で見られた（４０％）。梗塞部の再構成の失敗は、１分当たり６００回（ｂｐｍ）収縮する組織に細胞を移植することが難しかったからと考えられる。しかし、ドナー骨髄細胞のＹ染色体上での組織適合抗原に対する免疫反応が、メスのレシピエントの一部で修復が不十分だった原因と考えられる。ぎっしり詰まっている筋細胞は梗塞領域の６８±１１％を占め、心室の前面から後面へと延びていた（図２Ａ〜２Ｄ）。新しい筋細胞は、Ｌｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞を注射したマウスでは見られなかった（図２Ｅ）。
【０１５７】
Ｃ．心室機能の決定
マウスに抱水クローラルで麻酔をかけ（４００ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）、右頚動脈に、マイクロチップ圧力変換器（モデルＳＰＲ−６７１、Millar）を備えたカニューレを挿入し、非開胸標本内で左心室（ＬＶ）の圧力とＬＶ＋及び−ｄＰ／ｄｔの測定を行って、ＨＳＣ移植から得られた発達する筋細胞が、機能に影響を及ぼすかどうかを決定した。Ｌｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞を注射していない又は注射した複数の梗塞マウスを、統計上、合わせた。擬似手術した群と比較すると、梗塞群は心不全の兆候を示した（図３）。Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞で治療したマウスでは、ＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）が３６％低く、収縮−拡張期圧格差（ＬＶＤＰ）及びＬＶ＋及び−ｄＰ／ｄｔは、それぞれ３２％、４０％、及び４１％高かった（図４Ａ）。
【０１５８】
Ｄ．細胞増殖の決定及びＥＧＦＰの検出
腹部大動脈にカニューレを挿入し、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を注射することによって心臓を弛緩期で停止させ、心筋に、１０％緩衝ホルマリンを逆方向に潅流させた。左心室の基部から尖端までの３つの組織切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。冠状動脈閉塞後９±２日で、心室の梗塞部分が全体的に且つ組織学的に容易に確認された（図２Ａ参照）。梗塞領域の範囲を定める心内膜及び心外膜表面の長さと、左心室全体の心内膜及び心外膜の長さとを、それぞれの切片で測定した。その後、それらの商を計算して、それぞれの場合での平均梗塞サイズを得た。これは、顕微鏡に接続された画像解析器を使用して、４×倍率で行った。梗塞領域の範囲を定める心内膜及び心外膜周囲の割合（Pfeffer及びBraunwald、１９９０；Ｌｉ他、１９９７）は、未治療のマウスで差がなく、７８±１８％（ｎ＝８）であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞で治療したマウス（ｎ＝１２）では７５±１４％、又はＬｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞で治療したマウス（ｎ＝１１）では７５±１５％であった。
【０１５９】
Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞によって心筋再生が生じるかどうかを確かめるため、ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）を４〜５日間連続して毎日動物に投与し、その後犠牲にして、活性増殖中の累積的細胞分裂を決定した。切片を抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートし、Ｓ期における心臓細胞核のＢｒｄＵ標識を測定した。さらに、核内でのＫｉ６７の発現（Ｋｉ６７は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及び早期有糸分裂でサイクリング細胞中に発現する）を、ウサギポリクローナル抗マウスＫｉ６７抗体（Dako Corp.）でサンプルを治療することによって評価した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを２次抗体として使用した（図５及び６）。ＥＧＦＰは、ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ（Molecular Probes）で検出した。筋細胞は、マウスモノクローナル抗心筋ミオシン重鎖（ＭＡＢ １５４８；Chemicon）又はマウスモノクローナル抗−α−筋節アクチン（クローン５Ｃ５；Ｓｉｇｍａ）で認識し、内皮細胞はウサギポリクローナル抗ヒト第ＶＩＩＩ因子（Sigma）で認識し、平滑筋細胞は、マウスモノクローナル抗−α−平滑筋アクチン（クローン １Ａ４；Sigma）で認識した。核をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、１０μｇ／ｍｌで染色した。ＢｒｄＵ及びＫｉ６７によって標識された筋細胞（Ｍ）、内皮細胞（ＥＣ）、及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）の核のパーセンテージは、共焦点顕微鏡法によって得られた。これは、標識された核の数を、試験した核の総数で割ることによって実現された。各細胞集団でサンプリングされた核の数は、下記の通りであった。ＢｒｄＵ標識：Ｍ＝２９０８；ＥＣ＝２１５３；ＳＭＣ＝４８７７。Ｋｉ６７標識：Ｍ＝３７７１；ＥＣ＝４０５１；ＳＭＣ＝４７５２。ＥＧＦＰ標識に関してカウントされた細胞の数：Ｍ＝３２７８；ＥＣ＝２０５６；ＳＭＣ＝１２７４。再生心筋内の筋細胞のパーセンテージは、それぞれの場合に関し、心筋ミオシン染色細胞が占める面積を梗塞領域で表される総面積で割ったものを示すことによって決定した。筋細胞の増殖は、ＢｒｄＵ及びＫｉ６７により測定した場合、それぞれ内皮細胞の場合よりも９３％（ｐ＜０．００１）及び６０％（ｐ＜０．００１）高く、平滑筋細胞の場合よりも２２５％（ｐ＜０．００１）及び１７６％（ｐ＜０．００１）高かった。
【０１６０】
形成心筋内の細胞の出所を、ＥＧＦＰの発現によって決定した（図７及び８）。ＥＧＦＰ発現は細胞質に制限され、Ｙ染色体は新しい心臓細胞の核に制限された。ＥＧＦＰを、筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞に特異的なタンパク質の標識と組み合わせた。これにより、各心臓細胞のタイプの識別と、冠状血管に組織化された内皮細胞及び平滑筋細胞の認識が可能になった（図５、７、及び８）。ＥＧＦＰを発現する新しい筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞のパーセンテージは、それぞれ５３±９％（ｎ＝７）、４４±６％（ｎ＝７）、及び４９±７％（ｎ＝７）であった。これらの値は、ＥＧＦＰを発現する移植済みのＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ骨髄細胞の割合に一致しており、４４±１０％であった（ｎ＝６）。筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞の平均５４±８％（ｎ＝６）は、ドナートランスジェニクマウスの心臓でＥＧＦＰを発現した。
【０１６１】
Ｅ．Ｙ染色体の検出
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイでは、切片を、７０％ホルムアミドを含有する変性溶液に曝した。エタノールで脱水した後、切片をＤＮＡプローブＣＥＰ Ｙ（サテライトＩＩＩ）Spectrum Green（Vysis）と３時間ハイブリダイズした。核をＰＩで染色した。
【０１６２】
Ｙ染色体は、心室の生存部分からの細胞では検出されなかった。しかしＹ染色体は新たに形成された筋細胞で検出され、その出所が、注射された骨髄細胞からのものであることを示している（図９）。
【０１６３】
Ｆ．転写因子及びコネキシン４３の検出
切片を、ウサギポリクローナル抗ＭＥＦ２（Ｃ−２１；Santa Cruz）、ウサギポリクローナル抗ＧＡＴＡ−４（Ｈ−１１２；Santa Cruz）、ウサギポリクローナル抗Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５（Dr. Izumoから得た）、及びウサギポリクローナル抗コネキシン４３（Sigma）と共にインキュベートした。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma）を２次抗体として使用した。
【０１６４】
新たに形成された筋細胞が、機能的な能力を目標とする成熟細胞を表すことを確認するために、筋細胞強化因子２（ＭＥＦ２）、心臓特異的転写因子ＧＡＴＡ−４、及び筋細胞発達Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５の早期マーカーの発現について試験をした。心臓では、ＭＥＦ２タンパク質をＧＡＴＡ−４により補充して、ミオシン軽鎖やトロポニンＴ、トロポニンＩ、α−ミオシン重鎖、デスミン、心房性ナトリウム利尿因子、及びα−アクチンなど、いくつかの心臓遺伝子のプロモーターを相乗的に活性化する（Durocher他、１９９７；Morin他、２０００）。Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５は、筋細胞分化の初期に限定される転写因子である（Durocher他、１９９７）。再構成する心臓では、心筋ミオシン標識細胞の全ての核が、ＭＥＦ２（図７Ｄ〜７Ｆ）及びＧＡＴＡ−４（図１０）を発現したが、４０±９％だけがＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５を発現した（図７Ｇ〜７Ｉ）。これらの筋細胞の特性をさらに特徴付けるため、コネキシン４３の発現について決定した。このタンパク質は、細胞間接続と、筋細胞間での原形質膜チャネルの発生による電気的結合の原因になり（Beardsle他、１９９８；Musil他、２０００）、コネキシン４３は、細胞の細胞質内と、密接に並んだ分化細胞の表面で、明らかである（図１１Ａ〜１１Ｄ）。これらの結果は、心筋表現型に関して予測される機能的な能力に一致している。さらに、成熟の様々な段階での筋細胞が、同じ帯域内及び異なる帯域内で検出された（図１２）。
【実施例２】
【０１６５】
骨髄細胞の修復梗塞心筋への移動
Ａ．心筋梗塞及びサイトカイン
２月齢の１５匹のＣ５７ＢＬ／６オスマウスから脾臓摘出し、２週間後に組換えラット幹細胞因子（ＳＣＦ）を２００μｇ／ｋｇ／日の量で、且つ組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を５０μｇ／ｋｇ／日（Ａｍｇｅｎ）の量で、１日１回、５日間にわたって皮下注射した（Bodine他、１９９４；Orlic他、１９９３）。エーテル麻酔下で左心室（ＬＶ）を露出させ、冠状動脈を結紮した（Orlic他、２００１；Li他、１９９７；Li他、１９９９）。ＳＣＦ及びＧ−ＣＣＦをさらに３日間にわたり与えた。対照は、脾臓摘出した梗塞マウスと擬似手術（ＳＯ）したマウスであって生理食塩水を注射したものからなるものであった。ＢｒｄＵを５０ｍｇ／ｋｇ体重の量で１日に１回、１３日間にわたって与え、その後犠牲にしたが、これらマウスは２７日目に殺した。プロトコルは、ニューヨーク医科大学によって承認された。結果は平均±ＳＤである。有意性は、スチューデントｔ検定及びボンフェローニ法（Li他、１９９９）によって決定した。死亡率は、ログランク検定により計算した。Ｐ＜０．０５は有意であった。
【０１６６】
骨髄Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞は心原性系統に分化転換できるので（Orlic他、２００１）、死滅した心筋領域へと向かう可能性を高めるために、末梢循環内でその数を最大限にするプロトコルを使用した。正常な動物の場合、血液中のＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の度数は、骨髄中に存在する同様の細胞に対して少しの割合しかない（Bodine他、１９９４；Orlic他、１９９３）。既に実証したように、本明細書で使用されるサイトカインでの治療によって、骨髄中のＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の著しい増大、及び骨髄からのこれら細胞の末梢血への再分布が促進される。このプロトコルにより、循環系内のＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞が２５０倍に増大する（Bodine他、１９９４；Orlic他、１９９３）。
【０１６７】
現行の研究では、ＳＣＦ及びＧ−ＣＣＦによるＢＭＣの移動によって梗塞マウスの生存数が劇的に増大し、サイトカインで治療した場合はマウスの７３％（１５匹のうち１１匹）が２７日間生存したが、未治療の梗塞マウスでは死亡率が非常に高かった（図１３Ａ）。この群の多数の動物が、心筋梗塞（ＭＩ）後３〜６日で死亡し、１７％（５２匹のうち９匹）が２７日に達した（ｐ＜０．００１）。ＭＩ後４８時間以内で死亡したマウスについては、外科的外傷の影響を最小限に抑えるために死亡率曲線には含めなかった。梗塞サイズは、２７日目に左心室自由壁（ＬＶＦＷ）で失われた筋細胞の数によって測定した場合、サイトカインを注射した動物の場合が６４±１１％（ｎ＝１１）、生理食塩水を注射した動物の場合が６２±９％（ｎ＝９）と類似していた（図１４）。
【０１６８】
重要なのは、骨髄細胞の移動によって、手術後２７日で犠牲にした１１匹全てのサイトカインで治療した梗塞マウスにおいて、心筋再生が促進されたことである（図１３Ｂ）。梗塞部内の心筋増殖は、６日目（ｎ＝２）及び９日目（ｎ＝２）に早めに死亡した４匹のマウスでも見られた。心臓の修復は、損傷領域のほとんどを占める新たに形成された心筋帯によって特徴付けられた。発達する組織は、境界ゾーンから損傷領域の内部まで、及びＬＶＦＷの心内膜から心外膜まで延びた。サイトカインが存在しない場合は、心筋の置換が決して観察されず、瘢痕形成による治癒が明らかであった（図１３Ｃ）。逆に、コラーゲンが蓄積されたごく狭い領域が、治療済みマウスで検出された。
【０１６９】
Ｂ．心エコー検査及び血行動態によるＢＭＣ移動の検出
１３ＭＨｚ線形変換器（１５Ｌ８）を備えたSequoia ２５６ｃ（Acuson）を使用して、意識のあるマウスについて心エコー検査を実施した。胸部前面領域を剪毛し、２次元（２Ｄ）画像及びＭモードトレースを、乳頭筋レベルで胸骨短軸方向から記録した。Ｍモードトレースから、拡張期及び収縮期の解剖学的パラメータが得られた（Pollick他、１９９５）。駆出率（ＥＦ）を、２Ｄ短軸方向のＬＶ横断面領域から導き出した（Pollick他、１９９５）：ＥＦ＝［（ＬＶＤＡ−ＬＶＳＡ）／ＬＶＤＡ］×１００、ただしＬＶＤＡ及びＬＶＳＡは拡張期及び収縮期におけるＬＶ面積に対応する。マウスに抱水クローラルで麻酔をかけ（４００ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）、チャート記録計に接続されたマイクロチップ圧力変換器（ＳＰＲ−６７１、Millar）をＬＶ内に前進させて、非開胸標本内で圧力と＋及び−ｄＰ／ｄｔの評価を行った（Orlic他、２００１；Li他、１９９７；Li他、１９９９）。
【０１７０】
ＥＦは、冠状動脈閉塞後９日、１６日、及び２６日で、未治療のマウスよりも治療済みのマウスでそれぞれ４８％、６２％、及び１１４％高かった（図１５Ｄ）。サイトカインに曝したマウスでは、壁の梗塞領域において、収縮機能が時間と共に発達していった（図１５Ｅ〜Ｍ；図１６Ｈ〜Ｐ、www.pnas.org）。逆にＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）は、未治療のマウスで７６％以上大きかった。ＬＶ収縮期圧（図示せず）、収縮−拡張期圧格差（ＬＶＤＰ）、＋及び−ｄＰ／ｄｔの変化も、サイトカインによる治療を行わなかった場合にさらに厳しいものであった（図１７Ａ〜Ｄ）。さらに、梗塞部に接しまた梗塞部から離れたゾーンでの拡張期応力の増大は、サイトカインで治療したマウスの場合に６９〜７３％低かった（図１５Ｎ）。したがって、サイトカインで媒介される梗塞の修復によって、再生心筋の収縮レベルが目に見えて回復し、拡張期壁応力が低下し、心室性能が増大した。心筋再生によって、生体内での梗塞心臓の発達中に、窩腔の拡張及び壁が薄くなる状態が緩和された。
【０１７１】
心エコー検査によれば、ＬＶ収縮終期（ＬＶＥＳＤ）及び拡張終期（ＬＶＥＤＤ）の直径は、梗塞後９日、１６日、及び２６日で、サイトカインで治療したマウスよりも未治療のマウスの場合のほうが増大した（図１６Ａ〜Ｂ）。梗塞は、収縮期（ＡＷＳＴ）及び拡張期（ＡＷＤＴ）の前壁の厚さの評価を妨げた。測定可能なとき、収縮期（ＰＷＳＴ）及び拡張期（ＰＷＤＴ）の後壁の厚さは、治療済みマウスの場合より厚かった（図１６Ｃ〜Ｄ）。解剖学的に、梗塞部に接しまた梗塞部から離れている壁は、サイトカインを注射したマウスの場合よりも２６％及び２２％厚かった（図１６Ｅ）。ＢＭＣで誘発される修復により、４２％高い壁厚と房室半径との比が得られた（図１５Ａ）。さらに、組織の再生によって、窩腔の直径の拡大が−１４％、長軸が−５％（図１６Ｆ〜Ｇ）、房室容積が−２６％（図１５Ｂ）のように減少した。重要なのは、心室の質量と房室の容積との比が、治療した動物で３６％高いことであった（図１５Ｃ）。したがって、筋細胞及び血管構造の新しい集団の増殖及び分化を引き起こすＢＭＣの移動によって、心不全を定義する解剖学的変数が減じられた。
【０１７２】
Ｃ．心臓の解剖学的構造及び梗塞サイズの決定
血行動態測定の後、腹部大動脈にカニューレを挿入し、ＣｄＣｌ２で心臓をその拡張期で停止させ、心筋に１０％ホルマリンを潅流させた。ＬＶ房室に、ｉｎ ｖｉｖｏ測定した拡張周期圧と等しい圧力で固定液を満たした（Li他、１９９７；Li他、１９９９）。ＬＶ腔内軸を測定し、基底部、中間領域、及び尖端部からの３つの横断切片をパラフィンに埋め込んだ。中間切片は、ＬＶ厚、房室直径、及び容積を測定するのに使用した（Li他、１９９７；Li他、１９９９）。梗塞サイズを、ＬＶＦＷから失われた筋細胞の数によって決定した（Olivetti他、１９９１；Beltrami他、１９９４）。
【０１７３】
発達する帯域の心室質量に対する寄与を定量するため、まずＬＶＦＷ（１．０６ｇ／ｍｌで割った重量）の体積を、各マウス群ごとに決定した。データは、擬似手術した動物（ＳＯ）で５６±２ｍｍ３、梗塞後治療していない動物で６２±４ｍｍ３（生存可能なＦＷ＝４１±３；梗塞ＦＷ＝２１±４）、梗塞後サイトカインで治療したマウスで５６±９ｍｍ３（生存可能なＦＷ＝３７±８；梗塞ＦＷ＝１９±５）であった。これらの値を、２７日目のスペア及び失われた心筋の期待値と比較し、未治療の動物及びサイトカインで治療した動物での梗塞サイズを得た。ＳＯのＬＶＦＷ（５６ｍｍ３）の体積と、治療していないマウスの梗塞サイズ６２％、及び治療したマウスの梗塞サイズ６４％から、冠状動脈閉塞後２７日目で残されることになる心筋の体積（未治療＝２１ｍｍ３；治療済み＝２０ｍｍ３）及び失われることになる心筋の体積（未治療＝３５ｍｍ３；治療済み＝３６ｍｍ３）を計算することが可能であった（図１８Ａ）。新たに形成された心筋の体積は、サイトカインで治療したマウスでのみ検出され、１４ｍｍ３であることがわかった（図１８Ａ）。このように修復帯域によって、梗塞サイズが６４％（３６ｍｍ３／５６ｍｍ３＝６４％）から３９％［（３６ｍｍ３−１４ｍｍ３）／５６ｍｍ３＝３９％］に減少した。２７日目のＬＶＦＷのスペア部分は、未治療のマウス及び治療済みマウスで４１及び３７ｍｍ３であるので（上記参照）、図１８ａに示される残りの心筋は、それぞれ９５％（ｐ＜０．００１）及び８５％（ｐ＜０．００１）肥大した。一貫して筋細胞の体積は９４％及び７７％増大した（図１８Ｂ）。
【０１７４】
Ｄ．形成された心筋の全体積の決定
再生する心筋の体積を、３つの切片のそれぞれについて、回復した組織が占める面積及び切片の厚さを測定することにより決定した。これら２つの変数の積から、各切片での組織修復体積が得られた。３つの切片の値を合わせ、形成された心筋の全体積を得た。さらに、４００個の筋細胞の体積を各心臓ごとに測定した。これら切片を、デスミン及びラミニン抗体及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。中央に位置付けられた核を持つ長手方向に向いた細胞のみが、含まれていた。円筒形状であると仮定し、核の長さ及び端から端までの直径を各筋細胞ごとに収集して細胞の体積を計算した（Olivetti他、１９９１；Beltrami他、１９９４）。筋細胞をいくつかの種類に分け、それぞれの種類での筋細胞の数を、全ての筋細胞クラスの体積及び平均細胞体積の比率から計算した（Kajstura他、１９９５；Reiss他、１９９６）。心筋の単位面積当たりの細動脈及び毛細血管のプロフィル数を、前に行ったように測定した（Olivetti他、１９９１；Beltrami他、１９９４）。
【０１７５】
これら切片をＢｒｄＵ又はＫｉ６７抗体と共にインキュベートした。筋細胞（Ｍ）はマウスモノクローナル抗心筋ミオシンで認識し、内皮細胞（ＥＣ）はウサギポリクローナル抗第ＶＩＩＩ因子で、平滑筋細胞（ＳＭＣ）はマウスモノクローナル抗−α−平滑筋アクチンミオシンで認識した。ＢｒｄＵ及びＫｉ６７により標識されたＭ、ＥＣ、及びＳＭＣの核の割合を、共焦点顕微鏡法によって得た（Orlic他、２００１）。サイトカインで治療した１１匹のマウスからサンプリングした核；ＢｒｄＵ：Ｍ＝３５４１；ＥＣ＝２６０４；ＳＭＣ＝１８２４。Ｋｉ６７：Ｍ＝３０９６；ＥＣ＝２４６５；ＳＭＣ＝１４０４。
【０１７６】
ＢｒｄＵを、１４日目から２６日目の間に毎日注射して細胞増殖の累積の程度を測定し、一方Ｋｉ６７は、犠牲にしたときのサイクリング細胞の数を決定するためにアッセイにかけた。Ｋｉ６７は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、前期、及び中期の細胞を識別し、末期及び終期では減少する（Orlic他、２００１）。ＢｒｄＵ及びＫｉ６７陽性筋細胞のパーセンテージは、それぞれＥＣよりも１．６倍及び１．４倍高く、ＳＭＣよりも２．８倍及び２．２倍高かった（図１８Ｃ、１９）。形成される心筋は梗塞部の７６±１１％を占めており；筋細胞が６１±１２％を構成し、新しい血管が１２±５％、及びその他の構成要素が３±２％を構成していた。その帯域は、活発な増殖期にあり且つ広い粒度分布を有する１５×１０６個の筋細胞を含んでいた（図１８Ｄ〜Ｅ）。ＥＣ及びＳＭＣの増殖によって、新しい心筋１ｍｍ２当たり１５±５の細動脈及び３４８±８２の毛細血管が形成された。数層のＳＭＣと管腔直径が１０〜３０μｍである厚い壁の細動脈は、早期分化の血管を示した。時には、固定処置中の修復心筋内での冠状動脈枝の不完全な潅流によって、赤血球を含む細動脈及び毛細血管になった（図１８Ｆ〜Ｈ）。これらの結果から、新しい血管が機能的に適格であり冠状動脈循環系に接続されるという証拠が得られた。したがって、組織修復により梗塞サイズが縮小し、筋細胞の増殖が血管形成を上回り、筋肉の大量置換は梗塞心臓で広く行われる特徴であった。
【０１７７】
Ｅ．細胞分化の決定
細胞質及び核マーカーを使用した。筋細胞核：ウサギポリクローナルＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、及びＧＡＴＡ４抗体（Orlic他、２００１；Lin他、１９９７；Kasahara他，１９９８）；細胞質：マウスモノクローナルネスチン（Kachinsky他、１９９５）、ウサギポリクローナルデスミン（Hermann及びAebi、１９９８）、心筋ミオシン、マウスモノクローナル抗体α−筋節アクチン及びウサギポリクローナルコネキシン４３抗体（Orlic他、２００１）。ＥＣ細胞質：マウスモノクローナルｆｌｋ−１、ＶＥ−カドヘリン及び第ＶＩＩＩ因子抗体（Orlic他、２００１；Yamaguchi他、１９９３；Breier他、１９９６）。ＳＭＣ細胞質：：ｆｌｋ−１及びα−平滑筋アクチン抗体（Orlic他、２００１；Couper他、１９９７）。瘢痕は、コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型抗体の混合物によって検出された。
【０１７８】
筋細胞の分化状態を明らかにするために、５種の細胞質タンパク質を同定した（Orlic他、２００１；Kachinsky他、１９９５；Hermann及びAebi、１９９８）：ネスチン、デスミン、α−筋節アクチン、心筋ミオシン、及びコネキシン４３である。ネスチンは、形成される帯域全体に散乱した個々の細胞内で認められた（図２０Ａ）。これは例外として、その他全ての筋細胞は、デスミン（図２０Ｂ）、α−筋節アクチン、心筋ミオシン、及びコネキシン４３（図２０Ｃ）を発現した。いくつかの心筋構造遺伝子のプロモーターの活性化に関係する３つの転写因子について試験をした（Orlic他、２００１；Lin他。１９９７；Kasahara他、１９９８）：Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、及びＭＥＦ２（図２１Ａ〜Ｃ）。ｆｌｋ−１及びＶＥ−カドヘリン、すなわち２つのＥＣマーカーに陽性である単細胞（Yamaguchi他、１９９３；Breier他、１９９６）は修復組織に存在し（図２０Ｄ、Ｅ）、ｆｌｋ−１は、細動脈壁から分離され又は細動脈壁内にあるＳＭＣで検出された（図２０Ｆ）。このチロシンキナーゼ受容体は、血管形成中にＳＭＣの移行を促進させる（Couper他、１９９７）。したがって、梗塞心臓の修復では、全ての心臓細胞集団の増殖及び分化が行われ、それによって新たな心筋が得られた。
【実施例３】
【０１７９】
成体マウス心臓での原始心臓細胞の移行
原始細胞集団が成体心室心筋内に存在するかどうか、またこれらの細胞が移行する能力を有するかどうかを決定するために、３つの主要な増殖因子、すなわち肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を化学遊走物質として利用した。造血幹細胞の転位を促進させることが分かっていることから、ＳＣＦ及びＧＭＣＳＦを選択した。ＨＧＦは造血幹細胞の移行を誘発するが、この増殖因子は、心臓発生初期段階で心臓細胞前駆体の有糸分裂、分化、及び移行に大きく関わっている。これに基づき、マウス心臓から酵素によって分離した細胞を、そのサイズに応じて分けた。心臓組織から心臓細胞を分離する方法は当業者に周知であり、したがって必要以上の実験は行わない（参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第６２５５２９２号参照）。核と細胞質との比が高い、直径５〜７μｍの小さい未分化細胞を含有する分離された心臓細胞の同種の集団を、５μｍの細孔を含むゼラチンで被覆したフィルタを特徴とするボイデンマイクロチャンバ内で、移行アッセイにかけた（Boyden他、１９６２、J. Exptl. Med. １１５：４５３〜４５６）。
【０１８０】
３つの増殖因子の存在下で、移行した細胞の用量反応曲線には大きな差が検出されなかった。しかしＨＧＦは、濃度１００ｎｇ／ｍｌで、多数の細胞を移動させるように見えた。さらに、ＨＧＦに対して走化的応答を示した細胞は、ｃ−キット陽性（ｃ−キットＰＯＳ）細胞１５％、多剤耐性−１（ＭＤＲ−１）標識細胞５０％、及び幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）発現細胞３０％からなるものであった。移動した細胞を１５％ウシ胎児血清中で培養すると、その細胞は、筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び線維芽細胞に分化した。心筋ミオシン陽性筋細胞は標本の５０％を構成したが、第ＶＩＩＩ因子標識細胞は１５％含まれ、α−平滑筋細胞アクチン染色細胞は４％、ビメンチン陽性第ＶＩＩＩ因子陰性線維芽細胞は２０％含まれていた。残りの細胞は小量の未分化のものであり、これら４種の抗体で染色されなかった。結論として、マウス心臓は、増殖因子によって移動する原始細胞を有している。ＨＧＦは、生体外で４つの心臓細胞系統に分化する細胞に変える。
【実施例４】
【０１８１】
心臓Ｃ−キット陽性細胞の生体外での増殖及び生体内での新しい心筋の生成
原始ｃ−キットＰＯＳ細胞が老化したＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット内に存在するかどうかを決定するために、切り離した心臓細胞を、ｃ−キット受容体抗体（ＡＣＫ−４−ビオチン、抗−ｃ−キットｍＡｂ）で被覆した磁気ビーズに曝した。分離後、これらの小さい未分化細胞を１０％ウシ胎児血清中で培養した。細胞は２〜３日で付着し、１週間で増殖し始めた。７〜１０日で集密状態に達した。Ｐ２及びＰ４継代で確立される倍加時間まで、それぞれ３０時間及び４０時間必要であった。細胞を、老化に至らせることなくＰ１８（第９０世代）まで成長させた。複製能力はＫｉ６７標識によって明らかにされ、Ｐ２で、細胞の８８±１４％が核内にＫｉ６７タンパク質を含有していた。追加の測定をＰ１とＰ４の間で行い、細胞の４０％がα−筋節アクチン又は心筋ミオシンを発現し、１３％がデスミンを、３％がα−平滑筋アクチンを、１５％が第ＶＩＩＩ因子又はＣＤ３１を、１８％がネスチンを発現した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下、細胞は、適正に並べられた筋節との明らかな筋原線維組織を示さず、自発的な収縮は決して観察されなかった。同様に、Ａｎｇ ＩＩ、ノルエピネフリン、イソプロテレロール、機械的伸長、及び電場刺激は、収縮機能を初期化できなかった。これに基づき、筋原性の平滑筋細胞及び内皮細胞系統に関係するこれらの細胞がその生物学的特性を永久に失うのかどうか、またその役割を生体内で再度確立できるのかどうか、評価することを決めた。Ｐ２で細胞をＢｒｄＵ標識した後、冠状動脈閉塞の３〜５時間後に、梗塞Fischer３４４ラットの損傷領域にこれらＢｒｄＵ陽性細胞を注射した。２週間後、これらの動物を犠牲にし、梗塞領域の特徴について試験をした。核のＢｒｄＵ標識と併せて、その長軸に沿って平行に並べられた筋原線維を含有する筋細胞が認められた。さらに、細動脈及び毛細血管プロフィルを含む血管構造が存在し、やはりＢｒｄＵに陽性であった。結論として、原始ｃ−キット陽性細胞は老化心臓内に存在し、損傷して機能が低下した心筋に移植した場合、増殖して実質細胞及び冠状血管へと分化する能力が維持される。
【実施例５】
【０１８２】
若年及び老年のラット心臓での心臓幹細胞による筋細胞複製の媒介
心臓は有糸分裂後の器官ではないが、死滅細胞が置換されるよう生理的に細胞分裂する筋細胞の部分集団である。筋細胞の増殖は、病的な過負荷がかかっている間に高まって、筋肉の質量を増大させ、心臓の性能が維持される。しかし、これら複製される筋細胞の出所はまだ特定されていない。したがって、幹細胞／プロジェニター細胞の特徴を持つ原始細胞を、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラットの心筋内で捜した。老化が幹細胞のサイズ集団及び筋細胞の分裂に影響を及ぼすかどうか決定するために、若年及び老年の動物について調査した。４月齢のラットでのｃ−キット及びＭＤＲ１陽性細胞の数は、それぞれ組織１００ｍｍ２当たり１１±３個及び１８±６個であった。２７月齢のラットでの値は、３５±１０及び４１±１３／１００ｍｍ２であった。いくつかの新たに発生した小さい筋細胞は、依然としてｃ−キット又はＭＤＲ１陽性であることが明らかになった。サイクリン細胞の核内で発現するＫｉ６７タンパク質は、４月齢及び２７月齢で、それぞれ筋細胞の１．３±０．３％及び４．１±１．５％に検出された。６回又は５６回注射した後のＢｒｄＵの位置は、４月齢で１．０±０．４％及び４．４±１．２％に含まれ、２７月齢で４．０±１．５％及び１６±４％に含まれていた。組織切片で測定された分裂指数は、有糸分裂での筋細胞核の割合が、４月齢及び２７月齢でそれぞれ８２±２８／１０６及び４８５±９８／１０６であることを示した。これらの決定は、細胞分裂指数が得られるように、分離された筋細胞で確認された。この手法により、多核筋細胞の全ての核が同時に有糸分裂することを、明らかにすることが可能になった。この情報は、組織切片では得られなかった。収集された値は、４月齢で９５±３１／１０６筋細胞が、また２７月齢で６２０±９８／１０６筋細胞が分裂することを示した。どちらの年齢間隔でも、紡錘体、収縮環の形成、核膜の分解、核分裂、及び細胞質分裂が実証された。結論として、原始未分化細胞は成体心臓内に存在し、その年齢と共に生ずる増加は、細胞周期に入り且つ核分裂及び細胞質分裂を受ける筋細胞数の増加に並行している。この関係は、心臓幹細胞が、老化した心臓での筋細胞増殖のレベル及びその結果を調節できることを示唆している。
【実施例６】
【０１８３】
ヒト心臓のキメラ現象及び幹細胞の役割
損傷した心臓の再構築の際に、内在する原始細胞が果たす極めて重要な役割は、オスのレシピエントにメスの心臓を移植することに関連した器官のキメラ現象を考えるときに、十分に理解される。これを目的として、オスの宿主に移植された８個のメスの心臓について分析した。グラフト後のメスの心臓へのオス細胞の転位は、Ｙ染色体に関するＦＩＳＨによって確認された（実施例１Ｅ参照）。この手法によって、Ｙ染色体により標識された筋細胞、冠状細動脈、及び毛細血管のプロフィルは、それぞれ９％、１４％、及び７％であった。同時に、移植されたメスの心臓の未分化ｃ−キット及び多剤耐性−１（ＭＤＲ１）陽性細胞の数を測定した。さらに、これらの細胞がＹ染色体を含有する可能性を明らかにした。心臓移植では、レシピエントの心房部分を保存し、そこに、ドナー自身の心房部分を持ったドナーの心臓を取着する。この外科処置は、宿主及びドナーからの心房が、移植心臓の複雑な再構築プロセスに寄与することのできる未分化細胞を含有するかどうかを理解するのに極めて重要である。定量的に、ｃ−キット及びＭＤＲ１標識細胞の値は対照の非移植心臓で非常に低く、左心室心筋１００ｍｍ２当たり３ ｃ−キット及び５ ＭＤＲ１であった。対照的に、レシピエントの心房でのｃ−キット及びＭＤＲ１細胞の数は、１５個及び４２個／１００ｍｍ２であった。ドナーの心房で対応する値は１５個及び５２個／１００ｍｍ２であり、心室では１１個及び２１個／１００ｍｍ２であった。移植は、心臓の原始未分化細胞の著しい増加を特徴とした。宿主の心房の幹細胞はＹ染色体を含有するが、ドナーの心房及び心室のｃ−キット及びＭＤＲ１細胞のそれぞれ平均５５％及び６３％がＹ染色体を発現した。全てのｃ−キット及びＭＤＲ１陽性細胞は、ＣＤ４５に対して陰性であった。これらの観察は、移植した心臓へのオス細胞の転位が、ドナー心筋の再構成に大きな影響を及ぼすことを示唆している。結論として、幹細胞は成体心臓内に広く分布しており、その柔軟性及び移行能力により、筋細胞、冠状細動脈、及び毛細血管構造が高い分化度で生成される。
【実施例７】
【０１８４】
成体マウス心臓での幹細胞の識別及び位置付け
筋細胞の代謝回転は正常な心臓で生じ、心筋の損傷によって筋細胞の増殖及び血管増殖が活性化する。このような適応によって、多能性原始細胞が心臓内に存在し、死滅した筋細胞の生理的置換及び損傷後の細胞増殖応答に関与する可能性が高くなる。これを基に、幹細胞因子の受容体であるｃ−キットと、細胞色素、毒性物質及び薬物から押出し可能なＰ糖タンパク質である多剤耐性−１（ＭＤＲ１）と、細胞シグナル伝達及び細胞接着に関与する幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）とを含めた表面マーカーを利用して、正常なマウス心臓内に未分化細胞が存在することを決定した。左右心房と、心室の基底部、中間セクション、及び尖端部分とからなる４つの分離領域について分析した。高い値から低い値まで順に、ｃ−キット陽性細胞の数は、心房と、心室の尖端部、基底部、及び中間セクションについてそれぞれ、２６±１１、１５±５、１０±７、及び６±３／１００ｍｍ２であった。基底部及び中間セクションに比べ、心房及び先端部でｃ−キット陽性細胞の割合が大きいことは、統計的に有意であった。ＭＤＲ１陽性細胞の数はｃ−キットを発現するものよりも多いが、同様の局在パターンに従い、すなわち心房、尖端部、基底部、及び中間セクションで４３±１４、２９±１６、１４±７、及び１２±１０／１００ｍｍ２であった。この場合も、心房及び尖端部での値は他の２つの領域よりも大きかった。Ｓｃａ−１標識細胞は最高値を示し、１５０±３６／１００ｍｍ２の陽性細胞が心房内に見られた。ｃ−キット、ＭＤＲ１、及びＳｃａ−１に対して陽性の細胞は、ＣＤ４５に対し、また筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び線維芽細胞の細胞質タンパク質に対して陰性であった。さらに、ｃ−キットとＭＤＲ１の両方に陽性である細胞の数を測定して、２つの幹細胞マーカーを有する細胞を認識した。心臓全体では、ｃ−キット標識細胞の３６％がＭＤＲ１を発現し、ＭＤＲ１の１９％はｃ−キットも持っていた。結論として、幹細胞はマウス心臓全体に分布しているが、心房や尖端部など低応力の領域に蓄積される傾向がある。
【実施例８】
【０１８５】
内在する心臓幹細胞による梗塞心筋の修復
移行、浸潤、及び発現のアッセイ
ＨＧＦの受容体、ｃ−Ｍｅｔは、造血及び肝臓幹細胞上で（１２６、９０）、最も重要な場合には衛星骨格筋細胞上で（９２）、及び胚性心筋細胞上で（１２７）確認された。これらの発見により、本発明者等は、ｃ−ＭｅｔがＣＳＣ内に存在するかどうか、またそのリガンドＨＧＦがこれら未分化細胞に生物学的な影響を及ぼすかどうか決定しようとした。ＨＧＦは、生体外でＣＳＣの移行及び浸潤を促進させ、生体内でその貯蔵領域から梗塞心筋部位までの転位を助けるという仮説を立てた。ＨＧＦは、基質メタロプロテイナーゼ−２の発現及び活性化によって（９４、９５）細胞移行に影響を及ぼす（１２８）。この酵素族は細胞外基質内の障壁を破壊し、ＣＳＣの移動、ホーミング、及び組織回復を促進させることができる。
【０１８６】
ＩＧＦ−１は有糸分裂促進性及び抗アポトーシス性を有し、神経幹細胞の増殖及び分化に必要である（９６、９７、９８）。ＣＳＣがＩＧＦ−１Ｒを発現する場合、ＩＧＦ−１は同様の手法でＣＳＣに影響を及ぼす可能性があり、損傷心筋への移行中にその生存能力を保護する。ＩＧＦ−１の過発現は、成体マウス心臓内の筋細胞増殖を特徴とし（６５）、この形の細胞増殖は、ＣＳＣの活性化、分化、及び生存に左右される可能性がある。
【０１８７】
この研究の最初の部分では、移行及び浸潤のアッセイを実施して、走化性ＨＧＦの存在下におけるｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の移動特性を明らかにした。
【０１８８】
心臓細胞を酵素により分離し、筋細胞を処分した（１２４）。小細胞を無血清培地（ＳＦＭ）に懸濁した。上部ウェル及び下部ウェルを有する改良型ボイデンチャンバ（Neuro Probe, Gaithersburg, ＭＤ）を使用して、細胞移行を測定した。４８ウェルプレート用フィルタは、直径５μｍの細孔を有するゼラチン被覆されたポリカーボネート膜からなるものであった。底部ウェルに、０．１％ＢＳＡ及び高濃度のＨＧＦを含有するＳＦＭを満たし、小細胞懸濁液５０μｌを上部ウェル内に入れた。５時間後、フィルタを４％パラホルムアルデヒド中に４０分間固定し、ＰＩ、ｃ−キット及びＭＤＲ１抗体で染色した。ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧを２次抗体として使用した。６種の個別の実験を、各ＨＧＦ濃度で行った。４０のランダムに選択された場を各アッセイの各ウェル内でカウントして、用量反応曲線を生成した（図６１）。小細胞に対するＩＧＦ−１の細胞遊走促進作用は、ＩＧＦ−１を単独で又はＨＧＦと組み合わせて用いる移行アッセイを行うことによって除外された（データは図示せず）。浸潤アッセイは、２４ウェル及び１２ウェルの培養インサートを持つチャンバ（Chemicon, Temecula, ＣＡ）を利用して行った。増殖因子枯渇細胞外基質の薄層をインサート表面に広げた。逆に、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを下部チャンバに入れた。浸潤細胞は被覆を消化し、ポリカーボネート膜の底部に固着した。転位細胞の数を、移行アッセイで述べたものと同じプロトコルに従って、４８時間後に測定した。４種の個別の実験を行った（図６２）。移行アッセイで得られた結果と矛盾することなく、ＩＧＦ−１は細胞浸潤に何の影響も及ぼさなかった（データは図示せず）。
【０１８９】
移行はどちらの細胞型でも同様であり、ＨＧＦ １００ｎｇ／ｍｌでそのピークに達した。５時間経過後、下部チャンバに遊出したｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の数は、それぞれ対照細胞の３倍及び２倍であった。ＨＧＦ濃度が高い場合、細胞移行は改善されなかった（図６１及び６２）。これに基づき、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを用いて、ｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞が浸潤チャンバの合成細胞外基質に侵入する能力についても決定した。４８時間で、増殖因子は、チャンバの下部にあるｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の数のそれぞれ８倍及び４倍増加した（図６１及び６２）。ＩＧＦ−１は、２５〜４００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でこれらＣＳＣの移動度に何の影響も及ぼさなかった。ＩＧＦ−１をＨＧＦに添加しても、ＨＧＦ単独で得られたｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の移行及び浸潤特性に変化を与えなかった。
【０１９０】
小さい未分化のｃ−ＭｅｔＰＯＳ細胞を免疫磁気ビーズで収集し、これらの細胞がゼラチンを分解する能力について、ザイモグラフィにより評価した（図６３）。簡単に言うと、小細胞を心臓（ｎ＝４）から切り離し、その後、ｃ−Ｍｅｔ抗体で被覆されたマイクロビーズ（Miltenyi, Auburn, ＣＡ）で分離した。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦに３７℃で３０分間曝した。細胞溶解産物を、０．１％ゼラチンと共重合させた１０％ポリアクリルアミドゲル上に流した（Invitrogen, Carlsbad, ＣＡ）。このゲルを、クーマシーブルー染色溶液（０．５％）中でインキュベートし、ゼラチン分解活性領域を、グレイのバックグラウンドに対する透明な帯域として検出した。これは、ｃ−ＭｅｔＰＯＳ細胞が基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現するかどうか、またゲル中に存在する基質を消化できるかどうかを実証するために行った（９４、９５）。これら原始細胞の移動性は、少なくとも一部はＭＭＰの活性化が原因であることを示唆する肯定的な結果が得られた（図６３）。それと共に、これらｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ＣＳＣに対するＨＧＦの走化機能を指摘している。ＨＧＦのそのような役割は、そのｃ−Ｍｅｔ受容体との結合と、その後のＭＭＰ合成の刺激に媒介されると考えられる（９４、９５）。
【０１９１】
マウスの心筋梗塞
マウスに心筋梗塞をもたらし、５時間後、ＨＧＦ及びＩＧＦ−１を含有する溶液を、心房から境界ゾーンまで個別に４回注射した。ＨＧＦは、貯蔵されているＣＳＣと死滅組織との間に走化的（chemotactic）勾配が生成されるように高濃度で投与した。このプロトコルは、損傷領域へのＣＳＣのホーミングを高めるため、且つ新しい心筋を生成するために導入した。このような場合、動物の死亡に関連するような大きい梗塞が急速に減少し、この処置によって梗塞サイズ及び生存の限界を広げることができる。
【０１９２】
メス１２９ＳＶ−ＥＶマウスを使用した。麻酔の後（１５０ｍｇケタミン−１ｍｇアセプロマジン／ｋｇ ｂ．ｗ．、筋肉内）、マウスに人工呼吸をし、心臓を露出させ、左冠状動脈を結紮した（６１、８７）。増殖因子で治療する動物の冠状動脈結紮は、非常に大きい梗塞が誘発されるよう、大動脈の起点にできる限り近付けて行った。その後、胸部を閉じ、動物を回復させた。５時間後、マウスに麻酔をかけて再び開胸し、ＨＧＦ−ＩＧＦ−１の注射を４回、それぞれ２．５μｌずつ、心房から梗塞部に接する領域まで行った。最後の２回の注射は、境界ゾーンの反対側にした。ＨＧＦの濃度は、５０〜１００及び２００ｎｇ／ｍｌへと梗塞部の方向に漸進的に増大させた。ＩＧＦ−１は、２００ｎｇ／ｍｌという一定濃度で投与した。マウスに６日目から１６日目までＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）を注射して、この期間中に小さく新たに形成された増殖筋細胞を識別した。擬似手術したマウス及び梗塞後未治療マウスには、同様の４カ所の部位に通常の生理食塩水を注射した。
【０１９３】
ＣＳＣが器官修復に及ぼす影響について論じる前に、ｃ−キット及びＭＤＲ１を発現する細胞上のｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒの存在について、対照マウスの心房及び左心室（ＬＶ）で測定した。同一の分析を、冠状動脈閉塞にかけたマウスの心房と梗塞ＬＶ及び非梗塞ＬＶで行った。この決定は、増殖因子を投与してから２〜３時間後、すなわち冠状動脈閉塞後７〜８時間の時点で行った（目標は、原始細胞が死滅組織及び周囲の生存可能な心筋に浸潤し、ＨＧＦ及びＩＧＦ−１がこのプロセスに関与することを実証することであった）。
【０１９４】
ｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒは、正常な心臓（ｎ＝５）、梗塞後治療済みの心臓（ｎ＝６）、及び梗塞後未治療の心臓（ｎ＝５）の領域に分散させたｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞で検出された（図２２、Ａ〜Ｆ）。ｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の大きい梗塞は、ｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを単独で又は組み合わせて発現した。心筋梗塞及び増殖因子の投与は、一貫した手法で、心筋内にｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒがあり又はない状態でＣＳＣの相対的割合を変化させなかった（図６４）。ヘアピン１（アポトーシス）及びヘアピン２（壊死）標識及び核内（サイクリン細胞）のＫｉ６７発現を使用して、損傷心臓及び非損傷心臓の様々な部分でのｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の生存能力及び活性化を明らかにした（図２２、Ｇ〜Ｌ）。
【０１９５】
ＣＳＣは、対照マウスの心室よりも心房内に非常に数多く存在した。急性心筋梗塞及び増殖因子投与によって、心臓内の原始細胞の数及び分布が著しく変化した。生存可能なｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞は、境界ゾーン及び離れた組織のスペア心筋並びに梗塞領域の死滅心筋で、著しく増加した。重要なのは、ＣＳＣが心房で減少したことであり（図２２、Ｍ及びＮ）、原始細胞の転位が、この貯蔵部位から応力を受けた生存可能な心筋及び死滅心筋まで生じたことを示唆している。未治療のマウスでは、生存可能なＣＳＣが心室内よりも心房内に依然として多いという異なる現象に留意されたい。対照動物及び梗塞後治療済みのマウスでは、アポトーシス及び壊死が、梗塞部及び周囲の心筋内のｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞で検出されなかった。Ｋｉ６７標識は、境界ゾーン及び梗塞部に分布された未分化細胞の、それぞれほぼ３５％及び２０％で確認された（図６５）。梗塞後未治療のマウスでは、梗塞部のｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の大部分がアポトーシス性であった（図２２、Ｍ及びＮ）。壊死は見られなかった。梗塞部から遠隔の心筋及び心房組織まで、アポトーシス性ＣＳＣ死滅勾配が観察された。これらのマウスでは、生存可能なｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞のわずか１０〜１４％しかＫｉ６７を発現しなかった（図６５）。
【０１９６】
このようにこれらの結果は、ＣＳＣがｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを発現し、それによってＨＧＦ及びＩＧＦ−１が、梗塞心臓内でのＣＳＣのコロニー形成、増殖、及び生存にポジティブな影響を与えるという概念を裏付けている。生体外及び生体内のデータに基づけば、ＨＧＦは細胞移行に対して、またＩＧＦ−１は細胞分裂及び生存能力に対して支配的な役割を持っていると考えられる。しかし梗塞後未治療のマウスでは、ＣＳＣが梗塞領域に転位せず、前から存在する原始細胞がアポトーシスによって死滅する。したがって重要な疑問は、梗塞部内に位置付けられたＣＳＣが様々な心臓細胞系統内で分化して、死滅心筋を再構成できるかどうかである。肯定的な発見によれば、梗塞後治療済みマウスでの心臓修復のメカニズムと、梗塞後未治療のマウスで心筋再生が生じないことについての可能性ある説明が提供される。
【０１９７】
解剖学的測定では、ＣｄＣｌ２を用いて心臓をその拡張期で停止させ、心筋に１０％ホルマリンを潅流した。ＬＶ房室には、生体内で測定した拡張終期圧と同じ圧力で、固定液を満たした。ＬＶ窩腔内軸を決定し、中間セクションを使用して、ＬＶの厚さ及び房室の直径を得た。梗塞サイズは、心室中隔を含めたＬＶから失われた筋細胞の数によって測定した（８７）。
【０１９８】
１６日目の心筋梗塞では、未治療のマウス及びＨＧＦ−ＩＧＨ−１で治療したマウスの左心室及び中隔の筋細胞が、それぞれ４２％（ｎ＝１５）及び６７％（ｎ＝２２）失われた（図２３Ａ）。６０％大きい梗塞にもかかわらず、増殖因子に曝されたマウスは、心機能がより良好に保たれた（図２３Ｂ）。ＨＧＦ−ＩＧＦ−１により、ＬＶ拡張終期圧の上昇が小さくなり、＋ｄＰ／ｄｔ及び−ｄＰ／ｄｔの低下が小さくなった。梗塞サイズの差は死亡率に影響を与えず、２つのマウス群で同様であり、すなわち未治療のマウスでは４３％、治療済みのマウスでは４０％であった。重要なのは、増殖因子を受けた２２匹のマウスのうち１４匹が、ＬＶの６０％を超える領域に影響を及ぼす梗塞と共に、生存したことである。これらのマウスのうち７匹は、ＬＶの７５％〜８６％を巻き込んだ梗塞を持っていた。未治療のマウスは、６０％を決して上回らない梗塞を持っていた（図２３、Ｃ及びＤ）。注射をしたマウスとは対照的に、未治療の動物が生存するためには、ＬＶ壁の後面の一部及び心室中隔全体が保存されなければならなかった。６０％よりも大きい梗塞は、マウス、ラット、イヌ、及び任意のその他の動物種の寿命と相容れないものであった。不可逆的な心原性のショック及び死は、ヒトの場合４６％の梗塞で生じた（９９）。
【０１９９】
擬似手術したマウスのＬＶ容積と、未治療及び治療済み動物の梗塞サイズとから、冠状動脈閉塞後１６日目に残存することになる心筋及び失われることになる心筋の体積を計算することが可能であった。筋細胞、血管構造、及びその他の組織構成要素を含んだ新たに形成された心筋の体積は、増殖因子で治療したマウスでのみ検出され、８ｍｍ３であることがわかった。このように修復帯域は、梗塞サイズを６７％から５７％に減少させた（図６８及び６９）。
【０２００】
ＨＧＦ−ＩＧＦ−１の走化特性及び分裂促進特性によって、壁の梗塞領域にある原始細胞の移動、増殖、及び分化が生じ、新しい心筋が生成された。小動物におけるこの方法論的手法の複雑さにもかかわらず、梗塞部内の心筋帯の形成は、これらのケースの８５％で得られた（２６匹のマウスのうち２２匹）。この帯域は、損傷領域の６５±８％を占め、壁の内層及び外層から均等に離れた梗塞部の中間部分に位置していた。非常に大きい梗塞では、その壁の厚み全体が、発達する心筋に置換された（図２３、Ｅ〜Ｈ）。
【０２０１】
解剖学的に、長軸と房室の直径は２つの梗塞マウス群で同様であり、治療的介入によって積極的な心室再構築が促進されたことを示している。この概念は、治療済みマウスでの６０％大きい梗塞サイズと矛盾しないものであった。さらに、壁の厚さと房室半径との比は、未治療のマウスよりも治療済みのマウスで減少が小さくなった。この関係は、治療済みマウスでのＬＶ拡張終期圧の上昇がより小さいことと相俟って、この群の拡張期壁応力の増大を著しく減衰させた（図６７）。
【０２０２】
原始細胞を、モノクローナルｃ−キット及びＭＤＲ１抗体で標識した（８２、８３）。ＢｒｄＵの取込みはＢｒｄＵ抗体によって検出した（６１、８７）。内皮細胞は抗第ＶＩＩＩ因子で認識し、平滑筋細胞は抗−α−平滑筋アクチンで認識した。筋細胞の分化では、ネスチン、デスミン、心筋ミオシン、α−筋節アクチン、Ｎ−カドヘリン、及びコネキシン４３抗体を利用した。梗塞部での瘢痕形成は、抗コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の混合物により検出した（８３、６１、８７）。
【０２０３】
修復心筋の組成を形態計測学的に評価した。筋細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞に特異的な抗体を、実質細胞及び血管プロフィルの認識に用いた（６１、８７）。さらに、細胞のＢｒｄＵ標識を、経時的な組織再生のマーカーとして使用した。筋細胞は、帯域の８４±３％を占め、冠状血管構造は１２±３％、その他の構造構成要素は４±１％を占めた。新しい筋細胞は６００〜７２００μｍ３まで様々であり、平均体積は２２００±４００μｍ３であった（図６８及び６９）。これと共に、３．１±１．１百万個の筋細胞が形成され、失われた２．４±０．８百万個の細胞を補った。細胞再生のこのわずかな超過は、筋細胞のサイズと一致していなかった。擬似手術した心臓では、筋細胞の体積である１８０００±３６００μｍ３は、増殖する細胞よりも８．２倍大きかった。重要なのは、筋肉質量損失の１６％が梗塞後１６日で再構成されたことである（失われた筋肉量：１８０００×２．４×１０６＝４３ｍｍ３；再生された筋肉量：２２００×３．１×１０６＝７．０ｍｍ３；７．０：４３＝１６％）。新しい筋細胞は依然として成熟中であるが、生体内心エコー検査で実証されるようにまた生体外で機械的に実証されるように、機能的には十分に能力あるものであった。
【０２０４】
心エコー検査は、１３ＭＨｚ線形変換器を備えたAcuson Sequoia ２５６ｃを使用することにより、意識のあるマウスで行った（８７）。２次元画像及びＭモードトレースを、乳頭筋レベルで胸骨短軸方向から記録した。駆出率（ＥＦ）を、２Ｄ短軸方向のＬＶ横断面領域から導き出した：ＥＦ＝［（ＬＶＤＡ−ＬＶＳＡ）／ＬＶＤＡ］×１００、ただしＬＶＤＡ及びＬＶＳＡは拡張期及び収縮期におけるＬＶ面積に対応する。血行動態に関しては、マウスに麻酔をかけ、チャート記録計に接続されたMillarマイクロチップ圧力変換器をＬＶ内に前進させて、非開胸標本内で圧力と＋及び−ｄＰ／ｄｔの評価を行った。１５日目に実施した心エコー検査では、治療した梗塞部の壁の再生部分で収縮活性が部分的に回復したことを示した。駆出率も、未治療のマウスより治療したマウスのほうが高かった（図２４、Ａ〜Ｅ）。このように、構造的修復は機能的修復と結び付けられていた。
【０２０５】
新しい筋細胞が機能的な適格性を得て、心室性能の改善に寄与するのを確認するために、これらの細胞を、壁の梗塞領域にある再生心筋から酵素で切り離し（１２９）、その収縮行動を生体外で評価した（１２４、１３０）。梗塞後治療済みマウス（ｎ＝１０）からコラゲナーゼ消化によって分離された筋細胞を、１．０ｍＭ Ｃａ２＋を含有する細胞浴（３０±０．２℃）に入れ、持続時間が３〜５ｍｓであり強度が拡張期閾値の２倍である矩形脱分極パルス（０．５Ｈｚ）で刺激を与えた。パラメータは、コンピュータに保存されたビデオ画像から得た（１２４、１３０）。発達する筋細胞は小さく、筋細胞膜下領域の細胞の周辺に筋原線維が位置付けられていた。新しい筋細胞は、活発にＤＮＡを複製する新生細胞に似ていた。これらは、スペア肥大化心室筋細胞よりも著しく小さかった（図２５、Ａ及びＢ）。生存する古い筋細胞と比べると、増殖する細胞は、より高いピーク短縮及び短縮速度とより短いピーク短縮までの時間を示した（図２５、Ｃ〜Ｊ）。
【０２０６】
分離された、新たに発生した筋細胞をＫｉ６７で染色して、これらの細胞が循環するかどうか、したがってＤＮＡを合成するかどうか決定した。同一のプロトコルを、梗塞後治療済みマウスの分離された生存する肥大化筋細胞に適用した。これに基づき、単核細胞及び２核細胞中の各筋細胞核のＤＮＡ量を、ＰＩ染色及び共焦点顕微鏡法によって評価した（図２５、Ａ及びＢ参照）。対照の２倍体マウスリンパ球を基準として使用した。目標は、細胞系統に拘束される前にＣＳＣに細胞融合が生じるかどうかを明らかにすることであった。この可能性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって最近になって示された（１３１、１３２）。新しい非サイクリング筋細胞及び拡大スペア筋細胞は、２倍体核のみ有し、そのような現象が心臓修復で役割を果たす余地を与えなかった（図６６）。
【０２０７】
帯域内での成熟筋細胞の分化レベルを確立するために、ネスチン、デスミン、心筋ミオシン重鎖、α−筋節アクチン、Ｎ−カドヘリン、及びコネキシン４３の発現について評価した。Ｎ−カドヘリンは接着野を確認し、コネキシン４３は介在板の細隙結合を確認する。これらのタンパク質は発達上調節される。コネキシン４３は筋細胞の電気的結合及び収縮の同期性にも極めて重要である。これら６種のタンパク質は、本質的に全て新たに形成された筋細胞内で検出された（図２６、Ａ〜Ｎ）。ＢｒｄＵにより標識された筋細胞のパーセンテージは８４±９％であり、細胞増殖が再生組織で進行中であることをしめしている。心臓修復は、毛細血管及び細動脈の形成を含んでいた（図２７、Ａ〜Ｄ）。管腔内に赤血球が存在することは、血管が冠状動脈循環系に接続されていることを示していた。しかしこの筋細胞回復段階は、毛細血管構造よりも抵抗細動脈が広範に増殖されることを特徴としていた。新しい心筋１ｍｍ２当たり、細動脈が５９±２９、毛細血管が１３７±８０であった。
【０２０８】
現在わかっていることは、内在するＣＳＣがその貯蔵領域から移動して梗塞心筋内にコロニー形成し、そこで心臓細胞系統に分化して組織再生をもたらすことを示している。本明細書で利用される処置は、通常なら哺乳類の寿命と相容れない梗塞サイズの動物を救済することができた。
【実施例９】
【０２０９】
生体内で機能的適格性を獲得する心臓幹細胞の生体外分化
Ａ．細胞の収集及びクローニング
心臓細胞を、２０〜２５月齢のメスFischerラットから切り離した（１１１、１１２）。無傷の細胞を分離し、筋細胞を処分した。小細胞を懸濁させ、凝集体をストレーナで除去した。細胞を、膜の外面に位置しているＮ末端エピトープを認識するウサギｃ−キット抗体（Ｈ−３００、Santa Cruz）と共にインキュベートした（１２１）。細胞を、抗ウサギＩｇＧ（Dynal）で被覆された磁気ビーズに曝し、ｃ−キットＰＯＳ細胞を磁石で収集した（ｎ＝１３）。ＦＡＣＳでは（ｎ＝４）、細胞をｒ−フィコエリトリン結合ラットモノクローナル抗−ｃ−キット（Pharmingen）で染色した。どちらの方法でも、ｃ−キットＰＯＳ細胞は、小細胞集団の６〜９％の間で様々であった。
【０２１０】
ｃ−キットＰＯＳ細胞は、筋細胞（α−筋節アクチン、心筋ミオシン、デスミン、α−心筋アクチニン、コネキシン４３）、内皮細胞（ＥＣ；第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１、ビメンチン）、平滑筋細胞（ＳＭＣ；α−平滑筋アクチン、デスミン）、及び線維芽細胞（Ｆ；ビメンチン）の細胞質タンパク質に陰性であると記録した。筋細胞系統の核マーカー（Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、ＧＡＴＡ−４）は細胞の７〜１０％で、また細胞質タンパク質は細胞の１〜２％で検出された。ｃ−キットＰＯＳ細胞は、骨格筋転写因子（ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５）、或いは脊髄、リンパ球、及び赤血球の細胞系統のマーカー（ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＴＥＲ−１１９）を発現せず、細胞がＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞であることを示していた。
【０２１１】
ｃ−キットＰＯＳ細胞を１〜２×１０４細胞／ｍｌ ＮＳＣＭでプレートに播いたが、これは神経幹細胞の選択及び増殖に利用されるものである（１２２）。これは、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭ及びＨａｍのＦ１２（比１：１）、ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ、インスリン−トランスフェリン−セレナイトにより構成された。ｃ−キットＰＯＳ細胞は２週間で取着し、増殖し始めた（図２８ａ、ｂ）。次いでＮＳＣＭを分化培地（ＤＭ）に代え、７〜１０日で集密状態になった。細胞を、トリプシン処理によって継代した。サイクリング細胞は、Ｋｉ６７発現により決定されたように、継代（Ｐ）Ｐ１〜Ｐ５で７４±１２％から８４±８％まで様々であった（各Ｐでｎ＝５）。Ｐ２及びＰ４での倍加時間は平均４１時間であった。細胞は、増殖停止及び老化に至ることなくＰ２３まで分割し続け、その時点で細胞を凍結した。心臓系統はＰ０からＰ２３まで確認された。Ｐ０（ｎ＝７）、Ｐ３（ｎ＝１０）、Ｐ１０（ｎ＝１３）、及びＰ２３（ｎ＝１３）で、筋細胞は２９〜４０％、ＥＣは２０〜２６％、ＳＭＣは１８〜２３％、Ｆは９〜１６％であった。液体窒素中で６カ月増殖させたＰ２３の一定分量は、親細胞と同じ表現型を発現した。
【０２１２】
ＤＭで増殖させたときのＰ０及びＰ１では、細胞の５０％がＮｋｘ２．５を示し、６０％がＭＥＦ２を、３０％がＧＡＴＡ−４を、５５％がＧＡＴＡ−５を示した（図２８ｃ〜ｆ）。逆に、骨格筋（ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５）、血球（ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＴＥＲ−１１９）、及び神経（ＭＡＰ１ｂ、ニューロフィラメント２００、ＧＦＡＰ）マーカーは確認されなかった。
【０２１３】
クローニングでは、細胞を１０〜５０細胞／ｍｌ ＮＳＣＭで播種した（図２８ｇ）（１０９、１１０）。１週間後、単細胞から得られたコロニーが認められ（図２８ｈ）；フィブロネクチン、プロコラーゲンＩ型、及びビメンチンは、線維芽細胞系統を除き存在しなかった。個々のコロニーをクローニングシリンダーで分離し、プレートで培養した。多数のクローンを発育させ、各標本ごとに１つのクローンを選択して特徴付けをした。１０％ＦＣＳ及び１０−８Ｍデキサメタゾンを含有するＭＥＭを用いて分化を誘発させた（ＤＭ）。サブクローニングでは、多数のクローンから得た細胞を１０〜５０細胞／ｍｌ ＮＳＣＭでプレートに播いた。単一のサブクローンを分離し、ＤＭで培養した。各サブクローニングステップで、細胞の一定分量を懸濁液中で増殖し、クローン球体に発達させた。
【０２１４】
各クローンは、２〜３のＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の群を含有していたが（図２９ａ）、これらの細胞の大部分（約２０〜５０）はｃ−キットＮＥＧ細胞中に分散された。一部の細胞はＫｉ６７陽性であり、時折、有糸分裂状態にあった（図２９ｂ〜ｄ）。心筋ミオシン及びα−筋節アクチンを発現する筋細胞と、第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１、及びビメンチンを発現するＥＣと、α−平滑筋クチンを発現するＳＭＣと、ビメンチンのみ発現するＦとが、各クローンで確認された（図２９ｅ〜ｈ）。ネスチンを含有する小細胞の凝集体も存在した（補足情報）。このように、心筋から分離されたＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞は、幹細胞に期待される性質を有していた。これらはクローン原性で、自己再生し、多能性であり、主要な心臓細胞型の源になった。いくつかの初代クローンのサブクローン分析により、初代クローンの表現型の安定性、すなわちクローン原性、自己再生性、及び多能性を確認した。ほとんどのクローンの表現型は、初代クローンの表現型と区別がつかなかった。しかし８個のサブクローンのうちの２個では、その一方に筋細胞のみが得られ、他方にはＥＣのみ確認された。
【０２１５】
Ｃｏｒｎｉｎｇの未処理の皿で、懸濁液中で増殖させたクローン原性細胞は、球状のクローンを生成した（図３０ａ）。この足場依存性増殖は、幹細胞に典型的なものである１４、１５。この球体は、ｃ−キットＰＯＳ及びｃ−キットＮＥＧ細胞のクラスターと大量のネスチンからなるものであった（図３０ｂ〜ｄ）。その他幹細胞１４、１５と同様に、ＤＭで培養した後、球体がすぐに結合し、細胞はその球体から移行して分化した（図３０ｅ〜ｈ）。
【０２１６】
細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、未分化細胞をｃ−キット抗体で標識した。筋細胞に対するマーカーには、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−５、ネスチン、α−筋節アクチン、及びα−心筋アクチニン、デスミン、及び心筋ミオシン重鎖が含まれていた。ＳＭＣに対するマーカーにはα−平滑筋アクチン及びデスミンが、ＥＣには第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１、及びビメンチンが、Ｆには、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、及びプロコラーゲンＩ型が存在しない状態でビメンチンが含まれた。ＭｙｏＤ、ミオゲニン、及びＭｙｆ５は骨格筋細胞のマーカーとして利用した。ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、及びＴＥＲ−１１９は、造血細胞系統を排除するのに用いた。ＭＡＰ１ｂ、ニューロフィラメント２００、及びＧＦＡＰは、神経細胞系統を認識するのに使用した。ＢｒｄＵ及びＫｉ６７は、サイクリング細胞を確認するのに用いた（６１、８７）。核はＰＩで染色した。
【０２１７】
筋細胞及びＳＭＣは、生体外で収縮することができなかった。アンギオテンシンＩＩ、イソプロテレノール、ノルエピネフリン、及び電気的刺激では収縮が促進されなかった。ＥＣは、ｅＮＯＳなど完全分化のマーカーを発現しなかった。
【０２１８】
Ｂ．心筋梗塞及び細胞移植
ＢｒｄＵ標識細胞（Ｐ２；陽性細胞＝８８±６％）を移植した。心筋梗塞を、２月齢のメスFischerラットに発生させた（１１１）。５時間後、２２匹のラットの梗塞部に接する２つの対向する領域に２×１０５個の細胞を注射し、１０日目に１２匹のラットを犠牲にし、２０日目に１０匹のラットを犠牲にした。それぞれの間隔で、８〜９匹の梗塞ラット及び１０匹の擬似手術したラットに生理食塩水を注射し、５匹にはＬｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞を注射して対照として使用した。ケタミン麻酔下で、２０日目に殺すラットについてのみ、９日目と１９日目に心エコー検査を実施した。Ｍモードトレースから、ＬＶ拡張終期直径及び壁厚を得た。駆出率を計算した（８７）。１０日目及び２０日目に動物に麻酔をかけ、ＬＶ圧と＋及び−ｄＰ／ｄｔを非開胸標本で評価した（１１１）。死亡率は、手術後１０日目及び２０日目で未治療のラットよりも治療済みのラットで低かったが統計的に有意ではなく、全ての群を合わせた平均は３５％であった。プロトコルは、機関の審議委員会で承認された。
【０２１９】
Ｃ．解剖学的及び機能的結果
心臓を拡張期で停止させ、ホルマリンで固定した。梗塞サイズを、左心室から失われた筋細胞の割合によって決定し（８７）、１０日目の治療済み及び未治療のラットではそれぞれ５３±７％及び４９±１０％（ＮＳ）であり、２０日目の治療ずみ及び未治療のラットではそれぞれ７０±９％及び５５±１０％であった（Ｐ＜０．００１）。４００個の新しい筋細胞の体積を、各心臓で測定した。切片をデスミン及びラミニン及びＰＩで染色した。中心に位置付けられた核を持つ長手方向に向いた筋細胞では、細胞の長さ及び核の端から端までの直径を収集して細胞体積を計算した（８７）。
【０２２０】
切片をＢｒｄＵ及びＫｉ６７抗体と共にインキュベートした。再生心筋帯は、１０日目に１２匹の治療済み梗塞マウスのうち９匹で確認され、２０日目には１０匹の治療済み梗塞マウスの全てで確認された。１０日目、その心筋帯は薄く不連続であり、２０日目には厚くなって梗塞領域全体に存在した（図３１ａ〜ｃ）。筋細胞（Ｍ）、ＥＣ、ＳＭＣ、及びＦは、心筋ミオシン、第ＶＩＩＩ因子、α−平滑筋アクチン、及び第ＶＩＩＩ因子のない状態のビメンチンでそれぞれ確認した。筋細胞は、心筋ミオシン抗体及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によっても確認された。１０日目及び２０日目に、それぞれ３０及び４８ｍｍ３の新しい心筋を測定した。組織再生により、梗塞サイズは１０日目で５３±７％から４０±５％に（Ｐ＜０．００１）、２０日目で７０±９％から４８±７％に（Ｐ＜０．００１）にそれぞれ縮小した。
【０２２１】
ＢｒｄＵ及びＫｉ６７により標識された細胞は、共焦点顕微鏡法で確認した（１０３、１０５）。ＢｒｄＵ標識用にサンプリングされた核の数は、Ｍ＝５２２９、ＥＣ＝３５７２、ＳＭＣ＝４０１０、Ｆ＝５５２９であった。Ｋｉ６７に関して対応する値は、Ｍ＝９２９０、ＥＣ＝９１０３、ＳＭＣ＝８３９２であった。筋細胞の分化は、心筋ミオシン、α−筋節アクチン、α−心筋アクチニン、Ｎ−カドヘリン、及びコネキシン４３で明らかになった。コラーゲンは、コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型抗体により検出された。
【０２２２】
移植した細胞をＢｒｄＵで標識したので、発達する心筋の細胞の源はこのマーカーにより確認した。筋細胞、細動脈（図３１ｆ〜ｎ）、及び毛細血管プロフィルが検出された。１０日目、筋細胞、毛細血管、及び細動脈の割合は２０日目よりも低く、コラーゲンは２０日目よりも高かった。Ｋｉ６７で評価した細胞増殖は、１０日目で多く２０日目で減少した（補足説明）。
【０２２３】
心筋ミオシン、α−筋節アクチン、α−心筋アクチニン、Ｎ−カドヘリン、及びコネキシン４３が筋細胞中に検出された（図３１ｍ〜ｔ；補足説明）。１０日目、筋細胞は小さく、筋節部はごくまれに検出可能であり、Ｎ−カドヘリン及びコネキシン４３はその大部分が細胞質内に位置していた（図３１ｍ、ｎ、ｑ、ｒ）。筋細胞の体積は平均して１５００μｍ３であり、１３．９×１０６個の筋細胞が形成された。２０日目、筋細胞はぎっしり詰められ、筋原線維がより豊富であり、Ｎ−カドヘリン及びコネキシン４３は接着野及び介在板の細隙結合を画定した（図３１ｏ、ｐ、ｓ、ｔ）。筋細胞の体積は平均して３４００μｍ３であり、１３×１０６個の筋細胞が存在していた。
【０２２４】
筋細胞アポトーシスは、単一塩基のオーバーハングを持つヘアピンオリゴヌクレオチドプローブのｉｎ ｓｉｔｕ結紮によって測定した。アポトーシスに関してサンプリングされた核の数は、１０日目で３０４６４であり、２０日目で１２７６０であった。１０〜２０日で筋細胞数が保たれていることは、Ｋｉ６７標識の減少及びアポトーシスの増加に矛盾しないものであった（０．３３±０．２３％〜０．８５±０．３１％、Ｐ＜０．００１）。このように、筋細胞の増殖は早い段階で広く行われ、筋細胞の肥大は後に生じた。１０日から２０日までで、血管の数はほぼ倍になった。
【０２２５】
新しい筋細胞の機械的性質を決定する手順については既に述べた３０。梗塞後治療済みのラット（ｎ＝４）から分離した筋細胞を、１．０ｍＭ Ｃａ２＋を含有する細胞浴（３０±０．２℃）に入れ、持続時間が３〜５ｍｓで強度が拡張期閾値の２倍である矩形脱分極パルス（０．５Ｈｚ）により刺激を与えた。コンピュータに保存されたビデオ画像から機械的パラメータを得た。治療した心臓の梗塞領域及び非梗塞領域から分離した筋細胞の機械的動作を、２０日目に測定した（図３２ａ〜ｅ）。新しい細胞にはカルシウム耐性があり、刺激に応答した。しかしスペア筋細胞に比べ、成熟細胞は、より低減したピーク短縮及び短縮速度を示し、ピーク短縮までの時間及び５０％再伸長までの時間については２つの細胞群で同様であった（図３３ａ〜ｌ）。発達する筋細胞は、大部分が周辺に分布している筋原線維を有し、筋節線条が明らかであった（図３２ａ〜ｅ）。
【０２２６】
細胞移植により梗塞サイズ及び窩腔拡張が縮小し、壁厚及び駆出率が増加した。収縮が梗塞後の心室壁に再度見られ、拡張終期圧と、収縮−拡張期圧格差と、＋及び−ｄＰ／ｄｔが２０日目に改善された。拡張期応力は、治療済みラットで５２％低かった（補足情報）。このように、心臓修復により促進された構造的及び機能的な修正が、拡張期負荷を低減し、心室性能を回復させた。この有益な効果は、梗塞サイズが２つのラット群で同様であるにもかかわらず生じた。
【０２２７】
移植した細胞のコロニー形成、複製、分化、及び組織再生は、ｃ−キットＰＯＳ細胞及び損傷した心筋を必要とした。擬似手術したラットに注射されたｃ−キットＰＯＳ細胞はグラフト化が不十分であり、分化しなかった。梗塞部の境界にｃ−キットＮＥＧ細胞を注射しても、心臓修復には何の効果もなかった。
【０２２８】
本明細書で報告したＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の多能性表現型は、ニワトリ（１１３）、ゼブラフィッシュ（１１４）、及び哺乳類（１１５）の心臓細胞系統の決定は明らかに異なっており、このため筋細胞、ＳＭＣ、及びＥＣがそれぞれ個別の系統から生ずると結論される。しかし全ての研究が一致しているとは限らない（１１６）。これらの実験（１１３、１１４、１１５、１１６）は、本明細書で行ったように、注目された細胞のいずれかの発生能力に取り組んでいないので、種々の結果は正常な発生運命と発生能力との相違に関する別の例を示すようである。さらに、損傷心筋を修復する手段としての、ヒト胚性幹細胞（１１７）、プロジェニター内皮細胞（１０１）、及びクローン原性細胞（５２）の柔軟性が、最近になって実証された（１０１、５２）。
【実施例１０】
【０２２９】
増殖因子による心臓幹細胞（ＣＳＣ）の移動が梗塞心筋の修復を促進し、意識のあるイヌの局所的及び全体的な機能が改善される
以下に述べる事項以外は、前述の非限定的な実施例の方法を使用した。
【０２３０】
幹細胞のホーミング及び分化によるげっ歯類での梗塞後の心筋再生は、同様のタイプの心臓修復が大型の哺乳類でも生じるかどうかという疑問に答えないままである。さらに、新しい心筋が、収縮を回復させて梗塞区域の機能的異常に影響を及ぼす可能性があるかどうか、わかっていない。そのため、イヌに長期にわたり機器を付けて、血行動態及び局所的壁機能の測定を行った。１回心拍出量及びＥＦも決定した。左前下行冠状動脈の周囲の水圧式オクルダを膨張させることにより、心筋梗塞を誘発させた。４時間後、ＨＧＦ及びＩＧＦ−１を境界ゾーンに注射して幹細胞を移動し活性化させ、次いでイヌを３０日間モニタした。増殖因子は長期にわたり心臓修復を誘発して梗塞部の隆起を元に戻し、セグメント短縮は−２．０±０．７％から＋５．５±２．２％まで増加し、１回心仕事は−１８±１１から＋５３±１０ｍｍ×ｍｍＨｇまで増加し、１回心拍出量は２２±２から４５±４ｍｌまで増加し、駆出率は３９±３から６４±４％まで増加した。梗塞後８時間を経た治療済みのイヌでは、原始細胞の数が、基準である２４０±４０個のｃ−キット陽性細胞から１７００±４００個（離れた心筋）、４４００±１２００（境界ゾーン）、３１００±９００個のｃ−キット陽性細胞／１００ｍｍ２（梗塞面積）に増加した。Ｋｉ６７標識は、遠隔、境界、及び梗塞部の心筋のｃ−キット陽性細胞の、それぞれ４８％、４６％、及び２６％で検出された。このように、これら細胞の高いレベルで複製が行われた。これらの効果は、梗塞後治療していないイヌでは本質的に得られない。急性実験は、冠状動脈閉塞後１０〜３０日を経てから埋め込んだ結晶で画定された梗塞心筋の定量分析により補完した。新しい心筋での奇異的運動から規則的な収縮への変化は、筋細胞の生成を特徴とし、そのサイズは４００から１６０００μｍ３まで様々であり、平均体積は２０００±６４０μｍ３であった。ＢｒｄＵ標識した内皮細胞及び平滑筋細胞を持つ抵抗血管は、組織１ｍｍ２当たり８７±４８個であった。毛細血管は細動脈よりも２〜３倍高かった。これと共に、梗塞部の１６±９％が健康な心筋に置換された。このように、イヌに内在する原始細胞は、その貯蔵部位から移動して死滅した心筋に到達することができる。幹細胞の活性化及び分化は、梗塞心臓の修復を促進させ、局所の壁の運動及び全身の血行動態を改善する。
【実施例１１】
【０２３１】
内在心臓幹細胞の移動は、梗塞心臓におけるアンギオテンシンＩＩの遮断に対する重要な追加の治療を構成する
以下に述べる事項を除き、前述の非限定的な実施例の方法を使用した。
【０２３２】
心筋梗塞（ＭＩ）の主要な複雑な要素のうち２つは、筋肉質量の損失と窩腔の拡張であり、これらはどちらもネガティブな左心室（ＬＶ）再構築及び心臓性能の低下の原因となる。これらＭＩの悪影響を妨げようとする際、内在心臓幹細胞（ＣＳＣ）を移動し活性化して組織再生を促進させ、ＡＴ１受容体遮断薬ロサルタン（Ｌｏｓ）を２０ｍｇ／ｋｇ体重／日で投与して、細胞の肥大を弱め、それによって房室容積の膨張を弱めた。これに基づき、ＭＩをマウスで発生させ、それら動物を４つの群に、すなわち１．擬似手術したもの（ＳＯ）、２．ＭＩのみ、３．ＭＩ−Ｌｏｓ、４．ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣに細分した。ＭＩ後１カ月で動物を犠牲にし、ＬＶ機能、梗塞寸法、及び心臓再構築を評価した。心筋再構成は、ＣＳＣで治療したマウスでも測定した。ＬＶによって失われた筋細胞の数に基づけば、梗塞サイズはＭＩで４７％、ＭＩ−Ｌｏｓで５１％、ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣで５３％であった。ＭＩ及びＭＩ−Ｌｏｓに比べ、Ｌｏｓ及びＣＳＣで治療したＭＩは損傷心臓により好ましい結果をもたらし、すなわち房室直径に関してはＭＩに対し−１７％、ＭＩ−Ｌｏｓに対し−１２％であり、長軸に関してはＭＩに対し−２６％（ｐ＜０．００１）、ＭＩ−Ｌｏｓに対し−８％（ｐ＜０．０２）であり、房室容積に関してはＭＩに対し−４０％（ｐ＜０．０１）、ＭＩ−Ｌｏｓに対し−３５％（Ｐ＜０．０４）であった。ＬＶ質量と房室容積との比は、ＭＩ及びＬｏｓの場合よりもＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣの場合のほうがそれぞれ４７％（ｐ＜０．０１）及び５６％（ｐ＜０．０１）高かった。ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣでの組織修復は、９００μｍ３の１０×１０６個の新しい筋細胞で構成された。さらに、このマウス群では、心筋１ｍｍ２当たり７０の細動脈と２００の毛細血管があった。新しい心筋が９ｍｍ３生成されると、ＭＩサイズは２２％縮小され、すなわちＬＶの５３％から４１％になった。心エコー検査によれば、ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣによるマウスの壁部の梗塞領域に収縮機能が再度出現した。血行動態としては、ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣマウスは、より低いＬＶＥＤＰとより高い＋及び−ｄＰ／ｄｔを有していた。結論として、心室再構築に対するロサルタンのポジティブな影響は、ＣＳＣの梗塞領域への転位によって媒介される心臓修復のプロセスによって高められる。移動したＣＳＣは、梗塞サイズ及び心室拡張を低下させ、それによって梗塞心臓の収縮動作がさらに回復する。
【実施例１２】
【０２３３】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が、ｃ−ｍｅｔの核への転位を誘発し、ＧＡＴＡ−４の発現及び心臓肝細胞（ＣＳＣ）の分化を活性化させる
以下に述べる事項を除き、前述の非限定的実施例の方法を使用した。
【０２３４】
予備的研究で、本発明者等は、ｃ−キット又はＭＤＲ−１に対して陽性のＣＳＣが表面受容体ｃ−ｍｅｔを発現することを実証できた。ｃ−ｍｅｔはＨＧＦの受容体であり、リガンド結合は、基質メタロプロテイナーゼの合成を介して細胞運動性を促進させた。しかし、ｃ−ｍｅｔの活性化がＣＳＣの生態及び機能に追加の効果をもたらすのかどうかはわからなかった。そのため本発明者等は、５０ｎｇ／ｍｌでＨＧＦをＮＳＣＭに溶かしたものに曝したＣＳＣ上のｃ−ｍｅｔが、細胞内への内部移行及び転位によって増殖因子に応答するかどうか試験をした。驚くべきことに、核内でのｃ−ｍｅｔの所在は、原始的特徴を維持するこれら刺激を受けた細胞内で、共焦点顕微鏡法により検出された。このＨＧＦのｃ−ｍｅｔに対する珍しい影響により、移動した受容体が、ＣＳＣの細胞増殖及び分化に寄与するその他の核タンパク質と相互に作用する可能性が高まった。細胞系統の拘束での、心臓に特異的な転写因子ＧＡＴＡ−４極めて重要な役割による。免疫沈降法及びウェスタンブロット法によって、ｃ−ｍｅｔ及びＧＡＴＡ−４により作製されたタンパク質複合体を識別した。単一のＨＧＦ刺激の後の時間依存性分析では、１５分から３日まで、ｃ−ｍｅｔ−ＧＡＴＡ−４複合体の漸進的増加が示された。時間は、筋細胞及びその他の心臓細胞への原始細胞の分化にも結び付けられていた。ＧＡＴＡ−４とｃ−ｍｅｔとのＤＮＡレベルでの分子相互作用を確立するために、１時間にわたりＨＧＦで刺激を与えた細胞から分離した核抽出物について、ゲルリターデションアッセイを実施した。シフトしたバンドが、ＧＡＴＡ配列を含有するプローブを利用して得られた。しかしＧＡＴＡ−４抗体を添加すると、スーパーシフトバンドが得られた。逆に、ｃ−ｍｅｔ抗体を含むと、ＧＡＴＡ−４の帯域の光学密度が弱められた。ＴＡＴＡボックスの上流のＧＡＴＡ配列がｃ−ｍｅｔプロモーターで識別されるので、第２の運動性シフトアッセイを実施した。その場合、ＨＧＦで刺激を与えた細胞からの核抽出物は、ｃ−ｍｅｔ抗体いよって低下したシフトバンドをもたらした。対照的に、ＧＡＴＡ−４抗体は、スーパーシフトバンドを誘発した。このように、核レベルでのｃ−ｍｅｔのＨＧＦ媒介型転位によって、ｃ−ｍｅｔに転写因子の機能を与えることができ、将来の研究は、このＤＮＡ結合が、未成熟心臓細胞の分化をもたらすＧＡＴＡ−４の発現を高めるかどうか実証するであろう。
【０２３５】
このように本発明の好ましい実施形態について詳細に述べてきたが、添付の特許請求の範囲により定義される本発明は、その精神又は範囲から逸脱することなくその数多くの明らかな変形例が可能であるので、上述の特定の詳述事項に限定されるものではないことが理解されよう。
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】ｃ−キット発現に基づいてＦＡＣＳにより選別されたＥＧＦＰトランスジェニックマウスからのＬｉｎ−骨髄細胞を示す対数−対数プロットである（ｃ−キットＰＯＳ細胞（上部ゲート）の画分は６．４％であった。ｃ−キットＮＥＧ細胞は下部ゲートに示す。ｃ−キットＰＯＳ細胞は、ｃ−キットＮＥＧ細胞よりも１〜２ログ明るかった。）の画分は６．４％であった。）。
【図２】ＭＩ誘発マウスからの組織切片の写真である（この写真は、骨髄からのＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射した心筋梗塞（ＭＩ）領域（矢印）、残された生存可能な心筋（ＶＭ）、及び再生心筋（矢じり）を示す。倍率は１２×である。）。図２Ａと同じ組織切片の、より高い倍率での写真であり、５０×の倍率でＭＩ領域を中心とした状態である。図２Ｃ−Ｄは、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域の、低倍率及び高倍率での組織切片の写真であり、２Ｃの倍率は２５×、２Ｄの倍率は５０×である。図２Ｅは、Ｌｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞を注射したＭＩ領域の組織切片の写真であり、治癒のみ明らかな状態を示し、その倍率は５０×である（＊壊死性筋細胞。赤色＝心筋ミオシン；緑色＝核のＰＩ標識）。
【図３】ＭＩ誘発マウスからの組織切片の写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域を示す（心内膜（ＥＮ）から心外膜（ＥＰ）まで心筋が再生している切片が見られる。全ての写真は、心内膜下の梗塞組織（ＩＴ）と心内膜下のスペア筋細胞（ＳＭ）の存在が示されるように標識されている。図３Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すために染色されている（緑色）。倍率は２５０×である。図３Ｂは、心筋ミオシンの存在を示すために染色されている（赤色）。倍率は２５０×である。図３Ｃは、ＥＧＦＰとミオシンの両方の存在（赤色−緑色）、並びにＰＩで染色した核（青色）の存在を示すために染色されている。倍率は２５０×である。）。
【図４】図４Ａは、心筋梗塞が、左心室の拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、収縮−拡張期圧格差（ＬＶＤＰ）、ＬＶ＋圧力上昇率（ｄＰ／ｄｔ）、及びＬＶ−圧力減衰率（ｄＰ／ｄｔ）に及ぼす影響を示すグラフトである（左から右に、棒グラフは、擬似手術したマウス（ＳＯ、ｎ＝１１）、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射していないマウス（ＭＩ、ｎ＝５でＬｉｎ−ｃ−キットＮＥＧ細胞を注射したもの、ｎ＝６で注射していないもの）、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したマウス（ＭＩ＋ＢＭ、ｎ＝９）を示す。誤差棒は標準偏差である。＊、＋ｐ＜０．０５対ＳＯ及びＭＩ）。図４Ｂは、心筋内でのＬｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞分化に関して提案されたスキームと、機能的な関連を示す図である。
【図５】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域での心筋再生を示している（図５Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すために染色されている（緑色）。倍率は３００×である。図５Ｂは、細動脈におけるα−平滑筋アクチンの存在を示すために染色されている（赤色）。倍率は３００×である。図５Ｃは、ＥＧＦＰとα−平滑筋アクチンの両方（黄色−赤色）、並びにＰＩ染色核（青色）の存在を示すために染色されている。倍率は３００×である。図５Ｄ〜Ｆ及びＧ〜Ｉは、心筋ミオシン陽性細胞内のＭＥＦ２及びＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の存在を示す。図５Ｄは、ＰＩ染色核を示す（青色）。倍率は３００×である。図５Ｅは、ＭＥＦ２及びＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５標識を示すために染色されている（緑色）。倍率は３００×である。図５Ｆは、心筋ミオシン（赤色）、並びにＰＩによるＭＥＦ２又はＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５（核の中の明るい蛍光）を示すために染色されている。倍率は３００×である。図５Ｇは、図５は、ＰＩ染色核を示す（青色）。倍率は３００×である。図５Ｈは、ＭＥＦ２及びＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５標識を示すために染色されている（緑色）。倍率は３００×である。図５Ｉは、心筋ミオシン（赤色）、並びにＰＩによるＭＥＦ２又はＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５（核の中の明るい蛍光）を示すために染色されている。倍率は３００×である。）。
【図６】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域での心筋再生を示している（図６Ａ〜Ｃは、ＢｒｄＵに対する抗体の存在下でインキュベートした組織を示す。図６Ａは、ＰＩ標識核を示すために染色されている（青色）。倍率は９００×である。図６Ｂは、ＢｒｄＵ及びＫｉ６７で染色した核を示すために染色されている（緑色）。倍率は９００×である。図６Ｃは、α−筋節アクチンの存在を示すために染色されている（赤色）。倍率は９００×である。図６Ｄ〜Ｆは、Ｋｉ６７に対する抗体の存在下でインキュベートした組織を示す。図６Ｄは、ＰＩ標識核を示すために染色されている（青色）。倍率は５００×である。図６Ｅは、ＢｒｄＵ及びＫｉ６７で標識した核を示すために染色されている（緑色）。倍率は５００×である。図６Ｆは、α−平滑筋アクチンの存在を示すために染色されている（赤色）。倍率は５００×である。明るい蛍光：ＰＩとＢｒｄＵ（Ｃ）又はＫｉ６７（Ｆ）の組合せ）。
【図７】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域を示している（梗塞後の未修復組織領域（矢印）によって分離された生存可能な心筋（ＶＭ）と心筋の新しいバンド（ＮＢ）との境界ゾーンが示されている。図７Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すために染色されている（緑色）。倍率は２８０×である。図７Ｂは、心筋ミオシンの存在を示すために染色されている（赤色）。倍率は２８０×である。図７Ｃは、ＥＧＦＰとミオシン（赤色−緑色）の両方、並びにＰＩ染色核（青色）の存在を示すために染色されている。倍率は２８０×である。）。
【図８】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域の心筋再生を示している（図８Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すために染色されている（緑色）。倍率は６５０×である。図８Ｂは、心筋ミオシンの存在を示すために染色されている（赤色）。倍率は６５０×である。図８Ｃは、ＥＧＦＰとミオシンの両方の存在（黄色）、並びにＰＩ染色核（青色）を示すために染色されている。倍率は６５０×である。図８Ｄは、ＥＧＦＰの存在を示すために染色されている（緑色）。倍率は６５０×である。図８Ｅは、細動脈内のα−平滑筋アクチンの存在を示すために染色されている。倍率は６５０×である。図８Ｆは、ＥＧＦＰとα−平滑筋アクチンの両方（黄色−赤色）、並びにＰＩ染色核（青色）の存在を示すために染色されている。倍率は６５０×である。）。
【図９】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域を示し、且つ再生する心筋を示している（矢じり）（図９Ａは、心筋ミオシンの存在を示すために染色されており（赤色）、倍率は４００×である。図９Ｂは、Ｙ染色体の存在を示すために染色されている（緑色）。倍率は４００×である。図９Ｃは、Ｙ染色体（薄青色）とＰＩ標識核（濃青色）の両方の存在を示すために染色されている。心内膜下の梗塞組織（ＩＴ）と心外膜下のスペア筋細胞（ＳＭ）でのＹ染色体の欠乏に留意されたい。倍率は４００×である。）。
【図１０】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、心筋ミオシン陽性細胞内のＧＡＴＡ−４を示している（図１０Ａは、ＰＩ染色核を示す（青色）。倍率は６５０×である。図１０Ｂは、ＧＡＴＡ−４標識の存在を示す（緑色）。倍率は６５０×である。図１０Ｃは、心筋ミオシン（赤色）とＧＡＴＡ−４及びＰＩ（核の中の明るい蛍光）とを併せて示すために染色されている。倍率は６５０×である。）。
【図１１】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真である（図１１Ａは、梗塞組織と生存組織との境界ゾーンを示す。倍率は５００×である。図１１Ｂは再生する心筋を示す。倍率は８００×である。図１１Ｃは、コネキシン４３の存在を示すために染色されており（黄色−緑色）、筋細胞同士の接触は矢印で示す。倍率は８００×である。図１１Ｄは、α−筋節アクチン（赤色）とＰＩ染色核（青色）の両方を示すために染色されている。倍率は８００×である。）。
【図１２】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞を注射したＭＩ領域を示し、再生する筋細胞も示している（図１２Ａは、心筋ミオシン（赤色）とＰＩ標識核（黄色−緑色）の存在を示すために染色されている。倍率は１０００倍である。図１２Ｂは図１２Ａと同じであるが倍率７００×である。）。
【図１３Ａ−Ｂ】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真である（図１３Ａは、心筋を形成した状態の（矢じり）、サイトカインで治療したマウスの大きい梗塞部（ＩＭ）を（倍率は５０×）、より高い倍率（８０×−隣接パネル）で示す。図１３Ｂは、治療していないマウスのＭＩを示す。治癒部は、梗塞部全体を包含する（矢じり）（倍率５０×）。瘢痕は、より高い倍率で見られる（８０×−隣接パネル）。赤色＝心筋ミオシン；黄色−緑色＝核のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）標識；青色−マゼンタ＝Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン）。
【図１３Ｃ】治療済み及び未治療のＭＩ誘発マウスの死亡率及び心筋再生を示すグラフである（サイトカインで治療した梗塞マウス、ｎ＝１５；治療していない梗塞マウス、ｎ＝５２。ログランク検定：ｐ＜０．０００１）。
【図１４】梗塞サイズの定量測定を示すグラフである（梗塞後又は擬似手術後２７日で犠牲にした、擬似手術マウス（ＳＯ、ｎ＝９）、梗塞後未治療マウス（ＭＩ、ｎ＝９）、及びサイトカイン治療マウス（ＭＩ−Ｃ、ｎ＝１１）の左心室自由壁（ＬＶＦＷ）での筋細胞の総数。筋細胞損失のパーセンテージは梗塞サイズに等しい。Ｘ±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５対ＳＯ）。
【図１５Ａ−Ｃ】心筋梗塞、心臓の解剖学的構造及び機能の態様の比較を示すグラフである（図１５Ａ〜Ｃは、手術後２７日で犠牲にしたＬＶ寸法を示し、擬似手術（ＳＯ、ｎ＝９）、未治療の梗塞（ＭＩ、ｎ＝９）、及びサイトカインで治療した梗塞（ＭＩ−Ｃ、ｎ＝１０）である。）。
【図１５Ｄ】心エコー検査によるＥＦを示す図である（ＳＯ、ｎ＝９；ＭＩ、ｎ＝９；及びＭＩ−Ｃ、ｎ＝９）。
【図１５Ｅ−Ｍ】ＳＯ（ｅ〜ｇ）、ＭＩ（ｈ〜ｊ）、及びＭＩ−Ｃ（ｋ〜ｍ）のＭモード心エコー図である（新たに形成された収縮心筋（矢印））。
【図１５Ｎ】壁応力を示すグラフである；ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝８）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ＝９）（結果は平均±ＳＤ。＊、＊＊それぞれｐ＜０．０５対ＳＯ及びＭＩ）。
【図１６Ａ−Ｄ】心筋梗塞、心臓の解剖学的構造、及び心室機能の態様を示すグラフトである（図１６Ａ〜Ｄは、ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝９）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ＝９）の、心エコー検査によるＬＶＥＳＤ（ａ）、ＬＶＥＤＤ（ｂ）、ＰＷＳＴ（ｃ）、及びＰＷＤＴ（ｄ）を示す。図１６Ｅ〜Ｇは、ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝９）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ＝１０）において犠牲にされた、解剖学的に測定された壁部の厚さ（ｅ）、心室直径（ｆ）、及び長軸（ｇ）を示す。＊＊＊それぞれｐ＜０．０５対ＳＯ及びＭＩ）。
【図１６Ｅ−Ｇ】心筋梗塞、心臓の解剖学的構造、及び心室機能の態様を示すグラフトである（図１６Ａ〜Ｄは、ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝９）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ＝９）の、心エコー検査によるＬＶＥＳＤ（ａ）、ＬＶＥＤＤ（ｂ）、ＰＷＳＴ（ｃ）、及びＰＷＤＴ（ｄ）を示す。図１６Ｅ〜Ｇは、ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝９）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ＝１０）において犠牲にされた、解剖学的に測定された壁部の厚さ（ｅ）、心室直径（ｆ）、及び長軸（ｇ）を示す。＊＊＊それぞれｐ＜０．０５対ＳＯ及びＭＩ）。
【図１６Ｈ−Ｐ】ＳＯ（ｈ〜ｊ）、ＭＩ（ｋ〜ｍ）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ〜ｐ）の、２次元（２Ｄ）画像及びＭモードトレースである。
【図１７】心室機能の態様を示すグラフである（図１７Ａ〜Ｄは、梗塞後又は擬似手術後２７日での犠牲時に麻酔をかけたマウスのＬＶ血行動態を示す；ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝９）、及びＭＩ−Ｃ（ｎ＝１０）。記号及び統計値については図１３も参照されたい）。
【図１８Ａ−Ｃ】心筋再生の態様を示すグラフである（図１８Ａは、組織内の細胞を、ＭＩ及びＭＩ−Ｃ；ＳＯ、梗塞のない心筋の、２７日でのＬＶＦＷ内に残された生存可能な（Ｒｅ）心筋、失われた（Ｌｏ）心筋、及び新たに形成された（Ｆｏ）心筋に分類する。図１８Ｂは、スペア心筋における細胞肥大の量を示す。図１８Ｃは、再生する心筋での細胞増殖を示す。筋細胞（Ｍ）、ＥＣ、及びＳＭＣは、ＢｒｄＵ及びＫｉ６７で標識した；ｎ＝１１。＊、＊＊ｐ＜０．０５対Ｍ及びＥＣ）。図１８Ｄ〜Ｅは、形成された心筋内の筋細胞の体積、数（ｎ＝１１）、及びクラス分布（バケットサイズ、１００μｍ３；ｎ＝４４００）を示す。
【図１８Ｄ−Ｅ】心筋再生の態様を示すグラフである（図１８Ａは、組織内の細胞を、ＭＩ及びＭＩ−Ｃ；ＳＯ、梗塞のない心筋の、２７日でのＬＶＦＷ内に残された生存可能な（Ｒｅ）心筋、失われた（Ｌｏ）心筋、及び新たに形成された（Ｆｏ）心筋に分類する。図１８Ｂは、スペア心筋における細胞肥大の量を示す。図１８Ｃは、再生する心筋での細胞増殖を示す。筋細胞（Ｍ）、ＥＣ、及びＳＭＣは、ＢｒｄＵ及びＫｉ６７で標識した；ｎ＝１１。＊、＊＊ｐ＜０．０５対Ｍ及びＥＣ）。図１８Ｄ〜Ｅは、形成された心筋内の筋細胞の体積、数（ｎ＝１１）、及びクラス分布（バケットサイズ、１００μｍ３；ｎ＝４４００）を示す。
【図１８Ｆ−Ｈ】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、ＴＥＲ−１１９標識赤血球膜を持つ細動脈を示しており（緑色蛍光）；青色蛍光＝核のＰＩ染色；赤色蛍光＝ＳＭＣ内のα−平滑筋アクチンである（図１８Ｆは８００×に拡大されている。図１８Ｇ〜Ｈは１２００×に拡大されている）。
【図１９】Ｋｉ６７（Ａ、Ｂ）及びＢｒｄＵ（Ｃ、Ｄ）に対する抗体と共にインキュベートしたＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真である（図１９Ａは、心筋ミオシンによる筋細胞の標識を示す。核の明るい蛍光は、ＰＩとＫｉ６７の組合せを反映する。倍率は８００×である。図１９Ｂは、α−平滑筋アクチンによるＳＭＣの標識を示す。核の明るい蛍光は、ＰＩとＫｉ６７の組合せを反映する。倍率は１２００×である。図１９Ｃは、α−平滑筋アクチンによるＳＭＣの標識を示す。核の明るい蛍光は、ＰＩとＢｒｄＵの組合せを反映する。倍率は１２００×である。図１９Ｄは、第VIII因子による形成心筋でのＥＣの標識を示す。核の明るい蛍光は、ＰＩとＢｒｄＵの組合せを反映する。倍率は１６００×である。）。
【図２０】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す写真であり、心筋細胞分化のマーカーを示している（図２０Ａは、ネスチンによる筋細胞の標識を示すために染色されている（黄色））。赤色蛍光は心筋ミオシンを示す。倍率は１２００×である。図２０Ｂは、デスミンの標識を示すために染色されている（赤色）。倍率は８００×である。図２０Ｃは、コネキシン４３の標識を示すために染色されている（緑色）。赤色蛍光は心筋ミオシンを示す。倍率は１４００×である。図２０ＤはＶＥ−カドヘリンを示し、黄色−緑色蛍光は、ｆｌｋ−１によるＥＣの標識を反映している（矢印）。倍率は１８００×である。図２０Ｅは、ＥＣにおける第VIII因子を表す赤色蛍光を示し、黄色−緑色蛍光は、ｆｌｋ−１によるＥＣの標識を反映している（矢印）。倍率は１２００×である。図２０Ｆは、ｆｌｋ−１によるＳＭＣ細胞質の緑色蛍光標識と、ｆｌｋ−１により標識された内皮層を示す。赤色蛍光はα−平滑筋アクチンを示す。青色蛍光は、核のＰＩ標識を示す。倍率は８００×である。
【図２１】ＭＩ誘発マウスからの組織切片を示す（図２１Ａは、明るい蛍光を使用して、核のＰＩ標識とＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５との組合せを示す。倍率は１４００×である。図２１Ｂは、明るい蛍光を使用して、核のＰＩ標識とＧＡＴＡ−４との組合せを示す。倍率は１２００×である。図２１Ｃは、明るい蛍光を使用して、核のＰＩ標識とＭＥＦ２との組合せを示す。倍率は１２００×である（赤色蛍光は、心筋ミオシン抗体の染色を示し、青色蛍光は核のＰＩ標識を示す。Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、及びＭＥＦ２によって標識された筋細胞核の割合は、それぞれ６３±５％（サンプリングされた核＝２７９０、ｎ＝１１）、９４±９％（サンプリングされた核＝２８１０、ｎ＝１１）、及び８５±１４％（サンプリングされた核＝３０９０、ｎ＝１１）であった。）。）。
【図２２Ａ−Ｆ】正常な心臓、及び増殖因子で治療した心臓、及び未治療梗塞心臓の、心筋原始細胞を示す共焦点顕微鏡写真である。図２２Ａ〜Ｆは、擬似手術したマウスからの心房心筋の切片を示す。図２２Ａ及びＢ、２２Ｃ及びＤ、２２Ｅ及びＦは、それぞれ対になっている顕微鏡写真であり、心房心筋の同じ領域に異なる染色がなされた状態を示す。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ａ、黄色）はｃ−キットＰＯＳ（２２Ｂ、緑色）細胞内に発現する（２２Ｂ、黄色−緑色）。同様にＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｃ、黄色）は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｄ、緑色）細胞内で検出される（２２Ｄ、黄色−緑色）。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ｅ、赤色）とＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｅ、黄色）の共存は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｆ、緑色）細胞内に見出される（２２Ｆ、赤色−黄色−緑色）。矢印は、ｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞内のｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを指す。筋細胞の細胞質は赤色−紫色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｇ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、アポトーシス筋細胞を持つ梗塞心筋（ＭＩ）（明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）と、生存可能な筋細胞を持つ境界ゾーン（ＢＺ）（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ｃ−キット、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｈ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、壊死筋細胞を持つＭＩ（明るい核、ＰＩ及びヘアピン２）と、生存可能な筋細胞を持つＢＺ（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ＭＤＲ１、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｉ及び２２Ｊ：アポトーシス筋細胞（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）及びｃ−キットＰＯＳ細胞（２２Ｉ、緑色の環）及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（２２Ｊ、緑色の環）は、２匹の未治療のマウスの梗塞領域において、アポトーシスを引き起こす（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１；矢印）。生存可能な細胞は、青色の核（ＰＩのみ）を持つ。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞は、梗塞心筋内に存在する（２２Ｉ、緑色の環、青色の核、ＰＩのみ；矢じり）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを示す。２２Ｋ及び２２Ｌ：サイクリングｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ、緑色の環；矢印）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ、緑色の環；矢印）細胞は、増殖因子で治療したマウスの梗塞心筋中に存在する（黄色の点はアポトーシス性の核である）。ｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ）細胞内の明るい蛍光は、それらの核のＫｉ６７標識に対応する。２２Ａ〜Ｌで、バー＝１０μｍである。２２Ｍ及び２２Ｎは、手術後７〜８時間、及び増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間で犠牲にした、擬似手術したマウス（ＳＯ）、梗塞後治療したマウス（治療済み）、及び梗塞後治療しないマウス（未治療）の心臓の様々な領域で、生存可能でありまた死滅したｃ−キットＰＯＳ（２２Ｍ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｎ）細胞の分布を示すグラフであ���。略語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れている生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接している生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。２２Ｍと２２Ｎの両方の結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊は、それぞれＳＯ及び治療済みに対してＰ＜０．０５であることを示す。
【図２２Ｇ−Ｈ】正常な心臓、及び増殖因子で治療した心臓、及び未治療梗塞心臓の、心筋原始細胞を示す共焦点顕微鏡写真である。図２２Ａ〜Ｆは、擬似手術したマウスからの心房心筋の切片を示す。図２２Ａ及びＢ、２２Ｃ及びＤ、２２Ｅ及びＦは、それぞれ対になっている顕微鏡写真であり、心房心筋の同じ領域に異なる染色がなされた状態を示す。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ａ、黄色）はｃ−キットＰＯＳ（２２Ｂ、緑色）細胞内に発現する（２２Ｂ、黄色−緑色）。同様にＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｃ、黄色）は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｄ、緑色）細胞内で検出される（２２Ｄ、黄色−緑色）。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ｅ、赤色）とＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｅ、黄色）の共存は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｆ、緑色）細胞内に見出される（２２Ｆ、赤色−黄色−緑色）。矢印は、ｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞内のｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを指す。筋細胞の細胞質は赤色−紫色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｇ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、アポトーシス筋細胞を持つ梗塞心筋（ＭＩ）（明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）と、生存可能な筋細胞を持つ境界ゾーン（ＢＺ）（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ｃ−キット、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｈ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、壊死筋細胞を持つＭＩ（明るい核、ＰＩ及びヘアピン２）と、生存可能な筋細胞を持つＢＺ（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ＭＤＲ１、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｉ及び２２Ｊ：アポトーシス筋細胞（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）及びｃ−キットＰＯＳ細胞（２２Ｉ、緑色の環）及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（２２Ｊ、緑色の環）は、２匹の未治療のマウスの梗塞領域において、アポトーシスを引き起こす（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１；矢印）。生存可能な細胞は、青色の核（ＰＩのみ）を持つ。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞は、梗塞心筋内に存在する（２２Ｉ、緑色の環、青色の核、ＰＩのみ；矢じり）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを示す。２２Ｋ及び２２Ｌ：サイクリングｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ、緑色の環；矢印）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ、緑色の環；矢印）細胞は、増殖因子で治療したマウスの梗塞心筋中に存在する（黄色の点はアポトーシス性の核である）。ｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ）細胞内の明るい蛍光は、それらの核のＫｉ６７標識に対応する。２２Ａ〜Ｌで、バー＝１０μｍである。２２Ｍ及び２２Ｎは、手術後７〜８時間、及び増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間で犠牲にした、擬似手術したマウス（ＳＯ）、梗塞後治療したマウス（治療済み）、及び梗塞後治療しないマウス（未治療）の心臓の様々な領域で、生存可能でありまた死滅したｃ−キットＰＯＳ（２２Ｍ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｎ）細胞の分布を示すグラフであ���。略語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れている生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接している生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。２２Ｍと２２Ｎの両方の結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊は、それぞれＳＯ及び治療済みに対してＰ＜０．０５であることを示す。
【図２２Ｉ−Ｊ】正常な心臓、及び増殖因子で治療した心臓、及び未治療梗塞心臓の、心筋原始細胞を示す共焦点顕微鏡写真である。図２２Ａ〜Ｆは、擬似手術したマウスからの心房心筋の切片を示す。図２２Ａ及びＢ、２２Ｃ及びＤ、２２Ｅ及びＦは、それぞれ対になっている顕微鏡写真であり、心房心筋の同じ領域に異なる染色がなされた状態を示す。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ａ、黄色）はｃ−キットＰＯＳ（２２Ｂ、緑色）細胞内に発現する（２２Ｂ、黄色−緑色）。同様にＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｃ、黄色）は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｄ、緑色）細胞内で検出される（２２Ｄ、黄色−緑色）。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ｅ、赤色）とＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｅ、黄色）の共存は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｆ、緑色）細胞内に見出される（２２Ｆ、赤色−黄色−緑色）。矢印は、ｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞内のｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを指す。筋細胞の細胞質は赤色−紫色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｇ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、アポトーシス筋細胞を持つ梗塞心筋（ＭＩ）（明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）と、生存可能な筋細胞を持つ境界ゾーン（ＢＺ）（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ｃ−キット、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｈ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、壊死筋細胞を持つＭＩ（明るい核、ＰＩ及びヘアピン２）と、生存可能な筋細胞を持つＢＺ（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ＭＤＲ１、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｉ及び２２Ｊ：アポトーシス筋細胞（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）及びｃ−キットＰＯＳ細胞（２２Ｉ、緑色の環）及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（２２Ｊ、緑色の環）は、２匹の未治療のマウスの梗塞領域において、アポトーシスを引き起こす（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１；矢印）。生存可能な細胞は、青色の核（ＰＩのみ）を持つ。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞は、梗塞心筋内に存在する（２２Ｉ、緑色の環、青色の核、ＰＩのみ；矢じり）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを示す。２２Ｋ及び２２Ｌ：サイクリングｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ、緑色の環；矢印）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ、緑色の環；矢印）細胞は、増殖因子で治療したマウスの梗塞心筋中に存在する（黄色の点はアポトーシス性の核である）。ｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ）細胞内の明るい蛍光は、それらの核のＫｉ６７標識に対応する。２２Ａ〜Ｌで、バー＝１０μｍである。２２Ｍ及び２２Ｎは、手術後７〜８時間、及び増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間で犠牲にした、擬似手術したマウス（ＳＯ）、梗塞後治療したマウス（治療済み）、及び梗塞後治療しないマウス（未治療）の心臓の様々な領域で、生存可能でありまた死滅したｃ−キットＰＯＳ（２２Ｍ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｎ）細胞の分布を示すグラフであ���。略語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れている生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接している生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。２２Ｍと２２Ｎの両方の結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊は、それぞれＳＯ及び治療済みに対してＰ＜０．０５であることを示す。
【図２２Ｋ−Ｌ】正常な心臓、及び増殖因子で治療した心臓、及び未治療梗塞心臓の、心筋原始細胞を示す共焦点顕微鏡写真である。図２２Ａ〜Ｆは、擬似手術したマウスからの心房心筋の切片を示す。図２２Ａ及びＢ、２２Ｃ及びＤ、２２Ｅ及びＦは、それぞれ対になっている顕微鏡写真であり、心房心筋の同じ領域に異なる染色がなされた状態を示す。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ａ、黄色）はｃ−キットＰＯＳ（２２Ｂ、緑色）細胞内に発現する（２２Ｂ、黄色−緑色）。同様にＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｃ、黄色）は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｄ、緑色）細胞内で検出される（２２Ｄ、黄色−緑色）。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ｅ、赤色）とＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｅ、黄色）の共存は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｆ、緑色）細胞内に見出される（２２Ｆ、赤色−黄色−緑色）。矢印は、ｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞内のｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを指す。筋細胞の細胞質は赤色−紫色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｇ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、アポトーシス筋細胞を持つ梗塞心筋（ＭＩ）（明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）と、生存可能な筋細胞を持つ境界ゾーン（ＢＺ）（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ｃ−キット、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｈ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、壊死筋細胞を持つＭＩ（明るい核、ＰＩ及びヘアピン２）と、生存可能な筋細胞を持つＢＺ（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ＭＤＲ１、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｉ及び２２Ｊ：アポトーシス筋細胞（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）及びｃ−キットＰＯＳ細胞（２２Ｉ、緑色の環）及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（２２Ｊ、緑色の環）は、２匹の未治療のマウスの梗塞領域において、アポトーシスを引き起こす（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１；矢印）。生存可能な細胞は、青色の核（ＰＩのみ）を持つ。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞は、梗塞心筋内に存在する（２２Ｉ、緑色の環、青色の核、ＰＩのみ；矢じり）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを示す。２２Ｋ及び２２Ｌ：サイクリングｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ、緑色の環；矢印）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ、緑色の環；矢印）細胞は、増殖因子で治療したマウスの梗塞心筋中に存在する（黄色の点はアポトーシス性の核である）。ｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ）細胞内の明るい蛍光は、それらの核のＫｉ６７標識に対応する。２２Ａ〜Ｌで、バー＝１０μｍである。２２Ｍ及び２２Ｎは、手術後７〜８時間、及び増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間で犠牲にした、擬似手術したマウス（ＳＯ）、梗塞後治療したマウス（治療済み）、及び梗塞後治療しないマウス（未治療）の心臓の様々な領域で、生存可能でありまた死滅したｃ−キットＰＯＳ（２２Ｍ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｎ）細胞の分布を示すグラフであ���。略語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れている生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接している生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。２２Ｍと２２Ｎの両方の結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊は、それぞれＳＯ及び治療済みに対してＰ＜０．０５であることを示す。
【図２２Ｍ】正常な心臓、及び増殖因子で治療した心臓、及び未治療梗塞心臓の、心筋原始細胞を示す共焦点顕微鏡写真である。図２２Ａ〜Ｆは、擬似手術したマウスからの心房心筋の切片を示す。図２２Ａ及びＢ、２２Ｃ及びＤ、２２Ｅ及びＦは、それぞれ対になっている顕微鏡写真であり、心房心筋の同じ領域に異なる染色がなされた状態を示す。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ａ、黄色）はｃ−キットＰＯＳ（２２Ｂ、緑色）細胞内に発現する（２２Ｂ、黄色−緑色）。同様にＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｃ、黄色）は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｄ、緑色）細胞内で検出される（２２Ｄ、黄色−緑色）。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ｅ、赤色）とＩＧＦ−１Ｒ（２２Ｅ、黄色）の共存は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｆ、緑色）細胞内に見出される（２２Ｆ、赤色−黄色−緑色）。矢印は、ｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞内のｃ−Ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒを指す。筋細胞の細胞質は赤色−紫色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｇ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、アポトーシス筋細胞を持つ梗塞心筋（ＭＩ）（明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）と、生存可能な筋細胞を持つ境界ゾーン（ＢＺ）（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ｃ−キット、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｈ：黄色の線は、増殖因子で治療したマウスにおいて、壊死筋細胞を持つＭＩ（明るい核、ＰＩ及びヘアピン２）と、生存可能な筋細胞を持つＢＺ（青色の核、ＰＩのみ）とを分離する。生存可能なＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ＭＤＲ１、緑色）は、ＭＩ及びＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを含有する。２２Ｉ及び２２Ｊ：アポトーシス筋細胞（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１）及びｃ−キットＰＯＳ細胞（２２Ｉ、緑色の環）及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（２２Ｊ、緑色の環）は、２匹の未治療のマウスの梗塞領域において、アポトーシスを引き起こす（２２Ｉ及び２２Ｊ、明るい核、ＰＩ及びヘアピン１；矢印）。生存可能な細胞は、青色の核（ＰＩのみ）を持つ。生存可能なｃ−キットＰＯＳ細胞は、梗塞心筋内に存在する（２２Ｉ、緑色の環、青色の核、ＰＩのみ；矢じり）。筋細胞の細胞質は赤色に染色され、心筋ミオシンを示す。２２Ｋ及び２２Ｌ：サイクリングｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ、緑色の環；矢印）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ、緑色の環；矢印）細胞は、増殖因子で治療したマウスの梗塞心筋中に存在する（黄色の点はアポトーシス性の核である）。ｃ−キットＰＯＳ（２２Ｋ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ）細胞内の明るい蛍光は、それらの核のＫｉ６７標識に対応する。２２Ａ〜Ｌで、バー＝１０μｍである。２２Ｍ及び２２Ｎは、手術後７〜８時間、及び増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間で犠牲にした、擬似手術したマウス（ＳＯ）、梗塞後治療したマウス（治療済み）、及び梗塞後治療しないマウス（未治療）の心臓の様々な領域で、生存可能でありまた死滅したｃ−キットＰＯＳ（２２Ｍ）及びＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｎ）細胞の分布を示すグラフである。���語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れている生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接している生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。２２Ｍと２２Ｎの両方の結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊は、それぞれＳＯ及び治療済みに対してＰ＜０．０５であることを示す。
【図２３Ａ】梗塞部のサイズと左心室血行動態の評価を示すグラフである。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対してｐ＜０．０５の値を示す。略語は下記の通りである：ＭＩ−Ｔ、治療済み梗塞マウス；ＬＶ、左心室及び中隔。２３Ａ：生存する心筋の心筋肥大及び壊死領域の経時的治癒が、梗塞サイズに及ぼす影響を最小限に抑えるため、左心室及び中隔の筋細胞の損失により、梗塞寸法を測定した。この測定は、生存可能な組織の反応性肥大及び瘢痕形成による壊死性心筋の収縮とは無関係である（８７）。２３Ｂ：ＬＶ血行動態の評価を、ＬＶ拡張終期圧、ＬＶ収縮−拡張期圧格差、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ、及びＬＶ−ｄＰ／ｄｔからのデータによって示す。２３Ｃ〜２３Ｈは、治療していないマウス（２３Ｃ及び２３Ｄ）及び２匹の治療済みマウス（２３Ｅ〜２３Ｈ）の左心室の大きい梗塞部を示す共焦点顕微鏡写真である。２３Ｃ、２３Ｅ、及び２３Ｇのゲートにより画定された領域（バー＝１ｍｍ）を、２３Ｄ、２３Ｆ、及び２３Ｈにおいてより高い倍率で示す（バー＝０．１ｍｍ）。２３Ｃ及び２３Ｄでは、壁部の梗塞領域にＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン（青色）が蓄積されることにより、心筋再生が不十分であることを示している。スペア筋細胞及び炎症細胞の核は明らかである（緑色、ＰＩ）。生存可能な筋細胞の小さい層が、心外膜下に存在する（赤色、心筋ミオシン）。２３Ｅ〜２３Ｈでは、心筋ミオシン抗体の赤色蛍光によって、筋細胞の再生が示されている。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの小さい病巣（青色、矢じり）が、梗塞領域内に検出される。核は黄色−緑色（ＰＩ）である。略語は下記の通りである：ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞；ＲＶ、右心室。
【図２３Ｂ】梗塞部のサイズと左心室血行動態の評価を示すグラフである。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対してｐ＜０．０５の値を示す。略語は下記の通りである：ＭＩ−Ｔ、治療済み梗塞マウス；ＬＶ、左心室及び中隔。２３Ａ：生存する心筋の心筋肥大及び壊死領域の経時的治癒が、梗塞サイズに及ぼす影響を最小限に抑えるため、左心室及び中隔の筋細胞の損失により、梗塞寸法を測定した。この測定は、生存可能な組織の反応性肥大及び瘢痕形成による壊死性心筋の収縮とは無関係である（８７）。２３Ｂ：ＬＶ血行動態の評価を、ＬＶ拡張終期圧、ＬＶ収縮−拡張期圧格差、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ、及びＬＶ−ｄＰ／ｄｔからのデータによって示す。２３Ｃ〜２３Ｈは、治療していないマウス（２３Ｃ及び２３Ｄ）及び２匹の治療済みマウス（２３Ｅ〜２３Ｈ）の左心室の大きい梗塞部を示す共焦点顕微鏡写真である。２３Ｃ、２３Ｅ、及び２３Ｇのゲートにより画定された領域（バー＝１ｍｍ）を、２３Ｄ、２３Ｆ、及び２３Ｈにおいてより高い倍率で示す（バー＝０．１ｍｍ）。２３Ｃ及び２３Ｄでは、壁部の梗塞領域にＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン（青色）が蓄積されることにより、心筋再生が不十分であることを示している。スペア筋細胞及び炎症細胞の核は明らかである（緑色、ＰＩ）。生存可能な筋細胞の小さい層が、心外膜下に存在する（赤色、心筋ミオシン）。２３Ｅ〜２３Ｈでは、心筋ミオシン抗体の赤色蛍光によって、筋細胞の再生が示されている。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの小さい病巣（青色、矢じり）が、梗塞領域内に検出される。核は黄色−緑色（ＰＩ）である。略語は下記の通りである：ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞；ＲＶ、右心室。
【図２３Ｃ−Ｄ】梗塞部のサイズと左心室血行動態の評価を示すグラフである。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対してｐ＜０．０５の値を示す。略語は下記の通りである：ＭＩ−Ｔ、治療済み梗塞マウス；ＬＶ、左心室及び中隔。２３Ａ：生存する心筋の心筋肥大及び壊死領域の経時的治癒が、梗塞サイズに及ぼす影響を最小限に抑えるため、左心室及び中隔の筋細胞の損失により、梗塞寸法を測定した。この測定は、生存可能な組織の反応性肥大及び瘢痕形成による壊死性心筋の収縮とは無関係である（８７）。２３Ｂ：ＬＶ血行動態の評価を、ＬＶ拡張終期圧、ＬＶ収縮−拡張期圧格差、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ、及びＬＶ−ｄＰ／ｄｔからのデータによって示す。２３Ｃ〜２３Ｈは、治療していないマウス（２３Ｃ及び２３Ｄ）及び２匹の治療済みマウス（２３Ｅ〜２３Ｈ）の左心室の大きい梗塞部を示す共焦点顕微鏡写真である。２３Ｃ、２３Ｅ、及び２３Ｇのゲートにより画定された領域（バー＝１ｍｍ）を、２３Ｄ、２３Ｆ、及び２３Ｈにおいてより高い倍率で示す（バー＝０．１ｍｍ）。２３Ｃ及び２３Ｄでは、壁部の梗塞領域にＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン（青色）が蓄積されることにより、心筋再生が不十分であることを示している。スペア筋細胞及び炎症細胞の核は明らかである（緑色、ＰＩ）。生存可能な筋細胞の小さい層が、心外膜下に存在する（赤色、心筋ミオシン）。２３Ｅ〜２３Ｈでは、心筋ミオシン抗体の赤色蛍光によって、筋細胞の再生が示されている。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの小さい病巣（青色、矢じり）が、梗塞領域内に検出される。核は黄色−緑色（ＰＩ）である。略語は下記の通りである：ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞；ＲＶ、右心室。
【図２３Ｅ−Ｆ】梗塞部のサイズと左心室血行動態の評価を示すグラフである。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対してｐ＜０．０５の値を示す。略語は下記の通りである：ＭＩ−Ｔ、治療済み梗塞マウス；ＬＶ、左心室及び中隔。２３Ａ：生存する心筋の心筋肥大及び壊死領域の経時的治癒が、梗塞サイズに及ぼす影響を最小限に抑えるため、左心室及び中隔の筋細胞の損失により、梗塞寸法を測定した。この測定は、生存可能な組織の反応性肥大及び瘢痕形成による壊死性心筋の収縮とは無関係である（８７）。２３Ｂ：ＬＶ血行動態の評価を、ＬＶ拡張終期圧、ＬＶ収縮−拡張期圧格差、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ、及びＬＶ−ｄＰ／ｄｔからのデータによって示す。２３Ｃ〜２３Ｈは、治療していないマウス（２３Ｃ及び２３Ｄ）及び２匹の治療済みマウス（２３Ｅ〜２３Ｈ）の左心室の大きい梗塞部を示す共焦点顕微鏡写真である。２３Ｃ、２３Ｅ、及び２３Ｇのゲートにより画定された領域（バー＝１ｍｍ）を、２３Ｄ、２３Ｆ、及び２３Ｈにおいてより高い倍率で示す（バー＝０．１ｍｍ）。２３Ｃ及び２３Ｄでは、壁部の梗塞領域にＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン（青色）が蓄積されることにより、心筋再生が不十分であることを示している。スペア筋細胞及び炎症細胞の核は明らかである（緑色、ＰＩ）。生存可能な筋細胞の小さい層が、心外膜下に存在する（赤色、心筋ミオシン）。２３Ｅ〜２３Ｈでは、心筋ミオシン抗体の赤色蛍光によって、筋細胞の再生が示されている。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの小さい病巣（青色、矢じり）が、梗塞領域内に検出される。核は黄色−緑色（ＰＩ）である。略語は下記の通りである：ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞；ＲＶ、右心室。
【図２３Ｇ−Ｈ】梗塞部のサイズと左心室血行動態の評価を示すグラフである。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対してｐ＜０．０５の値を示す。略語は下記の通りである：ＭＩ−Ｔ、治療済み梗塞マウス；ＬＶ、左心室及び中隔。２３Ａ：生存する心筋の心筋肥大及び壊死領域の経時的治癒が、梗塞サイズに及ぼす影響を最小限に抑えるため、左心室及び中隔の筋細胞の損失により、梗塞寸法を測定した。この測定は、生存可能な組織の反応性肥大及び瘢痕形成による壊死性心筋の収縮とは無関係である（８７）。２３Ｂ：ＬＶ血行動態の評価を、ＬＶ拡張終期圧、ＬＶ収縮−拡張期圧格差、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ、及びＬＶ−ｄＰ／ｄｔからのデータによって示す。２３Ｃ〜２３Ｈは、治療していないマウス（２３Ｃ及び２３Ｄ）及び２匹の治療済みマウス（２３Ｅ〜２３Ｈ）の左心室の大きい梗塞部を示す共焦点顕微鏡写真である。２３Ｃ、２３Ｅ、及び２３Ｇのゲートにより画定された領域（バー＝１ｍｍ）を、２３Ｄ、２３Ｆ、及び２３Ｈにおいてより高い倍率で示す（バー＝０．１ｍｍ）。２３Ｃ及び２３Ｄでは、壁部の梗塞領域にＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン（青色）が蓄積されることにより、心筋再生が不十分であることを示している。スペア筋細胞及び炎症細胞の核は明らかである（緑色、ＰＩ）。生存可能な筋細胞の小さい層が、心外膜下に存在する（赤色、心筋ミオシン）。２３Ｅ〜２３Ｈでは、心筋ミオシン抗体の赤色蛍光によって、筋細胞の再生が示されている。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの小さい病巣（青色、矢じり）が、梗塞領域内に検出される。核は黄色−緑色（ＰＩ）である。略語は下記の通りである：ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞；ＲＶ、右心室。
【図２４Ａ−Ｄ】単一のマウスの心臓の、冠状動脈結紮前と結紮から１５日後の心エコー検査結果を示す図である。共焦点顕微鏡写真は、同じ心臓の断面を示す。２４Ａは、冠状動脈結紮前の、基本となる心エコー検査結果を示す。２４Ｂ及び２４Ｃは、２４Ａ及び２４Ｄで評価された心臓の断面の、低倍率（２４Ｂ、バー＝１ｍｍ）及び高倍率（２４Ｃ、バー＝０．１ｍｍ）での共焦点顕微鏡写真を示す。使用した略語は下記の通りである：ＲＶ、右心室；ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞。２４Ｄは、梗塞から１５日後の、同じ心臓の収縮機能に関する心エコーのドキュメンテーションを示す（矢じり）。２４Ｅは、結果が平均±ＳＤとして報告された、駆出率を示すグラフである。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対するｐ＜０．０５である。ＭＩ−Ｔは、治療した梗塞マウスを指す。
【図２４Ｅ】単一のマウスの心臓の、冠状動脈結紮前と結紮から１５日後の心エコー検査結果を示す図である。共焦点顕微鏡写真は、同じ心臓の断面を示す。２４Ａは、冠状動脈結紮前の、基本となる心エコー検査結果を示す。２４Ｂ及び２４Ｃは、２４Ａ及び２４Ｄで評価された心臓の断面の、低倍率（２４Ｂ、バー＝１ｍｍ）及び高倍率（２４Ｃ、バー＝０．１ｍｍ）での共焦点顕微鏡写真を示す。使用した略語は下記の通りである：ＲＶ、右心室；ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞。２４Ｄは、梗塞から１５日後の、同じ心臓の収縮機能に関する心エコーのドキュメンテーションを示す（矢じり）。２４Ｅは、結果が平均±ＳＤとして報告された、駆出率を示すグラフである。＊、＊＊はそれぞれ、擬似手術したマウス（ＳＯ）及び未治療の梗塞マウス（ＭＩ）に対するｐ＜０．０５である。ＭＩ−Ｔは、治療した梗塞マウスを指す。
【図２５Ａ−Ｂ】筋細胞再生の特性を詳述する共焦点顕微鏡写真である。これらの特性は、２５Ｇ〜Ｊのグラフで定量される。２５Ａ及び２５Ｂは、増殖因子で治療した心臓の梗塞心室の再生部分（２５Ａ）及び生存する心筋（２５Ｂ）から、酵素によって分離された筋細胞を示す。２５Ａは、小規模な筋細胞（赤色、心筋ミオシン）、明るい核（ＰＩ及びＢｒｄＵ）、及び青色の核（ＰＩのみ）を示すために染色されている。２５Ｂは、大規模な肥大筋細胞（赤色、心筋ミオシン）、明るい核（ＰＩ及びＢｒｄＵ）、及び青色の核（ＰＩのみ）を示す。２５Ａと２５Ｂは共に、そのバーが５０μｍに等しい。増殖因子で治療したマウスの梗塞後の、新しい筋細胞（２５Ｃ及び２５Ｄ）及びスペア筋細胞（２５Ｅ及び２５Ｆ）の機械的特性を示す。Ｒは、それら筋細胞の弛緩状態を指し、Ｃは収縮状態を指す。刺激が、細胞短縮（Ｇ）、短縮速度（Ｈ）、ピーク短縮までの時間（Ｉ）、及び５０％再伸長までの時間（Ｊ）に及ぼす影響は、Ｎ（新しい小規模な筋細胞）及びＳ（スペア肥大筋細胞）に関して得られた結果により示す。結果は、平均±ＳＤとして表す。＊は、Ｓに対してＰ＜０．０５の値を示す。
【図２５Ｃ−Ｊ】筋細胞再生の特性を詳述する共焦点顕微鏡写真である。これらの特性は、２５Ｇ〜Ｊのグラフで定量される。２５Ａ及び２５Ｂは、増殖因子で治療した心臓の梗塞心室の再生部分（２５Ａ）及び生存する心筋（２５Ｂ）から、酵素によって分離された筋細胞を示す。２５Ａは、小規模な筋細胞（赤色、心筋ミオシン）、明るい核（ＰＩ及びＢｒｄＵ）、及び青色の核（ＰＩのみ）を示すために染色されている。２５Ｂは、大規模な肥大筋細胞（赤色、心筋ミオシン）、明るい核（ＰＩ及びＢｒｄＵ）、及び青色の核（ＰＩのみ）を示す。２５Ａと２５Ｂは共に、そのバーが５０μｍに等しい。増殖因子で治療したマウスの梗塞後の、新しい筋細胞（２５Ｃ及び２５Ｄ）及びスペア筋細胞（２５Ｅ及び２５Ｆ）の機械的特性を示す。Ｒは、それら筋細胞の弛緩状態を指し、Ｃは収縮状態を指す。刺激が、細胞短縮（Ｇ）、短縮速度（Ｈ）、ピーク短縮までの時間（Ｉ）、及び５０％再伸長までの時間（Ｊ）に及ぼす影響は、Ｎ（新しい小規模な筋細胞）及びＳ（スペア肥大筋細胞）に関して得られた結果により示す。結果は、平均±ＳＤとして表す。＊は、Ｓに対してＰ＜０．０５の値を示す。
【図２６Ａ−Ｆ】成熟筋細胞の様々なマーカーを示す、対になった共焦点顕微鏡写真である（２６Ａ〜２６Ｎ、バー＝１０μｍ）。２６Ａ〜２６Ｆでは、核のＢｒｄＵ標識が緑色を呈するものとして２６Ａ、２６Ｃ、及び２６Ｅに示され、ネスチン（２６Ｂ、赤色）、デスミン（２６Ｄ、赤色）、心筋ミオシン（２６Ｆ、赤色）の所在が再生心筋の組織切片の筋細胞内に示されている。核は、２６Ｂ、２６Ｄ、及び２６ＦではＰＩのみによって標識され（青色）、２６Ｂ、２６Ｄ、及び２６ＦではＢｒｄＵとＰＩにより一緒に標識される（明るい）。２６Ｇ〜２６Ｎは、発達する心筋部分（２６Ｇ〜２６Ｊ）及び分離された筋細胞（２６Ｋ〜２６Ｎ）におけるコネキシン４３（２６Ｇ、２６Ｈ、２６Ｋ、及び２６Ｌ、黄色）及びＮ−カドヘリン（２６Ｉ、２６Ｊ、２６Ｍ、及び２６Ｎ、黄色）の同定を示す。筋細胞は心筋ミオシンによって染色され（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌ、及び２６Ｎ、赤色）、核はＢｒｄＵのみによって（２６Ｇ、２６Ｉ、２６Ｋ、及び２６Ｍ、緑色）、ＰＩのみによって（２６Ｈ及び２６Ｊ、青色）、またＢｒｄＵ及びＰＩを合わせて（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌ、及び２６Ｎ、明るい）染色される。
【図２６Ｇ−Ｊ】成熟筋細胞の様々なマーカーを示す、対になった共焦点顕微鏡写真である（２６Ａ〜２６Ｎ、バー＝１０μｍ）。２６Ａ〜２６Ｆでは、核のＢｒｄＵ標識が緑色を呈するものとして２６Ａ、２６Ｃ、及び２６Ｅに示され、ネスチン（２６Ｂ、赤色）、デスミン（２６Ｄ、赤色）、心筋ミオシン（２６Ｆ、赤色）の所在が再生心筋の組織切片の筋細胞内に示されている。核は、２６Ｂ、２６Ｄ、及び２６ＦではＰＩのみによって標識され（青色）、２６Ｂ、２６Ｄ、及び２６ＦではＢｒｄＵとＰＩにより一緒に標識される（明るい）。２６Ｇ〜２６Ｎは、発達する心筋部分（２６Ｇ〜２６Ｊ）及び分離された筋細胞（２６Ｋ〜２６Ｎ）におけるコネキシン４３（２６Ｇ、２６Ｈ、２６Ｋ、及び２６Ｌ、黄色）及びＮ−カドヘリン（２６Ｉ、２６Ｊ、２６Ｍ、及び２６Ｎ、黄色）の同定を示す。筋細胞は心筋ミオシンによって染色され（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌ、及び２６Ｎ、赤色）、核はＢｒｄＵのみによって（２６Ｇ、２６Ｉ、２６Ｋ、及び２６Ｍ、緑色）、ＰＩのみによって（２６Ｈ及び２６Ｊ、青色）、またＢｒｄＵ及びＰＩを合わせて（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌ、及び２６Ｎ、明るい）染色される。
【図２６Ｋ−Ｎ】成熟筋細胞の様々なマーカーを示す、対になった共焦点顕微鏡写真である（２６Ａ〜２６Ｎ、バー＝１０μｍ）。２６Ａ〜２６Ｆでは、核のＢｒｄＵ標識が緑色を呈するものとして２６Ａ、２６Ｃ、及び２６Ｅに示され、ネスチン（２６Ｂ、赤色）、デスミン（２６Ｄ、赤色）、心筋ミオシン（２６Ｆ、赤色）の所在が再生心筋の組織切片の筋細胞内に示されている。核は、２６Ｂ、２６Ｄ、及び２６ＦではＰＩのみによって標識され（青色）、２６Ｂ、２６Ｄ、及び２６ＦではＢｒｄＵとＰＩにより一緒に標識される（明るい）。２６Ｇ〜２６Ｎは、発達する心筋部分（２６Ｇ〜２６Ｊ）及び分離された筋細胞（２６Ｋ〜２６Ｎ）におけるコネキシン４３（２６Ｇ、２６Ｈ、２６Ｋ、及び２６Ｌ、黄色）及びＮ−カドヘリン（２６Ｉ、２６Ｊ、２６Ｍ、及び２６Ｎ、黄色）の同定を示す。筋細胞は心筋ミオシンによって染色され（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌ、及び２６Ｎ、赤色）、核はＢｒｄＵのみによって（２６Ｇ、２６Ｉ、２６Ｋ、及び２６Ｍ、緑色）、ＰＩのみによって（２６Ｈ及び２６Ｊ、青色）、またＢｒｄＵ及びＰＩを合わせて（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌ、及び２６Ｎ、明るい）染色される。
【図２７】新たに形成された冠状血管構造を示す、一連の共焦点顕微鏡写真である。２７Ａ〜２７Ｄには、細動脈が、ＴＥＲ−１１９で標識した赤血球膜（緑色）、核のＰＩ染色（青色）、及び平滑筋細胞のα−平滑筋アクチン染色（赤色）と共に示されている。全ての顕微鏡写真において、バーは１０μｍに等しい。
【図２８Ａ−Ｂ】免疫磁気ビーズ（ａ）及びＦＡＣＳ（ｂ）により得られた心臓Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の同定及び増殖を示す図である。ａ、ｂは、心筋細胞系の細胞質タンパク質に対して陰性と記録されたＮＳＣＭ内のｃ−キットＰＯＳ細胞であり、核はＰＩ（青色）で染色され、ｃ−キットはｃ−キット抗体で染色される（緑色）。ｃ〜ｆは、ＤＭのＰ１において、培養細胞が、その核のＮｋｘ２．５標識（ｃ）、ＭＥＦ２標識（ｄ）、ＧＡＴＡ−４標識（ｅ）、及びＧＡＴＡ−５標識（ｆ）の紫色の蛍光によって示される。ｇ、ｈでは、ＮＳＣＭによって選択され低密度で蒔かれた幹細胞（ｇ）によって、個々の小さいコロニーが発生する（ｈ）。バー＝１０μｍ
【図２８Ｃ−Ｆ】免疫磁気ビーズ（ａ）及びＦＡＣＳ（ｂ）により得られた心臓Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の同定及び増殖を示す図である。ａ、ｂは、心筋細胞系の細胞質タンパク質に対して陰性と記録されたＮＳＣＭ内のｃ−キットＰＯＳ細胞であり、核はＰＩ（青色）で染色され、ｃ−キットはｃ−キット抗体で染色される（緑色）。ｃ〜ｆは、ＤＭのＰ１において、培養細胞が、その核のＮｋｘ２．５標識（ｃ）、ＭＥＦ２標識（ｄ）、ＧＡＴＡ−４標識（ｅ）、及びＧＡＴＡ−５標識（ｆ）の紫色の蛍光によって示される。ｇ、ｈでは、ＮＳＣＭによって選択され低密度で蒔かれた幹細胞（ｇ）によって、個々の小さいコロニーが発生する（ｈ）。バー＝１０μｍ
【図２８Ｇ−Ｈ】免疫磁気ビーズ（ａ）及びＦＡＣＳ（ｂ）により得られた心臓Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の同定及び増殖を示す図である。ａ、ｂは、心筋細胞系の細胞質タンパク質に対して陰性と記録されたＮＳＣＭ内のｃ−キットＰＯＳ細胞であり、核はＰＩ（青色）で染色され、ｃ−キットはｃ−キット抗体で染色される（緑色）。ｃ〜ｆは、ＤＭのＰ１において、培養細胞が、その核のＮｋｘ２．５標識（ｃ）、ＭＥＦ２標識（ｄ）、ＧＡＴＡ−４標識（ｅ）、及びＧＡＴＡ−５標識（ｆ）の紫色の蛍光によって示される。ｇ、ｈでは、ＮＳＣＭによって選択され低密度で蒔かれた幹細胞（ｇ）によって、個々の小さいコロニーが発生する（ｈ）。バー＝１０μｍ
【図２９Ａ−Ｄ】クローン原性細胞の自己再生及び多能性を示す図である。ａ、クローン内のｃ−キットＰＯＳ細胞：核＝青色、ｃ−キット＝緑色（矢じり）。ｂ、３個のｃ−キットＰＯＳ細胞のうち２個（緑色、矢じり）が、核（青色）内でＫｉ６７を発現する（紫色、矢印）。ｃ、ｄ、Ｋｉ６７陽性（ｃ）分裂中期染色体（赤色）。ｄ、ｃ−キットＰＯＳ細胞（緑色）内でＫｉ６７及びＰＩ（紫色）により標識された分裂中期染色体。ｅ〜ｈ、クローン内で、Ｍ（ｅ）、ＥＣ（ｆ）、ＳＭＣ（ｇ）、及びＦ（ｈ）の細胞質（赤色）が、それぞれ心筋ミオシン、第ＶＩＩＩ因子、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンによって染色されている。核＝青色。Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞（緑色、矢じり）が存在する。バー＝１０μｍ
【図２９Ｅ−Ｈ】クローン原性細胞の自己再生及び多能性を示す図である。ａ、クローン内のｃ−キットＰＯＳ細胞：核＝青色、ｃ−キット＝緑色（矢じり）。ｂ、３個のｃ−キットＰＯＳ細胞のうち２個（緑色、矢じり）が、核（青色）内でＫｉ６７を発現する（紫色、矢印）。ｃ、ｄ、Ｋｉ６７陽性（ｃ）分裂中期染色体（赤色）。ｄ、ｃ−キットＰＯＳ細胞（緑色）内でＫｉ６７及びＰＩ（紫色）により標識された分裂中期染色体。ｅ〜ｈ、クローン内で、Ｍ（ｅ）、ＥＣ（ｆ）、ＳＭＣ（ｇ）、及びＦ（ｈ）の細胞質（赤色）が、それぞれ心筋ミオシン、第ＶＩＩＩ因子、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンによって染色されている。核＝青色。Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞（緑色、矢じり）が存在する。バー＝１０μｍ
【図３０Ａ−Ｄ】クローン原性細胞及び球状細胞を示す図である。ａ、ＮＳＣＭへの懸濁液中の球状クローン（矢じり）である。ｂ、クローン内の、ｃ−キットＰＯＳ細胞のクラスター（緑色、矢じり）及び陰性細胞である。核＝青色。ｃ、濃縮された細胞核（青色）及び大量のネスチン（赤色）を持つスフェロイドである。ｄ、スフェロイド内の、分解していないネスチンの蓄積（赤色）である。核＝青色。ｅ、球体から移行する細胞と共に、ＤＭに蒔かれたスフェロイドである。ｆ〜ｈ、スフェロイドから移行し且つ分化するＭ（ｆ）、ＳＭＣ（ｇ）、及びＥＣ（ｈ）は、それぞれ心筋ミオシン、α−平滑筋アクチン、及び第ＶＩＩＩ因子によって染色された細胞質（赤色）を有する。核＝青色。バー＝１０μｍ。
【図３０Ｅ−Ｈ】クローン原性細胞及び球状細胞を示す図である。ａ、ＮＳＣＭへの懸濁液中の球状クローン（矢じり）である。ｂ、クローン内の、ｃ−キットＰＯＳ細胞のクラスター（緑色、矢じり）及び陰性細胞である。核＝青色。ｃ、濃縮された細胞核（青色）及び大量のネスチン（赤色）を持つスフェロイドである。ｄ、スフェロイド内の、分解していないネスチンの蓄積（赤色）である。核＝青色。ｅ、球体から移行する細胞と共に、ＤＭに蒔かれたスフェロイドである。ｆ〜ｈ、スフェロイドから移行し且つ分化するＭ（ｆ）、ＳＭＣ（ｇ）、及びＥＣ（ｈ）は、それぞれ心筋ミオシン、α−平滑筋アクチン、及び第ＶＩＩＩ因子によって染色された細胞質（赤色）を有する。核＝青色。バー＝１０μｍ。
【図３１Ａ−Ｃ】心筋修復を示す図である。ａ〜ｃ、梗塞後の治療済みラット（ＭＩ）で発生する心筋（ａ、ｂ、矢じり）。新しいＭ＝ミオシン（赤色）；核＝黄色−緑色。注射の部位（矢印）。ｃ、梗塞後治療していないラットの心筋瘢痕（青色）。＊スペア筋細胞。ｄ〜ｌ、Ｍ（ｆ、ミオシン）及び冠状血管（ｉ、ＥＣ＝第ＶＩＩＩ因子；ｌ、ＳＭＣ＝α−平滑筋アクチン）は、ＢｒｄＵ（緑色）陽性核（ｅ、ｈ、ｋ）によって識別する。青色核＝ＰＩ（ｄ、ｇ、ｊ）。ｍ〜ｔ、２０日目の筋細胞（ｏ、ｐ、ｓ、ｔ）は、１０日目（ｍ、ｎ、ｑ、ｒ）よりも分化している。ｍ〜ｐ：コネキシン４３＝黄色（矢じり）、ｑ〜ｔ：Ｎ−カドヘリン＝黄色（矢じり）；ミオシン＝赤色。核＝青色；ＢｒｄＵ＝緑色（矢印）。バー＝１ｍｍ（ａ）、１００μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｄ〜ｔ）。
【図３１Ｄ−Ｅ】心筋修復を示す図である。ａ〜ｃ、梗塞後の治療済みラット（ＭＩ）で発生する心筋（ａ、ｂ、矢じり）。新しいＭ＝ミオシン（赤色）；核＝黄色−緑色。注射の部位（矢印）。ｃ、梗塞後治療していないラットの心筋瘢痕（青色）。＊スペア筋細胞。ｄ〜ｌ、Ｍ（ｆ、ミオシン）及び冠状血管（ｉ、ＥＣ＝第ＶＩＩＩ因子；ｌ、ＳＭＣ＝α−平滑筋アクチン）は、ＢｒｄＵ（緑色）陽性核（ｅ、ｈ、ｋ）によって識別する。青色核＝ＰＩ（ｄ、ｇ、ｊ）。ｍ〜ｔ、２０日目の筋細胞（ｏ、ｐ、ｓ、ｔ）は、１０日目（ｍ、ｎ、ｑ、ｒ）よりも分化している。ｍ〜ｐ：コネキシン４３＝黄色（矢じり）、ｑ〜ｔ：Ｎ−カドヘリン＝黄色（矢じり）；ミオシン＝赤色。核＝青色；ＢｒｄＵ＝緑色（矢印）。バー＝１ｍｍ（ａ）、１００μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｄ〜ｔ）。
【図３１Ｆ−Ｎ】心筋修復を示す図である。ａ〜ｃ、梗塞後の治療済みラット（ＭＩ）で発生する心筋（ａ、ｂ、矢じり）。新しいＭ＝ミオシン（赤色）；核＝黄色−緑色。注射の部位（矢印）。ｃ、梗塞後治療していないラットの心筋瘢痕（青色）。＊スペア筋細胞。ｄ〜ｌ、Ｍ（ｆ、ミオシン）及び冠状血管（ｉ、ＥＣ＝第ＶＩＩＩ因子；ｌ、ＳＭＣ＝α−平滑筋アクチン）は、ＢｒｄＵ（緑色）陽性核（ｅ、ｈ、ｋ）によって識別する。青色核＝ＰＩ（ｄ、ｇ、ｊ）。ｍ〜ｔ、２０日目の筋細胞（ｏ、ｐ、ｓ、ｔ）は、１０日目（ｍ、ｎ、ｑ、ｒ）よりも分化している。ｍ〜ｐ：コネキシン４３＝黄色（矢じり）、ｑ〜ｔ：Ｎ−カドヘリン＝黄色（矢じり）；ミオシン＝赤色。核＝青色；ＢｒｄＵ＝緑色（矢印）。バー＝１ｍｍ（ａ）、１００μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｄ〜ｔ）。
【図３１Ｏ−Ｐ】心筋修復を示す図である。ａ〜ｃ、梗塞後の治療済みラット（ＭＩ）で発生する心筋（ａ、ｂ、矢じり）。新しいＭ＝ミオシン（赤色）；核＝黄色−緑色。注射の部位（矢印）。ｃ、梗塞後治療していないラットの心筋瘢痕（青色）。＊スペア筋細胞。ｄ〜ｌ、Ｍ（ｆ、ミオシン）及び冠状血管（ｉ、ＥＣ＝第ＶＩＩＩ因子；ｌ、ＳＭＣ＝α−平滑筋アクチン）は、ＢｒｄＵ（緑色）陽性核（ｅ、ｈ、ｋ）によって識別する。青色核＝ＰＩ（ｄ、ｇ、ｊ）。ｍ〜ｔ、２０日目の筋細胞（ｏ、ｐ、ｓ、ｔ）は、１０日目（ｍ、ｎ、ｑ、ｒ）よりも分化している。ｍ〜ｐ：コネキシン４３＝黄色（矢じり）、ｑ〜ｔ：Ｎ−カドヘリン＝黄色（矢じり）；ミオシン＝赤色。核＝青色；ＢｒｄＵ＝緑色（矢印）。バー＝１ｍｍ（ａ）、１００μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｄ〜ｔ）。
【図３２】新たに発生した筋細胞を示す図である。ａ、修復心筋帯から酵素により分離された細胞。心筋ミオシン＝赤色；Ｂｒｄｕ＝緑色；核＝青色。ｂ〜ｅ、新しい筋細胞の分化。コネキシン４３＝黄色（ｂ、ｃ）；Ｎ−カドヘリン＝黄色（ｄ、ｅ）。心筋ミオシン＝赤色；Ｂｒｄｕ＝緑色；核＝青色。バー＝１０μｍ。
【図３３】筋細胞の機械的特性を示す図である。ａ〜ｄ、治療済みラットにおいて、梗塞後の再生心筋及び残存心筋からそれぞれ得られた新しい筋細胞（Ｎ）及びスペア筋細胞（Ｓ）；Ｒ＝弛緩、Ｃ＝収縮。ｅ〜ｈ、刺激が、細胞短縮とＮ（ｅ、ｇ）及びＳ（ｆ、ｈ）筋細胞の短縮速度に及ぼす影響。ｉ〜ｌ、結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対Ｓ。
【図３４】ラット心臓の原始細胞を示す図である。２２月齢のＦｉｓｃｈｅｒラットからの左心室心筋切片。Ａ、核を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の青色蛍光によって示す。Ｂ、緑色蛍光は、ｃ−キット陽性細胞であることを実証している。Ｃ、ＰＩとｃ−キットの組合せは、緑色及び青色蛍光によって示す。筋細胞の細胞質は、α−筋節アクチン抗体染色の赤色蛍光によって認識される。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図３５】ｃ−キットＰＯＳ細胞のＦＡＣＳ分析を示す図である。ｃ−キット発現レベル対細胞ＤＮＡを示す、メスFischer３４４ラットの左心室から得られた心臓細胞の２変量分布。細胞を、ＰＢＳ １ｍｌ当たり細胞１０６個の濃度で懸濁させた。細胞の蛍光を、アルゴンイオンレーザ（４８８ｎｍで発光）とＵＶ光を放出するヘリウム−カドミウムレーザとを組み合わせて使用することによりELITE ESPフローサイトメーター／セルソーター（Coulter Inc.）で測定した。矢印は、最小のｃ−キットレベルを表す閾値を示す。ＦＡＣＳ分析では、細胞を、ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合ラットモノクローナルｃ−キット抗体（Pharmingen）と共にインキュベートした。陰性対照として、Ｒ−ＰＥアイソタイプ標準物質を使用した。
【図３６】心臓ｃ−キットＰＯＳ細胞収集のためのスキーム（Ａ）及びＮＳＣＭでの心臓ｃ−キットＰＯＳ細胞の培養（Ｂ）を示す図である。Ａ、ｃ−キット表面受容体を発現する未分化細胞をｃ−キット抗体に曝し、その後、ＩｇＧ抗体で被覆された免疫磁気ビーズに曝す。ｃ−キットＰＯＳ細胞を磁石で収集し、ＮＳＣＭ内で培養する。Ｂ、免疫磁気ビーズがｃ−キットＰＯＳ細胞の表面に取着している（矢じり）。ｃ−キットＮＥＧ細胞は存在しないことが明らかである。位相差顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図３７】免疫磁気ビーズで収集した、分離されたばかりの細胞内の、ｃ−キットタンパク質を示す図である。ｃ−キットタンパク質は、ｃ−キット抗体の緑色蛍光によって示される。細胞に付着したビーズは赤色蛍光によって示される。青色蛍光は、核のＰＩ標識を反映している。したがって、ビーズにより選択された細胞はｃ−キットＰＯＳであることがわかった。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図３８】心筋細胞分化の転写因子を示す図である。ビーズの除去後、又はＦＡＣＳ分離の直後に塗抹を付け、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、及びＧＡＴＡ−４の検出用に細胞を染色した。パネルＡ〜Ｃの青色蛍光は、核のＰＩ標識に対応する。核内の紫色の蛍光は、Ｎｋｘ２．５（Ａ）、ＭＥＦ２（Ｂ）、及びＧＡＴＡ−４（Ｃ）の発現を反映している。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図３９】ｃ−キットＰＯＳ細胞及び骨格筋分化の転写因子を示す図である。パネルＡ〜Ｃは、ｃ−キットＰＯＳ細胞を示す（緑色蛍光、ｃ−キット抗体、青色蛍光、ＰＩ標識）。パネルＤ〜Ｆは、核（赤色蛍光、ＰＩ標識）内の緑色蛍光によって、ＭｙｏＤ（Ｄ）、ミオゲニン（Ｅ）、及びＭｙｆ５（Ｆ）に対する陽性対照（Ｃ２Ｃ１２筋原細胞系）を示す。ｃ−キットＰＯＳ細胞は、これら骨格筋転写因子に対して陰性であった。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図４０】分化培地（ＤＭ）でのｃ−キットＰＯＳ細胞の増殖を示す図である。ｃ−キット陽性細胞の平板培養から得られた集密細胞の単層。免疫磁気ビーズは、細胞をＤＮアーゼＩで緩やかに消化することによって除去した。この手順により、ビーズと抗ＩｇＧ抗体との間の短いＤＮＡリンカーが分解した。位相差顕微鏡法；バー＝２０μｍ。
【図４１】ＤＭ内のサイクリング細胞核を示す図である。Ｋｉ６７（紫色の蛍光）が、視野内に含まる核の大部分で発現する。青色蛍光は、核のＰＩ標識を反映している。共焦点顕微鏡法：バー＝１０μｍ。
【図４２】ｃ−キットＰＯＳ由来細胞の増殖速度を示す図である。Ｐ２及びＰ４、すなわち細胞数が２倍になるのに必要とされる時間ｔＤでの、細胞の指数関数的増殖曲線。各点は、５回又は６回の独立した測定に対応する。垂直バー、ＳＤ。
【図４３】心臓Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞の識別及び増殖を示す図である。Ｐ３のＤＭでは、Ｍ（Ａ）、ＥＣ（Ｂ）、ＳＭＣ（Ｃ）、及びＦ（Ｄ）の細胞質（緑色）が、それぞれ心筋ミオシン、第ＶＩＩＩ因子、α−平滑筋アクチン、及びビメンチン（第ＶＩＩＩ因子陰性）によって染色される。核＝赤色。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図４４】神経細胞の細胞質マーカーを示す図である。パネルＡ〜Ｃは、Ｐ１でのＤＭ内の細胞を示す（赤色蛍光、α−筋節アクチン；青色、ＰＩ標識）。パネルＤ〜Ｆは、細胞質（青色蛍光、ＰＩ標識）内の緑色蛍光によって、ＭＡＰ１ｂ（Ｄ、ニューロン２Ａ細胞系）、ニューロフィラメント２００（Ｅ、ニューロン２Ａ細胞系）、及びＧＦＡＰ（Ｆ、ＩＩＩ型星状膠細胞、クローンＣ８−Ｄ３０）に対する陽性対照を示す。ｃ−キットＰＯＳ由来細胞は、これら神経タンパク質に対して陰性であった。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図４５】線維芽細胞の細胞質マーカーを示す図である。パネルＡ〜Ｃは、ＮＳＣＭ内の未分化細胞の小コロニーを示す（緑色蛍光、ｃ−キット；青色、ＰＩ標識）。パネルＤ〜Ｆは、細胞質（青色蛍光、ＰＩ標識）内の赤色蛍光によって、フィブロネクチン（Ｄ）、Ｉ型プロコラーゲン（Ｅ）、及びビメンチン（Ｆ）に対する陽性対照を示す（ラット心臓線維芽細胞）。ｃ−キットＰＯＳ由来細胞は、これら線維芽細胞タンパク質に対して陰性であった。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図４６】ＦＡＣＳで分離したｃ−キットＰＯＳ細胞：クローン原性細胞の多能性を示す図である。クローンでは、Ｍ（Ａ）、ＥＣ（Ｂ）、ＳＭＣ（Ｃ）、及びＦ（Ｄ）の細胞質（赤色）が、それぞれ心筋ミオシン、第ＶＩＩＩ因子、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンによって染色される。青色蛍光、核のＰＩ標識。Ｌｉｎ−ｃ−キットＰＯＳ細胞（緑色蛍光、矢じり）が存在する。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図４７】早期分化での心臓細胞系統を示す図である。Ａ、Ｂ、早期分化での細胞の、細胞質内のネスチンのみの発現（緑色蛍光）。Ｃ、Ｄ、発達する筋細胞内（矢じり）でのネスチン（緑色、Ｃ）及び心筋ミオシン（赤色、Ｄ）の発現。Ｅ、Ｆ、発達する内皮細胞内（矢じり）でのネスチン（緑色、Ｅ）及び第ＶＩＩＩ因子（赤色、Ｆ）の発現。Ｇ、Ｈ、発達する平滑筋細胞内（矢じり）でのネスチン（緑色、Ｇ）及びα−平滑筋アクチン（赤色、Ｈ）の発現。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図４８】梗塞サイズ及び心筋修復を示す図である。Ａ、１０日目に、冠状動脈の閉塞によって、未治療のラット（ＭＩ）と治療済みラット（ＭＩ−Ｔ）の左心室の筋細胞数が、それぞれ４９％と５３％失われた。２０日目、冠状動脈の閉塞によって、未治療のラット（ＭＩ）と治療済みラット（ＭＩ−Ｔ）の左心室の筋細胞数が、それぞれ５５％と７０％失われた。ＳＯ、擬似手術をした動物。＊Ｐ＜０．０５対ＳＯ。＋Ｐ＜０．０５対ＭＩ。Ｂ、細胞移植により治療した動物（ＭＩ−Ｔ）において、冠状動脈閉塞後１０日目及び２０日目に壁部の梗塞領域内で新たに形成された心筋のパーセンテージ。＊Ｐ＜０．０５対１０日。Ｃ、Ｄ、細胞移植によって１０日目及び２０日目に形成された新しい心筋（Ｆ）の量を、形態計測学的に測定した（ベタ塗りの棒）。梗塞後に残存している心筋（Ｒ）及び失われた心筋（Ｌ）は、それぞれ斜線を入れた棒及び網掛けした棒で示す。発生した組織（Ｆ）により、残存する心筋（Ｒ＋Ｆ）が増加し、失われた心筋（Ｌ−Ｆ）が同じ量だけ減少した。その結果、細胞移植により治療したラットの両方のグループでは、心筋の修復によって梗塞サイズが縮小した。結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対ＭＩ。＋Ｐ＜０．０５対ＭＩ−ＴのＬｏ及びＦｏ。
【図４９】心筋修復を示す図である。Ａ、Ｂ、梗塞後治療した２個の心臓での再生心筋帯。赤色蛍光は、新たに形成された筋細胞の心筋ミオシン抗体染色に対応する。黄色−緑色蛍光は、核のＰＩ標識を反映している。青色蛍光（矢じり）は、壁部の梗塞領域内にコラーゲンが蓄積された小さい病巣を示す。共焦点顕微鏡法；バー＝１００μｍ。
【図５０】毛細血管の新生物形成を示す図である。毛細血管内に移植された細胞の分化は、内皮細胞のＢｒｄＵ標識によって識別した。Ａ、核のＰＩ標識（青色）；Ｂ、核のＢｒｄＵ標識（緑色）；Ｃ、毛細血管内皮（赤色）及びＢｒｄＵで標識された内皮細胞核（青色及び緑色）。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図５１】再生心筋の体積組成を示す図である。１０日から２０日までの間に、筋細胞（Ｍ）、毛細血管（Ｃａｐ）、及び細動脈（Ａｒｔ）の体積の割合が、それぞれ２５％、６２％、及び１４０％増加した。逆に、Ｉ型コラーゲン（Ｃ−Ｉ）及びＩＩＩ型コラーゲン（Ｃ−ＩＩＩ）の体積パーセントは、それぞれ７３％及び７１％減少した。結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対１０日。
【図５２】再生心筋内の細胞増殖を示す図である。１０日から２０日の間に、Ｋｉ６７で標識された筋細胞（Ｍ）、内皮細胞（ＥＣ）、及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）の割合が、それぞれ６４％、６３％、及び５９％減少した。結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対１０日。
【図５３】ＢｒｄＵ標識による再生心筋の識別を示す図である。Ａ、Ｄ、核は、ＰＩの青色蛍光によって示される。Ｂ、Ｅ、緑色蛍光は、核のＢｒｄＵ標識を実証している。Ｃ、Ｆ、筋細胞の細胞質は、α−心筋アクチニン（Ｃ）又はα−筋節アクチン（Ｆ）の赤色蛍光によって認識される。新しい筋細胞では、濃青色と薄青色の蛍光が、筋細胞核（Ｃ、Ｆ）のＰＩ標識とＢｒｄＵ標識の組合せを反映している。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図５４】新たに形成された筋細胞の数及び体積に時間が及ぼす影響を示す図である。１０日から２０日の間に、発達する筋細胞はそのサイズが著しく増大した。しかし細胞の数は、本質的に一定のままであった。粒度分布は、１０日目よりも２０日目のほうが広かった。
【図５５】新たに形成された冠状血管構造の発達に時間が及ぼす影響を示す図である。新たに形成された細動脈（Ａｒｔ）及び毛細血管（Ｃａｐ）の数値密度は、１０日から２０日の間に著しく増加した。結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対１０日。
【図５６】梗塞心室のスペア筋細胞を示す図である。Ａ、Ｂ、左心室及び心室中隔に残っている生存可能な組織から分離した、大規模な肥大筋細胞。赤色蛍光は心筋ミオシン抗体染色に対応し、青色蛍光はＰＩ標識に対応する。細胞の縁の黄色蛍光は、コネキシン４３（Ａ）及びＮ−カドヘリン（Ｂ）を反映している。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図５７】細胞移植及び心エコー検査を示す図である。心筋再生は、心室拡大を減衰させ（Ａ）、壁面の生存部分の厚さに影響を与えず（Ｂ）、心室の梗塞領域の厚さを増大させ（Ｃ）、駆出率を改善した（Ｄ）。ＳＯ＝擬似手術をしたもの；ＭＩ＝未治療の梗塞；ＭＩ−Ｔ＝治療済み梗塞。結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対ＳＯ；＊＊Ｐ＜０．０５対ＭＩ。
【図５８】心エコー検査によるトレースを示す図である。治療していない梗塞ラット（Ａ、Ｂ）及び治療した梗塞ラット（Ｃ、Ｄ）の２次元画像及びＭモードトレース。パネルＡ及びＣは、冠状動脈閉塞前の基準となる状態に対応する。収縮が再び出現することが、パネルＤで明らかである（矢じり）。
【図５９】心室の機能及び壁応力を示す図である。細胞移植によって心室機能が改善され、梗塞後の拡張期壁応力の増大が弱まった。ＳＯ＝擬似手術したもの；ＭＩ＝未治療の梗塞；ＭＩ−Ｔ＝治療済み梗塞；ＬＶＥＤＰ＝左心室拡張終期圧；ＬＶＤＰ＝左心室収縮−拡張期圧格差；＋ｄＰ／ｄｔ＝圧力上昇率；−ｄＰ／ｄｔ＝圧力減衰率。結果は平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５対ＳＯ；＊＊Ｐ＜０．０５対ＭＩ。
【図６０】正常な心筋内の細胞移植を示す図である。Ｐ２で得られたＢｒｄＵ標識細胞を、擬似手術したラットに注射した。２０日後、ほんのわずかな未分化細胞が確認された。Ａ、Ｃ、緑色蛍光は、核のＢｒｄＵ標識を実証しているＢ、Ｄ、筋細胞の細胞質が、α−筋節アクチンの赤色蛍光によって認識される。核は、ＰＩの青色蛍光によって示される。注射された細胞内で（矢じり）、明るい青色蛍光は、ＰＩとＢｒｄＵ標識の組合せを反映している（Ｂ、Ｄ）。共焦点顕微鏡法；バー＝１０μｍ。
【図６１】移行及び浸潤のアッセイを示す図である。結果を、平均±ＳＤとして報告する。＊は、増殖因子に曝されていない細胞との統計的有意差を示し、すなわちＰ＜０．０５である。
【図６２】移行及び浸潤のアッセイを示す図である。結果を、平均±ＳＤとして報告する。＊は、増殖因子に曝されていない細胞との統計的有意差を示し、すなわちＰ＜０．０５である。
【図６３】基質メタロプロテイナーゼ活性のアッセイを示す図である。ゼラチンザイモグラフィから得られたゲルのデジタル写真。
【図６４】増殖因子受容体を発現する原始細胞のグラフである。手術後７〜８時間と増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間を経てから犠牲にした擬似手術マウス（ＳＯ）、梗塞後治療した（治療済み）マウス、及び梗塞後治療していない（未治療）マウスの心臓の、様々な領域におけるｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞上のｃ−ｍｅｔ及びＩＧＦ−１Ｒの分布が示されている。これらの測定には、進行中のアポトーシスとは無関係な、全てのｃ−キットＰＯＳ細胞及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞が含まれる。使用する略語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れた生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接する生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。全ての結果を、平均±ＳＤとして報告する。
【図６５】サイクリング原始細胞の位置を示すグラフである。手術後７〜８時間と増殖因子投与後（治療済み）又は生理食塩水投与後（ＳＯ；未治療）２〜３時間を経てから犠牲にした擬似手術マウス（ＳＯ）、梗塞後治療した（治療済み）マウス、及び梗塞後治療していない（未治療）マウスの心臓の、様々な領域において生存可能なＫｉ６７標識ｃ−キットＰＯＳ及びＭＤＲ１ＰＯＳ細胞のパーセンテージを示す。使用する略語は下記の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞部から離れた生存可能な心筋；Ｂ、梗塞部に接する生存可能な心筋；Ｉ、生存不可能な梗塞心筋。示される結果は平均±ＳＤである。
【図６６】非サイクリング（実線）及びサイクリング（破線；Ｋｉ６７陽性核）筋細胞中のＤＮＡ含量の度数分布を示すグラフである。新しい筋細胞と古い筋細胞は、共に、２ｎ染色体に対応する量のクロマチンを示した。２ｎよりも多いＤＮＡ含量は、サイクリング核に限定された。測定された非サイクリング核は、２倍のリンパ球に匹敵する蛍光強度を示した。サンプリングには、６００個の新しい筋細胞、１０００個の古い筋細胞、及び１０００個のリンパ球が含まれていた。
【図６７】心筋梗塞が、心臓の解剖学的構造及び拡張期負荷に及ぼす影響を示すグラフである。結果を平均±ＳＤとして示す。＊、＊＊は、擬似手術マウス（ＳＯ）及び治療していない梗塞マウス（ＭＩ）に対してｐ＜０．０５の値を示す。ＭＩ−Ｔは、治療した梗塞マウスを指す。
【図６８】筋細胞のサイズの度数分布を示すグラフである。新たに発生した筋細胞の体積を、デスミン及びラミニン抗体及びＰＩで染色したセクションで測定した。中央に位置付けられた核を持つ、長手方向に向いた細胞のみが含まれていた。円筒形であると想定して、核の端から端までの長さ及び直径を各筋細胞ごとに収集し、細胞の体積を計算した。４００個の細胞を、それぞれの心臓で測定した。
【図６９】心筋修復を示すグラフである。擬似手術した（ＳＯ）マウスのＬＶ容積と梗塞サイズ、すなわち治療していないマウス（ＭＩ）の４２％及び治療したマウス（ＭＩ−Ｔ）の６７％に基づいて、残存することになる心筋（Ｒ）と失われることになる心筋（Ｌ）の体積を、２つのグループの梗塞マウス（図９）で計算した。新たに形成された心筋（Ｆ）の体積は、治療したマウスで定量的に測定した。心筋再生により、残存する心筋（Ｒ＋Ｆ）の体積が増大し、失われた心筋（Ｌ−Ｆ）の体積が同じ量だけ低下した。したがって、治療したマウスの梗塞サイズは１５％だけ低下した。
【０２３７】
（１）
内在性の体性幹細胞を刺激することを含む、心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／又は発生させ且つ／又は再生するための方法。
（２）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が成体幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が心臓幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（４）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が成体心臓幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（５）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が、心臓幹細胞及び心臓幹細胞以外の別のタイプの幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（６）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が、成体心臓幹細胞及び成体心臓幹細胞以外の別のタイプの幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（７）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が、心臓及び造血幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（８）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が、成体心臓及び成体造血幹細胞である、上記（１）に記載の方法。
（９）
前記内在性の体性幹細胞が系統陰性である、上記（１）に記載の方法。
（１０）
前記系統陰性体性幹細胞がｃ−キットＰＯＳである、上記（９）に記載の方法。
（１１）
治療上有効な用量の１種又は複数のサイトカインを心臓に送達する、上記（１）に記載の方法。
（１２）
治療上有効な用量を、損傷した心筋の境界領域に送達する、上記（１１）に記載の方法。
（１３）
治療上有効な用量を注射によって投与する、上記（１２）に記載の方法。
（１４）
治療上有効な用量を心筋内に注射する、上記（１３）に記載の方法。
（１５）
治療上有効な用量を経心外膜的に又は経心内膜的に注射する、上記（１３）に記載の方法。
（１６）
経心内膜的手法では、カテーテルをベースにした手法を使用する、上記（１５）に記載の方法。
（１７）
治療上有効な用量を、複数回の注射により送達する、上記（１３）に記載の方法。
（１８）
前記複数回の注射が、様々な濃度の１種又は複数のサイトカインを含む、上記（１７）に記載の方法。
（１９）
投与された注射が走化的勾配を形成する、上記（１７）に記載の方法。
（２０）
治療上有効な用量が内在性の体性幹細胞を刺激する、上記（１１）に記載の方法。
（２１）
刺激された内在性の体性幹細胞が動態化する、上記（２０）に記載の方法。
（２２）
前記動態化した内在性の体性幹細胞が、損傷した心筋及び／又は心筋細胞へと向かう、上記（２１）に記載の方法。
（２３）
前記動態化した内在性の体性幹細胞が、損傷した心筋及び／又は心筋細胞内に移行する、上記（２１）に記載の方法。
（２４）
前記動態化した内在性の体性幹細胞が、
ａ．筋細胞と、
ｂ．平滑筋細胞と、
ｃ．内皮細胞と
からなる群から選択された１種又は複数のタイプの細胞に分化する、上記（２１）に記載の方法。
（２５）
前記分化した体性幹細胞が増殖する、上記（２４）に記載の方法。
（２６）
前記分化した体性幹細胞が、心筋及び／又は心筋細胞にアセンブルされる、上記（２４）に記載の方法。
（２７）
前記分化した体性幹細胞が冠状動脈にアセンブルされる、上記（２４）に記載の方法。
（２８）
前記分化した体性幹細胞が細動脈にアセンブルされる、上記（２４）に記載の方法。
（２９）
前記分化した体性幹細胞が毛細血管にアセンブルされる、上記（２４）に記載の方法。
（３０）
前記分化した体性幹細胞が、少なくとも部分的に、損傷した心筋及び／又は心筋細胞に対して構造的及び機能的な完全性を回復する、上記（２４）に記載の方法。
（３１）
前記サイトカインが、
ａ．幹細胞因子と、
ｂ．顆粒球コロニー刺激因子と、
ｃ．間質細胞由来因子１と、
ｄ．インターロイキン３と、
ｅ．インスリン様増殖因子と、
ｆ．肝細胞増殖因子と、
ｇ．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、
ｈ．マクロファージコロニー刺激因子と、
ｉ．スチール因子と、
ｊ．血管内皮増殖因子と、
これらの組合せと
からなる群から選択された１種又は複数のサイトカインを含む、上記（１１）に記載の方法。
（３２）
前記サイトカインが、インスリン様増殖因子１及び肝細胞増殖因子を含む、上記（３１）に記載の方法。
（３３）
前記インスリン様増殖因子１を、０から５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で投与する、上記（３２）に記載の方法。
（３４）
前記インスリン様増殖因子１を、１５０から２５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で投与する、上記（３３）に記載の方法。
（３５）
前記インスリン様増殖因子１を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与する、上記（３４）に記載の方法。
（３６）
前記肝細胞増殖因子を、０から４００ｎｇ／ｍｌの間の様々な濃度で投与する、上記（３２）に記載の方法。
（３７）
前記肝細胞増殖因子を、５０から２００ｎｇ／ｍｌの間の様々な濃度で投与する、上記（３６）に記載の方法。
（３８）
ａ．幹細胞因子と、
ｂ．顆粒球コロニー刺激因子と、
ｃ．間質細胞由来因子１と、
ｄ．インターロイキン３と、
ｅ．インスリン様増殖因子と、
ｆ．肝細胞増殖因子と、
ｇ．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、
ｈ．マクロファージコロニー刺激因子と、
ｉ．スチール因子と、
ｊ．血管内皮増殖因子と、
これらの組合せと
からなる群から選択された１種又は複数のサイトカインを含む、治療上有効な量のサイトカインを含む医薬組成物。
（３９）
心臓血管疾患又は関連する病訴の治療、療法、又は予防に使用される、上記（３８）に記載の医薬組成物。
（４０）
心臓血管疾患又は関連する病訴の治療、療法、又は予防に使用される、上記（３８）に記載の医薬組成物を含むキット。
（４１）
損傷したばかりの心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／又は発生させ且つ／又は再生するのに使用される、上記（３８）に記載の医薬組成物を含むキット。
（４２）
上記（３８）に記載の医薬組成物を調製するためのキット。
（４３）
上記（３８）に記載の医薬組成物を作製する方法。
（４４）
ａ．治療上有効な用量の１種又は複数のサイトカインを投与して内在性の体性幹細胞を刺激するステップを含む、心筋及び／又は心筋細胞を修復し且つ／又は発生させ且つ／又は再生する方法。
（４５）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が成体幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（４６）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が心臓幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（４７）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が成体心臓幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（４８）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が、心臓幹細胞及び心臓幹細胞以外の別のタイプの幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（４９）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が、成体心臓幹細胞及び成体心臓幹細胞以外の別のタイプの幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（５０）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が心臓及び造血幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（５１）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が成体心臓及び成体造血幹細胞である、上記（４４）に記載の方法。
（５２）
前記内在性の体性幹細胞が系統陰性である、上記（４４）に記載の方法。
（５３）
前記系統陰性体性幹細胞がｃ−キットＰＯＳである、上記（５２）に記載の方法。
（５４）
治療上有効な用量の１種又は複数のサイトカインを心臓に送達する、上記（４４）に記載の方法。
（５５）
治療上有効な用量を、損傷した心筋の境界領域に送達する、上記（５４）に記載の方法。
（５６）
治療上有効な用量を注射によって投与する、上記（５５）に記載の方法。
（５７）
治療上有効な用量を心筋内に注射する、上記（５６）に記載の方法。
（５８）
治療上有効な用量を経心外膜的に又は経心内膜的に注射する、上記（５６）に記載の方法。
（５９）
前記経心内膜的手法ではカテーテルをベースにした手法を使用する、上記（５８）に記載の方法。
（６０）
治療上有効な用量を複数回の注射により送達する、上記（５６）に記載の方法。
（６１）
前記複数回の注射が、様々な濃度の１種又は複数のサイトカインを含む、上記（６０）に記載の方法。
（６２）
前記投与された注射が走化的勾配を形成する、上記（６０）に記載の方法。
（６３）
治療上有効な用量が内在性の体性幹細胞を刺激する、上記（４４）に記載の方法。
（６４）
前記刺激された内在性の体性幹細胞が動態化する、上記（６３）に記載の方法。
（６５）
前記動態化した内在性の体性幹細胞が、損傷した心筋及び／又は心筋細胞へと向かう、上記（６４）に記載の方法。
（６６）
前記動態化した内在性の体性幹細胞が、損傷した心筋及び／又は心筋細胞内に移行する、上記（６４）に記載の方法。
（６７）
前記動態化した内在性の体性幹細胞が、
ｄ．筋細胞と、
ｅ．平滑筋細胞と、
ｆ．内皮細胞と
からなる群から選択された１種又は複数のタイプの細胞に分化する、上記（６４）に記載の方法。
（６８）
前記分化した体性幹細胞が増殖する、上記（６７）に記載の方法。
（６９）
前記分化した体性幹細胞が心筋及び／又は心筋細胞にアセンブルされる、上記（６７）に記載の方法。
（７０）
前記分化した体性幹細胞が冠状動脈にアセンブルされる、上記（６７）に記載の方法。
（７１）
前記分化した体性幹細胞が細動脈にアセンブルされる、上記（６７）に記載の方法。
（７２）
前記分化した体性幹細胞が毛細血管にアセンブルされる、上記（６７）に記載の方法。
（７３）
前記分化した体性幹細胞が、少なくとも部分的に、損傷した心筋及び／又は心筋細胞に対して構造的及び機能的な完全性を回復する、上記（６７）に記載の方法。
（７４）
前記サイトカインが、
ｋ．幹細胞因子と、
ｌ．顆粒球コロニー刺激因子と、
ｍ．間質細胞由来因子１と、
ｎ．インターロイキン３と、
ｏ．インスリン様増殖因子と、
ｐ．肝細胞増殖因子と、
ｑ．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、
ｒ．マクロファージコロニー刺激因子と、
ｓ．スチール因子と、
ｔ．血管内皮増殖因子と、
これらの組合せと
からなる群から選択された１種又は複数のサイトカインを含む、上記（４４）に記載の方法。
（７５）
前記サイトカインが、インスリン様増殖因子１及び肝細胞増殖因子を含む、上記（７４）に記載の方法。
（７６）
前記インスリン様増殖因子１を、０から５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で投与する、上記（７５）に記載の方法。
（７７）
前記インスリン様増殖因子１を、１５０から２５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で投与する、上記（７６）に記載の方法。
（７８）
前記インスリン様増殖因子１を、２００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与する、上記（７７）に記載の方法。
（７９）
前記肝細胞増殖因子を、０から４００ｎｇ／ｍｌの間の様々な濃度で投与する、上記（７５）に記載の方法。
（８０）
前記肝細胞増殖因子を、５０から２００ｎｇ／ｍｌの間の様々な濃度で投与する、上記（７９）に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ−Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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【図１６Ａ−Ｄ】
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【図１６Ｅ−Ｇ】
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【図１６Ｈ−Ｐ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｃ】
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【図１８Ｄ−Ｅ】
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【図１８Ｆ−Ｈ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｆ】
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【図２２Ｇ−Ｈ】
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【図２２Ｉ−Ｊ】
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【図２２Ｋ−Ｌ】
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【図２２Ｍ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ−Ｄ】
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【図２３Ｅ−Ｆ】
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【図２３Ｇ−Ｈ】
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【図２４Ａ−Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ａ−Ｂ】
2010195804.tif 000051
【図２５Ｃ−Ｊ】
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【図２６Ａ−Ｆ】
2010195804.tif 000053
【図２６Ｇ−Ｊ】
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【図２６Ｋ−Ｎ】
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【図２７】
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【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２８Ｃ−Ｆ】
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【図２８Ｇ−Ｈ】
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【図２９Ａ−Ｄ】
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【図２９Ｅ−Ｈ】
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【図３０Ａ−Ｄ】
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【図３０Ｅ−Ｈ】
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【図３１Ａ−Ｃ】
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【図３１Ｄ−Ｅ】
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【図３１Ｆ−Ｎ】
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【図３１Ｏ−Ｐ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月9日(2010.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離、精製、及び増大された成体心臓幹細胞と、薬学上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２】
心臓幹細胞が、ｃ−キット陽性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
心臓幹細胞が、系統陰性である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
心臓幹細胞が、筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞へと分化し得る活性により特徴付けられる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
心臓幹細胞が、ｃ−Ｍｅｔ及び／又はＩＧＦ−１Ｒを発現する、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
約２×１０４〜約１×１０5の成人心臓幹細胞を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
心臓幹細胞が、ヒト心臓幹細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
心臓幹細胞が、自己由来である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
心筋内注射用に製剤化された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
心臓へのカテーテルによる送達用に製剤化された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
１又は２以上のサイトカインをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
１又は２以上のサイトカインが、幹細胞増殖因子及び／又はインスリン様増殖因子―１である、請求項１１に記載の医薬組成物。