(57)【要約】【課題】本発明は、Noggin mRNAのsiRNA 、Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNAに対し、細胞毒性がなく、細胞導入効率と導入後の発現効率が高く、且つ安全性の高い生体適合性高分子を用いて骨や軟骨の形成を促進する生体材料を提供することを目的とする。【解決手段】ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体とNoggin mRNAのsiRNA 、Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNAから選ばれた一種以上のsiRNAとを含有する生体材料である。これにリン酸カルシウム及び／又は骨誘導活性を有する細胞成長因子を含有させると、更に骨や軟骨の形成を促進することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体とNoggin mRNAのsiRNA 、 Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNAから選ばれた一種以上のsiRNAとを含有する生体材料。
【請求項２】
siRNA がNoggin mRNAのsiRNAである請求項１記載の生体材料。
【請求項３】
ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体に対するsiRNAの割合が0.01質量%以上である請求項1又は２記載の生体材料。
【請求項４】
ヒドロキシカルボン酸が、乳酸、グリコール酸、p-ジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ε-カプロラクトンから選ばれた一種以上である請求項１、２又は３記載の生体材料。
【請求項５】
ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体の構成単量体の両者のモル比が、5〜95/95〜5の範囲である請求項１、２、３又は４記載の生体材料。
【請求項６】
ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体の数平均分子量が、600〜68,000である請求項1〜５のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項７】
ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体中のヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールの割合が６５モル％以上である請求項1〜６のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項８】
前記生体材料に、更にリン酸カルシウムを含有させた請求項1〜７のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項９】
リン酸カルシウムに対するsiRNAの割合が0.0011質量%以上である請求項８記載の生体材料。
【請求項１０】
前記生体材料に、更に骨誘導活性を有する細胞成長因子を含有させた請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１１】
siRNAに対する細胞成長因子の割合が5質量%以上である請求項１０記載の生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内分解性と生体適合性に優れた共重合体を基剤とし、これと遺伝子を含有する生体材料であって、細胞毒性がなく遺伝子の発現効率に優れた、安全性が高い生体材料に関し、更に詳しくはヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体とNoggin mRNAのsiRNA 、 Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNAから選ばれた一種以上のsiRNAとを含有する生体材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の進歩と共に、治療効果を高める方法として、遺伝子治療が研究されている。近年では、新しい展開として、血管内皮細胞新生因子、神経成長因子等種々の細胞成長因子をコードする遺伝子を細胞内に導入することで組織修復を行う方法も研究され、その成果に大きな期待が寄せられている。また、RNA干渉(RNAi)により転写後の遺伝子の発現を抑制する方法も検討されている。RNAiは、2本鎖RNA(dsRNA)が酵素のダイサーによって切断されて形成された19〜21塩基程度の2本鎖RNAであるsiRNAがRNA-induced silencing complexに取り込まれ1本鎖となり、そのsiRNAが標的遺伝子のmRNAと相補的に結合することでmRNAを特異的に分解し、遺伝子発現を抑制する現象である。
【０００３】
細胞内への遺伝子導入は、投与部位から標的部位の細胞核まで、遺伝子発現に必要な核酸を効率的に導入させることが必要であり、代謝系の分解酵素による攻撃を受け難くするため、投与方法を含め数多くの方法が検討されている。特に、siRNAは、その分子量とポリアニオンの性質により、細胞膜を容易に透過しないことと、修飾されていないsiRNAは、血液や血清中に於いて比較的不安定で半減期は短時間であるため、標的組織への効果的なデリバリーシステムが求められている。
【０００４】
従来の細胞内への遺伝子導入技術としては、物理的に細胞膜を透過させるエレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法等がある。これらの方法による導入効率は比較的高いものの、その機器は高価であり、また細胞の損傷を要因とする遺伝子導入細胞数の減少という問題も生じている。
【０００５】
遺伝子のデリバリーシステムとして、アデノウイルスやレトロウイルス等の感染力を利用する方法は細胞への遺伝子導入効率は高い。しかし、アデノウイルスは免疫原性が強く抗体が形成されて不活性化したり、本来の感染臓器である肝臓に集積したりする問題を有している。また、レトロウイルスは、非分裂細胞には導入できない等一長一短がある。更にウイルスを使用する場合は、白血病等の発症のように安全性や、導入させることが可能な遺伝子が限定される等の問題がある。
【０００６】
これらウイルスベクターを使用する方法に対し、非ウイルスベクターを使用する方法として、遺伝子をカチオン性リポソーム、ポリエチレンイミン等のカチオン性高分子電解質に含有させる方法があるが、製造後の保存安定性の問題、あるいは導入効率や細胞特異性が低いと云う欠点が指摘されている。そこで、これらの改良として肝臓や脾臓の細網内皮系組織に認識され難く且つ血中の滞留を長時間化させる目的で、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマーにより修飾する方法が研究されている(非特許文献１、２参照)。唯、ポリエチレンイミンのようなカチオン性高分子電解質は細胞に対する静菌作用、殺菌作用等を有するため、多少に拘らず毒性を示すことが知られており、特にポリエチレンイミンは、生物であるヒメダカに対する毒性も強いことが報告されている(非特許文献３、４参照)。
【０００７】
それらを抑制するため、アクリル酸系重合体及び/又はメタクリル酸系重合体とラクトン類化合物及び/又はヒドロキシカルボン酸類化合物とエチレンオキシド及び/又はプロピレンオキシド類化合物とを反応させた共重合体からなる材料に、アンチセンスDNA、プラスミッドDNA、RNA等の遺伝子を含有させることが開示されている(特許文献１参照)。特許文献2には癌の遺伝子治療として、核酸と遺伝子送達ポリマーと医薬用物質を含む医薬組成物が開示され、遺伝子送達ポリマーとしてDDS(Drug Delivery System)として利用されている乳酸-グリコール酸共重合体やポリエチレングリコール結合ポリ(ラクチド-co-グリコリド)が記載されている。特許文献3にも同様に、乳酸-グリコール酸共重合体やポリエチレングリコール6000末端基修飾型乳酸-グリコール酸共重合体等の生体適合性高分子をプラスミドＤＮＡ、遺伝子、ｓｉＲＮＡ等核酸化合物のキャリアーとして使用することが記載されている。また、各々の特長を組合せる方法も提案されている。例えば特許文献４には、コラーゲン、セルロース、キトサン等の生体吸収性材料とBMP(Bone Morphogenetic Protein)-2遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを投与した後、エレクトロポーレーションにより標的細胞に導入することで骨または軟骨を形成させる方法が開示されている。
【０００８】
【非特許文献１】Akhtar,S et.al.,J. Clin.Invest.,117(12),p.3623-3632 (2007)
【非特許文献２】片岡一則,遺伝子医学,4(1),p.156-161(2000)
【非特許文献３】阿部達也ら, Polymer Preprints, Japan,56(1),p.1956(2007)
【非特許文献４】宮永信幸ら,水処理技術,18(4),p.333-342(1977)
【特許文献１】特開2004-215712号公報
【特許文献２】特開2008-523061号公報
【特許文献３】特開2007-99631号公報
【特許文献４】WO2005/089810号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、後述のsiRNAについて、細胞毒性が殆どなく、細胞導入効率は高く、また導入後の発現効率が優れた安全性の高い生体適合性材料について鋭意研究を重ねた結果、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体が前述の課題を解決し、Noggin mRNAのsiRNA 、 Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNA について特異的効果を発現することを見出し、係る知見に基づき本発明を完成させたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち本発明の第１の構成は、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体とNoggin mRNAのsiRNA 、 Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNAから選ばれた一種以上のsiRNAとを含有する生体材料に関する。
また、本発明の第２の構成は、上記siRNAが特にNoggin mRNAのsiRNAである生体材料に関する。
また、本発明の第３の構成は、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体に対するsiRNAの割合が0.01質量%以上である生体材料に関する。
また、本発明の第４の構成は、上記ヒドロキシカルボン酸が、乳酸、グリコール酸、p-ジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ε-カプロラクトンから選ばれた一種以上である生体材料に関する。
また、本発明の第５の構成は、上記ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体の構成単量体の両者のモル比が、5〜95/95〜5の範囲である生体材料に関する。
また、本発明の第６の構成は、上記ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体の数平均分子量が、600〜68,000である生体材料に関する。
また、本発明の第７の構成は、上記ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体中のヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールの割合が６５モル％以上である生体材料に関する。
また、本発明の第８の構成は、上記生体材料に、更にリン酸カルシウムを含有させた生体材料に関する。
また、本発明の第９の構成は、上記リン酸カルシウムに対するsiRNAの割合が0.0011質量%以上である生体材料に関する。
また、本発明の第１０の構成は、上記生体材料に、更に骨誘導活性を有する細胞成長因子を含有させた生体材料に関する。
また、本発明の第１１の構成は、siRNAに対する上記細胞成長因子の割合が5質量%以上である生体材料に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の生体材料は、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールを反応させて共重合体を合成し、これにNoggin mRNAのsiRNA 、 Follistatin mRNAのsiRNA、Sclerostatin mRNAのsiRNA、 Chordin mRNAのsiRNA、DCR mRNAのsiRNA, BMPMER mRNAのsiRNAから選ばれた一種以上のsiRNA（以下、単にＡ−siRNAと云う） を含有させることにより製造することができる。本発明の生体材料に用いる共重合体は、ポリエチレンイミン等従来のカチオン性高分子電解質のような細胞毒性を示さず、キャリアーとして適度の強度と生分解性を有する優れた共重合体である。また、特異的にＡ−siRNAに作用し、細胞周囲に於ける導入に必要な有効濃度を維持し且つ表面張力や浸透等の界面活性作用のため、細胞膜への作用が大となることで細胞導入効率は高くなる。また、細胞内での遺伝子の分解が抑制され存在期間が長くなることで、導入後の高い発現効率を実現したものである。即ち、本発明の生体材料を使用すれば、細胞内でのsiRNAの活性を必要な期間維持できるため、骨や軟骨の形成を促進することができ、その医療的価値は極めて高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の生体材料について説明すれば以下の通りである。本発明は骨や軟骨の形成を促進するため、遺伝子としてＡ−siRNA を使用するものである。Ａ−siRNA の働きは、骨形成において、BMPがそのアンタゴニストであるNoggin、  Follistatin、 Sclerostatin、 Chordin、 DCR、 BMPMER等と結合し、それらの活性を阻害すると考えられている。即ち、骨や軟骨の形成を促進するBMPの活性を高くするためには、細胞に存在するアンタゴニストを抑制することが必要であり、Ａ−siRNAを細胞内に導入することにより細胞内での、例えばNoggin mRNAの作用を阻害し、結果としてBMPが活性化し、骨や軟骨の形成が促進されることとなる。
【００１３】
そこで先ず、本発明の生体材料に使用する共重合体の製造方法について説明する。本発明に使用するヒドロキシカルボン酸としては、乳酸、グリコール酸、α、β、γ-ヒドロキシ酪酸、α-ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸等のヒドロキシカルボン酸を、また、モノマーが開環してヒドロキシカルボン酸を形成するラクチド、グリコリド、テトラメチルグリコリド、p-ジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ジメチルトリメチレンカーボネート、ε-カプロラクトン、δ-バレロラクトン、β-ブチロラクトン、γ-ブチロラクトン等のラクトン類を例示することができる。これらヒドロキシカルボン酸は、得られる共重合体の分解特性、吸水性等を調整するために２種以上を使用することができる。また、乳酸、ラクチドに関しては、L、DL、D体の何れであってもよく、これらを混合して使用してもよい。ラクチドに関しては、更にメソ体も使用することができる。
【００１４】
本発明で使用するヒドロキシカルボン酸は、細胞との親和性及び水溶性であるＡ−siRNAの生体材料中に於ける分散状態に関わる吸水量の観点から乳酸、グリコール酸、p-ジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ε-カプロラクトンが特に好ましい。
【００１５】
ポリエチレングリコールに関して言えば、分子量200〜10,000のものが使用され、好ましくは200〜4,000である。また、ポリエチレングリコールは両末端基が水酸基のものでも、一方の末端水酸基がメチル基、エチル基等で封鎖されていてもよい。
【００１６】
本発明の共重合体の製造は、常法に従って製造すればよく、ヒドロキシカルボン酸として乳酸、グリコール酸等を使用する場合、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとの重縮合を窒素ガス導入下あるいは減圧下で、100℃以上の反応温度で進める。更に、この反応を促進するため、リン酸、塩化第一スズ、陽イオン交換樹脂等の触媒を使用することもできる。ラクトン類を使用する場合は、2-エチルヘキサン酸スズ、ジラウリン酸ジブチルスズ、塩化第一スズ、塩化第二スズ、ジエチル亜鉛、乳酸亜鉛、チタニウムテトライソプロポキシド等、あるいはDechy-Cabaret,O.らの報告(Chem. Rev.,104,p.6147-6176(2004))に記載されている触媒を使用し開環重合を行う。
【００１７】
ヒドロキシカルボン酸を使用する場合やラクトン類を使用する場合、反応は溶融状態で進行するが、モノマーを適当な溶媒に溶解あるいは懸濁させて行うこともできる。このような溶媒の種類としては、塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等を例示することができる。
【００１８】
反応して得られる共重合体は、常法に従いアセトン、クロロホルム等の溶媒に溶解させ再沈殿法により精製を行う。即ちこのような溶媒に共重合体を溶解した後、エーテル、石油エーテル、ヘキサン等をその溶液の2〜6容量倍加え、反応生成物を析出させる。あるいは別法として、共重合体を5℃以下の水10倍容量に、溶解あるいは分散させた後、加熱して析出させる方法が採用される。このような精製によって、不純物となる低分子量のオリゴマーやホモポリマー、未反応原料を除去する。このようにして得られる共重合体は、重量平均分子量を数平均分子量で除した分子量分布が概ね1.02〜1.37である。分子量分布が広い場合、特に低分子量側が多く存在する時、共重合体中に存在するポリヒドロキシカルボン酸含量が多くなるため、共重合体の酸性度が高くなりＡ−siRNAを失活させることになる。
【００１９】
本発明の共重合体のヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールの構成単量体の両者のモル比について云えば、モル比は、5〜95／95〜5の範囲のものがよい。ヒドロキシカルボン酸の構成単位のモル比が5を下廻ると、共重合体は水溶性となり、短時間で細胞の周囲から流出するため、細胞内に浸透する際に必要となるＡ−siRNAの有効濃度とならない。また、モル比が95を上廻ると、ヒドロキシカルボン酸の構成をどのように変更しても、界面活性作用は小さい上分解速度が著しく遅くなるため、標的部位の細胞周囲に存在するＡ−siRNA濃度が減少し、その結果酵素により分解されるＡ−siRNA量が多くなり、細胞内への導入量が著しく減少し好ましくない。
【００２０】
また、共重合体の数平均分子量に関して云えば、600〜68,000の範囲のものがよく、この数平均分子量が600を下廻ると、分解性が大きくなると共に、加水分解物の酸性が強くなり局所でのpH低下を引き起こし,細胞に悪影響を与えるので好ましくない。反対に、数平均分子量が68,000を上廻ると、共重合体の分解速度が遅くなり、細胞内への導入量が著しく減少し好ましくない。また、常温でのＡ−siRNAとの混合も困難となるため好ましくない。従って、共重合体の数平均分子量は、更に好ましくは700〜41,000の範囲である。
【００２１】
更に共重合体について云えば、共重合体中のヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールの割合が65モル%以上のものを使用する。ヒドロキシカルボン酸と反応する他の成分としてエチレンオキシド-プロピレンオキシド共重合体、ポリプロピレンオキシドを使用するが、界面活性作用の点からプロピレンオキシドを35モル％以下で含有しているエチレンオキシドとの共重合体が好ましい。その共重合体はランダムポリマーでもブロックポリマーであってもよいが、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールの割合が65モル%を下回ると、疎水性が増加するため分解速度が遅くなると共に界面活性作用が減少することでＡ−siRNAの細胞内への導入量が減少する。
【００２２】
次に、本発明生体材料の製造方法の一例を示すと、ヒドロキシカルボン酸とポリエチレングリコールとを主構成単位とする共重合体とＡ−siRNAとを混合する。混合は、Ａ−siRNA が失活しない約40℃以下で行う。Ａ−siRNAを水溶液の状態で使用する場合、共重合体中の親水基が水分子を吸着するため同様の方法で混合することができるが、生体材料を加工し移植部位に適合する形状にし易くするため、凍結乾燥を行う。また、共重合体の分子量が高く高粘性を示す場合には、エタノール、イソプロピルアルコール等で低粘度とした後、Ａ−siRNAと混合することは可能ではあるが、Ａ−siRNAが失活しない量の添加量が要求される。
【００２３】
本発明の生体材料の製造に当たり、共重合体に対し使用するＡ−siRNAの割合は0.01質量%以上とすることが望ましい。使用割合が0.01質量%を下回ると、Ａ−siRNAの細胞周囲の濃度が有効濃度以下となるため、細胞内に浸透する前に分解され効果を示さない。
【００２４】
本発明生体材料の効果を更に高めるために、本発明において、更にリン酸カルシウムを含有させることが好ましい。本発明に使用されるリン酸カルシウムとしては、リン酸３カルシウム、第２リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸オクタカルシウム等を例示することができる。リン酸カルシウムの使用量は共重合体に対し1〜95質量％が好ましく、このリン酸カルシウムに対するＡ−siRNAの割合は0.0011質量%以上で使用することが好ましい。リン酸カルシウムを含有させることにより、リン酸カルシウムはＡ−siRNAと弱く配位し、Ａ−siRNAの生体内での分解が抑制され、供給したＡ−siRNA濃度が細胞周囲に於いて有効濃度領域となるため、細胞への導入効率が著しく高くなる。使用割合が0.0011質量%を下回ると効果は著しく低下する。尚、上記リン酸カルシウムの中で最も好ましいリン酸カルシウムは、生体内で崩壊、吸収されて新組織に置換されるリン酸３カルシウムと、低温で焼結して構造が低密度のヒドロキシアパタイトである。
【００２５】
上記リン酸カルシウムを含有させる方法は、如何なる方法であっても良いが、粒径10μm程度のリン酸カルシウムとＡ−siRNAの水溶液とを混合した後、共重合体と混合することが推奨される。また、5μm〜300μmの孔径を有する多孔質のリン酸カルシウム成形体に予めＡ−siRNAの水溶液を浸透させた後、共重合体と混合しても良い。
【００２６】
本発明生体材料の効果を更に高めるために、本発明において、更に骨誘導活性を有する細胞成長因子を含有させることが好ましい。骨誘導活性を有する細胞成長因子としては、未分化の間葉系細胞に細胞外から作用し、その遺伝形質を軟骨細胞や骨芽細胞へと誘導する骨形成因子(BMP-2、3、4、5、6、7、8、9)やTGF-β、bFGF、PTH等を例示することができる。骨誘導活性を有する細胞生長因子のＡ−siRNAに対する使用割合は5質量%以上が好ましい。この使用割合を下回ると骨誘導や軟骨誘導の効果を期待することができない。また、骨誘導活性を有する細胞成長因子を含有させる方法は如何なる方法であっても良いが、共重合体とＡ−siRNAの水溶液とを混合した後に混合することが好ましい。
【００２７】
尚、本発明生体材料に、抗炎症剤、抗生物質、制癌剤、免疫抑制剤、血圧降下剤、ホルモン等、あるいは神経成長因子、軟骨由来成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン1、2、3、プロスタグランジン等の薬理学的活性物質を同時に配合させることも可能であり、プラスミドDNA、アンチセンスDNA等のDNAあるいはIL-2遺伝子、VEGF遺伝子、HGF遺伝子等のサイトカイン遺伝子等を配合してもよい。
【００２８】
［実施例］
以下に本発明の実施例を掲げ説明を行なうが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、％は特に断らない限り全て質量％を示す。
【実施例１】
【００２９】
DL-ラクチド29.3g、数平均分子量4,000のポリエチレングリコール(キシダ化学(株)製,試薬)10.4gを容積50mlの反応管に入れ、更にこの反応管に8％オクタン酸スズのジエチルエーテル溶液を52μl添加し、これを-48℃で凍結した。凍結後、反応管内を1mmHgで1時間減圧して密封し、145℃で7時間の反応後、更に160℃で9時間反応を行った。反応生成物をアセトン100mlに加温溶解させ、これにジエチルエーテル550mlを加えて半透明の沈殿を得た。次いで、これを-45℃で30分間冷却し、分離した共重合体を70℃で減圧乾燥させた。
【００３０】
減圧乾燥後に共重合体の37gが得られた。ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)を用いて、この共重合体の分子量を測定した結果、数平均分子量は8,700、重量平均分子量は10,600、分子量分布は1.2であった。また、1H-NMRにより乳酸、エチレンオキサイドの各ユニットのモル比を求めた結果、各成分のモル比は57:43であった。更に、ＤＳＣによる測定でのガラス転移温度は10℃であった。
【００３１】
この共重合体30mgに、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μgを少量の水に溶解した水溶液を混合した後、凍結乾燥し、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の本発明の生体材料を調製した。この生体材料ペレットを、マウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後にペレットに接触した筋肉細胞内にsiRNAが導入されたことを蛍光標識により確認した。
【実施例２】
【００３２】
実施例１で得た共重合体30mgに、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μg、文献(N. R. Kubler, J.F. Reuther, G. Faller, T. Kirchner, R. Ruppert and W. Sebald, Int. J. Oral Maxillofac. Surgery, 1998, 27, 305-309)に記載する方法により得たrhBMP-2の5μgを少量の水と共に混合した後、凍結乾燥し、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の本発明生体材料を調製した。この生体材料ペレットを、マウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後に、ペレットに接触した筋肉細胞内にsiRNAが導入されたことを蛍光標識により確認した。また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、繊維状の骨梁が見られ、骨の形成が確認された。
【００３３】
［比較例１］
実施例１の共重合体に代えて、ポリ−dl−ラクチド（数平均分子量990）を使用し、この30mgに、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μgを少量の水に溶解した水溶液を混合した後、更に実施例２で得たrhBMP-2の5μgを加え、凍結乾燥し、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の複合体ペレットを調製した。これをマウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後に、ペレットに接触した筋肉細胞内のsiRNAの有無を蛍光標識により調べたが、siRNAの含有は見られなかった。
また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、骨の形成は移植片周辺のみであり、移植部中心にはポリ−dl−ラクチドが残存していた。
【００３４】
［比較例２］
実施例１の共重合体に代えて、アテロコラーゲン（(株)高研製）を30mg使用し、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μgを少量の水に溶解した水溶液を混合した後、更に実施例２で得たrhBMP-2の5μgを加え、凍結乾燥し、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の複合体ペレットを調製した。これをマウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後に、ペレットに接触した筋肉細胞内のsiRNAの有無を蛍光標識により調べたが、siRNAの含有はみられなかった。
また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、骨形成量は実施例２に比べて極めて少なかった。
【００３５】
［比較例３］
Noggin mRNAのsiRNAを使用しないことを除いては、実施例２と同様にして複合体ペレットを調製した。これをマウス(5週)の背部筋膜下に移植した。移植3週間後に移植片を摘出し、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、骨形成量は実施例２に比べて極めて少なかった。
【実施例３】
【００３６】
DL-ラクチド26g、p-ジオキサノン7.4g、数平均分子量1,000のポリエチレングリコール7.5gを使用し、実施例１と同様に反応を行い、更に同様に精製処理を行い、共重合体32gを得た。この共重合体の分子量をＧＰＣを使用して測定した結果、数平均分子量は3,900、重量平均分子量は4,300、分子量分布は1.1であった。また、1H-NMRにより乳酸、ジオキサノン、エチレンオキサイドの各ユニットのモル比を求めた結果、各成分のモル比は、59:11:30であった。更に、ＤＳＣによるガラス転移温度の測定結果は-9℃であった。
【００３７】
この共重合体50mgに、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μgを少量の水に溶解した水溶液を混合した後、更に実施例２で得たrhBMP-2の5μgを加え、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の本発明の生体材料を調製した。この生体材料ペレットを、マウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後にペレットに接触した筋肉細胞内にsiRNAが導入されたことを蛍光標識により確認した。
また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、実施例２と同様の骨形成が確認された。
【実施例４】
【００３８】
L-ラクチド29.4g、グリコリド15.9g、p-ジオキサノン17.5g及び数平均分子量4,000のポリエチレングリコール(キシダ化学(株)製試薬)24.6gを使用し、実施例１と同様に反応を行い、更に同様に精製処理を行い共重合体65gを得た。この共重合体の分子量をＧＰＣを使用して測定した結果、数平均分子量は9,100、重量平均分子量は10,000、分子量分布は1.1であった。また、1H-NMRにより乳酸、グリコール酸、ジオキサノン、エチレンオキサイドの各ユニットのモル比を求めた結果、各成分のモル比は24:19:8:49であった。更に、ＤＳＣによるガラス転移温度の測定結果は-10℃であった。
【００３９】
この共重合体40mgに、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μgを少量の水に溶解した水溶液を混合した後、更に実施例２で得たrhBMP-2の5μgを加えて凍結乾燥し、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の本発明の生体材料を調製した。この生体材料ペレットを、マウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後にペレットに接触した筋肉細胞内にsiRNAが導入されたことを蛍光標識により確認した。また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、実施例２と同様の骨形成が確認された。
【実施例５】
【００４０】
DL-ラクチド29.3g、数平均分子量4,000のポリエチレングリコールモノメチルエーテル(Fluka製,試薬)10.4gを使用し、実施例１と同様に反応を行い、更に同様に精製処理を行い、共重合体33gを得た。この共重合体の分子量をＧＰＣを使用して測定した結果、数平均分子量は8,500、重量平均分子量は9,900、分子量分布は1.2であった。また、1H-NMRにより乳酸、エチレンオキサイドの各ユニットのモル比を求めた結果、各成分のモル比は、55:45であった。更に、ＤＳＣによるガラス転移温度の測定結果は12℃であった。
【００４１】
この共重合体40mgに、Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μgを少量の水に溶解した水溶液を混合した後、更に実施例２で得たrhBMP-2の5μgを加え、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の本発明の生体材料を調製した。この生体材料ペレットを、マウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後にペレットに接触した筋肉細胞内にsiRNAが導入されたことを蛍光標識により確認した。また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、実施例２と同様の骨形成が確認された。
【実施例６】
【００４２】
Noggin mRNAのsiRNA（Invitrogen社製）10μg、実施例２で得たrhBMP-2の5μg、更にリン酸三カルシウム10mgを少量の水と共に混合し、これに実施例１で得た共重合体30mgを添加して混合した後、凍結乾燥し、直径6mm×厚さ3mmのペレット状の本発明の生体材料を調製した。この生体材料ペレットを、マウス(5週)の背部筋膜下に移植し、移植４日後にペレットに接触した筋肉細胞内にsiRNAが導入されたことを蛍光標識により確認した。また、移植3週間後に移植片を摘出して、移植片の軟質Ｘ線像及び組織像を観察し、更にCa含有量を測定して、骨組織の状態を調べた結果、実施例２の骨形成状態と比較して発達した骨形成状態が確認された。