(57)【要約】【課題】  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの線毛性凝集原の新規な製剤とその製造方法の提供。【解決手段】  細胞ペーストからの線毛性凝集原の抽出と抽出物の濃縮・精製が関与する多工程手順によって、Ｂｏｎｄｅｔｅｌｌａ菌株、特にＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ菌株から、線毛性凝集原製剤が得られる。線毛性凝集原製剤を用いて、百日咳菌毒素もしくはそれのトキソイド、６９ｋＤａ蛋白および線維状ヘマグルトニンならびに他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原などの他の百日咳抗原を含む非細胞性百日咳ワクチンを得ることができる。そのようなワクチンは、危険性のあるヒト群の７０％以上に保護を提供するものである。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤の製造方法において、
（ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株の細胞ペーストを得る工程；
（ｂ）該細胞ペーストから線毛性凝集原を選択的に抽出して、該凝集原を含む第１の上清と第１の残渣沈澱物を得る工程；
（ｃ）前記第１の残渣沈澱から第１の上清を分離する工程；
（ｄ）前記第１の上清を、線毛性凝集原を含む透明上清と非線毛性凝集原汚染物を含む第２の沈澱物を得るだけの温度および時間でインキュベーションする工程；
（ｅ）前記透明上清を濃縮して、粗線毛性凝集原溶液を得る工程；
（ｆ）前記粗線毛性凝集原溶液から線毛性凝集原を精製して、線毛性凝集原製剤を得る工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記インキュベーション工程（ｄ）を、約７５℃〜約８５℃の温度で実施する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーション工程（ｄ）の温度を約８０℃とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーション工程（ｄ）を、約１０分間〜約６０分間実施する請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーション工程（ｄ）の時間を約３０分間とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
線毛性凝集原の工程（ｂ）での選択的抽出を、細胞ペーストを約１Ｍ〜約６Ｍの尿素を含む緩衝液に分散させることで行う請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記第１の上清を濃縮してから、インキュベーション工程（ｄ）を行う請求項２記載の方法。
【請求項８】
濃縮工程（ｅ）を、前記透明上清から線毛性凝集原を沈澱させ、沈澱した線毛性凝集原を得られた上清から分離し、沈澱した線毛性凝集原を可溶化することで行う請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記沈澱形成を、前記透明上清にポリエチレングリコールを加えることで行う請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記沈澱形成を、前記透明上清に分子量約８０００のポリエチレングリコールを約３％〜約５％まで加えて、前記透明上清から前記凝集原を沈澱させることで行う請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールの濃度を約４．３〜約４．７重量％とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記凝集原を、カラムクロマトグラフィーによって粗線毛性凝集原溶液から精製する請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記カラムクロマトグラフィーで、セファデックス６Ｂおよび／またはＰＥＩシリカカラムクロマトグラフィーを行う請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記精製工程で、前記カラムクロマトグラフィー精製からの溶出液の滅菌によって無菌線毛性凝集原製剤を得る請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記無菌線毛性凝集原製剤を、無機塩アジュバントに吸収させる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記無機塩アジュバントがアルム（Ａｌｕｍ）である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ菌株である請求項１記載の方法。
【請求項１８】
実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株由来の線毛性凝集原製剤。
【請求項１９】
線毛性Ａｇｇ２の線毛性Ａｇｇ３に対する重量比が、約１．５：１〜約２：１である請求項１８記載の製剤。
【請求項２０】
請求項１記載の方法によって製造される請求項１９記載の線毛性凝集原製剤。
【請求項２１】
請求項１８、１９または２０に記載の凝集原製剤を含有する免疫原性組成物。
【請求項２２】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａによって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿主を保護するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるワクチンとして製剤された請求項２１記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
１以上の他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原をさらに含有する請求項２２記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記１以上の他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原が、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａリポオリゴ糖、外膜蛋白ならびに百日咳菌毒素もしくはそのトキソイドからなる群から選択される請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
約２：１：１の重量比で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの百日咳菌トキソイド、線維状へマグルチニンおよび線毛性凝集原を含有する請求項２４記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳菌トキソイド約１０μｇ、線維状ヘマグルチニン約５μｇおよび線毛性凝集原約５μｇを含有させることで得られている請求項２５記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
約１０：５：５：３の重量比で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白および線維状凝集原を含有する請求項２４記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳菌トキソイド約１０μｇ、線維状ヘマグルチニン約５μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有させることで得られている請求項２７記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
約２０：２０：５：３の重量比で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を含有する請求項２４記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳菌トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチニン約２０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有させることで得られている請求項２９記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
１以上の非Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原をさらに含有する請求項２４記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
前記非Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原が、ジフテリア菌トキソイド、破傷風菌トキソイド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの莢膜多糖類、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および風疹からなる群から選択される請求項３１記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
ヒト１回用量中に、ジフテリア菌トキソイドを約１５Ｌｆと破傷風菌トキソイドを約５Ｌｆの量でさらに含有する請求項２９記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
さらにアジュバントを含む請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルおよびリポ蛋白からなる群から選択される請求項３４記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａによって引き起こされる疾患に対して宿主を免疫感作する方法において、免疫学的に有効な量の請求項２１記載の免疫原性組成物を宿主に対して投与する工程を有してなる方法。
【請求項３７】
宿主がヒトである請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、細胞性百日咳ワクチン、その成分およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
関連出願に関する参照
本出願は、１９９５年５月４日出願の同時係属中の米国特許出願０８／４３３６４６号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
百日咳は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによって引き起こされる重度の非常に伝染性が強い上気道感染である。世界保健機構は、年間６０００万人の百日咳患者があり、０．５／１００万の割合でそれに関連する死者が出ていると推算している（参考文献１。本明細書を通じて、本発明が関係する最新技術についてより詳細に説明することを目的として、各種参考文献が括弧を施して引用される。各引用についての完全な文献情報が明細書末尾の、請求の範囲の直前にある。それにより、これらの参考文献の開示内容は、引用によって本開示に含まれる）。非予防接種群では、百日咳の発生率は５歳以下の小児において８０％という高率である（参考文献２）。百日咳は一般に子供の病気と考えられているが、青少年および成人において臨床的および無症候性の疾患であることを示す証拠が多くなっている（参考文献３、４および５）。
【０００４】
１９４０年代における化学的および熱的に不活化したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ微生物からなる全細胞ワクチンの導入によって、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓが原因の百日咳の発生率は大幅に低下した。全細胞ワクチンについての効力は、患者の定義によって決まるが、９５％以下であると推定されている（参考文献６）。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに感染すると、一生続く免疫が得られるが、全細胞ワクチンによる免疫感作後に保護効果の低下を示す証拠が増えている（参考文献３）。全細胞百日咳ワクチン接種、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および重篤な副作用との間の関係について言及する報告がいくつか行われたことから、ワクチン接種が低下し、結果的に新たな流行が起こった（参考文献７）。さらに最近では、所定成分百日咳ワクチンが開発されている。
所定成分百日咳ワクチン用の抗原
各種の非細胞性百日咳ワクチンが開発されており、それにはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ百日咳抗原、百日咳菌毒素（ＰＴ）、線維状ヘマグルトニン（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｏｎｉｎ）（ＦＨＡ）、６９ｋＤＡ外膜蛋白（ペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ））および線毛性凝集原などがある（後述の表１参照。表は明細書の末尾にある。）。
百日咳菌毒素
百日咳菌毒素は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する細菌毒素のＡ／Ｂ類の一種である外毒素である（参考文献８）。これら毒素のＡ部分は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示し、Ｂ部分は毒素の宿主細胞受容体への結合とその作用部位へのＡの転位に介在する。ＰＴはさらに、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの線毛上皮細胞への付着を促進し（参考文献９）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる巨食細胞の侵襲においてある役割を果たす（参考文献１０）。
【０００５】
非細胞性百日咳ワクチンはいずれも、主要な毒性因子であり保護抗原として提案されているＰＴを含むものであった（参考文献１１および１２）。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる自然感染により、ＰＴへの体液媒介性および細胞媒介性の両方の応答が生じる（参考文献１３および１７）。乳児は胎盤由来の抗ＰＴ抗体を持ち（参考文献１６および１８）、抗ＰＴ抗体を有するヒト初乳は、エアロゾル感染に対するマウスの受動保護において有効であった（参考文献１９）。非細胞性ワクチンによる免疫感作後には、ＰＴサブユニットに対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答が明らかになっており（参考文献２０）、全細胞ワクチン接種後にはＰＴに対するＣＭＩが応答が生じている（参考文献１３）。全細胞ワクチンまたは成分ワクチン中の化学的に不活化されたＰＴは動物モデルおよびヒトにおいて保護効果を有する（参考文献２１）。さらに、サブユニットＳ１に特異的なモノクローナル抗体は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する保護を行う（参考文献２２および２３）。
【０００６】
ＰＴの主要な病態生理学的効果は、それのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性によるものである。ＰＴはＮＡＤからＧｊグアニンヌクレオチド結合蛋白へのＡＤＰ−リボースの転移を触媒し、それによって細胞のアデニル酸シクラーゼ調節系を障害する（参考文献２４）。ＰＴはさらに、巨食細胞およびリンパ球の炎症部位への移動を防止し、好中球介在の食作用および殺細菌を妨害する（文献２５）。多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを用いて、ウシトランスジューシンのＡＤＰ−リボシル化（文献２６）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の群形成アッセイ（参考文献２７）、ヒスタミン感作（文献２８）、白血球増加症およびＮＡＤグリコヒドロラーゼなどのＳ１および／またはＰＴの酵素活性が評価されている。ＰＴ曝露を受けると、ＣＨＯ細胞は特徴的な群形成形態を取る。この現象は、ＰＴの結合とその後の転位およびＳ１のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性に対して依存性であり、ＣＨＯ細胞群形成アッセイはＰＴ完全毒素の完全性および毒性を調べるのに広範囲に使用されている。
線維状ヘマグルトニン
線維状ヘマグルトニンは、大きい（２２０ｋＤａ）無毒性ポリペプチドであり、細菌のコロニー形成時におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの上気道線毛細胞への付着を媒介する（参考文献９、２９）。自然感染により、抗ＦＨＡ抗体および細胞媒介性免疫が誘発される（参考文献１３、１５、１７、３０および３１）。抗ＦＨＡ抗体は、ヒト初乳において認められ、やはり胎盤を通じて伝達される（参考文献１７、１８および１９）。全細胞性または非細胞性の百日咳ワクチンによる予防接種により抗ＦＨＡ抗体が生じ、ＦＨＡを含む非細胞性ワクチンによってはさらに、ＦＨＡに対するＣＭＩ応答が誘発される（参考文献２０および３２）。ＦＨＡは、能動免疫または受動免疫後でのマウスの呼吸系感作モデルにおける保護抗原である（参考文献３３および３４）。しかしながら、ＦＨＡ単独では、マウスの脳内感作力アッセイにおいて保護を示さない（参考文献２８）。
６９ｋＤａ外膜蛋白（ペルタクチン）
６９ｋＤａ蛋白は、最初はＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから確認された外膜蛋白である（参考文献３５）。それはＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する保護抗原であることが明らかになっており、その後、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓの両方で確認されている。６９ｋＤａ蛋白は、真核細胞に直接結合し（参考文献３６）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる自然感染によって、抗Ｐ．６９体液応答を誘発し（参考文献１４）、Ｐ．６９も細胞介在性免疫応答を誘発する（参考文献１７、３７および３８）。全細胞ワクチンまたは非細胞性ワクチンによる予防接種によって抗Ｐ．６９抗体が誘発され（参考文献３２および３９）、非細胞性ワクチンによってＰ．６９ＣＭＩが誘発される（参考文献３９）。ペルタクチンは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによるエアロゾル感作に対してマウスを保護し（参考文献４０）、ＦＨＡとの併用によって、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する脳内感作試験において保護を示す（参考文献４１）。ポリクローナルまたはモノクローナルの抗Ｐ．６９抗体の受動的転移によっても、エアロゾル感作に対してマウスが保護される（参考文献４２）。
【０００７】
凝集原
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの血清型は、その凝集性線毛によって決まる。ＷＨＯは、１型、２型および３型の凝集原（Ａｇｇ）が交差保護性ではないことから、全細胞ワクチンにこれらの凝集原を含ませることを推奨している（参考文献４３）。Ａｇｇ１は非線毛性であって全てのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ菌株で認められるのに対して、血清型２型および３型Ａｇｇは線毛性である。自然感染または全細胞性もしくは非細胞性のワクチンによる免疫感作によって、抗Ａｇｇ抗体が誘発される（参考文献１５および３２）。マウスにおいて、エアロゾル感染後に、Ａｇｇ２およＡｇｇ３によって、特異的な細胞介在性免疫応答を生じさせることができる（参考文献１７）。Ａｇｇ２およびＡｇｇ３は、マウスにおいて呼吸系感作に対する保護効果を持ち、抗凝集原を含むヒト初乳も、このアッセイで保護を示す（参考文献１９、４４、４５）。
非細胞性ワクチン
最初に開発された非細胞性ワクチンは、サトウ（Ｓａｔｏ）らの２成分ＰＴ＋ＦＨＡワクチン（ＪＮＩＨ６）であった（参考文献４６）。このワクチンは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｈａｍａ株の培養上清からのＰＴ抗原およびＦＨＡ抗原の同時精製と、それに続くホルマリントキソイド化によって製造された。１９８１年以降、各種製造業者からの各種成分の非細胞性ワクチンを用いて、日本の小児の百日咳に対する免疫感作が奏功して、結果的に疾患の発生率が大幅に低下している（参考文献４７）。ＪＮＩＨ６ワクチンおよび単一成分ＰＴトキソイドワクチン（ＪＮＩＨ７）について１９８６年にスウェーデンで大規模な治験での試験が行われている。
【０００８】
最初の結果は、全細胞ワクチンについて報告されている効力より低い効力を示していたが、追跡調査試験では、血清学的方法によって診断される比較的軽い疾患に対しては、より有効であることが明らかになっている（参考文献４８、４９、５０、５１）。しかしながら、これらのワクチンにおいては、ホルマリン不活化ＰＴの毒性への復帰の現象を示す証拠があった。これらのワクチンはさらに、感染に対してではなく、疾患に対して保護作用があることが認められている。
【０００９】
現在、多くの新たな非細胞性百日咳ワクチンが評価を受けており、それにはＰＴ、ＦＨＡ、Ｐ．６９および／または凝集原の併用が含まれており、これらは表１に挙げてある。化学的無毒化のいくつかの方法が、ＰＴに対して行われており、それにはホルマリン（参考文献４６）、グルタルアルデヒド（参考文献５２）、過酸化水素（参考文献５３）およびテトラニトロメタン（参考文献５４）による不活化などがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そのように、現在市販されている非細胞性百日咳ワクチンは、適切な免疫原型の適切な抗原の適切な製剤が含まれていて、百日咳に対して感受性のヒトの群において所望のレベルの効力を得ることができていない。
【００１１】
そこで、特定の抗原を特定の相対量で含む有効な非細胞性百日咳ワクチンならびにその製造方法を提供することが望ましいものと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、非細胞性百日咳ワクチン製剤、その成分、そのようなワクチンおよびその成分の製造方法、ならびにその使用方法に関するものである。
【００１３】
本発明の一態様によれば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤の製造方法において、
（ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株の細胞ペーストを得る工程
（ｂ）該細胞ペーストから線毛性凝集原を選択的に抽出して、凝集原を含む第１の上清と第１の残渣沈澱物を得る工程
（ｃ）第１の残渣沈澱から第１の上清を分離する工程；
（ｄ）第１の上清を、線毛性凝集原を含む透明上清と非凝集原汚染物を含む第２の沈澱物を得るだけの温度および時間でインキュベーションする工程；
（ｅ）透明上清を濃縮して、粗線毛性凝集原を含有する溶液を得る工程；
（ｆ）粗線毛溶液から凝集原を精製して、凝集原製剤を得る工程を有してなる方法が提供される。
【００１４】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓであることができる。第１の上清は、約５０℃〜約１００℃、さらには約７５℃〜約８５℃、好ましくは約８０℃の温度でインキュベーションすることができる。インキュベーション時間は、約１０分間〜約６０分間、好ましくは約３０分間とすることができる。線毛性凝集原の細胞ペーストからの選択的抽出は、細胞ペーストを約１Ｍ〜約６Ｍの尿素を含む緩衝液に分散させることで行うことができる。特定の実施態様においては、第１の上清を濃縮してから、透明上清を得るような時間および温度でインキュベーションを行う。
【００１５】
透明上清の濃縮は、透明上清からの線毛凝集原の沈澱と、得られた上清からの線毛性凝集原の沈澱の分離と、沈澱した線毛性凝集原の可溶化などの簡便な手段によって行うことができる。沈澱形成は、透明上清に、分子量約８０００のポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコールを加えることで行うことができる。そのような沈澱形成で使用されるポリエチレングリコールの濃度は、約３％〜約５％、好ましくは約４．３％〜約４．７％として、透明上清からの前記線毛性凝集原の沈澱を行うことができる。
【００１６】
線毛性凝集原は、カラムクロマトグラフィーによって粗線毛溶液から精製することができ、カラムクロマトグラフィーには、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）６Ｂおよび／またはＰＥＩシリカカラムクロマトグラフィー等のゲル濾過などがあり得る。本発明の特定の態様において凝集原は、例えばカラムクロマトグラフィーからの溶出液（ｒｕｎ−ｔｈｒｏｕｇｈ）の無菌濾過によって滅菌された無菌凝集原製剤として提供される。特定の実施態様においては、無菌線毛性凝集原製剤は、アルム（Ａｌｕｍ）などの無機塩アジュバントに吸着される。
【００１７】
本発明の特定の態様においては、実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株から得られる線毛性凝集原製剤が提供される。凝集原１は反応原性であるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であることが報告されていることから、実質的にＬＯＳを含まない線毛性凝集原の提供はそれによる反応原性を低下させるものである。
【００１８】
Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は、そのような線毛性凝集原製剤では約１．５：１〜約２：１とすることができる。本発明の特定の実施態様においては、本発明で提供される方法によって製造される線毛性凝集原製剤が提供される。
本発明のさらに別の態様では、本発明で提供される線毛性凝集原製剤を有してなる免疫原性組成物が提供される。その免疫原性組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａによって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿主を保護するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるワクチンとして製剤することができ、１以上の他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原を含むことができる。その１以上の他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原は、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａリポオリゴ糖、外膜蛋白ならびに百日咳菌毒素もしくはそのトキソイドであることができ、それらの遺伝子的に無毒化された類縁体も含まれる。
本発明のさらに別の態様においては、本発明で提供される免疫原性組成物は、１以上の非Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原を有することができる。そのような非Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原は、ジフテリア菌トキソイド、破傷風菌トキソイド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの莢膜多糖類、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および／または風疹などがあり得る。
【００１９】
本発明で提供される免疫原性組成物はさらにアジュバントを含有することができ、そのようなアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルまたはリポ蛋白などがあり得る。
本発明の具体的な態様によれば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる感染によって引き起こされる疾患の症例に対して危険性のあるヒト群を保護するためのワクチン組成物であって、その危険群の構成員の７０％以上の範囲まで保護を提供するべく選択された相対量で、精製された形態での百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、ペルタクチンおよび凝集原を含有してなるワクチン組成物が提供される。
【００２０】
そのようなワクチン組成物は、約５〜約３０μｇ窒素の百日咳菌トキソイド、約５〜約３０μｇ窒素の線維状ヘマグルチニン、約３〜約１５μｇ窒素のペルタクチン、ならびに約１〜約１０μｇ窒素の凝集原を含有することができる。
ある具体的な実施態様においてワクチンは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａの百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約１０：５：５：３の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳菌トキソイド約１０μｇ、線維状ヘマグルチニン約５μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有させることができる。さらに別の特定の実施態様においてワクチンは、百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約２０：２０：５：３の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳菌トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチニン約２０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有させることができる。さらに別の特定の実施態様においてワクチンは、百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約２０：１０：１０：６の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳菌トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチニン約１０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約１０μｇおよび線毛性凝集原約６μｇを含有させることができる。
【００２１】
２１日以上の期間にわたる痙攣性の咳があって培養で確認された細菌感染のある患者に関しては、本発明のワクチン組成物が提供する危険性のあるヒト群に対する保護の程度は、約８０％以上、好ましくは約８５％以上であり得る。１日以上の期間の咳を有する軽度の百日咳患者に関しては、危険性のあるヒト群に対する保護の程度は、約７０％以上である。
【００２２】
ワクチンの凝集原成分は、凝集原１を実質的に含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含有するものである。Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は約１．５：１〜約２：１とすることができる。
【００２３】
本発明において提供されるワクチンには、破傷風菌トキソイドおよびジフテリア菌トキソイドを併用して、ＤＴＰワクチンを提供することができる。１実施態様においては、ワクチンは約１５Ｌｆのジフテリア菌トキソイドと約５Ｌｆの破傷風菌トキソイドを含む。
【００２４】
さらに、ワクチンはアジュバント、特にはアルム（Ａｌｕｍ）を含むこともできる。
【００２５】
そのような特定の実施態様において、免疫原性組成物は、それに含まれる各抗原に対してある免疫応答特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）を与え、その応答特性は、全細胞百日咳ワクチンによって得られるものと実質的に等価である。
本発明のさらに別の態様においては、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａによって生じる疾患に対して宿主を免疫感作する方法であって、ヒトなどの宿主に対して、本発明で提供される免疫原性組成物もしくはワクチンを免疫的に有効な量で投与する工程を有してなる方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらに別の態様においては、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる感染によって生じる疾患に対して、危険性のあるヒト群を免疫感作する方法であって、危険性のあるヒト群の構成員に対して、本発明で提供されるワクチン組成物を免疫的に有効な量で投与して、危険群の構成員の約７０％以上に保護を与える方法が提供される。
本発明の利点には、非細胞性百日咳ワクチンに含有させるのに好適な免疫原性凝集原製剤を簡単な方法で製造して、そのようなワクチンの効力を高めることができるというものがある。
【００２７】
本発明によって提供される凝集原製剤は、ワクチンによって免疫感作される宿主をＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓなどのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａによって生じる疾患から保護するための非細胞性の多成分ワクチン製剤において用途を有するものである。
【００２８】
特に、本発明で提供される凝集原製剤を含む免疫原性組成物は、二重盲検ヒト効力治験での評価向けに、米国政府の国立アレルギー・感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：ＮＩＡＩＤ）によって選択されており、それにより、特定の当業者に対して、その組成物が対象疾患（百日咳）の予防にある程度有効であることを示すだけの根拠が確立された。この治験は、本米国特許出願の出願日現在で継続中である。その治験の対象（本発明で提供されるワクチン）は、有用性がかなり予測できるものであるという要求を満足するものであった。
図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明および実施例からさらに詳細に理解される。
【００２９】
図１は、本発明の一態様によるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤の単離手順の図式的フローシートである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の一態様によるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤の単離手順の図式的フローシートである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
一態様において本発明は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤を製造するために用いることができる新規な方法を提供する。図１について説明すると、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤の製造方法のフローシートが示してある。図１からわかるように、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞ペーストなどの凝集原を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ細胞ペーストを、１０ｍＭ  リン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素などの尿素含有緩衝液で抽出して、細胞ペーストから凝集原を選択的に抽出することで、凝集原を含む第１の上清（ｓｐ１）と第１の残渣沈澱物（ｐｐｔ１）を得る。第１の上清（ｓｐ１）を、遠心分離などによって、第１の残渣沈澱物（ｐｐｔ１）から分離する。その残渣沈澱物（ｐｐｔ１）は廃棄する。次に、透明上清（ｓｐ１）を、例えば１００〜３００ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜フィルターを用いて、例えば１０ｍＭ  リン酸カリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  トリトンＸ−１００に対して濃縮・ダイアフィルトレーションを行うことができる。
【００３２】
次に、第１の上清を、凝集原を含む透明上清（ｓｐ２）と非凝集原汚染物を含む第２の廃棄沈澱物（ｐｐｔ２）を得るだけの温度および時間でインキュベーションする。適切な温度としては、約５０℃〜約１００℃、さらには約７５℃〜約８５℃などがあり、適切なインキュベーション時間としては、約１分間〜約６０分間などがある。次に、透明上清を、例えば分子量約８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度約４．５±０．２％となるまで加え、約３０分間以上ゆっくり撹拌することで濃縮して、第３の沈澱物（ｐｐｔ３）を得て、それを遠心にて回収することができる。残った上清ｓｐ３は廃棄する。
【００３３】
この第３の沈澱物（ｐｐｔ３）を、例えば、１０ｍＭ  リン酸カリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で抽出して、粗線毛性凝集原含有溶液を得る。その粗線毛溶液に１Ｍ  リン酸カリウムを加えて、それをリン酸カリウムに関して約１００ｍＭとすることができる。別法として、熱処理した線毛性凝集原の透明上清を、セファロースＣＬ６Ｂなどのゲルを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって沈澱形成を行わずに精製することができる。次に、粗溶液中の線毛性凝集原を、ＰＥＩシリカカラムを通過させる等のカラムクロマトグラフィーによって精製して、溶出液中の線毛性凝集原製剤を得る。
【００３４】
この線毛性凝集原含有溶出液をさらに、１００〜３００ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜を使用する１０ｍＭ  リン酸カリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液に対して濃縮・ダイアフィルトレーションすることができる。凝集原製剤は、≦０．２２μｍ膜フィルターによる濾過によって滅菌して、線毛性凝集原２および３を含む最終精製線毛性凝集原製剤を得ることができる。
【００３５】
本発明は、凝集原１を実質的に含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌株からの凝集原製剤を含むものである。Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は、約１．５：１〜約２：１とすることができる。そのような線毛性凝集原製剤は、本発明で提供され上記で詳細に説明した方法によって製造することができる。本発明はさらに、本発明で提供される線毛性凝集原製剤を含む免疫原性組成物（ワクチンを含む）も含むものである。そのようなワクチンには、線維状ヘマグルチニン、６０ｋＤａ外膜蛋白および百日咳菌毒素もしくはそれのトキソイド（文献６８に記載のＰＴの遺伝子的に無毒化した類縁体を含む）のような他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原、ならびにジフテリア菌トキソイド、破傷風菌トキソイド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの莢膜多糖類、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および／または風疹のような非Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原などがあり得る。各Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原をそれぞれアジュバント（例：アルム（Ａｌｕｍ））に吸収させて、本発明で提供されるワクチン中に特定の相対量で抗原を含有するワクチンを簡便かつ迅速に得る。
【００３６】
特定の実施態様において本発明は、以下の特性を有するワクチンを提供するものであり（ここで使用されるμｇ蛋白は、精製濃縮物について実施されるケルダール試験の結果に基づくものであり、蛋白窒素のμｇ数として表現されたものである）、そのいずれも筋肉注射によって投与することができる。
（ａ）ＣＰ10/5/5/3ＤＴ
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの一つの製剤を、ＣＰ10/5/5/3ＤＴと称した。ＣＰ10/5/5/3ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【００３７】
１０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
（ｂ）ＣＰ20/20/5/3ＤＴ
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの別の製剤を、ＣＰ20/20/5/3ＤＴと称した。ＣＰ20/20/5/3ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【００３８】
２０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
２０μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
（ｃ）ＣＰ10/5/5ＤＴ
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのある製剤を、ＣＰ10/5/5ＤＴと称した。ＣＰ10/5/5ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【００３９】
１０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
（ｄ）ＣＰ20/10/10/6ＤＴ
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのさらに別の製剤を、ＣＰ20/10/10/6ＤＴと称した。ＣＰ20/10/10/6ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【００４０】
２０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
１０μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
１０μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
６μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白（６９ｋＤＡ）
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原、百日咳菌毒素（例えば、本発明の譲受人に譲渡され引用によって本明細書に含まれるクラインら（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）の米国特許５０８５８６２号に記載のような、それの遺伝子的に無毒化された類縁体を含む）、ＦＨＡおよび６９ｋＤａ蛋白は、以下に記載のような各種方法によって製造することができる。
ＰＴの精製
ＰＴは、従来の方法を用いて、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ菌株の培養上清から単離することができる。例えば、セクラ（Ｓｅｋｕｒａ）らの方法（参考文献５５）を用いることができる。ＰＴの単離は、最初に培養上清を色素リガンドゲル充填剤（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を充填したカラムに吸収させることで行う。このカラムから、０．７５Ｍ  塩化マグネシウムなどの高濃度の塩によってＰＴを溶離させ、塩を除去した後に、臭化シアンで活性化したセファロースにフェチュインを結合させた構成のフェチュイン−セファロースアフィニティ充填剤のカラムに通す。ＰＴは、４Ｍ  マグネシウム塩を用いて、フェチュインカラムから溶離させる。
【００４１】
別法として、アイロンズら（Ｉｒｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ、参考文献５６）の方法を用いることができる。培養上清を、予めヘパトグロビンが共有結合的に結合したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラムに吸収させる。ＰＴをｐＨ６．５で吸収剤に結合させ、段階的にｐＨを１０まで変化させながら、０．１Ｍ  トリス／０．５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液を用いて、カラムから溶離させる。
【００４２】
別法として、１９８７年１１月１０日にスコット（Ｓｃｏｔｔ）らに与えられ、引用によって本明細書に含まれる米国特許４７０５６８６号に記載の方法を用いることができる。この方法では、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養上清もしくは細胞抽出物を、内毒素は吸着するがＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原は通過させるかあるいは内毒素から分離させるだけの能力を有するアニオン系イオン交換樹脂のカラムに通す。
【００４３】
別法としてＰＴは、本願の譲受人に譲渡され、引用によって本明細書に含まれる欧州特許３３６７３６号に記載のような、パーライトクロマトグラフィーを用いて精製することができる。
ＰＴの無毒化
ＰＴを無毒化して、最終ワクチンの副作用を起こし得る望ましくない活性を除去する。各種の従来の化学的無毒化法を使用することができ、それにはホルムアルデヒド、過酸化水素、テトラニトロメタンまたはグルタルアルデヒドによる処理などがある。
【００４４】
例えば、ムノズ（Ｍｕｎｏｚ）らの報告（参考文献５７）に記載の手順の変法を用いて、グルタルアルデヒドによってＰＴを無毒化することができる。この無毒化方法では、精製ＰＴを、０．０１Ｍ  リン酸緩衝生理食塩水を含む溶液中でインキュベーションする。溶液をグルタルアルデヒド０．０５％とし、混合物を室温で２時間インキュベーションし、Ｌ−リシンで０．０２Ｍとする。混合物をさらに室温で２時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳに対して２日間透析する。
【００４５】
特定の実施態様では、欧州特許３３６７３６号の無毒化方法を用いることができる。すなわち、ＰＴを以下のようにしてグルタルアルデヒドで無毒化することができる。
【００４６】
０．２２Ｍで塩化ナトリウムを含む精製ＰＴの７５ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）を等量のグリセリンで希釈して、蛋白濃度を約５０〜４００μｇ／ｍＬとする。溶液を加熱して３７℃とし、グルタルアルデヒドを最終濃度０．５％（容量基準）となるように加えて無毒化を行う。混合物を３７℃で４時間経過させ、アスパラギン酸（１．５Ｍ）を加えて、最終濃度０．２５Ｍとする。混合物を室温で１時間インキュベーションし、０．１５Ｍで塩化ナトリウムと５％でグリセリンを含むｐＨ８．０の１０ｍＭ  リン酸カリウム１０倍容量でダイアフィルトレーションを行って、グリセリン量を低下させ、グルタルアルデヒドを除去する。０．２μｍ膜を通して、ＰＴトキソイドを無菌濾過する。
【００４７】
組換え法を用いてトキソイド化分子として使用するのに無毒かまたはほとんど毒性を示さないＰＴ突然変異体分子を製造する場合、化学的無毒化は必要ない。
ＦＨＡの精製
ＦＨＡの精製は、コーウェル（Ｃｏｗｅｌｌ）らの報告（参考文献５８）に記載の方法にほぼ従って、培養上清から精製することができる。メチル化β−シクロデキストリンなどの成長促進剤を用いて、培養上清中のＦＨＡの収量を上昇させることができる。その培養上清を、ヒドロキシルアパタイトカラムに投入する。ＦＨＡはカラムに吸着されるが、ＰＴは吸着されない。カラムをトリトンＸ−１００でかなり洗浄して内毒素を除去する。次に、０．５ＭでＮａＣｌを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム溶液を用いてＦＨＡを溶離し、必要に応じてフェチュイン−セファロースカラムに通して、残っているＰＴを除去する。セファロースＣＬ−６Ｂカラムを通して、さらに精製を行うことができる。
【００４８】
別法として、ＦＨＡの精製を、その抗原に対するモノクローナル抗体を用いて行うことができ、その場合、抗体をＣＮＢｒ活性化アフィニティカラムに付着させておく（参考文献５９）。
【００４９】
別法として、ＦＨＡの精製を、上記の欧州特許３３６７３６号に記載の方法に従ってパーライトクロマトグラフィーによって行うことができる。
６９ｋＤａ外膜蛋白（ペルタクチン）の精製
最初に、引用によって本明細書に含まれる公開欧州特許出願４８４６２１号に記載された方法に従って、チメロサールなどの静菌剤を用いて細胞を不活化することで、細菌細胞から６９ｋＤａ外膜蛋白（６９Ｋまたはペルタクチン）を回収することができる。その不活化細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７〜８）などの水系媒体中に懸濁させ、高温（４５〜６０℃）で繰り返し抽出し、その後室温もしくは４℃まで冷却する。抽出によって、細胞から６９Ｋ蛋白が放出される。６９Ｋ蛋白含有物を沈澱によって回収し、アフィゲルブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ）カラムに通す。６９Ｋ蛋白を、０．５Ｍ  塩化マグネシウムなどの高濃度の塩で溶離させる。透析後、それをクロマトフォーカシング担体に通す。
【００５０】
別法として、本願の譲受人の名称で出願され、引用によって本明細書に含まれる公開ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１５５０５号に記載の方法に従って、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物の培養上清から、６９ｋＤａ蛋白を精製することができる。
【００５１】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの６９ｋＤａ外膜蛋白の他の適切な精製方法は、ゴット（Ｇｏｔｔｏ）らに１９８４年１月４日に与えられた米国特許５２７６１４２号およびバーンズ（Ｂｕｒｎｓ）らに１９９２年３月３１日に与えられた米国特許５１０１０１４号に記載されている。
【００５２】
本明細書に記載のような多くの治験がヒトにおいて行われて、百日咳に対する保護向けに、本発明の方法に従って製造される線毛性凝集原を含む成分ワクチンの安全性、非反応原性および有用性が確認されている。特に、ワクチンに含まれる各抗原に対する免疫応答（例えば、後述の表３に示したもの）が得られている。ある特定の非細胞性百日咳ワクチンＣＰ10/5/5/3ＤＴについて、危険性のあるヒト群における大規模なプラシーボ対照多施設二重無作為化治験で解析が行われ、代表的な百日咳に対するそのワクチンの効力が推算されている。
【００５３】
代表的百日咳疾患患者は以下のように定義された。
【００５４】
２１日以上の痙攣性の咳  および  培養で確認されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
または  対合血清でのＦＨＡもしくはＰＴに対するＥＬＩＳＡにおける１００％のＩｇＧもしくはＩｇＡ抗体上昇によって示されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ特異的感染の血清学的証拠あるいは
血清学的データがない場合、治験参加小児における咳発症の前後２８日以内に咳を発症したその家庭内の培養で確認されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ患者とその治験参加小児との間に接触があったこと
この治験の結果から、ＣＰ10/5/5/3ＤＴが上記のような代表的百日咳疾患についての患者定義で定義されたような百日咳の予防に約８５％の効力を持つことが明らかになった。同じ治験で、ＰＴおよびＦＨＡのみを含む２成分系百日咳非細胞性ワクチンは約５８％の効力であり、全細胞百日咳ワクチンは約４８％の効力であった（後述の表４参照）。さらに、ＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチンは、１日以上の期間の咳として定義される軽度の百日咳を、約７７％の効力で予防した。特に、得られた免疫応答特性は、百日咳に対して非常に有効であると報告されている全細胞百日咳ワクチンによる免疫感作後に得られたものと実質的に同等であった。
ワクチン製造および使用
そこで、ワクチンとしての使用に好適な免疫原性組成物を、本願に開示の方法に従ってＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原から製造することができる。このワクチンは、オプソニン作用性または殺細菌性となり得る抗体を産生する患者において免疫応答を誘発する。予防接種患者をＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓが感作したとしても、そのような抗体が細菌に結合し、不活化する。さらに、オプソニン作用性または殺細菌性の抗体は、別の機序によって保護を与える可能性もある。
【００５５】
ワクチンなどの免疫原性組成物は、液剤や乳剤などの注射剤として製剤することができる。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ免疫原は、その免疫原と適合性である医薬的に許容される賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤としては、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびそれらの組み合わせたものなどがあり得る。免疫原性組成物およびワクチンは、湿展剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバントなどの補助物質をさらに含有して、その有効性を高めることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射もしくは筋肉注射によって、非経口的に投与することができる。免疫原性製剤およびワクチンは、その製剤に適合する方法にて、治療上有効で、免疫原性があり、保護効果のあるような量で投与される。投与量は、治療を受ける患者によって決まるものであり、例えば、抗体を合成し、必要に応じて細胞介在性免疫応答を生じるその個人における免疫系の能力によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断によって決まる。しかしながら、好適な用量範囲は、当業者であれば容易に決定し得るものであり、免疫原をμｇ単位とすることになると考えられる。初期投与および追加免疫投与における好適な投与法も変動し得るものであるが、初期投与とそれに続く投与を行うものと考えられる。用量は投与経路によっても決まるものであり、宿主の大きさに応じて変動する。
【００５６】
本発明による免疫原性組成物中の免疫原の濃度は通常、約１〜約９５％である。１個の病原体のみの抗原材料を含むワクチンは単価ワクチンである。数種類の病原体の抗原材料を含むワクチンは、混合ワクチンであって、これも本発明に含まれる。そのような混合ワクチンは、例えば各種病原体からまたは同一病原体の各種菌株から、あるいは各種病原体の組み合わせからの材料を含むものである。
【００５７】
抗原をアジュバントと同時に（アジュバントは通常、リン酸緩衝生理食塩水の０．００５〜０．５％溶液として使用）抗原を投与すると、免疫原性を大幅に上昇させることができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を高めるが、必ずしもそれ自体が免疫原性とは限らない。アジュバントは、抗原を投与部位付近に局所的に保持することで、免疫系の細胞への抗原の緩やかな徐放を促進する貯蔵効果を生じることで作用し得るものである。アジュバントはさらに、免疫系の細胞を抗原貯蔵部まで引き寄せ、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発することができる。
【００５８】
免疫刺激剤またはアジュバントは、例えば、ワクチンに対する宿主の免疫応答を改善するために、長年にわたって使用されている。リポ多糖類などの内在性アジュバントは通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化細菌の成分である。外因性アジュバントは、代表的には共有結合的に抗原に結合する免疫調節剤であり、宿主の免疫応答を促進するよう製剤されている。そうして、非経口的に搬送される抗原に対する免疫応答を促進するアジュバントが確認されている。しかしながら、そのようなアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副作用を起こし得るものであることから、ヒトや多くの動物で使用するには不適なものとなっている。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（総称して通常は、アルム（Ａｌｕｍ）と称される）のみがヒトワクチンおよび動物ワクチンにおけるアジュバントとして常用される。ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドに対する抗体応答上昇におけるアルム（Ａｌｕｍ）の効力は明らかになっており、より最近では、ＨＢｓＡｇワクチンにアルム（Ａｌｕｍ）がアジュバントとして使用されている。アルム（Ａｌｕｍ）の有用性は一部の利用分野で明らかになっているが、それには制限がある。例えば、アルム（Ａｌｕｍ）はインフルエンザ予防接種には無効であり、必ずしも細胞介在性免疫応答を誘発するとは限らない。アルム（Ａｌｕｍ）をアジュバントとする抗原によって誘発される抗体は、マウスにおいては主としてＩｇＧ1アイソタイプであり、一部のワクチン剤による保護には最適ではない可能性がある。
【００５９】
広範囲の外因性アジュバントが抗原に対して強力な免疫応答を起こし得る。それには、膜蛋白抗原と複合体化したサポニン（免疫刺激錯体）、鉱油とのプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油中の死ミコバクテリウム、完全フロイントアジュバント、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）などの細菌産生物、ならびにリピドＡおよびリポソームなどがある。
【００６０】
体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞介在性免疫（ＣＭＩ）を効果的に誘発するためには、多くの場合、免疫原をアジュバント中で乳化させる。多くのアジュバントが有毒であり、症状としては、肉芽腫、急性および慢性の炎症（完全フロイントアジュバント、ＦＣＡ）、細胞崩壊（サポニンおよびプルロニックポリマー）および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）などがある。ＦＣＡは優れたアジュバントであり、研究で広範囲に使用されているが、その毒性のために、ヒトワクチンや動物ワクチンでの使用には許可されていない。
理想的なアジュバントの望ましい特性には次のものがある。
【００６１】
（１）毒性がないこと
（２）長期間の免疫応答を刺激する能力
（３）製造が簡単で、長期保存において安定であること
（４）各種経路で投与される抗原に対してＣＭＩとＨＩＲの両方を誘発できること
（５）他のアジュバントとの相乗作用
（６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）の群との選択的相互作用を行う能力
（７）適切なＴN２またはＴN１細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力
（８）抗原に対して適切な抗体アイソタイプ濃度（例：ＩｇＡ）を選択的に上昇させる能力
ロックホッフ（Ｌｏｃｋｈｏｆｆ）らに対して１９８９年８月８日に与えられた米国特許４８５５２８３号（引用によって本明細書に含まれる）には、Ｎ−グリシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカーバメート（これらはそれぞれ、免疫調節剤またはアジュバントとしてのアミノ酸によって糖残基が置換されている）などの糖脂質類縁体が開示されている。そこで、ロックホッフらは（米国特許４８５５２８３号および参考文献６０）、糖スフィンゴ脂質およびグリセロ糖脂質などの天然糖脂質と構造的に類似しているＮ−糖脂質類縁体が、単純疱疹ウィルスワクチンおよび偽性狂犬病ウィルスワクチンの両方において強力な免疫応答を誘発できることを報告している。糖脂質の中には、アノマー炭素原子を介して糖と直接結合する長鎖のアルキルアミンおよび脂肪酸から合成されて、天然脂質残基の機能を模倣するものもある。
【００６２】
モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）に対して与えられ、本願の譲受人に対して譲渡され、引用によって本明細書に含まれる米国特許４２５８０２９号には、オクタデシルチロシン・塩酸塩（ＯＴＨ）が、破傷風菌トキソイドならびにホリマリンで不活化したＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型小児麻痺ウィルスワクチンと複合体化した場合に、アジュバントとして機能することが開示されている。さらに、ニクソン−ジョージら（Ｎｉｘｏｎ−Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ、参考文献６１）は、組換えＢ型肝炎表面抗原と複合体化した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルがＢ型肝炎ウィルスに対する宿主の免疫応答を促進したと報告している。
【実施例】
【００６３】
実施例
上記の開示内容は、本発明の全般を説明するものであるので、以下の具体的な実施例を参照することで、より完全な理解を得ることができる。これら実施例は単に説明を目的として記載されているものであって、本発明の範囲を限定するものではない。状況から見て示唆されるかあるいは好都合なものとなる可能性がある場合、等価なものの形態および置換に対して変更を加えることは想到されるものである。本明細書においては具体的な用語を用いているが、そのような用語は説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００６４】
本開示およびこれらの実施例において使用されているが明瞭には説明されていない蛋白生化学、発酵および免疫学の方法は、科学文献に広く報告されているものであり、十分に当業者の能力の範囲内のものである。
実施例１
本実施例は、Ｂｏｒｅｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの成長について説明するものである。
【００６５】
原シード
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ菌株の原シード培養物を、凍結乾燥シードロットとして、２℃〜８℃で保存した。
【００６６】
作業シード
凍結乾燥培養物をホルニブロック（Ｈｏｒｎｉｂｒｏｏｋ）培地に回収し、それを用いてボルデー−ジャングー寒天（ＢＧＡ）平板に接種した。ホルニブロック培地は以下の組成である。
【００６７】
成分 １リットル当たり量
カゼイン加水分解物（活性炭処理）  １０．０ｇ
ニコチン酸  ０．００１ｇ
塩化カルシウム  ０．００２ｇ
塩化ナトリウム  ５．０ｇ
塩化マグネシウム・６水和物  ０．０２５ｇ
塩化カリウム  ０．２００ｇ
リン酸２カリウム  ０．２５０ｇ
デンプン  １．０ｇ
蒸留水  １．０リットルまで
１％炭酸ナトリウム溶液でｐＨを６．９±０．１に調節する。
【００６８】
培地を試験管中に分散させ、オートクレーブ中で２０分間水蒸気処理し、１２１℃〜１２４℃で２０分間オートクレーブ処理することで滅菌する。シードを、最初にＢＧＡ平板で、次に成分百日咳寒天（ＣＰＡ）で２回継代培養した。成分百日咳寒天（ＣＰＡ）は以下の組成を有する。
【００６９】
ＮａＣｌ  ２．５  ｇ／Ｌ
ＫＨ2ＰＯ4  ０．５  ｇ／Ｌ
ＫＣｌ  ０．２  ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ2（Ｈ2Ｏ）６  ０．１  ｇ／Ｌ
トリス塩基  １．５ｇ  ／Ｌ
カザミノ酸  １０．０  ｇ／Ｌ
ＮａＨグルタミン酸  １０．０  ｇ／Ｌ
濃ＨＣｌ  ｐＨ  ７．２まで
寒天  １５．０  ｇ／Ｌ
成長因子（ＣＰＧＦ）  １０．０  ｍＬ／Ｌ
成分百日咳成長因子（ＣＰＧＦ）−１００Ｘは以下の組成を有する。
【００７０】
Ｌ−システイン・ＨＣｌ  ４．０  ｇ／Ｌ
ナイアシン  ０．４  ｇ／Ｌ
アスコルビン酸  ４０．０  ｇ／Ｌ
還元グルタチオン  １５．０  ｇ／Ｌ
Ｆｅ2ＳＯ4（Ｈ2Ｏ）７  １．０  ｇ／Ｌ
ジメチル−β−シクロデキストリン  １００  ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2（Ｈ2Ｏ）２  ２．０  ｇ／Ｌ
最終培養物を百日咳シード懸濁緩衝液（ＣＰＳＢ）に懸濁し、２〜４ｍＬに小分けし、−６０℃〜−８５℃で冷凍保存した。百日咳シード懸濁緩衝液（ＰＳＳＢ）は以下の組成を有する。
【００７１】
カザミノ酸  １０．０  ｇ／Ｌ
トリス塩基  １．５ｇ  ／Ｌ
無水グリセリン  １００  ｍＬ／Ｌ
濃ＨＣｌ  ｐＨ  ７．２まで
これらのグリセリン懸濁液を、作業シード取得の原料として用いた。
培養方法
作業シードの増殖を、成分百日咳寒天ルー瓶中、３４℃〜３８℃で４〜７日間行った。その培養後、細胞を、成分百日咳培地（ＣＰＢ）によって寒天から洗い出した。サンプルについて、グラム染色により、培養物の純度および不透明度を観察した。
【００７２】
ＣＰＢを含む４リットル三角フラスコに細胞を移し、振盪しながら、３４℃〜３８℃で２０〜２６時間インキュベーションした。サンプルをグラム染色で観察し、培養物の純度を調べた。フラスコの内容物を合わせ、その懸濁液を用いて、ＣＰＢを含む２個の発酵槽に接種した（容量１０リットルで、初期ＯＤ600は０．１〜０．４）。シードは成長して、最終ＯＤ600は５．０〜１０．０となった。サンプルについて、グラム染色によって培地の純度と、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって無菌性を調べた。
実施例２
この実施例では、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞培養物からの抗原の精製について説明する。
【００７３】
培養および細胞濃縮物の製造
細菌懸濁液を、２個の生産発酵槽で、３４℃〜３７℃で３５〜５０時間成長させた。発酵槽のサンプリングを行って、培地滅菌性試験を行った。この懸濁液を連続流円板積層型遠心機（１２０００×ｇ）に送って、培地から細胞を分離した。細胞を回収して、線毛成分の抽出用に待機した。透明液体を≦０．２２μｍ膜フィルターに通した。濾過した液体を、１０〜３０ｋＤａを公称分子量限界（ＮＭＷＬ）とする膜を用いる限外濾過によって濃縮した。濃縮液を保存して、百日咳菌毒素（ＰＴ）、線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）および６９ｋＤａ（ペルタクチン）成分の分離・精製用に待機した。
【００７４】
培地成分の分離
上述の欧州特許３３６７３６号および出願人の公開ＰＣＴ出願ＷＯ  ９１／１５５０５号に記載の方法にほぼ従って、培地成分（６９ｋＤａ，ＰＴおよびＦＨＡ）を、パーライトクロマトグラフィーおよび選択的溶離の工程によって分離・精製した。行った具体的精製操作について以下に説明する。
【００７５】
百日咳菌毒素（ＰＴ）
パーライトカラムを、５０ｍＭ  トリス緩衝液、５０ｍＭ  トリス／０．５％  トリトンＸ−１００緩衝液および５０ｍＭ  トリス緩衝液で洗浄した。５０ｍＭ  トリス／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液を用いて、パーライトカラムからＰＴの分画を溶離させた。
【００７６】
パーライトクロマトグラフィーからのＰＴ分画をヒドロキシルアパタイトカラムに負荷し、３０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴを７５ｍＭ  リン酸カリウム／２２５ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で溶離した。カラムを２００ｍＭ  リン酸カリウム／０．６Ｍ  ＮａＣｌで洗浄して、ＦＨＡ分画を得て、それを廃棄した。精製ＰＴにグリセリンを５０％まで加え、混合物を２℃〜８℃で保存し、１週間以内に無毒化を行った。
【００７７】
線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
ＦＨＡ分画を５０ｍＭ  トリス／０．６Ｍ  ＮａＣｌでパーライトカラムから溶離した。線維状ヘマグルチニンをヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィーによって精製した。パーライトカラムからのＦＨＡ分画をヒドロキシルアパタイトカラムに負荷し、０．５％  トリトンＸ−１００を含む３０ｍＭ  リン酸カリウムと次に３０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴ分画を８５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液で溶離し、廃棄した。次に、２００ｍＭ  リン酸カリウム／０．６Ｍ  ＮａＣｌによってＦＨＡ分画を溶離し、２℃〜８℃で保存し、１週間以内に無毒化した。
【００７８】
６９ｋＤａ（ペルタクチン）
培地濃縮液を注射用水（ＷＦＩ）で希釈して、導電率を３〜４ｍＳ／ｃｍとし、パーライトカラムに、パーライト１ｍＬ当たり蛋白０．５〜３．５ｍｇの負荷量で負荷した。溶出液（６９ｋＤａ成分分画）を、１０〜３９ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜を用いる限外濾過によって濃縮した。濃縮溶出液に硫酸アンモニウムを３５±３％（重量／容量）まで加え、得られた混合物を２℃〜８℃で４±２日間保存するか、直ちに遠心した（７０００×ｇ）。過剰の上清を傾斜法にて除去し、沈澱物を遠心（７０００×ｇ）によって回収した。得られた６９ｋＤａペレットを−２０℃〜−３０℃で冷凍保存するか、あるいはトリスもしくはリン酸緩衝液に溶かして、直ちに使用した。
【００７９】
濃縮パーライト溶出液の３５％（重量／容量）硫酸アンモニウムによる沈澱形成によって得られた６９ｋＤａ外膜蛋白を用いて精製を行った。硫酸アンモニウム（１リットル当たり１００±５ｇ）を６９ｋＤａ分画に加え、混合物を２℃〜８℃で２時間以上撹拌した。混合物を遠心して（７０００×ｇ）、上清を回収した。上清に硫酸アンモニウム（１リットル当たり１００〜１５０ｇ）を加え、混合物を２℃〜８℃で２時間以上撹拌した。混合物を遠心して（７０００×ｇ）、ペレットを回収し、それを１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）に溶かした。溶液のイオン強度を、１５ｍＭ  硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）と同等に調節した。
【００８０】
６９ｋＤａ蛋白を、Ｑ−セファロースカラムと直列に連結したヒドロキシルアパタイトカラムに負荷した。６９ｋＤａ蛋白を溶出液に回収し、１５ｍＭ  硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）でカラムから洗い出し、溶出液中の６９ｋＤａと一緒に蓄積した。６９ｋＤａ蛋白蓄積液を、１００〜３００ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜で、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む６〜１０倍容量の１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８）でダイアフィルトレーションした。限外濾過液を回収し、限外濾過液中の６９ｋＤａ蛋白を濃縮した。
【００８１】
６９ｋＤａ蛋白について、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）による溶媒交換を行い、Ｑ−セファロースに吸着させ、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭ  硫酸アンモニウムで洗浄した。６９ｋＤａ蛋白を、５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８）で溶離した。６９ｋＤａ蛋白を、１０〜３０ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜で、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む６〜１０倍容量の１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８）でダイアフィルトレーションした。６９ｋＤａ蛋白を、≦０．２２μｍフィルターで無菌濾過した。この無菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸着を行った。
【００８２】
線毛性凝集原
培地からの分離後の細胞ペーストから、凝集原を精製した。細胞ペーストを、１０ｍＭ  リン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素を含む緩衝液中で細胞が０．０５容量部となるまで希釈し、３０分間混和した。細胞溶解物を遠心（１２０００×ｇ）によって透明とし、１００〜３００ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜フィルターを用い、１０ｍＭ  リン酸カリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  トリトンＸ−１００に対して濃縮・ダイアフィルトレーションを行った。
【００８３】
濃縮液を８０℃で３０分間加熱処理し、遠心（９０００×ｇ）によって再度透明とした。透明上清に、最終濃度が４．５％±０．２％となるようにＰＥＧ８０００を加え、３０分間以上ゆっくり撹拌した。得られた沈澱を遠心（１７０００×ｇ）によって回収し、ペレットを１０ｍＭ  リン酸カリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で抽出して、粗線毛性凝集原溶液を得た。線毛性凝集原をＰＥＩシリカに通して精製した。粗溶液を、１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液を用いてリン酸カリウムに関して１００ｍＭとし、ＰＥＩシリカカラムに通した。
【００８４】
カラムからの溶出液を、１００〜３００ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜フィルターを用い１０ｍＭ  リン酸カリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液に対して濃縮・ダイアフィルトレーションした。この無菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸着を行った。線毛性凝集原製剤は、線毛性Ａｇｇ２および線毛性Ａｇｇ３を重量比約１．５〜約２：１で含有し、実質的にＡｇｇ１を含まないことが認められた。
【００８５】
実施例３
本実施例は、精製Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、ＰＴおよびＦＨＡのトキソイド化について説明するものである。
【００８６】
実施例２に記載の方法に従って純粋な形で得られたＰＴについて、ＰＴ溶液中のグルタルアルデヒド濃度を０．５％±０．１％に調節し、３７℃±３℃で４時間撹拌することでトキソイド化した。Ｌ−アスパラギン酸塩を０．２１±０．０２Ｍまで加えることで、反応を停止した。混合物をさらに１±０．１時間にわたり室温に維持し、次に２℃〜８℃に１〜７日保持した。
【００８７】
得られた混合物を、３０ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜フィルターで、１０ｍＭ  リン酸カリウム／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／５％  グリセリン緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、次に≦０．２２μｍ膜フィルターに通すことで滅菌した。この滅菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸着を実施した。
【００８８】
実施例２に記載の方法に従って純粋な形で得られたＦＨＡ分画については、Ｌ−リシンとホルムアルデヒド濃度をそれぞれ４７±５ｍＭおよび０．２４±０．０５％に調節し、３５℃〜３８℃で６週間インキュベーションすることでトキソイド化した。次に、混合物を、３０ｋＤａ  ＮＭＷＬ膜フィルターで、１０ｍＭ  リン酸カリウム／０．５Ｍ  ＮａＣｌに対してダイアフィルトレーションし、次に膜フィルターに通すことで滅菌した。この滅菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸着を実施した。
実施例４
本実施例は精製Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原の吸着について説明するものである。
【００８９】
ＰＴ、ＦＨＡ、Ａｇｇおよび６９ｋＤａのそれぞれのリン酸アルミニウム（アルム（Ａｌｕｍ））への吸着用に、リン酸アルミニウムのストック液の濃度を１８．７５±１ｍｇ／ｍＬとした。好適な容器を準備し、いずれかの抗原を無菌的に容器中に懸濁させた。２−フェノキシエタノールを無菌的に加えて、最終濃度０．６％±０．１％（容量基準）とし、均一になるまで撹拌した。適切な量のリン酸アルミニウムを容器に無菌的に加えた。適切な容量の無菌蒸留水を加えて、リン酸アルミニウムの最終濃度を３ｍｇ／ｍＬとした。容器を密閉し、ラベルを施し、室温で４日間撹拌した。それから容器を保管して、最終製剤用に待機した。
【００９０】
実施例５
本実施例は、ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの製剤について説明するものである。
【００９１】
これ以前の実施例に記載の方法に従って得たＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原を、ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドとともに製剤して、いくつかの成分百日咳（ＣＰ）ワクチンを得た。
【００９２】
百日咳菌成分は、上記の実施例１〜４に詳細に記載した方法に従って液体培地中で成長させたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓから得た。成長終了後、培養培地と細菌細胞を遠心によって分離した。各抗原をそれぞれ精製した。百日咳菌毒素（ＰＴ）および線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）を、パーライトおよびヒドロキシルアパタイトでの連続クロマトグラフィーによって培地から精製した。ＰＴは、グルタルアルデヒドによって無毒化し、ＦＨＡ分画中に存在する残留ＰＴ（約１％）はホルムアルデヒドによって無毒化した。線毛性凝集原（２＋３）（ＡＧＧ）は、細菌細胞から得た。細胞を尿素で破壊して加熱処理し、線毛性凝集原をポリエチレングリコールによる沈澱形成およびポリエチレンイミンシリカでのクロマトグラフィーによって精製した。６９ｋＤａ蛋白（ペルタクチン）成分を、パーライトクロマトグラフィー工程（実施例２）からの溶出液から硫酸アンモニウム沈澱形成によって単離し、ヒドロキシルアパタイトおよびＱ−セファロースでの連続クロマトグラフィーによって精製した。全ての成分を、０．２２μｍ膜フィルターによる濾過によって滅菌した。
ジフテリア菌トキソイドは、標準法によって液体培地中で成長させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから得た。ジフテリア菌トキソイドの製造は５工程に分けることができる。すなわち、作業用シードの維持、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの成長、ジフテリア菌毒素の回収、ジフテリア菌毒素の無毒化およびジフテリア菌トキソイドの濃縮である。
【００９３】
ジフテリア菌トキソイドの製造
（Ｉ）作業用シード
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを凍結乾燥シードロットとして維持した。再生シードを３５℃±２℃で１８〜２４時間にわたり、レフラースロープ（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｓｌｏｐｅ）で成長させ、ジフテリア培地のフラスコに移した。次に、培地について純度とＬｆ含有量を調べた。残りのシードを用いて、発酵槽に接種した。
【００９４】
（II）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの成長
培地を、発酵槽中で３５℃±２℃でインキュベーション・撹拌した。培地に、所定量の硫酸第一鉄、塩化カルシウムおよびリン酸溶液を加えた。各溶液（リン酸塩、硫酸第一鉄、塩化カルシウム）の実際の量は、各培地ロットについて実験的に求めた。選択した濃度は、Ｌｆ含有量が最大となったものである。成長周期（３０〜５０時間）終了後、培地についてサンプリングを行って、純度およびＬｆ含有量を調べた。
【００９５】
重炭酸ナトリウムによってｐＨを調節し、温度を３５℃±２℃に維持しながら０．４％トルエンで１時間処理することで培地を不活化した。次に、無菌性試験を行って、生存Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅが存在しないことを確認した。
【００９６】
（III）ジフテリア菌毒素の回収
１個または数個の発酵槽からのトルエン処理した培養物を大きい槽に蓄積した。
【００９７】
約０．１２％重炭酸ナトリウム、０．２５％活性炭および２３％硫酸アンモニウムを加え、ｐＨを調べた。
【００９８】
混合物を約３０分間撹拌した。珪藻土を加え、混合物をデプスフィルターにポンプで送った。濾液を透明になるまで循環させ、回収し、サンプリングによってＬｆ含有量を調べた。追加の硫酸アンモニウムを濾液に加えて、濃度を４０％とした。さらに珪藻土も加えた。この混合物を２℃〜８℃で３〜４日間維持して、沈澱を形成させた。沈澱した毒素を回収し、０．９％生理食塩水に溶かした。珪藻土を濾過によって除去し、毒素を０．９％生理食塩水に対して透析して、硫酸アルミニウムを除去した。透析した毒素を蓄積し、サンプリングを行ってＬｆ含有量および純度を調べた。
【００９９】
（IV）ジフテリア菌毒素の無毒化
無毒化は透析直後に行う。無毒化を行うには、毒素を希釈して、最終溶液に以下のものが含有されるようにする。
【０１００】
ａ）ジフテリア菌毒素  １０００±１０％Ｌｆ／ｍＬ
ｂ）０．５％  重炭酸ナトリウム
ｃ）０．５％  ホルマリン
ｄ）０．９％（重量／容量）  Ｌ−リシン・モノ塩酸塩
この溶液を生理食塩水で規定量とし、ｐＨを７．６±０．１に調節した。
【０１０１】
セルロース珪藻土フィルターパッドおよび／または膜前置フィルターおよび０．２μｍ膜フィルターでトキソイドを濾過して回収容器に取り、３４℃で５〜７週間インキュベーションした。サンプリングを行って、毒性を調べた。
【０１０２】
（Ｖ）精製トキソイドの濃縮
トキソイドを蓄積し、限外濾過によって濃縮し、好適な容器に回収した。サンプリングを行って、Ｌｆ含有量および純度を調べた。保存剤（２−フェノキシエタノール）を加えて、最終濃度０．３７５％とし、ｐＨを６．６〜７．６に調節した。
【０１０３】
トキソイドを前置フィルターおよび０．２μｍ膜フィルター（または相当品）によって濾過することで滅菌し、回収した。無菌トキソイドをサンプリングして、トキソイドＬｆ含有量、保存剤含有量、純度（窒素含有量）、無菌性および毒性の不可逆性を調べた。無菌濃縮トキソイドを２℃〜８℃で保存して、最終製剤に備えた。
破傷風菌トキソイドの製造
破傷風菌トキソイド（Ｔ）は、液体培地中で成長させたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉから得た。
【０１０４】
破傷風菌トキソイドの製造は、５工程に分けることができる。すなわち、作業用シードの維持、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉの成長、破傷風菌毒素の回収、破傷風菌毒素の無毒化および破傷風菌トキソイドの精製である。
【０１０５】
（Ｉ）作業用シード
破傷風菌トキソイドへの変換向けの破傷風菌毒素の生産に使用したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉの菌株を、シードロットで凍結乾燥品として維持した。シードをチオグリコレート培地に接種し、３５℃±２℃で２４時間成長させた。サンプリングを行って、培地の純度を調べた。
【０１０６】
（II）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉの成長
破傷風菌培地を発酵槽中に分散させ、熱処理し、冷却した。次に、発酵槽に接種を行い、培地を３４℃±２℃で４〜９日間成長させた。サンプリングを行って、培地の純度およびＬｆ含有量を調べた。
【０１０７】
（III）破傷風菌毒素の回収
セルロース珪藻土パッドによる濾過によって、毒素を分離し、透明毒素を膜フィルターを用いて濾過滅菌した。サンプリングを行って、Ｌｆ含有量と滅菌性を調べた。毒素を、３００００ダルトンの孔径を用いて限外濾過で濃縮した。
【０１０８】
（IV）破傷風菌毒素の無毒化
毒素をサンプリングして、Ｌｆ含有量を調べてから無毒化を行った。０．５％（重量／容量）重炭酸ナトリウム、０．３％（容量基準）ホルマリンおよび０．９％（重量／容量）Ｌ−リシン・モノ塩酸塩を加えて、濃縮毒素（４７５〜５２５Ｌｆ／ｍＬ）を無毒化し、生理食塩水で規定量とした。ｐＨを７．５±０．１に調節し、混合物を３７℃で２０〜３０日間インキュベーションした。サンプリングを行って、無菌性と毒性を調べた。
【０１０９】
（Ｖ）トキソイドの精製
濃縮トキソイドを、前フィルターと次に０．２μｍ膜フィルターによって滅菌した。サンプリングを行って、無菌性およびＬｆ含有量を調べた。
【０１１０】
硫酸アンモニウムの至適濃度は、トキソイドサンプルから求めた分別「Ｓ」字曲線に基づいたものである。第１の濃縮液をトキソイドに加えた（１９００〜２１００Ｌｆ／ｍＬまで希釈）。混合物を２０℃〜２５℃で１時間以上維持し、上清を回収し、高分子量分画を含む沈澱物は廃棄した。
【０１１１】
硫酸アンモニウムの第２の濃縮液を第２の分別用の上清に加えて、低分子量不純物を除去した。混合物を２０〜２５℃に２時間以上維持し、その後、最長で３日間、２℃〜８℃で保管することができた。純粋トキソイドである沈澱物を遠心および濾過によって回収した。
【０１１２】
ＰＢＳによるアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（または相当品）限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションを行ってトキソイド溶液で硫酸アンモニウムが検出できなくなるようにすることで、精製トキソイドから硫酸アンモニウムを除去した。ｐＨを６．６〜７．６に調節し、２−フェノキシエタノールを加えて、最終濃度０．３７５％とした。トキソイドを膜濾過によって滅菌し、サンプリングを行って試験を行った（トキソイド、Ｌｆ含有量、ｐＨ、保存剤含有量、純度、無菌性および毒性の不可逆性）。
【０１１３】
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの一つの製剤を、ＣＰ10/5/5/3ＤＴと称した。ＣＰ10/5/5/3ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【０１１４】
１０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの別の製剤を、ＣＰ10/5/5ＤＴと称した。ＣＰ10/5/5ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【０１１５】
１０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのさらに別の製剤を、ＣＰ20/20/5/3ＤＴと称した。ＣＰ20/20/5/3ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【０１１６】
２０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
２０μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのさらに別の製剤を、ＣＰ20/10/10/6ＤＴと称した。ＣＰ20/10/10/6ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
【０１１７】
２０μｇ  百日咳菌トキソイド（ＰＴ）
１０μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
１０μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
６μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白（６９ｋＤＡ）
１５Ｌｆ  ジフテリア菌トキソイド
５Ｌｆ  破傷風菌トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
実施例６
本実施例は、本発明によって製造される成分非細胞性百日咳ワクチンの臨床評価について説明するものである。
【０１１８】
（ａ）成人での試験
成人および１６〜２０ケ月齢の小児における試験から、線毛性凝集原を含む多成分ワクチンが安全かつ免疫原性であることが示された（表２）。
【０１１９】
Ｉ相治験を、５成分百日咳ワクチン（ＣＰ10/5/5/3ＤＴ）を用いてアルバータ州カルガリーで１７〜１８月齢の小児で行ったところ、副作用が報告された。３３名の小児にワクチンを投与し、さらに別の３５名に６９ｋＤａ蛋白成分を含まない同じワクチンを投与した。
【０１２０】
局所反応は希であった。主として過敏性である全身性の副作用が治験参加者の約半数において認められ、それはどのワクチンを投与したかとは無関係であった。酵素イムノアッセイによる抗ＰＴ、抗ＦＨＡ、抗線毛性凝集原および抗６９ｋＤａ  ＩｇＧ抗体ならびにＣＨＯ細胞中和試験での抗ＰＴ抗体において有意な抗体上昇が測定された。抗６９ｋＤａ抗体の場合を除き、４成分（ＣＰ10/5/5ＤＴ）または５成分（ＣＰ10/5/5/3ＤＴ）を投与された小児において、抗体応答における差は検出されなかった。６９ｋＤａ蛋白を含む５成分ワクチンの投与を受けた小児は、有意に高い免疫感作後抗６９ｋＤａ抗体レベルを有していた。
【０１２１】
用量−応答試験がカナダのマニトバ州ウィニペグで４成分ワクチンを用いて行なわれた。２種類のワクチン製剤、すなわちＣＰ10/5/5/3ＤＴおよびＣＰ20/10/10/6ＤＴを用いた。全細胞ＤＰＴワクチンも対照として含めた。
【０１２２】
この治験は、追加免疫百日咳投与の時点で１７〜１８ケ月齢の幼児９１名における二重盲検試験であった。これらの小児は、ＣＰ10/5/5/3ＤＴおよびＣＰ20/10/10/6ＤＴのいずれも良好に耐容した。いずれの成分ワクチン投与後においても、局所反応や全身反応を起こした小児の数に差は示されなかった。それとは対照的に、全細胞ワクチン投与を受けた小児では、ＣＰ20/10/10/6ＤＴ成分ワクチン投与を受けた小児より局所および全身の反応を起こした小児数に有意な増加があった。
【０１２３】
幼児での治験
ＩＩ相
カナダのアルバータ州カルガリーおよびブリティッシュコロンビアで、ＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチンを用いた治験が行われた。この治験では、幼児４３２名に成分百日咳ワクチンまたは全細胞対照ワクチンＤＰＴを２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢で投与した。これらの小児は、ＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチンを良好に耐容した。局所反応は、各投与後において、全細胞ワクチンより成分ワクチンによる方が少なかった。
【０１２４】
成分百日咳ワクチンによる予防接種後に、全ての抗原に対する有意な抗体応答が示された。全細胞ワクチンの投与を受けた幼児は、線毛性凝集原ＤおよびＴに対して激しい抗体応答を示した。数ケ月後、成分ワクチン投与被験者の８２％〜８９％および全細胞ワクチン投与被験者の９２％で、線毛性凝集原に対する抗体力価に４倍以上の上昇があった。それとは対照的に、ＦＨＡに対する抗体応答は、成分ワクチン投与群で７５％〜７８％であったのに対して、全細胞投与群では３１％であった。成分ワクチン投与群の９０％〜９３％および全細胞投与群の７５％で、抗６９ｋＤａ抗体の４倍上昇が認められた。成分ワクチン投与群の４０％〜４９％および全細胞投与群の３２％で、酵素イムノアッセイによるＰＴに対する抗体に４倍上昇が認められた。成分ワクチン投与群の５５％〜６９％および全細胞投与群の６％で、ＣＨＯ中和によるＰＴ抗体に４倍上昇が認められた（表２）。
【０１２５】
ＩＩＢ相
２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢の幼児１００名において、ジフテリア含有量が１５Ｌｆと比較的低い製剤とそれに対して２５Ｌｆの製剤を用いて、Ｄ15ＰＴを対照とする無作為盲検試験で、ＣＰ20/10/10/6ＤＴワクチンおよびＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチンの評価を行った。２種類の成分製剤間で、副作用の率に差は検出されず、いずれも全細胞対照より反応原性が有意に低かった。抗原含有量が高いＣＰ20/20/5/3ＤＴワクチンの投与を受けた群では、酵素イムノアッセイおよびＣＨＯ中和によるＰＴとＦＨＡに対する抗体力価が相対的に高かった。７ケ月後には、抗ＦＨＡ幾何平均力価はＣＰ20/20/5/3ＤＴ投与群では９５．０、ＣＰ10/5/5/3ＤＴ投与群では４５．２であったのに対して、Ｄ15ＰＴ投与群では８．９に過ぎなかった。抗ＰＴ力価はそれぞれ、イムノアッセイによって１３３．３、５８．４および１０．４であり、ＣＨＯ中和によって８２．４、３２．７および４．０であった（表２）。
【０１２６】
本治験により、抗原含有量の高い、ジフテリア菌トキソイドおよび破傷風菌トキソイドを吸着によって併用した成分百日咳ワクチンが幼児において安全かつ免疫原性であり、抗原含有量が高いことで、反応原性の上昇を起こさずに、製造された抗原（ＰＴおよびＦＨＡ）に対する免疫応答が大きくなることが明らかになった。
【０１２７】
ＮＩＡＩＤのＩＩ相  米国比較試験
非細胞性百日咳ワクチンについての大規模効力試験の予備試験として、国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）による支援下に、米国でＩＩ相治験が行われた。ジフテリア菌トキソイドと破傷風菌トキソイドを吸着させて併用した本発明の一つの成分百日咳ワクチン（ＣＰ10/5/5/3ＤＴ）が、他の１２種類の非細胞性ワクチンおよび２種類の全細胞ワクチンとともにその治験に含まれていた。安全性の結果が、ＣＰ10/5/5/3ＤＴ成分ワクチンによって２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢で免疫感作された小児１３７名について報告されている。
【０１２８】
前述の治験からわかる通り、成分ワクチンは安全であり、低反応原性であり、しかもワクチンに対する耐容は良好であった。
【０１２９】
７ケ月後において、抗ＰＴ抗体、抗ＦＨＡ抗体、抗６９ｋＤａ抗体および抗線毛性凝集原抗体はいずれも、全細胞ワクチン投与後に得られたレベル以上であった（参考文献７１および表２）。小児を無作為にＣＰ20/20/5/3ＤＴまたはＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチン製剤のいずれかの投与に割り付けた二重盲検試験が行われた。計２０５０名の幼児を米国およびカナダで登録し、幼児１９６１名が治験を完了した。いずれのワクチンも、これらの幼児において安全で、低反応原性であり、免疫原性であった。免疫原性は、２９２名の小群で評価された。両方のワクチン製剤により、ワクチン中に含有される全ての抗原に対して抗体上昇が誘発された。ＣＰ20/20/5/3ＤＴ製剤の方がＦＨＡに対する抗体力価誘発が大きかったが、ＰＴについてはそうではなかった。ＣＰ10/5/5/3ＤＴ製剤は、線毛に対して相対的に高い力価および相対的に高い凝集原力価を誘発した。
【０１３０】
さらに別の安全性および免疫原性についての試験が、フランスで行われた。試験計画は、ワクチンの投与を２ケ月齢、３ケ月齢および４ケ月齢で行った以外、上記の北米での試験と同様であった。局所反応および全身反応は全般に軽度であった。全体的に、この投与方法を用いたフランスでの治験参加者では、ワクチンの許容度は良好であった。
【０１３１】
幼児１００００名での、２種類の非細胞性百日咳ワクチンおよび１種類の全細胞ワクチンについてのプラシーボ対照効力試験
ＮＩＡＩＤ  ＩＩ相米国比較試験の結果を受けて、２成分および５成分の非細胞性ワクチンが、多施設、対照、二重無作為化、プラシーボ対照効力試験向けに選択された。治験は、百日咳の発生率が高いスウェーデンで行なわれた。２成分ワクチンには、グリセロアルデヒドおよびホルマリン不活化ＰＴ（２５μｇ）、ホルマリン処理ＦＨＡ（２５μｇ）およびジフテリア菌トキソイド１７Ｌｆおよび破傷風菌トキソイド１０Ｌｆを含有させた。５成分百日咳ワクチンは、ＣＰ10/5/5/3ＤＴとした。治験に向けて、スウェーデンにおけるこの年齢群の幼児のほぼ１／２に相当する幼児１００００名を、出生登録を利用して、１４の地理的に決定された治験実施施設で募集した。
【０１３２】
１９９２年の１月および２月に生まれた小児を３薬剤（ａｒｍｅｄ）試験に無作為に割り付けた。親の同意を得た後、２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢で、幼児の２／３に対して、２種類のジフテリア−破傷風−非細胞性百日咳製剤のうちの１種類を投与した。対照群には、ＤＴのみを投与した。１９９２年５月に、米国で特許取得された市販の全細胞ＤＴＰワクチンが導入され、１９９２年の３月から１２月に生まれた小児を４薬剤試験に無作為に割り付けた。親の同意を得た後、２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢で、幼児の３／４に対して、３種類のＤＴＰ製剤のうちの１種類を投与した。対照群には、ＤＴのみを投与した。
【０１３３】
各ワクチンを約２５００名の小児に投与した。ワクチンは３回投与した。第１回投与は、２ケ月齢であって３ケ月齢未満の時点で行った。その後の投与は、８週間ずつの期間を設けて行った。ワクチンは筋肉注射にて投与した。
【０１３４】
小児および家族について、３０ケ月間の追跡調査を行った。百日咳が疑われる場合は、臨床データを収集し、鼻腔吸引液に対する細菌学的培養およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）診断を行うことで臨床検査的に確認した。急性期および回復期に採血を行って、血清学的診断を行った。
【０１３５】
この治験以前では、危険性のあるヒト群（特に、新生児）における本発明の成分百日咳ワクチンが提供するペルタクチンの程度は不明であった。特に、各種Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ成分および選択された相対量での百日咳ワクチン中での存在のワクチンの効力に対する寄与は不明であった。
【０１３６】
この治験の主目的は、非細胞性百日咳ワクチンと全細胞ワクチンがプラシーボと比較して代表的な百日咳に対する保護を与える能力を推算することにあった。
【０１３７】
第２のエンドポイントは、重度の異なる確定した百日咳感染に対するワクチンの効力を解明することにあった。
【０１３８】
ワクチンの効力は、非予防接種小児と比較した予防接種被験者における百日咳罹患確率のパーセント低下と定義される。
【０１３９】
２つのワクチン群における百日咳の相対的危険度は、その２群における疾患の確率の比で表現される。
【０１４０】
侵襲率とも称される百日咳罹患の確率は、各種方法によって推算することができる。標本数の計算においては、所定の試験群における百日咳罹患確率は、百日咳患者の小児と治験追跡調査終了後に試験群に残っていた小児との間の率によって計算される。
【０１４１】
代表的百日咳の予防における本治験での成分ワクチンＣＰ10/5/5/3ＤＴの効力を表４に示してあり、約８５％であった。同じ治験で、ＰＴおよびＦＨＡのみを含む２成分百日咳非細胞性ワクチンは約５８％の効力であり、全細胞ワクチンは約４８％の効力であった。ＣＰ10/5/5/3ＤＴはさらに、軽度の百日咳予防においても有効で、推定有効性は約７７％であった。
【０１４２】
【表１】
2010195829.tif 000003
【０１４３】
【表２】
2010195829.tif 000004
【０１４４】
【表３】
2010195829.tif 000005
【０１４５】
【表４】
2010195829.tif 000006
【０１４６】
Ａ：症例定義：２１日間痙攣咳き込み、及び培養で陽性
Ｂ：症例定義：温和な百日咳、少なくとも１日間の咳き込み
注：  １）信頼限界度
２）全細胞百日咳ワクチン
（参考文献）
【０１４７】
【表５】
2010195829.tif 000007
【０１４８】
【表６】
2010195829.tif 000008
【０１４９】
【表７】
2010195829.tif 000009
【０１５０】
【表８】
2010195829.tif 000010
【０１５１】
【表９】
2010195829.tif 000011
【０１５２】
【表１０】
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【０１５３】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【０１５４】
発明の要旨
本開示をまとめると、本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの線毛性凝集原の新規な製剤とその製造方法を提供するものである。線毛性凝集原は、他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原および非Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原とともに製剤して、多くの多成分百日咳ワクチンを得ることができる。そのようなワクチンは、ヒトにおいて安全、非反応原性、免疫原性であって、保護効果を持つ。
【０１５５】
本発明の技術的範囲内において、改良が可能である。
【図１】
2010195829.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月2日(2010.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に凝集原１を含まない、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株由来の線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）ならびに線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を含んでなる凝集原製剤の製造方法であって、
（ａ）ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株の菌体ペーストを調製する工程；
（ｂ）該菌体ペーストを緩衝液中に分散させ、前記線毛性凝集原２及び３を含む第１の上清ならびに第１の残渣沈澱物を形成する、菌体ペーストから線毛性凝集原２及び３を選択的に抽出する工程；
（ｃ）第１の残渣沈澱物から第１の上清を分離する工程；
（ｄ）第１の上清を所定の温度において、所定の時間インキュベーションして、線毛性凝集原２および３を含む純化された上清、ならびに非線毛性凝集原不純物を含む第２の沈澱物を形成し、次いで、第２の沈澱物から、該純化された上清を分離する工程；
（ｅ）純化された上清を濃縮し、純化された上清から線毛性凝集原２および３を沈澱させ、沈澱させた線毛性凝集原２および３を得られた上清から分離し、分離された線毛性凝集原２および３を可溶化することにより、粗線毛性凝集原溶液を調製する工程；ならびに
（ｆ）粗線毛性凝集原溶液から線毛性凝集原２および３を精製して、線毛性凝集原２および３を含んでなる凝集原製剤を調製する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
実質的に凝集原１を含まず、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株由来の線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）ならびに線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を、線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）の線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）に対する重量比が１．５：１〜２：１で、含んでなる凝集原製剤の製造方法であって、
（ａ）細胞膜表面上に凝集原１、線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）ならびに線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を有する、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株の菌体ペーストを調製する工程；
（ｂ）該菌体ペーストを１Ｍ〜６Ｍの尿素を含有する緩衝液中に分散させ、前記線毛性凝集原２及び３を含む第１の上清ならびに第１の残渣沈澱物を形成する、菌体ペーストから線毛性凝集原２及び３を選択的に抽出する工程；
（ｃ）第１の残渣沈澱物から第１の上清を分離する工程；
（ｄ）第１の上清を７５℃〜８５℃の温度において、１０分間〜６０分間の時間インキュベーションして、線毛性凝集原２および３を含む純化された上清、ならびに非線毛性凝集原不純物を含む第２の沈澱物を形成し、次いで、第２の沈澱物から、該純化された上清を分離する工程；
（ｅ）純化された上清を濃縮し、この純化された上清にポリエチレングリコールを加えることで、純化された上清から線毛性凝集原２および３を沈澱させ、沈澱させた線毛性凝集原２および３を得られた上清から分離し、分離された線毛性凝集原２および３を可溶化することにより、粗線毛性凝集原溶液を調製する工程；ならびに
（ｆ）粗線毛性凝集原溶液から線毛性凝集原２および３を精製して、実質的に凝集原１を含まず、線毛性凝集原２および３を含んでなる凝集原製剤を調製する工程
を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記インキュベーション工程（ｄ）において、前記温度を８０℃とすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーション工程（ｄ）において、前記時間を３０分間とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーション工程（ｄ）に先立ち、第１の上清を濃縮することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｅ）における、前記沈澱形成は、純化された上清に分子量８０００のポリエチレングリコールを３重量％〜５重量％の濃度まで加え、純化された上清から前記線毛性凝集原２および３の沈澱を起こさせることでなされる
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリエチレングリコールの濃度が、４．３重量％〜４．７重量％である
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記精製工程（ｆ）において、線毛性凝集原２および３は、カラムクロマトグラフィーにより粗線毛性凝集原溶液から精製される
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記カラムクロマトグラフィーは、セファデックス６Ｂカラム・クロマトグラフィーおよび／またはＰＥＩシリカカラム・クロマトグラフィーを含む
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記精製工程（ｆ）は、無菌の線毛性凝集原製剤を調製するため、前記カラムクロマトグラフィー精製の溶出液の滅菌を含む
ことを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記無菌線毛性凝集原製剤は、無機塩アジュバント上に吸着されている
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記無機塩アジュバントが水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム（通常、アルム（Ａｌｕｍ）と総称される）である
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株が、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株である
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属によって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿主を保護するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるワクチンとして製剤された、免疫原性組成物であって、
実質的に凝集原１を含まず、線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）ならびに線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を含有するボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株由来の線毛性凝集原製剤と、1以上の他のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属抗原を含む
ことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記1以上の他のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属抗原は、
線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、外膜蛋白ならびに百日咳菌毒素もしくはそのトキソイドからなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
２：１：１の重量比で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの百日咳菌トキソイド、線維状へマグルチニンおよび前記線毛性凝集原製剤を含有する
ことを特徴とする請求項１４または１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記重量比が、ヒト１回用量中に、百日咳菌トキソイド１０μｇ、線維状ヘマグルチニン５μｇおよび前記線毛性凝集原製剤５μｇを含有させることで得られている
ことを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
１０：５：５：３の重量比で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白および前記線毛性凝集原製剤を含有する
ことを特徴とする請求項１４または１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記重量比が、ヒト１回用量中に、百日咳菌トキソイド１０μｇ、線維状ヘマグルチニン５μｇ、６９ｋＤａ外膜蛋白３μｇおよび前記線毛性凝集原製剤５μｇを含有させることで得られている
ことを特徴とする請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
２０：２０：５：３の重量比で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの百日咳菌トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白および前記線毛性凝集原製剤を含有する
ことを特徴とする請求項１４または１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記重量比が、ヒト１回用量中に、百日咳菌トキソイド２０μｇ、線維状ヘマグルチニン２０μｇ、６９ｋＤａ外膜蛋白３μｇおよび前記線毛性凝集原製剤５μｇを含有させることで得られている
ことを特徴とする請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
ジフテリア菌トキソイド、破傷風菌トキソイド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの莢膜多糖類、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および風疹からなる群から選択される、１以上の非ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属免疫原をさらに含有する
ことを特徴とする請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
ヒト１回用量中に、ジフテリア菌トキソイドを１５Ｌｆと破傷風菌トキソイドを５Ｌｆの量でさらに含有する
ことを特徴とする請求項１９または２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
さらにアジュバントを含む
ことを特徴とする請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルおよびリポ蛋白からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項２４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属によって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿主を保護するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるワクチンとして製剤された、免疫原性組成物を調製するために、
実質的に凝集原１を含まず、線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）ならびに線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を含有するボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属菌株由来の線毛性凝集原製剤を、前記免疫原性組成物の成分として使用する方法。