(57)【要約】【課題】修飾カタラーゼポリペプチドを提供すること。【解決手段】上記修飾カタラーゼポリペプチドは、配列Ｘａａ−３−Ｘａａ−２−Ｘａａ−１を含むＰＴＳでの置換によって、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（配列番号１）の天然配列から修飾カルボキシル末端ペルオキシソーム標的シグナル（ＰＴＳ）を有し、ここで、独立して、Ｘａａ−３がＳｅｒ、Ａｌａ、またはＣｙｓであり；Ｘａａ−２がＬｙｓ，Ａｒｇ、またはＨｉｓであり；そしてＸａａ−１がＬｅｕまたはＭｅである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
生化学および医学分野の本発明は、ペルオキシソームへの移入増加のために設計された修飾カタラーゼタンパク質と、該修飾カタラーゼタンパク質とタンパク質の細胞送達および取り込みを高めるポリペプチドとの組み合わせとを目的とする。これらの組成物は、状態、例えば老化あるいはペルオキシソーム欠乏に関連した疾患または障害ならびに結果として生ずる過剰の過酸化水素および他の活性酵素種を処置するために、用いられる。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の説明）
ペルオキシソームは、真核細胞の必須の細胞下オルガネラである。これらの多機能性構造は、約２ダースのタンパク質（ペルオキシンと呼ばれている（ＴｅｒｌｅｃｋｙおよびＦｒａｎｓｅｎ，２０００））の慎重に組織化された反応を通して生ずる。。これらは、重要なプロセスである。すなわち、欠損は細胞に、ペルオキシソームの欠如またはそれらに起因して、オルガネラが、種々の生化学的機能および代謝機能を実行することができなくなることのいずれかをもたらす。しばしば、そのような欠点によって発病する（ＧｏｕｌｄおよびＶａｌｌｅ，２０００）。
【０００３】
どのようにしてペルオキシソームが生じて機能するかを理解することについて最近の主な進歩にかかわらず、オルガネラと細胞老化との関係についての乏しい情報だけが利用可能である。例えば、細胞の老化にともなってオルガネラがどのように機能するか、また、あるとしても、老化プロセスでのペルオキシソームがどのような役割を果たすかについては、不明である。
【０００４】
本発明者らは、それらのモデル系として、有限な複製寿命を持つ細胞であるヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）を使用した。これらの体細胞は、「ヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉｃｋ）番号」（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、１９６５）と呼ばれる限界に達するまで培養中に分裂（または倍加）する。この時点で、それらの細胞周期が停止すると、それらは「老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ）」と呼ばれる。この細胞老化のプロセスは、老いた生体全体でも起こる（Ｄｉｍｒｉら、１９９５）。細胞老化に関与する因子として、テロメア短縮、ＤＮＡ損傷および関連ゲノム不安定性、修飾遺伝子発現、ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）の集積（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９９で概説）が挙げられる。後者に関して、ミトコンドリアはＲＯＳの主な細胞性ジェネレーターとして、また皮肉にも遊離基攻撃の主な矛先として、広く考えられている（（Ｌｅｅら、Ｗｅｉ，２００１；Ｂｅｃｋｍａｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｓ，１９９８）。しかし、ミトコンドリアは、細胞ＲＯＳの唯一の源ではない。
【０００５】
もう一つのＲＯＳ源はペルオキシソームであり、それらの構成酵素の中でも、種々の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）発生オキダーゼを収容する。これらのオルガネラもまた、カタラーゼを含み、該カタラーゼはＨ２Ｏ２を水および酸素に分解して、このような有害な化合物の蓄積を防ぐ。このように、ペルオキシソームはＲＯＳの正味の生産がないことを確実にするために、これらの酵素の相対濃度または活性に関して微妙なバランスを保つ。どのようにしてオルガネラがこの平衡を保つかについては不明である。しかし、ペルオキシソーム酸化促進剤および抗酸化剤が強く連結していること、また正常な状態ではＲＯＳの正味の蓄積は起こらないことが知られている。また、細胞（および生体）が老化するにつれて、それらの調節機構に何が起こるかについては知られていない。
【０００６】
タンパク質は、受容体分子によって認識される特異的なペプチド配列（ペルオキシソームの標的シグナル（ＰＴＳ）と呼ばれている）によって、ペルオキシソームに対して向けられている。一部を除けば、ヒトペルオキシソームタンパク質は、カルボキシ末端配列であるＰＴＳ１を含む（非特許文献１）。ＰＴＳ１が同定され、それは、可溶性ペルオキシン（Ｐｅｘ５ｐ）によって、ペルオキシソームにシャトル化されている（非特許文献２）。大部分のペルオキシソーム酵素に関して、ＰＴＳ１は、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（＝ＳＫＬ）からなるトリペプチドまたは近縁の改変体である（非特許文献１）。対照的に、カタラーゼＰＴＳ１は、非標準的なＰＴＳ１であり、４アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（＝ＫＡＮＬ）（配列番号１）からなる（非特許文献３）。
【０００７】
本明細書に開示されるように、本発明によれば、これらの異なるＰＴＳ１は、Ｐｅｘ５ｐによる異なった認識（ＳＫＬは、ＫＡＮＬ（配列番号１）よりもかなり良好な基質である）を導き、また老化細胞において、著しく異なる移入効率をもたらす。本明細書中に開示されるように、老化線維芽細胞はペルオキシソームの酸化促進剤および抗酸化剤のこの脱結合の見かけの結果としてＲＯＳの量を増加させる。最後に、老化細胞でのペルオキシソームの現在の特徴づけは、これらのオルガネラの寸法および数の変化、ならびにそれらの表面からＰｅｘ５ｐを循環させて細胞質ゾルに戻ることを可能とする、それらの能力の変化を明らかにする。
【０００８】
Ｆ．Ｇ．Ｓｈｅｉｋｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２９６１−２９６６，１９９８）は、重篤な神経病理学を有する個人に由来し、カタラーゼを効率的に移入することはないヒト細胞を記載している。これらの細胞でのペルオキシソームカタラーゼを回復させる努力において、研究者は酵素の標的シグナルを変えた。しかし、タンパク質は、対応する遺伝子で一時的なトランスフェクションによって再導入された。この戦略は、細胞がカタラーゼを移入することができないことを修正したが、この文書はアプローチがなぜ作用したかの理由の詳細な分析を提供しなかった。さらに、細胞のトランスフェクションおよび安定な形質転換体のための付随的な（薬物）選択は、本発明の治療的なアプローチとは、明らかに互換性を持たない。本研究で使用されるオリゴヌクレオチドを検査することで、この研究で作られた遺伝子コンストラクトが、筆者がカタラーゼのＣ末端に付加しようと表面的には求めたＳＫＬトリペプチド末端とは異なり、Ｃ末端に配列ＫＡＮＬ−ＳＬＬ（配列番号２１）を持つカタラーゼタンパク質をコードすると判断することが可能である。さらに、この研究は単に１人の特定の患者の細胞系でカタラーゼを修復することだけに集中した。しかし、本発明者が発見して、初めてここで開示するもの、すなわち同様なカタラーゼの誤った標的化が老化ヒト細胞で生ずるということを開示しなかった。よって、もちろん、Ｓｈｅｉｋｈらの文献では、予防的に細胞を処理して老化プロセスを遅延させる考えも本明細書中に開示される配列でヒトカタラーゼの天然ＫＡＮＬ（配列番号１）  Ｃ末端の置換も提案しさえしなかった。
【０００９】
Ｌ．Ｈ．Ｊｉｎら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ３１  １５０９−１５１９，２００１では、カタラーゼが特化したペプチド配列である「タンパク質形質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）」（ＰＴＤ）を用いるヒト細胞に導入可能であることが開示されている。しかし、Ｊｉｎらの形質導入方法論は最高水準の技術ではなかった。ＰＴＤがカタラーゼのＮ末端に直接融合した組換え融合タンパク質が生成された。この融合タンパク質は発現され、変性条件下で精製された後、細胞に添加された。これらの条件を考慮して、細胞に入った変性カタラーゼを活性型に再折りたたみしなければならなかった。この酵素が細胞に入り、いくつかのＲＯＳを処理する証拠をその文献が提供しているが、その分子がペルオキシソーム（該分子の「正しい」細胞内アドレス）に送達されたことを示唆する証拠はなかった。実際、それとは反対に、酵素が細胞質ゾルに蓄積されることを示唆している知見が得られた。
【００１０】
Ｊｉｎらの研究では、カタラーゼ（またはカタラーゼ融合タンパク質）の一次構造に強力なペルオキシソーム標的シグナルの存在に関するいかなる説明もない。また、注目すべきことは、変性を必要とすることなく、おそらくより重要なこととして目的の分子とインフレーム融合を必要とすることなく、タンパク質の送達を可能とするタンパク質形質導入ドメインが他の研究によって、開発されている。本発明もまた、そのような分子を対象としている。
【００１１】
Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：１１７３−１１７６，２００１は、その天然状態で目的とするタンパク質を効果的に導入するタンパク質形質導入アプローチを記載した。「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は単にかつて細胞に入っていたそのリガンドから解離し、均衡状態の一部としてもはや現れない。本発明者は、この発明の特定の実施形態に基づいて、この技術を再改変カタラーゼ分子と結合すると考えた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Subramani、Physiol.Rev.(1998)78、171〜180
【非特許文献２】Dammai,V.およびSubramani,S.、Cell(2001)105、187〜196
【非特許文献３】Purdue,P.E.およびLazarow,P.B.  J.Cell Biol.(1996)134、849-862
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明者らは、新規の修飾カタラーゼ分子を設計した。この分子は、欠陥のあるペルオキシソームでのカタラーゼ機能を促進させる（例えば、回復させる）新規プロセスで使われる。組成物は、重要な抗酸化酵素であるカタラーゼの操作された誘導体を含む。本発明者は、ヒト細胞が老化するにつれて、ペルオキシソームで正しくカタラーゼを区画に分けるそれらの能力が損なわれるということを発見した。細胞が老化するにつれて、他の酵素、すなわちペルオキシソームカタラーゼもまた効率的には移入されないが、カタラーゼの現在の程度に影響を受けるようには見えない。このことは、２種類のタンパク質上でのＰＴＳの性質によると考えられている。ペルオキシソームオキシダーゼはＨ２Ｏ２と他のＲＯＳとを生産し続け、カタラーゼのレベルが減少することに起因して、それらの有害な代謝産物が蓄積する。ヒト細胞でのＲＯＳの増強は、老化プロセスに対して、また多数の疾患、特に神経変性症、パーキンソン症、アルツハイマー症、筋萎縮性側索硬化症等の変性性疾患に対する有意な一因であると思われる。
【００１４】
このように本発明は、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞で活性な形態のペルオキシソームを促進（例えば、修復）するための組成物および方法に関するもので、このオルガネラの内側でのＲＯＳの蓄積を減らし、それによって細胞内での蓄積も減らすことを目的とする。この減少は、そのような細胞の寿命を延ばすこと、および／またはいくつかの他の方法では、老化の影響を減少させること、同様に、長期にわたる酸化ストレスに続く変性変化を予防またはおそらく逆転させることが予測される。
【００１５】
ペルオキシソームタンパク質移入の分子機構の新しい理解に基づいて、大部分の状況下で能率的にオルガネラに酵素を導くことは、現在可能である。この改善されたターゲティング効率の１つの基礎はカタラーゼ分子の改変ＰＴＳの使用であり、それはペルオキシソームタンパク質移入受容体タンパク質（Ｐｅｘ５ｐ）とのより高い親和性相互作用を可能とする。下記の例は、天然カタラーゼよりも、より効率的に改変ＰＴＳを持つカタラーゼがこのＰｅｘ５ｐと相互作用することを示す。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、ペルオキシソームオキシタンパク質移入機構に対する高い親和性のリガンドを生ずるタンパク質生化学を用いて、カタラーゼ「タンパク質療法（タンパク質療法）」の技術を、ヒト細胞内に酵素を「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）」または送達する能力と組み合わせる。
【００１７】
本発明は、長期にわたって応じられなかった要求である生物学的欠損の置換に応える。本明細書に記載される研究は、ヒト細胞が老化にともなってカタラーゼを正しく区画分けする能力が落ちていることを明確に示している。同時に、これらの細胞で産生されるＲＯＳのレベルが増加した。タンパク質輸送、細胞生物学、およびタンパク質生化学に関する従来技術を用いて、本発明者はこのカタラーゼ欠乏を逆転させて、ＲＯＳの細胞蓄積を減らすか、おそらく除去する戦略、拡大解釈すれば化合物を説明する。
【００１８】
Ｓｈｅｉｋｈとその同僚たち（上掲）は、ヒト細胞でのカタラーゼの誤った標的化が「重篤な神経学的障害」を伴うことを開示している。したがって、現在のカタラーゼ技術の開発は、ヒトの健康、疾患、および老化に影響を与える。
【００１９】
本発明の結果は、カタラーゼの標的シグナルを修飾することなくヒト細胞にカタラーゼを導入することで、該酵素が細胞質ゾル内に主に蓄積されることを示唆している。そこで、ＲＯＳ産生の部位から離れた酵素を希釈し、修飾、不活性化、または分解処理する。しかし、下等生物（例えば、虫、ハエ）で示されているように、カタラーゼの細胞質ゾル内レベルが高まっても寿命に劇的な影響を及ぼしうる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は２つの技術に対して再び焦点をあてる。第１は、きわめて重要な抗酸化酵素を「送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」と称してヒト細胞に導入することを伴う。第２は、酵素が通常存在して最も効果的に機能することが知られているオルガネラで該酵素を正しく区画分けすることを意図している。このことを「標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」と称する。
【００２１】
ほとんどの方法は、（遺伝子、および）タンパク質を細胞に導入することに現在、利用可能ではない。かなり有望な１つの方法は、概して「遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」と称されている。
【００２２】
細胞外からカタラーゼを細胞に供給して該酵素にそこからＲＯＳをクエンチングさせることが可能かもしれないが、そのようなアプローチは最も効率的な戦略であるようには見えない（そのような方法によるカタラーゼの供給が実際いくつかのＲＯＳを処理しうる場合であっても）。
【００２３】
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
配列Ｘａａ−３−Ｘａａ−２−Ｘａａ−１を含むＰＴＳでの置換によって、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（配列番号１）の天然配列から修飾カルボキシル末端ペルオキシソーム標的シグナル（ＰＴＳ）を有する修飾カタラーゼポリペプチドであって、ここで、独立して、
Ｘａａ−３がＳｅｒ、Ａｌａ、またはＣｙｓであり；
Ｘａａ−２がＬｙｓ，Ａｒｇ、またはＨｉｓであり；そして
Ｘａａ−１がＬｅｕまたはＭｅである
修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目２）
Ｘａａ−３のアミノ末端側に、ｎ個の付加アミノ酸残基（ここで、ｎは１ないし約１７の整数である）をさらに含み、該付加残基が、第１の付加残基に対するＸａａ−４から１７番目の付加残基に対するＸａａ−２０まで連続的に番号付けされている、項目１に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目３）
ｎが約５ないし約１７である、項目２に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目４）
ｎが約７ないし約１３である、項目３に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目５）
ｎが約９ないし約１１である、項目３記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目６）
ｎが９である、項目３記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目７）
ｎが少なくとも１、２、または３であり、Ｘａａ−６からＸａａ−４のいずれか１つにおける残基が、疎水性アミノ酸である、項目２に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目８）
Ｘａａ−６からＸａａ−４のいずれか１つにおける残基が、独立して、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、またはＧｌｙである、項目７に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目９）
ｎが少なくとも１であり、残基Ｘａａ−４が負に帯電したアミノ酸である、項目２に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目１０）
残基Ｘａａ−４がＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓである、項目９に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目１１）
残基Ｘａａ−４がＬｙｓである、項目１０に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目１２）
Ｘａａ−３がＳｅｒであり、Ｘａａ−２がＬｙｓであり、そしてＸａａ−１がＬｅｕである、項目１〜１１のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目１３）
ＰＴＳ２型配列（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−（Ｘ５）−（Ｈｉｓ／Ｇｌｎ）−（Ａｌａ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ）を含むアミノ酸配列を、アミノ末端またはアミノ末端の近傍に含む、修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目１４）
上記ＰＴＳ２型配列が、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号１１）である、項目１３に記載の修飾カタラーゼポリペプチド。
（項目１５）
ＰＴＳ２型配列（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−（Ｘ５）−（Ｈｉｓ／Ｇｌｎ）−（Ａｌａ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ）を含むアミノ酸配列を、アミノ末端またはアミノ末端近傍にさらに含む、項目１に記載の修飾カタラーゼ。
（項目１６）
上記ＰＴＳ２型配列が、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号１１）である、項目１５に記載の修飾カタラーゼ。
（項目１７）
項目１、２、１３、または１５に記載の修飾カタラーゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、該コード配列が発現制御配列に作動可能に連結されている、核酸分子。
（項目１８）
項目１７に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
（項目１９）
項目１、２、１３、または１５に記載の修飾カタラーゼを調製するための方法であって、
（ａ）該修飾カタラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に有効な条件下でインキュベートする工程、および
（ｂ）該宿主細胞から該修飾カタラーゼを収集する工程
を包含する、方法。
（項目２０）
（ａ）項目１〜１１のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチドと
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアと
を含む、薬学的組成物。
（項目２１）
（ａ）項目１２に記載の修飾カタラーゼポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアと
を含む、薬学的組成物。
（項目２２）
（ａ）項目１３または１５のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアと
を含む、薬学的組成物。
（項目２３）
（ａ）項目１〜１１のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチドと、
（ｂ）それに結合もしくはそれと会合した送達もしくは転位分子または部分と
を含む、送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチド。
（項目２４）
（ａ）項目１２に記載の修飾カタラーゼポリペプチドと、
（ｂ）それに結合もしくはそれと会合した送達もしくは転位分子または部分と
を含む、送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチド。
（項目２５）
（ａ）項目１３または１５のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチドと、
（ｂ）それに結合もしくはそれと会合した送達もしくは転位分子または部分と
を含む、送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチド。
（項目２６）
上記送達分子が、ペプチドまたはポリペプチドである、項目２３に記載の送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチド。
（項目２７）
上記送達分子が、ペプチドまたはポリペプチドである、項目２４に記載の送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチド。
（項目２８）
上記送達分子が、ペプチドまたはポリペプチドである、項目２５に記載の送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチド。
（項目２９）
上記ペプチドまたはポリペプチドが、以下：
（ａ）ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質またはその転位活性誘導体、
（ｂ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４）を有するペネトラチン、
（ｃ）配列ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）を有するペネトラチン改変体Ｗ４８Ｆ、
（ｄ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号６）を有するペネトラチン改変体Ｗ５６Ｆ、
（ｅ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号７）を有するペネトランチン改変体、
（ｆ）異なるヘルペスウイルスに由来する単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２またはその転位活性相同体、および
（ｇ）配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）を有するＰｅｐ−１
からなる群から選択される、項目２６に記載の送達可能なポリペプチド。
（項目３０）
上記ペプチドまたはポリペプチドが
（ａ）ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質またはその転位活性誘導体、
（ｂ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４）を有するペネトラチン、
（ｃ）配列ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）を有するペネトラチン改変体Ｗ４８Ｆ、
（ｄ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号６）を有するペネトラチン改変体Ｗ５６Ｆ、
（ｅ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号７）を有するペネトランチン改変体、
（ｆ）異なるヘルペスウイルスに由来する単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２またはその転位活性相同体、および
（ｇ）配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）を有するＰｅｐ−１
からなる群から選択される、項目２７に記載の送達可能なポリペプチド。
（項目３１）
上記ペプチドまたはポリペプチドが
（ａ）ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質またはその転位活性誘導体、
（ｂ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４）を有するペネトラチン、
（ｃ）配列ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）を有するペネトラチン改変体Ｗ４８Ｆ、
（ｄ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号６）を有するペネトラチン改変体Ｗ５６Ｆ、
（ｅ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号７）を有するペネトランチン改変体、
（ｆ）異なるヘルペスウイルスに由来する単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２またはその転位活性相同体、および
（ｇ）配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）を有するＰｅｐ−１
からなる群から選択される、項目２８に記載の送達可能なポリペプチド。
（項目３２）
上記送達分子がＰｅｐ−１である、項目２９に記載の送達可能なポリペプチド。
（項目３３）
上記修飾カタラーゼと会合した送達部分が、リポソームである、項目２３に記載の送達可能なポリペプチド。
（項目３４）
上記リポソームが、食細胞または他のホスファチジルセリン認識細胞による取り込みのために、有効濃度の外部膜ホスファチジルセリンを含む、項目３３記載の送達可能なポリペプチド。
（項目３５）
細胞内の過酸化水素の濃度を減少させるための方法であって、該細胞を、項目１〜１１および１３〜１６のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチドに、該ポリペプチドが該濃度を減少させるために十分な量でペルオキシソームに対して標的化される条件下で、接触させる工程を包含する、方法。
（項目３６）
上記修飾カタラーゼポリペプチドが、それに結合もしくはそれと会合した送達もしくは転位分子または部分をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記接触させる工程が、インビトロである、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
上記接触させる工程が、インビボである、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
上記細胞が幹細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
上記細胞が人工器官の一部である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
上記接触させる工程が、インビトロである、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
上記接触させる工程が、インビボである、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
上記細胞が幹細胞である、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
上記細胞が人工器官の一部である、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
ペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルに関連するかまたはペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルによって引き起こされる疾患または状態に罹患する哺乳類被験体を処置するための方法であって、該被験体に、項目１〜１１および１３〜１６のいずれかに記載の修飾カタラーゼポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４６）
ペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルに関連するかまたはペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルによって引き起こされる疾患または状態に罹患する被験体を処置するための方法であって、該被験体に項目２０に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４７）
ペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルに関連するかまたはペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルによって引き起こされる疾患または状態に罹患する被験体を処置するための方法であって、該被験体に項目２１に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４８）
ペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルに関連するかまたはペルオキシソーム活性カタラーゼの不適当なレベルによって引き起こされる疾患または状態に罹患する被験体を処置するための方法であって、該被験体に項目２２に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４９）
上記被験体がヒトである、項目４５に記載の方法。
（項目５０）
上記疾患または状態が年齢関連性である、項目４５に記載の方法。
（項目５１）
年齢関連性皮膚皺または他の美観的損傷の発達を予防するための処置方法であって、項目４５に記載の方法を実行する工程を包含する、方法。
（項目５２）
上記投与する工程が局所的である、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
上記疾患または状態が、高脂血症、皮膚疾患、神経変性疾患、既存の虚血性状態、または該虚血性状態の処置後の再灌流傷害の危険性である、項目４５に記載の方法。
（項目５４）
上記投与する工程が局所的である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記被験体が、家畜またはクローン動物である、項目４５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、継代早期、継代中期、および継代後期のヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）でのＰＴＳ１（−ＳＫＬ）タンパク質移入を示す一連のグラフである。図１Ａ：半無傷ＩＭＲ９０  ＨＤＦを３７℃で、インビトロ移入反応でビオチニル化ルシフェラーゼとインキュベートした。４５分後、細胞を遠心およびホモゲナイズし、オルガネラペレット／ペルオキシソーム分画を調製した。オルガネラペレットの等価部分への移入の度合い（レベル）は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。表示された値（重複試料の平均値および範囲）は、時間０の値を減算した、時間経過にともなう４９０ｎｍでの吸光度単位である。Ｅ＝継代早期細胞、Ｍ＝継代中期細胞、およびＬ＝継代後期細胞。図１Ｂ：移入を細胞で直接検定したことを除いて図１Ａと同様に、半無傷Ｈｓ２７  ＨＤＦをビオチニル化ルシフェラーゼとともにインキュベートした。
【図２】図２は、カタラーゼ潜在性を示すグラフである。ＩＭＲ９０  ＨＤＦは、ジギトニン濃度を増大させて処理し、カタラーゼ（黒四角）および乳酸デヒドロゲナーゼ（黒丸）のレベルを測定した。データは、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下で測定し、全細胞活性（１００と設定）の％として表した。ベタのシンボル＝継代早期細胞、白抜きのシンボル＝継代後期細胞。
【図３】図３は、固相アッセイでのＰｅｘ５ｐ結合の分析を示すグラフおよび一連のブロットである。図３Ａ：２μｇのルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、カタラーゼ（Ｃａｔ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、または卵白アルブミン（Ｏｖａｌ）をマイクロタイタープレートに被覆し、ＧＳＴ−Ｐｅｘ５ｐの結合を調べた。示した値（４９０ｎｍでの吸光度単位）は、平均値±標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝５）を表す。リガンドブロットアッセイを図３Ｂないし図３Ｆに示す。８００ｎｇのＬｕｃ、Ｃａｔ、またはＢＳＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーで染色するか（図３Ｂ）、もしくはニトロセルロース膜に移してＧＳＴ−Ｐｅｘ５ｐでブロットした（図３Ｃ）。図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆ：特有のＰＴＳ１（ＫＡＮＬ）（配列番号１）、改変ＰＴＳ１（ＳＫＬ）、もしくは無ＰＴＳ１（−）を含む２００ｎｇの組換えヒトカタラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーで染色するか（図３Ｄ）、またはニトロセルロース膜に移して抗カタラーゼ抗血清で免疫ブロット（図３Ｅ）もしくはＧＳＴ−Ｐｅｘ５ｐでブロット（図３Ｆ）した。
【図４】図４は、オルガネラ膜とＰｅｘ５との結合を示す一連のブロットおよびグラフである。図４Ａないし図４Ｃは、老化ＨＤＦのオルガネラ上でのＰｅｘ５ｐ蓄積を示す。Ｐｅｘ５ｐは、抗Ｐｅｘ５ｐ抗血清（α５）または免疫前血清（ＰＩ）を用いた継代早期（Ｅ）、継代中期（Ｍ）、または継代後期（Ｌ）ＩＭＲ９０  ＨＤＦの界面活性剤可溶化オルガネラ由来の免疫沈降であり、また示したように、抗Ｐｅｘ５ｐ抗血清によって免疫ブロットした。オルガネラＰＭＰ７０もまた、免疫ブロッティングによって調べた。図４Ｄは、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ  １００ｐｌｕｓルミネッセンスイメージアナライザによるα５免疫ブロットの定量化を示す。縦軸の単位は任意である。同等の結果が３つの異なる実験で得られた。図４Ｅは、継代後期細胞から得たオルガネラの外側でＰｅｘ５ｐが蓄積することを示す。継代後期ＩＭＲ９０  ＨＤＦから得たオルガネラを、プロティナーゼＫおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００による処理を施すか未処理とし、示されるように、結果として生ずるオルガネラを抗Ｐｅｘ５ｐまたは抗カタラーゼ抗血清により免疫ブロットした。
【図５】図５は、老化ＨＤＦに蓄積するＨ２Ｏ２がペルオキシソームタンパク質移入を阻害することを示すグラフである。継代早期ＩＭＲ９０  ＨＤＦをＨ２Ｏ２で前処理し、ペルオキシソーム移入を図１Ａに示すように検討した。結果（平均値±ＳＤ）を４回の実験からプールし、未処理対照値（任意に１００に設定）に対して正規化して比較をおこなった。
【図６】図６は、継代早期（Ｅ）および継代後期（Ｌ）ヒト二倍体線維芽細胞へのカタラーゼ移入を示す。Ｌｅｇａｋｉｓら（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１３，４２４３−４２５５に概説されたように細胞数に対して正規化した反応で、ビオチニル化カタラーゼのペルオキシソーム移入を記載通りに検討した（Ｔｅｒｌｅｃｋｙら（２００１），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６３，９８−１０６）。
【図７】図７は、カタラーゼ誘導体に対するＰｅｘ５ｐの結合を示す。表面プラズモン共鳴を用いて、それ自身のＰＴＳを有するカタラーゼ（カタラーゼ−ＫＡＮＬ）（配列番号１）ならびに改変ＰＴＳを有するカタラーゼ（カタラーゼ−ＳＫＬ）に対するＰｅｘ５ｐの結合を検討した。提示される結果が応答単位（ＲＵ）であって、対照面に対しての非特異的結合について修正された点に注意する。ＧＳＴ標識Ｐｅｘ５ｐの１０００応答単位を、ＢＩＡＣＯＲＥのプロトコルに従ってアミン結合により、ＣＭ５センサーチップ表面に結合させた。１０μＭのカタラーゼコンストラクトを１０μＬ／分で１分間にわたり、チップ表面上に注入した。全ての実験で、ＢＩＡＣＯＲＥバイオセンサー３０００を用いた。
【図８】ペルオキシソームタンパク質移入の定量分析（ヒト二倍体線維芽細胞へのカタラーゼ−ＳＫＬ（−ＳＫＬ）およびカタラーゼ−ＫＡＮＬ（−ＫＡＮＬ）（配列番号１）移入の比較）を示す。ビオチニル化ルシフェラーゼおよびカタラーゼのペルオキシソーム移入を、種々の時間で、既に説明されたように（Ｔｅｒｌｅｃｋｙら（２００１），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６３，９８−１０６）、ＥＬＩＳＡ法による定量分析によって測定した。
【図９】図９は、カタラーゼ誘導体のペルオキシソーム移入（ヒト細胞のペルオキシソームへのルシフェラーゼ（−ＳＫＬ）およびカタラーゼ（−ＫＡＮＬ）（配列番号１）移入の比較）を示す。ビオチニル化カタラーゼ誘導体のペルオキシソーム移入を、種々の時間で、既に説明されたように（Ｔｅｒｌｅｃｋｙら（２００１），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６３２，９８−１０６）、ＥＬＩＳＡ法による定量分析によって測定した。
【図１０】図１０は、カタラーゼの形質導入を示す。無カタラーゼ症細胞（Ａｃａｔ）、ＩＭＲ９０細胞（ＩＭＲ９０）、またはヒトカタラーゼが形質導入された無カタラーゼ症細胞（Ａｃａｔ＋Ｃａｔ）、あるいはＨｉｓタグ付きカタラーゼ（Ａｃａｔ＋Ｈｉｓ−Ｃａｔ）のウエスタンブロットを生成した（抗ヒトカタラーゼ抗体をプライマリーインキュベーションで使用した。注記：カタラーゼモノマーがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で６０ｋＤａに移動）。
【図１１】図１１は、細胞過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）レベルの分析を示す。ヒト無カタラーゼ症（Ａｃａｔ）と、カタラーゼが形質導入された無カタラーゼ症細胞（Ａｃａｔ＋Ｃａｔ）を、蛍光色素２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテートを用いて、Ｈ２Ｏ２の存在について検討した。累積細胞蛍光の定量分析は、アメリカ国立衛生研究所のＩｍａｇｅ  Ｊ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いておこなった。注意する点は、表示された結果が、カタラーゼ処理細胞でのＨ２Ｏ２レベルが約６０％減少することを示しているということである。
【図１２】図１２は、ペルオキシソームタンパク質移入の定量的インビトロアッセイを模式的に示す。このアッセイはＥＬＩＳＡに基づき、半透過性ヒト細胞およびビオチニル化移入基質を用いる。「基本プロトコル」では、移入は細胞で直接評価される。「代替プロトコル」では、移入は細胞オルガネラ／ペルオキシソームの単離後に定量化される。Ａ、アビジン；Ｂ、ビオチン；ＨＲＰ、西洋わさびペルオキシダーゼ；Ｐ、ペルオキシソーム；ＰＴＳ、ペルオキシソーム標的シグナル；ＳＡ、ストレプトアビジン。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（好ましい実施形態の説明）
本開示は、特定の細胞（老化ヒト細胞を含む）が効率的に該細胞のペルオキシソーム酵素（カタラーゼを含む）を移入することに失敗することを明らかにする。カタラーゼは、特に「弱い」ターゲッティングシグナル（ＫＡＮＬ（配列番号１）  Ｃ末端テトラペプチド）を含む。本発明は、部分的に以下の概念に基づく。すなわち、「強い」ターゲッティングシグナル、例えば−ＳＫＬまたはＳＫＬの機能的誘導体を含むように改変されたカタラーゼは、かなり有害な活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞蓄積（例えば、年齢関連細胞蓄積）を減少、またはおそらく逆転させる。そのようなカタラーゼは、本明細書では「修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」または「標的（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」カタラーゼと称する。
【００２６】
したがって、好ましい修飾カタラーゼでは、ＫＡＮＬ（配列番号１）配列が取り除かれ、ＳＫＬまたはその機能的改変体（実施例参照）と置換されている。トリペプチドＳＫＬのいずれかの改変体を本発明で使用し得る。ただし、この改変体が十分な、しかし高すぎることのない親和性でＰｅｘ５ｐに結合し、ペルオキシソームへのカタラーゼの効率的移入および放出を可能にし、それによってペルオキシソームに生じたＨ２Ｏ２の分解をもたらすことが条件である。一実施形態では、トリペプチドはＳＬＬではない。一般に、トリペプチドがＫＡＮＬ（配列番号１）の後にあることが好ましい。
【００２７】
好ましいＳＫＬ改変体では、少なくとも１アミノ酸残基および、好ましくは１つのみが、異なる残基によって置換される。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、例えば、Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｇ．Ｅ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９，およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８４（これらは本発明で援用される）を参照せよ。アミノ酸配列でおこなうことが可能な置換の種類は、異なる種の相同タンパク質間でのアミノ酸変化の頻度の分析にもとづくものであってもよい。そのような分析にもとづいて、保存的置換、以下のような交換が挙げられる。すなわち、
【００２８】
【表１】
2010239971.tif 000002
【００２９】
本発明にもとづく最多数置換は、ペプチド分子の機能的特徴に変化をもたらさないものであり、ＰＴＳ  １のようにその作用が主に見られる。そうすることに先立って置換の正確な効果を予測することが難しいときでも、当業者は、効果がルーチンのスクリーニングアッセイによって、好ましくは本明細書中の生物学的および生化学的アッセイによって、評価することができることを理解する。置換アミノ酸は、天然または非天然のアミノ酸またはアミノ酸誘導体であり得る。
【００３０】
好ましい置換改変体は、Ｓ、Ｋ、およびＬのいずれか１つ以上の保存的置換を有する。好ましい置換として、
（１）Ｎ末端“−３”位置にあるＳのかわりにＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴ（好ましくはＡまたはＣ）、
（２）第２の（−２）位置にあるＫのかわりにＲまたはＨ、
（３）第３の（−１）位置にあるＬのかわりにＩ、Ｖ、またはＭ（好ましくはＭ）が挙げられる。
【００３１】
置換の上記の種のいかなる組合せでも、許容範囲内である。１つの好ましい置換改変体はＡＫＬであり、いくつかのペルオキシソーム酵素および有効なＰＴＳ１にある既知のＣ末端配列である。面白いことに、標的カタラーゼの調製は、天然のカタラーゼ配列で一つのアミノ酸置換だけを作ることによって、おこなわれる。ここで、３つのＣ末端残基がＡＮＬである。Ａｓｎ（Ｎ）に対するＬｙｓ（Ｋ）の置換は、酵素に対して強いペルオキシソーム移入シグナルを与えるＡＫＬペプチドで終わるカタラーゼをもたらす。
【００３２】
また、１または２つの残基がＳＫＬまたはその置換改変体のＮ末端側で加えられる付加改変体は、発明に含まれる。また、それがこのペプチド構造のペルオキシソーム移入強化機能に干渉しなければ、そのようないかなる付加も企画される。
【００３３】
機能的ＰＴＳとして働くことのできる改変体についての議論は、Ｌａｍｅｔｓｃｈｗａｎｄｔｎｅｒら（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３３６３５−３３６４３およびＧｏｔｔｏら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２，１６６０−１６６６を参照せよ。
【００３４】
本発明は、「普遍的ペルオキシソームターゲッティング配列（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｔａｒｅｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」（ＵＰＴＳ）も含む。この配列を、ペルオキシソームにそのタンパク質または他の分子を標的とするために、任意のタンパク質または他の分子に付加することができる（望ましくは融合または結合）。好ましいＵＰＴＳは、３ないし約２０アミノ酸、より好ましくは３ないし約１６残基、最も好ましくは約８ないし１２残基を有する。便宜上、残基は、以下の通りに負の整数をさかのぼることでＣ末端から番号付けされている。
【００３５】
ＮＨ２−．．．Ｘａａ−ｎ．．．Ｘａａ−４Ｘａａ−３Ｘａａ−２Ｘａａ−１−ＣＯＯ−（または単一文字コード  ＮＨ２−．．．Ｘ−ｎ．．．Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１−ＣＯＯ−）
したがって、１２残基ＵＰＴＳでは、Ｘａａ−ｎはＸａａ−１２、およびｎは１２に等しい。
【００３６】
本発明の配列のいずれかにおけるアミノ酸は、天然アミノ酸、または非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体である。
【００３７】
したがって、本発明の一実施形態は、配列Ｘａａ−３Ｘａａ−２Ｘａａ−１を含むＰＴＳでの置換によって、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（配列番号１）の天然配列から修飾されたカルボキシル末端ペルオキシソームターゲッティングシグナル（ＰＴＳ）を持つ修飾カタラーゼポリペプチドであり、
式中、独立して、（ａ）Ｘａａ−３はＳｅｒ、Ａｌａ、またはＣｙｓ；（ｂ）  Ｘａａ−２はＬｙｓ，Ａｒｇ、またはＨｉｓ；および（ｃ）Ｘａａ−１はＬｅｕまたはＭｅｔである。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、上記したように修飾カタラーゼポリペプチドは、Ｘａａ−３のアミノ末端側に、ｎ個の付加アミノ酸残基（式中、ｎが１ないし約１７の整数）をさらに有し、付加残基は、第１の付加残基のＸａａ−４から第１７の付加残基のＸａａ−２０間で連続的に番号が付けられている。付加アミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、またはその修飾改変体であってもよい。好ましくは、ｎは、約５ないし約１７（例えば、約７ないし約１３、または約９ないし約１１、あるいは９）である。別の実施形態では、ｎは少なくとも１、２、または３であり、Ｘａａ−６ないしＸａａ−４のいずれか１つにある残基は、疎水性アミノ酸（例えば、残基Ｘａａ−６ないしＸａａ−４は、独立して、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ａｌａ（Ａ）、またはＧｌｙ（Ｇ））である。別の実施形態では、ｎは少なくとも１であり、残基Ｘａａ−４は正に帯電したアミノ酸（例えば、残基Ｘａａ−４は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ），またはＨｉｓ（Ｈ）、好ましくはＬｙｓ（Ｋ））である。好ましくは、本発明の修飾カタラーゼのいずれかで、Ｘａａ−３はＳｅｒ（Ｓ）、Ｘａａ−２はＬｙｓ（Ｋ）、およびＸａａ−１はＬｅｕ（Ｌ）である。一実施形態では、置換ＰＴＳは配列  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕまたは  配列  Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕを含まない。
【００３９】
別の実施形態では、カタラーゼは、ペルオキシソームへの移入を強化する強いペルオキシソームターゲッティングシグナルとして働くＳＫＬのペプチドミメティックの結合によって、修飾される。好ましいペプチド模倣（ミメティック）化合物は、ＳＫＬまたはその生物学的活性のある改変体の生物学的効果を模倣する。ペプチド模倣薬は、非天然ペプチドまたは非ペプチド剤であってもよく、ＳＫＬの受容体結合活性または生物学的活性を持つように、ＳＫＬの結合要素の立体特異性を再び生成する（カタラーゼのＣ末端にある場合、または他のタンパク質に結合したＵＰＴＳの形状である場合）。ミメティックが結合する好ましい受容体は、Ｐｅｘ５ｐである。したがって、ミメティックはＰｅｘ５ｐの「基質」であると考えることもできる。生物学的活性のあるＳＫＬペプチドに類似して、ペプチドミメティックは、結合面（ＳＫＬが結合する任意のリガンドまたは受容体と相互作用する）結合面を有する。また、部分的なペプチド特性を保持する化合物も含まれる。例えば、本発明のペプチド内にあるタンパク質分解に不安定な結合のいずれかが同配体（Ｎ−メチル化；Ｄ−アミノ酸）等の非ペプチド因子あるいは還元型ペプチド結合（一方、分子の残りの部分はペプチド様の性質を保持）によって選択的に置換され得る。ペプチド模倣化合物（アゴニスト、基質、または阻害剤のいずれか）は、多数の生理活性ペプチド（例えばオピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、およびＨＩＶプロテアーゼ）について記載されている。ペプチド模倣化合物を設計および調製する方法は公知である（Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１−１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７））（これらの参照文献をそっくりそのまま援用する）。これらの方法は、ＳＫＬのＰｅｘ５ｐ結合特異性および生物活性を所有するペプチドミメティックを作るのに用いられる。そのような化合物を設計して合成するために、本開示を鑑みて、当業者が利用できるペプチド化学および一般の有機化学の知識で充分である。例えば、そのようなペプチドミメティックの同定は、本発明のペプチドの結晶学的に誘導された３Ｄ構造の検査によって、遊離したかたちで、別のポリペプチドに融合したかたちで、あるいはＰｅｘ５ｐ等のリガンド／受容体との複合体に結合したかたちで、おこなうことが可能である。あるいは、またはそれに加えて、ペプチドの構造を、核磁気共鳴スペクトル測定法の技術によって得ることができる。そのリガンドまたは受容体とのペプチドの相互作用の立体化学についてのより良好な知見によって、そのようなペプチド模倣薬の合理的な設計が可能になる。
【００４０】
上述のＣ末端ＰＴＳ−１型分子に加えて、第２の保存されたペルオキシソーム標的配列（ＰＴＳ２−型配列）が、Ｎ末端または該Ｎ末端の近傍にいくつかのペルオキシソーム局在タンパク質分子（しかしカタラーゼにはない）が天然に見つけられる。ＰＴＳ２の受容体は、Ｐｅｘ７Ｐである。ＰＴＳ２配列および機能に関しての概説は、Ｐｕｒｄｕｅら、２００１を参照せよ。Ｎ末端の「近傍（ｎｅａｒ）」は、該Ｎ末端の約４０アミノ酸内にあることを意味している。この９つのアミノ酸ターゲッティング部分のコンセンサス配列は、（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−（Ｘ５）−（Ｈｉｓ／Ｇｌｎ）−（Ａｌａ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ）である。好ましい実施形態において、このターゲッティング部分は、アミノ酸配列ＲＬＱＶＶＬＧＨＬ（配列番号１１）を持つ。この配列の活性改変体（例えば、１種類以上の保存的アミノ酸置換が存在する）は、それがペルオキシソームターゲティング活性を保持するという条件で、本発明にも含まれる。当業者は、それが所望の活性を保持するかどうか決定するために、推定配列を簡単に試験することができる。したがって、本発明の修飾カタラーゼポリペプチドは、そのＣ末端のＰＴＳ  １−型配列に加えて、またはその代わりに、上述のコンセンサスＰＴＳ２−型配列を持つペプチドを含み、望ましくは配列番号１１の配列を持つものであってもよい。ＰＴＳ２配列は、カタラーゼポリペプチドのＮ末端、またはその近傍で操作されることが好ましい。
【００４１】
ＰＴＳ１およびＰＴＳ２配列は、種々の動物種について記載されており、本発明の修飾カタラーゼタンパク質で「混合およびマッチング」される。もちろん、１つの動物種由来のＰＴＳがもう一つの種に導入される場合、異種間抗原性の効果が起こらないことが好ましい。
【００４２】
本発明の組成物および方法で使用される修飾カタラーゼ分子は、任意の動物源、望ましくは哺乳類、最も望ましくはヒトのカタラーゼに由来することができる。修飾カタラーゼは、数あるなかでも、家畜（例えば、ニワトリ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ）、愛玩動物、またはヒト（例えば、１つまたは別の疾患または状態について処置を受けている患者）に由来する（さらに再導入される）ことができる。１つの動物種からのカタラーゼ分子がもう一つの種に導入される場合、異種間抗原性の効果が起こらないことは好ましい。
【００４３】
ヒトカタラーゼタンパク質の配列は、（配列番号２）である。
【００４４】
【数１】
2010239971.tif 000003
【００４５】
また、上記の配列の修飾カタラーゼ対立遺伝子改変体（多数の改変体が同定されている）も意図している。本発明は、非ヒト哺乳類のカタラーゼ対立遺伝子改変体と同様に、それらの改変体のいずれかの配列を持つカタラーゼを含む。本明細書のどこかに記載された種類の人工的に作られたカタラーゼ改変体およびフラグメントの修飾形態もまた本発明の範囲内である。
【００４６】
上記ヒトカタラーゼタンパク質をコードする核酸の配列は、停止コドンを含んで、（配列番号３）である。
【００４７】
【数２】
2010239971.tif 000004
【００４８】
本発明の一実施形態は、カタラーゼを動物細胞（例えばヒト細胞）に導入する方法を含む。臨床設定では、老化または特定の疾患に伴う種々の欠乏症が現れる前に、これは老化関連プロセスまたは他の病理学的プロセスを遅くするために、予防的に実行される可能性がある。この方法のために有用な組成物は、カタラーゼ分子を含むもので、１種類以上のＰＴＳ（例えば、ＵＰＴＳ）またはＰＴＳのミメティック、および任意に、ポリペプチドまたはペプチド送達（「ターゲッティング」とは異なる）系となる別の成分と結合している。本明細書で用いられるように、「送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）』は細胞に分子を持ち込むことを意味しており、一方「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」はペルオキシソームに分子を持ち込むことを意味する。本明細書中に考察される送達分子は、細胞エントリーを生じるために他によって使われるポリペプチドまたはペプチドを含む。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）を参照せよ。この文献を本明細書ではそのまま全体として援用する。好ましい戦略は以下の通りである。すなわち、新しく設計されたカタラーゼ分子（例えばカタラーゼ−ＳＫＬ）を特別に設計したペプチドとインキュベートする。ここで、該ペプチドは、カタラーゼを「被覆」し、そのヒト細胞へのエントリーを促進する。この送達系は、カタラーゼに融合する送達ペプチドを必要とせず、カタラーゼは「形質導入」プロセスの前に変性されてはならない。多くの以前の送達系の不都合な点は、それが送達の前に「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」タンパク質の変性および細胞内でのその後の再生を必要としたということである。発明のこの態様は、細胞にタンパク質転位を促進するために、十分検査されたアプローチに基づく。この方法は、完全に折り畳んだタンパク質は、形質膜をまたがって形質導入されており、この状態でペルオキシソームに移入されることができるという事実を利用する。
【００４９】
細胞エントリーおよび転位を促進する「送達」ペプチド／ポリペプチドの１つの型として、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質（Ｆｒａｎｋｅｌ，ＡＤら、Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３（１９９８））とＡｎｔｅｎｎａｐｏｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ由来の第３のαヘリクス（（Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０（１９９４）；Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  ２１：９９−１０３  （２０００））が含まれる。後者のペプチドもまた、「ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）」として知られており、野生型配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４）を持つ１６個のアミノ酸からなるペプチドまたはＷ４８Ｆ（（ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ，配列番号５）およびＷ５６Ｆ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ，配列番号６）と示されるその２つの類似体／改変体（（Ｃｈｒｉｓｔｉａｅｎｓ  Ｂら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２，２６９：２９１８−２９２６）である。上記変異の両方を持つ別の改変体も含まれる（ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ，配列番号７）。
【００５０】
別のタンパク質（ファミリー）として、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）タンパク質が含まれ細胞内輸送の特性が優れており、また多くの周辺細胞に対してタンパク質を分配する能力を持っている（Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｇら、１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−３３；Ｏ’Ｈａｒｅ  ＆  Ｅｌｌｉｏｔｔ，米国特許第６，０１７，７３５号）。例えば、ＶＰ２２は、ｐ５３（Ｐｈｅｌａｎ，Ａ．ら、１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：４４０−３）またはチミジンキナーゼ（Ｄｉｌｂｅｒ，ＭＳら、１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：１２−２１）に結合し、インビトロで周辺細胞に対する結合したタンパク質の拡散を促進する。ＶＰ２２は、他のヘルペスウイルス（例えば鳥類のマレック病ウイルス（ＭＤＶ））に、「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）」を持つ。マレック病ウイルス１型ＵＬ４９はＨＳＶ−１  ＶＰ２２と相同性を共有し（Ｋｏｐｔｉｄｅｓｏｖａら、１９９５，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４０，３５５−３６２）、また外因性の適用後、細胞内輸送ができることが示されている（Ｄｏｒａｎｇｅら、２０００，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８１  Ｐｔ  ９：２２１９−２２３０）。これら全てのタンパク質は、この発明の修飾カタラーゼの細胞内取り込みを強化するためのアプローチを提供する細胞間拡散の性質を持っている。
【００５１】
また、ＨＩＶ−ＴＡＴもしくはＶＰ２２等の上記細胞間拡散または「送達」タンパク質の「機能的誘導体」も含まれ、それらには相同アミノ酸置換改変体、「フラグメント」、または化学的誘導体が包含され、該用語は以下のように定義される。機能的誘導体は、測定可能な転位または細胞間拡散（ＶＰ２２様）活性を保持するもので、該活性は所望のタンパク質、好ましくは修飾カタラーゼが、その後に効果的にペルオキシソームに移入されるように、細胞に首尾良くエントリーするのを促進する。このプロセスは、本発明にもとづいて、タンパク質の実用（例えば、治療）を可能とする。「機能的誘導体」は、該用語が本明細書中で統合的または代替的に用いられるかどうかにかかわりなく「改変体」および「フラグメント」を包含する。
【００５２】
上記の輸送タンパク質が輸送しているタンパク質（例えばカタラーゼ）と結合体化または他の方法で結合している場合、上記の輸送タンパク質が最も作用すると言われているので、それらを使用する場合に多くの欠点がある。標的カタラーゼと混合され、かつその作用にとって化学的に結合している必要のないより有効な送達ポリペプチドは、Ｍｏｒｒｉｓら（上掲）に記載されており、以下の両親媒性アミノ酸配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を持つＰｅｐ−１である。Ｐｅｐ−１は、以下の３つのドメインからなる。すなわち、
（１）５つのＴｒｐ残基（ＫＥＴＷ  ＷＥＴＷＷＴＥＷ、配列番号９）（上記配列番号８のＮ末端の１２残基）を含む疎水性Ｔｒｐ−リッチモチーフ。細胞膜に対する有効なターゲッティングおよびタンパク質との疎水性相互作用の開始にとって、このモチーフは望ましいか、必要とされる。
（２）ペプチドベクターの溶解度および細胞間送達を改善する親水性Ｌｙｓリッチドメイン（ＫＫＫＲＫＶ、配列番号１０）（ＳＶ−４０ウイルスラージＴ抗原の核局在化配列に由来する配列の６つのＣ末端残基）。
（３）配列番号８の内部残基であって、２つの活性なドメインを切り離し、疎水性および親水性の両ドメインの柔軟性と完全性とを改善するプロリンを含むスペーサードメイン（ＳＱＰ）。
【００５３】
したがって、本発明の別の実施形態は、送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチドであって、該ポリペプチドは本発明の修飾カタラーゼとそれに結合もしくは会合した送達もしくは転位分子または部分を含む。この送達分子は、ペプチドまたはポリペプチドであってもよい。例えば、
（ａ）ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質またはその転位活性のある誘導体、
（ｂ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４）を持つペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、
（ｃ）配列ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）を持つペネトラチン改変体Ｗ４８Ｆ、
（ｄ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号６）を持つペネトラチン改変体Ｗ５６Ｆ、
（ｅ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号７）を持つペネトラチン改変体、
（ｆ）異なるヘルペスウイルスからの単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２またはその転位活性のある相同体、または
（ｇ）配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）を持つＰｅｐ−１、である。
【００５４】
送達タンパク質（例えば、上記したペプチド）とＰＴＳ２型配列とが修飾カタラーゼポリペプチドに存在する場合、Ｎ末端からはじまる配列の順番が好ましい。すなわち、「送達配列」、ＰＴＳ２型配列、カタラーゼのＮ末端である。
【００５５】
以下に詳細に説明するように、送達可能なペルオキシソーム標的ポリペプチドは、リポソームに連結してもよい。したがって、本発明の別の態様は、本発明の送達可能なポリペプチドである（例えば、修飾カタラーゼポリペプチド）。ここで、修飾カタラーゼに伴う送達部分は、リポソームである。一実施形態では、食細胞または他のホスファチジルセリン認識細胞によって取り込むために、リポソームは有効濃度の外部膜ホスファチジルセリンを含んでいる。
【００５６】
本発明の修飾カタラーゼポリペプチドが、ペルオキシソーム内で、結果として細胞内で、Ｈ２Ｏ２のレベルを減少させる能力を保ち、かつ間接的に他のＲＯＳのレベルを減少させる能力を保つならば、それを任意に適当な長さとすることができる。種々の源由来のカタラーゼタンパク質の触媒部位の位置および特性は、当業者に周知である。したがって、例えば、本発明の修飾カタラーゼタンパク質を、基本的にタンパク質の１種類以上の触媒部位（さらにもちろん、本発明のＣ末端ＰＴＳ１型配列および／またはＮ末端ＰＴＳ２型配列、さらに上記したような任意の送達配列）から成るペプチドと同程度に小さなものとすることができる。より大きいフラグメントも含まれ、該フラグメントは、触媒部位に加えて、該触媒部位の側面のいずれか一方またはその両方に約１〜２０の追加のアミノ酸を含む分子から、完全長カタラーゼタンパク質よりも１アミノ酸だけ短い分子までの大きさの範囲である（Ｃ末端ＰＴＳ配列、Ｎ末端ＰＴＳ配列、または上記したような送達配列を含む）。適当なフラグメントを生成する方法、および酵素活性を該フラグメントが保持することを確立する方法は、決まり切った日常的な従来方法である。タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドという用語は、本明細書ではしばしば同義的に使用される。「ポリペプチド」の長さは、いかなる特定のサイズを意図したものではないので、「ポリペプチド」および「ペプチド」は重なる。
【００５７】
本発明の一実施態様は、本発明の修飾カタラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（例えば単離したポリヌクレオチド）であり、そのコード配列は発現制御配列に対して操作可能に連結されている（ポリヌクレオチドおよび核酸は、本明細書中で同義的に用いられる）。ポリヌクレオチドは、本発明の任意の修飾カタラーゼポリペプチドをコードすることが可能であり、上記のようにＰＴＳ  １および／またはＰＴＳ２配列を含む。任意には、ポリヌクレオチドは、修飾カタラーゼのＮ末端、またはその近傍で、フレーム単位で融合した、上記のような送達ペプチドをさらにコードする可能性がある。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列は、天然に生ずる配列と異なり得る。例えば、ポリヌクレオチドは遺伝暗号の縮重を反映するものであってもよく、および／または本明細書の他のところで述べられている型の改変体ポリペプチドをコードするものであってもよい。インビトロまたはインビボで、更なる使用のために修飾カタラーゼを調製する方法として、本発明のポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞で組換え的に修飾カタラーゼポリペプチドを発現する上で、有用である。
【００５８】
本明細書で使用されるように、「発現制御配列」という用語はポリヌクレオチド配列を意味するもので、この配列は、それが機能的に連結させられる（「操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を調整する。発現は、メッセンジャーＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで調整される。このように、発現制御配列という用語は、ｍＲＮＡ関連エレメントおよびタンパク質関連エレメントを含む。そのようなエレメントとして、プロモータ、プロモータ内のドメイン、上流エレメント、エンハンサー、組織または細胞特異性を与えるエレメント、応答エレメント、リボソーム結合配列、転写終結因子等が含まれる。発現制御配列がコード配列の発現をもたらすか、または該発現を達成するためにこのような方法で配置される場合、発現制御配列はヌクレオチド配列（例えばコード配列）に対して操作可能に連結する。例えば、プロモーターが操作可能に５’をコード配列に連結させる場合、コード配列がプロモーターによって駆動される。
【００５９】
適当な発現制御列を、宿主適合性および所望の目的のために選択することができる。これらはエンハンサー（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ由来）、誘導または構成型プロモーター、および細胞型または組織型特異的エレメントもしくは配列を含むもので、選択的または特異的細胞発現を可能とする。発現を駆動するのに用いられることができるプロモーターは、例えば、内因性プロモーター、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ｃ−ｆｏｓ、β−ｇｌｏｂｉｎ  （哺乳類宿主細胞に対して）；ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモーター（細菌宿主に対して）；あるいはアルファファクター、アルコールオキシダーゼ、またはＰＧＨプロモーター（酵母に対して）が含まれる。例えば、Ｍｅｌｔｏｎら、（１９８４）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．１２（１８），７０３５−７０５６；Ｄｕｎｎら（１９８４）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１６６，４７７−４３５；米国特許第５，８９１，６３６号；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８５，６０−８９を参照せよ。遺伝子の天然発現制御配列を用いて、ペプチドを組換え的に発現することが可能であり、例えばカタラーゼタンパク質由来の発現制御配列を用いて、本発明の組換え修飾カタラーゼポリペプチドの発現を駆動することができる。
【００６０】
目的とするタンパク質（例えば修飾カタラーゼポリペプチド）をコードする配列が発現制御配列に操作可能に連結されている組換えコンストラクトを作る方法は、従前通りである。一般に、目的のコード配列は発現ベクターの発現制御配列に対して操作可能に連結される。細胞に導入された場合、このようにして生成されたコンストラクト（組換えコンストラクト）はタンパク質を発現することができる。組換えコンストラクトを作る方法は、本発明と同時に使用される多くの他の分子生物学的方法と同様に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｙ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｄａｖｉｓら、（１９８６），Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｅｉｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓら、（１９８５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．で述べられている。
【００６１】
適当な発現制御配列の制御下におかれた目的とする配列は、一般に適当なベクターにクローニングされて、「コンストラクト」を形成する。数多くの適当なベクターが当業者に知られており、その多くは市販されている。以下のベクターを一例として挙げる。すなわち、細菌：  ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９  （Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；  ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；  真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。しかし、宿主で複製および生存が可能な限り、他のプラスミドまたはベクターのいずれかを用いることも可能である。適当な宿主細胞は当業者に明らかで、例えば、原核生物、酵母、昆虫、および動物（哺乳類含む）細胞が挙げられる。大量のコンストラクト、および／またはそれにコードされるポリペプチドを、適当な宿主細胞でコンストラクトを発現させることで調製することができる。
【００６２】
インビトロで本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する（細胞に「接触する」）方法は、当業者に明らかである。これらとしては、例えば、トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウム沈殿を媒介とする）、ウィルスベクターを介した感染（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、プソイド型レトロウイルス、またはポックスウイルスベクター）、注射（例えば、微量注入、電気穿孔法、ソノポレーション、遺伝子銃）、リポソーム送達（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）または従来の標準的な手順に従って開発された他のリポソーム）、または受容体媒介取り込みおよび他のエンドサイトーシス機構が挙げられる。当業者が理解するように、先行する方法の一部もまた細胞をインビボで「接触させる」のに用いられ得る。本発明のポリペプチドによりインビボで細胞を接触させる他の方法（例えば、そのようなポリペプチドを必要としている被験者に該ポリペプチドを投与する方法）を、以下に説明する。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を、該ポリヌクレオチドによってコードされた組換えポリペプチドの発現にとって有効な条件下で、インキュベートすることが可能である。有効な条件は、当業者に明らかである。それらは、例えば、温度、Ｏ２またはＣＯ２の濃度、適当な培養容器、および培地、その他であり、それらの全てが日常的に最適化される。ポリペプチドを収集して単離（例えば精製）する方法は、従来のものであり、当業者に周知である。
【００６４】
本発明の修飾カタラーゼポリペプチドまたはそれをコードする核酸を生成するための別の方法は、従来の手順を用いて、化学合成によってポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生産することが含まれる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部（例えば、カタラーゼの一部、例えば活性部位；ＰＴＳ；または送達ペプチド、あるいはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド）を合成することができ、合成された他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと連結しても、または組換えにより生成された１種類以上の分子、または天然の源から単離された分子と連結してもよい。そのような分子を連結する手順は従来通りである。
【００６５】
他の実施形態において、本発明は、例えば年齢関連および／または遊離基関連のヒト細胞病理学を処置する種々の生理的、製薬的、または治療的な組成物で、本発明の標的カタラーゼの使用に関する。本発明の方法によって予防または処置することができる状態（疾患状態または障害）は、ペルオキシソームの異常または欠陥に関連する状態（特に、異常なほどに低い有効性またはカタラーゼのレベルをもたらし、細胞内Ｈ２Ｏ２レベルとＲＯＳ生成のレベルの結果的上昇をもたらす状態）を含む。また、そのような状態を予防または処置する方法は、Ｈ２Ｏ２レベルおよび他のＲＯＳレベルをペルオキシソーム内で、結果的に細胞内で、また引き続いて周辺組織で、減少させることを含む。
【００６６】
一般に、本発明は、ペルオキシソームカタラーゼが不適当なレベルであることに関連した状態（例えば、疾患）の被験体（例えば、ヒト等の哺乳類）を処置する方法に関するもので、該方法は、被験体に対して本発明の修飾カタラーゼを有効量投与、好ましくは本発明の送達可能な修飾カタラーゼを投与することを含む。本発明の方法によって予防または処置される症状の種類のなかには、例えば、（１）皮膚疾患、好ましくは年齢関連性の変化および癌放射線障害性損傷に対する皮膚の保護；（２）乏血、特に再灌流損傷に対する保護；（３）一つには特定の脂質低下性の薬剤が肝癌を促進するので高脂血症を処置するために与えられる薬剤と同時におこなう血清脂質の低下；（４）神経変性疾患；および（５）老化が挙げられる。
【００６７】
鉄原子が触媒部位に存在する形態で、カタラーゼ酵素を本発明の方法で使用することができる。あるいは、酵素のアポ酵素型（鉄原子欠如）を使用してもよい。
【００６８】
ＵＰＴＳおよびペプチド送達系、特に本発明のカタラーゼターゲッティングおよび送達系の１つの好ましい使用は、局所キャリア（例えば、クリーム）のかたちで皮膚に対して投与することで、年齢関連皮膚変化を予防および／または処置する。正しく標的化可能なカタラーゼ（ヒト基底皮膚細胞に導入）は、ペルオキシソームに入り、年齢依存型の変化の予防および日光によって誘発される皮膚の変化からの保護に寄与する。一定の濃度のカタラーゼ溶液が酵素活性部位に結合した鉄原子によって緑色を呈することから、物質は潜在的利用者にとって不評である可能性がある。このことは、金属原子を欠いたカタラーゼアポ酵素の使用、またはビヒクル製剤に染料物質を含有させて、例えば、溶液またはクリームの色を変更することによって対処できる。
【００６９】
上記のように、本発明の標的カタラーゼ技術を用いることで、細胞（ヒト細胞を含む）の寿命を延ばすことができる。細胞は、通常、５０または６０回の集団倍加で老化する。操作されたカタラーゼを細胞および該細胞のペルオキシソームに導入することで、集団倍加回数の増加が予想される。本組成物は、細胞および生物レベルで寿命を延ばすことに使用することができる。例えば、幹細胞での集団倍加回数を、特定の人工臓器の寿命が延び得るように、増加させることができる。最終的には、組成物は、例えば、家畜、ペット、クローン動物、またはヒトの寿命を増加させることに適用できる。
【００７０】
本技術は、組織工学、特に老化から幹細胞および前駆細胞を遠ざけようとする分野に適用できる。これらの細胞は、調製するのが非常に困難（かつ高価）である。すなわち、それらの細胞が長期間にわたって機能を保つ何らかの機構が、大きな関心事になっている。したがって、一実施形態では、本発明の組成物は、任意のクラスまたはタイプの培養幹細胞に対して送達されるもので、該細胞として、全能性幹細胞、多能性造血幹細胞、神経、心臓、肝臓、骨、筋肉などの幹細胞を含む任意の系統の分化が決定付けられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）幹細胞、および組織、器官体腔または体液に存在する任意の幹細胞が挙げられる。細胞へのエントリーとペルオキシソームに対するターゲティングによって、カタラーゼＳＫＬ等の上記組成物は幹細胞の寿命を延ばす一方で、「若い」状態に細胞を保ち、さらに／または分裂を繰り返すことによるインビトロでの老化を抑制する。一実施形態では、そのような幹細胞または前駆細胞に対する処置が人工臓器の寿命を高める。
【００７１】
注目すべきことは、この標的カタラーゼ技術が寿命を延ばすことを求めており、損傷した細胞が分裂するのを妨げる天然の障壁を取り除くことによってではなく、遊離基の蓄積や誘導された損傷が以後起こることを妨げることによる。
【００７２】
心臓または脳の乏血の１つの徴候はＲＯＳによって誘発された損傷である。そして、それはこれらの器官の組織に相当な損傷をもたらす。病理学の多くは特に再灌流中に蓄積する、ＲＯＳから生じる。これは、医療を受けているが、患部組織に酸素の再導入による罹患率および死亡率で苦しむ患者の深刻な問題である。この発明によれば、ペルオキシソームのターゲティング技術（望ましくは標的カタラーゼまたは他のタンパク質の細胞に改良された送達に連結する）は、再灌流損傷を予防する際に、また乏血の処置の他の用途のために適用できる。遊離基攻撃を経験している組織における正しくターゲッティングされた高レベルのカタラーゼの適時の存在は、患者の回復のためになる。
【００７３】
本発明の好ましい動物の被験体は、哺乳類である。本発明は、特にヒト被験体の処置に有用である。用語「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本発明の修飾カタラーゼを含んでいる薬学的組成物の被験体に投与することを意図する。治療用組成物、例えば、Ｐｅｐ−１と混合した標的カタラーゼ（例えば、Ｃ末端でＳＫＬまたはＡＫＬのようなＵＰＴＳを持つ）の組合せは、生物学的に有効であるか治療的有効量で、薬学的に受容可能なキャリアで哺乳類の被験体（望ましくはヒト）に投与される。上記組成物は、単独でまたはもう一つの薬剤と組み合わせて投与することが可能である。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を持つポリペプチドまたはペプチドと同時に、またはＳＯＤ活性を刺激する小分子とともに投与してもよい。治療的有効量は、有効期間にわたって投与される場合、測定可能な臨床効果を達成する投薬量である。
【００７４】
本組成物の治療上効果のある量は、個体の症状、年齢、性、および体重やその個体での所望の応答を引き出す該組成物の能力等の要因によって変化する。投薬レジメンは、最適治療反応を提供するために調整され得る。例えば、毎日幾つかに分割した服用量を投与することができ、または服用量を治療状況の要求により指示されるとおりに比例的に減少させることができる。
【００７５】
標的カタラーゼの有効量は、一般にレシピエントの体重１キログラムあたり約１ナノグラムないし約５０ミリグラムであり、より好ましくは約１μｇないし約１０ｍｇ／ｋｇである。内服に適した剤形は、好ましくは１単位あたり約０．０１μｇないし１００μｇの活性成分を含む（後の用量範囲のために）。活性成分は、組成物の全重量に基づいて重量あたり０．５から９５％まで変動させることも可能である。ペルオキシソームの欠乏症（正常な老化に起因するものを含む）を伴う状況の治療の当業者は、過度の実験なしでこれらの用量を調整することが可能である。
【００７６】
活性化合物は、簡便な方法（例えば簡便かつ効果的なルートでの注射）で投与されることができる。好ましいルートとして、皮下、皮内、静脈内、腹膜内、および筋肉内のルートが挙げられる。他の可能なルートとして、局所（経口）髄腔内、吸入、経皮または直腸内適用が挙げられる。
【００７７】
本発明の１つの好ましい実施形態は、老化関連の変化を予防または改善するためにヒト皮膚を処置するための局所医薬（および／または化粧品）製剤における本標的カタラーゼ組成物である。
【００７８】
他の可能な美容的に許容可能なキャリアとして、流動パラフィン、イソプロピルパルミテート、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のポリオキシエチレンモノラウリル酸塩（５％）、または水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）が挙げられる。他の材料、例えば抗酸化剤、湿潤薬、粘性安定剤（水性の注射懸濁物用）、および類似の薬剤を必要に応じて添加してもよい。また、芳香剤を組成物に添加してその香りを改善してもよく、あるいは外観を強調するために有色の薬剤を添加してもよい。
【００７９】
そのような製剤は、多数の典型的な油のいずれかを含むものであってもよく、該油として、鉱油（流動パラフィン）、植物油（カライト（ｋａｒｉｔｅ）バター、ひまわり油、ごま油の液体分画）、動物油（パーヒドロスクアレン）、合成油（パーセリン（ｐｕｒｃｅｌｌｉｎ）油）、シリコーン油（シクロメチコン）、およびフルオロ油（ペルフルオロポリエーテル）が挙げられる。脂肪族アルコール、脂肪酸（ステアリン酸）、または合成脂肪酸エステル（エチルオレエートまたはトリグリセライド）およびワックス（固形パラフィン、カマウバ（ｃａｒｎａｕｂａ）ワックス、および蜜蝋）を脂肪として使うこともできる。
【００８０】
本明細書で使用されるように、「美容的に許容可能な局所キャリア」または「美容的に許容可能なビヒクル」とは、キャリア、希釈剤、または分散剤のことをいい、細胞送達ペプチド／ポリペプチドと組み合わさった標的カタラーゼを皮膚（またはその適当な層）に、過度の有害性、刺激、アレルギー性等をともなうことなく、送達することができる。加えて、美容的に許容可能であるために、局所キャリアは、望ましくは、有利な美容性質（例えば全体の感触、すりこまれる能力、過剰なべとつきの欠如等）を持つ。最も好ましい局所キャリアは、活性薬剤が分散または溶解することができる有機物質であり（Ｓａｇａｒｉｎ，  Ｅら、（１９７２）Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版、１：４８−６５、本明細書で援用）、美容的に許容可能な適当な局所キャリアの数多くの例が含まれる。例は、後述するように、種々の緩和剤、乳化剤、湿潤薬、増粘剤、および粉、さらに溶媒（水を含む）を含む。
【００８１】
美容的に許容可能な有機溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（２００−６００）、ポリプロピレングリコール（４２５−２０２５）、グリセロール、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、ブタンジオール、およびそれらの混合物である。
【００８２】
美容的に許容可能なビヒクルは、一般に活性組成物の重量で５％ないし９９．９％、好ましくは２５％ないし８０％であり、他の化粧用添加剤がない場合、組成物の残りを形成することができる。
【００８３】
組成物は、水性、水性／アルコール性、または油性の溶液；ローション剤または乳漿型の分散物；無水のまたは親油性ゲル類；水相中脂肪相またはその逆の分散によって得られる液体または半液体のコンシステンシーのエマルジョン；または、クリームまたはゲル型のやわらかい、半固体もしくは固体のコンシステンシーの懸濁物またはエマルジョンの形態であり得る。これらの組成物は、周知の技術によって処方される。
【００８４】
本発明の組成物がエマルジョンとして処方される場合、脂肪相の比率は組成物の全重量を基準として、５重量％ないし８０重量％、好ましくは５％ないし５０％とすることができる。エマルジョン形状で組成物に取り入れられる油、乳化剤、および共乳化剤は、化粧または皮膚科学的分野では従来使用されているものの中から選択される。乳化剤および共乳化剤は、組成物の全重量に対して、０．３重量％ないし３０重量％、好ましくは０．５％ないし２０％の範囲の比率で、組成物に存在することができる。
【００８５】
本発明の組成物が油性溶液またはゲルとして処方される場合、脂肪相は組成物の全重量の９０％超を構成することができる。
【００８６】
本発明の組成物は、添加物およびアジュバントを含むこともでき、それらは化粧、医薬、または皮膚科学の分野で従前通りであり、例えば親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性の活性薬剤、防腐剤、抗酸化剤、溶媒、芳香剤、充填材、殺菌剤、脱臭剤、色素、または着色剤が挙げられる。これらの種々の添加物およびアジュバントの量は、従来技術で使用される量であって、例えば組成物の全重量の０．０１％から１０％まで変動する。それらの性質に従い、これらの添加物およびアジュバントを、脂肪相に、または水相に導入することができる。
【００８７】
親水性ゲル化剤として、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリルコポリマー、例えばアクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリサッカリド、例えばヒドロキシプロピルセルロース、天然のガムおよびクレイが挙げられ、さらに親油性ゲル化剤として、典型的には改質クレイ（例えばベントン）、脂肪酸金属塩（例えばステアリン酸アルミニウムおよび疎水性二酸化ケイ素）、あるいはエチルセルロースおよびポリエチレンが挙げられる。
【００８８】
使用される緩和剤の平均親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）に主に依存して、油中水型乳剤または水中油型乳剤を提供する緩和剤とともに、油または油性材料が存在してもよい。そのような緩和剤の量は、組成物全体の約０．５重量％ないし約５０重量％、好ましくは約５重量％ないし３０重量％である。緩和剤は、エステル、脂肪酸およびアルコール類、ポリオール、ならびに炭化水素として分類される。
【００８９】
エステルは、モノエステルまたはジエステルであってもよい。許容される脂肪酸ジエステルとして、ジブチルアジペート、セバシン酸ジエチル、ジイソプロピルジメレート、およびジオクチルスクシネートが挙げられる。許容可能な分枝脂肪酸エステルとして、２−エチルヘキシルミリステート、ステアリン酸イソプロピル、およびパルミチン酸イソステアリルが挙げられる。許容可能な三塩基性酸性エステルとして、トリリノール酸トリイソプロピルおよびトリラウリルシトラートが挙げられる。許容可能な直鎖脂肪酸エステルとして、パルミチン酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイルユーケート（ｅｕｒｃａｔｅ）、オレイン酸ステアリルを含む。好ましいエステルとして、ココ−カプリル酸塩／カプリン酸塩（ココ−カプリル酸塩とココ−カプリン酸塩との混合）、プロピレングリコールミリスチルエーテル酢酸塩、ジイソプロピルアジペート、およびセシルオクタン酸塩が挙げられる。
【００９０】
適当な脂肪族アルコールおよび酸として、１０〜２０炭素原子の鎖を持つ化合物が挙げられる。特に好ましいものは、セチル、ミリスチル、パルミチルおよびステアリルアルコールならびに酸などの化合物である。
【００９１】
直鎖または分岐状鎖アルキルポリヒドロキシル化合物は、皮膚軟化剤として用いることができるポリオールの一つである。例えば、プロピレングリコール、ソルビト−ル、およびグリセリンが好ましい。また、有用なものは、重合体ポリオール（例えばポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）である。ブチレングリコールおよびプロピレングリコールも浸透増進剤として特に好ましい。
【００９２】
典型的な炭化水素は、どこでも１２ないし３０の炭素原子の炭化水素鎖を持つ。具体例としては、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、およびイソパラフィンが挙げられる。
【００９３】
本発明の化粧用組成物に含まれる機能的な成分のもう一つのカテゴリーは、増粘剤である。増粘剤は、通常、組成物の重量で、どこでも０．１ないし２０重量％、好ましくは約０．５重量％ないし１０重量％で存在する。典型的な増粘剤は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のもとで利用できる架橋ポリアクリラート材料である。キサンタン、カラギーナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン、およびローカストビーンゴムのようなゴムを用いることができる。場合によっては、増粘機能は、シリコーンや緩和剤としても機能する物質によって達成可能である。例えば、１０センチストークより粘度の高いシリコーンゴム及びステアリン酸グリセロールのようなエステルは両方の機能を有している。
【００９４】
本発明の化粧品組成物には粉末を配合してもよい。該粉末として、チョーク、タルク、白土、澱粉、スメクタイトクレイ、化学的に改質した珪酸アルミウニムマグネシウム、有機的に改質されたモンモリロナイトクレイ、水和珪酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、アルミニウム澱粉オクテニルスクシネート、および混合物が挙げられる。
【００９５】
組成物は、凍結乾燥された粒子状材料（無菌または無菌的に生産された溶液）のかたちであってもよい。ビヒクル、例えば水（好ましくは、生理学的に許容されるｐＨに、例えばリン酸緩衝生理食塩水で緩衝されている）または他の不活性固体若しくは液体材料、例えば通常生理食塩溶液または種々の緩衝液が存在してもよい。局所または皮下投与のために組成物を最適化する際に、特定のビヒクルを選ばれなければならない。
【００９６】
一般的な用語では、医薬／化粧用組成物は、標的カタラーゼ組成物を１種類以上の水不溶性または水溶性水性または非水性ビヒクルと混合、溶解、結合、またはさもなれば化合することによって調製される。必要に応じて、もう一つの適当な添加物またはアジュバントも含むませることができる。それはビヒクル、キャリア、または賦形剤、同様に組成物を処方するための条件は、タンパク質またはペプチドの生物活性または医薬活性に対して悪影響を及ぼすことがないようにすることが不可欠である。
【００９７】
本方法では、組成物を一度に投与することができるが、一般には複数回、当該分野の技術の範囲内で経験的に決定するように、一般に、おそらく数週、数月、または数年にわたって定期的に投与する。処置を毎日（または１日あたり２回以上）おこなうことができるが、有益、所望、または必要に応じて、一般には２〜３日毎に、あるいは週に一度というようにたまに、おこなう。被験体間の投薬量および期間必要条件は、皮膚および体型に応じて変えることが可能である。概して、約１．０ｎｇないし約１．０ｇ、好ましくは１．０μｇないし約１００ｍｇ、最も好ましくは約１００μｇないし約１０ｍｇの標的カタラーゼを、好ましくは適当な比率で細胞送達ポリペプチドと組み合わせて組成物に含ませる。いずれにしても、所望の結果を達成するのに必要とされる頻度および／または投薬量が経験的に決定されることは、当業者にとってルーチンワークの範囲内である。
【００９８】
所望の領域に直接活性成分を投与するための手段として、活性薬剤を局所的に適用されたビヒクル、例えば、溶液、懸濁物、エマルジョン類、油、クリーム、軟膏、粉、塗布剤、塗剤等の中に好ましくは取り込む。活性薬剤のためのキャリアは、噴霧可能または噴霧不可能な形状のどちらでもよい。噴霧不可能な形状は、局所適用に固有のキャリアを含んでおり、動粘性率を水のそれより望ましくは大きくしている半固体または固体の形態であるとよい。必要に応じて、これらを殺菌することができるか、補助薬剤（例えば浸透圧などに影響を及ぼす防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液または塩類）を混ぜ合わせることができる。噴霧不可能な局所製剤が含む好ましいビヒクルの例として、軟膏基剤（例えばポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００））；ＨＥＢクリームのような従来のクリーム；ゲル類；およびワセリン等が挙げられる。
【００９９】
ヒトの皮膚に対する好ましい局所適用について、本発明にもとづく化合物の有効量を所望の皮膚面に投与することが好ましい。処置される領域と使用される局所ビヒクルの性質とによって、この量は、通常、１回の適用あたり約０．００１ｍｇないし約１ｇまで変動する。好ましい局所調製物は、軟膏であり、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇの活性成分が、ＰＥＧ−１０００等の軟膏基剤１ｍｌあたりで使用される。
【０１００】
投与経路に依存して、活性化合物が材料でおおわれ、該化合物を不活性化することができる酵素、酸、および他の自然条件の作用から保護されている。したがって、組成物をその不活性化を遮る材料で覆う、もしくはそれと同時投与することが必要かもしれない。例えば、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼの酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート、およびトラジロール）またはリポソーム等のキャリア（従来のリポソームと同様に水中油中水型乳剤を含む）（Ｓｔｒｅｊａｎら、（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ７：２７）を用いることができる。
【０１０１】
ペルオキシソームターゲッティング用として、修飾カタラーゼポリペプチドまたは他のポリペプチド（融合タンパク質、結合体、フラグメント、改変体等を含む）を、移植可能な制御された放出（または「持続性放出」）製剤およびマトリックスを介して投与してもよい。これらの製剤として、限定されるものではないが、一般にポリオペプチドに適用可能であるポリ（Ｄ−、Ｌ−、またはＤＬ−乳酸／ポリグリコリド）ポリマー、エチレン−ビニルアセテート（ＥＶＡｃ：Ｅｌｖａｘ４０Ｗ、Ｄｕｐｏｎｔ）−生体腐食性ポリ無水物、ポリイミノ炭酸塩、アルギン酸ナトリウムミクロスフェア、ヒドロゲル、ＤおよびポリＤＬ（ラクチド／グリコリド）コポリマーが、本明細書で援用する以下の特許および刊行物で詳細に説明される数あるなかでも、挙げられる（米国特許第４，８９１，２２５号、第４，９４２，０３５号、第４，８７７，６０６号、第４，９０６４７４号、第４，８０６，６２１号、第４，７８９，５１６号、第４，９２５，６７７号、欧州特許第９２９１８Ｂ１号、欧州特許第１６６５９６Ｂ１号；Ｊｅｙａｎｔｈｉ，  Ｒら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１３：９１−９８（１９９０）；Ｇｒｅｉｇ，Ｎら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１：６１−７８（１９９０）；Ｋａｉｔｓｕ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６：２４９−２６３（１９８７）；Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：５１０３−５１０７（１９８９）；Ｅｃｋｅｎｈｏｆｆ，Ｂら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２：８９（１９８１））。
【０１０２】
鎌型赤血球は、修飾カタラーゼポリペプチドのキャリアとして用いられることができる。鎌型赤血球が正常な赤血球より微小血管内皮に付着して、局所低酸素およびアシドーシスの条件下でより大きな範囲に付着することは、知られている。低酸素血症の条件は、正常な赤血球の付着に対してはなんら効果はないが、血管内皮細胞への鎌赤血球付着は有意に増加する。脱酸素されたヘモグロビンＳの重合は、赤血球の変形とその変形性の著しい減少とをもたらす。これらの柔軟性のない細胞は、鎌型赤血球疾患の脈管閉塞現象の原因となる。微小血管内皮へのこの増加した付着は、α４β１インテグリンおよびＣＤ３６の発現が異常に増加することによって起こる。領域がよりいっそう低酸素になるので、反応性内皮上でのＶＣＡＭ−１およびＰセレクチンの発現が上方制御される。それによって、その領域でさらに多く循環鎌状細胞が捕捉される。
【０１０３】
本発明では、修飾カタラーゼポリペプチド、または該修飾ポリペプチドをコードする核酸を、内皮、特に微小血管系の細胞に対して、送達することが求められている場合、鎌形赤血球を送達ビヒクルとして使うことができる。生理的状況下で正常であることから、鎌状赤血球体質細胞（異型接合体から）の使用が好ましい。しかし、アシドーシスおよび／または低酸素血症微小血管系では鎌形となり、粘着しやすくなる。腫瘍に対する薬剤の送達のためのそのような鎌型赤血球の使用が記載されている。核摘出に先行する分化段階で、鎌形細胞を目的とする遺伝子で形質移入または形質導入することができる。核を摘出した細胞も作用するにもかかわらず、核をもつ鎌網状赤血球は遺伝物質を導入するための好ましい段階である。
【０１０４】
鎌型赤血球は、注射または輸液によって非経口的に投与される。第一に、しかし、鎌形赤血球は適合細胞を選択するために、ＡＢＯおよびＲｈ表現型について試験される。好ましくは、目的とする特異的な部位または器官、例えば頸動脈、門脈、大腿動脈、その他を、従来の血液輸液の注入に必要とされる時間と同じ時間にわたって、そして治療上有効な量（すなわち、治療量の組成物を送達する）の細胞で、潅流して、細胞を血管に静脈内または動脈内送達させる。これは、１時間にわたって、静脈内投与された１〜２５ｍｌ容量の充填細胞を含むことができる。一般に処置は、３日毎におこなわれるが、処置スケジュールは、柔軟であり、患者の応答に応じて延長されたり、短くなったりする。
【０１０５】
本発明の一実施態様は、本発明の修飾カタラーゼポリペプチドのいずれかと、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとを含む薬学的組成物である。
【０１０６】
本明細書で使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」として、任意のそして全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。製薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び作用物質の使用は、当業界では周知されている。いかなる従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない限り、治療用組成物で用いることが企画される。補助活性化合物は、組成物に組み込まれることもできる。
【０１０７】
好ましい薬学的に受容可能な希釈剤として、生理食塩水および水性緩衝液が挙げられる。注射のために適当な薬学的組成物として、無菌水溶液（水溶性）、あるいは無菌の注射可能溶液または分散物を即席調製するための分散物および無菌粉である。等張性剤、例えば、糖、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを薬学的組成物に含んでもよい。全例において、内用のために、組成物は無菌でなければならず、かつ流動的でなければならない。製造および保存の条件下で、安定でなければならず、微生物（例えば細菌と菌類）による汚染を予防する防腐剤を含まなければならない。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれら混合物中、および油中で分散液を調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件で、これらの調製は、微生物の増殖を防ぐために、防腐剤を含むことができる。
【０１０８】
キャリアは、溶媒または分散媒であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、ならびにその他）、およびそれらの適当な混合物を含む。適当な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【０１０９】
微生物の作用を防止することは種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成可能である。
【０１１０】
非経口組成物は、投与の容易さと投薬量の均一性のために投薬量単位形態で望ましくは処方される。投薬量単位形態は、哺乳類の被験体のために一体的投薬量として適している物理的に離散的な単位のことをいう。各々の単位は、必須の医薬キャリアに関連して所望の治療効果を生産するように計算された活性化合物の予め定められた量を含む。本発明の投薬単位形態に関する明細書は、以下によって指示され、かつ直接、以下の点に依存する。すなわち、
（ａ）活性化合物の独特の特徴と達成すべき特定の治療効果、および
（ｂ）個体における処置の感受性のために、そのような活性化合物を合成する従来技術で固有の限界。
【０１１１】
肺滴下注入のために、エアロゾル化した溶液が使われる。噴霧可能なエアゾール調製物では、活性タンパク質が、固体または液体不活性キャリア材料と組み合わせることができる。これは、スクイーズボトルにも充填し、または加圧された揮発性、かつ通常のガス状の推進体とともに混合される。エアゾール調製物は、本発明のタンパク質に加えて、溶媒、緩衝液、界面活性剤および抗酸化剤を含むことができる。
【０１１２】
本発明にもとづく組成物に対する他の薬学的に受容可能なキャリアは、リポソームであり、活性タンパク質が含まれる薬学的組成物は、分散しているか、脂質層に粘着した水性かつ同心性の複数の層からなる小体内に様々に存在する。活性タンパク質は、好ましくは水性層と脂質層、内側または外側、あるいはいずれにせよ、リポソーム懸濁液として一般に知られている非均質系で存在する。疎水性層、すなわち脂質層は、一般に、排他的ではないが、リン脂質（例えば、レシチンおよびスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えば、コレステロール）、多少のイオン表面活性物質（ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸）、ならびに／または疎水性である他の物質を含む。
【０１１３】
好ましい実施形態では、例えばカタラーゼＳＫＬを運搬するリポソームは、該リポソームの表面にホスファチジルセリン（ＰＳ）が豊富であるように設計される。細胞の内側および外側の膜リーフレットのアミノリン脂質含量に関して詳細な検討がなされた。通常、健康な若い細胞で、ＰＳは細胞膜の細胞質側で比較的高い濃度で見つけられるのに対し、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は膜の外面で比較的高い濃度で見つかる。このＰＥ／ＰＳ比率（外側／内部）は、老化細胞で、またはある種の癌細胞で逆転する。老化またはプログラム死細胞の食細胞排除は、マクロファージ（クリアランスに関係する他の細胞型と同様に）のような食細胞上で、受容体が外部のＰＳを認識することよって、部分的に生じる。このように、外部のＰＳは、取り込みのために「細胞をマークする」傾向がある。このことは、インビトロで見いだされるだけではなく、そのようなリポソームがインビボで注射されて、特定の部位（例えば肝臓洞様血管および脳）取り込まれる場合にも見られ得る。例えば、以下の文献を参照せよ。Ｋａｇａｎ  ＶＥら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；２８５（ｌ）：Ｌ１−１７；Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏ  ＧＧら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００３  Ｍａｙ  １；４１３（１）：４１−５２；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｋら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３；６５：７０１−３４．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｍａｙ  ０１；Ｍａｎｎｏ  Ｓ，ら、７：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２  Ｆｅｂ  １９；９９（４）：１９４３−８；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ＰＲら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｎｏｖ  １２；１５５（４）：６４９−５９；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  ＲＡら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００１  Ｊｕｎ；８（６）：５５１−６３；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  ＲＡら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ２０００；９２６：２１７−２５；Ｆａｄｏｋ  ＶＡら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｊａｎ  １２；２７６（２）：１０７１−７；Ｗｉｔｔｉｎｇ  Ａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０００  Ｓｅｐ；７５（３）：１０６０−７０；Ｋａｍｐｓ  ＪＡら、−Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９  Ｍａｒ  ５；２５６（１）：５７−６２；Ｂｅｖｅｒｓ  ＥＭら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１２６−３１；Ｂｅｖｅｒｓ  ＥＭら、２１：Ｌｕｐｕｓ．１９９６  Ｏｃｔ；５（５）：４８０−７；Ｂｒｕｃｋｈｅｉｍｅｒ  ＥＭら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ｊｕｎ；５９（６）：７８４−８；Ｔｏｍｉｚａｗａ  Ｈら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１９９３  Ａｐｒ；１０（４）：５４９−５２；Ｌｅｅ  ＫＤら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９２  Ｊａｎ  ３１；１１０３（２）：１８５−９７；Ｐａｌａｔｉｎｉ  Ｐら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９１  Ｆｅｂ；１０２（２）：３４５−５０；Ｕｔｓｕｇｉ  Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｊｕｎ  １；５１（１１）：３０６２−６．；Ｃｏｎｎｏｒ  Ｊら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８９  Ｍａｙ；８６（９）：３１８４−８．；Ｆｉｄｌｅｒ  ＩＪら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９８８  Ｎｏｖ  １５；９４８（２）：１５１−７３；Ａｌｌｅｎ  ＴＭら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８８  Ｎｏｖ；８５（２１）：８０６７−７１；Ｓｃｈｒｏｉｔ  ＡＪら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８５  Ａｐｒ  ２５；２６０（８）：５１３１−８；Ｓｃｈｒｏｉｔ  ＡＪら、Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．１９８４；５１（２）：２２７−３８．；Ｒｉｍｌｅ  Ｄら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４  Ｓｅｐ；６４（ｌ）：８１−７；Ｆｉｄｌｅｒ  ＩＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８０  Ｄｅｃ；４０（１２）：４４６０−６；Ｐｏｓｔｅ  Ｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９７６  Ｍａｙ；７３（５）：１６０３−７；これらの文献を本明細書では援用する。
【０１１４】
この特性は、相対的に高濃度のＰＳを外側層に有するリポソームを用いることで、本発明で利用され、「標識」細胞を模倣する。このことは、細胞質ゾルに放出された後にペルオキシソームに移動されるカプセルに入れられた材料、例えばカタラーゼＳＫＬが送達される効率を高める。
【０１１５】
別の実施形態では、リポソームは、さらに、融合誘導特性を有するタンパク質（例えばいくつかのウイルスタンパク質）、またはそのフラグメントもしくは改変体を含む。そのようなタンパク質は当業者に周知であり、議論されている。例えば、米国特許第５，９１６，８０３号；Ｈｕｇｈｓｏｎ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．５，２６５；Ｉｌｏｅｋｓｔｒａ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ２２，６７５；およびＷｈｉｔｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２，６７５を見よ。従来の方法は、そのようなタンパク質またはフラグメントをリポソームに付着させることができる。
【０１１６】
関連する実施形態では、赤血球細胞、または好ましくは、赤血球細胞ゴーストを、本発明の組成物をある種の細胞に入れる強化送達ビヒクルとして用いてもよい。上記リストに示す参照文献を見よ。
【０１１７】
この出願の考察の多くは、修飾ペルオキシソーム標的カタラーゼポリペプチドに向けられている。しかし、当業者はペルオキシソームに対するターゲティングカタラーゼ分子のための方法が同様に他の分子に適用され、これらの標的とされた分子が標的カタラーゼのために記載されるそれらと同等の組成物および方法で使用できることを理解する。発明の方法は、目的とする任意の分子をペルオキシソームに対して標的化させることにも用いられる。好ましい実施形態において、標的分子は、ペルオキシソームでＨ２Ｏ２または他のＲＯＳのレベルの減少を促進するものである。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、標的分子は、ペルオキシソームＨ２Ｏ２の量を調整することができる種々の小分子のいずれかを含む。適当な小分子は、当業者に明らかなものであり、例えば、ペルオキシソームでオキシダーゼの一つ以上の活性を阻害する小有機分子またはカタラーゼの活性を刺激する小有機分子を含む。本発明のペルオキシソームターゲティング分子をそのような小分子（それらの有効性のためのテストのための方法と同様に）に取り付ける方法は、従前通りである。
【０１１９】
別の実施形態では、標的分子はカタラーゼ（カタラーゼについて上記したように、または活性改変体もしくはそのフラグメント）以外の種々の酵素のいずれかを含み、それによってペルオキシソームの過酸化水素のレベルを低下させる。そのような酵素は、例えば、（ａ）グルタチオンレダクターゼとグルタチオンペルオキシダーゼとの組合せ；および（ｂ）ペルオキシレドキシンを含む。
【０１２０】
ペルオキシソームで効果的にＲＯＳを減らすために、グルタチオンレダクターゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼは、オルガネラに対して共輸送されなければならない。細胞質ゾルで還元グルタチオンを高レベルに維持するヒトグルタチオンレダクターゼは、適当なグルタチオンレダクターゼの一つである。適当なグルタチオンペルオキシダーゼのうちの一つが、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ１であり、酸化分解から赤血球内のヘモグロビンを保護する。
【０１２１】
種々のペルオキシレドキシンを本発明の組成物および方法で使うことができる。これらは、ヒトおよび他の動物源からの酵素を含む。例えば、ヒト酵素は、適当なペルオキシレドキシンの１つである。
【０１２２】
（１）ペルオキシレドキシン１（チオレドキシンペルオキシダーゼ２；チオレドキシン依存過酸化物レダクターゼ２；増殖関連タンパク質ＰＡＧ；ナチュラルキラー細胞増強因子Ａ（ＮＫＥＦ−Ａ））。この酵素は、細胞のレドックス調節に関与している；それは、グルタレドキシンからではなくチオレドキシン系を通して提供される還元当量で、過酸化物を還元する。酵素は代謝の間、発生する過酸化物を除去することにおいて重要な役割を果たすことができ、Ｈ２Ｏ２細胞内濃度を調整することによって、成長因子および腫瘍壊死因子アルファのシグナル伝達カスケードに関与するかもしれない。
【０１２３】
（２）ペルオキシレドキシン２（チオレドキシンペルオキシダーゼ１；チオレドキシン依存過酸化物レダクターゼ；チオール特異性抗酸化剤タンパク質（ＴＳＡ）；ＰＲＰ；ナチュラルキラー細胞増強因子Ｂ（ＮＫＥＦ−Ｂ））。この酵素は、細胞のレドックス調節に関与している；それは、チオレドキシン系を通して提供される還元当量で、過酸化物を還元する。酵素は、グルタレドキシンから電子を受け取ることができない。それは代謝の間、発生する過酸化物を除去することにおいて重要な役割を果たすことができ、Ｈ２Ｏ２の細胞内濃度を調整することによって、成長因子と腫瘍壊死因子アルファのシグナル伝達カスケードに関与すると考えられる。
【０１２４】
（３）ペルオキシレドキシン３（チオレドキシン依存過酸化物レダクターゼ、ミトコンドリア前駆体；抗酸化剤タンパク質（ＡＯＰ−１）；ＭＥＲ５タンパク質ホモログ；ＨＢＣ１８９；ＰＲＸ  ＩＩＩ）。この酵素は、細胞のレドックス調節に関与している。それは、ラジカル発生系による酸化損傷から遊離基感受性の酵素を保護する。
【０１２５】
（４）ペルオキシレドキシン４（Ｐｒｘ−ＩＶ；チオレドキシンペルオキシダーゼＡ０３７２；チオレドキシン依存過酸化物レダクターゼＡ０３７２；抗酸化剤酵素ＡＯＥ３７２；ＡＯＥ３７−２）。この酵素は、細胞のレドックス調節に関与していると思われる。それは、Ｉ−κ−Ｂ−αリン酸化の変調によって、細胞質ゾルでＮＦ−κ−Ｂの活性化を調整する。
【０１２６】
（５）ペルオキシレドキシン５（ａ，ｂ，ｃ）（ペルオキシレドキシン５前駆体イソ型ａ，ｂ，またはｃ；抗酸化剤酵素Ｂ  １６６；ＴＰｘ型ＶＩ；肝臓組織二次元−ＰＡＧＥスポット７１Ｂ；Ａｌｕコリプレッサー１［ヒト］）。ペルオキシレドキシン５は抗酸化剤酵素のペルオキシレドキシンファミリーのメンバーであり、過酸化水素とアルキルヒドロペルオキシドとを還元する。タンパク質は、標準条件下で、および炎症性のプロセスの間、異なる組織において抗酸化剤保護役割を果たすことができる。このタンパク質は、Ｐｅｘ５ｐと相互作用する。還元型であるこのタンパク質の結晶構造は、１．５オングストローム解像度に分解された。ペルオキシレドキシン５をコードする遺伝子は、ミトコンドリアまたはペルオキシソームの／細胞質の形態を生成するために、代替的なインフレームの翻訳開始部位を使用する。異なったイソ型をコードしている３つの転写産物改変体（ａ、ｂ、およびｃ）は、この遺伝子に関して同定された。
【０１２７】
（６）ペルオキシレドキシン６（ペルオキシレドキシン６；抗酸化剤タンパク質２；非セレングルタチオンペルオキシダーゼ；酸性のカルシウム非依存型ホスホリパーゼＡ２；１−Ｃｙｓペルオキシレドキシン［ヒト］）。ペルオキシレドキシン６は、チオール特異性抗酸化剤タンパク質ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、２つの異なった活性部位を有する二機能性酵素である。細胞のレドックス調節に関与している；Ｈ２Ｏ２と有機短鎖脂肪酸とリン脂質ヒドロペルオキシドを還元することができる。酸化的損傷に対する防御と同様にリン脂質代謝回転の調節の役割を果たすことができる。
【０１２８】
したがって、本発明の一実施態様は１つの分子または二個以上の分子の組合せであり、そのような処置を必要とする細胞（例えば老化細胞）のペルオキシソームで、Ｈ２Ｏ２（および間接的に、他のＲＯＳのレベルを減少させる）のレベルを減少させる。例えば、そのような分子は、Ｈ２Ｏ２の分解に関与するか、もしくは合成がＨ２Ｏ２に依存しているもう一つのＲＯＳの生成を阻害する、酵素を含むことができる。ここで、この酵素は本発明にしたがうＰＴＳペプチドに結合する。酵素は、そのＣ末端に付着されたＰＴＳ１型配列を有し得、および／またはそのＮ末端で、またはその近傍で付着したＰＴＳ２型配列を有し得る。一実施態様において、酵素はペルオキシレドキシン（例えば上述のヒトペルオキシレドキシンの６つのタイプのうちの１つ）である。もう一つの実施形態において、２つの分子が存在することができる。すなわち、グルタチオンレダクターゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼであり、どちらの酵素も本発明のＰＴＳを含む。
【０１２９】
ここで本発明の一般的な説明をおこなったが、以下の実施例を参照することで同じことがよりいっそう容易に理解される。なお、実施例は例証すること目的に提供されるものであって、特に言及しない限り、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３０】
（実施例Ｉ）
（材料および方法）
（細胞培養）
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，  ＮＪ）およびＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）からそれぞれ得た継代早期ＩＭＲ９０およびＨｓ２７  ＨＤＦを、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで培養した。細胞を、５％の二酸化炭素で補充された加湿インキュベーターで、３７℃に維持した。高継代レベルを達成するために、継代培養を通して細胞を増殖させた。継代後期細胞は、老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ（Ｄｉｍｒｉら、１９９５に記載される）について染色することによって、複製老化またはその近くであることを確認した。
【０１３１】
ここで示す細胞はＰｒｏＮｅｃｔｉｎ  Ｆ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）で前処理されたガラスカバーグラスの上で成長した。
【０１３２】
（インビトロ移入アッセイ）
ペルオキシソームタンパク質移入は、ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光をベースとするインビトロアッセイを使用する半透過細胞において検討された。両方のアプローチでは、ＰＴＳ１（−ＳＫＬ）を含む基質タンパク質（ルシフェラーゼ）を使用した。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）システムのために、ルシフェラーゼは、直接に細胞でまたは細胞／オルガネラ／ペルオキシソームの単離後に、ビオチニル化および移入を定量化した（Ｔｅｒｌｅｃｋｙ、２００２）。この方法に関する図示を、図２に示す。比較が等価数の細胞からなされることを確実にするために、全ての実験でＤＮＡ含有量を測定し、適切に修正した。ＤＮＡ定量化の蛍光定量的方法は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）をＤＮＡ結合染料として使用したことを除き、ＤｏｗｎｓとＷｉｌｆｉｎｇｅｒ（１９８３）によって記載されたようにした。
【０１３３】
免疫蛍光をベースとする移入アッセイは、ＬｅｇａｋｉｓおよびＴｅｒｌｅｃｋｙ（２００１）でＩＭＲ９０線維芽細胞について詳述されたようにして実施した。
【０１３４】
移入に対するＨ２Ｏ２の影響を検討するために、細胞を、血清添加培地中の１２５μＭ  Ｈ２Ｏ２で終夜にわたって、および収穫／透過化処理に先立って無血清培地中の２５０μＭ  Ｈ２Ｏ２で２時間にわたって前処理した。
【０１３５】
（免疫細胞化学／顕微鏡検査）
細胞（ガラスカバーグラス上で成長した）を、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドに１０分間にわたって固定し、１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌで１０分間処理し、そして１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００を用いて５分間にわたって透過処理した。細胞を、４％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで１時間にわたってブロックし、１時間、一次抗体とともにインキュベートし、そして３０〜４５分間、二次抗体とともにインキュベートした。ウサギ抗ＰＭＰ７０（７０ｋＤａのペルオキシソーム膜タンパク質）抗体は、１／２５０倍希釈で使用し、ウサギ抗カタラーゼ抗体は１／５００倍希釈で使用し、ウサギ抗Ｐｅｘ５ｐ抗体は１／５００倍希釈で使用し、そしてＣＹ３結合体化ヤギ抗ウサギ抗体は１／３００倍希釈で使用した。全て反応をＰＢＳで実施した。カバーグラスは、Ｓｌｏｗｆａｄｅ  ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してマウントした。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−３１０の共焦点顕微鏡を、全ての蛍光画像を得るために使用した。
【０１３６】
細胞Ｈ２Ｏ２の検出のために、使用する方法は、Ｏｈｂａら、１９９４およびＢａｓｓら、１９８３から修正した。ここで、細胞はＰＢＳで３回洗浄し、２５μＭの２’，７’−ジクロロフルオレシンジアセテートを用いて３７℃で１０分間処理した。細胞を再び洗浄し、細胞蛍光について４８８ナノメートルの励起波長を使用する共焦点顕微鏡によって検討した。ここで示す継代早期Ｈｓ２７  ＨＤＦは、それらに赤いＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ（登録商標）ミクロスフェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をエンドサイトーシスさせることによって「標識」された。終夜にわたるインキュベーションの後、それらの細胞を洗浄し、（「非標識である」）継代後期細胞を含むカバーグラス上へ接種した。その後、細胞のこれらの混合した集団を、Ｈ２Ｏ２の生成について調べた。
【０１３７】
（酵素潜在性（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌａｔｅｎｃｙ））
Ｗａｎｄｅｒｓら（１９８４）からの改変として、潜在性実験を行った。手短に言うと、集密的な１５ｃｍの皿を、ＨＢＳＳを用いて２回洗浄し、細胞をトリプシン処理によって取り除き、（約１０ｍｌ）１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．２５Ｍのスクロース、０．１％（ｖ／ｖ）のエタノール（緩衝液Ａ）中に再懸濁させた。次いで、細胞は、（ｉ）臨床用小型遠心器中でペレットにし、（ｉｉ）緩衝液Ａを用いて１回洗浄し、（ｉｉｉ）緩衝液Ａ中に再懸濁させ、（ｉｖ）適当なジギトニンおよびトリトンＸ−１００を含有する緩衝液Ａ反応溶液に等分した。透過化処理は、細胞を遠心分離（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅｄ）（２分）した後、４℃で５分間にわたって実施し、その結果生じた上澄を、Ｓｔｏｒｒｉｅ  および  Ｍａｄｄｅｎ（１９９０）に記載されたように、乳酸デヒドロゲナーゼまたはカタラーゼについて試験した。
【０１３８】
（プラスミド／タンパク質の調製）
ｐＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）およびｐＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬ哺乳類の発現ベクターを、ＰＣＲ増幅によってｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ）におけるＧＦＰの３’末端に１５ヌクレオチド配列を、そしてｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるＤｓＲｅｄ２の３’末端に１２ヌクレオチド配列に加えることによって生成した。ＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）については、正方向のプライマーである５’−ＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＣＴ−３’（配列番号１２）は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位を含み、ＧＦＰ  ＡＴＧ開始部位の上流のヌクレオチド配列を補足した。
逆方向プライマー５’−ＣＧＴｃｔｃｇａｇＴＴＡＴＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣ−ＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１３）であり、ＧＦＰの最後の２２ヌクレオチドを補足し、そしてカタラーゼのペルオキシソームのターゲティングシグナル（−ＫＡＮＬ（配列番号１）（下線部））、停止コドン、およびＸｈｏＩ部位（小文字部）をコードするヌクレオチドを含むインフレームの３’末端を生成する。ＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬについては、正方向のプライマーである５’−ＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’（配列番号１４）は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位を含み、ＤｓＲｅｄ２  ＡＴＧ開始部位の上流の核酸配列を補足した。逆プライマー５’ＣＧＴｃｔｃｇａｇＴＴＡＴＡＡＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号１５）は、ＤｓＲｅｄ２の最後の２１ヌクレオチドを補足し、そして、ペルオキシソームのターゲティングシグナル（−ＳＫＬ（下線部））、停止コドン、Ｘｈｏｌ部位（小文字部）をコードするヌクレオチドを含むインフレームの３′末端を生成する。ＰＣＲは、Ｐｗｏ重合酵素（Ｒｏｃｈｅ，Ｌａｖａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いるパーキンエルマーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００において実施し、Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位に挟まれたＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）かＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬかをコードしたフラグメントを得た。ｐＥＧＦＰ−Ｃ３およびｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１ベクターは、それぞれ、ＸｈｏＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを使用して消化され、ＧＦＰを含有するフラグメントとＤｓＲｅｄ２を含有するフラグメントの放出をもたらした。次いで、直線化ベクターを、Ｔ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、適当な消化されたＰＣＲフラグメント、ＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）またはＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬのいずれかとともに終夜にわたって連結させた。結果は、ｐＧＦＰ−ＫＡＮＬおよびｐＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬ（それぞれ、ＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）およびＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬを含む哺乳類の発現プラスミド）であり、それぞれサイトメガロウイルスプロモータの制御下にある。連結産物を、ＪＭ１０９細菌宿主に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートの上で平板培養した。各々の形質転換体の１つを選択し、増幅し、（ｐＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）とｐＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬ）プラスミドを単離し、配列決定（Ｒｏｂａｒｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）し、適切なコンストラクトの配列を確認した。ペルオキシソームのターゲティングシグナル−ＳＫＬをコードするヌクレオチドコーディングを−ＫＡＮＬ（配列番号１）の代わりに使用することを除き、同様にしてｐＧＦＰ−ＳＫＬを構築した。
【０１３９】
Ｐｅｘ５ｐ−結合アッセイにおける使用のために、それらのカルボキシ末端残基の同一性によってのみ異なる３つの（Ｈｉｓ）６タグ付き（配列番号１）ヒトカタラーゼタンパク質を、細菌内で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを利用して精製した。組換えタンパク質は、（ｉ）天然に存在するＫＡＮＬ（配列番号１）配列（ＫＡＮＬ（配列番号１））、（ｉｉ）ＳＫＬ配列（ＳＫＬ）か、または（ｉｉｉ）全くＰＴＳ１配列がない（−）、のいずれかをそれらのカルボキシ末端に含むように設計した。後者の場合、ＫＡＮＬ配列（配列番号１）を単に削除した。これらの分子を生成するための、ヒトカタラーゼ遺伝子は、全長のｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲ増幅された。同じ正方向のプライマーを、３つのコンストラクトの各々を増幅するために使用した。このヌクレオチドプライマーは５’−ＡＣＧＣａｇｇｃｃｔＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１６）であり、ＳｔｕＩ制限部位（小文字の）とともに、ヒトカタラーゼのアミノ末端側配列を補足した。
【０１４０】
３つの逆方向プライマー：
５’−ＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴ−３’（配列番号１７）、
５’−ＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＴ−３’（配列番号１８）、および
５’−ＧＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＴＧ−３’（配列番号１９）
を、カタラーゼのＫＡＮＬ（配列番号１）、ＳＫＬ、および「−」バージョンをそれぞれ生成するために設計した。これらのプライマーは、適当なアミノ酸置換および／または欠失をコードしたヌクレオチド変化を含んだ。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（小文字部）についても、停止コドンの下流に組み込まれた。「カタラーゼ」遺伝子の各々を、ＰＣＲ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）によって増幅し、適切に消化して、ｐＱＥ３０−Ｘａ（Ｑｉａｇｅｎ）に連結させた。連結産物を大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、そして回収されたプラスミドを切断解析とＤＮＡ塩基配列決定によって正しいことを確認した。次いで、配列を確認した（Ｈｉｓ）６タグ付き（配列番号２０）ヒトカタラーゼコンストラクトを、発現させ、製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従って精製した。
【０１４１】
（核微量注入及びイメージング）
ガラスカバーグラスの上で成長する継代早期および継代後期のＨｓ２７細胞を、微量注入器（マイクロインジェクター）を備えるＬｅｉｔｚ  Ｌａｂｏｖｅｒｔ  ＦＳの上に微量注入した。ガラス毛管針（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）は、Ｋｏｐｆ  Ｖｅｒｔｉｃａｌ  Ｐｉｐｅｔｔｅ  ｐｕｌｌｅｒ（ガラス電極製作器）を用いて作製した。プラスミドは、１００ｍＭのＫＣＩと２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）からなる注入緩衝液において１５μｇ／ｍｌに希釈した。細胞は、ｐＧＦＰ−ＳＫＬかまたはｐＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）を用いて核注入し、１８または４５時間にわたってインキュベートした。微量注入された細胞の生の蛍光画像は、ＦＩＴＣフィルタセットとＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｓ１００倒立顕微鏡の上で収集された。画像は、ＳｅｎｓｉＣａｍイメージングソフトウェア（ＰＣＯ  ＣＣＤ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して加工した。
【０１４２】
ｐＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）およびＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬが継代後期ＨＤＦに同時に核微量注入される場合、それらは、２０μｇ／ｍｌおよび１５μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ加えた。これらの細胞を、ガラスカバーグラスの上で成長させ、微量注入し、４２時間後に固定した。ガラススライドにマウントした後、細胞はＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡の上で像形成した。
【０１４３】
（Ｐｅｘ５ｐ  結合アッセイ）
Ａｍｅｒｙら、（２００１）に記載されたように、ヒトＰｅｘ５ｐは、大腸菌からグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパクとして単離された。タンパク質（Ｓｉｇｍａから入手した）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）において、マイクロタイターのウェル細片（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅ、Ｎｕｎｃ）上に、終夜にわたってコートした。（マイクロウェルのタンパク質の等価コーティングは、その場で実施されるＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって確認した。）ウェルは、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、ＰＢＳの１０ｍｇ／ｍｌの脱脂乳に加えて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を用いて、３０℃で４時間にわたってブロックした。ウェルを再び洗浄して、ＰＢＳ中で１．６μｇのＧＳＴ−ＨｓＰｅｘ５ｐを用いて終夜にわたってインキュベートした。ＧＳＴ−Ｐｅｘ５ｐ結合の量を測定するために、ウェルを洗浄し、ウサギ抗ＧＳＴ抗体（希釈１：２５００）に続いてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギ抗体（希釈１：２５００）とともにインキュベートした。洗浄後、Ｓｍｙｔｈｅら（１９９２）およびＴｅｒｌｅｃｋｙ（２００２）．に記載されたように、ウェルを発色させ、停止した。ミクロプレートリーダーは、４９０ｎｍで吸光度を決めるために使用した。
【０１４４】
Ｐｅｘ５ｐリガンドブロッティングは、以降の変化を伴いＦｒａｎｓｅｎら（１９９８年）に記載したようにして実施した。ここでは、反応緩衝液中にメチオニンを使用せず、そしてリガンドはＧＳＴ−Ｐｅｘ５ｐであった。また、結合と洗浄ステップの後、ＧＳＴ−Ｐｅｘ５ｐは、ウサギ抗ＧＳＴ抗体（１：２５００）とペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇ二次抗体（１：２５００）を用いて検出された。
【０１４５】
（免疫沈降／プロテアーゼ防御）
免疫沈降とプロテアーゼ防御実験は、ＩＭＲ９０線維芽細胞からのオルガネラの上で実施した。それらを調製するために、等価な数の細胞（上述のようにＤＮＡ含有量測定によって確認した）は、ＨＢＳＳで洗浄し、ラバーポリスマンを用いてホモジナイゼーション緩衝液（１０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ７．８）、１０ｍＭの酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のエタノール、０．２５Ｍのスクロース）で集められ、細いゲージ針を通過させることそれに続くＤｏｕｎｃｅホモジナイゼーションによって破壊した。核と破壊していない細胞は、４℃で１０分間にわたって１０００Ｘｇで遠心分離によって取り除き、そしてオルガネラは４℃で２０分間にわたって１０，０００Ｘｇで遠心分離によって単離した。（後のステップは、これら細胞からＰＭＰ７０／ペルオキシソームに定量的にペレットにする）。免疫沈降については、改質ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、０．５％（ｖ／ｖ）のデオキシコール酸、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）にプロテアーゼ阻害剤（完全なカクテル−Ｓｉｇｍａ）を加えたものを用いてオルガネラを溶解し、抗Ｐｅｘ５ｐ（または免疫前）抗体を加えた。回転器の４℃、２時間後に、プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ）を４℃で３０分間にわたり加えた。免疫沈降物を遠心分離によって採集し、洗浄し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ニトロセルロースへの移動後、抗Ｐｅｘ５ｐ抗体、引き続き化学発光二次抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてブロットをプローブした。
【０１４６】
プロテアーゼを処理した場合、オルガネラは氷上で３０分間にわたり５０μｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。２ｍｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオリドを追加することによって、反応を終了させた。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を試料に加え、タンパク質を１０％のゲル上で分離した。ニトロセルロースへの移動後、上述のようにして、抗Ｐｅｘ５ｐまたは抗カタラーゼ抗体を用いて免疫ブロットを実施した。ここで示すオルガネラは、プロテアーゼ処理の前に１％のトリトンＸ−１００で破壊した。
【０１４７】
（実施例ＩＩ）
（ＰＴＳ１移入効率の年齢関連低下）
生化学的に規定されるインビトロアッセイは、ペルオキシソームのＰＴＳ１タンパク質移入が老化細胞において低下されることを示すために使用された（図１）。この分析で使用された細胞（ＩＭＲ９０か、あるいはＨｓ２７  ＨＤＦ）は、適切な集団倍加レベル（ＰＤＬ）を達成するために、連続して継代させた。細胞のＰＤＬは、その年齢に類似しているとみなしてよく（検討のために、Ｂｅｃｋｍａｎ  および  Ａｍｅｓ（１９９８年）、Ｄｉｃｅ（１９９３年）を参照されたい）、ここで、我々の目的のために、（ＩＭＲ９０）継代早期細胞をＰＤＬ１−３５として、継代中期細胞をＰＤＬ３６−４５として、継代後期をＰＤＬ４６−６０として定義する。ＩＭＲ９０細胞は、約ＰＤＬ６０で複製老化に到達する。Ｈｓ２７細胞（比較可能な継代数で老化する）は、継代早期、継代中期、および継代後期で同様にして分析した。興味深いことに、両方の細胞型は、継代中期で始まる移入欠損を示した（図１）。
【０１４８】
これらのアッセイの移入基質は、ルシフェラーゼ、カルボキシ末端配列（セリン−リシン−ロイシン）を含むＰＴＳ  １−タンパク質（Ｇｏｕｌｄら、１９８７）であった。図１ＡとＢにおいて、我々は移入を評価するために、この基質のビオチニル化バージョンとＥＬＩＳＡ法による定量分析を利用した。このアッセイは、半透過性細胞を使用し、ペルオキシソームの内側のビオチニル化−ルシフェラーゼの蓄積を測定する（Ｔｅｒｌｅｃｋｙら、２００１、Ｔｅｒｌｅｃｋｙ，２００２）。輸送反応の後、非移入基質におけるビオチン基はブロックされ、移入は、細胞の均質化および分画化によって調製されたオルガネラ（図１Ａ）、または（溶解された）細胞（図１Ｂ）のいずれかで評価した。使用される細胞型またはアッセイのバリエーションにかかわりなく、ＰＴＳ  １−タンパク質移入は、継代後期ＨＤＦで最高６０％まで減少した。質的に類似の結果は、免疫蛍光をベースとする移入アッセイを使用して得られた（ＷｅｎｄｌａｎｄおよびＳｕｂｒａｍａｎｉ，１９９３；Ｒａｐｐら、１９９３）。そのアッセイでは、細胞がストレプトリジン−Ｏを用いて半透過され、ルシフェラーゼのペルオキシソームの蓄積が決定される。検出可能なペルオキシソームの数は、細胞の各々において免疫反応性構造を計数することによって決定された。継代早期細胞では平均の個数／細胞は約１６０であり、継代中期細胞では約４０であり、継代後期細胞では約１７０であった。この系で、移入は継代中期細胞でより劇的に影響を受けているようであり、おそらくアッセイの閾値性質を反映する。すなわち、得られる免疫蛍光シグナルは、大部分は、全部または無であり、特定のクリティカルなレベルよりも下に低下した移入は単に検出されない。
【０１４９】
（実施例ＩＩＩ）
（老化細胞でのペルオキシソームの特徴付け）
継代早期、継代中期、および継代後期ＨＤＦのペルオキシソームは、間接的な免疫蛍光顕微鏡によって検討された。オルガネラ（７０ｋＤａ（ＰＭＰ７０）のペルオキシソーム膜タンパク質に対する抗体との反応性によって同定される）は、継代早期細胞においてランダムに散在する点状構造として現れた。継代中期および継代後期細胞において、これら構造の数は、増加した。より慎重にこの点を記載するために、我々は、継代早期、継代中期、および継代後期ＩＭＲ９０細胞における単位面積当たりの免疫反応性構造の数を計数した。我々は、誰であっても、継代早期細胞におけるそのような構造が、継代中期細胞で１．６、継代後期細胞で２．２存在することを発見した。同様の結果がＨｓ２７細胞を用いて得られた。さらにまた、ペルオキシソームの存在度におけるこの増加は、膜ペルオキシン（ｐｅｒｏｘｉｎ）（Ｐｅｘｌ４ｐ）に対する抗体を用いても観察された。
【０１５０】
継代早期および継代後期細胞をより直接的に比較するために、我々は共培養細胞においてペルオキシソームのマーカーを分析した。これらの実験のために、継代早期および継代後期ＨＤＦは、免疫染色の前に、同じ培養皿とカバーグラス上で継代培養した（継代後期細胞の正体は、組織化学的バイオマーカーの老化関連（β−ガラクトシダーゼ）を用いた染色によって確認した）。一旦、ＰＭＰ７０に対する抗体を用いて染色した後に、再度、異なった齢の細胞においてペルオキシソーム番号および形状の違いを明らかにした。
【０１５１】
ペルオキシソームマトリックスタンパク質についても、共培養細胞における免疫細胞化学によって検討された。この目的のために２つの抗体、カタラーゼに対して発生するもの、カルボキシ末端ＰＴＳ１配列（セリン−リシン−ロイシン）を含むペプチドに対して特異的なものを使用した。両方の抗体は、継代早期細胞において点状構造を認識した。しかし、継代後期細胞では染色は顕著に異なり、ＩＭＲ９０では、両方のマトリックスマーカーが、相当量の広がった細胞質ゾル染色を伴って、より少ない強度で現れた。継代後期細胞のペルオキシソームマトリックスマーカーの挙動もまた、より可変的でもあった。Ｈｓ２７ｓにおいて、例えば、いくつかの老いた細胞のカタラーゼは、異なった、ペルオキシソームの構造にあるようだったが、細胞質ゾルにもあるようだった。他の染色では、より完全に細胞質ゾルだった。これらの結果は、少なくとも、一部の細胞カタラーゼと他のＰＴＳ１を含有する酵素が継代後期細胞において誤って局在化されることを示唆する。
【０１５２】
さらに、この点を調査するために、我々は潜在性分析を実施した（図２）。このアッセイにおいて、継代早期および継代後期（ＩＭＲ９０）細胞は、ジギトニン濃度を増大して処理され、（細胞質ゾル）乳酸デヒドロゲナーゼと（ペルオキシソーム）カタラーゼとの放出を酵素的に測定した。１００μｇ／ｍｌジギトニンで、乳酸デヒドロゲナーゼは継代早期細胞でほぼ完全に放出された。（類似するプロフィールは継代後期細胞で得られたが、簡潔化のために示さない。）かかる濃度は、形質膜が損なわれ、細胞質ゾルの区画へのアクセスが得られる点を確立する。ジギトニンのこの濃度、そしてジギトニンのより大きな濃度において、検出可能なカタラーゼの相対量は、継代後期細胞において著しく高く、それにより免疫蛍光によって示唆される誤った局在化を確認した。カタラーゼの完全な放出が、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で補充した緩衝液でのみ得られた点に注意されたい。
【０１５３】
（実施例ＩＶ）
（カタラーゼは、Ｐｅｘ５ｐと弱く相互作用する、弱いＰＴＳ１を含む）
原型のセリン−リシン−ロイシンカルボキシ末端を含むＰＴＳ１−タンパク質の移入は、老化細胞において明らかに損なわれている（例えば図１参照）。また、多様なＰＴＳ１（特に、リシン−アラニン−アスパラギン−ロイシン）を含むカタラーゼは、その移入効率の年齢に関連した低下を示す（図２参照）。これらのシグナルのうちの１つが他より有意に影響を受けるか否かを調べるために、我々は、継代早期ＨＤＦおよび継代後期ＨＤＦに対して、セリン−リシン−ロイシン（ＧＦＰ−ＳＫＬ）またはリシン−アラニン−アスパラギン−ロイシン（ＧＦＰ−ＫＡＮＬ）（配列番号１）のいずれかと連結した緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを、核微量注入した。次いで、生細胞は、蛍光顕微鏡下で１８時間後と４５時間後に、雑種タンパク質の発現について検討された。
【０１５４】
ＧＦＰ−ＳＫＬは、継代早期細胞において効率的に移入され、１８時間までにペルオキシソームに蓄積した（例えば、図２を参照のこと）。継代後期細胞において、移入は遅延し、１８時間後に現れた蛍光構造は微かなもののみであった。４５時間までになってやっと、ＧＦＰ−ＳＫＬが有意な程度に移入されたように見える。カタラーゼＰＳ−１で標識したＧＦＰ（ＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１））は、微量注入後の４５時間まで継代早期細胞のペルオキシソームに現われず、継代後期細胞のペルオキシソームに４５時間で全く蓄積しなかった。老いた細胞において、最終的にＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）の移入が発見される前に、約１１５時間を要した。
【０１５５】
また、我々は、同じ（老化）細胞において２つのＰＴＳ１配列を含むレポーターの移入を検討した。この実験では、ＤｓＲｅｄ２はセリン−リシン−ロイシンに結合され（ＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬ）、ＧＦＰはリシン−アラニン−アスパラギン−ロイシンに結合された（ＧＦＰ−ＫＡＮＬ）（配列番号１）。微量注入の４２時間後に、ＤｓＲｅｄ２−ＳＫＬがペルオキシソームにおいてどのように現れたかを記録したが、ＧＦＰ−ＫＡＮＬ（配列番号１）は細胞質ゾルに大部分が留まった。明らかに、老化は、ペルオキシソームタンパク質移入装置を損ない、カタラーゼのＰＴＳは特に影響を受ける。
【０１５６】
ＰＴＳ  １を含有するタンパク質の移入は、Ｐｅｘ５ｐ、可溶性の受容体分子（細胞質ゾルとオルガネラの間を往復する）（ＤａｍｍａｉおよびＳｕｂｒａｍａｎｉ，２００１）；ＤｏｄｔおよびＧｏｕｌｄ（１９９６）によって媒介される。Ｐｅｘ５ｐの機能的なサイクルは、細胞質ゾルにおけるそのカーゴ（ｃａｒｇｏ）の結合で始まる。２つのＰＴＳ  １を含有するタンパク質の移入効率の違いの潜在的な説明は、このステップにおけるＰｅｘ５ｐによって異なる認識である。Ｐｅｘ５ｐが、セリン−リシン−ロイシンＰＴＳ１を含むタンパク質（例えばルシフェラーゼ）と、これに対しリシン−アラニン−アスパラギン−ロイシンＰＴＳ１を含むタンパク質（例えばカタラーゼ）との優先的な相互作用を示したか否かを決定するために、我々は固相とリガンドブロット結合アッセイを実施した（図３Ａ〜３Ｆ）。前者において、ルシフェラーゼ、カタラーゼと２つの対照のタンパク質（ウシ血清アルブミンと卵白アルブミン）を、ミクロプレートのウェルにコートし、ＧＳＴタグ付きのヒトＰｅｘ５ｐを調べた。我々の結果は、ルシフェラーゼに対するＰｅｘ５ｐの結合が、一貫して、カタラーゼ（図３Ａに示される代表的な実験を参照）に対するよりも３倍から４倍高いことを示す。ほとんど結合していないことが対照のタンパク質について観察され（図３Ａ）、非結合は、（ｉ）  Ｐｅｘ５ｐの添加なし、（ｉｉ）コートされたタンパク質なし、（ｉｉｉ）または熱変性したＰｅｘ５ｐで実施した実験において検出された。類似の結果はリガンドブロッティングで得られた。リガンドブロッティングにおいて、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、およびウシ血清アルブミンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ニトロセルロースへ移され、Ｐｅｘ５ｐでブロットした。再度、ルシフェラーゼに対するＰｅｘ５ｐの結合は、試験される他のタンパク質に対するよりも劇的に高かった（図３Ｂ、３Ｃ）。
【０１５７】
我々は、それらのカルボキシ末端残基の正体のみによって異なる精製組換えヒトカタラーゼ分子に対するＰｅｘ５ｐの結合を検討することによって、この点についても示した。この実験では、カタラーゼ分子は、ポリ−ヒスチジンタグ（精製用）、およびそれ自身のＰＴＳ１（ＫＡＮＬ）（配列番号１）、変更されたＰＴＳ１（ＳＫＬ）、あるいはＰＴＳ１なし（−）のいずれかを含むように設計された。発現、精製、および特徴づけの後（図３Ｄ、３Ｅ）、３つの種がＰｅｘ５ｐでブロットした。図３Ｆで示すように、Ｐｅｘ５ｐは優先して「ＳＫＬ」ＰＴＳ１を有するカタラーゼと結合する。
【０１５８】
（実施例Ｖ）
（Ｐｅｘ５ｐ循環）
ペルオキシソームに対するその「拡張シャトル」の一部として、Ｐｅｘ５ｐおよび結合したカーゴは、オルガネラの膜上でドッキングタンパク質と相互作用する。この相互作用は一時的である；ペルオキシソーム膜の受容体の蓄積は、循環機構におけるエラーとタンパク質移入の結果として生じる減少と関係している（ＤｏｄｔおよびＧｏｕｌｄ，１９９６）。異常なＰｅｘ５ｐ循環が老化細胞に関連しているかどうかを調べるために、我々はペルオキシソーム関連Ｐｅｘ５ｐのレベルを分析した。これを達成するために、我々は、異なる年齢のＨＤＦからオルガネラ（等量のＰＭＰ７０に正規化）を単離し、Ｐｅｘ５ｐを免疫沈降した（図４Ａ−４Ｄ）。重要なことに、膜結合Ｐｅｘ５ｐのレベルは、継代中期のおよび継代後期細胞で一貫してより高かった。対照実験によれば、細胞Ｐｅｘ５ｐの総量がこれらの細胞で変わらず、オルガネラ膜に結合した量のみが変化したことを明らかにした。細胞のＰｅｘ５ｐの免疫染色によって、ペルオキシソーム結合での年齢関連増加が確認された。
【０１５９】
近年では、Ｐｅｘ５ｐはその反応サイクルの一部として実際にペルオキシソームに入ることが示された（ＤａｍｍａｉおよびＳｕｂｒａｍａｎｉ，２００１）。継代後期細胞で観察されるペルオキシソーム関連Ｐｅｘ５ｐが膜またはオルガネラ内部にあったかどうか決定するために、我々はプロテアーゼ−防御アッセイ（図４Ｅ）を実行した。この実験では、継代後期細胞からのオルガネラをプロティナーゼＫで処理して免疫ブロットにかけた。管腔の酵素であるカタラーゼが主に非感受性であった条件下で、我々の結果は、Ｐｅｘ５ｐがプロテアーゼによって完全に分解したことを示す。重要なことに、オルガネラが界面活性剤で前処理されたとき、Ｐｅｘ５ｐおよびカタラーゼ両方はプロテアーゼによって完全に分解した。まとめると、これらの結果は、老化細胞がそれらのペルオキシソームの表面でＰｅｘ５ｐを蓄積することを示唆する。Ｐｅｘ５ｐも継代早期細胞でペルオキシソーム（高プロテアーゼ感受性である）の表面に現れ、おそらくＰＴＳ  １移入受容体の正常な輸送を反映する点に留意する必要がある。
【０１６０】
（実施例ＶＩ）
（ペルオキシソーム老化における過酸化水素の役割）
酵素移入能力の減退を示すペルオキシソームに起こりうる結果は、恒常性調整の喪失である。すなわち、多分、それはＨ２Ｏ２や他の活性酸素（ＲＯＳ）を作り出すペルオキシソーム酵素と有害代謝物を分解するカタラーゼのようなものとの間のバランスの変化が存在する。そうした不均衡の一つの現れは、細胞中のＨ２Ｏ２の蓄積である。これを分析するため、我々は多様な年齢のヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）を酸化反応型の染料（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｙｅ）２’，７’ジクロロフルオレシンジアセテート（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）で処理した（Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ、１９８３；Ｏｈｂａら、１９９４）。この化合物は細胞に入り、非蛍光性で細胞不浸透の誘導体に変換される。次いで、それをＨ２Ｏ２にさらすと、化合物はその蛍光型である２’、７’ジクロロフルオレセン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）に変換され、共焦点顕微鏡で容易に視覚化できる。少量のＨ２Ｏ２が早期および継代中期細胞で見られた。しかしながら、継代後期細胞においては、ＲＯＳの目覚しい増加が現れた。同様な結果が、この測定を共培養された継代早期および後期ヒト二倍体線維芽細胞に行った際も観察された。また、継代早期ＨＤＦをカタラーゼ阻害剤のアミノトリアゾール（ａｍｉｎｏｔｒｉａｚｏｌｅ）で処理したものは、Ｈ２Ｏ２誘発という継代後期細胞でみられたものと大変似通った結果となった。従って、我々の研究は、ペルオキシソームが継代後期細胞でのＨ２Ｏ２産生に貢献するかもしれないという考え方を確かに支持はするものの、その貢献の程度については未解決の重要な問題として残されている。また、ペルオキシソームのタンパク質移入が既に継代中期細胞で損なわれているにもかかわらず、なぜＨ２Ｏ２が継代後期細胞において大量に蓄積するのかも、完全には明らかではない（図１）。多分、これはグルタチオンペルオキシダーゼ、あるいは、継代後期細胞において活性酸素を処理する能力が事実上圧倒的になる他のＨ２Ｏ２の分解活動の関与を反映している。
【０１６１】
Ｈ２Ｏ２の細胞内蓄積と老化表現型の関係は、既に確立されている。特に、ＣｈｅｎとＡｍｅｓは（１９９４）、Ｈ２Ｏ２の準致死量投与（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ  ｄｏｓｅｓ）で処理されたＨＤＦが、成長停止、重要な細胞内酵素の活性低下、そして「老化」形態を含む、多くの老化細胞の特徴を示すことを明らかにした。我々は、図５で少し違った問題点に目を向け、継代早期細胞をＨ２Ｏ２にさらすことが「ペルオキシソーム老化」を誘発するのか否か、そしてその構成酵素を移入するオルガネラの能力を低減させる結果となるか、を試した。我々の結果は、細胞のＨ２Ｏ２による処理がＰＴＳ１タンパク質の移入を著しく減少させる例を示している（図５）。さらに、これらのタンパク質は、免疫蛍光や免疫沈降で測定された通り、そのペルオキシソームにＰｅｘ５ｐを蓄積していた。要するに、これらの結果は、Ｈ２Ｏ２が老化した細胞に蓄積し、そうした蓄積がペルオキシソームの機能的な完全さを減退させることに貢献しているかもしれないことを示している。こうした現象は、「ペルオキシソームの老化」だけでなく、細胞の老化にも同様に貢献していると推定できる。
【０１６２】
（実施例ＶＩＩ）
（ペルオキシソームへのカタラーゼ移入の追加的研究）
その後の研究ではヒトの健康や老化におけるペルオキシソームタンパク質移入とオルガネラ生物発生（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の分子メカニズムの理解に関した。上で見た通り、ペルオキシソームの移入装置は年齢によって損なわれ、酵素カタラーゼが特に影響を受ける。ペルオキシソームはそのオルガネラで行われる多くの酸化反応の副産物としてＨ２Ｏ２を作り出す。１つの結果としてのペルオキシソーム内におけるカタラーゼ濃度の低下は、Ｈ２Ｏ２、おそらくは有害なＲＯＳの蓄積可能性をもたらす。この結果は、老化細胞は実に高いレベルのＨ２Ｏ２を産生し、これがオルガネラの移入能力の更なる低下に貢献し得ることを示唆した。また、ペルオキシソームの酸化促進剤および抗酸化剤の間のバランスの喪失は、細胞の老化に貢献しているのであろう。
【０１６３】
本発明者らは以前に、その構成酵素を効果的に移入することはできなかったが、老化したヒトの細胞にペルオキシソームがしかしながら大量に現れることを観察した。ペルオキシソーム生物発生を制御するメカニズムが機能しなくなったために、このオルガネラが、重要なタンパク質移入を欠いている間に、分裂する。この観察は、継代早期および継代後期細胞を電子顕微鏡で検査することで補強された。継代後期（古い）線維芽細胞は、免疫蛍光分析による観察でペルオキシソームであると解釈される大量の小さな小胞を明らかに収容している。少なくともこれらの小胞の一部はペルオキシソーム膜タンパク質７０（ＰＭＰ７０）に特異的な抗体、および金標識二次抗体により免疫装飾される。
【０１６４】
上記で議論した通り、老化に伴うタンパク質移入の欠陥はペルオキシソームの機能に障害をもたらす。これは、ある種のペルオキシソーム酵素の活性が、その移入減少のためか、または多分Ｈ２Ｏ２の蓄積による不活発化のために、損なわれるからである。この問題は、エーテル−リン脂質生合成の第１段階の触媒作用を担っている酵素、すなわちジヒドロキシアセトン−フォスフェイトアシルトランスフェラーゼ（ＤＨＡＰ−ＡＴ）を測る測定法を用いることで対応した。その結果は、継代後期細胞はこの重要な酵素の活動減退を表しており、このことは継代後期細胞のペルオキシソームは、ＤＨＡＰ−ＡＴにより開始される酵素的カスケードの最終産物である膜プラズマロゲンを低いレベルでしか含んでいないであろうとの予測へと結びつく。ペルオキシソームおよび／または他の細胞膜でのプラズマロゲンの減少は、プラズマロゲンが各種の有害な損傷に保護的な効果を発揮するだけに、その影響は深刻である。ＤＨＡＰ−ＡＴ酵素自身ＰＴＳ１とＰＴＳ２の２つの要素を含み、すなわち異種二量体である。このことは、ＰＴＳ１移入の不足（例えば、ツェルヴェーガー症候群（Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）患者の細胞中）、またはＰＴＳ２移入の不足（例えば、近節短縮性点状軟骨形成異常症患者の細胞中）がＤＨＡＰ−ＡＴレベルの顕著な減少をもたらすという観察により支持される。
【０１６５】
カタラーゼは継代早期および継代後期細胞両方において比較的少量移入される基質であるという我々の公開した観察を拡張するために、インビトロでの移入アッセイを行った。結果は図６（図８および図９につづく）の通りである。とりわけ、カタラーゼの移入は継代後期ヒト細胞において減少しており、上記ＩからＶＩまでの実施例とも合わせて、このことはこの酵素の細胞内における誤った局在化を示している。再度、カタラーゼはそのＣ末端に非標準的な（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＰＴＳ１（−ＫＡＮＬ）（配列番号１）を持っている。リガンドブロッティング（ｌｉｇａｎｄ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）手法に基づく研究は、再構築された（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）Ｃ末端、すなわち−ＳＫＬペプチド（−ＳＫＬ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の存在を持つカタラーゼが、ＰＴＳ１移入受容体のＰｅｘ５ｐとより強固な相互作用を行うことを示した。ここに記述した通り、これらの観察はＢＩＡＣＯＲＥバイオセンサー３０００を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使うことにより拡張した（図７）。この結果は前の観察を支持するものであり、その自然発生的なＰＴＳ１を持つカタラーゼは、−ＳＫＬ  ＰＴＳ１を含むその分子の変形に比べると不十分にしか認知されない。１つの濃度しか示されていないが、広範な「動力学」分析はオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅｓ）、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）およびＫＤ値の計算を可能にした。
【０１６６】
別の実験では、−ＳＫＬを含む酵素、ルシフェラーゼおよびカタラーゼの、インビトロでの移入効率を比較した。図８に示された通り、ルシフェラーゼはカタラーゼに比べ、ペルオキシソームの移入装置のための、はるかに強固な基質であり、影響は、細胞の老化によりさらにひどくなる。
【０１６７】
これらの結果からの１つの予測は、−ＳＫＬ  ＰＴＳ１を含むように操作されたカタラーゼは自然発生する−ＫＡＮＬ（配列番号１）−を含む酵素よりもより効率的に移入されるということである。図９はこの予測を確認しており、「強い」ＰＴＳ１を持つカタラーゼははるか大量に移入される。この実験は通常使われる細胞株である、ヒト細胞（Ａ４３１）を用いて行った。同様な結果はヒト線維芽細胞からも得られている。
【０１６８】
この変更された（ＰＴＳ１）標的シグナルによるより効率的なカタラーゼの移入は、ペルオキシソーム劣化の経過を変更しようとする本発明者の戦略の基礎として役立つ。ペルオキシソームに「再導入」されたカタラーゼは、管理できるレベルのＨ２Ｏ２を産生し、このおよび他の有害なＲＯＳの蓄積の影響の減少を経験する細胞をもたらす。
【０１６９】
カタラーゼの細胞中への効率的な導入のために、本発明者はＭｏｒｒｉｓとその同僚により記述された「タンパク質形質導入（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」戦略を活用する（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９、１１７３−１１７６、２００１）。この手法の基本は、特別に設計された２１アミノ酸ペプチド（Ｐｅｐ１またはＣｈａｒｉｏｔＴＡと呼ばれる）が関心対象のタンパク質、ここではカタラーゼを初期結合段階で吸着する点にある。このペプチド／カタラーゼ複合体は、次いでこの手順の形質導入段階で細胞に加えられる。複合体は細胞膜を越えて形質導入され、細胞の細胞質に接近し、その時点で複合体は分離する。カタラーゼは今やペルオキシソームの移入装置に自由に係合し、そしてそのオルガネラ内に移入される。
【０１７０】
最初に、容易に視覚化できるリポータータンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）を用い、本発明者はヒト線維芽細胞へのタンパク質の形質導入を行った。重要なことに、実験を４℃またはＡＴＰ不在の下で行った時には、細胞は未だ青色で（このことは、細胞β−ガラクトシダーゼの存在を示す）エンドサイトーシスはその結果を表さなかった。
【０１７１】
次いで、カタラーゼは本技法により細胞中へと送達された（図１０）。これらの実験は極めて少量のカタラーゼしか発現しない細胞である無カタラーゼ性（ａｃａｔａｌａｓｅｍｉｃ）の線維芽細胞に依存して行った（「Ａｃａｔ」と表示された細胞と通常の「ＩＭＲ９０」線維芽細胞の細胞中の免疫反応性カタラーゼのレベルを比較して欲しい）。しかしながら、形質導入が行われるや、（Ａｃａｔ）細胞内でカタラーゼのレベルは著しく増加した。もし、カタラーゼのＨｉｓタグ付き（Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ）ものが用いられたとしたら、このより大きい分子は形質導入され、やや遅く移動する（免疫反応性）種として存在した。この実験では研究対象のカタラーゼは独自のＰＴＳ１を持っていたが、他の結果から、この細胞の−ＳＫＬ−タグ付きの種類についても同様に形質導入されることが示唆される。
【０１７２】
本発明者らは前に継代早期細胞に比べ継代後期線維芽細胞は高いレベルのＨ２Ｏ２を産生することを示した。ここで、無カタラーゼ性線維芽細胞もまた高いレベルのＨ２Ｏ２を産生することを示し、そのレベルは例えば継代早期のＩＭＲ９０細胞と比べてもかなり高いものであった。重要なことに、こうした細胞へのカタラーゼの形質導入はＨ２Ｏ２の含有量を劇的に減少させた。こうした方法で調べた数多くの細胞で定量分析を可能にした。重要なことに、細胞中のＨ２Ｏ２の量はこの実験でおよそ５０％減少した。これらの無カタラーゼ性細胞は通常量のカタラーゼを作らないことに留意すべきである。しかしながら、それらの細胞が本質的に移入欠陥を有するという事前の証拠は存在しない。従って、これらの細胞を「老化」したとみなしてはならず、それ自身の「より弱い」ＰＴＳ１を有していてもカタラーゼを移入することが期待される。
【０１７３】
強い標識シグナル（ＳＫＬ）を含むようにカタラーゼを操作し、それを継代後期細胞に導入する実験も行った。そうしたカタラーゼは細胞のＨ２Ｏ２を減少させる。更に、カタラーゼ−ＳＫＬの継代早期細胞への導入は老化の開始を遅らせる（あるいは、解消する）。
【０１７４】
（実施例ＶＩＩＩ）
（哺乳動物でのカタラーゼ−ＳＫＬ処置のインビボ研究）
「タンパク質形質導入」は、マウスで研究されるように、動物の細胞および組織の中に生物学的に関連のあるポリペプチドを導入する比較的新しい形態である。例えば、「インビボタンパク質形質導入：生物学的活性タンパク質のマウスへの送達（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ）」を参照（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、２８５：１５６９−１５７２）。
【０１７５】
従って、研究はカタラーゼ−ＳＫＬを生きている生物に導入して行う。手順は次の通りである。ＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質（既述）からのタンパク質形質導入ドメインをカタラーゼ−ＳＫＬのＮ末端に融合させる。ポリヒスチジン親和性タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を分子に取り付ける（グループＡ）。１つの対照として（グループＢ）、天然のカタラーゼを同様にＨｉｓ−Ｔａｇを有するＨＩＶ−Ｔａｔドメインに融合させる。他の対照として（グループＣ）、天然のカタラーゼからＰＴＳ配列を取り除いたものをＨｉｓ−Ｔａｇを有するＨＩＶ−Ｔａｔドメインに融合させる。追加の対照はグループＤで、ヒト血清アルブミンを含む同様な分子量を持つ無関係のタンパク質でカタラーゼ酵素活性を欠いているもの、を融合させ同じように取扱い、ＳＫＬに連結させる。
【０１７６】
融合タンパク質を、ポリヒスチジン配列を金属原子に結合させることに基づくＮｉ−クロマトグラフィーを用いて単離する。単離した融合タンパク質を次に変性し、別個のグループのマウスにマウス一匹当たり１０μｇから１ｍｇ（Ｋｇ当たり０．１ｍｇから１０ｍｇ）の投与量で腹膜内注射をする。
【０１７７】
２から４時間の間隔を空けた後、注入されたタンパク質の生体内配分（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）と活性を測定する。生体内配分は関心ある組織夫々の酵素測定により測定する。トータルとしての細胞カタラーゼの活性は、Ｄを除くＡ，ＢそしてＣグループで増加していることが分かる。グループＡにおける増加が一番大きい。処理されたマウスから採られた肝臓、線維芽細胞、肺、心臓、脳、脾臓そして腎臓の細胞や組織から取得されたペルオキシソームに存在するカタラーゼの量と酵素活性を測定する。グループＡは、グループＢとＣよりもカタラーゼ酵素活性に加え、目立って多くのカタラーゼタンパク質を有する。グループＤはペルオキシソーム中に血清アルブミンタンパク質の存在を示しはするが、当然のことにカタラーゼ酵素活性の増加は全く無い。
【０１７８】
形質導入されたカタラーゼタンパク質の存在を、抗−Ｈｉｓ抗体またはＮｉ−ＨＲＰ細胞化学的染色試薬との反応性に加え、大きさ（内因性の形態よりもわずかに大きい）により、内因性カタラーゼ酵素から区別できる。
【０１７９】
生体内配分の研究は、測定可能な量のカタラーゼとグループＤのタンパク質が事実上検査された全ての組織に行きわたっていることを確認する。
【０１８０】
前述を踏まえて、次のパラメーターを測定すべく研究を設計し、次の結果を得る。
【０１８１】
（１）カタラーゼ−ＳＫＬを受け入れたより多くの動物が、対照に比べ酸化的ストレスに対し耐性である（この効果を定量化するために、細胞および／または生物を酸化的ストレス導入剤パラコートで処理し、タンパク質、ＤＮＡそして脂質への損傷を評価する。Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーを含むストレスマーカーを測定する。更に、（ａ）酸化されたタンパク質（タンパク質のカルボニル修飾の程度を検査して測定）、（ｂ）プラズマロゲンを決定する。そして、ＤＮＡへの酸化損傷を測定する。）；
（２）マウスが齢をとると、かれらの注入された天然カタラーゼを移入する能力は、注入されたカタラーゼ−ＳＫＬを移入する能力に比べて、低下する；
（３）カタラーゼ−ＳＫＬにより長期間にわたり（１週間に１回または２週間に１回）処置された動物においては（対照と比べて）：
（ｉ）ペルオキシソームおよび他の細胞小器官および生化学的過程が、構造と機能において「より若い」レベルを維持している。
【０１８２】
（ｉｉ）その発現が加齢に関連していることで知られている遺伝子の発現プロファイルが、より若い動物のそれとより密接に似通っている。
【０１８３】
（ｉｉｉ）「生活の質」（例えば、免疫機能、性欲、食欲、身体活動）や認知機能の尺度が改善する。
【０１８４】
（４）カタラーゼ−ＳＫＬにより長期間にわたり（１週間に１回または２週間に１回）処置された動物は（対照に比べ）より長く生きる。―彼らの寿命は約３０％増加する。
【０１８５】
（実施例の考察）
ペルオキシソームは、有核細胞の遍在するオルガネラである。ペルオキシソームは、コレステロールの種々の生理的プロセスで役割を果たす。例えば、該プロセスとして、脂質代謝と、コレステロール、胆汁酸、およびプラスマロゲン生合成の特異的なステップが挙げられ、ペルオキシソームがヒト健康のために不可欠なものとしている。オルガネラは、呼吸の一形態を実行し、そのオキシダーゼが、Ｈ２Ｏ２を最終産物として生成する。この非常に有毒なＲＯＳは、ペルオキシソームカタラーゼの作用を通して、少なくとも大部分の状況下で水に急速に変わる。ヒト細胞が老化するにつれて、ペルオキシソームが持つＨ２Ｏ２の生成と分解活性とのバランスの維持する能力と酸化ストレスを妨げる能力が損なわれて、細胞老化プロセスに貢献する。本発明者は、老化ＨＤＦでのペルオキシソームを特徴づけて、平衡が失われ、オルガネラ機能が減少したこの状態がどのようにして起こるのかを説明する。
【０１８６】
翻訳後に細胞質ゾルから酵素がペルオキシソームに移入される（Ｌａｚａｒｏｗ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｋｉ、１９８５）。上記したように、オルガネラの移入効率の年齢関連性の変化を検討した。結果は、高齢ではヒトペルオキシソームによるＳＫＬ含有ＰＴＳ１−レポーターの移入の効率が低いことを示した。ＰＴＳ  １は、ペルオキシソームにタンパク質を導くペプチド配列のクラスに与えられる名前である。全てのＰＴＳｌを含有する酵素は、それらの移送機構の一部として循環受容体（Ｐｅｘ５ｐ）を係合すると考えられる。カタラーゼは、ＰＴＳ  １を含有するが、他の全てのものと非常に異なるものである。ＧＦＰへＰＴＳ１を付加して融合タンパク質をもたらし、これは、（ａ）継代早期細胞のセリン−リジン−ロイシンタグ付きＧＦＰレポーターよりも効率が低く移入が起こり、また（ｂ）継代後期細胞での他のレポーターよりもかなり移入が少ない。これらの結果は、カタラーゼがペルオキシソームタンパク質移入装置にとって相対的に劣った基質であることを再び確認した（Ｌａｚａｒｏｗら、１９８２）。より最近の研究において、２つの線維芽細胞細胞系統はゼルウィガー（Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ）様障害を有する患者から単離していた。ここでは、カタラーゼの移入は選択的に損なわれる（Ｓｈｅｉｋｈら、前出）。「無カタラーゼペルオキシソーム」は、幼児レフサム疾患の患者でも説明されている（Ｆｕｊｉｗａｒａら、２０００）。
【０１８７】
継代早期細胞であってもカタラーゼの移入効率が劣る理由および継代後期細胞でその影響が悪化する理由の問題に関しては、Ｐｅｘ５ｐがカタラーゼを十分に認識するだけではないという事実に、部分的に、１番目の問題に対する答えが見える。
【０１８８】
本研究は、老化細胞で影響を受ける少なくとも１つの重要な機械的ステップ（Ｐｅｘ５ｐ循環の機械的ステップ）を同定した。酸化的に損傷を受けた巨大分子の蓄積は、細胞老化で一定の役割を果たし、これは生物の寿命の重要な決定因子であることがたしかなようである（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，２００１；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９９；ＢｅｃｋｍａｎおよびＡｍｅｓ，１９９８）。多数の変性性疾患を、細胞機能（ＭａｓｔｅｒｓおよびＣｒａｎｅ，１９９５）でのＲＯＳによって誘発された変更にも関連させることが可能である。本発明によれば、ペルオキシソーム（脂質−膜の生合成および機能を果たすことに不可欠なオルガネラ）は老化細胞によって経験される酸化的負荷の一因である。オルガネラは、それがＨ２Ｏ２（Ｓｉｎｇｈ，  １９９６）に消費する分子状酸素のほとんど全てを変える。１０％以上の全細胞酸素を消費している肝性ペルオキシソームの推定値を加味すると、これが考慮中のＲＯＳの有意な量であることは明らかである。ペルオキシソームにおけるＰＴＳ１含有酵素（特にカタラーゼ）を移入する能力の減少は、Ｈ２Ｏ２を能率的に代謝しない老化細胞で、機能的に損なわれたオルガネラを作成し、これは、深刻な潜在的結果である。蓄積したＨ２Ｏ２は酸化ストレスを増して、細胞構成要素に損傷を与える。最後に、Ｈ２Ｏ２の影響は、実際にさらにペルオキシソームの基質タンパク質移入の効率を低下させ得ることができることから、無際限に継続する悪循環を結果として生じることになる。重要なことは、老化の明らかな特徴がなんらか観察される前に、この循環は早く動き得、ペルオキシソーム機能障害および細胞老化の初期に貢献することができる。このように、本組成物および方法（そのような循環に反対に作用するようになっている）は、重要な構成要素を老化の影響の一部と戦う我々の能力に加える。
【０１８９】
（上記で引用した文献）
【０１９０】
【数３】
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【０１９１】
【数４】
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【０１９２】
【数５】
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【０１９３】
【数６】
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【０１９４】
上記で引用されたすべての参考文献は、特に援用されていようとなかろうと、その全体が本明細書中で参考として援用される。本願は、米国仮特許出願番号６０／４２２，１００（２００２年１０月３０日出願）（その全体が本明細書中で参考として援用される）の出願日の利益を主張する。
【０１９５】
ここで、本発明を完全に記載することにより、同一のものが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過度の実験を必要とせずに、等価なパラメータ、濃度、および条件の広範な範囲内で実施され得ることが当業者により理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【配列表】
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