(57)【要約】【課題】５−ＡＳＡ存在下におけるβ−カテニン経路の阻害の分析を含む、哺乳類の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の予防及び／又は治療における５−ＡＳＡの薬効の測定についての方法が開示される。【解決手段】より詳細には、本方法は、μ−プロトカドヘリン、E-カドヘリン、β−カテニン、Ａｘｉｎ１、ＩＣＡＴ、ｐ２１waf-1のようなβ−カテニンシグナル経路の調節に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現の定量、及びＫＬＦ４及びＣＥＢＰαのような癌抑制遺伝子の発現の定量を含む。遺伝子の発現は、ＱＲＴ−ＰＣＲ、及び免疫組織化学のような通常に利用可能な手法によって測定できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−ＡＳＡ存在下でのβ−カテニン経路の阻害を測定する工程を含む、哺乳類の結腸直腸癌予防及び／又は治療における５−ＡＳＡ薬効の測定方法。
【請求項２】
β−カテニンシグナル経路の調節に関与する少なくとも一つの遺伝子及び／又はＫＬＦ４ 及びＣＥＢＰαの発現を測定する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記の少なくとも一つの遺伝子を、前記哺乳類より単離する工程と、５−ＡＳＡの存在及び非存在下の両方における該遺伝子の発現を測定する工程を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
β−カテニンシグナル経路の調節に関与する前記少なくとも一つの遺伝子が、μ−プロトカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、Ａｘｉｎ１、ＩＣＡＴ及びｐ２１waf-1から選ばれることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つの遺伝子の発現が、ＱＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学によって測定されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インビトロ又はエクスビボにおいてβ−カテニン経路の阻害を測定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類が結腸直腸癌に罹患していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、哺乳類のＣＲＣの予防及び／又は治療における５−ＡＳＡ薬効の測定のための方法に関するものであり、５−ＡＳＡ存在下におけるβ−カテニン経路の阻害、及び独立した癌抑制遺伝子の活性化の解析を含むものである。
【０００２】
より詳細には、哺乳類のＣＲＣの予防及び／又は治療における５−ASA 薬効の測定のための方法であり、β−カテニンシグナル経路、及び他の癌抑制遺伝子の調節に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現の測定を含む。
【背景技術】
【０００３】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）に対するよく知られた化学予防活性で特徴づけられる（非特許文献１、２）。この活性は上述の疾病に進行する危険性の増加した患者のみならず、一般集団においても認められる。残念ながら、ＮＳＡＩＤｓの全身性毒性及び胃腸管毒性のため、発症患者の長期治療を要する臨床プロトコールの状況下において、これらの薬剤の投与が大幅に制限される。    
【０００４】
これらの化合物で誘発される治療と毒性両方の効果は、主としてＣＯＸ−1とＣＯＸ−２酵素の阻害に依存しており、該酵素は順に通常の数多くの生物学的機能を仲介するプロスタグランジン（ＰＧ）合成の抑制に関与する。
【０００５】
したがって、ＮＳＡＩＤｓの薬理学的特性は、実質的にはこれらの機能を妨害する能力にあるということができる。いくつかの報告によると、メサラジン（５アミノサリチル酸 又は５−ＡＳＡ) が、同程度の抗ＣＲＣ化学予防活性を達成すると同時に、ＮＳＡＩＤｓによって誘発される副作用を回避する期待が持てる代替物となり得ることが示されている。（非特許文献３−５）。
【０００６】
アスピリン、すなわちＮＳＡＩＤ系列化合物、との化学的類似性にもかかわらず、５−ＡＳＡは、弱いＣＯＸ阻害作用という、この治療薬の安全性を明確に説明する特性によって特徴づけられている。全く異なるメカニズムが抗炎症作用に影響を与えていると思われるのも、もっともであるし、それらメカニズムの中でもおそらくＮＦｋＢや ＰＰＡＲｓのような免疫応答を亢進する転写因子を阻害することにより重要な役割が果たされているであろう（非特許文献６）。
【０００７】
今日まで、５−ＡＳＡの化学予防の薬効はもっぱら、ＣＲＣに進展する危険性の増大を特徴とする炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病、及び潰瘍性大腸炎）に罹患した患者でのみ実証されており、その他の個々の範疇である健常人や遺伝性腫瘍症候群を有する患者では確かめられていないことが指摘される。この問題は、５−ＡＳＡを用いた抗ＣＲＣ化学予防の実現可能性を明確にするために役立ちうる具体的に計画された臨床治験を通してのみ一義的に対処し得るものではあるが、細胞及び分子レベルでこの化合物が発揮する抗癌作用に対する適切な特性評価は、このような研究に基本的寄与を提供し得る。
【０００８】
事実、この検討結果は、５−ＡＳＡの化学予防の薬効を分析する臨床プロトコールの生物学的理由付け又は裏づけを可能とし、検討された治療に対する薬理学的応答をモニターすることが可能な生物学的マーカーの特定を許容する。
【０００９】
この点において、増大するますます多くの証拠により、５−ＡＳＡによる刺激が、例えば、増殖の抑制や、アポトーシスの誘導、細胞周期チェックポイント及びＤＮＡ修復過程の増強のような大腸癌細胞に対する多くの生物学的作用を決定することが示されている（非特許文献７−１０）。
【００１０】
近年、興味深いことに５−ＡＳＡが、β−カテニンの核内への移行（β−カテニン蛋白質の転写活性を可能とするのに必要）を阻害することにより、β−カテニンシグナル経路を妨害することが証明されてきた（非特許文献１１）。
【００１１】
この知見により、５−ＡＳＡが大腸癌細胞に誘発する実際上すべての作用を原則として説明することができる。というのは、β−カテニンが、Ｇ１／Ｓ（非特許文献１２、１３）とＧ２／Ｍ細胞周期（非特許文献１３、１４）への移行及びさらに間接的にアポトーシスの分子メカニズムと関連づけられたからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Janne PA., Mayer RJ., N Engl J Med., 342:1960-8, 2000
【非特許文献２】Sandler RS., Halabi S., Baron JA., Budinger S., Paskett E., Keresztes R., Petrelli N., Pipas JM., Karp DD., Loprinzi CL., Steinbach G., Schilsky R., N. Engl J. Med., 348:883-90., 2003
【非特許文献３】Stolfi C., Pellegrini R., Franze E., Pallone F., Monteleone G., World J. Gastroenterol, 14:4434-9, 2008
【非特許文献４】Cheng Y., Desreumaux P., World J. Gastroenterol, 11:309-14, 2005
【非特許文献５】Allgayer H., Aliment Pharmacol. Ther., 18 Suppl., 2:10-4, 2003;
【非特許文献６】Rousseaux C., Lefebvre B., Dubuquoy L., Lefebvre P., Romano O., Auwerx J., Metzger D., Wahli W., Desvergne B., Naccari G.C., Chavatte P., Farce A., Bulois P., Cortot A., Colombel J.F., Desreumaux P., J. Exp. Med., 201:1205-15, 2005
【非特許文献７】Reinacher-Schick A., Schoeneck A., Graeven U., Schwarte-Waldhoff I., Schmiegel W., Carcinogenesis, 24:443-51,2003
【非特許文献８】Gasche C., Goel A., Natarajan L., Boland C.R., Cancer Res.;65:3993-7, 2005
【非特許文献９】Chu E.C., Chai J., Ahluwalia A., Tarnawski A.S., Aliment Pharmacol. Ther., 25:1443-9, 2007
【非特許文献１０】Luciani M.G., Campregher C., Fortune J.M., Kunkel T.A., Gasche C., Gastroenterology, 132:221-35, 2007
【非特許文献１１】Bos C.L., Diks S.H., Hardwick J.C., Walburg K.V., Carcinogenesis, 27:2371-82,2006
【非特許文献１２】Van de Wetering M., Sancho E., Verweij C., de Lau W., Oving I., Hurlstone A., van der Horn K., Batlle E., Coudreuse D., Haramis A.P., Tjon-Pon-Fong M., Moerer P., van den Born M., Soete G., Pals S., Eilers M., Medema R., Clevers H., Cell, 111:241-50, 2002
【非特許文献１３】Fevr T., Robine S., Louvard D., Huelsken J., Mol Cell Biol., 27:7551-9, 2007;
【非特許文献１４】Olmeda D., Castel S., Vilaro S., Cano A., Mol.Biol.Cell, 14:2844-60, 2003
【非特許文献１５】Aoki K. Aoki M. Sugai M. Harada N. Miyoshi H. Tsukamoto T. Mizoshita T. Tatematsu M. Seno H. Chiba T. Oshima M. Hsieh C.L., Taketo M.M., .Oncogene, 26:3511-20, 2007
【非特許文献１６】Palmer H.G., Gonzalez-Sancho J.M., Espada J., Berciano M.T., Puig I., Baulida J., Quintanilla M., Cano A., de Herreros A.G., Lafarga M., Munoz A., J. Cell Biol., 154:369-87, 2001
【非特許文献１７】Hou R., Liu L., Anees S., Hiroyasu S., Sibinga N.E., J. Cell Biol., 173:417-29, 2006
【非特許文献１８】Evans P.M., Liu C., Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghai), Jul.;40(7):554-64 Review, 2008
【非特許文献１９】Zhang W., Chen X., Kato Y., Evans P.M., Yuan S., Yang J., Rychahou P.G., Yang V.W., He X., Evers B.M., Liu C., Mol. Cell Biol., Mar;26(6):2055-64, 2006
【非特許文献２０】Schuster M.B., Porse B.T., Biochim. Biophys. Acta., Aug;1766(1):88-103. Epub. 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本特許において、我々は５−ＡＳＡのβ−カテニンシグナル経路を阻害する分子メカニズムの特性を、よりいっそう明らかにする目的で、ＣａＣｏ２ＣＲＣ細胞株に行った一連の実験結果を提示する。
【００１４】
得られた結果は、この作用が少なくとも部分的には、カドヘリン・スーパーファミリーに属するμ−プロカドヘリンと呼ばれる蛋白質の誘導を介していること、及び５−ＡＳＡで処理されたＣＲＣ細胞の細胞膜上へのβ−カテニンの捕捉を可能とすることを明確に示した。
【００１５】
本発明の効果
したがって、本発明の課題は、哺乳類、好ましくは罹患可能性のあるヒトに於いてＣＲＣの予防及び／又は治療に於ける５−ＡＳＡの薬効評価をインビトロ、エクスビボにおいて測定する方法を意味し、該方法は、５−ＡＳＡ存在下におけるβ−カテニン経路の阻害及び  独立した癌抑制遺伝子の発現の定量法を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
より詳細には、これは哺乳類に於いてＣＲＣの予防及び／又は治療に於ける５−ＡＳＡの薬効を、β−カテニンシグナル経路の制御に関与する少なくとも一つの遺伝子、及び他の癌抑制遺伝子の発現量を定量することにより測定する方法を意味する。
【００１７】
一つの実施形態では、前記方法は前記の少なくとも一つの遺伝子を前記哺乳類より単離する工程と、及び５−ＡＳＡの存在下と非存在下の両方において、それら遺伝子についての発現の定量する工程を含む。すなわち、もしも、５−ＡＳＡの存在における遺伝子の発現量が、非存在下におけるそれよりも高い場合には、そのような哺乳類では５−ＡＳＡがそれぞれＣＲＣの予防及び／又は治療において有効となる。
【００１８】
本発明の方法に適した好ましい遺伝子は、好ましくはμ−プロトカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、Ａｘｉｎ１、ＩＣＡＴ、ｐ２１waf-1、ＫＬＦ４及びＣＥＢＰαから選択される。
【００１９】
遺伝子の発現は、一般的に当業者において利用可能なＱＲＴ−ＰＣＲや免疫組織化学にしたがって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】５−ＡＳＡ処理されたＣａＣｏ２細胞におけるβ−カテニンシグナル経路に属する遺伝子のＱＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図であり、後記の結果において記載された実験条件下における細胞は、β−カテニンシグナル経路に属する遺伝子（すべてＹ軸上に示されている）のｍＲＮＡ発現を測定するため、ＱＲＴ−ＰＣＲにより解析された。ＫＬＦ４及びＣＥＢＰα癌抑制遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する５−ＡＳＡ処理によって評価された効果も示した。
【図２】５−ＡＳＡ処理されたＣａＣｏ２細胞におけるμ−プロトカドヘリン蛋白質の発現の経時ウェスタン・ブロット解析による評価の結果を示す図であり、この解析は、研究対象細胞の５−ＡＳＡ処理後、２４時間間隔で細胞質抽出液に対して実施された。解析した細胞試料は図の上に示した。それぞれのレーン内に充填された蛋白質量の標準化は、細胞質又は核内いずれかのアクチンを検出できるパン‐アクチン抗体（Ｐａｎ−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて実施した。
【図３】５−ＡＳＡ暴露処理されたＣａＣｏ２細胞におけるβ−カテニン蛋白質の蛍光抗体解析を示す図である。後記の結果のところで説明されるように５−ＡＳＡで刺激し、引き続き、抗β−カテニン一次抗体及びＦＩＴＣ複合体化二次抗体（緑色蛍光）にて染色した。無処理の対照細胞（ＣＯＮＴ．）もまた解析した。核はＤＡＰＩ（青色蛍光）を用いて対比染色した。二つの蛍光解析シグナルの重ね合わせ像も示す。
【図４】μ−プロトカドヘリン／β−カテニン蛋白質相互作用の共免疫沈降解析を示す図であり、この図は共免疫沈降解析結果を示し、５−ＡＳＡ処理されたＣａＣｏ２細胞におけるμ−プロトカドヘリン／β−カテニン蛋白質複合体の存在を証明する。μ−プロトカドヘリン発現のウェスタン・ブロット解析が、無処理対照細胞、及び５−ＡＳＡ処理ＣａＣｏ２細胞から得られた溶出液（インプット、左パネル）、正常対照ＩｇＧを用いて同じ細胞から得られた免疫沈降物（中央パネル）、及び抗β−カテニン抗体を用いて同じ細胞から得られた免疫沈降物（右パネル）で実施された。ＩＰは免疫沈降法、ＷＢはウェスタン・ブロット、Ａｂは抗体を示す。
【図５】ＨＴ２９結腸腺癌細胞株に対する５−ＡＳＡ処理によって測定された生物学的作用を示す図であり、ＨＴ２９細胞におけるβ−カテニンシグナル経路に属する遺伝子のｍＲＮＡ発現変動を、結果のところ及び図１に記載した実験条件におけるＱＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて解析した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
結果
５−ＡＳＡ処理に暴露されたＣａＣｏ２結腸腺癌細胞におけるβ−カテニンシグナル経路を制御する遺伝子の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析
我々の実験室において実施された予備実験では、５−ＡＳＡ処理がＣａＣｏ２細胞の増殖活性を抑制することを確認した。
【００２２】
我々は、この効果の根底にある分子メカニズムを検討するため、アフィメトリック方法論（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を用いてマイクロアレイ解析を実施し、２０ｍＭの５−ＡＳＡを９６時間処理することによってＣａＣｏ２細胞で確定されるトランスクリプトームの変化を評価した。 
得られた結果は、いくつかの癌抑制遺伝子の発現が増加する方向に制御されることを明らかにしていた。これは５−ＡＳＡによる抗増殖活性の誘発を潜在的に説明するものであり、それら遺伝子の中でも最も重要なのはμ−プロトカドヘリンに代表されるものであった。
【００２３】
この遺伝子はカドヘリン・スーパーファミリーのメンバーの一つをコードし、他の著者らによる以前の報告によると、β−カテニンシグナル経路すなわち、β−カテニン転写因子活性によって介在される細胞増殖経路の抑制物質と推測されるものである（非特許文献１６、１７）。
【００２４】
この発見の重要性は、β−カテニンシグナル経路は、ＣＲＣにおいて構成的に活性化されているということにある。
【００２５】
解析した細胞のうち５−ＡＳＡ処理によって、発現が増加方向に制御される他の癌抑制遺伝子としては、ＫＬＦ４やＣＥＢＰα転写因子が代表的であり、これらはかねてより一般的に上皮腫瘍細胞、特にＣＲＣ細胞の増殖抑制と関連づけられていた（非特許文献１８−２０）。
【００２６】
これらのデーターを検証するため、２０ｍＭの５−ＡＳＡによって４８時間、及び９６時間処理されたＣａＣｏ２細胞における、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）で解析した。
【００２７】
加えて、検討しているβ−カテニンシグナル経路に対する処理によって発現する機能効果の特徴をより一層明らかにするため、我々は他の以下に記す蛋白質をコードする遺伝子をも解析に含めた。
【００２８】
すなわち、経路の主要な構成成分であるβ−カテニンそのもの、β−カテニンを細胞膜上に捕捉する能力を有するＥ−カドヘリン、β−カテニン分解複合体を促進する能力のあるＡｘｉｎ１、核分画におけるβ−カテニンの転写阻害に関与するＩＣＡＴ、以前、増殖停止過程と関連づけられ、β−カテニンのネガティブターゲットであると実証されたｐ２１waf-1である。
【００２９】
μ−プロトカドヘリンは１２倍、ｐ２１waf-1は１６倍、ＫＬＦ４及びＣＥＢＰαは、４〜６倍、Ａｘｉｎ１とＩＣＡＴは２〜３倍のｍＲＮＡの発現の増加方向の制御が生じた。
【００３０】
最も顕著な発現変動は、結果的にμ−プロトカドヘリンとｐ２１waf-1遺伝子であった。このことは、採用した実験条件においてβ−カテニン経路が現実に阻害されていたことを示す。
【００３１】
これらの遺伝子の発現の増加方向の制御は刺激の最期（９６時間）において、より明白に現れた。Ｅ−カドヘリンとβ−カテニンのｍＲＮＡ発現は逆に影響は現れなかった（図１）。
【００３２】
５−ＡＳＡ処理されたＣａＣｏ２細胞におけるμ−プロトカドヘリン蛋白質発現のウエスタン・ブロット解析
μ−プロトカドヘリンの誘導を確認するため、我々は９６時間まで、２０ｍＭの５−ＡＳＡに暴露を受けてきたＣａＣｏ２細胞について、時間経過ウエスタン・ブロット解析を行った。
【００３３】
一連の実験結果は、μ−プロトカドヘリン蛋白質が徐々に、しかし顕著に、解析した細胞の細胞質抽出液で誘導されたことを証明した（図２）。
【００３４】
ＣａＣｏ２細胞におけるβ−カテニンの細胞内レベルに対する５−ＡＳＡ処理の効果
β−カテニンシグナル経路を調節する特定の制御メカニズムのため、異なる細胞内コンパートメントにおいて観察されるβ−カテニン蛋白質のレベルは、信頼のおけるその活性程度の指標を表す。
【００３５】
この前提に基づき、我々は、２０ｍＭの５−ＡＳＡ処理を受けているＣａＣｏ２細胞内におけるβ−カテニン蛋白質の分布を評価するため、蛍光抗体法を実施した。
【００３６】
得られた結果は、図３に提示され、９６時間の培養で、無処理の細胞ではβ−カテニンシグナルが核に局在し、細胞質にはより少ない一方で、５−ＡＳＡ処理細胞では、それはほぼ例外なく細胞膜に局在したという明白な証明を提供した。
【００３７】
したがって、この一連の実験は、ＣａＣｏ２細胞の５−ＡＳＡ処理が、処理細胞の細胞膜にβ−カテニン蛋白質を隔離することによって、β−カテニン蛋白質の核内移行を妨害することを示唆していた。
【００３８】
μ−プロトカドヘリン／β−カテニン蛋白質相互作用の共免疫沈降解析
我々のデーターから生じつつある仮説は、μ−プロトカドヘリンが、カドヘリンファミリーに属する他の蛋白質と同様に、β−カテニンを細胞膜上に結合できることを直接的に意味するだろう。
【００３９】
この相互作用を検証するため、共免疫沈降実験を実施し、該実験において９６時間、２０ｍＭの５−ＡＳＡで処理されたＣａＣｏ２細胞の細胞可溶化液から、特異抗体を用いてβ−カテニンを免疫沈降させ、引き続き、μ−プロトカドヘリンを検出することのできる全く別の抗体を用いて免疫沈降物のウェスタン・ブロット解析を行った。
【００４０】
この方法を用いることにより、我々は５−ＡＳＡ処理されたＣａＣｏ２細胞において、β−カテニンと相互作用するそれぞれ９３、及び１１０ｋＤａの２つの免疫活性のあるμ−プロトカドヘリン・バンドの存在を証明することができた（図４）。
【００４１】
興味深いことに、以前、他の著者らによって  ９３ｋＤａの野生型の蛋白質の糖化型であると認められた１１０ｋＤａの形態はもっぱらβ−カテニン免疫沈降物に認められ、その一方で対照試料では検出不能であった（図４）。この知見は１１０ｋＤａ型μ−プロトカドヘリンは、β−カテニンに優先的に結合することを特徴とする野生型蛋白質の翻訳後修飾型であることを示唆した。
【００４２】
結腸腺癌細胞株ＨＴ２９の５−ＡＳＡ処理で促進される生物学的作用の解析
これらの知見は、もう一つの結腸腺癌細胞株であるＨＴ２９細胞においても、同様の実験条件下で確認された。
【００４３】
図５に示すように、ＨＴ２９細胞の９６時間、２０ｍＭの５−ＡＳＡ処理によって、μ−プロトカドヘリンン及びｐ２１waf-1のｍＲＮＡの発現が、ＱＲＴ−ＰＣＲによって評価したところ、それぞれ３倍及び５倍に誘導される結果となった。
【００４４】
これらの実験は、検出された作用があまり明白な変動でないにもかかわらず、ＨＴ２９細胞の５−ＡＳＡに対する反応は実質的にＣａＣｏ２細胞におけるものに匹敵することを結果的に示した。
【実施例】
【００４５】
［実施例１］
定量リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析（ＱＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡは、細胞懸濁液及び凍結組織から、キアゲン全ＲＮＡ精製キットを用いて取扱説明書の推奨（Ｑｉａｇｅｎ, Ｖａｌｅｎｃｉａ, ＣＡ）に従い抽出された。    
ＲＮＡの完全性及び濃度は、Ｂｉｏ−Ａｎａｌｙｚｅｒ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて確認された。１００ｎｇの全ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてメーカーの取扱説明書にしたがって逆転写された。試料中のｍＲＮＡの相対量を定量するため、ＡＢＩのＰＲＩＳＭ  ７９００シークエンス検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）によってＱＲＴ−ＰＣＲが実施された。
【００４６】
μ−プロトカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、Ａｘｉｎ１、β−カテニン阻害物質及びＴＣＦ−４（ＩＣＡＴ）、ｐ２１waf-1ＫＬＦ４、ＣＥＢＰα及びグリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ増幅用のプライマー及びプローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍによって設計された。それぞれのｃＤＮＡ試料は、タックマン（Ｔａｑｍａｎ）のユニバーサルＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、５０μＬの反応容量で３回重複して実行された。熱サイクリングは５０℃での初期変性を、２分間、及び９５℃、１０分間で開始され、続いて９５℃、１５秒及び６０℃、１分間の４０サイクルでなされた。ＱＲＴ−ＰＣＲシグナルの評価は、ΔΔＣｔ相対定量法を用いて実施した。
【００４７】
その手順は、対象遺伝子の遺伝子発現の相対変化を、内在性の対照（ＧＡＰＤＨ）に対し標準化し、校正物質と比較して算出した。
【００４８】
得られた数値はｍＲＮＡのレベル変動相対量（ＲＱ）を単位として表した。
【００４９】
［実施例２］
免疫組織化学アッセイによるμ−プロトカドヘリン発現の解析
試料切片（４μｍ）をパラフィンブロックより切りだし、標準方法によって脱パラフィンした。簡潔に記載すると、脱パラフィンはキシロールで行い、切片はエタノールから水までを段階的に用いて再水和し、メタノール−過酸化水素（６％）溶液で１５分間処理した。次に切片はＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いて３回洗浄し、抗μ―プロトカドヘリン一次抗体（ウサギ抗ｍｕｃｄｈｌ抗体、Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  ＨＰＡ００９１７３）で室温にてインキュベートした。該抗体はビオチン化抗ウサギ二次抗体、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ペルオキシダーゼ複合体、及び色素原としてジアミノベンジジンを加えて検出した。切片（スライド）は次いでヘマトキシリン対比染色した。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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