(57)【要約】【課題】  非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列であって、Ｔｈ１型免疫活性化、サイトカイン産生、ＮＫ溶解活性、およびＢ細胞増殖を刺激することを含む、免疫反応を調節する核酸配列を提供すること。【解決手段】  少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして式：５’Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２３’（式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１はアデニン、グアニンまたはチミンであり；Ｘ２はシトシンまたはチミンであり；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約０−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である）を有する、単離核酸配列。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非げっ歯類被験体において喘息を処置または予防するための組成物であって、該被験体において喘息を処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該被験体は、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に抗原を投与されない、組成物。
【請求項２】
被験体において喘息を処置または予防するための組成物であって、該被験体において喘息を処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該組成物が、ＣｐＧ免疫刺激性核酸が経口投与されるように処方される、組成物。
【請求項３】
被験体においてアレルギーを処置または予防するための組成物であって、該被験体おいてアレルギーを処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該アレルギーがアレルギー性喘息ではない、組成物。
【請求項４】
前記被験体が、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に外因性アレルゲンを投与されない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
被験体において細胞障害性リンパ球応答を誘導するための組成物であって、該被験体において細胞障害性リンパ球応答を誘導するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含む、組成物。
【請求項６】
被験体において固形腫瘍を処置するための組成物であって、該被験体において固形腫瘍を処置するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量および該被験体においてＡＤＣＣを誘導するための抗体を含む、組成物。
【請求項７】
被験体において癌を処置するための組成物であって、該組成物は、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を含み、ここで、被験体は、癌の化学治療剤または免疫治療剤を、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と一緒にか、またはＣｐＧ免疫刺激性核酸を投与する前に投与される、組成物。
【請求項８】
被験体において骨髄の発達を増強するための組成物であって、該被験体において骨髄の発達を増強するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含む、組成物。
【請求項９】
前記被験体が、前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸と一緒にか、またはＣｐＧ免疫刺激性核酸を投与する前に化学治療剤に曝露される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
骨髄の発達を増強するための組成物であって、該組成物は、骨髄の発達を増強するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含む、組成物。
【請求項１１】
被験体において癌を処置するための組成物であって、該被験体において癌を処置するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量、および該被験体においてＡＤＣＣを誘導するための抗体を含み、ここで、該癌はリンパ腫ではない、組成物。
【請求項１２】
前記ＣｐＧ刺激性核酸が、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＣｐＧ刺激性核酸がＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴまたはＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が安定化される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、少なくとも１つのリン酸バックボーン修飾により安定化される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、経口、経皮、皮下、静脈内、非経口、腹腔内または鞘内に投与される、請求項１〜９および１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記被験体がヒトである、請求項１〜９および１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記被験体が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、またはサルである、請求項１〜９および１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、ステロール、陽イオン脂質、ヴィロソーム、またはリポソームとともに処方される、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、少なくとも以下の式：
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む配列を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物であって、ここで、Ｃは、非メチル化Ｃであり、Ｘ１Ｘ２およびＸ３Ｘ４はヌクレオチドであり、該核酸は８〜３０ヌクレオチドの長さであり、そして以下：
ＡＣＣＧＡＴＧＡＣＧ  ＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡ  ＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣ  ＣＡＣＣＧＴＧＣＴＧ、
ＡＣＣＧＡＴＧＡＣＴ  ＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＧＡＣＧ  ＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧ  ＧＴＧＡＣＧＧＣＡＣ  ＣＡＣＧＡＣＣＧＡＴ、
ＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧ  ＡＴＧＡＣＧＴＣＧＣ  ＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣ、
ＡＣＣＧＡＴＡＡＣＧ  ＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＧＣＧ  ＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧ  ＧＡＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＧＡＣＧ  ＴＣＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＣＧＡＴ  ＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＡＴＣＧ  ＡＴＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＴＣＧＣ  ＧＡＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＧＣＧＣ  ＧＣＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＣＧＴＡ  ＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣ  ＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡ  ＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ、
ＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧ  ＧＧＧＡＣＧＴＣＴＴ  ＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡ、
ＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧ  ＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴ  ＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡ、
ＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧ  ＣＧＧＡＣＧＴＣＣＧ  ＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡ、
ＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧ  ＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴ  ＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡ、
ＴＧＡＣＡＧＡＣＣＧ  ＡＴＧＡＣＧＴＣＧＣ  ＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧ、
ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧ  ＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡ  ＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣ、
ＣＡＣＧＴＧＣＡＣＧ  ＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡ  ＣＧＴＧＣＡＣＧＴＧ、
ＡＡＣＧＴＴＡＡＣＧ  ＴＴＡＡＣＧＴＴＡＡ  ＣＧＴＴＡＡＣＧＴＴ、
ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ、
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ  ＧＧＧＡＣＧＴＣＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＧＡＣＧＴＣＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＧＡＣＧＴＣＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ、
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ  ＣＣＧＡＣＧＴＣＣＣ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ、
ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＧＣＧＡＣＧＴＣＧＣ  ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ、
ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ  ＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡ  ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ、
ＡＣＣＧＡＴＣＧＡＴ  ＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＴＣＧ  ＡＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＴＣＧＣ  ＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＧＣＧＣ  ＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡ  ＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＧＣＧ  ＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＣＧＧＣ  ＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＧＴＣＧ  ＡＣＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＣＧＣ  ＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＡＧＣ  ＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＴＴＡＴ  ＡＡＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＴＡＴＡ  ＴＡＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＧＴＡ  ＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＧＡＡＴ  ＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＣＴＧＣ  ＡＧＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
ＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴ  ＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧおよび、ＡＣＣＧＡＴＣＣＴＡ  ＧＧＧＣＣＧＧＴＧＡ  ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ、
の配列のいずれでもない、組成物。
【請求項２１】
Ｘ１Ｘ２がＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＴまたはＡｐＡであり；Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＴまたはＣｐＴである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｘ１Ｘ２がＧｐＡであり、そしてＸ３Ｘ４がＴｐＴである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記核酸が、５’末端および３’末端にポリＧ配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸が、該核酸の３’末端に少なくとも２つのホスホロチオエート結合、および該核酸の５’末端に少なくとも５つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、８〜４２のヌクレオチドの長さである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、８〜３０のヌクレオチドの長さである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（免疫刺激性核酸分子）
本発明に帰着する研究は、一部、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の補助金第Ｒ２９−ＡＲ４２５５６−０１号により補助されている。米国政府が、本発明のある権利に対し権利を有する可能性がある。
【０００２】
本発明は、一般的にオリゴヌクレオチド、そしてより詳細には、免疫刺激性である、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
１９７０年代、数人の研究者が、細胞膜に高分子量のＤＮＡが結合することを報告した（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．ら，１９７１．”Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６８：１２１２；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｒ．Ｗ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｐ．Ｋ．ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，およびＢ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ．１９７５．”Ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｄｅ  ｖｉｓｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：９２８）。１９８５年、ＢｅｎｎｅｔｔらはＤＮＡがリンパ球に結合するのはリガンドと受容体の相互作用に似ているという最初の証拠を示した：結合は、飽和性で、競合し、そしてＤＮＡエンドサイトーシスおよびオリゴヌクレオチドへの分解につながるというものである（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｇ．Ｔ．Ｇａｂｏｒ，およびＭ．Ｍ．Ｍｅｒｒｉｔｔ．１９８５．”ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ”．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２）。ＤＮＡ同様、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）は、飽和性、配列独立性、そして温度およびエネルギー依存性に、細胞中に進入することが可能である（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｗ．，およびＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ．１９９１．”Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６：２３５に総論；Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．，Ｙ．Ｓｈｏｊｉ，およびＲ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ．１９９２．”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈａｒａｃ  ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ．Ｒ．Ｐ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，およびＪ．Ｇ．Ｉｚａｎｔ，監修，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．ニューヨーク中，ｐｐ．１３３；およびＺｈａｏ，Ｑ．，Ｔ．Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｈｅｒｒｅｒａ，およびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ．，１９９４．”Ｓｔａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ
Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ”．Ｂｌｏｏｄ．８４：３６６０）。ＤＮＡまたはＯＤＮ取りこみに対する受容体はまだクローンされていないし、そしてＯＤＮ結合および細胞取りこみが、高分子量ＤＮＡのものと同じまたは異なる機構を通じて起こるのかはまだ明確でない。
リンパ球のＯＤＮ取りこみは、細胞活性化により制御されることが示されてきた。Ｂ細胞分裂促進剤（ｍｉｔｏｇｅｎ）ＬＰＳにより刺激された脾臓細胞はＢ細胞集団中で劇的にＯＤＮ取りこみを亢進する一方、Ｔ細胞分裂促進剤Ｃｏｎ  Ａで処理した脾臓細胞はＴ細胞によるＯＤＮ取りこみ亢進を示したがＢ細胞では示さなかった（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｆ．Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ，Ｍ．Ｆ．Ｇｏｕｒｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．Ｋｉｓｃｈ，Ｌ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ，およびＡ．Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ．１９９１．”Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ”．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １：１６１）。
【０００４】
いくつかのポリヌクレオチドは、生物学的反応修飾因子として広く評価されてきた。おそらく最適な例は、ＩＦＮ産生の強力な誘発剤であると共に、マクロファージ活性化剤およびＮＫ活性誘発剤である、ポリ（Ｉ，Ｃ）である（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ａｄａｍｓ，Ｈ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｌｅｎｚ，Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅ．Ｓｃｈｌｉｃｋ，Ｒ．Ｒｕｆｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，およびＭ．Ａ．Ｃｈｉｒｉｇｏｓ．１９８５．”Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：１０５８；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．，Ｒ．Ｒ．Ｓａｌｕｐ，Ｔ．Ａ．Ｔｗｉｌｌｅｙ，およびＪ．Ｅ．Ｔａｌｍａｄｇｅ．１９８５．”Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．４：５１２；Ｋｒｏｗｎ，Ｓ．Ｅ．１９８６．”Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”．Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．１３：２０７；およびＥｗｅｌ，Ｃ．Ｈ．，Ｓ．Ｊ．Ｕｒｂａ，Ｗ．Ｃ．Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ  ＩＩ，Ｒ．Ｇ．Ｓｔｅｉｓ，Ｊ．Ｌ．Ｒｏｓｓｉｏ，Ｄ．Ｌ．Ｌｏｎｇｏ，Ｍ．Ｊ．Ｊｏｎｅｓ．Ｗ．Ｇ．Ａｌｖｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．Ｐｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，Ｋ．Ｌ．ＭｃＮｉｔｔ，およびＳ．Ｐ．Ｃｒｅｅｋｍｏｒｅ．１９９２．”Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｌｉｎｌｃａｌ  ａｎｄ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ”．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５２：３００５）。このネズミＮＫ活性化は、もっぱらＩＦＮ−β分泌の誘発によるものであるらしい（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．，およびＣ．Ａ．Ｂｉｒｏｎ．１９９３．”ＩＦＮ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｒｉｏｎ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３７１３）。この活性化は、デオキシリボースが効果を持たないため、リボース糖に特異的なものである。強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性があることから、ポリＬ−リジンおよびカルボキシメチルセルロース（ＲＮＡｓｅによる分解を減少させるため）と複合体を形成したポリ（Ｉ，Ｃ）を用いたいくつかの臨床試験が行われた（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，ら，１９８５．上に引用；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．，ら，１９８５．上に引用；Ｋｒｏｗｎ，Ｓ．Ｅ．，１９８６．上に引用；およびＥｗｅｌ，Ｃ．Ｈ．，ら，１９９２．上に引用）。不運なことに、これまで、ポリ（Ｉ，Ｃ）が���用な治療剤となるのを毒性副作用が阻んできた。
【０００５】
Ｃ８位において、臭素またはチオール基により置換されたグアニンリボヌクレオチドは、Ｂ細胞分裂促進剤であり、そして「Ｂ細胞分化因子」と置き換えてもよい（Ｆｅｌｄｂｕｓｈ，Ｔ．Ｌ．，およびＺ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ．１９８５．”Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ８−ｍｅｒｃａｐｔｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：３２０４；およびＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｇ．１９８６．”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ
ｓｙｎｅｒｇｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  Ｃ８−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｄｕｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ８−ｍｅｒｃａｐｔｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３３３５）。８−メルカプトグアノシンおよび８−ブロモグアノシンもまた、ＭＨＣ制限ＣＴＬの生成に対するサイトカイン要求と置き換えてもよく（Ｆｅｌｄｂｕｓｈ，Ｔ．Ｌ．，１９８５．上に引用）、ネズミＮＫ活性を増大させ（Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．，Ｍ．Ｅ．Ｊｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｍａｎｙａｋ，Ｎ．Ｈ．Ｓｉｇａｌ，およびＬ．Ｓ．Ｗｉｃｋｅｒ．１９８８”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ８−ｂｒｏｍｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３２４９）、そしてネズミＬＡＫ生成を誘発する際、ＩＬ−２と相乗作用を示す（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，およびＺ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ．１９９０．”Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）ｃｅｌｌｓ．Ｖ．８−Ｍｅｒｃａｐｔｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ａｓ  ａｎ  ＩＬ−２−ｓｐａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｉｎ  ＬＡＫｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３５２４）。これらＣ８置換グアノシンがＮＫおよびＬＡＫ活性を増大させるのは、これらがＩＦＮを誘導することによるらしい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，ら．１９９０．上に引用）。最近、ミコバクテリウム（ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により産生される５’三リン酸化チミジンが、ヒトγδＴ細胞サブセットに対し分裂促進作用を持つことが見出された（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｐ．，Ｆ．Ｄａｖｏｄｅａｕ，Ｍ．−Ａ．Ｐｅｙｒａｔ，Ｙ．Ｐｏｑｕｅｔ，Ｇ．Ｐｕｚｏ，Ｍ．Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ，およびＪ．−Ｊ．Ｆｏｕｒｎｉｅ．１９９４”Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  γδ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｉｃ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：２６７）。この報告は、免疫系が細菌核酸に対し優先して反応する方法を発展させてきた可能性があることを示している。
【０００６】
いくつかの観察により、ある種のＤＮＡ構造もまた、リンパ球を活性化させる能力がある可能性が示唆された。例えば、Ｂｅｌｌらは、脾臓細胞上清中の、ヌクレオソームタンパク質ＤＮＡ複合体がＢ細胞増殖および免疫グロブリン分泌を引き起こす（露出した（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡはしない）ことを報告した（Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｂ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，およびＰ．ＶａｎｄｅｎＢｙｇａａｒｔ．１９９０．”Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ＤＮＡ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ”．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１４８７）。他の場合では、露出したＤＮＡが免疫作用を有することが報告されている。例えば、Ｍｅｓｓｉｎａらは最近、２６０から８００ｂｐのポリ（ｄＧ）・（ｄＣ）およびポリ（ｄＧ・ｄＣ）断片はＢ細胞に対し分裂促進作用があることを報告している（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｇ．Ｓ．Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，およびＤ．Ｓ．Ｐｉｓｅｔｓｋｙ．１９９３．”Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ”．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１４８）。Ｔｏｋｕｎａｇａらは、ｄＧ・ｄＣは、γ−ＩＦＮおよびＮＫ活性を誘導することを報告している（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，およびＫ．Ｎａｍｂａ．１９８８．”Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ，ｐｏｌｙ（ｄＧ，ｄＣ），ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α／ｂ  ａｎｄ−ｇ，ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ”Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：６８２）。こうした人工的ホモポリマー配列のほかに、Ｐｉｓｅｔｓｋｙらは純粋な哺乳動物ＤＮＡは検出可能な免疫作用を持たないが、ある種の細菌由来のＤＮＡは、Ｂ細胞活性化および免疫グロブリン分泌を誘導することを報告した（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｇ．Ｓ．Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，およびＤ．Ｓ．Ｐｉｓｅｔｓｋｙ．１９９１．”Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９）。これらのデータがある異常な混入物質に起因するものでないと仮定すると、これらの研究により、細菌ＤＮＡの特定の構造または他の特性がＢ細胞活性化を誘発することを可能にしていることが示唆される。ミコバクテリウムＤＮＡ配列の研究により、ある種のパリンドローム配列を含むＯＤＮがＮＫ細胞を活性化することが可能であることが立証されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｅ．Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｙａｎｏ，およびＴ．Ｔｏｋｕｎａｇａ．１９９２．”Ｕｎｉｑｕｅ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩＮＦ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔ  ＩＮＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２；Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｅ．，Ｏ．Ｙａｎｏ，Ｙ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｂａｂａ，Ｔ．Ｍａｋｉｎｏ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ，およびＴ．Ｔｏｋｕｎａｇａ．１９９２．”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８３：１１２８）。
【０００７】
いくつかのホスホロチオエート修飾ＯＤＮは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＢ細胞刺激を誘導することが報告されている（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｃ．Ｃ．Ｃｈｕ，およびＷ．Ｅ．Ｐａｕｌ．１９９２．”Ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｉｇ２ｂ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｇ２ｂ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ”．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：５９７；Ｂｒｅｎｄａ，Ｒ．Ｆ．，Ａ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅ，Ｌ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｊ．ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，およびＧ．Ｚｏｎ．１９９３．”Ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｖ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ＨＩＶ−１”．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：２０３７；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ，Ｋ．Ｗ．，Ｋ．Ｌｏｍｂａｒｄ−Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｊ．Ｒ．Ｐｅｒｅｚ，Ｃ．Ｋｕｎｓｃｈ，Ｕ．Ｍ．Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｊ．Ｄ．Ｌａｒｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．Ｌａｎｄｒｅｔｈ，およびＲ．Ｎａｒａｙａｎａｎ．１９９３．”Ａ  ｓｅｎｓｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−κＢ  Ｔ６５  ｃａｕｓｅｓｓｅ  ｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ”．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：３０９；およびＰｉｓｅｔｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，およびＣ．Ｆ．Ｒｅｉｃｈ．１９９３．”Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ”Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５４：１０１）。これらの報告は、これらのＯＤＮの作用を説明するかもしれない共通する構造モチーフまたは配列要素を示唆していない。
【０００８】
ｃＡＭＰ反応要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および活性化転写因子（ＡＴＦ）または転写因子のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーは、普遍的に発現される種類の転写因子であり、これまでに１１のメンバーがクローンされている（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，Ｒ．Ｔ．，およびＰ．Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ：”Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ”．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．７：１４５，１９９３；Ｌｅｅ，Ｋ．Ａ．Ｗ．，およびＮ．Ｍａｓｓｏｎ：”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＥＢ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ”．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１７４：２２１，１９９３に総論）。これらはすべて塩基性領域／ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）クラスのタンパク質に属する。すべての細胞は、１つまたはそれ以上のＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質を発現しているようであるが、発現されるメンバーおよびｍＲＮＡスプライシング制御は組織特異的であるようである。活性化ドメインの差別的スプライシングにより、特定のＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質が転写阻害剤となるか活性化剤となるかが決定される可能性がある。多くのＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質はウイルス転写を活性化するが、活性化ドメインを欠失したスプライシング多様体のいくつかは、阻害作用を持つ。ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質はｃＡＭＰ反応要素であるＣＲＥを通じてホモまたはヘテロ二量体としてＤＮＡに結合することが可能である。ＣＲＥのコンセンサス型は、非メチル化配列ＴＧＡＣＧＴＣである（ＣｐＧがメチル化されていると結合はなくなる）（Ｉｇｕｃｈｉ−Ａｒｌｇａ，Ｓ．Ｍ．Ｍ．，およびＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ：”ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＴＧＡＣＧＴＣＡ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：６１２，１９８９）。
【０００９】
ＣＲＥの転写活性はＢ細胞活性化中に増加する（Ｘｌｅ，Ｈ．Ｔ．Ｃ．Ｃｈｉｌｅｓ，およびＴ．Ｌ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ：”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ”．Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：８８０，１９９３．）。ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、ＣＲＥを通じ、ｆｏｓ、ｊｕｎ  Ｂ、Ｒｂ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１（Ｔｓｕｋａｄａ，Ｊ．，Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｗ．Ｒ．Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．Ｗｅｂｂ，およびＰ．Ｅ．Ａｕｒｏｎ：”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＮＦ−ＩＬ６  ａｎｄ  ＣＲＥＢ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｇｅｎｅ”．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７２８５，１９９４；Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｄ．，Ｏ．Ｍ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｄ．Ｈｅｂｅｌ，Ｍ．Ｒｏｏｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐｏｗ−Ｓａｎｇ，およびＥ．Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ：”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ”．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：５７７，１９９３）、ＩＦＮ−（Ｄｕ，Ｗ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：”Ａｎ  ＡＴＦ／ＣＲＥＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｂ  ｇｅｎｅ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２１５０，１９９２）、ＴＧＦ−１（Ａｓｉｅｄｕ，Ｃ．Ｋ．，Ｌ．Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｋ．Ａｓｓｏｉａｎ，Ｍ．Ｅｈｒｌｉｃｈ：”Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＡＰ−１／ＣＲＥＢ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｆ  ＭＤＢＰ  ｔｏ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｓｉｔｅｓ  ｄｏｗｎ  ｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−Ｂ１
ｇｅｎｅ”．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２１９：５５，１９９４．）、ＴＧＦ−２、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｃｏｘ，Ｐ．Ｍ．，およびＣ．Ｒ．Ｇｏｄｉｎｇ：”Ａｎ  ＡＴＦ／ＣＲＥＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＤＲａｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＳＶ４０  Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ”．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４８８１，１９９２．）、Ｅ−セレクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ−８、生殖系列Ｉｇ定常領域遺伝子、ＴＣＲのＶ遺伝子、および増殖細胞核抗原（Ｈｕａｎｇ，Ｄ．，Ｐ．Ｍ．Ｓｈｉｐｍａｎ−Ａｐｐａｓａｍｙ，Ｄ．Ｊ．Ｏｒｔｅｎ．Ｓ．Ｈ．Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，およびＭ．Ｂ．Ｐｒｙｓｔｏｗｓｋｙ：”Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ−ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓ  ｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＣＲＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４２３３，１９９４．）などの免疫学的に重要な遺伝子を含む、複数の遺伝子発現を制御するようである。ｃＡＭＰ経路を通じた活性化に加え、ＣＲＥＢはまた、転写反応を仲介し、細胞内Ｃａ濃度を変化させることが可能である（Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ，およびＭ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ：”Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃ−ｆｏｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ”．Ｎｅｕｒｏｎ  ４：５７１，１９９０）。
【００１０】
ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質による転写活性化において、タンパク質−タンパク質相互作用の役割は、非常に重要であるらしい。ＮＦκＢタンパク質およびＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質の間の直接または間接的相互作用を報告する、いくつかの公表された研究がある（Ｗｈｉｔｌｅｙ，ら，（１９９４）Ｍｏｌ．＆  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：６４６４；Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，ら，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５３：７１２；Ｈｉｎｅｓ，ら，（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
８：３１８９；およびＤｕ，ら，（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７４：８８７．）。環状ＡＭＰ経路を通じたＣＲＥＢの活性化は、ＣＲＥＢのＳｅｒをリン酸化し、そして最近クローンされたタンパク質ＣＢＰとの結合を可能にする、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を必要とする（Ｋｗｏｋ，Ｒ．Ｐ．Ｓ．，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｊ．Ｃ．Ｃｈｒｉｖｉａ，Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｈ．Ｐ．Ｂａｃｈｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｇ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，およびＲ．Ｈ．Ｇｏｏｄｍａｎ：”Ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＢＰ  ｉｓ  ａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ”．Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：２２３，１９９４；Ａｒｉａｓ，Ｊ．，Ａ．Ｓ．Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｆ．Ｘ．Ｃｌａｒｅｔ，Ｔ．Ｓｍｅａ，Ｍ．Ｋａｒｉｎ，Ｊ．Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ，およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ：”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＡＭＰ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｌｉｅｓ  ｏｎ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ”．Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：２２６，１９９４．）。ＣＢＰはその後、転写を増加させる基本的な転写因子ＴＦＩＩＢと相互作用する。ＣＲＥＢはまた、ＴＡＴＡ結合タンパク質関連因子であり、その結合により転写を制御する可能性がある、ｄＴＡＦＩＩ１１０と相互作用することも報告されている（Ｆｅｒｒｅｒｌ，Ｋ．，Ｇ．Ｇｉｌｌ，およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ：”Ｔｈｅ  ｃＡＭＰ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＦＩＩＤ  ｃｏｍｐｌｅｘ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２１０，１９９４．）。これらの相互作用に加え、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、複数の他の核因子に特異的に結合することが可能である（Ｈｏｅｍｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｗ．Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ，およびＣ．−Ｙ．Ｃｈｅｎ：”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−２  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５：２５６，１９９１）が、これらの相互作用のほとんどに関し、生物学的重要性は未知である。ＣＲＥＢは通常、ホモ二量体またはいくつかの他のタンパク質と共にヘテロ二量体として、ＤＮＡと結合すると考えられている。驚くべきことに、ＣＲＥＢ単量体は、常に転写を活性化する（Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｗ．，およびＫ．Ａ．Ｗ．Ｌｅｅ：”Ａ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ
ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ”．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７２０４，１９９４．）。
【００１１】
細胞転写を制御する重要な役割とは別に、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質が、ウイルス複製に該タンパク質を必要とする、いくつかの感染性ウイルスおよびレトロウイルスにより機能を損なわれる（ｓｕｂｖｅｒｔｅｄ）ことが、最近示されている。例えば、サイトメガロウイルス極初期プロモーターは、最も強い既知の哺乳動物プロモーターの１つであるが、プロモーター機能に必須である１１コピーのＣＲＥを含む（Ｃｈａｎｇ，Ｙ．−Ｎ．，Ｓ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｋ．−Ｔ．Ｊｅａｎｇ，およびＧ．Ｓ．  Ｈａｙｗａｒｄ：”Ｔｈｅ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｉ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｍｉａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｅｈａｖｅ
ａｓ  ｂｏｔｈ  ｓｔｒｏｎｇ  ｂａｓａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ”．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２６４，１９９０）。多くのプロモーターを誘導するアデノウイルスＥＩＡタンパク質の、少なくともいくつかの転写活性化作用は、ＥＩＡ誘導可能転写活性化を仲介するＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質であるＡＴＦ−２のＤＮＡ結合ドメインにＥＩＡタンパク質が結合することによる（Ｌｉｕ，Ｆ．，およびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ：”Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１ａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ”．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：５２０，１９９４）。また、ＥＩＡがＣＲＥＢ結合タンパク質であるＣＢＰと結合することも示唆されている（Ａｒａｎｙ，Ｚ．，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，およびＲ．Ｅｃｋｎｅｒ：”Ｅ１Ａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐ３００  ａｎｄ  ＣＲＥＢ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＣＢＰ  ｂｅｌｏｎｇ  ｔｏ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ”．Ｃｅｌｌ  ７７：７７９，１９９４）。ヒトＴ細胞白血病および熱帯性痙攣麻痺（ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｐａｒｅｓｉｓ）を引き起こすレトロウイルスである、ヒトＴリンパ指向性ウイルスＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）もまた、複製にＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質を必要とする。この場合、該レトロウイルスはＴａｘというタンパク質を産生し、これがＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質に結合し、そしてこれらをその正常細胞結合部位とは異なる、ＨＴＬＶ転写エンハンサー内に存在するＤＮＡ配列（ＧおよびＣリッチ配列が隣接する）へと結合部位を変えさせる（Ｐａｃａ−Ｕｃｃａｒａｌｅｒｔｋｕｎ，Ｓ．，Ｌ．−Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｎ．Ａｄｙａ，Ｊ．Ｖ．Ｃｒｏｓｓ，Ｂ．Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｂｏｒｏｓ，およびＣ．−Ｚ．Ｇｉａｍ：”Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｈｉｇｈ  ｌｙｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｔａｘ”．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４５６，１９９４；Ａｄｙａ，Ｎ．，Ｌ．−Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｉ．Ｂｏｒｏｓ，およびＣ．−Ｚ．Ｇｉａｍ：
”Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ’ｓＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  Ｔａｘ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ  ａｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ２８２−２８４  ｎｅａｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５６４２，１９９４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ  ９５／２６２０４
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２
【００１４】
【非特許文献２】Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｅら、１９９２，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８３：１１２８
【００１５】
【非特許文献３】Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ら、１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：５９７
【００１６】
【非特許文献４】Ｂｒｅｎｄａ，Ｒ．Ｆ．ら、１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：２０３７
【００１７】
【非特許文献５】Ｍｃｌｎｔｙｒｅ，Ｋ．Ｗ．ら、１９９３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：３０９
【００１８】
【非特許文献６】Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら、１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２４４８
【００１９】
【非特許文献７】Ｋｒｉｅｇ，Ａ．ら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列であって、Ｔｈ１型免疫活性化、サイトカイン産生、ＮＫ溶解活性、およびＢ細胞増殖を刺激することを含む、免疫反応を調節する核酸配列を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして式：
５’Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２３’  
（式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１はアデニン、グアニンまたはチミンであり；Ｘ２はシトシンまたはチミンであり；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約０−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である）を有する、単離核酸配列である。
【００２２】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＸ１がチミンである。
【００２３】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＸ２がチミンである。
【００２４】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＧＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）ＴまたはＴＧＡＣＧＴＴである。
【００２５】
好適な実施形態では、上記核酸配列の配列がＴＧＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）Ｔである。
【００２６】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴである。
【００２７】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴである。
【００２８】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴである。
本発明はまた、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして式：
５’Ｎ１Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｎ２３’  
（式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１Ｘ２はＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＴおよびＡｐＡからなる群より選択され；Ｘ３Ｘ４はＴｐＴまたはＣｐＴからなる群より選択され；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約Ｏ−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である）を有する、単離核酸配列である。
【００２９】
好適な実施形態では、上記核酸配列の少なくとも２つの連続するＣｐＧを分離するヌクレオチドがチミンである。
【００３０】
好適な実施形態では、上記核酸配列のＸ３およびＸ４がチミンである。
【００３１】
好適な実施形態では、上記核酸配列の少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸バックボーン修飾を有する。
【００３２】
好適な実施形態では、上記核酸配列のリン酸バックボーン修飾がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である。
【００３３】
好適な実施形態では、上記核酸配列のリン酸バックボーン修飾が核酸の５’端で起こる。
【００３４】
好適な実施形態では、上記核酸配列の前記修飾が核酸の５’端の最初の２つのヌクレオチド間結合で起こる。
【００３５】
好適な実施形態では、上記核酸配列のリン酸バックボーン修飾が核酸の３’端で起こる。
【００３６】
好適な実施形態では、上記核酸配列の前記修飾が核酸の３’端の最後の５つのヌクレオチド間結合で起こる。
本発明はまた、患者における免疫活性化を刺激する方法であって、該刺激が主にＴｈ１型免疫活性化であり、上記の式を有する核酸配列を該患者に投与することを含む。
【００３７】
好適な実施形態では、患者がヒトである。
【００３８】
好適な実施形態では、患者におけるサイトカイン産生を刺激する方法であって、上記の式を有する核酸配列を該患者に投与することを含む。
【００３９】
好適な実施形態では、分泌されるサイトカインが：ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。
【００４０】
好適な実施形態では、患者がヒトである。
【００４１】
好適な実施形態では、核酸配列が：
【化１】
2010150280.tif 000002
からなる群より選択される。
【００４２】
好適な実施形態では、患者におけるＮＫ溶解活性を刺激する方法であって、上記の式を有する核酸配列を該患者に投与することを含む。
【００４３】
好適な実施形態では、患者がヒトである。
【００４４】
好適な実施形態では、核酸配列が：
【化２】
2010150280.tif 000003
からなる群より選択される。
【００４５】
好適な実施形態では、患者におけるＢ細胞増殖を刺激する方法であって、上記の式を有する核酸配列を該患者に投与することを含む。
【００４６】
好適な実施形態では、患者がヒトである。
【００４７】
好適な実施形態では、核酸配列が：
【化３】
2010150280.tif 000004
からなる群より選択される。
【００４８】
好適な実施形態では、患者における免疫活性化を刺激する方法であって、上記の式を有する核酸配列を該患者に投与することを含み、該核酸が
アジュバントとして作用する。
【００４９】
好適な実施形態では、患者が哺乳動物である。
【００５０】
好適な実施形態では、核酸配列が：
【化４】
2010150280.tif 000005
からなる群より選択される。
【００５１】
好適な実施形態では、喘息性障害を有する患者を治療する方法であって、薬学的に許容されるキャリアー内の、上記の式を有する核酸配列を、該患者に投与することによる。
【００５２】
好適な実施形態では、患者がヒトである。
【００５３】
好適な実施形態では、核酸配列がＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴである。
【００５４】
好適な実施形態では、ＣｐＧが仲介する白血球活性化を阻害することにより、自己免疫または他のＣｐＧ関連障害を有する患者を治療する方法であって、薬学的に許容されるキャリアー内のエンドソーム酸性化の阻害剤を該患者に投与することを含む。
【００５５】
好適な実施形態では、患者がヒトである。
【００５６】
好適な実施形態では、阻害剤が：バフィロマイシンＡ、クロロキン、およびモネンシンからなる群より選択される。
【００５７】
好適な実施形態では、阻害剤が約１０μＭ未満の用量で投与される。
【００５８】
好適な実施形態では、障害が、全身性エリテマトーデス、敗血症、炎症性腸疾患、乾癬、歯肉炎、関節炎、クローン病、グレーブズ病および喘息からなる群より選択される。
【００５９】
好適な実施形態では、障害が全身性エリテマトーデスである。
【発明の効果】
【００６０】
本発明によって、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列であって、Ｔｈ１型免疫活性化、サイトカイン産生、ＮＫ溶解活性、およびＢ細胞増殖を刺激することを含む、免疫反応を調節する核酸配列が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物の、さまざまなＤＮＡ配列に反応する用量依存性ＩＬ−６産生をプロットしたグラフである。図１Ａは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ（ｌ）および子ウシ胸腺ＤＮＡ（ｎ）配列およびＬＰＳ（大腸菌および子ウシ胸腺ＤＮＡの１０倍濃度）（ｕ）である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物の、さまざまなＤＮＡ配列に反応する用量依存性ＩＬ−６産生をプロットしたグラフである。図１Ｂは、コントロールホスホジエステルオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、５’ＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）（ｎ）および２つのホスホジエステルＣｐＧ  ＯＤＮ、５’ＡＴＣＧＡＣＣＴＡＣＧＴＧＣＧＴＴＣＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）（ｕ）および５’ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）（ｌ）である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物の、さまざまなＤＮＡ配列に反応する用量依存性ＩＬ−６産生をプロットしたグラフである。図１Ｃは、コントロールホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＧＣＴＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）（ｎ）および２つのホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ、５’ＧＡＧＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）（ｕ）および５’ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＡＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）（ｌ）である。データは３つ組の平均±標準偏差で表している。
【図２】図２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣｐＧ  ＤＮＡに誘導されるＩＬ−６産生を、注射後１−８時間で測定し、プロットしたグラフである。データは、２匹のマウスから得た血清の二重解析の平均を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウス（２匹／群）に１００μｌのＰＢＳ（ｏ）または２００μｇのＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）（ｎ）またはＣｐＧを含まないホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）（ｕ）を静脈内注射した。
【図３】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（２匹／群）に１００μｌのＰＢＳ、２００μｇのＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）またはＣｐＧを含まないホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）を静脈内注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激した後、さまざまな時点で、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により測定した、肝臓、脾臓、および胸腺中のＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現を示すオートラジオグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣｐＧ誘導ＩｇＭ産生の抗ＩＬ−６による用量依存性阻害をプロットしたグラフである。ＤＢＡ／２マウス由来の牌臓Ｂ細胞を、示した濃度の中和抗ＩＬ−６（ｕ）またはアイソタイプコントロール抗体（ｌ）の存在下で、ＣｐＧ  ＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）で刺激し、そして培養上清中のＩｇＭレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣｐＧ  ＯＤＮの非存在下では、抗ＩＬ−６ＡｂはＩｇＭ分泌に影響を及ぼさなかった（ｎ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、抗ＩＬ−６およびＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）（ｕ）、または抗ＩＬ−６抗体のみ（ｎ）と共に培養した、ＣｐＧ誘導脾臓Ｂ細胞の刺激指数をプロットしたグラフである。データは３つ組の平均±標準偏差を表している。
【００６２】
【図５】図５は、プロモーター欠損ＣＡＴ構築物（ｐＣＡＴ）、陽性コントロールプラスミド（ＲＳＶ）、またはＩＬ−６プロモーター−ＣＡＴ構築物のみをトランスフェクションした、または示した濃度のＣｐＧを含む、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）またはＣｐＧを含まない、５’ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）ホスホロチオエートＯＤＮと培養したものＷＥＨＩ−２３１細胞におけるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性をプロットした棒グラフである。データは３つ組の平均を表している。
【図６】図６は、免疫刺激性の非メチル化ＣｐＧを含む核酸の免疫作用の概観図である。示されるように、該核酸は、Ｂ細胞および単球性細胞（マクロファージおよび樹状細胞を含む）の両方を直接活性化することが可能である。該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、精製ＮＫ細胞を直接活性化しないが、ＮＫ細胞にＩＬ−１２に対する反応性を与え、ＩＦＮ−γ産生を顕著に増加させる。ＩＬ−１２産生を誘導し、そして続いてＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を増加させることにより、該免疫刺激性核酸は、Ｔｈ１型免疫反応を促進する。非常に精製されたＴ細胞によるサイトカイン分泌急増の直接活性化は見出されていない。しかし、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドによるＴｈ１サイトカイン分泌の誘導は、細胞障害性リンパ球反応の発展を促進する。
【図７】図７は、大腸菌（ＥＣ）ＤＮＡ（非メチル化ＣｐＧモチーフを含む）、コントロール（ＣＴ）ＤＮＡ（非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない）およびリポ多糖（ＬＰＳ）で処理した単球の、異なる測定時間、接触後１５および３０分後におけるＮＦκＢ  ｍＲＮＡ誘導を、示したオートラジオグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、反応性酸素種のレベルを測定するため、ジヒドロローダミン１２３染色剤と共にマウスＢ細胞を用いたフローサイトメトリーの結果を示している。図のパネルＡ中の、染色剤のみの試料は、染色剤に対し陽性の細胞が２８．６％であるバックグラウンドレベルを示している。反応性酸素種のこのレベルは、陽性コントロールであるＰＭＡおよびイオノマイシンにより２０分処理された細胞で、非常に上昇し８０％になった（パネルＢ）。ＣｐＧオリゴ（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）もまた、５０％を超える細胞が陽性となるような反応性酸素種のレベルの増加を示した（パネルＤ）。しかし、ＣｐＧが入れ替わった以外は同一の配列を持つオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＧＣＴ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）で処理した細胞は、反応性酸素種のレベルにこの有意な増加を示さなかった（パネルＥ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、クロロキン存在下で、反応性酸素種のレベルを測定するため、ジヒドロローダミン１２３染色剤と共にマウスＢ細胞を用いたフローサイトメトリーの結果を示している。クロロキンは、細胞における反応性酸素種のバックグラウンドレベルをわずかに低下させ、パネルＡの未処理細胞は、陽性であるものがわずか４．３％であるようにする。クロロキンはＣｐＧ  ＤＮＡ（パネルＢ）で処理した細胞における反応性酸素種誘導を完全に抑えるが、ＰＭＡおよびイオノマイシンで処理した細胞における反応性酸素種レベルは減少させない（パネルＥ）。
【図９】図９は、時間経過に対し肺洗浄細胞数をプロットしたグラフである。マウスにまずマンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ）「卵」を注射し、これによりＴｈ２免疫反応を誘導し、そして引き続きマンソン住血吸虫卵抗原”ＳＥＡ”（白丸）を吸入させた際、肺中に多くの免疫細胞が存在することを示す。しかし、マウスに最初に卵と共にＣｐＧオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）を与えた場合、肺中の免疫細胞は、続くＳＥＡ吸入によって増加しなかった（白三角）。
【図１０】図１０は、時間経過に対し肺洗浄好酸球数をプロットしたグラフである。再び、マウスにまず卵を注射し、そして引き続きＳＥＡ（白丸）を吸入させた際、肺中に多くの好酸球が存在することを示す。しかし、マウスに最初に卵と共にＣｐＧオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）を与えた場合、肺中の炎症性細胞は、続くＳＥＡ吸入によって増加しなかった（白三角）。
【００６３】
【図１１】図１１は、生理食塩水のみ；卵、その後ＳＥＡ；卵およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１、その後ＳＥＡ；および卵およびコントロールオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）、その後ＳＥＡへの曝露により誘導した、マクロファージ、リンパ球、好中球および好酸球細胞の比率への影響をプロットした棒グラフである。卵への最初の曝露時に、マウスをコントロールオリゴで処理した際、ＳＥＡ吸入後に続く好酸球の肺への流入にはほとんど影響がなかった。したがって、マウスに第１４日または第２１日に卵を吸入させた際、肺において急性炎症反応が発展した。しかし、最初の抗原曝露時である第０日および第７日に卵と共にＣｐＧオリゴを与えると、第１４日に卵抗原を吸入させた際の好酸球の増加が完全に抑えられた。
【図１２】図１２は、保護作用を持つＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０のオリゴのさまざまな量の注射に対する好酸球数をプロットした棒グラフである。
【図１３】図１３は、卵、その後ＳＥＡ（白ひし形）；卵およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０、その後ＳＥＡ（白丸）；または生理食塩水、その後生理食塩水（白四角）の注射に反応するマウスのインターロイキン４（ＩＬ−４）産生（ｐｇ／ｍｌ）を、時間経過に対しプロットしたグラフである。このグラフは、肺において、生じる炎症性反応が、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４のレベルと相関することを示す。
【図１４】図１４は、生理食塩水；卵、その後ＳＥＡ；またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０および卵、その後ＳＥＡの注射に反応するマウスのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生（ｐｇ／ｍｌ）を、時間経過に対しプロットした棒グラフである。このグラフは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの投与により、実際に肺のサイトカイン反応が、Ｔｈ１型免疫反応を示すＩＬ−１２産生へと変化することを示す。
【図１５】図１５は、生理食塩水；卵、その後生理食塩水；またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０および卵、その後ＳＥＡの注射に反応するマウスのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生（ｐｇ／ｍｌ）を、時間経過に対しプロットした棒グラフである。このグラフは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの投与により、肺のサイトカイン反応が、Ｔｈ１型免疫反応を示すＩＦＮ−ｇ産生にも変化することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明は、非メチル化シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドを含むある種の核酸が、患者におけるリンパ球を活性化し、そして患者の免疫反応をＴｈ２からＴｈ１に変化させる（例えば、単球性細胞および他の細胞を誘導し、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含むＴｈ１サイトカインを産生させることなどによる）という知見に基づく。この知見に基づき、本発明は１つの側面において、新規の免疫刺激性核酸組成物を特徴とする。
【００６５】
１つの態様において、本発明は、以下の式により表されるＣｐＧモチーフを含む単離免疫刺激性核酸配列を提供する：  
５’Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２３’
式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１はアデニン、グアニンまたはチミンであり；Ｘ２はシトシンまたはチミンであり；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約０−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である。
【００６６】
別の態様において、本発明は、以下の式により表されるＣｐＧモチーフを含む単離免疫刺激性核酸配列を提供する：  
５’Ｎ１Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｎ２３’
式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１Ｘ２はＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＴおよびＡｐＡからなる群より選択され；Ｘ３Ｘ４はＴｐＴまたはＣｐＴからなる群より選択され；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約０−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧの四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である。
【００６７】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸配列を患者、好ましくはヒトに投与することにより、免疫活性化を刺激する方法を提供する。好ましい態様において、免疫活性化は主に、免疫活性化のＴｈ１型をもたらす。
【００６８】
別の態様において、本発明の核酸配列はサイトカイン産生を刺激する。特に、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインが、本明細書に記載される核酸配列を用いた免疫系の刺激を介して産生される。他の側面において、本発明の核酸配列は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の溶解活性およびＢ細胞増殖を刺激する。
【００６９】
他の態様において、本発明の核酸配列は、マウスまたはヒトなどの哺乳動物において抗体を生成する間、人工的アジュバントとして使用するのに有用である。
【００７０】
別の態様において、ＣｐＧが仲介する白血球活性化への患者の反応を阻害することにより、自己免疫障害を治療する。本発明は、自己免疫障害を改善するため、バフィロマイシン、クロロキン、およびモネンシンなどのエンドソーム酸性化の阻害剤の投与を提供する。特に、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ
ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）をこの方法で治療する。
【００７１】
本発明の核酸配列はまた、他の障害（例えば腫瘍または癌、またはウイルス、真菌、細菌または寄生虫感染）を予防または改善するのに使用してもよい。さらに、該核酸配列を投与して、患者のワクチンに対する反応を刺激してもよい。さらに、請求される核酸分子配列を使用して、患者の免疫反応をＴｈ２からＴｈ１に変化させることにより、喘息性障害を治療し、または予防してもよい。
【００７２】
さらに、脱感作療法の一種として、請求される核酸分子を特定のアレルゲンと共に患者に投与し、喘息性障害に関連するアレルギー性反応の発生を治療し、または予防してもよい。
【００７３】
さらに、本明細書に記載される、本発明の核酸配列が、白血病細胞の細胞周期への進入を誘導する能力は、慢性白血病細胞の感受性を増加させた後に慣用的切除化学療法（ａｂｌａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）を行うことにより、または該核酸配列を他の免疫療法と組み合わせることにより、白血病を治療する際に該核酸を使用することに論拠を与える。
【００７４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項により、より明らかになるであろう。
【００７５】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において、以下の用語および句は、以下に述べる意味を有するものとする：
「アレルゲン」は、感受性患者においてアレルギー性または喘息性反応を誘導することが可能な物質を指す。アレルゲンのリストは膨大であり、そして花粉、昆虫毒、動物ふけ（ｄａｎｄｅｒ）塵、真菌胞子および薬剤（例えば、ペニシリン）を含んでもよい。天然の、動物および植物アレルゲンの例には、以下の属（ｇｅｎｕｓ）に特異的なタンパク質が含まれる：イヌ属（Ｃａｎｉｎｅ）（カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））；デルマトファゴイデス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）（例えばコナヒョウダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ））；ネコ属（Ｆｅｌｉｓ）（フェリス・ドメスティクス（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））；ブタタサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ））；ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）（例えばホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）またはネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）（スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ））；アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）（アルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ））；ハンノキ属（Ａｌｄｅｒ）；ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ）（アルヌス・グルティノサ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ））；カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ）（ベツラ・ベルコサ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ））；カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）（クウェルクス・アルバ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ））；オリーブ属（Ｏｌｅａ）（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ））；ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）（ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））；オオバコ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ）（例えばヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））；ヒカゲミズ属（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）（例えばパリエタリア・オフィチナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）またはパリエタリア・ユダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ））；チャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ）（例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ））；ミツバチ属（Ａｐｉｓ）（例えばアピス・ムルティフロルム（Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）（例えばクプレスス・セムペルビレンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、クプレスス・アリゾニカ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ）およびクプレスス・マクロカルパ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ））；ビャクシン属（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）（例えばユニペルス・サビオノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、ユニペルス・ビルギニアナ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ユニペルス・コムニス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびユニペルス・アシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ））；クロベ属（Ｔｈｕｙａ）（例えばツヤ・オリエンタリス（Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））；ヒノキ属（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ）（例えばヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ））；ゴキブリ属（��ｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）（例えばワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））；カモジグサ属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）（例えばアグロピロン・レペンス（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ））；ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）（例えばライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））；コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（例えばコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））；カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）（例えばカモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））；ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）（例えばヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｌｏｒ））；イチゴツナギ属（Ｐｏａ）（例えばナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）またはポア・コンプレサ（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））；カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）（例えばマカラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））；シラゲガヤ属（Ｈｏｌｃｕｓ）（例えばシラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓｌａｎａｔｕｓ））；ハルガヤ属（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）（例えばハルガヤ（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ））；オオカニツリ属（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）（例えばオオカニツリ（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ））；ヌカボ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）（例えばコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ））；アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）（例えばオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））；クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）（例えばクサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））；スズメノヒエ属（Ｐａｓｐａｌｕｍ）（例えばパスパルム・ノタツム（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ））；モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）（例えばソルグム・ハレペンシス（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））；およびスズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）（例えばコスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ））。
【００７６】
「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対する後天的過敏症を指す。アレルギー性疾患には、湿疹、アレルギー性鼻炎またはコリーザ、枯草熱、気管支喘息、じんま疹および食物アレルギー、および他のアトピー性疾患が含まれる。
【００７７】
「喘息」は炎症、気道の狭窄、および吸入作用物質（ｉｎｈａｌｅｄ  ａｇｅｎｔ）に対する気道反応性の増加により特徴付けられる呼吸器系の障害である。喘息は、すべてではないが、しばしばアトピー性またはアレルギー性症状と関連している。
【００７８】
「免疫系不全（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」は、患者の免疫系が正常能力では機能していないか、または、例えば患者における腫瘍または癌（例えば、脳、肺（例えば小細胞および非小細胞）、卵巣、乳房、前立腺、結腸の腫瘍と共に他の癌および肉腫）、または感染を除くために、患者の免疫反応を高めることが有用であるような、疾患または障害を意味するものとする。
【００７９】
感染性ウイルスの例には以下のものが含まれる：レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｌｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）またはＨＩＶ−ＩＩＩ；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離体などのヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）類）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ）類、肝炎Ａウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）；エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）類；ヒトコクサッキーウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｖｉｒｕｓ）類、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）類、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）類）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばウマ脳炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ
ｖｉｒｕｓ）類、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）類）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）類、脳炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）類、黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）類）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）類）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ
ｖｉｒｕｓ）類、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）類）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばエボラウイルス（ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）類）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）類、流行性耳下腺炎ウイルス（ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ））；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｖｉｒｕｓ）類）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）類、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）類、フレボウイルス（ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）類およびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ）類）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ）（出血性熱ウイルス（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）類）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）類、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）類およびロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）類）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（肝炎Ｂウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ））；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｌｒｉｄａｅ）（パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）類）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）類、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）類）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（大部分のアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）類）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  （ＨＳＶ））１および２、水痘−帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｉａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ））、疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）類）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）類、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）類、ポックスウイルス（ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）類）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばブタコレラウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ））；および分類されないウイルス（例えば、スポンジ型脳症（Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）の病因病原体、デルタ肝炎の病原体（肝炎Ｂウイルスの不完全付随体と考えられている）、非Ａ非Ｂ肝炎の病原体（１型＝経口感染、２型＝非経口感染（すなわち、肝炎Ｃ））；ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）および関連ウイルス、およびアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）類）。
【００８０】
感染性細菌の例には以下のものが含まれる：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジュネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナイ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコックス・アガラクティアイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ヴィリダンス群（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｇｒｏｕｐ））、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコックス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｌａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトチダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイド（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フゾバクテリウム・ヌタレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、フランベジアトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）。
【００８１】
感染性真菌の例には以下のものが含まれる：クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）。他の感染性生物（すなわち原生動物）には：熱帯性マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
【００８２】
「免疫刺激性核酸分子」は、非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（すなわち「ＣｐＧ  ＤＮＡ」またはグアノシンが続くシトシンを含み、そしてリン酸結合により結合するＤＮＡ）を含み、そして脊椎動物リンパ球を刺激する（例えば、該リンパ球に分裂促進作用を有し、または該リンパ球からのサイトカイン発現を誘導または増加させる）。免疫刺激性核酸分子は、二重鎖でもよいし、一本鎖でもよい。一般的には、ｉｎ  ｖｉｖｏでは二重鎖分子がより安定である一方、一本鎖分子は増加した免疫活性を有する。
【００８３】
好ましい態様の１つにおいて、本発明は、以下の式により表されるＣｐＧモチーフを含む単離免疫刺激性核酸配列を提供する：
５’Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２３’
式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１はアデニン、グアニンまたはチミンであり；Ｘ２はシトシンまたはチミンであり；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約０−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である。
【００８４】
別の態様において、本発明は、以下の式により表されるＣｐＧモチーフを含む単離免疫刺激性核酸配列を提供する：  
５’Ｎ１Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｎ２３’
式中、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１Ｘ２はＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＴおよびＡｐＡからなる群より選択され；Ｘ３Ｘ４はＴｐＴまたはＣｐＴからなる群より選択され；Ｎはいかなるヌクレオチドであってもよく、そしてＮ１＋Ｎ２は約０−２６塩基であり、ただしＮ１およびＮ２はＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず；そして該核酸配列は長さ約８−３０塩基である。
【００８５】
好ましくは、本発明の免疫刺激性核酸配列は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群より選択されるＸ１Ｘ２を含み、そしてＸ３Ｘ４はＴｐＴ、ＣｐＴおよびＧｐＴからなる群より選択される（例えば、表５を参照されたい）。細胞への取りこみを容易にするため、ＣｐＧを含む免疫刺激性核酸分子は、好ましくは長さ８から３０塩基の範囲にある。しかし、いかなる大きさの核酸（数ｋｂ長のものであっても）も、こうしたより大きな核酸は細胞内でオリゴヌクレオチドに分解されるため、十分な免疫刺激性モチーフが存在するのであれば免疫刺激性である。好ましい合成オリゴヌクレオチドは、５’および／または
３’末端またはその近傍にＣＣＧＧ四量体または１つより多いＣＣＧまたはＣＧＧ三量体を含まず、および／またはコンセンサス分裂促進性ＣｐＧモチーフはパリンドロームではない。オリゴヌクレオチドがリン酸バックボーン修飾を取りこんだ安定化オリゴヌクレオチドを用いて、免疫刺激反応を延長してもよい。例えば、該修飾は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である。より詳細には、リン酸バックボーン修飾は、核酸の５’端、例えば核酸の５’端の最初の２つのヌクレオチドで起こる。さらに、リン酸バックボーン修飾は、核酸の３’端、例えば核酸の３’端の最後の５つのヌクレオチドで起こってもよい。
【００８６】
好ましくは、免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡはオリゴヌクレオチドである場合、８から３０塩基の大きさの範囲である。また別に、ＣｐＧジヌクレオチドを、プラスミド中で大量スケールで産生し、その後、患者に投与する際に、オリゴヌクレオチドに分解させてもよい。好ましい免疫刺激性核酸分子（例えば、ワクチンの有効性を高めるのに使用するため、または患者における抗体（すなわち体液性）反応を刺激することにより、免疫系不全を治療するための該分子）は、Ｂ細胞、単球および／またはナチュラルキラー細胞反応（例えばサイトカイン、増殖、溶解または他の反応）に関し、比較的高い刺激指数を有する。
【００８７】
本発明の核酸配列は、例えば患者におけるサイトカイン産生を刺激する。サイトカインには、限定されるわけではないが、ＩＬ−６、ＩＩ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。典型的な配列には：ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ：４２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４３）、およびＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５６）が含まれる。
【００８８】
本発明の核酸配列はまた、ヒトなどの患者のナチュラルキラー細胞の溶解活性を刺激するのにも有用である。こうした配列の特定の、しかし限定されない例には：
【００８９】
【化５】
2010150280.tif 000006
【００９０】
【化６】
2010150280.tif 000007
が含まれる。
【００９１】
本発明の核酸配列はまた、ヒトなどの患者においてＢ細胞増殖を刺激するのにも有用である。こうした配列の特定の、しかし限定されない例には：
【００９２】
【化７】
2010150280.tif 000008
が含まれる。
【００９３】
他の側面において、本発明の核酸配列は、哺乳動物において抗体を産生する間に用いるアジュバントとして有用である。こうした配列の特定の、しかし限定されない例には：ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）、ＧＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）ＴおよびＴＧＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）Ｔが含まれる。さらに、請求される核酸配列を投与して、患者の免疫反応をＴｈ２からＴｈ１に変化させることにより、喘息性障害の症状を治療し、または予防してもよい。典型的な配列にはＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）が含まれる。
【００９４】
特定の免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡの刺激指数を、さまざまな免疫細胞検定において試験してもよい。好ましくは、Ｂ細胞増殖に関する免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡの刺激指数は、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約１５、そして最も好ましくは少なくとも約２０である。該指数は、詳細を実施例１に記載するように、ネズミＢ細胞培養物を２０μＭのＯＤＮと３７℃で２０時間接触させ、そして１μＣｉの３Ｈウリジンでパルス標識し；そして４時間後に採取しそしてカウントした、該Ｂ細胞培養物中の３Ｈウリジンの取りこみにより測定される。Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用、例えば、患者における細胞仲介（局所）免疫反応を刺激することにより免疫系不全を治療するためには、免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡが単球性細胞によるサイトカイン分泌および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性を効果的に誘導することが可能であることが重要である。
【００９５】
好ましい免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、治療徴候に依存して、実施例１２に記載される検定により測定されるように、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１５ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、７０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２７５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２をもたらすべきである。他の好ましい免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡは、実施例４に詳細に記載される検定により測定されるように、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、そして最も好ましくは少なくとも約２０％のＹＡＣ−１細胞特異的溶解、または少なくとも約３０、より好ましくは少なくとも約３５、そして最も好ましくは少なくとも約４０％の２Ｃ１１細胞特異的溶解をもたらすべきである。
【００９６】
「核酸」または「ＤＮＡ」は複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基、および置換ピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えばアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のどちらかである交換可能な有機塩基と連結した糖（例えばリボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書において、該用語は、リボヌクレオチドと共にオリゴデオキシリボヌクレオチドを指す。該用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわちポリヌクレオチドからリン酸を除いたもの）およびポリマーを含む他のいかなる有機塩基も含むものとする。核酸分子は、現存する核酸供給源（例えばゲノムまたはｃＤＮＡ）から得てもよいが、好ましくは合成（例えばオリゴヌクレオチド合成により産生される）である。
「核酸搬送複合体」は、標的手段（例えば、標的細胞（例えばＢ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面により高い親和性結合、および／または標的細胞による細胞取りこみの増加を生じる分子）と結合した（例えばイオンまたは共有結合する；または内部に被包される）核酸分子を意味するものとする。核酸分子搬送複合体の例には：ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、陽イオン脂質、ヴィロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合剤（例えば、標的細胞特異的受容体により認識されるリガンド）と結合した核酸が含まれる。好ましい複合体は、標的細胞により内在化する前に著しく結合が失われるのを防ぐため、ｉｎ  ｖｉｖｏで十分に安定でなくてはならない。しかし、該複合体は、核酸が機能型で放出されるよう、細胞内の適切な条件下で切断可能であるべきである。
【００９７】
「パリンドローム配列」は反転リピート（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のような配列、ここでＡおよびＡ’は通常のワトソン−クリック塩基対を形成することが可能な塩基である）を意味するものとする。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、こうした配列が二重鎖構造を形成してもよい。
【００９８】
「安定化核酸分子」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ分解（例えば、エキソまたはエンドヌクレアーゼを介する）に比較的耐性がある核酸分子を意味するものとする。安定化は長さまたは二次構造の結果である可能性がある。数１０から数１００ｋｂ長である、非メチル化ＣｐＧを含む核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ分解に比較的耐性である。より短い免疫刺激性核酸分子に関しては、二次構造を安定化し、そしてその効果を高めてもよい。例えば、核酸分子の３’端が上流領域に対し自己相補性を有し、それにより折りたたまれそして一種のステムループ構造を形成することが可能であれば、該核酸分子は安定化され、そしてより高い活性を示す。
【００９９】
本発明の好ましい安定化核酸分子は、修飾バックボーンを有する。免疫刺激における使用に関し、特に好ましい安定化核酸分子はホスホロチオエート（すなわち、核酸分子の少なくとも１つのリン酸酸素がイオウにより置きかえられている）またはホスホロジチオエート修飾核酸分子である。より詳細には、リン酸バックボーン修飾は、核酸の５’端、例えば核酸の５’端の最初の２つのヌクレオチドで起こる。さらに、リン酸バックボーン修飾は、核酸の３’端、例えば核酸の３’端の最後の５つのヌクレオチドで起こってもよい。核酸分子を安定化するのに加え、本明細書にさらに報告されるように、ホスホロチオエート修飾核酸分子（ホスホロジチオエート修飾を含む）は、本明細書に示される非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸分子の、免疫刺激の程度を増加させることが可能である。”Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ”と題される国際特許出願公告第ＷＯ  ９５／２６２０４号もまた、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの非配列特異的免疫刺激効果に関して報告している。本明細書に報告されるように、ホスホロチオエートバックボーンを有し、非メチル化ＣｐＧを含む核酸分子は、優先的にＢ細胞活性を活性化させることが見出されている一方、ホスホジエステルバックボーンを有し、非メチル化ＣｐＧを含む核酸分子は、優先的に単球性（マクロファージ、樹状細胞および単球）およびＮＫ細胞活性を活性化させることが見出されている。好ましいヒトモチーフを持つホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドもまた、単球性およびＮＫ細胞の強い活性化剤である。
他の安定化核酸分子には：アルキルおよびアリールホスホネート（荷電ホスホン酸酸素がアルキルまたはアリール基により置き換えられている）、ホスホジエステルおよび荷電酸素部分がアルキル化されたアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性ＤＮＡ類似体（ａｎａｌｏｇ）が含まれる。片方または両方の末端に、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含む核酸分子もまた、ヌクレアーゼ分解にかなりの耐性を持つことが示されている。
【０１００】
「患者」は、ヒトまたは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、サル、ラットおよびマウスを含む脊椎動物を意味するものとする。
【０１０１】
本明細書において、「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターは、自律複製および連結する核酸の発現が可能であるものである（例えば、エピソーム）。機能可能であるように連結した遺伝子の発現を指示することが可能なベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態であり、これは一般的に環状二重鎖ＤＮＡループを指し、ベクター型である際、染色体に結合しない。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最もよく使用される型のベクターであるため、互いに交換可能であるように使用されている。しかし、本発明は、同等の機能を提供する発現ベクターの他の型であって、そして引き続き本明細書において当業に知られる前記ベクターを含むよう意図される。
非メチル化ＣｐＧを含むある種の核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで示されるようにＢ細胞刺激活性を有する
内因性レトロウイルス配列に特異的な２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのリンパ球刺激作用を、添付される実施例１および２に記載されるプロトコルを用いて調べた経過において、驚くべきことに２４の「コントロール」（一群の「アンチセンス」ＯＤＮに対する、さまざまなスクランブル、センスおよびミスマッチコントロールを含む）中の２つもまた、Ｂ細胞活性化およびＩｇＭ分泌を仲介する一方、他の「コントロール」はいかなる影響も持たないことが見出された。
【０１０２】
２つの観察により、該「コントロール」ＯＤＮによるＢ細胞活性化の機構は、アンチセンス効果に関連しない可能性が示唆される。１）ＧｅｎＢａｎｋに記載される脊椎動物ＤＮＡ配列と比較すると、非刺激性ＯＤＮと比較した際に見られるより、高い相同性は見られず、そして２）２つのコントロールは１０μｇの脾臓ポリＡ＋ＲＮＡとのノーザンブロットに対し、ハイブリダイゼーションを示さなかった。これらのＯＤＮを異なる合成装置で再合成しても、またポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーにより徹底的に精製しても、同一の刺激が得られ、不純物の可能性は排除された。同様の刺激はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＢ細胞を用いても見られ、リポ多糖（ＬＰＳ）混入が結果を説明する可能性が排除された。
【０１０３】
２つの「コントロール」ＯＤＮが、２つの「アンチセンス」ＯＤＮと同様なＢ細胞活性化を引き起こしたという事実により、４つのＯＤＮすべては、他の非刺激性コントロールＯＤＮすべてに欠如する配列モチーフが関与する、ある種の非アンチセンス機構を通じてＢ細胞を刺激している可能性が生じる。これらの配列を比較すると、４つの刺激性ＯＤＮはすべて、非刺激性コントロールとは異なる配列背景にあるＣｐＧジヌクレオチドを含むことが発見された。
【０１０４】
刺激性ＯＤＮに存在するＣｐＧモチーフが、観察された刺激の原因であるのかどうか決定するため、さまざまな配列背景のメチル化、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む、またはＣｐＧジヌクレオチドを含まない、長さ５から４２塩基の範囲の３００を超えるＯＤＮを合成した。これらのＯＤＮには元の２つの「コントロール」（ＯＤＮ１および２）および元来「アンチセンス」として合成された２つ（ＯＤＮ  ３Ｄおよび３Ｍ；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２４４８（１９８９））が含まれ、その後脾臓細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を調べた（それぞれの配列は表１に記載される）。ＣｐＧジヌクレオチドを含む、いくつかのＯＤＮは、Ｂ細胞活性化およびＩｇＭ分泌を誘導した；この刺激の程度は、典型的にはより多くのＣｐＧジヌクレオチドを付加することにより増やすことが可能であった（表１；ＯＤＮ２を２ａに、３Ｄを３Ｄａおよび３Ｄｂに比較されたい）。刺激はアンチセンス機構または不純物に起因するものではないようであった。ＯＤＮはγδまたは他のＴ細胞集団の検出可能な増殖を引き起こさなかった。
【０１０５】
分裂促進性ＯＤＮ配列は、ＣｐＧジヌクレオチドに突然変異が起こった場合（表１；ＯＤＮ１を１ａに；３Ｄを３Ｄｃに；３Ｍを３Ｍａに；および４を４ａに比較されたい）、またはＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが５−メチルシトシンに置きかえられた場合（表１；ＯＤＮ  １ｂ、２ｂ、３Ｄｄ、および３Ｍｂ）、一様に非刺激性になった。ＣｐＧモチーフを一部メチル化することにより、刺激効果の部分的損失が引き起こされた（表１の２ａを２ｃに比較されたい）。対照的に、他のシトシンのメチル化は、ＯＤＮ活性を減少させなかった（ＯＤＮ  １ｃ、２ｄ、３Ｄｅおよび３Ｍｃ）。これらのデータは、ＣｐＧモチーフがＢ細胞を活性化するＯＤＮに存在する必須な要素であることを裏付けた。
【０１０６】
これらの研究の経過において、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する塩基が、ＯＤＮにより誘導されるネズミＢ細胞活性化を決定するのに、重要な役割を果たしていることが明確になった。最適刺激モチーフは、２つの５’プリン（好ましくはＧｐＡジヌクレオチド）および２つの３’ピリミジン（好ましくはＴｐＴまたはＴｐＣジヌクレオチド）に隣接するＣｐＧからなることが決定された。ＣｐＧモチーフをこの理想的配列に近づけるようＯＤＮに突然変異を加えると、刺激が改善された（例えば、表１、ＯＤＮ  ２を２ｅに；３Ｍを３Ｍｄに比較されたい）が、モチーフを壊すような突然変異は刺激を減少させた（例えば、表１、ＯＤＮ
３Ｄを３Ｄｆに；４を４ｂおよび４ｄに比較されたい）。一方、ＣｐＧモチーフの外側での突然変異は、剌激を減少させなかった（例えば、表１、ＯＤＮ  １を１ｄに；３Ｄを３Ｄｇに；３Ｍを３Ｍｅに比較されたい）。ヒト細胞の活性化に関しては、最良の隣接塩基はわずかに異なっていた（表５を参照されたい）。
【０１０７】
試験されたもののうち、８塩基より短いＯＤＮは非刺激性であった（例えば、表１、ＯＤＮ  ４ｅ）。試験された４８個の８塩基ＯＤＮのうち、高刺激性配列は、相補的な「パリンドローム」ＡＡＣＧＴＴを含むＴＣＡＡＣＧＴＴ（ＯＤＮ
４）と同定された。このモチーフをさらに最適化すると、両端にＧを含むＯＤＮが、特にＯＤＮの末端ヌクレオチド間結合をホスホロチオエート修飾することによりヌクレアーゼ耐性が与えられた場合、刺激の増加を示した。最初の２つおよび最後の５つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾された、ＯＤＮ
１５８５（５’ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２））は、マウス脾臓細胞増殖に平均２５．４倍の増加を引き起こしたのに比べ、両端の１０個のＧが１０個のＡに置きかえられた以外はＯＤＮ
１５８５と同じ配列を有するＯＤＮ  １６３８により誘導される増殖は平均３．２倍の増加であった。Ｇリッチ端の効果はシス（ｃｉｓ）であり；ポリＧ端を持っがＣｐＧモチーフを持たないＯＤＮを、１６３８と共に細胞に加えても増殖増加は得られなかった。８塩基対より長い核酸分子に関しては、非メチル化ＣｐＧを含む非パリンドロームモチーフが、より免疫刺激性であることが見出された。
【０１０８】
５’端のＴｐＣジヌクレオチドと共に６塩基パリンドロームを含む、他のオクタマーＯＤＮもまた活性があった（例えば、表１、ＯＤＮ  ４ｂ、４ｃ）。５’端の他のジヌクレオチドは刺激を減少させた（例えば、ＯＤＮ  ４ｆ；１６の可能なジヌクレオチドをすべて試験した）。３’ジヌクレオチドが存在しても、５’ジヌクレオチドの欠失を相殺するには不充分であった（例えば、表１、ＯＤＮ
４ｇ）。パリンドロームを破壊すると、オクタマーＯＤＮの刺激が除去された（例えば、表１、ＯＤＮ  ４ｈ）が、より長いＯＤＮにはパリンドロームは必要とされなかった。
【０１０９】
（表１：マウスＢ細胞のオリゴヌクレオチド刺激）
【０１１０】
【表１】
2010150280.tif 000009
刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）は、少なくとも３つの別々の実験に由来する、平均および標準偏差であり、そしてＯＤＮ非添加で培養されたウェルと比較している。
ＮＤ＝未実験
ＣｐＧジヌクレオチドを下線で示す。
点は同一性；ダッシュ（−）は欠失を示す。
Ｚは５メチルシトシンを示す。
【０１１１】
（表２．ネズミＩＬ−６産生およびＢ細胞活性化に対する最適ＣｐＧモチーフの同定）
【０１１２】
【表２】
2010150280.tif 000010
点は同一性を示す；ＣｐＧジヌクレオチドは下線で示す；ＮＤ＝未実験
ａ実験は少なくとも３回行い、同様の結果であった。ＣＨ１２．Ｌ．Ｘおよび脾臓Ｂ細胞の両方において、非刺激コントロール培養のＩＬ−６レベルは１０ｐｇ／ｍｌ以下だった。非刺激培養のＩｇＭレベルは５４７±８２ｎｇ／ｍｌであった。ＣｐＧジヌクレオチドは下線で示し、そして点は同一性を示す。
ｂ［３Ｈ］ウリジン取りこみは、非刺激コントロール（２３２２．６７±２１３．６８ｃｐｍ）に対する倍増加により示した（ＳＩ：刺激指数）。細胞は２０μＭのさまざまなＣｐＧ  Ｏ−ＯＤＮにより刺激した。データは３つ組の平均±ＳＤを表す。
ｃＥＬＩＳＡにより測定。
【０１１３】
リンパ球活性化の動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を、マウス脾臓細胞を用いて調べた。細胞をＯＤＮ添加と同時にパルス標識し、そしてちようど４時間後に採取すると、すでに３Ｈウリジン取りこみは２倍増加していた。刺激は１２−４８時間でピークに達し、そしてその後減少した。２４時間後、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ＯＤＮは検出されず、おそらくその後の刺激が落ちた原因と考えられる。抗ＩｇＭ（分裂促進する以下の用量）を含むまたは含まない精製Ｂ細胞をＣｐＧ  ＯＤＮと共に培養すると、２つの分裂促進剤を組み合わせた場合、相乗作用により４８時間後に約１０倍の増殖増加が見られた。刺激の程度は濃度依存性であり、そして、両方に最適な条件下では、ＬＰＳのものより常に高かった。ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートバックボーンを含むオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドのおよそ２００倍の効力であった。
【０１１４】
細胞周期解析を用い、ＣｐＧ−ＯＤＮにより活性化されたＢ細胞の比率を測定した。ＣｐＧ−ＯＤＮは、９５％以上のＢ細胞で周期開始（ｃｙｃｌｉｎｇ）を誘導した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ２３（周辺帯）およびＣＤ２３＋（濾胞）サブ集団に分類した脾臓Ｂリンパ球は、ＯＤＮ誘導刺激に対し、同等に反応し、パーコール勾配分画化により単離した休止および活性化Ｂ細胞集団も両方とも同様だった。これらの研究により、ＣｐＧ−ＯＤＮは本質的にすべてのＢ細胞が細胞周期に進入するのを誘導することが立証された。
免疫刺激性核酸分子はネズミＢ細胞アポトーシスを遮断する
ＷＥＨＩ−２３１などのある種のＢ細胞株は、抗ＩｇＭによるその抗原受容体のクロスリンクに反応し、増殖阻害および／またはアポトーシスを経るよう誘導される（Ｊａｋｗａｙ，Ｊ．Ｐ．ら，”Ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＷＥＨＩ−２３１
ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２２２５（１９８６）；Ｔｓｕｂａｔａ，Ｔ．，Ｊ．ＷｕおよびＴ．Ｈｏｎｊｏ：”Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｓ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣＤ４０．”Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：６４５（１９９３））。ＷＥＨＩ−２３１細胞は、ＬＰＳなど、ある種の刺激により、そしてＣＤ４０リガンドにより、この増殖停止から解放される。ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮもまた、ＷＥＨＩ−２３１を抗ＩｇＭが誘導する増殖停止から保護することが見出され、この作用には補助的な細胞集団が必要とされないことが示された。これに続く研究により、ＣｐＧ  ＯＤＮはＢｃｌ−ｘおよびｍｙｃ発現を誘導し、これがアポトーシスからの保護の原因となっている可能性が示される。また、ＣｐＧ核酸はまた、ヒト細胞でもアポトーシスを遮断することが見出されている。このアポトーシス阻害は、これがＣｐＧ  ＤＮＡによる免疫活性化を高め、そして延長することから、重要である。
ネズミＩＬ−６およびＩｇＭ分泌誘導およびＢ細胞増殖に最適なＣｐＧモチーフの同定
最適Ｂ細胞刺激ＣｐＧモチーフがＩＬ−６分泌に最適なＣｐＧモチーフと同一であるかを評価するため、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する塩基を漸次置換した、一群のＯＤＮを研究した。脾臓Ｂ細胞およびＣＨ１２．ＬＸ細胞を両方とも用い、このＯＤＮ群を、Ｂ細胞増殖、Ｉｇ産生、およびＩＬ−６分泌に対する作用に関し解析した。表２に示されるように、最適刺激モチーフは、２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンに隣接した非メチル化ＣｐＧを含む。一般的に、５’プリンをピリミジンに、または３’ピリミジンをプリンに突然変異させると、その作用が有意に減少する。５’プリンをＣに変えると特に有害であったが、５’プリンをＴに変えるか、または３’ピリミジンをプリンに変えた場合は、影響はより目立たなかった。これらの解析および他のＯＤＮの成績から、ＩＬ−６分泌の誘導に最適なＣｐＧモチーフはＴＧＡＣＧＴＴであることが決定され、これは最適分裂促進性およびＩｇＭ誘導ＣｐＧモチーフと同一であった（表２）。このモチーフは調べたパリンドロームを含む配列（１６３９、１７０７および１７０８）のいずれより、刺激性が高かった。
細菌ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド中のＧｐＧモチーフによるネズミサイトカイン分泌の誘導
実施例９に記載されるように、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激後に、脾臓細胞より分泌されるＩＬ−６量をＥＬＩＳＡにより測定した。ＣｐＧ  ＤＮＡに刺激された脾臓細胞により産生されるＩＬ−６に、Ｔ細胞がほとんどまたはまったく寄与していないことを示す予備研究にしたがい、全脾臓細胞よりもむしろ、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に用いた。表３に示されるように、ＩＬ−６産生は大腸菌ＤＮＡと共に培養した細胞では顕著に増加したが、子ウシ胸腺ＤＮＡと共に培養した細胞では増加しなかった。大腸菌ＤＮＡで観察されたＩＬ−６産生の増加は、他の細菌産物の混入によるものではないことを確認するために、解析前に該ＤＮＡをＤＮＡｓｅにより消化した。ＤＮＡｓｅ前処理により、大腸菌ＤＮＡにより誘導されるＩＬ−６産生は失われた（表３）。さらに、ＬＰＳ非反応性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来の脾臓細胞は、細菌ＤＮＡに反応し、同様のレベルのＩＬ−６を産生した。大腸菌ＤＮＡに誘導されるＩＬ−６分泌が細菌ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより仲介されるのかどうかを解析するため、メチル化大腸菌ＤＮＡおよび一群の合成ＯＤＮを調べた。表３に示すように、ＣｐＧ  ＯＤＮはＩＬ−６分泌を有意に誘導した（ＯＤＮ  ５ａ、５ｂ、５ｃ）が、ＣｐＧメチル化大腸菌ＤＮＡ、またはメチル化ＣｐＧを含む（ＯＤＮ  ５ｆ）、またはＣｐＧを含まないＯＤＮ（ＯＤＮ  ５ｄ）は誘導しなかった。ＣｐＧジヌクレオチド以外の部位の変化（ＯＤＮ  ５ｂ）または他のシトシンのメチル化（ＯＤＮ  ５ｇ）は、ＣｐＧ  ＯＤＮの効果を減少させなかった。３つのＣｐＧを持つＯＤＮ中の単一のＣｐＧのメチル化の結果、刺激の部分的減少が生じた（ＯＤＮ  ５ｃを５ｅに比較されたい；表３）。
【０１１５】
（表３．細菌ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド中のＣｐＧモチーフによる  ネズミＩＬ−６分泌の誘導）
【０１１６】
【表３】
2010150280.tif 000011
ＤＢＡ／２マウス由来のＴ細胞除去脾臓細胞を、酵素処理を行ったまたは行わないホスホジエステル修飾オリゴヌクレオチド（Ｏ−ＯＤＮ）（２０μＭ）、予ウシ胸腺ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）または大腸菌ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）で、またはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。データは３つ組の平均（ｐｇ／ｍｌ）±ＳＤを表す。ＣｐＧジヌクレオチドは下線で示し、そして点は同一性を示す。Ｚは５−メチルシトシンを示す。
ＣｐＧモチーフは人工アジュバントとして使用してもよい
免疫反応の非特異的刺激因子は、アジュバントとして知られている。アジュバントの使用は、可溶性抗原に反応する強い抗体を誘導するのに必須である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク、最新版；本明細書に援用される）。アジュバントの全般的な効果は劇的で、そしてその重要性は強調されすぎることはない。アジュバントの作用により、抗原をはるかに少ない用量で使用することが可能になり、そしてより持続性の高い抗体反応が生成される。免疫反応の非特異的活性化はしばしば、免疫反応獲得における成功および失敗の間の違いを生む可能性がある。アジュバントは何か特に避ける理由がない限り、最初の注射の際に使用するべきである。ほとんどのアジュバントは２つの構成要素を取り込む。１つの構成要素は、迅速な異化作用から抗原を保護するよう設計される（例えばリポソームまたは合成界面活性剤（Ｈｕｎｔｅｒら，１９８１））。リポソームは、免疫原が外部脂質層に取りこまれ、捕らえられた分子が免疫系により発見されない場合のみ有効である。もう一方の構成要素は、免疫反応を非特異的に刺激するであろう物質である。これらの物質は、リンホカインのレベルを上昇させることにより作用する。リンホカインは、抗原加工細胞の活性を直接刺激し、そして注射部位で局所炎症反応を引き起こす。初期の研究は、完全に熱殺細菌（Ｄｉｅｎｅｓ  １９３６）またはリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９５６）に頼っていた。ＬＰＳはかなり毒性が高く、そして、その構造的構成要素の解析を通じて、そのアジュバントとしての特性のほとんどは、リピドＡとして知られる部分にあることが示されている。リピドＡは、ＬＰＳよりはるかに毒性が低いが、依然として母体であるＬＰＳ分子のよりよいアジュバント特性を維持する、多くの合成および天然型として入手可能である。リピドＡ化合物はしばしばリポソームを用いて搬送される。
【０１１７】
最近、より容認できる副作用を持つ、強力なアジュバントを発見しようとする熱心な欲求から、新規合成アジュバントの産生が行われてきた。本発明は、ＣｐＧを含む核酸を含むアジュバントである、配列１８２６、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）を提供する。該配列は、強力な免疫活性化配列であり、そして完全フロイントアジュバントに匹敵するまたは勝る有効性を持つが、明らかな毒性を持たない、優れたアジュバントである。ＣｐＧモチーフによるネズミエＬ−６分泌誘導の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）
細菌ＤＮＡおよびＣｐＧ  ＯＤＮはＴ細胞除去ネズミ脾臓細胞において用量依存性にＩＬ−６産生を誘導したが、脊椎動物ＤＮＡおよびＣｐＧを含まないＯＤＮは誘導しなかった（図１）。ＩＬ−６産生は細菌ＤＮＡのおよそ５０μｇ／ｍｌ、またはＣｐＧ  Ｏ−ＯＤＮのおよそ４０μＭで横ばい状態になった。細菌ＤＮＡおよびＣｐＧ  ＯＤＮにより産生されるＩＬ−６の最高レベルは、それぞれ１−１．５ｎｇ／ｍｌおよび２−４ｎｇ／ｍｌであった。これらのレベルは、ＬＰＳ刺激後に見られるもの（０．３５ｎｇ／ｍｌ）より有意に高かった（図１Ａ）。ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡバックボーンを持つＣｐＧＯＤＮもまたＩＬ−６産生を誘導するかどうかを評価するため、Ｓ−ＯＤＮをＴ細胞除去ネズミ脾臓細胞に加えた。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮもまた、ＣｐＧ  Ｏ−ＯＤＮとほぼ同じレベルで用量依存性にＩＬ−６産生を誘導したが、ＣｐＧを含まないＳ−ＯＤＮはＩＬ−６を誘導しなかった（図１Ｃ）。０．０５μＭの濃度のＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮは、これらの細胞において最大限のＩＬ−６産生を誘導することが可能であった。この結果により、ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡバックボーン修飾は、ＣｐＧ  ＤＮＡがＩＬ−６分泌を誘導する配列特異的能力を維持し、そしてＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮはこの検定系においてＣｐＧ  Ｏ−ＯＤＮより８０倍以上強力であることが示された。
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧ  ＤＮＡによるネズミＩＬ−６分泌の誘導
細菌ＤＮＡおよびＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮがｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６分泌を誘導する能力を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｇの大腸菌ＤＮＡ、子ウシ胸腺ＤＮＡ、またはＣｐＧまたは非刺激性Ｓ−ＯＤＮを静脈注射し、そして刺激２時間後に放血させた。大腸菌ＤＮＡ注射群由来の血清中のＩＬ−６レベルは、およそ１３ｎｇ／ｍｌであったが、子ウシ胸腺ＤＮＡまたはＰＢＳ注射群由来の血清中にはＩＬ−６は検出されなかった（表４）。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮもまたｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６分泌を誘導した。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射群由来の血清中のＩＬ−６レベルは、およそ２０ｎｇ／ｍｌであった。対照的に、非刺激性Ｓ−ＯＤＮ刺激群由来の血清中にはＩＬ−６は検出されなかった（表４）。
【０１１８】
（表４．Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧ  ＤＮＡ刺激により誘導されるネズミＩＬ−６分泌）
【０１１９】
【表４】
2010150280.tif 000012
マウス（２匹／群）に１００μｌのＰＢＳ、２００μｇの大腸菌ＤＮＡまたは子ウシ胸腺ＤＮＡ、または５００μｇのＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮまたはＣｐＧを含まないコントロールＳ−ＯＤＮを静脈注射した。マウスを注射２時間後に放血させ、そして各血清を１：１０希釈したものをＩＬ−６  ＥＬＩＳＡにより解析した。ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡの感度限界は５ｐｇ／ｍｌであった。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮの配列は、５’ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＡＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４８）であり、そして非刺激性Ｓ−ＯＤＮの配列は５’ＧＣＴＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４９）である。配列４８にはＣｐＧがあるが、本明細書に説明されるように、刺激をもたらすには３’端に近すぎる。データは、２つ組の平均±ＳＤを表す。実験は少なくとも２回行い、同様な結果が得られた。
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧモチーフによる刺激後のネズミＩＬ−６分泌の動態
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧ  ＤＮＡによるＩＬ−６分泌誘導の動態を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ、またはＣｐＧを含まないコントロールＳ−ＯＤＮを静脈注射した。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射群では、血清ＩＬ−６レベルは１時間以内に有意に上昇し、そして２時間でピークに達し、およそ９ｎｇ／ｍｌのレベルとなった（図２）。血清中のＩＬ−６タンパク質は、４時間後、急速に減少し、そして刺激１２時間後には基底レベルに戻った。ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激群と対照的に、非刺激性Ｓ−ＯＤＮまたはＰＢＳ注射群由来の血清中には、有意なＩＬ−６増加は見られなかった（図２）。
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧモチーフにより誘導されるＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現の組織分布および動態
図２に示されるように、血清ＩＬ−６レベルは、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激後に急速に増加する。この血清ＩＬ−６の起源で可能性がある組織およびＣｐＧ  ＤＮＡ刺激後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩＬ−６遺伝子発現の動態を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｐＧまたはＣｐＧを含まないＳ−ＯＤＮを静脈注射し、そして肝臓、脾臓、胸腺、および骨髄から、刺激後さまざまな時点で、ＲＮＡを抽出した。図３Ａに示されるように、肝臓、脾臓、および胸腺におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルはＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射後３０分以内に増加した。肝臓ＩＬ−６  ｍＲＮＡは、注射後２時間でピークに達し、そして急速に減少し、そして刺激後８時間で基底レベルに戻った（図３Ａ）。脾臓ＩＬ−６  ｍＲＮＡは、刺激後２時間でピークに達し、そしてその後次第に減少した（図３Ａ）。胸腺ＩＬ−６
ｍＲＮＡは、注射後１時間でピークに達し、そしてその後次第に減少した（図３Ａ）。骨髄におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡはＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射後１時間以内に有意に増加したが、その後、基底レベルに戻った。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮに反応し、肝臓、脾臓および胸腺は、骨髄よりもより実質的なＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現増加を示した。
ＣｐＧ  ＤＮＡにより誘導されるネズミサイトカイン発現のパターン
Ｉｎ  ｖｉｖｏまたは全脾臓細胞において、以下のインターロイキン：ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１０のタンパク質レベルに、最初の６時間以内に有意な増加は検出されなかった（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２８７９−２８８３）。しかし、ＴＮＦ−αレベルは３０分以内に増加し、そしてＩＬ−６レベルはＣｐＧ  ＯＤＮを注射されたマウスの血清において、２時間以内に著しく増加した。脾臓細胞からのＩＬ−１２およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ｍＲＮＡ発現の増加もまた、最初の２時間以内に検出された。
【０１２０】
（表５．  ＣｐＧオリゴによるヒトＰＢＭＣサイトカイン分泌の誘導）
【０１２１】
【表５】
2010150280.tif 000013
点は同一性を示す；ＣｐＧジヌクレオチドは下線で示す。
１Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットを用いてＥＬＩＳＡにより測定（ｐｇ／ｍｌ）。細胞は示されたオリゴデオキシヌクレオチド（１２μｇ／ｍｌ）と共に１０％の自己血清中で、ＴＮＦ−αの場合は４時間、他のサイトカインの場合は２４時間培養した後、上清を採取し、そして検定した。データは、オリゴデオキシヌクレオチドを添加していないウェルより高いサイトカインレベルを表している。
【０１２２】
（ＣｐＧ  ＤＮＡはヒトＰＢＭＣ、特に単球からのサイトカイン分泌を促進する）
マウスサイトカイン発現を研究するのに用いたのと同一群のＯＤＮを用い、ヒト細胞もまたＣｐＧモチーフにより、サイトカインを発現（または増殖）するよう誘導されるのかを決定し、そして原因となるＣｐＧモチーフを同定した。オリゴヌクレオチド１６１９（ＧＴＣＧＴＴ）がＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ分泌の最適誘導因子であり、そしてごく近い値でオリゴヌクレオチド１６３４（ＧＴＣＧＣＴ）のほとんど同一のモチーフが続いた（表５）。オリゴデオキシヌクレオチド１６３７および１６１４（ＧＣＣＧＧＴおよびＧＡＣＧＧＴ）は強いＩＬ−６分泌を導いたが、相対的に他のサイトカインはほとんど誘導しなかった。したがって、ヒトリンパ球は、ネズミリンパ球と同様、周囲の塩基次第で、ＣｐＧジヌクレオチドに差別的に反応し、サイトカインを分泌するようである。さらに、ネズミ細胞を最もよく刺激するモチーフは、ヒト細胞に最も効果的なものとは異なる。あるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒト細胞の活性化に関し劣っている（それぞれ、パリンドローム形成配列ＧＡＣＧＴＣおよびＣＡＣＧＴＧを含む、オリゴデオキシヌクレオチド１７０７、１７０８）。
【０１２３】
単球に選択的に（しかし細胞障害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞にも）毒性を示し、そしてＢ細胞Ｉｇ分泌に影響しないＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（Ｌ−ＬＭＥ）処理により、サイトカイン分泌が失われることから、該ＤＮＡに反応する細胞は単球であるようである（表６）。トリパンブルー排除試験によると、Ｌ−ＬＭＥ処理でも生存しつづけた細胞は９５％を超える生存性を有し、これらの細胞にサイトカイン反応が見られないのは、単にすべての細胞タイプが非特異的に死んだことを反映しないことを示した。大腸菌（ＥＣ）ＤＮＡに反応するサイトカイン分泌は、ＥＣ  ＤＮＡのメチル化により失われることから、非メチル化ＣｐＧモチーフを必要とする（表６、下から２段目）。ＬＰＳ混入レベルは、天然およびメチル化ＤＮＡにおいて同一であるため、そして混入ＬＰＳの最大量の２倍の量を添加しても影響がなかったため（未提示）、ＤＮＡへのＬＰＳ混入では結果を説明できない。
【０１２４】
（表６．ＣｐＧ  ＤＮＡがヒトＰＢＭＣからのサイトカイン分泌を誘導する）
【０１２５】
【表６】
2010150280.tif 000014
１すべてのサイトカインレベルは前の表に記載したように、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットを用いたＥＬＩＳＡにより測定した。結果は異なるドナー由来のＰＢＭＣを用いたものの典型的なものである。
２これらの条件下のサイトカイン産生が単球（または他のＬ−ＬＭＥ感受性細胞）由来であるかどうか決定するため、細胞を１５分間、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（Ｌ−ＬＭＥ）で前処理した。
３ＥＣ  ＤＮＡは２Ｕ／μｇ  ＤＮＡのＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、製造者の指示にしたがってメチル化し、そしてメチル化をＨｐａ−１１およびＭｓｐ−Ｉ消化により確認した。陰性コントロールとして、最高濃度のＥＣ  ＤＮＡ中に最大量の２倍のＬＰＳを含む試料を含んだが、これらの実験条件下では検出可能なサイトカイン産生を誘導しなかった。ＮＤ＝未実験
Ｌ−ＬＭＥで処理したＰＢＭＣにおいてサイトカイン産生が失われることから、単球がＣｐＧ  ＤＮＡに反応するサイトカイン産生の原因である可能性が示唆された。この仮説をより直接的に試験するため、非常に精製されたヒト単球およびマクロファージに対するＣｐＧ  ＤＮＡの効果を試験した。仮説どおり、ＣｐＧ  ＤＮＡはヒトマクロファージによるサイトカイン、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−αの産生を直接活性化したが、ＣｐＧを含まないＤＮＡはしなかった（表７）。
【０１２６】
（表７．  精製ヒトマクロファージにおいて、  ＣｐＧ  ＤＮＡはサイトカイン発現を誘導する）
【０１２７】
【表７】
2010150280.tif 000015
（ＣｐＧモチーフに反応しネズミＩｇＭ産生を誘導する際のＩＬ−６の生物学的役割）
上述の動態研究により、ＣｐＧ刺激後１時間以内に起こるＩＬ−６分泌の誘導が、ＩｇＭ分泌に先行することが明らかになった。ＯＤＮが誘導するＩＬ−６分泌に対する最適ＣｐＧモチーフはＩｇＭに対し最適なものと同じである（表２）ことから、ＣｐＧモチーフが独立してＩｇＭおよびＩＬ−６産生を誘導するのか、またはＩｇＭ産生は、先行するＩＬ−６分泌に依存するのかを調べた。中和抗ＩＬ−６抗体を添加すると、ＣｐＧ  ＯＤＮが仲介するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＩｇＭ産生が、用量依存性に阻害されたが、コントロール抗体では阻害されなかった（図４Ａ）。対照的に、抗ＩＬ−６添加は、基底レベルまたはＣｐＧ誘導Ｂ細胞増殖のどちらにも影響しなかった（図４Ｂ）。
ＣｐＧ  ＤＮＡに反応するＩＬ−６プロモーターの転写活性増加
ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激後のＩＬ−６  ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベル増加は、転写または転写後制御の結果である可能性があった。ＩＬ−６プロモーターの転写活性がＣｐＧ  ＤＮＡと共に培養されるＢ細胞において上方制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されているか決定するため、ＣｐＧ  ＤＮＡに反応してＩＬ−６を産生するネズミＢ細胞株、ＷＥＨＩ−２３１にＩＬ−６プロモーター−ＣＡＴ構築物（ｐＩＬ−６／ＣＡＴ）（Ｐｏｔｔｒａｔｚ，Ｓ．Ｔ．ら，１７Ｂ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：９４４）をトランスフェクションした。ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＣｐＧを含まないＯＤＮのさまざまな濃度で刺激した後、ＣＡＴ検定を行った。図５に示すように、ＣｐＧ  ＯＤＮは用量依存性にＣＡＴ活性の増加を誘導したが、ＣｐＧを含まないＤＮＡはＣＡＴ活性を誘導しなかった。これにより、ＣｐＧがＩＬ−６プロモーターの転写活性を誘導することが確認された。
ＣｐＧ  ＯＤＮによるＢ細胞活性化の、５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合数への依存
ＯＤＮバックボーンの部分的イオウ修飾がＢ細胞活性化を高めるのに十分であるかを決定するため、同一の配列を持つが、５’端および３’端に異なる数のＳヌクレオチド間結合を持つ一連のＯＤＮの効果を試験した。ＯＤＮのヌクレアーゼ分解に関する先の研究に基づいて、細胞内エキソまたはエンドヌクレアーゼによる分解からのＯＤＮの最適保護を提供するには、５’端に少なくとも２つのホスホロチオエート結合が必要であることが決定された。したがって、２つの５’ホスホロチオエート修飾結合、およびさまざまな数の３’修飾結合を含むキメラＯＤＮのみを調べた。
【０１２８】
これらのＯＤＮのリンパ球刺激作用を、処理された脾臓細胞培養中のＲＮＡ合成（３Ｈウリジン取りこみにより）、またはＤＮＡ合成（３Ｈチミジン取りこみにより）の総レベルを測定することにより、３つの濃度（３．３、１０、および３０μＭ）で試験した（実施例１０）。ＣｐＧモチーフを持つＯ−ＯＤＮ（ホスホロチオエート修飾０／０）は少なくとも１０μＭの濃度で培養物に添加されなければ、脾臓細胞刺激を起こさなかった（実施例１０）。しかし、この配列が５’端で２つのＳ結合および３’端で少なくとも３つのＳ結合により修飾されると、３．３μＭの用量で、有意な刺激が見られた。この低い用量では、３’端修飾塩基の数が増えるにつれ、刺激レベルも次第に増加し、修飾塩基数が６に達するかまたは６を超えると、刺激指数は減少し始めた。一般的に、脾臓細胞刺激に対し最適な３’端Ｓ結合の数は５であった。これらの実験において、試験された３つの濃度すべてで、Ｓ−ＯＤＮは最適キメラ化合物より刺激性が低かった。
【０１２９】
（バックボーン修飾のタイプに対するＣｐＧ仲介リンパ球活性化の依存）
ホスホロチオエート修飾ＯＤＮ（Ｓ−ＯＤＮ）は、ホスホジエステル修飾ＯＤＮ（Ｏ−ＯＤＮ）よりはるかにヌクレアーゼに耐性である。したがって、Ｓ−ＯＤＮおよびＳ−Ｏ−ＯＤＮ（すなわち、中央の結合はホスホジエステルであるが、５’端の２つおよび３’の５つの結合はホスホロチオエート修飾である、キメラホスホロチオエートＯＤＮ）により引き起こされる免疫刺激が、Ｏ−ＯＤＮに比べ多いのは、前者のヌクレアーゼ耐性に起因する可能性がある。ＣｐＧ  ＯＤＮによる免疫刺激におけるＯＤＮヌクレアーゼ耐性の役割を決定するため、メチルホスホネート（ＭＰ）、ホスホロチオエートメチル（ＭＰＳ）、ホスホロチオエート（Ｓ）、またはホスホロジチオエート（Ｓ２）ヌクレオチド間結合のいずれかにより５’端および３’端がヌクレアーゼ耐性となっているキメラＯＤＮの刺激効果を試験した（実施例１０）。これらの研究により、そのヌクレアーゼ耐性にも関わらず、ＭＰ−Ｏ−ＯＤＮは実際、Ｏ−ＯＤＮより免疫刺激性が低かった。しかし、両方の非架橋Ｏ分子を５’および３’のＭＰＳヌクレオチド間結合に置きかえることにより、ＭＰおよびＳ修飾を組み合わせると、免疫刺激は、Ｏ−ＯＤＮにより引き起こされるレベルより、わずかに高いレベルまで回復した。
【０１３０】
Ｓ−Ｏ−ＯＤＮは、少なくとも３．３μＭを超える濃度では、Ｏ−ＯＤＮよりはるかに刺激性が高く、そしてＳ−ＯＤＮよりもさらに刺激性が高い。３μＭ以下の濃度では、３Ｍ配列を持つＳ−ＯＤＮは、対応するＳ−Ｏ−ＯＤＮより効果があるが、３Ｄ配列を持つＳ−ＯＤＮは、対応するＳ−Ｏ−ＯＤＮより効果が低かった（実施例１０）。これら２つの配列の刺激性ＣｐＧモチーフを比較すると、３Ｄ配列は、ＣｐＧに２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンが隣接し、刺激性モチーフと完全に一致することが認められた。しかし、ＯＤＮ  ３ＤにおいてＣｐＧにすぐ隣接する塩基は最適ではなく；５’ピリミジンおよび３’プリンを有する。さらなる試験に基づいて、免疫刺激に対する配列必要条件は、Ｓ−Ｏ−またはＯ−ＯＤＮよりもＳ−ＯＤＮに対してより厳しいことが見出された。最適ＣｐＧモチーフに対しわずかにしか一致しないＳ−ＯＤＮは、ほとんどまたはまったくリンパ球活性化を引き起こさない（例えば配列３Ｄ）。しかし、モチーフによく一致するＳ−ＯＤＮは、特に重要なのはＣｐＧにすぐ隣接する部位であるが、対応するＳ−Ｏ−ＯＤＮより効果が高かった（例えば配列３Ｍ、配列４および６）が、より高い濃度（３μＭを超える濃度）では、Ｓ−Ｏ−ＯＤＮのピーク効果がより高かった（実施例１０）。
【０１３１】
Ｓ２−Ｏ−ＯＤＮは著しく刺激性が高く、そして試験濃度すべてで、対応するＳ−ＯＤＮまたはＳ−Ｏ−ＯＤＮよりかなり高いリンパ球活性化を引き起こした。
【０１３２】
ＳまたはＳ２置換を持つＣｐＧ  ＯＤＮに見られるＢ細胞刺激の増加は、以下の作用：ヌクレアーゼ耐性、細胞取りこみ上昇、タンパク質結合上昇、および細胞内局在の変化、のいずれかまたはすべての結果である可能性がある。しかし、ＭＰ−Ｏ−ＯＤＮは実際、ＣｐＧモチーフを持つＯ−ＯＤＮより刺激性が低いため、ヌクレアーゼ耐性が唯一の説明ではありえない。以前の研究により、リンパ球によるＯＤＮ取りこみは、バックボーンの化学的特質により著しく影響を受けることが示されている（Ｚｈａｏら，（１９９３）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ
ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｈｏｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ，ａｎｄ  ｍｉｘｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３，５３−６６；Ｚｈａｏら，（１９９４）Ｓｔａｇｅｓ  ｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｅｄｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８４，３６６０−３６６６．）。最高細胞膜結合および取りこみはＳ−ＯＤＮで見られ、続いてＳ−Ｏ−ＯＤＮ、Ｏ−ＯＤＮ、およびＭＰ−ＯＤＮであった。この差別的取りこみは、免疫刺激の程度とよく相関している。
非メチル化ＣｐＧを含むオリゴはＮＫ細胞刺激活性を有する
ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドがＢ細胞に加え、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を刺激するか決定する実験を行った。表８に示されるように、ＣｐＧ  ＯＤＮ１および３Ｄｄと共に培養した脾臓細胞中で著しいＮＫ活性の誘導が見られた。対照的に、ＣｐＧを含まないコントロールＯＤＮで処理したエフェクターでは相対的に誘導が見られなかった。
【０１３３】
（表８．ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によるＮＫ活性誘導）
【０１３４】
【表８】
2010150280.tif 000016
（ＣｐＧを含まないＤＮＡでは見られない、ＣｐＧモチーフを持つＤＮＡによるＮＫ活性誘導）
３７℃で１８時間培養し、そしてその後Ｋ５６２（ヒト）またはＹａｃ−１（マウス）標的細胞殺傷に関し検定した細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞除去マウス脾臓細胞およびヒトＰＢＭＣ両方においてＮＫ溶解活性を誘導したが、脊椎動物ＤＮＡは誘導しなかった（表９）。細菌ＤＮＡの刺激活性が非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのレベルが増加した結果であるのかを決定するため、非メチル化、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む、またはＣｐＧジヌクレオチドを含まない５０を超える合成ＯＤＮの活性化特性を試験した。表９にまとめた結果により、合成ＯＤＮは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む限り、有意にＮＫ活性を刺激することが可能であることが立証された。ＣｐＧがパリンドローム中にあるＯＤＮ（パリンドロームＡＡＣＧＴＴを含むＯＤＮ１５８５など）の刺激効果と、パリンドロームを持たないＯＤＮ（１６１３または１６１９など）のものでは、違いがなかったが、最適刺激は一般的にＣｐＧが２つの５’プリンまたは５’ＧｐＴジヌクレオチドおよび２つの３’ピリミジンに隣接するＯＤＮで見られることが認められた。動態実験により、ＮＫ活性はＯＤＮ添加後１８時間前後でピークに達することが立証された。このデータは、ネズミＮＫ反応が、先行するＣｐＧ  ＤＮＡによる単球活性化に依存し、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−α／β産生につながることを示す（実施例１１）。
【０１３５】
（表９．  ＣｐＧを含まないＤＮＡでは見られない、ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡによるＮＫ活性誘導）
【０１３６】
【表９】
2010150280.tif 000017
ＯＤＮ配列中のＣｐＧジヌクレオチドは下線により示す；Ｚはメチルシトシンを示す。
小文字はヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を示し、滴定実験において、隣接する塩基次第で、非修飾ＯＤＮの２０倍を超える効力があった。ＯＤＮ取りこみレベルを有意に増加させるポリＧ端（ｇ）をいくつかのＯＤＮで使用した。
【０１３７】
これらの研究すべてから、ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫効果のより完全な理解が進み、これは図６にまとめられている。
【０１３８】
ＣｐＧモチーフによる免疫活性化は、ＣｐＧに隣接する塩基、およびＯＤＮ中に存在するＣｐＧの数および間隔に依存する可能性がある。理想的塩基背景における単一のＣｐＧは非常に強力でそして有用な免疫活性化因子である可能性があるが、より優れた効果は、適切な間隔および隣接塩基を持ついくつかのＣｐＧを含むＯＤＮで見られる可能性がある。ネズミＢ細胞を活性化するのに最適なＣｐＧモチーフはＴＧＡＣＧＴＴである。
【０１３９】
以下の研究を行い、ヒト細胞を刺激するのに最適なＯＤＮ配列を、ＣｐＧジヌクレオチドの数、間隔、および隣接塩基を変化させた効果を調べることにより、同定した。
【０１４０】
（ヒトＮＫ細胞の活性化に関する最適ＣｐＧモチーフを持つホスホロチオエートＯＤＮの同定）
臨床有用性を有するためには、ＯＤＮはヌクレアーゼ分解に対し保護される形で患者に投与されなければならない。ホスホジエステルＯＤＮを用い、これを達成する方法が当業によく知られており、そして脂質への被包またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの搬送系が含まれる。この保護はまた、ヌクレオチド間結合がヌクレアーゼ耐性であるものを含む修飾ＤＮＡバックボーンなど、ＤＮＡへの化学的置換を用いて達成してもよい。いくつかの修飾により、細胞取りこみの上昇など、付加的な望ましい特性が与えられる可能性がある。例えば、ホスホジエステル結合を、非架橋酸素原子の１つをホスホロチオエートＤＮＡを構成するイオウと置きかえることを介して修飾してもよい。ホスホロチオエートＯＤＮは細胞取りこみを高め（Ｋｒｉｅｇら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．６：１３３，１９９６．）、そしてＣｐＧモチーフも有する場合はＢ細胞刺激を改善してきた。ＮＫ活性化はｉｎ  ｖｉｖｏアジュバント効果と強く相関するため、ヒトＮＫ細胞を活性化するであろうホスホロチオエートＯＤＮの同定は非常に重要である。
【０１４１】
異なるホスホロチオエートＯＤＮ（さまざまな塩基背景のＣｐＧジヌクレオチドを含む）がヒトＮＫ活性化（表１０）に及ぼす効果を調べた。２コピーのＴＧＴＣＧＴＴモチーフを含む、ＯＤＮ  １８４０は、有意なＮＫ溶解活性を有した（表１０）。ＮＫ活性化に最適な付加的なＯＤＮをさらに同定するため、異なる数および間隔のＣｐＧモチーフを含む、およそ１００のＯＤＮを、ＯＤＮ  １９８２をコントロールとして調べた。結果を表１１に示す。
【０１４２】
有効なＯＤＮは５’端がＴＣまたはＴＧで始まったが、この必要条件は強制的ではなかった。内部ＣｐＧモチーフを持つＯＤＮ（例えばＯＤＮ  １８４０）は一般的に、５’ＴＣの直後にＧＴＣＧＣＴモチーフを持つもの（例えばＯＤＮ  １９６７および１９６８）より効力の弱い刺激因子である。３’側に第二のＧＴＣＧＴＴモチーフを有するＯＤＮ１９６８は、この第二のモチーフを欠くＯＤＮ
１９６７より常に刺激性が高かった。しかし、ＯＤＮ  １９６７は、実験１および３ではＯＤＮ  １９６８よりわずかに強力であったが、実験２ではそうではなかった。第三のＧＴＣＧＴＴモチーフを有するＯＤＮ２００５は、１９６８より平均してわずかに高いＮＫ活性を誘導した。しかし、各モチーフ間に２つのＴを付加することによりＧＴＣＧＴＴモチーフ間の間隔が増えた、ＯＤＮ  ２００６は、モチーフの１つにのみ間の２つのＴが付加された、ＯＤＮ  ２００５およびＯＤＮ  ２００７より優れていた。ＣｐＧモチーフ間の最小許容間隔は、ＯＤＮが３’端に２つのピリミジン（好ましくはＴ）を持つ限り、１ヌクレオチドであった（例えばＯＤＮ  ２０１５）。驚くべきことに、５’にＴを持つように２つのＧＴＣＧＴＴモチーフを端と端をつけてつないでも、ＮＫ活性のかなり強い誘導剤が生成された（例えばＯＤＮ  ２０１６）。ＯＤＮ  ２００２は、アデニンがそのＣｐＧを分離している（すなわち、ＣＧＡＣＧＴＴ）事実にも関わらず、かなりのＮＫ活性を誘導することから、チミン（Ｔ）が分離する連続ＣｐＧジヌクレオチドの選択が絶対であるわけではない。ＣｐＧを含まない（例えばＯＤＮ  １９８２）、ＣｐＧが連続する、またはよくない配列背景のＣｐＧを含む（例えばＯＤＮ  ２０１０）ＯＤＮがＮＫ活性化に刺激効果を持たないことにも注目すべきである。
【０１４３】
（表１０．  ＮＫ溶解活性（ＬＵ）のＯＤＮ誘導）
【０１４４】
【表１０】
2010150280.tif 000018
１溶解単位（ＬＵ）は記載した（８）ように測定した。簡潔には、ＰＢＭＣを正常ドナーから収集し、そしてフィコール上でスピンし、その後示されたＯＤＮ（６μｇ／ｍｌで培養物に添加）を含みまたは含まず２４時間培養した。その後、５１Ｃｒ標識Ｋ５６２細胞を溶解する能力を調べた。示した結果は、何人かの異なる正常ヒトドナーで得られた典型的なものである。２本オリゴ混合物は、各位における４塩基すべての無作為選択を含む。
【０１４５】
（表１１．  優れたモチーフを持つホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮによる
ＮＫ  ＬＵの誘導）
【０１４６】
【表１１】
2010150280.tif 000019
１ＰＢＭＣは実質的に本明細書で示された通りである。結果は６つの別々の実験の典型である；各実験は異なるドナーを表す。２これはＯＤＮ  １８４０をメチル化した型である；Ｚ＝５−メチルシトシン、ＬＵは溶解単位；ＮＤ＝未実験；ＣｐＧジヌクレオチドは明確にするため、下線で示している。
【０１４７】
（ヒトＢ細胞増殖の活性化に最適なＣｐＧモチーフを持つホスホロチオエートＯＤＮの同定）
ＣｐＧ  ＯＤＮがＢ細胞増殖を誘導する能力は、そのアジュバント可能性のよい評価基準となる。実際、強いアジュバント作用を持つＯＤＮは一般的にまた、Ｂ細胞増殖も誘導する。Ｂ細胞増殖を誘導するのに最適なＣｐＧ  ＯＤＮがＮＫ細胞活性を誘導するものと同じであるかどうか決定するため、ＯＤＮの同様な一群（表１２）を試験した。最も一定した刺激は、ＯＤＮ  ２００６で見られた（表１２）。
【０１４８】
（表１２．  ホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮによるヒトＢ細胞増殖の誘導）
【０１４９】
【表１２】
2010150280.tif 000020
１細胞＝外科的採取後−７０℃で保存したヒト脾臓細胞または正常ドナーから収集しそしてフィコール上でスピンしたＰＢＭＣ。細胞は９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレート上で、示したＯＤＮ（６μｇ／ｍｌで培養物に添加）を含みまたは含まず培養した。Ｎ＝１２実験。細胞は４−７日間培養し、採取前に１８時間、１μ  Ｃｉの３Ｈチミジンでパルス標識し、そしてシンチレーションカウントした。刺激指数＝示されたＯＤＮにより培養期間に渡り刺激した（培養を調整した後、ＯＤＮをさらに添加しなかった）ウェルにおけるｃｐｍに対する、ＯＤＮを含まないウェルにおけるｃｐｍの割合。ＮＤ＝未実験。
ヒトＩＬ−１２分泌を誘導するホスホロチオエートＯＤＮの同定
ＣｐＧ  ＯＤＮがＩＬ−１２分泌を誘導する能力は、特に、非常にＩＬ−１２に依存するＴｈ１免疫反応を誘導する能力に関し、そのアジュバント可能性のよい評価基準となる。したがって、一群のホスホロチオエートＯＤＮがヒトＰＢＭＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−１２を誘導する能力を調べた（表１３）。これらの実験により何人かのヒトＰＢＭＣにおいて、ほとんどのＣｐＧ  ＯＤＮがＩＬ−１２分泌を誘導する可能性があることが示された（例えば実験（ｅｘｐｔ）１）。しかし、他のドナーは２、３のＣｐＧ  ＯＤＮにしか反応しなかった（例えば実験２）。ＯＤＮ  ２００６はほとんどの被験者からのＩＬ−１２分泌の安定した誘導剤であった（表１３）。
【０１５０】
（表１３．ホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮによるヒトＩＬ−１２分泌誘導）
【０１５１】
【表１３】
2010150280.tif 000021
１ＰＢＭＣは正常ドナーから収集し、そしてフィコール上でスピンした後、９６ウエルマイクロタイタープレート上で、培養に６μｇ／ｍｌで添加される、示されたＯＤＮを含みまたは含まず、１０６細胞／ウェルで培養した。上清を２４時間後収集し、そして方法に記載されるＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを試験した。異なるドナーに対応する各実験で、標準曲線を走らせた。
【０１５２】
（Ｂ細胞および単球／ＮＫ細胞特異的オリゴヌクレオチドの同定）
図６に示されるように、ＣｐＧ  ＤＮＡは非常に精製されたＢ細胞および単球性細胞を直接刺激することが可能である。ＣｐＧ  ＤＮＡがこれらの細胞種を活性化する機構には多くの類似性がある。例えば、どちらも以下にさらに説明するＮＦκＢ活性化を必要とする。
【０１５３】
ＣｐＧ  ＤＮＡの異なる免疫作用のさらなる研究において、１種以上のＣｐＧモチーフがあることが発見された。特に、オリゴ１６６８はマウスＢ細胞に最適なモチーフを持ち、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞両方の活性化の強い誘導剤である一方、オリゴ１７５８は、弱いＢ細胞活性化剤であるが、依然として優れたＮＫ反応を誘導する（表１４）。
【０１５４】
（表１４．  異なるＣｐＧモチーフが  ネズミＢ細胞およびＮＫ活性化を最適に刺激する）
【０１５５】
【表１４】
2010150280.tif 000022
ＣｐＧジヌクレオチドを下線で示す；オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性を高めるため、ホスホロチオエート修飾バックボーンを持つよう合成した。１実施例１に記載されるように、２００ｎＭ濃度のオリゴデオキシヌクレオチドと４８時間培養した後の、Ｈチミジン取りこみにより測定した。２溶解単位で測定した。
【０１５６】
（免疫刺激性核酸の目的論的基礎）
脊椎動物ＤＮＡは、非常にメチル化されており、ＣｐＧジヌクレオチドは少数である。刺激性ＣｐＧモチーフは微生物ゲノムＤＮＡには一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡには非常にまれである。さらに、細菌ＤＮＡはＢ細胞増殖および免疫グロブリン（Ｉｇ）産生を誘導する一方、哺乳動物ＤＮＡは誘導しないことが報告されている（Ｍｅｓｓｌｎａ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９（１９９１））。実施例３にさらに記載される実験では、ＣｐＧメチラーゼによる細菌ＤＮＡのメチル化が分裂促進性をなくすることが見出され、ＣｐＧの状態の相違が細菌ＤＮＡによるＢ細胞刺激の原因であることを立証している。このデータは、以下の結論：細菌ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが細菌ＤＮＡの刺激作用の原因であること、を支持する。
【０１５７】
目的論的には、ＣｐＧモチーフによるリンパ球活性化は、細菌ＤＮＡを宿主ＤＮＡから区別することが可能な免疫防御機構を代表するようである。アポトーシス（細胞死）のため、炎症の多くの解剖学的部分および領域に一般的に存在するであろう宿主ＤＮＡは、ＣｐＧ抑制およびメチル化のため、ほとんどまたはまったくリンパ球活性化を誘導しないであろう。しかし、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡが存在すると、正確に感染した解剖学的部分、すなわち有益な部位で、リンパ球活性化が引き起こされることが可能となる。本新規活性化経路は、Ｔ細胞依存性抗原特異的Ｂ細胞活性化に代わる迅速な方法を提供する。ＣｐＧ経路は抗原受容体を通したＢ細胞活性化と相乗作用するため、細菌抗原に特異的な抗原受容体を持つＢ細胞は１つの活性化情報を細胞膜Ｉｇを通じて、そして第二の情報を細菌ＤＮＡから受け取り、そしてしたがって優先して活性化される傾向にあるであろう。本経路と、Ｂ細胞活性化の別の経路との相関関係は、ポリクローナル抗原を用い抗原特異的反応を誘導する生理学的機構を提供する。
【０１５８】
しかし、Ｂ細胞活性化は完全に非特異的ではないようである。細菌産物に特異的な抗原受容体を持つＢ細胞は、１つの活性化情報を細胞膜Ｉｇを通じて、そして第二の情報を細菌ＤＮＡから受け取り、それによりより強力に抗原特異的免疫反応を誘発する。他の免疫防御機構と同様、細菌ＤＮＡに対する反応は、ある環境では望ましくない結果を有する可能性がある。例えば、自己抗原に対する自己免疫反応もまた、自己抗原がまた、細菌ＤＮＡにより誘発される自己反応性Ｂ細胞への第二の活性化情報を提供する可能性があることから、細菌感染により優先的に誘発される傾向があるであろう。実際、細菌感染による自己免疫誘導は、よく見られる臨床的観察である。例えば、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスは：ｉ）抗ＤＮＡ抗体の産生により特徴付けられ；ｉｉ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを阻害する薬剤により誘導され（Ｃｏｒｎａｃｃｈｉａ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８（１９９３））；そしてｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の減少と関与する（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ  ３５：６４７（１９９２））が、細菌ＤＮＡの抗原受容体への結合によると共に、少なくとも部分的にＣｐＧモチーフにより提供される刺激情報を通じて、ＤＮＡ特異的Ｂ細胞活性化により、誘発されるようである。
【０１５９】
さらに、免疫系が強力にそして非特異的に活性化されることによる高い罹患率および死亡率に特徴付けられる敗血症は、直接多くのリンパ球を活性化するのに十分な濃度に達した、死んだ細菌から放出される、細菌ＤＮＡおよび他の産物により開始される可能性がある。敗血症症候群におけるＣｐＧ  ＤＮＡの役割に関するさらなる証拠は、Ｃｏｗｄｅｒｙ，Ｊ．ら，（１９９６）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５６：４５７０−４５７５に記載されている。
【０１６０】
表面Ｉｇ受容体を通じてＢ細胞を誘発する抗原と異なり、ＣｐＧ−ＯＤＮは検出可能なＣａ２＋流入、タンパク質チロシンリン酸化の変化、またはＩＰ  ３生成をまったく誘導しなかった。ＣｐＧモチーフを含むまたは含まないＦＩＴＣ結合ＯＤＮを用いたフローサイトメトリーを、Ｚｈａｏ，Ｑら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：５３−６６（１９９３））に記載されるように行い、そして同等の膜結合、細胞取りこみ、流出および細胞内局在が示された。これにより、ＣｐＧ  ＯＤＮに特異的な細胞膜タンパク質はない可能性が示唆される。細胞膜を通じて作用するよりむしろ、本データは、非メチル化ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドは、活性のために細胞に取りこまれることが必要であることを示唆する。固相テフロン（登録商標）支持体に共有結台したＯＤＮは非刺激性であり、アビジン・ビーズまたはアビジンコーティングペトリ皿に固定されたビオチン化ＯＤＮも同様であった。ＦＩＴＣまたはビオチンに結合したＣｐＧ  ＯＤＮは完全に分裂促進特性を保持し、立体障害がないことを示した。
【０１６１】
最近のデータは、転写因子ＮＦκＢが、ＣｐＧ効果の直接または間接的な媒介体として関与していることを示している。例えば、Ｂ細胞または単球をＣｐＧ  ＤＮＡで処理した１５分以内に、ＮＦκＢ結合活性レベルが上昇する（図７）。しかし、ＣｐＧモチーフを持たないＤＮＡによっては上昇しない。さらに、ＮＦκＢの２つの異なる阻害剤である、ＰＤＴＣおよびグリオトキシン（ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ）は、Ｂ細胞増殖または単球性細胞サイトカイン分泌により測定される、ＣｐＧ  ＤＮＡによるリンパ球刺激を完全に遮断し、ＮＦκＢ活性化が両方の細胞種に必要であることを示唆した。
【０１６２】
ＮＦκＢが活性化されうる機構にはいくつかの可能性がある。これらには、さまざまなプロテインキナーゼの活性化を介すもの、または反応性酸素種の生成を介すものが含まれる。Ｂ細胞および単球性細胞をＣｐＧ  ＤＮＡで処理した直後に誘導されるプロテインキナーゼ活性化に関する証拠は見出されておらず、そしてプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣおよびタンパク質チロシンキナーゼの阻害剤は、ＣｐＧが誘導する活性化に何の影響も持たない。しかし、ＣｐＧ  ＤＮＡは、Ｒｏｙａｌｌ，Ｊ．Ａ．およびＩｓｃｈｉｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０２：３４８−３５５（１９９３））に記載されるように高感度蛍光色素ジヒドロローダミン１２３により検出されるように、Ｂ細胞および単球性細胞の両方で、反応性酸素種産生の迅速な誘導を引き起こす。さらに、これらの反応性酸素種の生成に対する阻害剤は、ＣｐＧ  ＤＮＡによるＮＦκＢの誘導および後の細胞増殖およびサイトカイン分泌の誘導を完全に遮断した。
【０１６３】
遡って研究を進めると、次の疑問は、ＣｐＧ  ＤＮＡがどのように反応性酸素種生成をこれほど速く導くのかであった。発明者らによる以前の研究により、オリゴヌクレオチドおよびプラスミドまたは細菌ＤＮＡは細胞によりエンドソーム中に取りこまれることが立証された。これらのエンドソームは、細胞内部で急速に酸性化される。この酸性化段階がＣｐＧ  ＤＮＡが反応性酸素種を活性化する機構において重要であるかを決定するため、異なる機構を通じて働くクロロキン、モネンシン、およびバフィロマイシンを含む、エンドソーム酸性化の特異的阻害剤により、該酸性化段階を遮断した。図８Ａは、反応性酸素種のレベルを決定するための、マウスＢ細胞をジヒドロローダミン１２３色素と共に用いたフローサイトメトリー研究からの結果を示す。図のパネルＡ中の色素のみの試料は色素に陽性である細胞２８．６％のバックグラウンドレベルを示す。期待されたように、反応性酸素種のこのレベルは、陽性コントロールであるＰＭＡおよびイオノマイシンで２０分処理した細胞で、８０％に非常に上昇した（パネルＢ）。ＣｐＧオリゴで処理した細胞もまた、反応性酸素種レベルの上昇をしめし、５０％を超える細胞が陽性となった（パネルＤ）。しかし、ＣｐＧが交換された以外は同一の配列を持つオリゴヌクレオチドで処理した細胞は、反応性酸素種レベルにおけるこの有意な上昇を示さなかった（パネルＥ）。
【０１６４】
クロロキンが存在すると、結果は非常に異なる（図８Ｂ）。クロロキンは細胞における反応性酸素種のバックグラウンドレベルをわずかに下げ、パネルＡ中の未処理細胞は陽性であるものを４．３％しか持たない。クロロキンは、ＣｐＧ  ＤＮＡで処理した細胞における反応性酸素種の誘導を完全に抑える（パネルＢ）が、ＰＭＡおよびイオノマイシンで処理した細胞中の反応性酸素種レベルを減少させない（パネルＥ）。これにより、ＰＭＡにイオノマイシンを加えた場合と異なり、Ｂ細胞をＣｐＧ  ＤＮＡで処理した後の反応性酸素種の生成は、ＤＮＡがエンドソーム中で酸性化段階を経ることが必要であることが立証される。これは完全に新規な白血球活性化機構である。クロロキン、モネンシン、およびバフィロマイシンはまた、ＣｐＧ  ＤＮＡによるＮＦκＢ活性化も、続く増殖およびサイトカイン分泌誘導と共に、遮断するようである。
ＣｐＧ  ＤＮＡによる慢性免疫活性化および自己免疫障害
ＣｐＧ  ＤＮＡによるＢ細胞活性化は、Ｂ細胞受容体を通じた情報と相乗作用する。これにより、ＤＮＡ特異的Ｂ細胞は、細菌ＤＮＡがその抗原受容体に同時に結合することにより、そして共刺激性ＣｐＧ仲介情報により活性化される可能性が出てくる。さらに、ＣｐＧ  ＤＮＡはＢ細胞をアポトーシス耐性であるよう誘導する。ＤＮＡなどの自己抗原に対する免疫反応を防御するのに重要と考えられる機構である。実際、ｂ  ＤＮＡへの曝露により、抗ＤＮＡ抗体産生が誘発される可能性がある。このようにＣｐ  ＧＤＮＡが自己免疫を助長する潜在的可能性があるとすると、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス患者において、低メチル化ＣｐＧが豊富な血漿ＤＮＡの循環レベル上昇が永続的に見られることは、したがって、注目に値する。これらの知見により、狼癒（ｌｕｐｕｓ）原因病理形成においてＣｐＧ  ＤＮＡが慢性免疫活性化に対し何らかの役割を果たしていることが示唆される。
【０１６５】
狼瘡の治療に効果的な医薬品（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）の種類には、クロロキンなどの抗マラリア薬剤がある。これらの薬剤の治療機構は不明であるが、これらはエンドソーム酸性化を防ぐことが知られている。ＣｐＧ  ＤＮＡによる白血球活性化は、細胞表面受容体への結合を仲介しているのでなく、細胞取りこみが必要であり、これは酸性化されたクロロキン感受性細胞内区画への吸収エンドサイトーシスを介して起こる。これにより、ＣｐＧ  ＤＮＡによる白血球活性化は酸性化エンドソームと関連して起こる可能性が示唆され、そしてｐＨ依存性である可能性すらある。この仮説を試験するため、ＤＮＡ酸性化の特異的阻害剤を適用し、エンドソーム酸性化が阻害されている場合、Ｂ細胞または単球がＣｐＧ  ＤＮＡに反応することが可能であるかどうかを決定した。
【０１６６】
ＣｐＧ  ＤＮＡへの反応において検出される白血球活性化の最初の事象は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生であり、初代脾臓細胞およびＢおよび単球細胞株両方において、５分以内に誘導される。異なる作用機構を持つクロロキン、バフィロマイシンＡ、およびモネンシンを含むエンドソーム酸性化の阻害剤は、ＣｐＧが誘導するＲＯＳの生成を遮断したが、ＰＭＡ、またはＣＤ４０またはＩｇＭ連結により仲介されるＲＯＳ生成には影響を与えなかった。これらの研究は、さまざまな経路を通じた白血球活性化においてＲＯＳ生成が一般的な事象であることを示している。このＲＯＳ生成は、一般的に、ＣｐＧ  ＤＮＡに対するＲＯＳ反応にのみ必要とされるエンドソーム酸性化とは独立している。ＣｐＧに反応するＲＯＳ生成は、ＮＦκＢ阻害剤グリオトキシンにより阻害されず、ＮＦκＢ活性化に従属的なものではないことを裏付ける。
【０１６７】
ＣｐＧ  ＤＮＡのエンドソーム酸性化が他の免疫刺激性効果にも必要とされるか決定するため、実験を行った。ＬＰＳおよびＣｐＧ  ＤＮＡは両方とも、同様の迅速なＮＦκＢ活性化を誘導し、プロトオンコジーンｍＲＮＡレベルおよびサイトカイン分泌を上昇させた。ＤＮＡによるＮＦκＢ活性化は、ＣｐＧメチラーゼで処理したｂＤＮＡによっても、またはＣｐＧを破壊するよう塩基を交換したＯＤＮによっても誘導されないため、ＣｐＧモチーフに依存していた。特異的抗体を用いたスーパーシフト実験により、活性化ＮＦκＢがｐ５０およびｐ６５構成要素を含む複合体を形成することが示された。期待されなかったことではないが、ＬＰＳまたはＣｐＧ処理細胞におけるＮＦκＢ活性化は、ＩκＢαおよびＩκＢβの分解を伴った。しかし、エンドソーム酸性化阻害剤は、選択的にＣｐＧ誘導細胞活性化事象のすべてを遮断したが、ＬＰＳ誘導事象は遮断しなかった。ＣｐＧ仲介白血球活性化を阻害すると決定されたクロロキン濃度が非常に低い（＜１０μＭ）のは、これが抗マラリア活性および他の報告された免疫作用に必要とされる（例えば１００−１０００μＭ）よりかなり低い濃度であることから、注目に値する。これらの実験は、ＣｐＧ  ＤＮＡの刺激性作用の仲介においてｐＨ依存性情報伝達機構が役割を果たしていることを支持する。
【０１６８】
（表１５．  エンドソーム酸性化またはＮＦκＢ活性化の阻害剤による  ＣｐＧ誘導ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２発現の特異的遮断）
【０１６９】
【表１５】
2010150280.tif 000023
表１５レジェンド。ＩＬ−１２およびＴＮＦ−α検定：ネズミ単球細胞株Ｊ７７４（ＩＬ−１２検定には１ｘ１０５細胞／ｍｌ、またはＴＮＦ−αには１ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、示した濃度の示した阻害剤を含みまたは含まず２時間培養し、そしてその後、２μＭのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴＳＥＱＩＤ  Ｎｏ：１０）またはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４時間（ＴＮＦ−α）または２４時間（ＩＬ−１２）刺激し、上清を採取した。ＩＬ−１２またはＴＮＦ−αに関するＥＬＩＳＡ（ｐｇ／ｍｌ）を上清を用いて、実質的に記載されるように（Ａ．Ｋ．Ｋｒｉｅｇ，Ａ．−Ｋ．Ｙｉ，Ｓ．Ｍａｔｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｇ．Ａ．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｒ．Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｇ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，およびＤ．Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，５４６（１９９５）；Ｙｉ，Ａ．−Ｋ．，Ｄ．Ｍ．Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｔ．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ＭａｔｓｏｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７，５３９４−５４０２（１９９６）；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２８，１２８−１３３（１９９６））行った。ＣｐＧモチーフを欠くＯＤＮと共に培養した細胞はサイトカイン分泌を誘導しなかった。同様のＣｐＧ反応特異的阻害が、ＩＬ−６検定、および初代脾臓細胞またはＢ細胞株ＣＨ１２．ＬＸおよびＷＥＨＩ−２３１を用いた実験で見られた。２．５μｇ／ｍｌのクロロキンは、＜５μＭに同等である。ＰＤＴＣおよびカルパイン阻害剤ＩおよびＩＩを含むＮＦ−κＢ活性化の他の阻害剤から、示した阻害剤と同様の結果が得られた。示した結果は、１０の異なる実験から得られたものの典型である。
【０１７０】
ＣｐＧモチーフによる過剰な免疫活性化は、低メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡの循環レベル上昇と関連する自己免疫疾患、全身性エリテマトーデスの病因形成に寄与している可能性がある。クロロキンおよび関連する抗マラリア化合物は、全身性エリテマトーデスおよび他のいくつかの自己免疫疾患に効果的な治療薬剤であるが、その作用機構は不明である。非常に低い濃度のクロロキンがＣｐＧ仲介白血球活性化を特異的に阻害する能力を持つことを我々が立証したことにより、その有益な効果の新規機構が存在する可能性が示唆される。狼瘡再発は、しばしば微生物感染により誘発されると考えられていることは、注目に値する。感染組織に存在するｂＤＮＡレベルは局所炎症反応を誘導するのに十分である可能性がある。ＣｐＧ  ＤＮＡが敗血症症候群および他の疾患の媒介体として役割を果たしているらしいことと共に、我々の研究により、エンドソーム酸性化の阻害剤として作用する抗マラリア薬剤の新規治療適用の可能性が示唆される。
【０１７１】
ＣｐＧ誘導ＲＯＳ生成は、細胞活性化、またはこの活性化を仲介する情報の付随的な結果である可能性があった。ＲＯＳスカベンジャーであるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）はＣｐＧが誘導するＮＦκＢ活性化、サイトカイン産生およびＢ細胞増殖を遮断し、これらの経路においてＲＯＳ生成が原因としての役割を果たしていることが示唆される。これらのデータはＮＦκＢ活性化におけるＲＯＳの役割を支持する先の証拠と矛盾しない。ＷＥＨＩ−２３１Ｂ細胞（５ｘ１０５細胞／ｍｌ）をクロロキン（５μｇ／ｍｌ［＜１０μＭ］）またはグリオトキシン（０．２μｇ／ｍｌ）を含み、または含まず、３０分間、前培養した。分取した細胞をその後上記のように、１μＭのＣｐＧ  ＯＤＮ（１８２６）またはＣｐＧを含まないＯＤＮ（１９１１）、またはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（ｉｏｎｏ）を含むまたは含まないＲＰＭＩ培地中で１０分間培養した。細胞はその後ジヒドロローダミン１２３で染色し、そして細胞内ＲＯＳ産生を、記載されるようにフローサイトメトリーにより解析した（Ａ．Ｋ．Ｋｒｉｅｇ，Ａ．−Ｋ．Ｙｉ，Ｓ．Ｍａｔｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｇ．Ａ．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｒ．Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｇ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，およびＤ．Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，５４６（１９９５）；Ｙｉ，Ａ．−Ｋ．，Ｄ．Ｍ．Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｔ．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ＭａｔｓｏｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７，５３９４−５４０２（１９９６）；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２８，１２８−１３３（１９９６））。単球性細胞株であるＪ７７４細胞は、同様のｐＨ依存性ＣｐＧ誘導ＲＯＳ反応を示した。対照的にＣｐＧ  ＤＮＡは細胞外ＲＯＳ、また検出可能な好中球ＲＯＳの生成を誘導しなかった。これらのクロロキン濃度（およびエンドソーム酸性化の他の阻害剤に使用された濃度）は、Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４２６８（１９９４）：Ａ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｓ．Ａｋｈｔａｒ監修，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，中，ｐｐ．１７７（１９９５））に記載されるように、フルオレセイン結合ＯＤＮを用いた内在化ＣｐＧ  ＤＮＡの酸性化を防いだ。エンドソーム酸性化阻害に必要な濃度より高濃度では、非特異的阻害効果が見られた。各実験は少なくとも３回行い、同様な結果が得られた。
【０１７２】
ＮＦκＢは遺伝子発現の重要な制御因子として知られているが、ＣｐＧ  ＤＮＡに対する転写反応における役割は不明であった。このＮＦκＢ活性化がＣｐＧが仲介する遺伝子発現誘導に必要であるかどうかを決定するため、ＩκＢリン酸化阻害剤であるピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の存在下または非存在下で、細胞をＣｐＧ  ＤＮＡにより活性化した。ＮＦκＢのこれらの阻害剤は、ＣｐＧが誘導するプロトオンコジーンおよびサイトカインｍＲＮＡおよびタンパク質発現を完全に遮断し、これらの事象におけるＮＦκＢの媒介体としての本質的な役割が立証された。阻害剤のいずれも、これらの研究に用いた実験条件下で、細胞生存性を減少させなかった。ネズミ単球細胞株Ｊ７７４を、５μｇ／ｍｌの子ウシ胸腺（ＣＴ）、大腸菌（ＥＣ）、またはメチル化（ｍＥＣ）ＤＮＡ（記載されるように、ＣｐＧメチラーゼを用いてメチル化したもの４）、または０．７５μＭのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ  １８２６；表１５）またはＣｐＧを含まないＯＤＮ（ＯＤＮ  １７４５；ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ）の存在下で１時間培養し、その後、細胞を溶解し、そして核抽出物を調製した。コンセンサスＮＦκＢ部位を含む二重鎖ＯＤＮを５’放射標識し、そしてＥＭＳＡのプローブとして、実質的に記載されるように使用した（Ｊ．Ｄ．Ｄｉｇｎａｍ，Ｒ．Ｍ．ＬｅｂｏｖｉｔｚおよびＲ．Ｇ．Ｒｏｅｄｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１，１４７５（１９８３）；Ｍ．Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｄａｍｏｒｅ，Ｒ．Ｌａｗ，Ｇ．Ｌｅｅ，Ｐ．Ｗ．Ｋｉｎｃａｄｅ，Ｃ．Ｈ．Ｓｉｂｌｅｙ，Ｍ．ＫｕｅｈｌおよびＲ．Ｗａｌｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，４２２（１９９０））。ｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体の位置を、ｐ６５およびｐ５０に特異的な抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いたスーパーシフト法により決定した。ＬＰＳ誘導では見られない、ＣｐＧ誘導ＮＦκＢ活性化に対するクロロキン阻害はＪ７７４細胞を用いて証明した。該細胞はクロロキン（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で２時間、前培養し、そしてその後、上記のようにＥＣ  ＤＮＡ、ＣｐＧを含むＯＤＮ、ＣｐＧを含まないＯＤＮまたはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により１時間刺激した。ＣｐＧが誘導する、同様のクロロキン感受性ＮＦκＢ活性化がＢ細胞株ＷＥＨＩ−２３１および初代脾臓細胞でも見られた。これらの実験はクロロキン濃度２．５から２０μｇ／ｍｌの範囲にわたり３回行われ、同様の結果が得られた。
ＣｐＧ刺激ｍＲＮＡ発現は、Ｂ細胞および単球において、エンドソーム酸性化およびＮＦκＢ活性化を必要とすることも証明された。Ｊ７７４細胞（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、クロロキン（２．５μｇ／ｍｌ［＜５μＭ］）、またはＩκＢタンパク質分解を妨げ、そしてしたがってＮＦκＢ活性化を遮断するセリン／スレオニンプロテアーゼ阻害剤であるＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ；５０μＭ）の存在下または非存在下で、２時間培養した。細胞をその後、大腸菌ＤＮＡ（ＥＣ；５０μｇ／ｍｌ）、子ウシ胸腺ＤＮＡ（ＣＴ；５０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧを含むＯＤＮ（１８２６；１μＭ）、またはＣｐＧを含まないコントロールＯＤＮ（１９１１；１μＭ）を添加し、３時間刺激した。ＷＥＨＩ−２３１  Ｂ細胞（５ｘ１０５細胞／ｍｌ）を、グリオトキシン（０．１μｇ／ｍｌ）またはビスグリオトキシン（０．１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で２時間培養し、その後０．５μＭのＣｐＧを含むＯＤＮ（１８２６）またはＣｐＧを含まないコントロールＯＤＮ（１９１１；ＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＴＴ）で８時間刺激した。どちらの場合も、細胞を採取し、そしてＲＮＡｚｏｌを用い製造者のプロトコルにしたがってＲＮＡを調製した。複数プローブＲＮａｓｅプロテクション検定を、記載されるように行った（Ａ．−Ｋ．Ｙｉ，Ｐ．Ｈｏｒｎｂｅｃｋ，Ｄ．Ｅ．ＬａｆｒｅｎｚおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７，４９１８−４９２５（１９９６））。リボソームＲＮＡを積載（ｌｏａｄ）コントロール（Ｌ２３）として用い、各レーンに同程度の量のＲＮＡを積載した。これらの実験は３回行い、同様の結果が得られた。
【０１７３】
結果は、白血球が細胞内ＲＯＳのｐＨ依存性生成を含む新規機構を通してＣｐＧ  ＤＮＡに反応することを示す。ｐＨ依存性段階は、ＣｐＧ  ＤＮＡの輸送またはプロセシング、ＲＯＳ生成、または何らかの他の事象である可能性がある。ＲＯＳは広く、さまざまな細胞種における情報伝達経路の二次メッセンジャーであると考えられているが、Ｂ細胞における刺激情報を仲介することは以前には示されていなかった。
【０１７４】
おそらく、エンドソーム内または近傍に、ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡを特異的に認識するタンパク質があり、そして反応性酸素種生成を導いているものと思われる。細胞質内で特異的にＣｐＧ  ＤＮＡに結合する可能性がある、いかなるタンパク質も検出するため、ＣｐＧモチーフを含むまたは含まない５’放射活性標識オリゴヌクレオチドと共に、電気泳動移動度シフト検定（ＥＭＳＡ）を用いた。ＣｐＧモチーフを有する一本鎖オリゴヌクレオチドに特異的に結合するタンパク質に相当するらしいバンドが見出されたが、ＣｐＧモチーフを欠くオリゴヌクレオチド、またはメチル化されたＣｐＧモチーフのオリゴヌクレオチドに対応するものはなかった。この結合活性は、ＮＦκＢ結合部位を含むオリゴヌクレオチドを過剰に添加すると、遮断された。これにより、ＮＦκＢまたは関連するタンパク質が、刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドに結合するタンパク質またはタンパク質複合体の構成要素であることが示唆される。
ＮＦκＢが強く活性化されている時点で、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質の活性化は見られなかった。これらのデータはしたがって、ＮＦκＢタンパク質が実際にＣｐＧ核酸に結合する証拠を提供せず、むしろ、タンパク質がＣｐＧ活性に何らかの方法で必要とされる証拠を提供する。ＣＲＥＢ／ＡＴＦまたは関連タンパク質が、何らかの方法でＮＦκＢタンパク質または他のタンパク質と相互作用する可能性があり、したがってＣＲＥＢタンパク質結合モチーフおよび最適ＣｐＧモチーフの著しい類似性を説明することは可能である。該オリゴがＣＲＥＢ／ＡＴＦまたは関連タンパク質に結合し、そしてこれがＮＦκＢ活性化につながる可能性は残っている。
【０１７５】
また別に、ＣｐＧ核酸が、ＣＤ４０の細胞質領域に結合するＴＲＡＦタンパク質の１つに結合し、そしてＣＤ４０がクロスリンクされた際にＮＦκＢ活性化を仲介する可能性が高い。こうしたＴＲＡＦタンパク質の例には、ＴＲＡＦ−２およびＴＲＡＦ−５が含まれる。
【０１７６】
（免疫刺激性核酸作成法）
本発明に使用するため、当業によく知られる多くの方法のいずれかを用いて核酸を新規に合成してもよい。例えばｂ−シアノエチルホスホロアミダイト法（Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホン酸法（Ｇａｒｅｇｇら，（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７；Ｇａｒｅｇｇら，（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８，Ｇａｆｆｎｅｙら，（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２）である。これらの化学反応は、市場において入手可能な、さまざまな自動化オリゴヌクレオチド合成機により行われてもよい。また別に、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いるものなど既知の技術を用いて、存在する核酸配列（例えばゲノムまたはｃＤＮＡ）からオリゴヌクレオチドを調製してもよい。
【０１７７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための核酸は、分解（例えば、エンドおよびエキソヌクレアーゼを介した）に比較的耐性であることが好ましい。ステムループなどの二次構造は、分解に対し核酸を安定化することが可能である。また別に、核酸安定化は、リン酸バックボーン修飾を介して達成してもよい。好ましい安定化核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオエート修飾バックボーンを有する。ホスホロチオエートは、ホスホロアミダイトまたはＨ−ホスホン酸化学反応のどちらかを使用する自動化技術を用い、合成してもよい。アリールおよびアルキルホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように作成してもよく；
そしてアルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分が、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるようにアルキル化されている）は商業的に入手可能な試薬を用いて、自動化固相合成により調製してもよい。他のＤＮＡバックボーン修飾および置換を作成する方法が記載されてきている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５）。ＣｐＧモチーフを含む２’−Ｏ−メチル核酸もまた、免疫活性化を引き起こし、エトキシ修飾ＣｐＧ核酸も同様である。実際、ＣｐＧ効果を完全に無効にするバックボーン修飾は見つかっていないが、Ｃを５−メチルＣに置きかえることにより、効果は非常に減少する。
【０１７８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ投与には、核酸を、標的細胞（例えば、Ｂ細胞、単球性細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面へのより高い親和性結合および／または標的細胞による細胞取りこみ上昇をもたらす分子と結合し、「核酸搬送複合体」を形成してもよい。核酸を、適切な分子と、当業によく知られる技術を用いて、イオンまたは共有結合させてもよい。例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）など、さまざまなカップリングまたはクロスリンク剤を使用してもよい。核酸はまた、よく知られる技術を用いて、リポソームまたはヴィロソーム中に被包してもよい。
免疫刺激性核酸分子の治療的用途
免疫刺激性特性に基づき、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸分子をｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与し、「免疫系不全」を治療してもよい。また別に、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸分子を、免疫系不全を有する患者から得たリンパ球（例えばＢ細胞、単球性細胞またはＮＫ細胞）とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、そして活性化されたリンパ球をその後、患者に再移植してもよい。
【０１７９】
本明細書に報告されるように、非メチル化ＣｐＧを含む核酸分子に反応し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびおそらく他のものを分泌する脾臓細胞数が上昇する。ＩＬ−６発現の上昇は、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および単球性細胞において起こることが見出された。
【０１８０】
免疫刺激性核酸分子はまた、ワクチンと共に患者に投与し、患者の免疫系を助長し、そしてそれによりワクチンからのよりよい反応をもたらしてもよい。好ましくは、免疫刺激性核酸分子はワクチンよりわずかに前かまたは同時に投与される。所望により、最小限の抗原を含む慣用アジュバントをワクチンと共に投与してもよい。慣用アジュバントは、抗原吸収を高めることにより、さらにワクチン投与を改善する可能性があるからである。
【０１８１】
ワクチンがＤＮＡワクチンである際、少なくとも２つの構成要素がその有効性を決定する。第一に、ワクチンによりコードされる抗原が免疫反応の特異性を決定する。第二に、プラスミドのバックボーンにＣｐＧモチーフが含まれるのであれば、ワクチンに対するアジュバントとして機能する。したがって、ＣｐＧ  ＤＮＡは効果的な「危険信号」として作用し、そして、免疫系が領域内の新規抗原に対し強力に反応するようにする。この作用様式はおそらく主に、樹状細胞および他の「プロフェッショナル」抗原提示細胞に対するＣｐＧ  ＤＮＡの刺激性局所作用と共に、Ｂ細胞に対する共刺激作用に起因する。
【０１８２】
リンパ球を直接刺激し、そして抗原特異的反応を共刺激する、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび非メチル化ＣｐＧを含むワクチンは、単独で注射された際は不活性であり、そして抗原を吸収し、そしてそれにより免疫細胞により効果的に提示することを通じて作用すると考えられている慣用アジュバント（例えば、アルミニウム沈降物）とは基本的に異なる。さらに、慣用アジュバントはある種の抗原にしか働かず、抗体（体液性）免疫反応（Ｔｈ２）のみを誘導し、そして細胞性免疫反応（Ｔｈ１）誘導はほとんど行わない。多くの病原体に対し、体液性反応は防御にほとんど寄与せず、そして有害ですらありうる。
【０１８３】
さらに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、化学療法または免疫療法適用の前、同時、後に投与し、悪性細胞に対する、続く化学療法または免疫療法への反応性を高めても、またＧＭ−ＣＳＦなどの回復性サイトカインの誘導を通じた骨髄回復を速めてもよい。ＣｐＧ核酸はまたナチュラルキラー細胞の溶解活性および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増加させる。ＮＫ活性およびＡＤＣＣの誘導は、単独または他の治療と組み合わせ、癌免疫療法に有益であるようである。
【０１８４】
記載される免疫刺激性核酸分子の他の用途は、無害なアレルゲンに対しＩｇＥ抗体が生成されることにより一般的に引き起こされるアレルギーの脱感作におけるものである。非メチル化ＣｐＧ核酸により誘導されるサイトカインは主に、「Ｔｈ１」と呼ばれる種類であり、細胞性免疫反応により主に特徴付けられ、そしてＩＬ−１２およびＩＦＮ−γと関係する。免疫反応の他の主要な種類は、Ｔｈ２免疫反応と称され、むしろ抗体免疫反応およびＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生と関係する。一般的に、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型免疫反応により仲介され、そして自己免疫疾患はＴｈ１免疫反応により仲介されるようである。免疫刺激性核酸分子が患者における免疫反応をＴｈ２（ＩｇＥ抗体産生およびアレルギーと関係する）からＴｈ１反応（アレルギー性反応に対し防御性である）にシフトする能力に基づき、単独のまたはアレルゲンと組み合わせた、有効用量の免疫刺激性核酸（または核酸を含むベクター）を患者に投与し、アレルギーを治療または予防してもよい。
【０１８５】
非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸はまた、喘息の治療において、有意な治療利用性を有する可能性がある。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は喘息患者の気道で上昇している。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソタイプスイッチ、好酸球走化性および活性化、およびマスト細胞増殖を含む、喘息性炎症反応の重要な側面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローン形成およびＴｈ２サイトカイン産生を抑制することが可能である。
【０１８６】
以下の実施例１２に詳細に記載されるように、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（すなわち、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）は、ネズミ喘息モデルにおいて、炎症性細胞浸潤および好酸球増加症の発展を防ぐが、コントロールオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）は防がない。さらに、好酸球性炎症は、Ｔｈ２反応の抑制およびＴｈ１反応の誘導と関連していた。
【０１８７】
療法に使用する際、適切な有効量の、単独のまたは搬送複合体として処方された免疫刺激性核酸分子を、オリゴヌクレオチドが適切な標的細胞（例えばＢ細胞および単球性細胞）に取りこまれるようないかなる様式により、患者に投与してもよい。好ましい投与経路には、経口および経皮（例えばパッチ（ｐａｔｃｈ）を介して）が含まれる。投与の他の経路の例には、注射（皮下、静脈内、腸管外（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、腹腔内、鞘内など）が含まれる。注射は大量（ｂｏｌｕｓ）または連続注入であってもよい。
【０１８８】
単独核酸または核酸搬送複合体を、薬学的に許容されるキャリアーと共に投与してもよい。本明細書において、「薬学的に許容されるキャリアー」という句は、核酸または核酸搬送複合体と共に投与してもよく、そして核酸が意図する機能で働くようにする基質を含むことを意図する。こうしたキャリアーの例には、溶液、溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）、分散媒体（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）、遅延剤（ｄｅｌａｙ  ａｇｅｎｔ）、乳剤およびそれに匹敵するものが含まれる。薬学的活性基質に対するこうした媒体の使用は当業によく知られている。核酸と共に使用するのに適した他のいかなる慣用キャリアーも本発明の範囲内にある。
【０１８９】
核酸分子の「有効量」という用語は、望ましい生物学的作用を実現するに必要または十分な量を指す。例えば、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧを含む核酸の、免疫系不全を治療するための有効量は、腫瘍、癌、または細菌、ウイルスまたは真菌感染を除くのに必要な量である可能性がある。ワクチンアジュバントとしての使用の有効量は、患者のワクチンに対する免疫反応を助長するのに有用な量である可能性がある。喘息治療の「有効量」とは、喘息に関連するＴｈ２型免疫反応をＴｈ１型反応に変更するのに有用な量である可能性がある。いかなる特定の適用に対する有効量も、治療される疾患または異常、投与される特定の核酸（例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフの数または核酸におけるその位置）、患者の大きさ、または疾患または異常の重症度次第で変化する可能性がある。通常の当業者は、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を不必要な実験を必要とすることなく、経験的に決定することが可能である。
【０１９０】
本発明はさらに以下の実施例により説明されるが、該実施例はいかなる意味でもさらなる限定としてみなされるべきではない。本出願を通じて引用されるすべての参考文献の全内容（論文（ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、発行特許、公表特許出願、および同時係属特許出願を含む）は、明白に援用される。
【０１９１】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列であって、Ｔｈ１型免疫活性化、サイトカイン産生、ＮＫ溶解活性、およびＢ細胞増殖を刺激することを含む、免疫反応を調節する前記配列が開示される。該配列はまた、合成アジュバントとしても有用である。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１：Ｂ細胞総ＲＮＡ合成および細胞周期に対するＯＤＮの効果）
６−１２週齢の特定病原体除去（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）ＤＢＡ／２またはＢＸＳＢマウス（アイオワ大学動物飼育施設にて繁殖；実質的な系統相違は見られなかった）より得た、抗Ｔｈｙ−１．２および補体、およびリンパ球Ｍ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｍ）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カナダ・オンタリオ州ホーンビー）上での遠心分離（「Ｂ細胞」）によりＴ細胞を除去した脾臓からＢ細胞を精製した。Ｂ細胞に含まれるＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞は１％未満だった。８ｘ１０４のＢ細胞を３つ組で、９６ウェルマイクロタイタープレートの、１０％ＦＢＳ（６５℃３０分で、熱失活）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミン酸を含む１００μｌのＲＰＭＩ中に分注した。培養開始時に２０μＭのＯＤＮを添加し、３７℃で２０時間培養し、細胞を１μＣｉの３Ｈウリジンでパルス標識し、そして４時間後、採取しそしてカウントした。全脾臓細胞を２０μＭのＯＤＮを含み４８時間培養した後、Ｉｇ分泌Ｂ細胞をＥＬＩＳＡスポット検定を用いて数え上げた。表１に報告されるデータは、ＯＤＮを含まず培養した細胞に比較した刺激指数を表す。３Ｈチミジン取りこみ検定でも同様の結果が示されたが、分解されたＯＤＮから放出されるチミジンによる非特異的阻害がある程度見られた（Ｍａｔｓｏｎ．ＳおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ（１９９２）Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２：３２５）。
【０１９３】
（実施例２：Ｂ細胞からのＩｇＭ産生に対するＯＤＮの効果）
殺したばかりのマウスの脾臓由来の単一細胞懸濁物を、抗Ｔｈｙ１、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８および補体により、Ｌｅｉｂｓｏｎら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１６８１（１９８１））の方法により処理した。休止Ｂ細胞（＜０２％Ｔ細胞混入）をＤｅＦｒａｎｃｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５：１５２３（１９８２）の方法により、非連続パーコール勾配の６３−７０％のバンドより単離した。これらを３０μＭのＯＤＮまたは２０μｇ／ｍｌのＬＰＳ中で、上記のように４８時間培養した。活発にＩｇＭを分泌するＢ細胞数は、ＥＬＩｓｐｏｔ検定（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：５０６（１９９０））により測定すると、この時点で最大であった。この検定において、Ｂ細胞は抗Ｉｇコーティングマイクロタイタープレート上で６時間インキュベーションした。Ｂ細胞が産生したＩｇ（＞９９％はＩｇＭ）をホスファターゼ標識抗Ｉｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，アラバマ州バーミンガム）を用いて検出した。個々のＢ細胞から産生された抗体を、ホスファターゼが存在すると青い不溶性沈降物を形成するＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）の添加により視覚化した。２０−４０スポット／ウエルを産生する細胞の希釈物を用いて、抗体分泌Ｂ細胞／試料の総数を測定した。
すべての検定は３つ組で行った（データを表１に報告する）。いくつかの実験において、培養上清をＥＬＩＳＡによりＩｇＭに関し検定し、そしてＣｐＧ−ＯＤＮに反応する同様の上昇が示された。
【０１９４】
（実施例３：細菌ＤＮＡによるＢ細胞刺激）
ＤＢＡ／２のＢ細胞をＤＮＡなし、または５０μｇ／ｍｌのａ）マイクロコックス・リソデイクテイクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）；ｂ）ＮＺＢ／Ｎマウス脾臓；およびｃ）ＮＦＳ／Ｎマウス脾臓ゲノムＤＮＡと共に４８時間培養し、その後細胞採取４時間前に３Ｈチミジンでパルス標識した。２つ組ＤＮＡ試料をＤＮＡＳＥＩにより３７℃で３０分消化し、その後細胞培養に加えた。大腸菌ＤＮＡもまた、ＥＬＩＳＡスポット検定を用いると、４８時間後までにＩｇＭ分泌Ｂ細胞数を８．８倍誘導した。
【０１９５】
ＤＢＡ／２のＢ細胞を添加物なし、または５０μｇ／ｍｌのＬＰＳまたは２０μＭのＯＤＮ１；１ａ；４；または４ａを添加し、培養した。細胞を培養し、そして４、８、２４および４８時間で採取した。ＢＸＳＢ細胞を実施例１のように、５、１０、２０、４０または８０μＭのＯＤＮ  １；１ａ；４；または４ａまたはＬＰＳと共に培養した。この実験において、ＯＤＮを含まないウェルは３８３３ｃｐｍであった。各実験は、少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。３つ組ウェルの標準偏差は、５％未満であった。
【０１９６】
（実施例４：ナチュラルキラー細胞活性に対するＯＤＮの効果）
１０ｘ１０６のＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を４０μＭのＣｐＧ  ＯＤＮまたはＣｐＧを含まないＯＤＮを含むまたは含まない２ｍｌのＲＰＭＩ（実施例１に記載されるように補足）中で４８時間培養した。細胞を洗浄し、そしてその後、２つのＮＫ感受性標的細胞株（Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７）であるＹＡＣ−１および２Ｃ１１を用いた短期５１Ｃｒ放出検定において、エフェクターとして使用した。Ｖ底マイクロタイタープレートの０．２ｍｌ中の１０４個の５１Ｃｒ標識標的細胞に、エフェクター細胞をさまざまな濃度で添加し、そして５％ＣＯ２中で３７℃４時間培養した。
プレートをその後遠心分離し、上清の分取を放射活性に関しカウントした。エフェクター細胞の存在下に放出される５１Ｃｒから、標的細胞が単独培養される際放出される５１Ｃｒを引いたものを、２％酢酸で細胞溶解した後に放出される総カウントから、細胞が単独培養された際放出される５１Ｃｒを引いたもので割り、特異的溶解率を算出した。
【０１９７】
（実施例５：ＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究）
マウスの重量を測定し、そして０．２５ｍｌの無菌ＰＢＳまたはＰＢＳ中に溶解した示されたホスホロチオエートＯＤＮと共にＩＰを注射した。２４時間後、脾臓細胞を採取し、洗浄し、そしてＢ細胞にゲートを設けるため、フィコエリトリン結合６Ｂ２をビオチン結合抗Ｌｙ−６Ａ／Ｅまたは抗Ｉａｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）または抗Ｂｌａ−１（Ｈａｒｄｙ，Ｒ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１１６９（１９８４））と共に用い、フローサイトメトリー用に染色した。各条件に対し２匹のマウスを用い、そして個別に解析した。
【０１９８】
（実施例６：Ｂ細胞活性化に対するホスホロチオエートＯＤＮの滴定）
Ｂ細胞を、コントロール配列ＯＤＮ  １ａまたはＣｐＧ  ＯＤＮ  １ｄおよび３Ｄｄの配列を持つホスホロチオエートＯＤＮと共に培養し、そして２０時間後、３Ｈウリジンでパルス標識するか、または４４時間後、３Ｈチミジンでパルス標識し、採取しそしてｃｐｍを測定した。
【０１９９】
（実施例７：アポトーシスからのＢ細胞救済）
ＷＥＨＩ−２３１細胞（５ｘ１０４／ウェル）を、ＬＰＳまたはコントロールＯＤＮ  １ａまたはＣｐＧ  ＯＤＮ  １ｄおよび３Ｄｄの存在下または非存在下で、３７℃で１時間培養した後、抗ＩｇＭ（１μｇ／ｍｌ）を添加した。細胞をさらに２０時間培養した後、２μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンで４時間パルス標識した。本実験において、ＯＤＮも抗ＩｇＭも含まない細胞は、抗ＩｇＭの添加により９０．４ｘ１０３ｃｐｍの３Ｈチミジン取りこみを示した。表１に示されるホスホジエステルＯＤＮも同様の防御を示したが、ＯＤＮ分解による、ある程度の非特異的抑制を伴った。各実験は少なくとも３回繰り返し、同様の結果が得られた。
【０２００】
（実施例８：ネズミＩＬ−６のｉｎ  ｖｉｖｏ誘導）
ＤＢＡ／２メスマウス（２か月齢）に５００ｇのＣｐＧまたはコントロールのホスホロチオエートＯＤＮと共にＩＰを注射した。注射後さまざまな時点でマウスを放血させた。各時点で２匹のマウスを調べた。ＩＬ−６はＥＬＩＳＡにより測定し、そしてＩＬ−６濃度は組換えＩＬ−６を用いて生成した標準曲線との比較により算出した。検定感度は１０ｐｇ／ｍｌだった。８時間後には検出不能レベルであった。
【０２０１】
（実施例９：ネズミＩＬ−６転写の全身性誘導）
マウス系統および細胞株。５−１０週齢のＤＢＡ／２、ＢＡＬＢ／ｃ、およびＣ３Ｈ／ＨｅＪを、リンパ球供給源として用いた。すべてのマウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から得られ、そして特定病原体除去条件下で、アイオワ大学動物飼育施設で繁殖し、そして維持された。マウスＢ細胞株ＣＨ１２．ＬＸはＧ．Ｂｉｓｈｏｐ博士（アイオワ大学、アイオワシティ）の好意により提供された。
【０２０２】
細胞調製。マウスを頚椎脱臼により殺した。マウスの脾臓から無菌的に単一細胞懸濁を調製した。Ｔ細胞除去マウス脾臓細胞は、抗Ｔｈｙ−１．２および補体、およびリンパ球Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カナダ・オンタリオ州ホーンビー）上での遠心分離により、記載されるように（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら，（１９８９）Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ
ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２４４８）調製した。
【０２０３】
ＯＤＮおよびＤＮＡ。ホスホジエステルオリゴヌクレオチド（Ｏ−ＯＤＮ）およびバックボーン修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）はアイオワ大学のＤＮＡ中央施設またはＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州アラメダ）より得られた。大腸菌ＤＮＡ（Ｂ株）および子ウシ胸腺ＤＮＡはＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）より購入した。すべてのＤＮＡおよびＯＤＮはフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）および／またはエタノール沈澱により精製した。大腸菌および子ウシ胸腺ＤＮＡは、使用前に１０分間煮沸した後、氷上で５分冷却し、一本鎖にした。いくつかの実験では、大腸菌および子ウシ胸腺ＤＮＡを、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１Ｘ  ＳＳＣ中でＤＮａｓｅＩ（２Ｕ／μｇＤＮＡ）により３７℃で２時間消化した。大腸菌ＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのシトシンをメチル化するため、大腸菌ＤＮＡを、１６０μＭのＳ−アデノシルメチオニンを補ったＮＥＢｕｆｆｅｒ２中でＣｐＧメチラーゼ（Ｍ．ＳｓｓＩ；２Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）で処理し、そして３７℃で一晩インキュベーションした。メチル化ＤＮＡは上記のように精製した。メチル化効率はＨｐａＩＩ消化後、ゲル電気泳動による解析により確認した。すべての酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリー）より購入した。カブトガニ検定（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｓｓａｙ）によると、ＯＤＮ中のＬＰＳレベルは１２．５ｎｇｌ／ｍｇより低く、そして大腸菌および子ウシ胸腺ＤＮＡはＤＮＡ１ｍｇ当たり２．５ｎｇ未満のＬＰＳを含んだ。
【０２０４】
細胞培養。すべての細胞は５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃で培養し、１０％（ｖ／ｖ）熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１．５ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのＣｐＧを含むまたはＣｐＧを含まないホスホジエステルＯＤＮ（Ｏ−ＯＤＮ）（２０μＭ）、ホスホロチオエートＯＤＮ（Ｓ−ＯＤＮ）（０．５μＭ）、または大腸菌または子ウシ胸腺ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０中で３７℃で２４時間（ＩＬ−６産生に対し）、または５日間（ＩｇＭ産生に対し）維持した。刺激物質の濃度は、滴定を伴う予備実験に基づき選択された。いくつかの場合では、細胞はさまざまな濃度（１−１０μｇ／ｍｌ）のネズミＩＬ−６に対する中和ラットＩｇＧ１抗体（ハイブリドーマＭＰ５−２０Ｆ３）またはコントロールとして大腸菌ｂ−ガラクトシダーゼに対するラットＩｇＧ１  ｍＡｂ（ハイブリドーマＧＬ１１３；ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）（２０）と共にＣｐＧ  Ｏ−ＯＤＮにより５日間処理した。インキュベーション終了時に、培養上清分画を下記のようにＥＬＩＳＡにより解析した。
【０２０５】
ＩＬ−６およびＩｇＭのｉｎ  ｖｉｖｏ誘導。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＢＳ、子ウシ胸腺ＤＮＡ（２００μｇ／１００μｌＰＢＳ／マウス）、大腸菌ＤＮＡ（２００μｇ／１００μｌＰＢＳ／マウス）、またはＣｐＧを含むまたはＣｐＧを含まないＳ−ＯＤＮ（２００μｇ／１００μｌＰＢＳ／マウス）を静脈内（ｉｖ）注射した。マウス（２匹／群）をさまざまな時点で後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）穿刺により放血させ、そして頚椎脱臼により屠殺した。肝臓、脾臓、胸腺および骨髄を除去し、そしてこれらの臓器からＲＮＡｚｏ／Ｂ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、テキサス州フレンズウッド）を用い製造者のプロトコルにしたがってＲＮＡを調製した。
【０２０６】
ＥＬＩＳＡ。平底Ｉｍｍｕｎ  １プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，バージニア州チャンティリー）を炭酸−炭酸水素緩衝液（ｐＨ９．６）（１．５ｎＭ  Ｎａ２ＣＯ３，３５ｍＭＮａＨＣＯ３）中で、１００μｌ／ウェルの抗マウスＩＬ−６ｍＡｂ（ＭＰ５−２０Ｆ３）（２μｇ／ｍｌ）または抗マウスＩｇＭμ鎖特異的抗体（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用い４℃で一晩コーティングした。プレートをその後ＴＰＢＳ（０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，６．６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＴＰＢＳ中の１０％ＦＣＳで室温で２時間ブロッキングし、そしてその後再度洗浄した。培養上清、マウス血清、組換えマウスＩＬ−６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）または精製マウスＩｇＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンデイエゴ）は、１０％ＦＣＳ中で適切に希釈し、そして３つ組ウェル中で室温で６時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして１００μｌ／ウェルのビオチン化ラット抗マウスＩＬ−６モノクローナル抗体（ＭＰ５−３２Ｃ１１Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）（１０％ＦＣＳ中に１μｇ／ｍｌ）またはビオチン化抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を添加し、そして４５分間室温でインキュベーションした後ＴＰＢＳで洗浄した。１０％ＦＣＳで１：４０００希釈した西洋ワサビ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合アビジン（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュルス）（１００μｌ／ウェル）を添加し、そして室温で３０分インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして０．０５Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中のｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で３０分染色した。０．６７ＮＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止し、そしてプレートをマイクロプレート読み取り装置（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォータータウン）上で４９０−６００ｎｍで読み取った。結果は図１および２に示す。
【０２０７】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＩＬ−６に対する、センスプライマー、アンチセンスプライマー、および内部オリゴヌクレオチドプローブを、公表された配列を用いて合成した（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ａ．およびＭ．Ｓ．Ｄａｌｌｍａｎ（１９９１），Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｔａｌ  ｔｈｙｍｉｃ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４７：５５４）。ｃＤＮＡ合成およびＩＬ−６ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ．Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州ヘイワード）からのＲＴ−ＰＣＲ試薬を用い実質的にＭｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙおよびＤａｌｌｍａｎに記載されるように行った（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ａ．およびＭ．Ｓ．Ｄａｌｌｍａｎ（１９９１），Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｔａｌｔｈｙｍｉｃ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４７：５５４）。試料は３０サイクルの増幅の後、ゲル電気泳動をしその後、非ブロット（ｕｎｂｌｏｔ）解析（Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．ら，（１９９１）ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｒｉｅｄ  ｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ：ａｎ
ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｖｅｒ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３：１２３）により解析した。簡潔には、ゲルを室温で、変性緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＯＨ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で３０分ハイブリダイズし、その後再生緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８）中で３０分インキュベーションし、そして再蒸留水中で３０分洗浄した。ゲルを乾燥し、そして１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５Ｘ  ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ）中で４７℃で２時間プレハイブリダイズさせた。ゲルを２ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌのＩＬ−６に対するｇ−［３２Ｐ］ＡＴＰ末端標識内部オリゴヌクレオチドプローブ（５’ＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５６）と４７℃で一晩ハイブリダイズし、室温で４回洗浄し（２Ｘ  ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ）、そしてオートラジオグラフを行った。結果は図３に示した。
【０２０８】
細胞増殖検定。培地、ＣｐＧを含むまたはＣｐＧを含まないＳ−ＯＤＮ（０．５μＭ）またはＯ−ＯＤＮ（２０μＭ）でＤＢＡ／２マウス脾臓Ｂ細胞（５ｘ１０４細胞／１００μｌ／ウェル）を３７℃で２４時間処理した。細胞は最後の４時間、［３Ｈ］チミジンまたは［３Ｈ］ウリジン（１μＣｉ／ウェル）のいずれかでパルス標識した。［３Ｈ］用取りこみ量をＬｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、イリノイ州ダウナーズグローブ）を用い測定した。
【０２０９】
トランスフェクションおよびＣＡＴ検定。ＷＥＨＩ−２３１細胞（１０７細胞）を、２０μｇのコントロールまたはヒトＩＬ−６プロモーター−ＣＡＴ構築物（アーカンソー大学のＳ．Ｍａｎｏｌａｇａｓの好意により提供）（ｐｏｔｔｒａｔｚ，Ｓ．Ｔ．ら，（１９９４）１７Ｂ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｒｅｐｅｒｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓｂｙ  ａｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：９４４）と共に２５０ｍＶおよび９６０μＦで電気泳動した。電気泳動後、細胞をさまざまな濃度のＣｐＧを含むまたはＣｐＧを含まないＤＮＡにより刺激した。クロラムフェニコ−ル・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性をトランスフェクションの１６時間後、溶液検定（Ｓｅｅｄ，Ｂ．およびＪ．Ｙ．Ｓｈｅｅｎ（１９８８）Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈａｓｅ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅ  ７６：２７１）により測定した。
結果は図５に示している。
【０２１０】
（実施例１０：オリゴヌクレオチドの修飾が  ＣｐＧモチーフによるＢ細胞活性化の度合いを決定する）
標準的方法（ＢｅａｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ―Ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｋｅｙ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，１８５９−１８６２．）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティ）モデル３８０Ａ、３８０Ｂ、または３９４ＤＮＡ合成機により、ＯＤＮを合成した。ホスホジエステルＯＤＮを標準的ベーターシアノエチルホスホロアミダイト化学反応を用いて合成した。ホスホロチオエート結合は、標準的なヨウ素酸化の代わりに、イオウ元素を用い亜リン酸結合を酸化することにより導入した。４つの一般的なヌクレオシドホスホロアミダイトをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。すべてのホスホジエステルおよびチオエート含有ＯＤＮは濃アンモニアで５５℃で１２時間処理することにより脱保護した。ＯＤＮをゲル排除クロマトグラフィーにより精製し、そして使用前に凍結乾燥した。ホスホロジチオエート結合は、デオキシヌクレオシドＳ−（ｂ−ベンゾイルメルカプトエチル）ピロリジノチオホスホロアミダイト（Ｗｉｅｓｌｅｒ，Ｗ．Ｔ．ら，（１９９３）Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ  ｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．（監修），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９１−２０６．）を用いることにより導入した。ジチオエートを含むＯＤＮは、濃アンモニアで５５℃で１２時間処理し脱保護した後、逆相ＨＰＬＣ精製を行った。
【０２１１】
ホスホジエステルと共にメチルホスホノチオエートまたはメチルホスホネートを望ましいヌクレオチド間結合部位に含むオリゴマーを合成するため、２つの異なる合成サイクルを用いた。２つのサイクルの主な合成上の相違は、カップリング試薬であり、ジアルキルアミノメチルヌクレオシドホスフィンを使用し、そしてメチルホスホノチオエートの場合は酸化試薬を用いた。どちらかの誘導体を合成するため、ジアルキルアミノメチルヌクレオシドホスフィンの場合はカップリング反応速度が遅いため、縮合（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）時間を増やしている（ＪａｇｅｒおよびＥｎｇｅｌｓ，（１９８４）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｖｉａ  ａｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｉｔｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４，１４３７−１４４０）。カップリング段階が完了した後、メチルホスフィノジエステルを硫化試薬（二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中の５％イオウ元素、１００ミリモルのＮ，Ｎ−ジアメチルアミノピリジン）で各連続４５０秒で４回処理し、メチルホスホノチオエートを産生した。メチルホスホネート結合を生成するため、メチルホスフィノジエステルを標準的酸化試薬（テトラヒドロフラン／２，６−ルチジン／水中の０．１Ｍヨウ素）で処理した。
【０２１２】
シリカゲル結合オリゴマーを１：１（ｖ／ｖ）の蒸留ピリジン／濃アンモニアで、４日間４℃で処理した。上清を真空で乾燥し、水に溶解し、そしてＧ５０／５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上でクロマトグラフィーを行った。
【０２１３】
本明細書において、Ｏ−ＯＤＮはホスホジエステルであるＯＤＮを指し；Ｓ−ＯＤＮは完全にホスホロチオエート修飾されたものであり；Ｓ−Ｏ−ＯＤＮは中央の結合がホスホジエステルであるが、２つの５’および５つの３’結合がホスホロチオエート修飾されているキメラＯＤＮであり；Ｓ２−Ｏ−ＯＤＮは中央の結合がホスホジエステルであるが、２つの５’および５つの３’結合がホスホロジチオエート修飾されているキメラＯＤＮであり；そしてＭＰ−Ｏ−ＯＤＮは中央の結合がホスホジエステルであるが、２つの５’および５つの３’結合がメチルホスホネート修飾されているキメラＯＤＮである。調べたＯＤＮ配列（ＣｐＧジヌクレオチドは下線により示されている）には：
【０２１４】
【化８】
2010150280.tif 000024
が含まれる。これらの配列はこれらの研究の過程で試験した文字通り何百ものＣｐＧを含むおよびＣｐＧを含まないＯＤＮの代表である。
【０２１５】
マウス。Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から得、特定病原体除去条件下で維持したＤＢＡ／２、またはＢＸＳＢマウスを、５−１０週齢でリンパ球供給源として使用し、実質的に同一の結果が得られた。
【０２１６】
細胞増殖検定。細胞増殖検定には、マウス脾臓細胞（５ｘ１０４細胞／１００μｌ／ウェル）を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活ウシ胎児血清（Ｏ−ＯＤＮを用いる実験には６５℃に熱し、または修飾ＯＤＮのみを用いる実験には５６℃に熱する）、１．５μＭＬ−グルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ−１６４０中で、示されるように２４時間または４８時間培養した。１μＣｉの３Ｈウリジンまたはチミジンを（示されるように）各ウェルに添加し、そして細胞をさらに４時間培養した後採取した。フィルターをシンチレーション計測によりカウントした。３つ組ウェルの標準偏差は５％未満であった。結果は図６−８に示している。
【０２１７】
（実施例１１：ＮＫ活性誘導）
ホスホジエステルＯＤＮはＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州アラメダ）より購入した。ホスホロチオエートＯＤＮはアイオワ大学ＤＮＡ中央施設、またはＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド）より購入した。
大腸菌（Ｂ株）ＤＮＡおよび子ウシ胸腺ＤＮＡはＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）より購入した。すべてのＤＮＡおよびＯＤＮはフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）および／またはエタノール沈澱により精製した。カブトガニ検定によれば、ＯＤＮ中のＬＰＳレベルは１２．５ｎｇ／ｍｇ未満であり、そして大腸菌および子ウシ胸腺ＤＮＡはＤＮＡ１ｍｇ当たり、２．５ｎｇ未満のＬＰＳしか含まなかった。
【０２１８】
ウイルスを含まない４−６週齢のＤＢＡ／２、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）および先天的無胸腺ＢＡＬＢ／Ｃマウスは米国癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；メリーランド州ベセスダ）の退役軍人問題（Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ）を通じた契約により得た。Ｃ５７ＢＬ／６  ＳＣＩＤマウスはアイオワ大学動物飼育施設のＳＰＦバリア施設で繁殖した。
【０２１９】
ヒト末梢単核白血球（ＰＢＭＣ）は以前記載されたように得られた（Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．ら，（１９９０）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５：４５３；Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．およびＷ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１０３９；Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．およびＷ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０；１７）。ヒトまたはマウス細胞を５％ＣＯ２加湿インキュベーターの２４ウェルプレート中で（Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．ら，（１９９０）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５：４５３；Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．およびＷ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１０３９；およびＢａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．およびＷ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７）、培地のみを含み、またはＣｐＧを含むまたはＣｐＧを含まないＯＤＮを示された濃度で、または大腸菌または子ウシ胸腺ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を含み、５ｘ１０６／ウエルで３７℃で２４時間培養した。すべての培養物は１８時間で採取し、そして細胞を標準的に４時間、エフェクターとして用いた。Ｋ５６２（ヒト）またはＹＡＣ−１（マウス）標的細胞に対する５１Ｃｒ放出検定を以前記載したように行った。溶解単位（ＬＵ）の算出には、１ＬＵを３０％の特異的溶解をもたらすのに必要な細胞数として定義した。示したところで、ＩＦＮ−β（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ、カリフォルニア州サンディエゴ）またはＩＬ−１２（Ｃ１５．１、Ｃ１５．６、Ｃ１７．８およびＣ１７．１５；Ｔｈｅ  Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ペンシルバニア州フィラデルフィアのＧｉｏｒｇｉｏ  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ博士より提供）に対する中和抗体またはそのアイソタイプコントロールを培養開始時に１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。抗ＩＬ−１２添加には、各１０μｇの４つのＭＡＢ（またはアイソタイプコントロール）を同時に添加した。組換えヒトＩＬ−２は、１００Ｕ／ｍｌの濃度で使用した。
【０２２０】
（実施例１２：ネズミ喘息モデルにおける炎症性細胞浸潤および好酸球増加症の発展の予防）
６−８週齢のＣ５６ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバーより）に、５０００個のマンソン住血吸虫卵を、第０日および第７日に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与することにより免疫化した。マンソン住血吸虫卵は、Ｔｈ２免疫反応（例えば、ＩｇＥ抗体産生）を誘導する抗原（マンソン住血吸虫卵抗原（ＳＥＡ））を含む。ＩｇＥ抗体産生は喘息の重要な原因であることが知られている。
【０２２１】
免疫化マウスをその後、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む（すなわちＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）または含まない（すなわちコントロール、ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ；ＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ：１１）オリゴヌクレオチドで処理した（２００μｌの生理食塩水中に３０μｇ、ｉ．Ｐ．注射による）。可溶性ＳＥＡ（２５μｌの生理食塩水中に１０μｇ）を鼻腔内点滴注入により第１４日および第２１日に投与した。生理食塩水をコントロールとして用いた。
【０２２２】
マウスを気道攻撃後のさまざまな時点で屠殺した。全肺洗浄を行い、気道および肺胞の炎症性細胞を採取した。洗浄液のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。ノーザン解析およびＲＴ−ＰＣＲ研究を行うため、ＣｓＣｌ勾配によりＲＮＡを全肺から単離した。組織学的試験のため、肺を膨張させ、そして４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流した。
【０２２３】
図９は、マウスに最初に卵をｉ．ｐ．投与した際、そしてその後卵抗原を吸入させた際（白丸）、多くの炎症性細胞が肺に存在することを示す。しかし、マウスに最初に非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸を卵と共に与えた場合、続いて卵抗原を吸入させても肺中の炎症性細胞は増加しなかった（白三角）。
【０２２４】
図１０は、肺洗浄中に存在する好酸球のみを測定した場合、同様の結果が得られることを示す。好酸球は最も密接に喘息と結び付けられる炎症性細胞種である。
【０２２５】
図１１は、卵への最初の曝露時にマウスをコントロールオリゴで処理した場合、続くＳＥＡ吸入後、肺への好酸球浸潤にほとんど影響がないことを示す。したがって、マウスが第１４ま日たは第２１日に卵を吸入すると、肺において急性炎症反応が発展する。しかし、第０日および第７日の、最初の抗原曝露時に卵と共にＣｐＧオリゴを与えると、第１４日にマウスに卵抗原を吸入させた際、好酸球増加はほとんど完全に抑えられる。
【０２２６】
図１２は、非常に低い用量のオリゴヌクレオチド（＜１０μｇ）によりこの防御が与えられることを示す。
【０２２７】
図１３は、生じる炎症反応が肺中のＴｈ２サイトカインＩＬ−４のレベルと相関することを示す。
【０２２８】
図１４は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを投与すると、実際に、肺のサイトカイン反応が、Ｔｈ１型免疫反応を示すＩＬ−１２産生へと変化しうることを示す。
【０２２９】
図１５は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを投与するとまた、肺のサイトカイン反応が、Ｔｈ１型免疫反応を示すＩＦＮ−γ産生へと変化しうることを示す。
実施例１３：ＣｐＧオリゴヌクレオチドはヒトＰＢＭＣがサイトカインを分泌するよう誘導する
ヒトＰＢＭＣを標準的なフィコール・ハイパック上の遠心分離により、全血から調製した。細胞（５ｘ１０５／ｍｌ）を１０％の自己血清中で、９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＣｐＧまたはコントロールオリゴデオキシヌクレオチド（ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは２４μｇ／ｍｌ；ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは６μｇ／ｍｌ）と共に、ＴＮＦ−αの場合は４時間、他のサイトカインの場合は２４時間培養し、上清を採取してそして、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットまたは試薬を用い（ｐｇ／ｍｌ）、またはＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（ＩＬ−１２の場合）のサイトカインＥＬＩＳＡキットを用いたＥＬＩＳＡにより測定した。検定は製造者の指示にしたがい行った。データは、オリゴヌクレオチドを添加しないウエルより高いサイトカインレベルとして、表６に示す。
【０２３０】
当業者は、ルーチンの実験法以上のものを用いなくても、本明細書に記載される本発明の特定の態様には多くの同等物があることを認識するであろうし、または確認することが可能であろう。こうした同等物は以下の請求項により含まれるよう意図される。
【図１Ａ】
2010150280.tif 000025
【図１Ｂ】
2010150280.tif 000026
【図１Ｃ】
2010150280.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
2010150280.tif 000037
【図１０】
2010150280.tif 000038
【図１１】
2010150280.tif 000039
【図１２】
2010150280.tif 000040
【図１３】
2010150280.tif 000041
【図１４】
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【図１５】
2010150280.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月8日(2010.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非げっ歯類被験体において喘息を処置または予防するための組成物であって、該被験体において喘息を処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該被験体は、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に抗原を投与されない、組成物。