(57)【要約】      （修正有）【課題】トリコデルマ・リーセイより強いセルロース分解活性を示す酵素を産生するクロストリジウム・サーモセラムに属する微生物を用いたセルロース系バイオマスの処理方法を提供する。【解決手段】セルロース系バイオマスを、クロストリジウム・サーモセラム属に属し、弱アルカリ性で生育し、セルロース、フラクトース及びソルビトール資化能を有する微生物であるクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４又はＪＫ-Ｓ１４、またはその菌体培養物を用いて処理する。トリコデルマ・リーセイ由来の酵素の少なくとも４０分の１以下の酵素量で糸状菌酵素と同等以上の速度でセルロース分解できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウムに属し、弱アルカリ性で生育し且つセルロース、フラクトース及びソルビトール資化能を有する、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２７）菌株。
【請求項２】
クロストリジウムに属し、弱アルカリ性で生育し且つセルロース、フラクトース及びソルビトール資化能を有する、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２８）菌株。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の微生物を培養する、セルロソームを含むセルラーゼ及びヘミセルラーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載の微生物又はその菌体培養物を用いてセルロース系バイオマスを処理する、セルロース系バイオマスの糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム属に属するセルロース分解活性を示す微生物に係り、さらに同菌を用いたセルロソームを含むセルラーゼ及びヘミセルラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バガス、稲わら、籾殻、キノコ廃床、堆肥、木材チップ等のセルロース系バイオマスは、食糧生産を圧迫しないエネルギーや化学工業の原料資源として注目されている。特に、セルロース系バイオマスを燃料エタノールや発酵原料である糖へ変換する糖化技術において、より効率の良い技術の開発が切望されている。
【０００３】
セルロース系バイオマスの糖化方法には、物理的糖化、化学的糖化と酵素糖化の３つの方法がある。
物理的糖化処理にはボールミルや振動ミル又は蒸煮爆砕や加圧熱水処理など物理的に糖化を施す処理があるが、糖化までに多大なエネルギーを必要とすることや、効率が悪く、単独で用いるというよりは、化学的糖化や酵素糖化の前処理として併用されることが多い。化学的糖化処理には、アルカリ、酸または溶媒を利用するものがあるが、古くより酸糖化がよく用いられている。酸糖化は濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがある。しかし、酸糖化は、硫酸を用いるため、廃棄物処理や環境負荷の低減を必要とし、低コスト化及びエネルギー変換効率に限界があるといわれている。
【０００４】
酵素糖化は酸糖化に比べ、低温で処理できること、過分解が起こらずに糖の収率が高い等の利点があるため、澱粉質を多く含むバイオマスの酵素糖化で実用化されている。ところが、セルロース系バイオマスは、（１）セルロースが結晶構造を有していること、（２）結晶性セルロースをヘミセルロースやリグニンが取り囲んだ複雑な構造を形成しているため、澱粉系に比べ、酵素糖化がきわめて困難である。したがって、酵素による糖化処理前に、物理的あるいは化学的前処理による結晶構造の破壊等の前処理や大量のヘミセルラーゼやセルラーゼを必要とする。
【０００５】
現在、セルロース系バイオマスを効率的に糖化できるヘミセルラーゼやセルラーゼを産生する微生物の探索が行われている。特に糸状菌、中でもトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）を用いた酵素糖化が研究されている。例えば、特許文献１には酸性条件下でセルロース分解活性を示すトリコデルマ属菌が開示されている。
また、トリコデルマ属菌以外のセルロース分解活性を示す微生物として、非特許文献２〜６に示すように、クロストリジウム属（Clostridium）菌が知られている。なお、クロストリジウム属菌が産生する酵素は、複数のサブユニットからなるセルラーゼ複合体、セルロソーム（Cellulosome）を形成していることが報告されている（非特許文献６参照）。
【特許文献１】特開２００７−３１９０４０号公報
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８３  ９：１９５−２００
【非特許文献２】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  １９８０  Ｓｅｐｔ;４０:５７１−５７７
【非特許文献３】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  １９９０  Ｊａｎ;５４:３７−４２
【非特許文献４】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  １９８８  Ｊａｎ;５４:２０４−２１１
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ Ｓ Ａ. ２００６  Ｏｃｔ ３１;１０３（４４）:１６１６５−１６１６９
【非特許文献６】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ.  ２００５ Ｍａｒ;６９（１）:１２４−５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、クロストリジウム属に属するセルロース分解活性を示す微生物、そして、セルロソームを含むセルラーゼ及びヘミセルラーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、セルロース系バイオマスを効率的に糖化できるヘミセルラーゼやセルラーゼを産生する微生物の探索を重ねたところ、これまでに知られているクロストリジウム・サーモセラムに属する菌よりも強いセルロース分解活性を示す微生物の単離に成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下に示すクロストリジウム属に属するセルロース分解活性を示す微生物、そして、セルロソームを含むセルラーゼ及びヘミセルラーゼの製造方法を包含する技術である。
（１）クロストリジウムに属し、弱アルカリ性で生育し且つセルロース、フラクトース及びソルビトール資化能を有する、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２７）菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２８）菌株。
（２）クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２７）菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２８）菌株を培養することを特徴とする、セルロソームを含むセルラーゼおよびヘミセルラーゼの製造方法。
（３）クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２７）菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２８）菌株、又はその菌体培養物を用いてセルロース系バイオマスを処理する、セルロース系バイオマスの糖化方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のクロストリジウム・サーモセラムに属する菌が産生する酵素は、これまでに知られているクロストリジウム・サーモセラムが産生するセルロソームよりも強いセルロース分解活性を示す。また、本発明のクロストリジウム・サーモセラムに属する菌を培養して得られた酵素は、糸状菌トリコデルマ由来の酵素に比べ、セルロース系バイオマスの糖化効率が高いため、低コスト及びエネルギー変換効率の向上につながり有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らが単離したクロストリジウム・サーモセラムに属する菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  微生物寄託センターに、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２７）菌株、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＪＫ−Ｎ４４（ＮＩＴＥ  Ｐ−６２８）菌株として寄託されている（寄託日：平成２０年８月１２日）ので、この機関より入手することができる。
【００１１】
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株の菌学的性質を以下に記述する。
桿菌（約１．６〜３．０μｍ）、胞子形成能あり
好熱性菌
生育温度：５０℃〜６５℃、至適生育温度６０℃
生育ｐＨ：６．０〜９．０、至適ｐＨ７．０
偏性嫌気性菌  ガスＮ２及びＣＯ２に生育（ＣＯ２の場合、培地に炭酸ナトリウムを０．４％程度加える）
培地上の特徴：酸素が入っている培地では生育不可。生育ｐＨ７．０で良好。セルロース、セロビオースに生育する。セルロース培地ではセルロースがクリーム色になり分解する。
糖の資化性：セルロース、マンナン、キトサン、セロビオース、フラクトース及びソルビトール資化能を有する。
コロニー形態：セルロース寒天培地ではハローを形成、コロニーは白く小さい。培養日数が経過するとコロニーの周囲に白い粘性を帯びた輪を形成することもある。胞子を形成。−８０℃にて保存可能である。
１６ｓｒＲＮＡ（１６リボソームＲＮＡコード配列）：クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株との間で９９％の相同性を示す。
【００１２】
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株は、以下の点において、これまでに報告されているクロストリジウム・サーモセラムに属する微生物と相違する。
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５やクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９では、セルロース分解時にイエローアフィニティーサブスタンス（ＹＡＳ：Ｙｅｌｌｏｗ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を生産し、セルロースが黄色またはオレンジ色に着色することが知られているが（非特許文献１）、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株は黄色いＹＡＳ様物質を生産しない。
【００１３】
これまでの報告によると、クロストリジウム・サーモセラムはエタノール０．５％〜２％存在下において生育が著しく阻害を受けることが知られている（非特許文献２）。クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株では３％エタノール存在下において生育することができる。
【００１４】
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株は、通常のクロストリジウム属菌の培養に用いられる方法により培養することができる。例えば、以下の組成のＢＭ７ＣＬ培地でｐＨ７、５０℃〜６５℃の条件で行なえばよい。
【００１５】
培地の組成（１００ｍｌ当たり）
Ｋ２ＨＰＯ４                  ０．２９ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                    ０．１５ｇ
尿素                        ０．２１ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ   ０．４５g
【００１６】
以上の混合溶液をＨＣＬ又はＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整後、以下の
システイン塩酸塩            ０．０５％
ミネラル溶液２０μｌ        （組成：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：１ｇ，  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ，  ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ  ０．００１２５ｇ  を水４ｍｌに溶解）
リザズリン（２％溶液）      ５μｌ
炭素源：セルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ ２０ 又は Ａｖｉｃｅｌ） ０．５ｇ又はセロビオース０．５ｇ
【００１７】
炭素源は市販されているセルロース性物質ならいずれも利用できる。すなわちシグマセルやアビセルはもとより、ワットマンろ紙、クロマトグラフィー用セルロース粉末、綿、バクテリアセルロース等を利用することができる。また結晶性セルロースの代わりに、酸で膨潤したセルロースやボールミルや粉砕機により結晶性を低下させたセルロースでも炭素源として利用することができる。また再生紙、古紙や新聞紙、オフィス廃棄裁断紙やトイレットペーパーも炭素源として利用することができる。さらには、物理的、化学的な前処理を行った稲わら、麦わら、バガス、木材パルプ、芋パルプ、古紙、紙屑、綿屑等、セルロースを含んでいるものならいずれも炭素源として利用することができる。
【００１８】
また菌株の増殖促進のために上記培地成分以外に、ビタミンの混合液や微量金属混合液などを適当量添加してもよい。例えば、イノシトール、パントテン酸、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１、アミノ安息香酸、リボフラビン、ビオチン、葉酸等の混合液を適量添加してもよい。また鉄、ナトリウム、ヒ素、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、ヨウ素、ニッケル、銅、コバルト等の元素混合液を添加することもできる。さらに酵母エキス、ペプトンなどのアミノ酸やタンパク質加水分解物を豊富に含む窒素又は栄養源を上記培地の濃度以上に添加しても良いが、これら以外にも、例えば、硫酸アンモニウム、コーンスチープリカー、肉エキス、又はグルタミン酸やグリシンなどのアミノ酸であっても構わない。
【００１９】
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４菌株の菌学的性質を以下に記述する。
桿菌（約１．６〜３．０μｍ）、胞子形成能あり
好熱性菌
生育温度：５５℃〜６５℃、至適生育温度６０℃
生育ｐＨ：６．０〜９．０、至適ｐＨ７．０
偏性嫌気性菌  ガスＮ２及びＣＯ２に生育（ＣＯ２の場合、培地に炭酸ナトリウムを０．４％程度加える）
培地上の特徴：酸素が入っている培地では生育不可。生育ｐＨ７．０で良好。セルロース、セロビオースに生育する。セルロース培地ではセルロースがクリーム色になり分解する。
糖の資化性：セルロース、マンナン、キトサン、セロビオース、フラクトース及びソルビトール資化能を有する。
コロニー形態：セルロース寒天培地ではハローを形成、コロニーは白く小さい。培養日数が経過するとコロニーの周囲に白い粘性を帯びた輪を形成することもある。胞子を形成。−８０℃にて保存可能である。
１６ｓｒＲＮＡ（１６リボソームＲＮＡコード配列）：クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株との間で９９％の相同性を示す。
【００２０】
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５やクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９は、セルロース分解時にイエローアフィニティーサブスタンス（ＹＡＳ：Ｙｅｌｌｏｗ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を生産し、セルロースが黄色またはオレンジ色に着色することが知られているが（非特許文献１）、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４菌株は黄色いＹＡＳ様物質を生産しない。
【００２１】
また、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４菌株は、以下の点において、これまでに報告されているクロストリジウム・サーモセラムに属する微生物と相違する。
クロストリジウム・サーモセラムはエタノール０．５％〜２％以下において生育が著しく阻害を受けることが知られている（非特許文献２）。クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４菌株では３％エタノール存在下において生育することができる。
【００２２】
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４菌株は、通常のクロストリジウム属菌の培養に用いられる方法により培養することができる。例えば、以下の組成のＢＭ７ＣＬ培地でｐＨ７、５５℃〜６５℃の条件で行なえばよい。
【００２３】
培地の組成（１００ｍｌ当たり）
Ｋ２ＨＰＯ４                  ０．２９ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                    ０．１５ｇ
尿素                        ０．２１ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ   ０．４５ｇ
【００２４】
以上の混合溶液をＨＣＬ又はＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整後、以下の成分を添加してもよい。
システイン塩酸塩            ０．０５％
ミネラル溶液２０μｌ        （組成：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：１ｇ，  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ，  ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ  ０．００１２５ｇ  を水４ｍｌに溶解）
リザズリン（２％溶液）      ５μｌ
炭素源：セルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ ２０ 又は Ａｖｉｃｅｌ） ０．５ｇ又はセロビオース０．５ｇ
【００２５】
炭素源又は培地添加物等は、上記クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株の菌学的性質の説明で述べたとおりである。
【００２６】
なお、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４の培養において、増殖によるｐＨ低下を抑えるために、ＨＥＰＥＳ（２−{−(２−ハイドロキシエチル)−１−ピペラジニル]エタネスルフォニック酸：2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（３−モーフォリノプロパネスルフォン酸：3-Morpholinopropanesulfonic acid）等のグッドの緩衝剤を添加してもよい。また炭酸ナトリウムを添加し、気相を炭酸ガスで充填し、ｐＨを６．０〜７．０付近に維持調整しても構わない。また適当な濃度の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ剤の添加により連続的にｐＨ６．０〜７．０付近に維持調整してもよい。
【００２７】
本発明の新菌株は、嫌気性細菌であり分子状酸素が存在する環境下では増殖することが出来ないため、分子状酸素が存在する環境で本菌株を使用する場合は、不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム、アルゴンあるいは炭酸ガスなどを用いた曝気を行うことにより培地環境中に存在する酸素の除去を行なう。一般的に培地は、気相や培地に溶存している酸素を置換するため、窒素ガスでバブリングした後、オートクレーブで殺菌することが望ましい。また、硫化ナトリウム、システイン塩酸などの還元剤を添加しても良い。環境中に好気性の微生物が存在する場合は、好気性微生物が利用可能な有機物、例えば生ゴミ、余剰汚泥、し尿、デンプン、グルコースなどを加えることにより、予め環境から酸素を除去しても良い。
【００２８】
本発明は、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４のほか、それらの自然変異株や紫外線等で人為的に変異させた変異株、さらにクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４の組み換え菌であって、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４と同等のセルロース分解能を有する菌株を含むものである。
また、本明細書中において、「菌体培養物」とは、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４を培養して得られる培養物を意味し、菌体培養物は、そのままでもあるいは精製して用いてもよい。
【００２９】
セルロース系バイオマスの糖化は、バガス、稲わら、籾殻、キノコ廃床、堆肥、木材チップ、芋パルプ、古紙、綿等をクロストリジウム・サーモセラムに属する微生物又は菌体培養物と接触させて行なえばよい。クロストリジウム・サーモセラムに属する微生物を用いる場合には、接触を嫌気性条件下で培養する必要がある。
また、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株又はクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４、又は菌体培養物を安定的に保存するために、菌体又は菌体培養物に担体、界面活性剤や補助剤を加えてもよい。担体としては、リン酸緩衝液等の緩衝液や生理食塩水等の液体やカオリン、タルク、珪藻土等の固体を用いることができる。
【実施例１】
【００３０】
さらに、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。
田畑土壌、バガス、稲わら、籾殻、キノコ廃床、堆肥、木材チップ粕、廃棄パルプ、など農作物残渣[タイ国由来（バンコク県、チョンブリ県、プラチャンブリ県、アユタヤ県、ナコンパトム県、ラチャブリ県、サムットサコン県、ペチャブリ県、ラビ県、アン−トング県、ロプブリ県、ナコンラチャシマ県、カラシン県、コンケン県、サコンナコン県、ムクダハン県、アンナチャローン県）]を含むサンプル約２〜５ｇと、幅０．５〜１．０ｃｍ、長さ４〜５ｃｍに短冊形にカットしたろ紙（ワットマン社製  Ｎｏ.１）及び、結晶性セルロース（シグマセルタイプ２０・シグマ社製）とを、ＢＭ７培地２０〜２５ｍｌに懸濁した。得られた懸濁液を窒素（工業用グレード）にて十分にバブリングし、気相を窒素ガスで置換した後、ブチルゴム栓で密閉し、６０℃にて培養を行った。
なお、ＢＭ７培地の組成は、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二カリウム２．９ｇ／Ｌ，尿素２．１ｇ／Ｌ，酵母エキス（ディフコ社）４．５ｇ／Ｌ，システイン塩酸塩０．５ｇ／Ｌ、０．２ｍｌミネラル溶液(ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ５ｇ;  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．７５ｇ;  ＦｅＳＯ４．６Ｈ２Ｏ  ０．００６３ｇを水４ｍｌに溶解)とし、得られたＢＭ７培地をｐＨ７．０に調整した。
３日間から１週間程度培養後、サンプルを加えていない上記培養液と比較し、微生物分解によるろ紙の崩壊、分解、及び結晶性セルロースの添加量の明らかな減少や粉末に粘性が認められ、明らかに様子の相違が認められる培養液を選択した。選択した培養液をよく攪拌懸濁して、その０．５ｍｌの培養液を新しい結晶性セルロースを含むＢＭ７培地へ接種し、再度同条件にて培養を行った。この操作を数回繰り返し、セルロース分解菌を集積培養した。
【００３１】
約４日間、集積培養を行い、０．５％の結晶性セルロースを完全分解した培養液を選択した。その選択した培養液の一部を、結晶性セルロース０．５％、寒天(ディフコ社)１．５％を含むＢＭ７寒天培地に、適当な希釈倍率にて接種し、６０℃、７２時間〜８０時間培養を行った。
７２時間〜８０時間後にコロニーの周りにセルロース分解に伴う透明なハロー（Ｈａｌｏ）が認められるコロニーのみ選択し、再度０．５％の結晶性セルロースを含むＢＭ７液体培地に接種して、セルロース分解能を確認した。さらに分離したセルロース分解菌を純化するため、コロニー分離操作を３回繰り返した。
【００３２】
分解菌をさらに純化するために、７２時間で結晶性セルロース分解によるハローを形成できるコロニーの培養液の一部を、０．５％〜１％セロビオースを含むＢＭ７寒天培地に接種した。出現したコロニーを嫌気条件下で分離し、再度、０．５％結晶性セルロースを含むＢＭ７液体培地に接種し、セルロース分解能を確認した。これらの操作を３度繰り返し、最終的に、分離した培養物が、結晶性セルロース０．５％含むＢＭ７寒天培地において７２〜８０時間で結晶性セルロース分解によるハローを形成出来るかどうかを確認した。
そして、７２〜８０時間で結晶性セルロースを含む寒天培地において、セルロース分解に伴うハローを形成可能な分離培養物から菌株を単離して、ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４と命名した。
【実施例２】
【００３３】
ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ‐Ｓ１４（以下、本明細書中で「分離菌」又は「分離菌株」ということもある）の分類学上の特徴を明らかにするために、１６ｓｒＲＮＡの塩基配列解析を行った。ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４からのゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。
ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４をそれぞれ、０．５％セロビオースを含むＢＭ７液体培地を用いて培養後、４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を溶菌させるために、最終濃度０．５％になるように１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と、５μグラム／ｍｌになるようにプロテナーゼＫ（１ｍｇ/ｍｌ）溶液を加え、３７℃で１時間反応させた。さらに１％濃度になるように１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、６５℃で１０分間反応させた後、等量のクロロフォルム・イソアミルアルコール溶液を加えよく攪拌し、１５，０００回転で、５分間遠心分離にて水層を得た。この水層に再度フェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール混液を等量加え、攪拌し再度１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。この水層に対し０．６倍容量のイソプロパノールを加えゲノムＤＮＡを析出させ、再度遠心分離によりゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄、乾燥した。
１６ｓｒＲＮＡ増幅用ＰＣＲプライマーは２７Ｆオリゴヌクレオチドプライマー（ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ；配列番号３）及び１４９２Ｒオリゴヌクレオチドプライマー（ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ；配列番号４）を用い、ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間を３０サイクルの条件において増幅を行なった。
ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１(アプライドバイオシステムズ社)を用い、ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）または、ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）によりＤＮＡ配列の一部を読み取った。得られた、ＪＫ−Ｎ４４のｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を図１及び配列番号１に、ＪＫ−Ｓ１４のｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を図２及び配列番号２に示す。
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得られたＤＮＡ配列データを用いて、ホモロジー検索を行なった。その結果、ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４の１６ｓｒＲＮＡ配列は菌株クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株の１６ｓｒＲＮＡ配列に９９％の相同性を示したことから、分離菌株はクロストリジウム・サーモセラムに属することが明らかとなった。
図８にＪＫ−Ｎ４４菌株とクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株のＤＮＡ配列のアライメントを、図９にＪＫ−Ｓ１４とクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株のＤＮＡ配列のアライメントを示す。
【実施例３】
【００３４】
分離菌株の生理学的特徴を明らかにするために、生育温度範囲、生育可能ｐＨ範囲、炭素源の資化性試験を行なった。
【００３５】
生育温度範囲に対する試験は０．５％セロビオースを含むＢＭ７液体培地を用い、３０℃から５℃おきに７０℃まで生育可能かどうか、菌の生育に伴う菌体濃度の上昇を６００ｎｍによる濁度の上昇を指標に測定を行なった。
その結果、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株及び分離株ＪＫ−Ｓ１４では５０℃から６５℃で生育するが、分離菌株ＪＫ−Ｓ４４の生育温度は５５℃から６５℃と若干高い温度であった。いずれの菌株も至適生育温度は６０℃であった。
【００３６】
生育可能なｐＨの測定は上記同様に０．５％セロビオースを含むＢＭ７液体培地を用いて、ｐＨ４．０からｐＨ１０．０まで、ｐＨ１．０おきに培地中のｐＨを塩酸で調整した後、６００ｎｍによる濁度の上昇を指標に生育測定を行なった。なお、ｐＨ８はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を培地に添加しｐＨの調整を行ない、ｐＨ９．０〜１０．０は炭酸ナトリウム緩衝液を用いｐＨの調整を行なった。各ｐＨに調整された液体培地はオートクレーブ後、ｐＨメーターを用いて、指定のｐＨとなっているか確認をした後、菌を培養して試験を行なった。その結果、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株ではｐＨ６．０からｐＨ７．５の範囲で生育を確認できたが、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４菌株及びクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｎ４４はｐＨ６．０からｐＨ９．０まで生育可能であった。すなわち、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株よりも分離菌株はアルカリ側で生育可能であった。
【００３７】
糖の資化性は、セルロース、セロビオース、グルコース、フラクトース、ソルビトールを各０．５％それぞれ含んだＢＭ７液体培地を用いて測定を行なった。不溶性基質であるセルロースは、セルロースの消失により資化性の有無を判定した。またその他の可溶性基質を使用した場合、上記と同様に６００ｎｍでの濁度の上昇を測定した。培養は４日間行い、その後生育の有無を測定した。
糖質を抜いたＢＭ７培地にはすべての菌株において明確な生育は認められなかったが、既知菌株ではセロビオース、グルコースを炭素源に用いた場合、比較的長いラグが認められた。一方、分離菌株においてはＪＫ−Ｎ４４株でグルコースを炭素源にした場合にのみ長いラグが認められた。しかし、ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４は、ともにグルコース、フラクトース、ソルビトールといった炭素源においても資化性を示し、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株と異なる糖資化能を有することが明らかとなった。
【００３８】
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５やクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９では、セルロース分解時にイエローアフィニティーサブスタンス（ＹＡＳ：Ｙｅｌｌｏｗ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を生産し、分解に伴いセルロースが黄色またはオレンジ色に着色することが知られている（非特許文献１：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８３  ９：１９５−２００）。そこで、分離菌株がＹＡＳを生産するかを確認するため、０．５％セルロースを含むＢＭ７液体培地によりセルロースの着色を確認した。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５は上記培地接種後、４８時間以内にセルロースの白色が黄色く変色し、ＹＡＳが生産されていることが確認できた。一方、分離菌株クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４およびＪＫ−Ｎ４４菌株では、培地中のセルロースはクリーム色へ若干の変色は認められたものの、セルロース分解による消失まで黄色い着色は認められなかった。
なお、非特許文献３記載のクロストリジウム・サーモセラムＹＭ４菌株と、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４およびＪＫ−Ｎ４４菌株とは、クロストリジウム・サーモセラムＹＭ４菌株が二酸化炭素要求性であること、セルロース分解においてオレンジ〜黄色の着色が認められること、生育温度が４５〜６５℃であること、生育可能ｐＨが５．９〜８．１である点で相違する。なお、クロストリジウム・サーモセラムＹＭ４菌株の二酸化炭素要求性に関しては、「Ｎａ２ＣＯ３を含まない培地でＣＯ２をＮ２に置換したガス層では生育が観察されなかった」ことが記載されているが、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４およびＪＫ−Ｎ４４菌株は共に同じ条件下の培養でも生育する。
【００３９】
以上、分離菌株の生理学的特徴をクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株と比較して、表１に示す。
【表１】
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【００４０】
クロストリジウム・サーモセラムはセルロースを分解しエタノール、乳酸、酢酸を生産できることから、セルロースからの直接的なエタノール生産技術の開発に期待されている。しかしクロストリジウム・サーモセラムはエタノール耐性が非常に弱く０．５％〜１％以下において増殖が著しく阻害を受けることが知られている（非特許文献２：Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  １９８０  Ｓｅｐｔ;４０:５７１−５７７）。従ってエタノール耐性は非常に重要な性質と考えられる。そこで分離株のエタノール耐性を検討するため、エタノール３％（ｖ／ｖ）を含み、セロビオースを炭素源にしたＢＭ７液体培地により増殖試験を行った。エタノールの代わりに滅菌水を同量加えたＢＭ７培地を、増殖阻害の起こらない状態として対照に用いた。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５および分離菌株をそれぞれの上記培地に接種し、６０℃で１週間培養を行った後、６００ｎｍでの菌増殖に伴う濁度上昇を測定し比較した。その結果を表２に示した。エタノール３％存在下、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５ではエタノール不在時に比較し８４．２％の著しい増殖阻害を受けた。一方、分離株ではエタノール３％存在下では、２１．４％〜２４．７％の増殖阻害を受けるに止まり、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５よりも強いエタノール耐性能を有していることが明らかとなった。
【表２】
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【００４１】
分離菌株の形態的な特徴を検討するため、走査型電子顕微鏡を用いて形態観察を行った。
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５及び分離菌株を用い０．５％セロビオースを含むＢＭ７液体培地で培養後、ＰＢＳ緩衝液にて培養液１ｍｌを希釈し、メンブランフィルター（ポリカーボネートメンブレン：アドバンテック社製）を通して集菌し、ＰＢＳ緩衝液で一度洗浄を行った。そのメンブランフィルターは一晩、２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液に浸し固定化を行った。メンブランフィルターはさらにＰＢＳ緩衝液にて洗浄後、１．５％酸化オシミウムを含むＰＢＳ緩衝液に1時間浸漬した。そのメンブランフィルターはＰＢＳ緩衝液にて洗浄を行った後、５０％〜９９．５％エタノール濃度の系列で脱水処理を行い、ｔ−ブチルアルコールにより乾燥処理を行った。乾燥処理後、メンブランフィルターは白金パラジウムにてイオンコートを行い走査型電子顕微鏡（日本電子ＪＥＯＬ ＪＳＭ−５６００ＬＶ）により観察を行った。
結果を図３に示す。なお、図中の白横線は1μｍの大きさを示している。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株（図中（ａ）で示す）と、分離株ＪＫ−Ｎ４４（図中（ｂ）で示す）及びＪＫ‐Ｓ１４（図中（ｃ）で示す）とも桿菌で似たような形態を持っていたが、菌体の長さにおいて、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株は約４〜５μｍに対し、ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ‐Ｓ１４は、ともに長さ約１．６〜３．０μｍであり、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株に比べ、短い形態であることがわかる。
なお、非特許文献３にはクロストリジウム・サーモセラムＹＭ４菌株が０．４〜４μｍであることが記載されている。
【実施例４】
【００４２】
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５の結晶性セルロース分解によるハロー形成を分離菌株と比較した。
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５の培養液を使い、実施例１と同様に結晶性セルロースを０．５％含むＢＭ７寒天培地における結晶性セルロース分解によるコロニー周りのハロー形成を調べた。その結果、分離菌株がハロー形成した７２〜８０時間ではハローの形成は確認できず、ハロー形成まで９０時間〜９６時間を要した。
【００４３】
ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４が、すでに報告のあるクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９（非特許文献４：Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８８  Ｊａｎ;５４:２０４−２１１）やクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５（非特許文献５：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ Ｓ Ａ．  ２００６  Ｏｃｔ  ３１；１０３（４４）：１６１６５−１６１６９）より強い結晶性セルロース分解能を有しているかを確認するため、分離菌株の培養液とクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９及びクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５の培養液を用い、その分解活性に伴う結晶性セルロースの濁度低下を指標にした濁度測定法により分解活性の比較を行なった。この濁度測定法は「トゥルー  セルラーゼ  アクティビティー（Ｔｒｕｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８２  Ｍａｙ;４３:１１２５−１１３２））と呼ばれ、不溶性基質であるセルロースが分解によって消失していく過程を測定する方法である。この方法は、遊離還元糖を測定する方法よりも、真のセルラーゼ活性の強弱を比較、検討することができるので、またセルラーゼ種類に依存することなく全体のセルラーゼ活性を評価できる。
反応は結晶性セルロース粉末３ｍｇに０．５ｍｌの培養液、３ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ６．０）、０．５ ｍｌの１％ 塩化カルシウム溶液、０．５ ｍｌの０．１Ｍジオトレイトール（ＤＴＴ）、を加え蒸留水にて全量５ｍｌとし、６０℃で行なった。
【００４４】
その結果を図４に示す。グラフの横軸は反応時間を示し、縦軸は６６０ｎｍの濁度を示している。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９株（△で示す）やクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株（▲で示す）のセルロース分解活性は緩やかであるのに対し、ＪＫ−Ｎ４４（□で示す）やＪＫ‐Ｓ１４（■で示す）では９６時間以内に濁度が急激に減少し、ほとんど全ての結晶性セルロースが可溶化された。
この結果は、これらＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ‐Ｓ１４がクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ３１５４９やクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５よりも非常に高い結晶性セルロース分解活性を有していることを示している。
【実施例５】
【００４５】
１６ｒＳＲＮＡ配列解析から分離株はクロストリジウム・サーモセラムに属す微生物であり、分離菌株の持つ高い結晶性セルロース分解活性能はセルロソームと呼ばれる高分子酵素複合体によると考えられた（非特許文献６：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００５  Ｍａｒ；６９（１）：１２４−５４参照）ため、分離菌株と既知菌株の酵素活性を比較した。
【００４６】
分離株及びクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株から酵素複合体の調製を行い、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ活性の測定を行なった。
各菌株からの酵素複合体の調製は０．５％結晶性セルロースを炭素源としたＢＭ７液体培地にて結晶性セルロースが完全に分解するまで培養を行い、遠心分離により菌体を除いた。
【００４７】
その培養液にセルロース粉末を加え、一晩４℃にて攪拌し酵素複合体をセルロースに吸着させた。攪拌後、空カラムにセルロースが懸濁された培養液を注ぎ、セルロースと培養液を分別した後、数倍量の１０ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でセルロース非吸着物を洗浄した。セルロースに吸着させた酵素複合体は超純水約５０ｍｌで溶出し、以降使用する酵素溶液（セルロース吸着酵素画分）として用いた。結晶性セルロース分解活性は、６０℃で１時間、１％結晶性セルロース粉末（シグマセルタイプ２０  シグマ社製）および５ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）において酵素溶液を反応させ、遊離してきた還元糖量をソモジ・ネルソン法（澱粉・関連糖質酵素実験法  １９９８  生物化学実験法１９：４１−４２学会出版センター）により測定を行なった。
【００４８】
ヘミセルラーゼ活性としてキシラナーゼ活性及びマンナナーゼ活性を測定した。ヘミセルラーゼ活性は、上記と同様に基質としてセルロース粉末の代わりに１％キシラン（オートスペルトキシラン；シグマ社製）、又は０．２％ローカストビーンガム（シグマ社製）を用い、遊離してくる還元糖量をソモジ・ネルソン法により測定した。１分間に１μモルのグルコースを遊離する酵素の量を１ユニットの定義とした。
【００４９】
セルラーゼ及びヘミセルラーゼ活性の比較結果を表３に示す。
分離菌株の結晶性セルロース分解活性は、対照としたクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株に比較し、比活性で約３倍以上の高い活性を示し、前述の培養液を用いた結晶性セルロース分解に伴う濁度消失の結果と同様な傾向であった。キシラナーゼ活性やマンナーゼ活性も分離株でそれぞれ約２倍比活性が高い結果を示し、ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４は優れたセルラーゼ及びヘミセルラーゼの分解活性を有していることが明らかとなった。
【表３】
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【実施例６】
【００５０】
酵素複合体はセルロソームを代表とする高分子骨格タンパク質及び酵素サブユニットから構成されており、推定分子量は数十万〜数百万ダルトンになることが知られている（非特許文献６参照）。
分離菌株が産生する酵素が、結晶性セルロース分解活性及びヘミセルロース分解活性の酵素複合体であるかどうか確認するために、各培養液から調製した前述のセルロース吸着酵素画分を用い、ゲル濾過クロマトグラフィーにより溶出パターン及びセルラーゼ活性の検討を行った。
クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５、分離株ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ‐Ｓ１４株から調製したセルロース吸着酵素画分５ｍｌを用い、ゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−５００ＨＲ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に供した結果を図５に示す。図中、タンパク質溶出パターンを２８０ｎｍの吸光度で測定した結果を実線で示し、結晶性セルロース分解活性パターンを点線で示す。図中の矢印及び縦実線は、ＢＤはブルーデキストリン２０００（２０００キロダルトン）、ＴＧはチオグロブリン（６６９キロダルトン）、ＡＤはアルドラーゼ（１５８キロダルトン）の溶出位置をそれぞれ示している。
【００５１】
ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５と分離株のセルロース吸着酵素画分には、２０００キロダルトンから６６９キロダルトン付近の高分子溶出位置に２つの大きなピークが確認された。このピークのうちチオグロブリンの分子量に一致する位置に溶出したピークには高い結晶性セルロース分解活性が認められた。また結晶性セルロース分解活性と同じパターンでヘミセルラーゼ活性も存在しているのを確認した。
高い結晶性セルロース分解活性及びヘミセルロース分解活性が高分子量溶出位置に一致していることから、結晶性セルロース分解活性及びヘミセルロース分解活性は酵素複合体による活性と考えられた。
また、ゲル濾過クロマトグラフィーによる溶出パターンを比較すると、既知菌株クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５からの酵素複合体と分離菌株との溶出パターンが異なることから、分離株と既知菌株との間で、酵素複合体中の酵素サブユニットの種類または構成比が違うことが予想された。
【実施例７】
【００５２】
分離菌株はアルカリ側でも生育が可能であることから、分離菌株においてアルカリ側でも結晶性セルロース分解活性があることが予想された。そこで弱アルカリ（ｐＨ８．０）条件下で濁度法により結晶性セルロース分解活性の測定を行った。
結晶性セルロース粉末３ｍｇに、それぞれの酵素０．０５ｍｌ、３ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５ｍｌの１％ 塩化カルシウム溶液、０．５ ｍｌの０．１Ｍジオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、蒸留水にて全量５ｍｌとし、６０℃で酵素反応を行なった。その結果を図６に示す。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５（▲で示す）、分離菌株ＪＫ−Ｎ４４（□で示す）、ＪＫ−Ｓ１４（○で示す）において、結晶性セルロース分解に伴う濁度消失が確認された。さらに、分離菌株の酵素は両方とも、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５の酵素に比較し、アルカリ条件下での分解速度が速く、弱アルカリ条件下でも効率よく分解していることが確認された。
【実施例８】
【００５３】
従来、セルロース系バイオマス酵素糖化において使用される酵素としては、糸状菌トリコデルマ・リーシエ由来の糖化酵素が多く利用されている。分離株から調製した酵素液と糸状菌トリコデルマ・リーシエ由来の糖化酵素における結晶性セルロース分解活性を比較するために、濁度法により分解活性測定を行った。
糸状菌トリコデルマ・リーシエ由来の糖化酵素は、ノボザイムズ社製セルクラスト（登録商標）１．５Ｌを用いた。すなわち、結晶性セルロース粉末３ｍｇに、酵素溶液６．３ｍｇ又は１２．５ｍｇを加え、３ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、蒸留水にて全量５ｍｌとし、５０℃で糖化反応を行った。
分離株の酵素の場合、糸状菌の糖化酵素と同様に、結晶性セルロース粉末３ｍｇに調製した酵素液０．０３ｍｇ、３ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）、０．５ ｍｌの１％塩化カルシウム溶液、０．５ｍｌの０．１Ｍジオトレイトール（ＤＴＴ）、を加え蒸留水にて全量５ｍｌとし、６０℃で糖化反応を行なった。
【００５４】
濁度測定は実施例３と同様に６６０ｎｍで行い、また測定前の酵素タンパク量の測定は、ＢＣＡタンパク質定量キット（サーモサイエンティフィック社）により牛血清アルブミンをスタンダードとして各酵素のタンパク量を算出した。
結果を図７に示す。糸状菌由来の酵素６．３ｍｇ（◆で示す）及び１２．６ｍｇ（◇で示す）を用いた反応においては、ある程度までの結晶性セルロース分解による濁度低下は認められるものの、それ以降の分解は困難であった。これは糸状菌由来酵素では、結晶性セルロースの強固な構造を持った部分を分解できないためと推定される。
一方、分離菌株ＪＫ−Ｎ４４からの酵素０．３ｍｇ（○で示す）及びＪＫ−Ｓ１４からの酵素０．３ｍｇ（■で示す）を用いた試験では、９６時間以内に結晶性セルロースを完全に分解していた。これらの結果から、分離菌株ＪＫ−Ｎ４４及びＪＫ−Ｓ１４は、糸状菌由来の酵素の少なくとも４０分の１以下の酵素量で糸状菌酵素と同等以上の速度で分解でき、非常に効率的な分解が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＪＫ−Ｎ４４のｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示す図である。
【図２】ＪＫ−Ｓ１４のｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示す図である。
【図３】クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５とＪＫ−Ｎ４４およびＪＫ-Ｓ４４の形態を示す図である。
【図４】ＪＫ−Ｎ４４とＪＫ−Ｓ１４の結晶性セルロース分解活性を示すグラフである。
【図５】酵素複合体のゲル濾過クロマトグラフィー溶出パターンと結晶性セルロース分解活性を示すグラフである。
【図６】弱アルカリ（ｐＨ８．０）条件における結晶性セルロース分解活性を示すグラフである。
【図７】糸状菌酵素と分離菌株酵素の結晶性セルロース分解能の比較を示すグラフである。
【図８】ＪＫ−Ｎ４４菌株とクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株のＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図９】にＪＫ−Ｓ１４とクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株のＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【配列表】
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