(57)【要約】【課題】ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化に対し、優れたリン酸化阻害活性を有する新規化合物、前記新規化合物を含有するリン酸化阻害剤、糖尿病患者に対し、従来の薬剤とは異なる分子標的、及びメカニズムを有し、優れた効果を示す、安全性の高いインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤を提供すること。また、本発明は、第２に、前記インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかの効率的なスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害することを特徴とする新規化合物、前記新規化合物を含有するリン酸化阻害剤、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤、並びに、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害することを特徴とする化合物。
【請求項２】
ＥＲＫ２によるＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＳＴＡＴ３とＥＲＫ２との結合を阻害することによる請求項１から２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
下記アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドを含有する請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
α−α’−β−γ−δ’−σ−δ  ・・・アミノ酸配列構造（Ｉ）
〔アミノ酸配列構造（Ｉ）中、αはＮ末端であり、δはＣ末端であり、α及びα’はそれぞれリシン及びアルギニンのいずれかであり、δ及びδ’はそれぞれロイシン及びイソロイシンのいずれかを示す。β、γ、及びσは任意のアミノ酸を示す。〕
【請求項５】
ペプチドが、下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する請求項４に記載の化合物。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１）
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とするリン酸化阻害剤。
【請求項７】
請求項６に記載のリン酸化阻害剤を含有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤。
【請求項８】
請求項７に記載のインスリン抵抗改善剤を含有することを特徴とする糖尿病の予防乃至治療剤。
【請求項９】
少なくともＳＴＡＴ３とＥＲＫ２との相互作用の有無を測定することによりリン酸化阻害活性を有する化合物を選択し、
該化合物を投与していない糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｘ）と、該化合物を投与した糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｙ）とを比較して、Ｘ＞Ｙであるかどうかを評価すること、
により行われることを特徴とするインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法。
【請求項１０】
選択が、少なくとも化合物と、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されていないＳＴＡＴ３と、前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素とを混合させることにより混合物を調製する混合物調製工程と、
更に、前記混合物中のＳｅｒ７２７がリン酸化された前記ＳＴＡＴ３と、前記Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合する抗体とを反応させる抗体反応工程と、
前記抗体が結合しなかった前記ＳＴＡＴ３を含む前記混合物中の前記化合物をリン酸化阻害活性を有する化合物としてスクリーニングするスクリーニング工程と、
により行われる請求項９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化阻害活性を有する新規化合物、前記新規化合物を含有するリン酸化阻害剤、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤、並びに、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかの効率的なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値は、正常な状態では常に一定範囲内に調節されている。このような血糖値の調節には、インスリンと呼ばれる、膵臓に存在するランゲルハンス島のβ細胞から分泌されるペプチドホルモンが重要である。前記インスリンが細胞膜上に存在するインスリン受容体に結合すると、種々のシグナル伝達が起こる結果、糖新生が抑制され、血糖値が低下する。
血糖値が調節されている理由としては、ブドウ糖が、脳をはじめとした各器官の主要なエネルギー源となるものの、一方では、組織の糖化ストレスをもたらす有害物質として働くためである。
【０００３】
前述したような血糖値の調節能力（耐糖能）が弱まると、血糖値が病的に高まった状態、又は高まることがある状態となる。このように糖代謝が異常になった状態が糖尿病である。
前記糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）とに分類される。前記糖尿病の多数を占める２型糖尿病は、更に、インスリン分泌低下が原因となる糖尿病と、インスリンは分泌されており、その濃度も十分高いが、標的細胞でのグルコースに対するインスリン感受性の低下が原因となり血糖値が下がらない糖尿病とに分けられ、後者はインスリン抵抗性といわれる。
【０００４】
現在、糖尿病治療は、その病態に応じて各種薬剤による治療が行われており、その種類としては、主にインスリン、インスリン分泌促進剤、ブドウ糖吸収阻害剤、及びインスリン抵抗性改善剤に分けられる。
前述したインスリン抵抗性を示す患者には、第一選択薬としてインスリン抵抗性改善剤である塩酸メトフォルミン、塩酸ブホルミン、及び塩酸ピオグリタゾンなどが用いられる。しかしながら、副作用として胃腸障害が認められる他、心不全の既往がある場合には適用できないことなどが問題であった。また、塩酸ピオグリタゾンでは、副作用として体重増加が認められるため、食事療法を併用している場合、患者に負担がかかる点においても問題であった。
【０００５】
一方、近年、インスリン以外に血糖値を低下させる因子として、ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３（ＳＴＡＴ３）が報告された（非特許文献１参照）。
前記ＳＴＡＴ３は、シグナル伝達、及び転写活性化の双方において働くタンパク質であり、細胞増殖、分化、生存などの過程を制御する。前記ＳＴＡＴ３は、非リン酸化状態では細胞質に存在するが、Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ）によって活性化され、前記ＳＴＡＴ３のＴｙｒ７０５がリン酸化されると、前記ＳＴＡＴ３のホモダイマーを形成して核内へ移行し、目的遺伝子を活性化する転写因子として機能する。
前記ＳＴＡＴ３のホモダイマーは、核内において、糖新生に関与する転写因子に対しアンタゴニストとして働くため、その発現が亢進すると糖新生が抑制される結果、血糖値が低下する。
また、前記ＳＴＡＴ３は、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ２（ＥＲＫ２）により、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されると、前記ＳＴＡＴ３のホモダイマーの形成が阻害されることが知られている（非特許文献２〜４参照）。
しかしながら、前記ＳＴＡＴ３に関連した糖尿病治療の薬剤は知られていない。
【０００６】
したがって、糖尿病の予防乃至治療において、これらの既存の薬剤とは異なる標的分子、及びメカニズムを有し、より効果的かつ安全な薬剤、並びに、前記薬剤の候補物質を効率的にスクリーニングする方法は未だ提供されておらず、その速やかな提供が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎｏｕｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  １０（２），  ２００４，  ｐ．  １６８−７４
【非特許文献２】Ｃｈｕｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １７（１１），  １９９７，  ｐ．  ６５０８−１６
【非特許文献３】Ｊａｉｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １７（２４），  １９９８，  ｐ．  ３１５７−６７
【非特許文献４】Ｌｉｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０３（１４），  ２００６，  ｐ．  ５３２６−３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、第１に、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化に対し、優れたリン酸化阻害活性を有する新規化合物、前記新規化合物を含有するリン酸化阻害剤、糖尿病患者に対し、従来の薬剤とは異なる分子標的、及びメカニズムを有し、優れた効果を示す、安全性の高いインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤を提供することを目的とする。また、本発明は、第２に、前記インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかの効率的なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための手段としては、後述する付記に記載した通りである。
即ち、本発明の一つは、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害する化合物である。
本発明の一つは、前記化合物を含有するリン酸化阻害剤である。
本発明の一つは、前記リン酸化阻害剤を含有するインスリン抵抗性改善剤である。
本発明の一つは、前記インスリン抵抗性改善剤を含有する糖尿病の予防乃至治療剤である。
本発明の一つは、少なくともＳＴＡＴ３とＥＲＫ２との相互作用の有無を測定することによりリン酸化阻害活性を有する化合物を選択し、該化合物を投与していない糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｘ）と、該化合物を投与した糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｙ）とを比較して、Ｘ＞Ｙであるかどうかを評価すること、により行われるインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、第１に、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化に対し、優れたリン酸化阻害活性を有する新規化合物、前記新規化合物を含有するリン酸化阻害剤、糖尿病患者に対し、従来の薬剤とは異なる分子標的、及びメカニズムを有し、優れた効果を示す、安全性の高いインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤を提供することができる。また、本発明は、第２に、前記インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかの効率的なスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ウエスタンブロット法によるリン酸化阻害活性試験の結果である。
【図２】図２は、前記図１を拡大した図である。
【図３】図３は、有効性試験における、投与後０、１４、２８日目の各投与群の空腹時血糖値のグラフである。
【図４】図４は、有効性試験における、投与後１、１３、２７日目の各投与群の食後血糖値のグラフである。
【図５】図５は、有効性試験における、投与後０、２８日目の各投与群の空腹時血中インスリン値のグラフである。
【図６】図６は、有効性試験における、投与後０、２８日目の各投与群のＨＯＭＡ−ＩＲ値のグラフである。
【図７】図７は、有効性試験における、各投与群の血糖値増加のグラフである。
【図８】図８は、有効性試験における、各投与群の空腹時血中インスリン値増加のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（新規化合物）
本発明の新規化合物は、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害することを特徴とする。
前記ＳＴＡＴ３は、いくつかのリン酸化部位を有しており、例えば、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されると、前記ＳＴＡＴ３は、ホモダイマー化して核内へ移行することができず、転写因子として機能することができない。
前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化は、例えば、ＥＲＫ２により行われる。具体的には、前記ＥＲＫ２は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＥＫ１）によりＴｙｒ１８５がリン酸化されることにより活性化し、前記ＳＴＡＴ３と結合してヘテロダイマーを形成し、前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７をリン酸化する。
したがって、前記リン酸化阻害剤がＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害する結果、前記ＳＴＡＴ３のホモダイマー化は抑制されることなく、前記ＳＴＡＴ３のホモダイマーは転写因子として機能することができる。
【００１３】
＜アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドを含有する新規化合物＞
前記新規化合物は、例えば、下記アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドを少なくとも含有する。
【００１４】
−アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチド−
前記アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドとしては、以下に示す通りである。
α−α’−β−γ−δ’−σ−δ  ・・・アミノ酸配列構造（Ｉ）
前記アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドは、下記アミノ酸配列構造（ＩＩ）で表されるペプチド、及び下記アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）で表されるペプチドの少なくともいずれかが好ましい。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−β−γ−δ’−σ−δ  ・・・アミノ酸配列構造（ＩＩ）
α−α’−β−γ−Ｌｅｕ−σ−Ｌｅｕ  ・・・アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）
前記アミノ酸配列構造（Ｉ）、前記アミノ酸配列構造（ＩＩ）、及び前記アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）中、αはＮ末端であり、δはＣ末端であり、α及びα’はそれぞれリシン及びアルギニンのいずれかであり、δ及びδ’はそれぞれロイシン及びイソロイシンのいずれかを示す。β、γ、及びσは任意のアミノ酸を示す。
前記βとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、チロシンが好ましい。
前記γとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、イソロイシンが好ましい。
前記σとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アラニンが好ましい。
【００１５】
前記アミノ酸配列構造（Ｉ）、前記アミノ酸配列構造（ＩＩ）、及び前記アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）で表されるペプチドの中でも、下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドがより好ましく、下記配列番号：１で表されるペプチドそのものが特に好ましい。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１）
前記ペプチドとしては、前記新規化合物がＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化阻害活性を有する限りは、前記配列番号：１で表されるアミノ酸配列の全体又は一部において、１若しくは数個のアミノ酸が置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、前記ペプチドは、Ｎ末端若しくはＣ末端に化学修飾が施されたものであってもよい。前記化学修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル化、ミリストイル化、アミド化などが挙げられる。
【００１６】
前記新規化合物中の、前記のアミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記新規化合物は、前記のアミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドそのものであってもよい。
前記ペプチドの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により得られた合成ペプチドを入手する方法などが挙げられる。
前記ペプチドの化学合成の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド合成装置（島津製作所社製）を用いて化学合成する方法などが挙げられる。
【００１７】
前記新規化合物は、塩の状態であってもよい。前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルボン酸塩、無機酸塩、アミノ酸塩、スルホン酸塩などが挙げられる。
前記カルボン酸塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、ヒドロキシ酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、マレイン酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、リンゴ酸塩などが挙げられる。
前記無機酸塩としては、例えば、ハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
前記アミノ酸塩としては、例えば、アルギニン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
前記スルホン酸塩としては、例えば、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００１８】
（リン酸化阻害剤）
本発明のリン酸化阻害剤は、前述した新規化合物乃至その塩を少なくとも含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有する。
前記リン酸化阻害剤中の前記新規化合物乃至その塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記リン酸化阻害剤は、前記新規化合物乃至その塩そのものであってもよい。
【００１９】
＜その他の成分＞
前記リン酸化阻害剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記担体としても、特に制限はなく、例えば、前記リン酸化阻害剤の剤型などに応じて適宜選択することができる。
また、前記リン酸化阻害剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２０】
＜リン酸化阻害活性測定法＞
前記リン酸化阻害活性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫学的測定法などが挙げられる。
前記免疫学的測定法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの測定方法が挙げられ、中でもウエスタンブロット法による測定方法が好ましい。
【００２１】
＜用途＞
前記リン酸化阻害剤の用途としては、特に制限はなく、例えば、後述するインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤などの薬剤として好適に利用することができる。また、前記リン酸化阻害剤は、例えば、リン酸化を指標としたアッセイなどの試薬として利用することもできる。
前記リン酸化阻害剤を試薬として用いる場合、その使用方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養細胞の培養液中に添加する方法などが挙げられる。
【００２２】
（インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤）
＜インスリン抵抗性改善剤＞
本発明のインスリン抵抗性改善剤は、前述したリン酸化阻害剤を少なくとも含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有する。
前記インスリン抵抗性改善剤中の、前記リン酸化阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記インスリン抵抗性改善剤は、前記リン酸化阻害剤そのものであってもよい。
【００２３】
−インスリン抵抗性の評価−
前記インスリン抵抗性改善剤によりインスリン抵抗性が改善したか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＨＯＭＡ−ＩＲ（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）法で評価する方法が好ましい。前記ＨＯＭＡ−ＩＲ法は、下記計算式により、インスリン抵抗性の指標であるＨＯＭＡ−ＩＲ値を算出する方法である。
ＨＯＭＡ−ＩＲ（インスリン抵抗性指標）＝空腹時インスリン値（μＵ／ｍＬ）×空腹時血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）÷２２．５
前記ＨＯＭＡ−ＩＲ値の値が低いほど、インスリン抵抗性を改善したと判断することができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９８５  Ｊｕｌ  ２８（７），  ４１２−９、Ｋａｎａｕｃｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  Ｏｃｔ  ２５(１０)，  ２００２，  ｐ．１８９１−２参照）。
【００２４】
前記空腹時としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、食後１２時間〜１４時間が好ましい。
前記空腹時インスリン値、及び空腹時血糖値を測定するための血液サンプルを入手する方法としては、特に制限はなく、常法の採血により入手することができる。前記血液サンプルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血清が好ましい。前記血清を調整する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、採血した血液を遠心分離する方法などが挙げられる。
前記空腹時インスリン値を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスインスリンイライザ法キット（Ｃａｔ．  ＃ＥＺＲＭＩ−１３Ｋ、Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い定量する方法などが挙げられる。
前記空腹時血糖値を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｏｎｅ−ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ジョンソンアンドジョンソン社製）を用いて定量する方法などが挙げられる。
【００２５】
−用途−
前記インスリン抵抗性改善剤の用途としては、例えば、後述する糖尿病の予防乃至治療剤などの薬剤として好適に利用することができる。
【００２６】
＜糖尿病の予防乃至治療剤＞
本発明の糖尿病の予防乃至治療剤は、前記インスリン抵抗性改善剤を少なくとも含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有する。
前記糖尿病の予防乃至治療剤中の、前記インスリン抵抗性改善剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記糖尿病の予防乃至治療剤は、前記インスリン抵抗性改善剤そのものであってもよい。
【００２７】
＜その他の成分＞
前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記担体としても、特に制限はなく、例えば、前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤の剤型などに応じて適宜選択することができる。
また、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
（使用）
前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤は、１種単独で使用されてもよいし、２種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００２９】
（剤型）
前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、吸入散剤、注射用剤などが挙げられる。これらの中でも、注射用剤が、経口固形剤、経口液剤、及び吸入散剤と比較して消化されにくい点で好ましい。
【００３０】
＜注射用剤＞
前記注射用剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射用剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤、及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３１】
（投与）
前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、吸入による方法、注射による方法などが挙げられる。これらの中でも注射による方法が好ましい。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、中でもヒトに好適に用いられる。
【００３２】
（製造方法）
前記リン酸化阻害剤、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤の製造方法としては、特に制限はなく、例えば、前述した所望の剤型などに応じて適宜選択することができる。
【００３３】
（スクリーニング方法）
本発明のインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法は、少なくともリン酸化阻害活性を有する化合物を選択し、該化合物を投与した糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値を評価することにより行われ、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００３４】
＜選択＞
前記選択は、少なくともＳＴＡＴ３とＥＲＫ２との相互作用の有無を測定することによりリン酸化阻害活性を有する化合物を選択することにより行われ、例えば、混合物調製工程と、抗体反応工程と、スクリーニング工程とを含む。
【００３５】
−混合物調製工程−
前記混合物調製工程は、例えば、少なくとも化合物と、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されていないＳＴＡＴ３と、前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素とを混合させることにより混合物を調製する工程であり、更に、前記混合物中の前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素が、前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７をリン酸化する処理を含む。
【００３６】
−−混合物−−
前記混合物としては、前記化合物と、前記Ｓｅｒ７２７がリン酸化されていないＳＴＡＴ３と、前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素とを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
【００３７】
−−−化合物−−−
前記混合物中の化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチドなどが挙げられる。
前記化合物入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により得てもよいし、遺伝子組換え技術により得てもよい。
前記化合物を得るための前記化学合成の方法や前記組換え技術としても、特に制限はなく、例えば、当該技術分野において公知の手法の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
前記混合物中の、化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、終濃度で０．１ｍＭ〜５０ｍＭが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭがより好ましい。
前記化合物の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液で調製する方法などが挙げられる。
前記ＤＭＳＯの終濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍＭ〜１００ｍＭが好ましく、５ｍＭ〜１５ｍＭがより好ましい。
【００３８】
−−−ＳＴＡＴ３−−−
前記Ｓｅｒ７２７がリン酸化されていないＳＴＡＴ３（以下、「非リン酸化ＳＴＡＴ３」と称することがある。）の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を用いることができる。
前記混合物中の、非リン酸化ＳＴＡＴ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、終濃度で０．０１μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬが好ましく、０．０２５μｇ／ｍＬ〜０．０７５μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００３９】
−−−ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素−−−
前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素とは、前記非リン酸化ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７をリン酸化する酵素をいう。
前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｔｙｒ１８５がリン酸化され、活性化されたＥＲＫ２（以下、「活性化ＥＲＫ２」と称することがある。）が好ましい。
前記活性化ＥＲＫ２の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を用いることができる。
前記混合物中の、活性化ＥＲＫ２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、終濃度で０．０００１μｇ／ｍＬ〜０．０１５μｇ／ｍＬが好ましく、０．０００５μｇ／ｍＬ〜０．００５μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００４０】
−−−その他の成分−−−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記活性化ＥＲＫ２が酵素として活性可能な反応バッファー、ＡＴＰ、塩化マグネシウム、ＤＭＳＯなどが挙げられる。
前記反応バッファーの組成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０２質量％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（全て終濃度を示す）が好ましい。
前記ＡＴＰの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度で０．１ｍＭ〜５ｍＭが好ましく、０．５ｍＭ〜２ｍＭがより好ましい。
前記塩化マグネシウムの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度で１ｍＭ〜１００ｍＭが好ましく、５ｍＭ〜２０ｍＭがより好ましい。
前記ＤＭＳＯの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度で１質量％〜２５質量％が好ましく、５質量％〜２２質量％がより好ましい。
【００４１】
−−混合物の調製−−
前記混合物を得るために、混合物を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピペットで懸濁する方法などが挙げられる。
また、前記化合物、前記非リン酸化ＳＴＡＴ３、前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素、及び前記その他の成分の配合時期としては、特に制限はなく、前記混合物を調製する際の適当な段階で配合することができる。
【００４２】
−−リン酸化する処理−−
前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素が、前記非リン酸化ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７をリン酸化する処理（以下、「リン酸化処理」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リン酸化処理の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃〜３０℃が好ましい。
前記リン酸化処理の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０分間〜１５０分間が好ましい。
前記リン酸化を停止する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチレンジアミン四塩酸を添加する方法などが挙げられる。
【００４３】
−抗体反応工程−
前記抗体反応工程は、例えば、前記混合物中のＳｅｒ７２７がリン酸化された前記ＳＴＡＴ３と、前記Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合する抗体とを反応させる工程であり、前記結合した抗体を検出する処理を含む。
【００４４】
−−リン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合する抗体−−
前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化部位に結合する抗体（以下、「１次抗体」と称することがある。）としては、前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化部位を認識することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記１次抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ａｎｔｉ−ｐＳ７２７  ＳＴＡＴ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社製、カタログ番号：ｓｃ−２１８７６）を用いることができる。
【００４５】
−−反応−−
前記反応としては、例えば、前記Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３に、前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化部位に結合する抗体、即ち、前記１次抗体を結合させる反応である。
前記ＳＴＡＴ３と前記１次抗体とを反応させる温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃〜３０℃が好ましい。
前記ＳＴＡＴ３と前記１次抗体とを反応させる時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間〜１５分間が好ましい。
ここで、前記１次抗体が反応する前記ＳＴＡＴ３は、前記ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化部位がリン酸化された前記ＳＴＡＴ３である。
【００４６】
−−検出する処理−−
前記検出する処理としては、例えば、前記反応したＳＴＡＴ３を検出する処理である。
前記反応したＳＴＡＴ３を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１次抗体に特異的に結合する抗体（以下、「２次抗体」と称することがある。）により検出する方法などが挙げられる。
前記２次抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１次抗体を作製した宿主のＩｇＧなどが挙げられる。
また、前記２次抗体は、標識されていることが好ましい。前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などが挙げられる。
前記ＨＲＰを検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＨＲＰの基質を用いる方法などが挙げられる。
前記ＨＲＰの基質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが挙げられる。
【００４７】
−スクリーニング工程−
前記スクリーニング工程は、例えば、前記抗体が結合しなかった前記ＳＴＡＴ３を含む前記混合物中の前記化合物をリン酸化阻害活性を有する化合物としてスクリーニングする工程である。具体的には、化合物について、リン酸化阻害活性の有無を判断し、前記化合物が前記リン酸化阻害活性を有する場合は、その程度を判断する工程である。
【００４８】
前記スクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウエスタンブロット法で検出したバンド（Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のバンド）の強度を基準にリン酸化阻害活性の有無を判断する方法などが挙げられる。
前記バンドの強度を基準にリン酸化阻害活性の有無を判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化合物を含まない混合物をコントロールとし、前記コントロールと、化合物を含む混合物とを比較して、前記コントロールよりバンドが薄い、前記混合物中の前記化合物をリン酸化阻害活性を有する化合物として判断する方法を用いることもできるし、前記コントロールと比較せず、化合物を含む混合物間のバンド強度の違いにより、よりバンドが薄い前記混合物中の化合物はリン酸化阻害活性を有すると判断し、前記化合物をリン酸化阻害活性の強い化合物として判断する方法を用いることもできる。
前記バンドの強度を比較する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、目視により比較する方法、デンシトメーターなどの装置を用いて比較する方法などが挙げられる。
【００４９】
＜評価＞
前記評価は、少なくとも前記化合物を投与していない糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｘ）と、前記化合物を投与した糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｙ）とを比較して、Ｘ＞Ｙであるかどうかを評価することにより行われる。
【００５０】
前記糖尿病モデル動物の動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、マウスが、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニングを容易に行うことができる点で好ましい。前記糖尿病モデルのマウスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、遺伝性肥満マウスのｄｂ／ｄｂマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ社製）などが挙げられる。
【００５１】
前述した通り、ＨＯＭＡ−ＩＲ値は、その値が低いほど、インスリン抵抗性を改善したと判断することができるため、前記化合物を投与していない糖尿病モデルマウスのＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｘ）をコントロールとして、前記化合物を投与した糖尿病モデルのＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｙ）と比較したとき、Ｘ＞Ｙである場合、前記化合物はインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかとしてスクリーニングすることができる。なお、前記ＨＯＭＡ−ＩＲ値は、前述したＨＯＭＡ−ＩＲ法により算出することができる。
【００５２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記評価において、前記コントロールのＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｘ）と比較して、前記糖尿病モデルマウスのＨＯＭＡ−ＩＲ値を低下させた化合物について、その他の糖尿病関連因子などを指標に、更にインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤として有効な化合物を選択する工程などが挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明の実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００５４】
（製造例１：新規化合物の合成）
本発明の新規化合物として、下記配列番号：１で表されるペプチドを用いた。下記配列番号：１で表されるペプチドは、ペプチド合成装置（島津製作所社製）を用いて化学合成した。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１）
【００５５】
（試験例１：リン酸化阻害活性）
前記配列番号：１で表されるペプチドの、ＥＲＫ２によるＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化に対するリン酸化阻害活性を以下のようにして検討した。
【００５６】
＜リン酸化阻害活性を有する化合物の選択＞
−混合物調製工程−
−−反応液の調製−−
反応液として、５×反応バッファー（２５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１質量％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ））、Ａｃｔｉｖｅ  ＥＲＫ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）、ＳＴＡＴ３  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２ｍｇ／ｍＬ）（Ａｂｃａｍ社製）、及び蒸留水を、下記表１に示すように調製した。
【００５７】
【表１】
2010195692.tif 000002
【００５８】
−−化合物の調製−−
化合物としては、前記製造例１で化学合成したペプチド（配列番号：１）を用いた。また、比較対象として、５−ヨードツベルシジン（５−ｉｏｄｏｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた。
前記製造例１で示すペプチド（配列番号：１）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に懸濁し、終濃度１０ｍＭとなるように調製した。
前記５−ヨードツベルシジンは、ＤＭＳＯに懸濁し、終濃度５ｍＭとなるように調製した。
【００５９】
−−混合物の調製−−
前記反応液に、５×ＡＴＰ−ＭｇＣｌ２溶液（５ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び前記化合物であるペプチド（配列番号：１）又は前記５−ヨードツベルシジンの順序で添加し、更に蒸留水を添加して全サンプルの容量を揃えることにより、反応混合物を得た。
なお、前記反応混合物中に、前記ペプチド（配列番号：１）又は前記５−ヨードツベルシジンを添加しなかったものをコントロールとして用いた。
各サンプルの調製方法は、下記表２に示す。
【００６０】
【表２】
2010195692.tif 000003
前記表２より、ＳＴＡＴ３の終濃度は約０．０４８μｇ／ｍＬ、Ａｃｔｉｖｅ  ＥＲＫ２の終濃度は、約０．００１μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯの終濃度は１０質量％、ペプチドの終濃度は１ｍＭ、及び５−ヨードツベルシジンの終濃度は１．１４ｍＭである。
【００６１】
前記反応混合物を、３０℃にて１３０分間インキュベーションすることにより、Ａｃｔｉｖｅ  ＥＲＫ２によるＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を行った。
その後、前記コントロールの反応混合物（表２：サンプル１、２）には２．７５μＬ、前記５−ヨードツベルシジン（表２：サンプル３）、及び前記ペプチド（表２：サンプル４）の反応混合物にはそれぞれ５．５μＬずつ、０．５Ｍ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することにより、前記リン酸化を停止した。
【００６２】
−抗体反応工程−
−−ウエスタンブロット法−−
前記反応終了後の前記表２に示すサンプル１〜４を各２３μＬ使用し、それぞれ４×ＳＤＳローディングバッファー（１２５ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ６．８）、４．３質量％  ＳＤＳ、３０質量％  グリセロール、１０質量％  ２−メルカプトエタノール、０．０１質量％  ブロモフェノールブルー）を、前記コントロールの反応混合物（サンプル１、２）には４μＬ、前記５−ヨードツベルシジン（サンプル３）、及び前記ペプチド（サンプル４）の反応混合物にはそれぞれ８μＬずつ添加した。次いで、９５℃にて５分間煮沸した。
前記各サンプルを１５μＬずつ、マルチゲル（第一化学薬品製）にアプライし、泳動バッファー（２５ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．４）、１９２ｍＭ  Ｌ−グリシン、０．１質量％  ＳＤＳ）中にて、３０ｍＡ定電流で３０分間電気泳動を行った。
電気泳動終了後、前記マルチゲルを蒸留水で１０分間洗浄した。
【００６３】
前記マルチゲルをトランスファーバッファー（２５ｍＭ  トリス−塩酸、１９２ｍＭ  Ｌ−グリシン、２０質量％  メタノール）に馴染ませた後、１０Ｖ定電圧で６０分間ブロッティングすることにより、前記マルチゲルからＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、ＧＥヘルスケア社製）に、前記電気泳動したタンパク質を転写した。
【００６４】
−−−１次抗体反応−−−
１次抗体反応は、ＳＮＡＰｉｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて以下のようにして行った。
スキムミルク（雪印社製）をＴＢＳ（２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム）に懸濁し、０．５質量％に調製した。前記０．５質量％スキムミルク１０ｍＬをＳＮＡＰｉｄのウエルに添加し、真空ポンプで引きながら前記タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜のブロッキングを行った。
次いで、１次抗体として用いるａｎｔｉ−ｐＳ７２７  ＳＴＡＴ（カタログ番号：ｓｃ−２１８７６、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社製）９μＬをＴＢＳＴ（２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５質量％  ｔｗｅｅｎ−２０）３ｍＬに懸濁した。前記ブロッキング溶液を除去後、前記ウエルに前記１次抗体を添加し、１０分間静置することにより、前記１次抗体をＳｅｒ７２７がリン酸化したＳＴＡＴ３に結合させた。
前記１次抗体を含む溶液を除去後、前記ウエルにＴＢＳＴを１０ｍＬ添加し、結合していない前記１次抗体を洗浄した。前記１次抗体の洗浄は、３回行った。
【００６５】
−−−２次抗体反応−−−
２次抗体反応は、前記ＳＮＡＰｉｄを用いて以下のようにして行った。
２次抗体として用いるＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、カタログ番号：ＤＣ０６Ｌ）１６．２μＬをＴＢＳＴ３ｍＬに懸濁した。前記１次抗体の洗浄に用いたＴＢＳＴを除去後、前記ウエルに前記２次抗体を添加し、１０分間静置することにより、前記２次抗体を前記１次抗体に結合させた。
次いで、前記２次抗体を含む溶液を除去後、ＴＢＳＴを１０ｍＬ添加し、結合していない前記２次抗体を洗浄した。前記２次抗体の洗浄は、３回行った。
【００６６】
−−−発色反応−−−
前記２次抗体反応が終了したＰＶＤＦ膜を、発色バッファー（０．１Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  塩化マグネシウム）で５分間洗浄した。
次いで、発色反応液１０ｍＬに前記ＰＶＤＦ膜を浸漬し、発色反応を行った。数分間発色反応を行った後、発色を目視にて確認し、ＴＢＳＴで洗浄した。
なお、前記発色反応液は以下のように調製した。即ち、ＮＢＴ溶液（１７３ｍＭ  ニトロブルーテトラゾリウムを７０質量％  ジメチルホルムアミドに懸濁することにより調製した。）４５μＬと、ＢＣＩＰ溶液（２５０ｍｇ  ブロモクロロインドリルリン酸（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｓｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁することにより調製した。）３５μＬとを混合し、前記発色反応液を得た。
【００６７】
前記ウエスタンブロットの全体像を図１に、図１の拡大図を図２に示す。図１、及び図２において、右から順に、「マーカー」は分子量マーカー、「１．コントロール（２２％  ＤＭＳＯ）」は５−ヨードツベルシジンのコントロール、「２．コントロール（１０％  ＤＭＳＯ）」は配列番号：１で表されるペプチドのコントロール、「３．ヨードツベルシジン」は５−ヨードツベルシジンを添加したサンプル（サンプル３）、「４．ペプチド」は配列番号：１で表されるペプチドを添加したサンプル（サンプル４）を示す。
【００６８】
−スクリーニング工程−
【００６９】
試験例１のウエスタンブロット法の結果より、５−ヨードツベルシジン（サンプル３）は、バンドは検出されたが、コントロール（サンプル１）と比較してそのバンドの強度が弱かったことから、リン酸化阻害活性を有することが認められた。配列番号：１で表されるペプチド（サンプル４）は、全くバンドが検出されなかったことから、５−ヨードツベルシジン（サンプル３）と比較して強いリン酸化阻害活性を有するものと考えられる。
【００７０】
したがって、配列番号：１で表されるペプチドは、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害するリン酸化阻害剤として有用であることが認められた。
【００７１】
（試験例２：急性毒性試験）
配列番号：１で表されるペプチドの急性毒性について以下のように検討した。
【００７２】
＜試験動物＞
−順化−
試験動物として、メスのｄｂ／ｄｂマウス（体重：４０−６０ｇ、日齢：５６−７０日、Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ社製）を５４個体使用した。前記マウスが到着後、一般的な健康状態について評価し、試験前に７日間順化した。
【００７３】
−飼育−
前記マウスは、順化の間は集団で収容し、その後生存中は米国国家研究会議のガイドライン「試験動物の管理と使用に関する指針」に従い、個体ごとに収容した。
動物室の環境は、温度１８℃〜２６℃、相対湿度３０％〜７０％、昼夜それぞれ１２時間となるように制御し、温度、及び相対湿度は毎日測定した。
給餌は、全ての試験動物に自由給餌で飼料（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ社製、カタログ番号：Ｍ−０１Ｆ）を与えた。
空腹時血糖値、及び血中インスリン値を測定する前日は、２０時３０分〜２１時まで飼料を摂取させ、前記時間に食餌の残りがある場合は、前記食餌を取り除いた。絶食時間は、１２時間〜１４時間とし、血液採取後、食餌を与えた。水は、与える前に高圧滅菌し、自由給餌で与えた。
【００７４】
−試験動物の選抜−
摂食時、及び空腹時の血糖値の測定結果により、前記試験動物５４個体の中から５２個体を選抜し、血糖値が高すぎる、若しくは低すぎる個体は除外した。
【００７５】
−臨床所見−
１日１回、午前に前記試験動物の生存、及び便の確認を行い、午後に臨床所見を観察した。
【００７６】
＜急性毒性試験＞
−方法−
配列番号：１で表されるペプチドの急性毒性を試験するために、２個体の前記マウスを用いた。
前記ペプチドの調整方法としては、８．０ｍｇの前記ペプチドを０．４ｍＬの生理食塩水に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液（以下、「ペプチド溶液１」と称することがある。）を調製した。前記ペプチド溶液１は、投与前に新しく準備し、完全に均一かつ溶解するよう攪拌した。
前記ペプチド溶液１を用いて、３０ｍｇ／ｋｇ用量、及び１００ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかの用量を腹腔内に注射することで、１回投与した。
前記ペプチド溶液１を投与したマウスについて、１４日間臨床的な兆候や体重の変化を観察し、後述する測定方法により、空腹時血糖値、及び空腹時血中インスリン値を、０日目、及び１４日目に測定した。
【００７７】
−−血液サンプルの採取−−
空腹時血糖値、及び血中インスリン値測定のため、投与後０日目、及び１４日目に５０μＬの血液を眼窩後方から採取した。血清を得るために、採取した血液は、氷上のチューブに放置し、次いで、１時間以内に遠心分離（５，０００ｇ、２０分間、２℃〜８℃）した。前記遠心分離した分画は、ポリエチレン微小遠心管に移し、解析するまで−８０℃で凍結保存した。
【００７８】
−−血液化学測定−−
血糖値はＪｏｈｎｓｏｎ  ｏｎｅ−ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ジョンソンアンドジョンソン社製）により定量した。
血中インスリン値はマウスインスリンイライザ法キット（Ｃａｔ．  ＃ＥＺＲＭＩ−１３Ｋ、Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）により定量した。
【００７９】
−結果−
前記急性毒性試験の結果を、下記表３に示す。
【００８０】
【表３】
2010195692.tif 000004
前記表３より、３０ｍｇ／ｋｇ用量、及び１００ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかの用量で前記ペプチド溶液１を投与したマウスでは、空腹時血糖値、空腹時血中インスリン値、臨床所見からの有害事象、及び体重の有意な変化は認められなかった。投与後０日目、及び１４日目の空腹時血糖値、及び空腹時血中インスリン値は、前記表３に示した通りである。
【００８１】
（試験例３：有効性試験）
前記試験例１でリン酸化阻害活性を有していた化合物（配列番号：１で表されるペプチド）の、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかとしての有効性について以下のように評価した。
【００８２】
＜方法＞
−試験動物−
試験動物は、前記試験例２に記載のマウス５０個体を使用した。
【００８３】
−ペプチド溶液、及びメトフォルミン溶液の調製−
配列番号：１で表されるペプチドの有効性を試験するために、以下のようにペプチド溶液を調製した。
３．８ｍｇの前記ペプチドを、４．７５ｍＬの生理食塩水に溶解し、０．８ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液（以下、「ペプチド溶液２」と称することがある。）を調製した。前記ペプチド溶液２の１．７５ｍＬを、３．５ｍＬの生理食塩水に溶解し、０．２７ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液（以下、「ペプチド溶液３」と称することがある。）を調製した。更に、１ｍＬの前記ペプチド溶液３を、２ｍＬの生理食塩水に溶解し、０．０９ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液（以下、「ペプチド溶液４」と称することがある。）を調製した。
活性対照群として、メトフォルミン溶液を以下のように調製した。即ち、１２０ｍｇのメトフォルミン（シグマ社製）を４ｍＬの生理食塩水に溶解し、３０ｍｇ／ｍＬのメトフォルミン溶液を調整した。
前記ペプチド溶液２〜４、及びメトフォルミン溶液は、投与前に新しく準備し、完全に均一かつ溶解するよう攪拌した。
【００８４】
−投与−
有効性試験には、溶媒（生理食塩水）対照投与群、活性対照群としてメトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群、配列番号：１で表されるペプチド４．００ｍｇ／ｋｇ用量投与群、前記ペプチド１．３３ｍｇ／ｋｇ用量投与群、及び前記ペプチド０．４４ｍｇ／ｋｇ用量投与群の５つの投与群を用いた。前記各投与群には１０個体のマウスを使用した。
前記メトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群には、前記メトフォルミン溶液を、前記ペプチド４．００ｍｇ／ｋｇ用量投与群には、前記ペプチド溶液２を、前記ペプチド１．３３ｍｇ／ｋｇ用量投与群には、前記ペプチド溶液３を、前記ペプチド０．４４ｍｇ／ｋｇ用量投与群には、前記ペプチド溶液４を用いた。
メトフォルミンのヒトにおける適当な投与量は７５０ｍｇ／日であるため、前記投与量をマウスの体重で換算し、過剰量である１５０ｍｇ／ｋｇを投与した。
前記各試験集団の全てのマウスに、下記表４に示す投与容量で、２８日間、毎日腹腔内注射し、体重、空腹時血糖値、食後血糖値、及び空腹時血中インスリン値を、後述する測定方法により、下記表５に示す測定計画に従って測定した。
なお、各投与群は、下記表６に示すように、０日目の空腹時血糖値、空腹時血中インスリン値、及びＨＯＭＡ−ＩＲ値（インスリン抵抗性指標）が投与群間で等しい分布を持つように、５０個体の前記マウスを５つの投与群に分けた。ＨＯＭＡ−ＩＲ値の算出方法については、後述する。
図３に、前記０日目の各投与群の空腹時血糖値のグラフを示す。
図５に、前記０日目の各投与群の空腹時血中インスリン値のグラフを示す。
図６に、前記０日目の各投与群のＨＯＭＡ−ＩＲ値のグラフを示す。
【００８５】
−血液サンプルの採取−
空腹時血糖値、及び血中インスリン値測定のため、投与後０、１４、２８日目に５０μＬの血液を眼窩後方から採取した。血清は、前記試験例２と同様の方法で得た。
食後血糖値は、投与後１、１３、２７日目に尾静脈から採血し、測定した。
【００８６】
−血液化学測定−
血糖値、及び血中インスリン値は、前記試験例２と同様の方法で定量した。
インスリン抵抗性は、下記計算式を用いたＨＯＭＡ（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）法により決定した。
ＨＯＭＡ−ＩＲ（インスリン抵抗性指標）＝空腹時インスリン値（μＵ／ｍＬ）×空腹時血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）÷２２．５
前記ＨＯＭＡ−ＩＲ値の値が低いほど、インスリン抵抗性を改善したと判断することができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９８５  Ｊｕｌ  ２８（７），  ４１２−９、Ｋａｎａｕｃｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  Ｏｃｔ  ２５(１０)，  ２００２，  ｐ．１８９１−２参照）。
【００８７】
−数値解析−
全ての値は、平均値±平均誤差で表示した。集団間、及び集団内の重要な差異については、一方向分散分析、及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較で評価した。０．０５以下のｐ値については、統計的に有意と考えた。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
【表５】
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【００９０】
【表６】
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【００９１】
＜結果＞
投与後１３日目に食後血糖値を、１４日目に空腹時血糖値を測定した結果を、下記表７に示す。
図４に、前記投与後１３日目の各投与群の食後血糖値のグラフを示す。
図３に、前記投与後１４日目の各投与群の空腹時血糖値のグラフを示す。
【００９２】
【表７】
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【００９３】
投与後２７日目に食後血糖値を、２８日目に空腹時血糖値、及び空腹時血中インスリン値を測定し、ＨＯＭＡ−ＩＲ値を算出した結果を、下記表８に示す。
図４に、前記投与後２７日目の各投与群の食後血糖値のグラフを示す。
図３に、前記投与後２８日目の各投与群の空腹時血糖値のグラフを示す。
図５に、前記投与後２８日目の各投与群の空腹時血中インスリン値のグラフを示す。
図６に、前記投与後２８日目の各投与群の空腹時ＨＯＭＡ−ＩＲ値のグラフを示す。
なお、前記図３、図５、及び図６のグラフ中、「＃」は、前記数値解析より溶媒対象群に対して有意であることを示す。
【００９４】
【表８】
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【００９５】
投与後２８日目と０日目の空腹時血糖値、食後血糖値、及び空腹時血中インスリン値の差を、それぞれの値の増加として、下記計算式を用いて算出した。結果を下記表９に示す。
空腹時血糖値増加＝空腹時血糖値（２８日目）−空腹時血糖値（０日目）
食後血糖値増加＝食後血糖値（２８日目）−食後血糖値（０日目）
空腹時血中インスリン値増加＝空腹時インスリン値（２８日目）−空腹時インスリン値（０日目）
図７に、各投与群の前記空腹時血糖値増加、及び前記食後血糖値増加のグラフを示す。
図８に、各投与群の前記空腹時血中インスリン値増加のグラフを示す。
なお、前記図７のグラフ中、「＃」は、前記数値解析より溶媒対象群に対して有意であることを示す。
【００９６】
【表９】
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【００９７】
前記表６〜９より、溶媒対照群の空腹時血糖値増加は１１．１±１．７ｍＭであったのに対し、メトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群では、空腹時血糖値増加は５．８±２．４ｍＭであったことから、メトフォルミンは、０日目から２８日目にかけて、空腹時血糖値の増加を減弱させた（表９、図７）。しかしながら、メトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群の空腹時血糖値増加の減弱は、統計的に有意ではなかった。
一方、メトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群の投与後２８日目の空腹時血中インスリン値は低下し（表８、図５）、ＨＯＭＡ−ＩＲ値（インスリン抵抗性指標）を有意に低下させた（表８、図６）。
配列番号：１で表されるペプチド投与群も、２８日間の試験期間においてメトフォルミンと同様、空腹時血糖値増加の減弱は、統計的に有意ではなかった（表９、図７）。しかしながら、溶媒対照群と比較して、前記ペプチド１．３３ｍｇ／ｋｇ用量投与群、及び前記ペプチド４．００ｍｇ／ｋｇ用量投与群は、投与後２８日目における空腹時血中インスリン値（表８、図５）、及びＨＯＭＡ−ＩＲ値の有意な減少を引き起こした（表８、図６）。
また、配列番号：１で表されるペプチドの投与群では、投与濃度依存的に、空腹時血中インスリン値、及びＨＯＭＡ−ＩＲ値の低下が認められた（表８）。
更に、前記ペプチド１．３３ｍｇ／ｋｇ用量投与群、及び前記ペプチド４．００ｍｇ／ｋｇ用量投与群は、メトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群と比較して低濃度で投与したにもかかわらず、メトフォルミン１５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群と比較して、空腹時血中インスリン値、及びＨＯＭＡ−ＩＲ値が低下していた（表８、図５〜６）。
【００９８】
これらの結果より、配列番号：１で表されるペプチドは、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかとして有効であることが示された。
また、前記配列番号：１で表されるペプチドの有効濃度が、既存薬である前記メトフォルミンより低いことは、インスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかとして有利である。
【００９９】
本発明の好ましい態様を付記すると、以下の通りである。
（付記１）ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害することを特徴とする化合物。
（付記２）ＥＲＫ２によるＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害する付記１に記載の化合物。
（付記３）ＳＴＡＴ３とＥＲＫ２との結合を阻害することによる付記１から２のいずれかに記載の化合物。
（付記４）下記アミノ酸配列構造（Ｉ）で表されるペプチドを含有する付記１から３のいずれかに記載の化合物。
α−α’−β−γ−δ’−σ−δ  ・・・アミノ酸配列構造（Ｉ）
〔アミノ酸配列構造（Ｉ）中、αはＮ末端であり、δはＣ末端であり、α及びα’はそれぞれリシン及びアルギニンのいずれかであり、δ及びδ’はそれぞれロイシン及びイソロイシンのいずれかを示す。β、γ、及びσは任意のアミノ酸を示す。〕
（付記５）下記アミノ酸配列構造（ＩＩ）で表されるペプチドを含有する付記１から４のいずれかに記載の化合物。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−β−γ−δ’−σ−δ  ・・・アミノ酸配列構造（ＩＩ）
〔アミノ酸配列構造（ＩＩ）中、ＬｙｓはＮ末端であり、δはＣ末端であり、δ及びδ’はそれぞれロイシン及びイソロイシンのいずれかを示す。β、γ、及びσは任意のアミノ酸を示す。〕
（付記６）下記アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）で表されるペプチドを含有する付記１から５のいずれかに記載の化合物。
α−α’−β−γ−Ｌｅｕ−σ−Ｌｅｕ  ・・・アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）
〔アミノ酸配列構造（ＩＩＩ）中、αはＮ末端であり、ＬｅｕはＣ末端であり、α及びα’はそれぞれリシン及びアルギニンのいずれかを示す。β、γ、及びσは任意のアミノ酸を示す。〕
（付記７）ペプチドが、下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する付記４から６のいずれかに記載の化合物。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１）
（付記８）ペプチドが、下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる付記４から７のいずれかに記載の化合物。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１）
（付記９）ＳＴＡＴ３のホモダイマーの生成を促進する付記１から８のいずれかに記載の化合物。
（付記１０）付記１から９のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とするリン酸化阻害剤。
（付記１１）付記１０に記載のリン酸化阻害剤を含有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤。
（付記１２）付記１１に記載のインスリン抵抗改善剤を含有することを特徴とする糖尿病の予防乃至治療剤。
（付記１３）注射用剤である付記１２に記載の糖尿病の予防乃至治療剤。
（付記１４）少なくともＳＴＡＴ３とＥＲＫ２との相互作用の有無を測定することによりリン酸化阻害活性を有する化合物を選択し、該化合物を投与していない糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｘ）と、該化合物を投与した糖尿病モデル動物のＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｙ）とを比較して、Ｘ＞Ｙであるかどうかを評価すること、により行われることを特徴とするインスリン抵抗性改善剤、及び糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニング方法。
（付記１５）選択が、少なくとも化合物と、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されていないＳＴＡＴ３と、前記ＳＴＡＴ３をリン酸化する酵素とを混合させることにより混合物を調製する混合物調製工程と、更に、前記混合物中のＳｅｒ７２７がリン酸化された前記ＳＴＡＴ３と、前記Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合する抗体とを反応させる抗体反応工程と、前記抗体が結合しなかった前記ＳＴＡＴ３を含む前記混合物中の前記化合物をリン酸化阻害活性を有する化合物としてスクリーニングするスクリーニング工程と、により行われる付記１４に記載のスクリーニング方法。
（付記１６）混合物調製工程が、混合物中のＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７をリン酸化する処理を含む付記１５に記載のスクリーニング方法。
（付記１７）抗体反応工程が、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合した抗体を検出する処理を含む、付記１５から１６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（付記１８）検出が、Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合した抗体の宿主のＩｇＧにより検出される付記１７に記載のスクリーニング方法。
（付記１９）Ｓｅｒ７２７がリン酸化されたＳＴＡＴ３のリン酸化部位に結合した抗体の宿主のＩｇＧが、該ＩｇＧに結合した標識を用いて検出される付記１８に記載のスクリーニング方法。
（付記２０）スクリーニング工程が、化合物のリン酸化阻害活性の有無を判断することにより行われる付記１５から１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の新規化合物は、第１に、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化を阻害し、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化に対し、優れたリン酸化阻害活性を有することから、ＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７のリン酸化阻害剤として好適に利用可能である。更に、前記リン酸化阻害剤は、糖尿病患者の血糖値を低下させる、従来の薬剤とは異なる分子標的、及びメカニズムを有していることから、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、脂質代謝異常、及び高血圧などの予防乃至治療剤として有用である。また、前記リン酸化阻害剤は、薬剤としての用途のみならず、リン酸化を指標としたアッセイなどの試薬としても有用である。
また、第２に、本発明のスクリーニング方法は、前記インスリン抵抗性改善剤、及び前記糖尿病の予防乃至治療剤の少なくともいずれかのスクリーニングに好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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