(57)【要約】【課題】複数の細胞群の画像、特に異なる輝度をもつ細胞群の画像に対して、煩雑な操作・設定を行うことなく、細胞の境界を正確に検出可能な細胞画像解析装置を提供する。【解決手段】蛍光細胞画像を用いて細胞の境界を検出する、コンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、コンピュータを、一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、少なくとも、細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域とに分類する領域分類手段１ａ、細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域の両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する信号変化量算出手段１ｂ、所定の局所的な領域内において、所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する境界候補領域検出手段１ｃ、として機能させる画像解析ソフトウェアを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光細胞画像を用いて細胞の境界を検出する、コンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、
前記コンピュータを、
一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、少なくとも、細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域とに分類する領域分類手段、
前記領域分類手段が分類した細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域の両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する信号変化量算出手段、
前記所定の局所的な領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する境界候補領域検出手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴とする細胞画像解析装置。
【請求項２】
前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出する境界検出手段として機能させることを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析装置。
【請求項３】
前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、一画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の増加量又は減少量であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項４】
前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度が最大となる隣接領域における輝度の増加量又は減少量であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項５】
前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の増加量又は減少量の平均値であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項６】
前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項７】
前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度の平均値が最大となっている隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項８】
前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量の平均値であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項９】
前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、各画素の輝度と、当該画素に隣接する所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値又は当該画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値とを比較し、該輝度の平均値と当該画素の輝度との大小関係が変わるときの当該画素を細胞の境界として検出することを特徴とする請求項２、請求項２に従属する請求項３〜８のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１０】
前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素からなり且つ該基準領域を該一次元方向に挟んで隣接する２つの隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び２つの隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出することを特徴とする請求項２、請求項２に従属する請求項３〜８のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１１】
前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素又は所定数の複数画素からなり且つ該基準領域を該二次元方向に囲んで隣接する複数の隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び複数隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出することを特徴とする請求項２、請求項２に従属する請求項３〜８のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１２】
前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、複数の局所的な領域内において、前記領域分類手段、前記信号変化量算出手段、前記境界候補領域検出手段、前記境界検出手段を介してそれぞれ検出された、複数の細胞の境界をつなげて、細胞の輪郭を特定する細胞輪郭特定手段として機能させることを特徴とする請求項２に従属する請求項３〜８、請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１３】
前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する細胞輪郭補正手段として機能させることを特徴とする請求項３〜８、請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１４】
前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する細胞輪郭判別手段として機能させることを特徴とする請求項３〜８、請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１５】
前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、前記細胞輪郭判別手段が判別した閉曲線以外の閉曲線を、前記細胞内小器官又は細胞上の小さい斑点状のものの輪郭として判別する細胞内小器官等判別手段として機能させることを特徴とする請求項１４に記載の細胞画像解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞画像を解析して、細胞画像に含まれる各細胞の領域を特定する細胞画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞画像解析は、各細胞における特定の蛍光量や、定量化された形態量を抽出し、薬剤応答性などを測定することを目的としている。蛍光量や形態量は検出された細胞領域に依存する量であるため、各細胞の輪郭を正確に検出することが必要となる。特に、細胞の個数を正確に数える、細胞の形状を正確に認識する、細胞内部の明るさ（例えば、蛍光量）を正確に検出する等のためには、細胞の輪郭や細胞内器官の輪郭を正確に検出する必要がある。
【０００３】
しかし、細胞画像の解析を手動で行う場合には、時間がかかる、大量の解析ができない、領域の決定が恣意的で正確なデータが得られない等の問題がある。
そこで、細胞画像の自動解析を行う分野において、細胞の境界を正確に検出することが重要な課題となっている。
【０００４】
従来、細胞画像解析装置における、細胞等の輪郭を自動的に検出する方法としては、例えば、単一の輝度を一定の閾値として細胞画像を二値化することによって細胞等の輪郭を検出する方法（特許文献１）や、輝度差を用いて輝度変化の大きい点を細胞の境界の一部として検出する、より詳しくは、細胞画像における隣接するピクセルの輝度差を輝度変化量として算出し、算出した輝度変化量が一定の閾値よりも大きくなる点を細胞の境界の一部として検出する方法（特許文献２）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】「ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ１００  細胞イメージ  解析システム  解析ソフトウェア操作編」操作説明書  ページ３−７、発行者：オリンパス株式会社、発行年月：２００９．０２、バージョン１．４
【特許文献２】「ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ１００  細胞イメージ  解析システム  解析ソフトウェア操作編」操作説明書  ページ３−１５、発行者：オリンパス株式会社、発行年月：２００９．０２、バージョン１．４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
単一輝度を一定の閾値として二値化する方法の問題点
しかし、特許文献１に記載のような、単一の輝度を一定の閾値として細胞画像を二値化することによって細胞等の輪郭を検出する方法では、細胞の境界を正確に検出することが難しい。例えば、その全領域が閾値の輝度に満たない暗い細胞は、認識することができない。
特に、染色方法・対象の違い、あるいは複数の細胞種が混在して、細胞によって明るさが大きく異なるような実験系では、単一の閾値でもって細胞領域とそれ以外の領域とを切り分けることはできない。
【０００７】
このことを、図１１を用いて説明する。
図１１は明るさの異なる複数の細胞を単一の閾値で二値化する方法及びその方法により検出される細胞の輪郭の一例を示す説明図で、(a)は各細胞の輝度断面と閾値との関係を示す図、(b)は(a)の閾値で二値化することによって検出される細胞の輪郭と本来の輪郭を示す図である。図１１(a)中、Ｃ１〜Ｃ３は、それぞれ通常の明るさよりも暗い細胞１、通常の明るさよりも明るい細胞２、通常の明るさの細胞３の輝度断面を示している。
ここで、細胞３の輪郭が、本来の輪郭とほぼ同じサイズに検出される所定の輝度を一定の閾値として、図１１(a)に示した輝度断面を有する細胞画像を二値化する。すると、図１１(b)に示すように、細胞１の輪郭は、本来の輪郭よりも小さいサイズに検出され、細胞２の輪郭は本来の輪郭よりも大きいサイズに検出されてしまう。
【０００８】
輝度差を用いて輝度変化量の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法の問題点
また、特許文献２に記載のような、細胞画像における隣接するピクセルの輝度差を用いて輝度変化量の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法には、次のような問題点がある。
細胞の輪郭周辺領域の輝度変化量は対象とする細胞の明るさに依存する。このため、単一の閾値で二値化する方法と同様に、細胞の明るさに依存した問題がある。即ち、輝度差に対して一定の閾値を用いても、細胞が認識されない、細胞の輪郭の位置が本来の輪郭の位置からずれて検出されてしまうなどの問題が起こりうる。
【０００９】
このことを図１２を用いて説明する。
図１２は輝度差を用いて輝度変化の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法を示す説明図である。図１２中、Ｃ３’、Ｃ１’、Ｃ２’はそれぞれ通常の明るさの細胞３’、暗い細胞１’、明るい細胞２’の輝度断面、Ｓ３’、Ｓ１’、Ｓ２’はそれぞれ、各細胞における隣接するピクセルの輝度差を示している。
図１２に示すように、各細胞における隣接する輝度差に対して通常の明るさの細胞３’の輪郭を正確に検出可能な一定の閾値１を設定し、閾値１を上回る輝度差を生じる点を細胞領域の一部として検出するようにすると、暗い細胞１’は細胞周辺領域での輝度差が小さいため、全体が閾値を下回り、細胞の輪郭が検出されず、また、明るい細胞２’の輪郭は本来の輪郭よりも大きく検出されてしまう。また、例えば、暗い細胞１’の輪郭を正確に検出できるように閾値２を設定しても、閾値２では通常の明るさの細胞３’や明るい細胞２’についての輪郭を正確に検出できない。
【００１０】
特に、複数の細胞が近接している場合は、上記２つの方法のいずれを用いても細胞の境界を正確に検出することが難しい。
このことを図１３を用いて説明する。
図１３は複数の細胞が近接している状態と輝度断面との関係を示す説明図で、(a)は２つの細胞が近接した状態を示す図、(b)は(a)の状態における輝度断面を示す図である。
細胞が近接している場合、図１３(b)に示すように、近接する細胞に挟まれた領域（細胞間領域）で輝度が高くなる。このため、上述した単一の輝度を一定の閾値とする方法、輝度差を用いる方法のいずれでも、個々の細胞領域の検出が困難になる。
【００１１】
問題点１：精度の問題
このように、従来の細胞画像解析装置においては、細胞等の境界を自動検出する精度に問題があった。問題を引き起こす要因は、次のようなものである。
・バックグランド（あるいは、光の当たり方）が一様ではないため、細胞の位置によって明るさが変わること。
・細胞ごとに、蛍光標識による染色の度合いが異なり、発する蛍光の明るさが異なること。
・同じ細胞において、その内部で染色の度合いが異なり、よく染色されている領域とそれほど染色されていない領域とが混在すること。
・明視野観察の場合、得られる細胞画像の輝度が全体的に大きく、細胞とバックグランドとの輝度差が小さいため、そもそも単一の閾値を用いて細胞の境界を判別することが難しいこと。
【００１２】
問題点２：操作性の問題
従来の方法を用いて輪郭を正確に検出するためには、例えば、図１２で示したような輝度差の閾値を、細胞の明るさに応じて複数設定する必要がある。しかし、それでは、操作・設定が煩雑になってしまう。
【００１３】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、複数の細胞群の画像、特に異なる輝度をもつ細胞群の画像に対して、煩雑な操作・設定を行うことなく、細胞の境界を正確に検出可能な細胞画像解析装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明による細胞画像解析装置は、蛍光細胞画像を用いて細胞の境界を検出する、コンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、前記コンピュータを、一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、少なくとも、細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域とに分類する領域分類手段、前記領域分類手段が分類した細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域の両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する信号変化量算出手段、前記所定の局所的な領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する境界候補領域検出手段、として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴としている。
【００１５】
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出する境界検出手段として機能させることを特徴としている。
【００１６】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、一画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度が最大となる隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。
【００１８】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。
【００１９】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。
【００２０】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度の平均値が最大となっている隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。
【００２１】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。
【００２２】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、各画素の輝度と、当該画素に隣接する所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値又は当該画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値とを比較し、該輝度の平均値と当該画素の輝度との大小関係が変わるときの当該画素を細胞の境界として検出するのが好ましい。
【００２３】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素からなり且つ該基準領域を該一次元方向に挟んで隣接する２つの隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び２つの隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するのが好ましい。
【００２４】
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素又は所定数の複数画素からなり且つ該基準領域を該二次元方向に囲んで隣接する複数の隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び複数隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するのが好ましい。
【００２５】
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、複数の局所的な領域内において、前記領域分類手段、前記信号変化量算出手段、前記境界候補領域検出手段、前記境界検出手段を介してそれぞれ検出された、複数の細胞の境界をつなげて、細胞の輪郭を特定する細胞輪郭特定手段として機能させることを特徴としている。
【００２６】
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する細胞輪郭補正手段として機能させることを特徴としている。
【００２７】
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する細胞輪郭判別手段として機能させることを特徴としている。
【００２８】
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、前記細胞輪郭判別手段が判別した閉曲線以外の閉曲線を、前記細胞内小器官又は細胞上の小さい斑点状のものの輪郭として判別する細胞内小器官等判別手段として機能させることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、複数の細胞群の画像、特に異なる輝度をもつ細胞群の画像に対して、煩雑な操作・設定を行うことなく、細胞の境界を正確に検出可能な細胞画像解析装置が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】細胞画像における一つの細胞についての、細胞外領域であるバックグランド、細胞の境界周辺領域、細胞領域での輝度変化の一般的な特性を示す説明図である。
【図３】細胞の境界周辺領域の輝度シグナルの特徴を示す説明図で、(a)は光源となる蛍光物質が一点に存在する細胞を、顕微鏡に備わる撮像装置で撮像した場合における、境界周辺領域での輝度断面図、(b)は集団を形成している実際の細胞の境界周辺領域を、顕微鏡に備わる撮像装置で撮像した場合における、境界周辺領域での輝度断面図である。
【図４】本発明の細胞画像解析装置における細胞の境界を検出するための一方法を示す説明図で、細胞の境界周辺領域の輝度断面に対し、ピクセルの数列をとった状態を示す説明図である。
【図５】本発明の細胞画像解析装置における細胞の境界を検出するための他の方法を示す説明図で、(a)は細胞画像における任意の領域の一例を示す説明図、(b)は(a)における任意の領域周辺の画像を拡大して示す概念図、(c)は(b)の画像から任意の領域を抽出して示す概念図である。
【図６】本発明の実施例１にかかる細胞画像解析装置を用いた細胞画像解析の全体的な処理手順の概要を示すフローチャートである。
【図７】図６の細胞画像解析装置による細胞境界の検出処理手順を示すフローチャートである。
【図８】実施例１にかかる細胞画像解析装置による画像領域の分類〜細胞の境界候補領域の抽出処理の処理手順の一例を示す説明図で、(a)は細胞画像をバックグランド、細胞領域、細胞の境界候補領域に分類した状態を示す図、(b)は分類した細胞画像から細胞の境界候補領域を抽出した状態を示す図である。
【図９】実施例１の細胞画像解析装置を用いた輪郭の断片化に対する補正方法を示す説明図で、(a)は本来の細胞の輪郭を示す図、(b)は細胞の輪郭が断片化して検出された例を示す図、(c)は (b)の断片化された領域に等高線を引いた状態を示す図である。
【図１０】細胞内小器官の輪郭が検出された状態を示す説明図である。
【図１１】明るさの異なる複数の細胞を単一の閾値で二値化する方法及びその方法により検出される細胞の輪郭の一例を示す説明図で、(a)は各細胞の輝度断面と閾値との関係を示す図、(b)は(a)の閾値で二値化することによって検出される細胞の輪郭と本来の輪郭を示す図である。
【図１２】輝度差を用いて輝度変化の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法を示す説明図である。
【図１３】複数の細胞が近接している状態と輝度断面との関係を示す説明図で、(a)は２つの細胞が近接した状態を示す図、(b)は(a)の状態における輝度断面を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析装置の全体構成を示すブロック図である。
本実施形態の細胞画像解析装置１は、領域分類手段１ａと、信号変化量算出手段１ｂと、境界候補領域検出手段１ｃと、境界検出手段１ｄと、細胞輪郭特定手段１ｅと、細胞輪郭補正手段１ｆと、細胞輪郭判別手段１ｇと、細胞特徴量抽出手段１ｈと、統計・出力手段１ｉとを機能させる画像解析ソフトウェアと、画像解析ソフトウェアを備えるコンピュータとで構成されている。
【００３２】
領域分類手段１ａは、一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、少なくとも、細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域とに分類する。例えば、細胞領域とバックグランド領域と細胞の境界周辺領域とに分類できる。
信号変化量算出手段１ｂは、領域分類手段１ａが分類した細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域の両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する。
境界候補領域検出手段１ｃは、信号変化量算出手段１ｂが算出した所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する。
境界検出手段１ｄは、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、信号変化量算出手段１ｂが算出した所定の信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出する。
細胞輪郭特定手段１ｅは、複数の局所的な領域内において、領域分類手段１ａ、信号変化量算出手段１ｂ、境界候補領域検出手段１ｃ、境界検出手段１ｄを介してそれぞれ検出された、複数の細胞の境界をつなげて、細胞の輪郭を特定する。
細胞輪郭補正手段１ｆは、細胞輪郭特定手段１ｅが特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する。
細胞輪郭判別手段１ｇは、細胞輪郭特定手段１ｆが特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する。
細胞特徴量抽出手段１ｈは、取得した細胞領域内での画像を用いて、各細胞の明るさ、形態などの細胞の特徴量を抽出する。
統計・出力手段１ｉは、グループごとの細胞特徴量の平均化、比較などの統計処理や処理結果の出力を行う。
【００３３】
本発明では、個々の細胞の明るさが異なり、各細胞の輝度断面が、単一の閾値で各細胞の輪郭を正確に検出することができない分布を持つ、細胞群に対して、細胞ごとの閾値の操作・設定を行うことなく、細胞の輝度に応じた閾値で、細胞の輪郭を正確に検出するために、次のような原理を応用している。
【００３４】
細胞検出方法の原理１：細胞画像の輝度分布の特性
一般的に、蛍光細胞画像は、細胞の境界周辺領域において、輝度シグナルが安定的（滑らか）に大きく減衰していくという、輝度分布の特性を有している。本発明では、この特性を応用している。
図２は細胞画像における一つの細胞についての、細胞外領域であるバックグランド、細胞の境界周辺領域、細胞領域での輝度変化の一般的な特性を示す説明図である。
一般的に、細胞領域での蛍光シグナルの輝度は、その細胞内部の各点での染色の度合いが異なること等を原因として、所定の輝度値の幅においてランダムに近い状態で変化する。
また、バックグランドでの蛍光シグナルの輝度も、細胞領域での蛍光シグナルと同様、所定の輝度範囲内においてランダムに近い状態で変化する。
【００３５】
細胞検出方法の原理２：細胞の境界周辺領域での輝度分布の特性
これに対し、細胞の境界周辺領域でのシグナルの輝度は、光学的な特性に依存して滑らかに変化する。また、その変化量は、細胞領域やバックグランドでの輝度シグナルの変化量に比べて大きい。
例えば、理想的な実験系として、光源となる蛍光物質が一点に存在する細胞を、顕微鏡に備わる撮像装置で撮像した場合を考える。すると、輝度断面は、図２(a)に示すように、裾が穏やかに変化するカーブを描く。
実際の細胞内には、このような蛍光物質が集団を形成して存在している。集団を形成している物質の輝度断面は、上述した一点での輝度分布を重ね合わせたものとなる。そして、細胞の境界周辺領域では、図２(b)に示すように、緩やかな傾斜を描き、かつ、裾が滑らかに変化する。
つまり、細胞の境界周辺領域の各点の輝度は、安定的（即ち、滑らかに）、かつ、単調的に（即ち、輝度変化量の符号を同じに保ちながら）変化する。
そこで、本発明の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアが、信号変化量算出手段１ｂ、境界候補領域検出手段１ｃとして機能させることによって、細胞の位置の変化に対応した、輝度の変化量などの所定の信号変化量の変化傾向が同じになっている（輝度変化量の符号を同じに保ちながら変化する）領域を境界候補領域として自動的に検出するように構成されている。
【００３６】
なお、所定の信号変化量は、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、一画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度が最大となる隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度の平均値が最大となっている隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。
【００３７】
細胞検出方法の原理３：細胞の輪郭の定義
また、本発明の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出するように構成されている。より詳しくは、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、各画素の輝度と、当該画素に隣接する所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値又は当該画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値とを比較し、該輝度の平均値と当該画素の輝度との大小関係が変わるときの当該画素を細胞の境界として検出するように構成されている。
【００３８】
例えば、図３に示すように、細胞の境界周辺領域の輝度断面に対し、次のようなピクセルの数列をとる。
Ａ(1)，Ａ(2)，Ａ(3)（ここではＡ(3)が細胞領域に近づく方向とする。）
シグナルが安定している場合、Ａ(i)の列における輝度ａ(i)は単調に増加する。
一般的に、輝度の変極点は細胞の境界の位置と一致する。このため、上記数列に対して、次の条件を満たすｉ（細胞の境界周辺領域の輝度断面に対する点）を特定することで、細胞の境界の位置が求まる。
Δａ(i)＝ａ(i)−ａ(i-1)
としたとき、
Δa（i）＜Δa（i＋1）が、Δa（i）＞Δa（i＋1）へと不等号の向きが変わるi
画像解析ソフトウェアは、この輝度の変極点を信号変化量の変化の度合いが変化する領域として検出する。
【００３９】
細胞検出方法の原理４：変極点検出の具体例
本発明の細胞画像解析装置における画像解析ソフトウェアによる変極点の具体的な検出手順の一例を説明する。
本例の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素からなり且つ該基準領域を該一次元方向に挟んで隣接する２つの隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び２つの隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するように構成されている。
【００４０】
まず、Ａ(i−1)，Ａ(i)，Ａ(i＋1)の３点での輝度a(i−1)，a(i)，a(i＋1)の平均を算出する。
ここで、輝度の変化量がΔa（i）＞Δa（i＋1）となる場合、Ａ(i)での輝度ａ(i)を基準としたときのＡ(i+1)での輝度ａ(i+1)の増加量が、Ａ(i)での輝度ａ(i)を基準としたときのＡ(i-1)での輝度ａ(i-1)の減少量より小さいので、Ａ(i)での輝度ａ(i)は、３点の輝度の平均より小さくなる。
逆に、Ａ(i)での輝度ａ(i)が、３点の輝度の平均より大きい場合、Δａ(i)＜Δａ(ｉ+1)と判断することができる。
つまり、細胞の境界周辺領域の輝度断面に対する点ｉを、例えば１ピクセルごとにずらしながら、Ａ(i-1)，Ａ(i)，Ａ(i+1)の３点a(i-1)，ａ(i)，ａ(i+1)での輝度の平均とＡ(i)での輝度a(i)を比較し、その大小関係を検出することで、その大小関係が逆転する点を変極点として検出することができる。
【００４１】
なお、上記変極点の検出方法では、細胞領域の方向がわからないと、上記のようなピクセル数列を定義することができないという問題がある。
また、細胞領域の方向を定義しておき、その定義に基づいて細胞領域の方向を検出するのでは、細胞の境界の検出処理が煩雑になるという欠点がある。
【００４２】
そこで、本発明の細胞画像解析装置では、より好ましくは、図５に示すような方法を用いる。
本例の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素又は所定数の複数画素からなり且つ該基準領域を該二次元方向に囲んで隣接する複数の隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び複数隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するように構成されている。
【００４３】
図５に示すように、細胞画像上の細胞の境界候補領域において、所定の一点とその一点に２次元方向に隣接する点を備えた、任意の領域を抽出し、その任意の領域内での各点の輝度の平均を算出する。図５(a)は細胞画像における任意の領域の一例を示す説明図、図５(b)は図５(a)における任意の領域周辺の画像を拡大して示す概念図、図５(c)は図５(b)の画像から任意の領域を抽出して示す概念図である。
図５中、Ａ１１〜Ａ３３で示される領域（点）は、それぞれピクセルを示している。図５では、ピクセルＡ１１，Ａ１２，Ａ１３は細胞領域外、ピクセルＡ２１，Ａ２２，ａ２３は細胞の境界、ピクセルＡ３１，Ａ３２，Ａ３３は細胞領域内に位置している。
【００４４】
ここで、図５(c)に示す任意の領域内のピクセルＡ１１〜Ａ３３の平均輝度と、任意の領域の中心に位置するピクセルＡ２２の輝度とを比較する。
任意の領域は、図５(a)に示すように、細胞のサイズ、言い換えれば、細胞の境界の全長に対して非常に小さいサイズの領域である。このため、任意の領域では、図５(b)、図５(c)に示すように、細胞の境界（ピクセルＡ２１，Ａ２２，Ａ２３の領域）を中間領域として、細胞に近い細胞領域内（ピクセルＡ１１，Ａ１２，Ａ１３の領域）、細胞に遠い細胞領域外（ピクセルＡ３１，Ａ３２，Ａ３３）が規則的に並ぶ。
【００４５】
このため、図５に示すように、細胞画像上の細胞の境界候補領域内における所定の一点とその一点に２次元方向に隣接する点とからなる任意の領域を抽出した場合においても、図４で示した、１次元方向のピクセルの数列Ａ(i−1)，Ａ(i)，Ａ(i＋1)の３点を用いた場合と同様に、任意の領域における輝度が滑らかに変化する場合、その任意の領域内での各点の輝度の平均とその任意の領域の中心点での輝度との大小関係が変化する変極点を検出することによって、その変極点を細胞の境界として検出することができる。
【００４６】
細胞検出方法の原理５：光学系依存量に対する補正方法
上述した例では、各ピクセルでの輝度を比較したが、ピクセルの数は、画像の解像度や画像撮像装置における撮像光学系のレンズの倍率などに依存する。
そこで、本発明の細胞画像解析装置では、それらの撮像光学系に依存するピクセルの数に対する補正を行うため、ピクセル間の輝度を比較する代わりに、任意の距離単位を設定し、設定した任意の距離単位ごとの輝度を用いて上記と同じ方法で細胞の境界を検出するようにしてもよい。
例えば、点Ａ(i)，Ａ(i＋1)の間を１ピクセルではなく、３ピクセルの距離として定義して上記と同様の方法で細胞の境界を検出してもよい。
【００４７】
実施例１
図６は本発明の実施例１にかかる細胞画像解析装置を用いた細胞画像解析の全体的な処理手順の概要を示すフローチャートである。図７は図６の細胞画像解析装置による細胞境界の検出処理手順を示すフローチャートである。
実施例１の細胞画像解析装置の基本構成は、図１に示した実施形態の細胞画像解析装置と同じである。
実施例１の細胞画像解析装置を用いた細胞画像解析では、図６に示すように、まず、所定の画像取得装置を用い細胞画像として、例えば、複数色の蛍光（透過）画像を取得する（ステップＳ１）。
次いで、細胞画像解析装置の領域分類手段１ａが、画像領域を分類し、細胞のおおよその存在領域を検出し、さらに、境界候補領域検出手段１ｃが、細胞の境界候補領域を検出する（ステップＳ２）。
次いで、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した細胞の境界候補領域から細胞境界を特定する。さらに、この段階では、細胞輪郭特定手段１ｅが、境界検出手段１ｄが特定した細胞境界を用いて細胞の輪郭を特定するとともに、細胞輪郭補正手段１ｆが細胞の輪郭の補正、細胞輪郭判別手段１ｇが細胞の判別を行い正確な細胞領域を取得する（ステップＳ３）。
次いで、細胞特徴量抽出手段１ｈが、取得した細胞領域内での画像を用いて、各細胞の明るさ、形態などの細胞の特徴量を抽出する（ステップＳ４）。
次いで、統計・出力手段１ｉが、グループごとの細胞特徴量の平均化、比較などの統計処理や処理結果の出力を行う（ステップＳ５）。
【００４８】
ここで、画像領域の分類〜細胞の境界候補領域の抽出処理（ステップＳ２）と細胞境界の特定処理（ステップＳ３）の処理手順を、図７を用いて説明する。
画像領域の分類〜細胞の境界候補領域の抽出処理（ステップＳ２）では、まず、領域分類手段１ａが、例えば、一定の閾値で二値化する方法を用いて、細胞画像を、バックグランドとそれ以外の細胞の境界を含む領域の２領域に分類する、あるいは、例えば、細胞画像の全体領域の平均輝度を算出し、算出した平均輝度と所定の領域内での平均輝度を比較することで、およその細胞領域を特定するなど、ある程度絞り込むようにして、細胞画像を、図８(a)に示すように、バックグランド、細胞領域、細胞の境界候補領域の３領域に分類する。
次いで、信号変化量算出手段１ｂが、分類した細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域の両方にまたがる所定の局所的な領域内において、上述の「細胞検出方法の原理２」で述べたように、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出し、境界候補領域検出手段１ｃが、該所定の局所的な領域内における所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として検出する。
【００４９】
細胞境界の特定処理（ステップＳ３）では、境界検出手段１ｄが、まず、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内における、任意の点を細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）とし、例えば、図５に示したような任意の領域を抽出する。そして、任意の領域の中心に位置する細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）での輝度ａ（ｘ，ｙ）を検出する。細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）に対して２次元方向に隣接する点、あるいは細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）を基準とする半径内において指定される点で囲まれた領域の平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）を算出する（ステップＳ３１）。
【００５０】
次いで、輝度ａ（ｘ，ｙ）と平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）との大小関係が変化する点（ｘ，ｙ）を細胞の境界として検出する（ステップＳ３２）。
【００５１】
ところで、上記方法を用いても、ある領域においては、輝度ａ（ｘ，ｙ）と平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）との大小関係が変化する点（ｘ，ｙ）が特定できず、細胞輪郭特定手段１ｅを介して特定される細胞の輪郭が断片化する場合や、細胞内小器官が存在する領域においては、輝度ａ（ｘ，ｙ）と平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）との大小関係が変化する点（ｘ，ｙ）が複数特定され、細胞輪郭特定手段１ｅを介して細胞内小器官の輪郭も検出されてしまう場合が起こりうる。
そこで、本実施例の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアが、検出手段１ｄが検出した境界を用いて細胞輪郭特定手段が特定した細胞の輪郭に対して、細胞輪郭補正手段１ｆ、細胞輪郭判別手段１ｇを機能させて、次のような補正等を行う（ステップＳ３３）。
【００５２】
補正方法１：断片化に対する補正
輪郭の断片化に対しては、細胞輪郭補正手段１ｆが、これらの断片をつなぎ合わせて閉じた曲線を作ることで補正を行う。
図９(a)は本来の細胞の輪郭を示す図、図９(b)は細胞の輪郭が断片化して検出された例を示す図、図９(c)は図９(b)の断片化された領域に等高線を引いた状態を示す図である。
図９(c)に示すように、図９(b)に示した輪郭断片の各輝度を検出し、これらの輝度に対して画像中に輝度等高線を引くと、各細胞領域を閉じた曲線で定義することができ、図９(a)に示した本来の輪郭に近い輪郭が得られる。これらの等高線を平均化することで単一の曲線にして輪郭を得る。
即ち、特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する。
【００５３】
補正方法２：細胞内小器官に対する補正
上述したように、本発明の細胞画像解析装置において、図１０に示すように、細胞の輪郭の他に、細胞内小器官の輪郭を検出してしまう場合がある。
この場合、細胞輪郭判別手段１ｇが、細胞輪郭特定手段１ｅが特定する細胞の境界を結んで作成された複数の閉曲線に対し、「各細胞の一番外側の閉曲線が細胞の境界になる」ことを用いて、「抽出された境界で結ばれる複数の閉曲線の包含関係を定義しておき、その定義に基づいて細胞内小器官と細胞の境界を分類する」ことで補正を行う。
即ち、細胞輪郭特定手段１ｅが特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する。
これらの処理を行うことで、細胞の境界を極力正確に検出することができる。
なお、画像解析ソフトウェアは、さらに、コンピュータを、細胞輪郭特定手段１ｅが特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、細胞輪郭判別手段１ｇが判別した閉曲線以外の閉曲線を、細胞内小器官又は細胞上の小さい斑点上のものの輪郭として判別する細胞内小器官等判別手段として機能させるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の細胞画像解析装置は、細胞画像の自動解析分野に有用である。
【符号の説明】
【００５５】
１            細胞画像解析装置
１ａ          領域分類手段
１ｂ          信号変化量算出手段
１ｃ          境界候補領域検出手段
１ｄ          境界検出手段
１ｅ          細胞輪郭特定手段
１ｆ          細胞輪郭補正手段
１ｇ          細胞輪郭判別手段
１ｈ          細胞特徴量抽出手段
１ｉ          統計・出力手段
Ａ(1)、Ａ(2)、Ａ(3)、Ａ(i)、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３        細胞の境界周辺領域内における画素領域
ａ(1)、a(2)、a(3)、ａ(i)  細胞の境界周辺領域内における画素領域での輝度
Δａ(i)、Δａ(I+1)        細胞の境界周辺領域内における画素領域での輝度の変化量
ｉ                      細胞の境界周辺領域の輝度断面に対応する画素領域の点
ａ（ｘ，ｙ）            細胞の境界候補の基準領域とする点（ｘ，ｙ）における輝度
Ａ（ｘ，ｙ）            細胞の境界候補の基準領域とする点（ｘ，ｙ）含む所定領域における平均輝度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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