(57)【要約】【課題】ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法によりアルカリ性ホスファターゼアイソザイムを測定する測定法に出現する各アイソザイムのバンドの判定を行う。【解決手段】５６℃、１０分間の加熱処理前後の濃度図について、肝臓型ＡＬＰと塗布点（原点、高分子ＡＬＰ２）の各ピーク位置またはピークと判定した位置が一致するよう重ね合わせて表示または表記し、肝臓型ＡＬＰの染色帯のピーク位置またはピークと判定した位置と塗布点（高分子ＡＬＰ２）のピーク位置をそれぞれ１と０としその中間位に出現するＡＬＰアイソザイムの染色帯を相対移動度ＲＭ値で表すとき、ＲＭ＝０．９０±０．０２を骨型ＡＬＰ、ＲＭ＝０．８０±０．０２を小腸型ＡＬＰ、ＲＭ＝０．６６±０．０８を小腸型バリアントＡＬＰ、ＲＭ＝０．４７±０．１をビリアリー型ＡＬＰとそれぞれの染色帯をＲＭ値で特定し判定するアルカリ性ホスファターゼアイソザイムの検体検査方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離ゲルと濃縮ゲルの２層を有するポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法でヒトのアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）のアイソザイムを分析するとき、同一検体を容器に２分割しその一方を５６℃、１０分間加熱し、加熱前後の検体をそれぞれ電気泳動しＡＬＰ染色した電気泳動像を比色計またはＣＣＤカメラで撮影しそれぞれ波形化した濃度図を分析する方法において、肝臓型ＡＬＰの染色帯のピーク位置またはピークと判定した位置を１としかつ検体塗布点位置である濃縮ゲルの陰極側すなわち高分子ＡＬＰ２の位置を０とし、それらの中間位置に出現する各ＡＬＰアイソザイムの染色帯をそれぞれ相対移動度ＲＭで表し、ＲＭ＝１を肝臓型ＡＬＰ、ＲＭ＝０．９０±０．０２を骨型ＡＬＰ、ＲＭ＝０．８０±０．０２を小腸型ＡＬＰ、ＲＭ＝０．６６±０．０８を小腸型バリアントＡＬＰ、ＲＭ＝０．４７±０．１をビリアリー型ＡＬＰとそれぞれのＡＬＰアイソザイムの染色帯位置をＲＭ値で表しアイソザイムを特定し判定することを特徴とするアルカリ性ホスファターゼアイソザイムの検体検査方法。
【請求項２】
ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法でヒトのＡＬＰのアイソザイムの５６℃、１０分間の加熱前後の濃度図を分析する方法において、得られた２種類の濃度図波形について、肝臓型ＡＬＰのピーク位置またはピークと判定した位置と塗布点である高分子ＡＬＰ２の位置とをそれぞれ一致するよう重ね合わせて表示し、加熱前後における各ＡＬＰアイソザイムの減少の程度が濃度図波形上に明瞭に分かるよう配置した上で、１つの画面または印刷画像にすることを特徴とする請求項１のアルカリ性ホスファターゼアイソザイムの検体検査方法。
【請求項３】
ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法でヒトのＡＬＰのアイソザイムの５６℃、１０分間の加熱前後の濃度図を比較分析する方法において、肝臓型ＡＬＰに近接する陰極側の染色帯について、加熱前と後を比較しその差をとるときピークの高さまたは分画％が８０％以上消失したＲＭ＝０．９０±０．０２の部分を骨型ＡＬＰと判定することを特徴とする請求項１、請求項２のアルカリ性ホスファターゼアイソザイムの検体検査方法。
【請求項４】
ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法でヒトのＡＬＰのアイソザイムの５６℃、１０分間の加熱前後の濃度図を比較分析する方法において、肝臓型ＡＬＰに近接する陰極側の染色帯について、加熱前と後を比較しその差をとるときピークの高さまたはピークと判定した位置における分画％の差が１％〜２０％しか減少しないＲＭ＝０．９５±０．０２の部分を胎盤型ＡＬＰと判定することを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３のアルカリ性ホスファターゼアイソザイムの検体検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】ヒトや動物の血液中の酵素の１つであるアルカリ性ホスファターゼ（以後ＡＬＰ）を測定し判定する技術分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】血液中のＡＬＰは、その産生する臓器によりアイソザイムが存在することは良く知られている。このアイソザイムの分析法は既に４０年以上前より行われており、健常成人では主に肝臓型ＡＬＰと骨型ＡＬＰ及び小腸型ＡＬＰ（主に血液型がＢ型とＯ型のヒト）が出現する。小児期では骨型ＡＬＰが比較的多く出現し、成人の骨型ＡＬＰより電気泳動の移動度が若干速いと言われている。
妊婦には耐熱性の胎盤型ＡＬＰが出現し肝型ＡＬＰと骨型ＡＬＰの中間または骨型ＡＬＰとほぼ同位置に出現する。
ある種の疾病に罹患した患者の血液中には、健常人のＡＬＰアイソザイムに比べ非特定のアイソザイムが増加または減少し、移動度の異なる特異なアイソザイムが産生されることがあり、それぞれ疾患臓器の特定に活用されている。【０００３】ＡＬＰアイソザイムの分析には、特定のアイソザイム抗体を用いる免疫化学的分析法もあるが、通常は電気泳動法により行われることが多い。電気泳動法でＡＬＰアイソザイム分析を行う場合、その支持体としてアガロースゲルやセルロースアセテート膜を用いてアイソザイム自体の表面荷電で分析する測定法（参考文献１）とポリアクリルアミドゲルディスク（以後ＰＡＧディスク）ゲルのような分子ふるい効果のある支持体でアイソザイムを分子サイズの順に分析する測定法（参考文献４，５，６）が知られている。電気泳動法で分析されたＡＬＰアイソザイムは主にインジゴブルーのような染色液で特異的に染められ可視化される。【０００４】アガロースゲル電気泳動法では、陽極側からＩ型ＡＬＰ（高分子型）、ＩＩ型ＡＬＰ（肝臓型）、ＩＩＩ型ＡＬＰ（骨型）、ＩＶ型ＡＬＰ（胎盤型）、Ｖ型ＡＬＰ（小腸型）、ＶＩ型ＡＬＰ（免疫結合型）と呼ばれるアイソザイムが出現し、特にＩ型ＡＬＰ（高分子型）、ＩＩ型ＡＬＰ（肝臓型）、ＩＩＩ型ＡＬＰ（骨型）、ＩＶ型ＡＬＰ（胎盤型）、Ｖ型ＡＬＰ（小腸型）の分離は僅差でありそのアイソザイムの判定に苦労しており時々誤判定されたり、若しくは判定不良と報告書されることがあった。【０００５】ＰＡＧディスク電気泳動法では、陽極側から肝臓型ＡＬＰ、胎盤型ＡＬＰ、骨型ＡＬＰ、小腸型ＡＬＰ、小腸型バリアントＡＬＰ、ビリアリー型ＡＬＰ、免疫複合型ＡＬＰ、血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰ、高分子ＡＬＰ１、高分子ＡＬＰ２が検出される。
この他、腎臓型ＡＬＰ、Ｎａｇａｏ型ＡＬＰ、Ｒｅｇａｎ型ＡＬＰ、Ｋａｓａｈａｒａ型ＡＬＰや、肝臓型ＡＬＰよりも陽極側に特殊なバンドが出現することがある。
特にＰＡＧディスク電気泳動法では、小腸型ＡＬＰに係るアイソザイムは、小腸型ＡＬＰ、小腸型バリアントＡＬＰ、血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰの３種類検出される。【０００６】アガロースゲル電気泳動法（参考文献１）やセルロースアセテート膜電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分離分析法は、健常者の分析で判断を間違うことは少ないが、ＰＡＧディスク電気泳動法で確実に検出できる高分子ＡＬＰ１、高分子ＡＬＰ２の区別および血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰやビリアリー型ＡＬＰ、小腸型バリアントＡＬＰ等の出現する検体においてはそれらの区別できない。さらに胎盤型ＡＬＰの出現や、ＡＬＰ活性値が高い異常患者検体や免疫グロブリンを結合した免疫複合型ＡＬＰの出現があった場合、これらがアガロースゲルの網目に引っ掛かり分離がブロード状になり、その濃度波形を見てもそれぞれのアイソザイムを判定することは相当熟練した技術者でも難しいと言われている。
高分子ＡＬＰ１や高分子ＡＬＰ２は細胞膜断片をもったＡＬＰ分子と言われ、臨床的には細胞が壊れその一部がＡＬＰと一緒に血中に流れ出したものと考えられており、高分子ＡＬＰが増加することは臓器特異的な細胞の破壊が進んでいることを示している。またビリアリー型ＡＬＰの出現は胆汁鬱帯があることを意味しており、胆管閉塞の兆候でもある。これらの情報が的確に医師に伝わらないということは、診断や治療に役立たないことになり、当然分析法の信頼性が失われることになる。【０００７】ＰＡＧディスク電気泳動法に出現する肝臓型ＡＬＰよりも陽極側に出現する特殊なバンドはアガロースゲル電気泳動法やセルロースアセテート膜電気泳動法では検出できない。アガロースゲル電気泳動法等では、当然このバンドは他のアイソザイムと区別できない。分離の不確実性を解消するため添加剤を入れて電気泳動する方法が参考文献２に示されている。さらにアガロースゲル電気泳動法において、アイソザイムの判定を明確にするため参考文献３に示すようにＩ型ＡＬＰ（高分子型）の出現とＩＩ型ＡＬＰ（肝臓型）・ＩＩＩ型ＡＬＰ（骨型）の活性値の比、さらに波形の形で見分けようとしているものもある。【０００８】一方、ＰＡＧディスクゲル電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分離分析（参考文献４，５，６）は、アガロースゲル電気泳動法やセルロースアセテート膜電気泳動法より遅れて発表されたことと分析技術の操作が複雑なことやパターンの判読に熟練が要することなどによりその普及が進んでいない。
このＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分析は、ＰＡＧゲルに分子ふるい効果があることから分子サイズの順にアイソザイムが分離分析できることが知られている。前述のようにアイソザイムそのものの荷電で分析するアガロースゲル電気泳動法やセルロースアセテート膜電気泳動法とは分析原理が異なるため、ＰＡＧディスク電気泳動法特有の色々なバンドが出現する。ＰＡＧディスク電気泳動法でさえ肝臓型ＡＬＰ、胎盤型ＡＬＰ、骨型ＡＬＰ、小腸型ＡＬＰはアガロースゲル電気泳動法等と同様相当僅差の分離分析法であり、ＡＬＰ活性が高い患者では、アイソザイムバンドが互いに重なり合うことがあり判定を迷わせている。【０００９】    参考文献
１．医学検査、Ｖｏｌ．５６、Ｎｏ．６、７４９−７５１、２００６
２．特許公表２００３−５２７６００
３．特開２００２−１８１８２５
４．医学のあゆみ、Ｖｏｌ．１５５、Ｎｏ１１−１２、ｐ７４１−７４２、１９９０、１２／２２
５．生物物理化学、Ｖｏｌ．３５、Ｎｏ２、３１．１９９１
６．生物物理化学、Ｖｏｌ．３８、３１−３６．１９９４
７．特許第４２１１４６３号
８．特許第４１２００１１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】本願は、元々分離能の悪いアガロースゲル電気泳動法やセルロースアセテート膜電気泳動法ではなく、分子ふるい効果のあるＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分析法の電気泳動後の泳動像の分析、判定法に関するものである。
分子ふるい効果が期待できるＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分析法であっても同じ部位に異なる複数のバンドが出現したら当然それらの相互判断はより難しいものとなる。【００１１】妊婦やある種の癌では耐熱性の胎盤型ＡＬＰが出現することがあり、その出現位置は肝臓型ＡＬＰと骨型ＡＬＰの中間または骨型ＡＬＰに重なることが知られている。従って胎盤型ＡＬＰの出現を見逃し骨型ＡＬＰと誤判定されることがある。
ＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分析法ではこれら誤判定を防止するため、胎盤型ＡＬＰが熱に強いことを利用して、６５℃、３０分の加熱で、その他のＡＬＰアイソザイムが完全に失活し染色後のＡＬＰ染色帯（バンド）が消え、胎盤型ＡＬＰのみが残ることにより確実に判断できることは良く知られている。
胎盤型ＡＬＰがない場合でも、骨型ＡＬＰの活性値が高い患者の場合には、染色帯が肝臓型もしくは小腸型ＡＬＰと重なりそれぞれの鑑別が難しい。
その上小児期の骨型ＡＬＰは成人の骨型ＡＬＰよりも活性値が高い上、移動度が少し速く肝臓型ＡＬＰに接近すると言われている。
また時々骨型ＡＬＰと小腸型ＡＬＰの中間位に腎臓型ＡＬＰが現れることがあり、これらの判定はもっと難しい。
そのため分離が良いと言われるＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分析法でさえ、患者検体を２本に分けその一方を５６℃、１０分間の加熱処理し、未処理の検体と同時に電気泳動を行い、その差を専門の技師が目視により、それぞれのバンドを判定する方法が採られており、これにより胎盤型の存在を予め予測して、胎盤型ＡＬＰが疑われる場合さらに６５℃、３０分の加熱後に染色帯があるかどうかを調べ誤判定を回避している。【００１２】ＡＬＰアイソザイムは、アイソザイムの種類により熱失活性が異なることが知られており、５６℃、１０分間の加熱処理後の活性値は、未処理に較らべると下記のようになる。
胎盤型ＡＬＰ    …    ９２％
肝臓型ＡＬＰ    …    ３０％
小腸型ＡＬＰ    …    ２４％
骨型ＡＬＰ      …      ８％
この５６℃、１０分間の加熱処理を併用しその熱失活性から濃度図を目視により比較しＡＬＰアイソザイムの型を分析する手法は、以前より行われている。この分析法を併用してもやはり専門の検査技師の経験と熟練によらないと判定は難しい。さらに、技師の個人差も大きく結果の判定は混迷を極めていた。【００１３】本願は、５６℃、１０分間の加熱処理したものと未処理の泳動像またはその濃度図（デンシトグラム）を比較する際、単なる目視または濃度図上の比較ではなく、−定の数字による判定基準を設け、結果の判定が専門の熟練した検査技師でなくとも判断・判定できるようにした新しいＡＬＰアイソザイム判断方法を提供することを課題にした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】課題を解決する方法として、本願は、ＰＡＧディスク電気泳動法でＡＬＰアイソザイムの測定を行う際、同一被試験試料（検体）を異なる小試験管等の容器に２分割しその一方を５６℃、１０分間加熱し、加熱前後の検体をそれぞれ電気泳動しＡＬＰ染色した電気泳動像を比較する分析法（参考文献４，５，６）を用い、その双方の泳動像をＣＣＤカメラで撮影しそれぞれの濃淡を２次元の濃度波形にする参考文献７の「画像からの濃度定量法」において、参考文献８の相対移動度の技術をＡＬＰアイソザイムの分析に応用して相対移動度ＲＭの数値でもってそれぞれのＡＬＰアイソザイムを判定しようとするものである。
「画像からの濃度定量法」を使わなくても、普通の比色定量法による濃度計においても、相対移動度ＲＭ値を算出することができる測定機器であれば、本願が規定する相対移動度をＲＭの数値で表わし、それぞれのＡＬＰアイソザイムを数値で判定できることはいうまでもない。【００１５】参考文献８はリポ蛋白質の分析法であり、被試験試料（検体）の濃度図と健常者の濃度図を重ね合わせてその差異を検出するものである。
本願発明は、ＰＡＧディスク電気泳動法でＡＬＰアイソザイムの測定を行う際、同一被試験試料（検体）について５６℃、１０分間加熱したものと加熱しないものの濃度波形を肝臓型ＡＬＰのピーク位置またはピークと判定した位置と濃縮ゲルの陰極側塗布点のピーク位置（高分子ＡＬＰ２の位置）が一致するように重ね合わせした上、加熱前後でＡＬＰアイソザイムの熱失活性の差異を目視でも分かるようにした。この点、脂質健常者の濃度図（波形）を重ね合わせする引用文献８とは重ね合わせる目的も結果の解釈も完全に異なるものであることを付け加える。
これにより同一検体の、５６℃、１０分間加熱処理した前後の濃度図を一枚の濃度図の中で見ることができその差もはっきり見分けることが可能になった。
熱失活性の活用は、特に骨型ＡＬＰが他のＡＬＰより熱失活性が大きいので、熱処理前と熱処理後の濃度図を肝臓型ＡＬＰと高分子ＡＬＰ２の位置を正確に合わせることにより、特に骨型ＡＬＰの位置を見つけやすくなりかつ骨型ＡＬＰのすく後方に出現する小腸型ＡＬＰも区別し易くなる。【００１６】次に、相対移動度ＲＭについて述べる。相対移動度とは検体塗布点（原点）を０として最も早く移動する目的蛋白質の移動距離を１として、その中間に位置する色々な染色帯（バンド）を一定の数字で表す手法で昔から時々使われている。
電気泳動法は支持体や緩衝液および使用する泳動槽や周囲の温度等により、移動する蛋白質の移動度が微妙に変わる。そのため泳動像やその濃度波形をそのまま比較しても各染色帯の差異を正確に捉えることは非常に難しい。
その移動度を一定の基準で求め、それぞれの染色帯を数字で判定しようというものが相対移動度ＲＭである。表現の違いや基準の取り方の違いでＲｍやＲｐもしくはＲｆなどと記載されることもある。
その１例が引用文献８に示されリポ蛋白質の検体検査方法に使用されている。
本願はそのＲＭの概念をＡＬＰアイソザイムの測定に応用した。
本願発明は、肝臓型ＡＬＰのピーク位置またはピークと判定した位置を１としかつ陰極側の濃縮ゲルの試料塗布点部分（高分子ＡＬＰ２）のピーク位置またはピークと判定した位置を０とし、その中間位置に出現する各ＡＬＰアイソザイムのバンドのピーク位置またはピークと判定した位置をそれぞれ相対移動度ＲＭで表したとき、各ＡＬＰアイソザイムバンドの型すなわち由来臓器がほぼ確実に特定のＲＭ値で判定できることを発見したことにより成された。【００１７】本願におけるＲＭの算出方法を図１に示す。図１はＡＬＰアイソザイム分析用ＰＡＧディスクゲルの模式図であり、相対移動度ＲＭの算出法を次のように規定する。
ＡＬＰアイソザイム分析用ＰＡＧディスクゲルは、図１の（１）に示す分離ゲルと（２）に示す濃縮ゲルの２層になっている。電気泳動後インジゴブルーでＡＬＰ染色すると分離ゲル中や分離ゲルと濃縮ゲルの境界面等に、いろいろなＡＬＰアイソザイムバンドが出現する。陽極側（＋）から肝臓型ＡＬＰ  Ａ点（３）、骨型ＡＬＰ  Ｂ点（４）、小腸型ＡＬＰ  Ｃ点（５）、小腸型バリアントＡＬＰ  Ｄ点（６）、ビリアリー型ＡＬＰ  Ｅ点（７）、血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰ  Ｆ点（８）、分離ゲルと濃縮ゲルの境界部分に出現するバンド高分子ＡＬＰ１  Ｇ点（９）、濃縮ゲルの陰極側塗布点に出現するバンド高分子ＡＬＰ２  Ｈ点（１０）と命名する。そして肝臓型ＡＬＰ（Ｌ）の出現位置（３）のＡ点を１とし、高分子ＡＬＰ２の位置（１０）のＨ点を０とした時、骨型ＡＬＰ（Ｂ）Ｂ点（４）、小腸型ＡＬＰ（Ｉ）Ｃ点（５）、小腸型バリアントＡＬＰ（Ｖ）Ｄ点（６）、ビリアリー型ＡＬＰ（ＢＩ）Ｅ点（７）はそれぞれ次のように相対移動度ＲＭで表わすことができる。（ＡＨとはＡとＨ間の距離を表す。ＡＨ間の距離を１とするとＨＨ間は０である。）
肝臓型ＡＬＰ（Ｌ）            ＲＭ（Ｌ）＝ＡＨ／ＡＨ＝１
骨型ＡＬＰ  （Ｂ）            ＲＭ（Ｂ）＝ＢＨ／ＡＨ
小腸型ＡＬＰ    （Ｉ）        ＲＭ（Ｉ）＝ＣＨ／ＡＨ
小腸型バリアントＡＬＰ（Ｖ）  ＲＭ（Ｖ）＝ＤＨ／ＡＨ
ビリアリー型ＡＬＰ（ＢＩ）    ＲＭ（ＢＩ）＝ＥＨ／ＡＨ
高分子ＡＬＰ２                ＲＭ（ＡＬＰ２）＝ＨＨ／ＡＨ＝０
なお、ＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの分析では、血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰ、高分子ＡＬＰ１、高分子ＡＬＰ２についてもＲＭの表記は可能ではあるが、相対移動度ＲＭを使用しなくても泳動像または濃度図を見ればゲルの界面や位置により簡単に識別できるので敢えてＲＭの表記をしなくてもよい。【００１８】本発明は、ヒトのＡＬＰアイソザイムの各バンドの判定を経験や熟練に頼らず数字で行うことが出来るかどうかを研究を続けた結果、５６℃、１０分間の加熱処理後の熱失活性の有無による骨型ＡＬＰの位置と相対移動度ＲＭ値の双方を組み合わせれば特定のＲＭ値で各アイソザイムの判定ができることを発見したことにより成された。
それは、ＲＭ＝１を肝臓型ＡＬＰのピークとした場合、従来の技術である参考文献４，５，６において熟練した技術者が肝臓型、骨型、小腸型、小腸型バリアント、ビリアリー型ＡＬＰ等と判定した多数の患者群をそれぞれＲＭにより分類整理した結果、ＲＭ＝０．９０±０．０２の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置が骨型ＡＬＰであること、ＲＭ＝０．８０±０．０２の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置が小腸型ＡＬＰ、ＲＭ＝０．６６±０．０８の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置が小腸型バリアントＡＬＰ、ＲＭ＝０．４７±０．１の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置がビリアリー型ＡＬＰであることをそれぞれ確認した。
ＲＭ値の表現は、各ＡＬＰアイソザイムの判定の時に使用するので、ＲＭ値を結果報告書や印刷時に表記してもしなくてもよい。【００１９】加熱前後の濃度図の重ね合わせは、骨型ＡＬＰの存在を認識する以外に肝臓型ＡＬＰ、小腸型ＡＬＰのピーク位置またはピークと判定した位置の確認に非常に有効な手法であり、骨型ＡＬＰ、小腸型ＡＬＰの位置の推定に役立つ。
この濃度図を重ね合わせする方法をＲＭの判定に併用することでより正確な分析が出来ることを確認した。
ＡＬＰ活性が高い検体で泳動像の染色帯が重なった場合、当然濃度図の波形も重なる。このとき濃度図で染色帯のバンドのピーク位置特に骨型ＡＬＰ位置のピークがどこにあるか分からないことがある。この場合、２つに分けた被試験試料の一方を５６℃、１０分間加熱し同時にＰＡＧディスク電気泳動法を行った後、ＡＬＰアイソザイムを染色し得られた２種類の濃度分布波形いわゆる濃度図について、肝臓型ＡＬＰのピーク位置またはピークと判定した位置と塗布点位置高分子ＡＬＰ２の位置とを一致するよう重ね合わせた上、肝臓型ＡＬＰに近接した陰極側の染色帯バンドについて、加熱前と後を同じ濃度図上で比較し、その差が波形の高さまたは分画％が８０％以上減少しているＲＭ＝０．９０±０．０２の部分を骨型ＡＬＰと判定できることが分かった。
但し５６℃、１０分間の加熱条件（加熱温度や過熱時間の差、使用する検体量の差、試験管の材質など）により減少する波形の高さまたは分画％の減少率は変わるので実施するときは一定条件下が望ましい。【００２０】また骨型ＡＬＰ位置近辺に妊婦やある種の癌患者に胎盤型ＡＬＰが出現することがある。検査する前の被試験試料に胎盤型ＡＬＰの存在が、あらかじめ分かっていることは少ないため、何らかの方法で胎盤型ＡＬＰの存在を予測する必要がある。胎盤型ＡＬＰの確定診断には６５℃、３０分加熱後の試料にまだＡＬＰ活性帯が残っているかどうかで行われている。全ての被試験試料に胎盤型ＡＬＰの存在を確認するのは時間と費用がかかるため実用的でない。本願ではこの胎盤型ＡＬＰの存在を５６℃、１０分間の加熱前後の電気泳動像と濃度図からその存在を推定予測することができる方法を見つけた。
その方法は、５６℃、１０分間の加熱前後の濃度図を前述のように肝臓型ＡＬＰと高分子ＡＬＰ２のピークが一致するよう重ね合わせ、骨型ＡＬＰ位置において加熱前後の濃度図の差いわゆる波形の高さまたはＡＬＰ分画の％が１％〜２０％前後しか減少しないＲＭ＝０．９５±０．０２の部分を胎盤型ＡＬＰと推定することを見つけた。但し５６℃１０分間の加熱の条件によっては、波形の高さまたはＡＬＰ分画の％の減少率は若干変わることがある。
胎盤型ＡＬＰと推定した場合に限り更に６５℃、３０分間の加熱試験を実施しゲルに染色帯が認められれば胎盤型ＡＬＰの存在が確定する。
この推定試験を併用することで、全ての被試験検体について胎盤型ＡＬＰの確認試験をする必要がなくなったのである。【００２１】胎盤型ＡＬＰの確認に使用する６５℃、３０分間の加熱については必ずしも６５℃、３０分間にこだわる必要はない。被検体試料にコラーゲンなどが存在する場合、６５℃、３０分間加熱すると血清が固まり泳動用検体とすることが出来ないので６５℃、１０〜１５分間の加熱にとどめて試験する場合もある。【００２２】同一検体を５６℃、１０分間加熱したものとしないもののＰＡＧディスク電気泳動法で得られた電気泳動像をＣＣＤカメラで同時に撮影することは既に述べた（段落００１４）。電気泳動の報告書ではしばしば電気泳動像の写真とその濃度図を並べて貼り付けて報告書とすることがある。
一般的に、ＰＡＧによるＡＬＰアイソザイムの測定用ゲルは試験管内に酢酸等の固定液と一緒に浮かべて保存されている。
電気泳動像の写真を撮る前に試験管内に浮かんでいる加熱前後の染色済の２本のゲルの肝臓型ＡＬＰ位置を正確に一致させて撮影することは非常に難しい。【００２３】本願では、アイソザイムの型を相対移動度ＲＭで判定を行うため、５６℃、１０分間加熱したものとしないものの電気泳動像２種類の泳動画像を一緒に写真に撮るが、肝臓型ＡＬＰ位置がずれていると判定がし難いので、撮影後の画像を２つの画像に切り離し保存した上、どちらか一方の泳動像の画像を上下移動させて、肝臓型ＡＬＰの染色帯が一致するよう並べて同一画面あるいは印刷物としてカラーで表示することができた。同時に濃度図（波形）についても加熱前後の肝臓型ＡＬＰのピーク位置またはピークと判定した位置および高分子ＡＬＰ２のピーク位置の双方とも一致させることで判定を分かりやすくした。濃度図はどこからどこまでを波形とするのかの選択、それぞれの波形を別個に拡大または縮小出来るなどの選択も出来るようにした。【００２４】現在、腎臓型ＡＬＰが存在するかしないかなどは定かではないが、骨型ＡＬＰの僅か陰極側、小腸型ＡＬＰとの中間に出現すると言われている。腎臓型ＡＬＰは骨型ＡＬＰより５６℃、１０分間の加熱に強く、加熱前後の濃度図を重ねてみれば、骨型ＡＬＰ位置に少し活性帯が残っている。【００２５】その他、胎盤型ＡＬＰアイソザイムの有無の推定には、５６℃、１０分間の加熱前後のＡＬＰ総活性値（定量値、生化学分析装置による測定）の比較においても、その失活率が４０％を下回る（失活率が低い）場合にも胎盤型の存在を予測することもできる。【００２６】血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰは、血液型がＢ型とＯ型の人の血液中に度々検出され、分離ゲルと濃縮ゲルの境界面（高分子ＡＬＰ１）より若干陽極側に出現する。普通小腸型ＡＬＰの出現と連動して出現することが多いのでこれを見間違うことは殆どない。従ってＲＭ値で判定しなければならないことはない。
小腸型ＡＬＰが出現しているから、血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰも必ず出現すると言うことはない。逆に血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰが出現している場合は、小腸型ＡＬＰが必ず出現する。
同様に高分子ＡＬＰ１と高分子ＡＬＰ２も、ゲルの境界面である関係上ＲＭ値で判定しなければならないことはない。
【発明の効果】
【００２７】ＡＬＰアイソザイムの分析法において、電気泳動後の各アイソザイムの判定は熟練と経験を要した。今までの分析法では、分離不能や誤判定が数多く見られたり分離不能の表記がなされ問題となっていた。ヒトＡＬＰアイソザイムをＰＡＧディスク電気泳動法を用いて分離分析するとき、５６℃、１０分間の加熱前後の泳動像を比較する分析法を用いて、その濃度図を作成する段階で、肝臓型ＡＬＰの染色帯のピーク位置またはピークと判定した位置と検体塗布点のピーク位置（高分子ＡＬＰ２の位置）が一致するよう重ね合わせた上、各アイソザイムを相対移動度ＲＭを使用し判定を数字で行うことができるようになった。
特に加熱前後の濃度図を重ね合わせることで、骨型ＡＬＰは易熱性が他のアイソザイムより多いことが典型的で、骨型ＡＬＰの位置を明確に認識することができた。
以上によりこれまでは専門の医師や技師でも難しいと言われてきた結果の判定が、誰でも間違いなく簡単に相対移動度ＲＭという一定の基準で行えるようになった。
これにより分離不能の表現も誤判定もなくなり、診断に有意義な情報を提供できるようになった。結果的に検査の信頼性が高まり、さらに一定の判断基準の適用により検査技師個人の主観・熟練度などに頼らないため、大幅なコストダウンが達成できるようになった。
【実施例１】
【００２８】図２は、本願による分析実施例である。上半分が加熱前後の電気泳動像を肝臓型ＡＬＰが一致するよう並べて印刷した図である。未処理と書かれた（１１）の部分が加熱前の泳動像である。５６℃、１０分間加熱処理した泳動像（１２）は、その右側に示した。
下段右側の波形の大きいほう（１３）が加熱前の被験試料のＡＬＰアイソザイムの濃度図で、実線で示した濃度図が加熱後のＡＬＰアイソザイムの濃度図（１４）である。
図中１、２、３、４、５、６、７、８の記号は各ＡＬＰアイソザイムの判定分画名に対応し、下段左側分画名（１５）に対応する。
アイソザイムの分析・判定結果は表で示され、分画名（１５）の右側にその分画％（１６）と分画活性値（１７）、相対移動度ＲＭ（１８）がそれぞれ表記されている。電気泳動ではＡＬＰ活性値は測れないが、別途生化学の自動分析装置等で測定した活性値を記入し、分画％値（１６）に掛け合わせることで各々のアイソザイムの分画活性値（１７）を求めることができる。
図２は小腸型ＡＬＰが存在しない場合の例である。なお相対移動度ＲＭの表記（１８）は、アイソザイムの判定のために使用するので、印刷してもしなくても良い。
加熱前後の泳動像（１１）（１２）の写真から、加熱後の泳動像（１２）の試験管底が若干上がっており、これは肝臓型ＡＬＰ位置が一致するよう５６℃、１０分加熱処理した試験管（１２）の画像を印刷の直前に移動し位置を合わせた結果である。
図２の加熱前の波形（１３）、加熱後の波形（１４）のＲＭ＝０．９０の位置に出現したバンドを骨型ＡＬＰと判定したが、その減少率は８８．７％であり易熱性の骨型ＡＬＰの特徴を良く捉えている。その他いくつかの症例を検討した結果、骨型ＡＬＰのＲＭ＝０．９０±０．０２の位置に出現したバンドの減少率は概ね８０％を超えていた。
ＲＭ値に±を付けたのは電気泳動の泳動条件やＰＡＧディスクゲルのロット差や品質の差によりそれぞれのアイソザイムの移動度が変化した場合のことを考慮したものである。
参考文献７の濃度計においては、各波形の任意の位置の高さ（吸光度）は知りたい部分にカーソルを合わせるとその数値が表示できるよう構成されていることから、２つのピークの減少率は簡単に計算することができる。
【実施例２】
【００２９】  図３に胎盤型ＡＬＰが出現した濃度図の例を示す。泳動像の写真は省略した。
図３右の濃度図内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の記号は各ＡＬＰアイソザイムを示しそれは分画名（１５）にそれぞれ対応する。
明らかに図３の加熱前の波形（１３）、加熱後の波形（１４）のＲＭについて０．９５±０．０２の範囲に入っていることがわかる。また加熱前の波形のピークまたはピークと判定した位置と加熱後の波形のピークまたはピークと判定した位置について高さ（吸光度）を比較するとその減少率は１１．８％であった。
明らかに妊婦と分かっている症例ではＲＭ０．９５±０．０２でのピークまたはピーク様バンドの減少率は１．８５％と殆ど失活しない例もあることから、胎盤型ＡＬＰの減少率は１〜２０％と規定した。
この減少率はこの位置に重なっている骨型ＡＬＰの量により多少変動する。
【実施例３】
【００３０】図４は小腸型バリアントＡＬＰ、ビリアリー型ＡＬＰが出現した例である。図４の波形中の１、２、３、４、５、６、７、８の記号は分画名（１５）のアイソザイムの分画名にそれぞれ対応する。骨型ＡＬＰのＲＭ値は０．９を示し、小腸型ＡＬＰのＲＭ値は０．８を示し、小腸型バリアントＡＬＰのＲＭは０．６１を示した。ビリアリー型ＡＬＰのＲＭは０．５２であった。【００３１】実施例１、実施例２及び実施例３で示したようにＲＭの範囲は泳動条件で変わることを考慮しかつ多くの症例から骨型ＡＬＰをＲＭ＝０．９０±０．０２の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置とし、小腸型ＡＬＰをＲＭ＝０．８０±０．０２の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置、小腸型バリアントＡＬＰをＲＭ＝０．６６±０．０８の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置、ビリアリー型ＡＬＰをＲＭ＝０．４７±０．１の範囲に出現するピークまたはピークと判定した位置とそれぞれ断定した。
小腸型バリアントＡＬＰとビリアリー型ＡＬＰのＲＭ値は他のアイソザイムよりやや広い範囲になった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】    模式図
【図２】    分析実施例
【図３】    胎盤型ＡＬＰ出現例
【図４】    小腸型バリアントＡＬＰ、ビリアリー型ＡＬＰが出現した例
【符号の説明】
【００３３】（１）    分離ゲル
（２）    濃縮ゲル
（３）    肝臓型ＡＬＰ  Ａ点
（４）    骨型ＡＬＰ    Ｂ点
（５）    小腸型ＡＬＰ  Ｃ点
（６）    小腸型バリアントＡＬＰ  Ｄ点
（７）    ビリアリー型ＡＬＰ      Ｅ点
（８）    血液型依存性高分子小腸型ＡＬＰ  Ｆ点
（９）    高分子ＡＬＰ１          Ｇ点
（１０）  高分子ＡＬＰ２          Ｈ点
（１１）  加熱前の泳動像
（１２）  ５６℃、１０分間加熱処理後の泳動像
（１３）  加熱前試料のＡＬＰアイソザイムの濃度図
（１４）  加熱後試料のＡＬＰアイソザイムの濃度図
（１５）  分画名
（１６）  分画％
（１７）  分画活性値
（１８）  相対移動度ＲＭ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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