(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプル中の生体分子の量を測定するための方法を提供する。【解決手段】この方法は、磁性ナノ粒子を有する溶液を提供することと；溶液中の磁性ナノ粒子の表面にバイオプローブ分子を塗布することと；混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で溶液の第１交流磁化量を測定することと（γまたはβは、それぞれゼロより大きい整数）；検出すべき生体分子を含んだサンプルを溶液に添加して、サンプル中の生体分子をナノ粒子に塗布されたバイオプローブ分子と複合させることと；サンプルを添加して培養した後に、混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で溶液の第２交流磁化量を測定し、第１交流磁化量と第２交流磁化量の間の混合周波数（γｆ1＋βｆ2）の交流磁化量の減少を獲得して、生体分子の量を決定することを含む。【選択図】図３
2010204101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生体分子の量を測定するための方法であって、
磁性ナノ粒子を有する溶液を提供することと、
前記溶液中の前記磁性ナノ粒子の表面にバイオプローブ分子を塗布することと、
混合磁場の混合周波数（γｆ1＋βｆ2）（ここで、γおよびβは正の整数であり、ｆ1およびｆ2は前記混合磁場を生成するための２つの変化磁場の２つの異なる周波数である）で前記溶液の第１交流磁化量を測定することと、
検出すべき前記生体分子を含んだ前記サンプルを前記溶液に添加して、前記サンプル中の前記生体分子を前記磁性ナノ粒子に塗布された前記バイオプローブ分子と複合させることと、
培養時間に培養温度で前記溶液の培養を行うことと、
前記サンプルを添加して培養した後に、前記混合磁場の前記混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で前記溶液の第２交流磁化量を測定し、前記混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で前記第１交流磁化量と前記第２交流磁化量の間の交流磁化量の減少を獲得して、前記生体分子の量を決定することと
を含む方法。
【請求項２】
前記磁性ナノ粒子の成分が、Ｆｅ3Ｏ4、ＭｎＦｅ2Ｏ4、ＣｏＦｅ2Ｏ4またはＦｅ2Ｏ3である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記磁性ナノ粒子の直径が、約５ｎｍから約５００ｎｍの間である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記培養時間が、１分から５時間の間である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記培養時間中の培養温度が、１８℃から４５℃の間である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記バイオプローブ分子が、ポリクローナルまたはモノクローナル型を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
混合周波数で交流磁化量を測定するための装置であって、
少なくとも周波数ｆ1を有する第１交流電流および周波数ｆ2を有する第２交流電流を生成する交流生成ユニットと、
前記第１交流電流および前記第２交流電流によって駆動され、第１磁場および第２磁場を生成する同軸ソレノイドユニットと、
前記同軸ソレノイドユニット内に配置され、中にサンプルを配置して前記サンプルの交流磁化量を検出するとともに、ｆ1およびｆ2の様々な周波数の組合せに対応して、複数の周波数成分信号を出力するピックアップソレノイドと、
前記周波数成分信号を受信して、前記周波数成分信号を処理し、ターゲット周波数（γTｆ1＋βTｆ2）（ここで、γTおよびβTは正の整数であり、前記周波数ｆ1および前記周波数ｆ2は２つの異なる周波数である）で前記サンプルの前記交流磁化量を獲得する信号処理回路と
を含む装置。
【請求項８】
前記周波数ｆ1および前記周波数ｆ2が、１０1Ｈｚから１０6Ｈｚの範囲にある請求項７記載の装置。
【請求項９】
前記ピックアップソレノイドが、磁力計またはグラジオメータ型である請求項７記載の装置。
【請求項１０】
前記ピックアップソレノイドが、前記同軸ソレノイドユニットに同軸である請求項７記載の装置。
【請求項１１】
前記信号処理回路が、
デジタル信号処理ユニットと、
直列に接続されるｎ段階のアンプおよびフィルタであり、ｎが少なくとも２である、前記ｎ段階のアンプうちの第１アンプが前記ピックアップソレノイドに接続されて前記周波数成分信号を受信し、前記フィルタが前記ターゲット周波数を有する成分をフィルタリングする、ｎ段階のアンプおよびフィルタと、
前記フィルタと前記デジタル信号処理ユニットの間にそれぞれ接続され、前記デジタル信号処理ユニットに対して前記フィルタの出力信号をデジタル量に変換する複数のアナログデジタル変換器と、
前記デジタル信号処理ユニットから前記アンプにそれぞれ接続された複数のデジタルアナログ変換器と
を備え、前記デジタル信号処理ユニットが、抑制信号を生成して前記接続されたアンプにフィードバックされ、前記抑制信号が前記ターゲット周波数以外での一つ前の段階の前記フィルタからの出力信号の一部を抑制する請求項７記載の装置。
【請求項１２】
前記フィルタの中心周波数が、混合周波数の中の前記ターゲット周波数にある請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記デジタル信号処理ユニットから生成された前記抑制信号が、前記同軸ソレノイドによって生成された高調波周波数の信号および電子回路によって感応された副高調波周波数の信号を取り消すためのものである請求項１１記載の装置。
【請求項１４】
交流磁化量の減少と生体分子の濃度の間の関係を建立するための方法において、前記交流磁化量の減少が、既知の濃度を有する前記生体分子を測定したサンプルに添加して培養する前と後の、前記サンプルの交流磁化率の差異であって、前記方法が、
複数のサンプルを準備し、そのうちそれぞれのサンプルがバイオプローブ分子を塗布した複数の磁性ナノ粒子を有する溶液を含むとともに、生体分子濃度を有し、それぞれのサンプルが異なる生体分子濃度を有することと、
前記各サンプルに対して交流磁化量の減少を測定することと、
前記交流磁化量の減少のデータをロジスティック関数であるシグモイド関数
【数１】
2010204101.tif 000013
（ここで、ＩＭＲは百分率で示した前記交流磁化量の減少であり、φは各サンプル中の前記生体分子濃度であり、Ａ、Ｂ、φ oおよびρはフィッティング曲線を得るためのフィッティングパラメータである）でフィッティングすることと、
測定すべきサンプルに対する交流磁化量の減少ＩＭＲを測定するとともに、前記シグモイド関数の前記フィッティング曲線を用いてターゲット生体分子濃度を獲得することと
を含む方法。
【請求項１５】
交流磁化量の減少を測定するとは、
時間関数により混合周波数（γｆ1＋βｆ2）（ここで、γおよびβはそれぞれゼロよりも大きい整数であり、ｆ1およびｆ2は前記交流磁場の２つの基底周波数である）を有する交流磁場を印加することと、
前記時間のフレームにおける前記交流磁化量の分布に対して、初期領域と反応完了領域を決定することと、
前記初期領域および前記反応完了領域の前記交流磁化率の差異を算定することと
を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記混合周波数（γｆ1＋βｆ2）を有する前記交流磁場が、同軸の第１ソレノイドおよび第２ソレノイドを駆動することによって提供され、前記第１ソレノイドが前記基底周波数ｆ1を有し、前記第２ソレノイドが前記基底周波数ｆ2を有する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のバイオプローブと生体分子の間の反応を観測するための方法であって、
磁性ナノ粒子を有する溶液を提供することと、
前記溶液中の前記磁性ナノ粒子の表面にバイオプローブ分子を塗布することと、
培養時間に測定すべき前記生体分子を含んだサンプルを前記溶液に添加することと、
時間関数により混合周波数（γｆ1＋βｆ2）（ここで、γおよびβはそれぞれゼロより大きい整数であり、ｆ1およびｆ2は２つの異なる周波数である）で前記溶液の交流磁化量を測定することと
を含み、前記交流磁化量が、初期状態と反応完了状態では安定しているが、前記初期状態と前記反応完了状態の間で差がある方法。
【請求項１８】
前記磁性ナノ粒子が、Ｆｅ3Ｏ4、ＭｎＦｅ2Ｏ4、ＣｏＦｅ2Ｏ4またはＦｅ2Ｏ3である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記磁性ナノ粒子の直径が、約５ｎｍから約５００ｎｍの間である請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記交流磁化量に対する周波数の範囲が、約１０1Ｈｚから約１０6Ｈｚまでである請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性流体の磁化量（magnetization）の測定に関するものであり、特に、材料の交流磁化量を測定する装置および生体分子を検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
磁性流体は、溶剤に分散された磁性ナノ粒子を有するコロイド溶液である。磁性ナノ粒子の材料は、通常、強磁性である。そのため、それぞれの磁性ナノ粒子は、永久磁気モーメントを有する。溶剤中の磁性ナノ粒子を安定して分散させるために、磁性ナノ粒子は、界面活性剤で覆われている。例えば、界面活性剤に親水性有機材料を使用して、水溶液に磁性ナノ粒子を分散させることができる。界面活性剤とナノスケールのサイズを利用して、磁性ナノ粒子を溶剤中に個別に分散することができる。個々の磁性ナノ粒子は、熱エネルギーによって、ブラウン運動（Brownian motion）を起こす。それぞれの磁性ナノ粒子は、強磁性、つまり、永久磁気モーメントを有するが、磁性ナノ粒子の磁気モーメントの方向は、ゼロ磁場の液体中で等方性を持つため、液体中の磁性ナノ粒子の合成磁気モーメントは、ゼロ磁場においてゼロである。しかしながら、磁性流体に磁場が印加された時、各磁性ナノ粒子の磁気モーメントは、印加された磁場の方向に合わせられる傾向がある。印加された磁場をＨ、温度をＴとした場合の磁性流体の合成磁気モーメント（以下、磁化量と称す）Ｍに対する理論的分析を、ランジュバン関数（Langevin function）で表すことができる。
【数１】
2010204101.tif 000003
【０００３】
式（１）において、Ｍo=Ｎｍは飽和磁化量を示し、Ｎは磁性ナノ粒子の合計数、ｍは磁性粒子の平均磁気モーメントであり、xは以下のように表される。
【数２】
2010204101.tif 000004
ここで、Ｈは印加された磁場、ｋBはボルツマン定数（Boltzmann constant）、moは自由空間の透磁率、Ｔは測定温度を示す。
【０００４】
式（１）および式（２）に基づくと、指定温度Ｔの時、磁性流体の磁化量Ｍは、磁場Ｈの強度が増加するとともに単調に増加し、その後、高い磁場Ｈの場合に飽和値に達する。この飽和磁化量は、式（１）のＭoである。印加された磁場Ｈが除去された時、つまり、Ｈ＝０の時、磁性流体の磁化量は消失する。印加された磁場を抑制した時の磁性流体の逆方向のゼロ磁化は、液体中でブラウン運動を起こしている個々の磁性ナノ粒子の磁気モーメントの方向のランダム化によるものである。この特徴を超常磁性（superparamagnetism）という。
【０００５】
いくつかのガウス（Gauss）にある弱磁場で、室温（Ｔが約３００Ｋ）の場合、xは大体１０-3から１０-2まである。そのため、式（１）のＭは、テイラー展開（Taylor expansion）を用いてxがゼロで展開することができ、以下のように表される。
【数３】
2010204101.tif 000005
ここで、Ｍ(n)は、x＝０の時のx に対するＭの第ｎ階微分を示す。式（３）の右手側の偶数階微分はゼロになり、Ｍ(1)＝０．３２、Ｍ(3)＝−０．１２である。式（３）は、以下のように表すことができる。
【数４】
2010204101.tif 000006
【０００６】
式（４）の右手側のＯ5は、momH/kBTの５乗を示す。印加された磁場が交流（ＡＣ）によって生成され、周波数をｆoとする場合、Ｍはαｆo（αは正の奇数）の周波数で非ゼロ成分（non-zero component）を示す。したがって、周波数ｆoを有する弱交流磁場における磁性流体の磁化量は、ｆoだけでなくαｆoの周波数も有する。
【０００７】
式（１）または（４）において、Ｍoは、個々の磁性ナノ粒子の合計数Ｎに比例し、印加された交流磁場に反応する。そのため、指定された磁性流体の容量および周波数ｆoを有する固定された弱磁場において、個々の磁性ナノ粒子の合計数Ｎが減少した時、磁化量Ｍのスペクトルのαｆo成分の振幅は減少する。液体中のある反応によって磁性ナノ粒子を群生させるか、または大きくすることによって、印加された交流磁場に反応する個々の磁性ナノ粒子の合計数Ｎを減少させることができる。ある反応とは、例えば、液体中のバイオプローブ（bio-probe）とバイオターゲット（bio-target）の結合でもよい。この場合、バイオプローブは、界面活性剤に結合することによって、個々の磁性ナノ粒子に塗布される。そのため、磁性ナノ粒子は、生体機能を有するようになり、複合されたバイオターゲット（conjugated bio-target）で結合することができる。
【０００８】
例えば、抗体は、バイオプローブとして作用し、液体中の個々の磁性ナノ粒子に塗布される。これらの生体機能を有する磁性ナノ粒子は、複合抗原（conjugated antigen）と結合することができる。個々の磁性ナノ粒子における抗原と抗体の結合によって、磁性ナノ粒子は群生するか、または大きくなる。それによって、個々の磁性ナノ粒子の合計数Ｎは、ある固定された周波数の印加された交流磁場に反応して、確かに減少する。そのため、磁性ナノ粒子がバイオターゲットと結合した時、生体機能を有する磁性流体の磁化量Ｍのαｆo成分の振幅が減少することが推測される。また、さらに多くの磁性ナノ粒子がバイオターゲットと結合した時、振幅の減少はさらに強まる。そのため、バイオターゲットの量は、生体機能を有する磁性流体の磁化量Ｍのαｆo成分における減少を測定することによって、決定することができる。これは、ＩＭＲ（immunomagnetic reduction）のような生物検定技術に用いる基本的メカニズムである。
【０００９】
サンプルの交流磁化量を測定するために、従来の装置をいくつか提供する。図１は、交流磁場で磁性流体の磁化量を測定する従来の構造を概略的に示したものである。励磁ソレノイド（excitation solenoid）１０２は、交流電流発生装置１００によって周波数ｆoで駆動されて、交流磁場を生成する。ピックアップソレノイド（pick-up solenoid）１０４は、励磁ソレノイド１０２内に同軸に設けられる。ピックアップソレノイド１０４は、磁力計（magnetometer）型を参照する。磁性流体１０８は、ピックアップソレノイド１０４内に配置される。コイル１０６は、ソレノイド１０２および１０４によって形成される。交流電流発生装置１００は、周波数ｆoで交流電流をコイル１０６のソレノイド１０６に印加する。磁場の変化によって、コイル１０６のピックアップソレノイド１０４が感応して、交流電圧を出力する。しかしながら、交流電圧の出力は、磁性流体１０８に関係する。周波数ｆoの交流磁場が印加された時、磁性流体１０８が感応して、様々な周波数αｆo（α＝1、3、5、…ｎ）で交流磁化量を生成する。交流磁化量は、コイル１０６のピックアップソレノイド１０４で検出され、磁化量から電圧に信号を変換する。そのため、周波数αｆoの交流電圧は、コイル１０６のピックアップソレノイド１０４から電子回路１１０に出力される。電子回路１１０は、様々な周波成分に対して電圧信号を処理し、ターゲット周波数αTｆoを有する成分の数量を獲得する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、図１に示す測定の構造には、欠点がある。第一に、磁性流体によって生成された磁化量の他に、周囲の信号もピックアップソレノイドによって検出される。第二に、励磁ソレノイド１０２で生成された（ｆoの）交流磁場も探測される。そのため、ピックアップソレノイド１０４が出力したｆoの感応電圧は、他の周波数の感応電圧よりもはるかに大きい。電子回路１１０は、通常、アンプユニット（amplifying unit）を有し、αTｆoで電圧信号を増幅して、高感度検出を達成する。アンプユニットは、入力電圧に対して高レベルの制限を有するオペアンプ（operation amplifier）である。オペアンプは、入力電圧が高すぎると、正確に動作することができない。αTｆoの入力電圧が増幅されると、ｆoの入力電圧も増幅される。オペアンプの高レベル制限によって、αTｆoの電圧信号の増幅が制限され、総入力電圧をオペアンプの高レベル制限よりも低く保持する。第三に、ピックアップソレノイド１０４からｆoの入力電圧が出力された時、電子回路の副高調波効果によって、ｆo、２ｆo、３ｆo-、４ｆo、５ｆo、…等の周波数の出力電圧が出力される。これらのマイナス要因は、電子回路から出力されるαTｆoの合成出力電圧が、電子回路の周囲の信号、励起場、および副高調波信号に起因するために生じる。そのため、αTｆoの最終出力電圧は、信頼できないか、あるいは間違ってさえいる。
【００１１】
図１の欠点を克服するため、磁性流体の感応交流磁化量を測定する別の従来の設計を提供する。図２は、交流磁場で磁性流体の磁化量を測定する従来の構造を概略的に示したものである。図２において、ピックアップソレノイド１２０は、上部と下部の２つの部分を有する。これらの２つの部分にあるコイルは、反対方向につながり、直列に接続される。磁性流体１０８は、２つの部分のうちの１つ（例えば、上部）に配置される。そのため、これら２つの部分によって、周囲の信号が同時に検出される。電圧は、これら２つの部分の出力リード線から感応することができ、互いに取り消される。また、励磁ソレノイド１０２内のピックアップソレノイド１２０の位置を適切に設置させることによって、グラジオメータ（gradiometer）型のピックアップソレノイド１２０において、励磁ソレノイド１０２によって生成されたｆoの交流磁場の感応電圧が、取り消される。実際のケースでは、励磁ソレノイド１０２内のピックアップソレノイド１２０の位置を合わせることによって、ｆoの感応電圧を完全に取り消すことは不可能である。しかし、電子回路へのｆoの入力電圧は、図１に比べ、図２の測定構造で大幅に減らすことができる。これは、グラジオメータ型のピックアップソレノイドを使用した時に、電子回路の増幅を大幅に増やすことができることを意味する。しかしながら、上述したように、ｆoの入力電圧の存在は、出力に対して副高調波信号も発生させる。そのため、サンプルからのターゲット周波数αTｆoの信号は、通常、不必要な成分を有する。
【００１２】
以上のように、従来の設計は、磁性流体の交流磁化量を測定することができるが、ターゲット周波数が基底周波数ｆoの倍数であるαTｆoに制限されるため、結果として、αTｆoの出力電圧を信頼することができず、その設計も制限される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、サンプル中の生体分子の量を測定するための方法を提供する。この方法は、磁性ナノ粒子を有する溶液を提供することと；溶液中の磁性ナノ粒子の表面にバイオプローブ分子を塗布することと；混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で溶液の第１交流磁化量を測定することと（ここで、γまたはβは、それぞれゼロより大きい整数である）；検出すべき生体分子を含んだサンプルを溶液に添加して、サンプル中の生体分子をナノ粒子に塗布されたバイオプローブ分子と複合させることと；サンプルを添加して培養した後に、混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で溶液の第２交流磁化量を測定し、混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で第１交流磁化量と第２交流磁化量の間における交流磁化量の減少を獲得して、生体分子の量を決定することを含む。
【００１４】
本発明は、また、混合周波数で交流磁化量を測定するための装置を提供する。この装置は、少なくとも周波数ｆ1を有する第１交流電流および周波数ｆ2を有する第２交流電流を生成する交流生成ユニットを含む。同軸ソレノイドユニットは、第１交流電流および第２交流電流によって駆動され、第１磁場および第２磁場を生成する。グラジオメータ型のピックアップソレノイドは、同軸ソレノイドユニット内に配置され、このピックアップソレノイド内にサンプルを配置して、サンプルの交流磁化量を検出する。ｆ1およびｆ2の様々な周波数の組合せに対応して、複数の周波数成分信号を出力する。信号処理回路は、様々な周波数成分を含んだ信号を受信して、その信号を処理し、ターゲット周波数（γTｆ1＋βTｆ2）でサンプルの交流磁化量を獲得する。ここで、γTおよびβTは、正の整数であり、周波数ｆ1および周波数ｆ2は、第１交流電流および第２交流電流によってそれぞれ生成された２つの異なる周波数である。
【００１５】
本発明は、また、交流磁化量の減少と生体分子の濃度の間の関係を確立するための方法を提供する。交流磁化量の減少は、既知の濃度を有する生体分子を測定したサンプルに添加する前と後の、サンプルの交流磁化率の差異である。この方法は、複数のサンプルを準備することを含み、各サンプルは、バイオプローブ分子を塗布した複数の磁性ナノ粒子の溶液を含むとともに、生体分子濃度を有しており、それぞれのサンプルが異なる生体分子濃度を有する。各サンプルに対し、交流磁化量の減少を測定する。交流磁化量の減少のデータは、ロジスティック関数であるシグモイド関数（Sigmoid function）にフィッティング（fitting）することによって、以下の式（５）で表される。
【数５】
2010204101.tif 000007
ここで、ＩＭＲは、百分率で示した交流磁化量の減少であり、φは、各サンプル中の生体分子濃度であり、Ａ、Ｂ、φ oおよびρは、フィッティング曲線を得るためのフィッティングパラメータである。測定すべきサンプルのＩＭＲを測定して、式（５）のフィッティング曲線を用いてターゲット生体分子濃度を獲得する。
【００１６】
本発明は、サンプル中の磁性ナノ粒子と生体分子の間の反応を観測するための方法を提供する。この方法は、磁性ナノ粒子を有する溶液を提供することと；溶液中の磁性ナノ粒子の表面にバイオプローブ分子を塗布することと；培養時間に測定すべき生体分子を含んだサンプルを添加することと；時間関数により混合周波数（γｆ1＋βｆ2）で溶液の交流磁化量を測定することとを含む（ここで、γおよびβは、それぞれゼロより大きい整数、ｆ1およびｆ2は２つの異なる周波数）。交流磁化量は、初期状態と反応完了状態では安定しているが、初期状態と反応完了状態の間で差がある。
【発明の効果】
【００１７】
したがって、本発明は、混合周波数でも低ノイズでサンプル中の生体分子の測定をより正確に行うことができる。また、本発明が提供する磁化量の減少と生体分子の濃度の関係を確立する方法により、サンプル中の生体分子の濃度を容易に決定することができる。さらに、本発明は、サンプル中のバイオプローブと生体分子の関係を観測するための方法も提供する。
【００１８】
本発明の上記及び他の目的、特徴、および利点をより分かり易くするため、図面と併せた幾つかの実施形態を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】交流磁場で磁性流体の磁化量を測定する従来の構造を概略的に示したものである。
【図２】交流磁場で磁性流体の磁化量を測定する従来の構造を概略的に示したものである。
【図３】本発明の実施形態に係る交流磁場で磁性流体の磁化量を測定する構造を概略的に示したものである。
【図４】本発明の実施形態に係る磁性流体の磁化量を測定するための回路ブロック図を概略的に示したものである。
【図５】測定するサンプル中の磁化量と濃度の関係を概略的に示したものである。
【図６】本発明の実施形態に係るバイオプローブで塗布された磁性ナノ粒子と測定する生体分子の間の反応メカニズム(reaction mechanism)を概略的に示したものである。
【図７】本発明の実施形態に係るバイオプローブで塗布された磁性ナノ粒子の構造を概略的に示したものである。
【図８】本発明の実施形態に係る時間に基づき変化する磁化量で示される反応を概略的に示したものである。
【図９】本発明の実施形態に係るウィルスの濃度に対するＩＭＲ（％）の行為を概略的に示したものである。
【図１０】本発明の実施形態に係る生体分子の濃度に対する正規化ＩＭＲnor（％）の行為を概略的に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、混合周波数で交流磁化量を測定する方法および装置を提供し、様々な応用例を提供する。いくつかの実施例を提供して本発明を説明するが、本発明は提供した実施例のみに限られるものではない。
【００２１】
交流磁化量を測定する従来の設計を考慮して、励起場および電子回路の副高調波信号(sub-harmonic signals)から周波数αTｆ0の最終出力電圧への影響をさらに減らすため、本発明は、混合周波励起（mixed-frequency excitation）技術および電子回路の補償メカニズムの使用を提案する。
【００２２】
混合周波励起のため、印加された磁場に２つ以上の周波数を使用する。実際は、２つの異なる周波数を有する少なくとも２つの磁場を同時に適用する。例えば、図３は、本発明の実施形態に係る交流磁場で磁性流体の磁化量を測定する構造を概略的に示したものである。図３において、２つの周波数から混合周波励起を生成する例を示す。この状況において、同軸に並んだ２つの励磁ソレノイド２０４、２０６がある。２つの励磁ソレノイド２０４、２０６は、駆動ユニットとして交流電流発生装置２００、２０２によってそれぞれ駆動される。２つの交流電流発生装置２００、２０２は、異なる周波数ｆ1およびｆ2を有する電流をこれら２つの励磁ソレノイド２０４、２０６に別々に提供する。そのため、式（４）のＨは、Ｈ1＋Ｈ2に置き換えることができ、Ｈ1＝Ｈ1ocos（２πｆ1ｔ）、Ｈ2＝Ｈ2ocos（２πｆ2ｔ）、およびｆ1≠ｆ2である。式（４）は、以下のように表される。
【数６】
2010204101.tif 000008
【００２３】
式（６）は、Ｍが周波数αｆ1、αｆ2およびγｆ1＋βｆ2を有する成分の組合せであるということを示す（αは正の奇数、βおよびγは非ゼロ整数）。ピックアップソレノイド２０８および磁性流体２１２は、例えば、図１のピックアップソレノイド１０４および磁性流体１０８に類似してもよい。コイル２１０は、ソレノイド２０４、２０６、２０８によって形成される。周波数ｆ1およびｆ2の奇数の副高調波の他に、ｆ1およびｆ2の線型結合のような周波数を有する成分が、混合周波励起における磁性流体の磁化量に関係する。基底周波数ｆ1およびｆ2が線型独立の場合、コイル２１０からの出力信号の混合周波成分は、これらの成分が電子回路２１４で増幅された時に、電子回路２１４の副高調波効果によって妨害されない。また、ｆ1およびｆ2を適切に選択することによって、ターゲット周波数γTｆ1＋βTｆ2は、一般に使用される電気通信や商用電力システム等から離れることができる。そのため、磁性流体の磁化量が混合周波数で励起された時、γTｆ1＋βTｆ2の成分に対して環境からの影響を減らすことができる。
【００２４】
通常、γｆ1＋βｆ2の成分の振幅は、αｆ1およびαｆ2の振幅よりもはるかに弱い（α＝1、2、3、…ｎ）。そのため、電子回路２１４は、γｆ1＋βｆ2の成分の信号を増幅できる設計にする必要がある。しかしながら、上述したように、副高周波成分（すなわちαｆ1およびαｆ2）は、電子回路２１４のアンプを操作する入力信号が高レベルの制限を有するために、電子回路に対する増幅の性能が悪くなる。そのため、電子回路214は、αｆ1およびαｆ2の成分を取り消す補償メカニズムを有する。
【００２５】
図４において、ここで設計された電子回路のブロック図を示す。図４の電子回路は、実際には、交流電流発生装置を起動させる回路も含む。周波数ｆ1およびｆ2をそれぞれ有するトリガー信号は、デジタル信号処理（digital signal processing, DSP）によって生成される。この信号はデジタルで、デジタルアナログ変換器（digital-to-analog converter, DAC）２５２によって、アナログに変換される。アナログトリガー信号ｆ1およびｆ2によって、交流電流発生装置２００および２０２は、パワーアンプ２５４を介して、周波数ｆ1を有する交流電流を励磁ソレノイド１（２０４）に提供し、周波数ｆ2を有する交流電流を励磁ソレノイド２（２０６）に提供することができる。グラジオメータ型のピックアップソレノイド２０８からの出力信号は、周波数αｆ1、αｆ2およびγｆ1＋βｆ2で構成される。これらの成分の全ては、電子回路２１４のフィルタリング／増幅／補償によって処理され、混合周波数γTｆ1＋βTｆ2のターゲット成分を生成する（γTおよびβTは正の整数）。一般的には、異なるγTおよびβTを選択して混合周波数を獲得することで、異なる信号の強度を得ることができる。混合周波数γTｆ1＋βTｆ2は一般条件で、γTおよびβTの量は設計上の選択である。
【００２６】
図４は、本発明の実施形態に係る磁性流体の磁化量を測定するための回路ブロック図を概略的に示したものである。図４において、図３の装置を電子ブロック図で示す。図３の電子回路２１４は、デジタル信号処理ユニット２５０と、アンプ２６２、２７０、２８０と、フィルタ２６４、２７２、２７４、２８２と、アナログデジタル変換器（analog-to-digital converter, ADC）２６６、２７６、２８４と、デジタルアナログ変換器（digital-to-analog converter, DAC）２６８、２７８とを有する回路２６０を備え、少なくとも１つの段階を形成して、フィルタリング、増幅、補償の機能を実行する。本実施例においては、ｎ段階の信号処理を行う。実際には、ｎは２から５００までであってもよい。それぞれのフィルタリング／増幅／補償する部分は、１から１０００までの増幅率を有する（１は、アンプが使用されないことを意味する）。各ユニットは、アンプと、中心周波数がターゲット周波数であるバンドパスフィルタとを有する。
【００２７】
デジタル信号処理ユニット２５０は、高調波周波数ｆ1およびｆ2を設計上の選択毎に基底周波数として提供する。周波数ｆ1およびｆ2は、デジタルアナログ変換器２５２によってアナログ信号に変換され、交流電流発生装置２００および２０２を制御するようパワーアンプ２５４を通知して、交流電流を生成する。その結果、２つの励磁ソレノイド２０４および２０６は、異なる基底周波数ｆ1およびｆ2を有する交流電流によって駆動される。磁性流体を有するピックアップソレノイド２０８は、周波数αｆ1、αｆ2およびγｆ1＋βｆ2の様々な共振成分を有する信号スペクトラムを含む。α、βおよびγは正の整数であり、その１つの成分であるγTｆ1＋βTｆ2がターゲット周波数として得られ、増幅される。
【００２８】
ピックアップソレノイド２０８からのαｆ1、αｆ2およびγｆ1＋βｆ2の成分の信号は、第１段階のアンプ（ＡＭＰ１）２６２に入力される。これらの成分の全てが増幅される。しかしながら、ターゲット周波数γTｆ1＋βTｆ2付近にある中心フィルタリング周波数を有するフィルタ１  ２６４は、他の信号の成分をフィルタリングする。第１アナログデジタル変換器１Ａ  ２６６は、アナログ信号をデジタル信号に変換し、αｆ1およびαｆ2、特に、中心周波数γTｆ1＋βTｆ2付近のαｆ1およびαｆ2の振幅および位相を探し出すために、デジタル信号処理ユニット２５０に入力される。αｆ1およびαｆ2の成分を補償（またはオフセット）するために、デジタル信号処理ユニット２５０は、αｆ1およびαｆ2の逆位相信号を生成して、デジタルアナログ変換器１Ｂ  ２６８によって、増幅された信号のαｆ1およびαｆ2の成分を取り消す。第１段階の出力信号およびデジタルアナログ変換器１Ｂ  ２６８のαｆ1およびαｆ2の逆位相信号は、第２段階アンプ２７０に出力される。この逆位相信号は、例えば、反転位相でもよく、これによって、周波数γTｆ1＋βTｆ2を有するターゲット信号成分以外の他の信号を抑制する。そのため、他の成分に対するγTｆ1＋βTｆ2の相対振幅が増加する。その結果、αｆ1およびαｆ2の振幅は大幅に増幅されず、補償プロセスによって減少さえする。さらに、電子回路の副高調波効果も抑制される。そのため、第１段階のユニットからの出力信号の総強度を、第２段階アンプ２７０のオペアンプの高レベル制限より低く保持することができる。直列したフィルタリング／増幅／補償ユニットを使用することによって、ターゲット周波数γTｆ1＋βTｆ2の成分を大幅に増幅することができる。αｆ1、αｆ2およびγｆ1＋βｆ2の全ての成分の最終出力信号は、アナログデジタル変換器ｎＡ  ２８４によってデジタル信号処理ユニット２５０に導かれる。γTｆ1＋βTｆ2のターゲット成分の振幅は、デジタル信号処理ユニット２５０で分析され、出力される。
【００２９】
ここで、混合周波励起およびフィルタリング／増幅／補償電子回路の実施可能性を示す例を挙げる。本実施例において、検出すべきサンプルは、Ｆｅ3Ｏ4磁性流体を塗布した水性のデキストランであり、図７において説明する。Ｆｅ3Ｏ4以外にも、ＭｎＦｅ2Ｏ4、ＣｏＦｅ2Ｏ4、Ｆｅ2Ｏ3、…等の他の材料を磁性流体に使用してもよい。タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ等の他の親水性材料を用いて、磁性ナノ粒子の表面に塗布されたデキストランを置き換えてもよい。本実施例において、磁性流体における磁性ナノ粒子の平均径は、５６ｎｍである。注意すべきこととして、磁性ナノ粒子の平均径は、５６ｎｍのみに限定されない。一般的に、磁性ナノ粒子の平均径は、５ｎｍから５００ｎｍの範囲である。周波数ｆ1およびｆ2は、例えば、１０Ｈｚから１０6Ｈｚの間で変化することができる。γTｆ1＋βTｆ2のターゲット成分の出力振幅は、ゼロから０．３ｅｍｕ／ｇまでの様々な濃度、あるいは更に高い濃度の磁性流体に対して、図４のフィルタリング／増幅／補償電子回路を使用することによって、測定される。
【００３０】
図５は、測定するサンプル中の磁化量と濃度の関係を概略的に示したものである。ゼロから０．３ｅｍｕ／ｇまでの様々な濃度の磁性流体を、図３の装置で測定する。注意すべきこととして、検出時の磁性流体の最高濃度は、０．３ｅｍｕ／ｇに限定されない。濃度が高ければ高いほど、より多くの個々の磁性ナノ粒子が磁性流体に存在する。磁性流体の濃度がリニア関係で増加すると、γTｆ1＋βTｆ2のターゲット成分の磁化量ＭTも増加することが予測される。
【００３１】
図４の回路構造を有する図３の装置は、ＩＭＲによる生体分子の測定等の様々な応用を有する。図５の結果で立証されたように、磁性流体の濃度、すなわち、液体中の個々の磁性ナノ粒子の数が減少するにつれて、ＭTは小さくなる。本発明の装置は、磁性流体の磁化量を正確に測定して、その変化を観察する。この特性を利用することによって、液体中の生体分子を検出する方法を開発することができる。このような方法では、抗体のようなバイオプローブが磁性ナノ粒子に塗布される。
【００３２】
図６は、本発明の実施形態に係るバイオプローブで塗布された磁性ナノ粒子と測定する生体分子の間の反応メカニズムを概略的に示したものである。したがって、磁性ナノ粒子は、本質的に生体機能を有し、ターゲット生体分子と結合することができる。この結合によって、個々の生体機能を有する磁性ナノ粒子の一部は、物理的に大きくなるか、または群生する。図６（Ａ）において、塗布された抗体を有する磁性ナノ粒子が検出すべき生体分子と反応しない時、磁化量は初期状態ＭT,oである。この磁性ナノ粒子は小さく、回転しやすい。しかしながら、図６（Ｂ）において、ナノ粒子がターゲット生体粒子と反応した場合、いくつかの磁性ナノ粒子は大きくなるか、または群生する。この状況において、生体機能を有する磁性ナノ粒子が磁性流体のターゲット生体分子と結合した時、サンプルの磁化量ＭT,φは、初期状態ＭT,oの磁化量よりも小さくなると想定される。これは、ＩＭＲのような測定法を実行するメカニズムである。
【００３３】
生体機能を有する磁性ナノ粒子とターゲット生体分子の結合によって生じたＭTの減少を示す例を挙げる。図７は、本発明の実施形態に係るバイオプローブで塗布された磁性ナノ粒子の構造を概略的に示したものである。図７において、単一の磁性ナノ粒子は、例えば、Ｆｅ3Ｏ4でもよい。磁性ナノ粒子をデキストランで塗布し、それからバイオプローブ（または抗体）で塗布する。本実施例では、例えば、ポリクローナル抗体（polyclonal antibody）Ｈ１Ｎ２を使用する。ポリクローナル抗体の他に、モノクローナル（monoclonal antibody）抗体をバイオプローブに使用してもよい。Ｈ１Ｎ２は、豚インフルエンザ（swine-influenza）ウィルスの１つであり、含量を検出されるものである生体分子として本例に使用する。ターゲット生体分子Ｈ１Ｎ２を検出するために、濃度０．０２ｅｍｕ／ｇの磁性試剤４０‐μｌ（すなわち、抗Ｈ１Ｎ２の生体機能を有する磁性ナノ粒子を有する磁性流体）を６０‐μｌのＨ１Ｎ２溶液と混合する。本実施例における濃度は、０．０３２ＨＡＵ／５０‐μｌである。混合した後、図３および図４に概略的に示した装置を使用して、磁性試剤とＨ１Ｎ２溶液の混合液の時間依存性（time-dependence）ＭTを検出する。図８は、本発明の実施形態に係る時間関数により磁化量で示される反応を概略的に示したものである。図８において、丸い点は、培養前の磁性試剤とＨ１Ｎ２溶液の混合液のＭTを示す。点は、適時に安定状態で分布している。培養前のＭTは、ＭT,oで示される。例えば、２時間で収集したデータに対して時間平均値を出す。ＭT,oは、ターゲット混合周波数γTｆ1＋βTｆ2で６６．１８と測定される。十字の点は、生体機能を有する磁性ナノ粒子をターゲット生体分子Ｈ１Ｎ２と結合する過程に対応する。例えば２２℃の室温で結合／培養した後、ＭT,fは、磁性試剤とＨ１Ｎ２溶液の混合液が培養されて四角い点で示したような別の安定状態に達した後のデータに対する平均のＭTを示す。十字の点は、遷移状態を示す。図６で説明したように、磁化量ＭT,fは、十分な培養時間の後に小さくなる。注意すべきこととして、培養時間は、通常、バイオプローブの品質と培養温度による。培養温度は、例えば、１８℃から４５℃までであり、培養時間は、例えば、１分から５時間である。培養温度が上がると、培養時間は減少すると予測される。ＭT,fについて、四角い点の時間平均値は、６４．５４である。ＭTの大幅な減少は、生体機能を有する磁性ナノ粒子と生体分子Ｈ１Ｎ２の接合を証明する。さらに、ＩＭＲ信号は、以下の式を用いて、２．４８％と算出される。
【数７】
2010204101.tif 000009
数回の試験によって、測定値および標準偏差は、それぞれ２．４８％および０．０９％である。この結果は、本発明の推論を立証する。
【００３４】
更なる研究において、生体分子の各種濃度をＩＭＲ（％）で測定した。図９は、本発明の実施形態に係るウィルスの濃度に対するＩＭＲ（％）の行為を概略的に示したものである。図９において、ＩＭＲとターゲット生体分子の濃度の関係を調べる。本実施例において、ウィルスは、例えば、Ｈ１Ｎ２である。３×１０-4ＨＡＵ／５０‐μｌよりも小さい濃度では、ＩＭＲ信号は検出装置のノイズレベルに近い。Ｈ１Ｎ２の濃度が３×１０-4ＨＡＵ／５０‐μｌよりも大きい時、ＩＭＲ信号は、Ｈ１Ｎ２の濃度の増加とともに指数的に増加して、高濃度においてほぼ飽和値に達する。本発明からわかるように、図９におけるＩＭＲとターゲット生体分子Ｈ１Ｎ２の濃度φの関係は、シグモイド関数によって、以下の式（８）で表される。
【数８】
2010204101.tif 000010
ここで、図（８）のパラメーターＡは、この測定のノイズレベルに対応し、Ｂは、高濃度のターゲット生体分子の飽和ＩＭＲ信号を示す。図９のデータポイントを式（８）にフィッティングすると、Ａ、Ｂ、φoおよびρは、それぞれ１．０６、３．６５、０．０２４および０．６４になる。図９の相関係数Ｒ2は、０．９９７である。したがって、検出すべき生体分子の濃度φの関数で示されるＩＭＲの測定数量はとても高く、式（８）で適切に定義される。
【００３５】
ＩＭＲ‐φo曲線の式（８）で表される対数の行為(logistic behavior)は、Ｈ１Ｎ２だけでなく、他の種類の生体分子に対しても見られる。生体分子には、例えば、タンパク質、ウィルス、核酸（nuclei acid）、更には化学薬品も含まれる。もちろん、Ａ、Ｂ、φoおよびρは、異なる種類のターゲット生体分子によって変わってもよい。しかしながら、本発明の研究に基づくと、異なる生体分子または化学薬品の関係ＩＭＲ‐φoに関するユニバーサル曲線は、ＩＭＲを（ＩＭＲ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）に、φをφ／φoに縮尺することによって、様々なサンプルを式（８）の同じ曲線に示すことができ、さらに、式（９）で表される。
【数９】
2010204101.tif 000011
【００３６】
式（９）において、正規化ＩＭＲ（ＩＭＲnorと示す）は、正規化濃度Фの関数であり、パラメーターＡ、Ｂおよびφoを含まない。一般形式に当てはまる唯一のパラメーターは、ρである。図１０は、本発明の実施形態に係る生体分子の濃度に対する正規化ＩＭＲnor（％）の行為を概略的に示したものである。図１０において、いくつかのサンプルを測定して、図９のような曲線を得る。結果は、様々な生体分子を測定するユニバーサル曲線を示す。図１０のｙ軸に傾いたＩＭＲnor（％）は、百分率の単位で（ＩＭＲ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）である。図１０の各種生体分子の測定に関するパラメーターＡ、Ｂ、φoおよびρを、表１に示す。
【表１】
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【００３７】
言いかえると、式（９）は、様々な生物分子を描写するための一般曲線でもよい。実際の応用では、例えば、図３および図４に示した装置によって、特殊な生体分子のサンプルに対するＩＭＲを測定することができる。その後、式（８）または式（９）および用意された表に基づいて、検出すべき生体分子の濃度φを得ることができる。バイオプローブの提供者は、式（８）または式（９）に基づいて、パラメーターテーブルを用意することができるため、使用者は、ＩＭＲ数量を測定することによって、生体分子の濃度を簡単に測定することができる。測定する装置は、例えば、混合周波数で交流磁場を生成するソレノイドを有する図３および図４の装置でもよい。しかしながら、ＩＭＲ数量は、ソレノイドベースに限らず、他の方法で測定してもよい。本発明において、ＩＭＲの測定は、図３および図４の装置のみに限定されない。
【００３８】
以上のごとく、この発明を実施形態により開示したが、もとより、この発明を限定するためのものではなく、当業者であれば容易に理解できるように、この発明の技術思想の範囲内において、適当な変更ならびに修正が当然なされうるものであるから、その特許権保護の範囲は、特許請求の範囲および、それと均等な領域を基準として定めなければならない。
【符号の説明】
【００３９】
１００、２００、２０２  交流電流発生装置
１０２、１０４、１２０、２０４、２０６、２０８  ソレノイド
１０８、２１２  磁性流体
１１０、２１４  電子回路
１０６、２１０  コイル
２５４  パワーアンプ
２５０  デジタル信号処理ユニット
２６０  回路
２６６、２７６、２８４  アナログデジタル変換器
２５２、２６８、２７８  デジタルアナログ変換器
２６２、２７０、２８０  アンプ
２６４、２７２、２７４、２８２  フィルタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
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1.Abstract
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2. Representative Drawing 
Ｆｉｇ３  
Ｆｉｇ１
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Ｆｉｇ２
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Ｆｉｇ３
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Ｆｉｇ４
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Ｆｉｇ５
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Ｆｉｇ６
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Ｆｉｇ７
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Ｆｉｇ８
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Ｆｉｇ９
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Ｆｉｇ１０
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