(57)【要約】【課題】安定した検量線を作成するためにラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株より優れた株を探索し、より安定したビタミンB12定量法を確立することを目的とする。【解決手段】乳酸菌を使用して試料中のビタミンB12を定量する方法において、乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）を使用する。【選択図】図４
2010239874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を使用してビタミンB12を定量するためのビタミンB12定量用乳酸菌であって、
前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）であることを特徴とする、
ビタミンB12定量用乳酸菌。
【請求項２】
前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）であることを特徴とする、
請求項１に記載のビタミンB12定量用乳酸菌。
【請求項３】
乳酸菌を使用して試料中のビタミンB12を定量する方法において、
前記乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）を使用することを特徴とする、
ビタミンB12の定量方法。
【請求項４】
前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）であることを特徴とする、
請求項３に記載のビタミンB12の定量方法。
【請求項５】
前記試料を、水と、酢酸緩衝液、シアン化カリウム溶液で処理する工程において、
前記酢酸緩衝液として、0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することを特徴とする、請求項３又は４に記載のビタミンB12の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンB12のバイオアッセイに適用可能な、ビタミンB12定量用の乳酸菌及び該乳酸菌を用いたビタミンB12の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンB12は、我々ヒトを含めたすべての動物や一部の細菌、藻類が必要とする必須栄養素であり、生体内においてビタミンB12はメチル基の転位といった分子内転位反応の補酵素として重要な反応に関与している。供給源としては牛のレバー・貝類・青魚・乳製品・卵などの動物性食品が挙げられ、植物質中にはほとんど存在しないとされるため、菜食主義者にビタミンB12の欠乏症が多く、欠乏症としては、悪性貧血が挙げられる。この悪性貧血は骨髄による血球細胞の生産が減少し、致死的になる可能性もあり、悪性貧血から神経疾患をも引き起こすこともある。このような欠乏症を防止するために、食品中におけるビタミンB12の含有量を知り、栄養管理に役立てることが非常に重要である。
【０００３】
微量成分であるビタミンB12の定量法は、乳酸菌による微生物定量法、いわゆるバイオアッセイが、公的に認められた定量法として利用されており、日本食品標準成分表分析マニュアルにも記載されている。そして、指示菌として指定されている乳酸菌は、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830（分類学上はL. delbrueckii subsp.  lactis）である（非特許文献１）。
【０００４】
また、特表２００８−５０７９６４号公報には、２００〜５００ｍＭトレハロース／スクロースを含有する凍結溶液中で−８０℃で急速凍結され、それから凍結乾燥された微生物が入った微小滴定プレートを使用して、ビタミンB12などの物質を微生物学的に定量する方法が開示されており、前記微生物としてLactobacillus  delbrueckii  subsp.  lactisが使用されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５０７９６４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】文部科学省科学技術・学術審議会資源調査分科会食品成分委員会編，「五訂増補  日本食品標準成分表分析マニュアル」，国立印刷局，２００５年３月２２日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バイオアッセイに使用される他の定量用微生物としては原虫や大腸菌変異株などがあるが、それぞれ操作の煩雑さや低特異性等といった点で問題がある。機器分析が発達した現在ではHPLC法、放射性同位体希釈定量法、化学発光免疫測定法なども用いられるが、感度の不足や実験操作の難しさ、特殊な施設・設備を要するなどの問題点がある。
【０００８】
しかし、バイオアッセイによるビタミンB12の定量法は感度や簡便性に優れているが、検量線の安定性が十分でないという問題が以前から指摘されていた。この原因として、指示菌として指定されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830（L. delbrueckii subsp.  lactis）の生育がビタミンB12 制限下の合成培地中で安定せず、ビタミンB12 消費が菌の生育量へ正確に反映されていないことが考えられる。
【０００９】
この問題を解決するために過去に様々検討されてきたが、いまだ解決には至っていない。乳酸菌の中にはまだビタミンB12を要求するものが多くあるのでその中から新たな指示菌を見つけるのも解決策のひとつではないかと考えられる。
【００１０】
そこで本発明は、安定した検量線を作成するためにラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株より優れた株を探索し、より安定したビタミンB12定量法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、供試菌株としてラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830 株に相当する乳酸菌を漬物から分離し、分離した乳酸菌についてビタミンB12 定量用培地とシアノコバラミンを用いる常法により要求性を調べたところ、分離した乳酸菌はビタミンB12の要求性が高く、かつ生育がビタミンB12濃度に依存的である乳酸菌であることが判明した。そこで、分離した乳酸菌の検量線の精度や再現性、さらに添加回収試験により確度を検討したところ、日本食品標準成分表分析マニュアルで指定されている濃度範囲でラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830 株よりも検量線が安定しており、精度が高いとの知見を得た。
【００１２】
本発明はかかる知見に基づくものであり、乳酸菌を使用してビタミンB12を定量するためのビタミンB12定量用乳酸菌であって、前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii subsp.  delbrueckii）であることを特徴とする、ビタミンB12定量用乳酸菌を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、乳酸菌を使用するビタミンB12の定量方法において、前記乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii subsp.  delbrueckii）を使用することを特徴とする、ビタミンB12の定量方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のビタミンB12定量用乳酸菌及びビタミンB12の定量方法によれば、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指示菌として使用されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株と比較して、検量線が安定して精度が高いビタミンB12の定量が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ATCC 7830株（上段）とNRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）（下段）の対応する塩基配列を比較した結果を示す図である。
【図２】本実施形態のビタミンB12の定量方法に供される試料の調製方法の概要を説明した図である。
【図３】本実施形態のビタミンB12の定量方法に使用される検量線の作成手順と試料のビタミンB12量を定量する方法を説明した図である。
【図４】各乳酸菌のビタミンB12の検量線を示す図である。
【図５】NRIC0700株とNRIC0755株の最適回帰モデルを検討した結果を示す図である。
【図６】NRIC0705株とNRIC0756株の最適回帰モデルを検討した結果を示す図である。
【図７】酢酸緩衝液の濃度を0.1 mol/lとしたときの試料のビタミンB12の回収率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．ビタミンB12定量用乳酸菌
本実施形態のビタミンB12定量用乳酸菌は、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii subsp.  delbrueckii）である。
【００１７】
ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）の中でも、特にラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）のいずれかを選択することが好ましい。
【００１８】
これらの乳酸菌は、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株と比較して、適切な検量線が得られるため、精度の高いビタミンB12の定量を行うことができる。特に、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）については、ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌としての適格性に優れているため好ましい。
【００１９】
現在、ビタミンB12の指示菌として使用されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830は、分類学上はラクトバチルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・ラクティス（L. delbrueckii  subsp.  lactis）に分類されている。従って、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）とは多くの類似点を有している。
【００２０】
NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）、NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）及びNRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）の４株は、ATCC 7830株と比較して、形態学的性質、培養的性質、化学分類学的性質に関しては特に差異は認められない。但し、表１に示すように、生理学的性質において、生育温度範囲とラクトース発酵能が異なる。ラクトース発酵能については、上記４株がラクトース発酵能がないのに対して、ATCC 7830株は発酵能を有している。
【００２１】
【表１】
2010239874.tif 000003
【００２２】
また、NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）、NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）及びNRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）の４株は、16S rDNA配列は全く同じである（配列番号：１）。ATCC 7830株の16S rDNA配列（配列番号：２）と比較した場合、前記４株とATCC 7830株相同性は99.1％である。
【００２３】
図１は、ATCC 7830株（上段）とNRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）（下段）の対応する塩基配列を比較した結果を示す図である。図中、黒く反転させた箇所の塩基が相違していることを意味している。
【００２４】
NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）、NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）及びNRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）の培地は、公知の乳酸菌培地を使用することができ、培養条件も、生育温度以外については一般のラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii）と同じ条件で培養することができる。
【００２５】
２．ビタミンB12の定量方法
（１）試料の調製
図２は、本実施形態のビタミンB12の定量方法に供される試料の調製方法の概要を説明した図である。ビタミンB12の定量に供される試料の調製方法は、日本食品標準成分表の分析マニュアルに基づき実施することができる。
【００２６】
すなわち、ビタミンB12の定量を行う食品等の試料を採取し、そこに水、酢酸緩衝液及びシアン化カリウム溶液を添加した後、所定時間、煮沸抽出を行う。
【００２７】
ここで、日本食品標準成分表の分析マニュアルによれば、酢酸緩衝液は0.57mol/l酢酸緩衝液を使用するが、0.57mol/l酢酸緩衝液にかえて0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することが好ましい。発明者らが検討した結果、0.57mol/l酢酸緩衝液が後述するビタミンB12用培地に持ち込まれることによって、供試菌株のビタミンB12に対する確度に影響を及ぼすことが判明した。かかる場合に、0.57mol/l酢酸緩衝液にかえて0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することで、ビタミンB12の確度を高めることができる。
【００２８】
煮沸抽出後、冷却し、そこにメタリン酸溶液を添加する。定容し濾過した後、ろ液を分取し、ビタミンB12定量用試料と、アルカリ耐性因子定量用試料を調製する。
【００２９】
（２）ビタミンB12量の定量
図３は、本実施形態のビタミンB12の定量方法に使用される検量線の作成手順と上記（１）で調製した試料のビタミンB12量を定量する方法を説明した図である。ビタミンB12量の定量は、日本食品標準成分表の分析マニュアルに基づき実施することができる。
【００３０】
検量線の作成は、まず濃度を変えたビタミンB12の標準液を調製し、ビタミンB12を定量するための培地に加える。次に、ビタミンB12の定量用乳酸菌を接種し、所定の条件で乳酸菌を培養する。乳酸菌としては、上記１で説明したビタミンB12定量用乳酸菌を使用する。
【００３１】
上記１で説明したビタミンB12定量用乳酸菌を使用することにより、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指示菌として使用されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株と比較して、検量線が安定して精度が高いビタミンB12の定量が可能となる。
【００３２】
乳酸菌の培養後、吸光度を測定し、生育濁度を測定する。そして、ビタミンB12濃度とそれに対応する吸光度の値に基づいて検量線を作成する。
【００３３】
検量線を作成した後、上記（１）で調製したビタミンB12定量用試料をビタミンB12を定量用培地に加え、ビタミンB12定量用乳酸菌を添加して培養し、吸光度で生育濁度を測定する。同様にして、上記（１）で調製したアルカリ耐性因子定量用試料についても実施する。そして、先に作成した検量線から濁度に対応するビタミンB12量とアルカリ耐性因子量を算出する。
【００３４】
最後に、ビタミンB12量からアルカリ耐性因子量を引けば、試料中に含まれるビタミンB12含量を算出することができる。
【実施例】
【００３５】
１．検量線の作成
（１）供試菌株
ビタミンB12定量用乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）、NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）、NRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）及び従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株を使用した。
【００３６】
（２）保存方法
供試菌株を表２に示すトマト寒天培地に接種し、37℃、24時間培養後、1〜2週間低温室で保存した。
【００３７】
【表２】
2010239874.tif 000004
【００３８】
（３）前培養
トマト寒天培地に保存した供試菌株を表３に示すトマト培地に接種し、37℃、24時間培養した。これを2回行った。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
（４）接種菌液の調製
トマト培地にて培養後、0.85 %の滅菌生理食塩水を用いて、菌体洗浄を2回行い、菌体量を一定にするため600 nmにおける透過率が80〜90 ％となるように希釈し、接種菌液とした。
【００４１】
（５）本培地の調製
表４に示す組成からなるビタミンB12 定量用基礎培地（pH 6.0）1.25 mlにビタミンB12 標準液を加えて、必要に応じて蒸留水 でフィルアップし、全量2.5 mlとした。その後、121℃、5分間オートクレーブで滅菌したものを本培地とした。なお、ビタミンB12 標準液は、シアノコバラミン標準品を25%（v/v）エタノール溶液に溶かし、10 μg/mlの水溶液の361 nmの吸光度0.207を用いて希釈し、調製したものを使用した。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
（６）本培養
上記（４）で調製した接種菌液20 μlを上記（５）で調製したビタミンB12 定量用基礎培地に接種し、37℃、24時間培養した。
【００４４】
（７）生育濁度の測定
吸光度計（ＬＫＢ社製のNOVASPEC II）を使用して、600 nmの波長で上記（６）で得られた培養液中の生育濁度を測定した。対照として無接種培地の測定値を差し引き、各濃度における吸光度を求めた。
【００４５】
（８）検量線の作成
図４は、各乳酸菌のビタミンB12の検量線を示す図である。R2は決定係数を意味し、値が１に近づくほど理論値に近い検量線であることを示す。図４に示すとおり、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）、NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）、NRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）の各乳酸菌は、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株よりも決定係数（R2）の値が高く、ビタミンB12のバイオアッセイの指示菌としての適性が高いことが判明した。
【００４６】
（９）線形回帰モデルの選定
現在日本食品標準成分表の分析マニュアルにおいて選定されている線形回帰モデルは単回帰モデルである。しかし、線形回帰モデルは他にも対数容量モデルやロジスティック回帰モデルがあるため、供試菌株ごとに最も適した線形回帰モデルを選定することが望ましい。そこで、各供試菌株ごとに得られた検量線について、単回帰モデル、対数容量モデル、ロジスティック回帰モデルによる分析を行った。結果を表５に示す。
【００４７】
その結果、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）はロジスティック回帰モデル、NRIC0705株（受領番号：NITE AP-727）はロジスティック回帰モデル、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）は単回帰モデル又はロジスティック回帰モデル、NRIC0756株（受領番号：NITE AP-729）ロジスティック回帰モデルがそれぞれ適していることが判明した（図５、図６参照）。なお、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus  leichmannii）ATCC 7830 株は全線形回帰モデルにおいて「直線性」、「傾き」、「三連の誤差」のいずれの項目も安定性を示す変動係数が上記４株と比較して劣っていた。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
２．KCN法によるビタミンB12の抽出
（１）試料抽出液の調製
試料として市販のブロイラー鶏もも肉及び市販の干し海苔を使用し、日本食品標準成分表分析マニュアルに従い、KCN法によるビタミンB12の抽出を行った。試料2 gに水40 ml、0.57 mol/l酢酸緩衝液10 mlと0.05%（w/v）シアン化カリウム溶液0.4 mlを加え、100℃、30分間煮沸抽出した。得られた抽出液を冷却した後、10%（w/v）メタリン酸溶液0.6 mlを加え、水で100 mlに定容し、ろ紙（アドバンテック社製、No.2）でろ過することにより試料抽出液を得た。
【００５０】
なお、前記0.57 mol/l酢酸緩衝液は、酢酸39.6 mlと酢酸ナトリウム三水和物77.12 gを水に溶かし、1 mol/l塩酸溶液でpH 4.5に調製し、水を加えて1,000 mlとしたものを使用した。また、前記0.05%（w/v）シアン化カリウム溶液は、シアン化カリウム50 mgを0.2%（w/v）水酸化ナトリウム溶液に溶かし、100 mlに定容したものを使用した。
【００５１】
（２）ビタミンB12定量用試料の調製
上記（１）で得られた試料抽出液から25 mlを分取し、pH 6.0に調整した後、水で50 mlに定容し、ろ紙（アドバンテック社製、No.2）でろ過することによりろ液を得た。ろ液を必要に応じて希釈したものを試料溶液Aとし、ビタミンB12定量用の試料とした。
【００５２】
（３）アルカリ耐性因子定量用試料の調製
上記（１）で得られた試料抽出液から25 mlを分取し、pH11〜12に調整した後、オートクレーブに121℃、30分間かけて滅菌した。冷却後、pH 6.0に調整し、水で50 mlに定容し、ろ紙（アドバンテック社製、No.2）でろ過することによりろ液を得た。ろ液を必要に応じて希釈したものを試料溶液Bとし、アルカリ耐性因子定量用の試料とした。
【００５３】
３．試料中のビタミンB12 量の定量
（１）本培地への分注
上記１（５）で調製したビタミンB12 定量用基礎培地1.25 mlに、上記２（２）で調製した試料溶液Aを1 ml加え、蒸留水を加え、全量を2.5 mlとした。その後は上記１（６）（７）と同様の要領で培養し、生育濁度を測定した。また、試料溶液Aに代えて、上記２（３）で調製した試料溶液Bについても実施した。
【００５４】
（２）ビタミンB12 量の算出
ビタミンB12 量は、検量線から求めたビタミンB12濃度に基づき、下記数式（１）から算出した。また、アルカリ耐性因子含量は、検量線から求めたアルカリ耐性因子濃度に基づき、下記数式（２）から算出した。そして、下記数式（３）に示すように、試料溶液AのビタミンB12 量から、試料溶液Bのアルカリ耐性因子量を差し引くことにより、最終的に試料中のビタミンB12含量を算出した。結果を表６に示す。
【００５５】
【数１】
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【００５６】
【表６】
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【００５７】
４．試料抽出方法の検討
（１）試料を処理するときに使用する試薬の影響
試料を処理するときに使用する試薬（KCN、酢酸、メタリン酸）によって確度が影響を受けるか調べた。すなわち、検量線用に調製した各濃度のシアノコバラミン含有培地に、処理したシアノコバラミン標準液を一定量加え、供試菌株として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii）NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）と、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）を接種し、吸光度で生育濁度を測定し、その測定結果に基づいて添加回収率を算出し、確度が高い範囲を調べた。
【００５８】
結果を表７に示す。NRIC0700株（受領番号：NITE AP-726）は、0から120 pg/tubeの広い範囲で確度が高かった。これに対し、NRIC0755株（受領番号：NITE AP-728）は確度の高い範囲は0から80 pg/tubeであった。
【００５９】
この結果から、試料を抽出するときに使用する試薬（KCN、酢酸、メタリン酸など）が確度に影響を与える可能性が示唆された。
【００６０】
【表７】
2010239874.tif 000010
【００６１】
（２）試料を抽出する試薬の検討
上記（１）の結果に基づき、KCN法によるビタミンB12の抽出方法に使用する試薬の改良を行った。酢酸緩衝液の影響を低減させるため、酢酸緩衝液の濃度を0.57 mol/lから0.1 mol/lとした。すなわち、ビタミンB12の抽出に影響を与えず、かつ、検量線用の培地とビタミンB12量定量用の培地との酢酸緩衝液の濃度差が少なくなるように酢酸緩衝液の濃度を調整した。
【００６２】
図７に、供試菌株として、NRIC0070株を使用したときの試料のビタミンB12の回収率につき、理論値と実測値を比較した結果を示す。図７に示す通り、試料を抽出する際に使用する酢酸緩衝液の濃度を0.57 mol/lから0.1 mol/lにすることで、試料中のビタミンB12の回収率が0から160pg/5mlまでの範囲で、ほぼ100％となることが判明した。
【００６３】
また、上記（１）の測定可能範囲についても、培地条件の変更により0から120 pg/tube であった測定可能範囲が、0から160 pg/tube まで安定して測定できるようになった。これは、日本食品標準成分表の分析マニュアルで定めている150 pg/tube よりも広い範囲である。
【図２】
2010239874.tif 000011
【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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