(57)【要約】【課題】優れた脂肪蓄積抑制及び／又は脂質代謝改善作用を有し、肥満の抑制又は改善、脂肪肝等に有効な医薬品又は食品の提供。【解決手段】ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物を有効成分とする肥満予防又は改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物を有効成分とする肥満予防又は改善剤。
【請求項２】
ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体又はその培養物を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項３】
ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体又はその培養物を有効成分とする脂質代謝改善剤。
【請求項４】
ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含有する肥満予防又は改善用食品。
【請求項５】
ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ  ＡＰ−７００として寄託されたペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)ＬＰ２８株である請求項１記載の肥満予防若しくは改善剤、請求項２記載の脂肪蓄積抑制剤、請求項３記載の脂質代謝改善剤、又は請求項４記載の食品。
【請求項６】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ ＡＰ−７００として寄託されたペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)ＬＰ２８株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の菌体、培養物等を有効成分とする肥満予防又は改善剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、糖質や脂質等のエネルギー源が、生体組織、特に皮下脂肪組織や臓器周辺組織の白色脂肪細胞に中性脂肪として異常に蓄積された結果、体重が骨格系あるいは生理機能の限界を超えて増加した状態である。特に、腸間膜等の内臓周囲に蓄積する内臓脂肪組織は、糖質代謝や脂質代謝の異常を引き起こす原因とされており、心疾患、動脈硬化症、高血圧症、糖尿病、脂肪肝などの生活習慣病へと進展する場合もある。とりわけ、斯かる内臓脂肪型肥満に、糖尿病（糖代謝異常）、高脂血症（脂質代謝異常）、高血圧などの動脈硬化のリスクファクター（危険因子）が複数重なった状態をメタボリックシンドローム（代謝症候群）と呼び、各症状が軽度であっても、複数の症状が重なることにより相乗的に生活習慣病の発症頻度が高まるため、ハイリスク群としてこの予防と治療に注目が集まっている。
【０００３】
かように、メタボリックシンドローム、脂質代謝異常（例えば、脂肪肝、高脂血症）、糖質代謝異常（例えば、糖尿病）、更には心筋梗塞や脳梗塞などの心血管病には、内臓脂肪の蓄積が重要な発症要因と考えられており、これらの疾患や症状を予防・改善するためには内臓脂肪の蓄積を減少させることが重要である。
【０００４】
肥満を防止するためには、摂取する脂質の代謝を調節したり、体脂肪の燃焼を促進したり、脂肪の蓄積を抑制するような食材やサプリメントの摂取或いは医療分野における抗肥満剤の投与が提案されている。しかしながら、安全性、実用性（味や加工性）の面から肥満症状を有効に予防・改善し得るものは数少ないというのが現状である。
【０００５】
一方、乳酸菌は、古くから発酵乳、乳酸菌飲料、発酵バター等の乳製品等の食品を製造する際に用いられているが、乳酸菌自体も整腸効果を始め、様々な薬理作用を有することから、健康食品や医薬品等の素材としても利用されている。乳酸菌の脂肪蓄積に対する作用としては、ラクトバチルス属やラクトコッカス属乳酸菌に内臓脂肪減少作用があること（特許文献１）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌に脂肪肝抑制作用があること（特許文献２）等が報告されている。
【０００６】
しかしながら、ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌に脂肪蓄積抑制作用や脂質代謝改善作用があることはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２１４２５３号公報
【特許文献２】特開２００８−２４６８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れた脂肪蓄積抑制及び／又は脂質代謝改善作用を有し、肥満の抑制又は改善、脂肪肝等に有効な医薬品又は食品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、乳酸菌の薬理作用について鋭意検討したところ、ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌に脂肪蓄積抑制作用及び脂質代謝異常の改善作用があることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の１）〜６）に係るものである。
１）ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物を有効成分とする肥満予防又は改善剤。
２）ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体又はその培養物を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤。
３）ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体又はその培養物を有効成分とする脂質代謝改善剤。
４）ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含有する肥満予防又は改善用食品。
５）ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ  ＡＰ−７００として寄託されたペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)  ＬＰ２８株である１）の肥満予防若しくは改善剤、２）の脂肪蓄積抑制剤、３）の脂質代謝改善剤、又は４）の食品。
６）独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ ＡＰ−７００として寄託されたペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)  ＬＰ２８株。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の肥満予防又は改善剤、脂肪蓄積抑制剤、脂質代謝改善剤は、脂質代謝異常（例えば脂肪肝、高脂血症）、糖質代謝異常（例えば糖尿病）、更には心筋梗塞や脳梗塞などの心血管病の予防、治療又は改善のための医薬品、食品等として使用できる。そして、本発明のペディオコッカス属に属する乳酸菌は、安価に大量供給が可能であり、かつ安全性が高く長期投与も可能であることから、その有用性は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】高脂肪食摂取による体重変化率を示すグラフ。
【図２】高脂肪食摂取時における白色脂肪組織重量を示すグラフ。
【図３】高脂肪食摂取時における肝中性脂肪（トリグリセリド）量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の肥満予防又は改善剤に用いられる乳酸菌は、ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌である。
ペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌としては、本発明の効果を示す限り特に限定されず、例えば、ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、ペディオコッカス・ウリナエッキー（Pediococcus urinaeequi）、ペディオコッカス・セレビシェ（Pediococcus cerevisiae）、ペディオコッカス・ハロフィルス（Pediococcus halophilus）が挙げられるが、ヒト腸管における高い生存率等の性質を有し、食品に適用した際に生残性が高く、香味、物性も優れているものが好ましい。
【００１４】
このうち、より好適なものとして、ペディオコッカス・ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus) が挙げられ、ＮＩＴＥ  ＡＰ−７００（２００９年１月２７日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているペディオコッカス・ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus) ＬＰ２８株が好ましい。
ＬＰ２８株は、リュウガン（果物）から本発明者らによって初めて分離されたものであり、16S rDNAの塩基配列がペディオコッカス・ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus) ATCC 25745株のそれ (DDBJ / GenBank / EMBL ID = FM179610) と99.5％の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下において四連球菌の様相を呈することから、ペディオコッカス・ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus) と同定された。ＬＰ２８株の主な菌学的性質を以下に示す。
１）グラム陽性乳酸球菌、２）ホモ型乳酸発酵、３）カタラーゼ陰性、４）芽胞形成能無し、５）好気条件下でも培養可、６）菌体外多糖類を産生。
【００１５】
本発明においては、上記乳酸菌の菌体を、乳酸菌培養の常法に従って培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま用いることのみならず、当該培養・発酵液（培養上清）、その濃縮液や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。また、生菌体のみならず死菌体であってもよい。
【００１６】
本発明の乳酸菌を培養する培地には、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地等種々の培地を用いることができる。このような培地としては、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地等を例示することができる。
培養方法は、静置培養又はｐＨを一定にした中和培養や、回分培養及び連続培養等、菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はない。
また、培養に際しては、酒粕若しくは焼酎蒸留残渣又はそれらの抽出物を添加することが好ましく、特に発酵乳、発酵果汁又は発酵野菜汁を製造する場合には、これらを添加することにより良好な発酵物の製造が可能となり好ましい。
【００１７】
本発明のペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体又は菌体培養物の抽出物とは、菌体又は菌体培養物を、溶媒抽出することにより得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味するものである。
【００１８】
本発明の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、このうち、酢酸エチル等のエステル類、エタノール等のアルコール類が好ましい。
【００１９】
抽出条件は、使用する溶剤によっても異なるが、例えば、培養液１質量部に対して1〜１０質量部の溶剤を用い、０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、０．５時間〜３時間抽出するのが好ましい。
【００２０】
上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、必要に応じて粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、液々分配等の技術により、適宜精製して用いることもできる。
【００２１】
後記実施例に示すように、本発明のペディオコッカス属(Pediococcus)に属する乳酸菌の菌体は、過栄養状態における体重増加を抑制し、白色脂肪組織重量及び、肝中性脂肪（トリグリセリド）量を減少させる効果を有する。従って、ペディオコッカス属に属する乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、肥満予防又は改善剤、脂肪蓄積抑制剤又は脂質代謝改善剤となり得、体脂肪の蓄積、脂質代謝異常により引き起こされる病態、すなわち肥満、脂質代謝異常（例えば脂肪肝、高脂血症）、糖質代謝異常（例えば糖尿病）、更には心筋梗塞や脳梗塞などの心血管病の予防、治療又は改善に有効な、食品、医薬品等として使用可能である。また、食品は、肥満の予防又は改善、ダイエット等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品若しくは特定保健用食品等の機能性食品とすることも可能である。
【００２２】
本発明の肥満予防又は改善剤、脂肪蓄積抑制剤及び脂質代謝改善剤を医薬品やサプリメントとして用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の医薬製剤やサプリメントを調製するには、本発明の菌体や培養物の作用を妨げない範囲で、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の本発明の油脂の含有量は、全組成中の０．１質量％〜１００質量％、好ましくは１質量％〜１００質量％である。
【００２３】
本発明の肥満予防又は改善剤、脂肪蓄積抑制剤及び脂質代謝改善剤を食品として用いる場合の形態としては、果汁又は野菜汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、発酵乳、発酵果汁、発酵野菜汁、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料や、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物、佃煮などの各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
【００２４】
本発明のペディオコッカス属(Pediococcus)乳酸菌の培養物は、そのままヨーグルト、チーズ、味噌、醤油、漬物等の発酵食品となり、斯かる発酵乳やチーズを素材として使用し、内臓脂肪減少用のパンやスナック菓子、ケーキ等にすることもできる。
【００２５】
上記医薬品や食品への本発明乳酸菌の含有量は、特に限定されないが、一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良いが、例えば剤型が液体の場合には、乳酸菌体濃度を１×108cells/ml〜1×1010cells/mlとすることが好ましく、固体の場合には、1×108cells/g 〜 1×1010cells/gとすることが好ましい。
【００２６】
本発明のペディオコッカス属(Pediococcus)の乳酸菌を生菌として投与する場合は、成人一人当たり、1×1012〜5×1013cfu／日投与することが好ましい。
以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明する。
【実施例】
【００２７】
製造例１  乳酸菌菌体の調製
MRS培地（メルク社）を118℃で15分間殺菌した後、ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus) LP28株（NITE AP-700として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託（２００９年１月２７日））を接種し、28℃で36時間嫌気培養し、得られた培養物をPBSで3回洗浄後、凍結乾燥してLP28株の菌体粉末を得、実験に用いるまで-80℃において保存した。また、比較として、ソーセージより入手したLactobacillus plantarum SN13T株（NITE P-7）を同様に培養し、SN13T株の菌体粉末を得た。
【００２８】
試験例１
（１）試験方法
7〜8週齢のマウス(BALB/c)に6週間にわたって高脂肪食（D12492-Rodent Diet with 60 kcal% Fat, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ）を摂取させ、肥満を誘発させた後、更に8週間、同高脂肪食のほか、製造例１で調製したLP28株及びSN13T株の菌体粉末を摂取あるいは非摂取させ、体重の変化を観察した。また、菌体摂取開始8週後に、各個体の腹腔内の白色脂肪組織重量および肝中性脂肪量を測定した。
尚、肝中性脂肪量は、肝をクロロホルム／メタノール（２：１）で懸濁、振盪した後、クロロホルム層のトリグリセリド量を定量した（トリグリセライド定量用トリグリセライドE-テストワコー／和光純薬工業）。
また、LP28株及びSN13T株の菌体粉末の摂取は、砕いた餌1gに対し、菌体培養物粉末25mgを混合し、マウス（各群、5匹ずつ）に自由摂取させた。餌の摂取量は、乳酸菌非摂取群、LP28摂取群、SN13T摂取群間で差は見られず、1日当たり約2.5g／mouseであった。
【００２９】
（２）結果
LP28摂取群では、非摂取群と比べ、高脂肪食摂取による体重増加が有意に抑制(P<0.05)されたが、SN13T摂取群では、非摂取群と差は見られなかった（図１）。さらに、高脂肪食摂取時における白色脂肪組織重量（図２）、肝重量及び肝中性脂肪量が減少した（図３）。
このように、LP28には、過栄養状態における体重増加、脂肪増加、および脂肪肝を抑制する効果が認められたことから、メタボリック症候群の予防・改善に有効であると考えられる。
【００３０】
試験例２  肝における遺伝子発現の変動
試験例１における被験動物のうち、LP28摂取群と非摂取群の各１匹の肝よりtotal RNAを抽出し、cDNAマイクロアレイ解析（Affymetrix）を実施した。
その結果、超低密度リポタンパク質受容体（Very low density lipoprotein receptor）、CD36抗原（CD36 antigen）、PPARγ（Peroxisome proliferator activated receptor gamma）、ステアリン酸CoA 脱飽和酵素１（Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1）、SREBF1（Sterol regulatory element binding transcription factor 1）、脂肪酸シンターゼ（Fatty acid synthase）をはじめとして、多くの脂質関連遺伝子の発現変動が認められた。
【００３１】
実施例１  発酵乳の製造
ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus) LP28株（NITE AP-700）を梨濃縮汁１００％還元品、１．０％クエン酸ナトリウム及び１．０％焼酎蒸留残渣抽出物を含む培地にて３０℃で２０時間培養し、前培養液とした。１３％脱脂粉乳(明治乳業社製) に１％焼酎蒸留残渣抽出物を加えたものを１２１℃で１５分殺菌後、３０℃まで冷却して本培養培地とし、これに前培養液を２％量接種し、３０℃、２４時間培養し、発酵乳（乳酸酸度０．５９％）を得た。
【００３２】
実施例２  発酵野菜汁の製造
ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus) LP28株（NITE AP-700）を、梨濃縮汁１００％還元品、１．０％クエン酸ナトリウム及び１．０％焼酎蒸留残渣抽出物を含む培地にて３０℃で２０時間培養し、前培養液とした。ニンジン濃縮汁の１００％還元品に０．１％脱脂粉乳及び０．８％焼酎蒸留残渣抽出物を加えたものを１０５℃で５分殺菌後、３０℃まで冷却して人参汁培地を作成し、これに前培養液を２％量接種し、３０℃、２４時間培養し、発酵ニンジン汁（乳酸酸度０．６１％）を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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