(57)【要約】      （修正有）【課題】多様な有機酸を生産する従来の野生型菌株に比べて、他の有機酸をほとんど生成せず、高濃度でコハク酸を生成する特性を有している変異菌株を嫌気的な条件で培養することによるコハク酸の製造方法の提供。【解決手段】ルーメンバクテリアで乳酸、蟻酸及び酢酸生成に関与する乳酸脱水素酵素遺伝子（ｌｄｈＡ）及びピルビン酸−蟻酸分解酵素遺伝子（ｐｆｌ）が欠失された新規ルーメンバクテリア変異菌株（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ）。【選択図】図１
2010263911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルーメンバクテリア変異菌株において、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（以下、「ｌｄｈＡ」という）及びピルビン酸−蟻酸の分解酵素をコードする遺伝子（以下、「ｐｆｌ」という）が欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株。
【請求項２】
ルーメンバクテリア変異菌株において、ｌｄｈＡ、ｐｆｌ、ホスホトランスアセチル化酵素遺伝子（以下、「ｐｔａ」という）及び酢酸キナーゼ遺伝子（以下、「ａｃｋＡ」という）が欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株。
【請求項３】
ルーメンバクテリア変異菌株において、ｌｄｈＡ、ｐｆｌ及びホスホピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（以下、「ｐｐｃ」という）が欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株。
【請求項４】
前記ルーメンバクテリアが、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びアネロビオスピリルム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属からなる群より選択されることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか一項に記載のルーメンバクテリア変異菌株。
【請求項５】
前記ルーメンバクテリアが他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを生成する同型発酵菌株であることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか一項に記載のルーメンバクテリア変異菌株。
【請求項６】
前記ルーメンバクテリア変異菌株が、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫであることを特徴とする請求項１記載の変異菌株。
【請求項７】
前記ルーメンバクテリア変異菌株が、ＫＣＴＣ１０５５８ＢＰであることを特徴とする請求項６記載の変異菌株。
【請求項８】
前記ルーメンバクテリア変異菌株が、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７であることを特徴とする請求項２記載の変異菌株。
【請求項９】
前記ルーメンバクテリア変異菌株が、ＫＣＴＣ１０６２６ＢＰであることを特徴とする請求項８記載の変異菌株。
【請求項１０】
前記ルーメンバクテリア変異菌株が、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ４であることを特徴とする請求項３記載の変異菌株。
【請求項１１】
マンヘミア属、アクチノバチルス属及びアネロビオスピリルム属からなる群より選択されるルーメンバクテリアからｌｄｈＡ及びｐｆｌを欠失させることを含む、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法。
【請求項１２】
マンヘミア属、アクチノバチルス属及びアネロビオスピリルム属からなる群より選択され、ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されているルーメンバクテリアからｐｔａ及びａｃｋＡを更に欠失させることを含む、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法。
【請求項１３】
マンヘミア属、アクチノバチルス属及びアネロビオスピリルム属からなる群より選択され、ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されているルーメンバクテリアからｐｐｃを追加で欠失させることを特徴とする、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法。
【請求項１４】
前記ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されているルーメンバクテリアが、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ（ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ）であることを特徴とする請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ｌｄｈＡ及びｐｆｌの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記相同組換えは、欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクター及び欠失されたｐｆｌを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターが、ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢであり、前記欠失されたｐｆｌを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐｔａ及びａｃｋＡの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記相同組換えは、欠失されたｐｔａ及びａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記欠失されたｐｔａ及びａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＰＴＡ−ｓａｃＢであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐｐｃの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
前記相同組換えは、欠失されたｐｐｃを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記欠失されたｐｐｃを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＰＰＣ−ｓａｃＢであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢ。
【請求項２５】
欠失されたｐｆｌを含む遺伝子交換ベクターｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢ。
【請求項２６】
欠失されたｐｔａ及びａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターｐＰＴＡ−ｓａｃＢ。
【請求項２７】
欠失されたｐｐｃを含む遺伝子交換ベクターｐＰＰＣ−ｓａｃＢ。
【請求項２８】
請求項１乃至請求項３の何れか一項のルーメンバクテリア変異菌株を嫌気的な条件で培養する段階；及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法。
【請求項２９】
前記培養は他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを生成する同型発酵であることを特徴とする請求項２８記載のコハク酸の製造方法。
【請求項３０】
前記ルーメンバクテリア変異菌株は  Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ、ＬＰＫ７またはＬＰＫ４であることを特徴とする請求項２８記載のコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生産するルーメンバクテリア変異菌株及び該変異菌株を嫌気的な条件で培養することを特徴とするコハク酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、及びＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓなどを含む数種の嫌気性微生物が、ブドウ糖代謝を通じてコハク酸を最終的な産物として生成する（Ｚｅｉｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４：４２３，１９８０）。ＣＯ２が過量存在するときにブドウ糖から高濃度かつ高収率でコハク酸を生産すると知られたＡｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓを除いては、産業的に有用な収率でコハク酸を生産する菌株は報告されていない（Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２６：４９８，１９７６）。しかし、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓは、絶対嫌気性の微生物であるので、これを用いてコハク酸を生産する発酵工程は、微量の酸素に露出しても工程自体が不安定になるという欠点を有する。
【０００３】
このような欠点を改善するために、酸素に対して抵抗性を有し、かつ有機酸の生産性の高い菌株であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅが開発された。しかし、前記菌株は、コハク酸以外にも蟻酸、酢酸及び乳酸を生成するため、収率が低く、かつコハク酸以外の他の有機酸を除去する精製工程で多くのコストがかかるという欠点を有する。
【０００４】
コハク酸の生産のために、組換えられた大腸菌については多数の文献で報告されている。大腸菌の場合、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）及びピルビン酸−蟻酸の分解酵素をコードする遺伝子（ｐｆｌ）が欠失されれば、嫌気的な条件ではほとんど生育できない。また、乳酸は、発酵産物として出ないが、他の代謝産物である酢酸及びエタノールがコハク酸の生産量の半分ほどをそれぞれ占めて、産業化するには収率が低すぎるという欠点がある。このような欠点を補完するために、好気条件で大腸菌の菌体を増殖させた後、再び嫌気条件に変えてコハク酸の発酵を誘導したが、依然として生産性が低いという欠点がある（Ｖｅｍｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８：３２５，２００２）。また、コハク酸の発酵の代謝経路でＣＯ２を固定する、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、  ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、  ピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）、リンゴ酸酵素（ｍａｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）のような酵素の遺伝子を大腸菌に導入して、コハク酸の生産性を向上させた例が報告されている（Ｖｅｍｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６８：１７１５，  ２００２；  Ｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６２：１８０８，  １９９６；  Ｃｈａｏ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
５９：４２６１，  １９９３；  Ｓｔｏｌｓ  ａｎｄ  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６３：２６９５，  １９９７）。
【０００５】
一方、大腸菌でｐｔｓＧの欠失が菌体産生及びコハク酸の生産性の向上に寄与すると報告されているが（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：１４８，２００１）、ほとんどのルーメンバクテリアはｐｔｓＧを有していないため、大腸菌の場合と同様に、ｐｔｓＧを除去する過程が不要であるという利点がある。最近、コハク酸の発酵の代謝経路において、ＣＯ２を固定する酵素の遺伝子を大腸菌以外にアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やアネロビオスピリルム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属などのルーメンバクテリア（ｒｕｍｅｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ）に導入する試みが行われているが、他の有機酸が過量生成されるか、または収率が低くて、産業的に適用し難い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明者らは、高収率でコハク酸を生産する菌株を開発するために鋭意努力した結果、ルーメンバクテリアの一種であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅにおいて、ｌｄｈＡ及びｐｆｌを欠失させて、変異菌株であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ（ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ）を作製し、前記ＬＰＫ菌株でホスホトランスアセチル化酵素遺伝子（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）及びホスホピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）をそれぞれ欠失させて、変異菌株（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７及びＬＰＫ４）を作製した後、これを嫌気的な条件で培養した結果、コハク酸が高収率で生産されるということを見出し、本発明を完成することに至った。
【０００７】
従って、本発明の主な目的は、嫌気的な条件で他の有機酸は生成せず、コハク酸を高収率で生成するルーメンバクテリア変異菌株及びその製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記変異菌株を嫌気的な条件下で培養することを特徴とするコハク酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、ルーメンバクテリア変異菌株において、ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ルーメンバクテリア変異菌株において、ｌｄｈＡ、ｐｆｌ、ｐｔａ及びａｃｋＡが欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ルーメンバクテリア変異菌株において、ｌｄｈＡ、ｐｆｌ及びｐｐｃが欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株を提供する。
【００１２】
本発明において、前記ルーメンバクテリアは、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びアネロビオスピリルム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属からなる群より選択され、他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを生成する同型発酵菌株であることを特徴とすることができる。本発明の望ましい具現例において、前記ルーメンバクテリア変異菌株は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ，ＬＰＫ７またはＬＰＫ４である。
【００１３】
また、本発明は、マンヘミア属、アクチノバチルス属及びアネロビオスピリルム属からなる群より選択されるルーメンバクテリアからｌｄｈＡ及びｐｆｌを欠失させることを特徴とする、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明に係るルーメンバクテリア変異菌株の製造方法において、前記ｌｄｈＡ及びｐｆｌの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とし、前記相同組換えは、欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクター及び欠失されたｐｆｌを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とし、前記欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢであり、前記欠失されたｐｆｌを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢであることを特徴とすることができる。
【００１５】
また、本発明は、マンヘミア属、アクチノバチルス属及びアネロビオスピリルム属からなる群より選択され、ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されているルーメンバクテリアからｐｔａ及びａｃｋＡを追加で欠失させることを特徴とする、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法を提供する。
【００１６】
前記ｐｔａ及びａｃｋＡの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とし、前記相同組換えは、欠失されたｐｔａ及びａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とし、前記欠失されたｐｔａ及びａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＰＴＡ−ｓａｃＢであることを特徴とすることができる。
【００１７】
また、本発明は、マンヘミア属、アクチノバチルス属及びアネロビオスピリルム属からなる群より選択され、ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されているルーメンバクテリアからｐｐｃを更に欠失させることを特徴とする、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法を提供する。
【００１８】
前記ｐｐｃの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とし、前記相同組換えは、欠失されたｐｐｃを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とし、前記欠失されたｐｐｃを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＰＰＣ−ｓａｃＢであることを特徴とすることができる。
【００１９】
本発明において、前記ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失されているルーメンバクテリアは、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ（ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ）であることを特徴とすることができる。
【００２０】
また、本発明は、欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢと、欠失されたｐｆｌを含む遺伝子交換ベクターｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢと、欠失されたｐｔａ及びａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターｐＰＴＡ−ｓａｃＢと、欠失されたｐｐｃを含む遺伝子交換ベクターｐＰＰＣ−ｓａｃＢと、を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記ルーメンバクテリア変異菌株を嫌気的な条件で培養する段階と、前記培養液からコハク酸を回収する段階と、を含むコハク酸の製造方法を提供する。
【００２２】
本発明において、‘欠失’という用語は、前記遺伝子によりコードされる酵素が生成されないように、該当遺伝子を変形させたものを全て含む。
【００２３】
本発明では、まず、ルーメンバクテリアの一種であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅの遺伝体情報からｌｄｈＡ及びｐｆｌをそれぞれ検出した後、遺伝子欠失ベクターを利用してＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅの遺伝体から前記二つの遺伝子とも除去して、変異菌株（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ，ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ）を作製した。次いで、前記ＬＰＫ（ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ）からｐｔａ−ａｃｋＡ及びｐｐｃをそれぞれ欠失させて変異菌株を作製した後、それらの変異菌株が他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生産するということを確認した。
【００２４】
本発明の変異菌株（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ、ＬＰＫ４及びＬＰＫ７）は、通性嫌気性、グラム陰性、非運動性の桿菌（ｒｏｄ）または球桿菌（ｃｏｃｏｂａｃｉｌｌｉ）菌であって、内生胞子（ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ）を生成しない特性を有し、嫌気条件でコハク酸が生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｌｄｈＡ欠失ベクター（ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢ）の作製過程を示す図である。
【図２】ｐｆｌ欠失ベクター（ｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢ）の作製過程を示す図である。
【図３】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５ＥでｌｄｈＡ及びｐｆｌを欠失させて変異株（ＬＰＫ）を作製する過程を示す図である。
【図４】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫでｌｄｈＡ及びｐｆｌの欠失を確認した電気泳動写真である［Ｍ：Ｌａｍｂｄａ  ＨｉｎｄＩＩＩサイズ・マーカー；レーン１〜３：ＰＣＲ産物ＬＵ１及びＫＭ１（１．５ｋｂ）；レーン４〜６：ＰＣＲ産物ＬＤ２及びＫＭ２（１．７ｋｂ）；レーン７〜９：ＰＣＲ産物ＰＵ１及びＣＭ１（２．２ｋｂ）；及びレーン１０〜１２：ＰＣＲ産物ＰＤ２及びＣＭ２（１．６ｋｂ）］。
【図５】ＣＯ２で飽和された嫌気条件でＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫの培養特性を示すグラフである。
【図６】ｐｔａ及びａｃｋＡの欠失ベクター（ｐＰＴＡ−ｓａｃＢ）の作製過程を示す図である。
【図７】ｐｐｃ欠失ベクター（ｐＰＰＣ−ｓａｃＢ）の作製過程を示す図である。
【図８】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫでｐｔａ及びａｃｋＡを欠失させて変異株ＬＰＫ７を作製する過程を示す図である。
【図９】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫでｐｐｃを欠失させて変異株ＬＰＫ４を作製する過程を示す図である。
【図１０】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７でｐｔａ及びａｃｋＡの欠失を確認した電気泳動写真である［Ｍ：１ｋｂラダー・サイズ・マーカー；レーン１：ＰＣＲ産物Ｐ１３及びＰ１４（１．１ｋｂ）；及びレーン２：ＰＣＲ産物Ｐ１５及びＰ１６（１．５ｋｂ）］。
【図１１】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ４でｐｐｃの欠失を確認した電気泳動写真である［Ｍ：１ｋｂラダー・サイズ・マーカー；レーン１：ＰＣＲ産物Ｐ１３及びＰ１７（１．１ｋｂ）；及びレーン２：ＰＣＲ産物Ｐ１５及びＰ１８（１．５ｋｂ）］。
【図１２】ＣＯ２で飽和された嫌気条件でＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７の培養特性を示すグラフである。
【図１３】ＣＯ２で飽和された嫌気条件でＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ４の培養特性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは当業界に通常の知識を持つ者にとっては明らかである。
【００２７】
特に、下記実施例では、マンヘミア属菌株から遺伝子を欠失させて変異菌株を得た後、これを利用してコハク酸を高濃度で生成することを含む方法のみを例示したが、アクチノバチルス属やアネロビオスピリルム属などの他のルーメンバクテリア菌株を用いて、前記遺伝子が欠失された変異菌株を得、また、これを用いてコハク酸を製造することも、当業界に通常の知識を持つ者にとっては明らかである。
【００２８】
また、下記実施例では、特定の培地及び培養方法のみを例示したが、文献に報告されているように（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．  Ｅｎｇ．，  ２６：６３，  ２００３；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５８：６６３，  ２００２；  Ｌｅｅ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ２５：１１１，  ２００３；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，
５４：２３，  ２０００；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ７２：４１，  ２００１）、乳清やＣＳＬ（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｇｕｏｒ）などの糖化液と異なる培地を用いることや、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）や連続培養などの多様な方法を使用することも、当業界に通常の知識を持つ者にとっては明らかである。
【００２９】
実施例１：ｌｄｈＡ欠失ベクター（ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢ）の作製
ｌｄｈＡを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅ（ＫＣＴＣ  ０７６９ＢＰ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１及び２のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＰｓｔＩで切断し、これをｐＵＣ１８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓ．）に導入してｐＵＣ１８−Ｌ１を作製した。
配列番号１：５’−ＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＧ（ＬＳ１）
配列番号２：５’−ＣＴＴＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡ（ＬＰ１）
【００３０】
その後、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５ＥのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３及び４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これを前記ｐＵＣ１８−Ｌ１に導入してｐＵＣ１８−Ｌ１−Ｌ２を作製した。
配列番号３：５’−ＧＴＡＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣ（ＬＰ２）
配列番号４：５’−ＧＣＣＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧ（ＬＨ２）
【００３１】
ｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＰｓｔＩで切断して、得られたカナマイシン耐性遺伝子を、ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１８−Ｌ１−Ｌ２と融合させてｐＵＣ１８−Ｌ１−ＫｍＲ−Ｌ２を作製した。ＳａｃＩで切断したｐＵＣ１８−Ｌ１−ＫｍＲ−Ｌ２に下記配列番号５のリンカーを挿入して、新たなＸｂａＩ切断部位を作製した。
配列番号５：５’−ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴ
【００３２】
ｐＫｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１４５：６９，１９９４）を鋳型とし、下記配列番号６及び７のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られた産物をＸｂａＩで切断し、これを前記新たなＸｂａＩ制限酵素の位置に挿入してｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢを作製した（図１）。
配列番号６：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧ（ＳＸＦ）
配列番号７：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＴＣ（ＳＸＲ）
【００３３】
実施例２：ｐｆｌ欠失ベクター（ｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢ）の作製
ｐｆｌを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。ｓａｃＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ０２７３０）を含有したｐＫｍｏｂｓａｃＢを鋳型とし、下記配列番号８及び９のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたｓａｃＢ産物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、これをｐＵＣ１９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）に導入してｐＵＣ１９−ｓａｃＢを作製した。
配列番号８：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧ（ＳＢＧ）
配列番号９：５’−ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＴＣ（ＳＰＲ）
【００３４】
Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５ＥのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１０と１１のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＢａｍＨＩで切断し、これをＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１９−ｓａｃＢと融合してｐＵＣ１９−ｓａｃＢ−ｐｆｌを作製した。
配列番号１０：５’−ＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＧＡＴ（ＰＢ１）
配列番号１１：５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴ（ＰＢ２）
【００３５】
クロラムフェニコール耐性遺伝子を得るために、ｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）を鋳型とし、下記配列番号１２及び１３のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、前記ＰＣＲ産物をＳｍａＩで切断し、これをＢｓｔ１１０７Ｉで切断したｐＵＣ１９−ｓａｃＢ−ｐｆｌと融合してｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢを作製した（図２）。
配列番号１２：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡ（ＣＴＲ）
配列番号１３：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＴＡＡＡＴ（ＣＴＦ）
【００３６】
実施例３：Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ菌株の作製
図３は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅにおいて、ｌｄｈＡ及びｐｆｌを欠失させて変異株（ＬＰＫ）を作製する過程を示す図である。Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅを１０ｇ／ｌのグルコースを含有するＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）−グルコース培地に塗抹して、３７℃で３６時間培養した後、コロニーをＬＢ−グルコース液体培地１０ｍＬに接種して１２時間培養した。充分に成長した培養液をＬＢ−グルコース液体培地１００ｍＬに１％接種して、２００ｒｐｍ、３７℃の振盪培養器で培養した。
【００３７】
約４〜５時間後にＯＤが約０．２〜０．３になったとき、これを４℃、１０分間、４０００ｒｐｍの条件で遠心分離して細胞を得た後、４℃、１０％のグリセロール溶液２００ｍＬで細胞を再懸濁した。また、４℃、１０分間、４０００ｒｐｍの条件で遠心分離して細胞を得た後、４℃、１０％のグリセロール溶液２００ｍＬで細胞を再懸濁し、４℃、１０分間、４０００ｒｐｍの条件で遠心分離して細胞を得た。細胞とグリセロールとの体積比が１：１になるように再懸濁して細胞濃縮液を得た。
【００３８】
このようにして得た細胞濃縮液と、実施例１及び実施例２で作製された遺伝子交換ベクターｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢ及びｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢとを混合した後、１．８ｋＶ、２５μＦ，２００ｏｈｍｓの条件でエレクトロポレーションを行った。電気衝撃後、ＬＢ−グルコース液体培地１ｍＬを加えて、２００ｒｐｍ、３７℃の振盪培養器で１時間培養した。培養液を適切な抗生剤［Ｋｍ（最終濃度２５μｇ／ｍＬ）またはＣｍ（最終濃度６．８μｇ／ｍＬ）］を含有したＬＢ−グルコース固体培地に塗抹して、３７℃で４８時間以上培養した。コロニーが形成されれば、二重交差（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）のみ起こったものを選び出すために、これを、Ｋｍ（２５μｇ／ｍＬ）またはＣｍ（６．８μｇ／ｍＬ）を含有したＬＢ−スクロース（１００ｇ／ｌのスクロースを含有したＬＢ培地）培地にストリークした後、２４時間後に形成されたコロニーを同じプレートに再びストリークした。
【００３９】
前記プレートで形成されたコロニー（変異株）を、抗生剤が含まれたＬＢ−グルコース液体培地で培養し、培養された菌株から、ロッシェルなどの方法（Ｒｏｃｈｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１００：５９，１９９２）を応用して、ゲノムＤＮＡを分離した。前記分離された変異株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物を電気泳動することによってｌｄｈＡ及びｐｆｌの欠失の可否を確認した。
【００４０】
ｌｄｈＡの欠失の可否を確認するために、下記のように、ＰＣＲを２回行った。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１４及び１５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号１４：５’−ＧＡＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣ（ＫＭ１）
配列番号１５：５’−ＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＡＣ（ＬＵ１）
【００４１】
次いで、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１６及び１７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。前記２回のＰＣＲ反応で得られた反応物をゲル電気泳動して、そのサイズ（１．５ｋｂ）によってｌｄｈＡの欠失の可否を確認した（図４）。
配列番号１６：５’−ＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＴＧ（ＫＭ２）
配列番号１７：５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣ（ＬＤ２）
【００４２】
ｐｆｌの欠失の可否を確認するために、下記のようにＰＣＲを２回行った。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１８及び１９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号１８：５’−ＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴ（ＣＭ１）
配列番号１９：５’−ＣＴＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＧＴＡＴＧＴＡＴＴＧＣＣＧ（ＰＵ１）
【００４３】
次いで、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号２０及び２１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。前記２回のＰＣＲ反応で得られた反応物をゲル電気泳動して、そのサイズ（１．５ｋｂ）によってｐｆｌの欠失の可否を確認した（図４）。図４において、ＭはＬａｍｂｄａ  ＨｉｎｄＩＩＩサイズ・マーカーを、レーン１〜３はＰＣＲ産物ＬＵ１  ＆  ＫＭ１（１．５ｋｂ）を、レーン４〜６はＰＣＲ産物ＬＤ２  ＆  ＫＭ２（１．７ｋｂ）を、レーン７〜９はＰＣＲ産物ＰＵ１  ＆  ＣＭ１（２．２ｋｂ）を、レーン１０〜１２はＰＣＲ産物ＰＤ２  ＆  ＣＭ２（１．６ｋｂ）をそれぞれ示す。
配列番号２０：５’−ＴＡＣＴＧＣＧＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡ（ＣＭ２）
配列番号２１：５’−ＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＧＴＣＡＣ（ＰＤ２）
【００４４】
ｌｄｈＡの欠失は、配列番号１４及び１５のプライマー（ＬＵ１及びＫＭ１）を用いたＰＣＲの結果物が１．５ｋｂであり、それと同時に、配列番号１６及び１７のプライマー（ＬＤ２及びＫＭ２）を用いたＰＣＲの結果物が１．７ｋｂである事実によって確認された。そして、ｐｆｌの欠失は、配列番号１８及び１９のプライマー（ＰＵ１及びＣＭ１）を用いたＰＣＲの結果物が２．２ｋｂであり、それと同時に、配列番号２０及び２１のプライマー（ＰＤ２及びＣＭ２）を用いたＰＣＲの結果物が１．６ｋｂで事実によってが確認された。それぞれのプライマーの位置は図３に示した。前記方法で作製された変異菌株、すなわち、ｌｄｈＡ及びｐｆｌが欠失された菌株を、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫと命名し、これを２００３年１１月２６日付で国際寄託機関である韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号‘ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ’として寄託した。
【００４５】
実施例４：Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫの発酵特性
前記実施例３で作製されたＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫの発酵特性を調べるために、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件で培養し、これから生産される反応産物を分析した。まず、２０ｇ／Ｌのブドウ糖、５ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び１０ｇ／ＬのＭｇＣＯ３からなる前培養培地１００ｍＬに炭酸ガスを注入した後、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫを接種し、３９℃で１４時間前培養を行った。次いで、２０ｇ／Ｌのブドウ糖、５ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び５ｇ／ＬのＮａ２ＣＯ３からなる本培養培地０．９Ｌを２．５Ｌの培養槽に入れ、１００ｍＬの前培養された微生物を接種した後、３９℃でｐＨ６．５の条件下で、炭酸ガスを０．２５ｖｖｍの流速で供給しつつ回分培養を行った。
【００４６】
培養液内の細胞の濃度は、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ３０００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して測定し、培地内に含まれたコハク酸、ブドウ糖、乳酸、酢酸及び蟻酸の量は、ＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  ｃｏｌｕｍｎ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）で測定した（図５）。図５において、シンボルは、培養時間による細胞の濃度（●）、コハク酸（○）、ブドウ糖（■）、蟻酸（◇）及び酢酸（△）の濃度の変化を表す。図５に示すように、１４時間培養後に消耗されたブドウ糖の濃度は２０ｇ／Ｌであり、生成されたコハク酸の濃度は１７．２ｇ／Ｌであった。これによるコハク酸の収率（生成されたコハク酸の量／消費されたブドウ糖の量）は８１％であり、コハク酸の体積生産性（生成されたコハク酸の濃度／所要時間）は１．２３ｇ／Ｌ／ｈであった。本発明のＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫを、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件で培養して得るコハク酸の生産方法は、親菌株であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅを、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件で培養して得るコハク酸の生産方法より収率面において大きく向上し、コハク酸／酢酸の比率面では４０．７：１であり、ほとんど副産物のないコハク酸が得られた。
【００４７】
実施例５：ｐｔａ及びａｃｋＡ欠失ベクター（ｐＰＴＡ−ｓａｃＢ）の作製
ｐｔａ及びａｃｋＡを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ（ＫＣＴＣ  １０５５８ＢＰ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号２２及び２３のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、これをｐＵＣ１９に導入してｐＵＣ１９−ＰＴＡ１を作製した。
配列番号２２：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＧＣ
配列番号２３：５’−ＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＡＣＣＧＣＡＣＡＧ
【００４８】
その後、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号２４及び２５のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断し、これを前記ｐＵＣ１９−ＰＴＡ１に導入してｐＵＣ１９−ＰＴＡ１２を作製した。
配列番号２４：５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣ
配列番号２５：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＡＡＣ
【００４９】
スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ０２５８８）を含有したプラスミドｐＩＣ１５６（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１４２：７９，１９９４）を鋳型とし、下記配列番号２６及び２７のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片（スペクチノマイシン耐性遺伝子）をＥｃｏＲＶで切断し、これを前記ｐＵＣ１９−ＰＴＡ１２に導入してスペクチノマイシン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９−ＰＴＡ１Ｓ２を作製した。前記作製されたｐＵＣ１９−ＰＴＡ１Ｓ２をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、ｐＵＣ１９−ＳａｃＢ（実施例２を参照）に導入してｐＰＴＡ−ｓａｃＢベクターを作製した（図６）。
配列番号２６：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＣ
配列番号２７：５’−ＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＣ
【００５０】
実施例６：ｐｐｃ欠失ベクター（ｐＰＰＣ−ｓａｃＢ）の作製
ｐｐｃを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号２８及び２９のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、これをｐＵＣ１９に導入してｐＵＣ１９−ＰＰＣ１を作製した。
配列番号２８：５’−ＴＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＧＡ
配列番号２９：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＴＧ
【００５１】
その後、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３０及び３１のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断し、これを前記ｐＵＣ１９−ＰＰＣ１に導入してｐＵＣ１９−ＰＰＣ１２を作製した。
配列番号３０：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣ
配列番号３１：５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＴＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＴＣ
【００５２】
ＥｃｏＲＶで切断したスペクチノマイシン耐性遺伝子（実施例５を参照）を前記ｐＵＣ１９−ＰＰＣ１２に導入してｐＵＣ１９−ＰＰＣ１Ｓ２を作製し、これをＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、前記ｐＵＣ１９−ＳａｃＢに導入してｐＰＰＣ−ｓａｃＢベクターを作製した（図７）。
【００５３】
実施例７：Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７及びＬＰＫ４菌株の作製
図８及び図９は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫでｐｔａ−ａｃｋＡ及びｐｐｃをそれぞれ欠失させて変異株、ＬＰＫ７及びＬＰＫ４を作製する過程を示す図である。Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫを、１０ｇ／ｌのグルコースを含有したＬＢ−グルコース培地に塗抹して、３７℃で３６時間培養した後、コロニーをＬＢ−グルコース液体培地１０ｍＬに接種して１２時間培養した。充分に成長した培養液をＬＢ−グルコース液体培地１００ｍＬに１％接種して、３７℃の振盪培養器で培養した。
【００５４】
前記培養液から、実施例３と同じ方法で細胞濃縮液を得た後、これを、実施例５及び実施例６で作製された遺伝子交換ベクターｐＰＴＡ−ｓａｃＢ及びｐＰＰＣ−ｓａｃＢと混合した後、１．８ｋＶ、２５μＦ，２００ｏｈｍｓの条件でエレクトロポレーションを行った。電気衝撃後、ＬＢ−グルコース液体培地１ｍＬを加えて、２００ｒｐｍ、３７℃の振盪培養器で１時間培養した。
【００５５】
培養液を、スペクチノマイシン抗生剤（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を含有したＬＢ−グルコース固体培地に塗抹して、３７℃で４８時間以上培養した。コロニーが形成されれば、二重交差のみ起こったものを選び出すために、これを、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含有したＬＢ−スクロース培地（１００ｇ／ｌのスクロースを含有したＬＢ培地）にストリークした。２４時間後に形成されたコロニーをプレートに再びストリークした。前記プレートで形成されたコロニー（変異株）を、抗生剤が含まれたＬＢ−グルコース液体培地で培養し、培養された菌株から、ロッシェルらの方法を応用してゲノムＤＮＡを分離した。前記分離された変異株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物を電気泳動してｐｔａ−ａｃｋＡ及びｐｐｃの欠失の可否をそれぞれ確認した。
【００５６】
ｐｔａ−ａｃｋＡの欠失の可否を確認するために、下記のようにＰＣＲを２回行った。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３２及び３３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。次に、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３４及び３５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号３２：５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣ
配列番号３３：５’−ＧＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣ
配列番号３４：５’−ＧＣＡＴＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＧＣＴＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＧＧＡＧ
配列番号３５：５’−ＧＣＡＡＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＡＡＴＡＣＣＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧ
【００５７】
前記２回のＰＣＲ反応で得られた反応物をゲル電気泳動して、そのサイズによってｐｔａ−ａｃｋＡの欠失の可否を確認した（図１０）。図１０において、Ｍは、１ｋｂラダー・サイズ・マーカーを、レーン１は、ＰＣＲ産物Ｐ１３及びＰ１４（１．１ｋｂ）を、レーン２は、ＰＣＲ産物Ｐ１５及びＰ１６（１．５ｋｂ）を表す。ｐｔａ−ａｃｋＡの欠失は、配列番号３２及び３３のプライマー（Ｐ１３及びＰ１４）を用いたＰＣＲの結果物が１．１ｋｂであり、それと同時に、配列番号３４及び３５のプライマー（Ｐ１５及びＰ１６）を用いたＰＣＲの結果物が１．５ｋｂであるという事実によって確認した。プライマーの位置は図８に示した。前記方法で作製された変異菌株、すなわち、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫでｐｔａ−ａｃｋＡが欠失された菌株を、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７と命名し、これを国際寄託機関であるＫＣＴＣに寄託番号‘ＫＣＴＣ  １０６２６ＢＰ’として寄託した。
【００５８】
また、ｐｐｃの欠失の可否を確認するために、下記のように、ＰＣＲを２回行った。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３２及び３６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。次いで、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３４及び３７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号３６：５’−ＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣ
配列番号３７：５’−ＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＡＴＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧＣＧ
【００５９】
前記２回のＰＣＲ反応で得られた反応物をゲル電気泳動して、そのサイズによってｐｐｃの欠失の可否を確認した（図１１）。図１１において、Ｍは、１ｋｂラダー・サイズ・マーカーを、レーン１は、ＰＣＲ産物Ｐ１３及びＰ１７（１．１ｋｂ）を、レーン２は、ＰＣＲ産物Ｐ１５及びＰ１８（１．５ｋｂ）を表す。ｐｐｃの欠失は、配列番号３２及び３６のプライマー（Ｐ１３及びＰ１７）を用いたＰＣＲの結果物が１．１ｋｂであり、それと同時に、配列番号３４及び３７のプライマー（Ｐ１５及びＰ１８）を用いたＰＣＲの結果物が１．５ｋｂであるという事実によって確認した。プライマーの位置は図９に示した。前記方法で作製された変異菌株、すなわち、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫでｐｐｃが欠失された菌株を、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ４と命名した。
【００６０】
実施例８：ＬＰＫ７及びＬＰＫ４の発酵特性
前記実施例７で作製されたＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７及びＬＰＫ４の発酵特性を調べるために、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件で培養し、これから生産される反応産物を分析した。まず、実施例４に記載の前培養培地２００ｍＬに炭酸ガスを注入した後、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７及びＬＰＫ４をそれぞれ接種し、３９℃で２４時間前培養を行った。次いで、本培養培地（ブドウ糖濃度が１８ｇ／Ｌ（最終１００ｍＭ）であることを除いては、実施例４と同じである）１．８Ｌを６．６Ｌの培養槽に入れ、１００ｍＬの前培養された微生物を接種した後、３９℃でｐＨ６．５の条件下で、炭酸ガスを０．２５ｖｖｍの流速で供給しつつ回分式培養を行った。
【００６１】
細胞濃度と、コハク酸、ブドウ糖、乳酸、酢酸及び蟻酸の濃度とは、実施例４と同じ方法で測定した（図１２及び図１３）。図１２及び図１３において、シンボルは、培養時間による細胞の濃度（上側の●）及び、コハク酸（下側の●）、ブドウ糖（□）、蟻酸（◆）及び酢酸（▲）の濃度の変化を表す。図１２に示すように、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７を２２時間培養した後に消耗されたブドウ糖の濃度は１００ｍＭであり、生成されたコハク酸の濃度は１２４ｍＭであった。これによるコハク酸の収率（生成されたコハク酸の量／消耗されたブドウ糖の量）は、モル比で１２４％であった。そして、酢酸の生成が著しく減った（表１）。また、図１３に示すように、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ４を２２時間培養した後に消耗されたブドウ糖の濃度は１００ｍＭであり、生成されたコハク酸の濃度は１２３．７ｍＭであった。これによるコハク酸の収率（生成されたコハク酸の量／消費されたブドウ糖の量）は、モル比で１２３．７％であった。そして、酢酸の生成が野生型に比べて大きく減った（表１）。
【００６２】
本発明のＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．ＬＰＫ７を、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件で培養して得るコハク酸の生産方法は、親菌株であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ５５Ｅを、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件で培養して得るコハク酸の生産方法よりも、収率面において大きく向上し、コハク酸／酢酸の比率が９．８倍も向上することにより、ほとんど副産物のないコハク酸が得られた（表１）。
【００６３】
【表１】
2010263911.tif 000003
【００６４】
Ｂｕｌｔｅｒらによると、これまで知られた微生物で酢酸生成遺伝子を全て破壊させても、まだ知られていないアミノ酸及び脂肪酸の物質代謝でも相当量生成されると知られている（Ｂｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，１０１：２２９９，２００４）。したがって、本発明は、これまで知られた酢酸の生成経路を全て遮断したものであって、高効率かつ高濃度のコハク酸の発酵を達成した。
【００６５】
以上、本発明の内容の特定な部分を詳細に記述したが、当業界に通常の知識を持つ者にとってはこのような具体的な記述は単に好適な実施例に過ぎないものであり、本発明の範囲はこれによって限定されるものではない。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びその等価物によって定義されると言えるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上詳細に説明及び立証したように、本発明に係るＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐ．変異菌株（ＬＰＫ、ＬＰＫ７及びＬＰＫ４）は、ＣＯ２で飽和された嫌気的な条件ではコハク酸を生産し、酸素に対する抵抗性の高い通性嫌気性の菌株であるため、前記菌株を用いてコハク酸を製造する場合、絶対嫌気性の菌株を用いてコハク酸を生産する従来の方法に比べて、酸素露出などによる発酵工程の不安定性を画期的に除去できるだけでなく、他の有機酸の生成を除去することにより、精製工程及び生産収率の最適化及び極大化を達成することができる。
【図１】
2010263911.tif 000004
【図２】
2010263911.tif 000005
【図３】
2010263911.tif 000006
【図４】
2010263911.tif 000007
【図５】
2010263911.tif 000008
【図６】
2010263911.tif 000009
【図７】
2010263911.tif 000010
【図８】
2010263911.tif 000011
【図９】
2010263911.tif 000012
【図１０】
2010263911.tif 000013
【図１１】
2010263911.tif 000014
【図１２】
2010263911.tif 000015
【図１３】
2010263911.tif 000016
【配列表】
2010263911000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月23日(2010.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルーメンバクテリア変異菌株において、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（以下、「ｌｄｈＡ」という）及びピルビン酸−蟻酸の分解酵素をコードする遺伝子（以下、「ｐｆｌ」という）が欠失されており、嫌気的な条件で他の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸を高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株。