(57)【要約】      （修正有）【課題】従来より食品もしくは食品素材として利用されており、安全性に問題がない農水産物に由来する成分を有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】ホップ(Humulus Lupulus L.)の抽出物を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害剤（特にコラゲナーゼ阻害作用を有する創傷改善剤および潰瘍形成改善剤）、コラゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする食品もしくは食品素材、並びにビールまたは発泡酒を製造するにあたり、ホップ使用量の５０〜９０％を麦汁に添加して煮沸して得た高温の該麦汁に残りのホップを加えて静置し、濾過した後、発酵、熟成することを特徴とする、コラゲナーゼ阻害活性を有するビールまたは発泡酒の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップ(Humulus Lupulus L.)を８０〜１００℃で熱水抽出し、陽イオン交換樹脂に吸着させて水洗浄し、得られたエタノール可溶画分を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害作用を有する創傷改善剤。
【請求項２】
前記エタノール可溶画分が８０％エタノール可溶画分である、請求項１に記載の創傷改善剤。
【請求項３】
ホップ(Humulus Lupulus L.)を８０〜１００℃で熱水抽出し、陽イオン交換樹脂に吸着させて水洗浄し、得られたエタノール可溶画分を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害作用を有する潰瘍形成改善剤。
【請求項４】
前記エタノール可溶画分が８０％エタノール可溶画分である、請求項３に記載の潰瘍形成改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップに由来する物質を有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤、並びにこれを含有する食品もしくは食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス線維の分解をするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が種々の病体に関係していることが明らかとなっている。ＭＭＰの中でも、線維芽細胞等の間葉系細胞や、炎症部位に存在する好酸球等により産生される間質系のコラゲナーゼが、ガン細胞の転移や潰瘍形成、歯周炎やう歯形成等に関与することが報告されている（非特許文献１、特許文献１）。
【０００３】
一方、人の皮膚のシワやタルミの形成過程で起きる皮膚弾性の減少は、真皮線維芽細胞より産生されるコラゲナーゼがコラーゲンの傷害による３次元構造の変性に関わることが明らかとなっている。従って、そのコラゲナーゼの活性を抑制し、皮膚の弾力や張りを維持するコラーゲンの変性を防止することがシワやタルミの形成阻止、すなわち、皮膚の老化防止に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１８１１２９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】河医研研究年報  38、1988、ｐ25-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、線維芽細胞等の間葉系細胞や好酸球等により産生される間質系のコラゲナーゼに対して特異的に阻害活性を示し、炎症や創傷、ガンの転移、潰瘍形成、皮膚の老化等コラゲナーゼの関与する病体を改善し、或いは防止し得ることのできる物質、並びにこれを含有する食品もしくは食品素材を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するため、従来より食品もしくは食品素材として利用されており、人体に対して副作用の心配が殆どない農水産物の中から当該物質を検索すべく検討を重ねた。その結果、ビールの原料であるホップの有機溶媒もしくは水による抽出物に高いコラゲナーゼ阻害活性を有する成分があることを見出し、係る知見に基づいて本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、ホップ(Humulus Lupulus L.)を８０〜１００℃で熱水抽出し、陽イオン交換樹脂に吸着させて水洗浄し、得られたエタノール可溶画分を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害作用を有する創傷改善剤である。
請求項２に記載の本発明は、前記エタノール可溶画分が８０％エタノール可溶画分である、請求項１に記載の創傷改善剤である。
請求項３に記載の本発明は、ホップ(Humulus Lupulus L.)を８０〜１００℃で熱水抽出し、陽イオン交換樹脂に吸着させて水洗浄し、得られたエタノール可溶画分を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害作用を有する潰瘍形成改善剤。
請求項４に記載の本発明は、前記エタノール可溶画分が８０％エタノール可溶画分である、請求項３に記載の潰瘍形成改善剤である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来より食品素材として利用されており、安全性の上で心配のないホップに由来する特定の化合物を有効成分として含有するコラゲナーゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含有する食品もしくは食品素材が提供される。
さらに、ホップを原料として用いたビール等のアルコール飲料であって、高いコラゲナーゼ阻害活性を有するアルコール飲料の製造方法が提供される。
【００１０】
本発明に係るコラゲナーゼ阻害作用剤は、炎症、創傷、潰瘍形成、皮膚の老化などコラゲナーゼの関与する病体の改善や防止に有効である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のコラゲナーゼ阻害剤の有効成分は、ホップ(Humulus Lupulus L.)に含まれている。ホップは、イラクサ目の麻科に属し、宿根、雌雄異株の多年生植物であり、ビールの原料として世界中で広く使用されている。
【００１２】
ホップは、ビールに苦味と芳香を付与し、泡持ちも良くする。また、雑菌の繁殖を抑える他、薬効作用も多くあり、骨多孔症治療効果、抗ガン作用、動脈硬化予防作用があると報告されている（Biendl,M.:Hopfen Rundschau International, p.60,1999）。さらに、更年期障害への治療効果もあると言われている。しかし、コラゲナーゼ阻害効果については未だ報告がない。
【００１３】
ホップには低分子と高分子のポリフェノールが含まれている。フラボノイド類は、麦芽に含まれていないため、ビール中に存在するフラボノイドは、ホップ由来のポリフェノールであると認められる。
上記文献の記載によれば、上記したホップの薬効作用は、ホップに含まれているポリフェノールによるものである。しかしながら、ホップ由来のポリフェノールによるマトリックスメタロプロテアーゼの阻害作用については、これまでに報告がない。
【００１４】
ホップからポリフェノールを含む成分を抽出する場合には、水もしくは有機溶媒が使用される。はじめに、水を用いて抽出する場合について説明する。乾燥ホップを粉砕し、粉砕直後のホップ重量に対して水を５〜１００倍量、好ましくは３０〜７０倍量を加える。
次に、ホップを含んだ溶液を１〜３０分間、好ましくは１〜５分間加熱（８０〜１００℃）を行って、目的とする成分を抽出する。その後、抽出液を栓付遠心管に入れ１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行って沈殿物を除き、清澄なホップ抽出液を得る。
抽出液は、そのままでコラゲナーゼ阻害剤として用いられるが、所望により、該抽出液をエバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固して得られたものを阻害作用剤として用いることができる。
【００１５】
一方、有機溶媒を使用して抽出を行う場合について述べると、有機溶媒としては、エタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリル等が使用でき、特にエタノール、アセトンが好ましい。抽出法の１例を示すと、乾燥ホップを粉砕し、分液ロート等の適当な容器に入れ、エタノール等の有機溶媒を加えて振盪することにより抽出を行う。このとき、有機溶媒の使用量は、ホップ重量の５〜２０倍量、好ましくは１０倍量が適当である。
振盪は、適当な振盪機を用いて１５０〜６００ｒｐｍ、好ましくは２００〜４００ｒｐｍにて２０〜２５℃（または室温）で１０分間〜２時間、好ましくは２０分間〜１時間ほど行って、目的とする成分を抽出する。得られた抽出液を栓付遠心管に入れ１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行い、沈殿物を除いて清澄なホップ抽出液を得る。
この抽出液をコラゲナーゼ阻害剤として用いてもよいが、好ましくは、前述の如く、濃縮、乾固したものを用いる。
【００１６】
このようにして得られたホップの抽出物は、ポリフェノールを含んでおり、これがコラゲナーゼ阻害剤の有効成分である。なお、抽出物には、ポリフェノール以外の成分も含まれているが、精製品を望む場合の他は、これらを除去する必要はない。
ポリフェノールを選択的に抽出する場合には、乾燥ホップ、好ましくは粉砕物に、ホップ重量に対して５〜１００倍量、好ましくは３０〜７０倍量の水を加え、1〜３０分間、好ましくは１〜５分間加熱（８０〜１００℃）を行う。
得られた煮沸液を栓付遠心管に入れ１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行い、沈殿物を除き、清澄なホップ抽出液を得る。
次いで、エバポレーターを用いて減圧下で１〜２０ｍＬ、好ましくは１０ｍＬまで濃縮する。濃縮液に０．２〜１ｍＬ、好ましくは０．５ｍＬの６Ｎ塩酸と水酸化カルシウム１〜５ｇ、好ましくは３ｇを加える。次に、適当な振盪機を用いて１５０〜６００ｒｐｍ、好ましくは２００〜４００ｒｐｍで１〜１５分間、好ましくは１０分間振盪する。混合液を栓付遠心管に入れて１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿物を１０％酢酸溶液５〜２０ｍＬ、好ましくは１０ｍＬを添加して沈殿物を溶解させる。
【００１７】
この溶液を水酸化ナトリウム溶液でｐＨを５．５〜７．５、好ましくは６．５に調整後、陽イオン交換樹脂（ワットマン  SE52）３ｇから１０ｇ、好ましくは５ｇを添加してポリフェノールを吸着後、混合液を栓付遠心管に入れ１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行い、樹脂を回収したのち、蒸留水で洗浄後、８０％エタノールで樹脂を洗浄してポリフェノールを回収する。
得られたエタノール可溶画分を、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固した後、得られた乾固物をポリフェノールを有効成分として含むコラゲナーゼ阻害剤として好適に用いることができる。
【００１８】
これらの抽出物等は、食品や医薬品などの形態で提供される。食品もしくは食品素材として用いる場合は、単独で各種食品等に添加する他、必要に応じて安定剤、増量剤、膨張剤などの補助剤と併用して用いることができる。本発明に係る有効成分の食品等への添加量は、用途などを考慮して適宜決定すればよい。
また、医薬品として用いる場合には、散剤、顆粒、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤などの任意の剤形を採用することができる。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤などの常用の成分を必要に応じて適宜配合することができる。なお、有効成分の使用量については、用途などを考慮して適宜決定すればよい。
【００１９】
ホップに含まれているポリフェノールは、水などに容易に溶解する。従って、上記のようにして得られたポリフェノールを含む抽出物等は、例えばアルコール飲料、スポーツドリンクなどの飲料に加えて利用することができる。この場合の配合量についても、用途などを考慮して適宜決定すればよい。
【００２０】
次に、高いコラゲナーゼ阻害活性を有するビールまたは発泡酒の製造法について説明する。ビールまたは発泡酒の製造に用いる原料や製造方法などの条件は、基本的に従来法と同じで良く、麦汁を得る際におけるホップの用い方のみが通常の製造方法と異なる。
すなわち、仕込み工程において、麦汁を作る際にホップ使用量の５０〜９０％を麦汁に添加して常法により煮沸し、得られた高温の該麦汁に残りのホップを加えて静置する。静置時間は、１０〜３０分間が適当であり、好ましくは１５〜２５分間である。次いで、該麦汁を濾過した後、通常の発酵工程、熟成工程などを経て製品のビール、発泡酒を得る。
【実施例】
【００２１】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
ホップペレット３ｇを１００ｍＬの蒸留水に加え、３分間煮沸した。冷却後、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を脱イオン水で１０倍希釈した溶液８０μＬをサンプルとした（試験区１）。ホップの代わりに緑茶を用いて同様に処理を行って得た溶液８０μＬと、ザクロを使用して得た溶液８０μＬを、それぞれ試験区２、試験区３とした。
【００２２】
上記３種類のサンプルについてコラゲナーゼ阻害活性を測定した。Ｉ型コラゲナーゼの活性測定は次の通り行った。すなわち、１．５ｍＬマイクロチューブに蛍光標識Ｉ型コラーゲン(５０μｇ／５０μL／tube)を入れ、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ塩化カルシウムの入った０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)緩衝液５０μＬと試料１００μＬを加え、さらに、０．５unit／ｍＬコラゲナーゼ（株式会社ヤガイ）１０μＬを添加した後、３７℃で酵素反応を２時間行った。
反応終了後に，エタノール溶液２００μＬを添加して反応を停止させ、２０００×ｇで１５分間遠心分離して得た上澄液を励起光４９５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍで強度を測定した。なお、対照として、試料の代わりに水を用いた場合についても、同様の測定を行った。
反応活性阻害率は下記の（１）式により算出した。式中、Ｂ１は反応液中の試料として水を用いたときの蛍光強度を、Ｂ２はＢ１の反応液のコラゲナーゼをトリス緩衝液にしたときの蛍光強度を、Ｓ１は試料添加時の蛍光強度を、Ｓ２はＳ１の反応液中のコラゲナーゼをトリス緩衝液にしたときの蛍光強度を、それぞれ示す。
【００２３】
【数１】
2010195812.tif 000002
【００２４】
一方、IV型コラゲナーゼの活性測定は次の通り行った。すなわち、１．５ｍＬマイクロチューブに蛍光標識IVコラーゲン(２５μｇ／２５μＬ／tube)を入れ、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０.０１Ｍ塩化カルシウムの入った０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)緩衝液２５μＬ、試料５０μＬを加え、さらに、０．５unit／ｍＬコラゲナーゼ（株式会社ヤガイ）１０μＬを添加した後、４２℃で酵素反応を２時間行った。
反応終了後に、エタノール溶液３００μＬを添加して反応を停止させ、２０００×ｇで１５分間遠心分離して得た上澄液を励起光４９５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍで強度を測定した。なお、対照として、試料の代わりに水を用いた場合についても、同様の測定を行った。反応活性阻害率は上記（１）式により算出した。式中のＢ１、Ｂ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記した蛍光強度を示す。
Ｉ型コラゲナーゼの活性測定結果を表１に、IV型コラゲナーゼの活性測定結果を表２に示す。これらの表から明らかなように、ホップ抽出成分は、緑茶やザクロの抽出成分と同等のコラゲナーゼ阻害活性を示した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
【表２】
2010195812.tif 000004
【００２７】
実施例２
乾燥ホップ３ｇを１００ｍＬの蒸留水で３分間煮沸した。得られた煮沸液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、清澄な液を得た。次に、エバポレーターを用いて減圧下で１０ｍＬまで濃縮した。濃縮液に０．５ｍＬの６Ｎ塩酸と水酸化カルシウム３ｇを加えた後、振盪機を使って強く振盪した（３００ｒｐｍ、５分間）。
混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）して得た沈殿物に１０％酢酸溶液１０ｍＬを添加して沈殿物を溶解させた。次いで、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６．５に調整後、陽イオン交換樹脂（ワットマンン  SE52）５ｇを添加してポリフェノールを吸着後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行って樹脂を回収した。この樹脂を蒸留水で洗浄後、８０％エタノールで洗浄してポリフェノールを回収した。
エタノール可溶画分をエバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固し、得られた乾固物を脱イオン水５ｍＬで溶解した。ホップから抽出されたポリフェノールを含む成分について、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定したところ、強い阻害活性が認められた。なお、ポリフェノールを除いた画分には阻害活性が見られなかった。
【００２８】
実施例３
市販ビール、ホップを含まない麦汁、ホップを入れて９０分間煮沸した麦汁のそれぞれから遠心分離して得た上清について、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定した。結果を表３および表４に示した。これらの結果から明らかなように、市販ビール、ホップを含まない麦汁およびホップを添加し９０分間煮沸した麦汁のいずれも阻害活性は低い値を示した。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
【表４】
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【００３１】
実施例４
ホップを含まない麦汁１Ｌにホップ２ｇを添加し、９０分間煮沸した麦汁（試料ａ）、ホップを含まない麦汁１Ｌに１．４ｇのホップを添加し，９０分間煮沸した後、加熱を止めた高温麦汁に０．６ｇのホップを添加し、２０分間静置させて得た麦汁（試料ｂ）のそれぞれの上清について、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定した。結果を表５および表６に示した。これらの表から明らかなように、一部のホップを添加後、煮沸せずに２０分間放置して作成した麦汁、すなわち試料ｂのコラゲナーゼ阻害活性は高い値を示した。
また、試料ａおよび試料ｂのそれぞれの麦汁を発酵させて常法により製造したビールについて、同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定した。その結果を表７に示した。表７より、試料ｂ、すなわちホップ添加後高温で２０分静置して作成した麦汁を発酵させて得たビールのコラゲナーゼ阻害活性が高いことが分かる。
【００３２】
【表５】
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【００３３】
【表６】
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【００３４】
【表７】
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