(57)【要約】【課題】必要最小量の細胞を用い、細胞の成育や分化に適した培養空間を呈示するための細胞培養容器、細胞培養方法、細胞評価方法を提供すること。【解決手段】細胞培養容器１０は、表面に複数の大きさのマイクロ容器１１ａ〜１１ｄを有し、マイクロ容器１１ａ〜１１ｄは、７．８５×１０−５ｍｍ２〜７．１０×１０−４ｍｍ２の最小の底面積を有するマイクロ容器１１ｄと、最小の底面積を２倍〜１５倍の正の整数倍した異なる底面積を有するマイクロ容器１１ａ〜１１ｃとの、少なくとも２種類のマイクロ容器を有する。細胞培養方法は、細胞１個をマイクロ容器１１ａ〜１１ｄに注入し培養する培養方法であり、細胞評価方法は、細胞の成育や分化に最適な大きさの底面積を有するマイクロ容器および分化能を評価するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に複数の大きさのマイクロ容器を有する細胞培養容器であって、
前記複数のマイクロ容器は、７．８５×１０−５ｍｍ２〜７．１０×１０−４ｍｍ２の最小の底面積を有するマイクロ容器と、前記最小の底面積を２倍〜１５倍の正の整数倍した底面積を有するマイクロ容器との、少なくとも２種類のマイクロ容器を有することを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
前記複数のマイクロ容器の深さが２０μｍ〜１５０μｍであることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記複数のマイクロ容器底部の長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の各マイクロ容器に少なくとも１個の細胞を注入し、培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項５】
前記各マイクロ容器に少なくとも２種類の細胞を１個ずつ注入し、培養することを特徴とする請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の細胞培養方法で、未分化細胞を培養し、分化に最適なマイクロ容器底面積の大きさと分化能を評価する細胞評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。
【０００３】
単離した細胞は、直ちに浮遊状態にて試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿に接着させた状態で培養し、種々の試験、検査に用いられる。細胞培養に用いられる初代細胞、株化細胞には、生体内での試験いわゆるｉｎ  ｖｉｖｏ試験と同様の薬剤感受性、毒性反応などを示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器上で生体内類似の細胞機能が必要とされる。また、初代細胞を得るための単離操作が煩雑であること、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は高額であることから、少ない細胞数での試験方法が望まれている。
【０００４】
上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレート又はシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、１ウェルのサイズが小さくなる。この１ウェルが１培養皿に相当する。また、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状であり、この底面を培養面として用いている。
【０００５】
少ない細胞数で培養するためには、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルプレートが有効であるが、平板状の底面を有し、さらにその接着底面部は細胞にとっては大きすぎるため、細胞は本来の機能を低下させるあるいは消失させてしまう問題がある。
【０００６】
そこで、細胞培養底面に細胞約１個が接着可能な面積のみ細胞接着性分子を配置、およびその外周を非接着性分子で配置し、細胞を１個ずつ規定面積内に配置させる方法が検討されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３３１７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この方法では、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルプレートよりも、少ない細胞数での培養が可能であり、細胞１個の挙動が容易に観察できるものの、細胞が接着する底面積を強制的に制御しており、形成する接着斑により、その細胞の機能が確定され、従来の平板状底よりは機能低下が抑制されるものの、本来の機能とは大きく異なることが問題となっている。また、１種類の細胞を所定位置に配置することは可能であるが、２種類以上の細胞を任意の位置に１個ずつ配置することが困難であること、さらにこの方法は高コストであることが問題となっている。
【０００９】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、必要最小量の細胞を用い、細胞の成育や分化に適した培養空間を呈示するための細胞培養容器、細胞培養方法、細胞評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る細胞培養容器の一態様は、表面に複数の大きさのマイクロ容器を有する細胞培養容器であって、前記複数のマイクロ容器は、７．８５×１０−５ｍｍ２〜７．１０×１０−４ｍｍ２の最小の底面積を有するマイクロ容器と、前記最小の底面積を２倍〜１５倍の正の整数倍した異なる底面積を有するマイクロ容器との、少なくとも２種類のマイクロ容器を有する。また、前記複数のマイクロ容器の深さが２０μｍ〜１５０μｍであることが好ましく、前記複数のマイクロ容器底部の長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明に係る細胞培養方法の一態様は、上述した各マイクロ容器に少なくとも１個の細胞を注入し、培養する。または、各マイクロ容器に少なくとも２種類の細胞を１個ずつ注入し、培養する。
【００１２】
さらに、本発明に係る細胞評価方法の一態様は、上述した細胞培養方法で、未分化細胞を培養し、分化に最適なマイクロ容器底面積の大きさと分化能を評価する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、必要最小量の細胞を用い、細胞の成育や分化に適した培養空間を呈示するための細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養方法に用いる細胞培養容器の構成例を示す正面図である。
【図２】図１の細胞培養器のＩ−Ｉ断面図である。
【図３】実施例１に係る細胞培養容器とマイクロマニュピレーターを示す写真である。
【図４】実施例１に係る細胞培養方法に用いる細胞培養容器の構成を示す上面の電子顕微鏡像である。
【図５】実施例１に係る細胞培養方法に用いる細胞培養容器の各サイズの容器を拡大した電子顕微鏡像である。
【図６】実施例１に係る骨髄間葉系幹細胞の位相差顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る細胞培養容器には凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器すなわち培養空間が形成されている。このマイクロ容器の底面積及び深さを最適化することで、マイクロ容器内で細胞を培養し、細胞の成育や分化に適した環境を構築させることができる。
【００１６】
マイクロ容器の底面面積が大きすぎると、平板上での培養と同様、部分的に細胞は薄く伸び、目的の機能を示さない。一方、マイクロ容器の底面面積が小さすぎると、細胞を収容できなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、収容できる範囲かつ目的の機能を示し成育できる範囲とすることが好ましい。
【００１７】
また、マイクロ容器の深さも細胞を培養するために最適な範囲とする必要がある。深さが大きすぎると、作製が困難な上、物質拡散がしにくくなり培養環境が悪化してしまう。深さが小さすぎると、細胞が側壁を乗り越えてしまい、培養に適さない。なお、培養する細胞種に応じ、マイクロ容器の底面積、深さを便宜設定することにより、多様な培養系に適用することもできる。
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。また、「Ｘ〜Ｙ」は、Ｘ以上Ｙ以下を意味する。
【００１９】
実施の形態
図１は、本実施の形態に係る細胞培養容器の構成例を示す正面図であり、図２は図１のＩ−Ｉ断面図である。図１及び２に示すように、細胞培養容器１０はマイクロ容器１１ａ〜１１ｄを備える。以下、マイクロ容器１１ａ〜１１ｄを特に区別する必要がないときには、マイクロ容器１１と記す。細胞培養容器１０の培養面には、複数のマイクロ容器１１が形成されている。
【００２０】
図１及び２において、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、マイクロ容器１１の深さｂを示した。
【００２１】
マイクロ容器１１の底面形状は特に制限されるものではなく、正方形、円、多角形以外にも種々の形状を採用することができる。この底面積の最小値は、７．８５×１０−５ｍｍ２〜７．１０×１０−４ｍｍ２が好ましい。細胞の相当直径の最小は１０μｍ程度のため、７．８５×１０−５ｍｍ２より小さい底面積では、細胞がマイクロ容器内で培養できなくなる。また、細胞の相当直径の最大は３０μｍ程度のため、７．１０×１０−４ｍｍ２より大きい底面積は最小範囲とならない。従って、マイクロ容器１１は、７．８５×１０−５ｍｍ２〜７．１０×１０−４ｍｍ２の底面積を最小とし、該底面積の２倍〜１５倍の正の整数倍の底面積が好ましい。また、等方的な形状が好ましく、底面が矩形状の場合、長辺が短辺の１〜１．５倍であることが好ましい。
【００２２】
マイクロ容器１１の深さｂは、マイクロ容器１１で細胞を培養するため、例えば骨髄間質細胞を培養する場合は２０〜１５０μｍが好ましい。深さが２０ｕｍ未満では、細胞播種時に細胞がマイクロ容器内に留まり難くなり、深さが１５０ｕｍより大きいと作製が困難である。
【００２３】
図１では、７．８５×１０−５ｍｍ２〜７．１０×１０−４ｍｍ２の最小の底面積を含む、異なる底面積を有する４種類のマイクロ容器１１を示している。図１では、マイクロ容器１１ｄの底面積が最小であり、最小の底面積を２倍〜１５倍した異なる底面積を有するマイクロ容器１１ｃ、１１ｂ、１１ａを示している。しかしながら、底面積の種類は４つに限られるわけではない。細胞培養容器１０は、異なる底面積を有する少なくとも２種類のマイクロ容器１１を備えていることが好ましい。
【００２４】
本発明の細胞培養容器上のマイクロ容器１１を作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の方法が挙げられる。細胞培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。
【００２５】
モールドを用いて転写成形方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で凹凸パターンを形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ凹凸パターンに再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。
【００２６】
上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。
【００２７】
上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸パターンを成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。
【００２８】
本発明の細胞培養容器を構成する材料としては、透明で自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体等のアクリル系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の細胞培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、凹凸パターン表面側に表面処理を行い、改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。
【００３０】
上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。
【００３１】
また、コーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。
【００３２】
凹凸パターン上には、気泡の混入することなく培養液を注入するために親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。
【００３３】
また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。通常、細胞培養においては、生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。
【００３４】
本発明の細胞培養方法で培養する細胞は、特に制限がなく、平板では脱分化してしまう細胞が好ましい。また、動物種はラット、マウス、ニワトリ、イヌ、サル、ヒトなど目的に応じて選択すれば良い。例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、乳腺上皮細胞、繊毛上皮細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、類洞内皮細胞、クッパ−細胞、筋芽細胞、神経細胞、グリア細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、また、ＥＳ細胞、骨髄間質細胞、骨髄間葉系幹細胞）、神経幹細胞等の幹細胞などが挙げられる。
【００３５】
本発明の細胞培養方法でマイクロ容器に細胞を注入する方法は、特に制限がなく、安定して細胞への負荷なく、１個の細胞を１個のマイクロ容器に注入できる方法であれば良い。例えば、インクジェット、ディスペンサーなどの装置が挙げられる。
【実施例１】
【００３６】
次に本発明に係る細胞培養容器の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３７】
＜骨髄間葉系細胞の調製＞
培養に用いる骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）は以下のように調整した。１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大腿骨を摘出、骨内腔より取り出した骨髄細胞を細胞培養プレートに播種し、１５％牛胎仔血清、ペニシリン／カナマイシン／アンフォテリシンＢを添加したαＭＥＭ培地にて培養した。プレートに付着した細胞を長期経代培養することで自然不死化を誘発しシリンダー法、限界希釈法を用いた細胞クローニングにより、単一細胞株を作製した。
【００３８】
＜培養方法＞
培養に用いる培養液は２０％牛胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有したαＭＥＭを用い、２日毎に培養液の交換を行った。３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下にて培養を行った。
【００３９】
＜マイクロ容器への細胞播種方法＞
１個細胞のマイクロ容器内への播種は、図３に示す顕微鏡ステージ上に設置したマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡観察下にて行った。マイクロマニピュレーター先に装着したマイクロガラスニードルから細胞を播種、その後、ニードル先端からの吸水により水の流れを発生させ、チャンバー内への細胞誘導を行いマイクロ容器内へ播種した。
【００４０】
［実施例１］
図１に示す凹凸パターン形状であって、底部の幅ａ＝２０μｍ、４０μｍ、８０μｍ、１６０μｍ、深さｂ＝３０μｍのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリメタクリル酸メチル上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターン基材を得た。その凹凸基材上で骨髄間葉系幹細胞を上記培養法にて培養した。図４に細胞培養容器の構成を示す上面の電子顕微鏡像を示す。また、図５に細胞培養容器の各サイズの容器を拡大した電子顕微鏡像を示す。図５において、（ａ）はａ＝１６０μｍ、（ｂ）はａ＝８０μｍ、（ｃ）はａ＝４０μｍ、（ｄ）はａ＝２０μｍの場合であり、各サイズの電子顕微鏡像は拡大倍数が異なっている。
【００４１】
［比較例１］
市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済みディッシュを平板上のディッシュの一例として用いた。骨髄間葉系幹細胞を、上記マイクロマニュピレーターを用いてディッシュに播種し、上記培養方法にて培養した。
【００４２】
図６に、実施例１のマイクロ容器に播種した骨髄間葉系幹細胞の位相差顕微鏡像を示す。播種４時間後、マイクロ容器の直径２０μｍ、４０μｍでは細胞の大きさは約２０μｍでほとんど変化しないが、８０μｍでは約４０μｍ、１６０μｍでは約５０μｍであった。このように直径２０μｍ、４０μｍでは立体的形状を保持したまま培養が可能であるが、８０μｍ、１６０μｍでは培養時間の経過とともに扁平化が進行し、骨髄間葉系幹細胞から形態の異なる細胞へと変化した。比較例１では、扁平化が早く起り、紡錘形の形状を示した。実施例１では、異なる大きさの培養器を一つのチップに形成しているため、一つのチップ内で適切な培養環境を判定することが可能になる。
【００４３】
なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。
【符号の説明】
【００４４】
１０  細胞培養容器
１１  マイクロ容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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